JP7247368B2 - Ｂ７－ｈ３に特異的に結合する抗体およびその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する抗Ｂ７－Ｈ３抗体およびその使用に関し、より詳細には、抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片；それをコードする核酸；核酸を保有するベクター；ベクターを用いて形質転換された細胞；抗体またはその抗原結合性断片を調製するための方法；抗体またはその抗原結合性断片を含む、抗体－薬物コンジュゲートまたは多重特異性抗体；およびがん、自己免疫疾患、もしくは炎症性疾患を予防もしくは処置するための医薬組成物、または診断用組成物であって、各々がそれを含む組成物に関する。
我々の免疫系は、自己抗原に対する耐性を維持しながら病原体の侵入を有効に排除するように精密に調整されている。それらの中で、Ｔリンパ球は、腫瘍細胞を排除することができる主要細胞（エフェクター細胞）である。
免疫チェックポイントは、Ｔリンパ球活性化において極めて重要な役割を果たす共シグナル伝達分子であり、ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）シグナル伝達を阻害性または刺激性のどちらかになるように調節する（Immunological reviews 2017, 276:52-65）。
免疫監視を回避する一環として、一部の腫瘍細胞は、抑制を担う免疫チェックポイントのリガンドタンパク質を細胞表面に発現することによって、Ｔリンパ球の機能を阻害し、腫瘍微小環境を変化させ、その結果、免疫を抑制する。腫瘍免疫療法成功の代表例は、阻害性免疫チェックポイントＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４）およびＰＤ－１（プログラム死－１）、ならびに対応する抗原提示細胞および腫瘍細胞リガンド、Ｂ７ファミリー分子Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）、ならびにモノクローナル抗体遮断薬Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１（プログラム死－リガンド－１）である（N Engl J Med. 2011, 364(26): 2517-2526；N Engl J Med., 2012, 366 (26)2455-2465；およびN Engl J Med.2013, 369(2): 134-144）。
Ｂ７－Ｈ３（Ｂ７ホモログ３、またはＣＤ２７６（分化抗原群２７６））は、Ｂ７ファミリーのメンバーであり、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２）、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－Ｈ４（Ｂ７Ｓ１、Ｂ７ｘ、Ｖｔｃｎ１）、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ、ＧＩ２４、Ｄｉｅｓ１、ＰＤ－１Ｈ）、Ｂ７－Ｈ６（ＮＣＲ３ＬＧ１）およびＢ７－Ｈ７（ＨＨＬＡ２）と２０～３０％構造的相同性を有し（Blood 2013, 121(5): 734-744；およびMolecular Cancer Therapeutics 2017, 16(7): 1203-1211）、多様な生物学的機能を有する系統発生学的に保存されるタンパク質である。それは、２００１年に初めて発見され、共刺激分子リガンドとして導入された（Nature Immunology 2001, 2(3): 269274）。しかし、最近の研究により、研究結果が再調査され、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞上に発現される特定の免疫抑制性受容体のリガンドとコンジュゲートを形成すると抗原受容体シグナル伝達を負に調節できることが明らかにされた（Eur J Immunol. 2009, 39 (7): 1754-1764他諸々）が、結合パートナーは、まだ同定されていない。
Ｂ７－Ｈ３ ｍＲＮＡは、様々な正常組織に見られるが、このタンパク質はめったに発現されない。免疫活性化シグナルが与えられると、単球、マクロファージまたは樹状細胞においてタンパク質発現が誘導されるが、それは様々な固形癌において過剰発現され、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、腎がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、頭頸部がん、黒色腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、および他の腫瘍（例えば、小児期の小円形細胞腫瘍）に発現が認められた。ヒトＢ７－Ｈ３の場合、４Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３（ＩｇＶ－ＩｇＣ－ＩｇＶ－ＩｇＣ）が主形態であり、２Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３が若干見られるが、マウスの場合、２Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３が主形態である。しかし、両方の形態は、類似の機能を示す（Genome Biol. 2005, 6:233.1-233.7；PNAS 2008, 105 (30):10277-10278）。４Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３は、ナチュラルキラー細胞の抗腫瘍作用を阻害することができる（PNAS 2004, 101 (34): 12640-12645）。Ｂ７－Ｈ３阻害性シグナルは、ＴＣＲシグナル伝達に関与する分子（ＮＦ－κＢ、ＡＰ－１、ＮＦＡＴなど）との相互作用によって生じると推定され、動物実験においてＴｈ１（ヘルパーＴ細胞）、Ｔｈ２またはＴｈ１７を阻害することが認められた（J. Immunol. 2004, 173:2500-2506；Immunol. Rev. 2009, 229 (1):145-151）。
Ｂ７－Ｈ３タンパク質発現は、正常細胞では非常にわずかであるが、原発性および転移性腫瘍ならびに腫瘍血管系では有意に増加され、分化腫瘍細胞、腫瘍始原またはがん幹細胞をはじめとする多くの細胞型に見られ（Medicographia 2014, 36 (2): 285-292；およびCancer cell 2017, 31:501-515）、その発現は、一部の腫瘍型における予後不良と強く相関している。
Ｂ７－Ｈ３に対するモノクローナル抗体をはじめとする様々な改変抗体の開発過程で有望な治療有効性が得られており、臨床開発が進行中である（Medicographia 2014, 36 (2): 285-292）。
この技術劇背景のもとで、本発明者らは、ヒトＢ７－Ｈ３はもちろん、非ヒト（例えば、カニクイザル、マウス、ラットなど）Ｂ７－Ｈ３にも親和性をもって特異的に結合する抗Ｂ７－Ｈ３抗体を開発し、この抗体が、細胞表面Ｂ７－Ｈ３への結合後にエンドサイトーシスされ（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｚｅｄ）得ること、したがって、自己免疫疾患または炎症性疾患のための望ましいがん免疫療法剤または治療剤として役立ち得ることを見出した。上記に基づき、本発明者らは、本発明を遂行した。
この背景技術セクションに記載の上記情報は、本発明の背景の理解を向上させるためのものに過ぎず、本発明が属する技術分野の当業者に公知の先行技術を構成する情報を含まない可能性がある。
本発明の目的は、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸、およびそれを保有するベクターを提供することである。
本発明のもう１つの目的は、ベクターを用いて形質転換された細胞、およびそれを使用して抗体またはその抗原結合性断片を調製するための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患を予防または処置するための医薬組成物であって、抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物、およびそれを使用して疾患を処置するための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、抗体または抗原結合性断片を含む、抗体－薬物コンジュゲートまたは多重特異性抗体を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患を予防または処置するための医薬組成物であって、抗体またはその抗原結合性断片、抗体－薬物コンジュゲートまたは多重特異性抗体を含む、医薬組成物、およびそれを使用して疾患を処置するための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患または炎症性疾患を診断するための組成物であって、抗体またはその抗原結合性断片、抗体－薬物コンジュゲートまたは多重特異性抗体を含む、組成物、およびそれを使用して疾患を診断するための方法を提供することである。
上記目的を達成するために、本発明は、配列番号１、７、１３および１９からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１と、配列番号２、８、１４および２０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２と、配列番号３、９、１５および２１からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３と、配列番号４、１０、１６、２２、２４、２６、２８、３０、３３および３５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号５、１１、１７および３１からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号６、１２、１８、２３、２５、２７、２９、３２、３４および３６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３とを含む、抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
加えて、本発明は、抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸、核酸を含む組換え発現ベクター、および組換え発現ベクターを用いて形質転換された細胞を提供する。
加えて、本発明は、抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片を調製するための方法であって、（ｉ）形質転換細胞を培養すること、および（ｉｉ）得られた細胞培養液から抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片を回収することを含む方法を提供する。
加えて、本発明は、抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片と薬物とを含む、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。
加えて、本発明は、抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片を含む、多重特異性抗体を提供する。
加えて、本発明は、がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患を予防または処置するための医薬組成物であって、抗Ｂ７－Ｈ３抗体もしくはその抗原結合性断片、抗体－薬物コンジュゲートまたは多重特異性抗体を活性成分として含み、かつ薬学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物、およびそれを使用して疾患を処置するための方法を提供する。
加えて、本発明は、がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患を診断するための組成物であって、抗Ｂ７－Ｈ３抗体もしくはその抗原結合性断片、抗体－薬物コンジュゲートまたは多重特異性抗体を含む、組成物、およびそれを使用して疾患を診断するための方法を提供する。
図１は、Ｂ７－Ｈ３発現ベクターの模式図を示す。 図２は、パニング数に従ってＢ７－Ｈ３抗原へのポリｓｃＦｖ－ファージの結合能力を測定することにより得られた結果を示す。 図３は、モノｓｃＦｖ－ファージのＢ７－Ｈ３－Ｈｉｓ特異的結合能力をＥＬＩＳＡによって測定することにより得られた結果を示す。 図４は、選択されたＢ７－Ｈ３抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定することにより得られた結果を示す。 図５は、Ｂ７－Ｈ３の発現率をＦＡＣｓによって測定することにより得られた結果を細胞株ごとに示す。 図６ａ～６ｄは、細胞表面Ｂ７－Ｈ３への選択されたＢ７－Ｈ３抗体の結合力をＦＡＣｓにより測定することにより得られた結果を示す。図６ａは、ＣＤ２７６－０３３Ｅ０３抗体の結合力を測定することにより得られた結果を細胞株ごとに示し、図６ｂは、ＣＤ２７６－０５１Ｈ０４抗体の結合力を測定することにより得られた結果を細胞株ごとに示し、図６ｃは、ＣＤ２７６－０３９Ｃ０５およびＣＤ２７６－０４０Ｆ１０抗体の結合力を測定することにより得られた結果を細胞株ごとに示し、図６ｄは、６つの抗体の結合力を測定することにより得られた結果を細胞株ごとに示す。 同上 同上 同上 図７ａ～７ｅは、いくつかのタイプのＢ７－Ｈ３抗原と選択されたＢ７－Ｈ３抗体の結合力をＥＬＩＳＡによって測定することにより得られた結果を示す。 同上 同上 同上 同上 図８は、ＦｃＲｎ複合タンパク質と選択されたＢ７－Ｈ３抗体の結合力をＥＬＩＳＡによって測定することにより得られた結果を示す。 図９ａおよび９ｂは、選択されたＢ７－Ｈ３抗体と細胞表面Ｂ７－Ｈ３抗原の複合体のエンドサイトーシスを測定することにより得られた結果を示す。図９ａは、選択されたＢ７－Ｈ３抗体のエンドサイトーシスを経時的に同定することにより得られた結果を示し、図９ｂは、１８時間の時点で抗体のエンドサイトーシスの程度を測定することにより得られた結果を示す。 同上 図１０は、選択されたＢ７－Ｈ３抗体のエンドサイトーシスに起因する細胞傷害性を測定することにより得られた結果を示す。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される命名法は、当技術分野において周知であって一般に使用されているものである。
本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片の抗原としての役割を果たす、Ｂ７－Ｈ３タンパク質は、免疫細胞の活性の阻害に密接に関わっており、免疫細胞の表面に存在する膜タンパク質であり、免疫細胞の共阻害性受容体としての役割を果たす。Ｂ７－Ｈ３は、ヒトおよびサルなどの霊長類、ならびにマウスおよびラットなどの齧歯類を含む、哺乳動物に由来し得る。
本明細書において使用される場合、用語「Ｂ７－Ｈ３」は、細胞により天然に発現される、Ｂ７－Ｈ３の任意の変異体、アイソタイプおよび種ホモログを集合的に指す、概念である。好ましくは、この用語は、ヒトＢ７－Ｈ３を指すが、他の哺乳動物のＢ７－Ｈ３を含む概念であることもある。
本発明において、抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片は、好ましくは、配列番号６５により表されるヒトＢ７－Ｈ３タンパク質のアミノ酸配列またはその一部分に特異的に結合するが、それに限定されない。
本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する抗Ｂ７－Ｈ３抗体を指す。本発明の範囲は、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する完全抗体形態ばかりでなく、抗体分子の抗原結合性断片も含む。
完全抗体は、２本の完全長軽鎖および２本の完全長重鎖を有する構造であって、各軽鎖がジスルフィド結合により重鎖に接続されている、構造である。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）型を有し、サブクラスガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖定常領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）型を有する。
抗体の「抗原結合性断片」または「抗体断片」は、抗原結合機能を有する断片を指し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどの形態であり得る。抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と、軽鎖の定常領域と、重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）とを有する構造を有し、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を含む点で、Ｆａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、２つのＦａｂ’のヒンジ領域内のシステイン残基間にジスルフィド結合を形成することにより産生される。Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを有する、最小抗体断片を指す。
二本鎖Ｆｖ（２本鎖Ｆｖ）の場合、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、非共有結合により接続されており、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域がＣ末端においてペプチドリンカーを介して共有結合により接続されているかまたは直接接続されている、二本鎖Ｆｖのような二量体のような構造を一般に有し得る。そのような抗体断片を、タンパク質分解酵素を使用して得ることができ（例えば、全抗体のパパインによる制限酵素消化（ｐａｐａｉｎ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）はＦａｂを生じさせ、ペプシン消化はＦ（ａｂ’）２断片を生じさせる）、遺伝子組み換え技術によって構築することもできる。
一実施形態において、本発明による抗体は、Ｆｖ（例えば、ｓｃＦｖ）の形態であるか、または完全抗体の形態である。加えて、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）のうちのいずれか１つのアイソタイプであり得る。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）またはガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ型であり得る。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦＶ）および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、またはこのような抗体のエピトープ結合性断片およびこれらに類するものを含むが、それらに限定されない。例えば、本発明の抗体は、抗体を構成するアミノ酸配列の全てがヒト免疫グロブリン配列で構成されている、ヒト抗体配列であり得、必要に応じて、当技術分野において周知の方法に従って様々な形態、例えば、ヒト化抗体、キメラ抗体などに改変され得る。
本明細書において使用される場合、「抗体可変ドメイン」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖部分を指す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指す。
「相補性決定領域」（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、抗原結合に必要とされる、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として識別される３つのＣＤＲ領域を概して有する。
本発明は、配列番号１、７、１３および１９からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１と、配列番号２、８、１４および２０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２と、配列番号３、９、１５および２１からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３と、配列番号４、１０、１６、２２、２４、２６、２８、３０、３３および３５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号５、１１、１７および３１からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号６、１２、１８、２３、２５、２７、２９、３２、３４および３６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３とを含む、抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
具体的には、本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片は、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３；または
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む。
加えて、本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３７、３９、４１もしくは４３の重鎖可変領域を含むことがあり、または配列番号３８、４０、４２、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の軽鎖可変領域を含むことがある。
具体的には、それは、配列番号３７の重鎖可変領域および配列番号３８の軽鎖可変領域；配列番号３９の重鎖可変領域および配列番号４０の軽鎖可変領域；配列番号４１の重鎖可変領域および配列番号４２の軽鎖可変領域；配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号４４の軽鎖可変領域；配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号４５の軽鎖可変領域；配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号４６の軽鎖可変領域；配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号４７の軽鎖可変領域；配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号４８の軽鎖可変領域；配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号４９の軽鎖可変領域；または配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号５０の軽鎖可変領域を含み得る。
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４として識別される４つのＦＲを概して有する。
抗体は、一価または二価であり、単鎖または二本鎖を含む。機能的には、抗体の結合親和性（ＫＤ）は、１０－８Ｍ～１０－１２Ｍの範囲内である。例えば、抗体の結合親和性は、１０－８Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－１０Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－１０Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１０Ｍ、または１０－８Ｍ～１０－９Ｍである。
「ファージディスプレイ」は、ファージ、例えば繊維状ファージ粒子、の表面にエンベロープタンパク質の少なくとも一部分との融合タンパク質として変異型ポリペプチドを提示するための技法である。ファージディスプレイの有用性は、それが、無作為化されたタンパク質変異体の大きいライブラリーを標的とすることにより標的抗原に高い親和性をもって結合する配列を迅速かつ効率的に選別することができる、という点にある。ファージ上へのペプチドおよびタンパク質ライブラリーの提示は、特異的結合特性を有するポリペプチドを同定するために数百万のポリペプチドをスクリーニングするために使用されている。
ファージディスプレイ技術には、所望の特性を有する抗体を産生するための従来のハイブリドーマおよび組換え法と比較して短時間で様々な配列を有する大きい抗体ライブラリーを生成することができるという利点がある。加えて、免疫を必要としないので、ファージ抗体ライブラリーは、毒性である抗原または抗原性の低い抗原に対する抗体を生成することもできる。新規治療用抗体を生成および同定するためにファージ抗体ライブラリーを使用することもできる。
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を同定および単離することができる技術は、新規治療用抗体を単離するために重要である。ライブラリーからの高親和性抗体の単離は、ライブラリーのサイズ、細菌細胞における産生効率、およびライブラリーの多様性に依存し得る。
本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片は、本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片におけるアミノ酸配列の一部が保存的置換によって置換されている、抗体またはその抗原結合性断片を含む。
本明細書において使用される場合、「保存的置換」は、１つまたは複数のアミノ酸を、類似の生化学的特性を有するアミノ酸で置換することを含む、ポリペプチドの改変であって、ポリペプチドの生物学的または生化学的機能の喪失を引き起こさない改変を指す。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられる、置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のクラスは、当技術分野において定義されており、周知である。これらのクラスは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）である。本発明の抗体は、上記の保存的アミノ酸置換がたとえあっても、なお活性を保持することができる。
加えて、本発明は、本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸を提供する。本明細書において使用される場合の核酸は、細胞もしくは細胞溶解物中に存在することがあり、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在することもある。核酸は、それが、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ分染法、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野において周知の他のものを含む、標準的な技法によって、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞の核酸またはタンパク質から精製されている場合、「単離されている」かまたは「実質的に純粋」である。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含有することもあり、または含有しないこともある。核酸の基本構成単位であるヌクレオチドは、天然のヌクレオチドばかりでなく、糖または塩基領域が改変されている類似体も含む。本発明の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は、改変されていることもある。そのような改変には、ヌクレオチドの付加、欠失または非保存的もしくは保存的置換が含まれる。
本発明において、抗Ｂ７－Ｈ３抗体をコードする核酸は、重鎖可変領域をコードする配列番号５１、５３、５５および５７のポリヌクレオチド、ならびに軽鎖可変領域をコードする配列番号５２、５４、５６および５８～６４のポリヌクレオチドからなる群から選択される、任意の１つまたは複数の配列を含み得る。
上記の生物学的等価活性を有する改変を考えると、本発明の抗体またはそれをコードする核酸分子は、配列番号で示される配列に対して実質的同一性を示す配列を含むと解釈される。実質的同一性は、本発明の配列と他の任意の配列が、最大限に一致するように配置され、アラインメントされた配列が、当技術分野において一般に使用されているアルゴリズムを使用して分析されたとき、少なくとも９０％の相同性、好ましくは、少なくとも９５％の相同性、より好ましくは、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を示す配列を指す。
そのような相同性は、当技術分野において公知の方法による配列比較および／またはアラインメントにより判定することができる。例えば、本発明の核酸またはタンパク質の配列相同性は、配列比較アルゴリズム（例えば、ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ：ＢＬＡＳＴ）、手動アラインメント、目視検査およびこれらに類するものを使用して判定することができる。
別の態様では、本発明は、核酸を含む組換え発現ベクターに関する。本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片の発現のために、部分的または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学的技法（例えば、標的抗体を発現するハイブリドーマを使用する、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）により得ることができ、そのＤＮＡを転写および翻訳制御配列に「作動可能に連結」させ、発現ベクターに挿入することができる。ベクター成分は、一般に、次のうちの１つまたは複数をこれらに限定されないが含む：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、宿主において標的遺伝子を発現させる手段を指し、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、例えば、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、ならびにこれらに類するものを含む。ベクター内の、抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。
本明細書において使用される場合、用語「作動可能に連結されている」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する所期の機能を果たすための、抗体またはその抗原結合性断片をコードする遺伝子のベクターへのライゲーションを指す。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現のための細胞と適合性であるように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入され、または両方の遺伝子が、同じベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限酵素部位のライゲーション、または制限酵素部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。
一部の場合には、組換え発現ベクターは、形質転換細胞からの抗体鎖の分泌を助長するシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。抗体鎖遺伝子およびシグナルペプチドコード配列を、シグナルペプチドが抗体鎖のアミノ末端に結合することにより発現されるように、インフレームでベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよく、または異種シグナルペプチド（すなわち、免疫グロブリン以外のタンパク質に由来するシグナルペプチド）であってもよい。加えて、組換え発現ベクターは、形質転換細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御するための調節配列を含み得る。「調節配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含み得る。発現ベクターの設計が、形質転換される細胞の選択、タンパク質発現のレベルおよびこれらに類するものなどの因子に依存する異なる調節配列の選択によって変わり得ることは、当業者には理解され得る。
加えて、本発明のベクターは、ベクターから発現される抗体の精製を助長するために抗体遺伝子に融合された他の配列を含み得る。この配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）、６×Ｈｉｓ（ヘキサヒスチジン；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）およびこれらに類するものなどの、遺伝子であり得る。
ベクターは、当技術分野において選択ラベルとして一般に使用されている抗生物質耐性遺伝子を含み、この遺伝子は、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性のための遺伝子を含む。
加えて、本発明は、組換え発現ベクターを用いて形質転換された細胞を提供する。本発明による細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および昆虫細胞などであり得るが、これらに限定されない。
具体的には、本発明による細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）またはブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）であり得る。加えて、細胞は、真菌、例えば、コウジカビ属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、下等真核細胞、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ジゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ならびに真核細胞、例えば、高等真核生物（例えば、昆虫）の細胞であり得る。
加えて、本発明による細胞は、植物または哺乳動物に由来し得る。例えば、ＣＯＳ－７（サル腎臓細胞７）、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＣＨＯＫ１細胞、ＤＸＢ－１１細胞、ＤＧ－４４細胞、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ細胞、ＣＶ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＴＭ４細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、Ｗ１３８細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ＳＫ－Ｈｅｐ細胞、ＭＭＴ細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、３Ｔ３細胞、ＲＩＮ細胞、Ａ５４９細胞、ＰＣ１２細胞、Ｋ５６２細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０細胞、Ｕ２０Ｓ細胞、またはＨＴ１０８０細胞などが、利用可能であるが、これらに限定されない。好ましくは、ＣＯＳ７細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＣＨＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ ７８細胞およびＨＥＫ２９３細胞、より好ましくは、ＣＨＯ細胞を使用することができる。
様々な細胞／ベクターの組合せを使用して、本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体を発現させることができる。具体的には、真核細胞に好適な発現ベクターとしては、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルスおよびレトロウイルスに由来する発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。細菌細胞に使用され得る発現ベクターとしては、大腸菌由来細菌プラスミド、例えば、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣ、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびこれらの誘導体；より広い宿主範囲を有するプラスミド、例えばＲＰ４；ファージＤＮＡ、例えば、様々なファージラムダ誘導体、例えばλｇｔ１０、λｇｔ１１、およびＮＭ９８９；ならびに他のＤＮＡファージ、例えば、Ｍ１３および繊維状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。酵母細胞に有用である発現ベクターは、ＹＥｐプラスミドおよびその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクターは、ｐＶＬ９４１である。
ベクターは、細胞に形質導入またはトランスフェクトされる。「形質導入」または「トランスフェクション」には、原核または真核細胞に異種核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入するために一般に使用される多数の異なる技法、例えば、電気泳動、リン酸カルシウム沈降法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションまたはリポフェクションおよびこれらの類するものを、使用することができる。
加えて、本発明は、抗体またはその抗原結合性断片を調製するための方法であって、（ｉ）形質転換細胞を培養すること、および（ｉｉ）得られた細胞培養液から抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片を回収することを含む方法を提供する。抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片を発現することができる組換え発現ベクターを哺乳動物細胞に導入した場合、細胞において抗体を発現させるのに十分な期間、より好ましくは、細胞を培養する培養培地に抗体を分泌させるのに十分な期間、細胞を培養することにより、抗体またはその抗原結合性断片を調製することができる。
細胞を様々な培地で培養することができ、市販されている培地を制約なく培養培地として使用することができる。当業者に公知のあらゆる他の必須サプリメントを適切な濃度で含めることができる。適切な培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、選択される宿主細胞におけるタンパク質発現に既に使用されたおり、当業者には明らかであろう。
一部の場合には、発現された抗体を細胞培養液から単離し、均一に精製することができる。抗体の単離および精製は、従来のタンパク質単離および精製方法、例えば、クロマトグラフィーにより行なうことができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、プロテインＡカラムもしくはプロテインＧカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを挙げることができる。上記クロマトグラフィーに加えて、濾過、限外濾過、塩析、透析およびこれらに類するものをさらに組み合わせることにより、抗体を単離および精製することができる。
加えて、本発明は、抗体またはその抗原結合性断片と薬物とを含む、抗体-薬物コンジュゲートを提供する。
抗体－薬物コンジュゲートの場合、抗がん薬は、抗がん薬が標的がん細胞に送達されるまで、抗体に安定的に結合されていなければならない。標的に送達される薬物は、標的細胞の死を誘導するために抗体から放出されなければならない。この目的のために、薬物は、抗体に安定的に結合され、標的細胞から放出されたときに、標的細胞の死を誘導するのに十分な細胞傷害性を有さなければならない。
薬物は、薬理作用を示す薬剤であり、本発明の抗体またはその抗原結合性断片に結合させることができ、抗体またはその抗原結合性断片から酸性条件により単離することができ、標的細胞に対する治療効果を示すことができる、化合物を指す。薬物は、細胞毒素、放射性同位体、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、化学療法剤、および治療用核酸を含み得るが、これらに限定されない。
抗体－薬物コンジュゲートは、細胞に内在化され、抗体依存性細胞傷害を媒介することができる。
本明細書において使用される場合、用語「細胞傷害活性」は、抗体－薬物コンジュゲートの効果、すなわち、細胞内の代謝物の細胞を死滅させる、細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害する、もしくは成長（ｇｒｏｗｔｈ）を阻害する、抗体－薬物コンジュゲートの効果を指す。細胞傷害活性をＩＣ５０値として表すことができ、ＩＣ５０値は、細胞の２分の１が生存する単位容量（ｕｎｉｔ ｖｏｌｕｍｅ）当たりの濃度（モル濃度または質量）である。
用語「細胞毒素」は、細胞の機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞を破壊する、薬剤を一般に指す。代表的な細胞毒素としては、抗生物質；チューブリン重合阻害剤；ＤＮＡに結合して破壊するアルキル化剤；および必須細胞タンパク質、例えばプロテインキナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼ、酵素およびサイクリン、の機能またはタンパク質合成を破壊する薬剤が挙げられる。細胞毒素の例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにその類似体またはホモログを含むが、これらに限定されない。
放射線療法応用のために、本発明の抗体は、高エネルギー放射性同位体を含み得る。同位体を抗体に、例えば、抗体中に存在するシステイン残基に、直接結合させることができ、または同位体は、キレートを使用する放射性同位体への抗体の結合を媒介することができる。放射線療法に好適な放射性同位体は、α放射体、β放射体、およびオージェ電子を含むが、これらに限定されない。診断応用に有用な放射性同位体は、陽電子放射体およびγ放射体を含む。
抗増殖剤およびアポトーシス促進剤は、ＰＰＡＲ－ガンマ（例えば、シクロペンテノン型プロスタグランジン（ｃｙＰＧ））、レチノイド、トリテルペノイド（例えば、シクロアルタン、ルパン（ｌｕｐａｎ）、尿酸、オレアナン、プレエデラン（ｐｒｅｅｄｅｌａｎ）、ダマラン、ククルビタシンおよびリモノイドトリテルペノイド）、ＥＧＦ受容体阻害剤（例えば、ＨＥＲ４）、ラパマイシン、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（１，２５－ジヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ））、アロマターゼ阻害剤（ＦＥＭＡＲＡ（レトロゾン（ｒｅｔｒｏｚｏｎｅ）））、テロメラーゼ阻害剤、鉄キレート剤（例えば、３－アミノピリジン－２－カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン（トリアピン））、アポプチン（ウイルスタンパク質３－ニワトリ貧血ウイルスからのＶＰ３）、Ｂｃｌ－２およびＢｃｌ－Ｘ（Ｌ）阻害剤、ＴＮＦ－アルファ、ＦＡＳリガンド、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）、ＴＮＦ－アルファ／ＦＡＳリガンド／ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）シグナル伝達活性化剤、およびＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ生存経路シグナル伝達阻害剤（例えば、ＵＣＮ－０１およびゲルダナマイシン）を含む。
「化学療法剤」は、その作用機序を問わず、がんの処置に有用な化学物質である。化学療法剤のクラスは、アルキル化剤、代謝拮抗薬、紡錘体毒性植物アルカロイド、細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、抗体、光増感剤、およびキナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない。化学療法剤は、「標的療法」および旧来の化学療法に使用される化合物を含む。
コンジュゲートは、薬物を抗体またはその抗原結合性断片に結合させることによる公知の方法によって構築することができる。抗体と薬物を、それら自体の連結基およびこれらに類するものによって直接結合させることができ、またはリンカーもしくは他の物質を介して間接的に結合させることができる。薬物が抗体から切断される主要な機序は、リソソームの酸性ｐＨにおける加水分解（ヒドラゾン、アセタールおよびｃｉｓ－アコニテート様アミド）、リソソーム酵素（カテプシンおよび他のリソソーム酵素）によるペプチド切断、およびジスルフィドの還元を含む。これらの様々な切断機序の結果として、薬物が抗体に連結される機序は千差万別であり、任意の好適なリンカーが使用され得る。
抗体を薬物に結合させるための好適な連結基は、当技術分野において周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸により切断可能な基、光により切断可能な基、ペプチダーゼにより切断可能な基、およびエラスターゼにより切断可能な基を含む。
薬物が、直接結合される場合、連結基は、例えば、ＳＨ基を使用するジスルフィド結合、またはマレイミドにより媒介される結合を含み得る。例えば、抗体Ｆｃ領域の分子内ジスルフィド結合および薬物のジスルフィド結合が還元され、両方がジスルフィド結合により連結される。加えて、それは、マレイミドによる方法、およびシステインを抗体に遺伝子的に導入するための方法を含む。
抗体と薬物を、他の物質（リンカー）を介して間接的に連結させることができる。リンカーは、抗体、薬物、または両方と反応する、１つまたは２つ以上の官能基を好ましくは有する。官能基の例としては、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、ピリジニル基およびこれらに類するものが挙げられる。
加えて、本発明は、抗体またはその抗原結合性断片を含む、多重特異性抗体を提供する。多重特異性抗体は、２つ以上の異なるタイプの抗原（標的タンパク質）に結合することができる抗体を指し、遺伝子操作または任意の方法により調製された形態である。多重特異性抗体は、二重特異性抗体、三重特異性抗体または四重特性抗体を含む。
多重特異性抗体は、好ましくは、本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体が、免疫エフェクター細胞特異的標的分子への結合能力を有する抗体またはその断片に結合されている、形態である。免疫エフェクター細胞特異的標的分子は、好ましくは、ＴＣＲ／ＣＤ３、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ８９およびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（ＣＲ３）から選択されるが、これらに限定されない。
多重特異性抗体は、好ましくは、本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体が、免疫を刺激するかまたは阻害するサイトカインへの結合能力を有する抗体またはその断片に結合されている、形態である。免疫を刺激するかまたは阻害するサイトカインは、好ましくは、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＦＮα、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０およびＴＧＦ－βから選択されるが、これらに限定されない。
多重特異性抗体は、好ましくは、本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体が、がん処置に使用される標的、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、他の増殖因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＯＸ－４０、４－ＩＢＢおよびＩＣＯＳ、への結合能力を有する抗体または断片に結合されている、形態であるが、これに限定されない。
多重特異性抗体に属する抗体は、ｓｃＦｖに基づく抗体、Ｆａｂに基づく抗体、およびＩｇＧに基づく抗体などに分類され得る。二重特異性抗体の場合、抗体は、２つのシグナルを同時に阻害または増幅することができるので、１つのシグナルを阻害／増幅する場合よりも有効であり得る。各々のシグナルが、各々のシグナル阻害剤を用いて処置される場合と比較して、低い用量を投与すること、ならびに２つのシグナルを同時におよび同じ空間内で阻害／増幅することが可能である。
二重特異性抗体を調製するための方法は周知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する条件下での２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づく。
ｓｃＦｖに基づく二重特異性抗体の場合、異なるｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨを互いに組み合わせてダイアボディを作製することにより、ヘテロ二量体の形態でハイブリッドｓｃＦｖを調製することができ、異なるｓｃＦｖを互いに連結させてタンデムｓｃＦｖを作製することができ、各々のｓｃＦｖの末端においてＦａｂのＣＨ１およびＣＬを発現させることにより、ヘテロ二量体ミニ抗体を調製することができ、Ｆｃのホモ二量体ドメインであるＣＨ３ドメインの一部のアミノ酸を置換して「ノブイントゥホール」形態のホモ二量体構造に変化させること、およびこれらの変更されたＣＨ３ドメインを異なるｓｃＦｖ末端において発現させることによって、ヘテロ二量体ｓｃＦｖ型ミニボディを調製することができる。
Ｆａｂに基づく二重特異性抗体の場合、ジスルフィド結合またはメディエーターを使用して特異的抗原に対して生じる個々のＦａｂを互いに組み合わせることにより、ヘテロ二量体Ｆａｂを調製することができ、特異的Ｆａｂの重鎖もしくは軽鎖の末端において異なる抗原に対するｓｃＦｖを発現させることにより、抗原価を倍増させることができ、またはＦａｂとｓｃＦｖとの間にヒンジ領域を設けることにより、ホモ二量体の形態で抗原価４を有するようにそれを調製することができる。加えて、異なる抗原に対するｓｃＦｖをＦａｂの軽鎖および重鎖末端に融合させることにより、抗原価が３である二重標的化バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）を調製することができ、異なるｓｃＦｖをＦａｂの軽鎖および重鎖末端に融合させることにより、抗原価が３である三重標的化バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）を調製することができ、または３つの異なるＦａｂを化学的にコンジュゲートさせることによりそれを得ることもできる。
ＩｇＧに基づく二重特異性抗体の場合、マウスおよびラットハイブリドーマを再交雑させてハイブリッドハイブリドーマ（クアドローマとしても公知）を産生することにより二重特異性抗体を産生するための方法が公知である。加えて、軽鎖部分を共有しつつ、異なる重鎖についてのＦｃのＣＨ３ホモ二量体ドメインの一部のアミノ酸を改変することにより、ヘテロ二量体の形態で作製される、いわゆる「ホールおよびノブ」形態の二重特異性抗体を、調製することもできる。ＩｇＧの軽鎖および重鎖の可変ドメインではなく定常ドメインにおける２つの異なるｓｃＦｖを融合発現させることにより、ホモ二量体形態の（ｓｃＦｖ）４－ＩｇＧを調製することもできる。
加えて、本発明は、がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患を予防または処置するため医薬組成物であって、抗Ｂ７－Ｈ３抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそれを含む多重特異性抗体または抗体－薬物コンジュゲートを活性成分として含み、かつ薬学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物を提供する。
がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患または炎症性疾患は、Ｂ７－Ｈ３の発現または過剰発現に関連し得る。
本発明において、「がん」および「腫瘍」は、実質的に同じ意味で使用されており、無秩序な細胞成長および増殖を典型的に特徴とする哺乳動物における生理的状態を指すかまたはそれを意味する。
「予防」は、本発明による組成物を投与することによってがんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患の進行を阻害または遅延する任意の作用を指し、「処置」は、がんまたは腫瘍の発症を阻害すること、がんまたは腫瘍を軽減することまたは消失させること、自己免疫疾患または炎症性疾患を阻害すること、軽減することまたは消失させることを指す。
本発明の組成物を用いて処置することができるがんまたは癌腫は、特に限定されず、固形がんと血液がんの両方を含む。そのようながんの例は、皮膚がん、例えば黒色腫、肝臓がん、肝細胞癌、胃がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、気管支がん、上咽頭がん、咽頭がん、膵臓がん、膀胱がん、大腸がん、結腸がん、膵臓がん、子宮頸がん、脳がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、骨がん、皮膚がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、腎がん、食道がん、胆道がん、精巣がん、直腸がん、頭頸部がん、頸椎がん、尿管がん、骨肉腫、神経芽細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞種、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および他の腫瘍（例えば、小児期の小円形細胞腫瘍）からなる群から選択することができるが、これらに限定されない。
より詳細には、がんまたは腫瘍は、Ｂ７－Ｈ３タンパク質が発現されることを特徴とし得、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、腎がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、頭頸部がん、黒色腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫および他の腫瘍（例えば、小児期の小円形細胞腫瘍）からなる群から選択されることを特徴とし得る。がんは、原発がんであることもあり、または転移がんであることもある。
本発明において、自己免疫疾患または炎症性疾患は、喘息、関節リウマチ、または多発性硬化症であり得るが、これらに限定されない。
本発明において、医薬組成物は、治療有効量の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片を、薬学的に許容される添加剤とともに含む。「薬学的に許容される添加剤」は、医薬組成物の製剤化または安定化を助けるために活性成分に添加され得る物質であって、患者に対する有意な毒性効果を誘発しない物質である。
添加剤は、患者を刺激しない担体または希釈剤であって、投与された化合物の生物学的活性および特性を阻害しない、担体または希釈剤を指す。溶液として製剤化される組成物に許容される医薬担体は、無菌かつ生体適合性であり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの混合物を使用することができ、他の従来の添加剤、例えば、抗酸化剤、緩衝剤および静菌薬を必要に応じて添加することができる。加えて、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および滑沢剤をさらに添加することにより、それを注射製剤、例えば水溶液、懸濁液、エマルジョンなど、丸剤、カプセル、顆粒または錠剤の形態で製剤化することができる。
薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または分散液、および即時投与のための無菌注射用溶液または分散液の調製のための無菌粉末を含む。組成物は、好ましくは、非経口注射用に製剤化される。組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他のカスタマイズされた製剤として、製剤化することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。一部の場合には、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを、組成物に含めることもある。製薬技術分野において周知の方法を使用して、各々の製剤を調製することができる。
本発明による医薬組成物の投薬量は、特に限定されないが、患者の健康状態および体重、疾患の重症度、薬物のタイプ、投与経路ならびに投与の回数をはじめとする、様々な要因によって変わり得る。本発明による医薬組成物は、ヒト、ラット、マウス、家畜およびこれらに類するものをはじめとする哺乳動物に概して許容される経口または非経口経路の様々な経路によって、１日に１用量または複数用量で投与することができる。具体的には、それを経口、直腸内、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、経鼻、吸入、眼内、肺内または皮内経路によって従来の方法で投与することができるが、それは、それらに限定されない。
本発明による医薬組成物を患者に、必要に応じて、ボーラスとして投与または持続注入により投与することができる。例えば、Ｆａｂ断片により代表される本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体の抗原結合性断片のボーラス投与は、０．００２５～１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５～０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～０．１０ｍｇ／ｋｇ、または０．１０～０．５０ｍｇ／ｋｇの量での投与であり得る。持続注入の場合、Ｆａｂ断片により代表される本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体の抗原結合性断片を、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５～１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０～０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０～１．０ｍｇ／ｋｇ／分または０．１０～０．５０ｍｇ／ｋｇ／分の量で、１時間～２４時間、１時間～１２時間、２時間～１２時間、６時間～１２時間、２時間～８時間、または１時間～２時間の期間、投与することができる。本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片が投与される場合、投薬量は、約１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、２～８ｍｇ／ｋｇ、３～７ｍｇ／ｋｇ、または４～６ｍｇ／ｋｇであり得る。完全長抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、概して、３０～３５分間続く注入によって投与される。投与の頻度は、状態の重症度によって変わり得る。頻度は、週に３回から１または２週間に１回の範囲であり得る。
加えて、本発明は、がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患を予防または処置するための方法であって、がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患の予防または処置を必要とする患者に、治療有効量の抗Ｂ７－Ｈ３抗体もしくはその抗原結合性断片または多重特異性抗体または抗体－薬物コンジュゲートを投与することを含む方法に関する。予防または処置方法は、疾患の予防または処置を必要とする患者を投与の前に同定することをさらに含み得る。
一部の場合には、抗体またはその抗原結合性断片を他の従来の抗がん治療剤と組み合わせて使用することにより、Ｂ７－Ｈ３を発現する腫瘍細胞を有効に標的化し、抗腫瘍Ｔ細胞活性を増加させることにより免疫応答を増強することができる。抗体またはその抗原結合性断片を、他の抗新生物剤もしくは免疫原、例えば、弱毒化がん細胞、抗腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子をはじめとする）、抗原提示細胞（例えば、腫瘍由来の抗原もしくは核酸がパルスされた樹状細胞）、免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮα２、ＧＭ－ＣＳＦ）、および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子がトランスフェクトされた細胞；標準的ながん療法、例えば、化学療法、放射線療法もしくは外科手術；または他の抗体、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、他の増殖因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ－４０、４－ＩＢＢおよびＩＣＯＳに対する抗体と組み合わせて、使用することができる。本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片、およびそれを含む医薬組成物を、従来の抗がん治療剤と同時にまたは逐次的に投与することができる。
加えて、本発明は、がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患を診断するための組成物であって、抗Ｂ７－Ｈ３抗体もしくはその抗原結合性断片、抗体－薬物コンジュゲートまたは多重特異性抗体を含む、組成物、およびそれを使用して疾患を診断するための方法を提供する。
がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患を、試料における本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体もしくはその抗原結合性断片、抗体－薬物コンジュゲートまたは多重特異性抗体によるＢ７－Ｈ３発現のレベルを測定することによって、診断することができる。発現レベルを従来のイムノアッセイ法に従って測定することができ、それを、Ｂ７－Ｈ３に対する抗体を使用するラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、免疫沈降法、免疫組織化学染色、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、捕捉ＥＬＩＳＡ、阻害もしくは競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色およびイムノアフィニティー精製によって測定することができるが、それは、それらに限定されない。イムノアッセイの結果として、生体試料におけるＢ７－Ｈ３タンパク質の発現が正常な生体試料（例えば、正常な組織、血液、血漿または血清）におけるものより高度であった場合、疾患を診断することができる。
加えて、本発明は、診断用組成物を含む診断キットを提供する。本発明によるキットは、本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体もしくはその抗原結合性断片、それを含む抗体－薬物コンジュゲートまたは多重特異性抗体と、検出可能なシグナルを生成するための標識とを含み得る。標識は、抗体に結合された化学物質（例えば、ビオチン）、酵素（アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼまたはチトクロムＰ４５０）、放射性物質（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２およびＳ３５）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン）、発光物質、化学発光物質、およびＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を含み得るが、これらに限定されない。これに関連して、酵素の基質について、アルカリホスファターゼが酵素として使用される場合、ブロモクロロインドイルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェートおよびＥＣＦ（増強化学発光）などの発色基質が、基質として使用され、ホースラディッシュペルオキシダーゼが使用される場合、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ－ルシフェリン、ルシゲニン（ビス－Ｎ－メチルアクリジニウム二トレート）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬（１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ－フェニレンジアミン－ＨＣｌおよびピロカテコール）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）、ＡＢＴＳ（２，２’－アジン－ジ［３－エチルベンゾチアゾリンスルホネート］）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）およびナフトール／ピロニン、グルコースオキシダーゼおよびｔ－ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）（ｎｉｔｒｏ ｂｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）およびｍ－ＰＭＳ（フェナジンメトスルフェート）などの基質が使用されるが、これらに限定されない。
がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患を、試料と抗体との間の反応により提示されるシグナル強度を分析することにより診断することができる。診断に使用される酵素の活性またはシグナルの測定は、Ｂ７－Ｈ３発現を定性的にまたは定量的に分析することができる当技術分野において公知の様々な方法に従って行なうことができる。
本明細書において以降、本発明が、実施例によってより詳細に説明される。これらの実施例は、本発明を例証するためのものに過ぎず、本発明の範囲は、これらの実施例により限定されない。
実施例１：Ｂ７－Ｈ３抗原の発現および精製
実施例１－１：Ｂ７－Ｈ３タンパク質発現ベクターの構築
Ｂ７－Ｈ３の細胞外ドメインのみをクローニングするために、Ｊｕｒｋａｔ細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）と、制限酵素ＳｆｉＩ部位を５’および３’に含まれるＢ７－Ｈ３用のプライマー対（表１）とを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。得られたＰＣＲ産物およびＮ２９３Ｆベクターを使用して、８×Ｈｉｓ、ヒトＦｃまたはマウスＦｃがＢ７－Ｈ３の細胞外ドメインのカルボキシ末端に融合されたタンパク質を各々が発現する発現ベクターを構築した（図１）。
Figure 0007247368000001
実施例１－２：Ｂ７－Ｈ３抗原の発現および精製
ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、２３９６６、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を至適条件下で使用してトランスフェクションを行なった。ヒトＨＥＫ２９３Ｆ細胞を培地（＃Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ＡＧＴタイプ；ＡＧ１００００９Ｐ１、Ｔｈｅｒｍｏ．）に、１ｍｌ当たり細胞５×１０５個で接種し、細胞１×１０６個／ｍｌに達するまで培養した。実施例１－１で得た各発現ベクターをＰＥＩと混合してポリプレックスを形成し、次いで、細胞に添加することにより形質転換させ、次いで、５ｇ／ＬのＳｏｙｔｏｎｅ（Ｓｏｙｔｏｎｅ；＃２１２４８８、ＤＩＦＣＯ）を添加し、次いで、細胞をさらに６日間、培養した。発現されたＢ７－Ｈ３－Ｆｃ抗原を、プロテインＡアガロースおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（１．５ｃｍ×１００ｃｍ）ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して順次精製した。各々の抗原産生培養液を８，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離して、細胞残屑を除去し、０．２２μｍの孔径を有するボトルトップフィルターを使用して濾過した。精製を行なうために、３ｍｌのＮｉ－ＮＴＡ樹脂（＃３０２３０、ＱＩＡＧＥＮ）を空のカラムに入れ、次いで、樹脂を２０ｍｌの結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾール）とともに充填した。充填した樹脂に濾過した培養液を重力流速で流して、毎分０．２ｍｌの速度で樹脂に結合させた。１００ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭイミダゾール）を用いて洗浄を行い、次いで、溶出緩衝液（２５０ｍＭイミダゾール）を用いて溶出を行なった。溶出緩衝液で得られた緩衝液を
透析（１Ｌ、３回）によってＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水）と緩衝液交換した。タンパク質の濃度をＮａｎｏ－ｄｒｏｐにより測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー（＃ＴＳＫ－ＧＥＬ Ｇ－３０００ ＳＷＸＬサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、東ソー株式会社）を使用して各タンパク質を精製し、純度を同定し、それらの全ては、少なくとも９５％の純度を有した。
実施例２：Ｂ７－Ｈ３ヒト抗体の選択
実施例２－１：抗原の調製
実施例１で調製したＢ７－Ｈ３－ＨｉｓおよびＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から購入したＢ７－Ｈ３－Ｆｃ（＃１１１８８－Ｈ０２Ｈ）抗原の各々５０μｇをイムノソルブチューブ（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ ｔｕｂｅ）上にコーティングし、次いでブロッキングを行なった。
実施例２－２：ヒト抗体ライブラリーファージの調製
２．７×１０１０の密度を有するヒトｓｃＦｖライブラリーファージ（Ｙ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）に大腸菌を感染させ、次いで、得られた大腸菌を３０℃で１６時間培養した。培養液を遠心分離し、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を用いて上清を濃縮し、次いで、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）緩衝液に溶解して、ヒト抗体ライブラリーファージを調製した。
実施例２－３：バイオパニング
実施例２－２で得たライブラリーファージを、実施例２－１で用意したイムノソルベントチューブに入れ、室温で２時間反応させ、次いで１×ＰＢＳＴおよび１×ＰＢＳを用いて洗浄し、次いで、１００ｍＭのＴＡＥおよびＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液を用いて順次処理して、抗原に特異的に結合したｓｃＦｖ－ファージのみを溶出させた。溶出したファージに大腸菌を再び感染させ増幅させるパニングプロセスによって、陽性ファージのプールを得、第１のパニングラウンドで増幅したファージを用いて、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ－２０）洗浄ステップの回数を増加させたことを除いて同じ方法で、第２および第３のパニングラウンドを行なった。結果として、表２に示すように、抗原に結合したファージの数が、第３のパニングラウンドにおいてある程度まで増加された。
Figure 0007247368000002
実施例２－４：ポリファージＥＬＩＳＡ
ポリファージＥＬＩＳＡを行なって、各パニングラウンドによって得られた陽性ポリｓｃＦｖ－ファージ抗体プールの抗原特異性を調査した。各ラウンドにおいて得られたファージプールを用いてＥＬＩＳＡを、抗原Ｂ７－Ｈ３－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ）およびＢ７－Ｈ３－Ｈｉｓ（社内）でそれぞれコーティングしたイムノプレートならびに非特異的結合の指標として使用されるＩＴＧＡ６－Ｆｃタンパク質でコーティングしたイムノプレートを使用して、同時に行なった。ＥＬＩＳＡの陰性対照群として、抗体を提示しないＭ１３ファージである＃３８も使用した。
結果として、図２示すように、Ｂ７－Ｈ３－Ｈｉｓ抗原への結合能力は第２のラウンドパニングの陽性ファージプールから増大されたので、抗Ｂ７－Ｈ３ファージ抗体が首尾よく増加されたことを見出した。
実施例２－５：陽性ファージの選択
ポリファージＥＬＩＳＡにおいて高い結合能力を有することが確認された数千のモノクローンを第３のラウンドパニングの陽性ファージプールから選択し、９６ディープウェルプレートにおいてヘルパーファージに感染させ、培養し、次いで、上清中に存在するモノｓｃＦｖ－ファージを、Ｂ７－Ｈ３抗原でコーティングされたイムノプレートに移し、ＥＬＩＳＡを行なった。この時点で、Ｂ７－Ｈ３－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ）またはＢ７－Ｈ３－Ｈｉｓ（社内）についてのモノファージＥＬＩＳＡと、非特異的抗原対照群であるＩＴＧＡ６－Ｆｃタンパク質についてのＥＬＩＳＡとを同時に行い、得られた陽性ファージクローンがＢ７－Ｈ３に対して特異的であるかどうかを確認した。
結果として、図３に示すように、モノｓｃＦｖ－ファージクローンが、もっぱらＢ７－Ｈ３－Ｈｉｓへの強い結合能力を有することを見出し、数十の予備的抗体クローンを選択した。その一方で、特徴付けのために選択したＣＤ２７６－０３９Ｃ０５クローンの親和性を増大させるパニングを試みて、優れた抗体クローンをさらに確保した。
実施例２－６：陽性ファージ抗体のヌクレオチド配列分析
選択したモノクローンについて、ＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してファージミドＤＮＡを単離し、ヌクレオチド配列を分析した。重鎖および軽鎖のＣＤＲ３領域配列の分析の結果として、表３に示す通りのクローンを同定した。
Figure 0007247368000003

その一方で、重鎖および軽鎖のＣＤＲおよび可変領域のアミノ酸配列は、表４および５に記載の通りである。重鎖および軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの配列を下の表６に示す。
Figure 0007247368000004
Figure 0007247368000005
Figure 0007247368000006
Figure 0007247368000007
Figure 0007247368000008
実施例３；Ｂ７－Ｈ３ヒト抗体の産生
実施例３－１；ｓｃＦｖ形態からＩｇＧ形態への変換
実施例２で選択したモノクローナルファージ抗体をｓｃＦｖ形態からＩｇＧ形態に変換するために、制限酵素ＳｆｉＩ／ＮｈｅＩ部位を使用して重鎖可変領域のヌクレオチド配列をｐＮＡＴＶＨ（Ｙ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）にクローニングすることによりＮ２９３Ｆ ＨＣベクターを調製し、制限酵素ＳｆｉＩ／ＢｇｌＩＩ部位を使用して軽鎖可変領域のヌクレオチド配列をｐＮＡＴＶＬ（Ｙ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）にクローニングすることによりＮ２９３Ｆ ＬＣベクターを調製した。
実施例３－２：ヒト抗体の産生および精製
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にＮ２９３Ｆ ＨＣおよびＮ２９３Ｆ ＬＣベクターをコトランスフェクトし、培養の７日目に培養液を回収し、細胞および懸濁物質を遠心分離および０．２２μｍトップフィルター濾過によって除去し、次いで上清を併せ、プロテインＡビーズにより精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、抗Ｂ７－Ｈ３抗体の純度を分析した（図４）。
（１）プロテインＡクロマトグラフィー
培養液を８，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離して、細胞残屑を除去し、０．２２μｍの孔径を有するボトルトップフィルター（Ｓｔｅｒｉｔｏｐ－ＧＰ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ．＃ＳＣＧＰＳ０１ＲＥ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過した。その一方で、４ｍｌのプロテインＡセファロース樹脂スラリー（ＫＡＮＥＫＡ ＫａｎＣａｐＡ（商標）、カタログ番号ＫＫＣ２０１７０４０３＿０１）を空のカラム（＃ＢＲ７３１－１５５０、Ｂｉｏ－ｒａｄ）に入れ、次いで、樹脂を充填し、１００ｍｌのＤＰＢＳ（＃ＬＢ００１－０２）を用いて洗浄した。濾過した培地を、充填された樹脂上に負荷し、毎分１ｍｌの速度で流した（＃ＥＰ－１ Ｅｃｏｎｏポンプ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。１５０ｍｌのＤＰＢＳを用いて洗浄した後、それを、１０ｍｌの０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ３．３）を用いて溶出した。１０％の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を溶出物に添加してｐＨを中和し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１０（＃ＵＦＣ９０１０９６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して緩衝液をＤＰＢＳと交換した。このプロセスを約３回行なった後、それが約１ｍｌに濃縮されたらプロセスを中止し、濃度をＮａｎｏ－ｄｒｏｐにより測定した。
（２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
精製されたタンパク質の純度を確認するためにＳＤＳ－ＰＡＧＥを行なった。３μｇの精製されたタンパク質試料を５μＬの還元性試料緩衝剤および非還元性試料緩衝剤とそれぞれ混合し、１００℃で３分間、沸騰させた。１２％ゲルを泳動用タンク（＃１６５－８０２７、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に負荷し、１×泳動用緩衝液を、ゲルの内側に充填し、ゲルの外側の約１／３まで充填し、調製した試料を、泡の侵入を防止しながらピペットを使用してウェルに負荷した。４μＬのＡｃｃｕＢａｎｄ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒを、最も左側のウェルに負荷した。ゲルチャンバの上蓋を取り付け、電源に接続して２００Ｖ、１時間の条件で実行した。１時間後、ゲルをタンクから分離し、染色用緩衝液に浸漬し、攪拌機上で１時間染色した。その後、染色溶液を廃棄し、約１時間、脱色溶液とともに攪拌しながら脱色し、脱色溶液をもう一度交換して再度脱色した。脱色されたゲルを、蒸留水を用いて洗浄し、次いで、撮像デバイスを使用して画像を保存した。
（３）ウエスタンブロッティング
ＳＤＳ－ＰＡＧＥを１時間、（２）の場合と同様に実行し、次いで、ゲルをタンクから分離し、ＮＣ膜をゲルの下に配置し、カセットを固定し、転写用タンク（＃１６５－８０２７、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に入れ、転写緩衝液をその内部に充填し、次いで、約２時間、１１０Ｖで実行した。転写が完了したと予想されたとき、転写を停止し、ＮＣ膜を取り出し、ブロッキング溶液（１％脱脂乳／ＰＢＳ）を用いて室温で１時間、ブロッキングした。その後、二次抗体である抗ｈＦｃ－ＨＲＰ（＃３１４１３、Ｔｈｅｒｍｏ）および抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ（＃Ａ７０５８、Ｓｉｇｍａ）を、ブロッキング溶液を用いて１：４０００に希釈し、次いで、ＮＣ膜にかぶせ、室温で１時間、反応させた。ＮＣ膜を５回、各々１０ｍｌの１×ＰＢＳＴを用いて洗浄した。その後、ＥＣＬ溶液（＃１６０２４、Ｉｎｔｒｏｎ）をＮＣ膜上に散布し、次いで、Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ（ＵＶＩＴＥＣ、ミニＨＤ）を使用して、１秒、３０秒および１分の露光時間を用いて検出し、最良の画像を選択し、保存した。
実施例４：Ｂ７－Ｈ３モノクローナル抗体の特性
実施例４－１：細胞表面に発現されるヒトＢ７－Ｈ３への特異的結合力（ＦＡＣｓ）
ヒトＢ７－Ｈ３を発現する細胞の各々を、１試料当たり細胞０．５×１０６個になるように調製し、抗体の各々を特定の倍率に希釈し、次いで、調製した細胞と４℃で３０分間、反応させた。その後、２％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ（＃ＬＢ００１－０２、ｗｅｌｇｅｎｅ）を用いて細胞を３回洗浄し、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）蛍光物質を結合させた抗ヒトＩｇＧ抗体（＃ＦＩ－３０００、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）またはＰＥ－抗ｈＩｇＧ抗体（＃５５５７８７、ＢＤ）を使用して４℃で２０分間、反応させ、次いで、上記と同様に洗浄した。０．５ｍｌの２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ（＃２６１４０－０７９、Ｔｈｅｒｍｏ）に細胞を浮遊させ、次いで、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）であるフローサイトメーターを使用して結合力を分析した。結果として、Ｂ７－Ｈ３抗体は、細胞表面に発現されたＢ７－Ｈ３には濃度依存的に結合されるが、Ｂ７－Ｈ３抗体は、Ｂ７－Ｈ３が発現されないＲａｊｉ細胞、Ｂ７－Ｈ３がほとんど発現されないＪｕｒｋａｔ細胞、およびＢ７－Ｈ３がｓｈＲＮＡ（ＧＩＰＺヒトＣＤ２７６ ｓｈＲＮＡトランスフェクションスターターキット、＃Ｖ３ＬＨＳ＿３０６０２９、Ｔｈｅｒｍｏ）によってノックダウンされたＨＥＫ２９３Ｅ／ＫＤ細胞株には結合されないことを幾何平均値によって見出した（図６ａ～６ｄ、および下記表７）。各細胞株におけるＢ７－Ｈ３の発現は、ＰＥ蛍光物質を結合させた抗ヒトＣＤ２７６抗体（＃３３１６０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して測定した（図５）。
Figure 0007247368000009
実施例４－２：抗Ｂ７－Ｈ３抗体の熱安定性
示差走査蛍光定量法を使用して、抗体の熱安定性を試験した。抗体タンパク質をＤＰＢＳ中で希釈して３μＭ、４５μＬにし、５μＬの２００×シプロオレンジ染料（＃Ｓ６６５０、Ｔｈｅｒｍｏ）と混合し、５０μＬを各ｑＰＣＲチューブ（＃ＴＬＳ０８５１－白色、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に分取し、蓋（＃ＴＣＳ０８０３、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を閉めた。Ｂｉｏｒａｄ ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ装置を使用してｑＰＣＲを行なった。２５℃で３０秒間反応させ、次いで０．５分間、０．５℃刻みで９９℃までの各温度で反応させ、最後に２５℃で１０秒間反応させることにより、ｑＰＣＲを遂行した。融解温度（融解Ｔｍ）を、抗体構造の巻戻しについての速度定数として使用した。結果を下の表８に示す。
Figure 0007247368000010
実施例４－３：Ｂ７－Ｈ３抗原の親和性（ＯＣＴＥＴ）
Ｏｃｔｅｔ ＱＫ装置（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．）を使用してＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法）の原理に基づいて、Ｂ７－Ｈ３抗原への抗体の結合親和性を測定した。選択した抗Ｂ７－Ｈ３抗体を、ＡＨＣ（抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉）バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．）を用いて固定化し、各濃度に調製したヒトＢ７－Ｈ３抗原をそれに結合させ、親和性（ＫＤ）を得た。全ての緩衝液に、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．）を使用した。先ず、バイオセンサーを緩衝液に浸漬させてそれを安定化し、１０μｇ／ｍｌの濃度で緩衝液に溶解した抗Ｂ７－Ｈ３抗体を約５分間反応させ、ＡＨＣバイオセンサー上に固定化した。バイオセンサーを、緩衝液を用いて３～５分間洗浄して未固定抗体を除去し、各濃度（３０ｎＭ～０．２４ｎＭ）に調製したＢ７－Ｈ３抗原との結合反応を１０分間行い、次いで、解離反応を１０分間行なった。全ての実験を３０℃、１，０００ｒｐｍの条件で行い、センサーグラムデータを会合および解離プロセス中に経時的に収集した。Ｏｃｔｅｔデータ解析ソフトウェア９．０に従って、１：１グローバル結合フィッティングモデルに当てはめることにより、平衡解離定数（ＫＤ）を得た。結果として、ＫＤ値は、Ｂ７－Ｈ３抗原に対する高い親和性を示す０．０４～２．０ｎＭであった。結果を下の表９に示す。
Figure 0007247368000011
実施例４－４：Ｂ７－Ｈ３抗原に対する結合力（ＥＬＩＳＡ）
Ｈｉｓタグ付きＢ７－Ｈ３を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｎｉｃｋｅｌ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅ（＃１５１４２、ｐｉｅｒｃｅ）のウェルに入れ、室温で１時間、コーティングしたか、またはＦｃタグ付きＢ７－Ｈ３を、Ｉｍｍｕｎｅプレート（＃４３９４５４、Ｔｈｅｒｍｏ）のウェルに入れ、４℃で一晩コーティングした。マウスＢ７－Ｈ３（＃５０９７３－Ｍ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ）、ラットＢ７－Ｈ３（＃８０３８０－Ｒ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ）、カニクイザルＢ７－Ｈ３（＃９０８０６－Ｃ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ）、およびヒトＢ７－Ｈ３（＃Ｓ１４３５、Ｙ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、抗原として使用した。洗浄溶液（０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ（＃Ｐ９４１６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））を用いて３回洗浄した後、条件に依存して、３００μＬのブロッキング溶液である４％脱脂乳（＃２３２１２０、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）／ＰＢＳを添加し、室温で１時間放置して、非特異的結合をブロックした。特定の希釈倍率で段階的に希釈された抗体を添加し、室温で１時間揺動することにより反応させた。それを同様に洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトカッパ抗体（＃Ａ７１６４、Ｓｉｇｍａ）を添加し、室温で１時間放置した。洗浄溶液を用いて５回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（＃Ｔ０４４０－１Ｌ、Ｓｉｇｍａ）を添加し、室温で少なくとも３分間、遮光条件下で反応させ、発色を確認し、１規定硫酸溶液（＃Ｓ１４７８、Ｓａｍｃｈｕｎ）を添加することにより反応を停止させた。分光光度計（＃ＧＭ３０００、ＰｒｏｍｅｇａまたはＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。選択したモノクローナルＢ７－Ｈ３抗体は、ヒトＢ７－Ｈ３抗原に対してばかりでなく、マウス、ラットおよびカニクイザルＢ７－Ｈ３抗原に対しても、濃度関連結合力を有することを見出した（図７ａ～７ｅ）。
実施例４－５：ｐＨによるＦｃＲＮに対する結合力（ＥＬＩＳＡ）
ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ（＃１５５０８、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してビオチンをＦＣＧＲＴ ＆ Ｂ２Ｍ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒタンパク質（＃ＣＴ００９－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ）にコンジュゲートさせ、次いで、０．５ｍｇ／ｍＬを調製し、１００ｕＬを、オボアルブミン（＃Ａ５５０３、Ｓｉｇｍａ）でブロックされたＰｉｅｒｃｅ（商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）Ｃｏａｔｅｄ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｐｌａｔｅの各ウェルに入れ、揺動させながら室温で２時間コーティングした。ｐＨ６．０およびｐＨ７．２に滴定したリン酸ナトリウム溶液を用いて各ウェルを３回洗浄し、次いで、各溶液中で特定の倍率に希釈した１００ｕｌの抗体を各ウェルに入れ、揺動しながら室温で１時間反応させた。各溶液を用いて３回洗浄した後、１００ｕＬの１：５０００希釈Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（＃１０９－０３６－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ）を各ウェルに入れ、揺動しながら室温で１時間反応させた。ｐＨ６．０リン酸ナトリウム溶液を用いてそれを３回洗浄し、ＴＭＢ基質を添加し、遮光条件下で反応させた。色の変化が観察されたら、０．５Ｍ／Ｌの硫酸溶液を用いて反応を停止させた。Ｇｌｏｍａｘ（商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒシステム（＃ＧＭ３０００、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、ｐＨ６．０においてのみ濃度依存的にＦｃＲＮ－Ｂ２Ｍ複合体に結合するがｐＨ７．２においては結合しないことを見出した（図８）。
実施例４－６：７－Ｈ３抗原－抗体複合体のエンドサイトーシス（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ）
Ｃａｌｕ－６細胞株を、細胞１、２または４×１０５個になるように、１ｍｌの成長培地（ＲＰＭＩ１６４０（＃Ａ１０４９１－０１、Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ（＃２６１４０－０７９、Ｇｉｂｃｏ）、１× Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（＃１５２４０－０６２、Ｇｉｂｃｏ）、１００× ＭＥＭ ＮＥＡＡ（＃１１１４０－０５０、Ｇｉｂｃｏ））を用いて希釈し、次いで、５０μＬを９６ウェルプレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに入れ、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で少なくとも２４時間培養した。Ａ４９８細胞株を、細胞１、２または４×１０４個になるように、１ｍｌの成長培地｛ＤＭＥＭ（＃ＳＨ３０２４３．０１、Ｈｙｃｌｏｎ（商標））、１０％ＦＢＳ（＃２６１４０－０７９、Ｇｉｂｃｏ）、１× Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（＃１５２４０－０６２、Ｇｉｂｃｏ）、１００× ＭＥＭ ＮＥＡＡ（＃１１１４０－０５０、Ｇｉｂｃｏ）｝にて希釈し、次いで、５０μＬを９６ウェルプレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに入れ、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で少なくとも２４時間培養した。その一方で、試験することになる抗体とＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）ＦａｂＦｌｕｏｒ Ｒｅｄ（＃４７２２、ｅｓｓｅｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を１：３のモル比で混合し、３７℃で１５分間放置し、次いで、５０μＬを、細胞を含むウェルに注意深く添加した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ（ｅｓｓｅｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を装備したＣＯ２インキュベーターにプレートを入れ、内在化を観察した。スキャン条件として、倍率１００または２００倍で２４時間、３０分間隔で測定を行なったが、各ウェルについて時間ごとに４画像をスキャンした。スキャンした画像をＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ ２０１６Ｂプログラムで編集し、Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭの非線形フィットの中の１位相結合関数を使用して解析した（図９ａ）。あるいは、少なくとも２４時間培養した後、Ｇｌｏｍａｘ（商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒシステム（＃ＧＭ３０００、Ｐｒｏｍｅｇａ）における蛍光フィルター（励起－６２７ｎｍ、発光－６６０～７２０ｎｍ）を用いて赤色蛍光強度を測定した（図９ｂ）。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ ＦａｂＦｌｏｕｒ Ｒｅｄ試薬は、中性ｐＨにおいて蛍光を示さないがそれが酸性ｐＨになると赤色蛍光を発光するという特性を有する。抗体は、細胞表面のＢ７－Ｈ３抗原に結合され、次いで、エンドソームによってエンドサイトーシスされ、それがリソソームと融合されると、酸性ｐＨ（約４．７）環境に曝露されるため、強い赤色蛍光を発光する。抗Ｂ７－Ｈ３抗体を用いて処理した後に細胞内部の色が赤い細胞が経時的に増加されることを見出した（赤色オブジェクト数／ウェルまたは総赤色オブジェクト面積、ｕｍ２／ウェル）。このことから、細胞表面のＢ７－Ｈ３は抗体のエンドサイトーシスの標的であること、および抗Ｂ７－Ｈ３抗体のエンドサイトーシスは経時的に増加されることがわかる。
実施例４－７：Ｂ７－Ｈ３抗原－抗体複合体のエンドサイトーシス（ＦａｂＺＡＰ）
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍのＦａｂＺＡＰ抗体内在化キット（＃ＩＴ－５１）を使用して、抗体のエンドサイトーシスをその細胞傷害効果について確認した。サポリンは、リボソーム阻害剤であり、エンドサイトーシスされて放出されると細胞傷害性を引き起こす。サポリンコンジュゲートＦａｂＺＡＰタンパク質を成長培地中で４５ｎＭに希釈し、この溶液を用いて抗体を特定の比率で希釈し、次いで、室温で１５分間放置して、サポリンがコンジュゲートされるように反応させた。陰性対照群として使用することになるサポリンを１０ｕＭ溶液として調製し、次いで、特定の比率での連続希釈により調製し、別の陰性対象群である対象－ＳＡＰを１００ｎＭ溶液として調製し、次いで、特定の比率での希釈により調製した。各物質を用いて処理する前日に、Ａ４９８腎がん細胞株を、成長培地を用いて希釈し、９６ウェル培養プレートに１×１０３／ウェルで播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で少なくとも１６時間培養した。抗体および各物質を用いて７２時間処理した後、ＰＢＳ中で調製した５０ｕＬのＸＴＴ基質溶液を各ウェルに入れ、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で２時間反応させ、次いで、ＧｌｏＭａｘ（商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用して４５０ｎｍにて吸光度を測定した。サポリン物質は、細胞膜を透過することができないため、細胞傷害性を示さず、特異的抗原結合のない対照－ＳＡＰは、細胞成長に対して影響を与えなかった。対照的に、ＦａｂＺＡＰコンジュゲート抗Ｂ７－Ｈ３抗体の細胞傷害効果は、抗体の濃度が増加するにつれて増大されることも見出した。これは、Ａ４９８細胞株の表面に発現されたＢ７－Ｈ３に結合される抗Ｂ７－Ｈ３抗体が細胞に導入され、リソソームから放出されたサポリンによって、細胞傷害性が引き起こされたことを示す（図１０）。
本発明による抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトまたは非ヒトＢ７－Ｈ３に高い親和性で結合することができ、それに結合した後、エンドサイトーシスされ得る。したがって、抗Ｂ７－Ｈ３抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそれを含む抗体－薬物コンジュゲートもしくは多重特異性抗体を、がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患の予防、処置または診断に有利に使用することができる。
本発明の特定の部分を上で詳細に説明したが、この特定の説明が好ましい実施形態に過ぎないこと、および本発明の範囲がそれに限定されないことは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲が添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物により定義されることを意図している。

Claims (15)

  1. 配列番号１の重鎖ＣＤＲ（相補性決定領域）１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３；
    配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３；
    配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３；
    配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ３；
    配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３；
    配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３；
    配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ３；
    配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ３；
    配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３；または
    配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ３
    を含む、抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片。
  2. 配列番号３７、３９、４１または４３の重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片。
  3. 配列番号３８、４０、４２、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片。
  4. 請求項１から３のいずれか一項に記載の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片をコードする、核酸。
  5. 請求項４に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
  6. 請求項５に記載の組換え発現ベクターを用いて形質転換された細胞。
  7. 動物細胞、植物細胞、酵母細胞、大腸菌細胞および昆虫細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の細胞。
  8. ＣＯＳ－７（サル腎臓細胞７）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＭＤＣＫ細胞、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ ７８細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ならびに大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス属種、シュードモナス属種、プロテウス・ミラビリス、ブドウ球菌属種、コウジカビ属種、ピキア・パストリス、出芽酵母、ジゾサッカロミセス属種およびアカパンカビの細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の細胞。
  9. 抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片を調製する方法であって、
    （ｉ）請求項６に記載の細胞を培養すること、および
    （ｉｉ）得られた細胞培養液から抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合性断片を回収すること
    を含む方法。
  10. 請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と薬物とを含む、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
  11. 請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、多重特異性抗体。
  12. がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患を予防または処置するための医薬組成物であって、請求項１に記載の抗Ｂ７－Ｈ３抗体もしくはその抗原結合性断片、請求項１０に記載の抗体－薬物コンジュゲート、または請求項１１に記載の多重特異性抗体を活性成分として含み、かつ薬学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物。
  13. 前記がんまたは腫瘍が、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、腎臓がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、頭頸部がん、黒色腫、神経膠芽腫、および神経芽細胞腫からなる群から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 前記自己免疫疾患または炎症性疾患が、喘息、関節リウマチおよび多発性硬化症からなる群から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
  15. がんもしくは腫瘍、自己免疫疾患、または炎症性疾患を診断するための組成物であって、請求項１に記載の抗Ｂ７－Ｈ３抗体もしくはその抗原結合性断片、請求項１０に記載の抗体－薬物コンジュゲート、または請求項１１に記載の多重特異性抗体を含む、組成物。
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