KR102340989B1 - 클라우딘 3의 ecl-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도 - Google Patents

클라우딘 3의 ecl-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 클라우딘 3의 ECL-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 기능적 단편들의 암세포 검출, 진단, 영상화, 암 치료에의 적용 용도(항체 자체의 항암용도, ADC 및 CAR-발현 세포(특히, 면역세포)에의 적용)와, 이러한 용도에 있어서 현저한 효과를 나타내는 특유의 CDR 서열을 포함하는 항체 및 이의 기능적 단편에 관한 것이다.
클라우딘 3의 ECL-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 기능적 단편들은 다른 암 항원 또는 클라우딘 3의 ECL-1을 표적하는 기존의 항체들보다 암세포 검출, 진단, 영상화, 암 치료에의 적용(ADC 및 CAR-T에의 적용) 등에 있어서 매우 우수한 능력을 보인다. 특히 이러한 구체적인 일례로서 본원 발명에서 제공하는 특유의 CDR 서열을 포함하는 항체는 자체로서 항암능력을 보유할 뿐만아니라 다른 클라우딘 패밀리와 교차 반응성 없이 우수한 암세포 표적능을 나타내고, 마우스 클라우딘3과도 결합하므로 독성 및 효능평가의 비임상 실험을 통한 작용검증에도 유리하며, 세포 내재화(internalization) 등의 특성을 보유하여 상기 용도로의 적용에 있어 현저한 효과를 나타낸다.

Description

클라우딘 3의 ECL-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도{Antibody specifically binding to extracellular second loop of claudin 3, its fragment, and uses thereof}
본 발명은 클라우딘 3의 ECL-2(extracellular second loop)에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 클라우딘 3의 ECL-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 기능적 단편들의 암세포 검출, 진단, 영상화, 암 치료에의 적용 용도(항체 자체의 항암용도, ADC 및 CAR-발현 세포(특히,면역세포)에의 적용)와, 이러한 용도에 있어서 현저한 효과를 나타내는 특유의 CDR 서열을 포함하는 항체 및 이의 기능적 단편에 관한 것이다.
클라우딘(claudin)은 세포 간 밀착연접(tight junction, TJ)의 주요 필수 막단백질로서 포유류의 경우 27개의 패밀리가 있으며, 사람의 경우 포유류에서 클라우딘 13을 제외한 클라우딘 패밀리를 가지고 있다. 클라우딘 패밀리는 세포벽을 투과하여 박혀 있는 형태의 유사한 구조를 가지며, 대부분 두 개의 세포 외 루프(extracellular loop)를 가지고 있는 구조를 가지고 있다. 클라우딘은 세포 간 분자들의 흐름을 제어하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 최근 다양한 연구들을 통하여 결장암, 위암, 유방암, 식도암 및 난소암 등 암의 발생과도 밀접한 관련성이 있다는 연구가 보고되고 있다. 악성 종양의 약 90 %는 상피(epithelium)에서 유래한다. 정상 상피 세포에서, 세포는 상피 평면(epithelial plane)과 평행하게 위치된다. 따라서 정상적인 상피 조직간의 TJ를 구성하는 클라우딘은 조직 또는 기관의 표면에서 검출되기 힘들지만, 상피 종양 발생의 초기 단계에서 유사 분열 방추체(mitotic spindle)의 조절이 해제되고 세포가 평면을 벗어난 분열에 의해 증식되어 클라우딘이 조직 표면으로 노출된다.
특히, 뚜렷한 증상이 없고 수술과 화학적 요법 이외에는 적절한 치료 방법이 없어 예후가 나쁜 것으로 알려져 있는 난소암에서 클라우딘 패밀리 중 클라우딘 3와 클라우딘 4가 과발현된다는 것이 보고되었다(Claudin Proteins in Human Cancer: Promising New Targets for Diagnosis and Therapy, P.J. Morin, Cancer Res. 65: 9604-9006 (2005)). 또한 84명의 난소 장액성 선암(ovarian serous adenocarcinoma) 환자의 생존율과 클라우딘 3의 발현율을 Kaplan-Meier 기법의 생존커브로 확인한 결과, 클라우딘 3의 발현율이 환자의 수명 단축과 밀접한 관계가 있다는 연구가 보고되었다(Expression profile of tight junction protein claudin 3 and claudin 4 in ovarian serous adenocarcinoma with prognostic, Choi et al., Histol. Histopathol. 22:1185~1195(2005)). 이와 같이 암 조직에서 특이성이 높은 클라우딘 발현의 증감여부는 암 생성에 대한 예측지시인자로 사용될 수 있으며, 또한 암의 진단과 치료에 있어 클라우딘이 유용한 바이오마커가 되어 다양한 그룹에서 클라우딘을 타겟으로 하는 치료제 개발을 시도 중에 있다.
한편, 항체-약물-결합체(ADC, antibody drug conjugate)는 단클론 항체의 표적 특이성과 약물의 효능(예를 들어, 세포독성)의 특성을 조합한 것이다. ADC는 약물, 단클론 항체, 그리고 항체와 약물을 연결하는 링커(linker)를 포함한 세 가지 구성 요소로 구성되어 있으며, ADC 테크놀로지는 주로 암 세포의 표면에 발현된 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 약물을 종양세포에 전달하는 방법으로서 사용되고 있다. 하지만 단순히 특정 암 항원을 표적하는 항체가 ADC에 모두 적용될 수 있는 것은 아니다.
기존 항체는 큰 사이즈와 친수성 특징으로 살아있는 세포내부로 직접 침투하지 못한다. 따라서, 기존의 대부분의 항체는 세포외로 분비된 단백질 또는 세포막 단백질을 특이적으로 표적하고 있다. 일반적 항체와 고분자 바이오 의약품은 소수성인 세포막 통과가 불가능하여 세포질 내부의 다양한 질병관련 물질과 결합 및 저해하지 못하는 한계가 있다. 일반적으로 세포의 생장, 특이적 억제 등과 같은 기작연구를 위한 실험에서 사용되는 세포내부 물질과 특이적 결합하는 상업적 항체들은 살아있는 세포에 대해서 직접 처리하지 못하고, 세포내부 물질과 결합하기 위해서는 양친매성 글리코사이드인 사포닌(saponin)을 이용한 세포막 투과화(permeabilization) 과정을 통해 세포막에 천공을 형성하기 위한 전처리 과정이 반드시 필요하다. 저분자 물질, 핵산 또는 나노입자 등의 경우 다양한 시약, 전기천공법 또는 열충격 등의 방법을 사용하여 살아있는 세포내부로 수송이 가능하지만, 단백질 및 항체의 경우 상기한 대부분의 시약과 실험조건 등이 고유한 3차 구조에 악 영향을 미쳐 활성을 소실할 수 있다. 세포내부 단백질을 특이적 결합하고, 활성을 저해하는 세포내 항체(intracellular antibody, intrabody)가 개발되고 있지만, 이 또한 살아있는 세포의 세포막을 침투하는 활성이 없어 유전자 치료(gene therapy)용도로만 적용이 가능하여 향후 응용가능성이 매우 제한된다(Manikandan J et al., Protein i: interference at protein level by intrabodies, Front Biosci , 2007 Jan 1;12:1344-52).
항체-약물 접합체(ADC), 면역독소, 그리고 표적화된 핵산 전달을 비롯한 몇몇 치료적 접근법은 수용체에 결합할 뿐만 아니라 결합 시에 세포 내로 내재화 (internalization)되는 항체를 필요로 한다. ADC가 우수한 약효를 나타내기 위해서는 ADC가 세포 안으로 들어가는(internalization, 내재화) 과정이 필요한 것으로 알려져 있으나, 항체에 따라서 세포 내로 들어갈 수 있는 능력이 없거나 이에 대한 편차가 매우 크기 때문에 실제 ADC로 개발 가능한 항체와 이들의 효과가 제한적인 실정이다.
이에 본 발명자들은 ADC(항체-약물 결합체)로 사용하기에 적합한 여러 가지 특성을 겸비하는 항체를 개발하고자 연구하던 중, 클라우딘 3 ECL-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 기능적 단편의 암세포 검출, 진단, 영상화, 암 치료에의 적용(ADC 및 CAR-발현 세포(특히,면역세포)에의 적용 등) 가치를 확인하고, 이러한 구체적인 일례로서 본원 발명에서 제공하는 특유의 CDR 서열을 포함하는 항체가 자체로서 항암능력을 보유할 뿐만아니라 다른 클라우딘 패밀리와 교차 반응성 없이 우수한 암세포 표적능을 나타내고, 기존 공지의 클라우딘3 항체와 비교하여 매우 우수한 결합력(친화도)를 나타내며, 세포 내재화(internalization) 등의 특성을 보유하여 상기한 적용에 있어 현저한 효과를 보이는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(VH-CDR1), 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성결정부위 2(VH-CDR2), 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성결정부위 3(VH-CDR3)을 포함하는 중쇄가변영역; 및
서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위1(VL-CDR1), 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위 2(VL-CDR2), 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위 3(VL-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 이를 포함하는 세포 및 이를 이용한 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 클라우딘 3 검출용 조성물 및 이를 이용한 클라우딘 3 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 또는 영상화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 구체적으로 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 암세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다. 또한 클라우딘 3의 세포 외 두 번째 루프(extracellular second loop, ECL-2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 세포 내 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편; 및 약물이 결합된 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate)와 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 또한 클라우딘 3의 세포 외 두 번째 루프(extracellular second loop, ECL-2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편; 및 약물이 결합된 항체-약물 결합체와 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, ⅰ) 상기 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편; ii) 막통과 도메인(transmembrane domain); 및 iii) 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signlaing domain)을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 제공하는 것이다. 또한 ⅰ) 클라우딘 3의 세포 외 두 번째 루프(extracellular second loop, ECL-2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편; ii) 막통과 도메인(transmembrane domain); 및 iii) 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signlaing domain)을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 이를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 세포(특히, 면역세포)를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위1(VH-CDR1), 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성결정부위 2 (VH-CDR2), 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성결정부위 3(VH-CDR3)을 포함하는 중쇄가변영역; 및
서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위1(VL-CDR1), 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위 2(VL-CDR2), 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위 3(VL-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 이를 포함하는 세포 및 이를 이용한 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 클라우딘 3 검출용 조성물 및 이를 이용한 클라우딘 3 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 또는 영상화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 암세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다. 또한 클라우딘 3의 세포 외 두 번째 루프(extracellular second loop, ECL-2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 세포 내 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 기능적 단편; 및 약물이 결합된 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate)와 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 또한 클라우딘 3의 세포 외 두 번째 루프(extracellular second loop, ECL-2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편; 및 약물이 결합된 항체-약물 결합체와 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ⅰ) 상기 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편; ii) 막통과 도메인(transmembrane domain); 및 iii) 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signlaing domain)을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 제공한다. 또한 ⅰ) 클라우딘 3의 세포 외 두 번째 루프(extracellular second loop, ECL-2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편; ii) 막통과 도메인(transmembrane domain); 및 iii) 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signlaing domain)을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 이를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 세포(특히, 면역세포)를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어‘항체(antibody)’는 면역 글로불린(immunoglobulin, Ig)이라고도 불리며, 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 자연에서 발견되는 전체 항체(whole antibody)는 일반적으로 여러 도메인으로 이루어진 폴리펩티드인 경쇄(light chain, LC) 및 중쇄(heavy chain, HC)의 2개 쌍으로 이루어지거나, 이들 HC/LC의 2개의 쌍으로 된 구조를 기본 단위로 한다. 포유류의 항체를 구성하는 중쇄의 종류는 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 유형이 있으며, 중쇄의 종류에 따라 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 등 다른 종류의 항체를 구성하게 된다. 포유류의 항체를 구성하는 경쇄의 종류는λ 및 κ로 표시되는 2가지 종류가 존재한다.
항체의 중쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역과 불변영역으로 구분된다. 중쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CH1, CH2 및 CH3(IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄불변영역으로 구성되어 있으며, 경쇄는 1개의 불변영역인 CL으로 구성되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역(VH) 또는 경쇄가변영역(VL)의 하나의 도메인으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되어 1개의 공유 이황결합(disulfide bond)에 의해 연결되고, 경쇄와 결합한 두 분자의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항체는 2개의 중쇄 및 경쇄의 쌍(HC/LC)으로 구성되어 있으므로, 한 분자의 전체 항체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일 특이성을 갖게 된다.
항체가 항원에 결합하는 부위를 포함하는 가변영역은 서열 가변성이 적은 골격 부위(framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위(hypervariable region)인 상보성 결정부위(complementary determining region, CDR)로 세분된다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 N-말단부터 C-말단의 방향으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영역 안에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로, 항체의 항원 특이성에 가장 중요하다.
본 발명에서 용어“친화도”는 분자(예, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 상대(예, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, “결합 친화도”는 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 본 발명에서 항체의 "친화도"는 Kd로 표현되며, 이는 전술한 바와 같이 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 의미한다. 항원에 대한 항체 결합에 있어서 Kd 값이 클수록, 특정 항원에 대한 결합 친화도는 더 약하다. 상기 Kd 또는 친화도는 당해 분야에 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있으며, 예를들어, Surface Plasmon Resonance, Ligand Tracer Green 등의 측정 기기를 이용할 수 있다.
본 발명에서‘클라우딘 3(claudin 3, CLDN3으로도 표기)’은 클라우딘 패밀리에 속하는 단백질로서, 밀착연접(tight junctions)이 일어나는 부분에 존재하여 밀착연접에서 세포 간의 공간을 제거하는 특유의 역할을 한다. 밀착연접(tight junctions)은 동물과 같은 유기체의 조직에서 인접한 세포막을 연결하는 견고한 구조물이다. 클라우딘 3은 이온과 같은 작은 용질(solute)의 세포간 투과성을 조절하는 구조단백질이다. 클라우딘 3은 4개의 막통과(transmembrane)영역을 가지는 단백질이며, 두 개의 펩티드 루프(loop)를 세포 외부로 노출시키는 구조를 가지고 있다. 두 개의 펩티드 루프 중 클라우딘 3 전체 단백질 서열에서 보다 N-말단에 가까운 아미노산 영역의 루프를 세포외 첫 번째 루프(본 발명에서 ECL-1 또는 EL1으로 표기)로 칭하며, 다른 하나의 루프를 본 발명에서 세포외 두 번째 루프(본 발명에서 ECL-2 또는 EL2로 표기)로 칭한다. 바람직하게 상기 세포외 첫 번째 루프는 클라우딘 3 단백질 아미노산 서열의 27 내지 80번째 아미노산을 포함하는 영역이며, 세포 외 두 번째 루프는 클라우딘 3 단백질 아미노산 서열의 144 내지 159번째 아미노산을 포함하는 영역(서열번호 2 참조)을 의미한다.
Claudin 3는 Clostridium perfringens enterotoxin(CPE)에 대한 독소 수용체로서 기능하는 것으로 알려져 있다. CPE는 Claudin 3와 Claudin 4에 결합한 다음 세포 괴사를 일으키는 큰 복합체를 형성하여 세포막에 공극을 생성한다.
한편, 클라우딘 단백질들의 세포 외 도메인은 TJ(밀착 연접)의 형성에 관여하는데, 정상적인 상피 세포 단일층(normal confluent epithelial cell monolayer)에서 claudin3은 측면 막의 정단 위치(apical site of the lateral membrane)의 TJ 가닥 내에 존재하는 것으로 여겨지는데, 상피 종양 형성 및 종양 세포에서의 비평면(out-of-plane) 분화 동안의 유사분열 방추체의 조절장애는 세포 표면에 TJ 성분의 비정상적인 위치를 유도하는 것으로 추측된다(Saeki R, et al., Potency of claudin-targeting as antitumor therapy Mol Cell Pharmacol. 2010; 2:47-51.). 이와 관련하여, Claudin 3 단백질은 난소 암, 전립선 암, 유방암, 자궁암, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 방광암 및 결장암과 같은 많은 암 조직에서 노출 정도가 증가하는 것으로 보고되었다. Swedish Human Protein Atlas (HPA) 웹 사이트 (http://www.proteinatlas.org/)를 질병에 대한 Claudin 3 발현 프로파일의 참고 자료로 사용 가능하다. Claudin 3와 Claudin 4의 발현은 화학 요법 내성 및/ 또는 재발 성 자궁암에서 특히 높아지는데, 이는 미국에서 부인과 암 중에서 가장 치사율이 높은 것으로 알려져 있다. 그러나, 아직까지 종양 상태에서 노출되는 클라우딘 3를 특이적으로 검출하는데는 한계를 나타내고 있는 실정이다.
본원 발명에서 클라우딘 3은, 당업계에 클라우딘 3로 알려진 것이라면 그 구체적 생물 기원 및 서열이 특별히 제한되지 않을 수 있다. 일례로 본발명의 클라우딘 3은 마우스(Mus musculus) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. Q9Z0G9 등으로 공지된 것, 랫(Rattus norvegicus) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. Q63400 등으로 공지된 것, 닭 (Gallus gallus) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. Q98SR2 등으로 공지된 것, 개 (Canis lupus familiaris) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. Q95KM5 등으로 공지된 것, 원숭이(Macaca mulatta) 유래의 것으로서 UniProtKB Entry. F6RQF6 등으로 공지된 것, 인간(homo sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. O15551(서열번호 1 참조)등으로 공지된 것을 포함할 수 있다.
그리고 이러한 항체 및 이의 기능적 단편의 일례로서, 본 발명에서 제공하는 특유의 CDR 서열을 가지는 항체가 클라우딘 3 발현 세포에 대한 ADCC(Antibody dependent cell cytotoxicity) 효과가 현저하여 자체로서 항암효과를 보유할 뿐만아니라, 다른 클라우딘 패밀리와 교차 반응성 없이 클라우딘 3만을 특이적으로 표적하는 능력이 뛰어나고 기존 공지의 클라우딘3 항체와 비교하여 매우 우수한 결합력(친화도)를 나타내며, 또한 세포내부로 들어가는(internalize) 능력을 보유하여 암의 진단, 영상화 및 약물전달체로서의 기능이 우수한 것을 확인하였다. 특히 본원 발명의 항체 및 이의 기능적 단편은 클라우딘 3의 ECL-2 영역에 특이적으로 부착하는데, 이에 따라 클라우딘 3이 표면에 노출되지 않은 보통의 정상 조직과 달리 불완전한 연접(junction)을 형성하는 종양 조직에 본원 발명의 항체(또는 이의 기능적 단편이) 선택적으로 접근 가능하게 되며, 이러한 능력은 정상세포에 대한 항암 약물의 독성문제를 현저히 저감시키는 것으로서, 더욱 기술적 의의가 크다.
구체적으로 본 발명은, 하기의 CDR 서열을 포함하는 것을 특징으로하는 중쇄가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 제공한다:
서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위1(VH-CDR1), 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성결정부위 2 (VH-CDR2), 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성결정부위 3(VH-CDR3)을 포함하는 중쇄가변영역; 및
서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위1(VL-CDR1), 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위 2(VL-CDR2), 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위 3(VL-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변영역.
본 발명에 따른 항체는 상기한 CDR의 조합을 갖는 것이라면 그 종류에 제한이 없다. 구체적으로는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 특히 IgG 항체인 것이 바람직하다. 상기 IgG는 이의 아형으로서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한 1개의 B 세포에서 유래하는 단일클론(monoclonal)항체일 수도 있고, 복수의 B 세포에서 유래하는 다클론(polyclonal) 항체일 수도 있지만, 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이거나, 인간에서 유래한 항체의 부분과 다른 종의 동물에서 유래한 항체의 부분을 포함하는 키메릭(chimeric) 항체일 수 있다.
또한 본 발명에서 항체의 기능적 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하고 있는 단편을 의미하며, 구체적으로는 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, scFv, 디아바디(diabody) 또는 dsFv 등의 형태일 수 있다.
Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다. dsFv는 VH 및 VL 중 각각 하나의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩타이드를 당해 시스테인 잔기 간의 S-S 결합을 개재하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 Reiter 등에 의해 기재된 방법[참조: Protein Engineering, 7, 697(1994)]에 따라서 항체의 입체구조 예측에 근거하여 선택할 수 있다.
본 발명의 상기 항체 또는 이의 기능적 단편들은 클라우딘 3에 특이적으로 결합하며, 특히 클라우딘 3의 ECL-2(extracellular loop 2)에 매우 높은 친화도(affinity)로 특이적으로 부착하여 세포 내부로 내재화(internalization)되는 것을 특징으로 한다.
상기 클라우딘 3은 당업계에 클라우딘 3으로 알려진 것이라면 그 구체적 생물기원이 특별히 제한되지 않으며, 일례로 전술한 바와 같은 마우스 유래, 인간 유래, 랫 유래, 닭 유래, 개 유래 또는 원숭이 유래의 것 등을 포함한다. 바람직하게 인간 유래의 것을 의미하는 것일 수 있으며, 인간 클라우딘 3의 ECL-2는 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일실시예에서는 본원 발명의 항체가 클라우딘 3과 계통분석적으로 유연관계가 높은 다른 클라우딘 패밀리와는 교차반응성이 없는 것을 확인하여, 본 발명의 항체의 결합 특이성이 매우 우수한 것을 증명한 바 있다. 이러한 높은 수준의 결합 특이성은 클라우딘 3(특히 인간 클라우딘 3)을 검출하고 이를 특정 질병(특히, 클라우딘 3의 비정상적 (과)발현을 특징으로하는 질환)의 진단 및 영상화 등에 이용하여, 높은 정확성을 가지는 정보를 제공할 수 있다는 점에서 매우 의미있다.
따라서 본 발명은 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 클라우딘 3 검출용 조성물 및 키트를 제공한다 . 또한 본 발명은, (1) 상기 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및 (2) 상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 검출하는 단계를 포함하는 클라우딘 3 특이적 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 클라우딘 3과의 결합 여부 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 이에 제한되지 않으나, 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: 18F, 123I, 124I, 125I, 32P, 35S, 67Ga), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광 단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5), 자기공명 영상물질(예: Gadolinium(Gd, 가도리늄), 상자성입자(super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles))등 일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편은 검출 키트(kit) 또는, 진단 분석을 수행하기 위한 진단 키트로 제공될 수 있으며, 이때 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 포장된 시약들과 함께 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에, 키트는 기질 및 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자(cofactor)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액(예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민감도를 충분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.
상기 키트는 웨스턴 블럿 분석법, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동법, 조직 면역 염색법, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS), 단백질 칩 분석법 등에 이용되는 키트일 수 있으며, 각각의 분석법에 따라 함께 제공되는 시약, 보조물질, 용기(container), 고체 지지체 등은 당업계에 잘 아려져 있다.
상기 클라우딘 3 특이적 검출 방법에 따라, 당업자는 시료 내에 존재(또는 포함)하는 클라우딘 3 단백질의 유무와 농도를 측정가능하다. 본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 농도 측정을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
상기 (1) 단계에 앞서, 통상의 기술자는 항체 또는 이의 기능적 단편을 이용하여 단백질을 검출하는 공지의 방법을 적절하게 선택하고, 선택된 방법에 적합하게 시료를 준비할 수 있다. 또한 시료는 클라우딘 3의 비정상적 (과)발현을 특징으로하는 질환(예를들어, 암) 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 전혈(혈액), 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 등일 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 방법이란 여기 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 웨스턴 블랏, 면역 블랏, 닷 블랏, 면역조직화학염색, 효소면역분석(ELISA), 방사능면역검정법(radioimmunoassay), 경쟁적 결합 분석, 면역침전 등이 있다. 예를 들어 면역조직화학염색을 위해서는 세포나 조직의 절편을 고정하고 블락킹(blocking)하는 등의 전처리를 할 수 있다.
이어서 상기 (1) 단계에서는 전술한 바와 같이 준비된 시료에 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편을 접촉시킨다. 상기 접촉에 의하여 항원(클라우딘 3)-항체 복합체가 형성된다.
상기 (2) 단계에서는 시료에 생성된 항원-항체 복합체를 감지함으로써 시료 내 클라우딘 3 단백질의 존재 유무와 그 수준을 측정하는 단계이다. 전술한 바와 같이 검출에 이용된 본 발명의 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 표지된 상태로 제공된 것일 수 있으며, 이러한 경우 바로 표지를 검출할 수 있다. 그렇지 않은 경우에는 별도로 표지된 2차 항체를 사용할 수 있다. 상기 2차 항체란 1차 항체(이 경우, 본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편)의 Fc 부위 등에 결합하는 항체로서, 이러한 2차 항체의 사용에 대해서는 당업계에 주지되어 있다.
표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소(예를들어, 루시퍼라제, 퍼옥시다제, 갈락토시다제 등)를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량(예를 들어, 신틸레이션 계수(scintillation counting)에 의해 측정)을 측정함으로써 수행할 수 있다. 이외에도 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 바이오틴(biotin)에 접합된 형태로 제조되어, 적절히 표지된 스트렙토아비딘(streptavidin)과 반응시켜 감지할 수 있다. 아울러, 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.
이에 따라 상기 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편은 클라우딘 3의 (과)발현을 특징으로하는 질환의 진단 및 영상화에 이용될 수 있다. 본원 발명에서 진단 및 영상화 가능한 질환으로는, 당업계에 클라우딘 3의 비정상적인 발현(특히, 과발현)을 동반하는 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 암을 대상으로 하는 것일 수 있다. 따라서 본원 발명은, 상기 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물 및 암의 영상화용 조성물을 제공한다.
본원에서 상기 암(종양)은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 정상 상태와 비교하여 클라우딘 3의 과발현을 특징으로 하는 암 종류일 수 있고, 더욱 바람직하게 상피성 암일 수 있으며, 구체적 일례로 난소암, 결장암, 방광암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 자궁암, 자궁경부암, 흑색종, 대장암, 신장암 및 전이성 흉막 종양을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본원 발명의 항체 또는 이의 단편은 전술한 바와 같이 클라우딘 3에 대한 결합 특이성이 매우 높을 뿐만아니라, 클라우딘 3(특히 ECL-2)에 결합한 후 세포 내로 내재화(internalization)되는 것을 특징으로 한다. 이렇게 세포 내부로 들어가는 특성은 항체-약물 결합체(ADC, antibody-drug conjugate) 개발에 있어 큰 이점을 제공하며, ADC가 우수한 약효를 나타내기 위해서는 ADC가 세포 안으로 들어가는(internalization, 내재화) 과정이 필요한 것으로 알려져있다.
본원 발명에서 상기 내재화는 세포가 내부로 들어가는 것(침투)하는 것을 의미하는 것으로서, 내재화되는 유형 또는 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 엔도사이토시스(endocytosis)되는 것일 수 있다.
따라서 본원 발명은, 전술한 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 암세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본원 발명은 전술한 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편; 및 약물이 결합된 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate)를 제공한다 . 또한 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편; 및 이와 결합된 약물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC)"는 본 발명의 항체(또는 이의 기능적 단편)와 약물이 연결된 접합체를 의미하며, 면역접합체로도 불릴 수 있다. 상기 항체-약물 접합체는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
상기 항체-약물 접합체는 직접적으로 두 분자가 결합되는 것일 수 있고, 또는 링커 등의 임의의 수단에 의하여 간접적으로 두 분자가 결합되는 것일 수 있다. 상기 링커는 비절단성 링커 또는 절단성 링커일 수 있다. 일반적으로 ADC는 링커 등의 수단에 의한 간접적으로 결합되었다가 표적된 세포의 내부에서 약물이 절단될 수 있도록 설계되는 것이 이상적인 것으로 알려져 있다. 상기 링커는 세포 내 환경, 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀에 존재하는 절단제에 의해 절단될 수 있으며, 예를 들어 세포 내 펩티다아제 또는 프로테아제 효소 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 링커일 수 있다. 일반적으로 펩타이드 링커는 적어도 2개 이상의 아미노산 길이를 가진다. 일례로, 상기 절단성 링커는 pH 민감성으로, 특정 pH 값에서 가수분해에 민감할 수 있다. 일반적으로, pH 민감성 링커는 산성 조건에서 가수분해될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산성 불안정 링커 예를 들어, 하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니틱 아마이드 (cis-aconitic amide), 오르쏘에스테르, 아세탈, 케탈 등일 수 있다. 다른 일례로서, 상기 링커는 환원 조건에서 절단될 수도 있으며, 예를 들어 이황화 링커가 이에 해당할 수 있다. SATA (N-succinimidyl-S-acetylthioacetate), SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), SPDB (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate) 및 SMPT (N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene)를 사용하여 다양한 이황화 결합이 형성될 수 있다.
상기 약물 및/또는 약물-링커는 항체의 라이신을 통해 무작위로 접합되거나, 이황화 결합 사슬을 환원하였을 때 노출되는 시스테인을 통해 접합될 수 있다. 경우에 따라서, 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 시스테인을 통해 링커-약물이 결합될 수 있다. 상기 펩타이드 또는 단백질은 펩타이드 또는 단백질의 카복시 말단에서 결실(deletion)을 가지거나, 펩타이드 또는 단백질의 카복시(C) 말단에 스페이서 유닛의 공유결합을 통한 부가를 갖는다.
본 발명에서 용어, "약물"은 본 발명의 항체에 결합하여 치료 항체 자체의 효율을 증가시키거나, 항체의 혈중 내의 반감기를 증가시킬 수 있거나, 항체가 표적으로 하는 위치에 도달하여, 상기 표적 내의 암 등을 사멸시켜서 질병의 치료에 사용할 수 있는 물질을 제한 없이 포함하며, 그 예로 세포독성약물, 독소, 사이토카인, 케모카인, 항생제, 핵산분해효소와 같은 효소, 방사선 핵종, 광감각제, 광열나노소재, 나노파티클 및 미셀 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원 발명에서 상기 약물은 항체에 직접 연결(결합)될 수도 있고, 공지의 수단에 의하여 간접적으로 연결될 수 있다. 또한 항체에 결합되는 약물은, 상기 약물의 특정 담지 형태(예를 들어, 미셀, 나노파티클, 리포좀, 또는 덴드리머(dendrimer) 등에 담지된 형태 등을 모두 포함)로도 적용가능하다.
상기 세포독성약물은 질병의 치료에 사용할 수 있는 약물을 의미하며, 일례로 항암 활성을 지닌 약물(항암제)로서, 마이크로튜불린(microtubulin) 구조 형성 억제제, 유사분열(meiosis) 억제제, 토포아이소머라아제(topoisomerase) 억제제 또는 DNA 인터컬레이터(DNA intercalators)가 있다. 상기 세포 독성 약물은 메이탄시노이드(maytansinoid), 오리스타틴(auristatin), 돌라스타틴(dolastatin), 트리코테센(trichothecene), CC-1065 약물(NSC 298223), 칼리케아미신(calicheamicin), 에네딘(enediynes), 탁산(taxane), 안트라시클린(anthracycline), 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 빈데신(vindesine), 빈카 알카로이드(vinca alkaloid), 독소루비신(doxorubicin), 멜팔란(melphalan), 미토마이신 C(mitomycin C), 클로람부실(chlorambucil), 다우노루비신(daunorubicin), 다우노마이신(daunomycin), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 카르미노마이신(carminomycin), 아미노프테린(aminopterin), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 에스페라미신(esperamicin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 멜팔란(melphalan), 질소머스타드(메클로에타민 염산염)[nitrogen mustar(mechlorethamine HCL)], 시스-백금 및 그 동족체, 시스플라틴(cisplatin), CPT-11, 도세탁셀(docetaxel), 모노메틸 아우리스타틴 E(Monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(Monomethyl auristatin F), 또는 엠탄신(emtansine, DM1) 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "독소(toxin)"는 생물체가 만들어내는 독성을 가지는 약물을 의미하며, 그 종류는 특별히 제한되지 않으나, 식물독소, 동물독소, 균체외 독소 또는 세균 독소 등이 있다.
본원 발명의 항체는 전술한 바와 같이 클라우딘 3에 대한 결합 특이성이 매우 높을 뿐만아니라, 항체 자체가 클라우딘 3에 결합한 후 ADCC(Antibody dependent cell cytotoxicity)에 의한 세포독성 효과가 현저한 것이 특징이다. 이는 본 발명의 명세서 일실시예에 잘 나타나 있다. 따라서 본원 발명은 본원 발명의 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
항체의존성 세포독성(ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)은 NK 세포(natural killer cell)의 암세포 사멸기전 중의 하나로 알려졌다. NK 세포는 면역글로불린G(IgG)의 Fc에 대한 수용체인 CD16을 발현하며, 이 수용체를 통하여 다른 형태의 MHC 비제한성 살해를 수행할 수가 있다. 즉, NK 세포의 ADCC는 표적 세포를 인식하는 항체의 존재에 의존하는데, 항체가 항원과 결합하면 항체의 Fc 부위가 노출되며, 노출된 Fc 부위가 NK 세포의 수용체와 결합하여 다리를 형성하면, 수용체 결합으로 인해 발생하는 신호전달에 의해 NK 세포로부터 세포상해물질이 방출되어 표적 세포가 상해를 받는다.
이처럼 본원 발명의 항체는 자체로도 항암 효능을 지니기 때문에, 상기 항체를 항암활성 약물과 함께(특히, ADC의 형태로) 제공하는 경우에는 현저한 시너지 효과를 나타낸다.
본원 발명은 또한 상기한 항체 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 전술한 바와 같은 CDR 구성을 갖는 항체 또는 이의 단편을 암호화할 수 있는한 염기 조합이 특별히 제한되지 않는다. 아미노산 서열이 밝혀진 경우, 당업계에 공지된 코돈 정보에 기초하여 상기 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 기술은 당업계에 주지되어있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함하여 단쇄 또는 이중쇄의 형태의 핵산분자로서 제공될 수 있다.
또한 본원 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 ‘재조합(recombinant)’은 ‘유전자 조작(genetic manipulation)'과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝(molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다.
본 발명에서 ‘발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.
본 발명에서 ‘재조합 발현 벡터’란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. ‘작동가능하게 연결된(operably linked)’이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 상기 ‘발현조절서열(expression control sequence)’이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 상기 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절서열은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커 및/또는 복제 기원(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함 될 수 있다. 또한 상기 발현벡터는 필요에 따라 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며, pcDNA 등을 사용할 수 있다.
본원 발명에서 상기 재조합 벡터는 항체의 경쇄 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와; 중쇄 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 벡터에 동시에 포함(삽입)시킨 형태로 제공될 수 있고, 또는 2개(다른 종류를 포함)의 벡터에 각각 포함(삽입)시켜 제공될 수 있다.
또한 본원 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본원 발명에서 용어 숙주세포(host cell)는 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.
본 발명의 (숙주)세포는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
더욱 구체적 일례로서, 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체 예를 들어 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이， 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시 엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살 모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimur ium) , 세라티아 (Serratia), 예를 들어， 세 라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실리 (Bacilli), 예를 들어， 비. 섭틸리스 (B. subtil is) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis), 슈도모나스 (Pseudomonas)， 예를 들어 피 . 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 백터를 발현가능 한 것이면， 특별히 제한되지 아니하나， 바람직하게는 이 . 콜라이， 이에 한정되지 아니하나 예를 들어， 이 . 콜라이 ER2537, 이 . 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이 . 콜라이 W3110 (ATCC 27,325) 또는 LacZ가 발현 가능한 이. 콜라이일 수 있으며， 더욱 바람직하게는 이. 콜라이 ER2537일 수 있다. 본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속， 종 및 균주， 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 쉬조사카로마이세스품베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주， 예를 들어 케이. 락티스 (K.lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스. (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. ickerami i ) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (Κ· waltii) (ATCC 56,500)， 케이. 드로소필라룸 (K. drosophi larum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모를레란스 ((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누 스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226)； 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070)； 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia (EP 244,234))； 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬바 니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidental is); 및 필라멘트성 진균， 예를 들어 뉴로스포라， 페니실리움 (Penicillium), 를리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주， 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) 및 에이. 니거 (niger)가 사용가능 하다.
한편 본 발명의 세포는 동물세포 특히 척추동물 세포일 수 있다. 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었고 기술들이 폭넓게 이용 가능하다. 이에 제한되지 아니하나, 유용한 포유동물 숙주 세포의 예는 SV40에 의 해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라 이 (현탁 배양으로부터 서브클로닝된 293 또는 293 세포 [Graham 등， 1977， J Gen Virol. 36： 59]), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL10), 차이니즈 햄스터 난소 세포 /-DHFR" (CHO, Urlaub 등， 1980, Proc. Natl . Acad. Sci. USA 77: 4216； 예 를 들어, DG44), 마우스 세르를리 세포 (TM4, Mather, 1980, Biol . eprod. 23:243-251), 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70)， 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 경부 암세포 (HELA, ATCC CCL 2)， 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34)， 버팔로 랫트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐세포 (W138,ATCC CCL 75)， 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065)， 마우스 유방 종양 (匪 T 060562, ATCC CCL51), TRI 세포 (Mather 등， 1982, Annals NY. Acad. Sci. 383： 44-68), MRC 5 세포， FS4 세포， 인간 간암 세포주(Hep G2)- HEK 293 cell (human embryonic kidney cell) 및 Ex i293FTM cell일 수 있으며， 바람직하게는 CHO cell, HEK 293 cell(human embryonic kidney cell) 또는 Expi293FTM cell일 수 있다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다.본 발명의 일실시예에서는 CHO(Chinese hamster ovary)-S 세포를 이용한 바 있다.
상기 형질전환은 핵산(본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 탄화물 위스터(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격(heat shock)법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
상기 세포에는 항체의 경쇄 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와; 중쇄 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 벡터에 동시에 포함(삽입)시킨 형태로 제공된 재조합 벡터가 도입될 수 있고, 또는 상기 폴리뉴클레오티드가 각각 2개(다른 종류를 포함)의 벡터에 따로 포함(삽입)된 형태로 제공된 다수의 재조합 벡터를 하나의 세포 또는 다수의 세포에 도입시킬 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 항체의 중쇄, 경쇄 또는 이들의 기능적 단편을 생산하게 된다.
본 발명은 또한
(a) 상기 형질전환된 세포를 (폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서) 배양하여 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및
(b) 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 클라우딘 3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편의 생산방법을 제공한다.
상기 (a) 단계는 상기 형질전환된 숙주세포(하이브리도마 포함)를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 본 발명에 따른 항체의 중쇄, 경쇄 또는 항체의 기능적 단편의 폴리펩티드가 생산되도록 하는 단계이다. 상기 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등은 당업계에서 통상 사용되는 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 일례로, 상업적으로 이용가능한 배지， 예컨대 햄(Ham's) F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, M0), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma- Aldrich Co.), 및 둘베코 (Dulbecco's) 개질 이글 (Eagle's) 배지 (DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포를 배양 하기에 적합할수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자，염， 완충액, 뉴클레오티드, 항생제，미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다.
숙주 세포에서 생산되는 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화(targeted)되도록 할 수 있으며, 이는 전술한 바를 참조로 하여 이해된다.
또한 본 발명에 따른 항체가 클라우딘 3(특히, ECL-2)에 대한 결합특이성을 유지하도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩(refolding)시키고 기능성 구조(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우, 중쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 중쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고, 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다.
상기 (b) 단계는 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계이다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 이의 기능적 단편 폴리펩타이드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 항체 또는 그 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고, 원심분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 항체를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 이의 기능적 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 항체는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 항체, 이의 기능적 단편 또는 이들을 포함하는 ADC를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 조성물의 투여 경로는 공지된 항체 투여 방법, 예를 들어 정맥내, 복강내, 뇌내, 피하, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 기재된 서방성 (sustained release) 시스템에 의한 주사 또는 주입일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 일례로 본 발명의 항체는 전신으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체, 이의 기능적 단편 또는 이들을 포함하는 ADC는 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 본 발명의 치료용 조성물을 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, l9th Edition, Alfonso, R., ed, Mack Publishing Co.(Easton, PA: 1995))와 바람직한 순도를 갖는 항체를 혼합하여 저장하기 위해 동결건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 제조할 수 있다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충용액, 예를 들어 인산, 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다. 특정 실시 양태에서, 약학적 조성물은 비강 내 스프레이, 흡입 및/또는 다른 에어로졸(aerosol) 전달 비히클들에 의해 전달될 수 있다. 유전자, 폴리뉴클레오타이드 및 펩타이드 조성물을 비강 에어로졸 스프레이를 통해 폐에 직접 전달하기 위한 방법은, 예를 들면 미국 특허 제 5,756,353호 및 미국 특허 제 5,804,212호에 기재된 것을 참조로 할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 이들은 ADC로 제공되는 경우에 또한 투여용량을 달리할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도 및/또는 목적에 따라 유효성분(본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편)의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 0.01mg/kg/day - 1000mg/kg/day, 바람직하게는 0.1mg/kg/day 내지 100mg/kg/day이며 더욱 바람직하게는 1mg/kg/day 내지 20mg/kg/day의 유효 용량으로 일정간격으로 수차례 반복 투여 될 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
상기한 바와 같이, 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편은 전술한 특유의 CDR 구성을 가짐으로서 클라우딘 3 표적에 대한 특이성(specificity) 및 친화력(affinity)이 매우 우수한 것이 특징이다. 따라서 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편은 세포, 특히 면역세포에 대하여 클라우딘-3에 대한 표적능을 부여하는데 이용가능하다.
따라서 본원 발명은, 상기 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 CAR( 키메라 항원 수용체; chimeric antigen receptor)를 제공한다.
구체적으로, 본원 발명은
ⅰ) 전술한 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 세포외 도메인;
ii) 막통과 도메인(transmembrane domain); 및
iii) 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signlaing domain)을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 제공한다.
본 발명에서 용어, "CAR(chimeric antigen receptor)"는, 면역 효과기 세포(immune effector cell)에 특정 항원에 대한 특이성을 부여할 수 있는, 자연적으로 존재하지 않는 수용체를 의미한다. 보통, 상기 CAR은 T 세포에 단일클론항체의 특이성을 이식하기 위하여 사용되는 수용체를 말한다. CAR은 대개 세포 외 도메인(Ectodomain), 막투과성 도메인(transmembrane domain) 및 세포 내 도메인(Ectodomain)으로 구성된다.
상기 (i)세포 외 도메인은 전술한 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하며, 이들은 항원 결합 부위(antigen recognition region)를 포함하고 있다. CAR에 사용되는 항체는 항체 단편의 형태인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 Fab 또는 scFv 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 CAR의 (ii) 막통과 도메인은 세포 외 도메인과 연결된 형태로서, 자연적 또는 합성된 것에서 유래한 것일 수 있다. 자연적으로 존재하는 것에 유래한 경우, 막 결합 또는 막투과성 단백질에서 유래한 것일 수 있으며, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 체인, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 CD8 등 다양한 단백질의 막 투과성 영역에서 유래한 부분일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이러한 막통과 도메인의 서열은 막투과성 단백질의 막투과성 영역 부분을 공지하고 있는 당업계에 공지된 문헌 등으로부터 얻을 수 있다.
상기 CAR에서 (iii) 세포 내 신호전달 도메인은 막통과 도메인과 연결된 형태로서 세포 내부에 존재된다. 본 발명의 상기 세포 내 신호전달 도메인은 CAR의 항원 결합 부위(즉, 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편)에 항원이 결합하면 1차적으로 세포 활성화를 가져오는 신호를 발생 또는/및 전달하는 영역이다.
상기‘세포’는 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 면역세포(면역 효과기 세포)일 수 있다. 상기 면역세포는 당업계에 신체의 면역기능에 관여하는 것으로 알려진 세포라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 T 세포, NK(Natural Killer) 세포, NKT(Natural Killer T) 세포, 단핵구, 대식세포 또는 수지상세포 등을 포함하며, 이들의 전구세포도 포함하는 의미이다.
상기‘세포 활성화’란, 해당 세포가 가지고 있는 활성이 증가되는 것을 의미하는 것으로서, 이러한 활성의 종류는 특별히 제한되지 않으나, 일례로 세포의 면역반응 촉진일 수 있다. 특히, 상기 세포가 면역세포일 때 상기 활성화란 세포 자체의 면역반응 촉진 작용 뿐만아니라 면역세포의 수가 증가되는 것을 모두 포함하는 의미로 이해될 수 있다.
상기 세포 내 신호전달 도메인은 세포 외에 위치하는 항원 결합 부위(본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편)에 항원이 결합하였을 때, 세포(특히, 면역 세포) 활성화를 가져 올 수 있는 신호를 전달할 수 있는 것이라면 특별히 그 종류에 제한되지 않는다. 다양한 종류의 세포 내 신호전달도메인이 사용될 수 으며, 그 예로 면역수용체 티로신-기초한 활성화 모티프(tyrosine-based activation motif) 또는 ITAM일 수 있으며, 상기 ITAM은 CD3 제타(ξ, zeta), TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD278, CD66d , DAP10, DAP12, FcεRI(특히,γ) 및 이들의 조합(1개 또는 2개 이상)에서 유래한 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 CAR는 세포 종류에 따라서, 세포 내 신호전달 도메인과 함께 공동자극 도메인(costimultatory domain)을 추가로 포함하는 것이 바람직할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 공동자극 도메인은, 본 발명의 CAR에 포함되어 세포 내 신호전달 도메인에 의한 1차 신호에 더하여, 해당 세포(특히, 면역세포)에 최대 활성화 신호를 전달하는 역할을 수행하는 부분으로서, 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함하는, CAR의 세포 내 부분을 의미한다. 즉, 일부 면역 세포, 예를 들어 T 림프구 및 NK 세포는 최대 활성화를 위해 2개의 신호, 즉 1차 활성화 신호 및 공동자극 신호가 필요하고, CAR는 또한 세포외 도메인에 대한 항원의 결합이 1차 활성화 신호 및 공동자극 신호 둘다의 전송을 야기하도록, 임의로 공동자극 도메인을 포함할 수 있다.
상기 공동자극 분자는 세포 표면 분자로서, 항원에 대한 면역세포의 충분한 반응을 가져오는데 필요한 분자를 의미하며, 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 MHC 클래스 I 분자(MHC class I molecules), TNF 수용체 단백질(TNF receptor proteins), 면역글로불린-유사 단백질(Immunoglobulin-like proteins), 사이토카인 수용체(cytokine receptors), 인테그린(integrins), SLAM 단백질(signaling lymphocytic activation molecules), NK 세포 활성화 수용체(NK cell activating receptors), BTLA, Toll 리간드 수용체(Toll ligand receptor), OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18, lymphocyte function-associated antigen-1), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS(CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, PD-1 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 공동자극 도메인은 이러한 공동자극 분자 및 이의 조합(1개 또는 2개 이상)으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 세포 내 부분일 수 있다.
상기 공동자극 도메인은 신호전달 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있으며, 또한 복수개로 이루어진 신호전달 도메인의 사이에 포함될 수도 있다.
상기 CAR를 이루는 각 도메인들은 직접 연결될 수 있으며, 또한, 선택적으로, 짧은 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커가 CAR의 세포 내 도메인 및 막투과성 도메인을 연결할 수 있으며, 상기 링커는 본 발명의 CAR에 포함되어도, 세포 외에 위치한 항체에 항원이 결합하였을 때 세포 내 도메인을 통한 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 링커라면, 특별히 그 길이에 제한되지 않으며, 그예로, (G4S)3 링커 즉, GGGGSGGGGSGGGGS 등을 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 CAR 단백질을 암호화하는한 이의 염기 조합이 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 폴리뉴클레오티드 합성 기술에 의해 제작될 수 있다. 또한 상기 벡터는 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 재조합 벡터에 관하여 전술한 바를 참조로 한다.
또한 본원 발명은 상기 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 즉, 상기 본원 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 CAR 단백질이 발현되도록 변형된 세포(CAR-발현 세포)를 제공한다.
상기 세포는 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, CAR를 이루는 도메인 구성의 유래에 따라 신호전달에 유리한 세포 종류를 사용할 수 있다. 본원 발명에서 CAR 단백질이 발현되도록 변형되는 세포는 바람직하게, 면역세포일 수 있다. 상기 면역세포는 당업계에 신체의 면역기능에 관여하는 것으로 알려진 세포라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 T 세포, NK(Natural Killer) 세포, NKT(Natural Killer T) 세포, 단핵구, 대식세포 또는 수지상세포 등을 포함하며, 이들의 전구세포도 포함하는 의미이다. 가장 바람직하게는 T 세포 일 수 있다.
본 발명에서 용어,“T 세포”는 흉선에서 유래하는 림프구로서, 세포의 면역에 주된 역할을 하는 림프구를 의미한다. 상기 T 세포는 CD4+T세포(도움 T 세포, TH 세포), CD8+ T세포(세포독성 T 세포, CTL), 기억 T 세포, 조절 T 세포(Treg 세포) 자연살해 T 세포 등 있으며, 본 발명에서 CAR이 도입되는 T 세포는 바람직하게는 CD8+T세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일례로, 항원 특이적 CD8+T 세포는 암의 면역치료에 가장 효과적인 면역 세포로 평가되고 있다. 그러나 암의 면역치료에 사용할 항원 특이적 CD8+T 세포를 분리하기 위해서는 복잡한 과정과 오랜 기간이 필요하다. 이에, 항원 특이적 CD8+T 세포를 빠른 시간 내에 대량 생산하기 위한 방법 중 하나로 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)-변형된 T 세포가 고안되었다(Porter DL et al., N Engl J Med. 2011;365:725-33.). 이에 제한되지 않으나, 일반적인 일례로, CAR은, 특정 항원을 인식하는 항체의 scFv를 T 세포 활성화를 가져오는 신호전달 도메인, 바람직하게는 공동자극분자 및 CD3ξ의 신호전달도메인과 결합시킨 형태의 단백질로, CAR를 구성하는 항체 부분이 특정 항원을 인식할 경우, 강력한 T 세포 증식 신호전달을 유도하여 CD8+T 세포를 선택적으로 증식시키는 원리를 가지고 있다. 이렇게 증식된 세포는 암의 면역치료 작용에 기여한다.
이처럼 면역세포 치료제로서, 상기 본원 발명의 CAR가 발현되도록 변형된 면역세포는 정상세포 대비 암세포에 특이적으로 노출된 클라우딘 3(특히, ECL-2 영역)을 특이적으로 인지하여 결합하고, 이에 따른 면역세포 활성화에 따라 암세포 치료효과를 가질 수 있음을 알 수 있다. 기존에는 혈액암 위주의 CAR-변형 면역세포 치료제 기술이 다수를 이루고, 또한 기존의 CAR 기술들이 정상세포에도 타겟 될 가능성이 높은 것을 고려하면, 본원 발명은 정상세포 대비 고형암만을 특이적으로 타겟할 수 있어 부작용이 적으면서도(특히, 정상세포에 대한 부작용) 고형암에 대한 우수한 치료 효과를 가질 수 있다. 따라서 본원 발명은 상기 본원 발명의 CAR-발현 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
더 나아가 본 발명자들은, 전술한 항체와 같이 클라우딘 3의 세포 외 두 번째 루프(extracellular second loop, ECL-2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편들의 전술한 약물전달 용도, ADC, CAR 및 CAR-발현 세포(특히, 면역세포) 기술에의 적용을 제공한다. 이는 전술한 내용을 차용하여 이해된다.
클라우딘 3의 ECL-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 기능적 단편들은 다른 암 항원 또는 클라우딘 3의 ECL-1을 표적하는 기존의 항체들보다 암세포 검출, 진단, 영상화, 암 치료에의 적용(ADC 및 CAR-발현 세포(특히, 면역세포)에의 적용) 등에 있어서 가치가 크다. 특히 이러한 구체적인 일례로서 본원 발명에서 제공하는 특유의 CDR 서열을 포함하는 항체는 자체로서 항암능력을 보유할 뿐만아니라 다른 클라우딘 패밀리와 교차 반응성 없이 우수한 암세포 표적능을 나타내고 기존 공지의 클라우딘3 항체와 비교하여 매우 우수한 결합력(친화도)를 나타내며, 세포 내재화(internalization) 등의 특성을 보유하여 상기 용도로의 적용에 있어 현저한 효과를 나타낸다.
도 1a 및 도 1b는 CHO-CLDN3 세포주 바이오패닝 및 L- 클라우딘 3 세포주 ELISA를 이용하여 선별된 scFv 들에 대하여, CHO-K1세포(negative cell line, 대조군)에 대한 결합을 유세포분석(Flow cytometry)한 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 CHO-CLDN3 세포주 바이오패닝 및 L- 클라우딘 3 세포주 ELISA를 이용하여 선별된 scFv 들에 대하여, CHO-CLDN3 세포에 대한 결합을 유세포분석(Flow cytometry)한 결과이다.
도 3은 각각 환원(reducing) 조건 및 비환원(non reducing) 조건에서 생산된 4G3 IgG 항체 단백질에 대한 SDS-PAGE 실험결과로, 각 항체의 경쇄와 중쇄가 예상되는 분자량으로 모두 잘 발현되고 있는 것을 확인하였다.
도 4a는 클라우딘 패밀리들의 계통분석 유연관계를 나타낸다.
도 4b는 CLDN3과 계통분석적으로 가까이 위치한 CLDN4, CLDN5, CLDN6, CLDN8, CLDN9, CLDN17의 세포외 첫 번째 루프(EL1, Extracellular 1st loop) 및 세포외 두 번째 루프(EL2, Extracellular 2nd loop) 영역의 서열 상동성을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 각각의 인간 클라우딘 패밀리 단백질(CLDN1, CLDN3, CLDN4, CLDN5, CLDN6, CLDN8, CLDN9, CLDN17)을 발현하도록 형질전환된 HEK293 세포들에 본 발명의 4G3 항체를 처리하고 유세포분석하여, CLDN3 발현 세포에 대한 특이적 결합 능력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5c는 마우스 CLDN3을 발현하도록 형질전환된 HEK293 세포에 본 발명의 4G3 항체를 처리하고 유세포분석하여, CLDN3 발현 세포에 대한 결합 능력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 난소암으로서 클라우딘 3를 과발현하는 세포주인 OVCAR-3 및 Caov-3과, 클라우딘 3 발현이 매우 낮은 세포주인 TOV-112D, 여기에 CLDN3를 과발현하도록 형질전환시킨 hCLDN3/TOV-112D 세포에 본 발명의 4G3 항체를 처리하고 유세포분석하여, 4G3 항체의 결합특이성을 비교적으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 OVCAR-3, Caov-3, TOV-112D 및 hCLDN3/TOV-112D(TOV-112D_CLDN3으로 표기, 이하 동일) 세포에 대하여, 본 발명의 4G3 항체를 이용해 면역침강(Immumnoprecipitation) 분석을 수행한 결과를 나타낸다(input: 세포 용해물).
도 8a는 OVCAR-3, Caov-3, TOV-112D 및 hCLDN3/TOV-112D 세포에 대하여 대조군 항체(control IgG)를 이용하여 면역형광염색한 결과를 나타낸다.
도 8b는 OVCAR-3, Caov-3, TOV-112D 및 hCLDN3/TOV-112D 세포에 대하여 4G3 항체를 이용하여 면역형광염색한 결과를 나타낸다.
도 9a는 본원 발명 항체(4G3 IgG)의 CHO-K1세포(negative cell line, 대조군)에 대한 결합을 유세포분석(Flow cytometry)한 결과 이다.
도 9b는 본원 발명 항체(4G3 IgG)의 CHO-CLDN3세포(negative cell line, 대조군)에 대한 결합을 유세포분석(Flow cytometry)한 결과 이다.
도 9c는 CLDN3 발현 세포들(hCLDN3/HEK293 및 hCLDN3/TOV-112D)에서 본원 발명 항체(4G3 IgG)의 결합 친화도(해리 상수(KD))를 LigandTracer Green(ridgeview)로 측정한 결과이다.
도 10a는 세포외 첫 번째 루프(extracellular 1st loop, EL1)로서 CLDN1의 아미노산 1~104번 영역과 세포외 두 번째 루프(extracellula 2nd loop, EL2)로서 CLDN3 아미노산 104~220번 영역을 포함하는 융합단백질을 발현하는 세포(hCLDN1-3/HEK293)와, EL1으로서 CLDN3 아미노산 1~103번 영역과 EL2로서 CLDN1 아미노산 105~211번 영역을 포함하는 융합단백질을 발현하는 세포(hCLDN3-1/HEK293)에서, 각 융합단백질의 발현(구조) 양상에 대한 모식도이다.
도 10b는 hCLDN1-3/HEK293 또는 hCLDN3-1/HEK293 세포에 대하여 4G3 항체를 처리하고 유세포분석한 결과와(상단), 상기 세포들에서 목적하는 융합단백질이 제대로 발현되었는지를 확인한 웨스턴블로팅 결과를 나타낸다(하단).
도 11a는 본원 발명의 항체가 클라우딘 3에 결합한 후 세포 내부로 엔도사이토시스(endocytosis)되어 들어가는 것을 난소암 세포주인 OVCAR-3 및 Caov-3에 대하여 면역형광염색법을 이용하여 시간 경과에 따라 관찰한 결과를 나타낸다.
도 11b는 본원 발명 항체 특유의 내재화 효과를, 기존에 클라우딘 3에 부착하는 것으로 알려진 다른 항체(KM3907)와 대조적으로 보여준다.
도 12는 암세포로서 클라우딘 3를 과발현하는 세포주인 OVCAR-3 및 Caov-3과, 클라우딘 3 발현이 매우 낮은 세포주인 TOV-112D, 여기에 CLDN3를 과발현하도록 형질전환시킨 hCLDN3/TOV-112D 세포를 대상으로, 4G3 항체 처리에 의한 항체의존성 세포독성(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 효과를 농도 의존적으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 13a은 종양 이종이식(xenograft) 동물모델에서 본원 발명 4G3 항체의 in vivo 종양 표적능을 확인한 결과를 나타내며,
도 13b는 상기 동물모델에서 장기 적출 후 형광강도를 정량화한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
클라우딘3(CLDN3)에 특이적으로 결합하는 ScFv 스크리닝
<1-1> 항원
항원으로서 클라우딘 3는 스크리닝 과정 동안 각각 클라우딘 3 발현 세포주 및 클라우딘 3 리포파티클(lipoparticle)의 형태로 제공되었다. 클라우딘 3(NCBI reference number_O15551(서열번호 1 참조)) 발현 세포주를 만들기 위하여 CHO-K1 세포주를 이용하였다. 클라우딘 3 발현 벡터를 제작하기 위하여 pcDNA3.1(invitrogen)에 제한효소 HindIII, BamH1를 이용하여 클라우딘 3 유전자를 삽입하였다. 제작한 클라우딘 3 발현 벡터를 트랜스펙션(transfection) 후 400㎍/㎖의 제네티신(geneticin, g418)을 처리하여 형질전환체들을 선별하였다. 상기 클라우딘 3를 표면에 노출하고 있는 리포파티클(이하, 클라우딘 3 리포파티클로 칭함)은 인테그랄 몰레큘러(integralmolecular, Cat. No. RR-0733A)에서 주문하여 사용하였다.
<1-2> scFv phage 선별
클라우딘 3에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하기 위하여 파지디스플레이법(phage library display)을 이용하였다. 라이브러리는 합성한 인간 scFv 라이브러리를 사용하였으며, 라이브러리에 대한 구체적인 정보는 A Novel Human scFv Library with Non-Combinatorial Synthetic CDR Diversity (Bai X. et al., PLoS ONE., 10(10):e0141045 (2015))에 명시되어 있다. scFv 라이브러리에서 발현하는 scFv에는 HA tag을 태깅(tagging)하여 anti-HA FITC 항체(Genscript, A01621)에 의해 검출이 될 수 있도록 하였다. 상기 scFv 라이브러리를 사용하여 다음과 같이 바이오패닝(Biopanning)을 진행하였다.
먼저 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 클라우딘 3 발현 CHO-K1 세포주(이하, CHO-CLDN3로 칭함)를 이용하여 바이오패닝을 진행하였다. scFv 라이브러리 스톡을 3%FBS/PBS로 상온에서 블로킹(blocking)을 진행하였다. Trypsin을 이용하여 각각 1×107 개씩 CHO-CLDN3 세포와 CHO-K1세포(negative cell line)를 준비한다. CHO-K1세포(negative cell line)을 상기 블로킹 중인 라이브러리 스톡과 혼합하여, 상온에서 1시간 동안 디플리션(depletion)을 진행한다. 디플리션이 끝난 후, 원심분리하여 수득한 상등액을 항원인 CHO-CLDN3 세포와 혼합하여 상온에서 1시간 반응 시킨다. 원심분리하여 수득한 세포 펠렛을 3%FBS/PBS로 세척한 다음, 특이적으로 결합한 scFv-파지만 용리될 수 있도록 100 mM TEA(triethylamine)로 상온에서 5분 동안 반응 시키고, pH 8.5 Tris로 중화반응을 거쳐 scFv-항원 컨쥬게이트(conjugate)형태로 준비하였다. 준비된 scFv-항원 컨쥬게이트(conugate)를 E.coli TG1 세포에 첨가하여 감염시킨 다음, LB/앰피실린(ampicillin)/글루코스(glucose) 아가 배지에서 37℃로 하룻밤 배양하였다. 상기 E.coli TG1 세포를 SB/앰피실린 배지로 옮겨 OD600 값이 0.5가 될 때까지 배양한 다음, 1×1011 ~ 1×1012의 헬퍼 파지(helper phage)를 첨가하고 다시 1시간동안 37℃에서 배양한 후, 카나마이신(kanamycin)을 첨가하여 다시 하룻밤 배양하였다. 상기 하룻밤 배양한 배양액을 원심분리한 다음, 상층액을 PEG 용액과 4℃에서 반응시킨 후, 다시 원심분리하여 펠렛을 분리하였다. 펠렛을 PBS에 녹인 다음, 이를 원심분리하여 수득한 상층액을 scFv 라이브러리 용액으로 확보하였다. 이와 같은 과정을 4차례 반복하여 클라우딘 3의 항원과 특이적 결합을 하는 scFv 후보군을 확보하였다.
두 번째 방식으로 리포파티클을 이용하여 바이오패닝을 진행하였다. scFv 라이브러리 스톡을 리포파티클 null(클라우딘 3을 함유하지 않는 리포파티클)과 혼합하여 4% 탈지유(skim milk)로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 및 디플리션(depletion)을 동시에 진행하였다. 면역튜브(immunotube)에 클라우딘 3 리포파티클을 포함한 PBS 1ml을 넣고 4℃에서 16시간 반응시켜 튜브 안쪽 표면에 코팅하였다. 항원 용액을 따라내고 1회 세척하여 코팅되지 않은 항원을 제거하였다. 상기 면역튜브에 코팅해 놓은 항원(클라우딘 3 리포파티클)을 4% 탈지유(skim milk)로 상온에서 1시간 동안 블로킹을 진행하였다. 블로킹이 끝난 후 탈지유를 제거하고, scFv라이브러리 스톡과 혼합하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세척한 다음, 특이적으로 결합한 scFv-파지만 용리될 수 있도록 100 mM TEA로 상온에서 5분 동안 반응 시키고 pH 8.5 Tris로 중화반응을 거쳐 scFv-항원 컨쥬게이트(conjugate)형태로 준비하였다. 준비된 scFv-항원 컨쥬게이트(conugate)를 E.coli TG1 세포에 첨가하여 감염시킨 다음, LB/앰피실린(ampicillin)/글루코스(glucose) 아가 배지에서 37℃로 하룻밤 배양하였다. 상기 E.coli TG1 세포를 SB/앰피실린 배지로 옮겨 OD600 값이 0.5가 될 때까지 배양한 다음, 1×1011 ~ 1×1012의 헬퍼 파지(helper phage)를 첨가하고 다시 1시간동안 37℃에서 배양한 후, 카나마이신(kanamycin)을 첨가하여 다시 하룻밤 배양하였다. 상기 하룻밤 배양한 배양액을 원심분리한 다음, 상층액을 PEG 용액과 4℃에서 반응시킨 후, 다시 원심분리하여 펠렛을 분리하였다. 펠렛을 PBS에 녹인 다음, 이를 원심분리하여 상층액을 scFv 라이브러리 용액으로 확보하였다. 이와 같은 과정을 4차례 반복하여 클라우딘 3 의 항원과 특이적 결합을 하는 scFv 후보군을 확보하였다.
<1-3> 클라우딘 3( CLDN3 )에 특이적으로 결합하는 scFv 항체 선별
실시예 <1-2>에서 확보된 scFv 후보군에서 결합력이 우수한 scFv를 선별하기 위하여, 클라우딘 3 발현 세포주에 대하여 ELISA 분석을 수행하였다. 클라우딘 3 발현 세포주(이하, L- 클라우딘 3 세포로 칭함)는 L cell 에 상기 실시예 <1-1>에서 제작한 클라우딘 3 발현 벡터를 트랜스펙션 후, 600㎍/㎖의 제네티신(geneticin, g418)을 처리하여 형질전환체들을 선별하여 이용하였다. 상기 실시예 <1-2>에서 각 단계의 패닝이 끝난 라이브러리 스톡 각각(클라우딘 3 발현 세포주 또는 클라우딘 3 리포파티클을 이용한 스크리닝 결과물들 따로 이용)을 SB/앰피실린(ampicillin)/글루코스(glucose) 아가 배지에서 하룻밤 배양한 다음, 각각의 단일 콜로니(single colony)를 SB/앰피실린 배지 200㎕에 접종하여 37℃에서 3시간 동안 배양한 다음, IPTG 농도가 1 mM이 되도록 섞어준 후 다시 30℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양이 완료되면 배양액을 원심분리하여 세포만을 분리한 다음, TES 버퍼를 이용하여 세포를 용해시켜서 scFv를 확보하였다. 확보한 scFv를 L- 클라우딘 3 세포가 1×105씩 분주 된 플레이트에 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 이차 항체(anti-HA HRP, santacruz, Cat. No.sc-7392)를 첨가하여 40분 동안 반응시켰다. 이차 항체반응이 완료되면 TMB를 첨가하여 발색반응을 시키고 ELISA 리더기(450 nm)를 이용하여 분석하였다. ELISA 분석값을 상대적으로 비교하여 상위 16개의 우수한 scFv를 1차적으로 선별하였다(3A2, 3H8, 4A2, 4A3, 4B7, 4B10, 4D7, 3D2, 3D7, 3F11, 4A8, 4A9, 4A12, 4E4, 4G3, 4G7).
상기 ELISA를 통하여 선별한 scFv 후보들에 대하여, 유세포 분석기(Flow cytometry)를 이용해 CHO-CLDN3 세포와의 결합여부를 확인하였다. 대조군으로 본연의 CHO-K1세포를 이용하였다. 계대배양 중인 세포를 trypsin을 이용하여 단일 세포단위로 분리하여 3% FBS/PBS에 준비하였다. 상기 선별된 scFv 후보들을 SB/앰피실린 배지 5ml에 접종하여 37℃에서 3시간 동안 배양한 다음, IPTG 농도가 1 mM이 되도록 섞어준 후 다시 30℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양이 완료되면 배양액을 원심분리하여 세포만을 분리한 다음, TES 버퍼를 이용하여 세포를 용해시켜서 scFv를 확보하였다. CHO-K1세포(negative cell line, 대조군)와 CHO-CLDN3 세포(실험군)를 각 그룹마다 각각 2×105세포 씩 들어가도록 3%FBS/PBS에 준비한 다음, 상기 확보된 scFv를 처리하여 상온에서 1시간 반응하였다. 반응이 완료되면 3% FBS/PBS로 세척 후, anti-HA taq FITC 항체를 1:100으로 희석(3% FBS/PBS 100㎕으로 희석)하여 100ul를 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 반응 완료 후 세척하고, BD FACS Calibur로 분석하였다. 이때 상업적으로 판매되고 있는 anti-CLDN3(FAB4620F, R&D systems) 항체를 비교군으로 사용하였다. 대조군(도 1a, 도 1b 참조)에 비하여 실험군(도 2a, 도 2b 참조)에서만 피크의 이동이 일어나는 scFv 후보군들을 선별하였다(4A2, 4B7, 4B10, 4D7, 4A8, 4A9, 4A12, 4E4, 4G3, 4G7).
다음으로, 클라우딘 3 리포파티클을 이용한 최종 바이오패닝 결과(데이터 미도시)와 상기 실험 단계들에서 선별된 scFv 후보군의 결과를 비교하였다. 선별된 scFv에 대하여 시퀀싱(sequencing)을 수행하였고, 클라우딘3 리포파티클 및 클라우딘3 발현 세포주들(CHO-CLDN3 세포주 또는/및 L-클라우딘 3 세포주)에 대한 실험에서 모두 동일하게 하나의 클론 4G3이 확인되어, 상기 4G3을 최종 선발하였다. 4G3 scFv의 아미노산 서열을 분석한 결과는 하기 표 1과 같다.
Antibody 중쇄가변영역
CDRH1 CDRH2 CDRH3
4G3 SYAMS IINPSGASTSHAQRFQG RYGRYGSFDI
Antibody 경쇄가변영역
CDRL1 CDRL2 CDRL3
4G3 SGSTSNIGRNYVS DTSNKHF QSYDSSKVV
< 실시예 2>
scFv 항체의 IgG로의 전환 및 발현
<2-1> 전체 IgG 발현벡터 제작
앞서 선별된 4G3 scFv를 보다 통상적으로 사용되는 항체인 IgG의 형태로 변환시켰다. 상기 scFv의 CDR 부위를 기반으로 전체 IgG 형태를 발현할 수 있는 발현벡터를 제작하였다. 먼저, scFv의 경쇄가변영역(light chain variable region)과 중쇄가변영역(heavy chain variable region)을 각각 PCR을 통해 수득하였으며, 이때 4G3에 대해서는 하기 표 2에 도시된 프라이머를 사용하였다. 상기 경쇄가변영역 서열은 경쇄불변영역(light chain constant region) 서열이 삽입되어있는 발현벡터인 pOptiVec(Invitrogen)에 클로닝하고, 상기 중쇄가변영역 서열은 중쇄불변영역(heavy chain constant region)이 삽입되어있는 발현벡터인 pcDNA 3.3(Invitrogen)에 각각 클로닝하였다. 벡터로부터 클로닝한 scFv의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역과 함께 경쇄 및 중쇄 불변영역이 발현되어, 결과적으로 상기 scFv의 CDR 영역을 포함하는 전체 IgG 항체가 만들어지게 된다.
가변부위 프라이머 서열
경쇄 F 5'-ATTCGATCGATATGGAGACAGACACACTCCT
GCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGT
TCCACGTGGCAGAGCGTGCTGACCCAGCCT-3'
경쇄 R 5'-AGCCACCGTACGCAGCACGGTCAGCTTGGTACC-3'
중쇄 F 5'-ATTCGATCGATATGGAGACAGACACACTCCT
GCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGT
TCCACGTGGGAAGTGCAGCTGCTGGAAAGT-3'
중쇄 R 5'-CTTGGTGCTAGCGCTGCTCACGGTCACCAGAGT-3'
<2-2> 전체 IgG 항체 발현 CHO -S 세포주 제작(pool)
CHO-S 세포(Life Technologies Inc.)를 이용하여, 각각 4G3 IgG 항체 발현 세포주를 제작하였다. 상기 실시예 <2-1>에서 수득된 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자 서열에 대하여 Cricetulus griseus 종으로 코돈 최적화(codon optimization)를 하고, 이들 서열을 Freedom®pCHO1.0Vector에 클로닝한 후, 트랜스펙션 시약(FreeStyle™ MAX Reagent; Life Technologies Inc.)으로 CHO-S 세포에 형질도입하였다. 형질도입 후 항체 발현 세포주를 선별하기 위해, 퓨로마이신(puromycin)과 MTX(methotrexate)를 이용하여 2단계를 거쳐 선별하였다. 구체적으로 1차 선별에서는 puromycin 10ug/ml, MTX 100nM 또는 puromycin 20ug/ml, MTX 200nM으로 진행하여 세포 생존율이 기준 내에 들어오면 2차 과정을 진행하였다. 2차 선별에서는 puromycin 30ug/ml, MTX 500nM 또는 puromycin 50ug/ml, MTX 1000nM으로 진행하여 최종 세포 생존율 기준에 들어왔을 때 2차 선별을 종료하고 SFB(Simple Fed Batch)를 통해서 발현량이 높은 군을 선택하였다.
<2-3> 전체 IgG 항체 생산 및 정제
상기 <2-2>에서 제조된 각각의 항체 생산 세포주를 CD FortiCHO™ 배지에서 CO2 8%, 37℃, 100~120 rpm 조건으로, glucose를 3일, 5일, 7일째에 각각 4g/L, 4g/L, 6g/L 씩 넣어주면서 총 14일 배양하였다. 배양완료 후 배양액을 ultra-centrifuge 6000g로 원심분리하고, 이의 상층액을 0.2um filter를 이용하여 필터하였다. 정제를 위해 Protein A 레진(Mabselect SuRe, 11-0026-01 AD, GE Healthcare Life Sciences)을 사용하였고 평형버퍼(20mM Sodium Phosphate, 150mM NaCl, pH7.2), 세척버퍼(35mM Sodium Phosphate, 500mM NaCl, pH7.2), 용출버퍼(0.1M Sodium Citrate, pH3.6)를 사용하였다. AKTA™ avant를 이용하여 평형버퍼는 컬럼부피의 2배, 세척버퍼는 컬럼부피의 5배, 용출버퍼는 컬럼부피의 5배로하여 정제하였고, 용출 시 중화반응을 위해 pH 8.0 Tris-HCl 용액을 1/5씩 넣어주었다. 여과 멤브레인(CelluSep, 1430-45)을 사용하여 PBS로 2회 버퍼전환 후 원심분리 필터(Amicon Ultra-15, UFC905024, Merck)로 농축하였다.
각각 환원(reducing) 조건 및 비환원(non reducing) 조건에서 생산된 IgG 항체 단백질을 통상의 SDS-PAGE 기법으로 확인하여, 각 항체의 경쇄와 중쇄가 예상되는 분자량으로 모두 잘 발현되고 있는 것을 확인하였다. 도 3은 4G3 IgG 항체에 대한 SDS-PAGE 확인 결과를 나타낸다.
< 실시예 3>
본 발명 항체의 클라우딘 3에 대한 결합 특이성(binding specificity) 및 결합력 평가
<3-1> 여러 가지 클라우딘에 대한 CLDN / HEK293 세포주 제작
상기 실시예 <2-3>에서 제작된 항체의 항원 특이성을 확인하기 위하여, 인간 CLDN3과 계통분석적으로 가까이 위치한 클라우딘들, 특히 인간 CLDN4(NCBI accession number : O14493), CLDN5(O00501), CLDN6(P56747), CLDN8(P56748), CLDN9(O95484), CLDN17(P56750)에 대한 결합 유무를 비교평가하였다(도 4a 및 도 4b 참조). 또한 상기한 클라우딘 종류들 보다는 계통분석적으로 거리가 있지만 전형적인 클라우딘인 CLDN1(O95832) 본 실험에 비교군으로 사용되었다. 또한 개발된 항체가 마우스 CLDN3(Q9Z0G9)에도 결합하는지 알아보았다(4b 참조). 전술한 클라우딘들을 코딩하는 유전자 각각을 pcDNA3.1(+)(Invitrogen)에 클로닝하여 하였다. 이렇게 제작된 각각의 클라우딘 발현 벡터를, Fugene HD(E231A, Promega) 트렌스펙션 시약을 이용하여 HEK293(KCLB)에 형질도입시킨 후, G418로 내성 세포주를 선별하였다. 이렇게 제작된 인간 클라우딘을 지속 발현하는 세포주(hCLDN/HEK293)들에 대하여, 각 클라우딘들이 잘 발현되고 있는지의 확인은 상업적으로 판매되고 있는 anti-CLDN1(FAB4618G, R&D systems), anti-CLDN3(FAB4620F, R&D systems), anti-CLDN4(FAB4219F, R&D systems), anti-CLDN5(ab131259, Abcam), anti-CLDN6(ABIN1720916, Antibodies-online), anti-CLDN8(MAB5275, R&D systems), anti-CLDN9(ab187116, Abcam), anti-CLDN17 (MAB4619, R&D systems) 항체들을 이용하여 확인하였다.
<3- 2> CLDN / HEK293 세포주들에 대한 본 발명 항체의 교차반응성 평가
상기 실시예 <3-1>에서 제작된 여러 가지 클라우딘에 대한 hCLDNs/HEK293 세포주 및 mCLDN3/HEK293들에 대하여, 상기 실시예 <2-3>에서 제조된 항체의 교차 반응성을 확인하였다. 음성대조군으로는 본연의 HEK293 세포를 사용하였다. 먼저 세포 분리버퍼(cell dissociation buffer, Gibco, 13151-014)를 이용하여 단일 세포로 분리한 후 2.5×105개씩 분주(seeding)하고, 여기에 각각의 항체 5ug/ml을 넣고 1시간동안 얼음 위에서 반응시켰다. 반응 후 1% BSA/PBS로 세척하고 이차 항체인 goat anti-human IgG-FITC(109-095-098, Jackson Immunoresearch)를 1:100으로 처리하여, 1시간동안 얼음 위에서 반응시켰다. 반응 후 1% BSA/PBS로 세척하고, 유세포 분석기로서 BD FACSCalibur를 사용하여 분석하였다.
도 5a 및 도 5b는 상기 유세포분석 결과로서, 4G3 항체의 클라우딘 3에 대한 결합특이성을 비교적으로 보여준다. CLDN3과 계통분석학적으로 가까운 CLDN4, CLDN5, CLDN6, CLDN8, CLDN9 및 CLDN17을 이용한 어느 실험군에서도 피크이동이 보이지 않았다. 마우스 CLDN3을 이용한 실험 결과를 도 5c에서 보여주며, 본 발명의 항체는 마우스 인간 CLDN3와 상동성이 높은 마우스 CLDN3와도 결합함을 확인하였다.
이로써 본 발명의 각 항체는 인간CLDN3 및 마우스CLDN3 이외에 다른 클라우딘 패밀리와는 결합하지 않음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 각 항체는 상동성이 높은 다른 클라우딘 종류와는 교차반응 없이, CLDN3에만 특이적으로 결합한다.
<3-3> in vitro 암세포 검출 능력 확인_ 유세포분석
상기 실시예 <2-3>에서 제조된 항체들의 암 세포에 대한 결합력을 확인하였다. 난소암으로서 클라우딘 3를 과발현하는 세포주인 OVCAR-3(ATCC) 및 Caov-3(ATCC)과, 클라우딘 3 발현이 매우 낮은 세포주인 TOV-112D(ATCC), 여기에 CLDN3를 과발현하도록 형질전환시킨 hCLDN3/TOV-112D 세포를 이용하였다. hCLDN3/TOV-112D 세포의 제작은 상기 실시예 <3-1>에 기재된 것과 동일한 방법으로 수행되었다. 상기 세포들에 대한 항체 처리 및 유세포 분석은 실시예 <3-2>와 동일한 방법으로 수행되었다.
실험결과, 클라우딘 3발현 세포인 OVCAR-3, Caov-3, hCLDN3/TOV-112D에서는 피크이동이 확인되었고 음성세포주인 TOV-112D에서는 피크이동이 보이지 않았다. 대표적으로 도 6은, 상기 암세포들에 대한 4G3 항체의 결합특이성을 비교적으로 보여준다.
<3-4> 클라우딘 3 특이적 결합 재확인 _ 면역침강 ( Immumnoprecipitation )
면역침강법을 통해 본 발명의 항체가 상기 암세포에서 클라우딘 3에 결합함을 재확인하였다. 항체 음성대조군(control IgG)으로는 상업적으로 파는 인간 전체 항체(009-000-003, Jackson Immunoresearch)를 사용하였다. OVCAR-3(ATCC), Caov-3(ATCC), TOV-112D(ATCC), hCLDN3/TOV-112D의 각 세포를 protease inhibitor(11697498001, Roche)가 첨가된 PBS로 풀어준 뒤, 초음파 분쇄기로 2초 on/5초 off를 10회 실시한 후, 15000rpm, 4℃, 15분동안 원심분리하여 상등액을 취했다. BCA 정량법으로 각 세포 용해물(상등액)의 단백질 농도를 측정한 다음, 1mg씩 단백질을 취하여 각각의 항체 1ug을 넣고 4℃에서 1시간동안 회전하면서 반응시켰다. Protein A bead (11719408001, Roche)를 PBS로 평형화시키고, 5%BSA/PBS로 상기 비드(bead)를 4℃에서 1시간동안 회전하면서 블로킹하였다. 상기 항체 반응이 끝난 샘플에 비드를 50ul 넣고, 다시 4℃에서 1시간동안 회전하면서 반응시켰다. 항체와 비드의 반응이 끝나면, PBS로 3번 세척 후, 2X SDS loading 버퍼 30ul을 넣고 100℃에서 10분간 끓이고, 12000rpm으로 3분동안 원심분리하여 이의 상등액을 15% SDS gel 전기영동하였다. 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 진행하였고, 이때 일차 항체로는 anti-CLDN3(341700, Invitrogen)을 사용하였다.
분석결과, control IgG 처리군에서는 밴드가 나타나지 않았고, 본 발명의 항체는 OVCAR-3, Caov-3 및 hCLDN3/TOV-112D 세포를 이용한 실험군에서만 밴드가 관찰되었다. 도 7은 4G3 항체의 상기 세포들이 발현하는 클라우딘 3에 대한 결합 정도를 보여준다. 이로서 본 발명의 각 항체가 암세포의 클라우딘 3 단백질에 결합함을 재확인하였다.
<3-5> 클라우딘 3 특이적 결합 재확인 _ 면역형광 ( Immunofluorescence )
면역형광법을 통해 본 발명의 항체가 상기 암세포에서 클라우딘 3을 특이적으로 표적함을 재확인하였다. OVCAR-3(ATCC), Caov-3(ATCC), TOV-112D(ATCC), hCLDN3/TOV-112D의 각 세포를 4 well cell culture slide에 2×105 개씩 넣어주고 24시간 배양하였다. 배양액에 대조군 항체(ChromePure Human IgG, 009-000-003, Jackson ImmonoResearch) 또는 본 발명의 항체를 5ug/ul가 되도록 넣고 4℃에서 1시간동안 교반하여 반응시켰다. PBS로 세척 후 4% 세포를 포름알데히드로 상온에서 15분간 고정하였다. PBS 세척 후 5% BSA/PBS로 상온에서 1시간 블로킹하였다. PBS로 세척하고 이차 항체로서 goat anti-human IgG-FITC(109-095-098, Jackson Immunoresearch)를 1:100이 되도록 넣고 상온에서 1시간 반응하였다. PBS로 세척 후, 핵 염색을 위하여 Hoechst 33342(H3570, Invitrogen)을 1:5000이 되도록 넣고 10분간 상온에서 반응시켰으며, 그 후 PBS로 2회 더 세척하였다. FluoromountTM Aqueous Mounting Medium(F4680, SIGMA)로 마운팅 후, 커버슬라이드를 덮고 콘포칼 현미경(LSM700, Carl Zeiss, Inc.)으로 형광을 관찰하였다.
분석결과, 대조군 항체(control IgG) 처리군에서는 모든 세포주에서 형광이 관찰되지 않은 반면(도 8a 참조), 본 발명의 항체 처리군에서는 CLDN3 발현 세포주인 hCLDN3/TOV-112D, OVCAR-3, Caov-3의 세포표면에서 형광이 모두 관찰되었고 CLDN3 발현이 없는 TOV-112D 세포주에서는 형광이 관찰되지 않았다. 도 8b는 대표적으로 4G3 항체에 대한 상기 실험결과를 나타낸다.
<3-6> 클라우딘 3에 대한 결합력 비교 및 결합 친화성(binding kinetics) 확인
상기 실시예 <2-3>에서 제조된 4G3 IgG 항체에 대하여 이들의 클라우딘 3에 대한 결합력을 확인하였다. CHO-CLDN3 세포를 이용하여 유세포분석을 실시하였으며, 구체적인 실험방법은 상기 실시예 <1-3>과 동일하게 수행되었다. 대조군으로는 본연의 CHO-K1세포를 이용하였으며, 상업적으로 판매되고 있는 anti-CLDN3(FAB4620F, R&D systems) 항체를 비교군으로 사용하였다.
또한 클라우딘 3에 대한 항체의 결합 친화성을 확인하기 위해 LigandTracer Green(ridgeview)를 사용하여 측정하였다. LignadTrcer Green(ridgeview)은 항원을 발현하는 세포 상에서 FITC가 접합된 항체의 항원에 대한 결합 여부를 실시간으로 측정할 수 있는 세포 기반 측정 장비이다. 개발한 항체에 FITC Antibody Labeling Kit (53027, Pierce)를 이용하여 FITC를 접합하였다. 하루 전 blank로서 5%milk/PBS 500ul, 클라우딘 3 발현이 매우 낮은 레퍼런스 세포주, CLDN3 과발현시킨 세포주를 3×105cells/ml의 농도로 500ul를 100mm 배양접시 (172931, Thermo scientific) 4분면에 동전크기로 넣고 5% CO2, 37℃ 6시간 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 다시 배지 10ml을 넣어 하룻밤 배양하였다. 레퍼런스 세포주로서 HEK293(KCLB) 및 TOV-112D(ATCC)를 사용하였고, CLDN3 과발현 세포주로서 hCLDN3/HEK293 및 hCLDN3/TOV-112D를 사용하였다. 실험 당일 배지를 모두 제거하고 3ml 배지로 교체 후 배양 접시를 장비에 장착하고 안정화 후 FITC 접합된 항체를 최종 농도로 10nM, 30nM, 90nM, 270nM이 되도록 순차적으로 넣고 각각 형광값이 평형상태에 도달할 때 까지 반응시키고 마지막에 3ml 새 배지로 교체 후 해리정도를 확인하였다. 형광 측정 시간은 15초, 측정 지연시간은 4초, 측정 간격은 72초로 하였고, HEK293 세포 대비 hCLDN3/HEK293 세포에서의 형광값과, TOV-112D 세포 대비 hCLDN3/TOV-112D 세포에서의 형광값을 one to one two state fitting model 모델로 분석하였다. 결과 값을 도 9c 및 표 3에 나타낸다.
Figure 112018031074558-pat00001
도 9a 및 도 9b에서 보는 바와 같이, 4G3 IgG 항체에서 모두 피크 이동이 나타나 클라우딘 3에 결합한 것을 확인하였다. 이때 4G3 IgG 항체 처리군에서 피크 이동의 차이가 더 크게 나타났으며, 이로서 4G3 IgG 항체는 기존에 상업적으로 판매되고 있는 항체보다 클라우딘 3 특이적인 결합력이 더 우수한 것으로 확인되었다.
또한 결합 친화성 분석 결과 도 9c 및 표 3에서 보는 바와 같이, 4G3의 클라우딘 3 발현 세포에 대한 kinetic value(KD)는 2가지 세포주에서 각각 2.85nM(hCLDN3/HEK293), 3.17nM(hCLDN3/TOV-112D)으로 나타났으며 4G3의 클라우딘 3에 대한 높은 친화력을 확인하였다. 이러한 결과는 본원 발명의 4G3 IgG 항체가 기존 anti-claudin3 항체들보다도 현저히 우수한 친화력을 보유함을 보여주는 것으로, 예를들어 기존‘Chiara Romani etl al. Oncotarget. 2015’의 IgGH6 항체보다도 친화도가 5배 이상 우수한 것이다.
< 실시예 4>
항원 결합부위 확인
세포에서 자연적으로 발현된 CLDN3이 세포 외부로 드러나는 영역 중에서, 구체적으로 본 발명의 항체가 결합하는 항원 결합부위가 어디인지 확인하고자 하였다. 이에, CLDN3의 세포외 첫 번째 루프(extracellular 1st loop)와 세포외 두 번째 루프(extracellula 2nd loop)에 해당하는 영역 각각을 CLDN1에서 대응되는 영역과 치환한 융합단백질을 만들어 확인하였다. CLDN1의 아미노산 1~104번과 CLDN3 아미노산 104~220번을 발현하는 유전자(hCLDN1-3) 또는 CLDN1 아미노산 105~211번과 CLDN3 아미노산 1~103번을 발현하는 유전자(hCLDN3-1)를 각각 pcDNA3.1(+)(Invitrogen)에 클로닝하여 하였다. 각 유전자를 HEK293(KCLB)에 형질도입시킨 후 G418로 내성 세포주를 선별하여, hCLDN1-3 또는 hCLDN3-1의 융합단백질을 지속적으로 발현하는 세포주를 제작하였다. 이를 각각 hCLDN1-3/HEK293, hCLDN3-1/HEK293라 명명하였다(도 10a 참조). 각 세포주에서 목적하는 융합단백질이 발현되었는지는 anti-CLDN3 (341700, Invitrogen), anti-CLDN1 (sc-137121, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 이용하여 통상의 웨스턴 블로팅 방법으로 확인하였다(도 10b의 하단 참조). hCLDN1-3/HEK293 또는 hCLDN3-1/HEK293 세포에 대하여 4G3 항체의 처리 및 유세포 분석은 실시예 <3-2>와 동일한 방법으로 수행되었다.
분석결과 도 10b에서 보는 바와 같이, hCLDN1-3/HEK293에대한 실험에서는 피크의 이동이 보였고 hCLDN3-1/HEK293에대한 실험에서는 피크의 이동이 보이지 않았다. 이로서 4G3 항체는 hCLDN3의 세포외 두번째 루프(extracellula 2nd loop) 부분에 결합하는 것을 확인하였다.
< 실시예 5>
IgG 4G3 항체의 세포 내 섭취( endocytosis ) 확인
본 발명 항체의 세포 내부로의 내재화(internalization) 능력을 확인하기 위하여, 클라우딘 3 과발현 난소암 세포주인 OVCAR-3(ATCC) 및 Caov-3(ATCC)를 4 well cell culture slide에 2×105 개씩 넣어주고 24시간 배양하였다. 배양 후 세포에 라이소좀을 염색하는 LysoTracker Red DND-99(L7528, Life Technologies Inc.) 1mM과, 대조군 항체로서 control IgG(ChromePure Human IgG, 009-000-003, Jackson ImmonoResearch) 또는 KM3907(서열번호 13의 VH 및 서열번호 14의 VL을 가지는 항체로서, 실시예 <2-1>과 같은 방법으로 제작함(KM3907 항체 전장서열은 서열번호 15 및 16 참조)/ CLDN3&CLDN4 target, ECL-1 binding), 그리고 본원 발명의 4G3 항체를 10ug/ml이 되도록 처리하고 37℃에서 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 배양하였다. 각 시간별로 배양이 끝난 후, PBS로 세척하고 4% 포름알데히드로 상온에서 15분간 고정하였다. PBS 세척 후 0.1% Triton-X100/PBS로 5분간 3회 처리하였다. PBS로 세척 후 5%BSA/PBS로 상온에서 1시간 블로킹하였다. PBS로 세척하고 이차 항체로 goat anti-human IgG-FITC(109-095-098, Jackson Immunoresearch)를 1:100이 되도록 넣고 상온에서 1시간 반응하였다. PBS 세척 후 핵 염색을 위하여 Hoechst 33342(H3570, Invitrogen)을 1:5000이 되도록 넣고 10분간 상온에서 반응시켰으며, 그 후 PBS로 2회 더 세척하였다. FluoromountTM Aqueous Mounting Medium(F4680, SIGMA)로 마운팅 후, 커버슬라이드를 덮고 콘포칼 현미경(LSM700, Carl Zeiss, Inc.)으로 형광을 관찰하였다.
관찰 결과 도 11a에서 보는 바와 같이, 4G3 항체가 세포내로 들어가서 라이소좀 상에 위치하는 것을 확인하였다. 또한 도 11b에서 보는 바와 같이, 공지의anti-클라우딘 3 항체인 KM3907의 경우에는 세포 내부로의 내재화가 관찰되지 않았다.
< 실시예 6>
암세포에 대한 항체의존성 세포독성 확인
본 발명 항체의 항체의존성 세포독성(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)을 확인하기 위하여, NK-92MI에 Fc receptor인 CD16 유전자를 지속적으로 발현하는 세포주(이하, NK-92MI-CD16로 칭함.)를 사용하였다. NK-92MI-CD16 세포주를 제작하기 위하여 pcDNA3.1(+)(Invitrogen)에 Nhe1, EcoR1 제한효소를 이용하여 CD16 유전자를 삽입하고 electroporation 기법으로 NK-92MI 세포에 CD16 발현벡터를 트렌스펙션하였다. G418 화합물로 내성세포주를 선별 후 FACS Aria 장비로 과발현 세포주를 분리하였다. 난소암으로서 클라우딘 3를 과발현하는 세포주인 OVCAR-3(ATCC) 및 Caov-3(ATCC)과, 클라우딘 3 발현이 매우 낮은 세포주인 TOV-112D(ATCC), 여기에 CLDN3를 과발현하도록 형질전환시킨 hCLDN3/TOV-112D 세포 각각을 96well plate에 2×104 개씩 넣어주고 24시간 배양하였다. 대조군 항체(ChromePure Human IgG, 009-000-003, Jackson ImmonoResearch) 또는 4G3 항체를 0ng/ml, 0.1ng/ml, 1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml, 1000ng/ml, 10000ng/ml으로 처리한 후, NK-92MI-CD16 세포를 8×104개씩 넣고 37℃에서 6시간 배양하였다. PBS로 3회 세척 후 WST reagent(EZ-CYTOX, DoGen)를 처리하고 37℃에서 4시간동안 반응한 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
분석 결과 도 12에서 보는 바와 같이, 대조군 항체(control IgG)처리 군에서는 세포 독성이 나타나지 않았고, 4G3 항체 처리군에서는 hCLDN3/TOV-112D, OVCAR-3, Caov-3 세포에서 농도 의존적으로 세포독성이 나타났고 TOV-112D 세포에서는 세포 독성이 나타나지 않았다. 또한 클라우딘 3 발현 세포주들 중에서도, 클라우딘 3 발현량이 가장 높은 hCLDN3/TOV-112D 세포(도 7 참조)에서 가장 높은 수준의 세포 독성이 나타났다(도 12 참조).
상기 실험에서, CD16(FcγRIIIa)을 지속적으로 발현하는 NK-92MI-CD16 세포가 클라우딘3 항원에 대한 세포 독성효과를 보이는 것은 CAR-NK 기술의 원리와 유사한 메커니즘으로 암세포를 사멸시킬 수 있음을 시사한다. 실제로 ADCC 효능평가에서 클라우딘 3의 발현에 따라 독성효과가 일치함을 보이고 있으며 이는 CAR-NK 세포 제작에 본 개발 항체를 적용할 수 있음을 보여준다.
< 실시예 7>
in vivo 종양 표적능 확인
종양 이종이식(xenograft) 동물모델은 인간 난소암 세포 OVCAR-3(ATCC) 5×106 개를 100ul PBS에 부유시키고, 이를 6주령의 Athymic nude 암컷 마우스의 하부 옆구리에 피하주사하는 방법으로 제작하였다.
본 발명 항체의 in vivo 종양 표적능을 확인하기 위하여, 대조군 항체 (ChromePure Human IgG, 009-000-003, Jackson ImmonoResearch) 및 4G3 항체에 CF750 형광단을 VivoBriteTM Rapid Antibody Labeling Kit(92161, Biotium)를 이용하여 접합하였다. 형광/항체 몰랄 비율(degree of labeling, DOL)은 키트에서 제공하는 공식에 따라 권장하는 예상 비율에 맞게 각각 2.29와 2.82로 측정되었다.
상기 동물모델에 종양 이식 후 60일째에, CF750 형광이 표지된 대조군 항체또는 4G3 항체를 100ug/100ul의 용량으로 정맥 주사하였다. 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간이 경과된 시점에 소동물 생체 이미징 시스템 (In Vivo Imaging System, IVIS SpectrumCT, PerkinElmer)을 이용하여 마우스로부터 방출되는 형광 신호를 검출하였으며, 마지막 시점에서 간, 신장, 폐, 비장, 소장 및 종양을 적출하여 조직별 항체 분포의 형광 신호를 확인하였다. 제작사로부터 공급된 Living Imaging Software를 이용하여 형광 신호를 분석하였다.
실험 결과 도 13a 및 도 13b에서 보는 바와 같이, 대조군 항체(control IgG)와 비교하여 본원 발명의 4G3 항체는 시간이 경과함에 따라 이식종양을 특이적으로 표적하는 것을 확인하였고, 다른 조직과 대비해 종양에 축적되어 있음을 확인하였다.
본원 발명은 클라우딘 3의 ECL-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 기능적 단편들의 암세포 검출, 진단, 영상화, 암 치료에의 적용 용도(항체 자체의 항암용도, ADC 및 CAR-발현 세포(특히, 면역세포)에의 적용)와, 이러한 용도에 있어서 현저한 효과를 나타내는 특유의 CDR 서열을 포함하는 항체 및 이의 기능적 단편에 관한 것이다.
클라우딘 3의 ECL-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 기능적 단편들은 다른 암 항원 또는 클라우딘 3의 ECL-1을 표적하는 기존의 항체들보다 암세포 검출, 진단, 영상화, 암 치료에의 적용(ADC 및 발현 세포(특히, 면역세포)에의 적용) 등에 있어서 가치가 크다. 특히 이러한 구체적인 일례로서 본원 발명에서 제공하는 특유의 CDR 서열을 포함하는 항체는 자체로서 항암능력을 보유할 뿐만아니라 다른 클라우딘 패밀리와 교차 반응성 없이 우수한 암세포 표적능을 나타내고 마우스 클라우딘3 와도 결합하므로 독성 및 효능평가의 비임상 실험에도 유리하며, 기존 공지의 클라우딘3 항체와 비교하여 매우 우수한 결합력(친화도)를 나타내며, 세포 내재화(internalization) 등의 특성을 보유하여 상기 용도로의 적용에 있어 현저한 효과를 나타내므로, 진단 및 의약 산업분야 등에 있어서 산업상 이용가능성이 높다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation ABION Inc. PROMEDITECH INC. <120> Antibody specifically binding to extracellular second loop of claudin 3, its fragment, and uses thereof <130> NP17-0094 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLDN3(homo sapiens) <400> 1 Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser 20 25 30 Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys 50 55 60 Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg 65 70 75 80 Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala 100 105 110 Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Ala 115 120 125 Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg 130 135 140 Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly 145 150 155 160 Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu Leu Gly 165 170 175 Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Thr 180 185 190 Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala 195 200 205 Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val 210 215 220 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> extracellular 2nd loop sequence of CLDN3 <400> 2 Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met 1 5 10 15 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of 4G3 <400> 3 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of 4G3 <400> 4 Ile Ile Asn Pro Ser Gly Ala Ser Thr Ser His Ala Gln Arg Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of 4G3 <400> 5 Arg Tyr Gly Arg Tyr Gly Ser Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of 4G3 <400> 6 Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Arg Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 of 4G3 <400> 7 Asp Thr Ser Asn Lys His Phe 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of 4G3 <400> 8 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Lys Val Val 1 5 <210> 9 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for light chain of 4G3 <400> 9 attcgatcga tatggagaca gacacactcc tgctatgggt actgctgctc tgggttccag 60 gttccacgtg gcagagcgtg ctgacccagc ct 92 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for light chain of 4G3 <400> 10 agccaccgta cgcagcacgg tcagcttggt acc 33 <210> 11 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for heavy chain of 4G3 <400> 11 attcgatcga tatggagaca gacacactcc tgctatgggt actgctgctc tgggttccag 60 gttccacgtg ggaagtgcag ctgctggaaa gt 92 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for heavy chain of 4G3 <400> 12 cttggtgcta gcgctgctca cggtcaccag agt 33 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of KM3907(ref. patent EP2138576A1) <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Ile Ser Thr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Met Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asp Arg Trp Ser Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of KM3907(ref. patent EP2138576A1) <400> 14 Gly Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Phe Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 15 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of KM3907 <400> 15 Met Glu Trp Pro Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Glu Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Ile 35 40 45 Ser Thr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gly Lys Phe Met Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Pro Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Thr Arg Gly Asp Arg Trp Ser Gly Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 16 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lignt chain of KM3907 <400> 16 Met Asp Phe Leu Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ala Met Ser Arg Gly Gly Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly 50 55 60 Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gln Tyr Ser Gly Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 145 150 155 160 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 165 170 175 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 180 185 190 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 195 200 205 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 210 215 220 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

Claims (43)

  1. 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위1(VH-CDR1), 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성결정부위 2(VH-CDR2), 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성결정부위 3(VH-CDR3)을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위1(VL-CDR1), 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위 2(VL-CDR2), 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성결정부위 3(VL-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 기능적 단편은 디아바디, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dsFv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 클라우딘 3에 결합한 후 세포 내로 내재화(internalization)되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  4. 제3항에 있어서 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 클라우딘 3의 세포 외 두 번째 루프에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  5. 제1항의 항체 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  7. 제6항의 벡터를 포함하는 세포주.
  8. 제7항의 세포를 배양하여 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및
    상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 클라우딘 3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편의 생산방법.
  9. 제1항의 항체 또는 이의 기능적 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및
    상기 항체 또는 이의 기능적 단편을 검출하는 단계를 포함하는 클라우딘 3 특이적 검출 방법.
  10. 제1항의 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 클라우딘 3 검출용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성 입자(superparamagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것으로 표지되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항의 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 암은 난소암, 결장암, 방광암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 자궁암, 자궁경부암, 흑색종, 대장암, 신장암 및 전이성 흉막 종양으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항의 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 암 영상화용 조성물.
  15. 제1항의 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 난소암, 결장암, 방광암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 자궁암, 자궁경부암, 흑색종, 대장암, 신장암 및 전이성 흉막 종양으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제1항의 항체 또는 이의 기능적 단편; 및 약물이 결합된 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate).
  18. 제17항에 있어서, 상기 약물은 마이크로튜불린(microtubulin) 구조 형성 억제제, 유사분열(meiosis) 억제제, 토포아이소머라아제(topoisomerase) 억제제, DNA 인터컬레이터(DNA intercalators), 독소(toxin), 사이토카인, 케모카인, 항생제, 방사선 핵종, 광감각제, 광열나노소재, 나노파티클 및 미셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 결합체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는 결합체.
  20. 제1항의 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 암세포 특이적 약물 전달용 조성물.
  21. 제1항의 항체 또는 이의 기능적 단편; 및 이와 결합된 약물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물.
  22. 제1항의 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 CAR(키메라 항원 수용체) 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 상기 CAR는
    ⅰ) 제1항의 항체 또는 이의 기능적 단편;
    ii) 막통과 도메인(transmembrane domain); 및
    iii) 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signlaing domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 CAR 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 상기 iii)의 세포는 면역세포인 것을 특징으로 하는 CAR 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 상기 면역세포는 T 세포, NK(Natural Killer) 세포, NKT(Natural Killer T) 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상세포로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CAR 단백질.
  26. 제23항에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD3 제타(ξ, zeta), TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD278, CD66d , DAP10, DAP12, FcεRI 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 신호전달 도메인인 것을 특징으로 하는 CAR 단백질.
  27. 제23항에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인(costimultatory domain)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 CAR 단백질.
  28. 제27항에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 MHC 클래스 I 분자(MHC class I molecules), TNF 수용체 단백질(TNF receptor proteins), 면역글로불린-유사 단백질(Immunoglobulin-like proteins), 사이토카인 수용체(cytokine receptors), 인테그린(integrins), SLAM 단백질(signaling lymphocytic activation molecules), NK 세포 활성화 수용체(NK cell activating receptors), BTLA, Toll 리간드 수용체(Toll ligand receptor), OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18, lymphocyte function-associated antigen-1), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, PD-1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동자극 분자로부터 유래된 것을 특징으로 하는 CAR 단백질.
  29. 제22항의 CAR 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  30. 제22항의 CAR 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  31. 제30항의 재조합 벡터로 형질전환된 세포주.
  32. 제31항에 있어서, 상기 세포주는 면역세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포주.
  33. 제1항의 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 세포 내 약물 전달용 조성물.
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