UA128302C2 - Антитіла, специфічні до клаудину 6 (cldn6) - Google Patents

Антитіла, специфічні до клаудину 6 (cldn6) Download PDF

Info

Publication number
UA128302C2
UA128302C2 UAA201805468A UAA201805468A UA128302C2 UA 128302 C2 UA128302 C2 UA 128302C2 UA A201805468 A UAA201805468 A UA A201805468A UA A201805468 A UAA201805468 A UA A201805468A UA 128302 C2 UA128302 C2 UA 128302C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
acid sequence
cell
amino acid
antibody
nucleic acid
Prior art date
Application number
UAA201805468A
Other languages
English (en)
Inventor
Угур Сахін
Езлем Тюречі
Міхаель Козловскі
Корден ВАЛЬТЕР
Штефан Вйоль
Марія Кройцберг
Бернд ХУБНЕР
Міхаель Ердельян
Original Assignee
Астеллас Фарма Інк.
Йоханес Ґутенберґ-Університет Майнц
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP09014136A external-priority patent/EP2322555A1/en
Application filed by Астеллас Фарма Інк., Йоханес Ґутенберґ-Університет Майнц filed Critical Астеллас Фарма Інк.
Publication of UA128302C2 publication Critical patent/UA128302C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/02—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from eggs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіл, які можуть бути застосовані як терапевтичні засоби, для лікування і/або запобігання хворобам, пов'язаним з клітинами, які експресують CLDN6, включаючи хвороби, пов'язані з пухлинами, такі як рак яєчника, рак легень, рак шлунка, рак молочної залози, рак печінки, рак підшлункової залози, рак шкіри, зокрема злоякісну меланому, рак голови і шиї, зокрема саркому, рак жовчних шляхів, рак сечового міхура, рак нирки, рак товстої кишки, зокрема плацентарну хоріокарциному, рак шийки матки, рак яєчка і рак матки.

Description

хвороби, пов'язані з пухлинами, такі як рак яєчника, рак легень, рак шлунка, рак молочної залози, рак печінки, рак підшлункової залози, рак шкіри, зокрема злоякісну меланому, рак голови і шиї, зокрема саркому, рак жовчних шляхів, рак сечового міхура, рак нирки, рак товстої кишки, зокрема плацентарну хоріокарциному, рак шийки матки, рак яєчка і рак матки.
Протягом останнього десятиліття в клінічну практику для лікування раку успішно упроваджені антитіла, які є найбільш перспективними терапевтичними засобами в онкології.
Лікування раку, яке грунтується на використанні антитіл, має вищу специфічність і дає менше побічних ефектів в порівнянні з традиційними лікарськими засобами. Причина полягає в тому, що антитіла точно відрізняють нормальні від неопластичних клітин, а також в тому, що спосіб їх впливу грунтується на менш токсичних імунологічних протипухлинних механізмах дії, таких як активація комплементу і рекрутування цитотоксичних імунних клітин.
Клаудини є інтегральними мембранними білками, розташованими в місцях щільного контакту епітелію і ендотелію. Відомо, що клаудини мають чотири трансмембранних сегменти з двома позаклітинними петлями, при цьому М- ї С-кінці розташовуються в цитоплазмі. Родина трансмембранних білків клаудинів (СОМ) грає вирішальну роль в збереженні епітеліальних і ендотеліальних щільних контактів, а також в підтримці цитоскелету і в сигнальній системі клітини. Різниця в експресії цих білків пухлинними і нормальними клітинами, на додачу до їх мембранної локалізації, робить їх привабливою метою для імунотерапії раку, а застосування при лікуванні раку терапевтичних засобів на основі антитіл для націлювання на СІ ОМ обіцяє високий рівень терапевтичної специфічності.
Проте клінічне застосування терапевтичних засобів, націлених на СОМ, стикається з деякими перешкодами. При повсюдній експресії СІ ОМ в організмі і вирішальній ролі СІ ОМ в збереженні щільних контактів, для того, щоб збільшити до межі специфічність лікування і звести до мінімуму загальну токсичність, потрібна специфічність мішені для терапевтичних засобів, націлених на СІ ОМ.
МО 2009/087978 має відношення до анти-СІОМб антитіл та їх застосування як протипухлинних засобів. Зокрема, описуються моноклональні антитіла, позначені АВЗ-1,
АЄЕ1-16, АЕ49-11 і АЕ3-2О. Проте жодне з цих антитіл не було специфічним до СГ ОМб, як показано за допомогою ЕАСб-аналізу в прикладі 5. Антитіло АЕЗ3-20 вступало в реакцію з
СІГОМО, тоді як антитіла ДАЕ1-16 і АЕ49-11 показували значну здатність вступати в реакцію з
СІОМО і також вступали в реакцію з С ОМ4. Зв'язок антитіла АВ3-1 з СІ ОМб був таким же сильним, як його зв'язок з СІ ОМУ. У Прикладі 7 описано, що при введенні антитіл АЕ49-11 на мишачій моделі пухлини спостерігається тенденція до інгібування зростання пухлини і збільшення тривалості життя. Проте зважаючи на неспецифічність використаного антитіла, залишається неясним, чи є описані ефекти результатом зв'язування антитіла з СІ ОМб.
Таким чином, до цих пір не описане СІ ЮОМб-специфічне антитіло, яке селективно зв'язується з поверхнею клітин, які експресують СІ ОМб. Проте, таке специфічне антитіло було б необхідне для терапевтичних підходів на основі антитіл, які використовують СІ ОМб як мішень.
Вирівнювання послідовностей СІ ОМ3З, СІ 0ОМ4, СІ ОМ і СГ ОМО, показане на фіг. 1, ілюструє, що існує високий ступінь консервативності СІОМбЄ відносно інших білків клаудинів. Ця висока гомологія СГОМбЄ з іншими білками клаудинами, зокрема СІОМУ і СІОМ4, і той факт, що
МО 2009/087978 виявився не в змозі забезпечити СІ ЮОМб-специфічні антитіла, показують, що може бути неможливим отримання антитіл, які специфічно зв'язуються з СІ ЮОМб.
Розкриття винаходу
Експериментальні результати, розкриті в описі, підтверджують, що СГ ОМб експресується в різних ракових клітинах людини, тоді як експресія в нормальних тканинах обмежується плацентою.
Крім того, даний винахід вперше описує успішне отримання СІ ЮОМб-специфічних антитіл, здатних зв'язуватися з поверхнею інтактних клітин, які експресують СІГОМб. ЕАСсзЗ-аналіз інтактних клітин, які експресують СІ ОМб, показав специфічне зв'язування анти-СІ ОМб антитіл, тоді, як з клітинами, які експресують інші білки-клаудини, зокрема, СГОМ3, СГ ОМА і СІ ОМ, або з клітинами, які не експресують будь-які з цих СІ ОМ-білків, зв'язок не спостерігався. Таким чином, даний винахід несподівано показує, що може бути отримане антитіло, яке здійснює специфічну взаємодію антиген-антитіло з СІ ОМбЄ на поверхні клітин, які експресують СІ ОМб, але яке практично не демонструє взаємодії антиген-антитіло з іншими високогомологічними клаудинами.
Загалом, даний винахід пропонує антитіла, придатні як терапевтичні засоби, для лікування ілабо запобігання хворобам, які мають відношення до клітин, які експресують СГОМб, і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею, включаючи пухлинні захворювання, зокрема рак, наприклад рак яєчника, зокрема аденокарциному яєчника і тератокарциному яєчника, рак легенів, включаючи дрібноклітинний рак легень (ЗСІС) і недрібноклітинний рак легень (М5СІ С), зокрема плоскоклітинний рак легень і аденокарциному, рак шлунка, рак молочної залози, рак печінки, рак підшлункової залози, рак шкіри, зокрема бо базальноклітинну карциному і плоскоклітинну карциному, злоякісну меланому, рак голови і шиї,
зокрема злоякісну плеоморфну аденому, саркому, зокрема синовіальну саркому і карциносаркому, рак жовчної протоки, рак сечового міхура, зокрема перехідно-клітинну карциному і папілярний рак, рак нирки, зокрема нирковоклітинний рак, включаючи світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, рак товстої кишки, рак тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкої кишки і аденокарциному клубової кишки, ембріональну карциному яєчка, плацентарну хоріокарциному, рак шийки матки, рак яєчка, зокрема семіному яєчка, тератому яєчка і ембріональний рак яєчка, рак матки, герміному, таку як тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально- клітинну пухлину яєчка, та їх метастатичні форми.
У одному аспекті винахід має відношення до антитіла, здатного зв'язуватися з СІ ОМб, зв'язаним з поверхнею клітини, яка експресує СОМб. Бажано, антитіло практично нездатне зв'язуватися з СІ ОМО, пов'язаним з поверхнею клітини, яка експресує СІ ОМО9. Бажано, антитіло практично нездатне зв'язуватися з СІ ОМ4, зв'язаним з поверхнею клітини, яка експресує
СІГОМ4, і/або практично нездатне зв'язуватися з СГОМ3З, зв'язаним з поверхнею клітини, яка експресує СІГОМ3. Найкраще, антитіло практично нездатне зв'язуватися з СІ ОМ-білком, відмінним від СІОМб, зв'язаним з поверхнею клітини, яка експресує вказаний СІ ОМ-білок, і є специфічним для СІГОМб. Бажано, вказана клітина, яка експресує вказаний СІОМ-білок, єінтактною клітиною, зокрема непермеабілізованою клітиною (клітиною з непорушеною проникністю мембрани), і вказаний СІ ОМ-білок, зв'язаний з поверхнею клітини, має нативну, тобто неденатуровану конформацію. Краще, антитіло здатне зв'язуватися з одним або більш епітопами СІ ОМб, в їх нативній конформації.
У одному варіанті здійснення антитіло здатне зв'язуватися з епітопом, розташованим на позаклітинній ділянці СГОМЄ, причому вказана позаклітинна ділянка СІ ОМб бажано містить будь-яку амінокислотну послідовність з числа ЗЕО ІЮО МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 7, 5БЕО ІО МО: 14 і
ЗЕО ІЮО МО: 15, бажано амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: б або 5ЕО ІО МО: 7, краще амінокислотну послідовність зЕО ІО МО: 6. Краще, антитіло здатне зв'язуватися з епітопом, розташованим в межах будь-якої амінокислотної послідовності з числа 5ЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІО
МО: 7, 5ЕО ІЮО МО: 14 ї ЗЕО ІО МО: 15, бажано амінокислотної послідовності зЗЕО ІО МО: 6 або
ЗЕОІЮО МО: 7.
У одному варіанті здійснення антитіло здатне зв'язуватися з СІ ОМб шляхом взаємодії щонайменше з однією, бажано більше ніж однією, наприклад 2, 3, 4 або 5, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з ТПг33, Рпе35, СІуЗ37, бег39, Пе40 і
Ї еи151, бажано шляхом взаємодії щонайменше з однією, бажано більше ніж однією, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з Тпг33, Рпе35, СІуЗ37, Зег39 і Пе40, краще шляхом взаємодії щонайменше з однією, бажано більше ніж однією, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з Рпе35, сіІуЗ7, бег39 і Пе40, або яка складається з Тпг33, Рпез5, СІуЗ37 і Зег39, і зокрема, шляхом взаємодії щонайменше з однією, бажано більше ніж однією, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з Рпе35, СіІуЗ37 і бег39. Краще, антитіло не взаємодіє з однією або більше, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з Сішп1/54, АІаІ55, АгоІ58 і СІу161, і бажано не взаємодіє з однією або більше, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з Агаі/58 і СІу161.
Взаємодія між антитілом і СІ ОМб, зокрема в його нативній конформації, може бути дослідженою за допомогою скануючого аланіном мутагенезу амінокислот. Мутанти СІ ОМб можна визначити за їх здатністю зв'язуватися із специфічними моноклональними антитілами.
Зменшене зв'язування специфічного моноклонального антитіла з СІ ОМб-мутантом означає, що амінокислота, яка зазнала мутації (видозмінена), є важливим зв'язуючим залишком. Зв'язок можна проаналізувати, наприклад, за допомогою проточної цитометрії.
У одному варіанті здійснення антитіло отримують способом, який передбачає стадію імунізації тварини пептидом, який має будь-яку амінокислотну послідовність з-поміж
ЗЕОІО МО:6, 5ЕОІОМО:7, ЗЕБЕО ІО МО: 14 і 5ЕО 10 МО: 15, бажано амінокислотну послідовність «ЕО ІЮО МО: 6 або 5ЕО ІО МО: 7, або імунологічно еквівалентним пептидом або нуклеїновою кислотою або клітиною-хазяїном, яка експресує вказаний пептид.
У різних варіантах здійснення СІОМб, з яким антитіло здатне зв'язуватися, має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 2 або амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 8.
Особливо бажано, щоб антитіло було здатне зв'язуватися з СІ ОМб, який має амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 2, іздатне зв'язуватися з СІОМб, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8.
У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить важкий ланцюг, 60 який містить щонайменше одну, бажано дві, краще всі три СОВ-послідовності важкого ланцюга антитіла, вибрані з-поміж 5ЕО ІО МО: 34, 36, 38 і 40 або їх варіанту. У вищезазначених послідовностях важкого ланцюга антитіла, приведених на фіг. 25, СОВ-послідовності помічені прямокутником.
У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить важкий ланцюг, який включає СОВЗ-послідовність Хааї Су Хаа2 Маї ХааЗз, де Хааї є будь-якою амінокислотою, бажано ароматичною амінокислотою, краще Ріпе або Туг, найкраще Туг, Хаа?2 є будь-якою амінокислотою, бажано ароматичною амінокислотою, краще Ре або Туг, найкраще Туг, і Хааз є будь-якою амінокислотою, бажано ей або РПе, краще Гей. У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить важкий ланцюг, який включає СОВЗ послідовність
Азр Хааї! Су Хаа2 Маї Хааз або Хааї! Су Хаа2 Маї Хааз Азр, де Хааї, Хаа? і Хааз є, як описано вище. У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить важкий ланцюг, який включає СОВЗ послідовність Азр Хааї Су Хаа2 Маї Хааз Ар, де Хааї, Хаа? і Хааз є таким, як описано вище. У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить важкий ланцюг, який включає СОВЗ-послідовність Аа Агд Азр Хаа! Су Хаа2 Ма! Хааз
Азр Туг, де Хааї, Хаа? і Хааз є таким, як описано вище.
У одному варіанті здійснення антитіло згідно з вищенаведеними варіантами здійснення містить важкий ланцюг антитіла, який включає послідовність СОНІ1 відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 47 або її варіантів і/або СОВ2-послідовність відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 48 або її варіантів.
У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить важкий ланцюг, який включає послідовність важкого ланцюга, вибрану з-поміж 5ЕО ІО МО: 34, 36, 38 і 40 або їх варіантів.
У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить легкий ланцюг, який містить щонайменше одну, бажано дві, краще всі три СОВ-послідовності легкого ланцюга антитіла, вибрані з-поміж ЗЕО ІО МО: 35, 37, 39 ії 41 або їх варіантів. У вищезазначених послідовностях важкого ланцюга антитіла, приведені на фіг. 26 СОВ-послідовності, помічені прямокутником.
У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить легкий ланцюг, який включає СОВЗ-послідовність Агд Хааї Хаа2 Хааз Рго, де Хааї є будь-якою амінокислотою, бажано 5ег або Азп, найкраще 5ег, Хаа2 є будь-якою амінокислотою, бажано Туг, 5ег, Пе, Азп або Тпг, краще Туг, 5ег, або Азп, найкраще Авп, і Хааз є будь-якою амінокислотою, бажано 5ег або Туг, краще Туг. У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить легкий ланцюг, який включає СОНВЗ-послідовність Сіп Агу Хааї Хаа2 Хааз Рго Рго, де Хааї, Хаа2 і ХааЗ є таким, як визначено вище. У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить легкий ланцюг, який включає СОНЗ-послідовність Сіп Сіп Агуд Хааї Хаа?2
Хааз Рго Рго Тгр ТНг, де Хааї, Хаа2 і ХаазЗ є такими, як визначено вище. У одному варіанті здійснення антитіло, яке відповідає вищенаведеним варіантам здійснення, містить легкий ланцюг антитіла, який включає послідовність СОНІ1 відповідно до 5ЕО ІО МО: 52 або її варіант імлабо СОВ2-послідовність відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 53 або її варіант.
У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить легкий ланцюг, який містить послідовність легкого ланцюга, вибрану з-поміж 5ЕО ІЮО МО: 35, 37, 39 і 41 або їх варіантів.
У різних варіантах здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить важкий ланцюг, як обговорювалося вище, і легкий ланцюг, який також обговорювався вище.
У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить: () важкий ланцюг антитіла, який містить щонайменше одну, бажано дві, краще всі три СОВ- послідовності важкого ланцюга антитіла 5ЕО ІО МО: х або їх варіант, і (ї) легкий ланцюг антитіла, який містить щонайменше одну, бажано дві, краще всі три СОВ- послідовності легкого ланцюга антитіла 5ЕО ІО МО: х 41 або їх варіант; де х вибирають з поміж 34, 36, 38 і 40.
СОВ-послідовності у вищезазначених послідовностях важкого ланцюга антитіла і послідовностях легкого ланцюга антитіла, приведених на фіг. 25 і фіг. 26, відповідно, помічені прямокутником.
У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить: () важкий ланцюг антитіла, який містить СОРЗ-послідовність, вибрану з групи, яка складається з Хааї! Су Хааг2 Маї ХааЗз, Ар Хааї Су Хаа2г Маї Хааз, Хааї! Су Хаа2 Ма! Хааз Ар,
Азр Хааї Су Хаа2 Маї Хааз Авзр і АІа Агуд Ар Хааї Су Хаа2 Маї Хааз Азр Туг, де Хааї є будь- якою амінокислотою, бажано ароматичною амінокислотою, краще Рпе або Туг, найкраще Туг,
Хаа2 є будь-якою амінокислотою, бажано ароматичною амінокислотою, краще Рпе або Туг, найкраще Туг, і Хааз є будь-якою амінокислотою, бажано І еи або Ріє, краще / ен, і
(ї) легкий ланцюг антитіла, який містить СОВЗ-послідовність, вибрану з групи, яка складається з Агу Хааї! Хаа2 Хааз Рго, СіІп Агу Хааї Хаа2 Хааз Рго Рго, Сіп Сіп Агу Хааї! Хаа?2
Хааз Рго Рго Тгр ТНг, де Хааї є будь-якою амінокислотою, бажано 5ег або Азп, найкраще Зег,
Хаа2 є будь-якою амінокислотою, бажано Туг, Зег, Не, Азп або ТПг, краще Туг, бег або Авп, найкраще Азп, і Хааз є будь-якою амінокислотою, бажано 5ег або Туг, краще Туг.
У одному варіанті здійснення антитіло згідно з вищенаведеними варіантами здійснення містить (ї) важкий ланцюг, який включає послідовність СОН відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 47 або її варіантів і/або послідовність СОН2 відповідно до ЗЕО ІЮО МО: 48 або її варіантів і/або (ії) легкий ланцюг, який включає послідовність СОНІ відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 52 або її варіантів і/або
СОВ2 послідовність відповідно до 5ЕО ІО МО: 53 або її варіантів.
У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, містить: () важкий ланцюг антитіла, який містить послідовність важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: х або її варіант, і (ї) легкий ланцюг антитіла, який містить послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІО 5 МО: х1 або її варіант; де х вибирають з-поміж 34, 36, 38 і 40.
У кращих варіантах здійснення антитіло проявляє одне або більше із наступних дій: (ії) знищення клітин, які експресують СІ Мб, (ії) інгібування проліферації клітин, які експресують
СОМ, (ії) інгібування колонієутворення клітин, які експресують СГ ОМб, (ім) опосередковані ремісії тобто зменшення розміру, бажано повні ремісії, тобто повне зникнення розвинутих пухлин, (у) запобігання утворенню або повторному утворенню пухлин і (мі) інгібування метастазування клітин, які експресують СІ ОМб. Відповідно, антитіло може використовуватися для отримання одного або більше з-поміж перерахованого вище, зокрема, при введенні пацієнтові. Таке знищення клітин і/або інгібування однієї або більше за функцій клітин може використовуватися з терапевтичною метою, як описано тут. Зокрема, знищення клітин, інгібування проліферації клітин і/або інгібування колонієутворення клітин може використовуватися для лікування або запобігання захворюванню на рак, включаючи метастази раку. Інгібування проліферації, колонієутворення і/або метастазування клітин може використовуватися, зокрема, для лікування або запобігання метастазам раку і метастатичного поширення ракових клітин. Краще, антитіло, запропоноване винаходом, опосередковує знищення клітин, викликаючи лізис, опосередкований комплементзалежною цитотоксичністю (СОС), лізис, опосередкований антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (АОСС), апоптоз, гомотипічну адгезію і/або фагоцитоз, бажано, викликаючи СОС-опосередкований лізис і/або
АОСб-опосередкований лізис. Проте даний винахід також включає варіанти здійснення, в яких антитіло діє описаним тут чином, знищуючи клітини і/або інгібуючи одну або більше функцій клітин, наприклад клітинну проліферацію і/або колонієутворення, без індукції лізису, опосередкованого комплементзалежною цитотоксичністю (СОС), лізису, опосередкованого антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (АЮСС), апоптоз, гомотпічну адгезію і/або фагоцитоз. Наприклад, антитіло, запропоноване винаходом, також може діяти просто шляхом зв'язування з СІ ОМб на клітинній поверхні, таким чином, наприклад, зупиняючи проліферацію клітин. У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, не викликає СОС- опосередкований лізис клітин.
Бажано АОСсС-опосередкований лізис клітин відбувається у присутності ефекторних клітин, які в окремих варіантах здійснення вибирають з групи, яка складається з моноцитів, мононуклеарних клітин, МК-клітин і РММ (поліморфоядерних нейтрофілів), а фагоцитоз здійснюється макрофагами.
Активність, пов'язану з інгібуванням або зменшенням проліферації клітин, які експресують
СІГОМб, бажано ракових клітин, можна визначити іп мйго шляхом визначення проліферації клітин, які експресують СІОМб за допомогою методу, який передбачає використання бромдезоксіуридіну (5-бром-2-дезоксіуридін, ВКОШ). ВКОЇШ є синтетичним нуклеозидом, який є аналогом тимідину, який може включатися в новосинтезовану ДНК клітин, які відтворюються шляхом клітинного ділення (під час З-фази клітинного циклу), заміщаючи тимідин під час реплікації ДНК. Виявлення включеної хімічної речовини, наприклад, за допомогою антитіл, специфічних до ВКОИ, вкаже на клітини, в яких відбувається активне відтворення своєї ДНК.
Активність, пов'язану з інгібуванням або зменшенням колонієутворення клітин, які експресують СІ ОМб, бажано ракових клітин, можна визначити іп мйго за допомогою дослідження колонієутворення. Оцінка здатності утворювати колонії є мікробіологічною методикою для вивчення ефективності дії окремих речовин на виживання і проліферацію клітин.
Ця методика часто використовується в лабораторіях, які вивчають рак, для визначення дії 60 лікарських препаратів або опромінювання на проліферуючі пухлинні клітини. Експеримент включає три основні етапи: () обробку зразка клітин, зокрема ракових клітин, (ії) висівання клітин в посудину для культивування та (ії) етап росту клітин. Отримані колонії фіксують, фарбують і підраховують. Утворення колоній має велике значення при утворенні метастазів, якщо окремі клітини пухлин проникають в органи. Інгібуюча активність антитіл показує їх здатність пригнічувати утворення метастазів. Антитіла, що продемонстрували активність, пов'язану з інгібуванням або зменшенням колонієутворення, при дослідженні методом колонієутворення, є зокрема придатними для лікування або запобігання метастазам і метастатичному поширенню ракових клітин, зокрема, згаданих в описі видів раку.
У кращих варіантах здійснення антитіло проявляє одну або більше імунних ефекторних функцій відносно клітин, які несуть СІ ОМб, в нативній конформації, при цьому одну або більше імунних ефекторних функцій бажано вибирають з групи, яка складається з комплементзалежної цитотоксичності (СОС), антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ОСС), індукції апоптозу та інгібування проліферації, бажано ефекторними функціями є АОСС і/або СОС.
Бажано, вказана одна або більше активностей або одна або більше імунних ефекторних функцій, які проявляються вказаним антитілом, викликаються зв'язком вказаного антитіла з
СІГОМб, бажано з епітопом, розташованим на позаклітинній ділянці СГОМЄ, причому вказана позаклітинна ділянка СІ ОМ бажано містить будь-яку амінокислотну послідовність з числа ЗЕО
ІО МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 7, 5ЕО ІЮО МО: 14 ї 5ЕО ІО МО:15, бажано амінокислотну послідовність
ЗЕО Ір: 6 або 5ЕО ІО МО: 7, краще амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 6.
Згідно з винаходом клітина, яка експресує СІ ОМб, бажано характеризується зв'язком СІ ОМб з клітинною поверхнею. Клітина, яка експресує СІ ОМб, або клітина, яка несе СІ ОМб, в нативній конформації, бажано є пухлинною клітиною, такою як ракова клітина, бажано клітиною злоякісної пухлини, вибраної з групи, яка складається з раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника і тератокарциноми яєчника, раку легень, включаючи дрібноклітинний рак легень (5СІ С) і недрібноклітинний рак легень (МЗС С), зокрема плоскоклітинний рак легень і аденокарциноми, раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми і плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови і шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми, саркоми, зокрема синовіальної саркоми і карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, зокрема перехідно-клітинної карциноми і папілярного раку, раку нирок, зокрема нирковоклітинного раку, включаючи світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, раку товстої кишки, раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциноми тонкої кишки і аденокарциноми клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, плацентарної хоріокарциноми, раку шийки матки, раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка і ембріонального раку яєчка, раку матки, герміноми, такої як, тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально-клітинної пухлини яєчка та їх метастатичних форм.
Антитіло, запропоноване винаходом, може бути об'єднане з одним або більше терапевтичним ефекторним фрагментом (частинкою, молекулою), наприклад, радіоактивною міткою, цитотоксином, терапевтичним ферментом, агентом, який викликає апоптоз тощо, для того, щоб забезпечити прицільну цитотоксичність, тобто знищення пухлинних клітин.
У одному варіанті здійснення антитіло, запропоноване винаходом, (і) зв'язується з клітинами, які експресують СГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, і (ії) не зв'язується з клітинами, які не експресують СІ ОМб і які не характеризуються зв'язуванням СГОМ6Є з клітинною поверхнею. Антитіло, запропоноване винаходом, бажано (ії) опосередковує знищення і/або інгібує проліферацію клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються з'єднуванням СІГОМб з клітинною поверхнею, і (і) не опосередковує знищення і/або не інгібує проліферацію клітин, які не експресують СІОМб і які не характеризуються з'єднуванням СІ ОМ з клітинною поверхнею.
У окремих кращих варіантах здійснення антитіло, запропоноване винаходом, зв'язується з нативними епітопами СІ ОМб, присутніми на поверхні живих клітин, такими як 5ЕО ІО МО: 6 або 7. У додаткових кращих варіантах здійснення антитіло, запропоноване винаходом, є специфічним відносно ракових клітин, які експресують СГОМб і не зв'язується з раковими клітинами, які не експресують СІ ОМб.
Антитіла, запропоновані винаходом, можна отримати від різних видів тварин, включаючи, але не обмежуючись названими, мишей, щурів, кроликів, морських свинок і людину. Антитіла, запропоновані винаходом, також включають химерні молекули, в яких константна область антитіла, отримана від одного виду, бажано людини, об'єднана з ділянкою зв'язування антигену, отриманою від іншого виду. Більш того, антитіла запропоновані винаходом, включають гуманізовані молекули, в яких антигензв'язуючі ділянки, отримані від виду, який не є людиною, бо об'єднуються з константними і каркасними ділянками людського походження.
Антитіла, запропоновані винаходом, включають поліклональні і моноклональні антитіла і включають антитіла до Ідсга (наприклад, Ідсга, к, Л), 9025 (наприклад, Ідс2б, к, А), ОЗ (наприклад, Ід, к, АХ) і І9М. Проте, також розглядаються інші ізотипи антитіл, запропонованих даним винаходом, включаючи Ідсі, ІдАї, ІдА2, секреторні ІДА, дО і ІДЕ антитіла. Антитіла можуть бути цілими антитілами або їх антигензв'язуючими фрагментами, включаючи, наприклад, Раб, Е(аб)2, Гм, одноланцюгові фрагменти або біспецифічні антитіла Ру. Крім того, антигензв'язуючі фрагменти включають домен зв'язування імуноглобулінових гібридних білків, який містить (ї) поліпептид-зв'язуючий домен (такий як варіабельна область важкого ланцюга або варіабельна область легкого ланцюга), який з'єднується з імуноглобуліновою шарнірною ділянкою поліпептиду, (ії) константну область СН2 важкого ланцюга імуноглобуліну, сполучену з шарнірною ділянкою і (ії) константну область СНЗ важкого ланцюга імуноглобуліну, сполучену з
СНО константною областю. Такі домени зв'язування імуноглобулінових гібридних білків додатково розкриваються в 05 2003/0118592 і 005 2003/0133939.
Антитіло, запропоноване винаходом, бажано є моноклональним, химерним людським або гуманізованим антитілом або фрагментом антитіла. Антитіла, запропоновані винаходом, включають повністю людські антитіла. Такі антитіла можуть бути отримані в трансгенній тварині, яка не є людиною, наприклад в трансгенній миші, здатній продукувати багато ізотипів людських моноклональних антитіл до СІ ОМб за допомогою проведення У-О0-) рекомбінації і перемикання ізотипу. Така трансгенна тварина також може бути трансгенним кроликом для отримання поліклональних антитіл, наприклад, розкритих в 5 2003/0017534.
Бажано антитіла, запропоновані даним винаходом, відділяються від СІ ОМб з рівноважною константою дисоціації (Ко) приблизно 1-100 нМ або менше. Бажано антитіла, запропоновані винаходом, не реагують перехресно із спорідненими антигенами клітинної поверхні і таким чином не інгібують їх функцію.
У кращих варіантах здійснення антитіла, запропоновані даним винаходом, можуть характеризуватися однією або більше із наступних властивостей: а) специфічністю до СІ ОМб; р) спорідненістю зв'язування з СІ ОМб близько 100 нМ або менше, бажано близько 5-10 нм або менше і краще близько 1-3 НМ або менше с) здатністю викликати СОС клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею; а) здатністю інгібувати ріст клітин, які експресують СІОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею; е) здатністю викликати апоптоз клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею;
І здатністю викликати гомотипічну адгезію клітин, які експресують СІОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМ з клітинною поверхнею; 9) здатністю викликати АЮСС клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею у присутності ефекторних клітин;
І) здатністю збільшувати виживання суб'єкта, який має пухлинні клітини, які експресують
СОМ і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМ з клітинною поверхнею; ії) здатністю знищувати клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням
СОМ з клітинною поверхнею; )) здатністю агрегувати СІ ОМ на поверхні живих клітин.
Краще антитіло, описане тут, є антитілом, продукованим клітиною гібридомою або отриманим від клітини гібридоми, депонованої в О5МА (ІппоПепвіг. 7/В, 38124 Вгацп5спмеєїд,
Німеччина) і має одне з наступних позначень і реєстраційних номерів: 1) Т512тиМАВ 59А, реєстраційний номер О5М АССЗ3067, депонована 21 червня 2010; 2) Т512тиМАВ б0А, реєстраційний номер О5М АССЗ3068, депонована 21 червня 2010; 3) Т512тиМАВ 610, реєстраційний номер О5М АССЗ069, депонована 21 червня 2010; 4) СТ512тиМАВ 64А, реєстраційний номер О5М АССЗ3070, депонована 21 червня 2010; 5) Т512тиМАВ 65А, реєстраційний номер ОБМ АССЗО071, депонована 21 червня 2010; 6) СТ512тиМАВ 668, реєстраційний номер О5М АССЗ3072, депонована 21 червня 2010; 7) Т512тиМАВ 67А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ073, депонована 21 червня 2010; 8) СТ512тиМАВ 55А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3089, депонована 31 серпня 2010; або 9) ат512тимАВ 89А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3090, депонована 31 серпня 2010.
Антитіла, запропоновані винаходом, позначаються в описі шляхом посилання на позначення антитіла і/або шляхом посилання на клон, який продукує антитіло, наприклад, тимАВ 59А.
Крім того, більш бажаними антитілами є антитіла, які мають специфічність антитіл, 60 продукованих гібридомою або отриманих від описаної вище гібридоми, і зокрема, антитіла, які містять антигензв'язуючу ділянку або антигензв'язуючий центр, зокрема варіабельну ділянку, ідентичну або високогомологічну до ділянки антитіла, продукованого або отриманого від вищеописаної гібридоми. Передбачається, що кращими антитілами є антитіла, які мають СОВ- ділянки або ідентичні або високогомологічні до ділянок антитіл, продукованих або отриманих від описаної вище гібридоми. Під "високогомологічним" слід розуміти, що можуть бути зроблені від 1 до 5, бажано від 1 до 4, наприклад від 1 до 3, або 1 або 2 замін в кожній СОВ-ділянці.
Особливо бажаними є химерні і гуманізовані форми антитіл, продуковані гібридомою або отримані від неї.
Таким чином, антитіло, запропоноване винаходом, можна вибрати з групи, яка складається з () антитіла, продукованого або отриманого від клону, депонованого під реєстраційним номером О5М АССЗ3067 (5Т512тиМАВ 59А), 05М АССЗ3068 (СТ512тиМАВ б60А), 0О5М
АССЗО69 (СТ512тиМАВ 610) О54М АССЗО0О70 (сТ512тиМАВ 64А) О5М АССЗО071 (СТ512тимМАВ 65А), О5М АССЗ3072 (БТ512тимМАВ 668), О5М АССЗ073 (СТ512тиМмАВ 67А),
ОЗМ АССЗ3089 (5Т512тиМАВ 55А) або ОБМ АССЗ3090 (57512тиМАВ 859 А), (ії) антитіла, яке є химерною або гуманізованою формою антитіла згідно з (і), (ії) антитіла, яке має специфічність антитіла згідно з (і), і (м) антитіла, яке містить антигензв'язуючу ділянку або антигензв'язуючий центр антитіла згідно з (ї). Антигензв'язуюча ділянка або антигензв'язуючий центр антитіла згідно з (ї) може містити варіабельну ділянку антитіла згідно з (Її).
Даний винахід також має відношення до клітини, такої як клітина гібридоми, яка продукує антитіло, як описано тут.
Кращими клітинами гібридоми є ті, що депоновані в 0О5М2 (ІппоПепвіг. 7В, 38124
Вгайпзсепугеїд, Німеччина) і мають одне з наступних позначень і реєстраційних номерів: 1) Т512тиМАВ 59А, реєстраційний номер О5М АССЗ3067, депонована 21 червня 2010; 2) Т512тиМАВ б0А, реєстраційний номер О5М АССЗ3068, депонована 21 червня 2010; 3) Т512тиМАВ 610, реєстраційний номер О5М АССЗ069, депонована 21 червня 2010; 4) СТ512тиМАВ 64А, реєстраційний номер О5М АССЗ3070, депонована 21 червня 2010; 5) Т512тиМАВ 65А, реєстраційний номер ОБМ АССЗО071, депонована 21 червня 2010; 6) СТ512тиМАВ 668, реєстраційний номер О5М АССЗ3072, депонована 21 червня 2010; 7) Т512тиМАВ 67А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ073, депонована 21 червня 2010; 8) СТ512тиМАВ 55А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3089, депонована 31 серпня 2010; або 9) СТ512тиМАВ 89А, реєстраційний номер О5М АССЗ3090, депонована 31 серпня 2010.
Анти-СГОМб антитіла, запропоновані даним винаходом, можуть утворювати похідні, зв'язуватися або спільно експресуватися з іншими специфічностями зв'язування. У окремому варіанті здійснення винахід пропонує біспецифічну або мультиспецифічну молекулу, яка містить щонайменше першу специфічність зв'язування для СІ ОМб (наприклад, анти-СІ ОМб-антитіло або його міметик) і другу специфічність зв'язування для ефекторної клітини, наприклад специфічність зв'язування для рецептора Ес (наприклад, Ес-гамма-рецептора, такого як Ес- гамма-КІ, або будь-якого іншого Ес-рецептора) або Т-клітинного рецептора, наприклад СОЗ.
Відповідно, даний винахід включає біспецифічні і мультиспецифічні молекули, які зв'язуються і з СІОМб і з Ес-рецептором або Т-клітинним рецептором, наприклад СОЗ3.
Прикладами Ес-рецепторів є рецептор дб, Ес-гамма-рецептор (Есук), такий як ЕсукКІ (СОб4),
ЕсУКІ! (2032) і ЕсуйкП (СО016). Інші Ес-рецептори, такі як рецептори ІДдДА (наприклад, ЕсокКі), також можуть бути метою. Рецептор Ес бажано розташовується на поверхні ефекторної клітини, наприклад моноцита, макрофага або активованої мононуклеарної клітини. У кращому варіанті здійснення біспецифічні і мультиспецифічні молекули зв'язуються з Ес-рецептором на ділянці, відмінній від імуноглобулінової Ес (наприклад, дО або ІдА) ділянки зв'язування рецептора.
Отже, зв'язування біспецифічних і мультиспецифічних молекул не блокується фізіологічними рівнями імуноглобулінів.
У іншому аспекті анти-СІ ОМ антитіла запропоновані винаходом є похідними, пов'язаними з або спільно експресованими з іншими функціональними молекулами, наприклад іншим пептидом або білком (наприклад, Габі! фрагментом). Наприклад, антитіло, запропоноване винаходом, може бути функціонально пов'язаним (наприклад, за допомогою хімічної зв'язку, генетичного злиття, нековалетного зв'язку або іншого способу) з однією або більше іншими молекулярними частинками, наприклад іншим антитілом (наприклад, для отримання біспецифічного або мультиспецифічного антитіла), цитотоксином, клітинним лігандом або антигеном (наприклад, щоб отримати імунокон'югат, такий як імунотоксин). Антитіло, запропоноване даним винаходом, може бути зв'язане з іншими терапевтичними частинками, наприклад радіозотопом, невеликою молекулою протипухлинного лікарського засобу, рекомбінантним цитокіном або хемокіном. Відповідно, даний винахід включає цілий ряд 60 кон'югатів антитіл, біспецифічні і мультиспецифічні молекули і гібридні білки, які зв'язуються з клітинами, які експресують СІ ОМб, і/або з клітинами, які характеризуються зв'язуванням СІ Мб з клітинною поверхнею, і які можна використовувати для націлювання інших молекул на ці клітини.
В цілому, для цілей даного винаходу всі похідні антитіл, такі як кон'югати антитіл, біспецифічні і мультиспецифічні молекули і гібридні білки, описані тут, охоплюються терміном "антитіло".
У додатковому аспекті винахід також передбачає СІ ОМб-зв'язуючі білки, отримані з доменів, які не є імуноглобуліновими, зокрема одноланцюгові білки. Такі зв'язуючі білки і способи їх отримання описані, наприклад, в роботі Віп7 еї аї. (2005) Маїшиге ВіоїесппоіЇоду 23 (10): 1257- 1268, включеній до опису як посилання. Слід розуміти, що приведена в описі ідея відносно імуноглобуліну або похідних від імуноглобуліну зв'язуючих молекул, відповідно також може бути застосована до зв'язуючих молекул, отриманих з неімуноглобулінових доменів. Зокрема, використовуючи такі зв'язуючі молекули, отримані з неїмуноглобулінових доменів, можливо блокувати СІ ОМ клітин, які експресують вказану мішень і які характеризуються зв'язуванням вказаної мішені з клітинною поверхнею, і таким чином, як розкрито в описі відносно антитіл, запропонованих даним винаходом, здійснити терапевтичні ефекти, зокрема інгібування однієї або більше функцій клітин пухлин, розкритих в описі, наприклад інгібування проліферації. Хоча не обов'язково, але можливо, таким неімуноглобуліновим зв'язуючим молекулам надати ефекторних функцій антитіл, наприклад, шляхом злиття з Ес ділянкою антитіл.
Даний винахід в цілому включає лікування і/або діагностування хвороб, зокрема пухлинних захворювань, шляхом "націлювання" на СІГОМб, експресований клітинами і сполучений з поверхнею клітин. Ці способи забезпечують селективне виявлення і/або знищення таких клітин, тим самим зводячи до мінімуму шкідливі дії на нормальні клітини, які не експресують СІ ОМб і які не характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею. Переважно хворобами для лікування і діагностування є хвороби, при яких задіяні клітини, які експресують СІ ОМ і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею, наприклад пухлинні захворювання, зокрема ракові захворювання, такі як описані тут.
У одному аспекті винахід пропонує композиції, наприклад фармацевтичні і діагностичні композиції/набори, які містять антитіло, або комбінацію антитіл запропонованих даним винаходом. Фармацевтична композиція запропонована винаходом може містити фармацевтично прийнятний носій і може необов'язково містити один або більше ад'ювантів, стабілізуючих речовин тощо. У окремому варіанті здійснення композиція включає комбінацію антитіл, які зв'язуються з різними епітопами або які мають різні функціональні характеристики, наприклад викликають СОС і/або АЮОСС і викликають апоптоз. У цьому варіанті здійснення винаходу антитіла можуть використовуватися в комбінації, наприклад, як фармацевтична композиція, яка містить два або більше анти-СІ ОМб моноклональних антитіла. Наприклад, анти-СІ ОМ антитіла, які мають різні, але комплементарні активності, можуть бути об'єднані в єдине лікування для досягнення бажаного терапевтичного ефекту. У бажаному варіанті здійснення композиція включає анти-СІ ОМб антитіло, яке опосередковує СОС, в комбінації з іншим анти-СІ ОМб антитілом, яке викликає апоптоз. У іншому варіанті здійснення композиція включає анти-СІ ОМ6Є антитіло, яке опосередковує високоефективне знищення клітин-мішеней у присутності ефекторних клітин, в комбінації з іншим анти-СІОМбЄ антитілом, яке інгібує ріст клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею.
Даний винахід також включає одночасне або послідовне введення двох або більше анти-
СІГОМб антитіл, запропонованих даним винаходом, причому бажано щонайменше одне з вказаних антитіл є химерним анти-СІ ОМЄ антитілом і щонайменше одне додаткове антитіло є людським анти-СІОМб антитілом, при цьому антитіла зв'язуються з одним і тим же або з різними епітопами СІ ОМб. Краще химерне СІГОМб антитіло, запропоноване винаходом, вводиться першим, з подальшим введенням людського анти-СІ ОМб антитіла, запропонованого винаходом, причому людське анти-СІОМб антитіло бажано вводиться протягом тривалого періоду часу, тобто як підтримуюча терапія.
Антитіла, кон'югати, біспецифічні/умультиспецифічні молекули і композиції даного винаходу можуть використовуватися у ряді способів інгібування росту клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, і/або селективного знищення клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею, шляхом контакту клітин з ефективною кількістю антитіла, кон'югата, біспецифічної/мультиспецифічної молекули або композиції, так що зростання клітин інгібується ілабо клітина знищується. У одному варіанті здійснення спосіб включає знищення клітин, які 60 експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею,
необов'язково у присутності ефекторних клітин, наприклад, шляхом СОС, апоптозу, АОСС, фагоцитозу або за допомогою комбінації двох або більше з цих механізмів. Клітини, які експресують СІ ОМ6 і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, які можна інгібувати або знищити, використовуючи антитіла запропоновані винаходом, включають ракові клітини.
Антитіла, кон'югати, і біспецифічні/мультиспецифічні молекули і композиції, запропоновані даним винаходом, можна використовувати для лікування і/або запобігання цілому ряду хвороб, при яких задіяні клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, шляхом введення антитіл пацієнтам, які страждають на такі хвороби.
Приклади хвороб, які можна лікувати (наприклад, поліпшити стан) або запобігти, включають, але не обмежуються названими, онкологічні хвороби. Приклади онкологічних хвороб, які можна лікувати і/або запобігти, включають злоякісні захворювання, такі як рак яєчника, зокрема аденокарциному яєчника і тератокарциному яєчника, рак легень, включаючи дрібноклітинний рак легень (ЗСІ С) і недрібноклітинний рак легень (МЗС С), зокрема плоскоклітинний рак легень і аденокарциному, рак шлунка, рак молочної залози, рак печінки, рак підшлункової залози, рак шкіри, зокрема базальноклітинну карциному і плоскоклітинну карциному, злоякісну меланому, рак голови і шиї, зокрема злоякісну плеоморфну аденому, саркому, зокрема синовіальну саркому і карциносаркому, рак жовчної протоки, рак сечового міхура, зокрема перехідно- клітинну карциному і папілярний рак, рак нирки, зокрема нирковоклітинний рак, включаючи світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, рак товстої кишки, рак тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкої кишки і аденокарциному клубової кишки, ембріональну карциному яєчка, плацентарну хоріокарциному, рак шийки матки, рак яєчка, зокрема семіному яєчка, тератому яєчка і ембріональний рак яєчка, рак матки, герміному, таку як, тератокарциному або ембріональну карциному, зокрема ембріонально- клітинну пухлину яєчка та їх метастатичні форми.
У додатковому аспекті винахід має відношення до способу лікування або запобігання хворобі або порушенню, у яких залучені клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею, який передбачає введення суб'єктові антитіла, кон'югата, біспецифічної/мультиспецифічної молекули або композиції винаходу. Бажано хвороба або порушення є хворобою, пов'язаною з пухлиною і в конкретних варіантах здійснення її вибирають з групи, яка складається з раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника і тератокарциноми яєчника, раку легенів, включаючи дрібноклітинний рак легень (ЗСІСс) і недрібноклітинний рак легень (М5СІ С), зокрема плоскоклітинний рак легень і аденокарциному, раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми і плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови і шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми, саркоми, зокрема синовіальної саркоми і карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, зокрема перехідно-клітинної карциноми і папілярної раку, раку нирки, зокрема нирковоклітинного раку, включаючи світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, раку товстої кишки, раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкої кишки і аденокарциному клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, плацентарної хоріокарциноми, раку шийки матки, раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка і ембріональної раку яєчка, раку матки, герміноми, такої як тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально-клітинної пухлини яєчка та їх метастатичних форм. Переважно на поверхні вказаних клітин експресується СІ ОМб.
Винахід передбачає застосування описаних тут засобів і композицій для профілактичного іабо терапевтичного лікування пухлинних хвороб, тобто для лікування пацієнта, який має пухлинне захворювання або який має ризик розвитку пухлинного захворювання. У одному аспекті винахід пропонує способи інгібування зростання пухлин, які передбачають введення одного або більше з-поміж описаних тут засобів і композицій.
Бажано, описані тут засоби і композиції вводяться у такий спосіб, що терапевтично активна субстанція не доставляється або практично не доставляється до тканини або органу, в якому клітини експресують СІ ОМб і характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, тоді як тканина або орган вільні від пухлин, наприклад в тканину плаценти або плаценту. Для цього засобу і композиції, описані тут, вводяться місцево.
У одному аспекті винахід пропонує описане тут антитіло для застосування в описаних тут способах лікування. У одному варіанті здійснення винахід пропонує описану тут фармацевтичну композицію для застосування в описаних тут способах лікування.
У окремому варіанті здійснення винаходу суб'єкта, якому вводиться антитіло, додатково 60 лікують за допомогою засобу хіміотерапії, опромінювання або засобу, який модулює, наприклад який підсилює або інгібує, експресію або активність Ес-рецептора, наприклад Ес-гамма- рецептора, такого як цитокін. Типові цитокіни для введення під час лікування включають гранулоцитарний колонієсєтимулюючий чинник (05-С5Е), гранулоцитарно-макрофагальний колонієсєтимулюючий чинник (ЗМ-С5Е), інтерферон-у (ІЕМ-у) і чинник некрозу пухлини (ТМЕ).
Типові терапевтичні засоби включають, серед інших, протипухлинні засоби, такі як доксорубіцин, цисплатін, таксотер, 5-фторурацил, метотрексат, гемцитабін і циклофосфамід.
У наступному аспекті винахід має відношення до імунізації тварин, які не є людиною, наприклад мишей, людським СІ ОМбЄ або його пептидним фрагментом, для отримання антитіл.
Кращими пептидами для імунізації є пептиди, вибрані з групи, яка складається з 5ЕО ІЮО МО: 6,
ЗЕОІЮ МО: 7, 5ЕО ІЮО МО: 14 ії 5ЕО ІО МО: 15 та імунологічно еквівалентних пептидів.
Також як і трансгенні тварини, які не є людиною, тварини дикого типу можуть бути імунізовані очищеним або збагаченим препаратом СІОМб антигену або його пептидним фрагментом і/або нуклеїновими кислотами, і/або клітинами, які експресують СОМб або його пептидний фрагмент. Переважно трансгенна тварина, яка не є людиною, здатна продукувати багато ізотипів людських моноклональних антитіл до СІ ОМб (наприклад, Ід, ІдА і/або ІЗ9М) за допомогою проведення МУ-О-.) рекомбінації і перемикання ізотипу. Перемикання ізотипу може відбуватися за допомогою, наприклад, класичного або некласичного перемикання ізотипу.
Відповідно, в ще одному аспекті винахід пропонує виділені з тварини, які не є людиною, В- клітини, як описано вище. Потім виділені В-клітини можна імунізувати шляхом злиття з імморталізованою клітиною для отримання джерела (наприклад, гібридоми) антитіл запропонованих даним винаходом. Такі гібридоми (тобто продукуючі антитіла запропоновані винаходом) також охоплюються рамками винаходу.
У додатковому аспекті даний винахід має відношення до методів діагностування, виявлення і моніторингу пухлинної хвороби, що включає встановлення і/або визначення кількості СІ ОМб або клітин, які експресують СГ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, в біологічному зразку, узятому у пацієнта, за допомогою антитіла запропонованого винаходом. Біологічний зразок може бути узятий у пацієнта, який має пухлинне захворювання, або у якого підозрюють захворювання, або який захворює, або такого, у якого є ймовірність розвитку пухлинного захворювання.
У одному варіанті здійснення способу діагностування, виявлення або моніторингу пухлинної хвороби згідно з винаходом біологічний зразок і/або контрольний/еталонний зразок походить з тканини або органу, які відповідають тканині або органу, який слід продіагностувати, виявити або проконтролювати щодо ураження пухлинним захворюванням, наприклад злоякісною хворобою, яку слід діагностувати, виявити або проконтролювати, є карцинома яєчника, а біологічний зразок і/або контрольний/еталонний зразок є тканиною яєчника. Такі тканини і органи описуються тут, наприклад, у зв'язку з різними пухлинними захворюваннями і видами раку.
У одному варіанті здійснення способів діагностування, виявлення і моніторингу пухлинної хвороби біологічний зразок є зразком тканини або органу, в якому клітини, у тому випадку, коли в тканині або органі відсутня пухлина, практично не експресують СІ ОМб і не характеризуються значним зв'язуванням СГОМб з клітинною поверхнею. Бажано вказана тканина є тканиною, відмінною від тканини плаценти.
Як правило, рівень молекули-мішені в біологічному зразку порівнюється з еталонним рівнем, причому відхилення від вказаного еталонного рівня указує на наявність і/або стадію пухлинного захворювання у суб'єкта. Еталонний рівень може бути таким же, як рівень, визначений в контрольному зразку (наприклад, зразку здорової тканини або від здорового суб'єкта), або середнім рівнем у здорових суб'єктів. "Відхилення" від вказаного еталонного рівня означає будь-яку значущу зміну, наприклад збільшення або зменшення щонайменше на 10 95, 20 95, або 30 95, бажано щонайменше на 40 95 або 50 95, або навіть більше. Збільшена наявність СІ ОМб або клітин, які експресують СІ ОМ6б і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, у вказаному біологічному зразку або збільшена кількість С ОМб або клітин, які експресують СІГОМ6б і які характеризуються зв'язуванням СГОМб з клітинною поверхнею, в біологічному зразку в порівнянні з еталонним рівнем указує на наявність пухлинного захворювання.
В більшості випадків виявлення і/або визначення кількості в способах запропонованих винаходом включає використання мічених антитіл, які специфічно зв'язуються з молекулою- мішенню.
У окремому аспекті винахід має відношення до способу виявлення, тобто визначення положення або місця розташування пухлини, наприклад в конкретній тканині або органі, який бо передбачає введення антитіла, запропонованого даним винаходом, яке з'єднується з детектованою міткою у пацієнта. Мічення тканини або органу у вказаного пацієнта може вказувати присутність пухлини або наявність ризику розвитку пухлинної хвороби у вказаній тканині або органі.
Наприклад, антитіла, запропоновані винаходом, можна безпосередньо отримати від гібридоми, яка експресує антитіло, або можна клонувати і рекомбінантно експресувати в клітині- хазяїни (наприклад, СНО клітині або лімфоцитарній клітині). Додатковими прикладами клітин- хазяїнів є мікроорганізми, такі як Е. сої і гриби, наприклад дріжджі. Альтернативно, вони можуть проводитися рекомбінантно в трансгенних, таких, що не є людиною, тваринах і рослинах. Проте даний винахід також передбачає варіанти здійснення, в яких антитіла виробляються іп зйши шляхом імунізації або вакцинації пацієнта, як розкрито в описі.
Даний винахід також має відношення до нуклеїнових кислот, які містять гени або нуклеїновокислотні послідовності, які кодують антитіла або їх ділянки, наприклад ланцюг антитіла, як описано тут. Нуклеїнові кислоти можуть входити до складу вектора, наприклад плазміди, косміди, вірусу, бактеріофага або іншого використаного вектора, наприклад прийнятого в генній інженерії. Крім того, вектор може містити гени, наприклад маркерні гени, які дають можливість відбирати вектор у відповідній клітині-хазяїні та за відповідних умов. Крім того, вектор може містити елементи контролю експресії, що забезпечують належну експресію закодованих ділянок у відповідних хазяїнах. Такі елементи контролю відомі фахівцеві і можуть включати промотор, касети сплайсингу і кодон ініціації трансляції.
Бажано нуклеїнова кислота винаходу функціонально прикріпляється до вищезазначеної послідовності, яка контролює експресію, забезпечуючи експресію в еукаріотичних і прокаріотичних клітинах. Елементи контролю, які забезпечують експресію в еукаріотичних і прокаріотичних клітинах, добре відомі фахівцям в даній галузі техніки.
Способи конструювання нуклеїновокислотних молекул відповідно до даного винаходу з метою створення векторів, які містять вищезгадані нуклеїновокислотні молекули, введення векторів у відповідні вибрані клітини-хазяїни, індукції (викликання) або досягнення експресії добре відомі в даній галузі техніки.
Додатковий аспект даного винаходу має відношення до клітини-хазяїна, яка містить нуклеїнову кислоту або вектор, розкриті тут.
Інші ознаки і переваги даного винаходу стануть зрозумілими з наступного докладного опису і пунктів формули винаходу.
Короткий опис креслень
Фіг. 1. Вирівнювання послідовностей СІ ОМ3, СІ ОМ4, СІ ОМб і СІ ОМ.
Фіг. 2. Імунофлуоресцентний аналіз сироватки, отриманої від мишей, імунізованих з метою отримання СІ ОМб-специфічних антитіл. (А) Неприкріплені клітини СНО-К1, котрансфіковані нуклеїновими кислотами, які кодують людські СІ ОМб і СЕР, відповідно, були досліджені за допомогою анти-СІ ОМЄ моноклональних мишачих антитіл (КО Бузіет5, МАВЗ656). СІ ОМб розташовується на плазматичній мембрані трансфікованих клітин і може бути ціллю для специфічних антитіл на живих клітинах. (В) Сироватка мишей, на основі якої була отримана гібридома Е3-6С3-Н8В, містила антитіла, які зв'язуються з СІОМб вна поверхні неприкріплених клітин СНО-КІ, котрансфікованих нуклеїновими кислотами, які кодують людський СІ ОМб і СЕР.
Фіг. 3. Аналіз ендогенної експресії білків-клаудинів в клітинах НЕК293Т методом Вестерн- блотінгу.
Білкові лізати НЕК29ЗТ-клітин, трансфікованих нуклеїновими кислотами, які кодують СІ ОМЗ,
СІ ОомМ4, СОМ і СГ ОМО, відповідно, або фіктивно трансфіковані (контроль) були досліджені за допомогою Вестерн-блотінгу з використанням комерційно доступних анти-СІ ОМЗ(А) (Іпуйтодеп,
Саї Мо. 34-1700), анти-СГ ОМА(А) (7утеа, 32-9400), анти-СІ ОМб(А) (АВР, 01-8865) і анти-
СІ ОМУ(А) (Бапіа Сти7, 50-17672) антитіл. Антитіла виявляли експресію своїх відповідних мішеней тільки у відповідних НЕК29З3Т трансфектантах. У нетрансфікованих НЕК293Т клітинах не спостерігалося ендогенної експресії яких-небудь з цих клаудинів.
Фіг. 4. Оцінка специфічності комерційно доступних анти-СЇОМ-антитіл за допомогою проточної цитометрії.
Зв'язування комерційно доступних анти-СЇ ОМ-антитіл з клітинами НЕК293Т, трансфікованими нуклеїновими кислотами, які кодують СІГОМЗ3, С1О0М4, СІОМб їі СГОМО, відповідно, або нетрансфікованими клітинами визначали за допомогою проточної цитометрії.
Для цієї мішені специфічним є тільки комерційно доступне анти-СІ ОМЗ-антитіло.
Фіг. 5. Оцінка специфічності анти-СІОМ-антитіл, отриманих згідно з винаходом, за допомогою проточної цитометрії.
За допомогою проточної цитометрії було визначене зв'язування антитіл в супернатантах від моноклональних субклонів гібридоми з НЕК293Т клітинами, котрансфікованими вектором, який кодує СГОМб, СІ ОМ3, СІ ОМА 5 або СІ ОМО, і вектором, який кодує флуоресцентний маркер. (А) Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е3-6С3-Н8З специфічно зв'язувалися з СІ ОМб-трансфікованими клітинами, але не з клітинами, трансфікованими
СІГОоМ3, СГОМ4 ії СОМ, відповідно. Навпаки, антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е4-4Е7-Е2 зв'язувалися з клітинами, трансфікованими СГОМбЄ або СІ ОМО.
Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е3-6С3-Н8 також зв'язувалися з клітинами, трансфікованими (1143М) -5МР варіантом СІ ОМб. (В) Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е3-783-84 зв'язувалися з клітинами, трансфікованими СІ ОМб, СІ ОМ3 або СІ ОМО. Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е3-ЗЕ7-А5 зв'язувалися з клітинами, трансфікованими
СІ ОМб, СІ ОМА або СІ ОМ.
Фіг. 6. Специфічність зв'язування анти-СІ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимАВ
БОА, бОА, 610, 644А, 65А, 668 і 67А.
Зв'язування анти-СІ ОМб-антитіл з людськими СІ ОМб, 3, 4, 9 ії СІОМб 5МР (одиночний нуклеотидний поліморфізм) варіантом 1143М було проаналізовано проточною цитометрією за допомогою НЕК293Т клітин, які короткочасно експресують відповідний людський клаудин.
НЕК293Т були котрансфіковані флуоресцентним маркером, щоб розрізнити нетрансфіковані (01 ї ОЗ популяція) і трансфіковані (02 і 04 популяція) клітини. Використовували концентрацію антитіл, яка насищала зв'язування з СІ ОМб (25 мкг/мл). Експресію людських СІ ОМЄ, 3, 4,9 і
СІ ОМ6-5МР(НАЗМ) підтверджували за допомогою комерційно доступних моноклональних антитіл до людського клаудину-б6 (КУО Бузіеєт5, МАВЗб656), людського клаудину-3 (НО
Зузіет5, МАВ4620) і людського клаудину-4 (НО бузієт5, МАВ 4219).
Фіг. 7. Відносна спорідненість анти-СІ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А.
Для визначення відносної спорідненості за допомогою проточної цитометрії досліджували зв'язування анти-СІОМб-антитіл з людським ГОМб, стабільно експресованим на поверхні
НЕК293З-клітин. У експерименті із насичення зв'язування концентрацію антитіл наносили на графік проти РАСб-сигналів (середня інтенсивність флуоресценції). ЕСбво (концентрація антитіла, яка зв'язується з половиною місць зв'язування у стані рівноваги) обчислювали за допомогою нелінійної регресії. СІ ОМб-специфічні антитіла тимМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А показали дуже низькі значення ЕСво (ЕСво 200-500 нг/мл), причому насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій.
Фіг. 8. Активність, пов'язана з комплементзалежною цитотоксичністю (СОС), анти-СІ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А.
СОбС-активність анти-СІОМб антитіл проаналізували, використовуючи люцифераза- залежний метод аналізу для визначення ендогенної АТФ в нелізованих клітинах. Для цього
СНО-КІ клітини, які стабільно експресують людський СІ ОМб, обробили різними концентраціями тиМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 66В і 67А. МиМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 66В і 67А продемонстрували дозозалежну СОС-активність і викликали СОС за низьких концентрацій.
Фіг. 9. Активність, пов'язана з комплементзалежною цитотоксичністю (СОС), анти-СІ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимАВ 65А і 66В на клітини МЕС8 і МЕС8 І МТ52 54 (СІ ЮМ6 нокаутні), які ендогенно експресують СІ ОМб.
Анти-СІ ОМб-антитіла тимАВ 65А і 66В викликали СОС на клітинах МЕС8 дозозалежним чином. Мішень-специфічність тимАВ 65А і 66В забезпечувалася використанням МЕС8 /МТ52 54 клітин (СІ ОМ нокаутні).
Фіг. 10. Терапевтичний ефект раннього лікування антитілами тимАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А на моделі ксенотрансплантату мишей з прищепленою лінією пухлинних клітин 5О0 МЕСВ8.
Використовували модель ксенографтів МЕС8, які ендогенно експресують СІОМб, на безтімусних Миде-Рохпі"" мишах. В порівнянні з контрольною групою (фізіологічний розчин) тиМмАВ 59А, б6ОА, 610, 64А, 65 А, 66В і 67А показали інгібування росту пухлини у мишей з прищепленими клітинами МЕС8.
Фіг. 11. Специфічність зв'язування анти-СІ ОМб химерних моноклональних антитіл спітАВ
БІ, 64А, 67А і 89А.
Зв'язування анти-СІ ОМб-антитіл з людським СІ ОМ, 3, 4 і9, відповідно, проаналізували за допомогою проточної цитометрії, використовуючи клітини НЕК293, які стабільно експресують відповідний людський клаудин. Використаною концентрацією антитіл була концентрація, яка 60 насичує зв'язування (25 мкг/мл). Експресію людських СІГОМЗ, 4, б ї 9 підтверджували за допомогою комерційно доступних моноклональних антитіл до людського клаудину-З3 (НО
Зузіет5, МАВ4620) і людського клаудину-4 (КО БЗузіет5, МАВ 4219) ії СІ ОМ6/9-реактивних мишачих моноклональних антитіл тиМАВ 5Е202, відповідно. Негативний контроль здійснювався за ідентичних умов без первинного антитіла.
Фіг. 12. Відносна спорідненість анти-СІ Мб химерних моноклональних антитіл спітАВ 610, 64А, 67А і 89А до клітин НЕК293-СІ ОЮМб.
Для визначення відносної спорідненості зв'язування анти-СІОМб антитіл з людським
СІГОМб, стабільно експресованим на поверхні НЕК293, клітини досліджували за допомогою проточної цитометрії. У експериментах із насичення зв'язування концентрацію антитіл наносили проти ЕГАС5-сигналів (середня інтенсивність флуоресценції). ЕСзо (концентрація антитіл, яка зв'язує половину місць зв'язування в рівновазі) обчислювали шляхом нелінійної регресії.
СІ ОМб-специфічні антитіла спітАВ 64А і 89А показали дуже низькі значення ЕСво (ЕСво 450- 600 нг/мл), при цьому насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій. СпітАВ 67А і 610 показали низькі (ЕСзхо 1000 нг/мл) і середні (ЕСвхо 2300 нг/мл) значення ЕсСвбо, відповідно.
Фіг. 13. Відносна спорідненість анти-СІ Мб химерних моноклональних антитіл спітАВ 610, 64А, 61А і 89А до клітин МЕС8.
Для визначення відносної спорідненості анти-СІ ОМб антитіл до пухлинних клітин, які ендогенно експресували СІ ОМб, зв'язування з лінією клітин раку яєчка МЕС8 досліджували за допомогою проточної цитометрії. Антитіла спітАВ 64А і 89А показали дуже низькі значення
ЕСво (ЕСво 600-650 нг/мл), причому насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій, тоді як спітАВ 6ЇО і 67А показали середні (ЕСво 1700 нг/мл) і високі (ЕСво 6100 нг/мл) значення
ЕСозо, відповідно.
Фіг. 14. Відносна спорідненість анти-СІ Мб химерних моноклональних антитіл спітАВ 610, б64А, 67А і 89А до клітин ОМ90.
Для визначення афінності зв'язування анти-СІ ОМб-антитіл з пухлинними клітинами, які ендогенно експресують людський СІ ОМб, досліджували зв'язування з лінією клітин карциноми яєчника ОМ90 за допомогою проточної цитометрії. СІ ОМб-специфічні антитіла спітАВ 64А і 89А показали дуже низькі значення ЕСво (ЕСво 550-600 нг/мл) і насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій. СНІМАВ 610 і 67А показали середні значення ЕСво (ЕСво 1500 нг/мл і
ЕСвхо 2300 нг/мл, відповідно).
Фіг. 15. Активність, пов'язана з комплементзалежною цитотоксичністю (СОС), анти-СІ Мб химерних моноклональних антитіл спітАВ 610, 64А, 67А і 89А на клітинах дикого типу МЕСЗ8 і нокаутних клітинах МЕС8.
СОб-активність анти-СІ ОМб-антитіл проаналізували за допомогою люцифераза-залежного методу аналізу для визначення ендогенної АТФ в нелізованих клітинах. Для цього клітини дикого типу МЕС8 (МЕС8 І МТ52 77), які ектопічно експресують люциферазу, обробили різними концентраціями спітАВ 61, 64А, 67А і 89А. На клітинах МЕС-8 спітАВ 61ІЮ, 64А, 67А і 89А показали дозозалежну СОС-активність, тоді як жодні з цих антитіл не викликали неспецифічний лізис СІ ОМб-нокаутних клітин МЕС-8 (МЕС8 ІМТ52 54). Цей результат продемонстрував мішень-специфічні ефекторні функції спітАВ 6 І, 64А, 67А і 89А.
Фіг. 16. Активність, пов'язана з антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (АОСС), анти-
СІ ОМб химерних моноклональних антитіл спітАВ 610, 64А, 67А і 89А на клітинах дикого типу
МЕСЗ8 і нокаутних клітинах МЕС8.
Арсб-активність анти-СІ ОМ антитіл проаналізували за допомогою люцифераза-залежного методу аналізу для визначення ендогенної АТФ в нелізованих клітинах. Для цього клітини МЕС- 8 дикого типу (МЕС8 І МТ52 77) обробили різними концентраціями спітАВ 610, 64А, 67А і 89А.
СНІМАВ 6160, 64А, 67А і 89А показали дозозалежну АОСс-активність, і викликали АОСС навіть за низьких концентрацій антитіл. Щоб продемонструвати мішень-специфічність використовували клітини МЕС8 із стабільно нокаутним СІ ОМ6 (МЕС8 І МТ52 54).
Фіг. 17. Довгостроковий терапевтичний ефект раннього лікування анти-СІ ОМб мишачими моноклональними антитілами тимАВ 610, 64А і 67А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин МЕС8.
Використовували модель ксенотрансплантатів МЕС8, які ендогенно експресують СІ ОМб, на безтімусних Миде-Рохпі"" мишах. Протягом 46 днів мишей лікували СІ ЮОМб-специфічними антитілами. Після лікування контролювали зростання пухлини протягом 60 днів. Навіть після припинення імунотерапії у мишей, яких лікували мишачими моноклональними антитілами тиМАВ 6Ї0О, 64А і 67А, не спостерігалося зростання пухлини.
Фіг. 18. Терапевтичний ефект раннього лікування анти-СЇ ОМб мишачими моноклональними антитілами тимАВ 89А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною 60 лінією клітин МЕС8.
Використовували модель ксенотрансплантатів МЕС8, які ендогенно експресують СІ ОМб, на безтімусних Миде-Рохпі"" мишах. Діаграми розсіювання представляють об'єми прищеплених пухлин в різні моменти часу протягом раннього лікування МЕС8 ксенотрансплантатів у безтімусних мишей Миде-Рохпі"". У порівнянні з контрольною групою (фізіологічний розчин) тиМмАВ 89А показали інгібування росту пухлини у мишей з прищепленими клітинами МЕС8 (А).
Протягом 47 днів мишей обробляли РВ5 (контрольну групу) і СІ ОМб-специфічними антитілами, відповідно. Зростання пухлин контролювали протягом 51 дня. В порівнянні з РВ5-контролем у мишей, яких лікували тимАВВ8А, в кінці дослідження (В) пухлині не були виявлені.
Фіг. 19. Терапевтичний ефект анти-СІ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимАВ 64А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин МЕС8.
Діаграми розсіювання представляють об'єми прищеплених пухлин в різні моменти часу під час лікування розвинених ксенотрансплантатів МЕС8 у безтімусних мишей Миде-Рохп1"ч,
Імунотерапія мишачими моноклональними анти-СОМб антитілами тиМАВ 64А продемонструвала інгібування росту солідних МЕС8-ксенотрансплантатів у порівнянні з контрольними групами і з антитілом і з фізіологічним розчином.
Фіг. 20. Довгостроковий терапевтичний ефект лікування анти-СЇОМб мишачими моноклональними антитілами тиМмМАВ 6б64А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин МЕС8.
Через 15 днів після приживання трансплантата протягом 45 днів мишей лікували СІ ЮОМб- специфічним антитілом тимМАВ 64А. Зростання пухлин контролювали протягом додаткових 49 днів (А). На графіку видно збільшення тривалості життя мишей, яких лікували СІ ОМб- специфічним антитілом тимАВ 64А (В).
Фіг. 21. Терапевтичний ефект анти-СЇ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимМАВ 610, 67А і 89А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин
МЕСВ8.
Діаграми розсіювання представляють об'єми прищеплених пухлин МЕС8 в різні моменти часу під час лікування розвинених ксенотрансплантатів МЕС8. За допомогою мишачих моноклональних анти-СІ ОМб антитіл тимМАВ 610, 67А і 89А було досягнуте інгібування росту пухлин у порівнянні з контрольними групами (фізіологічний розчин і антитіло).
Фіг. 22. Довгостроковий терапевтичний ефект анти-СІ ОМбЄ мишачих моноклональних антитіл тиМАВ 610, 67А і 89А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин МЕС8.
Через 17 днів після приживання трансплантата протягом 42 днів мишей лікували СІ ОМб- специфічними антитілами тимАВ 610, 67А і 89А. Зростання пухлини контролювали протягом додаткових 49 днів (А). На графіку видно збільшення тривалості життя мишей, яких лікували
СІ ОМб-специфічними антитілами тиМмАВ 610 і 67А (В).
Фіг. 23. Терапевтичний ефект анти-СІ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимМАВ 64А і 89А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин дикого типу МЕС8 і МЕС8-клітинами із стабільно нокаутним СІ ОМб.
МиМАВ 64А їі 89А показали терапевтичну дію тільки у мишей з прищепленою пухлиною дикого типу МЕС8, але не у мишей з прищепленими клітинами МЕС8 з нокаутним СГ ОМб, що показує специфічність антитіл до мішені іп мімо.
Фіг. 24. Картування епітопів спітМАВ 610, 64А, 67А і 89А з високим розрізненням.
Аланінові мутанти називаються "залишок дикого типу число аланін" або "залишок дикого типу число гліцин' у випадку аланіну дикого типу, де амінокислоти даються у вигляді однобуквенного коду. Амінокислоти ЕЗ35, (537, 539 і можливо Т33 першого позаклітинного домену СГОМ6 важливі для взаємодії з СІ ОМб-специфічними химерними антитілами спітАВ 6ІЮ, 64А, 67А і 89А. Залишок 140 необхідний для зв'язування спітАВ 89А, причому він сприяє скріпленню спітАВ 610 і 67А. Крім того, 1151 другого позаклітинного домену СГ ОМб сприяє взаємодії з спітАВ 67А. Хоча експерименти із застосуванням імунофлуоресценції підтвердили експресію СІ ОМб у мутантів Р28А, УМУЗОА, О49А, І 50А, М/51ТА, С54А і Сб4А, вони не показали фарбування мембран. З цієї причини ми не могли виключити взаємодію наших антитіл з цими амінокислотами. Загалом, як встановлено тут, епітоп відповідає нашій стратегії імунізації за допомогою ДНК і пептидів ЕСІ-домену СІ ОМб.
Фіг. 25. Вирівнювання варіабельної області важкого ланцюга амінокислотних послідовностей
СІ ОМб-специфічних антитіл, запропонованих даним винаходом.
СОВ-послідовності (НСОВІ, НСОН2 і НСОВЗ) виділені прямокутником.
Фіг. 26. Вирівнювання варіабельної області легкого ланцюга амінокислотних послідовностей
СІ ОМб-специфічних антитіл, запропонованих даним винаходом. бо СОВ-послідовності (СОР, І СО і І СОВ3) виділені прямокутником.
Визначення термінів
Для того, щоб даний винахід був зрозумілішим, спочатку даються визначення термінів.
Додаткові визначення висловлюються протягом всього докладного опису.
Протягом всього докладного опису і подальших пунктів формули винаходу, якщо контекст не вимагає іншого, слід розуміти, що слово "містить" і його варіанти, такі як "утримує" і "який містить", припускає включення певного члена, цілого числа або стадії або групи членів, цілих чисел або стадій, а не виключення будь-якого іншого члена, цілого числа або стадії або групи членів, цілих чисел або стадій. Терміни в однині, використані в контексті опису винаходу (особливо в контексті формули винаходу), слід тлумачити як такі, що включають і однину, і множину, якщо в описі не вказано інакшого або інше явно не продиктоване контекстом.
Перераховування меж значень в описі служить тільки як спосіб скорочення згадування окремо кожного окремого значення, яке потрапляє в межі. Якщо не вказане іншого, кожне окреме значення включається в докладний опис, неначебто воно було окремо перераховане в описі.
Всі описані тут методи можуть здійснюватися в будь-якому відповідному порядку, якщо в описі не вказано інакше або інше явним чином не протирічить контексту. Використання всіх без виключення прикладів або характерних виразів (наприклад, "такий як"), наданих в описі, має на меті тільки краще ілюструвати винахід і не обмежує рамки винаходу, заявлені в іншій формі.
Формулювання докладного опису не повинні тлумачитись як такі, що означають який-небудь незаявлений елемент, істотний для здійснення винаходу на практиці.
Клаудини є білками, які є найбілош важливими компонентами щільних контактів, де вони створюють трансклітинний бар'єр, який контролює потік молекул в міжклітинному просторі між клітинами епітелію. Клаудини є трансмембранними білками, які перетинають мембрану 4 рази, при цьому і М-кінець, і С-кінець розташовуються в цитоплазмі. Перша позаклітинна петля складається в середньому з 53 амінокислот і друга петля із близько 24 амінокислот. СІ ОМ і
СОМ є найбільш схожими членами родини СІ ОМ.
Термін "СІ ОМ", як він використовується в описі, означає клаудин і включає СІ ОМб, СІ ОМ,
СГ ОМА їі СІ ОМ3. Переважно СІ ОМ є людським СІ ОМ.
Термін "СГОМ6" бажано має відношення до людського СІ ОМ і зокрема до (ї) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність
Зо ЗБЕО ІО МО: 2 або яка кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 8, наприклад до нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеїновокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 1, або (ії) білка, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 2 або який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 8. Перша позаклітинна петля СІ ОМб бажано містить амінокислоти з 28 до 80, краще амінокислоти з 28 до 76 амінокислотної послідовності, вказаної в «ЖЕО ІЮО МО: 2, або амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО ІО МО: 8, наприклад амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО І МО: 7. Друга позаклітинна петля С ОМЄ бажано містить амінокислоти з 138 до 160, бажано амінокислоти з 141 до 159, краще амінокислоти з 145 до 157 амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО ІЮО МО: 2, або амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО ІЮ МО: 8, такої як амінокислотна послідовність, вказана в ЗЕО ІО МО: 6. Вказані перша і друга позаклітинні петлі бажано утворюють позаклітинну ділянку СІ ОМб.
Термін "СГ ОМУ9" бажано має відношення до людського СІ ОМ і, зокрема, до (ї) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО: 9, або (ії) білок, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 9. Перша позаклітинна петля СІГОМУ бажано містить амінокислоти з 28 до 76 амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО І МО: 9. Друга позаклітинна петля СІ ОМОУ бажано містить амінокислоти з 141 до 159 амінокислотної послідовності, вказаної в ЗЕО ІО МО: 9. Вказані перша і друга позаклітинні петлі бажано утворюють позаклітинну ділянку СІ ОМО.
Термін "СГОМ4" бажано має відношення до людського СІ ОМА і зокрема до (Її) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮО МО: 10, або (ії) білок, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО 1ЮО МО: 10. Перша позаклітинна петля СІГОМ4 бажано містить амінокислоти з 28 до 76 амінокислотної послідовності, вказаної в ЗЕО ІЮ МО: 10. Друга позаклітинна петля СІ ОМА бажано містить амінокислоти з 141 до 159 амінокислотної послідовності, вказаної в ЗЕО ІО МО: 10. Вказані перша і друга позаклітинні петлі бажано утворюють позаклітинну ділянку СІ ОМА.
Термін "СІ ОМ3" бажано має відношення до людського СІ ОМ3З і, зокрема, до (ї) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО: 11, або (ії) білок, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 11. Перша позаклітинна петля СГОМ3 бажано містить амінокислоти з 27 до 75 амінокислотної послідовності, вказаної в ЗЕО ІЮ МО: 11. Друга позаклітинна петля СІ ОМА бажано містить амінокислоти з 140 до 158 амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО ІО МО: 11. Вказані перша і друга позаклітинні петлі бажано утворюють позаклітинну ділянку СІ ОМ.
Описані вище послідовності СОМ включають будь-які варіанти вказаних послідовностей, зокрема мутанти, сплайс-варіанти, конформації, ізоформи, алельні варіанти, видові варіанти і видові гомологи, зокрема наявні в природі. Алельний варіант має відношення до зміни в нормальній послідовності гена, значення якого часто є незрозумілим. Повне генетичне секвенування часто визначає численні алельні варіанти для даного гена. Видовий гомолог є нуклеїновокислотною або амінокислотною послідовністю, джерелом походження яких є інший вид, ніж у даної нуклеїновокислотної або амінокислотної послідовності. Термін "СІ ОМ" включає () СОМ сплайс-варіанти, (ії) СІ ОМ-посттрансляційно модифіковані варіанти, зокрема включаючи варіанти з різним глікозилюванням, наприклад статусом М-глікозилювання, (ії) СІ ОМ конформаційні варіанти, (ім) варіанти СІ ОМ, пов'язаного з раком, і СОМ не пов'язаного з раком.
Бажано СІ ОМ перебуває в його нативній конформації.
Було виявлено, що СІ ОМб експресується при раку, наприклад раку яєчника, раку легень, раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, меланомі, раку голови і шиї, саркомі, раку жовчних шляхів, нирковоклітинному раку і раку сечового міхура. Зокрема, СІОМбЄ є бажаною мішенню для запобігання і/або лікування раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника і тератокарциноми яєчника, раку легені, включаючи дрібноклітинний рак легень (5СІС) і недрібноклітинний рак легень (М5СІ С), зокрема плоскоклітинного раку легень і аденокарциноми, раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, зокрема базальноклітинной карциноми і плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови і шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми, саркоми, зокрема синовіальної саркоми і карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, зокрема перехідно-клітинної карциноми і папілярного раку, раку нирки, зокрема нирковоклітинного раку, включаючи світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, раку товстої кишки, раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкої кишки і аденокарциному клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, плацентарної хоріокарциноми, раку шийки матки, раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка і ембріонального раку яєчка, раку матки, герміноми, такої як, тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально-клітинної пухлини яєчка та їх метастатичних форм. У одному варіанті здійснення ракове захворювання, пов'язане з експресією СІГОМб, вибирають з групи, яка складається з раку яєчника, раку легень, метастатичного раку яєчника і метастатичного раку легень. Переважно рак яєчника є карциномою або аденокарциномою. Переважно рак легень є карциномою або аденокарциномою, і переважно є бронхіолярним раком, наприклад бронхіолярною карциномою або бронхіолярною аденокарциномою. У одному варіанті здійснення пухлинна клітина, пов'язана з експресією СІ ОМб, є клітиною такого раку.
Термін "частина" належить до ділянки. Відносно окремої структури, наприклад амінокислотної послідовності або білка, термін "частина" може позначати неперервну або перервану ділянку вказаної структури. Бажано частина амінокислотної послідовності містить щонайменше 1 95, щонайменше 5 96, щонайменше 10 95, щонайменше 20 95, щонайменше 30 95, бажано щонайменше 4095, бажано щонайменше 5095, краще щонайменше 60 95, краще щонайменше 7095, ще краще щонайменше 80 95 і найкраще щонайменше 90 95 амінокислот вказаної амінокислотної послідовності. Бажано, якщо частина є перерваною ділянкою, вказана перервана ділянка складається з 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше частин структури, причому кожна частина є неперервним елементом структури. Наприклад, перервана ділянка амінокислотної послідовності може складатися з 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше, бажано не більше ніж 4 частин вказаної амінокислотної послідовності, при цьому кожна частина бажано містить щонайменше 5 неперервних амінокислот, щонайменше 10 неперервних амінокислот, бажано щонайменше 20 неперервних амінокислот, бажано щонайменше 30 неперервних амінокислот амінокислотної послідовності.
Терміни "частина" і "ррагмент" використовуються тут як взаємозамінні та належать до неперервного елемента. Наприклад, частина структури, така як амінокислотна послідовність або білок, належить до неперервного елемента вказаної структури. Ділянка, частина або фрагмент структури бажано включає в себеодне або більше функціональних властивостей вказаної структури. Наприклад, ділянка, частина або фрагмент епітопу або пептиду бажано є імунологічно еквівалентним (рівнозначним) до епітопу або пептиду, з якого він отриманий.
Термін "позаклітинна ділянка СОМ" в контексті даного винаходу належить до частини
СІ ОМ, оберненої до позаклітинного простору клітини і доступної із зовнішньої частини вказаної 60 клітини, що є бажаним, наприклад, для антитіл, розташованих зовні клітини. Бажано термін належить до однієї або більше позаклітинних петель або їх частини, або будь-якої іншої позаклітинної частини СІ ОМ, яка бажано є специфічною для вказаного СІ ОМ. Бажано вказана частина містить щонайменше 5, щонайменше 8, щонайменше 10, щонайменше 15, щонайменше 20, щонайменше 30, або щонайменше 50 амінокислот або більше.
Необхідно розуміти, що термін "СОМ, зв'язаний з поверхнею клітини, належить до нативного СОМ, тобто СОМ в його неденатурованому, бажано природно згорнутому стані.
Бажано термін "СОМ, зв'язаний з поверхнею клітини, означає, що СІ ОМ зв'язується 3, і розташовується на плазматичній мембрані вказаної клітини, при цьому щонайменше частина
СІ ОМ, бажано позаклітинна ділянка, обернена до позаклітинного простору вказаної клітини і є доступною із зовнішньої частини вказаної клітини, наприклад для антитіл, розташованих зовні клітини. Зв'язок може бути прямим або непрямим (опосередкованим). Наприклад, зв'язок може здійснюватися одним або більше трансмембранними доменами, одним або більше ліпідними якорями і/або шляхом взаємодії з будь-яким іншим білком, ліпідом, сахаридом або іншою структурою, яка знаходиться на зовнішній стороні плазматичної мембрани клітини. Наприклад,
СІ ОМ, зв'язаний з поверхнею клітини, може бути трансмембранним білком, тобто інтегральним мембранним білком, який має позаклітинну ділянку, або може бути білком, зв'язаним з поверхнею клітини, за допомогою взаємодії з іншим білком, який є трансмембранним білком.
СІГОМб є з'єднаним з поверхнею клітини, якщо він розташовується на поверхні вказаної клітини і є доступним для зв'язування СІ ОМб-специфічними антитілами, доданими до клітини. У кращих варіантах здійснення клітина, яка характеризується зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, є клітиною, яка експресує СГОМб. Слід розуміти, що у випадку, коли клітини експресують СІГОМб, сполучений з поверхнею вказаних клітин, СІ ОМб може бути тільки частиною експресованого СІ ОМб.
Термін "клітина, яка несе СОМ", переважно означає, що вказана клітина несе СОМ на своїй поверхні, тобто що СІ ОМ з'єднується з поверхнею вказаної клітини.
Термін "клітинна поверхня" або "поверхня клітини" використовується відповідно до його звичайного значення в даній області і відповідно включає зовнішню поверхню клітини, доступну для зв'язування з білками і іншими молекулами.
Вираз "СОМ, експресований на поверхні клітини" означає, що СІОМ, експресований клітиною, входить до складу поверхні вказаної клітини.
Відповідно до винаходу СІ ОМб є частково експресованим в клітині і є частково сполученим з клітинною поверхнею, якщо рівень експресії і з'єднання є нижчим у порівнянні з експресією і з'єднанням в клітинах плаценти або в тканині плаценти. Бажано рівень експресії і з'єднання є меншим ніж на 10 95, бажано меншим ніж на 5 95, З 905, 2 90, 1 Зо, 0,5 95, 0,1 95 або 0,05 95 від експресії і з'єднання в клітинах плаценти або в тканині плаценти або навіть нижче. Бажано,
СІГОМб є частково експресованим в клітині і є частково сполученим з клітинною поверхнею, якщо рівень експресії і з'єднання перевищує рівень експресії і з'єднання в неканцерогенній, доброякісній тканині, відмінній від тканини плаценти, не більше ніж в 2 рази, бажано 1,5 разу і бажано не перевищує рівень експресії і з'єднання у вказаній неканцерогенній, доброякісній тканині. Бажано СІ ОМ6б є частково експресованим в клітині і є частково сполученим з клітинною поверхнею, якщо рівень експресії і з'єднання є рівнем, нижчим від межі виявлення і/або якщо рівень експресії і з'єднання є дуже низьким для здійснення зв'язування СІ ОМб-специфічними антитілами, доданими до клітин.
Відповідно до винаходу СІ ОМ експресується в клітині і з'єднується з клітинною поверхнею, якщо рівень експресії і з'єднання перевищує рівень експресії і з'єднання в неканцерогенній іншій доброякісній тканині, відмінній від тканини плаценти, бажано більше ніж в 2 рази, бажано в 10 разів, 100 разів, 1000 разів або 10000 разів. Бажано СІ ОМб експресується в клітині і з'єднується з клітинною поверхнею, якщо рівень експресії і з'єднання є вищим від межі виявлення і/або якщо рівень експресії і з'єднання є достатньо високим для здійснення зв'язування СІ ЮОМб-специфічними антитілами, доданими до клітин. Бажано СіІОМб, експресований в клітині, експресується або експонується на поверхні вказаної клітини.
Термін "плот" належить до мікродоменів мембрани, багатих на сфінголіпіди і холестерин, розташованих в просторі зовнішнього "листка" (шару) плазматичної мембрани клітини.
Здатність деяких білків з'єднуватися усередині таких доменів та їх здатність утворювати "агрегати" або "фокальні агрегати" може впливати на функцію білків. Наприклад, переміщення молекул СГОМЄ в такі структури після зв'язування антитілами даного винаходу створює високу щільність комплексів СІ ОМб-антиген-антитіло в плазматичних мембранах. Така висока щільність комплексів СІ ОМб-антиген-антитіло може дати поштовх ефективній активації системи комплементу під час СОС.
Відповідно до винаходу термін "хвороба" належить до будь-якого патологічного стану, включаючи рак, зокрема, описані тут форми раку. "Хвороби, які торкаються клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням
СОМ з клітинною поверхнею" означає згідно з винаходом, що експресія і з'єднання в клітинах ураженої тканини або органу переважно є збільшеними в порівнянні з показниками для здорової тканини або органу. Під збільшенням розуміють збільшення щонайменше на 10 95, зокрема щонайменше 20 95, щонайменше 50 95, щонайменше 100 96, щонайменше 200 95, щонайменше 50095, щонайменше 100095, щонайменше 1000095 або навіть більше. У одному варіанті здійснення експресія і з'єднання з клітинною поверхнею виявляється тільки в ураженій тканині, тоді як експресія в здоровій тканині пригнічується. Відповідно до винаходу, хвороби, пов'язані з клітинами, які експресують СОМ і які характеризуються з'єднанням СІ ОМб з їх клітинною поверхнею, включають пухлинні захворювання, такі як ракові захворювання. Більше того, відповідно до винаходу, пухлинні захворювання, такі як ракові захворювання, переважно є тими хворобами, при яких клітини пухлини або ракові клітини експресують СІ ОМб і характеризуються з'єднанням СІ ОМ з їх клітинною поверхнею.
Терміни "пухлинна хвороба", "хвороба, пов'язана з пухлиною" або "онкогенна хвороба", як вони використовуються в описі, включають хворобу, яка відрізняється неправильно регульованим клітинним ростом, проліферацією, диференціюванням, адгезією і/або міграцією, що може приводити до утворення або схильності до утворення пухлини і/або пухлинних метастазів. Під "пухлинною клітиною" мають на увазі клітину, яка розмножується шляхом швидкого, неконтрольованого клітинного ділення і продовжує рости після припинення надходження стимулу, який ініціює нове зростання.
Під "пухлиною" мають на увазі аномальну групу клітин або тканину, яка росте в результаті швидкої неконтрольованої клітинної проліферації і продовжує рости після припинення надходження стимулу, який ініціює нове зростання. У пухлин спостерігається часткова або повна відсутність структурної організації і функціональної узгодженості з нормальною тканиною і зазвичай формується окрема маса тканини, яка може бути доброякісною, передзлоякісною або злоякісною.
Переважно "пухлинна хвороба", "хвороба, пов'язана з пухлиною" або "онкогенна хвороба" відповідно до винаходу є раком, тобто злоякісним захворюванням, а пухлинна клітина є раковою клітиною. Переважно "пухлинна хвороба", "хвороба, пов'язана з пухлиною" або "онкогенна хвороба" характеризується наявністю клітин, які експресують СІОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, причому пухлинна клітина експресує СІ ОМ і характеризується зв'язуванням СІ ОМ6б з клітинною поверхнею.
Клітина, яка експресує СІГОМб і яка характеризується зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, переважно є пухлинною клітиною або раковою клітиною, переважно клітиною пухлин і видів раку, описаних тут. Переважно така клітина є відмінною від клітин плаценти.
Переважно ракові хвороби або види раку відповідно до винаходу вибирають з групи, яка складається з раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника і тератокарциноми яєчника, раку легенів, включаючи дрібноклітинний рак легень (ЗСІ С) і недрібноклітинний рак легень (М5СЇІ С), зокрема плоскоклітинний рак легень і аденокарциному, раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, зокрема базальноклітинной карциноми і плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови і шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми, саркоми, зокрема синовіальної саркоми і карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, зокрема перехідно-клітинної карциноми і папілярного раку, раку нирки, зокрема нирковоклітинного раку, включаючи світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, раку товстої кишки, раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкої кишки і аденокарциному клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, плацентарної хоріокарциноми, раку шийки матки, раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка і ембріонального раку яєчка, раку матки, герміноми, такої як, тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально-клітинної пухлини яєчка та їх метастатичних форм.
Основними видами раку легень є дрібноклітинний рак легень (ЗСІ С) і недрібноклітинний рак легень (МЗС С). Існує три основні підтипи недрібноклітинного раку легень: плоскоклітинний рак легень, аденокарцинома і крупноклітинний рак легень. Аденокарциноми складають приблизно 1095 випадків раку легень. Зазвичай цей вид раку спостерігається на периферії легень, на противагу до дрібноклітинного раку легень і плоскоклітинного раку легень, які мають тенденцію розташовуватися більш центрально.
Рак шкіри є злоякісним утворенням на шкірі. Найпоширенішими видами раку шкіри є 60 базальноклітинний рак, плоскоклітинна карцинома і меланома. Злоякісна меланома є тим типом раку шкіри, який викликає найбільше занепокоєння. Вона пов'язана з неконтрольованим ростом пігментних клітин - меланоцитів.
Відповідно до винаходу "карцинома" є раком, який починається у вистилаючому шарі (епітеліальних клітинах) органів. "Бронхіолярна карцинома" є карциномою легень і, як вважається, виникає в епітелії термінальних бронхіол, де неопластична тканина тягнеться по ходу альвеолярних стінок і росте в невеликих кількостях усередині альвеоли. Муцин може бути видно у деяких клітинах і в речовині в альвеолі, куди також включаються голі клітини. "Аденокарцинома" є раком, який виникає в залозистій тканині. Ця тканина до того ж є частиною великої групи тканин, відомих як епітеліальні тканині. Епітеліальна тканина включає шкіру, залози і цілий ряд інших тканин, які вистилають порожнини і органи тіла. З погляду ембріології епітелій походить з ектодерми, ендодерми і мезодерми. Щоб належити до аденокарциноми, клітини необов'язково повинні бути частиною залози, якщо тільки вони проявляють секреторні властивості. Ця форма карциноми може виникати у деяких вищих тварин, включаючи людей. Добре диференційовані аденокарциноми мають тенденцію бути схожим на залозисту тканину, з якої вони походять, тоді як погано диференційовані не можуть.
За допомогою фарбування клітин з матеріалу біопсії патолог визначає, чи є пухлина аденокарциномою або іншим типом раку. Аденокарциноми можуть виникати в багатьох тканинах організму унаслідок широкого поширення залоз в організмі. Разом з тим, що кожна залоза не може секретувати одну і ту ж речовину, коли у клітини існує зовнішньосекреторна функція, вона вважається залозистою, і тому її злоякісна форма називається аденокарциномою.
Злоякісні аденокарциноми вторгаються в інші тканини і дають метастази, які також проникають в інші тканини. Аденокарцинома яєчника є найбільш поширеним типом карциноми яєчника.
Сюди включаються серозні і слизисті аденокарциноми, світлоклітинна аденокарцинома |і ендометриоїдна аденокарцинома. "Цистаденокарцинома" є злоякісною формою поверхневої епітеліально-стромальної пухлини, типу карциноми яєчника.
Вважають, що поверхневі епітеліально-стромальні пухлини є класом новоутворень, які походять з поверхневого епітелію яєчника (зміненого репіопешт (очеревина)) або з ектопічного ендометрію або тканини фалопієвої (маткової) труби. Ця група пухлин складає більшість всіх пухлин яєчника.
Тератокарцинома належить до герміногенної пухлини, яка є сумішшю тератоми з ембріональною карциномою або з хоріокарциномою або з обома. Хоріокарцинома є злоякісною трофобластичною і таким раком, зазвичай плаценти, який швидко розвивається. Він характеризується раннім поширенням в легені з потоком крові.
Саркома є раком сполучної тканини (кісткової, хрящової, жирової), яка призводить до проліферації мезодерми. Цей вид раку протилежний до карцином, які мають епітеліальне походження. Синовіальна саркома є рідкісною формою раку, яка зазвичай зустрічається біля суглобів рук і ніг. Вона є одним з видів сарком м'яких тканин.
Нирково-клітинна карцинома, відома також як нирково-клітинний рак або нирково-клітинна аденокарцинома, є раком нирки, який походить з вистилання проксимальних звитих канальців, дуже маленьких трубочок в нирці, які фільтрують кров і видаляють продукти життєдіяльності.
Нирково-клітинна карцинома є поза всяких сумнівів найбільш поширеним типом раку нирок у дорослих і найбільш летальним зі всіх урогенітальних пухлин. Окремими підтипами нирково- клітинної карциноми є світлоклітинний рак нирок і папілярний рак нирок. Світлоклітинний рак нирок є найбільш поширеною формою нирково-клітинної карциноми. Під мікроскопом клітини світлоклітинного раку здаються дуже блідими або світлими. Папілярний рак нирок є другим найбільш поширеним підтипом. При деяких, якщо не при більшості, з цих форм раку утворюються невеликі пальцеподібні вирости (які називаються сосочками, папіломами).
Герміногенна пухлина є новоутворенням, яке походить з ембріональних клітин. Герміногенні пухлини можуть бути раковими і нераковими пухлинами. Зазвичай ембріональні клітини зустрічаються усередині гонад (яєчника і яєчка). Герміногенні пухлини, які виникають зовні гонад (наприклад, на голові, в роті, на шиї, нирковій мисці; у зародках, у немовлят і маленьких дітей найчастіше виявляються на середній лінії тіла, зокрема на кінчику куприка) можуть бути вродженими вадами розвитку, які виникають унаслідок помилок під час розвитку ембріона.
Двома основними класами герміногенних пухлин є семіноми і несеміноми, при цьому несеміноми включають тератокарциному, ембріональну карциному, пухлини жовткового мішка, хоріокарциному і диференційовану тератому. Більшість клітинних ліній від несеміном рівноцінні ембріональним карциномам, тобто вони майже повністю складаються із стволових клітин, які не диференціюються за початкових умов, хоча деякі можуть реагувати на індукуючі чинники диференціювання, такі як ретиноєва кислота.
Під "метастазуванням" мають на увазі поширення ракових клітин з первинного місцеположення в іншу частину організму. Утворення метастаз є дуже складним процесом і залежить від відділення злоякісних клітин від первинної пухлини, інвазії позаклітинного матриксу, проникності ендотеліальних базальних мембран для проникнення в порожнину тіла і судин, а потім, після транспортування кровотоком, інфільтрації органів-мішеней. Нарешті, зростання нової пухлини в місці-мішені залежить від ангіогенезу. Метастази пухлини можуть виникати навіть після видалення первинної пухлини, оскільки пухлинні клітини або компоненти можуть залишитися і розвинути метастатичний потенціал. У одному варіанті здійснення термін "метастази" відповідно до винаходу має відношення до "віддаленої метастази", тобто метастази, віддаленої від первинної пухлини і системи регіональних лімфатичних вузлів.
Клітини вторинної або метастатичної пухлини є такими ж, як в первинній пухлині. Це означає, наприклад, що, якщо карцинома яєчника метастазує в печінку, вторинна пухлина складається з анормальних клітин яєчника, а не з анормальних клітин печінки. Пухлину в печінці потім називають метастатичною карциномою яєчника, а не раком печінки.
Під терміном "лікувати" розуміють введення суб'єктові сполуки або композиції, розкритих тут, для запобігання або усунення хвороби, включаючи зменшення розмірів пухлини або кількості пухлин у суб'єкта; затримки або уповільнення хвороби у суб'єкта; інгібування або уповільнення розвитку нової хвороби у суб'єкта; зменшення частоти і тяжкості симптомів і/або рецидивів у суб'єкта, який має в даний час або що раніше мав захворювання; і/або подовження, тобто збільшення тривалості життя суб'єкта.
Термін "лікування хвороби" передбачає зцілення, скорочення тривалості, поліпшення, запобігання, уповільнення або придушення прогресу або погіршення або запобігання або затримку початку хвороби або її симптомів.
Під тим, "який має ризик" мають на увазі суб'єкт, тобто пацієнт, який має вищий, ніж зазвичай, шанс розвитку хвороби, зокрема раку, в порівнянні з основною популяцією. Крім того, суб'єкт, який мав або в даний час має хворобу, зокрема рак, є суб'єктом з підвищеним ризиком розвитку хвороби, оскільки хвороба у суб'єкта може продовжувати розвиватися. У суб'єктів, які мають рак в даний час або що мали рак, також є підвищений ризик утворення метастазів раку.
Термін "імунотерапія" має відношення до лікування, яке зачіпає специфічну імунну реакцію.
У контексті даного винаходу такі терміни як "оберегти (захистити)», "запобігти", "профілактичний", "превентивний" або "запобіжний" мають відношення до запобігання або лікування і виникнення і/або поширення пухлини у індивідуума. Термін "імунотерапія" в контексті даного винаходу бажано належить до активної пухлинної імунізації або протипухлинної вакцинації. Профілактичне введення імунотерапії наприклад профілактичне введення композиції винаходу, бажано оберігає реципієнта від розвитку пухлинного зростання.
Терапевтичне проведення імунотерапії, наприклад терапевтичне введення композиції винаходу, може привести до придушення прогресування/зростання пухлини. Сюди включається зменшення швидкості прогресування/зростання пухлини, зокрема переривання прогресування пухлини, яке бажано веде до усунення пухлини. Терапевтичне проведення імунотерапії може захистити індивідуума, наприклад, від поширення або метастазування існуючих пухлин.
Термін "імунізація" або "вакцинація" описує процес введення антигену суб'єктові з метою викликати імунну відповідь через терапевтичні або профілактичні причини.
Терміни "суб'єкт", "індивідуум", "організм" або "пацієнт" використовуються як взаємозамінні і мають відношення до хребетних, бажано ссавців. Наприклад, ссавці в контексті даного винаходу є людьми, приматами, тваринами, які не є людьми, домашніми тваринами, такими як собаки, кішки, вівці, велика рогата худоба, кози, свині, коні тощо, лабораторними тваринами, такими як миші, щури, кролики, морські свинки тощо, а також тваринами, яких утримують, наприклад, в зоопарку. Термін "тварина" як він використовується в описі також включає людей.
Термін "суб'єкт" також може включати пацієнта, тобто тварину, краще людину, яка має хворобу, переважно хворобу, пов'язану з експресією СІ ОМб, переважно онкогенну хворобу, таку як рак.
Термін "ад'ювант" належить до сполук, які подовжують або підсилюють або прискорюють імунну відповідь. Композиція даного винаходу бажано впливає без додавання ад'ювантів.
Проте, композиція даної заявки може містити будь-який відомий ад'ювант. Ад'юванти включають різнорідну групу сполук, таких як олійні емульсії (наприклад, ад'юванти Фрейнда), мінеральні сполуки (такі як галун), бактерійні продукти (такі як токсин Вогавіє!а репиввів), ліпосоми та імуностимулюючі комплекси. Прикладами ад'ювантів є монофосфорил-ліпід-А (МРІ.
ЗтНКіїпе Вееспат), сапоніни, такі як 2521 (ЗтіййКіїпе Вееспат), 00521 (ЗтіїйКіїпе Вееспат; 60 УМО 96/33739), 057, 0517, 0518 і 05-11 (50 еї аї., 1997, Мої. Се 7: 178-186), неповні ад'юванти Фрейнда, повні ад'юванти Фрейнда, вітамін Е, монтанід, галун, СРО олігонуклеотиди (Кхієд еї аї., 1995, Маштге 374: 546-549) і різні емульсії вода-в-олії, які отримують з олій, які піддаються біологічному розкладанню, таких як сквалеон і/або Токоферол.
Відповідно до винаходу зразок може бути будь-яким зразком, придатним згідно з даним винаходом, зокрема біологічним зразком, наприклад зразком тканини, включаючи рідини організму, і/або клітинним зразком, і може бути отриманий звичайним способом, наприклад шляхом біопсії тканини, включаючи біопсію пункції і шляхом узяття крові, бронхіального аспірата, слини, сечі, калу або інших рідин організму. Відповідно до винаходу термін "біологічний зразок" також включає фракції біологічних зразків.
Термін "антитіло" належить до глікопротеїну, який містить щонайменше два важкі (Н) ланцюги і два легкі (І) ланцюги, взаємно сполучені дисульфідними зв'язками, і включає будь-яку молекулу, яка містить антигензв'язуючу ділянку. Термін "антитіло" включає моноклональні антитіла та їх фрагменти або похідні, включаючи, без обмеження, людські моноклональні антитіла, гуманізовані моноклональні антитіла, химерні моноклональні антитіла, одноланцюгові антитіла, наприклад, 5сЕм'5 і антигензв'язуючі фрагменти антитіл, такі як Раю і Габ1 фрагменти, а також включає всі рекомбінантні форми антитіл, наприклад антитіла, експресовані в прокаріотах, неглікозильовані антитіла і будь-які антигензв'язуючі фрагменти антитіл і похідні, як описується тут. Кожен важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (позначається в описі МН) і константної області важкого ланцюга. Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (позначається в описі МІ) і константної області легкого ланцюга. Області МН і Мі можна додатково підрозділити на області гіперваріабельності, які називаються ділянками, що визначають комплементарність (СОР), які чергуються з ділянками, консервативнішими, які називаються каркасними ділянками (ЕК). Кожна
МН і Мі. складається з трьох СО і чотирьох ЕЕ, розташованих від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: ЕК1, СОВІ, ЕН2, СОН2, ЕВЗ, СОВЗ, ЕКА4. Варіабельні області важкого і легкого ланцюга містять домен зв'язування, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередкувати зв'язування імуноглобуліну з тканиною-хазяїном або чинниками, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (Сід) класичної системи комплементу.
Відповідно до винаходу термін "цонайменше одна з СОВ послідовностей" бажано означає щонайменше СОВЗ послідовність. Термін "СОВ послідовності ланцюга антитіла" переважно має відношення до СОНІ, СОН2 і СОВЗ важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла.
Згідно з винаходом посилання на ланцюг антитіла, який містить конкретну СОВ- послідовність, таку як окрема СОРЗ-послідовність, означає, що вказана окрема СОВ- послідовність або утворює СОВ-ділянку, таку як СОВЗ-ділянка вказаного ланцюга антитіла, тобто СОВ-ділянка складається з вказаної окремої СОВ-послідовності, або утворює частину
СОВ-ділянки, таку як СОВЗ- ділянка вказаного ланцюга антитіла, тобто СОВ-ділянка містить вказану конкретну СОВ-послідовність.
Якщо згідно з винаходом робиться посилання на антитіло, яке містить окремий важкий ланцюг антитіла і/або окремий легкий ланцюг антитіла, наприклад ланцюг, який містить конкретні СОВ-послідовності, бажано, щоб обидва важкі ланцюги і/або обидва легкі ланцюги антитіла, кожен, складалися з окремого важкого ланцюга антитіла і/або окремого легкого ланцюга антитіла.
Термін "гуманізоване антитіло" належить до молекули, яка має ділянку зв'язування антигену, отриману в основному від імуноглобуліну тварини, яка не є людиною, при цьому в основі решти структури імуноглобулінової молекули лежить структура і/або послідовність людського імуноглобуліну. Ділянка зв'язування антигену може або містити повні варіабельні домени, приєднані до константних доменів, або тільки гіперваріабельні ділянки (СОВ), приєднані до відповідних каркасних ділянок у варіабельних доменах. Ділянки зв'язування антигену можуть бути дикого типу або модифікованими однією або більше амінокислотними замінами, наприклад модифікованими, щоб бути більше схожими на людський імуноглобулін.
Деякі форми гуманізованих антитіл зберігають всі СОВ-послідовності (наприклад, гуманізоване мишаче антитіло, яке містить всі шість СОВ від мишачого антитіла). Інші форми мають один або більше СОВ, змінених відносно первинного антитіла.
Термін "химерне антитіло" належить до антитіл, в яких одна частина кожної з амінокислотних послідовностей важкого і легкого ланцюгів є гомологічною до відповідних послідовностей в антитілі, отриманому від конкретного виду або яке належить до певного класу, тоді як решта сегменту ланцюга є гомологічним до відповідних послідовностей іншого виду.
Зазвичай варіабельна ділянка і легкого, і важкого ланцюгів копіює варіабельні ділянки антитіл, 60 отриманих від одного виду ссавців, тоді як константні частини є гомологічними до послідовностей антитіл, отриманих від іншого виду. Однією очевидною перевагою таких химерних форм є те, що варіабельну ділянку можна легко отримати із відомих на даний час джерел, використовуючи досяжні В-клітини або гібридоми від організмів-хазяїнів, які не є людиною, в комбінації з константними областями, отриманими, наприклад, з препаратів клітин людини. Притому, що варіабельна область має перевагу легкості отримання, а джерело не впливає на специфічність, константна область, будучи людською, менш ймовірно викличе імунну відповідь у суб'єкта-людини при введенні антитіл, ніж викликала б константна область з джерела, яке не є людиною. Проте визначення не обмежується цим окремим прикладом.
Термін "антигензв'язуюча ділянка" антитіла (або просто "ділянка зв'язування"), як він використовується в описі, належить до одного або більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном. Показано, що антигензв'язуюча функція антитіла може здійснюватися фрагментами повнорозмірного антитіла. Приклади зв'язуючих фрагментів, охоплені терміном "антигензв'язуюча ділянка" антитіла, включають (ії) Рар- фрагменти, одновалентні фрагменти, які складаються з МІ, МН, СІ ї СН доменів; (ії) Е(аб)2- фрагменти, двовалентні фрагменти, які містять два РГаб-фрагменти, сполучені дисульфідним містком в шарнірній області; (ії) Ба-фрагменти, які складаються з МН- і СН-доменів; (ім) Еу- фрагменти, які складаються з МІ- ії МН-доменів одноланцюгових антитіл, (у) ЗАбБ-фрагменти (Ууага еї аї, (1989) Маїшгте 341: 544-546), які складаються з МН-домену; (мі) ізольовані гіперваріабельні ділянки (СОР) і (мії) комбінації двох або більше ізольованих СОР, які необов'язково можуть з'єднуватися синтетичним лінкером. Крім того, хоча два домени Еу- фрагмента, МІ ії МН, кодуються окремими генами, їх можна з'єднати, використовуючи рекомбінантні методи, за допомогою синтетичних лінкерів, що дає їм можливість бути єдиним білковим ланцюгом, в якому Мі- ії МН-області розташовуються парами, щоб утворити одновалентні молекули (відомі як одноланцюгові Ем (зсЕм); дивися, наприклад, Віга еї аї. (1988)
Зсіепсе 242: 423-426; і Нивіоп еї аЇ. (1988) Ргос. Май. Асад. сі. БА 85: 5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також охоплені терміном "антигензв'язуюча ділянка" антитіла.
Додатковим прикладом є домензв'язуючі гібридні імуноглобуліни, які містять (ї) поліпептидний домен зв'язування, який приєднується до шарнірної області імуноглобуліну, (ії) константну область СН2 важкого ланцюга імуноглобуліну, приєднану до шарнірної області і (ії) константну область СНЗ важкого ланцюга імуноглобуліну, приєднану до константної області СНІ.
Зв'язуючий домен поліпептиду може бути варіабельною областю важкого ланцюга або варіабельною областю легкого ланцюга. Домензв'язуючі імуноглобулінові гібридні білки додатково розкриваються в 5 2003/0118592 і 05 2003/0133939. Ці фрагменти антитіл отримують за допомогою звичайних методів, відомих фахівцям в даній галузі техніки, при цьому фрагменти піддаються скринінгу щодо придатності, також як і інтактні антитіла.
Термін "епітоп" належить до антигенної детермінанти в молекулі, тобто частини в молекулі, яка розпізнається імунною системою, наприклад, яка розпізнається антитілом. Наприклад, епітопи є окремими, тривимірними ділянками на антигені, які розпізнаються імунною системою.
У контексті даного винаходу епітоп бажано походить від білка СІ ОМ. Зазвичай епітопи складаються з хімічно активних поверхневих угруповань молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги цукрів, і зазвичай мають специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні характеристики заряду. Конформаційні і неконформаційні епітопи розрізняються тим, що зв'язування з першим, але не з другим, втрачається у присутності денатуруючих розчинників. Епітоп білка, такого як СОМ, бажано містить неперервну або перервану частину вказаного білка і складає бажано від 5 до 100, бажано від 5 до 50, краще від 8 до 30, найкраще від 10 до 25 амінокислот в довжину, наприклад, епітоп може мати бажано 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 амінокислот в довжину.
Термін "перерваний епітоп", як він використовується в описі, позначає конформаційний епітоп на білковому антигені, який утворюється щонайменше з двох окремих областей в первинній послідовності білка.
Термін "біспецифічна молекула" включає будь-який агент, наприклад білок, пептид, або білковий або пептидний комплекс, який має дві різних специфічності зв'язування. Наприклад, молекула може зв'язуватися з або взаємодіяти з (а) антигеном клітинної поверхні, і (Б)
Ес-рецептором на поверхні ефекторної клітини. Термін "мультиспецифічна молекула" або "гетероспецифічна молекула" включає будь-який агент, наприклад білок, пептид, або білковий або пептидний комплекс, який має більше ніж дві різних специфічності зв'язування. Наприклад, молекула може зв'язуватися з або взаємодіяти з (а) антигеном клітинної поверхні і (Б)
Ес-рецептором на поверхні ефекторної клітини і (с) щонайменше з одним іншим компонентом.
Відповідно, винахід включає, але не обмежується цим, біспецифічні, триспецифічні, 60 тетраспецифічні та інші мультиспецифічні молекули, спрямовані до СІ ОМ, і до інших мішеней,
таких як Ес-рецептори на ефекторних клітинах. Термін "біспецифічні антитіла" також включає діабоди (аіабодіе5). Діабоди є двовалентними біспецифічними антитілами, в яких МН- і Мі - домени експресуються на одному поліпептидному ланцюзі, але з використанням лінкера, який є дуже коротким, щоб дати можливість утворити пару двом доменам на одному і тому ж ланцюзі, таким чином, змушуючи домени утворювати пару з комплементарними доменами іншого ланцюга і породжує дві антигензв'язуючих ділянки (дивися, наприклад, , Ноїїдег, Р., еї аї. (1993)
Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 90: 6444-6448; РоЦак, В. .., еї а). (1994) Зщисіиге 2: 1121-1123).
Термін "гетероантитіла", як він використовується в описі, належить до двох або більше антитіл, їх похідним або антигензв'язуючим ділянкам, з'єднаним разом, щонайменше двоє з- поміж яких мають різні специфічності. Ці різні специфічності включають специфічність зв'язування для Ес-рецептора на ефекторній клітині і специфічність зв'язування для антигену або епітопу на клітині-мішені, наприклад пухлинній клітині.
Антитіла, описані тут, можуть бути людськими антитілами. Термін "людське антитіло", як він використовується в описі, включає антитіла, які мають варіабельну і константну області, отримані від імуноглобулінових послідовностей людських зародкових ліній (дегтіїпе). Людські антитіла, відповідно до винаходу, можуть включати амінокислотні залишки, які не кодуються імуноглобуліновими послідовностями людських зародкових ліній (наприклад, мутації, введені за допомогою випадкового або сайт-специфічного мутагенезу іп міго або за допомогою соматичної мутації іп мімо).
Термін "моноклональне антитіло", як він використовується в описі, належить до препарату молекул антитіл з однорідним молекулярним складом. Моноклональне антитіло проявляє одну специфічність зв'язування і спорідненість до окремого епітопу. У одному варіанті здійснення моноклональні антитіла виробляються за допомогою гібридоми, яка включає В-клітину, отриману від тварини, яка не є людиною, наприклад миші, сполучену з імморталізованою клітиною.
Термін "рекомбінантні антитіла", як він використовується в описі, включає всі антитіла, які виходять, експресуються, створюються або виділяються за допомогою рекомбінантних способів, наприклад (а) антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною або трансхромосомною відносно генів імуноглобулінів, або гібридоми, отриманої з них, (б) антитіла, виділені з клітини-хазяїна, трансформованої для того, щоб вона експресувала антитіла, наприклад, з трансфектоми, (с) антитіла, виділені з комбінаторної бібліотеки рекомбінантних антитіл, і (4) антитіла отримані, експресовані, створені або виділені будь-якими іншими способами, які зачіпають сплайсинг послідовностей генів імуноглобулінів з іншою ДНК- послідовністю.
Термін "трансфектома", як він використовується в описі, включає рекомбінантні еукаріотичні клітини-хазятни, які експресують антитіло, такі як клітини СНО, клітини М5/0, клітини НЕК293, клітини НЕК293Т, рослинні клітини або клітини грибів, включаючи клітини дріжджів.
Термін "гетерологічне антитіло, як він використовується в описі, визначається з огляду на трансгенний організм, який продукує таке антитіло. Цей термін належить до антитіла, яке має амінокислотну послідовність або кодованого нуклеїновокислотною послідовністю, яка відповідає послідовності, виявленій в організмі, який не є трансгенним організмом, і як правило, отриманому від іншого виду, ніж трансгенний організм.
Термін "гетерогібридне антитіло", як він використовується в описі, належить до антитіла, яке має легкий і важкий ланцюги від різних організмів. Наприклад, антитіло, яке має важкий ланцюг людини, сполучений з мишачим легким ланцюгом, є гетерогібридним антитілом.
Винахід включає всі антитіла і похідні антитіл, описані тут, які для цілей винаходу охоплюються терміном "антитіло". Термін "похідні антитіл" належить до будь-якої модифікованої форми антитіла, наприклад кон'югату антитіла і іншого агента або антитіла, або фрагмента антитіла.
Описані тут антитіла бажано є ізольованими. Термін "ізольоване антитіло", як він використовується в описі, належить до антитіла, яке в основному є вільним від інших антитіл, які мають інші антигенні специфічності (наприклад, ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язується з СІ ОМбЄ, є в основному вільним від антитіл, які специфічно зв'язують антигени, відмінні від СІ ОМб). Проте ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом, ізоформою або варіантом людського СГОМб, може мати перехресну реактивність до інших споріднених антигенів, наприклад від інших видів (наприклад, видовими гомологами СІ ОМб).
Більш того, ізольоване антитіло може бути в основному вільним від іншого клітинного матеріалу іабо хімічних речовин. У одному варіанті здійснення винаходу комбінація "ізольованих" моноклональних антитіл має відношення до антитіл, які мають різні специфічності і об'єднані в 60 чітко визначену композицію.
Згідно із даним винаходом антитіло здатне зв'язуватися з певною мішенню, якщо воно має значну спорідненість із зазначеною певною мішенню й зв'язується із зазначеною певною мішенню в стандартних методах дослідження, таких, як описуються тут. Краще, коли антитіло здатне зв'язуватися з мішенню, якщо його зв'язування із зазначеною мішенню можна виявити за допомогою проточної цитометрії (за допомогою РАС5 аналізу), за допомогою якої визначають зв'язування зазначеного антитіла із зазначеною мішенню, експресованою на поверхні інтактних клітин. Краще антитіло зв'язується із зазначеною мішенню, і цей зв'язок можливо зафіксувати, якщо воно присутнє у концентрації 10 мкг/мл або нижче, 5 мкг/мл або нижче або 2 мкг/мл або нижче. Краще антитіло зв'язується із зазначеною мішенню, і цей зв'язок можливо зафіксувати, якщо воно присутнє у концентрації 50 нМ або нижче, 30 нМ або нижче або 15 нМ або нижче. "Спорідненість" або "спорідненість зв'язування" часто оцінюється рівноважною константою дисоціації (Ко). Бажано, термін "значна спорідненість" належить до зв'язування з певною мішенню з константою дисоціації (Ко) 105 М або нижче, 105 М або нижче, 10-7 М або нижче, 1038
М або нижче, 109 М або нижче, 10-79 М або нижче, 10-" М або нижче або 10-2 М або нижче.
Антитіла запропоновані даним винаходом бажано мають значення ЕСзо для зв'язування з
СГ ОМб 6500 нг/мл або нижче, 3000 нг/мл або нижче, 2500 нг/мл або нижче, 2000 нг/мл або нижче, 1500 нг/мл або нижче, 1000 нг/мл або нижче, 500 нг/мл або нижче, 400 нг/мл або нижче, 300 нг/мл або нижче, 200 нг/мл або нижче, або 100 нг/мл або нижче.
Антитіло не є здатним (значно) зв'язуватися з мішенню, якщо воно не має значної спорідненості із зазначеною мішенню й не зв'язується значно із зазначеною мішенню в стандартних методах. Краще антитіло не здатне (значно) зв'язуватися з мішенню, якщо його зв'язування із зазначеною мішенню не виявляється за допомогою проточної цитометрії (за допомогою ЕАС5 аналізу), за допомогою якої визначають зв'язування зазначеного антитіла із зазначеною мішенню, експресованою на поверхні інтактних клітин. Краще, антитіло зв'язується із зазначеною мішенню, але цей зв'язок неможливо зафіксувати, якщо воно присутнє у концентрації до 2 мкг/мл, бажано до 5 мкг/мл, бажано до 10 мкг/мл, бажано до 20 мкг/мл, більш бажано до 50 мкг/мл, зокрема до 100 мкг/мл або до 150 мкг/мл, до 200 мкг/мл або вище. Краще антитіло зв'язується із зазначеною мішенню, і цей зв'язок неможливо зафіксувати, якщо воно присутнє у концентрації до 15 нМ, бажано до 30 нМ, бажано до 50 нМ, бажано до 100 нМ,
Зо бажано до 150 нМ або до 170 нМ, до 300 нМ, до 600 нМ, до 1000 нМ, до 1300 нм або вище.
Краще, антитіло зв'язується із зазначеною мішенню, і цей зв'язок неможливо зафіксувати, якщо воно присутнє у концентрації, яка насичує зв'язування з мішенню, з якою зв'язується антитіло, тобто СІ ОМб6. Краще, антитіло не має значної спорідненості до мішені, якщо воно зв'язується із зазначеною мішенню з Ко, яка щонайменше в 10 разів, 100 разів, 103 рази, 104 рази, 105 разів або 106 разів є вищою, ніж Ко зв'язування з певною мішенню, з якою здатне зв'язуватися антитіло. Наприклад, якщо Ко зв'язування антитіла з мішенню, з якою здатне зв'язуватися антитіло, становить 10-77 М, тоді Ко зв'язування з мішенню, до якої антитіло не має значної спорідненості, становила б щонайменше 10 М, 105 М, 107 М, 103 М, 102 М або 107 М.
Антитіло є специфічним для певної мішені, якщо воно здатне зв'язуватися із зазначеною певною мішенню, тоді як воно не здатне зв'язуватися з іншими мішенями, тобто має незначну спорідненість до інших мішеней і незначно зв'язується з іншими мішенями при стандартних методах аналізу. Згідно з винаходом антитіло є специфічним до СІ ОМб, якщо воно здатне зв'язуватися з СІ ОМб, але не здатне зв'язуватися з іншими мішенями, зокрема білками клаудинами, відмінними від СІ ОМб, такими як СГОМО, СГ ОМ4, СГ ОМ ї СОМ. Краще, антитіло є специфічним до СІ ОМб, якщо спорідненість і зв'язування з білком клаудином, відмінним від
СІГОМб, таким як СГОМУ, СГ ОМ4, СГ ОМЗ ї СОМ, не перевищує значно спорідненості до або зв'язування з білками, неспорідненими із клаудином, такими як бичачий сироватковий альбумін (ВЗА), казеїн, людський сироватковий альбумін (НБА) або трансмембранні білки, які не є клаудинами, такі як молекули МНС або рецептор трансферину або будь-який інший специфічний поліпептид. Краще, антитіло є специфічним для певної мішені, якщо воно зв'язується із зазначеною мішенню з Ко, яка щонайменше в 10 разів, 100 разів, 103 рази, 104 рази, 105 разів або 106 разів є нижчою, ніж Ко зв'язування з мішенню, яка не є специфічною. Наприклад, якщо Ко зв'язування антитіла з мішенню, яка є специфічною, становить 10 М, то Ко зв'язування з мішенню, яка не є специфічною, має бути щонайменше 10- 5 М,105М,107М, 103 М, 102 М або 107 М.
Зв'язування антитіла з мішенню можна визначити експериментально, використовуючи будь- який придатний метод, див., наприклад, Веггої5Ку еї аї., "Апіїбоду-Апіїдеп Іпівегасіпв" п
Еипдатепіа! Іттипоіоду, Раш, МУ. Е., Еа., Камеп Ргез5 Мем мок, М М (1984), Киру, дЧат'5
Іттипоіоду, У. Н. Егеетап і Сотрапу Мем/ ХогК, М У (1992), і описані тут методи. Спорідненість 60 можна легко визначити за допомогою звичайних методів, таких як рівноважний діаліз; за допомогою приладу Віасоге 2000, використовуючи загальні методи, запропоновані виробником; за допомогою радіоіїмунологічного аналізу з використанням міченого радіоактивним ізотопом цільового антигену або іншими методами, відомими фахівцям. Дані про спорідненість можна проаналізувати, наприклад, за допомогою методу 5саїснага еї аїЇ., Апп М.У. Асайд. сі, 51:660 (1949). Визначена спорідненість окремої взаємодії антитіло-антигсен може варіювати, якщо вимірювання проводилося за різних умов, наприклад концентрації солі, рН. Таким чином, вимірювання спорідненості й інших параметрів зв'язування антигену, наприклад, Ко, ІСбво, бажано проводяться за допомогою стандартизованих розчинів антитіла й антигену й стандартизованого буфера.
Унікальною властивістю антитіла, запропонованого даним винаходом, є здатність зв'язуватися із клаудином б на клітинній поверхні. Це продемонстровано за допомогою проточної цитометрії на клітинах, які експресують клаудин 6.
Для перевірки зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, які експресують клаудини, використовували проточну цитометрію. Коротко, клітинні лінії, які експресують мембранозв'язані клаудини (вирощені за стандартних умов росту), змішуються з різними концентраціями антитіл в РВ5, що містить 2 95 інактивованої нагріванням ЕСЗ і 0,1 95 МаМз при 4 "С протягом 30 хвилин. Після промивання клітини вступали в реакцію із вторинним антитілом, міченим флуоресцентною міткою за тих же самих умов, за яких проводилося фарбування первинного антитіла. Зразки досліджували методом БАС5 з використанням висвітлення й параметрів бічного світлорозсіювання для пропущення одиничних клітин, при цьому визначається зв'язування мічених антитіл.
Термін "зв'язування" відповідно до винаходу бажано має відношення до специфічного зв'язування, як визначено тут.
Термін "ізотип", як він використовується в описі, належить до класу антитіл (наприклад, ІМ або Ідс 1), які кодуються генами константної області важкого ланцюга.
Вираз "перемикання ізотипу", як він використовується в описі, належить до явища, за допомогою якого клас або ізотип антитіла змінюється від одного класу Їд до одного з інших класів Ід.
Термін "природний", як він використовується в описі відносно об'єкта, стосується тієї обставини, що об'єкт може бути знайдений у природі. Наприклад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовність, яка є присутньою в організмі (включаючи віруси), яка може бути виділена із природного джерела, і яка не була навмисно модифікована людиною в лабораторії, є природною.
Термін "перегрупована", як він використовується в описі, належить до конфігурації важкого ланцюга або легкого ланцюга імуноглобулінового локусу, у якому М сегмент розташовується безпосередньо поруч із О-) або ) сегментом у конформації, яка кодує фактично повний УН або
МІ. домен, відповідно. Перегрупований генний локус імуноглобуліну (антитіла) може бути встановлений шляхом порівняння із зародковою ДНК; перегрупований локус буде мати щонайменше один рекомбінований семичленний/дев'ятичленний гомологічний елемент.
Термін "перегрупована" або "зародкова конфігурація", як він використовується в описі, відносно М сегмента стосується конфігурації, у якій М сегмент є нерекомбінованим для того, щоб знаходитися безпосередньо поруч із О або .-сегментом.
Термін "нуклеїновокислотна молекула", як він використовується в описі, включає молекули
ДНК і молекули РНК. Нуклеїновокислотна молекула може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але бажано є дволанцюговою ДНК. Нуклеїновокислотна молекула може використовуватися для введення в клітину, тобто трансфекцфії клітини, наприклад у формі
РНК, яку можна одержати за допомогою транскрипції іп міго з матриці ДНК. Більше того, РНК може бути модифікована перед використанням шляхом стабілізації послідовності, кепінгу й поліаденілювання.
Нуклеїнові кислоти, описані згідно з винаходом, бажано є ізольованими. Термін "ізольована нуклеїнова кислота" означає згідно з винаходом, що нуклеїнова кислота була (ї) ампліфікована іп міо, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), (ії) отримана рекомбінантно шляхом клонування, (ії) очищена, наприклад, за допомогою розщеплення й гель- електрофоретичного фракціонування або (ім) синтезована, наприклад за допомогою хімічного синтезу. Ізольована нуклеїнова кислота є нуклеїновою кислотою, яка є доступною для маніпуляцій за допомогою технології рекомбінантних ДНК.
Нуклеїнові кислоти згідно з винаходом присутні окремо або в комбінації з іншими нуклеїновими кислотами, які можуть бути гомологічними або гетерологічними. У кращих варіантах здійснення нуклеїнові кислоти є функціонально пов'язаними з послідовностями, які бо контролюють експресію, які можуть бути гомологічними або гетерологічними відносно зазначеної нуклеїнової кислоти, при цьому термін "гомологічні" означає, що нуклеїнова кислота також є функціонально зв'язаною з послідовністю, яка природно контролює експресію, а термін "гетерологічні" означає, що нуклеїнова кислота не є функціонально зв'язаною з послідовністю, яка природно контролює експресію.
Нуклеїнова кислота, така як нуклеїнова кислота, що експресує РНК і/або білок або пептид, і послідовність, яка контролює експресію, є "функціонально" зв'язаними один з одним, якщо вони ковалентно зв'язані один з одним таким чином, що експресія або транскрипція зазначеної нуклеїнової кислоти знаходиться під контролем або під впливом зазначеної послідовності, що контролює експресію. Якщо нуклеїнова кислота повинна транслюватися у функціональний білок, тоді, за наявності послідовності, що контролює експресію, пов'язаної з кодуючою послідовністю, індукція зазначеної послідовності, що контролює експресію, викликає транскрипцію зазначеної нуклеїнової кислоти, не викликаючи зрушення рамки в кодуючій послідовності, або зазначена кодуюча послідовність не здатна транслюватися в бажаний білок або пептид.
Термін "послідовність, яка контролює експресію" включає згідно з винаходом промотори, ділянки зв'язування рибосом, енхансери та інші елементи контролю, які регулюють транскрипцію гена або трансляцію мРНК. В окремих варіантах здійснення винаходу послідовності, які контролюють експресію, можуть регулюватися. Точна структура послідовності, яка контролює експресію, може змінюватися залежно від виду або типу клітин, але як правило, містить 5'-нетранскибовану й 5'- і 3і--нетрансльовані послідовності, які задіяні в ініціації транскрипції й трансляції, відповідно, такі як ТАТА-бокс, кепінг-послідовність, СААТ послідовність тощо. Конкретніше, 5'-нетранскибовані послідовності, які контролюють експресію, містять промоторну область, яка включає промоторну послідовність для транскрипційного контролю функціонально зв'язаної нуклеїнової кислоти. Послідовності, які контролюють експресію, також можуть містити енхансерні послідовності або послідовності активації.
Згідно з винаходом термін "промотор" або "промоторна область" має відношення до нуклеїновокислотної послідовності, яка розташовується вище (преігеат) (5) відносно експресованої нуклеїновокислотної послідовності й контролює експресію послідовності, забезпечуючи розпізнавання й сайт зв'язування для РНК-полімерази. "Промоторна область" може включати додатковий сайт розпізнавання й зв'язування для додаткових факторів, які залучені в процес регуляції транскрипції гена. Промотор може контролювати транскрипцію прокаріотичного або еукаріотичного гена. Крім того, промотор може бути "Ііндуцибельним" і може ініціювати транскрипцію у відповідь на індукуючий агент або може бути "конститутивним", якщо транскрипція не контролюється індукуючим агентом. Ген, який знаходиться під контролем індуцибельного промотору, не експресується або експресується тільки в невеликому ступені, якщо відсутній індукуючий агент. У присутності індукуючого агента включається ген або збільшується рівень транскрипції. Загалом, це опосередковує зв'язуванням специфічного фактора транскрипції.
Промотори, які згідно з винаходом є кращими, включають промотори для 5Рб, ТЗ і Т7 полімерази, людський Об РНК промотор, СММ-промотор та їх штучні гібридні промотори (наприклад, СМУ), де частина або частини з'єднуються із частиною або частинами промоторів генів інших клітинних білків, наприклад, таких як людський САРОН (гліцеральдегід -3-фосфат- дегідрогеназа), і включаючи або не включаючи додатковий інтрон(и).
Згідно з винаходом термін "експресія" використовується в його найбільш загальному значенні й включає продукування РНК або РНК і білка/пептиду. Він також включає часткову експресію нуклеїнових кислот. Більше того, експресія може здійснюватися тимчасово або стабільно. Згідно з винаходом термін експресія також включає "аберантну експресію" або "аномальну експресію". "Аберантна експресія" або "аномальна експресія" означає згідно з винаходом, що експресія є зміненою, бажано підвищеною, у порівнянні з еталонною, бажано в порівнянні зі станом у неонкогенній нормальній клітині або у здорового індивідуума. Збільшення експресії розуміють як збільшення щонайменше на 10 95, зокрема щонайменше на 20 95, щонайменше на 50 95 або щонайменше на 100 95. В одному варіанті здійснення експресії виявляється тільки в порушеній хворобою тканині, у той час як експресія в здоровій тканині пригнічується.
У кращому варіанті здійснення нуклеїновокислотна молекула згідно з винаходом присутня у векторі, у відповідних випадках із промотором, який контролює експресію нуклеїнової кислоти.
Термін "вектор" використовується тут у його самому загальному значенні й включає будь-який проміжний переносник нуклеїнової кислоти, який дає можливість зазначеній нуклеїновій кислоті, наприклад, бути внесеній в прокаріотичні й/або еукаріотичні клітини й, за потреби, інтегруватися 60 в геном. Вектори цього сорту бажано є реплікованими й/або експресуються в клітинах. Вектори включають плазміди, фагміди, бактеріофаги або вірусні геноми. Термін "плазміда", як він використовується в описі, загалом, має відношення до конструкта екстрахромосомного генетичного матеріалу, звичайно дуплекса кільцевої ДНК, який може реплікуватися незалежно від хромосомної ДНК.
Як вектор для експресії антитіла може використовуватися або тип вектора, у якому важкий ланцюг антитіла й легкий ланцюг присутні в різних векторах, або тип вектора, у якому важкий ланцюг і легкий ланцюг присутні в тому самому векторі.
Запропоновану в описі ідею відносно нуклеїновокислотної і амінокислотної послідовностей, наприклад зазначених у списку послідовностей, слід також відносити до модифікацій (тобто варіантів) зазначених специфічних послідовностей, які дають у результаті послідовності, які є функціонально еквівалентними до зазначених специфічних послідовностей, наприклад амінокислотних послідовностей, які проявляють властивості, ідентичні або подібні до властивостей специфічних амінокислотних послідовностей, і нуклеїновокислотні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності, які проявляють властивості, ідентичні або подібні до властивостей амінокислотних послідовностей, які кодуються специфічними нуклеїновокислотними послідовностями. Однією важливою властивістю є збереження зв'язування антитіла з його мішенню або забезпечення ефекторних функцій антитіла, таких як
СОС і/або АОСС. Бажано послідовність, модифікована відносно специфічної послідовності, коли вона заміняє специфічну послідовність в антитілі, зберігає зв'язування зазначеного антитіла з мішенню й бажано функції зазначеного антитіла, як описано тут.
Подібним чином, наведену тут ідею відносно специфічних антитіл або гібридом, які продукують специфічні антитіла, слід тлумачити таким чином, щоб також відносити її до антитіла, що характеризується амінокислотною послідовністю й/або нуклеїновокислотною послідовністю, яка є модифікованою в порівнянні з амінокислотною послідовністю й/або нуклеїновокислотною послідовністю специфічних антитіл, але є функціонально еквівалентною.
Однією важливою властивістю є збереження зв'язування антитіла з його мішенню або здійснення ефекторних функцій антитіла. Бажано послідовність, модифікована відносно специфічної послідовності, коли вона заміняє специфічну послідовність в антитілі, зберігає зв'язування зазначеного антитіла з мішенню й бажано функції зазначеного антитіла, як описано тут, наприклад, СОС-опосередкований лізис або АОСС-опосередкований лізис.
Зокрема, фахівцям ясно, що послідовності СОК, гіперваріабельні й варіабельні області можуть бути модифіковані без втрати здатності зв'язуватися з мішенню. Наприклад, СОК- ділянки будуть або ідентичними або високогомологічними до областей антитіл, перерахованих тут. Під "високогомологічною" мають на увазі, що в СОК може бути зроблено від 1 до 5, бажано від 1 до 4, наприклад від 1 до З або 1 або 2 заміни. На додачу до цього гіперваріабельні й варіабельні ділянки можуть бути модифіковані таким чином, щоб вони демонстрували значну гомологію з ділянками антитіл, спеціально розкритих тут.
Слід розуміти, що описані тут специфічні нуклеїнові кислоти також включають нуклеїнові кислоти, модифіковані заради оптимізації частоти використання кодону в окремій клітині-хазяїні або організмі. Відмінності в частоті використання кодону між організмами може приводити до ряду проблем, які стосуються гетерологічної генної експресії. Оптимізація кодону зміною одного або більше нуклеотидів первісної послідовності може дати в результаті оптимізацію експресії нуклеїнової кислоти, зокрема оптимізацію ефективності трансляції, у гомологічному або гетерологічному хазяїні, у якому повинна експресуватися зазначена нуклеїнова кислота.
Згідно з винаходом варіант, похідне, модифікована форма або фрагмент нуклеїновокислотної послідовності, амінокислотна послідовність або пептид бажано має функціональну властивість нуклеїновокислотної послідовності, амінокислотної послідовності або пептиду, відповідно, з якого він був отриманий. Такі функціональні властивості включають взаємодію з або зв'язування з іншими молекулами. В одному варіанті здійснення варіант, похідне, модифікована форма або фрагмент нуклеїновокислотної послідовності, амінокислотна послідовність або пептид є імунологічно еквівалентним до нуклеїновокислотної послідовності, амінокислотної послідовності або пептиду, відповідно, з якого він був отриманий.
Бажано ступінь ідентичності між специфічною нуклеїновокислотною послідовністю й нуклеїновокислотною послідовністю, яка є модифікованою у відношенні або яка є варіантом зазначеної специфічної нуклеїновокислотної послідовності, становить щонайменше 70 95, бажано щонайменше 75 95, більш бажано щонайменше 80 95, ще краще щонайменше 90 95 або найкраще щонайменше 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995. Що стосується СІОМ б-нуклеїновокислотних варіантів, то ступінь ідентичності бажано становить щонайменше близько 300, щонайменше близько 400, щонайменше близько 450, щонайменше близько 500, бо щонайменше близько 550, щонайменше близько 600 або щонайменше близько
630 нуклеотидів. У кращих варіантах здійснення ступінь ідентичності дається для повної довжини еталонної нуклеїновокислотної послідовності, наприклад нуклеїновокислотних послідовностей, наведених у переліку послідовностей. Бажано дві послідовності є здатними гіоридизуватися й утворювати стабільний дуплекс один з одним, коли гібридизацію бажано проводять за умов, які забезпечують специфічну гібридизацію між полінуклеотидами (жорсткі умови). Жорсткі умови описуються, наприклад, в МоїІесшаг Сіопіпуд: А І абогаїгу Мапиаї, у. затьгоок еї аї., Еайогв, 2па Еайіоп, Со Зргіпа Натбог І арогаїогу рге55, Соїй ргіпуд Нагбог,
Мем уогК, 1989 або Сигтепі Ргоїосоїв5 іп МоіІесшіаг Віоіоду, Е.М. А!,зибеї еї аї., Едіог5, допп УмМієу 8. бопв, Іпс., Мем/ УогК і стосуються, наприклад, гібридизації при 65 "С у буфері для гібридизації (3,5 х 550, 0,0295 фіколу, 0,02 95 полівінілпіролідону, 0,02 95 бичачого сироваткового альбуміну, 2,5 мМ МапгРох (рі 7), 0,5 95 505, 2 мМ ЕОТА). 5552 є 0,15М хлоридом натрію/0,15М цитратом натрію, рН 7. Після гібридизації мембрану, на яку була перенесена ДНК, промивають, наприклад, в 2 х 550 за кімнатної температури, а потім в 0,1-0,5 х 55С/0,1 х 505 за температур до 68 760.
Термін "варіант" згідно з винаходом також включає мутанти, сплайс-варіанти, конформації, ізоформи, алельні варіанти, видові варіанти й видові гомологи, зокрема ті, які присутні від природи. Алельний варіант має відношення до зміни в нормальній послідовності гена, значення якої часто є неясним. Повне генетичне секвенування часто встановлює численні алельні варіанти для даного гена. Видовий гомолог є нуклеїновою кислотою або амінокислотною послідовністю, джерелом походження яких є інші види, ніж у нуклеїновокислотної або амінокислотної послідовності.
Для цілей даного винаходу "варіанти" амінокислотної послідовності включають варіанти амінокислотних вставок, варіанти амінокислотних добавок, варіанти амінокислотних делецій і/або варіанти амінокислотних замін. Варіанти амінокислотних делецій, що містять делецію на
М-кінці й/або С-кінці білка, також називаються М-кінцевими й/або С-кінцевими укороченими варіантами.
Варіанти амінокислотних вставок включають вставки однієї або двох, або більше амінокислот в окрему амінокислотну послідовність. У випадку варіантів, які мають вставку, амінокислотної послідовності в окрему ділянку амінокислотної послідовності вставляється один або більше амінокислотних залишків, хоча при відповідному скринінгу отриманого продукту також можна виявити випадкові вставки.
Варіанти амінокислотних добавок включають аміно- і/або карбокси-кінцеві злиття однієї або більше амінокислот, такі як 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 або більше амінокислот.
Варіанти амінокислотних делецій характеризуються видаленням однієї або більше амінокислот з послідовності, наприклад видаленням 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 або більше амінокислот. Делеції можуть відбуватися в будь-якому місці білка.
Варіанти амінокислотних замін характеризуються щонайменше видаленням одного залишку в послідовності й вставкою іншого залишку на його місце. Перевага надається модифікаціям, які перебувають у положеннях амінокислотної послідовності, які не є консервативними між гомологічними білками або пептидами, і/або замінам амінокислот на інші амінокислоти, які мають подібні властивості. Бажано амінокислотні зміни в білкових варіантах є консервативними амінокислотними змінами, тобто замінами так само заряджених або незаряджених амінокислот.
Консервативна зміна амінокислоти стосується заміни однієї із родини амінокислот, які є спорідненими за структурою бічного ланцюга. Природні амінокислоти підрозділяються на чотири родини: кислі (аспартат, глутамат), основні (лізин, аргінін, гістидин), неполярні (аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан) і незаряджені полярні (гліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, серин, треонін, тирозин) амінокислоти. Фенілаланін, триптофан і тирозин іноді класифікуються разом як ароматичні амінокислоти.
Бажано ступінь подібності, краще ідентичності між специфічною амінокислотною послідовністю й амінокислотною послідовністю, яка є модифікованою відносно або яка є варіантом зазначеної специфічної амінокислотної послідовності, наприклад між амінокислотними послідовностями, що демонструють істотну гомологію, буде становити щонайменше 70 95, бажано щонайменше 8095, ще краще щонайменше 90 95 або найкраще щонайменше 95 95, 96 95, 97 У5, 98 95 або 99 95. Ступінь подібності або ідентичності бажано приводиться для амінокислотної області, яка становить щонайменше близько 10 95, щонайменше близько 2095, щонайменше близько 30595, щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 5095, щонайменше близько 6095, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95 або близько 100 95 повної довжини еталонної амінокислотної послідовності. Наприклад, якщо еталонна амінокислотна 60 послідовність складається з 200 амінокислот, ступінь подібності або ідентичності бажано приводиться щонайменше приблизно для 20, щонайменше приблизно 40, щонайменше приблизно 60, щонайменше приблизно 80, щонайменше приблизно 100, щонайменше приблизно 120, щонайменше приблизно 140, щонайменше приблизно 160, щонайменше приблизно 180 або приблизно для 200 амінокислот, бажано неперервних амінокислот. Що стосується СОМ б-поліпептидних варіантів, ступінь подібності або ідентичність приводиться бажано для ділянки щонайменше близько 100, щонайменше близько 120, щонайменше близько 140, щонайменше близько 160, щонайменше близько 180, щонайменше близько 200 або щонайменше близько 210 амінокислот. У кращих варіантах здійснення ступінь подібності або ідентичності приводиться для повної довжини еталонної амінокислотної послідовності, наприклад амінокислотних послідовностей, наведених у списку послідовностей. Вирівнювання для визначення подібності послідовності, бажано ідентичності послідовності, можна виконати відомими в даній галузі техніки способами, бажано з використанням найкращого способу вирівнювання послідовності, наприклад, АїЇдп з використанням стандартних налаштувань, бажано ЕМВО55:пеедіє, Матриця: Віозитб2, Штраф за відкриття пробілу 10.0, Штраф за продовження пробілу 0.5. "Подібність послідовності" указує відсоток амінокислот, які або є ідентичними або які представляють консервативні амінокислотні заміни. "Ідентичність послідовності" між двома поліпептидними або нуклеїновокислотними послідовностями вказує відсоток амінокислот або нуклеотидів, які є ідентичними між послідовностями. "Відсоток ідентичності" отримують після виконання оптимального вирівнювання, цей відсоток є чисто статистичним, а відмінності між двома послідовностями розподіляються випадково і вздовж повної їх довжини. Порівняння послідовності між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями зазвичай здійснюється шляхом порівняння /- цих послідовностей після їх оптимального вирівнювання, вказане порівняння проводиться за допомогою сегменту або "вікна порівняння" для того, щоб встановити і порівняти локальні області схожості послідовності. Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведене, окрім способу вручну, за допомогою алгоритму локальної гомології Зтій і
Уагептап, 1981, Ааз Арр. маїйй. 2, 482, за допомогою алгоритму локальної гомології МедаІетанп і
Уучпз5сй, 1970, 9. Мої. Віої. 48, 443, за допомогою методу пошуку схожості Реагзоп апа Гіртап, 1988, Ргос. Май Асай. Зсі. ОБА 85, 2444, або за допомогою комп'ютерних програм із застосуванням цих алгоритмів (ЗАР, ВЕ5ТРІТ, РАБЗТА, ВІАБТ Р, ВІ А5Т М ї ТЕА5БТА іп
Муізсопзіп Сепеїйс5 боїймаге Раскаде, Сепеїйсз Сотршиег Стор, 575 осіепсе Огіме, Мадізоп,
ММів.).
Відсоток ідентичності обчислюється шляхом визначення числа ідентичних положень між двома послідовностями при порівнянні, діленням цього числа на число порівнюваних положень і множенням отриманого результату на 100 для того, щоб отримати відсоток ідентичності між цими двома послідовностями. "Консервативні заміни" можуть бути зроблені, наприклад, на основі схожості полярності, заряду, розчинності, гідрофобності, гідрофільності і/або аліфатичної природи залучених залишків. Наприклад, (а) неполярні (гідрофобні) амінокислоти включають аланін, лейцин, ізолейцин, валін, пролін, фенілаланін, триптофан і метіонін; (5) полярні нейтральні амінокислоти включають гліцин, серин, треонін, цистеїн, тирозин, аспарагін і глутамін; (с) позитивно заряджені (основні) амінокислоти включають аргінін, лізин і гістидин; і (4) негативно заряджені (кислі) амінокислоти включають аспарагінову кислоту і глутамінову кислоту. Як правило, заміни можуть бути зроблені в групах (а) -(4). Крім того, гліцин і пролін можуть бути заміщені один іншим, виходячи з їх здатності розривати а-спіралі. Деякі кращі заміни можуть бути зроблені серед наступних груп: () З іт;(їЇ) Ріс; і (ії) А, М, Ії ї І. Якщо генетичний код відомий, за допомогою технології рекомбінантних і синтетичних ДНК кваліфікований учений легко може створити ДНК, яка кодує консервативні амінокислотні варіанти.
Даний винахід включає антитіла, в яких можуть бути зроблені зміни в Ес-ділянці для зміни функціональних і фармакокінетичних властивостей антитіл. Такі зміни можуть привести до зменшення або збільшення Сід-зв'язування і СОС або ЕсукК-зв'язування і АОСС. Заміни можуть бути зроблені, наприклад, в одному або більше амінокислотних залишках константної області важкого ланцюга, тим самим викликаючи зміну ефекторної функції, і одночасно зберігаючи здатність зв'язуватися з антигеном в порівнянні з модифікованим антитілом, див. 05 5,624,821 і 5 5,648,260.
Час напівжиття антитіла іп мімо може бути покращений шляхом модифікації епітопу рятувального (заїмаде) рецептора константного домену Ід або Ід-подобного константного домену, так що молекула не містить інтактний домен або інтактну Їд Ес СНО ділянку, див. 60 О56,121,022 і 05 6,194,551. Час напівжиття іп мімо може бути додатково збільшений за допомогою здійснення мутацій на Ес-ділянці, наприклад, шляхом заміни треоніну на лейцин в положенні 252, шляхом заміни треоніну на серин в положенні 254, або шляхом заміни треоніну на фенілаланін в положенні 256, див. 05 6,27,375.
Більше того, з метою зміни ефекторної функції антитіл може бути модифікований глікозильований варіант антитіл. Наприклад, антитіла можуть експресуватися в трансфектомі, яка не приєднує фукозну одиницю, зазвичай приєднану до Авп в положенні 297 Ес-ділянки, для того, щоб підсилити спорідненість Ес- ділянки із Ес-рецептором, яка, у свою чергу, приводитиме до підвищеної АОСС антитіл у присутності МК-клітин, див. Зпієїй еї аї. (2002) УВС, 277: 26733.
Більше того, галактозилювання може бути зроблене з метою модифікувати СОС.
Альтернативно, в іншому варіанті здійснення мутації можуть бути введені випадково уздовж всієї або частини послідовності, яка кодує анти-СІ ОМб антитіло, наприклад, за допомогою насичу вального мутагенезу і може бути проведений скринінг отриманих модифікованих анти-
СОМ антитіл відносно активності зв'язування.
Згідно з винаходом термін "клітина" або "клітина-хазяїн" бажано має відношення до інтактної клітини, тобто клітини з інтактною мембраною, яка не вивільняє нормальні внутрішньоклітинні компоненти, такі як ферменти, органели або генетичний матеріал. Інтактна клітина бажано є живою клітиною, тобто живою клітиною, здатною виконувати свої нормальні метаболічні функції. Бажано вказаний термін згідно з винаходом має відношення до будь-якої клітини, яка може бути трансформована або трансфікована екзогенною нуклеїновою кислотою. Термін "клітина" включає згідно з винаходом прокаріотичні клітини (наприклад, Е. сої) або еукаріотичні клітини (наприклад, дендритні клітини, В-клітини, СНО клітини, СО5 клітини, К5Об2 клітини,
НЕК293 клітини, клітини НЕГА, дріжджові клітини і клітини комах). Усередині клітини можна виявити екзогенну нуклеїнову кислоту (ї) окремо як таку у вільно диспергованому вигляді, (ії) введену в рекомбінантний вектор або (ії) інтегровану в геном клітини-хазяїна або мітохондріальну ДНК. Особливо бажаними є клітини ссавців, наприклад клітини людини, мишей, хом'яків, свиней, кіз і приматів. Клітини можуть бути отримані з цілого ряду типів тканин і включають первинні клітини і клітинні лінії. Конкретні приклади включають кератиноцити, лейкоцити периферійної крові, стволові клітини кісткового мозку і ембріональні стволові клітини.
У додаткових варіантах здійснення клітина є антиген-презентуючою клітиною, зокрема дендритною клітиною, моноцитом або макрофагом. Термін "клітина-хазяїн", як він використовується в описі, бажано призначається для вказування клітини, в яку може бути введений рекомбінантний вектор експресії.
Клітина, яка містить нуклеїновокислотну молекулу, бажано експресує пептид або білок, закодований нуклеїновою кислотою.
Термін "трансгенна тварина" належить до тварини, яка має геном, який містить один або більше трансгенів, бажано трансгенів важкого і/або легкого ланцюга, або трансхромосом (або інтегрованих або неінтегрованих в природну ДНК генома тварини), бажано здатних експресувати трансгени. Наприклад, трансгенна миша може мати трансген людського легкого ланцюга і або трансген людського важкого ланцюга або трансхромосому людського важкого ланцюга, так що миша продукує людські анти-СІ ОМб антитіла, коли вона імунізована СІ ОМб- антигеном і/або клітинами, які експресують СІ ОМб. Трансген людського важкого ланцюга може бути інтегрований в хромосомну ДНК миші, як у випадку трансгенної миші, наприклад, НИМАБб миші, наприклад НСо7 або НСої2 миші, або трансген людського важкого ланцюга може бути збережений екстрахромосомно, як у випадку трансхромосомних (наприклад, КМ) мишей, як описано в УМО 02/43478. Такі трансгенні і трансхромосомні миші можуть бути здатні продукувати багато ізотипів людських моноклональних антитіл до СІ ОМб (наприклад, Ідс, ІдА і/або ІДЕ) при проведенні М-О-.) рекомбінації і перемикання ізотипу.
Термін "зменшити" або "інгібувати", як він використовується в описі, означає здатність викликати повне зменшення, бажано на 5 95 або більше, 10 95 або більше, 20 95 або більше, краще 50 95 або більше і найкраще на 75 95 або більше рівня, наприклад рівня проліферації клітин. Термін "інгібувати" або подібні вирази включають повне або практично повне інгібування, тобто зменшення до нуля або практично до нуля.
Такі терміни як "збільшення" або "посилення" переважно належать до збільшення або посилення щонайменше приблизно на 10595, бажано щонайменше на 2095, бажано щонайменше на 30 9565, краще щонайменше на 40 95, краще щонайменше на 50 956, ще краще щонайменше на 8095 і найкраще щонайменше на 10095. Ці терміни також можуть мати відношення до обставин, за яких під час початку відліку (у точці нуль) не існує помітного сигналу відносно певного з'єднання або умови, а в певний момент часу, пізніше, ніж початок відліку, є помітний сигнал або умова.
Зо
Термін "імунологічно еквівалентний" означає, що імунологічно еквівалентна молекула, наприклад імунологічно еквівалентна амінокислотна послідовність, проявляє однакові або в основному однакові імунологічні властивості і/або має однаковий або в основному однаковий імунологічний вплив, наприклад, відносно типу імунологічної дії, такої як індукція гуморальної іабо клітинної імунної відповіді, сили і/або тривалості індукованої імунної реакції або специфічності імунної реакції. У контексті даного винаходу термін "імунологічно еквівалентний" переважно використовується відносно імунологічних дій або властивостей пептиду або пептидного варіанту, використаного для імунізації. Конкретною імунологічною властивістю є здатність зв'язуватися з антитілами і, якщо буде потрібно, викликати імунну відповідь, бажано шляхом стимулювання продукування антитіл. Наприклад, амінокислотна послідовність є імунологічно еквівалентною до еталонної амінокислотної послідовності, якщо вказана амінокислотна послідовність при контакті з імунною системою суб'єкта викликає імунну реакцію, бажано продукування антитіл, які проявляють специфічність вступу в реакцію з еталонною амінокислотною послідовністю, такою як еталонна амінокислотна послідовність, яка утворює частини СІ ОМб.
Термін "імунні ефекторні функції" в контексті даного винаходу включає будь-які функції, опосередковані компонентами імунної системи, які призводять до інгібування зростання пухлини і/або інгібуванню розвитку пухлини, включаючи інгібування поширення пухлини і метастазування. Бажано імунні ефекторні функції призводять до знищення клітин пухлини.
Бажано імунні ефекторні функції в контексті даного винаходу є антитіло-опосредованими ефекторними функціями. Такі функції включають комплементзалежну цитотоксичність (СОС), антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС), індукцію апоптозу в клітинах, які несуть асоційований з пухлиною антиген, наприклад, шляхом з'єднання антитіла з поверхнею антигену, ілабо інгібування проліферації клітин, які несуть асоційований з пухлиною антиген, бажано
АОСС і/або СОС. Таким чином, антитіла, здатні опосередкувати один або більше імунних ефекторних функцій, бажано є здатними опосередкувати знищення клітин, викликаючи СОС- опосередкований лізис, АЮСС-опосередкований лізис, апоптоз, гомотипічну адгезію і/або фагоцитоз, бажано викликаючи СОС-опосередкований лізис і/або АОСС-опосередкований лізис.
Крім того, антитіла можуть діяти просто шляхом зв'язування з пухлинно-асоційованими антигенами на поверхні пухлинної клітини. Наприклад, антитіла можуть блокувати функцію антигену, який асоціюється з пухлиною, або викликати апоптоз тільки шляхом зв'язування з пухлинно-асоційованим антигеном на поверхні пухлинної клітини.
Докладний опис винаходу
Механізми дії тАб
Не дивлячись на те, що наступний опис представляє аналіз механізму, який лежить в основі терапевтичної ефективності антитіл запропонованих даним винаходом, він не повинен розглядатися як такий, що обмежує винахід яким би то не було чином.
Описані тут антитіла можуть взаємодіяти з компонентами імунної системи, бажано через
АрСС або СОС. Антитіла, запропоновані винаходом, також можуть використовуватися для "цільового навантаження" (наприклад, радіоїзотопами, лікарськими засобами або токсинами), для того, щоб безпосередньо знищувати пухлинні клітини, або можуть використовуватися синергійно разом з традиційними засобами хіміотерапії, впливаючи на пухлини за допомогою додаткових механізмів дії, включаючи протипухлинні імунні відповіді, які можуть бути порушені внаслідок побічних цитотоксичних ефектів препаратів хіміотерапій на Т-лімфоцити. Проте антитіла, запропоновані винаходом, також можуть діяти просто шляхом зв'язування з СІ ОМб на клітинній поверхні, таким чином, наприклад, блокуючи проліферацію клітин.
Антитілозалежна клітинна цитотоксичність
АОрСС є здатністю ефекторних клітин (зокрема лімфоцитів) знищувати клітини, при цьому для функціонування лімфоцитів необхідно, щоб клітина-мішень була помічена антитілом.
Бажано АОСС спостерігається, коли антитіла зв'язуються з антигенами на пухлинних клітинах, а Ес-домени антитіл зв'язують Ес-рецептори (ЕСК) на поверхні імунних ефекторних клітин. Було встановлено декілька родин Ес-рецепторів, при цьому характерно, що специфічні популяції клітин експресують певні Ес-рецептори. АОСС можна розглядати як механізм прямої індукції руйнування (різного ступеня) пухлини, який приводить до презентації антигену та індукції Т-клітинних відповідей, направлених на пухлину. Бажано індукція АОСС іп о мімо призводить до Т-клітинної відповіді, направленої на клітини пухлин і відповіді антитіл хазяїна.
Комплементзалежна цитотоксичність.
Іншим способом знищення клітин, який може бути опосередкований антитілами, є СОС.
Найефективнішим ізотипом для активації комплементу є (ЯМ. Також дуже ефективними при 60 спрямовуванні СОС через класичний шлях активації комплементу є ІДС! ї Ід53. Бажано,
утворення комплексів антиген-антитіло в цьому каскаді призводить до розкриття численних місць зв'язування Сід в безпосередній близькості на СН2 доменах задіяних молекул антитіл, наприклад молекул дб (Сід є одним з трьох субкомпонентів комплементу СІ). Бажано ці розкриті місця зв'язування Сід перетворюють взаємодію Сід - ІдсС до цього з низькою спорідненістю на спорідненість з високою авидністю, яка запускає каскад подій, які залучають ряд інших білків комплементу, і призводить до протеолітичного вивільнення хемотаксичних/активуючих агентів ефекторних клітин СЗа і Сбза. Бажано каскад комплементу закінчується утворенням мембрано-атакуючого комплексу, який створює пори в клітинній мембрані, які сприяють вільному проходженню води і розчинених речовин в клітини і з клітин.
Продукування антитіл
Антитіла, запропоновані винаходом, можна отримати за допомогою ряду методів, включаючи звичайну методику отримання моноклональних антитіл, наприклад методом гіоридизації стандартних соматичних клітин КоПіег і Міївієїп, Маїшге 256: 495 (1975). Не дивлячись на те, що методи гібридизації соматичних клітин є бажаними, в принципі можна використовувати інші методи отримання моноклональних антитіл, наприклад шляхом вірусної або онкогенної трансформації В-лімфоцитів, або методом фагового дисплея з використанням бібліотек генів антитіл.
Бажаною тваринною системою для отримання гібридоми, яка секретує моноклональні антитіла, є мишача система. Отримання гібридоми в миші є загальноприйнятим методом.
Протоколи імунізації і методики виділення імунізованих спленоцитів для злиття добре відомі в даній галузі техніки. Клітини (наприклад, мишачі клітини мієломи), які зливаються і процедури злиття також добре відомі.
Іншими кращими тваринними системами для отримання гібридом, які секретують моноклональні антитіла, є щури або кролики (наприклад, система, описана в бріеКег-Ро!еї еї аї.,
Ргос. Май. Асад. Зсі. О.5.А. 92:9348 (1995), дивися також Козві еї аї., Ат. 9. Сііп. 35 Раїпої. 124:295(2005)).
У іншому кращому варіанті здійснення людські моноклональні антитіла, спрямовані до
СІГОМб, можна отримати за допомогою трансгенних або трансхромосомних мишей, які несуть частини людської імунної системи, а не мишачої системи. Ці трансгенні або трансхромосомні миші включають мишей, відомих як миші НиМАБ і миші КМ, відповідно, і разом згадуються в описі як "трансгенні миші". Отримання людських антитіл в таких трансгенних мишах можна здійснити, як детально описано для СО2О в УМО2004 035607
Іншою стратегією отримання моноклональних антитіл є пряме виділення генів, які кодують антитіла, з лімфоцитів, які продукують антитіла, наприклад, див. ВабсоскК еї єї!., 1996; А помеї! 5ігагеду Тог депегаїіпуд топосіопа! апіїбодіє5 їтот взіпдіє, ізоїаїедй Іутрпосуїез ргодисіпу апіїбоїе5 ої аєїіпей з5ігаїеау. Подробиці розробки рекомбінантних антитіл дивися також в У/еіІ5сної і Кгашйв,
Весотбріпапі апіроде5 ог сапсег Шегару І5ВМ-0-89603-918-8 і Веппу К.С. Го Антитіло
Епдіпеегіпд ІЗВМ 1-58829-092-1.
Імунізація
Для отримання антитіл до СГОМб, мишей можна імунізувати кон'югованими з носієм пептидами, отриманими з СІ ОМб-послідовності, препаратом, збагаченим рекомбінантно експресованим СІ ОМб-антигеном або його фрагментами і/або клітинами, які експресують
СІГОМб або його фрагменти, як описано. Альтернативно, мишей можна імунізувати ДНК, яка кодує людський повнорозмірний СІ ОМб або його фрагменти. У тому випадку, коли імунізація з використанням очищеного або збагаченого препарату антигену СГОМб не приводить до утворення антитіл, мишей також можна імунізувати клітинами, які експресують СІГОМб, наприклад, клітинною лінією, щоб сприяти імунній відповіді.
Імунну відповідь можна контролювати впродовж виконання протоколу імунізації, відбираючи зразки плазми і сироватки з хвостової вени або ретроорбітально. Миші з достатнім титром анти-
СІ ОМ імуноглобуліну можуть використовуватися для злиття. Мишей можна піддати стимуляції внутрішньочеревно і внутрішньовенно клітинами, які експресують СІ ОМ, і за 3-5 днів до забою і видалення селезінки для того, щоб збільшити швидкість секретування специфічних антитіл гіоридомами.
Отримання гібридом, які продукують моноклональні антитіла
Для отримання гібридом, які продукують моноклональні антитіла до СІ ОМб, з лімфатичних вузлів або селезінки, отриманих від імунізованих мишей, можуть бути виділені клітини і злиті з відповідною імморталізованою клітинною лінією, наприклад лінією клітин мієломи миші. Потім можна відібрати отримані гібридоми із продукування антиген-специфічних антитіл. У такому випадку за допомогою методу ЕЇІ5А можна відібрати окремі комірки з гібридомами, які 60 секретують антитіла. За допомогою імунофлуоресценції і РЕАаАС5-аналізу з використанням клітин,
які експресують СГ ОМб, можна встановити антитіла із специфічністю до СІ ОМб. Гібридоми, які секретують антитіла, можна знов висіяти, провести відбір і позитивні за анти-СІ ОМб моноклональними антитілами можна субклонувати за допомогою серійного розведення. Потім стабільні субклони культивують іп мйго в середовищі для культури тканини, щоб отримати і охарактеризувати антитіла.
Отримання трансфектом, які продукують моноклональні антитіла
Антитіла, запропоновані винаходом, також можна отримати в клітинах-хазяїнах, таких як, трансфектоми, використовуючи, наприклад, комбінацію методів рекомбінантних ДНК і методів трансфекції генів, добре відомих в даній галузі техніки (Могтізоп, 5. (1985) Зсіепсе 229: 1202).
Наприклад, в одному варіанті здійснення гени(ген), які представляють інтерес, наприклад гени антитіл, можуть лігувати у вектор експресії, такий як еукаріотична експресуюча плазміда, яка, наприклад, використовується системою експресії гена 55, розкритою в УМО 87/04462,
МО 89/01036 і ЕР 338 841, або інші системи експресії, добре відомі в даній галузі. Очищена плазміда з клонованими генами антитіла може бути введена в еукаріотичну клітину-хазяїна, таку як СНО клітини, М5/0О клітини, НЕК293Т клітини або НЕК293 клітини або альтернативно інші еукаріотичні клітини, подібні до клітин рослин, грибів або дріжджів. Методами, які використовується для введення цих генів можуть бути методи, описані в даній галузі техніки, такі як електропорація, ліпофектин, ліпофектамін або інші. Після введення цих генів антитіл в клітини-хазяїни, клітини, які експресують антитіло можуть бути пізнані і відібрані. Ці клітини є трансфектомами, які потім можна ампліфікувати і масштабувати для продукування антитіл.
Рекомбінантні антитіла можуть бути ізольовані і очищені з цих культуральних супернатантів і/або клітин.
Альтернативно, клоновані гени антитіла можуть бути експресованими в інші системи експресії, включаючи прокаріотичні клітини, такі як мікроорганізми, наприклад Е. соїї. Більше того, антитіла можуть продукуватися в трансгенних організмах, які не є людиною, і бути присутніми, наприклад, в молоці овець і кроликів або в яйцях курей, або в трансгенних рослинах; дивися, наприклад, Мета, Н., еї аї. (1998) 9. Іттипої. Меїй. 216: 165-181; РоїоскК, еї а!. (1999) У). Іттипої. Меїй. 231: 147-157; і РізсНег, В., еї аї. (1999) Вісі. Спет. 380: 825-839.
Використання часткових послідовностей антитіл для експресії інтактних антитіл (тобто гуманізація і химеризація). а) Химеризація
Мишачі моноклональні антитіла можуть використовуватися як терапевтичні антитіла для людей, у тому випадку, коли до них прикріпляється токсин або коли їх мітять радіоактивними ізотопами. При повторному застосуванні немічені мишачі антитіла є високоїмуногенними для
З5 людини, що приводить до зменшення терапевтичного ефекту. Основна імуногенність опосередкована константними областями важкого ланцюга. Імуногенність мишачих антитіл у людини можна зменшити або повністю її уникнути, якщо відповідні антитіла зробити химерними або гуманізованими. Химерні антитіла є антитілами, різні частини яких походять від різних видів тварин, наприклад антитіла мають варіабельну область, отриману від мишачого антитіла і константну область людського імуноглобуліну. Химеризація антитіл досягається з'єднанням варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів мишачих антитіл з людською константною областю важкого і легкого ланцюгів (наприклад, як описано Кгацз еї аї., у Мейовд5 іп МоіІесшаг
Віооду зепез5, Весотбіпапі апіїрбодіеє їтог сапсег Шегару ІЗВМ-0-89603-918-8). У бажаному варіанті здійснення химерні антитіла отримують з'єднанням людської константної області каппа- легкого ланцюга з мишачою варіабельною областю легкого ланцюга. У бажаному варіанті здійснення химерні антитіла отримують з'єднанням людської константної області лямбда- легкого ланцюга з мишачою варіабельною областю легкого ланцюга. Кращими константними областями важкого ланцюга для отримання химерних антитіл є Їдс1, дез і Ідс4. Іншими кращими константними областями важкого ланцюга для отримання химерних антитіл є Ідс2,
ІЧА, дО і ТОМ. р) Гуманізація
Антитіла взаємодіють з цільовими антигенами бажано через амінокислотні залишки, розташовані в шести гіперваріабельних ділянках (СОР) важкого і легкого ланцюгів. З цієї причини амінокислотні послідовності в СОВА є більш різними між окремими антитілами, ніж послідовності зовні СОВА. Оскільки СОВ-послідовності відповідають за більшість взаємодій антитіло-антиген, є можливою експресія рекомбінантних антитіл, які наслідують властивостям специфічних природних антитіл, шляхом конструювання векторів експресії, які включають СОВ- послідовності від специфічних природних антитіл, пересаджені на каркасні послідовності від іншого антитіла з іншими властивостями (див., наприклад, Кіеспітапп, Ї, еї а!. (1998) Маїиге 332: 60 0 323-327; допев, Р. еї аїі. (1986) Маїште 321: 522-525; і Оцееп, З еї а). (1989) Ргос. Маї! Асаай. 5сі.
И.5.А. 86: 10029-10033). Такі каркасні послідовності можна отримати з публічних баз даної ДНК, яка включає зародкові послідовності генів антитіл. Ці зародкові послідовності відрізнятимуться від зрілих послідовностей генів антитіл, оскільки вони не включають повністю зібрані мінливі гени, які формуються при М (0) 9-з'єднанні під час дозрівання В-клітини. Зародкові генні послідовності також відрізнятимуться від послідовностей високоафінного антитіла з вторинного репертуару окремою рівномірною варіабельною областю. Наприклад, соматичні мутації є відносно рідкісними в амінокінцевій частині каркасної ділянки 1 і в карбоксикінцевій частині каркасної ділянки 4. Більше того, багато соматичних мутацій значно не змінюють зв'язуючі властивості антитіла. З цієї причини, необхідно отримати повну послідовність ДНК окремого антитіла, для того, щоб наново створити (відновити) інтактне рекомбінантне антитіло, яке має властивості, схожі з властивостями первинного антитіла (див. М/О 99/45962). З цією метою, як правило, достатньо часткових послідовностей важкого і легкого ланцюгів, які сполучають СОВ- ділянки. Часткова послідовність використовується, щоб визначити, які зародкові варіабельні і сполучаючі генні сегменти сприяють рекомбінуванню мінливих генів антитіла. Потім використовується зародкова послідовність, щоб заповнити ті частини варіабельних ділянок, яких бракує. Лідерні послідовності важкого і легкого ланцюгів розщеплюються під час дозрівання білка і не вносять внесок до властивостей антитіла. Щоб додати відсутні послідовності, клоновані КДНК-послідовності можна з'єднати з синтетичними олігонуклеотидами за допомогою лігування або ПЛР-ампліфікації. Альтернативно, повна варіабельна область може бути синтезована як набір коротких, олігонуклеотидів, які перекриваються, і об'єднана за допомогою ПЛР -ампліфікації щоб створити клон з повністю синтетичною варіабельною областю. Цей процес має певні переваги, такі як єлімінація, або включення, або окремі сайти рестрикції, або оптимізація окремих кодонів.
Нуклеотидні послідовності транскриптів важкого і легкого ланцюгів з гібридом використовуються для складання перекриваючого набору синтетичних олігонуклеотидів, щоб створити синтетичні М-послідовності з можливістю кодування тих же самих амінокислот, як в природній послідовності. Послідовності синтетичного важкого і каппа-ланцюга можуть відрізнятися від природних послідовностей в трьох варіантах: нитки повторних нуклеїнових основ перериваються, щоб полегшити синтез олігонуклеотидів і ПЛР-ампліфікацію; оптимальні сайти ініціації трансляції включаються згідно правилам Колак (Когак, 1991, 9. ВіоІ. 5 Спет. 266: 19867-19870); і сайти Ніпан створюються вище від сайтів ініціації трансляції.
Що стосується варіабельних областей і важкого і легкого ланцюгів, оптимізовані кодуючі і відповідні некодуючі ділянки послідовностей розділяються на 30-50 нуклеотидів приблизно в серединній точці відповідного некодуючого олігонуклеотиду. Таким чином, для кожного ланцюга олігонуклеотиди можуть бути зібрані в двониткові набори, які перекриваються, які охоплюють сегменти із 150-400 нуклеотидів. Ці пули (клястери, групи) потім використовуються як матриці для отримання продуктів ПЛР-ампліфікації з 150-400 нуклеотидів. Як правило, одна варіабельна область олігонуклеотидного набору розділятиметься на два пули, які окремо ампліфікуються, щоб виробити два ПЛР-продукти, що перекриваються. Потім ці продукти, що перекриваються, потім об'єднують за допомогою ПЛР-ампліфікації щоб створити повну варіабельну область. Також може бути бажане включення фрагмента варіабельної області важкого або легкого ланцюга, що перекривається, в ПЛР-ампліфікацію для створення фрагментів, які можна легко клонувати в конструкти векторів експресії.
Потім реконструйовані химерну і гуманізовану варіабельні області важкого і легкого ланцюгів об'єднують з клонованими послідовностями промоторної ділянки, лідерної ділянки, ділянки ініціації трансляції, константної області, 3" нетрансльованих ділянки, ділянка поліаденілювання і ділянки термінації транскрипції, щоб утворити конструкти вектора експресії.
Конструкти експресії важкого і легкого ланцюгів можуть бути об'єднані в один вектор, ко- трансфіковані, послідовно трансфіковані або окремо трансфіковані в клітини-хазяїни, які потім зливаються з утворенням клітини-хазяїна, яка експресує обидва ланцюги. Описані плазміди, які використовуються в створенні векторів експресії для людського |ЇдОк. Плазміди можуть бути створені так, що ПЛР-ампліфіковані кКДНК-послідовності М важкого і М каппа легкого ланцюга можуть використовуватися для реконструювання мінігенів повного важкого і легкого ланцюгів. Ці плазміди можуть використовуватися для експресії повністю людського або химерного Ідс1, каппа або Ід04, каппа-антитіл. Можуть бути створені подібні плазміди для експресії інших ізотипів важкого ланцюга або для експресії антитіл, що містять лямбда-легкі ланцюги.
Таким чином, в іншому аспекті винаходу структурні ознаки анти-СІЇ ОМб-антитіл, запропонованих даним винаходом, використовуються для створення структурно-споріднених гуманізованих анти-СІ ОМб-антитіл, які зберігають щонайменше одну функціональну 60 властивість антитіл, запропонованих даним винаходом, наприклад зв'язування з СІ ОМб.
Конкретніше, одна або більше СОВ-ділянок мишачого моноклонального антитіла може бути рекомбінантно об'єднана з відомими людськими каркасними ділянками і СОВ для створення додаткових рекомбінантно-сконструйованих гуманізованих анти-СІ ОМб-антитіл, запропонованих даним винаходом.
Зв'язування з клітинами, які експресують антиген
Здатність антитіла зв'язуватися з СІ ОМб можна визначити за допомогою стандартних методів аналізу, таких як методи, представлені в прикладах (наприклад, ЕГІ5ЗА, Вестерн- блотінг, імунофлуоресценція і проточна цитометрія).
Ізолювання і характеристика антитіл
З метою очищення моноклональних анти-СІ ОМб-антитіл відібрані гібридоми вирощують в дволітровій ролерній колбі. Альтернативно анти-СІ ОМб-антитіла можна отримати в біореакторі на основі діалізу. За потреби супернатанти можна профільтрувати, концентрувати перед проведенням афінної хроматографії з протеїн-Сс-сефарозою або протеїн-А-сефарозою. Чистоту елюйованого дб можна проконтролювати за допомогою гель-електрофорезу (« високоефективної рідинної хроматографії. Буферний розчин можна поміняти на РВБ5, а концентрацію можна визначити при 00280 з використанням коефіцієнта екстинції 1,43.
Моноклональні антитіла можна розділити на аліквоти і зберігати при -80 "С.
Для того, щоб визначити, чи зв'язуються відібрані анти-СІ ОМб-моноклональні антитіла з єдиним епітопом, може бути застосований сайт-направлений або мульти-сайт-направлений мутагенез.
Встановлення ізотипу
Для встановлення ізотипу очищених антитіл проводили аналіз ЕЇІ5БА з різними комерційними наборами (наприклад, 2утей, Коспе Оіадпобвіїсв5). Комірки титраційних мікропланшетів покривають антимишиним ід. Після блокування проводили реакцію з моноклональними антитілами або очищеними ізотипними контролями за кімнатної температури протягом двох годин. Потім проводили реакцію або з мишачим Ідсі, Ід2а, Іде26Б або Іде, ІДдА або із специфічним мишачим Ідм, кон'югованим з пероксидазою. Після промивання планшети обробляють АВТ5 субстратом (1 міліграм/мл) і досліджують при 00 405-650. Альтернативно, можна використовувати набір для ізотипування Ізобігір Моизе Мопосіопаї! Апіїбоду Ізоїуріпд Кії (Косне, Саї. Мо. 1493027), як описано виробником.
Проточний цитометричний аналіз
Для того, щоб продемонструвати наявність анти-СІ ОМб антитіл в сироватці імунізованих мишей або зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, які експресують СІ ОМб, можна використовувати проточну цитометрію. Лінії клітин, які експресують СОМ в нормі або після трансфекції, і негативні контролі, які втратили експресію СГ ОМ (вирощені за стандартних умов), змішують з різними концентраціями моноклональних антитіл в супернатантах від гібридоми або в РВ5, що містить 195 ЕВ5, та інкубують при 4 "С протягом 30 хв. Після промивання мічені АРС або АїЇехаб47 анти-ІдСб антитіла можуть зв'язуватися з СІ ЮМб- связанними моноклональними антитілами за таких же умов, як умови для фарбування первинних антитіл. Зразки можна проаналізувати за допомогою проточної цитометрії на приладі
ЕАС5, використовуючи параметри прямого і бічного розсіювання світла, щоб пропускати окремі живі клітини. Для того, щоб відрізнити СІ ОМб-специфічні моноклональні антитіла від неспецифічних зв'язуючих речовин в одному вимірюванні, можна використовувати метод ко- трансфекції. Клітини тимчасово трансфіковані плазмідами, які кодують СІОМ6б і флуоресцентним маркером, можна пофарбувати, як описано вище. Трансфіковані клітини можна встановити в іншому діапазоні флуоресценції, ніж антитіло-зафарбовані клітини.
Оскільки більшість трансфікованих клітин експресують обидва трансгени, СІ ОМб-специфічні моноклональні антитіла зв'язуються переважно з клітинами, які експресують флуоресцентний маркер, тоді як неспецифічні антитіла зв'язуються в співрозмірному співвідношенні з нетрансфікованими клітинами. Можна застосовувати альтернативний метод аналізу з використанням флуоресцентної мікроскопії на додачу до або замість проточної цитометрії.
Клітини можна пофарбувати так, як описано вище, і досліджувати за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
Імунофлуоресцентна мікроскопія
Для того, щоб продемонструвати наявність анти-СІ ОМб-антитіл в сироватці імунізованих мишей або зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, які експресують СІ ОМб, можна використовувати імунофлуоресцентну мікроскопію. Наприклад, клітинні лінії, які експресують СГОМбЄ або спонтанно або після трансфекції, і негативні контролі, які втратили експресію СГОМб6, вирощують на предметних скельцях за стандартних умов вирощування в 60 середовищі ОМЕМ/Е12 з додаванням 10 95 ембріональної телячої сироватки (ЕС5), 2 мМ 1-
глутаміну, 100 мкг/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину. Потім клітини фіксують метанолом або параформальдегідом або залишають необробленими. Потім проводять реакцію клітин з моноклональними антитілами до СІ ОМб протягом 30 хвилин при 25 "С. Після промивання проводять реакцію клітин з міченими Аіїеха555 антимишачими дб вторинними антитілами (МоІесшаг Ргобез) за тих же самих умов. Після цього можна досліджувати клітини за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
Загальні рівні СІОМЄ в клітинах можна спостерігати, коли клітини зафіксовані метанолом або зафіксовані параформальдегідом і пермеабілізовані Тритоном Х-100. В живих клітинах і непермеабілізованих, фіксованих параформальдегідом клітинах можна досліджувати поверхневу локалізацію СІ ОМб. Крім того, націлювання СІ ОМб на щільні контакти можна вивчати за допомогою спільного фарбування з маркерами щільних контактів, наприклад 20О-1.
Більше того, можна вивчати результати зв'язування антитіл і локалізацію СІ ОМЄб в клітинній мембрані.
Вестерн-блотінг
Анти-СІГОМ6 дО можна додатково протестувати на реакційну здатність з СІ ОМб-антигеном за допомогою Вестерн-блотінга. Коротко, можна приготувати клітинні екстракти клітин, які експресують СІОМб, і відповідні негативні контролі і провести електрофорез в поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфата натрію (505). Після електрофорезу відокремлені антигени переносять на мембрани нітроцелюлози, блокують і досліджують за допомогою тестованих моноклональних антитіл. Ідс-зв'язування можна визначити за допомогою антимишачого дос міченого пероксидазою і виявити за допомогою ЕСІ -субстрату.
Імуногістохімія
Анти-СГОМб мишачі (Я можна додатково протестувати на реакційну здатність з СІ ОМб- антигеном за допомогою імуногістохімічного аналізу добре відомим фахівцеві в даній галузі способом, наприклад з використанням кріозрізів, фіксованих параформальдегідом або ацетоном, або фіксованих параформальдегідом парафінових зрізів зразків неракових тканин або ракових тканин, узятих у пацієнта під час звичайних хірургічних процедур, або у мишей з ксенотрансплантатів пухлин, інокульованих за допомогою ліній клітин, які експресують СІ ОМб спонтанно або після трансфекції. Для імунофарбування антитіла, які реагують з СІ ОМб, можуть бути проінкубовані, а потім кон'юговані з міченими пероксидазою хріну козячими антимишачими або козячими антикроликовими антитілами (БАКОС) згідно з інструкціями продавця.
Активність антитіл іп міїго, пов'язана з фагоцитозом і здатністю знищувати клітини
На додачу до специфічності зв'язування з СІ ОМб, анти-СІ ОМб-антитіла можна перевірити щодо їх спроможності опосередковувати фагоцитоз і знищення клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІГОМб з клітинною поверхнею. Перевірка активності моноклональних антитіл іп мйго забезпечує первинний скринінг до тестування на моделях іп мімо.
Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АЮОСС):
Коротко, поліморфоядерні клітини (РММ), МК-клітини, моноцити, мононуклеарні клітини або інші ефекторні клітини від здорових донорів можна очистити центрифугуванням в градієнті щільності фікол-гіпака, з подальшим руйнуванням забруднюючих еритроцитів. Промиті ефекторні клітини суспендують в КРМІ з додаванням 1095 інактивованої нагріванням ембріональної телячої сироватки або альтернативно з 5 95 інактивованої нагріванням людської сироватки і змішують з 5'Сі-міченими клітинами-мішенями, які експресують СІОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею, в різних співвідношеннях ефекторних клітин до клітин-мішеней. Альтернативно, клітини-мішені можна помітити лігандом, який підсилює флуоресценцію (ВАТРА). Високо флуоресцентний хелат європію з підсилюючим лігандом, який вивільняється з мертвих клітин, можна визначити за допомогою флуориметра. У іншому альтернативному способі може використовуватися трансфекція клітин-мішеней люциферазою. При цьому доданий люцифер жовтий може окислюватися тільки живими клітинами. Потім можна додати очищені анти-СІ ОМб дос в різних концентраціях. Як негативний контроль можна використовувати нерелевантний людський дб. Дослідження проводиться протягом від 4 до 20 годин при 37 "С залежно від типу використовуваних ефекторних клітин.
Цитоліз в зразках можна оцінити шляхом вимірювання вивільнення 2'Сг або наявність хелату
ЕШТОА в культуральному супернатанті. Альтернативно, можна виміряти люмінесценцію живих клітин, що є результатом окислення люцифера жовтого.
Також можна перевірити різні комбінації анти-СІОМб-моноклональних антитіл, щоб визначити чи посилюється цитоліз при дії складів моноклональних антитіл.
Комплементзалежна цитотоксичність (СОС):
Моноклональні анти-СІ ОМб-антитіла можна перевірити щодо їх здатності опосередковувати
СОС за допомогою ряду відомих методів. Наприклад, сироватку для отримання комплементу можна отримати з крові відомим фахівцям способом. Для визначення СОсС-активності моноклональних антитіл можна використовувати різні методи. Наприклад, можна визначити вивільнення ?/Сг або можна оцінити підвищену проникність мембран за допомогою методу виключення пропідіум йодидом (РІ). Коротко, цільові клітини промивають 5 х 105/мл і інкубують з різними концентраціями тМАБ протягом 10-30 хвилин за кімнатної температури або при 37 "С.
Потім додають сироватку або плазму до остаточної концентрації 20 95 (00./06.) і клітини інкубують при 37 "С протягом 20-30 хвилин. До всіх клітин кожного зразка додають розчин РІ в пробірку для ЕАСоЗ-аналізу. Після цього суміш негайно аналізують за допомогою проточної цитометрії, використовуючи ЕАСсЗ-набір.
У альтернативному способі дослідження індукцію СОС можна встановити на прикріплених клітинах. У одному варіанті здійснення цього методу аналізу клітини висівають за 24 години до дослідження з щільністю З3х10"/комірку в плоскодонні титраційні мікропланшети для культур тканин. Наступного дня культуральне середовище видаляють і клітини інкубують з антитілами (три повтори). Контрольні клітини інкубують в культуральному середовищі або культуральному середовищі, яке містить 0,2 95 сапоніну для визначення фонового лізису і максимального лізису, відповідно. Після інкубації протягом 20 хвилин за кімнатної температури супернатант видаляють і додають до клітин 2095 (06б./06б.) людської плазми або сироватки в ОМЕМ (заздалегідь нагрітої до 37 "С) і інкубують протягом наступних 20 хвилин при 37 "С. До клітин додають розчин пропідій йодиду (10 мкг/мл). Потім супернатанти замінюють РВ5, що містить 2,5 мкг/мл етидіум броміду і вимірюють випускання флуоресценції після збудження при 520 нм при 600 нм за допомогою Тесап Заїййге. Відсоток специфічного лізису обчислюють як вказано далі:
Фо специфічного лізису - (флуоресценція зразка - фонова флуоресценція)/ (флуоресценція за максимального лізису- фонова флуоресценція) х 100.
Інгібування клітинної проліферації моноклональними антитілами:
Наприклад, щоб перевірити здатність моноклональних анти-СіОМб-антитіл ініціювати апоптоз, їх інкубують з пухлинними клітинами, позитивними за СІОМб, або СІ ОМб- трансфікованими пухлинними клітинами при 37 "С протягом приблизно 20 годин. Клітини збирають, промивають в анексин-М зв'язуючому буфері (ВО бБіозсіеєпсе5), та інкубують з анексином М, сполученим з РІТС або АРС (ВО Біозсіепсез5) протягом 15 хвилин в темноті. До всіх клітин кожного зразка додають розчин РІ (10 мкг/мл в РВ5) в пробірку для ЕАСсС5-аналізу і відразу оцінюють за допомогою проточної цитометрії (як описано вище). Альтернативно, загальне інгібування клітинної проліферації моноклональними антитілами можна визначити за допомогою комерційно доступних наборів. За допомогою набору для визначення клітинної проліферації ОЕГРІА (РегКіп-ЕІтег, Саї. Мо. АБО200) можна провести неізотопний імуноаналіз в мікропланшетах, заснований на вимірюванні включення 5-бром-2'-дезоксиуридіну (ВКОМ) під час синтезу ДНК проліферуючими клітинами. Включені ВКОШ визначають за допомогою мічених європієм моноклональних антитіл. Щоб зробити можливим виявлення антитіл, клітини фіксують і проводять денатурацію ДНК, використовуючи Ріх (фіксуючий) розчин. Незв'язані антитіла змивають і додають в розчин індуктор ОЕЇРІА, щоб відокремити іони європію від мічених антитіл, де вони утворюють високо флуоресцентні хелати з компонентами індуктора ОБЕЇ РІА.
Флуоресценція, виміряна в кожній комірці за допомогою флуориметрії з часовим розрізненням є пропорційною до синтезу ДНК в клітині.
Доклінічні дослідження
Моноклональні антитіла, які зв'язуються з СІ ОМ, також можуть бути перевірені на моделі іп мімо (наприклад, на імунодефіцитних мишах з ксенотрансплантатом пухлин, інокульованих клітинними лініями, які експресують СІ ОМб, можливо після трансфекції) для встановлення їх ефективності при контролі зростання клітин пухлин, які експресують СІ ОМб.
Дослідження антитіл запропонованих даним винаходом іп мімо можна провести після ксенотрансплантації пухлинних клітин, які експресують СІ ОМбЄ, імунодефіцитним мишам або іншим тваринам. Щоб визначити дію антитіл на запобігання утворенню пухлин або симптомів, пов'язаних з пухлиною, антитіла можна ввести мишам, вільним від пухлини, з подальшою ін'єкцією пухлинних клітин. Щоб встановити терапевтичну ефективність відповідних антитіл відносно зменшення росту пухлин або симптомів, пов'язаних з пухлиною, антитіла можна ввести мишам - носіям пухлин. Застосування антитіл можна комбінувати із застосуванням інших речовин, таких як цитостатичні засоби, інгібітори чинників зростання, блокатори клітинного циклу, інгібітори ангіогенезу або іншими антитілами, щоб визначити синергійну 60 ефективність і потенційну токсичність комбінацій. Щоб проаналізувати токсичні побічні явища,
опосередковані антитілами запропонованими винаходом, тварині можна інокулювати антитіла або контрольні реагенти і ретельно вивчити симптоми, можливо пов'язані з терапією антитілами до СІ ОМб. Зокрема, можливі побічні явища від застосування іп мімо СІ ОМб-антитіл включають токсичний вплив на тканини, які експресують СІ ОМб, включаючи плаценту. Антитіла, які розпізнають СІ ОМ6Є у людини і у інших видів, наприклад мишей, є, зокрема, придатними для прогнозу можливих побічних явищ, опосередкованих застосуванням моноклональних СІ ОМб- антитіл, у людей.
Картування епітопів
Картування епітопів, які розпізнаються антитілами запропонованими винаходом, можна провести, як детально описано в "Еріоре Марріпу Ргоїосої!в" (Меїпоаз іп МоїІесшіаг Віоіоду) бу
Сіепп Е. Моїтіз ІЗВІМ-089603-375-9 і в "Еріоре Марріпо: А Ргасіїса! Арргоасі" Ргасіїса! Арргоасін зЗегіез, 248 Бу Оїмуп М. В. М/езімоса), Егапк с. Нау.
Ї. Біспецифічні/мультиспецифічні молекули, які зв'язуються з СІ ОМб
У іншому варіанті здійснення винаходу антитіла до С ОМЄ можуть утворювати похідне або можуть з'єднуватися з іншою функціональною молекулою, наприклад, іншим пептидом або білком (наприклад, Бабі фрагментом), щоб утворити біспецифічну або мультиспецифічну молекулу, яка зв'язується з різними сайтами зв'язування або цільовими епітопами. Наприклад, антитіло, запропоноване винаходом, може бути функціонально зв'язане (наприклад, шляхом хімічного зв'язку, генетичного об'єднання (злиття), нековалентного зв'язку або іншим чином) з однією або більше іншими зв'язуючими молекулами, такими як інше антитіло, пептид або зв'язуючий міметик.
Відповідно, даний винахід включає біспецифічні і мультиспецифічні молекули, які містять щонайменше одну першу специфічність зв'язування для СІіОМб і другу специфічність зв'язування для другого цільового епітопу. У окремому варіанті здійснення винаходу другий цільовий епітоп є Ес-рецептором, наприклад людським Ес-гаммакКі (СО64) або людським Ес- альфа-рецептором (СО89) або Т-клітинним рецептором, наприклад СОЗ3. Отже, винахід включає біспецифічні і мультиспецифічні молекули, здатні зв'язуватися з ефекторними клітинами, які експресують Ес-гаммакК, Ес-альфак або Ес-епсилонК (наприклад, моноцитами, макрофагами або поліморфоядерними клітинами (РММ)) і з клітинами-мішенями, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею. Ці біспецифічні і мультиспецифічні молекули можуть націлювати ефекторні клітини на клітини, які експресують
СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, і можуть ініціювати активність ефекторних клітин, опосередковану Ес-рецептором, наприклад, фагоцитоз клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею, антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС), вивільнення цитокінів або продукування супероксид-аніону.
Біспецифічні і мультиспецифічні молекули винаходу можуть додатково включати третю специфічність зв'язування, на додачу до анти-Ес-специфічності зв'язування і анти-СЇ ОМб6- специфічності зв'язування. У одному варіанті здійснення третя специфічність зв'язування є частиною антистимулюючого чинника (ЕЕ), наприклад молекулою, яка зв'язується з поверхнею білка, задіяного в цитотоксичній активності і таким чином збільшує імунну відповідь проти клітини-мішені. "Частина антистимулюючого чинника" може бути антитілом, функціональним фрагментом антитіла або лігандом, який зв'язується з даною молекулою, наприклад антиген або рецептор, і таким чином призводить до посилення ефекту зв'язування детермінант для Ес- рецептора або антигену клітини-мішені. "Частина антистимулюючого чинника" може зв'язувати
Ес-рецептор або антиген клітини-мішені. Альтернативно, частина антистимулюючого чинника може зв'язуватися з частинкою (епійу), яка відрізняється від частинки, з якою зв'язуються перша і друга специфічності зв'язування. Наприклад, частина антистимулюючого чинника може зв'язуватися з цитотоксичною Т-клітиною (наприклад, через СО2, СОЮЗ, 208, 2028, С04, С040,
ІСАМ-1 або іншою імунною клітиною, що призводить до підвищення імунної відповіді проти клітини-мішені).
У одному варіанті здійснення біспецифічні і мультиспецифічні молекули винаходу містять як специфічність зв'язування щонайменше одне антитіло, включаючи, наприклад, Раб, Раб,
К(авб)2, Рм або один ланцюг Ему. Антитіло також може бути димером легкого ланцюга або важкого ланцюга, або будь-яким мінімальним його фрагментом, таким як Ем або одноланцюговий конструкт, як описано в і адпег єї аіІ., 05 4,946,778. Антитіло також може бути доменом зв'язування химерного білка імуноглобуліну, як розкрито в Ш5 2003/0118592 і 05 2003/0133939.
У одному варіанті здійснення біспецифічні і мультиспецифічні молекули винаходу містять специфічність зв'язування для Ес-гаммакК або Ес-альфакК, присутніх на поверхні ефекторної клітини, і другу специфічність зв'язування для антигену клітини-мішені, наприклад СІ ОМб.
У одному варіанті здійснення специфічність зв'язування для Ес-рецептора забезпечується моноклональним антитілом, зв'язування якого не блокується людським імуноглобуліном С (ІДС).
Термін "Ідс рецептор", як він використовується в описі, належить до будь-якого з восьми генів гамма-ланцюга, розташованих на хромосомі 1. Ці гени кодують всі дванадцять трансмембранних або розчинних ізоформ рецептора, які розділені на три класи Ес-гамма- рецепторів: Ес-гаммакі! (СО64), Ес-гаммакі! (СО032) і Ес-гаммакі (СО16). У одному з кращих варіантів здійснення Ес-гамма-рецептор є людським високоафінним Ес-гаммакі.
У інших кращих варіантах здійснення специфічність зв'язування для РЕс-рецептора забезпечується антитілом, яке зв'язується з людським ІдА-рецептором, наприклад Ес-альфа- рецептором (Ес-альфак! (СО89)) зв'язування якого бажано не блокується людським імуноглобуліном А (ІдА). Термін "ІдА-рецептор" включає генний продукт одного альфа-гена (Ес- альфакі), розташованого на хромосомі 19. Відомо, що цей ген кодує декілька альтернативних трансмембранних сплайс-ізоформ від 55 до 110 Каа. Ес-альфак! (СО89) конститутивно експресується на моноцитах/макрофагах, еозинофільних і нейтрофільних гранулоцитах, але не експресується на популяціях неефекторних клітин. Ес-альфакі має середню афінність і до ІДАЇ до ІдА2, яка збільшується після дії цитокінів, таких як 5-С5ЗЕ або 5М-С5Е (Мопоп, Н. б. еї аї. (1996) СтйісаІ ВНеміемує іп Іттипоіоду 16: 423-440). Було описано чотири Ес-альфакі- специфічних моноклональні антитіла, які були названі АЗ, АБУ, Аб2 і А77, які зв'язують
Ес-альфак!і зовні ІдА ліганд-зв'язуючого домену (Мопіевїго, К. С. еї аїІ. (1992) 9.Іттипої. 148: 1764).
У іншому варіанті здійснення біспецифічна молекула складається з двох моноклональних антитіл згідно з винаходом, які мають комплементарні функціональні активності, наприклад одне антитіло бажано індукує СОС, а інше антитіло бажано індукує апоптоз.
Термін "антитіло, специфічне до ефекторної клітини", як він використовується в описі, належить до антитіла або функціонального фрагмента антитіла, який зв'язується з
Ес-рецептором ефекторних клітин. Кращі антитіла для застосування у винаході зв'язуються з
Ес-рецептором ефекторних клітин в сайті, який не зв'язується ендогенним імуноглобуліном.
Термін "ефекторна клітина", як він використовується в описі, належить до імунної клітини, яка залучається у ефекторну фазу імунної відповіді, на відміну від фази розпізнавання і фази активації імунної відповіді. Приклади імунних клітин включають клітини мієлоїдного і лімфоїдного походження, наприклад лімфоцити (наприклад, В-клітини і Т-клітини, включаючи цитолітичні Т-клітини (СТІ), клітини-кілери, клітини природні (натуральні) кілери, макрофаги, моноцити, еозинофіли, нейтрофіли, поліморфоядерні клітини, мастоцити і базофіли. Деякі ефекторні клітини експресують специфічні Ес-рецептори і виконують специфічні імунні функції.
У кращих варіантах здійснення ефекторна клітина здатна індукувати антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АЮСС), наприклад нейтрофіл, здатний індукувати АОСС. Наприклад, моноцити, макрофаги, які експресують ЕСЕ, беруть участь в специфічному знищенні клітин- мішеней і презентуванні антигенів іншим компонентам імунної системи або зв'язуються з клітинами, які презентують антигени. У інших варіантах здійснення ефекторна клітина може фагоцитувати антиген-мішень, клітину-мішень або мікроорганізм. Експресія конкретного ЕСК на ефекторній клітині може регулюватися гуморальними чинниками, такими як цитокіни.
Наприклад, було виявлено, що експресія Ес-гаммакКі регулюється з підвищенням інтерфероном гамма (ІЕМ-у). Ця посилена експресія збільшує цитотоксичну активність Ес-гаммакКіІ-несучих клітин проти мішеней. Ефекторна клітина може фагоцитувати або лізувати антиген-мішень або клітину-мішень. "Клітина-мішень" позначає будь-яку небажану клітину у суб'єкта (наприклад, людини або тварини), на яку може націлюватися антитіло, запропоноване винаходом. У кращих варіантах здійснення клітина-мішень є клітиною, яка експресує або яка гіперекспресує СГОМб і яка характеризується зв'язуванням СІ ОМ з клітинною поверхнею. Клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, як правило, включають пухлинні клітини.
ЇЇ. Імунокон'югати
У іншому аспекті даний винахід визначає властивість анти-СІ ОМб-антитіла, кон'югованого з терапевтичною частинкою або засобом, таким як цитотоксин, лікарський засіб (наприклад, імуносупресор) або радіоїзотоп. Такі кон'югати називаються в описі "імунокон'югати".
Імунокон'югати, які включають один або більше цитотоксинів, називаються "імунотоксини". 60 Цитотоксин або цитотоксичний засіб є будь-яким засобом, який має негативний вплив на клітини, зокрема, убиває клітини. Приклади включають таксол, цитохалазин В, граміцидин О, етидіум бромід, еметин, мітоміцин, етопозид, теніпозид, вінкристін, вінбластін, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксиантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин ОЮ, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол, пуроміцин та їх аналоги або гомологи.
Відповідні терапевтичні засоби для утворення імунокон'югатів винаходу включають, але не обмежуються цим, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, б-меркаптопурин, б-тіогуанін, цитарабін, флударабін, 5-фторурацил, декарбазин), алкілюючі засоби (наприклад, хлорметин, тіотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (В5МО) і ломустин (ССМО), циклофосфамід, бусулфан, дибромманітол, стрептозотоцин, мітоміцин С і цис-дихлордіамінплатина (ІІ) (ОР) цисплатин), антрациклінові антибіотики (наприклад, даунорубіцин (раніше дауноміцин) і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (раніше актиноміцин), блеоміцин, мітраміцин і антраміцин (АМС), і антимітотичні засоби (наприклад, вінкристін і вінбластин).
У кращому варіанті здійснення терапевтичний засіб є цитотоксичним засобом або радіотоксичним засобом. У іншому варіанті здійснення терапевтичний засіб є імуносупресором.
У іншому варіанті здійснення терапевтичний засіб є ЗМ-С5Е (гранулоцитарно-макрофагальним колонієсєтимулюючим чинником). У кращому варіанті здійснення терапевтичний засіб є доксорубіцином, цисплатіном, блеоміцином, сульфатом (зиїаїє), кармустіном, хлорамбуцилом, циклофосфамідом або рициною А.
Антитіла, запропоновані даним винаходом, також можна з'єднати з радіоізотопом, наприклад, йодом-131, ітрієм-90 або індієм-111, щоб отримати цитотоксичні радіофармацевтичні кошти для лікування порушення, пов'язаного з СІ ОМб, такого як рак.
Кон'югати антитіл запропонованих даним винаходом можна використовувати для того, щоб модифікувати дану біологічну відповідь, при цьому лікарська частинка не повинна розглядатися як така, що обмежує класичні хімічні терапевтичні лікарські засоби. Наприклад, лікарська частинка може бути білком або поліпептидом, який проявляє бажану біологічну активність.
Такий білок може включати, наприклад, ферментативний активний токсин, або його активний фрагмент, такий як абрин, рицину А, екзотоксин синегнійної палички або дифтерійний токсин; білок, такий як чинник некрозу пухлини або інтерферон-у; або модифікатори біологічної відповіді такі як, наприклад, лімфокіни, інтерлейкін-1 ("1-1"), інтерлейкін-2 ("І -2"), інтерлейкін-б (7-67, гранулоцитарно-моноцитарний колонієстимулюючий чинник (ОМ-С5Е), гранулоцитарний колонієстимулюючий чинник ("5-С5Е") або інші чинники росту.
Методи кон'югування (з'єднання) такої терапевтичної частинки з антитілом добре відомі, див., наприклад, Агпоп еї аїЇ, "Мопосіопа! Апіїбодіез5 Рог Іттипоїагдейпуд ОЇ Огид5 Іп Сапсег
ТНегару", іп Мопосіопа! Апіїбодієз апа Сапсег ТПегару, Веївтеїйа еї аї. (еадв.), рр. 243-56 (АІап В.
І ів55, Іпс. 1985); НеїЇвігот еї аї., "Апіїбодіез Бог ЮОгиа Оеїїмегу", ій СопітоПїейа Огид Оеїїмегу (2па
Еа.), Вобіпзоп еї аї. (едв5.), рр. 623-53 (Магсе! ОеккКег, Іпс. 1987); ТПпогре "Апіїрбоду Саїтієтв. ОЇ
Суїоохіс Адепів Іп Сапсег Тнегару: А Вемієм", іп Мопосіопа! Апіїбодієвз "84: Віоіодіса! апа Сіїпісаї
Арріїсайопв, РіпсНегаві аї. (едв.), рр. 475-506 (1985); "Апаїузів, Незиїїв5, апа Ешиге Ргозресіїме ОЇ
Те ТПегарешіс Озе ОГ Вадіоїабеївєд Апіїрбоду Іп Сапсег ТНегару", іп Мопосіопа! Апіїбодієв. Рог
Сапсег Оеїесіїоп апа Тнегару, ВаЇдміп еї аї. (едв5.), рр. 303-16 (Асадетіс Ргез5 1985) і Тногре еї аІ., "Те Ргерагайїоп апа Сушюїюхіс Ргорепіє5з ОЇ Апіїроду-Тохіп Сопідаїев", Іттипої. Нем., 62: 119-58 (1982).
У додатковому варіанті здійснення антитіла, запропоновані винаходом, приєднується до лінкера-хелатора, наприклад тіуксетану, який дозволяє антитілу кон'югувати з радіоізотопом.
І. Фармацевтичні композиції
У іншому аспекті даний винахід пропонує композицію, наприклад фармацевтичну композицію, яка містить одне або комбінацію антитіл даного винаходу. Фармацевтичні композиції можуть бути уведені в склад з фармацевтично прийнятними носіями або розчинниками, а також будь-якими іншими добре відомими ад'ювантами (допоміжними засобами) і ексципієнтами відповідно до звичайних методів, розкритих в Кетіпдіоп: Те 5сіепсе і Ргасіїсе ої Рпагтасу, 19 Еайіоп, Сеппаго, Ед., Маск Рибіїзпіпд Со., Еазіоп, РА, 1995. У одному варіанті здійснення композиції включають комбінацію декількох (наприклад, двох або більше) ізольованих антитіл, запропонованих даним винаходом, які діють за допомогою різних механізмів дії, наприклад одне антитіло, яке бажано діє, викликаючи СОС, в комбінації з іншим антитілом, яке бажано діє, викликаючи апоптоз.
Крім того, фармацевтичні композиції винаходу можуть вводитися при комбінованій терапії, тобто, у поєднанні з іншими засобами. Наприклад, комбінована терапія може включати композицію даного винаходу щонайменше з одним протизапальним засобом або щонайменше з 60 одним імуносупресорним засобом. У одному варіанті здійснення такі терапевтичні засоби включають одне або більше протизапальних засобів, таких як стероїдний лікарський засіб або
М5ЗАЇЮ (нестероїдний протизапальний лікарський засіб). Кращі засоби включають, наприклад, аспірин і інші саліцилати, інгібітори Сох-2, такі як рофекоксиб (віокс) і целекоксиб (целебрекс),
М5АЇІЮО, такі як ібупрофен (мотрин, адвіл), фенопрофен (налфон), напроксен (напросин), суліндак (клінорил), диклофенак (волтарен), піроксикам (фелден), кетопрофен (орудис), дифлунізал (долобід), набуметон (релафен), етодолак (лодин), оксапрозин (дейпро) та індометацин (індоцин).
У іншому варіанті здійснення такі терапевтичні засоби включають засоби, які призводять до виснаження або функціональної інактивації регуляторних Т-клітин, такі як циклофосфамід в низькій дозі, анти-СТІ А4 антитіла, анти-І/ 2 або анти-ІЇ 2-рецепторні антитіла.
У іншому варіанті здійснення такі терапевтичні засоби включають однин або більше засобів хіміотерапії, таких як похідні таксолу, таксотер, гемцитабін, 5-фторурацил, доксорубіцин (адриаміцин), цисплатин (платінол), циклофосфамід (цитоксан, процитокс, неосар). У іншому варіанті здійснення антитіла запропоновані даним винаходом можуть вводитися в комбінації із засобами хіміотерапії що бажано демонструють терапевтичну ефективність у пацієнтів, які страждають на рак, наприклад описаний тут тип раку.
У іншому варіанті здійснення антитіла, запропоновані винаходом, можуть вводитися у поєднанні з радіотерапією і/або аутологічною периферійною стволовою клітиною або трансплантацією кісткового мозку.
Термін "фармацевтично прийнятний носій", як він використовується в описі, включає всі і будь-які розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, ізотонічні засоби і засоби, які затримують всмоктування, і тому подібне, які є фізіологічно сумісними. Бажано носій є придатним /- для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спінального або епідермального введення (наприклад, за допомогою ін'єкції або вливання). Залежно від способу введення активна сполука, наприклад, антитіло, біспецифічна і мультиспецифічна молекула, може бути покрита речовиною, яка захищає сполуку від дії кислот та інших природних умов, які можуть інактивувати сполуку. "Фармацевтично прийнятна сіль" належить до солі, яка зберігає бажану біологічну активність початкової сполуки і яка не має якого-небудь небажаного токсичного впливу (див. наприклад, Вегде, 5. М., еї а. (1977) 9. Рпагт. Зсі. 66: 1-19).
Приклади таких солей включають солі приєднання кислоти і солі приєднання основи. Солі приєднання кислоти включають солі, отримані з нетоксичних неорганічних кислот, таких як соляна кислота, азотна кислота, фосфорна, сірчана, бромисто-воднева кислота, йодистоводнева кислота, фосфориста і тому подібні, а також з нетоксичних органічних кислот, таких як аліфатичні моно- і дикарбонові кислоти, фенілзаміщені алканові кислоти, гідроксіалканові кислоти, ароматичні кислоти, аліфатичні і ароматичні сульфонові кислоти і тому подібні. Солі приєднання основи включають солі отримані з лужноземельних металів, таких як натрій, калій, магній, кальцій тощо, а також з нетоксичних органічних амінів, таких як М,
М'-дибензилетилендіамін, М-метилгюкамін, хлорпрокаїн, холін, діетаноламін, етилендіамін, прокаїн тощо.
Композиція даного винаходу може бути введена за допомогою цілого ряду способів, відомих в даній галузі техніки. Фахівцеві в даній області зрозуміло, що шлях і/або спосіб введення варіюватиме залежно від бажаних результатів. Активні сполуки можна приготувати разом з носіями, які захищатимуть сполуки від швидкого вивільнення, наприклад, у вигляді композицій з контрольованим вивільненням, включаючи імплантати, трансдермальні пластирі і мікроїнкапсульовані системи доставки. Можна використовувати біодеградовані, біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколієва кислота, колаген, поліортоефіри і полімолочна кислота. Як правило, способи приготування таких композицій відомі фахівцям в даній галузі техніки. Див., наприклад, Зивіаіпей і Сопігоїей КеїЇєазе Огид
Оеїїмегу Зузієтв, у. АВ. Нобріпзоп, єйд., Магсеї! Оеккег", Іпс., Мему МоїК, 1978.
Для введення сполуки, запропонованої винаходом певними способами, може бути потрібним покрити сполуки речовиною, або спільно ввести сполуку з речовиною, яка запобігає її інактивації. Наприклад, сполуки можна ввести суб'єктові у відповідному носієві, наприклад ліпосомах, або розчиннику. Фармацевтично прийнятні розчинники включають сольові і водні буферні розчини. Ліпосоми включають СОС емульсії вода-в-олії-у-воді, а також звичайні ліпосоми (5іге)ап еї аї. (1984) 9. Меигоїттипої. 7: 27).
Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для екстемпорального приготування стерильних розчинів для ін'єктції, або дисперсій. бо Використання таких середовищ і компонентів для фармацевтично активних речовин відоме в даній галузі техніки. За винятком випадків, коли будь-яке звичайне середовище або засіб є несумісним з активною сполукою, розглядається їх використання у фармацевтичних композиціях винаходу. Крім того, до композиції можуть бути включені додаткові активні сполуки.
Як правило, терапевтичні композиції повинні бути стерильними і стійкими за умов виробництва і зберігання. Композиції можуть бути складені у вигляді розчину, мікроемульсії, ліпосоми або іншої упорядкованої структури, придатної для високої концентрації лікарського засобу. Носій може бути розчинником або дисперсійним середовищем, яке містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь і тому подібне) та їх відповідні суміші. Належну текучість можна зберегти, наприклад, використовуючи покриття, таке як лецитин, зберігаючи бажаний розмір часточок у випадку дисперсії і використовуючи поверхнево-активні речовини. У багатьох випадках бажаним є включення до композиції ізотонічних засобів, таких як цукор, поліспирти, такі як манітол, сорбітол або хлорид натрію. Тривале всмоктування композицій для ін'єкцій, може досягатися включенням до композиції засобу, який затримує всмоктування, наприклад моностеарату і желатину.
Стерильні розчини для ін'єкції можна приготувати шляхом введення у відповідний розчинник активної сполуки у необхідній кількості з одним або комбінацією інгредієнтів, перерахованих вище, як буде потрібно, з подальшою стерилізацією мікрофільтрацією.
Як правило, дисперсії готують шляхом введення активної сполуки в стерильний носій, який містить основне дисперсійне середовище і інші необхідні інгредієнти, з числа перерахованих вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних розчинів для ін'єкції, кращими способами приготування є вакуумне висушування і висушування (ліофілізація) сублімацією, які дають порошок активного інгредієнта плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з його заздалегідь стерильно-профільтрованого розчину.
Режими дозування підбирають так, щоб забезпечити оптимальну бажану відповідь (наприклад, терапевтичну відповідь). Наприклад, може бути введена єдина доза, може бути введено декілька окремих доз протягом деякого часу або дозування може бути пропорційно зменшене або збільшене, як диктує гостра необхідність терапевтичної ситуації. Особливо вигідно розробляти парентеральні композиції в стандартній лікарській формі для простоти введення і одноманітності дозування. Стандартна лікарська форма при використанні тут належить до фізично дискретних одиниць, придатних як одиничні дозування для суб'єктів, яким потрібне лікування; кожна одиниця містить заздалегідь визначену кількість активної сполуки, підраховану так, щоб отримати бажаний терапевтичний ефект, у поєднанні з необхідним фармацевтичним носієм.
Приклади фармацевтично прийнятних антиоксидантів включають: (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, цистеїн гідрохлорид, бісульфат натрію, натрію метабісульфіт, сульфіт натрію і тому подібне; (2) жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутильований гідроксіанізол (ВНА), бутильований гідрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол і тому подібне; і (3) металеві хелатуючі агенти, такі як лимонна кислота, етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕОТА), сорбітол, винна кислота, фосфорна кислота тощо.
Композиції, запропоновані даним винаходом, включають терапевтичні композиції, придатні для орального, назального, місцевого (включаючи щокове і під'язикове), ректального, вагінального і/або парентерального введення. Композиції можуть бути зручно представлені в стандартній лікарській формі і можуть бути приготовані будь-якими відомими в області фармацевтики способами. Кількість активного інгредієнта, яку необхідно об'єднати з носієм для отримання стандартної лікарської форми, варіюватиме залежно від суб'єкта, якого необхідно лікувати, і конкретного способу введення. Кількість активного інгредієнта, яку необхідно об'єднати з носієм для отримання стандартної лікарської форми, в більшості випадків буде такою кількістю композиції, яка дає терапевтичний ефект.
Композиції, запропоновані даним винаходом, придатні для вагінального застосування, також включають вагінальні супозиторії, тампони, креми, гелі, пасти, піни або спреї, які містять придатні носії, відомі в даній галузі техніки. Лікарські форми для місцевого або трансдермального введення композицій даного винаходу включають порошки, спреї, мазі, пасти, креми, лосьйони, гелі, розчини, пластирі і засоби для інгаляції. Активна сполука може бути змішаною в стерильних умовах з фармацевтично прийнятним носієм і з будь-якими консервантами, буферами або пропелентами, які можуть бути потрібними.
Фрази "парентеральне введення" і "введений парентерально", як вони використовується в описі, означають відмінні від ентерального і місцевого введення способи введення, зазвичай за допомогою ін'єкції і включають, без обмеження, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, бо внутрішньоартеріальну, підоболонкову, внутрішньокапсульну, внутрішньоочноямкову,
внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, внутрішньоочеревинну, транстрахеальну, підшкірну, внутрішньошкірну, внутрішньосуставну, підкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспінальну, епідуральну і внутрішньогрудинну ін'єкцію і вливання.
Приклади відповідних водних і неводних носіїв, які можуть застосовуватися у фармацевтичних композиціях винаходу, включають воду, етанол, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь тощо) та їх відповідні суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, і складні органічні ефіри для ін'єкції, такі як етилолеат. Належну текучість можна зберегти, наприклад, використовуючи покриття, таке як лецитин, зберігаючи бажаний розмір часточок у випадку дисперсії і використовуючи поверхнево-активні речовини.
Ці композиції також можуть містити ад'юванти, такі як консерванти, зволожуючі засоби, емульгуючі речовини і диспергуючі речовини. Запобігання присутності мікроорганізмів можна забезпечити методами стерилізації а також включенням різних антибактеріальних і протигрибкових засобів, наприклад, парабену, хлорбутанолу, фенолсорбінової кислоти і тому подібного. Також може бути бажаним включення до композиції ізотонічних засобів, таких як цукру, хлориду натрію тощо. Крім того, тривале всмоктування фармацевтичної форми, яка ін'єктується, може досягатися включенням засобів, які затримують всмоктування, таких як алюміній моностеарат і желатин.
Незалежно від вибраного способу введення сполуки даного винаходу, яка може використовуватися у придатній формі гідрату, і/або фармацевтичні композиції, запропоновані даним винаходом, входять до складу фармацевтично прийнятних лікарських форм за допомогою звичайних методів, відомих фахівцям в даній галузі техніки.
Фактичні рівні дозувань активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях даного винаходу можуть варіювати так, щоб отримати кількість активного інгредієнта, яка є ефективною для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для окремого пацієнта, композиції і способу введення, але не є токсичними для пацієнта. Вибраний рівень дозування залежатиме від цілого ряду фармакокінетичних чинників, включаючи активність окремих застосованих композицій даного винаходу, спосіб введення, час введення, швидкість виведення конкретної використаної сполуки, тривалість лікування, інші лікарські засоби, сполуки і/або речовини, які використовуються в комбінації з конкретними застосованими сполуками, вік, стать, вагу, стан, загальний стан здоров'я і попередню історію хвороби пацієнта, якого необхідно лікувати, і подібних чинників, добре відомих в медицині.
Лікар або ветеринар, який є фахівцем в даній галузі, може легко визначити і призначити потрібну ефективну кількість фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар або ветеринар може почати призначати дозування сполук винаходу, які вживаються у фармацевтичній композиції, з рівнів нижчих, ніж необхідні для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово збільшувати дозування до досягнення бажаного результату. Загалом, придатна щоденна доза композиції винаходу буде такою кількістю сполуки, яка є найнижчим дозуванням, ефективним для отримання терапевтичного ефекту. Як правило, така ефективна доза залежатиме від чинників, описаних вище. Бажано, щоб введення було внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, внутрішньоочеревинним або підшкірним введенням, бажано введенням, розташованим проксимально відносно місцеположення мішені. За потреби ефективна щоденна доза терапевтичної композиції може бути введена у вигляді двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести або більше ссубдоз, введених окремо з відповідними інтервалами впродовж всього дня, необов'язково в стандартних лікарських формах. Не дивлячись на те, що можливе введення сполуки даного винаходу окремо, бажаним є введення сполуки у вигляді фармацевтичної композиції.
У одному варіанті здійснення антитіла, запропоновані винаходом, можуть бути введені за допомогою вливання (інфузії), бажано повільного неперервного вливання протягом тривалого періоду, наприклад більше 24 годин, для того, щоб зменшити токсичні побічні дії. Введення також може здійснюватися шляхом неперервного вливання протягом періоду від 2 до 24 годин, наприклад від 2 до 12 годин. Такий режим може повторюватися один або більше разів, за потреби, наприклад через 6 місяців або 12 місяців. Дозування можна визначити і відрегулювати, вимірюючи кількості циркулюючих моноклональних анти-СІОМб-антитіл після введення в біологічному зразку, використовуючи антиідіотипові антитіла, націлені на анти-СІ ОМб-антитіла.
У іншому варіанті здійснення антитіла вводяться як підтримуюча терапія, наприклад один раз на тиждень протягом періоду з 6 місяців або більше.
У іншому варіанті здійснення антитіла згідно з винаходом можуть вводитися за допомогою режиму, який передбачає одне вливання антитіл проти СІ ОМб, а потім вливання антитіл проти
СІГОМб, кон'югованого з радіоїзотопом. Цей режим можна повторити, наприклад, через 7-9 днів.
У одному варіанті здійснення винаходу терапевтичні сполуки винаходу введені в ліпосоми.
У кращому варіанті здійснення ліпосоми включають націлюючий фрагмент (частку).
У найкращому варіанті здійснення терапевтичні сполуки в ліпосомах доставляються шляхом болюсного вливання в місце, розташоване проксимально відносно бажаної області, наприклад місцеположення пухлини. Композиція може бути текучою до такого ступеня, щоб легко вводитися за допомогою шприца. Композиція повинна бути стійкою в умовах виробництва і зберігання і повинна бути захищена від забруднюючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії і гриби.
У додатковому варіанті здійснення антитіла, запропоновані винаходом, можуть бути розроблені так, щоб запобігти або зменшити їх транспорт крізь плаценту. Це можна зробити за допомогою відомих в даній галузі техніки методів, наприклад, шляхом пегілювання антитіла або шляхом використання К(аб) 2" фрагментів. Як додаткові посилання можна згадати "Сиппіпдапат-
Випаієз С, 2йцо 2, СНИ В, Кеепап у. (1992) ВіоїІодіса! асіїмйіез ої роїуеїНуіІепе-діусо іттиподіориййп сопідаїев. Кезівіапсе (0 епгутаїйс дедгадайоп.» .. Іттипої. Меїподв, 152: 177- 190; їі о "Гапдог М. (1995) Маїгегпаї!-ТеїтаІ! іапеїег ої іттиподіобийй5, Апп. АПегду Азтта
Ітітипої.» 74: 279-283. "Терапевтично ефективну дозу" для лікування пухлин можна оцінити (визначити) за реальною відповіддю пухлини, при цьому відповідь може бути повною або частковою. Повна відповідь (СК) визначається як відсутність клінічного, радіологічного або іншого наочного підтвердження хвороби. Часткова відповідь (РК) - це зменшення загального розміру пухлини більше, ніж на 50 95. Середній час прогресу є мірою, яка характеризує тривалість об'єктивної відповіді пухлини. "Терапевтично ефективну дозу" для лікування пухлин можна також оцінити за її можливістю стабілізувати прогрес хвороби. Здатність сполуки інгібувати (припиняти) рак можна оцінити за допомогою тваринної моделі, яка прогнозує ефективність на пухлинах людини. Альтернативно, цю властивість композиції можна оцінити, вивчивши можливість сполуки інгібувати ріст клітин або (викликати) апоптоз за допомогою методів дослідження іп міго, відомих кваліфікованим практикам. Терапевтично ефективна кількість терапевтичної сполуки може зменшити розмір пухлини або іншим чином поліпшити симптоми у суб'єкта. Фахівець в даній галузі буде здатний визначити такі кількості, виходячи з таких чинників, як розмір суб'єкта, тяжкість симптомів у суб'єкта і вибраної конкретної композиції або способу введення.
Композиція повинна бути стерильною і текучою до такого ступеня, щоб її можна було ввести за допомогою шприца. Окрім води, носій може бути ізотонічним, забуференним сольовим розчином, етанолом, поліолом (наприклад, гліцерином, пропіленгліколем і рідким поліетиленгліколем тощо) та їх відповідними сумішами. Належну текучість можна зберегти, наприклад, використовуючи покриття, такі як лецитин, зберігаючи бажаний розмір частинок у випадку дисперсії і використовуючи поверхнево-активні речовини. У багатьох випадках бажаним є включення до композиції ізотонічних засобів, таких як, цукри, поліспирти, такі як манітол, сорбітол або хлорид натрію. Тривале всмоктування композицій, для цій може досягатися включенням до композиції засобу, який затримує всмоктування, наприклад, алюмінію моностеарата і желатину.
Коли активна сполука відповідним чином захищена, як описано вище, сполуку можна вводити перорально, наприклад, з інертним розчинником або засвоєним їстівним носієм.
ЇМ. Застосування і способи винаходу
Антитіла (включаючи імунокон'югати, біспецифічні/умультиспецифічні молекули, композиції та інші похідні, описані тут) даного винаходу мають численні можливості терапевтичного застосування, які стосуються лікування порушень, які торкаються клітин, які експресують СІ ОМб6 і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею. Наприклад, антитіла можуть бути введені в клітини в культурі, наприклад іп міїго або ех мімо, або суб'єктові-людині, наприклад іп мімо, з метою лікування або запобігання цілому ряду порушень, таких як описані тут. Переважно суб'єкти включають пацієнтів-людей, які мають порушення, які можна скоректувати або поліпшити, знищивши уражені хворобою клітини, зокрема, клітини, які характеризуються зміненою експресією СІ ОМб і/або зміненим зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею в порівнянні з нормальними клітинами.
Наприклад, в одному варіанті здійснення антитіла, запропоновані даним винаходом, можна використовувати для лікування суб'єкта з онкогенним порушенням, наприклад порушенням, яке характеризується наявністю пухлинних клітин, які експресують СГ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СОМ з клітинною поверхнею. Приклади онкогенних хвороб, які можна лікувати і/або запобігти, включають всі види раку, які експресують СІ ОМб, і пухлинні форми, включаючи, 60 описані тут.
Фармацевтичні композиції і способи лікування, описані згідно з винаходом, також можуть використовуватися для імунізації або вакцинації з метою запобігти хворобі, описаній тут.
У інших варіантах здійснення антитіла, запропоновані винаходом, можуть використовуватися для встановлення рівнів СГОМЄ або конкретних форм СІГОМб, або рівнів клітин, які містять СІ ОМ6 на поверхні мембран, причому потім рівні можна пов'язати з певними хворобами або симптомами хвороб, таких як описані вище. Альтернативно, антитіла можна використовувати для виснаження або впливу на функціонування клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, показуючи тим самим, що ці клітини є важливими посередниками хвороби. Це може досягатися шляхом контакту зразка і контрольного зразка з анти-СІ ОМб-антитілом за умов, які допускають утворення комплексу між антитілом і СГ ОМб. Будь-які утворені антитілом і СІ ОМбЄ комплекси виявляють і порівнюють в зразку і в контрольному зразку, тобто еталонному зразку.
На початку антитіла запропоновані винаходом можна протестувати щодо їх активності зв'язування, співвіднесеної з терапевтичним або діагностичним застосуванням іп міїго.
Наприклад, антитіла можна протестувати за допомогою проточної цитометрії, як описано тут.
Антитіла, запропоновані винаходом, можна використовувати для виявлення іп мімо або іп міго однієї або більше з-поміж наступних біологічних активностей: інгібувати зростання і/або диференціювання клітин, які експресують СІ ОМ6б і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМ з клітинною поверхнею; знищувати клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею; опосередкувати фагоцитоз або АОСС клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею, у присутності ефекторних клітин; опосередкувати СОС клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, у присутності комплементу; опосередкувати апоптоз клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням
СІ ОМ з клітинною поверхнею; індукувати гомотипічну адгезію і/або викликати переміщення в ліпідні "плоти" після зв'язування СІ ОМб.
У окремому варіанті здійснення антитіла використовуються іп мімо або іп міго для того, щоб лікувати, запобігати або діагностувати ряд хвороб, пов'язаних з СГОМб. Приклади хвороб, пов'язаних з СІ ОМб, включають, серед інших типи раку, такі як описані тут.
Як описано вище, анти-СІ ЮОМб-антитіла, запропоновані винаходом, можуть бути введені спільно з одним або більше іншими терапевтичними засобами, наприклад цитотоксичним засобом, радіотоксичним засобом, антиангіогенним засобом або і імуносупресорним засобом, щоб зменшити індукцію імунних відповідей проти антитіл запропонованих даним винаходом.
Антитіло може бути пов'язаним із засобом (як імунокомплекс) або може вводитися окремо від засобу. У останньому випадку (окреме введення) антитіло може бути введене до, після або одночасно із засобом або може бути введено спільно з іншими відомими методами лікування, наприклад, протираковою терапією, наприклад, опромінюванням. Такі терапевтичні засоби включають, серед інших, антинеопластичні засоби, як перераховані вище. Спільне введення анти-СІ ОМб-антитіл даного винаходу із засобами хіміотерапії надає два протиракові засоби, які діють за допомогою різних механізмів, які цитотоксично впливають на пухлинні клітини. Таке спільне введення може вирішити проблеми, пов'язані з розвитком резистентності до лікарських засобів або зміною антигенності пухлинних клітин, коли вони не вступають в реакцію з антитілом.
Композиції (наприклад, антитіла, мультиспецифічні і біспецифічні молекули і імунокон'югати) винаходу, які мають сайти зв'язування комплементу, такі як частини ІдсІ-2 або -3 або ІДМ, які зв'язують комплемент, також можуть використовуватися у присутності комплементу. У одному варіанті здійснення обробка ех мімо популяції клітин, що містять клітини-мішені, зв'язуючим засобом винаходу і відповідних ефекторних клітин може доповнюватися додаванням комплементу або сироватки, яка містить комплемент. Фагоцитоз клітин-мішеней, покритих зв'язуючим агентом винаходу, може бути покращено зв'язуванням білків комплементу. У іншому варіанті здійснення клітини-мішені, покриті композиціями винаходу, також можуть бути лізовані комплементом. У ще одному варіанті здійснення композиції винаходу не активують комплемент.
Крім того, композиції винаходу також можуть бути введені разом з комплементом.
Відповідно, в рамках винаходу знаходяться композиції, які містять антитіла, мультиспецифічні або біспецифічні молекули і сироватку або комплемент. Ці композиції вигідні тим, що комплемент розташовується в безпосередній близькості до антитіл, мультиспецифічних або біспецифічних молекул.
Альтернативно, антитіла, мультиспецифічні або біспецифічні молекули винаходу і комплемент або сироватка можуть бути введені окремо. Зв'язування композицій даного 60 винаходу з клітинами-мішенями може викликати переміщення комплексу СІ ОМб-антиген-
антитіло в ліпідні "плоти" клітинної мембрани. Таке переміщення створює високу щільність комплексів антиген-антитіло, що може ефективно активувати або підсилити СОС.
Крім того, в рамках даного винаходу знаходяться набори, які містять композиції антитіл, запропонованих даним винаходом (наприклад, антитіла і імунокон'югати) та інструкції щодо їх застосування. Набір може додатково містити один або більше додаткових реагентів, таких як імуносупресорний засіб, цитотоксичний засіб або радіотоксичний засіб, або одне або більше додаткових антитіл запропонованих даним винаходом (наприклад, антитіло, яке має комплементарну активність).
Відповідно, пацієнтам, яких лікують композиціями антитіл запропонованих даним винаходом, додатково може вводитися (до, одночасно або після введення антитіла запропонованого винаходом) інший терапевтичний засіб, такий як цитотоксичний або радіотоксичний засіб, який підсилює або підвищує терапевтичний ефект антитіл запропонованих даним винаходом.
У інших варіантах здійснення суб'єкта можна додатково лікувати модулюючими засобами, наприклад, які підсилюють або інгібують, експресію і активність Ес-гамма або Ес-альфа- рецепторів, наприклад, лікувати суб'єкта цитокінами. Кращі цитокіни включають гранулоцитарний колонієсєтимулюючий чинник (05-С5Е), гранулоцитарно-макрофагальний колонієсєтимулюючий чинник (5М-СЗЕ), інтерферон-у (ІЕМ-у) і чинник некрозу пухлин (ТМЕ).
Іншими важливими засобами для підвищення терапевтичної ефективності антитіл і фармацевтичних композицій, описаних тут, є Д-глюкани, гомополісахариди розгалужених залишків глюкози, які продукуються цілим рядом рослин і мікроорганізмів, наприклад бактеріями, водоростями, грибами, дріжджами і хлібними злаками. Також можуть використовуватися фрагменти р-глюканів, які продукуються організмами. Бажано р-глюкан є полімером В(1,3) глюкози, в якому щонайменше деякі з глюкозних одиниць скелету, наприклад 3-6 95 глюкозних залишків скелету, мають гілки, такі як В-(1,6) відгалуження.
У окремому варіанті здійснення винахід пропонує способи виявлення наявності СІ ОМб- антигену в зразку, або вимірювання кількості СІ ОМб-антигена, які передбачають контакт зразка і контрольного зразка з антитілом, яке специфічно зв'язується з СІ ОМб, за умов, що допускають утворення комплексу між антитілом або його частиною і СІ ОМб. Потім визначається утворення комплексу, при цьому відмінність між утворенням комплексу в зразку в порівнянні з контрольним зразком служить ознакою наявності СІ ЮОМб-антигена в зразку.
У іншому варіанті здійснення винахід пропонує спосіб визначення наявності або визначення кількості клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМ з клітинною поверхнею іп мімо або іп мйго. Спосіб передбачає (ї) введення суб'єктові композиції винаходу, сполученої з виявленим маркером, і (ії) проведення виявлення у суб'єкта вказаного виявленого маркера за допомогою засобів виявлення, щоб встановити області, які містять клітини, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею.
Описані вище способи є придатними, зокрема, для діагностування хвороб, пов'язаних з СІ ОМб, ілабо локалізації хвороб, пов'язаних з СІ ОМбЄ, таких як ракові хвороби. Збільшена кількість
СОМ в зразку, вища, ніж кількість СГОМЄ в контрольному зразку, служить ознакою наявності хвороби, пов'язаної з СІ ОМб, у суб'єкта, зокрема людини, від якої отриманий даний зразок.
При використанні в описаних вище способах описане тут антитіло може бути надане з міткою, яка функціонує, щоб: (ї) надати виявлений сигнал; (ії) взаємодіяти з іншою міткою, щоб модифікувати виявлений сигнал, який надається першою або другою міткою, наприклад, ЕКЕТ (флуоресцентне резонансне перенесення енергії); (ії) впливати на рухливість, наприклад, електрофоретичну рухливість, за допомогою заряду, гідрофобності, форми або інших фізичних параметрів, або (ім) забезпечити захоплення частинки, наприклад, афінність (спорідненість), антитіло/лантиген або іонне комплексоутворення. Придатними мітками є такі структури, як флуоресцентні мітки, люмінесцентні мітки, хромофорні мітки, радіоізотопні мітки, ізотопні мітки, бажано стабільні ізотопні мітки, ізобарні мітки, ферментні мітки, мітки у вигляді часточок, зокрема металічних часточок, магнітних часточок, полімерних часточок, невеликі органічні молекули, такі як біотин, ліганди рецепторів або зв'язуючі молекули, такі як білки клітинної адгезії або лектини, мічені послідовності, які містять нуклеїновокислотні і/або амінокислотні залишки, які можна виявити, використовуючи зв'язуючі агенти тощо. Мітки включають, без обмеження, сульфат барію, йоцетамову кислоту, іопаноєву кислоту, іподат кальцію, натрію диатризоат, меглумін диатризоат, метризамід, натрію тиропаноат і радіодіагностичні, включаючи випромінювачі позитронів, такі як фтор-18 і вуглець-11, гамма-випромінювачі, такі як йод-123, технецій-99т, йод-131 ії індій-111, нукліди для ядерного магнітного резонансу, такі як фтор і гадоліній.
У іншому варіанті здійснення імунокон'югати винаходу можуть використовуватися для націлювання сполук (наприклад, терапевтичних засобів, міток, цитотоксинів, радіотоксинів, імуносупресорів тощо) на клітини, які мають СІОМб, сполучений з поверхнею, шляхом зв'язування таких сполук з антитілом. Таким чином, винахід також пропонує способи локалізації ех мімо або іп міїго клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, наприклад, циркулюючих пухлинних клітин.
Даний винахід додатково проїілюстрований за допомогою наступних прикладів, які не слід тлумачити як такі, що обмежують рамки винаходу.
Приклади
Використані тут процедури і методи описуються і здійснюються власне відомим способом і як описано, наприклад, в ЗатьгоокК еї аї!., МоіІесшаг Сіопіпа: А І арбогаїютгу Мапиаї, 2па Еайіоп (1989) Соїй 5ргіпд Нагрог І арогаїогу Ргез5, Соїй 5ргіпд Нагрог, М.У. Всі методи, включаючи використання наборів і реагентів, здійснюються відповідно до інструкцій виробника, якщо спеціально не вказане інше.
Приклад 1. Кількісне визначення експресії СІ ОМб в нормальних тканинах, ракових тканинах і лініях клітин за допомогою ПЛР із зворотною транскрипцією в масштабі реального часу (ВТ-
ПЛР)
Загальну клітинну РНК екстрагували із заморожених зразків тканини і ліній ракових клітин за допомогою набору КМеазу Міпі Кії (Оіадеп), гібридизували (ргітеа м/йй) атТ'в олігонуклеотидом і піддавали реакції зворотної транскрипції з Биреїгзсгірі І (СІВСОЛ/Л їегесі) відповідно до рекомендацій виробника. Цілісність отриманої кДНК перевіряли шляхом ампліфікації транскриптів роЗ3 протягом 30 циклів ПЛР. Після нормування по НРКТ кількісно визначили експресію СІ ОМ за допомогою обчислення 55СТ.
Був протестований кожен нормальний тип тканини від трьох індивідуумів. У нормальних тканинах можна було виявити тільки кількості слідів транскриптів СІ ОМб після проведення 40 циклів КТ-ПЛР. Єдиною нормальною тканиною, яка трохи перевершує мінімальну експресію, була плацента.
На відміну від нормальних тканин, висока експресія СІ ОМб була виявлена в зразках карциноми яєчника (аденокарциноми), раку легенів (М5СІ С, з найвищою частотою і рівнями експресії в аденокарциномі), раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри (базальноклітинна карцинома і плоскоклітинна карцинома), злоякісної меланоми, раку голови і шиї (злоякісна плеоморфна аденома), саркоми (синовіальна саркома і карциносаркома), раку жовчних проток, нирковоклітинного раку (світлоклітинна карцинома і папілярна карцинома), раку матки і ракових клітинних ліній А2780 (карцинома яєчника), МІН-ОМСАКЗ (карцинома яєчника), НСТ-116 (рак товстого кишечника), ЕБО-27 (карцинома яєчника), СРСО-М (5010), МСІ-НЬБ2 (МЗС С), 5МО-1 (рак шлунка), КАТОП (рак шлунка), ХАРС (рак підшлункової залози), ДОЗ (рак шлунка), РО9У7 (рак шлунка), МКМ7 (рак шлунка).
Приклад 2. Кількісне визначення експресії СІ ОМб в нормальних тканинах, тканинах раку і лініях клітин за допомогою Вестерн-блотінга
Для Вестерн-блотінга використовували 20 мкг загального білка, виділеного з клітин, лізованих за допомогою лізуючого буфера Лемлі. Екстракти розводили в відновлюючому буфері для зразка (Коїй), проводили 505-РАСЕ і потім переносили електроблотінгом на РМОБ- мембрану (РаїЇ). Імунофарбування проводили з використанням поліклональних антитіл до
СІ ОМ (АКР) і бета-актину (Арсат) з подальшим виявленням первинних антитіл за допомогою кон'югованих з пероксидазою хріну козячих антимишачих і козячих антикролячих вторинних антитіл (Оако).
Був протестований лізат кожної нормальної тканини від п'яти індивідуумів. Експресія білка
СІОМб не була виявлена ні в одній з досліджених нормальних тканин. На відміну від нормальних тканин, висока експресія білка СІ ОМб була виявлена в зразках карциноми яєчника і раку легені. Експресія СІ ОМбЄ була виявлена в МІН-НОУСАВЗ (карцинома яєчника), МКМ7 (рак шлунка), АО5 (рак шлунка), СРО-М (5СІ С), НСТ-116 (рак товстої кишки), РЕШУ7 (рак шлунка),
МЕС8 (ембріональна карцинома яєчка), УЗАК (плацентарна хоріокарцинома), УЗЕСЗ (плацентарна хоріокарцинома), ВЕМ/О (плацентарна хоріокарцинома) і РА-1 (тератокарцинома яєчника).
Приклад 3. Імуногістохімічний (ІНС) аналіз експресії СІ ОМ6 в нормальних тканинах і ракових тканинах
Зрізи тканин (4 мкм), залитих в парафін, інкубували протягом 1 години при 58 С на платформі з підігрівом (НІ 1220, І еіса). Парафін видаляли із зрізів, інкубуючи зрізи в Коїсієаг (Коїй) протягом 2х10 хвилин за кімнатної температури. Потім зрізи регідрували в наборі спиртів 60 із ступінчастою концентрацією (99 95, 2 х 96 95, 80 95 ії 70 906, 5 хвилин в кожному). Вилучення антигену здійснювали кип'ятінням мікроскопічних препаратів (слайдів) при 12070 (15 рві) протягом 15 хвилин в 10 мМ цитратному буфері (рН 6,0) - 0,05 95 Твін-20. Відразу після кип'ятіння препарати інкубували в РВ5 протягом 5 хвилин. Активність ендогенної пероксидази блокували 0,3 95 пероксидом водню в МЕОН протягом 15 хвилин за кімнатної температури. Щоб уникнути неспецифічного зв'язування, препарати блокували 10 95 козячою сироваткою в РВ5 протягом 30 хвилин за кімнатної температури. Після цього, препарати інкубували з СІ ОМб- специфічними поліклональними антитілами (1 мкг/мл) (АКР) протягом ночі при 4 "С. Наступного дня препарати промили РВ5 за кімнатної температури (3 х 5 хвилин) і інкубували з 100 мкл вторинних антитіл (Роуегмізіоп полі НЕКР-анти-кролик дос, готові до використання (Іттипог одіс)) протягом 1 години за кімнатної температури. Після цього, препарати промили
РВ5 за кімнатної температури (3 х5 хвилин). Остаточне фарбування проводили, використовуючи набір МЕСТОК МОМАКЕЮО Бибвзігагє КИ 5К-4800 від Месіог ІаБвогаїюгіє5 (Вигіпдате). Зрізи дофарбовували гематоксиліном протягом 90 сек за кімнатної температури.
Після зневоднення в наборі спиртів із зростаючою концентрацією (70 95, 80 95, 2х96 95 і 99 95,
Ббхвилин в кожному), і 10 хвилинної інкубації в ксилолі препарати покривали за допомогою набору Х-іга Кії (Меайе Нізіоїеснпіс).
Експресія білка СІ ОМб не була виявлена в нормальних тканинах легені, яєчника, шлунка, товстої кишки, підшлункової залози, печінки, дванадцятипалої кишки або нирки. На відміну від нормальних тканин, сильне або щонайменше значне фарбування спостерігалося в зрізах уражених тканин, таких як тканини з карциномою яєчника, раком легені, раком шкіри, раком підшлункової залози, раком шлунка, раком молочної залози, раком сечового міхура (перехідно- клітинна карцинома), раком шийки матки, раком яєчка (семінома) і раком матки. Виразно акцентоване фарбування спостерігалося на плазматичних мембранах епітеліальних клітин злоякісної популяції, тоді як прилеглі стромальні і незлоякісні епітеліальні клітини не забарвлювалися. Ці результати демонструють, що білок СІОМб розташовується на плазматичній мембрані злоякісних клітин.
Приклад 4. Отримання мишачих антитіл до СІ 0ОМб а. Отримання векторів експресії, які кодують повнорозмірний СІ ОМб і фрагменти СІ ОМб6
Штучна кодон-оптимізована послідовність ДНК (ЗЕО ІЮО МО: 3), яка кодує повнорозмірний
СІ ОМ6 (МСВІ реєстраційний номер МР 067018.2, 5ЕО ІО МО: 2), була отримана за допомогою хімічного синтезу (ОЕМЕАКТ Ас, Німеччина) і клонована у вектор рсоОМАЗ.1/тус-Нів (Іпмігодеп,
США), утворивши вектор р3953. Вставка стоп-кодона давала можливість експресії білка СІ ОМб6 без з'єднання з вектором, який кодує тус-Нів їад. Експресію СГОМЄ перевірили за допомогою
Вестерн-блотінга, проточної цитометрії і імунофлуоресцентного аналізу з використанням комерційно доступних анти-СІ ОМб антитіл (АКР, 01-8865; НО бузівтв, МАВЗ656).
Крім того, була отримана кодон-оптимізована послідовність ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 4), яка кодує очікуваний позаклітинний фрагмент домену 2 (ЕС2) СГ ОМб (5ЕБО ІО МО: 6) при об'єднанні з
М-кінцевою Ід каппа лідерною послідовністю, отриманою від сигнального пептиду, а потім 4 додатковими амінокислотами, щоб забезпечити відповідну ділянку рестрикції сигнальною пептидази (ЗЕО ІО МО: 5), і клонована в рсрМАЗ.1/тус-Ніх вектор, утворюючи вектор р3974. До імунізації експресія фрагмента ЕС2 була підтверджена за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії на транзиєнтно трансфікованих і фіксованих параформальдегідом (РЕА) клітинах
СНО-КІ за допомогою комерційно доступних анти-птус антитіл (Сеї! ЗБідпаїїпо, МАВ 2276).
Б. Отримання клітинних ліній, які стабільно експресують СІ ОМб
Клітинні лінії НЕК293 і РЗ х 63ЗАдвиЦ.І, які стабільно експресують СІ ОМб, були отримані за допомогою стандартних методів з використанням вектора р3953. с. Імунізація.
Мишей Ваї?р/с імунізували 25 мкг плазмідною ДНК р3974 разом з 4 мкл РЕІ-манози (РЕІ-Мап; іп мімо-іеїРЕ! м-Мап від компанії РоїуРіиз ТгапеТесйоп) (150 мМ РЕЇІ-Мап в НО з 5 95 глюкози) шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції в 0, 16 і 36 днів. На 48 день і 62 день мишей імунізували шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції мієломними клітинами РЗ х б63Адви.І, трансфікованими вектором р3953 для стабільної експресії СІ ОМб. Клітини, введені на 62 день, до ін'єкції опромінювали 3000 радій. Наявність антитіл проти СГОМЄ в сироватці мишей контролювали за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії між днями 20 і 70, використовуючи СНО-К1 клітини, ко-трансфіковані нуклеїновими кислотами, які кодують СГОМ6б і СЕР. Для цього через 24 години після трансфекції РЕА-фіксовані або нефіксовані клітини інкубували з сироваткою від імунізованих мишей при розведенні 1:100 протягом 45 хвилин за кімнатної температури (КТ).
Клітини промивали, інкубували з міченими АіІеха555 антимишачими Ід антитілами (МоїЇІесшаг
Ргобез) і досліджували за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
У зразках сироватки, отриманої від миші, на основі якої була отримана гібридома Е3-6С3-
Н8, були виявлені анти-СІ ОМбЄ специфічні антитіла; див. фіг. 2.
Для отримання моноклональних антитіл мишей з виявленими анти-СГОМб імунними відповідями стимулювали за чотири дні до спленектомії за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції 2х107 клітин НЕК293, стабільно трансфікованих вектором р3953. а. Отримання гібридом, які продукують мишачі моноклональні антитіла до СІ ОМб
Спленоцити (б х 107), виділені з імунізованої миші, були сполучені з клітинами (3 х 107) мієломи мишей РЗ х 63ЗА98.653 (АТСС, СКІ 1580) за допомогою РЕС 1500 (Коспе, СК 10783641001). Клітини висівали приблизно 5 х 107 клітин на комірку в титраційні мікропланшети з плоским дном і культивували приблизно протягом двох тижнів в селективному середовищі
ЕРМІ, яке містить 1095 інактивованої нагріванням ембріональної телячої сироватки, 1 95 добавок для зростання клітин (пубгідота їТивіоп апа сіопіпд зирріетепО) (НЕС5, Коспе, СК. 11363735), 10 мМ НЕРЕ5, 1 мМ пірувату натрію, 4,5 95 глюкози, 0,1 мМ 2-меркаптоетанол, 1 х пеніцилін/стрептоміцин і 1 х НАТ добавки (Іпийгодеп, СКІ. 21060). Через 10-14 днів окремі комірки скринували за допомогою проточної цитометрії на анти-СІ 0ОМб моноклональні антитіла.
Секретуючі антитіла гібридоми були субклоновані методом серійних розведень і знову протестовані на анти-СОМб моноклональні антитіла. Стабільні субклони культивували в середовищі для культури тканини, щоб отримати невеликі кількості антитіл для характеристики.
Від кожної гібридоми був вибраний щонайменше один клон, який зберіг реакційну здатність материнських клітин (перевірену за допомогою проточної цитометрії). Для кожного клону були створені панелі з дев'яти ампул, які зберігали в рідкому азоті.
Приклад 5. Характеристики зв'язування супернатантів, отриманих від гібридом і моноклональних антитіл. а. Контроль якості тимчасово трансфікованих клітин НЕК293Т за допомогою (і) Вестерн- блотінга і (ії) проточної цитометрії () Клітини НЕК293Т були трансфіковані нуклеїновими кислотами, які кодують СІ ОМЗ3,
СІ ОМ4, СОМ, ії СГ ОМО, відповідно, або фіктивно-трансфіковані. Експресію СГ ОМ3, СІ ОМА,
СІГОМб або СІ ОМО в клітинах НЕК293Т визначали за допомогою Вестерн-блотінга. Для цього клітини збирали через 24 години після трансфекції і лізували. Лізат піддавали ДСН- електрофорезу (505-РАСЕ), переносили на мембрану нітроцелюлози і фарбували анти-СІ ОМЗ (А) (Іпмйгодеп, 34-1700), анти-СІ ОМА(А) (7утеа, 32-9400), анти-СОІ Мб(А) (АВР, 01-8865) або анти-СІ ОМУ(А) (Запіа Стги7, 5с-17672) антитілами, які специфічно зв'язувалися з С-кінцем відповідного клаудину за денатуруючих умов. Після інкубації з міченими пероксидазою вторинними антитілами і проявлення реагентом ЕСІ. використовували барвник ГА5З-3000 (Рції) для візуалізації. Смуги очікуваних молекулярних мас СІОМ3, СІГОМ4, СІОМб і СОМ, відповідно, спостерігалися тільки в трансфікованих клітинах, але не в контрольних клітинах (Фіг. 3), показуючи, що клітини НЕК293Т не експресують ендогенно який-небудь з досліджених клаудинів і, таким чином, є придатним інструментом для визначення перехресної реактивності
СІ ОМб-антитіл. (ї) Клітини НЕК293Т (ї) були додатково проаналізовані методом проточної цитометрії з використанням анти-СІ ОМ-антитіл, які розпізнають нативні епітопи (анти-СІ ОМЗ Ідб2а миші (К5О, МАВ4620), анти-СГОМ4 ІдбСг2га миші (КО, МАВ4219), анти-СГОМб Іде25 миші (КО,
МАВЗ656)). Антитіла, отримані від компанії Зідта під серійними номерами МУ9144 і М8894, служили контролями ізотипу. Специфічність цих анти-СІ ОМ-антитіл була проаналізована за допомогою клітин НЕК293ЗТ, тимчасово трансфікованих нуклеїновими кислотами, які кодують
СІОМ3, СІОМ4, СІОМб, і СІ ОМе, відповідно. Анти-СІ ОМб-антитіла проявляли перехресну реактивність щодо СІОМ3, СІОМ4 і СГ ОМ9. Анти-СІЇ ОМ4-антитіла проявляли перехресну реактивність щодо СГ ОМ3, СІ ОМб і СІ ОМ9. Анти-СІ ОМЗ-антитіла специфічно зв'язувалися з
СГОМІЗ (фіг. 4). р. Визначення специфічності моноклональних антитіл, отриманих відповідно до винаходу, за допомогою проточної цитометрії
Клітини НЕК293Т були ко-трансфіковані вектором, який кодує різні білки СІ ОМ, ії вектором, який кодує флуоресцентний маркер. Через 24 години після трансфекції клітини зібрали за допомогою 0,05 95 розчину трипсин/ЕДТА і промили буфером ЕАС5 (РВ5, що містить 2 95 ЕС5 і 0,1 95 азиду натрію). Клітини перенесли в титраційні мікропланшети з О-подібним дном в кількості 2 х 105 клітин на комірку і інкубували протягом 60 хвилин при 4 "С з супернатантами від гіоридоми. Після промивки буфером ЕРАС5 (три рази) клітини інкубували з кон'югованими з алофікоціаніном (АРС) антимиша Ідс Ін2дан2р-3 специфічними вторинними антитілами (Оіапома, 115-135-164). Після цього клітини двічі промили, а величину зв'язування оцінили 60 методом проточної цитометрії за допомогою ВО РАСс5АЇтау (Фіг. 5). Експресію флуоресцентного маркера наносили на вісь абсцис відносно зв'язування антитіл по осі ординат. Як позитивний контроль використовували комерційно доступні анти-С ОМб Ідб2Ь антитіла миші (КО,
МАВЗ656), а антитіла від компанії Зідта під серійним номером М8894 служили контролем ізотипу.
Антитіла в супернатантах від моноклональних субклонів гібридоми Е3-6С3-Н2, Е3-6С3-НВ,
Е3-6С3-НО, Е3-6С3-08 і Е3-6С3-04, всі отримані від гібридоми Е3-6С3, були специфічними до
СГОМб і не зв'язувалися з СІ ОМО, СІ ОМЗ ії СГОМа4. Наприклад, Фіг. 5А показує результати для моноклонального субклону гібридоми Е3-6С3-Н8З. Антитіла в супернатантах від моноклонального субклону гібридоми ЕЗ3-6С3-Н8 також зв'язувалися з клітинами, трансфікованими варіантом (1143М) -5МР СГ ОМб. Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е4-4Е7-Б2 зв'язувалися як з СГ ОМб, такі з СІ ОМО (Фіг. 5А). Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е3-783-84 зв'язувалися з СІ ОМб, СІ ОМ3 і СГОМО (Фіг. 58). Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми ЕЗ-З3Е7-А5 зв'язувалися з СІ ОМб, СІ ОМА і СІ ОМ (Фіг. 58).
Приклад 6: Отримання і тестування моноклональних антитіл до СІ ОМб а. Отримання вектора експресії, який кодує позаклітинний домен СІ ОМ
Кодон-оптимізована послідовність ДНК (ЗЕО ІЮО МО: 12), яка кодує очікуваний позаклітинний фрагмент домену 1 (ЕС1) СГ ОМб6 (ЗЕО ІЮО МО: 7), об'єднана з М-кінцевою Ід каппа лідерною послідовністю, отриманою від сигнального пептиду, а потім 4 додатковими амінокислотами, щоб забезпечити відповідну ділянку рестрикції сигнальної пептидази (5ЗЕО ІО МО: 13), була отримана і клонована в рсОМАЗ.1/тус-Ніз вектор, утворюючи вектор р3973. До імунізації експресія фрагмента ЕС1 була підтверджена за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії на тимчасово трансфікованих і фіксованих параформальдегідом (РЕА) клітинах СНО-КІ за допомогою комерційно доступних анти-тус антитіл (Сеї! Зідпаїпо, МАВ 2276). р. Імунізація
Мишей Ваїр/с імунізували 25 мкг плазмідною ДНК р3973 разом з 4 мкл РЕІ-манози (РЕІ-Мап; іп мімо-їеєРЕ! м-Мап від компанії РоїуРіиз Тгапе/Тесйоп) (150 мМ РЕЇІ-Мап в НгО з 5 95 глюкози) за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції на 0 їі 14 день. На 28 і 44 день мишей імунізували підшкірно КІСН-кон'югованими пептидами 5ЕО ІО МО: 14 ії 5ЕО ІО МО: 15 (100 мкг кожного в
РВ5, УРТ Рерііде ТесппоЇодіеєз СМВН, Німеччина) разом з очищеним за допомогою ВЕЖХ РТО-
Сро-оОрМ (25 мкг в РВ5; 5-ТССАТОАСОТТССТОАСОТТ; Еигоїп5 МУУС Орегоп, Німеччина). На 64, 77 і 97 день мишей імунізували за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції 2 х 107
РЗ х 6ЗАдви.І клітин мієломи, трансфікованих вектором р3953 для стабільної експресії СІ ОМб.
Перед введенням клітини були оброблені мітоміцином С (2,5 мкг/мл, бідта-Аїагісп, М4287). На 64 і 97 день клітини були введені разом з очищеним за допомогою ВЕЖХ РТО-Сра-оОМ (50 мкг в РВ5), а на 77 день разом з неповним ад'ювантом Фрейнда. Для продукування моноклональних антитіл, мишей з детектованою анти-СІ ОМбЄ імунною відповіддю стимулювали за чотири дні до спленектомії за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції 2 х 107 клітин
НЕК293, стабільно трансфікованих вектором р3953. с. Тестування моноклональних антитіл до СІ ОМб
Проточна цитометрія
Для тестування зв'язування моноклональних антитіл з СІ ОМб і його гомологами, клітини
НЕК293Т були тимчасово трансфіковані відповідною кодуючою клаудин плазмідою, при цьому експресію аналізували проточною цитометрією. Щоб розрізнити трансфіковані і нетрансфіковані клітини, клітини НЕК293Т були котрансфіковані флуоресцентним маркером як репортер. Через 24 години після трансфекції клітини збирали за допомогою 0,05 95 трипсин/ЕОТА, промивали буфером ЕГАС5 (РВ5, який містить 2 95 ЕС5 і 0,1 95 азиду натрію) і ресуспендували в ЕАС5- буфері в концентрації 2 х 109 клітин/мл. 100 мкл клітинної суспензії інкубували з відповідними антитілами у вказаних концентраціях протягом 30 хвилин при 4 "С. Антитіла, які проявляють перехресну реакційну здатність, використовували для детекції експресії СІ ОМб їі СІ ОМ.
Комерційно доступні мишачі антиклаудин антитіла анти-СІ ОМ3 (КО, МАВ4620) і анти-СІ ОМА (КО, МАВ4219) служили позитивним контролем, тоді як мишачі Їдс2а (Зідта, М9144) і ІДд62Б5 (Зідта, М8894), відповідно, служили контролем ізотипу. Клітини тричі промивали ЕАС5- буфером і інкубували з АРС-кон'югованими антимишачими дб Ін2ан2р-За специфічними вторинними антитілами (Оіапома, 115-135-164) протягом 30 хвилин при 4 "С. Клітини двічі промивали і ресуспендували в РЕАС5-буфері. Зв'язування аналізували за допомогою проточної цитометрії з використанням ВО БАС5АІтау. Експресію флуоресцентного маркера наносили на графік по осі абсцис відносно зв'язування антитіла по осі ординат. соро 5О0
Комплемент-залежну цитотоксичність (СОС) визначали шляхом вимірювання вмісту внутріклітинного АТФ в нелізованих клітинах після додавання людського комплементу до клітин- мішеней, які інкубуються з анти-СІ ОМб-антитілами. Для вимірювання АТФ використовували люмінесцентну реакцію люциферази, як дуже чутливий аналітичний метод.
Клітини СНО-КІ, стабільно трансфіковані СІ ОМб (СНО-К1-СІ ОМб), збирали за допомогою 0,05 95 трипсин/ЕЮОТА, двічі промивали середовищем Х-Мімо 15 (І0оп2а, ВЕО04-4189) і ресуспендували в концентрації 1 х 107 клітин/мл в середовищі Х-Мімо 15. 250 мкл клітинної суспензії переносили в 0,4 см кювету для електропорації і змішували з 7 мкг іп мйго транскрибованої РНК, яка кодує люциферазу (Іссітегазе ІМТ КМА). Проводили електропорацію клітин при 20088 ії 300 мкФ за допомогою Сепе Риїзег ХсеїЇ (Віо Кай). Після електропорації клітини ресуспендували в 2,4 мл теплого середовища Ю-МЕМ/Е12 (11) з сішаМах-ї (Іпмйгодеп, 31331-093), яке містить 1095 (об./06.) ЕС5, 1 95 (об./06.) пеніциліну/стрептоміцину і 1,5 міліграм/мл 5418. Висіювали 50 мкл клітинної суспензії на комірку в прозорий 96-комірковий РР- планшет і інкубували при 37 "С і 7,595 СО». Через 24 години після електропорації до клітин додавали 50 мкл моноклональних мишачих анти-СІ ЮОМб-антитіл в 60 95 КРМІ (що містить 20 мМ
НЕРЕФЗ) і 40 95 людської сироватки (суміш сироваток, отримана від шести здорових донорів) у певних концентраціях. 10 мкл 8 95 (06./06.) Тритону Х-100 в РВ5 на комірку додали до контролів загального лізису, тоді як до контролів максимуму життєздатних клітин і до поточних зразків додали 10 мл РВ5 на комірку. Після інкубації протягом 80 хвилин при 37 "С і 7,5 95 СО» додали 50 мкл люциферинової суміші (3,84 міліграм/мл ЮО-люциферину, 0,64 О/мл атфази і 160 мМ
НЕРЕ5 в аанго) на комірку. Планшет інкубували в темноті протягом 45 хв. за кімнатної температури. Люмінесценцію вимірювали за допомогою люминометра (Іпіїпіе М200, ТЕСАМ).
Результати дані у вигляді інтегрованих чисельних відносних світлових одиниць (КІ О).
Проводили електропорацію МЕС8 клітин при 2008 і 400 мкФ і культивували в КРМІ 1640 в середовищі БІ ОТАМАХ-Ї (Іпийгодеп, 61870), яке містить 10 95 (0б./06.) ЕС5.
Специфічний лізис обчислювали таким чином:
Специфічний лізис (90) - 100 - (зразок -- загальний лізис)/ (максимум життєздатних клітин -- загальний лізис) х 100) максимум життєздатних клітин: 10 мкл РВ5, без антитіл загальний лізис: 10 мкл 8 95 (0б./06.) Тритон Х-100 в РВ5, без антитіл
Раннє лікування
Для раннього лікування антитілами 2 х 107 МЕС8 клітин в 200 мкл РВ5 підшкірно інокулювали в бік безтімусних мишей Миде-Рохпі"». Кожна експериментальна група складалася з самок мишей 6-8 тижневого віку. Через три дні після інокуляції протягом 46 днів вводили 200 мкг очищених мишачих моноклональних антитіл тимМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А двічі на тиждень, почергово, за допомогою внутрішньовенних і внутрішньоочеревинних ін'єкцій.
Експериментальні групи, оброблені РВ5, служили негативним контролем. Об'єм пухлин (ТМ - (довжина х ширина?)/2) вимірювали двічі на тиждень. ТМ виражався в мм?, що давало можливість побудувати криві зростання пухлини залежно від часу. Коли пухлина досягала об'єму більше ніж 1500 мм?, мишей забивали. й. Результати
Мишачі моноклональні антитіла тимАВ 59А, боА, 610, 64А, 65А, 668В і 67А показали сильне зв'язування з людським СІ ОМб і СІ ОМ6 5МР (одиночний нуклеотидний поліморфізм) варіантом
І143М, але не спостерігалося зв'язування з СІ ОМ, 4 і 9 (Фіг. 6).
МиМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А показали дуже низькі значення ЕСвзо (ЕСво 200- 500 нг/мл), при цьому насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій (Фіг. 7).
МиМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А продемонстрували дозозалежну СОС -активність і викликали СОС за низьких концентрацій (Фіг. 8). Анти-СІ ОМб-антитіла тимАВ 65А і 668 викликали СОС на клітинах МЕС8 дозозалежним чином (Фіг. 9). Специфічність до мішені тиМАВ 65А і 668 поліпшувалася при використанні клітин МЕС8 І МТ52 54 (СІ ОМб нокаутні).
Крім того, тимМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 66В і 67А показали інгібування зростання пухлини у мишей з прищепленими клітинами МЕСЗ8 (Фіг. 10).
Приклад 7. Отримання і тестування химерних моноклональних антитіл до СІ ОМб а. Отримання мишиних/людських химерних моноклональних антитіл
Для химеризації варіабельну область мишачого важкого ланцюга і легкого ланцюга, включаючи лідерні послідовності, ампліфікували за допомогою ПЛР і праймерів, перерахованих в таблиці нижче. Мишачі важкі ланцюги об'єднували за допомогою сайту рестрикції АРАЇ (5-4а00000-3) з М-кінцевою частиною людського ланцюга Есгамма!, який кодується вектором експресії. Варіабельні домени мишачого каппа ланцюга, включаючи лідерні послідовності, 60 клонували попереду константної області з використанням сайту рестрикції В5ІММІ. Відповідну орієнтацію константної області у векторі, тобто відповідну для попереднього промотора вектора, підтвердили секвенуванням. Унаслідок положення сайту рестрикції АРАЇ, будь-яка ампліфікація варіабельної області, включаючи лідерну послідовність, з цією метою повинна включати перші 11 нуклеотидів послідовності людської гамма-1 константної області на додачу до послідовності сайту АРАЇ. Нуклеотидна послідовність людської константної області гамма- 1 важкого ланцюга числиться як 5ЕО ІЮО МО: 24, амінокислотна послідовність експресованої людської гамма-1 константної області числиться як 5ХЕО ІЮО МО: 25. Нуклеотидна послідовність, яка кодує константну частину каппа легкого ланцюга, числиться як 5ЕО ІЮО МО: 26, відповідна амінокислотна послідовність числиться як 5ХЕО ІЮО МО: 27.
Таблиця 1
Мишачі лінії клітин гібридоми, які використовувались для клонування антитіл 11111110 тимМАВ | 0 їзотип | ПраймебЗзЕОЮ МОї/:
Важкий ланцюг
Легкий ланцюг
Відповідно до мишачих аналогів химерні моноклональні антитіла називаються, наприклад, спітАВ 64А, тобто додається префікс "спіт".
Ампліфікація мишачих варіабельних областей легкого і важкого ланцюгів, включаючи лідерні послідовності, проводиться згідно методу "Зїер-ошї ПЛР" описаному в Маї? еї аї!. (Мисівїс
Асід5 Кезеагсі, 1999, Мої. 27, Мо. 6). Для цього отримують загальну РНК з моноклональних гіоридомних клітинних ліній (див. таблицю 1) стандартними способами, відомими фахівцям в даній галузі техніки, наприклад, з використанням набору КМеазу Міпі КИ (Оіадеп).
Одноланцюгову кКДНК отримують відповідно до методу "перемикання матриці (етріаге-5у/їсп)» також описаному в Маї? еї аї. (Мисієїс Асід5 Кезеагсі, 1999, Мої. 27, Мо. 6, 1558). На додачу до (ат) 30 олігомера (5ЕО ІО МО: 28), вона включала ДНК/РНК гібридний олігомер (ЗЕО ІО МО: 29), який служить 5" адаптором перемикання матриці під час полімеризації нитки кКДНК. У цьому адапторному олігомері останні три нуклеотиди були рибо- замість дезоксирибонуклеотидів.
Подальша "Сіер-оцші ПЛР" використовувала антисмисловий олігомер, націлений на константну область мишачого каппа ланцюга або на константну область підкласу 2а гамма ланцюга (ЗЕОІО МО: 30 ї 31, відповідно). Підклас ЇД мишачих моноклональних антитіл, продукованих лінією клітин гібридоми, був раніше імунологічно проаналізований за допомогою |Ізобігір (Коспе), і таким чином був вибраний відповідний антисмисловий олігомер (див. таблицю 1).
Суміш праймерів служила як смисловий олігомер в "їер-оції ПЛР", причому вона містила два
Зо олігомери, які відносяться до ЗЕО ІЮО МО: 32 і 33.
Встановлені мишачі варіабельні області, включаючи лідерні послідовності, потім були ампліфіковані за допомогою ПЛР, не включаючи 5' ТК і 3 мишачу константну область, з додаванням сайтів рестрикції до кінців, які давали можливість субклонування в отримані вектори експресії, які несуть людські константні області. Крім того, смислові олігомери, які забезпечили консенсусну послідовність Козак (5-ЯССОССАССО-3) і антисмислових олігомерів для варіабельних областей важкого ланцюга, включали перші 11 нуклеотидів людською гамма- 1 константної області на додачу до сайту рестрикції АРАЇ (див. таблицю 1, 5ЕО ІЮ МО5: 17 ї0 23). Варіабельні області каппа легкого ланцюга, включаючи лідерні послідовності, були клоновані за допомогою ферментів рестрикції НіпапіІ ї ВБІМІ, варіабельні області гамма важкого ланцюга вимагали Ніпаї! ї АРАЇ ферменти рестрикції.
Крім того, були ампліфіковані мишачі варіабельні області легкого і важкого ланцюгів, включаючи лідерні послідовності, і були отримані додаткові химерні моноклональні антитіла до
СОМ відповідно до протоколу, розкритого вище.
Б. Отримання химерних моноклональних анти-СІ ОМб-антитіл
Химерні моноклональні антитіла тимчасово експресувались в клітинах НЕК293Т (АТСС
СВАІ-11268), трансфікованих плазмідною ДНК, яка кодує легкий і важкий ланцюги відповідного антитіла. За 24 години до трансфекції 8 х 10 клітин висівали на 145 мм чашки для
Б2 культивування клітин і культивували в 25 мл середовища НЕК293Т (ОМЕМ/Е12--0І ОТАМАХАЇ, 10 95 ЕС5, 1 95 пеніцилін/стрептоміцин). 20 мкг плазмідної ДНК розчинили в 5 мл середовища
НЕК293Т без добавок на чашку. Після додавання 75 мкл лінійного полієтиленіміну (РЕЇ) (1 міліграм/мл) (РоїЇузсіепсе, 23966) (ДНК"РЕЇ) -суміш інкубували 15 хвилин за кімнатної температури. Після цього до клітин краплями додавали суміш для трансфекції. Через 24 години після трансфекції НЕК293Т-середовище замінили Рго29За-середовищем (ІГопга, ВЕ12-7640), яке містить 1 95 пеніцилін/'стрептоміцину. Для оптимальної експресії трансфіковані клітини культивували при 37 "С ії 7,5 95 СбОг протягом додаткових 96-120 годин. Супернатант збирали, очищали химерні антитіла за допомогою ЕРІ С, використовуючи білок-А-колонки. Концентрацію антитіл визначали за допомогою 505-РАСЕ. с. Тестування химерних моноклональних антитіл до СІ ОМб
Проточна цитометрія
Щоб перевірити специфічність і афінність зв'язування СІ ОМб-специфічних химерних моноклональних антитіл з клітинами НЕК293, стабільно трансфікованими СІ ОМ3, 4, 6 або 9, відповідно, лінії пухлинних клітин, які ендогенно експресують СГОМб, були досліджені за допомогою проточної цитометрії. Для цього клітини збирали 0,0595 трипсином/ЕОТА, промивали ЕАС5ЗОбуфером (РВ5, який містить 2 95 ЕС5 і 0,1 95 азиду натрію) і ресуспендували в ЕАСЗ-буфері за концентрації 2 х 109 клітин/мл. 100 мкл клітинної суспензії інкубували з відповідним антитілом за вказаних концентрацій протягом 6О хвилин при 4 "С. Химерне перехресно-реактивне антитіло (спітАВ 5202) використовували для визначення експресії
СІОМб ії СГОМУ. Комерційно доступні мишачі антиклаудин антитіла анти-СЇОМЗ3 (ВО,
МАВ4620) і анти-СІ 0Мм4 (КО, МАВ4А219) використовувались як позитивні контролі, тоді як людський Ідсі-каппа (бідта, 15154) служив негативним контролем. Клітини три рази промивали РАС5-буфером і інкубували протягом 30 хвилин при 4 "С з АРС-кон'югованим козиним антилюдина Ідс Ес-гамма (Оіапома, 109-136-170) або АРС-кон'югованими антимиша
Ід І-2ган2бЗа (Оіапома, 115-135-164) специфічними вторинними антитілами, відповідно.
Клітини двічі промивали і ресуспендували в РГАСо5-буфері. Зв'язування аналізували за допомогою проточної цитометрії, використовуючи ВО ЕГАСЗА!тау. соро
Комплементзалежну цитотоксичність (СОС) визначали шляхом вимірювання вмісту внутріклітинного АТФ в нелізованих клітинах після додавання людського комплементу до клітин- мішеней, що інкубуються з анти-СІ ОМб-антитілами. Для вимірювання АТФ використовували люмінесцентну реакцію люциферази, як дуже чутливий аналітичний метод.
У цьому дослідженні використовували клітини дикого типу МЕС8 (СГОМ6 позитивні) і МЕС8
СІ ОМб-нокаутні клітини (СІ ОМ негативні), котрі, як ті, так і інші, були стабільно трансдуковані конструктом експресії люциферази. Клітини збирали 0,05 95 трипсином/ЕЮОТА і доводили до концентрації 2 х 10» клітин/ммл в КРМІ середовищем СіІшамМах-! (Іпийгодеп, 61870-010), яке містить 10 95 (06б./06.) ЕС5. 1 х 107 клітин висівали в прозорі 96-коміркові РР-планшети та інкубували протягом 24 годин при 37 "С і 595 СО». Після інкубації до клітин додали 50 мкл моноклональних химерних анти-СІ ОМб-антитіл в 60 95 ЕРМІ (що містить 20 мМ НЕРЕФ) і 40 95 людської сироватки (суміш сироваток, отримана від шести здорових донорів) у певних концентраціях. 10 мкл 895 (0б./06.) Тритона Х-100 в РВ5 на комірку додали до контролів загального лізису, тоді як до контролів максимуму життєздатних клітин і до поточних зразків додали 10 мл РВ5 на комірку. Після інкубації протягом 80 хвилин при 37 "С і 5 У65 СбО» додали 50 мкл люциферинової суміші (3,84 міліграм/мл О-люциферину, 0,64 О/мл атфази і 160 мМ НЕРЕ5 в аанго) на комірку. Планшет інкубували в темноті протягом 45 хв. за кімнатної температури.
Люмінесценцію вимірювали за допомогою люмінометра (Іпіпіе М200, ТЕСАМ). Результати подані у вигляді інтегрованих чисельних відносних світлових одиниць (КІ 0).
Специфічний лізис обчислювали таким чином:
Специфічний лізис (|д5|1-100-((зразок - загальний лізис)у/максимум життєздатних клітин - загальний лізис)х100) максимум життєздатних клітин: 10 мкл РВ5, без антитіл загальний лізис: 10 мкл 8 95 (0б./06.) Тритон Х-100 в РВ5, без антитіл
АрСС
Антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС) визначали шляхом вимірювання вмісту внутрішньоклітинного АТФ в нелізованих клітинах після додавання людського РВМС до клітин- мішеней, які інкубуються з анти-СІ ОМб-антитілами. Для вимірювання АТФ використовували люмінесцентну реакцію люциферази, як дуже чутливий аналітичний метод.
У цьому дослідженні використовували клітини дикого типу МЕС8 (СІ ОМб позитивні) і МЕС8 60 СІ ОМб-нокаутні клітини (СІ ОМб негативні), які, як ті, так і інші, були стабільно трансдуковані конструктом експресії люциферази. Клітини збирали 0,05 96 трипсином/ЕЮОТА і доводили до концентрації 2 х 10» клітин/ммл в КРМІ середовищем СіІшамМах-! (Іпийгодеп, 61870-010), яке містить 1095 (об./06.) ЕС5 і 20 мМ Нерев. 1 х 107 клітин висівали в прозорі 96-коміркові
РР-планшети і інкубували 4 години при 37 "С і 5 95 СО».
РВМС (мононуклеарні клітини периферичної крові) виділяли із зразків людської донорської крові центрифугуванням в градієнті щільності з використанням Рісої! Нурадне (СЕ Неайсаге, 17144003). Були виділені РМВС, як містять інтерфазу, клітини двічі промивали РВ5/ЕОТА (2 мМ). 1 х 108 РВМС висівали в 50 мл середовища Х-Мімо 15 (І опга, ВЕ0О4-4180), що містить 5 95 інактивованої нагріванням людської сироватки (І опга, О514-402Е), та інкубували протягом 2 годин при 37 "С і 5 95 СО.
Через 4 години після висівання клітин-мішеней (МЕС-8) до клітин додавали 25 мкл моноклональних химерних анти-СІ ОМб-антитіл в РВ5 у вказаних концентраціях. Неприкріплені
РВМС, які відокремилися від прикріплених моноцитів протягом 2 годин інкубації, зібрали і відрегулювали концентрацію до 8 х 105 клітин/мл в середовищі Х-мімо 15. 25 мкл цієї клітинної суспензії додали до клітин-мішеней і моноклональних химерних анти-СІ ОМб-антитіл. Планшети інкубували протягом 24 годин при 37 "С і 5 95 СО".
Через 24 години інкубації 10 мкл 8 95 (00./06.) Тритона Х-100 в РВ5 на комірку додали до контролів загального лізису, тоді як до контролів максимуму життєздатних клітин і до поточних зразків додали 10 мл РВ5 на комірку. Додали 50 мкл люциферинової суміші (3,84 міліграм/мл О- люциферину, 0,64 О/мл атфази і 160 мМ НЕРЕ5 в данго) на комірку. Планшет інкубували в темноті протягом 30 хв. за кімнатної температури. Біолюмінесценцію вимірювали за допомогою люмінометра (Іпіпіе М200, ТЕСАМ). Результати дані у вигляді інтегрованих чисельних відносних світлових одиниць (КІ 0).
Специфічний лізис обчислювали таким чином:
Специфічний лізис |9Уо| - 100-Кзразок -- загальний лізис)//максимум життєздатних клітин -- загальний лізис)х100) максимум життєздатних клітин: 10 мкл РВ5, без антитіл загальний лізис: 10 мкл 8 95 (0б./06.) Тритон Х-100 в РВ5, без антитіл й. Результати
Анти-СГОМб химерні моноклональні антитіла спітАВ 610, 64А, 67А і 89А показали сильне зв'язування з людським СІ ОМб, тоді як зв'язування з СІ ОМ, 4 і 9 не спостерігалося (Фіг. 11).
Що стосується зв'язування з людським СІ ОМб, стабільно експресованим на поверхні клітин
НЕК293, анти-СГОМб химерні моноклональні антитіла спітАВ 64А і 89А продемонстрували дуже низькі значення ЕСво (ЕСво 450-600 нг/мл) і насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій. СпітАВ 67А і 610 показали низьке (ЕСвзо 1000 нг/мл) і середнє (ЕСво 2300 нг/мл) значення ЕСвхо, відповідно (Фіг. 12).
Що стосується зв'язування з СІ ОМб, ендогенно експресованим на клітинах МЕС8, анти-
СІГОМб химерні моноклональні антитіла спітАВ 64А і 89А продемонстрували дуже низькі значення ЕСво (ЕСво 600-650 нг/мл), причому насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій, тоді як спітАВ 610 і 67А показали середнє (ЕСвхо 1700 нг/мл) і високе (ЕСзо 6100 нг/мл) значення ЕсСбо, відповідно (Фіг. 13).
Що стосується зв'язування з СОМб6, ендогенно експресованим на клітинах ОМ90О, анти-
СІГОМб химерні моноклональні антитіла спітАВ 64А і 89А продемонстрували дуже низькі значення ЕСво (ЕСво 550-600 нг/мл), а насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій. СНІМАВ 610 і 67А показали середні значення ЕСво (ЕСво 1500 нг/мл і ЕСво 2300 нг/мл, відповідно) (Фіг. 14).
Анти-СІГ ОМ химерні моноклональні антитіла спітАВ 6160, 64А, 67А і 89А продемонстрували дозозалежну СОС-активність на клітинах МЕС-8 (Фіг. 15).
Анти-СГОМ6 химерні моноклональні антитіла спітАВ 610, 64А, 67А і 89А продемонстрували дозозалежну АЮСС-активність на клітинах МЕС-8 і викликали АОСС навіть за низьких концентрацій антитіл (Фіг. 16).
Ці результати демонструють специфічність цих химерних моноклональних антитіл до
СІ ОоМб.
Приклад 8. Лікування за допомогою моноклональних антитіл до СІ ОМ
Раннє лікування
Для дослідження раннього лікування антитілами 2 х 107 МЕС8 клітин в 200 мкл РВ5 (Сбіврсо) підшкірно інокулювали в бік безтімусних мишей Миде-Рохпі"». Кожна експериментальна група складалася з самок мишей 6-8 тижневого віку. Через три дні після інокуляції протягом семи тижнів вводили 200 мкг очищених мишачих моноклональних антитіл тимМАВ 89А двічі на 60 тиждень, почергово, шляхом внутрішньовенних і внутрішньоочеревинних ін'єкцій.
Експериментальна група, оброблена РВ5, служила негативним контролем. Об'єм пухлини (ТМ - (довжина х ширинаг2)/2) вимірювали двічі на тиждень. ТМ виражався в мм?, що давало можливість побудувати криві зростання пухлини залежно від часу. Коли пухлина досягала об'єму більше ніж 1500 мм?, мишей забивали.
Лікування на прогресуючій стадії
Для лікування за допомогою антитіл розвинених ксенотрансплантатів пухлин 2 х 107 клітин
МЕС8 в 200 мкл середовища КРМІ (Сібсо) підшкірно інокулювали в бік самок безтімусних мишей Миде-БРохпі"" 6-8-тижневого віку. Об'єм пухлини (ТМ - (довжина х ширина?)/2) вимірювали двічі на тиждень. ТМ виражався в мм?, що давало можливість побудувати криві зростання пухлини залежно від часу. Через 15 - 17 днів після інокуляції клітин пухлини мишей розділили на лікувальні групи по вісім тварин в групі з однорідними розмірами пухлин вище 80 мм3. 200 мкг очищених мишачих моноклональних антитіл тимАВ бІО, 64А, 67А і 89А застосовували протягом п'яти тижнів, чергуючи внутрішньовенні і внутрішньоочеревинні ін'єкції, двічі на тиждень. Експериментальні групи, оброблені РВ5 і неспецифічними антитілами, служили негативними контролями. Коли пухлини досягали об'єму більше ніж 1500 мм3, мишей забивали.
На мишачій моделі ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин
МЕС8 було показано, що при ранньому лікуванні мишачими моноклональними антитілами тиМмАВ 610, 64А і 67А, не спостерігалося якого-небудь зростання пухлини у мишей навіть після припинення імунотерапії (фіг. 17).
На мишачій моделі ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин
МЕС8 було показано, що раннє лікування тимАВ 89А викликає інгібування зростання пухлини, при цьому у мишей, яких лікували тимАВВ89А, в кінці дослідження пухлина не була виявлена (фіг. 18).
При лікуванні на прогресуючій стадії мишачого ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин МЕС8, тиМАВ 64А продемонстрували інгібування зростання пухлини (фіг. 19).
При лікуванні на прогресуючій стадії мишачого ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин МЕС8, у мишей, яких лікували тимАВ 64А, спостерігалося збільшення тривалості життя (фіг. 20).
При лікуванні на прогресуючій стадії мишачого ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин МЕС8, інгібування зростання пухлини досягалося за допомогою мишачих моноклональних анти-СІ ОМб антитіл тимАВ 6160, 67А і 89А (фіг. 21).
При лікуванні на прогресуючій стадії мишачого ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин МЕС8, у мишей, яких лікували СІ ЮОМб-специфічними антитілами тимМАВ 6ІО або 67А, спостерігалося збільшення тривалості життя (фіг. 22).
При лікуванні на прогресуючій стадії мишачого ксенотрансплантату пухлини, прищепленого клітинами МЕС8 дикого типу і клітинами МЕС8 із стабільним нокаутним СІ ОМб, тимМмАВ 64А і 89А показали терапевтичний ефект тільки на мишах, прищеплених клітинами МЕС8 дикого типу, але не у мишей, прищеплених МЕС8 СГОМб-нокаутними клітинами, що показує СІОМб- специфічность антитіл іп мімо (фіг. 23).
Приклад 9. Високодозвільне картування епітопів моноклональних антитіл до СІ ОМб
СОМ специфічні моноклональні антитіла показали тільки дуже слабке (за його наявності) зв'язування з лінійними пептидами в ЕГІЗА-досліджені картування епітопів, маючи на увазі що їх епітопи є конформаційними. Щоб проаналізувати взаємодію між антитілами, описаними тут, і
СІОМб ов його нативній конформації як метод картування епітопів використовували сайтнаправлений мутагенез на культурі клітин ссавців. Був проведений аланін-скануючий мутагенез амінокислот 27-81 і 137-161 в першому і другому позаклітинному домені, відповідно.
Після транзієнтної експресії в клітинах НЕК293Т, мутанти СІ ОМ були оцінені за їх здатністю зв'язуватися із специфічними моноклональними антитілами. Зменшене зв'язування специфічних моноклональних антитіл з СІ ОМб-мутантом означає, що амінокислота, яка мутує, є важливим зв'язуючим і/або конформаційним залишком. Зв'язування проаналізували за допомогою проточної цитометрії. Для того, щоб розрізнити трансфіковані і нетрансфіковані клітинні популяції, клітини ко-трансфікували флуоресцентним маркером.
Амінокислотні залишки СІ ОМб, які є важливими для взаємодії з СІ ОМб-специфічними химерними антитілами, були методично встановлені за допомогою сканування аланіном.
Мутації аланіну і гліцину були викликані за допомогою сайтнаправленого мутагенезу (ЕМЕАКТ
Ас, Німеччина). Щоб перевірити зв'язування моноклональних химерних антитіл з СІ ОМб дикого типу ії його мутантами, клітини НЕК293Т були транзиєнтно трансфіковані відповідною клаудин- бо кодуючою плазмідою, а експресію аналізували за допомогою проточної цитометрії. Для того,
щоб розрізнити трансфіковані і нетрансфіковані клітини НЕК293Т клітини як репортером ко- трансфікували флуоресцентним маркером. Через 24 години після трансфекції клітини зібрали 0,05 95 трипсином/ЕЮТА; промили РАС5-буфером (РВ5, що містить 295 РОБ і 0,1 95 азид натрію) і ресуспендували в ГАС5-буфері при концентрації 2 х 105 клітин/мл. 100 мкл клітинної суспензії інкубували з 10 мкг/мл антитіл протягом 45 хвилин при 4 "С. Комерційно доступні мишачі анти-СІ ОМ (КО, МАВЗ656) використовували як контроль для визначення експресії на клітинній поверхні мутантів СІ ОМб. Клітини три рази промивали ГАС5-буфером і інкубували з
АРС-кон'югованим козиним антилюдина Ідс Ес-гамма (Оіапома, 109-136-170) або АРС- кон'югованим антимишачим Ідс Ін2ан2бБ-За специфічним вторинним антитілом (Оіапома, 115-135-164) протягом 30 хвилин при"С. Клітини промивали двічі і ресуспендували в ЕАС5- буфері. Зв'язування з трансфікованою клітинною популяцією аналізували за допомогою проточної цитометрії з використанням ВО РАС5АЇїтау. Відповідно, експресію флуоресцентного маркера наносили на графік по осі абсцис відносно зв'язування антитіл по осі ординат. Середня інтенсивність сигналу зв'язування моноклонального химерного антитіла СІ ОМб-специфічного з мутантом СІОМб була виражена у вигляді відсотка від зв'язування з диким типом.
Амінокислоти, необхідні для зв'язування, не показали зв'язування після мутації, тоді як амінокислоти, які підтримують зв'язування, показали тільки зменшене зв'язування у порівнянні з диким типом.
Картування епітопів з високим розрізненням показало, що амінокислоти ЕЗ35, (337, 539 і можливо Т33 першого позаклітинного домена СГОМб є важливими для взаємодії з СІ ОМб- специфічними химерними антитілами спітАВ 610, 64А, 67А і 89А. Залишок 140 є необхідним для зв'язування спітАВ 89А, і він сприяє скріпленню спітАВ 610 і 67А. Крім того, ГІ51 другого позаклітинного домена СІ ОМб є важливим для взаємодії з спітАВ 67А (фіг. 24).
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ЗАМ» ГАНІМЕД ФАКМАСЬОТКАЯЗ АГ тв ін. «3802 Амтитіда для нівування дану «305 Зва-чи РСТ «130» як Б 014 135,7 «5М» впав . «і50» ВР ІЗ поБ 95. «ййхх ЗОЗ ОВ «МБО» Ж Єх/35, 58 І каві» 2аї0оз07 аб «ей В ОБ» О,ох «Кіз ване Мі хкБо» Ба аа» Басевеям тУуехвасть 3.5 па» «ві 55 хе днк 3 людина «3Опх З савсасісзє сосатрннако бсссосасох сесбозсвує чсачзисисев свасоїйооє «б акодсаскироа сспузеасзса ЗваКсстеузта Ззрозсшетча свекор сеча То засстЗцнист степессоо чсссзсясЗа дачзьчасося сквосвісмиу пвасвалат Іо цкзччсцессо ваЗЕазсееО Ззазоссся бчзавсзось зсчксЗнусА Чадо а шацасасває «смт сзасрсастя седумеаство папапчаєссї зсазассщса за) пусчссебес ЗсЗксасичо ссбостодся дос о зесозаваце сао зва твузствачи левисвссть казкова звазатессв вЗпсспасої зЗспсйево зо касчеачасєтя бесровуове сровзчуетес срзасуссая соссчсчку сеачалесу дао памдесвесв косозпчанвек сеасгавсосо сручесчоосЯа адапосзааа чодайацосу зва чадзсоесхсс ссасокаЗя седочевосо бозадескек куска у сачоачачео по спощхчсеяса стсаососио пз ос сачодесосв чссвтеалає Заспсозсьас ОО схавсазокау стсшсклусак сіпсчуЗая сосссокачи асосеассва заводи то стасакестац чпевасррр чсассозспвоац соспвовосс ахссвчваз чзусашещссо 7Бо завсяуестетоа сиве Зевсостсвох бобосщестх срассацеві сосесевасх вай зачатка азвасссакс сЗааааєссяв зспбаазчеяк сзастсвовс Вобсвссову яп зесткчевУє кЕсссвсасок счузсцавоц взссввачад зазастисве звувсоскЗЯ за аксусявчає чоссасисьв даздссогоєс ааастасзса ассвакосзу дичпсУсеу іо раде 1 за»-ваРст вед ЖІНОК стзсассоче скспсазсвя засазасеує ссосзвазазе ссевскоасо зе циве зчичевстеоспо вчаасзссвсь фчасаеокоас псссосвиоск асссасвсії сізорааскос 14 бок сасо споцодзааа савзайєчасоо чзбказсззвач састпоссово сссопчавие їхпо кеттассксв чек ессооу Сосозаєвет аочтосасос собдчоасов зуурассауєе 3259 впічбвуєссю созапспсат порлраслеєсе щшосаспоссвоб щшесогзассо соиссароетса 1355 сопособ со аосслвивеке совесвейта дачсвсчемо пУкеазЗзече дя «ВБ02 «В що « х х з т Фет . з-за Людина
Ай й
Ма віа йешж діа су Мей піп пт3Уе Її бу УВУ Уві цей жвх Безм о їмви
З У 19 15 пу тжр уах Авоа с Ук без Уаї Бек був Аза цей Бо Меб тТкр о буз Ма ло як зо тТвх Аїв Ка ХіФ З3У Ай оЗек Хе бах Уві Аза Мо ах чаї ткр ях 35 за 5 бі бе) жТхо мес беу Сувз ущі Уа біз бБвке тах Зі із Меї зівп о сСув 55 5 по ув чаї тек влрошек ва цен віа ме вВго бій Аввоїбем бів вів лід те зе во вхч ові без Суф Чаї Тіз Аза ем оїйна Уа Аза бем бра піу ем Пед з де 5 з5
УВА Жук мем Кіз Обі дія їув Сує Тнк ТтТвУ Сув Уді Роб біз Був ав; ха Мих Мо
Бек Бу Лів Аюч їн УВА. їжа Тахо Бех б3іу Хі Ма) Бпєс Уаї Т1ів бек
ТВ 425 25
Зіу чаї й) Тих їв Фі Бжо У Сую тТжротвх Аза ів Аїд ті тТхєш 339 135 145 вх Авр ве Тк ват Бо Сйецд омаї Віа бій ія СА Ху Аюжф Б3м Бер хЯх аа тб 155 п1у Аз Бех їео Тук бе 01у Ткр діз ів бек К1у іх Бей їж Бей 155 ї7о ї75 рада й запо аавСсТ ве БТІ. ХЕ
Му зу піу іМеб бен Сук Су ТЬх Суз бу пек піу Фу бек піа сіу . ї85 185 185 ко Беу Мів Тк Меї а1я Ак Тух Зак Тркх бек Від Бто Бвіа їі18 Бех 155 255 255
Аха біу Бко дек Зі тТух БкОо ту о Хув ДЕв тТук тУвУ 210 25 о «й» «із ВХ «Щ1й» й сзїзх ДНК жо ,
Цітучна
ЙДИ» . - «й» кодонелитначинана нуклеотидна песлімовність, вка кодує люздуський клпудин й хаО2 З пзазсзсЗзо вві баасасе сасідзачич засазавчио чзкбадезааєс Квзацчасамс Бо засапудспеєй стапоуссвяс чзипзасвеас взаезесссзло запа катя аспек ї5х5О чзрацчокчай сусло копрасассм бапозаодощ дЗазатоасо зссвозсЯ 1855 цосзасачсех сучас сачасачяс садово зазасчвЗо Бччедакає 7438 зЗачсвосея бСсачацзчєсві Босзвазчухз асувовалеї ЗсгчоасопиЗ ссосвуванви 20 спеваосчс сечацесска сеоасЗзосЯ состзпозао сасспоцеео досспоепоУч зей тпсасстсЗс селЗсЗосвнаєт сусзссассю зожсачаччв звачоасачо азопессчи «29 скоесесуас азвсоусаво зечеЕсВеча Соехшсущон чзесдасасто всссссеВЕ 4859 зкссЗзассвс согсуссвсо зссСсцсувив Боаблсваєсо пече Ззудсосава 5чо зузцазансе зпосчссазо сбосвесспа часуччесус стсваузаєстя соус во
З«сазачлесЕ посзеЗсває асассста зсоззсучпьс сосзачаєосе звуусеасьмих Ей сур сацсализає чосопоассх Бозусвувач состав бавопосвоса я лоувасьвсяє зечараззаа себсавасвсЕ саспусзспяо осавуссчсс ссасачечаз тво шпиЕзассвВоя бспечекищо вади Зп
А: ха 65 «Й» дик «Й
Мтучна «ххх «ЗХ3з КкОдОоНн-ептТимізована мчнлезиявна поєд пет, пр кни оз дім
ІкК занооптиміхована нуклеотиди послідовність, Яка кодує ДМ Фк Ппнувані позаклимині петлі (ЕС) подського клаудиму ї «0» Я тлусусцєсав зЗасвосавоєс сЕЗсовссав зчавассепас асссталозс сасоачесє о
ШстостртЗд дестсачасс сбвсзазсза спссвстовя бссазачась Собасавосо ї2о ваче і зад Т дез ЮХОБ.СхК сскчосоачеє зазчоссвов азесксовусс своззузУєта века 1855 «іо «Щі» ЗВ . «й1йз фр . сВАя» ЗИтучна ;
Ав х «ВЗ» скиМувані и позяклітинні петлі людського клазудину б, які містять ір капа лідегрну посліДОВНІСТЬ «ха хай» БІСКАХ, «яйяв (1). й
ЄЖЗУ в капа лідецна послідовність «иВпх хеаів КОМАЇМ
АЙНОз (265р,.(38, «ах пчікувані 2 поздкніт, іпетлЬівС?і як: тки плед Е очікувані є позаклітивн петліікСерлкідського пллудину 5 «4002 5
Мезе із тах о ЛарожБЕ Бех обер» оБбев о ттгр о УВУ фица Хжні їм; Тур оМві РКО ї 5 10 ї5 сіу Бах Хм Зіу авр азіа Вів бій хо ка Ар обрбе ТуУук Ада Бо Бей ши 28 30
Уаіїі Аів Бім Віа сти лук
ЗУ
«ЗО» 5 дхїйї» 33 «й» фег
ЯЗ» Пюденма -«400з Є лхз АврмоБве Тух АБи рко Мед Уві Аїд сб дів біб Був 3 У ї0 -йї0з 7 «А 53 «пай» Феї хи5іах» Людина «ох
Бус Меб ткросув Уві тТвх дів Же тіє БЗіу лава йзк Ті гаї маї Віа
АХ ни хо З
Зіп ущі уві Ткропій б3у ем ТкроМеє Зак Суб Уві баз бів Зок ТВт о а за ік біз Меб бів Сув Був УЗ Тух Авродек ем їм дій без рус ЗІВ каце 4 чаш-пиРІТ вва ТИВ. сх 42 45 двр іа піп віта вія ьо «їй» Я «МУ» шо «ЖЖ» фр
ВАХ» Людина «йхй» «ах» МАВХАМХ «ЖИжЖи (343. .1343) «лих - жи : . ха» пюдокий клпудан Б АЯЗУ поліморивівл
Ах
Ма Ма йеу Лія 5Зіу Мек сій Хі гео бЗіу Уві Уаїф Шей ТИЖ ім їжа їх З Мо ї5 слу тТквромаії Ана су бен уві Бех Сув дія їх ро Меб тЕо Бу У жи 5 Зо
ТВ Аза Ве сі З1У Ав о бек ЖХіе Уа) баз вза під Уві Мазі Тхв Ст 35 за 35
ЗлЛу йвиа тр Ме бек Сув Уа) УаМ бів бех Тахо б3іу біп Меб біб Сує 50 55 о муз чаї Тух йзу бат їеа їжи Біа фізи ко біз дер оре) ЯК Аза Віа «В за я о вх Аїа цей був бах її2 Аза без йти Уа) Бій уем оре ЗУ Без оїи це зо У ча тТук іа Аїв З1у Аза був Сувз Так тТвх Су заз 3 Оз Буд Акр ї8о 125 Мо веж ув Віа Ако їв УА. іви Тк бех ві її баі Бір УВУ Тіб шех
МБ їх 55
Зі Чаї Бем Тнх їм їїз Руз Уві Сув тТкр о Тлх ЗМіа ців Дів сві їі їх уз жо
Ате Мер Рів Тух Мат Вко ей аії Аза біз Аів Зія Му Вхе сій йо ї5О 155 ха
О1У Ахв о Зехк тм Тук пец 01у Тхв Аза Аз беж піу бер ром Бей би 355 378 ї7У
Бацйе З
ЗаЕ-ЧВСТ вез ВТУВ. ХЕ щшіУ бьУи піу ви їтеь був Суб Тк Су Бхо беж 01у ху Век о бОза Му
ЩО ї85 330 шко Зежк нів Тух Мек Мія ку ТУк Бех Жвх бех Аіз руз Аза хів Вех їч5 І 295 лк Зіу Рхо ех ЗМ) Тук Бко ТЦ був дви Тух Уа)з т1о ші о «Мій» З «сИБі2 І
КК ях ее кий Я «ША ой: 7 Людина «мМ З мас Аза беж Тк ЗжЖу пев Зі без ем О1у Ме Тв ем Віа Ув3 еа й З а ї5
ЗУ тЕШ Бзи спфу ТБ Мен омаї бек СУув Аїя о беи Бко їжи тую Був Уві о ле Зо
Хрит Аїа вис хів с1у АвлоЗех Жіє Уві Заї Аза Зі Уві Уаї Тв 0 їх 5 35
ЗіУу йеи Ткв о Мех Бек о Сув чаї та бір опе ЖВу у Зі Меиб За о сСув а 5 5 їуб ух тТУх Авродек пеа Би Аза їм Рко 1 Аве Ммеяа бі0й Аїв дів 5» то 75 о їху йхв Кез Сум Заії її Аза Бем оїзм дви Азія Бен їбези Зіу без Бен
ЗЕ з з5
Уві Аза хів тих піж Ме 012» Сув тех тТвж о Сує Уві Фі3 Аве об1з Зіу їоо іо уко
Аза муз ліз Бут Щї1ї« Уві їжи тВвх 5та сзу Уа тів Мер оБзиа їоа Ахв. 115 150 їх лак тіж Фунт щі я ач ї- я сук, мм сія я х яку лів вч Укі Бей Щ38 рхо Уві Суб Тср ТВ АІВ Ків дів Це Тв 150 її 1390
ЗМ; Бер о рпе Тух Ав Бо Геш туваї Аза бій діа це) Був вх бі ївю 14 155 5 155
Сі Аза Ват оімаб тБух їх ЗУ ТкроАів Аїд Лів Авіа цео фЗачз Меб зи
ВУ Ето ЩІ5 51у піУу шіу па їв Сув бут Твх о Сув Бгто Бко Рко Зі уві й дет рачЧе 5
38Х-БОРТК дез ВУ, їдо 185 Ва
Куб вка Зіу Бтб ВХ зи су тТух Бек ї1е Бюз бох АхаЯ Бех З1у дів ї88 во хх .
Зак слу рев Азр о муз АК зр Тук Упії іо ЗМУ хижа» їо «її» 05 «пЗих фрі «й» ; ; «УЗ: Людина ки
Мет дід Бак ес сіу їж (ба Маї меж біт біб Віа цей Аїа хай ем
Х ч 39 їх
ЗМУ Тур ої) Лів ак мес беиа був був Аза їни Жто Меб Тхр око Ма 2а зх з км я З твх Аза Бім Кієсє п) Бек Ба» їіз маї тас безе ід тах о Хзє Тхрофій 315 20 «а сі без ЖхроМес АвпосСув Ма) Уві сід Бак о тах б1іу бій Меб бів Сув
Зо В во
Муз Май Хук АвроЗах фан іа Азя їез БЕ 33 вБроїва бів діа дій «5 за 5 З
Аку Аїв Бей і Бі Жіє Бек їЗз ів Уві Аіїа лів їн ЗУ Уві. їжи . З по -5
Мен йвк уаї хі зу Фіу Був сбув тиж Вп Сув їеб 03; ввр осі) Жех 120 3п5 14390 х їду Ж зліт УМ МО Тіт пл ідо хк ге хи - Та ал Щі з ків Був Аа бує ТБХ Меб її Уві дід злу Майї ма о бпа їжи їдю Бів
У МЕС 125 жу Мешм мес УЩі дів УВА Буо уві Бех тхр ХВ Аз Нів бат х1іе їіїв ї38 135 35
Со гену М пу усу - Чак з и стек и, п їх о є.
ПішоАво овМо бук вки Бк бе) Мв3 діа Бех Зі Зб БУ Дку «Ме; 145 ї55 ї55 хо піч Мі хау ую пух Я ухаич лох т Оп т ї га 1 Жуч чкж Віа пе Хі Тук ЗАЇ Су Ткб Аза Аза дек ЗКу оп їм рей оц ха ї15 5 "т 1 5 Обі ги пси й у се а сухе М вах
Зіу Фіу 1у Бем обзо Сузв Суд АввоСув рко Рко Лту ТВх Авроїув ру їде вах іїчо
Раз 7 за2-БОРСТ вез ВТО ЕХ
Тух чех Аїа був Тук Бех Аза Аза Акуч Бех ліз Лід дів бек Два тТУХ 155 аа 205 чаї «пі» Ті 6 АЙВХМ» 29) «ака» фрр ази Людина «зо» мес бек Мей с1у ей Зі ї1іе Трркобіу Тахо Аза ром діа уаж пе о1у ї й Мо 5 тТкр о їна сіу ТВ тів маїз Суз Сжв діа їн Бро Меї тТхр о Аха уаї Бех 2 25 Зо
Аза бле Хі О1у Беж Дст її: ї3Зє Чо Зех бі Авпоїїе тур 01 Ту з 3 й
Мей Жхр Ме Аза осСув уяві Уві бів Беж Тк б1іу біо меб б) Сує Був 5О за ва
Узі Тух Авр Бек Меб пед Аза їні ко Чіп о Авроїво бід діа лів Акч то 75 Зо
Віа рей їїе уаї Маї Аїд її це) пем Аза вза рде Су йога Уа дЕ зо 35
Аза ей чаї сіу Аза шій Сув ТЕ Ава Су Уві 012 Аве Ар тТпх лій 00 жо хо їув Аів Був її: ткк їз Уві Аза У ма) без Вл їі цен Віз дід 115 о 125 їеи Пен Твж о Бсеи Убі ко Уві Пежо тТко бек о дла ват ТАК оїзї її га 130 135 140 знр Різ о тух Ап орто Уаї Уаї рсо 214 діа іп Бжв Акчосій мес щу 145 Тло 155 ї5о
Аїда сіфіу без Тук таї ту Тер діа Аівз Дів діа ей сій дей те пу 155 170 ї75
ЗУ Кіа їем їй Су Суб дех Сув руо Буо Аха 014 Був Був Тух ТрЕ йо зно ї8о
Баче В захо за пБТИВО ХХ вів о Ких Ху Уві Уві Ху ет Аза Вт Бтая бе Тахо пі рко б1Уу дів уз ЗИ 05 пз цей бі ЖБК осіу Тух АвроАка був Бе о Тух Ма хо 215 230 «Ві0в 15
АВМі»х 355 «Ка - ям «пі3» ДНК
Штучне «ший» " «ваз» кодом-оптимізована мнуклестидна лослідютчість, яка нодує одну очікувану позаклітенну петлю (КСО) людського клаудину 6 «Ой» ОВ лсасвьченуа авдицевссас сгссаксучс авсвасаксЗ сучЕчасесса зЗзКЧЕасо БИ тзУчУшечЕ «ві ачсмо сова своа асассоаєи зпвзеЗгачез сдачакчяИ їз счесадевевос Кежсвскчат позацвгоя сах ох, 59 «МІ ІЗ «ЕМЬи Об «ХЕ» фр «Ява пнучна чи куйЯх очнувана А пезаклітинна петля людеськомо клаудину б, яма містять в капла підерну послідовність «хом І «єойіз Віспа «ший 0.6
ПТ су сезим тк їх «Кая» |в наноз лідерні пасвідовисть «шаО» «Вих» 0 бопюю «ий (95 )..175, си. ; з пит ї тяж очікувана Її позвклітякна петля (ЕСЕ) подснемо клаудину Є «400
Мей опіз ЖдЄ Авроїж Хеб; Без пед Ткрозаї ем обои їшех Ткр Узі Бо ї 5 її ї5
ЗАу Бех увг очі АвроАза Аза сію» ко Бко Ме Тур був маі ТБх дів 29 25 Ка
Бе їі 43у Авип о Зех їзев ді Уві Аїв бій Ууді Уаїз тТкв о зім піу лев з ак
Тхр мес Бек Сук уві уз їЩ3п Вех бмж сіу сів Ме бій Сув був Уві е 35 со раце З
343-ча БСК нац БОБ. ЖХЕ тТух Бар Чех їви рем вія їжа ко біб бар о ем сій Аза дів ва то т 5о
Зак Ака Зфу Рхуо рре шіц б3а Пубз Пси їі ех 016 б1а Авроцен бло 85 о з5
Мек нів Тйх біу нів нів Нів Нів нію Ні 195 ї05 «ЯМ А епі З «піз вдрг
УЗ , «хз» д юдина ап 3 ко Мек тТкр Пуз чаї ТїТвк Аза ЕБе ї4зе Бу Ав) йех 41е х 5 10 «231 15 «2312: 15 «М Фет «Шар .
Дюдина «ніх 15
Мак бр їн Ущі ТМмк Віа Рез їзіє Му Аза Бек їЇїє Уді Уаі дід ї 5 18 15 «хаб» ТЕ «із 23 «ММ х днк «й
Штучна «Ід» «ВЗЯВ дл запа уклаоги й камні 15 капаєчасой Коси. до «Міо 17 «й3іх 3 «пі» днк
Зх с м іх ; :
Зутучна послідавність «ХІб2 «яжах блійзнуклеостиди «ОО» 17 чачавацсси Здппоасовосв Коаоззахчова спетзоаковов сто 43 «230з 18 хі» 43 сад ЗК 3» ДНК
Мк у у ,
Штучна послідовність «ВО х
База 10 з48-5ОБОСКТ дез ВТЛЕ,СхЕ «аа» лиюнуклестиди 40 8 чачачцвссо сезасопваЗ сспвазчазаєс сакчачачея щу у «ХО 8 «хіх 45 «ЯМ» ДНК «32 Бус вче ; 7 Меучна послідовність «ах «ха» 0 бліонуклести ди «апоО» 15 "У ззавацчзссс спозсцзаза ссозавлачас сасозвчечкя че 33 «УМІВ з «23112 45 «аж» ДНЕ «Я3в ор : ,
Штучна послідовність «вай» хЯж3х о Одконунлеотиди «асп» йо пазвосстесс сструсучазт стчачоауас сусовааУку че 33 «Зах йХ «піз а «Ай яцо «хІі3х днк
Штучна погліДОВНІСТЬ си «ВИД тд тує хи» дідігонуклалтиди «Аз ХХ чвиваєсоаєсої здссдсунелов сщасасереса вчгасазаєо стос 5 со» й «Мі» 33 «хіх» ВМк суїз шШтуЧчНОІ ПОСЛІДОВНІСТЬ йди»
СЕТ мн пити каз Одіонуклеотиди «4003 55 хвсасчраот всрсоасрвсов вас усЧоЯо со З «ха 23 «й З ий , «Зіах НК
Штучна послідовнисть «0» «ХаЗ» блвконуклестиди «300» х3 півпзсчовса сесавевоса дисерчУвоеє со зі
Баче 1 зап-чавст вез хи. хК «пі02 иа «иМі» ВУ «Й пчк «Ват
Людина Я «ях 34 зФдестссасса аззчоссаду счкчеососп споцспссса зсвдсваазач сассоваплод Бо зЗчсеасволисвУ ссскоаЗеся состава частаськис подвдеанеї Звоспзма їх кззЗазсезадоз чассасссває сессззоЗов сасаопскос сеодосЗзкасо човзовоасаве 159 чусесосзсв зсссааоскя счечУрчасо зкасссацдсва зсвисопода сасосадвнаих аа сатаксїчсв возсцеавсса спзосссоелйо дасасслаза супасвачаз азот зп «нцащсудод всватапося сабстессос особусссатп сослазазс чсеЗаЗсупа що спитсазоасях босом сос слоссвзачссо заівсвссс бсзакчаксач саЗаасиссю Км чаччсчосе УсУусчнцка чавосзсзацє сасзчазпасс словазізаа че сдасея во тасвеччаса сс чазУс йсасаводос авцдвисаачи псазвавача зсвдрасяао За ачлизвссотаса часов с сясастчасс дксассулавс вузасозо чаасаусвая 509
Чадасасваче зсвачаксго савсозвзуцео сепссвпссе бссаксзчавва часове Бо дапчасснадЯ чЧисвуссовоя ччашстосвУу пщсаосасос соспососВч сс пивОда тихо зущивсаєсвача аповапеаке сесспасскас сезлічаваа зоессгассо сзопсочасасс во зчссусачацу Заплава сва сера сс пачейлаасі апдачассовос соспспсачіт чо сотдуасвос вочусатске сисессусас зоодацчисув ссзсучаєсма Звасайчеу зо сашсачуєчса аа ссвУу срусайсуса апзсвозаца сбскапвсвв спаспвивИио БО сздавуксте свЗсстоай сасочастаз гад за3 чйаз 5 «ВА» З кйзМях Фр
Зі н жи Людина «ой» 25 вів Бех ТВ БУ Ху ка дек Уща Бе Бо їФео Віа хо йех Зак ому 1 5 ї6 М ех Тих бек осі щу Тих Аза Аза рей спір Су ме) Уві су Дб отух 25 їй
ББе о Бка ід Бо 95Рі СКвВи Маї Бех тр о Ака дах біу дід Пед чих беж 36 о 5 сік Уа ні ТВ жЖре руб бі хві ба біз пеє ех Чі їм Тужх Вех
Зо З або
Базче 19 зі45-ЕИЕСТ вецз 5Т25.пхК іа бтт ех МАХ Уві тВу маї Бхо беж ех ех ме Зі жу чЧій тТвх то 75 во тух хле Сук о ймат зад Ав НЕів Бує Бко бу Ай твсоМуУх УВІ АЧЮ ув ка зо по вАха ув іа Бто Буз бек Сув вве Був ТНх Нів Тахо Сую Бо Вко був . 195 Ток 119
Вже Віа рРхо сі Без пз су Ту Бко беж Уа) Бе їео Ве вхо рЕо 115 ї2о 25 цпув Ркз Бу АБр отак ем ме їі бах Бу ХВЄ Бкго Фів Уа Зрлж о сСев їз ка 14о
УЮ УВЬ Мазі взуро Уа) йех Вів Зі Вею бо азіа мМаї му Ре Авлоттр 1945 150 й УЗ ї155 тух УАМ дер чу Мах Зі Уаї НІВ дв діа буш тах бук рхо дха б 155 У7о Мях «Ма бі тух Ав Зак ТВ Тук дк маї Маії бек о уаї бе) Жак УВІ їби но 185 їз нов осів Бжхроткробем вза О1У Суз ба тух ву Сув Гу: в) Бех АВд ї85 (1 295 їув Аза їв бкй о Міа Бко Хе бЗ)м Був ТВт узі йех муз Аза бжз б1у 10 . 215 хи г я - її алу їх о у. у тк се ТУ. кру ї т.
Пів овкО БхЗз Ода вхо біз Уві Теу ТВх о їбжюо бує Рхо Жех Асу 33 ЗМ хх 230 135 ао
Ммек жЖих мув бо ій Уві Кех мем Жак Су ей ай Бу Зі Бре Тук
АБ 250 255 ко Бех АвроТ)е Аз уві ба Ткробіа Зек Аза о біу іп ро 034 Ави 575
Аа отТух Був ТВхотТвкК о рхо Рко бай їни дви обек Авробіу беж ре ре 275 85 285
Вей Тух вах Муз ви Тк УаЗі Бвробую Бех Аж Тур обЗів йіп ЗХу Азот зви за 10 чаї Ре Шех Пує Бех Ууаї Мек Ніє 0345 ліз іа ін баки Нів тук ЖВЕ зх 10 з15 32
Бацде лі
ЗаХ-БИРСТК зей ЗТ. сх
Сім був бек меа дек Сей шех жо ОЛу мув зи5 Зо «Мї0» 6 «из ЗХ «пі» днк су ев -
Людина тай» хх счкасзалкдя псзспссса счЕчисВОє сссоссоса ЗУЧчесувуса плеспзачесс 55 йчосвсосчслса зсзкечосция пебесоцеани авлрстстасо ссоддваяча савачзсаеа М2хо їзтаз3зчсзт всзаспоссо чозззасапс васачесавоо взвасабово счаповоечає но ззсавазаци совспуусасач сссивиаляадо жосстчассс кзазсвазує суасевозща 235 звадвдсасазоеєч боатмчаоия сЗачасзале свссазазит сешопачеси песавосаня 159 ачевосваста часа став За «паст 7 «аМй» 187 «ВХ» : из Фр. ст нада кдд, їз Людина кАйО» У ак тВхи уві віз дія же дек уві рме ї1е Рце рто ро Бек Авр обу ї 5 їй її сів без мук Безу (лу ТІ Аїз бек Узі Уувь Сув їз Бей Ава Ави ба т 35 35 тУХ рхо вхЗ Чіа АзвоМмув Майї Сів тТхр муз Уаі Авр о Ап Аїя Мец о за Б ек щіу Ал) бек о Ола сім ба уаї тВх ом; О1о АВр ойех Був Бр бах хо ва 58
ТВх Ту Бех їси дек пек ТрК їєпі ТВХ Заез Бех та Ліз бар о Тух О14
Б зо У ви
Бут нів пув Уві Жук Віа Су чаш Майї ТВХ Нав Са шу Мем Беж пек
У за 5 рхо УаМ ТВХ Бу о Пеж РЕ Авиа дже ЗУ б) був
Мп Мп «іо» 8 «ії За «Мій» ДНК си -х - : ; ти Штучна гпенотдовнть заз 14
З42-БІРСТ де ЗТІ5, ШК «Ох ха3з СушонуклакиВди «ав» «33» Віз функці «ий» (ЗМ.
ТМ тгірільк й зеніт мем : «ТИЖ певний (будьнки й) муклеотид «А00» дл
ЕВ свое БІОС ло 32
АЙМІіМ шО «2112: 305 п п ст днк че ВИ : - 7 Штучна поблумниісті» «Во «ВЗ» йанонуклестЯди «5002 25 зпоасавсязе вЕсазсусьт язсасосао за «302 35 «ХЯ1ї2 7 «Мій» зи «зздх В
Пітучна послідовність «02 «аа» суйонуклесотиди й ках за сичЧессавсоїя засо козча ссакоу 25 «»3х 3 «МЮУ» 75
ТУ», » хі» ДНКЕ «й ур ; ;
Штучна послідовність «ВЖИ х -ЖЙ3» Одітнуклесрядзи «а» 31 зоачачапса зе. ацявьс суда й «х3б» 32 «Мі 4й «аа» ДЕК «Й у, . .
Штучна послідевність шар - міки вчу си «да МАГ ануклеотиди «АбЧе З зсавсовасцво севсквкауЗ щпелаадсачсоя зсарсввсови воавес 5 «ій» 3 «їз З
Баче 15
З48-НИРСК зех БТІ. сх «аа» ДНК 8135 Піучна послідовність «их «иааз Олігонуклеостиди «400» 33 зЗБадтсвочас озсівкаощ че 27 «210 34 «1» 117 «їз Фру «213 впаіцря пені і 135 зртучна послідовність о. «ВИЙ» «25» Послідовність МН антитіла «а3оз 34 зім Маїі бз2п Бен» сб1о Оз дек Оіу рхо буд рец уві їжа вхо су Аїа ї Ка То 15
Бек Меб Був Же шЖсу Су був Аза Бех с(1у Тух дех вро тду Оу тує 20 25 за
Тит Меб Аєп о Ткромаї Кук Зів Бех Нів піу ув Ап цей З ххюр 116 35 а Я
Зір йец хі Ази Рхо Тук вЕпосіу сіу Тнж бек Тух Аа дій Муз вна 5 що був біу цув Віа Тк Мем Таж її бвроБуб Зек беж век тТну дів Ттух
БЕ 7 т о
Мес 41о Бей оБем пек о реу Твх Бек 013 Авр Вех діа уд тух Тух сСув ве зо зе вів Аку о АзротТук Сіу Ту Уві цем АвуроХук тТхр З1у сій піу тв тех 0 105 110 іїжМи Твж ай Шех Зеу
Мо «102 35 «Вік 107 «Й рт ей з мі іншу опа» Штучна послідовність «ЙО «Шй3» Послідовність М. антитіла «400 35 ів ї1е Муаії їем о їЖвк бій Ве Бус діа ї1ї6 Ме Бсож діа бвж Рко сту
У 5 30 ї5
Раче 15 з43-53ВОТ сет ВТІ5.бхк ій Мпув Майї ТЬьк хів лах о Сув бек Віа бек бек бек чаї Бех ТуУух їжи о ХУ 30
Нів Ткр РН Сбіп бів Ммув Его ЗїУ ТвВробех рго Був оБбец Тхю Уві тук
За йо 5 ну ТНК бек дай мем рус бек б1у ба) рхо діа АхЗ рію сіу 01іу шву 5а 55 С
ОлЛу бек с1у Трх дех Тух Чех їні ЖТВк Тів дек Акт Ме ЗУ Ма стій є то 75 но
Авр Аза Аза тТвх тух тух був ЗМО Зій вже дек її Чужх Вго Бго Тхр зо зі тах Вре бу п01у Бім Твх Зуб без біз ї1е Був ї120 1055 «кВі0з 36 «й1їії» ї1У; «пі» фер .
ВІЗ ря до пагпіпивиі «л138 Штучна послідовність «ЙО «аа» Послідовність УН вигтатіла ха)» Зб
Ми Уві бімй ем Зіп шій пек сїу ро (іч тва Уа був ко ОКУ Ав. 1 З іо 15
Чек Мек цу їі бек Суш пуд Аїя Яек оїу Тух жех Ре Ту зїу тТуг 2о а 39
ТВжЖ Ме АБ оТкроУаї їлев іп беу Нів Оу йпув Авпопец сь тТхрої1е 35 2о 5
ЗіУ Бей ї3їе АБлп ої Тух дей зі сі Тах її Тур Аво) біпобує РБЄ 5
Муз О1у ув Аїа тп аа Тк Ууді Авр Був ех ех Бех Тпх Аза Тух
ГІ о 75 ва
Ме би ес мец Бек Тен Так о Век 01 Влройек Аза уді Тук тує Суд
У за за дів Ажа Авр ТуУух Оіу Бе маі рем дво Тухк ЖТхр о Осіу біп о сіу ток тТвх чо 1055 10
Баце 17
348-БИРОТ вез дТ35.Кис їва Тйх Узі бек бе «хо 37 «її 1807 «іже фр тяж» іДтучна послідовність «йо тиз3» Послідовність М. антитіла «аа» 37 бМа їїіе Уві бе тнЕ бід бЗех бжхо бех їіе Меб ех уві бехт о бхо оту ї 5 10 15 сів муз Уа) Тахо її: Тих Су Зек Аіа бах Вах Зех Ууді бах Хтух Меї 20 вх 30
Нів Ткр Ре 0105 біз Ммува РЕОо п1у Тк беж о рхо був зей Сув Т1е тух 35 ай 45 зех Жик ет Аво їжа Аз) Чех с1у Ууаї БкКо лід Ака Впе Бех бі Аг за ва о злу ех зу тах Бак о тук бех аб Тех тів бер Бхч Мві Аза віза пли па ТУ во лер Віа Аза УБх Тух Тух Сув шій іп Ак Шех Ави Тух вхо рко ТЕр ве зо на
Тех ле Оу Озу СІу ТБж їв пед біотів їв
Ма що «х1ї0з з «Елі» 17 п Ким Фет «7 те : т гжі3 Штучна послідовність хо хз Послідовність МН антитіла хар0з З ча тах бів їи 015 Оп бек об1у Рко бій пи уаї ув о рко Ф1у дід їі їх 10 ї5
ПпекоМес пув їі: бек Сув мує Аїя бек Зуу Тук бек де Так біу тут о 25 за
Тв Мес дво Тр Уві уз біпобежт Нів Зіу був Ап оБез бій Тхр о тіє
Зх 40 ав
Раце ХВ
342-Ч9РСТ вед ВТІ5.ехЕ пЬу печ їз два бо тує Ав бО1іу Ту її Ї35 Тур бяп Зій Мун ВОв о 5 ва
СПув Ф1у Сув іа тТвх реа тру чаї АбБр омув бе Шех бех Тру Віа ТуУХ вх 70 Та чо
Мек сім цеа їжа дех ред Твж бек сій Авробек діа Уді вро Тух Сув за Зо ав
Аха Ажч Аврорбе О1у Тук Майї Бей Дер тух Ткр Зіу бів біу тТдх тик
Мп 125 х19
Бач Тв Уві беху Бех - зе. і 115 «-кїд» ЗО «ЗЗАх 307 «из фр «и К - . «ау» Штучна послідовність «ах хааЗ» Послідовність Мі. знтитіда «100з 39 біп ї1ї8 Уаї їез Тек біз Бек о рхо Аза її Ме бек діа Бех ру сі 3 « 10 М піч був уаї Тех її Ті Сув чех лід Шех ех ву Ууаї Бех Тух Меє и КК
Нів тТхв Ре сіп спів Та о Рхо О1у ТЕ бех рхо був мех тив оїіє Тут зо 458
Зак Жах беж Аби їм Аза Зекобіу Уаі Бо Аза дуз Бе дет О1у бек
БЕ 50 ски Бех П1у Тк Зек Тук бек їец Ту її5 чех лЛта уді Віз Аїа Зі 85 а 75 о
Ахр Аїа Ала тнЕ ТрЕ Тук Сув 012 б1п ду бер тру Тух Рхо Рхо жЖхр
ВЕ зо 55
ТЕХ вра зу вік ТУ ТК о Ппув йеи сій її ух
М 105 «й10х «3 «Хі1їз 117 «вій фРТ «3 , м : ; я» Штучна послідсвність «дао» где 35
Заг-ваРСТ вед 5Т25.їхК «22 Послідовність У антитіла «ой» 49 -іш Ммаї ЗіЗ без біп бів Зек Ах Руб Мі її уаії Ммув ра с1у Ма 1 їх ха 15
МЗех Мебс цув ї3е мех Сув цув Аза йех Фіу Тух Яек Бце Тако б1у Тук о 25 За
ТЕ Їєві Азвпофжур Уві був біл беж Бів 01у Був Ана ем сій Тер Тіг 35 39 35 дУуу меси ї1їе Ави Рхо Тук Авп Фіу піу цеж бек бук Ав ошій Хув біна 5о ки що бух Авробув Аза Твх пе) Тру уві Авроїув Бех Бех Шех ткх діа тух «5 76 т во
Мекозій пев дез Зах рей Тл Зек 01 вро оЗек діа Уві Тук Тух Сув за 5
Аза вха вАзр Тук С1іу тТук Мві Рце Авр туш Ткр аїуУу їй ої тв тих то 15 о
Мед твх чаї век ех ї15 «ха» 41 «ШЕ» ОМ «ній» Фр «213 , о. ,
Штучна послідовність «а» «ваЗ пелілевмієть М летчижів
Послідовність Мі антитіва «200» 51 дів г) уаї мем Так бій Бех во Аза хів Меб бек Ма бек ко сіу ї ч хо 15 ів був Маї Тйх (116 Тих Сув зЗеу Від пах бех пет чаї вай Тухк Ме за КІя 30 дви бл ям нів о тТхор вне бій їси Буй Рх5 01у ТВу дек ро цув обей; газ їюїє Тух
З 80 З зЗек ТВХ бек дви Бей Дія бек О1у Маї руо діа йха впе Бех б1у АкЗ
О Б 50
Зіу век Ру Ту Пек о Тук Зак іц ТВк Тіз беу са Ме 014 Ав сім 70 75 во
Баде 20 за8-58ВОТ вза ВТо5,ЕХе
АзроАів Азїа ТИХ Тух тух Сув щі2й сій дк Два вбп о Тух ро хо ткЕр г 85 за 55 бик рве 01у с1у 1у Тихо Був пей біс її6є Буд
Щпо мої «ММ» 45 «112 5 «ій» Фр ках Штучна послідовніст» «ий О «МЕЯ» Послідовмість МА СОДУ антитіла «ишо» шк . «зії» РІЗНЕ ФУНКЦІЇ чай (МК... «23» Певна змінокислота, бажана проматизна амінокислота, краще ле або Ту, ше краще Туг «230» Й . «332 РІЗНЕФУНКЦІЇ кВай» (33.43) «883» Певна вмінохислота, бажано авоматична амінокислота, краще РНе айо Ту ще краще Туг «М п. й . ка» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «й (з). .415) тя Певна амінокислога, бажано еп або Рне, краще ви «400з 47 хХав зу Хав Маї Хда і 5 «10» 43 «2315 5 «1» Фр хвіЗ» Цінучна послідовність «ий» «ЖИ» Послідоввість МН СОВЗ антитіла «402 . «й2ї» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «ВЯаз» (2.62) «хх Певна зміокислота, бажано проматична амінокислота, кое Рае або Туг, ще нращое Туг «их х ск ща ст «зе РІЗНЕФУНКЦЕ «иа (а)... (4) кхаЗв у . -К чо г 773 певну вмівокислоте, бажано ароматична амінокислота, кркцце ле або Туг, ще крннце Тук пивом
Раце 51
. за3-В2юстТ ве БТЕ5.гх «232 РІЗНІ ФУНКЦІЇ «ай» (1651..(8) «аа» Певна амінокислота, бажано Цен або вне, кращеїей «а00з 43 йзр Хва сіу Хав чаї Хай 1 5 «Ві0» «4 «211 5 «вій фФрр «ЗАЗ» тучзна послідовність «Оз «2и32 Послідовність МУ СКУ знтудтіла «ЙО иа у она РІЗНІ ФУНКІНІ чі ш «ий 4Р..11)
За» Певна амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краще бле ябо Туг, ще краще Туг «ай . йдія «912 РІЗНІ ФУНКЦІЇ «аю» (31... «823 Девма амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краще Ре або тує, ще нраще Туг
ВМО и кляті «пух АН ВУНКАІЙ хай» 451,.45) «23 Певна вімінокислогта, бажано цем пбо ВАе, краще ви хабо» 45 ха зіу Хай Уаї Хаз Дер ї 5 хах0оз 45 «ХМ 7 «айв фер
Зх Штузма послідовність «шах «8232 Послідовисть УН СОКЗ внтиплд «830х -
ЗЦавуцниг «331» ІВНЕФВУНКЦІЇ «йша» (81..(93 Я хв23» Дезма амінокнолота, бажано ароматична гмінокислота, краще Ре вбо тТук ще краще Тук кеВ» й «Вшжх РІЗНІ ФУНКЦІЇ хайше» 414), сем: т ; ;. В ді . р ттЯ3» Перма амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краще Ре або Туг, ще краще Тук «ЙО» ваце 07
. е зав-пивстТ ве яти. їх «ззах РІЗНІ ФУНКЦІЇ хийх» 15,5 ака» Певна амінокислота, бажано ем або рне, краще їв «аО0з 45
Авр Хза біу Кава уаї Хай Лер й ь 5 «210» 46 «іх» 10 «Мій» фр стру й : сах Штучна послідовність «ай» «й» Послідовність МН СОВ3 антитіла «ах о «3312 РІЗНІ ФУНКЦІЇ , «й» (4у:-(4 «ЙЗ3 . : ; 5 ях Певна амінокиспота, бажано ароматична амінокислот, краще бе або Туг, ще краще Туг «В» . «раз» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «Яйз (бр. (Бі я що . -. - твя3» Певна амінокислота, бажано арстматична амінокислота, кваще Рпе або Туг, ще крани Тут «Шабо я «23315 ВІЗНЕФУНКЦІЇ я: пиши» (8)..(8) 593» Певна амінокислота, бажано оч або спе, краще це «4005 46
Аїв Акту АвроХва Оіу Хаа Маії Хаа Авротує ї 5 їй «оз аз «Вії» В «НіЗз фр кя1х Штучна паслідовність «ух «2832 Послідовнить УН СВІ антитіла «йо» 47 бпУу тТук бек Ре Тих біу Тух ТЕ 3 5 . «їй» яв «ал» В «Шамо Ффрт хяї3» Штучна послідовність чив» «заз» Послідовниль МН СОВІ антитіяв
Тацце 23 з342-БОРСТ веж тав, кЕ «вий . , . «ЗЗї» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «пай» (В..48) 5883» Повна амінснислога, бажано ТНг, Зег або Пе, краще ТВг й «Ф0йх 48 і її Авю Рко Тух Ав сО1у 01У Хав х в сїі10х 48 «312 5 «юій» Фет тах Штучна послідовність кий» , «вда» Послідовність МОСОКЗ амтитійв «вай, «Вила ОРІЗНЕФУНКЦЕ «ай» (31..8) тя» Певна змінокислога, бажано 58і збо Ав, краще бег «их що п «ції РІЗНЕФУНИКЦІЇ япй» 13Р.,13, тяВЯ» Певна амівокаслога, Бажано Тут, 5ег, Не, Ахп або Ту, нранце Туг, Заг або
Азп, ще крвще Аки «Ох сш « «3315 РІЗНІ ФУНКЦІЇ «й» (4.8) їЖеА» Певна аміномислота, бажано Зег або Ту; краще Туг «4002 489 пха Ххва Хва Хай ро 4 У «из Бо «їз 7 «хі» ру «КМЗ ; : :
Штучна послідовність «230» «ха» Послідовність М. СОВА вітитіла я хиб» и. м «33їх ВІЗНІ ФУНКЦІЇ хиВя: (3...
ТВ» Певна аміномислота, бажано бек або доп, краще бег «230» й «0» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «вій» (4), 14) х2332 Певна амінокислота, бажано Туг, бег, Це, Ази або ТНг, краще Ту, ет або
Ап, ще краще Ази че
РБаце 24
. заж-чавСТ ве 5ТО5,КкЕ «Ва РІЗНІ ФУНКЦІЇ " сах 35) .,.15) «ий32 Певна амінокислота, бажано заг або тує, краше Тут «400 50 чіп о Аку хХаз Хаа Хваа рхо рхо ії 5 «а» Б «Мі» 10 «из «Фр вх» . -
З Штузна поспідовіність «Зх хааїз» Послідовність М. СОВЗ знуйхтійа «ках - «паз» ВРІЗНІ ФУНКЦІЇ кава (81.14, «893» Певна амінекислотв, Євжано бот збо Ап, кран баг «вад» «зва. 0 РЕНІ ФУНКЦІЇ «Яд 45);..(5) 27 є й х ; є - - -: хла3з певна вміномислота, бажано Туг, 5ег, Ме, Ах або Тр, краще Тут, Зег або
Ап, ще країце Д5и каб я «Зз3ї» РІЗНЕ ФУНКЦІЇ «ша 63,..45) ко тях . - дод п
Хе Певна амінокислота, бажано бегабо Тут, краще Туг «А0П0Оз 51 іп бів АхУ Хва Ха Хава о Рко Рко ТгротОК 1 У ї6 «йїйх БЕ «Ці» 5 х8318з фрт
ЗХ» дітучна послідовність «хай «а83» Послідовність М. СОВІ дититіла «ий» ха пит «Заіз РІЗНЕ ФУНКЦІЇ кийй» (4..(4 93» Повна амінокислота, бажано 5ег або Доп, краще ЗЕ «400 52 лих пйпех Ууаі Хда Тут
Х
1 5 «б 5
АЙТї» З «НА ФР
Раце 25
342-БУРОСВ вза ВТО. КЕ Ї 8132 Штучна послідовність І кВ» «ай» Послідовність МІОСОВО витітійд «00» 53 йву Те Бех ї
Раче 26

Claims (35)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб одержання антитіла проти СІОМб, яке зв'язується з СІОМб або його антигензв'язуючим фрагментом, причому спосіб включає етапи: а) культивування клітини-хазяїна, трансформованої експресуючою конструкцією, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, і експресуючу конструкцію, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, де експресуючі конструкції присутні в одному або декількох експресійних векторах, в умовах, у яких клітина-хазяїн експресує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент; а також б) збір препарату антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, експресованого клітиною; де: () послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує області НСОКІ, НСОК2 і НСОКЗ важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 34, і послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує області І СК1, ГСОоК2 і СОКЗ легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 35, де НОСОК! складається з амінокислотної послідовності ЗУЗЕТОУТ (5БЕО ІО МО: 47), ідентифікованої в 5ЕБЕО ІО МО: 34, НСОК2 складається з амінокислотної послідовності ІМРУМОСТ (ЗЕБЕО ІО МО: 54), ідентифікованої в 5ЕО ІО МО: 34, і НСОКЗ складається з амінокислотної послідовності АКОУСУМІ ОМ (5ЕО ІО МО: 55), ідентифікованої в 5ЕО ІЮО МО: 34, і де ГСОКІ! складається з амінокислотної послідовності 555 (5БО І МО: 56), ідентифікованої в ЗЕО ІО МО: 35, І СОКа2 складається з амінокислотної послідовності ЗТ5 (5ЕО ІЮ МО: 53), ідентифікованої в 5ЕБЕО ІЮО МО: 35, і ЇСОКЗ складається з амінокислотної послідовності ЗОЗОКБІМРРУМТ (5ЕО ІО МО: 57), ідентифікованої в ЗЕО ІЮО МО: 35; (ї) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує області НСОКІ, НСОК2 і НСОКЗ важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 36, і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну область легкого ланцюга антитіла, містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує області І СК1, Зо ГСОоК2 і СОКЗ легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 37, де НСОКІ складається з амінокислотної послідовності ЗУЗЕТОМТ (5БЕО ІО МО: 47), ідентифікованої в 5ЕБЕО ІО МО: 36, НСОК2 складається з амінокислотної послідовності ІМРУМОСТ (ЗЕБЕО ІО МО: 54), ідентифікованої в 5ЕО ІО МО: 36, і НСОКЗ складається з амінокислотної послідовності АКОМСЕМІ ОМ (5ЕО ІО МО: 58), ідентифікованої в ЗЕО ІО МО: 36, і де ГСОКІ! складається з амінокислотної послідовності ЗЗМ5У (5БО ІЮ МО: 56), ідентифікованої в ЗЕО ІО МО: 37, І СОКа2 складається з амінокислотної послідовності ЗТ5 (5ЕО ІЮ МО: 53), ідентифікованої в 5ЕБЕО ІЮО МО: 37, і ЇСОКЗ складається з амінокислотної послідовності ОЗОК5МУРРУМТ (ЗЕО ІО МО: 59), ідентифікованої в 5ЕО ІЮО МО: 37; (її) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує області НСОКІ, НСОК2 і НСОКЗ важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 38, і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ділянки І СК, ГСОоК2 і СОКЗ легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 39, де НОСОК! складається з амінокислотної послідовності ЗУЗЕТОУТ (5БО ІО МО: 47), ідентифікованої в 5ЕБЕО ІО МО: 38, НСОК2 складається з амінокислотної послідовності ІМРУМОСІ (З5ЕБО ІО МО: 60), ідентифікованої в ЗЕО ІО МО: 38, і НСОКЗ складається з амінокислотної послідовності АКОЕОСУМІ ОМ (5ЕО ІО МО: 61), ідентифікованої в 5ХЕО ІЮО МО: 38, і де ГСОКІ! складається з амінокислотної послідовності ЗЗМ5У (5БО ІЮ МО: 56), ідентифікованої в ЗЕО ІО МО: 39, І СОКа2 складається з амінокислотної послідовності ЗТ5 (5ЕО ІЮ МО: 53), ідентифікованої в ЗЕО ІО МО: 39, і ЇСОКЗ складається з амінокислотної послідовності ООКОТУРРУМТ (ЗЕО ІО МО: 62), ідентифікованої в 5ЕО ІО МО: 39; або (м) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує області НСОКІ, НСОК2 ії НСОКЗ важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 40, і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ділянки І СК, СО і СОКЗ легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 41, де НОСОК! складається з амінокислотної послідовності ЗУЗЕТОУТ (5БЕО ІО МО: 47), ідентифікованої в 5ЕБЕО ІО МО: 40, НСОК2 складається з амінокислотної послідовності ІМРУМОоСсе5 (5БО ІЮО МО: 63), ідентифікованої в 5ЕО І МО: 40, НСОКЗ складається з бо амінокислотної послідовності АКОУСУМЕОМ (5ЕО ІО МО: 64), ідентифікованої в ЗЕО ІЮО МО: 40,
І СОК1 складається з амінокислотної послідовності БХОММУ (5ЕО ІЮО МО: 65), ідентифікованої в 5ЕО І МО: 41, ЇСОК2 складається з амінокислотної послідовності 515 (5ЕБЕО ІЮО МО: 53), ідентифікованої в 5ЕБЕО ІО МО: 41, ії ЇСОКЗ складається з амінокислотної послідовності ООМКММУРРУМТ (5ЕО ІО МО: 66), ідентифікованої в 5ЕО ІЮ МО: 41.
2. Спосіб за п. 1, де зазначеною клітиною-хазяїном є лімфоцитарна клітина, еукаріотична клітина-хазяїн, клітина СНО, клітина М5/0, клітина НЕК293, клітина НЕК293Т, клітина рослини, грибкова клітина, дендритна клітина, В-клітина, клітина СО5, клітина К562, клітина НЕГА, клітина дріжджів або клітина комахи.
3. Спосіб за п. 2, у якому зазначена клітина-хазяїн є клітиною СНО.
4. Спосіб за будь-яким із пп. 1-3, у якому зазначений експресійний вектор містить промоторну послідовність, лідерну послідовність, послідовність ініціації трансляції, константну область легкого ланцюга, константну область важкого ланцюга, 3'-нетрансльовану послідовність, послідовність поліаденілювання або послідовність термінації транскрипції.
5. Композиція рекомбінантних нуклеїнових кислот, яка містить нуклеїнові кислоти послідовностей, які включають: () послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг антитіла, який містить області НОСОК, НОСОК і НСОКЗ важкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 34, де НОСОК! складається з амінокислотної послідовності ЗУЗЕТОУТ (5БЕО ІО МО: 47), ідентифікованої в 5ЕБЕО ІО МО: 34, НСОК2 складається з амінокислотної послідовності ІМРУМОСТ (ЗЕБЕО ІО МО: 54), ідентифікованої в 5ЕО ІО МО: 34, і НСОКЗ складається з амінокислотної послідовність АКОУСУМІ ОМ (5ЕО ІО МО: 55), ідентифікованої в 5ХЕО ІЮО МО: 34, та послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує легкий ланцюг антитіла, що містить області СО, СО2 і ГГ СОКЗ легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 35, де ЇСОК'1 складається з амінокислотної послідовності 55М5У (ЗЕО ІО МО: 56), ідентифікованої ЗЕО Ір МО: 35, ЇСОК2 складається з амінокислотної послідовності 515 (5ЕО ІО МО: 53), ідентифікованої в 5ЕО ІЮ МО: 35, а /СОКЗ складається з амінокислотної послідовності ООМКБІМРРУМТ (ЗЕО ІО МО: 57), ідентифікованої в ЗЕО ІЮО МО: 35; (ї) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг антитіла, який містить області Зо НОСОК, НОСОК і НСОКЗ важкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 36, де НОСОК! складається з амінокислотної послідовності ЗУЗЕТОУТ (5БЕО ІО МО: 47), ідентифікованої в 5ЕБЕО ІО МО: 36, НСОК2 складається з амінокислотної послідовності ІМРУМОСТ (ЗЕБЕО ІО МО: 54), ідентифікованої в 5ЕО ІО МО: 36, і НСОКЗ складається з амінокислотної послідовності АКОМСЕМІ ОМ (5ЕО ІО МО: 58), ідентифікованої в 5ХЕО ІЮО МО: 36, та послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує легкий ланцюг антитіла, що містить області СО, СО2 і ГГ СОКЗ легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 37, де ЇСОК'1 складається з амінокислотної послідовності 55М5У (ЗЕО ІО МО: 56), ідентифікованої в ЗЕО ІО МО: 37, ЇСОК2 складається з амінокислотної послідовності ЗТ (ЗЕБО ІЮО МО: 53), ідентифікованої в 5ЕО ІЮ МО: 37, а /СОКЗ складається з амінокислотної послідовності ООКО5МУРРУЛ (ЗЕО ІО МО: 59), ідентифікованої в 5ЕО ІЮО МО: 37; (її) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг антитіла, який містить області НОСОК, НОСОК і НСОКЗ важкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 38, де НОСОК! складається з амінокислотної послідовності ЗУЗЕТОУТ (5БЕО ІЮО МО: 47), ідентифікованої в 5ЕБЕО ІО МО: 38, НСОК2 складається з амінокислотної послідовності ІМРУМОСІ (З5ЕБО ІО МО: 60), ідентифікованої в ЗЕО ІО МО: 38, і НСОКЗ складається з амінокислотної послідовності АКОЕСУМІ ОМ (5ЕО ІО МО: 61), ідентифікованої в 52ЕО ІЮО МО: 38, та послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує легкий ланцюг антитіла, що містить області БО СО, СО2 і ГГ СОКЗ легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 39, де ЇСОК1 складається з амінокислотної послідовності 5Х5М5У (5ЕО ІО МО: 56), ідентифікованої в ЗЕО ІО МО: 39, ЇСОК2 складається з амінокислотної послідовності ЗТ (ЗЕБО ІЮО МО: 53), ідентифікованої в 5ЕО І МО: 39, а /СОКЗ складається з амінокислотної послідовності ООК5ТУРРУМТ (ЗЕО ІО МО: 62), ідентифікованої в ЗЕО ІЮО МО: 39; або (м) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг антитіла, який містить області НСОКІ, НСОК2О і НСОКЗ важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 40, де НСОКІ складається з амінокислотної послідовності ЗУЗЕТОУТ (5ЕО ІО МО: 47), ідентифікованої в 5ЕО ІЮО МО: 40, НСОМКО складається з амінокислотної послідовності ІМРУМОСс5 (5БО ІЮО МО: 63), ідентифікованої в ЗЕО 0 МО: 40, ії НСОКЗ складається з амінокислотної послідовності бо АКОУСУМЕОУ (5ЕО ІО МО: 64), ідентифікованої в 5ЕО ІО МО: 40, та послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує легкий ланцюг антитіла, що містить області СО, СО і ГГ СОКЗ легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 41, де ЇСОКІ1 складається з амінокислотної послідовності ЗОММУ (5ЕО ІЮО МО: 65), ідентифікованої в ЗЕО ІО МО: 41, ЇСОК2 складається з амінокислотної послідовності 515 (ЗБО ІЮО МО: 53), ідентифікованої в 5ЕО ІЮ МО: 41, а /СОКЗ складається з амінокислотної послідовності ООМКММУРРУМТ (5ЕО ІО МО: 66), ідентифікованої в 5ЕО ІЮ МО: 41.
б. Композиція рекомбінантних нуклеїнових кислот за п. 5, де зазначена послідовність нуклеїнової кислоти кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 34, 36, 38 або 40.
7. Композиція рекомбінантних нуклеїнових кислот за п. 5 або 6, де рекомбінантна нуклеїнова кислота містить константну область важкого ланцюга людини або миші.
8. Композиція рекомбінантних нуклеїнових кислот за п. 7, де зазначена нуклеїнова кислота, що кодує зазначену константну область важкого ланцюга людини, містить послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 24 або кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 25.
9. Композиція рекомбінантних нуклеїнових кислот за будь-яким з пп. 5-8, де зазначена послідовність нуклеїнової кислоти кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність зхЕО ІО МО: 35, 37, 39 або 41.
10. Композиція рекомбінантних нуклеїнових кислот за будь-яким з пп. 5-9, де рекомбінантна нуклеїнова кислота містить константну область легкого ланцюга людини або миші.
11. Композиція рекомбінантних нуклеїнових кислот за п. 10, де зазначена нуклеїнова кислота, яка кодує зазначену константну область легкого ланцюга людини, містить послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 26 або кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 27.
12. Композиція рекомбінантних нуклеїнових кислот за будь-яким із пп. 5-11, де зазначена послідовність нуклеїнової кислоти функціонально пов'язана з послідовностями контролю експресії.
13. Композиція рекомбінантних нуклеїнових кислот за п. 12, де зазначена послідовність контролю експресії забезпечує експресію в прокаріотичній або еукаріотичній клітині-хазятні.
14. Рекомбінантна клітина, яка містить композицію рекомбінантних нуклеїнових кислот за будь- яким із пп. 5-13, де зазначені нуклеїнові кислоти кодують антитіло проти СІ ОМб або його антигензв'язуючий фрагмент, що зв'язується з СІ ОМб.
15. Рекомбінантна клітина за п. 14, де зазначена клітина є лімфоцитарною клітиною, еукаріотичною клітиною-хазяїном, клітиною СНО, клітиною М5/0, клітиною НЕК293, клітиною НЕК293Т, клітиною рослини, грибковою клітиною, дендритною клітиною, В-клітиною, клітиною СО5, клітиною К5б62, клітиною НЕГА, клітиною дріжджів або клітиною комахи.
16. Рекомбінантна клітина за п. 15, де зазначена клітина є клітиною СНО.
17. Антитіло проти СОМЄ або його антигензв'язуючий фрагмент, що зв'язується з СІ ОМб, де зазначене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент одержують із рекомбінантної клітини за будь-яким із пп. 14-16.
18. Спосіб одержання клітини, продукуючої антитіло, який включає стадії: а) трансформування клітини експресійним вектором, який містить композицію нуклеїнових кислот за будь-яким із пп. 5-13, де зазначені нуклеїнові кислоти кодують антитіло проти СОМЄ або його антигензв'язуючий фрагмент, що зв'язується з СІ ОМб; а також б) одержання трансформованої клітини, де трансформована клітина містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг антитіла, і послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує легкий ланцюг антитіла.
19. Спосіб одержання антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, що зв'язується з СІГОМб, причому спосіб включає етапи: (а) культивування клітини-хазяїна людини, трансформованої одним або декількома експресійними векторами, в умовах, у яких клітина-хазяїн експресує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент; і (Б) збір препарату антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, експресованого клітиною- хазяїном людини; де один або більше експресійних векторів містять: () послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить області СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга антитіла, які мають амінокислотні послідовності у положеннях 26-33, положеннях 51-58 і положеннях 97-106 5ЕО ІЮО МО: 34, відповідно; і послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить області СОКІ, СОМК2 і СОКЗ легкого ланцюга антитіла, які мають амінокислотні послідовності у положеннях 27-31, положеннях 49-51 і бо положеннях 88-97 5ЕО І МО: 35, відповідно; або
(ї) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить області СОК1, СОМ і СОКЗ важкого ланцюга антитіла, які мають амінокислотні послідовності у положеннях 26-33, положеннях 51-58 і положеннях 97-106 5ЕО ІО МО: 36, відповідно; і послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить ділянки СОКІ, СОК2 ії СОКЗ легкого ланцюга антитіла, які мають амінокислотні послідовності у положеннях 27-31, положеннях 49-51 і положеннях 88-97 5ЕО І МО: 37, відповідно; або (її) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить області СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга антитіла, які мають амінокислотні послідовності у положеннях 26-33, положеннях 51-58 і положеннях 97-106 5ЕО ІЮО МО: 38, відповідно; і послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить ділянки СОКІ, СОК2 ії СОКЗ легкого ланцюга антитіла, які мають амінокислотні послідовності у положеннях 27-31, положеннях 49-51 і положеннях 88-97 5ЕО І МО: 39, відповідно; або (м) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить області СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга антитіла, які мають амінокислотні послідовності у положеннях 26-33, положеннях 51-58 і положеннях 97-106 5ЕО ІЮО МО: 40, відповідно; і послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить ділянки СОКІ, СОК2 ії СОКЗ легкого ланцюга антитіла, які мають амінокислотні послідовності у положеннях 27-31, положеннях 49-51 і положеннях 88-97 5ЕО ІО МО: 41, відповідно.
20. Спосіб за п. 19, де клітина-хазяїн людини є клітиною НЕК293, клітиною НЕК293Т, дендритною клітиною, В-клітиною, клітиною К5б62, клітиною НЕГА або лімфоцитарною клітиною.
21. Спосіб за п. 19 або 20, де людська клітина-хазяїн є В-клітиною.
22. Спосіб за будь-яким із пп. 19-21, у якому експресійний вектор містить промоторну послідовність, лідерну послідовність, послідовність ініціації трансляції, константну область легкого ланцюга, константну область важкого ланцюга, 3'-нетрансльовану послідовність, послідовність поліаденілювання або послідовність термінації транскрипції.
23. Спосіб за будь-яким із пп. 19-22, де антигензв'язуючий фрагмент є Раб, Е(аб)2, Ем або одноланцюговим Ем.
24. Рекомбінантна нуклеїнова кислота, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, якою є: () послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 34, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 35; (ї) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 36, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 37; (її) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 38, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність з«ЕО ІЮО МО: 39; або (м) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 40, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 41.
25. Рекомбінантна нуклеїнова кислота за п. 24, де послідовність нуклеїнової кислоти функціонально пов'язана з послідовностями контролю експресії.
26. Рекомбінантна клітина людини, яка включає: () послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 34, і послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО: 35; (ї) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 36, і послідовність БО нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 37; (її) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 38, і послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО: 39; або (м) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 40, ї послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 41,
де послідовність нуклеїнової кислоти функціонально пов'язана з послідовностями контролю експресії.
27. Рекомбінантна клітина за п. 26, у якій клітиною є клітина НЕК293, клітина НЕК293Т, дендритна клітина, В-клітина, клітина К562, клітина НЕГА або лімфоцитарна клітина.
28. Поліпептид, кодований рекомбінантною нуклеїновою кислотою за п. 24 або 25.
29. Поліпептид за п. 28, який додатково містить шарнірну область імуноглобуліну.
30. Антитіло проти СГ ОМб, експресоване рекомбінантною клітиною людини за п. 26 або 27, де антитіло зв'язується з СІ ОМб.
31. Антигензв'язуючий фрагмент, експресований рекомбінантною клітиною людини за п. 26 або 27, де антигензв'язуючий фрагмент зв'язується з СІ ОМб, де антигензв'язуючий фрагмент є Раб, Е(аб)2, Ем або одноланцюговим РУ.
32. Антигензв'язуючий фрагмент за п. 31, де антигензв'язуючий фрагмент злитий із шарнірною областю імуноглобуліну.
33. Спосіб одержання рекомбінантної еукаріотичної клітини-хазятна, який включає стадії: а) трансформування еукаріотичної клітини експресійним вектором, який містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту за п. 24 або 25; і б) одержання трансформованої клітини, де трансформована клітина містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту.
34. Спосіб за п. 33, де рекомбінантна еукаріотична клітина-хазяїн є клітиною людини.
35. Спосіб за п. 34, у якому клітиною людини є клітина НЕК293, клітина НЕК293Т, дендритна клітина, В-клітина, клітина К562, клітина НЕГА або лімфоцитарна клітина. Позакліткова петля 1 сім (ЗО 10 МО: З МАБТОТКБІ МТА НОТУ ЕСАТРЕНКМІАЛЕТ МЕТУ ЧАСУЧНЕЗОНМИОСУУОВТО КО СЬОМЕ (БЕО ТО МО: 19) МАБМОБОУВОТАЬАУ ТОМИ ВУМЬСПАТРЕМНВУТАКІСОМІУТВОТІНКООрИМКСУЧОВТО БО сЬриЗ (БЖО рожа: 1) "ВЕИСОКІТСТАБАУ ІСТ ІУССАВЕМНИМВАКІСВМІТТВОМІНЕСОЮМИСУтОКТО З жо храу хх ужиті ду ккукуюєруикко, жу, ук уяянекк о жкниких СЬОМЕ (БЕО ІЗ МО: ОМШСКУТНВ ОА ОАВИВОСУТВОМУАТЕ ІІІ ВОВКСТТСУКЕКОВКАВІЬТ 12О сЬоМмо (5БО 0 МО: 5) ОМОСКУТОВСОАБРОПІЬ ОА МАСІ ВСБЬАВіЬСТІ МАТ ТОВОСТТОЧКОЮСАКАКІУВТ 199 сі0Бм4 (ОКО ТО МО: 19) ОМИСКУТОВЕЬАЬРОСЬОААВАБЧУТЕЕІІУАВЬСУ ВІВ СКСЕВСЬКОЮЗАКВКХМІУ 129 СсЬрМЯ (5ЖО 10 ВО: 1) ОМОСКУТОВСОДЬРОЛЬОААНАСІУТВІЬАВКОСВ ОВУ ІНСУрОгАКАКІТІУ 319 ККУ я зер ре лу вк же, ЖЖ: їх. Позакліткова петля 2 піде (БО І ОМО: 2) БОТУКУ ІДУТЬ КУСИТАНАТІКОК УМ ОАКЕОКВЕ САМУ сКАВОВЬИВІСОСЬ 189 сом ІБЖО 10 МО: 5) ВОУІБЬЬАОІБУЬІВУСИТАНВІ КЮКУНРІМАЕВКВЕрОВВ ОВО ВАВІ МІСНІ 180 сіпя4 (ЗКО їо МО: 39) ВПУУКОАСЬМУТТВУНУТАНМІТОЮКУНВІЧАБЛОКВЕМОАЗруУЄНААВІЬЬиЗОСЬ 180 сьшмЗ (ЗВО То МО: 3) ВПТБРІОАВЬЬТЬХРУВИЗАМТІХВОРХВЕУУВВАСККЕМОАСЬХЧСМААВАТОВЬОА ІТ 19121211, 2: рі КІН УЮМІХ,, жк жжукаяву й жк, я сьоме (Же Ї0 МО: 2) МІСТОК ОпРаНуМавВХВтТЕАВВІВОВЕКТЕ» се їТКМУХ 928 ПОМ (БЕ ЇО МО: 8) ПОСТСВРРОЗЕВСВО ВВ СсТЕІРОВІ ОВ КипУХ І пЬбМа (БЮ ТІ МОЄ ВО; БОСМСБРВУ- З ПКРУБАК З ХВАВНЯВАВДНЯ тиху ОВ СОМІ (ЕКО ОЇ КО: 1) ПІСВСВРВ---ЕККУТАТКУУУЗАКВЕТОВСАВІСТОУОВКОХ? 28 киж, ж, х зх Ж жжж ж
Фіг.
СЕР анти-С.ОЮМб з'єднані и: ле они ни и тори ші ке лу я . в ее ще чативні 000 ! ша щі моя ЕКЗ а шк ная й п, ня не во
Фіг. 2А ОБР анти-Сі че з'єднані нативні ШЕ | т я шк ь Фі 28 авнтих анти. анти- анти». сома сіомнА) сірка) сома) т г З 8 з з 8 8 що ж в й а щ 5 -й ж ен ооо Йой о 5 0 о во по вок шок -к во БУ У т т ту тк з М В в В щ щ Ж Ж ж Ж жо ж ж ж щ м щ щ ш щш пох ЩІ і жккккю З сіоме. сірмз о сірма оосцомв| че Фіг З ізатип анти «С ОМЕ анти СЬСЗ анти ОНА Іі «ВО і Е.І; ша В і МНН; но: їі дя; і ВМ: . Е,тТВШМ хх ВХ ЕЕ" МОВ: іх, ВО ук - туттуєтехі 1 5 о -ПИНММнввооов у т зво 1 5 5 Зоо 1 5 - вової нетранофіковані еВ. й «Б сл и: І ж: З Зв ї 1 ЗОН хх ! пр, і ОПП і 7 пон онвояя : я пон ! Му щи аж ї кеок бу кі і щкожУ щи оту : пох» ох ке М сон ВВ важка СОН. нн НВ. Г проек ПЗУ пр Тов, Клена МО Гоехх давминко пихи Палій хворо ї ХМ урррдооооовосоввсовввя: ! з М 15 зонної 7 кон х но: 10 В-во ї 7 БМ ММввви: кою : пон: 1 "В і ЗЕ: 1 Ху ї- св і з х Пи Н р о: СІри Ве 18" ж 15 Б: ЕЕ ух с: ВН: з 18 ВМО й БОНН: 1 Я ПО: 1Б5- до я 1. : 7 дк: фе У ЕНН: 7 хюя 1 вх тра нефіковані | пом і Н се , В : п, Ї Гоа її о ВВ. роя Тл Ти і яко и і ! У і щи й ще тий Гук ок оці Мн ВВ он ВА ОСС ЯВЯА І Ве ГКУ НУ 001 трек днк ФА ок Ве рев тувка й : ЕЗ В - дах пр Є ів: | «ММ «ЕВ «ЕВ
СОМ. 5 М: к. 5: ЕМ : ПО: . . 1Х о ВХ; Н ще пров хо лох хі ШО: ї «НН: ро - В. їі АВ «МН. фон ож зві Укоций си ок; роож ому ох чор що ві КА окклннннннн НВ ВВА пня в ВВ сні ії ВО: : Зх р і пам: сім і: о і кВ от В «І цц ж ої 1 Б; х ВВ, Ж Зоо т КУМ пово ді а: НЕ дея В ВО і ВО: транефіковані «ва, і кв: - в і 5, М: і о МОХ і і х ННЯ ! : - ау : е ВОВНОЮ ї дк Мои кі ! ЧЕ окон ак, ї «ов ие : кое ом ооКі Кшш-ВЯ Ш- КА і ння КА Ї они ВВА я поли Вол Гек поко ОВ ГБ есе А Бе ЕНН: ; ХНН і и 7 ДМ: : у Кк. : : око у Е ої - Ов Н ооо : дюкокоо ооо: ії же: ще М й ж «БМ : :- швах: : З ЕПННННН В її: ВОМ: З НН: і а НЕ ІЖ ох: 3 ВЕБ: : г КПИИПИИИ о і пої 1: ооо: т ЖМОМввввво транефіковані оз і пом: 15 в: із нем їі ВОЮ і ов і Ох. 1 пох, їх МОМ Не ПОМ Ї оті Те дн і ще осо щи це: ( ко ци ві 1 чу коки кі 1 кое и и: ГО ВА сення сон дн МеВ ТОВ А
Фіг. 4 нн В сома сиром сіоме не : | дрясех Я пут їі зразок пд муєко пд рі трах 3 лико од з ВМО и МОВО ОО, зво оо во овен о вв і Моосоно онов, ВИ Кон ннннняя М НН, і но нн. ГІ 00 Фр кн ОХ ПОМ с ВХ, ї їх в. ї ж ВМ: Н 1 ЕКО | ВЕН: 1 о» - ВМККВВОо зн МО. Мн ко ог Зк 0000 ВОК я щ Ві 7" ее пас п я сс сс я, кз-еб3на і; с 5 У Б В г су, В нн МОУ ДИН нн ОО 0 Ви М 0127, оон вон КІ мно ми в ин ПО В В ОК ВВ ВВ ПОС ї і ЕК В ра р. В пої М, дн кр де ша о и о ооо ко ген т нене вен їх. он вони 2-17 Во ом у і Кия КК ! Мо М: ви НН ! ОВ ШЕ і мі аю с ак ! : п ї ! ! х с ті пт пн ВИННА осо ож 00 ! кох ПІ ЗИ дяді рі гади я яні ї зі росте М її з М «Мою о фол юо що г ВМО їі ВО В у М їі МІ 0 Он М демон: з ВО Нива ЕЕ р ВВ с На сс іш ПО о . . НКУ Доу нос кв і ЦЕ с С КВ 5 ях М ! КЕ 15. ВОМ я: і ММ 0 МОМ А МОМ: Ка-ЯаК КЕ ; ві - дО Во ї й - ООН ВО і ї де я ! Ф З- і: її: ЕЕ: НН | 7 ВМ: ії Ве: и ! Ів с | ен Док вне ПП и ДО я 0 В но і 1. ї. т і; ! і ак ж мими пи ЕН КОКОН ОВ Її ооо то КОХ :
і а. ШКО кб шою кі | ями й : а : АТ ї7 ви 1 пд ининининту і Мо МОЖ інн Мона ВН іно вНоА Мо ВН юн пледи кіп АКОТ с лини чали вжж ня я флюс ввів вають полк. . й хх ізотип Сьоме назуМОМи і ххх ВЗануєко р прут лем ПН і і -. ВОМ су М я і і у Во до 1 "кл оо Зо : 7 ВВ М 010 ЗВ до у ї іш коми 1 0 МО
Ух. ДОКовв ко М ши ВВКОВОВО Кия І! 7 ВВЕ ВЕВВВВ вве | КІ В ММ і Її дО ин С 0 ВОЮ ух
ЕЗ.4СЗ-НА ж 5 І - вн: п в: хі ЛИ ооо : і ВООВНОВО Мовою і -з»шш нн ! шк А - о НІ ко ко. ! їжа її 00 ей їі : ОДПІ ПІП ної Кене Фі, БА
СТ рентна Ада ннн я нут нннннчнннтн рентна ення опюхоеиункх З ннюя і і свя АД мухко : ! бром пи муєко пої ! і хржюгх (Мудеуєхх ЇХ « ВИ МОННМНМННЯ.
Ворон опор дорос росою! оон Моро оодовювовкю й ШЕ: ие 5 ШиИше т ооо ооо о 7 пово 0 оо оо 7 ов по НУ по о сн пої Я ЕЕ і вно вовк і їни и 000 ОО ооо ом.
МО ооо у ов р Ша М. її іч ге ВОМ а п еВ Х Р кг: ВОМ Ох і я ї- ШОЕ с 0 НВ па шин слу М, к3-тВв3.-ВА Ех М : Те ОВО В ГЕщ Ва : С Ма и і па в: І с МНН у М кї Н дО пово : ї 1 о ї ВОоснох ооо і ЕК 1 олово : В КУ НК рн у Оу у МК вовни т КТ Зм вн хї о зо А ! БОМ а 0 МОМ ї "шо: свв і рами її Ме : ВІ ЗМІН і «Ай ох СУ і ! ї : 1 Її Мі ' : і і жо І вн ; аб ОС фі яЙ Мини оно Он ою : ве ве - поминанни Мен Мен ДЦЦІПИПИЦІЦЦЦЦЦІННЯНЯ снення ОТО Кн Др рення ТА т Ан ння ттяну не нн і зго ку срлекко Я і ех Фев пунка рі згахх дужлянка де і І Знаю удумих ПУ З 7 Пк ВО ою М - дО ММ: т ШО ші е ншНи М, : , ВІМБІОМНМНННООХ ої, БмнОМННОООМ о Ши ви І У Мом: Пе ге-- ВО Пе ху У 1 ік ВН і в- ВОМ нх і пе ВЕК су ВОК Вес: | а ВО: ЕЗ-ЗЕТ-АУ яЗ- Вс і-ї пи ем с мно ХО м р в У т: ВО ВИСО ВВ Н По ково і МНК Он ї ОО ДВО и шари: х - МОМ: А ша ню 0 ВО: 1---3 Житлова похо ооо у Жоя Мр, Но ою ---1 ЛЕН Пн З У ЩО о - КВ мовив ! мм ким БОБ "жна і Нв в.
КО КОВО Шо сяк і і : : - І у в, Ї ; й І ск ннвжев і КВН нн іно КН ххх іооевожев Фіг В і Зі я зІщіс теропег і км я се с, сом КНР суще сона ОН . кар т вико ст мий се ТАК нти пути оцту кдд во Доеня а зані В чо Її І зей ЕВ юю 1 2 ях Кік ої ти ї і ще пови: ї І лю ДИ їх ко Кіш орі 1 ОО СоЗВМВЕЕКК ххх ІОВ - ЕК, у ке ідопюті Тс: пої СОВИ хх. ІА ПОЗИТИВНИХ ові Ї5 се й. 1 ма їде Б Б у ОМ: рин Х ЕД Ко Мн М Мі В: хо СА Фо мое щу т МОЖ ней З. ХУ ї М, 15 Ки ОВК ФЕ х ПИ. Н контролі Її ке я ейКИР іх НМ хо: х чи
Щі . ші 15 ММС і а ОД і Те КК ме Малина СМІХ, ли БЕХ нн іти Уж хх Фомо «МеКо Мох хе ох ух хх мжсюню хо понос хх ооо - згдіх Ах й й Оотип пимМАВОК ним ЗА тема В шу, почат нннжжжтьких нн нн дир ух хво. ТЯ то Ж т "Ж схуд Її СОН пах ТО 3 ! ро Я 0 -ї саше Кі КН - 1 ї і ий НЯ 1 У 1 «ЕІ кеш 1 ШУ МЕЖІ: нки ОБО їз рум, ПОШОВ ЗШ і ЕБ' а А 1 ПУ Род о 7 хх ї ї ; Іа Ж да МВА ЕЕ ОК ' БОСЗ, одутісніні рн ВО я -е Думі В М Сх ох З НУ КИ їх В: ХО КМ 0 мВ : З 00 ЕОМ їх що М ' Х МОН 10 ЧЕ ТВО РОКИ ! ко КИ їх ЖЕО 15 МК 1 15 ШУМ . пре зх зро 7 ме ші : МАМ В ко КО Знежс в ба хх М це ит оюю Хек КУЖ я княесняттяни тт ХК дян Адя ння М МДЕ МИМ МУ КЖУЮ ок УК МУКОЮ зх ко ми ки ках. ЗОМе мамою аю дл тюттяннннн ту вітрі пд рт сш ЗЕ ту 3 2 І І вит тлу пе м зааоія го я яд я | шк сей ДН ЗБ о 1 : ох 105 ЗОВ і Ск ї ЕН пюх ї ії шві ха с: аю о ЕН му о и х ї : тоже пк: пи ШИ ОКУ рову шини щи З ши я : Мих Мох Пет ВУ ень яМРИїа3У ОЙ ПК о ОХ з ЗА 1 хх ща Ша їх со р Те з т я БЕ 5 жо й ЗЕ Ж ов | мож : М 2 МО Й сн БМ У сення ВВ вдячна й як У мий МеЧИХ ч хи іо КмХх зо шк с оХКІХККИ Фохе у МюМ УМ сяк : Моя ск і осо Зою ЕК 1 і і ї . : і : 1 і селі : о одроуиї ї « , Її ' і ЩІ : і й і ше 5 сої і і Вч; і : е : КТ ЕЕ м тій Ко их 1. 2-4 їх мекісст о ул АК М з ши ст ши хви у шій М і ях по ей сон хе КС ока ОВ вона ОЇ З КА Я й еВ ха в ш МОЖ 1 ПОН х ОО пої жо вих оо ЗМІ - КОМА МЕНІ ВЕ о зр з біо новб ові ТК Лиюю охК не Кок КК п сллявнь МОМ «ХК СХЮЄ УК охо Ко КуМю ЗИ СИМ ХКЮ ТОЮ ТОЖ б пеки КК дру фидитюннтіу дит пенні же г ї і М зххеоі У і ох й хи Б ак «ох Ж К. Б а ' : ї Е ДО: ха. ї і ше і РЕ Ж мех | І дже Її бе : КЕ і ЩЕ Ек : ик ПА 15 . . и 5, і дн іучевте Зб ах 070.0 1 кат я З Ж юр яр т ІОВ ав ПОС ж кл Я ке Ж ем ХО МОРІ о ха ОККО пюі ув З ПОВ пн З ІІ. 3 р кове хом: РО в, ар: КО піші ой БИКА я зар мої Персея вдо ВИ ХЕ ур ит АЮ он т УЮ ХК ЗХКОх ТОМХ ек яюю я Че ХХ Маю Мдаю ню р по схе дення - дурня : ст детрит зей СЯ охо Б Ї й ше Я де М ! і Н З ї ! ! їх ї і о Ти КЕ 1 її. 5 5 7-4 У 1х Ток ІК ЯК сих п. хх А ун Що В опер дує А М Ж У Зо есеютнн У п осскннн В у мова СЯ Тов зоба х и: - МК по ос ке ф в со НН НИЙ схо осо ОВ Хо жк пр БИ яри ори МЕ Мо жа у ой ЗК 2 5 ер До МЕ Мою св ск КО ок тн МК осн ло хх УМО юю. Хом охо їпххю (ХХХ ох пи хжм Ух ЛО Мою сю мую.
пшМмАВ ВА тА Я ОМА 5 ти МАВ ТА дудиТТ и шити А зи цеуттртттти щи мех Ї сно мою о с пожКо Те спон жі ЩО ж ПОМ і кат я Кох КСО їж 1. ув Мк. Ї ПОЕМ іш В дик паю оС ни Ши ШИ ШОЙ ШИ х хх Кг ПІ їз п ЖЖ : ОКА ї М захв ІЗ хр Вр Ск ке п 5 КО зо Де долях іСМОоМмО « ПВ їж ОВ х ПО: 15 КО ї ОН ПОН шо 5 еВ і х ЦІЛ Ід кі І БК і Ж Кит і ни о Н , чи ті Ком і оо ї тім: | зак ром ії ЩА Че З срме | з МТУ жк жу юМ по кед может ТАКА у ую Кук житякнту чо хо шМ МКМ ЦКМ У М МОБ Мою МОЮ обл» Мао нах хх КО оо ком охо де шиті 0 фуру щі Не з кий - і. са зеюих м щу жа сив х солод Б: їз с Я їх хм с сама с тоолі Пр рок КОН до м ОО о те п х БЕ 5 ще ЕМ СОМ. Хо 1 КО. ТО до» КК КОЖ п КВ: ; , Є НКТ ння по Дня шо ПО : те ання МЕЧ ЯЗУ х КМ Ж УК Ех ох В НН Пе " Во: . Мами. ' в ово ЩЕ В МИТ ІВ КОЛІТ - ' КК: її о х р Ко ! ШИК рот чу ЩО Ул дух що кіс змі пф щі ВВЕ ск 0 нн МЕ в нн во Б нн т ща кю мою ух зп ХМ лк кою хо нку сю юка 53 МК ХХХ МК здлддтннндчнннтнннняття др о дурня оду туя КА пан Ук «ке і та соухд я хо ї ї : І І їж ї Ух ; ! Ї сх Її їж ї І шршжюої і І духо : і їн, ! Їде
- 1. й д.д М І А Ж М. бе й Обі полей 5 пня. тк, пря (бомауЯ по ї. дя я ям Пити, ка Ом ї мих Є дю реву М Мем В Три куючри КУ поле у о п В Ж пи В й пив ї Кроква Е о С З р порве ввВя У я В В 1 У тод КА ОК В Х те їх с рок ОТ ОККО У ОКИС ОК ери Ох ПОМ Ж ей жк ОХ БК ай / ОН УКХ ОВ ЩЕ: к 5 Пуми зу ПЕВ ХА ин Енн ЖЕ іти У очлх мб м ХК -к о ую ЗХ юю Я Зх МУМ МКМ НК зи о омю цем нау» хо прмдллнтлунлнлаанА Няні УК кя уяв ерудит зло КК сМНИ нКЖКЮ ЩХ і пМх яку зу Ї м м дювкле Ї ХА х ! ті ! т і Її е і і Не но іще : Меню і 6000 шк ї дІтВ Ж пня - й ще 1 Кк Мо я р, й и І о че шт Бо, Які я Бей ші Ух Я булку У ПО суєти ОК у пеки ето Х Ме КИМ х по п й ап. В р по вом "ВІН оо ССО ПКВВВВВВВВ. са Тр ПОБУ ОН: У. Х що М | ше 7 ОМ ТЕО т і я «й ЩА КИМ, ТЕ ксянквов ЕМ оденВ Я рин ЗА днесь т МК 4 ю ОЖух пух омюю МХхю Зх МО Ми ХХ пххщд: МОМ соб цююю Моро ДЕ дж тр ,. Шу шо С плиту лю 3 м пухка космхеї ! ее ї - і І « і І з. : І во І ад хо : ти до, : Же І око: ! Е - 4 ІЕЕ її 34 їх фени 23 5 ня са ек Фоудюі у ВВЕ май пи щей Ж жі прода же хто СОВА п сну екю Му ер я он ІК По х КВ ко нео а ОВУ І ОВ. Мо по ОВО с Зв з комуни я ОО: ХО х МИТ КУ ПОМ шк Б ШЕШЕ Й ООН ях ОО, кої с саві пф. МЕ ше и ММК Ви : ПЕВ до пустотні ш М нн ЗУ ян ПИЙ ха СЮЗ ЧК С ВХЮб Зхю Ум: М аж ххх Муха УЖ МХУ Мах) дик, ко ха пе мХю ххх; хни Фі 8 (хонтр) нє "В ВЗМАВ ЗНА ль льотні ся т дення з -жк» ПЗАМАВ ВОД, ш а й яке МАВ ВО Ж 5 с Ж пло ленню тот КААККААААААА АКА ннінкнтенанючоя - доню нн ЕНЕШНИХ - пмМАВ 8А й фе СИ в т 2 г : в к пУАВ БА е й У вх я Я а фанат Я тимМАВ БОБ В у, . а пУМАВ ОА ГА щи х я - я х дожиоюододіооогооооооеосоовося с 2 я У ій гЗжНИЙ я Кс 2 Х 5 й . й МЕ З фусхогостєвоееетосаєтєтєєтєєчн нт В 1000 20000 Зоо г тка агат Кануентрація гнЕлмМл)
Яд лиж нн сн ян юж ніж ок жу жо кр кі Ж Ал АЛа АА, ЛА ЗАА МАР А А ЧАЙ ЧАР АК А ЧАЙ. ЧАК ВА, А, ЧА Чі Рірь А н ченю Рі МН. ЧК чин пінь Ріко ча Р Є НЄ ЖЖ тю ет Ж м еп сх да теє т вехтю же тех сою жк юю ою ктежткх сн кл, ЛА ДЛОВЦВННЮ ВВ КТ па тести че песткчт чтого тп пото ме пат пе пот че тя ми МАВ ОА з зоняно у дднннннчжтннннннонсюееснкессн В Як о тлиМАВ ОА - з ддннонткнтткдннюттететнтся К м я ролнннс ке пи МАВ ВО і че пишМАВ бай в р . з «м опи МмМАВ БА ФО ВО век онов я КН ннннннннннтняя - в, що ; В ти МАВ БОБ Ед Ще Ні нн в М -к Дрю Др м мл ся ххх ж дж лето лих ето ТЕ ТеС Ро Те ЕЕ РОСТЕ РЕБЕР ЧЕ Ро об хек пох ОБ тех оо юю пек тт ее окт, те ек ою яю я в ! Що ЇВ и і ш ЗД ЯК мли ля ек желе ее тет пек одотві пох то, зок пох фло хек дою ох ток сь дж Зою оси ех ек єю єю юю є юю жу что хіт юю єю юю ж б ї Я ще фе княже тютюн тк те че тю тт те вуж яю полня вч жк тя чен тя за ! п лАРА МЕРЕ РРОРЕ ЗЕ РР РА ВВАЖАВ РЕ ЄЮ Р Фо ЯН ЧЕН фі тю ніж Фе якіх іні пінні доб ок тож ж, бю нію бі тіж вх дя жк жа кля что ВА; ЖК хкя кжх жо ска я ї ї ЖЕНЕ Аа АНА АНАЖХ АААААААА КАНАТ АААААВАААААНРАНТННАААААААААНАААА, В кю ооо зоб ее ко Концентрація (нглмл)
Фіг. 8 МЕСВ МЕС УТ 5 «ч Друсестните є чию учи и жи жу чу и ул ючих юних и ни п тоМАВВКА х тьмАВоза я пиМАВОВА тв со Ж ще м х хх ще х в ІВ ів Ку ІВ В З З а В |; ж ко як 1Ж НІ: хо її З як 15 18 щ- ЕО 5 З 5 ї Ж 15 І 1 ЕВ З 1 че ча зо ОН НхяКК 7 15 щю нНякЕ о ню ОО БААКХюЮ Концентрація (вгмл) Концентрація (нг/мл Фе З ранмне лікування - МЕСЯ раннє лікування - ВЕС точ ень і: ло в День В нд ва День 14 Е ХЕ х КІ В «5 СД з М за дач де Е ге В в В 25 і --к ух є) о їз ку НУ й в ; о З: т х Об о ЙО коду дО ех ще «є я ж що є т « « В Ж ї ї . т я В: В Я Б 5 5 ВЕ : о ж НЕ я в в вд ЕЕ В й Б Б Я 5 Я Ж ЕЕ В В ЕЕ є раннє пікування «- МЕС ранмне лікування ях МЕСЯ День хі День 28 пе Ва лав З 4 х їх оно реЯшК; М ї х її хЕ це роз -
Б. док
Ге. т шо 5 їі У
«ої. Я Фенікс нн і от з їх ВЕ 8» З 5 ІБ: ЕЕ Ж ЕЕ Б Б БЕ х х я нг о пе ВЕ ВЕ ЕХ ав Сьоме ОЦ с : МЗ сьома сома фр вишня рлянннн т щої рення, рення зе о, і От ! . от, і А негативний хе їз й о В : ; шк і ІК що ЦЕ і ОК : хонтроль тр ок ЇЇ жів ' в, ! Я ! хоожх ! Я п ' Її ! и у і знійж їжі і хі і і і х рота і Ну і ж ФК ект КВ. ке оюнтуюннтнтняя ЗВО і КІ: ! мом омюз мохом "фе сх оюжюхо зу що кою пою ее пі з! і і о-и КЕ 5; 51 о, ; ку і і Н Ал позитивний КІ ; Й жі Я . грі «ді ОР зді Бо з, гі Контроль о» ПЕ Ї Но НН ! г ТО РО як Бо щі НЕ їх рі М І 1 З їі ' ще і ГІ : о | і гі й ї ї К х 1 ї У Н ' й І З и А днини ї щі. х | Ї й х У М сю МОм ие ик Щ Голиня теє клини? нова ав ал пові Фоожю чех ой ою 355 їхЖ НМ БЮ 7 ах ко чехи рн 00 пря денне, патини, те) ко. ї «и і тої : ПОРО, і; ! І В : : о й ЕВ ' л : світАВ НО ". ОЇ ев рев Я : Бр: 1 КЕ і і і
Р. хі і КОН ! ! рі і т Гео он В жі; : ГУ я. Па | 1 і
4. дення пкт пня В ласти еВ ОХ | і ї : У у; ше юю є сечею З. ЖБК. учення пит пк У пддян и І 35 СМ М мах ПКюю яОКмО УМО юне об ХМ ЛК бою у тдх не цех хо доб рання, рення ши руд ! С як і : ; ; «5 пен Зк ЕЕ ха рок і А і ж ! | й з ож В : НАВ ВА г: Бі ек ; РоОяокв і Рі і І ТР ЇЇ ле і ХВ і НН і че Іі Її їосхеіжа і ее; | і і НИ | о і С | р : ех ІА і КВ ох : У І нею, «хе М стнятняняні 5 КВК. уче де з четтнн абс. х , с тоб мкоо охах мо жк охо хор МО СЮОМхУ МК оожх Опуояже Хоб ою хе птн дннчттттттстяннну пп Ї СТЕ оооююй є пеяняннннння вд хі я ох -ї ! їх і яю ке, | їй ! : з і : МК Кі і НН і свіщаАВ А Бору «ої ОО і г: за і В З їі : тк Про шк Її ж : і р: ка Ї Же ї щи : і : ; М : й і Й окуня РЕ: в чи МОХ кох ї по б сттреттстьо, 0 овен ВА он ренктентнян 1 Ую/ М ЗИМИ МО. ю б: кю охо нал АААААААня, ї Дитину Кт пит зі А кі ром ше: в К яю їі ! А і й . 3 : щ ї | : Ї світа ВЯА Н ка у и і ЩЕ Щь В і НЕ і і КЕ: аю І; ! її м НІ хо ВВ і вно у ! х КЕ 15 , ; Ї водну ЗК оленя шо в ' М Я У ом охюю по иєне пу б кине пллт тні тжчіноуєттений МУ й О1Хю схо Чо МКО ну зада Зо м з ете
Зв'язування з НЕК293-СІ ОМ що ня по дддонинненнтнннсннненеюнннннннт Ве ОЛІТАВ ВТО
Ф. 10000 Ін -- СВІТАВ А Е Ки ов -8- спітАВ ОА я Б Ж ж г ай і і ся рай іш з Фф Жю0И о во 04000 ОВ вопа 0 ЗО0000 Концентрація (нг/мл) Фі 12 Зв'язування з МЕСЯ ШК ЖОВ й КЗ | ей 7 СПАВ о ов дня СВІПАН БА я " --- опітАВ ВТА -- Ж а спітАВ ВЗА оон є Зою М Я 2-х щ с Фу ще з 0 2000 8000 дос водою 40009 Концентрація (нг/мл)
Фіг. 13 Зв'язування з СУ90 о 280004 . ! -е- сітАВ БО т х
Я. 200004 динею - В спітАВ ВВА 5 що. -йе ОЛНИПАВ ВАТА Я Х б й 2 300004 " | -й Ф и ще ФВ в зба Я боб ВООб 40000 Концентрація (нг/мл)
Фіг. 14
МЕСВ дикий тип МЕС нокаутні ІС ОМ6 позитивні) (СОМ негативні) Не а Ж спимо вх Б свколе вд Ж сплав вод Й сбаФе А й ОП опи кю її лвтав Я 8 спопАВ ВтА -- В сво ЗТА шт 8 тк К г З їз я
З. 5 Б В Я 5 5 Ж я с: "т г. 5 як. ЖК тк - Е в 3 Ж Б 3 З Е З - В В В в 5 А в В 5 В. В пою Я - В В в В е З В К о 5 В я о зо ши! що 31 ! фр В.Я В Вінн «- ША 2 2 «З З ЗК ї 100 За КОЮ 1 о 1000 КОЮ Концентрація (нг/мл) ! Концентрація (нгмлі Фі 15 МЕСЯ дикий тип МЕСВ нокаутні (ОМ позитивні) (СОМ мегативні) Же оч Й сота пай Ж спитав Що слокАН ВА Я сивая ТЕ ондтвв ВФУ Цовчеваню я кікове ВгА - 80 орікжа ятА - п ій а ро : ро х З щі я й жі в З З т ОО В по - я В 5 5 - Ж Ж й В ш х ; х Б Ж В Б В ж ; як В 8 В 5 Во ях я в В В Ж 49 Е : хх в ж В й В ш - ро : я 5 - ко щи ш 1. в І 5 8 8 5 8 о ї а | їз Ом 2 Ж й В В 8 2 . т ВОК ; : ЕВ щ ж Ж В г ЩІ й : с - Як. ще Ж: я » г В У. і - ; Б В В ож І | ШЕ 5 Ме сенси Вони ун. сну З а. в Є и ун сне сннвВв 1 вк КОЮ ВЕК Ю 1 Зо КО ЕХ КНЮ Концентрація (нглмл) Концентрація (нг/мл) Фіг 16
Ріст пухлини - РО5 контрольна група Ріст пухлини - ти МАВ 810 яко миша » мишаї 258 як миша? ко в мищшай о ! | і зе мтшаз я о о миша Е ЯВИ 0 лікунання ; ; що клея по дове лікудання -оомкнай х І Же хе мищаб га 5 мишай 2 150 в ; . -ш 5 Фо мущеЗ Я Во Фо уко й 4 мища З Би їі З миша? ш ЗБОб я ГГ, Я сишзї 2 лов і ши В о і я іх ко машай х | фокиша В й 55 Я я Що мдшаЗ З є З ще окищше З ДН нн я бони ю о і Девпь День Ріст пухлини «ти МАВ Б4А ріст пухлини - пуМАВ 87А зо мужлаї в куда 48205 о миша 28 о маша Й "а во зиюмаЗ б бе мущша З ЩОО2ОБОЇ нити т нка? ЗОН ану Ж озмишай - жкккки З « - і св х миша? Ж : я мищай Е з - мишай Е Н | 8 мищшай м - Гая 4 х. Ж душа ї 0- 8 Ушсаї її зов миша? 2 зов і г - фо ослищо В - : й меща 5 - і мая ГК в ха Фо машай по БНО Ж миша З З Фо сяшаій о Ж о мища В ТОВ во о ВО ВОВК О- ВВ фі офу кдд ою ВВ, сонвв а фбврнева ав. НВ и и оо. о 5 КІ ї па 155 День Дянь Фіг 17 (А Раннє лікування - МЕС Раннє лікування - МЕСВ Раннє пікування - МЕС шк День 730 те День? вк День - 7х І че х а? З «щі ох Х зва 2 ж - Ж ї и ш 2 Кон Б де Ї Зх, і х х 3 м 5 і Ї я в ш КІ з - ох є ї х мно ню 2. і ша ЗА о скккндвектн тт о 3 З ! з спліт тя и пеенннкнннннн Ка ся ДЕ есесссссеосссстрдовюдодюдеде діжки (рболнллнжлих до кратне ідевютсннтя мех ш їх хх я У 5 х я їЕ - Ех З З Кк Е Е Ріст пухляни - РВУ контроль Вірт пухлини - ту МАВ 83А -еомуишаї де з коми Мина хе , Мише т ЯМУ -коминий 5 є чо мищаЗ Е й що ЯВОе ліхусохих ВІ х пімучохма ожоа З х Ї.ововввавак ей ко зх Ж Хо пеки ш ук Ж усві воно вів яко кожна Я М Зах й) яко мищеб 5 і .
є 3. ДЯ 7 Щ «хв і яко свя 5 2 й У 1 в Й й мив 2 і комеще 5 й чо , Е і , Фома й ь мен - чем З Фосмши? їй 5 а вкомешай хх 1 У х: ї - 1 й омеший Зп Я і р о іхурх щ 2 5 Ж вані се Ф пк 2 і як маша с» в. маних я фіни фо пт за : Якоеха 5 те 358 ОН вн в яв вав вве День День Фі 185
Покращене пікування - МЕСВ Покращена лікувамня - МЕСВ Покращене лікування - МЕСВ Девь 15 - початок імунотералії День о Дечь 34 « чо 2 ВИЗ - ЩО. га х : 5 ж ве фомщля: є Зв Е ; з тя я т тити ня З во . х Ж Кк з В Б доз х з: ВЗ я КУ ще, х и СВ Ж Зо що 7 х тих т Що х Е вими а 2 Ге мих а - з - п ся з 7 КО 2 Ма я вий о ог АААААКААААНХ « х таза. а ЩО ШО) ния с КК пли А 5 2 ж о Щ" пу хх й я о з Зх Ту з пи з х тт З Др пт окт а корміпякнннннютлечк нта п ТА Я вин й : ї ! ї Е : ї Е 5 Е Е ву В : у ї Бо д Ж фіг 19 Ріст пухлими- Антитіла, хонтроль о, Релтопукпини - ти МАВ БА Ріст пухлини - РЕ контроль як юною жоюища з миші ох ВК текхваних ; хкомхкяй од зкуяаиня у оминає обж ж рісузжчих мишах х І як мм х 1 як вишах ре ї нер зе миша Х ! к яки Б зо і зомишка Ж і 7 і як мищая не і ! Р х оо: ві як хмкоцюв Е зм ї хкмуцкйї х Я й; ; як іщно й Х Й й ! і Фмнща й хх і Е й | як мий Е ЗЕ Гн Фк Ж.
НИ оо Є Я й / ї кока? В в у з коми я и М о де босих Дін і ожив Є 1 5 К ік не д до і дя мона що ! я у о аа, 5 Її а мир «БВ рок ким ооо вні Пе КУ «р он ондулін крб трюнину се УКВ В ук пою вовною - ї до че ча 5 зе 2 з ха . 55 ще ке В щК З у З 8: м День Девь День (В) Виживання з ква яке -- Дититіпа, контрапь к їі. а ШО МАВ БА д ІА - 5 Бе Зежху й Д е К дожодеяннетиннякнкькй го й в й В 28 ха 53 во ве День фіг 20
Покращене лікування - МЕС8 Покращене лікування - МЕСВ8 День 17 - початок імунотерапії День 24 ет. З -е 35 Б Е ха з щі «г В х х - ях да о бе з А 8 х 2 єї -к зи па » с: ЗО к 4 - ри
5 . а по з х 5 ПО б а я зебр сввіюх 2 ої кад Ю м К й о Зх й 9 цто с Ку о і З ТОббнх ях щ а х у --х ве х З В в 5 Б В т 8 5 5 8 Г- 5 т а 5 р я к « е х З З З я З З З з Е ХЕ Е 5 І Е Е І Е ї 5 Ж Покращене лікування - МЕС Покращене лікування - МЕСВ День 38 День 48 бе хх те ща з 5 2 Ф а омеруюте 5 ШО фути тя стю тю кт - ВО щ- б Ж я з а В 1 2 Й з Е т 5 м М х З де е 2 с ш Б з е п Стор нею стр - с в. - д ти кет ді бо пе вх о й п бо стей о » в о І: є т її а
А г. З їх ї «г З є к Е З Е Е Е КЯ х Фіг 21 Ріст пукпини « РВЕ комтроль В Ріст пухлини - Антитіла, контроле тв 4 ЩО лес : з 5 не сносх щі Я а Ж и 0 п нявх З ви хек г МІВ вн І Ма, ш їх мишах Ж з ЯН мушу Цолкао ВИ жи МЕЗО СХ кв ще Як май Ж й Й р М яв де 7 М дах дв дек - Є за и Кт М осо о ан ия са Вдровсе ОВК си жжжжжжжютжтя іш У Ба як зе З Я З «8 а з День День Ріст пухлини - ти МАВ ЯЗ Ріст пухлини - мишач МАТ ЯТА Ріст пухлини - мишачі мАт ВА муці й ї миша Мох ТНК ву я МЯК об ЗВО В Е містах явні зп пелет в РУ я меце» Ж Е титуваних Якомлиму ра ОХ. кКЬКАУ. - МОХ укемай Ве еосюоююююєькккки . Мих у ЖКУ ОЗ В ки ж Мимах х і ; моно Ж І : з мих я В зи мУша В х Н не ш х ; З коми ях доча ях дов ! й жищах ку я ХК зве ев ій онко Ж ? Б че й - КО щ чо У день День День Фік 22
Виживання Е : Й же Антитійа, контроль хі із і з пиМАВ ВЗА г де а зх З у -у
; у. Як ТПВ МАВ ВА хх х ЖКККоКвь. віх Е у ч я во і їй лиИМАВІЮ З і і.
Ф. і; З нннЯнян як пн в 2 | г
8. ;
і Й. у. Бона ооюсогюссой ! е з ! Я ок ос ає «Фоюсвок «с Й ! :
В . День
Фіг. 22 (продовж. Покращене пікування - МЕСВ Покращене лікування - МЕСВ Покращене лікування - МЕСВ пи я вс ік така т - дея Дане» - початок імунотевапії День 28 День ЗВ тд ТККХ . ми хо їЕ і ЕН і я '
Е . яви ; Ж З « «в | 5 як . і е Щ- ЗВ; і що як « що | 5» и ЕЯ ко г і У Б ' х х ок й У зв ее ЗЛИЙ й Ж 5 йо юю З їж і с и Є х шок 87 ро ох т - З тт а З ї от А ї у в Е заж ; ШФоояя шофен ! ТУ нні» Ко ук в ША в мох рок «о пі М 8 : ІА бо акне р нь ще В до, ка КА ТЯ од М рох "у ш 7 МА ж 5 ж а ЗХ КИ з Ор В Кох 5 обои Б о с З сюбасня сн х нь і (Дн (дінки тодпонкДнкнуннх дод ве ко ееефрюєткюттеттететкжюєююєтетя ї кох У х й хх ії й Ех - Е ко Ж о Ж 5 55515: 55 т 85 5: 88 795 83 282 88175 5 5 я Ж я 55 - 8 5 я Я 5 З Ех Еш хв є ГА КО є 5 Ка 5 й я : х г їх х х . Е ' 8 Е ї Е ї : шо 7 ШИ ї рі ї ЩН Ме з Й АХ ї с в і МЕС І з стіякиМ яко Ж ОМЕ Я аспоуким ко е МЕПОВ з стійким фо ОМ екжвуУния і МОБ мохВУММ : «ДУМ нокаутом Фіг 23 п ЕС зв 27-81 НИ ОТО підішднк у т дів кві и я пи ие вима с То ік я ем міш кА А ' й СД КИКкУТАКІСНЕ УМАЯУМУЕЬЖМ СУ УТ МОСКВИ АВ РЮЮТЮВАНІ Іназва іленкерюи зо нрав ака яп я: но Зі яв ав кт АВіНа в, ПІВОа М В ВІ КВОТ ВУ ВА? КИ Ве ит Рита ТіК Мт УВІ ИВВХ щі й у. А Ь - ї Ь Зв дк сер февніннн нн і ; ; у і Е ; і Ь : і : М- , ; щ- ; м- : тет ЮК и щини вк Брак и Ов ЕВ т КЕНЕ кри осіоада ак КР РРО ВВ В В хх БЕ РаЖК 11, ГРІ: Блер Кн В ВЕК НЕННЯ КМЗ ВА ХР ІКІ ЇЇ Р; В В В : ГРІ : ! ЖІХ х І ж рр ЕТ | ГБ в ми Вітя ШтереннаВ ВАВ ІХ КІ 1 І В В ХК ах ЗЕ оте УКР В.Я ЯВВК 2 орні в вні з : ох рр рих хі Бр рох т НН КА ма МІ НН АН ВИ А В МАН НО А НИ НИМ Е НА НК НО | в крава 3 ун прото рт рнодиня рнрр КМКи пер Го стіт АНА по вУЮРІ УГАЕАСКНЕ Назва 7 черпає нтрня вро віхи і мо чн оно вірно зкюсю хокею він сінна: 1 І рі рі рр: и по, . теетянінтнннтнинннтн певен вн жі змінений трамспорт до мембрани птнаснюда аа: і п | й сет фетр сф і немає впливу на зв'язування аититіпа іона АВ | і НН і р: Ер це У тет фр фреонів рн НУ у "язуванни вті г стві ВА ' ! й й Пр і) сприяє зв язуванню вититіта Ех пишшшшшши тити В суттево для зв'язування вититійа МЖК ння Денніс винен сно ненні нні ння Единий нин енд Фік 24 рт фтт А ААААААЛАВАНАНАХ З ВМО ЦЕ НЄоРЕЬУКРСАБиКІВСКАВееКТИ ПМИМНУКОяКЕКЛЬЕВІСИ ВУСІ УВОКЕКСКВА ТтУТІВКоБЕТауМЕЬсЬТЕ ЗА ОНА (І ЕУСЬОЮБОРЕЬУХРСА НК ВКА ОУЕН КОН оКНЬЕМІОЦНРІНОСТ УВОКРЕНКАТЬТУВКЕ Ва ТАУМЕи МЕ ОНА ПКУ СБООБОРЕБУКВСАЕЕКІ СКАТ КТЕХ ЦЕХУ КОВКОКНиЕКІ НИ ХЕ КОСОВІ МОКЕЖСКАТЬТУуЄКИВТувЕВісЬ ВЕ сажа ПІЕУОМЮБСВЕЬУКРОАОНКТВСХ НЕ УПТРТСУТМИКУКОВНСКНЬЕВІОЦІНРУКОС ТІ УКОКККОКАТЬТУЮКУВОТАХМЕЬЬЗЬТОЕ птн негиз рн днина ниття о ТОК оурттт тт нот нио (ж; ОБУ ОАКОСТУЬ ст НЕ ТМ ОБАУТУЗАКНУОКУСО та БОБТТЬТУБЕ НА ГЯ ЗЗАЖКХОАВОКСХТЬ в БИОТТЬЕУЕЗ НА (З ПІАУТУ АКОТ СУУРИМЯСОСТТЬТВ5 Копеала ПМ БУАУТТ АКОТ ї- боЗТТОТУу5Е Фіг 25 З МО (Б ОІТБТОБЕАІКОВаРСЕКТТ ІОВ ВЕКУУ КРОК ЕКЬНе ІНЬ БУрАКТИЗ ев иТі МИЙАЕПААТУТО М З НА ПІОЦУАТОВРАРНОАЛРСЕКУТІО АВК ННКРООКВОТОЕКЬКІ СТІН ЬАОСУВАКРАЗ ВОЗІВ ТІЗКУВАКОВАТУ ТОЮ ЗОБА ОрОБЧЬТОВРеМЕЗІРОоЕКУТІТС КАВОВІ МНЕРО КРОКОМ ОНАЗ БУВаВРОВВОЛОТВІ ЗІЗ ВАЕВБАТИНИО Я ОА ПР ОТУВІООРАТНІАДВИВКУХІТСЗАЦОВ ММК ОЬКРОТ КВК, БІУБТЕМЬВЕЛУРАВРЕОВО СТВІ яВМЕАВ ВААТІТЦОЮ Сопежюх 1) ОТТВТОШРАТНОЗАВВОЕКУТІТСВВ ОМ МНН ООКРСТВРКВНІ ОТО АЕСУВАВУВсЗОВИТВ БІТ ВЕАВОААТОЮЮ ІБ ОННБ ХРРЕНВОСТЕЬКІЕ ІА ГНН АЗІТРВИНУСВОТЕЬЕТЕ ЦМА БИНДІМІРВМЦСОсТЕВЕТК БА (ЗПУКНМУ РИ ЦУСОВІКЬВІК Копбемию МОНАХИ ДеоСКІКЬКІК
Фіг. 26
UAA201805468A 2009-11-11 2010-11-11 Антитіла, специфічні до клаудину 6 (cldn6) UA128302C2 (uk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26020209P 2009-11-11 2009-11-11
EP09014136A EP2322555A1 (en) 2009-11-11 2009-11-11 Antibodies specific for claudin 6 (CLDN6)
US36161810P 2010-07-06 2010-07-06
EP10006956 2010-07-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA128302C2 true UA128302C2 (uk) 2024-06-05

Family

ID=43480734

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201207057A UA117799C2 (uk) 2009-11-11 2010-11-11 Моноклональне антитіло, специфічне до клаудину 6 (cldn6)
UAA201805468A UA128302C2 (uk) 2009-11-11 2010-11-11 Антитіла, специфічні до клаудину 6 (cldn6)

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201207057A UA117799C2 (uk) 2009-11-11 2010-11-11 Моноклональне антитіло, специфічне до клаудину 6 (cldn6)

Country Status (29)

Country Link
US (5) US9487584B2 (uk)
EP (3) EP2499161B8 (uk)
JP (3) JP5889196B2 (uk)
KR (4) KR20210130250A (uk)
CN (4) CN102741289B (uk)
AU (3) AU2010318316B2 (uk)
BR (1) BR112012011143B1 (uk)
CA (2) CA2775373C (uk)
CY (2) CY1120300T1 (uk)
DK (2) DK3305813T3 (uk)
ES (2) ES2649389T3 (uk)
HK (1) HK1253300A1 (uk)
HR (2) HRP20171749T1 (uk)
HU (2) HUE035516T2 (uk)
IL (2) IL218628B (uk)
LT (2) LT2499161T (uk)
ME (1) ME02943B (uk)
MX (2) MX347150B (uk)
NO (1) NO2499161T3 (uk)
NZ (2) NZ716587A (uk)
PL (2) PL3305813T3 (uk)
PT (2) PT3305813T (uk)
RS (2) RS60168B1 (uk)
RU (1) RU2675997C2 (uk)
SG (2) SG10202110692WA (uk)
SI (2) SI3305813T1 (uk)
UA (2) UA117799C2 (uk)
WO (1) WO2011057788A1 (uk)
ZA (1) ZA201202418B (uk)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6358588A (ja) * 1986-08-29 1988-03-14 Toshiba Corp バ−コ−ド読取装置
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
NZ594480A (en) 2009-02-20 2013-11-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer
AU2010318316B2 (en) * 2009-11-11 2016-01-14 Astellas Pharma Inc. Antibodies specific for Claudin 6 (CLDN6)
EP2404936A1 (en) 2010-07-06 2012-01-11 Ganymed Pharmaceuticals AG Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo
KR102128027B1 (ko) * 2011-05-13 2020-06-30 가니메드 파마슈티칼스 게엠베하 클라우딘 6을 발현하는 암 치료용 항체
AU2012258087B2 (en) * 2011-05-13 2017-07-20 Astellas Pharma Inc. Antibodies for treatment of cancer expressing claudin 6
CN103320381B (zh) * 2012-03-23 2015-04-15 上海市儿童医院 一种多能干细胞表面标志物及其用途
US9758591B2 (en) 2012-08-24 2017-09-12 The Regents Of The University Of California Antibodies and vaccines for use in treating ROR1 cancers and inhibiting metastasis
RU2678127C2 (ru) * 2012-11-13 2019-01-23 Бионтех Аг Агенты для лечения экспрессирующих клаудин раковых заболеваний
BR122020024124B1 (pt) * 2012-11-13 2024-01-30 Biontech Ag Agentes para tratamento de doenças cancerosas expressando claudina
EP3027208B1 (en) * 2013-07-31 2020-06-24 Biontech AG Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
WO2015014376A1 (en) * 2013-07-31 2015-02-05 Biontech Ag Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
PE20160870A1 (es) 2013-11-06 2016-09-09 Abbvie Stemcentrx Llc Anticuerpos anti-claudina novedosos y metodos de uso
CN113307873A (zh) 2013-11-11 2021-08-27 中外制药株式会社 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子
JP6726656B2 (ja) * 2014-04-01 2020-07-22 バイオエヌテック セル アンド ジーン セラピーズ ゲーエムベーハーＢｉｏｎｔｅｃｈ Ｃｅｌｌ ＆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｇｍｂｈ クローディン６特異的免疫受容体およびｔ細胞エピトープ
MA40921A (fr) * 2014-11-05 2017-09-12 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-cldn et procédés d'utilisation
US11154615B2 (en) 2014-11-11 2021-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region
MY196869A (en) 2016-06-27 2023-05-05 Univ California Cancer treatment combinations
EP3556771A4 (en) 2016-12-07 2020-04-22 Osaka University CLAUDINE 5 ANTIBODIES AND MEDICINE CONTAINING SAME
US11053313B2 (en) 2017-05-08 2021-07-06 Osaka University Anti-CLDN-5 antibody, and drug containing said antibody
WO2019048040A1 (en) 2017-09-06 2019-03-14 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh ANTIBODIES USEFUL IN THE DIAGNOSIS OF CANCER
WO2019065964A1 (ja) 2017-09-29 2019-04-04 第一三共株式会社 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
US11952422B2 (en) 2017-12-05 2024-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137
EP3735463A4 (en) * 2018-01-05 2022-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha THERAPEUTIC AGENT INDUCING CYTOTOXICITY
WO2020075325A1 (ja) * 2018-10-09 2020-04-16 公立大学法人福島県立医科大学 子宮体癌患者の予後予測バイオマーカー
CA3129834A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-20 Integral Molecular, Inc. Claudin 6 antibodies and uses thereof
CA3134055A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 The Regents Of The University Of California Claudin-6 antibodies and drug conjugates
US20220168440A1 (en) 2019-03-25 2022-06-02 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-pyrrolobenzodiazepine deprivative conjugate
BR112021023173A2 (pt) * 2019-07-10 2022-01-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Moléculas de ligação à claudin-6 e usos das mesmas
CN111087465B (zh) * 2019-12-24 2020-12-08 广州医科大学 一种针对密蛋白6的抗体偶联药物及应用
TWI770917B (zh) 2020-03-31 2022-07-11 日商中外製藥股份有限公司 密連蛋白６靶向多特異性抗原結合分子及其用途
EP4302777A1 (en) * 2021-03-05 2024-01-10 Shanghai Genbase Biotechnology Co., Ltd. Anti-cldn6 antibody and use thereof
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
JPWO2023053282A1 (uk) 2021-09-29 2023-04-06
WO2024022512A1 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Claudin-6 binding moieties and uses thereof
US12049502B2 (en) 2022-11-30 2024-07-30 Integral Molecular, Inc. Antibodies directed to claudin 6, including bispecific formats thereof
CN116064622B (zh) * 2023-02-13 2023-10-13 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 Claudin6-mCherry报告基因CHO-K1稳转细胞株制备及应用

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
US5830755A (en) 1995-03-27 1998-11-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services T-cell receptors and their use in therapeutic and diagnostic methods
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5677139A (en) 1995-04-21 1997-10-14 President And Fellows Of Harvard College In vitro differentiation of CD34+ progenitor cells into T lymphocytes
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5928631A (en) 1997-06-09 1999-07-27 The Procter & Gamble Company Methods for controlling environmental odors on the body using compositions comprising uncomplexed cyclodextrins
US20020127584A1 (en) 1997-09-18 2002-09-12 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US5932445A (en) 1997-11-07 1999-08-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Signal peptide-containing proteins
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
NZ510464A (en) 1998-09-01 2004-05-28 Genentech Inc Further pro polypeptides and sequences thereof
WO2000026360A1 (en) 1998-11-03 2000-05-11 Adherex Technologies Inc. Compounds and methods for modulating claudin-mediated functions
JP2002532083A (ja) 1998-12-17 2002-10-02 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ４７個のヒト分泌タンパク質
AU3479700A (en) 1999-02-22 2000-09-14 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Genes associated with diseases of the colon
PT1185648E (pt) 1999-06-22 2007-06-29 Genentech Inc Métodos e composições para a inibição do crescimento de células neoplásicas.
AU2883700A (en) 1999-06-23 2001-01-09 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1067182A3 (en) 1999-07-08 2001-11-21 Helix Research Institute Secretory protein or membrane protein
PL201086B1 (pl) * 1999-07-12 2009-03-31 Genentech Inc Zastosowanie przeciwciał wiążących się z antygenem CD20
WO2001053312A1 (en) 1999-12-23 2001-07-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001051513A2 (en) 2000-01-14 2001-07-19 Corixa Corporation Ovarian tumor-associated sequences
AU2001249622B2 (en) 2000-03-30 2007-06-07 Massachusetts Institute Of Technology RNA sequence-specific mediators of RNA interference
AU6531101A (en) 2000-06-02 2001-12-17 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2412211A1 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Genetech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
JP2004514420A (ja) 2000-07-20 2004-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードする核酸
AU2001271973A1 (en) 2000-07-20 2002-02-05 Kevin P. Baker Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
CN1468250A (zh) 2000-08-03 2004-01-14 ��ķһ����˹��̹ 在转基因动物中产生人源化抗体
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2633413C (en) 2001-06-20 2012-08-21 Genentech, Inc. Antibodies against tumor-associated antigenic target (tat) polypeptides
JP2005500034A (ja) * 2001-06-20 2005-01-06 プロション バイオテク リミテッド 受容体型タンパク質チロシンキナーゼ活性化を遮断する抗体、そのスクリーニング方法、及びその使用
CA2379661A1 (en) * 2002-03-28 2003-09-28 Kursad Turksen Paracellular drug delivery system
AU2003230874A1 (en) 2002-04-16 2003-11-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP1594447A2 (en) 2002-10-02 2005-11-16 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
CN101928344B (zh) 2002-10-17 2014-08-13 根马布股份公司 抗cd20的人单克隆抗体
WO2004060270A2 (en) 2002-10-18 2004-07-22 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AT500651B9 (de) 2003-05-27 2010-04-15 Altropus Gmbh Aktiv immunisierender antikörper
CA2528669A1 (en) 2003-06-09 2005-01-20 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US20080305493A1 (en) 2004-03-08 2008-12-11 Avalon Pharmaceuticals Determining Cancer-Linked Genes and Therapeutic Targets Using Molecular Cytogenetic Methods
US7431927B2 (en) * 2005-03-24 2008-10-07 Epitomics, Inc. TNFα-neutralizing antibodies
ITRM20050297A1 (it) * 2005-06-08 2006-12-09 Univ Siena Anticorpi diretti contro la proteina basica della mielina che riconoscono un epitopo del cd64 e uso di essi come immunodepressivi.
WO2007024715A2 (en) * 2005-08-19 2007-03-01 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
EP1790664A1 (en) * 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
EP2486941B1 (en) * 2006-10-02 2017-03-15 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human antibodies that bind CXCR4 and uses thereof
EP2087103A4 (en) * 2006-11-13 2011-01-05 Hoffmann La Roche ANTIBODIES MODIFYING CANCER DISEASE
WO2008114733A1 (ja) 2007-03-16 2008-09-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 抗Claudin-4抗体
EP1997832A1 (en) 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
WO2009025759A1 (en) * 2007-08-17 2009-02-26 Progenics Pharmaceuticals (Nevada), Inc. Tight junction proteins associated with infection and entry of hepatitis c virus (hcv), methods and uses thereof
WO2009028663A1 (ja) 2007-08-30 2009-03-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 抗Claudin-3抗体
EP2060583A1 (en) 2007-10-23 2009-05-20 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
SG187457A1 (en) * 2008-01-11 2013-02-28 Univ Tokyo Anti-cldn6 antibody
US20090258096A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Bionovo, Inc. Anticancer Methods Employing Extracts of Gleditsia sinensis Lam
EP2352764B1 (en) 2008-10-14 2018-03-28 Ablynx N.V. AMINO ACID SEQUENCES TARGETING HUMAN CD4 and CXCR4, CCR5, TLR4, ALPHAV INTEGRIN, BETA3-INTEGRIN,BETA1-INTEGRIN, HUMAN ALPHA2-INTEGRIN, CD81, SR-BI, CLAUDIN-1, CLAUDIN-6 AND/OR CLAUDIN-9, RESPECTIVELY, AND NEUTRALIZING VIRAL ENTRY
DE102009026960A1 (de) 2008-12-18 2010-07-01 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur Steuerung einer Bremsbetätigung eines Hybridfahrzeugs
EP2221063A1 (en) 2009-02-20 2010-08-25 Ganymed Pharmaceuticals AG Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer
NZ594480A (en) 2009-02-20 2013-11-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer
EP2322555A1 (en) 2009-11-11 2011-05-18 Ganymed Pharmaceuticals AG Antibodies specific for claudin 6 (CLDN6)
AU2010318316B2 (en) 2009-11-11 2016-01-14 Astellas Pharma Inc. Antibodies specific for Claudin 6 (CLDN6)
EP2404936A1 (en) 2010-07-06 2012-01-11 Ganymed Pharmaceuticals AG Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo
AU2012258087B2 (en) * 2011-05-13 2017-07-20 Astellas Pharma Inc. Antibodies for treatment of cancer expressing claudin 6
EP2605017A1 (de) 2011-12-16 2013-06-19 Protagen AG Markersequenzen für gynäkologisches Malignom und deren Verwendung
EP2875046B1 (en) 2012-07-19 2020-02-26 Amgen Inc. Human btnl3 proteins, nucleic acids, and antibodies and uses thereof
RU2678127C2 (ru) * 2012-11-13 2019-01-23 Бионтех Аг Агенты для лечения экспрессирующих клаудин раковых заболеваний
JP6726656B2 (ja) * 2014-04-01 2020-07-22 バイオエヌテック セル アンド ジーン セラピーズ ゲーエムベーハーＢｉｏｎｔｅｃｈ Ｃｅｌｌ ＆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｇｍｂｈ クローディン６特異的免疫受容体およびｔ細胞エピトープ

Also Published As

Publication number Publication date
PL2499161T3 (pl) 2018-03-30
US10745477B2 (en) 2020-08-18
KR20190031335A (ko) 2019-03-25
EP2499161A1 (en) 2012-09-19
JP6502992B2 (ja) 2019-04-17
CY1123192T1 (el) 2021-10-29
HRP20200591T1 (hr) 2020-07-10
BR112012011143A2 (pt) 2016-11-29
IL246710A0 (en) 2016-08-31
IL246710B (en) 2020-05-31
NZ734307A (en) 2020-05-29
US20180162938A1 (en) 2018-06-14
CA2775373A1 (en) 2011-05-19
JP5889196B2 (ja) 2016-03-22
SG10201500975YA (en) 2015-04-29
MX2020011790A (es) 2020-11-24
KR101960509B1 (ko) 2019-03-20
CA3050655A1 (en) 2011-05-19
AU2010318316A1 (en) 2012-04-26
WO2011057788A1 (en) 2011-05-19
US20120308478A1 (en) 2012-12-06
NO2499161T3 (uk) 2018-02-03
LT3305813T (lt) 2020-05-11
KR20210130250A (ko) 2021-10-29
RS56502B1 (sr) 2018-02-28
DK3305813T3 (da) 2020-04-20
SI2499161T1 (sl) 2017-12-29
KR20120115226A (ko) 2012-10-17
MX2012005444A (es) 2012-06-19
RU2012123995A (ru) 2013-12-20
RS60168B1 (sr) 2020-05-29
IL218628B (en) 2018-12-31
ME02943B (me) 2018-10-20
ES2649389T3 (es) 2018-01-11
DK2499161T3 (da) 2017-11-27
HK1253300A1 (zh) 2019-06-14
AU2010318316B2 (en) 2016-01-14
HUE049404T2 (hu) 2020-09-28
EP3305813B1 (en) 2020-01-15
CY1120300T1 (el) 2019-07-10
EP2499161B8 (en) 2017-10-25
KR102317098B1 (ko) 2021-10-25
HUE035516T2 (en) 2018-05-28
JP6125604B2 (ja) 2017-05-10
CN106432500A (zh) 2017-02-22
CN106432500B (zh) 2020-06-02
KR102126964B1 (ko) 2020-06-25
KR20200075903A (ko) 2020-06-26
JP2013510808A (ja) 2013-03-28
US9487584B2 (en) 2016-11-08
JP2017140041A (ja) 2017-08-17
US20160222125A1 (en) 2016-08-04
US9932401B2 (en) 2018-04-03
BR112012011143B1 (pt) 2020-05-19
ZA201202418B (en) 2013-06-26
CN105348389B (zh) 2019-12-20
AU2016202235B2 (en) 2017-12-07
IL218628A0 (en) 2012-05-31
EP3689911A1 (en) 2020-08-05
US20200339677A1 (en) 2020-10-29
CN102741289B (zh) 2016-08-03
LT2499161T (lt) 2017-11-27
US11858988B2 (en) 2024-01-02
EP2499161B1 (en) 2017-09-06
PT3305813T (pt) 2020-04-22
AU2018201640B2 (en) 2020-04-30
EP3689911B1 (en) 2024-08-21
AU2018201640A1 (en) 2018-04-05
PL3305813T3 (pl) 2021-04-19
CN111875703A (zh) 2020-11-03
PT2499161T (pt) 2017-12-05
NZ716587A (en) 2017-10-27
CA2775373C (en) 2019-10-29
CN105348389A (zh) 2016-02-24
ES2784483T3 (es) 2020-09-28
RU2675997C2 (ru) 2018-12-25
MX347150B (es) 2017-04-17
UA117799C2 (uk) 2018-10-10
CN102741289A (zh) 2012-10-17
JP2016047845A (ja) 2016-04-07
CN111875703B (zh) 2024-06-04
US20240092896A1 (en) 2024-03-21
EP3305813A1 (en) 2018-04-11
HRP20171749T1 (hr) 2018-01-26
SI3305813T1 (sl) 2020-07-31
SG10202110692WA (en) 2021-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA128302C2 (uk) Антитіла, специфічні до клаудину 6 (cldn6)
JP6637083B2 (ja) 癌の治療のための抗体
KR101960004B1 (ko) Cldn6 생체내 표적-지향된 항체를 이용하는 암 치료법
JP6748282B2 (ja) 癌の治療のための抗体
RU2816850C2 (ru) Антитела для лечения раковых заболеваний, при которых экспрессируется клаудин 6