TW200823235A - Prophylactic and therapeutic agent for cancers - Google Patents

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Shuji Sato
Tsutomu Oshima
Tomofumi Kurokawa
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Takeda Pharmaceutical
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Description

200823235 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於針對Nectin-2之單株抗體之用途，具體 雨言，用作癌之預防及治療劑、癌細胞之凋亡促進劑、癌 細胞之增殖阻礙劑及利用經由抗體Fc區域之活體防禦機 制之癌細胞阻礙劑等。 【先前技術】 對於癌，預期可藉由基因之微陣列圖譜數據 • (microarray profiling data)評價其病態，實際上已報告可藉 由白血病之基因表現剖析將白血病分類。再者，藉由查明 各個癌組織之基因表現圖譜及累積其分類，可以預測對於 特定癌治療法之反應性或發現對於特定癌之新創藥物標靶 蛋白質。具體而言，觀察到某種癌中某種蛋白質之表現亢 進時，對於新近被診斷為抗原陽性之患者，可以藉由：⑴ 使該蛋白質之表現量降低，(ii)阻礙該蛋白質之機能，（iii) I使宿主對於該蛋白質之免疫回應明顯化等方法導入抗腫瘤 活性。同時，對於被診斷為抗原陰性之患者，則迅速替換 成其他的治療法等，而不用擔心對患者造成無用的負擔。 如上述之表現圖譜解析，可以期待對於癌之分子診斷及分 子標的治療藥之開發有重大貢獻。
Nectin-2 a 基因（RefSeq 登錄號碼 NM—002856)及 Nectin-25 基因（EMBL登錄號碼X80038)係從人類白血 病細胞株TF · 1之cDNA選殖而得之基因，其分別編碼包 括479個胺基酸及538個胺基酸之蛋白質（RefSeq登錄號 6 319597 200823235 碼 NP—002847 及 EMBL 登錄號碼 CAA56342)aNectin-23 基因係Nectin-2 α基因之勇接變異體（splicing variants)， Nectin-2 5基因所編碼之蛋白質雖含有相當於Nectin-2 α 基因所編碼之蛋白質之第1號至第350號胺基酸序列之胺 基酸序列，但從351號至C末端侧之胺基酸序列則與 Nectin-2 α 不同。再者，將在 Nectin-2 α 基因及 Nectin-2 (5 基因方面呈現類似性（homology)之小鼠基因（GenBank登 錄號碼BC009088及RefSeq登錄號碼NM_〇〇8990)從來 •自小鼠ES細胞之基因庫選殖，此等基因分別編碼包括467 個胺基酸及530個胺基酸之蛋白質（GenBank登錄號碼 AAH09088及RefSeq登錄號碼NP_033016)。此等小鼠 Nectin-2基因，若與人類Nectin-2a基因及Rectin-23基因 比對，就鹼基序列而言分別具有約72%及約72%之類似 性，就胺基酸序列而言，分別具有約69°/。及約73%之類似 性（homology)。Nectin-2 a 及 Nectin-2 5 (以下總稱為 • Nectin-2)係蛋白質分子，具有 PVRL2、PRR2、PVRR2、 HveB、CD112 等不同名字，屬於由 Nectin-1、Nectin-2、 Nectin-3及Nectin-4四個成員所構成之Nectin家族。Nectin 家族（以下，有時亦將其總稱為Nectin)。再者，就具有Nectin 樣構造之膜蛋白質而言，已有知NecM、Necl-2、Necl-3、 Necl-4 及 Necl-5(J· Biol· Chemu(2004)，279(17)，ρ18015· pl8025)。
Nectin屬於免疫球蛋白超級家族，係在細胞外區域具 有3個免疫球蛋白樣環之一次膜貫通型糖蛋白質。Nectin 7 319597 200823235 分子在細胞膜上形成順式二聚體，在鄰接細胞之細胞膜上 之順式二聚體彼此藉由反式結合，而以與Ca+2濃度無關之 方式控制上皮細胞彼此之細胞間接著，或者Sertoli細胞與 精子細胞之細胞間接著（蛋白質核酸酵素（2003)，48(2)， pl05-pll2; Curr· Biol.(2002)，12, pll45_pll50)。再者，有 關於Nectin-1及Nectin-3藉由反式結合形成神經突觸之報 告（J· Cell Biol.(2002)，156, p555_p565)。已知雖然在相同 分子間以親同種抗原（homophylic)之方式形成Nectin之反 Φ 式鍵結，但是在 Nectin-Ι 與 Nectin-3、Nectin-l 與 Nectin-4、 Nectin_2與Nectin_3以及Nectin-3與Necl-5之間亦可形成 親異種抗原性（heterophylic)反式結合（J· Biol· Chem.(2002)， 277(30)，ρ27006-ρ270Π)。再者，已知 Nectin 在細胞内之· C末端區域結合於afadin，經由該分子連結於肌動蛋白細 胞骨架（J· Cell Sci.(2003)，l 16(1)，pi7-p27)。 關於細胞接著以外之Nectin之生理機能，已報告，例 I如，Nectin-Ι係作為在疱疹病毒上表現之糖蛋白D之受 體，且有疱疹病毒侵入細胞時作為立足點之機能（J· Cell Sci.(2003)，116(1)，pl7_p27)。又，Nectin-2 係在天然殺手 細胞上表現之DNAM-1 (CD 226)之配體（ligand)之一，研判 表現DNAM-1之天然殺手細胞以表現於標的細胞上之 Nectin-2作為立足點而發揮細胞毒殺活性（J· Exp. Med.(2003)，198(4)，ρ557·ρ567)。此外，對於 Nectin-2，已 有下列報告：係參與癌阻礙基因p53路徑之基因之一（W0 02/99040號公報）；係結合於可用在血管新生疾病、癌.、'病 8 319597 200823235 毒感染之治療之蛋白質Nectin-3之蛋白質（WO 02/ 28902 號公報）；參與病毒感染之受體（WO 99/63063.號公報）；係 可用於乳癌及卵巢癌之診斷及治療之基因之一（WO 02/00677號公報）；係在各種癌中之表現亢進且有希望作為 抗腫瘤性抗體醫藥之標的之16種基因之一（WO 03/088808 號公報）；以及係在癌組織中表現宄進而有希望用於癌之診 斷及預防之基因之一（WO 04/030615號公報）。已有報告作 為於癌組織表現顯著增加的基因，發現為Nectin-2基因， •且該基因的反義寡核苷酸促進癌細胞的細胞祠亡 (apoptosis)(WO 2005/097204 號公報）。 就針對Nectin-2之單株抗體而言，雖已報告針對人類 Nectin-2 之小鼠（mouse)或大鼠（rat)單株抗體（Blood (1998)， 92(12), p4602-p4611; J. ViroL(2000)74(3)p 1267-pl 274;
Inti. ImmunoL(2004)l 6(4), p533-p53 8; Mol. Immunol.
(2005)42vp463-p469; JEM(2003)198(4>? p557-p567; ViroL 鲁（1998)246, pl79-pl89; J· Virol.(2001)75(2)plll85-plll95; FEBS(2005)579，p2243-p2249)、針對小鼠 Nectin-2 之單株 抗體（J· Virol.(2001)75(2)plll85-plll95; JBC(2001)276, p48350-p48355; Oncogene(l 999)18, pl609-pl617; JCB (1999)145, p539-p549; Exp. Cell Res.(1997)235? p374-84)，但未記載有關此等抗體對癌細胞之增殖阻礙活性。 【發明内容】 目前之抗癌劑均伴隨副作用，因此殷切期望在臨床醫 療上特異性作用於癌細胞，對正常組織之影響小，僅誘發 9 319597 200823235 癌細胞之增殖阻礙之安全性藥劑。 本發明者為了解決上述課題，反覆深入研究的結果， 發現Nectin-2基因為在癌組織中表現顯著增加之基因，亦 發現該基因之反義寡核苦酸促進癌細胞之 >周亡。再者，成 功製作針對Nectin-2之單株抗體，且發現該單株抗體具有 優異之癌細胞增殖阻礙活性。本發明者基於此等認知反覆 檢討，結果完成本發明。 亦即，本發明係關於： 鲁[1] 一種單株抗體，其針對含有與序列編號：l(Nectin_2 α ) 或序列編號：3(Nectin-2 5)所示之胺基酸序列同一或 實質同一之胺基酸序列之蛋白質或其部分肽或其鹽。 [2] 如[1]記載之單株抗體，其針對含有序列編號： 3(Nectin-2占）所示之胺基酸序列之蛋白質或其部分 肽或其鹽。 [3] 如[1]記載之抗體，其係人類單株抗體。 φ [4] 如[1]記載之抗體，其係嵌合（chimeric)單株抗體。 [5] 如[1]記載之抗體，其係人類化（111111^11匕6(1)單株抗體。 [6] 如[1]記載之抗體，其係抗體之怪定區域（constant region)屬於人類IgG!亞群之單株抗體。 [7] 如[1]記載之抗體，其具有癌細胞增殖阻礙活性。 [8] 如[1]記載之抗體，其具有抗體依存性細胞毒殺活性 (ADCC : Antibody-dependent cellular cytotoxicity) 〇 [9] 如[1]記截之抗體，其具有Nectin_2/Nectin-3或
Nectin-2/Nectin-2反式結合阻礙活性。 〜 ' 10 319597 200823235 [10] 如[1]記載之抗體，其係能識別存在於序列編號： l(Nectin-2 α )或序列編號3(Nectin-2 (5 )所示胺基酸序 列之第1至350號（細胞外區域）之胺基酸序列之抗原 決定基（epitope)之單株抗體。 [11] 如[1]記載之抗體，其係能識別存在於序列編號： l(Nectin-2 α )或序列編號3(Nectin-2 (5 )所示胺基酸序 列之第47至142號(第一 IG樣結構威（domain))或第 175至240號（第二IG樣結構域）之胺基酸序列之抗原 • 決定部位之單株抗體。 [12] 如[1]記載之抗體，其係能識別包含序列編號： l(Nectin-2 α )或序列編號3(Nectin-2占）所示胺基酸序 列之第 75、76、77、78、95、137、145、173、184, 186及212號中之至少一個胺基酸殘基之胺基酸序列 之單株抗體。 [13] 如[1]記載之抗體，其中，對於含有與序列編號：1或 φ 序列編號：3所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺
基酸序列之蛋白質或其部分肽或其鹽，該抗體會與下 列所示之融合瘤細胞產生之單株抗體競爭性結合於 其上：Necl-803-2(FERM BP-10417)、Necl-244-3 (FERM BP- 10423)、Necl-530-l(FERM BP-10424)、 Necl-903-l(FERM BP-10425) ^ Neel-520-1 (FERM BP-10426)、Neel_845-2(FERM BP-10427)、Neel-834-1 (FERM BP-10428)、Neel· 964-l(FERM ABP-10683)、 Necl-1302-2(FERM ABP- 10684)、NecK554-l(FERM 11 319597 200823235 ABP-10681)、Necl-769-2(FERM ABP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM ABP-10685)。
[14] 如[1]記載之抗體，其能識別與Necl-803_2(FERM BP-10417)、Necl-244-3(FERM BP.10423)、Necl-530睡 1(FERM BP-10424)、Necl-903-l(FERM BP-10425)、 Necl-520-l(FERM BP-10426) - Necl-845-2(FERM BP-10427) > Necl-834-l(FERM BP-10428) > Necl-964-1 (FERM ABP-10683) 、Neel-1302-2(FERM ABP- 10684) > Necl-554- 1(FERM ABP-10681) > Necl-769-2 (FERM ABP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM ABP酿 10685) 所示之融合瘤細胞產生之單株抗體所識別之胺基酸 序列同一或實質同一 < 胺基酸序列。 [15] —種融合瘤細胞，其能產生如[1]記載之抗體。 [16] 如[15]記載之融合瘤細胞，其係以Necl-803-2(FERM BP-10417) ^ Necl-244-3(FERM BP-10423) ^ Necl-530-1(FERM BP-10424) ^ Necl-903-1 (FERM BP-10425) > Necl-520-l(FERM BP-10426) > Necl-845-2(FERM BP-10427) > Necl-834-l(FERM BP-10428) > Necl-964-1 (FERM ABP-10683)、Necl-1302_2(FERM ABP-10684)、Necl-554-l(FERM ABP-10681)、Necl-769-2 (FERM ABP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM ABP-10685) 表示。 [17] —種單株抗體，其係由如[16]記載之融合瘤細胞所產 生〇 ; - 12 319597 200823235 [18] 如[1]記載之抗體，其係重組型單株抗體。 [19] 如[1]記载之抗體，其中，抗體重鏈可變區域之第一互 補性決疋區域（CDR1)、第二互補性決定區域（cdr2) 及弟二互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與⑴選自序列編號：184、200、216、232、24*8、 264、280及296所成群組中之序列編號，（Η)選自序 列編號：185、、217、233、249、265、281 及 297 所成群組中之序列編號以及（iii)選自序列編號：186、 > 202、218、234、250、266、282 及 298 所成群組中之 序列編號所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基 酸序列。 ^ B [19 a]如[19] §己載之抗體’其中’抗體重鍵可變區域之第一 互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：184、序列編號：185及序列編號：186 | 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [19b]如[19]記載之抗體，其中，抗體重鏈可變區域之第一 互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號·· 200、序列編號：201及序列編號：2〇2 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [19c]如[19]記載之抗體，其中，抗體重鏈可變區域之第一 互補性決定區蟑（CDRL)、第二互補性決定區域（CDR2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 13 319597 200823235 含與序列編號：216、序列編號：217及序列編號：21 8 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [19d]如[19]記載之抗體，其中，抗體重鏈可變區域之第一 互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域（CdR2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號· 2 3 2、序列編號：2 3 3及序列編號：2 3 4 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [19e]如[19]記載之抗體’其中，抗體重鍵可變區域之第一 互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域（Cdr2) 及第二互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：248、序列編號：249及序列編號·· 250 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [19f]如[19]記載之抗體，其中，抗體重鏈可變區域之第一 互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域（cdr2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：264、序列編號：265及序列編號：266 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [19g]如[19]記載之抗體，其中，抗體重鏈可變區域之第一 互補性決疋區域（CDR1)、第二互補性決定區域（cdr2) 及第二互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：280、序列編號：281及序列編號：282 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [19h]如[19]記載之抗體，其中，抗體重鏈可變區域之第一 互補性决疋區域（CORl·)、弟二互補性決定區域（cdr2) 319597 14 200823235 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：296、序列編號：297及序列編號：298 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [，20]如[1]記載之抗體，其中，抗體重鏈可變區域之第一互 補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2) 及弟二互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與（iv)選自序列編號：192、208、224、240、256、 272、288及304所成群組中之序列編號，（V)選自序 歹丨J 編號：193、209、225、241、257、273、289 及 305 所成群組中之序列編號，（vi)選自序列編號：194、 210、226、242、258、274、290 及 306 所成群組中之 序列編號所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基 酸序列。 [20a]如[20]記載之抗體，其中，抗體輕鏈可變區域之第一 互補性決定區域（CDR1)、第二互補性:決定區域（cdr2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：192、序列編號：193及序列編號：194 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [20b]如[20]記載之抗體，其中，抗體輕鏈可變區域之第一 互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：208、序列編號：209及序列編號：21〇 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [20c]如[20]記載之抗體”其中，抗體輕鏈可變區域之第一 319597 15 200823235 互補性決定區域（CDRl)、第二互補性決定區域（CDR2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：224、序列編號：225及序列編號：226 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [20d]如[20]記載之抗體，其中，抗體輕鏈可變區域之第一 互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2) 及弟二互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：240、序列編號：241及序列編號：242 • 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [20e]如[20]記载之抗體，其中，抗體輕鏈可變區域之第一 互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之联基酸序列分別包 含與序列編號：256、序列編號：257及序列編號：258 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [20f]如[20]記載之抗體，其中，抗體輕鏈可變區域之第一 _ 互補性決定區域(CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：272、序列編號·· 273及序列編號：274 所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [20g]如[20]記载之抗體，其中，抗體輕鏈可變區域之第一 互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域(CDR2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：288、序列編號：289及序列編號·· 290 ，所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 319597 16 200823235 [20h]如[20]記載之抗體，其中，抗體輕鏈可變區域之第一 互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2) 及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分別包 含與序列編號：304、序列編號：305及序列編號：306 所不之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [21] —種診斷劑’其包括：針對含有與序列編號·· 1或序 列編號：3所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基 酸序列之蛋白質或其部分肽或其鹽之單株抗體。
[22] 如[21] δ己載之診斷劑，其係癌之診斷劑。 [23] 一種醫藥，其包括：針對含有與序列編號：1或序列 編號：3所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸 序列之蛋白質或其部分肽或其鹽之單株抗體。 [24] 如[23；U己載之醫藥，其係癌之預防及治療劑。 [25] 如[23]記載之醫藥，其係癌細胞之祠亡促進劑。 [26] 如[23] δ己載之㈣，其係癌細胞之增殖阻礙劑。 [27] 如[23μ己載之醫藥，其係利用經由抗體k區域之活體 防S機制之癌細胞阻礙劑。 [28] —種癌之預防及治底士、+ # 療方法，其特徵為：對於哺乳動 物，投與有效量之針對人女 針對含有與序列編號：1或序列編 戶斤不之胺基酸序列同—或實質同一之 列之蛋白質或其部分肽或翻之單株抗體。序 [29] —種癌細胞之凋亡促 .沪叙古4曰疋進方去，其特徵為：對於哺乳動 物，才又與有效1之針對合 ^ 0 了 3有與序列編號：1或序列编 说· 3所示之胺基酸岸I 扇 斤列同_或實質同一之胺基酸序 319597 17 200823235 列之蛋白質或其部分肽或其鹽之單株抗體。 _ -㈣細胞之增额财法，其特徵為：對於嗜乳動 2 &與有效1之針對含有與序列編號：1或序列編 號1所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序 歹,之虫白質或其部分肽或其鹽之單株抗體。 間二㈣i用經由抗體之Fc區域介導之身體防紫機構之 二也阻礙方法，其特徵為：對於哺乳動物，投盘有 對含有與序列編號：1或序列編號：3所示 之^^基酸序列同_ *每所pi 所 J J或貝貝同一之胺基酸序列之蛋白 貝或部分肽或其鹽之單株抗體。 [32] =針對含有與序列編號：i或序列編號：3所示之 序列同-或實質同-之胺基酸序列之蛋白質 {分肽或其鹽之單株抗體之用途，其係用於製造 癌之預防及治療劑。 [33] 一種針對含有與序列編號：1或序列編號：3所干之 • 序列同-或實質同-之胺基酸序列之蛋白質 癌細胞之调亡促進劑。述其係用於製造 [34] 、種針對含有與序列編號：^或序列編號：3所示之 Π或貝貝同一之胺基酸序列之蛋白質 細單株抗體之用途’其係用於製造 [35] -種針對含有與序列編號：ι或序列-之 胺基酸序列同-或實質同-之胺基酸序列 319597 18 200823235 或其部分肽或其鹽之單株抗體之用途，其係用於製造 利用經由抗體Fc區域之活體防禦機制之癌細胞阻礙 劑。 [36] —種乳癌之預防或治療劑，其係含有以Neel-803-2 (FERM BP-10417)、Necl-244-3(FERM BP-10423)、 Necl-530-l(FERM BP-10424) 、Neel-903-1 (FERM BP-10425)^ Neel-520-1 (FERM BP-10426)> Neel-845-2 (FERM BP-10427)、Necl-834-l(FERM BP-10428)、 Necl-964-l(FERM BP-10683) > Necl-1302-2(FERM BP-10684)、Neel-554· 1(FERM BP-10681)、Nec 1-769-2 (FERM BP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所 示之融合瘤細胞產生的單株抗體。 [37] —種乳癌之預防或治療劑，其係含有與以Necl-803-2 (FERM BP-10417)、Necl-244-3(FERM BP-10423)、 Necl-530-l(FERM BP-10424)、Necl-903-l(FERM BP-10425)、Neel-52(M(FERM BP-10426)、Neel-845-2 (FERM BP-10427)、Necl-834-l(FERM BIM0428)、 Necl-964-l(FERM BP-10683) > Necl-1302-2(FERM BP-10684)-Neel-554-1(FERM BP-10681)> Neel-769-2 (FERM BP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所 示之融合瘤細胞產生的單株抗體，針對Nectin-2為競 爭性結合的單株抗體。 [3 8]如上述[37]之乳癌之預防或治療劑，其中，與以 Necl<554_l(FERMBP-10681)所示之融合瘤細胞產生 19 319597 200823235 的單株抗體，針對Nectin_2為競爭性結合的單株抗體 為 Necl-1044_4(FERM ABP-10805)或 Necl-1032-2 (FERM BP-10684) 〇 [39]如上述[37]之乳癌之預防或治療劑，其中，與以 Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所示之融合瘤細胞產 生的單株抗體，針對Nectin_2為競爭性結合的單株抗 體為 Nec8-3704-7(FERM ABP-10807)或 Nec8-3517-ll (FERM ABP_10806)。 _ [40]如上述[36]或[37]之乳癌之預防或治療劑，係利用經 由抗體之Fc區域的活體防禦機制。 [41] 一種乳癌之預防或治療劑，係含有抗體所成者，該抗 體包含抗體重鏈可變區域之第一互補性決定區域 (CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2)及第三互補性 決定區域（CDR3)之胺基酸序列，分別與⑴選自序列編 號：184 、 200 、 216 、 232 、 248 、 264 、 280 及 296 所 0 成組群中之序列編號，（ii)選自序列編號·· 185、201、 217、233、249、265、281及297所成組群中之序列 編號以及（iii) 選自序列編號：186、202、218、234、 250、266、282及298所成組群中之序列編號所示之 胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [42] —種乳癌之預防或治療劑，係含有抗體所成者，該抗 體包含抗體輕鏈可變區域之第一互補性決定區域 (CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2)及第三互補性 決定區域（CDR3)之胺基酸序列，分別與（iv)選自序列 20 319597 200823235 編號：192、208、224、240、256、272、288 及 304 所成組群中之序列編號，（V)選自序列編號：193、209、 225、241、257、273、289及305所成組群中之序列 編號，（vi)選自序列編號：194、210、226、242、258、 274、290及306所成組群中之序列編號所示之胺基酸 序列同一或實質同一之胺基酸序列。 [43] —種乳癌之預防或治療劑，係含有抗體所成者，該抗 體包含抗體重鏈可變區域之第一互補性決定區域 (CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2)及第三互補性 決定區域（CDR3)之胺基酸序列，分別與⑴選自序列編 號：184、200、216、232、248、264、280 及 296 所 成組群中之序列編號，（ii)選自序列編號：185、201、 217、233、249、265、281及297所成組群中之序列 編號以及（iii) 選自序列編號：186、202、218、234、 250、266、282及298所成組群中之序列編號所示之 胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列；抗體輕鏈 可變區域之第一互補性決定區域（CDR1)、第二互補性 決定區域（CDR2)及弟二互補性決定區域（CDR3)之胺 基酸序列，分別與（iv)選自序列編號：192、208、224、 240、256、272、288及304所成組群中之序列編號， (V)選自序歹，j 編號：193、209、225、241、257、273、 289及305所成組群中之序列編號，（vi)選自序列編 號:194 、 210 、 226 、 242 、 258 、 274 、 290 及 306 所 成組君f中乏序列編號所示之胺基酸序列同一或實質 21 319597 200823235 同一之胺基酸序列；以及抗體恆定區域。 [44] 一種融合瘤細胞，係以Necl-1044-4(FERMABP-10805)、Nec8-3517-11(FERM ABP-10806)或 Nec8-3704-7(FERMABP-10807)所表示者。 [45] —種單株抗體，係由上述[44]之融合瘤細胞所產生者。 [46] —種單株抗體，係與以 Necl-1044-4(FERM ABP-10805)、Nec8-3517-11(FERM ABP-10806)或 Nec8-3704-7(卩£尺]^[人3?-10807)所示之融合瘤細胞產生的 單株抗體為競爭性結合的單株抗體。 [47] —種乳癌之預防或治療劑，係含有上述[45]或[46]之 單株抗體所成者。 [48] —種乳癌之預防或治療劑，係含有抗體所成者，該抗 體與包含下述之抗體為競爭性結合：抗體重鍵可變區 域之第一互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區 域（CDR2)及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序 列分別與⑴選自序列編號：184、200、216、232、248、 264、280及296所成組群中之序列編號，（ii)選自序 列編號：185、2(U、217、233、249、265、281 及 297 所成組群中之序列編號以及（iii)選自序列編號：186、 202、218、234、250、266、282 及 298 所成組群中之 序列編號所不之胺基酸序列。 [49] 一種乳癌之預防或治療劑，係含有抗體所成者，該抗 體與包含下述之抗體為競爭性結合：抗體輕鏈可變區 域之第一互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區 22 319597 200823235 域（CDR2)及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序 歹4 ，分另4 自序歹編號：192、208、224、240、 256、272、288及304所成組群中之序列編號，（v)選 自序歹，J 編號：193、209、225、241、257、273、289 及305所成組群中之序列編號，（vi)選自序列編號： 194、210、226、242、258、274、290 及 306 所成組 群中之序列編號所示之胺基酸序列。 [50] —種乳癌之預防或治療劑，係含有抗體所成者，該抗 • 體與包含下述之抗體為競爭性結合：抗體重鏈可變區 域之第一互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區 域（CDR2)及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序 列分別與（i)選自序列編號：184、200、216、232.、248、 264、280及296所成組群中之序列編號，（ii)選自序 列編號：185、201、217、233、249、265、281 及 297 所成組群中之序列編號以及（iii)選自序列編號：186、 • 202、218、234、250、266、282 及 298 所成組群中之 序列編號所示之胺基酸序列；抗體輕鏈可變區域之第 一互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域 (CDR2)及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序 列，分別與（iv)選自序列編號：192、208、224、240、 256、272、288及304所成組群中之序列編號，（v)選 自序列編號：193、209、225、241、257、273、289 及305所成組群中之序列編號，(vi)選自序列編號： 、194、210、226、242、258、274、290 及 306 所成組 23 319597 200823235 群中之序列編號所示之胺基酸序列；以及抗體恆 域。 針對含有與序列編號：1或序列編號：3所示之胺基酸 序列同一或實質同一之胺基酸序列之蛋白質或其部分肤或 其鹽之f株抗體可安全地使㈣為癌（例如大腸癌、乳癌、 肺癌、則列腺癌、食道癌、胃癌、肝臟癌、膽道癌、脾臟 癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、 胰臟癌、腦腫瘤、血癌等）之預防及治療劑（較佳為乳癌山、 •肺癌、大腸癌、前列腺癌、印巢癌、胰臟癌等之預防及治 療劑）、癌細胞之凋亡促進劑、癌細胞之增殖阻礙劑、癌^ 胞之細胞週期變化之誘發劑、利用經由抗體Fe區域之活體 防禦機制之癌細胞阻磷劑、.抗體依存性癌細胞毒殺劑等。 【實施方式】 '
含有與序列編號：1所示之胺基酸序列同一或實質同 一之胺基酸序列之蛋白質（以下簡稱為Nectin_2a)或含有與 _序列編號：3所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸 序列之蛋白質（以下簡稱為Nectin-25)(以下，有時將二者合 稱為Nectin-2或本發明蛋白質）可為來自溫血動物（例如土 撥鼠、大鼠（rat)、小鼠（mouse)、雞、兔子、豬、羊、牛、 狼子4 )之細胞[例如肝細胞、脾細胞、神經細胞、神經膠 質細胞、胰臟冷細胞、骨髓細胞、血管系膜（mesangium) 細胞、朗格漢細胞（Langerhans cell)、表皮細胞、上皮細胞、 杯細胞、内皮細胞、平滑肌細胞、纖維母細胞、纖維細胞、 肌細胞、脂肪細胞、‘免疫鈿胞（例如巨噬細胞、τ _細胞、B 319597 200823235 細胞、天然殺手細胞、肥胖細胞、嗜中性白血球、嗜鹼性 球、嗜酸性球、單核球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、 骨細胞、骨母細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞或間質 細胞，或者此等細胞之前驅細胞、幹細胞或癌細胞等]，或 存在有此等細胞之組織[例如腦、腦之各部位（例如嗅球、 扁桃核、大腦基底球、海馬、視丘、下視丘、大腦皮質、 延髓、小腦）、脊髓、下垂體、胃、胰臟、腎臟、肝臟、生 殖腺甲狀腺、膽囊、骨髓、副腎、皮膚、肌肉、肺、消 化官（例如大腸、小腸）、血管、心臟、胸腺、脾臟、顎下 腺、周邊血液、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤、子宮、骨、 關節、骨骼肌等]之蛋白質，亦可為合成蛋白質。 就與序列編號：1或序列編號：3所示之胺基酸序列實 質同一之胺基酸序列而言，可列舉與序列編號：丨或序列 編號· 3所示之胺基酸序列具有約5〇%以上（較佳為約 以上，更佳為約70%以上，進一步更佳為約8〇%，再進一 #步更佳為約90%，特佳為約95%以上）之類似性（h〇m〇i〇㈣ 之胺基酸序列。 —就3有與序列編號··〗或序列編號·· 3所示之胺基酸序 列貫質同-之胺基酸序列之蛋白質而言，例如以含有與序 列編號：1或序列編號：3所示之胺基酸序列實質同一之胺 基酸序歹卜且具有與含有序列編號·· 1或序列編號：3所示 之月女序列之蛋白質實質同質活性之蛋白質等為較佳。 ㊣基g夂序列之類似性，可使用類似性計算演算法N⑽ (National Center f〇r Biotechnology Information 319597 25 200823235
Basic L0cal Alignment Search T〇〇I) , 〇，允許間隙（gap)，·矩陣=BLOSUM62;過遽=〇ff)計算。 所謂實質同質，表示此等性質在性質（例如生理學^ 理學）上為同質。因此，本發明蛋白質 ^ 4知月a白貝之活性雖以同 如約0.01至100倍’較佳為約01至1〇倍，更佳為〇 5 至2倍）為較佳，但此等活性之程度、蛋白質之分子量等旦 之要素可以不同。、里
Neet.2亦包括，例如，含有下述⑴至⑺胺基酸序列 •之蛋白質等所謂的突變蛋白⑽㈣：⑴序列編號：！或序 列編號·· 3所示之胺基酸序列中之i或2個以上（例如約i 至50個，較佳為約丨至3〇個，更佳為約〗至⑺個，再更 ，為約數個（1至5))胺基酸缺失之胺基酸序列；⑴)序列編 唬·1或序列編號：3所示之胺基酸序列中附加 個以上（例如約i至50個，較佳為約i至3〇個，更佳^約 1.至10個，再更佳為約數個（1至5))胺基酸之胺基酸序列，· 鲁（111)序列編號：1或序列編號：3所示之胺基酸序列中插入 有1或2個以上（例如約i至50個，較佳為約工至個， 更佳為約1至10個，再更佳為約數個（1至5))胺基酸之胺 基酸序列；（W)序列編號：丨或序列編號：3所示之胺基酸 序列中之1或2個以上（例如約1至5〇個，較佳為約1至 30個，更佳為約！至1〇個，再更佳為約數個（1至胺基 酸被其他胺基酸置換而成之胺基酸序列；或（v)將此等組合 而成之胺基酸序列。 如上述在胺.基酸序列有插入、缺失或置換之情況，對 319597 26 200823235 於該插人、缺失或置換之位置無特殊限定。 本说明書中之蛋白質，依昭& _
、肽榇纪之慣例，左端為N 末端（胺基末端），右端為C末端齡末端）。就以含有序 列編號：1所Μ胺基酸相之蛋白質為首之本發明所用 之虫白貝* 5，C末端可為鲮基(_c〇〇H)、羧酸根(―⑺、 醯胺（-CONH2)或醋(-COOR)之任—者。 在本文中’就醋中之R而言，可使用如甲基、乙基、 =丙基、異丙基、正丁基等c16垸基；如環戊基、環己基 專CW展烧基；如苯基、α_萘基等c“2芳基，·如节基、苯 =基等苯基-CW完基或如α萘基甲基等α·蔡基心2燒 基，二甲基乙醯氧曱基等。 在細in_2 t，C末端以外具有縣（或幾根基）時， 羧基經醯化或醋化者亦包含於本發明所使用之Neciin_2 中。此時之酯可使用上.述C末端之酯等。 者在Nectin 2中，N末端之胺基酸殘基（例如甲硫 參ϋ文殘基）之胺基包括經保護基（例如甲醯基、乙醯基等Cw 烷醒基等之C6酿基等)保護者、在身體内將被切斷而生成 N末端之麵醯胺酸殘基經焦麵胺酸化者、分子内之胺基酸 侧鏈^之取代基（例如.、SH、胺基"米峻基、十朵基、 j基等）經適當保護基（例如f醯基、乙酸基等烧酸基 等之C〗_6醯基）保護者、或結合糖鏈之所謂糖蛋白質等之複 合蛋白質等。 就Nectin-2之具體例而言，可列舉如含有序列編號: 所示之胺基酸序列之蛋白質（Nectin_2a)、含有序列編號、 319597 27 200823235 3所示之胺基酸序列之蛋白質（Nectin-2S)等。
Nectm-2之部分肽，可為上述之Nectin_2之部分肽，較 佳為與上述之Nectin-2之部分肽具有同樣性質者之任一者^ 舉例s之’可以使用具有^^以匕^之構成胺基酸序列 中之至少20個以上（較佳為5〇個以上，更佳為川個以上， 進一步更佳為100個以上，最佳為2〇〇個以上）胺基酸序列 之肽。 #者，本發明所用之―2之部分肽，可為該胺基 •酸序列中之1或2個以上（較佳為約1JL2〇個，更佳為約 1至10個，進一步更佳為數個（1至5個）)胺基酸缺失；或 者在該胺基酸序列中附加有i貞2個以上(較佳為約i至 20個，更佳為約i至10個，進一步更佳為數個（ι至$個）） 胺基酸；或者在該胺基酸序列中插入有^或2個以上（較佳 為力1至20個，更佳為約1至1 〇個，進一步更佳為數個 (1個至5個）)胺基酸；或者在該胺基酸序列中插入^或2 鲁個以上（較隹為約i至2〇個，更佳為約i至1〇個，進一步 更佺為數個（1至5個）)胺基酸；或者該胺基酸序列中之工 或2個以上（較佳為j至2〇個，更佳為約五至1 〇個，進一 y更么為放個（1至5個）)胺基酸被其他胺基酸置換。 再者，就Nectin-2之部分肽而言，c末端可為羧基 (-COOH)、幾酸根（_C0Cr)、醯胺^⑶而^或醋卜⑶叫之 任一者。 /再者，Nectin-2之部分肽，與上述Neciin_2同樣地， 亦巴括在c末％以外具有魏基(或幾酸根）者、N末端之胺 319597 28 200823235 基酸殘基（例如曱硫胺酸殘基）之胺基經保護基保護者、N 端侧在身體内經切斷所生成之麩醯胺酸殘基經焦麩胺酸化 者、分子内之胺基酸侧鏈上之取代基經適當保護基保護 者、或結合有糖鏈之所謂糖肽等複合肽等。 就Nectin-2或其部分肽之鹽而言，可以使用與生理學 上容許之酸(例如無機酸、有機酸）或驗（例如驗金屬鹽）等所 形成之鹽，尤其以生理學上可容許之酸加成鹽為較佳。關 於此等鹽，可使用例如與無機酸（例如鹽酸、填酸、氮溴酸、 _硫酸）等所形成之鹽，或與有機酸（例如乙酸、曱酸、丙酸、 富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、專 酸、苯曱酸、曱磺酸、苯磺酸）形成之鹽等。 本發明之針對Nectin-2或其部分肽或其鹽之單株抗體 (以下有時簡稱為本發明之抗體），若為可以識別Nectin-2 或其部分肽或其鹽之抗體，則任何種單株抗體皆可。其中， 以使用人類單株抗體為較佳。 φ 又，就本發明之抗體而言，以針對Nectin-25或其部 分肽或其鹽之單株抗體(尤其是人類單株抗體）為較佳。 再者，本發明之抗體，以使用具有以下（1)至（8)之特徵 中之至少一種之抗體為較佳。 (1) 具有癌細胞（例如人類癌細胞OV-90)之增殖阻礙活 性。 (2) 具有抗體依存性細胞毒殺活性（ADCC : Antibody-dependent cellular cytotoxicity) 〇 : (3)具有Nectin-T之順式結合阻礙活性。具體而言，： 29 319597 200823235 (i) 阻礙Nectin-2 α之同元（homo)順式結合； (ii) 阻礙Nectin-2 5之同元順式結合；或 (iii) 阻礙 Nectin-2a 與 Nectin-2(5 之異元（hetero) 順式結合。 (4)具有 Nectin-2/Nectin-3 或者 Nectin_2/Nectin-2 之反 式結合阻礙活性。具體而言， ⑴阻礙Nectin-2 α 之同元順式二聚體與 Nectin-2a之同元順式二聚體之反式結合； (ii) 阻礙Nectin-2a 之同元順式二聚體與
Nectin-2(5之同元順式二聚體之反式結合； (iii) 阻礙Nectin-2 a 之同元順式二聚體與 Nectin-2 α和Nectin-2 5之異元順式二聚體 之反式結合； (iv) 阻礙Nectin-2 α 之同元順式二聚體與
Nectin-3之同元順式二聚體之反式結合； (V) 阻礙Nectin-2 (5 之同元順式二聚體與
Nectin-2 5之同元順式二聚體之反式結合； (vi) 阻礙Nectin-2 5 之同元順式二聚體與
Nectin-2 α和Nectin-2 5之異元順式二聚體 之反式結合； (vii) 阻礙Nectin-2 (5 之同元順式二聚體與 Nectin-3之同元順式二聚體之反式結合； (viii) 阻礙 Nectin-2a 和 Nectin-2 5 之異元順式二 聚體、與Nectin-3之同元順式二聚體之反式結: 30 319597 200823235 合； (ix)阻礙Nectin-2a和Nectin_2 5之異元順式二 聚體與Nectin-2a和Nectin-2(^之異元順式 二聚體之反式結合。 (5)屬於實施例4所示之抗原決定部位群I至VII或實 施例18所示之抗原決定部位亞群之任一者。以屬於實施例 4之抗原決定部位群IV、VI或VII為較佳。以屬於實施例 18之抗原決定部位亞群IVb、VIb或Vila為更佳。 籲 （6)可識別與藉由 Necl-803-2(FERM BP-10417)、 Necl-244-3(FERM BP-10423)、
Necl-530-l(FERM BP-10424)、
Necl-903-l(FERM BP-10425) >
Necl-520-l(FERM BP-10426)、
Necl-845-2(FERM BP-10427) ^
Necl-834-l(FERM BP-10428)、 φ Necl-964-l(FERM ABP-10683) >
Necl-1302-2(FERM ABP-10684)、
Necl_554-1(FERM ABP-10681)、
Necl-769-2(FERM ABP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM ABP-10685) 所示之融合瘤細胞產生之單株抗體（屬於表4之抗原決定 部位群I、IV、V、VI、VII之抗體）所識別之胺基酸序列同 一或實質同一之臉基酸序列。 、 其中，關於『與藉由 Neci-803-2(FERM ΒΡ:1·〇417)、 31 319597 200823235
Necl-244-3(FERM BP-10423) ^ Neel-530-1 (PERM BP-10424) ^ Necl-903-l(FERM BP-10425) ^ Necl-520-l(FERM BP-10426)、Necl-845-2(FERM BP-10427)、Necl-834-1 (FERM BP-10428)、Necl-964-l(FERM ABP-10683)、 Necl-1302-2(FERM ABP-10684) 、 Necl-554-l(FERM ABP-10681)、Necl-769-2(FERM ABP-10682)或 Nec8-4116 -8(FERM ABP-10685)所示之融合瘤細胞產生之單株抗體 (屬於表4之抗原決定部位I、IV、V、VI、VII之抗體）所 _識別之胺基酸序列（以下簡稱為抗原決定部位）同一或實質 同一之胺基酸序列』中之『與抗原決定部位實質同一之胺 基酸序列』，可列舉如(i)該抗原決定部位之胺基酸序列中 之1或2個以上（例如約1至10個，較佳為數個（1至5個）） 胺基酸缺失而成之胺基酸序列；（ii)在該抗原诀定部位之胺 基酸序列中附加有1或2個以上（例如約1至10個，較佳 為數個（1至5個））胺基酸而成之胺基酸序列；（iii)在該抗 馨原決定部位之胺基酸序列中插入有1或2個以上（例如約1 至10個，較佳為數個（1至5個））胺基酸而成之胺基酸序 列；（iv)該抗原決定部位部位之胺基酸序列中之1或2個 以上（例如約1至10個，較佳為數個（1至5個））胺基酸以 其他胺基酸置換而成之胺基酸序列;或（v)組合上述⑴至（iv) 之胺基酸序列。對於上述胺基酸序列之插入、附加、缺失 或置換之位置無特殊限定。 更具體而言，關於「與抗原決定部位實質同一之胺基 \.酸序列」，可列舉抗·原決定部位附近之胺基酸序列，可列舉 32 319597 200823235 如⑴在抗原決定部位部分之N末端側附加有1或,2個以上 (例如約1至1 0個，較佳為數個（1至5個））胺基酸而成之 胺基酸序列；（Π)在抗原決定部位部分之C末端侧附加有！ 或2個以上（例如約1至1 〇個，較佳為數個（1至5個））胺 基酸而成之胺基酸序列；（iii)在抗原決定部位部分之N末 端侧之胺基酸序列中附加有1或2個以上（例如約1至1 〇 個，較佳為數個（1至5個））胺基酸而成之胺基酸序列；（iv) 在抗原決定部位部分之C末端侧之胺基酸序列中附加有1 •或2個以上（例如約1至10個，較佳為數個（1至5個））胺 基酸而成之胺基酸序列等。
舉例言之 ’「NecK803-2(FERM BP-10417)、 Necl-244-3(FERM BP-10423) 、 Neel-530-1(FERM BP-10424) > Necl-903-l(FERM BP-10425) - Necl-520-1 (FERM BP、10426)、Necl-845-2(FERM BP-10427)、 Necl-834-l(FERM BP-10428) > Necl-964-l(FERM ABP-鲁 10683)、Necl-1302-2(FERM ABP-10684)、Necl-554-1 (FERM ABP-10681) ^ Necl-769-2(FERM ABP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM ABP-10685)」所示之融合瘤細胞產生 之各單株抗體、以及屬於與該單株抗體所屬群相同之群之 其他單株抗體，被判定為可以識別與該單株抗體同一或實 質同一之胺基酸序列。 (7)針對 Nectin-2a 或 Nectin-2 5，與 Necl-803-2 (FERM BP-10417) >
Neel - 244-3(PERM BP-10423) ^ - 33 319597 200823235
Necl-530-!(FERM BP-10424) >
Necl-903-l(FERM BP-10425)、
Neel-520-1(FERM BP-10426) ^
Necl-845-2(FERM BP-10427)、
Necl-834-l(FERM BP-10428)、
Necl-964-1(FERM ABP-10683)、
Necl-1302-2(FERM ABP-10684)、
Necl-554-l(FERM ABP-10681) > _ Necl-769-2(FERMABP，10682)或 Nec8-4116-8(FERM ABP-10685) 所示之融合瘤細胞產生之各單株抗體為競爭性結合。 其中，「針對Nectin-2 α或Nectin-2 5，與各融合瘤細 胞產生之單株抗體為競爭性結合」係指藉由添加過剩量之 上述12種抗體之任一者，針對Nectin-2a或Nectin-2占 之結合會受到競爭性阻礙之抗體，具體而言，例如當添加 鲁為該抗體之50倍莫耳量之上述12種抗體之任一者時，顯 示約50至100%之結合阻礙率之抗體。 (8)含有與 Necl-803-2(FERM BP-10417)、 Necl-244-3(FERM BP-10423) >
Necl-530-l(FERM BP-10424)、
Necl-903-l(FERM BP-10425)、
Necl-520-l(FERM BP-10426) >
Necl-845-2(FERM BP-10427)、 - Necl-834-l(FERMBP-10428)、 34 319597 200823235
Necl-964-l(FERM ABP-10683)、
Necl-1302-2(FERM ABP-10684)、
Necl-554-l(FERM ABP-10681)、
Necl-769-2(FERM ABP-10682)或 Nec8-4116 _8(FERM ABP-10685) 所示之融合瘤細胞產生之單株抗體之胺基酸序列同一或實 質同一之胺基酸序列之單株抗體。 其中，就上述之與單株抗體之胺基酸序列（以下稱為胺 ®基酸序列A)同一或實質同一之胺基酸序列而言，與胺基酸 序列具有約50%以上（較佳為約60%以上，更佳為約70% 以上，進一步更佳為約80%以上，再進一步更佳為約90% 以上，特佳為約95%)類似性（homology)之胺基酸序列等。 含有與胺基酸序列A同一或實質同一之胺基酸序列之 抗體，例如，以含有與上述胺基酸序列A實質同一之胺基 酸序列且具有與含有胺基酸序列A之蛋白質實質同質之活 •性之抗體為較佳。 胺基酸序列之類似性，可使用類似性計算演算法NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，在以下條件（期望値 =10 ;允許間隙；矩陣=BLOSUM62 ;過濾計算。 所謂實質同質，表示此等性質在性質（例如生理學或藥 理學）上為同質。因此，本發明蛋白質之活性雖以同等（例 如約0.01至100倍，較佳為約0·1至1〇倍，更佳為〇·5 至2倍）為較佳，但此等活性之程度、蛋白質之分子量等量 319597 35 200823235 之要素可以不同。 再者’含有與胺基酸序歹,j A同一或實冑同一之 ^列之早株抗體’例如亦包括含有下述( 列之抗料：⑴胺基酸序列“之1或2個以上（例.如約1 至50個’較佳為約i至3〇個’更佳為約1至1〇個，再更 ^為約數個（1至5))胺基酸缺失之胺基酸序列；⑼胺基酸 奶歹1 A中附加有上或2個以上(例如約工至個’較佳為 、、1至3〇個，更佳為約1至10個，再更佳為約數個(1至 5個）)胺基酸之胺基酸序列；（m)胺基酸序列a中插入有工 或2個以上（例如約1至5〇個，較佳為約1至30個，更佳 為約1至10個，再更佳為約數個（1至5個）)胺基酸之胺基 酸序列；（iv)胺基酸序列A中之！或2個以上（例如約ι至 50個，較佳為約丨至3〇個，更佳為約丄至個，再更佳 為約數個（1至5個）)胺基酸以其他胺基酸置換而成之胺基 酉文序列，或（V)將此等組合而成之胺基酸序列。 • 再者，本發明之抗體包括嵌合抗體、人類化抗體、人 類抗體及抗體片段。所謂「嵌合抗體」意指具有來自異種 抗體之可變區域及人類抗體恒定區域之抗體（例如參照歐 洲專利公開公報ΕΡ0125023等）。所謂「人類化抗體」意指 改變小鼠等對於人類而言為異種之抗體，將H鏈及L鏈之 互補性決定部以外之一次構造用人類抗體之對應一次構造 置換而成之抗體。所謂「人類抗體」意指使用導入有人類 抗體基因之基因轉移動物所製作之單株抗體（參照歐洲專 利公開公報· ΕΙ>0546073)、、以及使用將人類抗體基因呈現 36 319597 200823235 (presenting)於噬菌體、大腸桿菌、酵母菌、動物細胞等細 胞表面或核糖體上而得之基因庫，亦即使用所謂抗體展# 技術所製作之單株抗體（Nature Biotechnology 23 1105(2005))及使用由產生針對Nectin-2之抗體的人類B細 胞之細胞融合法或嗔菌體展現（phage display)法等技術所 單離之單株抗體。 在本發明中，所謂「抗體片段」係指全長抗體之_音卩 分，一般而言，係指包含抗原結合區域或可變區域者。抗 籲原片段包括，例如，Fab、Fab’、F(ab’）2、單鏈抗體（scFv)、 二硫化物安定化抗體（dsFv)等。 依照本發明之較佳態樣之抗體能識別··存在於序列編 號：l(Neetki-2a)或序列編號：3(Nectin-25)所示之胺基酸 序列之第1至350號（細胞外區域）之胺基酸序列中之抗原 決定部位；:存在於序列編號：1 (Nectin-2a)或序列編號： 3(Nectin-2S)所示之胺基酸序列之第47至142號（第一 IG 鲁樣結構域）或第175至240號（第二IG樣結構域）之胺基酸 序列中之抗原決定部位；或者包括序列編號：l(Nectin-2o〇 或序列編號：3(Nectin-25)所示之胺基酸序列之第75、76、 77、78、95、137、145、173、184、186、212 號之至少一 者之胺基酸殘基之胺基酸序列。 又，本發明提供含有特定C D R胺基酸序列或可變區域 胺基酸序列之單株抗體。再者，本發明亦提供包括特定之 CDR胺基酸序列之單株抗體輕鏈或其片段、單株抗體重鏈 ** 或其片段。 ：， 37 319597 200823235 於抗體之重鏈及輕鏈之N末端側存在可變區域，其分 別被稱為重鏈可變區域（VH)及輕鏈可變區域(VL)。在可變 區域内存在互補性決定區域（complementarily determining region，CDR)，該部份負責抗原識別之特異性。可變區域 之CDR以外之部分具有保持CDR之構造之角色，其被稱 為框架區域（framework region ; FR)。在重鏈及輕鏈之C末 端側存在恆定領域，其分別被稱為重鏈恆定區域（CH)及輕 鏈恆定區域（CL)。在重鏈可變區域中，存在第一互補性決 ⑩定區域（CDR 1)、第二互補性決定區域（CDR2)及第三互補性 決疋區域（CDR3)二個互補性決定區域。重鍵可變區域中之 三個互補性決定區域被總稱為重鏈互補性決定區域。在輕 鏈可變區域中，同樣地存在第一互補性決定區域（CDR1)、 第二互補性決定區域（CDR2)及第三互補性決定區域 (CDR3)三個互補性決定區域。輕鍵可變區域中之三個互補 性決定區域被總稱為輕鏈互補性決定區域。 • 具體而言，依照本發明之較佳態樣之抗體中，抗體重 鏈可變區域之第一互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決 定區域（CDR2)及第三互補性決定區域（Cdr3)之胺基酸序 列分別包括與⑴選自序列編號：184、200、216、232、248、 264、280及296所成族群中之序列編號；（ii)選自序列編 號：185、201、217、.233、249、265、281 及 297 所成族 群中之序列編號以及（iii)選自序列編號：186、202、218、 234、250、266、282及298所成族群中之序列編號所示之 胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。..… 38 319597 200823235 再者，依照本發明之較佳態樣之抗體中，抗體輕鏈可 變區域之第一互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區 域（CDR2)及第三互補性決定區域(CDR3)之胺基酸序列分 別包括與（iv)選自序列編號：192、208、224、240、256、 272、288及304所成族群中之序列編號所示之胺基酸序 歹1J ; (v)選自序列編號：193、209、225、241、257、273、 289及305所成族群中之序列編號所示之胺基酸序列及（Vi) 選自序歹4 編號：194、210、226、242、258、274、290 及 鲁306所成族群中之序列編號所示之胺基酸序列同一或實質 同一之胺基酸序列。 本發明抗體之CDR序列雖無需被限定，但作為VH CDR卜VH CDR2及VH CDR3之胺基酸序列之適當組合、 作為VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之胺基酸序列之適 當組合，係示於下述之表21及22中。對於CDR以外之胺 基酸序列無特殊限定，CDR以外之胺基酸序列係來自其他 書抗體，尤其是其他物種之抗體之所謂CDR移植抗體包含於 本發明之抗體中。CDR以外之胺基酸序列以來自人類之胺 基酸序列為較佳，需要時可在框架區域（FR)中附加、缺失、 置換及/或插入1至數個胺基酸殘基。 ， 再者’本發明之抗體可變區域之胺基酸序列及鹼基序 列以表25所記載者為較佳。 §有本發明抗體之特定CDR胺基酸序列或可變區域 胺基酸序列之單株抗體之製作可使用公知之方法。 : - . ' . 本發明之抗體，係-抗體之怪定區域較佳屬於人類抗 39 319597 200823235 體，更佳屬於人類IgG，進一步更佳屬於人類IgG 1亞群之 單株抗體。 針對Nectin-2或其部分肽或此等之鹽（以下說明抗體 時，有時將此等簡稱為Nectin-2)之抗體，可依照本身公知 之抗體或抗血清之製造法而製造。 以下針對本發明抗體之抗原製備法及該抗體之製造方 法加以說明。 (1)抗原之製備 籲就調製本發明抗體所使用之抗原而言，可以使用例如 含有序列編號：1或序列編號：3所示之胺基酸序列之蛋白 質（Nectin-2)或其部分狀或此等之鹽、天然或人為地高度表 現含有序列編號：1或序列編號：3所示之胺基酸序列之蛋 白質（Nectin-2)之細胞株或其膜部分、Nectin-2之細胞夕卜區 域蛋白質與其他蛋白質或狀之融合蛋白質或其鹽、或者具 有一種或二種以上與Nectin_2相同之抗原決定基之（合成） _肽等之任一種（以下，有時將其簡稱為本發明之抗原）。 就本發明之抗原之具體例而言，以使用天然或人為地 高度表現Nectin-2之細胞株或其膜部分、Nectin-2之細胞 外區域蛋白質或其鹽、Nectin-2之細胞外區域與其他蛋白 質或肽之融合蛋白質、或者具有一種或二種以上與 Nectin-2相同之抗原決定基之（合成）狀等為較佳。 關於其他蛋白質或肽，可列舉如FLAG-tag、His-tag、 Myc-tag、V5-tag、GST-tag、S-tag、T7-tag，或者人類抗體、 小鼠抗體等之Fc區域等。 .· 40 319597 200823235 上述（合成）肽之長度，只要為具有免疫原性之長度， 將無特殊限定，可列舉具有如6個、較佳10個、更佳12 個連續胺基酸殘基者。
Nectin-2或其部分肽或其鹽，可藉由本身公知之蛋白 質之精製方法或以其為基準之方法，從上述人類或溫血動 物之細胞或組織製造；或者可藉由培養含有編碼蛋白質之 DNA之轉形體而製造。或者可以下述之肽合成法為基準而 製造。再者，Nectin-2之細胞外區域與其他蛋白質或肽之 ⑩融合蛋白質可藉由培養含有編碼該融合蛋白質之DNA之 轉形體而製造。 (a) 在從人類或溫血動物（例如土撥鼠、大I、小鼠、 ，雞、兔子、豬、羊、牛、猴子）之組織或細胞調製本發明之 抗原或此等之鹽之情形，均質化該組織或細胞後，可以使 用粗製部分（例如膜部分、可溶性部分）直接作為抗原。或 者用酸、界面活性劑或醇等進行萃取，藉由組合鹽析、透 I析、凝膠過濾、逆相層析、離子交換層析、親和性層析等 層析精製單離該萃取液。 (b) 在使用含有DNA之轉形體製造Nectin-2或 Nectin-2之細胞外區域與其他蛋白質（狀）之融合蛋白質之 情形，該DNA可依照公知之選殖方法[例如Molecular Clonmg(2nd ed.; J. Sambrook et al·，Cold Spring Harbor Lab. Press，1989)記載之方法等]製作。 完全地編碼Nectin-2或其部分肽（以下，在對於編碼 Nectin-2或其部分肽之DNA之選殖及表現之說明中，有時 41 319597 200823235 將Nectin-2或其部分肽簡稱為Nectin-2)之DNA之選殖手 段’可為使用具有編碼Nectin-2之驗基序列之一部分之合 成DNA引子並藉由PCR方法進行擴增；或者使用編碼 Nectin-2之一部分或全區域之DNA片段或合成DNA並加 以標識，藉由與此等經標識之DNA雜交而篩選出插入適 當載體之DNA。PCR所用之模板（template)聚核苷酸只要 為含有編碼Nectin-2之驗基序列者，可為任一者。再者， 可為基因體DNA、基因體DNA庫、來自上述細胞及組織 _之cDNA、來肩上述細胞及組織之cDNA庫及合成DNA之 任一者。雜交之方法，例如可依照在Molecular Cloning 2nd(J. Sambrook et al;? Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) 中記載之方法進行。再者，在使用市售之基因庫之情形， 可依照隨附使用說明書中記載之方法進行。以在高嚴苛 (high strigent)之條件下進行為更佳。 高嚴苛條件係指，例如，鈉濃度為約19至40 mM， ⑩較佳為約19至20 mM，溫度為約50至70°C，較佳為約 60至65°C之條件。尤其以鈉濃度為約19 mM且溫度為約 65°C之情形為最佳。 更具體而言，⑴可以使用含有序列編號：2所示之鹼 基序列之DNA等作為編碼含有序列編號：1所示之胺基酸 序列之蛋白質（Nectin-2a)之DNA; (ii)可以使用含有序列編 號:4所示之鹼基序列之DNA等作為編碼含有序列編號： 3所示之胺基酸序列之蛋白質（Nectin-25)之DNA。 ’ DNA之鹼基存列之轉換，可使用PCR、公知之套組（例 42 319597 200823235 如 MutanTM_super Express Km(寶酒造有限公司）、 MutanTM-K(寶酒造有限公司）等，依照ODA-LA PCR法、 Gapped duplex法、Kunkel法等本身公知之方法或以此等 方法為準之方法進行。 編碼經選殖化之Nectin-2之DNA，視目的可直接使 用，或者依照期望用限制酵素消化，或附加連結子(linker) 而使用。該DNA在其5’末端侧具有ATG作為轉譯起始密 碼子，再者，在3’末端侧具有TAA、TGA或TAG作為轉 馨譯終止密碼子。此等轉譯起始密碼子或轉譯終止密碼子， 可藉由使用適當的合成DNA接頭（adapter)而予以附加。欲 得到編碼Nectin-2之細胞外區域與其他蛋白質(肽）之融合 蛋白質或其鹽之DNA時，可將藉由與上述同樣之方法選 殖或合成之編碟Nectin-2細胞外區域之DNA與編碼其他 蛋白質（肽）之DNA，依照本身公知之方法或以其為基準之 方法而加以連結。 _ Nectin-2之表現載體’例如可猎由（i)從編石馬Nectin-2 4 DNA切出目標DNA片段’（ii)將該DNA片畏連結於適 當表現載體中之啟動子之下游而製造。 關於載體，可以使用來自大腸桿菌之質體（例如 pBR322、pBR325、pUC12、pUC13);來自枯草桿菌之質 體（例如pUBllO、pTP5、pC194);來自酵母菌之質體（例如 pSHl9、pSHl5)，又-嗟菌體等嗟菌體、反轉錄病毒 (retrovirus)、牛痘病毒（vaccinia virue)等動物病毒、桿狀病 毒等尾轰病毒等之外，可以使用pAl，ll、pXTl、pRx/CMV、 43 319597 200823235 pRc/RSV、pcDNAI/Neo 等。 本發明所使用之啟動子，只要對於基因表現所用之宿 主而言為適當的啟動子，可使用任一種。舉例言之，使用 動物細胞作為宿主時，可列舉SR α啟動子、S V40啟動子、 LTR啟動子、CMV(巨細胞病毒）啟動子、HSV-TK啟動子 等。 此等之中，以使用CMV啟動子、SR α啟動子等為較 佳。宿主為大腸桿菌屬細菌時，以trp啟動子、lac啟動子、 • recA啟動子、XPL啟動子、lpp啟動子、T7啟動子等為較 佳；宿主為桿菌（bacillus)屬細菌時，以SP01啟動子、SP02 啟動子、penP啟動子等為較佳；宿主為酵母菌時，以PH05 啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等為較 佳。宿主為昆蟲細胞時，以多面體（polyhedrin)啟動子、P10 啟動子等為較佳。 表現載體，除上述之外，視期望可使用含有加強子 • (enhancer)、剪接信號、poly A附加信號、選擇標記、SV40 複製起點（以下有時簡稱為SV40ori)等者。關於選择標記， 可列舉如二氫葉酸還原酵素（以下有時簡稱為dhfr)基因[胺 甲嗓吟（methotrexate，MTX)抗性]、安比西林（ampicillin) 抗性基因（以下有時簡稱為Ampr)、新黴素（Neomycin)抗性 基因（以下有時簡稱為Neor，G418抗性）等。尤其在使用 dhfr基因缺損之中國倉鼠細胞作為選擇dhfr基因之標記之 情形，亦可藉由不含胸腺嘧啶之培養基選擇目標基因。、 再者，視,，需要可在1^也11-2之:1^端末側附加適合宿主, 44 319597 200823235 之信號序列。宿主為大腸桿菌屬之細菌時，可以利用 PhoA ·信號序列、〇mpA ·信號序列等；宿主為桿菌屬之 細菌時，可以利用（2 -殿粉酶·信號序列、枯草桿菌蛋白 酶·信號序列等；宿主為酵母菌時，可以利用MF α ·信 號序列、SUC2 ·信號序列等；宿主為動物細胞時，可以利 用胰島素·信號序列、α -干擾素·信號序列、抗體分子· 信號序列等。 可以使用含有編碼如此構築之Nectin-2之DNA之載 _體製造轉形體。 關於宿主，例如，可以使用大腸桿菌屬細菌、桿菌屬 細菌、酵母菌、昆蟲細胞、昆蟲、動物細胞等。 關於大腸桿菌屬細菌之具體例，可以使用，例如，大 腸桿菌（Escherichia coli)K12 · DHl[Proc· Natl· Acad· Sci· USA，60 卷，160(1968)]、JM103[Nucleic Acids Research，9 卷，309(1981)]，JA221[Journal of Molecular Biology，120 •卷，517(1978)]、HB101 [Journal of Molecular Biology，41 卷， 459(1969)]、C600[Genetics, 39 卷，440(1954)]等。 關於桿菌屬細菌，可以使用，例如，枯草桿菌（Bacillus subtilis)MI114[Gene，24 卷，255(1983)]、207-21[Journal of Biochemistry，95 卷，87(1984)]等。 關於酵母菌，可以使用，例如，啤酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R、NA87-11A、 DKD-5D、20B-12 ;粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)NCYC191J、NCYC2036 ;畢赤酵母菌(pichia 45 319597 200823235 pastoris)KM71 等。 關於昆蟲細胞，舉例言之，在病毒為AcNPV之情形， 可以使用來自夜盜蛾幼蟲之細胞株（Spodoptera frugiperda cell ; Sf細胞）、來自粉紋夜蛾（Trichoplusia ni)之中腸之 MG1細胞；來自粉紋夜蛾之卵之HighFiveTM細胞、來自棉 鈴蟲（Mamestra brassicae)之細胞或來自竹潛甲（Estigmena acrea)之細胞等。在病毒為BmNPV之情形，可以使用來自 蠶之細胞株（Bombyx mori N細胞；BmN細胞）等。關於該 • Sf細胞，可以使用，例如，sf9細胞（ATCC CRL1711)、Sf21 細胞（以上，Vaughn，J.L·等人，In Vivo, 13, 213·217，（1977)) 等。 關於昆蟲，可以使用，例_，蠶之幼蟲[前田等人；
Nature，315 卷，592(1985)] 〇 關於動物細胞，可以使用，例如，猴子COS-7細胞、 Vero細胞、中國倉鼠CHO細胞（以下簡稱為CHO細胞）、 dhfr基因缺損之中國倉鼠CHO細胞（以下簡稱為CHO(dhf〇 細胞）、小鼠L細胞、小鼠AtT-20細胞、小鼠骨聽瘤細胞、 小鼠ATDC5細胞、小鼠NS0細胞、小鼠FM3A細胞、大 鼠GH3細胞、人類FL細胞、人類胚胎HEK293細胞、人 類胚胎293F細胞等。 為了轉形大腸桿菌屬細菌，可以依照，例如Proc. Natl. Acad· Sci· USA，69 卷，2110(1972)及 Gene，17 卷，107(1982) 等所記載之方法進行。 - ^ - …為了轉形桿菌屬細菌，可以依照，例如，Molecular & 46 319597 200823235
General Genetics，168卷，111(1979)等所記載之方法進行。 為了轉形酵母菌，可以依照，例如，Methods in Enzymology，194 卷，182-187(1991)、Proc. Natl· Acad. Sci· USA，75卷，1929(1978)等所記載之'方法進行。 為了轉形昆蟲細胞，可以依照，例如，Bio/Technology， 6, 47-55(1988)等所記載之方法進行。 為了轉形動物細胞，可以依照，例如，細胞工學別冊 8新細胞工學實驗規程，263-267(1995)(秀潤社發行）、 # Virology, 52卷，456(1973)所記載之方法進行。 如上述，可以得到用含有編碼Nectin-2之DNA之表 現質體轉形所得之轉形體。 , 培養宿主為大腸桿菌屬細菌、桿菌屬細菌之轉形體之 時，培養所使用之培養基以液體培養基為宜，該液體培養 基含有該轉形體之繁殖所必需之碳源、氮源、無機物及其 他養分。碳源例如為葡萄糖、糊精、可溶性澱粉、蔗糖等； 鲁氮源例如為銨鹽類、硝酸鹽類、玉米澱粉液、蛋白腺、酪 蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯萃取液等無機或有機物 質；無機物例如為氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂等。再者， 可以添加酵母萃取物、維生素類、成長促進因子等。培養 基之pH値期望為約5至8。 培養大腸桿菌屬細菌時之培養基，以例如含有葡萄 糖、酿蛋白胺基酸（casamino acids)之M9培養基[Miller， Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Hatbor Laboratory，New York 1972]為較隹。其 47 319597 200823235 中為了使啟動子更有效率地運作，需要時可加入例如3 β -吲哚丙烯酸等藥劑。 宿主為大腸桿菌屬細菌時，通常在約1 5至43°C下進 行培養約3至24小時，需要時可併行通氣及擾拌。 宿主為桿菌屬細菌時，通常在約30至40t：下進行培 養約6至24小時，需要時可併行通氣及攪拌。 培養宿主為酵母菌之轉形體時，關於培養基，可列舉 Burkholder 最低培養基(Burkholder)[Proc. Natl. Acad· Sci· • USA，77卷，4505(1980)];及含有0.5%酪蛋白胺基酸之SD 培養基[Proc· Natl. Acad· Sci· USA，81 卷，5330(1984)]。培 養基之pH以調整至約5至8為較佳。培養通常在約20°C 至35°C下進行約24至72小時，需要時可併行通，氣及攪拌。 培養宿主為昆蟲細胞或昆蟲之轉形體時，可以使用在 葛莉絲（Grace’s)昆蟲培養基（Nature, 195，788(1962))中通 宜加入經去活化之10%牛血清等添加物者等。培養基之pH φ値以調整至6·2至6·4為較佳。培養通常在約27°C進行約3 至5日，需要時可併行通氣及攪拌。 培養宿主為動物細胞之轉形體時，，可以使用，例如含 有約5至20%之胎牛血清之MEM培養基[Science，122卷， 501(1952)]、DMEM 培養基[Virology，8 卷，396(1959)]、 RPMI 1640 培養基[The Journal of the American Medical Association，199 卷,519(1967)]、199 培養基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73 卷，1(1950)] 等。pH以約6至8為較佳。培養通常在約30至40°C進行 48 319597 200823235 約15至60小時，需要時可併行通氣及攪拌。 如上述’可在轉形體之細胞内、細胞膜或細胞外生成
Nectin-2 〇 為了從上述培養物分離精製Nectin-2,可藉由，例如， 下述方法進行。 ^從坧養菌或細胞萃取Nectin-2時，適宜使用下述方法 等於坨養後，用公知之方法收集菌體或細胞，將其懸浮 蠢於適當的緩衝液，藉由超音波、溶菌酶（lysozyme)及/或凍 二解等，壞菌體或細胞後，藉由離心分離或過濾、得到蛋 貝之粗十取液。在緩衝液中可含有尿素或胍鹽酸鹽等蛋 :貝:又性劑’或可含有Trit〇nX_i〇〇TM等界面活性劑。在 ectm-2分泌於培養液之情形，培養終了 4，用本身公知 之方法分，或細胞與上清液，並收集上清液。' 拌制如此付到之培養上清液或萃取液中所含之Nectin-2之 精製，可以藉由適當址人 癱進行。關於此等八4、、、 分離及精製方法來 • 關於此寺公知之分離及精製方法，可以祛田·醯乂 及溶劑沉殿法等利用溶解产之;;方法悉了以使用.鹽析 (知mtration)及凝心、；；/法，透析法、超過滤法 方法·離子ιί 等主要利用分子量之差異之 利用特異親和性之方法二=兴之方法’·親和層析等 等利用疏水性差異之H二+目互作用層析、逆相層析 M m 去，寻黾集焦（cllr〇matofc)eusin2@ 利用等電點差異之方法等。 i0cusm幻寺 如此得到之Necf丨η 0 各 ,^ ώ 1η-2 ’在以游離體得到之产茶叮级 由本身公知之方法或以复 于剠之t月形，可精 /、為基準之方法轉變成鹽；相反 319597 49 200823235 地，在以鹽得敎情形，可藉由本身公 基準之方法轉變成游離體或其他鹽。 方法或以其為 除去多肽。關於蛋白質 騰，蛋白酶、精胺酿基内狀酶、蛋白 ；白:、 之酶免度榀疋法或西方轉潰法等測定。 #作為ΠΓ直接❹表現Neetin_2之哺乳杨細胞本身 編二 原。關於，乳動物細胞，可以使用以上述 胞等法轉形上述⑷項所述之天然細胞所得之細 胞ΐ。關於轉形體所使用之宿主，只要為從人類、猴子、 大既、小氣、倉氣等採取之細胞，可為任何細胞，以使用 93、，’田胞、c〇S7 細胞、CHO-K1 細胞、ΝΙΗ3Τ3 細胞、
Balb3T3細胞、FM3A細胞、L929細胞、sp2/〇細胞、ρ則 .細胞、NS0細胞、B16細胞或P388細胞等為較佳。 (d)具有一種或二種以上與Nectin_2相同之抗原決定 ，之（合成）肽或其鹽，可依照本身公知之肽之合成法，或 藉由用適當的肽酶切斷Nectin_2而製造。肽之合成法可 為例如’固相合成法及液相合成法之任一者。亦即，藉 由將可構成該肽之部分肽或胺基酸與殘餘部分縮合，生成 物若具有保護基則脫去保護基，以製造目標肽。關於公知 之縮合方法及保護基之脫離，可列舉在以下⑴至（v)中記載 之方法…. 319597 50 200823235 (i) M. Bodanszky 及 M.A.Ondetti ; Peptide Synthesis， Interscience Publishers，New York(1966 年）； (ii) Schroeder 及 Luebke ; The Peptide，Academic Press, New York(1965 年）·， (iii) 泉屋信夫等，肽合成之基礎及實驗，丸善股份公 司（1975 年）； (iv) 矢島治明及神原俊平，生化學實驗講座1，蛋白質 之化學 IV，205，（1977 年）； • (v)矢島治明監修，醫藥品開發續篇，第14卷，肽合 成，廣川書店。 再者，將反應後之一般精製方法，例如溶劑萃取、蒸 餾、管枉層析、液相層析及再結晶等組合，並用其精製單 離本發明所用之部分肽。以上述方法得到之部分肽為游離 體之情形，可藉由本身公知之方法或以其為基準之方法轉 變成鹽；相反地，在以鹽得到之情形，可藉由本身公知之 _方法或以其為基準之方法轉變成游離體或其他鹽。 (2)單株抗體之製作 (a)藉由雜交法所製成之產單株抗體細胞之製作 將本發明之抗原投與至溫血動物。關於免疫方法，只 要能促進抗體產生，可為任何方法，以使用靜脈内注射、 腹腔内注射、肌肉内·注射、皮下注射、皮内注射或足掌注 射等為較佳。 表現本發明蛋白質之天然哺乳動物細胞或轉形哺乳動 物細胞，可以懸浮於組織培養用之培養基（例如RPMI1640) 51 319597 200823235 或缓衝液（例如漢克氏（Hank，s)平衡鹽溶液）之狀態，注射免 疫動物。 本發明之抗原，可以不溶狀態進行直接免疫。再者， 可將本發明之抗原結合或吸附於適當之支持體而成之複合 體進行免疫。該支持體（carrier)與本發明之抗原（半抗原） 之混合比，只要可效率良好地針對結合或吸附於支持體之 本發明抗原之抗體，則可以任何比率結合或吸附任何種支 持體；通常可使用結合或吸附有製作針對半抗原之抗體時 •所常用之天然或合成高分子支持體之半抗原，其中該支持 體與半抗原之重量比為（U至100: 1。關於天然的高分子 支持體，可以使用如牛、兔子、人類等哺乳動物之血清白 蛋白，或如牛、兔子等哺乳動物之甲狀腺球蛋白，如牛、 兔子、人類、羊等哺乳動物之血色素，餘孔蟲戚血藍蛋白 (keyhole limpet hemocyanin)等。關於合成之高分子支持 體’可以使用例如聚胺基酸類、聚苯乙烯類、聚丙烯酸類、 #聚乙烯類、聚丙烯類等聚合物或共聚物等各種乳朦等。 人再者’於半抗原與共聚物之偶合方面，可使用各種縮 Μ卜舉例言之，宜使用：用於將路胺酸、組胺酸、色胺 酸交聯之雙偶氮化聯苯胺等二偶氮鑌化合物、用於將胺基 彼此父聯之戊二酸等二盤化合物、甲苯_2,4_二異氛酸醋等 ，異氰酸酯化合物、用於將硫醇基彼此交聯之ν，ν,_鄰-苯 二馬來亞胺等二馬來醯亞胺化合物、用於將胺基與硫醇 來顧胺基活性s|化合物、用於將胺基與縣 父聯之碳二亞胺化合物等。再纟，在將胺基彼此交聯之時， 319597 52 200823235 在一者之胺基上藉由與具有二硫吡啶基之活性酯試藥（例 如3-(2-吡啶基二硫）丙酸N-琥珀醯亞胺基酯（SPDP)等）反 應後進行還原而導入硫醇基，在另一者之胺基上藉由馬來 醯亞胺活性酯試藥導入馬來醯亞胺試藥，然後使該二者反 應。 投與本發明之抗原時，為了提高免疫動物之抗體產生 能力，將本發明之免疫原與弗氏（Freund’s)完全佐劑或弗氏 不完全佐劑、礬土、里比（Ribi)佐劑等佐劑混合或調製成乳 鲁液後，投與至動物。通常每2至6週投與一次，進行釣2 至10次。再者，在製作本發明之單株抗體之時，可利用 DNA免疫法（例如參照Nature，356卷，152頁至154頁）。 關於所使用之溫血動物，雖可列舉如猴子、兔子、狗、土. 撥鼠、小鼠、大鼠、中國倉鼠、羊、山羊、路乾、路馬、 雞，但以使用小鼠及大鼠為較佳。此等溫血動物可為野生 型者；再者，為了得到對抗原更強之免疫反應，此等動物 以將抗原蛋白質之該溫血動物直向同源基因（orthologous 馨 gene)剔徐（knock out)之K0動物為佳。又，為了製作人類 單株抗體，可以使用剔除溫血動物之抗體基因且導入人類 抗體基因之基因轉移動物（請參照歐洲專利公開公報 EP0546073)或基因植入（knock in)動物（WO 02/098217 號公 報、W0 03/020743 號公報）。 製作產生單株抗體細胞時，從以抗原免疫之溫血動物 (例如小鼠）選擇確認呈現抗體價之個體，於最後一次免疫 .後2至5日後，採取脾臟或淋巴結，藉由將其所含之產.生 53 319597 200823235 抗體之B細胞與同種或異種之骨髓瘤細胞融合，可以調製 產生單株抗體之融合瘤。抗血清中抗體價之測定，可採用 定量特異性結合於抗原之抗體量之方法。舉例言之，如下 述，使固相化蛋白質抗原或抗原表現細胞株與抗血清反應 後，藉由經標識之抗免疫球蛋白抗體檢測結合於此等抗原 之抗體量而測定抗體價。融合操作可依照已知之方法，例 如，凱樂吉米爾斯坦（Keller and Milstein)之方法（Nature, 256，495(1975))實施。關於融合促進劑，可列舉如聚乙二 ❿醇（PEG)或仙台病毒（Sendai virus)等，以PEG為較佳。 關於骨髓腫瘤細胞，雖可列舉如NS-1、P3U1、SP2/0、 AP-1等溫血動物之骨艟瘤細胞，但以使用SP2/0及P3U1 為較佳。所用之產抗體細胞（脾臟細胞）數目與骨髓瘤細胞 數目之較佳比率為約1 : 1至20 : 1，PEG(以PEG1000至 PEG6000)以約10至80%之濃度添加，且在20至40°C(較 佳為30至37°C)下培養1至10分鐘，藉此可更有效率地 •貫施細胞融合。 再者，關於用於製作產單株抗體細胞之細胞融合操 作，可以使用電融合法。 融合瘤之篩選，可以依照本身公知或以其為基準之方 法進行。通常可以使用添加HAT(次黃嗓呤 (hypoxanthine)、胺基 口業吟（aminopterin)、胸腺口密 17定）之動物 細胞用培養基進行。關於篩選及育種用培養基，只要融合 瘤可以繁殖，可以使用任何培養基。舉例言之，可以使用 含有1至20%(較佳為10至20%)胎牛血清之RPMI 1640 54 319597 200823235 乂有1至1〇%胎牛血清之GiT培養基(和光純藥 ；；ί二么司）、或融合瘤培養用無血清培養基（SFM-】〇i 曰水衣樂股份公司）等。培養溫度通常為⑼至贼，以奸 培養時間通常為5日至3星期，以1星μ U為Μ °培養通常可在5%二氧化碳下進行。 法，：ίΐ單株抗體之融合瘤之篩選方面，可使用各種方 所 ，，、、.將融合瘤培養上清液直接添加於可溶性蛋白 ♦體而成之固相（例如m或添加於其吸附於支持 螢光物質等標識之抗免^放射性物質、酵素、 用之脾臟細胞為小鼠之情：二抗體(例如在細胞融合所 抗體）或蛋白質A反應^入、以使用抗小鼠免疫球蛋白 m 4 Ih " 祆測出結合於固相之單株抗體 ::法，或者在吸附有抗免疫球蛋白 A之 相中添加融合瘤培養上、、主汸' &史臼貝A之固 酵素、營光物質等標識=、:繼而藉由與以放射性物質、 #出結合於固相之抗原特 白質抗原反應，而檢測 #白質抗原表現性細胞之^:生㈣抗體之方法等。在使用蛋 培養上清液，繼而與4开;二f該細胞中添加融合瘤 後，用流式細胞測定儀（fl ^識之抗免疫球蛋白抗體反應 定該細胞之螢光強度，可^^t〇meter)等曼光檢測裝置測 白質抗原之單株抗體。双/則出結合於該細胞膜上之蛋 (b)藉由其他方法製作單株抗體 本發明之抗體之製作 如可以旋用「將藉由以人:不限於⑽斤記裁之方法， *、或溫血動物（例如猴子、兔子、 319597 55 200823235 狗、土撥鼠、小鼠、大鼠、中國倉鼠、羊、駱駝、駱馬、 雞等）之B淋巴球作為材料之公知方法所製作之抗體基因 庫，呈現於噬菌體、大腸桿菌、酵母菌、動物細胞等之細 胞表面或核糖體上」之所謂抗體展示（antibody display)技 術[Nature Biotechnology 23，1105(2005)]。人類或溫血動物 可為天然者，亦可為高度表現本發明之抗原之癌症之患 者，或藉由⑷記載之方法用本發明之抗原免疫之溫血動 物。關於呈現於細胞表面之抗體之形態，可列舉IgG分 ⑩子、IgM分子、Fab片段、單鏈Fv(scFv)片段等，但不限 於此。 特異性結合於本發明抗原之單株抗體（片段）之基因可 藉由下述方法得到：使支持上述抗體基因庫之抗體（片段） 呈現細胞或抗體（片段）呈現梭糖體與本發明抗原反應一定 時間，洗淨除去非特異性結合者後，將特異性結合於本發 明抗原者溶出回收，將該抗體（片段）呈現細胞（presenting 馨cell)或抗體（片段）呈現核糖體藉由公知方法增殖後，重複 進行同樣之方法數次，最後從選殖之抗體（片段）呈現細胞 或抗體（片段）呈現核糖體單離該單株抗體（片段）基因。如此 得到之單株抗體（片段）基因，藉由公知之方法與IgG抗體 基因之該區域重組，可得到單株IgG抗體基因。 再者，本發明之抗體可藉由將從人類或上述溫血動物 單離之產抗體細胞在試管中，藉由本身公知之方法以本發 明之抗原免疫後，以與（a)所記載者同樣之方法製作融合瘤 、而得到。 ^ · 56 319597 200823235 (C)單株抗體之製造 本發明之單株抗體’可藉由培養（a)所得到之產生單株 抗體之融合瘤而製造；或者藉由培養人為地表現下列基因 之重組細胞株而製造：以公知方法從（a)所得之產生單株抗 體之融合瘤單離而得之抗體基因、或（b)所得之單株抗體美 因。再者’可將該抗體基因藉由公知之方法併入溫血^ 或植物之染色體中’並使其產生於溫血動物之血液、乳汁、 卵或植物體、黴等中而製造[Curr· Opin. Biotechnol. 7, ⑩ 536(1996)、Nature Rev. Genet 4, 794(2003)、Appl· Environ·
Microbiol.70, 2567(2004)]。關於溫血動物，可使用牛、山 羊、羊、豬、雞、小鼠、兔子等。關於植物，可使用煙草、 玉米、馬鈐薯、浮萍等。 … 本發明之單株抗體，可藉由本身公知之方法，例如免 疫球蛋白之分離精製方法[例如鹽析法、醇沉澱法、等電點 /儿炎法、離子父換層析法、疏水性交互作用層析法、逆相 籲層析、旋膠過濾層析法、羥基填灰石層析法、籍由固定有 對於杬原或蛋白質A、蛋白質G等抗體有親和性之物質之 支持體分離糈製出單獨抗體之親和層析法等各種層析 法]，從含上述單株抗體之原料得到。 (3)含有本發明抗體之醫藥 含有上述本發明抗體之醫藥，可使用作為 例如癌 (例如大腸癌、乳癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝 臟癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子官癌、卵巢癌、 睪丸癌、曱狀腺癌、胰臟癌、腦腫瘤、血浪腺瘤等）之預防 〇 … 319597 200823235 及m療劑（以乳癌、肺癌、大腸癌、前列腺癌、卵巢癌、胰 臟癌等之預防及治療劑為較佳）、癌細胞之凋亡促進劑、癌 細胞之增殖阻礙劑、癌細胞之細胞週期變化之誘發劑、癌 轉移抑制劑、癌細胞之接著阻礙劑、利用經由抗體之Fc 區域之活體防禦機制之癌細胞障礙劑、抗體依存性之癌細 胞毒殺劑等。關於利用經由抗體之Fe區域之活體防禦機制 之癌細胞毒殺方法，可列舉藉由身體之效應（effect〇r)細胞 之抗體依存性細胞毒殺活性（Antib〇dy·以…“加 ceii_mediated Cyt〇t〇xicity; ADCC)或補體依存性細胞毒殺 活 I*生（Complement- Dependent Cytotoxicity ; CDC);以使用 ADCC為較佳。 …含有本發明抗-體之醫藥為低毒性，可以本身為液劑之 形式:製成適當劑型之醫藥組成物，經口或非經口投與⑽ 如血管内投與、皮下投與等）至哺乳動物（例如大鼠、兔子、 羊、豬、牛、貓、狗、猴子等）。 成物ίΓ之抗體，可投與其本身’或製成適當的醫藥組 W又/、。關於投與所用之醫藥組成物，可為含有本發明 鹽以及藥理學上容許之支持體、稀釋劑或賦形劑 ^樂組成物可製成適於經口或非經Π投與之劑型 向知供。 劑等關tr經口投與用之組成物，可使用例如注射劑、栓 :”㈣可包括靜脈注射劑、皮下注射劑、皮内注 t時劑、點滴注射劑等劑型。此等注射劑可依: 調製m射劑之調製方法，例如，可藉ζ 319597 58 200823235 :本么月之4几體或其鹽在上述一般注一 液或油性液中溶解、懸浮或乳化而調製。關於=囷水性 性液，例如可以使用生理食鹽水、包含 戈用之水 華之望？^ 1糖或其他補助 醇)、，,亦可與適當的溶解補助劑，例如醇(如乙 •夕兀醇（如丙二醇、聚乙二醇）、非離子界面活 如聚山梨醇酐酯8〇、H /蜊[例 rsn替甘、 惠麻子油之聚氧伸乙其 (莫耳)加成物）等併用。關於油性液，可使用，例如 ►二Γ等；且可與作為助溶劑之苯甲酸苯甲醋、苯 直:二=所調製之注射液以充填入適當安瓶為較佳。 劑所，可藉由將上述抗體或其鹽與-般检 w尸/r用之基劑混合而調製。 關於經口投與用之組成物，為固體或液體劑型， 舉錠雌括糖衣錠、膜衣錠）、丸劑、顆粒劑二 月¥、膠展劑（包括軟膠囊劑）、糖漿劑、乳劑、懸浮劑等。 如士述之組成物可藉由公知之方法製造，可含有製劑領域 所系用之支持體、稀释劑或賦形劑。關於錠劑所用之支持 體及賦形劑’可使用例如乳糖、澱粉、蔗糖、硬脂酸鎂。 、上述非經口用或經口用之醫藥組成物宜調製成適於活 成刀之投與量之投藥單位之劑型。關於此等投藥單位之 j型’可列舉如錠劑、丸劑、膠囊劑、注射劑（安瓿）、栓 d關於抗體之含量，每投藥單位劑型通常含有5至5〇〇 mg 上述^體，更特定而言，就注射劑而言，含5至1〇0 mg, 上述抗體，就其他劑型而言，含1〇至25〇 mg上述抗體。 3有本發明抗體·之上述預防或治療劑、調節劑之投與 59 319597 200823235 量隨投與對象、所針對之疾病、症狀、投與途徑等而異， 例如，在用於成人乳癌之治療及預防時，宜藉由靜脈注射 投與本發明之抗體，每次通常約〇·〇1至20 mg/kg體重， 以約0.1至10 mg/kg體重為較佳，以約0.1至5 mg/kg體 重為更佳，每日約1至5次，以每日約1至3次為較佳。 在其他非經口及經口投與之情形，亦可投與以其為基準之 量。在症狀特別嚴重之情形，可視其症狀而增加劑量。 本發明之抗體可以其本身或適當之醫藥組成物投與。 •上述投與所用之醫藥組成物係包含上述抗體或其鹽以及藥 理學上容許之支持體、稀釋劑或賦形劑者。該組成物可製 成適於經口或非經口投與（例如血管内注射、皮下注射等） 之劑型。 再者，上述各組成物可含有與上述抗體配合時不會產 生不良交互作用之其他成分。 再者，本發明之抗體可與其他藥劑併用，此等藥劑例 馨如為烧化劑（例如環填醯胺（cyclophosphamide)、異環樓酸 胺（ifosfamide)等）、代謝拮抗劑（例如甲胺喋呤 (methotrexate)、5-氟尿,^(5-fluorouracil)等）、抗癌性抗 生物質（斜如絲裂黴素（mitomycin)、阿黴素（adriamycin))、 來自植物之抗癌劑（例如長春新驗（vincristine)、長春地辛 (vindesin)、紫杉醇（taxol)等）、順銘（cisplatin)、卡翻 (carboplatin)、愛托氧化物（^〇卩〇乂1(16)、愛萊諾迪肯 (irinotecan)等。本發明之抗體及上述藥劑可於同時或不同 ，時間投與至患者。 · . 60 319597 200823235 (4)使用本發明抗體之Nectin-2之定量法 本發明之抗體，由於可以特異性地識別Nectin-2，所 以可用於受檢液中Nectin-2之定量，尤其是藉由三明治式 免疫測定法之定量等。 亦即，本發明提供： (i) 一種受檢液中之Nectin_2之定量法，其特徵為：使 本發明之抗體與受檢液及經標識化之Nectin-2競爭性地反 應，並測定結合於該抗體之經標識化Nectin-2之比例；
(ii) 一種受檢液中之Nectin-2之定量法，其特徵為：使 受檢液與支持體上不溶化之本發明抗體及經標識之本發明 之其他抗體同時或連續地反應之後，測定不溶化支持體上 之標識劑之活性；以及 (iii) 一種受檢液中之Nectin-2之定量法，其特徵為： 使受檢液與支持體上不溶化之本發明抗體反應，藉由例如 表面電漿共振（Surface Plasmon Resonance: SPR)等檢測法 測定結合於不溶化支持體之Nectin-2之量之變化而測定。 在上述（ii)之定量法中，以使用Nectin-2之結合部位不 同之抗體為較佳。… 再者，在使用本發明之抗體進行Nectin-2之定量方 面，可進行藉由組織染色等之檢測。在此等目的方面，可 以使用抗體分子本身，亦可以使用抗體分子之F(ab’)2、Fab’ 或F ab部分。 使用本發明抗體之Nectin-2之定量法無特別之限制， 只要係藉由化厚或物理方法檢測出對應於被測定液中抗原 61 319597 200823235 量G列如蛋白質量）之抗體、抗原或抗體_抗原複合體之量， 並從使用含已知量抗原之標準液所製作之標準曲線計算出 ectin 2之里之方法，則可使用任一種測定法。例如適合 使用琴射比濁法（nephelometry)、競爭法、免疫測定法、抓 法及三明治法，就感度及特異性之觀點而言，以使用下述 三明治法為特佳。 關於使用標識物質之測定法所用之標識劑，例如，可 以使用放射性同位素、酵素、螢光物質、發光物質等。關 鳙於放射性同位素，例如可以使用、[nii]、、pc] 等。關於酵素，以使用安定且比活性大者為較佳，例如可 使用β-半乳糖普酶（p-gaiactosidase)、葡萄糖普酶、驗性 碟酸酶、過氧化酶、韻果酸脫氫酵素等。關於榮光物質5 可以使用例如菁類（cyanine)螢光色素（例如Cy2、、
Cy5、Cy5.5、Cy7(AmarSham Bi〇scienee)等）、螢米胺 (Fluorescamin)、螢光素異硫氰酸酯、Fiu〇r色素 鲁(Invitrogen公司）、銪螢光錯合物（perkin Elmer公司）等’。、 關於發光物質，可以使用，例如，魯求諾（lumin〇1)、魯米 諾衍生物、蟲螢光素（iuciferrin)、光澤精(lucigenin)等。再 者，於抗體或抗原與標識劑之結合上，可以使用生物素 (biotin)-抗生物素蛋白（avidin)系統。 、 抗原或抗體之不溶化’可以採用物理吸附，亦可採用 不溶化、固定化蛋白質或酵素等時通常所用之使用化學鍵 結之方法。在將抗原或抗體不溶化時，可將該等蛋白質 生物素標識，-並使鏠黴抗生物素蛋白（streptav..idin)結合至 319597 62 200823235 預先不溶化之支持體。在將抗體不溶化時，使蛋白質A、 蛋白質G、抗免疫球蛋白抗體等結合至不溶化之支持體。 關於支持體’卩列舉填脂糖、葡聚糖咖以㈣、纖維素等 不/合性夕糖類，聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚矽氧等合成樹 脂；或玻璃等。 在三明治法中，使受檢液與本發明之抗體反應（一次反 應），再與經標識之其他本發明抗體反應（二次反應）後，藉 由測疋不’谷化支持體上標識劑之活性，可以定量受檢液中 本毛月A白貝之里。一次反應及二次反應可以相反順序進 订二再者，可同時進行，亦可錯開時間進行。標識化劑及 不命化之方法可以上述者為基準。再者，在藉由三明治法 之免疫測定法中，固相用抗體或標識用抗體所用之抗體非 必須為-種，就提高測定靈敏度之目的而言，可使用二種 以上抗體之混合物。 在使用本务明之二明治法之Nectin_2測定法中，一次 反應及二次反應所用之本發明抗體以使用Nectin_2之結合 部位不同之抗體為較佳。 可將本發日狀抗❹於三日㈣法以外之測定系統，你 如競爭法、免疫測定法、SPR法或散射比濁法等。 在競爭法中，.使受檢㈣之抗職標識抗原與抗體進 订競筆反應後，將未反應的標識抗原（F)與和抗體結合之標 識抗原（B)分離（B/F分離），測定B與F任一者之標識量^ 以定量受檢液中之抗原量。在本反應法中，可採用：：可 溶性抗體作為抗體Μ吏用-聚乙二醇、在十對上述抗體之第二 319597 63 200823235 抗體等進行B/F分離之液相法；以及用固相化抗體作為第 一抗體、或者用可溶性抗體作為第一抗體且用固相化抗體 作為第二抗體之固相化法。 在免疫測定法中，使受檢液中之抗原及固相化抗原與 定里標識化抗體進行競爭反應後，分離固松與液相；或 者使文檢液中之抗原與過剩量之標識化抗體反應，繼而加 入固相化抗原並使未反應之標識化抗體結合於固相後，分 離固相與液相。接著，測定任一相之標識量及定量受檢液 •中之抗原量。 在SPR法中，於玻璃基板上所形成之金薄膜表面上使 抗體不’合化，使叉檢液通過該薄膜上面，並使用表面電漿 ，、振（8?11)之原理（蛋白質核酸酵素，37，2977_29料 (1992))定量與薄膜上抗體結合之受檢蛋白質之量之變化。 再者，在散射比濁法中，測定凝膠内或溶液中抗原抗 體反，之結果所生成之不溶性沉降物之量。在受檢液中之 1抗原里少’僅得到少量沉卩备蘇主 、散射之雷射散射^法採㈣”射 ^個此等免疫學敎法用於本發明之定量法時，益 須^㈣之條件及操作等。在個別之方法中—般之條件 及麵作法，除本業人士通常之技術考慮之外，只要能建構
Ne^n-2 ^ ^ ^ ^ gp ^ 〇 ^ f ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 及明，可參照總論及出版書籍。 " 言之’可以參照:入江寬編著「放射性免疫檢定」 ㈣社哪49铸行）H編著「放㈣免= 319597 64 200823235 續編」（講談社，昭和54年發行）、石川榮治等人編著「酵 素免疫測定法」（醫學書院，昭和53年發行）、石川榮治等 人編著「酵素免疫測定法」（第2版）（醫學書院，昭和57 年發行）、石川榮治等人編著「酵素免疫測定法」（第3版）（醫 學書院，昭和62年發行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol· 70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques(Part B))、同書 Vol· 74 (Immunochemical Techniques(Part C))、同書 Vol. 84 ® (Immunochemical Techniques(Part D · Selected
Immunoassays)) ^ 1¾ ^ Vol. 92(Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol· 121(Immunocliemical Teclmiques(Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以 上均由Academic Press發行）。 如上述’藉由使用本發明之抗體可以良好靈敏度地定 •量 Nectin-2 〇 (5)使用本發明抗體之診斷劑及診斷方法 在藉由使用本發明之抗體定量Nectin-2之濃度，以檢 測Nectm-2之濃度增加之情形，可以診斷出，例如，癌（例 如大勝癌、乳癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝臟 癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、即巢癌、 睪丸癌、曱狀腺癌、胰臟癌、腦腫瘤、血液腫瘤等）或將來 罹患癌之可能性高者。 再者，本發J月之抗體可用於檢測存在於體液或組織等 65 319597 200823235 受檢體中之Nectin-2。亦可用於精製Nectin-2用之抗體管 柱之製作、精製時各部分所含Nectin-2之檢測、受檢細胞 内之Nectin-2之行為分析等。 (6)與本發明之乳癌之預防或治療劑中所使用之抗體為競 爭性結合之抗體的篩選 本發明之乳癌之預防或治療劑中所使用之抗體可使用以 Necl-803-2(FERM BP-10417) >
Necl-244-3(FERM BP-10423)、 _ Necl-530-l(FERM BP-10424)、
Necl-903-l(FERM BP-10425)、
Necl-520-l(FERM BP-10426)、
Necl-845-2(FERM BP-10427)、
Necl-834-l(FERM BP-10428)、
Necl-964-l(FERM BP-10683)、
Necl-1302-2(FERM BP-10684)、
Necl_554_l(FERM BP_10681)、
Necl-769-2(FERM BP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM BP-10685) 所示之融合瘤細胞產生的單株抗體（以下，亦稱為本發明所 使用抗體）。 再者，本發明所使用抗體包含具有該等融合瘤所產生 抗體之特定CDR胺基酸序列或可變區域胺基酸序列之遺 傳工程學上所產生之抗體（包含抗體片段）。 … 抗體之重鏈及輕鏈之N末端侧存在可，變區域，分別稱 66 319597 200823235 為重鏈可變區域（VH)與輕鏈可變區域（VL)。可變區域内存 在互補性決定區域（complementary determining region: CDR)，該部分擔任抗原識另的特異性。可變區域的CDR 以外部份，具有保持CDR構造的角色，稱為框架區域 (framework region; FR)。重鏈及輕鏈之C末端側存在怪定 區域，分別稱為重鏈恆定區域（CH)與輕鏈恆定區域（Cl)。 重鏈可變區域中存在第一互補性決定區域（CDR1 )、第二互 補性決定區域(CDR2)及第三互補性決定區域（CDR3)。重鏈 春可變區域中的三種互補性決定區域總稱為重鏈互補性決定 區域。輕鏈可變區域中亦相同地，存在第一互補性決定區 域（CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2)及第三互補性決定 區域（CDR3)。輕鏈可變區域中的三種互補性決定區域總稱 為輕鏈互補性決定區域。 本發明所使用抗體之CDR胺基酸序列與鹼基序列，各 自如後文所述之表21至24所示者。 m 抗體重鏈可變區域之第一互補性決定區域（CDR1)、第 二互補性決定區域（CDR2)及第三互補性決定區域（CDR3) 之胺基酸序列分別具有與（i)選自序列編號：184、200、 216、232、248、264、280及296所成組群中之序列編號， (ii)選自序列編號·· 185、201、217、233、249、265、281 及297所成組群中之序列編號以及（iii)選自序列編號： 186、202、218、234、250、266、282 及 298 所成組群中 之序列編號所示之胺基酸序列同一之胺基酸存列。 - 抗體輕鏈可變區域之第一互補性決定區喊（CDR1)、第 67 319597 200823235 二互補性決定區域（CDR2)及第三互補性決·定區域（CDR3) 之胺基酸序列，分別具有與（iv)選自序列編號：192、208、 224、240、256、272、288及304所成組群中之序列編號， (v)選自序列編號：193、209、225、241、257、273、289 及305所成組群中之序列編號，（vi)選自序列編號：194、 210、226、242、258、274、290及306所成組群中之序列 編號所不之胺基酸序列。 本發明所使用抗體中，CDR以外之胺基酸序列不特別 _限定，CDR以外之胺基酸序列為其他抗體，特別是源自他 種的抗體，或者CDR移植抗體包含於本發明所使用抗體。 CDR以外之胺基酸序列較佳為源自人類之胺基酸序列，必 要時亦可於框架領域（FR)伴隨有1至數個的胺基酸殘基之 附加、缺失、置換及/或插入。 本發明所使用抗體中，抗體可變區域之胺基酸序列及 驗基序列，較佳為表25所揭示者。含有本發明所使用抗體 馨之特定CDR胺基酸序列或可變區域之胺基酸序列之單株 抗體，可使用習知方法製作。 (ii)與本發明之乳癌之預防或治療劑中所使用之抗體 針對Nectin-2為競爭性結合之抗體以 . · ， . . --
Necl-803-2(FERM BP-10417)、
Necl-244-3(FERM BP_10423)、 - - · · Necl-530-l(FERM BP-10424) >
Necl,903-1(FERM BP-10425)、
Necl-520-l(FERM BP-10426) v … 68 319597 200823235
Necl-845-2(FERM BP-10427) >
Necl-834-l(FERM BP-10428) >
Necl-964-l(FERM BP-10683)、
Necl-1302-2(FERM BP-10684)、
Necl-554-l(FERM BP-10681)、
Necl-769-2(FERM BP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM BP-10685) 所示之融合瘤細胞產生的單株抗體，或具有該等融合瘤所 _產生抗體之特定CDR胺基酸序列或可變區域胺基酸序列 ，之遺傳工程學上所產生之抗體（包含抗體片段），與針對 Nectin-2為競爭性結合之單株抗體（以下，稱為與本發明所 使用抗體為競爭性結合之抗體），可根據下述方法製得。 (iii)與本發明所使用抗體為競爭性結合之抗體，可藉由 測定針對Nectin-2為競爭性結合結果的測定法篩選而獲得。 篩選所使用之「Nectin-2」，為序列編號：1所示之胺 修基酸序列（以下，簡稱為Nectin-2a)或序列編號：3所示之 胺基酸序列（以下，簡稱為Nectin-25)(以下，兩者合稱為 Nectin-2或本發明所使用蛋白質）。可為源自人類或溫血動 物的細胞或組織之蛋白質，亦可為基因重組之蛋白質。再 者，亦可為序列編號：1或序列編應：3所示胺基酸序列之 部分序列所示之肽，例如，可使用序列編號：1 (Nectin-2a) 或序列編號：3(Nectin-25)所示胺基酸序列之第1至350號 (細胞外區域）胺基酸序列所示之肽、序列編號：1 (Nectin-2a) 或序列編號：3(Neetin-25)所示胺基酸序列之第47至142 69 319597 200823235 號（第1的IG樣結構域）或第175至24〇號（第2的1〇樣結 構域）之胺基酸序列所示之肽等。進一步地，亦可為：〇末 端之羧基為經酯化或醯胺化者；N末端之胺基酸殘基（例如 甲硫胺酸殘基）之胺基使用保護基保護者；分子内之胺基酸 侧鏈上的取代基使用適當保護基保護者；或者經結合糖鏈 或糖肽等複合肽等，亦包含生理學上容許的酸（例如無機 酸、有機酸）或驗(例如驗金屬鹽)等鹽的形態。 此處’「競爭性結合的抗體」係指藉由過量添加本發明 鲁所使用抗體之任一者而針對Nectin_2結合為競爭性阻礙的 抗體。具體而言，針對Nectin-2結合試驗時所供給之受驗 抗體，相對於該受驗抗體，添加50倍莫耳量之本發明所使 用抗體之任一者時，該試驗抗體之針對Neetin_2結合為 50%以上受到阻礙之抗體。 本文中，本發明所使用抗體包含嵌合抗體、人類化抗 體、人類抗體。「嵌合抗體」意指具有源自異種抗體之可變 鲁區域與人類抗體恒定區域之抗體（例如，參照歐洲專利公開 公報EP0125023等）。「人類化抗體」為改變大氣等人類異 種的抗體，以人類抗體的對應之一次構造置換Η鏈與l鏈 之互補性決定部位以外的一次榛造的抗體。「人類抗體」意 指使用經導入有人類抗體之'基因之基因轉殖動物所製作之 單株抗體（參照歐洲專利公開公報ΕΡΌ546073)以及於噬菌 體、大腸桿菌、酵母菌、動物細胞等細胞表面或微脂體 (liposome)上提示使用資料庫或抗體展現技術所製作之單 株抗體（Nature.Biotechnology 23，1105(2005))，以及產生針 70 319597 200823235 對Nectinj之抗體的b細胞使用細胞融合法或噬菌體展現 法等技術所單離之單株抗體。本發明所使用抗體，較佳為 抗體的恆定區域為人類抗體，更較佳為人類IgG，再較佳 為屬於人類IgG亞群（IgG subclass)之單株抗體。 (7) 本發明之乳癌之預防或治療劑 含有上述本發明所使用抗體或與Nectin_2競爭性結合 的本發明所使用抗體之醫藥，為乳癌之預防或洽療劑，係 利用經由抗體之Fc區域的活體防禦機制之乳癌的預防或 鲁治療劑，可使用作為抗體依存性之乳癌細胞毒殺劑等。利 用經由抗體之Fc區域的活體防禦機制之乳癌細胞毒殺方 法，可列舉藉由活體的有效細胞之抗體依存性細胞毒殺活 性（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity; ADCC)或補 體依存性細胞毒殺活性（Complement-Dependent Cytotoxicity; CDC)，較佳使用 ADCC。 (8) 本發明更包含以下的發明。 • 亦即，本發明為以 Necl_1044-4(FERM ABP-10805)、 Nec8-3517-11(FERM ABP-10806)或 Nec8-3704-7(FERM ABP-10807)所表示之融合瘤細胞；以Necl-1044-4(FERM ,ABP-10805)、Nec8-3517-11(FERM ABP-10806)或 Nec8-3704-7(FERM ABP_10807)所表示之融合瘤細胞產生之單 株抗體；與以 Necl-1044-4(FERM ABP-10805)、Nec8-3517-11(FERM ABP-10806)或 Nec8-3704'7(FERM ΑΒΡ-10807)所表示之融合瘤細胞產生之單株抗體為競爭性結合 的單株抗體；以及含有該等單株抗體之乳癌之預防或洽療 71 319597 200823235 劑。 相關發明可與上述（6)至（7)所揭示之實施態樣同樣的 方式實施。 融合瘤細胞Necl_1044_4係以寄存編號 FERM ABP-10805由2007年4月3日起寄存於日本國茨城縣筑波 市東1 丁目1番地1中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立 行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄託中心。 融合瘤細胞Nec8-3517-ll係以寄存編號FERM ABP-10806由2007年4月3日起寄存於日本國茨城縣筑波 市東1 丁目1番地1中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立 行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄託中心。 融合瘤細胞Nec8-3704-7係以寄存編號FERM ABP-10807由2007年4月3日起寄存於日本國茨城縣筑波 市東1 丁目1番地1中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立 行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄託中心。 在本說明書中，鹼及胺基酸以簡稱表示時，係採用依 據 IUPACMUB Commission on Biochemical Nomenclature) 之簡稱或該領域中習用之簡稱，其例記載於下。再者，關 於胺基酸，可以得到光學異構體之情形，若未特別明示， 表不L·體。 DNA :去氧核糖核酸 cDNA ·互補之去氧核糖核酸 A 」腺嘌呤 T :胸腺嘧啶 . Λ 72 319597 200823235 G :鳥嘌呤 C :胞癌咬 RNA :核糖核酸 mRNA :傳信核糖核酸 dATP 去氧腺苦三磷酸 dTTP :去氧胸苷三磷酸 dGTP :去氧鳥苷三構酸 dCTP :去氧胞苷三磷酸 ATP :腺苷三磷酸 EDTA :乙二胺四乙酸 SDS :十二基硫酸鈉 Gly :甘胺酸 Ala :丙胺酸 Val :纈草胺酸 Leu :白膦酸 lie :異白胺酸 Ser :絲胺酸 Thr :羥丁胺酸 Cys :胱胺酸 Met :甲硫胺酸 Glu :麩胺酸 Asp :天冬胺酸 Lys :離胺酸 Axg :精胺酸. 200823235
His :組胺酸 Phe :苯丙胺酸 Tyr ••酪胺酸 Trp :色胺酸 Pro :脯胺酸 Asn :天冬醯胺酸 Gin ••楚醯胺酸 pGlu :焦麩胺酸
Sec :硒代半胱胺酸（selenocysteme) 本說明書之序列表之序列編號，示於以下之序列中。 [序列編號：1] 表示Nectin_2a之胺基酸序列。， [序列編號：2] 表示編碼具有序列編號：1所示之胺基酸序列之Nectin-2a 之DNA驗基序列。 •[序列編號：3] 表示Nectin-23之胺基酸序列。 • · · , .
[序列編號·· 4] 表示編碼具有序列編號：3所示之胺基酸序列之Nectin-23 之DNA驗基序列。 [序列編號：5] 表示Nectin-3之胺基酸序列。 [序列編號：ό] 表示編碼具有序列編號：5 .所示之胺基酸序列之；Nectin-3 74 319597 200823235 之DNA驗基序列。 [序列編號：7；| 之驗基序 表示參考例1及參考例2所用之反義寡核苷酸 列。 [序列編號：8] 表不參考例1及參考例2所用之對照寡核芽酸1之鹼基序
[序列編號·· 9] 表示參考例2所用之引子1之鹼基序列。 [序列編號：10] 表不參考例2所用之引子2之鹼基序列。 [序列編號：11] 〇 表示參考例2所用之TaqMan探針i之鹼基序列 [序列編號：12] 表示參考例2所用之引子3之驗基序列。 •[序列編號：13] 表示參考例2所用之引子4之驗基序列。 [序列編號:14] 表示參考例2所用之TaqMan探針2之鹼基序列。 [序列編號：15] 表不芩考例3及參考例4所用之引子5之鹼基序列。 [序列編號：16] 表不參考例3所用之引子6之驗基序列。 [序列編號：17] 319597 75 200823235 之驗基序列 表示參考例4所用之引子7 [序列編號：18j 表示參考例5所用之引子8之鹼基序列。 [序列編號：19] 表示參考例5、參考例6及參考例7所用之siRNA-1之 基序列。 [序列編號：20]
表示參考例5、參考例6及參考例7所用之siRNAq之 基序列。 [序列編號：21] 表示參考例5、參考例6及參考例7所用之siRNA_2之鹼 基序列。 [序列編號：22] 表示參考例5、參考例6及參考例7所用之siRNA_2之鹼 基序列。 •[序列編號：23] 表示參考例5、參考例6及參考例7所用之311〇^人_3之鹼 基序列。 [序列編號：24] — 表示參考例5、參考例6及參考例7所用之碰做_3之鹼 基序列。 [序列編號：25] . Ϊ 表示參考例5、參考例6及灸老仏| 7 m / 久，号例7所甩之siRNA-4之鹼 基序列。 319597 76 200823235 [序列編號：26] 表示參考例5、參考例6芬会土/ , β « 可1 j b及翏考例7所用之siRNA-4之鹼 基序列。 [序列編號：27] 表不夢考例5、芩考例6及參考例7所用之siRNA_5之鹼 基序列。 [序列編號·· 28] 表不蒼考例5、參考例6及參考例7所用之siRNA_5之驗 •基序列。 [序列編號：29] 表示參考例12所用之引子33之鹼基序列。 [序列編號：30] 表示參考例12使用之引子34之鹼基序列。 [序列編號·· 31 ] 表示Nectin-2ED-FLAG蛋白質之胺基酸序列。 •[序列編號·· 32] 、 表示編碼序列編號:31所示之Nectin-2ED-FLAG蛋白質之 胺基酸序列之DNA之驗基序列。
[序列編號：33L 表示參考例15所用之引子33之驗基序列。 [序列編號：34] 表示參考例15所用之引子34之鹼基序列。' [序列編號：35] 表示參考例15,所用之引子3 5之驗基序列。 77 319597 200823235 [序列編號：36] 表示參考例15所用之引子36之驗基序列。 [序列編號：37] 表示Nectin-2ED-hFc蛋白質之胺基酸序列。 [序列編號：38] 表示編碼序列編號：37所示之Nectin-2ED-hFc蛋白質之胺 基酸序列之DNA鹼基序列。 [序列編號：39] ®表示參考例17所用之肽1之胺基酸序列。 [序列編號：40] 表示參考例17所用之肽2之胺基酸序列。一 [序列編號：41] 表示參考例士7所用之肽3之胺基酸序列。 [序列編號：42] 表示參考例18及參考例19所用之引子42之鹼基序列。 •[序列編號：43] 表示參考例18及參考例19所用之引子43之鹼基序列。 [序列編號:· 44] 表示麥考例及參考例19所用之TaqMan探針3之鹼基 序列。 [序列編號：45] 表不蒼考例21所用之引子45之鹼基序列。 [序列編號：46] 參考例21所用之引子46之鹼基序列。 78 319597 200823235 [序列編號：47] 表示參考例21所用之引子47之鹼基序列。 [序列編號：48] 表示參考例21所用之引子48之鹼基序列。 [序列編號：49] 表示Nectin-3ED-liFc蛋白質之胺基酸序列。 [序列編號：50] 表示編碼序列編號:49所示之Nectin-3ED-hFc蛋白質之胺 基酸序列之DNA驗基序列。 [序列編號：51] 表示Nectin-3ED-mFc蛋白質之胺基酸序列。 [序列編號：52] 表示編碼序列編號:51所示之Nectin-3ED-mFc蛋白質之 胺基酸序列之DNA驗基序列。 [序列編號：53] •表示編碼參考例25所用之FLAG蛋白質(FLAG-FSALNOT) 之胺基酸序列之DNA鹼基序列。 [序列編號：54] 表示編碼參考例25所用之FLAG蛋白質（FLAG-RSALNOT) 之胺基酸序列之DN A鹼基序列。 [序列編號：55] 表示參考例25所用之引子55之鹼基序列。 [序列編號：56] 表示參考例25所用之引子56之鹼基序列。 79 319597 200823235 [序列編號：57] 表示Nectin_3ED-FLAG蛋白質之胺基酸序列。 [序列編號：58]
表示編碼Nectin-3ED-FLAG蛋白質之胺基酸序列之DNA 驗基序列。 [序列編號：59] 表示參考例29所用之引子59之鹼基序列。 [序列編號：β0] 籲表示參考例29所用之引子60之鹼基序列。 [序列編號：61] 表示編碼Nectin-Ι蛋白質之胺基酸序列之DNA驗基序列。 [序列編號：62] 表示Nectin-l·蛋白質之胺基酸序列。 [序列編號：03] 表示參考例29所用之引子63之鹼基序列。 •[序列編"5虎· 64] 表示參考例29所用之引子64之鹼基序列。 … [序列編號：65] 表示參考例29所用之引子65之鹼基序列。 [序列編號：66] 表示參考例29所用之引子66之鹼基序列。 [序列編號：67] 表示編碼Nectin-4蛋白質之胺基酸序列之DNA驗基序列。 [序列編號·*、68] 80 319597 200823235 表示Nectin-4蛋白質之胺基酸序列。 [序列編號：69] 表示參考例29所用之引子69之鹼基序列。 [序列編號：70] 表示參考例29所用之引子70之鹼基序列。 [序列編號·· 71] 表示Necl-5蛋白質之胺基酸序列。 [序列編號：72] •主- 表不編碼Necl-5蛋白質之胺基酸序列之DNA鹼基序列。 [序列編號：73] 表示參考例30所用之引子73之鹼基序列。 [序列編號：74] 表示參考例30所用之引子74之鹼基序列。… [序列編號：75] 表示參考例30所甩之引子75之鹼基序列。 •[序列編號·· 76] 表示參考例30所用之引子76之鹼基序列。 [序列編號：77] 表示參考例30所用之引子77之鹼基序列。 [序列編號：78] 表不欠缺Nectin-2之Igi域之蛋白質之胺基酸序列。 [序列編號：79] 表示編碼欠缺、Nectin_2之Igl域之蛋白質之胺基酸序列 IWA鹼基序列。 81 319597 200823235 [序列編號：80』 表不人缺Nectm-2之ig2域之蛋白質之胺基酸序列。 [序列編號：81] 之Ig2域之蛋白質之胺基酸序列 表示編碼欠缺Neetin_2 DNA鹼基序列。 [序列編號：82] 表示參考例31所用之引子82之驗基序列。 [序列編號：δ3] •表示參考例31所用之引子83之鹼基序列。 [序列編號：84] 表示參考例31所用之引子84之驗基序列。 [序列編號：85] 表示參考例31所用之引子85之鹼基序列。 [序列編號·· δ6] 表示食蟹猴Nectin_2蛋白質之胺基酸序列。 •[序列編號：δ7] 表不編碼食蟹猴Nectin-2蛋白質之胺基酸序列之DNA 基序列。 [序列編號·· 88] 表示參考例32所用之引子88之鹼基序列。 [序列編號:89] 表示參考例32所用之引子89之鹼基序列。 [序列編號：90] 表’,、參考例33所用之引子9〇之驗基序列。… 82 319597 200823235 [序列編號：91] 表示參考例33所用之引子91之鹼基序列。 [序列編號：92] 表示參考例33所用之引子92之鹼基序列。 [序列編號：93] 表示參考例33所用之引子93之驗基序列。 [序列編號：94] 表示參考例33所用之引子94之鹼基序列。 镛[序列編號：95；] 表示參考例33所用之引子95之鹼基序列。 [序列編號：96] 表示參考例33所用之引子96之鹼基序列。 [序列編號：971 表不參考例33所用之引子97之鹼基序列。 [序列編號·· 98] #表示參考例34所用之引子Q37A之鹼基序列。 [序列編號：99] 表示參考例34所用之引子Q37ar之鹼基序列。 t序列編號：100] 表示參考例34所用之引子P40G之鹼基序列。 [序列編號：ιοη 表不夢考例34所用之引子P40G R之鹼基序列。 [序列編號：102] 表示參考例34所用之引子Q45A之鹼基序列。 83 319597 200823235 [序列編號：103] 表示參考例34所用之引子Q45AR之鹼基序列。 [序列編號：104] 表示參考例34所用之引子H55A之鹼基序列。 [序列編號：105] 表示參考例34所用之引子H55A R之鹼基序列。 [序列編號：106] 表示參考例34所用之引子V60A之鹼基序列。 •[序列編號：107] 表示參考例34所用之引子V60AR之鹼基序列。 [序列編號· 10 8 ] 表示參考例34所用之引子Y64A之鹼基序列。 [序列編號：109] 表示參考例34所用之引子Y64AR之鹼基序列。 [序列編號·· 110] 馨表示參考例34所用之引子Q71A之鹼基序列。 [序列編號：111] 表示參考例34所用之引子Q71AR之鹼基序列。 [序列編號：112] 表示參考例34所用之引子A75G之鹼基序列。 [序列編號：113] 表示參考例34所用之引子入750 11之鹼基序列。 [序列編號：114] 表示參考例34所用之引子P76G之鹼基序列。 84 319597 200823235 [序列編號：115] 表示參考例34所用之引子之P76GR之鹼基序列。 [序列編號：116] 表示參考例34所用之引子A77G之鹼基序列。 [序列編號：117] 表示參考例34所用之引子A77GR之鹼基序列。 [序列編號：118] 表示參考例34所用之引子N78A之鹼基序列。 •[序列編號：119] 表示參考例34所用之引子N78AR之鹼基序列。 [序列編號：120] 表示參考例34所用之引子H79A之鹼基序列。 [序列編號：121] 表示參考例34所用之引子H79AR之鹼基序列。 [序列編號：122] 書表示參考例34所用之引子Q80A之鹼基序列。 [序列編號：123] 表示參考例34所用之引子Q80A R之鹼基序列。 [序列編號：124] 表示參考例34所用之引子N81A之鹼基序列。 [序列編號：125] 表示參考例34所用之引子N81AR之鹼基序列。 ，[序列編號:126] 表示參考例34所用之引子K88A之鹼基序列9 85 319597 200823235 [序列編號：127] 表示參考例34所用之引子K88A R之鹼基序列。 [序列編3虎· 12 8 ] 表示參考例34所用之引子S95A之鹼基序列。_ [序列編號：129] 表示參考例34所用之引子895入尺之鹼基序列。 [序列編號：130] 表示參考例34所用之引子K109A之鹼基序列。 •[序列編號：131] 表示參考例34所用之引子K109AR之鹼基序列。 [序列編號：132] 表示參考例34所用之引子E117A之鹼基序列。 [序列編號：133] 表示參考例34所用之引子E117AR之鹼基序列。 [序列編號：134] •表示參考例34所用之引子D122A之鹼基序列。 [序列編號：135] 表示參考例34所用之引子D122A R之鹼基序列。 [序列編號·· 136] 表示參考例34所用之引子H128A之鹼基序列。 [序列編號：137] \ 表示參考例34所用之引子H128AR之驗基序列。 [序列編號：138] 表示參考例34所用之引子N137A之鹼基序列。 86 319597 200823235 [序列編號：139] 表示參考例34所用之引子N137A R之鹼基序列。 [序列編號：140] 表示參考例34所用之引子F145A之鹼基序列。 [序列編號：141] 表示參考例34所用之引子F145AR之鹼基序列。 [序列編號：142] 表示參考例34所用之引子K147A之鹼基序列。 •[序列編號：143] 表示參考例34所用之引子K147A R之鹼基序列。 [序列編號：144] 表示參考例34所用之引子Vi5〇A之鹼基序列。 [序列編5虎· 14 5 ] :二ϋ 表示參考例34所用之引子V150AR之鹼基序列。 [序列編號：146] 參表示參考例34所用之引子Μ153Α之鹼基序列。 [序列編號：147] 表示參考例34所用之引子Ml53AR之鹼基序列。 [序列編號：148] 表示參考例34所用之引子T154A之鹼基序列。 [序列編號：149] 表示參考例34所用之引子T154AR之鹼基序列。 [序列編號：150] 表示參考例35所用之引子Q165A之鹼基序列> 87 319597 200823235 [序列編號：151] 表示參考例35所用之引子Q165A R之鹼基序列。 [序列編號：152] 表示參考例35所用之引子K170A之鹼基序列。 [序列編號：153] 表示參考例35所用之引子K170A R之鹼基序列。 [序列編號·· 154] 表示參考例35所用之引子F173A之鹼基序列。 擊[序列編號：155] 表示參考例35所用之引子F173A R之鹼基序列。 [序列編號·· 156] 表示參考例35所用之引子P177G之鹼基序列。 [序列編號：157] 表示參考例35所用之引子P177GR之鹼基序列。 [序列編號：158] .表示參考例35所用之引子Π84Α之鹼基序列。 [序列編號：159] 表示參考例35所用之引子I184AR之鹼基序列。 [序列編號：160] 表示參考例35所用之引子K186A之鹼基序列。 [序列編號:161] 表示參考例35所用之引子K186AR之鹼基序列。 [序列編號：162] 表示參考例35所用之引子L197A之鹼基序列。 319597 88 200823235 [序列編號：163] 表示參考例35所用之引子L197A R之鹼基序列。 [序列編號：164] 表示參考例35所用之引子W202A之鹼基序列。 [序列編號：165] 表示參考例35所用之引子W202AR之鹼基序列。 [序列編號：166] 表示參考例35所用之引子E206A之鹼基序列。 _ [序列編號：167] 表示參考例35所用之引子E206AR之鹼基序列。 [序列編號·· 168] 表示參考例35所用之引子T212A之鹼基序列。 [序列編號· 169] --〜… 表示參考例35所用之引子T212AR之鹼基序列。 [序列編號:170] 、 鲁表示參考例35所用之引子T235A之鹼基序列。 [序列編號：171] 表示參考例35所用之引子T235AR之鹼基序列。 [序列編號：172] 表示參考例35所用之引子K239A之鹼基序列。 [序列編號.：173] 表示參考例35所用之引子K239AR之鹼基序列。 [序列編號：174] 表示參考例35所用之引子A249G之鹼基序列。 89 319597 200823235 [序列編號：175] 表示參考例35所用之引子A249gR之鹼基序列。 [序列編號：176] 表示實施例19所用之引子176之鹼基序列。 [序列編號：Π7] 表示實施例19所用之引子177之鹼基序列。 [序列編號：178] 表示實施例19所用之引子178之鹼基序列。 •[序列編號：179] 表示實施例19所用之引子179之鹼基序列。 [序列編號·· 180] 表示實施例19所用之引子180之鹼基序列。 [序列編號：181] 表示實施例19所用之引子181之鹼基序列。 [序列編號：182] 參表示實施例19所用之引子182之鹼基序列。 [序列編號·· 183] 表示實施例19使用之引子183之鹼基序列。 [序列編號：184] 表示Neel-244-3之重鏈之CDR1 (胺基酸序列）。 [序列編號·· 185] 表示Necl_244_3之重鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：186] 表示Necl-244-3之重鏈之CDR3(胺基酸序列.）。 200823235 [序列編號：18 7 ] 表示Nee 1-244-3之重鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：188] 表示Neel-244-3之重鏈之CDR1 (鹼基序列）。 [序列編號：189] 表示Nee 1-244-3之重鏈之0〇112(鹼基序列）。 [序列編號：190] 表示Necl-244-3之重鏈之CDR3(鹼基序列）。 •[序列編號：191] 表示Neel-244-3之重鏈可變區域之鹼基序列。 [序列編號：192] 表示Nee 1-244-3之輕鏈之CDR1(胺基酸序列）。 [序列編號：193] 表示Necl-244-3之輕鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：194] 鲁表示Necl_244-3之輕鏈之CDR3(胺基酸序列）。 [序列編號：195] 表示Nee 1-244-3之輕鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：196] 表示Neel-244-3之輕鏈之CDR1(鹼基序列）。 [序列編號：197] 表示Necl-244-3之輕鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：19 8 ] 表示Necl_244-3之輕鏈之CDR3(鹼基序列）。 91 319597 200823235 [序列編號：199] 表示Necl-244_3之輕鏈可變區域之驗基序列。 [序列編號：200] 表示Neel-530-1之重鏈之CDR1 (胺基酸序列）。 [序列編號：201] 表示Necl-530-l之重鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：202] 表示Necl-530-l之重鏈之CDR3(胺基酸序列）。 •[序列編號：203] 表示Neel-530-1之重鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：204] 表示Necl-530-l之重鏈之CDR1(鹼基序列）。、 [序列編 *5虎· 2 0 5 ] - : ' : 表示Necl-530-l之重鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：206] 鲁表示Necl-530-l之重鏈之CDR3(鹼基序列）。 [序列編號：207] 表示Neel-530-1之重鏈可變區域之鹼基序列。 [序列編號：2 0 8 ] 表示Neel-530-1之輕鏈之CDR1(胺基酸序列）。 [序列，編號：209] 表示Necl_530-1之輕鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：210] 、表示Necl-530-l之輕鏈之CDR3(胺基酸序列）。 92 319597 200823235 [序列編號：211] 表示Neel-530-1之輕鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：212] 表示Necl-530-l之輕鏈之CDR1 (鹼基序列）。 [序列編號：213] 表示Necl-530-l之輕鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：214] 表示Necl-530-l之輕鏈之CDR3(鹼基序列）。 籲[序列編號：215] 表示Neel-530-1之輕鏈可變區域之驗基序列。 [序列編號：216] 表示Necl-554-l之重鏈之CDR1 (胺基酸序列）。 [序列編號:217] 表示Necl-554-l之重鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：218] 鲁表示Neel-554-1之重鏈之CDR3(胺基酸序列）。 [序列編號：219] 表示Necl-554-l之重鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：220] 表示Necl-554-l之重鏈之CDR1 (鹼基序列）。 [序列編號：221] 表示Necl-554_1之重鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：222] 表示Necl-554-l之重鏈之CDR3(鹼基序列）。 93 319597 200823235 [序列編號：223] 表示Necl-554-l之重鏈可變區域之鹼基序列。 [序列編號：224] 表示Necl-554-l之輕鏈之CDR1 (胺基酸序列）。 [序列編號：225] 表示Necl-554-l之輕鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：226] 表示Necl_554-1之輕鏈之CDR3(胺基酸序列）。 參[序列編號：227] 表示Neel-554-1之輕鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：228] 表示Necl-554-l之輕鏈之CDR1(鹼基序列）。 [序列編號：229] 表示Necl-554-l之輕鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：230] 馨表示Necl-554-l之輕鏈之CDR3(鹼基序列）。 [序列編號：231] 、 表示Necl-554-l之輕鏈可變區域之鹼基序列。 [序列編號：232] 表示Necl-803-2之重鏈之CDR1 (胺基酸序列）。 [序列編號：233] 表示Necl-803-2之重鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：234] 表示Necl«803-2之重鏈之CDR3(胺基酸序列）。 94 319597 200823235 [序列編號：235] 表示Neel-803-2之重鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號·· 236] 表示Necl-803-2之重鏈之CDR1(鹼基序列）。 [序列編號：237] 表示Necl-803-2之重鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：238] 表示Necl-803-2之重鏈之CDR3(鹼基序列）。 •[序列編號：239] 表示Necl-803-2之重鏈可變區域之鹼基序列。 [序列編號：240]、 表示Necl-803-2之輕鏈之CDR1(胺基酸序列）。 [序列編*5虎· 241 ] 表示Necl-803-2之輕鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：242] 鲁表示Necl-8〇3-2之輕鏈之CDR3(胺基酸序列）。 [序列編號· 243] 表示Necl-803-2之輕鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號· 244] 表示Necl-803-2之輕鏈之CDR1 (鹼基序列）。 [序列編號. ：245] 表示Necl-803-2之輕鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：246] 表示Necl-803-2之輕鏈之CDR3(鹼基序列）。 95 319597 200823235 [序列編號：247] 表示Neel-803-2之輕鏈可變區域之驗基序列。 [序列編號：248] 表示Neel-834-1之重鏈之CDR1 (胺基酸序列）。 [序列編號：249] 表示Necl-834-l之重鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：250] 表示Necl-834-l之重鏈之CDR3(胺基酸序列）。 籲[序列編號：251] 表示Necl-834-l之重鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：252] 表示Necl-834-l之重鏈之CDR1(鹼基序列）。 [序列編號：253] 表示Necl-834-l之重鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：.254] 肇表示Necl-834-l之重鏈之CDR3(鹼基序列）。 [序列編號：255] 表示Necl-834-l之重鏈可變區域之鹼基序列。 、[序列編號：256] 表示Neel-834-1、之輕鏈之CDR1 (胺基酸序列）。 [序列編號：257] 表示Necl-834-Γ之輕鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：2 5 8 ] '表示Necl_834-1之輕鏈之CDR3(藤基酸序列）。 96 319597 200823235 [序列編號：259] 表示Necl-834-l之輕鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：260] 表示Neel-834-1之輕鏈之CDR1 (鹼基序列）。 [序列編號：261] 表示Necl-834-l之輕鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：262] 表示Necl-834-l之輕鏈之CDR3(鹼基序列）。 肇[序列編號：263] 表示Nec 1-834-1之輕鏈可變區域之驗基序列。 [序列編號：264] 表示Necl-845-2之重鏈之CDR1 (胺基酸序列）。 [序列編號：265] / 二 表示Necl-845-2之重鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號： .266] 鲁表示Neel-845·2之重鏈之CDR3(胺基酸序列）。 [序列編號：267] 表示Neel-845-2之重鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：268] 表示Necl_845-2之重鏈之CDR1 (鹼基序列）。 [序列編號：269] 表示Necl-845-2之重鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號·· 270] 表不Neel- 845-2之重鍵之CDR3(驗基序列）。 97 319597 200823235 [序列編號：271] 表示Neel-845-2之重鏈可變區域之驗基序列。 [序列編號：272] 表示Nee 1-845-2之輕鏈之CDR1 (胺基酸序列）。 [序列編號：273] 表示Necl-845-2之輕鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：274] 表示Neel-845-2之輕鏈之CDR3(胺基酸序列）。 * [序列編號：275] 表示Nee 1-845-2之輕鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：276] 表示Neel-845-2之輕鏈之CDRl·(鹼基序列）。 [序列編號：277] …—— - 表示Neel-845-2之輕鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：278] ⑩表示Necl-845-2之輕鏈之CDR3(驗基序列）。 [序列編號：279] 表示Nee 1-845-2之輕鏈可變區域之驗基序列。 [序列編號：280] 表示Necl-903-l之重鏈之CDR1(胺基酸序列）。 [序列編號：2 81 ] 表示Necl-903-l之重鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：2 8 2 ] 表示Necl-903-l之重鏈之CDR3(胺基酸序列)。 98 319597 200823235 [序列編號：283] 表示Necl-903〜1之重鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：284] 表示Neel-903-1之重鏈之CDR1 (鹼基序列）。 [序列編號：285] 表示Necl-903-l之重鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：2 8 6 ] 表示Neel-903-1之重鏈之CDR3(鹼基序列）。 暴[序列編號：287] 表示Neel-903-1之重鏈可變區域之鹼基序列。 [序列編號：2 8 8 ] 表示Necl-903-l之輕鏈之CDR1 (胺基酸序列）。. [序列編號:289] …^^”一-二：二 表示Necl-903-l之輕鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：290] ⑩表示Necl-903-l之輕鏈之CDR3(胺基酸序列）。 [序列編號：291] 表示Necl-903-l之輕鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：292] 表示Neel-903-1之輕鏈之CDR1 (鹼基序列）。 [序列編號：293] 表示Necl-903_1之輕鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：294] 表示Necl-903-l之輕鏈之CDR3(鹼基序列）。 99 319597 200823235 [序列編號：295] 表示Neel-903-1之輕鏈可變區域之驗基序列。 [序列編號：296] 表示Nec8-4116-8之重鏈之0〇尺1(胺基酸序列）。· [序列編號：297] 表示Nec8-4116-8之重鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：298] 表示Nec8-4116-8之重鏈之CDR3(胺基酸序列）。 ⑩[序列編號：299] 表示Nec 8-4116-8之重鏈可變區域之胺基酸序列。 [序列編號：300] 表示Nec8-4116-8之重鏈之CDR1 (鹼基序列）。 [序列編號：301] 一…… 表示Nec8-4116-8之重鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：302] •表示Nec8-4116_8之重鏈之CDR3(鹼基序列）。 [序列編號：303] 表示Nec8-4116-8之重鏈可變區域之驗基序列。 [序列編號：：304] 表示Nec8-4116-8之輕鏈之CDR1 (胺基酸序列）。 [序列編號：305] 表示Nec8-4116-8之輕鏈之CDR2(胺基酸序列）。 [序列編號：306] 表示Nec8-4116_8之輕鏈之CDR3(胺基酸序列）。 100 319597 200823235 [序列編號· 307] 表不Nec8-4116-8之蘇灰* 7c上 、孝A鏈可變區域之胺基酸序 [序列編號：308] 表不Nec8-4116-8之輕鏈之CDR1(鹼基序列）。 [序列編號：309] 表不Nec8_4116_8之輕鏈之CDR2(鹼基序列）。 [序列編號：310] 表示Nec8-4116-8之輕鏈之CDR3(鹼基序列）。 ® [序列編號：311] 表示Nec8-4116-8之輕鏈可變區域之鹼基序列。 [序列編號：312] 表示參考例38所製得抗體標準品之η鏈的n末端胺基酸 序列。 [序列編號：313] 表示參考例38所製得抗體標準品之l鏈的Ν末端胺基酸 •序列。 [序列編號：314] 表示編碼由與序列編號：312之胺基酸序列吻合之生殖系 列（germline)所預測之信號序列的Ν末端之鹼基序列。 [序列編號：315] 表示編碼由與序列編號：313之胺基酸序列吻合之生殖系 列（germline)所預測之信號序列的N末端之驗基序列。 [序列編號：316] 京示參考例38所使用之引子之臉I序列。… 101 319597 200823235 [序列編號：317] 表示參考例3 8所使用之引子之驗基序列。 下述實施例1所得之融合瘤細胞Neci_8〇3_2自2〇()5 年9月16日起寄存於日本國茨城縣筑波市東〗丁目〗番地 1中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立行政法人產業技術綜 合研究所專利生物寄託中心，寄存編號為ferm 10417、 下述實施例1所得之融合瘤細胞Nec 自如Μ •年10月4日起寄存於日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地 1中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立行政法人產業技術综 合研究所專利生物寄託中心，寄存編號為FERM '10423 〇 下述貝加例1所得之融合瘤細胞Necl-530-l自2005 年10月4曰起寄存於日本國茨城縣筑波市東〗丁目、番地 1中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立行政法人產業技術綜 ❿合研究所專利生物寄託中心，寄存編號為FERM Bp_ 10424 °
下述實施例1所得之融合瘤細胞Necl-903-l自20Ό5 年10月4曰起寄存於日本國茨城縣筑波市東i 丁目！番地 1中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立行政法人產業技術綜 合研究所專利生物寄託中心，寄存編號為FERM 10425 〇 . 下述實施例1所得之融合瘤細胞NecK52(M自2〇〇5 年10月4日起寄存於曰本國茨城縣筑波市東i 丁目丨番地 3.19597 102 200823235 1中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立行政法人產業技術綜 合研究所專利生物寄託中心，寄存編號為FERM BP- 10426 〇 下述實施例1所得之融合瘤細胞Necl-845-2自2005
rp 1 〇 B A a 4曰起寄存於日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地 中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立行政法人產業技術綜 °研究所專利生物寄託中心，寄存編號為FERM BP- 10427 〇 • 、、一 下述實施例1所得之融合瘤細胞Necl-834-l自2005 年 10 Η /1 曰起寄存於日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地 中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立行政法人產業技術綜 °研究所專利生物寄託中心，寄存編號為FERM ΒΡ- 10428 〇 下述實施例8所得之融合瘤鈿胞Necl-554-l自2006 月日起寄存於日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地 馨中央第6(郵遞區號3〇5·8566)之獨立行政法人產業技術綜 Ό研究所專利生物寄託中心，寄存編號為FERM ΑΒΡ-10681 〇 下述實施例8所得之融合瘤細胞Neel-769-2自2006 年9月20日起寄存於日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地 中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立行政法人產業技術綜 口研究所專利生物寄託中心，寄存編號為FERM BP-10682 〇 下述實施例8所得之、融合瘤細胞Neel-964-1 .自2006 103 319597 200823235 年9月20日起寄存於日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地 1中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立行政法人產業技術綜 合研究所專利生物寄託中心，寄存編號為FERM ABP-10683 。 下述實施例8所得之融合瘤細胞Neel-1302-2自2006 年9月20日起寄存於日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地 1中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立行政法人產業技術綜 合研究所專利生物寄託中心，寄存編號為FERM ABP-• 10684 。 下述實施例8所得之融合瘤細胞Nec8_4116_8自2006 年9月20日起寄存於日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地 1中央第6(郵遞區號305-8566)之獨立行政法人產業技術綜 合研究所專利生物寄託中心，寄存編號為FERM ABP-10685。 實施例 φ 在下文中藉由參考例及實施例更具體地說明本發明， 但本發明不受其限定。 參考例1 Nectin-2a及Nectin-25基因之反義寡核苷酸所 產生之人類大腸癌細胞株HT-29之細胞凋亡誘導 設計能與Nectin-2a基因之轉譯區域或Nectin-23基因 之内含子區域雜交之反義寡核苷酸序列（序列編號：7)後， 合成硫代磷酸酯化之寡核苷酸，得到HPLC精製標準品（以 下簡稱為反義寡核苷酸1)。至於對照組，同樣地將具有序 -列編號：7所示之鹼基序列之反向序列之-寡核苷酸（序列編 104 319597 200823235 號：8)予以硫代磷酸酯化，得到HPLC精製標準品（以下， 簡稱為對照募核苷酸）。 將從美國菌種培養收集所（ATCC)購入之人類大腸癌 細胞株HT-29懸浮於含10%胎牛血清（FBS)(JRH公司）之 McCoy’s 5A培養基（Invitrogen公司）[以下簡稱為M5培養 基]，將其以每孔1 xlO4個之細胞密度播種於96孔平底組 織培養盤（Becton Dickinson公司）中，於5%二氧化碳氣流 中及37°C下培養一晚。將200 ng反義寡核苷酸1或200 ng 肇對照寡核苷酸 1，與親脂胺 2000(Lipofect:amine 2000)(Invitrogen 公司）0·5μΣ 及 Opti-MEM I(Invitrogen 公 司）50μΕ混合在一起，並於室溫置放20分鐘。將上述HT-29 培養細胞之培養上清液之培養基預先交換成〇pti-MEM I 5〇>L，在其中添加全'量之寡核苷酸混合液，繼續於5%二 氧化碳氣流中及37°C下培養3小時後，再次將培養基交換 成M5培養基。繼續培養2曰後，使用Casepase-Glo 3/7 _檢定（Promega公司），依照隨附之規程，測定上述寡核苷 酸之細胞凋亡誘導活性。結果，Nectin-2a基因及Nectin-25 基因之反義寡核苷酸1(序列編號：7)，與對照募核苷酸1(序 列編號：8)相比，顯示約1.9倍之細胞凋亡誘導活性，且 顯示統計學上顯著之差異（P < 〇·05)。 參考例2 Nectin_2a基因及Nectin_25基因之反義募核苷 酸所造成之人類大腸癌細胞株HT-29中Nectin-2a基因及 基因之mRNA表現量降低 ，將參考例1所用之人類大腸癌細胞株HT-29懸浮於 105 319597 200823235 M5培養基中，將其以每孔6χ104個之細胞密度播種於24 孔平底組織培養盤（Becton Dickinson公司）中，於5%二氧 化碳氣流中及37t：下培養一晚後，依照參考例1之方法轉 染反義寡核苷酸1及對照寡核苷酸1。但與細胞播種數成 比例地將全部添加物量或溶液量增至6倍。將此等細胞於 5%二氧化碳氣流中及37°C下培養24小時後，使用RNeasy Mini Total RNA Kit 萃取總 RNA。以約 400 ng 之總 RNA 作為模板，使用 TaqMan Reverse Transcription Reagents 籲（Applied Biosystems公司）依照隨附之規程進行反轉錄反 應，而調製cDNA。Nectin-2a基因之表現量係藉由下述方 法測定：以相當於製成總RNA(total RNA)5ng之cDNA作 為模板，加入 TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems公司）7·5μΣ、各為500nM之引子1(序列編號·· 9)及引子2(序列編號：10)、100 nlV[之經FAM標識之 TaqMan探針1 (序列編號：11)並使反應液量成為15μΙν，然 鲁後進行定量性PCR。PCR反應如下述進行：50°C · 2分鐘、 95°C · 10分鐘後，重複95°C · 15秒、6〇°C · 1分鐘之循環 40次。Nectin-25基因之表現量係藉由下述方法測定：以 相當於製成總RNA 5ng之cDNA作為模板，加入TaqMan Universal PCR Master Mix 7.5pL、各為 500nM 之引子 3(序
列編號·· 12)及引子4 (序列編號·· 13)、1 〇 〇 [之經FAM 標識之TaqMan探針2(序列編號：14)並使反應液量成為 15μΙ>，與Nectin-2a基因同樣地進行定量性pcr。PCR如 下述進行·· 5 0 °C · 2分鐘、9 5 °C · 10分鐘後，重複，9 5X · 319597 106 200823235 , C 1里之循環40次。使用TaqManP_肌動蛋 白對…、"式背彳（Applied Biosystems公司）測定同量模板 CDNA中所含之β_肌動蛋白基因之mRNA表現量，以作為 内部標準。 在未轉‘养核苦酸之情況，NeCfin_2(x基因及Nectin-25 基因之表現量分別為β-肌動蛋白基因表現量之0.15%及 〇.76% °相對於此’在反義寡核苷酸1(序列編號：7)投與 群中，Nectin_2a基因及Nectin_2g基因之表現量分別為β_ 肌動蛋白基因表現量之0.095%及0·45〇/〇，與未轉染寡核苷 酉欠之6況相比，確認具統計學上顯著之表現量③< 〇·〇ι)降 低另方面，在作為陰性對照組用之對照寡核苦酸1 (序 列、、扁號8)才又與群中’ K[ectin-2a基因及Nectin-25基因之 表現里分別為P-肌動蛋白基因表現量之0.18%及0.76%， 與未轉染寡核苷酸之情況為同等。 此專、、々果及參考例1之結果暗示藉由Nectin_2a基因 及Nectin 2δ基因之表現量降低，可誘發人類大腸癌細胞 株ΗΤ-29之細胞凋亡。 參考例3編碼Nectinja之cdnA之選殖及鹼基序列之決定 以人類肺癌細胞株A549之Marathon-Ready cDNA(BD Biosciences公司）作為槙板，使用附加有限制酵素Ec〇RI 之識別序列之引子5(序列編號：15)及附加有限制酵素 EcoRV之識別序列之引子6(序列編號：16)進行Pcr。該 反應中反應液之組成為：cDNA 1 pL、Pfu Turbo Hotstart DNA聚合酶（STRATAGENE公司）1 U、引子5(序列編號： 107 319597 200823235 15)及引子6(序列編號：16)各lpM、dNTPs 200μΜ及2 x GC 緩衝液I(TaKaRa Bio公司）1〇μΕ，合計20μΕ。PCR如下述 進行：94°C · 1分鐘後，重複94T： · 5秒、72t： · 4分鐘之 循環5次，重複94°C · 5秒、70°C · 4分鐘之循環5次及 重複94°C · 5秒、68°C · 4分鐘之循環35次。繼而用PCR 純化套組（QIAGEN公司）精製該PCR產物後，用限制酵素 EcoRI及EcoRV消化。同樣地用限制酵素EcoRI及EcoRV 處理pcDNA 3.1(+)(Invitrogen公司製），並用PCR純化套 ⑩組將其精製。該二DNA片段藉由DNA接合套組ver.2(DNA Ligation Kit ver.2)(TaKaRa Bio公司）接合後，導入大腸桿 菌TOP10(Invitrogen公司）中，然後在含安比西林之LB瓊 脂培養基中進行選擇培養。解析回收自經增殖之大腸桿菌 純株备各個基.因純株之序列，結果得到具有屬碼项ectin-2O^ 蛋白質（序列編號：1)之cDNA序列（序列編號：2)之動物細 胞用表現載體 pcDNA3.1(+)-Nectin-2a。 馨參考例4 編碼Nectin-25之cDNA之選殖及鹼基序列之決定 以人類肺癌細胞株A549之Marathon-Ready cDNA(BD Biosciences公司）作為模板，使用附加有限制酵素EcoRI 之識別序列之引子5(序列編號：15)及附加有限制酵素 EcoRV之識別序列之引子7(序列編號·· 17)進行PCR。該 反應中反應液之組成如下：使用上述cDNA溶液IpL作為 模板，且含 Pfu Turbo Hotstart DNA 聚合酶（STRATAGENE 公司）1 U、引子5(序列編號：15)及引子7(序列編號：17) 各 ΙμΜ、dNTPs 200μΜ 及 2 X GC 缓衝液 I(TaKaRa Bio 公 108 319597 200823235 司）10μΕ，合計20μ1。PCR如下述進行：94°C · 1分鐘後， 重複94°C · 5秒、72°C · 4分鐘之循環5次，重複94°C · 5 秒、7(TC · 4分鐘之循環5次及重複94t： · 5秒、68t： · 4 分鐘之循環35次。繼而使用PCR純化套組（QIAGEN公 司），以50>L水將該PCR產物溶出，以其作為模板進行 PCR反應。該反應中反應液之組成如下：使用上述PCR產 物1 pL作為模板，且加入含Pfu Turbo Hotstart DNA聚合 酶1 U、引子5(序列編號：15)及附加有限制酵素EcoRV _之識別序列之引子8(序列編號：18)各ΙμΜ、dNTPs 200 μΜ 及2 x GC緩衝液I lOpL，合計20μΕ之液量。PCR如下述 進行：94°C · 1分鐘後，重複94°C · 20秒、60°C · 15秒、 72°C · 2分鐘之循環25次。繼而，用PCR純化套組精製該 pcDNA3.1(+)(Invitrogen 公司）用限制酵素£〇〇111及£〇〇1^ 消化。將此等用PCR純化套組精製。使用DNA接合套組 • ver.2(TaKaRa Bio公司）接合二DNA片段後，導入大腸桿 菌TOP10(Invitrogen公司），在含安比西林之LB瓊脂培養 基中進行選擇培養。解析回收自經增殖之大腸桿菌純株之 各個基因純株之序列，結果得到具有編碼Nectin-25蛋白 質（序列編號：3)之cDNA序列（序列編號：4)之動物細胞用 表現載體 pcDNA 3.1 (+)-Nectin-23。 參考例5 Nectin-2 siRNA所造成之人類大腸癌細胞株 HT-29之細胞增殖之抑制 '製作針對Ne，ctm-2〇l·基因或Nectin-23基因（以下將其 109 319597 200823235 總稱為Nectin_2基因）之mRNA之五種siRNA(siRNA-l、 siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4 及 siRNA_5)以每種等量之方 式混合而得之混合物（以下，將其總稱為1^6〇1^11-2-siRNA；hsiRNA-l、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4 及 siRNA-5 分別藉由將二種RNA片段雜交而製作（siRNA-1係將具有 序列編號：19所示之驗基序列之RNA與具有序列編號： 20所示之驗基序列之RNA雜交；siRNA-2係將具有序列 編號·· 21所示之驗基序列之RNA與具有序列編號·· 22所 鲁示之驗基序列之RNA雜交；siRNA-3係將具有序列編號： 23所示之驗基序列之RNA與具有序列編號：24所示之驗 基序列之RNA雜交；siRNA_4係將具有序列編號：乃所 示之鹼基序列之RNA與具有序列編號：26所示之鹼基序 列之RNA雜父，siRNA-5係將具有序列編號:27所示之 驗基序狀RNA與具有序列編號：2δ所示之驗基序列之 RNA雜交。使用從Dharmacon公司贐Α ^ -入之非特異性對照組 IX(Non-specific Control IX)(以下將发 丁〜％為非沉默dsRNA) 作為陰性對照組。 具體而言，將從美國菌種培養收隹。 本所（American Type
Culture Collection(ATCC))購入之人来5 丄 入^大腸癌細胞株HT-29 懸浮於含10°/〇FBS(JRH公司）之 M5A增養基中，以每皿 5χ105個之細胞密度播種於1〇 、、且織培養皿（Becton Dickinson公司）。將其在5%二氧化石卢> I乳流中，於37。<3培養 一晚後，使用胰蛋白酶-EDTA溶液糸j虚 乂 ^ ± u 叫離細胞，然後藉由離 心分離操作回收。"將該HT-29細的 、& ΐχιο6個懸浮於含 319597 110 200823235
Nectin-2_ siRNA 150 pmol 或非沉默 dsRNA 150 pmol 之 Cell Line Nucleofector Kit V(Amaxa 公司）所附之溶液 V ΙΟΟμΙν中，依照Nucleofector之程式T-20進行轉染，在5% 二氧化碳氣流中，於37°C培養24小時。將此等細胞以3,000 個/孔再播種於96孔平底組織培養盤中，在5%二氧化碳氣 流中，於37°C培養5日。從各孔除去培養基後，將該培養 盤於-80°C冷卻5分鐘，繼而於室溫放置5分鐘使細胞破 壞。接著，在各孔中添加含1% PicoGreen(Invitrogen公司） •及1% IGEPAL-GA630(ICN公司）之水溶液lOOpL並放置於 室溫 20 分鐘後，使用 Multilabel Counter(Perkin Elmer 公 司）計測螢光強度（激發波長485 nm，發光波長535 nm)， 並測定細胞内DNA含量。結果，Nectin-2-siRNA添力σ群與 非沉默dsRNA添加群相比，螢光強度降低约38%，兩者在 統計學上顯示有意義的差異（P< 0.001)。從此等可以明白 藉由添加Nectin-2-siRNA，可以顯著地阻礙HT-29細胞株 •之增瘦。 參考例6 Nectin-2 siRNA所造成·之人類大腸癌細胞株 HT-29之細胞週期變化 將參考例1所用之人類大腸癌細胞株HT-29懸浮於 M5A培養基中，以每皿5χ105個之細胞密度播種於10 組織培養孤。在5%二氧化碳氣流中，於37°C培養一晚後， .以參考例5之方法為基準，轉染Nectin-2-siRNA或作為險 性對照組之非沉默dsRNA，在5%二氧化碳氣流中，於37¾ 繼續培養24小時。將此等細胞以·2χ105個/孔之量再播種 111 319597 200823235 於6孔平底組織培養盤（Bect〇riDickinson公司）中，然後在 5%二氧化碳氣流中’於37〇c培養5日。將各孔之培養細胞 藉由騰蛋白酶-EDTA處理而剝離後，使用CyCie TEST Plus DNA 試劑套組（Bect〇n Dickins〇n 公司），藉由 FACScan (Bect〇n Dickinson公司）解析細胞週期。結果，Nectin-2-siRNA添加群’與作為陰性對照組之非沉默dsRNA添加群 相比，在G0/G1期之細胞之比率上升約13%，在s期之細 胞之比率降低約11%。該結果暗示Nectin-2-siRNA可誘導 冒人類大腸癌細胞株HT-29之細胞週期之變化。 參考例7 Nectin-2 siRNA所造成之人類大腸癌細胞株 HT-29之Nectin-2 mRNA表現量降低 將參考例1所用之大腸癌細胞株HT-29懸浮.於M5A 培養基中，以每皿5 X1Ό5個之細胞密度播種於10 cm組織 培養皿。在5%二氧化碳氣流中，於37°C培養一晚後，以 參考例5之方法為基準，轉染Nectin-2-siRNA或作為陰性 鲁對照組之非沉默dsRNA，在5%二氧化碳氣流中，於37°C 繼續培養24小時。使用 RNeasy Mini Total RNA Kit(QIAGEN公司）從此等細胞萃取出總RNA。以約loo ng 之總RNA作為模板，使用TaqMan反轉錄試劑（Applied Biosystems公司）進行反轉錄反應。Nectin_2a基因之mRNA 之表現量係藉由下述方法測定：以相當於可製成全RNA 10 ng 之 cDNA 作為模板，力口入 TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems 公司）5pL、各為 500 nM 之 引子1 (序列編號：9)及引子2(序列編號· 10)、1 〇〇 nM之… 112 319597 200823235 經FAM標識之TaqMan探針1 (序列編號·· 11)並使反應液 量成為1 ΟμΕ，然後進行定量性PCR法。另一方面，Nectin_2S 基因之mRNA之表現量係藉由下述方法測定：以相當於可 製成總RNA 10 ng之cDNA作為模板，加入TaqMan
Universal PCR Master Mix 5pL、各為 500 nM 之引子 3(序 列編號：12)及引子4(序列編號：13)、loo nM之經FAM 標識之TaqMan探針2(序列編號：14)並使反應液量成為 lOpL，然後進行定量性PCR。PCR如下述進行：50°C · 2 •分鐘、95°C · 10分鐘後，重複95°C · 15秒、60°C · 1分鐘 之循環40次。使用TaqMan β-肌動蛋白對照試劑（Applied Biosystems公司）測定同量模板cDNA中所含之β-肌動蛋 白基因之mRNA表現量，以作為内部標準。
Nectin-2_siRNA添加群，與作為陰性對照組之-非沉默 dsRNA添力口群相比，Nectin-2a之mRNA表現量降低69%， Nectin-23之mRNA表現量降低73%。任一情況皆可見到 鲁兩者間具有統計學上顯著的差異（ρ < 〇·〇〇 1)。此等結果顯 示 Nectin-2-siRNA 可誘導 Nectin_2a 基因及 Nectin-23 基因 之mRNA表覌量降低。 參考例8 在人類癌組織中Nectin-2 mRNA之表現亢進 藉，由定量性PCR法比較檢討在人類癌組織及人類正 常組織中Nectin-2基因之mRNA表現量。使用cDNA CeHAT· SD Breast Tumor 1 (Cosmo Bio 公司）、cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 2(Cosmo Bio &g)、HumanColon Matched cDNA Pair Panel(BD Biosciences 公司）、Human 113 319597 200823235
Lung Matched cDNA Pair Panel(BD Biosciences 公司）及 Human Ovary Matched cDNA Pair Panel(BD Biosciences 公 司）作為PCR之模板。在Nectin-2a基因之mRNA表現量 之測定中，以1 // L之cDNA作為模板，並加入TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems 公司）7·5 //L、各為500 nM之引子1(序列編號：9)及引子2(序列編 號·· 10)、100 nM之經FAM標識之TaqMan探針1(序列編 號：11)且使反應液量成為15pL。在Nectin-25基因之mRNA _表現量之測定中，以1 μίν之cDNA作為模板，並加入 TaqMan Universal PCR Master Mix 7.5pL、各為 500 nM 之 引子3(序列編號:12)及引子4(序列編號：13)、100 nM之 經FAM標識之TaqMan探針2(序列編號·· 14)並使反應液 量成為 15>L。不過，對於 cDNA CeHAT-SD Breast Tumor l(Cosmo Bio 公司）及 cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 2(Cosmo Bio公司），將模板量調整為0.2// L。PCR如下述 鲁進行·· 50°C · 2分鐘、95°C · 10分鐘後，重複95°C · 15秒、 60t： · 1分鐘之楯環40次。另一方面，測定同量模板cDNA 中所含之β-肌動蛋白基因之mRNA表現量，以作為内部標 準。結果在人類癌組織中Nectin-2a基因之mRNA表現量 與人類正常組織之表現量相比，就cDNA CeHAT_SD Breast Tumoj： l(Cosmo Bio公司）之3名捐贈者而言，各為1.1倍、 10 倍及 4·3 倍；就 cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 2(Cosmo Bio公司）之3名捐贈者而言，各為12倍、3.5倍及21倍。 词樣地，關於Nectin_2a基因之mRNA表現i，就Human 114 319597 200823235
Colon Natched cDNA Pair Panel(BD Biosciences 公司）所包 括之5名捐贈者而言，在癌組織中者分別為在正常組織中 者之 4·8 倍、3.2 倍、2.6 倍、1.9 倍、1.8 倍；就 Human Lung Matched cDNA Pair Panel(BD Biosciences 公司）所包括之 5 名捐贈者而言，在癌組織中者分別為在正常組織中者之11 倍、3.7 倍、4.1 倍、3·2 倍、1.3 倍；就 Hiimaii Ovary Matched cDNA Pair Panel(BD Biosciences 公司）所包括之 5 名捐贈 者中之4人而言，在癌組織中者分別為在正常組織中者之 • 1.3倍、1.8倍、2·6倍、2.4倍。在癌組織中Nectin-2S基 因之mRNA表現量，與正常組織之表現量相比，cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 1 (Cosmo Bio 公司）所包括之 3 名 捐贈者中之2人分別為1.1倍及5.3倍；cDNA CpHAT-SD Breast Tumor 2(Cosmo Bio公司）所包括之3名捐贈者中之 2人分別為2.0倍及2.5倍。同樣地，關於Nectin-25基因 之 mRNA 表現量，就 Human Colon Matched cDNA Pair 鲁Panel(BD Bio sciences公司）所包括之5名捐贈者中之3人 而言，在癌組織中者分別為在正常組織中者之1.3倍、1.8 倍、1·5 倍；就 Human Lung Matched cDNA Pair Panel(BD Biosciences公司）所包括之5名捐贈者中之4人而言，在 癌組織中者分別為在正常組織中者之4·8倍、3.7倍、1.1 倍、1.3 倍；就 Human Ovary Matched cDNA Pair Panel(BD Bio sciences公司）所包括之5名捐贈者中之4人而言，在 癌組織中者分別為在正常組織中者之4·2倍、2.1倍、2.4 倍、4.2倍。從此等結果可以確認在癌組織中，與正常組- 115 319597 200823235 織相比，Nectin_2a基因及Nectin-23基因之mRNA表現宄 進。 參考例9 在人類癌細胞株中Nectin-2基因之mRNA之表 現量比較 將骨性肉瘤細胞株 Saos-2、腦腫瘤細胞株 SK-N-MC、SK-N-AS、SK-N-BE、SK善DZ、SK-N-FI、 SK-N-SH、D341 Med、Daoy、DBTRG-05MG、U-118 MG、 U-87 MG、CCF-STTG1、SW 1088、乳癌細胞株 HCC1937、 0 ZR-75]、AU565、MCF-7、MDA-MB幽23 卜 SKBR-3、BT474、 MDA-MB-435s、MDA-MB-436、MDA-MB-468、MDA_MB-175VII、T-47D 大腸癌細胞株 Caco-2、COLO 201、COLO 205、COLO 320DM、DLD-1、HCT-15、HCT-8、HT-29、 LoVo、1^180、LS123、LS174T、Ν(：Ι-Η548、NCI-SNU-C1、 SK-CO-1、SW 403、SW 48、SW 480、SW 620、SW 837、 SW 948、HCT 116、WiDr、非小細胞肺癌細胞株A549、 鲁 NCI-H23、NCMI226、NCI-H358、NCI-H460、NCI-H522、 NCI-H661、NCI-H810、NCI-H1155、NCI-H1299、 NCI-H1395、NCI-H1435、NCI-H1581、NCI_H1651、 NCI-H1703、NCI-H1793、NCLH2073、NCI-H2085、 NCI-H2106、NCI-H2228、NCI-H2342、NCI-H2347、 SK-LU-l、Να-Η2122、SK-MES-1、NCI-H292、小細胞肺 癌細胞株 NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H889、 NCI-H1417、NCI_H1672、NCI-H1836、NCI-H1963、 NCI-H2227、NCI-N417、SHP-77、卵巢癌細胞株 ES-2、、 116 319597 200823235
Caov-3、MDAH2774、NIH:OVCAR3、OV-90、SK-OV_3、 TOV-112D、TOV-21G、前列腺癌細胞株 DU 145、LNCaP、 網膜母細胞瘤細胞株WERI-Rb-1、Y79、睪丸癌細胞株 Cates-1B(以上由ATCC購入）、大腸癌細胞株COCM1、非 小細胞肺癌細胞株VMRC-LCD及前列腺癌細胞株PC3(以 上由 Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB) 購入）分別依照ATCC或JCRB推薦之培養方法培養，並使 用RNeasy Mini Total RNA Kit從培養細胞調製總RNA。以 _該總RNA作為模板進行反轉錄反應，以調製cDNA，藉由 以該cDNA作為模板進行定量性PCR，以測定Nectin-2基 因之mRNA表現量。
Nectin-2基因之mRNA表現量之定量，以從上述總 — RNA 5 ng得到之- cDNA作為模板，並依照參考例2記載之 方法進行。另一方面，測定同量模板cDNA中所含之卜肌 動蛋白基因之mRNA表現量，以作為内部標準。 φ 在各癌細胞株中Nectin_2a基因及Nectin_23基因之 mRNA表現量，用β-肌動蛋白基因之mRNA表現量予以標 準化所得之相對表現量示於[表1 ]中。在所調查之全癌細胞 株中，明白2株表現相當於β-肌動蛋白mRNA之1 %以上 之Nectin-2amRNA;再者，12株表現相當於β-肌動蛋白 mRNA 之 1%以上之 Nectin_23mRNA。 117 319597 200823235 表1 細胞名稱 Meet i n-2 a Necti n-2 δ 細胞名稱 Nectin a Necti η-2 δ 細胞名稱 Nectin -2 0£ Necti n-2 δ Saos-2 0.04 0.10 HCT-8 0.36 L44 NCI-HI155 0.06 0.06 CCF-STTG1 0.19 0.39 ΗΤ-29 0.35 1·93 NC卜HI 299 0.57 0.82 SW 1088 0.17 0.11 LoVo 0.16 0.46 NCI-HI 581 0.19 0.61 DBTRG-05MG 0.08 0.18 LS 180 0.17 0·36 NCI-H2106 0.05 0.13 IM18 MG 0.26 0·08 LS123 0.29 0.90 NCI-HI 87 0·00 0.01 U-87 MG 0.13 0.11 LS174T 0·08 0·44 NC卜H378 0.06 0.11 D341 Med 0.1! 0.09 NCI-H548 1·11 2.07 NCI-H526 0.26 0.41 Daoy 0.13 0·11 NCI-SNU-C 1 0.19 0.30 NCI-H889 0.07 0.19 SK-N-AS 0.06 0.04 SK-C0-1 0.57 1.35 fiCI-H1417 0.08 0. 20 SK-N-BE 0.03 0.04 SW 403 0.12 0·49 NCI-H1672 0.07 0·51 SK-N-DZ 0.03 0.03 SW 48 0.21 0.22 NCI-H1836 0.12 0.27 SK-N-FI 0.12 0.17 SW 480 0·14 0.26 NCI-H1963 0.04 0.05 SK-N-SH 0.09 0.19 SW 620 0.10 0·38 NCI-H2227 0.12 0.36 SK-N-MC 0.10 0.09 SW 837 0.36 L27 NCI-N417 0.00 0.00 AU565 0.05 0.13 SW 948 0.56 1.19 SHP-77 0.10 0.33 «CF-7 0-D8 0.68 _r 0.21 L92 NCI-H226 0.04 0.26 MDA-MB-231 0.08 0.11 ^549 0.24 0.25 k卜HI 703 b: 30 0.48 SK-BR-3 0·31 — 0.65 NCI-H23 0.15 0.24 NCI-H2122 0.02 0.17 BT474 0.19 0·58 NCI-H358 0.12 0. 46 SK-MES-1 0.04 0.12 HCC1937 0.15 0.29 NCI-H522 0.20 0.18 pCI-H292 0.00 1.03 -435 s 0.08 0.12 NCI-H1395 0.16 0·39 Caov-3 0.08 0.30 ZR-75-1 0.63 1.57 NCI-H1435 0.40 0.46 «DAH2774 0.12 0.17 削ΗίΒ-436 0.08 0.15 NCI-HI 651 0.07 0.21 NIH:OVCAR3 0.17 0.43 «DA-MB-468 0.04 0.26 NCI-HI 793 0/13 0· 25 OV-90 1.09 5.06 MDA-MB-175 VII 0.03 0.12 NCI-H2073 0.15 0·34 SK-OV-3 0,32 0. 72 T-47D 0·08 0·40 NCI-H2085 0. 20 0·34 T0V-112D 0.46 0.45 C0CM1 0.22 0·77 NC卜H2228 0·34 0.44 T0V-21G 0.24 0. 25 Caco-2 0.37 p. 99 NCI-H2342 0.64 2.45 PS-2 0.20 0.28 COLO 201 0·16 0.40 NC 卜 H2347 0.05 0.12 DU 145 0.14 0·60 COLO 205 0.23 0.63 SK-LIH 0.04 0.10 tNCaP 0.29 0· 60 COLO 320DM 0.15 0.24 VMRC-LCD 0.12 0.10 m 0·14 0.24 DLD-1 0.35 1.26 NCI-H460 0.12 0.15 Y79 0,11 0.19 HCT 116 0.40 0.71 NCI-H661 0.13 0.44 iERI-Rb-1 0.25 0. 54 HCT-15 0.43 0.76 NCI-H810 0.09 0.20 Cates-IB 0.16 0.18 參考例10 藉由Nectin-23cDNA免疫製作抗Nectin-2兔-子 118 319597 200823235 多株抗體 委託Genovac公司（日本農產工業股份公司），藉由使 用基因槍之DNA免疫法製作抗Nectin-2兔多株抗體。組 入有編碼Nectin-25(序列編號：3)之胺基酸序列之CDNA 之動物細胞用表現載體，依照Genovac公司申請之專利文 獻（WO 00/29442號公報）所記載之方法塗布於顯微粒子， 用基因槍將二隻兔子以該經塗布之顯微粒子免疫，從耳靜 脈進行試驗採血且確認得到之血清之抗體價上升後，於麻 ♦醉下進行頸動脈採血，分別得到 127 mL及115 mL抗血清。 將此等抗血清用PB S稀釋2倍、離心分離，將得到之 上清液供給至抗，原管柱中，該抗原管柱係將Nectin 2ED-FLAG 蛋白質固定於 HiTrap NHS-activated HP (Amersham Biosciences公司）而製作。將相同的管柱用PBS 洗淨後，用含〇·15 M NaCl之0·1 Μ甘胺酸-HCl(pH 3)溶 馨出，將溶出液用1 M Tris-HCl(pH 8)快速中和後，於4°C對 PBS進行整夜透析，精製取得Nectin-2兔子多株抗體。將 此處所得之抗Nectin-2兔子多株抗體分別命名為N2-R1及 N2-R2 〇 參考例11 在人類癌細胞株中Nectin-2蛋白質之表現量 藉由流式細胞測定法調查人類癌細胞中Nectin-2蛋白 質之表現量。將人類癌細胞株、1^€：1-111703、111[-29、0¥_90、 SKBR-3、SK-OV-3、NCI-H2342、TOV-112D、NCI-H2122、 NCI-H292、Capan-2、MDA-MB-231、BxPC-3、HCT-8、 119 319597 200823235 SK-N-DZ、Caov-3、DU 145、A549、Caco-2、WiDr、ZR-75-1、 HCT-15、NCI-H1299、NCI-H2228、BT474(以上從 ATCC 購入）分別藉由ATCC推薦之方法培養，使用染色緩衝液 (BD Biosciences公司）製作細胞之懸浮液並使其成為1x1 〇6 個/mL。在細胞懸浮液中’以使最終濃度成為3 pg/mL之 方式添加參考例10所製作之抗Nectin-2兔子多株抗體 (N2-R2)，並於4°C反應1小時。藉由同樣之方法，以使最 終濃度成為 3pg/mL之方式添加未經免疫之兔子 • IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司），以作為 陰性對照組。將該細胞懸浮液進行離心分離操作後，用染 色緩衝液洗淨，以使最終濃度成為lOpg/mL之方式添加經 Alexa488標識之抗兔子IgG抗體（Invitrogen公司），並於 4°C反應1小時。將再次用染色缓衝液洗淨之細胞供給至 FACScan(Becton Dickinson 公司），測定各細胞之 Nectin-2 蛋白質表現濃度。各細胞株之N2-R2染色細胞之螢光強度 拳中央値對陰性對照組之螢光強度中央値之比示於[表2] 中。攸該結果可以明白在來自肺癌、乳癌、彡p巢癌等複數 種癌症之癌細胞株中，Nectin-2蛋白質高度表現。 319597 120 200823235 表2 細胞名稱 比值 細胞名稱 比值 NCI-H1703 72.5 HCT-8 48.8 HT-29 65.5 SK-N-DZ 6.0 0V-90 133.4 Caov-3 28.4 SKBR -3 61.6 DU 145 17.9 SK-0V-3 65.0 A549 16· 9 NCHK2342 62.1 Caco-2 50.5 T0V-112D 44.1 WDr 50· 0 NCI-H2122 28.1 ZR-75-1 25· 5 NCI-H292 10.6 HCT-15 25.9 Capan-2 83· 6 NCI-H1299 36.9 «ΟΆ-ΜΒ-231 17.0 NCI-H2228 20.9 BxPC-3 46. 6 BT474 42.0 參考例12 重組型Nectin-2細胞外區域-FLAG蛋白質之動 物鈿胞用-表現載體之構築 V · -
以參考例4所製作之動物細胞用表現載體（pcDNA 3.1(+)-Nectin-23)作為模板，使用附加有限制酵素EcoRI 之識別序列之引子33(序列編號：29)及附加有限制酵素 Xhol之識別序列之引子34(序列編號：30)進行PCR。在該 反應中反應液之組成如下：pcDNA 3.1(+>-Nectin-23 10 ng、Pfu Ultra Hotstart DNA 聚合酶（STRATAGENE 公司）2.5 U、引子33(序列編號：29)及引子34(序列編號：30)各 0·2μΜ、dNTPs 200μΜ 及 l〇xPfu Ultra 緩衝液 (STRATAGENE公司）5pL，合計50μΕ。PCR反應如下述進 行：95°C · 2 分鐘後，重複 95t： · 30 秒、60°C · 30 秒、72。(： · 1分15秒之循環30次，之後72°C· 10分鐘。接下來用PCR 121 319597 200823235 純化套組（QIAGEN公司）精製該PCR產物後，用限制酵素 EcoRI 及 Xhol 消化。同樣地將 pCMV-Tag4(STRATAGENE 公司）亦用限制酵素EcoRI及Xhol消化。使用Wizard SV Gel 及 PCR Clean-Up System(Promega 公司）精製各個 DNA 片段後，使用Ligation High(TOYOBO公司）接合兩DNA 片段。將所得之質體導入大腸桿菌TOP10(Invitrogen公司） 中，在含卡那黴素（kanamycin)之LB瓊脂培養基中進行選 擇培養。解析回收自經增殖之大腸桿菌純株之各個基因純 ⑩株之序列，結果得到具有編碼Nectin-2ED-FLAG蛋白質（序 列編號：31)之cDNA序列（序列編號：32)之動物細胞用表 現載體 pCMV-Tag4_Nectin- 2ED-FLAG，其中該 Nectin-2ED-FLAG蛋白質係於Nectin_23蛋白質之細胞外 區域（序列編號：3所識之Nectin-23之胺基酸序列之第1 號至第361號）之C末端融合有FLAG標籤而製成。 參考例13 重組型NectindED-FLAG蛋白質之調製 ❿使用Freestyle 293表現系統（Invitrogen公司）調製由 參考例12所製作之動物細胞用表現載體（pcMV-Tag4-Nectin-2ED-FLAG)。具體而言，使用 293 Fectin(Invitrogen 公司）將293F細胞株以動物細胞用表現載體pCMV-Tag4-Nectin-2ED-FLAG轉染，將該細胞株在8%二氧化碳氣流 中，於37°C旋轉培養3日。離心分離細胞懸浮液，將所得 之培養上清液用〇·45μπι之濾器過濾後，供給至以填酸緩 衝生理食鹽水（PBS)半衡化之抗FLAG抗體管柱(Sigma公 司）中。用PBS洗淨管柱後，用含有濃度為〇.! mg/mL之 122 319597 200823235 FLAG肽之PBS溶出Nectin-2ED-FLAG蛋白質。將該溶出 部分用Vivaspin(VIVA SCIENCE公司）進行超濃縮後，使用 以 PBS平衡化之凝膠過濾管柱 PD-10(Amersham Biosciences公司，變更公司名為GE Healthcare)除去混入 之FLAG肽。再度濃縮，取得高純度之重組型Necti.n-2ED-FLAG蛋白質。 參考例14 抗Nectin-2兔子多株抗體之製作 以參考例13所調製之重組型Nectin-2ED-FLAG蛋白 ⑩質作為免疫原，製作抗Nectin-2兔子多株抗體。將 Nectin-2ED-FLAG蛋白質之PBS溶液與弗氏完全佐劑等量 混合所製作之乳化物，以每隻〇·1 mg之Nectin-2ED-FLAG 蛋白質之量注射至3隻家兔（日本白色種，雌性，3公斤） 一之臂部皮下及皮内，以進行免疫。至於第二次以後之免疫，二 同樣地調製使用弗氏不完全佐劑之蛋白質乳化物，每二星 期進行追加免疫，共進行7次。 _ 免疫前以及第4次及第6次免疫一星期後，從耳靜脈
W 進行試驗採血，藉由使用塗覆Nectin-2ED-FLAG蛋白質之 免疫測定盤之ELIS A確認血清抗體價上升。於最終免疫1 星期後，於麻醉下從3隻兔子之頸動脈採血，分別取得78.9 ml、78.2 ml 及 78.8 ml 之抗金清。
將此等抗血清用PBS稀釋2倍、離心分離，將得到之 上清液供給至抗原管枉中，該抗原管柱係將Nectin-2ED-FLAG 蛋白質固定於 HiTrap NHS-activated HP ，（Amersham Biosciences公司，該公司名已*變更為GE 123 319597 200823235
Healthcare公司）而製作。將該管柱用PBS洗淨後，用含 0·15 M NaCl之0·1 Μ甘胺酸-HCl(pH 3)溶出，將溶出液用 1 M Tris-HCl(pH 8)快速中和後，於4°C對PBS進行整夜透 析，取得抗Nectin-2兔子多株抗體（Ν2-Νο·1、N2-N0.2及 Ν2·Νο·3) 〇 參考例15 重組型Nectin-2細胞外區域-Fc蛋白質之動物 細胞用表現載體之構築 (1)人類IgGl · Fc片段基因之選殖 • 以來自人類脾臟之 Marathon-Ready cDNA(BD BIOSCIENCES公司）作為模板，使用附加有限制酵素EC〇RI 之識別序列之引子33(序列編號：33)及附加有限制酵素 Xhol之識別序列之引子34(序列編號：34)進.行PCR。該反 應中反應液之組成為：上述cDNA 1 pL、Pfu Turbo Hotstart DNA聚合酶（STRATAGENE公司）1 U、引子33(序列編號： 33)及引子34(序列編號：34)各ΙμΜ、dNTPs 200μΜ及2 x • GC 缓衝液 I(TaKaRa Bio 公司）10pL，合計 20pL。PCR 反 應如下述進行：95°C · 1分鐘後，重複95°C · 20秒、60°C · 15秒、72°C · 2分鐘之循環30次。繼而用PCR純化套組 (QIAGEN公司）精製該PCR產物，然後用限制酵素EcoRI 及Xhol消化。同樣地亦用限制酵素EcoRI及Xhol消化 pcDNA 3.1(+)(Invitrogen 公司製）。將所得二 DNA^片段用 PCR純化套組精製，然後使用DNA接合套組ver.2(DNA Ligation Kit ver.2)(TaKaRa Bio公司）接合後，將其導入大
~腸桿菌T9P10(InVitrogen公司）中，並在含安比西林之LB 124 319597 200823235 瓊脂培養基中進行選擇培養。解析回收自經增殖之大腸桿 菌純株之各個基因純株之序列，得到具有編碼人類IgGl 之Fc區域之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)_hFc〇 (2)Nectin-2細胞外區域-人類Fc嵌合蛋白質表現載體之構 築 以參考例4所製作之pcDNA 3.1(+)-Nectin-25作為模 板，使用附加有限制酵素Hindlll之識別序列之引子35(序 修列編號：35)及附加有限制酵素EcoRI之識別序列之引子 36(序列編號：36)進行PCR。該反應中反應液之組成為： pcDNA 3.1(+)_Nectin-2510 ng、Pfu Turbo Hotstart DNA 聚 合酶2·5 U、引子35(序列編號：35)及引子36(序列編號： 36)各 0·2μΜ、dNTPs 200μΜ 及 2 X GC 缓衝液 I lOpL，合 計20μΕ。PCR如下述進行：95°C · 1分鐘後，重複95°C · 20秒、60T： · 15秒、72°C · 2分30秒之循環35次。將反 φ應產物以瓊脂糖凝膠電泳分離後，用凝膠萃取套組 (QIAGEN公司）精製，並用限制酵素Hindlll及EcoRI消 化。同樣地亦用限制酵素Hindlll及EcoRI消化pcDNA 3.1(+)-hFc。使用DNA接合套組ver.2接合該二DNA片段 後，將其導入大腸桿菌TOP10中，並在含安比西林之LB 瓊脂培養基中進行選擇培養。解析回收自經增殖之大腸桿 菌純株之各個基因純株之序列，得到具有編碼融合蛋白質 (序列編號：37)之cDNA序列（序列編號：38)之動物細胞用 表覌載體（pcDNA 3.1(+)-Nectin_2ED-hFc)，其中該融哈蛋 125 319597 200823235 白質係由Nectin-23蛋白質之細胞外區域（序列編號：3所 表示之Nectin-25之胺基酸序列之第1號至第350號）與人 類IgGl之Fc區域融合而成。 參考例16 重組型Nectin-2ED-Fc蛋白質之調製
使用FreeStyle 293表現系統（Invitrogen公司），籍由 參考例15所製作之動物細胞用表現載體（pcpNA 3.1(+)-Nectin-2ED-hFc)調製其所編碼之 Nectin-2ED-hFc 蛋 白質。具體而言，使用293 Fectin(Invitrogen公司）將293F 書細胞株以pcDNA 3· 1 (+)-Nectin-2ED-hFc轉染，將該細跑株 在8%二氧化碳氣流中，於37°C旋轉培養3日。將細胞懸 浮液離心分離，所得之培養上清液用〇·22μιη之濾器過濾 後’供給至以PBS平衡化之rProteinA Sepharose FF管柱 (Amersham Biosciences公司，該公司名已變更為 GE Healthcare)中。用PBS洗淨管柱後，用含有〇·ΐ5 M NaCl 之0·1 Μ甘胺酸-HCl(pH 3.5)溶出，將溶出液用1 Μ 鲁Tris-HCl(pH 8)快速中和。將Nectin-2ED-hFc溶出部分於 4t：對PBS進行整夜透析後，使用Amicon Ultral5 30MWCO (MILLIPORE公司）進行超濃縮，取得重組型Nectin-2ED-Fc 蛋白質。 參考例17 使用肽抗原製作抗Nectin-2兔子多株抗體 依據Nectin-2a蛋白質（序列編號：1)及Nectin-25蛋白 質（序列編號：.3)之胺基酸序列，合成由15個胺基酸組成 之以下3種肽（肽1至3)。 • 肽1之胺基酸序列— . 126 319597 200823235 [Cys- Lys- Met- Gly- Pro- Ser-Phe- Pro- Ser- Pro-Lys- Pro-Gly- Ser-Glu (序列編號：39)]係在Nectin-2a蛋白質（序列編號：1)及 Nectin-25蛋白質（序列編號：3)之第88號至第101號之胺 基酸序列之N末端附加有Cys殘基之序列。 肽2之胺基酸序列 [Arg- Glu- Thr- Pro- Arg- Ala- Ser- Pro- Arg- Asp- Val-Gly- Pro- Leu- Cys 參（序列編號：40)]係在Nectin-2a蛋白質（序列編號：1)之第 347號至360號之胺基酸序列之C末端附加有Cys殘基之 序列。 肽3之胺基酸序列 , [Cys- Thr ^Leu- Gly- Ala- Ser- Glu- His- Ser- Pro- Leu-
Lys- Thr- Pro- Tyr (序列編號：41)]係在Nectin-25蛋白質（序列編號：3)之第 426號至439號之胺基酸序列之N末端附加有Cys殘基之 序列。 將上述肽1、肽2及肽3分別化學鍵結於支持體蛋白 質，即馬來醯亞胺化鑰孔蟲戚血藍蛋白（KLH)(Pierce公司） 者作為免疫原。免疫動物係使用雄性兔KBL : JW( 11週齡， 北山兔），初次免疫係使用上述免疫原與弗氏完全佐劑 (Difco公司）所組成之乳化物，第二次免疫之後係使用該免 疫原與弗氏不完全佐劑（Difco公司）所組成之乳化物，每2 •星期將該等乳化物以每隻兔〇·5 mg(以蛋白質量計）之量注 127 319597 200823235 射於背部皮下’合計進行4次免疫。初次免疫後第52日， 將各兔於麻醉下進行頸動脈採血，從以肽1、肽2或肽3 免疫之兔中分別得到70 ml、66 ml 、72 ml之抗血清。將 從如此所得之抗血清中，藉由硫酸銨鹽析法濃縮免疫球蛋 白口P刀用蛋白質A親和性管柱（Amersham Biosciences公 司，該公司名已變更為GE Healthcare)精製，得到IgG抗 體部分。將如此得到之IgG抗體，供給至經由Cys殘基而 將各肽偶合至瓊脂糖（Sephar〇se)管柱（Amersham 鲁Biosciences公司，該公司名已變更為gE Healthcare)所成 之固定化管柱中。將該管柱用PBS洗淨後，使用含8 Μ尿 素之PBS溶出肽特異性抗體。將此等溶出液對Pbs進行透 析而除去尿素後，藉由超濃縮及濾器過濾滅菌後，取得針 對肽1、肽2及肽3之抗Nectin-2兔子多株抗體精製標準 品（AS-2704、as-2705 及 AS-2706)。 參考例18重組型全長Nectin-25安定表現NSO細胞株之 •建立 建立安定地表現Nectin-23蛋白質（序列編號：3)之 NS0細胞株。為了取得動物細胞用表現載體ρΕΕ12·4· Nectin-25，用限制酵素EcoRI及EcoRV消化參考例4所製 作之pcDNA3.1(+)-Nectin-25。同樣地用限制酵素EcoRI 及Smal消化pEEl2.4動物細胞表現載體（Lonza Biologies 公司）。將所得片段進行瓊脂糖凝膠電泳，切出目標片段並 用 MinElute 凝膠萃取套組（MinElute Gel Extraction Kit) (QIAGEN公司）精製，將該二DNA片段用Ligation High 128 319597 200823235 (TOYOBO 公司）接合後，導入〇〇1^616加1^§11〇115〇1 (ΤΟΥΟΒΟ公司），在含安比西林之LB瓊脂培養基中進行 選擇培養。將經增殖之大腸桿菌純株在含安比西林之LB 培養基中培養，使用 QIAfilter Plasmid Maxi kit(QIAGEN 公司）從離心分離而回收之菌體調製質體。將質體用限制酵 素EcoRI消化後，藉由瓊脂糖凝膠電泳確認Nectin-25基 因之插入，得到具有編碼Nectin-2S蛋白質（序列編號：3) 之cDNA序列（序列編號：4)之動物細胞用表現載體 鲁 pEE12.4-Nectin-25。使用電穿孔儀（genepulser)(Bio-Rad 公司），以藉由限制酵素(Pvul)消化之直線化ΡΕΕ12·4-Nectin-23 40pg 轉染（250 V，400pF)NSO 細胞（2χ 107 個）。 將經轉染之NSO細胞再懸浮於含10%透析用FBS (Invitrogen公司）及2 mM L-麩醯胺酸之DMEM培養基 (JRH公司），將其如下述播種於90孔平底組織培養盤中： 每孔8,000個/50μΙ，共計16盤；每孔2,000個/50μΙ^，共 •計20盤；每孔400個/50>1，共計40盤。將此等盤於8% 二氧化碳氣流中，於37°C培養24小時後，將含10%透析 用 FBS 及 GS supplement(JRH 公司）之 GS 選擇 DMEM 培 養基（JRH公司）加至各孔中，每孔150μΕ，於8%二氧化碳 氣流中，於37°C繼續培養3至4星期。將在上述選擇培養 基中增殖之純株再播種於24孔平底組織培養盤中，使用 RNeasy 96套組（QIAGEN公司）從經增瘦之細胞萃取全 RNA 後，使用 TaqMan One Step PCR Master Mix Reagents Kit(Applied Bio systems*公司）進行定量性PCR，並選擇 129 319597 200823235
Nectin-25mRNA高表現株。定量性PCR之反應液，以總 RNA 100 ng 為模板，並加入 2X Master Mix(Applied Biosystems 公司）25μΙν、40X MultiScribe(Applied Biosystems公司）ΐ·25μΙ>、各為50 nM之引子42(序列編號： 42)及引子43(序列編號：43)、50 nM之經FAM標識之 TaqMan探針3(序列編號：44)，且將反應液量調成50μ]^。 PCR如下述進行：48°C · 30分鐘、95°C · 1〇分鐘後，重複 95°C · 15秒、60它· 1分鐘之循環4〇次。其結果選取高度 馨表現Nectin-M基因之mRNA之NSO細胞12株。 此等12株之Nectin-25蛋白質表現量，藉由使用參考 例17所製作之抗Nectin-2肽兔子多株抗體（AS-2704)之流 ，式細胞測定儀來比較，在其中選取高度表現Nectin_2&蛋 白質之NSO細胞株（#2-75)。 ： ： / 參考例19重組型全長Neetin-25安定表現FM3A細胞株 之建立 φ 建立安定地表現Nectin-23蛋白質（序列編號：3)之 FM3A細胞株。為了取得動物細胞用表現載體pEF1_ Nectin-23 ’使用限制酵素ecori及EC0RV济化參考例4 所製作之pcDNA 3.1(+)_Nectin-2S。同樣地用限制酵素 EcoRI及EcoRv消化動物細胞表現載體pEFl/myc-His A(Invitr〇gen公司）。將所得片段用PCR純化套組（QIAGEN 公司）精製’將該二DNA片段用DNA接合套組ver.2 (TaKaRa 公司）接合履，導入 Competent high JM109 (T〇Y〇B〇公司），並在含安比西林之X3B瓊脂培養基中進 130 319597 200823235 行選擇培養。將經增殖之大腸桿菌純株在含安比西林之LB 培養基中進行培養’使用 QIAprep Turbo Miniprep kit(QIAGEN公司）從离隹心分离隹而回收之菌體調製質體。將 該質體用限制酵素EcoRI及EcoRV消化後，藉由缓脂糖凝 膠電泳確認Nectin-25基因之插入，得到具有編碼Nectin_23 蛋白質（序列編號：3)之cDNA序列（序列編號：4)之動物細 胞用表現載體pEFl-Nectin-25。
使用電穿孔儀（gene pulser)(Bio-Rad 公司），&pEFl-鲁Nectin_2δ40μg轉染（350V，950μF)FM3A細胞（lχl07個）。 將經轉染之FM3A細胞再懸浮於含10% FBS(Invitrogen公 司）之RPMI 1640培養基（Invitrogen公司），然後於5%二氧 化碳氣流中，於37°C培養18小時。將該基因導入細胞再 懸浮於添加有 10%FBS 及 1 mg/mL Geneticine(Invitrogen 公司）之RPMI 1640培養基，以1，000個/200μΕ、100個 /200μΙ>各20盤之方式播種於96孔平底組織培養盤中，然 修後於5%二氧化碳氣流中，於37°C繼續培養1至2星期。 將在上述選擇培養基中經增殖之純株再播種於24孔平底 組織培養盤中，使用RNeasy 96套組（QIAGEN公司）從經 增殖之細胞萃取全RNA後，使用TaqMan One Step PCR Master Mix Reagents Kit(Applied Biosystems 公司）進行定 量性PCR，並選擇Nectin-25mRNA高表現株。在定量性 PCR之反應液中，以總RNA 100 ng為模板，並加入2X Master Mix(Applied Biosystems 公司）25pL、40X MultiScribe(Applied Biosystems 公司）1·25μΕ、各為 50 nM 131 319597 200823235 之引子1(序列編號：9)及引子2(序列編號：ίο)、50 nM之 經FAM標識之TaqMan探針1(序列編號·· 11)，且將反應 液量調成50μΙ^。PCR反應如下述進行：48°C · 30分鐘、 95°C · 10分鐘後，重複95t： · 15秒、60。〇 · 1分鐘之循環 40次。其結果選取高度表現Nectin-25基因之mRNA之 FM3A細胞7株。 此專7株之Nec tin-2 δ蛋白質表現量，藉由使用參考 例17所製作之抗Nectin-2肽兔子多株抗體（AS-2704)之流 •式細胞測定儀來比較，在其中選取高度表現Nectin_25蛋 白質之FM3A細胞株（#58、#60)。再者，將此等細胞株再 懸浮於上述選擇培養基中、，以3個/200μΕ、1個/200yL、 0.3個/200pL各1盤之方式播種於96孔平底組織培養盤 中，然後於5%二氧化碳氣流中，於37°C繼續培養。將呈= 單純株之經增殖細胞株之一部分供給至上述流式細胞測定 儀，並選取Nectin-25蛋白質表現量高之純株（#60-6)。 I參考例20 重組型全長Nectin-N安定表現CHO-K1細胞 株之建立
建立安定地表現Nectin-23蛋白質（序列編號：3)之 CHO-K1細胞株。將在參考例18中所構築之>^(^11-23動 物細胞用表現載體（pEE12·4-Nectin-2δ)藉由限制酵素PvuI 消化而直線化，使用基因槍，以40pg該經直線化之 Nectin-25動物細胞用表現載體轉染CHO-K1細胞（ΙχΙΟ7 個）.。將經轉染之CHO-K1細胞再懸浮於含10%透析用 -FBS(Invitrt)gen 公司）及 GS supplenxent(JRE[公司）之 DMEM 132 319597 200823235 培養基（JRH公司）中，將其以每孔2,500個/50μ[之方式播 種於96孔平底組織培養盤40盤中。在5%二氧化碳氣流 中，於371：培養24小時後，在20盤之各孔中加入含33 ·3μΜ 或66·6μΜ MSX(ICN公司）之上述培養基150>L，並在5% 二氧化碳氣流中，於37°C繼續進行選擇培養3至4星期。 在上述選擇培養基中，將經增殖之純株再播種於24孔平底 組織培養盤中，使用RNeasy 96套組（QIAGEN公司）從經 增殖之細胞取得總RNA，以其作為模板進行反轉錄反應。 •然後將該反應產物作為模板進行定量性PCR，並選取高度 表現Nectin-23之mRNA之前60株。 此等60株之Nectin-25蛋白質表現量，藉由使用參考 ,例17所製作之抗Nectin-2肽兔子多株抗體（AS-2704)之流 : 式細胞測定儀來比較，選取高度表現Nectin-2S蛋白質之 CHO-K1 細胞株（43-2)。 參考例21 重組型Nectin-3細胞外區域-Fc蛋白質之動物 I細胞用表現蛋白質之構築 (1)小鼠IgG2a · Fc片段之選殖 以來自小鼠脾臟之 Marathon-Ready cDNA(BD Biosciences公司）作為模板，使用附加有限制酵素EcoRI 之識別序列之引子4 5 (序列編號.4 5)及附加有限制酵素 Xhol之識別序列之引子46(序列編號：46)進行PCR反應。 該反應中反應液之組成為··上述cDNA 1 pL、Pfu Turbo Hotstart DNA 聚合酶（STRATAGENE 公司）1 u、引子 45(序 列編號：45)及引子46(序列編號：46)各·lplVhdNITs 200μΜ 133 319597 200823235 及2 x GC緩衝液I(TaKaRa Bio公司）10pL，合計液量調整 成20μΕ。PCR如下述進行：95°〇.1分鐘後，重複95°〇· 20秒、60°C · 15秒、72°C · 2分鐘之循環30次。繼而用 PCR純化套組（QIAGEN公司）精製該PCR產物後，用限制 酵素EcoRI及Xhol消化。同樣地用限制酵素EcoRI及Xhol 消化pcDNA 3.1(+)(Invitrogen公司製）。將其用PCR純化 套組精製。使用DNA接合套組ver.2(TaKaRa Bio公司）接 合該二DNA片段後，將其導入大腸桿菌TOP10(Invitrogen 參公司）中，然後在含安比西林之LB瓊脂培養基中進行選擇 培養。解析回收自經增殖之大腸桿菌純株之各個基因純株 之序列，結果得到具有編碼小鼠IgG2a之Fc區域之cDNA 序列之動物細胞用表現載體pcDNA3.1(+)-mFc。、 (2)Nectin-3細胞外區域人類Fc嵌合蛋白質表現載體之構 築 以人類肺癌細胞株A549之Marathon-Ready cDNA(BD 鲁Biosciences公司）作為模板，使用附加有限制酵素Hindlll 之識別序列之引子47(序列編號：47)及附加有限制酵素 EcoRI之識別序列之引子48(序列編號：48)進行PCR。該 反應中反應液之組成為：上述cDNA lpL、Pfu Turbo
Hotstart DNA聚合酶2.5 U、引子47(序列編號：47)及引子 48(序列編號：48)各ΙμΜ、dNTPs 200μΜ及2 x GC缓衝液 I(TaKaRaBio公司）25pL，且將合計液量調整成5(^L〇PCR 如下述進行：95。(： · 1分鐘後，重複951： · 20秒、60。(3 · 15秒、72°C · 2分鐘之循環35次。該PCR產物用PCR純“ 134 319597 200823235 化套組精製後，用限制酵素Hindlll及EcoRI消化。同樣 地用限制酵素Hindlll及EcoRI消化參考例15所製作之 pcDNA 3.1(+)-hFc。將反應產物用壤脂糖凝膠電泳分離 後，用凝膠萃取套組（Gel Extraction Kit)(QIAGEN公司）精 製。該二DNA片段藉由使用DNA接合套組ver.2(DNA 1^831^〇11幻1；¥61：.2)接合後，導入大腸桿菌1'0?10中，然後 在含安比西林之LB瓊脂培養基中進行選擇培養。解析回 收自經增殖之大腸桿菌純株之各個基因純株之序列，結果 •得到具有編碼融合蛋白質（序列編號：49)之cDNA序列之 動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-3ED-hFc，其 中，該融合蛋白質由Nectin-3蛋白質之細胞外區域（序列編 號：5所示之Nectin-3之胺基酸序列之第1號至第404號） 與人類IgGl之Fc區域融合而成。 ：..... (3)Nectin-3細胞外區域-小鼠Fc嵌合蛋白質表現載體之構 築 φ 將（2)所得之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-3ED_hFc用限制酵素Hindlll及EcoRI消化，並用 瓊脂糖凝膠電泳分離後，切出編碼Nectin-3蛋白質之細胞 外區域之DNA片段，並用凝膠萃取套組精製。同樣地將（1) 得到之pcDNA 3.1 (+)-mFc用限制酵素Hindlll及EcoRI消 化，並將反應產物用瓊脂糖凝膠電泳分離後，用凝膠萃取 套鈕精製。將該二DNA片段用DNA接合套組ver.2接合 後，導入大腸桿囷TOP 10並在含安比西林之LB壇脂培養 基中進行選擇培養。解析回收自經增瘦之大勝桿菌純株之— 135 319597 200823235 各個基因純株之序列，結果得到具有編碼融合蛋白質（序列 編號：51)之cDNA序列（序列編號：52)之動物細胞用表現 載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-3ED-hFc，其中，該融合蛋白質 由Nectin-3蛋白質之細胞外區域（序列編號：5所示之 Nectin-3之胺基酸序列之第1號至第404號）與小鼠Fc區 域融合而成。 參考例22 重組型Nectin-3ED-mFc蛋白質之調製 使用FreeStyle 293表現系統（Invitrogen公司）調製參 _ 考例 21 製作之 pcDNA 3.1(+)-Nectin_3ED-mFc 所編碼之 Nectin-3ED-mFc蛋白質。具體而言，使用 293fectin (Invitrogen 公司）以 pcDNA 3.1(+)_Nectin- 3ED_mFc 轉染 293F細胞株，在8%二氧化碳氣流中並於37°C旋轉培養3 日。離心分離細胞懸浮液，將所得之培養上清液用· 〇·22μπι 之濾器過濾後，供給至用 PBS平衡化之rProtein A Sepharose FF 管柱（Amersham Biosciences 公司，該公司名 馨已變更為GE Healthcare)。用PBS洗淨管柱後，用含0·15 Μ NaCl之0·1 Μ甘胺酸-HCl(pH 3.5)溶出，將溶出液用1 Μ Tris-HCl(pH 8)快速中和。將Nectin-3ED-Fc溶出部分於4°C 對PBS進行透析整夜後，使用Amicon Ultra 15 30MWCO (MILLIPORE公司）進行超濃縮，取得重組型Nectin-3ED-mFc蛋白質。 參考例23抗Nectin-2兔子多株抗體之精製 為了減低免疫組織染色（IHC)時之非特異反應，將參考 例14所製作之抗Nectiti-2兔子·多株抗體N2-N0.2供給至 136 319597 200823235
Nectin-3ED-FLAG管柱，以除去結合至FLAG標籤之抗體 部分，其中該Nectin-3ED-FLAG管柱係藉由將參考例26 所製作之Nectin-3ED-FLAG蛋白質固定於HiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare 公司）而製成。將通過該 管柱之Nectin-2特異性兔子多株抗體部分回收，即 N2-N0.2-2，將其用於IHC實驗。 參考例24 在人類癌組織中Nectin-2蛋白質之表現亢進 藉由免疫組織化學（IHC)檢討在人類癌組織中 _ Nectin-2蛋白質之表現。具體而言，將人類乳癌組織陣列 (Cybrdi公司）及人類卵巢癌組織陣列（Cybrdi公司）、人類 正常組織陣列（Biomax公司）予以脫石蝶處理後，浸潰於抗 原賦活化溶液（DAKO公司），並在高壓釜（autoclave)中於 121°C處理15分鐘。接下來，將此等組織陣列水洗後，用 3%過氧化氩水溶液於室溫處理7.5分鐘，用PBS洗淨後， 使用山羊血清（Vectastain公司）於室溫進行20分鐘封阻反 肇應。除去山羊血清後，使用含有參考例23所精製之1 pg/mL 之Ν2-Νο·2-2之抗體稀釋緩衝液（DAKO公司）並於反應 一夜。使用PBS洗淨陣列後，使用ENVISION+(DAKO公 司）於室溫反應30分鐘。再次用PBS進行洗淨，將含有0.01 %過氧化氫水溶液之DAB基質（Merck公司）溶液添加至組 織陣列中’並於室溫反應3分鐘。之後，進行水洗並浸潰 於蘇木精（hematoxylin)l分鐘後，進行脫水處理。以顯微 鏡觀察點加在各陣列中之組織時，由表2 A及表2B所示之 -比率顯然可知在癌組織中，Nectin-2蛋白質之表現顯著地 137 319597 200823235
變得亢進。 表2A 乳房組織 分類 陽性率 浸潤性腺管癌（Infiltrating ductal carcinoma) 89%(16/18) 腺管癌（Ductal carcinoma) 100%(7/7) 浸潤性小葉癌（Infiltrating lobular carcinoma) 100%(9/9) 髓樣癌（Medullary carcinoma) 50%(3/6) 黏液腺癌（Mucinous adenocarcinoma) 71%(5/7) 帕哲特式症（Paget’s disease) 100%(7/7) 正常乳房（Normal breast) 0%(0/5)
表2B 卵巢組織（Ovarian Tissues) 分類 ^ 陽性率 ,' .. 上皮 漿液性腺癌（Serous carcinoma) 55%(22/40) 顆粒細月包癌（Granular carcinoma) 100%(3/3) 明細月包癌 Clear cell carcinoma) 50%(l/2) 類内膜癌（Endometrioid carcinoma) 0%(0/l) 黏液癌（Mucinous carcinoma) 25%(l/4) 布倫納腫瘤（Brenner tumor) 100%(1/1) 胚細胞瘤（Germinoma) 0%(0/4) 卵泡膜細胞癌（Theca cell carcinoma) 100%(1/1) 轉移癌（Metastatic carcinoma) 17%(l/6) 正常卵巢(Normal ovary) 0%(0/3) 參考例25 重組型Nectin-3鈿胞外區域-FLAG蛋白質之動 物細胞用表現載體之構築 製作重組型Nectin-3細胞外區域-FLAG蛋白質之動物 138 319597 200823235 細胞用表現載體時，首先，構築可附加FLAG標籤序列之 載體。具體而言，將5,末端磷酸化之二種類合成DNA，即 FLAG-FSALNOT(序列編號：53)或 FLAG-RSALNOT(序列 編號：54)，用 TE(含 1 mM EDTA 之1^-11€：1(卩118)稀釋成 為50μΜ後，將等量混合，於951加熱10分鐘後進行徐 冷配對（annealing)。接下來將動物用表現載體 pCI-neo(Promega公司）用限制酵素Nhel及Notl消化後， 進行瓊脂糖凝膠電泳，並將載體片段用凝膠萃取套組 籲（QIAGEN公司）萃取。將已進行配對之上述合成DNA混合 於經上述限制酵素處理之pCI- neo中，使用Ligation High(TOYOBO公司）進行接合反應，以構築附加有FLAG :標籤序列之動物細胞用表現載體pCI-FLAG。 繼而，以參考例21所製作之動物細胞用表現載體 pcDNA 3.1(+)-Nectin-3ED-hFc作為模板，使用附加有限制 酵素Sail之識別序列之引子55(序列編號：55)及附加有限 鲁制酵素Nhel之識別序列之引子56(序列編號：56)並進行 PCR。在該反應中反應液之組成如下··以pcDNA 3.1(+)-Neetin-3ED_hFc 作為模板，並加入 pyrobestDNA聚合酶 (TaKaRa Bio公司）2.5 U、引子55(序列編號：55)及引子 56(序列編號：56)各 〇.5pM、dNTPs 200μΜ 及 10 X Pyrobest 緩衝液II(TaKaRa Bio公司）5pL，合計50μ[。PCR反應如 下述進行：94°C . 2分鐘後，重複94°C · 30秒、60°C · 30 秒、68°C · 1·5分鐘之循環30次，接著68°C · 2分鐘。接 著該POR產物用PCR純化套組（QIAGEN公司）精製，然後·· 139 319597 200823235 用限制酵素Sail及Nhel消化。同樣地亦用限制酵素Sail 及Nhel消化上述pCI-FLAG。使用PCR純化套組精製二 DNA片段後，用Ligation High(TOYOBO公司)接合該二 DNA片段。將得到之反應物導入大腸桿菌 TOP10 (Invitrogen公司）中，並在含安比西林之LB瓊脂培養基中 進行選擇培養。解析回收自經增殖之大腸桿菌純株之各個 基因純株之序列，得到具有編碼Nectin-3ED-FLAG蛋白質 (序列編號：57)之cDNA序列（序列編號：58)之動物細胞用 _ 表現載體 pCI-Nectin-SED-FLAG，其中該 Nectin-3ED-FLAG蛋白質係由FLAG標籤融合至Nectin-3蛋白質（序列 編號：5)之胺基酸序列之第1號至第404號之C末端而成。 參考例26 重組型Nectin-3ED-；FLAG蛋白質之調製 使用FreeStyle 293表現系統（Invitrogen公司）調製參 考例 25製作之動物細胞用表現載體（pCI-Nectin-3ED-FLAG)所編碼之Nectin-3ED_FLAG蛋白質。具體而 修言，使用293 fectin(Invitrogen公司）以動物細胞用表現載 體pCI_Nectin-3ED-FLAG轉染293F細胞株，將該細胞在 8%二氧化碳氣流中並於37°C旋轉培養3日。離心分離細胞 懸浮液，將所得之培養上清液用0·45μπι之濾器過濾後， 供給至用含0·3 M NaCl之0·1 M Tris-HCl(pH 7.5)平衡化之 抗FLAG抗體管柱（Sigma公司）。用含0·3 M NaCl之0.1 Μ Tris-HCl(pH 7.5)洗淨管柱後，用含濃度為〇·1 mg/mL之 FLAG肽之相同緩衝液溶出Nectin-3ED-FLAG蛋白質。將 該溶出部分用-Amicon Ultra 15(30K MWCOXMUlipore 公 140 319597 200823235 司）進行超濃縮後，供給至用PBS平衡化之PD-10脫鹽管 柱（GE Healthcare公司），除去混入之FLAG肽並再度濃 縮，取得高純度之重組型Nectin-3ED-FLAG蛋白質。 參考例27 抗Nectin-3兔子多株抗體之製作 以參考例26所調製之重組型Nectin-3ED- FLAG蛋白 質作為免疫原，製作抗Nectin_3兔子多株抗體。將 Nectin_3ED-FLAG蛋白質之PBS溶液與弗氏完全佐劑 (Difco公司）等量混合所製作之乳化物，以每隻0·1 # mgNectin-3ED-FLAG蛋白質之量注射至2隻家兔（曰本白 色種，雌性，3公斤）之背部皮下及皮内，以進行免疫。至 於第二次以後之免疫，同樣地調製使用弗氏不完全佐劑 (Difco公司）之相同蛋白質乳化物，每二星期重複進行免疫 7次。 免疫前以及第4次及第6次免疫一星期後，從耳靜脈 進行試驗採血，藉由使用塗覆Nectin-3ED-FLAG蛋白質之 免疫測定盤之ELISA確認血清抗體價上升。於最終免疫1 星期後，於麻醉下從2隻兔子之頸動脈採血，分別取得78.9 ml及78.8 1111之抗血请。 將此等抗血清用PBS稀釋2倍並將經離心分離知上清 液供應至抗原管柱，該抗原管柱係將Nectin-3ED-FLAG蛋 白質固定於 HiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare 公司） 而製作。將管柱用PBS洗淨後，用含0.15 M NaCl之0.1 Μ 甘胺酸-HCl(pH 3)容出，將溶出液用1 μ Tris-HCl(pH 8) 快速中和後，於4°C對PBS.進行整夜透析，取得抗Nectin-3 141 319597 200823235 兔子多株抗體（Ν3-Νο·1及Ν3·Νο.3)。 參考例28 抗Nectin-2人類單株抗體之大量調製 活體内抗腫瘤活性測定所用之11種抗Nectin-2人類 單株抗體從產生該抗體之融合瘤（Necl-803-2、 Necl-964-l、Necl-303-2、Necl-554-l、Necl-1302-2、 Necl-769-2、Necl-1305-1、Necl-141-3、Necl-209-2、 Neel-909-1及Neel-847-2)調製。以下例示其典型的調製方 法。將上述融合瘤細胞株在含有10%FBS、Ultra-Low _ IgG(Invitrogen 公司）之 1H 培養基（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium : Ham’s F-12 = 1 : 1-0.1 mM MEM # 必需胺基酸溶液、1 mM丙酮酸鈉溶液、2 mM L-麵蕴胺酸 溶液；Invitrogen公司）中，於37。(：及5%二氧化碳氣流中 擴增培養後，在1次慣化培養基（1Η培養基：CD融合瘤-培 養基、8 mM L-麵酿胺酸溶液=1 : 1，invitrogen公司）中 進行擴增並培養1日，然後在主要培養基（1H培養基：CD 融合瘤培養基、8 mM L-麵醯胺酸溶液=1 : 3，Invitrogen 公司）中進行擴增；在使用旋轉燒瓶之情形，於37°C及5% 二氧化碳氣流之條件下，在使用50L容積之攪拌培養槽之 情形，於37°C、溶存氧濃度2 ppm、pH 7.0、攪拌旋轉次 數40 rpm之條件下，培養5至7日。在此期間，根據培養 基成份分析添加葡萄糖溶液及L-麵醯胺酸溶液。主培養以 細胞生存率50%附近作為目標終點。培養終了後進行離心 分離（7,46〇xg，20分鐘）並回收上清液。 使用超過濾膜（Hydrosar.t膜，分子量劃分界線：1〇，、〇〇〇; 142 319597 200823235
Hydrozalt公司）將如此得到之各融合瘤培養上清液濃縮， 將缓衝液置換成含〇·15 M NaCl之20 mM磷酸緩衝液（pH 7.0)後，進行離心分離操作（14,300 X g，20分鐘），得到上 清液。將其更精密地過濾（Stericup HV，0.45 μπι; Millifore 公司），得到濃縮液。使其吸附於以含0J5 M NaCl i20mM 磷酸緩衝液（pH 7·0)平衡化之蛋白質A Sepharose管柱（22 mm ID><79 mm，GE Healthcare公司），用20倍管柱容量之 相同緩衝液洗淨管柱。將結合於管柱之抗體部分用0.1 Μ 檸檬酸鈉缓衝液（pH 3·0)以20倍管柱容量之通液量溶 出，之後立即加入1/10容量之1 M Tris-HCl缓衝液（pH 9.0) 進行中和。將該抗體溶液用超過濾膜（Amicon Ultra，分子 量劃分：30,000 ; Millipore公司）濃縮後，供給至用PBS 平衡化之 Superdex 200 管柱（26 mm- ID X 60 cm，GE Healthcare公司）中，用相同緩衝液溶出，得到抗體單體部 分。將其供給至用PBS平衡化之ActiClean EtOX管柱（25 mm ID X 59 mm，Sterogen · Biosciences 公司），除去内毒 素後，用超過濾膜（Amicon Ultra，分子量劃分：10,000 ; Millipore公司）濃縮，再進行無菌過濾（Millex GV，0.22 μπι ; Millipore公司），得到精製抗體。 由於已知用蛋白質A管柱從融合瘤Neel-554-1之培養 上清液精製得之抗體部分係例外的活性抗體與不活性抗體 之混合物，所以再將該抗體部分供給至陽離子交換管柱， 以分離取得活性部分。亦即，將上述蛋白質A管枉精製抗 體部分用20 mM乙酸鈉緩衝液(pH ·5·0)稀釋3倍，使其吸 143 319597 200823235 附於以含100 mM NaCl之20 mM乙酸鈉緩衝液(pH 5·0)平 衡化之SP-5PW管柱（21·5 mm ID χ 150 mm，東曹公司）。 將該管柱用約2倍管柱容量之含100 mM NaCl之20 mM 乙酸鈉緩衝液（pH 5.0)洗淨後，藉由以70分鐘之時間使溶 離液之NaCl濃度從100 mM上升至300 mM之直線濃度梯 度溶出法，將活性抗體部分與不活性抗體部分分離，.並回 收活性抗體部分（SP3)。將如此得到之抗體溶出液用超過濾 膜（Amicon Ultra，分子量劃分界線：30,000 ; Millipore 公 _司）濃縮，供給至用PBS平衡化之Superdex 200管柱（26 mm ID X 60 cm ’ GE Healthcare公司）中，用相同緩衝液溶 出，得到抗體單體部分。將其供給至用PBS平衡化之
ActiClean EtOX 管:柱（25 mm ID><59 mm，Sterogen · Biosciences公司），除去内毒素後·，…用超:過濾膜(Amicon Ultra ’分子量劃分界線：10,000 ; Millipore公司）濃縮，再 進行無菌過濾（Millex GV，0·22 μπι ; Millipore 公司），得 到精製抗體。將該精製抗體命名為Necl-554-1 SP3。 如此得到之精製抗體，任一者以使用SDS-PAGE及
Superdex 200管柱之凝膠過濾1!?1^測定時，顯示95%以 上之純度。再者，使用ENDOSPECY®-ES-24S set(生化學 工業公司）及TOXICOLOR® DIA set(生化學工業公司）分析 抗體欉準品之内毒素含量，其任一者皆在0.1 EU/mg抗體 以下。 參考例 29 Nectin-1、Nectin_3、Nectin_4、Necl-5 之動物 .細胞.用表現截體之構築— 144 319597 200823235 人類 Nectin-l 基因藉由 Marathon-Ready cDNA (TaKaRa Bio公司）作為模板，使用附加有'限制酵素EcoRV 之識別序列之引子59(序列編號：59)及附加有限制酵素 Xhol之識別序列之引子60(序列編號：60)進行PCR而取 得。該反應中反應液之組成為：以上述cDNA溶液1 pL作 為模板，並加入 Pfu Turbo Hotstart DNA 聚合酶 (STRATAGENE公司）1 U、引子59(序列編號：59)及引子 60(序列編號：60)各 ΙμΜ、dNTPs 200μΜ 及 10 X Pfu Ultra _緩衝液（STRATAGENE公司）2pL，合計20μΙ^。PCR如下述 進行：95°C · 1分鐘後，重複95°C · 20秒、60°C · 15秒、 72°C · 3分鐘之循環40次。繼而將該PCR產物用PCR純 化套組（QIAGEN公司）精製後，用限制酵素EcoRV及Xhol 消化。同樣地，-用1艮制酵素EcoRV及Xhol消化 pCMV-Tag4(STRATAGEN 公司）。將此等 DNA 片段用 PCR 純化套組精製，並使用DNA接合套組ver.2(TaKaRa Bio 公司）接合該二DNA片段。將該反應混合物導入大腸桿菌 TOP10(Invitrogen公司）中，在含卡那黴素（Kanamycin)之 LB瓊脂培養基中進行選擇培養。解析回收自經增殖之大腸 桿菌純株之各個基因純株之序列’得到具有編碼Nedi11-1 蛋白質（序列編號：62)之cDNA序列（序列編號：61)之動物 細胞用表現載體pCMV-Tag 4_Nectin_l。
人類 Nectin-3 基因藉由以 MTC MultiPle Tissue cDNA
Paners(Takara Bio公司）戶斤含人類胎盤之cDNA作為核板’ 使用附加有限制酵素HindlH之識別序列之引子47(序列編 145 319597 200823235 號：47)及附加有限制酵素EcoRV之識別序列之引子63(序 列編號：63)進行PCR而取得。該反應中反應液之組成為： 上述 cDNA 溶液 lpL、Pfu Turbo Hotstart DNA 聚合酶 1 U、 引子47(序列編號：47)及引子63(序列編號：63)各ΙμΜ、 dNTPs 200μΜ 及 2 X GC 緩衝液吻1^1^31〇公司）1(^， 合計20μΕ。PCR如下述進行·· 95°C · 1分鐘後，重複95°C · 20秒、60°C · 15秒、72°C · 2分鐘之循環40次。將該PCR 產物用PCR純化套組精製後，用限制酵素Hind III及 _ EcoRV消化。同樣地，用限制酵素Hind III及EcoRV消化 pcDNA 3.1(+)(Invitrogen 公司）。將此等 DNA 片段用 PCR 純化套組精製，並使用DNA接合套組ver.2接合該二DNA 片段。將該反應混合物導入大腸桿菌TOP10中，在含安比 西林之LB瓊脂培養基中進行選擇培養。解析回责-自經增 殖之大腸桿菌鈍株之各個基因純株之序列，得到具有編碼 Nectin-3蛋白質（序列編號：5)之cDNA序列（序列編號·· 6) ▲之動物細胞用表現載體pcDNA3.1(+)_ Nectin-3。以其中得 到之pcDNAS.U+yNectin-S作為模板，並使用附加有限制 酵素Hindlll之識別序列之引子47(序列編號：47)及附加 有限制酵素Xhol之識別序列之引子64(序列編號：64)進 行PCR。該反應中反應液之組成為：上述pcDNA 3.1(+)-Nectin-3 100 ng、Pfu Turbo Hotstart DNA 聚合酶 2.5 ϋ、引子47(序列編號：47)及引子64(序列編號：64) 各 ΙμΜ、dNTPs 200μΜ 及 2 X GC 缓衝液 I 25pL，合計 50μΙ。PCR如下述進行：95、°C · 1分鐘後，重複95°C * 20 146 319597 200823235
秒、60°C · 15秒、72°C · 2分鐘之循環30次。將該PCR 產物用PCR純化套組精製後，用限制酵素Hind m及xh〇I 消化。同樣地，用限制酵素Hind HI及Xhol消化 pCMV-Tag4。將此等DNA片段用MinElute PCR純化套組 (QIAGEN公司）精製，並使用.DNA接合套組ver.2接合該 二DNA片段。將該反應混合物導入大腸桿菌τορίο中， 在含卡那黴素（Kanamycin)之LB瓊脂培養基中進行選擇培 養。解析回收自經增殖之大腸桿菌純株之各個基因純株之 ⑩序列，得到具有編碼Nectin-3蛋白質（序列編號·· 5)之cDNA 序列（序列編號·· 6)之動物細胞用表現載體pCMV-Tag4 -Nectin-3 〇 人類Nectin-4基因藉由人類肺之Marathon-Ready cDNAfTaKaRa Bio公司）作為模板，使用附加·有限制酵素 EcoRI之識別序列之引子65(序列編號：65)及附加有限制 酵素Xhol之識別序列之引子66(序列編號：66)進行PCR 而取得。該反應中反應液之組成為：上述cDNA溶液1 pL、 Pfu Turbo Hotstart DNA聚合酶1 U、引子65(序列編號： 65)及引子66(序列編號：66)各ΙμΜ、dNTPs 200μΜ及10 X Pfu Ultra缓衝液2pL，合計20μΙ。PCR如下述進行：95°C · 1分鐘後，重複95X： · 20秒、6(TC · 15秒、72t： · 3分鐘 之循環40次。繼而將該PCR產物用PCR純化套組精製後， 用限制酵素EcoRI及Xhol消化。同樣地，用限制酵素EcoRI 及Xhol消化pCMV-Tag4。將此等DNA片段用PCR純化 套組精製.，將插入之DNA片段與載體片段甩DNA接合套 147 319597 200823235 組ver.2予以接合。將該反應混合物導入大腸桿菌ΤΟΡΙΟ 中，在含卡那黴素（Kanamycin)之LB瓊脂培養基中進行選 擇培養。解析回收自經增殖之大腸桿菌純株之各個基因純 株之序列，得到具有編碼Nectin-4'蛋白質（序列編號：68) 之cDNA序列（序列編號：67)之動物細胞用表現載體 pCMV-Tag 4 -Nectin-4 〇 人類Necl-5基因藉由人類小勝之Marathon-Ready cDNA(TaKaRa Bio公司）作為模板，使用附加有限制酵素 # Hind III之識別序列之引子69(序列編號：69)及附加有限 制酵素Sail之識別序列之引子70(序列編號：70)進行PCR 而取得。該反應中反應液之組成為：上述cDNA溶液1 pL、 Pfu Turbo Hotstart DNA聚合酶1 U、引子69(序列編號： 69)及引子70(序列編號：70)各ΙμΜ、dNTPs 200μΜ及10f Pfu Ultra缓衝液2pL，合計20pL。PCR如下述進行：95°C · 1分鐘後，重複95°C · 20秒、60°C · 15秒、72°C · 3分鐘 馨之循環40次。繼而將該PCR產物用PCR純化套组精製後， 與pCR-Blimt II-TOPCKInvitrogen公司）接合。將該反應混 合物導入大知才干囷TOP 10中’在含卡那徽素(Kanamycin) 之LB瓊脂培養基中進行選擇培養。解析回收自經增殖之 大腸桿囷純株之各個基因純株之序列，得到具有編碼 Neel-5蛋白質（序列編號：71)之cDNA序列（序列編號：72) 之選殖載體pCR-Blunt II-Necl-5。將所得到之pCR-Blunt II-Nec 1-5用限制酵素Hind III及Sail消化，同樣地將 pCMV-Tag4用限制酵素Hind III及Sail消化。將此尊DNA . 319597 148 200823235 片段用MinElute PCR純化套組精製，將該二DNA片段用 DNA接合套組ver.2予以接合。將該反應物導入大腸桿菌 TOP 10中，在含卡那穆支素（Kanamycin)之LB ί复脂培養基中 進行選擇培養。解析回收自經增殖之大腸桿菌純株之各個 基因純株之序列，得到具有編碼Necl-5蛋白質（序列編號： 71)之cDNA序列（序列編號：72)之動物細胞用表現載體 pCMV-Tag 4 -Necl-5 〇 參考例30 缺損Igl域或Ig2域之Nectin-2變異體之動物 •細胞用表現載體之構築 藉由下述方法取得缺損Nectin-2細胞外區域之Ig 1域 或Ig2域之Nectin-2變異基因。以在參考例4中取得之 pcDNA 3.1(+)-Nectin-23作為模板，進行PCR。該反應中 反應液之組成為：上述 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2S10 ng ; Pfu
Turbo Hotstart DNA 聚合酶(STRATAGENE 公司)1 U;對於
Igl域缺損體而言，附加有限制酵素EcoRI之識別序列之
贏引子5(序列編號：15)及附加有限制酵素EcoRV之識別序 W 列之引子73(序列編號：73)各ΙμΜ，對於Ig2域缺損體而 言，附加有限制酵素EcoRl·之識別序列之引子5(序列編 號：15)及附加有限制酵素EcoRV之識別序列之引子74(序 列編號：74)各ΙμΜ ; dNTPs 200μΜ ;以及2 X GC緩衝液 I(TaKaRa Bio公司）10μΕ，合計20μΙν。PCR如下述進行： 95t · 1 分鐘後，重複 95t： · 20 秒、60°C · 15 秒、72°C · 1·5分鐘之循環30次。繼而將該PCR產物用PCR純化套 組（QIAGEN公司）精製後，用限制酵素EcoRI及EcoRV.消 149 319597 200823235 化。同樣地，用限制酵素EcoRI及EcoRV消化pcDNA 3.1(+)(Invitrogen公司）。將此等用PCR純化套組精製，將 PCR產物之限制酵素消化物與載體片段用DNA接合套組 ver.2(TaKaRa Bio公司）予以接合後，導入大腸桿·菌 TOP10(Invitrogen公司）中，在含安比西林之LB遭脂培養 基中進行選擇培養，得到經擴增之各個PCR片段之質體 pcDNA 3.1(+)-Nectin_2Z\ Igl-Ι 及 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2 Δ Ig2-1 ° 鲁 接下來使用pcDNA 3.l(+)-Nectin_23作為模板，進行 PCR。該反應中反應液之組成為： 上述pcDNA3.1(+)-Nectin_2310 ng ; Pfu Turbo Hotstart DNA 聚合酶 1 U ;對於 Ig 1域缺損體而言，附加有限制酵素EcoRV之識別序列之 引子75(序列編號：75)及附加有限制酵素Xhol之識別序 列之引子76(序列編號：76)各ΙμΜ，對於1名2域缺損體而 言，附加有限制酵素EcoRV之識別序列之引子77(序列編 馨號：77)及附加有限制酵素Xhol之識別序列之引子76(序 列編號：76)各ΙμΜ ; dNTPs 200μΜ ;以及2 X GC缓衝液 I ΙΟμΙ^，合計20pL。PCR如下述進行：95°C · 1分鐘後， 重複95°C · 20秒、60°C · 15秒、72°C · 1·5分鐘之循環30 次。繼而將該PCR產物用PCR純化套組精製，並用限制 酵素EcoRV及Xhol消化。同樣地，用限制酵素EcoRV及 Xhol 消化如上述構築之 pcDNA 3.1(+)-Nectin_2Z\ Igl-Ι 及 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2Z\ Ig2-1。將此等限制酵素消化物用 PCR純化套組精製，然後將使用引子75(序列編號：75)及 150 319597 200823235 引子76(序列編號：76)之PCR產物之限制酵素消化物與 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2A Igl-Ι 之限制酵素消化物，用 DNA 接合套組ver.2予以接合；同樣地，將使用引子77(序列編 號：77)及引子76(序列編號：76)之PCR產物之限制酵素 消化物與pcDNA 3.1(+)-Nectin-2Z\ Ig2-1之限制酵素消化 物，用DNA接合套組Ver.2予以接合。將此等接合物導入 大腸桿菌TOP10中，在含安比西林之LB瓊脂培養基中進 行選擇培養，得到具有編碼缺損Nectin-2之Ig 1域之蛋白 書質（序列編號：78)之cDNA序列（序列編號：79)之動物細胞 用表現載體pcDNA 3.1(+)_Nectin-2AIgl，以及得到具有編 碼缺損Nectin-2之Ig2域之蛋白質（序列編號：80)之cDNA 序列（序列編號「81)之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1 (+)-Nectin-2AIg2 ° 參考例31 食蟹猴Nectin-2 cDNA之選殖及鹼基序列之決 定 鲁 如下述取得食蟹猴Nectin-2基因。以從食蟹猿之睪丸 所調製之全RNA約]^g(UNITECH公司）作為模板，使用 TaqMan反轉錄試劑（Applied Biosystems公司）並依照規程 進行反轉錄反應，以調製cDNA庫。以該cDNA庫作為模 板，使用引子82(序列編號：82)及引子83(序列編號·· 83) 進行PCR。該反應中反應液之組成為：相當於約40 ng全 RNA 之上述 cDNA，Pfu Turbo Hotstart DNA 聚合酶 (STRATAGENE公司）1U、引子82(序列編號：82)及引子 83(序列編號：83)各 lyM、dNTPs 200μΜ 以及 10 X Pfu Ultra 151 319597 200823235 緩衝液（STRATAGENE公司）2gL，合計20μΙ^。PCR如下述 進行：96°C · 1分鐘後，重複96°C · 20秒、60°C · 15秒、 72°C· 2.5分鐘之循環40次。繼而以該PCR產物作為模板， 並使用引子84(序列編號:84)及引子85(序列編號：85)， 以進行PCR。該反應中反應液之組成為··上述pcr產物
IpL、Pfu Turbo Hotstart DNA 聚合酶 1 u、引子 84(序列編 號：84)及引子85(序列編號：85)各ΙμΜ、dNTPs 200 μΜ 及10 x Pfu Ultra緩衝液2μ1，合計20μΕ。PCR如下述進 鲁行：96°C · 1 分鐘後，重複 96°C · 20 秒、60°C · 15 秒、72°C · 2·5分鐘之循環40次。繼而將該PCR產物用MinElute PCR 純化套組（QIAGEN公司）精製，並與pCR-Bhmt II_TOPO(Invitrogen公司）接合後，導入大腸桿菌勝任細胞 (competent cell)TOP10(Invitrogen 公司）中，在含卡那獯i：素-(Kanamycin)之LB瓊脂培養基中進行選择培養。解析回收 自經增殖之大腸桿菌純株之各個基因純株之序列，得到具 有編碼食蟹猴Nectin-2蛋白質（序列編號：86)之cDNA序 列（序列編號·· 87)之載體 pCR-Blunt IIvmaNectin-2。 參考例32 食蟹猴^〇(^11-2動物細胞用表現載體之構築 以在參考例31中製作之含有食蟹猴Nectin-2基因之 pCR_Blunt II- maNectin-2作為模板，使用附加有限制酵素 EcoRI之識別序列之引子88(序列編號：88)及附加有限制 酵素Xhol之識別序列之引子89(序列編號·· 89)進行PCR。 在該反應中反應液之組成為·· pCR-Blunt II_ maNectin-2 10 ng、KOD-Plus-DNA 聚合酶（TOYOBO 公司）1ϋ、引子 88(序 152 319597 200823235 列編號：88)及引子89(序列編號：89)各0·3μΜ、dNTPs 200μΜ及10 x PCR緩衝液（TOYOBO公司）5pL，合計 50μΕ。PCR如下述進行：95°C · 3分鐘後，重複95°C · 30 秒、60°C · 30秒、68t： · 1分鐘30秒之循環35次。繼而 將該PCR產物用MinElute PCR純化套組（QIAGEN公司） 精製後，用限制酵素EcoRI及Xhol消化，並用MinElute PCR純化套組（QIAGEN公司）精製。同樣地，使用限制酵 素 EcoRI 及 Xhol 诮化 pcDNA 3.1(+)(Invitrogen 公司）並用 籲瓊脂糖電泳分離後，使用MinElute凝膠萃取套組（QIAGEN 公司）精製載體片段。將如此得到之插入DNA片段與載體 片段用Ligation High(TOYOBO公司）予以接合後，導入大 腸桿菌Competent high DH5a(TOYOBO公司），然後在含安 比西林之LB瓊脂培養基中進行選擇培養。解析回收自經 增殖之大勝桿菌純株之各個基因純株之序列，得到具有編 碼食蟹猴Nectin-2蛋白質（序列編號：86)之cDNA序列（序 •列編號：87)之動物細胞用表現載體pcDNA 3· 1(+)-maNectin-2 〇 參考例33導入食蟹猴型變異之人類Nectin-2動物細胞用 表現載體之構築
以在參考例4中製作之動物細胞用表現載體pcDNA ;* · - - 3.1(+)-Nectin_25作為模板，使用附加有限制肆素Hind III 之識別序列之引子90(序列編號：90)及引子91(序列編號： 91) ’或附加有限制酵素EcoRI，之識別序列之引子92(序列 編號：92)及引子93(序列編號> 93)進行PCR。在該反應中 153 319597 200823235 反應液之組成為：pcDNA 3.1(+)-Nectin-2310 ng、KOD-Plus- DNA聚合酶（TOYOBO公司）11；、引子90(序列編號： 90)及引子91(序列編號：91)各0·3μΜ或者引子92(序列編 號：92)及引子93(序列編號：93)各0·3μΜ、dNTPs 200μΜ 及 lOxPCR 緩衝液（ΤΟΥΟΒΟ 公司）5μΕ，合計 50μ[。PCR 、如下述進行：95°C · 3分鐘後，重複95t： · 30秒、60T： · 30秒、68°C · 1分鐘之循環35次。繼而、將該PCR產物用 MinElute PCR純化套組（QIAGEN公司）精製。接著，以如 泰此所得之PCR產物之混合物作為模板，並使用引子90(序 列編號：90)及引子92(序列編號：92)進行PCR。在該反應 中反應液之組成為：上述之精製PCR產物各.5pL、KOD-Plus-DNA聚合酶11；、引子90(序列編號：90)及引子92(序 列編號：92)各 0·3μΜ、dNTPs 200μΜ 及 10 X PCR 諼衝液 5pL，合計50μΙ^。PCR如下述進行·· 95°C · 3分鐘後，重 複95QC · 30秒、60°C · 30秒、68°C · 1分鐘之循環20次。 馨繼而將該PCR產物用MinElute P0R純化套組精製後，用 限制酵素Hind III及EcoRI消化，將消化物用MinElute PCR /純化套組精製。同樣地，用限制酵素Hind III及EcoRI消 化pcDNA 3.1(+)(Invitrogen公司），並進行瓊脂糖凝膠電泳 後，用MinElute凝膠萃取套組（QIAGEN公司）精製目標載 .體片段。將插入DNA片段與載體片段用 Ligation High(TOYOBO公司）予以接合後，導入大腸桿菌Competent high DH5a(TOYOBO公司），然後在含安比西林之LB瓊脂 培養基中-進行選擇培養。解析回收自經增殖之大腸桿菌純 154 319597 200823235 株之各個基因純株之序列，得到具有編碼蛋白質 AN77-78PD之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2(AN77-78PD)，其中該蛋白質 AN77- 78PD 係由人類Nectin-25蛋白質（序列編號：3)之第77號之Ala 變異成Pro，以及第78號之Asn變異成Asp而成。 以在參考例4中製作之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-23作為模板，使用附加有限制酵素Hind III 之識別序列之引子90(序列編號：90)及引子94(序列編號： _ 94)，或附加有限制酵素EcoRI之識別序列之引子92(序列 編號：92)及引子95(序列編號：95)進行PCR。在該反應中 反應液之組成為：pcDNA 3.1(+)-Nectin-2510 ng、KOD-Plus- DNA聚合酶1 U、引子90(序列編號：90)及引子94(序 列編號:94)各0·3μΜ或者引子92(序列編號:92)及引子 95(序列編號：95)各 0·3μΜ、dNTPs 200μΜ 及 10 X PCR 緩 衝液5gL，合計50pL。PCR如下述進行：95°C · 3分鐘後， •重複95°C · 30秒、60°C · 30秒、68°C · 1分鐘之循環35 次。繼而將該PCR產物用MinElute PCR,純化套組精製。 以如此所得之PCR產物之混合物作為模板，並使用引子 90(序列編號：90)及引子92(序列編號：92)進行PCR。在 * . * · . 該反應中反應液之組成為：上述之精製PCR產物各5μΙ>、 KOD- Plus· DNA聚合酶1 U、引子90(序列編號：90)及引 子 92(序歹丨J 編號:92)各 0·3μΜ、dNTPs 200μΜ 及 10 X PCR 緩衝液5pL，合計50μΕ。PCR如下述進行·· 95°C · 3分鐘 後，重複95°C 7 30秒、60°C · 30秒、68°(： .1分鐘之循環- 155 319597 200823235 20次。以下，藉由與上述同樣之方法，得到具有編碼蛋白 質G113R之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2(G113R)，其中該蛋白質G113R係由人類 Nectin-25蛋白質（序列編號·· 3)之第113號之Gly變異成 Arg而成。 其次，以在參考例4中製作之動物細胞用表現載體 pcDNA 3·1(+)-Nectin-23作為模板，使用附加有限制酵素 Hind III之識別序列之引子90(序列編號·· 90)及引子96(序 •列編號·· 96)，或附加有限制酵素EcoRI之識別序列之引子 92(序列編號：92)及引子97(序列編號·· 97)進行PCR。在 該反應中反應液之組成為：pcDNA 3.1(+)-Nectin-2510 ng、KOD- Plus- DNA聚合酶1 u、引子90(序列編號：90) 及引子96(序列編號：96)各〇·3μΜ或者引子96(序列編號-> 96)及引子97(序列編號：97)各0·3μΜ、dNTPs 200μΜ及 10 x PCR缓衝液5pL，合計5〇μΙ。PCR如下述進行：95°C · 3分鐘後，重複95°C · 30秒、60°C · 30秒、68°C · 1分鐘 之循環35次。繼而將該PCR產物用MinElute PCR純化套 組精製。接著，以如此所得之PCR產物作為模板，並使用 引子90(序列編號：90)及引子92(序列編號：92)進行PCR。 在該反應中反應液之組成為：上述之精製PCR產物各 5μί、KOD- Plus- DNA聚合酶1 u、引子90(序列編號：90) 及引子92(序列編號:92)各〇·3μΜ、dNTPs 200μΜ及10 X PCR缓衝液5pL，合計50μΕ。PCR如下述進行：95。(： · 3 分鐘後，重複95°C · 30秒、60。(： · 30秒、68°C · 1分鐘之 156 319597 200823235 循環20次。以下，藉由與上述同樣之方法，得到具有編碼 蛋白質H128R之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3,l(+)_Nectin-2(H128R)，其中該蛋白質H128R係由人類 Nectin-2S蛋白質（序列編號·· 3)之第128號之His變異成
Arg而成。 參考例34 在Igl結構域中進行1個胺基酸置換所得之人 類Nectin-2ED-Fc蛋白質之動物細胞用表現載體之構築 以在參考例15中製作之動物細胞用表現載體pcDNA ⑩ 3.1(+)-Nectin-2ED -hFc 作為模板，並使用 Quick Change XL- Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene 公司），將編 碼Nectin-2之Igl域中26處所之胺基酸殘基之DNA序列， 以分別使一處所之胺基酸殘基置換成丙胺酸殘基或甘胺酸 殘基之方式加入變異。讓反應中反應液之組成為：上述表一 現質體（20 ng/pL)7pL、10 X緩衝液35pL、dNTP混合物 7pL、Quick Solution 21 pL、Pfu Turbo DNA 聚合酶（2·5 _ U/pL)7pL，在其中加入蒸餾水使其合計量成為300pL，將 其以每管9pL之量注入26支PCR用試管中，並分別加入 • · . -· 下述引子(各3·7μΜ)之組合：引子Q37A(序列編號：98)與 引子Q37AR(序列編號：99)、引子P40G(序列編號：1〇〇) 與引子P40G R(序列編號：101)、引子Q45A(序列編號： 102)與引子Q45A R(序列編號：103)、引子Η55Α(序列編 號·· 104)與引子Ή55Α R(序列編號·· 105)、引子V60A(序 列編號：106)與引子V60A R(序列編號：107)、引子Υ64Α(序 …列編號：108)與引子Υ64Α R(序列編號：109)、引子Q71Α(序 157 319597 200823235 列編號：110)與引子Q71A R(序列編號：111)、引子A75G(序 列編號：112)與引子A75G R(序列編號：113)、引子P76G(序 列編號:114)與引子P76G R(序列編號：115)、引子A77G(序 列編號：116)與引子A77G R(序列編號：117)、引子N78A(序 列編號：118)與引子N78A R(序列編號：119)、引子H79A(序 列編號：120)與引子H79A R(序列編號：121)、引子Q80A(序 列編號：122)與引子Q80A R(序列編號：123)、引子N81A(序 :列編號：124)與引子N81A R(序列編號：1.25)、引子K88A(序 _列編號：126)與引子K88AR(序列編號：127)、引子S95A(序 列編號：128)與引子S95A R(序列編號：129)、引子 K109A(序列編號：130)與引子K109A R(序列編號：131)、 引子E117A(序列編號：132)與引子E117A R(序列編號： 133)、·引子D122▲(序列編號：134)與引子、D122A'Rt序列 編號：135)、引子H128A(序列編號：136)與引子H128A R(序 列編號：137)、引子N137A(序列編號：138)與引子N137A 鲁R(序列編號：I39)、引子FIMA(序列編號：14〇)與引子 F145AR(序列編號：141)、引子K147A(序列編號：142)與 引子K147A R(序列編號：143)、引子V150A(序列編號： 144)與引子VI50A R(序列編號：145)、引子Ml53A(序列 編號：146)與引子M153A R(序列編號：147)、引子T154A(序 列編號：148)與引子T154A R(序列編號：149)，各引子之 添加量為〇.5pI^PCR之反應如下述進行：95°C · 1分鐘後， 重複95°C · 50秒、60°C · 50秒、68°C · 7分鐘40秒之循 、環18次之後_，68°C· · 7分鐘。反應後，在26管之PCR液 158 319597 200823235 中，每管添加bL之限制酵素DPnI(2 U/KL)，於37°C反應 1小時。將此等之反應混合液2 pL導入大知桿囷XL 10 - G ο 1 d Ultracompetent cells20pL中，並在含安比西林之1^瓊脂 培養基中進行選擇培養。解析回收自經增殖之大腸桿菌純 株之各個基因純株之序列，分別得到具有編碼蛋白質 Q37A(其中Nectin-2ED_Fc(序列編號·· 37)之第37號之Gin 變異成Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體PcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(Q37A)、具有編碼蛋白質 p40G(其中 _ Nectin-2ED-Fc(序列編號·· 37)之第40號之Pro變異成Gly) 之 cDNA序列之動物細胞用表現載體 pcDNA 3.1(+)-Nectin、2ED- Fc(P40G)、具有編碼蛋白質 Q45A(其中 Nectin-2ED_Fc(序列編號：37)尤第45號之Gln變異成Ala) 之cDNA序列-，之:動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Q45A)、具有編碼蛋白質 H55A(其中 Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第55號之ms變異成Ala) ⑩之cDNA序列之動物細胞用表現載體PcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(H55A)、具有編碼蛋白質¥60八(其中 Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第6〇號之Val變異成Ala) 之cDNA序列之動物細胞用表現載體PcI)NA 3.1(»Nectiii_2ED_IMV60A：)、具有編碼蛋白質 Y64A(其中 Nectin_2ED-Fc(序列編號：37)之第64號之Tyr變異成Ala) 之cDNA序列之動物細胞用表現載體PcDNA 3·1⑴-NeCtin-2ED-Fc(Y64A)、具有編碼蛋白質Q?1A(其中
Nectin-2ED_Fc(序列編號：37)么第71號之Gln變異成Ala) 159 319597 200823235
之 cDNA 序列之動物細胞用表現載體 pcDNA
3.1(+)-Nectin-2ED_Fc(Q71A)、具有編碼蛋白質 A75G(其中 Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第75號之Ala變異成Gly) 之 cDNA 序列之動物細胞用表現載體 pcDNA
3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(A75G)、具有編碼蛋白質 P76G(其中 Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第76號之Pro變異成Gly) 之 cDNA 序列之動物細胞用表現載體 pcDNA
3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(P76G)、具有編碼蛋白質 A77G(其中 • Nectin_2ED-Fc(序列編號：37)之第77號之人1&變異成〇^0 之 cDNA 序列之動物細胞用表現載體 pcDNA 3.1(+)_Nectin-2ED- Fc(A77G)、具有編碼蛋白質，78八(其 中Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第78號之Asn變異成 Ala)之cDNA之動物細胞用_表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(N78A)、具有編碼蛋白質 H79A(其 中Neetin-2ED-Fc(序列編號：37)之第79號之His變異成 蠢Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(H79A)、具有編碼蛋白質 Q80A(其 中Nectin-2ED_Fc(序列編號：37)之第80號之Gin變異成 Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+>Nectin-2ED- Fc(Q80A)、具有編碼蛋白質 N81A(其 中Nectin_2ED_Fc(序列編號：37)之第81號之Asn變異成 Ala)之 cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(N81A)、具有編碼蛋白質 K88A(其 ，.中Nectin-2ED_Fc(序列編號：37)之第88·號之Lys變異成 160 319597 200823235
Ala)之cDNA序歹之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K88A)、具有編碼蛋白質 S95A(其中 Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第95號之Ser變異成Ala) 之 cDNA 序歹^之動物細胞用表現載體 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(S95A)、具有編碼蛋白質 K109A(其 中Nectin_2ED-Fc(序列編號·· 37)之第109號之Lys變異成 Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3、l(+)_Nectin-2ED- Fc(K109A)、具有編碼蛋白質 E117A(其 籲中Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第117號之Glu變異成 Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)_Nectin-2ED- Fc(E117A)、具有編碼蛋白質 D122A(其 中Nectin-2,ED-Fc(序列編號：37)之第122號之Asp變異成 Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現截體pcDNA 3.1(+)-Nectin_2ED_ Fc(D122A)、具有編碼蛋白質 H128A(其 中Nectin-2ED_Fc(序列編號：37)之第128號之His變異成 書Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin_2ED- Fc(H128A)、具有編碼蛋白質 N137A(其 中Nectin-?ED-Fc(序列編號：37)之第137號之Asn變異成 Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(N137A)、具有編碼蛋白質 F145A(其 中Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第145號之Phe變異成 Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA S/U+hNectindED- Fc(F145A)、具有編碼蛋白質 K147A(其 中Nectin-2ED-Fc(序列編號37)之第147號之Lys變異成 161 319597 200823235
Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3·l(+)-Nectin-2ED· Fc(K147A)、具有編石馬蛋白質 vi5qa(其 中Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第15〇號之Val變異成 Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-NeCtin-2ED- FC(V150A)、具有編碼蛋白賀 M153A(其中Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第l53號之 Met變異成Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(M153A)、具有編碼蛋白質 ⑩T154A(其中Nectin-2ED_Fc(序列編號：37)之第154號之
Thr變異成Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(T154A)。 參考例35 在Ig2結構域中進行1個胺基酸置換所得之人 類Nectin-2ED-Fc蛋白質之動物細胞用表現載體之構築 以在參考例15中製作之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-liFc 作為模板，並使用 Quick Change • XL-Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene 公司），將編馬 Nectin-2之Ig2域中13處所之胺基酸殘基之DNA序列， 以分別使一處所之胺基酸殘基置換成丙胺酸殘基或甘胺酸 殘基之方式加入變異。該反應中反應液之組成為：上述表 現質體（20 ng^L)3.5gL、10 X 缓衝液 17.5pL、dNTP 混合 物 3.5pL、Quick Solution 10·5μΙ、Pfu Turbo DNA 聚合酶 (2.5 U^L)3.5pL，在其中加入蒸餾水使其合計量成為 150pL，將其以每管9pL之量注入13支PCR甩試管中， 並分別加入下述引子（各3:7μΜ)之:組合：引子Q165A(序歹^ 162 31959? 200823235 編號：150)與引子Q165AR(序列編號：151)、引子K170A(序 列編號：152)與引子K170A R(序列編號：153)、引子 F173A(序列編號：154)與引子F173A R(序列編號：155)、 引子P177G(序列編號：156)與引子P177G R(序列編號： 157)、引子I184A(序列編號：158)與引子I184A R(序列編 號：159)、引子K186A(序列編號：160)與引子K186A R(序 列編號：161)、引子L197A(序列編號：162)與引子L197A R(序列編號：163)、引子W202A(序列編號：164)與引子 冒W202A R(序列編號：165)、引子E206A(序列編號：166) 與引子E206AR(序列編號：167)、引子T212A(序列編號： 168)與引子T212AR(序列編號：169)、引子T235A(序列編 號：170)與引子T235A R(序列編號：171)、引子K239A(序 列編號:172)與引子K239A R(序列編號：173)、引子 A249G(序列編號：174)與引子A249G R(序列編號：175)， 各引子之添加量為〇.5pL。PCR如下述進行：95°C · 1分鐘 後，重複 95t： · 50 秒、60°G · 50 秒、68°〇.7分鐘40秒 之循環18次之後，在68X進行反應7分鐘。反應後，在 13管之PCR液中，每管添加1 kL之限制酵素Dpnl(2 U/pL)，於37°C反應1小時。將此等之反應混合液2pL導 入大腸桿菌 XL10 - Gold Ultracompetent cells 20gL 中，並 在含安比西林之LB瓊脂培養基中進行選择培養。解析回 收自經增殖之大腸桿菌純株之各個基因純株之庠列，分別 得到具有編碼蛋白質Q165A(其中Nectin-2ED: Fc(序列編 號：37)之第Γ65號之Gin變嗔成Ala)之cDNA,序列之動物 163 319597 200823235 細胞用表現載體 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(q165a) 具有編碼蛋白質K170A(其中Nectin-2ED-Fc(序歹虎· 37) 之第170號之Lys變異成Ala)之cDNA序列之動物細胞用 表現載體 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(K17〇a)、1亡 ^、具有編 碼蛋白質F173A(其中Nectin_2ED-Fc(序列編號：37)之第 173號之Phe變異成Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現 載體 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(F173A)、具有編碼蛋白
質P177G(其中Nectin_2ED-Fc(序列編號：37)之第177號 之Pro變異成Gly)之cDNA序列之動物細胞用表現載體 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(P177G)、具有編瑪蛋白質 I184A(其中Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第184號之Ile 變異成Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現戴體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED: Fc(I184A)、具有編碼蛋白質 k186a(其 中Nectin-2ED-Fc(序列編號· 37)之第186號之Lys變異成
Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 籲 3.1(+)_Nectin-2ED-Fc(K186A)、具有編碼蛋白質 L197A(其 中Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第197號之Leu變異成
Ala)之cDNA序歹之動物細胞用、表現載體peDNA
3.1(+)-Nectin-2ED_ Fc(L197A)、具有編碼蛋白質 W202A(其 中Nectin-2ED-Fc(序列編號· 37)之第202號之Trp變異成 Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+>Nectin-2ED-Fc(W202A)、具有編碼蛋白質 R206A(其 中Nectin-2ED_Fc(序列編號：37)之第206號之Glu變異成 Ala)之 cDNA序列之動物細胞用表現載體 pcDNA 164 319597 200823235
3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(E206A)、具有編碼蛋白質 T212A(其 中Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第212號之Thr變異成 Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(T212A)、具有編碼蛋白質 T235A(其 中Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第235號之Thr變異成 Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體peDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(T235A)、具有編碼蛋白質 K239A(其 中Nectin-2ED-Fc(序列編號：37)之第239號之Lys變異成 _ Ala)之cDNA序列之動物細胞用表現載體pcD：NiA 3.1(+)-Nectin_2ED- Fc(K239A)、具有編碼蛋白貧 A249G(其 中Nectin-2ED-Fc(序列編號37)之第249號之Ala變異成 Gly)之cDNA. ··序列之動物細胞用表現截體pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED- Fc(A249G) 〇 實施例1 抗Nectin-2人類單株抗體之製作 將參考例16所調製之Nectin_2ED-Fc蛋白質（1.6 春mg/mLlBS溶液）或參考例13所調製之Nectin-2ED-FLAG 蛋白質（2 mg/mLPBS溶液）與弗氏完全佐劑（1)价〇公司）等 容量混合所調製之乳化物分別注射入KM小鼠(10週齡， 12週齡，雄性；麒麟啤酒股份公司）各5隻之皮下及皮内， 每隻50pg以進行免疫。第二次以後，將此等重組型Nectin-2 細胞外區域蛋白質及弗氏不完全佐劑(Difco公司）等容量 混合所調製之乳化物同樣地每2星期進行追加免疫一次。 再者將參考例19所建立之Nectin-25安定表現FM3A 細胞株（#60·6)及參考例所建立之Nectin-25安定表現 165 319597 200823235 NSO細胞株（#2-75)進彳于燒瓶培養’將其分別猎由離心分離 (l，200rpmx5分鐘）回收細胞’再懸浮於1640 (Invitrogen公司）後’藉由離心分離（1，2〇〇 rPmx5分鐘）回收 細胞，如此重複進行3次’以除去血清成分。將回收之各 細胞再懸浮於RPMH640培養基中並使其濃度成為5χ107 個/mL，將溶解於培養基中之絲裂黴素c(和光 純藥股份公司）以使最終濃度成為20呢/]〇1[之方式添加， 並於37°C培養30分鐘。將經絲裂黴素C處理之兩細胞株 鲁用10 mL之PBS同樣地洗淨3次後，將再懸浮於PBS並 使濃度成為2χ107個/mL者注射入KM小鼠（10週齡至12 週齡，雄性）各5隻之腹腔内，每隻1 X 107個/500μΕ，每 一星期重複進行免疫一次。
再者，將 Nectin-2ED-Fc 蛋白質或 Nectin-2ED-FLAG 蛋白質與弗氏完全佐劑（Difco公司）等容量混合所調製之 乳化物分別注射入5隻KM小鼠（12週齡，雄性)之皮下及 春皮内，每隻50pg，以進行免疫。初次免疫一星期後，藉由 上述方法將經絲裂黴素C處理之Nectin-25 .表現FM3A細 胞株以每隻lxlO7個/5Ό0μΕ之量注射入腹腔内進行免疫。 第 3 日將 Nectin-2ED-Fc、Nectin-2ED-FLAG 與弗氏不完全 佐劑等容量混合所調製之乳化物分別注射入皮下及皮内， 每隻50#g，以進行免疫，同時藉由上述方法將經絲裂黴素 C處理之Nectin-23表現FM3A細胞株(#60_6)以每隻lxl〇7 個/500μ1之量注射入腹腔内進行免疫。第4日以後，只藉 由上述方法將經絲裂黴素c處理之NectinJS,表現FM3A 166 319597 200823235 細胞株（#60-6)以每隻1x1 〇7個/500μΕ之量注射入腹腔内進 行免疫。 在免疫開始前及第3次免疫1星期後，在乙醚麻醉下 自全部小鼠進行眼底採血，取得抗血清，藉由下述之流式 細胞測定法調查血清抗體價。亦即將參考例20所建立之 Nectin-25安定表現CHO細胞株（#43-2)及模擬（mock)-CHO 細胞株之細胞懸浮液（PBS)分別分注於聚丙烯製試管，每管 5χ105個，藉由離心分離（l，200 rpm><5分鐘）除去PBS。將 •此等細胞殘餘物再懸浮於經含1%BSA及10%FBS之PBS 稀釋100倍之上述小鼠抗血清，每種50μ：ί，並使其在冰上 暗處反應30分鐘。在該細胞懸浮液中加入20〇μΙ^ PBS並 進行離心分離（1，2〇〇 rpmX5分鐘）後，將上清液吸引除去， 將細胞殘餘物再懸浮於經含1 % BSA及10 % FBS i PBS 稀釋 100 倍之抗-人類 igG(H+L)Alexa 488(Invitrogen 公司） 溶液50μΕ，並使其在冰上暗處反應30分鐘。將該細胞懸 φ浮液同樣地用PBS洗淨3次後，將細胞殘餘物再懸浮於 PBS 200μΕ中，使用流式細胞測定儀MPL 500(BECKMAN COULTER公司）測定各細胞之螢光強度，以螢光強度為橫 軸，以細胞數為縱軸作圖，比較血清抗體價。 在上述方法中，於確認血清抗體價充分上升之KM小 鼠中，將此等蛋白質抗原以l〇#g/隻之量經由尾靜脈注射 投與至以Nectin-2ED_Fc或Nectin-2ED_FLAG免疫之個體 中，再者，將相同細胞株以每隻lx 1〇7個之量經由腹腔内 、注射投與至以Ν&9Ηη-2δ安定表現鈿胞株免疫之個體中。… 167 319597 200823235 於此等之最終免疫3日後將該小鼠放血死亡並摘出脾臟， 將所得到之小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞 (P3X63Ag8U.l(P3Ul))以5 : 1之比例混合，並使用聚乙二 醇（PEG)l，500(Roche Diagnostics公司）使之融合，其中該 小鼠骨趨瘤細胞係在將8-氮雜鳥嗓呤（Sigma公司）1小瓶 (vial)溶解於含10%FBS等之Daigo T培養基[其係在f_12 Nutrient Mixture(HAM)(Invitrogen 公司）與 iscove，s Modified Dulbecco’s Medium(Invitrogen 公司）之等量混合 培養基中，添加MEM非必須胺基酸溶液(invitr〇gen& 司）、丙酮酸鈉（Invitrogen公司）及L-麩酸胺酸（invitr〇gen 公司）而成者]500 ml所成之培養基中經慣化培養之小鼠骨 髓瘤細胞。細胞融合操作係依照試藥所附之手冊進行。將. 融合後之細胞再懸浮於含10 % FBS及10% BM Condimed HI (Roche Diagnostics 公司）之 Daigo T 培養基，將在 96 孔 培養盤中以5x104個/lOOpL/孔之量播種脾臟細胞者，在5 書％二氧化碳氣流中，於37°C培養1日後，添加含0·1 mM次 黄嘌呤、0·4μΜ 胺嗓吟（aminopterin)、0.016 mM 胸苦 (HAT)、10% BM Condimed HI 及 10%FBS 之 Daigo T 培養 基（HAT選擇培養基）100μΕ/孔，再於5%二氧化碳氣流中， 於37°C繼續培養，以每3 .日2次之頻率將培養上清液之3/4 用新鮮的HAT選擇培養基交換。 將在培養之第7日至第14日見到純株增殖之孔之培養 上清液供給至使用Nectin-2δ,安定表現CHO細胞株（#43-2) 或模擬-CHO細胞株之細胞ELIS A，並篩選產生抗N、ectin-2 168 319597 200823235
人類單株抗體之融合瘤。亦即，將Nectin_25安定表現CHO 細胞株（#43-2)或模擬-CHO細胞株之細胞株，在使用含1〇% 透析FBS及GS supplement之GS選擇DMEM培養基下， 於96孔組織培養盤中培養，將各細胞株生長至匯合程度之 培養盤之上清液予以吸除後，添加含2%FBS之 PBS(+)200pL/孔，於冰上暗處培養1小時。將各孔之上澄 清液吸除，添加融合瘤培養上清液50μΙ7孔，使其於冰上 暗處反應2小時。將該培養盤用冷卻至4°C之PBS(+)洗淨 參 1次，每孔添加用含2%FBS之PBS(+)稀釋3,000倍之抗-人類IgG(H +L)鏈特異性（山羊）過氧化酶結合物（conjugate) (CALBIOCHEM公司）l〇〇pL/孔，並使其於冰上暗處反應2 小時。將該培養盤用冷卻至4°C之PBS(+)洗淨3次後，添 加 3,3 ’，5,5’·.四甲基聯苯胺（TMB)溶液（SureBlue Microwell TMB 過氧化酶受質；Kirkegaard & Perry Laboratories 公 司）100μΙ7孔，並於室溫顯色5分鐘，添加2N硫酸（和光純 參藥股份公司）100μ1/孔並使酵素反應停止。使用培養盤讀數 器（Multiskan BICHROMATIC; Thermo Electron Co·)測定各 孔之吸光度(450 nm)，將Nectin_2表現CHO細胞株培養盤 之吸光度為0.5以上及模擬-CHO細胞株培養盤之吸光度 為0·3以下者判定為陽性孔。從此等中選擇產生抗原特異 性及親和性特別高之IgG抗體之融合瘤，並再懸浮於含 10% FBS 及 10%;BM Condimed H1 之 Daigo T 培養基後’ 以0·5個/孔之量播種:於96孔組織培養盤中，將藉由顯微 鏡觀察確認為單株之融合·瘤之培養上清液用上述Cell 169 319597 200823235 ELISA再次篩選，建立產生抗Nectin-2人類單株抗體之融 合瘤純株。將如此得到之256種產生Nectin-2人類單株抗 體之融合瘤在 100 mL之含10% FBS、Ultra low IgG(Invitrogen公司）之〇&1$〇丁培養基中進行燒瓶培養， 將培養上清液離心分離（1，200 rpm x 5分鐘），取得含單株 抗體之上澄清液。在此等培養上清液中添加經PBS平衡化 之蛋白質 A Sepharose FT 200pL(Amersham Biosciences 公 司，該公司名已變更為GE Healthcare公司），並於4。(：缓 慢地振動整夜並吸附抗體。藉由離心分離操作回收該蛋白 質A支持體，用PBS洗淨後，以含〇·3Μ NaCl之0.1M甘 胺酸-HCl(pH 3·0)1·2 mL溶出IgG部分。將該溶出液用1M Tris-HCl(pH 8·0)快速中和後，藉由使用超過率膜（vivaSpin 6 ·分子量分劃界線：1〇 kDa)(Sartorius公司）之超濃縮操 作將緩衝液置換成PB S，將其作為抗Nectin-2人類單株抗 體標準品而用於下述活體外性狀解析。 鲁實施例2 抗Nectin-2人類單株抗體之結合活性 抗Nectin-2人類單株抗體之結合親和力，藉由將實施 例1所調製之抗Nectin_2人類單株抗體以含2%FBS之 PBS(+)階段性稀釋而成者供給至實施例1所示之使用 Nectin-2安定表現CHO細胞株之細胞ELISA，並製成濃度 依存性曲線，而相對評價各抗體之EC5()值。各單株抗體之 抗原特異性，藉由比較對Nectin-2安定表現CHO細胞株 培養盤之結合性與對模擬-CHO細胞株培養盤之結合性而 加以確認。將各抗Nectin-2單株抗體之EC5G彙總於表3 170 319597 200823235 中 0 實施例3抗Nectin-2人類單株抗體之亞群 將實施例1所取得之抗Nectin-2人類單株抗體之亞群 藉由下示ELISA鑑定。將特異性識別人類igh、igG2、 IgG3、IgG4、IgM之η鏈及人類κ鏈之6種抗體[抗-人類 IgGi，純化Fc片段（小鼠）（CALBIOCHEM公司）；抗人類 IgG2，純化Fc片段（小鼠）(CALBIOCHEM公司）；小鼠抗-人類 IgG3(Zymed 公司）；Ms X Hu IgG4 Fc(CHEMICON 公 司）；單株小鼠抗-人類_IgM(Zymed公司）；純化山羊抗-人 類κ輕鏈抗體b+f親和性（Bethyl公司）]分別用50 rnM碳酸 鈉-碳酸氫鈉緩衝液(pH 9.6)稀釋至濃度為2pg/mL，將其以 50μΕ/孔之量添加至96孔half-well免疫培養盤（Costar公司) 中並於室溫反應5小時。從各孔除去反應液後，添加含2 5 % Blockase(DAINIPP〇N PHARMACEUTICALS 公司）之蒸餾 水ΙΟΟμΙ^/孔，並於4°C封阻隔夜。 將如此製作之ELISA用培養盤用含0.05% Tween 20 之PBS洗淨二次後，添加實施例丨所精製取得之各抗 Nectin-2人類單株抗體以含1〇% Blockase並用蒸餾水稀釋 成1 pg/mL而調製者50μΙ7孔，並於室溫反應2小時。將該 培養盤用含0.05% Tween 20之PBS洗淨4次後，添加用含 10%Blockase 之蒸餾水稀釋 5,000 倍之抗-lgG+IgA +IgM (H+L) ’ 人類’山羊，辣根過氧化酶(h〇rSeradish peroxidase) (Zymed公司，)50pL/孔後，於室溫顯色2分鐘，並添加2N 硫酸(和先純藥股份公司)50μΙ7孔，以停止酵素反應:。將各 171 319597 200823235 孔之吸光度（450 nm)使用培養盤言買數器（Muitiskan BICHROMATIC)測定’從固定化於顯示比其他孔顯著高之 吸光度之孔之抗體之抗原特異性鑑定各抗體之亞群。將該 結果示於表3A中。 實施例4籍由抗Nectin-2人類單株抗體之抗原決定部位 來分群 將貫施例1所取付之抗Nectin-2人類單株抗體藉由其 所識別之抗原決定部位之不同來分群。以下說明其方法。 修為了進行抗體間之彼此阻礙反應，將實施例1所取得之單 株抗體中187種抗Nectin-2人類單株抗體用生物素標識。 亦即，將抗Nectin-2人類單株抗體1〇叩添加於生物素標 記套組-NH2(Dojindo公司）所附之WS緩衝液50gL，使用 Microcon YMSOCMILLIPORE公司）進行超濃縮至溶液量幾 乎為零為止。在該殘留液中依次添加生物素標記套組-NH2 所附之反應緩衝液50μ!ν及溶解於50pL之DMSO之NH2 反應性生物素4pL，並於37°C反應10分鐘。將該反應混 合物再次藉由超濃縮操作將緩衝液置換成WS緩衝液，得 到以生物素標識之抗Nectin-2人類單株抗體，將其使用於 下所示之檢定（assay)中。將實施例1所取得之抗Nectin_2 人類早株抗體之含2%FBS之PBS溶液（25pg /mL)5pL及 Nectin-25安定表現CHO細胞株之含2%FBS之PBS懸浮 液（2χ 10個/mL) 15pL以及鍵抗生物素蛋白(streptavidin)·
Alexa Fluor 647 結合物(Invitrogen 公司）5pL 添加至 FMAT ，培養盤（384孔培養獒丄黑色透明、底，，加蓋；Applied 319597 172 200823235
Biosystems公司），混合後於室溫反應1〇分鐘。在該培養 盤中添加以上述方法製作之生物素化抗Nectin-2人類單株 抗體之含2%FBS之PBS溶液（〇.5gg /mL)5pL，並於室溫培 養60分鐘。設置添加含2%FBS之PBS(以代替未經標識之 抗Nectin-2單株抗體溶液）之孔以作為對照實驗。對於該拮 抗阻礙反應之生物素標識以全部抗體之組合進行。將該培 養盤設置於Applied Biosystems 8200細胞檢測系統 (Applied Biosystems)，並測定各孔之螢光強度。使用下式 馨 計异出在各抗Nectin-2人類單株抗體之組合中之拮抗阻礙 率。 拮抗阻礙率=(1-Α/Β)χ1〇〇 - A :添加未經標識抗體之孔之FL1總值 B 未添加未經橋識抗體之孔之FL1總值 … 在各抗體之組合中，使用多變數解析軟體SpotFire
DecisionSite for Lead Discovery(Spotfire 公司）解析用該計 春算式所得之阻礙率，從如此得到之樹形圖依照抗原決定部 位將抗Nectin-2人類單株抗體分群，結果分類成屬於j至 VII之7個大族群之抗體及不屬於任一該等族群之抗體。 將各抗Nectin-2人類單株抗體之抗原決定部位族群彙總於 表4中。 實施例5抗Nectin-2人類單株抗體之Nectin-2-Nectin-3 反式結合阻礙活性 已知 Nectin-2 雷與 Nectin-3 進行異嗜性（heterophilic) 反式結合。將‘實施例1所取得之各抗Nectin_2人類單株抗^ 173 319597 200823235 體之Nectin_2-Nectin-3反式結合阻礙用下文所示之 Biacore(Biacore 2Ό0Ό ; Biacore公司，該公司名已變更為 GE Healthcare公司）測定法進行定量性評價。將感測晶片 CM5(Biacore公司，該公司名已變更為GE Healthcare公司） 安裝於Biacore 2000，藉由下述方法製作Nectin-3ED-Fc 蛋白質固定化晶片。亦即’使用HBS-EP緩衝液（Biacore 公司，該公司名已變更為GE Healthcare公司）作為運作緩 衝液（running buffer)，將其與胺偶合套組（Biacore公司， 該公司名已變更為GE Healthcare公司）所附之N-乙基 -N’-(3-二曱胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)及N-羥基 琥珀醯亞胺（NHS)溶解於蒸餾水所調製之溶液，以每種 ΙΟΟμΙ等量混合，以1〇μΙ7分鐘之流速通液至感測晶片、7 分鐘後，將參考例22所調製之Nectin-3ED_mFc(l mg/mL PBS溶液）用10 mM乙酸緩衝液（pH5.0)(Biacore公司，該 公司名已變更為GE Healthcare公司）稀釋至160pg /mL而 馨調製者以ΙΟμίν分鐘之流速通液至感測晶片7分鐘後，將 該蛋白質固定化於晶片上。接下來將該相同套組所附之乙 醇胺溶液以ΙΟμυ分鐘之流速通液至感測晶片7分鐘，將 殘餘的活性NHS基封阻。再者，將10 mM NaOH以lOpL/ 分鐘之流速通液1分鐘，洗淨感測晶片。對於如此製作之 固定有 Nectin3ED-mFc蛋白質之感測晶片，將 Nectin-2ED-hFc 蛋白質溶液（SOpg /mL HBS-EP 緩衝液）與 抗Nectin-2人類單株抗體溶液或對照組人類抗體溶液 (Human IgG Whole molecuTe Chrom Pure ； Jackson 公 174 319597 200823235 司）(60pg /mL HBS-EP緩衝液）之等容量混合液以20μΙ/分 鐘之流速通液至其上歷2分鐘，記錄回應之變化，藉由下 述計算式算出Nectin-2-Nectin-3反式結合阻礙率。 Nectin_2-Nectin_3 反式結合阻礙率（％)=(A-B)x 100/A A:使用對照抗體時之回應 B ··使用抗Nectin-2人類單株抗體時之回應 將各抗Nectin-2人類單株抗體之Nectin-2-Nectin-3反式結 合阻礙活性彙總於表5中。 實施例6 使用OV-90人類卵巢癌細胞株之抗Nectin-2人 類單株抗體之細胞增殖阻礙活性 實施例1所取得之各抗Nectin-2人類單株抗體在試管 中之OV-90人類卵巢癌細胞株增殖阻礙活性藉由下述方法 測定。在OV-90細胞株之培養方面，使用包含15% FBS(JRH 公司）之MCDB 105(Sigma公司）與培養基199(Sigma公司） 之等量混合培養基，放置1日，以每皿4.5 X 105個之細胞 鲁密度播種於10 cm組織培養皿（Becton Dickinson公司），藉 由在5%二氧化碳氣流中於37°C培養而進行繼代培養。從 OV_90細胞株之皿剝離，係藉由用膠原酶N-2(Nitta Gelatin 公司）400 U於37°C處理2分鐘，然後加入細胞溶離缓衝液 (Invitrogen公司）2 m卜並於37°C處理15分鐘而進行。將 如此得到之細胞懸浮液離心分離（丨000 rpm，3分鐘），將回 收之細胞以3χ104個/mL之密度再懸浮於含1%FBS之 MCDB 105/培養基199之等量混合培養基。 * 實施例1所取得之抗Nectin-2人類單株抗體、參考例 175 319597 200823235 14所製作之抗Nectin-2多株抗體（N2-N0.1)及對照人類抗 It (Human IgG Whole molecule Chrom Pure； Jackson 公司） 分別用PBS調製成300pg /mL之溶液，或將PBS以每孔 10pL之量添加至 96孔細胞培養用培養皿（Becton Dickinson公司）中，然後每孔添加ΙΟΟμΙν之上述OV-90細 胞懸浮液。再者，為了測定下述細胞增殖阻礙率測定時之 貧景值，製備在PBS ΙΟμΕ中加入相同培養基ΙΟΟμί之孔。 將該培養盤在5%二氧化碳氣流中，於37°C培養6日後， 每孔添加ΙΟμΕ之細胞增殖測定用試藥WST-8溶液（細胞計 數套組-8 ; Dojindo公司）’將培養盤在5%二氧化碳氣流 中，於37。(3培養1小時後，將來自生成之曱犧（formazan) 之各孔之吸光度（450 nm)用培養盤讀數器（Multiskan BICHROMATIC)測定，藉由下述計算式算出OV-90細胞株 增殖阻礙率。 細胞增殖阻礙率=[(A-B)-(C-B)]x100/(A-B) A:添加對照人類抗體之孔之吸光度 B :添加PBS之孔（未添加OV-90細胞株）之吸光度 C ··添加抗Nectin-2人類單株抗體或抗Nectin-2兔子 多株抗體之孔之吸光度 在取得之抗Nectin-2人類單株抗體之中，有對於 OV-90細胞株之細胞增殖阻礙活性強之抗體或弱之抗體。 再者，抗Nectin_2兔子多株抗體（Ν2-Νο·1)在終濃度為3〇pg /mL下，顯示約10%之OV-90細胞株增瘦阻礙活性。將各 Nectin-2人類單株抗體（終濃度30>g/mL)在試管中之 176 319597 200823235 0V-90細胞株增殖阻礙率彙總於表6中。 在上述一次篩選中顯示較強試管内OV-90細胞株增殖 阻礙活性之30種抗體再度從融合瘤培養調製，使用藉由蛋 白質A管柱層析及凝膠過濾HPLC進行高純度精製而得之 抗體標準品，再次藉由上述方法測定對於OV-90細胞株之 濃度依存性（100、30、10、3、卜0.3、0·03μ§ /mL)細胞增 殖阻礙活性。其結果，選出再現性良好地顯示抗體濃度依 存性強之OV-90細胞株增殖阻礙活性之8種抗Nectin-2人 類單株抗體（Necl-803-2、Neclv5.20- 1、Necl-530-l、 Necl-845-2、Necl-834-1、Necl-244-3、Necl-303-2、 Necl-903_1)。此等抗體，於將OV-90細胞株生長附著於96 孔細胞培養用培養盤上後加入抗體溶液之情況，亦同樣地 顯示活性。將上述8種抗Nectin-2人類單株抗體於各濃度 之OV-90細胞株增殖阻礙活性彙總於表7中。
177 319597 200823235表3
EC50 EC50 EC50 名稱_πΜ___πΜ__名稱 ηΜ Necl-102-l 0.44 Necl-555-5 146 N»o!-1142-1 4.45 NeclH03-l ❹.13 Nect-56B-t 0J2 Nect-1150-2 0.09 Nect-105-1 U8 Nee1-€08-i 0.60 N#c1-!103-2 0.98 Necl-t08-2 14$ Νβο1-θ10-2 0.29 Nect-t 202-5 0.71 Necl-川 一3 0.51 Neot-6t4>5 0.95 Necl-1203-1 0.49 0.17 Nec1-e31-ta 0.91 Neot-1204-4 10.77 Nect-t24-2 0.90 Nect-704-f 9.91 NectH2O0-8 0.96 Nect-ta3-2 0.75 ΝβοΙ-7Τβ-« 0.S6 Nec1-12i2-7 0.63 Nec 卜 Η1·3 1.36 Nect-718-2 2.15 Nec1-!2t4-5 Q.B2 Ν·ο1-ί44-1 10.95 Neot-72i-1 2.07 Ned-1216-1 1.02 N 时 1-145-2 οιβ Nec卜730-4 0.54 Ν·οΙ-ί21β-3 7.22 Neci-202-1 0.37 Nect-738-2 0.3$ Nect-t 232-2 Q.43 Nec1-205-1 0.48 Nec1-740-2 0.81 NecH 234-1 0.95 Nact~2〇e-2 0J2 Νβο1-74δ-1 3.62 Nect-1236-1 1.84 Nect-208-l 0J1 Neel-755-5 0.40 N«si-4 239-2 1.33 Ned-200-2 0·2β ΝβοΙ-75β-8 11.85 Nec卜1302-2 0.53 Ν·ο1-213-2 9.06 Necl-759-9 0.33 Nect-t3t4-3 85.64 Nect-2t5-3 U» Nact-765-t 2.68 Nec2-1405-12 5.06 Neet-2t7-2 5.40 Νβο1-7βδ-2 0.16 Nec2-t41t-1 17.31 Νβο!-22β-3 0.29 NecW73,7 0.36 Ν·ο2-ί422-1 47.54 Nec1-231-1 3J2 Nect-803-2 023 N®c2-1613-3 1.69 Necl-233-t 2.35 Necl-8i2-4 1.86 Nec2-1S25-4 0.35 Nec1-235-1 2.07 Necl-B15-1 ϋΜ Nec2-t633-4 0J3 Nect-244-3 6.49 Necl-818-4 2.18 Nec3-1829-2 S.01 Nect-259-t 0.t3 Necl-819-2 0.68 Nec3-1907-t 0.26 N»c 卜 301-2 1.62 Ν·οί-821-3 1.74 Nec3-I908-4 1.11 Nect-302-1 Z49 Nect-83t-4 4M Nec3-t927-3 0M Hec^m-Z 26.77 Nec卜834-t 5.74 Nec3_t932H 0.71 Nec1-304-2 0.16 Ned-835-1 3.38 Nec3-2006-t ί·57 N0〇t-3O8-2 0.3« NecHa42-2 0·的 Nec3-2025-3 0.41 Nect-3t1-2 1.35 Ν·οί-843-1 0.46 Nw3-2M«-f D.45 N»cl-313-t 0.47 Neei-845-2 0.53 Nec3-2109-2 t.06 Ν·ο1-31β-1 0.80 Nec1-S47-2 0.50 Nec3-2123-t Γ 1.80 Nect-3t0-2 o.t 7 N®c1-a68-7 0.59 Nec3-2134-t 0.72 Necl-320-1 1.40 Meet- 0.59 Nec3-22!3"! t.21 Hect-322-δ D.t7 Νβο1-Ε78-ί 1.56 Hec5-32S-1 0.54 Nect-326-7 2.33 Nac1-888-1t 4.42 Nec5-532-f 4.61 Nec1-332-1 2.07 Neot-903-1 0*21 Νβο5-βί7-7 1.60 Neel-333-1 08 MtoI-007-1 0.22 Nec5-1906-6 041 Ν·ο1-33β-2 0.14 Nec!-d08-2 1.41 Nec5-2309-1 0.37 N»cH338-1 0.61 Nec1-909-1 1.25 Nec6-151-4 0.82 Nec1-341-10 7.55 Neot-914~1 0.19 Nec6-505-2 0.47 Nwj1-34&-t 029 Necl-917-2 0.1 β Nec6-94CH7 3.10 Nect-372-2 0.10 Neol-9!8-2 22.64 Νβοβ-94Τ-4 !.3I Necl-410-3 0.67 Nect-919«1 0.37 Nec8-3330-1 0.61 Nect-4tl-1 0.66 Hec1-920-t 0.79 Nec8-3350-t 0.33 NecHie，1 t.00 0.53 Nec8-341(M 0.34 Keel-427-2 0.35 KtoB28-1 023 Mec8-3424-1 t.05 Ned-428-t 0.58 Nec1-92S~2 0.71 Nec8-35t7-” 「025 Nec1-445-4 1.4f Necl-930-1 4.05 Νβοβ-3523-2 0.51 N«cl-458-e 3.3d Necl-938-1 3.73 Ntc8-3524-14 0.30 Nect-460-1 4.42 Nect-938-2 2.0d N«c8-3e6d-4 0.50 NecWM-1 3.92 Necf-940-f 2.21 Nec8_3704-7 0.88 Nect-470-2 1.75 Neo1-948- 3 i.3t Nec8-37t7-4 0.96 Necl-501-ί 0.33 Ne。卜$64_1 0.36 Nec»-3723-3 0·25 Neot-503-β 0Λ2 NeoH1004-2 0.69 NecB-3734-1 0.38 Νβσί-505-3 117.40 «•cHOOS-2 2.32 NecB-3806-2 1.32 Necl-506-1 0.73 Kec1,1008-1 10.97 Nec8-3814-17 0.19 Nect-507-t 0.27 Necl-i012-1 0.t2 Nec8-3823-5 0.40 Neel-508-2 0.56 Nec!-t020-1 0.60 Nec8-3833-6 0.87 N«ct-52(H1 0.39 Nec1H02t-1 0.27 Nec8-3H1-4 D.45 Ned-521-3 10.60 Nec1-t036-5 t.59 Nac8-4024-5 0.47 N«st-522-2 t.00 Nect-103^-3 0.72 Nec8-4t1t-2 0^0 Nect-52e-1 0.27 Necf-1044-4 2.05 Ν·οδ-4”6-8 0.36 Ned-528-2 0.62 Necf-!085-t 7.70 Nec8-4t44-2 0^8 Nec1-530-t 0.79 Nect-1115-2 0.71 Nec8-4188-1 0.98 N»ct-53B-3 1.10 Necl-1128-t 0,87 Nec8-4244-8 0.48 M#ct-54S-5 \M Mect-tt32-2 1 58 Nec8-4ai5-t D.78 Necl-549-4 0.38 Nec1-t138H 4.07 Nec8-4324-5 029 Ned-554-1 U1 Ν·ο1-1139-1 0.58 178 319597
200823235表3A
名稱 亞型 H鏈/L鏈 Nect~102~1 G1/k Nec1-103-1 G1/k Neel-105-1 G2/k Ned-108-2 G1/k Necl-11卜3 Gt/k Neel-119-1 Gl/k Nec1-124-2 G1/k Necl~133~2 G4/k Nec1 -141 一 3 G1/k Ned-144-1 Gt/k Ned-145-2 G1/k Nec1-202-1 G1/k Nect-205-1 G1/k Nec1-206-2 G1/k Ned-208-1 G1/k Nec1-209-2 G1/k Nect-213~2 G1/k Ned-215-3 G1/k Neel-217-2 G1/k Nec1-231~1 G1/k Neel-235-1 G4/k Nec1-244-3 G1/k Neel-259-1 G1/k Ned-301-2 G1/k Ned-302-1 G1/k 名稱 亞型 fl鏈/L鏈 Nect-555-5 G4/k Ned-568-1 G1/k Ned-608-1 G1/k Ned-610-2 G1/k Necl-614-5 G1/k Ned-631-10 G2/k Nec1-704-1 G1/k Nec1-716*~6 G1/k Ned-718 - 2 G1/k Ned-726-t G1/k Ned-730-4 G1/k Neel-738-2 Gl/k Nec1-740-2 G1/k Mec1-755-5 G1/k Ned-758-8 G1/k Nec1-759-9 G2/k Nec1-765-1 G2/k Nec1-769-2 Gl/k Nect-773-7 G4/k Neel -803- 3 G1/k Neel-812-4 G1/k Ned-815-1 G1/k Neel-818-4 G2/k Nec1-819-2 Gl/k Nec1-821-3 G1/k 名稱 亞型 H鏈/L鏈 Neel-1138 -1 G1/k Ned-1139-1 G4/k Ned-1142-1 G4/k Ned-1150-2 G1/k Nect-1163-2 Gt/k Ned-1202-5 G1/k Nec1-1203-1 G1/k Nec1_1204~4 G1/k Ned-1209-8 G1/k Ned-1212-7 G4/k Ned-1214-5 G1/k Nec1-1216一1 G1/k Neo1-12t8-7 G2/k Nec1-1232-2 G1/k Ned-1234-1 Gl/k Nec1-1236-1 G1/k Ned-1239-2 G1/k Ned-1302-2 Gl/k Nect-1305-1 G1/k Ned—1314-3 G2/k Nec2-1409-12 Gl/k Nec2-1411-1 G1/k Nec2-1422-1 G4/k Nec2-1613-3 G2/k Nec2-1625-4 G4/k 179 319597 200823235
Nec1-303-2 G1/k Nec1-831-4 G1/k Nec2-t633-4 G1/k Nee1-304-2 G1/k Nec1-834-l G1/k Nec3-1829-2 G4/k Ned-308-2 G1/k Nec1-835-1 G1/k Nec3-t907-1 G4/k Nec1-313-1 Gl/k Necl-842-2 Gl/k Nec3-t908-4 Gl/k Neo1~316-1 G1/k Ned -843-1 Gl/k Nec3-1927-3 G4/k Nec1-319-2 G1/k Nec1-845-2 G1/k Nec3-1932-1 G4/k Necl-320~1 G1/k Neel-847-2 G1/k Nec3-2006-l G1/k Neel-322-5 G1/k Nec1-868-7 G4/k Nec3-2025-3 G1/k Nec1~326-7 G1/k Ned-869- 6 G1/k Nec3-2036-6 G1/k Necl-332-1 Gl/k Nec1-878-1 G1/k Nec3-2109-2 G2/k Ned-333-1 G1/k Nec卜888-11 G1/k Nec3-2123-1 G1/k Nec1-336-2 G4/k Nec1-903-1 Gl/k Nec3-2134-1 G4/k Ned-338-1 G2/k Ned-907-1 G1/k Nec3—2213-1 G1/k Neel-341-10 Gl/k Nec1-908-2 G1/k Nec51323-2 G4/k Nec1*-349-1 G1/k Nec1-909-1 G1/k Nec5-326-1 G2/k Ned-411 -1 G4/k Necl-9t4H G1/k Nec5-532-1 G1/k Ned-416-1 G2/k Nec1-917-2 G1/k Nec5-617-7 G4/k Ned-427-2 G4/k Ned-918-2 G1/k Nec5-2309-7 G2/k Nec1-428-1 G1/k Mecl-919-1 G1/k Nec6-505-2 G4/k Nec1-445-4 G1/k Nec1-92(M G1/k Nec6-940-7 G4/k Nec1-458-6 Gl/k Nec1-927-14 G4/k Nec8-3350-1 G4/k Nec1-460-1 G4/k Nec1-930-1 G1/k Nec8-341(M G1/k Ned-464-1 G1/k Nec1-938一2 G1/k Νβα8-3517-11 G1/k Ned-470-2 Gl/k Ned -940-2 G1/k Nec8-3523-3 G1/k Nec1-501-1 G4/k Nec1-948~3 G1/k Nec8-3524-14 G1/k Nec1-503-8 G4/k Neo卜964-1 G1/k Nec8—3669~4 G1/k Nec1-505-3 G2/k Nec1-1004-2 G1/k Mec8-3704-7 Gt/k Nec1-506-1 G1/k Nec1-1005-2 G4/k Nec8-3717-4 G4/k Neel-507-1 G1/k Nec1-1008-1 G4/k Nec8-3723-3 G1/k 180 319597 200823235
Nect-520-1 G1/k Neel-522-2 G2/k Neel-526-1 G4/k Ned-528-2 G1/k Neel-530-2 G1/k Ned -538- 3 G2/k Nec1 -546-5 G1/k Ned-549-4 G4/k Nec1-554-1 G1/k
Ned-508-2 G4/k Nec1-1012-1 G2/k Nea8-3734-1 G2/k Mec1 一1020H G4/k Nec1~t02t~2 G1/k Ned-1036-5 Gt/k Nec1-1039-3 G1/k Nec1~1044~4 G1/k Nec1-1085-1 Gl/k Nec1~1115-2 G1/k Neel-1132-2 G1/k
Nec8-3806-2 G2/k Nec8-3814-17 G1/k Nec8-3823-5 G1/k Nec8-3833-6 G4/k Nec8-4024-5 G1/k Nec8—4116-8 G1/k Nec8-4144-2 G4/k Nec8-4188-1 G4/k 181 319597 200823235 表4 名稱 抗原決定部位 名稱 抗原決定部位
Necl-102-l VI N#c1-103-1 W Nect-105-t VI Nect-l〇a-2 7K Nec卜”卜3 VI w Νβο1-!24-2 诹 Nec!-l33-2 V Necl-141-3 VI Nec1«144-1 VI Nect-t45-2 VI Mecl-202-1 I Necl-205-t V Necl-206-2 w Necf-208-1 V Nect-20»-2 YI Nect-2t3-2 m Necf-215-3 N Necl-217-2 m Neel-226-3 V Nec!-231-t N Nect-233-1 m Ned-235-! V Neel-244-3 VI M®o1-259-1 VI Nect-30 卜 2 V Nect-302-1 I Nec1-303-2 w Nec1-304-2 w Nect-308-2 通 Neel-311_2 ND Necl-313-1 VI Nec1-3ie-t VI Nect-319-2 VI Nect-320-1 I Ν·οί-322-5 V Nect-326-7 N Neol-332-1 VI Nec1_333_t 17 Nec1-33M VI Nect-338-t w Nect-341-10 N N®ef-349-t Vi Nec1-372-2 V Nec1-410-3 ND Nect-4tt-1 VI NecI-416-1 I Nec 卜 427-2 Vi Neci-428-1 V Nect-445*4 N NecI-458-6 N Necl-460-1 Π Nec 卜 4β4·ί Π Nec1-47l>-2 N Nec1-50!-t W Nact-503-8 w Nod-505-3 VI Ν·οί-50β-1 V Necf-507-1 V Necl-508-2 VI Nee 卜 52CM V! Nec1-521-3 ND Neci-522-2 VI Necl-526-1 VI Necl-528-2 V Nec1-53CM VI Nec1,53B-3 VI Necl-546-5 V N%ct-549-4 VK Necl-554-1 N 名稱 抗原決定部位
Mecl-555-5 W Necl-1142-1 W Nect-568-1 通 Nect-1150-2 m Νβαί-608-Ι W NecH 163-2 m Nect-6f(H2 V Nec1 - 120M V Necl-614-5 19 Nec 卜1203·! ϊ Νβο1-δ31-ίΟ V Neo卜1204-4 I Nect-704-1 VI Nec1-l20&-8 I ΝβοΙ-71β-6 V Nee卜1212-7 w Necl-718-2 V Neel*1214-5 VI Nec!-72«-1 N Nect-12te-f V Nect-730~4 m Nect-1218-7 N Neel-738-2 VI Neci-t232-2 n Ned-740-2 V Neel-1234-1 I N®c1-74§-1 ND Nec卜1230-1 N Neel-755-5 VI Nect-!23t-2 N Nect-758-8 1 Nect-1302-2 N Heci-759-9 VI Nect-t305-l V Nect-765-f V! Nec1-t314-3 VI Nect-78S-2 V Nec2-14C»-12 N Nect-773-7 ¥1 Nec2H4ll-1 ND Necl-803-2 VI Nec2-1422-1 NO Neel-812-4 N Nec2-1613-3 N Nect-8T5-1 n Nec2-te25-4 VI Nect-818-4 VI Nec2-1633-4 n Ned-819-2 vx Nec3-182&-2 VI Νβαί-821-3 I Nec3-i907-t V Necl-831-4 IV Nec3-1908-4 VI Hect-B34-1 VI Mec3-1827-3 V Nec1-B35-1 N Nec3 -1832-1 V Nec1-B42-2 I Nec3-2008-t w Nec1~B43-1 VI Nec3-2025-3 V Necl-845-2 VI Nec3-2036-e VK Necl-847-2 VI Nec3-*21(»-2 V Nect-888-7 通 Nec3-2t23-l V Neel-869-0 V! Nec3-2134»1 w Necl-878-1 V Nec3-22t3-1 V Necl-838-11 m Nec5-326-1 V Nec1-903»1 VI Nec5-532-1 IV Nec1-907-1 巩 Nec5-617-7 n Nec1-908-2 VI Nec5-t908-6 I Nect-909-1 V! Nec5-23C»-7 I Necl-914-1 w Wec6-15卜 4 ND Nect,17-2 n NecB-505-2 VI Nec1-9t8-2 VI Nec6-940-7 N Nec1-91»-1 V N«c6~947-4 ND Nec1-92CM V Nec8-3734-t I Nect-eZ7-!4 逋 Nec8-3330-t V Nect-928-1 V Nec8-3350-t w N«c1-929-2 V Nec8-341CM 通 Necl-930-1 m Nec8-3424-1 V Necl-938-1 ND Nec8~3517-H 逋 Nect-«38-2 m Nec8-3523-3 V Nec 卜MQ-2 N NecS-3524-14 w Nect-M8-3 VI Nec8-3$69-4 w Nec1-964-1 I NecB-3704-7 7K Ned-1004-2 V Nec8-37t7-4 V Nect-1005-2 N Nec8-3723,3 Ίί N«c1-1008-1 N NecS-脚)6-2 ΊΙ Nec1-t012-1 V Nec8-3814-t7 VK Necl-1020-1 n Nec8-3823-5 V Nec1*t021-2 V Ν«8-3Ε33-β w Necl-1036-5 I Nec8-3Wt-4 VI Nect-!03»-3 I Nec8-4024-$ VI Necl-1044-4 N Neo8-4t1t-2 V Nee卜1085-1 & Nac8-4116-8 VI Neel-tit5-2 I Nec8-4t44-2 VI Ned-1128-1 ND Nec8-418S-1 w Nee 卜 im-2 V Nec8-4244-8 V Neol-t138-1 N NTC8-43t5^t V Necl-t130-1 li Nec8-4324-5 V 182 319597 200823235 表5
名稱 反式結合抑制率(¾) Nect-t02-t 31 Necl-111-3 44 Ned-209-2 88 Nec1-244-3 35 Nect-303«2 6 Ned-313-1 12 Ned-316-1 56 Nec1-319-2 70 Nect-332-t 93 Neel-505-3 8 Necl-506-1 83 Nec1-508-2 92 Ned-530" 1 36 Ned-704-1 23 Nec1-730-4 43 Ned-738-2 79 Nect*755-5 84 Nect-765-1 5
名稱 反式結合抑制率(％) Neel-803-2 91 Nect-818-4 97 Nee1-834-1 86 Ned-843-1 89 Nee卜845-2 86 Nect-869-6 80 Neel~903~1 85 Nect~9l8~2 73 NecIH 115-2 13 Nect-1128-1 23 Neat-1150-2 82 Nect-1209-8 8 Nec1-t214-5 6 Nec3-2025-3 91 Nec5-323-2 60 Nec6~505-2 86 Nec8-4024-5 93 名稱 生長抑制平均值(¾) (vs OV_80> 名稱 生長抑制平均值a) (vs OV-90) Nec1-102~t 6.7 Nect-834-ί 14.5 Necl-141-3 11.2 Ned-843-1 9,5 Nect-144-1 9.9 Neol-845-2 12.3 Nec卜 209-2 9.7 Nect-878-1 17.7 Nec 卜244-3 16.7 Nec卜888-11 B.3 Nect-259-1 12,4 Nec卜903-1 16.8 Nec1-303-2 tB.4 Neat-908-2 14.7 Necl-311 «2 12.3 Neci-909~! t6.9 Nec1-3t3-1 7.1 Nec卜918-2 t5.0 Nad-316H 13.5 Ned-938-2 9.4 Nec卜313-2 12.9 Nec1~1085-1 6.5 Neel -332H 8.4 Neci-111-3 11.2 Neel-505-3 9.8 Nect-1150-2 13.0 Necl-508-2 6.2 Meet-1183-2 5.7 Neci-520-t too Nect-t204-4 11.6 Nec!-530-t 16.9 Nect-t20B-8 13.2 Nec卜555-5 11.3 Nect-1214-5 7.3 Necl-631-10 15.0 Nec卜1314·3 12.8 Nec 卜730-4 9.2 Nec2-t 625-4 7.2 N.c卜738-2 21.2 Nec5-323-2 10.2 Necl-749-1 16.5 Nec6-505-2 6.6 Neel-755-5 12.7 Nec8-3704-7 16.9 Nec卜758-B 6.3 Nec8-3941-4 10.5 Nect-785-t 7.6 Nec8-4024-5 13.4 Kact-803-2 13.3 Nec8-4n6-B 14.1 Ned-818-4 5.3 183 319597 200823235 表7
名稱 抗體濃度 (iiE/ml) 生長抑 Ned-244-3 t00ug/mL §5 30ug/ml 7.0 10ug/mL 6.9 3ug/ml 7.0 1ug/mL 4.9 0.3ug^ml 2.0 0.03u«/ml -1.3 Νβο 卜303-2 100ug/mL 30ug/ml 6.9 10u*/mL 5·5 3ug/ml 3.0 1ug/rr»L ,5.1 0.3ug/ml -2.9 0.03u£/ml -7.4 Neot-520-t tOOug/mL O 30ug/ml 11.3 lOug/mL 13.7 3ug/ml 9.3 1ug/mL 7.0 0.3ug/ml 1.2 0.03us/ml 2.0 Necl-530-1 100ug/mL 13T"" 30ug/mi 9.6 10ug/mL 8.2 3ug/ml 10.3 1 ug/mL 8.2 0.3ug/ml 0.5 0.03ug/ml -4.6 名稱 抗體濃度 玍长抑制率— (ΐ/κ/ml) (X) "NecT-803-2 lOOyg/mL Ϊλ4 30ug/ml 14.3 lOug/mL 16.8 3ug/ml 13.5 1 ug/mL 15.5 0.3ug/m! 15.1 0.03uic/ml 3.8 Nec1-834-l lOOug/mL ~ΪΤβ ZOug/ml 12.9 tOug/mL 8.3 3ug/ml 9.6 1 ug/mL 12.8 0.3ug/ml 0.8 0.03ug/ml 2.9 Neel-845-1 TOOug/mL 15.7 " 30ug/ml 8.3 10ug/mL 10.3 3ug/ml 5.8 t ug/mL 1U 0.3ug/ml 4.β 0.03us/ml -3.2 Nec1-903-1 100ug/mL 5.8 ~ 30ug/ml 7.3 10ug/mL 2.8 3ug/ml 3.9 1 ug/mL 4.5 0.3ug/ml -1.3 0.03uK/ml -6.3 實施例7抗Nectin-2人類單株抗體之ADCC(抗體·依存性 細胞毒殺性） 測定實施例1所製作之抗Nectin-2人類單株抗體中之
Necl-803-2、Nec8-4116-8、Necl-520- 1、Necl-530-l、 Necl-845-2、Nec8-3941-4、Necl-834-1、Necl-244-3、 Necl-918-2、Nec8-3806-l、Necl-303-2、Necl-903-1 之 ADCC。使用人類卵巢癌細胞株OV-90作為標靶細胞，在 效應（effector)細胞方面，使用將市售之凍結人類末梢血單 核球（As往hi Techno Glass公司）在含有10 nM重組型人類 IL-2(DIACLONE Research 公司）、55μΜ 2-疏基乙醇 184 319597 200823235 (Invitrogen 公司）及 10% FBS(JRH 公司）之 RPMI 1640 培養 基（Invitrogen公司）中培養一夜者。 將對數增殖期之OV-90細胞株依照實施例6之方法回 收，藉由對於 IxlO6個細胞添加 250μα Na251Cr04 (Amersham Biosciences公司，該公司名已變更為 GE Healthcare公司），並於37°C培養1小時而進行51 Cr標識。 將此等細胞用含0.4%BSA(Invitrogen公司）之RPMI 1640 培養基(以下稱為〇.4%BSA/RPMI培養基）洗淨4次後，以 • ΙχΙΟ5個/mL再懸浮於0.4%BSA / RPMI培養基中。將該標 靶細胞懸浮液ΙΟΟμΜΙχΙΟ4個細胞）及上述抗Nectin-2人類 單株抗體用〇.4%BSA/RPMI培養基稀釋成終濃度為 0.015pg/mL、0/15pg/mL 及 1.5pg/mL 之溶液，將該等溶液 50μΕ添加至96孔RMC培養盤（BIOBIK公司）之各孔中。 添加相同量之作為陰性對照組之非免疫人類IgG(最終濃 度1.5pg/mL)或D-PBS(Invitrogen公司）。將此等培養盤在 _冰上培養1小時後，加入上述效應細胞（effector cells)懸:浮 液5 χΙΟ5個/孔(效應細胞：標靶細胞=50 : 1)，在5%二氧化 碳氣流中，於37°C反應4小時。將各孔之細胞懸浮液移至 96孑L Multiscreen 45pm(Millipore公司）中，藉由離心分離 操作回收培養上清液。使用7計數器（AccuFLEX 9" 7〇〇〇; Aloka Co·)測定從細胞内漏出至此等培養上清液中之放射 活性（樣品释出活性，sample release)。ADCC之最大傷害 活性（最大釋出活性，maximum release)，係在加入Trit〇n_X 100(Sigma公司）並使其最終濃度成為1%時在培養上清液 185 319597 200823235 中所檢測到之放射活性；再者，自然釋出活性（sp〇ntaneous release)，係在加入含10%Fbs之RPMI 1640培養基以代替 效應細胞時在培養上清液中所檢測到之放射活性。成為 ADCC強度之指標之特異性溶裂（Specific iySis)(〇/〇)係用下 式計算出：（[樣品釋出活性]-[自然釋出活性])/([最大釋出 活性l· [自然釋出活性])χ100(表8)。相對於非免疫人類 IgG(最終濃度1.5pg/mL)添加時及D-PBS添加時之 ADCC(特異性溶裂）皆為17%，屬於亞群為IgGi之抗 _ Nectin-2 人類單株抗體Necl-803-2、Nec8-4116-8、Nec^520-1、Necl-530-l、Necl-845-2、Nec8-3941-4、Necl-834-l、 Necl_903_l 之 ADCC 在 1.5pg/mL 下，分別為 35%、34%、 30%、27%、30%、34%、31%、32%而呈顯著地高。尤其 是抗體4116-8，即使在抗體最終濃度為0.015 pg/mL下， 特異性溶裂為33%，而顯示比其他抗Nectin-2人類單株抗 體強之ADCC 〇 參 319597 186 200823235 表8
抗體 抗體濃度 特異性溶裂 (pg/mD (%) 非免疫IgG L5 17 NoAb 一 17 Necl-803*2 0015 23 0.15 31 1.5 35 Nec8-4116-8 0.015 33 0.15 33 L5 34 Necl-5201 0.015 21 0.15 27 1.5 30 Necl-530-1 0.015 19 0·15 25 1.5 27 Necle845e2 0.015 22 0.15 28 1.5 30 Nec8*3941-4 0.015 23 015 32 1.5 34 Necl-834-1 0.015 19 0.15 26 1.5 31 Necl-244-3 0.015 16 0.15 22 1.5 24 Necl-918-2 0.015 21 ❹‘15 22 1-5 25 Nec8-3806 1 0.015 16 0·15 20 1.5 22 Necl-303-2 0.015 21 0.15 26 1.5 24 Necl-903-1 0.015 24 ❹.15 33 1·5 32 自然釋出活性 一 0 最大釋出活性 一 100 187 319597 200823235 實施例8 抗Nectin-2人類單株抗體之追加製作 除了實施例1所製作之抗體之外，藉由下述方法對於 KM小鼠進行免疫，以追加製作抗Nectin-2人類單株抗體。 亦即，將參考例16所調製-之Nectin_2ED-Fc蛋白質（1·6 mg/mL PBS溶液）與弗氏完全佐劑（Difco公司）等容量混 合，將如此調製之乳化物分別注射入KM小鼠（10週齡， 12週齡，雄性，麒麟啤酒股份公司）5隻之皮下及皮内，每 隻50μΕ，以進行免疫。2星期後，將使用弗氏不完全佐劑 _ (Difco公司）所製作之相同蛋白質乳化物分別注射入ΚΜ小 鼠5隻之皮下及皮内，每隻25pL，以進行免疫。再二星期 後，使用相同乳化物l(^g/隻進行免疫。 於免疫開始前及第3次免疫後1星期，將全部小鼠在 乙醚麻醉下進行眼底採血及取得抗血清，藉由與實施例1 所記載者同樣之方法調查血清抗體價。在確認血清抗體價 充分上升之KM小鼠中，將Nectin-2ED-Fc以l(^g/隻之 I量進行尾靜脈注射，藉由與實施例1所記載者同樣之方法 追加取得產生抗Nectin-2人類單株抗體之融合瘤，以從該 培養上清液調製抗體。 實施例9 抗Nectin-2人類單株抗體對於Nectin_l、 Nectin-3、Nectin-4、Neel- 5蛋白質之交叉反應性 為了確認實施例1所製作之抗Nectin-2人類單株抗體 對於人類Nectin-2之特異性，對於人類Nectin家族蛋白質 (Nectin-1、Nectin_3、Nectin-4)及 Necl-5 蛋白質之交叉反 應性，…藉由使用此等蛋白質之暫時性表現細胞之流式細胞 188 319597 200823235 測定法（以下稱為FCM)來調查。具體而言，將CHO-K1細 胞株在T75燒瓶中，於使用含10%FBS(JRH公司）之DMEM 與F-12之等量混合培養基（Invitrogen公司）下，在5%二氧 化碳氣流中，於37°C培養1至2日。當該細胞生長至約90% 匯合時，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司）並依照 隨附之規程（protocol)，以參考例18所製作之pEE〇
I -Nectin_23、參考例 29 所製作之 pCMV_Tag 4-Nectin-l、 pCMV-Tag 4-Nectin-3、pCMV_Tag 4-Nectin_4、pCMV-Tag 4 善-Neel-5以及作為陰性對照組質體之pcDNA 3.1(+) (Invitrogen公司）進行轉染。轉染4星期後，將導入此等基 因之CHO-K1細胞之培養基與新鮮之上述培養基交換，然 後再培養2日。將此等細胞用D-PBS洗淨二次，甩不含酶、 以PBS為主體之細胞溶離緩衝液剝離細胞，將此等細胞用 含1%卩38及0.1%疊氮化鈉之〇_?38(_)(以下稱為？〇^缓 衝液）以5x106個/mL之密度再懸浮。將此等細胞懸浮液以 φ 30μ：ί之量加入96孔V底盤中，然後加入用FCM缓衝液 稀釋成15pg/mL之抗Nectin-2人類單株抗體（Necl-803-2、 Necl-520-l - Necl-530-l 、Necl-834-l 、Necl-244-3 、 Necl-303-2、Necl-903-1、或 Nec8-4116-8)，以及陽性對照 抗體[抗人類Nectin-1小鼠單株抗體（ZYMED公司），參考 例14所製作之抗Nectin-2兔多株抗體Ν2·Νο·2，參考例 27製作之抗Nectin-3兔多株抗體、抗人類Nectin-4山羊多 株抗體（R&D公司），或抗人類Necl-5小鼠單株抗體（LAB VISION公司）20μΙ；(最疼濃度：6pg/mL)，並於冰上反應1，.， 189 319597 200823235 小時。在各孔中加入FCM缓衝液200μΕ，藉由離心分離操 作洗淨1次後，加入用FCM緩衝液稀釋成lOjag/mL之Alexa 4 8 8 識一次抗體5 0 μΐ^/孔並使之懸浮後，於冰上反應1 小時。再者，使用人類抗體作為一次抗體時，使用Alexa Fluor 488山羊抗-人類lgG(H+L)作為二次抗體；使用小鼠 抗體作為一次抗體時，使用Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠 IgG(H+L)作為二次抗體；使用兔.子抗體作為一次抗體時， 使用Alexa Fluor 488山羊抗-兔子IgG(H+L)作為二次抗 籲體，使用山羊抗體作為一次抗體時，使用Alexa Fluor 488 驢抗-山羊IgG(H+L)作為二次抗體。將此等細胞再用FCM 緩衝液洗淨2次後，再懸浮於250μΙ>之FCM緩衝液，並 用流式細胞測定儀MPL 500(BECKMAN COULTER公司） 測定染色細胞之螢光強度。對於各抗體，計算導入各基因 之CHO-K1細胞之螢光強度之中間值相對於導入陰性對照 質體pcDNA3.1(+)之CHO-K1細胞之螢光強度之中間值之 馨比，將其結果示於表9。該比為1時表示抗體全然未結合 至該蛋白質，該比大時，表示抗體強力地結合於該蛋白質。 從此等結果可以明白供給至本實驗之8種抗人類Nectin-2 人類單株抗體與其他人類Nectin家族蛋白質（Neetin-1、 Nectin-3、Nectin_4)及Necl-5蛋白質無交叉反應，為對 Nectin-2特異性抗體。 190 319597 200823235 表9
Nectin-1 Nectin-2 Kectin-3 Nectin-4 Keel-5 陽性對照抗體 79. 9 151. 6 10· 7 3.7 496. 8 Nec 1-803-2 L2 75· 0 1.2 1. 1 1.1 Necl-520-l 1. 1 62.6 1. 1 1.2 1.0 Necl-530-l 1. 0 66.7 1.2 !. 1 LO Necl-834-l 1.2 63· 1 1.2 I. I 1.0 Necl-244-3 1.2 57,5 1.2 1.2 1. 1 Necl-303-2 LO 11. 1 1.0 0, 9 0.9 Necl-903-1 1.2 71.9 1.2 1· 1 1.2 Nec8-4116-8 1· 3 717 l 1 1. 1 1.0
實施例10 抗Nectin-2人類單株抗體之Nectin-2-Nectin_2 結合阻礙活性 測定實施例1及實施例8所取得之抗Nectin-2人類單 鲁株抗體之Nectin-2-Nectin-2結合阻礙活性，藉由利用時間 分解螢光法之下述方法進行定量性評價。首先，將參考例 16所调製之Nectin-2ED- Fc蛋白質1 mg，藉由使用 VIVASPIN MWCO 30,000(VIVA SCIENCE 公司）尤超過濾、 法’對著50 mM碳酸納缓衝液(pH 9.6)進行濃縮置換而調 製成4 mg/mL溶液。在該Nectin-2ED- Fc溶液中，添加 DELFIA Eu-標記套組（Perkin Elmer公司）所附之£11_標士己 試劑並混合後，於4。(：反應一夜。藉由上述超過濾法從反 應混合物除去未反應之Eu+3，·同時將緩衝液，製換成ρΒ§， 319597 191 200823235 而調製成經Eu標識之Nectin-2ED- Fc。此時之Eu3+導入數 為5.23分子/每分子之Nectin-2ED- Fc。繼而將Nectin-2ED-Fc用50mM碳酸鈉緩衝液（pH 9.6)稀釋成濃度為5pg /mL，將其添力口至Wallac Delfia用培養盤（Perkin Elmer公 司），lOOpg/孔，並於室温反應5小時。其後在各孔中添加 含2%BSA之PBS 200μΙ>，並於4°C進行封阻隔夜。將該培 養盤用0.05% Tween 20-PBS(PBS-T)洗淨2次後，將用含 0.2% BSA之PBS稀釋成 600 μg/mL之抗 Nectin-2人類單 •株抗體或對照 hIgG(Hiiman IgG Whole molecule Chrom Pure ; Jackson公司）與用含0·2% BSA之PBS稀釋成 6.4pg/mL之經βιι標識之Nectin-2ED- Fc予以等量混合， 每孔添加所得混合物1 OOpL，並於室溫使其反應1.5小時。 將該培養盤用 PBS-T洗淨6次後，添加強化溶液 (Enhancement Solution，Perkin Elmer 公司）200μΕ/孑L ，並 於室溫用培養盤混合器攪拌1分鐘。使甩ARVO 1420 春Multilabel Coimter(Perkin Elmer公司）測定如此反應之各 孔之615 nm之螢光（激發光340 nm，延遲時間400μ秒）， 並藉由下述計算式算出Nectin-2-Nectin-2反式結合阻礙 率0
Nectin-2-Nectin_2 反式結合阻礙率（％)=(Α-Β)χ100/Α A :使用對照hlgG時之計數 B :使用抗Nectin-2人類單株抗體時之記數 將各抗Nectin-2人類單株抗體之Nectin-2-Nectin-2反 式結合阻礙率彙總示於表10中。 ： :: 192 319597 200823235 表ίο 名稱 Neciin-2 - Nectin-2 反式結合抑制率⑽ Nec1-244-3 28 Nec1-259-1 24 Neel-303-2 19 Nec1-316-1 30 Necl-63卜10 78 Neel-738-3 38 Nec卜740-1 71 Ned - 834-1 40 Nec1-878-1 69 Nec1-918-2 34 Nec1-1115-2 7 NecH 150-2 48 Necl-1209-8 28 Nec8-3717-4 70 Nec8-3823-4 79 Nec8-4024-5 30 Nec8-411卜2 76 Control hlgG 0 實施例11 抗Nectin-2人類單株抗體之ADCC(抗體依存 性細胞毒殺性） 測定實施例1所製作之抗Nectin-2人類單株抗體中之 群 I 之 Necl-964-l，群JV 之 Necl-303-l、Necl-554-l、 193 319597 200823235
Necl-1302-2、群 V 之 Necl-769»2、Necl-1305-l、群 VI 之 Necl-141-3、Necl-209-2、Necl-909-l、Necl-847-2、 Necl-803-2、群 VII 之 Nec8-4116-8 之 ADCC。使用人類卵 巢癌細胞株OV-90作為標祀細胞，在效應（effector)細胞方 面，使用蔣市售之涞結人類末梢血單核球（Asahi Techno Glass ,公司）在含有0.1 nM重組型人類IL-2(DIACLONE Research 公司）、55μΜ 2-魏基乙醇（Invitrogen 公司）及 10 % FBS(JRH公司）之RPMI 1640培養基（Invitrogen公司）中培 •養-夜者。 將對數增殖期之OV-9O細胞株依照實施例6之方法回 收，藉由對於1χ1〇6個細胞添加250pCi之Na251Cr04(GE Healthcare公司），並於37°C培養1小時而進行51Cr標識。 將此等細胞用含0·4 % BSA(Invitrogen公司）之RPMI 1640 培養基（以下稱為〇·4 % BSA / RPMI培養基）洗淨4次後， 將ΙχΙΟ5個細胞再懸浮於0.4 %BSA/RJPMI培養基中。將 •該標靶細胞懸浮液100μΙ；(1><1〇4個細胞）及上述抗Nectin-2 人類單株抗體用0·4 % BSA / RPMI培養基稀釋成終濃度為 0.0015pg/mL、（L015pg/mL、0.15pg/mL 及 1.5pg/mL 之溶 液，將該等溶液SOgL添加至96孔RMC培養盤（BIOBIK 公司)之各孔中。添加相同量之作為陰性對照組之非免疫人 類 IgG(最終濃度 1.5pg/mL)或 D-PBS(Invitrogen 公司）。將 此等培養盤在冰上培養1小時後，加入上述效應細胞 (effector cells)懸浮液5χ105個/孔（效應細胞：標靶細胞 =50 : 1)，在5%二氧化碳氣流中，·於3 7°C反應4小時。將 194 319597 200823235 各孔之細胞懸浮液移至96孔Multiscreen 45Km(Millip〇re 公司）中，藉由離心分離操作回收培養上清液。使用丫计數 器（AccuFLEX γ7000 ; ALOKA Co·)測定從細胞内漏出至此 等培養上清液中之放射活性（樣品釋出活性，sample release)。ADCC之最大傷害活性（最大釋出活性，maximum release)，係在加入Triton-X 100(Sigma公司）並使其最終濃 度成為1 %時在培養上清液中所檢測到之放射活性；再者’
自然釋出活性（spontaneous release)，係在加入含1 〇 % FBS 之RPMI 1640培養基以代替效應細胞時在培養上清液中所 檢測到之放射活性。成為ADCC強度之指標之特異性溶裂 (specific lysis)(%)係用下式計算出：（[樣品釋出活性]-[自 然釋出活性])/([最大釋出活性]•[自然釋出活性])xl00(表 11 及 12)。 相對於非免疫人類IgG(最終濃度1.5pg/mL)添加時及 D-PBS添加時之ADcc(特異性溶裂）各為4 %及3 %，群工 之抗Neetin_2人類單株抗體Necl-964-l，群IV之
NecM54-l、NecLi3〇2-2、Necl-769,2、群 VI 之 Neel- 8〇3·2、群Vn之Nec8_4116-8之ADCC在抗體最終濃度 L5Rg/mL 下’分別為 12%、19%、15%、12%、15%、17% 而王頌著地南。尤其是群IV之Necl-554-l及群VII之 Nec8- 4116-8，Pd /士 , 田 即使在抗體最終濃度為（U5pg/mL下，特 兴丨生令裂分別為15 %及12 %，而顯示比其他抗Nectin_2 人類單株抗體強之ADCc 〇 195 319597 200823235 表11 抗體 特異性溶裂 抗體 (pg/ml) (%) 非免疫IgG 1.5 4 D-PBS - 3 Ned-964-1 0.0015 -3 0.015 2 0.15 8 1.5 12 Nect~303~1 0.0015 -1 0.015 1 0.15 0 1.5 3 Ned-554-1 0.0015 0 0.015 7 0.15 15 1.5 19 Ned-1302-2 0.0015 3 0.015 3 0.15 7 1.5 15 Neol-769-2 0.0015 4 0.015 5 0.15 10 1.5 12 Neel-1305-1 0.0015 3 0.015 4 0.15 4 196 319597 200823235 表12
抗體； 特異性溶裂 抗體 (pg/ml) (%) Neel-1305-1 1.5 5 Ned-141-3 0,0015 -3 0.015 -2 0.15 -3 1.5 -2 Ned-209-2 0.0015 _3 0.015 -1 0.15 2 1.5 4 Neel-909-1 0.0015 A 0.015 Λ 0.15 0 L5 3 Nec1-847-2 0,0015 1 0.015 1 0.15 8 1.5 11 Nec1-803-2 0.0015 0 0.015 3 0.15 8 1.5 15 Nec8-4116-8 0.0015 2 0.015 1 0.15 12 1.5 17 197 319597 200823235 實施例12 抗Nectin-2人類單株抗體在活體中之抗腫瘤活 性 調查實施例1所取得之抗Nectin-2人類單株抗體中， Necl-803-2、Necl-964-l、Necl-303-2、Necl-554-lSP3、 Necl-1302-2、Necl-769-2、Necl-1305-1、Necl-141-3、 Necl-209-2、Necl-909-1 及NecL·847-2 在OV-90人類卵巢 細胞之裸鼠皮下移植模型中之抗腫瘤活性。各抗Nectin-2 人類單株抗體標準品係使用藉由參考例28所記載之方法 ®調製者。將OV-90細胞株播種於150 cm2組織培養燒瓶 (Coming公司）中，其中使用含15%FBS(JRH公司）之 MCDB105(Sigma公司）與培養基199(Sigma公司）之等量混 合培養基，並在5%二氧化碳氣流中，於37°C進行培養。 將藉由胰蛋白酶-EDTA處裡而剝離得到之對數增殖期之 OV-90細胞株懸浮液，在使用离隹心分离隹操作（1，〇〇〇 rpm，3 分鐘）下，用 Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS) 馨（Invitrogen公司）洗淨3次。將如此得到之細胞再懸浮於 HBSS中並使其密度為8χ107個/mL。 將購自日本可麗亞（Clea)之裸鼠（BALB/cAJcl-nu/nu) (5週齡’雌性）進行慣化（habituation)飼育1星期後，將上 述OV-90細胞懸浮液接種於腹侧皮下100(lL/個體。於細胞 接種10日後，用游標卡尺測定OV-90腫瘤之長徑與短徑， 藉由下述計算式算出腫瘤體積。 腫瘤體積（mm3)=長徑χ(短徑）2/2 從移植有OV-90細胞株之上述裸鼠中選拔生長附著腫 198 319597 200823235 瘤塊，並測定各個體之體重後，分成各群之平均腫瘤塊體 積成為均等（約50 mm3)之群。於細胞接種第10、13、17、 20、24、27、31日，將用PBS稀釋成0.15mg/mL之上述 抗Nectin-2人類單株抗體溶液或PBS以每隻10 mL/kg之 量經由尾靜脈投與，與此同時藉由上述方法測定腫瘤體 積。抗Nectin-2人類單株抗體之增殖阻礙活性，依據藥物 投與開始4星期後之腫瘤體積，藉由下述計算式計算出 T/C(治療組/對照組）。再者，投與群間之顯著差異檢定係 鲁使用Parametric Dunnet型多重比較檢定（S AS前臨床套裝 5·0 版）。 T/C(%)=[(抗體投與群中從藥物投與開始計之腫瘤體積增 加量）/(PBS投與群中從藥物投與開始計之腫瘤體積增加 量）]χΐ〇〇 在上述抗Nectin-2人類單株抗體之中，有強力阻礙 OV-90細胞株腫瘤塊之增殖之抗體及微弱阻礙OV-90細胞 0株腫瘤塊之增殖之抗體。將各抗Nectin-2人類單株抗體之 T/C及相對於PBS投與群之顯著差異值（P值）彙總示於表 13中。 199 319597 200823235 表13 T/C⑻ /值 Nec1-803-2 47 0.0113 Neel-964-1 62 Necl-303-2 102 Nec卜554-1SP3 34 0. 0028 Neel-1302-2 63 Necl-769-2 83 Neel-1305-1 104 Neel-141-3 72 Nec1-209-2 94 Neel-909-1 74 Nec卜847-2 81 實施例13 抗Nectin-2人類單株抗體之結合結構域 鲁（domain)解析 在抗Nectin-2人類單株抗體之抗原決定部位探索方法 之一中，對於Nectin-2之Igl域（序列編號1或編號3所示 之胺基酸序列之第47至142號)缺損蛋白質及Nectin-2之 Ig2域（序列編號1或編號3所示之胺基酸序列之第175至 240號）缺損蛋白質之反應性藉由使用此等蛋白質之暫時性 表覌CHO-K1細胞之FCM法來調查。具體而言，藉由與 實施例9同樣之方法，製作暫時性表現下列載體之CHO-K1 細胞懸浮液：參考例18所製作之ρΕΕ12·4 -Nectm-25、參 200 319597 200823235
考例 30 所製作之 pcDNA 、peDNA 3.1(+)_Nectm-2AIg2 以及作為陰性對照之 pcDNA 31(+)。 將此等細胞懸浮液以30μΕ/孔之量加入96孔v底燒瓶中， 然後在其中加入用FCM缓衝液稀釋成丨5 μ£/πιι之實施例】 所製作之數個抗Nectin-2單株抗體或參考例14所製作之 抗Nectin-2兔子多株抗體ν2_ Νο·2 20μΙ^(終濃度： 6pg/mL)，並於冰上反應1小時。在各孔中加入FCM緩衝 - * 液200>L，藉由離心分離操作洗淨1次後，加入用FcM缓 衝液稀釋成lOpg/mL之Alexa 488標識二次抗體50μΙ7孔， 混合並於冰上反應1小時。關於Alexa 488標識二次抗體， 對於人類抗體，使用 Alexa Fluor 488山羊抗-人類 IgG(H+L);對於兔子抗體，使用Alexa Fluor 488山羊抗-兔IgG(H+L)(Invitrogen公司）。將各孔之細胞再用FCM缓 衝液洗淨2次後，再懸浮於250μΕ之FCM缓衝液，並用 流式細胞測定儀MPL 500(BECKMAN COULTER公司）測 ❿定染色細胞之螢光強度。對於各抗體，將一次抗體添加群 之螢光強度之中間值相對於陰性對照群之螢光強度之中間 值之比當作對於導入各個基因之CHO-K1細胞之反應性， ^ · - . 並示於表14及15中。在表中，對於pcDNA 3.1(+)-Nectin-2Z\Igl 導入細胞及 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2AIg2 導 入細胞之反應性分別以delta-Igl及delta-Ig2表示，並將 相對於陰性對照組之比為2以上者規定為具有反應性；以 與delta-Igl之比為2以上之與delta-Ig2之比為2以下者 判定為能識.別Nectin_2之Ig2之抗體；以與delta_Igl毛:比 201 319597 200823235 為2以下之與delta-Ig2之比為2以上者判定為能識別 Nectin-2之Igl之抗體。再者，上述任一比值皆在2以下 之反應性之抗體之結合結構域（抗原決定部位結構域）記載 為「未知」。 .其結果暗示屬於抗原決定部位群IV之抗體能識別 Nectin-2之Ig2結構域。再者，屬於抗原決定部位群V及 VI之抗體能識別Nectin-2之Igl結構域。 • 202 319597 200823235表14
名稱 delta-Ig1 delta -lg2 抗原決定部位-結構域 無 1.0 1.1 多株抗體Ab 4.5 8.9 Nec1~l02~1 to 4.6 Ig1 Ned-141 -3 1.0 2.6 Igl Ned-202-1 1.0 14 未知 Nec1 -244"~3 1.0 2.9 Ig1 Ned-308-2 1.1 1.1 未知 Ned-313-1 1.0 1.0 未知 Ned-333-1 4.2 1.1 Ig1 Nec1-410-3 2.9 1.3 Ig2 Ned-460-1 0,8 2.8 Ig1 Nec1-464-1 1.0 3.5 Igl Nec1-503-3 1.0 1.0 未知 Nec1-738-2 1.0 5.1 Igl Ned-755-5 1.0 4.8 Ig1 Necl-803-2 1.0 5.3 Igl Neol-888-11 1.0 1.0 未知 Ned-909-t 1.0 3.5 Igl Neel-919-1 1.0 6.9 Ig1 Ned-930-1 1.0 1.1 未知 Ned-964-1 1.1 1.1 未知 Ned-1044-4 11 0.8 Ig2 Mec1-1302-2 4.1 1.1 Ig2 Nec6-15l—4 1.0 1.0 未知 Nec8-3410-1 1.0 1.3 未知 Nec8-3823-5 0.9 3.0 Ig1 Nec8-4116-8 1.0 ,1.0 未知 203 319597 200823235 表15 名稱 delta_Ig1 delta - Ig2 抗原決定部位-結構域 多株抗體Ab 7.8 10.6 無 to to Ned-554-1 SP3 4.3 1.0 Ig2 NeciH 236-1 SP3 4.5 1.1 Ig2 Nec1-215_8 SP3 4.4 1.1 Ig2 Nec1_333-3 SP3 4.2 1.1 Ig2 Ned-1044-4 2.9 1.1 Ig2 Nec1-554-1 3.6 1.0 Ig2 NecH215 - 8 4.3 1.1 Ig2 Ned-1236-1 4.4 1.2 Ig2 Ned-1613-3 5.1 1.1 Ig2 Neci-333-3 3,6 1.1 Ig2 Ned-326-7 1.1 1.3 未知 Nec1-1138-1 4.0 1.0 Ig2 Nec1-1218"7 2.5 1.1 Ig2 Nee1-803—2 0.9 6,2 Ig1 Ned-244-3 1.0 4.8 Ig1 Nec8-4116-8 0.9 1.0 未知 Nec1-103-1 1.0 1.3 未知 Neel-1302-2 3,5 1.2 Ig2 Nec1-1005-2 2.0 0.8 Ig2 204 319597 200823235 實施例14抗Nectm_2單株抗體對於食蟹猴Nectin-2之交 叉反應性
藉由使用暫日守性表現食蟹猴Nectin-2之κΐ細胞 之流式細胞測定法（FCM)，來調查實施例^所製作之抗 Nectm-2人類單株抗體對於食蟹猴Nectin_2之交叉反應 性。藉由與實施例9同樣之方法，分別製作暫時性表現下 列載體之CHO-K1細胞懸浮液：參考例丨8所製作之 • ρΕΕ12·4 -Nectin-20、參考例 32 所製作之 pcDNA 3.1(+)-maNectm-2、或作為陰性對照之 pCDNA 3.1(+)。將 此等細胞懸浮液以30μΕ/孔之量加入96孔V底培養盤中， 然後在其中加入一次抗體，即用FCM缓衝液稀釋成 15pg/mL之實施例1所製作之數個抗人類Nectin-2人類單 株抗體或參考例14所製作之抗Nectin-2兔子多株抗體 Ν2-Νο·2 20pL(隶終濃度：/mL)，並於冰上反應1小時。 之後，在各孔中加入FCM缓衝液200μΙ^，藉由離心分離操 參作洗淨1衣後，加入用FCM緩衝液稀釋成1 〇#g/mL之Alexa 488標識二次抗體50pL/孔，使之懸浮並於冰上反應1小 時。再者，對於人類抗體，使用Alexa Fluor 488山羊抗-人類IgG(H+L);對於兔子抗體，使用Alexa Fluor 488山 羊抗-兔子IgG(H+L)(Invitrogen公司）。繼而，將此等細胞 用FCM缓衝液洗淨2次後，再懸浮於250μΕ之FCM缓衝 液，並用流式細胞測定儀MPL 500(BECKMAN COULTER 公司）測定染色細胞之螢光強度，並確認各抗體之結合反應 性。對於各抗體，將一次抗體添加群之螢光強度之中間值 205 319597 200823235 相對於陰性對照群之螢光強度之中間值之比示於表16 中。從該結果可知實施例1所製作之抗人類Nectin-2人類 單株抗體之中，存在對於食蟹猴Nectin-2不具交叉反應性 者。屬於群IVb之Necl-554-l、屬於抗原決定部位群VI 之Neel-319-2、Neel-843-1、屬於抗原決定部位群VII之 Nec8-4116-8對於食蟹猴Nectin-2顯示交叉反應性。相對 於此，屬於抗原決定部位群VI之Neel-111-3、Neel_144_1、 Necl_209_2、Necl-244-3、Necl-316-l、Necl-332-l、 • Necl-520-1、Necl_53(M、Necl:704-1、Necl-730-4、 Necl-803-2、Necl,834-1、Necl-843-1、Necl-845-2、 Necl-903-1、Necl-909-1、NecK918-2、Necl-1214-5、 Nec8-4024-5對於食蟹猴Nectin-2未顯示交叉反應性。 206 319597 200823235 表16 人類 Nec tin-2 食蟹猴Nec t in-2 未添加一次抗體 0.8 0.9 陽性對照抗體 18, 7 15.8 Necl-111~3 29. 9 1.3 Neel-144-1 37.9 1.2 Neel-209-2 45. 8 L6 Necl-244-3 24. 6 1. 1 Neel-316-1 38.4 1.1 Necl-319-2 47· 8 4.2 Necl-332-1 5L7 1.3 Neel-520-1 25.4 1，0 Nec1-530-1 40. 5 1.0 Nec1-554-1 43. 0 14.8 ’ Nec1-704-1 22. 2 1. 3 Nec1-730-4 36. 3 1.4 Nec1-803-2 48.6 1, 1 Nech834-1 49· 5 1. 1 Nec1-843-1 47· 6 3. 1 Nec1-845-2 42.9 1.7 Neel-903-1 43. 9 LI Neel-909-1 43. 7 1.7 Nec1-918-2 28. 3 L 3 Nec Μ 214-5 45. 4 1. 8 Nec8-4024-5 59.2 , 2.0 Nec8-4116-8 44 3 30.9 207 319597 200823235 實施例15 抗Nectin-2人類單株抗體對於導入食蟹猴型變 異之Nectin-2之交叉反應性 藉由使用暫時性表現導入食蟹猴型變異之人類 Nectin-2-之CHO- K1細胞之流式細胞測定法（FCM)，來調 查實施例1所製作之抗Nectin-2人類單株抗體對於導入食 蟹猴型變異之人類Nectin-2之交叉反應性。藉由與實施例 9同樣之方法，製作暫時性表現下列載體之CHO-K1細胞 懸浮液：參考例18所製作之ρΕΕ12·4 -Nectin-25，參考例 3 3所製作之導入食蟹猴型變異之人類Nectin-2之動物細胞· 用表現載體：pcDNA 3.1(+)-Nectin-2(AN77-78PD)、pcDNA 3.1(+)-Nectin細2(G113R)、pcDNA 3J(+)-Nectin-2(H128R)， 以及作為陰性對照之pcDNA 3.1(+)。將此等細胞懸浮液以 3OpL/孔之量加入96孔V底培養盤中，然後在其中加入一 次抗體，即用FCM缓衝液稀釋成15pg/mL之實施例1所 製作之數個抗人類Nectin-2人類單株抗體20μΜ最終濃 春度：6 pg /mL)，並於冰上反應1小時。之後，在各孔中加 入FCM缓衝—液200μΙ，藉由離心分離操作洗淨1次後，加 入用FCM缓衝液稀釋成10pg/mL之Alexa Fluor 488山羊 抗-人顧IgG(H+L)5(^L，使之懸浮，並於冰上反應1小時。 .. . 繼而，將此等鈿胞用FCM緩銜液洗淨2次後，再懸浮於 250pL之卩€]^缓衝液，並用流式細胞测定儀]\«>1 500(BECKMAN COULTER公司）測定染色細胞之螢光強 度。對於各抗體，將一次抗體添加群之螢光強度之中間值 柑對於陰性對照群之螢光強度之中間值之比示於表17 208 319597 200823235 中。從其結果可知：於抗原決定部位群VI之Necl-lll-3、 Necl-209-2、Necl-244-3、Necl-316-l、Necl-332-l、 Necl'520-1、Necl-530'1、Necl-704-1、Necl-730-4、 Necl-803-2、Necl-834-1、Necl-843-1、Necl-845-2、 Necl-903-1、Necl-909-1、Necl-918-2、Necl-1214-5、 Nec8-4024-5對於 G113R及H128R之結合力與對於 Nectin-2之結合力為同等，不過不會與AN77-78PD結合。 該結果暗示此等人類單株抗體可以識別包括Nectin-2之 胃Ala77或Asn78之區域。另一方面，屬於群IVb之 Necl-544-l，屬於群 VI 之 Necl-144-l、Necl-319-2、 Necl-843_1，屬於群 VII 之Nec8-4116-8對於AN77-78PD、 G113R及H128R之結合力與對於Nectin-2之結合力為同
209 319597 200823235 表17 .
Nectin-2 ANT7-T8PD G113R H128R 未添加一次抗體 0.8 0· 9 0· 8 0· 8 陽性對照抗體 18. 7 20.3 17.9 19.8 NecMll-3 29.9 1.4 28· 5 38.6 Necl-144-1 37.9 19.3 30· 9 27. 2 Neel-209-2 45. 8 1.9 41.9 56.8 Neel-244-3 24 6 1. 1 23. 3 29· 6 Neel-316-1 38. 4 1.2 37. 8 50.0 Nee 1-319-2 47.8 6. 9 43.8 61. 1 Ned -332-1 51.7 1. 6 43.7 60· 6 Ned-520-l 25· 4 L0 22.5 31· 6 Neel-530-1 40.5 0.9 36.7 5L5 Nee 1-554-1 43. 0 44.2 38· 7 51. 5 Ned - 704-1 22· 2 1.4 19. 3 25.3 Ned -730-4 36.3 L0 32.4 42.2 Necl_803-2 48· 6 1. 1 41.9 54,9 Necl-834-l 49.5 1:2 45. 9 55.8 Nec1-843-1 47. 6 4· 1、 43-1 52· 4 Nec1-845-2 42.9 2.3 40. 1 51. 9 Necl-903-1 43.9 0.9 38. 9 55.8 Neel-909-1 43.7 1.4 32.5 45· 5 Neel-918-2 28· 3 1.4 26-0 34.3 NecF1214 - 5 45.4 1.7 42· 4 53.7 Nec8-4G24-5 59, 2 2.2 50.7 71. 1 Nec8-4116-8 44.3 40.9 37.5 50· 5 210 319597 200823235 實施例16 屬於抗原決定部位群V及VI之抗Nectin-2人 類單株抗體之抗原決定部位解析 在實施例13中，暗示屬於抗原決定部位群V及VI之 抗體能識別Nectin-2之Igl域。為了將此等抗Nectin-2人 類單株抗體之抗原決定部位更詳細地特定化，調製對於 Nectin-2ED-Fc之Igl域進行1胺基酸置換而成之重組蛋白 質，並調查抗Nectin-2人類單株抗體對於此等變異體之結 合活性。對於293細胞株，使用293 fectin(Invitrogen公司） 香以下列載體進行轉染：參考例15所製作2pCDNA 3.1(+)-Nectin-2ED_hFc，以及參考例 34 所製作之 Nectin-2ED_Fc 之1胺基酸置換體之動物細胞用表現载體： pcDNA 3.1(+)-Nectin- 2ED-Fc(Q37A) > 、 pcDNA 3.1(+)_Nectin'2ED-Fc(P40G)、 pcDNA 3.1(+)_Nectin- 2ED-Fc(Q45A)、 pcDNA 3.1(+).Nectin- 2ED-Fc(H55A)^ • pcDNA 3.1(+)-Nectin- 2ED- Fc(V60A)、 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Y64A)、 pcDNA 3 J(+).Nectin- 2ED- Fc(Q71A)-pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED_Fc(A75G)、 pcDNA 3.1 (+)-Nectin-2ED-Fc(P76G)>
PcDNA 3.1 (+)^Nectin-2ED-Fc(A77G) > pcDNA 3,1 (+).Nectin-2ED^Fc(N78A) > pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED_Fc(H79A)、 pcDNA 3.1(+).Nectin-2ED-Fc(Q80A) ^ ， 319597 211 200823235 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(N81A)、 pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K88A)、 pcDNA 3.1(+)-Nectin- 2ED -Fc(S95A) pcDNA 3.1 (+)-Nectin- 2ED -Fc(K109A) ^ pcDNA 3.1(+)-Nectin· 2ED -Fc(E117A)、 pcDNA 3.1(+)-Nectin- 2ED -Fc(D122A)、 pcDNA 3.1(+)-Nectin- 2ED -Fc(H128A)、 pcDNA 3.1(+)-Nectin- 2ED -Fc(N137A)、 ® pcDNA 3.1(+)-Nectin -2ED -Fc(F145A) > pcDNA 3.1(+)-Nectin -2ED -Fc(K147A)、 pcDNA 3.1(+)-Nectin -2ED -Fc(V150A) > pcDNA 3.1 (+)-Nectin -2ED -Fc(M153A)-pcDNA 3.1(+)-Nectin -2ED -Fc(T154A)。然後藉由將此等細 胞在8%二氧化碳氣流中，於37°C旋轉培養3日，使上述 質體所編碼之Nectin -2ED -Fc蛋白質及其1胺基酸置換體 •蛋白質，~、麗、一一-A75G、P76G、A77G、N78A、H79A、Q80A、N81A、K88A、 S95A、K109A、Έ117Α、D122A、H128A、N137A、F145A、 K147A、V150A、M153A、T154A]分泌至培養上清液中。 藉由離心分離操作及過濾器過濾從各細胞懸浮液調製培養 上清液，並供應至以下之ELISA。 將¥施例1所製作之抗Nectin-2人類單株抗體 , / 1
Nec8-4116-8用50mM碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液（pH9·6)稀 釋至5,ug/mL之濃度，.將其添加至96孔half well免疫培養 212 319597 200823235 盤（Costar公司）50μΙ>/孔，並於室溫使其反應5小時。從各 孔中除去反應液後，添加含2%BSA之PBS ΙΟΟμΕ/孔，並 於4°C封阻隔夜。將如此製作之ELISA用培養盤以含0.05% Tween 20之PBS洗淨二次後，添加：暫時性表現Nectin -2ED-Fc蛋白質（野生型）及上述Nectin -2ED -Fc之1胺基 酸置換體蛋白質之上述293F細胞株培養上清液用含 0.2%BSA之PBS稀釋5倍而成者50pL/孔，並於室溫使其 反應2小時。再者，將作為陰性對照之293F細胞用培養, •基加至相同培養盤中。將該培養盤用含0.05% Tween 20之 PB S洗淨6次後’添加只施例4所製作之生物素化抗 Nectin-2人類單株抗體用含0.2%BSA之PBS稀釋為5ng/ml 至20ng/ml之濃度之溶液50μΙ^孔，並於室溫使其反應2 小時。將該培養盤甩含0·05°/。Tween 20之PBS洗淨6次， 添加經含0.2%BSA之PBS稀釋3,000倍之抗生物素蛋白 (avidin)_HRP(Vector公司）5〇pL/孔，並於室溫使其反應2 修小時。將該培養盤用含0.05% Tween 20之PBS洗淨6次， 添加TMB溶液（SureBlue Microwell TMB過氧化酶受 質）50#L/孔後，於室溫進行顯色1分鐘，添加2N硫酸（和 光純藥股份公司）50μΕ/孔，使酵素反應停止。使用培養盤 讀數器(Multiskan BICHROMATIC)測定各孔之吸光度（45〇 nm)。藉由下式計算出各生物素化抗Nectin-2人類單株抗 體對於各個Nectin -2ED -Fc之1胺基酸置換體之反應性。 反應性（％野生型）=[吸光度（1胺基酸.置換體>吸光度 (陰性對·照）]/[吸光度（野生型)_吸光度（陰性對照)]x1()〇 319597 213 200823235 表18中，於實施例4被分類成抗原決定部位群VI之 抗體中，有見到對於A75G、P76G及N78A結合力低者以 及見到對於A75G、P76G、N78A及N137A結合力低者， 此暗示前者之抗體群能識別含有Ala75、Pro76、Asn78之抗 原決定部位，後者之抗體群能識別含有Ala75、Pro76、Asn78 及Asn137之抗原決定部位。再者，於實施例4被分類成抗 原決定部位群V之抗體中，見到對於F145A之反應性低 者，此暗示此等抗體能識別含Phe145之抗原決定部位。
214 319597 200823235表18
S 1 8 B 3 S & B S S I 1 8 S ® s 8 B P5 8 m & g g 5 g 〇5 i £ 1 8 s P： R S3 5； CO r— §5 5 8 5 CO S3 2 B 8 I 5 i 8 m B B δ 扮 茌 CO &J P g ffi g 茳 § I I B B S B 良 S 8 8 § s 8 g 8 S i i 8 s P： JB 5； 沼 闷 B 8 S3 B ai S Bi B i i 8 8 JO CSJ S in g g g R g 9 ? 1 8 S s § 8 S3 s s CO 8 S 8 fe δ I 1 8 5 So 5 8 K2 @ a s s 艺 s? m g 8 g i 8 & s 88 B S? S 〇> 8 S s δ Θ 5 I δ 1 8 m 8i 8 8 Bi 8 B g g) ? 田 〒 I 8 88 a ES & 8 SB 8 田 s τ 8 s S 1 = 1 1 1 1 1 i < 5 i i g 田 g 2 S s 5 垂 E S I
l ί vJ l· \ £ ? 5 J ί t κ ? H ? s if g ί 6 3 E J g Ϊ g J g τ i 1 |g ί 1 S 丨年 1 g i R i 5 i R ί g ；田 s Ϊ g ；B k ί f '8 g δ ：R3 i s g s 丨田 g s 1 1 8 S Τ g g g g § I s 卜 to 口 耷 s g B 6 £ s ? 1 B cn τ S 2 m g R g I 1 8 5 B ? g g s © g R g i I 8 g R ο S s 〇 s g i s i 8 P F= τ S 兹 CO § 8¾ g σ> 8 g 岛 寸 s? P B 袞 §; g S B 1 8 g FS CO a 运 s g P 8 1 1 8 B τ £5 s g s B g R i 8 S F2 B 0 B 53 g g g i 1 8 g 8 8 ίο 窆 g g ^r S B e 1 1 8 B ffi δ g g s g R i s 1 B to R ro s 53 ffi σ> I 8 CO CO g s 〇 S § T 8 § * i 1 i i 1 i i i 1 乏 $ E P 215 319597 200823235 實施例17屬於抗原決定部位群I及VII之抗Nectin-2人 類單株抗體之抗原決定部位解析 為了將實施例1取得之抗Nectin-2人類單株抗體之抗 原決定部位更詳細地特定化，調製對於Nectin-2ED-Fc之 域進行1胺基酸置換而成之重組蛋白質，並調查此等 之結合活性。對於293F細胞株，使用293 fectin(Invitrogen 公司）以下列載體進行轉染：參考例15所製作之pcDNA 3.l(+)-Nectin-2ED-hFc，以及參考例 35 所製作之 Nectin-2E：I^Fc之1胺基酸置換體之動物細胞用表現載體：
PcDNA 3.1(+)-Nectin- 2ED-Fc(Q165A) ^
PeDNA 3/l(+)-Nectin- 2ED-Fc(K170A)、
PcDNA 3.1(+>-Nectin- 2ED-Fc(F173A) > ⑽Na 3.1(+)-Nectin- 2ED-Fc(P177G)、
PcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(I184A)、
PeDNA 3.1(+)-Nectin_ 2ED_ Fc(K186A)、 • PeDNA 3:l(+)-Nectin_ 2ED_ Fc(L197A)、
PcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(W202A) ^
PcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(E206A) > pcDNA 3.1(+)-Nectin-2ED^Fc(T212A) >
PeDNA 3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(T235A)、
PcDNA 3.1 (+)-Nectin-2ED-Fc(K239A)、 PeD]s[A3.1(+)-Nectiii-2ED_Fc(A249G)，然後藉由將此等細 胞在8.%二氧化碳氣流中，於37°C旋轉培養3日，使上述 .質體所編碼之Nectin-2ED-Fc蛋白質„及其.1 .胺基酸變異體 216 319597 200823235 蛋白質[Q165A、K170A、F173A、P177G、Ί184Α、K186A、 L197A、W202A、E206A、T212A、T235A、K239A、A249G] 分泌至培養上清液中。藉由離心分離操作及過濾器過濾從 各細胞懸浮液調製培養上)青液，並供應至以下之ELISA。 將實施例1所製作之抗Nectin-2人類單株抗體 Nec8-803-2用50 mM碳酸鈉-碳酸氳鈉緩衝液（pH 9.6)稀 釋至5pg/mL之濃度，將其添加至96孔half well免疫培養 盤（Costar公司）50μΕ/孔，並於室溫使其反應5小時。從各 ·. 孔中除去反應液後，添加含2%BSA之PBS 100μΙ7孔，並 於4°C封阻隔夜。將如此製作之ELISA用培養盤以含0.05% Tween 20之PBS洗淨二次後，暫時性表現Nectin-2ED-Fc 蛋白質（野生型）及上述Neetin -2ED-Fc之1胺基酸置換體 蛋白質之上述293F細胞株培養上清液用含〇.2%BSA之 PBS稀釋25倍或125倍而成者，5〇μΙ^/孔添加，並於室溫 使其反應2小時。再者，將作為陰性對照之293F細胞用 ⑩培養基加至栢同培養盤中。將該培養盤用含0.05% Tween 2 0之PB S洗淨6次後’添加貫施例4所製作之生物素標識 抗Nectin-2抗體用含0.2%BSA之PBS稀釋至1 ng/mL之 濃度之溶液50μ]：/孔，並於室溫使其反應2小時。將該培 養盤用含0.05% Tween 20之PBS洗淨6次，添加經含 0.2%BSA之PBS稀釋3,000倍之抗生物素蛋白（avidin)-HRP(Vector公司）50μυ孔，並於室溫使其反應2小時。將 該培養盤用含0.05% Tween 20之pbs洗淨6次，添加ΤΜΒ —溶液（SureBlue Microwell TMB 過氧化酶受，質；urkegaard 319597 217 200823235 & Perry Laboratories，Inc.)50pL/孔後，於室溫進行顯色 1 分鐘，然後添加2N硫酸(和光純藥股份公司）50μυ孔，使 酵素反應停止。使用培養盤讀數器（SPECTRAmax 340PC ; Molecular Devices，Inc·)測定各孔之吸光度（450 nm)。藉由 下式計算出各生物素標識抗Nectin-2人類單株抗體對於各 個Nectin，2ED -Fc之1胺基酸置換體之反應性，並將結果 彙總於表19 〇 反應性（％野生型)=[吸光度（1胺基酸置換體吸光度 •(陰性對照）]/[吸光度（野生型）-吸光度（陰性對照）]χ100 屬於抗原決定部位群I之Necl-964-l對於Nectin-2ED -hFc之1胺基酸置換體之結合活性，就對於1184入、 K186A、T212A而言顯著較低，此暗示該抗體能識別含有 .·* I ' * lie184、Lys186、Thr122之抗原決定部位。另一方面，在屬於 抗原決定部位群VII之抗體群中，Necl-4116-8、Nec9-100 4·1、Nec9-1236-1、Nec9-1637-1 對於 Nectin -2ED-hFc 之 ⑩1胺基酸置換體之結合活性，就對於F173A而言，此暗示 該等抗體能識別含有Phe173之抗原決定部位。 218 319597 200823235 表19 純株名稱 Necl-964-l Nectin2-ED-Fc 100 Q165A 89 K170A 95 F173A 104 P177G 104 I184A 33 K186A 16 L197A 98 W202A 102 E206A 100 T212A 21 T235A 104 K239A 104 實施例18 抗原決定部位群之細分類 將實施例1及實施例8所製作之抗Nectin-2人類單株 抗體，如實施例4所示，分類成七個抗原決定部位群，藉 由下述之檢討再將此等群細分類。例如，若詳細調查在實 •施例中所進行之拮抗阻礙實驗之結果，屬於抗原決定部位 群IV之抗體中，有一群抗體亦顯示如同抗原決定部位群 VII之拮抗阻礙反應。此等抗體，被認定與抗原決定部位 群IV之抗體中未顯示如同抗原決定部位群VII之拮抗阻礙 反應者在數個所識別之抗原決定部位上不同，爲方便計， 將此等抗體稱為抗原決定部位群IVb，而將屬於抗原決定 部位群IV且未顙示如同抗原決定部位群VII之拮抗阻礙反 應之抗體群稱為抗原決定部位群IVa，如此細分成二亞群 (表20)。再·者，屬.於抗原決定部位群VI之抗體中，有抗 219 319597 200823235 體群顯示如同抗原決定部位群i之抗體群之拮抗阻礙反 應。此等抗體，被認定與抗原決定部位群VI之抗體中未 顯示如同抗原決定部位群I之拮抗阻礙反應者在數個所識 別之抗原決定部位上不同，爲方便計，將此等抗體稱為抗 原決定部位群Via。再者，將在實施例16中晨於抗原決定 部位群Vl·且未顯示如同抗原決定部位群I之拮抗阻礙反應 之抗體群分類成：對於A75G、P76G及N78A之結合力低 之抗體群以及對於A75G、P76G、N78A及N137A之結合 _力低之抗體群。其中，為方便計，將對於八750、？760及 N78A之結合力低之抗體群稱為抗原決定部位群VIb;將對 於A75G、P76G、N78A及N137A之結合力低之抗體群稱 為抗原決定部位群Vic(表20)。此暗示在實施例16中屬於 抗原決定部位群Via之抗體Neel-141-3，顯示對於任一胺 基酸置換體之結合力與對於野生型之結合力為約略同等， 且與抗原決定部位群VIb及抗原決定部位群Vic不同。再 赢者，發現在實施例17中，屬於抗原決定部位群VII之抗體 9 中有對於F173A之結合力低之抗體群。其中，爲方便計， 將見到對於F173A之結合力低之屬於抗原決定部位群VII 之抗體群稱為抗原決定部位群Vila，又爲方便計，將其以 外屬於抗原決定部位群VII之抗體群稱為抗原決定部位群 Vllb(表 20) 〇 220 319597 200823235 表20 名稱 抗原決定部 位群 Nee卜102-1 Via NecH05 -1 Via NecMll-3 m Ned -141 - 3 Via Ned -209- 3 Vic Neel-215-3 m Neel-23卜1 IVa Neel-244-3 Vie Neel-303-2 IVa Neel-313-1 Via Neel-326-7 Nb Ned -333-1 Nb Ned - 34H0 IVa Nee 1-445-4 IVa Nee 1-458-6 IVa Neel-470-2 IVa Nee 1-520-1 Vlb Ned - 522-2 Via Necl-530-1 Vlb Nee 1-538-3 Via Nee 1-554-1 m Neel-555-5 IVa Nee 1-726-1 IVa Mec1-759-9 Via Ned -765-1 Via Nee卜803-2 Vlb Nee 1-812-4 IVa Ned-83 卜4 IVa Neel-834-1 YIe Nee 1-835-1 IVa Neel-845-2 Ylb 名稱 抗原決定部 位群 Ned -903-1 Vlb Neel-948-3 Via NecW005-2 IVa Ned -1008-1 IVa Ned -1044-4 IVb Necl-1138-1 IVb Necl-1142-1 IVa Neel-1163-2 Via Necl-1218-7 IVb NecM236~l IVb Ned -1239- 2 IVa Necl-1302-2 IVa Nec2-1409-12 IVa Nec2-1613-3 m Nec2-1625-4 Nec3-1908-4 Via Nec5-532-1 IVa Nec6-940-7 r^a Nec8-4116-8 Vila Nec9-143~3 Vllb Nec9-136-1 Vllb Nec9-1004-1 Vila Nec9-1018-1 Vllb Nec9-1236-1 Vila Nec9-1502-2 Vic Nec9-1637-1 Vila NeclO-1666-1 Vlb Necl0-1707-3 Vlb NeclO-1861-1 Vic NeclO-2005-1 Vlb NeclO-2439-2 Vic 221 319597 200823235 實施例19 抗Nectin-2人類單株抗體之可變區域之鹼基序 列及胺基酸序列 將實施例1所製作之抗Nectin-2人類單株抗體 Necl-244-3、Necl-530-l、Necl-554-l、Necl-803-2、 Necl-834-1、Necl-845-2、Necl-903-1、Nec8-4116-8 之可 變區域之驗基序列、胺基酸序列藉由以下之方法決定。具 體而言，使用 SuperScriptlll Cells Direct cDNA 合成系統 (Invitrogen公司），將實施例1所建立之產生抗Nectin-2人 類單株抗體之融合瘤3至ΙΟχΙΟ5個懸浮於80μΙ^之PBS， 將其之1 μΣ於冰上加至裝有RNaseOUT 1 pL及再懸浮用缓 衝液ΙΟμΕ之PCR試管中，並於75°C加熱10分鐘。繼而 在冰上加入10 X DNase缓衝液1 ·6μΙ^及DNase 5pL，並於 室溫放置5分鐘後，將試管放回冰上，加入25mM EDTA 1·2μί並於70°C加熱5分鐘。接著，加入01igo(dT)2() 2pL 及10 mM dNTP混合物lpL並於7(TC加熱5分鐘後，於冰 鲁上放置2分鐘，加入5 X RT缓衝液6pL、Rnase OUT ΙμΣ、 SuperScriptlll RT IgL及 0·1 mM DTT IgL，並於 50〇C 反應 50分鐘，再於85QC反應5分鐘，以合成cDNA。 以各融合瘤所合成之上述DNA作為模板，於 Necl-244謹3、Necl-530-l、Necl-803-2、Necl-834-l、 Neel-845-2、Neel-903-1之Η鏈基因之情況，使用引子 176(序列編號：176)及引子177(序列編號：177)，於其L 鏈基因之情沉，使用引子178(序列編號：178)及引子179(序 列編號：179);於Nec8-4116-8之Η鏈基因之情況，使用 222 319597 200823235 引子177及引子178，於其L鏈基因之情況，使用引子 180(序列編號：180)及引子179 ;再者，於Necl-554-l之 Η鏈基因之情況，使用引子181(序列編號：181)及引子 177，於其L鏈基因之情況，使用引子182(序列編號：182) 及引子179，此等基因分別藉由PCR法擴增。在該反應中 反應液之組成包含：上述cDNA 4#L、KOD-Plus-(TOYOBO 公司）1U、引子各 0·3μΜ、dNTPs 200μΜ、MgS〇4 1 mM、 10 x PCR衝緩液（TOYOBO公司），液量合計50pL。PCR ®以下述方式加熱而進行·· 94°C · 2分鐘後，重複進行94°C · 15秒、60°C · 30秒、68t： · 1分鐘之循環30次，接著進 行68°C · 5分鐘加熱。Η鏈基因，以PCR終了後之反應液 bL作為模板，再度進行與上述同樣之PCR。該PCR產物 用PCR純化套組（QIAGEN公司）精製，溶出至EB緩衝液 75pL〇 DNA鹼基序列決定用之反應，係使用由上述PCR產 •物精製溶液 10pL、ABI PRISM BigDye Terminator ν3·1 循 環定序套組之循環定序混合物（Applied Biosystems公 司）8pL、引子183(序列編號：183)3.2 pmol所組成之容量 為20μΙ之溶液，進行96°C · 2分鐘後，重複進行96°C · 秒、50°C · 5秒、60t： · 4分鐘之循環25次。反應液之 精製，係使用 Sephadex G-75 Superfine(GE Healthcare 公司） 置換成蒸餾水30μΙ^而進行。將該反應生成物供給至DNA 序列解析裝置 ABI PRISM 3100(Applied Biosystems 公 司），依照該裝置所附之手冊決定DNA序列。該抗體之胺 223 319597 200823235 基酸序列依照一般方法從dna序列推定。 結果’明白Necl-244_3之Η鏈可變區域係編碼序列編 號· 187所示之胺基酸序列之驗基序列（序列編號：11)，
Necl-244-3之L鏈可變區域係編碼序列編號：195所示之 胺基酸序列之鹼基序列（序列編號：199) ; NeCl-530_l之Η 鏈可變區域係編碼序列編號：203所示之胺基酸序列之鹼 基序列（序列編號：207)，Neel-530-1之L鏈可變區域係編 碼序列編號：211所示之胺基酸序列之鹼基序列（序列編 修號· 215)，Neel-554-1之Η鏈可變區域係編碼序列編號： 219所示之胺基酸序列之鹼基序列（序列編號·· 223)，
Neel-554-1之L鏈可變區域係編碼序列編號：227所示之 胺基酸序列之鹼基序列（序列編號：231) ; Neel-803-2之Η 鏈可變區域係編碼序列編號：235所示之胺基酸序列之驗 基序列（序列編號：239) ; Nee 1-803-2之L鏈可變區域係編 碼序列編號：243所示之胺基酸序列之驗基序列（序列編 ⑩號· 247)，Neel-834-1之Η鏈可變區域係編碼序列編號·· 251所示之胺基酸序列之鹼基序列（序列編號：255)， Necl-834-l之L鏈可變區域係編碼序列編號·· 259所示之 胺基酸序列之鹼基序列（序列編號：263) ; Necl-845-2之Η 鏈可變區域係編碼序列編號：267所示之胺基酸序列之驗 基序列（序列編號：271) ; Nee 1-845-2之L鏈可變區域係編 碼序列編號：275所示之胺基酸序列之鹼基序列（序列編 號：279) ; Necl-903-l之Η鏈可變區域係編碼序列編號： 283所示之胺基酸序列之鹼基序列（序列編號：287); 319597 224 200823235
Neel-903-1之L鏈可變區域係編碼序列編號·· 291所示之 胺基酸序列之鹼基序列（序列編號：295) ; Nec8-4116-8之 H鏈可變區域係編碼序列編號：299所示之胺基酸序列之 驗基序列（序列編號：303) ; Nec8-4116-8之L鏈可變區域 係編碼序列編號：307所示之胺基酸序列之鹼基序列（序列 編號：311) 〇 人其中所得抗體之重鏈之CDR1至3(胺基酸序列）之組 5如表21所纪載。再者，該抗體之輕鏈之cdri至3 (胺 基駄序列)之組合如表22所記載。其中所得抗體之重鏈之 至3(貞双基序列）係編碼記載於表21之胺基酸序列之 列其之組合如表23所記載。再者，其中所得抗體 之輕鏈之CDR1至3(鹼基序列)係編碼記 之 酸序列之驗基序列’其之組合如表24所記載之版基 列及而言其中所得抗趙之可變區域之胺基酸序 歹j及基序列如表25所記載。 之胺=2:將此等抗體之各個之H鏈及l鏈可變區域 :及第：:：:於第1圖’以及將各個驗基序列示於第2 319597 225 200823235 表21 抗Nectin-2抗體重鏈之CDR序列（胺基酸序列） 純株編號 重鏈 CDR1 CDR2 CDR3 Neel-244-3 SYYWS (184) YIYYSGSTNHNPSLKS (185) DGGDDYNYGMDV (186) Neel-530-1 SYYWT (200) YVYYSGSTNYNPSLKS (201) DPGEDYYYGMDV (202) Nec1-554-1 SYNMN (216) S1SSSSSYIYYADSVKG (217) DYYGSGTYYLFDY (218) Nec1-803-2 SYYWT (232) YIYYSGSTNSNPSLKS (233) DPGEDYNYGMDV (234) Nec1-834-1 SYYWS (248) YIYYSGSTNYNPSLKS (249) DAGEDYSYGMDV (250) Nec1-845-2 SYYWT (264) YIYYSGSTNYNPSLKS (265) DPGEDYNYGMDV (266) Nec1-903-1 SYXWT (280) YIYYSGSTNYNPSLKS (281) DPGEDYNYGMDV (282) Nec8~4116-8 SYYWT (296) YIFYSGSTNYNPSLKS (297) GIAGMDV (298) 序列後之括弧内之數字表示序列編號〇
表22 抗Nectin-2抗體輕鏈之CDR序列（胺基酸序列） 純株編號 輕鏈 CDR1 CDR2 CDR3 Ned-244-3 RASQGISSXLA(192) DASSLXS (193) QQXNSYPXT(194) Nec1-530-1 RASQGISSXLA (208) DASSLES (209) QQFNSYPRT (210) Nec1-554-1 RASQSIGSSLH (224) YASQSFS (225) HQSRSLPIT (226) Nec1~803~2 RASQGISSALA (240) DASSLES (241) QQFNSYPRT (242) Nec1-834-1 RASQGISSALA (256) DASSLES (257) QQFNSYRT (258) Nec1—845-2 RASQGISSALA (272) DASSLES (273) QQFNSYPRT (274) Nec1-903-1 RASQGISSALA (288) DASSLES (289) QQFNSYPRT (290) Nec8-4116~8 RASQSIGSSLH (304) YASQSFS (305) HQSRSLPIT (306) 序列後之括弧内之數字表示序列編號。 226 319597 200823235 表23 抗Nectin-2抗體重鏈之CDR序列（鹼基序列） 純株編號 重鏈 CDR1 CDR2 CDR3 Ned-244-3 AGTTACTACTGGAGC (188) TATATCTATTACAGTGG GAGCACCAACCACAAC CCCTCCCTCAAGAGT (189) GATGGTGGGGACGAC TACAACTACGGTATG GACGTC (190) Nec1-530-1 AGTTACTACTGGAGC (204) TATGTCTATTACAGTGG GAGCACCAACTACAACC CCTCCCTCAAGAGT (205) GACCCTGGGGAAGAC TACTACTACGGTATG GACGTC (206) Nec1~554- 1 AGCTATAACATGAAC (220) TCCATTAGTAGTAGTAG TAGTTACATATACTACG CAGACTCAGTGAAGGGC (221) GATTACTATGGTTCG GGGACTTATTATCTC TTTGACTAC (222) Ned-803-2 AGTTACTACTGGAGC (236) TATATCTATTACAGTGG GAGCACCAACTCCAAG CCCTCCCTCAAGAGT (237) GACCCTGGGGAAGAC TACAACTACGGTATG GACGTC (238) Ned-834-1 AGTTACTACTGGAGC (252) TATATCTATTACAGTGG GAGCACCAACTACAACC CCTCCCTCAAGAGT (253) GATGCTGGGGAGGAC TACTCCTACGGTATG GACGTC (254) Nec1-845-2 AGTTACTACTGGACC (268) TATATCTATTACAGTGG GAGCACCAACTACAACC CCTCCCTCAAGAGT (269) GACCCTGGGGAAGAC TACAACTACGGTATG GACGTC (270) Nec1-903-1 AGTTACWACTGGACC (284) TATATCTATTACAGTGG GAGCACCAACTACAACC CCTCCCTCAAGAGT (285) GACCCTGGGGAAGAC TACAACTACGGTATG GACGTC (286) Nec8_ 4116-8 AGTTACTATTGGACC (300) TATATCTTTTACAGTGG GAGCACCAACTACAACC CCTCCCTCAAGAGT (301) GGTATAGCAGGTATG GACGTC (302) 序列後之括弧内之數字表示序列編號。 319597 227 200823235 表24 抗Nectin-2抗體輕鍵之CDR序列（驗基序列） 純株編號 輕鏈 CDR1 CDR2 CDR3 Ned ~244- 3 CGGGCRAGTCAGGGCAT TAGCAGYGSKTTAGCC (196) GATGCMTCCAGTTTG SAAAGT (197) CAACAGTWTAATAGT TACCCTYGGACG (198) Nec1-530- 1 CGGGCAAGTCAGGGCAT TAGCAGTGSTTTAGCC (212) GATGCCTCCAGTTTG GAAAGT (213) CAACAGTTTAATAGTT ACCCTCGGACG (214) Nec1-554-1 CGGGCCAGTCAGAGCAT TGGTAGTAGCTTACAC (228) TATGCTTCCCAGTCC TTCTCA (229) CATCAGAGTAGGAGT TTACCGATCACC (230) Nec1-803-2 CGGGCAAGTCAGGGCAT TAGCAGTGCTTTAGCC (244) GATGCCTCCAGTTTG GAAAG (245) CAACAGTTTAATAGTT ACCCTCGGACG (246) Nec1-834- 1 CGGGCAAGTCAGGGCAT TAGCAGTGCTTTAGCC (260) GATGCCTCCAGTTTG GAAAGT (261) CAACAGTTTAATAGTT ACCGGACG (262) Ned-845-2 CGGGCRAGTCAGGGYAT TAGCAGYGCTTTAGCC (276) GATGCCTCCAGTTTG GAAAGT (277) CAACAGTTTAATAGTT ACCCTCGGACG (278) Nec1~903"· 1 CGGGCAAGTCAGGGCAT TAGCAGTGCTTTAGCC (292) GATGCCTCCAGTTTG GAAAGT (293) CAACAGTTTAATAGTT ACCCTCGGACG (294) Nec8~ 4116-8 AGGGCCAGTCAGAGTGT TAGCAGCAGCTACTTAG CC (308) GGTGCATCCAGCAGG GCCACT (309) CAGCAGTATGGTAGC TCACCGTACACT (310) 序列後之括弧内之數字表示序列編號 228 319597 200823235 表25 抗Nectin-2抗體可變區域之鹼基序列及胺基酸序歹4 純株編號 驗基序列 胺基酉 重鏈 輕鏈 重鏈 Neel-244-3 序列編號191 序列編號199 序列編號187 Necl530-1 序列編號207 序列編號215 序列編號203 序列 Necl554-1 序列編號223 序列編號231 序列編號219 序列編號227 Necl-803-2 序列編號239 序列編號247 序列編號235 序列編號243 Necl834_l 序列編7虎25 5 序列編號263 序列編號251 序列編號259 Neel 845-2 序列編號271 序列編號279 序列編3虎2 6 7 序列編號275 Necl903-1 序列編號287 序列編號295 序列編號283 序列編號291 Necl4116-8 序列編號303 序列編號311 序列編號299 丨編5虎3〇7 針對含有與序列編號：1或序列編號：3所示之胺基酸 序列同一或實質同一之胺基酸序列之蛋白質或其部分狀或 其鹽之單株抗體可安全地使用作為癌（例如大腸癌、乳癌、 肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝臟癌、膽道癌脾臟 癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、 胰臟癌、腦腫瘤、血癌等）之預防及治療劑（較隹為乳癌、 肺癌、大腸癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌等之預防及治 _療劑）、癌細胞之凋亡促進劑、癌細胞之增殖阻礙劑、癌細 胞之細胞週期變化之誘發劑、效應細胞依存性之癌細胞阻 礙劑等。 參考例36抗Nectin-2人類單株抗體之製作 (i) 編碼於參考例16所調製之Nectin-25之細胞外區 域（Met^Gly361)與人類IgGl抗體Fc區域 (Pro217-Lys447)之融合蛋白質之動物細胞表現載 體，於人類.293細胞株（Invitrogen公司）瞬時地表 319597 229 200823235 現所調製重組Nectin-2ED-hFc融合蛋白質 (1.6mg/mL PBS 溶液），或者 (ii)編碼Nectin-25之細胞外區域（Met^Gly361)與 FLAG Tag(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)i 融合蛋白質之動物細胞表現載體，於人類293細 胞株（Invitrogen公司）瞬時地表現於參考例13所 調製之Nectin-2ED-hFc融合蛋白質（2mg/mL PBS 溶液） # 與弗氏完全佐劑（Difco公司）等容量混合而調製乳化 物。 該等乳化物於KM小鼠（10週齡、20週齡、雄性；KIRIN BEER公司）各5隻的皮下與皮内分別注射10至50pg/隻的 初次免疫。第 2次以後，同樣地以等量混合重組 Nectin-2ED-hFc融合蛋白質或重組Nectin-2ED-FLAG融合 蛋白質，與弗氏不完全佐劑（Difco公司）等量混合而調製的 春乳化物，以每2星期一次追加免疫。再者，安定表現 Nectin_2(5 之重組 FM3A 細胞株（#60-6)(參照 PCT/JP2006/ 320429)或安定表現Nectin_23之重組NSO細胞株（#2·75)， 於燒瓶培養，將其回收藉由洗淨操作去除血清成分後，以 絲裂黴素C(Mitomycin C)(和光純藥公司）於37°C處理30分 鐘。經絲裂黴素C處理之兩細胞株以10mL的PBS洗淨3 次後，以成為2χ107個/mL的方式再懸浮於PBS，將其於 KM小鼠（KIRIN BEER公司；10週齡至12週齡，雄性）各5 隻的腹腔内以lxl〇7個/500pL，以每1星期，次重複免疫。 230 319597 200823235 進一步地，上述重組Nectin-2ED-hFc蛋白質或重組 Nectin-2ED-FLAG蛋白質，與弗氏完全佐劑等容量混合所 調製之乳化物，於KM小鼠（12週齡、雄性）各5隻的皮下 與皮内分別注射10至5Opg/隻的初次免疫。初次免疫的1 週期間後，藉由上述方法之經絲裂黴素C處理之Nectin_23 表現重組FM3A細胞株以ΙχΙΟ7個/500μΕ於各者之腹腔内 免疫。第3次為重組Nectin-2ED-hFc蛋白質或重組 Nectin-2ED-FLAG蛋白質，與弗氏不完全佐劑等容量混合 鲁所調製之乳化物，分別於皮下與皮内，同時經絲裂黴素c 處理之Nectin-23表現重組FM3A細胞株（#60-6)以1χ1〇7 個/500μί於每1星期一次於各者之腹腔内免疫。第4次以 後為僅以藉由上述方法之經絲裂彳綠素C處理之Nectin-23 表現重組FM3A細胞株（#60-6)以IxlO7個/500μί於各者之 腹腔内免疫。 免疫開始前及免疫後的全部小鼠於醚麻醉下，眼底採 •血取得抗血清，根據以下所述之流式細胞測定法（flow cytometry)研究血清抗體價。亦即，安定表現Nectin-25之 重組 CHO 細胞株（#43-2)(參照 PCT/JP2006/320429)與 mock-CHO細胞株的細胞懸浮液(PBS)分別以各者5χ105個 分注於聚丙烯管，藉由離心分離（l，200rpm X 5分鐘）去除 PBS。該細胞殘渣，各以經含有i%BSA^10%FBSiPBS 稀釋，100倍之小鼠抗血清50pL再懸浮，於冰上暗處反應 30分鐘。於該細胞懸浮液中添加200>L PBS而離心分離 • (l,，200rpm><5分鐘）後，吸引去除上清液，細胞殘该以經含 231 319597 200823235 有 1%BSA 與 10%FBS 之 PBS 稀釋 100 倍之 anti-human IgG(H+L)Alex 488(Invitrogen 公司）溶液 50pL 再懸浮，於 冰上暗處反應30分鐘。該細胞懸浮液以同樣地PBS洗淨3 次後，細胞殘渣再懸浮於PBS 200μ!^，使用流式細胞儀 MPL500(ECKMAN COULTER公司）測定各細胞之螢光強 度，以橫軸為螢光強度、縱軸為細胞數作成圖形比較A清 抗體價。 以上述方法充分地確認血清抗體價上升之KM小鼠 中，經重組 Nectin-2ED-hFc 或重組 Nectin-2ED-FLAG 免疫 之個體為尾靜脈注射該等蛋白質抗原，或經安定表現 Nectin-25之重組細胞株免疫之個體為腹腔内注射相同細 ，胞株。該等最終免疫3日後，將該小鼠放血致死而摘取脾 臟，所獲得小鼠脾臟細胞，與對預先含有10%FBS之Daigo T 培養基(F-12 Nutrient Mixture(HAM)(Invitrogen 公司）與 Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(Invitrogen 公司）之 •等量混合培養基中，添加MEM Non-Essential Amino Acid Solution(Invitroge,n 公司）、丙酮酸納（Invitrogen 公司）及 L-麩胺醯胺（Invitrogen公司）者)500mL溶解有8-氮雜鳥嘌吟 (HybriMax，Sigma-Aldrich公司）1管之培養基慣化培養之 小鼠骨髓瘤細胞P3X63Ag8U.l(P3Ul)(ATCC)，以5 : 1的 比例混合，使用聚乙二醇（PEG)l，500(Roche Diagnotics公 司）融合。融合細胞操作根據試劑所附之操作手冊進行。融 合後的細胞再懸浮於含有10%FBS與10% BM Condimed Hl (Roclie Diagtiotics公司）之Daigo T培養基中，以脾臟細 232 319597 200823235 胞5χ104個/ 100μΙ7孔接種於96孔培養盤。該培養盤於50/〇 二氧化碳氣流中，於37°c培養1日後，以ι〇〇μΐ>/孔添加含 有O.lmM次黃嘌呤、〇.4μΜ胺基嗓呤、0.016mM胸喷咬 (HAT)、10% BM Condimed Ή1 與 10%FBS 之 Daigo T 培養 基（HAT選擇培養基），進一步地每3曰2次以新鮮的ΗΑΊΓ 選擇培養基交換培養上清液的3/4之條件下，於5%二氧化 碳氣流中，於37t：繼續培養。 培養經過第7日至第14日使用Cell ELISA篩選安定 表現Nectin_23之重組CHO細胞株（#43-2)或mock-CHO細 胞株之見到純株增殖的孔的培養上清液，建立產生抗 Nectin-2人類單株抗體之融合瘤。亦即，安定表現Nectin-25 之重組CHO細胞株（#43-2)或mock-CHO細胞株，使用含 有10%透析FBS及GS supplement之GS選擇DMEM培養 基（Dulbeceo’s Modified Eagle Medium; Invitrogen 公司）於 96孔組織培養盤培養。各細胞株達匯合(confluent)後吸引 馨去除培養上清液，以200μΙ^/各孔添加含有2%FBS之 I>BS(+)，於冰上暗處培養1小時。吸引去除各孔之上清液 後，以50μΕ/各孔添加融合瘤培養上清液，於冰上暗處反 應2小時，該盤以於4°C冷卻之PBS(+)洗淨1次後，以 lOOpL/各孔添加經以含有2%FBS之PBS(+)稀釋3,000倍之 anti-human IgG(H+L)chain specific(GOAT)peroxidase conjugate(CALBIOCHEM公司)，於冰上暗處反應2小時。 該盤以於4°C冷卻之PBS(+)洗淨3次後，以100pL/各孔添 加 3,3’，5,5’-四曱基’聯苯胺（TMB)溶液（SureBlue Microweil 233 319597 200823235 TMB peroxidease substrate; Kirkegaard & Perry Laboratories公司），於室溫發色5分鐘，以100pL/各孔添 加2N硫酸（和光純藥公司）停止酵素反應。使用盤讀數儀 (plate reader)(Multiskan BICHROMATIC; Thermo Electron 公司）測定各孔之吸光度（450nm)，接種表現Nectin-23之重 組CHO細胞株之盤吸光度為〇.5以上，且接種mock-CHO 細胞株之盤吸光度未達0.3者判定為陽性者。由該等之中 選擇特別是抗原特異性與親和性高的IgG抗體產生融合 _瘤，再懸浮於含有10%FBS與10%BMCondimedHl之 Daigo T培養基。該等細胞株以0.5個/孔接種於96孔組織 培養盤，藉由顯微鏡觀察卻認有單株細胞株之融合瘤之培 養上清液，、使用上述Cell ELISA再度選殖，建立258種類 之抗Nectin-2人類單株抗體產生融合瘤純株。 所製得之抗Nectin-2人類單株抗體產生融合瘤於含有 lOOmL 之 10%FBS Ultra low IgG(Invitrogen 公司）之 Daigo • T培養基中以燒瓶培養，離心分離（1，200卬111\ 5分鐘）培養 上清液取得其上清液。於該等培養上清液中添加經以PBS 平衡之 Protein A Sepharose FF 200pL(GE Healtiicare Bio-science公司），於4°C整夜缓慢振盪吸附抗體。藉由离隹 心分離操作回收該Prtotein A，以PBS洗淨後，以含有0.3M NaCl 之 0·1Μ 甘胺酸-HCl(pH3.0)1.2mL 溶出 IgG 部份。於 該溶出液添加1M Tris-HCl(pH8.0)快速中和後，使用超過 率膜（Vivaspin 6:分子量劃分10kDa)(Sartorius公司）藉由超 濃縮操作與PBS緩翁液交換，其作為活體外性狀解析所使 234 319597 200823235 用之抗Nectin-2人類單株抗體標準品。 由抗體產生融合瘤純株中，獲得產生本發明所使用抗 體之融合瘤純株之 Necl-803-2(FERM BP-10417)、 Necl-244_3(FERM BP-10423) ^ Necl-530-l(FERM BP-10424) ^ Necl-903-l(FERM BP-10425) > Necl-520-1 (FERM BP-10426)、Necl-845-2(FERM BP-10427)、Necl-834-1 (FERM BP-10428) ^ Necl-964-l(FERM BP- 10683) > Necl-1302-2(FERM BP-10684)、Necl-554-l(FERM BP-10681)、 • Necl:769-2(FERM BP-10682) - Nec8-4116-8(FERM BP-10685)、Necl-1044-4、Nec8-3517-ll 或 Nec8-3704-7。 參考例37與本發明所使用抗體針對Nectin-2為競爭性結 合之抗體的選擇 與參考例36所製作之本發明所使用抗體針對Nectin-2 為競爭性結合之單株抗體，係藉由下述方法選擇。 首先，為了進行抗Nectin-2人類單株抗體彼此之針對 _ Nectin-2競爭性結合阻礙反應，於參考例36所取得之抗 Nectin-2人類單株抗體以生物素標識作為受驗抗體。亦 即，將抗Nectin-2人類單株抗體10>g添加於生物素標記 套組-NHJDojindo公司）所附之WS緩衝液50pL，使用 Microcon YM50(MILLIPORE公司）進行超濃縮至溶液量幾 乎為零為止。在該殘留液中依次添加生物素標記套組-NH2 所附之反應緩衝液50μΕ及溶解於50pL之DMSO之NH2 反應性生物素4pL，並於37°C反應10分鐘。將該反應混 合物再次藉由超濃縮操作將緩衝液置換成WS,緩衝液，得 319597 235 200823235 到以生物素標識之抗Nectin-2人類單株抗體，將其使用於 下所示之檢定（assay)中。 於參考例36所製作之本發明所使用抗體（未標識抗 Nectin-2單株抗體）經以含有2%FBS之PBS稀釋為 25pg/mL之溶液5pL、懸浮於含有2%FBS之PBS之
Nectin-25安定表現CHO細胞株（#43-2)之懸浮液（2χ105個 /mL)l 5μ[、以及鍵抗生物素蛋白（streptavidin)-Alexa Fluor 647結合物（11^出0§印公司）5从!^添加至？]^[八1：培養盤（384 φ 孔培養盤，黑色透明底，加蓋；Applied Biosystems公司）， 混合後於室溫反應10分鐘。在該培養盤中添加以上述方法 製作之生物素標識抗Nectin-2人類單株抗體（受驗抗體）經 以含有2%FBS之PBS稀釋為〇.5pg/mL之溶液5pL，於室 溫培養60分鐘。作為對照實驗，替代未標識抗Nectin-2 單株抗體溶液，設置添加有同容量之含有2%FBS之PBS 之孔。經生物素標識所提供之受驗抗體與本發明所使用抗 參體之全體組合而進行針對該Nectin-2競爭性結合阻礙反 應。各孔的螢光強度（FL1總值）使用Applied Biosystems 8200 Cellular Detection 系統(Applied Biosystem 公司）測 定。抗Nectin-2人類單株抗體之各組合中競爭性結合組礙 率使用下所示公式算出。 競爭性結合組礙率=(1-Α/Β)χ 100 A:於受驗抗體中’添加未標識抗體之孔的jpl 1總值 B ·於受驗抗體中’不添加未標識抗體之孔的fl 1總值 •… 根據本方法，例如，由參考例.，36所製作之抗Nectin»2 236 319597 200823235 人類單株抗體中，選擇性地取得例如Necl-1044-4與 Necl-1302-2作為針對Nectin-2為競爭性結合之抗體。再 者，選擇性地取得Nec8-3704-7與Nec8-3517-l l作為針對 Nectin-2為競爭性結合之抗體。 表26顯示藉由抗Nectin-2人類單株抗體生物素標識 之Nec8-4116-8與Nectin-2的結合組礙率，再者，表27顯 示藉由杭Nectin-2人類單株抗體生物素標識之Necl-554-l 與Nectin-2的結合組礙率。 ® 又，由此所選擇之與本發明所使用抗體針對Nectin-2 為競爭性結合之抗體Necl-1044-4與Necl-1302-2、 Nec8-3704-7 與 Nec8-3517-ll 分別寄存。 表26
Biotin標識抗體 未標識抗體 阻礙率（％) Nec8-4116_8 Nec8-3517-ll 91 Nec8-4116-8 Nec8-3704-7 98 Nec8-4116-8 Nec8-4116-8 98 Nec8-4116-8 Neel-244-3 0 Nec8-4116-8 Necl-845-2 22 Nec8-4116_8 Necl-520-1 48 Nec8-4116_8 Neel-769-2 0 表27
Biotin標識抗體 未標識抗體 阻礙率（％) Necl-544-1 Necl-544-ί 87 Necl-544-1 Necl-1044-4 92 Necl-544-1 Necl-1302-2 82 Necl-544-1 Necl-244-3 0 Necl-544-1 Necl-845-2 0 Necl-544-1 Necl-520-1 41 Necl-544-1 Necl-769-2 0 237 319597 200823235 參考例38重組抗Nectin-2人類單株抗體（Nec8-4116_8)之 大量調製 重組抗Nectin-2人類單株抗體（Nec8-4116-8)將其抗體 基因藉由於CHOK1SV細胞株（LonZa Biologies)中安定表 現而調製。由產生抗Nectin-2人類單株抗體之融合瘤 Nec8-4116-8之培養上清液，使用蛋白質A管柱所精製之 抗體標準品之Η鏈與L鏈於還原條件下，進行SDS -聚丙 烯醯胺電泳分離，Η鏈及L鏈之蛋白質轉印於PVDF膜。 鲁Η鏈多數為Ν末端經焦麩胺醯基化，使用 Pfu Pyroglutamate Aminopeptidase(TaKaRa Bio 公司）進行焦麵 胺酸去除反應。轉印於PVDF膜之蛋白質的N末端脸基酸 序列使用蛋白質定序儀（ABI)決定。由此所得之N末端胺 基酸序列（H鏈（序列編號：312)、L鏈(序列編號：3 13))使用 V B A SE(http://vbase. mrc-cpe.cam.ac.uk) 進行類似性 (homology)檢索，選擇編碼與上述胺基酸序列吻合之生殖
籲系列（VH4、VKIIIA27)所預測之信號序列的N末端之鹼基 序列（H鏈（序列編號:314)、L鏈（序列編號:315))。合成於 該等信號序列附加有限制酵素Hind III位置與Kozak序列 之寡DNA作為前置引子（forward primer)(H鏈（序列編號： 176)、L鏈（序列編號：180))。另一方面，分別合成於抗體 Η鏈與L鏈基因的終止碼（stop codon)的下游附加有限制酵 素EcoRI位置之寡DNA(H鏈（序列編號：316)、L鏈（序列 編號：317))作為反置引子（reverse primer)。由融合瘤細胞 (Nec8-4116-8)使用 SuperScriptlll Cells Direct cDNA 238 319597 200823235
Synthesis System(Invitrogen 公司）所調製之 CDNA 作為模 板，使用上述引子進行PCR分別取得Nec8_4116-8抗體之 Η鏈及L鏈之全長基因。 由此所取付之Η鍵基因與L·鍵基因分別以限制酵素 Hind III與EcoR I分解後，其精製片段分別插入含有動物 表現載體pEE6.4(Lonza Biologies公司)及楚胺醯胺合成酵 素（GS)基因之動物表現截體pEE 12^(Lonza Biologies公司） 之Hind ΠΙ-EcoR I位置’構築Η鏈表現载體與l鏈表現載 ®體。進一步地，藉由限制酵素Not I/Sal I分解由各載體切 出而單離Η鍵插入片段與L鍵插入片段後，使其接合 (ligate)，構築同時含亦GS基因、Η鏈基因、l鏈基因之 雙基因載體。該載體根據Lonza Biologies公司之操作手 冊，轉染至CHOK1SV細胞，於含甲硫胺酸磺醯亞胺 (Methionine Sulphoximine(MSX))之培養基中，選擇培養於 96孔組織培養盤。使用ELISA定量單一純株有增瘦的孔 _之培養上清液中人類抗體濃度，選擇22種類之安定地高表 現Nec8-4116-8之重組細胞株。擴大培養該等細胞株後， 於無血清培養基中浮游慣化，建立細胞增殖性與抗體生產 性皆高之Nec8-4116_8安定表現CHOK1SV細胞株（純株25 至 78) 〇 上述CHOK1SV細胞株於含有2.5μΜ甲硫胺酸磺醯亞 胺（MP Biomedicals 公司）及 GS supplement(5〇x，SAFC 公 司）之ProCH05培養基（Cambrex公司）中，於37。(：、5%二 氧化碳氣流中擴大培養後，使用2L之發酵槽（jar 239 319597 200823235 fermentor)，攪拌培養32曰（37t：，溶存氧濃度2mg/L，pH6.7 至7·0，攪拌迴轉數80 rpm)，通氣100至300mL/min)。該 期間中，根據培養基之成份分析而添加葡萄糖溶液、L-麩 胺酸溶液、GS supplement(5〇x，SAFC 公司）、Amino Acids(5〇x，SAFC 公司）' Trace Elements(10,00〇x，SAFC 公司）、Vitamins(10〇x，SAFC 公司）及 Soy Hydrolysate (5〇χ，SAFC公司）。以細胞升存率約降低至10%之時點結 束主培養。 馨 其次離心分離（7,46〇xg，20分鐘）該培養上清液回收上 清液，使用超過濾膜（Hydrosart膜，分子量劃分10,000 ; Sartorius公司）將其濃縮，以含有0.15M NaCl之20mM石粦 酸缓衝液（ρΗ7·0)置換。離心分離（14,30〇xg，20分鐘）該濃 縮液取得上清液，進一步將其過濾（StericupHV，0.45μπι; Millipore公司）取得濃縮液。將其吸附於經含有0.15Μ NaCl 之20mM填酸緩衝液(ρΗ7·0)平衡化之Protein A Sepharose 馨管柱（22 mmID><79mm，GE Healthcare 公司），以20倍管柱 容量之相同緩衝液洗淨管柱後，藉由0.1M檸檬酸鈉緩衝液 (ρΗ3·0)溶出結合於管柱之抗體分液。於該溶出液立即加入 1/10容量之1Μ Tris-HCl緩衝液(pH 9.0)中和後，該抗體溶 液使用超過濾（AmiconUltra，分子量劃分30,000 ; Millipore 公司）濃縮。將其提供至以PBS平衡化之Superdex 200管柱 (26mmIDx60cm，GEHealthcare公司），以相同緩衝液溶出獲 得抗體單體分液。進一步地將該抗體分液提供至以PBS平 衡化之 ActiClean EtOX 管柱.(25mmID><59mm，Sterogene 公 240 319597 200823235 司）去除内毒素，使用超過濾（AmiconUltra，分子量劃分 10,000 ; Millipore 公司）濃縮，無菌過濾（MillexGV，〇·22μπι ; Millipore公司）獲得重組Nec8-4116-8精製標準品。由此所 得之精製抗體以使用SDS-PAGE及Superdex 200管柱之凝 膠過濾HPLC顯示95%以上的純度。再者，抗體標準品的内 毒素含,量使用EmX)SPECY®_ES-24S set(生化學工業公司） 與TOXICOLOR® DIA set(生化學工業公司）分析，為 0.1EU/mg抗體以下。 •參考例39抗Nectin-2人類單株抗體（Necl-554-l)之大量調 製 抗Nectin-2人類單株抗體Necl-554-l係由產生該抗體 之融合瘤細胞株（Necl-554-l)藉由以下的方法調製。融合 瘤細胞株Necl-554_1以含有10%FBS之IH培養基（Iscove，s Modified Dulbecco’s Medium: Ham’s F_12=1:1，O.lmM MEM非必需胺基酸溶液，ImM丙酮酸納溶液，2mM L- •麩胺醯胺溶液；Invitrogen公司），於37DC、. 5%二氧化碳氣 流中擴大培養後，於1次慣化培養基（IH培養基：CD Hybridoma Medium，8mM L·麩胺醯胺溶液= 1:1，Invitrogen 公司）擴大培養1日，進一步使用5L攪拌培養槽於主培養 培養基（IH 培養基：CD Hybridoma Medium，8mM L-麩胺 醢胺溶液= 1:3，Invitrogen公司）擴大培養5至7日（37°C， 溶存氧濃度2mg/L，pH 7·0，授拌迴轉數40 rpm)。於該斯 間中，根據培養基的成分分析而添加葡萄糖溶液以及L-麩胺醯胺溶液·。以細胞升存.率約降教至50%之時點結束主 241 319597 200823235 培養。 其次離心分離（7,46〇xg，20分鐘）該培養上清液回收上 清液，使用超過濾膜（Hydrosart膜，分子量劃分1〇,〇〇〇 ; Sartorius公司）將其濃縮，以含有0·15Μ NaCl之20mM璃 酸緩衝液(ρΗ7·0)置·換。離心分離（14,30〇xg，20分鐘）該濃 縮液取得上清液，進一步更精密過濾（StericupHV，0·45μιη; Millipore公司）取得濃縮液。將其吸附於經含有〇.15]\4 NaCl之20mM磷:酸缓衝液（ρΗ7·0)平衡化之Protein A • Sepharose 管柱（22 mmIDx79nim，GE Healthcare 公司），以 20倍管柱容量之相同緩衝液洗淨管柱後，藉由〇·ιμ檸檬 酸鈉緩衝液（ρΗ3·0)溶出結合於管柱之抗體分液。於該溶出 液立即加入1/10容量之1Μ Tris-HCl緩衝液（pH 9.0)中和。 如此所製得之精製抗體分液例外地分為活性抗體與不 活性抗體之混合物。因此’該抗體分液進一步地以2〇mM 乙酸納緩衝液（ρΗ5·0)稀釋3倍，使其吸附於以含1〇〇 mM _ NaCl之20 mM乙酸鈉缓衝液（pH 5·0)平衡化之SP-5PW陽 離子交換管柱（21.5 mm ID X 150 mm，東曹公司）。將該管 柱用約2倍管柱容量之相同缓衝液洗淨後，藉由以7〇分鐘 之時間使溶離液之NaCl濃度從100 mM上升至300 〇1]\4之 直線濃度梯度溶出法，分離為3個溶出分液。該等溶出分 液針對 Nectin-2之結合活性使用固相化重組 Nectin-2-ED-Fc蛋白質以£1^人測定，回收最高比活性之 抗體分液（SP3^ 4抗Nectin-2抗體分液。將如此得到之抗 體 >谷出液用超過濾膜（Amicon Ultra 5分子量劃分界線： 242 319597 200823235 30,000 ; Millipore公司）濃縮，供給至用FBS平衡化之 Superdex 200 管柱（26 mm ID X 60 cm，GE Healthcare 公 司）中，用相同緩衝液溶出，得到抗體單體部分。將其供給 至用 PBS 平衡化之 ActiClean EtOX 管柱（25 mm IDx59 mm，Sterogen · Biosciences公司），除去内毒素後，用超 過濾膜（Amicon Ultra，分子量劃分界線：1 〇,〇〇〇; Millipore 公司）濃縮，再進行無菌過濾（Millex GV，0.22 μπι; Millipore 公司），得到精製抗體。將該精製抗體命名為Necl-554-1 • SP3。 如此得到之精製抗體，使用SDS-PAGE及Superdex 200管柱之凝膠過濾HPLC，顯示95%以上之純度。再者， 使用 ENDOSPECY®_ES-24S set(生化學工業公司）及 TaXICOLOR®DIA set(生化學工業公司）分析抗體標準品之 内毒素含量，其任一者皆在0.1 EU/mg抗體以下。 實施例20抗Nectin-2人類罩株抗體之針對乳癌細胞株之
• ADCC 測定於參考例36及參考例37所製作之抗Nectin-2人 類單株抗體 Necl-554-l、Necl-1044-4、Necl-1302-2、 Nec8-4116-8、Nec8-3517-ll、Nec8-3704-7 之 ADCC。使用
根據實施例22揭示之方法所培養之人類乳癌細胞株 MDA-MB-23KATCC)作為標乾細胞，在效應（effector)細胞方 面，使用將市售之凍結人類末梢血單核球（ALLCELLS公司） 在含有10 nM重組型人類il-2(DIACLONE Research公 司）、…55μΜ 2-鲼基乙醇（Invhrogen 公司）及 10% ‘FBS(JRH 243 319597 200823235 公司）之RPMI 1640培養基（Invitrogen公司）中培養一夜 者。分別地，Necl-1044-4、Necl-1302-2、Nec8-4116-8、 Nec8-3517-ll、Nec8-3704-7使用參考例36揭示之抗體標 準品，Necl-554-l使用參考例39揭示之抗體標準品 (Necl-554-1 SP3) 〇 回收對數增殖期之人類乳癌細胞株MDA-MB-231，藉 由對於 1 X 106 個細胞添加 250pCi Na251Cr〇4(GE Healthcare 公司），並於37T：培養1小時而進行51Cr標識。將此等細 •胞用10%FBS/RPMI 1640培養基洗淨4次後，以ΙχΙΟ5個 /mL再懸浮於10%FBS/RPMI培養基中。ADCC，係將細胞 懸浮液50/zL(5xl03個細胞）及上述抗體用10%FBS / RPMI 培養基稀釋成終濃度為 0.0015 # g/mL、 0.015/z g/mL、0.15/zg/mL 及 1.5/zg/mL 之溶液，將該等 溶液25//L添加至96孔RMC培養盤（BIOBIK公司）之各 孔中。添加相同量之作為陰性對照組之非免疫人類IgG(最 鲁終濃度 〇.〇〇15/zg/mL、0.015/zg/mL、0.15/zg/mL 及 1.5//g/mL)或用於未添加抗體（No Ab)時檢出非特異性活 性之D-PBS (Invitrogen公司）。將此等培養盤在冰上培養1 小時後，加入上述效應細胞（effector cells)懸浮液2.5><105 個/孔（效應細胞：標靶細胞=50 : 1)，在5%二氧化碳氣流 中，於37°C反應4小時。各孔從細胞内漏出至此等培養上 清液中之放射活性（樣品釋出活性，sample release)使用閃 爍計數器（Scintillation Counter)(TopCount NXT)測定。亦 即，反應後之細胞懸浮液移至Muhi-screer]r0.45 /z.、，m過濾 244 319597 200823235 盤（Millipore公司），離心分離（l，200rpm，10分鐘）該盤回 收培養上清液。該培養上清液5 0 // L，加至每孔添加有15 0 /z L 之 Microscint 40(PerkinElmer 公司）之 96 孔盤（Costar 公司），於室溫混合30分鐘。使用閃爍技術器測定各孔的 螢光（表33)。ADCC之最大傷害活性（最大釋出活性， maximum release)，係在加入 Triton-X 100(Sigma 公司）並 使其最終濃度成為1°/❹時之放射活性；再者，自然釋出活 性（spontaneous release) ’ 係在力口入含 1 〇%FBS 之 RPMI 1640 _培養基以代替效應細胞時之放射活性。成為ADCC強度之 指標之特異性溶裂（specif lySiS)(%)係用下式計算出：（[樣 品釋出活性H自然釋出活性Μ[最大釋出活性]_[自然釋出 活性])χ100〇 319597 245 200823235 表33 抗體 抗體（// g/ml) 特異性溶裂（％) 非免疫IgG 0.0015 7 0.015 9 0.15 8 1.5 7 No Ab 6 Necl-554-1 0.0015 8 0.015 11 0.15 16 1.5 16 Necl-1044-4 0.0015 10 0.015 9 0.15 9 1.5 14 Necl-1302-2 0.0015 8 0.015 8 0.15 11 1.5 14 Nec8_4116-8 0.0015 8 0.015 11 0.15 15 1.5 16 Nec8_3517-ll 0.0015 10 0.015 12 0.15 15 1.5 17 Nec8-3704-7 0.0015 9 0.015 12 0.15 16 1.5 16 實施例21抗Nectin-2人類單株抗體之針對人類前列腺細 246 319597 200823235 胞株、人類肺癌細胞株、源自人類血癌之細胞株之ADCC 測定於參考例36所製作之抗Nectin-2人類單株抗體 Necl-554-l、Nec8-4116-8之ADCC。使用人類肺癌細胞株 NCI-H1299、人類前列腺細胞株Dul45、源自人類血癌之 細胞株U937作為標把細胞，在效應（effector)細胞方面， 使用將市售之凍結人類末梢血單核球（ALLCELLS公司）在 含有10 nM重組型人類IL-2(DIACL0NE Research公司）、 55/zM 2-魏基乙醇（Invitrogen 公司）及 10% FBS(JRH 公司） 參之RPMI 1640培養基（Invitrogen公司）中培養一夜者。人類 肺癌細胞株NCI-H1299、人類前列腺細胞株Dul45、源自 人類血癌之細胞株U937由ATCC購入，該等細胞株係根 據ATCC建議之方·法培養。分別地，Nec8-4116-8使用參考 例36揭示之抗體標準品，Necl-554-l使用參考例39揭示 之抗體標準品（Necl-554-1 SP3)。 回收對數增殖期之各種癌細胞，藉由對於lx 106個細 φ 胞添加 250 /zCi Na251Cr04(GE Healthcare 公司），並於 37 °C培養1小時而進行51Cr標識。將此等細胞用10% FBS/RPMI 1640培養基洗淨4次後，以ΙχΙΟ5個/mL再懸 浮於10% FBS/RPMI培養基中。ADCC，係將細胞懸浮液 50/zL(5xl03個細胞）及上述抗體用10%FBS / RPMI培養 基稀釋成終濃度為 0.0015# g/mL、0.015// g/mL、 0·15 μ g/mL及1·5 /z g/mL之溶液，將該等溶液25 /z L添加 至96孔RMC培養盤（BIOBIK公司）之各孔中。添加相同量 之作為陰性對照組之非免疫人類IgG(最終濃度0·0015 μ g/ 247 319597 200823235 mL、0·015 /z g/mL、0· 15 /z g/mL 及 1 ·5 “ g/mL)或用於未添 加抗體（No Ab)時檢出非特異性活性之D_PBS(：Iiwit]rc)geii 公司）。將此等培養盤在冰上培養1小時後，加入上述效應 細胞（effector cells)懸浮液2.5X105個/孔（效應細胞：標靶 細胞=50: 1)，在5%二氧化碳氣流中，於37¾反應4小時。 各孔從細胞内漏出至此專培養上 >月液中之放射活性（樣品 釋出活性，sample release)使用閃爍計數器（ScintUlati〇n
Counter)(TopCount NXT)與揭示於實施例2〇同樣的方法測 •定（表34)。ADCC之最大傷害活性(最大釋出活性，maximum release) ’係在加入Triton-X 100(Sigma公司）並使其最終濃 度成為1 A k之放射活性，再者’自然釋出活性（spontaneous release)，係在加入含1〇%fbS之RPMI 1640培養基以代替 效應細胞時之放射活性。成為ADCC強度之指標之特異性 溶裂（specific lysis)(%)係用下式計算出：（[樣品釋出活 性]-[自然釋出活性])/([最大釋出活性]_ [自然釋出活性])χ • 100 〇 248 319597 200823235 表34 抗體 抗體 (β g/ml) NCI_H1299 之 特異性溶裂(％) Dul45之特異 性溶裂(％) U937 溶裂(％) 非免疫IgG 0.0015 18 9 ' 26 ~ ~ 0.015 23 9 27 0.15 22 10 27 1.5 20 9 27 No Ab - 16 7 Yl ~~ Necl-554-1 0.0015 19 10 28 '' 0.015 24 13 27 0.15 28 14 36 1.5 26 16 34 Nec8-4116-8 0.0015 21 "28 ' ~~ 0.015 23 12 28 0.15 28 15 36 1.5 29 15 32 實施例22抗Nectin-2人類單株抗體之活體内抗腫瘤活性 (MDA-MB-231人類乳癌細.胞株SCID小鼠肺轉移治療模 •式) '、 於參考例36所製作之抗Nectin-2人類單株抗體 (Nec8-4116-8及Neel-554-1)之抗腫瘤活性，於使用 MDA-MB-231人類乳癌細胞株（由ATCC購入）之SCID小 鼠肺轉移治療模式中研究。Nec8-4116-8抗體標準品及 Necl_554-1 SP3抗體標準品係使用分別根據參考例38及 參考例39所揭示之方法所調製者。MDA-MB-231細胞株 係使用含有 10%FBS(ThermoElectron 公司）之 Leibovitz’s 249 319597 200823235 L-15(Invitrogen公司）培養基，接種於10cm組織培養罐 (Corning公司），不供給碳酸氣體，於37°C培養。藉由胰 蛋白酶-EDTA處理剝離而獲得對數增殖期之MDA_MB-231 細胞株的懸浮液，使用離心分離操作（l，〇〇〇rpm，3分鐘）， 以 Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)(Invitrogen 公司） 洗淨3次，所獲得之細胞以5χ106個/mL的密度再懸浮。 由日本CLEA公司購入之SCID小鼠（C.B-17/Icr-scid/ scidJcl)(5週齡，雌性）使用上述MDA-MB-231細胞懸浮液 •於尾靜脈各接種200/zL/個體。細胞接種後14日，測定各 個體的體重後，以各群之平均體重為均等（約20g)之方式分 為1群5隻。Neel-554-1的抗腫瘤活性評估實驗，係於細 胞接種後 14、21、28、35、42、49 日，以 PBS 稀釋為 0.3mg/mL 或 0.03mg/mL 之 Necl-554-1 SP3 溶液，或 PBS 為 lOmL/kg 經由尾靜脈投與。另一方面，Nec8-4116-8的抗腫瘤活性 評估實驗，係於細胞接種後14、21、28、35、42、49、56 參日，以 PBS 稀釋為 0.3mg/mL 或 0.03mg/mL 之 Nec8-4116-8 溶液，或PBS為10mL/kg經由尾靜脈投與。NecK554-l 與Nec8-4116-8之抗腫瘤活性，係以計測產生於肺的橫隔 膜之癌純株而評估。再者，實驗群間的顯著差異係使用參 數次常式（parametric)Dunnett型多重比較檢定（s AS前臨床 Package.Version 5.0)檢定。
Necl-554_1與Nec8-4116-8之任一投與濃度皆顯著 (ρ<0·0001)抑制 MDA-MB-231細胞於肺的增值。 Neel-554-1投與群與PBS投與群之癌純株數（平均值±標準 319597 250 200823235 差）及兩群間的顯著差異檢定值（尸值）示於表35, Nec8-4116-8投與群與PBS投與群之癌純株數（平均值土標 準差)及兩群間的顯著差異檢定值（P值）示於表36。 表35 癌純株數 戶值 PBS 234+33 - Neel-554-1 3 mg/kg 31+24 <0.0001 Necl-554-1 0.3 mg/kg 20+6 <0.0001 響表36 癌純株平均數 尸值 PBS 152+46 麵 Nec8-4116-8 3 mg/kg 18 土10 <0.0001 Nec8-4116-8 0.3 mg/kg 41 土 23 <0.0001 實施例23抗Nectin-2人類單株抗體之活體内抗腫瘤活性 (MDA-MB-231人類乳癌細胞株SCID小鼠皮下移植治療模 式） 於參考例36所製作之抗Nectin-2人類單株抗體 (Nec8_4116-8及Necl-554-l)之抗腫瘤活性，於使用 MDA-MB-231人類乳癌細胞株（由ATCC購入）之SCID小 鼠皮下移植治療模式中研究。Nec8-4116-8抗體標準品及 Necl-554-l SP3抗體標準品係使用分別根據參考例38及 參考例39所揭示之方法所調製者。MDA-MB-231細胞株 係使用含有10%FBS(Hyclone公司）及7,5%重碳酸鈉 (Invitrogen 公司)1/40 容量之1^^>〇¥]12’5 1^15(111¥1打〇8611公 251 319597 200823235 司）培養基，接種於10 cm組織培養罐（Corning公司），於 5%碳酸氣體中，於37°C培養。藉由胰蛋白酶-EDTA處理 剝離而獲得對數增殖期之MDA-MB-231細胞株的懸浮 液，使用離心分离隹操作（l，〇〇〇rpm，3分鐘），以Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)(Invitrogen 公司）洗淨 3 次。 所獲得之細胞再懸浮於HBSS與Matrigel(BD Biosciences 公司）的等量混合液獲得3x107個/mL的密度的細胞懸浮 液。 拳 由日本CLEA公司購入之SCID小鼠（C.B-17/Icr-scid/ scidJcl)(5週齡，雌性)使用上述MDA-MB-231細胞懸浮液 於腹侧皮下各接種1O0//L/個體。細胞接種後28日，以游 標卡尺測定MDA-MB-231腫瘤塊的長徑與短徑，藉由下式 算出腫瘤體積。 腫瘤體積（mm3)=長徑x(短徑）2/2 測定接種MDA-MB-231細胞隻上述SCID小鼠之各個 鲁體的體重後，以各群之平均腫瘤體積為均等（約170 mm3) 之方式分群。細胞接種後28、31、35' 38、42日，以PBS 稀釋為 3mg/mL 之 Nec8-4116-8、Necl-5 54-1 SP3 溶液，或 為lOmL/kg經由尾靜脈投與，同時藉由上述方法測定 腫瘤體積。Nec8-4116-8與Necl-554-l之增殖抑制活性， 係以藥物投與開始3星期後的塚聊體積為基準，根據下述 计异式算出T/C(Treatment/Control)值。再者，實驗群間的 颁著差異係使用參數次常式（parametric)Dunnett型多重比 -較檢定（SAS前臨床Package Version 5.0)檢定。 252 319597 200823235 t/c( /〇)[(抗體投藥群之由藥物投與開始時之腫瘤體積 的增加里）/(PBS投與群之由藥物投與開始時之腫瘤體積的 增加量）]χ100 第4圖顯示癌細胞株移植後腫瘤體積平均值的經時變 化。
Nec8-4116-8投與群與Necl_554_i投與群之T/c值分 別為39·2%與38.7%，兩抗體之任一者皆顯著地（ρ<〇·〇〇〇ΐ) 抑制MDA-MB-231細胞株腫瘤的增值（第4圖）。 •貫施例24抗Nectm-2人類單株抗體之活體内抗腫瘤活性 (OV-90人類卵巢癌細胞株SCID小鼠肝臟轉移治療模式） 於參考例36.所製作之抗Nectin-2人類單株抗體 (>^8-4116-8)之抗腫瘤活性，於使用〇^9〇人類卵巢癌細 胞株（由ATCC購入）之SCID小鼠肝臟轉移治療模式中研 究。Nec8-4116-8抗體標準品係使用分別根據參考例38所 揭示之方法所調製者。OV-90細胞株係使用將MCDB 105 鲁Medium(Sigma公司）於1L蒸餾水溶解後調整為ρΗ7·5無菌 過濾，其次將該 MCDJB 105 Medium 500mL 與 Medium 199(Sigma公司）500mL混合，且於其中加入FBS(Tliermo Electron公司）150mL之培養基，接種於150cm2之培養燒 瓶（Corning公司），於5%碳酸氣流中，於3 7°C培養。藉由 胰蛋白酶-EDTA處理剝離而獲得對數增殖期之OV-90細胞 株的懸浮液，使用離心分離操作（l，000rpm，3分鐘），以 Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)(Invitrogen 公司）洗淨 3次，·所獲得之細胞以lx 1〇7個/mL的方式再懸浮。 253 319597 200823235 由日本CLEA公司購入之SCID小鼠（BALB/cAJc1_ nu/nu)(5週齡’雌性）於峻麻醉下打開腹部，露出脾臟，於 脾臟内各接種100/ZL/個體之上述〇v_9〇細胞懸浮液。細 胞接種後’觀察到於肝臟的存活之14日以後每.〗星期（14、 21 28 35 及 42 日）以 pbs 稀釋為 3mg/mL 之 Nec8-4116-8 溶液以3 之方式經由尾靜脈投與。又，對照群係 投與生理食鹽水。最終投與後的丨星期於尾靜脈内投與 之乃^伊凡斯藍⑴”旧則狀乃肝臟摘出後浸於⑺^中性緩衝 響福馬林溶液固定，以肉眼觀察肝臟中轉移的癌細胞株 殖。 其結果，於對照群之肝臟中腫瘤增值為6例中確認有 6例，相對於此，Nec8-4116-8群之肝臟中腫瘤增值為6例 中確認有不超過1例，Nec8-4116-8顧著地抑制於肝臟支 存活的癌細胞增瘦。 【圖式簡單說明】 • 第1圖顯示實施例1所得之本發明抗體之Η鏈可變區 域之胺基酸序列（序列編號：187、203、219、235、25 1、 267、283及299)及L鏈可變區域之胺基酸序列（序列編號: 195、211、227、243、259、275、291 及 307)。 第2圖顯示實施例1所得之本發明抗體之η鏈可變區 域之驗基序列（序列編號·· 191、207、223、239、255、271、 287 及 303)。 第3圖顯示實施例1所得之本發明抗體之l鏈可變區 域之驗基序列（序列編號·· 199、215、231、247、263、279、 319597 254 200823235 295 及 311)。 第4圖顯示實施例23中癌細胞株移植後腫瘤體積平 均值的經時變化。
255 319597

Claims (1)

  1. 200823235 τ、申請專利範圍·· I:種單株抗體，其係針對含有與序列編號：〗或序 "u.3所示之胺基酸序列同-或實質同-之胺基酸序列 之蛋白質或其部分肽或其鹽之單株抗體。 \如申請專利範圍第1項之抗體，其係針對含有序列編 3所不之胺基酸序列之蛋白質或其部分肽或其鹽 卓株抗體。 .如申請專利範圍第1項之抗體，其係人類單株抗體。 4. 如申請專利範圍# i項之抗體，其係嵌合型單株抗體。 5. 如申請專利範圍帛】項之抗體，其係人類化單株抗體。 6·如申請專利範圍第1項之抗體，其係屬於人類IgGi亞 群之單株抗體。 ' 1 如申請專利範圍第1項之抗體，其具有癌細胞增殖阻礙 活性。 8.如申請專利範圍第丨項之抗體，其具有抗體依存性細胞 •毒殺活性（ADCC : Antibody-dependent cellular cytotoxicity) ° 9·如申請專利範圍第i項之抗體，其具有Nectin_2/ Nectin-3或Nectin_2/Nectin-2反式結合阻礙活性。 10·如申請專利範圍第1項之抗體，其係能識別序列—編號： 1或序列編號：3所示胺基酸序列之第1至35〇號胺基 酸序列中所存在之抗原決定部位（epitope)之單株抗體。 11.如申請專利範圍第1項之抗體，其係能識別序列編號： - 1或序列編號：3所示胺基酸序列之第47至142號或第 — 319597 256 200823235 175至240號胺基酸序列中所存在之抗原決定部位之單 株抗體。 12·如申請專利範圍第1項之抗體，其係能識別包含序列編 號：1或序列編號·· 3所示胺基酸序列之第75、76、77、 78、95、137、145、173、184、186 及 212 號中之至少 一個胺基酸殘基之胺基酸序列之單株抗體。 13·如申請專利範圍第1項之抗體，其中，針對含有與序列 編號：1或序列編號：3所示之胺基酸序列同一或實質 同一之胺基酸序列之蛋白質或其部分肽或其鹽，該抗體 與下列所示之融合瘤細胞產生之單株抗體為競爭性結 合：Necl-803-2 (FERM BP-10417)、Necl-244-3(FERM BP-10423)、Necl-530-l(FERM BP-10424)、Necl-903-1 (FERM BP-10425)、Necl_520_l (FERM BP-10426)、 Necl-845-2(FERM BP-10427) > Necl-834-l(FERM BP-10428)^ Necl-964-l(FERM ABP- 10683) - Necl-1302-2 (FERM ABP-10684)、Necl-554-1 (JFERM ABP-10681)、 Necl-769-2(FERM ABP'10682)或 Nec8-4116-8 (FERM ABP-10685) 〇 14.如申請專利範圍第1項之抗體，其識別與Necl-803_2 (FERM BP-10417)、Necl-244-3(FERM BP-10423)、 Necl-530-l(FERM BP-10424) > Necl-903-l(FERM BP-10425) ^ Necl-520-l(FERM BP-10426) ^ Necl-845-2 (FERM BP-10427)、Necl-834-l(FERM BP-10428)、 Necl-964-l(FERM ABP-10683)、Necl-1302-2(FERM … 257 319597 200823235 ABP-10684) > Necl-554-l(FERM ABP-10681) ^ Necl-769 -2(FERM ABP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM ABP-10685) 所示之融合瘤細胞產生之單株抗體所識別之胺基酸序 列為同一或實質同一之胺基酸序列。 15·—種融合瘤細胞，其產生申請專利範圍第1項之抗體。 16·如申請專利範圍第15項之融合瘤細胞，其係以 Necl-803-2(FERM BP-10417) > Necl-244-3(FERM BP-10423) ^ Necl-530-l(FERM BP-10424) > Necl-903-1 (FERM BP-10425) > Necl-520-1 (FERM BP-10426) v Necl-845-2(FERM BP-10427)、Necl-834-l(FERM BP-10428) ^ Necl-964-l(PERM ABP-10683) ^ Necl-1302-2 (FERM ABP_10684)、Necl-554-l(FERM ABP-10681)、 Necl-769-2(FERM ABP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM ABP-10685)表示。 ^ 17·—種單株抗體，其係由申請專利範圍第16項之融合瘤 細胞所產生。 18.如申請專利範圍第1項之抗體，其係重組型單株抗體。 19·如申請專利範圍第1項之抗體，其中，抗體重鏈可變區 域之第一互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域 (CDR2)及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分 別包含與⑴選自序列編號：184、200、216、232、248、 264、280及296所成組群中之序列編號，（的選自序列 編號：185、201、217、233、249、265、281 及 297 所 成組群中之序列編號以及（Hi)選自序列編號：186、202、 258 319597 200823235 218、234、250、266、282及298所成組群中之序列編 號所示之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 20·如申請專利範圍第1項之抗體，其中，抗體輕鏈可變區 域之第一互補性決定區域（CDR1)、第二互補性決定區域 (CDR2)及第三互補性決定區域（CDR3)之胺基酸序列分 別包含與（iv)選自序列編號·· 192、208、224、240、256、 272、288及3〇4所成組群中之序列編號，（v)選自序列 編號·· 193、209、225、241、257、273、289 及 305 所 成組群中之序列編號，（vi)選自序列編號··. 194、210、 D6、242、258、274、290及306所成組群中之序列編 唬所不之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列。 21Y種診斷劑，其包括··針身含有與序列編號··工或序列 、扁唬· 3所不之胺基酸序列同一或實質同一之胺基酸序 幻之蛋白質或其部分肽或其鹽之單株抗體。 如申請專㈣圍第21項之診㈣，其係癌之診斷劑。 種醫藥」其包括:針對含有與序列編號：1或序列編 =疋3所不之胺基酸序賴—或實質同—之胺基酸序列 24 自f或其部分肽或其鹽之單株抗體。 申’專利範圍第23項之醫藥甘么 劑。 桌其係癌之預防或治療 25·如申請專利範圍第23項之醫筚，1总 進劑。市其係癌細胞之凋亡促 ^ 6 Jj {' 如申凊專利範圍第23項之醫藥，甘 ， …礙劑。 ，’、，、係癌細胞之增 319597 259 200823235 27.如申請專利範圍第幻項之較越 >區域之活㈣彳^ t ^ 係、利用，經由抗體之 28插亡+ ”成制之癌細胞阻礙劑。 28·—種癌之預防或治療方、 投盥H旦> 、寸被為·對於哺乳動物， 所示之胺基酸序列同· 次序列編唬· 3 白皙弋苴却八 次貝貝同一之胺基酸序列之蛋 白貝或其部分肽或其鹽之單株抗體。 3所之針對含有與序列編號：1或序列編號： 1貝貝同一之胺基酸序列之蛋 貝次，、口 P刀肽或其鹽之單株抗體。 3=種癌細胞之增殖阻礙方法，其特徵為：對於哺乳動 ”斤示之胺基酸序列同一或實丄或㈣ 及只貝冋一之胺基酸序列之蛋 貝或。卩/刀肽或其鹽之單株抗體。 31·—種利用經由抗體 ? 體 £域之活體防禦機制之癌細胞 對人有盘忘其特徵為：對於哺乳動物’投與有效量之針 對3有與^列編號：1或序列編號：3所示之胺基酸序 ::鴎或ι貝同一之胺基酸序列之蛋白質或其部分肽 或其鹽之單株抗體。 32, -種針對含有與序列編號：i或序列編號·· 3所示之胺 基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列之蛋白質或其 4刀肽或其鹽之單株抗體之用途，其係用於製造癌之預 防或治療‘劑。 、 33. —種.針對含有與序列編號：〗或序列編號：3所示之胺 319597 260 200823235 基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列之蛋白質或其 部分肽或其鹽之單株抗體之用途，其係用於製造癌細胞 之凋亡促進劑。 34·—種針對含有與序列編號:1或序列編號：3所示之胺 基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列之蛋白質或其 部分肽或其鹽之單株抗體之用途，其係用於製造癌細胞 之增殖阻礙劑。 35·—種針對含有與序列編號：1或序列編號：3所示之胺 基酸序列同一或實質同一之胺基酸序列之蛋白質或其 部分肽或其鹽之單株抗體之用途，其係用於製造利用經 由抗體之Fc區域之活體防禦機制之癌細胞阻礙劑。 36·—種乳癌之預防或治療劑，其係含有以Necl-803-2 (PERM BP-10417)、Necl-244-3(FERM BP-10423)、 Neel-530-1 (FERM BP-10424) 、 Neel-903-1(FERM BP-10425)、Necl-520-l(FERM BP-10426)、Necl-845-2 (FERM BP-10427)、Necl-834-l(FERM BP-10428)、 Necl_964-1(FERM BP -10 6 83) - Neel -13 0 2 - 2 (F ERM BP-10684)、Necl-554-l(FERM BP-10681)、NeclV769-2 (FERM BP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所示 之融合瘤細胞產生的單株抗體。 37. —種乳癌之預防或治療劑，其係含有與以 Necl-803-2(FERM BP-10417) 、 Necl-244-3(FERM BP-10423) > Necl-530-l(FERM BP-10424) ^ Necl-903-1 (FERM BP-10425)、Necl-520-l(FERM BP-10426)、 261 319597 200823235 Necl-845-2(FERM BP-10427) 、 Necl-834-l(FERM BP-10428) - Neel-964-1 (PERM BP-10683) > Neel-1302-2 .(FERM BP-10684)、Necl-554-l(FERM BP-10681)、 Necl-769-2(FERM BP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所示之融合瘤細胞產生的單株抗體針對 Nectin-2為競爭性結合的單株抗體。 3 8 ·如申請專利範圍第3 7項之乳癌之預防或治療劑，其 中’與以Necl-554-l(FERMBP-10681)戶斤示之融合瘤細 • 胞產生的單株抗體針對Nectin-2為競爭性結合的單株 抗體為 Necl-1044-4(FERM ABP-10805)或 Necl-1032-2 (FERM BP-10684)。· 39·如申請專利範圍第37項之乳癌之預防或治療劑，其 中，與以Nec8-4116-8(FERM ΒΡ-10685)所示之融合瘤細 胞產生的單株抗體針對Nectin-2為競爭性結合的單株 抗體為 Nec8-3704-7(FERM ABP-l0807)或 Nec8-3517-11 φ (FERM ABP-10806)。 40·如申請專利範圍第36或37項之乳癌之預防或治療劑， 係利用經由抗體之Fc區域的活體防禦機制。 41· 一種乳癌之預防或治療劑，係含有抗體所成者，該抗體 包含抗體重鏈可變區域之第一互補性決定區域 (CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2)及第三互補性決 定區域（CPR3)之胺基酸序列，分別與（i)選自序列編號： 184、200、216、232、248、264、280 及 296 所成組群 .… 中之序列編號，（ϋ)選自序列編號185,201、217、233、 262 319597 200823235 249、265、281及297所成組群中之序列編號以及（m) 選自序列編號：186、202、218、234、250、266、282 -及298所成組群中之序列編號所示之胺基酸序列同一或 實質同一之胺基酸序列。 42·—種乳癌之預防或治療劑，·係含有抗體所成者，該抗體 包含抗體輕鏈可變區域之第一互補性決定區域 (CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2)及第三互補性決 定區域（CDR3)之胺基酸序列，分別與（iv)選自序列編 _ 號：192、208、224、240、256、272、288 及 304 所成 組群中之序列編號，⑺選自序列編號：193、209、225、 24卜257、273、289及305所成組群中之序列編號，（Vi) 選自序列編號：194、210、226、242、258、274、290 及306所成組群中之序列編號所示之胺基酸序列同一或 實質同一之胺基酸序列。 43·—種乳癌之預防或治療劑，係含有抗體所成者，該抗體 φ 包含抗體重鏈可變區域之第一互補性決定區域 (CDR1)、第二互補性決定區域（CDR2)及第三互補性決 定區域（CDR3)之胺基酸序列，分別與⑴選自序列編號： 184、200、216、232、248、264、280 及 296 所成組群 中之序列編號，（ii)選自序列編號：185、201、217、233、 249、265、281及297所成組群中之序列編號以及（iii) 選自序列編號：186、202、218、234、250、266、282 及298所成組群中之序列編號所示之胺基酸序列同一或 實質同一之胺基酸序列；抗體輕鏈可變區域之‘第一互補 263 319597 200823235 性決定區域（CDRl)、第二互補性決定區域（CDR2)及第 三互補性決定區域(CDR3)之胺基酸序列，分別與（iv)選 自序列編號：192、208、224、240、256、272、288 及 304所成組群中之序列編號，（v)選自序列編號:193、 209、225、241、257、273、289 及 305 所成組群中之序 列編號，（vi)選自序列編號：194、210、226、242、258、 274、290及306所成組群中之序列編號所示之胺基酸序 列同一或實質同一之胺基酸序列；以及抗體恆定區域。 _ 44· 一 種融合瘤細胞，係以 Necl-1044-4(FERM ABP-10805)、Nec8-3517-11(FERM ABP-10806)或 Nec8-3704-7(FERM BP-10807)所表示者。 45·—種單株抗體，係由申請專利範圍第44項之融合瘤細 胞所產生者。 46· —種單株抗體，係與以]^〇1-1044-4(下五尺]^入；6?-10805)、Nec8-3517-11 (FERM ΑΒΡ·10806)或 Nec8-3704麵 參 7(FERM BP-10807)所示之融合瘤細胞產生的單株抗體 為競爭性結合的單株抗體。 47· —種乳癌之預防或治療劑，係含有上述申請專利範圍第 45或46項之單株抗體所成者。 264 319597 200823235 序列表 <110〉武田藥品工業股份有限公司 <120〉癌之預防、治療劑 <130> G07-0129 <150> PCT/JP2006/320429 <151〉 2006-10-06 <150> JP2007-100876 〈151> 2007-04-06 〈160> 317 <170> Patentln version 3. 3
    <210> 1 <211> 479 <212〉 PRT <213〉人類 <400> 1 Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro 5 10 15 Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gin 20 25 30 Asp Val Arg Val Gin Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gin Leu Gly Gly 35 40 45 Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr 50 55 60 He Ser Leu Val Thr Trp Gin Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gin 65 70 75 80 Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro B5 90 95 Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gin Ser Thr 100 105 " 110 Gly Gin Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gin Asp Ala Thr Leu Ala Leu His 115 120 125 Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr 130 - 135 140 Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val He Ala 145 150 155 160 Lys Pro Lys Asn Gin Ala Glu Ala Gin Lys Val Thr Phe Ser Gin Asp 165 170 175 Pro Thr Thr Val Ala Leu Cys He Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala 180 185 190 Arg lie Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gin 195 200 205 Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr 210 215 220 Leu Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val 225 .230 235 240 Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu lie Pro Val Thr Leu Ser 245 250 255 Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser lie Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp
    200823235 260 265 270 Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn 275 280 285 Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro 290 295 300 Thr Ser Ala Val Ala Gin Gly Ser Gin Leu Val· He His Ala Val Asp 305 310 315 320 Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly 325 330 335 Met Gly Arg Ala Glu Gin Val He Phe Val Arg Glu Thr Pro Arg Ala 340 345 350 Ser Pro Arg Asp Val Gly Pro Leu Val Trp Gly Ala Val Gly Gly Thr 355 , 360 365 Leu Leu Val Leu Leu Leu Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe He Leu 370 375 380 Leu Arg Val Arg Arg Arg Arg Lys Ser Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gly 385 390 395 400 Ala Ser Gly Asp Gly Gly Phe Tyr Asp Pro Lys Ala Gin Val Leu Gly 405 410 415 Asn Gly Asp Pro Val Phe Trp Thr Pro Val Val Pro Gly Pro Met Glu 420 425 430 Pro Asp Gly Lys Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys . Ala Glu 435 440 445 Lys Gly Leu Met Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Glu Asp Asp Met Glu 450 455 460 Ser Gin Leu Asp Gly Ser Leu lie Ser Arg Arg Ala Val Tyr Val 465 470 475 <210〉 2 <211〉 1437 <212> DNA <213〉人類 <400> 2 atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccget gctgtggccg ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc gaggtgcgag gccagctcgg· gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgot gccacctgtt cctggactgt acatctccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcctggcagc gagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactgggc aagacacaga ggcagagctc caggacgcca cgctggccct ccacgggctc acggtggagg acgagggcaa ctacacttgc gagtttgcca ccttccccaa ggggtccgtc cgagggatga cctggctcag agtcatagcc aagcccaaga accaagctga ggcccagaag gtcacgttca gccaggaccc tacgacagtg gccctctgca tctccaaaga gggccgccca cctgcccgga tctcctggct ctcatccctg gactgggaag ccaaagagac tcaggtgtca gggaccctgg ccggaactgt cactgtcacc agccgcttca ccttggtgcc ctcgggccga gcagatggtg tcacggtcac ctgcaaagtg gagcatgaga gcttcgagga accagccctg atacctgtga ccctctctgt acgctaccct cctgaagtgt ccatctccgg ctatgatgac aactggtacc tcggccgtac tgatgccacc ctgagctgtg acgtccgcag caacccagag cccacgggct atgactggag cacgacctca ggcaccttcc cgacctccgc agtggcccag ggctcccagc tggtcatcca cgcagtggac agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg ccgtgggcat gggccgcgct gagcaggtca tctttgtccg agaaaccccc agggcctcgc cccgagatgt gggcccgctg gtgtgggggg ccgtgggggg gacactgctg gtgctgctgc ttctggctgg ggggtccttg gccttcatcc tgctgagggt gaggaggagg aggaagagcc ctggaggagc aggaggagga gccagtggcg acgggggatt ctacgatccg aaagctcagg tgttgggaaa tggggacccc gtcttctgga caccagtagt ccctggtccc atggaaccag atggcaagga tgaggaggag gaggaggagg aagagaaggc agagaaaggc ctcatgttgc ctccaccccc agcactcgag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080. 1140 1200 1260 1320 1380 2 200823235 1437 gatgacatgg agtcccagct ggacggctcc ctcatctcac ggcgggcagt ttatgtg <210〉 3 <211> 538 <212> PRT 〈213〉人類 <400〉 3 Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro. Thr Pro 5 10 15 Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gin 20 25 30 Asp Val Arg Val Gin Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gin Leu Gly Gly 35 40 45 Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr 50 55 60
    lie Ser Leu Val Thr Trp Gin Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gin 65 70 75 80 Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro 85 90 95 Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gin Ser Thr 100 105 110 Gly Gin Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gin Asp Ala Thr Leu Ala Leu His 115 120 125 Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr 130 135 140 Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val He Ala 145 150 155 160 Lys Pro Lys Asn Gin Ala Glu Ala Gin Lys Val Thr Phe Ser Gin Asp 165 170 175 Pro Thr Thr Val Ala Leu Cys lie Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala 180 185 190 Arg lie Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gin 195 200 205 Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr 210 215 220 Leu Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val 225 230 235 240 Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu lie Pro Val Thr Leu Ser 245 250 255 Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser He Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp 260 265 270 Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn ..275 280 ； 285 Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser· Gly Thr Phe Pro 290 295 300 Thr Ser Ala Val Ala Gin Gly Ser Gin Leu Val lie His Ala Val Asp 305 310 315 320 Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly 325 330 335 Met Gly Arg Ala Glu Gin Val He Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn Thr 340 345 350 Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly lie He Gly Gly lie lie Ala Ala 355 360 365 lie lie Ala Thr Ala Val Ala Ala Thr Gly lie Leu lie Cys Arg Gin 370 375 380 Gin Arg Lys Glu Gin Thr Leu Gin Gly Ala Glu Glu Asp Glu Asp Leu 200823235 385 Glu Gly Pro Pro Ala Gin Glu Met 420 Ser Pro Leu Lys 435 Gin Glu Met Pro 450 Gly Pro Leu His 465 Pro Pro Gly Pro Glu Glu Gly Glu 500 Tyr Asp Ala Leu 515 Gly Phe Val Met 530 390 Ser Tyr Lys 405 Pro Ser Gin Pro Pro Leu Phe 425 Thr Pro Tyr Phe Asp 440 Glu Leu Arg Tyr His 455 Pro Gly Ala 470 Pro Ala Val 485 Glu Glu Glu Ser Tyr Ser Ser Arg Ala 535 Thr Ser Glu Asp Glu Tyr 505 Ser Pro 520 Met Tyr 395 Thr Pro 410 Thr Leu Ala Gly Pro Thr Leu Gly 475 Val Ser 490 Leu Asp Ser Asp Val Lys Ala Gly Ala Ala Ser 445 Leu Glu 460 Ser Pro Leu Asp Lys lie Ser Tyr 525 400 Lys Leu Glu 415 Ser Glu His 430 Cys Thr Glu Glu Arg Ser He Pro Val 480 Leu Glu Asp 495 Asn Pro lie 510 Gin Gly Lys <210〉 4 <211〉 1614 <212〉 DNA 〈213〉人類 〈400> 4 atggcccggg ctgctgctgc gaggtgcgag cctggactgt aatgtggccg gagcggctgt caggacgcca gagtttgcca aagcccaaga gccctctgca gactgggaag agccgcttca gagcatgaga cctgaagtgt ctgagctgtg ggcaccttcc agtctgttca gagcaggtca atcatcgggg atctgccggc gagggacctc ccctcccagc gatgctggcg gaagaacggt cctccagggc gaggaggaag ccctctgatt ccgctgccct tgctgctcct gccagctcgg acatttccct ccttccaccc ccttcgtctc cgctggccct ccttccccaa accaagctga tctccaaaga ccaaagagac ccttggtgcc gcttcgagga ccatctccgg acgtccgcag cgacctccgc ataccacctt tctttgtccg gcatcatcgc agcagcggaa cctcctacaa tcttcactct cctcatgcac caggaccctt cacctgctgt agtatctgga cctaccaggg cctgccgtcg ggaaaccgga gggcaccgtg ggtgacctgg taagatgggt tgccaagcag ccacgggctc ggggtccgtc ggcccagaag gggccgccca tcaggtgtca ctcgggccga accagccctg ctatgatgac caacccagag agtggcccag cgtctgcaca agagaccccc cgccatcatt ggagcagacg gccaccgacc gggggcctcg tgagcaggaa gcaccctgga ggaagacgtt caagatcaac caaaggcttt agatcgccgc gcccaggatg gagctgccgt cagcgcccag cccagcttcc agcactgggc acggtggagg cgagggatga gtcacgttca cctgcccgga gggaccctgg gcagatggtg atacctgtga aactggtacc cccacgggct ggctcccagc gtcaccaatg aacacagcag gctactgctg ctgcaggggg ccaaaagcga gagcacagcc atgcctcgat gccacaagcc tccctggatc cccatctatg gtcatgtccc cgacgccgct tgcgagttca gccacctgct atgcacctgc ccagcccgaa aagacacaga acgagggcaa cctggctcag gccaggaccc tctcctggct ccggaactgt tcacggtcac ccctctctgt tcggccgtac atgactggag tggtcatcca ccgtgggcat gcgcaggggc tggctgccac cagaggagga agctggaggc cactcaagac accatgagct tggggtcccc tagaggatga atgctctgtc gggccatgta gctgtggccg agtgctaccc gccacctgtt gaaccaccag gcctggcagc ggcagagctc ctacacttgc agtcatagcc tacgacagtg ctcatccctg cactgtcacc ctgcaaagtg acgctaccct tgatgccacc cacgacctca cgcagtggac gggccgcgct cacaggcggc gggcatcctt cgaagacctg acaggagatg cccctacttt gcccaccttg catcccggtg ggagggggag ctatagcagc tgtg oooooooooooooooooooooooooo, 4 628406284062840628406284061 112334 4 5667789900122334556 <210〉 5 <211〉 549 <212> PRT 4 200823235 <213〉人類 <400〉 5 Met Ala Arg Thr Leu Arg Pro Ser Pro Leu Cys Pro Gly Gly Gly Lys 5 10 15 Ala Gin Leu Ser Ser Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Leu Gin 20 25 30 Pro Pro Thr Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Phe Pro Leu Leu Leu 35 40 45 Phe Ser Arg Leu Cys Gly Ala Leu Ala Gly Pro He He Val Glu Pro 50 55 60 His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn Val Ser Leu Lys Cys Leu lie 65 70 75 80 Glu Val Asn Glu Thr He Thr Gin He Ser Trp Glu Lys lie His Gly 85 90 95 Lys Ser Ser Gin Thr Val Ala Val His His Pro Gin Tyr Gly Phe Ser 100 · 105 HO
    Val Gin Gly Glu Tyr Gin Gly Arg Val Leu Phe Lys Asn Tyr Ser Leu 115 120 125 Asn Asp Ala Thr lie Thr Leu His Asn lie Gly Phe Ser Asp Ser Gly 130 135 140 Lys Tyr He Cys Lys Ala Val Thr Phe Pro Leu Gly Asn Ala Gin Ser 145 150 155 160 Ser Thr Thr Val Thr Val Leu Val Glu Pro Thr Val Ser Leu lie Lys 165 170. 175 Gly Pro Asp Ser Leu He Asp Gly Gly Asn Glu Thr Val Ala Ala He 180 185 190 Cys lie Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val Ala His He Asp Trp Glu Gly 195 200 205 Asp Leu Gly Glu Met Glu Ser Thr Thr Thr Ser Phe Pro Asn Glu Thr 210 215 220 Ala Thr lie He Ser Gin Tyr Lys Leu Phe Pro Thr Arg Phe Ala Arg 225 230 235 240 Gly Arg Arg lie Thr Cys Vai Vai Lys His Pro Ala Leu Giu Lys Asp 245 250 255 He Arg Tyr Ser Phe lie Leu Asp lie Gin Tyr Ala Pro Glu Val Ser 260 265 270 Val Thr Gly Tyr Asp Gly Asn Trp Phe Val Gly Arg Lys Gly Val Asn 275 280 285 Leu Lys Cys Asn Ala Asp Ala Asn Pro Pro Pro Phe Lys Ser Val Trp 290 .295 300 Ser Arg Leu Asp Gly Gin Trp Pro Asp Gly Leu Leu Ala Ser Asp Asn 305 310 315 320 Thr Leu His Phe Val His Pro Leu Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Val Tyr 325 330 335 lie Cys Lys Val Thr Asn Ser Leu Gly Gin Arg Ser Asp Gin Lys Val 340 345 350 He Tyr He Ser Asp Pro Pro Thr Thr Thr Thr Leu Gin Pro Thr He 355 360 365 Gin Trp His： Pro Ser Thr Ala Asp lie Glu Asp Leu Ala Thr Glu Pro 370 375 380 Lys Lys Leu Pro Phe Pro Leu Ser Thr Leu Ala Thr He Lys Asp Asp 385 390 395 400 Thr . He Ala Thr lie He Ala Ser Val Val Gly Gly Ala Leu Phe lie 405 410 415 Val Leu Val Ser Val Leu Ala Gly lie Phe Cys Tyr Arg Arg Arg Arg 420 425 430
    200823235 Thr Phe Arg Gly Asp Tyr Phe Ala Lys Asn Tyr lie Pro Pro Ser Asp 435 440 445 Met Gin Lys Glu Ser Gin He Asp Val Leu Gin Gin Asp Glu Leu Asp 450 455 460 Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys Lys Glu Asn Lys Asn Pro Val Asn Asn 465 470 475 480 Leu lie Arg Lys Asp Tyr Leu Glu Glu Pro Glu Lys Thr Gin Trp Asn '485 490 495 Asn Val Glu Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Pro Met Asp Tyr Tyr Glu 500 505 510 Asp Leu Lys Met Gly Met Lys Phe Val Ser Asp Glu His Tyr Asp Glu 515 520 525 Asn Glu Asp Asp Leu Val Ser His Val Asp Gly Ser Val lie Ser Arg 530 535 540 Arg Glu Trp Tyr Val 545 <210〉 6 <211〉 1647 <212〉 DNA 〈213〉人類 <400〉 6 atggcgcgga ccctgcggcc gtccccgctg tgtcctggag gcggcaaagc acaactttcc tccgcttctc tcctcggagc cgggctcctg ctgcagcccc cgacgccacc tccgctgctg ctgctgctct tcccgctgct gctcttctcc aggctctgtg gtgccttagc tggaccaatt attgtggagc cacatgtcac agcagtatgg ggaaagaatg tttcattaaa gtgtttaatt gaagtaaatg aaaccataac acagatttca tgggagaaga tacatggcaa aagttcacag actgttgcag ttcaccatcc ccaatatgga ttctctgttc aaggagaata tcagggaaga gtcttgttta aaaattactc acttaatgat gcaacaatta ctctgcataa cataggattc tctgattctg gaaaatacat ctgcaaagct gttacattcc cgcttggaaa tgcccagtcc tctacaactg taactgtgtt agttgaaccc actgtgagcc tgataaaagg gccagattct ttaattgatg gaggaaatga aacagtagca gccatttgca tcgcagccac tggaaaaccc gttgcacata ttgactggga aggtgatctt ggtgaaatgg aatccactac aacttctttt ccaaatgaaa cggcaacgat tatcagccag tacaagctat ttccaaccag atttgctaga ggaaggcgaa ttacttgtgt tgtaaaacat ccagccttgg aaaaggacat ccgatactct ttcatattag acatacagta tgctcctgaa gtttcggtaa caggatatga tggaaattgg tttgtaggaa gaaaaggtgt taatctcaaa tgtaatgctg atgcaaatcc accacccttc aaatctgtgt ggagcaggtt ggatggacaa tggcctgatg gtttattggc ttcagacaat actcttcatt- ttgtccatcc attgactttc aattattctg gtgtttaiat ctgtaaagtg accaattccc ttggtcaaag aagtgaccaa aaagtcatct acatttcaga tcctcctact actaccaccc ttcagcctac aattcagtgg catccctcaa ctgctgacat cgaggatcta gcaacagaac ctaaaaaatt gcccttccca ttgtcaactt tggcaacaat taaggatgac acaattgcca cgatcattgc tagtgtagtg ggtggggctc t.cttcatagt acttgtaagt gttttggctg gaatattctg ctataggaga agacggacgt ttcgtggaga ctactttgcc aagaactaca ttccaccatc agatatgcaa aaagaatcac aaatagatgt tcttcaacaa gatgagcttg attcttaccc agacagtgta aaaaaagaaa acaaaaatcc agtgaacaat ctaatacgta aagactattt agaagagcct’ gaaaaaactc agtggaacaa tgtagaaaat ctcaataggt ttgaaagacc aatggattat tatgaagatc taaaaatggg aatgaagttt gtcagtgatg aacattatga tgaaaacgaa gatgacttag tttcacatgt agatggttcc gtaatttcca ggagggagtg gtatgtt <210> 7 <211> 20 <212〉 DNA 〈2.13〉人工序列 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1647 6 200823235 <220〉 <223> Antisense oligonucleotide 1 <400> 7 tcccaacacc tgagctttcg <210〉 8 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> Control oligonucleotide 1 <400> 8 gctttcgagt ccacaaccct
    <210〉 9 〈211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉引子 <400> 9 ggtcatcttt gtccgagaaa cc <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉引子 <400> 10 tgagctttcg gatcgtagaa tc 〈210〉 11 -<211> 18 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> TaqMan Probe 1 <400〉 11 ccgagatgtg ggcccgct <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉引子 200823235 <400> 12 cccactcaag accccctact tt <210〉 13 <211> 22 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉引子 <400〉 13 gctcatggta tcgaggcatt tc
    <210> 14 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223> TaqMan Probe 2 <400> 14 atgctggcgc ctcatgcact gag <210〉 15 〈211〉 25 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223>引子 <400〉 15 aattgaattc atggcccggg ccgct <210〉 16 <211> 32 <212〉 DNA 〈213>人工序列 ’ <220〉 ’ <223〉引子 <400〉 16 aattgatatc tcacacataa actgcccgcc gt <210> 17 <21.1> 29 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉引子 <400> 17 200823235 gatatctcac acatacatgg cccgggaca 29 〈210〉 18 <211> 34 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> 〈223〉引子 <400> 18 attgatatct cacacataca tggcccggga catg 34 <210> 19 <211〉 19 <212> RNA 〈213>人工序列
    <220〉 <223〉 siRNA-1 <400> 19 acuacacuug cgaguuugc 19 <210> 20 <211〉 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223> siRNA-1 κ AΛΛ\ ΟΛ \^υυ/ ώυ gcaaacucgc aaguguagu 19
    <210> 21 <211> 19 <212〉 RNA 〈213>人工序列 〈220〉 <223> siRNA-2 <400〉 21 aaaguggagc augagagcu 19 <210〉 22 <211〉 19 <2；12> RNA <213〉人工序列 <220〉 <223> siRNA-2 <400〉 22 agcucucaug cuccacmm 19 9 200823235 <210> 23 <21I> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223> siRNA-3 <400> 23 ggucaucuuu guccgagaa 〈210〉 24 <211〉 19 <212> RNA <213〉人工序列
    〈220> <223〉 siRNA-3 <400〉 24 uucucggaca aagaugacc 〈210〉 25 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223> siRNA-4 <400> 25 gauucuacga uccgaaagc <210> 26 <211〉 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223> siRNA-4 <400> 26 gcuuucggau cguagaauc <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223> siRNA-5 <400> 27 ggaagagaag gcagagaaa <210> 28 200823235 <211〉 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220〉 <223> siRNA-5 <400〉 28 uuucucugcc UUCUCUUCC 19 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉
    〈223>引子 <400> 29 aattgaattc atggcccggg ccgct 25 <210〉 30 <211〉 30 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> 〈223〉引子 <400〉 30 aattctcgag ggcccctgcg cctgctgtgt 30 <210〉 31 <2ϋ> 371 <212〉 PRT <213〉人類 〈400> 31 Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro 5 10 15 Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gin 20 25 30 Asp Val Arg Val Gin Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gin Leu Gly Gly 35 40 45 Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr 50 55 60 He Ser . Leu Val Thr Trp Gin Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gin 65 70 75 80 Asn Val Ala Ala Phe His Pro L-ys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro 85 90 95 Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gin Ser Thr 100 105 110 Gly Gin Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gin Asp Ala Thr Leu Ala Leu His 115 120 125 Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr 130 135 140 Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val lie Ala 11 200823235 145 150 155 160 Lys Pro Lys Asn Gin Ala Glu Ala Gin Lys Val Thr Phe Ser Gin Asp 165 170 175 Pro Thr Thr Val Ala Leu Cys He Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala 180 185 190 Arg lie Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gin 195 200 205 Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr 210 215 220 Leu Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val 225 230 235 240 Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu He Pro Val Thr Leu Ser 245 250 255 Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser lie Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp 260 265 270 Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn 275 280 285
    Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro 290 295 300 Thr Ser Ala Val Ala Gin Gly Ser Gin Leu Val lie His Ala Val Asp 305 310 315 320 Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly 325 330 335 Met Gly Arg Ala Glu Gin Val He Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn Thr 340 345 350 Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly He Leu Giu Asp Tyr Lys Asp Asp 355 360 365 Asp Asp Lys 370 <210〉 32 ‘ <211> 1113 〈212〉 DNA . <213〉人類 〈400〉 32 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1113 atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt cctggactgt acatttccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcctggcagc gagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactgggc aagacacaga ggcagagctc caggacgcea cgctggccct ccacgggctc acggtggagg acgagggcaa ctacacttgc gagtttgcca ccttccccaa ggggtccgtc cgagggatga cctggctcag agtcatagcc aagcccaaga accaagctga ggcccagaag gtcacgttca gccaggaccc tacgacagtg gccc'tctgca tctccaaaga gggccgccca cctgcccgga tctcctggct ctcatccctg gactgggaag ccaaagagac tcaggtgtca gggaccctgg ccggaactgt cactgtcacc agccgcttca ccttggtgcc ctcgggccga gcagatggtg tcacggtcac. ctgcaaagtg gagcatgaga gcttcgagga accagccctg atacctgtga ccctctctgt acgctaccct cctgaagtgt ccatctccgg ctatgatgac aactggtacc tcggccgtac tgatgccacc ctgagctgtg acgtccgcag caacccagag cccacgggct atgactggag cacgacctca ggcaccttcc cgacctccgc. agtggcccag ggctcccagc tggtcatcca cgcagtggac agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg ccgtgggcat gggccgcgct gagcaggtca tctttgtccg agagaccccc aacacagcag gcgcaggggc cacaggcggc atcetcgagg attacaagga tgacgacgat aag <210> 33 12 200823235 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 〈223〉引子 <400> 33 aattgaattc cccaaatctt gtgacaaaac 30 <210> 34 <211> 29 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220〉
    <223〉引子 <400> 34 aattctcgag tcatttaccc ggagacagg 29 〈210〉 35 <211〉 25 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉引子 〈400> 35 aattaagctt atggcccggg ccgct 25 <210> 36 <211〉 24 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉引子 <400〉 36 aattgaattc gggggtttct cgga 24 <210> 37 <211> 583 <212〉 PRT <213〉人類 <400> 37 Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro 5 10 15 Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gin 20 25 30 13 200823235 Asp Val Arg Val Gin Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gin Leu Gly Gly 35 40 45 Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr 50 55 60 He Ser Leu Val Thr Trp Gin Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gin 65 70 75 80 Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro 85 90 95 Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gin Ser Thr 100 105 110 Gly Gin Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gin Asp Ala Thr Leu Ala Leu His 115 120 125 Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr 130 135 140
    Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val He Ala 145 150 155 160 Lys Pro Lys Asn Gin Ala Glu Ala Gin Lys Val Thr Phe Ser Gin Asp 165 170 175 Pro Thr Thr Val Ala Leu Cys He Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala 180 185 190 Arg He Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gin 195 200 205 Val . Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr 210 215 220 Leu Val· Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val 225 230 235 240 Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu lie Pro Val Thr Leu Ser 245 250 255 Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser lie Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp 260 265 270 Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn 275 280 285 Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro 290 295 300 Thr Ser Ala Val Ala Gin Gly Ser Gin Leu Val He His Ala Val Asp 305 310 315 320 Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly 325 330 335 Met Gly Arg Ala Glu Gin Val He Phe Val Arg Glu Thr Pro Glu Phe 340 345 350 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 355 360 365 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 370 375 380 Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 385 390 395 400 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 405 410 415 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 420 425 430 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 435 440 445 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 450 455 460 Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 465 470 475 480 Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 14
    200823235 485 490 495 Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 500 505 510 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 515 520 525 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 530 535 540 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 545 550 555 560 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 565 570 575 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 580 <210> 38 <211〉 1749 <212〉 DNA <213〉人類 <400> 38 atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt cctggactgt acatttccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcctggcagc gagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactgggc aagacacaga ggcagagctc caggacgcca cgctggccct ccacgggctc acggtggagg acgagggcaa ctacacttgc gagtttgcca ccttccccaa ggggtccgtc cgagggatga cctggctcag agtcatagcc aagcccaaga accaagctga ggcccagaag gtcacgttca gccaggaccc tacgacagtg gccctctgca tctccaaaga gggccgccca cctgcccgga tctcctggct ctcatccctg gactgggaag ccaaagagac tcaggtgtca gggaccctgg ccggaactgt cactgtcacc agccgcttda ccttggtgcc ctcgggccga gcagatggtg tcacggtcac ctgcaaagtg gagcatgaga gcttcgagga accagccctg atacctgtga ccctctctgt acgctaccct cctgaagtgt ccatctccgg ctatgatgac aactggtacc tcggccgtac tgatgccacc ctgagctgtg acgtccgcag caacccagag cccacgggct atgactggag cacgacctca ggcaccttcc cgacctccgc agtggcccag ggctcccagc tggtcatcca cgcagtggac agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg ccgtgggcat gggccgcgct gagcaggtca tctttgtccg agagaccccc gaattcccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa <210> 39 <211> 15 〈212〉 PRT <213〉人工序列 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1749 15 <220〉 200823235 <223> Peptide 1 used in Example 16 <400> 39 Cys Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro Lys Pro Gly Ser Glu 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT 〈213>人工序列 <220〉 <223> Peptide 2 used in Example 16 〈400〉 40 Arg Glu Thr Pro Arg Ala Ser Pro Arg Asp Val Gly Pro Leu Cys 5 10 15
    <210〉 41 <211〉 15 〈212〉 PRT 〈213>人工序列 <220 > <223> Peptide 3 used in Example 16 <400> 41 Cys Thr Leu Gly Ala Sex Glu His Ser Pro Leu Lys Thr Pro Tyr 5 10 15 〈210〉 42 〈211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 、 〈220〉 <223〉引子 <400> 42 20 gcccactcaa gaccccctac <210〉 43 <211> 19 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 〈223〉引子 <400> 43 tcgaggcatt tcctgctca <210〉 44 <211〉 21 <212〉 DNA 16 19 200823235 <213〉人工序列 <220〉 <223〉引子 <400> 44 ttgatgctgg cgcctcatgc a <210> 45 <211〉 28 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉引子 <400> 45
    aattgaattc cccagagggc ccacaatc <210> 46 <211〉 27 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉引子 <400> 46 、 aattctcgag tcatttaccc ggagtcc <210> 47 <211〉 29 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉引子 <400> 47 agttaagctt atggcgcgga ccctgcggc <210〉 48 <211> 26 <212> DNA 、 〈213>人工序列 <220> <223〉引子 <400〉 48 attgaattcc gtggcaattg tgtcat <210> 49 200823235 Thr Leu 5 Ser Ser 20 Pro Pro Leu Cys Ala Val Glu Thr 85 Gin Thr 100 Glu Tyr Thr He Cys Lys Val Thr 165 Ser Leu 180 Ala Thr Glu Met lie Ser He Thr 245 Ser Phe 260 Tyr Asp Asn Ala Asp Gly Phe Val 325 Val Thr 340 Ser Asp Pro Ser Pro Phe Thr Glu 405 Pro Gly Gly Gly Lys 15 Leu Gin <211> 637 <212> PRT <213〉人類 <400〉 49 Met Ala Arg Ala Gin Leu Pro Pro Thr 35 Phe Ser Arg 50 His Val Thr 65 Glu Val Asn Lys Ser Ser Val Gin Gly 115 Asn Asp Ala 130 Lys Tyr lie 145 Ser Thr Thr Gly Pro Asp Cys He Ala 195 Asp Leu Gly 210 Ala Thr He 225 Gly Arg Arg lie Arg Tyr Val Thr Gly 275 Leu Lys Cys 290 Ser Arg Leu 305 Thr Leu His lie Cys Lys He Tyr lie 355 Gin Trp His 370 Lys Lys Leu 385 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ccaatatgga acttaatgat ctgcaaagct agttgaaccc aacagtagca aggtgatctt tatcagccag tgtaaaacat tgctcctgaa taatctcaaa ggatggacaa attgactttc aagtgaccaa aattcagtgg gcccttccca caaatcttgt accgtcagtc tgtcctggag ctgcagcccc aggctctgtg ggaaagaatg tgggagaaga ttctctgttc gcaacaatta gttacattcc actgtgagcc gccatttgca ggtgaaatgg tacaagctat ccagccttgg gtttcggtaa tgtaatgctg tggcctgatg aattattctg aaagtcatct catccctcaa ttgtcaactt gacaaaactc ttcctcttcc gcggcaaagc cgacgccaec gtgccttagc tttcattaaa tacatggcaa aaggagaata ctctgcataa cgcttggaaa tgataaaagg tcgcagccac aatccactac ttccaaccag aaaaggacat caggatatga atgcaaatcc gtttattggc gtgtttatat acatttcaga ctgctgacat tggcaacaat acacatgccc ccccaaaacc acaactttcc tccgctgctg tggaccaatt gtgtttaatt aagttcacag tcagggaaga cataggattc tgcccagtcc gccagattct tggaaaaccc aacttctttt atttgctaga ccgatactct tggaaattgg accacccttc ttcagacaat ctgtaaagtg tcctcctact cgaggatcta taaggatgac accgtgccca caaggacacc oooooooooooooooooooooo 628406284062 8406284062 11233445667789 9001223 19 200823235 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a <210> 51 <211> 638 〈212〉 PRT <213〉人類 <400> 51
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    gttgcacata ttgactggga aggtgatctt ggtgaaatgg aatccactac aacttctttt ccaaatgaaa cggcaacgat tatcagccag tacaagctat ttccaaccag atttgctaga ggaaggcgaa ttacttgtgt tgtaaaacat ccagccttgg aaaaggacat ccgatactct ttcatattag acatacagta tgctcctgaa gtttcggtaa caggatatga tggaaattgg tttgtaggaa gaaaaggtgt taatctcaaa tgtaatgctg atgcaaatcc aecacccttc aaatctgtgt ggagcaggtt ggatggacaa tggcctgatg gtttattggc ttcagacaat actcttcatt ttgtccatcc attgactttc aattattctg gtgtttatat ctgtaaagtg accaattccc ttggtcaaag aagtgaccaa aaagtcatct acatttcaga tcctcctact actaccaccc ttcagcctac aattcagtgg catccctcaa ctgctgacat cgaggatcta gcaacagaac ctaaaaaatt gcccttccca ttgtcaactt tggcaacaat taaggatgac acaattgcca cggaattccc cagagggccc acaatcaagc cctgtcctcc atgcaaatgc ccagcaccta acctcttggg tggaccatcc gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat gtactcatga tctccctgag ccccatagtc acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat gacccagatg tccagatcag ctggtttgtg aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca caaacccata gagaggatta caacagtact ctccgggtgg tcagtgccct ccccatccag caccaggact ggatgagtgg caaggagttc aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca gcgcccatcg agagaaccat ctcaaaaccc aaagggtcag taagagctcc acaggtatat gtcttgcctc caccagaaga agagatgact aagaaacagg tcactctgac ctgcatggtc acagacttca tgcctgaaga catttacgtg gagtggacca acaacgggaa aacagagcta aactacaaga acactgaacc agtcctggac tctgatggtt cttacttcat gtacagcaag ctgagagtgg aaaagaagaa ctgggtggaa agaaatagct actcctgttc agtggtccac gagggtctgc acaatcacca cacgactaag agcttctccc ggactccggg taaa 660 720 780 840 900 9601020 1080 11401200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1914 <210〉 53 <211〉 102 <212> DNA <213〉人工<220〉 <223> DNA encoding flag protein <400> 53 ctagtctcga gaattcacgc gtggtacctc tagagtcgac atggactaca aggacgacga tgacaaggct agcgactaca aggacgacga tgacaagtga gc 60102
    <210> 54 <211〉 101 <212〉 DNA <213〉人工 〈220〉 <223> DNA encoding flag protein <400> 54 ' ggccgctcac ttgtcatcgt cgtccttgta gtcgctagcc ttgtcatcgt cgtccttgta gtccatgtcg actctagagg taccacgcgt aattctcgag a 60101 <210> 55 〈211〉 34 <212> DNA <213〉人工 22 200823235 <220〉 <223〉引子 〈400> 55 acgcgtcgac caccatggcg cggaccctgc ggcc <210> 56 <211> 29 <212〉 DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 56 ctagctagcc gtggcaattg tgtcatcct
    <210〉 57 <211> 414 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> Nectin-3ED~FLAG protein <400> 57 Met Ala Arg Thr Leu Arg Pro Ser Pro Leu Cys Pro Gly Gly Gly Lys 1 5 l〇 15 Ala Gin Leu Ser Ser Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Leu Gin 20 25 30 Pro Pro Thr Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Phe Pro Leu Leu Leu 35 40 45 Phe Ser Arg Leu Cys Gly Ala Leu Ala Gly Pro He lie Val Glu Pro 50 55 60 His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn Val Ser Leu Lys Cys Leu lie 65 70 75 80 Glu Val Asn Glu Thr He Thr Gin lie Ser Trp Glu Lys He His Gly 85 90 .95 Lys Ser Ser Gin Thr Val Ala Val His His Pro Gin Tyr Gly Phe Ser 100 105 110 23 200823235 Val Gin Gly Glu Tyr Gin Gly Arg Val Leu Phe Lys Asn Tyr Ser Leu 115 120 125 Asn Asp Ala Thr lie Thr. Leu His Asn He Gly Phe Ser Asp Ser Gly 130 135 140 Lys Tyr lie Cys Lys Ala Val Thr Phe Pro Leu Gly Asn Ala Gin Ser 145 150 155 160 Ser Thr Thr Val Thr Val Leu Val Glu Pro Thr Val Ser Leu He Lys 165 170 175 Gly Pro Asp Ser Leu lie Asp Gly Gly Asn Glu Thr Val Ala Ala lie 180 185 190
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    <223〉引子 <400〉 59 aattgatatc atggctcgga tggggctt 28 0 12 3 1111 2 2 2 2 /\ κ\ /\ /\ sdnaax <220> <223〉引子 〈400〉 60 aattctcgag cacgtaccac tccttctt 〈210> 61 <211〉 1551， <212〉 DNA <213〉人類 <400> 61 atggctcgga tggggcttgc gggcgccgct ggacgctggt ggggactcgc tctcggcttg 60 accgcattct tcctcccagg cgtccactcc caggtggtcc aggtgaacga ctccatgtat 120 ggcttcatcg gcacagacgt ggttctgcac tgcagctttg ccaacccgct tcccagcgtg 180 aagatcaccc aggtcacatg gcagaagtcc accaatggct ccaagcagaa cgtggccatc 240 tacaacccat ccatgggcgt gtccgtgctg gctccctacc gcgagcgtgt ggaattcctg 300 cggccctcct tcaccgatgg cactatccgc ctctcccgcc tggagctgga ggatgagggt 360 gtctacatct gcgagtttgc taccttccct acgggcaatc gagaaagcca gctcaatctc 420 26 、 200823235 acggtgatgg aaggggcagg agtgtggtat cccaatggca cagcagtcct ctcaacgtgc cagcggatgg cactggacca ttcttcaagg cccatcggta tctcctcccg gcggggagca cgccggcaca agcaaggcag gactcagacg gaggaggagg gacgaggacg tacggggacc atggtttctc ccaaacccac atgacaaggt cctgggaaac cagtgacggt tggcctgcat agtatgagcc acgtgaagct cgctaaatgg gacccatcaa cacgctcagg aacatgggcg tcctgctggt ccttcaaggg gcatccccca acgagaagaa agggcggtgg ccaagcggcc ggactctggg agaacgacgg caattggata cctggtggcc tcggttaaaa catcagccgc cgtcaactac tgaggtaacc cacctgcaaa ctctctcccc ctacagcctg ccaggtggag gcgcgccggg gttgattgtg tgactacagc gcaccaccca ggccggccca agggggcgag ctacttcacc ctaccagtac gtctttcatt gagggtaccc acctgcacct ggtgaggcag taccgcctgg cacatggacc attgaggggt gctgatgcta aagggtgtgg gcagggacct gtcaatatca ccggtgccca gtcggcggga accaagaagc ccaatggcac ctgggtggaa cgcaaggtgg gtggatgagg gaccctgagc tccaagaagg aggcagtgct cagccaatgg agtaccagga tgcccagcag gcttcaagga ttgatggcaa accccccagc aggcccagaa acatctgtga cagaattccc cggccatcat tcgtggtcgc acgtgtatgg agaacctgca gcagctatga gcggccccca ccgaggcccg agctggactt agtggtacgt tcgagccaag gaagcctccc gatccggaac ggaagcccac aagcctcact ctggtacctg cactgagtac cagaaccctc ggccaccaac ctacaccccg tgggggcgtg. cctgcgtcgg caacggctac gtaccccgac ggaggaggag ccccaaatat tcaggacggc ggctgagaac g 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1551 <210〉 62 <211〉 517 <212〉 PRT <213〉人類 <400> 62 Met Ala Arg Met Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Pro Gly Val His Ser Gin Val 20 25 30 Val Gin Val Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe He Gly Thr Asp Val Val 35 40 . 45 27 200823235 Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Ser Val Lys He Thr Gin 50 55 60 Val Thr Trp Gin Lys Ser Thr Asn Gly Ser Lys Gin Asn Val Ala He 65 70 75 80 Tyr Asn Pro Ser Met Gly Val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Arg 85 90 95 Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr He Arg Leu Ser 100 105 110
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    <210> 76 <211> 26 <212> DNA 〈213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400> 76 aattcctcga gtcacacata catggc 26 <210> 77 <211〉 27 <212> DNA <213〉人工 <220> 〈223>引子
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    Lys Pro Gly Ser Gin Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gin Ser Thr 100 105 110 Arg Gin Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gin Asp Ala Thr Leu Ala Leu Arg 115 120 125 Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr 130 135 140 Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val lie Ala 145 150 155 160 Lys Pro Gin Asn His Ala Glu Ala Gin Glu Val Thr Phe Ser Gin Asp 165 170 . 175 Pro Val Pro Val Ala Arg Cys lie Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala 180 185 190 Arg He Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gin 195 200 205 Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr 210 215 220 Leu Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val 225 230 235 240 Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu He Pro Val Thr Leu Ser 245 250 255 46 200823235 Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser lie Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp 260 265 270 Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val His Ser Asn 275 280 285 Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly lie Phe Pro 290 295 300 Thr Ser Ala Val Ala Gin Gly Ser Gin Leu Val He His Ala Val Asp 305 310 315 320
    Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly 325 330 335 Met Gly Arg Ala Glu Gin Val lie Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn Thr 340 345 350 Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly He lie Gly Gly He He Ala Ala 355 360 365 lie lie Ala Thr Ala Val Ala Ala Thr Gly lie Leu lie Cys Arg Gin 370 375 380 Gin Arg Lys Glu Gin Thr Leu Gin Gly Ala Glu Glu Asp Glu Asp Leu 385 390 395 400 Glu Gly Pro Pro Ser Tyr Lys Pro Pro Thr Pro Lys Ala Lys Leu Glu 405 410 415 Glu Gin Glu Met Pro Ser Gin Leu Phe Thr Leu Gly Ala Ser Glu His 420 425 430 Ser Pro Leu Lys Thr Pro Tyr Phe Asp Ala Gly Ala Ser Cys Thr Glu 435 440 445 Gin Glu Met Pro Arg Tyr His Glu Leu Pro Thr Leu Glu Glu Arg Ser 450 455 460 Gly Pro Leu His Pro Gly Ala Thr Ser Leu Gly Ser Pro lie Pro Val 465 470 475 480 47 200823235 Pro Pro Gly Pro Pro Val Val Glu Asp Val Ser Leu Asp Leu Glu Asp 485 490 495 Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Leu Asp Lys lie Asn Pro Val 500 505 510 Tyr Asp Ala Leu Ser Tyr Ser Sex Pro Ser Asp Ser Tyr Gin Gly Lys 515 520 525 Gly Phe Val Met Ser Arg Ala Met Tyr Val 530 535 〈210〉 87 <211〉 1614 <212〉 DNA <213> Macaca fascicularis <400〉 87 cgacgccgct gctgtggccg tgcgagttca agtactaccc gccacctgct gccacctgtt atgcacctcc agaccaccag ccagcccgaa gcccggcagc aagacacaga ggcggagctc acgaaggcaa ctacacctgc cctggcteag agtcatagcc gccaggaccc tgtgccagtg tctcctggct ctcatccctg ccggcactgt caccgtcacc tcacggtcac ctgcaaagtg ccctctctgt acgctaccct tcggccgtac tgatgccacc atgactggag cacgacctca tggtcatcca cgcggtggac ccgtgggcat gggccgcgct 60 120 180 240 300 •360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 atggcccggg ccgttgccct cctgccgtcg agatcgccgc ctgctgctgc tgctgctccg gaaaaccgga gcccaggatg gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt cctggactgt acatctccct ggtgacctgg cagcgcccag aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc cagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactaggc caggacgcca cgctggccct ccgcgggctc acggtggagg gagtttgcca ccttccccaa ggggtcggtc cgagggatga aagccccaga accacgctga ggcccaggag gtcacgttca gcccgctgca tctccaaaga gggtcgccca cctgcccgga gactgggaag ccaaagagac ccaggtatca gggaccctgg agccgcttca ccttggtccc ctcgggccga gcagatggtg gagcatgaga gcttcgagga gccagccctg atacctgtga cctgaagtgt ccatctccgg ctatgatgac aactggtacc ctgagctgtg acgtccacag caacccagag cccacgggct ggcatcttcc caacctccgc agtagcccag ggctcccagc agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg 48 1020 200823235
    gagcaggtca tctttgtccg agagaccccc aacacagcag gcgcaggggc cacgggcggc 1080 atcatcgggg gcatcatcgc cgccatcatt gcgactgctg tggctgccac gggcatcctt 1140 atctgccggc agcagcggaa ggagcagacg ctgcaggggg cagaggagga tgaagaccta 1200 gagggacctc cctcctacaa gccaccgacc ccaaaagcga agctggagga gcaggagatg 1260 ccctcccagc tcttcactct gggggcctcg gagcacagcc cactcaagac cccctacttt 1320 gacgctggcg cctcatgcac tgagcaggaa atgcctcgat accatgaatt gcccactttg 1380 gaagagcggt caggacccct gcaccctgga gccacaagcc tgggatcccc catcccggtg 1440 cctccagggc cacctgttgt ggaagacgtt tccctggatc tagaggatga ggagggggag 1500 gaggaggaag agtatctgga taagatcaac cccgtctacg atgctctgtc ctacagcagc 1560 ccctctgatt cctaccaggg caaaggcttt gtcatgtccc gggccatgta cgtg 1614 <210〉 88 <211〉 25 <212> DNA 〈213〉人工 <220> <223〉引子 <400〉 88 aattgaattc atggcccggg ccgtt 25 <210〉 89 <211> 31 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400> 89 aattctcgag tcacacgtac atggcccggg a 31 <210〉 90 <211〉 36 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400> 90 agaagcttgc caccatggcc cgggccgctg ccctcc 36 49 200823235 <210> 91 〈211〉 25 <212〉 DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400〉 91 cattctggtg gtctggaggt gcatc 〈210〉 <211> <212〉 <213〉 ah 9233DN人 <220> <223〉引子 <400> 92 gagaattctc acacatacat ggcccgggac atg 33 <210> 93 <211> 25 <212> DNA 〈213> 人工 <220〉 <223〉引子 <400> 93 gatgcacctc cagaccacca gaatg 25 <210〉 94 <211〉 22 <212> DNA 〈213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400> 94 ctgtgtcttg cctagtgctc tg 〈210〉 95 〈211〉 22 〈212〉 DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 95 50 200823235 cagagcacta ggcaagacac ag 22
    <210> 96 <211〉 21 <212> DNA <213〉 人工 <220〉 <223〉引子 <400> 96 cgtgagcccg cggagggcca g <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400〉 97 ctggccctcc gcgggctcac g 0 12 3 lx ^ IX 2 2 2 2 < < < < ah 9828DN人 <220> <223〉引子 <400> 98 ggatgtgcga gttgcagtgc <210〉 99 <211> 28 <212> DNA 〈213>人工 ccgag <220> <223〉引子 <400> 99 ctcgggtagc actgcaactc gcacatcc <210〉 100 <211> 30 <212> DNA 〈213> 人工 .21 21 28 28 51 <220〉 200823235 <223〉引子 <400> 100 gagttcaagt gctaggcgag gtgcgaggcc <210〉 <211〉 <212> <213> 101二Λχ <220〉 <223〉引子 <400〉 101 ggcctcgcac ctcgcctagc acttgaactc 30 <210〉 <211〉 <212〉 <213> 102 30 DNA 人工 <220> <223〉引子 <400> 102 ccgaggtgcg aggcgcgctc gggggcaccg 30 <210> 〈211> <212〉 <213〉 103 30 DNA 人工 <220〉 <223〉引子 <400> 103 cggtgccccc gagcgcgcct cgcacctcgg 30 <210〉 <211> <212〉 <213〉 104 30 DNA 人工 <220> <223〉引子 <400〉 104 tggagctgcc <210> 105 <211> 30 〈212〉 DNA 52 200823235 <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 105 caggtggcag cagggcgcac ggcagctcca 30 <210> 106 <211> 27 <212> DNA <213〉人工 <220>
    <223〉引子 <400> 106 27 ctgctgccac ctgctcctgg actgtac <210> 107 <211〉 27 <212> DNA <213〉人工 <220〉 〈223>引子 <400> 107 gtacagtcca ggagcaggtg gcagcag 27 <210> 108 <211> 30 <212> DNA <213〉人工 〈220〉 <223〉引子 <400〉 108 ctgttcctgg actggccatc tccctggtga 30 <210〉 109 <211> 30 <212〉 DNA - <213〉人工 〈220> <223〉引子 <400〉 109 tcaccaggga gatggccagt ccaggaacag 30 53 200823235 <210> <211> <212> 〈213〉 0 ah 1 9 N、 1 2 D Ax 〈220〉 <223>引子 〈400〉 110 cctggtgacc tgggcgcgcc cagatgcac 29 <210> 111 <211〉 29 <212> DNA 〈213〉人工 〈220〉 〈223>引子 ‘ <400> 111 gtgcatctgg gcgcgcccag gtcaccagg 29 <210> 112 <211> 29 <212> DNA 〈213> 人工 <220〉 〈223>引子 <400> 112 gcagcgccca gatggacctg cgaaccacc <210〉 113 <211〉 29 〈212〉 DNA 、 <213〉人工 〈220〉 <223〉引子 <400> 113 ggtggttcgc aggtccatct gggcgctgc <210> 114 <211〉 28 <212〉 DNA 〈213> 人工 <220> <223〉引子 <400> 114 54 200823235 gcgcccagat gcaggtgcga accaccag <210> 115 <211> 28 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉.引子 <400> 115 ctggtggttc gcacctgcat ctgggcgc <210> 116 <211> 30
    <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 116 gcccagatgc acctgggaac caccagaatg <210〉 117 <211〉 30 〈212〉 DNA <213〉人工 <220〉 <223〉引子 <40G> 117 cattctggtg gttcccaggt gcatctgggc <210> 118 <211〉 30 〈212〉 DNA <213〉人工 〈220〉 <223〉引子 <400> 118 cagatgcacc tgcggcccac cagaatgtgg <210> 119 〈211〉 30 <212> DNA 〈213> 人工 <220> 200823235 <223〉引子 <400> 119 ccacattctg gtgggccgca ggtgcatctg <210〉 <211〉 <212> <213〉 120 30 DNA 人工 〈220〉 <223〉引子 <400〉 120 atgcacctgc gaacgcccag aatgtggccg 30 <210> <211> <212> 〈213〉 121 30 DNA 人工 <220〉 <223〉引子 <400〉 121 cggccacatt ctgggcgttc gcaggtgcat 30 <210> <211> <212> <213〉 122 26 DNA 人工 <220〉 <223〉引子 <400> 122 cctgcgaacc acgcgaatgt ggccgc <210〉 123 <211> 26 <212〉 DNA <213〉 人工 <220> <223> 引子 <400〉 123 gcggccacat ' > > > 0 12 i—111 2 2 2 4 A 1230DN 56 200823235 <213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400> 124 ctgcgaacca ccaggctgtg gccgccttcc <210> 125 <211〉 30 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉
    <223〉引子 <400> 125 ggaaggcggc cacagcctgg tggttcgcag <210> 126 <211> 30 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 126 ccgccttcca ccctgcgatg ggtcccagct <210> 127 <211> 30 <212> DNA 〈213.〉人工 <220〉 <223〉引子 <400> 127 agctgggacc catcgcaggg tggaaggcgg <210〉 128 <211> 30 <212> DNA <213〉人工 <220> 〈223>引子 <400> 128 gtcccagctt ccccgccccg aagcctggca 200823235 <210> 129 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400> 129 tgccaggctt cggggcgggg aagctgggac 30 <210> 130 <211〉 30 <212> DNA <213〉 人工 <220> 〈223>引子 <400> 130 ccttcgtctc tgccgcgcag agcactgggc 30 <210> 131 〈211〉 30 <212> DNA 〈213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400> 131 gcccagtgct ctgcgcggca gagacgaagg 30
    0 12 3 1X lx IX IX 2 2 2 2 < < < 〈220〉 <223〉引子 <400> 132 tgggcaagac acagcggcag agctccagg 29 〈210〉 133 <211> 29 <212〉 DNA 〈213> 人工 <220〉 <223〉引子 <400> 133 58 200823235 29 cctggagctc tgccgctgtg tcttgccca <210> 134 <211> 29 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 〈400〉 134 ggcagagctc caggccgcca cgctggccc 29 〈210〉 135
    <211> 29 <212〉 DNA <213〉人工 <220> 〈223〉引子 〈400〉 135 gggccagcgt ggcggcctgg agctctgcc 29 <210〉 136 <211〉 30 <212> DNA 〈213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400〉 136 ccacgctggc cctcgccggg ctcacggtgg 30 <210〉 137 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工 <220〉 〈223〉引子 <400〉 137 ccaccgtgag cccggcgagg gccagcgtgg 30 <210> 138 <211> 28 <212〉 DNA 〈213> 人工 59 <220〉 .28200823235
    <223〉引子 <400> 138 ggaggacgag ggcgcctaca cttgcgag <210> 139 <211〉 28 <212> DNA 〈213>人工 <220〉 <223〉引子 <400> 139 ctcgcaagtg taggcgccct cgtcctcc 28
    > > > > 0 12 3 IX 1x IX o ah 1430DN人 <220> 〈223>引子 <400> 140 gcgagtttgc caccgccccc aaggggtccg <210> <211> <212> <213> ulsDNAAX <220> <223〉引子 <400> 141 cggacccctt gggggcggtg gcaaactcgc <210> 142 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 〈400> 142 ttgccacctt ccccgcgggg tccgtccgag <210> 143 <211> 30 <212> DNA 30 30 60 30 200823235 <213〉人工 <220> <223〉引子 <400〉 143 ctcggacgga ccccgcgggg aaggtggcaa 30 <210> 144 <211> 27 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 〈223>引子 <400> 144
    27 cccaaggggt ccgcccgagg gatgacc <210> 145 <211> 27 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 145 ggtcatccct cgggcggacc ccttggg 27 <210〉 146 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 146 ggtccgtccg aggggcgacc tggctcagag 30 <210〉 147 <211> 30 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400〉 147 ctctgagcca ggtcgcccct cggacggacc 30 61 200823235 〈210〉 148 <211> 29 <212> DNA <213〉人工 〈220〉 〈223>引子 <400> 148 ccgtccgagg gatggcctgg ctcagagtc 29 〈210〉 149 <211〉 29 <212> DNA 〈213> 人工 〈220〉 <223〉引子 <400> 149 gactctgagc caggccatcc ctcggacgg 〈210〉 150 <211> 30 〈212〉 DNA <213〉 人工 〈220〉 <223〉引子 <400〉 150 ccaagcccaa gaacgcagct gaggcccaga 30 〈210〉 151 <211> 30 <212> DNA <213〉人工 〈220〉 <223〉引子 <400〉 151 tctgggcctc agctgcgttc ttgggcttgg <210> <211> <212〉 <213> 〈220〉 <223> 152grxs <400> 152 62 200823235 aagctgaggc ccaggcggtc acgttcagcc <210> 153 〈211〉 30 <212〉 DNA <213〉人工 〈220〉 <223〉引子 <400> 153 ggctgaacgt gaccgcctgg gcctcagctt 30 〈210> 〈211> <212> <213> 4 ah 5 ο N K 1 3 D /y
    <220> 〈223〉引子 <400〉 154 cccagaaggt cacggccagc caggacccta <210〉 155 <211> 30 <212> DNA 〈213> 人工 〈220〉 〈223>引子 <400> 155 tagggtcctg gctggccgtg accttctggg 30 30 〈210> 156 <211> 30 <212> DNA 〈213> 人工 <220> <223〉引子 <400> 156 cgttcagcca ggacggtacg acagtggccc > > > > 0 12 3 11* IX IX 2 2 2 2 7 A工 5 o N K 1 3 D Ay 63 <220〉 30 200823235 〈223>引子 <400> 157 gggccactgt cgtaccgtcc tggctgaacg <210> 158 <211> 30 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 158 30 cagtggccct ctgcgcctcc aaagagggcc
    > > > > 0 12 3 ix IX IX lx 2 2 2 2 9 Ax 1530DN人 <220> 〈223〉引子 <400> 159 30 ggccctcttt ggaggcgcag agggccactg <210> 160 <211> 30 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400> 160 ccctctgcat ctccgcagag ggccgcccac <210> 161 <211> 30 <212〉 DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 161 gtgggcggcc ctctgcggag atgcagaggg 〈210〉 162 〈211〉 30 <212> DNA 64 30 200823235 <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 162 cccggatctc ctgggcctca tccctggact <210〉 163 <211> 30 <212> DNA <213> 人工 <220〉 <223> 引子 <400〉 163 agtccaggga tgaggcccag gagatccggg
    <210〉 164 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工 〈220〉 〈223〉引子 <400> 164 tctcatccct ggacgcggaa gccaaagaga <210〉 165 <211〉 30 <212> DNA <213〉 人工 〈220> <223〉引子 <400> 165 tctctttggc ttccgcgtcc agggatgaga <210〉 166 <211〉 29 <212〉 DNA <213> 人工 〈220> <223〉 引子 <400〉 166 ctgggaagcc aaagcgactc aggtgtcag 200823235 7 ah 6 9 N 1 2 D A/ <210〉 <211> <212〉 <213〉 <220> <223〉引子 <400> 167 29 ctgacacctg agtcgctttg gcttcccag <210> 168 <211〉 29 〈212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 〈4⑻ > 168 ctcaggtgtc aggggccctg gccggaact 9 ah 6 9 N 1 2 D ^ > > > > 0 12 3 IX IX ΊΧ IX 2 2 2 2 <220> <223〉引子 <400> 169 agttccggcc agggcccctg acacctgag <210> 170 <211〉 29 <212> DNA 〈213> 人工 <220> <223〉引子 〈400> 170 gagcagatgg tgtcgcggtc acctgcaaa <210> 171 <211〉 29 <212> DNA <213〉人工 <220〉 〈223>引子 <400〉 171 66 200823235 tttgcaggtg accgcgacac catctgctc 29
    <210> 172 <211> 30 <212> DNA <213〉人工 <220> <223>引子 <400> 172 tcacggtcac ctgcgcagtg gagcatgaga <210> 173 〈211〉 30 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400> 173 tctcatgctc cactgcgcag gtgaccgtga <210〉 174 <211> 29 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 <223〉引子 <400> 174 cttcgaggaa ccaggcctga tacctgtga <210> 175 <211> 29 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 175 tcacaggtat caggcctggt tcctcgaag 30 30 29 <210> 176 〈211〉 39 〈212〉 DNA 〈213〉 人工 〈220〉 67 29 39200823235 <223〉引子 <400〉 176 caaaagcttg ccgccaccat gaaacacctg tggttcttc <210> 177 〈211〉 29 〈212〉 DNA <213〉人工 〈220〉 <223〉引子 <400> 177 aaaatgaatt ctcatttacc cggagacag 29
    <210> 178 <211〉 33 <212> DNA 〈213〉 人工 〈220〉 <223> 引子 <400〉 178 ataaagcttg ccgccaccat ggacatgagg gtc 33
    <210〉 179 <211> 38 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 179 ccggaattcc taacactctc ccctgttgaa gctctttg 〈210〉 180 〈211〉 36 <212〉 DNA <213〉人工 〈220〉 〈223>引子 <400> 180 caaaagcttg ccgccaccat ggaarcccca gckcag 38 <210〉 181 <211〉 35 <212> DNA 68 36 35 200823235 <213> 人工 <220> <223> 引子 <400〉 181 caaaagcttg · <210> 182 <211> 30 <212〉 DNA <213〉 人工 <220> 〈223〉 引子 <400> 182 caaaagcttg i 〈210〉 183 〈211〉 19 <212〉 DNA <213〉 人工 <220〉 <223〉 引子 <400〉 183 30 aagtagtcct tgaccaggc 19 > > > > 0 12 3 IX 1i IX IX 2 2 2 2 84 PRT· <400> 184 Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 <210> 185 〈211〉 16 〈212〉 PRT <213〉 人類 <400〉 185 Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn His Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 186 <211> 12 69 200823235 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 186 Asp Gly Gly Asp Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val <210〉 187 <211〉 121 〈212〉 PRT 〈213〉人類 <400> 187 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
    Thr Leu Ser Leu lie Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 Gly Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr He Ser Val Asp Thr Ala Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Asp Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210〉 188 <211> 15 <212> DNA <213〉人類 <400> 188 agttactact ggagc 70 15 48200823235 <210〉 189 <211〉 48 <212> DNA <213〉人類 <400> 189 tatatctatt acagtgggag caccaaccac aacccctccc tcaagagt 〈210〉 190 <211〉 36 <212〉 DNA <213〉 人類 <400〉 190 gatggtgggg acgactacaa ctacggtatg gacgtc 36
    <210> 191 <211〉 363 <212〉 DNA <213> 人類 <400〉 191 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 atctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caaccacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgg ccaagaacca gttctocctg 240 aagctgaact ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatggtggg 300 gacgactaca actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 363
    gcc <210><211〉<212> <213〉 19211 PRT 人類 <220> 〈221〉 〈222〉 <223> <400> misc_feature (9). . (9) Xaa can be any naturally, occurring amino acid 192 Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Ser Xaa Leu Ala 1 5 10 <210〉 193 71 200823235 <211> 7 <212> PRT <213〉人類 <220> 〈221〉misc—featiire <222> (6). . (6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid 〈400〉 193 Asp Ala Ser Ser Leu Xaa Ser 1 5
    <210> 194 <211> 9 <212> PRT 〈213>人類 <220〉. <221〉 misc一feature <222> (3) . . (3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc一feature 〈222〉 （8).. (8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 194 Gin Gin Xaa Asn Ser Tyr Pro Xaa Thr i 5 <210> 195 <211> 107 <212> PRT 〈213>人類 <220〉 <221> misc—featiire <222〉 （32)·.(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> 〈221> misc_feature 〈222〉 （46).. (46) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> mi s c_feature 〈222〉 （55).. (55) 72 200823235 <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc—feature 〈222〉 （58〉.. （58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220〉 〈221〉 misc一feature <222〉 （91)·. (91) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid 〈220〉 〈221〉 misc一feature <222〉 （96)·· (96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400〉 195
    Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr He Thr Gys Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Ser Xaa 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Xaa Ser Gly Xaa Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He lie Ser Leu Gin Pro
    Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Xaa Asn Ser Tyr Pro Xaa 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210〉 196 〈211〉 33 <212〉 DNA <213〉人類 <400> 196 cgggcragtc agggcattag cagygsktta gcc <210> 197 73 33 21 200823235 <211> 21 <212〉 DNA <213〉人類 <400> 197 gatgcmtcca gtttgsaaag t <210> 198 <211> 27 〈212〉 DNA <213〉人類 <400> 198 27 caacagtwta atagttaccc tyggacg <210〉 199 <211〉 321 <212> DNA <213> 人類 <400> 199
    60 120 180 240 300 321 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgyc gggcragtca gggcattagc agygskttag cctggtatca gcagaaacca gggaaagctc ctaagytcct gatctatgat gcmtccagtt tgsaaagtgg grtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcatcag cctgcagcct gaagattttg caacttatta ctgtcaacag twtaatagtt accctyggac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa a <210> 200 <211〉 5 <212> PRT <213〉人類 <400〉 200 Ser Tyr Tyr Trp Thr 15 〈210〉 201 <211〉 16 <212> PRT 〈213〉 人類 <400> 201 Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15 74 200823235 <210> 202 <211> 12 <212> PRT <213〉人類 <400> 202 Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 15 10 <210> 203 <211> 121 <212> PRT <213〉人類 〈400〉 203
    Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 〈210〉 204 <211〉 15 <2i2> DNA <213〉人類 204 <400> 75 200823235 15 48 agttactact ggacc <210〉 205 <211〉 48 <212〉 DNA <213〉 人類 <400> 205 tatgtctatt acagtgggag caccaactac aacccctccc tcaagagt
    <210> 206 <211> 36 <212〉 DNA <213〉 人類 <400〉 206 gaccctgggg aagactacta ctacggtatg gacgtc 36 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga * ctggtgaagc c11cggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggacctggat ccggcagccc 120
    <210〉 207 <211> 363 <212> DNA 〈213〉 人類 <400> 207 ccagggaagg gactggagtg gattggatat gtctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagagcca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtacgag agaccctggg 300 gaagactact actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 gcc 363 <210X 208 <211> 11 〈212〉 PRT 〈213〉人類 <220〉 <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid 〈400〉 208 Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Xaa Leu Ala 1 5 10 76 200823235 <210> 209 <211> 7 <212> PRT <213〉人類 <400> 209 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 210 〈211〉 9 〈212〉 PRT <213〉人類.
    〈400〉 210 Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr <210〉 211 〈211〉 107 <212> PRT <213〉人類 <220〉 <221> misc_feature <222> (32).. (32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid 〈400〉 211 Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Ser Xaa 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 77 200823235 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 212 <211〉 33 <212> DNA <213〉人類 〈400〉 212 cgggcaagtc agggcattag cagtgsttta gcc
    <210〉 213 <211〉 21 <212〉DNA <213〉人類 〈400〉 213 gatgcctcca gtttggaaag t <210> 214 <211> 27 <212> DNA <213〉人類 <400> 214 caacagttta atagttaccc tcggacg <210> 215 <211> 321 <212> DNA <213〉人類 〈400〉 215 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgstttag cctggtatca gcagaaacca gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt: tggaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcggac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa a <210〉 216 <211〉 5 <212〉 PRT 200823235 <2、13>人類 <400> 216 Ser Tyr Asn Met Asn 1 5 〈210〉 217 <211> 17 <212> PRT 〈213>人類 <400> 217 Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly > > > > 0 12 3 IX 1—x Tx 2 2 2 2 8 T類 1 3 R 2 1 p A/ <400> 218 Asp Tyr Tyr Giy Ser Gly Thr Tyr Tyr Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 219 <211〉 123 <212> PRT <213〉人類 〈400〉 219 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 79 200823235 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 220 <211> 15 <212> DNA <213〉人類 15 51 <400〉 220 agctataaca tgaac 〈210〉 221 <211> 51 <212> DNA 〈213〉人類 <400〉 221 tccattagta gtagtagtag ttacatatac tacgcagact cagtgaaggg c 〈210〉 222 〈211〉 39 <212> DNA 〈213〉人類 〈400〉 222 gattactatg gttcggggac ttattatctc tttgactac <210> 223 〈211〉 369 <212> DNA <213〉人類 〈400〉 223 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctataaca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 80 200823235 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagattac 300 tatggttcgg ggacttatta tctctttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcagcc 369 <210〉 224 <211> 11 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 224 Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 5 T類 2 R、 2 7 p > > > > 0 12 3 IT--111 2 2 2 2 <400> 225 Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser 1 5 <210〉 226 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類 〈400〉 226 His Gin Ser Arg Ser Leu Pro lie Thr 1 5 〈210〉 227 <211> 107 〈212〉 PRT <213〉人類 <400> 227 Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys 15 10 15 Glu Lys Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Ser * 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 81 200823235 Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin Ser Arg Ser Leu Pro lie 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 228 <211> 33 〈212〉 DNA 〈213〉人類 <400> 228 33 cgggccagtc agagcattgg tagtagctta cac 9 A類 2 1 N、 2 2 D 7 > > > > 0 12 3 τχ IX 2 2 2 2 <400> 229 tatgcttccc agtccttctc a 21 〈210〉 230 〈211〉 27 〈212〉 DMA <213〉人類 <400〉 230 catcagagta ggagtttacc gatcacc 27 〈210〉 231 <211〉 321 <212〉 DNA <213〉，人類 〈400〉 231 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc atcacctgcc gggccagtca gagcattggt agtagcttac actggtacca gcagaaacca gatcagtctc caaagctcct catcaagtat gcttcccagt ccttctcagg ggtcccctcg 60 120 82 180 240 200823235 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag ectggaagct gaagatgctg cagcgtatta ctgtcatcag agtaggagtt taccgatcac cttcggccaa gggacacgac tggagattaa a <210> 232 〈211〉 5 <212> PRT <213〉人類 <400> 232 Ser Tyr Tyr Trp Thr 1 5
    300 321 <210〉 233 <211> 16 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 233 Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 〈210〉 234 〈211〉 12 <212> PRT <213〉人類 <4.00> 234 Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val <210> 235 <211> 121 <212> PRT 〈213>人類 〈400〉 235 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15 .Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 83 200823235 Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr He Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110
    Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210〉 236 <211〉 15 〈212〉 DNA 〈213〉人類 <400〉 236 agttactact ggacc 15 <210> 237 〈211〉 48 <212〉 DNA 〈213>人類 <400〉 237 48 36 tatatctatt acagtgggag caccaactcc aacccctccc tcaagagt <210〉 238 <211〉 36 <212〉 DNA <213〉人類 <400〉 238 gaccctgggg aagactacaa ctacggtatg gacgtc <210〉 239 <211〉 363 <212> DNA 〈213〉人類 <400> 239 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cttgtccctc 60 84 200823235 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggacctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactccaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtacgag agaccctggg 300 gaagactaca actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 gcc 363 <210> 240 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 240 Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 1 T類 4 R L 2 7 p > > > > 0 12 3 IX IX IX IX 2 2 2 2 <400> 241 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 242 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類 <400〉 242 Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr <210> 243 <211> 107 <212> PRT <213〉人類 <400〉 243 Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 85 200823235 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 .25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Yal Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95
    Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 244 <211> 33 <212> DNA <213〉人類 <400〉 244 cgggcaagtc agggcattag cagtgcttta gcc 33 <210> 245 <211> 21 <212〉 DNA <213〉人類 <400> 245 gatgcctcca gtttggaaag t 21 <210〉 246 <211〉 27 <212> DNA <213〉人類 <400> 246 caacagttta atagttaccc tcggacg 27 <210〉 247 <211〉 321 〈212〉DNA <213〉人類 <400〉 247 86 60200823235 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcggac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa a 120 180 240 300 321
    <210> 248 <211〉 5 <212> PRT <213〉人類 <400> 248 Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210〉 249 <211〉 16 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 249 Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 5 10 15 〈210〉<2il><212〉 <213〉 250 12 PRT 人類 250 Asp Ala Gly Glu Asp Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <400> <210〉 251 <211> 121 <212> PRT 〈213〉人類 <400> 251 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 87 200823235
    Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Ser Ala Ser He Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He 35 40 45 Gly Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr He Ser He Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Ala Gly Glu Asp Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 252 <211〉 15 <212> DNA <213〉人類 〈400〉 252 agttactact ggagc <210〉 <211〉<212> 〈213> 3 A類 5 8 N λ' 2 4 D <400> 253 tatatctatt acagtgggag caccaactac aacccctccc tcaagagt 48 0 12 3 IX ίΛ lx IX 2 2 2 2 < < < < <400> 254 gatgctgggg aggactactc ctacggtatg gacgtc <210> 255 <211> 363 88 60 200823235 <212> DNA 々 <213〉人類 <400〉 255 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc acctgcactg tctctagtgc ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac ccctccctca agagtcgagt caccatatca atagacacgt ccaagaacca gttctccctg aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatgctggg gaggactact cctacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca gcc
    120 180 240 300 360 363 <210> 256 〈211〉 11 <212〉 PRT 〈213〉人類 <400〉 256 Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210〉 257 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉人類 〈400〉 257 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 258 <211〉 8 <212> PRT <213〉人類 〈400〉 258 Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Arg Thr 1 5 . <210> 259 <211〉 106 <212> PRT <213〉人類 89 200823235 <400〉 259 Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
    Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 260 <211〉 33 <212> DNA <213〉人類 <400〉 260 33 cgggcaagtc agggcattag cagtgcttta gcc <210〉 261 〈211〉 21 <212〉 DNA <213〉人類 <400〉 261 21 gatgcctcca gtttggaaag t <210> 262 <211〉 24 <212> DNA <213〉人類 <400〉 262 caacagttta atagttaccg gacg 90 24 200823235 <210> 263 <211〉 318 <212> DNA <213〉人類 <400〉 263 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accggacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaa 318 <210〉 264 <211> 5 <212> PRT <213〉人類 <400> 264 Ser Tyr Tyr Trp Thr 1 5 5 T類 6 6 R 1\ 2 1 p 7 > > > > 0 12 3 IX IX IX 1X 2 2 2 2 <400> 265 Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 266 <211> 12 <212〉 PRT 〈213〉人類 <400> 266 Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210〉 267 <211〉 121 <212> PRT <213〉人類 91 200823235 <400> 267 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 Gly Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
    Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 268 <211〉 15 <212> DNA <213〉人類 15 <400> 268 agttactact ggacc <210> 269 <211> 48 <212> DNA <213〉人類 <400〉 269 tatatctatt acagtgggag caccaactac aacccctccc tcaagagt 48 <210〉 270 <211> 36 <212> DNA <213〉人類 92 36 36200823235 <400〉 270 gaccctgggg aagactacaa ctacggtatg gacgtc <210〉 271 〈211〉 363 <212> DNA <213〉人類 <400> 271 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cttgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggacctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtacgag agaccctggg 300 gaagactaca actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 gcc 363 <210> 272 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 272 Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 273 <211> 7 〈212〉 PRT <213〉人類 <400> 273 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 〈210〉 274 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 274 Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 93 200823235 <210> 275 〈211〉 107 <212> PRT <213〉人類 <400〉 275 Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
    Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 276 <211〉 33 〈212〉 DNA <213〉人類 <400> 276 33 cgggcragtc agggyattag cagygcttta gcc <210> 277 <211〉 21 <212> DNA <213〉人類 〈400〉 277 gatgcctcca gtttggaaag t <210> 278 <211〉 27 <212> DNA 94 21 200823235 <213〉人類 ， <400> 278 caacagttta atagttaccc tcggacg 27 <210〉 279 〈211〉 321 〈212〉 DNA <213〉 人類 〈400〉 279 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
    atcacttgcc gggcragtca gggyattagc agygctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcggac gttcggccaa 3Q0 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210〉 280 〈211〉 5 〈212〉 PRT <213〉人類 <220〉 〈221〉 misc一feature <222〉（3). · (3) <223〉 Xaa can be any naturally occurring amino acid <400〉.280 Ser Tyr Xaa Trp Thr 1 〈210〉 281 〈211〉 16 〈212〉 PRT <213〉 人類 〈400〉 281 Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 〈210〉 282 <21i> 12 <212> PRT <213> 人類 95 200823235 <400〉 282 Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 283 <211〉 121 <212〉 PRT <213〉人類 <220〉 <221> mi sc一f eatur e <222> (33).· (33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 283 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Tyr 20 25 30 Xaa Trp Thr Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He 35 40 45 Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr lie Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 4 A類 8 5 N ^ 2 1 D ^ > > > > 0 12 3 1111 2 2 2 2 96 15 200823235 <400〉 284 agttacwact j <210> 285 <211> 48 <212> DNA <213> 人類 <400> 285 tatatctatt ; <210> 286 <211〉 36 <212〉 DNA <213〉 人類 <400〉 286 48 gaccctgggg aagactacaa ctacggtatg gacgtc 7 3 A類 8 6 N 2 3 D > > > > 0 12 3 IX lx T± ix 2 2 2 2 <400> 287 caggtgcagc acctgcactg ccagggaagg ccctccctca aagctgagtt gaagactaca tgcaggagtc tctctggtgg gactggagtg agagtcgagt ctgtgaccgc actacggtat gggcccagga ctccatcagt gattgggtat caccatatca tgcggacacg ggacgtctgg ctggtgaagc agttacwact atctattaca ttagacacgt gccgtgtatt ggccaaggga cttcggagac ggacctggat gtgggagcac ccaagaacca actgtacgag ccacggtcac cttgtccctc ccggcagccc caactacaac gttctccctg agaccctggg cgtctcctca 60 120 180 240 300 360 gc 0 12 3 lx IX IX 2 2 2 2 < < < < 8 T類 8 1 R 2 1 p A/ <400〉 288 Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala Leu Ala 15 10 > > > 0 12 IX IX 2 2 2 97 200823235 <213〉人類 〈400〉 289 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser <210> 290 〈211〉 9 <212> PRT <213>人類 <400〉 290 Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 . 5
    <210> 291 <211〉 107 <212> PRT <213〉人類 〈400〉 291 Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He· Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 . 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210> 292 <211> 33 <212> DNA 98 33200823235 <213〉人類 <400〉 292 cgggcaagtc agggcattag cagtgcttta gcc <210><211〉<212> <213> 293 21 DNA 人類 <400〉 293 gatgcctcca gtttggaaag t 21 <210〉<211><212> <213〉 294 27 DNA 人類 <400> 294 caacagttta atagttaccc tcggacg 27 <210〉 295 〈211〉 321 <212〉 DNA 〈213〉 人類 <400> 295 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210><211〉<212〉 <213〉 296 5 PRT 人類 <400〉 296 Ser Tyr Tyr Trp Thr 1 5 > > 0 12 111 2 2 2 2916PR 99 200823235 <213〉人類 〈400〉 297 Tyr lie Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 8 T類 9 R L 2 7 p夕 > > > > 0 12 3 1111 2 2 2 2 <400> 298 Gly lie Ala Gly Met Asp Val 1 5 <210> 299 <211〉 116 <212> PRT 〈213〉人類 <400> 299 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Arg Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Thr Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He 35 40 45 Gly Tyr He Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Cys Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala. Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly He Ala Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 100 15 200823235 <210> 300 <211〉 15 <212> DNA <213〉人類 <400〉 300 agttactatt ggacc <210> 301 <211> 48 <212> DNA · <213〉人類 <400〉 301 48 tatatctttt acagtgggag caccaactac aacccctccc tcaagagt
    <210> 302 <211〉 21 <212> DNA <213〉人類 <400> 302 21 ggtatagcag gtatggacgt c <210〉 303 <211〉 348 <212〉 DNA <213〉 人類 <400〉 303
    caggtgcaac tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc acctgcactg tctctggtgg ctccatcaga agttactatt ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atcttttaca ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt aagctgacct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cttcggagac ggacctggat gtgggagcac ccaagaacca actgtgcgaa cctcagcc cctgtccctc ccggcagccc caactacaac gtgctccctg aggtatagca 60120 180 240 300 348 <210〉 304 〈211〉 11 <212〉 PRT <213〉 人類 〈400〉 304 Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 101 200823235 <210> 305 <211> 7 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 305 Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser 1 5 <210> 306 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人類 <400> 306 His Gin Ser Arg Ser Leu Pro lie Thr 7 7 T類 ο o R 3 1 p /y > > > > 0 12 3 IX 1X 1A wi 2 2 2 2 <400〉 307 Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys Γ 5 . 10 15 Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu He 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin Ser Arg Ser Leu Pro lie 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105 102 200823235 <210> 308 <211〉 36 <212> DNA <213〉人類 <400> 308 agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc 36 <210> 309 <211〉 21 〈212〉 DNA <213〉人類 <400> 309 ggtgcatcca gcagggccac t 21
    <210> 310 <211〉 27 <212〉 DNA <213〉人類 <400〉 310 cagcagtatg gtagctcacc gtacact 27 <210> 311 <211> 324 <212〉 DNA <213〉 人類 〈400〉 311 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgta cacttttggc 300 caggggacca agctggagat caaa 324 〈210〉 312 〈211〉 11 <212〉 PRT <213〉 人類 <400〉 312 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu 1 5 10 103 200823235 <210〉 313 <211> 10 <212> PRT <213〉人類 <400〉 313
    Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr 1 5 <210〉 314 <211〉 21 <212> DNA <213> 人類 〈400〉 314 atgaaacacc tgtggttctt c 21 <210> 315 <211> 18 <212> DNA <213〉人類 <400> 315 atggaaaccc cagcgcag 18 <210> 316 <211〉 30 〈212〉 DNA <213〉人工 <220> 〈223〉引子
    <400> 316 ggatgaattc tcatttaccc ggagacaggg 30 <210> 317 〈211〉 28 <212> DNA <213〉人工 <220> r <223〉引子 <400> 317 ccggaattcc taacactctc ccctgttg 28 104
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