JP2023058515A - クローディン3のecl-2に特異的に結合する抗体、その断片及びその使用 - Google Patents
クローディン3のecl-2に特異的に結合する抗体、その断片及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023058515A JP2023058515A JP2023006843A JP2023006843A JP2023058515A JP 2023058515 A JP2023058515 A JP 2023058515A JP 2023006843 A JP2023006843 A JP 2023006843A JP 2023006843 A JP2023006843 A JP 2023006843A JP 2023058515 A JP2023058515 A JP 2023058515A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- cancer
- functional fragment
- claudin
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000599 Claudin-3 Proteins 0.000 title claims abstract description 202
- 102000004106 Claudin-3 Human genes 0.000 title claims abstract description 201
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 191
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 323
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 141
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 126
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 37
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 107
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 81
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 53
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 50
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 49
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 46
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 claims description 42
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 claims description 42
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 35
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 claims description 34
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 23
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 20
- -1 ICOS (CD278) Proteins 0.000 claims description 17
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims description 15
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 14
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 13
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 claims description 11
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 claims description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 10
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100029215 Signaling lymphocytic activation molecule Human genes 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000633786 Homo sapiens SLAM family member 6 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100029197 SLAM family member 6 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010074687 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 6
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 5
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 5
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 102100024263 CD160 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 101000761938 Homo sapiens CD160 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 101001078158 Homo sapiens Integrin alpha-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001035237 Homo sapiens Integrin alpha-D Proteins 0.000 claims description 4
- 101001046687 Homo sapiens Integrin alpha-E Proteins 0.000 claims description 4
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000971538 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily F member 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000589305 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000633780 Homo sapiens Signaling lymphocytic activation molecule Proteins 0.000 claims description 4
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100039904 Integrin alpha-D Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022341 Integrin alpha-E Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 claims description 4
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100021458 Killer cell lectin-like receptor subfamily F member 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 102100032851 Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100038082 Natural killer cell receptor 2B4 Human genes 0.000 claims description 4
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 claims description 4
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 claims description 4
- 102100027744 Semaphorin-4D Human genes 0.000 claims description 4
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 4
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012625 DNA intercalator Substances 0.000 claims description 3
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 claims description 3
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims description 3
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 claims description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 claims description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims description 3
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010056102 CD100 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 108010017009 CD11b Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010062802 CD66 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027217 CD82 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 101710139831 CD82 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024533 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025466 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027816 Cytotoxic and regulatory T-cell molecule Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000585551 Equus caballus Pregnancy-associated glycoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022086 GRB2-related adapter protein 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029360 Hematopoietic cell signal transducer Human genes 0.000 claims description 2
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 claims description 2
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 claims description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914337 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000900690 Homo sapiens GRB2-related adapter protein 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000990188 Homo sapiens Hematopoietic cell signal transducer Proteins 0.000 claims description 2
- 101001046683 Homo sapiens Integrin alpha-L Proteins 0.000 claims description 2
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 claims description 2
- 101001046668 Homo sapiens Integrin alpha-X Proteins 0.000 claims description 2
- 101001015037 Homo sapiens Integrin beta-7 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001047640 Homo sapiens Linker for activation of T-cells family member 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001090688 Homo sapiens Lymphocyte cytosolic protein 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000589301 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001124867 Homo sapiens Peroxiredoxin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000692259 Homo sapiens Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000702132 Homo sapiens Protein spinster homolog 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000633778 Homo sapiens SLAM family member 5 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000633784 Homo sapiens SLAM family member 7 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000596234 Homo sapiens T-cell surface protein tactile Proteins 0.000 claims description 2
- 101000809875 Homo sapiens TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000795169 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Proteins 0.000 claims description 2
- 101000648507 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000679857 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 claims description 2
- 108010041100 Integrin alpha6 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010030465 Integrin alpha6beta1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100033016 Integrin beta-7 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024032 Linker for activation of T-cells family member 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100034709 Lymphocyte cytosolic protein 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 101100236305 Mus musculus Ly9 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 2
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010004222 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100032852 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710141230 Natural killer cell receptor 2B4 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100026066 Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029216 SLAM family member 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029198 SLAM family member 7 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100035268 T-cell surface protein tactile Human genes 0.000 claims description 2
- 102100038717 TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Human genes 0.000 claims description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100029690 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Human genes 0.000 claims description 2
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 claims description 2
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022156 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 101001038499 Yarrowia lipolytica (strain CLIB 122 / E 150) Lysine acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010072917 class-I restricted T cell-associated molecule Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims 2
- 206010035610 Pleural Neoplasms Diseases 0.000 claims 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims 2
- 201000003437 pleural cancer Diseases 0.000 claims 2
- 101710182312 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 18
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 15
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 abstract description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 33
- 102000002029 Claudin Human genes 0.000 description 25
- 108050009302 Claudin Proteins 0.000 description 25
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 22
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 102100040836 Claudin-1 Human genes 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 101000749331 Homo sapiens Claudin-1 Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 8
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 8
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 7
- 101100060164 Mus musculus Cldn3 gene Proteins 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 7
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 7
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 102100038447 Claudin-4 Human genes 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 6
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 6
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 6
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 5
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 102100039586 Claudin-17 Human genes 0.000 description 4
- 108090000601 Claudin-4 Proteins 0.000 description 4
- 102100038446 Claudin-5 Human genes 0.000 description 4
- 102100038449 Claudin-6 Human genes 0.000 description 4
- 102100026096 Claudin-8 Human genes 0.000 description 4
- 102100026097 Claudin-9 Human genes 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 101000888612 Homo sapiens Claudin-17 Proteins 0.000 description 4
- 101000882908 Homo sapiens Claudin-3 Proteins 0.000 description 4
- 101000882890 Homo sapiens Claudin-4 Proteins 0.000 description 4
- 101000882896 Homo sapiens Claudin-5 Proteins 0.000 description 4
- 101000882898 Homo sapiens Claudin-6 Proteins 0.000 description 4
- 101000912659 Homo sapiens Claudin-8 Proteins 0.000 description 4
- 101000912661 Homo sapiens Claudin-9 Proteins 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 102000050015 human CLDN3 Human genes 0.000 description 4
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- VQZYZXLBKBUOHE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)butanoate Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC(C)CC(=O)ON1C(=O)CCC1=O VQZYZXLBKBUOHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 102000004161 Claudin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 2
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Chemical class 0.000 description 2
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 2
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012122 aqueous mounting media Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical group N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- QZIQJVCYUQZDIR-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine hydrochloride Chemical compound Cl.ClCCN(C)CCCl QZIQJVCYUQZDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 2
- 229960005558 mertansine Drugs 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 208000012988 ovarian serous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoic acid methyl ester Natural products COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UOWVMDUEMSNCAV-WYENRQIDSA-N rachelmycin Chemical compound C1([C@]23C[C@@H]2CN1C(=O)C=1NC=2C(OC)=C(O)C4=C(C=2C=1)CCN4C(=O)C1=CC=2C=4CCN(C=4C(O)=C(C=2N1)OC)C(N)=O)=CC(=O)C1=C3C(C)=CN1 UOWVMDUEMSNCAV-WYENRQIDSA-N 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Chemical class 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- UFIVODCEJLHUTQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-(1-phenylethyldisulfanyl)-2h-pyridine-1-carboxylate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C)SSC1C=CC=CN1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O UFIVODCEJLHUTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-acetylsulfanylacetate Chemical compound CC(=O)SCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSWBNALIBMCQED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-phenyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)C(C=1C=CC=CC=1)(C)SSC1=CC=CC=N1 XSWBNALIBMCQED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JSHOVKSMJRQOGY-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(pyridin-2-yldisulfanyl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCSSC1=CC=CC=N1 JSHOVKSMJRQOGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[1-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethyl]benzoate Chemical compound C=1C=C(C(=O)ON2C(CCC2=O)=O)C=CC=1C(C)SSC1=CC=CC=N1 GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N (2s)-2-[[(2r,3r)-3-methoxy-3-[(2s)-1-[(3r,4s,5s)-3-methoxy-5-methyl-4-[methyl-[(2s)-3-methyl-2-[[(2s)-3-methyl-2-(methylamino)butanoyl]amino]butanoyl]amino]heptanoyl]pyrrolidin-2-yl]-2-methylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N 0.000 description 1
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-15-(4-hydroxy-18-methoxycarbonyl-5,18-seco-ibogamin-18-yl)-16-methoxy-1-methyl-6,7-didehydro-aspidospermidine-3-carboxylic acid methyl ester Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- ZXVVLPRANUATCA-UHFFFAOYSA-N CC(ON(C(CC1)=O)C1=O)=[S+]C(C)=O Chemical compound CC(ON(C(CC1)=O)C1=O)=[S+]C(C)=O ZXVVLPRANUATCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000006271 Discosoma sp. Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 229930189413 Esperamicin Natural products 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101000873418 Homo sapiens P-selectin glycoprotein ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100021593 Interleukin-7 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000481961 Lachancea thermotolerans Species 0.000 description 1
- 241000235651 Lachancea waltii Species 0.000 description 1
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 description 1
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000882909 Mus musculus Claudin-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102100034925 P-selectin glycoprotein ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 231100000742 Plant toxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 108010062314 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Proteins 0.000 description 1
- 102000010841 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Human genes 0.000 description 1
- 102000008115 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150052859 Slc9a1 gene Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 1
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N [4-[[(2S)-5-(carbamoylamino)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)hexanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]pentanoyl]amino]phenyl]methyl N-[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1S,2R)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-methylamino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-N-methylcarbamate Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]([C@@H](CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)c1ccccc1)OC)N(C)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)OCc1ccc(NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCCN2C(=O)CCC2=O)C(C)C)cc1)C(C)C IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- SAZUGELZHZOXHB-UHFFFAOYSA-N acecarbromal Chemical compound CCC(Br)(CC)C(=O)NC(=O)NC(C)=O SAZUGELZHZOXHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 231100000659 animal toxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229930195731 calicheamicin Natural products 0.000 description 1
- HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N calicheamicin Chemical compound C1[C@H](OC)[C@@H](NCC)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2C\3=C(NC(=O)OC)C(=O)C[C@](C/3=C/CSSSC)(O)C#C\C=C/C#C2)O[C@H](C)[C@@H](NO[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](SC(=O)C=3C(=C(OC)C(O[C@H]4[C@@H]([C@H](OC)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)=C(I)C=3C)OC)[C@@H](O)C2)[C@@H]1O HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N 0.000 description 1
- 230000005880 cancer cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229930188550 carminomycin Natural products 0.000 description 1
- XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N carminomycin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N 0.000 description 1
- XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N carminomycin I Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001725 carubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Chemical class 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Chemical class 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 201000010288 cervix melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- AMRJKAQTDDKMCE-UHFFFAOYSA-N dolastatin Chemical compound CC(C)C(N(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)N(C)C(C(C)C)C(OC)CC(=O)N1CCCC1C(OC)C(C)C(=O)NC(C=1SC=CN=1)CC1=CC=CC=C1 AMRJKAQTDDKMCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930188854 dolastatin Natural products 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- LJQQFQHBKUKHIS-WJHRIEJJSA-N esperamicin Chemical compound O1CC(NC(C)C)C(OC)CC1OC1C(O)C(NOC2OC(C)C(SC)C(O)C2)C(C)OC1OC1C(\C2=C/CSSSC)=C(NC(=O)OC)C(=O)C(OC3OC(C)C(O)C(OC(=O)C=4C(=CC(OC)=C(OC)C=4)NC(=O)C(=C)OC)C3)C2(O)C#C\C=C/C#C1 LJQQFQHBKUKHIS-WJHRIEJJSA-N 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 201000010255 female reproductive organ cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008571 general function Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical class ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- 229960002868 mechlorethamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108010093470 monomethyl auristatin E Proteins 0.000 description 1
- 108010059074 monomethylauristatin F Proteins 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002905 orthoesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000003123 plant toxin Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000031877 prophase Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N rhodamine B 5-isothiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(N=C=S)C=C1C(O)=O YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000009958 sewing Methods 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical class [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N taxane Chemical class C([C@]1(C)CCC[C@@H](C)[C@H]1C1)C[C@H]2[C@H](C)CC[C@@H]1C2(C)C DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N 0.000 description 1
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LZAJKCZTKKKZNT-PMNGPLLRSA-N trichothecene Chemical compound C12([C@@]3(CC[C@H]2OC2C=C(CCC23C)C)C)CO1 LZAJKCZTKKKZNT-PMNGPLLRSA-N 0.000 description 1
- 229930013292 trichothecene Natural products 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229960004355 vindesine Drugs 0.000 description 1
- UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N vindesine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(N)=O)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1N=C1[C]2C=CC=C1 UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
Abstract
【課題】本発明は、クローディン3のECL-2に特異的に結合する抗体及びその機能的断片の癌細胞検出、診断、映像化、癌の治療への適用(抗体自体の抗癌使用、ACD及びCAR-発現細胞(特に、免疫細胞)への適用)と、このような使用において著しい効果を示す特有のCDR配列を含む抗体及びその機能的断片を提供する。【解決手段】特定の配列を有する抗体又はその機能的断片、前記抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチド、それを含むベクター、それを含む細胞及びそれを利用した前記の抗体又はその機能的断片を生産する方法を提供する。【選択図】図14a
Description
本出願は2018年3月28日に出願された大韓民国特許出願第10-2018-0036190号を優先権として主張し、前記の明細書全体は出願の参考文献である。
本発明はクローディン3のECL-2(extracellular second loop)に特異的に結合する抗体、その断片及びその使用に関するもので、より詳しくはクローディン3のECL-2に特異的に結合する抗体及びその機能的断片らの癌細胞検出、診断、映像化、癌の治療への適用使用(抗体自体の抗がん使用、ADC及びCAR-発現細胞(特に、免疫細胞)への適用)と、このような使用において顕著な効果を示す特有のCDR配列を含む抗体及びその機能的断片に関するものである。
クローディン(claudin)は、細胞間の密着結合(thigh junction,TJ)の主要必須膜タンパク質として哺乳類の場合27個のファミリーがあり、ヒトの場合は哺乳類からクローディン13を除いたクローディンファミリーを有している。クローディンファミリーは細胞壁を透過して刺されている形態の類似した構造を有し、殆ど2つの細胞外ループ(extracellular loop)を有している構造を有している。クローディンは細胞間分子らの流れを制御する役割をすることが知られているが、最近様々な研究を通して結腸癌、胃癌、乳房癌、食道癌及び卵巣癌など、癌の発生にも密接な関連性があるという研究が報告されている。悪性腫瘍の約90%は上皮(epithelium)に由来する。正常上皮細胞では、細胞は上皮面(epithelial plane)と平行に配置される。したがって、正常的な上皮組織の間のTJを成すクローディンは組織又は器官の表面から検出され難いが、上皮腫瘍細胞発生の初期段階から有糸分裂紡錘体(mitotic spindle)の調節が解除され、細胞が平面から外れた分裂により増殖されることで、クローディンが組織表面に露出される。
特に、明確な症状が無く、手術と科学的療法以外に適切な治療方法が無いため、予後が思わしくないと知られている卵巣癌からクローディンファミリーの内、クローディン3とクローディン4が過剰発現されることが報告された(Claudin Proteins in Human Cancer:Promising New Targets for Diagnosis and Therapy,P.J. Morin,Cancer Res.65:9604-9006 (2005))。又、84人の卵巣漿液腺癌(ovarian serous adenocarcinoma)患者の生存率とクローディン3の発現率をKaplan-Meier法の生存カーブで確認した結果、クローディン3の発現率は患者の寿命短縮と密接な関係があるという研究が報告された(Expression profile of tight junction protein claudin 3 and claudin 4 in ovarian serous adenocarcinoma with prognostic,Choi et al.,Histol.Histopathol.22:1185~1195(2005))。このように、癌の組織で特異性が高いクローディン発現の増減有無は癌の生成に対する予測指示因子として使うことが可能なため、又、癌の診断と治療においてクローディンが有用なバイオマーカーとされ、様々なグループでクローディンをターゲットにする治療剤の開発を試みている。
一方、抗体-薬物-複合体(ADC、antibody drug conjugate)は単クローン抗体の標的特異性と薬物の効能(例えば、細胞毒性)の特性を組み合わせ
たものである。ADCは薬物、単クローン抗体、そして抗体と薬物を繋ぐリンカー(linker)を含む3つの主要要素で構成されており、ADCテクノロジーは主に癌細胞の表面に発現された特定抗原に特異的に結合する抗体を使用して、薬物を腫瘍細胞に伝達する方法として使われている。しかし、単に特定癌抗原を標的とする抗体がADCに全て適用できるのではない。
たものである。ADCは薬物、単クローン抗体、そして抗体と薬物を繋ぐリンカー(linker)を含む3つの主要要素で構成されており、ADCテクノロジーは主に癌細胞の表面に発現された特定抗原に特異的に結合する抗体を使用して、薬物を腫瘍細胞に伝達する方法として使われている。しかし、単に特定癌抗原を標的とする抗体がADCに全て適用できるのではない。
従来の抗体は、大きいサイズと親水性の特徴のためで、生きている細胞の内部に直接浸透することができない。したがって、従来殆どの抗体は細胞外に分泌されたタンパク質又は細胞膜タンパク質を特異的に標的している。一般的な抗体と高分子バイオ医薬品は疎水性である細胞膜の通過が不可能であり、それによって細胞質内部の多様な病気関連物質と結合及び阻害できない限界がある。一般的に細胞の生長、特異的抑制等の機構研究のための実験で使われる細胞内部物質と特異的結合する商業的抗体は生きている細胞に対して直接処理ができず、細胞内部物質と結合するためには両親媒性グリコサイドのサポニン(saponin)を利用した細胞膜透過化(permeabilization)過程を通って、細胞膜に穿孔を形成するための前処理過程が必ず必要である。低分子物質、核酸又はナノ粒子等の場合、様々な試薬、電気穿孔法又は熱衝撃などの方法を使うことで、生きている細胞内部へ輸送できるようになるが、タンパク質及び抗体の場合、前記の殆どの試薬と実験条件等が固有な3次構造に悪影響を及ぼし、活性を消失する可能性がある。細胞内部タンパク質を特異的に結合し、活性を阻害する細胞内抗体(intracellular antibody、intrabody)が開発されているが、それもまた生きている細胞の細胞膜を浸透する活性がないため、遺伝子治療(gene therapy)の使用のみに適用が可能なため、今後の応用可能性が極めて制限される(Manikandan J et al.,Protein i:interference at protein level by intrabodies,Front Biosci,2007 Jan 1;12:1344-52)。
抗体-薬物複合体(ADC)、免疫毒素、そして標的化された核酸伝達をはじめとする幾つかの治療的アプローチは、受容体に結合するだけでなく、結合時に細胞内に内在化(internalization)する抗体を必要とする。ADCが優れた薬効を示すためにはADCが細胞内に入る(internalization、内在化)過程が必要であることが知られているが、抗体によっては細胞内に入れる能力が無いか、又はこれに対する偏差が極めて大きいため、実際にADCで開発可能な抗体とこれらの効果が制限的であることが実情である。
そこで、本発明者等はADC(抗体-薬物複合体)に使用に適した様々な特徴を兼備する抗体を開発するため研究していた中、クローディン3ECL-2に特異的に結合する抗体及びその機能的断片の癌細胞検出、診断、映像化、癌治療への適用(ADC及びCAR-発現細胞(特に、免疫細胞)への適用等)価値を確認し、このような具体的な一例として本発明で提供する特有のCDR配列を含む抗体が自ら抗癌能力を有しているだけでなく、他のクローディンファミリーとの交差反応性が無く、優れた癌細胞標的能力を示し、従来公知のクローディン3抗体と比べて極めて優れた結合力(親和度)を示し、細胞内在化(internalization)などの特性を保有し、前記の適用において著しい効果を示すことを確認し、本発明を完成させた。
従って、本発明の目的は、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位1(VH-CDR1)、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位2(VH-CDR2)、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列を含む 重鎖相補性決定部位3(VH-CDR3)を含む重鎖可変領域;及び
配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位1(VL-CDR1)、配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位2(VL-CDR2)、及び配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領部位3(VL-CDR3)を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその機能的断片を提供することである。
配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位1(VL-CDR1)、配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位2(VL-CDR2)、及び配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領部位3(VL-CDR3)を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその機能的断片を提供することである。
本発明の他の目的は、前記の抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチド、それを含むベクター、それを含む細胞及びそれを利用した前記の抗体又はその機能的断片を生産する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、前記の抗体又はその機能的断片を有効成分と含むクローディン3検出用組成物及びそれを利用したクローディン3の検出方法を提供することである。
また、前記の抗体又はその機能的断片で構成されるクローディン3の検出用組成物及びそれを利用したクローディンン3の検出方法を提供することである。
また、前記の抗体又はその機能的断片で必須的に構成されるクローディン3の検出用組成物お及びそれを利用したクローディン3の検出方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌診断用又は映像化用組成物を提供することである。
また、前記の抗体又はその機能的断片で構成される癌診断用又は映像化用組成物を提供することである。
また、前記の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌診断用又は映像化用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、具体的に前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供することである。
また、前記の抗体又はその機能的断片で構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供することである。
また、前記の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物提供することである。
また、本発明のさらに他の目的は、クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む細胞内薬物伝達用組成物を提供することである。
また、クローディン3の細胞外2番目ループ(extracellular second loop, ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片で構成される細胞内薬物伝達用組成物を提供することである。
また、クローディン3の細胞外2番目ループ(extracellular second loop, ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片で必須的に構成される細胞内薬物伝達用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate)とそれを有効成分と
して含む癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
して含む癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
また、前記の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate)とそれを有効成分とて構成される癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
また、前記の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate)とそれを有効成分とて必須的に構成される癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
また、本発明のさらに他の目的はクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体とそれを有効成分と含む癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
また、クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second
loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate)とそれを有効成分として構成される癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate)とそれを有効成分として構成される癌の予防及び治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、i)前記の本発明の抗体又はその機能的断片;ii)膜通過ドメイン(transmembrane domain);及びiii)細胞内シグナル伝達ドメイン(intracellular signlaing domain)を含むCAR(chimeric antigen receptor)タンパク質を提供することである。また、i)クローディン3細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;ii)膜通過ドメイン(transmembrane domain);及びiii)細胞内シグナル伝達ドメイン(intracellular signlaing domain)を含むCAR(chimeric antigen receptor)タンパク質を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記のCAR(chimeric antigen receptor)タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドと、それを含む組換えベクター、及び前記のベクターで形質転換された細胞(特に、免疫細胞)を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、クローディン3検出用製剤、癌診断用製剤、癌映像用製剤、癌細胞特異的薬物伝達用製剤を製造するための前記の抗体又はその機能的断片の使用を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量はそれを必要とする個体に投与する段階を含むクローディン3の特異的検出方法、癌診断方法、癌映像化方法、癌細胞特異的薬物伝達方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、癌の予防及び治療用製剤を製造するための前記の抗体の使用又は前記の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体の使用を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記の抗体を有効成分として含む組成物又は前記の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供する
ことである。
ことである。
本発明のさらに他の目的は、細胞内薬物伝達用製剤を製造するためのクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の使用を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む細胞内薬物伝達方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体の使用を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供することである。
前記のような目的を達成するために、本発明は配列番号3から表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1(VH-CDR1)、配列番号4から表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2(VH-CDR2)、配列番号5から表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3(VH-CDR3)を含む重鎖可変領域;及び
配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1(VL-CDR1)、配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2(VL-CDR2)、及び配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3(VL-CDR3)を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその機能的断片を提供する。
配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1(VL-CDR1)、配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2(VL-CDR2)、及び配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3(VL-CDR3)を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその機能的断片を提供する。
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記の抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチド、それを含むベクター、それを含む細胞及びそれを利用した前記の抗体又はその機能的断片を生産する方法を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するため、本発明は前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含むクローディン3検出用組成物及びそれを利用したクローディン3の検出方法を提供する。
また、本発明は前記の抗体及びその機能的断片で構成されるクローディン3検出用組成物及びそれを利用したクローディン3の検出方法を提供する。
また、本発明は前記の抗体及びその機能的断片で必須的に構成されるクローディン3検出用組成物及びそれを利用したクローディン3の検出方法を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌診断用又は映像化用組成物を提供する。
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片で構成される癌診断用又は映像化用組成物を提供する。
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌診断用又は映像化用組成物を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は前記の抗体を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明は前記の抗体で構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明は前記の抗体で必須的に構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は前記の抗体又は、その機能的断片を有効成分として含む癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供する。
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片で構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供する。
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供する。
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明はクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片で構成される細胞内薬物伝達用組成物を提供する。
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明はクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片で必須的に構成される細胞内薬物伝達用組成物を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は前記の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate)とそれを有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate)とそれを有効成分として構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明は前記の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate)とそれを有効成分として必須的に構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明はクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体-薬物複合体とそれを有効成分として構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明はクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体-薬物複合体とそれを有効成分として必須的に構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明はi)クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;ii)膜通過ドメイン(transmembrane
domain);及び iii)細胞内シグナル伝達ドメイン(intracellular signlaing domain)を含むCAR(chimeric antigen receptor)タンパク質を提供する。また、i)クローディン3細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;ii)膜通過ドメイン(transmembrane domain);及びiii)細胞内シグナル伝達ドメイン(intracellular signlaing domain)を含むCAR(chimeric antigen receptor)タンパク質を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は前記のCAR(chimeric antigen receptor)タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドと、それを含む組換えベクター、及び前記のベクターで形質転換された細胞(特に、免疫細胞)を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、クローディン3検出用製剤、癌診断用製剤、癌映像用製剤、癌細胞特異的薬物伝達用製剤を製造するための前記抗体又はその機能的断片の使用を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、前記の抗体又はその機能的断片を有効成分と含む組成物の有効量はそれを必要とする個体に投与する段階を含むクローディン3の特異的検出方法、癌診断方法、癌映像化方法、癌細胞特異的薬物伝達方法を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、癌の予防及び治療用製剤を製造するための前記抗体の使用又は前記抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体の使用を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、前記抗体を有効成分として含む組成物又は前記抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、細胞内薬物伝達用製剤を製造するためのクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の使用を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む細胞内薬物伝達方法を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体の使用を提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、クローディン3の細胞外第二ループ(ext
racellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供する。
racellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供する。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明への用語“抗体(antibody)”とは、免疫グロブリン(immunoglobulin,Ig)とも称され、抗原に選択的に作用して生態免疫に関与するタンパク質の総称である。自然で発現される全体抗体(whole antibody)は一般に複数のドメインからなるポリペプチドの軽鎖(light chain,LC)及び重鎖(heavy chain,HC)の2つのペアからなるか、それらHC/LCの2つのペアで成している構造を基本単位とする。哺乳類の抗体を構成する重鎖の種類はギリシャアルファベットα、δ、ε、γ及びμで表示される5つのタイプがあって、重鎖の種類によりそれぞれIgA、IgD、IgE、IgG及びIgM等、他の種類の抗体を構成するようになる。哺乳類の抗体を構成する軽鎖の種類はλ及びκで表示される2つの種類が存在する。
本発明への用語“抗体(antibody)”とは、免疫グロブリン(immunoglobulin,Ig)とも称され、抗原に選択的に作用して生態免疫に関与するタンパク質の総称である。自然で発現される全体抗体(whole antibody)は一般に複数のドメインからなるポリペプチドの軽鎖(light chain,LC)及び重鎖(heavy chain,HC)の2つのペアからなるか、それらHC/LCの2つのペアで成している構造を基本単位とする。哺乳類の抗体を構成する重鎖の種類はギリシャアルファベットα、δ、ε、γ及びμで表示される5つのタイプがあって、重鎖の種類によりそれぞれIgA、IgD、IgE、IgG及びIgM等、他の種類の抗体を構成するようになる。哺乳類の抗体を構成する軽鎖の種類はλ及びκで表示される2つの種類が存在する。
抗体の重鎖と軽鎖は構造的にアミノ酸配列の可変性により可変領域と不変領域に区切られる。重鎖の不変領域は抗体の種類によりCH1、CH2及びCH3(IgA、IgD及びIgG抗体)及びCH4(IgE及びIgM抗体)等、3つ又は4つの重鎖不変領域で構成されていて、軽鎖は1つの不変領域のCLで構成されている。重鎖と軽鎖の可変領域はそれぞれ重鎖可変領域(VH)又は軽鎖可変領域(VL)の一つのドメインから成っている。軽鎖と重鎖はそれぞれの可変領域と不変領域が並べて一つの共有ジスルフィド結合(disulfide bond)により連結され、軽鎖と結合した2つの分子の重鎖は、2つの共有ジスルフィド結合を通って連結されて、全体抗体の形を形成する。全体抗体は重鎖及び軽鎖の可変領域を介して、抗原に特異的に結合し、全体抗体は2つの重鎖及び軽鎖の双(HC/LC)で構成されているため、1つの分子の全体抗体は2つの可変領域を通って同一な2つの抗原に結合する二価の単一特異性を有することになる。
抗体が抗原に結合する部位を含む可変領域は配列可変性の少ないフレームワーク領域(framework region,FR)と配列可変性の高い超可変領域(hypervariable region)の相補性決定領域(complementary determining region,CDR)に細分される。VHとVLはそれぞれ3つのCDR及び4つのFRがN-末端からC-末端の方向にFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4順で配列されている。抗体の可変領域の中でも配列可変性の一番高いCDRが抗原と直接結合する部位であって、抗体の抗原特異性に最も重要である。
本発明で用語“親和度”は分子(例、抗体)の単一結合部位とその結合相手(例、抗原)の間に非共有的相互作用の総合の強度を意味する。他に示さない限り、本願で使われたように、“結合親和度”は結合対の構成員等(例えば、抗体及び抗原)の間の1:1相互作用を反映する固有結合親和度を意味する。分子Xのその相手Yに対する親和度は一般に解離定数(Kd)に表される。本発明で、抗体の“親和度”はKdで表現され、それは前述したように抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。抗原に対する抗体結合においてKdの値が大きいほど、特定抗原に対する結合親和度はさらに弱い。前記Kd又は親和度は当該分野に公知された通常の方法により測定可能であって、例え、Surface Plasmon Resonance,Ligand Tracer Green等の測定機器を利用することができる。
本発明で“クローディン3(claudin 3,CLDN3にも表記)”はクローディ
ンファミリーに属するタンパク質であり、密着結合(tight junctions)が発するところに存在し、密着結合から細胞間の空間を除去する特有の役割を有する。密着結合(tight junctions)は動物のような有機体の組織から引接した細胞膜を連結する頑固な構造物である。クローディン3はイオンのような小さい溶質(solute)の細胞間透過性を調節する構造タンパク質である。クローディン3は4つの膜通過(transmembrane)領域を有するタンパク質であり、2つのペプチドループ(loop)を細胞外部に露出させる構造を有している。2つのペプチドループの内、クローディン3全体タンパク質配列により、N-末端に近いアミノ酸領域のループを細胞外第一ループ(本発明でECL-1又はEL1で表記)と称し、もう一つのループを本発明で細胞外第二ループ(本発明でECL-2又はEL2で表記)と称する。好ましくは、前記細胞外第一ループは、クローディン3タンパク質アミノ酸配列の27乃至80番目のアミノ酸を含む領域で、細胞外第二ループは、クローディン3タンパク質アミノ酸配列の144乃至159番目アミノ酸を含む領域(配列番号2参照)を意味する。
ンファミリーに属するタンパク質であり、密着結合(tight junctions)が発するところに存在し、密着結合から細胞間の空間を除去する特有の役割を有する。密着結合(tight junctions)は動物のような有機体の組織から引接した細胞膜を連結する頑固な構造物である。クローディン3はイオンのような小さい溶質(solute)の細胞間透過性を調節する構造タンパク質である。クローディン3は4つの膜通過(transmembrane)領域を有するタンパク質であり、2つのペプチドループ(loop)を細胞外部に露出させる構造を有している。2つのペプチドループの内、クローディン3全体タンパク質配列により、N-末端に近いアミノ酸領域のループを細胞外第一ループ(本発明でECL-1又はEL1で表記)と称し、もう一つのループを本発明で細胞外第二ループ(本発明でECL-2又はEL2で表記)と称する。好ましくは、前記細胞外第一ループは、クローディン3タンパク質アミノ酸配列の27乃至80番目のアミノ酸を含む領域で、細胞外第二ループは、クローディン3タンパク質アミノ酸配列の144乃至159番目アミノ酸を含む領域(配列番号2参照)を意味する。
Claudin3はウエルシュ菌エンテロトキシン(Clostridium perfringens enterotoxin)(CPE)に対する毒素受容体として機能すると知られている。CPEはClaudin3とClaudin4に結合すり次第、細胞壊死を起こす大きな複合体を形成して細胞膜に空隙を生成する。
一方、クローディンタンパク質の細胞外ドメインはTJ(密着結合)の形成に関与するが、正常の上皮細胞単一層(normal confluent epithelial cell monolayer)でClaudin3は側面膜の最頂端部(apical
site of the lateral membrane)のTJストランドの中に存在するとされるが、上皮腫瘍形成及び腫瘍細胞からの非表面(out-of-plane)分化の間の有糸分裂紡錘体の調節障害は細胞表面のTJ成分の非常識的位置を誘導することと推測される(Saeki R,et al., Potency of claudin-targeting as antitumor therapy Mol Cell Pharmacol.2010;2:47-51.)。それに関して、Claudin3タンパク質は卵巣癌、前立腺癌、乳房癌、子宮癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌及び結腸癌のような多くの癌組織からの露出程度が増加することと報告された。Swedish Human Protein Atlas (HPA)ウェブサイト
(http://www.proteinatlas.org/)を病気に対するClaudin3の発現プロファイルの参考資料として用いられる。Claudin3とClaudin4の発現は化学用法耐性及び/又は再発性子宮癌で特に高まるが、それはアメリカで婦人科の癌の内、最も致死率が高いと知られている。しかし、今まで腫瘍状態から露出されるClaudin3を特異的に検出するのには限界を示しているのが実情である。
site of the lateral membrane)のTJストランドの中に存在するとされるが、上皮腫瘍形成及び腫瘍細胞からの非表面(out-of-plane)分化の間の有糸分裂紡錘体の調節障害は細胞表面のTJ成分の非常識的位置を誘導することと推測される(Saeki R,et al., Potency of claudin-targeting as antitumor therapy Mol Cell Pharmacol.2010;2:47-51.)。それに関して、Claudin3タンパク質は卵巣癌、前立腺癌、乳房癌、子宮癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌及び結腸癌のような多くの癌組織からの露出程度が増加することと報告された。Swedish Human Protein Atlas (HPA)ウェブサイト
(http://www.proteinatlas.org/)を病気に対するClaudin3の発現プロファイルの参考資料として用いられる。Claudin3とClaudin4の発現は化学用法耐性及び/又は再発性子宮癌で特に高まるが、それはアメリカで婦人科の癌の内、最も致死率が高いと知られている。しかし、今まで腫瘍状態から露出されるClaudin3を特異的に検出するのには限界を示しているのが実情である。
本発明でクローディン3は、当業界でクローディン3として知られたものなら、その具体的生物起源及び配列に特別な制限が無い。一例で本発明のクローディン3はマウス(Mus musculus)由来のものとして、NCBI(Genbank)Accession No.Q9Z0G9等で公知されたもの、ラット(Rattus norvegicus)由来のものとして、NCBI(Genbank)Accession No.Q63400等で公知されたもの、トリ(Gallus gallus)由来のものとして、NCBI(Genbank)Accession No.Q98SR2等で公知されたもの、イヌ(Canis lupus familiaris)由来のものとして、NCBI(Genbank)Accession No.Q95KM5等で公知されたもの、サル(Macaca mulatta)由来のものとして、UniProtKB Entry. F6RQF6等で公知されたもの、ヒト(homo sapiens)由来のものとして、NCBI(Genbank)Accession No.O15551(配
列番号1参照)等で公知されたものを含むことができる。
列番号1参照)等で公知されたものを含むことができる。
そして、このような抗体及びその機能的断片の一例として、本発明から提供する特有のCDR配列を有する抗体がクローディン3発現細胞に対するADCC(Antibody dependent cell cytotoxicity、抗体依存性細胞障害作用)効果が著しく、自ら抗癌効果を有しているだけでなく、他のクローディンファミリーとの交差反応性が無く、クローディン3のみを特異的に標的する能力が優れていて、従来公知のクローディン3抗体と比較して極めて優れた結合力(親和度)を示し、また細胞内部に入る(internalize、内在化する)能力を有して癌の診断、映像化及び薬物伝達体としての機能が優れていることを確認した。特に本発明の抗体及びその機能的断片はクローディン3のECL-2領域に特異的に付着するが、それによりクローディン3が表面に露出されない通常の正常組織とは違い、不完全な連接(junction)を形成する腫瘍組織に本発明の抗体が(又はその機能的断片が)選択的接近可能になり、そのような能力は正常細胞に対する抗癌薬物の毒性問題を凄まじく低減させるもので、より技術的意義が大きい。
具体的に本発明は、後記のCDR配列を含むことを特徴とする重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体又はその機能的断片を提供する:
配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位1(VH-CDR1)、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位2(VH-CDR2)、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位3(VH-CDR3)を含む重鎖可変領域;及び
配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位1(VL-CDR1)、配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位2(VL-CDR2)、配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位3(VL-CDR3)を含む軽鎖可変領域。
配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位1(VL-CDR1)、配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位2(VL-CDR2)、配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位3(VL-CDR3)を含む軽鎖可変領域。
また本発明は、後記のCDR配列を含むことを特徴とする重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体及びその機能的断片を提供する:
配列番号18で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位1(VH-CDR1)、配列番号19で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位2(VH-CDR2)、及び配列番号20で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位3(VH-CDR3)を含む重鎖可変領域;及び
配列番号21で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位1(VL-CDR1)、配列番号22で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位2(VL-CDR2)、配列番号23で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位3(VL-CDR3)を含む軽鎖可変領域。
配列番号21で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位1(VL-CDR1)、配列番号22で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位2(VL-CDR2)、配列番号23で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位3(VL-CDR3)を含む軽鎖可変領域。
本発明による抗体は前記のCDRの組合せを有するのであれば、その種類に制限はない。具体的にはIgG、IgA、IgM、IgE及びIgDからなる群から選ばれるものもあり、特にIgG抗体であることが望ましい。前記IgGはその亜型としてIgG1、IgG2、IgG3、IgG4等を含むが、それに限定されない。また1つのB細胞から由来する単クローン(monoclona)抗体の可能性があり、複数のB細胞から由来するポリクローナル(polyclonal)抗体の可能性もあるが、抗体の重鎖と軽鎖のアミノ酸配列が実質的に同一の抗体の集団の単クローン抗体であることが望ましい。また、本発明の抗体又はその断片は酵素、蛍光物質、放射線物質及びタンパク質等と接合したものもあるが、これに限定されない。
本発明の抗体はヒトを含む哺乳動物、鳥類等を含む任意の動物から由来したものもあり、望ましくはヒトから由来するものか、ヒトから由来した抗体の部分と別種の動物から由来した抗体の部分を含むキメリック(chimeric)抗体もある。
また、本発明から抗体の機能的断片は全体抗体の抗原特異的結合力を維持している断片を意味し、具体的にはFab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、scFv、ディアボディ(diabody)又はdsFvなどの形態もある。
Fab(fragment antigen-binding)は抗体の抗原結合断片で、重鎖と軽鎖それぞれの一つの可変ドメインと不変ドメインで構成される。F(ab’)2は抗体をペプシンで加水分解させて生成される断片で、2つのFabが重鎖ヒンジ(hinge)でジスルフィド結合(disulfide bond)により繋がる形をしている。F(ab’)はF(ab’)2断片のジスルフィド結合を還元して分離させたFabに重鎖ヒンジが加わった形の段量体抗体断片である。Fv(variable fragment)は重鎖と軽鎖それぞれの可変領域のみに構成される抗体の断片である。scFv(single chain variable fragment)は重鎖可変領域(VH)と軽鎖可変領域(VL)が柔軟なペプチドリンカーで繋がれている組換え抗体断片である。ディアボディ(diabody)はscFvのVHとVLが極めて短いリンカーで連結され、互いに結合できず、同一な形の他のscFvのVLとVHとそれぞれ結合し、二量体を形成している形の断片を意味する。dsFvはVH及びVLのうちそれぞれ一つのアミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、当該システイン残基間のS-S結合を介在して結合させたものを意味する。システイン残基に置換されるアミノ酸残基はReiter等により記載された方法[参照:Protein Engineering, 7, 697(1994)]により抗体の立体構造予測に根拠して選択できる。
本発明の前記又はその機能的断片はクローディン3に特異的に結合し、特にクローディン3のECL-2(extracellular loop 2)に極めて高い親和度(affinity)に特異的に付着して細胞内部に内在化(internalization)することを特徴とする。
前記のクローディン3は当業界にクローディン3として知られたものなら、その具体的生物起源に特に制限は無く、一例で前述したものと同様のマウス由来、ヒト由来、ラット由来、トリ由来、イヌ由来又はサル由来のものなどを含む。望ましくヒト由来のものを意味するものもあり、ヒトクローディン3のECL-2は望ましく配列番号2で表されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一実施例では本発明の抗体がクローディン3と系統解析的に柔軟関係が高い他のクローディンファミリーとは交差反応性が無いことを確認し、本発明の抗体の結合特異性が相当に優れていることを証明している。このような高いレベルの結合特異性はクローディン3(特にヒトクローディン3)を検出し、それを特定の病気(特に、クローディン3の異常な(過剰)発現を特徴とする疾患)の診断及び映像化などに利用し、高い正確性を有する情報を提供することができるので、極めて意味が深い。
したがって、本発明は前記抗体又はその機能的断片を有効成分として含むクローディン3検出用組成物及びキットを提供する。また、本発明は、(1)前記本発明の抗体又はその機能的断片を試料と接触させる段階、及び(2)前記抗体又はその機能的断片を検出する段階を含むクローディン3の特異的検出方法を提供する。
また、本発明は前記抗体及びその機能的断片で構成されるクローディン3検出用組成物及
びキットを提供する。
びキットを提供する。
また、本発明は前記抗体及びその機能的断片で必須的に構成されるクローディン3検出用組成物及びキットを提供する。
本発明の前記抗体又はその機能的断片は、クローディン3との結合の有無を確認し、検出及び定量を容易にするために、標識された状態で提供されることができる。即ち、検出可能な標識にリンク(例:共有結合及び架橋)されて提供されることができる。前記検出可能な標識は、それに制限されないが、発色酵素(例:ペルオキシダーゼ、アルカラインホスファターゼ)、放射性同位元素(例:18F、123I、124I、125I、32P、35S、67Ga)、クロモフォア(chromophore)、発光物質又は蛍光物質(例:FITC、RITC、蛍光タンパク質(GFP(Green Fluorescent Protein);EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)、RFP(Red Fluorescent Protein);DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein);CFP(Cyan Fluorescent Protein)、CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein)、YFP(Yellow Fluorescent Protein)、Cy3、Cy5及びCy7.5)、自己共鳴映像物質(例:Gadolinium(Gd、ガドリニウム)、常磁性粒子(super paramagnetic particles)又は超常磁性粒子(ultrasuper paramagnetic particles))などもあり得る。
本発明の抗体又はその機能的断片は、検出キット(Kit)又は診断分析を行うための診断キットとして提供することが可能なため、そのとき使用説明書と共に、前に指定された量で包装された試薬と一緒に提供できる。抗体が酵素で標識された場合、キットには基質及び発色端又は蛍光端を提供する基質前駆体として酵素により要求される補助因子(cofactor)が含められる。また、安定化剤、緩衝液(例えば、遮断緩衝液又は溶解緩衝液)などと同じく他の添加剤が含められる。様々な試薬の相対的量は分析の敏感度を十分最適化させる試薬の溶液内濃度を提供するため幅広く変化できる。試薬は溶解時適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、一般に凍結乾燥された、乾燥文末として提供できる。
前記のキットはウエスタンブロット分析法、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)、放射線免疫分析法、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動法、組織免疫染色、免疫沈降分析法、補体結合分析法、フローサイトメトリー(FACS)、プロテインチップ分析法などに使われるキットでもあって、それぞれの分析法により提供される試薬、補助物質、容器(container)、固体支持体等は当業界に良く知られている。
前記クローディン3特異的検出方法により、当業者は試料内に存在(又は包含)するクローディン3タンパク質の有無と濃度を測定できる。
本願で検出とは、定量及び/又は定性分析を含むことで、存在、不存在の検出及び濃度測定を含むことでそのような方法は当業界で公知されていて、当業者であれば本願の実施のための適切な方法を選択できる。
前記(1)段階の前に、通常の技術者は抗体又はその機能的断片を利用してタンパク質を検出する公知の方法を適切に選択し、選択された方法に適合した試料を用意できる。また、試料はクローディン3の異常な(過剰)発現を特徴とする疾患(例えば、癌)の有無を
診断しようとする被検体から採取した生検などから得られた細胞や組織、全血(血液)、血清、血漿、唾液、脳脊髄液などもあるが、これに限定されない。前期抗体を利用してタンパク質を検出する方法とはそれに制限されるものではないが、例えば、ウエスタンブロット、免疫ブロット、ドット・ブロット、免疫組織化学染色、酵素免疫分析(ELISA)、放射能免疫検定法(radioimmunoassay)、競争結合分析、免疫沈降法などがある。例えば、免疫組織化学染色のためには、細胞や組織切片を固定し、ブロック(blocking)するなどの前処理をすることができる。
診断しようとする被検体から採取した生検などから得られた細胞や組織、全血(血液)、血清、血漿、唾液、脳脊髄液などもあるが、これに限定されない。前期抗体を利用してタンパク質を検出する方法とはそれに制限されるものではないが、例えば、ウエスタンブロット、免疫ブロット、ドット・ブロット、免疫組織化学染色、酵素免疫分析(ELISA)、放射能免疫検定法(radioimmunoassay)、競争結合分析、免疫沈降法などがある。例えば、免疫組織化学染色のためには、細胞や組織切片を固定し、ブロック(blocking)するなどの前処理をすることができる。
続いて前記(1)の段階では前述したように準備された試料に本発明による抗体又はその機能的断片を接触させる。前記の接触により抗原(クローディン3)-抗体複合体が形成される。
前記(2)段階では試料に生成された抗原-抗体複合体を感知することで、試料内クローディン3タンパク質の存在有無とその水準を測定する段階である。前述したように検出に利用された本発明の前記抗体又はその機能的断片は、標識された状態で提供されることもあり、その場合直ぐに標識を検出することができる。それでない場合は、別途標識された2次抗体を用いられる。前記2次抗体とは、1次抗体(その場合、本発明の抗体又はその機能的断片)のFc部位などに結合する抗体として、そのような2次抗体の使用については当業界に周知されている。
標識による検出方法は当業界に広く知られているが、例えば次のような方法により遂行できる。若し検出可能な標識で蛍光物質を利用する場合は、免疫蛍光染色法を利用することができる、例え、蛍光物質で標識された本発明のペプチドを試料と反応させて未結合又は非特異的な結合産物を除去してから、蛍光顕微鏡下でペプチドによる蛍光を観察することができる。また、検出可能な標識で酵素(例えば、ルシフェラーゼ,ペルオキシダーゼ,ガラクトシダーゼなど)を利用する場合には酵素反応を通った基質の発色反応により吸光度を測定し、放射線物質の場合には、放射線放出量(例えば、シンチレーション係数(scintillation counting)により測定)を測定することで遂行できる。それ以外にも本発明による抗体又はその断片はバイオティン(biotin)に接合された形で製造され、適切に標識されたストレプトアビジン(streptavidin)と反応させて感知することができる。併せて、検出された結果は、検出標識による公知された映像化方法によって、映像化することができる。
それによって前記本発明の抗体又はその機能的断片はクローディン3の(過剰)発現を特徴とする疾患の診断及び映像化に利用できる。本発明で診断及び映像化可能な疾患では、当業界にクローディン3の異常な発現(特に、過剰発現)を同伴するものと知られているものなら、その種類が特に限られてはないが、望ましく癌を対象にする可能性がある。したがって、本発明は、前記本発明の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌診断用組成物及び癌の映像化用組成物を提供する。
また、前記本発明の抗体又はその機能的断片で構成される癌診断用組成物及び癌の映像化用組成物を提供する。
また、前記本発明の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌診断用組成物及び癌の映像化用組成物を提供する。
本願から前記の癌(腫瘍)はその種類が特に限られてはないが、望ましくは正常状態と比較してクローディン3の過剰発現を特徴とする癌の種類でもあり、より望ましくは上皮性癌でもあって、具体的一例としては卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、食道癌、乳房癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮癌、子宮頸部癌又は黒色腫等を含むが、それに限ら
れてはいない。
れてはいない。
また本発明の抗体又はその断片は前述したようにクローディン3に対する結合特異性が極めて高いだけでなく、クローディン3(特にECL-2)に結合した後、細胞内に内在化(internalization)されることを特徴とする。こうして細胞内部に入る特性は抗体-薬物複合体(ADC,antibody-drug conjugate)の開発において大きな利点を提供して、ADCが優れた薬効を示すためにはADCが細胞内に入る(internalization, 内在化)過程が必要であると知られている。
本発明で前記内在化は細胞が内部に入ること(浸透すること)を意味することで、内在化されるタイプ又は種類が特に限られてはいないが、一例でエンドサイトーシス(endocytosis)されることもある。
したがって、本発明は、前述した本発明の抗体及びその機能的断片を有効成分として含む癌細胞と特異的薬物伝達用組成物を提供する。
また、前述した本発明の抗体又はその機能的断片で構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供する。
また、前述した本発明の抗体又はその機能的断片で必須的に構成される癌細胞特異的薬物伝達用組成物を提供する。
具体的に、本発明は前述した本発明の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate)を提供する。また、本発明の抗体又はその機能的断片;及びそれと結合された薬物を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物を提供する。
本発明において、用語“抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate,ADC)”は本発明の抗体(又はその機能的断片)と薬物が連結された複合体を意味し、免疫複合体とも呼ばれる。前記抗体-薬物複合体は当業界に公知された様々な方法を利用して製造することができる。
前記の抗体-薬物複合体は、直接2つの分子が結合されることもあって、またはリンカー等の任意の手段によって、間接的に2つの分子が結合されるものもある。前記リンカーは非切断性リンカー又は切断性リンカーでもある。一般に、ADCは、リンカー等の手段によって、間接的に結合されてから標的された細胞の内部で薬物が伝達できるように設計されることが理想的であると知られている。前記リンカーは細胞内環境、例えばリソゾーム又はエンドゾームに存在する切断剤によって切断可能なため、例えば、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えばリソソーム又はエンドソームプロテアーゼにより切断できるペプチドリンカーでもある。一般にペプチドリンカーは少なくとも2つ以上のアミノ酸長さを有する。一例で、前記切断性リンカーはpH敏感性で、特定のpHの値で加水分解に敏感なこともある。一般に、pH敏感性リンカーは酸性条件で加水分解できることを示す。例えば、リソゾームで加水分解できる酸性不安定リンカー、例えば、ハイドラゾーン、セミカバゾン、チオセミカバゾン、シス-アコニットアミド(cis-aconitic amide)、オルソエステル、アセタール、ケタ-ールなどもある。他の一例で、前記リンカーは還元条件で切断されることもあり、例えばジスルフィド型リンカーがそれに該当することもある。SATA(N-succinimidyl-S-acetylthioacetate、S-アセチルチオ酢酸スクシンイミジル)、SPDP(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate
、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸 N-スクシンイミジル)、SPDB(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート)及びSMPT(N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene、N-スクシンイミジルーオキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン)を使用して様々なジスルフィド結合が形成できる。
、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸 N-スクシンイミジル)、SPDB(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート)及びSMPT(N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene、N-スクシンイミジルーオキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン)を使用して様々なジスルフィド結合が形成できる。
前記の薬物及び/又は薬物-リンカーは抗体のライシンを介して無作為に接合されるか、ジスルフィド結合鎖を還元したとき露出されるシステインを介して接合できる。場合によっては、遺伝工学的に製作されたタグには例えば、ペプチド又はタンパク質に存在するシステインを介してリンカー-薬物が結合することができる。前記ペプチド又はタンパク質は、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端から結実(deletion)を有するか、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ(C)末端にスペーサーユニットの共有結合を介して付加を有する。
本発明において、用語“薬物”は、本発明の抗体に結合して治療抗体自体の効率を増加させたり、抗体の血中内の半減期を増加させる事もあったり、抗体が標的にする位置に到達して、前記標的内の癌などを死滅させて病気の治療に用いられる物質を無制限で含み、その例として、細胞毒性薬物、毒素、サイトカイン、ケモカイン、抗生物質、核酸分解酵素のような酵素、放射線核種、光感覚剤、光熱ナノ素材、ナノパーティクル及びミセルなどがあるが、これらに限定されない。
本発明において、前記薬物は、抗体に直接連結(結合)されることもあり、公知の手段により間接的に連結されることもある。また、抗体に結合する薬物は、前記薬物の特定担持形態(例えば、ミセル、ナノパーティクル、リポソーム、又はデンドリマー(dendrimer)などに担持された形態等をすべて含む)でも適用可能である。
前記の細胞毒性薬物は、病気の治療に用いられる薬物を意味し、一例では抗癌活性を有する薬物(抗癌剤)として、マイクロチューブリン(microtubulin)構造形成抑制剤、有糸分裂(meiosis)抑制剤、トポアイソメラーゼ(topoisomerase)抑制剤又はDNAインターカレータ(DNA intercalators)がある。前記の細胞毒性薬物は、メイタンシノイド(maytansinoid)、オーリスタチン(auristatin)、ドラスタチン(dolastatin)、トリコテセン(trichothecene)、CC-1065薬物(NSC 298223)、カリケアミシン(calicheamicin)、エンジイン(enediynes)、タキサン(taxane)、アントラサイクリン(anthracycline)、メトトレキサート(methotrexate)、アドリアマイシン(adriamycin)、ビンデシン(vindesine)、ビンカアルカロイド(vinca alkaloid)、ドキソルビシン(doxorubicin)、メルファラン(melphalan)、マイトマイシンC(mitomycin C)、クロラムブシル(chlorambucil)、ダウノルビシン(daunorubicin)、ダウノマイシン(daunomycin)、エトポシド(etoposide)、テニポシド(teniposide)、カルミノマイシン(carminomycin)、アミノプテリン(aminopterin)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、ブレオマイシン(bleomycin)、エスペラミシン(esperamicin)、5-フルオロウラシル(5-fluorouracil)、メルファラン(melphalan)、窒素マスタード(メクロレタミン塩酸塩)[nitrogen mustar(mechlorethamine HCL)]、シス-白金およびその同族体、シスプラチン(cisplatin)、CPT-11、ドセタキセル(docetaxel)、モノメチルアウ
リスタチンE(Monomethylauristatin E)、モノメチルアウリスタチンF(Monomethylauristatin F)又はエムタンシン(emtansine, DM1)等を含むことができ、これに限定されない。
リスタチンE(Monomethylauristatin E)、モノメチルアウリスタチンF(Monomethylauristatin F)又はエムタンシン(emtansine, DM1)等を含むことができ、これに限定されない。
本発明において、用語“毒素(toxin)”は、生物体が作り出す毒性を有する薬物を意味し、その種類は特に限定されてはいないが、植物毒素、動物毒素、菌体外毒素又は細菌毒素などがある。
本発明の抗体は、前述のようにクローディン3に対する結合特異性がかなり高いだけでなく、抗体自体がクローディン3に結合した後ADCC(Antibody dependent cell cytotoxicity、抗体依存性細胞毒性)による細胞毒性効果が著しいことが特徴である。それは本発明の明細書の一実施例によく示されている。したがって、本発明は本発明の前記抗体を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明の前記抗体で構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明の前記抗体で必須的に構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明の前記抗体で必須的に構成される癌の予防及び治療用組成物を提供する。
抗体依存性細胞毒性(ADCC,antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)はNK細胞(natural killer cell)の癌細胞の死滅機構の一つとして知られた。NK細胞は免疫グロブリンG(IgG)のFcに対する受容体のCD16を発現し、この受容体を介して他の形のMHC非制限性殺害を行うことができる。即ち、NK細胞のADCCは標的細胞を認識する抗体の存在に依存するが、抗体が抗原と結合すると抗体のFc部位が露出され、露出されたFc部位がNK細胞の受容体と結合して橋を形成すると、受容体結合によって発生するシグナル伝達によりNK細胞から細胞傷害物質が放出されて、標的細胞が傷害を受ける。
このように,本発明の抗体は,自らにも抗癌の効能を有するため、前記抗体を抗癌活性薬物を一緒に(特に、ADCの形に)提供する場合には著しいシナジー効果を示す。
本発明は、また、前記抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。
前記抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドは、前述したものと同様のCDR構成を有する抗体又はその断片を暗号化できる限り、塩基の組合せに特に限定されない。アミノ酸配列が明かされた場合、当業界に公知されたコドン情報に基づいて前記アミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチドを製造する技術は、当業界に周知されている。前記ポリヌクレオチドはDNA、cDNA及びRNA配列を全て含む短鎖又は二重鎖の形態の核酸分子として提供されることができる。
また、本発明は、本発明による抗体又はその断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明において、“組換え(recombinant)”は“遺伝子操作(genetic manipulation)”と互換して用いられ、遺伝子に変形を加え、切って、繋ぐ等の分子的クローニング(molecular cloning)実験技法を利用して自然の状態では存在しない形の遺伝子を製造することを意味する。
本発明において、“発現(expression)”は細胞へのタンパク質又は核酸が生成されることを意味する。
本発明において、“発現(expression)”は細胞へのタンパク質又は核酸が生成されることを意味する。
本発明において、“組換え発現ベクター”とは、適した宿主細胞(host cell)から目的とするタンパク質又は核酸(RNA)を発現できるベクターとして、ポリヌクレオチド(遺伝子)インサートが発現できるよう作動可能に連結された重要な調節要素を含む遺伝子組換え体を意味する。“作動可能に連結される(operably linked)”とは、一般的機能を行うように、核酸発現調節配列と目的するタンパク質又はRNAをコーディングする核酸配列が機能的に連結(functional linkage)されているもので、発現調節配列により遺伝子が発現されるよう連結されたことを意味する。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組換え技術を利用して製造することが可能なため、部位-特異的DNA切断及び連結は、当該技術分野から一般に知られた酵素等を使用する。前記“発現調節配列(expression control sequence)”とは特定の宿主細胞から作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を調節するDNA配列を意味する。そのような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適宜のmRNAリボソーム結合部位をコーディングする配列、転写及び解読の終結を調節する配列、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサー等を含む。前記ベクターのプロモーターは、構成的又は誘導性であることもある。前記の作動可能に連結された遺伝子配列と発現調節配列はベクターを含む宿主細胞を選択するための選択マーカー及び/又は複製起点(replication origin)を一緒に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれることもある。また、前記発現ベクターは必要により膜標的化又は分泌のためのシグナル配列又はリーダー配列を含んでおり、目的によって多様に製造することができる。
シグナル配列には、宿主がエシェリキア属菌の場合には、PhoAシグナル配列、OmpAシグナル配列等が、宿主がバチルス属菌の場合には、α-アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列等が、宿主が酵母である場合には、MFαシグナル配列、SUC2シグナル配列等が、宿主が動物細胞の場合には、インスリンシグナル配列、α-インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列等が用いられるが、これに限定されない。
本発明の組換え発現ベクターは、クローニング分野において通常用いられるベクターであれば、種類は特に限らず、その例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクター等を含むが、それに限らない。前記プラスミドには、大腸菌由来プラスミド(pBR322、pBR325、pUC118及びpUC119、pET-22b(+))、バチラスサブティリス由来プラスミド(pUB110及びpTP5)及び酵母由来のプラスミド(YEp13、YEp24 及びYCp50)等があり、前記ウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルスのような動物ウイルス、バキュロウイルスのような昆虫ウイルス等が用いられ、pcDNA等が用いられる。
本発明で前記組換えベクターは抗体の軽鎖又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドと;重鎖又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドを一つのベクターに同時に包含(挿入)させた形で提供可能なため、又は2つの(他の種類を含む)のベクターにそれぞれ包含(挿入)させて提供できる。
また、本発明は本発明による抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに形質転換された細胞を提供する。
本発明において、用語宿主細胞(host cell)は、任意の手段(例:電気衝撃法、カルシウムホスファターゼ沈殿法、微細注入法、形質転換法、ウイルス感染など)によって細胞内に導入された異種性DNAを含む原核又は真核細胞を意味する。
本発明の(宿主)細胞は、本発明の組換え発現ベクターの含まれる抗体又はその断片を暗号化するポリヌクレオチドを発現するに用いられる細胞であれば、その種類は特に限定されない。本発明による組換え発現ベクターで形質転換された細胞(宿主細胞)は、原核生物(例えば、大腸菌)、真核生物(例えば、酵母又は他の菌類)、植物細胞(例えば、タバコ又はトマト植物細胞)、動物細胞(例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター(hamster)細胞、ラット細胞(rat cell)、マウス細胞(mouse cell)、昆虫細胞又はそれらから由来するハイブリドーマでもある。望ましくはヒトを含む哺乳類から由来する細胞であることもある。
より具体的一例として、原核生物はグラム陰性又はグラム陽性有機体、例えば、エンテロバクテリアセー(Enterobacteriaceae)、例えば、エシェリキア(Escherichia)、例えば、イ・コーライ、エンテロバクター(Enterobacter)、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ(Salmonella)、例えば、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella Typhimurium)、セラチア(Serratia)、例えば、セラチア・マルセスカンス(Serratia marcescans)と及びシゲラ(Shigella)、及びバシリ(Bacilli)、例えば、ビ・ズブチリス(B. subtilis)及びビ・リケニフォルミス(B.
licheniformis)、シュードモナス(Pseudomonas)、例えばピ・エルギノーザ(P. aeruginosa)及びストレプトマイセス(Streptomyces)を含む。本発明の細胞は、本発明のベクターを発現できるものであれば、特に限られることはないが、望ましくはイ・コーライ、それに限られないが、例えば、イ・コーライER2537、イ・コーライB、イ・コーライX1776(ATCC 31,537)、イ・コーライW31(ATCC27,325)又はLacZが発現可能なイ・コーラである可能性があり、より望ましくは、イ・コーライER2537かもしれない。本発明の細胞として、真核生物はサッカロマイセス・セレビジアに(Saccharomyces cerevisiae)が最もよく用いられる。しかし、多くの他の属、種及び菌株、それに限られないが、例えばシジョカロマイセスプムベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロマイセス宿主、例えばケイ・ラクティス(K.lactis)、ケイ・プラギリス(K.fragilis)(ATCC 12,424)、ケイ・ブルガリクス(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケイ・ウィカラミ(K.ickeramii) (ATCC 24,178)、ケイ・ワルティ(K.waltii)(ATCC 56,500)、ケイ・ドロソフィラルム(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、ケイ・テルモレランス((K.thermotolerans)及びケイ・マルシアヌス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(EP402,226);ピキア・パストリス(Pichia pastoris)(EP183,070);カンジダ(Candida);トリコデルマ・レエシア(Trichoderma reesia(EP244,234));ニューロスポラクラサ(Neurospora crassa);シュバニッシュラウス(Schwanniomyces)、例えばニューロスポラ、ペニシリウム(Penicillium)、ポリポクラジウム(Tolypocladium)及びアスパジラス(Aspergillus)の宿主、例えばエー・ニドゥランス(A.nidulans)及びエイ・ニーガー(A.niger)が用いられる。
licheniformis)、シュードモナス(Pseudomonas)、例えばピ・エルギノーザ(P. aeruginosa)及びストレプトマイセス(Streptomyces)を含む。本発明の細胞は、本発明のベクターを発現できるものであれば、特に限られることはないが、望ましくはイ・コーライ、それに限られないが、例えば、イ・コーライER2537、イ・コーライB、イ・コーライX1776(ATCC 31,537)、イ・コーライW31(ATCC27,325)又はLacZが発現可能なイ・コーラである可能性があり、より望ましくは、イ・コーライER2537かもしれない。本発明の細胞として、真核生物はサッカロマイセス・セレビジアに(Saccharomyces cerevisiae)が最もよく用いられる。しかし、多くの他の属、種及び菌株、それに限られないが、例えばシジョカロマイセスプムベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロマイセス宿主、例えばケイ・ラクティス(K.lactis)、ケイ・プラギリス(K.fragilis)(ATCC 12,424)、ケイ・ブルガリクス(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケイ・ウィカラミ(K.ickeramii) (ATCC 24,178)、ケイ・ワルティ(K.waltii)(ATCC 56,500)、ケイ・ドロソフィラルム(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、ケイ・テルモレランス((K.thermotolerans)及びケイ・マルシアヌス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(EP402,226);ピキア・パストリス(Pichia pastoris)(EP183,070);カンジダ(Candida);トリコデルマ・レエシア(Trichoderma reesia(EP244,234));ニューロスポラクラサ(Neurospora crassa);シュバニッシュラウス(Schwanniomyces)、例えばニューロスポラ、ペニシリウム(Penicillium)、ポリポクラジウム(Tolypocladium)及びアスパジラス(Aspergillus)の宿主、例えばエー・ニドゥランス(A.nidulans)及びエイ・ニーガー(A.niger)が用いられる。
一方、本発明の細胞は動物細胞、特に脊椎動物細胞であることもある。培養(組織培養)において脊椎動物細胞の増殖は、慣用的な方法であり、様々な技術が幅広く利用できる。これに限定されないが、有用な哺乳動物宿主細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1ライン(COS-7,ATCC CRL1651)、ヒト胚腎臓ライン(懸濁培養からサブクローニングされた293又は293細胞[Graham等、197
7、J Gen Virol.36:59])、子ハムスター腎臓細胞(BHK、ATCCL10)、チャイニーズハムスター卵巣細胞/- DHFR”(CHO,Urlaub等、1980、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216;例えば、DG44)、マウスセルリー細胞(TM4,Mather,1980,Biol.eprod.23:243-251)、サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70)、アフリカ緑のサル腎臓細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、ヒト頸部癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)、イヌ腎臓細胞(MDCK,ATCCCL
34)、バッファローラット肝細胞(BRL3A,ATCC CRL1442)、ヒト肺細胞(W138,ATCC CCL75)、ヒト肝細胞(Hep G2,HB8065)、マウス乳房腫瘍(MMT060562,ATCC CCL51)、TRI細胞
(Mather等、1982、Annals NY.Acad.Sci.383:44-68)、MRC5細胞、FS4細胞、ヒト肝癌細胞株(Hep G2)-HEK 293
cell(humanem bryonic kidney cell)及びExpi293FTMcellであり、望ましくにはCHO Cell、HEK293 cell(human embryonic kidney cell)又はExpi293FTMcellであることもある。宿主細胞によってタンパク質の発現量や数式等が異なるため、当業者の目的に最も適した宿主細胞を選択して用いられる。本発明の一実施例では、CHO(Chinese hamster ovary)-S細胞を用いたことがある。
7、J Gen Virol.36:59])、子ハムスター腎臓細胞(BHK、ATCCL10)、チャイニーズハムスター卵巣細胞/- DHFR”(CHO,Urlaub等、1980、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216;例えば、DG44)、マウスセルリー細胞(TM4,Mather,1980,Biol.eprod.23:243-251)、サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70)、アフリカ緑のサル腎臓細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、ヒト頸部癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)、イヌ腎臓細胞(MDCK,ATCCCL
34)、バッファローラット肝細胞(BRL3A,ATCC CRL1442)、ヒト肺細胞(W138,ATCC CCL75)、ヒト肝細胞(Hep G2,HB8065)、マウス乳房腫瘍(MMT060562,ATCC CCL51)、TRI細胞
(Mather等、1982、Annals NY.Acad.Sci.383:44-68)、MRC5細胞、FS4細胞、ヒト肝癌細胞株(Hep G2)-HEK 293
cell(humanem bryonic kidney cell)及びExpi293FTMcellであり、望ましくにはCHO Cell、HEK293 cell(human embryonic kidney cell)又はExpi293FTMcellであることもある。宿主細胞によってタンパク質の発現量や数式等が異なるため、当業者の目的に最も適した宿主細胞を選択して用いられる。本発明の一実施例では、CHO(Chinese hamster ovary)-S細胞を用いたことがある。
前記形質転換は、核酸(本発明の抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチド)を有機体、細胞、組織又は器官に導入するどのような方法も含み、当分野で公知されたよう宿主細胞によって適した標準技術を選んで行うことができる。このような方法には、電気穿孔法(electroporation)、原形質融合、リン酸カルシウム(CaPO4)沈殿、塩化カルシウム(CaCl2)沈殿、シリコン炭化物ウィスカー(Silicon carbidewhiskers)、超音波処理(sonication)、アグロバクテリア媒介の形質転換、PEG(polyethylenglycol)による沈殿法、デキストランサルフェート、リポフェクタミン、熱衝撃(heat shock)法、粒子総衝撃法(particle gun bombardment)等が含まれるが、それに限られない。
前記の細胞には抗体の軽鎖又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドと;重鎖又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチドを1つのベクターに同時に包含(挿入)させた形で提供された組換えベクターが導入可能なため、又は前記ポリヌクレオチドがそれぞれ2つ(他の種類を含む)のベクターに別々で包含(挿入)された形で提供された多数の組換えベクターを1つの細胞又は多数の細胞に導入できる。前記本発明による組換え発現ベクターで形質転換された細胞は本発明による抗体の重鎖、軽鎖又はその機能的断片を生産することになる。
本発明はまた、
(a)前記形質転換された細胞を(ポリヌクレオチドが発現される条件下で)培養して軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階;及び
(b)前記細胞又はそれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含む、クローディン3タンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の生産方法を提供する。
(a)前記形質転換された細胞を(ポリヌクレオチドが発現される条件下で)培養して軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階;及び
(b)前記細胞又はそれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含む、クローディン3タンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の生産方法を提供する。
前記(a)段階は、前記形質変換された宿主細胞(ハイブリドーマを含む)を培養し、宿主細胞に導入された組換え発現ベクターから本発明による抗体の重鎖、軽鎖又は抗体の機能的断片のポリペプチドが生産されるようにする段階である。前記宿主細胞を培養するための培地組成と培養条件、培養時間などは当業界で通常用いられる方法により適切に選ぶことができる。一例で、商業的利用ができる培地、例えばハム(Ham’s)F10(S
igma-Aldrich Co.、St.Louis、M0)、最小必須培地(MEM、Sigma-Aldrich Co.)、RPMI-1640(Sigma- Aldrich Co.)、及びダルベッコ(Dulbecco’s)改質イーグル(Eagle’s)培地(DMEM、Sigma-Aldrich Co.)が細胞を培養するのに適合するかもしれないが、これに限定されない。前記培地は必要であればホルモン及び/又は他の成長因子、塩、緩衝液、ヌクレオチド、抗生剤、微量元素及びグルコース又は同等のエネルギー源が追加できる。
igma-Aldrich Co.、St.Louis、M0)、最小必須培地(MEM、Sigma-Aldrich Co.)、RPMI-1640(Sigma- Aldrich Co.)、及びダルベッコ(Dulbecco’s)改質イーグル(Eagle’s)培地(DMEM、Sigma-Aldrich Co.)が細胞を培養するのに適合するかもしれないが、これに限定されない。前記培地は必要であればホルモン及び/又は他の成長因子、塩、緩衝液、ヌクレオチド、抗生剤、微量元素及びグルコース又は同等のエネルギー源が追加できる。
宿主細胞から生産される抗体分子は細胞の細胞質内に蓄積されるか、適切なシグナル配列により細胞の外部又は培養培地に分泌されるか、ペリプラズムなどで標的化(targeted)されるように可能なため、それは前述したことを参照にして理解される。
また、本発明による抗体がクローディン3(特に、ECL-2)に対する結合特異性を維持するよう当業界に公知されている方法を利用し、タンパク質リフォールディング(refolding)させて機能性構造(conformation)を有するようにすることが望ましい。また、IgG形の抗体を生産する場合、重鎖と軽鎖は別の細胞から発現させて、別途の段階から重鎖と軽鎖を接触させ完全な抗体を構成するように製造することもでき、重鎖と軽鎖を同一の細胞から発現するようにして、細胞内部から完全な抗体を形成するようにすることもできる。
前記(b)段階は、宿主細胞から生産された抗体又はその断片を収得する段階である。宿主細胞から生産された抗体又はその機能的断片ポリペプチドの特性、宿主細胞の特性、発現方式又はポリペプチドの標的化の有無等を考慮し、通常の技術者は収得方法を適切に選択及び調節できる。例えば、培養培地から分泌された抗体又はその断片は宿主細胞を培養した培地を収得し、遠心分離して不純物を除去する等の方法で抗体を回収できる。必要により細胞内特定小器官や細胞質に存在する抗体を細胞外部に放出して回収するために抗体またはその機能的断片の機能的構造に影響を及ぼさない範囲で細胞を融解することもできる。また、収得した抗体はクロマトグラフィー、フィルター等によるろ過、透析などの方法により、不純物をさらに除去して濃縮する過程をさらに踏むことができる。
本発明による薬学的組成物は、本発明の抗体とその機能的断片、又はこれらを全部含むADCを単独で含むか、1つ以上の薬学的に許容される担体と一緒に適した形態に製剤化されることができ、賦形剤又は希釈剤をさらに含有することができる。前記で“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常的に胃腸障害、目眩などのようなアレルギー反応又はそれと同様の反応を起こさない非毒性の組成物を意味する。
薬学的に許容される担体では例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体をさらに含むことができる。経口投与用担体はラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアル酸等を含むことができる。併せて、ペプチド製剤に対する経口投与用に使われる様々な薬物伝達用物質を含むことができる。また、非経口投与用担体は水、適したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコール等を含むことができ、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適した安定化剤には亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又は適合する保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチルー又はプロピル-パラベン及びクロロブタノールがある。
本発明の薬学的組成物は前記の成分意外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤などをさらに含むことができる。それ以外の薬学的に許容される担体及び製剤は当業界から知られている全てのタイプのものを参考にできる。
本発明の組成物はヒトを伴う哺乳動物にどのような方法にも投与することができる。例えば、経口又は非経口的に投与することができる。具体的に本発明の組成物の投与経路は公知された抗体投与方法、例えば静脈内、腹腔内、脳内、皮下、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、又は病変内経路による注射又は注入、又は後記記載された徐放性(sustained release)システムによる注射又は注入の可能性があり、これに限定されない。一例で本発明の抗体は全身に又は局部的に投与できる。
本発明の薬学的組成物は、前述のような投与経路に応じて経口投与用又は非経口投与用製剤として剤形化することができる。
本発明による薬学的組成物において、前記の抗体、この機能的断片、又はそれらを含むADCは、臨床投与時に経口及び非経口の様々の剤形で投与できるが、製剤化する場合には普段使用する充電剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して製造できる。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも1つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース(sucrose)又はラクトース(lactose)又はゼラチンなどを混ぜて調剤できる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用することができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤又はシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。
非経口投与のための製剤は滅菌された水溶液、非水性水溶液、懸濁用剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。本発明の治療用組成物は任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と望ましい純度を有する抗体を混合し貯蔵するため凍結乾燥されたケーキ又は安定化剤は使用された投与量及び濃度から需要者に非毒性であり、緩衝溶液、例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸;アスコルビン酸をはじめとする抗酸化剤;低分子量(約10個未満の残基)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性重合体、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン;単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えばEDTA;糖アルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール;塩-形成反対イオン、例えばナトリウム;と(又は)非イオン性界面活性剤、例えばツイン、フルロニクス又はポリエチレングリコール(PEG)が含まれる。
非経口投与用製剤の場合には注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟膏剤、オイル剤、保湿剤、ゲル剤、エアロゾル及び鼻腔吸入剤の形に、当業界に公知された方法により剤形化できる。それら剤形は全ての製薬会社に一般に公知された処方所に記載されている。特定実施様態で、薬学的組成物は鼻腔内スプレー、吸入及び/又は他のエアロゾル(aerosol)伝達ビークルにより伝達できる。遺伝子、ポリヌクレオチド及びペプチド組成物は鼻腔エアロゾルスプレーを通って肺に直接伝達するための方法は、例えばアメリカ特許第5,756,353号及びアメリカ特許5,804,212号に記載されたものを参照にできる。
本発明の抗体又はその機能的断片の総有効量は、単一投与量(single dose)で投与されることもあり、多重投与量(multiple dose)が長期間投与される分割治療方法(fractionated treatment protocol)により投与されることもある。それらのADCで提供される場合はまた投与容量を異にすることができる。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度及び/又は目的により有効成分(本発明の抗体又はその機能的断片)の含有量を異にすることができるが、通常には0.0
1mg/kg/day-1000mg/kg/day、望ましくは0.1mg/kg/dayから100mg/kg/dayであり、さらに好ましくは1mg/kg/dayから20mg/kg/dayの有効容量に一定の間隔で数回反復投与することができる。しかし前記の薬学的組成物の容量は製剤化方法、投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率などの様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決まるものであるから、このような点を考慮するとき、当分野の通常の知識を有する者であれば、本発明の組成物の適切な有効投与量を決定できるはずである。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を示す限りその剤形、投与経路及び投与方法に特に限定されない。
1mg/kg/day-1000mg/kg/day、望ましくは0.1mg/kg/dayから100mg/kg/dayであり、さらに好ましくは1mg/kg/dayから20mg/kg/dayの有効容量に一定の間隔で数回反復投与することができる。しかし前記の薬学的組成物の容量は製剤化方法、投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率などの様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決まるものであるから、このような点を考慮するとき、当分野の通常の知識を有する者であれば、本発明の組成物の適切な有効投与量を決定できるはずである。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を示す限りその剤形、投与経路及び投与方法に特に限定されない。
前記のように、本発明の抗体又はその機能的断片は前述の特有のCDR構成を有することでクローディン3標的に対する特異性(specificity)及び親和性(affinity)がかなり優秀であることが特徴である。従って本発明の抗体又はその機能的断片は細胞、特に免疫細胞に対してクローディン3に対する標的能を付与するに利用可能である。
したがって本発明は、前記本発明の抗体又はその機能的断片を含むCAR(キメラ抗原受容体; chimeric antigen receptor)を提供する。
具体的に、本発明は
i)前述した本発明の抗体又はその機能的断片を含む細胞のドメイン;
ii)膜通過ドメイン(transmembrane domain);及び
iii)細胞内シグナル伝達ドメイン(intracellular signlaing domain)を含むCAR(chimeric antigen receptor)タンパク質を提供する。
i)前述した本発明の抗体又はその機能的断片を含む細胞のドメイン;
ii)膜通過ドメイン(transmembrane domain);及び
iii)細胞内シグナル伝達ドメイン(intracellular signlaing domain)を含むCAR(chimeric antigen receptor)タンパク質を提供する。
本発明で用語“CAR(chimeric antigen receptor)”は、免疫効果機細胞(immune effector cell)に特定抗原に対する特異性を与えられる、自然的存在しない受容体を意味する。普段、前記のCARは、T細胞に単クローン抗体の特異性を移植するため用いられる受容体を意味する。CARは大概細胞外ドメイン(Ectodomain)、膜透過性ドメイン(transmembrane
domain)及び細胞内ドメイン(Ectodomain)で構成される。
domain)及び細胞内ドメイン(Ectodomain)で構成される。
前記(i)細胞外ドメインは前述した本発明の抗体又はその機能的断片を含み、その抗原結合部位(antigen recognition region)を含んでいる。CARに使われる抗体は抗体断片の形であることが望ましく、より望ましくはFab又はscFvの形もあるが、特にそれに制限されることではない。
また、前記CARの(ii)膜通過ドメインは細胞外ドメインと連結された形で、自然的又は合成されたものから由来したものでもある。自然に存在するものから由来した場合、膜結合又は膜透過性タンパク質から由来したものでもあって、T細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータチェーンCD28、CD3エプシロン、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154又はCD8などの様々なタンパク質のまく透過性領域から由来した部分でもあって、これに限定されない。このような膜通過ドメインの配列は膜透過性タンパク質のまく透過性領域部分を公知している当業界かから公知された文献などから得られる。
前記CARから(iii)細胞内シグナル伝達ドメインは膜通過ドメインと連結された形として細胞内部に存在する。本発明の前記細胞内シグナル伝達ドメインはCARの抗原結
合部位(即ち、本発明の抗体又はその機能的断片)に抗原が結合すると1次的に細胞活性化をもたらすシグナルを発生又は/及び伝達する領域である。
合部位(即ち、本発明の抗体又はその機能的断片)に抗原が結合すると1次的に細胞活性化をもたらすシグナルを発生又は/及び伝達する領域である。
前記“細胞”は、その種類が特に限定されないが、望ましくは免疫細胞(免疫効果機細胞)の可能性がある。前期免疫細胞は当業界に身体の免疫機能に関与するものと知られている細胞であれば、その種類が特に限定されないが、例えばT細胞、NK(Natural
Killer)細胞、NKT(Natural Killer T)細胞、単球、マクロファージ又は樹状細胞などを含み、その前駆細胞も含まれている意味である。
Killer)細胞、NKT(Natural Killer T)細胞、単球、マクロファージ又は樹状細胞などを含み、その前駆細胞も含まれている意味である。
前記の“細胞活性化”とは、該当細胞が有している活性が増加することを意味することで、このような活性の種類は特に限定されないが、一例で細胞の免疫反応促進もある。特に、前記細胞が免疫細胞の場合、前記活性化とは細胞自体の免疫反応の促進作用だけでなく、免疫細胞の数が増えることを全て含む意味として理解できる。
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外に位置する抗原結合部位(本発明の抗体又はその機能的断片)に抗原が結合した場合、細胞(特に、免疫細胞)活性化をもたらすシグナルを伝達できるものなら、特にその種類が限られない。様々な種類の細胞内シグナル伝達ドメインが用いられ、その例としては免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(tyrosine-based activation motif)又はITAMであることができ、前記ITAMはCD3ゼータ(ξ、zeta)、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD278、CD66d、DAP10、DAP12、FcεRI(特に、γ)及びその組み合わせ(1個又は2個以上)に由来するものを含むことができるが、それらに限定されるものではない。
また、本発明のCAR細胞の種類によって、細胞内シグナル伝達ドメインと共に共同刺激ドメイン(costimultatory domain)をさらに含むことが望ましいかもしれないが、これに限定されない。
前記共同刺激ドメインは、本発明のCARに含まれ、細胞内シグナル伝達ドメインによる1次シグナルに加え、該当細胞(特に、免疫細胞)に最大活性化シグナルを伝達する役割を行う部分として、共同刺激分子の細胞内ドメインを含む、CARの細胞内部分を意味する。即ち、一部免疫細胞、例えばTリンパ球及びNK細胞は、最大活性化のため2つのシグナル、即ち1次活性化シグナル及び共同刺激シグナルが必要で、CARはまた細胞外ドメインに対する抗原の結合が1次活性化シグナル及び共同刺激シグナル両方の転送を引き起こすため、任意に共同刺激ドメインを含むことができる。
前記共同刺激分子は、細胞表面分子であって、抗原に対する免疫細胞の十分な反応をもたらすことに必要な分子を意味し、当業界に知られたものであれば、その種類が特に限られてはないが、例えばMHCクラスI分子(MHC class I molecules)、TNF受容体タンパク質(TNF receptor proteins)、免疫グロブリン-類似タンパク質(Immunoglobulin-like proteins)、サイトカイン受容体(cytokine receptors)、インテグリン(integrins)、SLAMタンパク質(signaling lymphocytic activation molecules)、NK細胞の活性化受容体(NK cell activating receptors)、BTLA、Tollリガンド受容体(Toll ligand receptor)、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18、lymphocyte function-associated antigen-1)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83と特異的結合するリガンド、PD-1およびその組み合わせからなる群から選択される可能性がある。前期共同刺激ドメインはこのような共同刺激分子及びその組合せ(1つ又は2つ以上)でできる群から選ばれた分子の細胞内部分でもある。
前記共同刺激ドメインは、シグナル伝達ドメインのN-末端又はC-末端に繋ぐことができ、また複数でできているシグナル伝達ドメインの間に含まれることができる。
前記CARを成す各ドメインは、直接連結することが可能なため、また、選択的に、短いオリゴペプチド又はポリペプチドリンカーがCARの細胞内ドメイン及び膜透過性ドメインを連結することが可能なため、前記のリンカーは本発明のCARに含まれても、細胞外に位置する抗体に抗原が結合したときの細胞内ドメインを介してT細胞活性化を誘導できるリンカーなら、特にその長さに制限は無く、その例で、(G4S)3リンカー、即ち、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号17)などを使用することができる。
また、本発明は、前記のCAR(chimeric antigen receptor)タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。前記ポリヌクレオチドは、本発明の抗体又はその機能的断片を含むCARタンパク質を暗号化する限りこの塩基の組合せに特に制限は無く、当業界に公知されたポリヌクレオチド合成技術により製作できる。また、前記ベクターは、CARタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドを細胞内に伝達することに用いられる物質を意味することで、組換えベクターに関して、前述のことを参照する。
また、本発明は、前記CARタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターに形質転換された細胞を提供する。即ち、前記本発明が抗体又はその機能的断片を含むCARタンパク質が発現するよう変形された細胞(CARー発現細胞)を提供する。
前記細胞は、その種類に特に制限は無く、CARを成すドメイン構成の由来に応じて、シグナル伝達に有利な細胞種類を使用することができる。本発明でCARタンパク質が発現するように変形される細胞は望ましくは、免疫細胞であり得る。前記免疫細胞は、当業界で身体の免疫機能に関与するものと知られている細胞であれば、その種類に特に限定はないが、例えばT細胞、NK(Natural Killer)細胞、NKT(Natural Killer T)細胞、単核球、マクロファージ又は樹状細胞等を含み、その前駆細胞も含む意味である。最も望ましいのはT細胞でもある。
本発明で用語“T細胞”は、胸腺から由来するリンパ球であって、細胞の免疫に主な役割
をするリンパ球を意味する。前記T細胞はCD4+T細胞(アシスタントT細胞、TH細胞)、CD8+T細胞(細胞毒性T細胞、CTL)、記憶T細胞、調節T細胞(Treg細胞)自然殺害T細胞等あり、本発明でCARが導入されるT細胞は、好ましくはCD8+T細胞である可能性があるが、それに限定されない。
をするリンパ球を意味する。前記T細胞はCD4+T細胞(アシスタントT細胞、TH細胞)、CD8+T細胞(細胞毒性T細胞、CTL)、記憶T細胞、調節T細胞(Treg細胞)自然殺害T細胞等あり、本発明でCARが導入されるT細胞は、好ましくはCD8+T細胞である可能性があるが、それに限定されない。
一例で、抗原特異的CD8+T細胞は癌の免疫治療に最も効果のある免疫細胞として評価されている。しかし、癌の免疫治療に使用する抗原特異的CD8+T細胞を分離するため複雑な過程と長い期間が必要である。それに、抗原特異的CD8+T細胞を早い時間内に大量生産するための方法の1つとして、キメリック抗原受容体(chimeric antigen receptor, CAR)-変形されたT細胞が考案された(Porter DL et al.,NEngl JMed.2011;365:725-33.)。これに限定されないが、一般的一例として、CARは、特定抗原を認識する抗体のscFvをT細胞活性化をもたらすシグナル伝達ドメイン、望ましくは共同刺激分子及びCD3ζのシグナル伝達ドメインと結合した形のタンパク質で、CARを構成する抗体部分が、特定の抗原を認識した場合には、強力なT細胞増殖シグナル伝達を誘導し、CD8+T細胞を選択的に増殖させる原理を有している。こうして増殖された細胞は癌の免疫治療作用に寄与する。
このように免疫細胞の治療剤として、前記本発明のCARが発現するように変形された免疫細胞は、正常細胞に比べ癌細胞に特異的に露出されたクローディン3(特に、ECL-2領域)を特異的に認知して結合し、それに伴う免疫細胞活性化により癌細胞治療効果を有することができることを示す。従来は血液癌中心のCAR-変形免疫細胞治療剤技術が多数を占め、また従来のCAR基準の正常細胞にもターゲットされる可能性が高いことを考慮すると、本発明は、正常細胞に比べ固形癌のみを特異的にターゲットできて、副作用が少なく(特に、正常細胞に対する副作用)、固形癌に対する優れた治療効果を有することができる。したがって本発明は、前記本発明のCAR-発現細胞を有効成分として含む癌の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することができる。
さらに、本発明者等は、前述した抗体のように、クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の前述した薬物伝達の使用、ADC、DAR及びCAR-発現細胞(特に、免疫細胞)技術への適用を提供する。それは前述した内容を借用して理解される。
本発明は、クローディン3検出用製剤、癌診断用製剤、癌映像化用製剤、癌細胞特異的薬物伝達用製剤を製造するための前記の抗体又はその機能的断片の使用を提供する。
本発明は、前記の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含むクローディン3の特異的検出方法、癌診断方法、癌映像化方法、癌細胞特異的薬物伝達方法を提供する。
本発明は、癌の予防及び治療用製剤を製造するための前記抗体の使用又は前記抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体の使用を提供する。
本発明は、前記抗体を有効成分として含む組成物又は前記抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供する。
本発明は、細胞内薬物伝達用製剤を製造するためのクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の使用を提供する。
本発明は、細胞内薬物伝達用製剤を製造するためのクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物を有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む細胞内薬物伝達方法を提供する。
本発明は、癌の予防及び治療用製剤を製造するためのクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体の使用を提供する。
本発明はクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的に結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を提供する。
本発明の前記の“有効量”とは、個体に投与した場合、癌の改善、治療、予防、検出、診断又は癌の抑制効果を示す量を言い、前記“個体”とは動物、望ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物の可能性があり、動物で由来した細胞、組織、器官の可能性がある。前記個体は、前記の効果が必要な患者(patient)の可能性もある。
本発明の前記“治療”は、癌又は癌の症状を改善することを包括的に指し、それはこのような疾患を治癒したり、実質に予防したり、又は状態を改善させることを含むこともあり、癌から始まった一つの症状又は殆どの症状を緩和させたり、治癒したり予防することを含むが、それに制限されるのではない。
本発明の用語“~を含む(comprising)”とは、“含有する”又は“特徴とする”と同じく使われ、組成物又は方法において、言及されない追加的な成分要素又は方法段階等を排除しない。用語“~で構成される(consisting of)”とは他に記載されてない追加的要素、段階又は成分等を除外することを意味する。用語“必須的に構成される(essentially consisting of)”とは、組成物又は方法の範囲において、記載された成分要素又は段階と共に、その基本的特性に実質的に影響を及ぼさない成分要素又は段階等を含むことを意味する。
クローディン3のECL-2に特異的に結合する抗体及びその機能的断片は、他の癌抗原又はクローディン3のECL-1を標的にする従来の抗体より癌細胞検出、診断、映像化、がん治療への適用(ADC及びCAR-発現細胞(特に、免疫細胞)への適用)などにおいて価値が大きい。時にこのような具体的一例として、本発明で提供する特有のCDR配列を含む抗体は、自ら抗癌能力を有するだけではなく、他のクローディンファミリーと交差反応性の無き、優れた癌細胞標的能力を示し、従来公知のクローディン3抗体と比較して非常に優れた結合力(親和度)を示し、細胞内在化(internalization)などの特性を有して前記使用への適用において著しい効果を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
但し、後記実施例は、本発明を例示するのみ、本発明の内容が後記実施例に限定するものではない。
但し、後記実施例は、本発明を例示するのみ、本発明の内容が後記実施例に限定するものではない。
実施例1:クローディン3(CLDN3)に特異的に結合するScFvスクリーニング。
1-1.抗原
抗原としてクローディン3はスクリーニングの過程で、それぞれクローディン3発現細胞株とクローディン3リポパーティクル(lipoparticle)の形で提供された。クローディン3(NCBI reference number_O15551(配列番号1参照))の発現細胞株を作るためにCHO-K1細胞株を用いた。クローディン3発現ベクターを製作するためにpcDNA3.1(invitrogen)に制限酵素HindIII、BamH1を用いてクローディン3遺伝子を挿入した。製作したクローディン3発現ベクターをトランスフェクション(transfection)の後、400μg/mlのジェネティシン(geneticin、g418)を処理して形質転換体を選別した。前記クローディン3を表面に露出しているリポパーティクル(以下、クローディン3リポパーティクルに称する)は、インテグラルモレキュラ(Integralmolecular、Cat.No. RR-0733A)から購入して使用した。
1-1.抗原
抗原としてクローディン3はスクリーニングの過程で、それぞれクローディン3発現細胞株とクローディン3リポパーティクル(lipoparticle)の形で提供された。クローディン3(NCBI reference number_O15551(配列番号1参照))の発現細胞株を作るためにCHO-K1細胞株を用いた。クローディン3発現ベクターを製作するためにpcDNA3.1(invitrogen)に制限酵素HindIII、BamH1を用いてクローディン3遺伝子を挿入した。製作したクローディン3発現ベクターをトランスフェクション(transfection)の後、400μg/mlのジェネティシン(geneticin、g418)を処理して形質転換体を選別した。前記クローディン3を表面に露出しているリポパーティクル(以下、クローディン3リポパーティクルに称する)は、インテグラルモレキュラ(Integralmolecular、Cat.No. RR-0733A)から購入して使用した。
1-2.scFv phage選別
クローディン3に特異的に結合する抗体をスクリーニングするために、ファージディスプ
レイ法(phage library display)を用いた。ライブラリは、合成したヒトscFvライブラリを使用しており、ライブラリの具体的な情報は、A Novel Human scFv Library with Non-Combinatorial Synthetic CDR Diversity(Bai X. et al.,PLoS ONE.,10(10):e0141045(2015))に示される。scFvライブラリで発現するscFvは、HA tagをタギング(tagging)してanti-HA FITC抗体(Genscript、A01621)によって検出することができるようにした。前記scFvライブラリを使用して、次のようにバイオパニング(Biopanning)を行った。
クローディン3に特異的に結合する抗体をスクリーニングするために、ファージディスプ
レイ法(phage library display)を用いた。ライブラリは、合成したヒトscFvライブラリを使用しており、ライブラリの具体的な情報は、A Novel Human scFv Library with Non-Combinatorial Synthetic CDR Diversity(Bai X. et al.,PLoS ONE.,10(10):e0141045(2015))に示される。scFvライブラリで発現するscFvは、HA tagをタギング(tagging)してanti-HA FITC抗体(Genscript、A01621)によって検出することができるようにした。前記scFvライブラリを使用して、次のようにバイオパニング(Biopanning)を行った。
先ず、前記実施例1-1から製造したクローディン3発現CHO-K1細胞株(以下、CHO-CLDN3と称する)を利用してパイオパニングを実施した。scFvライブラリストックを3%FBS/PBSで常温でブロッキング(blocking)を進行した。Trypsinを利用しそれぞれ1×107個ずつ、CHO-CLDN3細胞とCHO-K1細胞(negative cell line)を用意する。CHO-K1細胞(negative cell line)を前記ブロッキングされているライブラリのストックと混合して、室温で1時間ディプリーション(depletion)を進行する。ディプリーションが終わった後、遠心分離して得た上澄み液を抗原であるCHO-CLDN3細胞と混合して、室温で1時間反応させる。遠心分離して得られた細胞ペレットを3%FBS/PBSで洗浄した後、特異的に結合したscFv-ファージのみ溶出されるように、100mM TEA(triethylamine)で、室温で5分間反応させ、pH8.5 Trisで中和反応を経てscFv-抗原コンジュゲート(conjugate)の形で準備した。用意されたscFv-抗原コンジュゲート(conjugate)をE.coli TG1細胞に添加して感染させた後、LB/アンピシリン(ampicillin)/グルコース(glucose)アガ培地で37℃で一晩培養した。前記E.coli TG1細胞をSB /アンピシリン培地に移動OD600値が0.5になるまで培養した後、1×1011~1×1012のヘルパーファージ(helper phage)を添加し、再度1時間、37℃で培養した後、カナマイシン(kanamycin)を添加して再度一晩培養した。前記一晩培養した培養液を遠心分離し、上澄み液をPEG溶液と4℃で反応させた後、再び遠心分離してペレットを分離した。ペレットをPBSに溶かした後、それを遠心分離して得た上澄み液をscFvライブラリ溶液に確保した。このような過程を4回繰り返してクローディン3の抗原と特異的結合をするscFv候補群を確保した。
2番目の方法としてリポパーティクルを利用してバイオパニングを進行させた。
scFvライブラリストックをリポパーティクルnull(クローディン3を含まないリポパーティクル)と混合し、4%脱脂乳(skim milk)で室温で1時間ブロッキング(blocking)とディプリーション(depletion)を同時に行った。免疫チューブ(immunotube)にクローディン3リポパーティクルを含むPBS
1mlを入れて、4℃で16時間反応させて、チューブの内側表面にコーティングした。抗原溶液に沿って1回洗浄してコーティングされていない抗原を除去した。前記免疫チューブにコーティングしておいた抗原(クローディン3リポパーティクル)を4%スキムミルク(skim milk)で室温で1時間ブロッキングを行った。ブロッキングの後、スキムミルクを除去し、scFvライブラリストックと混合して、室温で1時間反応させた。PBSで洗浄した後、特異的に結合したscFv-ファージのみ溶出されるように、100mM TEAに、室温で5分間反応させpH 8.5 Trisで中和反応を経てscFv-抗原コンジュゲート(conjugate)の形で準備した。用意されたscFv-抗原コンジュゲート(conjugate)をE.coli TG1細胞に添加して感染させた後、LB/アンピシリン(ampicillin)/グルコース(glucose)アガ培地で37℃で一晩培養した。前記E.coli TG1細胞をSB/アン
ピシリン培地に移動OD600値が0.5になるまで培養した後、1×1011~1×1012のヘルパーファージ(helper phage)を添加し、再度1時間、37℃で培養した後、カナマイシン(kanamycin)を添加して再度一晩培養した。前記一晩培養した培養液を遠心分離し、上澄み液をPEG溶液と4℃で反応させた後、再び遠心分離してペレットを分離した。ペレットをPBSに溶かした後、それを遠心分離して上澄み液をscFvライブラリ溶液に確保した。このような過程を4回繰り返してクローディン3の抗原と特異的結合をするscFv候補群を確保した。
scFvライブラリストックをリポパーティクルnull(クローディン3を含まないリポパーティクル)と混合し、4%脱脂乳(skim milk)で室温で1時間ブロッキング(blocking)とディプリーション(depletion)を同時に行った。免疫チューブ(immunotube)にクローディン3リポパーティクルを含むPBS
1mlを入れて、4℃で16時間反応させて、チューブの内側表面にコーティングした。抗原溶液に沿って1回洗浄してコーティングされていない抗原を除去した。前記免疫チューブにコーティングしておいた抗原(クローディン3リポパーティクル)を4%スキムミルク(skim milk)で室温で1時間ブロッキングを行った。ブロッキングの後、スキムミルクを除去し、scFvライブラリストックと混合して、室温で1時間反応させた。PBSで洗浄した後、特異的に結合したscFv-ファージのみ溶出されるように、100mM TEAに、室温で5分間反応させpH 8.5 Trisで中和反応を経てscFv-抗原コンジュゲート(conjugate)の形で準備した。用意されたscFv-抗原コンジュゲート(conjugate)をE.coli TG1細胞に添加して感染させた後、LB/アンピシリン(ampicillin)/グルコース(glucose)アガ培地で37℃で一晩培養した。前記E.coli TG1細胞をSB/アン
ピシリン培地に移動OD600値が0.5になるまで培養した後、1×1011~1×1012のヘルパーファージ(helper phage)を添加し、再度1時間、37℃で培養した後、カナマイシン(kanamycin)を添加して再度一晩培養した。前記一晩培養した培養液を遠心分離し、上澄み液をPEG溶液と4℃で反応させた後、再び遠心分離してペレットを分離した。ペレットをPBSに溶かした後、それを遠心分離して上澄み液をscFvライブラリ溶液に確保した。このような過程を4回繰り返してクローディン3の抗原と特異的結合をするscFv候補群を確保した。
1-3.クローディン3(CLDN3)に特異的に結合するscFv抗体選別
実施例1-2で確保されたscFv候補群から結合力に優れたscFvを選別するために、クローディン3発現細胞株に対してELISA分析を行った。クローディン3発現細胞株(以下、L-クローディン3細胞と称する)は、L cellに前記実施例1-1で作製したクローディン3発現ベクターをトランスフェクションした後、600μg/mlのジェネティシン(geneticin,g418)を処理して形質転換体を選別して使用した。前記実施例1-2の各段階のパニングが終わったライブラリストックそれぞれ(クローディン3発現細胞株またはクローディン3リポパーティクルを用いたスクリーニング結果に別に利用)をSB/アンピシリン(ampicillin)/グルコース(glucose)アガ培地で一晩培養した後、それぞれの単一コロニー(single colony)をSB/アンピシリン培地200μlに接種して37℃で3時間培養した後、IPTG濃度が1mMになるように混ぜてから、再び30℃で一晩培養した。培養が終わったら、培養液を遠心分離して細胞のみを分離した後、TESバッファーを用いて細胞を溶解させてscFvを確保した。確保したscFvをL-クローディン3細胞が1×105ずつ分注したプレートに処理して、室温で1時間反応させた後、二次抗体(anti-HA
HRP,santacruz,Cat.No.sc-7392)を添加して40分間反応させた。二次抗体反応が完了したら、TMBを添加して発色反応をさせてELISAリーダー(450nm)を用いて分析した。ELISA分析値を相対的に比較して、上位23個の優れたscFvを1次的に選別した(1C4,1F11,2A12,2B4,2E5,2E12,2F8,3A2,3H8,4A2,4A3,4B7,4B10,4D7,3D2,3D7,3F11,4A8,4A9,4A12,4E4,4G3,4G7)。
実施例1-2で確保されたscFv候補群から結合力に優れたscFvを選別するために、クローディン3発現細胞株に対してELISA分析を行った。クローディン3発現細胞株(以下、L-クローディン3細胞と称する)は、L cellに前記実施例1-1で作製したクローディン3発現ベクターをトランスフェクションした後、600μg/mlのジェネティシン(geneticin,g418)を処理して形質転換体を選別して使用した。前記実施例1-2の各段階のパニングが終わったライブラリストックそれぞれ(クローディン3発現細胞株またはクローディン3リポパーティクルを用いたスクリーニング結果に別に利用)をSB/アンピシリン(ampicillin)/グルコース(glucose)アガ培地で一晩培養した後、それぞれの単一コロニー(single colony)をSB/アンピシリン培地200μlに接種して37℃で3時間培養した後、IPTG濃度が1mMになるように混ぜてから、再び30℃で一晩培養した。培養が終わったら、培養液を遠心分離して細胞のみを分離した後、TESバッファーを用いて細胞を溶解させてscFvを確保した。確保したscFvをL-クローディン3細胞が1×105ずつ分注したプレートに処理して、室温で1時間反応させた後、二次抗体(anti-HA
HRP,santacruz,Cat.No.sc-7392)を添加して40分間反応させた。二次抗体反応が完了したら、TMBを添加して発色反応をさせてELISAリーダー(450nm)を用いて分析した。ELISA分析値を相対的に比較して、上位23個の優れたscFvを1次的に選別した(1C4,1F11,2A12,2B4,2E5,2E12,2F8,3A2,3H8,4A2,4A3,4B7,4B10,4D7,3D2,3D7,3F11,4A8,4A9,4A12,4E4,4G3,4G7)。
前記ELISAを通って選別したscFv候補に対し、フローサイトメトリー(Flow
Cytometry)を用いてCHO-CLDN3細胞との結合するかどうかを確認した。対照群に本来のCHO-K1細胞を用いた。継代培養中の細胞をtrypsinを利用して、単一の細胞単位で分離して、3%FBS/PBSで準備した。前記選別されたscFv候補をSB/アンピシリン培地5mlに接種して37℃で3時間培養した後、IPTG濃度が1mMになるように混ぜた後、再び30℃で一晩培養した。培養が完了したら、培養液を遠心分離して細胞のみを分離した後、TESバッファーを用いて細胞を溶解させてscFvを確保した。CHO-K1細胞(negative cell line、対照群)とCHO-CLDN3細胞(実験群)を、各グループ毎にそれぞれ2×105細胞ずつ入るように3%FBS/PBSで準備した後、前記確保されたscFvを処理して、室温で1時間反応した。反応が完了すると、3%FBS/PBSで洗浄した後、anti-HA taq FITC抗体を1:100に希釈(3%FBS/PBS 100μlで希釈)して100ulを処理し、室温で1時間反応した。反応完了後洗浄し、BD FACS Caliburで分析した。この時、商業的に販売されているanti-CLDN3(FAB4620F、R&D systems)抗体を比較群として使用した。対照群(図1参照)に比べて実験群(図2参照)のみのピークの移動が起こるscFv候補群を選別した(2B4,4A2,4B7,4B10,4D7,4A8,4A9,4A12,4E4,4G3,4G7)。
Cytometry)を用いてCHO-CLDN3細胞との結合するかどうかを確認した。対照群に本来のCHO-K1細胞を用いた。継代培養中の細胞をtrypsinを利用して、単一の細胞単位で分離して、3%FBS/PBSで準備した。前記選別されたscFv候補をSB/アンピシリン培地5mlに接種して37℃で3時間培養した後、IPTG濃度が1mMになるように混ぜた後、再び30℃で一晩培養した。培養が完了したら、培養液を遠心分離して細胞のみを分離した後、TESバッファーを用いて細胞を溶解させてscFvを確保した。CHO-K1細胞(negative cell line、対照群)とCHO-CLDN3細胞(実験群)を、各グループ毎にそれぞれ2×105細胞ずつ入るように3%FBS/PBSで準備した後、前記確保されたscFvを処理して、室温で1時間反応した。反応が完了すると、3%FBS/PBSで洗浄した後、anti-HA taq FITC抗体を1:100に希釈(3%FBS/PBS 100μlで希釈)して100ulを処理し、室温で1時間反応した。反応完了後洗浄し、BD FACS Caliburで分析した。この時、商業的に販売されているanti-CLDN3(FAB4620F、R&D systems)抗体を比較群として使用した。対照群(図1参照)に比べて実験群(図2参照)のみのピークの移動が起こるscFv候補群を選別した(2B4,4A2,4B7,4B10,4D7,4A8,4A9,4A12,4E4,4G3,4G7)。
次に、クローディン3リポパーティクルを用いた最終的なバイオパニング結果(データ未
図示)と、前期の実験段階で選別されたscFv候補群の結果を比較した。選別されたscFvについてシーケンス(sequencing)を実行し、クローディン3リポパーティクルとクローディン3発現細胞株の(CHO―CLDN3細胞株及び/又はL-クローディン3細胞株)の実験では、2つの2B4と4G3クローンを確保した。2B4、4G3 scFvのアミノ酸配列を分析した結果は、後記の表1の通りである。
図示)と、前期の実験段階で選別されたscFv候補群の結果を比較した。選別されたscFvについてシーケンス(sequencing)を実行し、クローディン3リポパーティクルとクローディン3発現細胞株の(CHO―CLDN3細胞株及び/又はL-クローディン3細胞株)の実験では、2つの2B4と4G3クローンを確保した。2B4、4G3 scFvのアミノ酸配列を分析した結果は、後記の表1の通りである。
実施例2:4G3 scFv抗体のIgGへの転換及び発現
2-1.全体IgG発現ベクター製作
先に選別された4G3 scFvをより通常的に使用される抗体のIgGの形に変換させた。前記scFvのCDR部位を基盤に全体IgG形を発現できる発現ベクターを製作した。先ず、scFvの軽鎖可変領域(light chain variable region)と重鎖可変領域(heavy chain variable region)をそれぞれPCRを介して収得し、そのとき4G3においては後記の表2に図示されたプライマーを使用した。前記軽鎖可変領域配列は軽鎖不変領域(light chain
constant region)配列が挿入されている発現ベクターのpOptiVec(Invitrogen)にクローニングし、前期重鎖可変領域配列は重鎖不変領域(heavy chain constant region)が挿入されている発現ベクターのpcDNA 3.3(Invitrogen)にそれぞれクローニングした。ベクターからクローニングしたscFvの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と一緒に軽鎖及び重鎖不変領域が発現され、結果には前記scFvのCDR領域を含む全体IgG抗体が作られる。
先に選別された4G3 scFvをより通常的に使用される抗体のIgGの形に変換させた。前記scFvのCDR部位を基盤に全体IgG形を発現できる発現ベクターを製作した。先ず、scFvの軽鎖可変領域(light chain variable region)と重鎖可変領域(heavy chain variable region)をそれぞれPCRを介して収得し、そのとき4G3においては後記の表2に図示されたプライマーを使用した。前記軽鎖可変領域配列は軽鎖不変領域(light chain
constant region)配列が挿入されている発現ベクターのpOptiVec(Invitrogen)にクローニングし、前期重鎖可変領域配列は重鎖不変領域(heavy chain constant region)が挿入されている発現ベクターのpcDNA 3.3(Invitrogen)にそれぞれクローニングした。ベクターからクローニングしたscFvの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と一緒に軽鎖及び重鎖不変領域が発現され、結果には前記scFvのCDR領域を含む全体IgG抗体が作られる。
2-2.全体IgG抗体発現CHO-S細胞株製作(pool)
CHO-S細胞(Life Technologies Inc.)を利用し、それぞれ4G3 1gG抗体発現細胞株を製作した。前記実施例2-1から収得した重鎖及び軽鎖をコーディングする遺伝子配列に対してCricetulus griseus種でコドン最適化(codon optimization)し、それら配列をFreedom(R)pCHO1.0Vectorでクローニングした後、トランスフェクション試薬(FreeStyleTMMAX Reagent;Life Technologies Inc.)でCHO-S細胞に形質導入した。形質導入後の抗体発現細胞株を選別するために、ピューロマイシン(puromycin)とMTX(methotrexate)を利用して、2段階を経て選別した。具体的には、1次選別では、puromycin 10ug/mlの、MTX 100nMまたはpuromycin 20ug/mlの、MTX 200nMで進行し、細胞生存率が基準内に入ってくると、2次処理を行った。2次選別では、puromycin 30ug/mlの、MTX 500nMまたはpuromycin 50ug/mlの、MTX1000nMで進行して最終的な細胞生存率の基準に入ってきたとき、2次選別を終了してSFB(Simple Fed Batch)を介して発現量が高い群を選択した。
CHO-S細胞(Life Technologies Inc.)を利用し、それぞれ4G3 1gG抗体発現細胞株を製作した。前記実施例2-1から収得した重鎖及び軽鎖をコーディングする遺伝子配列に対してCricetulus griseus種でコドン最適化(codon optimization)し、それら配列をFreedom(R)pCHO1.0Vectorでクローニングした後、トランスフェクション試薬(FreeStyleTMMAX Reagent;Life Technologies Inc.)でCHO-S細胞に形質導入した。形質導入後の抗体発現細胞株を選別するために、ピューロマイシン(puromycin)とMTX(methotrexate)を利用して、2段階を経て選別した。具体的には、1次選別では、puromycin 10ug/mlの、MTX 100nMまたはpuromycin 20ug/mlの、MTX 200nMで進行し、細胞生存率が基準内に入ってくると、2次処理を行った。2次選別では、puromycin 30ug/mlの、MTX 500nMまたはpuromycin 50ug/mlの、MTX1000nMで進行して最終的な細胞生存率の基準に入ってきたとき、2次選別を終了してSFB(Simple Fed Batch)を介して発現量が高い群を選択した。
2-3.全体IgG抗体生産及び精製
前記2-2から製造されたそれぞれの抗体生産細胞株をCD FortiCHOTM培地からCO2 8%,37℃,100~120rpm条件で、glucoseを3日、5日、7日目にそれぞれ4g/L、4g/L、6g/Lずつ入れながら14日目に培養した。培養完了後、培養液をultra-centrifuge 6000gで遠心分離し、この上澄み液を0.2um filterを用いてフィルタした。精製のためにProtein Aレジン(Mabselect SuRe、11-0026-01 AD、GE Healthcare Life Sciences)を使用して、平衡バッファー(20mM Sodium Phosphate、150mM NaCl、pH7.2)、洗浄バッファー(35mM Sodium Phosphate、500mM NaCl、pH7.2)、溶出バッファー(0.1M Sodium Citrate、pH3.6)を使用した。AKTATMavantを利用して、平衡バッファーは、カラム体積の2倍、洗浄バッファはカラム体積の5倍、溶出バッファーはカラム体積の5倍にして精製し、溶出時中和反応のためにpH8.0 Tris-HCl溶液を1/5ずつ入れた。ろ過膜(CelluSep、1430-45)を使用して、PBSで2回バッファの切り替え後、遠心分離フィルター(Amicon Ultra-15、UFC905024、Merck)で濃縮した。
前記2-2から製造されたそれぞれの抗体生産細胞株をCD FortiCHOTM培地からCO2 8%,37℃,100~120rpm条件で、glucoseを3日、5日、7日目にそれぞれ4g/L、4g/L、6g/Lずつ入れながら14日目に培養した。培養完了後、培養液をultra-centrifuge 6000gで遠心分離し、この上澄み液を0.2um filterを用いてフィルタした。精製のためにProtein Aレジン(Mabselect SuRe、11-0026-01 AD、GE Healthcare Life Sciences)を使用して、平衡バッファー(20mM Sodium Phosphate、150mM NaCl、pH7.2)、洗浄バッファー(35mM Sodium Phosphate、500mM NaCl、pH7.2)、溶出バッファー(0.1M Sodium Citrate、pH3.6)を使用した。AKTATMavantを利用して、平衡バッファーは、カラム体積の2倍、洗浄バッファはカラム体積の5倍、溶出バッファーはカラム体積の5倍にして精製し、溶出時中和反応のためにpH8.0 Tris-HCl溶液を1/5ずつ入れた。ろ過膜(CelluSep、1430-45)を使用して、PBSで2回バッファの切り替え後、遠心分離フィルター(Amicon Ultra-15、UFC905024、Merck)で濃縮した。
それぞれ還元(reducing)条件および非還元(nonreducing)条件で生産されたIgG抗体タンパク質を通常のSDS-PAGE技法で確認して、各抗体の軽鎖と重鎖が予想される分子量で、すべてが上手く発現されていることを確認した。図3は、4G3 IgG抗体のSDS-PAGE確認結果を表す。
実施例3:本発明抗体のクローディン3に対する結合特異性(binding specificity)及び結合力評価
3-1.様々なクローディンに対するCLDN/HEK293細胞株製作
前記実施例2-3から製作された抗体の抗原特異性を確認するために、ヒトCLDN3と系統分析的に近く位置したクローディン、特にヒトCLDN4(NCBI accession number : O14493),CLDN5(O00501),CLDN6(P56747),CLDN8(P56748),CLDN9(O95484),CLDN17(P56750)に対する結合有無を比較評価した。(図4a又は図4b参照)。又、前期のクローディン種類よりは系統分析的に距離があるが、典型的なクローディンのCLDN1(O95832)が本事件に比較群に使用された。又、開発された抗体がマウスCLDN3(Q9Z0G9)にも結合するか調べてみた(4bを参照)。前述したクローディンをコーディングする遺伝子のそれぞれをpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にクローニングしている。このように製作された、それぞれのクローディン発現ベクターを、Fugene HD(E231A、Promega)トランスクション試薬を用いてHEK293(KCLB)に形質導入した後、G418で耐性細胞株を選別した。このように製作されたヒトクローディンを持続発現する細胞株(hCLDN/HEK293)らに対し、各クローディンがよく発現されているかどうかの確認は、商業的に販売されている
anti-CLDN1(FAB4618G、R&D systems)、anti-CLDN3(FAB4620F、R&D systems)、
anti-CLDN4(FAB4219F、R&D systems)、anti-CLDN5(ab131259、Abcam)、
anti-CLDN6(ABIN1720916、Antibodies-online)、anti-CLDN8(MAB5275、R&D systems)、anti-CLDN9(ab187116、Abcam)、anti-CLDN17(MAB4619、R&D systems)抗体を用いて確認した。
3-1.様々なクローディンに対するCLDN/HEK293細胞株製作
前記実施例2-3から製作された抗体の抗原特異性を確認するために、ヒトCLDN3と系統分析的に近く位置したクローディン、特にヒトCLDN4(NCBI accession number : O14493),CLDN5(O00501),CLDN6(P56747),CLDN8(P56748),CLDN9(O95484),CLDN17(P56750)に対する結合有無を比較評価した。(図4a又は図4b参照)。又、前期のクローディン種類よりは系統分析的に距離があるが、典型的なクローディンのCLDN1(O95832)が本事件に比較群に使用された。又、開発された抗体がマウスCLDN3(Q9Z0G9)にも結合するか調べてみた(4bを参照)。前述したクローディンをコーディングする遺伝子のそれぞれをpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にクローニングしている。このように製作された、それぞれのクローディン発現ベクターを、Fugene HD(E231A、Promega)トランスクション試薬を用いてHEK293(KCLB)に形質導入した後、G418で耐性細胞株を選別した。このように製作されたヒトクローディンを持続発現する細胞株(hCLDN/HEK293)らに対し、各クローディンがよく発現されているかどうかの確認は、商業的に販売されている
anti-CLDN1(FAB4618G、R&D systems)、anti-CLDN3(FAB4620F、R&D systems)、
anti-CLDN4(FAB4219F、R&D systems)、anti-CLDN5(ab131259、Abcam)、
anti-CLDN6(ABIN1720916、Antibodies-online)、anti-CLDN8(MAB5275、R&D systems)、anti-CLDN9(ab187116、Abcam)、anti-CLDN17(MAB4619、R&D systems)抗体を用いて確認した。
3-2.CLDN/HEK293細胞株に対する本発明の抗体の交差反応性の評価
実施例3-1で製作された複数のクローディンのhCLDNs/HEK293細胞株とmCLDN3/HEK293者に対し、前記実施例2-3で製造された抗体の交差反応性を確認した。陰性対照群には、本来のHEK293細胞を使用した。まず、細胞分離バッファ(cell dissociation buffer、Gibco、13151-014)を用いて、単一の細胞に分離した後、2.5×105個ずつ分注(seeding)し、ここで、それぞれの抗体5ug/mlを入れ、1時間の間に氷の上で反応させた。反応後、1%BSA/PBSで洗浄し、二次抗体であるgoat anti-human IgG-FITC(109-095-098、Jackson Immunoresearch)を1:100で処理して、1時間の間氷の上で反応させた。反応後、1%BSA/PBSで洗浄し、フローサイトメトリーとしてBD FACS Caliburを使用して分析した。
実施例3-1で製作された複数のクローディンのhCLDNs/HEK293細胞株とmCLDN3/HEK293者に対し、前記実施例2-3で製造された抗体の交差反応性を確認した。陰性対照群には、本来のHEK293細胞を使用した。まず、細胞分離バッファ(cell dissociation buffer、Gibco、13151-014)を用いて、単一の細胞に分離した後、2.5×105個ずつ分注(seeding)し、ここで、それぞれの抗体5ug/mlを入れ、1時間の間に氷の上で反応させた。反応後、1%BSA/PBSで洗浄し、二次抗体であるgoat anti-human IgG-FITC(109-095-098、Jackson Immunoresearch)を1:100で処理して、1時間の間氷の上で反応させた。反応後、1%BSA/PBSで洗浄し、フローサイトメトリーとしてBD FACS Caliburを使用して分析した。
図5a及び図5bは、前記フローサイトメトリー分析の結果として、4G3抗体のクローディン3の結合特異性を比較的に示す。CLDN3と系統解析学的に近いCLDN4、CLDN5、CLDN6、CLDN8、CLDN9とCLDN17を利用したどの実験群でもピークの移動が見られなかった。マウスCLDN3を用いた実験の結果を図5cに示し、本発明の抗体は、マウス、ヒトCLDN3と相同性が高いマウスCLDN3とも結合す
ることを確認した。
ることを確認した。
それで本発明の各抗体は、ヒトCLDN3およびマウスCLDN3以外のクローディンファミリとは結合しないことを確認した。すなわち、本発明の各抗体は、相同性が高い他のクローディン種類とは交差反応せず、CLDN3のみ特異的に結合する。
3-3.in vitro癌細胞の検出能力を確認_フローサイトメトリー分析
前記実施例2-3で製造された抗体の癌細胞に対する結合力を確認した。卵巣癌としてクローディン3を過剰発現する細胞株であるOVCAR-3(ATCC)とCaov-3(ATCC)と、クローディン3発現が極めて低い細胞株であるTOV-112D(ATCC)、ここCLDN3を過剰発現するように形質転換させたhCLDN3/TOV-112D細胞を用いた。hCLDN3/TOV-112D細胞の作製は、前記実施例3-1に記載されたのと同じ方法で行われた。前記細胞に対する抗体処理とフローサイトメトリー分析は、実施例3-2と同様の方法で行われた。
前記実施例2-3で製造された抗体の癌細胞に対する結合力を確認した。卵巣癌としてクローディン3を過剰発現する細胞株であるOVCAR-3(ATCC)とCaov-3(ATCC)と、クローディン3発現が極めて低い細胞株であるTOV-112D(ATCC)、ここCLDN3を過剰発現するように形質転換させたhCLDN3/TOV-112D細胞を用いた。hCLDN3/TOV-112D細胞の作製は、前記実施例3-1に記載されたのと同じ方法で行われた。前記細胞に対する抗体処理とフローサイトメトリー分析は、実施例3-2と同様の方法で行われた。
実験の結果、クローディン3発現細胞であるOVCAR-3、Caov-3、hCLDN3/TOV-112Dは、ピークの移動が確認され、陰性細胞株であるTOV-112Dは、ピークの移動が見られなかった。代表的にも図6は、前記癌細胞に対する4G3抗体の結合特異性を比較的に示す。
3-4.クローディン3特異的結合再確認_免疫沈降(Immumnoprecipitation)
免疫沈降法により、本発明の抗体が前記癌細胞でクローディン3に結合することを再確認した。抗体陰性対照群(control IgG)としては、商業的に売るヒト全体抗体(009-000-003、Jackson Immunoresearch)を使用した。OVCAR-3(ATCC)、Caov-3(ATCC)、TOV-112D(ATCC)、hCLDN3/TOV-112Dの各細胞をprotease inhibitor(11697498001、Roche)が添加されたPBSで解放した後、超音波破砕機で2秒on/5秒offを10回行った後、15000rpm、4℃、15分間遠心分離して上澄み液を取った。BCA定量法では、各細胞溶解物(上澄み液)のタンパク質濃度を測定した後、1mgずつタンパク質をとり、それぞれの抗体1ugを入れて4℃で1時間回転しながら反応させた。Protein A bead(11719408001、Roche)をPBSで平衡化させて、5%BSA/PBSで前記ビーズ(bead)を4℃で1時間回転しながらブロッキングした。前記抗体反応が終了したサンプルにビーズを50ul入れて、再び4℃で1時間の間に回転しながら反応させた。抗体とビーズの反応が終わると、PBSで3回洗浄した後、2X SDS loadingバッファ30ulを入れて、100℃で10分間煮沸、12000rpmで3分間遠心分離して異議上澄み液を15%SDS gel電気泳動した。通常の方法でウエスタンブロッティング(western blotting)を行っており、この時、一次抗体としては、anti-CLDN3(341700、Invitrogen)を使用した。
免疫沈降法により、本発明の抗体が前記癌細胞でクローディン3に結合することを再確認した。抗体陰性対照群(control IgG)としては、商業的に売るヒト全体抗体(009-000-003、Jackson Immunoresearch)を使用した。OVCAR-3(ATCC)、Caov-3(ATCC)、TOV-112D(ATCC)、hCLDN3/TOV-112Dの各細胞をprotease inhibitor(11697498001、Roche)が添加されたPBSで解放した後、超音波破砕機で2秒on/5秒offを10回行った後、15000rpm、4℃、15分間遠心分離して上澄み液を取った。BCA定量法では、各細胞溶解物(上澄み液)のタンパク質濃度を測定した後、1mgずつタンパク質をとり、それぞれの抗体1ugを入れて4℃で1時間回転しながら反応させた。Protein A bead(11719408001、Roche)をPBSで平衡化させて、5%BSA/PBSで前記ビーズ(bead)を4℃で1時間回転しながらブロッキングした。前記抗体反応が終了したサンプルにビーズを50ul入れて、再び4℃で1時間の間に回転しながら反応させた。抗体とビーズの反応が終わると、PBSで3回洗浄した後、2X SDS loadingバッファ30ulを入れて、100℃で10分間煮沸、12000rpmで3分間遠心分離して異議上澄み液を15%SDS gel電気泳動した。通常の方法でウエスタンブロッティング(western blotting)を行っており、この時、一次抗体としては、anti-CLDN3(341700、Invitrogen)を使用した。
分析の結果、control IgG処理群では、バンドが示されず、本発明の抗体は、OVCAR-3、Caov-3およびhCLDN3/TOV-112D細胞を用いた実験群へのみバンドが観察された。図7は、4G3抗体の前記細胞が発現するクローディン3の結合程度を示す。それにより、本発明の各抗体が癌細胞のクローディン3タンパク質に結合することを再確認した。
3-5.クローディン3特異的結合再確認_免疫蛍光(Immunofluorescence)
免疫蛍光法により、本発明の抗体が前記癌細胞でクローディン3を特異的に標的すること
を再確認した。OVCAR-3(ATCC)、Caov-3(ATCC)、TOV-112D(ATCC)、hCLDN3/TOV-112Dの各細胞を4 well cell
culture slideに2×105個ずつ入れて24時間培養した。培養液に対照群の抗体(ChromePure Human IgG、009-000-003、Jackson ImmonoResearch)または本発明の抗体を5ug/ulになるように入れ、4℃で1時間攪拌して反応させた。PBSで洗浄後、4%の細胞をホルムアルデヒドで、室温で15分間固定した。 PBS洗浄後、5%BSA/PBSで、室温で1時間ブロッキングした。PBSで洗浄し、二次抗体としてgoat anti-human IgG-FITC(109-095-098、Jackson Immunoresearch)を1:100になるように入れ、常温で1時間反応した。PBSで洗浄後、核染色のためにHoechst 33342(H3570、Invitrogen)を1:5000になるように入れて、10分間、室温で反応させ、その後、PBSで2回以上洗浄した。FluoromountTMAqueous Mounting Medium(F4680、SIGMA)でマウントした後、カバースライドを伏せてからコンフォーカル顕微鏡(LSM700、Carl Zeiss、Inc.)で蛍光を観察した。
免疫蛍光法により、本発明の抗体が前記癌細胞でクローディン3を特異的に標的すること
を再確認した。OVCAR-3(ATCC)、Caov-3(ATCC)、TOV-112D(ATCC)、hCLDN3/TOV-112Dの各細胞を4 well cell
culture slideに2×105個ずつ入れて24時間培養した。培養液に対照群の抗体(ChromePure Human IgG、009-000-003、Jackson ImmonoResearch)または本発明の抗体を5ug/ulになるように入れ、4℃で1時間攪拌して反応させた。PBSで洗浄後、4%の細胞をホルムアルデヒドで、室温で15分間固定した。 PBS洗浄後、5%BSA/PBSで、室温で1時間ブロッキングした。PBSで洗浄し、二次抗体としてgoat anti-human IgG-FITC(109-095-098、Jackson Immunoresearch)を1:100になるように入れ、常温で1時間反応した。PBSで洗浄後、核染色のためにHoechst 33342(H3570、Invitrogen)を1:5000になるように入れて、10分間、室温で反応させ、その後、PBSで2回以上洗浄した。FluoromountTMAqueous Mounting Medium(F4680、SIGMA)でマウントした後、カバースライドを伏せてからコンフォーカル顕微鏡(LSM700、Carl Zeiss、Inc.)で蛍光を観察した。
分析の結果、対照群の抗体(control IgG)処理群では、すべての細胞株で蛍光が観察されていないのに対し(図8a参照)、本発明の抗体処理群では、CLDN3発現細胞株であるhCLDN3/TOV-112D、OVCAR-3、Caov-3の細胞表面への蛍光の全て観察されたCLDN3発現がないTOV-112D細胞株では、蛍光が観察されなかった。図8bは代表的に4G3抗体の前記実験の結果を示す。
3-6.クローディン3の結合力の比較と結合親和性(binding kinetics)を確認
前記実施例2-3で製造された4G3 IgG抗体について、そのクローディン3の結合力を確認した。CHO-CLDN3細胞を用いてフローサイトメトリー分析を実施し、具体的な実験方法は、前記実施例1-3と同様に行われた。対照群では、本来のCHO-K1細胞を用いており、商業的に販売されているanti-CLDN3(FAB4620F、R&D systems)抗体を比較群として使用した。
前記実施例2-3で製造された4G3 IgG抗体について、そのクローディン3の結合力を確認した。CHO-CLDN3細胞を用いてフローサイトメトリー分析を実施し、具体的な実験方法は、前記実施例1-3と同様に行われた。対照群では、本来のCHO-K1細胞を用いており、商業的に販売されているanti-CLDN3(FAB4620F、R&D systems)抗体を比較群として使用した。
また、クローディン3に対する抗体の結合親和性を確認するためにLigandTracer Green(ridgeview)を使用して測定した。LignadTrcer
Green(ridgeview)は抗原を発現する細胞上でFITCが接合された抗体の抗原に対する結合するかどうかをリアルタイムで測定することができる細胞ベースの測定装置である。開発した抗体にFITC Antibody Labeling Kit(53027、Pierce)を用いてFITCを接合した。一日前blankとして5%ミルク/PBS 500ul、クローディン3発現が極めて低い基準細胞株、CLDN3過剰発現させた細胞株を3×105cells/mlの濃度で500ulを100mm培養皿(172931、Thermo scientific)4象限にコインサイズで入れて5%CO2、37℃で6時間培養後、培地を除去し、PBSで洗浄した後、再び培地10mlを入れて一晩培養した。リファレンス細胞株としてHEK293(KCLB)とTOV-112D(ATCC)を使用し、CLDN3過剰発現細胞株としてhCLDN3/HEK293とhCLDN3/TOV-112Dを使用した。実験当日培地をすべて削除し、3ml培地に交換した後、培養皿を装備に装着して安定化した後FITC接合された抗体を最終濃度で3nM、9nMになるように順次入れ、それぞれ蛍光値が平衡状態に達するまで反応させ最後に3mlの新しい培地に交換した後、解離程度を確認した。蛍光測定時間は15秒、測定遅延時間は4秒、測定間隔は72秒し、3回繰り返し実験してHEK293細胞に比べhCLDN3/HEK293細胞への蛍光値と、TOV-112D細胞比hCLDN3/TOV-112D細胞への蛍光値を一対一二状態適合モデル(o
ne to one two state fitting model)で分析した。結果の値を図9c及び表3に示す。
Green(ridgeview)は抗原を発現する細胞上でFITCが接合された抗体の抗原に対する結合するかどうかをリアルタイムで測定することができる細胞ベースの測定装置である。開発した抗体にFITC Antibody Labeling Kit(53027、Pierce)を用いてFITCを接合した。一日前blankとして5%ミルク/PBS 500ul、クローディン3発現が極めて低い基準細胞株、CLDN3過剰発現させた細胞株を3×105cells/mlの濃度で500ulを100mm培養皿(172931、Thermo scientific)4象限にコインサイズで入れて5%CO2、37℃で6時間培養後、培地を除去し、PBSで洗浄した後、再び培地10mlを入れて一晩培養した。リファレンス細胞株としてHEK293(KCLB)とTOV-112D(ATCC)を使用し、CLDN3過剰発現細胞株としてhCLDN3/HEK293とhCLDN3/TOV-112Dを使用した。実験当日培地をすべて削除し、3ml培地に交換した後、培養皿を装備に装着して安定化した後FITC接合された抗体を最終濃度で3nM、9nMになるように順次入れ、それぞれ蛍光値が平衡状態に達するまで反応させ最後に3mlの新しい培地に交換した後、解離程度を確認した。蛍光測定時間は15秒、測定遅延時間は4秒、測定間隔は72秒し、3回繰り返し実験してHEK293細胞に比べhCLDN3/HEK293細胞への蛍光値と、TOV-112D細胞比hCLDN3/TOV-112D細胞への蛍光値を一対一二状態適合モデル(o
ne to one two state fitting model)で分析した。結果の値を図9c及び表3に示す。
図9aおよび図9bに示したように、4G3 IgG抗体の両方のピークの移動が現れクローディン3に結合したことを確認した。この時、4G3 IgG抗体処理群でピークの移動の差がより大きく現れ、それにより4G3 IgG抗体は、従来の商業的に販売されている抗体よりもクローディン3特異的な結合力がより優れていることを確認された。
また、結合親和性の分析結果図9c及び表3に示すように、4G3のクローディン3発現細胞のkinetic value(KD)は、2つの細胞株で、それぞれ4.03nM(hCLDN3/HEK293)、2.35nM(hCLDN3/TOV-112D)に現れ4G3のクローディン3の高い親和性を確認した。その結果は、本発明の4G3 IgG抗体が従来のanti-claudin3抗体と比べ著しく優れた親和性を保持することを示してものであり、例えば、従来の“Chiara Romani etl al.Oncotarget.2015”のIgGH6抗体よりも親和性が5倍以上の優れたものである。
実施例4:抗原結合部位を確認
細胞で自然に発現されたCLDN3細胞外に表れる領域の中で、具体的に、本発明の抗体が結合する抗原結合部位がどこなのか確認しようとした。そこで、CLDN3の細胞外第一ループ(extracellular 1st loop)と細胞外第二ループ(extracellula 2nd loop)に対応する領域のそれぞれをCLDN1で対応する領域と置換した融合タンパク質を作成確認した。CLDN1のアミノ酸1~104番のCLDN3アミノ酸104~220回を発現する遺伝子(hCLDN1-3)またはCLDN1のアミノ酸105~211番とCLDN3のアミノ酸1~103番を発現する
細胞で自然に発現されたCLDN3細胞外に表れる領域の中で、具体的に、本発明の抗体が結合する抗原結合部位がどこなのか確認しようとした。そこで、CLDN3の細胞外第一ループ(extracellular 1st loop)と細胞外第二ループ(extracellula 2nd loop)に対応する領域のそれぞれをCLDN1で対応する領域と置換した融合タンパク質を作成確認した。CLDN1のアミノ酸1~104番のCLDN3アミノ酸104~220回を発現する遺伝子(hCLDN1-3)またはCLDN1のアミノ酸105~211番とCLDN3のアミノ酸1~103番を発現する
遺伝子(hCLDN3-1)をそれぞれpcDNA 3.1(+)(Invitrogen)にクローニングした。各遺伝子をHEK293(KCLB)に形質導入させた後、G418で耐性細胞株を選別して、hCLDN1-3またはhCLDN3-1の融合タンパク質を持続的に発現する細胞株を作製した。それそれぞれhCLDN1-3/HEK293、hCLDN3-1/HEK293と命名した(図10a参照)。各細胞株から、目的とする融合タンパク質が発現されたがanti-CLDN3(341700,Invitrogen)、anti-CLDN1(sc-137121,Santa Cruz Biotechnology、Inc.)を用いて、通常のウエスタンブロティングの方法で確認した(図10bの下部を参照)。hCLDN1-3/HEK293又はhCLDN3-1/HEK293細胞に対して4G3抗体の処理とフローサイトメトリー分析は、実施例3-2と同様の方法で行われた。
分析結果図10bに示すように、hCLDN1-3/HEK293の実験では、ピークの
移動が見られ、hCLDN3-1/HEK293の実験では、ピークの移動が見られなかった。それにより4G3抗体はhCLDN3の細胞外第二ループ(extracellula 2nd loop)部分に結合することを確認した。
移動が見られ、hCLDN3-1/HEK293の実験では、ピークの移動が見られなかった。それにより4G3抗体はhCLDN3の細胞外第二ループ(extracellula 2nd loop)部分に結合することを確認した。
実施例5:IgG 4G3抗体の細胞内摂取(endocytosis)確認
本発明の抗体の細胞内への内在化(internalization)能力を確認するために、クローディン3過剰発現卵巣癌細胞株であるOVCAR-3(ATCC)とCaov-3(ATCC)を、4ウェル細胞培養スライド(well cell culture slide)に2×105個ずつ入れて24時間培養した。培養後、細胞にライソジョムを染色するLysoTracker Red DND-99(L7528,Life
Technologies Inc.)1mMと、対照群の抗体としてcontrol
IgG(ChromePure Human IgG,009-000-003,Jackson ImmonoResearch)またはKM3907(配列番号13のVHおよび配列番号14のVLを有する抗体であって、実施例2-1と同様の方法で製作する(KM3907抗体全長配列は、配列番号15および16を参照)/CLDN3&CLDN4 target,ECL-1 binding))、および本明細書発明の4G3抗体を10ug/mlになるように処理し、37℃で1時間、2時間、4時間、6時間培養した。各時間によって培養が終わった後、PBSで洗浄し、4%ホルムアルデヒドで室温で15分間固定した。PBS洗浄後、0.1% Triton-X100/PBSで5分間3回処理した。 PBSで洗浄後、5%BSA/PBSで室温で1時間ブロッキングした。PBSで洗浄し、二次抗体としてgoat anti-humanIgG-FITC(109-095-098,Jackson Immunoresearch)を1:100になるように入れ、常温で1時間反応した。PBS洗浄後、核染色のためにHoechst 33342(H3570、Invitrogen)を1:5000になるように入れて、10分間、室温で反応させ、その後、PBSで2回以上洗浄した。FluoromountTM Aqueous Mounting Medium(F4680,SIGMA)でマウントした後、カバースライドをカバーコンフォーカル顕微鏡(LSM700,Carl Zeiss,Inc.)で蛍光を観察した。
本発明の抗体の細胞内への内在化(internalization)能力を確認するために、クローディン3過剰発現卵巣癌細胞株であるOVCAR-3(ATCC)とCaov-3(ATCC)を、4ウェル細胞培養スライド(well cell culture slide)に2×105個ずつ入れて24時間培養した。培養後、細胞にライソジョムを染色するLysoTracker Red DND-99(L7528,Life
Technologies Inc.)1mMと、対照群の抗体としてcontrol
IgG(ChromePure Human IgG,009-000-003,Jackson ImmonoResearch)またはKM3907(配列番号13のVHおよび配列番号14のVLを有する抗体であって、実施例2-1と同様の方法で製作する(KM3907抗体全長配列は、配列番号15および16を参照)/CLDN3&CLDN4 target,ECL-1 binding))、および本明細書発明の4G3抗体を10ug/mlになるように処理し、37℃で1時間、2時間、4時間、6時間培養した。各時間によって培養が終わった後、PBSで洗浄し、4%ホルムアルデヒドで室温で15分間固定した。PBS洗浄後、0.1% Triton-X100/PBSで5分間3回処理した。 PBSで洗浄後、5%BSA/PBSで室温で1時間ブロッキングした。PBSで洗浄し、二次抗体としてgoat anti-humanIgG-FITC(109-095-098,Jackson Immunoresearch)を1:100になるように入れ、常温で1時間反応した。PBS洗浄後、核染色のためにHoechst 33342(H3570、Invitrogen)を1:5000になるように入れて、10分間、室温で反応させ、その後、PBSで2回以上洗浄した。FluoromountTM Aqueous Mounting Medium(F4680,SIGMA)でマウントした後、カバースライドをカバーコンフォーカル顕微鏡(LSM700,Carl Zeiss,Inc.)で蛍光を観察した。
観察結果図11aで示すように、4G3抗体が細胞内に入り、ライソジョム上に位置することを確認した。また、図11bに示すように、公知のanti-クローディン3抗体であるKM3907の場合には、細胞内への内在化が観察されなかった。
実施例6:癌細胞に対する抗体依存性細胞毒性の確認
本発明の抗体の抗体依存性細胞毒性(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ADCC)を確認するために、NK-92MIにFc receptorであるCD16遺伝子を持続的に発現する細胞株(以下、NK-92MI-CD16で呼ばれる)を使用した。NK-92MI-CD16細胞株を作製するためにpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にNhe1、EcoR1制限酵素を用いてCD16遺伝子を挿入し、electroporation技法でNK-92MI細胞のCD16発現ベクターをトランスクションした。G418化合物で耐性細胞株を選別した後FACS Aria機器に過剰発現細胞株を分離した。様々な癌細胞でクローディン3発現による効果を確認するために、まず、各細胞のクローディン3発現程度を見た抗体でフローサイトメトリー分析で確認した後MFIを比較した(図12a乃至図12eを参照)。前記細胞に対する抗体処理とフローサイトメトリー分析は、実施例3-2と同様の方法で行われた。抗体依存性細胞毒性を示するために、各細胞を96ウェルプレートに2×104個ずつ入れて24時間培養した。対照群の抗体(ChromePure Human IgG,009-000-003,Jackson ImmonoResearch)または4G3抗体を0ng/mlの、0.1ng/mlの、1ng/mlの、10ng/mlの、100ng/mlの、1000ng/mlの、100
00ng/mlの処理した後、NK-92MI-CD16細胞を8×104個ずつ入れて37℃で4時間培養した。細胞が溶解されて出てきたLDH(Lactatedehydrogenase)を測定するために遠心分離した後、上澄み液を取ってCytoTox96(R)Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(G1780,Promega)を用いて490nmへの吸光度を測定した。抗体依存性細胞毒性を測定するための計算式は以下の通りである。
本発明の抗体の抗体依存性細胞毒性(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ADCC)を確認するために、NK-92MIにFc receptorであるCD16遺伝子を持続的に発現する細胞株(以下、NK-92MI-CD16で呼ばれる)を使用した。NK-92MI-CD16細胞株を作製するためにpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にNhe1、EcoR1制限酵素を用いてCD16遺伝子を挿入し、electroporation技法でNK-92MI細胞のCD16発現ベクターをトランスクションした。G418化合物で耐性細胞株を選別した後FACS Aria機器に過剰発現細胞株を分離した。様々な癌細胞でクローディン3発現による効果を確認するために、まず、各細胞のクローディン3発現程度を見た抗体でフローサイトメトリー分析で確認した後MFIを比較した(図12a乃至図12eを参照)。前記細胞に対する抗体処理とフローサイトメトリー分析は、実施例3-2と同様の方法で行われた。抗体依存性細胞毒性を示するために、各細胞を96ウェルプレートに2×104個ずつ入れて24時間培養した。対照群の抗体(ChromePure Human IgG,009-000-003,Jackson ImmonoResearch)または4G3抗体を0ng/mlの、0.1ng/mlの、1ng/mlの、10ng/mlの、100ng/mlの、1000ng/mlの、100
00ng/mlの処理した後、NK-92MI-CD16細胞を8×104個ずつ入れて37℃で4時間培養した。細胞が溶解されて出てきたLDH(Lactatedehydrogenase)を測定するために遠心分離した後、上澄み液を取ってCytoTox96(R)Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(G1780,Promega)を用いて490nmへの吸光度を測定した。抗体依存性細胞毒性を測定するための計算式は以下の通りである。
分析の結果図13a乃至図13eに示すように、対照群の抗体(control IgG)処理群では、細胞毒性が示されず、4G3抗体処理群では、クローディン3発現細胞で細胞毒性が確認された。クローディン3発現量に応じたADCC効果を比較してみたとき、クローディン3発現MFI値が高いほど、細胞毒性EC50が低くなる傾向を示した。
前記実験では、CD16(FcγRIIIa)を継続的に発現するNK-92MI-CD16細胞がクローディン3抗原に対する細胞毒性効果を示すことはCAR-NK技術の原理と同様のメカニズムで癌細胞を死滅させることがあると示唆している。実際ADCC効果の評価でクローディン3の発現に基づいて効果の傾向が一致することを示しており、それはCAR-NK細胞作製に本開発の抗体を適用することができることを示している。
実施例7:in vivoの腫瘍標的化能の確認
腫瘍異種移植(xenograft)動物モデルは、ヒト卵巣癌細胞OVCAR-3(ATCC)とヒトの乳癌細胞T47D(ATCC)5×106個を100ul PBSに浮遊させ、それを6週齢のAthymic nude雌マウスの下部脇腹に皮下注射する方法で作製した。T47Dの場合17β-estradiol pellet(SE-121、Innovative Research of America)を皮下に一緒に植えた。
腫瘍異種移植(xenograft)動物モデルは、ヒト卵巣癌細胞OVCAR-3(ATCC)とヒトの乳癌細胞T47D(ATCC)5×106個を100ul PBSに浮遊させ、それを6週齢のAthymic nude雌マウスの下部脇腹に皮下注射する方法で作製した。T47Dの場合17β-estradiol pellet(SE-121、Innovative Research of America)を皮下に一緒に植えた。
本発明の抗体のin vivo腫瘍標的化能を確認するために、対照群の抗体(ChromePure Human IgG、009-000-003、Jackson ImmonoResearch)と4G3抗体のCF750蛍光体をVivoBriteTM Rapid Antibody Labeling Kit(92161、Biotium)を利用して接合した。蛍光/抗体モルラル比(degree of labeling、DOL)は、キットで提供する公式に基づいて推奨される予想比に合わせて、それぞれ2.29と2.82で測定された。
前記動物モデルに腫瘍移植後60日目に、CF750蛍光が標識された対照群の抗体または4G3抗体を100ug/100ulの容量で静脈内注射した。6時間、24時間、48時間、72時間、96時間が経過した時点で小動物生体イメージングシステム(In Vivo Imaging System、IVIS SpectrumCT、PerkinElmer)を用いて、マウスから放出される蛍光シグナルを検出し、最後の時点で、肝臓、腎臓、肺、脾臓、小腸、および腫瘍を摘出して組織別の抗体分布の蛍光シグナルを確認した。出版社から供給されたLiving Imaging Softwareを用いて蛍光シグナルを分析した。
実験結果図14aおよび図14bに示すように、対照群の抗体(control IgG)と比較して本発明の4G3抗体は、時間が経過するにつれて、移植腫瘍を特異的に標的することを確認し、他の組織と備え腫瘍に蓄積されていることを確認した。
本発明はクローディン3のECL-2に特異的に結合する抗体及びその機能的断片の癌細胞検出、診断、映像化、癌治療剤への適用用途(抗体自体の抗癌用途、ADC及びCAR-発現細胞(特に、免疫細胞)への適用)と、このような用途において著しい効果を示す特有のCDR配列を含む抗体及びその機能的断片に関するものである。
クローディン3のECL-2に特異的に結合する抗体及びその機能的断片は、他の癌抗原またはクローディン3のECL-1を標的にする従来の抗体より癌細胞検出、診断、映像化、癌の治療への適用(ADC及び発現細胞(特に免疫細胞)への適用)などにおいて価値が大きい。特にこのような具体的一例として、本発明として抗癌能力を有しているだけでなく、他のクローディンファミリーと交差反応性のなき優れた癌細胞標的化能を示し、マウスクローディン3とも結合するため、毒性及び効能評価の非臨床実験にも有利であり、従来公知のクローディン3抗体と比較し、非常に優れた結合力(親和度)を示し、細胞内在化(internalization)などを有して、前記用途への適応において著しい効果を示すため、診断及び医薬産業分野などにおいて産業上の利用可能性が高い。
Claims (59)
- 配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補決定部位1(VH-CDR1)、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補決定部位2(VH-CDR2)、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補決定部位3(VH-CDR3)を含む重鎖可変領域;及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位1(VL-CDR1)、配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位2(VL-CDR2)、及び配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補決定部位3(VL-CDR3)を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその機能的断片。
- 前記抗体は、IgG、IgA、IgM、IgE、およびIgDからなる群から選択され、前記機能的断片は、ディアボディー、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dsFvとscFvからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の抗体又はその機能的断片。
- 前記抗体又はその機能的断片はクローディン3に結合した後、細胞内に内在化(internalization)されることを特徴とする、請求項1に記載の抗体又はその機能的断片。
- 前記抗体又はその機能的断片はクローディン3の細胞外第二ループに特異的に結合することを特徴とする、請求項3に記載の抗体又はその機能的断片。
- 請求項1に記載の抗体又はその機能的断片を暗号化するポリヌクレオチド。
- 請求項5に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項6に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項7の細胞を培養して軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階;及び前記細胞又はそれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含む、クローディン3タンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片の製作方法。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片を試料と接触させる段階;及び前記抗体又はその機能的段階を検出する段階を含むクローディン3の検出方法。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片を有効成分として含むクローディン3検出用組成物。
- 前記抗体又はその機能的断片は発色酵素、放射性同元素、クロモフォア(chromophore)、発光物質、蛍光物質(fluorescer)、常磁性粒子(superparamagnetic particles)と超常磁性粒子(ultrasuper paramagnetic particles)からなる群から選択される1つ以上のものをカバーされていることを特徴とする、請求項10に記載の組成物。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌診断用組成物。
- 前記癌は卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、食道癌、乳房癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮がん、子宮頸がん、メラノーマ、大腸がん、腎臓がん、および転移性胸膜腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする、請求項12に記載の組成物。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌映像化用組成物。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物。
- 前記癌は卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、食道癌、乳房癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮がん、子宮頸がん、メラノーマ、大腸がん、腎臓がん、および転移性胸膜腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする、請求項15に記載の組成物。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate)。
- 前記薬物はマイクロチューブリン(microtubulin)構造の形成の抑制剤、有糸分裂(meiosis)抑制剤、トポアイソマラアゼ(topoisomerase)抑制剤、DNAインターカレーター(DNA intercalators)、毒素(toxin)、サイトカイン、ケモカイン、抗生剤、放射性核種、光感覚剤、光熱ナノ素材、ナノパーティクル及びミセルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項17に記載の結合体。
- 前記薬物は抗癌剤であることを特徴とする、請求項17に記載の結合体。
- 請求項1の抗体またはその機能的断片を有効成分として含む癌細胞特異的薬物伝達用組成物。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片;及びそれと結合された薬物を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片を含むCAR(キメラ抗原受容体)タンパク質。
- 前記CARは、
i)請求項1の抗体又はその機能的断片;
ii)膜通過ドメイン(transmembrane domain);及び
iii)細胞内シグナル伝達ドメイン(intracellular signlaing domain)を含むことを特徴とする、請求項22に記載のCARタンパク質。 - 前記iii)の細胞は免疫細胞であることを特徴とする、請求項23に記載のCARタンパク質。
- 前記免疫細胞はT細胞、NK( Natural Killer)細胞、NKT(Natural Killer T)細胞、 単核球、マクロファージ及び樹状細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項24に記載のCARタンパク質。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ(ξ,zeta)、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3エプシロン、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD278、CD66d、DAP10、DAP12、FcRI及びその組み合わせにより、
なる群から選択されたシグナル伝達ドメインであることを特徴とする、請求項23に記載のCARタンパク質。 - 前記細胞内シグナル伝達ドメインは共同刺激ドメイン(costimultatory domain)をさらに含むことを特徴とする、請求項23に記載のCARタンパク質。
- 前記の共同刺激ドメインはMHCクラスI分子(MHC class I
molecules)、TNF受容体タンパク質(TNF receptor proteins)、免疫グロブリン-類似タンパク質(Immunoglobulin-like proteins)、サイトカイン受容体(cytokine receptors)、インテグリン(integrins)、SLAMタンパク質(signaling
lymphocytic activation molecules)、NK細胞の活性化受容体(NK cell activating receptors)、BTLA、Tollリガンド受容体(Toll ligand receptor)、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18、lymphocyte function-associated antigen-1)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a
、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELP1G(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83と特異的に結合するリガンド、PD-1およびその組み合わせからなる群から選択された共同刺激分子から由来したことを特徴とする、請求項27に記載のCARタンパク質。 - 請求項22のCARタンパク質を暗号化するポリヌクレオチド。
- 請求項22のCARタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項30の組換えベクターで形質転換された細胞。
- 前記細胞は免疫細胞であることを特徴とする、請求項31に記載の形質転換された細胞。
- クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む細胞内薬物伝達用組成物。
- 前記の断片はクローディン3に結合した後、細胞質に内在化(internalization)されることを特徴とする、請求項28の組成物。
- クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的結合する抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate)。
- 前記薬物は、マイクロチューブリン(microtubulin)構造の形成の抑制剤、有糸分裂(meiosis)抑制剤、トポアイソマラアゼ(topoisomerase)抑制剤、DNAインターカレーター(DNA intercalators)、毒素(toxin)、サイトカイン、ケモカイン、抗生剤、放射性核種、光感覚剤、光熱ナノ素材、ナノパーティクル及びミセルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項35に記載の複合体。
- 前記薬物は抗癌剤であることを特徴とする、請求項35に記載の複合体。
- クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的結合する抗体又はその機能的断片;及びそれと結合された薬物を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物。
- i)クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的結合する抗体又はその機能的断片;
ii)膜通過ドメイン(transmembrane domain);及び
iii)前記抗体に抗原が結合するとT細胞活性化をもたらす細胞内シグナル伝達ドメイン(intracellular signlaing domain)を含CAR(chimeric antigen receptor)タンパク質。 - 前記細胞内シグナル伝達ドメインは共同刺激ドメイン(costimulatory domain)をさらに含むことを特徴とするCAR(chimeric antigen receptor)タンパク質。
- 請求項39のCARタンパク質を暗号化するポリヌクレオチド。
- 請求項39のCARタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項42の組換えベクターで形質転換された細胞。
- クローディン3検出用製剤を製造するための請求項1の抗体またはその機能的断片。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量
を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の診断方法。 - 癌診断用製剤を製造するための請求項1の抗体又はその機能的断片。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌診断方法。
- 癌映像化用製剤を製造するための請求項1の抗体又はその機能的断片。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌映像化方法
- 癌の予防及び治療用製剤を製造するための請求項1の抗体又はその機能的断片。
- 請求項1の抗体又を有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与する段階を含む癌の治療方法。
- 癌細胞特異的薬物伝達用製剤を製造するための請求項1の抗体又はその機能的断片。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌細胞特異的薬物伝達方法。
- 癌の予防及び治療用製剤を製造するための請求項1の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体。
- 請求項1の抗体又はその機能的断片;及び薬物が結合された抗体-薬物重合体を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法。
- 細胞内薬物伝達用製剤を製造するためのクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的結合する抗体又はその機能的断片。
- クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的結合する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与することを特徴する細胞内薬物伝達方法。
- 癌の予防及び治療用製剤を製造するためのクローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的結合する抗体又はその機能的断片;及びそれと結合された薬物。
- クローディン3の細胞外第二ループ(extracellular second loop,ECL-2)に特異的結合する抗体又はその機能的断片;及びそれと結合された薬物を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の治療方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2018-0036190 | 2018-03-28 | ||
KR1020180036190A KR102340989B1 (ko) | 2018-03-28 | 2018-03-28 | 클라우딘 3의 ecl-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도 |
PCT/KR2019/003594 WO2019190206A1 (ko) | 2018-03-28 | 2019-03-27 | 클라우딘 3의 ecl-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도 |
JP2020552830A JP7311530B2 (ja) | 2018-03-28 | 2019-03-27 | クローディン3のecl-2に特異的に結合する抗体、その断片及びその使用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020552830A Division JP7311530B2 (ja) | 2018-03-28 | 2019-03-27 | クローディン3のecl-2に特異的に結合する抗体、その断片及びその使用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023058515A true JP2023058515A (ja) | 2023-04-25 |
JP2023058515A5 JP2023058515A5 (ja) | 2023-09-15 |
Family
ID=68060609
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020552830A Active JP7311530B2 (ja) | 2018-03-28 | 2019-03-27 | クローディン3のecl-2に特異的に結合する抗体、その断片及びその使用 |
JP2023006843A Pending JP2023058515A (ja) | 2018-03-28 | 2023-01-19 | クローディン3のecl-2に特異的に結合する抗体、その断片及びその使用 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020552830A Active JP7311530B2 (ja) | 2018-03-28 | 2019-03-27 | クローディン3のecl-2に特異的に結合する抗体、その断片及びその使用 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210115134A1 (ja) |
EP (1) | EP3778638A4 (ja) |
JP (2) | JP7311530B2 (ja) |
KR (1) | KR102340989B1 (ja) |
CN (1) | CN112204053A (ja) |
AU (1) | AU2019243255B2 (ja) |
BR (1) | BR112020019553A2 (ja) |
CA (1) | CA3095139A1 (ja) |
MX (1) | MX2020010082A (ja) |
RU (1) | RU2768002C1 (ja) |
WO (1) | WO2019190206A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021060914A1 (ko) * | 2019-09-26 | 2021-04-01 | (재)록원바이오융합연구재단 | 항-클라우딘-3 키메라 항원 수용체 |
AR125136A1 (es) * | 2021-03-19 | 2023-06-14 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Receptores de antígenos quiméricos dirigidos a claudina-3 y métodos para tratar el cáncer |
CN114478802B (zh) * | 2022-01-28 | 2023-05-26 | 郑州大学 | 一种嵌合抗原受体及其应用 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
EP0402226A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Institut National De La Recherche Agronomique | Transformation vectors for yeast yarrowia |
US5707644A (en) | 1989-11-04 | 1998-01-13 | Danbiosyst Uk Limited | Small particle compositions for intranasal drug delivery |
US5756353A (en) | 1991-12-17 | 1998-05-26 | The Regents Of The University Of California | Expression of cloned genes in the lung by aerosol-and liposome-based delivery |
EP1790664A1 (en) * | 2005-11-24 | 2007-05-30 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer |
EP2103628A4 (en) * | 2006-12-14 | 2012-02-22 | Forerunner Pharma Res Co Ltd | MONOCLONAL ANTIBODY ANTI-CLAUDIN 3, AND TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER USING SUCH ANTIBODY |
WO2009028663A1 (ja) * | 2007-08-30 | 2009-03-05 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | 抗Claudin-3抗体 |
PL3026064T3 (pl) * | 2011-05-13 | 2019-05-31 | Ganymed Pharmaceuticals Gmbh | Przeciwciała do leczenia nowotworu z ekspresją klaudyny 6 |
US9751941B2 (en) * | 2013-03-14 | 2017-09-05 | Abion Inc. | Antigen derived from extracellular domain of multi-transmembrane protein and uses thereof |
KR101782623B1 (ko) * | 2013-07-10 | 2017-09-28 | 서울대학교산학협력단 | 복합 막횡단 단백질의 세포막외 펩타이드 항원 및 그의 용도 |
RU2016122041A (ru) * | 2013-11-06 | 2017-12-11 | ЭББВИ СТЕМСЕНТРКС ЭлЭлСи | Новые анти-клаудин антитела и способы их применения |
CN104548130A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-04-29 | 四川大学 | 一种干扰Claudin3 基因表达的靶向脂质体 |
SI3280729T1 (sl) * | 2015-04-08 | 2022-09-30 | Novartis Ag | Terapije CD20, terapije CD22 in kombinacija terapij s celico, ki izraža himerni antigenski receptor CD19 (CAR) |
WO2016180468A1 (en) * | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh | Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes |
KR20180036190A (ko) | 2016-09-30 | 2018-04-09 | 양진홍 | 키워드 기반의 장면 인식 방법 및 시스템 |
KR102055936B1 (ko) * | 2017-09-20 | 2019-12-16 | 에이비온 주식회사 | 클라우딘 3 및 4에 대한 단일클론항체 및 그의 용도 |
-
2018
- 2018-03-28 KR KR1020180036190A patent/KR102340989B1/ko active IP Right Grant
-
2019
- 2019-03-27 RU RU2020133771A patent/RU2768002C1/ru active
- 2019-03-27 CA CA3095139A patent/CA3095139A1/en active Pending
- 2019-03-27 MX MX2020010082A patent/MX2020010082A/es unknown
- 2019-03-27 CN CN201980035930.1A patent/CN112204053A/zh active Pending
- 2019-03-27 EP EP19778218.8A patent/EP3778638A4/en active Pending
- 2019-03-27 US US17/042,374 patent/US20210115134A1/en active Pending
- 2019-03-27 AU AU2019243255A patent/AU2019243255B2/en active Active
- 2019-03-27 JP JP2020552830A patent/JP7311530B2/ja active Active
- 2019-03-27 WO PCT/KR2019/003594 patent/WO2019190206A1/ko unknown
- 2019-03-27 BR BR112020019553-7A patent/BR112020019553A2/pt unknown
-
2023
- 2023-01-19 JP JP2023006843A patent/JP2023058515A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2019243255A1 (en) | 2020-11-12 |
US20210115134A1 (en) | 2021-04-22 |
JP2021518758A (ja) | 2021-08-05 |
CA3095139A1 (en) | 2019-10-03 |
AU2019243255B2 (en) | 2023-06-08 |
KR20190113465A (ko) | 2019-10-08 |
EP3778638A1 (en) | 2021-02-17 |
RU2768002C1 (ru) | 2022-03-22 |
WO2019190206A1 (ko) | 2019-10-03 |
CN112204053A (zh) | 2021-01-08 |
BR112020019553A2 (pt) | 2021-01-12 |
JP7311530B2 (ja) | 2023-07-19 |
KR102340989B1 (ko) | 2021-12-20 |
MX2020010082A (es) | 2021-03-25 |
EP3778638A4 (en) | 2022-05-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20180222996A1 (en) | Bispecific scfv immunofusion (bif) | |
JP2023058515A (ja) | クローディン3のecl-2に特異的に結合する抗体、その断片及びその使用 | |
KR102125032B1 (ko) | 인간 dlk1에 대한 항체 및 이의 용도 | |
US20230017956A1 (en) | Chimeric antigen receptor to which anti-cotinine antibody is linked, and use thereof | |
AU2007318483A1 (en) | Anti-human Dlk-1 antibody showing anti-tumor activity in vivo | |
KR20150046316A (ko) | 엽산 수용체 1의 검출을 위한 진단성 검정 및 키트 | |
KR102250234B1 (ko) | Lag-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도 | |
JPWO2008044754A1 (ja) | 癌の予防・治療剤 | |
JP7247368B2 (ja) | B7-h3に特異的に結合する抗体およびその使用 | |
JP2023540526A (ja) | ネクチン-4抗体およびそれの使用 | |
KR20180101483A (ko) | 치료적 항-cd9 항체 | |
JP2010524433A (ja) | ヒト腫瘍細胞に結合するヒト抗cd166抗体 | |
AU2017306506A1 (en) | Antibody to programmed cell death 1 (PD-1) and use thereof | |
CN113906052A (zh) | 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
JP7466442B2 (ja) | 抗原結合分子および組合せ | |
WO2023061505A1 (en) | Anti-glypican 3 antibodies | |
WO2022116079A1 (zh) | 一种抗ceacam5的人源化抗体及其制备方法和用途 | |
AU2022205325A1 (en) | Anti-fgfr3 antibody and use thereof | |
JP2022546768A (ja) | 抗vsig4抗体または抗原結合フラグメントおよびその使用 | |
CA3211935A1 (en) | Anti-vaccinia virus antigen antibodies and related compositions and methods | |
AU2022267410A1 (en) | EGFRvIII BINDING PROTEINS | |
KR20240016216A (ko) | 항-ror1 항체 및 이의 용도 | |
IL307367A (en) | GUCY2C binding polypeptide and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230125 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230125 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230901 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240214 |