JPWO2008044754A1 - 癌の予防・治療剤 - Google Patents

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Abstract

配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するヒトモノクローナル抗体は、癌などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤などとして有用である。

Description

本発明は、Ｎｅｃｔｉｎ−２に対するモノクローナル抗体およびその用途、具体的には、癌の予防・治療剤または診断薬、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤などに関する。
癌において、遺伝子のマイクロアレイプロファイリングデータでその病態が評価しうることが予見され、実際、白血病においては遺伝子発現プロファイルによる白血病の分類が可能であることが報告されている。また個々の癌組織の遺伝子発現プロファイルを明らかにし、その分類を積み重ねることによって、特定の癌治療法に対する反応性を予測したり特定の癌に対する新たな創薬標的タンパク質を発見したりすることが可能となると考えられる。具体的には、ある種の癌においてある種のタンパク質の発現亢進が認められる場合には、新たに抗原陽性と診断された患者に対して（ｉ）該タンパク質の発現量を低下させる、（ｉｉ）該タンパク質の機能を抑制する、（ｉｉｉ）該タンパク質に対する宿主免疫応答を顕在化させる等の方法によって抗腫瘍活性を導くことが可能となる。これと同時に、抗原陰性と診断された患者に対しては別の治療法への切替が迅速に行えるなど、患者に無用な負担をかける懸念がなくなると予想される。以上のように発現プロファイル解析は、癌の分子診断と分子標的治療薬の開発に多大な貢献をなしうるものと期待されている。
Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２８５６）およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子（ＥＭＢＬ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ８００３８）は、ヒト白血病細胞株ＴＦ−１由来のｃＤＮＡからクローニングされた遺伝子であり、それぞれ４７９アミノ酸および５３８アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００２８４７およびＥＭＢＬ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＡ５６３４２）。Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子は、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子のスプライシングバリアントであり、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子によってコードされるタンパク質はＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子によってコードされるタンパク質の１番目から３５０番目までのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有しているが、３５１番目よりＣ末端側のアミノ酸配列が異なっている。さらに、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＣ００９０８８およびＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００８９９０）がマウスＥＳ細胞由来のライブラリーからクローニングされており、これらはそれぞれ４６７アミノ酸および５３０アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＨ０９０８８およびＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３３０１６）。これらのマウスＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子はヒトＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子に対して塩基配列でそれぞれ約７２％および約７２％、アミノ酸配列でそれぞれ約６９％および約７３％の相同性を有している。Ｎｅｃｔｉｎ−２αおよびＮｅｃｔｉｎ−２δ（以下、Ｎｅｃｔｉｎ−２と総称することもある）はＰＶＲＬ２、ＰＲＲ２、ＰＶＲＲ２、ＨｖｅＢ、ＣＤ１１２などの異名を持つタンパク分子であり、Ｎｅｃｔｉｎ−１、Ｎｅｃｔｉｎ−２、Ｎｅｃｔｉｎ−３、およびＮｅｃｔｉｎ−４の４つのメンバーから構成されるＮｅｃｔｉｎファミリーに属している。Ｎｅｃｔｉｎファミリーは（以下、これらをＮｅｃｔｉｎと総称することもある）。またＮｅｃｔｉｎ様の構造を有する膜タンパク質としてＮｅｃ１−１、Ｎｅｃ１−２、Ｎｅｃ１−３、Ｎｅｃ１−４およびＮｅｃ１−５が知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４），２７９（１７），ｐ１８０１５−ｐ１８０２５）。
Ｎｅｃｔｉｎは免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、細胞外領域に３つの免疫グロブリン様ループを有する一回膜貫通型糖タンパク質である。Ｎｅｃｔｉｎ分子は細胞膜上でシス二量体を形成し、隣接する細胞の細胞膜上のシス二量体同士がトランス結合することにより、Ｃａ２＋濃度とは無関係な様式で上皮細胞同士、あるいはセルトリ細胞と精子細胞との細胞間接着を制御していると考えられている（蛋白質 核酸 酵素（２００３），４８（２），ｐ１０５−ｐ１１２；Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２００２），１２，ｐ１１４５−ｐ１１５０）。また、Ｎｅｃｔｉｎ−１とＮｅｃｔｉｎ−３はトランス結合により神経シナプス形成に関わるとの報告がある（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００２），１５６，ｐ５５５−ｐ５６５）。Ｎｅｃｔｉｎのトランス結合は同一の分子間でホモフィリックに形成されるが、Ｎｅｃｔｉｎ−１とＮｅｃｔｉｎ−３、Ｎｅｃｔｉｎ−１とＮｅｃｔｉｎ−４、Ｎｅｃｔｉｎ−２とＮｅｃｔｉｎ−３およびＮｅｃｔｉｎ−３とＮｅｃ１−５との間の様にヘテロフィリックなトランス結合も形成されることが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００２），２７７（３０），ｐ２７００６−ｐ２７０１３）。また、Ｎｅｃｔｉｎは細胞内にあるＣ末端領域でアファディンに結合し、この分子を介してアクチン細胞骨格に連結することが知られている（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．（２００３），１１６（１），ｐ１７−ｐ２７）。
細胞接着以外のＮｅｃｔｉｎの生理的機能としては、例えばＮｅｃｔｉｎ−１はヘルペスウイルス上に発現しているｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＤに対する受容体として働き、ヘルペスウイルスが細胞に侵入する際の足場として機能していると報告されている（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．（２００３），１１６（１），ｐ１７−ｐ２７）。また、Ｎｅｃｔｉｎ−２はナチュラルキラー細胞上に発現するＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）のリガンドの１つであり、ＤＮＡＭ−１を発現するナチュラルキラー細胞は標的細胞上に発現するＮｅｃｔｉｎ−２を足場として細胞傷害活性を発揮すると考えられている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００３），１９８（４），ｐ５５７−ｐ５６７）。この他、Ｎｅｃｔｉｎ−２は癌抑制遺伝子ｐ５３経路に関与する遺伝子の１つ（ＷＯ０２／９９０４０号公報）、血管新生疾患、癌、ウイルス感染の治療に有用なタンパク質Ｎｅｃｔｉｎ−３に結合するタンパク質（ＷＯ０２／２８９０２号公報）、ウイルス感染に関与する受容体（ＷＯ９９／６３０６３号公報）、乳癌や卵巣癌の診断と治療に有用な遺伝子のうちの１つ（ＷＯ０２／００６７７号公報）、種々の癌で発現亢進し抗腫瘍性抗体医薬の標的として有望な１６種類の遺伝子の中の１つ（ＷＯ０３／０８８８０８号公報）、ならびに癌組織で発現亢進し癌の診断、予防に有望な遺伝子の１つ（ＷＯ０４／０３０６１５号公報）として報告されている。癌組織で発現が顕著に増加する遺伝子としてＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子が見出され、この遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが癌細胞のアポトーシスを促進することが報告されている（ＷＯ２００５／０９７２０４号公報）。
Ｎｅｃｔｉｎ−２に対するモノクローナル抗体としては、ヒトＮｅｃｔｉｎ−２に対するマウスまたはラットモノクロナール抗体（Ｂｌｏｏｄ（１９９８），９２（１２），ｐ４６０２−ｐ４６１１；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４（３）ｐ１２６７−ｐ１２７４；Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００４）１６（４），ｐ５３３−ｐ５３８；Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５）４２，ｐ４６３−ｐ４６９；ＪＥＭ（２００３）１９８（４），ｐ５５７−ｐ５６７；Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）２４６，ｐ１７９−ｐ１８９；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１）７５（２）ｐ１１１８５−ｐ１１１９５；ＦＥＢＳ（２００５）５７９，ｐ２２４３−ｐ２２４９）やマウスＮｅｃｔｉｎ−２に対するモノクローナル抗体（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１）７５（２）ｐ１１１８５−ｐ１１１９５；ＪＢＣ（２００１）２７６，ｐ４８３５０−ｐ４８３５５；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９９）１８，ｐ１６０９−ｐ１６１７；ＪＣＢ（１９９９）１４５，ｐ５３９−ｐ５４９；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．（１９９７）２３５，ｐ３７４−ｐ３８４）が報告されているが、これらの抗体の癌細胞の増殖抑制活性については記載されていない。
現行の抗がん剤はいずれも副作用を伴い、医療現場に置いては癌細胞に対し特異的に作用し、正常組織への影響ができるだけ少なく癌細胞の増殖阻害のみを誘導する安全な薬剤が切望されている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、癌組織で発現が顕著に増加する遺伝子としてＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子を見出し、この遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが癌細胞のアポトーシスを促進することも見出した。さらに、Ｎｅｃｔｉｎ−２に対するモノクローナル抗体の作製に成功し、当該モノクローナル抗体が優れた癌細胞増殖抑制活性などを有することを見出した。本発明者らはこの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕配列番号：１（Ｎｅｃｔｉｎ−２α）または配列番号：３（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体、
〔２〕配列番号：３（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体である上記〔１〕記載の抗体、
〔３〕ヒトモノクローナル抗体である上記〔１〕記載の抗体、
〔４〕キメラモノクローナル抗体である上記〔１〕記載の抗体、
〔５〕ヒト化モノクローナル抗体である上記〔１〕記載の抗体、
〔６〕抗体の定常領域がヒトＩｇＧ１サブクラスに属するモノクローナル抗体である上記〔１〕記載の抗体、
〔７〕癌細胞増殖阻害活性を有する上記〔１〕記載の抗体、
〔８〕抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有する上記〔１〕記載の抗体、
〔９〕Ｎｅｃｔｉｎ−２／Ｎｅｃｔｉｎ−３またはＮｅｃｔｉｎ−２／Ｎｅｃｔｉｎ−２トランス結合阻害活性を有する上記〔１〕記載の抗体、
〔１０〕配列番号：１（Ｎｅｃｔｉｎ−２α）または配列番号：３（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）で表されるアミノ酸配列の、１−３５０番目（細胞外領域）のアミノ酸配列に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体である上記〔１〕記載の抗体、
〔１１〕配列番号：１（Ｎｅｃｔｉｎ−２α）または配列番号：３（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）で表されるアミノ酸配列の、４７−１４２番目（第１のＩＧ様ドメイン）または１７５−２４０番目（第２のＩＧ様ドメイン）のアミノ酸配列に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体である上記〔１〕記載の抗体、
〔１２〕配列番号：１（Ｎｅｃｔｉｎ−２α）または配列番号：３（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）で表されるアミノ酸配列の、第７５，７６，７７，７８，９５，１３７，１４５，１７３，１８４，１８６及び２１２番目の少なくとも１つのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体である上記〔１〕記載の抗体、
〔１３〕配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対して、Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する上記〔１〕記載の抗体、
〔１４〕Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を認識する上記〔１〕記載の抗体、
〔１５〕上記〔１〕記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
〔１６〕Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示される上記〔１５〕記載のハイブリドーマ細胞、
〔１７〕上記〔１６〕記載のハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体、
〔１８〕組換え型モノクローナル抗体である上記〔１〕記載の抗体、
〔１９〕抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号：１８４，２００，２１６，２３２，２４８，２６４，２８０および２９６からなる群より選択される１種の配列番号、（ｉｉ）配列番号：１８５，２０１，２１７，２３３，２４９，２６５，２８１および２９７からなる群より選択される１種の配列番号および（ｉｉｉ）配列番号：１８６，２０２，２１８，２３４，２５０，２６６，２８２および２９８からなる群より選択される１種の配列番号、で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔１〕記載の抗体、
〔１９ａ〕抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：１８４、配列番号：１８５および配列番号：１８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔１９〕記載の抗体、
〔１９ｂ〕抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２００、配列番号：２０１および配列番号：２０２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔１９〕記載の抗体、
〔１９ｃ〕抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２１６、配列番号：２１７および配列番号：２１８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔１９〕記載の抗体、
〔１９ｄ〕抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２３２、配列番号：２３３および配列番号：２３４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔１９〕記載の抗体、
〔１９ｅ〕抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２４８、配列番号：２４９および配列番号：２５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔１９〕記載の抗体、
〔１９ｆ〕抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２６４、配列番号：２６５および配列番号：２６６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔１９〕記載の抗体、
〔１９ｇ〕抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２８０、配列番号：２８１および配列番号：２８２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔１９〕記載の抗体、
〔１９ｈ〕抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２９６、配列番号：２９７および配列番号：２９８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔１９〕記載の抗体、
〔２０〕抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉｖ）配列番号：１９２，２０８，２２４，２４０，２５６，２７２，２８８および３０４からなる群より選択される１種の配列番号、（ｖ）配列番号：１９３，２０９，２２５，２４１，２５７，２７３，２８９および３０５からなる群より選択される１種の配列番号および（ｖｉ）配列番号：１９４，２１０，２２６，２４２，２５８，２７４，２９０および３０６からなる群より選択される１種の配列番号、で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔１〕記載の抗体、
〔２０ａ〕抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：１９２、配列番号：１９３および配列番号：１９４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔２０〕記載の抗体、
〔２０ｂ〕抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２０８、配列番号：２０９および配列番号：２１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔２０〕記載の抗体、
〔２０ｃ〕抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２２４、配列番号：２２５および配列番号：２２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔２０〕記載の抗体、
〔２０ｄ〕抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２４０、配列番号：２４１および配列番号：２４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔２０〕記載の抗体、
〔２０ｅ〕抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２５６、配列番号：２５７および配列番号：２５８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔２０〕記載の抗体、
〔２０ｆ〕抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２７２、配列番号：２７３および配列番号：２７４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔２０〕記載の抗体、
〔２０ｇ〕抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：２８８、配列番号：２８９および配列番号：２９０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔２０〕記載の抗体、
〔２０ｈ〕抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号：３０４、配列番号：３０５および配列番号：３０６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記〔２０〕記載の抗体、
〔２１〕配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体を含有してなる診断剤、
〔２２〕癌の診断剤である上記〔２１〕記載の診断剤、
〔２３〕配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体を含有してなる医薬、
〔２４〕癌の予防・治療剤である上記〔２３〕記載の医薬、
〔２５〕癌細胞のアポトーシス促進剤である上記〔２３〕記載の医薬、
〔２６〕癌細胞の増殖阻害剤である上記〔２３〕記載の医薬、
〔２７〕抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤である上記〔２３〕記載の医薬、
〔２８〕哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法、
〔２９〕哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進方法、
〔３０〕哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法、
〔３１〕哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与することを特徴とする、抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害方法、
〔３２〕癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の使用、
〔３３〕癌細胞のアポトーシス促進剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の使用、
〔３４〕癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の使用、
〔３５〕抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の使用、
〔３６〕 Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤、
〔３７〕 Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体とＮｅｃｔｉｎ−２に対して競合的に結合するモノクローナル抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤、
〔３８〕 Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体とＮｅｃｔｉｎ−２に対して競合的に結合するモノクローナル抗体が、Ｎｅｃ１−１０４４−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０５）またはＮｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）である上記〔３７〕に記載の乳癌の予防または治療剤、
〔３９〕 Ｎｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体とＮｅｃｔｉｎ−２に対して競合的に結合するモノクローナル抗体が、Ｎｅｃ８−３７０４−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０７）またはＮｅｃ８−３５１７−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０６）である上記〔３７〕に記載の乳癌の予防または治療剤、
〔４０〕 抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用するものである上記〔３６〕または〔３７〕に記載の乳癌の予防または治療剤、
〔４１〕 抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号：１８４，２００，２１６，２３２，２４８，２６４，２８０および２９６からなる群より選択される配列番号、（ｉｉ）配列番号：１８５，２０１，２１７，２３３，２４９，２６５，２８１および２９７からなる群より選択される配列番号および（ｉｉｉ）配列番号：１８６，２０２，２１８，２３４，２５０，２６６，２８２および２９８からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤、
〔４２〕 抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉｖ）配列番号：１９２，２０８，２２４，２４０，２５６，２７２，２８８および３０４からなる群より選択される配列番号、（ｖ）配列番号：１９３，２０９，２２５，２４１，２５７，２７３，２８９および３０５からなる群より選択される配列番号および（ｖｉ）配列番号：１９４，２１０，２２６，２４２，２５８，２７４，２９０および３０６からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤、
〔４３〕 抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号：１８４，２００，２１６，２３２，２４８，２６４，２８０および２９６からなる群より選択される配列番号、（ｉｉ）配列番号：１８５，２０１，２１７，２３３，２４９，２６５，２８１および２９７からなる群より選択される配列番号および（ｉｉｉ）配列番号：１８６，２０２，２１８，２３４，２５０，２６６，２８２および２９８からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉｖ）配列番号：１９２，２０８，２２４，２４０，２５６，２７２，２８８および３０４からなる群より選択される配列番号、（ｖ）配列番号：１９３，２０９，２２５，２４１，２５７，２７３，２８９および３０５からなる群より選択される配列番号および（ｖｉ）配列番号：１９４，２１０，２２６，２４２，２５８，２７４，２９０および３０６からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、及び抗体定常領域含む抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤、
〔４４〕 Ｎｅｃ１−１０４４−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０５）、Ｎｅｃ８−３５１７−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０６）またはＮｅｃ８−３７０４−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０７）で表示されるハイブリドーマ細胞、
〔４５〕 上記〔４４〕に記載のハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体、
〔４６〕 Ｎｅｃ１−１０４４−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０５）、Ｎｅｃ８−３５１７−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０６）またはＮｅｃ８−３７０４−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０７）で表示されるハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合するモノクローナル抗体、
〔４７〕 上記〔４５〕または〔４６〕に記載のモノクローナル抗体を含有してなる、乳癌の予防または治療剤、
〔４８〕 抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号：１８４，２００，２１６，２３２，２４８，２６４，２８０および２９６からなる群より選択される配列番号、（ｉｉ）配列番号：１８５，２０１，２１７，２３３，２４９，２６５，２８１および２９７からなる群より選択される配列番号および（ｉｉｉ）配列番号：１８６，２０２，２１８，２３４，２５０，２６６，２８２および２９８からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列を含む抗体と競合的に結合する抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤、
〔４９〕 抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉｖ）配列番号：１９２，２０８，２２４，２４０，２５６，２７２，２８８および３０４からなる群より選択される配列番号、（ｖ）配列番号：１９３，２０９，２２５，２４１，２５７，２７３，２８９および３０５からなる群より選択される配列番号および（ｖｉ）配列番号：１９４，２１０，２２６，２４２，２５８，２７４，２９０および３０６からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列を含む抗体と競合的に結合する抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤、
〔５０〕 抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号：１８４，２００，２１６，２３２，２４８，２６４，２８０および２９６からなる群より選択される配列番号、（ｉｉ）配列番号：１８５，２０１，２１７，２３３，２４９，２６５，２８１および２９７からなる群より選択される配列番号および（ｉｉｉ）配列番号：１８６，２０２，２１８，２３４，２５０，２６６，２８２および２９８からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列、抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉｖ）配列番号：１９２，２０８，２２４，２４０，２５６，２７２，２８８および３０４からなる群より選択される配列番号、（ｖ）配列番号：１９３，２０９，２２５，２４１，２５７，２７３，２８９および３０５からなる群より選択される配列番号および（ｖｉ）配列番号：１９４，２１０，２２６，２４２，２５８，２７４，２９０および３０６からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列、及び抗体定常領域を含む抗体と競合的に結合する抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤である。
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体は例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤、抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤、抗体依存性の癌細胞傷害剤などとして安全に使用することができる。
図１は、実施例１で得られた本発明の抗体のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：１８７、２０３、２１９、２３５、２５１、２６７、２８３及び２９９）およびＬ鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：１９５、２１１、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１及び３０７）を示す。
図２は、実施例１で得られた本発明の抗体のＨ鎖可変領域の塩基配列（配列番号：１９１、２０７、２２３、２３９、２５５、２７１、２８７及び３０３）を示す。
図３は、実施例１で得られた本発明の抗体のＬ鎖可変領域の塩基配列（配列番号：１９９、２１５、２３１、２４７、２６３、２７９、２９５及び３１１）を示す。
図４は、実施例２３における癌細胞株移植後の腫瘍体積平均値の経実的変化を示す。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、Ｎｅｃｔｉｎ−２αと略記する）または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、Ｎｅｃｔｉｎ−２δと略記する）（以下、両者を併せてＮｅｃｔｉｎ−２または本発明のタンパク質と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、本発明のタンパク質の活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
また、Ｎｅｃｔｉｎ−２としては、例えば、（ｉ）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
Ｎｅｃｔｉｎ−２がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるＮｅｃｔｉｎ−２に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、Ｎｅｃｔｉｎ−２には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
Ｎｅｃｔｉｎ−２の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ−２α）、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）などがあげられる。
Ｎｅｃｔｉｎ−２の部分ペプチドとしては、前記したＮｅｃｔｉｎ−２の部分ペプチドであって、好ましくは、前記したＮｅｃｔｉｎ−２と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、Ｎｅｃｔｉｎ−２の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられるＮｅｃｔｉｎ−２の部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、Ｎｅｃｔｉｎ−２の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、Ｎｅｃｔｉｎ−２の部分ペプチドには、前記したＮｅｃｔｉｎ−２と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
Ｎｅｃｔｉｎ−２またはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のＮｅｃｔｉｎ−２もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体（以下、本発明の抗体と略記することがある）は、Ｎｅｃｔｉｎ−２もしくはその部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、いかなるモノクローナル抗体であってもよい。なかでも、ヒトモノクローナル抗体が好ましく用いられる。
また、本発明の抗体としては、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ、もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体（特に、ヒトモノクローナル抗体）が好ましい。
さらに、本発明の抗体としては、以下の（１）〜（８）の特徴の少なくとも１つを有する抗体が好ましく用いられる。
（１）癌細胞（例えば、ヒト癌細胞ＯＶ−９０）の増殖阻害活性を有する。
（２）抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有する。
（３）Ｎｅｃｔｉｎ−２のシス結合阻害活性を有する。具体的には、
（ｉ）Ｎｅｃｔｉｎ−２αのホモなシス結合を阻害する、
（ｉｉ）Ｎｅｃｔｉｎ−２δのホモなシス結合を阻害する、または
（ｉｉｉ）Ｎｅｃｔｉｎ−２αとＮｅｃｔｉｎ−２δとのヘテロなシス結合を阻害する。
（４）Ｎｅｃｔｉｎ−２／Ｎｅｃｔｉｎ−３またはＮｅｃｔｉｎ−２／Ｎｅｃｔｉｎ−２のトランス結合阻害活性を有する。具体的には、
（ｉ）Ｎｅｃｔｉｎ−２αのホモなシス二量体と、Ｎｅｃｔｉｎ−２αのホモなシス二量体とのトランス結合を阻害する、
（ｉｉ）Ｎｅｃｔｉｎ−２αのホモなシス二量体と、Ｎｅｃｔｉｎ−２δのホモなシス二量体とのトランス結合を阻害する、
（ｉｉｉ）Ｎｅｃｔｉｎ−２αのホモなシス二量体と、Ｎｅｃｔｉｎ−２αとＮｅｃｔｉｎ−２δとのヘテロなシス二量体とのトランス結合を阻害する、
（ｉｖ）Ｎｅｃｔｉｎ−２αのホモなシス二量体と、Ｎｅｃｔｉｎ−３のホモなシス二量体とのトランス結合を阻害する、
（ｖ）Ｎｅｃｔｉｎ−２δのホモなシス二量体と、Ｎｅｃｔｉｎ−２δのホモなシス二量体とのトランス結合を阻害する、
（ｖｉ）Ｎｅｃｔｉｎ−２δのホモなシス二量体と、Ｎｅｃｔｉｎ−２αとＮｅｃｔｉｎ−２δとのヘテロなシス二量体のトランス結合を阻害する、
（ｖｉｉ）Ｎｅｃｔｉｎ−２δのホモなシス二量体と、Ｎｅｃｔｉｎ−３のホモなシス二量体とのトランス結合を阻害する、
（ｖｉｉｉ）Ｎｅｃｔｉｎ−２αとＮｅｃｔｉｎ−２δとのヘテロなシス二量体と、Ｎｅｃｔｉｎ−３のホモなシス二量体とのトランス結合を阻害する、
（ｉｘ）Ｎｅｃｔｉｎ−２αとＮｅｃｔｉｎ−２δとのヘテロなシス二量体と、Ｎｅｃｔｉｎ−２αとＮｅｃｔｉｎ−２δとのヘテロなシス二量体とのトランス結合を阻害する。
（５）実施例４で示したエピトープグループＩ〜ＶＩＩまたは実施例１８で示したエピトープサブグループの何れかに属する。好ましくは、実施例４のエピトープグループＩＶ、ＶＩまたはＶＩＩに属する。より好ましくは実施例１８のエピトープサブグループＩＶｂ、ＶＩｂまたはＶＩＩａに属する。
（６）Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、
Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、
Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、
Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、
Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、
Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、
Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）
Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）
Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）
Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）
Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）または
Ｎｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）
で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体（表４のエピトープグループＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩに属する抗体）が認識するアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を認識する。
ここで、「Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５））で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体（表４のエピトープＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩに属する抗体）が認識するアミノ酸配列（以下、エピトープ部位と略記する）と同一または実質的に同一のアミノ酸配列」の「エピトープ部位と実質的に同一のアミノ酸配列」とは、（ｉ）当該エピトープ部位のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１０個程度、好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）当該エピトープ部位のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）当該エピトープ部位のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）当該エピトープ部位のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などが挙げられる。上記のアミノ酸配列の挿入、付加、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
より具体的には、「エピトープ部位と実質的に同一のアミノ酸配列」としては、エピトープ部位の近傍のアミノ酸配列が挙げられ、例えば、（ｉ）エピトープ部分のＮ末端側に１または２個以上（例えば１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉ）エピトープ部分のＣ末端側に１または２個以上（例えば１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）エピトープ部分のＮ末端側のアミノ酸配列（例えば１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｖ）エピトープ部分のＣ末端側のアミノ酸配列（例えば１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列などが挙げられる。
例えば、「Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５））で表示されるハイブリドーマ細胞により産生される各モノクローナル抗体と、該モノクローナル抗体の属するグループと同じグループに属する他のモノクローナル抗体は、該モノクローナル抗体と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を認識すると考えられる。
（７）Ｎｅｃｔｉｎ−２αまたはＮｅｃｔｉｎ−２δに対して、
Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、
Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、
Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、
Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、
Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、
Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、
Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、
Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、
Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、
Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、
Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）または
Ｎｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）
で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する。
ここで、「Ｎｅｃｔｉｎ−２αまたはＮｅｃｔｉｎ−２δに対して、各ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する抗体」とは、上記の１２種類の抗体のいずれかを過剰量添加することによりＮｅｃｔｉｎ−２αまたはＮｅｃｔｉｎ−２δに対する結合が競合的に阻害される抗体を指しており、具体的には、例えば、該抗体に対して上記の１２種類の抗体のいずれかを５０倍モル量添加した時に約５０〜１００％の結合阻害率を示す抗体をいう。
（８）Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、
Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、
Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、
Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、
Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、
Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、
Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、
Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、
Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、
Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、
Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）、または
Ｎｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）
で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するモノクローナル抗体。
ここで、上記のモノクローナル抗体のアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列Ａ）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列としては、アミノ酸配列Ａと約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列Ａと実質的に同一のアミノ酸配列を含有する抗体としては、例えば、前記のアミノ酸配列Ａと実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、アミノ酸配列Ａを含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有する抗体などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、抗体の活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
また、アミノ酸配列Ａと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するモノクローナル抗体としては、例えば、（ｉ）アミノ酸配列Ａ中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）アミノ酸配列Ａに１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）アミノ酸配列Ａに１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）アミノ酸配列Ａ中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する抗体なども含まれる。
なお、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および抗体断片を含む。「キメラ抗体」とは、異種抗体由来の可変領域とヒト抗体定常領域とを有する抗体を意味する（例えば、欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３等参照）。「ヒト化抗体」とはマウス等のヒトにとって異種の抗体を改変して、Ｈ鎖とＬ鎖の相補性決定部以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造で置き換えた抗体を言う。「ヒト抗体」とは、ヒトの抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）およびヒト抗体遺伝子をバクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上に提示させたライブラリー、いわゆる抗体ディスプレー技術を用いて作製したモノクローナル抗体（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３，１１０５（２００５））およびＮｅｃｔｉｎ−２に対する抗体を産生するヒトＢ細胞から細胞融合法やファージディスプレー法等の技術を用いて単離されたモノクローナル抗体を意味する。
本発明において、「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合領域または可変領域を含むものをいう。抗体断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）などが含まれる。
本発明の好ましい態様に係る抗体は、配列番号：１（Ｎｅｃｔｉｎ−２α）または配列番号：３（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）で表されるアミノ酸配列の、１−３５０番目（細胞外領域）のアミノ酸配列に存在するエピトープ；配列番号：１（Ｎｅｃｔｉｎ−２α）または配列番号：３（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）で表されるアミノ酸配列の、４７−１４２番目（第１のＩＧ様ドメイン）または１７５−２４０番目（第２のＩＧ様ドメイン）のアミノ酸配列に存在するエピトープ；又は配列番号：１（Ｎｅｃｔｉｎ−２α）または配列番号：３（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）で表されるアミノ酸配列の、第７５，７６，７７，７８，９５，１３７，１４５，１７３，１８４，１８６，２１２番目の少なくとも１つのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を認識する。
また、本発明は、特定のＣＤＲアミノ酸配列または可変領域アミノ酸配列を含有するモノクローナル抗体を提供する。さらに、本発明は、特定のＣＤＲアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体軽鎖またはその断片、モノクローナル抗体重鎖またはその断片をも提供する。
抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端側には可変領域が存在し、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）と呼ばれる。可変領域内には相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）が存在し、この部分が抗原認識の特異性を担っている。可変領域のＣＤＲ以外の部分は、ＣＤＲの構造を保持する役割を有し、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖および軽鎖のＣ末端側には定常領域が存在し、それぞれ重鎖定常領域（ＣＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）と呼ばれる。重鎖可変領域中には、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。重鎖可変領域中の３つの相補性決定領域をまとめて重鎖相補性決定領域と呼ぶ。軽鎖可変領域中にも同様に、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。軽鎖可変領域中の３つの相補性決定領域をまとめて軽鎖相補性決定領域と呼ぶ。
具体的には、本発明の好ましい態様に係る抗体は、抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（１）配列番号：１８４，２００，２１６，２３２，２４８，２６４，２８０および２９６からなる群より選択される配列番号、（ｉｉ）配列番号：１８５，２０１，２１７，２３３，２４９，２６５，２８１および２９７からなる群より選択される配列番号および（ｉｉｉ）配列番号：１８６，２０２，２１８，２３４，２５０，２６６，２８２および２９８からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む。
また本発明の他の好ましい態様に係る抗体は、抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉｖ）配列番号：１９２，２０８，２２４，２４０，２５６，２７２，２８８および３０４からなる群より選択される配列番号、（ｖ）配列番号：１９３，２０９，２２５，２４１，２５７，２７３，２８９および３０５からなる群より選択される配列番号および（ｖｉ）配列番号：１９４，２１０，２２６，２４２，２５８，２７４，２９０および３０６からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む。
本発明の抗体のＣＤＲ配列は必ずしも限定されないが、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３としてのアミノ酸配列の好適な組合せ、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３としてのアミノ酸配列の好適な組合せは、後述する表２１および２２に示されている。ＣＤＲ以外のアミノ酸配列は特に限定されず、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列が他の抗体、特に、他種の抗体由来である、いわゆるＣＤＲ移植抗体が本発明の抗体に包含される。ＣＤＲ以外のアミノ酸配列はヒト由来のアミノ酸配列が好ましく、必要に応じてフレームワーク領域（ＦＲ）に１ないし数個のアミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／または挿入を伴っていてもよい。
なお、本発明の抗体可変領域のアミノ酸配列および塩基配列は、表２５に記載のものが好ましい。
本発明の抗体の特定のＣＤＲアミノ酸配列または可変領域アミノ酸配列を含有するモノクローナル抗体の作製は、公知の方法を用いることができる。
本発明の抗体は、抗体の定常領域が好ましくはヒト抗体、より好ましくはヒトＩｇＧ、さらに好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラスに属するモノクローナル抗体である。
Ｎｅｃｔｉｎ−２もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、抗体の説明においては、これらを単にＮｅｃｔｉｎ−２と略記する場合がある）に対する抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
以下に、本発明の抗体の抗原調製法、および該抗体の作製法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ−２）もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ−２）を天然にあるいは人為的に高発現する細胞株またはその膜画分、Ｎｅｃｔｉｎ−２の細胞外領域タンパク質とその他のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質またはその塩、またはＮｅｃｔｉｎ−２と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある）。
本発明の抗原の具体例としては、Ｎｅｃｔｉｎ−２を天然にあるいは人為的に高発現する細胞株またはその膜画分、Ｎｅｃｔｉｎ−２の細胞外領域タンパク質またはその塩、Ｎｅｃｔｉｎ−２の細胞外領域とその他のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質、またはＮｅｃｔｉｎ−２と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなどが好ましく用いられる。
その他のタンパク質またはペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、Ｖ５−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ、Ｓ−ｔａｇ、Ｔ７−ｔａｇ、やヒト抗体、マウス抗体などのＦｃ領域などが挙げられる。
かかる（合成）ペプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限定されないが、例えば６個、好ましくは１０個、より好ましくは１２個の連続するアミノ酸残基を有するものが挙げられる。
Ｎｅｃｔｉｎ−２もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法あるいはそれに準ずる方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。またＮｅｃｔｉｎ−２の細胞外領域とその他のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質はその融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって製造することができる。
（ａ）本発明の抗原またはそれらの塩をヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の組織または細胞から調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることができる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。
（ｂ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いてＮｅｃｔｉｎ−２、もしくはＮｅｃｔｉｎ−２の細胞外領域とその他のタンパク質（ペプチド）との融合タンパク質またはその塩を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法〔例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法など〕に従って作製することができる。
Ｎｅｃｔｉｎ−２またはその部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単にＮｅｃｔｉｎ−２と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、Ｎｅｃｔｉｎ−２をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡをＮｅｃｔｉｎ−２の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ＰＣＲに用いる鋳型ポリヌクレオチドとしては、Ｎｅｃｔｉｎ−２をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ−２α）をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｉｉ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたＮｅｃｔｉｎ−２をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。Ｎｅｃｔｉｎ−２の細胞外領域とその他のタンパク質（ペプチド）との融合タンパク質またはその塩をコードするＤＮＡを得る場合には、上記と同様の方法によりクローニングするか合成したＮｅｃｔｉｎ−２細胞外領域をコードするＤＮＡとその他のタンパク質（ペプチド）をコードするＤＮＡとを自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って連結する事ができる。
Ｎｅｃｔｉｎ−２の発現ベクターは、例えば、（イ）Ｎｅｃｔｉｎ−２をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウィルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、Ｎｅｃｔｉｎ−２のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたＮｅｃｔｉｎ−２をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、マウスＡＴＤＣ５細胞、マウスＮＳＯ細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞、ヒト胎児ＨＥＫ２９３細胞、ヒト胎児細胞２９３Ｆ細胞、などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、Ｎｅｃｔｉｎ−２をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９巻，５１９（１９６７〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外にＮｅｃｔｉｎ−２を生成せしめることができる。
上記培養物からＮｅｃｔｉｎ−２を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
Ｎｅｃｔｉｎ−２を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にＮｅｃｔｉｎ−２が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるＮｅｃｔｉｎ−２の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、およびゲルろ過法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、クロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるＮｅｃｔｉｎ−２が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するＮｅｃｔｉｎ−２を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成するＮｅｃｔｉｎ−２の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。
（ｃ）Ｎｅｃｔｉｎ−２を発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記（ａ）項で述べたような天然の細胞、上記（ｂ）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスターなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｂａｌｂ３Ｔ３細胞、ＦＭ３Ａ細胞、Ｌ９２９細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｐ３Ｕ１細胞、ＮＳＯ細胞、Ｂ１６細胞、またはＰ３８８細胞などが好ましく用いられる。
（ｄ）Ｎｅｃｔｉｎ−２と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＮｅｃｔｉｎ−２を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 １、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して投与される。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、またはフットパッド注射などが好ましく用いられる。
本発明のタンパク質を発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）または緩衝液（例、Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。
本発明の抗原は、不溶化したものを直接免疫することもできる。また、本発明の抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）と本発明の抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させた本発明の抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同志を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同志を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同志を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
本発明の抗原を投与する際には、免疫動物の抗体産生能を高めるため、本発明の免疫原をフロインド完全アジュバントやフロインド不完全アジュバント、Ａｌｕｍ、Ｒｉｂｉアジュバント等のアジュバントと混合もしくはエマルションを調製して該動物に投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。また、本発明のモノクローナル抗体の作製に際しては、ＤＮＡ免疫法を利用してもよい（例えば、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻、１５２頁−１５４頁参照）。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。これらの温血動物は野生型のものであっても良いし、また抗原に対してより強い免疫反応を得るために抗原たんぱく質の該温血動物オルソローグ遺伝子をノックアウトしたＫＯ動物であっても良い。またヒトモノクローナル抗体を作製する為には、温血動物の抗体遺伝子をノックアウトし、ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）やノックイン動物（ＷＯ ０２／０９８２１７号公報、ＷＯ ０３／０２０７４３号公報）等を用いればよい。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生Ｂ細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、抗原に特異的に結合する抗体量を定量できるどんな方法であっても良い。例えば後記のように、固相化したタンパク質抗原や抗原発現細胞株と抗血清とを反応させたのち、これらに結合した抗体量を標識抗免疫グロブリン抗体により検出することにより抗体価を測定することができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、ＳＰ２／０やＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
また、モノクローナル抗体産生細胞の作製の為の細胞融合操作として電気融合法を用いても良い。
ハイブリドーマの選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、可溶性のタンパク質抗原やタンパク質抗原発現細胞を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質、酵素、蛍光物質などで標識した抗免疫グロブリン抗体（例えば細胞融合に用いられる脾臓細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを反応させることにより、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、あるいは抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質、酵素、蛍光物質などで標識した可溶性のタンパク質抗原を反応させることにより、固相に結合した抗原特異的なモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。タンパク質抗原発現細胞を用いる場合には、該細胞にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に蛍光標識抗免疫グロブリン抗体を反応させた後、フローサイトメーター等の蛍光検出装置で該細胞の蛍光強度を測定することにより、該細胞膜上のタンパク質抗原に結合したモノクローナル抗体を検出することができる。
（ｂ）その他の方法によるモノクローナル抗体作製
本発明の抗体の作製方法は（ａ）に記載の方法に限定されるものではなく、例えばヒトや温血動物（例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマ、ニワトリなど）のＢリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させた、いわゆる抗体ディスプレー技術を用いる事ができる。〔Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１１０５（２００５）〕ヒトや温血動物はナイーブなものであっても良いし、本発明の抗原を高発現した癌の患者や本発明の抗原を（ａ）に記載の方法で免疫された温血動物であっても良い。細胞表面に提示させる抗体の形態としてはＩｇＧ分子、ＩｇＭ分子、Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント等が挙げられるがこれに限定されるものではない。
本発明の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体（フラグメント）の遺伝子は、上述の抗体遺伝子ライブラリーを担いだ抗体（フラグメント）提示細胞もしくは抗体（フラグメント）提示リボソームを本発明の抗原に対し一定時間反応させ、非特異的に結合するものを洗浄除去した後、本発明の抗原に特異的に結合するものを溶出回収し、その抗体（フラグメント）提示細胞もしくは抗体（フラグメント）提示リボソームを公知の方法により増殖させた後、数回同様の方法を繰り返し、最終的にクローン化した抗体（フラグメント）提示細胞もしくは抗体（フラグメント）提示リボソームから公知の方法により単離することにより得られる。こうして得たモノクローナル抗体フラグメント遺伝子は公知の方法によりＩｇＧ抗体遺伝子の該領域と組替えることにより、モノクローナルＩｇＧ抗体遺伝子を得ることができる。
また、本発明の抗体は、ヒトや上述の温血動物から単離した抗体産生細胞を試験管内において本発明の抗原により自体公知の方法により免疫した後、（ａ）に記載と同様の方法によりハイブリドーマを作製する事により得ることもできる。
（ｃ）モノクローナル抗体の製造
本発明のモノクローナル抗体は（ａ）で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマや、（ａ）で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから公知の方法で単離された抗体遺伝子や（ｂ）で得られたモノクローナル抗体遺伝子を人為的に発現させた組換え細胞株を培養することにより製造する事ができる。また該抗体遺伝子を公知の方法により温血動物や植物の染色体に組み込み、温血動物の血液、乳汁、卵や植物体、カビ等に生産させることにより製造する事もできる〔Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｖｈｎｏｌ．７，５３６（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ ４，７９４（２００３）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０，２５６７（２００４）〕。温血動物としては例えばウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、マウス、ウサギ等が用いられる。また植物体としてはタバコ、トウモロコシ、ジャガイモ、ウキクサ等が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体は、上記のモノクローナル抗体含有原料から自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原あるいはプロテインＡやプロテインＧなどの抗体に親和性のある物質を固定化した担体により抗体のみを分離精製するアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等〕に従って行なうことができる。
（３）本発明の抗体を含有する医薬
上記した本発明の抗体を含有する医薬は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤、癌転移抑制剤、癌細胞の接着阻害剤、抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤、抗体依存性の癌細胞傷害剤などとして使用することができる。抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害方法としては、生体のエフェクター細胞による抗体依存性細胞障害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）が挙げられるが、好ましくはＡＤＣＣが用いられる。
本発明の抗体を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防・治療剤、調節剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、血管内注射、皮下注射など）に適する剤形として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシド、イリノテカンなどと併用してもよい。本発明の抗体および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。
（４）本発明の抗体を用いるＮｅｃｔｉｎ−２の定量法
本発明の抗体は、Ｎｅｃｔｉｎ−２を特異的に認識することができるので、被検液中のＮｅｃｔｉｎ−２の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化されたＮｅｃｔｉｎ−２とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＮｅｃｔｉｎ−２の割合を測定することを特徴とする被検液中のＮｅｃｔｉｎ−２の定量法、
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＮｅｃｔｉｎ−２の定量法、および
（ｉｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体とを反応させ、不溶化担体に結合したＮｅｃｔｉｎ−２の量的な変化を例えば表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）等の検出法により測定することを特徴とする被検液中のＮｅｃｔｉｎ−２の定量法
を提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、Ｎｅｃｔｉｎ−２の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。
また、本発明の抗体を用いてＮｅｃｔｉｎ−２の定量を行えるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いるＮｅｃｔｉｎ−２の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法、ＳＰＲ法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ユーロピウム蛍光錯体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）などが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。抗原あるいは抗体の不溶化はこれらのタンパク質をビオチン標識し、ストレプトアビジン（アビジン）を予め不溶化した担体に結合させてもよい。抗体の不溶化はプロテインＡ、プロテインＧ、抗イムノグログリン抗体などを予め不溶化した担体に結合させても良い。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法によるＮｅｃｔｉｎ−２の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明の抗体は、Ｎｅｃｔｉｎ−２の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。
本発明の抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法、ＳＰＲ法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
ＳＰＲ法ではガラス基板上に形成した金の薄膜表面上に抗体を不溶化させ、この薄膜上に被検液を通液させて薄膜上の抗体に結合した被検たんぱく質の量的な変化を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の原理（蛋白質 核酸 酵素，３７，２９７７−２９８４（１９９２））を用いて定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＮｅｃｔｉｎ−２の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ））、同書 Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ））、同書 Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、同書 Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書 Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書 Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、Ｎｅｃｔｉｎ−２を感度良く定量することができる。
（５）本発明の抗体を用いる診断剤・診断方法
さらには、本発明の抗体を用いてＮｅｃｔｉｎ−２の濃度を定量することによって、Ｎｅｃｔｉｎ−２の濃度の増加が検出された場合、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するＮｅｃｔｉｎ−２を検出するために使用することができる。また、Ｎｅｃｔｉｎ−２を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中に含まれるＮｅｃｔｉｎ−２の検出、被検細胞内におけるＮｅｃｔｉｎ−２の挙動分析などのために使用することができる。
（６）本発明の乳癌の予防・治療剤に用いられる抗体
Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、
Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、
Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、
Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、
Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、
Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、
Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、
Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、
Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、
Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、
Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）、または
Ｎｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）、
で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体（以下、本発明に用いられる抗体と呼ぶことがある。）を使用することができる。
また、本発明に用いられる抗体は、これらのハイブリドーマが産生する抗体の特定のＣＤＲアミノ酸配列または可変領域アミノ酸配列を有する遺伝子工学的に産生された抗体（抗体断片を含む）を含む。
抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端側には可変領域が存在し、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）と呼ばれる。可変領域内には相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）が存在し、この部分が抗原認識の特異性を担っている。可変領域のＣＤＲ以外の部分は、ＣＤＲの構造を保持する役割を有し、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖および軽鎖のＣ末端側には定常領域が存在し、それぞれ重鎖定常領域（ＣＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）と呼ばれる。重鎖可変領域中には、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。重鎖可変領域中の３つの相補性決定領域をまとめて重鎖相補性決定領域と呼ぶ。軽鎖可変領域中にも同様に、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。軽鎖可変領域中の３つの相補性決定領域をまとめて軽鎖相補性決定領域と呼ばれる。
本発明に用いられる抗体のＣＤＲのアミノ酸配列と塩基配列は、後述する表２１〜２４に各々示されている。
抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号：１８４，２００，２１６，２３２，２４８，２６４，２８０および２９６から選択される配列番号、（ｉｉ）配列番号：１８５，２０１，２１７，２３３，２４９，２６５，２８１および２９７からなる群より選択される配列番号および（ｉｉｉ）配列番号：１８６，２０２，２１８，２３４，２５０，２６６，２８２および２９８からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。
抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉｖ）配列番号：１９２，２０８，２２４，２４０，２５６，２７２，２８８および３０４からなる群より選択される配列番号、（ｖ）配列番号：１９３，２０９，２２５，２４１，２５７，２７３，２８９および３０５からなる群より選択される配列番号および（ｖｉ）配列番号：１９４，２１０，２２６，２４２，２５８，２７４，２９０および３０６からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列を有する。
本発明に用いられる抗体において、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列は特に限定されず、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列が他の抗体、特に、他種の抗体由来である、いわゆるＣＤＲ移植抗体が本発明に用いられる抗体に包含される。ＣＤＲ以外のアミノ酸配列はヒト由来のアミノ酸配列が好ましく、必要に応じてフレームワーク領域（ＦＲ）に１ないし数個のアミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／または挿入を伴っていてもよい。
本発明に用いられる抗体において、抗体可変領域のアミノ酸配列および塩基配列は、表２５に記載のものが好ましい。本発明に用いられる抗体の特定のＣＤＲアミノ酸配列または可変領域アミノ酸配列を含有するモノクローナル抗体は、公知の方法を用いて作製することができる。
（７）本発明の乳癌の予防・治療剤に用いられる抗体とＮｅｃｔｉｎ−２に対して競合的に結合するモノクローナル抗体
Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、
Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、
Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、
Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、
Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、
Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、
Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、
Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、
Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、
Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、
Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）、または
Ｎｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）
で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体、または、これらのハイブリドーマが産生する抗体の特定のＣＤＲアミノ酸配列または可変領域アミノ酸配列を有する遺伝子工学的に産生された抗体（抗体断片を含む）と、Ｎｅｃｔｉｎ−２に対して競合的に結合するモノクローナル抗体（以下、本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体ともいう。）は、以下のとおり得ることができる。
（７）−（ｉ）抗原の調製
本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体を調製するために使用される抗原としては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ−２）もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ−２）を天然にあるいは人為的に高発現する細胞株またはその膜画分、Ｎｅｃｔｉｎ−２の細胞外領域タンパク質とその他のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質またはその塩、またはＮｅｃｔｉｎ−２と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチド、配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列もしくはその部分塩基配列を含有する動物細胞発現ベクターなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明に用いられる抗原と称することもある）。
Ｎｅｃｔｉｎ−２の細胞外領域との融合タンパク質を作製するための「その他のタンパク質またはペプチド」としては、例えば、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、Ｖ５−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ、Ｓ−ｔａｇ、Ｔ７−ｔａｇ、やヒト抗体、マウス抗体などのＦｃ領域などが挙げられる。
本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体を調製するために使用されるＮｅｃｔｉｎ−２と同一の抗原決定基を有するペプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限定されないが、例えば６個、好ましくは１０個、より好ましくは１２個の連続するアミノ酸残基を有するものが挙げられる。
本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体を調製するために使用される配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ−２）もしくはその部分ペプチドとしては、Ｎｅｃｔｉｎ−２の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
なお、本発明に用いられる抗体の抗原決定基は、本願の基礎出願であるＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２０４２９に説明されている。本発明ではＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２０４２９の記載をも引用する。
Ｎｅｃｔｉｎ−２もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法あるいはそれに準ずる方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。またＮｅｃｔｉｎ−２の細胞外領域とその他のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質はその融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって製造することができる。
（７）−（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体産生細胞の作製
（２）−（ｉ）に記載の抗原は、温血動物に対して投与される。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、またはフットパッド注射などが好ましく用いられる。本発明に用いられる抗原は、不溶化したものを直接免疫することもでき、また抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。
本発明に用いられる抗原を投与する際には、免疫動物の抗体産生能を高めるため、本発明に用いられる抗原をフロインド完全アジュバントやフロインド不完全アジュバント、Ａｌｕｍ、Ｒｉｂｉアジュバント等のアジュバントと混合もしくはエマルションを調製して該動物に投与してもよい。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。また、抗原に対してより強い免疫反応を得るために抗原たんぱく質の該温血動物オルソローグ遺伝子をノックアウトしたＫＯ動物であっても良い。またヒトモノクローナル抗体を作製する為には、温血動物の抗体遺伝子をノックアウトし、ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）やノックイン動物（ＷＯ ０２／０９８２１７号公報、ＷＯ ０３／０２０７４３号公報）等を用いればよい。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生Ｂ細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、ＳＰ２／０やＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。ハイブリドーマの選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。
（ｂ）その他の方法によるモノクローナル抗体作製
抗体の作製方法は上記の方法に限定されるものではなく、例えばヒトや温血動物（例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマ、ニワトリなど）のＢリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させた、いわゆる抗体ディスプレー技術を用いる事ができる。〔Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１１０５（２００５）〕ヒトや温血動物はナイーブなものであっても良いし、本発明に用いられる抗原を高発現した癌の患者や本発明に用いられる抗原を（ａ）に記載の方法で免疫された温血動物であっても良い。細胞表面に提示させる抗体の形態としてはＩｇＧ分子、ＩｇＭ分子、Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント等が挙げられるがこれに限定されるものではない。
本発明に用いられる抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体（フラグメント）の遺伝子は、上述の抗体遺伝子ライブラリーを担いだ抗体（フラグメント）提示細胞もしくは抗体（フラグメント）提示リボソームを本発明に用いられる抗原に対し一定時間反応させ、非特異的に結合するものを洗浄除去した後、本発明に用いられる抗原に特異的に結合するものを溶出回収し、その抗体（フラグメント）提示細胞もしくは抗体（フラグメント）提示リボソームを公知の方法により増殖させた後、数回同様の方法を繰り返し、最終的にクローン化した抗体（フラグメント）提示細胞もしくは抗体（フラグメント）提示リボソームから公知の方法により単離することにより得られる。こうして得たモノクローナル抗体フラグメント遺伝子は公知の方法によりＩｇＧ抗体遺伝子の該領域と組替えることにより、モノクローナルＩｇＧ抗体遺伝子を得ることができる。
本発明に用いられる抗体の特定のＣＤＲアミノ酸配列または可変領域アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するモノクローナル抗体を遺伝子工学的に取得することもできる。
ここで、上記の本発明に用いられる抗体の特定のＣＤＲアミノ酸配列または可変領域アミノ酸配列（以下、アミノ酸配列Ａ）と実質的に同一のアミノ酸配列としては、アミノ酸配列Ａと約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
また、アミノ酸配列Ａと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するモノクローナル抗体としては、例えば、（ｉ）アミノ酸配列Ａ中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数個（例えば１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）アミノ酸配列Ａに１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）アミノ酸配列Ａに１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数個（例えば１〜５個））のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）アミノ酸配列Ａ中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数個（例えば１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する抗体なども含まれる。
また、本発明に用いられる抗体は、ヒトや上述の温血動物から単離した抗体産生細胞を試験管内において本発明に用いられる抗原により自体公知の方法により免疫した後、ハイブリドーマを作製する事により得ることもできる。
本発明に用いられるモノクローナル抗体は（ａ）で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマや、（ａ）で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから公知の方法で単離された抗体遺伝子や（ｂ）で得られたモノクローナル抗体遺伝子を人為的に発現させた組換え細胞株を培養することにより製造する事ができる。また該抗体遺伝子を公知の方法により温血動物や植物の染色体に組み込み、温血動物の血液、乳汁、卵や植物体、カビ等に生産させることにより製造する事もできる〔Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｖｈｎｏｌ．７，５３６（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ ４，７９４（２００３）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０，２５６７（２００４）〕。温血動物としては例えばウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、マウス、ウサギ等が用いられる。また植物体としてはタバコ、トウモロコシ、ジャガイモ、ウキクサ等が用いられる。
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、可溶性のタンパク質抗原やタンパク質抗原発現細胞を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質、酵素、蛍光物質などで標識した抗免疫グロブリン抗体（例えば細胞融合に用いられる脾臓細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを反応させることにより、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、あるいは抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質、酵素、蛍光物質などで標識した可溶性のタンパク質抗原を反応させることにより、固相に結合した抗原特異的なモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。タンパク質抗原発現細胞を用いる場合には、該細胞にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に蛍光標識抗免疫グロブリン抗体を反応させた後、フローサイトメーター等の蛍光検出装置で該細胞の蛍光強度を測定することにより、該細胞膜上のタンパク質抗原に結合したモノクローナル抗体を検出することができる。
本発明に用いられるモノクローナル抗体は、上記のモノクローナル抗体含有原料から自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原あるいはプロテインＡやプロテインＧなどの抗体に親和性のある物質を固定化した担体により抗体のみを分離精製するアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等〕に従って行なうことができる。
（７）−（ｉｉｉ）本発明の乳癌の予防・治療剤に用いられる抗体と競合的に結合する抗体のスクリーニング
本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体は、Ｎｅｃｔｉｎ−２に対して競合的に結合するかどうかを測定する測定法によってスクリーニングすることにより得ることができる。
スクリーニングに用いられる「Ｎｅｃｔｉｎ−２」とは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列（以下、Ｎｅｃｔｉｎ−２αと略記する）または配列番号：３で表されるアミノ酸配列（以下、Ｎｅｃｔｉｎ−２δと略記する）（以下、両者を併せてＮｅｃｔｉｎ−２または本発明に用いられるタンパク質と称することもある）である。ヒトや温血動物の細胞もしくは組織に由来するタンパク質であってもよく、組換えタンパク質であってもよい。また、配列番号１または配列番号３で表されるアミノ酸配列の部分配列で表されるペプチドであってもよく、例えば、配列番号：１（Ｎｅｃｔｉｎ−２α）または配列番号：３（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）で表されるアミノ酸配列の、１−３５０番目（細胞外領域）のアミノ酸配列で表されるペプチド、配列番号：１（Ｎｅｃｔｉｎ−２α）または配列番号：３（Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）で表されるアミノ酸配列の４７−１４２番目（第１のＩＧ様ドメイン）または１７５−２４０番目（第２のＩＧ様ドメイン）のアミノ酸配列で表されるペプチドなどを用いることができる。さらに、Ｎｅｃｔｉｎ−２には、Ｃ末端のカルボキシル基がエステル化またはアミド化したもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれ生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などの塩の形態をとっていてもよい。
ここで、「競合的に結合する抗体」とは、本発明に用いられる抗体のいずれかを過剰量添加することによりＮｅｃｔｉｎ−２に対する結合が競合的に阻害される抗体を指している。具体的には、被試験抗体をＮｅｃｔｉｎ−２に対する結合試験に供したとき、該被試験抗体に対して本発明に用いられる抗体のいずれかを５０倍モル量を添加した場合に、該試験抗体のＮｅｃｔｉｎ−２に対する結合が５０％以上阻害される抗体をいう。
ここで、本発明に用いられる抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を含む。「キメラ抗体」とは、異種抗体由来の可変領域とヒト抗体定常領域とを有する抗体を意味する（例えば、欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３等参照）。「ヒト化抗体」とはマウス等のヒトにとって異種の抗体を改変して、Ｈ鎖とＬ鎖の相補性決定部以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造で置き換えた抗体を言う。「ヒト抗体」とは、ヒトの抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）およびヒト抗体遺伝子をバクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上に提示させたライブラリー、いわゆる抗体ディスプレー技術を用いて作製したモノクローナル抗体（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１１０５（２００５））およびＮｅｃｔｉｎ−２に対する抗体を産生するヒトＢ細胞から細胞融合法やファージディスプレー法等の技術を用いて単離されたモノクローナル抗体を意味する。本発明に用いられる抗体は、好ましくは抗体の定常領域がヒト抗体、より好ましくはヒトＩｇＧ、さらに好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラスに属するモノクローナル抗体である。
（８）本発明の乳癌の予防・治療剤
上記した本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的にＮｅｃｔｉｎ−２に結合する抗体を含有する医薬は、乳癌の予防・治療剤、抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する乳癌の予防または治療剤、抗体依存性の乳癌細胞傷害剤などとして使用することができる。抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する乳癌細胞障害方法としては、生体のエフェクター細胞による抗体依存性細胞障害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）が挙げられるが、好ましくはＡＤＣＣが用いられる。
本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明に用いられる抗体およびその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体を含有する上記予防・治療剤、調節剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、血管内注射、皮下注射など）に適する剤形として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル、ゲンシタビン等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル等）、ホルモン療法剤（例、タモキシフェン、アナストロゾル、レトロゾル等）、白金製剤（例、シスプラチン、カルボプラチン等）、分子標的剤（例、ハーセプチン、ゲフィチニブ、イマチニブ等）、エトポシド、イリノテカンなどと併用してもよい。本発明に用いられる抗体および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。
（９）本発明は、更に以下の発明を包含する。
すなわち、Ｎｅｃ１−１０４４−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０５）、Ｎｅｃ８−３５１７−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０６）またはＮｅｃ８−３７０４−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０７）で表示されるハイブリドーマ細胞、Ｎｅｃ１−１０４４−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０５）、Ｎｅｃ８−３５１７−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０６）またはＮｅｃ８−３７０４−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０７）で表されるハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体、Ｎｅｃ１−１０４４−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０５）、Ｎｅｃ８−３５１７−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０６）またはＮｅｃ８−３７０４−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０７）で表示されるハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合するモノクローナル抗体、及びこれらのモノクローナル抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤にかかる発明である。
かかる発明は、前記（６）〜（８）に記載された実施態様と同様に実施することができる。
ハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−１０４４−４は２００７年４月３日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０５として寄託されている。
ハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ８−３５１７−１１は２００７年４月３日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０６として寄託されている。
ハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ８−３７０４−７は２００７年４月３日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０７として寄託されている。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ ：セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
Ｎｅｃｔｉｎ−２αのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するＮｅｃｔｉｎ−２αをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
Ｎｅｃｔｉｎ−２δのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するＮｅｃｔｉｎ−２δをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
Ｎｅｃｔｉｎ−３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するＮｅｃｔｉｎ−３をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
参考例１および参考例２で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチド１の塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
参考例１および参考例２で用いられたコントロールオリゴヌクレオチド１の塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
参考例２で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
参考例２で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
参考例２で用いられたＴａｑＭａｎプローブ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
参考例２で用いられたプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
参考例２で用いられたプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
参考例２で用いられたＴａｑＭａｎプローブ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
参考例３および参考例４で用いられたプライマー５の塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
参考例３で用いられたプライマー６の塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
参考例４で用いられたプライマー７の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
参考例５で用いられたプライマー８の塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
参考例５、参考例６および参考例７で用いたｓｉＲＮＡ−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
参考例５、参考例６および参考例７で用いたｓｉＲＮＡ−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
参考例５、参考例６および参考例７で用いたｓｉＲＮＡ−２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
参考例５、参考例６および参考例７で用いたｓｉＲＮＡ−２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
参考例５、参考例６および参考例７で用いたｓｉＲＮＡ−３の塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
参考例５、参考例６および参考例７で用いたｓｉＲＮＡ−３の塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
参考例５、参考例６および参考例７で用いたｓｉＲＮＡ−４の塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
参考例５、参考例６および参考例７で用いたｓｉＲＮＡ−４の塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
参考例５、参考例６および参考例７で用いたｓｉＲＮＡ−５の塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
参考例５、参考例６および参考例７で用いたｓｉＲＮＡ−５の塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
参考例１２で用いられたプライマー３３の塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
参考例１２で用いられたプライマー３４の塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３２〕
配列番号：３１で表されるＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
参考例１５で用いられたプライマー３３の塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
参考例１５で用いられたプライマー３４の塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
参考例１５で用いられたプライマー３５の塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
参考例１５で用いられたプライマー３６の塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３８〕
配列番号：３７で表されるＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
参考例１７で用いられたペプチド１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４０〕
参考例１７で用いられたペプチド２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４１〕
参考例１７で用いられたペプチド３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４２〕
参考例１８、および参考例１９で用いられたプライマー４２の塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
参考例１８、および参考例１９で用いられたプライマー４３の塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
参考例１８、および参考例１９で用いられたＴａｑＭａｎプローブ３の塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
参考例２１で用いられたプライマー４５の塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
参考例２１で用いられたプライマー４６の塩基配列を示す。
〔配列番号：４７〕
参考例２１で用いられたプライマー４７の塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
参考例２１で用いられたプライマー４８の塩基配列を示す。
〔配列番号：４９〕
Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｈＦｃタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５０〕
配列番号：４９で表されるＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｈＦｃタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５１〕
Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｍＦｃタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５２〕
配列番号：５１で表されるＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｍＦｃタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５３〕
参考例２５で用いられたＦＬＡＧタンパク質（ＦＬＡＧ−ＦＳＡＬＮＯＴ）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５４〕
参考例２５で用いられたＦＬＡＧタンパク質（ＦＬＡＧ−ＲＳＡＬＮＯＴ）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５５〕
参考例２５で用いられたプライマー５５の塩基配列を示す。
〔配列番号：５６〕
参考例２５で用いられたプライマー５６の塩基配列を示す。
〔配列番号：５７〕
Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５８〕
Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
参考例２９で用いられたプライマー５９の塩基配列を示す。
〔配列番号：６０〕
参考例２９で用いられたプライマー６０の塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕
Ｎｅｃｔｉｎ−１タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６２〕
Ｎｅｃｔｉｎ−１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６３〕
参考例２９で用いられたプライマー６３の塩基配列を示す。
〔配列番号：６４〕
参考例２９で用いられたプライマー６４の塩基配列を示す。
〔配列番号：６５〕
参考例２９で用いられたプライマー６５の塩基配列を示す。
〔配列番号：６６〕
参考例２９で用いられたプライマー６６の塩基配列を示す。
〔配列番号：６７〕
Ｎｅｃｔｉｎ−４タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６８〕
Ｎｅｃｔｉｎ−４タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６９〕
参考例２９で用いられたプライマー６９の塩基配列を示す。
〔配列番号：７０〕
参考例２９で用いられたプライマー７０の塩基配列を示す。
〔配列番号：７１〕
Ｎｅｃ１−５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７２〕
Ｎｅｃ１−５タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７３〕
参考例３０で用いられたプライマー７３の塩基配列を示す。
〔配列番号：７４〕
参考例３０で用いられたプライマー７４の塩基配列を示す。
〔配列番号：７５〕
参考例３０で用いられたプライマー７５の塩基配列を示す。
〔配列番号：７６〕
参考例３０で用いられたプライマー７６の塩基配列を示す。
〔配列番号：７７〕
参考例３０で用いられたプライマー７７の塩基配列を示す。
〔配列番号：７８〕
Ｎｅｃｔｉｎ−２のＩｇ１ドメインを欠損させたタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７９〕
Ｎｅｃｔｉｎ−２のＩｇ１ドメインを欠損させたタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８０〕
Ｎｅｃｔｉｎ−２のＩｇ２ドメインを欠損させたタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８１〕
Ｎｅｃｔｉｎ−２のＩｇ２ドメインを欠損させたタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８２〕
参考例３１で用いられたプライマー８２の塩基配列を示す。
〔配列番号：８３〕
参考例３１で用いられたプライマー８３の塩基配列を示す。
〔配列番号：８４〕
参考例３１で用いられたプライマー８４の塩基配列を示す。
〔配列番号：８５〕
参考例３１で用いられたプライマー８５の塩基配列を示す。
〔配列番号：８６〕
カニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８７〕
カニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８８〕
参考例３２で用いられたプライマー８８の塩基配列を示す。
〔配列番号：８９〕
参考例３２で用いられたプライマー８９の塩基配列を示す。
〔配列番号：９０〕
参考例３３で用いられたプライマー９０の塩基配列を示す。
〔配列番号：９１〕
参考例３３で用いられたプライマー９１の塩基配列を示す。
〔配列番号：９２〕
参考例３３で用いられたプライマー９２の塩基配列を示す。
〔配列番号：９３〕
参考例３３で用いられたプライマー９３の塩基配列を示す。
〔配列番号：９４〕
参考例３３で用いられたプライマー９４の塩基配列を示す。
〔配列番号：９５〕
参考例３３で用いられたプライマー９５の塩基配列を示す。
〔配列番号：９６〕
参考例３３で用いられたプライマー９６の塩基配列を示す。
〔配列番号：９７〕
参考例３３で用いられたプライマー９７の塩基配列を示す。
〔配列番号：９８〕
参考例３４で用いられたプライマーＱ３７Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：９９〕
参考例３４で用いられたプライマーＱ３７Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１００〕
参考例３４で用いられたプライマーＰ４０Ｇの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０１〕
参考例３４で用いられたプライマーＰ４０Ｇ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０２〕
参考例３４で用いられたプライマーＱ４５Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０３〕
参考例３４で用いられたプライマーＱ４５Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０４〕
参考例３４で用いられたプライマーＨ５５Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０５〕
参考例３４で用いられたプライマーＨ５５Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０６〕
参考例３４で用いられたプライマーＶ６０Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０７〕
参考例３４で用いられたプライマーＶ６０Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０８〕
参考例３４で用いられたプライマーＹ６４Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０９〕
参考例３４で用いられたプライマーＹ６４Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１０〕
参考例３４で用いられたプライマーＱ７１Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１１〕
参考例３４で用いられたプライマーＱ７１Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１２〕
参考例３４で用いられたプライマーＡ７５Ｇの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１３〕
参考例３４で用いられたプライマーＡ７５Ｇ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１４〕
参考例３４で用いられたプライマーＰ７６Ｇの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１５〕
参考例３４で用いられたプライマーＰ７６Ｇ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１６〕
参考例３４で用いられたプライマーＡ７７Ｇの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１７〕
参考例３４で用いられたプライマーＡ７７Ｇ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１８〕
参考例３４で用いられたプライマーＮ７８Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１９〕
参考例３４で用いられたプライマーＮ７８Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２０〕
参考例３４で用いられたプライマーＨ７９Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２１〕
参考例３４で用いられたプライマーＨ７９Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２２〕
参考例３４で用いられたプライマーＱ８０Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２３〕
参考例３４で用いられたプライマーＱ８０Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２４〕
参考例３４で用いられたプライマーＮ８１Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２５〕
参考例３４で用いられたプライマーＮ８１Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２６〕
参考例３４で用いられたプライマーＫ８８Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２７〕
参考例３４で用いられたプライマーＫ８８Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２８〕
参考例３４で用いられたプライマーＳ９５Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２９〕
参考例３４で用いられたプライマーＳ９５Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３０〕
参考例３４で用いられたプライマーＫ１０９Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３１〕
参考例３４で用いられたプライマーＫ１０９Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３２〕
参考例３４で用いられたプライマーＥ１１７Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３３〕
参考例３４で用いられたプライマーＥ１１７Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３４〕
参考例３４で用いられたプライマーＤ１２２Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３５〕
参考例３４で用いられたプライマーＤ１２２Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３６〕
参考例３４で用いられたプライマーＨ１２８Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３７〕
参考例３４で用いられたプライマーＨ１２８Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３８〕
参考例３４で用いられたプライマーＮ１３７Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３９〕
参考例３４で用いられたプライマーＮ１３７Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４０〕
参考例３４で用いられたプライマーＦ１４５Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４１〕
参考例３４で用いられたプライマーＦ１４５Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４２〕
参考例３４で用いられたプライマーＫ１４７Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４３〕
参考例３４で用いられたプライマーＫ１４７Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４４〕
参考例３４で用いられたプライマーＶ１５０Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４５〕
参考例３４で用いられたプライマーＶ１５０Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４６〕
参考例３４で用いられたプライマーＭ１５３Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４７〕
参考例３４で用いられたプライマーＭ１５３Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４８〕
参考例３４で用いられたプライマーＴ１５４Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４９〕
参考例３４で用いられたプライマーＴ１５４Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５０〕
参考例３５で用いられたプライマーＱ１６５Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５１〕
参考例３５で用いられたプライマーＱ１６５Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５２〕
参考例３５で用いられたプライマーＫ１７０Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５３〕
参考例３５で用いられたプライマーＫ１７０Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５４〕
参考例３５で用いられたプライマーＦ１７３Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５５〕
参考例３５で用いられたプライマーＦ１７３Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５６〕
参考例３５で用いられたプライマーＰ１７７Ｇの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５７〕
参考例３５で用いられたプライマーＰ１７７Ｇ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５８〕
参考例３５で用いられたプライマーＩ１８４Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５９〕
参考例３５で用いられたプライマーＩ１８４Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６０〕
参考例３５で用いられたプライマーＫ１８６Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６１〕
参考例３５で用いられたプライマーＫ１８６Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６２〕
参考例３５で用いられたプライマーＬ１９７Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６３〕
参考例３５で用いられたプライマーＬ１９７Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６４〕
参考例３５で用いられたプライマーＷ２０２Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６５〕
参考例３５で用いられたプライマーＷ２０２Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６６〕
参考例３５で用いられたプライマーＥ２０６Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６７〕
参考例３５で用いられたプライマーＥ２０６Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６８〕
参考例３５で用いられたプライマーＴ２１２Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６９〕
参考例３５で用いられたプライマーＴ２１２Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７０〕
参考例３５で用いられたプライマーＴ２３５Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７１〕
参考例３５で用いられたプライマーＴ２３５Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７２〕
参考例３５で用いられたプライマーＫ２３９Ａの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７３〕
参考例３５で用いられたプライマーＫ２３９Ａ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７４〕
参考例３５で用いられたプライマーＡ２４９Ｇの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７５〕
参考例３５で用いられたプライマーＡ２４９Ｇ Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７６〕
実施例１９で用いられたプライマー１７６の塩基配列を示す。
〔配列番号：１７７〕
実施例１９で用いられたプライマー１７７の塩基配列を示す。
〔配列番号：１７８〕
実施例１９で用いられたプライマー１７８の塩基配列を示す。
〔配列番号：１７９〕
実施例１９で用いられたプライマー１７９の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８０〕
実施例１９で用いられたプライマー１８０の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８１〕
実施例１９で用いられたプライマー１８１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８２〕
実施例１９で用いられたプライマー１８２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８３〕
実施例１９で用いられたプライマー１８３の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８４〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の重鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：１８５〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の重鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：１８６〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の重鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：１８７〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８８〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の重鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：１８９〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の重鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：１９０〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の重鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：１９１〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：１９２〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の軽鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：１９３〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の軽鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：１９４〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の軽鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：１９５〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１９６〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の軽鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：１９７〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の軽鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：１９８〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の軽鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：１９９〕
Ｎｅｃ１−２４４−３の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２００〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の重鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２０１〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の重鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２０２〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の重鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２０３〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２０４〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の重鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２０５〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の重鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２０６〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の重鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２０７〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２０８〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の軽鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２０９〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の軽鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２１０〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の軽鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２１１〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２１２〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の軽鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２１３〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の軽鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２１４〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の軽鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２１５〕
Ｎｅｃ１−５３０−１の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２１６〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の重鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２１７〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の重鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２１８〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の重鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２１９〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２０〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の重鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２２１〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の重鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２２２〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の重鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２２３〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２２４〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の軽鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２２５〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の軽鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２２６〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の軽鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２２７〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２８〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の軽鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２２９〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の軽鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２３０〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の軽鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２３１〕
Ｎｅｃ１−５５４−１の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２３２〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の重鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２３３〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の重鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２３４〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の重鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２３５〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３６〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の重鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２３７〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の重鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２３８〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の重鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２３９〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２４０〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の軽鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２４１〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の軽鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２４２〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の軽鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２４３〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４４〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の軽鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２４５〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の軽鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２４６〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の軽鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２４７〕
Ｎｅｃ１−８０３−２の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２４８〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の重鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２４９〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の重鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２５０〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の重鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２５１〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２５２〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の重鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２５３〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の重鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２５４〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の重鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２５５〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２５６〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の軽鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２５７〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の軽鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２５８〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の軽鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２５９〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２６０〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の軽鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２６１〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の軽鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２６２〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の軽鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２６３〕
Ｎｅｃ１−８３４−１の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２６４〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の重鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２６５〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の重鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２６６〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の重鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２６７〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２６８〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の重鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２６９〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の重鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２７０〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の重鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２７１〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２７２〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の軽鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２７３〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の軽鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２７４〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の軽鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２７５〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２７６〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の軽鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２７７〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の軽鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２７８〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の軽鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２７９〕
Ｎｅｃ１−８４５−２の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２８０〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の重鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２８１〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の重鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２８２〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の重鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２８３〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２８４〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の重鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２８５〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の重鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２８６〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の重鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２８７〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２８８〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の軽鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２８９〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の軽鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２９０〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の軽鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２９１〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２９２〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の軽鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２９３〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の軽鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２９４〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の軽鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：２９５〕
Ｎｅｃ１−９０３−１の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：２９６〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の重鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２９７〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の重鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２９８〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の重鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：２９９〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３００〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の重鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：３０１〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の重鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：３０２〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の重鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：３０３〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３０４〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の軽鎖のＣＤＲ１（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：３０５〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の軽鎖のＣＤＲ２（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：３０６〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の軽鎖のＣＤＲ３（アミノ酸配列）を示す。
〔配列番号：３０７〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３０８〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の軽鎖のＣＤＲ１（塩基配列）を示す。
〔配列番号：３０９〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の軽鎖のＣＤＲ２（塩基配列）を示す。
〔配列番号：３１０〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の軽鎖のＣＤＲ３（塩基配列）を示す。
〔配列番号：３１１〕
Ｎｅｃ８−４１１６−８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３１２〕
参考例３８で得られた抗体標品のＨ鎖のＮ末端アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３１３〕
参考例３８で得られた抗体標品のＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３１４〕
配列番号：３１２のアミノ酸配列と合致するｇｅｒｍｌｉｎｅから予測されるシグナル配列のＮ末端をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３１５〕
配列番号：３１３のアミノ酸配列と合致するｇｅｒｍｌｉｎｅから予測されるシグナル配列のＮ末端をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３１６〕
参考例３８で使用されたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１７〕
参考例３８で使用されたプライマーの塩基配列を示す。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−８０３−２は２００５年９月１６日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−２４４−３は２００５年１０月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−５３０−１は２００５年１０月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−９０３−１は２００５年１０月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−５２０−１は２００５年１０月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−８４５−２は２００５年１０月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−８３４−１は２００５年１０月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８として寄託されている。
後述の実施例８で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−５５４−１は２００６年９月２０日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１として寄託されている。
後述の実施例８で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−７６９−２は２００６年９月２０日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２として寄託されている。
後述の実施例８で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−９６４−１は２００６年９月２０日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３として寄託されている。
後述の実施例８で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ１−１３０２−２は２００６年９月２０日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４として寄託されている。
後述の実施例８で得られたハイブリドーマ細胞Ｎｅｃ８−４１１６−８は２００６年９月２０日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５として寄託されている。
以下において、参考例および実施例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１ Ｎｅｃｔｉｎ−２αおよびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９のアポトーシス誘導
Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子の翻訳領域もしくはＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のイントロン領域にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：７）を設計後、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製標品を得た（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチド１と略する）。コントロールとしては、配列番号：７で示される塩基配列のリバース配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：８）を同様にｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化し、ＨＰＬＣ精製標品を得た（以下、コントロールオリゴヌクレオチド１と略する）。
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入したヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨ社）含有ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）〔以下、Ｍ５培地と略することもある〕で懸濁し、１ウェル当たり１ｘ１０４個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に播種し、５％炭酸ガス気流中３７℃で一晩培養した。２００ｎｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド１、または２００ｎｇのコントロールオリゴヌクレオチド１をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．５μＬと共にＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５０μＬと混合し、室温で２０分間放置した。上述のＨＴ−２９培養細胞の培養上清を予めＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ ５０μＬに培地交換しておき、これに上記オリゴヌクレオチド混合液を全量添加して５％炭酸ガス気流中３７℃で３時間培養を継続した後、再度Ｍ５培地に培地交換した。更に２日間培養を継続した後、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて添付プロトコールに従い、上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。その結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド１（配列番号：７）はコントロールオリゴヌクレオチド１（配列番号：８）に比べて約１．９倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を示した。
参考例２ Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９のＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
参考例１で用いたヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９をＭ５培地に懸濁し、１ウェル当たり６ｘ１０４個の細胞密度で２４穴平底組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、参考例１の方法に従ってアンチセンスオリゴヌクレオチド１およびコントロールオリゴヌクレオチド１をトランスフェクションした。但し細胞播種数に比例して全ての添加物量あるいは溶液量を６倍にスケールアップした。これらの細胞を５％炭酸ガス気流中、３７℃で２４時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。約４００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応を行ってｃＤＮＡを調製した。Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子の発現量はトータルＲＮＡにして５ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）７．５μＬ、プライマー１（配列番号：９）およびプライマー２（配列番号：１０）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ１（配列番号：１１）を１００ｎＭとなるように加え反応液量１５μＬとし、定量的ＰＣＲを行って測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の発現量はトータルＲＮＡにして５ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ７．５μＬ、プライマー３（配列番号：１２）およびプライマー４（配列番号：１３）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ２（配列番号：１４）を１００ｎＭとなるように加え反応液量１５μＬとし、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子と同様に定量的ＰＣＲを行って測定した。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＴａｑＭａｎ β−ａｃｔｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定しこれを内部標準とした。
オリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合には、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の発現量はそれぞれβ−アクチン遺伝子発現量の０．１５％、０．７６％であった。これに対しアンチセンスオリゴヌクレオチド１（配列番号：７）投与群ではＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の発現量はそれぞれβ−アクチン遺伝子発現量の０．０９５％、０．４５％と、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合と比べて統計学的に有意（Ｐ＜０．０１）な発現量低下が認められた。一方、陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド１（配列番号：８）投与群ではＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の発現量はそれぞれβ−アクチン遺伝子発現量の０．１８％、０．７６％であり、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合と同等であった。
これらの結果と参考例１の結果から、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の発現量の低下によりヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９のアポトーシスが誘発されたことが示唆された。
参考例３ Ｎｅｃｔｉｎ−２αをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー５（配列番号：１５）、および制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー６（配列番号：１６）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ １μＬ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー５（配列番号：１５）、およびプライマー６（配列番号：１６）各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）１０μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲは、９４℃・１分の後、９４℃・５秒、７２℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、７０℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、６８℃・４分のサイクルを３５回繰り返した。次にＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶにて消化した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も同様に制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶにて処理し、これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにて精製した。両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーションした後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析した結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２αタンパク質（配列番号：１）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２αを得た。
参考例４ Ｎｅｃｔｉｎ−２δをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー５（配列番号：１５）、および制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー７（配列番号：１７）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ溶液１μＬを鋳型として使用し、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー５（配列番号：１５）およびプライマー７（配列番号：１７）各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）１０μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲは、９４℃・１分の後、９４℃・５秒、７２℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、７０℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、６８℃・４分のサイクルを３５回繰り返した。次にＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ産物を５０μＬの水にて溶出し、これを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ＰＣＲ産物１μＬを鋳型として使用し、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１Ｕ、プライマー５（配列番号：１５）、および制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー８（配列番号：１８）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉを１０μＬ加え、合計２０μＬの液量とした。ＰＣＲは、９４℃・１分の後、９４℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２分のサイクルを２５回繰り返した。次にＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにて該ＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＶにて消化した。同様にｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＶにて消化した。これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにて精製し、両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーションさせた後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析した結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：４）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを得た。
参考例５ Ｎｅｃｔｉｎ−２ ｓｉＲＮＡによるヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９の細胞増殖抑制
Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、もしくはＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子（以下、これらを総称してＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子と称する）のｍＲＮＡに対する５種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１、ｓｉＲＮＡ−２、ｓｉＲＮＡ−３、ｓｉＲＮＡ−４、およびｓｉＲＮＡ−５）を等量ずつ混合したものを作製した（以下、これをＮｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡと称する）。ｓｉＲＮＡ−１、ｓｉＲＮＡ−２、ｓｉＲＮＡ−３、ｓｉＲＮＡ−４、およびｓｉＲＮＡ−５は、それぞれ２種類のＲＮＡ断片（ｓｉＲＮＡ−１は配列番号：１９で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：２０で表される塩基配列を有するＲＮＡとを、ｓｉＲＮＡ−２は配列番号：２１で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：２２で表される塩基配列を有するＲＮＡとを、ｓｉＲＮＡ−３は配列番号：２３で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：２４で表される塩基配列を有するＲＮＡとを、ｓｉＲＮＡ−４は配列番号：２５で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：２６で表される塩基配列を有するＲＮＡとを、ｓｉＲＮＡ−５は配列番号：２７で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：２８で表される塩基配列を有するＲＮＡとを）をハイブリダイズさせることにより作製した。陰性コントロールとしては、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社より購入したＮｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩＸ（以下、これをｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡと称する）を用いた。
具体的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入したヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９を、１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ社）を含むＭ５Ａ培地で懸濁し、１枚あたり５ｘ１０５個の細胞密度で１０ｃｍ組織培養シャーレ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に播種した。これを５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を剥離し、遠心分離操作により回収した。このＨＴ−２９細胞１ｘ１０６個をＮｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ １５０ｐｍｏｌもしくはｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡ １５０ｐｍｏｌを含むＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ａｍａｘａ社）に付属のｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ １００μＬに懸濁し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのプログラムＴ−２０にてトランスフェクションし、５％炭酸ガス気流中、３７℃で２４時間培養を行った。これらの細胞を３，０００個／ウェルで９６穴平底組織培養プレートに再播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で５日間培養した。各ウェルから培地を除去後、プレートを−８０℃で５分間冷却し、次いで室温で５分間放置し細胞を破壊した。次に各ウェルに１％ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および１％ＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３０（ＩＣＮ社）を含む水溶液１００μｌを添加し室温２０分間放置した後、Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍ）を計測し、細胞内ＤＮＡ含量を測定した。その結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ添加群はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡ添加群に比べて約３８％蛍光強度が低下し、両者は統計学的に有意な差（Ｐ＜０．００１）を示した。このことから、Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ添加によりＨＴ−２９細胞株の増殖が有意に抑制される事が明らかとなった。
参考例６ Ｎｅｃｔｉｎ−２ ｓｉＲＮＡによるヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９の細胞周期の変化
参考例１で用いたヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９をＭ５Ａ培地に懸濁し、１枚あたり５ｘ１０５個の細胞密度で１０ｃｍ組織培養シャーレに播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、参考例５の方法に準じてＮｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ、もしくは陰性コントロールとしてｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡをトランスフェクションし、５％炭酸ガス気流中、３７℃で２４時間培養を継続した。これらの細胞を２ｘ１０５個／ウェルで６穴平底組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に再播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で５日間培養した。各ウェルの培養細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理により剥離した後、ＣｙｃｌｅＴＥＳＴ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により細胞周期を解析した。その結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ添加群では陰性コントロールとして用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡ添加群に比べ、Ｇ０／Ｇ１期にある細胞の比率が約１３％上昇し、Ｓ期にある細胞の比率が約１１％低下していた。このことから、Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡによりヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９の細胞周期の変化が誘導されることが示唆された。
参考例７ Ｎｅｃｔｉｎ−２ ｓｉＲＮＡによるヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９のＮｅｃｔｉｎ−２ ｍＲＮＡ発現量低下
参考例１で用いたヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９をＭ５Ａ培地に懸濁し、１枚あたり５ｘ１０５個の細胞密度で１０ｃｍ組織培養シャーレに播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、参考例５の方法に準じてＮｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡもしくは陰性コントロールとしてｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡをトランスフェクションし、５％炭酸ガス気流中、３７℃で２４時間培養した。これらの細胞をよりＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。約１００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写反応を行った。Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子のｍＲＮＡの発現量はトータルＲＮＡにして１０ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μｌ、プライマー１（配列番号：９）およびプライマー２（配列番号：１０）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ１（配列番号：１１）を１００ｎＭとなるように加え、反応液量１０μＬとし定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。一方、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡの発現量はトータルＲＮＡにして１０ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ５μＬ、プライマー３（配列番号：１２）およびプライマー４（配列番号：１３）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ２（配列番号：１４）を１００ｎＭとなるように加え、反応液量１０μＬとし定量的ＰＣＲを行って測定した。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＴａｑＭａｎ β−ａｃｔｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定しこれを内部標準とした。
Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ添加群では、陰性コントロールとして用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡ添加群に比べＮｅｃｔｉｎ−２αのｍＲＮＡ発現量は６９％、Ｎｅｃｔｉｎ−２δのｍＲＮＡ発現量は７３％低下しており、いずれも両者の間に統計学的に有意な差（Ｐ＜０．００１）が見られた。これらの結果より、Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡによりＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の低下が誘導されたことが示された。
参考例８ ヒト癌組織におけるＮｅｃｔｉｎ−２ ｍＲＮＡの発現亢進
ヒト癌組織とヒト正常組織におけるＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量的ＰＣＲ法により比較検討した。ＰＣＲの鋳型としてはｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ １（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社）、ｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ ２（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社）、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、およびＨｕｍａｎ Ｏｖａｒｙ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いた。Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子のｍＲＮＡ発現量の測定は１μＬのｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）７．５μＬ、プライマー１（配列番号：９）およびプライマー２（配列番号：１０）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ１（配列番号：１１）を１００ｎＭとなるように加え反応液量を１５μＬとした。Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の測定は１μＬのｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ７．５μＬ、プライマー３（配列番号：１２）およびプライマー４（配列番号：１３）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ２（配列番号：１４）を１００ｎＭとなるように加え反応液量を１５μＬとした。但し、ｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ １（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社）、およびｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ ２（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社）については鋳型量を０．２μＬとした。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し、これを内部標準とした。その結果、ヒト癌組織におけるＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子のｍＲＮＡ発現量はヒト正常組織の発現量に比べ、ｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ １（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社）に含まれる３人のドナーで各々１．１倍、１０倍、４．３倍、またｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ ２（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社）に含まれる３人のドナーで各々１２倍、３．５倍、２１倍であった。同様にして、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子のｍＲＮＡ発現量はＨｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に含まれる５人のドナーの癌組織では正常組織の各々４．８倍、３．２倍、２．６倍、１．９倍、１．８倍、Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に含まれる５人のドナーの癌組織では正常組織の各々１１倍、３．７倍、４．１倍、３．２倍、１．３倍、またＨｕｍａｎ Ｏｖａｒｙ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に含まれる５人のドナーのうち４人の癌組織では正常組織の各々１．３倍、１．８倍、２．６倍、２．４倍であった。癌組織におけるＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量は正常組織の発現量に比べ、ｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ １（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社社）に含まれる３人のドナーのうち２人で各々１．１倍、５．３倍、ｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ ２（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社）に含まれる３人のドナーのうち２人で各々２．０倍、２．５倍であった。。同様にして、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量はＨｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社社）に含まれる５人のドナーのうち３人の癌組織では正常組織の各々１．３倍、１．８倍、１．５倍、Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に含まれる５人のドナーのうち４人の癌組織では正常組織の各々４．８倍、３．７倍、１．１倍、１．３倍、またＨｕｍａｎ Ｏｖａｒｙ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に含まれる５人のドナーのうち４人の癌組織では正常組織の各々４．２倍、２．１倍、２．４倍、４．２倍であった。これらの結果より、癌組織では正常組織に比べＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡの発現が亢進していることが確認された。
参考例９ ヒト癌細胞株におけるＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｍＲＮＡの発現量比較
骨肉種細胞株Ｓａｏｓ−２、脳腫瘍細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ｄ３４１Ｍｅｄ、Ｄａｏｙ、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ、Ｕ−１１８ＭＧ、Ｕ−８７ＭＧ、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１、ＳＷ１０８８、乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７、ＺＲ−７５−１、ＡＵ５６５、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩ、Ｔ−４７Ｄ大腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２、ＣＯＬＯ２０１、ＣＯＬＯ２０５、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−８、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＬＳ１８０、ＬＳ１２３、ＬＳ１７４Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ５４８、ＮＣＩ−ＳＮＵ−Ｃ１、ＳＫ−ＣＯ−１、ＳＷ４０３、ＳＷ４８、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＷ８３７、ＳＷ９４８、ＨＣＴ１１６、ＷｉＤｒ、非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ８１０、ＮＣＩ−Ｈ１１５５、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＮＣＩ−Ｈ１３９５、ＮＣＩ−Ｈ１４３５、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、ＮＣＩ−Ｈ１６５１、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ１７９３、ＮＣＩ−Ｈ２０７３、ＮＣＩ−Ｈ２０８５、ＮＣＩ−Ｈ２１０６、ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＮＣＩ−Ｈ２３４２、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＳＫ−ＬＵ−１、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１８７、ＮＣＩ−Ｈ３７８、ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＮＣＩ−Ｈ８８９、ＮＣＩ−Ｈ１４１７、ＮＣＩ−Ｈ１６７２、ＮＣＩ−Ｈ１８３６、ＮＣＩ−Ｈ１９６３、ＮＣＩ−Ｈ２２２７、ＮＣＩ−Ｎ４１７、ＳＨＰ−７７、卵巣癌細胞株ＥＳ−２、Ｃａｏｖ−３、ＭＤＡＨ２７７４、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ−９０、ＳＫ−ＯＶ−３、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＴＯＶ−２１Ｇ、前立腺癌細胞株ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、網膜芽腫細胞株ＷＥＲＩ−Ｒｂ−１、Ｙ７９、精巣癌細胞株Ｃａｔｅｓ−１Ｂ（以上ＡＴＣＣより購入）、大腸癌細胞株ＣＯＣＭ１、非小細胞肺癌細胞株ＶＭＲＣ−ＬＣＤおよび前立腺癌細胞株ＰＣ３（以上Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）より購入）を、それぞれＡＴＣＣあるいはＪＣＲＢが推奨している培養方法に従って培養し、培養細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを調製した。このトータルＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行いｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として定量的ＰＣＲを行うことにより、Ｎｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。
Ｎｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｍＲＮＡ発現量の定量は上記トータルＲＮＡ ５ｎｇより得られたｃＤＮＡを鋳型とし、参考例２に記載の方法に従って行った。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し、これを内部標準とした。
各癌細胞株におけるＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量をβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量で標準化した相対的発現量を〔表１〕に示す。調べた全癌細胞株のうち２株がβ−アクチンｍＲＮＡの１％以上のＮｅｃｔｉｎ−２α ｍＲＮＡを発現し、また１２株がβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡの１％以上のＮｅｃｔｉｎ−２δ ｍＲＮＡを発現していることが明らかとなった。
Figure 2008044754
 参考例１０ Ｎｅｃｔｉｎ−２δ ｃＤＮＡ免疫による抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体の作製
ジーンガンを用いたＤＮＡ免疫法による抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体作製を、Ｇｅｎｏｖａｃ社（日本農産工業（株））に委託して行った。Ｎｅｃｔｉｎ−２δ（配列番号：３）のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを組み込んだ動物細胞用発現ベクターをＧｅｎｏｖａｃ社出願の特許文献（ＷＯ００／２９４４２号公報）に記載されている方法に従いマイクロパーティクルに塗布し、これをジーンガンを用いてウサギ２羽に免疫した。耳静脈より試験採血して得た血清の抗体価上昇を確認した後、麻酔下頚動脈採血を行ってそれぞれ１２７ｍＬ、および１１５ｍＬの抗血清を得た。
これらの抗血清をＰＢＳで２倍希釈し、遠心分離した上澄液をＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質をＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に固定化し作製した抗原カラムに供した。同カラムをＰＢＳで洗浄後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３）で溶出し、溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で速やかに中和した後、ＰＢＳに対して４℃で終夜透析して抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体を精製取得した。ここで得られた抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体をそれぞれＮ２−Ｒ１、およびＮ２−Ｒ２と命名した。
参考例１１ ヒト癌細胞株におけるＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質の発現量
ヒト癌細胞におけるＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質の発現量をフローサイトメトリーにより調べた。ヒト癌細胞株、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＨＴ−２９、ＯＶ−９０、ＳＫＢＲ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３４２、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＮＣＩ−Ｈ２９２、Ｃａｐａｎ−２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢＸＰＣ−３、ＨＣＴ−８、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、Ｃａｏｖ−３、ＤＵ１４５、Ａ５４９、Ｃａｃｏ−２、ＷｉＤｒ、ＺＲ−７５−１、ＨＣＴ−１５、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＢＴ４７４（以上、ＡＴＣＣより購入）をそれぞれＡＴＣＣ推奨の方法により培養し、Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてそれぞれ１ｘ１０６個／ｍＬとなるように細胞の懸濁液を作製した。細胞懸濁液に参考例１０で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体（Ｎ２−Ｒ２）を最終濃度３μｇ／ｍＬとなるよう添加し、４℃で１時間反応させた。同様の手法により、非免疫ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を最終濃度３μｇ／ｍＬとなるように添加し陰性コントロールとした。この細胞懸濁液を遠心分離操作後、Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒにて洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、４℃で１時間反応させた。再度Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に供し、各細胞のＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質発現レベルを測定した。各細胞株の陰性コントロールの蛍光強度中央値に対するＮ２−Ｒ２染色細胞の蛍光強度中央値の比を〔表２〕に示した。この結果から、肺癌、乳癌、卵巣癌など複数の癌種に由来するヒト癌細胞株においてＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質が高発現していることが明らかとなった。
Figure 2008044754
 参考例１２ 組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２細胞外領域−ＦＬＡＧタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
参考例４で作製した動物細胞用発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー３３（配列番号：２９）、および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー３４（配列番号：３０）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成はｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δ １０ｎｇ、ＰｆｕＵｌｔｒａ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）２．５Ｕ、プライマー３３（配列番号：２９）、およびプライマー３４（配列番号：３０）各０．２μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）５μＬの合計５０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・２分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・１分１５秒のサイクルを３０回繰り返した後に、７２℃・１０分の反応を行った。次にＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩにて消化した。同様にｐＣＭＶ−Ｔａｇ４（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）も制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて消化した。Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてそれぞれのＤＮＡ断片を精製した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて両ＤＮＡ断片をライゲーションさせた。得られたプラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析した結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質の細胞外領域（配列番号：３で表されるＮｅｃｔｉｎ−２δのアミノ酸配列の１番目から３６１番目）のＣ末端にＦＬＡＧタグが融合したＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質（配列番号：３１）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：３２）を有する動物細胞用発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧを得た。
参考例１３ 組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質の調製
参考例１２にて作製した動物細胞用発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧ）によりコードされるＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて調製した。具体的には、２９３Ｆ細胞株に動物細胞用発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧを２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションし、この細胞を８％炭酸ガス気流中、３７℃で３日間旋回培養した。細胞懸濁液を遠心分離して得た培養上清を０．４５μｍのフィルターを用いろ過した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化した抗ＦＬＡＧ抗体カラム（Ｓｉｇｍａ社）に供した。ＰＢＳでカラムを洗浄した後、ＦＬＡＧペプチドを０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳにてＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を溶出した。この溶出画分をＶｉｖａｓｐｉｎ（ＶＩＶＡ ＳＣＩＥＮＣＥ社）を用いて限外濃縮した後、ＰＢＳで平衡化したゲルろ過カラムＰＤ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）を用いて混入するＦＬＡＧペプチドを除去し、再度濃縮して高純度の組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を取得した。
参考例１４ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体の作製
参考例１３で調製した組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を免疫原として抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体を作製した。Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質のＰＢＳ溶液とフロインド完全アジュバントとを等量混合して作製したエマルションを、家兎（日本白色種、雌、３ｋｇ）３羽の背部皮下および皮内に１羽あたりＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質として０．１ｍｇずつ免疫した。２回目以降の免疫にはフロインド不完全アジュバントを用いたタンパク質エマルションを同様に調製し、２週間毎に７回追加免疫した。
免疫前および４回目と６回目の免疫１週間後に耳静脈より試験採血し、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質をコートしたイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡにより血清抗体価の上昇を確認した。最終免疫の１週間後に３羽のウサギより麻酔下頚動脈採血を行い、それぞれ７８．９ｍｌ、７８．２ｍｌ、７８．８ｍｌの抗血清を取得した。
これらの抗血清をＰＢＳで２倍希釈し遠心分離した上澄液を、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質をＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）に固定化し作製した抗原カラムに供した。カラムをＰＢＳで洗浄後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３）で溶出し、溶出液を速やかに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した後、ＰＢＳに対して４℃で終夜透析し、抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体（Ｎ２−Ｎｏ．１、Ｎ２−Ｎｏ．２、およびＮ２−Ｎｏ．３）を取得した。
参考例１５ 組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２細胞外領域−Ｆｃタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
（１）ヒトＩｇＧ１・Ｆｃフラグメント遺伝子のクローニング
ヒト脾臓由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー３３（配列番号：３３）、および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー３４（配列番号：３４）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ １μＬ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー３３（配列番号：３３）およびプライマー３４（配列番号：３４）各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）１０μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２分のサイクルを３０回繰り返した。次にＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩにて消化した。同様にｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩにて消化した。これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにて精製し、両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーションさせた後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈＦｃを得た。
（２）Ｎｅｃｔｉｎ−２細胞外領域−ヒトＦｃキメラタンパク質発現ベクターの構築
参考例４で作製したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを鋳型とし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を付加したプライマー３５（配列番号：３５）、および制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー３６（配列番号：３６）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成はｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δ １０ｎｇ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５Ｕ、プライマー３５（配列番号：３５）およびプライマー３６（配列番号：３６）各０．２μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、２ｘＧＣ Ｂｕｆｒｅｒ Ｉ１０μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２分３０秒のサイクルを３５回繰り返した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＥｃｏＲＩにて消化した。同様にｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈＦｃも制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにて消化した。両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を用いてライゲーションさせた後、大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析した結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質の細胞外領域（配列番号：３で表されるＮｅｃｔｉｎ−２δのアミノ酸配列の１番目から３５０番目）とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が融合したタンパク質（配列番号：３７）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：３８）を有する動物細胞用発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃ）を得た。
参考例１６ 組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質の調製
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、参考例１５にて作製した動物細胞用発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃ）によりコードされるＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃタンパク質を調製した。具体的には、２９３Ｆ細胞株にｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃを２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションし、８％炭酸ガス気流中、３７℃で３日間旋回培養した。細胞懸濁液を遠心分離して得た培養上清を０．２２μｍのフィルターを用いろ過した後、ＰＢＳで平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）に供した。ＰＢＳでカラムを洗浄した後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）で溶出し、溶出液を速やかに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した。Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃ溶出画分を４℃でＰＢＳに対して終夜透析した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ ３０ＭＷＣＯ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて限外濃縮し、組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質を取得した。
参考例１７ ペプチド抗原を用いた抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体の作製
Ｎｅｃｔｉｎ−２αタンパク質（配列番号：１）およびＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）のアミノ酸配列に基づき、１５アミノ酸からなる以下の３種のペプチド（ペプチド１〜３）を合成した。
ペプチド１のアミノ酸配列
〔Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（配列番号：３９）〕は、Ｎｅｃｔｉｎ−２αタンパク質（配列番号：１）、およびＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）の８８番目から１０１番目までのアミノ酸配列のＮ末端にＣｙｓ残基を付加した配列である。
ペプチド２のアミノ酸配列
〔Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（配列番号：４０）〕は、Ｎｅｃｔｉｎ−２αタンパク質（配列番号：１）の３４７番目から３６０番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、Ｃｙｓ残基を付加した配列である。
ペプチド３のアミノ酸配列
〔Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（配列番号：４１）〕は、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）の４２６番目から４３９番目までのアミノ酸配列のＮ末端に、Ｃｙｓ残基を付加した配列である。
上記ペプチド１、ペプチド２およびペプチド３を、それぞれキャリアータンパク質；マレイミド化Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ社）に化学結合させたものを免疫原とした。免疫動物は雄性ウサギＫＢＬ：ＪＷ（１１週齢、北山ラベス）を用い、初回は上記免疫原とフロインド完全アジュバンド（Ｄｉｆｃｏ社）とから成るエマルションを、２回目以降は同免疫原とフロインド不完全アジュバンド（Ｄｉｆｃｏ社）とから成るエマルションをそれぞれタンパク量として各０．５ｍｇずつ背部皮下に２週間毎に合計４回免疫した。初回免疫後５２日目に各ウサギを麻酔下、頚動脈採血し、ペプチド１、ペプチド２またはペプチド３を免疫したウサギから各々７０ｍｌ、６６ｍｌ、７２ｍｌの抗血清を得た。このようにして得られた抗血清からイムノグロブリン画分を硫安塩析法により濃縮し、プロテインＡアフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）により精製し、ＩｇＧ抗体画分を得た。こうして得たＩｇＧ抗体を、各ペプチドをＣｙｓ残基を介してセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）にカップリングした固定化カラムに供した。カラムをＰＢＳで洗浄した後、８Ｍ尿素を含むＰＢＳを用いてペプチド特異的抗体を溶出した。これらの溶出液をＰＢＳに対して透析して尿素を除いた後、限外濃縮、フィルターろ過滅菌することにより、ペプチド１、ペプチド２、およびペプチド３に対する抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体精製標品（ＡＳ−２７０４、ＡＳ−２７０５、およびＡＳ−２７０６）を取得した。
参考例１８ 組換え型完全長Ｎｅｃｔｉｎ−２δ安定発現ＮＳＯ細胞株の樹立
Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）を安定的に発現するＮＳＯ細胞株を樹立した。動物細胞用発現ベクターｐＥＥ１２．４−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを取得するため、参考例４で作製したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＶにて消化した。同様に動物細胞発現ベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＳｍａＩにて消化した。これらをアガロースゲル電気泳動し目的断片を切り出しＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製し、両ＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーションさせた後、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、遠心して回収した菌体からＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にてプラスミドを調製した。プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化後、アガロースゲル電気泳動でＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の挿入を確認し、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：４）を有する動物細胞用発現ベクターｐＥＥ１２．４−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを得た。制限酵素（ＰｖｕＩ）消化により直線化したｐＥＥ１２．４−Ｎｅｃｔｉｎ−２δ ４０μｇをＮＳＯ細胞（２ｘ１０７個）にジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてトランスフェクション（２５０Ｖ，４００μＦ）した。これを１０％透析ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ培地（ＪＲＨ社）に再懸濁させ、９６穴平底組織培養プレート１６枚に１ウェルあたり８，０００個／５０μＬ、プレート２０枚に１ウェルあたり２，０００個／５０μＬ、プレート４０枚に１ウェルあたり４００個／５０μＬとなるよう播種した。これらを８％炭酸ガス気流中、３７℃で２４時間培養した後、１０％透析ＦＢＳおよびＧＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＪＲＨ社）を含有するＧＳ選択ＤＭＥＭ培地（ＪＲＨ社）を各ウェルに１５０μＬずつ加え、８％炭酸ガス気流中、３７℃で３〜４週間培養を継続した。上記選択培地中で増殖したコロニーを２４穴平底組織培養プレートへ再播種し、増殖した細胞よりＲＮｅａｓｙ ９６Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した後、ＴａｑＭａｎ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量的ＰＣＲを行い、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ ｍＲＮＡ高発現細胞株を選択した。定量的ＰＣＲの反応液は、トータルＲＮＡ １００ｎｇを鋳型とし、２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）２５μＬ、４０Ｘ ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１．２５μＬ、プライマー４２（配列番号：４２）およびプライマー４３（配列番号：４３）を各５０ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ３（配列番号：４４）を５０ｎＭとなるように加え、反応液量５０μＬとした。ＰＣＲは、４８℃・３０分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。その結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡを高発現しているＮＳＯ細胞１２株を選択取得した。
これら１２株のＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質発現量を参考例１７で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ペプチドウサギポリクローナル抗体（ＡＳ−２７０４）を用いたフローサイトメトリーにより比較し、中でもＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質を高発現するＮＳＯ細胞株（＃２−７５）を選択取得した。
参考例１９ 組換え型完全長Ｎｅｃｔｉｎ−２δ安定発現ＦＭ３Ａ細胞株の樹立
Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）を安定的に発現するＦＭ３Ａ細胞株を樹立した。動物細胞用発現ベクターｐＥＦ１−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを取得するため、参考例４で作製したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＶにて消化した。同様に動物細胞発現ベクターｐＥＦ１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＶにて消化した。これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製し、両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲートさせた後、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、遠心して回収した菌体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にてプラスミドを調製した。プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＶにて消化後、アガロースゲル電気泳動でＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の挿入を確認し、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：４）を有する動物細胞用発現ベクターｐＥＦ１−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを得た。
ｐＥＦ１−Ｎｅｃｔｉｎ−２δ ４０μｇをＦＭ３Ａ細胞（１ｘ１０７個）にジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）にてトランスフェクション（３５０Ｖ，９５０μＦ）した。これを１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に再懸濁し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で１８時間培養した。この遺伝子導入細胞を１０％ＦＢＳおよび１ｍｇ／ｍＬ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁させ、９６穴平底組織培養プレートに１ウェルあたり１，０００個／２００μＬ、１００個／２００μＬとなるよう各２０枚ずつ播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で１〜２週間培養を継続した。上記選択培地中で増殖したコロニーを２４穴平底組織培養プレートへ再播種し、増殖した細胞よりＲＮｅａｓｙ ９６ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した後、ＴａｑＭａｎ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量的ＰＣＲを行い、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ ｍＲＮＡ高発現細胞株を選択した。定量的ＰＣＲの反応液は、トータルＲＮＡ １００ｎｇを鋳型とし、２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）２５μＬ、４０Ｘ ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１．２５μＬ、プライマー１（配列番号：９）およびプライマー２（配列番号：１０）を各５０ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ１（配列番号：１１）を５０ｎＭとなるように加え、反応液量５０μＬとした。ＰＣＲ反応は、４８℃・３０分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。その結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡを高発現しているＦＭ３Ａ細胞７株を選択取得した。
これら７株のＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質発現量を参考例１７で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ペプチドウサギポリクローナル抗体（ＡＳ−２７０４）を用いたフローサイトメトリーにより比較し、中でもＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質を高発現するＦＭ３Ａ細胞株（＃５８、＃６０）を選択取得した。さらにこれらの細胞株を上記選択培地に再懸濁させ９６穴平底組織培養プレートに１ウェルあたり３個／２００μＬ、１個／２００μＬ、０．３個／２００μＬになるよう各１枚ずつ播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で培養を継続した。単一コロニーとして増殖した細胞株の一部を上記のフローサイトメトリーに供し、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質発現量の高いクローン（＃６０−６）を選択取得した。
参考例２０ 組換え型完全長Ｎｅｃｔｉｎ−２δ安定発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞株の樹立
Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株を樹立した。参考例１８で構築したＮｅｃｔｉｎ−２δ動物細胞用発現ベクター（ｐＥＥ１２．４−Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）を制限酵素ＰｖｕＩ消化により直線化し、４０μｇをＣＨＯ−Ｋ１細胞（１ｘ１０７個）にジーンパルサーを用いてトランスフェクションした。これを１０％透析ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＧＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＪＲＨ社）を含有するＤＭＥＭ培地（ＪＲＨ社）に再懸濁させ、９６穴平底組織培養プレート４０枚に１ウェルあたり２，５００個／５０μＬとなるよう播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で２４時間培養した後、３３．３μＭまたは６６．６μＭ ＭＳＸ（ＩＣＮ社）を含む上記培地１５０μＬをそれぞれプレート２０枚ずつに加え、５％炭酸ガス気流中、３７℃で３〜４週間選択培養を継続した。上記選択培地中で増殖したコロニーを２４穴平底組織培養プレートへ再播種し、増殖した細胞よりＲＮｅａｓｙ ９６ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを取得しこれを鋳型として逆転写反応を行った。さらにこの反応産物を鋳型として定量的ＰＣＲを行い、Ｎｅｃｔｉｎ−２δのｍＲＮＡを高発現する上位６０株を選択取得した。
これら６０株のＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質発現量を参考例１７で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ２ペプチドウサギポリクローナル抗体（ＡＳ−２７０４）を用いたフローサイトメトリーにより比較し、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質を高発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（４３−２）を選択取得した。
参考例２１ 組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−３細胞外領域−Ｆｃタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
（１）マウスＩｇＧ２ａ・Ｆｃフラグメントのクローニング
マウス脾臓由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー４５（配列番号：４５）および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー４６（配列番号：４６）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ １μＬ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー４５（配列番号：４５）およびプライマー４６（配列番号：４６）各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭおよび２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）１０μＬで、合計２０μＬの液量とした。ＰＣＲは、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２分のサイクルを３０回繰り返した。次にＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩにて消化した。同様にｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩにて消化した。これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにて精製し、両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーションさせた後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析した結果、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域をコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｍＦｃを得た。
（２）Ｎｅｃｔｉｎ−３細胞外領域−ヒトＦｃキメラタンパク質発現ベクターの構築
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を鋳型とし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を付加したプライマー４７（配列番号：４７）および制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー４８（配列番号：４８）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ １μＬ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５Ｕ、プライマー４７（配列番号：４７）およびプライマー４８（配列番号：４８）各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）２５μＬを加え、合計５０μＬの液量とした。ＰＣＲは、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２分のサイクルを３５回繰り返した。該ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにて精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩにて消化した。同様に参考例１５で作製したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈＦｃを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩにて消化した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を用いてライゲーションした後、大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養したした。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析した結果、Ｎｅｃｔｉｎ−３タンパク質の細胞外領域（配列番号：５で表されるＮｅｃｔｉｎ−３のアミノ酸配列の１番目から４０４番目）とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が融合したタンパク質（配列番号：４９）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：５０）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｈＦｃを得た。
（３）Ｎｅｃｔｉｎ−３細胞外領域−マウスＦｃキメラタンパク質発現ベクターの構築
（２）で得た動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｈＦｃを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩにて消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後Ｎｅｃｔｉｎ−３タンパク質の細胞外領域をコードするＤＮＡ断片を切り出し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。同様に（１）で得たｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｍＦｃを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩにて消化し、反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を用いてライゲーションした後、大腸菌ＴＯＰ１０に導入しアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析した結果、Ｎｅｃｔｉｎ−３タンパク質の細胞外領域（配列番号：５で表されるＮｅｃｔｉｎ−３のアミノ酸配列の１番目から４０４番目）とマウスのＦｃ領域が融合したタンパク質（配列番号：５１）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：５２）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｍＦｃを得た。
参考例２２ 組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｍＦｃタンパク質の調製
参考例２１にて作製したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｍＦｃによりコードされるＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｍＦｃタンパク質をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い調製した。具体的には、２９３Ｆ細胞株にｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｍＦｃを２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションし、８％炭酸ガス気流中、３７℃で３日間旋回培養した。細胞懸濁液を遠心分離して得た培養上清上澄液を０．２２μｍのフィルターを用いろ過した後、ＰＢＳで平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）に供した。ＰＢＳでカラムを洗浄した後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）で溶出し、溶出液を速やかに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した。Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−Ｆｃ溶出画分をＰＢＳに対して４℃、終夜透析した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ ３０ＭＷＣＯ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて限外濃縮し、組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｍＦｃタンパク質を取得した。
参考例２３ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体の精製
免疫組織染色（ＩＨＣ）時の非特異反応を低減させるため、参考例１４で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体Ｎ２−Ｎｏ．２を、参考例２６で作製したＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質をＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に固定化して作製したＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧカラムに供し、ＦＬＡＧタグに結合する抗体画分を除去した。同カラムから素通りしたＮｅｃｔｉｎ−２特異的なウサギポリクローナル抗体画分をＮ２−Ｎｏ．２−２として回収し、これをＩＨＣ実験に用いた。
参考例２４ ヒト癌組織におけるＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質の発現亢進
ヒト癌組織おけるＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質の発現をＩＨＣにより検討した。具体的には、ヒト乳癌組織アレイ（Ｃｙｂｒｄｉ社）、およびヒト卵巣癌組織アレイ（Ｃｙｂｒｄｉ社）、ヒト正常組織アレイ（Ｂｉｏｍａｘ社）ヒトを脱パラフィン処理した後に、抗原賦活化溶液（ＤＡＫＯ社）に浸漬させオートクレーブにて１２１℃で１５分間処理した。次にこれらの組織アレイを水洗後、３％過酸化水素水を用いて室温で７．５分間処理し、ＰＢＳにて洗浄した後、ヤギ血清（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ社）を用いて室温で２０分間ブロッキング反応を行った。ヤギ血清を除去後、参考例２３で精製した１μｇ／ｍＬのＮ２−Ｎｏ．２−２を含む抗体希釈緩衝液（ＤＡＫＯ社）を用いて４℃で一晩反応させた。ＰＢＳを用いてアレイを洗浄後、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋（ＤＡＫＯ社）を用いて室温で３０分間反応させた。再度ＰＢＳにて洗浄を行い、０．０１％過酸化水素水を含むＤＡＢ基質（Ｍｅｒｃｋ社）溶液を組織アレイに添加し室温で３分間反応させた。その後、水洗を行いヘマトキシリンに１分間浸漬させた後、脱水処理を行った。顕微鏡により各アレイにスポットされた組織を観察したところ、表２Ａおよび表２Ｂに示す割合でＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質が癌組織で有意に発現亢進している事が明らかとなった。
Figure 2008044754
Figure 2008044754
 参考例２５ 組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−３細胞外領域−ＦＬＡＧタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−３細胞外領域−ＦＬＡＧタンパク質の動物細胞用発現ベクターの作製にあたり、先ず、ＦＬＡＧタグ配列を付加させることのできるベクターを構築した。具体的には、５’末端をリン酸化した２種類の合成ＤＮＡ、ＦＬＡＧ−ＦＳＡＬＮＯＴ（配列番号：５３）もしくはＦＬＡＧ−ＲＳＡＬＮＯＴ（配列番号：５４）を５０μＭになるようにＴＥ（１ｍＭ ＥＤＴＡ含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８））で希釈後、等量を混合し、９５℃・１０分間加熱後徐冷してアニーリングを行った。次に動物細胞用発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を制限酵素ＮｈｅＩとＮｏｔＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動し、ベクター断片をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で抽出した。この制限酵素処理したｐＣＩ−ｎｅｏにアニーリングを行った上記合成ＤＮＡを混合しＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーション反応を行い、ＦＬＡＧタグ配列を付加した動物発細胞発現用ベクターｐＣＩ−ＦＬＡＧを構築した。
次に参考例２１で作製した動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｈＦｃを鋳型とし、制限酵素ＳａｌＩの認識配列を付加したプライマー５５（配列番号：５５）、および制限酵素ＮｈｅＩの認識配列を付加したプライマー５６（配列番号：５６）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成はｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｈＦｃを鋳型とし、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）２．５Ｕ、プライマー５５（配列番号：５５）とプライマー５６（配列番号：５６）各０．５μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）５μＬの合計５０μＬとした。ＰＣＲは、９４℃・２分の後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・１．５分のサイクルを３０回繰り返した後に、６８℃・２分の反応を行った。次に該ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した後、制限酵素ＳａｌＩ、およびＮｈｅＩにより消化した。同様に上述のｐＣＩ−ＦＬＡＧを制限酵素ＳａｌＩとＮｈｅＩにより消化した。ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて両ＤＮＡ断片を精製した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて両ＤＮＡ断片をライゲーションさせた。得られた反応物を大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、Ｎｅｃｔｉｎ−３タンパク質（配列番号：５）のアミノ酸配列の１番目から４０４番目のＣ末端にＦＬＡＧタグが融合したＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質（配列番号：５７）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：５８）を有する動物細胞用発現ベクターｐＣＩ−Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧを得た。
参考例２６ 組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質の調製
参考例２５にて作製した動物細胞用発現ベクター（ｐＣＩ−Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧ）によりコードされるＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて調製した。具体的には、動物細胞用発現ベクターｐＣＩ−Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧを２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて２９３Ｆ細胞株にトランスフェクションし、この細胞を８％炭酸ガス気流中、３７℃で３日間旋回培養した。細胞懸濁液を遠心分離して得た培養上清を０．４５μｍのフィルターを用いろ過した後、０．３Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化させた抗ＦＬＡＧ抗体カラム（Ｓｉｇｍａ社）に供した。０．３Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄した後、ＦＬＡＧペプチドを０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する同緩衝液にてＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を溶出した。この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５（３０ＫＭＷＣＯ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて限外濃縮した後、ＰＢＳで平衡化させたＰＤ−１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に供し、混入するＦＬＡＧペプチドを除去し、再度濃縮して高純度の組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を取得した。
参考例２７ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−３ウサギポリクローナル抗体の作製
参考例２６で調製した組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を免疫原として抗Ｎｅｃｔｉｎ−３ウサギポリクローナル抗体を作製した。Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質のＰＢＳ溶液とフロインド完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）とを等量混合して作製したエマルションを、家兎（日本白色種、雌、３ｋｇ）２羽の背部皮下および皮内に１羽あたりＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質として０．１ｍｇずつ免疫した。２回目以降の免疫にはフロインド不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）を用いた同タンパク質エマルションを同様に調製し、２週間毎に７回免疫を繰り返した。
免疫前および４回目と６回目の免疫１週間後に耳静脈より試験採血し、Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質をコートしたイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡにより血清抗体価の上昇を確認した。最終免疫の１週間後に２羽のウサギより麻酔下、頚動脈採血を行い、それぞれ７８．９ｍｌ、７８．８ｍｌの抗血清を取得した。
これらの抗血清をＰＢＳで２倍希釈し遠心分離した上澄液を、Ｎｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質をＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に固定化し作製した抗原カラムに供した。カラムをＰＢＳで洗浄後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３）で溶出し、溶出液を速やかに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した後、ＰＢＳに対して４℃で終夜透析し、抗Ｎｅｃｔｉｎ−３ウサギポリクローナル抗体（Ｎ３−Ｎｏ．１およびＮ３−Ｎｏ．３）を取得した。
参考例２８ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の大量調製
Ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性測定に用いた１１種類の抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体は該抗体産生ハイブリドーマ（Ｎｅｃ１−８０３−２、Ｎｅｃ１−９６４−１、Ｎｅｃ１−３０３−２、Ｎｅｃ１−５５４−１、Ｎｅｃ１−１３０２−２、Ｎｅｃ１−７６９−２、Ｎｅｃ１−１３０５−１、Ｎｅｃ１−１４１−３、Ｎｅｃ１−２０９−２、Ｎｅｃ１−９０９−１およびＮｅｃ１−８４７−２）から調製した。以下にその典型的な調製方法を例示する。上記ハイブリドーマ細胞株を１０％ＦＢＳ，Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＩＨ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２＝１：１、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１ｍＭピルビン酸ナトリウム溶液、２ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３７℃、５％炭酸ガス気流中で拡大培養した後、１次馴化培地（ＩＨ培地：ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ、８ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液＝１：１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に拡大して１日培養し、さらに主培養培地（ＩＨ培地：ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ、８ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液＝１：３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に拡大してスピナーフラスコを用いる場合は３７℃、５％炭酸ガス気流中、５０Ｌ容攪拌培養槽を用いる場合は３７℃、溶存酸素濃度２ｐｐｍ、ｐＨ７．０、攪拌回転数４０ｒｐｍ条件下で５〜７日間培養した。その間、培地成分分析を基にグルコース溶液およびＬ−グルタミン溶液を添加した。主培養は細胞生存率５０％付近を目安として終了した。培養終了後、遠心分離（７，４６０ｘｇ、２０分間）を行って培養上清を回収した。
こうして得た各ハイブリドーマ培養上清を限外ろ過膜（ハイドロザルト膜、分画分子量１０，０００；ザルトリウス社）を用いて濃縮し、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー置換した後、遠心分離操作（１４，３００ｘｇ、２０分間）を行い、上澄液を得た。これを更に精密ろ過（ステリカップＨＶ、０．４５μｍ；ミリポア社）して濃縮液を得た。これを０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２２ｍｍＩＤｘ７９ｍｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に吸着させ、２０カラム容量の同緩衝液でカラムを洗浄した。カラムに結合した抗体画分は０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を２０カラム容量通液することにより溶出させ、直ちに１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を加え中和した。この抗体溶液を限外ろ過膜（アミコンウルトラ、分画分子量３０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮した後、ＰＢＳで平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（２６ｍｍＩＤｘ６０ｃｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に供し、同緩衝液で溶出して抗体単量体画分を得た。これをＰＢＳで平衡化したＡｃｔｉＣｌｅａｎ ＥＴｏｘカラム（２５ｍｍＩＤｘ５９ｍｍ、ステロジーン・バイオセパレーションズ社）に供してエンドトキシンを除去した後、限外ろ過膜（アミコンウルトラ、分画分子量１０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮し、さらに無菌ろ過（マイレクスＧＶ、０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）して精製抗体を得た。
ハイブリドーマＮｅｃ１−５５４−１の培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム精製された抗体画分は例外的に活性抗体と不活性抗体との混合物である事が分かった為、この抗体画分をさらに陽イオン交換カラムに供し、活性画分を分離取得する事とした。すなわち、上記のＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム精製抗体画分を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で３倍希釈して１００ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化させたＳＰ−５ＰＷカラム（２１．５ｍｍＩＤｘ１５０ｍｍ、東ソー社）に吸着させた。このカラムを約２カラム容量の１００ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄した後、溶離液のＮａＣｌ濃度を７０分間で１００ｍＭから３００ｍＭへ上昇させる直線濃度勾配溶出法により活性抗体画分と不活性抗体画分を分離し、活性抗体画分（ＳＰ３）を回収した。こうして得た抗体溶出液を限外ろ過膜（アミコンウルトラ、分画分子量３０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮し、ＰＢＳで平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（２６ｍｍＩＤｘ６０ｃｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に供し、同緩衝液で溶出して抗体単量体画分を得た。これをＰＢＳで平衡化したＡｃｔｉＣｌｅａｎ ＥＴｏｘカラム（２５ｍｍＩＤｘ５９ｍｍ、ステロジーン・バイオセパレーションズ社）に供してエンドトキシンを除去した後、限外ろ過膜（アミコンウルトラ、分画分子量１０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮し、さらに無菌ろ過（マイレクスＧＶ、０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）して精製抗体を得た。この精製抗体をＮｅｃ１−５５４−１ ＳＰ３と命名した。
こうして得られた精製抗体はいずれもＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いたゲルろ過ＨＰＬＣで９５％以上の純度を示した。また抗体標品のエンドトキシン含量をエンドスペシーＥＳ−２４Ｓセット（生化学工業社）およびトキシカラーＤＩＡセット（生化学工業社）用いて分析したところ、いずれも０．１ＥＵ／ｍｇ抗体以下であった。
参考例２９ Ｎｅｃｔｉｎ−１、Ｎｅｃｔｉｎ−３、Ｎｅｃｔｉｎ−４、Ｎｅｃ１−５の動物細胞用発現ベクターの構築
ヒトＮｅｃｔｉｎ−１遺伝子はヒト脳のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー５９（配列番号：５９）と制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー６０（配列番号：６０）を用いてＰＣＲを行うことにより取得した。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ溶液１μＬを鋳型として使用し、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー５９（配列番号：５９）とプライマー６０（配列番号：６０）各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）２μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・３分のサイクルを４０回繰り返した。該ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩにより消化した。同様にｐＣＭＶ−Ｔａｇ４（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ社）を制限酵素ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩにて消化した。これらのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーションさせた。この反応混合物を大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、Ｎｅｃｔｉｎ−１タンパク質（配列番号：６２）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：６１）を有する動物細胞用発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−１を得た。
ヒトＮｅｃｔｉｎ−３遺伝子はＭＴＣ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ Ｐａｎｅｌｓ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）に含まれるヒト胎盤のｃＤＮＡを鋳型とし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を付加したプライマー４７（配列番号：４７）、と制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー６３（配列番号：６３）を用いてＰＣＲを行うことにより取得した。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ溶液１μＬ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １Ｕ、プライマー４７（配列番号：４７）およびプライマー６３（配列番号：６３）各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）１０μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２分のサイクルを４０回繰り返した。該ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶにより消化した。同様にｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶにより消化した。これらのＤＮＡ断片をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてそれぞれ精製し、両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を用いてライゲーションさせた。この反応混合物を大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、Ｎｅｃｔｉｎ−３タンパク質（配列番号：５）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：６）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−３を得た。ここで得られたｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−３を鋳型とし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を付加したプライマー４７（配列番号：４７）と制限酵素ｘｈｏＩの認識配列を付加したプライマー６４（配列番号：６４）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成はｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−３ １００ｎｇ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５Ｕ、プライマー４７（配列番号：４７）およびプライマー６４（配列番号：６４）各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ ２５μＬの合計５０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２分のサイクルを３０回繰り返した。該ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩにより消化した。同様にｐＣＭＶ−Ｔａｇ４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩにより消化した。これらのＤＮＡ断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を用いてライゲーションさせた。この反応混合物を大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、Ｎｅｃｔｉｎ−３タンパク質（配列番号：５）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：６）を有する動物細胞用発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−３を得た。
ヒトＮｅｃｔｉｎ−４遺伝子はヒト肺のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー６５（配列番号：６５）と制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー６６（配列番号：６６）を用いてＰＣＲを行うことにより取得した。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ溶液１μＬ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １Ｕ、プライマー６５（配列番号：６５）とプライマー６６（配列番号：６６）各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・３分のサイクルを４０回繰り返した。次に該ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにより消化した。同様にｐＣＭＶ−Ｔａｇ４を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて消化した。これらのＤＮＡ断片をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにて精製し、挿入ＤＮＡ断片とベクター断片とをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を用いてライゲーションさせた。この反応混合物を大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、Ｎｅｃｔｉｎ−４タンパク質（配列番号：６８）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：６７）を有する動物細胞用発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−４を得た。
ヒトＮｅｃ１−５遺伝子はヒト小腸のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）を鋳型とし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を付加したプライマー６９（配列番号：６９）、および制限酵素ＳａｌＩの認識配列を付加したプライマー７０（配列番号：７０）を用いてＰＣＲを行うことにより取得した。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ溶液１μＬ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １Ｕ、プライマー６９（配列番号：６９）とプライマー７０（配列番号：７０）各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・３分のサイクルを４０回繰り返した。次に該ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した後、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とライゲーションさせた。この反応混合物を大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、Ｎｅｃ１−５タンパク質（配列番号：７１）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：７２）を有するクローニングベクターｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｎｅｃ１−５を得た。ここで得られたｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｎｅｃ１−５を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩにて消化し、同様にｐＣＭＶ−Ｔａｇ４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩにより消化した。これらのＤＮＡ断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、両ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を用いてライゲーションさせた。この反応物を大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、Ｎｅｃ１−５タンパク質（配列番号：７１）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：７２）を有する動物細胞用発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃ１−５を得た。
参考例３０ Ｉｇ１もしくはＩｇ２ドメイン欠損Ｎｅｃｔｉｎ−２変異体の動物細胞用発現ベクターの構築
Ｎｅｃｔｉｎ−２細胞外領域のＩｇ１ドメイン、もしくはＩｇ２ドメインを欠損させたＮｅｃｔｉｎ−２変異体遺伝子を以下の方法により取得した。参考例４で取得したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを鋳型とし、ＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は上記ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを１０ｎｇ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、Ｉｇ１ドメイン欠損体には制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー５（配列番号：１５）および制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー７３（配列番号：７３）、またＩｇ２ドメイン欠損体には制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー５（配列番号：１５）および制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー７４（配列番号：７４）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）１０μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・１．５分のサイクルを３０回繰り返した。次に該ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶとを用いて消化した。同様にｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶとを用いて消化した。これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにて精製し、ＰＣＲ産物の制限酵素消化物とベクター断片とをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーションさせた後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養し、増幅した各々のＰＣＲ断片を有するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ１−１、およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ２−１を得た。
次にｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δ １０ｎｇを鋳型として使用し、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １Ｕ、Ｉｇ１ドメイン欠損体には制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー７５（配列番号：７５）および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー７６（配列番号：７６）、またＩｇ２ドメイン欠損体には制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー７７（配列番号：７７）および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー７６（配列番号：７６）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ １０μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・１．５分のサイクルを３０回繰り返した。次に該ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、制限酵素ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩとを用いて消化した。同様に上記で構築したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ１−１、およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ２−１も制限酵素ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩにて消化した。これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにて精製し、プライマー７５（配列番号：７５）とプライマー７６（配列番号：７６）を用いたＰＣＲ産物の制限酵素消化物とｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ１−１の制限酵素消化物とをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を用いてライゲーションさせ、同様にプライマー７７（配列番号：７７）とプライマー７６（配列番号：７６）を用いたＰＣＲ産物の制限酵素消化物とｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ２−１の制限酵素消化物とをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を用いてライゲーションさせた。これらを大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養し、Ｎｅｃｔｉｎ−２のＩｇ１ドメインを欠損させたタンパク質（配列番号：７８）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：７９）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ１、および、Ｎｅｃｔｉｎ−２のＩｇ２ドメインを欠損させたタンパク質（配列番号：８０）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：８１）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ２を得た。
参考例３１ カニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２ ｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
カニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子を以下の様に取得した。カニクイザルの精巣より調製したトータルＲＮＡ約１μｇ（ＵＮＩＴＥＣＨ社）を鋳型として、ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応を行ってｃＤＮＡライブラリーを調製した。このｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、プライマー８２（配列番号：８２）とプライマー８３（配列番号：８３）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成はトータルＲＮＡ約４０ｎｇに相当する上記ｃＤＮＡ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー８２（配列番号：８２）とプライマー８３（配列番号：８３）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）２μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲは、９６℃・１分の後、９６℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２．５分のサイクルを４０回繰り返した。次に該ＰＣＲ産物を鋳型としプライマー８４（配列番号：８４）とプライマー８５（配列番号：８５）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は上記該ＰＣＲ産物１μＬ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １Ｕ、プライマー８４（配列番号：８４）とプライマー８５（配列番号：８５）各１μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬの合計２０μＬとした。ＰＣＲは、９６℃・１分の後、９６℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２．５分のサイクルを４０回繰り返した。次に該ＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とライゲーションさせた後、大腸菌コンピテントセルＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、カニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質（配列番号：８６）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：８７）を有するベクターｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍａＮｅｃｔｉｎ−２を得た。
参考例３２ カニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２動物細胞用発現ベクターの構築
参考例３１で作製したカニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子を含有するｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍａＮｅｃｔｉｎ−２を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー８８（配列番号：８８）、および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー８９（配列番号：８９）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成はｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍａＮｅｃｔｉｎ−２を１０ｎｇ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）１Ｕ、プライマー８８（配列番号：８８）とプライマー８９（配列番号：８９）各０．３μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ社）５μＬの合計５０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・３分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・１分３０秒のサイクルを３５回繰り返した。次に該ＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて消化し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。同様にｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて消化し、アガロース電気泳動分離後、ベクター断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。こうして得られた挿入ＤＮＡ断片とベクター断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーションさせた後、大腸菌Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、カニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質（配列番号：８６）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：８７）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｍａＮｅｃｔｉｎ−２を得た。
参考例３３ カニクイザル型変異を導入したヒトＮｅｃｔｉｎ−２の動物細胞用発現ベクターの構築
参考例４で作製した動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを鋳型とし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を付加したプライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９１（配列番号：９１）、もしくは制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー９２（配列番号：９２）とプライマー９３（配列番号：９３）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成はｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを１０ｎｇ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）１Ｕ、プライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９１（配列番号：９１）、もしくはプライマー９２（配列番号：９２）とプライマー９３（配列番号：９３）を各０．３μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ社）５μＬの合計５０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・３分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを３５回繰り返した。次に該ＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。次に、こうして得られたＰＣＲ産物の混合物を鋳型とし、プライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９２（配列番号：９２）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は上記の精製ＰＣＲ産物を各５μＬ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １Ｕ、プライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９２（配列番号：９２）各０．３μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬの合計５０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・３分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２０回繰り返した。次に該ＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＥｃｏＲＩにて消化し、消化物をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。同様にｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにて消化し、アガロースゲル電気泳動後、目的のベクター断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。挿入ＤＮＡ断片とベクター断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーションさせた後、大腸菌Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、ヒトＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）の７７番目のＡｌａがＰｒｏに、７８番目のＡｓｎがＡｓｐに変異したタンパク質、ＡＮ７７−７８ＰＤをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２（ＡＮ７７−７８ＰＤ）を得た。
次に参考例４で作製した動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを鋳型とし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を付加したプライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９４（配列番号：９４）、もしくは制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー９２（配列番号：９２）とプライマー９５（配列番号：９５）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成はｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを１０ｎｇ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １Ｕ、プライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９４（配列番号：９４）、もしくはプライマー９２（配列番号：９２）とプライマー９５（配列番号：９５）を各０．３μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬの合計５０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・３分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを３５回繰り返した。次に該ＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。こうして得られたＰＣＲ産物の混合物を鋳型とし、プライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９２（配列番号：９２）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は上記の精製ＰＣＲ産物を各５μＬ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １Ｕ、プライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９２（配列番号：９２）各０．３μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬの合計５０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・３分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２０回繰り返した。以下、上述と同様の方法により、ヒトＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）の１１３番目のＧｌｙがＡｒｇに変異したタンパク質、Ｇ１１３ＲをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２（Ｇ１１３Ｒ）を得た。
次に参考例４で作製した動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを鋳型とし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を付加したプライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９６（配列番号：９６）、もしくは制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー９２（配列番号：９２）とプライマー９７（配列番号：９７）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成はｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを１０ｎｇ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １Ｕ、プライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９６（配列番号：９６）、もしくはプライマー９６（配列番号：９６）とプライマー９７（配列番号：９７）を各０．３μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬの合計５０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・３分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを３５回繰り返した。次に該ＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。次に、こうして得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、プライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９２（配列番号：９２）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は上記の精製ＰＣＲ産物を各５μＬ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １Ｕ、プライマー９０（配列番号：９０）とプライマー９２（配列番号：９２）各０．３μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および１０ｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬの合計５０μＬとした。ＰＣＲは、９５℃・３分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２０回繰り返した。以下、上述と同様の方法により、ヒトＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）の１２８番目のＨｉｓがＡｒｇに変異したタンパク質、Ｈ１２８ＲをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２（Ｈ１２８Ｒ）を得た。
参考例３４ Ｉｇ１ドメインに１アミノ酸置換を行ったヒトＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
参考例１５にて作製した動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃを鋳型とし、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてＮｅｃｔｉｎ−２のＩｇ１ドメイン中２６ヵ所のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を、該アミノ酸残基を各々１箇所ずつアラニン残基あるいはグリシン残基に置換するよう変異を加えた。該反応における反応液の組成は上記発現プラスミド（２０ｎｇ／μＬ）７μＬ、１０ｘＢｕｆｆｅｒ ３５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ ７μＬ、Ｑｕｉｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２１μＬ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ）７μＬに蒸留水を加え合計３００μＬとしたものを９μＬずつ２６本のＰＣＲ用チューブに分注し、さらにそれぞれ３．７μＭのプライマーＱ３７Ａ（配列番号：９８）およびプライマーＱ３７Ａ Ｒ（配列番号：９９）、もしくはプライマーＰ４０Ｇ（配列番号：１００）およびプライマーＰ４０Ｇ Ｒ（配列番号：１０１）、もしくはプライマーＱ４５Ａ（配列番号：１０２）およびプライマーＱ４５Ａ Ｒ（配列番号：１０３）、もしくはプライマーＨ５５Ａ（配列番号：１０４）およびプライマーＨ５５Ａ Ｒ（配列番号：１０５）、もしくはプライマーＶ６０Ａ（配列番号：１０６）およびプライマーＶ６０Ａ Ｒ（配列番号：１０７）、もしくはプライマーＹ６４Ａ（配列番号：１０８）およびプライマーＹ６４Ａ Ｒ（配列番号：１０９）、もしくはプライマーＱ７１Ａ（配列番号：１１０）およびプライマーＱ７１Ａ Ｒ（配列番号：１１１）、もしくはプライマーＡ７５Ｇ（配列番号：１１２）およびプライマーＡ７５Ｇ Ｒ（配列番号：１１３）、もしくはプライマーＰ７６Ｇ（配列番号：１１４）およびプライマーＰ７６Ｇ Ｒ（配列番号：１１５）、もしくはプライマーＡ７７Ｇ（配列番号：１１６）およびプライマーＡ７７Ｇ Ｒ（配列番号：１１７）、もしくはプライマーＮ７８Ａ（配列番号：１１８）およびプライマーＮ７８Ａ Ｒ（配列番号：１１９）、もしくはプライマーＨ７９Ａ（配列番号：１２０）およびプライマーＨ７９Ａ Ｒ（配列番号：１２１）、もしくはプライマーＱ８０Ａ（配列番号：１２２）およびプライマーＱ８０Ａ Ｒ（配列番号：１２３）、もしくはプライマーＮ８１Ａ（配列番号：１２４）およびプライマーＮ８１Ａ Ｒ（配列番号：１２５）、もしくはプライマーＫ８８Ａ（配列番号：１２６）およびプライマーＫ８８Ａ Ｒ（配列番号：１２７）、もしくはプライマーＳ９５Ａ（配列番号：１２８）およびプライマーＳ９５Ａ Ｒ（配列番号：１２９）、もしくはプライマーＫ１０９Ａ（配列番号：１３０）およびプライマーＫ１０９Ａ Ｒ（配列番号：１３１）、もしくはプライマーＥ１１７Ａ（配列番号：１３２）およびプライマーＥ１１７Ａ Ｒ（配列番号：１３３）、もしくはプライマーＤ１２２Ａ（配列番号：１３４）およびプライマーＤ１２２Ａ Ｒ（配列番号：１３５）、もしくはプライマーＨ１２８Ａ（配列番号：１３６）およびプライマーＨ１２８Ａ Ｒ（配列番号：１３７）、もしくはプライマーＮ１３７Ａ（配列番号：１３８）およびプライマーＮ１３７Ａ Ｒ（配列番号：１３９）、もしくはプライマーＦ１４５Ａ（配列番号：１４０）およびプライマーＦ１４５Ａ Ｒ（配列番号：１４１）、もしくはプライマーＫ１４７Ａ（配列番号：１４２）およびプライマーＫ１４７Ａ Ｒ（配列番号：１４３）、もしくはプライマーＶ１５０Ａ（配列番号：１４４）およびプライマーＶ１５０Ａ Ｒ（配列番号：１４５）、もしくはプライマーＭ１５３Ａ（配列番号：１４６）およびプライマーＭ１５３Ａ Ｒ（配列番号：１４７）、もしくはプライマーＴ１５４Ａ（配列番号：１４８）およびプライマーＴ１５４Ａ Ｒ（配列番号：１４９）の組み合わせでそれぞれのプライマーを０．５μＬずつ添加したものとした。ＰＣＲは９５℃・１分の後、９５℃・５０秒、６０℃・５０秒、６８℃・７分４０秒のサイクルを１８回繰り返した後に、６８℃・７分の反応を行った。反応後、２６本のＰＣＲ液に制限酵素ＤｐｎＩ（２Ｕ／μＬ）を１μＬずつ添加し、３７℃・１時間反応させた。これらの反応混合液２μＬを大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ２０μＬに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の３７番目のＧｌｎがＡｌａに変異したタンパク質Ｑ３７ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｑ３７Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の４０番目のＰｒｏがＧｌｙに変異したタンパク質Ｐ４０ＧをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｐ４０Ｇ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の４５番目のＧｌｎがＡｌａに変異したタンパク質Ｑ４５ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｑ４５Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の５５番目のＨｉｓがＡｌａに変異したタンパク質Ｈ５５ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｈ５５Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の６０番目のＶａｌがＡｌａに変異したタンパク質Ｖ６０ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｖ６０Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の６４番目のＴｙｒがＡｌａに変異したタンパク質Ｙ６４ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｙ６４Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の７１番目のＧｌｎがＡｌａに変異したタンパク質Ｑ７１ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｑ７１Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の７５番目のＡｌａがＧｌｙに変異したタンパク質Ａ７５ＧをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ａ７５Ｇ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の７６番目のＰｒｏがＧｌｙに変異したタンパク質Ｐ７６ＧをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｐ７６Ｇ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の７７番目のＡｌａがＧｌｙに変異したタンパク質Ａ７７ＧをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ａ７７Ｇ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の７８番目のＡｓｎがＡｌａに変異したタンパク質Ｎ７８ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｎ７８Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の７９番目のＨｉｓがＡｌａに変異したタンパク質Ｈ７９ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｈ７９Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の８０番目のＧｌｎがＡｌａに変異したタンパク質Ｑ８０ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｑ８０Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の８１番目のＡｓｎがＡｌａに変異したタンパク質Ｎ８１ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｎ８１Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の８８番目のＬｙｓがＡｌａに変異したタンパク質Ｋ８８ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ８８Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の９５番目のＳｅｒがＡｌａに変異したタンパク質Ｓ９５ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｓ９５Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１０９番目のＬｙｓがＡｌａに変異したタンパク質Ｋ１０９ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ１０９Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１１７番目のＧｌｕがＡｌａに変異したタンパク質Ｅ１１７ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｅ１１７Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１２２番目のＡｓｐがＡｌａに変異したタンパク質Ｄ１２２ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｄ１２２Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１２８番目のＨｉｓがＡｌａに変異したタンパク質Ｈ１２８ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｈ１２８Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１３７番目のＡｓｎがＡｌａに変異したタンパク質Ｎ１３７ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｎ１３７Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１４５番目のＰｈｅがＡｌａに変異したタンパク質Ｆ１４５ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｆ１４５Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１４７番目のＬｙｓがＡｌａに変異したタンパク質Ｋ１４７ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ１４７Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１５０番目のＶａｌがＡｌａに変異したタンパク質Ｖ１５０ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｖ１５０Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１５３番目のＭｅｔがＡｌａに変異したタンパク質Ｍ１５３ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｍ１５３Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１５４番目のＴｈｒがＡｌａに変異したタンパク質Ｔ１５４ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｔ１５４Ａ）をそれぞれ得た。
参考例３５ Ｉｇ２ドメインに１アミノ酸置換を行ったヒトＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
参考例１５にて作製した動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃを鋳型とし、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてＮｅｃｔｉｎ−２のＩｇ２ドメイン中１３ヵ所のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を、該アミノ酸残基を各々１箇所ずつアラニン残基あるいはグリシン残基に置換するよう変異を加えた。該反応における反応液の組成は上記発現ベクター（２０ｎｇ／μＬ）３．５μＬ、１０ｘＢｕｆｆｅｒ １７．５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ ３．５μＬ、Ｑｕｉｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０．５μＬ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ）３．５μＬに蒸留水を加え合計１５０μＬとしたものを９μＬずつ１３本のＰＣＲ用チューブに分注し、さらにそれぞれ３．７μＭのプライマーＱ１６５Ａ（配列番号：１５０）およびプライマーＱ１６５Ａ Ｒ（配列番号：１５１）、もしくはプライマーＫ１７０Ａ（配列番号：１５２）およびプライマーＫ１７０Ａ Ｒ（配列番号：１５３）、もしくはプライマーＦ１７３Ａ（配列番号：１５４）およびプライマーＦ１７３Ａ Ｒ（配列番号：１５５）、もしくはプライマーＰ１７７Ｇ（配列番号：１５６）およびプライマーＰ１７７Ｇ Ｒ（配列番号：１５７）、もしくはプライマーＩ１８４Ａ（配列番号：１５８）およびプライマーＩ１８４Ａ Ｒ（配列番号：１５９）、もしくはプライマーＫ１８６Ａ（配列番号：１６０）およびプライマーＫ１８６Ａ Ｒ（配列番号：１６１）、もしくはプライマーＬ１９７Ａ（配列番号：１６２）およびプライマーＬ１９７Ａ Ｒ（配列番号：１６３）、もしくはプライマーＷ２０２Ａ（配列番号：１６４）およびプライマーＷ２０２Ａ Ｒ（配列番号：１６５）、もしくはプライマーＥ２０６Ａ（配列番号：１６６）およびプライマーＥ２０６Ａ Ｒ（配列番号：１６７）、もしくはプライマーＴ２１２Ａ（配列番号：１６８）およびプライマーＴ２１２Ａ Ｒ（配列番号：１６９）、もしくはプライマーＴ２３５Ａ（配列番号：１７０）およびプライマーＴ２３５Ａ Ｒ（配列番号：１７１）、もしくはプライマーＫ２３９Ａ（配列番号：１７２）およびプライマーＫ２３９Ａ Ｒ（配列番号：１７３）、もしくはプライマーＡ２４９Ｇ（配列番号：１７４）およびプライマーＡ２４９Ｇ Ｒ（配列番号：１７５）の組み合わせでそれぞれのプライマーを０．５μＬずつ添加したものとした。ＰＣＲは９５℃・１分の後、９５℃・５０秒、６０℃・５０秒、６８℃・７分４０秒のサイクルを１８回繰り返した後に、６８℃・７分の反応を行った。反応後、１３本のＰＣＲ液に制限酵素ＤｐｎＩ（２Ｕ／μＬ）を１μＬずつ添加し、３７℃・１時間反応させた。これらの反応混合液２μＬを大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ２０μＬに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１６５番目のＧｌｎがＡｌａに変異したタンパク質Ｑ１６５ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｑ１６５Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１７０番目のＬｙｓがＡｌａに変異したタンパク質Ｋ１７０ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ１７０Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１７３番目のＰｈｅがＡｌａに変異したタンパク質Ｆ１７３ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｆ１７３Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１７７番目のＰｒｏがＧｌｙに変異したタンパク質Ｐ１７７ＧをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｐ１７７Ｇ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１８４番目のＩｌｅがＡｌａに変異したタンパク質Ｉ１８４ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｉ１８４Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１８６番目のＬｙｓがＡｌａに変異したタンパク質Ｋ１８６ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ１８６Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の１９７番目のＬｅｕがＡｌａに変異したタンパク質Ｌ１９７ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｌ１９７Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の２０２番目のＴｒｐがＡｌａに変異したタンパク質Ｗ２０２ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｗ２０２Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の２０６番目のＧｌｕがＡｌａに変異したタンパク質Ｅ２０６ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｅ２０６Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の２１２番目のＴｈｒがＡｌａに変異したタンパク質Ｔ２１２ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｔ２１２Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の２３５番目のＴｈｒがＡｌａに変異したタンパク質Ｔ２３５ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｔ２３５Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の２３９番目のＬｙｓがＡｌａに変異したタンパク質Ｋ２３９ＡをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ２３９Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（配列番号：３７）の２４９番目のＡｌａがＧｌｙに変異したタンパク質Ａ２４９ＧをコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ａ２４９Ｇ）を得た。
実施例１ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の作製
参考例１６で調製したＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質（１．６ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ溶液）または参考例１３で調製したＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質（２ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ溶液）とフロインド完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）とを等容量混合して調製したエマルションをＫＭマウス（１０週齢、１２週齢、雄；キリンビール（株））各５匹の皮下および皮内にそれぞれ５０μｇ／匹で免疫した。２回目以降はこれらの組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２細胞外領域タンパク質とフロインド不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）とを等量混合して調製したエマルションを同様に２週間毎に追加免疫した。
また、参考例１９で樹立したＮｅｃｔｉｎ−２δ安定発現ＦＭ３Ａ細胞株（＃６０−６）と参考例１８で樹立したＮｅｃｔｉｎ−２δ安定発現ＮＳＯ細胞株（＃２−７５）をフラスコ培養し、それぞれ遠心分離（１，２００ｒｐｍｘ５分）によって細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に再懸濁後、遠心分離（１，２００ｒｐｍｘ５分）によって細胞を回収することを３回繰り返し、血清成分を除去した。回収した各細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に５ｘ１０７個／ｍＬになるよう再懸濁させ、ＲＰＭＩ１６４０培地に溶解させたマイトマイシンＣ（和光純薬（株））を最終濃度２０μｇ／ｍＬになるよう添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。マイトマイシンＣ処理した両細胞株を１０ｍＬのＰＢＳで同様に３回洗浄後、２ｘ１０７個／ｍＬになるようＰＢＳに再懸濁させたものをＫＭマウス（１０週齢−１２週齢、雄）各５匹の腹腔内に１ｘ１０７個／５００μＬずつ１週間毎に繰り返し免疫した。
またＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質またはＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質とフロインド完全アジュバントとを等容量混合して調製したエマルションをＫＭマウス（１２週齢、雄）各５匹の皮下および皮内にそれぞれ５０μｇ／匹で免疫し、初回免疫の１週間後に上記の方法によりマイトマイシンＣ処理したＮｅｃｔｉｎ−２δ発現ＦＭ３Ａ細胞株を１ｘ１０７個／５００μＬずつ腹腔内に免疫した。３回目はＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧとフロインド不完全アジュバントとを等容量混合して調製したエマルションを皮下および皮内にそれぞれ５０μｇ／匹で免疫し、同時に上記の方法によりマイトマイシンＣ処理したＮｅｃｔｉｎ−２δ発現ＦＭ３Ａ細胞株（＃６０−６）を１ｘ１０７個／５００μＬずつ腹腔内に免疫した。４回目以降は上記の方法によりマイトマイシンＣ処理したＮｅｃｔｉｎ−２δ発現ＦＭ３Ａ細胞株（＃６０−６）のみを１ｘ１０７個／５００μＬずつ腹腔内に免疫した。
免疫開始前および３回目の免疫１週間後に全てのマウスからエーテル麻酔下、眼底採血して抗血清を取得し、以下に述べるフローサイトメトリー法により血清抗体価を調べた。すなわち、参考例２０で樹立したＮｅｃｔｉｎ−２δ安定発現ＣＨＯ細胞株（＃４３−２）とｍｏｃｋ−ＣＨＯ細胞株の細胞懸濁液（ＰＢＳ）をそれぞれ５ｘ１０５個ずつポリプロピレンチューブに分注し、遠心分離（１，２００ｒｐｍｘ５分）によりＰＢＳを除去した。これらの細胞残渣を、１％ＢＳＡおよび１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００倍希釈した上記マウス抗血清５０μＬずつに再懸濁させ、氷上暗所で３０分間反応させた。この細胞懸濁液にＰＢＳを２００μＬ加え遠心分離（１，２００ｒｐｍｘ５分）した後、上澄液を吸引除去し、細胞残渣を１％ＢＳＡおよび１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００倍希釈したＡｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）溶液５０μＬに再懸濁させ、氷上暗所で３０分間反応させた。この細胞懸濁液を同様にＰＢＳで３回洗浄した後、細胞残渣をＰＢＳ２００μＬに再懸濁させ、フローサイトメーターＭＰＬ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いて各細胞の蛍光強度を測定し、横軸に蛍光強度を縦軸に細胞数をとったグラフを作成して血清抗体価を比較した。
上記の方法で十分な血清抗体価上昇が確認されたＫＭマウスに、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦｃまたはＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧを免疫した個体にはこれらのタンパク質抗原を１０μｇ／匹ずつ尾静脈注射し、またＮｅｃｔｉｎ−２δ安定発現細胞株を免疫した個体には同細胞株を１ｘ１０７個ずつ腹腔内注射した。これらの最終免疫３日後に該マウスを放血死させて脾臓を摘出し、得られたマウス脾臓細胞とあらかじめ１０％ＦＢＳ含有Ｄａｉｇｏ Ｔ培地（Ｆ−１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＨＡＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）との等量混合培地にＭＥＭ Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、およびＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したもの）５００ｍＬに対し８−Ａｚａｇｕａｎｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社）１バイアルを溶解させた培地で馴化培養しておいたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１））とを５：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１，５００（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）を用いて融合させた。細胞融合操作は試薬に添付のマニュアルに従って行った。融合後の細胞を１０％ＦＢＳおよび１０％ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）含有Ｄａｉｇｏ Ｔ培地に再懸濁させ、９６ウェル培養プレートに脾臓細胞５ｘ１０４個／１００μＬ／ウェルで播種したものを５％炭酸ガス気流中、３７℃で１日間培養した後、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、０．０１６ｍＭチミジン（ＨＡＴ）、１０％ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１および１０％ＦＢＳ含有Ｄａｉｇｏ Ｔ培地（ＨＡＴ選択培地）を１００μＬ／ウェル添加し、さらに５％炭酸ガス気流中、３７℃で培養を継続し、３日毎に２回、培養上清の３／４を新鮮なＨＡＴ選択培地に交換した。
培養７日目〜１４日目にかけてコロニーの増殖が見られたウェルの培養上清をＮｅｃｔｉｎ−２δ安定発現ＣＨＯ細胞株（＃４３−２）またはｍｏｃｋ−ＣＨＯ細胞株を用いたＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡに供し、抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。すなわち、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ安定発現ＣＨＯ細胞株（＃４３−２）とｍｏｃｋ−ＣＨＯ細胞株を１０％透析ＦＢＳ、およびＧＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含有するＧＳ選択ＤＭＥＭ培地を用いて９６ウェル組織培養プレートで培養し、各細胞株がコンフルエントに達したプレートの培養上清を吸引除去した後、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）を２００μＬ／ウェル添加し、氷上暗所で１時間インキュベートした。各ウェルの上澄液を吸引除去し、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェルずつ添加し、氷上暗所で２時間反応させた。このプレートを４℃に冷やしたＰＢＳ（＋）で１回洗浄したあと、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）で３，０００倍希釈したＡｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＧＯＡＴ）ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）を１００μＬ／ウェルずつ添加し、氷上暗所で２時間反応させた。プレートを４℃に冷やしたＰＢＳ（＋）で３回洗浄した後、３，３’，５，５’ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）溶液（ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ＴＭＢ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温５分間発色させ、２Ｎ硫酸（和光純薬（株））を１００μＬ／ウェルずつ添加して酵素反応を停止させた。各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏ．）を用いて測定し、Ｎｅｃｔｉｎ−２発現ＣＨＯ細胞株プレートの吸光度が０．５以上かつｍｏｃｋ−ＣＨＯ細胞株プレートの吸光度が０．３未満のものを陽性ウェルと判定した。これらの中から特に抗原特異性と親和性の高そうなＩｇＧ抗体産生ハイブリドーマを選択し、１０％ＦＢＳおよび１０％ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１含有Ｄａｉｇｏ Ｔ培地に再懸濁させた後、９６ウェル組織培養プレートに０．５個／ウェルで播種し、顕微鏡観察によりモノクローンである事を確認したハイブリドーマの培養上清を上記Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡで再度スクリーニングして抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ・クローンを樹立した。こうして得た２５６種類の抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを１００ｍＬの１０％ＦＢＳ，Ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）含有Ｄａｉｇｏ Ｔ培地中でフラスコ培養し、培養上清を遠心分離（１，２００ｒｐｍｘ５分）してモノクローナル抗体を含有する上澄液を取得した。これらの培養上清にＰＢＳで平衡化したプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ ２００μＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）を添加し４℃で終夜緩やかに振とうさせて抗体を吸着させた。このプロテインＡ担体を遠心分離操作により回収し、ＰＢＳで洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）１．２ｍＬにてＩｇＧ画分を溶出した。この溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて速やかに中和した後、限外濾過膜（ビバスピン６：分画分子量１０ｋＤａ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いた限外濃縮操作によりＰＢＳにバッファー置換し、これを抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体標品として下記のｉｎ ｖｉｔｒｏ性状解析に用いた。
実施例２ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の結合活性
抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の結合親和力は実施例１に示したＮｅｃｔｉｎ−２安定発現ＣＨＯ細胞株を用いたＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡに実施例１で調製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）で段階希釈したものを供し、濃度依存性曲線を作成することにより各抗体のＥＣ５０値を相対評価した。各モノクローナル抗体の抗原特異性はＮｅｃｔｉｎ−２安定発現ＣＨＯ細胞株プレートに対する結合性とｍｏｃｋ−ＣＨＯ細胞株プレートに対する結合性との比較により確認した。各抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のＥＣ５０をまとめて表３に示す。
実施例３ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のサブクラス
実施例１で取得した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のサブクラスを以下に示すＥＬＩＳＡにより同定した。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭのＨ鎖およびヒトκ鎖を特異的に認識する６種類の抗体（Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１，Ｆｃ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｍｏｕｓｅ），ｐｕｒｉｆｉｅｄ；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社、Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ２，Ｆｃ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｍｏｕｓｅ），ｐｕｒｉｆｉｅｄ；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ３；Ｚｙｍｅｄ社、Ｍｓ ｘ Ｈｕ ＩｇＧ４ Ｆｃ；ＣＨＥＭＩＣＯＮ社、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ−ＩｇＭ；Ｚｙｍｅｄ社、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｋａｐｐａ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂ＋ｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ；Ｂｅｔｈｙｌ社）をそれぞれ５０ｍＭ炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、これを９６穴ハーフウェルイムノプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）に５０μＬ／ウェルずつ添加して室温５時間反応させた。各ウェルから反応液を除去した後２５％ブロックエース（ＤＡＩＮＩＰＰＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ社）含有蒸留水を１００μＬ／ウェルずつ添加し４℃、終夜ブロッキングした。
このように作製したＥＬＩＳＡ用プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄した後、実施例１で精製取得した各抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を１０％ブロックエース含有蒸留水で１μｇ／ｍＬに希釈調製したものを５０μＬ／ウェル添加し、室温２時間反応させた。このプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄した後、１０％ブロックエース含有蒸留水で５，０００倍希釈したＡｎｔｉ−ＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ），Ｈｕｍａｎ，Ｇｏａｔ，Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｚｙｍｅｄ社）を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温２時間反応させた。さらにプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで６回洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ＴＭＢ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を５０μＬ／ウェルずつ添加後室温２分間発色させ、２Ｎ硫酸（和光純薬（株））を５０μＬ／ウェルずつ添加して酵素反応を停止させた。各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ）を用いて測定し、他と比べて有意に高い吸光度を示すウェルに固定化された抗体の抗原特異性から各抗体のサブクラスを同定した。その結果を表３Ａに示す。
実施例４ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のエピトープによるグルーピング
実施例１で取得した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を、その認識エピトープの違いによりグループ化した。以下にその方法を示す。抗体同士の拮抗阻害反応を行うため、実施例１で取得したモノクローナル抗体のうち１８７種類の抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体をビオチン標識した。すなわち、抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体１０μｇをＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）に付属のＷＳ Ｂｕｆｆｅｒ ５０μＬに添加し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ５０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて溶液量がほとんど無くなるまで限外濃縮した。この残液にＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２に付属のＲｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ５０μＬと５０μＬのＤＭＳＯに溶解したＮＨ２ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｉｎ ４μＬとを順次添加し、３７℃で１０分間反応させた。この反応混合物を再度限外濃縮操作によりＷＳ Ｂｕｆｆｅｒにバッファー置換し、Ｂｉｏｔｉｎ標識抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を得、これらを以下に示すアッセイに使用した。実施例１で取得した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ溶液（２５μｇ／ｍＬ）５μＬとＮｅｃｔｉｎ−２δ安定発現ＣＨＯ細胞株の２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ懸濁液（２ｘ１０５個／ｍＬ）１５μＬ、およびＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５μＬをＦＭＡＴｐｌａｔｅ（３８４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ Ｂｌａｃｋ／Ｃｌｅａｒ Ｂｏｔｔｏｍ ｗｉｔｈ Ｌｉｄ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に添加し、混合した後室温で１０分間反応させた。このプレートに上記の方法で作製したＢｉｏｔｉｎ化抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ溶液（０．５μｇ／ｍＬ）５μＬを添加し、室温で６０分間インキュベートした。対照実験として非標識抗Ｎｅｃｔｉｎ−２モノクローナル抗体溶液の代わりに２％ＦＢＳ含有ＰＢＳを添加したウェルを設けた。この拮抗阻害反応ビオチン標識に供した全ての抗体の組合せについて行った。このプレートをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ８２００ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にセットし、各ウェルの蛍光強度を測定した。各抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の組合せにおける拮抗阻害率は以下に示す式を用いて算出した。
拮抗阻害率＝（１−Ａ／Ｂ）ｘ１００
Ａ；非標識抗体を添加したウェルのＦＬ１ ｔｏｔａｌ値
Ｂ；非標識抗体を添加していないウェルのＦＬ１ ｔｏｔａｌ値
各抗体の組合せについて、この計算式で得られたおける阻害率を多変数解析ソフト、ＳｐｏｔＦｉｒｅ ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ ｆｏｒ Ｌｅａｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ社）を用いて解析し、そこで得られた樹形図から抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体をエピトープによりグループ化し、その結果としてＩからＶＩＩの７個の大きなグループに属する抗体と、どのグループにも属さない抗体に分類した。各抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のエピトープグループをまとめて表４に示す。
実施例５ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のＮｅｃｔｉｎ−２−Ｎｅｃｔｉｎ−３トランス結合阻害活性
Ｎｅｃｔｉｎ−２はＮｅｃｔｉｎ−３とヘテロフィリックにトランス結合することが知られている。実施例１で取得した各抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のＮｅｃｔｉｎ−２−Ｎｅｃｔｉｎ−３トランス結合阻害を下記に示すビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ２０００；Ｂｉａｃｏｒｅ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）測定法で定量的に評価した。センサーチップＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）をＢｉａｃｏｒｅ２０００に装着し、下記の方法によりＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−Ｆｃタンパク質固定化チップを作製した。すなわち、ＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉａｃｏｒｅ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）をランニングバッファーとして用い、Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）に付属のＮ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）とＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）とを蒸留水に溶解させて調製した溶液を１００μＬずつ等量混合し、流速１０μＬ／分で７分間センサーチップに通液した後、参考例２２で調製したＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｍＦｃ（１ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ溶液）を１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）（Ｂｉａｃｏｒｅ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）で１６０μｇ／ｍＬに希釈調製したものを流速１０μＬ／分で７分間センサーチップに通液し、チップ上に該タンパク質を固定化した。次いで同キットに付属のエタノールアミン溶液を流速１０μＬ／分で７分間センサーチップに通液し、残った活性ＮＨＳ基をブロッキングした。さらに１０ｍＭ ＮａＯＨを流速１０μＬ／分で１分間通液し、センサーチップを洗浄した。このようにして作製したＮｅｃｔｉｎ−３ＥＤ−ｍＦｃタンパク質固定化センサーチップに対し、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃタンパク質溶液（８０μｇ／ｍＬ ＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒ）と抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体溶液もしくはコントロールヒト抗体溶液（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｈｒｏｍ Ｐｕｒｅ；Ｊａｃｋｓｏｎ社）（６０μｇ／ｍＬ ＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒ）との等容量混合液を流速２０μＬ／分で２分間通液し、レスポンスの変化を記録し、下記の計算式によりＮｅｃｔｉｎ−２−Ｎｅｃｔｉｎ−３トランス結合阻害率を算出した。
Ｎｅｃｔｉｎ−２−Ｎｅｃｔｉｎ−３トランス結合阻害率（％）＝（Ａ−Ｂ）ｘ１００／Ａ
Ａ：コントロール抗体を用いたときのレスポンス
Ｂ：抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を用いたときのレスポンス
各抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のＮｅｃｔｉｎ−２−Ｎｅｃｔｉｎ−３のトランス結合阻害活性をまとめて表５に示す。
実施例６ ＯＶ−９０ヒト卵巣癌細胞株を用いた抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の細胞増殖阻害活性
実施例１で取得した各抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＯＶ−９０ヒト卵巣癌細胞株増殖阻害活性を下記の方法により測定した。ＯＶ−９０細胞株の培養には、１５％ＦＢＳ（ＪＲＨ社）を含むＭＣＤＢ１０５（Ｓｉｇｍａ社）とＭｅｄｉｕｍ１９９（Ｓｉｇｍａ社）との等量混合培地を用い、１日置きに１枚あたり４．５ｘ１０５個の細胞密度で１０ｃｍ組織培養シャーレ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で培養する事により継代した。ＯＶ−９０細胞株のシャーレからの剥離は、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｎ−２（Ｎｉｔｔａ Ｇｅｌａｔｉｎ社）４００Ｕで３７℃、２分間処理し、さらにＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２ｍＬを加えて３７℃、１５分間処理することにより行った。こうして得た細胞懸濁液を遠心分離（１０００ｒｐｍ、３分）して回収した細胞を１％ＦＢＳ含有ＭＣＤＢ１０５／Ｍｅｄｉｕｍ１９９等量混合培地に３ｘ１０４個／ｍＬの密度で再懸濁させた。
実施例１で取得した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体、参考例１４で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体（Ｎ２−Ｎｏ．１）、およびコントロールヒト抗体（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｈｒｏｍ Ｐｕｒｅ；Ｊａｃｋｓｏｎ社）をそれぞれＰＢＳで３００μｇ／ｍＬに調製した溶液、もしくはＰＢＳを９６穴細胞培養用プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に１０μＬ／ウェルずつ添加し、上記のＯＶ−９０細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルずつ添加した。また下記の細胞増殖阻害率測定時のバックグラウンド値を測定する為、ＰＢＳ１０μＬに同培地１００μＬを加えたウェルを準備した。このプレートを５％炭酸ガス気流中、３７℃で６日間インキュベートした後、細胞増殖測定用試薬ＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８；Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を１０μＬ／ウェルずつ添加し、プレートを５％炭酸ガス気流中、３７℃で１時間インキュベートした後、生成ホルマザンに由来する各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ）を用いて測定し、下記の計算式によりＯＶ−９０細胞株増殖阻害率を算出した。
細胞増殖阻害率＝［（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｂ）］ｘ１００／（Ａ−Ｂ）
Ａ：コントロールヒト抗体添加ウェルの吸光度
Ｂ：ＰＢＳを添加（ＯＶ９０細胞株非添加）ウェルの吸光度
Ｃ：抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体もしくは抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体添加ウェルの吸光度
取得した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の中には、ＯＶ−９０細胞株に対して細胞増殖阻害活性の強い抗体や弱い抗体があった。また、抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体（Ｎ２−Ｎｏ．１）は終濃度３０μｇ／ｍＬで約１０％のＯＶ−９０細胞株増殖阻害活性を示した。各抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体（終濃度３０μｇ／ｍＬ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＯＶ−９０細胞株増殖阻害率をまとめて表６に示す。
上記一次スクリーニングで比較的強いｉｎ ｖｉｔｒｏ ＯＶ−９０細胞株増殖阻害活性を示した３０抗体を再度ハイブリドーマから培養調製し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムクロマトグラフィーおよびゲルろ過ＨＰＬＣにより高純度精製した抗体標品を用いて、再度上述の方法によりＯＶ−９０細胞株に対する濃度依存的（１００、３０、１０、３、１、０．３、０．０３μｇ／ｍＬ）な細胞増殖阻害活性を測定した。その結果、抗体濃度依存的な強いＯＶ−９０細胞株増殖阻害活性を再現性良く示す８種の抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体（Ｎｅｃ１−８０３−２、Ｎｅｃ１−５２０−１、Ｎｅｃ１−５３０−１、Ｎｅｃ１−８４５−２、Ｎｅｃ１−８３４−１、Ｎｅｃ１−２４４−３、Ｎｅｃ１−３０３−２、Ｎｅｃ１−９０３−１）を選択した。これらの抗体はＯＶ９０細胞株を９６穴細胞培養用プレート上に生着させた後に抗体溶液を加えた場合でも同様の活性を示した。上記８種の抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の各濃度におけるＯＶ−９０細胞株増殖阻害活性をまとめて表７に示す。
Figure 2008044754
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 実施例７ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）
実施例１で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のうち、Ｎｅｃ１−８０３−２、Ｎｅｃ８−４１１６−８、Ｎｅｃ１−５２０−１、Ｎｅｃ１−５３０−１、Ｎｅｃ１−８４５−２、Ｎｅｃ８−３９４１−４、Ｎｅｃ１−８３４−１、Ｎｅｃ１−２４４−３、Ｎｅｃ１−９１８−２、Ｎｅｃ８−３８０６−１、Ｎｅｃ１−３０３−２、Ｎｅｃ１−９０３−１のＡＤＣＣを測定した。ターゲット細胞としてはヒト卵巣癌細胞株ＯＶ−９０を用い、エフェクター細胞には市販の凍結ヒト末梢血単核球（旭テクノグラス社）を１０ｎＭ組換え型ヒトＩＬ−２（ＤＩＡＣＬＯＮＥ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、５５μＭ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で一晩培養したものを用いた。
対数増殖期のＯＶ−９０細胞株を実施例６に記載の方法により回収し、１ｘ１０６個の細胞に対し２５０μＣｉのＮａ２ ５１ＣｒＯ４（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に社名変更）を添加して３７℃、１時間インキュベートすることにより５１Ｃｒ標識した。これらの細胞を０．４％ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（以後０．４％ＢＳＡ／ＲＰＭＩ培地と称する）で４回洗浄した後、０．４％ＢＳＡ／ＲＰＭＩ培地に対し１ｘ１０５個／ｍＬに再懸濁させた。このターゲット細胞懸濁液１００μＬ（１ｘ１０４細胞）と上記の抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を０．４％ＢＳＡ／ＲＰＭＩ培地で終濃度０．０１５μｇ／ｍＬ、０．１５μｇ／ｍＬおよび１．５μｇ／ｍＬとなるように希釈した溶液５０μＬとを９６穴ＲＭＣプレート（ＢＩＯＢＩＫ社）の各ウェルに添加した。陰性コントロールとして非免疫ヒトＩｇＧ（最終濃度１．５μｇ／ｍＬ）もしくはＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を同量添加した。これらのプレートを氷上で１時間インキュベートした後、上述のエフェクター細胞懸濁液を５ｘ１０５個／ウェルずつ加え（エフェクター細胞：ターゲット細胞＝５０：１）、５％炭酸ガス気流中、３７℃で４時間反応させた。各ウェルの細胞懸濁液を９６ウェルマルチスクリーン４５μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移し変え、遠心分離操作により培養上清を回収した。これらの培養上清中に細胞内から漏出した放射活性（ｓａｍｐｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ）をγカウンター（ＡｃｃｕＦＬＥＸ γ７０００；Ａｌｏｋａ Ｃｏ．）を用いて測定した。ＡＤＣＣの最大傷害活性（ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度１％になるように加えた場合、また自然放出活性（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ）は、エフェクター細胞のかわりに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を加えた場合に培養上清中に検出される放射活性とした。ＡＤＣＣ強度の指標となるｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ（％）は、（〔ｓａｍｐｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ〕−〔ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ〕）／（〔ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ〕−〔ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ〕）ｘ１００として算出した（表８）。非免疫ヒトＩｇＧ（最終濃度１．５μｇ／ｍＬ）添加時およびＤ−ＰＢＳ添加時のＡＤＣＣ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ（％））は共に１７％であったのに対し、サブクラスがＩｇＧ１に属する抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体Ｎｅｃ１−８０３−２、Ｎｅｃ８−４１１６−８、Ｎｅｃ１−５２０−１、Ｎｅｃ１−５３０−１、Ｎｅｃ１−８４５−２、Ｎｅｃ８−３９４１−４、Ｎｅｃ１−８３４−１、Ｎｅｃ１−９０３−１のＡＤＣＣは各々１．５μｇ／ｍＬで３５％、３４％、３０％、２７％、３０％、３４％、３１％、３２％と有意に高かった。特に抗体４１１６−８は抗体最終濃度０．０１５μｇ／ｍＬでもｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓが３３％と他の抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体に比べより強いＡＤＣＣを示した。
Figure 2008044754
 実施例８ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の追加作製
実施例１で作製した抗体に加え、ＫＭマウスに以下の方法により免疫を行い、抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を追加作製した。すなわち、参考例１６で調製したＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質（１．６ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ溶液）とフロインド完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）とを等容量混合して調製したエマルションをＫＭマウス（１０週齢、１２週齢、雄；キリンビール（株））５匹の皮下および皮内にそれぞれ５０μｇ／匹で免疫した。２週間後、フロインド不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）を用いて作製した同タンパク質エマルションをＫＭマウス５匹の皮下および皮内にそれぞれ２５μｇ／匹で免疫した。さらに２週間後に同エマルションを１０μｇ／匹で免疫した。
免疫開始前および３回目の免疫１週間後に全てのマウスをエーテル麻酔下、眼底採血して抗血清を取得し、実施例１に記載と同様の方法により血清抗体価を調べた。十分な血清抗体価上昇が確認されたＫＭマウスに、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃを１０μｇ／匹ずつ尾静脈注射し、実施例１に記載と同様の方法により抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを追加取得し、その培養上清から抗体を調製した。
実施例９ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のＮｅｃｔｉｎ−１、Ｎｅｃｔｉｎ−３、Ｎｅｃｔｉｎ−４、Ｎｅｃ１−５タンパク質に対する交差反応性
実施例１で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のヒトＮｅｃｔｉｎ−２に対する特異性を確認する為、ヒトＮｅｃｔｉｎファミリータンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ−１、Ｎｅｃｔｉｎ−３、Ｎｅｃｔｉｎ−４）およびヒトＮｅｃ１−５に対する交差反応性をこれらのタンパク質の一過性発現細胞を用いたフローサイトメトリー法（以下ＦＣＭと称する）により調べた。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株をＴ７５フラスコ中、１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ社）を含有するＤＭＥＭ及びＦ−１２の当量混合培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて５％炭酸ガス気流中、３７℃で１〜２日培養した。この細胞が約９０％コンフルエントになったところで、参考例１８にて作製したｐＥＥ１２．４−Ｎｅｃｔｉｎ−２ δ、参考例２９にて作製したｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−１、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−３、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−４、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃ１−５、および陰性コントロールプラスミドとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付のプロトコールに従いトランスフェクションした。その４時間後にこれらの遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培地を新鮮な上記培地と交換し、さらに２日間培養した。これらの細胞をＤ−ＰＢＳで２回洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ｅｎｚｙｍｅ−ｆｒｅｅ，ＰＢＳ−ｂａｓｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細胞を剥離させ、１％ＦＢＳ、０．１％アジ化ナトリウムを含有するＤ−ＰＢＳ（−）（以後ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒと称する）で５×１０６個／ｍＬの密度で再懸濁させた。これらの細胞懸濁液を９６ウェルＶ底プレートに３０μＬずつ入れ、ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで１５μｇ／ｍＬに希釈した抗ヒトＮｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体（Ｎｅｃ１−８０３−２、Ｎｅｃ１−５２０−１、Ｎｅｃ１−５３０−１、Ｎｅｃ１−８３４−１、Ｎｅｃ１−２４４−３、Ｎｅｃ１−３０３−２、Ｎｅｃ１−９０３−１、もしくはＮｅｃ８−４１１６−８）及び、陽性コントロール抗体〔抗ヒトＮｅｃｔｉｎ−１マウスモノクローナル抗体（ＺＹＭＥＤ社）、参考例１４で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体Ｎ２−Ｎｏ．２、参考例２７で作製した抗ヒトＮｅｃｔｉｎ−３ウサギポリクローナル抗体、抗ヒトＮｅｃｔｉｎ−４ヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社）、もしくは抗ヒトＮｅｃ１−５マウスモノクローナル抗体（ＬＡＢ ＶＩＳＩＯＮ社）〕を２０μＬ（最終濃度：６μｇ／ｍＬ）加え、氷上で１時間反応させた。各ウェルにＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ ２００μＬを加え、遠心分離操作により１回洗浄した後、ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで１０μｇ／ｍＬに希釈したＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体を１ウェル当たり５０μＬ加え懸濁させた後、氷上で１時間反応させた。なお、１次抗体としてヒト抗体を用いた場合にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、マウス抗体を用いた場合にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、ウサギ抗体を用いた場合にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、ヤギ抗体を用いた場合にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をそれぞれ２次抗体として用いた。これらの細胞をさらにＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、２５０μＬのＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁させ、フローサイトメーターＭＰＬ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）で染色細胞の蛍光強度を測定した。各抗体について陰性コントロールプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞の蛍光強度のｍｅｄｉａｎ値に対する各遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞の蛍光強度ｍｅｄｉａｎ値の比を計算し、その結果を表９に示した。この比が１の場合、抗体が該タンパク質に対して全く結合せず、比が大きいほど抗体が該タンパク質に強く結合することを意味している。これらの結果から、本実験に供した８種類の抗ヒトＮｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体は他のヒトＮｅｃｔｉｎファミリータンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ−１、Ｎｅｃｔｉｎ−３、Ｎｅｃｔｉｎ−４）およびヒトＮｅｃ１−５にとは交差反応せずヒトＮｅｃｔｉｎ−２に特異的な抗体であることが明らかとなった。
Figure 2008044754
 実施例１０ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のＮｅｃｔｉｎ−２−Ｎｅｃｔｉｎ−２トランス結合阻害活性
実施例１および実施例８で取得した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のＮｅｃｔｉｎ−２−Ｎｅｃｔｉｎ−２トランス結合阻害活性は時間分解蛍光法を利用した下記の方法で定量的に評価した。まず、参考例１６で調製したＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質１ｍｇをＶＩＶＡＳＰＩＮ ＭＷＣＯ ３０，０００（ＶＩＶＡ ＳＣＩＥＮＣＥ社）を用いた限外ろ過法により５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に濃縮置換し、４ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。このＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ溶液にＤＥＬＦＩＡ Ｅｕ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）付属のＥｕ−ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを添加し混和した後、４℃で一晩反応させた。反応混合物から上述の限外ろ過法により未反応のＥｕ３＋を除去すると同時にＰＢＳにバッファー置換し、Ｅｕ標識Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃを調製した。この時のＥｕ３＋導入数はＮｅｃｔｉｎ−２−ＥＤ−Ｆｃ１分子あたり５．２３分子であった。次にＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃを５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、これをＷａｌｌａｃ Ｄｅｌｆｉａ用プレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）に１００μＬ／ウェルずつ添加して室温５時間反応させた。その後各ウェルに２％ＢＳＡ含有ＰＢＳを２００μＬずつ添加し、４℃で終夜ブロッキングした。そのプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄した後、０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで６００μｇ／ｍＬに希釈した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体もしくはＣｏｎｔｒｏｌ ｈＩｇＧ（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｈｒｏｍ Ｐｕｒｅ；Ｊａｃｋｓｏｎ社）と０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで６．４μｇ／ｍＬに希釈したＥｕ標識Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃとを等量混合し、これを１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温１．５時間反応させた。このプレートをＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を２００μＬ／ウェル添加し、室温１分間プレートミキサーで攪拌した。こうして反応させた各ウェルの６１５ｎｍの蛍光（励起光３４０ｎｍ、遅延時間４００μ秒）をＡＲＶＯ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて測定し、下記の計算式によりＮｅｃｔｉｎ−２−Ｎｅｃｔｉｎ−２トランス結合阻害率を算出した。
Ｎｅｃｔｉｎ−２−Ｎｅｃｔｉｎ−２トランス結合阻害率（％）＝（Ａ−Ｂ）×１００／Ａ
Ａ：コントロールｈＩｇＧを用いたときのカウント
Ｂ：抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を用いたときのカウント
各抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のＮｅｃｔｉｎ−２−Ｎｅｃｔｉｎ−２のトランス結合阻害活性をまとめて表１０に示す。
Figure 2008044754
 実施例１１ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）
実施例１で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のうち、グループＩのＮｅｃ１−９６４−１、グループＩＶのＮｅｃ１−３０３−１、Ｎｅｃ１−５５４−１、Ｎｅｃ１−１３０２−２、グループＶのＮｅｃ１−７６９−２、Ｎｅｃ１−１３０５−１、グループＶＩのＮｅｃ１−１４１−３、Ｎｅｃ１−２０９−２、Ｎｅｃ１−９０９−１、Ｎｅｃ１−８４７−２、Ｎｅｃ１−８０３−２、グループＶＩＩのＮｅｃ８−４１１６−８のＡＤＣＣを測定した。ターゲット細胞としてはヒト卵巣癌細胞株ＯＶ−９０を用い、エフェクター細胞には市販の凍結ヒト末梢血単核球（旭テクノグラス社）を０．１ｎＭ組換え型ヒトＩＬ−２（ＤＩＡＣＬＯＮＥ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、５５μＭ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で一晩培養したものを用いた。
対数増殖期のＯＶ−９０細胞株を実施例６に記載の方法により回収し、１ｘ１０６個の細胞に対し２５０μＣｉのＮａ２ ５１ＣｒＯ４（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を添加して３７℃、１時間インキュベートすることにより５１Ｃｒ標識した。これらの細胞を０．４％ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（以後０．４％ＢＳＡ／ＲＰＭＩ培地と称する）で４回洗浄した後、０．４％ＢＳＡ／ＲＰＭＩ培地に対し１ｘ１０５個／ｍＬに再懸濁させた。このターゲット細胞懸濁液１００μＬ（１ｘ１０４細胞）と、上記の抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を０．４％ＢＳＡ／ＲＰＭＩ培地で終濃度０．００１５μｇ／ｍＬ、０．０１５μｇ／ｍＬ、０．１５μｇ／ｍＬおよび１．５μｇ／ｍＬとなるように希釈した溶液５０μＬとを９６穴ＲＭＣプレート（ＢＩＯＢＩＫ社）の各ウェルに添加した。陰性コントロールとして非免疫ヒトＩｇＧ（最終濃度１．５μｇ／ｍＬ）もしくはＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を同量添加した。これらのプレートを氷上で１時間インキュベートした後、上述のエフェクター細胞懸濁液を５ｘ１０５個／ウェルずつ加え（エフェクター細胞：ターゲット細胞＝５０：１）、５％炭酸ガス気流中、３７℃で４時間反応させた。各ウェルの細胞懸濁液を９６ウェルマルチスクリーン４５μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移し変え、遠心分離操作により培養上清を回収した。これらの培養上清中に細胞内から漏出した放射活性（Ｓａｍｐｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ）をγカウンター（ＡｃｃｕＦＬＥＸ γ７０００；ＡＬＯＫＡ Ｃｏ．）を用いて測定した。ＡＤＣＣの最大傷害活性（Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度１％になるように加えた場合、また自然放出活性（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ）は、エフェクター細胞のかわりに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を加えた場合に培養上清中に検出される放射活性とした。ＡＤＣＣ強度の指標となるＳｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ（％）は、（〔Ｓａｍｐｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ〕−〔Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ〕）／（〔Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ〕−〔Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ〕）ｘ１００として算出した（表１１および１２）。
非免疫ヒトＩｇＧ（最終濃度１．５μｇ／ｍＬ）添加時およびＤ−ＰＢＳ添加時のＡＤＣＣ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ（％））は各々４％、３％であったのに対し、グループＩの抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体Ｎｅｃ１−９６４−１、グループＩＶのＮｅｃ１−５５４−１、Ｎｅｃ１−１３０２−２、Ｎｅｃ１−７６９−２、グループＶＩのＮｅｃ１−８０３−２、グループＶＩＩのＮｅｃ８−４１１６−８のＡＤＣＣは抗体最終濃度１．５μｇ／ｍＬで各々１２％、１９％、１５％、１２％、１５％、１７％と有意に高かった。特にグループＩＶのＮｅｃ１−５５４−１およびグループＶＩＩのＮｅｃ８−４１１６−８は抗体最終濃度０．１５μｇ／ｍＬでのＳｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓが各々１５％、１２％と他の抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体に比べより強いＡＤＣＣを示した。
Figure 2008044754
Figure 2008044754
 実施例１２ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
実施例１で取得した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のうち、Ｎｅｃ１−８０３−２、Ｎｅｃ１−９６４−１、Ｎｅｃ１−３０３−２、Ｎｅｃ１−５５４−１ＳＰ３、Ｎｅｃ１−１３０２−２、Ｎｅｃ１−７６９−２、Ｎｅｃ１−１３０５−１、Ｎｅｃ１−１４１−３、Ｎｅｃ１−２０９−２、Ｎｅｃ１−９０９−１およびＮｅｃ１−８４７−２の抗腫瘍活性をＯＶ−９０ヒト卵巣癌細胞株のヌードマウス皮下移植モデルにおいて調べた。各抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体標品は参考例２８に記載の方法により調製したものを用いた。ＯＶ−９０細胞株は、１５％ＦＢＳ（ＪＲＨ社）を含むＭＣＤＢ１０５（Ｓｉｇｍａ社）とＭｅｄｉｕｍ１９９（Ｓｉｇｍａ社）との等量混合培地を用い、１５０ｃｍ２組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ処理により剥離して得た対数増殖期のＯＶ−９０細胞株懸濁液を、遠心分離操作（１，０００ｒｐｍ、３分）を用いてＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３回洗浄した。こうして得た細胞をＨＢＳＳに８ｘ１０７個／ｍＬの密度で再懸濁させた。
日本クレアより購入したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ）（５週齢、雌）を１週間馴化飼育した後、上記ＯＶ−９０細胞懸濁液を腹側皮下に１００μＬ／個体ずつ接種した。細胞接種１０日後にＯＶ−９０腫瘍塊の長径と短径をノギスで測定し、下記の計算式により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径ｘ（短径）２／２
ＯＶ−９０細胞株を移植した上記ヌードマウスの中から腫瘍塊の生着したものを選抜し、各個体の体重を測定した後、各群の平均腫瘍塊体積が均等（約５０ｍｍ３）になるように群分けした。細胞接種１０、１３、１７、２０、２４、２７、３１日目に、ＰＢＳで０．１５ｍｇ／ｍＬに希釈した上記抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体溶液もしくはＰＢＳを１０ｍＬ／ｋｇずつ尾静脈投与し、それと同時に上記の方法により腫瘍体積を測定した。抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の増殖抑制活性は、薬物投与開始４週間後の腫瘍体積を基に、下記の計算式によりＴ／Ｃ（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／Ｃｏｎｔｒｏｌ）値を算出した。また投与群間の有意差検定にはパラメトリックＤｕｎｎｅｔ型多重比較検定（ＳＡＳ前臨床パッケージＶｅｒｓｉｏｎ ５．０）を用いた。
Ｔ／Ｃ（％）＝［（抗体投与群における薬物投与開始時からの腫瘍体積の増加量）／（ＰＢＳ投与群における薬物投与開始時からの腫瘍体積の増加量）］ｘ１００
上記の抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の中には、ＯＶ−９０細胞株腫瘍塊の増殖を強く抑制する抗体や弱く抑制する抗体があった。各抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のＴ／ＣとＰＢＳ投与群に対する有意差検定値（Ｐ ｖａｌｕｅ）をまとめて表１３に示す。
Figure 2008044754
 実施例１３ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の結合ドメイン解析
抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のエピトープ探索方法の一つとして、Ｎｅｃｔｉｎ−２のＩｇ１ドメイン（配列番号１または配列番号３で表されるアミノ酸配列の４７〜１４２番目）欠損タンパク質およびＩｇ２ドメイン（配列番号１または配列番号３で表されるアミノ酸配列の１７５〜２４０番目）欠損タンパク質に対する反応性を、これらのタンパク質の一過性発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いたＦＣＭにより調べた。具体的には、実施例９と同様の方法により、参考例１８で作製したｐＥＥ１２．４−Ｎｅｃｔｉｎ−２δ、および参考例３０で作製したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ２、また陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）を一過性発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液を作製した。これらの細胞懸濁液を９６ウェルＶ底プレートの各ウェルに３０μＬずつ加え、そこへＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで１５μｇ／ｍＬに希釈した幾つかの実施例１で作製した抗ヒトＮｅｃｔｉｎ−２モノクローナル抗体または参考例１４で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体Ｎ２−Ｎｏ．２を２０μＬ（終濃度：６μｇ／ｍＬ）ずつ加えて氷上で１時間反応させた。各ウェルにＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ２００μＬを加え、遠心分離操作により１回洗浄した後、ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで１０μｇ／ｍＬに希釈したＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体を５０μＬずつ加え、混合し、氷上で１時間反応させた。Ａｌｅｘａ４８８標識２次抗体は、ヒト抗体にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、ウサギ抗体にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。各ウェルの細胞をＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、２５０μＬのＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁させ、フローサイトメーターＭＰＬ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いて染色細胞の蛍光強度を測定し、各抗体の陰性コントロール群の蛍光強度ｍｅｄｉａｎ値に対する１次抗体添加群の蛍光強度ｍｅｄｉａｎ値の比を各々の遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する反応性として表１４および１５に示した。表中ではｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ１導入細胞およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ΔＩｇ２導入細胞に対する反応性をそれぞれ、ｄｅｌｔａ−Ｉｇ１、ｄｅｌｔａ−Ｉｇ２と表記し、陰性コントロールに対する比が２以上のものを反応性があると規定し、Ｄｅｌｔａ−Ｉｇ１との比が２以上でｄｅｌｔａ−Ｉｇ２との比が２以下のものはＮｅｃｔｉｎ−２のＩｇ２ドメインを認識する抗体、またｄｅｌｔａ−Ｉｇ１との比が２以下でｄｅｌｔａ−Ｉｇ２との比が２以上のものはＮｅｃｔｉｎ−２のＩｇ１ドメインを認識する抗体と判断した。また、上記のいずれの比も２以下の反応性の抗体の結合ドメイン（エピトープドメイン）は“ｕｎｋｎｏｗｎ”と記載した。
その結果、エピトープグループＩＶに属する抗体はＮｅｃｔｉｎ−２のＩｇ２ドメインを認識していることが示唆された。また、エピトープグループＶおよびＶＩに属する抗体はＮｅｃｔｉｎ−２のＩｇ１ドメインを認識していることが示唆された。
Figure 2008044754
Figure 2008044754
 実施例１４ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２モノクローナル抗体のカニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２に対する交差反応性
実施例１で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のカニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２に対する交差反応性をカニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２一過性発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いたＦＣＭにより調べた。実施例９と同様の方法により、参考例１８にて作製したｐＥＥ１２．４−Ｎｅｃｉｎ−２δ、参考例３２で作製したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｍａＮｅｃｔｉｎ−２、もしくは陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）を一過性発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液を各々作製した。これらの細胞懸濁液を９６ウェルＶ底プレートの各ウェルに３０μＬずつ加え、そこへ１次抗体としてＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで１５μｇ／ｍＬに希釈した幾つかの実施例１で作製した抗ヒトＮｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体、もしくは陽性コントロール抗体として参考例１４で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ウサギポリクローナル抗体Ｎ２−Ｎｏ．２を２０μＬ（最終濃度：６μｇ／ｍＬ）ずつ加えて氷上で１時間反応させた。その後各ウェルにＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ２００μＬを加え、遠心分離操作により１回洗浄した後、ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで１０μｇ／ｍＬに希釈したＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体を５０μＬずつ加え、懸濁させて、氷上で１時間反応させた。なお、ヒト抗体にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、ウサギ抗体にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。次にＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで細胞を２回洗浄した後、２５０μＬのＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁させ、フローサイトメーターＭＰＬ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）で染色細胞の蛍光強度を測定し、各抗体の結合反応性を確認した。各抗体について陰性コントロール群の蛍光強度ｍｅｄｉａｎ値に対する１次抗体添加群の蛍光強度ｍｅｄｉａｎ値の比を表１６に示した。この結果から、実施例１で作製した抗ヒトＮｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の中にはカニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２に交差反応するものとしないものが存在することが分かった。グループＩＶｂに属するＮｅｃ１−５５４−１、エピトープグループＶＩに属するＮｅｃ１−３１９−２、Ｎｅｃ１−８４３−１、エピトープグループＶＩＩに属するＮｅｃ８−４１１６−８はカニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２に対し交差反応性を示した。これに対しエピトープグループＶＩに属するＮｅｃ１−１１１−３、Ｎｅｃ１−１４４−１、Ｎｅｃ１−２０９−２、Ｎｅｃ１−２４４−３、Ｎｅｃ１−３１６−１、Ｎｅｃ１−３３２−１、Ｎｅｃ１−５２０−１、Ｎｅｃ１−５３０−１、Ｎｅｃ１−７０４−１、Ｎｅｃ１−７３０−４、Ｎｅｃ１−８０３−２、Ｎｅｃ１−８３４−１、Ｎｅｃ１−８４３−１、Ｎｅｃ１−８４５−２、Ｎｅｃ１−９０３−１、Ｎｅｃ１−９０９−１、Ｎｅｃ１−９１８−２、Ｎｅｃ１−１２１４−５、Ｎｅｃ８−４０２４−５はカニクイザルＮｅｃｔｉｎ−２に対し交差反応性を示さなかった。
Figure 2008044754
 実施例１５ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のカニクイザル型変異を導入したＮｅｃｔｉｎ−２に対する交差反応性
実施例１で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のカニクイザル型変異を導入したヒトＮｅｃｔｉｎ−２に対する交差反応性を、カニクイザル型変異を導入したヒトＮｅｃｔｉｎ−２一過性発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いたＦＣＭにより調べた。実施例９と同様の方法により、参考例１８で作製したｐＥＥ１２．４−Ｎｅｃｉｎ−２δ、参考例３３で作製したカニクイザル型変異を導入したＮｅｃｔｉｎ−２の動物細胞用発現ベクター；ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２（ＡＮ７７−７８ＰＤ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２（Ｇ１１３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２（Ｈ１２８Ｒ）、および陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）を一過性発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液を作製した。これらの細胞懸濁液を９６ウェルＶ底プレートの各ウェルに３０μＬずつ加え、それに１次抗体としてＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで１５μｇ／ｍＬに希釈した幾つかの実施例１で作製した抗ヒトＮｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を２０μＬ（最終濃度：６μｇ／ｍＬ）ずつ加えて氷上で１時間反応させた。その後各ウェルにＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ２００μＬを加え、遠心分離操作により１回洗浄した後、ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒで１０μｇ／ｍＬに希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を５０μＬ加え、懸濁させて、氷上で１時間反応させた。次にＦＣＭ ｂｕｒｆｅｒで細胞を２回洗浄した後、２５０μＬのＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁させ、フローサイトメーターＭＰＬ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）で各染色細胞の蛍光強度を測定し、各抗体の陰性コントロール群の蛍光強度ｍｅｄｉａｎ値に対する１次抗体添加群の蛍光強度ｍｅｄｉａｎ値の比を表１７に示した。この結果から、グループＶＩに属するＮｅｃ１−１１１−３、Ｎｅｃ１−２０９−２、Ｎｅｃ１−２４４−３、Ｎｅｃ１−３１６−１、Ｎｅｃ１−３３２−１、Ｎｅｃ１−５２０−１、Ｎｅｃ１−５３０−１、Ｎｅｃ１−７０４−１、Ｎｅｃ１−７３０−４、Ｎｅｃ１−８０３−２、Ｎｅｃ１−８３４−１、Ｎｅｃ１−８４３−１、Ｎｅｃ１−８４５−２、Ｎｅｃ１−９０３−１、Ｎｅｃ１−９０９−１、Ｎｅｃ１−９１８−２、Ｎｅｃ１−１２１４−５、Ｎｅｃ８−４０２４−５はＧ１１３ＲおよびＨ１２８Ｒに対してＮｅｃｔｉｎ−２と同等に結合したが、ＡＮ７７−７８ＰＤには結合しなかった。この結果はこれらのヒトモノクローナル抗体がＮｅｃｔｉｎ−２のＡｌａ７７またはＡｓｎ７８を含む領域を認識している可能性を示唆している。一方、グループＩＶｂに属するＮｅｃ１−５５４−１、グループＶＩに属するＮｅｃ１−１４４−１、Ｎｅｃ１−３１９−２、Ｎｅｃ１−８４３−１、グループＶＩＩに属するＮｅｃ８−４１１６−８はＡＮ７７−７８ＰＤ、Ｇ１１３ＲおよびＨ１２８Ｒに対してＮｅｃｔｉｎ−２と同等に結合した。
Figure 2008044754
 実施例１６ エピトープグループＶおよびＶＩに属する抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のエピトープ解析
実施例１３においてエピトープグループＶおよびＶＩに属する抗体はＮｅｃｔｉｎ−２のＩｇ１ドメインを認識していることが示唆された。これらの抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のエピトープをさらに詳細に特定する事を目的として、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦｃのＩｇ１ドメインに１アミノ酸置換を行った組換えタンパク質を調製し、これらの変異体に対する抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の結合活性を調べた。２９３Ｆ細胞株に、参考例１５で作製したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃ、および参考例３４で作製したＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃの１アミノ酸置換体の動物細胞用発現ベクター；ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｑ３７Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｐ４０Ｇ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｑ４５Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｈ５５Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｖ６０Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｙ６４Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｑ７１Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ａ７５Ｇ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｐ７６Ｇ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ａ７７Ｇ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｎ７８Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｈ７９Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｑ８０Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｎ８１Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ８８Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｓ９５Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ１０９Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｅ１１７Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｄ１２２Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｈ１２８Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｎ１３７Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｆ１４５Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ１４７Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｖ１５０Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｍ１５３Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｔ１５４Ａ）を２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションした。そしてこれらの細胞を８％炭酸ガス気流中、３７℃で３日間旋回培養することにより、上記プラスミドにコードされるＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質およびその１アミノ酸変異体タンパク質［Ｑ３７Ａ、Ｐ４０Ｇ、Ｑ４５Ａ、Ｈ５５Ａ、Ｖ６０Ａ、Ｙ６４Ａ、Ｑ７１Ａ、Ａ７５Ｇ、Ｐ７６Ｇ、Ａ７７Ｇ、Ｎ７８Ａ、Ｈ７９Ａ、Ｑ８０Ａ、Ｎ８１Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｓ９５Ａ、Ｋ１０９Ａ、Ｅ１１７Ａ、Ｄ１２２Ａ、Ｈ１２８Ａ、Ｎ１３７Ａ、Ｆ１４５Ａ、Ｋ１４７Ａ、Ｖ１５０Ａ、Ｍ１５３Ａ、Ｔ１５４Ａ］を培養上清中に分泌させた。各細胞懸濁液から遠心分離操作およびフィルターろ過により培養上清を調製し、以下のＥＬＩＳＡに供した。
実施例１で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体Ｎｅｃ８−４１１６−８を５０ｍＭ炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、これを９６穴ハーフウェルイムノプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）に５０μＬ／ウェルずつ添加して室温５時間反応させた。各ウェルから反応液を除去した後２％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ添加し４℃、終夜ブロッキングした。このように作製したＥＬＩＳＡ用プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）および上記のＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ１アミノ酸置換体タンパク質を一過性発現させた上記の２９３Ｆ細胞株培養上清を０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５倍希釈したものを、５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温２時間反応させた。また陰性コントロールとして２９３Ｆ細胞用の培地を同プレートに添加した。このプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで６回洗浄した後、実施例４で作製したビオチン化抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５ｎｇ／ｍＬから２０ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈した溶液を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温２時間反応させた。このプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで６回洗浄し、０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３，０００倍希釈したＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温２時間反応させた。このプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで６回洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ＴＭＢ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を５０μＬ／ウェルずつ添加後室温１分間発色させ、２Ｎ硫酸（和光純薬（株））を５０μＬ／ウェルずつ添加して酵素反応を停止させた。各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ）を用いて測定した。個々のＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃの１アミノ酸置換体に対する各ビオチン化抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の反応性は以下の式により算出した。
反応性（％ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）＝［吸光度（１アミノ酸置換体）−吸光度（陰性コントロール）］／［吸光度（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）−吸光度（陰性コントロール）］×１００
表１８において実施例４でエピトープグループＶＩに分類された抗体の中にはＡ７５Ｇ、Ｐ７６ＧおよびＮ７８Ａに対する結合力の低下が見られるものとＡ７５Ｇ、Ｐ７６Ｇ、Ｎ７８ＡおよびＮ１３７Ａに対する結合力の低下が見られるものがあり、前者の抗体群がＡｌａ７５、Ｐｒｏ７６、Ａｓｎ７８を含むエピトープを、後者の抗体群がＡｌａ７５、Ｐｒｏ７６、Ａｓｎ７８、およびＡｓｎ１３７を含むエピトープを認識することが示唆された。また、実施例４でエピトープグループＶに分類された抗体はＦ１４５Ａに対する反応性の低下が見られ、これらの抗体がＰｈｅ１４５を含むエピトープを認識することが示唆された。
Figure 2008044754
 実施例１７ エピトープグループＩおよびＶＩＩに属する抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のエピトープ解析
実施例１で取得した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のエピトープをさらに詳細に特定する事を目的として、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦｃのＩｇ２ドメインに１アミノ酸置換を行った組換えタンパク質を調製し、これらの結合活性を調べた。２９３Ｆ細胞株に、参考例１５で作製したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃ、および参考例３５で作製したＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃの１アミノ酸置換体の動物細胞用発現ベクター；ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｑ１６５Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ１７０Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｆ１７３Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｐ１７７Ｇ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｉ１８４Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ１８６Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｌ１９７Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｗ２０２Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｅ２０６Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｔ２１２Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｔ２３５Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ｋ２３９Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ（Ａ２４９Ｇ）を２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションし、これらの細胞を８％炭酸ガス気流中、３７℃で３日間旋回培養することにより、上記プラスミドにコードされるＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質およびその１アミノ酸変異体タンパク質［Ｑ１６５Ａ、Ｋ１７０Ａ、Ｆ１７３Ａ、Ｐ１７７Ｇ、Ｉ１８４Ａ、Ｋ１８６Ａ、Ｌ１９７Ａ、Ｗ２０２Ａ、Ｅ２０６Ａ、Ｔ２１２Ａ、Ｔ２３５Ａ、Ｋ２３９Ａ、Ａ２４９Ｇ］を培養上清中に分泌させた。各細胞懸濁液から遠心分離操作およびフィルターろ過により培養上清を調製し、以下のＥＬＩＳＡに供した。
実施例１で取得した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体Ｎｅｃ１−８０３−２を５０ｍＭ炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、これを９６穴ハーフウェルイムノプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）に５０μＬ／ウェルずつ添加して室温５時間反応させた。各ウェルから反応液を除去した後２％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ添加し４℃、終夜ブロッキングした。このように作製したＥＬＩＳＡ用プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃタンパク質（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）およびＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ１アミノ酸置換体タンパク質を一過性発現させた上記の２９３Ｆ細胞株培養上清を０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２５倍もしくは１２５倍希釈したものを５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温２時間反応させた。また陰性コントロールとして２９３Ｆ細胞用の培地を同プレートに添加した。このプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで６回洗浄した後、実施例４で作製したビオチン標識抗Ｎｅｃｔｉｎ−２抗体を０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈した溶液を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温２時間反応させた。このプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで６回洗浄し、０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３，０００倍希釈したＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温２時間反応させた。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで６回洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ＴＭＢ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を５０μＬ／ウェルずつ添加後室温１分間発色させ、２Ｎ硫酸（和光純薬（株））を５０μＬ／ウェルずつ添加して酵素反応を停止させた。各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）をプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ３４０ＰＣ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。個々のＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−Ｆｃ１アミノ酸置換体に対する各ビオチン標識抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の反応性は以下の式により算出し、結果を表１９にまとめた。
反応性（％ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）＝［吸光度（１アミノ酸置換体）−吸光度（陰性コントロール）］／［吸光度（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）−吸光度（陰性コントロール）］×１００
エピトープグループＩに属するＮｅｃ１−９６４−１のＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃ１アミノ酸置換体に対する結合活性はＩ１８４Ａ、Ｋ１８６Ａ、Ｔ２１２Ａで顕著に低下し、この抗体がＩｌｅ１８４、Ｌｙｓ１８６、Ｔｈｒ２１２を含むエピトープを認識することが示唆された。一方エピトープグループＶＩＩに属する抗体群の中でＮｅｃ８−４１１６−８、Ｎｅｃ９−１００４−１、Ｎｅｃ９−１２３６−１、Ｎｅｃ９−１６３７−１のＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃ１アミノ酸置換体に対する結合活性はＦ１７３Ａで顕著に低下し、これらの抗体がＰｈｅ１７３を含むエピトープを認識することが示唆された。
Figure 2008044754
 実施例１８ エピトープグループの細分化
実施例１および実施例８で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体は実施例４に示すように大きく７つのエピトープグループに分類されたが、その後の検討によりこれらがさらに細分化されることが分かった。例えば、実施例４で行った拮抗阻害実験の結果を詳細に調べると、エピトープグループＩＶに属する抗体の中にはエピトープグループＶＩＩの抗体とも拮抗阻害反応を示す一群の抗体があった。これらの抗体はエピトープグループＶＩＩと拮抗阻害反応を示さないエピトープグループＩＶの抗体とは若干エピトープが異なるものと考えられるので、便宜上エピトープグループＩＶｂ、エピトープグループＩＶに属し、エピトープグループＶＩＩと拮抗阻害反応を示さない抗体群をエピトープグループＩＶａというようにサブグループ化した（表２０）。また、エピトープグループＶＩに属する抗体の中にはエピトープグループＩに属する抗体群と拮抗阻害反応を示す抗体群があった。これらの抗体はエピトープグループＩと拮抗阻害反応を示さないエピトープグループＶＩの抗体とは若干異なるエピトープを認識していると考えられる為、便宜上これらをエピトープグループＶＩａと称することとした。さらに、実施例１６においてエピトープグループＶＩに属し、エピトープグループＩと拮抗阻害反応を示さない抗体群はＡ７５Ｇ、Ｐ７６ＧおよびＮ７８Ａに対する結合力低下が見られる抗体群とＡ７５Ｇ、Ｐ７６Ｇ、Ｎ７８ＡおよびＮ１３７Ａに対する結合力低下が見られる抗体群に分かれた。そこでＡ７５Ｇ、Ｐ７６ＧおよびＮ７８Ａに対する結合力低下が見られる抗体群を便宜上エピトープグループＶＩｂ、Ａ７５Ｇ、Ｐ７６Ｇ、Ｎ７８ＡおよびＮ１３７Ａに対する結合力低下が見られる抗体群を便宜上エピトープグループＶＩｃとした（表２０）。実施例１６において、エピトープグループＶＩａに属する抗体Ｎｅｃ１−１４１−３はいずれのアミノ酸置換体に対してもｗｉｌｄ ｔｙｐｅとほぼ同等の結合力を示し、エピトープグループＶＩｂやＶＩｃとエピトープが異なることが示唆された。また、実施例１７においてエピトープグループＶＩＩに属する抗体の中にはＦ１７３Ａに対する結合力低下を示す抗体群が見出された。そこでＦ１７３Ａに対する結合力低下が見られるエピトープグループＶＩＩに属する抗体群を便宜上エピトープグループＶＩＩａ、それ以外のエピトープグループＶＩＩに属する抗体群を便宜上エピトープグループＶＩＩｂとした（表２０）。
Figure 2008044754
 実施例１９ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の可変領域の塩基配列、アミノ酸配列
実施例１で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体Ｎｅｃ１−２４４−３、Ｎｅｃ１−５３０−１、Ｎｅｃ１−５５４−１、Ｎｅｃ１−８０３−２、Ｎｅｃ１−８３４−１、Ｎｅｃ１−８４５−２、Ｎｅｃ１−９０３−１、Ｎｅｃ８−４１１６−８の可変領域の塩基配列、アミノ酸配列を以下の手法により決定した。具体的にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｃｅｌｌｓ Ｄｉｒｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、実施例１で樹立した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ３〜１０×１０５個を８０μＬのＰＢＳに懸濁させ、そのうち１μＬを氷上でＲＮａｓｅＯＵＴ １μＬとＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬの入ったＰＣＲチューブに加え、７５℃で１０分間加熱した。次に氷上で１０×ＤＮａｓｅＩ Ｂｕｆｆｅｒ １．６μＬとＤＮａｓｅＩ ５μＬを加え、室温で５分間放置後、チューブを氷上に戻し、２５ｍＭ ＥＤＴＡ１．２μＬを加え、７０℃で５分間加熱した。続いてＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０２μＬと１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ１μＬを加え７０℃で５分間加熱後、氷上で２分間放置し、５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ６μＬ、ＲＮａｓｅ ＯＵＴ１μＬ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ ＲＴ１μＬ、および０．１ｍＭ ＤＴＴ１μＬを加え５０℃で５０分、さらに８５℃で５分間反応させてｃＤＮＡを合成した。
各ハイブリドーマより合成した上記ｃＤＮＡを鋳型にし、Ｎｅｃ１−２４４−３、Ｎｅｃ１−５３０−１、Ｎｅｃ１−８０３−２、Ｎｅｃ１−８３４−１、Ｎｅｃ１−８４５−２、Ｎｅｃ１−９０３−１のＨ鎖遺伝子はプライマー１７６（配列番号：１７６）およびプライマー１７７（配列番号：１７７）、Ｌ鎖遺伝子はプライマー１７８（配列番号：１７８）およびプライマー１７９（配列番号：１７９）を用いて、Ｎｅｃ８−４１１６−８のＨ鎖遺伝子はプライマー１７７およびプライマー１７８、Ｌ鎖遺伝子はプライマー１８０（配列番号：１８０）およびプライマー１７９を用いて、また、Ｎｅｃ１−５５４−１のＨ鎖遺伝子はプライマー１８１（配列番号：１８１）およびプライマー１７７、Ｌ鎖遺伝子はプライマー１８２（配列番号：１８２）およびプライマー１７９を用いてそれぞれＰＣＲ法により増幅させた。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ４μＬ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）１Ｕ、プライマー各０．３μＭ、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、ＭｇＳＯ４１ｍＭ、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ社）を含む合計５０μＬとした。ＰＣＲは９４℃・２分の後、９４℃・１５秒、６０℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを３０回繰り返し、続いて６８℃・５分間加熱して行った。Ｈ鎖遺伝子はＰＣＲ終了後の反応液１μＬを鋳型にして再度上記と同様のＰＣＲを行った。該ＰＣＲ産物はＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、ＥＢ ｂｕｆｆｅｒ７５ｕＬに溶出した。
ＤＮＡ塩基配列決定のための反応は上記のＰＣＲ産物精製溶液を１０μＬ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）８μＬ、プライマー１８３（配列番号：１８３）３．２ｐｍｏｌからなる容量２０μＬの溶液を用い、９６℃・２分の後、９６℃・１０秒、５０℃・５秒、６０℃・４分のサイクルを２５回繰り返して行った。反応液の精製はＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて蒸留水３０μＬに置換して行った。この反応生成物をＤＮＡ配列解析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に供し、同装置に添付のマニュアルによりＤＮＡ配列を決定した。各抗体のアミノ酸配列はＤＮＡ配列より常法に従って推定した。
その結果、Ｎｅｃ１−２４４−３のＨ鎖可変領域は配列番号：１８７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：１９１）、Ｎｅｃ１−２４４−３のＬ鎖可変領域は配列番号：１９５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：１９９）、Ｎｅｃ１−５３０−１のＨ鎖可変領域は配列番号：２０３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２０７）、Ｎｅｃ１−５３０−１のＬ鎖可変領域は配列番号：２１１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２１５）、Ｎｅｃ１−５５４−１のＨ鎖可変領域は配列番号：２１９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２２３）、Ｎｅｃ１−５５４−１のＬ鎖可変領域は配列番号：２２７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２３１）、Ｎｅｃ１−８０３−２のＨ鎖可変領域は配列番号：２３５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２３９）、Ｎｅｃ１−８０３−２のＬ鎖可変領域は配列番号：２４３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２４７）、Ｎｅｃ１−８３４−１のＨ鎖可変領域は配列番号：２５１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２５５）、Ｎｅｃ１−８３４−１のＬ鎖可変領域は配列番号：２５９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２６３）、Ｎｅｃ１−８４５−２のＨ鎖可変領域は配列番号：２６７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２７１）、Ｎｅｃ１−８４５−２のＬ鎖可変領域は配列番号：２７５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２７９）、Ｎｅｃ１−９０３−１のＨ鎖可変領域は配列番号：２８３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２８７）、Ｎｅｃ１−９０３−１のＬ鎖可変領域は配列番号：２９１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：２９５）、Ｎｅｃ８−４１１６−８のＨ鎖可変領域は配列番号：２９９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：３０３）、Ｎｅｃ８−４１１６−８のＬ鎖可変領域は配列番号：３０７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：３１１）、であることが明らかとなった。
ここで得られた抗体の重鎖のＣＤＲ１〜３（アミノ酸配列）の組合せは表２１に記載される通りである。また、その抗体軽鎖のＣＤＲ１〜３（アミノ酸配列）の組合せは表２２に記載される通りである。また、ここで得られた抗体の重鎖のＣＤＲ１〜３（塩基配列）は、表２１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、その組合せは、表２３に記載される通りである。また、ここで得られた抗体の軽鎖のＣＤＲ１〜３（塩基配列）は、表２２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、その組合せは、表２４に記載される通りである。
更に、ここで得られた抗体の可変領域のアミノ酸配列および塩基配列は、表２５に記載した通りである。
参考のため、図１にこれら各抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域のアミノ酸配列を、また図２および３にそれぞれの塩基配列を示す。
Figure 2008044754
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 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するヒトモノクローナル抗体は例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤、エフェクター細胞依存性の癌細胞障害剤などとして安全に使用することができる。
参考例３６ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の作製
（ｉ）参考例１６で調製したＮｅｃｔｉｎ−２δの細胞外領域（Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ３６１）とヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃ領域（Ｐｒｏ２１７−Ｌｙｓ４４７）との融合タンパク質をコードする動物細胞発現ベクターをヒト２９３Ｆ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に一過性発現させて調製した組換えＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃ融合タンパク質（１．６ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ溶液）または（ｉｉ）Ｎｅｃｔｉｎ−２δの細胞外領域（Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ３６１）とＦＬＡＧタグ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）との融合タンパク質をコードする動物細胞発現ベクターをヒト２９３Ｆ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に一過性発現させて参考例１３で調製した組換えＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧ融合タンパク質（２ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ溶液）と、フロインド完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）とを等容量混合してエマルションを調製した。
これらのエマルションをＫＭマウス（１０週齢、１２週齢、雄；キリンビール（株））各５匹の皮下および皮内にそれぞれ１０〜５０μｇ／匹ずつ初回免疫した。２回目以降は組換えＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃタンパク質または組換えＮｅｃｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質とフロインド不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）とを等量混合して調製したエマルションを同様に２週間毎に追加免疫した。また、Ｎｅｃｔｉｎ−２δを安定発現する組換えＦＭ３Ａ細胞株（＃６０−６）（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２０４２９を参照）やＮｅｃｔｉｎ−２δを安定発現する組換えＮＳＯ細胞株（＃２−７５）をフラスコ培養し、これを回収して洗浄操作により血清成分を除去した後、マイトマイシンＣ（和光純薬（株））で３７℃、３０分間処理した。マイトマイシンＣ処理した両細胞株を１０ｍＬのＰＢＳで３回洗浄後、２ｘ１０７個／ｍＬになるようＰＢＳに再懸濁させ、これらをＫＭマウス（キリンビール（株）；１０週齢−１２週齢、雄）各５匹の腹腔内に１ｘ１０７個／５００μＬずつ１週間毎に繰り返し免疫した。
さらに、上記の組換えＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃタンパク質または組換えＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質と、フロインド完全アジュバントとを等容量混合して調製したエマルションをＫＭマウス（１２週齢、雄）各５匹の皮下および皮内にそれぞれ１０〜５０μｇ／匹で免疫し初回免疫した。初回免疫の１週間後に上記の方法によりマイトマイシンＣ処理したＮｅｃｔｉｎ−２δ発現組換えＦＭ３Ａ細胞株を１ｘ１０７個／５００μＬずつ腹腔内に免疫した。３回目は組換えＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃまたは組換えＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧとフロインド不完全アジュバントとを等容量混合して調製したエマルションを皮下および皮内にそれぞれ免疫し、同時にマイトマイシンＣ処理したＮｅｃｔｉｎ−２δ発現組換えＦＭ３Ａ細胞株（＃６０−６）を１ｘ１０７個／５００μＬずつ腹腔内に１週間毎に免疫した。４回目以降は上記の方法によりマイトマイシンＣ処理したＮｅｃｔｉｎ−２δ発現組換えＦＭ３Ａ細胞株（＃６０−６）のみを１ｘ１０７個／５００μＬずつ腹腔内に免疫した。
免疫開始前および免疫後に全てのマウスからエーテル麻酔下、眼底採血して抗血清を取得し、以下に述べるフローサイトメトリー法により血清抗体価を調べた。すなわち、Ｎｅｃｔｉｎ−２δを安定発現する組換えＣＨＯ細胞株（＃４３−２）（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２０４２９を参照）とｍｏｃｋ−ＣＨＯ細胞株の細胞懸濁液（ＰＢＳ）をそれぞれ５ｘ１０５個ずつポリプロピレンチューブに分注し、遠心分離（１，２００ｒｐｍｘ５分）によりＰＢＳを除去した。これらの細胞残渣を、１％ＢＳＡと１０％ＦＢＳとを含有するＰＢＳで１００倍希釈した上記マウス抗血清５０μＬずつに再懸濁させ、氷上暗所で３０分間反応させた。この細胞懸濁液にＰＢＳを２００μＬ加え遠心分離（１，２００ｒｐｍｘ５分）した後、上澄液を吸引除去し、細胞残渣を１％ＢＳＡと１０％ＦＢＳとを含有するＰＢＳで１００倍希釈したａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）溶液５０μＬに再懸濁させ、氷上暗所で３０分間反応させた。この細胞懸濁液を同様にＰＢＳで３回洗浄した後、細胞残渣をＰＢＳ２００μＬに再懸濁させ、フローサイトメーターＭＰＬ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いて各細胞の蛍光強度を測定し、横軸に蛍光強度を縦軸に細胞数をとったグラフを作成して血清抗体価を比較した。
上記の方法で十分な血清抗体価上昇が確認されたＫＭマウスのうち、組換えＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ｈＦｃまたは組換えＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧを免疫した個体にはこれらのタンパク質抗原を尾静脈注射し、またＮｅｃｔｉｎ−２δを安定発現する組換え細胞株を免疫した個体には同細胞株を腹腔内注射した。これらの最終免疫３日後に該マウスを放血死させて脾臓を摘出し、得られたマウス脾臓細胞と、あらかじめ１０％ＦＢＳを含有するＤａｉｇｏ Ｔ培地（Ｆ−１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＨＡＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）との等量混合培地にＭＥＭ Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、およびＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したもの）５００ｍＬに対し８−Ａｚａｇｕａｎｉｎｅ（ＨｙｂｒｉＭａｘ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）１バイアルを溶解させた培地で馴化培養しておいたマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）（ＡＴＣＣ）とを５：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１，５００（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）を用いて融合させた。細胞融合操作は試薬に添付のマニュアルに従って行った。融合後の細胞を１０％ＦＢＳと１０％ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）とを含有するＤａｉｇｏ Ｔ培地に再懸濁させ、９６ウェル培養プレートに脾臓細胞５ｘ１０４個／１００μＬ／ウェルで播種した。これを５％炭酸ガス気流中、３７℃で１日間培養した後、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、０．０１６ｍＭチミジン（ＨＡＴ）、１０％ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１および１０％ＦＢＳを含有するＤａｉｇｏ Ｔ培地（ＨＡＴ選択培地）を１００μＬ／ウェル添加し、さらに培養上清の３／４を３日毎に２回、新鮮なＨＡＴ選択培地に交換しながら、５％炭酸ガス気流中、３７℃で培養を継続した。
培養７日目〜１４日目にかけてコロニーの増殖が見られたウェルの培養上清をＮｅｃｔｉｎ−２δを安定発現する組換えＣＨＯ細胞株（＃４３−２）またはｍｏｃｋ−ＣＨＯ細胞株を用いたＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡでスクリーニングし、抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立した。すなわち、Ｎｅｃｔｉｎ−２δを安定発現する組換えＣＨＯ細胞株（＃４３−２）とｍｏｃｋ−ＣＨＯ細胞株を１０％透析ＦＢＳ、およびＧＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含有するＧＳ選択ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて９６ウェル組織培養プレートで培養した。各細胞株がコンフルエントに達したプレートの培養上清を吸引除去した後、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ（＋）を２００μＬ／ウェルずつ添加し、氷上暗所で１時間インキュベートした。各ウェルの上澄液を吸引除去した後、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェルずつ添加し、氷上暗所で２時間反応させた。このプレートを４℃に冷やしたＰＢＳ（＋）で１回洗浄した後、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ（＋）で３，０００倍希釈したａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＧＯＡＴ）ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）を１００μＬ／ウェルずつ添加し、氷上暗所で２時間反応させた。プレートを４℃に冷やしたＰＢＳ（＋）で３回洗浄した後、３，３’，５，５’ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）溶液（ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ＴＭＢ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温５分間発色させ、２Ｎ硫酸（和光純薬（株））を１００μＬ／ウェルずつ添加して酵素反応を停止させた。各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏ．）を用いて測定し、Ｎｅｃｔｉｎ−２発現組換えＣＨＯ細胞株を播種したプレートの吸光度が０．５以上で、かつｍｏｃｋ−ＣＨＯ細胞株を播種したプレートの吸光度が０．３未満のものを陽性ウェルと判定した。これらの中から特に抗原特異性と親和性の高いＩｇＧ抗体産生ハイブリドーマを選択し、１０％ＦＢＳと１０％ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１とを含有するＤａｉｇｏ Ｔ培地に再懸濁させた。これらの細胞株を９６ウェル組織培養プレートに０．５個／ウェルで播種し、顕微鏡観察によりモノクローンである事を確認したハイブリドーマの培養上清を上記Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡで再度スクリーニングして２５８種類の抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ・クローンを樹立した。
こうして得た抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを１００ｍＬの１０％ＦＢＳ Ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＤａｉｇｏ Ｔ培地中でフラスコ培養し、培養上清を遠心分離（１，２００ｒｐｍｘ５分）してその上澄液を取得した。これらの培養上清にＰＢＳで平衡化したプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ２００μＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加し４℃で終夜緩やかに振とうさせて抗体を吸着させた。このプロテインＡ担体を遠心分離操作により回収し、ＰＢＳで洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）１．２ｍＬにてＩｇＧ画分を溶出した。この溶出液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて速やかに中和した後、限外濾過膜（ビバスピン６：分画分子量１０ｋＤａ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いた限外濃縮操作によりＰＢＳにバッファー置換し、これを抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体標品としてｉｎ ｖｉｔｒｏ性状解析に用いた。
抗体産生ハイブリドーマ・クローンのなかから、本発明に用いられる抗体を産生するハイブリドーマ・クローンであるＮｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）、Ｎｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）、Ｎｅｃ１−１０４４−４、Ｎｅｃ８−３５１７−１１またはＮｅｃ８−３７０４−７を得た。
参考例３７ 本発明に用いられる抗体とＮｅｃｔｉｎ−２に対し競合的に結合する抗体の選択
参考例３６で作製した本発明に用いられる抗体とＮｅｃｔｉｎ−２に対し競合的に結合するモノクローナル抗体は以下に述べる方法により選択した。
まず、抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体同士のＮｅｃｔｉｎ−２に対する競合的結合阻害反応を行うため、参考例３６で取得した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を被試験抗体としてビオチンで標識した。すなわち、抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体１０μｇをＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）に付属のＷＳ Ｂｕｆｆｅｒ５０μＬに添加し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ５０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて溶液量がほとんど無くなるまで限外濃縮した。この残液にＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２に付属のＲｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ５０μＬ、および５０μＬのＤＭＳＯに溶解したＮＨ２ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｉｎ４μＬを順次添加し、３７℃で１０分間反応させた。この反応混合物を再度限外濃縮操作によりＷＳ Ｂｕｆｆｅｒにバッファー置換し、ビオチン標識抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体を調製し、これらを以下のアッセイに使用した。
参考例３６で作製した本発明に用いられる抗体（非標識抗Ｎｅｃｔｉｎ−２モノクローナル抗体）を、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２５μｇ／ｍＬに希釈した溶液５μＬ、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ安定発現ＣＨＯ細胞株（＃４３−２）を２％ＦＢＳを含有するＰＢＳに懸濁させた懸濁液（２ｘ１０５個／ｍＬ）１５μＬ、およびＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５μＬをＦＭＡＴ ｐｌａｔｅ（３８４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ Ｂｌａｃｋ／Ｃｌｅａｒ Ｂｏｔｔｏｍ ｗｉｔｈ Ｌｉｄ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に添加し、これらを混合した後室温で１０分間反応させた。このプレートに上記の方法で作製したビオチン標識抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体（被試験抗体）を２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬに希釈した溶液５μＬを添加し、室温で６０分間インキュベートした。対照実験として非標識抗Ｎｅｃｔｉｎ−２モノクローナル抗体溶液の代わりに同容量の２％ＦＢＳを含有するＰＢＳを添加したウェルを設けた。このＮｅｃｔｉｎ−２に対する競合的結合阻害反応をビオチン標識に供した被試験抗体と本発明に用いられる抗体との全ての組合せについて行った。各ウェルの蛍光強度（ＦＬ１ ｔｏｔａｌ値）をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ８２００ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の各組合せにおける競合的結合阻害率は以下に示す式を用いて算出した。
競合的結合阻害率＝（１−Ａ／Ｂ）ｘ１００
Ａ；被試験抗体に、非標識抗体を添加したウェルのＦＬ１ ｔｏｔａｌ値
Ｂ；被試験抗体に、非標識抗体を添加していないウェルのＦＬ１ ｔｏｔａｌ値
本手法により、例えば、参考例３６で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体の中からＮｅｃｔｉｎ−２に対してＮｅｃ１−５５４−１と競合的に結合する抗体として例えばＮｅｃ１−１０４４−４とＮｅｃ１−１３０２−２を選択的に取得した。またＮｅｃｔｉｎ−２に対してＮｅｃ８−４１１６−８と競合的に結合する抗体として例えばＮｅｃ８−３７０４−７とＮｅｃ８−３５１７−１１を選択的に取得した。
表２６に抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体によるビオチン標識Ｎｅｃ８−４１１６−８とＮｅｃｔｉｎ−２との結合阻害率を、また表２７に抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体によるビオチン標識Ｎｅｃ１−５５４−１とＮｅｃｔｉｎ−２との結合に対する競合的結合阻害率を示す。
なお、こうして選択された本発明に用いられる抗体とＮｅｃｔｉｎ−２に対して競合的に結合する抗体Ｎｅｃ１−１０４４−４とＮｅｃ１−１３０２−２、Ｎｅｃ８−３７０４−７とＮｅｃ８−３５１７−１１は、それぞれ寄託されている。
Figure 2008044754
Figure 2008044754
 参考例３８ 組換え抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体（Ｎｅｃ８−４１１６−８）の大量調製
組換え抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体（Ｎｅｃ８−４１１６−８）は該抗体遺伝子をＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）に安定発現させることにより調製した。抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＮｅｃ８−４１１６−８の培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを用いて精製した抗体標品のＨ鎖とＬ鎖を還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って分離し、Ｈ鎖、Ｌ鎖タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。Ｈ鎖はＮ末端がピログルタミル化されている事が多い為、Ｐｆｕ Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（タカラバイオ）を用いてピログルタミン酸除去反応を行った。ＰＶＤＦ膜に転写したタンパク質のＮ末端アミノ酸配列はプロテインシーケンサー（ＡＢＩ）を用いて決定した。こうして得られたＮ末端アミノ酸配列（Ｈ鎖（配列番号：３１２）、Ｌ鎖（配列番号：３１３））をＶ ＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）を用いてホモロジー検索し、上記アミノ酸配列と合致するｇｅｒｍｌｉｎｅ（ＶＨ４、ＶＫＩＩＩＡ２７）とそれから予測されるシグナル配列のＮ末端をコードする塩基配列（Ｈ鎖（配列番号：３１４）、Ｌ鎖（配列番号：３１５））を選択した。これらのシグナル配列に制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩサイトとＫｏｚａｋ配列を付加したオリゴＤＮＡをフォワードプライマー（Ｈ鎖（配列番号：１７６）、Ｌ鎖（配列番号：１８０））として合成した。一方、リバースプライマーとして抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子の終止コドンの下流に制限酵素ＥｃｏＲ Ｉサイトを付加したオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した（Ｈ鎖（配列番号：３１６）、Ｌ鎖（配列番号：３１７））。ハイブリドーマ細胞（Ｎｅｃ８−４１１６−８）からＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｃｅｌｌｓ Ｄｉｒｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて調製したｃＤＮＡを鋳型にし、上記のプライマーを用いてＰＣＲを行いＮｅｃ８−４１１６−８抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の全長遺伝子をそれぞれ取得した。
こうして得られたＨ鎖遺伝子、Ｌ鎖遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩでそれぞれ消化した後、その精製ＤＮＡ断片を動物細胞発現ベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）およびグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子を含有する動物細胞発現ベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）のＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＥｃｏＲ Ｉサイトへそれぞれ挿入し、Ｈ鎖発現ベクター、Ｌ鎖発現ベクターを構築した。さらに、各ベクターから制限酵素Ｎｏｔ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ消化により切り出したＨ鎖遺伝子挿入フラグメントとＬ鎖遺伝子挿入フラグメントを単離した後、ライゲートさせ、ＧＳ遺伝子、Ｈ鎖遺伝子、Ｌ鎖遺伝子を共に含むダブルジーンベクターを構築した。このベクターをＬｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社のマニュアルに従ってＣＨＯＫ１ＳＶ細胞にトランスフェクションし、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ（ＭＳＸ）を含む培地中、９６ウェル組織培養プレートで選択培養した。単一コロニーが増殖したウェルの培養上清中のヒト抗体濃度をＥＬＩＳＡで定量し、２２種類のＮｅｃ８−４１１６−８を安定的に高発現する組換え細胞株を選択した。これらの細胞株を拡大培養した後、無血清培地に浮遊馴化し、細胞増殖性と抗体生産性の高いＮｅｃ８−４１１６−８安定発現ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株（Ｃｌｏｎｅ２５−７８）を樹立した。
上記ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株を２５μＭ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）およびＧＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×、ＳＡＦＣ社）を含むＰｒｏＣＨＯ５培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社）で３７℃、５％炭酸ガス気流中で拡大培養した後、２Ｌジャーファーメンターを用いて３２日間攪拌培養（３７℃、溶存酸素濃度２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ６．７〜７．０、攪拌回転数８０ｒｐｍ、通気１００〜３００ｍＬ／ｍｉｎ）した。この期間中、培地の成分分析を基にグルコース溶液、Ｌ−グルタミン溶液、ＧＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×、ＳＡＦＣ社）、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（５０×、ＳＡＦＣ社）、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（１０，０００×、ＳＡＦＣ社）、Ｖｉｔａｍｉｎｓ（１００×、ＳＡＦＣ社）およびＳｏｙ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（５０×、ＳＡＦＣ社）を添加した。細胞生存率が約１０％まで低下した時点で主培養を終了した。
次にこの培養上清を遠心分離（７，４６０ｘｇ、２０分間）してその上澄液を回収し、これを限外ろ過膜（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜、分画分子量１０，０００；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いて濃縮し、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に置換した。この濃縮液を遠心分離（１４，３００ｘｇ、２０分間）して上澄液を得、それを更にフィルターろ過（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ ＨＶ、０．４５μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）して濃縮液を得た。これを０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２２ｍｍＩＤｘ７９ｍｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に吸着させ、２０カラム容量の同緩衝液でカラムを洗浄した後、カラムに結合した抗体画分を０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）により溶出させた。この溶出液に直ちに１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を加え中和した後、この抗体溶液を限外ろ過膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ、分画分子量３０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮した。これをＰＢＳで平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（２６ｍｍＩＤｘ６０ｃｍ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に供し、同緩衝液で溶出して抗体単量体画分を得た。さらにこの抗体画分をＰＢＳで平衡化したＡｃｔｉＣｌｅａｎ ＥｔＯＸカラム（２５ｍｍＩＤｘ５９ｍｍ、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ社）に供してエンドトキシンを除去し、限外ろ過膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ、分画分子量１０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮し、無菌ろ過（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ、０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）して組換えＮｅｃ８−４１１６−８精製標品を得た。こうして得られた精製抗体はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いたゲルろ過ＨＰＬＣで９５％以上の純度を示した。また、抗体標品のエンドトキシン含量をエンドスペシーＥＳ−２４Ｓセット（生化学工業社）とトキシカラーＤＩＡセット（生化学工業社）を用いて分析したところ、０．１ＥＵ／ｍｇ抗体以下であった。
参考例３９ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体（Ｎｅｃ１−５５４−１）の大量調製
抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体Ｎｅｃ１−５５４−１は該抗体産生ハイブリドーマ細胞株（Ｎｅｃ１−５５４−１）から以下の方法により調製した。ハイブリドーマ細胞株Ｎｅｃ１−５５４−１を１０％ＦＢＳ（Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ ＩｇＧ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＩＨ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２＝１：１、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１ｍＭピルビン酸ナトリウム溶液、２ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３７℃、５％炭酸ガス気流中で拡大培養した後、１次馴化培地（ＩＨ培地：ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ、８ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液＝１：１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に拡大して１日培養し、さらに主培養培地（ＩＨ培地：ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ、８ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液＝１：３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に拡大して５０Ｌ攪拌培養槽を用いて５〜７日間培養（３７℃、溶存酸素濃度２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、攪拌回転数４０ｒｐｍ）した。この期間中、培地の成分分析を基にグルコース溶液およびＬ−グルタミン溶液を添加した。細胞生存率が約５０％まで低下した時点で主培養を終了した。
次にこの培養上清を遠心分離（７，４６０ｘｇ、２０分間）してその上澄液を回収し、これを限外ろ過膜（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜、分画分子量１０，０００；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いて濃縮し、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー置換した。これを遠心分離（１４，３００ｘｇ、２０分間）して上澄液を得、更に精密ろ過（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ ＨＶ、０．４５μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）して濃縮液を得た。これを０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２２ｍｍＩＤｘ７９ｍｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に吸着させ、２０カラム容量の同緩衝液でカラムを洗浄した。カラムに結合した抗体画分は０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）により溶出させ、直ちに１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を加え中和した。
こうして得た精製抗体画分は例外的に活性抗体と不活性抗体との混合物である事が分かった。そこで、この抗体画分をさらに２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で３倍希釈し、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化させたＳＰ−５ＰＷ陽イオン交換カラム（２１．５ｍｍＩＤｘ１５０ｍｍ、東ソー社）に吸着させた。このカラムを約２カラム容量の同緩衝液で洗浄した後、溶離液のＮａＣｌ濃度を７０分間で１００ｍＭから３００ｍＭへ上昇させる直線濃度勾配溶出法により３つの溶出画分として分離した。これらの溶出画分のＮｅｃｔｉｎ−２に対する結合活性を固相化組換えＮｅｃｔｉｎ−２−ＥＤ−Ｆｃタンパク質を用いたＥＬＩＳＡで測定し、最も高い比活性を示した抗体画分（ＳＰ３）を抗Ｎｅｃｔｉｎ−２抗体画分として回収した。こうして得た抗体溶出液を限外ろ過膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ、分画分子量３０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮した後、ＰＢＳで平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（２６ｍｍＩＤｘ６０ｃｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に供し、同緩衝液で溶出して抗体単量体画分を得た。これをＰＢＳで平衡化したＡｃｔｉＣｌｅａｎ ＥｔＯＸカラム（２５ｍｍＩＤｘ５９ｍｍ、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ社）に供してエンドトキシンを除去した後、限外ろ過膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ、分画分子量１０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮し、さらに無菌ろ過（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ、０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）して精製抗体を得た。この精製抗体をＮｅｃ１−５５４−１ ＳＰ３と命名した。
こうして得られた精製抗体はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いたゲルろ過ＨＰＬＣで９５％以上の純度を示した。また、抗体標品のエンドトキシン含量をエンドスペシーＥＳ−２４Ｓセット（生化学工業社）およびトキシカラーＤＩＡセット（生化学工業社）用いて分析したところ、０．１ＥＵ／ｍｇ抗体以下であった。
実施例２０ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のヒト乳癌細胞株に対するＡＤＣＣ
参考例３６および参考例３７で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体Ｎｅｃ１−５５４−１、Ｎｅｃ１−１０４４−４、Ｎｅｃ１−１３０２−２、Ｎｅｃ８−４１１６−８、Ｎｅｃ８−３５１７−１１、Ｎｅｃ８−３７０４−７のＡＤＣＣを測定した。ターゲット細胞として実施例２２に記載の方法に従って培養したヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ）を用い、エフェクター細胞には市販の凍結ヒト末梢血単核球（ＡＬＬＣＥＬＬＳ社）を０．１ｎＭ組換え型ヒトＩＬ−２（ＤＩＡＣＬＯＮＥ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、５５μＭ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（以後１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地と称する）中で一晩培養したものを用いた。Ｎｅｃ１−１０４４−４、Ｎｅｃ１−１３０２−２、Ｎｅｃ８−４１１６−８、Ｎｅｃ８−３５１７−１１、Ｎｅｃ８−３７０４−７は参考例３６に記載の抗体標品を、Ｎｅｃ１−５５４−１は参考例３９に記載の抗体標品（Ｎｅｃ１−５５４−１ ＳＰ３）をそれぞれ用いた。
対数増殖期のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を回収し、１．０ｘ１０６個の細胞に対し２５０μＣｉのＮａ２ ５１ＣｒＯ４（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加し、３７℃、１時間インキュベートすることにより５１Ｃｒ標識した。この細胞株を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で４回洗浄した後、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地に対し１ｘ１０５個／ｍＬに再懸濁させた。ＡＤＣＣは、細胞懸濁液５０μＬ（５ｘ１０３細胞）と上記の抗体を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で終濃度０．００１５μｇ／ｍＬ、０．０１５μｇ／ｍＬ、０．１５μｇ／ｍＬおよび１．５μｇ／ｍＬとなるように希釈した溶液２５μＬとを９６穴ＲＭＣプレート（ＢＩＯＢＩＫ社）の各ウェルに添加して行った。陰性コントロールとして非免疫ヒトＩｇＧ（最終濃度０．００１５μｇ／ｍＬ、０．０１５μｇ／ｍＬ、０．１５μｇ／ｍＬおよび１．５μｇ／ｍＬ）もしくは抗体無添加（Ｎｏ Ａｂ）時の非特異的な活性を検出するためＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を同量添加した。これらのプレートを氷上で１時間インキュベートした後、上述のエフェクター細胞懸濁液を２．５ｘ１０５個／ウェルずつ加え（エフェクター細胞：ターゲット細胞＝５０：１）、５％炭酸ガス気流中、３７℃で４時間反応させ、各ウェルの細胞内から培養上清中に漏出した放射活性（Ｓａｍｐｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ）をシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ）を用いて測定した。すなわち反応後の細胞懸濁液をＭｕｌｔｉ−ｓｃｒｅｅｎ ０．４５μｍフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒａ社）に移し、そのプレートを遠心分離（１，２００ｒｐｍ、１０分間）して培養上清を回収した。この培養上清５０μＬをマイクロシンチ４０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を１５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した９６ｗｅｌｌプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）に加え、室温で３０分間混合した後、各ウェルの蛍光をシンチレーションカウンターを用いて測定した（表３３）。ＡＤＣＣの最大傷害活性（Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度１％になるように加えた場合、また自然放出活性（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ）は、エフェクター細胞のかわりに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を加えた場合の放射活性とした。ＡＤＣＣ強度の指標となるＳｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ（％）は、（〔Ｓａｍｐｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ〕−〔Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ〕）／（〔Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ〕−〔Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ〕）ｘ１００として算出した。
Figure 2008044754
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実施例２１ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のヒト前立腺癌細胞株、ヒト肺癌細胞株、ヒト血液癌由来細胞株に対するＡＤＣＣ
参考例３６で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体、Ｎｅｃ１−５５４−１、Ｎｅｃ８−４１１６−８のＡＤＣＣを測定した。ターゲット細胞としてヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ヒト前立腺癌細胞株Ｄｕ１４５、ヒト血液癌細胞株Ｕ９３７を用い、エフェクター細胞には市販の凍結ヒト末梢血単核球（ＡＬＬＣＥＬＬＳ社）を０．１ｎＭ組換え型ヒトＩＬ−２（ＤＩＡＣＬＯＮＥ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、５５μＭ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（以後１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地と称する）中で一晩培養したものを用いた。ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ヒト前立腺癌細胞株Ｄｕ１４５、ヒト血液癌細胞株Ｕ９３７はＡＴＣＣから購入し、これらの細胞株はＡＴＣＣ推奨の方法に準じて培養した。Ｎｅｃ８−４１１６−８は参考例３６に記載の抗体標品を、Ｎｅｃ１−５５４−１は参考例３９に記載の抗体標品（Ｎｅｃ１−５５４−１ ＳＰ３）をそれぞれ用いた。
対数増殖期の各種癌細胞を回収し、１．０ｘ１０６個の細胞に対し２５０μＣｉのＮａ２ ５１ＣｒＯ４（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加して３７℃、１時間インキュベートすることにより５１Ｃｒ標識した。これらの細胞株を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で４回洗浄した後、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地に対し１ｘ１０５個／ｍＬに再懸濁させた。ＡＤＣＣは細胞懸濁液５０μＬ（５ｘ１０３細胞）と上記の抗体を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で終濃度０．００１５μｇ／ｍＬ、０．０１５μｇ／ｍＬ、０．１５μｇ／ｍＬおよび１．５μｇ／ｍＬとなるように希釈した溶液２５μＬとを９６穴ＲＭＣプレート（ＢＩＯＢＩＫ社）の各ウェルに添加して行った。陰性コントロールとして非免疫ヒトＩｇＧ（最終濃度０．００１５μｇ／ｍＬ、０．０１５μｇ／ｍＬ、０．１５μｇ／ｍＬおよび１．５μｇ／ｍＬ）もしくは抗体無添加（Ｎｏ Ａｂ）時の非特異的な活性を検出するためＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を同量添加した。これらのプレートを氷上で１時間インキュベートした後、上述のエフェクター細胞懸濁液を２．５ｘ１０５個／ウェルずつ加え（エフェクター細胞：ターゲット細胞＝５０：１）、５％炭酸ガス気流中、３７℃で４時間反応させ、各ウェルの細胞内から培養上清中に漏出した放射活性（Ｓａｍｐｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ）をシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ）を用いて実施例２０に記載の方法と同様に測定した（表３４）。ＡＤＣＣの最大傷害活性（Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度１％になるように加えた場合、また自然放出活性（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ）は、エフェクター細胞のかわりに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を加えた場合の放射活性とした。ＡＤＣＣ強度の指標となるＳｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ（％）は、（〔Ｓａｍｐｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ〕−〔Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ〕）／（〔Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ〕−〔Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ〕）ｘ１００として算出した。
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 実施例２２ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞株スキッドマウス肺転移治療モデル）
参考例３６で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体（Ｎｅｃ８−４１１６−８およびＮｅｃ１−５５４−１）の抗腫瘍活性を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞株（ＡＴＣＣより購入）を用いたスキッドマウス肺転移治療モデルにおいて調べた。Ｎｅｃ８−４１１６−８抗体標品は参考例３８、Ｎｅｃ１−５５４−１ ＳＰ３抗体標品は参考例３９に記載の方法によりそれぞれ調製したものを用いた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）培地を用い、１０ｃｍ組織培養シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、炭酸ガス無供給下、３７℃で培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ処理により剥離して得た対数増殖期のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の懸濁液を、遠心分離操作（１，０００ｒｐｍ、３分）を用いてＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３回洗浄した。こうして得た細胞をＨＢＳＳに５ｘ１０６個／ｍＬの密度で再懸濁させた。
日本クレア社より購入したスキッドマウス（Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌ）（５週齢、雌）に上記ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞懸濁液を尾静脈に２００μＬ／個体ずつ接種した。細胞接種後１４日目に、各個体の体重を測定した後、各群の平均体重が均等（約２０ｇ）になるように１群あたり５匹に分けた。Ｎｅｃ１−５５４−１の抗腫瘍活性評価実験では、細胞接種後１４、２１、２８、３５、４２、４９日目に、ＰＢＳで０．３ｍｇ／ｍＬもしくは０．０３ｍｇ／ｍＬに希釈したＮｅｃ１−５５４−１ ＳＰ３溶液、もしくはＰＢＳを１０ｍＬ／ｋｇずつ尾静脈投与した。一方、Ｎｅｃ８−４１１６−８の抗腫瘍活性評価実験では、細胞接種後１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６日目に、ＰＢＳで０．３ｍｇ／ｍＬもしくは０．０３ｍｇ／ｍＬに希釈したＮｅｃ８−４１１６−８溶液、もしくはＰＢＳを１０ｍＬ／ｋｇずつ尾静脈投与した。
Ｎｅｃ１−５５４−１とＮｅｃ８−４１１６−８の抗腫瘍活性は、肺の横隔膜側に生じた癌コロニー数を計測することで評価した。また実験群間の有意差はパラメトリックＤｕｎｎｅｔｔ型多重比較検定（ＳＡＳ前臨床パッケージＶｅｒｓｉｏｎ５．０）を用いて検定した。
Ｎｅｃ１−５５４−１とＮｅｃ８−４１１６−８はいずれの投与濃度でも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の肺での増殖を有意（ｐ＜０．０００１）に抑制した。Ｎｅｃ１−５５４−１投与群とＰＢＳ投与群の癌コロニー数（平均±標準偏差）および両群間の有意差検定値（Ｐ ｖａｌｕｅ）を表３５に、Ｎｅｃ８−４１１６−８投与群とＰＢＳ投与群の癌コロニー数（平均±標準偏差）および両群間のＰ ｖａｌｕｅを表３６に示す。
Figure 2008044754
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実施例２３ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株スキッドマウス皮下移植治療モデル）
参考例３６で作製したＮｅｃ８−４１１６−８およびＮｅｃ１−５５４−１の抗腫瘍活性をＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞株（ＡＴＣＣより購入）を用いたスキッドマウス皮下移植治療モデルにおいて調べた。Ｎｅｃ８−４１１６−８抗体標品は参考例３８、Ｎｅｃ１−５５４−１ ＳＰ３抗体標品は参考例３９に記載の方法によりそれぞれ調製したものを用いた。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）および７．５％重炭酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１／４０容量を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）培地を用い、１０ｃｍ組織培養シャーレ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ処理により剥離して得た対数増殖期のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株懸濁液を、遠心分離操作（１，０００ｒｐｍ、３分）を用いてＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３回洗浄した。こうして得た細胞をＨＢＳＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の等量混合液に再懸濁させ３ｘ１０７個／ｍＬの密度の細胞懸濁液を得た。
日本クレア社より購入したスキッドマウス（Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌ）（５週齢、雌）を１週間馴化飼育した後、上記ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞懸濁液を腹側皮下に１００μＬ／個体ずつ接種した。細胞接種２８日後にＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍塊の長径と短径をノギスで測定し、下記の計算式により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径ｘ（短径）２／２
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を播種した上記スキッドマウスの各個体の体重を測定した後、各群の平均腫瘍塊体積が均等（約１７０ｍｍ３）になるように群分けした。細胞接種後２８、３１、３５、３８、４２日目に、ＰＢＳで３ｍｇ／ｍＬに希釈した上記Ｎｅｃ８−４１１６−８、もしくはＮｅｃ１−５５４−１ ＳＰ３抗体溶液もしくはＰＢＳを１０ｍＬ／ｋｇずつ尾静脈投与し、それと同時に上記の方法により腫瘍体積を測定した。Ｎｅｃ８−４１１６−８およびＮｅｃ１−５５４−１の増殖抑制活性は、薬物投与開始３週間後の腫瘍体積を基に、下記の計算式によりＴ／Ｃ（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／Ｃｏｎｔｒｏｌ）値として算出した。また実験群間の有意差はパラメトリックＤｕｎｎｅｔｔ型多重比較検定（ＳＡＳ前臨床パッケージＶｅｒｓｉｏｎ５．０）を用いて検定した。
Ｔ／Ｃ（％）＝［（抗体投与群における薬物投与開始時からの腫瘍体積の増加量）／（ＰＢＳ投与群における薬物投与開始時からの腫瘍体積の増加量）］ｘ１００
図４に癌細胞株移植後の腫瘍体積平均値の経実的変化を示す。
Ｎｅｃ８−４１１６−８投与群およびＮｅｃ１−５５４−１投与群のＴ／Ｃ値はそれぞれ３９．２％、３８．７％であり、両抗体はいずれもＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株腫瘍の増殖を有意に抑制した（ｐ＜０．０００１）（図４）。
実施例２４ 抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性（ＯＶ−９０卵巣癌細胞株ヌードマウス肝臓転移治療モデル）
参考例３６で作製した抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ヒトモノクローナル抗体（Ｎｅｃ８−４１１６−８）の抗腫瘍活性を、ＯＶ−９０ヒト卵巣癌細胞株（ＡＴＣＣより購入）を用いたヌードマウス肝臓転移治療モデルにおいて調べた。Ｎｅｃ８−４１１６−８抗体標品は参考例３８に記載した方法により調製したものを用いた。ＯＶ−９０細胞株は、ＭＣＤＢ １０５ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ社）を１Ｌの蒸留水に溶解後ｐＨを７．５に調整して無菌ろ過し、次いでこのＭＣＤＢ １０５ Ｍｅｄｉｕｍ ５００ｍＬとＭｅｄｉｕｍ１９９（Ｓｉｇｍａ社）５００ｍＬとを混合し、これにＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）を１５０ｍＬ加えた培地を用い、１５０ｃｍ２培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ処理により剥離して得た対数増殖期のＯＶ−９０細胞株の懸濁液を遠心分離（１，０００ｒｐｍ、３分）により沈殿させたのちＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３回洗浄した。こうして得た細胞をＨＢＳＳに１ｘ１０７個／ｍＬとなるように再懸濁させた。
日本クレア社より購入したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ）（５週齢、雌）をエーテル麻酔下開腹し、脾臓を露出させ、脾臓内に上記ＯＶ−９０細胞懸濁液を１００μＬ／個体ずつ接種した。細胞接種後、肝臓での生着が観測される１４日目以降１週間毎（１４、２１、２８、３５および４２日目）にＰＢＳで３ｍｇ／ｍＬに希釈したＮｅｃ８−４１１６−８を３０ｍｇ／ｋｇとなるように尾静脈内投与した。なお、対照群には生理食塩水を投与した。最終投与の１週間後に２．５％エバンスブルー１ｍＬを尾静脈内に投与し、肝臓を摘出後１０％中性緩衝ホルマリン溶液に浸して固定し、肝臓に転移した癌細胞株の増殖を肉眼的に観察した。
その結果、対照群では肝臓における腫瘍増殖が６例中６例に認められたのに対してＮｅｃ８−４１１６−８投与群では肝臓における腫瘍増殖は６例中１例に認められたに過ぎず、Ｎｅｃ８−４１１６−８は肝臓に生着した癌細胞増殖を顕著に抑制した。
［配列表］
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Claims (47)

  1. 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体。
  2. 配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
  3. ヒトモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
  4. キメラモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
  5. ヒト化モノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
  6. ヒトＩｇＧ１サブクラスに属するモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
  7. 癌細胞増殖阻害活性を有する請求項１記載の抗体。
  8. 抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有する請求項１記載の抗体。
  9. Ｎｅｃｔｉｎ−２／Ｎｅｃｔｉｎ−３またはＮｅｃｔｉｎ−２／Ｎｅｃｔｉｎ−２トランス結合阻害活性を有する請求項１記載の抗体。
  10. 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の、１−３５０番目のアミノ酸配列に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
  11. 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の、４７−１４２番目または１７５−２４０番目のアミノ酸配列に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
  12. 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の、第７５，７６，７７，７８，９５，１３７，１４５，１７３，１８４，１８６及び２１２番目の少なくとも１つのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
  13. 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対して、Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する請求項１記載の抗体。
  14. Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）またはＮｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を認識する請求項１記載の抗体。
  15. 請求項１記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
  16. Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示される請求項１５記載のハイブリドーマ細胞。
  17. 請求項１６記載のハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体。
  18. 組換え型モノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
  19. 抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号：１８４，２００，２１６，２３２，２４８，２６４，２８０および２９６からなる群より選択される配列番号、（ｉｉ）配列番号：１８５，２０１，２１７，２３３，２４９，２６５，２８１および２９７からなる群より選択される配列番号および（ｉｉｉ）配列番号：１８６，２０２，２１８，２３４，２５０，２６６，２８２および２９８からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
  20. 抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉｖ）配列番号：１９２，２０８，２２４，２４０，２５６，２７２，２８８および３０４からなる群より選択される配列番号、（ｖ）配列番号：１９３，２０９，２２５，２４１，２５７，２７３，２８９および３０５からなる群より選択される配列番号および（ｖｉ）配列番号：１９４，２１０，２２６，２４２，２５８，２７４，２９０および３０６からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
  21. 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体を含有してなる診断剤。
  22. 癌の診断剤である請求項２１記載の診断剤。
  23. 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体を含有してなる医薬。
  24. 癌の予防・治療剤である請求項２３記載の医薬。
  25. 癌細胞のアポトーシス促進剤である請求項２３記載の医薬。
  26. 癌細胞の増殖阻害剤である請求項２３記載の医薬。
  27. 抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤である請求項２３記載の医薬。
  28. 哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
  29. 哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進方法。
  30. 哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
  31. 哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与することを特徴とする、抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害方法。
  32. 癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の使用。
  33. 癌細胞のアポトーシス促進剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の使用。
  34. 癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の使用。
  35. 抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の使用。
  36. Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）、またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤。
  37. Ｎｅｃ１−８０３−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１７）、Ｎｅｃ１−２４４−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２３）、Ｎｅｃ１−５３０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２４）、Ｎｅｃ１−９０３−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２５）、Ｎｅｃ１−５２０−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２６）、Ｎｅｃ１−８４５−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２７）、Ｎｅｃ１−８３４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４２８）、Ｎｅｃ１−９６４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８３）、Ｎｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）、Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）、Ｎｅｃ１−７６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８２）、またはＮｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体とＮｅｃｔｉｎ−２に対して競合的に結合するモノクローナル抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤。
  38. Ｎｅｃ１−５５４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８１）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体とＮｅｃｔｉｎ−２に対して競合的に結合するモノクローナル抗体が、Ｎｅｃ１−１０４４−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０５）またはＮｅｃ１−１３０２−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８４）である請求項３７記載の乳癌の予防または治療剤。
  39. Ｎｅｃ８−４１１６−８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６８５）で表示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体とＮｅｃｔｉｎ−２に対して競合的に結合するモノクローナル抗体が、Ｎｅｃ８−３７０４−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０７）またはＮｅｃ８−３５１７−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０６）である請求項３７記載の乳癌の予防または治療剤。
  40. 抗体のＦｃ領域を介した生体防御機構を利用するものである請求項３６から３９のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
  41. 抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号：１８４，２００，２１６，２３２，２４８，２６４，２８０および２９６からなる群より選択される配列番号、（ｉｉ）配列番号：１８５，２０１，２１７，２３３，２４９，２６５，２８１および２９７からなる群より選択される配列番号および（ｉｉｉ）配列番号：１８６，２０２，２１８，２３４，２５０，２６６，２８２および２９８からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤。
  42. 抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉｖ）配列番号：１９２，２０８，２２４，２４０，２５６，２７２，２８８および３０４からなる群より選択される配列番号、（ｖ）配列番号：１９３，２０９，２２５，２４１，２５７，２７３，２８９および３０５からなる群より選択される配列番号および（ｖｉ）配列番号：１９４，２１０，２２６，２４２，２５８，２７４，２９０および３０６からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤。
  43. 抗体重鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号：１８４，２００，２１６，２３２，２４８，２６４，２８０および２９６からなる群より選択される配列番号、（ｉｉ）配列番号：１８５，２０１，２１７，２３３，２４９，２６５，２８１および２９７からなる群より選択される配列番号および（ｉｉｉ）配列番号：１８６，２０２，２１８，２３４，２５０，２６６，２８２および２９８からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、抗体軽鎖可変領域の第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉｖ）配列番号：１９２，２０８，２２４，２４０，２５６，２７２，２８８および３０４からなる群より選択される配列番号、（ｖ）配列番号：１９３，２０９，２２５，２４１，２５７，２７３，２８９および３０５からなる群より選択される配列番号および（ｖｉ）配列番号：１９４，２１０，２２６，２４２，２５８，２７４，２９０および３０６からなる群より選択される配列番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、及び抗体定常領域含む抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤。
  44. Ｎｅｃ１−１０４４−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０５）、Ｎｅｃ８−３５１７−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０６）またはＮｅｃ８−３７０４−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０７）で表示されるハイブリドーマ細胞。
  45. 請求項４４に記載のハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体。
  46. Ｎｅｃ１−１０４４−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０５）、Ｎｅｃ８−３５１７−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０６）またはＮｅｃ８−３７０４−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０７）で表示されるハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合するモノクローナル抗体。
  47. 請求項４５または４６に記載のモノクローナル抗体を含有してなる、乳癌の予防または治療剤。
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