CN106519035B - 体内利用cldn6靶标定向之抗体的癌症治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体内利用CLDN6靶标定向之抗体的癌症治疗。本发明涉及使用结合CLDN6的抗体治疗和/或预防与表达CLDN6之细胞相关的肿瘤疾病，特别是癌症和癌症转移。本申请证明抗体与肿瘤细胞表面上的CLDN6的结合足以抑制肿瘤的生长并足以延长肿瘤患者的存活和寿命。另外，抗体与CLDN6的结合有效地抑制CLDN6阳性生殖细胞肿瘤(例如畸胎癌或胚胎癌，特别是睾丸的生殖细胞肿瘤)的生长。

Description

体内利用CLDN6靶标定向之抗体的癌症治疗

本申请是中国专利申请CN201180033503.3的分案申请，原申请是国际申请号PCT/EP2011/003312于2013年1月6日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及体内利用CLDN6靶标定向之抗体的癌症治疗。

背景技术

癌症在全世界范围内是一个重大的健康问题并且仍是最主要的死因之一。癌细胞在生物学上显著不同于它们所来源的非恶性细胞。这些区别是由于癌症发生期间所获得的遗传改变，还导致在癌症细胞中形成定性或定量地改变的分子结构。特别地，这种癌症相关结构是遗传产物，其表达在恶性转化期间被诱导或增强。

免疫系统能够通过两种不同的模式识别并破坏细胞：固有免疫和获得性免疫。固有组分由巨噬细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞，单核细胞和粒细胞组成。这些细胞识别涉及细胞转化的分子形式并且释放多种细胞因子和炎症介质。固有应答针对外源抗原缺乏记忆能力，其为获得性免疫应答中所存在的特征。后者这一免疫系统组分也以针对外源抗原的特异性为特征，该特异性由淋巴细胞上受体的存在所赋予。抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)也在获得性应答中起重要作用-它们吞食外源抗原并且以主要组织相容性复合体的形式将它们呈递给淋巴细胞。CD4+T细胞具有以II型MHC分子途径识别的抗原的受体，之后其能够使它们释放细胞因子并进一步活化CD8+淋巴细胞(细胞毒性T淋巴细胞；CTL)或B细胞。CTL是细胞介导免疫的一部分，能够通过凋亡或穿孔素(perforin)介导的细胞裂解来清除以I型MHC分子途径呈递的细胞。普遍认为T-细胞介导免疫在抗肿瘤应答中具有非常重要的作用。B细胞参与释放免疫球蛋白并因此是体液免疫系统的一部分。

如果适当地进行靶向或增强，可在治疗上利用免疫功能以控制甚至根除恶性病变。参与癌症发生的遗传和后天变化产生抗原，其以与微生物抗原类似的方式被免疫系统所识别。

在过去的十年间，抗体已被成功地引入临床用于癌症治疗，并且已成为肿瘤学中最有希望的疗法。与常规药物相比，基于抗体的癌症治疗具有较高特异性和较低副作用的潜力。原因是抗体在正常和肿瘤细胞之间的精确区分，及其作用方式依赖毒性较小的免疫抗肿瘤机制(例如，补体激活和募集细胞毒性免疫细胞)的事实。

密蛋白(claudin)是位于上皮与内皮的紧密连接内的整合膜蛋白。预测密蛋白具有四个跨膜区段以及两个细胞外环，并且N末端和C末端位于胞质中。跨膜蛋白质的密蛋白(claudin，CLDN)家族在上皮与内皮紧密连接的维持中发挥关键作用，并且还可能在细胞骨架的维持中以及在细胞信号转导中发挥作用。

我们发现CLDN6在多种癌症的组织中表达，而在正常非癌症组织中的表达限于胎盘。这样的癌症包括卵巢癌症(特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺部癌症(包括小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌)、胃部癌症、乳癌、肝部癌症、胰腺癌症、皮肤癌症(特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌)、恶性黑色素瘤、头颈部癌症(特别是恶性多形性腺瘤)、肉瘤(特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、胆管癌症、膀胱癌症(特别是移行细胞癌和乳头状癌)、肾部癌症(特别是肾细胞癌，包括透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌)、结肠癌症、小肠癌症(包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌)、睾丸胚胎癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌症、睾丸癌症(特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌症)和子宫癌症，及其转移形式。

此外，我们能够产生能够与表达CLDN6之完整细胞表面上的CLDN6特异性结合的抗体。对于这些抗体，表达除了CLDN6之外的密蛋白(特别是CLDN3、CLDN4和CLDN9)的细胞或者不表达任何这些CLDN蛋白的细胞未观察到结合。

这里，我们通过证明结合肿瘤细胞表面上的CLDN6的抗体足以赋予显著的肿瘤生长抑制扩展了这些观察结果。转染了CLDN6的肿瘤细胞和非转染的异种移植物的肿瘤生长体内评估显示由结合CLDN6的抗体介导的CLDN6转染细胞的肿瘤生长特异性抑制。另外，证明了结合CLDN6的抗体足以抑制体内内源性表达CLDN6之肿瘤细胞的肿瘤生长。这建立了以下的原理性证明(proof-of-principle)：结合CLDN6的抗体有效地抑制肿瘤生长，并且提供了以下证据，对于旨在通过靶向CLDN6来抑制肿瘤生长的治疗抗体，CLDN6是引人注意的靶标。

另外，证明了在体内结合CLDN6的抗体有效地抑制人CLDN6阳性生殖细胞肿瘤细胞系的肿瘤生长，这证明结合CLDN6的抗体可用作选择性治疗剂以靶向并诱导生殖细胞肿瘤(例如睾丸生殖细胞肿瘤)的杀伤。

因此，我们首次提供了直接证据：与肿瘤细胞表面上的CLDN6相结合的抗体在体内引起肿瘤生长减少，并且提供证明：特异性结合CLDN6引起使得肿瘤生长减少的治疗性干预。另外，我们提供证据：与肿瘤细胞表面上的CLDN6相结合的抗体在体内导致存活延长和肿瘤患者的寿命增加。

因此，本发明涉及使用结合CLDN6的抗体治疗和/或预防与表达CLDN6之细胞相关的肿瘤疾病，特别是癌症和癌症转移。本申请证明抗体与肿瘤细胞表面上的CLDN6的结合足以抑制肿瘤的生长并足以延长存活并增加肿瘤患者的寿命。另外，抗体与CLDN6的结合有效地抑制CLDN6阳性生殖细胞肿瘤(例如畸胎癌或胚胎癌，特别是睾丸的生殖细胞肿瘤)的生长。

发明内容

在一个方面中，本发明涉及体内抑制肿瘤生长的抗体，其中所述肿瘤的细胞表达密蛋白6(CLDN6)并且其中所述抗体能够结合CLDN6。在一个实施方案中，所述抗体通过结合CLDN6抑制肿瘤的生长。在一个实施方案中，所述抗体对于CLDN6是特异性的。在一个实施方案中，所述抗体为单克隆、嵌合、人或人源化抗体，或者是抗体片段或合成抗体。所述肿瘤可选自卵巢癌症(特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤)、肺部癌症(包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌)、胃部癌症、乳癌、肝部癌症、胰腺癌症、皮肤癌症(特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌)、恶性黑色素瘤、头颈部癌症(特别是恶性多形性腺瘤)、肉瘤(特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、胆管癌症、膀胱癌症(特别是移行细胞癌和乳头状癌)、肾部癌症(特别是肾细胞癌，包括透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌)、结肠癌症、小肠癌症(包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌)、睾丸胚胎癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌症、睾丸癌症(特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌症)和子宫癌症，及其转移形式。所述肿瘤可以是生殖细胞肿瘤(例如畸胎癌或胚胎癌)。所述生殖细胞肿瘤可以是睾丸的生殖细胞肿瘤。

在另一个方面中，本发明涉及选自下列的抗体：(i)由以如下登录号保藏的克隆产生的或可从其获得的抗体：DSM ACC3059(GT512muMAB 36A)、DSM ACC3058(GT512muMAB27A)或DSM ACC3057(GT512muMAB 5F2D2)；(ii)(i)中抗体的嵌合化或人源化形式的抗体；(iii)具有(i)中抗体的特异性的抗体；以及(iv)包含(i)中抗体的抗原结合部分或抗原结合位点的抗体。所述(i)抗体的抗原结合部分或抗原结合位点可包含(i)中抗体的可变区。

根据上述方面中任何一者的抗体可以连接至少一个治疗效应子部分，例如，放射性标记、细胞毒素、细胞毒性酶(cytotoxic enzyme)。

在另一个方面中，本发明涉及能够产生根据上述上述方面中任何一者的抗体的杂交瘤。

在另一个方面中，本发明涉及以登录号DSM ACC3059(GT512muMAB 36A)，DSMACC3058(GT512muMAB 27A)或DSMACC3057(GT512muMAB 5F2D2)保藏的杂交瘤。

在另一个方面中，本发明涉及药物组合物，其包含根据上述方面中任何一者的抗体。所述药物组合物可为治疗性或预防性肿瘤疫苗的形式。在一个实施方案中，所述药物组合物用于治疗和预防肿瘤疾病。

在另一个方面中，本发明涉及治疗患有肿瘤疾病或有肿瘤疾病发生风险的患者的方法，其中所述肿瘤的细胞表达密蛋白6(CLDN6)并且其中所述方法包括施用能够结合CLDN6的抗体。在一个实施方案中，所述抗体在施用至患者时通过结合CLDN6来抑制患者中肿瘤的生长。在一个实施方案中，所述抗体连接至少一个治疗效应子部分(例如，放射性标记、细胞毒素、细胞毒性酶)。所述抗体可以是CLDN6特异性的。所述抗体可以是单克隆、嵌合、人或人源化抗体，或者是抗体片段或合成抗体。在一个实施方案中，所述方法包括施用根据上述方面中任何一者的药物组合物。

在任何上述方面中，所述肿瘤疾病可选自：卵巢癌症(特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤)、肺部癌症(包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌)、胃部癌症、乳癌、肝部癌症、胰腺癌症、皮肤癌症(特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌)、恶性黑色素瘤、头颈部癌症(特别是恶性多形性腺瘤)、肉瘤(特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、胆管癌症、膀胱癌症(特别是移行细胞癌和乳头状癌)、肾部癌症(特别是肾细胞癌，包括透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌)、结肠癌症、小肠癌症(包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌)、睾丸胚胎癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌症、睾丸癌症(特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌症)和子宫癌症，及其转移形式。

在任何上述方面中，所述肿瘤疾病可以是生殖细胞肿瘤疾病，例如以畸胎癌或胚胎癌为特征的疾病。所述生殖细胞肿瘤疾病可以是睾丸的生殖细胞肿瘤。

在任何上述方面中，所述CLDN6可包含由包含序列表SEQ ID NO：1之核酸序列或者所述核酸序列之变体的核酸所编码的氨基酸序列，和/或可包含序列表SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。

本文所述的抗体能够结合CLDN6并且优选能够结合与表达CLDN6之细胞表面相关联的CLDN6。优选地，所述抗体基本不能与CLDN3相结合(尤其当与表达CLDN3之细胞表面相关联时)和/或基本不能与CLDN4相结合(尤其当与表达CLDN4之细胞表面相关联时)。优选地，所述抗体基本不能与CLDN9相结合(尤其当与表达CLDN9之细胞表面相关联时)。最优选地，所述抗体基本不能与CLDN6以外的其他CLDN蛋白相结合(尤其当与表达所述CLDN蛋白质之细胞表面相关联时)，并且是CLDN6特异性的。优选地，表达所述CLDN蛋白质的所述细胞是完整细胞，特别是非透化的细胞，并且与细胞表面相关联的所述CLDN蛋白具有天然的(即非变性的)构象。优选地，所述抗体能够与一个或更多个天然构象的CLDN6表位相结合。

在一些具体的优选实施方案中，本文所述的抗体与存在于活细胞表面上的CLDN6天然表位(例如，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5的表位)相结合。在另一些优选的实施方案中，本发明的抗体是表达CLDN6之肿瘤细胞特异性的，并且不与不表达CLDN6的癌细胞相结合。优选地，本文所述的抗体与CLDN6特异性结合。

在一个实施方案中，本文所述的抗体能够与位于CLDN6的细胞外部分中的表位相结合，其中CLDN6的所述细胞外部分优选地包含SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO：5的氨基酸序列。优选地，所述抗体能够与位于SEQ ID NO：5的氨基酸序列中的表位相结合。

在一个实施方案中，所述抗体可通过包括以下步骤的方法来获得：用具有SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之氨基酸序列的肽免疫接种动物，更优选SEQ ID NO：5的氨基酸序列或免疫上等同的肽或者表达所述肽的核酸或宿主细胞。

在一些不同的实施方案中，所述抗体能够结合的CLDN6具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或SEQ ID NO：6的氨基酸序列。尤其优选地是，所述抗体能够与具有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的CLDN6相结合，并且能够与具有SEQ ID NO：6之氨基酸序列的CLDN6相结合。

在一些优选的实施方案中，本文所述的抗体具有以下活性中的一种或更多种：(i)杀伤表达CLDN6的细胞，(ii)抑制表达CLDN6之细胞的增殖，(iii)抑制表达CLDN6之细胞的集落形成，和(iv)抑制表达CLDN6之细胞的转移。可将杀伤细胞、抑制细胞的增殖和/或抑制细胞的集落形成治疗性地用于抑制肿瘤生长，其包括防止和/或预防肿瘤生长、延缓肿瘤生长和/或减少现有肿瘤的尺寸，从而可治疗性地用于治疗或预防癌症、癌症转移和/或癌细胞的转移性散布。

优选地，文中描述的抗体通过诱导补体依赖性细胞毒作用(complementdependent cytotoxicity，CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒作用(antibody dependentcellularcytotoxicity，ADCC)介导的裂解、凋亡、同质性黏附(homotypic adhesion)和/或吞噬作用介导对细胞的杀伤，优选通过诱导CDC介导的裂解和/或ADCC介导的裂解。

优选地，ADCC介导的细胞裂解在效应细胞存在时发生，所述效应细胞在具体实施方案中选自单核细胞(monocyte)、单个核细胞(mononuclear cell)、NK细胞和PMN，吞噬作用是通过巨噬细胞来实现。

可通过在使用溴脱氧尿苷(5-溴-2-脱氧尿苷，BrdU)的测定中测定表达CLDN6之癌细胞的增殖来体外测量抑制或降低表达CLDN6之细胞(优选癌细胞)增殖的活性。BrdU是合成的核苷，其是胸苷的类似物，并且可被并入复制中细胞(在细胞周期的S期中)的新合成DNA中，在DNA复制的过程中替代胸苷。使用例如BrdU特异性的抗体检出所并入的化学物质表明细胞正在活跃地复制其DNA。

在克隆生成测定(clonogenic assay)中，可体外测量抑制或降低表达CLDN6之细胞(优选癌细胞)集落形成的活性。克隆生成测定是用于研究特定药剂对细胞存活和增殖之有效性的微生物学技术。其在癌症研究的实验室中经常使用，用于测定药物或辐射对增殖的肿瘤细胞的作用。该实验涉及三个主要的步骤：(i)向细胞(特别是癌细胞)样品施加处理，(ii)将细胞铺板于组织培养容器中，以及(iii)使细胞生长。对所产生的集落进行固定、染色、计数。如果个别肿瘤细胞定植(colonize)器官，对于转移的形成来说，集落形成是重要的。抗体的抑制作用表明其抑制转移形成的潜力。在克隆生成测定中，具有抑制或降低集落形成之活性的抗体尤其可用于治疗或预防癌细胞(特别是本文中提及的癌类型)的转移和转移性扩散。

在一些优选的实施方案中，本文所述的抗体表现出对抗带有天然构象CLDN6之细胞的一种或更多种免疫效应子功能，其中所述一种或更多种免疫效应子功能优选地选自补体依赖性细胞毒作用(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、诱导凋亡以及抑制增殖，优选地所述效应子功能是ADCC和/或CDC。

优选地，本文所述的抗体表现出肿瘤生长抑制或者免疫效应子功能是由所述抗体与CLDN6相结合(优选与位于CLDN6的细胞外部分之内的表位相结合)而诱导的，其中CLDN6的所述细胞外部分优选地包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO：5的氨基酸序列。

根据本发明，表达CLDN6的细胞优选地具有下述特征：CLDN6与其细胞表面相关联。表达CLDN6之细胞或者以CLDN6与其细胞表面相关联或带有天然构象CLDN6为特征的细胞优选地是肿瘤细胞(例如，癌细胞)，优选来自本文所述的癌的癌细胞。

本文所述的抗体可以连接一个或更多个治疗效应子部分(例如，放射性标记、细胞毒素、治疗性酶(therapeutic enzyme)、诱导凋亡的药剂等)以提供靶向的细胞毒性(即，杀伤肿瘤细胞)。

在一个实施方案中，本文所述的抗体(i)与表达CLDN6的细胞相结合，并且(ii)不与不表达CLDN6的细胞相结合。本文所述的抗体优选(i)介导杀伤表达CLDN6的细胞和/或抑制其增殖，并且(ii)不介导杀伤不表达CLDN6之细胞和/或不抑制其增殖。

在一个实施方案中，本文所述的抗体可以具有一个或更多个以下特性：

a)对CLDN6的特异性；

b)约100nM或更低的与CLDN6的结合亲和力，优选约5～10nM或更低，以及更优选约1～3nM或更低，

c)清除表达CLDN6的肿瘤细胞的能力；

d)防止或延缓表达CLDN6的肿瘤细胞之增殖的能力；

e)延长具有表达CLDN6的肿瘤细胞之对象存活的能力。

在一个实施方案中，本文所述的抗体降低肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞死亡，因此具有肿瘤抑制或肿瘤破坏作用。

本文所述的优选的抗体是由杂交瘤细胞产生的或可从其获得的抗体，所述杂交瘤细胞保藏在DSMZ(Inhoffenstr.7B，38124 Braunschweig，Germany)，并且具有以下命名和登录号之一：

1.GT512muMAB 36A，登录号DSM ACC3059，保藏于2010年4月13日；

2.GT512muMAB 27A，登录号DSM ACC3058，保藏于2010年4月13日；或

3.GT512muMAB 5F2D2，登录号DSM ACC3057，保藏于2010年4月13日。

本文中通过参照抗体的命名和/或通过参照产生抗体的克隆来命名本发明的抗体，例如muMAB 36A。

另一些优选的抗体具有由上述杂交瘤产生或可从其获得的抗体之特异性的那些，并且特别地包含与由上述杂交瘤产生的或可从其获得的抗体的抗原结合部分或抗原结合位点(特别是可变区)相同或高度同源的抗体。预期优选的抗体包括具有与由上述杂交瘤产生的或可从其获得的抗体的CDR区相同或高度同源之区域的抗体。“高度同源”旨在表示可进行1至5个(优选1至4个，例如1至3个或者1或2个)替换。尤其优选的抗体是由上述杂交瘤产生的或可从其获得的抗体的嵌合化和人源化形式。

本发明还涉及细胞，例如产生本文所述的抗体的杂交瘤细胞。

优选的杂交瘤细胞是保藏于DSMZ(Inhoffenstr.7B，38124 Braunschweig，Germany)的杂交瘤细胞，并且其具有以下命名和登录号之一：

1.GT512muMAB 36A，登录号DSM ACC3059，保藏于2010年4月13日；

2.GT512muMAB 27A，登录号DSM ACC3058，保藏于2010年4月13日；或

3.GT512muMAB 5F2D2，登录号DSM ACC3057，保藏于2010年4月13日。

本发明还涉及核酸，所述核酸包含编码本文所述的抗体或其部分(例如，抗体链)的基因或核酸序列。所述核酸可包含于载体(vector)(例如，质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者例如常规地用于基因工程中的其他载体)中。所述载体可包含另外的基因，例如标志物基因，其允许在合适的宿主细胞和在合适的条件下选择所述载体。此外，所述载体可包含表达控制元件，其允许在合适的宿主中适当地表达编码区。这样的控制元件是技术人员已知的，并且可包括启动子、剪接盒(splice cassette)和翻译起始密码子。

优选地，本发明的核酸与允许在真核或原核细胞中表达的表达控制元件可操作地连接。确保在真核或原核细胞中表达的控制元件是本领域技术人员公知的。

用于构建核酸分子的方法，用于构建包含核酸分子之载体的方法，用于将载体引入到合适的所选宿主细胞中的方法，或用于引起或实现核酸分子表达的方法是现有技术中公知的。

本发明的另一个方面涉及包含本文中所公开的核酸或载体的宿主细胞。

在一个方面中，本发明提供包含本文所述的抗体或抗体组合的组合物(例如，药物和诊断组合物/试剂盒)。本发明的药物组合物可包含可药用载剂(carrier)，并且可任选地包含一种或更多种辅料、稳定剂等。在一个具体的实施方案中，所述组合物包含抗体的组合，所述抗体与独特的表位结合或者具有独特的功能特征(例如，诱导CDC和/或ADCC)。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物是治疗性或预防性抗肿瘤疫苗。

在一个方面中，本发明提供治疗和预防的方法，其治疗患有肿瘤疾病或有肿瘤疾病发生风险的患者。在一个方面中，本发明提供用于抑制肿瘤生长的方法。在一个方面中，本发明提供用于诱导肿瘤细胞死亡的方法。这些方面可包括向患者施用本文所述的抗体或组合物。

本发明还包括同时或顺序施用两种或更多种抗CLDN6抗体，其中优选至少一种所述抗体是嵌合抗CLDN6抗体，并且至少一种其他抗体是人抗CLDN6抗体，所述抗体与相同或不同的CLDN6表位相结合。优选地，首先施用本发明的嵌合CLDN6抗体，随后施用人抗CLDN6抗体，其中优选长时间(即，作为维持治疗)施用所述人抗CLDN6抗体。

本文所述的抗体或组合物可用于抑制表达CLDN6之肿瘤细胞的生长和/或选择性杀伤表达CLDN6的肿瘤细胞并因此抑制肿瘤生长的多种方法，其通过使细胞与有效量的抗体或组合物接触来进行，从而抑制细胞的生长和/或杀伤细胞。在一个实施方案中，所述方法包括杀伤表达CLDN6的肿瘤细胞，任选地在效应细胞存在下，例如通过CDC、凋亡、ADCC、吞噬作用或通过这些机制中的两种或更多种的组合来进行杀伤。

本文所述的抗体或组合物可用于通过向患有肿瘤疾病或有肿瘤疾病发生风险的患者施用所述抗体或组合物而治疗和/或预防涉及表达CLDN6之细胞的肿瘤疾病。

本发明可涉及肿瘤疾病的预防性和/或治疗性治疗，即用于治疗患有肿瘤疾病或有肿瘤疾病发生风险的患者。在一个方面中，本发明提供用于抑制肿瘤生长的方法，其包括施用一种或更多种本文所述的抗体和组合物。

优选地，以这样的方式施用本文所述的抗体和组合物，以使所述治疗活性物质(特别是抗体)不被递送或基本不被递送至没有肿瘤时也表达CLDN6的组织或器官(例如，胎盘组织或胎盘)。为此，可局部施用本文所述的药剂和组合物。

在一个方面中，本发明提供本文所述的抗体用于本文所述的治疗方法。在一个实施方案中，本发明提供本文所述的药物组合物用于本文所述的治疗方法。

本文所述的治疗可与外科切除术和/或辐射和/或传统化学疗法结合。

通过以下的详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优势将十分清楚。

发明详述

在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文中有另外要求，词语“包含(comprise)”以及变化形式(例如，“comprises”和“comprising”)将被理解为意指包括所陈述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但是在一些实施方式中，可排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题由所陈包含的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组组成。除非本文中另外指明或者与上下文明确地相矛盾，描述本发明的上下文中(特别地在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词要解释为一个/种或更多个/种。本文中值的范围的记载仅意在充当分别表示落入该范围的每个分别的值的简略表示方法。除非本文中另外指明，每个单独的值均如同其在本文中被单独记载那样而并入本说明书。除非本文中另外指明或者与上下文明确地相矛盾，可以以任何合适的顺序进行本本文所述的所有方法。除非另外要求，本文中提供的任何和全部实施例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅意在更好地举例说明本发明，并不对本发明的范围作出限制。本说明书中没有语言应当被解释为表明对实施本发明至关重要的任何不要求保护之元素。

密蛋白是蛋白质家族，是紧密连接的最重要成分，其中所述紧密连接建立了控制上皮细胞之间胞间间隙中分子流的细胞旁屏障(paracellular barrier)。密蛋白是4次跨膜的跨膜蛋白质，其N-末端和C-末端均位于胞质中。第一细胞外环由平均53个氨基酸组成，而第二细胞外环由约24个氨基酸组成。CLDN6和CLDN9是CLDN家族中最相似的成员。

本文中使用的术语“CLDN”意为密蛋白，其包括CLDN6、CLDN9、CLDN4和CLDN3。优选地，CLDN是人CLDN。

术语“CLDN6”优选地表示人CLDN6，并且尤其表示下述蛋白质，即所述蛋白质包含(i)由包含序列表SEQ ID NO：1之核酸序列或所述核酸序列之变体的核酸所编码的氨基酸序列，和/或(ii)序列表SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。CLDN6的第一细胞外环优选地包含SEQ ID NO：2中所示或SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的28至80位氨基酸，更优选28至76位氨基酸，例如，SEQ IDNO：3中所示的氨基酸序列。CLDN6的第二细胞外环优选地包含SEQ IDNO：2中所示氨基酸序列或SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的138至160位氨基酸，优选141至159位氨基酸，更优选145至157位氨基酸，例如SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。所述第一和/或第二细胞外环优选地形成CLDN6的细胞外部分。

术语“CLDN9”优选地表示人CLDN9，并且尤其表示下述蛋白质，即所述蛋白质包含序列表SEQ ID NO：7的氨基酸序列或所述氨基酸的变体。CLDN9的第一细胞外环优选地包含SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的28至76位氨基酸。CLDN9的第二细胞外环优选地包含SEQID NO：7中所示氨基酸序列的141至159位氨基酸。所述第一和/或第二细胞外环优选地形成CLDN9的细胞外部分。

术语“CLDN4”优选地表示人CLDN4，并且尤其表示下述蛋白质，即所述蛋白质包含序列表SEQ ID NO：8的氨基酸序列或所述氨基酸的变体。CLDN4的第一细胞外环优选地包含SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列的28至76位氨基酸。CLDN4的第二细胞外环优选地包含SEQID NO：8中所示氨基酸序列的141至159位氨基酸。所述第一和/或第二细胞外环优选地形成CLDN4的细胞外部分。

术语“CLDN3”优选地表示人CLDN3，并且尤其表示下述蛋白质，即所述蛋白质包含序列表SEQ ID NO：9的氨基酸序列或所述氨基酸的变体。CLDN3的第一细胞外环优选地包含SEQ ID NO：9中所示氨基酸序列的27至75位氨基酸。CLDN3的第二细胞外环优选地包含SEQID NO：9中所示氨基酸序列的140至158位氨基酸。所述第一和/或第二细胞外环优选地形成CLDN3的细胞外部分。

上文中描述的CLDN序列包括所述序列的任何变体，特别是突变体，剪接变体，构象、同种型、等位基因变体，物种变体和物种同源物，特别是天然存在的变体。等位基因变体表示基因正常序列的改变，其意义通常是不清楚的。完整的基因测序通常鉴定出给定基因的很多等位基因变体。物种同源物是给定核酸或氨基酸序列的具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。术语“CLDN”应包括(i)CLDN剪接变体，(ii)CLDN翻译后修饰变体，特别地包括具有不同糖基化(例如，N-糖基化状态)的变体，(iii)CLDN构象变体，(iv)CLDN癌相关的和CLDN非癌相关的变体。优选地，CLDN以其天然构象存在。

术语“部分(portion)”是指级分(fraction)。对于具体结构(例如氨基酸序列或蛋白质)，术语其“部分”可表示所述结构的连续或不连续级分。优选地，氨基酸序列的部分包含所述氨基酸序列之氨基酸的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、优选至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％以及最优选至少90％。优选地，如果所述部分是不连续级分，所述不连续级分是由结构的2、3、4、5、6、7、8或更多个部件组成，每个部件是连续的结构元件。例如，氨基酸序列的不连续级分可由所述氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8或更多个(优选不超过4个)部件组成，其中每个部件优选地包含所述氨基酸序列的至少5个连续的氨基酸、至少10个连续的氨基酸、优选至少20个连续的氨基酸、优选至少30个连续的氨基酸。

术语“部件(part)”和“片段(fragment)”在本文中可互换使用，并且是指连续的元件。例如，结构(例如氨基酸序列或蛋白质)的部分是指所述结构的连续元件。结构的部分(portion)、部件(part)或片段(fragment)优选地包含所述结构的一个或更多个功能特征。例如，表位或肽的部分(portion)、部件(part)或片段(fragment)优选地与从其来源的表位或肽是免疫学上等同的。

在本发明的情况下，术语“CLDN的细胞外部分”是指CLDN朝向细胞外空间的部件，并优选地可从所述细胞的外侧接近，例如被位于细胞外的抗体所接近。优选地，该术语是指CLDN的一个或更多个细胞外环或其部件或者任何其他细胞外部件(所述其他细胞外部件优选地是所述CLDN特异性的)。优选地，所述部件包含至少5个、至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个或者更多个氨基酸。

根据本发明，由细胞表达的CLDN优选与所述细胞表面相关联。术语“与细胞表面相关联的CLDN”意为CLDN与所述细胞的质膜相关联并位于所述质膜，其中CLDN的至少一部分(优选细胞外部分)朝向所述细胞的细胞外空间，并且可从所述细胞的外侧接近，例如被位于细胞外的抗体所接近。所述关联可以是直接或间接的。例如，所述关联可以是通过一个或多个跨膜结构域、一个或多个脂质锚和/或通过与可见于细胞质膜外层(outer leaflet)的任何其他蛋白质、脂质、糖或其他结构的相互作用。例如，与细胞表面关联的CLDN可以是具有细胞外部分的跨膜蛋白质(即，整合膜蛋白)或者可以是通过与其他蛋白质(其为跨膜蛋白质)相互作用而与细胞表面相关联的蛋白质。

如果CLDN6位于所述细胞的表面并且可被添加至细胞的CLDN6特异性抗体接近并结合，则CLDN6与细胞表面相关联。要理解的是，在细胞表达CLDN6的情况下，与所述细胞表面相关联的CLDN6可仅是所表达的CLDN6的一部分。

术语“带有CLDN的细胞”优选地意为所述细胞在其表面上带有CLDN，即CLDN与所述细胞的表面相关联。

按照现有技术中通常的意义使用“细胞表面”或“细胞的表面”，并且因此包括可被蛋白质和其他分子接近并结合的细胞的外侧。

词语“表达于细胞表面上的CLDN”意为细胞所表达的CLDN与所述细胞的表面相关联。

根据本发明，如果表达和关联水平低于胎盘细胞或胎盘组织中的表达和关联，则CLDN6基本不表达于细胞中并且基本不与细胞表面相关联。优选地，表达和关联的水平低于胎盘细胞或胎盘组织中表达和关联的10％，优选低于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％，或者甚至更低。优选地，如果表达和关联的水平超过除了胎盘组织之外的非肿瘤发生性、非癌性的组织中表达和关联水平的2倍(优选1.5倍)并且优选地不超过所述非肿瘤发生性、非癌性的组织中的表达和关联水平，则CLDN6基本不表达于细胞中并且基本不与细胞表面相关联。优选地，如果表达或关联水平低于检出限和/或如果表达或关联水平太低而使添加至细胞的CLDN6特异性抗体无法结合，则CLDN6基本不表达于细胞中并且基本不与细胞表面相关联。

根据本发明，如果表达和关联水平超过除了胎盘组织之外的非肿瘤发生性、非癌性组织中表达和关联水平，优选超过2倍，优选10倍、100倍、1000倍或10000倍，则CLDN6表达于细胞中并且与细胞表面相关联。优选地，如果表达和关联水平高于检出限和/或如果表达和关联水平足够高以使添加至细胞的CLDN6特异性抗体结合，则CLDN6表达于细胞中并且与细胞表面相关联。优选地，表达于细胞中的CLDN6表达或暴露于所述细胞的表面上。

术语“筏(raft)”是指位于细胞质膜的外层区域中的富含鞘脂和胆固醇的膜微结构域(microdomain)。某些蛋白质与这样的结构域关联的能力及其形成“聚集体”或“焦点聚集体(focal aggregate)”的能力可影响蛋白质的功能。例如，被本发明的抗体结合之后，CLDN6分子转位到这样的结构中，在质膜中产生高密度的CLDN6抗原-抗体复合物。这样的高密度的CLDN6抗原-抗体复合物可使CDC过程中的补体系统有效激活。

术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体及其片段或衍生物，包括但不限于人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、单链抗体(例如，scFv′s)和抗原结合的抗体片段(例如，Fab和Fab′片段)，并且还包括抗体的所有重组形式，例如原核细胞中表达的抗体、非糖基化的抗体以及本文所述的任何抗原结合的抗体片段和衍生物。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。VH和VL区还可再分为高变区(称为互补决定区(complementarity determining region，CDR))，其间散布着较为保守的区域(称为框架区(framework region，FR))。VH和VL各自由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端向羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。

术语“人源化抗体”是指具有基本衍生自来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子的其余免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白之结构和/或序列的。抗原结合位点可包含与恒定结构域融合的完整可变结构域或仅包含移植到可变结构域中合适框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或者可通过一个或更多个氨基酸替换而被修饰，例如被修饰成更接近于人免疫球蛋白。人源化抗体的一些形式保留所有CDR序列(例如，含有小鼠抗体全部6个CDR的人源化小鼠抗体)。另一些形式具有相对于初始抗体改变的一个或更多个CDR。

术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中每个重链和轻链氨基酸序列的一部分与衍生自特定物种的抗体中的相应序列同源，而所述链的其余区段与另一物种中相应的序列同源。一般来说，轻链和重链的可变区都类似于衍生自一个哺乳动物物种之抗体的可变区，而恒定部分与衍生自另一物种的抗体序列同源。这种嵌合形式的一个明显的优势是，可变区可便利地使用容易获得的来自非人宿主生物的B细胞或杂交瘤与衍生自目前已知的来源，其与衍生自例如人细胞制备物的恒定区相组合。虽然可变区具有方便制备以及特异性不受来源影响的优势，但当注射所述抗体时，人的恒定区比来自非人来源的恒定区引起更低可能性的人对象免疫应答。然而，该定义不限于这个特定的实例。

术语抗体的“抗原结合部分”(或者简单地“结合部分”)是指抗体的一个或更多个片段，其保留与抗原特异性的结合能力。已证明可通过全长抗体的片度来进行抗体的抗原结合功能。包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的一价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含通过铰链区中二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)，以及(vii)可任选地通过合成接头(synthetic linker)连接的两种或更多种分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)是由分开的基因所编码的，可使用重组方法通过合成接头将它们连接，所述合成接头使它们作为单个蛋白质链而制造，其中VL和VH区配对以形成一价分子(被称为单链Fv(singel chain Fv，scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体也意在包括于术语抗体的“抗原结合部分”之中。另一个实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白质，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，以及(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。所述结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。US 2003/0118592和US 2003/0133939中也公开了结合结构域免疫球蛋白融合蛋白质。通过使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，筛选所述片段，以与完整抗体相同的方式使用所述片段。

本文中使用的抗体用于被动抗肿瘤免疫治疗，并且可以或不可以连接治疗效应子部分(例如，放射性标记、化学疗法(例如适于癌症治疗的顺铂、氨甲喋呤、阿霉素等)、细胞毒素、治疗性酶、诱导凋亡的药剂等)以提供靶向的细胞毒性(即，杀伤肿瘤细胞)。

优选地，本文所述的抗体通过诱导补体依赖性细胞毒作用(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞的细胞毒作用(ADCC)介导的裂解、凋亡、同质性黏附和/或吞噬作用(优选通过诱导CDC介导的裂解和/或ADCC介导的裂解)介导对细胞的杀伤。本文所述的抗体优选地与免疫系统的组分相互作用，优选通过ADCC或CDC相互作用。然而，本发明的抗体还可简单地通过与细胞表面上的肿瘤抗原相结合而发挥作用，因而例如阻断细胞的增殖。

ADCC描述本文所述的效应细胞(特别是淋巴细胞)的细胞杀伤能力，其优选地要求靶细胞被抗体所标记。

优选地，当抗体与肿瘤细胞上的抗原结合并且抗体Fc结构域占用免疫效应细胞表面上的Fc受体(FcR)时，ADCC发生。已鉴定数个Fc受体家族，并且特定细胞群特征性地表达确定的Fc受体。ADCC可被视为直接诱导不同程度的即时肿瘤破坏的机制，其还导致抗原呈递以及肿瘤指导的T细胞应答的诱导。优选地，体内诱导ADCC将导致针对肿瘤的T细胞应答和宿主源性抗体应答。

CDC是另一种抗体指导的细胞杀伤方法。IgM是补体激活的最有效同种型。通过经典的补体激活途径，IgG1和IgG3也均非常有效地指导CDC。优选地，在该级联中，抗原-抗体复合物的形成导致所参与的抗体分子(例如，IgG分子)的C_H2结构域上暴露多个紧邻的C1q结合位点(C1q是补体C1的三个亚组分之一)。优选地，这些暴露的C1q结合位点将之前低亲和力的C1q-IgG相互作用转变为高亲和力的相互作用，这触发与一系列其他补体蛋白相关的事件级联，并导致蛋白水解释放效应细胞趋化/激活剂C3a和C5a。优选地，补体级联在膜攻击复合物形成后结束，所述膜攻击复合物在细胞膜中产生孔，其促进水和溶质自由进出通过所述细胞，从而可导致细胞凋亡。

术语“抗体”包括“双特异性分子”即具有两个不同的结合特异性的分子。例如，所述分子可以与以下结合或相互作用：(a)细胞表面抗原，和(b)效应细胞表面上的Fc受体。术语“抗体”还包括“多特异性分子”或“异特异性分子(heterospecific molecule)”，即具有超过两个不同的结合特异性的分子。例如，所述分子可以与以下结合或相互作用：(a)细胞表面抗原，(b)效应细胞表面上的Fc受体，和(c)至少一种其他成分。因此，本发明包括但不限于针对CLDN6以及针对其他靶标(例如，效应细胞上的Fc受体)的双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性分子。术语“抗体”还包括“双特异性抗体”，其还包括双抗体(diabody)。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达于单个多肽链上，但使用的接头太短从而无法使相同链上的两个结构域之间配对，因而迫使所述结构域与其他链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。

术语“抗体”还包括“异种抗体(heteroantibody)”，该术语是指两个或更多个抗体、其衍生物或连接在一起的抗原结合区，其中至少两个具有不同的特异性。这些不同的特异性包括对效应细胞上的Fc受体的结合特异性，以及对靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的抗原或表位的结合特异性。

“靶细胞”应当意为对象(例如，人或动物)中可被本发明抗体所靶向的任何不合需要的细胞。在一些优选的实施方案中，所述靶细胞是表达CLDN6的细胞。表达CLDN6的细胞通常包括肿瘤细胞。

本文中使用的术语“效应细胞”是指参与免疫应答之效应期(而不是免疫应答的识别和激活期)的免疫细胞。示例性的免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞(包括细胞毒T淋巴细胞(cytolytic T cell，CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达特定的Fc受体并且执行特定的免疫功能。在一些优选的实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖性细胞的细胞毒作用(ADCC)，例如嗜中性粒细胞能够诱导ADCC。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞参与对靶细胞的特异性杀伤并且将抗原呈递至免疫系统的其他组分，或者与呈递抗原的细胞结合。在另一些实施方案中，效应细胞可吞噬靶抗原、靶细胞或微生物。可通过体液因子(例如细胞因子)调节效应细胞上特定FcR的表达。例如，已发现干扰素γ(IFN-γ)上调Fc-γRI的表达。这种增强的表达提高荷有Fc-γRI之细胞对靶标的细胞毒活性。效应细胞可吞噬靶抗原或靶细胞或使其溶解。

本文所述的抗体可以是人抗体。本文中使用的术语“人抗体”意在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列之可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不被人种系免疫球蛋白序列(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变而引入的突变)所编码的氨基酸残基。

本文所述的抗体可以是单克隆抗体。本文中使用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。在一个实施方案中，单克隆抗体是由杂交瘤产生的，所述杂交瘤包含与永生化细胞融合的获自非人动物(例如，小鼠)的B细胞。

本文所述的抗体可以是重组抗体。本文中使用的术语“重组抗体”包括由重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)从以免疫球蛋白基因转基因或转染色体动物(例如，小鼠)中或者从其制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从转化以表达抗体的宿主细胞中(例如，从转染瘤中)分离的抗体，(c)从重组的、组合的抗体文库中分离的抗体，和(d)由涉及将免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。

本文中使用的术语“转染瘤”包括表达抗体的重组真核宿主细胞，例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、植物细胞或真菌(包括酵母)细胞。

本文中使用的“异源抗体”是相对于产生所述抗体的转基因生物而定义的。该术语是指具有下述氨基酸序列或与其对应的编码核酸序列的抗体，即所述氨基酸序列或与其对应的编码核酸序列存在于并非所述转基因生物的生物体中，并且通常所述抗体衍生自不同于所述转基因生物的物种。

本文中使用的“异杂合抗体(heterohybrid antibody)”是指具有不同生物来源之轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链相关联之人重链的抗体是异源杂合抗体。

本发明包括本文所述的所有抗体和衍生物，其对于本发明的目的而言均包括于术语“抗体”中。术语“抗体衍生物”是指抗体的任何修饰形式，例如，抗体与其他试剂或者抗体或抗体片段的缀合物。

本文所述的抗体优选地是分离的。本文中使用的“分离的抗体”意指这样的抗体，其基本没有具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，与CLDN6特异性结合的分离抗体是这样的抗体，其基本没有与CLDN6以外的抗原特异性结合的抗体)。然而，与人CLDN6的表位、同种型或变体特异性结合的分离的抗体可以具有与其他相关抗原(例如，来自其他物种)(例如，CLDN6的物种同源物)的交叉反应性。此外，分离的抗体可基本没有其他细胞物质和/或化学品。在本发明的一个实施方案中，“分离的”单克隆抗体的组合表示具有不同特异性并且组合于明确界定的组合物中的抗体。

根据本发明，如果在标准测定中抗体与预先确定的靶标有显著的亲和力并且与所述预先确定的靶标结合，则所述抗体能够与所述预先确定的靶标结合。经常通过平衡解离常数(K_D)衡量“亲和力”或“结合亲和力”。优选地，术语“显著的亲和力”是指以10^-5M或更低、10^-6M或更低、10^-7M或更低、10^-8M或更低、10^-9M或更低、10^-10M或更低、10^-11M或更低或者10^-12M或更低的解离常数(K_D)与预先确定的靶标结合。

如果在标准的测定中抗体不具有对靶标的显著亲和力并且不与所述靶标显著地结合，则所述抗体(基本)不能与所述靶标结合。优选地，如果在流式细胞术分析(FACS分析)中(其中测定所述抗体与表达于完整细胞表面上的所述靶标的结合)抗体不与靶标可检测地结合，则所述抗体(基本)不能与所述靶标结合。优选地，如果以高达2μg/ml、优选高达10μg/ml、更优选高达20μg/ml、特别是高达50μg/ml或高达100μg/ml或者更高的浓度存在，则所述抗体不与所述靶标可检测地结合。优选地，如果抗体与所述靶标以比与预先确定之靶标(所述抗体所能够与其结合)结合之K_D高至少10倍、100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍高的K_D结合，则抗体不具有对靶标的显著亲和力。例如，如果抗体与所述抗体所能够结合的所述靶标相结合的K_D是10^-7M，则抗体不具有显著亲和力的与靶标结合的K_D可以是至少10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M、10^-2M或10^-1M。

根据本发明的抗体优选地能够与预先确定的靶标(特别是CLDN6)特异性结合。

如果抗体能够与预先确定的靶标结合而不能与其他靶标结合(即，在标准测定中对其他靶标没有显著的亲和力并且不与其他靶标显著地结合)，则所述抗体对所述预先确定的靶标是特异性的。根据本发明，如果抗体能够与CLDN6结合但(基本)不能与其他靶标(特别是除CLDN6之外的密蛋白，例如CLDN9、CLDN4、CLDN3和CLDN1)结合，则所述抗体是CLDN6特异性的。优选地，如果与CLDN6之外的密蛋白(例如，CLDN9、CLDN4、CLDN3和CLDN1)的亲和力和结合没有显著超过与密蛋白不相关的蛋白质(例如，牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)、酪蛋白、人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)或非密蛋白的膜蛋白质(例如，MHC分子或转铁蛋白受体)或任何其他指定的多肽)的亲和力或结合，则所述抗体是CLDN6特异性的。优选地，如果抗体与所述靶标以比与预先确定之靶标(所述抗体对其不是特异性的)结合之K_D低至少10倍、100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍的K_D结合，则所述抗体对预先确定的靶标是特异性的。例如，如果抗体与对其特异性靶标之结合的K_D是10^-7M，则与对其非特异性靶标之结合的K_D可以是至少10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M、10^-2M或10^-1M。

可使用任何合适的方法实验性测定抗体与靶标的结合；参见例如Berzofsky等，″Antibody-Antigen Interactions″In Fundamental Immunology，Paul，W.E.，编，RavenPress New York，N Y(1984)，Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and Company NewYork，N Y(1992)和本文所述的方法。可使用常规技术很容易地测定亲和力，例如，通过平衡透析；通过使用BIAcore 2000仪器，使用制造商所描述的一般方法；通过使用放射标记的靶抗原的放射免疫测定；或通过技术人员已知的其他方法。例如，可通过Scatchard等，AnnN.Y.Acad.ScL，51：660(1949)的方法分析亲和力数据。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH)下测量，所测量的具体抗体-抗原相互作用的亲和力可以不同。因此，亲和力的测量和其他抗原-结合参数(例如，K_D、IC₅₀)优选地用抗体与抗原的标准化的溶液以及标准化的缓冲液制成。

本文中使用的“同种型”是指由重链恒定区基因所编码的抗体类型(例如，IgM或IgG1)。根据本发明的抗体包括多克隆和单克隆抗体，并且包括IgG2a(例如，IgG2a、κ、λ)、IgG2b(例如，IgG2b、κ、λ)、IgG3(例如，IgG3、κ、λ)和IgM抗体。然而，本发明还包括其他抗体同种型，包括IgG1、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗体。

本文中使用的“同种型转换”是指抗体的类型或同种型从一种Ig类型变为另一种Ig类型的现象。

本文中使用的应用于对象的术语“天然的(naturally occurring)”是指对象可在自然中找到的事实。例如，存在于可以从天然来源中分离的生物(包括病毒)中并且已在实验室中被人刻意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然的。

本文中使用的术语“重排的”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中在实质上编码完整的VH或VL结构域的构象中，V区段的位置分别紧邻D-J或J区段。可通过比较种系DNA来鉴定重排的免疫球蛋白(抗体)基因座；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源性元件。

本文中关于V区段而使用的术语“未重排的”或“种系构型”是指这样的构型，其中V区段未重组，以使其紧邻D或J区段。

根据本发明，抗体可来源于不同的物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。抗体还包括嵌合分子，其中源自一个物种(优选人)的抗体恒定区与源自另一个物种的抗原结合位点组合。此外，抗体包括人源化分子，其中源自非人物种之抗体的抗原结合位点与人来源的恒定和框架区相组合。

可通过多种技术产生抗体，所述技术包括常规的单克隆抗体法，例如Kohler andMilstein，Nature 256：495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管优选体细胞杂交法，原则上可采用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如病毒或癌基因转化B淋巴细胞或使用抗体基因文库的噬菌体展示技术。

用于制备分泌单克隆抗体之杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤生产是非常完善的方法。分离用于融合的经免疫脾细胞的免疫方案和技术是现有技术中已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。

用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的其他优选动物系统是大鼠和兔系统(例如描述于Spieker-Polet等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：9348(1995)，还参见Rossi等，Am.J.Clin.Pathol.124：295(2005))。

在另一个优选的实施方案中，可使用带有部分人免疫系统(而非小鼠系统)的转基因或转染色体小鼠来生成抗CLDN6的人单克隆抗体。这些转基因的和转染色体的小鼠包括分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且其在本文中统称为“转基因小鼠”。可按照WO2004035607中对CD20的详细描述那样在这样的转基因小鼠中产生人抗体。

用于生成单克隆抗体的另一个策略是从所定义策略的产生抗体之淋巴细胞中直接分离编码抗体的基因，例如参见Babcock等，1996；A novel strategy for generatingmonoclonal antibodies from single，isolated lymphocytes producing antibodiesof defined strategy。对于重组抗体工程的细节还参见Welschof and Kraus，Recombinant antibodes for cancertherapy ISBN-0-89603-918-8和Benny K.C.LoAntibody EngineeringISBN 1-58829-092-1。

为产生CLDN6的抗体，如所描述的那样可用载剂缀合的衍生自CLDN6序列的肽，重组表达的CLDN6抗原或其片段的富集制备物和/或表达CLDN6或其片段的细胞免疫接种小鼠。或者，可用DNA编码的全长人CLDN6或其片段免疫接种小鼠。在使用纯化的或富集的CLDN6抗原制备物免疫接种而不产生抗体的情况中，还可用表达CLDN6的细胞(例如，细胞系)免疫接种小鼠以促进免疫应答。

可在免疫方案的过程中监测免疫应答，其中通过尾静脉或眶后取血来获得血浆和血清样品。具有足够效价的抗CLDN6免疫球蛋白的小鼠可用于融合。在处死和取出脾之前3～5天，可用表达CLDN6的细胞腹膜内或静脉内对小鼠进行加强以提高分泌特定抗体之杂交瘤的比例。

为生成产生抗CLDN6单克隆抗体的杂交瘤，可从获自经免疫小鼠的淋巴结、脾或骨髓分离细胞，并使其与合适的永生化细胞系(例如，小鼠骨髓瘤细胞系)融合。随后可从所产生的杂交瘤中筛选抗原特异性抗体的产生。随后可通过ELISA从各个孔筛选分泌抗体的杂交瘤。使用表达CLDN6的细胞，通过免疫荧光和FACS分析来鉴定对CLDN6具有特异性的抗体。可再次接种分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，并且如果其仍然是抗CLDN6单克隆抗体阳性，则可通过有限稀释进行亚克隆。可随后体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中生成用于表征的抗体。

还可使用例如现有技术中公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合以在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体(Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。

例如，在一个实施方案中，可将目的基因(例如，抗体基因)连接到表达载体(例如，真核表达质粒(例如，WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338 841中公开的GS基因表达系统或现有技术中公知的其他表达系统所使用的真核表达质粒))中。可将具有所克隆的抗体基因的纯化质粒引入真核宿主细胞，例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞或HEK293细胞或者其他真核细胞，例如植物来源的细胞、真菌或酵母细胞。用于引入这些基因的方法可以是现有技术中所描述的方法，例如电穿孔、lipofectine、lipofectamine等。将这些抗体基因引入宿主细胞之后，可鉴定和选择表达所述抗体的细胞。这些细胞代表转染瘤，随后可放大其表达水平并提高规模以产生抗体。可从这些培养上清液和/或细胞中分离和纯化重组抗体。

或者，可在其他表达系统(包括原核细胞(例如微生物(例如大肠杆菌(E.coli)))中表达所克隆的抗体基因。此外，可在转基因的非人动物中产生抗体，例如在来自绵羊和兔的奶中，或在来自母鸡的卵中，或在转基因植物中产生；参见例如Verma，R.，等(1998)J.Immunol.Meth.216：165-181；Pollock，等(1999)J.Immunol.Meth.231：147-157；和Fischer，R.，等(1999)Biol.Chem.380：825-839。

当用毒素或放射性同位素标记后，鼠单克隆抗体可在人中被用作治疗性抗体。非标记的鼠抗体在人中是高度免疫原性的，当重复应用后导致治疗作用的降低。主要的免疫原性是由重链恒定区介导的。如果使各个抗体嵌合化或人源化，可降低或完全避免鼠抗体在人中的免疫原性。嵌合抗体是其中的不同部分来自不同动物物种的抗体，例如具有来自鼠抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。抗体的嵌合化是通过将鼠抗体重链和轻链的可变区与人重链和轻链恒定区相连接而实现的(例如，Kraus等在Methods in MolecularBiology series，Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8中所描述的那样)。在一个优选的实施方案中，嵌合抗体是通过将人κ-轻链恒定区与鼠轻链可变区相连接而生成的。在另一个优选的实施方案中，可通过将人λ-轻链恒定区与鼠轻链可变区相连接而生成嵌合抗体。优选的用于生成嵌合抗体的重链恒定区是IgG1、IgG3和IgG4。其他优选的用于生成嵌合抗体的重链恒定区是IgG2、IgA、IgD和IgM。

抗体主要通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与目标抗原相互作用。为此，在各个抗体之间，CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列更多样化。因为CDR序列负责多数抗体-抗原相互作用，通过构建包含从具有不同特性的不同抗体移植到框架序列上的来自特定天然抗体CDR序列的表达载体，可表达模拟特定天然抗体之特性的重组抗体(参见例如Riechmann，L.等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321：522-525；和Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。这样的框架序列可获自包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库。这些种系序列会不同于成熟的抗体基因序列，因为它们不会包含完整组装的可变区基因，完整组装的可变区基因是通过B细胞成熟过程中的V(D)J连接而形成的。在可变区中均匀的各个位置上，种系基因序列还会不同于高亲和力的二级全套抗体的序列。例如，体细胞突变在框架区1的氨基末端部分和在框架区4的羧基末端部分中相对罕见。此外，很多体细胞突变不明显地改变抗体的结合特性。为此，并不必需获得具体抗体的整个DNA序列以重新产生具有与原抗体相似结合特性的完整重组抗体(见WO 99/45962)。跨越CDR区的部分重链和轻链序列对于该目的通常是足够的。所述部分序列被用于测定哪个种系可变区段和连接基因区段贡献于重组的抗体可变基因。随后将种系序列用于填充可变区的缺失部分。在蛋白质成熟的过程中切除重链和轻链前导序列，其并不贡献于最终抗体的特性。为了添加丢失的序列，可通过连接或PCR扩增来将被克隆的cDNA序列与合成的寡核苷酸组合。或者，可作为一组短的、重叠的、寡核苷酸来合成整个可变区，并通过PCR扩增来组合以产生整个合成的可变区克隆。该过程具有某些优势，例如清除或包含特定的限制位点，或者优化特定的密码子。

使用来自杂交瘤的重链和轻链转录本的核苷酸序列来设计重叠的合成寡核苷酸组以产生具有与天然序列相同氨基酸编码能力的合成V序列。合成的重链和κ链序列可以如下三种方式不同于天然序列：重复的核苷酸碱基串被中断以促进寡核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak规则(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870)并入最佳的翻译起始位点；以及在翻译起始位点的上游设计HindIII位点。

对于重链和轻链可变区，优化的编码和对应的非编码链序列大约在对应的非编码寡核苷酸的中点处被分解成30～50个核苷酸。因此，对于每条链，所述寡核苷酸可被组装成为跨越150～400个核苷酸区段的重叠双链组。随后将汇集池(pool)用作模板以产生150～400个核苷酸的PCR扩增产物。一般来说，单个可变区核苷酸组将被分解成两个汇集池，其被分别扩增以生成两个重叠的PCR产物。随后通过PCR扩增将这些重叠的产物组合以形成完整的可变区。还可在PCR扩增中理想地包括重链或轻链恒定区的重叠片段以生成很容易被克隆到表达载体构建体中的片段。

随后将所重建的嵌合化的或人源化的重链和轻链可变区与克隆的启动子、前导、翻译起始、恒定区、3’非翻译、聚腺嘌呤和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可组合到单个载体中，共转染、依次转染或分别转染到宿主细胞中，随后使所述宿主细胞融合形成表达这两个链的宿主细胞。描述了用于构建人IgGκ表达载体的质粒。可这样构建所述质粒，以使PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列可被用于重新构建完整的重链和轻链小基因(minigene)。这些质粒可被用于完整地表达人或嵌合IgG1，κ或IgG4，κ抗体。可构建类似的质粒用于表达其他重链同种型，或用于表达包含λ轻链的抗体。

因此，在本发明的另一方面中，使用本文所述的抗CLDN6抗体的结构特征以产生结构相关的人源化抗CLDN6抗体，其保持至少一种本发明抗体的功能特性(例如，与CLDN6结合)。更具体地说，小鼠单克隆抗体的一个或更多个CDR区可与已知的人框架区和CDR重组地组合以产生其他重组改造的人源化抗CLDN6抗体。

使用标准的结合测定，例如实施例中列出的测定(例如，ELISA、Western印迹、免疫荧光和流式细胞术分析)，可测定抗体与CLDN6结合的能力。

术语“表位”是指分子中的抗原决定簇，即是指分子中被免疫系统识别(例如被抗体识别)的部件。例如，表位是被免疫系统识别的抗原上离散的三维部位。在本发明的情况下，所述表位优选地衍生自CLDN蛋白。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如，氨基酸或糖侧链)组成，并且经常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，丧失与前者而不丧失与后者的结合。蛋白质(例如，CLDN)的表位优选地包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且长度优选地是5至100个、优选5至50个、更优选8至30个、最优选10至25个氨基酸，例如，所述表位的长度可优选地是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。

本文中使用的术语“不连续表位”意为蛋白质抗原上的构象表位，其是由蛋白质的一级序列中的至少两个分开的区域形成的。

根据本发明，术语“结合”优选涉及特异性结合。“特异性结合”意指物质(如抗体)与其特异性靶标(如表位)的结合强于与其他靶标的结合。如果物质与第一种靶标结合的解离常数(K_D)低于与第二种靶标的解离常数，则其与第一种靶标的结合强于与第二种靶标的结合。优选地，物质特异性结合的靶标的解离常数(K_D)比该物质非特异性结合的靶标的解离常数(K_D)低超过10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍或10¹⁰倍。

本文中使用的术语“核酸”意在包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)分子。根据本发明，核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生和化学合成的分子。根据本发明，核酸可以是单链或双链的线性或共价环状闭合分子。

根据本发明描述的核酸优选地已被分离。根据本发明，术语“分离的核酸”意为所述核酸是(i)体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过切割和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。分离的核酸是可用于重组DNA技术之操作的核酸。

根据本发明，核酸可单独存在或与其他核酸联合存在，所述其他核酸可以是同源的或异源的。在一些优选的实施方案中，核酸与表达控制序列功能性连接，所述表达控制序列与所述核酸可以是同源或异源的，其中术语“同源的”意为所述核酸还天然地与表达控制序列功能性连接，而术语“异源的”意为所述核酸天然地不与表达控制序列功能性连接。

如果它们是彼此以这样的方式共价连接以使所述核酸的表达或转录在所述表达控制序列的控制或影响之下，则核酸(例如，表达RNA和/或蛋白质或肽的核酸)与表达控制序列彼此功能性连接。如果要将所述核酸翻译成为功能性蛋白质，那么用表达控制序列与编码序列功能性连接，诱导所述表达控制序列导致所述核酸的转录，而不引起编码序列中的移码或者所述编码序列不能被翻译成为所需的蛋白质或肽。

根据本发明，术语“表达控制序列”或“表达控制元件”包含启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件。在本发明的一些具体的实施方案中，可调节所述表达控制序列。表达控制序列的精确结构可根据物种或细胞类型而不同，但通常包含5′-非转录的以及5′-和3′-非翻译序列，其分别参与转录和翻译的起始，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。更具体地说，5′-非转录的表达控制序列包含启动子区，其包含用于功能性连接的核酸之转录控制的启动子序列。表达控制序列还可包括增强子序列或上游激活子序列。

根据本发明，术语“启动子”或“启动子区”表示这样的核酸序列，其位于被表达核酸序列的上游(5′)，并且通过提供对RNA聚合酶的识别和结合位点而控制序列的表达。“启动子区”还可包含识别和结合参与基因转录调节之其他因子的位点。启动子可控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以是“可诱导型的”并且可以响应于诱导剂而起始转录，或者如果转录不受诱导剂控制，所述启动子可以是“组成型的”。如果不存在诱导剂，在可诱导型启动子控制之下的基因不表达或仅少量表达。在诱导剂存在下，所述基因被打开或转录水平提高。这一般是通过特定转录因子的结合所介导的。

根据本发明，优选的启动子包括SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工的杂合启动子(例如，CMV)，其中一个部件或一些部件与其他细胞蛋白质(例如，人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氨酶))的基因启动子的一个部件或一些部件融合，并且包含或不包含额外的内含子。

根据本发明，以最通常的意义使用术语“表达”，其包括产生RNA或产生RNA和蛋白质/肽。它还包括核酸的部分表达。此外，可以瞬时地或稳定地进行表达。根据本发明，术语表达还包括“异常表达”或“不正常表达”。

根据本发明，“异常表达”或“不正常表达”意为与参比相比(优选与非肿瘤发生性的正常细胞或健康的个体中的状态相比)表达改变(优选提高)。表达的提高是指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。在一个实施方案中，表达仅见于患病的组织，而健康组织中的表达被抑制。

在一个优选的实施方案中，根据本发明，核酸分子，在适当情况下与控制核酸表达的启动子一起，存在于载体中。在此以其最常用的意义使用的术语“载体”，其包括用于核酸的任何中间运载体(vehicle)，其使所述核酸例如被引入原核和/或真核细胞，并且在适当情况下被整合进入基因组。这类载体优选地在所述细胞中复制和/或表达。载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。本文中使用的术语“质粒”通常表示可独立于染色体DNA而复制的染色体外遗传物质的构建体，通常为环状DNA双链体。

对于表达抗体的载体，可使用其中抗体重链和轻链存在于不同的载体中的载体类型或者其中重链和轻链存在于同一载体中的载体类型。

本文中给出的关于特定核酸和氨基酸序列(例如，序列表中的序列)的教导解释为还涉及所述特定序列的修饰形式，其导致功能性等同于所述特定序列的序列，例如，氨基酸序列表现出与所述特定氨基酸序列相同或相似的特性，并且编码氨基酸序列的核酸序列表现出与所述特定核酸序列所编码的氨基酸序列相同或相似的特性。

类似地，本文中给出的关于特定抗体或产生特异性抗体之杂交瘤的教导解释为还涉及以相对于所述特定抗体的所述氨基酸序列和/或核酸序列是经修饰的但是功能上等同的氨基酸序列和/或核酸序列为特征的抗体。一个重要的特性是保持抗体与其靶标的结合或维持抗体的效应功能。优选地，当用相对于特定序列修饰的序列替换抗体中的特定序列时，保持所述抗体与靶标的结合，并且优选保持本文所述的所述抗体的功能，例如CDC介导的裂解或ADCC介导的裂解。

本领域技术人员会理解，可修饰高变区和可变区(特别是CDR的序列)而不失去与靶标结合的能力。例如，CDR区会与本文中指定的抗体相同或高度同源。对于“高度同源”，考虑可在CDR中进行1至5个(优选1至4个，例如1至3个或者1或2个)替换。此外，可修饰高变区和可变区，以使其显示出与本文中具体公开的抗体区域基本同源。

应该理解，本文所述的特定核酸还包括为了优化特定宿主细胞或生物中的密码子使用而进行了修饰的核酸。生物之间密码子使用的差异可引起多种关于异源基因表达的问题。通过改变原始序列中的一个或多个核苷酸而进行密码子优化可在待表达所述核酸的同源或异源宿主中引起核酸表达的优化，特别是翻译效率的优化。例如，如果根据本发明需使用来自人并编码抗体恒定区和/或构架区的核酸，例如用于制备嵌合或人源化抗体，则为了优化密码子使用而修饰所述核酸可能是优选的，特别是在如果所述核酸(任选地与异源核酸如来自本文所述其他生物的核酸融合)需在不同于人的生物(如小鼠或仓鼠)细胞中表达的情况下。例如，可修饰编码人轻链和重链恒定区的核酸序列，以包含一个或多个、优选至少1、2、3、4、5、10、15、20个以及优选至多10、15、20、25、30、50、70或100个或更多核苷酸替换，所述替换引起密码子使用的优化。这样的核苷酸替换优选指不引起所编码氨基酸序列改变的核苷酸替换，或者指分别编码人轻链和重链恒定区的其他核酸序列中相应位置的相应替换。

优选地，特定核酸序列与相对于所述特定核酸序列而修饰的核酸序列或所述特定核酸序列之变体的核酸序列的同一性程度会为至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％或者最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。对于CLDN6核酸变体，同一性的程度优选针对至少约300、至少约400、至少约450、至少约500、至少约550、至少约600或至少约630个核苷酸的区域给出。在一些优选的实施方案中，针对全长的参比核酸序列(例如，序列表中给出的核酸序列)给出同一性程度。优选地，这两个序列能够彼此杂交并形成稳定的双链体，杂交优选在允许多核苷酸之间特异性杂交的条件(严格条件)下进行。严格条件描述于例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等，Editors，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，New York，1989或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等，Editors，John Wiley&Sons，Inc.，New York，并且是指例如在65℃下在杂交缓冲液(3.5×SSC、0.02％Ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、2.5mM NaH₂PO₄(pH 7)、0.5％SDS、2mM EDTA)中的杂交。SSC是0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH 7。杂交之后，清洗已被转移了DNA的膜，例如室温下在2×SSC中清洗，并随后在高达68℃的温度下在0.1～0.5×SSC/0.1×SDS中清洗。

根据本发明，关于例如核酸和氨基酸序列的术语“变体”包括任何变体(特别是突变体，剪接变体，构象、同种型、等位基因变体，物种变体和物种同源物)，特别是天然存在的变体。等位基因变体涉及基因正常序列中的改变，其意义经常不清楚。全基因测序通常鉴定给定基因的大量等位基因变体。物种同源物是给定核酸或氨基酸序列的具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。

关于核酸分子，术语“变体”包括简并核酸序列，其中根据本发明的简并核酸由于遗传密码的简并性而不同于密码子序列中的参比核酸。

另外，根据本发明的特定核酸序列的“变体”包括含有单个或多个(例如至少2个、至少4个或至少6个并且优选多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达10个、多达15个或多达20个)核苷酸替换、缺失和/或添加的核酸序列。

对于本发明的目的而言，氨基酸序列的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。

在具有插入的氨基酸序列变体的情况中，向氨基酸序列的特定位点中插入一个或更多个氨基酸残基，尽管随机插入并对所产生的产物进行合适的筛选也是可能的。

氨基酸缺失变体的特征为从序列中除去一个或更多个氨基酸。

氨基酸替换变体的特征为序列中至少一个残基被除去并在其位置中插入其他残基。优选在氨基酸序列中同源蛋白质或肽之间非保守的位置处修饰和/或优选将氨基酸置换为其他具有相似特性的氨基酸。

优选地，蛋白质变体中的氨基酸改变是保守性氨基酸改变，即替换带有类似电荷的或不带电荷的氨基酸。

特定氨基酸序列与相对于所述特定氨基酸而修饰的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体之间(例如，显示基本同源的氨基酸序列之间)优选的相似性程度、优选的同一性会为至少70％，优选至少80％，甚至更优选至少90％或者最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。对于CLDN6多肽变体，优选地针对至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个、至少约200个、至少约210个氨基酸的区域给出相似性或同一性程度。在一些优选的实施方案中，针对全长的参比氨基酸序列(例如，序列表中所给出的氨基酸序列)给出相似性或同一性程度。

“序列相似性”表示相同或存在保守性氨基酸替换的氨基酸百分比。两个多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸或核苷酸百分比。

术语“百分同一性”意在表示在最佳比对之后获得的两个待比较的序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，并且这两个序列之间的差异在其整个长度上随机地分布。通过任选地比对它们之后，比较这些序列，常规地进行两个核苷酸或氨基酸序列之间的序列比较，所述比较是通过区段或“比较窗”进行的，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。除了手工进行之外，可通过Smith and Waterman，1981，AdsApp.Math.2，482的局部同源性算法，通过Neddleman and Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法，通过Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85，2444的相似性搜索法，或者通过使用这些算法的计算机程序(Wisconsin GeneticsSoftware Package中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.)来产生对用于比较之序列的最佳比对。

通过测定被比较的两个序列之间相同位置的数目来计算百分同一性，将该数目除以所比较的位置数并使结果乘以100以获得这两个序列之间的百分同一性。

例如，可根据所涉残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质而进行“保守性替换”。例如：(a)非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；以及(d)带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。替换通常可在组(a)～(d)之内进行。此外，根据甘氨酸和脯氨酸破坏α-螺旋的能力，它们可以彼此替换。可在以下组之间进行一些优选的替换：(i)S和T；(ii)P和G；以及(iii)A、V、L和I。鉴于已知的遗传代码以及重组和合成DNA技术，技术人员可很容易地构建编码保守性氨基酸变体的DNA。

本发明包括所述核酸序列、氨基酸序列、肽或蛋白质(特别是本文所述的抗体)的衍生物。

术语“衍生物”包括核酸在核苷酸碱基、糖或磷酸酯上的任何化学衍生化。术语“衍生物”还包括含有非天然存在的核苷酸和核苷酸类似物。优选地，核酸的衍生化提高其稳定性。

根据本发明，蛋白质和肽的“衍生物”为蛋白质和肽的修饰形式。这样的修饰包括任何化学修饰并且包括单个或多个与蛋白质或肽相关联之任何分子(例如碳水化合物、脂和/或蛋白质或肽)的替换、缺失和/或增加。术语“衍生物”还延伸至所述蛋白质和肽的全部功能性化学等同物。优选地，修饰的肽具有提高的稳定性和/或提高的免疫原性。

根据本发明，核酸序列、氨基酸序列、肽或蛋白质的变体、衍生物、修饰形式、片段、部件(part)或部分(portion)优选地分别具有从其来源的核酸序列、氨基酸序列、肽或蛋白质的功能特性。这样的功能特性包括与肽或蛋白质(例如抗体或抗体靶标，特别是CLDN6)的相互作用、核酸的选择性结合以及酶活性。在一个实施方案中，核酸序列、氨基酸序列、肽或蛋白质的变体、衍生物、修饰形式、片段、部件(part)或部分(portion)分别与从其来源的核酸序列、氨基酸序列、肽或蛋白质免疫学上等同。在一个实施方案中，功能特性是免疫学特性。

根据本发明，细胞优选地是完整细胞，即具有完整膜的未释放其正常的细胞内成分(例如，酶、细胞器或遗传物质)的细胞。完整细胞优选地是活细胞(viable cell)，即能够进行正常代谢功能的活细胞(living cell)。优选地，细胞是人细胞。

如本文中使用的“细胞”可以是“宿主细胞”，其意为指重组核酸已被引入的细胞。

术语“转基因动物”是指具有包含一个或更多个转基因(优选重链和/或轻链转基因)或转染色体(transchromosome)(整合或不整合到动物的天然基因组DNA中)的基因组的动物，并且其优选能够表达所述转基因。例如，转基因小鼠可具有人轻链转基因以及人重链转基因或人重链转染色体，以使当用CLDN6抗原和/或表达CLDN6的细胞免疫时，所述小鼠产生人抗-CLDN6抗体。人重链转基因可被整合到小鼠的染色体DNA中(如转基因小鼠(例如，HuMAb小鼠(例如，HCo7或HCol2小鼠))中的情况那样)，或者可以染色体外维持人重链转基因(如WO 02/43478中描述的转染色体(例如，KM)小鼠中的情况那样)。通过进行V-D-J重组和同种型转换，这样的转基因和转染色体小鼠可以以能够产生多同种型的抗CLDN6的人单克隆抗体(例如，IgG、IgA和/或IgE)。

根据本发明，术语“治疗效应子部分”意为可发挥治疗作用的任何分子。根据本发明，将治疗效应分子优选地选择性引入表达CLDN6的细胞，其包括抗癌剂、放射性同位素、毒素、细胞静止剂或细胞裂解药等。抗癌剂包括，例如氨鲁米特、硫唑嘌呤、硫酸博来霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环孢霉素、cytarabidine、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、紫杉醇、依托泊苷、氟尿嘧啶、干扰素-α、洛莫司汀、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托坦、盐酸丙卡巴肼、硫鸟嘌呤、硫酸长春碱和硫酸长春新碱。其他抗癌剂例如在Goodman和Gilman，″The Pharmacological Basis of Therapeutics″，第8版，1990年，McGraw-Hill，Inc.中尤其在第52章(Antineoplastic Agents(Paul Calabresi和BruceA.Chabner))中有所描述。毒素可以是蛋白质(例如美洲商陆抗病毒蛋白、霍乱毒素、百日咳毒素、蓖麻毒素、多花白树毒蛋白、相思豆毒素、白喉外毒素或绿脓杆菌(Pseudomonas)外毒素。毒素残基还可以是高能量发射放射性核素(例如钴60)。

本文中使用的“降低”或“抑制”意为引起总体降低的能力，优选5％或更高、10％或更高、20％或更高、更优选50％或更高并且最优选75％或更高水平的降低，例如细胞增殖水平的降低。术语“抑制”或类似的词语包括完全或基本完全的抑制，即降低至0或基本降低至0。

术语例如“提高”或“增强”优选地表示提高或增强约至少10％、优选至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少80％并且最优选至少100％。

术语“免疫学上等同”意为例如对于免疫作用的类型(例如诱导体液和/或细胞免疫应答)、所诱导的免疫反应的强度和/或持续时间或者所诱导的免疫反应的特异性而言，免疫学上等同分子(例如免疫学上等同氨基酸序列)表现出相同或基本相同的免疫特性和/或发挥相同或基本相同的免疫作用。在本发明的情况中，术语“免疫学上等同”优选地是相对于免疫的肽或肽变体或者抗体的免疫作用或特性而使用的。特定的免疫特性是与抗体结合和(在适当情况下)产生免疫应答(优选地通过刺激抗体的产生)的能力。例如，如果所述氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统时诱导免疫反应(优选抗体，其具有与参比氨基酸序列(例如，所述参比氨基酸序列形成CLDN6的部件)反应的特异性)，则所述氨基酸序列与参比氨基酸序列免疫学上等同。

在本文的情况中，术语“免疫效应子功能”包括免疫系统的组分所介导的任何功能，其导致抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发生，包括抑制肿瘤的播散和转移。优选地，免疫效应子功能导致杀伤肿瘤细胞。优选地，本发明的情况中的免疫效应子功能是抗体介导的效应子功能。这样的功能包括补体依赖性细胞毒作用(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、在带有肿瘤相关抗原(例如CLDN6)的细胞中诱导凋亡(例如，通过抗体与表面抗原的结合)和/或抑制带有肿瘤相关抗原之细胞的增殖，优选ADCC和/或CDC。因此，能够介导一种或更多种免疫效应子功能的抗体优选地能够通过诱导CDC介导的裂解、ADCC介导的裂解、凋亡、同质性黏附和/或吞噬作用(优选通过诱导CDC介导的裂解和/或ADCC介导的裂解)介导对细胞的杀伤。抗体还可简单地通过与肿瘤细胞表面上的肿瘤相关抗原结合而发挥作用。例如，抗体可仅通过与肿瘤细胞表面上的肿瘤相关抗原结合而阻断肿瘤相关抗原的功能或诱导凋亡。

本文所述的抗体、组合物和方法可用于治疗患有肿瘤疾病(例如，以存在表达CLDN6的肿瘤细胞为特征的疾病)的对象。可治疗和/或预防的肿瘤疾病的实例包括所有表达CLDN6的癌症和肿瘤实体(包括本文所述的那些)。

本文所述的抗体、组合物和方法还可用于免疫或接种疫苗，以预防本文所述的疾病。

根据本发明，术语“疾病”是指任何病理状态，包括癌症，特别是本文中所描述形式的癌症。

根据本发明，“与表达CLDN6之细胞相关的疾病”意为与健康组织或器官中的状态相比，病态的组织或器官的细胞中的CLDN6的表达优选地提高。提高是指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或者甚至更高。在一个实施方案中，表达仅见于病态的组织，而健康组织中的表达被抑制。根据本发明，与表达CLDN6之细胞相关或相关联的疾病包括肿瘤疾病，例如癌疾病。此外，根据本发明，肿瘤疾病(例如癌疾病)优选是这样的疾病，其中肿瘤细胞或癌细胞表达CLDN6。

根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”指由细胞异常生长(称为肿瘤细胞(neoplastic cell或tumor cell))所形成的膨胀或病变。“肿瘤细胞”意为通过迅速的、不可控的细胞增殖而生长并且在引起该新生长的刺激消除之后继续生长的异常细胞。肿瘤表现为部分或完全缺乏结构性组织(structrual organization)和与正常组织的功能性协调，并且通常形成独特的组织块，所述肿瘤可以是良性的、恶化前的或恶性的。

良性肿瘤是缺乏癌症的所有三种恶性特征的肿瘤。因此，对于定义，良性肿瘤不会以无限制的侵略性方式生长，不会侵袭周围组织，并且不会扩散至非邻近组织(转移)。良性肿瘤的一般实例包括痣和子宫肌瘤。

术语“良性”意味着温和且非进展性的疾病，事实上很多类型的良性肿瘤对健康无害。然而，一些由于其缺乏癌症的侵袭特征而被定义为“良性肿瘤”的肿瘤仍然可产生负面的健康影响。其实例包括产生“质量效应”(压迫生命器官(例如血管))的肿瘤或者可过度产生某些激素的内分泌组织的“功能性”肿瘤(实例包括甲状腺腺瘤、肾上腺皮质腺瘤和垂体腺瘤)。

良性肿瘤通常被抑制其能够以恶性方式表现的外表面所围绕。在一些情况中，某些“良性”肿瘤由于肿瘤之肿瘤细胞的亚群中另外的遗传变化随后可引起恶性癌症。该现象显著的实例是管状腺瘤，普通型结肠息肉(结肠癌症的重要前体)。管状腺瘤中的细胞(像时常发展成癌症的大部分肿瘤)显示细胞成熟和外观的某些异常，共同地称为发育异常。这些细胞异常在很少或从不变为癌的良性肿瘤中未见，但是见于其他没有形成离散团块的癌前组织异常(例如子宫颈的癌前病变)中。一些机构倾向将发育异常肿瘤称为“恶化前”，并且对于很少或从不引起癌症的肿瘤保留术语“良性”。

肿瘤是由于瘤形成(neoplasia)的异常组织团块。瘤形成(希腊语，新生长)是细胞的异常增殖。细胞生长过度并且与其周围的正常组织不协调。生长以同一过度方式进行，甚至在刺激停止之后仍然如此。这通常引起块或肿瘤。肿瘤可以是良性的、恶化前的或恶性的。

根据本发明的“肿瘤的生长”或“肿瘤生长”指肿瘤提高其大小的趋势和/或肿瘤细胞增殖的趋势。

优选地，根据本发明的“肿瘤疾病”是癌症疾病(即恶性疾病)并且肿瘤细胞是癌细胞。优选地，“肿瘤疾病”以表达CLDN6的细胞为特征并且肿瘤细胞表达CLDN6。

癌症(医学术语：恶性肿瘤)是一类疾病，其中一组细胞展现出不受控制的生长(超过正常限制的分裂)、侵袭(侵入并且破坏邻近组织)并且有时转移(通过淋巴和血液扩散至身体中的其他位置)。癌症的这三种恶性特征将它们与良性肿瘤区分开，良性肿瘤有自限性，并且不会侵袭或转移。大部分癌症来自肿瘤，但是有一些(如白血病)不是。

表达CLDN6的细胞优选地是肿瘤细胞或癌细胞，优选本文所述的肿瘤和癌的肿瘤细胞或癌细胞。优选地，这样的细胞不是胎盘细胞。

将癌症通过类似肿瘤和由此假定肿瘤来源之组织的细胞类型进行分类。它们分别是组织学和位置。

根据本发明的术语“癌症(cancer)”包括白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾部癌症、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌症、脑的癌症、宫颈癌症、肠癌(intestinal cancer)、肝部癌症、结肠癌症、胃部癌症、肠癌(intestine cancer)、头颈部癌症、胃肠癌、淋巴结癌、食道癌、结肠直肠癌、胰腺癌症、耳鼻喉(ENT)癌、乳癌、前列腺癌、子宫的癌症、卵巢癌症和肺部癌症以及其转移。其实例为肺部癌症、乳房癌、前列腺癌、结肠癌症、肾细胞癌、宫颈癌症或者上述癌症类型或肿瘤的转移。根据本发明的术语癌症还包括癌症转移。

根据本发明的优选的肿瘤疾病或癌症选自：卵巢癌症(特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤)、肺部癌症(包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌)、胃部癌症、乳癌、肝部癌症、胰腺癌症、皮肤癌症(特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌)、恶性黑色素瘤、头颈部癌症(特别是恶性多形性腺瘤)、肉瘤(特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、胆管癌症、膀胱癌症(特别是移行细胞癌和乳头状癌)、肾部癌症(特别是肾细胞癌，包括透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌)、结肠癌症、小肠癌症(包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌)、睾丸胚胎癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌症、睾丸癌症(特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌症)和子宫癌症，及其转移形式。

根据本发明的尤其优选的肿瘤疾病或癌症选自卵巢癌症、肺部癌症、转移性卵巢癌症和转移性肺部癌症。优选地，所述卵巢癌症是卵巢癌(ovarian carcinoma)或卵巢腺癌。优选地，所述肺部癌症是癌或腺癌，并且优选地是细支气管癌，例如细支气管癌或细支气管腺癌。在一个实施方案中，肿瘤细胞是这样的癌的细胞。转移性卵巢癌症包括转移性卵巢癌和转移性卵巢腺癌，转移性肺部癌症包括转移性肺癌、转移性肺腺癌、转移性细支气管癌和转移性细支气管腺癌。

肺部癌症的主要类型是小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。有三种主要亚型的非小细胞肺癌：鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌。腺癌占肺部癌症的约10％。与小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌(二者均倾向于位于更中心的位置)相反，这种癌通常见于肺的外周。

皮肤癌症是皮肤上的恶性生长。最常见的皮肤癌症是基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤。恶性黑色素瘤是严重类型的皮肤癌症。它是由色素细胞(称为黑素细胞)的不可控生长所引起的。

根据本发明，“癌(carcinoma)”是来源于上皮细胞的恶性肿瘤。该组表示最常见的癌症，包括乳房癌、前列腺癌和结肠癌症的常见形式。

“细支气管癌(bronchiolar carcinoma)”是肺的癌，被认为源自终末细支气管的上皮，其中肿瘤组织沿着肺泡壁延伸，并在肺泡中以小团块生长。在一些细胞中以及在肺泡中的物质(其还包含裸露的细胞)中可展示出黏蛋白。

“腺癌”是源自腺组织的癌症。该组织也是称为上皮组织的较大组织分类的一部分。上皮组织包括皮肤、腺体以及内衬于身体的腔和器官的多种其他组织。上皮在胚胎学上源自外胚层、内胚层和中胚层。被分类为腺癌的细胞不一定必需是腺体的一部分，只要他们具有分泌特征即可。这种形式的癌可发生于一些高等哺乳动物(包括人)中。分化良好的腺癌倾向于与其所来源的腺组织类似，而低分化的腺癌可以不是这样。通过染色来自活检的细胞，病理学家将确定肿瘤是否是腺癌或其他一些类型的癌。因为身体内腺体普遍存在的属性，腺癌可源自身体的很多组织。虽然每种腺体可不分泌相同的物质，只要细胞有外分泌功能，它就可被认为是腺性的，并且它的恶性形式因而被命名为腺癌。只要有充足的时间，恶性腺癌侵袭其他组织并经常转移。卵巢腺癌是最常见类型的卵巢癌。它包括浆液和黏液性腺癌、透明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。

“囊腺癌”是表面上皮-间质肿瘤(surface epithelial-stromal tumor)(一种卵巢癌类型)的恶性形式。

表面上皮-间质肿瘤是被认为源自卵巢表面上皮(改性的腹膜)或源自异位子宫内膜或输卵管(管)组织的一类卵巢肿瘤。该组肿瘤占所有卵巢肿瘤的绝大多数。

“绒毛膜癌”是恶性的、滋养层的和侵袭性的癌，通常是胎盘的癌。它以早期血行扩散至肺为特征。

肾细胞癌(renal cell carcinoma)(还称为肾细胞癌(renal cell cancer)或肾细胞腺癌)是源自近曲小管(肾中过滤血液并除去废物的非常小的管)之衬里的肾部癌症。目前，肾细胞癌是成人中最常见的肾部癌症类型，并且是所有生殖泌尿肿瘤中最致命的。肾细胞癌的独特亚型是透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌。透明细胞性肾细胞癌是最常见形式的肾细胞癌。当在显微镜下观察时，组成透明细胞性肾细胞癌的细胞表现的非常苍白或透明。乳头状肾细胞癌是第二常见的亚型。这些癌在一些(如果不是大多数的话)肿瘤中形成小的手指样突出(称为乳头状突起)。

肉瘤是始于结缔组织或间充质细胞的恶性肿瘤。这与上皮来源的癌相反。滑膜肉瘤是罕见形式的癌症，其通常发生在臂或腿的关节附近。它是一种软组织肉瘤。

生殖细胞肿瘤是源自生殖细胞的肿瘤。生殖细胞肿瘤可以是癌性或非癌性的肿瘤。生殖细胞通常发生于性腺(卵巢和睾丸)内。源自性腺外(例如，头中，口内，颈，骨盆；在胎儿、婴儿和幼儿中最常见于身体中线，特别地在尾骨的尖部)的生殖细胞肿瘤可以是源自胚胎发育过程中之错误的出生缺陷。

两种主要类型的生殖细胞肿瘤是精原细胞瘤和非精原细胞瘤，其中非精原细胞瘤包括：畸胎癌、胚胎癌、卵黄囊瘤、绒毛膜癌和分化的畸胎瘤。来自非精原细胞的多数细胞系等同于胚胎癌，即它们几乎完全由在基础条件下不分化的干细胞组成，尽管其中一些可以响应于分化诱导剂(例如，视黄酸)。

畸胎癌(teratocarcinoma)是指生殖细胞肿瘤，它是畸胎瘤(teratoma)与胚胎癌或与绒毛膜癌或与这二者的混合物。该类型的混合的生殖细胞肿瘤可简单地认为是具有胚胎癌或绒毛膜癌的元件的畸胎瘤，或者简单地忽略畸胎瘤组分和仅仅指其恶性组分：胚胎癌和/或绒毛膜癌。

淋巴瘤和白血病是源自造血(血形成)细胞的恶性肿瘤。

母细胞瘤(Blastic tumor)或胚细胞瘤是类似不成熟或胚组织的肿瘤(一般是恶性的)。在儿童中常见许多这些肿瘤。

“转移”意为癌细胞从其初始位置扩散至身体的其他部分。转移的形成是非常复杂的过程，有赖于恶性细胞从原发肿瘤脱离，侵袭细胞外基质，穿透内皮基底膜进入体腔和血管，并随后通过血液运输，然后浸润靶器官。最后，新肿瘤(即继发性肿瘤或转移性肿瘤)在目标位置的生长有赖于血管发生。甚至在除去原发肿瘤之后仍经常发生肿瘤转移，因为肿瘤细胞或组分可残留并发展出转移潜力。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”表示“远端转移”，其表示远离原发肿瘤和局部淋巴结系统的转移。

继发性或转移性肿瘤的细胞与原发性肿瘤中的细胞类似。这意味着例如如果卵巢癌症转移至肝，则所述继发性肿瘤由异常的卵巢细胞(而不是异常的肝细胞)组成。随后，肝中的肿瘤被称为转移性卵巢癌症(而不是肝部癌症)。

在卵巢癌症中，转移可通过以下方式发生：通过直接接触或延伸，其可侵袭接近卵巢或卵巢周围的附近组织或器官(例如输卵管、子宫、膀胱、直肠等)；通过播种(seeding)或脱落至腹腔中，这是卵巢癌症扩散最常见的方式。癌细胞从卵巢团块表面断开并且“掉”入腹部中的其他组织(例如肝、胃、结肠或隔膜)；通过从卵巢团块逃脱，侵袭淋巴管，之后转移至身体的其他区域或远离的器官(例如肺或肝)；通过从卵巢团块逃脱，侵袭血液系统，之后转移至身体的其他区域或远离的器官。

根据本发明，转移性卵巢癌症包括输卵管中的癌症、腹部器官中的癌症(例如肠中的癌症、子宫中的癌症、膀胱中的癌症、直肠中的癌症、肝中的癌症、胃中的癌症、结肠中的癌症、隔膜中的癌症)、肺中的癌症、腹部内层或骨盆(腹膜)中的癌症和脑中的癌症。类似地，转移性肺部癌症指这样的癌症，其从肺扩散至身体中的远离的和/或数个位置并且包括肝中的癌症、肾上腺中的癌症、骨中的癌症和脑中的癌症。

当人再次受到过去影响他们的条件影响时，发生复发或再发生。例如，如果患有肿瘤疾病的患者已经得到成功治疗所述疾病而且再次发生所述疾病，那么所述新发生的疾病可被认为是复发或再发生。然而，根据本发明，肿瘤疾病的复发或再发生可未必在原始肿瘤疾病的位置发生。因此，例如，如果患者患有卵巢肿瘤并且接受成功治疗，那么复发或再发生可以是发生卵巢肿瘤或在不同于卵巢的位置发生肿瘤。肿瘤的复发或再发生还可包括这样的状况，其中在不同于原始肿瘤之位置的位置以及在原始肿瘤的位置发生肿瘤。优选地，患者接受治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤并且在不同于原始肿瘤之位置的位置上的肿瘤是继发性肿瘤或转移性肿瘤。

“治疗”意为向对象施用本文所述的化合物或组合物以：预防或清除肿瘤或使对象中的肿瘤的大小或肿瘤的数目降低；阻滞或减缓对象中的肿瘤生长；抑制或减缓对象中新肿瘤或肿瘤转移的发生；降低目前患有或以前曾患有癌症之对象中的症状和/或复发的频率或严重程度；和/或延长(即，提高)所述对象的寿命。

尤其，术语“疾病的治疗”包括疾病或其症状的治愈，缩短持续时间，改善、预防、减缓或抑制进展或恶化，或者预防或延缓发生。

“有风险”意为被鉴定为与一般人群相比具有高于患肿瘤疾病(特别是癌症)正常几率的对象(即，患者)。此外，已患有或目前患有肿瘤疾病(特别是癌症)的对象是具有提高的患癌症风险的对象，因为这样的对象可继续患癌症。目前已患有或曾患有肿瘤的对象还具有提高的肿瘤转移风险。

术语“免疫治疗”表示涉及特异性免疫反应的治疗。在本发明的情况下，术语例如“保护”、“预防”、“预防性的(prophylactic)”、“预防的(preventive)”或“保护性的(protective)”表示在个体中预防或治疗(或二者兼有)肿瘤的发生和/或传播，并且尤其指使对象将患有肿瘤的机会最小化或延缓患有肿瘤。例如，如上述，有肿瘤发生风险的对象应是治疗以预防肿瘤的人选。

预防性施用免疫治疗(例如，预防性施用本发明的组合物)优选地对接受者进行保护以避免发生肿瘤生长。治疗性施用免疫治疗(例如，治疗性施用本发明的组合物)可导致抑制肿瘤的进展/生长。这包括使肿瘤的进展/生长减速(特别是破坏肿瘤的进展)，这优选地导致肿瘤的清除。

术语“体内”指在对象中的情况。

可互换地使用术语“对象”、“个体”或“患者”，其表示脊椎动物，优选哺乳动物。例如，在本发明的情况中，哺乳动物是人、非人灵长类、家养的动物(例如，犬、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等)、实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)以及圈养的动物(例如，动物园中的动物)。本文中使用的术语“动物”还包括人。术语“对象”还可包括患者，即，患有疾病(优选与CLDN6之表达相关的疾病(优选肿瘤疾病(例如癌症)))的动物(优选人)。

作为用于免疫或接种疫苗之组合物的一部分，优选地，本文所述的一种或更多种药剂与一种或更多种用于诱导免疫应答或用于提高免疫应答的佐剂一起施用。术语“佐剂”表示延长或增强或加速免疫应答的化合物。本发明的组合物优选地在不添加佐剂的情况下发挥其作用。尽管如此，本申请的组合物可包含任何已知的佐剂。佐剂包含一组异质的化合物，例如油乳剂(例如，弗氏佐剂)、无机化合物(例如，明矾)、细菌产物(例如，百日咳毒素杆菌(Bordetella pertussis)毒素)、脂质体和免疫刺激复合物。

佐剂的实例是单磷酰基-脂质-A(MPL SmithKline Beecham)。皂苷，例如QS21(SmithKline Beecham)、DQS21(SmithKline Beecham；WO 96/33739)、QS7、QS17、QS18和QS-L1(So等，1997，Mol.Cells 7：178-186)，不完全弗氏佐剂，完全弗氏佐剂，维生素E，montanid，明矾，CpG寡核苷酸(Krieg等，1995，Nature 374：546-549)和多种以生物可降解的油(例如，角鲨烯和/或生育酚)制备的油包水型乳剂。

根据本发明，“样品”可以是任何根据本发明可使用的样品，特别是生物样品，例如组织样品(包括体液)和/或细胞样品，并且可以以常规方式获得，例如通过组织活检(包括钻取活检)以及通过取血、支气管吸出物、痰、尿、粪便或其他体液。根据本发明，术语“样品”还包括经处理的样品，例如生物样品的级分或分离物(例如核酸和肽/蛋白质分离物)。

也可施用刺激患者免疫应答的其他物质。例如，可能在接种免疫中使用细胞因子，这是因为其对淋巴细胞的调节特性。例如，这样的细胞因子例如包括白细胞介素-12(IL-12)(其显示提高疫苗的保护性作用(Hall(1995)Science 268：1432-1434))、GM-CSF和IL-18。

有许多化合物增强免疫应答并且因此可用于疫苗接种。所述化合物包括以蛋白质或核酸形式提供的共刺激分子，例如B7-1和B7-2(分别为CD80和CD86)。

本发明的治疗活性化合物可通过任何常规途径(包括通过注射或输注)施用。施用可例如口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮下或经皮进行。优选地，抗体经由肺喷雾治疗施用。

在另一个实施方案中，可以这样配制本发明的抗体以防止或降低其被运输通过胎盘。这可通过现有技术中已知的方法(例如，通过抗体的聚乙二醇化或通过使用F(ab)2′片段)来进行。还可参照″Cunningham-RundlesC，Zhuo Z，Griffith B，Keenan J.(1992)Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulinconjugates.Resistance to enzymatic degradation.J.Immunol.Methods，152：177-190；和参照″Landor M.(1995)Maternal-fetal transfer of immunoglobulins，Ann.AllergyAsthmaImmunol.74：279-283。

本发明组合物以有效量施用。“有效量”指单独或与其他制剂一起达到预期反应或预期作用的量。在治疗特定疾病或特定状况的情况中，预期反应优选地涉及抑制疾病的过程。这包括减缓疾病的进展，特别地中断或改变疾病的进展。治疗疾病或状况中的期望反应还可延缓或预防所述疾病或所述状况发生。

本发明组合物的有效量将有赖于待治疗的状况、疾病的严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理状况、尺寸和重量)、治疗时间、伴随治疗(如果存在)的类型、施用的特定途径及类似的因素。因此，施用本发明组合物的剂量可有赖于多种这样的参数。在这样的情况下，当用初始剂量患者中的反应不充分，可使用较高剂量(或者通过不同的更局部的给药途径而达到的有效地较高剂量)。

本发明的药物组合物优选地是无菌的并且包含有效量的治疗活性物质，以产生期望反应或期望作用。

本发明的药物组合物通常以药物可相容的量并且在药物可相容的制备物中施用。术语“药物可相容”指不与所述药物组合物之活性组分的作用有相互影响的无毒材料。该类型的制备物一般可包括盐、缓冲物质、防腐剂、载剂、补充免疫增强物质(例如佐剂(例如CpG寡核苷酸、细胞因子、趋化因子、皂苷、GM-CSF和/或RNA))和(在适当情况下)其他治疗活性化合物。当用于医药时，所述盐应是药物可相容的。然而，非药物可相容的盐可用于制备药物可相容的盐并且包括在本发明中。该类型的药理学或药物可相容的盐以非限制的方式包括由以下酸制备的那些：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药物可相容的盐还可如碱金属盐或碱土金属盐制备，例如钠盐、钾盐或钙盐。

本发明的药物组合物可包含药物可相容载剂。术语“载剂(carrier)”指天然或合成性的有机或无机组分，其中组合活性组分以促进应用。根据本发明，术语“药物可相容载剂”包括一种或更多种可相容固体或液体填料、稀释剂或包封物质，它们适于施用至患者。一般使得本发明药物组合物的组分能够不发生显著破坏预期药物功效的相互作用。

本发明的药物组合物可包含合适的缓冲物质，例如盐中的乙酸、盐中的柠檬酸、盐中的硼酸和盐中的磷酸。

药物组合物还可(在适当情况下)包含合适的防腐剂，例如苯扎氯铵、氯丁醇、尼泊金和硫柳汞。

所述药物组合物一般以均一剂量形式提供并且可以本身已知的方式制备。本发明的药物组合物可以是例如胶囊、片剂、锭剂、溶液、悬浮液、糖浆剂、酏剂的形式或者是乳剂的形式。

适于肠胃外施用的组合物一般包含活性化合物的无菌水性或非水性制备物，其优选与受者血液等渗。可相容载剂或溶剂的实例为Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。另外，一般无菌固定油用作溶液或悬浮介质。

本发明通过以下图和实施例进行细节描述，图和实施例仅用于示例目的并且不意为限制。由于本描述和本实施例，同样包含在本发明中的其他实施方案为技术人员所得到。

附图说明

图1：

抗CLDN6鼠单克隆抗体muMAB 5F2D2、27A和36A的结合特异性。

muMAB 5F2D2、27A和36A抗体与表达CLDN6的细胞强结合，而他们不与表达CLDN3或CLDN4的细胞结合。

图2：

muMAB 5F2D2分别与瞬时转染CLDN6、3、4或9的HEK293T细胞结合的的滴定。

muMAB 5F2D2显示与人CLDN6强结合，而与人CLDN9弱结合。抗体不与人CLDN3或4相互作用。

图3

muMAB 27A分别与瞬时转染CLDN6、3、4或9的HEK293T细胞相结合的的滴定。

muMAB 27A显示与人CLDN6强结合，而与人CLDN9非常弱地结合。抗体不与人CLDN3或4相互作用。

图4

muMAB 36A分别与瞬时转染CLDN6、3、4或9的HEK293T细胞相结合的的滴定。

muMAB 36A显示与人CLDN6强结合，而几乎不与人CLDN9相结合。抗体不与人CLDN3或4相互作用。

图5

抗CLDN6鼠单克隆抗体muMAB 5F2D2、27A和36A的相对亲和力。

muMAB 5F2D2和27A表现的EC50值为350～450ng/ml并且在低浓度下达到饱和结合，而muMAB 36A没有显示饱和结合，甚至在最高浓度下也是如此。

图6

抗CLDN6鼠单克隆抗体muMAB 5F2D2的补体依赖性细胞毒作用(CDC)活性。

muMAB 5F2D2显示出剂量依赖的CDC活性。

图7

抗CLDN6鼠单克隆抗体muMAB 27A和36A的补体依赖性细胞毒作用(CDC)活性。

muMAB 27A表现出剂量依赖的CDC活性，而muMAB 36A不能体外诱导CDC。

图8

嵌合抗CLDN6抗体chimAB 5F2D2对内源性表达CLDN6之NEC8和NEC8 LVTS2 54(CLDN6敲低)的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的诱导。

嵌合抗CLDN6抗体chimAB 5F2D2以剂量依赖的方式诱导对具有两个不同供体之效应细胞的NEC8细胞的ADCC。使用chimAB 5F2D2诱导对NEC8 LVTS2 54(CLDN6敲低)的ADCC的效率强烈降低。

图9

早期治疗异种移植物模型中muMAB 5F2D2的治疗作用。

在植入了稳定表达人CLDN6的HEK293细胞的小鼠中，muMAB 5F2D2显示特异和强肿瘤生长抑制。

图10

早期治疗异种移植物模型中muMAB 5F2D2的治疗作用。

在Kruskal-Wallis试验中用muMAB 5F2D2治疗后第28天(及其后)肿瘤体积显著地减小。

图11

早期治疗异种移植物模型中muMAB 5F2D2的治疗作用。

用单克隆鼠抗CLDN6抗体muMAB 5F2D2治疗的小鼠相对于PBS对照组显示了延长的存活。

图12

早期治疗异种移植物模型中muMAB 27A的治疗作用。

在植入了稳定表达人CLDN6的HEK293细胞的小鼠中，muMAB 27A显示特异和强肿瘤生长抑制。

图13

早期治疗异种移植物模型中muMAB 36A的治疗作用。

在植入了稳定表达人CLDN6的HEK293细胞的小鼠中，muMAB 36A显示特异并且强肿瘤生长抑制。

图14

早期治疗异种移植物模型中muMAB 27A和36A的治疗作用。

用单克隆鼠抗CLDN6抗体muMAB 27A和36A治疗的小鼠显示了延长的存活。

图15

在NEC8细胞中人CLDN3、4、6和9表达的免疫印迹分析。

睾丸生殖细胞肿瘤细胞系NEC8仅显示了CLDN6的表达(A)，而分别显示没有表达CLDN3、4或9(B)。

图16

使用流式细胞术分析在NEC8细胞上的CLDN6表面表达。

CLDN6在NEC8细胞上表达。

图17

在使用植入肿瘤细胞系NEC8之小鼠的早期治疗异种移植物模型中muMAB 5F2D2的治疗作用。

与盐水对照组相比，在植入内源性表达人CLDN6之NEC8细胞的小鼠中，muMAB5F2D2显示出特异和强肿瘤生长抑制。

图18

在使用植入肿瘤细胞系NEC8之小鼠的早期治疗异种移植物模型中muMAB 5F2D2的治疗作用。

Kruskal-Wallis试验显示在用muMAB 5F2D2治疗后第21和42天肿瘤体积减小。

具体实施方式

实施例

本文中描述或以本身已知的和例如在Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.中所描述的方式实施本文中使用的技术和方法。除非具体指明，根据制造商的信息实施所有方法(包括试剂盒和试剂的使用)。

实施例1：材料和方法

A.生成抗CLDN6的鼠抗体

a.生成编码全长CLDN6和CLDN6片段的表达载体

通过化学合成(GENEART AG，Germany)制备编码全长CLDN6(SEQ ID NO：2)的非天然的、密码子优化的DNA序列(SEQ ID NO：10)并将其克隆到pcDNA3.1/myc-His载体(Invitrogen，USA)中以产生载体p3953。插入终止密码子使得CLDN6蛋白的表达不与载体所编码的myc-Hjs标签融合。使用市售的抗CLDN6抗体(ARP，01-8865；R&D Systems，MAB3656)，通过Western印迹、流式细胞术和免疫荧光分析测试CLDN6的表达。

此外，制备密码子优化的DNA序列(SEQ ID NO：11)并将其克隆到pcDNA3.1/myc-His载体中以产生载体p3974，所述DNA序列编码与源自N-末端Ig κ前导序列的信号肽融合的CLDN6(SEQ ID NO：5)的推定的细胞外结构域2(extracellular domain 2，EC2)片段，其后面有4个额外的氨基酸以确保正确的信号肽切割位点(SEQ ID NO：12)。免疫之前，使用市售的抗myc抗体(Cell Signaling，MAB 2276)，通过免疫荧光显微术在瞬时转染的且多聚甲醛(PFA)固定的CHO-K1细胞中确证EC2片段的表达。

b.生成稳定表达CLDN6的细胞系

使用载体p3953，通过标准技术生成稳定表达CLDN6的HEK293和P3X63Ag8U.1细胞系。

c.免疫接种

MuMAB 5F2D2：通过在第0、16和36天腹膜内注射，用25μg p3974质粒DNA以及4μlPEI-甘露糖(PEI-Man；in vivo-jetPEI^TM-Man，来自PolyPlus Transfection)(含有5％葡萄糖的H₂O中的150mM PEI-Man)一起免疫接种Balb/c小鼠。在第48和62天时，通过腹膜内注射2×10⁷个转染了p3953载体以稳定表达CLDN6的P3X63Ag8U.1骨髓瘤细胞免疫接种小鼠。在注射之前，以3000拉德(rad)辐照第62天所施用的细胞。

MuMAB 27A：在第0和13天时，通过腹膜内注射2×10⁷个转染了p3953载体以稳定表达CLDN6的P3X63Ag8U.1骨髓瘤细胞免疫接种Balb/c小鼠。在第21天，通过腹膜内注射2×10⁷个以p3953载体稳定转染的HEK293细胞加强具有肿瘤的小鼠。3天后，处死小鼠并制备脾细胞。通过静脉注射，将5×10⁷个脾细胞移植至另一只Balb/c小鼠中。在第35、49、67和104天，通过腹腔内注射2×10⁷个以p3953载体以及经HPLC纯化的硫代磷酸酯修饰的CpG寡脱氧核苷酸(PTO-CpG-ODN)(50μg；5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT；Eurofins MWG Operon，Germany)一起稳定转染的P3X63Ag8U.1骨髓瘤细胞免疫接种移植的小鼠。施用前，细胞用丝裂霉素C(5μg/ml，Sigma-Aldrich，M4287)处理。

MuMAB 36A：通过在第0、16和36天腹膜内注射，用25μg p3974质粒DNA以及4μlPEI-甘露糖(PEI-Man；in vivo-jetPEI^TM-Man，来自PolyPlus Transfection)(含有5％葡萄糖的H₂O中的150mM PEI-Man)一起免疫接种C57BL/6小鼠。在第55、69和85天，通过腹膜内注射2×10⁷转染了p3953载体以稳定表达CLDN6的P3X63Ag8U.1骨髓瘤细胞免疫接种小鼠。在第85天，与经HPLC纯化的PTO-CpG-ODN(PBS中的50μg；5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT；EurofinsMWG Operon，Germany)一起施用细胞。

通过使用以编码CLDN6的核酸和GFP共转染的CHO-K1细胞的免疫荧光显微镜术监测小鼠血清中抗CLDN6的抗体的存在。为此，转染后24小时，PFA固定的或非固定的细胞与来自免疫的小鼠的1∶100稀释的血清在室温(RT)下孵育45分钟。清洗细胞，与Alexa555标记的抗鼠Ig抗体(Molecular Probes)孵育，并进行荧光显微镜分析。

为生成单抗，在进行脾切除术之前4天，通过腹膜内注射2×10⁷个以p3953载体稳定转染的HEK293细胞加强具有可检出的抗CLDN6免疫应答的小鼠。

d.生成产生抗CLDN6鼠单克隆抗体的杂交瘤

使用PEG 1500(Roche，CRL 10783641001)，将从经免疫小鼠中分离的6×10⁷个脾细胞与3×10⁷个小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653(ATCC，CRL 1580)融合。在平底微量滴定板中以约5×10⁴个细胞/孔接种细胞，在含有10％经热灭活的胎牛血清、1％杂交瘤融合和克隆添加剂(hybridoma fusion and cloning supplement，HFCS，Roche，CRL 11363735)、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、4.5％葡萄糖、0.1mM 2-巯基乙醇、1×青霉素/链霉素以及1×HAT添加剂(Invitrogen，CRL 21060)的PRMI选择培养基中培养约2周。10至14天之后，通过流式细胞术筛选每个孔的抗CLDN6单克隆抗体。通过有限稀释对分泌抗体的杂交瘤进行亚克隆，并再次测试抗CLDN6的单克隆抗体。培养稳定的亚克隆以在组织培养基中生成少量用于表征的抗体。从来自保持母体细胞之反应性(通过流式细胞术测试)的每个杂交瘤中选择至少一个克隆。为每个克隆生成9小瓶细胞的库并将其储存于液氮中。

B.流式细胞术

为测试单克隆抗体与CLDN6及其他密蛋白的结合，用相应的编码密蛋白的质粒瞬时转染HEK293T细胞，并通过流式细胞术分析表达。为了区分转染的和非转染的细胞，用荧光标记物作为报道基因共转染HEK293T细胞。转染24小时之后，用0.05％胰蛋白酶/EDTA收获细胞，用FACS缓冲液(含有2％FCS和0.1％叠氮化钠的PBS)清洗，以2×10⁶个细胞/ml的浓度悬于FACS缓冲液中。在4℃下，将100μl细胞悬液与指定浓度的合适抗体一起孵育30分钟。市售的小鼠抗密蛋白抗体抗CLDN6(R&D，CRL MAB3656)、抗CLDN3(R&D，MAB4620)和抗CLDN4(R&D，MAB4219)充当阳性对照，而小鼠IgG2b(Sigma，CRL M8894)充当同种型对照。用FACS缓冲液清洗细胞三次，并将其与别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗小鼠IgG1+2a+2b+3a特异性的二抗(Dianova，CRL 115-135-164)一起孵育30分钟。清洗细胞两次，重悬于FACS缓冲液中。使用BD FACSArray通过流式细胞术分析结合。以荧光标志物的表达为横轴，相对于纵轴上的抗体结合进行作图。

单克隆抗体与内源性表达CLDN6的细胞系的结合以类似的方式进行分析。

C.免疫印迹分析

通过免疫印迹对于CLDN6、3、4和9的表达分析NEC8细胞。瞬时转染了CLDN6、3、4、9的HEK293T细胞作为阳性对照并且瞬时转染了模拟质粒的HEK293T细胞作为阴性对照。在Laemmli缓冲液中收集细胞，裂解并进行SDS-PAGE。将凝胶进行印迹并且分别用抗-CLDN3(Invitrogen，34-1700)、抗-CLDN4(Invitrogen，32-9400)、抗-CDLN6(ARP，01-8865)或抗-CLDN9(Santa Cruz，sc-17672)抗体染色。用过氧化物酶标记的二抗孵育之后，印迹用ECL试剂显色并且使用LAS-3000显像仪(Fuji)进行可视化。

D.CDC分析

向与抗CLDN6抗体一起孵育的靶细胞中添加人补体之后，通过测量未裂解细胞中细胞内ATP的含量测定补体依赖性的细胞毒作用(CDC)。作为非常灵敏的分析方法，使用萤光素酶的生物发光反应测量ATP。

用0.05％胰蛋白酶/EDTA收获稳定转染CLDN6的CHO-K1细胞(CHO-K1-CLDN6)，用X-Vivo 15培养基(Lonza，BE04-418Q)清洗两次，以1×10⁷个细胞/ml的浓度悬于X-Vivo 15培养基中。将250μl的细胞悬液转移到0.4cm电穿孔杯(electroporation cuvette)中并将其与7μg体外转录的编码萤光素酶的RNA(萤光素酶IVT RNA)混合。使用GenePulser Xcell(Bio Rad)以200V和300μF电穿孔细胞。电穿孔之后，将细胞悬于2.4ml预热的含有10％(v/v)FCS、1％(v/v)青霉素/链霉素和1.5mg/ml G418的具有GlutaMaX-I的D-MEM/F12(1∶1)培养基(Invitrogen，31331-093)中。将50μl/孔细胞悬液接种进入白色96孔PP板中，在37℃和7.5％CO₂下孵育。电穿孔之后24小时，以指定浓度向细胞中添加50μl60％RPMI(含有20mMHEPES)和40％人血清(获自6位健康供体的混合血清)中的单克隆鼠抗CLDN6抗体。向总裂解对照中添加每孔10μl PBS中的8％(v/v)Triton X-100，而向最大活细胞对照和向实际样品中添加每孔10μl的PBS。在37℃和7.5％CO₂下孵育80分钟之后，每孔添加50μl荧光素混合物(ddH₂O中的3.84mg/ml D-荧光素、0.64U/ml ATP酶和160mM HEPES)。在RT下，将板在黑暗中孵育45分钟。使用发光计(Infinite M200，TECAN)测量生物发光。以积分数字相对光单位(relative light unit，RLU)给出结果。

按以下计算比裂解(specific lysis)：

最大活细胞：10μl PBS，没有抗体

总裂解：10μl PBS中的8％(v/v)Triton X-100，没有抗体

E.ADCC分析

在基于萤光素酶的测定系统中对于其能够诱导对内源性表达CLDN6之NEC8细胞和具有CLDN6敲低的NEC8细胞(NEC8 LVTS2 54)的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)进行嵌合化单克隆抗CLDN6抗体分析。

用0.05％胰蛋白酶/EDTA收获NEC8或NEC8 LVTS2 54靶细胞，用X-Vivo 15培养基清洗两次，然后使用Gene Pulser Xcell(Bio Rad)用7μg萤光素酶IVT RNA(200V，400μF)电穿孔2.5×10⁶个细胞。电穿孔之后，将细胞悬于2.4ml预热的含有10％FCS的RPMI培养基中。将50μl/孔细胞悬液(5×10⁴个细胞)接种进入白色96孔PP板中，在37℃和5％CO₂下孵育6小时。使用Ficoll(Ficoll-Paque TM Plus，GE Healthcare，17-1440-03)从健康供体血液样品中富集人外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC悬浮于含有5％热灭活人血清的X-Vivo 15(Lonza，BE04-418Q)中，在37℃和5％CO₂下孵育。孵育2～4小时之后，在自然杀伤(NK)细胞中富集上清液。以指定浓度向NEC8细胞中添加25μl在PBS中稀释的抗体。以20∶1的比率(效应细胞比靶细胞)添加富集的NK细胞，并且将样品在37℃和5％CO₂下孵育24小时。如在“CDC”中描述的，通过测量具有萤光素酶的细胞内ATP的含量来测量细胞裂解。

F.早期治疗测定

对于早期抗体治疗，将200μl PBS中的5×10⁶个HEK293-CLDN6细胞(稳定表达CLDN6的HEK293细胞)皮下接种进入无胸腺的Nude-Foxnl^nu小鼠的胁部。HEK293-模拟细胞用作阴性对照。每个实验组由8只6～8周龄的雌性小鼠组成。(在分别植入HEK293-CLDN6细胞或HEK293-模拟细胞的小鼠的情况下，盐水对照组由10只小鼠组成。)接种之后3天，每周两次交替静脉内和腹膜内注射应用200μg纯化的鼠单克隆抗体muMAB 5F2D2、27A和36A 46天。以PBS治疗的实验组充当阴性对照。每两周监测一次肿瘤体积(TV＝(长度×宽度²)/2)。以mm³表示TV，允许构建随时间的肿瘤生长曲线。当肿瘤达到大于1500mm³的体积时，杀死小鼠。

实施例2：根据本发明所获得的抗体与密蛋白的结合

使用瞬时表达相应的人密蛋白的HEK293T细胞，通过流式细胞术分析鼠单克隆抗体muMAB 5F2D2、27A和36A与人CLDN6、3、4和9的结合。与荧光标志物共转染HEK293T以区分未转染的(Q3群)和转染的(Q4群)细胞。所使用的抗体浓度是饱和结合CLDN6的浓度(25μg/ml)。用抗人密蛋白-6(R&D Systems，MAB3656)、人密蛋白-3(R&D Systems，MAB4620)和人密蛋白-4(R&D Systems，MAB 4219)的市售单克隆抗体确证人CLDN6、3、4和9的表达。

muMAB 5F2D2、27A和36A抗体显示与表达CLDN6的细胞强结合，而他们不与表达CLDN3或CLDN4的细胞相结合，参见图1。

muMAB 5F2D2、27A和36A抗体在不同浓度(0.01、0.1、1、10、100、1000、10000和25000ng/ml)下与瞬时表达人CLDN6、CLDN3、CLDN4或CLDN9的HEK293T细胞孵育。通过流式细胞术检测结合；参见图2、3和4。y轴表示通过抗体结合的细胞的百分比(Q2群)，而x轴表示所使用的抗体的浓度。

muMAB 5F2D2显示与人CLDN6的强结合和与人CLDN9的弱结合。muMAB 27A显示与人CLDN6的强结合和与人CLDN9的弱结合。muMAB 36A显示与人CLDN6的强结合和几乎不与人CLDN9结合。没有抗体与CLDN3或4相互作用。

为测定相对亲和力，通过流式细胞术分析抗CLDN6抗体与HEK293细胞表面上稳定表达的人CLDN6的结合。在饱和结合实验中，将抗体的浓度相对于FACS信号(荧光强度的中位值)作图；参见图5。通过非线性回归计算EC50(在平衡时与一半的结合位点结合的抗体浓度)。结果显示抗体具有特有的结合方式。muMAB 5F2D2和27A表现出非常低的EC50值(EC50350～450ng/ml)，并且在低浓度达到饱和结合，而muMAB 36A没有显示饱和结合，甚至在最高浓度下也是如此。

实施例3：根据本发明所获得的抗体的效应子功能

使用检测未裂解细胞中内源性ATP的萤光素酶依赖的测定分析抗CLDN6抗体的CDC活性。为此，用不同浓度的muMAB 5F2D2、27A或36A或者作为内部对照(internal control)的抗CLDN6(R&D Systems，MAB3656)处理稳定表达人CLDN6的CHO-K1细胞。

muMAB 5F2D2以剂量依赖的方式表现出CDC活性；参见图6。muMAB 27A表现剂量依赖性CDC活性，而muMAB 36A不能体外诱导CDC；参见图7。

测定嵌合抗CLDN6抗体chimAB 5F2D2诱导对内源性表达CLDN6之NEC8和NEC8LVTS254(CLDN6敲低)细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的能力；参见图8。嵌合抗CLDN6抗体chimAB 5F2D2和阳性对照赫塞汀(Herceptin)以剂量依赖的方式诱导对具有两个不同供体之效应细胞的NEC8细胞的ADCC。与NEC8亲本细胞相比，诱导对NEC8 LVTS2 54细胞(CLDN6敲低)的ADCC的效率随chimAB 5F2D2剧烈减少，证明chimAB 5F2D2的靶标特异性。

实施例4：根据本发明所获得的抗体的治疗效果

在早期治疗异种移植物模型中测试muMAB 5F2D2的治疗效果，其中将稳定转染的HEK293-CLDN6和HEK293-模拟异种移植物植入无胸腺的Nude-Foxnl^nu小鼠中。

muMAB 5F2D2在植入稳定表达人CLDN6的HEK293细胞之小鼠中显示特异和强肿瘤生长抑制；参见图9。muMAB 5F2D2对植入模拟对照细胞的小鼠中的肿瘤生长没有影响。分开的小鼠盐水对照组以应用抗体等同的注射体积接受作为媒介物的PBS。

另外，在用muMAB 5F2D2治疗之后的第28天(及其后)，Kruskal-Wallis测试显示肿瘤体积显著减小；参见图10。此外，用单克隆鼠抗CLDN6抗体muMAB 5F2D2治疗的小鼠与PBS对照组相比显示延长的存活。在植入HEK293-模拟细胞的小鼠(作为对照组)中没有观察到抗体依赖性效果；参见图11。

类似地，在早期治疗异种移植物模型中，muMAB 27A和muMAB 36A的测试在植入稳定表达人CLDN6的HEK293细胞之小鼠中显示特异和强肿瘤生长抑制；参见图12和13。此外，muMAB 27A和36A在延长植入的小鼠的存活中是有效的；参见图14。

实施例5：在生殖细胞肿瘤中CLDN6作为癌症靶标

在NEC8细胞中通过免疫印迹分析测试CLDN3、4、6和9表达。睾丸生殖细胞肿瘤细胞系NEC8仅显示了CLDN6的表达(A)，但是没有显示分别表达CLDN3、4或9(B)；参见图15。使用瞬时转染了编码对应人密蛋白的表达载体的HEK293细胞通过Western印迹测试所使用的抗CLDN3、4或9抗体的特异性。

使用流式细胞术分析NEC8细胞上的CLDN6表面表达。市售抗CLDN6抗体(R&DSystems，MAB3656)检测NEC8细胞上CLDN6的表达；参见图16。将鼠IgG2b(Sigma，CRL M8894)用作同种型对照。

在早期治疗异种移植模型中使用植入肿瘤细胞系NEC8的小鼠测试muMAB 5F2D2的治疗效果。与盐水对照组相比，muMAB 5F2D2在植入内源性表达人CLDN6之NEC8细胞的小鼠中显示出特异和强肿瘤生长抑制；参见图17。在用muMAB 5F2D2治疗后的第21和42天，Kruskal-Wallis测试显示肿瘤体积减小；参见图18。

保藏微生物或其他生物材料的证明

表PcT/Ro/134(1998年7月；2004年1月重印)

生物材料的附加页

另外保藏物的识别

1)保藏机构的名称和地址：

DSMZ-德国微生物菌种和细胞培养物保藏中心

Inhoffenstr.7B

38124 Brauschweig

DE

针对上述保藏物的额外指示：

-小鼠(Mus musculus)骨髓瘤P3X63Ag8.653与小鼠(Mus musculus)脾细胞融合

-分泌抗人CLDN6抗体的杂交瘤

2)保藏人：

所有上述保藏物均由以下单位制备：

加尼梅德药物公司

Freiligrathstrasse 12

55131 Mainz

DE

以下部分对应于母案申请中的权利要求书：

1.体内抑制肿瘤生长的抗体，其中所述肿瘤的细胞表达密蛋白6(CLDN6)，并且其中所述抗体能够与CLDN6相结合。

2.项1的抗体，其中所述抗体通过结合CLDN6来抑制所述肿瘤的生长。

3.项1或2的抗体，其中所述抗体是CLDN6特异性的。

4.项1至3中任一项的抗体，其中所述抗体是单克隆、嵌合、人或人源化抗体、或者是抗体片段或合成抗体。

5.项1至4中任一项的抗体，其中所述肿瘤选自：卵巢癌症，特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤；肺部癌症，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌；胃部癌症；乳癌；肝部癌症；胰腺癌症；皮肤癌症，特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌；恶性黑色素瘤；头颈部癌症，特别是恶性多形性腺瘤；肉瘤，特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤；胆管癌症；膀胱癌症，特别是移行细胞癌和乳头状癌；肾部癌症，特别是肾细胞癌，包括透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌；结肠癌症；小肠癌症，包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌；睾丸胚胎癌；胎盘绒毛膜癌；子宫颈癌症；睾丸癌症，特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌症；子宫癌症；生殖细胞肿瘤，特别是畸胎癌或胚胎癌，优选地睾丸的生殖细胞肿瘤；及其转移形式。

6.抗体，其选自以下：

(i)由以如下登录号保藏的克隆产生的或可从其获得的抗体：DSM ACC3059(GT512muMAB 36A)、DSM ACC3058(GT512muMAB 27A)或DSM ACC3057(GT512muMAB 5F2D2)，

(ii)(i)中所述抗体的嵌合化或人源化形式的抗体，

(iii)具有(i)中所述抗体的特异性的抗体，和

(iv)包含(i)中所述抗体的抗原结合部分或抗原结合位点的抗体，

其中，(i)中所述抗体的抗原结合部分或抗原结合位点优选地包含(i)中所述抗体的可变区。

7.项1至6中任一项的抗体，其与至少一个治疗效应子部分相连接，其中所述治疗效应子部分优选地是放射性标记、细胞毒素、细胞毒性酶。

8.能够产生项1至7中任一项的抗体的杂交瘤。

9.杂交瘤，其以登录号DSM ACC3059(GT512muMAB 36A)，DSMACC3058(GT512muMAB27A)或DSM ACC3057(GT512muMAB 5F2D2)保藏。

10.包含项1至7中任一项的抗体的药物组合物，其中所述药物组合物优选地为治疗性或预防性肿瘤疫苗的形式。

11.项10的药物组合物，其用于治疗或预防肿瘤疾病。

12.治疗患有肿瘤疾病或有肿瘤疾病发生风险之患者的方法，其中所述肿瘤的细胞表达密蛋白6(CLDN6)，并且其中所述方法包括施用能够结合CLDN6的抗体。

13.项12的方法，其中所述抗体在施用至所述患者时通过结合CLDN6来抑制所述患者中所述肿瘤的生长。

14.项12或13的方法，其中所述抗体连接至少一个治疗效应子部分，其中所述治疗效应子部分优选地是放射性标记、细胞毒素或细胞毒性酶。

15.项12至14中任一项的方法，其中所述抗体是CLDN6特异性的。

16.项12至15中任一项的方法，其中所述抗体是单克隆、嵌合、人或人源化抗体、或者是抗体片段或合成抗体。

17.项12至16中任一项的方法，其中所述方法包括施用项10或11的药物组合物。

18.项11的药物组合物或项12至17中任一项的方法，其中所述肿瘤疾病选自：卵巢癌症，特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤；肺部癌症，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌；胃部癌症；乳癌；肝部癌症；胰腺癌症；皮肤癌症，特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌；恶性黑色素瘤；头颈部癌症，特别是恶性多形性腺瘤；肉瘤，特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤；胆管癌症；膀胱癌症，特别是移行细胞癌和乳头状癌；肾部癌症，特别是肾细胞癌，包括透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌；结肠癌症；小肠癌症，包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌；睾丸胚胎癌；胎盘绒毛膜癌；子宫颈癌症；睾丸癌症，特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌症；子宫癌症；生殖细胞肿瘤疾病，特别是畸胎癌或胚胎癌，优选地睾丸的生殖细胞肿瘤疾病；及其转移形式。

19.项1至7中任一项的抗体、项10、11和18中任一项的药物组合物或项12至18中任一项的方法，其中CLDN6包含由包含序列表SEQ IDNO：1之核酸序列或所述核酸序列之变体的核酸所编码的氨基酸序列。

20.项1至7和19中任一项的抗体、项10、11、18和19中任一项的药物组合物或项12至19中任一项的方法，其中CLDN6包含序列表SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。

Claims (26)

1.与密蛋白6(CLDN6)结合并在结合CLDN6后诱导对肿瘤生长的体内抑制的抗体，其中所述抗体不与表达CLDN3或CLDN4的细胞可检测地结合，

所述抗体包含由以如下登录号保藏的克隆产生的或可从其获得的抗体的抗原结合部分或抗原结合位点：DSMACC3059、DSMACC3058或DSMACC3057，

其中所述抗体未连接至治疗效应子部分，并且其中CLDN6由序列表中SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6的氨基酸序列所组成或者由序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列所编码的氨基酸序列所组成。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗原结合部分或抗原结合位点包含由以如下登录号保藏的克隆产生的或可从其获得的抗体的可变区：DSMACC3059、DSMACC3058或DSMACC3057。

3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是CLDN6特异性的。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述肿瘤选自：卵巢癌症；肺部癌症；胃部癌症；乳癌；肝部癌症；胰腺癌症；皮肤癌症；头颈部癌症；肉瘤；胆管癌症；膀胱癌症；肾部癌症；结肠癌症；小肠癌症；胎盘绒毛膜癌；睾丸癌症；和子宫癌症；及其转移形式。

5.根据权利要求4所述的抗体，其中睾丸癌症是睾丸胚胎癌，并且其中皮肤癌症是恶性黑色素瘤，并且其中子宫癌症是子宫颈癌症。

6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述肿瘤是生殖细胞肿瘤。

7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述生殖细胞肿瘤是畸胎癌或胚胎癌。

8.根据权利要求6所述的抗体，其中所述生殖细胞肿瘤是睾丸的生殖细胞肿瘤。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其用于制备药物。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其用于治疗或预防肿瘤疾病。

11.能够表达权利要求1至8中任一项所述之抗体的重组真核宿主细胞。

12.根据权利要求11所述的重组真核宿主细胞，其选自：CHO细胞、NS/0细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、植物细胞和真菌细胞。

13.根据权利要求12所述的重组真核宿主细胞，其中所述真菌细胞是酵母细胞。

14.包含根据权利要求1至8中任一项所述之抗体和至少一个治疗效应子部分的缀合物，其中所述抗体与所述治疗效应子部分相连接。

15.根据权利要求14所述的缀合物，其中所述治疗效应子部分是放射性标记、细胞毒素或细胞毒性酶。

16.根据权利要求14或15所述的缀合物，其中所述抗体由以如下登录号保藏的克隆产生或可从其获得：DSM ACC3059、DSM ACC3058或DSM ACC3057。

17.包含根据权利要求1至8中任一项所述之抗体或者根据权利要求14至16中任一项所述之缀合物的药物组合物。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其为治疗性或预防性肿瘤疫苗的形式。

19.根据权利要求17或18所述的药物组合物，其用于治疗或预防肿瘤疾病。

20.根据权利要求1至8中任一项所述之抗体或者根据权利要求14至16中任一项所述之缀合物在制备用于治疗患有肿瘤疾病或有肿瘤疾病发生风险之患者药物中的用途，其中所述肿瘤的细胞表达密蛋白6(CLDN6)。

21.根据权利要求20的用途，其中所述抗体或缀合物在施用至所述患者时通过结合CLDN6来抑制所述患者中所述肿瘤的生长。

22.根据权利要求20所述的用途，其中所述肿瘤选自：卵巢癌症；肺部癌症；胃部癌症；乳癌；肝部癌症；胰腺癌症；皮肤癌症；头颈部癌症；肉瘤；胆管癌症；膀胱癌症；肾部癌症；结肠癌症；小肠癌症；胎盘绒毛膜癌；睾丸癌症；和子宫癌症；及其转移形式。

23.根据权利要求22所述的用途，其中睾丸癌症是睾丸胚胎癌，并且其中皮肤癌症是恶性黑色素瘤，并且其中子宫癌症是子宫颈癌症。

24.根据权利要求20所述的用途，其中所述肿瘤是生殖细胞肿瘤。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述生殖细胞肿瘤是畸胎癌或胚胎癌。

26.根据权利要求24或25所述的用途，其中所述生殖细胞肿瘤是睾丸的生殖细胞肿瘤。

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