KR101960004B1 - Cldn6 생체내 표적-지향된 항체를 이용하는 암 치료법 - Google Patents

Cldn6 생체내 표적-지향된 항체를 이용하는 암 치료법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CLDN6을 발현하는 세포와 관련된 질환, 특히 암 및 암 전이를 CLDN6에 결합하는 항체를 이용하여 치료 및/또는 예방하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 종양 세포 표면의 CLDN6에 대한 항체 결합이 상기 종양의 성장을 억제하는데 충분하고 종양 환자의 생존을 연장시켜 더 오래 살게 한다는 것이 입증되었다. 또한, CLDN6에 대한 항체의 결합은 기형암종 또는 배아 암종, 특히 고환의 생식세포 종양과 같은 CLDN6 양성 생식 세포 종양의 성장을 억제하는데 효과적이다.

Description

CLDN6 생체내 표적-지향된 항체를 이용하는 암 치료법{CANCER THERAPY USING CLDN6 TARGET-DIRECTED ANTIBODIES IN VIVO}
암은 전세계적으로 건강을 위협하는 심각한 질병이며 여전히 주요한 사망원인이다. 암세포는 이들이 기원하는 비악성 세포와는 실제로 생물학적으로 차이가 있다. 이러한 차이는 암의 발현 과정 중에 획득된 유전적 변경에 기인하며, 이로 인해 무엇보다도 암세포의 분자 구조가 정량적으로나 정성적인 측면에서 변경된다. 이러한 종류의 암과 관련된 구조는 특히, 유전적 생성물인데 이러한 생성물의 발현은 악성 형질전환이 일어나는 동안 유도되거나 증가된다.
면역계는 2가지 별도의 양상, 즉: 선천성 및 후천성 면역을 통해 세포를 인식하여 파괴할 수 있다. 선천성 면역 성분은 대식세포, 천연 킬러(NK) 세포, 단핵구 및 과립구로 이루어진다. 이들 세포들은 세포 형질전환과 연관된 분자 패턴을 동정하여 여러가지 사이토카인과 염증성 매개체들을 방출한다. 선천성 반응은 후천성 면역반응에 존재하는, 외래 항원에 대한 기억 능력이 결여되어 있다. 면역계의 이러한 기억 능력은 림프구 상의 수용체의 존재로 인해 부여되는 외래 항원에 대한 특이성으로도 나타난다. 항원 제시 세포(APCs) 역시도 후천성 면역반응에서 어떤 역할을 하는데, 즉, 이들은 외래 항원을 사로잡아서 이들을 주요 조직적합성 복합체와 관련한 림프구에 제시한다. CD4+ T 세포는 MHC 클래스 II 분자와 관련하여 항원을 인식하여, 항원을 사이토카인에게 방출시키는 수용체를 생산하며 CD8+ 림프구(세포독성 T 림프구; CTLs) 또는 B 세포를 활성화시킨다. CTL은 세포 매개형 면역의 일익을 담당하며 MHC 클래스 I 분자와 관련하여 제시된 세포들을 세포자멸사 또는 퍼포린(perforin) 매개형 세포 용해를 통해 세포들을 제거할 수 있다. T 세포 매개형 면역이 항종양 반응에서 핵심적인 역할을 담당한다는 것은 정설로 받아들여지고 있다. B 세포는 면역글로불린 방출과 관련되어 있으며 따라서 체액성 면역계의 일부분이다.
면역 기능은 적절히 조준 및 증강될 경우, 이를 이용하여 악성 병변을 치료적으로 제어하고 심지어는 제거할 수도 있다. 암 발생과 관련된 유전적 및 후천적 변화는 미생물 항원과 유사한 방식으로 면역계에 의해 인식되는 항원을 생산한다.
항체는 암 치료에의 사용을 위하여 임상에 성공적으로 도입되었으며, 지난 10년에 걸쳐 종양학에 있어 가장 전도 유망한 치료법으로 등장하였다.
암에 대한 항체에 기초한 치료요법은 종래의 약물과 비교하여 높은 특이성 및 낮은 부작용 프로파일의 잠재성을 가진다. 그 이유는 항체에 의한 정상 및 종양성신생세포들 사이에 정밀한 구분과, 작용 모드가 세포독성의 면역 세포들의 모집(recruitement) 및 보체 활성을 비롯한 적은 독성 면역 항종양 메커니즘에 의존한다는 사실이다.
클라우딘(Claudin)은 상피조직 및 내피의 타이트 정션 내에 위치하는 막관통 단백질(integral membrane protein)이다. 클라우딘은 두 개의 세포외 루프를 가지는 4개의 막관통 단편과 세포질 내에 위치하는 N 및 C 말단을 포함하는 것으로 예상된다. 막관통 단백질의 클라우딘(CLDN) 패밀리는 상피조직 및 내피의 타이트 정션에 중요한 역할을 수행하고, 또한 세포 골격의 유지 및 세포 신호 전달에 중요한 역할을 할 수도 있다.
본 발명자들은 CLDN6이 다양한 암 조직에서 발현되는 반면, 정상적인 비암성 조직에서 발현되는 경우는 태반으로 국한된다는 것을 발견하였다. 이러한 암의 예로는 난소암, 특히 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암(SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 포함하는 폐암, 특히 편평상피세포 암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저 세포암종 및 편평 세포암종, 악성 흑색종, 두부 및 경부암, 특히 악성 다형성 선종, 육종, 특히 활막 육종 및 암육종, 담도암, 방광암, 특히 이행 세포 암종 및 갑상선 유두암종, 신장암, 특히 투명세포 신세포 암종 및 유두상 신세포 암종을 포함하는 신세포 암종, 결장암, 회장암을 포함하는 소장암, 특히 소장 선암 및 회장 선암, 고환 배아성 암종, 태반 융모 상피암종, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형종 및 배아성 고환암, 및 자궁암, 이들의 전이 형태와 같은 암을 들 수 있다.
또한, 본 발명자들은 CLDN6을 발현하는 온전한 세포 (intact cells)의 표면에서 CLDN6와 특이적으로 결합할 수 있는 항체들을 제조할 수 있었다. 이들 항체들은 CLDN6 이외의 클라우딘 단백질, 특히 CLDN3, CLDN4 및 CLDN9을 발현하는 세포나 또는 이들 CLDN 단백질들 중 어떠한 것도 발현하지 않는 세포에는 결합하지 않는 것으로 관찰되었다.
본 발명자들은 종양 세포 표면의 CLDN6에 대한 항체 결합이 종양 억제를 유의적으로 억제함을 입증함으로써 이러한 관찰결과를 확립하였다. CLDN6로 형질감염된 종양세포와 형질감염되지 않은 이종이식편의 종양 성장의 생체내 평가 결과CLDN6에 대한 항체 결합에 의해 매개형 CLDN6-형질감염된 세포의 종양 성장이 특이적으로 억제된 것으로 나타났다. 뿐만 아니라, CLDN6에 대한 항체 결합은 내재적으로 CLDN6를 발현하는 종양 세포의 생체내 종양 성장을 억제하는데도 충분한 것으로 입증되었다. 이것은 CLDN6에 대한 항체 결합이 종양 성장을 억제하는데 효과적이라는 원리증명(proof-of-principle)을 확립하는 것으로서, CLDN6이 CLDN6의 표적화에 의해 종양 성장을 억제하도록 설계된 치료 항체의 매력적인 표적이라는 증거를 제시하는 것이다.
또한, CLDN6에 대한 항체 결합은 세포내에서 인간의 CLDN6 양성 생식세포 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적임으로 해서 CLDN6에 결합하는 항체가 고환의 생식세포종양과 같은 생식세포 종양을 표적화하여 사멸을 유도하는 선택적인 치료제로서 유용하다는 것도 입증되었다.
따라서, 본 발명자들은 생체내 종양 세포 표면의 CLDN6에 결합하는 항체가 종양 성장을 저감시킨다는 최초의 직접적인 증거를 제공하며 CLDN6에 대한 특이적인 결합이 종양 성장을 약화시키는 치료적 중재(therapeutic intervention)를 결과시킨다는 증거를 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명자들은 생체내 종양 세포 표면의 CLDN6에 결합하는 항체가 종양 환자들을 더 오래 생존할 수 있게 하여 수명을 연장시키는 결과를 낳을 수 있다는 증거도 제공한다.
따라서, 본 발명은 CLDN6을 발현하는 세포와 관련된 종양 질환, 특히 CLDN6에 결합하는 항체를 이용한 암 및 전이성 암을 치료 및/또는 예방하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 종양 세포 표면의 CLDN6에 대한 항체 결합이 해당 종양의 성장을 억제하여 종양 환자를 더 오래 생존하도록 하며 수명을 연장시킨다는 것이 증명되었다. 또한, CLDN6에 대한 항체의 결합은 기형암종 또는 배아암종, 특히 고환의 생식세포 종양과 같은 CLDN6 양성 생식세포 종양의 성장을 억제하는데 효과적이다.
발명의 개요
한가지 측면에서, 본 발명은 생체내에서 종양 성장을 억제하는 항체에 관한 것으로, 여기서 종양 세포는 클라우딘 6(CLDN6)을 발현하는 것이고 항체는 CLDN6에 결합할 수 있는 것이다. 한가지 구체예에서, 항체는 CLDN6에 결합함으로써 종양 성장을 억제한다. 한가지 구체예에서, 항체는 CLDN6에 특이적이다. 한가지 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이거나 또는 항체의 단편 또는 합성 항체이다. 종양은 난소암, 특히 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암(SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 포함하는 폐암, 특히 편평상피세포 암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저 세포암종 및 편평 세포암종, 악성 흑색종, 두부 및 경부암, 특히 악성 다형성 선종, 육종, 특히 활막 육종 및 암육종, 담도암, 방광암, 특히 이행 세포 암종 및 갑상선 유두암종, 신장암, 특히 투명세포 신세포 암종 및 유두상 신세포 암종을 포함하는 신세포 암종, 결장암, 회장암을 포함하는 소장암, 특히 소장 선암 및 회장 선암, 고환 배아성 암종, 태반 융모 상피암종, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형종 및 배아성 고환암, 및 자궁암, 이들의 전이 형태와 같은 암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 종양은 기형암종 또는 배아암종과 같은 생식세포 종양일 수 있다. 생식세포 종양은 고환의 생식세포 종양일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 수탁번호 DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A), 또는 DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2)로 기탁된 클론에 의해 생산 또는 수득되는 항체, (ii) (i)에 기재된 항체의 키메라형 또는 인간화된 형태의 항체, (iii) (i)에 기재된 항체의 특이성을 갖는 항체 및 (iv) (i)에 기재된 항체의 항원결합부분 또는 항원결합부위를 포함하는 항체로 이루어진 군에서 선택되는 항체에 관한 것이다. (i)에 기재된 항체의 항원결합부분 또는 항원결합부위는 (i)에 기재된 항체의 다양한 영역을 포함할 수 있다.
전술한 측면들에 따른 항체들은 방사능표지, 세포독소 또는 세포독성 효소와 같은 적어도 1종의 치료적 이펙터에 결합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전술한 측면들에 따른 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 수탁번호 DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A), 또는 DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2)로 기탁된 하이브리도마에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전술한 측면에 따른 항체를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다. 의약 조성물은 치료적 또는 예방적 종양 백신의 형태일 수 있다. 한가지 구체예에서, 의약 조성물은 종양 질환의 치료 또는 예방에 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 질환에 걸려있거나 걸릴 위험이 있는 환자들을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 종양 세포는 클라우딘 6 (CLDN6)을 발현하는 것이고 상기 방법은 CLDN6에 결합할 수 있는 항체를 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. 한가지 구체예에서, 항체는 환자에게 투여될 경우 CLDN6에 결합함으로 해서 환자 내의 종양의 성장을 억제한다. 한가지 구체예에서, 항체는 방사능표지, 세포독소 또는 세포독성 효소와 같은 적어도 1종의 치료 이펙터 부분에 결합된다. 항체는 CLDN6에 특이적일 수 있다. 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이거나 항체 단편 또는 합성 항체일 수 있다. 한가지 구체예에서, 이 방법은 전술한 측면에 따른 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하여 이루어진다.
전술한 측면 중 어느 하나에서, 종양 질환은 난소암, 특히 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암(SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 포함하는 폐암, 특히 편평상피세포 암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저 세포암종 및 편평 세포암종, 악성 흑색종, 두부 및 경부암, 특히 악성 다형성 선종, 육종, 특히 활막 육종 및 암육종, 담도암, 방광암, 특히 이행 세포 암종 및 갑상선 유두암종, 신장암, 특히 투명세포 신세포 암종 및 유두상 신세포 암종을 포함하는 신세포 암종, 결장암, 회장암을 포함하는 소장암, 특히 소장 선암 및 회장 선암, 고환 배아성 암종, 태반 융모 상피암종, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형종 및 배아성 고환암, 및 자궁암, 이들의 전이 형태와 같은 암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
전술한 측면 중 어느 하나에서, 종양 질환은 기형암종 또는 배아암종으로 특징지어지는 질환과 같은 생식세포 종양 질환일 수 있다. 생식세포 종양 질환은 고환의 생식세포 종양 질환일 수 있다.
전술한 측면 중 어느 하나에서, CLDN6은 서열목록의 SEQ ID NO: 1에 따른 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체를 포함하는 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함할 수 있고 및/또는 서열목록의 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 설명된 항체는 CLDN6에 결합될 수 있으며 CLDN6을 발현하는 세포 표면에 부착된 CLDN6에 결합할 수 있다. 좋기로는, 이 항체는 CLDN3에 실질적으로 결합할 수 없고, 특히 CLDN3을 발현하는 세포의 표면에 부착된 경우에 결합할 수 없고, 및/또는 실제로 CLDN4에 실질적으로 결합할 수 없고, 특히 CLDN4을 발현하는 세포의 표면에 결합할 수 없다. 좋기로는 항체가 실질적으로 CLDN9에 실질적으로 결합할 수 없고, 특히 CLDN9을 발현하는 세포의 표면에 결합할 수 없는 것이 바람직하다. 가장 좋기로는 상기 항체가 CLDN6를 제외한 CLDN 단백질에 실질적으로 결합할 수 없고, 특히 상기 CLDN 단백질을 발현하는 세포의 표면에 결합된 CLDN6를 제외한 CLDN 단백질에는 실질적으로 결합할 능력이 없는 것이고, CLDN6에 대하여 특이적인 것이다. 좋기로는 상기 CLDN 단백질을 발현하는 상기 세포는 온전한 것이고, 특히 비투과화(non-permeabilized)된 세포이고, 세포의 표면에 부착된 상기 CLDN 단백질은 천연의, 즉 변성되지 않은 형태를 가지는 것이다. 좋기로는 상기 항체는 그 자연 형태에서 CLDN6의 1 이상의 에피토프에 결합할 수 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명에 설명된 항체는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5와 같은 것이 살아있는 세포 표면에 존재하는 CLDN6의 천연 에피토프에 결합한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 CLDN6-발현 종양 세포에 특이적이며 CLDN6을 발현하지 않는 종양 세포에는 결합하지 않는다. 좋기로는, 본 발명의 항체는 CLDN6에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다.
한가지 구체예에서, 본 발명에 설명된 항체는 CLDN6의 세포외 부분에 위치하는 에피토프에 결합할 수 있는 것이고, 여기서 상기 CLDN6의 세포외 부분은 좋기로는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열, 더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 좋기로는, 상기 SEQ ID NO: 5의 아미노한 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합할 수 있는 것이 바람직하다.
한가지 구체예에서, 항체는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5, 더욱 좋기로는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 5 또는 면역학적으로 동등한 펩타이드 또는 핵산 또는 상기 펩타이드를 발현하는 숙주 세포로 동물을 면역시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다.
다른 구체예에서, 항체가 결합할 수 있는 능력이 있는 CLDN6는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 가진다. 항체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가지는 CLDN6에 결합할 수 있고, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 가지는 CLDN6에 결합할 수 있는 능력이 있는 것이 특히 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 다음 활성, 즉: (i) CLDN6를 발현하는 세포의 사멸, (ii) CLDN6를 발현하는 세포의 증식 억제, (iii) CLDN6를 발현하는 세포의 콜로니 형성 억제 및 (iv) CLDN6를 발현하는 세포의 전이 억제 활성 중 한가지 이상의 활성을 갖는다. 세포의 사멸, 세포의 증식 억제 및/또는 세포의 콜로니 형성 억제는 종양 성장을 중단 및/또는 방지하고, 종양을 지연시키고 및/또는 존재하는 종양의 크기를 감소시키는 것을 포함하여 종양 성장을 억제하는데 치료적으로 이용할 수 있으므로, 암, 암 전이 및/또는 암세포의 전이적 확산의 치료 또는 예방에 치료적으로 이용될 수 있다.
좋기로는 본 발명의 항체는 보체 의존성 세포독성(CDC) 매개형 용해, 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 매개형 용해, 세포자멸사(apoptosis), 동형 부착 및/또는 식균작용, 좋기로는 CDC 매개형 용해 및/또는 ADCC 매개형 용해의 유도에 의해 세포들의 살해를 매개하는 것이 바람직하다.
좋기로는 세포의 ADCC 매개 용해는 모노사이트, 단핵 세포, NK 세포 및 PMN들로 구성된 군에서 선택되는 이펙터 세포(effector cell)의 존재 하에서 일어나는 것이 좋고, 식세포작용은 대식세포에 의하는 것이 좋다.
CLDN6를 발현하는 세포, 좋기로는 암 세포의 증식을 억제 또는 감소시키는 활성은 브로모데옥시유리딘(5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU)를 사용하는 분석 중에서 CLDN6-발현 암 세포의 증식을 측정하여 인 비트로에서 측정될 수 있다. BrdU는 티미딘의 유사체인 합성의 뉴클레오타이드이고, DNA 복제 중에 티민을 대체하면서 복제 중인(세포 사이클의 S 위상에 있는) 세포의 새롭게 합성된 DNA 속으로 혼입될 수 있다. 예컨대 BrdU에 특이적인 항체를 사용하여 혼입된 화합물이 탐지되는 것은 활발하게 DNA를 복제하고 있는 세포를 나타낸다.
CLDN6를 발현하는 세포, 좋기로는 암 세포의 콜로니 형성을 억제 또는 감소시키는 활성은 클론형성 측정법(clonogenic assay)에서 인 비트로 측정될 수 있다. 클론형성 측정법은 세포의 생존 및 증식에 대하여 특이적인 제제의 효능을 시험하기 위한 미생물학적 기법이다. 이는 종양 세포 증식에 대한 약물 또는 방사능의 효능을 시험하기 위하여 암 연구 실험실에서 빈번하게 사용된다. 실험은 다음의 3가지 주요 단계와 관련된다: (i) 세포, 특히 암 세포의 시료에 치료법을 적용하는 단계, (ii) 세포를 조직 배양 용기에 두는 단계 및 (iii) 세포를 성장하게 두는 단계. 생성된 콜로니를 고정시키고, 염색하고, 계수한다. 콜로니 형성은 개개의 종양 세포가 기관을 잠입하는 경우에 전이의 형성과 관련하여 중요하다. 항체의 억제 활성은 전이 형성을 억제하는 그들의 잠재력을 나타낸다. 클론형성 측정법에서 콜로니 형성을 억제하거나 감소시키는 활성을 가지는 항체는 암 세포, 특히 본 명세서에 기재된 종류의 암의 전이 및 전이성 전파를 치료하거나 예방하는데 특히 유용하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 자연적 형태에서 CLDN6을 전달하는 세포에 대하여 1 이상의 면역 이펙터 기능을 나타내는데, 여기서 상기 1 이상의 면역 이펙터 기능이란 좋기로는 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체 의존성 세포 매개 독성(ADCC), 세포자멸사의 유도 및 증식의 억제로 구성된 군으부터 선택되고, 좋기로는 상기 이펙터 기능이란 ADCC 및/또는 CDC이다.
좋기로는, 본 발명의 항체에 의해 발휘되는 종양 성장 억제 또는 면역 이펙터 기능은 상기 세포의 CLDN6에 대한 결합, 좋기로는 CLDN6의 세포외부에 위치하는 에피토프에 대한 결합에 의해 발휘되는 것이 좋고, 여기서, CLDN6의 세포외부는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열, 더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, CLDN6를 발현하는 세포는 좋기로는 그의 세포 표면에 CLDN6가 결합됨을 특징으로 한다. CLDN6를 발현하는 세포 또는 그의 표면이 CLDN6와 결합된 세포 또는 그의 자연적인 배열에서 CLDN6를 담지하는 세포는 좋기로는 종양 세포, 예컨대 암세포, 좋기로는, 본 발명에 설명된 암세포인 것이 바람직하다.
본 발명에 설명된 항체는 표적화된 세포 독성, 즉 종양 세포의 살해를 제공하기 위하여, 1 이상의 약학적 이펙터 모이어티, 예컨대 방사능 표지, 세포독소, 약학적 효소, 세포자멸사를 유도하는 제제 등과 결합될 수 있다.
한가지 구체예에서 본 발명에 설명된 항체는 (i) CLDN6를 발현하는 세포에 결합하고, 및 (ii) CLDN6를 발현하지 않는 세포에는 결합하지 않는다. 본 발명에 설명된 항체는 좋기로는 CLDN6를 발현하는 세포의 살해 및/또는 증식 억제를 매개하고, 및 (ii) CLDN6를 발현하지 않는 세포의 살해는 매개하지 않고 및/또는 CLDN6를 발현하지 않는 세포의 증식은 억제하지 않는다.
한가지 구체예에서, 본 발명에 설명된 항체는 다음의 특성들 1 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 한다:
a) CLDN6에 대한 특이성;
b) CLDN6에 대한 결합 특이성이 약 100 nM 이하, 좋기로는 약 5-10 nM 이하, 더욱 좋기로는 약 1-3 nM 이하임;
c) CLDN6를 발현하는 종양 세포를 고갈시키는 능력이 있음;
d) CLDN6를 발현하는 종양 세포의 증식을 중단 또는 지연시키는 능력;
e) CLDN6를 발현하는 종양 세포가 있는 대상자의 생존을 연장시키는 능력.
한가지 구체예에서, 본 발명에 설명된 항체는 종양 세포 성장을 감소 및/또는 종양 세포 사멸을 유발하므로, 종양 억제 또는 종양 파괴 효과가 있다.
본 발명에 설명된 바람직한 항체는 DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Germany)에 다음의 수탁번호로 기탁된 하이브리도마 세포로부터 생산되거나 수득가능한 항체인 것이 좋다:
1. GT512muMAB 36A, 수탁번호 DSM ACC3059, 수탁일: 2010. 04. 13;
2. GT512muMAB 27A, 수탁번호 DSM ACC3058, 수탁일: 2010. 04. 13; 또는
3. GT512muMAB 5F2D2, 수탁번호 DSM ACC3057, 수탁일: 2010. 04. 13.
본 발명의 항체는 항체의 명칭을 언급하는 것에 의하여 및/또는 항체를 생산하는 클론(예컨대, muMAB 36A)을 언급하는 것에 의하여 본 명세서에 명명된다.
다른 바람직한 항체는, 상기에서 기술한 하이브리도마로부터 생산되고 얻을 수 있는 항체, 특히 항원 결합 부분 또는 항원 결합 부위, 특히 앞서 기술한 하이브리도마로부터 생산되고 얻을 수 있는 항체의 그것과 동일하거나 고도의 상동성을 가지는 가변 영역을 포함하는 항체의 특이성을 갖는 것들이다. 바람직한 항체란 앞서 기술된 하이브리도마로부터 생산되고 얻을 수 있는 항체의 영역과 동일하거나 고도의 상동성을 가지는 CDR 영역을 가지는 것들로 해석된다. "고도의 상동성"이란 1 내지 5개, 좋기로는 1 내지 3개 또는 1개 또는 2개와 같은 1 내지 4 개의 치환이 있을 수 있는 것으로 해석된다. 특히 바람직한 항체는 앞서 기술된 하이브리도마로부터 생산되고 얻을 수 있는 항체의 키메라 및 인간화 형태이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포와 같은 세포에 관한 것이기도 하다.
바람직한 하이브리도마 세포는 DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Germany)에 다음의 수탁번호로 기탁된 하이브리도마 세포인 것이 좋다:
1. GT512muMAB 36A, 수탁번호 DSM ACC3059, 수탁일: 2010. 04. 13;
2. GT512muMAB 27A, 수탁번호 DSM ACC3058, 수탁일: 2010. 04. 13; 또는
3. GT512muMAB 5F2D2, 수탁번호 DSM ACC3057, 수탁일: 2010. 04. 13.
본 발명은 여기에 개시된 항체 또는 그 일부, 예컨대, 항체 사슬을 코딩하는 핵산 서열 또는 유전자를 포함하는 핵산에 관한 것이다. 핵산은 벡터, 예컨대, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 또는 예컨대, 유전 공학에서 통상적으로 사용된 다른 벡터에 포함될 수 있다. 벡터는 적절한 숙주세포 및 적절한 조건하에 벡터의 선택을 허용하는 마커 유전자로써 추가적인 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 적절한 숙주에서 코딩 영역의 적절한 발현을 허용하는 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 그러한 조절 요소는 당업자에게 알려져있고, 프로모터, 스플라이스 카세트 및 번역 개시 코돈을 함유할 수 있다.
좋기로는, 본 발명의 핵산은 진핵 또는 원핵 세포들에서 발현하게 하는 상기 발현 조절 요소에 작동적으로 결합된다. 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 발현을 보증하는 조절 요소는 기술분야에 잘 알려져 있다.
발현을 일으키거나 이루기 위해, 선택된 숙주 세포에 적절히 도입되기 위한 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터구축을 위한 본 발명에 따른 핵산 분자를 구축하기 위한 방법은 기술분야에 잘 알려져있다.
본 발명의 추가적인 면은 여기에 개시된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체들의 조합을 포함하는 조성물, 예컨대 약학적 및 진단적 조성물/키트를 제공한다. 본 발명의 의약 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있고, 1 이상의 보조제, 안정제 등을 임의로 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 조성물은 독특한 에피토프에 부착하거나, CDC 및/또는 ADCC를 유도 및 세포자멸사 유도와 같은 독특한 기능적 특성을 보유하는 항체들의 조합을 포함한다.
한가지 구체예에서, 본 발명의 의약 조성물은 치료적 또는 예방적 항종양 백신이다.
한가지 측면에서, 본 발명은 종양 질환에 걸린 환자 또는 종양 질환의 발병 위험이 있는 환자를 치료하기 위한 치료 및 예방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 한가지 측면에서, 본 발명은 종양 세포 사멸을 유도하는 방법을 제공한다. 이러한 측면들은 본 발명에 설명된 항체 또는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 2 이상의 항CLDN6 항체를 동시에 또는 순차 투여하는것을 포함하며, 여기서 상기 항체들 중 적어도 1 이상은 키메라 항CLDN6 항체이고 적어도 1 이상의 또 다른 항체는 CLDN6의 같거나 다른 에피토프에 결합하는 항체인 인간 항CLDN6 항체인 것이 바람직하다. 좋기로는, 본 발명의 키메라 CLDN6 항체를 먼저 투여한 다음 인간 항CLDN6 항체를 투여하는 것이 좋으며, 이 때 인간 항CLDN6 항체는 장기간, 즉, 유지 치료법의 일환으로서 장기간 투여되는 것이 좋다.
본 발명의 항체 또는 조성물은 CLDN6를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하고 및/또는 CLDN6를 발현하는 종양 세포를 선택적으로 사멸시켜, 상기 종양 세포를 유효량의 항체 또는 조성물과 접촉시킴으로써, 종양 세포의 성장을 억제 및/또는 사멸시키도록 하는 다양한 종양 세포 성장 억제법에 이용될 수 있다. 한가지 구체예에서, 이 방법은 예컨대 CDC, 세포자멸사, ADCC, 식균작용, 또는 이들 메카니즘 중 2 이상의 조합에 의하여, 임의로 이펙터 세포의 존재 하에, CLDN6를 발현하는 종양 세포를 사멸시키는 것을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 조성물은 CLDN6을 발현하는 세포와 관련된 종양 질환을 앓거나 앓을 위험이 있는 환자에게 항체 또는 조성물을 투여함으로써 CLDN6을 발현하는 세포와 관련된 종양 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 종양 질환을 앓거나 앓을 위험이 있는 환자를 치료하기 위한, 종양 질환의 예방 및/또는 치료와 관련이 있다. 한가지 측면에서, 본 발명은 본 발명의 1 이상의 항체 및 조성물을 투여하는 것을 포함하는 종양 성장 억제 방법을 제공한다.
좋기로는, 본 발명의 항체 및 조성물은 치료 활성 물질, 특히 항체가 태반 조직 또는 태반과 같이 CLDN6을 발현하는 종양이 없는 조직이나 장기에는 전달되지 않도록 또는 실질적으로 전달되지 않도록 투여되는 것이 바람직하다. 이를 위하여, 본 발명의 제제 및 조성물을 국소투여할 수 있다.
한가지 측면에서, 본 발명은 본 발명에 설명된 치료 방법에 사용되기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 한가지 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 설명된 치료 방법에 사용되기 위한 본 발명에 설명된 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 치료법은 외과적 절제 및/또는 방사능요법 및/또는 전통적인 화학요법과 병용될 수 있다.
본 발명의 다른 특징들과 장점은 후술되는 상세한 설명과 특허청구범위로부터 명백히 파악될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 명세서와 특허청구범위를 통하여, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은, 언급된 멤버, 멤버의 정수 또는 단계 또는 그룹, 단계 또는 그룹을 포함하는 것을 시사하는 것으로 이해될 것이고, 다른 멤버, 멤버의 다른 정수 또는 단계 또는 그룹, 정수 또는 단계를 배제하는 것으로 이해되서는 아니되나, 어떤 구체예에서는, 이러한 다른 멤버, 정수 또는 단계 또른 멤버, 정수 또는 단계의 그룹들이 배제되어, 문제의 해당 주어가 언급된 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계의 그룹만으로 이루어지는 경우도 있을 수 있다. 발명을 기술하는 문맥(특히 청구항의 문맥)에서 사용되는 용어 "일" 및 "하나" 및 "그" 및 유사한 언급은, 본 명세서에 다르게 지시되거나 문맥에 의해 명백히 모순되는 것이 아닌 한, 단수 및 복수 모두를 커버하는 것을 해석될 것이다. 본 명세서에서 값의 범위의 인용은, 그 범위 이내에 속하는 각각의 분리된 값을 개별적으로 언급하는 것을 단지 속기의 방법으로 제공하기 위해 의도된 것이다. 본 명세서에서 다르게 지시하지 않는 한, 각각의 개별 값은 그들이 마치 본 명세서에 개별적으로 언급된 것과 같이 본 명세서에 혼입된다. 본 명세서에 기술된 모든 방법은, 본 명세서에 다르게 지시되거나, 문맥에 의해 명백히 모순되는 것이 아닌 한, 적절한 임의의 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 및 모든 예시 또는 예시적인 언어(예컨대, "와 같은")의 사용은 단지 발명을 더 잘 기술하려는 의도일 뿐이고, 다르게 청구되는 발명의 범위에 제한을 가하고자 하는 의도가 아니다. 명세서에 사용된 그 어떠한 언어도, 발명의 실행에 필수적인 임의의 비-청구된 요소를 지시하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
클라우딘은 타이트 정션의 가장 중요한 성분인 단백질의 일 족인데, 여기서 그들은 상피의 세포 사이의 세포 내 공간 중에서 분자의 흐름을 조절하는 세포간(paracellular) 장벽을 이룬다. 클라우딘은 그 N-말단 및 C-말단이 모두 세포질 내에 존재하면서 멤브레인을 4회 가로지르는 막통과 단백질이다. 제1의 세포외 루프는 평균 53개 아미노산으로 이루어지고, 제2의 것은 24개 아미노산 정도로 이루어진다. CLDN6 및 CLDN9는 CLDN 패밀리의 가장 유사한 멤버이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CLDN"는 클라우딘을 의미하고, CLDN6, CLDN9, CLDN4 및 CLDN3을 포함한다. 좋기로는 CLDN은 인간 CLDN이다.
용어 "CLDN6"는 좋기로는 인간 CLDN6와 관련되고, 특히 (i) 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함하는 핵산 또는 상기 핵산 서열의 변이체를 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열, 및/또는 (ii) 서열목록의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단백질과 관련된다. CLDN6의 제1의 세포외 루프는, SEQ ID NO: 3에 나타난 아미노산 서열과 같이, SEQ ID NO: 2에 나타난 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 6에 나타난 아미노산 서열의 좋기로는 28 내지 80번째 아미노산, 보다 좋기로는 28 내지 76번째 아미노산을 포함한다. CLDN6의 제2의 세포외 루프는 SEQ ID NO: 6에 나타난 아미노산 서열과 같이, SEQ ID NO: 2에 나타난 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 6에 나타난 아미노산 서열의 138 내지 160번째 아미노산, 좋기로는 141 내지 159 아미노산, 보다 좋기로는 145 내지 157번째 아미노산을 바람직하게 포함한다. 상기 제1 및 제2의 세포외 루프는 좋기로는 CLDN6의 세포외 부분을 형성한다.
용어 "CLDN9"는 좋기로는 인간 CLDN9과 관련되고, 특히 서열목록 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단백질에 관한 것이다. CLDN9의 제1의 세포외 루프는 SEQ ID NO: 7에 나타난 아미노산 서열의 28 내지 76번째 아미노산을 바람직하게 포함한다. CLDN9의 제2의 세포외 루프는 SEQ ID NO: 7에 나타난 아미노산 서열의 141 내지 159번째 아미노산을 바람직하게 포함한다. 상기 제1 및/또는 제2의 세포외 루프는 CLDN9의 세포외 부분을 바람직하게 형성한다.
용어 "CLDN4"는 좋기로는 인간 CLDN4와 관련되고, 특히 서열목록의 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단백질에 관한 것이다. CLDN4의 제1의 세포외 루프는 SEQ ID NO: 8에 나타난 아미노산 서열의 28 내지 76번째 아미노산을 바람직하게 포함한다. CLDN4의 제2의 세포외 루프는 SEQ ID NO: 8에 나타난 아미노산 서열의 141 내지 159번째 아미노산 서열을 바람직하게 포함한다. 상기 제1 및/또는 제2의 세포외 루프는 CLDN4의 세포외 부위를 바람직하게 형성한다.
용어 "CLDN3"는 좋기로는 인간 CLDN3에 관련된 것이고, 특히 서열목록 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단백질에 관한 것이다. CLDN3의 제1의 세포외 루프는 SEQ ID NO: 9으로 나타난 아미노산 서열의 27 내지 75번째 아미노산을 바람직하게 포함한다. CLDN3의 제2의 세포외 루프는 SEQ ID NO: 9으로 나타난 아미노산 서열의 140 내지 158번째 아미노산을 바람직하게 포함한다. 상기 제1 및/또는 제2의 세포외 루프는 CLDN3의 세포외 부위를 바람직하게 형성한다.
앞서 기술한 CLDN 서열들은 상기 서열의 임의의 변이체를 포함하는데, 특히, 돌연변이, 스플라이스 변이체, 입체 이성질체, 이소형태, 대립성 변이체, 종 변이체 및 종 상동체(species homolog), 특히 자연적으로 존재하는 것들을 포함한다. 대립성 변이체는 유전자의 정상 서열 중의 변경과 관련되는데, 그 중요성은 종종 불분명하다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자의 수많은 대립성 변이체를 동정한다. 종 상동체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열의 것과 상이한 종 출처를 가지는 핵산 또는 아미노산 서열이다. 용어 "CLDN"는 (i) CLDN 스플라이스 변이체, (ii) 특히 N-글리코실화 상태와 같은 상이한 글리코실화를 가지는 변이체를 포함하는 CLDN-번역후 변형 변이체, (iii) CLDN 입체 형태 변이체, (iv) CLDN 암 관련 및 CLDN 비-암 관련 변이체를 포괄하는 것이어야 한다. CLDN는 좋기로는 자연 형태로 존재한다.
용어 "부분(portion)"은 단편을 의미한다. 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 특정 구조와 관련하여, 상기 용어 그것의 "부분"은 상기 구조의 연속된 또는 불연속된 단편을 의미할 수 있다. 좋기로는 아미노산의 부분이란 상기 아미노산 서열의 아미노산의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 좋기로는 적어도 40%, 좋기로는 적어도 50%, 보다 좋기로는 적어도 60%, 보다 좋기로는 적어도 70%, 더욱 보다 좋기로는 적어도 80%, 그리고 가장 좋기로는 적어도 90%을 포함한다. 바람직하게는 만일 부분이 불연속된 단편이라면, 상기 불연속된 단편은 구조의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 더 많은 일부분으로 구성되며, 각각의 일부분은 상기 구조의 연속된 요소이다. 예를 들어, 아미노산 서열의 불연속된 단편은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 이상, 좋기로는 상기 아미노산 서열의 4 일부분보다 많지 않은 것으로 구성될 수 있는데, 여기서 각각의 일부분은 상기 아미노산 서열의 적어도 5개의 연속된 아미노산, 적어도 10개의 연속된 아미노산, 좋기로는 적어도 20개의 연속된 아미노산, 좋기로는 적어도 30개의 연속된 아미노산을 바람직하게 포함한다.
용어 "일부분(part)" 및 "단편(fragment)"은 본 명세서에서 교환적으로 사용될 수 있고, 연속된 요소를 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 구조의 부분은 상기 구조의 연속된 요소를 의미한다. 구조의 부분, 일부분 또는 단편은 상기 구조의 1 이상의 기능적 성질을 바람직하게 포함한다. 예를 들어, 에피토프 또는 펩타이드의 부분, 일부분, 단편은 좋기로는 그것이 유래된 에피토프 또는 펩타이드와 면역학적으로 동등하다.
본 발명의 문맥 중에서 용어 "CLDN의 세포외 부분 (an extracellular portion of a CLDN)"는 세포의 세포외 공간을 마주하는 CLDN의 부분, 바람직하게는 상기 세포의 외부로부터의 접근, 즉 세포의 외부에 위치한 항체에 의한 접근이 가능한 부분을 언급한다. 좋기로는 상기 용어는 CLDN에 바람직하게 특이적인 CLDN의 1 이상의 세포외 루프 또는 그 일부 또는 다른 임의의 세포외 부위를 언급한다. 좋기로는, 상기 일부분은 적어도 5, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 또는 적어도 50개 아미노산 또는 그 이상을 포함한다.
본 발명에서, 어떤 세포에 의해 발현되는 CLDN은 좋기로는 상기 세포의 표면에 부착되는 것이 바람직하다. 용어 "세포의 표면에 부착된 CLDN(CLDN associated with the surface of a cell)"이란 CLDN이 상기 세포의 세포질막에 결합 및 위치하고, 여기서 CLDN의 적어도 일부분, 좋기로는 세포외 부분이 상기 세포의 세포외 공간에 면해 있어서, 상기 세포의 외부로부터 접근이 가능하여, 예컨대 세포의 외부에 위치한 항체에 의한 접근이 가능함을 의미한다. 상기 부착은 직접적 또는 간접적일 수 있다. 예를 들어, 부착은 1 이상의 막투과 도메인, 1 이상의 지방 앵커에 의하여, 및/또는 다른 임의의 단백질, 지방, 당류, 또는 세포의 세포막의 외부 리플렛에서 발견될 수 있는 다른 구조와의 상호 작용에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들어 세포의 표면에 부착된 CLDN는 세포외 부분을 가지는 막투과 단백질, 즉 막관통 단백질(integral membrane protein)이거나, 또는 막투과 단백질인 다른 단백질과의 상호 작용에 의하여 세포의 표면에 부착된 단백질일 수 있다.
CLDN6이 어떤 세포의 표면에 위치하여 상기 세포에 첨가된 CLDN6-특이적 항체에 의한 결합 접근성이 있는 경우 상기 세포 표면과 부착된다. CLDN6이 어떤 세포들에 의해 발현될 경우, 상기 세포들과 부착된 CLDN6은 발현된 CLDN6의 오직 부분일 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "CLDN을 담지하는 세포"는 바람직하게는 상기 세포가 그 표면에 CLDN을 담지하는 것, 즉 CLDN이 상기 세포의 표면에 부착된 것을 의미한다.
"세포 표면" 또는 "세포의 표면"은 당업계의 일반적 의미에 따라 사용되고, 단백질 또는 다른 분자의 결합에 접근 가능한 세포의 외부를 포함한다.
표현 "세포의 표면에서 발현되는 CLDN"는 세포에 의하여 발현되는 CLDN가 상기 세포의 표면과 결합되어 발견되는 것을 의미한다.
본 발명에 따를 때, 그 발현 및 결합의 레벨이 태반 세포 또는 태반 조직의 발현 및 결합과 비교하여 더 낮은 경우, CLDN6는 세포 중에서 실질적으로 발현되지 않으며, 세포의 표면과 실질적으로 결합되지 않는다. 바람직하게는, 상기 발현 및 결합의 레벨은 태반 세포 또는 태반 조직에서의 발현 및 결합의 10% 미만, 좋기로는 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% 또는 0.05% 미만 또는 심지어 더 낮은 값이다. 좋기로는 그 발현 및 결합의 레벨이 태반 조직이 아닌 비종양성, 비암성 조직에서의 발현 및 결합을 2배 이하, 좋기로는 1.5배 이하로 초과하는 경우, 좋기로는 상기 비종양성, 비암성 조직에서의 발현 및 결합의 레벨을 초과하지 않는 경우, CLDN6는 세포 내에서 실질적으로 발현되지 않으며, 세포 표면과 실질적으로 결합되지 않는다. 좋기로는 발현 또는 결합의 레벨이 탐지 한계 아래이거나 및/또는 발현 또는 결합의 레벨이 세포에 첨가된 CLDN6-특이적 항체에 의한 결합을 허여하기에 지나치게 낮은 경우, CLDN6는 세포 내에서 실질적으로 발현되지 않으며, 세포 표면과 실질적으로 결합되지 않는다.
본 발명에 따를 때, CLDN6의 발현 및 결합의 레벨이 태반 조직이 아닌 비종양성, 비암성 세포 내의 발현 및 결합의 레벨을 초과하는 경우, 좋기로는 2배보다 많이, 좋기로는 10배, 100배, 1000배, 또는 10000배 보다 많이 초과하는 경우, CLDN6는 세포 내에서 발현되며, 세포 표면에 부착된다. 좋기로는 CLDN6의 발현 및 결합의 레벨이 탐지 한계보다 높거나 및/또는 그 발현 및 결합이 세포에 첨가된 CLDN6-특이적 항체의 결합을 허여할 정도로 충분히 높은 경우에, CLDN6는 세포 내에서 발현되고 세포의 표면에 부착된다. 좋기로는 세포 내 발현되는 CLDN6는 상기 세포의 세포 표면 상에서 발현 및 노출된다.
용어 "라프트(raft)"는 세포의 세포막의 외부 잎 영역 중에 위치하는 스핑고리피드- 및 콜레스테롤이 풍부한 막 마이크로도메인을 의미한다. 특정 단백질이 이와 같은 도메인에 결합하는 능력 및 "응집체" 또는 "병소 응집체"를 형성하는 그 능력은 단백질의 기능에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체가 결합된 후에, CLDN6 분자를 그와 같은 구조 속으로 이동시키는 것은 세포막 중에서 고밀도의 CLDN6 항원-항체 복합체를 형성한다. 이와 같은 고밀도의 항원-항체 복합체는 CDC 중에 보체 시스템의 효과적인 활성화를 가능하게 할 수 있다.
"항체"라는 용어는 이황화결합에 의해 상호-연결된 적어도 두개의 중쇄(H) 및 적어도 두개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질을 의미하며, 그 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 용어 "항체"는 인간 단일클론 항체, 인간화 단일클론 항체, 키메라 단일클론 항체, 단일쇄 항체, 예컨대 Fab 및 Fab' 단편과 같은 scFv's 및 항원-결합 항체 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단일 클론 항체 및 그 단편 또는 유도체를 포함하고, 또한 항체들, 예컨대 원핵세포들에서 발현된 항체들, 비글리코실화된 항체들, 및 어떠한 항원-결합 항체 단편들 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 유도체들의 모든 재조합 형태들을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (줄여서, 본 발명에서 VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (줄여서, 본 발명에서 VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역들은 프래임 영역들(FR)로 불리는 더 보존된 영역들로 산재된(interspersed), 상보성 결정 영역들(CDR)로 불리는 과변이의 영역들로 추가적으로 다시나누어질 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음과 같은 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 아미노 말단부터 카복시 말단까지 3개의 CDR들과 4개의 FR들로 구성된다. 중쇄들 및 경쇄들의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체들의 불변 영역들은 전통적인 보체 시스템의 제1 성분 (Clq) 및 면역 시스템 (예컨대, 이펙터 세포들)의 다양한 세포들을 포함하는 숙주 조직들 또는 인자들에 면역 글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
"인간화된 항체"라는 용어는 비인간 종들로부터의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원 결합 사이트를 가지는 분자를 말하는 것으로, 분자의 남아있는 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 근거한다. 항원 결합 사이트는 불변 도메인들 상에 융합된 완전 가변 영역들 또는 가변 도메인들에서 적절한 골격 영역들 상에 이식된 오직 상보성 결정 영역들 (CDR)를 포함할 수 있다. 항원 결합 사이트는 야생(wild-type)이거나 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대, 인간 면역글로불린과 좀 더 닮기위한 변형에 의해 변형될 수 있다. 인간화된 항체들의 몇몇 형태들은 모든 CDR 서열들(예컨대 마우스 항체로부터 모든 6개의 CDR들을 포함하는 인간화 마우스 항체)을 보존한다. 다른 형태들은 원래의 항체에 관하여 변경된 하나 이상의 CDR들을 가진다.
"키메라 항체"라는 용어는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열의 일 부분이 특별한 종에 속하거나 특별한 종들로부터 유래된 항체들에서 상응하는 서열들과 상동성이고, 반면 사슬의 남아있는 부분(segment)은 상응하는 서열들에 달리 상동성이다. 전형적으로 경쇄 및 중쇄들의 가변 영역은 포유류의 한 종들로부터 유래된 항체들의 가변 영역들과 닮은 반면, 불변 부분들은 달리 유래된 항체들의 서열들과 상동성이다. 그러한 키메라 형태들의 한가지 분명한 잇점은 가변 영역이 예컨대, 인간 세포 제조로부터 유래된 불변 영역들과 조합하여 비인간 숙주 유기체로부터 쉽게 이용가능한 B-세포들 또는 하이브리도마를 이용하여 현재 알려진 소스로부터 편리하게 유래될 수 있다는 것이다. 가변 영역은 각각의 제조물의 잇점을 가지고, 특이성은 소스에 영향을 받지 않는 반면, 인간인 불변 영역은 항체들이 비인간 소스로부터의 불변 영역인 것 보다 항체들이 주입될 때 인간 대상으로부터의 면역 반응을 잘 이끌어내지 않는다. 그러나 정의는 이러한 특별한 예시에 제한되지 않는다.
항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 (또는 간단히, "결합 부분")은 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장(full-length) 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있다는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함된 결합 단편들의 예들은 (i) Fab 단편들, VL, VH, CL 및 CH 도메인들로 구성된 1가의 단편들; (ii) F(ab')2 단편들, 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가의 단편들; (iii) VH 및 CH 도메인들로 구성된 Fd 단편들; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인들로 구성된 Fv 단편들, (v) dAb 단편들 (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), VH 도메인으로 구성됨; (vi) 분리된 상보성 결정 영역들 (CDR), 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의적으로 결합될 수 있는 두개 이상의 CDR들의 조합들을 포함한다. 또한, VL 및 VH의 2개의 도메인들이 분리된 유전자들에 의해 코딩됨에도 불구하고, VL과 VH영역들이 1가의 분자들을 형성하기 위해 짝을 이루는 단일 단백질 사슬로써 그것들이 만들어지도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법들을 이용하여 결합될 수 있다 (단일 사슬 Fv (scFv)로 알려진; Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 참고). 그러한 단일 사슬 항체들은 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에서 포함될 수 있는 것으로 생각된다. 추가적인 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩타이드에 융합되는 결합 도메인 폴리펩타이드, (ii) 힌지 영역에 융합되는 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역, (iii) CH2 불변 영역에 융합되는 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질들이다. 결합 도메인 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질들은 추가적으로 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 개시된다. 이러한 항체 단편들은 기술분야에 당업자에게 알려져있는 통상의 기술을 이용하여 얻고, 그 단편들은 인택트(intact) 항체들처럼 동일한 방식으로 사용을 위해 스크리닝된다.
본 발명에 설명된 항체들은 수동 항종양 면역요법에 유용하며, 표적화된 세포독성의 제공, 즉 종양 세포를 사멸시키기 위해, 치료적 이펙터 모이어티, 예컨대 방사능 표지, 암치료법에 적합한 화학치료제, 예컨대 시스플라틴, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 세포자멸사를 유도하는 제제, 치료적 효소, 세포독소 등과 결합되거나 결합되지 않을 수 있다.
좋기로는 본 발명에 설명된 항체들은 보체 의존성 세포독성(CDC) 매개형 용해, 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 매개형 용해, 세포자멸사(apoptosis), 동형 부착 및/또는 식균작용, 좋기로는 CDC 매개형 용해 및/또는 ADCC 매개형 용해의 유도에 의해 세포들의 살해를 매개하는 것이 바람직하다. 본 발명에 설명된 항체들은 좋기로는 ADCC 또는 CDC를 통해 면역계의 성분들과 상호반응한다. 그러나, 본 발명의 항체들은 세포 표면의 종양 항원과 결합함으로써, 예컨대 세포의 증식을 차단하여, 간단하게 효과를 발휘할 수도 있다.
ADCC는 본 발명에 개시된 것처럼 이펙터 세포들, 특히 림프구들의 세포 살해 능력을 설명하고, 이것은 좋게는 항체에 의해 마킹(mark)되는 표적 세포를 필요로 한다.
ADCC는 좋게는 항체들이 종양 세포상에 항원과 결합하고, 항체 Fc 도메인들이 면역 이펙터 세포들의 표면의 Fc 수용체(FcR)와 관여할 때 일어난다. Fc 수용체들의 몇몇 패밀리들이 동정된 바 있으며, 특이적 세포 집단은 특징적으로 규명된 Fc 수용체들을 발현한다. ADCC는 항원 표시 및 종양 관련된 T 세포 반응의 유도를 가져오는 즉각적인 종양 파괴의 다양한 정도를 직접 유도하기 위한 메커니즘으로서 간주될 수 있다. 좋게는, ADCC의 생체 내 유도는 종양 관련 T 세포 반응들 및 숙주 유래 항체 반응을 가져온다.
CDC는 항체에 의해 지시될 수 있는 다른 세포 살해 방법이다. IgM은 보체 활성을 위한 가장 효과적인 이소타입이다. IgG1 및 IgG3는 전형적인 보체활성 경로를 통해 CDC를 지시하는 것에서 매우 효과적이다. 좋게는, 이러한 캐스캐이드(cascade)에서, 항원-항체 복합체들의 형성은 IgG 분자 (C1q는 보체 C1의 3개의 하위인자 중 하나이다)를 비롯한 항체 분자를 참여하는 CH2 도메인상에 가깝게 근접하여 다중 C1q 결합 사이트의 노출을 일으킨다. 좋게는, 이러한 노출된 C1q 결합 사이트는 이전의 낮은 친화도의 C1q-IgG 상호반응을 높은 애비더티(avidity)로 전환하고, 이것은 다른 일련의 보체 단백질이 관련된 하나의 캐스캐이드 작용을 일으키고, 이펙터 세포 화학주성의/활성제 C3a 및 C5a의 단백질 분해적 방출을 가져온다. 좋게는, 막의 형성에서 보체 캐스캐이드 말단은 복합체를 공격하고, 이것은 세포 내외의 용질 및 물의 자유(free) 통과를 촉진하는 세포 막에서 포어를 형성하여 세포자멸사를 유도할 수 있다.
용어 "항체"는 "이중특이성(bispecific) 분자", 즉 2가지 서로 다른 결합 특이성을 갖는 분자들을 포괄한다. 예를 들어, 상기 분자는 (a) 세포 표면 항원, 및 (b) 이펙터 세포 표면상의 Fc 수용체와 결합하거나 상호작용할 수 있다. 용어 "항체"는 "다중특이성(multispecific) 분자" 또는 "이종특이성(heterospecific) 분자", 즉, 세가지 이상의 상이한 결합 특이성을 갖는 분자들을 포괄한다. 예를 들어, 상기 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포 표면상의 Fc 수용체, 및 (c) 적어도 하나의 다른 성분과 결합하거나 상호작용할 수 있다. 따라서, 본 발명은, CLDN6 및 이펙터 세포들 상의 Fc 수용체를 비롯한 다른 표적들에 대한 이중특이성, 삼중특이성, 사중특이성, 및 다른 다중특이성 분자들을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 용어 "항체"는 이체(diabodies)들 역시도 포괄하는 "이중특이성 항체들"을 포괄한다. 이체들은 2가의 이중특이성 항체인데, 여기서, VH 및 VL 도메인들이 단일 폴리펩타이드 사슬에 발현되지만, 같은 사슬상의 두개의 도메인들 사이에 짝을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인들이 다른 사슬들의 상보적 도메인들과 짝을 이루고, 두개의 항원 결합 사이트들을 생성할 수 있는 이중특이성 항체들이다 (Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123 참고).
"항체"라는 용어는 또한 2 이상의 항체들, 그 유도체들, 또는 함께 결합되는 항원 결합 영역들을 가리키는, "헤테로항체(heteroantibody)" 역시도 포괄하며, 이들 중 적어도 2개는 서로 다른 특이성을 갖는 것이다. 이러한 상이한 특이성들은 이펙터 세포 상에 Fc 수용체를 위한 결합 특이성, 및 표적 세포, 예컨대 종양 세포 상에 항원 또는 에피토프를 위한 결합 특이성을 포함한다.
"표적 세포"는 본 발명의 항체의 표적이 될 수 있는 대상(예를 들어 인간 혹은 동물)으로서 바람직하지 않은 세포이면 어느 것이든 무방하다. 바람직한 구체예에서, 표적 세포는 CLDN6을 발현하는 세포이다. CLDN6를 발현하는 세포는 전형적으로 종양 세포를 포함한다.
본 발명에서, "이펙터 세포"라 함은 면역 반응의 인지적 및 활성화 단계에 반대되는 면역 반응의 이펙터 단계에 관련된 면역 세포를 가리킨다. 대표적 면역 세포는 골수 또는 림프구 기원 세포, 예를 들어 림프구 세포(예를 들어 B 세포 및 세포독성 T 세포(세포독성 T 림프구:CTLs)를 포함하는 및 T 세포), 살해 세포, NK 세포, 대식 세포, 모노사이트, 호산성 세포(eosinophils), 호중성 세포(neutrophils), 다형핵 세포, 과립성 세포, 비만 세포, 호염기성 세포(basophils))를 포함한다. 일부 이펙터 세포는 특이적 Fc 수용체를 발현하고 특이적 면역 기능을 수행한다. 선호된 구체예에서, 예를 들어 ADCC를 유도할 수 있는 호중성 세포와 같이 이펙터 세포는 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현하는 모노사이트, 대식 세포는 표적세포의 특이적 치사에 관여하고, 면역체계의 다른 구성성분에 항원을 표시하거나 항원을 표시하는 세포에 결합하는 데 관여한다. 다른 구체예에서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 세포, 또는 미생물을 식균할 수 있다. 이펙터 세포상에 특정 FcR의 발현은 사이토카인과 같은 체액(humoral) 인자에 의해 통제된다. 예를 들어, Fc-감마RI의 발현은 인터페론 감마(IFN-γ)에 의해 상승 통제되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 향상된 발현은 Fc-감마RI를 포함하는 세포의 표적에 대한 식균 작용을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원이나 표적 세포를 식균하거나 분리시킬 수 있다.
본 발명에 설명된 항체들은 인간 항체들일 수 있다. 본 발명에서 사용된 "인간 항체"라는 용어는 인간 생식계보(germline) 면역글로불린 서열들로부터 유래된 가변 영역 및 불면부를 가지는 항체들을 포괄하는 것이다. 본 발명의 인간 항체들은 인간 생식계보 면역글로불린 서열들에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다 (예컨대, 무작위적으로 또는 시험관 내 사이트-특이적 돌연변이 또는 생체 내 체세포 변이에 의해 의한 돌연변이).
본 발명에 설명된 항체들은 모노클로날 항체들일 수 있다. 본 발명에서 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 단일 분자 조성물의 항체 분자들의 제조물을 말한다. 모노클로날 항체는 단일 결합 특이성 및 특별한 에피토프를 위한 친화도를 나타낸다. 한가지 구체예에서, 모노클로날 항체들은 불멸 세포에 융합되는 비인간 동물, 예컨대, 마우스로부터 얻어지는 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 발명에 설명된 항체들은 재조합 항체들일 수 있다. 본 발명에서 사용되는"재조합 항체"라는 용어는 (a) 면역글로불린 유전자들 또는 그들로부터 제조되는 하이브리도마에 관하여 유전자 이식 또는 트랜스염색체적인 동물 (예컨대, 마우스)로부터 분리된 항체들 , (b) 항체를 발현하기 위해 형질전환된 숙주 세포, 예컨대, 트랜스팩토마로부터 분리된 항체들, (c) 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체들, 및 (d) 다른 DNA 서열들에 면역글로불린 유전자 서열들의 스플라이싱과 관련된 다른 수단들에 의해 분리되거나, 생성되거나, 발현되거나 제조된 항체들을 비롯한, 재조합적 수단에 의해 분리되거나, 생성되거나, 발현되거나, 제조된 모든 항체들을 포함한다.
본 발명에서 사용된, "트랜스펙토마(transfectoma)"라는 용어는 CHO 세포들, NS/0 세포들, HEK293 세포들, HEK293T 세포들, 식물 세포들, 또는 효모를 포함하는 곰팡이를 비롯한 항체를 발현하는 재조합 진핵 숙주세포들을 포함한다.
본 발명에서 사용된, "이종 항체(heterologous antibody)"는 그러한 항체를 생산하는 형질전환 생물과 관련하여 규정된다. 이 용어는 해당 형질전환 생물이 아닌 생물에서 발견되는 대응하는 아미노산 서열 또는 인코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 의미하며, 일반적으로 그 형질전환 생물이 아닌 종으로부터 유도된다.
본 발명에서 사용된, "헤테로하이브리드 항체"는 상이한 생물로부터 기원하는 경쇄와 중쇄를 가지는 항체를 말한다. 예컨대, 쥐의(뮤린) 경쇄와 인간의 중쇄가 결합된 항체는 헤테로하이브리드 항체이다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 모든 항체 및 항체의 유도체를 포함하는데, 본 발명의 목적은 용어 "항체"에 의하여 포괄된다. 용어 "항체 유도체"란 항체의 임의의 변형된 형태, 예컨대 항체와 다른 약제 또는 항체, 또는 항체 단편과의 컨쥬게이트를 의미한다.
본 발명에 설명된 항체들은 분리되는 것이 좋다. 본 발명에서 사용된 "분리된 항체"는 상이한 항원성 특이성을 가지는 다른 항체들이 프리(free)한 항체들을 나타내는 것으로 생각된다 (예컨대, CLDN6에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 실질적으로 CLDN6이 아닌 항체들에 특이적으로 결합하는 항체들이 프리(free)한 것이다). 인간 CLDN6의 에피토프, 이소형태 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 그러나, 다른 관련된 항원들, 예컨대, 다른 종들(예컨대, CLDN6 종들 동족체)로부터, 크로스-반응성을 가질 수 있다. 또한, 분리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질들이 없을 수 있다. 본 발명의 한가지 구체예에서, "분리된" 모노클로날 항체들의 조합은 여러가지 상이한 특이성들을 가지고 잘 규정된 조성물에서 혼합되는 항체들에 관한 것이다.
본 발명에 따라, 만일 항체가 소정의 표적에 대하여 유의적인 친화성을 가지고, 표준 분석법에서 상기 소정의 표적에 결합한다면, 상기 소정의 표적에 결합할 수 있는 것이다. "친화성(affinity)" 또는 "결합 친화성"은 종종 평형 해리 상수 (KD)에 의해 측정된다. 좋기로는, "유의적인 친화성(significant affinity)"이라는 용어는 소정의 표적에 대하여 10-5 M 이하, 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 또는 10-12 M 이하의 해리 상수(KD)로 결합함을 의미한다.
항체는 그것이 상기 표적에 대해 현저한 친화도를 가지지 않고, 표준 분석에서 상기 표적에 현저하게 결합하지 않는다면, 항체는 상기 표적에 결합할 능력이 (실질적으로) 없는 것이다. 좋기로는, 온전한 세포의 표면에 발현되는 표적에 대한 항체의 결합을 측정하는 유세포 분석(FACS 분석) 중에 항체가 상기 표적에 탐지 가능하게 결합하지 않는다면, 상기 항체는 상기 표적에 결합할 능력이 (실질적으로) 없는 것이다. 좋기로는, 상기 항체는 최대 2 ㎍/ml까지, 좋기로는 10 ㎍/ml 이하, 좋기로는 20 ㎍/ml 이하, 더 좋기로는 50 ㎍/ml 이하, 특히 100 ㎍/ml 이하 또는 그 이상의 농도로 표적이 존재할 경우 상기 표적에 검출가능하게 결합하지 않는 것이 좋다. 좋기로는 항체가 결합할 수 있는 소정의 표적에 대한 결합을 위한 KD에 비해 적어도 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 또는 106배 더 높은 KD 값으로 상기 표적에 항체가 결합하는 경우, 항체는 상기 표적에 대해 유의적인 친화성을 갖지 않는다. 예를 들어 항체가 결합할 수 있는 표적에의 항체의 결합에 대한 KD 값이 10-7 M인 경우, 항체가 유의적인 친화성을 갖지 않는 상기 표적에의 결합을 위한 KD 값은 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M일 것이다.
본 발명에 따른 항체는 소정의 표적, 좋기로는 CLDN6에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 것이 바람직하다.
어느 항체가 다른 표적에는 결합할 수 없는 것, 즉 다른 표적에는 현저한 친화도를 가지지 않고, 표준 분석에서 다른 표적에는 현저하게 결합하지 않는 것인 반면에, 미리 정해진 표적에는 결합할 수 있는 것이라면, 그 항체는 상기 미리 정해진 표적에 특이적인 것이다. 본 발명에 따를 때, 어느 항체가 CLDN6에 대해서는 결합할 수 있지만, 다른 표적, 특히 CLDN9, CLDN4, CLDN3 및 CLDN1와 같이 CLDN6가 아닌 다른 클라우딘 단백질에는 (실질적으로) 결합할 수 없는 것이라면, 그 항체는 CLDN6에 특이적인 것이다. 좋기로는, CLDN9, CLDN4, CLDN3 및 CLDN1와 같은 CLDN6가 아닌 클라우딘 단백질에 대한 친화도 및 결합이, 소 혈청 알부민(BSA), 카제인, 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 클라우딘과 관계없는 단백질에 대한 친화도 또는 결합, 또는 MHC 분자 또는 트랜스페린 수용체와 같은 비클라우딘 막투과 단백질, 또는 다른 특정 폴리펩타이드에 대한 친화도 또는 결합을 현저하게 능가하는 것이 아니라면, 상기 항체는 CLDN6에 대하여 특이적인 것이다. 좋기로는 어느 항체가 특이적이지 않은 표적에의 결합을 위한 KD 값보다 적어도 10-배, 100-배, 103-배, 104-배, 105-배, 또는 106-배 더 낮은 KD 값을 가지고 미리 정해진 표적에 결합한다면, 그 항체는 상기 표적에 대하여 특이적인 것이다. 예를 들어 어느 항체가 그것이 특이적인 표적에 결합하기 위한 KD 값이 10-7 M인 경우, 그것이 특이적이지 않은 표적에 결합하기 위한 KD 값은 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M일 것이다.
항체의 표적에 대한 결합은 임의의 적절한 방법을 사용하여 실험적으로 측정될 수 있는데, 예를 들어 논문(Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman 및 Company New York, N Y (1992)) 및 본 명세서에 기술된 방법을 참조하라. 평형투석의 사용; 제조사에 의해 개괄된 일반적 절차를 사용하는 BIAcore 2000 기구의 사용; 방사능 표지된 표적 항원을 사용하는 방사능 면역 분석법에 의하여; 또는 숙련된 기술자에게 알려진 또 다른 방법에 의하는 것과 같은 통상적인 기법을 사용하여 친화도를 손쉽게 결정할 수 있다. 친화도 데이터는 예를 들어 논문(Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949))의 방법에 의하여 분석될 수 있다. 만일 다른 조건(예컨대 염 농도, pH)에서 측정된다면, 특정 항체-항원 결합의 측정된 친화도는 변할 수 있다. 따라서, 친화도 및 KD, IC50와 같은 다른 항원-결합 파라미터의 측정은 표준화된 항체 및 항원 용액 및 표준화된 완충액을 사용하여 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에서, "이소타입(isotype)"이라는 용어는 중쇄 불변 영역 유전자들에 의해 코딩되는 항체 클래스(예컨대, IgM 또는 IgG1)를 나타낸다. 본 발명에 따른 항체들에는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체가 포함되며, IgG2a (예컨대, IgG2a κ, λ), IgG2b (예컨대 IgG2b, κ, λ), IgG3 (예컨대 IgG3, κ, λ) 및 IgM 항체가 포함된다. 그러나, IgG1, IgAl, IgA2, 분비성 IgA, IgD, 및 IgE 항체를 비롯한 다른 항체 이소타입들도 본 발명에 포괄된다.
본 발명에서, "이소타입 스위칭(switching)"이라 함은 항체들의 클래스 또는 이소타입이 하나의 Ig 클래스로부터 다른 Ig 클래스들 중 하나까지로 변화하는 현상을 나타낸다.
본 발명의 목적상, "자연적으로 일어나는"이라는 용어는 해당 대상이 자연에서 발견됨을 의미한다. 예컨대, 자연의 소스(source)로부터 분리될 수 있고, 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 생명체 (바이러스들을 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 자연적으로 일어나는 것이다.
본 발명에서 "재배열된(rearranged)"라 함은, 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 로커스(locus)의 배열을 나타내는 것으로, V 부분은 필수적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 구조에서 D-J 또는 J 부분에 바로 인접하여 위치된다. 재배열된 면역글로불린 (항체) 유전자 로커스는 생식계보(germline) DNA와 비교에 의해 확인될 수 있다; 재배열된 로커스는 적어도 하나의 재조합된 헵타머/나노머 상동성 요소를 가질 것이다.
V 부분과 관련하여 본 발명에서 사용된 "비재배열된(rearranged)" 또는 "생식계보(germline) 배열"라는 용어는 V 부분이 D 또는 J 부분에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 배열을 의미한다.
본 발명에 따라, 항체는 마우스, 래트, 토끼, 기니픽 및 인간을 비롯한 여러가지 종들로부터 유래될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 항체는 또한 하나의 종으로부터 유래한 항체 불변 영역이, 다른 종으로부터 유래한 항원 결합부와 조합되어 있는 키메라 분자도 포함한다. 또한, 항체에는 비인간 종으로부터 유래된 항체의 항원 결합부가 인간 기원의 불변 영역 및 프레임워크 영역와 조합된 인간화 분자도 포함된다.
본 발명의 항체는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예컨대, the standard somatic cell hybridization technique of Kohler 및 Milstein, Nature 256: 495 (1975),을 함유하는 다양한 기술에 의해 생산가능하다. 체세포 혼성화 절차가 선호될 지라도, 주로, 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술들이 전개될 수 있다, 예컨대, B-임파구 또는 파지의 바이러스 또는 종양 형질변환은 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 기술을 나타낸다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위한 선호되는 동물 시스템은 쥐과(뮤린) 계열이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 잘 구축된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장림프구의 분리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 기술분야에서 잘 알려져있다. 융합 파트너 (예컨대, 쥐의 골수종 세포)와의 융합 절차 역시도 공지이다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 다른 선호되는 동물 시스템은 래트 및 래빗 시스템이다 (예컨대, Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)에 개시되어 있음).
다른 구체예에서, CLDN6에 관한 인간 모노클로날 항체들은 마우스 시스템 보다 인간 면역 시스템의 부분들을 수행하는 유전자이식(transgenic) 또는 트랜스염색체적(transchromosomal) 마우스를 이용하여 생성가능하다. 이러한 유전자이식 및 트랜스염색체적 마우스는 각각 HuMab 마우스 및 KM 마우스로 알려져 있고, "유전자 이식 마우스"로 여기에 집합적으로 언급된다. 그러한 유전자 이식 쥐 내에 인간 항체의 생산은 WO2004 035607에서 CD20을 위한 자세히 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
모노클로날 항체들을 생성하기 위한 또 다른 전략은 예컨대, Babcock et al., 1996; 규정된 전략의 항체를 생산하는 단일의 분리된 임파구들로부터 모노클로날 항체를 생산하기 위한 신규한 전략을 참고한, 규정된 전략의 항체를 생산하는 임파구로부터 항체를 코딩하는 유전자를 직접 분리하는 것이다. 재조합 항체 공학의 자세한 내용은 또한 문헌(Welschof 및 Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 및 Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1)을 참고할 수 있다.
CLDN6에 대한 항체를 생성하기 위해, 마우스를 CLDN6 서열로부터 유래된 담체-콘쥬게이트된 펩타이드, 기재된 CLDN6을 재조합적으로 발현된 풍부한 제조물 또는 그 단편 및/또는 CLDN6 또는 그의 단편을 발현하는 세포들로 면역화될 수 있다. 또 다르게, 마우스는 전장 인간 CLDN6 또는 그 단편을 코딩하는 DNA로 면역화시킬 수 있다. CLDN6 항원의 정제된 또는 풍부한 제조물을 이용한 면역화가 항체를 생성하지 않는 경우에, 마우스는 면역 반응을 촉진하기 위해, CLDN6을 발현하는 세포들, 예컨대 세포주로 또한 면역화될 수 있다.
면역 반응은 꼬리 정맥 또는 안와후(retroorbital) 출혈(bleeds)에 의해 수득되는 혈장 및 혈청 시료로 면역화 프로토콜의 코스로 모니터될 수 있다. 충분한 역가의 항CLDN6 면역글로불린을 가진 마우스를 융합에 이용할 수 있다. 마우스는 희생되어, 하이브리도마를 분비하는 특이적 항체의 비율을 증가시키기 위한 비장 제거 전에 3일 내지 5일 동안 CLD18 발현 세포들로 복강내 또는 정맥내로 부스트(boost)될 수 있다.
CLDN6에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스들로부터 얻은 림프절 세포들, 비장 또는 골수를 분리하고, 마우스 골수 세포주를 비롯한 적절한 불멸 세포주에 융합할 수 있다. 이어서, 결과적으로 얻어진 하이브리도마들을 항원 특이적 항체의 생산을 위해 스크리닝할 수 있다. 그리고나서, 각각의 웰들은 하이브리도마를 분비하는 항체를 위한 ELISA에 의해 스크린될 수 있다. CLDN6 발현 세포들을 이용한 면역형광 및 FACS에 의해, CLDN6에 특이적인 항체들이 확인될 수 있다. 하이브리도마를 분비하는 항체는 리플레이트(replate)될 수 있고, 다시 스크린될 수 있으며, 만약 항CLDN6 모노클로날 항체들을 위해 여전히 양성이라면 제한한계 희석법에 의해 서브클론될 수 있다. 안정적인 서브클론은 그리고나서 특성화를 위한 조직 배양 배지에서 항체를 생성하기 위해 시험관내(in vitro)에서 배양될 수 있다.
본 발명의 항체들은 예컨대, 기술분야에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법들의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다 (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
예컨대, 한가지 구체예에서, 흥미로운 유전자(들), 예컨대, 항체 유전자들은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템 또는 기술분야에 잘 알려진 다른 발현 시스템에 의해 사용된 것을 비롯한 진핵 발현 플라스미드를 비롯한 발현 벡터내로 라이게이션 될 수 있다. 클론된 항체 유전자들을 가진 정제된 플라스미드는 CHO 세포들, NS/0 세포들, HEK293T 세포들 또는 HEK293 세포들 또는 대안적으로 식물 유래 세포들, 곰팡이 또는 효모 세포들과 같은 다른 진핵 세포들내로 도입될 수 있다. 이러한 유전자들을 도입하기 위해 사용되는 방법은 일렉트로포레이션, 리포펙틴, 리포펙타민 또는 다른 것들을 비롯한 기술분야에 기재된 방법들일 수 있다. 숙주 세포 내에서 이러한 항체 유전자들의 도입 후에, 항체를 발현하는 세포들은 확인되고 선택된다. 이러한 세포들은 그리고나서 그 발현 수준을 위해 증폭되고, 항체를 생산하기 위해 업스케일(upscale)될 수 있는 트랜스펙토마를 나타낸다. 재조합 항체들은 이러한 배양 상청액 및/또는 세포들로부터 분리되고 정제될 수 있다.
별법으로, 클론된 항체 유전자들은 E.coli를 비롯한 미생물을 비롯한 원핵 세포들을 함유하는 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 또한, 항체들은 쉽(sheep) 또는 래빗으로부터의 우유에서 또는 암탉의 달걀에서와 같은 형질전환 비인간 동물들 또는 형질전환 식물들에서 생산될 수 있다(Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; 및 Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839 참고).
뮤린(뮤린) 모노클로날 항체들은 독소 또는 방사성 동위원소로 표지될 때 인간 내에서 치료적 항체로써 사용될 수 있다. 비표지된 뮤린 항체들은 반복적으로 치료적 효과의 감소를 가져올 때 인간 내에서 높은 면역성이다. 뮤린 항체의 면역원성은 중쇄 불변 영역에 의해 매개된다. 인간에서 뮤린 항체들의 면역원성은 만약 각각의 항체들이 키메라화되거나 인간화되면 감소되거나 완전히 막을 수 있다. 키메라 항체들은 항체들이고, 뮤린 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 가지는 것을 비롯한 상이한 동물 종들로부터 유래된 상이한 부분들이다. 항체들의 키메라화는 인간 중쇄 및 경쇄의 불변영역과 뮤린 항체 중쇄 및 경쇄의 불변 영역을 결합함에 의해 성취된다 (예컨대, Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8에 의해 개시된). 선호되는 방식으로는, 키메라화된 항체는 인간 카파 경쇄의 불변 영역을 뮤린 경쇄의 가변 영역에 결합시킴으로써 생성할 수 있다. 또 다른 선호되는 항체의 키메라화 방식으로는 인간 람다(lambda) 경쇄의 불변 영역을 뮤린 경쇄의 가변 영역에 결합시키는 방법이 있다. 키메라화된 항체 생성을 위한 선호되는 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG3 및 IgG4가 있다. 그 밖에 키메라 항체의 생성을 위해 선호되는 중쇄 불변 영역으로는 IgG2, IgA, IgD 및 IgM이 있다.
항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 보체 결정 영역(CDR) 안에 존재하는 아미노산 잔기들을 통해 표적 항원과 반응한다. 이 때문에 CDR 내부의 아미노산 서열들은 CDR 외부의 서열보다 각각의 항체들 사이에서 다양하게 나타난다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원간 반응에 있어 결정적 역할을 하기 때문에, 서로 다른 성질들을 가진 서로 다른 항체로부터의 골격(framework) 서열들 상에 이식되는 특이적으로 일어나는 항체로부터 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써, 특이적 자연적으로 발생하는 항체들의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(e.g., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; 및 Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). 그러한 골격 서열은 생식계보(germline) 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 이러한 생식계보 서열은 성숙한 항체 유전자 서열과 다를 것인데, 이들은 B 세포의 성숙 분열기 동안 V (D) J가 결합됨으로써 생성되는 완전히 결합된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이기 때문이다. 생식계보 유전자 서열은 또한 가변 영역 전체에 고르게 분포된 각각의 고친화도 이차적 레퍼토리 항체와도 다를 것이다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 골격 영역 1의 아미노 말단 부분과 골격 영역 4의 카르복시기 말단 부분에서는 상대적으로 빈번하지 않다. 또한 많은 체세포 돌연변이는 항체의 결합 성질을 크게 변화시키지 못한다. 따라서, 원래의 항체의 결합 성질과 유사한 성질을 갖는 온전한 재조합 항체를 재현하고자 특정 항체의 DNA 서열 전체를 얻을 필요는 없다(WO 99/45962). 이 같은 목적을 위해서는 해당 CDR 영역에 걸쳐있는(spanning) 중쇄 및 경쇄 서열의 일부만으로 충분하다. 이 부분적 서열은 재조합된 항체 가변 영역들에 기여되는 생식계보 가변 및 결합 유전자 단편을 결정하는 데 사용된다. 그 후 이 생식계보 서열은 가변 영역의 빠진 부분을 채우게 된다. 중쇄 및 경쇄 리딩(leading) 서열은 단백질 성숙기 동안 분열되어 최종 항체의 성질에는 아무런 영향을 끼치지 못한다. 빠진 서열을 더하기 위해, 클론된 cDNA 서열들은 라이게이션 또는 PCR 증폭을 통해 합성 올리고뉴클레오타이드와 결합될 수 있다. 또는 그 대신, 전체적으로 합성 가변 영역 클론을 생성하기 위해 가변 영역 전체가 하나의 짧고 겹쳐진 올리고뉴클레오타이드 세트로 합성되어 PCR 증폭을 통해 합성될 수도 있다. 이 과정은 특정 코돈의 제거 또는 포함, 특정 제한 사이트, 또는 최적화 등의 장점이 있다.
하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 전사물의 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 합성 올리고뉴클레오타이드의 중복 세트를 설계함으로써, 자연적 서열과 동일한 아미노산 코딩 능력을 갖는 합성 V 서열을 생성할 수 있다. 이러한 합성 중쇄 및 카파 사슬 서열은 세가지 측면에서 자연적 서열과 다를 수 있다: 첫째, 반복되는 뉴클레오타이드 염기의 스트링(strings)들은 올리고뉴클레오타이드 합성과 PCR 증폭을 촉진하기 위해 방해받는다; 둘째, Kozak의 룰(Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870)에 따라 최적 번역 개시 사이트들이 병합된다; 셋째, HindIII 사이트들은 번역 개시 사이트들의 유전자조작된 업스트림이다.
중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 모두에 있어서, 최적화된 코딩 및 대응하는 비코딩, 스트랜드(strand) 서열들은 대응하는 비코딩 올리고뉴클레오타이드의 거의 중간점에서 30-50개의 뉴클레오타이드로 쪼개진다. 이에 따라 각각의 사슬에서, 올리고뉴클레오타이드들은 150-400개의 뉴클레오타이드 단편을 걸치는 중복 더블 스트랜디드 세트로 조합될 수 있다. 이 풀은 다시 150-400개 뉴클레오타이드의 PCR 증폭 생산물을 생성하는 데 주형으로 쓰인다. 전형적으로, 단일 가변 영역 올리고뉴클리오타이드 세트는 2개의 풀로 분할되고 따로 증폭되어 두 개의 겹치는 PCR 생산물을 생성하게 된다. 이렇게 생성된 겹치는 생산물은 다시 PCR 증폭에 의해 결합되어 완전한 가변 영역을 형성한다. 발현 벡터 구축물로 쉽게 클론될 수 있는 단편을 생성하기 위해, PCR 증폭 내에 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 겹치는 단편을 PCR 증폭에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.
재구축된 키메라화 또는 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역들은 클론된 프로모터, 리더, 번역 개시, 불변 영역, 3’비번역된, 폴리아데닐레이션, 전사 종결 서열과 결합되어 발현 벡터 구축물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 구축물은 단일 벡터로 결합되거나, 숙주 세포로 공동-형질감염되거나, 연속적으로 형질감염되거나, 혹은 개별적으로 형질감염될 수 있다. 이 숙주 세포는 이후 합쳐져 두 사슬을 모두 발현하는 숙주 세포를 구성하게 된다. 인간 IgGκ를 위한 발현 벡터의 구축에 사용되는 플라스미드에 대해서 설명한다. 이 플라스미드는, PCR 증폭된 V 중쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열이 완전한 중쇄 및 경쇄 미니유전자들(minigenes)을 재구축하는 데 쓰일 수 있도록 구축될 수 있다. 이러한 플라스미드는 완전히 인간 또는 키메라화된 IgG1, 카파 또는 IgG4, 카파 항체들을 발현하는 데 쓰일 수 있다. 유사한 플라스미드가 다른 중쇄 이소타입 발현이나 람다 경쇄를 포함하는 항체 발현을 위해 구축될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 항CLDN6 항체들의 구조적 특질은 CLDN6에 결합하는 것을 비롯한, 본 발명의 항체들의 적어도 하나의 기능적 특징을 보유하는 구조적으로 관련된 인간화된 항CLDN6 항체들을 생성하기 위해 사용된다. 더욱 구체적으로, 마우스 모노클로날 항체들의 하나 이상의 CDR 영역들을 공지의 인간 프레임워크 영역 및 CDRs와 재조합시킴으로써, 부가적인, 재조합된 인간화 항CLDN6 항체들을 만들 수 있다.
CLDN6에 대한 항체의 결합 능력은 실시예에 제시되는 것들과 같은 표준 결합 어세이들을 이용하여 측정될 수 있다 (예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광 및 유세포 분석).
용어 "에피토프"는 분자에 있어서 항원성 결정부위, 즉 면역계에 의해 인식되는 분자의 일부분, 예를 들어 항체에 의하여 인식되는 분자의 일부분을 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 항원 상의 불연속적인 3차원적 부위인데, 이는 면역 시스템에 의하여 인식된다. 본 발명의 문맥에서, 에피토프는 좋기로는 CLDN 단백질로부터 유래한다. 에피토프들은 당 곁사슬 또는 아미노산들을 비롯한 분자들의 화학적 활성 표면 그룹핑들로 구성되고, 일반적으로 특이적 전하 특징들 뿐만 아니라 특이적 3차원 구조적 특징을 가진다. 구조적인(Conformational) 에피토프와 비구조적인 에피토프들은 변성 용매의 존재 하에서, 후자가 아닌 전자에 대한 결합이 소실된다는 점에서 구별된다. CLDN과 같은 단백질의 에피토프는 좋기로는 상기 단백질의 연속 또는 불연속적인 부분을 포함하고, 좋기로는 5 내지 100, 좋기로는 5 내지 50, 더 좋기로는 8 내지 30, 가장 좋기로는 10 내지 25개의 아미노산 길이인데, 예컨대 에피토프는 좋기로는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 아미노산 길이일 수 있다.
본 발명에서 "불연속적인 에피토프"라는 용어는 단백질의 주요(primary) 서열 중 적어도 2개의 별개 영역들로부터 형성되는 단백질 항원 상의 구조적 에피토프를 말한다.
본 발명에서, "결합"이라 함은 좋기로는 특이적 결합에 관한 것이다. "특이적 결합"이라 함은 항체와 같은 물질이 다른 표적에 대한 결합에 비해, 항체가 특이적인 에피토프와 같은 표적에 대해 보다 강하게 결합하는 것을 일컫는다. 만일 어떤 물질이 제2 표적에 대해서보다 낮은 해리 상수(KD)로 제1 표적에 대해 결합한다면, 그 물질은 제2 표적보다 제1 표적에 대해 더 강하게 결합하는 것이다. 좋기로는 해당 물질이 특이적으로 결합하는 표적에 대한 해리 상수(KD)는, 그 물질이 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리 상수에 비해 102배, 103배, 104배, 105배, 106배, 107배, 108배, 109배, 또는 1010배 더 낮은 것이 바람직하다.
본 발명에서 "핵산"이라는 용어는 데옥시리보핵산(DNA)와 리보핵산(RNA)를 포함한다. 본 발명에 따른 핵산이라는 용어에는 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산된 분자와 화학합성된 분자들이 모두 포괄된다. 본 발명에서, 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥으로 존재할 수 있고 선형 분자 또는 공유적으로 원형을 그리며 밀폐된 분자로 존재할 수도 있다.
본 발명에 따라 기재된 핵산들은 분리된 것들이 바람직하다. 본 발명에서 "분리된 핵산"이라는 용어는 핵산이 (i) 시험관 내, 예컨대 폴리머라제 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되거나, (iii) 예컨대 절단 및 젤 전기영동 분획에 의해 정제되거나, 또는 (iv) 예컨대 화학 합성에 의해 합성되었다는 것을 의미한다. 분리된 핵산은 재조합 DNA 기술에 의한 조작을 위해 이용될 수 있는 핵산이다.
본 발명에 따른 핵산들은 단독 또는 다른 핵산들과 조합하여 존재할 수 있고, 이것은 동종이거나 이종일 수 있다. 선호된 구체예에서, 핵산은 상기 핵산에 관하여 동종 또는 이종일 수 있는 발현 조절 서열들에 기능적으로 연결되는데, 여기서 "동종(homologous)"이라는 용어는 핵산이 자연적으로 발현 조절 서열에 또한 기능적으로 연결된 것을 의미하고, "이종(heterologous)"은 핵산이 자연적으로 발현 조절 서열에 기능적으로 연결되지 않았다는 것을 의미한다.
만약, 핵산 및 발현조절 서열이 상기 핵산의 발현 또는 전사가 조절되거나 상기 발현 조절 서열의 영향 하에 있는 방식으로 서로 공유적으로 연결되어 있다면, RNA 및/또는 단백질 또는 펩타이드를 발현하는 핵산을 비롯한 핵산 및 발현 조절 서열은 서로 "기능적으로" 연결된다. 핵산이 기능적 단백질로 번역되고, 그리고나서 코딩 서열에 기능적으로 결합된 발현 조절 서열과 함께라면, 코딩 서열 또는 소망하는 단백질 또는 펩타이드로 번역될 수 없는 상기 코딩 서열에서 프래임 쉬프트(frame shift)를 일으키는 것 없이, 상기 발현 조절 서열의 유도는 핵산의 전사를 일으킨다.
"발현 조절 서열" 또는 "발현 조절 요소"라는 용어는 본 발명에 따라 프로모터, 리보솜 결합 사이트, 인핸서(enhancer), 및 유전자의 전사 또는 mRNA의 번역을 조절하는 다른 조절 요소들을 포함한다. 본 발명의 특별한 구체예에서, 발현 조절 서열은 조절될 수 있다. 발현 조절 서열의 정확한 구조는 세포 유형 또는 종들의 기능에 따라 변화될수 있지만, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열, 및 유사종을 비롯한 전사 및 번역 개시에 관련된 5'-비전사된 및 5'- 및 3'-비번역된 서열들 각각을 일반적으로 포함한다. 더욱 구체적으로, 5'-비전사화된 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 조절 서열은 또한 인핸서 서열들 또는 업스트림 활성자 서열들을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 "프로모터" 또는 "프로모터 영역"이라는 용어는 발현되는 핵산 서열에 대해 업스트림 (5') 위치되는 핵산 서열에 관한 것이고, RNA-폴리머라제를 위한 인식 및 결합 사이트를 제공하는 것에 의해 서열의 발현을 조절한다. "프로모터 영역"은 유전자의 전사 조절에 관련된 추가적인 인자들을 위한 인식 및 결합 사이트를 추가적으로 포함한다. 프로모터는 원핵 또는 진핵 유전자들의 전사를 조절할 수 있다. 또한, 프로모터는 "유도가능할" 수 있고, 유도제에 반응하는 전사를 개시할 수 있거나, 전사가 유도제에 의해 조절되지 않는다면 "구조적" 일 수 있다. 만약 유도제가 없다면, 유도가능한 프로모터의 조절 하에 유전자는 발현되지 않거나, 작은 범위로 오직 발현된다. 유도제의 존재에서, 유전자는 스위치-온(switch on)되거나 전사의 수준이 증가된다. 이것은 일반적으로, 특이적 전사 인자의 결합에 의해 매개된다.
본 발명에 따라 선호된 프로모터들은 SP6, T3 및 T7 폴리머라제를 위한 프로모터들, 인간 U6 RNA 프로모터, CMV 프로모터, 및 일부분(part) 또는 부분들이 예컨대, 인간 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 비롯한 다른 세포 단백질들의 유전자들의 프로모터들의 일부분 또는 부분들과 융합된 그것의 인공적인 하이브리드 프로모터들 (예컨대, CMV) 및 추가적인 인트론(들)을 포함하거나 포함하지 않는 프로모터들을 포함한다.
본 발명에 따라, "발현"이라는 용어는 가장 일반적인 의미에서 사용되고, RNA 또는 RNA 및 단백질/펩타이드의 생산을 포함한다. 그것은 또한 핵산들의 부분적인 발현을 포함한다. 또한, 발현은 일시적으로 또는 안정적으로 수행될 수 있다. 본 발명에 따를 때, 용어 발현은 또한 "변종 발현" 또는 "비정상적 발현"을 포함한다.
"변종 발현" 또는 "비정상적 발현"은 본 발명에 따를 때 참조와 비교하여, 좋기로는 비종양성 정상 세포 또는 건강한 개인에서의 상태와 비교하여, 그 발현이 변경, 좋기로는 증가된 것을 의미한다. 발현의 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 그 이상 증가된 것을 의미한다. 한가지 구체예에서, 건강한 조직에서는 발현이 억제되는 반면에, 병든 조직에서만 오직 발현이 발견된다.
선호되는 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산은 벡터 내에 존재하고, 적절하게 프로모터와 함께, 이것은 핵산의 발현을 조절한다. "벡터"라는 용어는 가장 넓은 의미에서 사용되고, 상기 핵산을 예컨대, 원핵세포 및/또는 진핵세포에 도입시키고, 적절하게, 게놈에 삽입하는 핵산을 위한 어떠한 중개 비히클(intermediary vehicle)을 포함한다. 이러한 종류의 벡터들은 좋게는 복제되고/거나 세포 내에서 발현된다. 벡터들은 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지 또는 바이러스 게놈들을 포함한다. "플라스미드"라는 용어는 여기에서 사용된 바와 같이, 일반적으로 염색체외적인 유전적 물질의 구조, 보통 원형 DNA 듀플렉스의 구조물에 관한 것이고, 이것은 염색체 DNA의 독립적으로 복제할 수 있다.
항체의 발현을 위한 벡터로서, 항체 중쇄 및 경쇄가 서로다른 벡터들에서 존재하는 벡터 유형이거나 중쇄 및 경쇄가 동일한 벡터 내에 존재하는 벡터 유형도 사용될 수 있다.
특이적 핵산 및 아미노산 서열에 관하여 본 발명에 설명된 교시 내용, 예컨대, 서열목록에 나타난 것들과 같은 것은 상기 특이적 서열들에 기능적으로 등가인 서열들을 나타내는 상기 특이적 서열들의 변형, 예컨대, 특이적 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 그것들과 비슷하거나 동일한 특징들을 나타내는 아미노산 서열들을 코딩하는 핵산 서열들 및 특이적 아미노산 서열들의 그것과 동일하거나 유사한 특징을 나타내는 아미노산 서열에 관한 것이기도 하도록, 해석되어야만 한다.
마찬가지로, 특이적 항체 또는 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마와 관련하여 본 명세서에 설명된 교시 내용은 특이적 항체의 아미노산 서열 및/또는 핵산 서열과 비교하여 변형된 아미노산 서열 및/또는 핵산 서열을 특징으로 하지만, 기능적으로 동등한 항체와도 또한 관련되는 것으로 해석될 것이다. 한가지 중요한 성질은 그 표적에 대한 항체의 결합을 보유하거나 항체의 이펙터 기능을 지속하는 것이다. 좋기로는 특정 서열에 관하여 변형된 서열은, 그것이 항체 내의 특정 서열을 치환한 경우에도, 표적에 대한 상기 항체의 결합 및 좋기로는 본 명세서에 기술된 바와 같은 상기 항체의 기능, 즉 CDC 매개 용해 또는 ADCC 매개 용해를 유지한다.
당업자들은 특히, CDR의 서열들, 과변이성 및 변이 영역들이 표적에 결합하는 능력을 잃어버림이 없이 변형될 수 있음을 잘 알고 있다. 예컨대, CDR 영역들은 본 발명에서 특정된 항체들의 영역들과 동일하거나 고도로 상동적일 것이다. "고도로 상동적(highly homologous)"이라 함은, 1 내지 5, 좋기로는 1 내지 4, 예컨대 1 내지 3 또는 1 또는 2개의 치환이 CDR에서 일어날 수 있는 것으로 한다. 이에 더해, 과변이 및 가변 영역들은 그것들이 여기에 특이적으로 개시된 항체들의 영역들과 실질적인 상동성을 나타내기 위해 변형될 수 있다.
본 발명에 개시된 특이적 핵산들은 또한 특별한 숙주 세포 또는 유기체들에서 코돈 사용을 최적화 하기 위하여 변형된 핵산들을 함유하는 것으로 이해된다. 생명체들 간의 코돈의 용도의 차이점은 이종기원의(heterologous) 유전자 발현에 관한 다양한 문제를 가져온다. 원래의 서열의 1 이상의 뉴클레오타이드를 변화시키는 것에 의한 코돈 최적화는 핵산이 발현되는 동종 또는 이종기원의 숙주에서 핵산의 발현의 최적화, 특히 번역 효율의 최적화로 나타날 수 있다. 예를 들어, 인간으로부터 유래하고 항체의 불변 영역 및/또는 프레임워크 영역을 코딩하는 핵산을 본 발명에 따라 예컨대 키메라 항체 또는 인간화 항체를 제조하는데 이용할 경우, 코돈의 최적 사용을 위하여 상기 핵산을 변형시키는 것이 바람직할 수 있으며, 특히, 만일 상기 핵산이 임의로 본 발명에 설명된 바와 같은 다른 생물로부터 유도된 핵산과 같은 이종 핵산에 융합될 경우, 마우스나 햄스터와 같이 인간과는 다른 생물로부터의 세포에서 발현되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 인간 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 1 이상, 좋기로는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 및 좋기로는 최대 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 또는 100 이상의 뉴클레오타이드 치환을 포함하도록 변형시켜 최적화된 코돈 이용성을 결과시킬 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 치환은 좋기로는 코딩된 아미노산 서열의 변화를 일으키지 않는 뉴클레오타이드의 치환에 관한 것이거나 또는 각각 인간의 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 코딩하는 다른 핵산 서열의 대응하는 위치에서의 대응하는 치환에 관한 것이 바람직하다.
특정 핵산 서열과, 상기 특정 핵산 서열에 대하여 변형되거나 또는 그것의 변이체인 핵산 서열 사이의 동일성의 정도는 좋기로는 적어도 70%, 좋기로는 적어도 75%, 보다 좋기로는 적어도 80%, 보다 더 좋기로는 적어도 90% 또는 가장 좋기로는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 것이다. 좋기로는 CLDN6 핵산 변이체에 관한 동일성의 정도는 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 450, 적어도 약 500, 적어도 약 550, 적어도 약 600 또는 적어도 약 630개 뉴클레오타이드의 영역에 대하여 주어진다. 바람직한 구체예에서, 동일성의 정도는 서열 목록에서 주어진 핵산 서열과 같은 참조 핵산 서열의 전체 길이에 대하여 주어진다. 좋게는, 두개의 서열들은 혼성화 및 좋게는 폴리뉴클레오티드들 (엄격한 조건들) 사이에 특이적 혼성화를 허용하는 조건하에 수행되는 혼성화와 함께 서로 안정적인 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 엄격한 조건들은 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York에 기재되고, 예컨대, 혼성화 완충액 (3.5 x SSC, 0.02% 피콜, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소혈청알부민, 2.5　mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5% SDS, 2　mM EDTA)에서 65℃에서 혼성화를 나타내는 것이다. SSC는 0.15　M 염화나트륨/0.15　M 구연산나트륨, pH 7이다. 혼성화 후, DNA가 전이된 막은 예컨대, 실온에서 2 X SSC로 세척하고 난 다음, 68℃까지의 온도에서 0.1-0.5 ×SSC/0.1 ×SDS로 세척한다.
본 발명에서 예컨대 핵산 및 아미노산 서열과 관련한 "변이체(variant)"라는 용어는 모든 변이체, 특히 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 컨포메이션, 이소형태, 대립성 변이체, 종 변이체 및 종 상동체, 특히 자연적으로 존재하는 변이체를 포괄한다. 대립성 변이체는 유전자의 정상 서열 중의 변경과 관련되는데, 그 중요성은 종종 불분명하다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자에 대한 수많은 대립성 변이체를 동정한다. 종 상동체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열의 것과 상이한 종 출처를 가지는 핵산 또는 아미노산 서열이다.
핵산 분자의 경우, "변이체"라는 용어에는 축퇴(degenerate) 핵산 서열이 포함되는데, 여기서 본 발명에 따른 축퇴 핵산은 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 코돈 서열이 레퍼런스 핵산과는 다른 핵산을 말한다.
또한, 본 발명에 따른 특이적인 핵산 서열의 "변이체"는 적어도 2, 4, 또는 적어도 6개 및 좋기로는 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 10, 최대 15, 또는 최대 20개의 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 부가가 일어난 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 목적상, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 결실 변이체, 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다.
삽입을 가지는 아미노산 서열 변이체의 경우, 1 이상 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 부위 속으로 삽입되나, 생성물의 적절한 스크리닝을 구비한 랜덤한 삽입 또한 가능하다.
아미노산 결실 변이체는 당해 서열로부터 1 이상의 아미노산의 제거에 의해 특징지어진다.
아미노산 치환 변이체는 서열 내 적어도 하나의 잔기를 제거하고 그 위치에 다른 잔기를 삽입하는 것을 그 특징으로 한다. 상동체 단백질 또는 펩타이드 사이에 보존되지 않은 아미노산 서열 부위에서의 변형 및/또는 아미노산을 유사한 성질을 가지는 다른 것으로 치환하는 것이 선호된다.
바람직하게는 단백질 변이체에서의 아미노산의 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 전하성 또는 비전하성 아미노산의 치환이 좋다.
좋기로는 실질적인 상동성을 나타내는 아미노산 서열들 사이와 같이, 특이적 아미노산 서열 및 상기 특이적 아미노산 서열에 관하여 변형된 또는 그에 관한 변이체인 아미노산 서열 사이에 유사성(similarity), 좋게는 동일성(identity)의 정도는 적어도 70%, 좋게는 적어도 75%, 더 좋게는 적어도 80%, 더욱 더 좋게는 적어도 90% 또는 가장 좋게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 것이다. CLDN6 폴리펩타이드 변이체와 관련하여, 유사성 또는 동일성의 정도는 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 적어도 약 200, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 적어도 약 200, 적어도 약 210개의 아미노산 서열의 대역에 대하여 주어지는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 유사성 또는 동일성 정도는 서열목록에 주어진 아미노산 서열과 같은 레퍼런스 아미노산 서열의 전장에 대하여 주어지는 것이 좋다.
"서열 유사성"은 동일하거나 또는 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산들의 백분율을 나타낸 것이다. 두 폴리펩타이드 또는 핵산 서열들 사이에 "서열 동일성"은 서열들 사이에 동일하다는 아미노산들 또는 뉴클레오티드들의 백분율을 나타낸 것이다.
"백분율(percentage) 동일성"은 최상의 정렬 후에 비교하고자 하는 2개의 서열들 간에 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 가리키는 것으로, 이 백분율은 순수하게 통계적인 것이며 2개의 서열 간의 차이는 그 전장에 걸쳐 무작위적으로 분포하는 것이다. 2개의 뉴클레오티드들 또는 아미노산 서열들 사이의 서열 비교들은 전통적으로 그것들을 최적으로 정렬시킨 후에 이러한 서열들을 비교함으로써 수행되고, 상기 비교는 서열 유사성의 국부 영역을 비교하고 확인하기 위해 "비교의 윈도우(window)"에 의해 또는 부분(segment)에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 손으로 뿐만 아니라, Smith 및 Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 로컬 상동성 알고리즘에 의해, 또는 Neddleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443 의 로컬 상동성 알고리즘에 의해, 또는 Pearson 및 Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444의 유사성 조사 방법에 의해, 또는 이러한 알고리즘들을 이용하는 컴퓨터 프로그램들(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)에 의해, 생산될 수 있다.
백분율 동일성은 비교되는 두개의 서열들 사이에 동일한 위치들의 수를 측정하고, 이러한 수를 비교되는 위치들의 수로 나누고, 두 서열들 사이의 백분율 동일성을 얻기 위해 100을 곱하여 결과값을 얻음으로써 계산된다.
"보존적 치환"은 예컨대, 관련된 잔기들의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양쪽성 성질에서 유사성에 근거하여 만들어진다. 예컨대, (a) 비극성 (소수성) 아미노산들은 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 함유한다; (b) 극성 중성 아미노산들은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 함유한다; (c) 양성적으로 전하를 띠는 (염기) 아미노산들은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 함유한다; (d) 음성적으로 전하를 띠는 (산성) 아미노산들은 아스팔틱산 및 글루탐산을 함유한다. 치환은 전형적으로 (a)-(d) 그룹들 내에서 만들어질 수 있다. 추가적으로, 글리신 및 프롤린은 [알파]-헬리스를 붕괴시키기 위한 능력에 근거하여 서로 치환될 수 있다. 몇몇 선호되는 치환들은 다음의 그룹들: (i) S 및 T; (ii) P 및 G; 및 (iii) A, V, L 및 I 중에서 만들어질 수 있다. 알려진 유전적 코드, 재조합 및 합성 DNA 기술을 가지고, 숙련된 과학자는 쉽게 보존적 아미노산 변이체를 코딩하는 DNA들을 구성할 수 있다.
본 발명은 핵산 서열, 아미노산 서열, 펩타이드 또는 단백질, 특히 본 발명에 설명된 항체의 유도체를 포함한다.
"유도체(derivative)"라는 용어는 뉴클레오타이드 염기 상의, 당 또는 포스페이트 상의 여하한 화학적 유도체화를 포괄한다. "유도체"라는 용어는 또한 자연적으로 일어나지 않는 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 함유하는 핵산도 포괄한다. 어떤 핵산을 유도체화시키면 그의 안정성이 증가되는 것이 좋다.
본 발명에 따라, 단백질 및 펩타이드의 "유도체"는 단백질 및 펩타이드의 변형된 형태이다. 이러한 변형은 화학적 변형이면 어느 것이든 포괄되며, 그 단백질 또는 펩타이드와 연관된 모든 분자, 예컨대 탄수화물, 지질 및/또는 단백질 또는 펩타이드의 단일 또는 복수개의 치환, 결실 및/또는 부가가 여기에 속한다. "유도체"라는 용어는 또한 상기 단백질과 펩타이드와 기능적으로 동등한 모든 화학적 동등물을 포함한다. 변형된 펩타이드는 안정성이 증가되고 및/또는 면역원성이 증가된 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, 핵산 서열, 아미노산 서열, 펩타이드 또는 단백질의 변이체, 유도체, 변형된 형태, 단편, 일부분 또는 부분은 이들이 유래하는 상기 각각의 핵산, 아미노산 서열, 펩타이드 또는 단백질의 기능적 특성을 갖는 것이다. 이러한 기능적 특성으로는 항체 또는 항체 표적, 특히 CLDN6과 같은 펩타이드 또는 단백질과의 상호반응, 핵산의 선택적 결합 및 효소 활성을 들 수 있다. 한가지 구체예에서, 변이체, 유도체, 변형된 형태, 단편, 핵산 서열, 아미노산 서열, 펩타이드 또는 단백질의 일부분 또는 부분은 이들이 유도된 각각의 핵산 서열, 아미노산 서열, 펩타이드 또는 단백질과 면역학적으로 동등하다. 일 구체예에서, 기능적 특성은 면역학적 특성이다.
본 발명에 따라, 세포는 온전한 세포, 즉, 효소, 소기관(organelles), 또는 유전 물질과 같은 그의 정상적인 세포내 성분들을 방출하지 않은, 온전한 막을 갖는 온전한(intact) 세포인 것이 좋다. 온전한 세포는 좋기로는 살아있는(viable) 세포, 즉 그의 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포인 것이 바람직하다. 세포는 인간 세포인 것이 좋다.
"세포"는 본 발명에서 "숙주 세포"일 수 있고, 재조합 핵산이 도입된 세포를 의미하는 것이다.
용어 "형질전환 동물(transgenic animal)"은 하나 이상의 이식 유전자(transgene), 좋게는 중쇄 및/또는 경쇄 이식 유전자 또는 트랜스염색체 (동물의 자연 게노믹(genomic) DNA에 삽입된 또는 비삽입된)를 포함하는 게놈을 가지고, 좋게는 이식 유전자들을 발현할 수 있는 동물을 나타낸다. 예컨대, 형질전환 마우스는 인간 경쇄 이식 유전자 및 인간 중쇄 이식 유전자 또는 인간 중쇄 트랜스염색체를 가질 수 있고, 마우스는 CLDN6 및/또는 CLDN6발현 세포들로 면역화될 때 인간 항-CLDN6 항체들을 생산한다. 중쇄 이식 유전자는 형질전환 마우스들, 예컨대, HCo7 또는 HCol2 마우스들을 비롯한 HuMAb 마우스들의 경우와 같이, 마우스의 염색체 DNA로 삽입될 수 있거나, 인간 중쇄 이식 유전자는 WO 02/43478에 기재된 바와 같이, 트랜스염색체(예컨대, KM) 마우스의 경우처럼, 염색체외적으로 유지될 수 있다. 그러한 형질전환 및 트랜스염색체 마우스들은 V-D-J 재조합 및 이소타입 스위칭을 거침에 의해 CLDN6(예컨대, IgG, IgA 및/또는IgE)에 대한 인간 모노클로날 항체들의 다양한 이소타입들을 생산할 수 있다.
본 발명에 따라, "치료 이펙터 모이어티(therapeutic effector moiety)"는 치료 효과를 발휘할 수 있는 분자를 의미한다. 본 발명에서, 치료 이펙터 분자는 CLDN6을 발현하는 세포에 선택적으로 가이드되는 것이 바람직하고, 여기에는 항암제, 방사능동위원소, 독소, 세포증식억제제 또는 세포용해약물 등이 포함된다. 항암제는 예컨대 아미노글루테티미드, 아자티오프린, 블레오마이신 설페이트, 부술판, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 시타라비딘, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 탁솔, 에토포시드, 플루오로우라실, 인터페론-α, 로무스틴, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토테인, 프로카르바진 HCl, 티오구아닌, 빈블라스틴 설페이트 및 빈크리스틴 설페이트이다. 기타 항암제는 예컨대 Goodman 및 Gilman의 문헌 ["The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc., in particular Chapter 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner)]에 설명되어 있다. 독소는 포키위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 콜레라 독소, 백일해 독소, 리신, 젤로닌, 아브린, 디프테리아 외독소 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소와 같은 단백질일 수 있다. 독소 잔기는 또한 코발트-60과 같은 고에너지-방출 방사선핵종일 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 "감소" 또는 "억제"라는 용어는 세포 증식 레벨과 같은 레벨과 관련하여, 전체적인 감소, 좋기로는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 및 가장 바람직하게는 75% 이상의 감소를 야기할 수 있는 능력을 의미한다. 용어 "억제" 또는 유사한 어구는 완전한 또는 필수적으로 완전한 억제, 즉 0 또는 필수적으로 O으로의 감소를 포함한다.
"증가" 또는 "촉진"과 같은 용어는 적어도 약 10%, 좋기로는 적어도 약 20%, 좋기로는 적어도 약 30%, 보다 좋기로는 적어도 약 40%, 보다 좋기로는 적어도 약 50%, 보다 더 좋기로는 적어도 약 80%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 100%의 증가 또는 촉진과 관계된다.
"면역학적으로 동등한(immunologically equivalent)"이라는 용어는 면역학적으로 동등한 아미노산 서열과 같은 면역학적으로 동등한 분자가, 예컨대 체액성 및/또는 세포성 면역 반응, 유도된 면역 반응의 강도 및/또는 기간 또는 유도된 면역 반응의 특이성과 같은 면역학적 효과의 유형과 관련하여 같거나 또는 기본적으로 같은 면역학적 효과를 발휘함을 의미한다. 본 발명의 문맥상, "면역학적으로 동등한"이라는 용어는 면역 또는 항체와 관련하여 사용되는 펩타이드 또는 펩타이드 변이체의 특성 또는 면역학적 효과와 관련하여 사용되는 것이 좋다. 특정한 면역학적 특성은 항체와 결합하는 능력으로서, 적절한 경우, 좋기로는 항체 생산을 촉진함으로써 면역 반응을 일으키는 능력이다. 예를 들어, 만일 어떤 아미노산 서열이 대상자의 면역계에 노출될 경우 면역 반응, 좋기로는 레퍼런스 아미노산 서열, 예컨대 CLDN6의 일부분을 형성하는 레퍼런스 아미노산 서열과의 반응 특이성을 갖는 항체를 유도할 경우, 상기 아미노산 서열은 상기 레퍼런스 아미노산 서열과 면역학적으로 동등한 것이다.
본 발명의 문맥상, 용어 "면역 이펙터 기능"은, 종양 확산 및 전이의 억제를 포함하는, 종양 성장의 억제 및/또는 종양 발전의 억제를 야기하는 면역 시스템의 성분에 의하여 매개되는 임의의 기능을 포함한다. 좋기로는 면역 이펙터 기능은 종양 세포의 살해를 일으킨다. 좋기로는 본 발명의 문맥에서 면역 이펙터 기능은 항체-매개 이펙터 기능이다. 이와 같은 기능은, 예를 들어 표면 항원에의 항체의 결합, 및/또는 종양-관련 항원을 나르는 세포의 증식 억제, 좋기로는 ADCC 및/또는 CDC에 의한, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 종양-관련 항원, 예컨대 CLDN6을 담지하는 세포의 세포자멸사의 유도를 포함한다. 따라서, 1 이상의 면역 이펙터 기능을 매개하는 능력이 있는 항체는 좋기로는 CDC-매개된 용해, ADCC-매개된 용해, 세포자멸사, 동형 부착 및/또는 식균작용, 좋게는 CDC 매개된 용해 및/또는 ADCC 매개된 용해를 유도하는 것에 의한 세포 살해를 매개할 수 있다. 또한, 항체는 종양 세포의 표면 상의 종양-관련 항원에 단순히 결합하는 것에 의하여 효과를 행사할 수도 있다. 예를 들어, 항체는 종양 세포의 표면 상의 종양-관련 항원에 단지 결합하는 것에 의하여 종양-관련 항원 기능을 차단하거나 또는 세포자멸사를 유도할 수 있다.
본 발명에 설명된 항체, 조성물 및 방법은 종양 질환, 예컨대 CLDN6를 발현하는 종양 세포의 존재에 의해 특징지어지는 질환에 걸린 대상자를 치료하는데 이용될 수 있다. 치료 및/또는 예방될 수 있는 종양 질환의 예로는 본 발명에 설명된 것들을 비롯하여 CLDN6를 발현하는 모든 암 및 종양을 들 수 있다.
본 발명에 설명된 항체, 조성물 및 방법은 또한 본 발명에 설명된 질환을 예방하기 위한 예방접종 또는 면역화에 이용될 수도 있다.
본 발명에서, "질환"이라는 용어는 암, 특히 본 발명에 설명된 유형의 암을 비롯한 모든 병리적 상태를 일컫는다.
본 발명에서 "CLDN6를 발현하는 세포와 관련된 질병"이라 함은, 병든 조직 또는 기관의 세포 중에서 발현 및 결합이 건강한 조직 또는 기관에서의 상태와 비교하여 좋기로는 증가되는 것을 의미한다. 증가란 적어도 10% 증가, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 심지어 더 증가하는 것을 의미한다. 한가지 구체예에서 발현은 병든 조직에서만 오직 발견되는 반면, 건강한 조직 내 발현은 억제된다. 본 발명에서, CLDN6를 발현하는 세포와 관련되거나 연관된 질환은 암 질환과 같은 종양 질환을 포함한다. 또한, 본 발명에서, 암 질환과 같은 종양 질환은 종양 세포 또는 암 세포가 CLDN6을 발현하는 것들인 것이 바람직하다.
본 발명에서, "종양" 또는 "종양 질환"이라는 용어는 세포의 비정상적인 성장에 의하여 형성되는 병변 또는 팽윤을 가리킨다 (신생세포 또는 종양 세포라 함). "종양 세포"라 함은 급속하고 비조절형인 세포 증식에 의해 성장하고, 새로운 성장을 개시한 자극이 중단된 후에도 계속하여 성장하는, 비정상적인 세포를 의미한다. 종양은 정상적인 조직이 갖는 구조적 조직 및 기능적 코디네이션을 부분적으로 또는 전적으로 결여하며, 대개 양성, 전악성 또는 악성일 수 있는 뚜렷한 조직 덩어리를 형성한다.
양성 종양은 암의 3가지 악성 특성들이 없는 종양이다. 따라서, 정의상, 양성 종양은 무제한적으로, 공격적인 방식으로 성장하지 않고, 주변 조직에 침입하지도 않으며, 비인접 조직으로 확산(전이)되지도 않는다. 양성 종양의 전형적인 예로는 사마귀와 자궁근종을 들 수 있다.
"양성(benign)"이라는 용어는 온화하고 비진행성인 질환을 시사하며, 실제로 많은 양성 종양은 건강에 해롭지 않다. 그러나, 암의 침습성 특징을 결여함으로 해서 "양성 종양"으로 판정된 어떤 신생물들은 건강에 나쁜 영향을 미칠 수도 있다. 이의 예로는 어떤 호르몬을 과다생산할 수 있는, 내분비 조직의 "기능성" 종양 (예컨대 갑상선 선종, 부신 피질 선종 및 뇌하수체 선종을 들 수 있다) 또는 "질량 효과(mass effect)" (혈관과 같은 주요 장기의 압박)을 일으키는 종양을 들 수 있다.
양성 종양은 일반적으로 악성 형식으로 거동하는 능력을 억제하는 외부 표면에 의해 감싸여 있다. 몇몇 경우, 특정의 "양성" 종양은, 종양 신생 세포의 서브파퓰레이션에서의 부가적인 유전적 변화에 기인하는 악성 암으로 나중에 발전할 수 있다. 이러한 현상의 현저한 예는 대장암의 중요한 전구체인 대장 폴립의 일반적 형태인 관상 선종이다. 관상 선종의 세포들은 종종 암으로 진행하는 대부분의 종양처럼, 집합적으로 형성이상(dysplasia)으로 알려진 세포의 성숙 및 외관과 관련항 어떤 비정상성을 나타낸다. 이러한 세포의 비정상성은 암으로 거의 또는 전혀 전환되지 않는 양성 종양에서는 나타나지 않으나, 자궁경부의 전암성 병변과 같이 불연속적인 덩어리를 형성하지 않는 다른 전암성 조직 비정상성에서는 나타난다. 몇몇 당국에서는 형성이상적인 종양을 "전악성(pre-malignant)"라 칭하는 것을 선호하며, 암으로 전혀 또는 거의 변하지 않는 종양에 대해 "양성"이라는 용어를 사용하는 것을 유보하고 있다.
신생물(neoplasm)은 신생물 형성의 결과로 인한 비정상적인 조직 덩어리이다. 신생물 형성 (그리스어로 새로운 성장이라는 의미임)은 세포의 비정상적인 증식이다. 세포의 증식이 과도하여, 그를 둘러싼 정상적인 조직의 성장과 조화를 이루지 못하게 된다. 이러한 비정상적인 성장은 자극이 중단된 후에도 동일하게 과도한 방식으로 지속된다. 이것은 대개 럼프 또는 종양을 일으킨다. 신생물은 양성, 전악성 또는 악성일 수 있다.
본 발명에서 "종양의 성장" 또는 "종양 성장"이라 함은 종양이 그 크기를 증가시키는 경향 및/또는 종양 세포가 증식하려는 경향과 관련이 있다.
본 발명에 따른 "종양 질환"은 좋기로는 암 질환, 즉, 악성 질환이며, 종양 세포는 암 세포이다. 좋기로는 "종양 질환"은 CLDN6를 발현하는 세포이고 종양 세포는 CLDN6를 발현한다.
암(의학적 용어:악성 신생물)은 일단의 세포 그룹이 조절되지 않는 성장(정상적인 한계를 벗어난 분열), 침습(주변 조직으로의 침투 및 주변 조직의 파괴), 및 때로 전이(림프 또는 혈액을 통한 체내의 다른 위치로의 확산)을 나타내는 질환 클래스이다. 암의 이러한 세가지 악성 특성으로 인해 암은, 자가 제한적이고, 침습 또는 전이하지 않는 양성 종양과 구별된다. 대부분의 암은 종양을 형성하지만, 백혈병과 같은 몇몇은 그렇지 않다.
CLDN6를 발현하는 세포는 종양 세포 또는 암세포, 좋기로는 본 발명에 설명된 종양 및 암인 것이 바람직하다. 좋기로는, 이러한 세포는 태반 세포 이외의 세포인 것이 바람직하다.
암은 종양을 닮은 세포 종류, 및 따라서 종양의 기원으로 추정되는 조직의 종류에 따라 분류된다. 이들은 각각 조직학 및 위치이다.
본 발명에서 "암"이라 함은 백혈병, 고환종, 흑색종, 기형종, 림프종, 신경모세포종, 신경아교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 소장암, 간암, 결장암, 위암, 내장암, 두경부암, 위장관암, 림프절암, 식도암, 대장암, 췌장암, 이비인후(ENT) 암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 이들의 전이를 포함한다. 이의 예로는 폐암종, 유선암종, 전립선 암종, 결장암종, 신장세포 암정, 자궁경부 암종 또는 전술한 암 종류 또는 종양의 전이를 들 수 있다. 본 발명에서 암이라는 용어는 암 전이를 포함한다.
본 발명에 따른 종양 질환 또는 암은 난소암, 특히 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암(SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 포함하는 폐암, 특히 편평상피세포 암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저 세포암종 및 편평 세포암종, 악성 흑색종, 두부 및 경부암, 특히 악성 다형성 선종, 육종, 특히 활막 육종 및 암육종, 담도암, 방광암, 특히 이행 세포 암종 및 갑상선 유두암종, 신장암, 특히 투명세포 신세포 암종 및 유두상 신세포 암종을 포함하는 신세포 암종, 결장암, 회장암을 포함하는 소장암, 특히 소장 선암 및 회장 선암, 고환 배아성 암종, 태반 융모 상피암종, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형종 및 배아성 고환암, 및 자궁암, 이들의 전이 형태와 같은 암을 들 수 있다.
본 발명에서 특히 바람직한 종양 질환 또는 암은 난소암, 폐암, 전이성 난소암 및 전이성 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 좋기로는, 난소암은 난소 암종 또는 난소 선암종이다. 좋기로는, 폐암은 암종 또는 선암종이고 좋기로는 세기관지성 암종 또는 세기관지성 선암종과 같은 세기관지암이다. 한가지 구체예에서, 종양 세포는 이러한 암의 세포이다. 전이성 난소암에는 전이성 난소 암종 및 전이성 난소 선암종이 포함되고, 전이성 폐암에는 전이성 폐암종, 전이성 폐 선암종, 전이성 세기관지성 암종 및 전이성 세기관지성 선암종이 포함된다.
폐암의 주요 유형은 소세포 폐암(SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)이다. 비소세포 폐암종에는 3가지 주요 유형, 즉: 편평상피세포 암종, 선암종 및 대세포 폐암종이 있다. 선암종은 폐암의 약 10%를 차지한다. 이러한 암은 소세포 폐암 및 편평상피세포 폐암 (두가지 모두 보다 중심에 위치함)과 반대로, 대개 폐의 주변부에서 관찰된다.
피부암은 피부 상의 악성 성장이다. 가장 흔한 피부암은 기저세포 암, 편평상피 세포암 및 흑색종이다. 악성 흑색종은 피부암의 심각한 유형이다. 이것은 멜라닌세포라 칭해지는 색소 세포의 제어되지 않은 성장에 기인한다.
본 발명에 따라, "암종"은 상피 세포로부터 유래하는 악성 종양이다. 이 그룹은 대부분 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암의 흔한 형태를 비롯한 가장 흔한 암이다.
"세기관지성 암"은 말단 세기관지의 상피층으로부터 유래하는 것으로 여겨지는 폐의 악성 종양인데, 신생 조직은 폐포 벽을 따라 신장하고, 폐포 내 작은 덩어리로 성장한다. 점액소는 세포의 몇몇 중에서, 그리고 벗겨진 세포를 또한 포함하는 폐포 중의 물질 중에서 나타날 수 있다.
"선암"은 샘 조직에서 발생하는 암이다. 이 조직은 또한 상피 조직으로 알려진 더 큰 조직 카테고리의 일 부분이다. 상피 세포는 피부, 샘 및 몸의 체강 및 기관에 정렬하는 다양한 다른 조직을 포함한다. 상피층은 발생학상으로 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로부터 유래한다. 선암으로서 분류되기 위해서 세포가 분비 성질을 가지는한, 샘의 일부일 필요는 없다. 이러한 악성 종양의 형태는 인간을 포함하는 몇몇 고등 동물에서 발생할 수 있다. 잘 분화된 선암은 그들이 유래한 샘 조직을 닮는 경향이 있는 반면에, 잘 분화되지 못한 것은 그러하지 아니하다. 생검으로부터 세포를 염색하는 것에 의하여, 병리학자들은 종양이 선암인지 또는 다른 형태의 암인지 결정할 것이다. 선암은 몸체의 도처에 위치하는 샘의 특성상 신체의 많은 조직에서 발생할 수 있다. 각각의 샘은 동일한 물질을 분비하지 않을 수도 있는 반면, 세포에 외분비 기능이 있는 한 그것은 샘으로 여겨지며, 따라서 그것의 악성 형태를 선암으로 명명한다. 악성 선암은 다른 조직을 침범하고, 그렇게 하기에 충분한 시간이 주어지는 경우 종종 전이된다. 난소 선암은 가장 흔한 난소 악성 종양의 형태이다. 그것은 장액 및 점액소의 선암, 투명세포 선암 및 자궁내막양 선암을 포암한다.
"낭선암"은 난소암의 한 형태인 표피 상피-스트로마 종양의 악성 형태이다.
표피 상피-스트로마 종양은 난소 표면 상피층(변형된 복막) 또는 전위 자궁내막 또는 팔로피오관(관의) 조직으로부터 난소 종양의 일종으로 여겨진다. 이 종양 군은 모든 난소 종양의 대다수를 차지한다.
"융모막암종"은 대개 태반에서 발생하는 악성의 영양막성의 공격성이 높은 암이다. 이것은 폐로의 조기 혈행파종성 확산에 의해 특징지어진다.
신세포 암 또는 신세포 암종으로도 알려져 있는 신장 세포 암종은 혈액을 거르고 노폐물을 제거하는 신장 내 매우 작은 튜브인 근위세뇨관의 내층으로부터 유래되는 신장암이다. 신세포 암종은 지금까지 성인에게 발행하는 신장암의 가장 흔한 형태이고, 모든 비뇨 생식기 종양 중에서 가장 치명적이다. 신세포 암종의 뚜렷한 서브타입으로는 투명세포 신세포암 및 유두상 신세포암이 있다. 투명세포 신세포암은 신세포 암종에서 가장 흔한 형태이다. 현미경으로 관찰하는 경우 투명세포 신세포암을 이루는 세포들은 매우 창백하고 투명하게 보인다. 유두상 신세포암은 두 번째로 흔한 서브타입이다. 이들 암은 대부분의 종양에서는 아닐지라도, 몇몇 종양에서 작은 손가락 유사의 돌기(유두라고 불리움)를 형성한다.
육종은 연결 조직 또는 중배엽 세포로부터 유래하는 악성 종양이다. 이것은 상피세포에 기원하는 암종과 대비되는 것이다. 활막육종은 대개 팔다리의 관절 근방에서 일어나는 희귀암이다. 이것은 연조직 육종의 일례이다.
배아 세포 종양은 배아 세포로부터 유래한 신생물이다. 배아 세포 종양은 암성 또는 비암성 종양일 수 있다. 배아 세포는 일반적으로 생식선(난소 및 정소) 내부에서 발생한다. 생식선의 외부(예컨대, 머리, 입안, 목, 골반 내; 몸 중심선, 특히 꼬리뼈의 첨단에서 가장 빈번하게 발견되는 태아, 아기 및 어린아이 내)에서 유래하는 배아 세포 종양은 배아의 발달 중의 잘못에서 야기되는 선천적 결함일 수 있다.
배아 세포 종양의 두개의 주된 부류는 정상피종 및 비정상피종인데, 여기서 비정상피종은 기형암종, 배아암, 난황 낭종, 융모막 암종 및 분화된 기형증을 포함한다. 비정상피종으로부터 유래한 대부분의 세포주는 배아암종과 동등한데, 다시 말해 몇몇은 레티노산과 같은 분화 유도제에 반응하더라도, 그들은 기저 조건에서 분화하지 않는 줄기 세포로 거의 전체를 구성한다.
기형암종이란 기형증이 배아암 또는 융모막암종 또는 둘 모두와 혼합된 것인 배아 세포 종양을 의미한다. 이러한 유형의 혼합 배아 세포 종양은 단순히 배아 암종 또는 융모막암종의 요소를 갖는 기형종으로 알려져 있거나, 또는 단순히 기형종 요소를 무시하고 그의 악성 요소: 배아 암종 및/또는 융모막암종만을 칭하는 것일 수도 있다.
림프종 및 백혈병은 조혈(혈액-형성) 세포로부터 유래하는 악성 질병이다.
모세포 종양 또는 모세포종은 미성숙 또는 배아 조직을 닮은 종양(대개 악성임)이다. 이들 종양은 대부분 아동에서 가장 흔하다.
"전이"라 함은 암이 그의 원래 위치로부터 체내의 다른 부분으로 퍼지는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며 일차 종양으로부터 악성 세포의 탈리, 세포외 매트릭스 침입, 체강 및 혈관으로 유입하기 위한 내피 기저막 침투, 및 이어서 혈액에 의한 전달 후, 표적 장기로의 침습에 의존한다. 마지막으로, 새로운 종양, 즉 표적 부위에서의 2차 종양 또는 전이성 종양의 성장은 혈관신생에 의존한다. 종양 세포 또는 성분은 일차 종양 제거 후에도 남아있을 수 있고 전이 가능성이 있으므로, 종양 전이가 흔히 발생한다. 한가지 구체예에서, 본 발명에 따른 "전이"라는 용어는 일차 종양 및 국소 림프절 시스템과 멀리 떨어진 전이와 관련된 "원발성 전이"와 관련되어 있다.
2차 또는 전이성 종양의 세포들은 원래의 종양의 세포들과 비슷하다. 이것은, 예컨대, 만일 난소암이 간으로 전이된 경우, 2차 종양은 비정상적인 간세포가 아니라 비정상적인 난소 세포로 만들어짐을 의미한다. 이 경우, 간의 종양은 간암이 아니라 전이성 난소암으로 부른다.
난소암에서, 전이는 다음의 방식으로 일어날 수 있다; 직접적인 접촉 또는 익스텐젼에 의해, 예컨대 나팔관, 자궁, 방광, 직장 등과 같은 난소 근방 또는 주변에 위치한 조직이나 장기로 침입할 수 있음; 복강 내로 씨딩(seeding) 또는 발산(shedding)에 의하여 일어나는 전이로서, 가장 흔한 난소암 확산 방식이다. 암세포는 난소 매스(mass) 표면을 파괴하여 간, 위장, 결장 또는 횡경막과 같은 복강내의 다른 구조물에 "적하(drop)"한다; 난소 매스로부터 떨어져 나와서, 림프관으로 침입한 다음 폐나 간과 같은 체내의 멀리 떨어진 장기까지 간다; 난소 매스로부터 떨어져 나와 혈류계를 따라 체내의 다른 부위 또는 멀리 떨어진 장기까지 간다.
본 발명에 따라, 전이성 난소암에는 나팔관의 암, 창자 내의 암과 같은 복부 장기 내의 암, 자궁 내의 암, 방광 내의 암, 직장 내의 암, 간 내의 암, 위장 내의 암, 결장 내의 암, 횡경막 내의 암, 폐 내의 암, 복부 또는 골반의 내막(복막)의 암, 뇌 내의 암이 포함된다. 마찬가지로 전이성 폐암이라 함은 폐로부터 멀리 떨어진 및/또는 복수개의 신체 부위로 퍼진 암을 말하며 간 내의 암, 부신 내의 암, 뼈 속의 암, 뇌 내의 암이 여기에 포함된다.
재발(relapse) 또는 반복(recurrence)은 대상자가 전에 걸렸던 병태에 다시 걸리게 되는 것이다. 예를 들어, 환자가 종양 질환에 걸려셔, 상기 질환의 성공적인 치료를 받은 다음, 상기 질환이 다시 발병할 경우 상기 새로 발병한 질환은 재발 또는 반복이라 할 수 있다. 그러나, 본 발명에서는, 종양 질환의 재발 또는 반복이 반드시 종양 질환이 본래 발생한 부위에서 일어나야 하는 것은 아니다. 따라서, 예컨대, 만일 환자가 난소 종양을 앓았었고 치료가 성공적이었다 해도 재발 또는 반복은 난소 종양의 발생이거나 또는 난소와 다른 부위의 종양의 발생일 수 있다. 종양의 재발 또는 반복은 또한 종양이 본래 일어난 부위와 다른 부위에서 일어나는 경우 뿐만 아니라 종양이 본래 발생했던 부위에서 일어날 수도 있다. 좋기로는 환자가 치료받은 본래의 종양이 일차 종양이고 본래의 종양과 다른 부위에서 발생한 종양은 이차 또는 전이성 종양이다.
"치료하다"라는 용어는 대상자 체내의 종양을 에방 또는 제거하거나 종양의 크기를 감소시키거나 종양의 수를 감소시키기 위해; 대상자 체내의 종양의 성장을 억지 또는 지연시키기 위해; 대상자 체내의 새로운 종양 또는 종양 전이의 발달을 억제 또는 지연시키기 위해; 현재 종양이 있거나 또는 과거에 종양을 앓았던 대상자에서 종양 증상의 발증 또는 위중도 및/또는 재발을 감소시키기 위해; 및/또는 대상자의 수명을 연장시키기 위해 대상자에게 본 발명의 화합물 또는 조성물을 투여하는 것으르 의미한다.
특히, "질병의 치료"라 함은 질병 또는 그의 증상의 치유, 기간 단축, 완화, 예방, 진행 또는 악화를 지연 또는 억제하거나 발병을 예방 또는 지연시키는 것을 포함한다.
"걸릴 위험이 있다"라는 표현은 대상자, 즉 종양 질환, 특히 암의 발병 확률이 일반적인 집단에 비해 정상적인 경우보다 높은 환자를 의미한다. 이에 더해, 종양 질환, 특히 암에 걸렸던 적이 있거나 현재 걸린 대상자는 암 발병 위험이 높은 대상자이며, 따라서 암이 지속적으로 발병될 수 있다. 현재 또는 과거에 암에 걸렸던 대상자에 있어서는 또한 종양 전이 위험성도 증가한다.
"면역요법"이라는 용어는 특이적인 면역 반응과 관련한 치료에 관한 것이다. 본 발명의 문맥상, "보호하다", "예방하다", "예방적인", "방지하는", 또는 "보호적인"이라는 용어는 개체에 있어서 종양의 발생 및/또는 전파의 예방이나 치료 또는 두가지 모두에 관한 것으로, 특히, 대상자에 있어서 종양의 발병 기회를 최소화하거나 또는 종양의 발병을 지연시키는 것을 의미한다. 예컨대, 종양에 걸릴 위험이 있는 대상자는 전술한 바와 같이 종양을 예방하기 위한 요법의 후보자가 될 수 있다.
면역요법의 예방적 투여, 에컨대 본 발명의 조성물의 예방적 투여는 피투여자를 종양 성장 발달로부터 보호해준다. 면역요법의 치료적 투여, 예컨대 본 발명의 조성물의 치료적 투여는 종양의 진행/성장을 억제할 수 있다. 이것은 종양의 진행/성장을 지연시키고, 특히, 종양의 진행을 파괴하여, 좋기로는 종양을 제거하게 한다.
"생체 내 (in vivo)"라는 용어는 대상자 체내에서 일어나는 것과 관련이 있다.
용어 "대상자", "개체", 또는 "환자"는 호환적으로 사용되며, 척추 동물, 좋기로는 포유류를 의미한다. 예를 들어 본 발명의 문맥에서 포유류란 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등의 가축, 마우스, 래트, 래빗, 귀니아 피그 등의 실험 동물뿐만 아니라, 동물원의 동물들과 같은 포확된 동물을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "동물"이란 사람을 포함한다. 용어 "대상자" 또한 환자, 즉 동물, 좋기로는 질병, 좋기로는 CLDN6의 발현과 관련된 질병, 좋기로는 암과 같은 종양성 질병을 가진 인간을 포함한다.
면역화 또는 예방접종을 위한 조성물의 일부로서, 좋기로는 본 발명에 설명된 1 이상의 제제를 면역 반응을 증가시키거나 면역 반응을 유도하기 위한 1 이상의 보조제와 함께 투여하는 것이 바람직하다. 용어 "보조제"는 면역 반응을 연장 또는 증진 또는 가속화하는 화합물과 관련된다. 본 발명의 조성물은 좋기로는 보조제의 추가 없이 그 효능을 행사한다. 그러나, 본 출원의 조성물은 알려진 임의의 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 오일 유화물(예컨대 프로인드 어주번트), 미네랄 화합물(명반 등), 박테리아 생성물(Bordetella pertussis 톡신 등), 리포좀 및 면역-자극성 복합체와 같은 화합물의 이종 군을 포함한다. 보조제의 예로는 모노포스필-리피드-A(MPL SmithKline Beecham). QS21와 같은 사포닌(SmithKline Beecham), DQS21(SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, 및 QS-L1(So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), 불완전한 프로이드 어주번트, 완전한 프로이드 어주번트, 비타민 E, 몬타니드(montanid), 백반, CpG 올리고뉴클레오타이드(Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549) 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤과 같이 생물학적으로 분해가능한 오일로부터 제조한 다양한 오일 내 물 유화물 등이 있다.
본 발명에 따라, "시료(sample)"는 본 발명에 따라 유용한 어떠한 시료, 체액들을 포함한 특히 조직 시료 및/또는 세포적 시료와 같은 생물학적 시료일 수도 있고, 펀치(punch) 생검을 포함한 조직 생검 및 혈액, 기관지 흡인(bronchial aspirate), 가래, 소변, 대변 또는 다른 체액들에 의한 것과 같은 통상적인 방법에 의해 얻을 수 있다. 본 발명에 따라, "시료"라는 용어는 생물학적 시료들의 분획이나 분리물, 예컨대 핵산 및 펩타이드/단백질 분리물과 같은 가공된 시료도 포함한다.
환자의 면역 반응을 촉진하는 기타 물질 역시도 투여될 수 있다.예를 들어, 림프구에 대한 사이토카인의 조절 특성을 감안하여, 예방접종에 사이토카인일 사용할 수 있다. 이러한 사이토카인으로는 예컨대 백신의 보호작용을 증가시키는 것으로 나타난 인터류킨-12 (IL-12)(Hall (1995) Science 268: 1432-1434), GM-CSF 및 IL-18를 수 있다
면역 반응을 증강시키고 따라서 예방접종에 사용될 수 있는 화합물이 여러가지 있다. 상기 화합물들은 B7-1 및 B7-2 (각각 CD80 및 CD86)과 같은 핵산 또는 단백질의 형태로 제공되는 공동자극(costimulating) 분자들을 포함한다.
본 발명의 치료적 활성 화합물들은 주사 또는 인퓨젼을 비롯한 통상적인 경로로 투여될 수 있다. 투여는 예를 들어, 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 피내 또는 경피 경로로 실시될 수 있다. 좋기로는 항체를 폐 에어로졸을 통해 치료적으로 투여하는 것이 바람직하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체들은 태반을 가로지르는 운송을 예방하거나 줄이기 위해 제조될 수 있다. 이것은 기술분야에 알려진 방법들, 예컨대, 항체들의 페그화에 의해 또는 F(ab)2' 단편들의 사용에 의해 행해질 수 있다. 이와 관련하여, "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance 내지 enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; 및 내지 "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283"도 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"이라 함은 소망되는 반응 또는 소망되는 효과를 단독으로 얻게 하거나 또는 추가 투여에 의해 얻게 해주는 양을 의미한다. 특정 질환 또는 특정 병태의 치료의 경우, 소망되는 반응은 좋기로는 당해 질환의 경과를 억제하는 것에 관한 것이다. 이것은 질병의 진행의 지연, 특히 질병의 진행을 간섭 또는 역전시키는 것을 포함한다. 질병 또는 병태의 치료에 소망되는 반응은 또한 상기 질병이나 병태의 발병을 예방하거나 발명을 지연시키는 것일 수도 있다.
본 발명의 조성물의 유효량은 치료하고자 하는 병태, 질병의 위중도, 연령, 생리적 상태, 크기 및 체중과 같은 환자의 개체별 변수, 치료 기간, 병용 치료(있을 경우)의 종류, 특정한 투여 경로 및 유사한 인자에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명의 조성물의 투여량은 이러한 여러 변수들에 따라 달라질 수 있다. 환자에 있어서 초기 투여량으로 반응이 불충분할 경우, 더 많은 투여량 (또는 다른, 보다 국소화된 투여 경로에 의해 달성되는 효과적으로 더 높은 투여량)을 이용할 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물은 좋기로는 멸균된 것이며 소망되는 반응 또는 소망되는 효과를 발생하기 위해 치료 활성 물질을 유효량으로 함유한다.
본 발명의 의약 조성물은 일반적으로 약학적으로 양립가능한 양 및 약학적으로 양립가능한 제제로서 투여된다. "약학적으로 양립가능한 (pharmaceutically compatible)"이라는 용어는 의약 조성물의 활성 성분의 작용과 상호반응하지 않는 비독성 물질을 일컫는다. 이러한 유형의 제제들로는 대체로 염, 완충물질, 보존제, 담체, 보조제, 예컨대 CpG 올리고뉴클레오타이드와 같은 면역력 증강 보조물질, 사이토카인, 케모카인, 사포닌, GM-CSF 및/또는 RNA 및 적절한 경우, 기타의 치료 활성 화합물을 들 수 있다. 약제에 사용될 경우, 염은 약학적으로 양립가능하여야 한다. 그러나, 약학적으로 양립가능하지 않은 염들도 약학적으로 양립가능한 염을 제조하는데 사용될 수 있으며 본 발명에 포함된다. 약리적 또는 약학적으로 양립가능한 이러한 유형의 염들로는 다음의 산, 즉: 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등과 같은 산으로부터 제조되는 것들을 들 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 약학적으로 양립가능한 염들은 또한 알칼리 금속염 또는 알칼리토 금속염, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염으로서 제조될 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물은 약학적으로 양립가능한 담체를 함유할 수 있다. "담체(carrier)"라는 용어는 투여를 용이하게 하기 위해 활성 성분과 조합되는, 천연 또는 합성 기원의 유기 또는 무기 성분을 가리킨다. 본 발명에서, "약학적으로 양립가능한 담체"라는 용어는 환자에게 투여하는데 적합한, 1 이상의 양립가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함한다. 본 발명의 의약 조성물의 성분들은 대개 소망되는 약학적 효능을 실질적으로 손상시키는 상호반응을 일으키지 않는 물질이다.
본 발명의 의약 조성물은 염 중의 아세트산, 염 중의 시트르산, 염 중의 붕산 및 염 중의 인산과 같은 적절한 완충물질을 함유할 수 있다.
의약 조성물은 적절한 경우, 염화벤잘코늄, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살과 같은 적절한 보존제를 함유할 수 있다.
의약 조성물은 대개 균일한 투여 제형으로 제공되며 그 자체로 공지인 방식으로 제조될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 캡슐, 정제, 로젠지, 용액, 현탁제, 시럽, 엘릭시르 또는 예컨대 에멀젼 형태일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 대체로 활성 화합물의 멸균된 수성 또는 비수성 제제를 포함하는데, 이것은 수혜자의 혈액과 등장성인 것이 바람직하다. 양립가능한 담체 및 용매의 예는 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 용액 또는 현탁액의 매질로서는 대개 멸균된 고정 오일이 사용된다.
이하에 첨부된 도면과 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 이들은 어디까지나 설명 목적을 위해 제시된 것으로서 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 설명과 실시예를 참조로, 당업자들은 본 발명에 포함된 것과 유사한 다른 추가 구체예들을 실시할 수 있을 것이다.
도 1:
항 CLDN6 뮤린 모노클로날 항체 muMAB 5F2D2, 27A 및 36A의 결합 특이성.
MuMAB 5F2D2, 27A 및 36A 항체들은 CLDN6를 발현하는 세포에 강하게 결합하는 반면, CLDN3 또는 CLDN4를 발현하는 세포에는 결합하지 않는다.
도 2:
CLDN6 , 3, 4 또는 9에 의해 각각 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포에 대한 muMAB 5F2D2 결합의 적정.
MuMAB 5F2D2는 인간 CLDN6에 대하여 강한 결합을 나타내고 인간 CLDN9에 대해서는 약한 결합을 나타낸다. 항체는 인간 CLDN3 또는 4와는 상호반응하지 않는다.
도 3:
CLDN6 , 3, 4 또는 9에 의해 각각 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포에 대한 muMAB 27A 결합의 적정.
MuMAB 27A는 인간 CLDN6에 대하여 강한 결합을 나타내고 인간 CLDN9에 대해서는 약한 결합을 나타낸다. 항체는 인간 CLDN3 또는 4와는 상호반응하지 않는다.
도 4:
CLDN6 , 3, 4 또는 9에 의해 각각 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포에 대한 muMAB 36A의 적정.
MuMAB 36A는 인간CLDN6에 대하여 강한 결합을 나타내고 인간 CLDN9에 대해서는 약한 결합을 나타낸다. 항체는 인간 CLDN3 또는 4와는 상호반응하지 않는다.
도 5:
항 CLDN6 뮤린 모노클로날 항체 muMAB 5F2D2, 27A 및 36A의 상대적 친화도.
MuMAB 5F2D2 및 27A는 350-450 ng/ml의 EC50 값을 나타내며 저농도에서 결합 포화가 달성되는 반면 muMAB 36A는 최고 농도에서조차도 결합 포화가 나타나지 않는다.
도 6:
항 CLDN6 뮤린 모노클로날 항체 muMAB 5F2D2의 보체 의존성 세포독성( CDC ) 활성.
MuMAB 5F2D2는 투여량-의존 방식으로 CDC 활성을 나타낸다.
도 7:
항 CLDN6 뮤린 모노클로날 항체 muMAB 27A 및 36A의 보체 의존성 세포독성.
MuMAB 27A는 투여량-의존 방식으로 CDC 활성을 나타내는 반면 muMAB 36A는 시험관내에서 CDC를 유도하지 못한다.
도 8:
내인적으로 CLDN6 를 발현하는 NEC8 및 NEC8 LVTS2 54에 대한 키메라 항 CLDN6 항체 chimAB 5F2D2에 의한 항체 의존성 세포 매개형 세포독성( ADCC )의 유도 ( CLDN6 녹-다운).
키메라 항CLDN6 항체 chimAB 5F2D2는 서로 다른 2 도너의 이펙터 세포와 함께 NEC8 세포에 대하여 투여량 의존 방식으로 ADCC를 유도한다. NEC8 LVTS2 54 세포에 대한 ADCC 유도 효능 (CLDN6 녹-다운)은 chimAB 5F2D2에 의해 강하게 감소된다.
도 9:
초기 처리 이종이식 모델에 있어서 muMAB 5F2D2의 치료 효과.
MuMAB 5F2D2는 인간 CLDN6을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포가 이식된 마우스에서 특이적이고 강한 종양 성장 억제를 나타낸다.
도 10:
초기 처리 이종이식 모델에 있어서 muMAB 5F2D2의 치료 효과.
크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검사에서 muMAB 5F2D2로 처리한지 28일 후 (및 그 후에도) 종양의 크기가 유의적으로 감소되었다.
도 11:
초기 처리 이종이식 모델에 있어서 muMAB 5F2D2의 치료 효과.
모노클로날 뮤린 항CLDN6 항체 muMAB 5F2D2로 처리된 마우스들은 PBS 대조군으로 처리된 경우보다 더 오래 생존한 것으로 나타났다.
도 12:
초기 처리 이종이식 모델에 있어서 muMAB 27A의 치료 효과.
MuMAB 27A는 인간 CLDN6을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포가 이식된 마우스에서 특이적이고 강한 종양 성장 억제를 나타낸다.
도 13:
초기 처리 이종이식 모델에 있어서 muMAB 36A의 치료 효과.
MuMAB 36A는 인간 CLDN6을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포가 이식된 마우스에서 특이적이고 강한 종양 성장 억제를 나타낸다.
도 14:
초기 처리 이종이식 모델에 있어서 muMAB 27A 및 muMAB 36A의 치료 효과.
모노클로날 뮤린 항CLDN6 항체 muMAB 27A 및 36A로 처리된 마우스들은 오래 생존한 것으로 나타났다.
도 15:
NEC8 세포에서의 인간 CLDN3 , 4, 6 및 9 발현의 면역블랏 ( immunoblot ) 분석.
고환 생식 세포 종양 세포주 NEC8는 CLDN6의 발현만을 나타내고 (A) CLDN3, 4 또는 9 각각의 발현은 나타내지 않는다 (B).
도 16:
유세포 분석( flow cytometry )을 이용한 NEC8 세포에 대한 CLDN6 표면 발현 분석.
CLDN6은 NEC8 세포에서 발현된다.
도 17:
종양 세포주 NEC8 이 이식된 마우스를 이용한 이종이식 모델의 초기 처리시 muMAB 5F2D2의 치료 효과.
식염수 대조군에 비해 muMAB 5F2D2는 내인적으로 인간 CLDN6을 발현하는 NEC8 세포가 이식된 마우스에서 특이적이고도 강력한 종양 성장 억제를 나타낸다.
도 18:
종양 세포주 NEC8이 이식된 마우스를 이용한 이종이식 모델의 초기 처리시 muMAB 5F2D2의 치료 효과.
크루스칼-왈리스 검사 결과 muMAB 5F2D2 치료후 제21 및 제42일에 종양의 크기가 감소된 것으로 나타났다.
실시예
본 명세서의 사용된 기법 및 방법은 여기에 기술되며, 기술된 것과 같은 방법 또는 그 자체로 알려진 방법, 예컨대 논문(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y)에서의 방법으로 수행된다. 키트 및 시약의 사용을 포함하는 모든 방법은 특별한 지시가 없는 한 제조사 정보에 따라 수행된다.
실시예 1: 재료 및 방법
A. CLDN6에 대한 뮤린 항체의 제조
a. 전장 CLDN6 및 CLDN6 단편을 인코딩하는 발현 벡터의 제조
전장 CLDN6(SEQ ID NO: 2)를 인코딩하는 코돈 최적화한 인공 DNA 서열(SEQ ID NO: 10)을 화학 합성법(GENEART AG, Germany)으로 준비하고, pcDNA3.1/myc-His 벡터(Invitrogen, USA) 속으로 클로닝하여 벡터 p3953을 제조하였다. 정지 코돈의 삽입은 myc-His 태그를 코딩하는 벡터에 융합시킴없이 CLDN6 단백질의 발현을 허여하였다. CLDN6의 발현은 상업적으로 이용가능한 항-CLDN6 항체(ARP, 01-8865; R&D Systems, MAB3656)를 사용하여 웨스턴 블롯, 유세포 분석 및 면역형광분석법으로 시험하였다.
또한, 올바른 신호 펩타이드 절단 부위(SEQ ID NO: 12)를 확실히 하기 위하여, 4개의 추가적인 아미노산이 뒤따르는 N-말단 Ig 카파 리더 유래 신호 펩타이드와의 융합형태로서, CLDN6 (SEQ ID NO: 5)의 잠정적인 세포외 도메인 2(EC2) 단편을 인코딩하는 코돈-최적화 DNA 서열(SEQ ID NO: 11)을 제조하고, pcDNA3.1/myc-His 벡터 속으로 클로닝하여 벡터 p3974를 제조하였다. 면역화에 앞서, 일시적으로 감염시킨 파라포름알데히드(PFA)-고정된 CHO-K1 세포를 상업적으로 이용가능한 항-myc 항체(Cell Signaling, MAB 2276)를 사용하여 면역형광 현미경으로 관찰하여 EC2 단편의 발현을 확인하였다.
b. CLDN6 를 안정적으로 발현하는 세포주의 제조
CLDN6를 안정적으로 발현하는 HEK293 및 P3X63Ag8U.1 세포주를 벡터 p3953을 사용한 표준 기술을 사용하여 제조하였다.
c. 면역화
MuMAB 5F2D2: 제0, 16 및 36일에 PEI-만노스(PEI-Man; 폴리플러스 트랜스펙션에서 유래한 생체 내 (in vivo)-jetPEITMMan) (5% 글루코스 수용액 중의 PEI-Man 150 mM) 4 ㎕와 함께 p3974 플라스미드 DNA 25 ㎍를 사용하여, 복강내 주사로 Balb/c 마우스를 면역화하였다. 제48일과 제62일에 CLDN6을 안정적으로 발현하도록 p3953 벡터로 형질감염시킨 2 x 107 P3X63Ag8U.1 골수종 세포를 복강내 주사하여 마우스를 면역화하였다. 62번째 날에 투여된 세포는 주입전에 3000 rad로 조사된 것이었다.
MuMAB 27A: 제0일과 제13일에 CLDN6를 안정적으로 발현하도록 p3953 벡터로 형질감염시킨 2 x 107 P3X63Ag8U.1 골수종 세포를 복강내 주사하여 Balb/c 마우스를 면역화하였다. 제21일에 종양이 발생한 마우스들에게 p3953 벡터로 형질감염시킨 2 x 107 HEK293 세포를 복강내 주사하여 부스트시켰다. 3일 후, 마우스들을 희생시켜 비장 세포를 준비하였다. 5 x 107개의 비장 세포를 정맥 주사에 의해 다른 Balb/c 마우스 내로 이식하였다. 제 35, 49, 67 및 104일에, p3953 벡터로 안정적으로 형질감염된 2 x 107 P3X63Ag8U.1 골수종 세포와 HPLC 정제된 포스포로티오에이트-변형된 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드 (PTO-CpG-ODN) (50 ㎍; 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT; Eurofins MWG Operon, Germany)를 이용하여, 상기 이식된 마우스를 복강 내 주사로 면역화하였다. 투여에 앞서, 세포들을 미토마이신-C (5 ㎍/ml, Sigma-Aldrich, M4287)로 처리하였다.
MuMAB 36A: 제0, 16 및 36일에 PEI-만노스(PEI-Man; 폴리플러스 트랜스펙션에서 유래한 생체 내 (in vivo)-jetPEITMMan) (5% 글루코스 수용액 중의 PEI-Man 150 mM) 4 ㎕와 함께 p3974 플라스미드 DNA 25 ㎍를 사용하여, 복강내 주사로 C57BL/6 마우스를 면역화하였다. 제55, 69 및 85일에 CLDN6을 안정적으로 발현하도록 p3953 벡터로 형질감염시킨 2 x 107 P3X63Ag8U.1 골수종 세포를 복강내 주사하여 마우스를 면역화하였다. 제85일에 세포와 HPLC-정제된 PTO-CpG-ODN (PBS 중 50 ㎍; 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT; Eurofins MWG Operon, Germany)를 함께 투여하였다.
CLDN6 및 GFP를 인코딩하는 핵산으로 공동-감염시킨 CHO-K1 세포를 사용하여 마우스 혈청 중 CLDN6에 대한 항체의 존재를 면역형광 현미경으로 관찰하였다. 이를 위하여, 감염 후 24시간에 PFA-고정 또는 비고정된 세포를 면역화된 마우스로부터 유래한 혈청의 1:100 희석액과 상온(RT)에서 45분간 배양하였다. 세포를 세척하고 Alexa555-표지된 항-마우스 Ig 항체(Molecular Probes)와 배양하고, 형광 현미경으로 관찰하였다.
모노클로날 항체 생산을 위하여, 비장절제 4일 전에 p3953 벡터로 안정적으로 감염된 2 x 107개 HEK293 세포를 복강내 주사하여 탐지가능한 항CLDN6 면역 반응을 가지는 마우스를 부스트하였다.
d. CLDN6 에 대한 뮤린 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조
면역화된 마우스로부터 분리한 비장세포 6 x 107개를 PEG 1500(Roche, CRL 10783641001)를 사용하여 마우스 골수종 세포주 P3X63Ag8.653(ATCC, CRL 1580)의 세포 3 x 107개와 융합시켰다. 평평한 저면 마이크로티터 플레이트의 각 웰당 대략 5 x 104개의 세포를 넣고, 열로 불활성화한 우태아 혈청 10%, 하이브리도마 융합 및 클로닝 보충제(HFCS, Roche, CRL 11363735) 1%, HEPES 10 mM, 소듐 피루베이트 1 mM, 글루코스 4.5%, 2-메르캅토에탄올 0.1 mM , 1 x 페니실린/스트렙토마이신 및 1 x HAT 보충제(Invitrogen, CRL 21060)를 포함하는 RPMI 선택적 배지 중에서 약 2주간 배양하였다. 10 내지 14일 후에, 유세포 분석기를 사용하여 항CLDN6 모노클로날 항체에 대하여 개별 웰을 스크리닝하였다. 항체 분비 하이브리도마를 한계 희석으로 서브 클로닝하고, 항CLDN6 모노클로날 항체에 대하여 다시 시험하였다. 특성화를 위하여, 안정된 서브 클론을 배양하여 조직 배양 배지로 적은 양의 항체를 발생시켰다. 모 세포의 반응성을 보유하고 있는 각각의 하이브리도마(유세포 분석기로 시험함)의 적어도 1종의 클론을 선별하였다. 각각의 나인-바이얼-세포 뱅크를 발생시키고 액상 질소 중에 보관하였다.
B. 유세포 분석( Flow cytometry)
CLDN6 및 다른 클라우딘에 대한 모노클로날 항체의 결합을 시험하기 위하여, HEK293T 세포를 상응하는 클라우딘-코딩 플라스미드로 일시적으로 감염시키고, 유세포 분석기를 사용하여 발현을 분석하였다. 감염된 세포와 비감염된 세포를 차별화하기 위하여, 리포터로서 형광 마커를 사용하여 HEK293T 세포를 공동 감염시켰다. 감염 24시간 후에 0.05% 트립신/EDTA를 사용하여 세포를 수확하고, FACS 완충액(2% FCS 및 0.1% 소듐 아자이드를 포함하는 PBS)을 사용하여 세척하고, 농도가 2 x 106 세포/ml인 FACS 완충액 중에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분 동안, 세포 현탁액 100 ㎕를 지시된 농도의 적당한 항체와 배양하였다. 상업적으로 이용가능한 마우스 항-클라우딘 항체들인 항CLDN6 (R&D, CRLㅡMAB3656), 항CLDN3 (R&D, MAB4620) 및 항CLDN4(R&D, MAB4219)을 양성 대조군으로서 사용하고, 마우스 IgG2a(Sigma, CRL M8894)를 이소타입 대조군으로 사용하였다. FACS 완충액을 사용하여 세포를 3회 세척하고, 알로피코시아닌 (APC)-접합된 항-마우스 IgG 1+2a+2b+3a 특이적 2차 항체(Dianova, 115-135-164)와 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 2회 세척하고 FACS 완충액에 재현탁시켰다. BD FACSArray를 사용한 유세포 분석법으로 결합을 분석하였다. 수직축 상의 항체 결합에 대한 형광 마커의 발현을 수평축 상에 도시하였다. 내인적으로 CLDN6을 발현하는 세포주에 대한 모노클로날 항체의 결합을 유사한 방식으로 분석하였다.
C. 면역블랏 분석( Immunoblot analysis)
면역블랏 분석에 의해 NEC8 세포를 CLDN6, 3, 4 및 9 발현에 대하여 분석하였다. 양성 대조군으로서 HEK293T 세포를 CLDN6, 3, 4, 9 중 어느 하나로 일시적으로 형질감염시키거나 음성 대조군으로 모인 플라스미드(mock plasmid)를 이용하였다. 세포를 라멜리 완충액에서 수확하고, 용해시킨 다음 SDS-PAGE로 검사하였다. 겔을 블라팅하고 항CLDN3 (Invitrogen, 34-1700), 항CLDN4 (Invitrogen, 32-9400), 항CDLN6 (ARP, 01-8865) 또는 항CLDN9 (Santa Cruz, sc-17672) 항체로 각각 염색하였다. 퍼옥시다제로 표지된 제2 항체와 함께 인큐베이션시킨 후 ECL 시약을 이용하여 블랏을 전개시키고 LAS-3000 영상기(Fuji)를 이용하여 가시화시켰다.
D. CDC 분석
항CLDN6 항체와 배양시킨 표적 세포에 인간 보체를 첨가한 후에, 용해되지 않은 세포 중의 세포 내 ATP의 함량을 측정하는 것에 의하여, 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity (CDC))을 측정하였다. ATP 측정을 위해 매우 민감한 분석 기법으로서, 루시퍼라제의 발광 반응을 사용하였다.
CLDN6으로 안정적으로 감염된 CHO-K1 세포(CHO-K1-CLDN6)를 0.05% 트립신/EDTA로 수확하고, X-Vivo 15 배지(Lonza, BE04-418Q)로 2회 세척하고, X-Vivo 15 배지 중에 1 x 107 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다.
세포 현탁액 250 ㎕을 0.4 cm의 전기 영동 큐벳으로 이전시키고, 루시퍼라제(luciferase IVT RNA)를 인코딩하는 인 비트로 전사된 RNA 7 ㎍과 혼합하였다. 진 펄서 엑스세포(Gene Pulser Xcell, Bio Rad)을 사용하여 200 V 및 300 μF에서 세포를 전기 영동 시켰다. 전기 영동 후에 10% (v/v) FCS, 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신 및 1.5 mg/ml G418를 포함하는 GlutaMax-I 배지(Invitrogen, 31331-093)와 함께 미리 데워둔 D-MEM/F12 (1:1) 2.4 ㎖에 세포를 현탁시켰다. 웰 당 세포 현택액 50 ㎕를 화이트 96-웰 PP-플레이트에 넣고, 7.5% CO2 및 37℃에서 배양하였다. 전기 영동 24시간 후에 60% RPMI(20 mM HEPES을 포함하는 것) 및 40% 인간 혈청(6명의 건강한 기증자로부터 얻은 혈청 풀) 중의 단일클론 뮤린 항CLDN6 항체 50 ㎕을 지시된 농도로 세포에 첨가하였다. PBS 내 8% (v/v) 트리톤 X-100을 웰당 10 ㎕로 총 용해(total lysis) 대조군에 첨가한 반면에, 최대 생존 세포(max viable cells) 대조군 및 실제 시료에는 PBS를 웰당 10 ㎕으로 첨가하였다. 7.5% CO2 및 37℃에서 80분의 배양 후에 루시페린 믹스(3.84 mg/ml D-루시페린, 0,64 U/ml ATPase 및 ddH2O 중의 160 mM HEPES)를 웰당 50 ㎕으로 첨가하였다. 플레이트를 RT에서 45분 동안 암실에서 배양하였다. 루미노메터(Infinite M200, TECAN)를 사용하여 발광을 측정하였다. 결과는 통합된 디지털 RLU(relative light units) 값으로 나타낸다.
특이적 용해(specific lysis)는 다음에 의하여 계산된다.
Figure 112013002004600-pct00001
최대 생존 세포(max viable cells): 항체 없이 PBS 10 ㎕
총 용해(total lysis):항체 없이 PBS 중의 8% (v/v) 트리톤 X-100 10 ㎕
E. ADCC 분석
루시페라제에 기초한 분석 시스템에서 내인적으로 CLDN6을 발현하는 NEC8 세포와 CLDN6 녹-다운된 NEC8 세포 (NEC8 LVTS2 54)에 대한 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)를 유도하는 능력에 대하여 키메라화된 모노클로날 항CLDN6 항체를 분석하였다.
NEC8 또는 NEC8 LVTS2 54 표적 세포들을 0.05% 트립신/EDTA을 이용하여 수확하고, X-Vivo 15 매질로 2회 세척한 다음 2.5 x 106 세포를 Gene Pulser Xcell (Bio Rad)를 이용하여 7 μg 루시페라제 IVT RNA와 함께 전기영동시켰다 (200 V, 400 μF). 전기영동 후, 세포들을 10% FCS를 함유하는 예열된 RPMI 2.4 ml에 현탁시켰다. 웰 당 50 ㎕의 세포 현탁액 (5 x 104 세포)를 백색의 96-웰 PP-플레이트에 접종하고 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMCs)를 Ficoll (Ficoll-Paque TM Plus, GE Healthcare, 17-1440-03)을 이용하여 건강한 도너의 혈액으로부터 엔리취시켰다. PBMCs를 5% 열-불활성화된 인간 혈청이 보강된 X-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q)에 현탁시키고, 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 2-4시간 인큐베이션한 후, 상등액은 자연 살해(NK) 세포로 엔리치되었다. 지정 농도로 PBS에 희석된 25 ㎕ 항체를 NEC8 세포에 첨가하였다. 엔리치된 NK 세포들을 20:1 (이펙터 세포 대 표적 세포)의 비율로 첨가하고 시료를 37℃ 및 5% CO2에서 24 시간 인큐베이션시켰다. "CDC"에 설명된 바와 같이 루시페라제를 이용하여 세포내 ATP 함량을 측정함으로써 세포의 용해 여부를 판정하였다.
F. 초기 처리 분석
초기 항체 처리를 위하여, PBS 200 ㎕ 중에 있는 5　x　106 HEK293-CLDN6 세포 (CLDN6를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포)를 무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스의 옆구리에 피하 접종하였다. HEK293-모인(mock) 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 각각의 실험그룹은 6-8주령의 암컷 마우스 8마리로 구성되었다. (HEK293-CLDN6 또는 - 모인 세포가 각각 이식된 마우스의 경우, 식염수 대조군은 10마리의 마우스로 이루어졌다). 접종 3일 후 200 ㎍의 정제된 뮤린 모노클로날 항체 muMAB 5F2D2, 27A 및 36A를 1주일에 2회 정맥주사와 복강내 주사를 교대로 하여 46일 동안 투여하였다. PBS로 처리된 실험 그룹을 음성 대조군으로 삼았다. 종양 크기 (TV=(길이x폭2)/2)을 2주일에 한번 모니터링하였다. TV를 mm3로 표시하고 경시적인 종양 성장 곡선을 그렸다. 종양의 크기가 1500 mm3 보다 커질 경우 마우스를 죽였다.
실시예 2: 본 발명에 따른 항체의 클라우딘에 대한 결합
대응하는 인간 클라우딘을 일시적으로 발현하는 HEK293T 세포를 이용하여 유세포 분석에 의해 인간 CLDN6, 3, 4 및 9에 대한 뮤린 모노클로날 항체 muMAB 5F2D2, 27A 및 36A의 결합을 분석하였다. HEK293T를 형광 마커로 공형질감염시켜 형질감염되지 않은 세포 (Q3 집단)과 형질감염된 세포 (Q4 집단)을 구별하였다. 사용된 항체 농도는 CLDN6에 대한 결합을 포화시키는 농도였다 (25 ㎍/ml). 인간 CLDN6, 3, 4 및 9의 발현 여부는 인간 클라우딘-6 (R&D Systems, MAB3656), 인간 클라우딘-3 (R&D Systems, MAB4620) 및 인간 클라우딘-4 (R&D Systems, MAB 4219)에 대한 시판되는 모노클로날 항체를 이용하여 확인하였다.
MuMAB 5F2D2, 27A 및 36A 항체들은 CLDN6를 발현하는 세포에 대해 강한 결합을 나타내는 반면, 이들은 CLDN3 또는 CLDN4를 발현하는 세포에 대하여는 결합하지 않았다: 도 1 참조.
MuMAB 5F2D2, 27A 및 36A 항체들을 인간 CLDN6, CLDN3, CLDN4 또는 CLDN9를 일시적으로 발현하는 HEK293T 세포와 함께 여러가지 농도 (0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000, 10000 및 25000 ng/ml)로 인큐베이션하였다. 유세포분석에 의해 결합을 측정하였다; 도 2, 3 및 4 참조. y축은 항체에 의해 결합된 세포의 백분율을 나타내고 (Q2 집단) x축은 사용된 항체의 농도를 나타낸다.
MuMAB 5F2D2는 인간 CLDN6에 대한 강한 결합을 나타내고 인간 CLDN9에 대해서는 약한 결합을 나타내었다. MuMAB 27A는 인간 CLDN6에 대해 강한 결합을 나타내고 인간 CLDN9에 대해서는 약한 결합을 나타내었다. MuMAB 36A는 인간 CLDN6에 대해 강한 결합을 나타내고 인간 CLDN9에 대해서는 약한 결합을 나타내었다. 항체들 중 어느 것도 인간 CLDN3 또는 4와 상호반응하지 않았다.
상대적인 친화도를 구하기 위해, HEK293 세포 표면 상에 안정적으로 발현된 인간 CLDN6에 대한 항CLDN6 항체의 결합을 유세포 분석을 이용하여 분석하였다. 포화 결합 실험에서 항체의 농도를 FACS 신호에 대하여 그렸다 (형광 강도의 메디안); 도 5 참조. EC50 (평형 상태에서 결합 부위들의 절반에 결합하는 항체 농도 0을 비선형 회귀법에 의해 구하였다. 그 결과 항체들은 특징적인 결합 패턴을 갖는 것으로 나타났다. MuMAB 5F2D2 및 27A는 낮은 EC50값 (EC50 350-450 ng/ml)을 나타내었고 낮은 농도에서 결합 포화가 달성된 반면 muMAB 36A는 최고 농도에서조차도 결합 포화되지 않았다.
실시예 3: 본 발명에 따라 얻어진 항체의 이펙터 기능
용해되지 않은 세포에서의 내인성 ATP를 검출하기 위해 루시페라제-의존성 분석을 이용하여 항CLDN6 항체의 CDC 활성을 분석하였다. 이 목적으르 위해, 인간 CLDN6를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포를 내부 대조군(internall control)로서 다양한 농도의 MuMAB 5F2D2, 27A 또는 36A 또는 항CLDN6 (R&D Systems, MAB3656)으로 처리하였다.
MuMAB 5F2D2는 투여량 의존 방식으로 CDC 활성을 나타내었다: 도 6 참조. MuMAB 27A는 투여량 의존적으로 CDC 활성을 나타내는 반면 muMAB 36A는 시험관내에서 CDC를 유도하지 못하였다: 도 7 참조.
내인적으로 CLDN6를 발현하는 NEC8 및 NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 녹-다운) 세포에 대한 항체-의존성 세포 매개형 세포독성(ADCC)를 유도하는 키메라 항CLDN6 항체인 chimAB 5F2D2의 능력을 측정하였다; 도 8 참조. 키메라 항CLDN6 항체 chimAB 5F2D2 및 양성 대조군 허셉틴(Herceptin)은 투여량 의존 방식으로 서로 다른 2 도너의 이펙터 세포와 함께 NEC8 세포에서 ADCC를 유도하였다. NEC8 모세포에 비해 chimAB 5F2D2의 경우 NEC8 LVTS2 54 세포 (CLDN6 녹-다운)에 대한 ADCC 유도 효능이 크게 저하되었으므로, chimAB 5F2D2의 표적 특이성은 증명되었다.
실시예 4: 본 발명에 따라 얻은 항체들의 치료 효과
안정하게 형질감염된 HEK293-CLDN6 및 HEK293-모인 이종이식편을 무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스에 삽입시킨 초기 처리 이종이식 모델에서 muMAB 5F2D2의 치료 효과를 검사하였다.
MuMAB 5F2D2는 인간 CLDN6를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포가 이식된 마우스에서 특이적이고 강한 종양 성장 억제를 나타냈다; 도 9 참조. MuMAB 5F2D2는 모인 대조군 세포가 삽입된 마우스에서 종양 성장에 대해 아무런 효과도 나타내지 않았다. 별도의 식염수 대조군 마우스에게 투여된 항체와 동량의 PBS 비히클을 주사하였다.
이에 더해, 크루스칼-왈리스 검사를 실시하자 muMAB 5F2D2로 처리한지 28일째 (및 그 후에도)에 종양 크기가 유의적으로 감소한 것으로 나타났다; 도 10 참조. 뿐만 아니라, 모노클로날 뮤린 항CLDN6 항체 muMAB 5F2D2로 처리된 마우스들은 PBS 대조군에 비해 더 오래 생존하였다. 이러한 항체-의존 효과는 대조군으로서 HEK293-모인 세포를 삽입한 마우스에서는 관찰되지 않았다: 도 11 참조.
마찬가지로, 초기 치료 이종이식 모델에서 muMAB 27A 및 muMAB 36A는 인간 CLDN6을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포가 이식된 마우스에서 특이적이고도 강한 종양 성장 억제를 나타내었다.; 도 12 및 13 참조. 또한, muMAB 27A 및 36A는 이식된 마우스의 생존을 연장시키는데 효과가 있었다; 도 14 참조.
실시예 5: 생식 세포 종양에 있어서 암 표적으로서의 CLDN6
CLDN3, 4, 6 및 9의 발현을 면역블랏 분석을 이용하여 NEC8 세포에서 검사하였다. 고환의 생식세포 종양 세포주 NEC8은 CLDN6만을 발현하였고 (A) CLDN3, 4 또는 9는 각각 발현하지 않았다 (B); 도 15 참조. 사용된 항CLDN3, 4 및 9 항체들의 특이성을 대응하는 인간 클라우딘을 인코딩하는 발현 벡터에 의해 일시적으로 형질감염시킨 HEK293T 세포를 이용하여 웨스턴 블랏에 의해 검사하였다.
NEC8 세포 상의 CLDN6 표면 발현을 유세포 분석에 의해 분석하였다. 시판되는 항CLDN6 항체 (R&D Systems, MAB3656)에 의해 NEC8 세포 상에서 CLDN6의 발현이 검출되었다; 도 16 참조. 마우스 IgG2b (Sigma, CRL M8894)를 이소타입 대조군으로서 사용하였다.
종양 세포주 NEC8이 이식된 마우스를 이용하는 초기 처리 이종이식 모델을 이용하여 muMAB 5F2D2의 치료 효과를 검사하였다. 식염수 대조군에 비해 muMAB 5F2D2는 인간 CLDN6를 내인적으로 발현하는 NEC8 세포가 이식된 마우스에서 특이적이고 강한 종양 성장 억제를 나타내었다; 도 17 참조. 크루스칼-왈리스 검사 결과 muMAB 5F2D2로 처리한 후 제21과 제42일에 종양 크기가 감소한 것으로 나타났다; 도 18 참조.
Figure 112013002004600-pct00002

생물학적 물질과 관련한 추가 시트
또 다른 기탁물의 동정:
1) 기탁기관의 명칭 및 주소는 다음과 같다:
명칭: 데에스엠젯-도이치 잠룽 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하
주소: 독일 38124 브라운쉬바이크 인호펜슈트라세 7베
Figure 112013002004600-pct00003

전술한 기탁에 관한 부가 설명:
- 마우스 (Mus musculus) 골수종 P3X63Ag8.653 마우스(Mus musculus)
비장세포와 융합됨
- 인간 CLDN6에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마
2) 기탁자:
전술한 기탁은 모두 하기 기탁자에 의해 수행되었다:
가니메드 파마슈티칼스 아게
독일 55131 마인츠 프라일리히라트슈트라세 12
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMACC3059 20100413 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMACC3058 20100413 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMACC3057 20100413
SEQUENCE LISTING <110> Ganymed Pharmaceuticals AG et al. <120> Cancer therapy using target-directed antibodies in vivo <130> 342-57 PCT <150> EP 10 006 957.4 <151> 2010-07-06 <150> US 61/361,632 <151> 2010-07-06 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgacactcgg cctaggaatt tcccttatct ccttcgcagt gcagctcctt caacctcgcc 60 atggcctctg ccggaatgca gatcctggga gtcgtcctga cactgctggg ctgggtgaat 120 ggcctggtct cctgtgccct gcccatgtgg aaggtgaccg ctttcatcgg caacagcatc 180 gtggtggccc aggtggtgtg ggagggcctg tggatgtcct gcgtggtgca gagcaccggc 240 cagatgcagt gcaaggtgta cgactcactg ctggcgctgc cacaggacct gcaggctgca 300 cgtgccctct gtgtcatcgc cctccttgtg gccctgttcg gcttgctggt ctaccttgct 360 ggggccaagt gtaccacctg tgtggaggag aaggattcca aggcccgcct ggtgctcacc 420 tctgggattg tctttgtcat ctcaggggtc ctgacgctaa tccccgtgtg ctggacggcg 480 catgccatca tccgggactt ctataacccc ctggtggctg aggcccaaaa gcgggagctg 540 ggggcctccc tctacttggg ctgggcggcc tcaggccttt tgttgctggg tggggggttg 600 ctgtgctgca cttgcccctc gggggggtcc cagggcccca gccattacat ggcccgctac 660 tcaacatctg cccctgccat ctctcggggg ccctctgagt accctaccaa gaattacgtc 720 tgacgtggag gggaatgggg gctccgctgg cgctagagcc atccagaagt ggcagtgccc 780 aacagctttg ggatgggttc gtaccttttg tttctgcctc ctgctatttt tcttttgact 840 gaggatattt aaaattcatt tgaaaactga gccaaggtgt tgactcagac tctcacttag 900 gctctgctgt ttctcaccct tggatgatgg agccaaagag gggatgcttt gagattctgg 960 atcttgacat gcccatctta gaagccagtc aagctatgga actaatgcgg aggctgcttg 1020 ctgtgctggc tttgcaacaa gacagactgt ccccaagagt tcctgctgct gctgggggct 1080 gggcttccct agatgtcact ggacagctgc cccccatcct actcaggtct ctggagctcc 1140 tctcttcacc cctggaaaaa caaatgatct gttaacaaag gactgcccac ctccggaact 1200 tctgacctct gtttcctccg tcctgataag acgtccaccc cccagggcca ggtcccagct 1260 atgtagaccc ccgcccccac ctccaacact gcacccttct gccctgcccc cctcgtctca 1320 ccccctttac actcacattt ttatcaaata aagcatgttt tgttagtgc 1369 <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu 85 90 95 Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp 100 105 110 Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser 115 120 125 Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile 130 135 140 Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly 180 185 190 Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 210 215 220 <210> 3 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Met Trp Lys Val Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala 1 5 10 15 Gln Val Val Trp Glu Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr 20 25 30 Gly Gln Met Gln Cys Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln 35 40 45 Asp Leu Gln Ala Ala 50 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln 1 5 10 15 Cys Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala 20 25 30 Ala <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu 85 90 95 Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp 100 105 110 Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser 115 120 125 Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Val Ile 130 135 140 Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly 180 185 190 Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 210 215 220 <210> 7 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Ser Thr Gly Leu Glu Leu Leu Gly Met Thr Leu Ala Val Leu 1 5 10 15 Gly Trp Leu Gly Thr Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Leu Trp Lys Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Leu Leu 85 90 95 Val Ala Ile Thr Gly Ala Gln Cys Thr Thr Cys Val Glu Asp Glu Gly 100 105 110 Ala Lys Ala Arg Ile Val Leu Thr Ala Gly Val Ile Leu Leu Leu Ala 115 120 125 Gly Ile Leu Val Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile 130 135 140 Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Leu Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Met Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Pro Pro Gln Val Glu Arg 180 185 190 Pro Arg Gly Pro Arg Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Ser Arg Ser Gly Ala 195 200 205 Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val 210 215 <210> 8 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Ser Met Gly Leu Gln Val Met Gly Ile Ala Leu Ala Val Leu 1 5 10 15 Gly Trp Leu Ala Val Met Leu Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Val Thr Ser Gln Thr Ile Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Val Ile Ile Ser Ile Ile Val Ala Ala Leu Gly Val Leu 85 90 95 Leu Ser Val Val Gly Gly Lys Cys Thr Asn Cys Leu Glu Asp Glu Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Lys Thr Met Ile Val Ala Gly Val Val Phe Leu Leu Ala 115 120 125 Gly Leu Met Val Ile Val Pro Val Ser Trp Thr Ala His Asn Ile Ile 130 135 140 Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Ser Gly Gln Lys Arg Glu Met 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Asn Cys Pro Pro Arg Thr Asp Lys Pro 180 185 190 Tyr Ser Ala Lys Tyr Ser Ala Ala Arg Ser Ala Ala Ala Ser Asn Tyr 195 200 205 Val <210> 9 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser 20 25 30 Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys 50 55 60 Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg 65 70 75 80 Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala 100 105 110 Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Ala 115 120 125 Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg 130 135 140 Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly 145 150 155 160 Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu Leu Gly 165 170 175 Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Thr 180 185 190 Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala 195 200 205 Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val 210 215 220 <210> 10 <211> 780 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic nucleic acid <400> 10 caagcgcgtc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct gttaattaac taaggtacca 60 agcttgccac catggccagc gccggcatgc agatcctggg agtggtgctg accctgctgg 120 gctgggtgaa cggcctggtg tcctgcgccc tgcccatgtg gaaagtgacc gccttcatcg 180 gcaacagcat cgtggtggcc caggtcgtgt gggagggcct gtggatgagc tgtgtggtgc 240 agagcaccgg ccagatgcag tgcaaggtgt acgacagcct gctggccctg cctcaggatc 300 tgcaggccgc cagagccctg tgtgtgatcg ccctgctggt cgccctgttc ggcctgctgg 360 tgtacctcgc tggcgccaag tgcaccacct gtgtggagga aaaggacagc aaggcccggc 420 tggtcctgac aagcggcatc gtgttcgtga tcagcggcgt gctgacactg atccccgtgt 480 gctggaccgc ccacgccatc atccgggact tctacaaccc tctggtggcc gaggcccaga 540 agagagagct gggcgccagc ctgtatctgg gatgggccgc ctcaggactg ctgctgctgg 600 gcggaggcct gctgtgctgt acatgtccta gcggcggctc ccagggccct agccactaca 660 tggcccggta cagcaccagc gcccctgcca tcagcagagg ccccagcgag taccccacca 720 agaactacgt gtgataggaa ttcgagctct tatggcgcgc ccaattcgcc ctatagtgag 780 <210> 11 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic nucleic acid <400> 11 ggcgcgccaa ggtaccaagc ttgccaccat ggaaaccgac accctgctgc tgtgggtgct 60 gctcctgtgg gtcccaggct ctacaggcga cgccgcccag cccagagact tctacaaccc 120 cctggtggcc gaggcccaga agctcgagtc tagagggtta attaa 165 <210> 12 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 12 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu 20 25 30 Val Ala Glu Ala Gln Lys 35 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 13 tccatgacgt tcctgacgtt 20

Claims (20)

  1. 생체내(in vivo) 종양 성장을 억제하는 항체로서,
    상기 종양의 세포는 클라우딘 6 (CLDN6)를 발현하고,
    상기 항체는 CLDN6에 결합할 수 있는 것이고, 수탁번호 DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A), 또는 DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2)로 기탁된 클론에 의해 생산 또는 수득되는 것인 항체.
  2. 제1항에 있어서, 항체는 CLDN6에 결합함으로써 종양 성장을 억제하는 것인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 항체는 CLDN6에 특이적인 것인 항체.
  4. 제1항에 있어서, 항체는 모노클로날, 키메라, 인간 또는 인간화 항체이거나 또는 항체의 단편 또는 합성 항체인 것인 항체.
  5. 제1항에 있어서, 종양은 난소암, 소세포 폐암(SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 포함하는 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 악성 흑색종, 두부 및 경부암, 육종, 담도암, 방광암, 갑상선 유두암종, 신장암, 결장암, 회장암을 포함하는 소장암, 고환 배아성 암종, 태반 융모 상피암종, 자궁경부암, 고환암, 자궁암, 및 생식세포 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  6. (i) 제1항에 기재된 항체의 키메라형 또는 인간화된 형태의 항체,
    (ii) 제1항에 기재된 항체의 특이성을 갖는 항체 및
    (iii) 제1항에 기재된 항체의 항원결합부분 또는 항원결합부위를 포함하는 항체
    로 이루어진 군에서 선택되는 항체.
  7. 제1항에 있어서, 방사능표지, 세포독소 또는 세포독성 효소인 1 이상의 치료적 이펙터 모이어티에 부착된 것인 항체.
  8. 제1항에 있어서, CLDN6은 서열목록의 SEQ ID NO: 1에 따른 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체를 포함하는 핵산에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  9. 제8항에 있어서, CLDN6은 서열목록의 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 것인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마.
  11. 수탁번호 DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A), 또는 DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2)로 기탁된 하이브리도마.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체를 포함하는 종양 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 의약 조성물은 치료적 또는 예방적 종양 백신의 형태인 것인 의약 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 종양 질환은 난소암, 소세포 폐암(SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 포함하는 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 악성 흑색종, 두부 및 경부암, 육종, 담도암, 방광암, 갑상선 유두암종, 신장암, 결장암, 회장암을 포함하는 소장암, 고환 배아성 암종, 태반 융모 상피암종, 자궁경부암, 고환암, 자궁암, 및 생식세포 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 의약 조성물.
  15. 제12항에 있어서, CLDN6은 서열목록의 SEQ ID NO: 1에 따른 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 변이체를 포함하는 핵산에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 것인 의약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, CLDN6은 서열목록의 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 것인 의약 조성물.
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