CN105813650A - 新型抗-密蛋白抗体和使用方法 - Google Patents

新型抗-密蛋白抗体和使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供新型抗?CLDN抗体和抗体药物缀合物(ADC)，包括其衍生物，和使用其治疗增殖性病症的方法。

Description

新型抗-密蛋白抗体和使用方法
交叉引用的申请
本申请要求于2013年11月6日提交的美国临时申请号61/900,916的权益，所述美国临时申请以其整体通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并且在此以其整体通过引用并入。2014年11月5日创建的所述ASCII副本被命名为sc2701pct_S69697_1040WO_SEQL_110514.txt，并且大小为229,316字节。
发明领域
本申请总体涉及新型抗-CLDN抗体或其免疫反应性片段和包括抗体药物缀合物、包含其的组合物，其用于治疗、诊断或预防癌症和其任何复发或转移。本发明的所选实施方案提供此类抗-CLDN抗体或抗体药物缀合物用于治疗癌症的用途，其包括降低致瘤性细胞频率。
发明背景
干细胞和祖细胞的分化和增殖是正常的进行过程，其一致作用以支持器官形成、细胞修复和细胞替代期间的组织生长。紧密调节系统以确保基于生物的需要而仅产生适当的信号。细胞增殖和分化通常仅在对于替换损伤的或正在死亡的细胞或对于生长必要时发生。然而，这些过程的破坏可以通过许多因素触发，所述因素包括，各种信号传导化学物的不足或过多，改变的微环境的存在，遗传突变或其组合。正常细胞增殖和/或分化的破坏可以导致各种病症，包括增殖性疾病，诸如癌症。
用于癌症的常规治疗性治疗包括化疗、放疗和免疫治疗。通常这些治疗无效且外科手术切除不可提供可行的临床替代手段。现有护理标准的限制在患者经历第一线治疗且随后复发的那些情况下尤其明显。在此类情况下，难治性肿瘤频繁出现，其通常为侵袭性和不可治愈的。许多实体瘤的总体生存率经多年主要维持不变，这至少部分由于现有防止复发、肿瘤复发和转移的疗法的失败。因此，仍然非常需求针对增殖性病症开发更靶向和有效的疗法。本发明解决了该需求。
发明概述
本发明广泛涉及结合至密蛋白(CLDN)蛋白家族的至少一个成员的抗体和抗体药物缀合物(ADC)。
在所选实施方案中，本发明包含结合至表达CLDN家族的至少一种蛋白的癌症干细胞的抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合至CLND6或特异性结合至CLDN6和CLDN9。在另一个实施方案中，本发明的抗体以基本上相同的表观结合亲和力结合至CLDN6和CLDN9。本发明的任何抗-CLDN抗体都可以是内化抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体结合至CLDN家族的至少一个成员且与包含以下的抗体竞争结合：SEQ ID NO:21的轻链可变区(VL)和SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)；或SEQ ID NO:25的VL和SEQ ID NO:27的VH；或SEQ ID NO:29的VL和SEQ ID NO:31的VH；或SEQID NO:33的VL和SEQ ID NO:35的VH；或SEQ ID NO:37的VL和SEQ ID NO:39的VH；或SEQ IDNO:41的VL和SEQ ID NO:43的VH；或SEQ ID NO:45的VL和SEQ ID NO:47的VH；或SEQ ID NO:49的VL和SEQ ID NO:51的VH；或SEQ ID NO:53的VL和SEQ ID NO:55的VH；或SEQ ID NO:57的VL和SEQ ID NO:59的VH。
在另一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合至CLND6；或特异性结合至CLDN6和CLDN9且与包含以下的抗体竞争结合：SEQ ID NO:21的轻链可变区(VL)和SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)；或SEQ ID NO:25的VL和SEQ ID NO:27的VH；或SEQ ID NO:29的VL和SEQID NO:31的VH；或SEQ ID NO:33的VL和SEQ ID NO:35的VH；或SEQ ID NO:37的VL和SEQ IDNO:39的VH；或SEQ ID NO:41的VL和SEQ ID NO:43的VH；或SEQ ID NO:45的VL和SEQ ID NO:47的VH；或SEQ ID NO:49的VL和SEQ ID NO:51的VH；或SEQ ID NO:53的VL和SEQ ID NO:55的VH；或SEQ ID NO:57的VL和SEQ ID NO:59的VH。
本文公开的任何抗-CLDN抗体可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或重组的抗体或其片段。
在一个具体实施方案中，本发明包含人源化抗体，所述人源化抗体结合至CLDN家族的至少一种蛋白且与包含以下的抗体竞争结合：如SEQ ID NO:61中所述的三个可变轻链CDR(CDRL)；和如SEQ ID NO:63中所述的三个可变重链CDR(CDRH)；或如SEQ ID NO:65中所述的三个CDRL和如SEQ ID NO:67中所述的三个CDRH；或SEQ ID NO:69中所述的三个CDRL和如SEQ ID NO:71中所述的三个CDRH；如SEQ ID NO:73中所述的三个CDRL和如SEQ ID NO:75中所述的三个CDRH。
在一个进一步实施方案中，本发明包含人源化抗体，所述人源化抗体结合至CLDN家族的至少一种蛋白且与包含VH和VL的抗体竞争结合，其中VL具有包含SEQ ID NO:151的CDRL1、SEQ ID NO:152的CDRL2和SEQ ID NO:153的CDRL3的三个CDRL；或VL具有包含SEQ IDNO:157的CDRL1、SEQ ID NO:158的CDRL2和SEQ ID NO:159的CDRL3的三个CDRL；或VL具有包含SEQ ID NO:163的CDRL1、SEQ ID NO:164的CDRL2和SEQ ID NO:165的CDRL3的三个CDRL；或VL具有包含SEQ ID NO:169的CDRL1、SEQ ID NO:170的CDRL2和SEQ ID NO:171的CDRL3的三个CDRL。
在一个进一步实施方案中，本发明包含人源化抗体，所述人源化抗体结合至CLDN家族的至少一种蛋白且与包含VH和VL的抗体竞争结合，其中VH具有包含SEQ ID NO:154的CDRH1、SEQ ID NO:155的CDRH2和SEQ ID NO:156的CDRH3的三个CDR(CDRH)；或VH具有包含SEQ ID NO:160的CDRH1、SEQ ID NO:161的CDRH2和SEQ ID NO:162的CDRH3的三个CDRH；或VH具有包含SEQ ID NO:166的CDRH1、SEQ ID NO:167的CDRH2和SEQ ID NO:168的CDRH3的三个CDRH；或VH具有包含SEQ ID NO:172的CDRH1、SEQ ID NO:173的CDRH2和SEQ ID NO:174的CDRH3的三个CDRH。
在一个进一步实施方案中，本发明包含人源化抗体，所述人源化抗体结合至CLDN家族的至少一种蛋白且与以下抗体竞争结合：包含VL和VH的抗体，其中VL具有包含SEQ IDNO:151的CDRL1、SEQ ID NO:152的CDRL2和SEQ ID NO:153的CDRL3的三个CDRL且VH具有包含SEQ ID NO:154的CDRH1、SEQ ID NO:155的CDRH2和SEQ ID NO:156的CDRH3的三个CDRH；或包含VL和VH的抗体，其中VL具有包含SEQ ID NO:157的CDRL1、SEQ ID NO:158的CDRL2和SEQ ID NO:159的CDRL3的三个CDRL且VH具有包含SEQ ID NO:160的CDRH1、SEQ ID NO:161的CDRH2和SEQ ID NO:162的CDRH3的三个CDRH；或包含VL和VH的抗体，其中VL具有包含SEQID NO:163的CDRL1、SEQ ID NO:164的CDRL2和SEQ ID NO:165的CDRL3的三个CDRL且VH具有包含SEQ ID NO:166的CDRH1、SEQ ID NO:167的CDRH2和SEQ ID NO:168的CDRH3的三个CDRH；或包含VL和VH的抗体，其中VL具有包含SEQ ID NO:169的CDRL1、SEQ ID NO:170的CDRL2和SEQ ID NO:171的CDRL3的三个CDRL且VH具有包含SEQ ID NO:172的CDRH1、SEQ IDNO:173的CDRH2和SEQ ID NO:174的CDRH3的三个CDRH。
在一个实施方案中，本发明包含人源化抗体，所述人源化抗体结合至CLDN家族的至少一种蛋白，其包含如SEQ ID NO:114中所述的全长轻链和如SEQ ID NO:115中所述的全长重链；或如SEQ ID NO:116中所述的全长轻链和如SEQ ID NO:117中所述的全长重链；或如SEQ ID NO:118中所述的全长轻链和如SEQ ID NO:119中所述的全长重链；或如SEQ IDNO:120中所述的全长轻链和如SEQ ID NO:121中所述的全长重链。
在一个实施方案中，本发明包含含有本文公开的任何抗-CLDN抗体的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗体缀合至有效载荷。在另一个实施方案中，本发明包含含有ADC的药物组合物，其中所述ADC包含缀合至有效载荷的本发明的抗-CLDN抗体。
在另一个实施方案中，本发明包含编码本文公开的任何抗-CLDN抗体的抗体的核酸。在一个相关实施方案中，本发明包含含有编码本文公开的抗-CLDN抗体的一种或多种核酸的载体或包含所述载体的宿主细胞。
在一个优选实施方案中，本发明包含抗体药物缀合物(ADC)，其包含嵌合的、CDR移植的、人源化的或重组的人抗体或其片段，其结合至表达CLDN家族的至少一种蛋白的癌症干细胞，其中所述抗体缀合至细胞毒性剂。
在另一个实施方案中，本发明包含式Ab-[L-D]n的ADC，其中Ab是本文公开的抗-CLDN抗体中的任一种；L是任选的连接体；D是药物；且n是约1至约20的整数。
在一个实施方案中，本发明包含治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用包含ADC的药物组合物，其中所述ADC包含缀合至有效载荷的本发明的抗-CLDN抗体。
在一些实施方案中，本发明包含治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用包含抗-CLDN ADC的药物组合物，其中所述癌症选自卵巢癌，肺癌，例如肺腺癌，乳癌和胰腺癌。
在一个实施方案中，本发明包含治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用包含抗-CLDN ADC和至少一种额外的治疗性部分的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明包括减少肿瘤细胞群体中的癌症干细胞的方法，其中所述方法包括使包含癌症干细胞和除了癌症干细胞以外的肿瘤细胞的肿瘤细胞群体与抗-CLDN ADC接触；由此降低癌症干细胞的频率，例如，可以在体内或在体外进行此类接触。
在一个实施方案中，本发明包含将细胞毒素递送至细胞的方法，其包括使细胞与包含本文公开的任何抗-CLDN抗体的ADC接触。
附图简述
图1显示所选患者来源的异种移植(PDX)肿瘤中通过全转录组(SOLiD)测序测定的CDLN4、CLDN6和CLDN9的相对mRNA表达水平。肿瘤类型根据表4中列出的缩写表示；
图2A显示与非致瘤性(NTG；白色柱)细胞和匹配的正常组织(黑色柱)相比癌症干细胞(CSC；灰色柱)中的CLDN4、CLDN6和CLDN9的相对mRNA表达，如通过qRT-PCR测定；
图2B-2D显示qRT-PCR测定的PDX肿瘤中分别CLDN4、CLDN6和CLDN9的相对mRNA表达水平；
图2E-2G显示来自具有十八种不同肿瘤类型之一的患者的整个肿瘤样本(黑色点)或匹配的正常邻近组织(白色点)中如通过qRT-PCR测量的CLDN4(图2E)、CLDN6(图2F)或CLDN9(图2G)的mRNA表达的相对水平；
图3A和3B显示源自公共数据库的大量肿瘤和正常组织的CLDN6(图3A)和CLDN9(图3B)的相对mRNA表达；
图3C显示源自公共数据库的针对五种肿瘤类型的个别肿瘤样品的CLDN6(x-轴)相对于CLDN9(y-轴)的相对mRNA表达；
图3D显示图3C中显示的五种不同肿瘤类型的散点图的图心(质心)的图以及绘制的图心的最佳拟合回归线；
图4A是显示由23种人CLDN基因编码的30种CLDN蛋白之间的相似性的相对程度的树形图；
图4B显示CLDN4、CLDN6和CLDN9中的细胞外结构域(ECD)1或ECD2的氨基酸残基的百分比同一性的表格表示；
图4C显示包含CLDN4、CLDN6和CLDN9的人、大鼠、小鼠和食蟹猴直系同源物的集合的16种蛋白间的ECD1和ECD2环中的氨基酸残基的百分比同一性的表格表示；
图5A-5H提供小鼠和人源化抗-CLDN抗体的氨基酸和核酸序列。图5A和5B显示hSC27.22、hSC27.108和hSC27.204的示例性小鼠和人源化抗-CLDN抗体(SEQ ID NO:21-75，奇数)和变体的轻链(图5A)和重链(图5B)可变区氨基酸序列。图5C显示hSC27.22、hSC27.108和hSC27.204的此类示例性小鼠和人源化抗-CLDN抗体(SEQ ID NO:20-74，偶数)和变体的相同的轻链和重链可变区的核酸序列。图5D显示人源化抗体hSC27.1和hSC27.22、hSC27.22的十三种变体、hSC27.108的一种变体和hSC27.204的十五种变体的全长轻链和重链的氨基酸序列。图5E-5H显示人源化抗-CLDN抗体hSC27.1(图5E)、hSC27.22(图5F)、hSC27.108(图5G)和hSC27.204(图5H)的轻链和重链可变区的注释的氨基酸序列(根据Kabat等人编号)，其中使用Kabat、Chothia、ABM和Contact方法推导CDR；
图6A显示如通过流式细胞术检测的抗-CLDN抗体SC27.1和SC27.22结合过表达人CLDN4、CLDN6和CLDN9的HEK-293T细胞的能力，其中结果显示为平均荧光强度的变化(ΔMFI)和直方图，其中黑色实线指示与荧光减一(FMO)同种型对照(灰色填充)相比所示抗体与过表达所示CLDN蛋白的细胞的结合；
图6B显示如通过流式细胞术检测的抗-CLDN抗体结合过表达CLDN4、CLDN6和CLDN9的HEK-293T细胞的能力，其中结果显示为对于各抗体与各细胞系的结合的平均荧光强度(MFI)；
图6C显示示例性抗-CLDN抗体对于CLDN6和CLDN9的表观结合亲和力，如通过抗体的量相比于固定数目的表达目的抗原的细胞的滴定所测定；
图7显示与荧光减一(FMO)同种型对照(灰色填充)相比在源自肝、肺、卵巢和胰腺PDX肿瘤的细胞群体中的CLDN4、CLDN6和CLDN9蛋白的表达(黑色实线)；
图8A显示与非致瘤性(虚线)卵巢、胰腺和肺肿瘤细胞群体和FMO同种型对照(灰色填充)相比在人CSC中的CLDN4、CLDN6和CLDN9蛋白的表达(黑色实线)；
图8B显示用CLDN+(闭环)或CLDN-(开环)卵巢肿瘤细胞移植的小鼠中的肿瘤的生长，其中CLDN+肿瘤细胞表现出与CLDN-卵巢肿瘤细胞相比增强的致瘤性；
图9A和9B显示，抗-CLDN抗体SC27.1和SC27.22能够内化至过表达人CLDN4、CLDN6和CLDN9的细胞中并介导皂草毒蛋白细胞毒素的递送；
图10A显示使用免疫组织化学的各种PDX肺、乳房和卵巢肿瘤细胞中的CLND6的表达；且
图10B显示使用免疫组织化学的各种原发性卵巢肿瘤中的CLND6的表达。
发明详述
本发明可以多种不同形式实施。本文公开例举本发明的原理的其非限制性说明性实施方案。本文所使用的任何章节标题仅用于组织目的且不应解释为限制所述主题。为了本公开的目的，除非另有说明，否则所有鉴定序列登录号可见于NCBI参考序列(RefSeq)数据库和/或NCBI存档序列数据库。
已经令人惊讶地发现CLDN是许多肿瘤类型的生物标志物，且可以利用该关联用于治疗此类肿瘤。也已经出乎意料地发现，CLDN与致瘤性细胞相关，并且可以有效地用来抑制或消除它们。已知下面将更详细描述的致瘤性细胞表现出对许多常规治疗的耐受性。与现有技术的教导相反，公开的化合物和方法有效地克服该固有的耐受性。
本发明提供抗-CLDN抗体(包括抗体药物缀合物)及其在预后、诊断、治疗诊断、治疗和/或预防多种CLDN相关癌症而不管任何特定作用机制或特异性靶向的细胞或分子组分的用途。
I密蛋白(CLDN)生理学
密蛋白是整合膜蛋白，其包含紧密连接(极化细胞类型中的最顶端细胞-细胞粘着连接，诸如上皮或内皮细胞片层中发现的那些)的主要结构蛋白。紧密连接由成网络的蛋白链构成，所述成网络的蛋白链形成细胞周围的连续密封，以便为细胞旁空间中的溶质和水的转运提供物理、但可调节的屏障。人中的密蛋白蛋白家族由大小范围为22-34kDa的至少23个成员构成。所有密蛋白都具有跨膜四蛋白拓扑结构，其中两个蛋白末端位于膜的细胞内表面上，导致形成两个细胞外(EC)环EC1和EC2。EC环介导头对头同嗜性相互作用，且对于密蛋白的某些组合，异嗜性相互作用，其导致形成紧密连接。特定密蛋白-密蛋白相互作用和密蛋白EC序列是离子选择性和紧密连接强度的关键决定因素(例如，参见Nakano等人,2009,PMID:19696885)。通常，EC1大小为约50-60个氨基酸，含有较大W-X(17-22)-W-X(2)-C-X(8-10)-C基序内的保守二硫键和参与离子通道形成的许多带电荷残基(Turksen andTroy,2004,PMID:15159449)。EC2小于EC1，为约25个氨基酸。由于其螺旋-转角-螺旋构象，已经提出，EC2有助于在相对细胞膜上形成密蛋白的二聚体或多聚体，尽管在两个环中的突变可扰乱复合物形成。体外密蛋白-密蛋白复合物可以大小范围为二聚体至六聚体，这取决于所涉及的特定密蛋白(Krause等人,2008,PMID:18036336)。个别密蛋白显示一定范围的组织特异性表达模式，以及发育调节的表达，如通过PCR分析所测定(Krause等人,2008,PMID:18036336；Turksen,2011,PMID:21526417)。
序列分析可用于构建密蛋白家族成员的系统树，表明蛋白序列的关系和相关性的程度(图4A)。例如，可见CLDN6和CLDN9蛋白密切相关，鉴于它们的基因在染色体位置16p3.3处的相邻头对头位置，这表明原始基因复制。这些相似性可能转化为这些家族成员异型相互作用的能力。类似地，CLDN3和CLDN4蛋白通过序列分析密切相关，并且它们的基因可以发现串联于染色体位置7r11.23。某些家族成员之间的EC1或EC2环的高度同源性(例如图4B)为开发与各种密蛋白家族成员多反应的抗体提供机会。
CLDN6，也称为skullin，是发育调节的密蛋白。代表性CLDN6蛋白直向同源物包括但不限于：人(NP_067018)，黑猩猩(XP_523276)，猕猴(NP_001180762)，小鼠(NP_061247)，和大鼠(NP_001095834)。在人中，CLDN6基因由在染色体位置16p13.3处跨越约3.5kBp的2个外显子组成。CLDN6基因座的转录得到成熟的1.4kB mRNA转录物(NM_021195)，其编码219氨基酸蛋白(NP_061247)。CLDN6表达于承诺为上皮命运的ES细胞衍生物中(Turksen andTroy,2001,PMID:11668606)、周皮中(Morita等人,2002,PMID:12060405)和表皮的上基部水平中(Turkson and Troy,2002,PMID:11923212)。其也表达于正在发育的小鼠肾脏中(Abuazza等人,2006,PMID:16774906)，尽管在成体肾脏中未检测到表达(Reyes等人,2002,PMID:12110008)。CLDN6也连同CLDN1和CLDN9是丙型肝炎病毒的辅助受体(Zheng等人,2007,PMID:17804490)。
CLDN9是CLDN6的最密切相关的家族成员。代表性CLDN9蛋白直向同源物包括但不限于：人(NP_066192)，黑猩猩(XP_003314989)，猕猴(NP_001180758)，小鼠(NP_064689)，和大鼠(NP_001011889)。在人中，CLDN9基因由在染色体基因座16p13.3处跨越约2.1kBp的单一外显子组成。无内含子的CLDN9基因座的转录得到2.1kB mRNA转录物(NM_020982)，其编码217氨基酸蛋白(NP_0066192)。CLDN9表达于内耳(Kitarjiri等人,2004,PMID:14698084；Nankano等人,2009,PMID:19696885)，角膜(Ban等人,2003,PMID:12742348)，肝脏(Zheng等人,2007,PMID:17804490)和正在发育的肾脏(Abuazza等人,2006,PMID:16774906)的各种结构中。与其在耳蜗中的表达一致，表达具有错义突变的CLDN9蛋白的动物显示听力缺陷，这可能是由于细胞旁K+渗透性改变，随之扰动对于参与声音检测的毛细胞的去极化关键的离子电流。CLDN9在内耳的细胞中的表达特别定位于通过其它密蛋白形成的更顶端紧密连接束下方的子结构域，表明不是正常组织中的所有密蛋白都发现于最顶端和可接近的紧密连接中(Nankano等人,2009,PMID:19696885)。与耳蜗中的结果相比，表达错义CLDN9的小鼠显示没有肝或肾功能缺陷的体征(Nankano等人,2009,PMID:19696885)。
CLDN4也称为产气荚膜梭状芽孢杆菌肠毒素受体，这是由于其高亲和力结合该毒素，所述毒素负责食物中毒和其它消化道疾病。代表性CLDN4蛋白直向同源物包括但不限于：人(NP_001296)，黑猩猩(XP_519142)，猕猴(NP_001181493)，小鼠(NP_034033)，和大鼠(NP_001012022)。在人中，无内含子的CLDN4基因在染色体位置17q11.23处跨越约1.82kBp。CLDN4基因座的转录得到1.82kB mRNA转录物(NM_001305)，其编码209氨基酸蛋白(NP_001296)。与CLDN4结合由胃肠病原体产生的毒素的能力一致，可以在整个胃肠道以及在前列腺、膀胱、乳房和肺中检测到CDLN4表达(Rahner等人,2001,PMID:11159882；Tamagawa等人,2003,PMID:12861044；Wang等人,2003,PMID:12600828；Nichols等人,2004,PMID:14983936)。
尽管密蛋白在正常组织的功能和动态平衡中是重要的，肿瘤细胞频繁表现出异常的紧密连接功能。这可以与密蛋白的失调表达和/或定位联系起来，所述密蛋白的失调表达和/或定位为肿瘤细胞的去分化或要求迅速生长的癌组织在具有异常血管形成的肿瘤块内有效地吸收营养物的结果(Morin,2005,PMID:16266975)。个别密蛋白家族成员可以在某些癌症类型中上调，但在其它癌症类型中下调。例如，CLDN3和CLDN4表达在某些胰腺癌、乳癌和卵巢癌中升高，但可在其它乳腺(例如，“密蛋白-低”)癌中更低。密蛋白可以是抗体药物缀合物(ADC)的特别好的目标，因为已知密蛋白经历胞吞作用，一些密蛋白的周转时间相对于其它膜蛋白是短的(Van Itallie等人,2004,PMID:15366421)，密蛋白表达在癌细胞中失调，且肿瘤细胞间的紧密连接结构在癌细胞中被破坏。这些特性可以为抗体结合肿瘤组织、但非正常组织中的密蛋白提供更多机会。尽管对于各密蛋白特异性的抗体可以是有用的，但也可能多反应性密蛋白抗体将更可能促进有效载荷递送至更广泛的患者群体。具体地，多反应性密蛋白抗体可以允许由于较高聚集抗原密度而更有效靶向表达多种密蛋白的细胞，降低具有低水平的任何个别密蛋白的抗原表达的肿瘤细胞的逃逸的可能性，并且如下面表达实例中可见，扩展单一ADC的治疗适应症的数目。
II癌症干细胞
根据当前模型，肿瘤包含非致瘤性细胞和致瘤性细胞。非致瘤性细胞不具有自我更新的能力，并且不能可再现地形成肿瘤，甚至当以过量细胞数移植至免疫功能低下的小鼠中时。占肿瘤的细胞群体的0.1-40％的致瘤性细胞，在本文中也称为“肿瘤起始细胞”(TICs)，具有形成肿瘤的能力。致瘤性细胞涵盖可互换地称为癌症干细胞(CSCs)的肿瘤永存细胞(TPC)和肿瘤祖细胞(TProg)两者。
CSC，如支持在正常组织中的细胞层次的正常干细胞，能够无限自我复制，同时维持多谱系分化的能力。CSC能够生成致瘤性后代和非致瘤性后代两者，并且能够完全概括亲本肿瘤的异质细胞组成，如通过将少量分离的CSC连续分离和移植入免疫功能低下小鼠中所表明。
TProg，如CSC，具有刺激原代移植中的肿瘤生长的能力。然而，不同于CSC，它们不能概括亲代肿瘤的细胞异质性，并且在随后的移植物中重新起始肿瘤发生的效率较低，因为TProg通常仅能够有限数目的细胞分裂，如通过将少量高度纯化的TProg连续移植入免疫功能低下小鼠所表明。TProg可以进一步被分为早期TProg和晚期TProg，其可以通过表型(例如，细胞表面标志物)和它们不同的概括肿瘤细胞架构的能力进行区分。尽管都不能与CSC概括肿瘤至相同的程度，早期TProg比晚期TProg具有概括亲代肿瘤的特征的更大能力。尽管存在上述区别，已经显示，一些TProg群体，在稀有情况下，可以获得通常归因于CSC的自我更新能力，并且可以自身变为CSC。
CSC表现出比以下更高的致瘤性且相对更静息：(i)TProg(早期和晚期TProg两者)；和(ii)非致瘤性细胞，诸如肿瘤浸润的细胞，例如，成纤维细胞/基质、内皮细胞和造血细胞，其可以衍生自CSC，且通常构成肿瘤块。鉴于常规疗法和方案，在很大程度上，已经被设计为减瘤且攻击快速增殖细胞，CSC比更快速增殖TProg和其它大量肿瘤细胞群体诸如非致瘤性细胞对常规疗法和方案更耐受。可以使得CSC对常规疗法相对更化学耐受的其它特征是多药耐药转运蛋白的增加的表达、增强的DNA修复机制和抗凋亡基因表达。CSC中的这些特性构成确保具有晚期肿瘤的大部分患者的长期利益的标准肿瘤学治疗方案的失败的关键原因，因为标准化疗不靶向实际刺激继续肿瘤生长和复发的CSC。
已经令人惊讶地发现，CLDN表达与各种致瘤性细胞亚群相关。本发明提供抗-CLDN抗体，其可特别用于靶向致瘤性细胞，并且可以用于沉默、敏化、中和、降低频率、阻断、废除、干扰、降低、阻碍、制止、控制、消耗、减轻、介导、减少、重编、消除或以其它方式抑制(统称为“抑制”)致瘤性细胞，由此促进增殖性疾病(例如癌症)的治疗、控制和/或预防。有利地，可以选择本发明的新型抗-CLDN抗体，使得它们优选在施用于受试者后降低致瘤性细胞的频率或致瘤性，而无论CLDN决定簇的形式(例如，表型或基因型的)。致瘤性细胞频率的降低可以作为以下的结果而发生：(i)致瘤性细胞的抑制或消除；(ii)控制致瘤性细胞的生长、扩增或复发；(iii)中断致瘤性细胞的起始、繁殖、维持或增殖；或(iv)通过以其它方式阻碍致瘤性细胞的生存、再生和/或转移。在一些实施方案中，致瘤性细胞的抑制可以作为一种或多种生理通路变化的结果而发生。通路中的变化，无论通过抑制致瘤性细胞、改变它们的潜能(例如，通过诱导分化或生态位破坏(niche disruption))或以其它方式干扰致瘤性细胞影响肿瘤环境或其它细胞的能力，允许通过抑制肿瘤发生、肿瘤维持和/或转移和复发而更有效地治疗CLDN相关病症。
可用于评价致瘤性细胞的频率的降低的方法包括但不限于细胞计数或免疫组织化学分析，优选通过体外或体内有限稀释分析(Dylla等人2008，PMID:PMC2413402和Hoey等人，2009，PMID：19664991)。
体外有限稀释分析可以通过在促进集落形成的固体培养基上培养分级或未分级的肿瘤细胞(例如，分别来自处理和未处理的肿瘤)和计数和表征生长的集落来进行。或者，可以将肿瘤细胞连续稀释至具有含有液体培养基的孔的板上，且可以在接种之后的任何时间、但优选在接种之后多于10天将各孔评分为集落形成阳性或阴性的。
体内有限稀释通过将来自未处理的对照或来自暴露于所选治疗剂的肿瘤的肿瘤细胞以连续稀释移植至免疫功能低下的小鼠中并随后将小鼠评分为肿瘤形成阳性或阴性来进行。所述评分可以在植入的肿瘤可检测之后任何时间、但优选在移植之后60天或更多天进行。有限稀释实验测定致瘤性细胞的频率的结果的分析优选使用泊松分布统计学或评价预定义的确定性事件(诸如是否在体内生成肿瘤的能力)的频率来进行(Fazekas等人,1982,PMID:7040548)。
流式细胞术和免疫组织化学也可以用于测定致瘤性细胞频率。两种技术均采用结合本领域公认的已知富集致瘤性细胞的细胞表面蛋白或标志物的一种或多种抗体或试剂(参见WO 2012/031280)。如本领域中已知，流式细胞术(例如，荧光激活的细胞分选(FACS))也可用于表征、分离、纯化、富集或分选各种细胞群体，包括致瘤性细胞。流式细胞术通过将其中悬浮细胞的混合群体的流体流传递通过电子检测装置来测量致瘤性细胞水平，所述电子检测装置能够测量高达每秒数千颗粒的物理和/或化学特征。免疫组织化学提供额外信息，因为其能够通过用结合致瘤性细胞标志物的标记的抗体或试剂染色组织样品而原位(例如，在组织切片中)显现致瘤性细胞。
本发明的抗体可用于通过方法诸如，例如，流式细胞术、磁性激活的细胞分选(MACS)、激光介导的切片或FACS鉴定、表征、监测、分离、切片或富集致瘤性细胞的群体或亚群。FACS是用于基于特定细胞表面标志物以高于99.5％纯度分离细胞亚群的可靠方法。用于表征和操作致瘤性细胞(包括CSC)的其它相容技术可以见于，例如，U.S.P.N.12/686,359、12/669,136和12/757,649。
下面列出已经与CSC群体相关，并已用于分离或表征CSC：ABCA1、ABCA3、ABCG2、ADAM9、ADCY9、ADORA2A、AFP、AXIN1、B7H3、BCL9、Bmi-1、BMP-4、C20orf52、C4.4A、羧肽酶M、CAV1、CAV2、CD105、CD133、CD14、CD16、CD166、CD16a、CD16b、CD2、CD20、CD24、CD29、CD3、CD31、CD324、CD325、CD34、CD38、CD44、CD45、CD46、CD49b、CD49f、CD56、CD64、CD74、CD9、CD90、CEACAM6、CELSR1、CPD、CRIM1、CX3CL1、CXCR4、DAF、核心蛋白聚糖、easyh1、easyh2、EDG3、eed、EGFR、ENPP1、EPCAM、EPHA1、EPHA2、FLJ10052、FLVCR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GD2、GJA1、GLI1、GLI2、GPNMB、GPR54、GPRC5B、IL1R1、IL1RAP、JAM3、Lgr5、Lgr6、LRP3、LY6E、MCP、mf2、mllt3、MPZL1、MUC1、MUC16、MYC、N33、Nanog、NB84、巢蛋白、NID2、NMA、NPC1、制癌蛋白M、OCT4、OPN3、PCDH7、PCDHA10、PCDHB2、PPAP2C、PTPN3、PTS、RARRES1、SEMA4B、SLC19A2、SLC1A1、SLC39A1、SLC4A11、SLC6A14、SLC7A8、smarcA3、smarcD3、smarcE1、smarcA5、Sox1、STAT3、STEAP、TCF4、TEM8、TGFBR3、TMEPAI、TMPRSS4、转铁蛋白受体、TrkA、WNT10B、WNT16、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、YY1和β-联蛋白。参见，例如，Schulenburg等人,2010,PMID:20185329,U.S.P.N.7,632,678和U.S.P.N.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416和2011/0020221。
类似地，与某些肿瘤类型的CSC相关的细胞表面表型的非限制性实例包括CD44高CD24低、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38-、CD44+CD24-、CD46高CD324+CD66c-、CD133+CD34+CD10-CD19-、CD138-CD34-CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2β1 高CD133+、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及本领域中已知的其它CSC表面表型。参见例如，Schulenburg等人,2010,同上,Visvader等人,2008,PMID:18784658和U.S.P.N.2008/0138313。关于本发明的特别感兴趣的是包含CD46高CD324+表型的CSC制备物。“阳性”、“低”和“阴性”表达水平当它们适用于标志物或标志物表型时如下定义。具有阴性表达(即“-”)的细胞在本文中定义为表达小于或等于在荧光发射的额外通道中在染色针对其它目的蛋白的鸡尾酒混合物标记的完全抗体存在的情况下在荧光通道中用同种型对照抗体观察到的表达的95百分位数的那些细胞。本领域技术人员将理解，用于定义阴性事件的该程序被称为“荧光减一”或“FMO”染色。表达大于使用上述FMO染色程序用同种型对照抗体观察到的表达的95百分位数的细胞在本文中被定义为“阳性”(即”+”)。如本文所定义，存在广泛定义为“阳性”的各种细胞群体。如果抗原的平均观察表达高于使用如上所述用同种型对照抗体的FMO染色测定的95百分位数，则细胞被定义为阳性的。如果平均观察表达高于通过FMO染色测定的95百分位数并且在95百分位数的一个标准偏差内，则阳性细胞可被称为具有低表达(即“低”)的细胞。或者，如果平均观察表达高于通过FMO染色测定的95百分位数并且高于95百分位数的大于一个标准偏差，则阳性细胞可被称为具有高表达(即“高”)的细胞。在其它实施方案中，99百分位数可优选用作阴性和阳性FMO染色之间的分界点，并且在特别优选的实施方案中，百分位数可以大于99％。
CD46高CD324+标志物表型和刚刚上面例举的那些可以与标准流式细胞术分析和细胞分选技术结合使用，以表征、分离、纯化或富集TIC和/或TPC细胞或细胞群体用于进一步分析。
本发明的抗体降低致瘤性细胞的频率的能力因此可以使用上述技术和标志物来确定。在一些情况下，抗-CLDN抗体可使致瘤性细胞的频率降低10％、15％、20％、25％、30％或甚至35％。在其它实施方案中，致瘤性细胞的频率可降低约40％、45％、50％、55％、60％或65％。在某些实施方案中，公开的化合物可使致瘤性细胞的频率降低70％、75％、80％、85％、90％或甚至95％。应当理解，致瘤性细胞的频率的任何降低可能导致赘瘤形成的致瘤性、持续性、复发和侵袭性的相应降低。
III抗体
A.抗体结构
抗体及其变体和衍生物(包括公认的命名法和编号系统)已广泛描述于例如Abbas等人(2010),Cellular and Molecular Immunology(第6版),W.B.Saunders Company；或Murphey等人(2011),Janeway’s Immunobiology(第8版),Garland Science。
如本文所使用，“抗体”或“完整抗体”通常是指Y形四聚蛋白，其包含两个重(H)多肽链和两个轻(L)多肽链，所述多肽链通过共价二硫键和非共价相互作用结合在一起。将人轻链分类为κ或λ轻链。各轻链由一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)构成。各重链包含一个可变结构域(VH)和一个恒定区，该恒定区在IgG、IgA和IgD情况下包含三个名为CH1、CH2和CH3的结构域(IgM和IgE具有第四个结构域CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域是由柔性铰链区分离，该柔性铰链区为具有可变长度(在IgG中通常为约10个至约60个氨基酸)的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。轻链和重链两者中的可变结构域通过约12个或更多个氨基酸的“J”区域与恒定结构域接合，且重链也具有约10个额外氨基酸的“D”区域。各类别的抗体进一步包含由配对半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。
如本文所使用，术语“抗体”包括多无性繁殖系抗体(polyclonal antibody)、多克隆抗体(multiclonal antibody)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化和灵长类动物化(primatized)抗体、CDR移植抗体、人抗体、重组产生的抗体、细胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗个体基因型抗体、合成抗体(包括其突变蛋白和变体)、免疫特异性抗体片段(诸如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段)、单链片段(例如ScFv和ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合体和其它修饰，和任何其它免疫应答性分子，只要其呈现与决定簇的优先缔合或结合。此外，除非由上下文约束条件说明，否则该术语进一步包含所有类别的抗体(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和所有亚类(即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域通常分别由相应小写希腊字母α、δ、ε、γ和μ表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列而指定为两种明确相异类型(称为κ和λ)之一。
抗体的可变结构域显示一种抗体与另一种抗体的氨基酸组成的显著变化且主要负责抗原识别和结合。各轻链/重链配对的可变区形成抗体结合位点，使得完整IgG抗体具有两个结合位点(即其为二价的)。VH和VL结构域包含三个具有极端可变性的区域，其称为高变区，或更通常称为互补决定区(CDR)，其由四个可变性较低的区域(称为构架区(FR))构架和分离。VH和VL区域之间的非共价缔合形成Fv片段(对于“可变片段”)，其含有抗体的两个抗原结合位点之一。ScFv片段(对于单链可变片段)，其可通过遗传改造获得，在单一多肽链(由肽连接体分离的抗体的VH区和VL区)中缔合。
如本文所使用，除非另有说明，否则将氨基酸指定至各结构域、构架区和CDR可根据由以下文献提供的编号方案之一来进行：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest(第5版),US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242；Chothia等人,1987,PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel,编(2007)Handbook ofTherapeutic Antibodies,第3版,Wily-VCH Verlag GmbH and Co.。包含如由Kabat、Chothia和MacCallum(或“Contact”)定义的CDR的氨基酸残基(如获得自Abysis网站数据库(参见下文))描述于下文中。
表1
Kabat Chothia MacCallum
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 52-56 47-58
VH CDR3 95-102 95-102 93-101
VL CDR1 24-34 24-34 30-36
VL CDR2 50-56 50-56 46-55
VL CDR3 89-97 89-97 89-96
抗体序列中的可变区和CDR可根据在本领域中已开发的一般规则(如上文描述，诸如，例如Kabat等人编号系统)或通过将序列针对已知可变区的数据库比对来鉴定。用于鉴定这些区域的方法描述于Kontermann和Dubel,编,Antibody Engineering,Springer,NewYork,NY,2001和Dinarello等人,Current Protocols in Immunology,John Wiley andSons Inc.,Hoboken,NJ,2000。抗体序列的示例性数据库描述于“Abysis”网站,www.bioinf.org.uk/abs(由A.C.Martin in the Department of Biochemistry&Molecular Biology University College London,London,England维护)和VBASE2网站,www.vbase2.org(如描述于Retter等人,Nucl.Acids Res.,33(Database issue):D671-D674(2005))中且可通过前述网站获得。优选地，序列使用Abysis数据库分析，所述Abysis数据库整合来自Kabat等人、IMGT和Protein Data Bank(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据。参见Dr.Andrew C.R.Martin的书本章节Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains.:Antibody Engineering Lab Manual(编辑:Duebel,S.和Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547，也可得自网站bioinforg.uk/abs)。Abysis数据库网站进一步包括已开发用于鉴定可根据本文中的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文中描述的所有CDR都根据Abysis数据库网站按照Kabat等人衍生。
对于本发明中讨论的重链恒定区氨基酸位置，编号根据首先描述于Edelman等人,1969,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 63(1):78-85中的Eu索引进行，其描述据报道为第一个测序的人IgG1的骨髓瘤蛋白Eu的氨基酸序列。Edelman的EU索引也描述于Kabat等人,1991(参见上文)中。因此，重链的上下文中的术语“如Kabat中描述的EU索引”或“Kabat的EU索引”或“EU编号”是指基于如Kabat等人,1991(参见上文)中描述的Edelman等人的人IgG1Eu抗体的残基编号系统。用于轻链恒定区氨基酸序列的编号系统类似地描述于Kabat等人(同上)中。
与本发明相容的示例性κ轻链恒定区氨基酸序列描述于紧随下方：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:1)。
类似地，与本发明相容的示例性IgG1重链恒定区氨基酸序列描述于紧随下方：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:2)。
可使用标准分子生物学技术，将公开的恒定区序列或其变型或衍生物与公开的重链和轻链可变区可操作缔合以提供可以原样使用或并入本发明的抗-CLDN ADC的全长抗体。
更通常，本发明的抗体或免疫球蛋白可以由特异性识别相关决定簇或与相关决定簇缔合的任何抗体生成。如本文所使用，“决定簇”或“目标”意指任何可检测的特性、性质、标志物或因子，其可与特定细胞、细胞群体或组织可鉴定地关联或特定地在特定细胞、细胞群体或组织之中或之上被发现。决定簇或目标在性质上可为形态的、功能的或生物化学的，且优选为表型的。在某些优选实施方案中，决定簇为由特定细胞类型或在某些条件下(例如在特定生态位(niche)中的细胞周期或细胞的特定时间点期间)由细胞差异表达(过表达或表达不足)的蛋白。为了本发明的目的，决定簇优选差异表达于异常癌细胞上且可包含CLDN蛋白或其剪接变体、同工型或家族成员中的任一种，或其特定结构域、区域或表位。“抗原”、“免疫原性决定簇”、“抗原决定簇”或“免疫原”意指当引入免疫活性动物时可刺激免疫应答且由免疫应答产生的抗体识别的任何蛋白或其任何片段、区域或结构域。本文中考虑的决定簇的存在或不存在可用于鉴定细胞、细胞亚群或组织(例如肿瘤、致瘤性细胞或CSC)。
在免疫球蛋白分子中存在两种类型的二硫桥或键：链间和链内二硫键。如本领域中众所周知，链间二硫键的位置和数目根据免疫球蛋白类别和种类而不同。尽管本发明不限于抗体的任何特定类别或亚类，为了说明的目的，应当在本公开中使用IgG1免疫球蛋白。在野生型IgG1分子中，存在十二个链内二硫键(每条重链上四个和每条轻链上两个)和四个链间二硫键。链内二硫键通常有点受保护，且比链间键对还原相对较不敏感。相反，链间二硫键位于免疫球蛋白的表面上，可接近于溶剂，且通常相对容易还原。两个链间二硫键存在于重链之间，且一个从每条重链至其各自的轻链。已经表明，链间二硫键对于链缔合不是必要的。IgG1铰链区在重链中含有形成链间二硫键的半胱氨酸，其提供结构支持连同促进Fab运动的柔性。重/重IgG1链间二硫键位于残基C226和C229(EU编号)，而IgG1的轻链和重链(重/轻)之间的IgG1链间二硫键形成于κ或λ轻链的C214和重链的上铰链区中的C220之间形成。
B.抗体生成和产生
本发明的抗体可以使用本领域中已知的各种方法来产生。
1.在宿主动物中生成多无性繁殖系抗体
在各种宿主动物中产生多无性繁殖系抗体在本领域中是众所周知的(参见例如Harlow和Lane(编)(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press；和Harlow等人(1989)Antibodies,NY,Cold Spring Harbor Press)。为了生成多无性繁殖系抗体，用抗原性蛋白或包含抗原性蛋白的细胞或制备物免疫免疫活性的动物。在一段时间之后，通过使动物出血或处死动物而获得含有多无性繁殖系抗体的血清。血清可以获得自动物的形式使用，或者所述抗体可被部分或完全纯化以提供免疫球蛋白级分或分离的抗体制备物。
任何形式的抗原或含有抗原的细胞或制备物可用于生成对于决定簇特异性的抗体。术语“抗原”在广义上使用，并且可以包含所选目标的任何免疫原性片段或决定簇，包括单一表位，多个表位，单个或多个结构域或整个细胞外结构域(ECD)。所述抗原可以是分离的全长蛋白，细胞表面蛋白(例如，用在其表面上表达抗原的至少一部分的细胞免疫)或可溶性蛋白(例如，用仅具有蛋白的ECD部分免疫)。所述抗原可以在遗传修饰的细胞中产生。任何上述抗原可以单独使用或与本领域中已知的一种或多种免疫原性增强佐剂组合使用。编码抗原的DNA可以是基因组的或非基因组的(例如，cDNA)，并且可以编码足以引发免疫原性应答的ECD的至少一部分。任何载体都可以用于转化其中表达所述抗原的细胞，包括但不限于腺病毒载体，慢病毒载体，质粒和非病毒载体，诸如阳离子脂质。
2.单克隆抗体
在所选实施方案中，本发明涵盖单克隆抗体的用途。术语“单克隆抗体”或mAb是指获得自基本上均质抗体的群体的抗体，即组成该群体的个别抗体除了可少量存在的可能突变(例如天然存在的突变)以外是相同的。
单克隆抗体可使用多种技术制备，所述技术包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物(例如)或其一些组合。例如，在优选实施方案中，单克隆抗体可使用杂交瘤和生物化学和遗传改造技术产生，所述技术诸如更详细地描述于：An,Zhigiang(编)Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic,John Wileyand Sons,第1版2009；Shire等人(编)Current Trends in Monoclonal AntibodyDevelopment and Manufacturing,Springer Science+Business Media LLC,第1版2010；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版1988；Hammerling,等人,:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981)。生成许多特异性结合至决定簇的单克隆抗体之后，具体地，合适的抗体可以通过各种筛选过程基于例如对于决定簇的亲和力或内化的速率进行选择。在特别优选的实施方案中，如本文所述产生的单克隆抗体可以用作源抗体，且进一步修饰，例如，以改善对于目标的亲和力，改善其在细胞培养物中的产生，降低体内免疫原性，生成多特异性构建体，等。单克隆抗体产生和筛选的更详细说明描述于下面和所附实施例中。
3.人抗体
所述抗体可包含完全人抗体。术语“人抗体”是指具有对应于由人产生和/或已经使用任一种用于产生本文所述的人抗体的技术制备的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体(优选单克隆抗体)。
在一个实施方案中，可通过筛选使用噬菌体展示制备的重组组合抗体文库来分离重组人抗体。在一个实施方案中，所述文库是scFv噬菌体或酵母展示文库，其使用人VL和VHcDNA产生，所述人VL和VH cDNA由分离自B细胞的mRNA制备。
人抗体也可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如，其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活且已引入人免疫球蛋白基因的小鼠)中来制备。在攻击后，观察到抗体生成，其在所有方面均密切地类似于人中所见，包括基因重排、组装和完全人抗体所有组成成分。该方法描述于例如关于技术的U.S.P.N.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，和U.S.P.N.6,075,181和6,150,584；以及Lonberg和Huszar,1995,PMID:7494109)。或者，人抗体可经由使产生针对目标抗原的抗体的人B淋巴细胞(此类B淋巴细胞可从患有肿瘤性病症的个体回收或可在体外进行免疫)永生化来制备。参见例如Cole等人,Monoclonal Antibodies和Cancer Therapy,AlanR.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,1991,PMID:2051030；和U.S.P.N.5,750,373。
4.衍生的抗体
一旦已经如上所述生成、选择和分离源抗体，它们可以进一步改变，以提供具有改善的药物特征的抗-CLDN抗体。优选地，所述源抗体使用已知的分子改造技术修饰或改变，以提供具有期望的治疗特性的衍生的抗体。
4.1嵌合和人源化的抗体
本发明的所选实施方案包含免疫特异性结合至CLDN的鼠抗体，且为了本公开的目的，可视为“源”抗体。在所选实施方案中，与本发明相容的抗体可通过源抗体的恒定区和/或抗原结合氨基酸序列的任选的修饰而从此类“源”抗体获得。在某些实施方案中，如果源抗体中的所选氨基酸通过缺失、突变、取代、整合或组合而改变，则抗体“衍生”自源抗体。在另一个实施方案中，“衍生的”抗体是其中源抗体的片段(例如一个或多个CDR或整个重链和轻链可变区)与受体抗体序列组合或并入受体抗体序列中以提供衍生物抗体(例如嵌合或人源化抗体)的抗体。可以使用如下所述的标准分子生物学技术生成这些”衍生的”抗体，诸如例如，以改善对决定簇的亲和力；改善抗体稳定性；改善细胞培养物中的产量和产率；降低体内免疫原性；降低毒性；促进活性部分的缀合；或产生多特异性抗体。此类抗体也可通过化学方式或翻译后修饰通过成熟分子(例如糖基化模式或聚乙二醇化)的修饰而衍生自源抗体。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗体包含已经共价接合的衍生自来自至少两种不同物种或类别的抗体的蛋白区段的嵌合抗体。术语“嵌合的”抗体涉及构建体，其中重链和/或轻链的部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的剩余部分与来自另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这样的抗体的片段相同或同源(U.S.P.N.4,816,567；Morrison等人,1984,PMID:6436822)。在一些优选实施方案中，本发明的嵌合抗体可以包含可操作连接至人轻链和重链恒定区的所选鼠重和轻链可变区中的所有或大部分。在其它特别优选的实施方案中，抗-CLDN抗体可以“衍生自”本文公开的小鼠抗体。
在其它实施方案中，本发明的嵌合抗体是“CDR移植的”抗体，其中所述CDR(如使用Kabat、Chothia、McCallum等定义)衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的CDR，而抗体的剩余部分衍生自来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体。对于在人中使用，可将一种或多种所选啮齿动物CDR(例如小鼠CDR)移植至人受体抗体中，取代人抗体中一个或多个天然存在的CDR。这些构建体通常具有提供完全强度人抗体功能(例如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))同时降低受试者对抗体的不想要的免疫应答的优点。在特别优选的实施方案中，CDR移植的抗体将包含并入人构架序列的获得自小鼠的一个或多个CDR。
CDR移植的抗体与“人源化”抗体类似。如本文所使用，“人源化”抗体是包含衍生自一种或多种非人抗体(供体或源抗体)的一种或多种氨基酸序列(例如CDR序列)的人抗体(受体抗体)。在某些实施方案中，“回复突变”可以引入人源化抗体，其中受体人抗体的可变区的一个或多个FR中的残基被替代为来自非人物种供体抗体的相应残基。此类回复突变可以帮助维持移植CDR的适当三维构型且由此改善亲和力和抗体稳定性。可以使用来自不同供体物种的抗体，所述供体物种包括但不限于，小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。此外，人源化抗体可包含未在受体抗体或供体抗体中发现的新残基以例如进一步改进抗体表现。如下面实施例7中所述提供与本发明相容的CDR移植和人源化的抗体。
各种本领域公认的技术可用于确定何种人序列用作受体抗体以提供根据本发明的人源化构建体。相容的人种系序列和确定它们作为受体序列的方法的汇编公开于例如Tomlinson,I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.227:776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today 16:237-242；Chothia,D.等人(1992)J.Mol.Biol.227:799-817；和Tomlinson等人(1995)EMBO J 14:4628-4638，其各自以其整体并入本文。The V-BASE目录(VBASE2–Retter等人,Nucleic Acid Res.33；671-674,2005)，其提供人免疫球蛋白可变区序列的综合性目录(由Tomlinson,I.A.等人编译MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK)，也可用于鉴定相容的受体序列。此外，描述于例如U.S.P.N.6,300,064中的共有人构架序列也可证明是可以根据本发明教导使用的相容的受体序列。通常，基于与鼠源构架序列的同源性连同源和受体抗体的CDR规范结构的分析选择人构架受体序列。衍生抗体的重和轻链可变区的衍生序列然后可以使用本领域公认的技术合成。
通过实例的方式，CDR移植和人源化的抗体和相关方法描述于U.S.P.N.6,180,370和5,693,762。对于进一步细节，参见例如Jones等人,1986,PMID:3713831)；和U.S.P.N.6,982,321和7,087,409。
CDR移植或人源化的抗体可变区与人受体可变区的序列同一性或同源性可如本文所讨论来确定，且当以此方式测量时，将优选共享至少60％或65％序列同一性，更优选至少70％、75％、80％、85％或90％序列同一性，甚至更优选至少93％、95％、98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置的不同在于保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被取代为具有具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)侧链(R基团)的另一氨基酸残基的取代。通常，保守氨基酸取代将实质上不改变蛋白的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列与彼此的不同在于保守取代的情况下，百分比序列同一性或相似性程度可上调以校正取代的保守性质。
应当理解，如附图中提供的注释的CDR和构架序列根据Kabat等人使用专有Abysis数据库定义。然而，如本文中所讨论，本领域技术人员可以根据Chothia等人或MacCallum等人提供的编号方案容易地鉴定CDR。
4.2位点特异性抗体
可以将本发明的抗体改造以促进与细胞毒素或其它抗癌剂的缀合(如下面更详细讨论)。在抗体上的细胞毒素的位置和药物抗体比(DAR)方面，抗体药物缀合物(ADC)制备物包含ADC分子的均质群体是有利的。基于本公开内容，本领域技术人员可容易地制造如本文所述的位点特异性的改造的构建体。如本文所使用，“位点特异性抗体”或“位点特异性构建体”意指抗体或其免疫反应性片段，其中将重链或轻链中的至少一个氨基酸缺失、改变或取代(优选用另一种氨基酸)，以提供至少一个游离半胱氨酸。类似地，“位点特异性缀合物”应保持为意指包含位点特异性抗体和缀合至一个或多个未配对的半胱氨酸的至少一个细胞毒素或其它化合物的ADC。在某些实施方案中，未配对的半胱氨酸残基将包含未配对链内的残基。在其它优选的实施方案中，游离半胱氨酸残基将包含未配对链间半胱氨酸残基。改造的抗体可以是各种同种型，例如IgG、IgE、IgA或IgD；且那些类别内，抗体可以是各种亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。对于IgG构建体，抗体的轻链可包含各自并入C214的κ或λ同种型，在优选的实施方案中，由于在IgG1重链中缺乏C220残基，C214可以是未配对的。
在一个实施方案中，改造的抗体包含至少一个氨基酸缺失或链内或链间半胱氨酸残基的取代。如本文所使用，“链间半胱氨酸残基”意指参与抗体的轻链和重链之间或抗体的两条重链之间的天然二硫键的半胱氨酸残基，而链内半胱氨酸残基是在相同重链或轻链中与另一个半胱氨酸自然配对的半胱氨酸残基。在一个实施方案中，缺失或取代的链间半胱氨酸残基参与轻链和重链之间的二硫键的形成。在另一个实施方案中，缺失或取代的半胱氨酸残基参与两个重链之间的二硫键。在一个典型的实施方案中，由于抗体的互补结构(其中所述轻链与重链的VH和CH1结构域配对，并且其中一个重链的CH2和CH3结构域与互补的重链的CH2和CH3结构域配对)，在轻链或重链中的单个半胱氨酸的突变或缺失将导致在该改造抗体中的两个未配对的半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，链间半胱氨酸残基缺失。在其它实施方案中，链间半胱氨酸被取代为另一个氨基酸(例如，天然存在的氨基酸)。例如，所述氨基酸取代可导致将链间半胱氨酸替换为中性(例如丝氨酸、苏氨酸或甘氨酸)或亲水性(例如甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)残基。在一个特别优选的实施方案中，链间半胱氨酸被替换为丝氨酸。
在本发明考虑的一些实施方案中，缺失或取代的半胱氨酸残基是在轻链(κ或λ)上，从而留下重链上的游离半胱氨酸。在其它实施方案中，缺失或取代的半胱氨酸残基是在重链上，留下轻链恒定区上的游离半胱氨酸。组装后，应当理解，在完整抗体的轻链或重链中的单个半胱氨酸的缺失或取代导致产生具有两个未配对的半胱氨酸残基的位点特异性抗体。
在一个特别优选的实施方案中，将IgG轻链(κ或λ)的位置214的半胱氨酸(C214)缺失或取代。在另一个优选的实施方案中，将IgG重链上的位置220的半胱氨酸(C220)缺失或取代。在进一步的实施方案中，将重链上的位置226或位置229的半胱氨酸缺失或取代。在一个实施方案中，重链上的C220被取代为丝氨酸(C220S)，以提供轻链中的期望的游离半胱氨酸。在另一个实施方案中，轻链中的C214被取代为丝氨酸(C214S)，以提供重链中的期望的游离半胱氨酸。此类位点特异性构建体提供于实施例8中。这些优选构建体的概述显示于紧随下方的表2，其中所有编号都是根据Kabat中所述的EU索引，且WT代表“野生型”或没有改变的天然恒定区序列，且δ(Δ)指定氨基酸残基的缺失(例如，C214Δ表明在位置214的半胱氨酸已缺失)。
表2
以类似的方式，优选的实施方案可以包含位点特异性IgG4抗体，其中改变或消除重链的C127残基，以便在轻链的220位置提供游离的半胱氨酸。如以下实施例中所述，此类实施方案可表现出改善的稳定性和降低的毒性。
如本文所公开，用于生成具有药物负荷的确定位点和化学计量的抗体-药物缀合物的策略广泛适用于所有抗-CLDN抗体，因为它主要涉及抗体的保守恒定结构域的改造。因为各类别和亚类的抗体的氨基酸序列和天然二硫键是充分记录的，本领域技术人员无需过度实验就可容易地制造各种抗体的改造的构建体，因此，此类构建体明确地考虑为在本发明的范围内。
4.3恒定区修饰和改变的糖基化
本发明的所选实施方案也可包含恒定区(即Fc区)的取代或修饰，包括但不限于氨基酸残基取代、突变和/或修饰，其导致产生具有优选特征的化合物，所述特征包括但不限于：药代动力学改变、血清半衰期延长、结合亲和力增加、免疫原性降低、产量增加、Fc配体与Fc受体(FcR)的结合改变、ADCC或CDC增强或降低、糖基化/或二硫键改变和结合特异性改变。
具有改善的Fc效应子功能的化合物可以例如通过参与Fc结构域和Fc受体(例如FcγRI、FcγRIIA和B、FcγRIII和FcRn)之间的相互作用的氨基酸残基的改变来生成，其可导致细胞毒性增加和/或药代动力学改变，诸如血清半衰期延长(参见例如Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。
在所选实施方案中，可通过修饰(例如取代、缺失或添加)经鉴定为参与Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基来生成体内半衰期延长的抗体(参见例如国际公开WO 97/34631；WO 04/029207；U.S.P.N.6,737,056和U.S.P.N.2003/0190311)。关于此类实施方案，Fc变体在哺乳动物(优选为人)中可提供以下半衰期：大于5天、大于10天、大于15天、优选大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月。半衰期延长导致较高血清效价，其因此降低抗体的施用频率和/或降低待施用的抗体的浓度。可在例如转基因小鼠或经转染的表达人FcRn的人细胞系中，或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期。WO 2000/42072描述与FcRn的结合改善或降低的抗体变体。还参见例如Shields等人J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在其它实施方案中，Fc变化可导致ADCC或CDC活性增强或降低。如本领域中已知，CDC是指目标细胞在补体存在的情况下的裂解，且ADCC是指细胞毒性的一种形式，其中结合至某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的FcR的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至载荷抗原的目标细胞且随后用细胞毒素杀死目标细胞。在本发明的背景中，提供具有“改变”的FcR结合亲和力的抗体变体，其与亲本或未修饰的抗体或包含天然序列FcR的抗体相比结合增强或降低。此类表现出降低的结合的变体可具有极少或不可感知的结合，例如与FcR的结合为天然序列的0-20％，例如如通过本领域中众所周知的技术测定。在其它实施方案中，与天然免疫球蛋白Fc结构域相比，变体将呈现增强的结合。应当理解，这些类型的Fc变体可有利地用于增强公开的抗体的有效抗肿瘤特性。在还有其它实施方案中，此类变化导致结合亲和力增加、免疫原性降低、产量增加、糖基化改变和/或二硫键(例如对于缀合点)、结合特异性改变、吞噬作用增加；和/或细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。
还有其它实施方案包含一种或多种改造的糖形，例如包含改变的糖基化模式或改变的碳水化合物组成的位点特异性抗体，其共价连接至蛋白(例如在Fc结构域中)。参见例如Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740。改造的糖形可用于多种目的，包括但不限于增强或降低效应子功能、增加抗体对目标的亲和力或促进抗体产生。在其中期望降低效应子功能的某些实施方案中，分子可经改造以表达无糖基化形式。可导致消除一个或多个可变区构架糖基化位点以由此消除该位点处的糖基化的取代是众所周知的(参见例如U.S.P.N.5,714,350和6,350,861)。相反，可通过在一个或多个额外糖基化位点进行改造来为含有Fc的分子赋予增强的效应子功能或改善的结合。
其它实施方案包括Fc变体，其具有改变的糖基化组成，诸如具有降低量的岩藻糖基残基的次岩藻糖基化抗体或具有增加的二分型GlcNAc结构的抗体。已表明此类改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。改造的糖形可通过本领域技术人员已知的任何方法生成，例如通过使用改造或变体表达菌株、通过与一种或多种酶(例如N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))共表达、通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子或通过在已经表达包含Fc区的分子之后修饰碳水化合物(参见例如WO 2012/117002)。
4.4片段
无论选择何种形式的抗体(例如嵌合、人源化等)以实践本发明，应当理解，可根据本文中的教导使用其免疫反应性片段(自身或作为抗体药物缀合物的部分)。“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如本文所使用，术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，且术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其免疫特异性结合所选抗原或其免疫原性决定簇或与所选抗原或其免疫原性决定簇反应或与衍生所述片段的完整抗体竞争特异性抗原结合。
示例性位点特异性片段包括：可变轻链片段(VL)、可变重链片段(VH)、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段、双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。此外，活性位点特异性片段包含抗体的部分，其保留其与抗原/底物或受体相互作用且以与完整抗体类似的方式(尽管效率可能稍微较低)修饰抗原/底物或受体的能力。此类抗体片段可以进一步改造以包含一个或多个游离半胱氨酸。
在其它实施方案中，抗体片段是包含Fc区域且保留当完整抗体中存在时通常与Fc区域相关的生物功能(诸如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合)中的至少一种的片段。在一个实施方案中，抗体片段是单价抗体，其具有与完整抗体实质上类似的体内半衰期。例如，此类抗体片段可包含连接至Fc序列的抗原结合臂，其包含能够赋予片段体内稳定性的至少一个游离半胱氨酸。
如本领域技术人员将公认，可通过分子改造或经由完整或完全抗体或抗体链的化学或酶促处理(诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)或通过重组方式获得片段。关于抗体片段的更详细描述，参见例如Fundamental Immunology,W.E.Paul，编,Raven Press,N.Y.(1999)。
4.5多价构建体
在其它实施方案中，本发明的抗体和缀合物可为单价或多价(例如二价、三价等)。如本文所使用，术语“效价”是指与抗体相关的潜在目标结合位点的数目。各目标结合位点特异性结合一个目标分子或目标分子上的特定位置或基因座。当抗体为单价时，分子的各结合位点将特异性结合至单一抗原位置或表位。当抗体包含多于一个目标结合位点(多价)时，各目标结合位点可特异性结合相同或不同分子(例如可结合至不同配体或不同抗原，或相同抗原上的不同表位或位置)。参见例如U.S.P.N.2009/0130105。
在一个实施方案中，所述抗体为双特异性抗体，其中两条链具有不同特异性，如描述于Millstein等人,1983,Nature,305:537-539。其它实施方案包括具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。其它更复杂的相容多特异性构建体和其制造方法描述于U.S.P.N.2009/0155255，以及WO 94/04690；Suresh等人,1986,Methods in Enzymology,121:210；和WO96/27011。
多价抗体可免疫特异性结合至期望的目标分子的不同表位，或可免疫特异性结合至目标分子以及异源表位，诸如异源多肽或固体支持物质。尽管优选实施方案仅结合两种抗原(即双特异性抗体)，但本发明也涵盖具有额外特异性的抗体(诸如三特异性抗体)。双特异性抗体也包括交联或“异缀合物”抗体。例如，异缀合物中的抗体之一可与抗生物素蛋白偶联，另一者与生物素偶联。例如，已提出此类抗体使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(U.S.P.N.4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。异缀合物抗体可使用任何便利的交联方法制备。合适交联剂连同多种交联技术在本领域中是众所周知的，且公开于U.S.P.N.4,676,980。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体可用于过继免疫基因治疗以治疗肿瘤。在一个实施方案中，本发明的抗体(例如，ScFv片段)可用于生成嵌合抗原受体(CAR)。“CAR”是由包含本发明的抗-CLDN抗体或其免疫反应性片段(例如ScFv片段)、跨膜结构域和至少一个细胞内结构域的ECD构成的融合蛋白。在一个实施方案中，已经遗传改造以表达CAR的T细胞、自然杀伤细胞或树突细胞可以引入患有癌症的受试者，以刺激受试者的免疫系统特异性靶向表达CLDN的肿瘤细胞。在优选的实施方案中，本发明的CAR将包含起始初始细胞质信号传导序列(即，用于起始经由T细胞受体复合物的抗原依赖性的初始活化的序列)的细胞内结构域，例如，衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的细胞内结构域。在其它优选的实施方案中，本发明的CAR将包含起始二级或共刺激信号的细胞内结构域，例如，衍生自CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体的细胞内结构域(参见U.S.P.N.US/2014/0242701)。
在还有其它实施方案中，使用本领域普通技术人员众所周知的方法将具有期望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原组合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列(诸如包含铰链、CH2和/或CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域)融合。
5.抗体的重组产生
抗体及其片段可使用获得自产生抗体的细胞的遗传物质和重组技术产生或修饰(参见例如Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods inEnzymology vol.152Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Sambrook和Russell(编)(2000)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版),NY,Cold Spring HarborLaboratory Press；Ausubel等人(2002)Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John&Sons,Inc.；和U.S.P.N.7,709,611)。
本发明的另一个方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。核酸可存在于全细胞中、细胞裂解物中或以部分纯化或实质上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl分带(banding)、柱层析法、琼脂糖凝胶电泳和本领域中众所周知的其它技术)从其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白)分离时，核酸是“分离的”或变成实质上纯的。本发明的核酸可为例如DNA(例如基因组DNA、cDNA)、RNA及其人工变体(例如肽核酸)(无论单链或双链或RNA)，RNA，且可以含有或不含内含子。在一个优选实施方案中，所述核酸为cDNA分子。
本发明的核酸可使用标准分子生物学技术获得。对于通过杂交瘤(例如，如下面实施例中所述制备的杂交瘤)表达的抗体，编码抗体的轻链和重链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于获得自免疫球蛋白基因文库的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，编码抗体的核酸可从文库回收。
编码VH和VL区段的DNA片段可进一步通过标准重组DNA技术操作，例如以便将所述可变区基因转化为全长抗体链基因，转化为Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作连接至编码另一蛋白(诸如抗体恒定区或柔性连接体)的另一DNA片段。如上下文中所使用的术语“可操作连接”意指接合两个DNA片段以便使由两个DNA片段编码的氨基酸序列保留于构架中。
可通过将编码VH的DNA可操作连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而将编码VH区的分离DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见例如Kabat,等人(1991)(同上))且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选为IgG1或IgG4恒定区。示例性IgG1恒定区描述于SEQ ID NO:2。对于Fab片段重链基因，可将编码VH的DNA可操作性连接至另一仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。
可通过将编码VL的DNA可操作连接至编码轻链恒定区(CL)的另一DNA分子，将编码VL区的分离DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见例如Kabat,等人(1991)(同上))且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区，但最优选为κ恒定区。在这方面，示例性相容κ轻链恒定区描述于SEQ ID NO:1。
本文考虑表现出与本发明的多肽的“序列同一性”、“序列相似性”或“序列同源性”的某些多肽(例如，抗原或抗体)。“同源”多肽可以表现出65％、70％、75％、80％、85％或90％序列同一性。在其它实施方案中，“同源”多肽可以表现出93％、95％或98％序列同一性。如本文所使用，两个氨基酸序列之间的百分比同源性与两个序列之间的百分比同一性等效。两个序列之间的百分比同一性是由所述序列共享的相同位置的数目的函数(即％同源性＝相同位置数目/总位置数目×100)，其考虑对于两个序列的最佳比对所需引入的缺口的数目和各缺口的长度。两个序列之间的序列的比较和百分比同一性的测定可使用数学算法完成，如以下非限制性实施例中所述。
可使用已并入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))的算法、使用PAM120权数残基表、缺口长度处罚12和缺口罚分4来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，可使用已并入GCG软件包(可得自www.gcg.com)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法、使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵和缺口权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。
此外或替代地，本发明的蛋白序列可进一步用作“查询序列”以进行针对公共数据库的搜索，以便例如鉴定相关序列。此类搜索可使用Altschul,等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)进行。BLAST蛋白搜索可以用XBLAST程序、得分＝50、字长＝3进行以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对以用于比较目的，可如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
不相同的残基位置的不同可在于保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被取代为具有具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的侧链的另一氨基酸残基的取代。通常，保守氨基酸取代将实质上不改变蛋白的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列与彼此的不同在于保守取代的情况下，百分比序列同一性或相似性的程度可上调以校正取代的保守性质。在存在用非保守氨基酸取代的情况下，在优选的实施方案中，表现出序列同一性的多肽将保留本发明多肽(例如，抗体)的期望功能或活性。
本文还考虑表现出与本发明的核酸的“序列同一性”、“序列相似性”或“序列同源性”的核酸。“同源序列”意指表现出至少约65％、70％、75％、80％、85％或90％序列同一性的核酸分子的序列。在其它实施方案中，核酸的“同源序列”可以表现出与参考核酸的93％、95％或98％序列同一性。
本发明还提供包含可操作连接至启动子的上述此类核酸的载体(参见例如WO 86/05807；WO 89/01036；和U.S.P.N.5,122,464)；和真核生物分泌途径的其它转录调节和处理控制元件。本发明还提供具有那些载体和宿主表达系统的宿主细胞。
如本文所使用，术语“宿主表达系统”包括可经改造以产生本发明的核酸或多肽和抗体的任何类型的细胞系统。此类宿主表达系统包括但不限于用重组噬菌体DNA或质粒DNA转化或转染的微生物(例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用重组酵母表达载体转染的酵母(例如酵母属(Saccharomyces))；或具有重组表达构建体的哺乳动物细胞(例如COS、CHO-S、HEK-293T、3T3细胞)，所述重组表达构建体含有来源于哺乳动物细胞或病毒的基因组的启动子(例如腺病毒晚期启动子)。宿主细胞可用两种表达载体共转染，例如第一载体编码重链衍生的多肽且第二载体编码轻链衍生的多肽。
转化哺乳动物细胞的方法是本领域中众所周知的。参见例如U.S.P.N.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。宿主细胞也可经改造以允许产生具有各种特征的抗原结合分子(例如修饰的具有GnTIII活性的糖形或蛋白)。
为了长期高产率产生重组蛋白，稳定表达是优选的。因此，稳定表达所选抗体的细胞系可使用标准领域公认的标准技术改造且形成本发明的一部分。宿主细胞可用适当表达控制元件(例如启动子或增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择标记物转化，而非使用含有病毒复制起点的表达载体。可使用本领域中众所周知的任何选择系统，包括谷氨酰胺合酶基因表达系统(GS系统)，其提供用于在某些条件下增强表达的有效方法。完全或部分结合EP 0 216 846、EP 0 256 055、EP 0 323 997和EP 0 338 841以及U.S.P.N.5,591,639和5,879,936讨论GS系统。另一种用于开发稳定细胞系的优选表达系统为FreedomTM CHO-S试剂盒(Life Technologies)。
一旦通过重组表达或任何其它公开的技术产生本发明的抗体，则其可通过本领域中已知的方法纯化或分离，意味着所述抗体经鉴定且从其天然环境分离和/或回收且与将干扰抗体的诊断或治疗用途的污染物分离。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。
这些分离的制备物可使用各种本领域公认的技术纯化，所述技术诸如离子交换和大小排阻层析、透析、渗滤和亲和层析，特别是蛋白A或蛋白G亲和层析。
6.产生后选择
无论如何获得，可以选择、克隆抗体产生细胞(例如杂交瘤、酵母集落等)，并针对期望特征(包括例如稳健生长、高抗体产量和期望抗体特征，诸如针对目的抗原的高亲和力)而进一步筛选。杂交瘤可以在细胞培养物中体外扩增或可以在同系免疫功能低下的动物中体内扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤和/或集落的方法是本领域普通技术人员众所周知的。一旦鉴定期望抗体，则可使用常用的本领域公认的分子生物学和生物化学技术分离、操作和表达相关遗传物质。
由未处理的文库产生的抗体(或天然或合成)可以具有中等亲和力(约106至107M-1的Ka)。为了增强亲和力，可通过构建抗体文库(例如通过经由使用易错聚合酶体外引入随机突变)和从那些二级文库再选择针对抗原具有高亲和力的抗体(例如通过使用噬菌体或酵母展示)来体外模拟亲和力成熟。WO9607754描述用于诱导免疫球蛋白轻链的CDR中的诱变以产生轻链基因的文库的方法。
可使用多种技术来选择抗体，包括但不限于噬菌体或酵母展示，其中在噬菌体或酵母上合成人组合抗体或scFv片段的文库，用目的抗原或其抗体结合部分筛选文库，且分离结合抗原的噬菌体或酵母，由此可以获得抗体或免疫反应性片段(Vaughan等人,1996,PMID:9630891；Sheets等人,1998,PMID:9600934；Boder等人,1997,PMID:9181578；Pepper等人,2008,PMID:18336206)。用于生成噬菌体或酵母展示文库的试剂盒是商业可得的。还存在其它可用于生成和筛选抗体展示文库的方法和试剂(参见U.S.P.N.5,223,409；WO 92/18619,WO 91/17271,WO 92/20791,WO 92/15679,WO 93/01288,WO 92/01047,WO 92/09690；和Barbas等人,1991,PMID:1896445)。此类技术有利地允许筛选大量候选抗体且提供相对容易的序列操作(例如通过重组改组)。
IV抗体的特征
在所选实施方案中，可以选择、克隆抗体产生细胞(例如杂交瘤、酵母集落)，并针对有利特性(包括例如稳健生长、高抗体产量和如下文更详细讨论，期望的位点特异性抗体特征)而进一步筛选。在其它情况下，可通过针对动物的接种选择特定抗原(例如特异性CLDN同工型)或目标抗原的免疫反应性片段来赋予抗体的特征。在还有其它实施方案中，所选抗体可如上所述改造以增强或改进免疫化学特征，诸如亲和力或药代动力学。
A.中和抗体
在所选实施方案中，本发明的抗体可以是“拮抗剂”或“中和”抗体，意味着所述抗体可以直接或通过防止决定簇与结合伴侣诸如配体或受体的缔合而与决定簇缔合和阻断或抑制所述决定簇的活性，由此中断否则将由分子的相互作用导致的生物反应。当过量抗体使结合至决定簇的结合伴侣的量降低至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多(如例如通过目标分子活性或在体外竞争性结合测定中所测量)时，中和或拮抗剂抗体将实质上抑制决定簇与其配体或底物的结合。应当理解，改变的活性可使用本领域公认的技术直接测量或可通过活性改变对下游的影响(例如肿瘤发生或细胞存活)来测量。
B.内化抗体
有证据证明大部分表达的CLDN蛋白保持与致瘤性细胞表面缔合，由此允许公开的抗体或ADC的局部化和内化。在优选实施方案中，此类抗体将与在内化后杀死细胞的一种或多种药物缔合或缀合。在特别优选实施方案中，本发明的ADC将包含内化位点特异性ADC。
如本文所使用，“内化”的抗体是在与相关抗原或受体结合后由细胞摄取(连同任何细胞毒素)的抗体。对于治疗性应用，内化将优选在有需要的受试者中在体内发生。内化的ADC的数目可足以杀死表达抗原的细胞，尤其表达抗原的癌症干细胞。根据作为整体的细胞毒素或ADC的效价，在一些情况下，细胞中摄取单一抗体分子足以杀死抗体结合的目标细胞。例如，某些药物高度有效，使得少量的与抗体缀合的毒素的分子的内化足以杀死肿瘤细胞。可通过本领域公认的测定法(包括以下实施例中描述的测定法)确定抗体在与哺乳动物细胞结合后是否内化。检测抗体是否内化至细胞中的方法也描述于U.S.P.N.7,619,068。
C.消耗抗体
在其它实施方案中，本发明的抗体是消耗抗体。术语“消耗”抗体是指优选结合至细胞表面上或附近的抗原且诱导、促进或引起细胞的死亡(例如通过CDC、ADCC或引入细胞毒性剂)的抗体。在一些实施方案中，所选消耗抗体将与细胞毒素缀合。优选地，消耗抗体将能够杀死定义细胞群体中的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的表达CLDN的细胞。如本文所使用，术语“表观IC50”是指连接至毒素的一抗杀死表达由一抗识别的抗原的细胞的50％的浓度。所述毒素可以直接缀合至一抗，或可以经由识别一抗的二抗或抗体片段与一抗缔合，所述二抗或抗体片段直接缀合至毒素。优选地，消耗性抗体将具有小于5μM、小于1μM、小于100nM、小于50nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于2nM或小于1nM的IC50。在一些实施方案中，细胞群体可包含富集、切分、纯化或分离的致瘤性细胞，包括癌症干细胞。在其它实施方案中，细胞群体可包含包含癌症干细胞的完全肿瘤样品或异源肿瘤提取物。标准生物化学技术可用于根据本文中的教导监测和定量致瘤性细胞的消耗。
D.结合亲和力
本文公开具有对于特定决定簇(例如，CLDN)的高结合亲和力的抗体。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。当解离常数KD(koff/kon)为≤10-7M时，本发明的抗体可以免疫特异性结合其目标抗原。当KD为≤5x10-9M时，抗体以高亲和力特异性结合抗原，且当KD为≤5x10-10M时，抗体以非常高亲和力特异性结合抗原。在本发明的一个实施方案中，抗体具有≤10-9M的KD和约1x10-4/sec的解离速率。在本发明的一个实施方案中，解离速率为<1x10-5/sec。在本发明的其它实施方案中，抗体将以约10-7M至10-10M的KD结合至决定簇，并且在又另一个实施方案中，它将以KD≤2x10-10M结合。本发明的还有其它所选实施方案包含具有以下KD(koff/kon)的抗体：小于10-6M、小于5x10-6M、小于10-7M、小于5x10-7M、小于10-8M、小于5x10-8M、小于10-9M、小于5x10-9M、小于10-10M、小于5x10-10M、小于10-11M、小于5x10-11M、小于10-12M、小于5x10-12M、小于10-13M、小于5x10-13M、小于10-14M、小于5x10-14M、小于10-15M或小于5x10-15M。
在某些实施方案中，本发明的免疫特异性结合至决定簇(例如，CLDN)的抗体可以具有以下结合速率常数或kon(或ka)速率(抗体+抗原(Ag)k on←抗体-Ag)：至少105M-ls-l、至少2x105M-ls-l、至少5x105M-ls-l、至少106M-ls-l、至少5x106M-ls-l、至少107M-ls-l、至少5x107M-ls-l或至少108M-ls-l。
在另一个实施方案中，本发明的免疫特异性结合至决定簇(例如，CLDN)的抗体可以具有以下解离速率常数或koff(或kd)速率(抗体+抗原(Ag)k off←抗体-Ag)：小于l0-ls-l、小于5xl0-ls-l、小于l0-2s-l、小于5xl0-2s-l、小于l0-3s-l、小于5xl0-3s-l、小于l0-4s-l、小于5xl04s-l、小于l0-5s-l、小于5xl0-5s-l、小于l0-6s-l、小于5xl0-6s-l、小于l0-7s-l、小于5xl0-7s-l、小于l0-8s-l、小于5xl0-8s-l、小于l0-9s-l、小于5xl0-9s-l或小于l0-10s-l。
结合亲和力可以使用本领域中已知的各种技术测定，所述技术例如，表面等离振子共振、生物层干涉、双极化干涉、静态光散射、动态光散射、等温滴定量热法、ELISA、分析超速离心和流式细胞术。
如本文所使用，术语“表观结合亲和力”是指当在细胞的表面上过表达抗原时抗体与其目标抗原的表观结合。抗体对于抗原的表观结合亲和力在本文中描述为“表观EC50”，这是抗体与过表达抗原的细胞的50％最大结合发生的浓度。在一个实施方案中，如果两种抗体具有彼此差异在于不超过45％、不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过10％或不超过5％的表观EC50值，则它们可以被称为对于抗原具有“基本上相同的”表观结合亲和力，具有>99％置信度。在另一个实施方案中，如果结合多种目标抗原(例如，对于一种或多种CLDN蛋白多反应)的抗体对于各抗原的表观EC50值彼此差异不超过45％、不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，则所述抗体可以被称为对于多种抗原具有“基本上相同的”表观结合亲和力，具有>99％置信度。由于用于测定抗体对于抗原的表观结合亲和力的测定法通常利用过表达抗原且在假定平衡或接近平衡条件下暴露于抗体的细胞，所以表观EC50值反映亲合力或多种结合亲和力的组合或积累强度。因此，在一个相关实施方案中，如果表示为表观EC50值的两种抗体对于表达抗原的目标细胞系的表观结合亲和力彼此差异不超过45％、不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，则它们对于细胞系将共享基本上相同的亲合力，具有>99％置信度。类似地，如果结合多种目标抗原(例如，对于一种或多种CLDN蛋白多反应)的抗体对于各抗原的表观EC50值彼此差异不超过45％、不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，则所述抗体可以被称为对于多种抗原具有基本上相同的亲合力，具有>99％置信度。
E.分仓和表位作图
如本文所使用，术语“分仓(binning)”是指用于基于抗体的抗原结合特征和它们是否与彼此竞争而将抗体分组至“仓室”中的方法。仓室的初始测定可通过如本文所述的表位作图和其它技术进一步改进和证实。然而，应当理解，凭经验将抗体分配至各个仓室提供可指示公开的抗体的治疗潜能的信息。
更具体地，可通过使用本领域中已知和本文实施例中描述的方法确定所选参考抗体(或其片段)是否竞争结合第二测试抗体(即处于相同仓室)。在一个实施方案中，参考抗体与CLDN抗原在饱和条件下缔合，且然后使用标准免疫化学技术测定二级或测试抗体结合至CLDN的能力。如果测试抗体能够实质上与参考抗-CLDN抗体同时结合至CLDN，则与初级或参考抗体相比，二级或测试抗体结合至不同表位。然而，如果测试抗体不能实质上同时结合至CLDN，则测试抗体结合至相同表位、重叠表位或与由初级抗体结合的表位紧邻(至少位阻上)的表位。即，测试抗体竞争抗原结合且与参考抗体处于同一仓室中。
当在公开的抗体的上下文中使用时，术语“竞争”或“竞争抗体”意指抗体之间的竞争，如由其中测试抗体或所测试的免疫功能性片段抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合的测定法所测定。通常，此类测定法涉及使用结合至固体表面或细胞的纯化的抗原(例如CLDN或其结构域或片段)、未标记的测试抗体和标记的参考抗体。通过在测试抗体存在的情况下测定结合至固体表面或细胞的标记量来测量竞争性抑制。通常，测试抗体以过量存在和/或允许首先结合。关于测定竞争性结合的方法的额外细节提供于本文实施例中。通常，当竞争抗体以过量存在时，其使参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况下，使结合抑制至少80％、85％、90％、95％或97％或更多。
相反，当结合参考抗体时，其优选使随后添加的测试抗体(即，抗-CLDN抗体)的结合抑制至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况下，使测试抗体的结合抑制至少80％、85％、90％、95％或97％或更多。
通常，分仓或竞争性结合可以使用各种本领域公认的技术来确定，所述技术诸如例如，免疫测定法，诸如western印迹，放射免疫测定法，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，“夹心”免疫测定法，免疫沉淀测定法，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散测定法，凝集测定法，补体-固定测定法，免疫放射测定法，荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法。此类免疫测定法是常规和本领域中众所周知的(参见，Ausubel等人，编，(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。此外，也可以使用交叉阻断测定法(参见，例如，WO 2003/48731；和Harlow等人(1988)Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane)。
用于确定竞争性抑制的其它技术(且因此为“仓室”)，包括：表面等离振子共振，其使用，例如，BIAcoreTM 2000系统(GE Healthcare)；使用生物层干涉，其使用，例如，Octet RED(ForteBio)；或流式细胞术珠阵列，其使用，例如，FACSCanto II(BD Biosciences)或多重LUMINEXTM检测阵列(Luminex)。
Luminex是能够实现大规模多重抗体配对的基于珠粒的免疫分测定平台。所述测定比较抗体对与目标抗原的同时结合模式。配对中的一种抗体(捕获mAb)结合至Luminex珠粒，其中各捕获mAb结合至不同颜色的珠粒。另一种抗体(检测mAb)结合至荧光信号(例如藻红蛋白(PE))。所述测定分析抗体与抗原的同时结合(配对)且将具有类似配对概况的抗体分组在一起。检测mAb和捕获mAb的类似概况表明两种抗体结合至相同或密切相关的表位。在一个实施方案中，配对概况可以使用Pearson相关系数确定，以鉴定与测试的抗体的实验对象组上的任何特定抗体最密切相关的抗体。在优选的实施方案中，如果抗体对的Pearson相关系数为至少0.9，则将确定测试/检测mAb与参考/捕获mAb在相同的仓室中。在其它实施方案中，Pearson相关系数为至少0.8、0.85、0.87或0.89。在进一步实施方案中，Pearson相关系数为至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析获得自Luminex测定的数据的其它方法描述于U.S.P.N.8,568,992。Luminex同时分析100种不同类型的珠粒(或更多)的能力提供几乎无限的抗原和/或抗体表面，导致生物传感器测定中的抗体表位概况分析中的通量和分辨率改善(Miller,等人,2011,PMID:21223970)。
“表面等离振子共振”是指允许通过检测生物传感器基质内蛋白浓度的变化来分析实时特异性相互作用的光学现象。
在其它实施方案中，可用于确定测试抗体是否“竞争”与参考抗体结合的技术是“生物层干涉测量术”，即这样的光学分析技术，其分析从两个表面反射的白光的干涉模式：生物传感器尖端上固定的蛋白的层，和内部参考层。结合至生物传感器尖端的分子数目的任何变化均引起可实时测量的干涉模式的偏移。此类生物层干涉测定可以如下使用Octet RED机器进行。将参考抗体(Ab1)捕获于抗小鼠捕获芯片上，然后使用高浓度非结合抗体以封闭芯片且收集基线。然后通过特异性抗体(Ab1)捕获单体、重组目标蛋白，且将尖端浸入具有作为对照的相同抗体(Ab1)的孔或具有不同测试抗体(Ab2)的孔中。如果未发生进一步结合(如通过与对照Ab1比较结合水平确定)，则确定Ab1和Ab2是“竞争”抗体。如果用Ab2观察到额外结合，则确定Ab1和Ab2不与彼此“竞争”。可扩展该方法以使用代表独特仓室的96孔板中的一整列抗体筛选独特抗体的大型文库。在优选的实施方案中，如果参考抗体使测试抗体与共同抗原的特异性结合降低至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％，则测试抗体将与参考抗体竞争。在其它实施方案中，使结合抑制至少80％、85％、90％、95％或97％或更多。
一旦已经定义涵盖一组竞争抗体的仓室，则可以实施进一步表征以确定仓室中的抗体结合的抗原上的特定结构域或表位。结构域-水平表位作图可以使用由Cochran等人,2004,PMID:15099763描述的方案的改良方案来进行。精细表位作图是确定抗原上包含抗体结合的决定簇的表位的特定氨基酸的方法。术语“表位”在其常用生物化学意义上使用，并且是指目标抗原的能够被识别且被特定抗体特异性结合的该部分。在某些实施方案中，表位或免疫原性决定簇包括分子的化学活性表面分组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且在某些实施方案中，可具有特定三维结构特征和/或比电荷特征。在某些实施方案中，当抗体优先识别蛋白和/或大分子的复杂混合物中的其目标抗原时，则抗体被称为特异性结合抗原。
当抗原是多肽(诸如CLDN)时，表位通常可由连续氨基酸和通过蛋白的三级折叠而相邻的非连续氨基酸(“构象表位”)形成。在此类构象表位中，存在跨越蛋白上的彼此线性分离的氨基酸残基的相互作用点。由连续氨基酸形成的表位(有时称为“线性”或“连续”表位)通常在蛋白变性后保留，而由三级折叠形成的表位通常在蛋白变性后损失。抗体表位通常包括独特空间构象中的至少3个、且更通常至少5个或8-10个氨基酸。表位确定或“表位作图”的方法是本领域中众所周知的，并且可以与本公开内容结合使用以鉴定CLDN上由公开的抗体结合的表位。
相容表位作图技术包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹法(Reineke(2004)MethodsMol Biol 248:443-63)或肽裂解分析。此外，可使用诸如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰的方法(Tomer(2000)Protein Science 9:487-496)。在其它实施方案中，修饰辅助概况分析(Modification-Assisted Profiling；MAP)，也称为基于抗原结构的抗体概况分析(Antigen Structure-based Antibody Profiling；ASAP)提供根据各抗体与化学或酶促修饰的抗原表面的结合概况的相似性来将大量针对相同抗原的单克隆抗体归类的方法(U.S.P.N.2004/0101920)。该技术允许快速过滤遗传相同抗体，使得表征可集中于遗传相异抗体。应当理解，MAP可用于将本发明的抗-CLDN抗体分选至结合不同表位的抗体组。
一旦确定抗原上的期望的表位，则可能生成针对该表位的抗体，例如通过使用本发明中描述的技术用包含表位的肽进行免疫。或者，在发现过程期间，抗体的生成和表征可阐明关于位于特定结构域或基序中的期望的表位的信息。从该信息，则可能针对与相同表位的结合来竞争筛选抗体。一种实现这一点的方法是进行竞争研究以发现竞争结合抗原的抗体。用于基于抗体的交叉竞争而对抗体进行分仓的高通量方法描述于WO 03/48731中。其它分仓或结构域水平或表位作图的其它方法(包含抗体竞争或酵母上的抗原片段表达)是本领域中众所周知的。
V抗体缀合物
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体可以与药学活性部分或诊断部分缀合以形成“抗体药物缀合物”(ADC)或“抗体缀合物”。术语“缀合物”被广泛使用，并且是指任何药学活性部分或诊断部分与本发明的抗体的共价或非共价缔合，而无论缔合的方法。在某些实施方案中，所述缔合通过抗体的赖氨酸或半胱氨酸残基来实现。在特别优选的实施方案中，药物活性或诊断部分可以经由一个或多个位点特异性游离的半胱氨酸缀合至抗体。公开的ADC可用于治疗和诊断目的。
本发明的ADC可用于将细胞毒素或其它有效载荷递送至目标位置(例如，致瘤性细胞和/或表达CLDN的细胞)。如本文所使用，术语“药物”或“弹头”可以互换使用，并且将意指生物活性或可检测的分子或化合物，包括如下所述的抗癌剂。“有效载荷”可以包含与任选的连接体化合物组合的药物或弹头。缀合物上的弹头可以包含肽，多肽，蛋白，在体内代谢为活性剂的前体药物，聚合物，核酸分子，小分子，结合剂，模拟剂，合成药物，无机分子，有机分子和放射性同位素。在一个有利实施方案中，公开的ADC在释放并激活有效载荷之前将结合的有效载荷以相对非活性、无毒状态导向至目标位点。这种有效载荷的靶向释放优选通过以下来实现：经由一个或多个半胱氨酸或赖氨酸的有效载荷的稳定缀合和最小化过度缀合的毒性物质种类的ADC制备物的相对均匀的组成。连同被设计为一旦药物连接体已经被递送至肿瘤位点、则大量释放药物的药物连接体，本发明的缀合物可以实质上降低不期望的非特异性毒性。这有利地提供在肿瘤位点的相对高水平的活性细胞毒素，同时最小化非靶向细胞和组织的暴露，从而提供增强的治疗指数。
应当理解，尽管本发明的优选实施方案包含治疗性部分(例如，细胞毒素)，但其它有效载荷诸如诊断剂和生物相容的修饰剂可以得益于由公开的缀合物提供的靶向释放。因此，涉及示例性的治疗有效载荷的任何公开内容也适用于如本文讨论的包含诊断剂或生物相容性修饰剂的有效载荷，除非上下文另有规定。所选有效载荷可以共价或非共价地连接至抗体，并表现出各种化学计量摩尔比，这至少部分地取决于用于实现缀合的方法。本发明的缀合物可通过下式表示：
Ab-[L-D]n或其药学上可接受的盐，其中
a)Ab包含抗-CLDN抗体；
b)L包含任选的连接体；
c)D包含药物；且
d)n是约1至约20的整数。
本领域技术人员将理解，可以使用许多不同的连接体和药物来制造根据上式的缀合物，且缀合方法将取决于组分的选择而变化。因此，与公开的抗体的反应性残基(例如，半胱氨酸或赖氨酸)缔合的任何药物或药物连接体化合物与本文的教导相容。类似地，允许所选药物与抗体的缀合(例如，位点特异性缀合)的任何反应条件都在本发明的范围之内。尽管上述内容，本发明的特别优选的实施方案包括使用与温和的还原剂组合的稳定剂将药物或药物连接体选择性缀合至游离半胱氨酸，如本文所述。此类反应条件趋于提供具有较少的非特异性缀合和污染物和相应较少毒性的更均匀的制剂。
与本文的教导相容的示例性有效载荷描述于下文：
A.治疗剂
本发明的抗体也可缀合、连接或融合至或以其它方式缔合至药学活性部分，所述药学活性部分为治疗性部分或药物，诸如抗癌剂，包括但不限于，细胞毒性剂，细胞生长抑制剂，抗血管生成剂，减积剂，化疗剂，放疗剂，靶向抗癌剂，生物反应调节剂，癌症疫苗，细胞因子，激素疗法，抗转移剂和免疫治疗剂。
优选的示例性抗癌剂(包括同系物和其衍生物)包含1-去氢睾酮、安曲霉素类、放线菌素D、博莱霉素、卡里奇霉素、秋水仙素、环磷酰胺、细胞松弛素B、更生霉素(以前为放线菌素)、二羟基炭疽菌素、二酮、吐根碱、表柔比星、溴化乙锭、依托泊苷、糖皮质激素、短杆菌肽D、利多卡因、美登素诸如DM-1和DM-4(免疫原)、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、紫杉醇、普鲁卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、替尼泊苷、丁卡因和上述任何的药学上可接受的盐或溶剂化物、酸或衍生物。
额外的相容的细胞毒素包括多拉司他汀类和阿里他汀类(auristatins)，包括单甲基阿里他汀E(MMAE)和单甲基阿里他汀F(MMAF)(Seattle Genetics)，鹅膏蕈碱类诸如α-鹅膏蕈碱，β-鹅膏蕈碱，γ-鹅膏蕈碱或ε-鹅膏蕈碱(Heidelberg Pharma)，DNA小沟结合剂诸如多卡米星衍生物(Syntarga)，烷化剂诸如修饰或二聚的吡咯并苯并二氮杂(PBD)，氮芥，thioepa，苯丁酸氮芥，美法仑，卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲霉素，丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂，剪接抑制剂诸如meayamycin类似物或衍生物(例如，FR901464，如U.S.P.N.7825267中所述)，管状结合剂诸如埃博霉素类似物和紫杉醇和DNA损伤剂诸如刺孢霉素和埃斯波霉素，抗代谢物诸如甲氨喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，和5-氟尿嘧啶达卡巴，抗有丝分裂剂诸如长春碱和长春新碱，和蒽环类诸如柔红霉素(以前为道诺霉素)和多柔比星和上述任何的药学上可接受的盐或溶剂化物、酸或衍生物。
在一个实施方案中，本发明的抗体可以与抗-CD3结合分子缔合，以招募细胞毒性T细胞，并让它们靶向致瘤性细胞(BiTE technology；参见例如Fuhrmann等人(2010)AnnualMeeting of AACR Abstract No.5625)。
在进一步实施方案中，本发明的ADC可以包含使用适当的连接体缀合的治疗性放射性同位素。可以与此类实施方案相容的示例性放射性同位素包括，但不限于，碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、铜(62Cu、64Cu、67Cu)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、111In)、铋(212Bi、213Bi)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Tin、225Ac、76Br和211At。其它放射性核素也可以作为诊断和治疗剂，特别是60至4,000keV的能量范围内的那些。
在某些优选的实施方案中，本发明的ADC可以包含作为细胞毒性剂的吡咯并苯并二氮杂(PBD)及其药学上可接受的盐或溶剂化物、酸或衍生物。PBD是烷化剂，其通过在小沟共价结合至DNA和抑制核酸合成而发挥抗肿瘤活性。PBD已显示具有有效的抗肿瘤特性，同时表现出最小的骨髓抑制。与本发明相容的PBD可以使用几种类型的连接体(例如，包含具有游离巯基的马来酰亚胺基部分的肽基连接体)连接至抗体，并且在某些实施方案中，是二聚体形式(即，PBD二聚体)。可缀合至公开的抗体的相容的PBD(和任选的连接体)描述于例如：U.S.P.N.6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、2011/0256157、WO2011/130613、WO2011/128650、WO2011/130616和WO2014/057074。
本发明的抗体也可以缀合至生物反应调节剂。例如，在特别优选的实施方案中，药物部分可以是具有期望生物学活性的多肽。此类蛋白可以包括，例如，毒素，诸如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、豹蛙酶(或另一种细胞毒性RNase)、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、白喉毒素；细胞凋亡剂，诸如肿瘤坏死因子，例如，TNF-α或TNF-β，α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、AIM I(WO 97/33899)、AIM II(WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi等人，1994,PMID:7826947)、和VEGI(WO 99/23105)；血栓形成药，抗血管发生药，例如制管张素或内皮生长抑制素；淋巴因子，例如，白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、或生长因子，例如，生长激素(GH)。
B.诊断或检测剂
在其它优选的实施方案中，本发明的抗体或其片段或衍生物与诊断或可检测试剂、标记物或报道分子缀合，所述诊断或可检测试剂、标记物或报道分子可以是例如生物分子(例如，肽或核苷酸)、小分子、荧光团或放射性同位素。标记的抗体可用于监测过度增殖性病症的发展或进展或作为临床测试程序的部分来测定特定疗法(包括公开的抗体(即治疗诊断剂))的效力或测定治疗的将来进程。此类标记物或报道分子也可以用于纯化选择的抗体用于抗体分析(例如，表位结合或抗体分仓)、分开或分离致瘤性细胞或用于临床前程序或毒理学研究中。
可以通过将抗体与可检测物质偶联来实现此类诊断、分析和/或检测，所述可检测物质包括但不限于：各种酶，包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，诸如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光材料，诸如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光物质，诸如但不限于荧光素酶、荧光素和水母蛋白；放射性物质，诸如但不限于碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、111In)和锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、和117Tin；使用各种正电子发射断层显像的正电子发射金属、非放射性顺磁金属离子和放射性标记或与特定放射性同位素缀合的分子。在此类实施方案中，适当的检测方法是本领域中众所周知的，并且可以容易地从许多商业来源获得。
在其它实施方案中，可以将抗体或其片段与标记物序列或化合物诸如肽或荧光团融合或缀合，以促进纯化或诊断或分析程序诸如免疫组织化学、生物层干涉测量、表面等离振子共振、流式细胞术、竞争性ELISA、FACs等。在优选的实施方案中，所述标记物包含组氨酸标签，诸如pQE载体提供的标签(Qiagen)等等，其中许多可商业获得。可用于纯化的其它肽标签包括但不限于：对应于源自流感血凝素蛋白的表位的血凝素“HA”标签(Wilson等人，1984，Cell 37：767)和“flag”标签(U.S.P.N.4,703,004)。
C.生物相容的修饰剂
在所选实施方案中，本发明的抗体可以与生物相容的修饰剂缀合，所述生物相容的修饰剂可用于如期望地调整、改变、改进或调节抗体特征。例如，可以通过结合相对高分子量聚合物分子诸如商业可得的聚乙二醇(PEG)或类似的生物相容的聚合物而生成具有增加的体内半衰期的抗体或融合构建体。本领域技术人员将理解，可以以许多不同分子量和分子构型获得PEG，可以选择所述分子量和分子构型为抗体赋予特定特性(例如，可以定制半衰期)。可以通过将PEG缀合至抗体或抗体片段的N-或C-末端，或经由赖氨酸残基上存在的ε-氨基而将PEG连接至有或没有多功能连接体的所述抗体或抗体片段或衍生物。可以使用导致生物学活性最小丧失的直链或支链聚合物衍生化。可以通过SDS-PAGE和质谱密切监测缀合程度，从而确保PEG分子与抗体分子最佳缀合。可以通过例如大小排阻层析或离子交换层析将未反应的PEG与抗体-PEG缀合物相分离。以类似的方式，可以将公开的抗体与白蛋白缀合，以使抗体或抗体片段在体内更稳定或具有更长的体内半衰期。该技术是本领域众所周知的，参见，例如，WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和EP 0413,622。其它生物相容的缀合物对于普通技术人员是显而易见的，并且可以根据本文的教导容易地鉴定。
D.连接体化合物
许多连接体化合物可用于将本发明的抗体缀合至相关药物。优选地，连接体将与反应性残基(优选地，半胱氨酸或赖氨酸)和所选药物化合物共价结合。因此，与所选抗体残基反应且可用于提供本发明的相对稳定的缀合物(位点特异性的或以其它方式)的任何连接体与本文教导相容。
许多相容的连接体可以有利地结合至亲核的还原的半胱氨酸和赖氨酸。涉及还原的半胱氨酸和赖氨酸的缀合反应包括但不限于，硫醇-马来酰亚胺，硫醇-卤代(酰卤)，硫醇-烯，硫醇-炔，硫醇-乙烯基砜，硫醇-二砜，硫醇-硫代磺酸盐(或酯)，硫醇-吡啶基二硫化物和硫醇-对氟(parafluoro)反应。如本文进一步讨论，硫醇-马来酰亚胺生物缀合是最广泛使用的方法之一，这是由于其快速反应速率和温和的缀合条件。这种方法的一个问题是，逆向迈克尔反应(retro-Michael reaction)，和马来酰亚胺基连接的有效载荷从抗体损失或转移至血浆中的其它蛋白(诸如例如，人血清白蛋白)的可能性。然而，在优选实施方案中，如本文实施例15中描述的选择性还原和位点特异性抗体的使用可用于稳定缀合物并降低这种不期望的转移。硫醇-酰卤反应提供不能经受逆向迈克尔反应，因此更稳定的生物缀合物。然而，与基于马来酰亚胺的缀合相比，硫醇-卤化物反应通常具有较慢的反应速率，因此效率不高。硫醇-吡啶基二硫化物反应是另一种流行的生物缀合路线。吡啶基二硫化物经历与游离硫醇的快速交换，导致产生混合二硫化物和释放吡啶-2-硫酮。混合二硫化物可在还原性细胞环境中裂解，释放有效载荷。在生物缀合中获得更多关注的其它方法是硫醇-乙烯基砜和硫醇-二砜反应，其各自都与本文教导相容且明确地包括在本发明的范围之内。
在优选实施方案中，相容连接体将为细胞外环境中的ADC赋予稳定性，防止ADC分子的聚集，并保持在ADC易溶于在含水介质中游离可溶，并处于单体状态。在转运或递送至细胞中之前，ADC优选是稳定的且保持完整，即，抗体保持连接至药物部分。尽管连接体在目标细胞以外是稳定的，但是它们被设计为在细胞内以一定有效的速率被裂解或降解。因此，有效的连接体将：(i)保持抗体的特异性结合特性；(ii)允许缀合物或药物部分的细胞内递送；(iii)保持稳定和完整，即不裂解或降解，直至缀合物已被递送或转运至其目标位点；和(iv)维持药物部分的细胞毒性、细胞杀伤作用或细胞抑制效果。ADC的稳定性可通过标准分析技术进行测定，所述标准分析技术诸如质谱法、疏水性相互作用色谱法(HIC)、HPLC，和分离/分析技术LC/MS。如上面所描述，抗体和药物部分的共价结合需要连接体具有两个反应性官能团，即在反应意义上是二价的。可用于连接两个或更多个官能或生物活性部分(诸如MMAE和位点特异性抗体)的二价连接体试剂是已知的，并且已描述用于提供其所得缀合物的方法。
与本发明相容的连接体可以广义地被分类为可裂解和不可裂解的连接体。可裂解的连接体(其可以包括酸不稳定连接体、蛋白酶可裂解的连接体和二硫化物连接体)被内化至目标细胞中且在细胞内的内体-溶酶体途径中裂解。细胞毒素的释放和活化依赖于内体/溶酶体酸性隔室，所述内体/溶酶体酸性隔室促进酸不稳定的化学键诸如腙或肟的裂解。如果溶酶体特异性蛋白酶裂解位点被改造为进入连接体，则细胞毒素将在它们的细胞内目标附近释放。或者，含有混合二硫化物的连接体提供一种方法，通过所述方法，细胞毒性有效载荷在细胞内释放(因为它们在细胞的还原环境中是选择性裂解的)，但不能在血流中的富氧环境中释放。通过比较的方式，含有酰胺连接的聚乙二醇或烷基间隔基的相容性非可裂解连接体在目标细胞内ADC的溶酶体降解期间释放毒性的有效载荷。在一些方面，连接体的选择将取决于缀合物中使用的特定药物。
因此，本发明的某些实施方案包含通过细胞内环境(例如，在溶酶体或内体或胞膜窖内)中存在的裂解剂可裂解的连接体。所述连接体可以是，例如，由细胞内肽酶或蛋白酶(包括，但不限于，溶酶体或内体蛋白酶)裂解的肽基连接体。在一些实施方案中，所述肽基连接体是至少两个氨基酸长，或至少三个氨基酸长。裂解剂可包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，已知其各自水解二肽药物衍生物，导致活性药物在目标细胞内的释放。可通过硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶B裂解的示例性肽基连接体是包含Phe-Leu的肽，因为已经发现组织蛋白酶-B在癌组织中高度表达。此类连接体的其它实例描述于，例如，U.S.P.N.6,214,345。在一个特定优选的实施方案中，可由细胞内蛋白酶裂解的肽基连接体是Val-Cit连接体、Val-Ala连接体或Phe-Lys连接体，诸如U.S.P.N.6,214,345中所述。使用治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优点是，所述药剂当缀合时通常减弱，且所述缀合物的血清稳定性通常高。
在其它实施方案中，可裂解的连接体是pH敏感的。通常，pH敏感的连接体在酸性条件下是可水解的。例如，可使用在溶酶体中可水解的酸不稳定连接体(例如，腙，肟，缩氨基脲，缩氨基硫脲，顺式乌头酰胺，原酸酯，缩醛，缩酮，等)(参见例如，U.S.P.N.5,122,368；5,824,805；5,622,929)。此类连接体在中性pH条件(诸如在血液中的条件)下是相对稳定的，但在低于pH5.5或5.0(溶酶体的近似pH)是不稳定的。
在还有其它实施方案中，连接体在还原条件下是可裂解的(例如，二硫化物连接体)。多种二硫化物连接体是本领域已知的，包括，例如，可使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)，SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)，SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)来形成的二硫化物连接体。在还有其它具体实施方案中，连接体是丙二酸酯连接体(Johnson等人,1995,Anticancer Res.15:1387-93)，马来酰亚胺基苯甲酰基连接体(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)，或3'-N-酰胺类似物(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
在特别优选的实施方案中(描述于U.S.P.N.2011/0256157)，相容的肽基连接体将包含：
其中星号表示与药物的连接点，CBA是抗-CLDN抗体，L1是连接体，A是将L1连接至抗体上的反应性残基的连接基团，L2是共价键或与-OC(＝O)-一起形成自脱落(self-immolative)连接体，并且L1或L2是可裂解的连接体。
L1优选为可裂解的连接体，并且可以被称为用于针对裂解活化连接体的触发器。
L1和L2(当存在时)的性质可以广泛地变化。这些基团基于它们的裂解特性进行选择，这可以通过在被递送缀合物的位点的条件来决定。通过酶的作用裂解的那些连接体是优选的，尽管也可以使用通过pH(例如，酸或碱不稳定的)、温度或照射后(例如光不稳定的)的变化可裂解的连接体。在还原或氧化条件下可裂解的连接体也可以用于本发明。
L1可以包含氨基酸的连续序列。氨基酸序列可以是用于酶促裂解的目标底物，从而允许释放药物。
在一个实施方案中，L1是通过酶的作用可裂解的。在一个实施方案中，酶是酯酶或肽酶。
在一个实施方案中，L1包含二肽。二肽可以被表示为-NH-X1-X2-CO-，其中-NH-和-CO-分别表示氨基酸基团X1和X2的N-和C-末端。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸的任何组合。当连接体是组织蛋白酶不稳定的连接体时，二肽可以是组织蛋白酶介导的裂解的作用位点。
另外，对于具有羧基或氨基侧链官能团的那些氨基酸基团，分别例如Glu和Lys，CO和NH可表示侧链官能团。
在一个实施方案中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：-Phe-Lys-，-Val-Ala-，-Val-Lys-，-Ala-Lys-，-Val-Cit-，-Phe-Cit-，-Leu-Cit-，-Ile-Cit-，-Phe-Arg-和-Trp-Cit-，其中Cit为瓜氨酸。
优选的是，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：-Phe-Lys-，-Val-Ala-，-Val-Lys-，-Ala-Lys-和-Val-Cit-。
最优选的是，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
在一个实施方案中，L2存在并与-C(＝O)O-一起形成自脱落连接体。在一个实施方案中，L2是酶促活性的底物，从而允许释放药物。
在一个实施方案中，当L1通过酶的作用可裂解并且L2存在时，酶裂解L1和L2之间的键。
L1和L2，当存在时，可以通过选自以下的键连接：-C(＝O)NH-，-C(＝O)O-，-NHC(＝O)-，-OC(＝O)-，-O-C(＝O)O-，-NH-C(＝O)O-，-OC(＝O)NH-和-NHC(＝O)NH-。
连接至L2的L1的氨基可以是氨基酸的N-末端，或者可以从氨基酸侧链，例如赖氨酸氨基酸侧链的氨基衍生。
连接至L2的L1的羧基可以是氨基酸的C-末端，或者可以从氨基酸侧链，例如谷氨酸氨基酸侧链的羧基衍生。
连接至L2的L1的羟基可以由氨基酸侧链，例如丝氨酸氨基酸侧链的羟基衍生。
术语“氨基酸侧链”包括在以下中发现的那些基团：(i)天然存在的氨基酸，诸如丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，和缬氨酸；(ii)次要氨基酸诸如鸟氨酸和瓜氨酸；(iii)非天然氨基酸，β-氨基酸，天然存在的氨基酸的合成的类似物和衍生物；和(iv)前述物质的所有对映异构体，非对映异构体，异构体富集的，同位素标记的(例如2H，3H，14C，15N)，受保护的形式，和外消旋混合物。
在一个实施方案中，-C(＝O)O-和L2一起形成以下基团：
其中星号表示与药物或细胞毒性剂位置的连接点，波浪线表示与连接体L1的连接点，Y为-N(H)-，-O-，-C(＝O)N(H)-或-C(＝O)O-，并且n为0至3。亚苯基环任选被一个、两个或三个如本文所述的取代基取代。在一个实施方案中，亚苯基任选被卤素、NO2、R或OR取代。
在一个实施方案中，Y是NH。
在一个实施方案中，n是0或1。优选的是，n为0。
当Y是NH且n是0时，自脱落连接体可被称为对氨基苄基羰基连接体(PABC)。
在另一特别优选的实施方案中，连接体可以包括自脱落连接体，且二肽一起形成基团-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其如下所示：
其中星号表示与所选细胞毒性部分的连接点，且波浪线表示与可被缀合至抗体的连接体(例如，间隔基-抗体结合区段)的剩余部分的连接点。在二肽的酶促裂解后，当远程位点被活化时，自脱落连接体将允许受保护的化合物(即，细胞毒素)的彻底释放，这沿着下面所示的路线进行：
其中L*是连接体的剩余部分的活化形式，所述连接体包含现在已经裂解的肽基单元。药物的彻底释放确保它们将保持期望的毒性活性。
在一个实施方案中，A为共价键。因此，L1与抗体直接相连。例如，当L1包含连续氨基酸序列时，该序列的N-末端可以直接连接至抗体残基。
在另一个实施方案中，A是间隔基团。因此，L1与抗体间接地连接。
L1和A可以通过选自以下的键连接：-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-NHC(＝O)-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、和-NHC(＝O)NH-。
如将在下面更详细地讨论，本发明的药物连接体将优选连接至半胱氨酸(包括游离半胱氨酸)上的反应性硫醇亲核体。为此，通过用各种还原剂诸如DTT或TCEP或如本文所述的温和还原剂处理，可以使抗体的半胱氨酸具有与连接体试剂缀合的反应性。在其它实施方案中，本发明的药物连接体将优选连接至赖氨酸。
优选的是，连接体含有亲电官能团，其用于与抗体上的亲核官能团反应。抗体上的亲核基团包括，但不限于：(i)N末端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸，和(iv)当抗体被糖基化时的糖羟基或氨基。胺、硫醇和羟基基团是亲核的，并且能够反应以便与包括以下的连接体部分和连接体试剂上的亲电基团形成共价键：(i)马来酰亚胺基团，(ii)活化的二硫化物，(iii)活性酯，诸如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯，HOBt(N-羟基苯并三唑)酯，卤代甲酸酯，和酰卤；(iv)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；和(v)醛类，酮类，羧基，且，其中的一些例举如下：
在特别优选的实施方案中，位点特异性抗体和药物-连接体部分之间的连接是通过位点特异性抗体的游离半胱氨酸的硫醇残基和存在于连接体上的末端马来酰亚胺基团。在此类实施方案中，抗体和药物-连接体之间的连接是：
其中星号表示与药物-连接体的剩余部分的连接点，并且波浪线表示与抗体的剩余部分的连接点。在本实施方案中，S原子优选衍生自位点特异性的游离半胱氨酸。关于其它相容的连接体，结合部分包含可与活化的残基反应以提供期望的缀合物的末端碘乙酰胺。在任何情况下，鉴于本公开内容，本领域技术人员可容易地将公开的药物-连接体化合物各自与相容抗-CLDN位点特异性抗体缀合。
E.缀合
应当理解，许多众所周知的不同的反应可用于将药物部分和/或连接体连接至所选抗体。例如，利用半胱氨酸的巯基的各种反应可用于缀合期望部分。特别优选的实施方案将包括缀合包含一个或多个游离半胱氨酸的抗体，如下面详细讨论。在其它实施方案中，本发明的ADC可以通过将药物缀合至所选抗体中存在的赖氨酸残基的溶剂暴露的氨基而生成。还有其它实施方案包括活化N-末端的苏氨酸和丝氨酸残基，其然后可用于将公开的有效载荷连接至抗体。所选缀合方法将优选地适合于优化连接至抗体的药物的数目，并提供相对高的治疗指数。
用于将治疗性化合物缀合至半胱氨酸残基的各种方法是本领域中已知的，并且对于本领域技术人员是显而易见的。在碱性条件下，半胱氨酸残基将被去质子化，以生成硫醇盐亲核体，所述硫醇盐亲核体可以与软亲电体诸如马来酰亚胺和碘乙酰胺反应。通常，用于此类缀合的试剂可以与半胱氨酸的半胱氨酸硫醇直接反应以形成缀合的蛋白，或与连接体-药物直接反应以形成连接体-药物中间体。在连接体的情况下，采用有机化学反应、条件和试剂的几个途径是本领域技术人员已知的，包括：(1)本发明的蛋白的半胱氨酸基团与连接体试剂经由共价键反应，以形成蛋白-连接体中间体，随后与活化的化合物反应；和(2)化合物的亲核基团与连接体试剂经由共价键反应，以形成药物-连接体中间体，随后与本发明的蛋白的半胱氨酸基团反应。如本领域技术人员从前述将显而易见，双官能连接体可用于本发明中。例如，所述双官能连接体可以包含用于共价连接至一个或多个半胱氨酸残基的硫醇修饰基团和用于共价或非共价连接至所述化合物的至少一个连接部分(例如，第二硫醇修饰部分)。
缀合前，可通过用还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT)或(三(2-羧乙基)膦(TCEP))处理使抗体具有与连接体试剂缀合的反应性。在其它实施方案中，可通过赖氨酸与试剂(包括但不限于2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut氏试剂)、SATA、SATP或SAT(PEG)4)的反应将其它亲核基团引入抗体中，导致胺转化为硫醇。
关于此类缀合，半胱氨酸硫醇或赖氨酸氨基团是亲核的，且能够反应以便与连接体试剂或化合物-连接体中间体或药物上的亲电基团形成共价键，所述亲电基团包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯类，HOBt酯类，卤代甲酸酯类和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺类；(iii)醛类，酮类，羧基和马来酰亚胺基团类；和(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物，经由硫化物交换。化合物或连接体上的亲核基团包括，但不限于：胺，硫醇，羟基，酰肼，肟，肼，缩氨基硫脲，肼羧酸酯，和芳基酰肼基团，其能够反应以便与连接体部分和连接体试剂上的亲电基团形成共价键。
优选的标记试剂包括马来酰亚胺，卤代乙酰基，碘乙酰胺琥珀酰亚胺基酯，异硫氰酸酯，磺酰氯，2,6-二氯三嗪基，五氟苯基酯和亚磷酰胺，尽管也可以使用其它官能团。在某些实施方案中，方法包括，例如，使用马来酰亚胺、碘乙酰胺或卤代乙酰/烷基卤化物、氮杂环丙烷(aziridne)、丙烯酰基衍生物与半胱氨酸的硫醇反应以产生硫醚，所述硫醚与化合物反应。用活化的piridyldisulphide二硫化物交换游离的硫醇也可用于产生缀合物(例如，使用5-硫代-2-硝甲酸(TNB))。优选地，使用马来酰亚胺。
如上所示，赖氨酸也可用作反应性残基以实现缀合，如本文所述。亲核赖氨酸残基通常通过胺-反应的琥珀酰亚胺酯靶向。为了获得去质子的赖氨酸残基的最佳数目，水溶液的pH必须低于赖氨酸铵基团的pKa，其为约10.5，所以反应的典型pH为约8和9。用于偶联反应的常见试剂是NHS-酯，其通过赖氨酸酰化机制与亲核赖氨酸反应。经历类似反应的其它相容的试剂包含异氰酸酯和异硫氰酸酯，其也可以与本文的教导结合使用以提供ADC。一旦已经活化赖氨酸，上述连接基团中的许多可用于将弹头共价结合至抗体。
用于将化合物缀合至苏氨酸或丝氨酸残基(优选N-末端残基)的方法也是本领域中已知的。例如，已经描述方法，其中羰基前体衍生自丝氨酸或苏氨酸的1,2-氨基醇，其可以通过高碘酸盐氧化选择性且迅速转化为醛形式。醛与待连接至本发明的蛋白的化合物中的半胱氨酸的1,2-氨基硫醇的反应形成稳定的噻唑烷产物。该方法特别可用于在N-末端丝氨酸或苏氨酸残基标记蛋白。
在特别优选的实施方案中，可以通过引入一个、两个、三个、四个或多个游离半胱氨酸残基(例如，制备包含一个或多个游离的非天然半胱氨酸氨基酸残基的抗体)而将反应性硫醇基团引入所选抗体(或其片段)。此类位点特异性抗体或改造的抗体允许缀合物制备物表现出增强的稳定性和实质均质性，这至少部分由于，提供本文所述的改造的一个或多个游离半胱氨酸位点和/或新型缀合程序。不同于完全或部分地还原每个链内或链间抗体二硫键以提供缀合位点(且与本发明完全相容)的常规的缀合方法，本发明额外地提供某些制备的游离半胱氨酸位点的选择性还原和将药物-连接体导向至某些制备的游离半胱氨酸位点。由改造的位点和选择性还原促进的缀合特异性允许在期望位置的位点定向缀合的高百分比。显著的是，这些缀合位点中的一些，诸如存在于轻链恒定区的末端区域中的缀合位点，通常难以有效地缀合，因为它们与其它游离半胱氨酸发生交叉反应。然而，通过分子改造和选择性还原所得游离半胱氨酸，可以获得有效缀合率，这大大减少了不希望的高DAR污染物和非特异性毒性。更一般地，改造构建体和包括选择性还原的公开的新型缀合方法提供具有改善的药代动力学和/或药效学和潜在地改善的治疗指数的ADC制备物。
位点特异性构建体呈现一个或多个游离半胱氨酸，其当还原时包含硫醇基团，其是亲核的并且能够反应以与连接体部分上的亲电基团(诸如上面公开的那些)形成共价键。本发明的优选的抗体将具有可还原的非配对链间或链内半胱氨酸，即提供此类亲核基团的半胱氨酸。因此，在某些实施方案中，还原的未配对的半胱氨酸的游离巯基与公开的药物-连接体的末端马来酰亚胺基或卤代乙酰胺基的反应将提供期望的缀合。在此类情况下，可以通过用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或(三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理，使得抗体的游离半胱氨酸对与连接体试剂的缀合具有反应性。因此每个游离半胱氨酸将理论上呈现反应性硫醇亲核体。尽管此类试剂是相容的，但应当理解，可以使用本领域技术人员已知的各种反应、条件和试剂，实现位点特异性抗体的缀合。
此外，已经发现，可以选择性还原所述改造抗体的游离半胱氨酸以提供增强的位点定向缀合并减少不希望的、潜在毒性的污染物。更具体地，已经发现“稳定剂”诸如精氨酸在蛋白中调节蛋白中的分子内和分子间的相互作用，并且可以与选择的还原剂(优选相对温和的)结合使用，以选择性还原游离半胱氨酸并便于如本文所述的位点特异性缀合。如本文所使用，术语“选择性还原(selective reduction)”或“选择性地还原(selectivelyreducing)”可以互换使用，并应当意指一个或多个游离半胱氨酸的还原，而同时基本上不断裂存在于改造抗体中的天然二硫键。在所选实施方案中，这可以通过某些还原剂来实现。在其它优选的实施方案中，改造构建体的选择性还原将包括，使用与还原剂(包括温和还原剂)组合的稳定剂。应当理解的是，术语“选择性缀合”应意指，如本文所述的已经被选择性还原的改造抗体与细胞毒素的缀合。在这方面，组合使用此类稳定剂与还原剂可显著提高位点特异性缀合的效率，如通过在重和轻抗体链上的缀合的程度和制备物的DAR分布所确定。
尽管不希望受任何特定理论所束缚，但此类稳定剂可发挥作用以调节静电微环境和/或在期望的缀合位点调节构象变化，由此允许相对温和的还原剂(其不实质上还原完整的天然二硫键)以促进在期望的游离半胱氨酸位点的缀合。已知此类试剂(例如，某些氨基酸)形成盐桥(经由氢键键合和静电相互作用)，并且可以使得赋予稳定效应的方式调节蛋白-蛋白相互作用，所述稳定效应可引起有利的构象变化和/或可减少不利的蛋白-蛋白相互作用。此外，此类试剂可以发挥作用以在还原后抑制不期望的分子内(和分子间)半胱氨酸-半胱氨酸键的形成，因此促进期望的缀合反应，其中所述改造的位点特异性半胱氨酸(优选经由连接体)结合至药物。由于反应条件不提供完整的天然二硫键的显著还原，缀合反应被自然地驱动到游离半胱氨酸上相对少的反应性硫醇(例如，优选2个游离硫醇)。如先前所提到，这大大降低如本文所述制成的缀合制备物中的非特异性缀合和相应杂质的水平。
在所选实施方案中，与本发明相容的稳定剂将通常包含至少一个胺部分具有碱性pKa的化合物。在某些实施方案中，胺部分将包含伯胺，而在其它优选实施方案中，胺部分将包含仲胺。在还有其它优选实施方案中，胺部分将包含叔胺。在其它所选实施方案中，胺部分将包含氨基酸，而在其它相容的实施方案中，胺部分将包含氨基酸侧链。在还有其它实施方案中，胺部分将包含蛋白原氨基酸。在还有其它实施方案中，胺部分包含非蛋白原氨基酸。在特别优选的实施方案中，相容的稳定剂可以包含精氨酸，赖氨酸，脯氨酸和半胱氨酸。此外，相容的稳定剂可以包括胍和具有碱性pKa的含氮杂环。
在某些实施方案中，相容的稳定剂包含具有至少一个胺部分具有大于约7.5的pKa的化合物，在其它实施方案中，主题胺部分将具有大于约8.0的pKa，在还有其它实施方案中，胺部分将具有大于约8.5的pKa，且在还有其它实施方案中，稳定剂将包含具有大于约9.0的pKa的胺部分。其它优选实施方案将包含稳定剂，其中胺部分将具有大于约9.5的pKa，而某些其它实施方案将包含稳定剂，其表现出具有大于约10.0的pKa的至少一个胺部分。在还有其它优选实施方案中，稳定剂将包含具有pKa大于约10.5的胺部分的化合物，在其它实施方案中，稳定剂将包含具有pKa大于约11.0的胺部分的化合物，而在还有其它实施方案中，稳定剂将包含pKa大于约11.5的胺部分。在还有其它实施方案中，稳定剂将包含具有pKa大于约12.0的胺部分的化合物，而在还有其它实施方案中，稳定剂将包含pKa大于约12.5的胺部分。本领域技术人员将理解，可以使用标准技术容易地计算或测定相关的pKa并且将其用来确定使用所选化合物作为稳定剂的适用性。
公开的稳定剂显示在与某些还原剂组合时特别有效地将缀合靶向至游离位点特异性半胱氨酸。对于本发明的目的，相容的还原剂可包括，产生用于缀合的还原的游离位点特异性半胱氨酸而不显著破坏改造抗体天然二硫键的任何化合物。在此类条件下，由所选稳定剂和还原剂的组合提供，活化的药物连接体主要限于结合至期望的游离位点特异性半胱氨酸位点。相对温和的还原剂或在相对低的浓度使用以提供温和条件的还原剂是特别优选的。如本文所使用，术语“温和的还原剂”或“温和的还原条件”应被保持为意指任何试剂或由还原剂产生的状态(任选地在稳定剂的存在下)，所述试剂或状态提供，在一个或多个游离半胱氨酸位点的硫醇，而基本上不破坏存在于改造抗体中的天然二硫键。即，温和的还原剂或条件能够有效地还原一个或多个游离半胱氨酸(提供硫醇)，而不显著破坏蛋白的天然二硫键。期望的还原条件可以通过许多基于巯基的化合物来提供，所述基于巯基的化合物建立用于选择性缀合的适当环境。在优选的实施方案中，温和的还原剂可以包含具有一个或多个游离硫醇的化合物，而在特别优选的实施方案中，温和的还原剂将包含具有单一游离硫醇的化合物。与本发明相容的还原剂的非限制性实例包括谷胱甘肽，n-乙酰基半胱氨酸，半胱氨酸，2-氨基乙烷-1-硫醇和2-羟基乙烷-1-硫醇。
应当理解的是，以上所述选择性还原方法在靶向缀合至游离半胱氨酸中是特别有效的。在这方面，可通过各种本领域公认的技术来确定缀合至位点特异性抗体中的期望的目标位点的程度(本文定义为“缀合效率”)。可以通过评估目标缀合位点(在本发明中，轻链的c-末端上的游离半胱氨酸)上的缀合相对于所有其它缀合位点上的缀合的百分比，确定药物与抗体的位点特异性缀合的效率。在某些实施方案中，本文方法提供有效地将药物缀合至包含游离半胱氨酸的抗体。在一些实施方案中，缀合效率为至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或更多，如由目标缀合相对于所有其它缀合位点的百分比来测量。
应当进一步理解的是，能够缀合的改造抗体可以含有游离半胱氨酸残基，所述游离半胱氨酸残基包含巯基，所述巯基在抗体产生或存储时被封闭或加帽。此类帽包括与巯基相互作用并防止或抑制缀合形成的蛋白、肽、离子和其它物质。在一些情况下，未缀合的改造抗体可以包含游离半胱氨酸，所述游离半胱氨酸结合在相同或不同的抗体上的其它游离半胱氨酸。如本文所讨论，此类交叉反应性可在制造程序期间导致各种污染物。在一些实施方案中，改造抗体可在缀合反应之前要求脱帽。在具体的实施方案中，本文的抗体是脱帽的，并表现出能够缀合的游离巯基。在具体实施方案中，本文抗体进行脱帽反应，所述脱帽反应不扰乱或重新排列天然存在的二硫键。应当理解，在大多数情况下，在正常的还原反应(还原或选择性还原)过程中发生脱帽反应。
F.DAR分布和纯化
与本发明的位点特异性抗体缀合的优点之一是生成包含狭窄DAR分布的相对均匀的ADC制备物的能力。在这方面，在药物和改造抗体之间的化学计量比方面，公开的构建体和/或选择性缀合提供样品内的ADC物质种类的均质性。如上面简要讨论，术语“药物抗体比”或“DAR”是指，药物与抗体的摩尔比。在一些实施方案中，缀合物制备物在它的DAR分布方面可以是基本上均质的，这意味着在所述制备物中存在具有特定DAR(例如，2或4的DAR)的位点特异性ADC的主要物质种类，其在载荷位点方面(即在游离半胱氨酸上)也是均匀的。在本发明的某些实施方案中，可能通过使用位点特异性抗体或选择性组合，实现期望的均质性。在其它优选的实施方案中，可通过组合使用位点特异性构建体与选择性还原而实现期望的均质性。在还有其它特别优选的实施方案中，可以使用分析或制备色谱技术进一步纯化制备物。在每个这些实施方案中，可以使用本领域已知的各种技术分析ADC样品的均质性，所述技术包括但不限于SDS-PAGE，HPLC(例如，大小排阻HPLC，RP-HPLC，HIC-HPLC等)或毛细管电泳。
关于ADC制备物的纯化，应当理解，可以采用标准的药物的制备方法，以获得期望的纯度。如本文所讨论，液相色谱法诸如反相(RP)和疏水性相互作用色谱法(HIC)可以通过药物载荷值分离混合物中的化合物。在一些情况下，混合模式色谱(MMC)也可以用于分离具有特定的药物载荷的物质种类。更一般地，一旦除去不溶性污染物，可以使用标准技术(诸如，例如，羟磷灰石色谱法，凝胶电泳，透析和亲和色谱法，特别感兴趣的亲和色谱法)进一步纯化抗体制备物。在这方面，蛋白A可用于纯化基于人IgG1、IgG2或IgG4重链的抗体，而蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和用于人IgG3。用于蛋白纯化的其它技术诸如离子交换柱上的分级，乙醇沉淀，硅胶上的色谱，肝素上的色谱，阴离子或阳离子交换树脂上的琼脂糖凝胶色谱(诸如聚天冬氨酸柱)，色谱聚焦，SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的，这取决于待回收的抗体或缀合物。
公开的ADC及其制备物可以包含各种化学计量摩尔比的药物和抗体部分，这取决于抗体(例如，改造构建体)的构型，并且至少部分地取决于用于实现缀合的方法。在某些实施方案中，药物载荷/每ADC可以包含1-20个弹头(即，n是1-20)。其它所选实施方案可以包含具有1至15个弹头的药物载荷的ADC。在还有其它实施方案中，所述ADC可以包含1-12个弹头或，更优选，1-10个弹头。在某些优选的实施方案中，所述ADC将包含1至8个弹头。
关于位点特异性缀合物，取决于多少和哪些链间和链内二硫键被破坏，理论药物载荷可以是相对高的，尽管由于聚集体和其它污染物，实际限制诸如游离半胱氨酸交叉反应性将限制包含此类DAR的均质制备物的生成。即，较高的药物载荷，例如>6，可引起某些抗体-药物缀合物的聚集，不溶性，毒性，或细胞通透性的损失。鉴于此类顾虑，由本发明提供的实际药物载荷的优选范围是1至8个药物/每缀合物，即，其中1、2、3、4、5、6、7或8个药物共价连接至每个抗体(例如，对于IgG1，其它抗体可以具有不同的载荷能力，这取决于二硫键的数目)。优选地，本发明的组合物的DAR将为约2、4或6，且在特别优选的实施方案中，DAR将包含约2。
尽管本发明提供相对高水平的均质性，但公开的组合物实际上包含各种浓度的一定范围的药物有效载荷(例如1至8个药物/每IgG1抗体)的缀合物(连同主要由游离半胱氨酸交叉反应性引起的某些反应污染物)且包含通过各种硫醇基团连接至抗体的药物部分的混合物。使用选择性还原和制造后纯化，可使缀合物组合物达到其主要含有单一主要的期望的ADC物质种类(例如药物载荷为2)和相对低水平的其它ADC物质种类(例如药物载荷为1、4、6等)的点。平均DAR值表示完整组合物(即合在一起的所有ADC物质种类)的药物载荷的加权平均值。由于所用定量方法的固有不确定性和在商业环境中完全移除非主要ADC物质种类的困难，可接受的DAR值或说明通常呈现为平均值、范围或分布(即平均DAR为2+/-0.5)。医药环境中优选使用包含该范围(即1.5至2.5)内的所测量的平均DAR的组合物。
因此，在某些优选实施方案中，本发明将包含平均DAR为1、2、3、4、5、6、7或8(各自+/-0.5)的组合物。在其它优选实施方案中，本发明将包含2、4、6或8+/-0.5的平均DAR。最终，在所选优选实施方案中，本发明将包含2+/-0.5的平均DAR。应当理解，在某些优选实施方案中，范围或偏差可小于0.4。因此，在其它实施方案中，组合物将包含1、2、3、4、5、6、7或8(各自+/-0.3)的平均DAR；2、4、6或8+/-0.3的平均DAR或甚至更优选2或4+/-0.3的平均DAR或甚至2+/-0.3的平均DAR。在其它实施方案中，IgG1缀合物组合物将优选包含平均DAR为1、2、3、4、5、6、7或8(各自+/-0.4)的组合物和相对低水平(即小于30％)的非主要ADC物质种类。在其它优选实施方案中，ADC组合物将包含2、4、6或8(各自+/-0.4)的平均DAR和相对低水平(<30％)的非主要ADC物质种类。在特别优选实施方案中，ADC组合物将包含2+/-0.4的平均DAR和相对低水平(<30％)的非主要ADC物质种类。在还有其它实施方案中，当针对其它DAR物质种类测量时，主要的ADC物质种类(例如，2的DAR)将以以下浓度存在：大于70％的浓度，大于75％的浓度，大于80％的浓度，大于85％的浓度，大于90％的浓度，大于93％的浓度，大于95％的浓度，或甚至大于97％的浓度。
如下面实施例中详述，来自缀合反应的ADC制备物中每抗体的药物分布可通过常规方式表征，诸如UV-Vis分光光度法、反相HPLC、HIC、质谱、ELISA和电泳。也可确定在药物数/每抗体的方面的ADC的定量分布。通过ELISA，可确定特定ADC制备物中药物数/每抗体的平均值。然而，药物数/每抗体值的分布无法由抗体-抗原结合和ELISA的检测限制辨别。此外，用于检测抗体-药物缀合物的ELISA测定法不确定药物部分在何处连接至抗体(诸如重链或轻链片段)或特定氨基酸残基。
VI诊断和筛选
A.诊断剂
本发明提供用于检测、诊断或监测增殖性病症的体外和体内方法和筛选来自患者的细胞以鉴定肿瘤细胞(包括致瘤性细胞)的方法。此类方法包括鉴定具有癌症的个体用于治疗癌症或监测癌症的进展，包括使患者或从患者获得的样品(在体内或体外)与如本文所述的抗体接触，并检测抗体与样品中结合或游离的目标分子的缔合的存在或不存在或水平。在一些实施方案中，所述抗体将包含如本文所述的可检测的标记或报道分子。
在一些实施方案中，所述抗体与样品中的特定细胞的缔合可以表示该样品可以含有致瘤性细胞，从而表明，可以用如本文所述的抗体有效治疗具有癌症的个体。
样品可以通过许多测定法分析，所述测定法例如放射免疫测定，酶免疫测定(例如，ELISA)，竞争性结合测定法，荧光免疫测定法，免疫印迹测定法，Western印迹分析和流式细胞术测定法。相容的体内治疗诊断或诊断测定法可包括本领域公认的成像或监测技术，例如磁共振成像，计算机断层扫描(例如CAT扫描)，正电子断层扫描(例如，PET扫描)、射线成像，超声波等。
在一个特别优选的实施方案中，可以使用本发明的抗体以检测和定量患者样品(例如，血浆或血液)中的特定决定簇(例如，CLDN)的水平，其可以进而，可用于检测、诊断或监测与相关决定簇相关的增殖性病症。在相关的实施方案中，可以使用本发明的抗体以在体内或体外检测、监测和/或定量循环肿瘤细胞(WO 2012/0128801)。在还有其它优选实施方案中，循环肿瘤细胞可包含致瘤性细胞。
在本发明的某些实施方案中，可以在治疗或方案之前使用公开的抗体评估或表征受试者或来自受试者的样品中的致瘤性细胞，以建立基线。在其它实施方案中，可以从衍生自所治疗的受试者的样品评估所述致瘤性细胞。
B.筛选
在某些实施方案中，所述抗体可用于通过与决定簇相互作用筛选样品以鉴定改变肿瘤细胞的功能或活性的化合物或试剂(例如，抗体或ADC)。在一个实施方案中，使肿瘤细胞与抗体或ADC接触，且所述抗体或ADC可用于筛选表达特定目标(例如，CLDN)的细胞，以便鉴定此类细胞而用于目的，包括但不限于，诊断目的，且监测此类细胞以确定治疗效力或针对表达此类目标的细胞富集细胞群体。
在又另一个实施方案中，方法包括使肿瘤细胞与测试剂或化合物直接或间接地接触，且确定所述测试剂或化合物是否调节决定簇相关肿瘤细胞的活性或功能，例如，细胞形态或活力、标志物的表达、分化或去分化、细胞呼吸、线粒体活性、膜完整性、成熟、增殖、活力、凋亡或细胞死亡中的变化。直接相互作用的一个实例是物理相互作用，而间接相互作用包括，例如，组合物对中间分子作用，所述中间分子进而作用于引用的实体(例如，细胞或细胞培养物)。
筛选方法包括高通量筛选，其可以包括任选定位或放置在预先确定的位置(例如，培养皿、管、烧瓶、滚瓶或板上)的细胞的阵列(例如，微阵列)。高通量机器人或手动处理方法可以在短时段内探测化学相互作用，并确定许多基因的表达水平。已经开发出利用分子信号(例如，经由荧光团或微阵列(Mocellin and Rossi,2007,PMID:17265713))和以非常快的速度处理信息的自动分析的技术(例如，参见Pinhasov等人,2004,PMID:15032660)。可以筛选的文库包括，例如，小分子文库，噬菌体展示文库，全人抗体酵母展示文库(Adimab)，siRNA文库和腺病毒转染载体。
VII医药制备物和治疗性用途
A.制剂和施用途径
本发明的抗体或ADC可以使用本领域公认的技术以各种方式配制。在一些实施方案中，本发明的治疗性组合物可以纯施用或以含有最少额外组分的形式施用，而其它组合物可任选配制以含有合适的药学上可接受的载体。如本文所使用，“药学上可接受的载体”包含本领域中众所周知的赋形剂、媒介物、助剂和稀释剂，并且可得自用于药物制剂中使用的商业来源(参见例如Gennaro(2003)Remington:The Science and Practice ofPharmacy with Facts and Comparisons:Drugfacts Plus,第20版,Mack Publishing；Ansel等人(2004)Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版,Lippencott Williams and Wilkins；Kibbe等人(2000)Handbook of PharmaceuticalExcipients,第3版,Pharmaceutical Press.)。
合适的药学上可接受的载体包含相对惰性且可以有助于缀合物的施用或可以帮助将活性化合物加工成药学优化以递送至作用位点的制备物的物质。
此类药学上可接受的载体包括可以改变制剂的形式、稠度、粘度、pH、张力、稳定性、摩尔渗透压浓度、药代动力学、蛋白聚集或溶解度的试剂，且包括缓冲剂、润湿剂、乳化剂、稀释剂、包封剂和皮肤渗透增强剂。载体的某些非限制性实例包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、精氨酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨糖醇、葡聚糖、羧甲基纤维素钠及其组合。用于全身施用的抗体可配制以用于经肠、肠胃外或局部施用。实际上，所有三种类型的制剂可同时使用以实现活性成分的全身施用。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂和制剂描述于Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2000)第20版Mack Publishing。
用于经肠施用的合适制剂包括硬或软明胶胶囊、丸剂、片剂，包括包衣片剂、酏剂、悬浮液、糖浆剂或吸入剂和其控释形式。
适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括水性或非水性、等张、无热原、无菌液体(例如溶液、悬浮液)，其中溶解、悬浮或以其它方式提供活性成分(例如于脂质体或其它微粒中)。此类液体可额外含有其它药学上可接受的载体，诸如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂，和使制剂与所欲受体的血液(或其它相关体液)等张的溶质。赋形剂的实例包括例如水、醇类、多元醇类、甘油、植物油类等。用于此类制剂中的合适的等张的药学上可接受的载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液(Ringer'sSolution)或乳酸盐化的林格氏注射液(Lactated Ringer's Injection)。
用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含约10μg/mL至约100mg/mL的ADC或抗体浓度。在某些所选实施方案中，抗体或ADC浓度将包含20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300、μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL或1mg/mL。在其它优选实施方案中，ADC浓度将包含2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL。
可以通过各种途径将本发明的化合物和组合物体内施用于有需要的受试者，所述途径包括，但不限于，口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌内、心内、心室内、气管内、经颊、直肠、腹膜内、皮内、局部、经皮、和鞘内、或以其它方式通过植入或吸入进行。主题组合物可以配制成固体、半固体、液体、或气体形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊、粉剂、粒剂、药膏、溶液剂、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂、和气雾剂。可以根据预期的应用和治疗方案选择适当的制剂和施用途径。
B.剂量
特定剂量方案(即剂量、时机和重复)将取决于特定个体以及经验上的考虑，诸如药代动力学(例如半衰期、清除率等)。施用频率的确定可以由本领域技术人员诸如主治医师基于考虑病况和所治疗的病况的严重度和所治疗的受试者的年龄和总体健康状况等来进行。施用频率可以经疗法进程基于所选组合物的效力和给药方案的评价进行调整。此类评价可以基于特定疾病、病症或状况的标志物来进行。在其中个体具有癌症的实施方案中，这些包括经由触诊或目视观察的肿瘤大小的直接测量；通过x-射线或其它成像技术的肿瘤大小的间接测量；如通过直接肿瘤活检和肿瘤样品的显微镜检查所评价的改善；根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如，对于前列腺癌的PSA)或抗原的测量；增殖或致瘤性细胞的数目的减少，此类肿瘤细胞的减少的维持；肿瘤细胞的增殖的减少；或转移的发展的延迟。
本发明的CLDN抗体或ADC可以各种范围施用。这些包括约5μg/kg体重至约100mg/kg体重/每剂量；约50μg/kg体重至约5mg/kg体重/每剂量；约100μg/kg体重至约10mg/kg体重/每剂量。其它范围包括约100μg/kg体重至约20mg/kg体重/每剂量和约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重/每剂量。在某些实施方案中，剂量为至少约100μg/kg体重，至少约250μg/kg体重，至少约750μg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约5mg/kg体重，至少约10mg/kg体重。
在所选实施方案中，将以约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg/kg体重/每剂量施用(优选静脉内)CLDN抗体或ADC。其它实施方案可以包括以约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000μg/kg体重/每剂量施用ADC。在其它优选实施方案中，将以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.58、9或10mg/kg施用公开的缀合物。在还有其它实施方案中，可以12、14、16、18或20mg/kg体重/每剂量施用缀合物。在还有其它实施方案中，可以25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100mg/kg体重/每剂量施用缀合物。用本文中的教导，本领域技术人员可基于临床前动物研究、临床观察以及标准医药和生物化学技术和测量容易地确定各种CLDN抗体或ADC的适当剂量。
其它给药方案可以基于如U.S.P.N.7,744,877中公开的体表面积(BSA)计算。如众所周知，BSA使用患者的身高和体重来计算，并提供由他或她身体的表面积代表的受试者大小的量度。在某些实施方案中，可以1mg/m2至800mg/m2、50mg/m2至500mg/m2的剂量和100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2的剂量施用所述缀合物。还应当理解的是，本领域公认和凭经验的技术可用于确定适当剂量。
抗-CLDN抗体或ADC可以特定时间表施用。通常，将有效剂量的CLDN缀合物一次或多次施用于受试者。更具体地，以一个月一次、一个月多于一次或一个月少于一次将有效剂量的ADC施用于受试者。在某些实施方案中，CLDN抗体或ADC的有效剂量可多次施用，包括持续至少一个月、至少六个月、至少一年、至少两年或几年的时段。在还有其它实施方案中，所公开的抗体或ADC的施用之间可经过几天(2、3、4、5、6或7)、几周(1、2、3、4、5、6、7或8)或几个月(1、2、3、4、5、6、7或8))或甚至一年或几年。
在某些优选实施方案中，涉及缀合的抗体的疗程将包含所选药物产品在数周或数月时段内的多次剂量。更具体地，本发明的抗体或ADC可以每天一次、每两天一次、每四天一次、每周一次、每十天一次、每两周一次、每三周一次、每个月一次、每六周一次、每两个月一次、每十周一次或每三个月一次施用。在这方面，应当理解，可基于患者反应和临床实践改变剂量或调节时间间隔。
对于已经给予一次或多次施用的个体中公开的治疗组合物，也可以凭经验确定剂量和方案。例如，可以给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在所选实施方案中，剂量可分别基于凭经验确定或观察的副作用或毒性而逐渐增加或降低或减少。为了评价所选组合物的效力，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或状况的标志物。对于癌症，这些包括经由触诊或目视观察的肿瘤大小的直接测量，通过x-射线或其它成像技术的肿瘤大小的间接测量；如通过直接肿瘤活检和肿瘤样品的显微镜检查所评价的改善；根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如，对于前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原的测量，疼痛或麻痹的减少；改善的与肿瘤相关的讲话、视觉、呼吸或其它残疾；增加的食欲；或如通过接受的测试或生存的延长所测量的生活质量的增加。对本领域技术人员将显而易见的是，剂量将取决于个体、肿瘤状况的类型、肿瘤状况的阶段、个体中肿瘤状况是否已经开始转移至其它位置和过去和同时正在使用的治疗而变化。
C.组合疗法
CLDN蛋白表达于上皮细胞的紧密连接中，其中CLDN蛋白被认为建立细胞旁屏障，其控制上皮细胞之间的细胞间空间中的分子的流动。抗-CLDN抗体的使用可导致上皮细胞的紧密连接的破坏，因此改善治疗剂的进入，否则所述治疗剂将无法穿透癌细胞。因此，与本发明的抗-CLDN抗体和ADC组合使用各种治疗剂可用于预防或治疗癌症和预防癌症的转移或复发。如本文所使用，“组合疗法”意指包含至少一种抗-CLDN抗体或ADC和至少一种治疗性部分(例如，抗癌剂)的组合的施用，其中所述组合优选与(i)单独使用的抗-CLDN抗体或ADC，或(ii)单独使用的治疗性部分，或(iii)与另一治疗性部分组合使用治疗性部分(不加入抗-CLDN抗体或ADC)相比具有癌症的治疗的治疗性协同作用或改善癌症的治疗的可测量的治疗效果。如本文所使用，术语“治疗性协同作用”意指，抗-CLDN抗体或ADC和一个或多个治疗性部分的组合，其具有比抗-CLDN抗体或ADC和所述一个或多个治疗性部分的组合的累加效应更高的治疗效果。
通过与对照或基线测量比较而定量公开的组合的期望的结果。如本文所使用，相对术语诸如“改善”、“增加”或“减少”分别表示相对于对照的值，所述对照诸如在开始本文所述的治疗之前在同一个体中的测量值，或在不存在本文中所述的抗-CLDN抗体或ADC、但存在其它治疗性部分(诸如护理治疗的标准)的情况下的对照个体(或多个对照个体)中的测量值。代表性对照个体是患有与所治疗的个体相同形式的癌症的个体，其与所治疗的个体的年龄约相同(以确保治疗的个体和对照个体的疾病的阶段是相当的。)
对疗法的响应的变化或改善通常是统计学显著的。如本文所使用，术语“显著性”或者“显著的”涉及在两种或更多种实体之间存在非随机关联性的概率的统计分析。为了确定关系是否为“显著的”或具有“显著性”，可以计算“p值”。低于用户定义的截止点的p值被认为是显著的。小于或等于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、或小于0.001的p值可被认为是显著的。
协同治疗效果可以是由单一治疗性部分或抗-CLDN抗体或ADC引起的治疗效果，或由给定组合的抗-CLDN抗体或ADC或单一治疗性部分引起的治疗效果的总和的至少约两倍、或至少约五倍、或至少约十倍、或至少约二十倍、或至少约五十倍、或至少约一百倍的效果。协同治疗效果也可观察为，与单一治疗性部分或抗-CLDN抗体或ADC引起的治疗效果，或由给定组合的抗-CLDN抗体或ADC或单一治疗性部分引起的治疗效果的总和相比，治疗效果增加至少10％或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％或更多。协同效果还是允许在组合使用治疗剂时减少治疗剂的给药的效果。
在实施组合疗法中，可以使用相同或不同的施用途径或以单一组合物、或作为两种或更多种不同组合物将抗-CLDN抗体或ADC和一种或多种治疗性部分同时施用于受试者。或者，用抗-CLDN抗体或ADC的治疗可以在抗癌部分治疗之前，或之后，例如，间隔为数分钟至数周。在一个实施方案中，在彼此的约5分钟至约两周内施用治疗性部分和抗体或ADC两者。在还有其它实施方案中，在施用所述抗体和治疗性部分之间可以经过几天(2、3、4、5、6或7)、几周(1、2、3、4、5、6、7或8)或几个月(1、2、3、4、5、6、7或8)。
所述组合疗法可以以各种时间表(诸如每天一次、两次或三次，每两天一次，每三天一次，每周一次，每两周一次，每个月一次，每两个月一次，每三个月一次，每六个月一次)施用，直至所述病况得到治疗、减轻或治愈，或者可以连续地施用。所述抗体和治疗性部分可以交替几天或几周施用；或者给予抗-CLDN抗体或ADC治疗的顺序，随后为一次或多次用额外的治疗部分治疗。在一个实施方案中，抗-CLDN抗体或ADC与一个或多个治疗部分组合施用，持续短治疗周期。在其它实施方案中，施用所述组合疗法，持续长治疗周期。所述组合疗法可以经由任何途径施用。
在一些实施方案中，所述抗-CLDN抗体或ADC可以与各种第一线癌症治疗组合使用。在一个实施方案中，所述组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和铂类似物(例如，异环磷酰胺、丝裂霉素C、长春地辛、长春碱、依托泊苷、ironitecan、吉西他滨、紫杉烷类、长春瑞滨、甲氨喋呤和培美曲塞)和任选一种或多种其它治疗部分。
在另一个实施方案中，所述组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和基于铂的药物(例如，卡铂或顺铂)和任选一种或多种其它治疗性部分(例如，长春瑞滨；吉西他滨；紫杉烷诸如例如，多西他赛或紫杉醇；irinotican；或培美曲塞)。
在另一个实施方案中，用于治疗EGFR阳性NSCLC的组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和阿法替尼和任选一种或多种其它治疗性部分(例如，埃罗替尼和/或贝伐单抗)。
在另一个实施方案中，用于治疗EGFR阳性NSCLC的组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和埃罗替尼和任选一种或多种其它治疗性部分(例如，贝伐单抗)。
在另一个实施方案中，用于治疗ALK阳性NSCLC的组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和色瑞替尼和任选一种或多种其它治疗性部分。
在另一个实施方案中，用于治疗ALK阳性NSCLC的组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和克唑替尼和任选一种或多种其它治疗性部分。
在另一个实施方案中，所述组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和贝伐单抗和任选一种或多种其它治疗性部分(例如，紫杉烷，诸如，例如，多西他赛或紫杉醇；和/或铂类似物)。
在另一个实施方案中，所述组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和贝伐单抗和任选一种或多种其它治疗性部分(例如，吉西他滨和/或铂类似物)。
在一个实施方案中，所述组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和基于铂的药物(例如，卡铂或顺铂)类似物和任选一种或多种其它治疗性部分(例如紫杉烷，诸如，例如，多西他赛和紫杉醇)。
在一个实施方案中，所述组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和基于铂的药物(例如，卡铂或顺铂)类似物和任选一种或多种其它治疗性部分(例如紫杉烷，诸如，例如，多西他赛和紫杉醇和/或吉西他滨和/或多柔比星)。
在一个具体实施方案中，用于治疗铂耐受的肿瘤的组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和多柔比星和/或依托泊苷和/或吉西他滨和/或长春瑞滨和/或异环磷酰胺和/或亚叶酸调节的5-氟尿嘧啶和/或贝伐单抗和/或他莫昔芬；和任选一种或多种其它治疗性部分。
在另一个实施方案中，所述组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和PARP抑制剂和任选一种或多种其它治疗性部分。
在另一个实施方案中，所述组合疗法包括使用抗-CLDN抗体或ADC和贝伐单抗和任选环磷酰胺。
本发明还提供抗-CLDN抗体或ADC与放疗的组合。如本文所使用，术语“放疗”意指，用于诱导肿瘤细胞内局部DNA损伤的任何机制，诸如γ-辐射、X-射线、UV-辐射、微波、电子发射等。还考虑使用将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞的组合疗法，并且可以与本文公开的抗-CLDN抗体组合使用或作为其缀合物使用。通常，经约1至约2周的时间段以脉冲施用放疗。任选地，所述放疗可以作为单一剂量或作为多个连续剂量施用。
在其它实施方案中，抗-CLDN抗体或ADC可以与下述抗癌剂中的一种或多种组合使用。
D.抗癌剂
如本文所使用，术语“抗癌剂”或“化疗剂”是“治疗部分”的一个子集，其进而是被描述为“药物活性部分”的药剂的子集。更具体地，“抗癌剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症诸如癌症的任何试剂，包括但不限于细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减积剂、化疗剂、放疗和放疗剂、靶向的抗癌剂、生物反应调节剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、抗转移剂和免疫治疗剂。应当理解，在如上面所讨论的所选实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物，并且可以在施用前与抗体缔合。在某些实施方案中，将公开的抗癌剂与抗体连接，以提供如本文公开的ADC。
也可以是抗癌剂的术语“细胞毒性剂”意指对细胞有毒性且降低或抑制细胞的功能和/或引起细胞的破坏的物质。通常，该物质是源自活生物体的天然存在的分子(或合成制备的天然产物)。细胞毒性剂的实例包括但不限于小分子毒素或细菌的酶学活性毒素(例如，白喉毒素、假单胞菌内毒素和外毒素、葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxinA))，真菌的酶学活性毒素(例如，α-八叠球菌、局限曲菌素(restrictocin))、植物的酶学活性毒素(例如，相思豆毒蛋白、蓖麻毒素、蒴莲素(modeccin)、槲寄生素(viscumin)、美洲商陆抗病毒蛋白、皂素、白树毒素、momoridin、天花粉蛋白、大麦毒素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII、和PAP-S)、观赏苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、丝林霉素(mitegellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素、伊诺霉素和tricothecenes)或动物的酶学活性毒素(例如，细胞毒性RNase，诸如细胞外胰RNase；DNaseI，包括其片段和/或变体)。
抗癌剂可以包括抑制、或设计为抑制癌细胞或可能变为癌性或生成致瘤性后代的细胞(例如，致瘤性细胞)的任何化学剂。此类化学试剂经常针对对于细胞生长或分裂必需的细胞内过程，并且因此针对通常迅速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，并且因此抑制细胞进入有丝分裂。此类试剂经常施用，并且经常在组合中，例如，在制剂CHOP中是最有效的。再次，在所选实施方案中，此类抗癌剂可缀合至公开的抗体。
可与本发明的抗体组合(或缀合)使用的抗癌剂的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸盐(或酯)、阿那曲唑、鹅膏蕈碱类、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基阿美胺(methylamelamine)、多聚乙酰(acetogenin)、喜树碱(camptothecin)、BEZ-235、硼替佐米(bortezomib)、苔藓抑素(bryostatin)、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib)、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)、多卡米星(duocarmycin)、艾榴素(eleutherobin)、埃罗替尼(erlotinib)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔、烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin)、双膦酸盐(或酯)、埃斯波霉素(esperamicin)、色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C、canfosfamide,卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素类(chromomycinis)、环磷酰胺、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依西美坦(exemestane)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟维司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)、伊达比星(idarubicin)、拉帕替尼(lapatinib)、来曲唑(letrozole)、洛那法尼(lonafarnib)、麻西罗霉素(marcellomycin)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、帕唑帕尼(pazopanib)、培洛霉素(peplomycin)、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、雷帕霉素(rapamycin)、罗多比星(rodorubicin)、索拉非尼(sorafenib)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、他莫昔芬柠檬酸盐(tamoxifen citrate)、替莫唑胺(temozolomide)、tepodina、替吡法尼(tipifarnib)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、凡德他尼(vandetanib)、伏氯唑(vorozole)、XL-147、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂(诸如弗林酸(frolinic acid))、醋葡醛内酯(aceglatone)、醛磷酰胺醣苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、贝斯布希(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵(elliptinium acetate)、爱波喜龙(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、硝酸镓、羟基脲、香菇多醣(lentinan)、氯尼达明(lonidainine)、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他汀(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、足叶草酸(podophyllinic acid)、2-乙基肼、丙卡巴肼、多醣复合物、丙亚胺；根霉素(rhizoxin)；SF-1126、西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙基胺；单端孢霉烯类(trichothecenes)(T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)；环磷酰胺；噻替派(thiotepa)；紫杉烷(taxoids)、苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物、长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(或酯)(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；草酸铂；XL518、PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂(其降低细胞增殖)和以上任一者的药学上可接受的盐或溶剂化物、酸或衍生物。该定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体抗体、抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂和抗雄激素；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸；核糖核酸酶，诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗、rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素(Esperamicin)，和以上任一者的药学上可接受的盐或溶剂化物、酸或衍生物。
特别优选的抗癌剂包含商业或临床可用的化合物，诸如埃罗替尼(erlotinib)(Genentech/OSI Pharm.)、多西他赛(docetaxel)(Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CAS号51-21-8)、吉西他滨(gemcitabine)(Lilly)、PD-0325901(CAS号391210-10-9，Pfizer)、顺铂(顺二胺，二氯铂(II)，CAS号15663-27-1)、卡铂(CAS号41575-94-4)、紫杉酚(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(Genentech)、替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS号85622-93-1，ScheringPlough)、他莫昔芬(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺， )和多柔比星(doxorubicin)其它市售或临床可用抗癌剂包含草酸铂(Sanofi)、硼替佐米(bortezomib)(Millennium Pharm.)、索坦(sutent)(SU11248，Pfizer)、来曲唑(letrozole)(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(imatinib Mesylate)(Novartis)、XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，Array BioPharma,Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟维司群(fulvestrant)(AstraZeneca)、甲酰四氢叶酸(leucovorin/folinic acid)、雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)，Wyeth)、拉帕替尼(lapatinib)(GSK572016，Glaxo Smith Kline)、氯那法尼(lonafarnib)(SARASARTM，SCH 66336，Schering Plough)、索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006，Bayer Labs)、吉非替尼(gefitinib)(AstraZeneca)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11，Pfizer)、替匹法尼(tipifarnib)(ZARNESTRATM，Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(无十六醇聚氧乙烯醚(乳浮))、紫杉酚(paclitaxel)的经白蛋白改造的纳米粒子制剂(AmericanPharmaceutical Partners,Schaumberg,Il)、凡他尼布(vandetanib)(rINN，ZD6474，AstraZeneca)、苯丁酸氮芥(chloranmbucil)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、坦罗莫司(temsirolimus)(Wyeth)、帕唑帕尼(pazopanib)(GlaxoSmithKline)、坎磷酰胺(canfosfamide)(Telik)、噻替派和环磷酰胺长春瑞滨卡培他滨(capecitabine)(Roche)、他莫昔芬(包括柠檬酸他莫昔芬、(柠檬酸托瑞米芬(托米芬)(toremifine citrate))、(乙酸甲地孕酮)、(依西美坦(exemestane)；Pfizer)、服美坦(formestanie))、法倔唑(fadrozole)、(伏罗唑(vorozole))、(来曲唑(letrozole)；Novartis)和(阿那曲唑(anastrozole)；AstraZeneca)。
术语“药学上可接受的盐”或“盐”意指分子或大分子的有机或无机盐。酸加成盐可以与氨基形成。示例性盐包括，但不限于，硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1′亚甲基双-(2-羟基3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可以涉及包括另一种分子诸如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。所述抗衡离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可以在其结构中具有多于一个带电原子。当多个带电原子是药学上可接受的盐的部分时，该盐可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
“药学上可接受的溶剂化物”或“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子和分子或大分子的缔合。形成药学上可接受的溶剂化物的溶剂的实例包括，但不限于，水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
在其它实施方案中，本发明的抗体或ADC可与当前处于临床试验或商业可得的多种抗体(或免疫治疗剂)中的任一者组合使用。公开的抗体可与选自以下的抗体组合使用：阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿玛图单抗(amatuximab)、阿纳图单抗(anatumomab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、比伐珠单抗(bivatuzumab)、兰妥莫单抗(blinatumomab)、贝土西单抗(brentuximab)、坎土珠单抗(cantuzumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、西他珠单抗(citatuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、西瓦图单抗(clivatuzumab)、可那木单抗(conatumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、多兹图单抗(drozitumab)、杜利图单抗(duligotumab)、杜斯图单抗(dusigitumab)、地莫单抗(detumomab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛图单抗(dalotuzumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依洛珠单抗(elotuzumab)、恩斯图单抗(ensituximab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、法利珠单抗(farletuzumab)、非拉珠单抗(ficlatuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、福沃图单抗(flanvotumab)、福图西单抗(futuximab)、盖尼图单抗(ganitumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、吉瑞昔单抗(girentuximab)、吉乐木单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊戈伏单抗(igovomab)、伊加图单抗(imgatuzumab)、因达西单抗(indatuximab)、依珠单抗(inotuzumab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、lambrolizumab、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、洛沃图单抗(lorvotuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫西图单抗(moxetumomab)、拉纳图单抗(narnatumab)、那图莫单抗(naptumomab)、奈昔木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、nivolumab、诺非图单抗(诺莫单抗)(nofetumomabn)、obinutuzumab、奥卡拉单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉珠单抗(olaratumab)、奥拉帕尼(olaparib)、奥纳珠单抗(onartuzumab)、奥珀珠单抗(oportuzumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕木单抗(panitumumab)、帕撒图单抗(parsatuzumab)、帕瑞图单抗(patritumab)、派图单抗(pemtumomab)、培妥珠单抗(pertuzumab)、pidilizumab、平妥单抗(pintumomab)、普立木单抗(pritumumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、radretumab、雷莫芦单抗(ramucirumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗妥木单抗(robatumumab)、沙妥莫单抗(satumomab)、司美替尼(selumetinib)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、斯图珠单抗(simtuzumab)、索利托单抗(solitomab)、塔卡珠单抗(tacatuzumab)、他普莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替妥木单抗(teprotumumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、图土珠单抗(tucotuzumab)、乌利昔单抗(ublituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、沃瑟珠单抗(vorsetuzumab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)、CC49、3F8、MDX-1105和MEDI4736及其组合。
其它特别优选的实施方案包括使用批准用于癌症疗法的抗体，包括，但不限于，利妥昔单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、patitumumab、奥法木单抗(ofatumumab)、伊匹单抗和brentuximab vedotin。本领域技术人员将能够容易地鉴定与本文的教导相容的额外抗癌剂。
E.放疗
本发明还提供抗体或ADC与放疗(即，用于诱导肿瘤细胞内局部DNA损伤的任何机制，如γ辐射、X-射线、UV辐射、微波、电子发射等)的组合。还考虑使用将放射性同位素靶向递送至肿瘤细胞的组合治疗，并且公开的抗体或ADC可以与靶向的抗癌剂或其它靶向方式结合使用。通常，在约1至约2周的时间段以脉冲形式施用放疗。可以将放疗施用于患有头颈癌的受试者持续约6至7周。任选地，可以作为单一剂量或作为多个连续剂量施用放疗。
VIII适应症
本发明提供本发明的抗体和ADC用于诊断、治疗诊断、治疗和/或预防各种病症(包括肿瘤、炎症、血管生成和免疫病症和病原体引起的病症)的用途。具体地，关键治疗目标是肿瘤病况，包含实体瘤，尽管血液恶性肿瘤在本发明的范围内。在某些实施方案中，本发明的抗体将用于治疗表达特定决定簇(例如，CLDN)的肿瘤或致瘤性细胞。优选地，待治疗的“受试者”或“患者”将是人，尽管如本文所使用，术语应当清楚地包括任何哺乳动物物种。
经受根据本发明的治疗的肿瘤病况可以是良性或恶性的；实体瘤或其它血液肿瘤；并且可以选自包括但不限于以下的组：肾上腺瘤、AIDS相关癌症、软组织腺泡状肉瘤、星状细胞肿瘤、自主神经节肿瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌和移行细胞癌)、囊胚腔病症、骨癌(釉质瘤、动脉瘤性骨嚢肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索癌、嫌色性肾脏细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、结缔组织增殖性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、上皮病症、尤因肿瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性结构不良、胆嚢和胆管癌、胃癌、胃肠道疾病、妊娠滋养层成瘤性疾病、生殖细胞瘤、腺体病症、头颈癌、下丘脑癌、肠癌、胰岛细胞瘤、卡波氏肉瘤、肾脏癌(肾脏母细胞瘤、乳头状肾脏细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等)、巨噬细胞病症、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌肿瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、神经母细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、小儿癌症、外周神经鞘膜肿瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、后代眼色素层黑色素瘤(posterious unveal melanoma)、罕见性血液性病症、肾脏转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、间质病症、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌和子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌和平滑肌瘤)。
在其它优选实施方案中，公开的抗体和ADC可尤其有效治疗肺癌，包括以下亚型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌(例如，鳞状细胞非小细胞肺癌或鳞状细胞小细胞肺癌)。在所选实施方案中，所述抗体和ADC可以施用于表现出有限期疾病或广泛期疾病的患者。在其它优选的实施方案中，公开的缀合抗体将施用于难治性患者(即，其疾病在完成初始疗法的进程期间或之后不久复发的那些)；敏感的患者(即，其复发在初始治疗之后长于2-3个月的那些)；或表现出对基于铂的药剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂)和/或紫杉烷(例如，多西他赛、紫杉醇、larotaxel或卡巴他赛)的耐受性的患者。
本发明还提供呈现具有良性或癌前期的肿瘤的受试者的防止或预防性治疗。不从使用本发明的抗体的治疗中排除任何特定类型的肿瘤或增殖性病症。
IX制品
本发明包括包含一个或多个容器的药学包装和试剂盒，其中容器可以包含一个或多个剂量的本发明的抗体或ADC。在某些实施方案中，所述包装和试剂盒含有单位剂量，意指预定量的包含例如本发明的抗体或ADC的组合物(具有或不具有一种或多种额外试剂和任选一种或多种抗癌剂)。
本发明的试剂盒将通常在合适容器中含有本发明的抗体或ADC的药学上可接受的制剂和相同或不同容器中的任选的一种或多种抗癌剂。试剂盒也可含有用于诊断或组合疗法的其它药学上可接受的制剂或装置。诊断装置或装置的实例包括可用于检测、监测、定量与增殖性病症相关的细胞或标志物(对于此类标志物的完全列表，参见上文)或分析其概况的那些。在特别优选实施方案中，所述装置可用于体内或体外检测、监测和/或定量循环肿瘤细胞(参见例如WO2012/0128801)。在还有其它优选实施方案中，循环肿瘤细胞可包含致瘤性细胞。本发明考虑的试剂盒还可以含有适当药剂以组合本发明的抗体或ADC与抗癌剂或诊断剂(例如，参见U.S.P.N.7,422,739)。
当试剂盒的组分提供于一种或多种液体溶液中时，所述液体溶液可以是非水性的，然而，水溶液是优选的，其中无菌水溶液是特别优选的。试剂盒中的制剂也可以作为干燥粉末或冻干形式提供，所述干燥粉末或冻干形式可以在添加适当液体后重构。用于重构的液体可以含于分开的容器中。此类液体可以包含无菌的药学上可接受的缓冲剂或其它稀释剂，诸如注射用抑菌水、磷酸缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。当所述试剂盒包含与额外的治疗剂或药剂组合的本发明的抗体或ADC，所述溶液可以摩尔当量组合或以一种组分超过另一种组合的方式预混合。或者，本发明的抗体或ADC和任何任选的抗癌剂或其它药剂在施用于患者前可以分开地保持在不同的容器内。
试剂盒可以包含一个或多个容器和容器中、容器上或与容器相关的标签或包装插页，其表明封闭的组合物用于诊断或治疗选择的疾病病况。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。所述容器可以包含无菌入口，例如容器可以是静脉内用溶液袋或具有皮下注射针可穿透塞子的小瓶。
在一些实施方案中，所述试剂盒可以含有这样的装置，通过所述装置将抗体和任何任选组分施用于患者，例如，一个或多个针或注射器(预填充的或空的)，眼滴管、移液管、或其它此类类似装置，可以从所述装置将制剂注射或引入受试者或应用于身体的病变区域。本发明的试剂盒也将通常包括用于包含小瓶的装置，或此类类似物，和用于商业销售的密闭的其它组分，诸如，例如，吹塑成型的塑料容器，其中放置并保留期望的小瓶和其它装置。
X其它内容
除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步，除非上下文另外需要，单数术语应该包括复数，并且复数术语应该包括单数。此外，在说明书和随附的权利要求中提供的范围包括两端点和端点之间的所有点。因此，2.0至3.0的范围包括2.0、3.0、和2.0和3.0之间的所有点。
通常，本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和化学的技术是本领域众所周知并且通常使用的那些。本文所使用的命名法以及此类技术也是本领域中常用的。通常根据本领域众所周知的常规方法，并且如本说明书通篇引用的各种参考文献中所述，进行本发明的方法和技术，除非另有指明。
XI参考文献
无论关于特定参考文献是否使用表述“通过引用并入”，本文引用的所有专利、专利申请和出版物和电子可得材料(包括例如核苷酸序列提交(例如GenBank和RefSeq中的)和氨基酸序列提交(例如SwissProt、PIR、PRF、PBD中的)，以及来自GenBank和RefSeq中的标注的编码区的翻译)均通过引用并入。仅出于清楚理解的目的给出上文详细描述和随后的实施例。不应从其理解为不必要的限制。本发明不限于所示和所述的精确细节。对本领域技术人员显而易见的变型将包括于通过权利要求定义的本发明中。本文使用的任何部分的标题仅用于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
XII序列表概述
本申请附有包含多种核酸和氨基酸序列的序列表。以下表3提供包括的序列的概述。
表3
XIII实施例
通过参考以下实施例将更容易理解因此上面通常描述的本发明，所述实施例通过举例的方式提供，而不是意在限制本发明。所述实施例不意在表示以下实验是所有或唯一进行的实验。除非另外指明，份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是处于或接近大气压。
PDX肿瘤细胞类型通过缩写和随后的数字表示，其指示特定肿瘤细胞系。测试样品的代数由随附样品名称的p0-p#表示，其中p0表明直接获得自患者肿瘤的未传代的样品，且p#表明在测试前肿瘤已经通过小鼠传代的次数。如本文所使用，肿瘤类型和亚型的缩写如下显示于表4中：
表4
实施例1
使用全转录组测序鉴定CLDN4、CLDN6和CLDN9表达
为了表征实体瘤当存在于癌症患者中时的细胞异质性、使用特定表型标志物鉴定CSC和鉴定临床相关的治疗目标，使用本领域公认的技术开发并维护大型PDX肿瘤库。通过多次传代异质肿瘤细胞，在免疫功能低下的小鼠中，增殖包含大量离散肿瘤细胞系的PDX肿瘤库，所述异质肿瘤细胞最初获自受各种实体瘤恶性肿瘤影响的众多癌症患者。大量具有良好定义的谱系的离散早代PDX肿瘤细胞系的持续可用性大大促进CSC的鉴定和分离，因为PDX肿瘤允许CSC的可再现和重复的表征。使用最少传代的PDX肿瘤细胞系简化体内实验，并提供可容易核查的结果。此外，早代PDX肿瘤响应于治疗剂，诸如伊立替康(即)，其为驱动肿瘤生长、对现有治疗的耐受性和肿瘤复发的根本机制提供临床相关见解。
为了从PDX肿瘤细胞系生成RNA，在肿瘤达到800-2,000mm3之后从小鼠切出肿瘤，并使用本领域公认的酶促消化技术(参见例如，U.S.P.N.2007/0292414)将肿瘤解离成单细胞悬浮液。将选择解离的PDX肿瘤细胞制备物耗尽小鼠细胞，并基于其CD46高和/或CD324(CSC亚群的标志物)的表达进行分选(对于CD46高的定义，参见U.S.P.N 2013/0260385)。表达人EpCAM、CD46高和/或CD324(即CSC)或EpCAM、但非CD46高和/或CD324(即NTG细胞)的细胞通过使用BD FACSAria细胞分选仪的FACS分离，并根据制造商的说明裂解于RLTplus RNA裂解缓冲液(Qiagen)中。然后将裂解物储存在-80℃，并解冻用于RNA提取。解冻后，根据供应商的说明使用RNeasy分离试剂盒(Qiagen,GmbH)提取总RNA，且然后再次使用制造商的方案和推荐的仪器设置使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)和/或生物分析仪2100(Agilent Technologies)上进行定量。所得总RNA制备物通过基因测序和基因表达分析来评估。
使用Applied Biosystems(ABI)边寡核苷酸连接/检测边测序(SOLiD)4.5或SOLiD5500xl下一代测序系统(Life Technologies)进行定量的高质量RNA的全转录组测序。使用来自ABI的被设计用于低输入总RNA的改良的全转录组方案，或Ovation RNA-Seq系统V2TM(NuGEN Technologies)，从1ng总RNA样品生成cDNA。将所得cDNA文库片段化，并在测序运行过程中添加条形码适配子以允许合并来自不同样品的片段文库。由SOLiD平台生成的数据作图到使用公布的人基因组的NCBI版本hg19.2的RefSeq版本47注释的34609个基因，并且在大多数样品中提供RNA水平的可验证的测量。使用作图至基因的外显子区域的度量RPM(每百万次读取)和RPKM(每百万次每千碱基读取)，将来自SOLiD平台的测序数据名义上表示为转录物表达值，从而实现基础基因表达分析被均一化和计算为RPM_转录物或RPKM_转录物。
使用SOLiD的全转录组测序的结果显示与以下PDX细胞系中的NTG相比在分选的CSC中的CLDN4mRNA的升高表达：BR13、BR22、OV100、PA20和PA3，以及额外的CSC群体(包括BR36、OV106MET、OV72MET和OV91MET)中的高表达(图1)。CLDN6mRNA在分选的CSC群体(包括BR36、OV106MET、OV72MET和OV91MET)中升高(图1)。不同于对于CLDN4或CLDN6的情况，观察到相关的家族成员CLDN9在所有分选的肿瘤群体中具有低表达。与肿瘤样品相反，正常卵巢和胰腺组织显示所有三种家族成员CLDN4、CLDN6和CLDN9没有表达或非常低的mRNA表达。
不同类型的人肿瘤中的升高的CLDN4和CLDN6mRNA表达的鉴定表明这些抗原值得作为潜在的诊断和/或免疫治疗目标进一步评价。
实施例2
使用QRT-PCR的肿瘤中的CLDN4、CLDN6和CLDN9MRNA的表达
为了在肿瘤细胞亚群中证实CLDN4、CLDN6的表达并进一步描绘CLDN9表达，在获得自来自各种PDX模型的分选的CSC和NTG群体(如实施例1中所述)的RNA样品上运行QRT-PCR。使用Fluidigm BioMarkTM HD系统根据行业标准方案进行QRT-PCR。使用高容量CDNAArchive试剂盒(Life Technologies)根据制造商的说明将1ng如实施例1所述制备的RNA转化为CDNA。使用CLDN4、CLDN6和CLDN9特异性Taqman测定法预扩增的CDNA材料然后用于随后的QRT-PCR实验。
如图2A中所示，CLDN4表现出相比于来自相同PDX肿瘤系的NTG群体的BR31(TNBC)、LU86(SCLC)和PA14的CSC亚群中的升高表达。相比于正常肺和胰腺中的表达，分选的CSC群体显示CLDN4的高10-100倍的表达，表明用于靶向这些PDX模型的CSC的治疗窗口和潜在益处。还发现当与衍生自相同PDX肿瘤系的NTG群体相比时，CLDN6表现出BR13(TNBC)、CR81和PA3的CSC亚群中的升高表达，其中CLDN6的CSC表达比正常胰腺和结肠中的CLDN6表达大约10,000倍(图2A)。最后，还发现，当与获得自相同PDX肿瘤系的NTG群体相比时，CLDN9显示BR13(TNBC)、CR81、OV27MET(OV-S)和OV44(OV-S)的CSC群体中的升高表达，其中CLDN9的表达比正常结肠细胞中发现的表达高约10,000倍。这些发现验证关于CLDN4和CLDN6的类似群体的全转录组测序获得的结果，且清楚地显示，在各种分选的CSC群体中，CDLN4、CLDN6和/或CLDN9高度过表达。
为了进一步确定额外肿瘤样本中的CLDN4、CLDN6和CLDN9的表达水平，将各种大块(未分选)PDX肿瘤细胞系中的相关CLDN家族成员的mRNA表达与当使用ADC治疗剂时担心不可耐受毒性的正常组织(NormTox：结肠、胃、小肠、肺和胰腺)和在毒性方面较少担心的正常组织(Norm：乳房、卵巢)中的mRNA表达进行比较。发现CLDN4mRNA表达在许多大块BR、CR、LU-SCC和PA PDX系中升高，其中在BR-TNBC、CR、LU-SCC、PA中看到最高表达(图2B)。CLDN6mRNA在OV-S和OV-PS中高度过表达(图2C)，而CLDN6mRNA水平在BR-TNBC和LU-Ad和CR PDX系的子集中也升高(图2C)。最后，发现当与正常组织中发现的水平相比时，CLDN9mRNA在某些PDX细胞系(包括BR-TNBC、CR、LU-Ad、OV和PA PDX系)中升高(图2D)。这些结果表明，CLDN4、CLDN6和CLDN9表达在不同PDX肿瘤模型中升高，表明针对CLDN4、CLDN6和CLDN9的抗体将允许全面靶向多种癌症适应症。这些发现进一步表明，在某些所选实施方案中，多反应性抗体(即，免疫特异性结合至CLDN4、CLDN6和CLDN9抗原中的多于一种的抗体)可以特别有效地减少或消除致瘤性细胞。
为了将该分析进一步扩展至较大组的原代人肿瘤样品以及正常组织样品，使用TissueScanTM qPCR(Origene Technologies)384-孔阵列上的CLDN4、CLDN6或CLDN9-特异性Taqman测定法根据制造商的说明来进行qRT-PCR测定。该阵列能够跨越18个不同肿瘤类型比较基因表达，每个肿瘤采用多个患者来源的样品。明显地，Origene测定也能够比较来自正常组织与相同组织类型的肿瘤组织的表达。图2E、2F和2G分别显示对于所分析的各肿瘤类型的各种全肿瘤样本(黑点)中的CLDN4、CLDN6和CLDN9的表达水平，其针对β肌动蛋白均一化，并相对于匹配的正常组织(白点)中的表达进行绘制。未扩增的样本指定为45的循环计数值(Ct)，其代表在实验方案中最后的扩增循环。各点代表单一组织样本，其中对于所示肿瘤或匹配的正常组织类型的样品的平均几何值表示为黑线。
在子宫颈、子宫内膜和卵巢肿瘤中，以及在食管、肝、胃、肺、睾丸和膀胱肿瘤的子集中看到CLDN4相对于匹配的正常组织的过表达(图2E)。这包括2/2肝脏的胆管癌，1/3肝脏的腺瘤和3/12肝细胞癌。具有CLDN4的过表达的胃肿瘤子集包括7/7腺癌和1/1绒毛状腺瘤(数据未显示)。在子宫内膜、卵巢和睾丸肿瘤以及肾上腺、乳房、食管、肝、肺、淋巴瘤和胃肿瘤的子集中看到CLDN6相对于匹配的正常组织的过表达(图2F)。这包括2/2肝脏的胆管癌，2/3肝脏的腺瘤和7/12肝细胞癌(数据未显示)。在肾上腺、子宫内膜、食管和卵巢肿瘤以及乳房、肺和膀胱肿瘤的子集中看到CLDN9相对于匹配的正常组织的过表达(图2G)。这些数据表明，异常CLDN4、CLDN6和CLDN9表达可以指示和/或牵涉于上述肿瘤中的肿瘤发生和/或肿瘤进展，且再次表明，针对这些密蛋白的抗体可用于有效地治疗各种肿瘤。
实施例3
来自癌症基因组集的原发性肿瘤中的CLDN表达概况
使用称为癌症基因组集(TCGA，美国国家癌症研究所)的肿瘤和正常样品的大型公开可得的数据集在各种肿瘤中证实CLDN6和CLDN9家族成员的mRNA的表达。来自IlluminaHiSeq_RNASeqV2平台的外显子水平3表达数据下载自TCGA数据入口(https:// tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp)，并解析以聚集来自各单一基因的个别外显子的读取值，以便对于各样品中的各基因生成单一值读取值/每千碱基外显子/每百万绘制的读取值(RPKM)。然后使用Tableau软件展示卷起的数据。CLDN6和CLDN9的解析数据分别显示于图3A和3B，其中各样品代表为单一点，黑色水平线代表给定正常组织或肿瘤亚型内的抵销数据点的四分位边界。图3A显示与所有其它正常组织相比，CLDN6表达在亚型为卵巢浆液性囊腺癌的OV肿瘤中升高。此外，与正常肺样品和大量乳腺浸润性癌肿瘤(BRCA)相比，CLDN6在大量LU-Ad样品中升高。对于CLDN9可以观察到与对于CLDN6观察到的模式类似的过表达模式(图3B)。再次，这些数据表明，CLDN6和CLDN9表达水平表明各种肿瘤中的肿瘤发生，并增强其选择作为潜在的治疗目标。
在TCGA数据中发现的五种所选肿瘤类型(OV、LU-Ad、LU-SC(鳞状细胞癌)、BR和SK)中，对于显示两种基因的非零RPKM表达值的样品，绘制CLDN6相比于CLDN9的相对表达(图3C)。选择这些肿瘤类型以涵盖从高(OV)到低(SK)的相对表达水平的范围。图3C显示两种基因的共表达经适应症从高(散点图中的右上象限)到低(左下象限)的渐进性转换，表明可以连接这些基因的表达。这可以通过绘制来自各散点图的图心(质心)更容易地显现(图3D)。图心显示彼此邻近(在染色体16上头对头)的CLDN6和CLDN9基因的高显著性的非常紧密的相关性(r2＝0.0996；p＝0.0001)。在这些相同的五种适应症中，在CLDN6和不同的密蛋白基因CLDN1的表达之间(r2＝0.14)；CLDN6和另一种跨膜四蛋白CD81之间(r2＝0.02)；或CLDN6和其在染色体16上的其它相邻基因TNFRSF12A之间(r2＝0.47)无显著的相关性(数据未显示)。在CLDN6和CLDN4基因的共表达中看到更温和、但显著的相关性(r2＝0.80；p<0.05)(数据未显示)。CLDN6和CLDN9之间的这种相当令人惊讶的强烈相关性可能是这两种基因与彼此的接近的结果，但也暗示这些基因的功能联系或功能共失调。几种癌症适应症中的CLDN6和CLDN9之间的紧密共表达模式为靶向多种目标CLDN蛋白作为治疗策略提供理由。
实施例4
重组CLDN蛋白的克隆和
表达和过表达细胞表面CLDN蛋白的细胞系的改造
为了推导密蛋白蛋白序列之间的关系，Vector NTI软件包的AlignX程序用于比对来自23种人CLDN基因的30种密蛋白蛋白序列。该比对的结果被描绘为图4A中的树状图。图4A的概览显示，CLDN6和CLDN9序列密切相关，在树形图的相同分支上彼此相邻出现。图4A还显示，CLDN4是CLDN6的下一个最密切相关的家族成员。数据的更详细的概览显示，人CLDN6蛋白在细胞外结构域(ECD)中与人CLDN9蛋白序列非常密切相关，其中在ECD1中具有>98％同一性且在ECD2中具有>91％同一性(图4B)。还发现人CLDN4在ECD序列中与人CLDN6密切相关，其中在ECD1中具有>84％同一性且在ECD2中具有>78％同一性(图4B)。基于这些蛋白序列关系，据推测，用人CLDN6抗原免疫将得到识别人CLDN6的抗体，所述人CLDN6也将与人CLDN9交叉反应，可能还与人CLDN4交叉反应。
为了确定对于筛选这些多反应性密蛋白抗体将需要CLDN6、CLDN9和CLDN4的何种物种直向同源物，分析来自以下物种各自的CLDN4、CLDN6和CLDN9的ECD序列：人、食蟹猴、小鼠和大鼠。当可用时，使用AlignX和NCBI数据库蛋白序列进行分析(人、小鼠和大鼠蛋白的NP登录号显示于图4C中)。或者，从通过人CLDN开放阅读框序列相比于食蟹猴全基因组鸟枪法测序重叠群的BLAST组装的食蟹猴CLDN基因的翻译推导蛋白序列。这些比对的检查揭示：(1)CLDN4、CLDN6和CLDN9蛋白的推导的食蟹猴蛋白ECD序列与各自人ECD序列100％相同；(2)小鼠和大鼠CLDN9ECD序列与人直系同源物序列100％相同；且(3)小鼠和大鼠CLDN4和CLDN6ECD序列与彼此不同且不同于各自的人直系同源物。因此，包含人CLDN4、人CLDN6、人CLDN9、小鼠CLDN4、小鼠CLDN6、大鼠CLDN4和大鼠CLDN6的七种构建体的集合的生成应当能够确定任何抗体与所有可能的12种直向同源物的交叉反应。
编码人CLDN6、CLDN4和CLDN9蛋白的DNA片段。
为了生成本发明中涉及人CLDN6(hCLDN6)蛋白需要的所有分子和细胞材料，合成编码与NCBI蛋白登录NP_067018相同的蛋白的密码子优化的DNA片段(IDT)。该DNA克隆用于表达成熟hCLDN6蛋白或其片段的构建体的所有后续改造。类似地，购买编码与人CLDN4(hCLDN4)的NCBI蛋白登录NP_001296或人CLDN9(hCLDN9)的NCBI蛋白登录NP_066192相同的蛋白的密码子优化的DNA片段，且用于表达hCLDN4或hCLDN9蛋白或其片段的构建体的所有后续改造。
编码小鼠CLDN6和CLDN4蛋白的DNA片段。
为了生成本发明中涉及小鼠CLDN6(mCLDN6)蛋白需要的所有分子和细胞材料，合成编码与NCBI蛋白登录NP_061247相同的蛋白的密码子优化的DNA片段(IDT)。该DNA克隆用于表达成熟mCLDN6蛋白或其片段的构建体的所有后续改造。类似地，购买编码与小鼠CLDN4(mCLDN4)的NCBI蛋白登录NP_034033相同的蛋白的密码子优化的DNA片段，且用于表达成熟mCLDN4蛋白或其片段的构建体的所有后续改造。
编码大鼠CLDN6和CLDN4蛋白的DNA片段。
为了生成本发明中涉及大鼠CLDN6(rCLDN6)蛋白需要的所有分子和细胞材料，合成编码与NCBI蛋白登录NP_001095834相同的蛋白的密码子优化的DNA片段(IDT)。该DNA克隆用于表达成熟rCLDN6蛋白或其片段的构建体的所有后续改造。类似地，购买编码与大鼠CLDN4(rCLDN4)的NCBI蛋白登录NP_001012022相同的蛋白的密码子优化的DNA片段，且用于表达成熟rCLDN4蛋白或其片段的构建体的所有后续改造。
细胞系改造
使用慢病毒载体以使用本领域公认的技术转导HEK-293T或3T3细胞系而构建过表达上面列出的各种CLDN蛋白的改造的细胞系。首先，使用PCR以使用上述商业合成的DNA片段作为模板扩增编码目的蛋白(例如，hCLDN6、mCLDN6、rCLDN6、hCLDN9、hCLDN4、mCLDN4或rCLDN4)的DNA片段。然后，将个别PCR产物亚克隆至慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP(System Biosciences)的多克隆位点(MCS)中，以生成一组慢病毒载体。所得pCDH-EF1-CLDN-T2A-GFP载体中的T2A序列促进肽键缩合的核糖体跳跃，导致两种独立蛋白的表达：T2A肽的上游编码的特定CLDN蛋白的高水平表达，和T2A肽的下游编码的GFP标记蛋白的共表达。该组慢病毒载体用于使用本领域技术人员众所周知的标准慢病毒转导技术生成过表达个别CLDN蛋白的分开的稳定的HEK-293T或3T3细胞系。用FACS使用也是GFP强阳性的高表达HEK-293T亚克隆选择CLDN阳性细胞。
实施例5
抗-CLDN抗体的生成
因为CLDN6与CLDN4和CLDN9同源性最高(参见图4A且如上述实施例4中所述分析)，CLDN6用作用于生成多反应性抗-CLDN抗体的免疫原。用过表达hCLDN6的HEK-293T细胞或3T3细胞(如实施例4中所述生成)接种小鼠，以产生生成抗体的杂交瘤。用以等体积的佐剂乳化的1百万个hCLDN6-HEK-293T细胞接种六只小鼠(以下菌株各自两个：Balb/c，CD-1，FVB)。使用过表达CLDN6的3T3细胞进行六只小鼠的第二次分开的接种(以下菌株各自两个：Balb/c，CD-1，FVB)。初始接种之后，用以等体积的明矾佐剂乳化的过表达CLDN6的细胞注射小鼠，每周两次，持续4周。
将小鼠处死并对引流淋巴结(腘，腹股沟，和内侧髂)进行解剖并将其用作抗体产生细胞的来源。通过使用模型BTX Hybrimmune系统(BTX Harvard Apparatus)的电细胞融合，将B细胞的单细胞悬浮液(305x106个细胞)与非分泌性P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC#CRL-1580)以1:1的比例融合。将细胞重悬浮于杂交瘤选择培养基：补充有重氮丝氨酸(Sigma)的DMEM培养基(Cellgro)、15％胎克隆I血清(Hyclone)、10％BM condimed(RocheApplied Sciences)、1mM丙酮酸钠、4mM L-谷氨酰胺、100IU青霉素-链霉素、50μM 2-巯基乙醇和100μM次黄嘌呤，并将在三个T225烧瓶中在每烧瓶90mL选择培养基中培养。将烧瓶置于含有5％CO2和95％空气的加湿37℃培养箱中六天。将该文库以约15x106个活细胞/小瓶冷冻于CryoStor CS10缓冲液(BioLife Solutions)的6个小瓶中，且储存于液氮中。
将来自文库的一个小瓶在37℃解冻，并将冷冻的杂交瘤细胞添加至90mL如上所述的杂交瘤选择培养基，并置于T150烧瓶中。将细胞在具有5％CO2和95％空气的湿润的37℃培养箱中培养过夜。第二天，从烧瓶收集杂交瘤细胞，并以每孔一个细胞(使用FACSAria I细胞分选仪)在200μL补充的杂交瘤选择培养基中将细胞铺板入48块Falcon 96孔U-底板。将杂交瘤培养10天，并使用流式细胞术，针对对于hCLDN6、hCLDN4或hCLDN9蛋白特异性的抗体，筛选上清液。流式细胞术如下进行：将每孔1×105个用编码hCLDN6、hCLDN4或hCLDN9的慢病毒载体稳定转导的HEK-293T细胞与100μL杂交瘤上清液孵育30分钟。用PBS/2％FCS洗涤细胞，然后将细胞与每样品50μL DyeLight 649标记的山羊-抗-小鼠IgG，Fc片段特异性二抗(在PBS/2％FCS中稀释(1：200))孵育。15分钟孵育之后，将细胞用PBS/2％FCS洗涤两次，并且将细胞再悬浮于含有DAPI(以检测死细胞)的PBS/2％FCS中，并通过流式细胞术，针对超过用同种型对照抗体染色的细胞荧光的荧光进行分析。在旁边设置对于CLDN抗原中的一种或多种的抗体测试阳性的所选杂交瘤，用于进一步表征。剩余未使用的杂交瘤文库细胞在液氮中被冷冻用于将来文库测试和筛选。
实施例6
抗-CLDN抗体的测序
如上所述生成抗-CLDN抗体，然后如下测序。使用RNeasy Miniprep试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明从所选杂交瘤细胞纯化总RNA。每个样品使用104至105个细胞。将分离的RNA样品储存于-80℃，直至使用。使用两种5'引物混合物组合3’小鼠Cγ引物扩增各杂交瘤的Ig重链的可变区，所述5'引物混合物包含86个小鼠特异性前导序列引物，所述前导序列引物被设计为靶向完整小鼠VH所有组成成分，所述3’小鼠Cγ引物对所有小鼠Ig同种型特异性。类似地，将含有64个被设计以用于扩增每个Vκ小鼠家族的5’Vκ前导序列的引物混合物与对于小鼠κ恒定区特异性的单一反向引物组合使用，以扩增和测序κ轻链。如下使用Qiagen一步(One Step)RT-PCR试剂盒，从100ng总RNA扩增VH和VL转录物。针对各杂交瘤运行总共四个RT-PCR反应，两个用于VK轻链和两个用于VH重链。PCR反应混合物包括，1.5μLRNA,0.4μL 100μM的重链或κ轻链引物(由IDT定制合成)，5μL 5x RT-PCR缓冲液，1μLdNTP，0.6μL含有逆转录酶和DNA聚合酶的酶混合物。热循环仪程序包括以下步骤：RT步骤50℃持续60分钟，95℃持续15分钟，随后35个循环的(94.5℃持续30秒，57℃持续30秒，72℃持续1分钟)和在72℃持续10分钟的最终孵育。使用与上文所述相同的特异性可变区引物，对提取的PCR产物进行测序。将PCR产物送至外部测序供应商(MCLAB)用于PCR纯化和测序服务。
图5A绘制来自抗-CLDN抗体的许多新型小鼠轻链可变区的连续氨基酸序列(SEQID NO:21-57，奇数)。图5B绘制来自相同抗-CLDN抗体的新型小鼠重链可变区的连续氨基酸序列(SEQ ID NO:23-59，奇数)。小鼠轻链和重链可变区核酸序列提供于图5C中(SEQ IDNO:20-58，偶数)。综上，图5A和5B提供10种小鼠抗-CLDN抗体(称为SC27.1、SC27.22、SC27.103、SC27.104、SC27.105、SC27.106、SC27.108(等同于SC27.109)、SC27.201、SC27.203和SC27.204)的注解序列。注释氨基酸序列以鉴定根据Kabat定义的构架区(即FR1-FR4)和互补决定区(即图5A中的CDRL1-CDRL3或图5B中的CDRH1-CDRH3)。使用Abysis数据库的专有版本分析可变区序列以提供CDR和FR名称。尽管根据Kabat编号CDR，本领域技术人员将理解，也可以根据Chothia、McCallum或任何其它接受的命名系统来定义CDR和FR名称。
各特定抗体的SEQ ID NO是连续的奇数。因此，单克隆抗-CLDN抗体SC27.1分别对于VL和VH包含氨基酸SEQ ID NO:21和23；且SC27.22包含SEQ ID NO:25和27等。各抗体氨基酸序列的对应核酸序列包括于图5C中且具有刚刚前面相应氨基酸SEQ ID NO的SEQ ID NO。因此，例如，SC27.1抗体的VL和VH的核酸序列的SEQ ID NO分别是SEQ ID NO:20和22。
实施例7
嵌合和人源化抗-CLDN抗体的生成
如下使用本领域公认的技术生成嵌合抗-CLDN抗体。使用实施例6中描述的方法从产生抗-CLDN抗体的杂交瘤提取总RNA且PCR扩增RNA。关于小鼠抗体的VH和VL链的V、D和J基因区段的数据获自本发明的抗-CLDN抗体的核酸序列(对于核酸序列，参见图5C)。使用以下限制性位点，设计对于抗体的VH和VL链的构架序列特异性的引物组：用于VH片段的AgeI和XhoI，以及用于VL片段的XmaI和DraIII。用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，然后用限制性酶AgeI和XhoI进行针对VH片段的消化，和用限制性酶XmaI和DraIII进行针对VL片段的消化。对VH和VL消化的PCR产物分别进行纯化并连接入IgH或IgK表达载体。在10μL的总体积中用200U T4-DNA连接酶(New England Biolabs)，7.5μL的消化和纯化的基因特异性PCR产物和25ng线性化的载体DNA，进行连接反应。在42℃下用3μL连接产物经由热休克转化感受态大肠杆菌DH10B细菌(Life Technologies)，并以100μg/mL的浓度将感受态大肠杆菌DH10B细菌铺板于氨苄青霉素板上。在扩增的连接产物的纯化和消化之后，将VH片段克隆入包含HuIgG1的pEE6.4表达载体(Lonza)(pEE6.4HuIgG1)的AgeI-XhoI限制性位点且将VL片段克隆入包含人κ轻链恒定区的pEE12.4表达载体(Lonza)(pEE12.4Hu-Kappa)的XmaI-DraIII限制性位点。
通过用pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-κ表达载体共转染HEK-293T或CHO-S细胞而表达嵌合抗体。转染前，在标准条件下，在150mm板中，在Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)(其补充有10％热灭活的FCS，100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素G)中培养HEK-293T细胞。为了瞬时转染，使细胞生长至80％汇合。2.5μg pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-κ载体DNA各自添加至1.5mL Opti-MEM中的10μL HEK-293T转染试剂。将该混合物在室温下孵育30分钟，并添加至细胞。在转染之后三至六天收获上清液。对于CHO-S细胞，将2.5μgpEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-Kappa载体DNA各自添加至400μL Opti-MEM中的15μg PEI转染试剂。将混合物在室温孵育10分钟，并添加至细胞。在转染后三至六天收获上清液。通过以800×g离心10分钟从细胞碎片使含有重组嵌合抗体的培养上清液澄清并将其保存在4℃。重组嵌合抗体用蛋白A珠纯化。
如下使用专有计算机辅助的CDR移植方法(Abysis Database,UCL Business)和标准分子改造技术将小鼠抗-CLDN抗体人源化。基于人种系抗体序列的构架序列和CDR规范结构以及相关小鼠抗体的构架序列和CDR之间的最高同源性设计可变区的人构架区。为了分析的目的，根据Kabat编号进行将氨基酸分配至各CDR结构域。一旦选择可变区，它们由合成基因区段生成(Integrated DNA Technologies)。使用上面对于嵌合抗体所述的分子方法克隆和表达人源化抗体。
人源化抗体的VL和VH氨基酸序列衍生自相应小鼠抗体的VL和VH序列(例如，hSC27.1衍生自小鼠SC27.1)。在生成的四种人源化抗体(hSC27.1、hSC27.22、hSC17.108和hSC27.204)的轻链或重链可变区中没有进行构架改变或回复突变。
为了解决稳定性问题，使用相同VH1家族中的不同VH构架产生hSC27.22的三种变体。所述变体被称为hSC27.22-VH1-8；hSC27.22-VH1-46；hSC27.22-VH1-69。此外，构建hSC27.108的一种变体，被称为hSC27.108v1，其与hSC27.108共享相同的重链(SEQ ID NO:119)，但与hSC27.108相比轻链不同。此外，生成hSC27.204的几种变体，被称为hSC27.204v1至hSC27.204v15，其中所有都共享相同的轻链(SEQ ID NO:120)，但是重链不同。hSC27.204和hSC27.204v4的重链在单一构架区突变T28D中不同。hSC27.204v1至hSC27.204v3和hSC27.204v5至hSC27.204v7在CDR中并入保守突变，以解决稳定性问题。具体地，hSC27.204v1、hSC27.204v2和hSC27.204v3在hSC27.204重链背景上分别含有修饰N58K、N58Q和T60N。类似地，hSC27.204v5、hSC27.204v6和hSC27.204v7在hSC27.204v4背景上分别含有修饰N58K、N58Q和T60N。最后，变体hSC27.204v8和hSC27.204v9在重链的位置93不包括回复突变，以尽可能减少免疫原性。具体地，变体hSC27.204v8、hSC27.204v9、hSC27.204v10、hSC27.204v11、hSC27.204v12、hSC27.204v13、hSC27.204v14和hSC27.204v15对应于变体hSC27.204、hSC27.204v1、hSC27.204v2、hSC27.204v3、hSC27.204v4、hSC27.204v5、hSC27.204 6和hSC27.204v7，除了变体8-15缺乏A93T回复突变。
此外，构建hSC27.22人源化的抗体恒定区的9种变体。第一变体hSC27.22ss1是位点特异性变体，并在下面实施例8中更详细描述。通过用IgG2(称为“hSC27.22IgG2”)或IgG4的突变形式(称为“hSC27.22IgG4R409K”；“hSC27.22IgG4S228P”；“hSC27.22IgG4S228PK370E R409K”；“hSC27.22IgG4K370E”；“hSC27.22IgG4S228P K370E”；“hSC27.22IgG4C127SS228P”；“hSC27.22IgG4C127S K370E”；和“hSC27.22IgG4C127S S228P K370E”)取代IgG同种型而构建其它变体。下表5显示根据Kabat等人编号的人源化的抗-CLDN抗体及其变体的概述。
在各情况下，检查人源化的抗体的结合亲和力，以确保其基本上等同于相应的小鼠抗体。图5A描绘示例性人源化抗体及其变体的VL的连续氨基酸序列。图5B描绘示例性人源化抗体及其变体的VH的连续氨基酸序列。抗-CLDN人源化抗体的轻链和重链可变区的核酸序列提供于图5C中。
图5D显示示例性人源化抗体及其变体的轻链和重链的全长序列。hSC27.1(SEQ IDNO:75和76)和hSC27.22(SEQ ID NO:77和78)。
图5E至5H包含显示CDR的hSC27.1(图5E)；hSC27.22(图5F)；hSC27.108(图5G)；和hSC27.204(图5H)人源化抗体的轻链和重链可变区的注释的氨基酸序列(根据Kabat等人编号)，如使用Kabat、Chothia、ABM和Contact方法确定。
实施例8
位点特异性抗-CLDN抗体的生成
构建改造的人IgG1/κ抗-CLDN位点特异性抗体，其包含天然轻链(LC)恒定区和重链(HC)恒定区，其中在HC的上铰链区中的半胱氨酸220(C220)(其与LC中的半胱氨酸214(C214)形成链间二硫键)被取代为丝氨酸(C220S)。当组装时，HC和LC形成抗体，所述抗体包含两个适合于缀合至治疗剂的游离半胱氨酸。除非另有说明，恒定区残基的所有编号是根据如在Kabat等人所述的EU编号方案。
如下生成改造的抗体。通过DNA2.0(Menlo Park,CA)密码子优化hSC27.22抗体的HC的核酸序列(SEQ ID NO:67)以生成以下核酸序列：
CAAGTGCAGCTCGTCCAGTCCGGTGCCGAAGTCAAGAAGCCGGGCGCATCAGTGAAAGTGTCGTGCAAAGCCTCCGGGTACACCTTCACCTCATACTGGATGAACTGGGTCCGCCAAGCCCCGGGACAGAGACTGGAGTGGATGGGCATGATTCACCCATCCGATTCCGAGATCCGGCTGAACCAGAAGTTCAAGGACCGCGTGACCATCACCCGGGACACCAGCGCCAGCACTGCCTACATGGAATTGAGCTCGCTGCGGTCCGAGGATACCGCTGTGTACTATTGCGCGAGGATCGACTCCTACTACGGCTACCTTTTCTACTTCGACTACTGGGGACAAGGGACGACCGTGACTGTGTCGAGC(SEQ ID NO:178)。
将优化的核酸克隆至在HC的恒定区中含有C220S突变的表达载体上。将编码hSC27.22的突变体C220S HC的载体与编码hSC27.22的天然IgG1κLC的载体一起共转染于CHO-S细胞中，并使用哺乳动物瞬时表达系统表达。改造的含有C220S突变体的抗-CLDN位点特异性抗体被称为hSC27.22ss1。hSC27.22ss1位点特异性抗体的全长HC的氨基酸序列显示于图5D(SEQ ID NO:122)。hSC27.22ss1的LC的氨基酸序列与hSC27.22的LC的氨基酸序列(SEQ ID NO:123)是相同的。
还构建包含天然的LC恒定区和突变的HC恒定区的改造的人IgG4/κ抗-CLDN位点特异性抗体，其中在LC中与半胱氨酸220(C220)形成链间二硫键的IgG4重链的CH1中的半胱氨酸127(C127)被丝氨酸(C127S)取代。当组装时，HC和LC形成包含适合于缀合至治疗剂的两个游离半胱氨酸的抗体。使用Quikchange位点定向诱变试剂盒(Agilent)根据制造商的方案使用IgG4表达载体作为模板进行该修饰。
如下生成改造的抗体。将hSC27.22的密码子优化的核酸(SEQ ID NO:178)克隆至在HC的恒定区中含有C127S突变的表达载体上。将编码hSC27.22的突变体C127S HC的载体与编码hSC27.22的天然IgG1κLC的载体一起共转染于CHO-S细胞中，并使用哺乳动物瞬时表达系统表达。将C127S修饰应用于如上述实施例7中所述生成的各种修饰的IgG4构建体。所得IgG4位点特异性构建体显示于上表5和图5D中，且被称为：hSC27.22IgG4S228P；hSC27.22IgG4R409K；hSC27.22IgG4S228P K370E R409K；hSC27.22IgG4K370E；hSC27.22IgG4S228P K370E；hSC27.22IgG4C127S S228P；hSC27.22IgG4C127S K370E；和hSC27.22IgG4C127S S228P K370E。
通过SDS-PAGE表征改造的抗-CLDN位点特异性抗体，以证实已经生成正确的突变体。在还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)的存在和不存在的情况下，在来自Life Technologies的预制10％Tris-甘氨酸微型凝胶上进行SDS-PAGE。电泳后，用胶体考马斯溶液染色凝胶(数据未显示)。在还原条件下，观察到对应于游离LC和游离HC的两个条带。该模式是还原条件下的IgG分子典型的。在非还原条件下，条带模式不同于天然IgG分子，表明HC和LC之间不存在二硫键。观察到对应于HC-HC二聚体的约98kD的条带。此外，观察到对应于游离LC的模糊条带和对应于LC-LC二聚体的约48kD的主要条带。由于在各LC的c-末端上的游离半胱氨酸，预计形成一定量的LC-LC物质种类。
实施例9
抗-CLDN抗体的特异性
表征如实施例5中所述生成的小鼠抗体，以确定它们是否与CLDN家族成员和CLDN家族成员的直向同源物交叉反应。
如下进行流式细胞术分析：用如上述实施例4中所述制备的编码(i)hCLDN6、mCLDN6和rCLDN6；(ii)hCLDN9；或(iii)hCLDN4、mCLDN4和rCLDN4的慢病毒载体稳定转导HEK-293T细胞。在4℃将用上述表达构建体稳定转导的1x105个HEK-293T细胞与在50μl最终体积的PBS/2％FCS中稀释至10μg/ml的hSC27.1或hSC27.22抗体一起孵育30分钟。孵育后，将细胞用200μL PBS/2％FCS洗涤，通过离心沉淀，弃去上清液，并将细胞沉淀再悬浮于50μL/样品的1:200稀释于PBS/2％FCS中的DyeLight 649标记的山羊-抗-小鼠IgG，Fc片段特异性的二抗中。在4℃孵育15分钟之后，将细胞如先前所述用PBS/2％FCS洗涤和沉淀两次，并再悬浮于100μL含有2μg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)的PBS/2％FCS中。通过流式细胞术分析样品，并针对超过用同种型对照抗体染色的细胞的荧光的荧光用DyeLight649评价活细胞。
上述流式细胞术测定导致许多抗-CLDN抗体的鉴定。基于相比于使用减去一种(FMO)同种型对照的荧光测定的信号对于所述抗体与特异性过表达所示CLDN家族成员的细胞系的结合的几何平均荧光强度的变化(ΔMFI)确定交叉反应性(灰色-实心)(图6A)。因此，两种hCLDN6结合抗体SC27.1和SC27.22可以描述为密蛋白多反应性抗体，因为它们在该测定中与人CLDN家族的三个成员(hCLDN6、hCLDN4和hCLDN9)交叉反应。SC27.1和SC27.22抗体也结合至CLDN4和CLDN9的小鼠和大鼠直向同源物(数据未显示)。
为了测试各种额外小鼠抗体结合至CLDN家族成员的能力，使用过表达人CLDN4、CLDN6或CLND9的细胞系进行流式细胞术，所述细胞系已经与10μg/mL纯化的抗-CLDN一抗或小鼠IgG2b对照抗体孵育，随后与Alexa 647抗-小鼠二抗孵育。如图6B中所示，所有抗体都结合至CLDN6，然而一些是CLDN6特异性的(例如，SC27.102、SC27.105和SC27.108)，且其它是多反应性的且结合至CLDN6和CLDN9两者(例如，SC27.103和SC27.204)，或CLDN6和CLDN4两者(例如，SC27.104)。因此，对于本发明的抗体，获得广泛范围的多反应性结合概况。
为了比较多反应性抗-CLDN抗体对于CLDN6和CLDN9的表观结合亲和力，用人源化的抗-CLDN抗体hSC27.22的系列稀释物进行流式细胞术。将抗体连续稀释至范围为50pg/ml至100μg/ml的浓度，并添加至含有过表达CLDN6或CLDN9的HEK-293T细胞的96孔板，并在冰上保持一小时。添加抗人二抗(Jackson ImmunoResearch目录号109-605-098)，并在黑暗中孵育一小时。将细胞在PBS中洗涤两次，其后添加Fixable Viability染料(eBioscience目录号65-0863-14)，持续10分钟。用PBS额外洗涤后，将细胞用多聚甲醛(PFA)固定，并根据制造商的说明在BD FACS Canto II流式细胞仪上阅读。使用荧光微球(Bangs Laboratories)根据制造商的说明将MFI值均一化。对于抗体与CLDN6或CLDN9表达细胞的结合观察到的均一化的最大MFI值用于使用以下方程将数据转换为各过表达细胞的分数最大结合：分数最大结合＝(观察到的均一化的MFI/最大均一化的MFI)。然后使用GraphPad Prism软件包(LaJolla,CA)中提供的相比于响应模型的log(抑制剂)的四参数可变斜率曲线拟合计算hSC27.22对于各细胞系的结合的表观EC50值。图6C显示人源化多反应性抗-CLDN6抗体hSC27.22具有与对于CLDN9的表观EC50基本上相同的对于CLDN6的表观EC50。(表观EC50CLDN6 3.45μg/mL(拟合优度的r2＝0.9987，99％置信区间：2.51 4.75μg/mL)；表观EC50CLDN9 4.66μg/mL(拟合优度的r2＝0.9998，99％置信区间：4.09 5.31μg/mL))。
实施例10
使用流式细胞术检测PDX肿瘤上的CLDN蛋白表达
流式细胞术用于评价两种代表性hCLDN6结合抗体hSC27.1和hSC27.22特异性检测PDX肿瘤细胞的表面上的hCLDN蛋白的存在的能力。同种型染色和荧光减一(FMO)对照用于证实染色特异性。
本领域公认的酶促组织消化技术用于获得PDX肿瘤细胞的单细胞悬浮液(参见，例如，U.S.P.N.2007/0292414)。将PDX肿瘤收获、解离并用商业可得的抗小鼠CD45和H-2kD抗体(以区分小鼠细胞)和抗人EpCAM和抗-CLDN抗体共染色。抗-hCLDN抗体hSC27.1表明人(即mCD45和H-2kD阴性)EpCAM-阳性肿瘤细胞的子集(包括OV-S(例如，OV44,OV54)，OV-PS(例如，OV63MET)，PA，LU-SCC(例如，LU22)，LU-Ad(例如，LU134,LU135)和LIV的阳性染色(图7)。同种型对照抗体和FMO对照用于证实染色特异性，这是本领域的标准惯例。使用BD FACSCanto II流式细胞仪根据制造商的说明进行流式细胞仪。
hCLDN染色的水平在不同的PDX肿瘤细胞系间不同，其中一些肿瘤细胞完全不染色(数据未显示)，而其它肿瘤细胞系表现出相比于同种型对照的人肿瘤细胞(例如，OV63MET)的几乎一致阳性的染色(图7)。这些数据表明，hCLDN在人肿瘤亚型的亚群上表达，所述人肿瘤亚型的亚群可以适合于使用本发明的抗-CLDN抗体或ADC的治疗。
实施例11
癌症干细胞群体中的CLDN表达的富集
肿瘤细胞可以广泛分为两种类型的细胞亚群：非致瘤性细胞(NTG)和肿瘤起始细胞或致瘤性细胞。致瘤性细胞具有当植入免疫功能低下的小鼠时形成肿瘤的能力，而非致瘤性细胞则没有。癌症干细胞(CSC)是致瘤性细胞的子集，且能够无限自我复制，同时维持多谱系分化的能力。
为了证实实施例1和2中的观察(其显示各种肿瘤的CSC亚群中的CLDN4、CLDN6和CLDN9的过表达)，且为了确定本发明的抗-CLDN抗体是否能够检测致瘤性CSC群体，如上面实施例10中所述将PDX肿瘤解离成单细胞悬浮液，且选择标志物CD46高CD324+用于如下富集CSC肿瘤细胞亚群(参见WO 2012/031280)。
PDX肿瘤单细胞悬浮液与以下抗体孵育：抗-CLDN SC27.1；抗人EPCAM；抗人CD46；抗人CD324；和抗小鼠CD45和H-2kD抗体。然后评价肿瘤细胞，用于通过流式细胞术使用BDFACS Canto II流式染色仪染色。OV-S(例如，OV44和OV54MET)、OV-PS(例如，OV91MET)、PA、LU-Ad(例如，LU135)和LU-Sq(例如，LU22)PDX肿瘤的人EPCAM+CD46高CD324+CSC肿瘤细胞亚群表明用抗-CLDN SC27.1抗体的阳性染色，而NTG细胞(CD46低/-和/或CD324-)表明用抗-CLDN抗体的显著较少的染色(图8A)。同种型对照抗体和FMO对照用于证实染色特异性，这是本领域的标准惯例。概述CSC和NTG细胞的表面上观察到的抗-CLDN抗体的差异染色的表格显示于图8A中，其中表达计算为各自肿瘤细胞亚群的所示抗-CLDN抗体和同种型对照之间的几何平均荧光强度的变化(ΔMFI)。这些数据证实CSC上的hCLDN蛋白的表达，且再次表明抗-CLDN抗体可以有效治疗癌症。
为了确定肿瘤中的CLDN表达是否可以与增强的致瘤性相关，进行以下研究。将人OV PDX肿瘤样品(OV91MET)在免疫功能低下的小鼠中生长，并肿瘤达到800-2,000mm3之后切出。使用本领域公认的酶促消化技术将肿瘤解离成单细胞悬浮液(参见，例如，U.S.P.N.2007/0292414)。人OV PDX肿瘤细胞用小鼠抗-CD45或抗-H2kD抗体和抗-ESA抗体染色以区分人肿瘤细胞和小鼠细胞。将肿瘤也用抗-CLDN抗体(SC27.22)染色，然后使用FACSAriaTM流式细胞仪(BD Biosciences)进行分选。将人OV PDX肿瘤细胞分离成CLDN+和CLDN-亚群。用200个CLDN+OV肿瘤细胞皮下注射五个雌性NOD/SCID免疫功能低下的小鼠；且用200个CLDN-OV肿瘤细胞注射五个小鼠。每周测量肿瘤体积，持续四个月。
图8B显示CLDN+(闭环)肿瘤细胞能够在体内在功能上重构肿瘤，而CLDN-肿瘤(开环)则没有。因此，表达CLDN的肿瘤细胞的致瘤性比不表达CLDN的那些肿瘤细胞大得多，表明CLDN蛋白可以在功能上定义人肿瘤内的致瘤性亚群，且支持所选抗-CLDN ADC可用于靶向可以导致显著肿瘤消退和预防肿瘤复发的肿瘤细胞的致瘤性亚群的概念。
实施例12
抗-CLDN抗体在体外促进细胞毒性剂的递送
为了确定抗-CLDN抗体是否能够内化和介导细胞毒性剂递送至活肿瘤细胞，使用所选抗-CLDN抗体和连接至抗小鼠二抗FAB片段的皂草毒蛋白进行体外细胞杀伤测定。皂草毒蛋白是使核糖体失活、由此抑制蛋白合成并导致细胞的死亡的植物毒素。皂草毒蛋白是仅在细胞内具有细胞毒性，在细胞内，它可以接近核糖体，但其自身无法内化。因此，这些测定中的皂草毒蛋白介导的细胞毒性表明抗小鼠FAB-皂草毒蛋白缀合物仅在抗-CLDN抗体的结合和内化后内化至靶细胞中的能力。
HEK-293T细胞和过表达hCLDN6、hCLDN4或hCLDN9的HEK-293T细胞的单细胞悬浮液以500个细胞/孔铺板至BD组织培养板(BD Biosciences)中。一天后，将250pM纯化的SC27.1、SC27.22或同种型对照(mIgG1)抗体和固定浓度的2nM抗-小鼠IgG FAB-皂草毒蛋白缀合物(Advanced Targeting Systems)添加至培养物。抗体处理后，将HEK-293T细胞孵育72小时。孵育之后，根据制造商的说明使用(Promega)计数活细胞。将使用仅与二级FAB-皂草毒蛋白缀合物孵育的含有细胞的培养物的粗发光计数设定为100％参考值，并相应地计算所有其它计数。抗-CLDN抗体SC27.1和SC27.22两者在250pM的浓度有效地杀死过表达hCLDN6和hCLDN9的HEK-293T细胞(图9A)，然而小鼠IgG1同种型对照抗体(mIgG1)在相同浓度则没有。未处理的HEK-293T细胞没有被所述处理有效地杀死，然而过表达hCLDN4的HEK-293T细胞被SC27.1有效地杀死，但没有被测试的剂量的SC27.22处理杀死。水平虚线代表没有观察到细胞毒性的水平。
为了测定额外抗体对于CLDN4、CLDN6或CLDN9的表观IC50，经0.15nM至1000nM的浓度范围用抗体的滴定液重复上述段落中描述的实验(图9B)。如上所述通过计算在各抗体浓度观察到的细胞杀死的百分数，且将曲线拟合至所得数据，以计算抗体对各细胞系的杀死活性的表观IC50。具有>2000nM的表观IC50的抗体被认为不杀死特定的细胞系，并且在图9B中表示为“NK”。对照小鼠IgG1抗体也没有杀死任何测试的细胞系。尽管该细胞毒性测定法经由结合的抗原的内化测量各种抗体介导细胞毒素的递送的能力，而不是提供抗体结合亲和力的直接量度，图9B中显示的抗体的表观IC50通常与图6B中呈现的单点流式细胞术数据良好相关。例如，在两个实验中，显示SC27.108是CLDN6特异性的(表观IC50＝100nM)。类似地，通过流式细胞术，SC27.103显示与CLDN6的强结合和与CLDN9的适度结合，这与对于CLDN6的58nM的表观IC50值和对于CLDN9的466nM的表观IC50值相关。然而，还明显的是，高于背景的可检测的结合不总是导致可检测的杀死(例如，SC27.104结合至CLDN9(参见图6B)，但不能有效地内化和杀死过表达CLDN9的细胞(参见图9B)；然而SC27.201结合CLDN9(参见图6B)，并且能够内化至表达CLDN9的细胞中并杀死那些细胞(参见图9B))。
总之，上述结果表明多反应性抗-CLDN抗体介导内化的能力，和她们递送细胞毒性有效载荷的能力，这支持抗-CLDN抗体可具有作为用于ADC的靶向部分的治疗效用的假设。
实施例13
使用免疫组织化学检测肿瘤的表面上的CLDN6
为了评价肿瘤中的CLDN6蛋白表达的程度，在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的PDX肿瘤和原发性卵巢肿瘤的组织微阵列(TMA)上进行免疫组织化学(IHC)。
切割细胞沉淀块的平面切片，并封固在显微镜载玻片上。二甲苯去石蜡化之后，将5μm切片在99℃用抗原修复溶液(Dako)预处理20分钟，冷却至75℃，然后用PBS中的0.3％过氧化氢处理，然后用抗生物素蛋白/生物素封闭溶液(Vector Laboratories)处理。然后将FFPE载片用3％BSA/PBS缓冲液中的10％驴血清封闭，并在室温与3％BSA/PBS中稀释至10μg/ml的购自IBL America(目录号18865)的抗-CLDN6兔多克隆一抗孵育30分钟。在室温将FFPE载片与3％BSA/PBS中稀释至2.5μg/ml的生物素-缀合的驴抗-兔抗体(VectorLaboratories)孵育30分钟，随后与链霉亲和素-HRP(ABC Elite试剂盒；VectorLaboratories)孵育。在室温用3,3'-二氨基联苯胺(Thermo Scientific)发展生色检测5分钟，并将组织用迈耶的苏木精(IHC World)复染，用乙醇洗涤并浸入二甲苯。
为了证实抗-CLDN6一抗的特异性，在过表达hCLDN6、hCLDN4或hCLND9的HEK-293T细胞的FFPE载片上进行IHC。抗-CLDN6多克隆抗体特异性染色过表达hCLDN6的HEK-293T细胞沉淀，但不染色hCLDN4和hCLDN9的过表达细胞系(数据未显示)。
图10A显示OV、BR和LU PDX肿瘤中的hCLDN6表达的总结概述，如通过IHC测定。得到无染色(-)至高染色强度(+++)的染色强度的得分。还注明表达CLDN6的肿瘤细胞的百分数。在LU、BR和OV肿瘤中观察到CLDN6表达，其中许多PDX系在FFPE载片上的90％细胞中显示表达。
为了测定卵巢癌患者中的hCLDN6表达的百分数，还在从由切割自癌症患者的125个原发性卵巢肿瘤制备的TMA生成的FFPE载片上进行IHC(Oklahoma University)。在TMA的数字扫描的图像上利用Leica Biosystems Tissue IA软件生成H-得分。简言之，在组织IA优化器下在量度染色的细胞算法中分配对于hCLDN6特异性的染色优先性。然后单独注释TMA得分，使得图像分析将仅分析肿瘤细胞，而不分析其它组织成分诸如基质。使用产生H-得分的hCLDN6膜染色算法分析TMA。使用下式针对肿瘤细胞的膜染色计算H-得分算法：H-得分＝(在0的％染色强度)*0+(在1+的％染色强度)*1+(在2+的％染色强度)*2+(在3+的％染色强度)*3。因此，该得分产生范围为0至300的连续变量。图10B中的表中的结果显示TMA的125个肿瘤样品中的CLDN6的表达水平，其中70％的肿瘤表达一定水平的CLDN6。
总之，这些IHC数据表明CLDN6在卵巢、乳房和肺肿瘤的细胞表面上以及原发性人肿瘤中表达，再次证实密蛋白是用于开发抗体和ADC治疗剂用于治疗显著数目的癌症患者的相关目标。抗-CLDN6在这些和可能额外的癌症适应症中可以具有诊断效用。
实施例14
抗-CLDN6抗体-药物缀合物的制备
制备具有Ab-[L-D]结构的抗-CLDN抗体药物缀合物(ADC)，其中Ab是指抗-CLDN抗体，L是指任选的连接体(例如，包含具有游离巯基基团的末端马来酰亚胺基部分的连接体)且D是指药物或细胞毒素(例如阿里他汀类、卡里奇霉素等)。各ADC包含共价连接至连接体-药物的抗-CLDN抗体。使用本领域已知的技术，例如基本上如下，合成和纯化ADC。在20℃，在含有5mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，通过每摩尔抗体预定摩尔添加一定摩尔三(2-羧乙基)-膦(TCEP)部分还原抗-CLDN抗体的胱氨酸键，持续90分钟。以3摩尔/摩尔抗-CLDN抗体的比率添加溶解于二甲基乙酰胺(DMA)中的连接体-药物。使反应进行30分钟。使用水中制备的N-乙酰基半胱氨酸(NAC)的10mM储备溶液，通过将过量NAC添加至连接体-药物淬灭反应。20分钟的最小淬灭时间之后，通过添加0.5M乙酸将pH调节至6.0，并使用30kDa膜通过渗滤缓冲液交换至渗滤缓冲液中。然后将渗滤的抗-CLDN ADC用蔗糖和聚山梨醇酯20制备至目标最终浓度。针对蛋白浓度(通过测量UV)、聚集(SEC)、药物抗体比(DAR)(通过反相HPLC(RP-HPLC))和体外细胞毒性分析所得抗-CLDN ADC。
实施例15
使用选择性还原方法缀合位点特异性抗-CLDN抗体
如上面实施例14中所述制备具有Ab-[L-D]结构的抗-CLDN抗体药物缀合物(ADC)，其中Ab部分是如上面实施例8中所述生成的位点特异性抗体，例如hSC27.22ss1。期望产物是这样的ADC，其在各LC恒定区上的未配对的半胱氨酸(在IgG1位点特异性抗体的情况下的C214或IgG4位点特异性抗体上的C127)最大限度地缀合，且尽可能减少具有大于2(DAR>2)或小于2(DAR<2)的药物抗体比(DAR)的ADC，同时尽可能增加具有2的DAR(DAR＝2)的ADC。
为了进一步改善缀合的特异性和最终位点特异性ADC的均匀性，使用，例如，方法选择性还原位点特异性抗体(例如，“hSC27.22ss1”或“hSC27.22IgG4C127S S228P”)，所述方法包括稳定剂(例如，L-精氨酸)和温和的还原剂(例如谷胱甘肽)，然后与连接体-药物缀合，随后为制备型疏水性相互作用层析(HIC)，其用于分离不同的DAR物质种类。例如，基本上如下所述进行上述程序。
在室温在含有1M L-精氨酸/5mM还原型谷胱甘肽(GSH)/5mM EDTA(pH 8.0)的缓冲液中部分还原位点特异性抗体的制备物，持续最少1小时。然后使用30kDa膜(MilliporeAmicon Ultra)将所有制备物缓冲液交换至20mM Tris/3.2mM EDTA(pH 8.2)缓冲液中，以去除还原缓冲液。然后在室温将所得部分还原的制备物经由连接体(例如马来酰亚胺连接体)缀合至细胞毒素(例如阿里他汀、卡里奇霉素等)，持续最少30分钟。然后通过将过量NAC添加至连接体-药物使用水中制备的NAC的10mM储备溶液淬灭反应。20分钟的最少淬灭时间之后，通过添加0.5M乙酸将pH调节至6.0。使用30kDa膜将位点特异性ADC缓冲液交换至渗滤缓冲液中。然后用高盐缓冲液稀释位点特异性的ADC制备物以增加导电率，以促进结合至树脂上，然后上样至丁基HP树脂层析柱(GE Life Sciences)上。然后，采用渐降的盐梯度以基于疏水性分离不同的DAR物质种类，其中DAR＝0物质种类首先洗脱，随后是DAR＝1，DAR＝2，然后是更高的DAR物质种类。
使用RP-HPLC分析最终ADC“HIC纯化的DAR＝2”制备物，以测定HC和LC上的百分比缀合和DAR分布。还使用分析型HIC分析样品以测定DAR＝2物质种类相对于不想要的DAR>2和DAR<2物质种类的量。
实施例16
人源化抗-CLDN抗体药物缀合物在体内抑制肿瘤生长
使用本领域公认的技术，基本上如下文所述，测试，例如如上面实施例14和15中所述生成的抗-CLDN ADC，以表明其抑制免疫缺陷小鼠中的卵巢肿瘤生长的能力。
使用本领域公认的技术在雌性NOD/SCID小鼠的侧腹中皮下生长表达CLDN的PDX肿瘤系和不表达CLDN的对照肿瘤系。每周一次或两次监测肿瘤体积和小鼠重量。当肿瘤体积达到150-250mm3时，将小鼠随机分配至治疗组，并用1或2mg/kg人源化抗-CLDN ADC的单一剂量、2mg/kg抗-半抗原对照人IgG ADC或媒介物对照(例如，0.9％盐水或5％葡萄糖)的单一剂量腹膜内注射。治疗后，监测肿瘤体积和小鼠重量，直至肿瘤超过800mm3或小鼠变得生病。选择用人源化抗-CLDN ADC治疗的小鼠用于进一步分析，包括毒性研究，所述小鼠不表现出超出免疫缺陷的荷瘤NOD/SCID小鼠中常见的那些的任何有害健康影响且与对照IgGADC和媒介物相比有效地减小肿瘤体积。
实施例17
抗-CLDN抗体药物缀合物降低肿瘤干细胞频率
如实施例11中所表明，CLDN表达与癌症干细胞相关。因此，为了表明用抗-CLDNADC治疗降低已知耐药且刺激肿瘤复发和转移的癌症干细胞(CSC)的频率，进行体内有限稀释测定(LDA)，例如，基本上如下所述。
在免疫缺陷小鼠中皮下生长PDX肿瘤(例如黑色素瘤或卵巢肿瘤)。当肿瘤体积平均大小为150mm3–250mm3时，将小鼠随机分成两组。一组腹膜内注射缀合至药物的人IgG1作为阴性对照；且另一组腹膜内注射抗-CLDN ADC(例如，如实施例14和15中制备)。给药后一周，使来自各组的两个代表性小鼠安乐死，并收获它们的肿瘤并分散至单细胞悬浮液。然后如先前实施例1中所述收获、合并和分解来自各处理组的肿瘤细胞。所述细胞用FITC缀合的抗小鼠H2kD和抗小鼠CD45抗体标记来检测小鼠细胞；用EpCAM标记来检测人体细胞；且用DAPI来检测死细胞。然后通过FACS使用BD FACS Canto II流式细胞仪分选所得悬浮液，并分离和收集活的人肿瘤细胞。
用1250、375、115或35个用抗-CLDN ADC处理的分选的来自肿瘤的人细胞注射小鼠的四个组群。作为阴性对照，用1000、300、100或30个用对照IgG1ADC处理的分选的来自肿瘤的活的人细胞移植小鼠的四个组群。每周测量受体小鼠中的肿瘤，且在肿瘤达到1500mm3之前使个别小鼠安乐死。受体小鼠被评分为具有阳性或阴性肿瘤生长。阳性肿瘤生长被定义为超过100mm3的肿瘤生长。
泊松分布统计学(L-Calc软件，Stemcell Technologies)用于计算各群体中的CSC的频率。

Claims (32)

1.抗体，所述抗体结合至表达CLDN家族的至少一种蛋白质的癌症干细胞。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体特异性结合至CLND6。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体特异性结合至CLDN6和CLDN9。
4.权利要求3的抗体，其中所述抗体以基本上相同的表观结合亲和力结合至CLDN6和CLDN9。
5.权利要求1的抗体，其中所述抗体以基本上相同的表观结合亲和力结合至CLDN6和CLDN9。
6.权利要求1-5的抗体，所述抗体是内化抗体。
7.抗体，所述抗体结合至CLDN家族的至少一个成员且与包含以下的抗体竞争结合：
SEQ ID NO:21的轻链可变区(VL)和SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)；或
SEQ ID NO:25的VL和SEQ ID NO:27的VH；或
SEQ ID NO:29的VL和SEQ ID NO:31的VH；或
SEQ ID NO:33的VL和SEQ ID NO:35的VH；或
SEQ ID NO:37的VL和SEQ ID NO:39的VH；或
SEQ ID NO:41的VL和SEQ ID NO:43的VH；或
SEQ ID NO:45的VL和SEQ ID NO:47的VH；或
SEQ ID NO:49的VL和SEQ ID NO:51的VH；或
SEQ ID NO:53的VL和SEQ ID NO:55的VH；或
SEQ ID NO:57的VL和SEQ ID NO:59的VH。
8.权利要求7的抗体，其中所述抗体特异性结合至CLND6。
9.权利要求7的抗体，其中所述抗体特异性结合至CLDN6和CLDN9。
10.权利要求7的抗体，其中所述抗体是嵌合的、CDR移植的、人源化的或重组的抗体或其片段。
11.权利要求7的抗体，其中所述抗体是内化抗体。
12.人源化抗体，所述人源化抗体结合至CLDN家族的至少一种蛋白质且与包含以下的抗体竞争结合：如SEQ ID NO:61中所述的三个可变轻链CDR(CDRL)；和如SEQ ID NO:63中所述的三个可变重链CDR(CDRH)；或如SEQ ID NO:65中所述的三个CDRL和如SEQ ID NO:67中所述的三个CDRH；或SEQ ID NO:69中所述的三个CDRL和如SEQ ID NO:71中所述的三个CDRH；如SEQ ID NO:73中所述的三个CDRL和如SEQ ID NO:75中所述的三个CDRH。
13.权利要求12的人源化抗体，其包含VH和VL，其中所述VL具有包含SEQ ID NO:151的CDRL1、SEQ ID NO:152的CDRL2和SEQ ID NO:153的CDRL3的三个CDRL；或所述VL具有包含SEQ ID NO:157的CDRL1、SEQ ID NO:158的CDRL2和SEQ ID NO:159的CDRL3的三个CDRL；或所述VL具有包含SEQ ID NO:163的CDRL1、SEQ ID NO:164的CDRL2和SEQ ID NO:165的CDRL3的三个CDRL；或所述VL具有包含SEQ ID NO:169的CDRL1、SEQ ID NO:170的CDRL2和SEQ IDNO:171的CDRL3的三个CDRL。
14.权利要求12的人源化抗体，其包含VH和VL，其中所述VH具有包含SEQ ID NO:154的CDRH1、SEQ ID NO:155的CDRH2和SEQ ID NO:156的CDRH3的三个CDR(CDRH)；或所述VH具有包含SEQ ID NO:160的CDRH1、SEQ ID NO:161的CDRH2和SEQ ID NO:162的CDRH3的三个CDRH；或所述VH具有包含SEQ ID NO:166的CDRH1、SEQ ID NO:167的CDRH2和SEQ ID NO:168的CDRH3的三个CDRH；或所述VH具有包含SEQ ID NO:172的CDRH1、SEQ ID NO:173的CDRH2和SEQ ID NO:174的CDRH3的三个CDRH。
15.权利要求12的人源化抗体，其包含VH和VL，其中所述VL具有包含SEQ ID NO:151的CDRL1、SEQ ID NO:152的CDRL2和SEQ ID NO:153的CDRL3的三个CDRL且所述VH具有包含SEQID NO:154的CDRH1、SEQ ID NO:155的CDRH2和SEQ ID NO:156的CDRH3的三个CDRH；或包含VL和VH的抗体，其中所述VL具有包含SEQ ID NO:157的CDRL1、SEQ ID NO:158的CDRL2和SEQID NO:159的CDRL3的三个CDRL且所述VH具有包含SEQ ID NO:160的CDRH1、SEQ ID NO:161的CDRH2和SEQ ID NO:162的CDRH3的三个CDRH；或包含VL和VH的抗体，其中所述VL具有包含SEQ ID NO:163的CDRL1、SEQ ID NO:164的CDRL2和SEQ ID NO:165的CDRL3的三个CDRL且所述VH具有包含SEQ ID NO:166的CDRH1、SEQ ID NO:167的CDRH2和SEQ ID NO:168的CDRH3的三个CDRH；或包含VL和VH的抗体，其中所述VL具有包含SEQ ID NO:169的CDRL1、SEQ ID NO:170的CDRL2和SEQ ID NO:171的CDRL3的三个CDRL且所述VH具有包含SEQ ID NO:172的CDRH1、SEQ ID NO:173的CDRH2和SEQ ID NO:174的CDRH3的三个CDRH。
16.人源化抗体，所述人源化抗体结合至CLDN家族的至少一种蛋白质，其包含如SEQ IDNO:114中所述的全长轻链和如SEQ ID NO:115中所述的全长重链；或如SEQ ID NO:116中所述的全长轻链和如SEQ ID NO:117中所述的全长重链；或如SEQ ID NO:118中所述的全长轻链和如SEQ ID NO:119中所述的全长重链；或如SEQ ID NO:120中所述的全长轻链和如SEQID NO:121中所述的全长重链。
17.权利要求1-16中任一项的抗体，其中所述抗体缀合至有效载荷。
18.核酸，其编码权利要求1-16中任一项的抗体。
19.权利要求17的核酸，所述核酸含于载体中。
20.权利要求18的核酸，所述核酸在宿主细胞中表达。
21.抗体药物缀合物(ADC)，其包含嵌合的、CDR移植的、人源化的或重组的人抗体或其片段，其结合至表达CLDN家族的至少一种蛋白的癌症干细胞，其中所述抗体缀合至细胞毒性剂。
22.式Ab-[L-D]n的ADC，其中Ab是权利要求1-16的抗体；L是任选的连接体；D是药物；且n是约1至约20的整数。
23.药物组合物，其包含权利要求22的ADC。
24.治疗癌症的方法，其包括将权利要求23的药物组合物施用于有需要的受试者。
25.权利要求24的方法，其中所述癌症选自卵巢癌、肺癌、乳癌和胰腺癌。
26.权利要求25的方法，其中所述癌症是肺腺癌。
27.权利要求26的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
28.权利要求24的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少一种额外的治疗部分。
29.减少肿瘤细胞群体中的癌症干细胞的方法，其中所述方法包括使包含癌症干细胞和除了癌症干细胞以外的肿瘤细胞的肿瘤细胞群体与抗-CLDN ADC接触；由此降低癌症干细胞的频率。
30.权利要求29的方法，其中所述接触在体内进行。
31.权利要求29的方法，其中所述接触在体外进行。
32.将细胞毒素递送至细胞的方法，其包括使所述细胞与权利要求22的ADC接触。
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