TR201808018T4 - Anti-B7-H3 antikoru. - Google Patents
Anti-B7-H3 antikoru. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201808018T4 TR201808018T4 TR2018/08018T TR201808018T TR201808018T4 TR 201808018 T4 TR201808018 T4 TR 201808018T4 TR 2018/08018 T TR2018/08018 T TR 2018/08018T TR 201808018 T TR201808018 T TR 201808018T TR 201808018 T4 TR201808018 T4 TR 201808018T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- amino acid
- sequence represented
- antibody
- seo
- numbers
- Prior art date
Links
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 claims abstract description 156
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 claims abstract description 156
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 84
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 376
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 353
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 353
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 301
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 196
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 191
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 126
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 118
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 90
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 86
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 58
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 49
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 40
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 39
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 37
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 30
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 29
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 29
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 28
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 20
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 17
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 17
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 13
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 13
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 13
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 12
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 claims description 12
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 12
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 11
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 claims description 11
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 10
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 claims description 9
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 8
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 5
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 4
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 claims description 3
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims description 3
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 claims description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 22
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 134
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 92
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 87
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 79
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 79
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 68
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 61
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 56
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 52
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 46
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 40
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 38
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 35
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 35
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 35
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 34
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 34
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 34
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 34
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 34
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 33
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 32
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 32
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 28
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 25
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 25
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 22
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 22
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 21
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 21
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 21
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 21
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 21
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 20
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 18
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 18
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 18
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 16
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 16
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 16
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 16
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 15
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 15
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 14
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 13
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 101000884279 Homo sapiens CD276 antigen Proteins 0.000 description 12
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 12
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 12
- -1 for example Proteins 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 12
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 11
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 8
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 102000048770 human CD276 Human genes 0.000 description 8
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 8
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 8
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 8
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 7
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 5
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 5
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 4
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N Chromium-51 Chemical compound [51Cr] VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 3
- 101710093458 ICOS ligand Proteins 0.000 description 3
- 102100034980 ICOS ligand Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101000884277 Mus musculus CD276 antigen Proteins 0.000 description 3
- 101710094000 Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150085390 RPM1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 3
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 3
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 3
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N Asn-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220541878 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein_M30L_mutation Human genes 0.000 description 2
- 239000012739 FreeStyle 293 Expression medium Substances 0.000 description 2
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- JPHYJQHPILOKHC-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JPHYJQHPILOKHC-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- VAIWPXWHWAPYDF-FXQIFTODSA-N Glu-Asp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VAIWPXWHWAPYDF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 2
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 2
- RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N Lys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N Phe-Pro Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N1[C@@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102100032990 Trem-like transcript 2 protein Human genes 0.000 description 2
- 101710149051 Trem-like transcript 2 protein Proteins 0.000 description 2
- LWFWZRANSFAJDR-JSGCOSHPSA-N Trp-Val Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LWFWZRANSFAJDR-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 2
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003385 sodium Chemical class 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 208000023747 urothelial carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTHUYJIXSMGYOQ-KOORYGTMSA-N 17-hydroxyprogesterone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)C)[C@@]1(C)CC2 VTHUYJIXSMGYOQ-KOORYGTMSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150111329 ACE-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OKEWAFFWMHBGPT-XPUUQOCRSA-N Ala-His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CN=CN1 OKEWAFFWMHBGPT-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N Ala-Tyr-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)CC1=CC=C(O)C=C1 AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N Arg-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SUIJFTJDTJKSRK-IHRRRGAJSA-N Asn-Pro-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SUIJFTJDTJKSRK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- REQUGIWGOGSOEZ-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Asn Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)C(=O)N REQUGIWGOGSOEZ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VHQOCWWKXIOAQI-WDSKDSINSA-N Asp-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VHQOCWWKXIOAQI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N Asp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- QLNSPJMIYWEWNF-UHFFFAOYSA-N CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C.CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C.CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C QLNSPJMIYWEWNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100244725 Caenorhabditis elegans pef-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102100037412 Germinal-center associated nuclear protein Human genes 0.000 description 1
- RBWKVOSARCFSQQ-FXQIFTODSA-N Gln-Gln-Ser Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RBWKVOSARCFSQQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- QFJPFPCSXOXMKI-BPUTZDHNSA-N Gln-Gln-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N QFJPFPCSXOXMKI-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- SIGGQAHUPUBWNF-BQBZGAKWSA-N Gln-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O SIGGQAHUPUBWNF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NJMYZEJORPYOTO-BQBZGAKWSA-N Gln-Pro Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O NJMYZEJORPYOTO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- QXUPRMQJDWJDFR-NRPADANISA-N Glu-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QXUPRMQJDWJDFR-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N Gly-Ala-Tyr Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- PABFFPWEJMEVEC-JGVFFNPUSA-N Gly-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)CN)C(=O)O PABFFPWEJMEVEC-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N Gly-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- BLCLNMBMMGCOAS-URPVMXJPSA-N Goserelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](COC(C)(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NNC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 BLCLNMBMMGCOAS-URPVMXJPSA-N 0.000 description 1
- 108010069236 Goserelin Proteins 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- RWIKBYVJQAJYDP-BJDJZHNGSA-N Ile-Ala-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN RWIKBYVJQAJYDP-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- CNMOKANDJMLAIF-CIQUZCHMSA-N Ile-Thr-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNMOKANDJMLAIF-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHSJMSCOLJVTCX-ZDLURKLDSA-N L-Glutaminyl-L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O HHSJMSCOLJVTCX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220470475 L-seryl-tRNA(Sec) kinase_C57L_mutation Human genes 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- KAFOIVJDVSZUMD-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Gln Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O KAFOIVJDVSZUMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAPNERBWQWUPTI-YUMQZZPRSA-N Lys-Gln Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O OAPNERBWQWUPTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PLOUVAYOMTYJRG-JXUBOQSCSA-N Lys-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PLOUVAYOMTYJRG-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004696 Poly ether ether ketone Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DXTOOBDIIAJZBJ-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DXTOOBDIIAJZBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CPRLKHJUFAXVTD-ULQDDVLXSA-N Pro-Leu-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CPRLKHJUFAXVTD-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- RCYUBVHMVUHEBM-RCWTZXSCSA-N Pro-Pro-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RCYUBVHMVUHEBM-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108090000919 Pyroglutamyl-Peptidase I Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FZEUTKVQGMVGHW-AVGNSLFASA-N Ser-Phe-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FZEUTKVQGMVGHW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 206010065954 Stubbornness Diseases 0.000 description 1
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- LCPVBXOHXMBLFW-JSGCOSHPSA-N Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)=CNC2=C1 LCPVBXOHXMBLFW-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- WVHUFSCKCBQKJW-HKUYNNGSSA-N Trp-Gly-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WVHUFSCKCBQKJW-HKUYNNGSSA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N Trp-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JONPRIHUYSPIMA-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ala-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JONPRIHUYSPIMA-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- AZGZDDNKFFUDEH-QWRGUYRKSA-N Tyr-Gly-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AZGZDDNKFFUDEH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N Tyr-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- FZSPNKUFROZBSG-ZKWXMUAHSA-N Val-Ala-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O FZSPNKUFROZBSG-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- VFOHXOLPLACADK-GVXVVHGQSA-N Val-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VFOHXOLPLACADK-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FMQGYTMERWBMSI-HJWJTTGWSA-N Val-Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](C(C)C)N FMQGYTMERWBMSI-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010045350 alanyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 229940103272 aluminum potassium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960002932 anastrozole Drugs 0.000 description 1
- YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N anastrozole Chemical compound N#CC(C)(C)C1=CC(C(C)(C#N)C)=CC(CN2N=CN=C2)=C1 YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000019568 aromas Nutrition 0.000 description 1
- 239000003886 aromatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940046844 aromatase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N benzene-1,4-diol;bis(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1.C1=CC(F)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(F)C=C1 JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004365 benzoic acid Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 description 1
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007707 calorimetry Methods 0.000 description 1
- 229940034605 capromab pendetide Drugs 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- FRPJXPJMRWBBIH-RBRWEJTLSA-N estramustine Chemical compound ClCCN(CCCl)C(=O)OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 FRPJXPJMRWBBIH-RBRWEJTLSA-N 0.000 description 1
- 229960001842 estramustine Drugs 0.000 description 1
- 239000000328 estrogen antagonist Substances 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 229960002913 goserelin Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002163 hydrogen peroxide Drugs 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000031942 natural killer cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008529 pathological progression Effects 0.000 description 1
- 229960005079 pemetrexed Drugs 0.000 description 1
- QOFFJEBXNKRSPX-ZDUSSCGKSA-N pemetrexed Chemical compound C1=N[C]2NC(N)=NC(=O)C2=C1CCC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QOFFJEBXNKRSPX-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 238000011170 pharmaceutical development Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002530 polyetherether ketone Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 229960004622 raloxifene Drugs 0.000 description 1
- GZUITABIAKMVPG-UHFFFAOYSA-N raloxifene Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=C(C(=O)C=2C=CC(OCCN3CCCCC3)=CC=2)C2=CC=C(O)C=C2S1 GZUITABIAKMVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HYHCSLBZRBJJCH-UHFFFAOYSA-M sodium hydrosulfide Chemical compound [Na+].[SH-] HYHCSLBZRBJJCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium atom Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N trappsol cyclo Chemical compound CC(O)COC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)COCC(O)C)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1COCC(C)O ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 108010027345 wheylin-1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
- VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N yttrium atom Chemical compound [Y] VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Mevcut buluş, bir tümör üzerinde bir terapötik etkiye sahip olan bir antikor ile ilgilidir. Yani, buluş bir anti-tümör aktivite göstermesi için B7-H3'ü bağlayan bir antikor ile ilgilidir. Buluşun bir amacı, bir tümör üzerinde bir terapötik etkiye sahip olan bir farmasötik sağlamaktır. Bir anti-tümör aktivite göstermesi için B7-H3'ü bağlayan bir anti-B7-H3 antikoru elde etme ile, bir tümörü tedavi etmek için antikoru ve benzerlerini içeren bir farmasötik bileşim elde edilir.
Description
TARIFNAME
ANTI-B7-H3 ANTIKORU
Teknik Saha
Mevcut bulus, B7-H3'ü baglayan ve bir tümör için bir terapötik ve/veya önleyici ajan
olarak yararli olan bir antikor ile ilgilidir ve ayrica bir tümörü tedavi etmenin ve/veya
önlemenin bir yönteminde kullanimi için antikor ile de ilgilidir.
Teknigin Altyapisi
B7-H3, bir tek-geçisli transmembran yapiya sahip olan bir proteindir (Patent-disi belge
1). B7-H3'ün N-ucu ekstraselüler alani, iki varyant içerir. Varyant 1, iki yerin her birinde
sirasiyla bir V-benzeri ve bir C-benzeri lg alani içerir ve Varyant 2, bir yerinde sirasiyla
bir V-benzeri ve bir C-benzeri lg alani içerir. B7-H3'ün N-ucu intraselüler alani 45
amino asit içerir.
B7-H3 için bir reseptör olarak, bir tek-geçisli transmembran yapiya sahip olan TLT-2
bildirilmistir (Patent-disi belge 2). Bununla birlikte, burada ayrica, TLT-2'nin B7-H3 için
bir reseptör olmadigini direten bir rapor da vardir (Patent-disi belge 3). Önceki rapora
göre, reseptör B7-H3'e baglandiginda, CD8-pozitif T hücrelerinin aktivasyonu
güçlendirilir.
B7-H3'ün çogu kanser tipinde, özellikle küçük-hücreli-olmayan akciger kanserinde,
böbrek kanserinde, ürotelyal karsinomda, kolorektal kanserde, prostat kanserinde,
gliyoblastom multiformede, ovaryan kanserde ve pankreatik kanserde asiri-eksprese
edildigi klinik olarak bildirilmistir (Patent-disi belgeler 4 ila 11). Ilaveten, prostat
kanserinde, B7-H3'ün ekspresyonunun yogunlugunun klinikopatolojik malignite,
örnegin, tümör hacmi, ekstraprostatik invazyon veya Gleason skoru ile pozitif bir
sekilde korele oldugu ve ayrica kanser progresyonu ile de korele oldugu bildirilmistir
(Patent-disi belge 8). Benzer sekilde, gliyoblastom multiformede, B7-H3'ün
ekspresyonu olaysiz sag kalim ile negatif bir sekilde koreledir (Patent-disi belge 9) ve
pankreatik kanserde, B7-H3'ün ekspresyonu, lenf nodu metastazi ve patolojik
progresyon ile koreledir (Patent-disi belge 11). Ovaryan kanserde, B7-H3'ün
ekspresyonu, lenf nodu metastazi ve patolojik progresyon ile koreledir.
Ilaveten, B7-H3 genine karsi bir B7-H3-pozitif kanser hücresi hattina siRNA uygulama
ile, fibronektine yapiskanligin azaltildigi ve böylece hücre göçünün ve matrijel
invazyonunun azaltildigi bildirilmistir (Patent-disi belge 12). Ilaveten, gliyoblastom
multiformede, B7-H3'ün ekspresyonunun NK hücresi-aracili hücre ölümünden kaçmaya
olanak sagladigi bildirilmistir (Patent-disi belge 13).
Diger taraftan, B7-H3'ün yalnizca kanser hücrelerinde degil ayni zamanda tümörlerde
veya çevreleyen damarlarda da ek3prese edildigi bildirilmistir (Patent-disi belgeler 5 ve
14). BY-H3 ovaryan kanser kan damarlarinda eksprese edildiginde, sag kalim oraninin
düsürüldügü bildirilmistir.
B7 familyasi moleküllerinin, immün sistem ile ilgili oldugu öne sürülmüstür. B7-H3'ün,
monositlerde, dentritik hücrelerde ve aktive edilmis T hücrelerinde eksprese edildigi
bildirilmistir (Patent-disi belge 15). Sitotoksik T hücreleri aktive edildiginde, B7-H3'ün
CD4-pozitif veya CD8-pozitif T hücrelerinin proliferasyonunu kostimüle ettigi
bildirilmistir. Bununla birlikte, burada ayrica B'I-H3'ün bir kostimülatör rol oynamadigina
yönelik bir rapor da vardir (Patent-disi belge 1).
B7-H3 moleküllerinin, otoimmün hastaliklar ile ilgili oldugu bildirilmistir. Romatizmada
ve diger otoimmün hastaliklarda, BY-H3'ün fibroblast-benzeri sinoviositler ve aktive
edilmis T-hücreleri arasindaki etkilesimde önemli bir rol oynadigi (Patent-disi belge 16)
ve BY-H3'ün, sitokinler aktive edilmis makrofajlardan salindiginda bir kostimülatör
faktör olarak islev gösterdigi ve böylelikle sepsisin meydana gelmesi ile ilgili oldugu
(Patent-disi belge 17) bildirilmistir. Ilaveten, bir anti-BT-HS antikorunu indüksiyon fazi
sirasinda astimin bir fare modeline uygulama ile, rejyonel lenf nodlarinda Th2 hücresi-
aracili sitokin üretiminin bir anti-fare B7-H3 antikorunu uygulanmasi yoluyla
baskilanmasindan dolayi astimin Iyilestirildigi bildirilmistir (Patent-disi belge 18).
B7-H3 açisindan, fare B7-H3'üne karsi bir antikorun intra-tümöral infiltre eden CD8-
pozitif T hücrelerini güçlendirdigi ve tümör büyümesini baskiladigi bildirilmistir (Patent-
disi belge 14). Ilaveten, BT-H3 varyant 1'i taniyan bir antikorun adenokarsinom
üzerinde bir in vivo anti-tümör etki gösterdigini açiklayan bir patent vardir (Patent
belgesi 1).
tanimayan bir monoklonal antikor TES7'yi açiklar.
Patent belgesi 2, insan B7-homologu 3'ün 4lg alan izoformunu, 4Ig-B7-H3'ü, baglayan
bir monoklonal antikor 8H9'u açiklar.
Bu çalismalara ragmen, bir anti-B7-H3 antikoru için bir in vivo anti-tümör etki gösteren
bir epitop simdiye kadar açiklanmamistir ve BT-H3'ün ekstraselüler alaninin bir spesifik
amino asit dizisinin kanseri tedavi etmek amaciyla bir monoklonal antikor için bir epitop
olarak kullanisli olduguna yönelik rapor yoktur.
Antikorlar ayni antijen için spesifik olsa bile, antikorlarin özellikleri, antikorlarin
epitoplarindaki veya dizilerindeki farkliliklardan dolayi çesitlilik gösterebilir. Antikorlarin
özelliklerindeki farkliliktan dolayi, insanlara klinik olarak uygulanmakta olduklarinda,
antikorlar tibbi ajanin etkililigi, terapötik yanitin sikligi, yan etkilerin insidansi veya ilaç
direnci, vb. açisindan farkli reaksiyonlar gösterir.
B7-H3'e karsi antikorlar ile ilgili olarak ayrica, esi benzeri görülmemis özelliklere sahip
olan bir antikorun olusturulmasi da güçlü bir sekilde talep edilmektedir.
Ilgili Teknik Belgeler
Patent Belgesi
Patent-disi Belgeler
Patent-disi Belge 2: Proceedings of the National Academy of Sciences of the
Patent-disi Belge 7: Cancer Immunology, Immunotherapy, 2010, vol. 59, pp.
1163-1171
Patent-disi Belge 13: Proceedings of the National Academy of Sciences of the
Patent-disi Belge 19: American Association for Cancer Research. Proceedings
of the Annual Meeting, April 2008, vol. 49, page 606.
Bulusun Kisa Açiklamasi
Bulus tarafindan Çözülecek olan Problemler
Bulusun bir amaci, bir tümör üzerinde bir terapötik etkiye sahip olan bir farmasötik
içinde kullanilacak olan bir antikor ve antikorun bir fonksiyonel fragmanini saglamaktir
ve bir tümörü tedavi etmenin bir yönteminde kullanim için bir antikor veya antikorun bir
fonksiyonel fragmanini saglamaktir ve benzerleridir.
Problemleri Çözmek için Araçlar
Mevcut bulusun sahipleri, yukaridaki amaci basarmak amaciyla yogun çalismalar
yapmistir ve sonuç olarak, bunlar bir anti-tümör aktivite göstermesi için B7-H3'ü
spesifik olarak baglayan bir antikor buldular ve böylelikle bulusu tamamladilar. Yani,
bulus, asagidaki buluslari içerir.
(1) Asagidaki özelliklere sahip olma ile karakterize edilen bir antikor veya bunun bir
fonksiyonel fragmani:
(a) B7-H3'ü spesifik olarak baglama, burada B7-H3, SEQ ID NO: 6 veya 10 ile
temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir moleküldür ve antikor veya antikorun
bir fonksiyonel fragmani, IgC2'den olusan bir polipeptidi baglar, burada IgCZ,
BY-H3'ün bir alanidir;
(b) bir antikor-bagimli hücre-aracili fagositoz (ADCP) aktivitesine sahip olma;
(0) bir in vivo anti-tümör aktivitesine sahip olma ve
(d) B7-H3'ü baglamak için M30 antikoruna karsi bir kompetitif inhibitör aktiviteye
sahip olma, burada M30 antikoru, SEQ ID NO: 51'in 20 ila 471 arasindaki
amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir agir zincir ve
SEO lD NO: 53'ün 23 ila 235 arasindaki rezidülerinden olusan bir amino asit
dizisi içeren bir hafif zincir içerir.
(2) Yukaridaki (1)'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, her
biri B7-H3'ün bir alani olan lgCt'i ve lgC2'yi baglar.
(3) Yukaridaki (1)'e veya (2)'ye göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani
olup, burada IgCZ, SEQ ID NO: 6'da 358 ila 456 arasindaki amino asit numaralari
ile temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir alandir.
(4) Yukaridaki (2)'ye göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup,
burada IgCt, SEQ ID NO: 6'da 140 ila 244 arasindaki amino asit numaralari ile
temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir alandir.
(5) Yukaridaki (1) ila (4) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun
bir fonksiyonel fragmani olup, bir antikor-bagimli hücresel sitotoksisite (ADCC)
aktivitesine ve/veya bir kompleman-bagimli sitotoksisite (CDC) aktivitesine sahiptir.
(6) Yukaridaki (1) ila (5) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun
bir fonksiyonel fragmani olup, burada tümör, kanserdir.
(7) Yukaridaki (6)'ya göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup,
kanser, akciger kanseridir, meme kanseridir, prostat kanseridir, pankreatik
kanserdir, kolorektal kanserdir, bir melanomdur, karaciger kanseridir, ovaryan
kanserdir, idrar kesesi kanseridir, mide kanseridir, özofajiyal kanserdir veya böbrek
kanseridir.
(8) Yukaridaki (1) ila (7) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikonin
bir fonksiyonel fragmani olup, agir zincirin tamamlayicilik belirleme bölgeleri olarak
SEQ ID NO: 92 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRH1, SEQ ID
NO: 93 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRH2 ve SEQ ID NO: 94
ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRH3 içerir ve hafif zincirin
tamamlayicilik belirleme bölgeleri olarak SEQ ID NO: 95 ile temsil edilen bir amino
asit dizisinden olusan CDRL1, SEQ ID NO: 96 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan CDRL2 ve SEQ ID NO: 97 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan CDRL3 içerir.
(9) Yukaridaki (1) ila (8) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun
bir fonksiyonel fragmani olup, SEQ ID NO: 51'de 20 ila 141 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken
bölgesi ve SEO ID NO: 53'te 23 ila 130 arasindaki amino asit numaralari ile temsil
edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içerir.
(10) Yukaridaki (1) ila (9) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya
antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, burada bir sabit bölge, bir insan-kaynakli
sabit bölgedir.
(11) Yukaridaki (10)'a göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup,
burada SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir
zincir ve SEO ID NO: 59 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif
zincir içerir.
(12) Yukaridaki (1) ila (11) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya
antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, beserilestirilmistir.
(13) Yukaridaki (12)'ye göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup,
asagidakileri içerir: (a) SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (b) SEQ ID NO: 87'de 20 ila
141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (c)
SEQ ID NO: 89'da 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden, (d) SEQ lD NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (e) (a) ila (d) arasindaki
dizilerin herhangi biri ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip olan
bir amino asit dizisinden ve (f) burada (a) ila (d) arasindaki dizilerin herhangi birinde
bir veya bir kaç amino asidin silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir amino asit
dizisinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir
degisken bölgesi ve (g) SEQ ID NO: ?1'de 21 ila 128 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (h) SEQ lD NO: 73'te 21 ila
128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (i)
SEQ ID NO: 75'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden, (j) SEQ ID NO: ?7'de 21 ila 128 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (k) SEQ ID NO: 79'da 21 ila
128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (I)
SEO ID NO: 81'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden, (m) SEQ ID NO: 83'te 21 ila 128 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (n) (9) ila (m) arasindaki
dizilerin herhangi biri ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip olan
bir amino asit dizisinden ve (o) burada (9) ila (m) arasindaki dizilerin herhangi
birinde bir veya bir kaç amino asidin silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir
amino asit dizisinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisinden olusan bir
(14) Yukaridaki (13)'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup,
asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir degisken bölgesi ve bir hafif
zincir degisken bölgesi içerir: SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken
bölgesi ve SEO ID NO: ?1'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil
edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO:
85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 73'te 21 ila 128
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan
bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken
bölgesi ve SEO ID NO: 75'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil
edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO:
85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEQ ID NO: ?7'de 21 ila 128
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan
bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken
bölgesi ve SEO ID NO: 79'da 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil
edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO:
85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 81'de 21 ila 128
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan
bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken
bölgesi ve SEO ID NO: 83'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil
edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO:
91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 71'de 21 ila 128
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan
bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken
bölgesi ve SEO ID NO: 73'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil
edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO:
91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 75'te 21 ila 128
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan
bir hafif zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino
asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir
degisken bölgesi ve SEO ID NO: ?7'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari
ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi.
(15) Yukaridaki (13)'e veya (14)'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel
fragmani olup, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir ve bir hafif
zincir içerir: SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil
edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 71'de 21 ila
233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden
olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari
ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 73'te
21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO
asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino
asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve
SEQ ID NO: ??'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki
amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir
ve SEQ lD NO: ?9'da 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen
bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan
bir agir zincir ve SEO ID NO: 81'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile
temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila
471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden
olusan bir agir zincir ve SEQ lD NO: 83'te 21 ila 233 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID
NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino
asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?1'de 21 ila 233 arasindaki
amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif
zincir; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil
edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?3'de 21 ila
233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden
olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit
numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO
asit dizisinden olusan bir hafif zincir ve SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki
amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir
ve SEQ ID NO: ?7'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen
bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir.
(16) Yukaridaki (13) ila (15) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya
antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir
agir zincir ve bir hafif zincir içerir: SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?1 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?3 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ lD NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?5 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?7 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden
dizisinden
dizisinden
dizisinden
dizisinden
dizisinden
dizisinden
dizisinden
dizisinden
olusan bir agir zincir ve SEO lD NO: 79 ile temsil edilen bir amino
olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino
olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 81 ile temsil edilen bir amino
olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino
olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 83 ile temsil edilen bir amino
olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino
olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 71 ile temsil edilen bir amino
olusan bir hafif zincir; SEQ lD NO: 91 ile temsil edilen bir amino
olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 73 ile temsil edilen bir amino
dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 75 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir hafif zincir ve SEO ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO lD NO: 77 ile temsil edilen bir amino asit
dizisinden olusan bir hafif zincir.
(17) Yukaridaki (1) ila (16) arasindakilerin herhangi birine göre antikorun
fonksiyonel fragmani olup, burada fonksiyonel fragman Fab, F(ab)2, Fab' ve Fv'den
olusan gruptan seçilir.
(18) Yukaridaki (1) ila (16) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya
antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, bir birinci ve bir ikinci agir zincir içerir,
burada birinci ve ikinci agir zincirin her biri bagimsiz bir sekilde asagidaki (i) ila (iii)
arasindan seçilir:
(i) bir tam-boy agir zincir;
(ii) burada agir zincirin karboksil ucundan 1 amino asidin silindigi bir agir
zincir veya
(iii) burada agir zincirin karboksil ucundan 2 amino asidin silindigi bir agir
tercihen, burada birinci ve ikinci agir zincirin her biri madde (ii)'den seçilir.
(19) Yukaridaki (18)'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup,
burada birinci ve ikinci agir zincirin her biri bagimsiz bir sekilde maddeler (ii)'den
veya (iii)'ten seçilir ve burada agir zincirin karboksik ucunda yer alan amino asit
rezidüsü amidatlanir, tercihen burada amino asit rezidüsü, bir prolin rezidüsüdür.
(20) Yukaridaki (1) ila (19) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya
antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, burada antikor veya antikorun fonksiyonel
fragmani, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir modifikasyon içeren bir
modifiye edilmis varyanttir: bir kimyasal kismin bir amino asit rezidüsüne baglantisi,
bir N-bagli veya O-bagli karbonhidrat zinciri, N-bagli veya O-bagli glikosilasyon, N-
veya C-ucu isleme, deamidasyon, bir aspartik asit rezidüsünün izomerizasyonu, bir
metiyonin rezidüsünün oksidasyonu ve bir metiyonin rezidüsünün N-ucuna
eklenmesi.
(21) Yukaridaki (1) ila (20) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya
antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, burada bir glikanin modifikasyonu, bir
antikor-bagimli hücresel sitotoksik aktiviteyi güçlendirmek için regüle edilir.
(22) Bir polinükleotid olup, yukaridaki (1) ila (17) arasindakilerin herhangi birine
göre antikoru veya antikorun birfonksiyonel fragmanini sifreler.
arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO:
52'de 67 ila 390 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi
(24) Yukaridaki (22)'ye veya (23)'e göre polinükleotid olup, SEQ ID NO: 62 ile
temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 58 ile temsil edilen bir nükleotid
dizisi içerir.
(25) Yukaridaki (22)'ye veya (23)'e göre polinükleotid olup, asagidakileri içerir: (a)
SEO ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir
nükleotid dizisinden, (b) SEQ ID NO: 86`da 58 ila 423 arasindaki nükleotid
numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (C) SEQ ID NO: 88'de 58 ila
423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (d)
SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir
nükleotid dizisinden ve (e) (a) ila (d) arasindaki nükleotid dizilerinin herhangi birine
komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir polinükleotide sert kosullar
altinda hibridize olan bir polinükleotid içeren bir nükleotid dizisinden olusan gruptan
seçilen bir nükleotid dizisi ve (f) SEQ ID NO: 70`te 61 ila 384 arasindaki nükleotid
numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (g) SEQ ID NO: ?2'de 61 ila
384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (h)
SEQ ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir
nükleotid dizisinden, (i) SEQ ID NO: 76'da 61 ila 384 arasindaki nükleotid
numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (j) SEQ ID NO: ?8'de 61 ila 384
arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (k) SEQ ID
NO: 80'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid
dizisinden, (I) SEQ ID NO: 82'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile
temsil edilen bir nükleotid dizisinden ve (m) (f) ila (l) arasindaki nükleotid dizilerinin
herhangi birine komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir polinükleotide
sert kosullar altinda hibridize olan bir polinükleotid içeren bir nükleotid dizisinden
olusan gruptan seçilen bir nükleotid dizisi.
(26) Yukaridaki (25)'e göre polinükleotid olup, asagidakilerden olusan gruptan
seçilen nükleotid dizileri içerir: SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid
numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70'te 61 ila 384
arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO:
84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi
ve SEO ID NO: 72'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir
nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile
temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid
numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423
arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO:
76'da 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi;
SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir
nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 78'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile
temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid
numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO lD NO: 80'de 61 ila 384
arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO:
84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi
ve SEO ID NO: 82'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir
nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile
temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid
numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 90'da 58 ila 423
arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO lD NO:
SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir
nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile
temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki
nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 76'da 61 ila
384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi.
(27) Yukaridaki (25)'e veya (26)'ya göre polinükleotid olup. asagidakilerden olusan
gruptan seçilen nükleotid dizileri içerir: SEQ ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki
nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?0'de 61 ila
699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID
NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid
dizisi ve SEO ID NO: ?2'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil
edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid
numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 699
arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO:
84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi
ve SEO ID NO: ?6'da 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir
nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile
temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: ?8'de 61 ila 699 arasindaki
nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila
1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID
NO: 80'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid
dizisi; SEQ ID NO: 84`te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil
edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 82'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid
numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ile 1413
arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO lD NO:
SEQ ID NO: 90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir
nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 72'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile
temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ile 1413 arasindaki nükleotid
numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: 74'te 61 ila 699
arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO:
90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid
dizisi ve SEO ID NO: ?6'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil
edilen bir nükleotid dizisi.
(28) Yukaridaki (25) ila (27) arasindakilerin herhangi birine göre polinükleotid olup,
asagidakilerden olusan gruptan seçilen nükleotid dizileri içerir: SEQ ID NO: 84 ile
temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: ?0 ile temsil edilen bir nükleotid
dizisi; SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?2 ile
temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi
ve SEO ID NO: ?4 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84 ile temsil
edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: 76 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi;
SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?8 ile temsil
edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve
SEO ID NO: 80 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen
bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: 82 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID
NO: 90 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70 ile temsil edilen bir
nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO:
72 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90 ile temsil edilen bir nükleotid
dizisi ve SEO ID NO: 74 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 90 ile
temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 76 ile temsil edilen bir nükleotid
(29) Bir ekspresyon vektörü olup, yukaridaki (22) ila (28) arasindakilerin herhangi
birine göre bir polinükleotid içerir.
(30) Bir konak hücre olup, yukaridaki (29)'a göre ekspresyon vektörü ile transforme
(31) Yukaridaki (30)'a göre konak hücre olup, burada konak hücre, bir ökaryotik
hücredir.
(32) Bir antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini üretmenin bir yöntemi
olup, karakterize edici özelligi, yukaridaki (30)'a veya (31)'e göre konak hücreyi
kültürlemenin bir adimini ve kültürleme adiminda elde edilen bir kültürlenmis
Üründen arzu edilen bir antikoru veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini
toplamanin bir adimini içermesidir.
(33) Bir farmasötik bilesim olup, karakterize edici özelligi, yukaridaki (1) ila (21)
arasindakilere göre antikorlarin veya antikorlarin fonksiyonel fragmanlarinin en az
birini Içermesidir.
(34) Yukaridaki (33)'e göre farmasötik bilesim olup, bir tümörü tedavi etmek içindir.
(35) Bir tümörü tedavi etmek için bir farmasötik bilesim olup, karakterize edici
özelligi, yukaridaki (1) ila (21) arasindakilere göre antikorlarin veya antikorlarin
fonksiyonel fragmanlarinin en az birini ve kanser için en az bir terapötik ajan
içermesidir.
(36) Yukaridaki (1) ila (21) arasindakilere göre antikor veya antikorun fonksiyonel
fragmani olup, bir tümörü tedavi etmenin bir yönteminde kullanim içindir.
(37) Bir tümörü tedavi etmenin bir yönteminde kullanim için yukaridaki (1) ila (21)
arasindakilere göre antikor veya antikorun fonksiyonel fragmani olup, yöntem
antikoru veya fonksiyonel fragmani ve kanser için en az bir terapötik ajani es-
zamanli olarak, ayri ayri veya sirali olarak bir bireye uygulamayi içerir.
(38) Yukaridaki (34)'e veya (35)'e göre kullanim için farmasötik bilesim veya
yukaridaki (36)'ya veya (37)'ye göre kullanim için antikor veya fonksiyonel fragman
(39) Yukaridaki (38)'e göre farmasötik bilesim, antikor veya fonksiyonel fragman
olup, burada kanser, akciger kanseridir, meme kanseridir, prostat kanseridir,
pankreatik kanserdir, kolorektal kanserdir, bir melanomduri karaciger kanseridir,
ovaryan kanserdir, idrar kesesi kanseridir, mide kanseridir, özofajiyal kanserdir
veya böbrek kanseridir.
Bulusun Avantaji
Bulusa göre, kanser için, BT-H3'ü baglayan ve kanser hücrelerine karsi bir anti-tümör
aktivitesine sahip olan bir antikor içeren bir terapötik ajan veya benzeri elde edilebilir.
Sekillerin Kisa Açiklamasi
aktivitesinin varligini veya yoklugunu gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata
çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=3).
hücrelerine karsi ADCP aktivitesinin varligini veya yoklugunu gösteren bir
gösterimdir.
hücrelerine ve BY-HS-eksprese eden 293 hücrelerine karsi ADCC aktivitesinin
varligini veya yoklugunu gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari,
standart hatalari temsil eder (n=3). Sekilde, "sahte", M30'un bos vektör ile
transfekte edilmis 293 hücrelerine karsi ADCC aktivitesini gösterir ve "B7H3",
M30'un B7-H3-eksprese eden 293 hücrelerine karsi ADCC aktivitesini gösterir.
aktivitesinin varligini veya yoklugunu gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata
çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=3).
reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun
baglama özelligini gösterir ve düz çizgi. bir M30 antikorunun baglama özelligini
gösterir.
reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun
baglama özelligini gösterir ve düz çizgi, bir M30 antikorunun baglama özelligini
gösterir.
reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun
baglama özelligini gösterir ve düz çizgi, bir M30 antikorunun baglama özelligini
gösterir.
reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun
baglama özelligini gösterir ve düz çizgi, bir M30 antikorunun baglama özelligini
gösterir.
karsi reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun
baglama özelligini gösterir ve düz çizgi, bir M30 antikorunun baglama özelligini
gösterir.
reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun
baglama özelligini gösterir ve düz çizgi, bir M30 antikorunun baglama özelligini
gösterir.
edilmis farelere karsi anti-tümör aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki
hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=10).
aktivitesini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari
temsil eder (n=8). ilaveten, "mm^3", "mm3" ifadesini gösterir.
karsi ADCP aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari,
standart hatalari temsil eder (n=4).
ile implante edilmis farelere karsi anti-tümör aktivitelerini gösteren bir
gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=9).
varyant 1 antijeninin bir ekstraselüler alan polipeptit antijenini baglama için
M30'a karsi kompetitif inhibitör aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki
hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=3).
varyant 2 antijeninin bir ekstraselüler alan polipeptit antijenini baglama için
M30'a karsi kompetitif inhibitör aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki
hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=3).
antikorunun NCl-H322 hücrelerine karsi ADCP aktivitelerini gösteren bir
gösterimdir. Sekildeki hata Çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=4).
hücrelerine karsi ADCC aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata
çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=3).
(SEQ ID NO: 28).
(SEQ ID NO: 29).
gösterir (SEO ID NO: 50).
gösterir (SEQ ID NO: 51).
gösterir (SEO ID NO: 52).
gösterir (SEQ ID NO: 53).
sabit bölgesinin ve bir Insan poII-A ekleme sinyalinin bir nükleotid dizisini
gösterir (SEQ ID NO: 56).
nükleotid dizisini gösterir (SEQ ID NO: 57).
dizisini gösterir (SEO ID NO: 58).
dizisini gösterir (SEQ ID NO: 59).
dizisini gösterir (SEQ ID NO: 62).
dizisini gösterir (SEQ ID NO: 63).
(SEQ ID NO: 70).
gösterir (SEQ ID NO: 71).
(SEO ID NO: 72).
gösterir (SEO ID NO: 73).
(SEO ID NO: 74).
gösterir (SEO ID NO: 75).
(SEO ID NO: 76).
gösterir (SEO ID NO: 77).
(SEO ID NO: 78).
gösterir (SEO ID NO: 79).
(SEO ID NO: 80).
gösterir (SEO ID NO: 81).
(SEO ID NO: 82).
gösterir (SEO ID NO: 83).
(SEO ID NO:84).
gösterir (SEO ID NO: 85).
(SEO ID NO: 86).
gösterir (SEO ID NO: 87).
(SEO ID NO:88).
gösterir (SEQ ID NO: 89).
(SEQ ID NO: 90).
gösterir (SEQ ID NO: 91).
231 hücreleri ile implante edilmis farelere karsi anti-tümör aktivitesini gösteren
bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=6).
Bulusu Uygulama Modu
Burada kullanildigi sekliyle, "kanser" ve “tümör“ terimleri ayni anlamda kullanilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "gen" terimi, yalnizca DNA'yi degil ayni zamanda bunun
mRNA'sini, bunun cDNA'sini ve bunun cRNA'sini da içerir.
Burada kullanildigi sekliyle, "polinükleotid" terimi, bir nükleik asit ile ayni anlamda
kullanilir ve ayrica DNA'yi, RNA'yi, problari, oligonükleotidleri ve primerleri de içerir.
Burada kullanildigi sekliyle, "polipeptit" ve "protein" terimleri, ayrim olmadan kullanilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "hücre" terimi ayrica, bir hayvan bireyi içindeki hücreleri ve
kültürlenmis hücreleri de içerir.
Burada kullanildigi sekliyle, "B7-H3", B7-H3 proteini ile ayni anlamda kullanilir ve
ayrica, B7-H3 varyant 1'i ve/veya B7-H3 varyant 2'yi de ifade eder.
Burada kullanildigi sekliyle, "hücre yaralanmasi" terimi, burada hücrelerde bazi formda
patolojik degisime neden olunan bir hâli ifade eder ve hücre yaralanmasi dogrudan
yaralanma ile sinirlandirilmaz ve hücrelerin yapisina ve fonksiyonuna hasarin tüm
çesitlerini, örnegin, DNA klevajini, baz-dimer olusumunu, kromozomal klevaji, hücre
bölünme mekanizmasina hasari ve çesitli enzimatik aktivitelerde bir düsüsü, içerir.
Burada kullanildigi sekliyle, "sitotoksik aktivite" terimi, yukarida-tarif edilen hücre
yaralanmasina neden olma aktivitesini ifade eder.
Burada kullanildigi sekliyle, "antikor-bagimli hücre-aracili fagositoz aktivitesi" terimi,
örnegin, tümör hücrelerini, bir antikor tarafindan aracilik edilen monositler veya
makrofajlar ile fagositoz etme aktivitesi anlamina gelir. Terim ayrica, "antikor-bagimli
fagositoz aktivitesi" olarak da adlandirilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "antikor-bagimli hücresel sitotoksisite aktivitesi" terimi,
örnegin, tümör hücrelerine, bir antikor tarafindan aracilik edilen NK hücreleri ile hasar
verme aktivitesi anlamina gelir.
Burada kullanildigi sekliyle, "kompleman-bagimli sitotoksisite aktivitesi" terimi,
örnegin, tümör hücrelerine, bir antikor tarafindan aracilik edilen kompleman ile hasar
verme aktivitesi anlamina gelir.
Burada kullanildigi sekliyle, "bir antikorun fonksiyonel fragmani" terimi, bir antikorun bir
antijen-baglama aktivitesine sahip olan bir parsiyel fragmanini ifade eder, burada Fab,
F(ab')2, scFv ve benzerlerini içeren fragman antikorun bir tam veya parsiyel
fonksiyonuna sahiptir. Terim ayrica, indirgeme kosullari altinda F(ab')2'ye muamele
etme ile elde edilen bir antikorun bir degisken bölgesi içindeki bir tek-degerlikli fragman
olan Fab' molekülünü de içerir. Bununla birlikte, terim, fragman bir antijen için bir
baglama afinitesine sahip oldugu sürece bu moleküller ile sinirlandirilmaz. ilaveten, bu
fonksiyonel fragmanlar yalnizca, bir antikor proteininin bir tam-boy molekülüne uygun
bir enzim ile muamele etme ile elde edilen bir fragmani degil ayni zamanda bir genetik
olarak modifiye edilmis antikor geni kullanilarak uygun bir konak hücre içinde üretilen
bir proteini de içerir.
Burada kullanildigi sekliyle, "Fab'" terimi, yukarida tarif edildigi üzere indirgeme
kosullari altinda F(ab')2'ye muamele etme ile elde edilen bir antikorun bir degisken
bölgesi içindeki bir tek-degerlikli fragmani ifade eder. Bununla birlikte, bir genetik olarak
modifiye edilmis antikor geni kullanilarak üretilen Fab' da, bulusun Fab' terimine dâhil
Burada kullanildigi sekliyle, "epitop" terimi, bunu bir spesifik anti-B7-H3 antikorunun
bagladigi B7-H3'ün bir parsiyel peptit veya bir parsiyel tersiyer yapisini ifade eder.
Yukarida-tarif edilen B7-H3'ün bir parsiyel peptidi olan epitop, teknikte uzmanligi olan
kisiler tarafindan iyi bilinen bir yöntem, örnegin, bir immüno-analiz, ile belirlenebilir ve
örnegin, asagidaki yöntem kullanilabilir. Ilk olarak, bir antijenin çesitli parsiyel yapilari
üretilir. Parsiyel yapilarin üretilmesinde, bir bilinen oligopeptit sentez teknigi
kullanilabilir. Örnegin, C ucundan veya N ucundan BY-Hß'ü sirali bir sekilde kisaltma ile
elde edilen uygun sekilde kisaltilmis uzunluklara sahip olan bir dizi polipeptit, teknikte
uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen bir genetik rekombinasyon teknigi kullanilarak
üretilir. Bundan sonra, bu polipeptitlere karsi bir antikorun reaktivitesi incelenir ve bir
tanima yeri kabaca belirlenir. Akabinde, daha kisa uzunluklara sahip olan peptitler
sentezlenir ve antikorun bu peptitler ile reaktivitesi incelenir, böylece epitop
belirlenebilir. ilaveten, bunu bir spesifik antikorun bagladigi bir antijenin bir parsiyel
tersiyer yapisi olan epitop, antikora bitisik uzanan antijenin amino asit rezidülerini X-
isini yapisal analizi ile tanimlama ile belirlenebilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "ayni epitopu baglayan antikorlar“ ifadesi, ortak bir epitopu
baglayan farkli antikorlari ifade eder. Bir ikinci antikor bunu bir birinci antikorun
bagladigi bir parsiyel peptidi veya bir parsiyel tersiyer yapiyi bagladiginda, birinci
antikorun ve Ikinci antikorun ayni epitopu bagladigi belirlenebilir. ilaveten, bir ikinci
antikorun bir antijeni baglamak için bir birinci antikor ile rekabet ettigini (yani, ikinci
antikorun birinci antikor ve antijen arasindaki baglamayi inhibe ettigini) konfirme etme
ile, spesifik epitop dizisi veya yapisi belirlenmemis olsa bile, birinci antikorun ve ikinci
antikorun ayni epitopu bagladigi belirlenebilir. ilaveten, birinci antikor ve ikinci antikor
ayni epitopu bagladiginda ve ayrica birinci antikor bir özel aktiviteye, örnegin, bir anti-
tümör aktivitesine, sahip oldugunda, ikinci antikorun da ayni aktiviteye sahip olmasi
beklenir. Bu dogrultuda, bir ikinci anti-B7-H3 antikoru, bunu bir birinci anti-B7-H3
antikorunun bagladigi bir parsiyel peptidi bagladiginda, birinci antikorun ve ikinci
antikorun B7-H3'ün ayni epitopunu bagladigi belirlenebilir. Ilaveten, bir ikinci anti-B7-
H3 antikorunun BY-H3'ü baglamak için bir birinci anti-B7-H3 antikoru ile rekabet ettigini
konfirme etme ile, birinci antikorun ve ikinci antikorun B7-H3'ü ayni epitopunu baglayan
antikorlar oldugu belirlenebilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "CDR" terimi, bir tamamlayicilik belirleme bölgesini (CDR)
ifade eder ve bir antikor molekülünün her bir agir ve hafif zincirinin üç tamamlayicilik
belirleme bölgesine (CDR'Iere) sahip oldugu bilinir. CDR ayrica. hiper-degisken bölge
olarak da adlandirilir ve bir antikorun her bir agir ve hafif zincirinin bir degisken bölgesi
içinde bulunur. Bu, bunun primer yapisinda olagan disi bir sekilde yüksek degiskenlige
sahip olan bir yerdir ve burada polipeptidin her bir agir ve hafif zincirinin primer
yapisinda üç ayri CDR vardir. Bu spesifikasyonda, bir antikorun CDR'Ieri açisindan,
agir zincirin CDR'Ierii agir zincirin amino asit dizisinin amino-ucu tarafindan CDRH1,
CDRH2 ve CDRH3 ile temsil edilir ve hafif zincirin CDR'Ieri, hafif zincirin amino asit
dizisinin amino-ucu tarafindan CDRL1. CDRL2 ve CDRL3 ile temsil edilir. Bu yerler,
tersiyer yapida birbirine yakindir ve bunu antikorun bagladigi bir antijen için özgüllügü
Burada kullanildigi sekliyle, "hibridizasyon sert kosullar altinda gerçeklesir" ifadesi,
burada hibridizasyonun bunun altinda, bir piyasada satilan hibridizasyon çözeltisi
ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech, Inc. firmasi tarafindan üretilir) içinde
68°C'de hibridizasyon gerçeklestirme ile veya üzerine immobilize edilmis DNA'ya sahip
olan bir filtre kullanilarak 0,7 ile 1,0 M NaCI varliginda 68°C'de hibridizasyon
gerçeklestirme, akabinde 0,1 ila 2 x SSC çözeltisi (1 x SSC çözeltisi, 150 mM NaCI'den
ve 15 mM sodyum sitrattan olusturulur) kullanilarak 68°C`de yikama gerçeklestirme ile
tanimlamanin basarilabildigi kosullar altinda veya buna es-deger kosullar altinda
gerçeklestirildigi bir prosesi ifade eder.
1. B7-H3
B7-H3, bir kostimülatör molekül olarak antijen-sunan hücreler üzerinde eksprese edilen
B7 familyasinin bir üyesidir ve immün aktiviteyi güçlendirmek veya baskilamak için T
hücreleri üzerindeki bir reseptör üzerinde etki ettigi düsünülür.
B7-H3, bir tek-geçisli transmembran yapisina sahip olan bir proteindir ve BY-H3'ün N-
ucu ekstraselüler alani iki varyant içerir. B7-H3 varyant 1 (4Ig-B7-H3) sirasiyla iki
yerinde bir V-benzeri veya C-benzeri lg alani içerir ve B7-H3 varyant 2 (2Ig-BT-H3)
sirasiyla bir yerinde bir V-benzeri veya C-benzeri lg alani içerir.
Bulusun ürünlerini yapmak için kullanilacak olan B7-H3 için oldugu gibi, BT-H3, bir
insanin veya bir insan-olmayan memelinin (örnegin, bir siçanin veya birfarenin) B7-H3-
eksprese eden hücrelerinden dogrudan saflastirilabilir ve kullanilabilir veya yukarida-
tarif edilen hücrelerin bir hücre membrani fraksiyonu hazirlanabilir ve kullanilabilir.
ilaveten, BY-H3 bunun in vitro sentezi veya genetik mühendisligi yoluyla bir konak
hücre içinde bunun üretilmesi ile elde edilebilir. Bu tarz genetik mühendisliginde,
spesifik olarak, B7-H3 cDNA'si B7-H3 cDNA'sini eksprese edebilen bir vektöre entegre
edildikten sonra, B7-H3, bunu transkripsiyon veya translasyon için gerekli olan
enzimleri, substratlari ve enerji maddelerini içeren bir çözelti içinde sentezleme ile veya
B7-H3'ü bir baska prokaryotik veya ökaryotik transforme edilmis konak hücre içinde
eksprese etme ile elde edilebilir.
Bir insan B7-H3 varyant 1 geninin bir açik okuma çerçevesinin (ORF) nükleotid dizisi,
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 5 ile temsil edilir ve bunun amino asit dizisi, Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 6 ile temsil edilir. ilaveten, SEQ ID NO.'Iari: 5'in ve 6'nin dizileri
Sekil 13'te gösterilir.
Bir insan BY-H3 varyant 2 geninin bir ORF'sinin nükleotid dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID
NO: 9 ile temsil edilir ve bunun amino asit dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 10 ile
temsil edilir. ilaveten, SEQ lD NO.'Iari: 9'un ve 10'un dizileri Sekil 14'te gösterilir.
ilaveten, burada B7-H3'ün yukarida-tarif edilen amino asit dizilerinin herhangi birinde
bir veya bir kaç amino asidin sübstüte edildigi, silindigi ve/veya eklendigi bir amino asit
dizisinden olusan ve ayrica proteininkine es-deger olan bir biyolojik aktiviteye de sahip
olan bir protein de, B7-H3'e dâhil edilir.
Bundan sinyal dizisinin uzaklastirildigi matür insan B7-H3 varyant 1, SEQ ID NO: 6 ile
temsil edilen amino asit dizisinin 27 ila 534 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan
bir amino asit dizisine karsilik gelir. ilaveten, bundan sinyal dizisinin uzaklastirildigi
matür insan B7-H3 varyant 2'si, SEQ ID NO: 10 ile temsil edilen amino asit dizisinin 27
ila 316 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisine karsilik gelir.
B7-H3 varyant 1'de, ilgili alanlar, N ucundan itibaren lgV1, IgC1, IgV2 ve IgCZ
sirasinda bulunur ve Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 6'da, IgV1, 27 ila 139 arasindaki
amino asit numaralarina karsilik gelir, IgC1, 140 ila 244 arasindaki amino asit
numaralarina karsilik gelir, IgV2, 245 ila 357 arasindaki amino asit numaralarina
karsilik gelir ve IgC2, 358 ila 456 arasindaki amino asit numaralarina karsilik gelir.
ilaveten, BT-H3 varyant 2'de, ilgili alanlar, N ucundan itibaren IgV1 ve IgCZ sirasinda
bulunur ve Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 10'da, IgV1, 27 ila 140 arasindaki amino asit
numaralarina karsilik gelir ve !902, 141 ila 243 arasindaki amino asit numaralarina
karsilik gelir.
B7-H3 cDNA'si, örnegin, burada bir sablon olarak B7-H3 cDNA'sini eksprese eden bir
cDNA kütüphanesi ve B7-H3 cDNA'sini spesifik olarak çogaltan primerler kullanilarak
bir polimeraz zincir reaksiyonunun (bundan SOnra "PCR" olarak ifade edilir)
gerçeklestirildigi bir PCR denilen yöntem, ile elde edilebilir (Saiki, R. K. et al., Science,
nükleotid dizisine komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir polinükleotide
sert kosullar altinda hibridize olan ve B7-H3'ünkine es-deger olan bir biyolojik aktiviteye
sahip olan bir proteini sifreleyen bir polinükleotid de, B7-H3 cDNA'sina dâhil edilir.
ilaveten, insan veya fare B7-H3 Iokusundan transkribe edilen bir uç-birlestirme varyanti
olan bir polinükleotid veya buna komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir
polinükleotide sert kosullar altinda hibridize olan ve B'I-H3'ünkine es-deger olan bir
biyolojik aktiviteye sahip olan bir proteini sifreleyen bir polinükleotid de BY-H3
cDNA'sina dâhil edilir.
ilaveten, burada Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 6 veya 10 ile temsil edilen amino asit
dizisinde bir veya bir kaç amino asidin sübstüte edildigi, silindigi veya eklendigi bir
amino asit dizisinden veya bu dizilerin her birinden sinyal dizisini uzaklastirma ile elde
edilen bir amino asit dizisinden olusan ve B7-H3'ünkine es-deger olan bir biyolojik
aktiviteye sahip olan bir protein de, B7-H3'e dâhil edilir. ilaveten, fare veya insan B7-H3
asit dizisinden veya burada yukaridaki amino asit dizisinde bir veya bir kaç amino
asidin sübstüte edildigi, silindigi veya eklendigi bir amino asit dizisinden olusan ve B7-
H3'ünkine es-deger olan bir biyolojik aktiviteye sahip olan bir protein de, B7-H3'e dâhil
2. Anti-B7-H3 antikorunun üretilmesi
Burada tarif edildigi üzere B7-H3'e karsi bulusun antikoru, bir hayvani B7-H3 veya B7-
H3'ün amino asit dizisinden seçilen bir gelisigüzel polipeptit ile immünize etme ve
yaygin prosedürlere göre in vivo üretilen antikoru toplama ve saflastirma ile elde
edilebilir. Bir antijen olarak kullanilacak olan B7-H3'ün biyolojik türü, insanoglu ile
sinirlandirilmaz ve bir hayvan. insanlar disindaki bir hayvandan. örnegin, bir fareden
veya bir siçandan, türetilen B7-H3 ile immünize edilebilir. Bu durumda, elde edilen
heterolog B7-H3'ü ve insan BT-Hß'ünü bir antikor baglamasi arasindaki çapraz-
reaktiviteyi inceleme ile, bir insan hastaligi için uygulanabilir olan bir antikor seçilebilir.
ilaveten, bir monoklonal antikor, B7-H3'e karsi bir antikor üreten antikor-üreten
hücreleri bilinen yöntemlere göre miyelom hücreler ile kaynastirma ile olusturulan bir
Bu arada, bir antijen olarak kullanilacak olan B7-H3 genetik mühendisligi kullanilarak
bir konak hücre içinde B7-H3 genini eksprese etme ile elde edilebilir.
Spesifik olarak, B7-H3 genini eksprese edebilen bir vektör üretilir ve elde edilen vektör
geni eksprese etmesi için bir konak hücre içine transfekte edilir ve akabinde eksprese
edilen B7-H3 saflastirilir. Bundan sonra, B7-H3'e karsi bir antikor elde etmenin bir
yöntemi spesifik olarak tarif edilecektir.
(1) Antijenin preparasyonu
Anti-B7-H3 antikoru üretmek için kullanilacak olan antijenin örnekleri, B7-H3'ü, B7-
H3'ün ardisik en az 6 amino asidini içeren bir parsiyel amino asit dizisinden olusan bir
polipeptidi ve buna verilen bir amino asit dizisini veya tasiyiciyi ekleme ile elde edilen
bir türevi içerir.
B7-H3, insan tümör dokularindan veya tümör hücrelerinden dogrudan saflastirilabilir ve
kullanilabilir. ilaveten, B7-H3 bunu in vitro sentezleme ile veya bunu genetik
mühendisligi ile bir konak hücre içinde üretme ile elde edilebilir.
Bu tarz genetik mühendisligi açisindan, spesifik olarak, B7-H3 cDNA'si B7-H3
cDNA'sini eksprese edebilen bir vektör içine entegre edildikten sonra, B7-H3, bunu
transkripsiyon ve translasyon için gerekli olan enzimleri. substratlari ve enerji
maddelerin içeren bir çözelti içinde sentezleme ile veya B7-H3'ü bir baska prokaryotik
veya ökaryotik transforme edilmis konak hücre içinde eksprese etme ile elde edilebilir.
ilaveten, antijen ayrica, bir membran proteini olan B7-H3'ün ekstraselüler alanini uygun
bir konak-vektör sisteminde bir antikorun sabit bölgesine baglama ile elde edilen bir
füzyon proteinini eksprese etme ile bir sekretuvar protein olarak da elde edilebilir.
B7-H3 cDNA'si, örnegin, bir sablon olarak B7-H3 cDNA'sini eksprese eden bir cDNA
kütüphanesi ve B7-H3 cDNA'sini spesifik olarak çogaltan primerler kullanilarak bir
polimeraz zincir reaksiyonunun (bundan sonra "PCR" olarak ifade edilir)
gerçeklestirildigi bir PCR denilen yöntem, ile elde edilebilir(bakiniz, Saiki, R. K. et al.,
Polipeptidin in vitro sentezi için sistem olarak, örnegin, Roche Diagnostics, Inc. firmasi
tarafindan üretilen Rapid Translation System (RTS), örnek olarak gösterilebilir, ancak
bununla sinirlandirilmaz.
Prokaryotik konak hücrelerin örnekleri, Escherichia co/i'yi ve Baci'llus subtili's'i içerir.
Konak hücreleri bir hedef gen ile transforme etmek için, konak hücreler, bir replikon,
yani, konak ile uyumlu olan bir türden türetilen bir replikasyon orijini ve bir regülatör
dizi, içeren bir plazmid vektörü ile transforme edilir. Ilaveten, vektör tercihen,
transforme edilmis hücreye fenotipik selektivite verebilen bir diziye sahiptir.
Ökaryotik konak hücrelerin örnekleri, omurgali hücrelerini, böcek hücrelerini ve maya
hücrelerini içerir. Omurgali hücreler olarak, örnegin, simian COS hücreleri (Gluzman,
Y., Cell, (, mürin fibroblastlari NIH3T3 (ATCC
No: CRL-1658) ve Çin hamsteri ovaryan hücrelerinin (CHO hücrelerinin; ATCC: CCL-
61) dihidrofolat redüktaz-kusurlu suslari (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl.
birlikte, hücreler bunlarla sinirlandirilmaz.
Bu sekilde elde edilen transformant, yaygin prosedürlere göre kültürlenebilir ve
transformanti kültürleme ile, bir hedef polipeptit intraselüler veya ekstraselüler olarak
üretilir.
Kültürleme için kullanilacak olan uygun bir vasat, kullanilan konak hücrelere bagli
olarak yaygin bir sekilde kullanilan çesitli kültür vasatlarindan seçilebilir. Escherichia
coli kullanildiginda, örnegin, gerektiginde bir antibiyotik, örnegin, amfilisin veya IPMG
ile takviye edilmis bir LB vasati kullanilabilir.
Bu tarz kültürleme yoluyla transformant tarafindan intraselüler veya ekstraselüler olarak
üretilen bir rekombinant protein, proteinin fiziksel veya kimyasal özelliklerinden
yararlanilan bilinen çesitli ayirma yöntemlerinin herhangi biri ile ayrilabilir ve
saflastirilabilir.
Yöntemlerin spesifik örnekleri, yaygin bir protein çökelticisi ile muameleyi,
ultrafiltrasyonu, sivi kromatografinin çesitli tiplerini, örnegin, moleküler elek
kromatografisini (jel filtrasyonunu), emilim kromatografisini, iyon degisim
kromatografisini ve afinite kromatografisini, diyalizi ve bunlarin bir kombinasyonunu
ilaveten, alti histidinli rezidülerin bir etiketini eksprese edilecek olan bir rekombinant
proteine tutturma ile, protein bir nikel afinite kolonu ile verimli bir sekilde saflastirilabilir.
Alternatif olarak, lgG Fc bölgesini eksprese edilecek olan bir rekombinant proteine
tutturma ile, protein bir protein A kolonu ile verimli bir sekilde saflastirilabilir.
Yukarida-tarif edilen yöntemleri birlestirme ile, çok miktardaki bir hedef polipeptit
yüksek verimde ve yüksek saflikta kolaylikla üretilebilir.
(2) Anti-B7-H3 monoklonal antikorunun üretilmesi
B7-H3'ü spesifik olarak baglayan antikorun örnekleri, B7-H3'ü spesifik olarak baglayan
bir monoklonal antikoru içerir ve bu tarz bir antikoru elde etmenin bir yöntemi asagida
tarif edilir.
Bir monoklonal antikorun üretilmesi genel olarak, asagidaki operasyonel adimlari
gerektirir:
(a) bir antijen olarak kullanilacak olan bir biyopolimeri saflastirma;
(b) bir hayvani antijenin enjeksiyonu ile immünize etme ile antikor-üreten hücreler
hazirlama, kan alma, dalagin kesip çikarildigini belirlemek için bunun antikor
titresini analiz etme;
(c) miyelom hücreleri (bundan sonra "miyelom" olarak ifade edilir) hazirlama;
(d) antikor-üreten hücreleri miyelom ile kaynastirma;
(e) bir arzu edilen antikoru üreten hibridomlarin bir grubunu tarama;
(f) hibridomlari tek hücre klonlarina bölme (klonlama):
(g) opsiyonel olarak, bir monoklonal antikorun büyük bir miktarini üretmek için
hibridomu kültürleme veya hibridOm ile implante edilmis bir hayvani yetistirme;
(h) bu sekilde üretilen monoklonal antikoru biyolojik aktivite ve baglama özgüllügü
için inceleme veya antikorun özelliklerini bir etiketlenmis antikor reaktifi olarak
inceleme ve benzerleri.
Bundan sonra, bir monoklonal antikoru üretmenin yöntemi yukaridaki adimlari takip
ederek detayli bir sekilde tarif edilecektir, bununla birlikte, yöntem bununla
sinirlandirilmaz ve örnegin, dalak hücrelerinden ve miyelom hücrelerinden baska
antikor-üreten hücreler kullanilabilir.
(a) Antijenin saflastirilmasi
Antijen olarak, yukarida tarif edildigi sekilde yöntem ile hazirlanan B7-H3 veya bunlarin
bir parsiyel peptidi kullanilabilir.
ilaveten, B7-H3'ü eksprese eden rekombinant hücrelerden hazirlanan bir membran
fraksiyonu veya B7-H3'ü eksprese eden rekombinant hücrelerin kendisi ve ayrica
burada tarif edildigi üzere proteinin teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen bir
yöntem ile kimyasal olarak sentezlenmis bir parsiyel peptidi de antijen olarak
kullanilabilir.
(b) Antikor-üreten hücrelerin preparasyonu
Adim (a)'da elde edilen antijen bir adjuvan, örnegin, Freund komplet veya inkomplet
adjuvani veya alüminyum potasyum sülfat, ile karistirilir ve elde edilen karisim bir
deneysel hayvani immünize etmek için bir immünojen olarak kullanilir. Deneysel
hayvan olarak, bilinen bir hibridom üretim yönteminde kullanilan herhangi bir hayvan
herhangi bir sorun olmadan kullanilabilir. Spesifik olarak, örnegin, bir fare, bir siçan, bir
keçi, koyun, sigir, bir at veya benzerleri kullanilabilir. Bununla birlikte, ekstrakte edilmis
antikor-üreten hücreler ile kaynastirilacak olan miyelom hücrelerin kolay erisilebilirligi
bakis açisiyla, bir fare veya bir siçan tercihen immünize edilecek olan hayvan olarak
kullanilir.
ilaveten, kullanilan olan farenin veya siçanin susu özel olarak sinirlandirilmaz ve bir
fare durumunda, örnegin, çesitli suslar, örnegin, A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, CSH,
SYBL, CS7BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB ve
129 ve benzerleri kullanilabilir ve bir siçan durumunda, örnegin, Wistar, Low, Lewis,
Sprague Dawley, ACI, BN, Fischer ve benzerleri kullanilabilir.
Bu fareler ve siçanlar deneysel hayvan besIeyicileri/distribütörleri, örnegin, CLEA
Japan, Inc. ve Charles River Laboratories Japan, Inc. firmalari, tarafindan piyasada
satilir.
Bunlar arasinda, asagida tarif edilen miyelom hücreleri ile kaynastirmanin uygunlugu
dikkate alindiginda, bir fare durumunda, BALB/c susu ve bir siçan durumunda, Wistar
ve Low suslari immünize edilecek olan hayvan olarak özellikle tercih edilir.
Ilaveten, insanlar ve fareler arasindaki antijenik homoloji dikkate alindiginda,
otoantikorlari uzaklastirmak için azaltilmis biyolojik fonksiyona sahip olan bir fare, yani,
bir otoimmün hastaligi olan bir fare, kullanmak ayrica tercih edilir.
immünizasyon zamaninda bu tarz farenin veya siçanin yasi tercihen, 5 ila 12 haftadir,
daha tercihen 6 ila 8 haftadir.
Bir hayvani BT-H3 ile veya bunun bir rekombinanti ile immünize etmek için, örnegin,
mesela, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell
Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. ve Mayer, M. M., Experimental
lmmunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) ve benzeri
kaynaklarda, detayli bir sekilde tarif edilen bilinen bir yöntem kullanilabilir.
Bu immünizasyon yöntemleri arasinda, burada tarif edildigi üzere bir tercih edilen
spesifik yöntem, örnegin, asagidaki sekildedir.
Söyle ki, ilk olarak, antijen görevi gören bir membran proteini fraksiyonu veya antijeni
eksprese etmeye neden olan hücreler bir hayvana intradermal veya intraperitoneal
olarak uygulanir.
Bununla birlikte, uygulamanin her iki yolunun kombinasyonu, immünizasyon etkililigini
arttirmak için tercih edilir ve intradermal uygulama ilk yarida gerçeklestirildiginde ve
intraperitoneal uygulama ikinci yarida veya yalnizca son dozlamda
gerçeklestirildiginde, immünizasyon etkililigi özel olarak arttirilabilir.
Antijenin uygulama planlamasi, immünize edilecek olan hayvanin tipine, münferit
farkliliklara veya benzerlerine bagli olarak çesitlilik gösterir. Bununla birlikte, genel
olarak, burada antijenin 3 ila 6 kere uygulandigi ve dozlam araliginin 2 ila 6 hafta
oldugu bir uygulama planlamasi tercih edilir ve burada antijenin 3 ila 4 kere uygulandigi
ve dozlam araliginin 2 ila 4 hafta oldugu bir uygulama planlamasi daha çok tercih edilir.
ilaveten, antijenin dozu, hayvanin tipine, münferit farkliliklara veya benzerlerine bagli
olarak çesitlilik gösterir, bununla birlikte, doz genel olarak, 0,05 ile 5 mg'a, tercihen
yaklasik 0,1 ile 0,5 mg'a ayarlanir.
Bir destekleyici immünizasyon, yukarida tarif edildigi üzere antijenin uygulanmasindan
1 ila 6 hafta, tercihen 2 ila 4 hafta, daha tercihen 2 ila 3 hafta sonra gerçeklestirilir.
Destekleyici immünizasyonu gerçeklestirme zamaninda antijenin dozu, hayvanin tipine
veya boyutuna veya benzerlerine bagli olarak çesitlilik gösterir, bununla birlikte,
örnegin, bir fare durumunda doz genel olarak 0,05 ile 5 mg'a, tercihen 0,1 ila 0,5 mg'a,
daha tercihen yaklasik 0,1 ile 0,2 mg'a ayarlanir.
Dalak hücreleri ve antikor-üreten hücreleri içeren Ienfositler, destekleyici
immünizasyonan 1 ila 10 gün, tercihen 2 ila 5 gün, daha tercihen 2 ila 3 gün sonra
immünize edilmis hayvandan aseptik olarak uzaklastirilir. Bu sirada, antikor titresi
ölçülür ve bir yeterli bir sekilde arttirilmis antikor titresine sahip olan bir hayvan antikor-
üreten hücrelerin bir tedarik kaynagi olarak kullanildiginda, müteakip prosedür daha
verimli bir sekilde yürütülebilir.
Burada kullanilacak olan antikor titresini ölçme yönteminin örnekleri, bir RIA yöntemini
ve bir ELISA yöntemini içerir, ancak yöntem bunlarla sinirlandirilmaz.
Örnegin, bir ELISA yöntemi kullanildiginda, burada tarif edildigi üzere antikor titresinin
ölçümü asagida tarif edildigi sekilde prosedürlere göre yürütülebilir.
Ilk olarak, bir saflastirilmis veya parsiyel olarak saflastirilmis antijen bir kati fazin
yüzeyine, örnegin, ELISA için bir 96-kuyucuklu plakaya, adsorbe edilir ve buna adsorbe
edilmis antijene sahip Olmayan kati fazin yüzeyi antijen ile ilgili olmayan bir protein,
örnegin, bovin serum albümini (bundan sonra "BSA" olarak ifade edilir), ile kaplanir.
Yüzey yikandiktan sonra, yüzey, örnek içindeki antikorun antijeni baglamasina olanak
saglamak için bir primer antikor olarak bir seri olarak seyreltilmis örnek (örnegin, fare
serumu) ile temas ettirilir.
ilaveten, bir sekonder antikor olarak, bir fare antikoruna karsi bir enzim ile etiketlenmis
bir antikor eklenir ve bunun fare antikorunu baglamasina izin verilir. Yikamadan sonra,
enzim için bir substrat eklenir ve absorbansta sübstratin parçalanmasi veya benzeri ile
indüklenen renk gelisiminden dolayi gerçeklesen bir degisim ölçülür ve antikor titresi
ölçüme göre hesaplanir.
Antikor-üreten hücrelerin immünize edilmis hayvanin dalak hücrelerinden veya
hücreleri durumunda, burada antikor-üreten hücrelerin, bir paslanmaz çelik elek ile
filtrasyon yoluyla hücreleri elde etmek için dalagi homojenize etme ve hücreleri Eagle's
Minimum Essential Medium (MEM) içinde süspanse etme ile ayrildigi bir genel yöntem
kullanilabilir.
(c) Miyelom hücrelerinin (bundan sonra "miyelom" olarak adlandirilir)
preparasyonu
Hücre füzyonu için kullanilacak olan miyelom hücreleri özel olarak sinirlandirilmaz ve
uygun hücreler bilinen hücre hatlarindan seçilebilir. Bununla birlikte, bir hibridom
kaynastirilmis hücrelerden seçilirken kolaylik hesaba katildiginda, seleksiyon
prosedürü belirlenmis olan bir HGPRT (hipoksantin-guanin fosforibosil transferaz)
kusurlu sus kullanmak tercih edilir.
Daha spesifik olarak, bu tarz bir HGPRT-kusurlu susun örnekleri, farelerden türetilmis
siçanlardan türetilmis 'ü ve insanlardan türetilmis
ve 'i içerir. Bu HGPRT-kusurlu suslar, örnegin, American Type
Culture Collection'da (ATCC) (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'nda) veya
benzerlerinde, mevcuttur.
Bu hücre suslari, uygun bir vasat, örnegin, bir 8-azaguanin vasati [glutamin, 2-
merkaptoetanol, gentamisin ve fetal bovin serumu ile takviye edilen bir RPMI 1640
vasatina 8-azaguanin ekleme ile elde edilen bir vasat (bundan sonra "FBS" olarak ifade
edilir)], Iscove's Modified Dulbecco Medium (bundan sonra "IMDM" olarak ifade edilir)
veya Dulbecco's Modified Eagle Medium (bundan sonra "DMEM" olarak ifade edilir)
içinde alt-kültürlenir. Bu durumda, hücre füzyonunu gerçeklestirmeden 3 ila 4 gün önce,
hücreler, hücre füzyonu gününde en az 2 x 107 hücreyi garanti etmek için bir normal
vasat [örnegin, %10 FBS Içeren bir ASF104 vasati (Ajinomoto Co., Ltd. tarafindan
üretilmistir)] içinde alt-kültürlenir.
(d) Hücre füzyonu
Antikor-üreten hücreler ve miyelom hücreleri arasindaki füzyon, hücrelerin sag kalim
oraninin asiri bir sekilde düsürülmedigi kosullar altinda bilinen bir yönteme göre (Weir,
D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. l. ll. III., Blackwell Scientific
Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. ve Mayer, M. M., Experimental
bir sekilde gerçeklestirilebilir.
Bu tarz bir yöntem olarak, örnegin, burada antikor-üreten hücrelerin ve miyelom
hücrelerinin yüksek bir konsantrasyonda bir polimer, örnegin, polietilen glikol, içeren bir
çözelti içinde karistirildigi bir kimyasal yöntem, elektrik stimülasyonu kullanilan bir
fiziksel yöntem veya benzerleri kullanilabilir. Bu yöntemler arasinda, kimyasal yöntemin
spesifik bir örnegi, asagida tarif edilir.
Söyle ki, yüksek bir konsantrasyonda bir polimer içeren çözelti içinde polietilen glikolün
kullanildigi durumda, antikor-üreten hücreler ve miyelom hücreleri 1500 ila 6000, daha
tercihen 2000 ila 4000, araliginda bir moleküler agirliga sahip olan bir polietilen glikol
dakika, tercihen 5 ila 8 dakika, boyunca karistirilir.
(e) Hibridomlarin bir grubunun seçilmesi
Yukarida-tarif edilen hücre füzyonu ile elde edilen hibridomlari seçme yöntemi özel
olarak sinirlandirilmaz. Genel olarak, bir HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin)
Bu yöntem, hibridomlar aminopterin varliginda sag kalamayan bir HGPRT-kusurlu
susun miyelom hücreleri kullanilarak elde edildiginde etkilidir.
Söyle ki, kaynasmamis hücreleri ve hibridomlari bir HAT vasati Içinde kültürleme ile
yalnizca, aminopterine dirençli olan hibridomlarin selektif bir sekilde sag kalmasina ve
çogalmasina izin verilir.
(f) Tek hücre klonuna bölme (klonlama)
Hibridomlar için bir klonlama yöntemi olarak, bilinen bir yöntem, örnegin, bir
metilselüloz yöntemi, bir yumusak agaroz yöntemi veya bir sinirlayici seyreltme
yöntemi, kullanilabilir (bakiniz, örnegin, Barbara, B. M. ve Stanley, M. 8.: Selected
Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco
(1980)). Bu yöntemler arasinda, özel olarak, bir üç-boyutlu kültür yöntemi, örnegin, bir
metilselüloz, tercih edilir. Örnegin, hücre füzyonu ile üretilen hibridomlarin grubu, bir
metilselüloz vasati, örnegin, CIonaCeIl-HY Selection Medium D (StemCeII
Technologies, inc., tarafindan üretilir, #03804), içinde süspanse edilir ve kültürlenir.
Akabinde, olusan hibridom kolonileri toplanir, böylece monoklonal hibridomlar elde
edilebilir. Toplanan ilgili hibridom kolonileri kültürlenir ve elde edilen bir hibridom kültürü
süpernatanti içinde bir kararli antikor titresine sahip oldugu konfirme edilmis olan bir
hibridom bir BY-H3 monoklonal antikoru-üreten hibridom susu olarak seçilir.
Bu sekilde olusturulan hibridom susunun örnekleri, B7-H3 hibridomu M30'u içerir. Bu
arada, bu spesifikasyonda, B7-H3 hibridomuM30 tarafindan üretilen bir antikor, "M30
antikoru" veya basit bir sekilde "M30" olarak ifade edilir.
M30 antikorunun agir zinciri, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 51 ile temsil edilen bir amino
asit dizisine sahiptir. ilaveten, M30 antikorunun hafif zinciri, Dizi Listesi'nde SEQ ID
NO: 53 ile temsil edilen bir amino asit dizisine sahiptir. Bu arada, Dizi Listesi'nde SEQ
asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sinyal dizisidir, 20 ila 141 arasindaki
amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir degisken bölgedir ve 142 ila 471
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sabit bölgedir. ilaveten,
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 53 ile temsil edilen hafif zincir amino asit dizisinde, 1 ila 22
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sinyal dizisidir, 23 ila
130 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir degisken bölgedir
ve 131 ila 235 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sabit
bölgedir.
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 51 ile temsil edilen agir zincir amino asit dizisi, Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 50 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi tarafindan sifrelenir. Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 50 ile temsil edilen nükleotid dizisinde, 1 ila 57 arasindaki
nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir sinyal dizisini sifreler, 58 ila
423 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir degisken
bölgesini sifreler ve 424 ila 1413 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi
antikorun agir zincir sabit bölgesini sifreler.
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 53 ile temsil edilen hafif zincir amino asit dizisi, Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 52 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi tarafindan sifrelenir. Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 52 ile temsil edilen nükleotid dizisinde, 1 ila 66 arasindaki
nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir sinyal dizisini sifreler, 67 ila
390 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir degisken
bölgesini sifreler ve 391 ila 705 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi
antikorun hafif zincir sabit bölgesini sifreler.
(g) Hibridomu kültürleme ile monoklonal antikorun preparasyonu
Bu sekilde seçilen hibridomu kültürleme ile, bir monoklonal antikor verimli bir sekilde
elde edilebilir. Bununla birlikte, kültürlemeden önce, bir hedef monoklonal antikoru
üreten bir hibridomun taramasini gerçeklestirmek tercih edilir.
Bu tarz taramada, bilinen bir yöntem kullanilabilir.
Burada tarif edildigi üzere antikorun ölçümü, örnegin, yukarida tarif edilen madde (b)'de
açiklanan bir ELISA yöntemi, ile yürütülebilir.
Yukarida tarif edilen yöntem ile elde edilen hibridom, sivi nitrojen içinde bir
dondurulmus hâlde veya -80°C'de veya altinda bir dondurucuda saklanabilir.
Klonlamanin tamamlanmasindan sonra, vasat bir HAT vasatindan bir normal vasata
degistirilir ve hibridom kültürlenir.
Büyük-ölçekli kültür, bir büyük kültür sisesi kullanilarak rotasyon kültürü ile veya
döndürücü (spinner) kültür ile gerçeklestirilir. Büyük-ölçekli kültür ile elde edilen
süpernatanttan, burada tarif edildigi üzere proteini spesifik olarak baglayan bir
monoklonal antikor, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen yöntemler,
örnegin, jel filtrasyonu, kullanilarak saflastirma ile elde edilebilir.
ilaveten, hibridom, hibridom olarak ayni sustaki bir farenin (örnegin, yukarida-tarif
edilen BALB/c'nin) abdominal kavitesine veya hibridomu çogaltmak için bir Nu/Nu
faresine enjekte edilir, böylece bulusun monoklonal antikorunu büyük bir miktarda
içeren assitler elde edilebilir.
Hibridomun abdominal kaviteye uygulandigi durumlarda, bir mineral yagi, örnegin,
2,6,10,14-tetrametil pentadekan (pristan) bundan 3 ila 7 gün önce uygulandiginda,
assitlerin daha büyük miktarlari elde edilebilir.
Örnegin, bir immunosüpresan T hücrelerini inaktive etmek için hibridom olarak ayni
sustan bir farenin abdominal kavitesine önceden enjekte edilmistir. Bundan 20 gün
sonra, 106 ila 107 hibridom klon hücresi bir serumsuz vasat (0,5 ml) içinde süspanse
edilir ve süspansiyon farenin abdominal kavitesine uygulanir. Genel olarak, abdomen
genisletilir ve assitler ile doldurulur, assitler fareden toplanir. Bu yöntem ile, monoklonal
antikor kültür çözeltisi içindekine kiyasla yaklasik 100 kat veya daha yüksek olan bir
konsantrasyonda elde edilebilir.
Yukarida-tarif edilen yöntem ile elde edilen monoklonal antikor, örnegin, Weir, D. M.:
Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications,
Oxford (1978), kaynaginda tarif edilen bir yöntem ile saflastirilabilir.
Bu sekilde elde edilen monoklonal antikor, B7-H3 için yüksek antijen özgüllügüne
sahiptir.
(h) Monoklonal antikorun analizi
Bu sekilde elde edilen monoklonal antikorun izotipi veya alt-sinifi asagida oldugu
sekilde belirlenebilir.
Ilk olarak, tanimlama yönteminin örnekleri, bir Ouchterlony yöntemini, bir ELISA
yöntemini ve bir RIA yöntemini içerir.
Bir Ouchterlony yöntemi basittir, ancak monoklonal antikorun konsantrasyonu düsük
oldugunda, bir kondensasyon operasyonu gereklidir.
Diger taraftan, bir ELISA yöntemi veya bir RIA yöntemi kullanildiginda, kültür
süpernatantini bir antijen-adsorbe edilmis kati faz ile dogrudan reaksiyona sokma ve
sekonder antikorlar olarak immünoglobülin izotiplerinin ve alt-siniflarinin çesitli tiplerine
karsilik gelen antikorlari kullanma ile, monoklonal antikorun izotipi ve alt-sinifi
tanimlanabilir.
Buna ek olarak, daha basit bir yöntem olarak, piyasada satilan bir tanimlama kiti
(örnegin, Bio-Rad Laboratories, Inc. firmasi tarafindan üretilen Mouse Typer Kit) veya
benzerleri de kullanilabilir.
ilaveten, bir proteinin kantitatif belirlenmesi, Folin Lowry yöntemi veya 280 nm'de
absorbansa dayanan bir hesaplama yöntemi [ = immünoglobülin 1 mg/ml]
ile gerçeklestirilebilir.
ilaveten, monoklonal antikor (2)'deki (a) ila (h) arasindaki adimlari tekrar
gerçeklestirme ile ayri ve bagimsiz bir sekilde elde edildiginde bile, M30
antikorununkine es-deger olan bir sitotoksik aktiviteye sahip olan bir antikor elde etmek
mümkündür. Bu tarz bir antikorun bir örnegi olarak, M30 antikoru ile ayni epitopu
baglayan bir antikor örnek olarak gösterilebilir. M30, IgC1 veya IgC2 alani içindeki bir
epitopu tanir, bu B7-H3 ekstraselüler alani içindeki bir alandir ve lgCt alanini veya
özellikle, B7-H3'ün [901 veya IgCZ alaninda bulunan bir epitop örnek olarak
gösterilebilir. Bir yeni üretilmis monoklonal antikor, M30 antikorunun bagladigi bir
parsiyel peptit yapisini veya bir parsiyel tersiyer yapiyi bagladiginda, monoklonal
antikorun M30 antikoru ile ayni epitopu bagladigi belirlenebilir. ilaveten, monoklonal
antikorun B7-H3'ü baglamak için M30 antikoru ile rekabet ettigini (yani, monoklonal
antikorun M30 antikoru ve B7-H3 arasindaki baglamayi inhibe ettigini) konfirme etme
ile, spesifik epitop dizisi veya yapisi belirlenmemis olsa bile, monoklonal antikorun M30
antikoru ile ayni epitopu bagladigi belirlenebilir. Monoklonal antikorun M30 antikoru ile
ayni epitopu bagladigi konfirme edildiginde, monoklonal antikorun M30 antikorununkine
es-deger olan bir sitotoksik aktiviteye sahip olmasi güçlü bir sekilde beklenir.
(3) Diger antikorlar
Bulusun antikoru, B7-H3'e karsi yalnizca yukarida-tarif edilen monoklonal antikorlari
degil ayni zamanda insanlara heterolog antijenisiteyi azaltma amaciyla yapay
modifikasyon ile elde edilen bir rekombinant antikoru, Örnegin, bir kimerik antikoru, bir
beserilestirilmis antikoru ve bir insan antikorunu, da içerir. Bu antikorlar, bilinen
yöntemler kullanilarak üretilebilir.
Bu tarz bir kimerik antikor olarak, burada antikor degisken ve sabit bölgelerinin farkli
türlerden türetildigi bir antikor, örnegin, burada bir fare- veya siçan-kaynakli antikor
degisken bölgesinin bir insan-kaynakli sabit bölgeye baglandigi bir kimerik antikor,
Bir fare anti-insan B7-H3 antikoru M30'dan türetilen bir kimerik antikor, SEQ ID NO:
51'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisinin bir agir
zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 53'ün 23 ila 130
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisinin bir hafif zincir degisken
bölgesini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikordur ve bir gelisigüzel insan-kaynakli
sabit bölgeye sahip olabilir. Bu tarz bir kimerik antikorun bir örnegi olarak, Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 63'ün 1 ila 471 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan
amino asit dizisinin bir agir zincirinden ve Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 59'un 1 ila 233
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisinin bir hafif zincirinden
olusan bir antikor örnek olarak gösterilebilir. Bu sirada, Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 63
ile temsil edilen agir zincir dizisinde, 1 ila 19 arasindaki amino asit rezidülerinden
olusan amino asit dizisi bir sinyal dizisidir, 20 ila 141 arasindaki amino asit
rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir degisken bölgedir ve 142 ila 471 arasindaki
amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sabit bölgedir. ilaveten, Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen hafif zincir amino asit dizisinde, 1 ila 20
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sinyal dizisidir, 21 ila
128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir degisken bölgedir
ve 129 ila 233 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sabit
bölgedir.
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen agir zincir amino asit dizisi, Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 62 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi tarafindan sifrelenir. Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 62 ile temsil edilen nükleotid dizisinde, 1 ila 57 arasindaki
nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir sinyal dizisini sifreler, 58 ila
423 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir degisken
bölgesini sifreler ve 424 ila 1413 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi
antikorun agir zincir sabit bölgesini sifreler.
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen hafif zincir amino asit dizisi, Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 58 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi tarafindan sifrelenir. Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 58 ile temsil edilen nükleotid dizisinde, 1 ila 60 arasindaki
nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir sinyal dizisini sifreler, 61 ila
384 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir degisken
bölgesini sifreler ve 385 ila 699 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi
antikorun hafif zincir sabit bölgesini sifreler.
Bu tarz bir beserilestirilmis antikor olarak, bir insan-kaynakli antikora yalnizca bir
tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) entegre etme ile elde edilen bir antikor (bakiniz,
ayni zamanda CDR dizisini bir CDR-greftleme yöntemi ile bir insan antikoruna grefte
etme ile elde edilen bir antikor (WO 90/07861) örnek olarak verilebilir.
Bununla birlikte, M30 antikorundan türetilen beserilestirilmis antikor, beserilestirilmis
antikor M30 antikorunun CDR dizilerinin 6 tipinin tümüne sahip oldugu ve bir anti-tümör
aktivitesine sahip oldugu sürece bir spesifik beserilestirilmis antikor ile sinirlandirilmaz.
Bu arada, M30 antikorunun agir zincir degisken bölgesi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO:
92 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRH1'e (NYVMH), Dizi Listesi'nde
SEO ID NO: 93 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRH2'ye
(YINPYNDDVKYNEKFKG) ve Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 94 ile temsil edilen amino
asit dizisinden olusan CDRH3'e (WGYYGSPLYYFDY) sahiptir. Ilaveten, M30
antikorunun hafif zincir degisken bölgesi, Dizi Listesi'nde SEQ lD NO: 95 ile temsil
edilen amino asit dizisinden olusan CDRL1'e (RASSRLIYMH), Dizi Listesi'nde SEO ID
NO: 96 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRL2'ye (ATSNLAS) ve Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 97 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRLS'e
(QQWNSNPPT) sahiptir.
Fare antikoru M30'un beserilestirilmis antikorunun bir örnegi olarak, (1) Dizi Listesi'nde
rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinin, (2) yukarida tarif edilen amino asit dizisi
(1) ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip bir amino asit dizisinin ve
(3) burada yukarida tarif edilen amino asit dizisinde (1) bir veya bir kaç amino asidisin
silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir amino asit dizisinin herhangi birinden
olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirin ve (4) Dizi Listesi'nde SEQ
asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinin, (5) yukarida tarif edilen amino asit
dizisi (4) ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip bir amino asit dizisinin
ve (6) burada yukarida tarif edilen amino asit dizisinde (4) bir veya bir kaç amino
asidisin silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir amino asit dizisinin herhangi
birinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirin bir gelisigüzel
kombinasyonu örnek olarak gösterilebilir.
Bu arada, burada kullanildigi sekliyle "bir kaç" terimi, 1 ila 10'u, 1 ila 9'u, 1 ila 8'i, 1 ila
Bu spesifikasyonda amino asit sübstitüsyonu olarak, bir konservatif amino asit
sübstitüsyonu tercih edilir. Konservatif amino asit sübstitüsyonu, amino asit yan
zincirleri ile ilgili olan bir amino asitler grubu içinde gerçeklesen bir sübstitüsyonu ifade
eder. Tercih edilen amino asit gruplari asagidaki sekildedir: bir asidik grup (aspartik asit
ve glutamik asit); bir bazik grup (Iizin, arjinin ve histidin); bir polar-olmayan grup (alanin,
valin, Iösin, izolösin, prolin, fenilalanin, metiyonin ve triptofan) ve bir yüksüz polar
familya (glisin, asparajin, glutamin, sistein, serin, treonin ve tirozin). Daha çok tercih
edilen amino asit gruplari asagidaki sekildedir: bir alifatik hidroksi grubu (serin ve
treonin); bir amid-içeren grup (asparajin ve glutamin): bir alifatik grup (alanin, valin,
asit sübstitüsyonu tercihen, orijinal amino asit dizisine sahip olan bir maddenin
özelliklerini bozmayan bir grup içinde gerçeklestirilir.
Yukarida tarif edilen bir agir zincirin ve bir hafif zincirin tercih edilen bir
kombinasyonuna sahip olan bir antikor olarak, SEQ ID NO: 85'in 20 ila 141 arasindaki
amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir
degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'in 21 ila 128 arasindaki
amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir
degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20 ila
141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir
agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 73'ün 21 ila 128
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif
zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20
ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir
agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 75'in 21 ila 128
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif
zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20
ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir
agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 77'nin 21 ila 128
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif
zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20
ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir
agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 79'un 21 ila 128
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif
zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20
ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir
agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 81'in 21 ila 128
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif
zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20
ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir
agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 83'ün 21 ila 128
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif
zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 91'in 20
ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir
agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'in 21 ila 128
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif
zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 91'in 20
ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir
agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 73'ün 21 ila 128
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif
zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 91'in 20
ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir
agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 75'in 21 ila 128
arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif
zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor ve SEO ID NO: 91'in
ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan
bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 77'nin 21 ila
128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor örnek olarak
gösterilebilir.
Yukarida tarif edilen bir agir zincirin ve bir hafif zincirin daha çok tercih edilen bir
kombinasyonuna sahip olan bir antikor olarak,
SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'de 21 ila 233
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincirden olusan bir antikor;
SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 73'te 21 ila 233
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincirden olusan bir antikor;
SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 75'te 21 ila 233
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincirden olusan bir antikor;
SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: 77'de 21 ila 233
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincirden olusan bir antikor;
SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: 79'da 21 ila 233
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincirden olusan bir antikor;
SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 81'de 21 ila 233
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincirden olusan bir antikor;
SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 83'te 21 ila 233
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincirden olusan bir antikor;
SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'de 21 ila 233
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincirden olusan bir antikor;
SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 73'te 21 ila 233
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincirden olusan bir antikor;
SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: 75'te 21 ila 233
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincirden olusan bir antikor ve
SEO ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir
amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: ?7'de 21 ila 233
arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir
hafif zincirden olusan bir gösterilebilir.
Dahasi, yukarida tarif edilen bir agir zincirin ve bir hafif zincirin tercih edilen bir
kombinasyonuna sahip olan bir antikor olarak, SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini
içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'in bir amino asit dizisini içeren bir hafif
zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir
zincirden ve SEO ID NO: 73'ün bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan
bir antikor; SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID
NO: 75'in bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO:
85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 77'nin bir amino asit
dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 85'in bir amino asit
dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 79'un bir amino asit dizisini içeren bir
hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir
zincirden ve SEO ID NO: 81'in bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir
antikor; SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO:
83`ün bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEO lD NO:
91'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'in bir amino asit
dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 73'ün bir amino asit dizisini içeren bir
hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 91'in bir amino asit dizisini içeren bir agir
zincirden ve SEO ID NO: 75'in bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir
antikor ve SEO ID NO: 91'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID
olarak gösterilebilir.
Yukarida-tarif edilen agir zincir amino asit dizisi ile yüksek bir homolojiye sahip olan bir
diziyi yukarida-tarif edilen hafif zincir amino asit dizisi ile yüksek bir homolojiye sahip
olan bir dizi ile birlestirme ile, yukarida-tarif edilen antikorlarin her birininkine es-deger
olan bir sitotoksik aktiviteye sahip olan bir antikoru seçmek mümkündür. Bu tarz bir
homoloji genel olarak, %95 veya daha fazla olan bir homolojidir, en tercihen %99 veya
daha fazla olan bir homolojidir. ilaveten, burada agir zincir veya hafif zincir amino asit
dizisinde bir veya bir kaç amino asit rezidüsünün sübstüte edildigi, silindigi veya
eklendigi bir amino asit dizisini birlestirme ile, yukarida-tarif edilen antikorlarin her
birininkine es-deger olan bir sitotoksik aktiviteye sahip olan bir antikoru seçmek de
mümkündür.
Iki amino asit dizisi arasindaki homoloji, Blast algoritmasi versiyon 2.2.2'nin varsayilan
parametreleri kullanilarak belirlenebilir (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden,
Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller and David J. Lipman
(1997), "Gapped BLAST and FSI-BLAST: a new generation of protein database search
Bu arada, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 85, 87, 89 veya 91 ile temsil edilen agir zincir
amino asit dizisinde, 1 ila 19 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit
dizisi bir sinyal dizisidir, 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino
asit dizisi bir degisken bölgedir ve 142 ila 471 arasindaki amino asit rezidülerinden
olusan amino asit dizisi bir sabit bölgedir.
hafif zincir amino asit dizisinde, 1 ila 20 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan
amino asit dizisi bir sinyal dizisidir, 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden
olusan amino asit dizisi bir degisken bölgedir ve 129 ila 233 arasindaki amino asit
rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sabit bölgedir.
Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 85, 87, 89 veya 91 ile temsil edilen agir zincir amino asit
dizileri, Dizi Listesi'nde sirasiyla SEQ lD NO: 84, 86, 88 veya 90 ile temsil edilen
nükleotid dizileri tarafindan sifrelenir. ilaveten, SEQ ID NO.'Iari: 84 ve 85 ile temsil
edilen diziler Sekil 34'te, SEQ ID NO.'Iari: 86 ve 87 ile temsil edilen diziler Sekil 35'te,
SEQ ID NO.'Iari: 88 ve 89 ile temsil edilen diziler Sekil 36'da ve SEO ID NO.'Iari: 90 ve
92 ile temsil edilen diziler Sekil 37'de gösterilir. Yukaridaki nükleotid dizilerinin her
birinde, 1 ila 57 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi, antikorun agir zincir
sinyal dizisini sifreler, 58 ila 423 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi
antikorun agir zincir degisken bölgesini sifreler ve 424 ila 1413 arasindaki
nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir sabit bölgesini sifreler.
ile temsil edilen nükleotid dizileri tarafindan sifrelenir. ilaveten, SEQ lD NO.'Iari: 70 ve
71 ile temsil edilen diziler Sekil 27'de, SEQ ID NO.'Iari: 72 ve 73 ile temsil edilen diziler
Sekil 28'de, SEQ ID NO.'Iari: 74 ve 75 ile temsil edilen diziler Sekil 29'da SEO lD
temsil edilen diziler Sekil 31'de, SEQ ID NO.'Iari: 80 ve 81 ile temsil edilen diziler Sekil
32'de ve SEO ID NO.'Iari: 82 ve 83 ile temsil edilen diziler Sekil 33'te gösterilir.
Yukaridaki nükleotid dizilerinin her birinde, 1 ila 60 arasindaki nükleotidlerden olusan
nükleotid dizisi, antikorun hafif zincir sinyal dizisini sifreler, 61 ila 384 arasindaki
nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir degisken bölgesini sifreler
ve 385 ila 699 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir
sabit bölgesini sifreler.
Bu nükleotid dizilerinin herhangi biri ve bir baska antikorun bir nükleotid dizisi
arasindaki homoloji ayrica, Blast algoritmasi kullanilarak da belirlenebilir.
ilaveten, bulusun antikoru, M30 antikoru ile ayni epitopu baglayan bir insan antikorunu
içerir. Bir anti-B7-H3 insan antikoru, yalnizca, bir insan kromozomundan türetilen bir
antikorun bir gen dizisine sahip olan bir insan antikorunu ifade eder. Anti-B7-H3 insan
antikoru, bir insan antikorunun agir ve hafif zincir genlerini içeren bir insan kromozomu
fragmanina sahip olan bir insan antikoru-üreten fare kullanilan bir yöntem ile elde
Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y.,
Matuda, T. and lijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al.,
Bu tarz bir insan antikoru-üreten fare asagida oldugu sekilde spesifik olarak
olusturulabilir. Burada endojen immünoglobülin agir ve hafif zincir gen Iokuslarinin
bozuldugu ve yerine, insan immünoglobülini agir ve hafif zincir gen Iokuslarinin bir
maya yapay kromozom (YAC) vektörü veya benzeri vasitasiyla uygulandigi bir genetik
olarak modifiye edilmis hayvan, bir nakavt hayvan ve bir transgenik hayvan üretme ve
bu hayvanlari çiftlestirme ile olusturulur.
ilaveten, bir rekombinant DNA teknigine göre, bir insan antikorunun bu tarz bir agir
zincirinin ve bir hafif zincirinin her birini sifreleyen cDNA'Iar ve tercihen bu tarz
cDNA'Iari içeren bir vektör kullanilmasi ile, ökaryotik hücreler transforme edilir ve bir
rekombinant insan monoklonal antikoru üreten bir transformant hücre kültürlenir,
böylece antikor ayrica kültür süpernatantindan da elde edilebilir.
Burada, konak olarak, örnegin, ökaryotik hücreler, tercihen memeli hücreleri, örnegin,
CHO hücreleri, lenfositler veya miyelom hücreleri, kullanilabilir.
ilaveten, bir insan antikoru kütüphanesinden seçilen bir faj gösterimi-kaynakli insan
antikorunu elde etmenin bir yöntemi (bakiniz, Wormstone, I. M. et al., lnvestigative
Örnegin, burada bir insan antikorunun bir degisken bölgesinin bir tek-Zincirli antikor
(scFv) olarak bir fajin yüzeyi üzerinde eksprese edildigi ve bir antijeni baglayan bir fajin
kullanilabilir.
Bunun bir antijeni baglamasina göre seçilen fajin genini analiz etme ile, bir antijeni
baglayan bir insan antikorunun degisken bölgesini sifreleyen bir DNA dizisi
belirlenebilir.
Bir antijeni baglayan scFv'nin DNA dizisi belirlendiginde, diziyi içeren bir ekspresyon
vektörü hazirlama ve vektörü eksprese etmek için uygun bir konak içine uygulama ile
Bir yeni üretilmis insan antikoru, M30 antikorunun bagladigi bir parsiyel peptit yapisini
veya bir parsiyel tersiyer yapiyi bagladiginda, insan antikorunun M30 antikoru ile ayni
epitopu bagladigi belirlenebilir. ilaveten, insan antikorunun BT-H3'ü baglamak için M30
antikoru ile rekabet ettigini (yani, insan antikorunun M30 antikoru ve BT-H3 arasindaki
baglamayi inhibe ettigini) konfirme etme ile, spesifik epitop dizisi veya yapisi
belirlenmemis olsa bile, insan antikorunun M30 antikoru ile ayni epitopu bagladigi
belirlenebilir. Insan antikorunun M30 antikoru ile ayni epitopu bagladigi konfirme
edildiginde, insan antikorunun M30 antikorununkine es-deger olan bir sitotoksik
aktiviteye sahip olmasi güçlü bir sekilde beklenir.
Yukarida-tarif edilen yöntemler ile elde edilen kimerik antikorlar, beserilestirilmis
antikorlar veya insan antikorlari, Örnek 3'te gösterilen bir yöntem veya benzerleri ile
bunlarin antijen-baglama özellikleri için degerlendirilir ve bir tercih edilen antikor
seçilebilir.
Antikorlarin özelliklerinin karsilastirilmasinda kullanim için bir baska indeksin bir örnegi
olarak, antikorlarin kararliligi örnek olarak verilebilir. Bir diferansiyel tarama
kalorimetresi (DSC), proteinlerin bagil konformasyonel kararliliginin bir avantajli indeksi
olarak kullanilacak olan bir termal denatürasyon orta-nokta sicakligini (Tm) çabuk ve
dogru bir sekilde ölçebilen bir cihazdir. Bir DSC kullanarak Tm degerleri ölçme ve
degerleri karsilastirma ile, termal kararliliktaki bir farklilik karsilastirilabilir. Antikorun
saklama kararliliginin antikorlarin termal kararliligi ile biraz korelasyon gösterdigi bilinir
(Lori Burton et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-
273) ve bir tercih edilen antikor, bir indeks olarak termal kararliligin kullanilmasi ile
seçilebilir. Antikorlari seçmek için diger indekslerin örnekleri, asagidaki özellikleri içerir:
uygun bir konak hücredeki verim yüksektir ve bir sulu çözelti içinde agregat-
olusturabilirlik düsüktür. Örnegin, en yüksek verimi gösteren bir antikor her zaman en
yüksek termal kararliligi göstermez ve bundan dolayi, yukarida-tarif edilen indekslere
göre kapsamli degerlendirme yapma ile insanlara uygulama için en uygun olan bir
antikoru seçmek gereklidir.
ilaveten, burada bir antikorun tam-boy agir ve hafif zincir dizilerinin uygun bir baglayici
kullanilarak baglandigi, böylece bir tek-Zincirli immünoglobülinin elde edildigi, bir
Shirrmann, T. et al., mAbs (2010), 2, (1) pp. 1-4). Bu tarz bir tek-Zincirli
immünoglobülini dimerize etme ile, elde edilen dimer, kendisi bir tetramer olan bir
antikorunkilere benzeyen bir yapiya ve bir aktiviteye sahip olabilir. ilaveten, bulusun
antikoru, bir tek agir zincir degisken bölgesine sahip olan ve bir hafif zincir dizisine
sahip olmayan bir antikor olabilir. Bu tarz bir antikor, bir tek alanli antikor (sdAb) veya
bir nanobodi olarak adlandirilir ve gerçekte, bu tarz bir antikor develerde ve lamalarda
gözlenir ve bunun bir antijen-baglama afinitesine sahip oldugu bildirilmistir
göre antikorun fonksiyonel fragmaninin bir tipi olarak da yorumlanabilir.
Bulusa, antikorun bir modifiye edilmis varyanti veya antikorun bir fonksiyonel fragmani
da dâhil edilir. Modifiye edilmis varyant, bulusun antikorunu veya antikorunun bir
fonksiyonel fragmanini kimyasal veya biyolojik modifikasyona tabi tutma ile elde edilen
bir varyanti ifade eder. Bu tarz bir kimyasal olarak modifiye edilmis varyantin örnekleri,
bir kimyasal kismi bir amino asit iskeletine baglama ile kimyasal olarak modifiye edilmis
varyantlari, bir N-bagli veya O-bagli karbonhidrat zinciri ile kimyasal olarak modifiye
edilmis varyantlari, vb. içerir. Bu tarz bir biyolojik olarak modifiye edilmis varyantin
örnekleri, translasyondan sonra modifikasyon (örnegin, N-bagli veya O-bagli
glikosilasyon, N- veya C-ucu isleme, deamidasyon, aspartik asidin izomerizasyonu
veya metiyoninin oksidasyonu) ile elde edilen varyantlari ve bir prokaryotik konak
hücrede eksprese edilme ile burada bir metiyonin rezidüsünün N ucuna eklenmis
oldugu varyantlari içerir.
ilaveten, böylece bulusun antikorunun veya burada tarif edildigi üzere bir antijenin
saptanmasina veya izolasyonuna olanak saglamak amaciyla etiketlenmis olan bir
antikor, örnegin, bir enzim ile etiketlenmis antikor, bir flüoresans ile etiketlenmis antikor
ve afinite ile etiketlenmis antikor da, modifiye edilmis varyant anlamina dâhil edilir.
Bulusun antikorunun veya antikorunun bir fonksiyonel fragmaninin bu tarz bir modifiye
edilmis varyanti, bulusun orijinal antikorunun veya antikorunun bir fonksiyonel
fragmaninin kararliligi ve kanda alikonulmasini iyilestirmek, bunun antijenisitesini
azaltmak, bu tarz bir antikoru veya bir antijeni saptamak veya izole etmek ve benzeri
için kullanislidir.
ilaveten, bulusun antikoruna bagli olan bir glikanin modifikasyonunu (glikosilasyonunu,
defükosilasyonunu, vb.) regüle etme ile, antikor-bagimli hücresel sitotoksik aktiviteyi
güçlendirmek mümkündür. Antikorlarin bir glikaninin modifikasyonunu regüle etmek
açiklar. Bununla birlikte, teknik, bunlarla sinirli degildir. Bulusun antikoruna veya
antikorunun fonksiyonel fragmanina, burada bir glikanin modifikasyonunun regüle
edildigi bir antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani da dâhil edilir.
Bir antikorun ilk olarak bir antikor genini izole etme ve akabinde geni uygun bir konak
içine uygulama ile üretildigi durumlarda, uygun bir konagin ve uygun bir ekspresyon
vektörünün bir kombinasyonu kullanilabilir. Antikor geninin spesifik örnekleri, bu
spesifikasyonda tarif edilen bir antikorun bir agir zincir dizisini sifreleyen bir genin ve
bunun bir hafif zincir dizisini sifreleyen bir genin bir kombinasyonunu içerir. Bir konak
hücre transforme edildiginde, agir zincir dizisi genini ve hafif zincir dizisi genini ayni
ekspresyon vektörüne ve ayrica ayri ayri farkli ekspresyon vektörlerine yerlestirmek
mümkündür.
Ökaryotik hücrelerin konak olarak kullanildiginda durumlarda, hayvan hücreleri, bitki
hücreleri ve ökaryotik mikroorganizmalar kullanilabilir. Bu tarz hayvan hücreleri olarak,
memeli hücreleri, örnegin, simian COS hücreleri (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp.
hamsteri ovaryan hücrelerinin (CHO hücrelerinin; ATCC: GOL-61) dihidrofolat
redüktaz-kusurlu suslari (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Prokaryotik hücrelerin kullanildigi durumlarda, örnegin, Escherichia coli ve Bacillus
subtilis örnek olarak verilebilir.
Arzu edilen bir antikorun veya antikorun bir fonksiyonel fragmaninin bir genini
transformasyon yoluyla bu hücrelere uygulama ve bu sekilde transforme edilmis
hücreleri in vitro kültürleme ile, antikor elde edilebilir. Yukarida-tarif edilen kültür
yönteminde, verim bazen antikorun dizisine bagli olarak çesitlilik gösterebilir ve böylece
bir farmasötik olarak kolaylikla üretilen bir antikoru bir es-deger baglama aktivitesine
sahip olan antikorlar arasindan bir indeks olarak verim kullanilarak seçmek
mümkündür. Bundan dolayi, bulusun antikoruna veya antikorunun fonksiyonel
fragmanina, bir antikoru veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini üretmenin
transforme edilmis konak hücreyi kültürlemenin bir adimini ve arzu edilen bir antikoru
veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini kültürleme adiminda elde edilen bir
kültürlenmis üründen toplamanin bir adimini içerme ile karakterize edilen bir yöntemi ile
elde edilen bir antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani da dâhil edilir.
Bu arada, bir kültürlenmis memeli hücresinde üretilen bir antikorun agir zincirinin
karboksil ucundaki bir lizin rezidüsünün silindigi bilinir (Journal of Chromatography A,
antikorun agir zincirinin karboksil ucundaki iki amino asit rezidüsünün (glisinin ve
lizinin) silindigi ve karboksil ucunda yeni yer alan bir prolin rezidüsünün amidatlandigi
dizisinin bu tarz silinmesi ve modifikasyonu antikorun antijen-baglama afinitesini ve
efektör fonksiyonunu (kOmplemanin aktivasyonunu, antikor-bagimli hücresel
sitotoksisiteyi, vb.) etkilemez. Bundan dolayi, bulusa bu tarz modifikasyona tabi tutulan
bir antikor ve antikorun bir fonksiyonel fragmani da dâhil edilir ve burada agir zincirin
karboksil ucunda bir veya iki amino asidin silinmis oldugu bir silinme varyanti, silinme
varyantinin amidasyonu ile elde edilen bir varyant (öregin, burada karboksil ucu prolin
rezidüsünün amidatlandigi bir agir zincir) ve benzerleri örnek olarak verilebilir. Bulusa
göre antikorun agir zincirinin karboksil ucunda bir silinmeye sahip olan silinme
varyantinin tipi, antijen-baglama afinitesi ve efektör fonksiyon korundugu sürece
yukaridaki varyantlar ile sinirlandirilmaz. Bulusa göre antikoru olusturan iki agir zincir,
bir tam-boy agir zincirden ve yukarida-tarif edilen silinme varyantindan olusan gruptan
seçilen bir tipte olabilir veya bunlardan seçilen kombinasyon hâlindeki iki tipten olabilir.
Her bir silinme varyantinin miktarinin orani, bulusa göre antikoru üreten kültürlenmis
memeli hücrelerinin tipinden ve kültür kosullarindan etkilenebilir, bununla birlikte,
karboksil ucundaki bir amino asit rezidüsünün bulusa göre antikora ana bilesenler
olarak dâhil edilen iki agir zincirin ikisinde de silindigi bir durum örnek olarak verilebilir.
Bulusun antikorunun izotipi konusunda sinirlandirma yoktur ve bunlarin örnekleri, IgG
(IgG1, IgGZ, IgG3, lgG4), lgM, lgA(lgA1, IgA2), lgD ve lgE'yi içerir ve bunlarin tercih
edilen örnekleri, IgG'yi ve IgM'yi içerir ve ilaveten bunlarin daha çok tercih edilen
örnekleri, IgG1'i ve lgG2'yi içerir.
ilaveten, bulusun antikoru antikorun veya bunun bir modifiye edilmis fragmaninin bir
antijen-baglama yerine sahip olan antikorun bir fonksiyonel fragmani olabilir. Antikorun
fragmani, antikora bir proteaz, örnegin, papain veya pepsin, ile muamele etme veya
antikor genini bir genetik mühendisligi teknigine göre modifiye etme ve modifiye edilmis
geni kültürlenmis uygun hücrelerde eksprese etme ile elde edilebilir. Bu antikor
fragmanlari arasinda, antikorun fonksiyonlarinin tümüne veya bir kismina sahip olan bir
fragman, bunun asagidaki fonksiyonlara sahip olmasi sartiyla, antikorun bir fonksiyonel
fragmani olarak adlandirilabilir:
(a) B7-H3'ü spesifik olarak baglama, burada BT-H3, SEQ ID NO: 6 veya 10 ile
temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir moleküldür ve antikor veya antikorun bir
fonksiyonel fragmani IgCZ'den olusan bir polipeptidi baglar, burada IgC2, B7-H3'ün
bir alanidir;
(b) bir antikor-bagimli hücre-aracili fagositoz (ADCP) aktivitesine sahip olma;
(o) bir in vivo anti-tümör aktivitesine sahip olma ve
(d) BY-H3'ü baglamak için M30 antikoruna karsi bir kompetitif inhibitör aktiviteye
sahip olma, burada M30 antikoru, SEQ lD NO: 51'in 20 ila 471 arasindaki amino
asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir agir zincir ve SEO ID NO:
53'ün 23 ila 235 arasindaki rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir hafif
zincir içerir.
Antikorun fonksiyonlari olarak, genellikle antijen-baglama aktivitesi, bir antijenin
aktivitesini nötralize etmenin bir aktivitesi, bir antijenin aktivitesini güçlendirmenin bir
aktivitesi, antikor-bagimli hücresel sitotoksisite (ADCC) aktivitesi ve kompleman-
bagimli sitotoksisite (CDC) aktivitesi örnek olarak verilebilir. Yukaridan asikar olacagi
üzere, bulusa göre antikorun ve antikorun fonksiyonel fragmaninin fonksiyonu, B7-
H3'ün bir spesifik baglama aktivitesidir, burada B7-H3, SEQ ID NO: 6 veya 10 ile temsil
edilen bir amino asit dizisi içeren bir moleküldür ve antikor veya antikorun bir
fonksiyonel fragmani IgCZ'den olusan bir polipeptidi baglar, burada IgCZ, BY-H3'ün bir
alanidir; bir antikor-bagimli hücre-aracili fagositoz (ADCP) aktivitesidir; bir in vi'vo anti-
tümör aktivitesidir veBY-H3'ü baglamak için M30 antikoruna karsi bir kompetitif inhibitör
aktivitedir, burada M30 antikoru, SEO ID NO: 51'in 20 ila 471 arasindaki amino asit
rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 53`ün 23
ila 235 arasindaki rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir hafif zincir içerir.
Sitotoksik aktiviteye (anti-tümör aktivitesine) tümör hücrelerine karsi bir ADCP
aktivitesinin aracilik etmesi tercih edilir. ilaveten, bulusun antikoru ADCP aktivitesine ek
olarak ADCC aktivitesine ve/veya CDC aktivitesine sahip olabilir. Özel olarak, bir
güncel olarak mevcut anti-tümör antikoru içeren bir farmasötigin bir proliferatif sinyali
bloke etmek için tümör hücreleri üzerinde dogrudan etki ettigi, bir hücre ölümü sinyalini
indüklemek için tümör hücreleri üzerinde dogrudan etki ettigi, anjiyogenezi
baskilandigi, NK hücreleri tarafindan aracilik edilen ADCC aktivitesini indükledigi ve
kompleman tarafindan aracilik edilen CDC aktivitesini indükledigi, böylece tümör
sahipleri, bu basvurunun bulusuna göre anti-B7-H3 antikorunun ADCP aktivitesinin bir
güncel olarak mevcut anti-tümör antikoru içeren bir farmasötigin aktivitesi olarak
bildirildiginden haberdar degildir. Antikorun fragmaninin örnekleri, Fab'i, F(ab')2'yi Fv,
tek-Zincirli Fv'yi (scFv), burada agir zincirin ve hafif zincirin Fv molekülleri uygun bir
baglayici vasitasiyla baglanir, bir diabodiyi (diabodileri), bir lineer antikoru ve antikorun
fragmanindan olusan bir polispesifik antikoru içerir. Ilaveten, indirgeme kosullari altinda
F(ab')2'ye muamele etme ile elde edilen bir antikorun bir degisken bölgesindeki bir tek-
degerlikli fragman olan Fab' da antikorun fragmanina dâhil edilir.
Ilaveten, bulusun antikoru en az iki farkli antijen tipine özgüllügü olan bir polispesifik
antikor olabilir. Genel olarak, bu tarz bir antikor, iki antijen tipini baglar (yani, bir
bispesifik antikordur), bununla birlikte, burada kullanildigi sekliyle, "polispesifik antikor",
iki veya daha fazla (örnegin, üç) antijen tipine özgüllüge sahip olan bir antikoru içerir.
Bulusun polispesifik antikoru, bir tam-boy antikor veya bu tarz bir antikorun birfragmani
(örnegin, bir F(ab')2 bispesifik antikor) olabilir. Bispesifik antikor, iki antikor tipinin agir
ve hafif Zincirlerini (HL çiftlerini) baglama ile üretilebilir veya ayrica bispesifik antikor-
üreten kaynastirilmis hücreleri hazirlamak amaciyla farkli monoklonal antikorlar üreten
539).
Bulusun antikoru, bir tek-Zincirli antikor olabilir (ayrica scFv olarak da ifade edilir). Tek-
zincirli antikor, antikorun agir zincir degisken bölgesini ve hafif zincir degisken bölgesini
bir polipeptit baglayici vasitasiyla baglama ile elde edilebilir (Pluckthun, The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg ve Moore tarafindan
vasitasiyla baglama ile üretilen bir BiscFv fragmani da bispesifik antikor olarak
kullanilabilir.
Bir tek-Zincirli antikor üretmenin bir yöntemi, bu teknik alanda bilinir (bakiniz, örnegin,
. Bu scFv'de,
agri zincir degisken bölgesi ve hafif zincir degisken bölgesi bir konjugat olusturmayan
bir baglayici vasitasiyla, tercihen bir polipeptit baglayici vasitasiyla baglanir (Huston, J.
degisken bölgesi ve hafif zincir degisken bölgesi ayni antikordan veya farkli
antikorlardan türetilebilir.
Degisken bölgeleri baglamak için kullanilacak olan polipeptit baglayici olarak, örnegin,
12 ila 19 rezidüden olusan belirli bir tek-Zincirli peptit kullanilir.
Bir scFv'yi sifreleyen bir DNA, yukarida-tarif edilen antikorun agir zincirini veya agir
zincir degisken bölgesini sifreleyen bir DNA ve bunun hafif zincirini veya hafif zincir
degisken bölgesini sifreleyen DNA arasindan seçilen bir DNA`nin tümünü veya arzu
edilen kismini içeren bir sablon olarak bir DNA kullanilarak ve ayrica sablon DNA'nin
her iki ucunu tanimlayan bir primer çifti de kullanilarak PCR yoluyla amplifikasyon
gerçeklestirme ve böylece bunun söz konusu iki ucunu agir zincirin ve hafif zincirin her
birine baglamak için ilaveten bir polipeptit baglayici kismini sifreleyen bir DNA'yi ve
polipeptidin her iki ucunu tanimlayan bir primer çiftini birlestirme ile amplifikasyon
gerçeklestirme ile elde edilebilir.
ilaveten, bir scFv'yi sifreleyen DNA üretildiginde, bunu içeren bir ekspresyon vektörü ve
ekspresyon vektörü ile transforme edilmis bir konak yaygin prosedürlere göre elde
edilebilir. ilaveten, elde edilen konagi kullanma ile, bir scFv yaygin prosedürlere göre
elde edilebilir. Bunun bir antikor fragmani, bir geni elde etme ve geni yukarida tarif
edilene benzer bir sekilde eksprese etme ile bir konak içinde üretilebilir.
Bulusun antikoru, bir antijen için bunun afinitesini arttirmak amaciyla multimerize
edilebilir. Multimerize edilecek olan antikor, antikorun bir tipi veya ayni antijenin çok
sayida epitopunu taniyan çok sayida antikor olabilir. Antikorun multimerizasyonunun bir
yöntemi olarak, IgG CH3 alanini iki scFv molekülüne baglama, streptavidine baglama,
bir heliks-dönüs-heliks motifinin uygulanmasi ve benzerleri örnek olarak verilebilir.
Bulusun antikoru, farkli amino asit dizilerine sahip olan çok sayida anti-B7-H3 antikoru
tipinin bir karsimi olan bir poliklonal antikor olabilir. Poliklonal antikorun bir örnegi
olarak, farkli CDR'ye sahip olan çok sayida antikor tipinin bir karisimi örnek olarak
verilebilir. Bu tarz bir poliklonal antikor olarak, farkli antikorlar üreten hücrelerin bir
karisimini kültürleme ve akabinde elde edilen kültürden antikorlari saflastirma ile elde
Bir modifiye edilmis antikor olarak, çesitli molekül tiplerinin herhangi birine, örnegin,
polietilen glikole (PEG), baglanmis bir antikor da kullanilabilir.
ilaveten, bulusun antikoru, bu antikorlarin herhangi biri ve bir baska tibbi ajan arasinda
olusturulan bir konjugat (immünokonjugat) formunda olabilir. Bu tarz bir antikorun
örnekleri, burada antikorun bir radyoaktif materyale veya bir farmakolojik etkiye sahip
olan bir bilesige konjuge edildigi bir konjugati içerir (Nature Biotechnology (2005) 23,
pp. 1137-1146). Bunlarin örnekleri, indiyum (1”In)-kapromab pendetidi, teknetiyum
(99mTc)-nofetumomab merpentani, indiyum (mim-ibritumomabi, itriyum (9°Y)-
ibritumomabi ve iyodür (131I)-tositumomabi içerir.
Elde edilen antikor, homojeniteye kadar saflastirilabilir. Antikorun ayrilmasi ve
saflastirilmasi, bir geleneksel protein ayirma ve saflastirma yöntemi kullanilarak
gerçeklestirilebilir. Örnegin, antikor kolon kromatografisini, filtre filtrasyonunu,
ultrafiltrasyonu, tuz presipitasyonunu, diyalizi, preparatif poliakrilamid jel elektroforezini,
izoelektrik odaklama elektroforezini ve benzerlerini uygun bir sekilde seçme ve
birlestirme ile ayrilabilir ve saflastirilabilir (Strategies for Protein Purification and
Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al., eds., Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow
ve David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), ancak yöntem bunlarla
sinirland irilmaz.
Bu tarz kromatografinin örnekleri, afinite kromatografisini, iyon degisim
kromatografisini, hidrofobik kromatografiyi, jel filtrasyon kromatografisini, ters faz
kromatografisini ve adsorpsiyon kromatografisini içerir.
Bu tarz kromatografi, sivi kromatografi, örnegin, HPLC veya FPLC, kullanilarak
gerçeklesti rilebilir.
Afinite kromatografisinde kullanilacak olan bir kolon olarak, bir Protein A kolonu ve bir
Protein G kolonu örnek olarak verilebilir. Örnegin, bir kolon olarak, bir Protein A kolonu,
Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) ve benzerlerini kullanma örnek olarak
verilebilir.
ilaveten, üzerine immobilize edilmis bir antijene sahip olan bir tasiyici kullanilmasi ile,
antikor ayrica antikorun antijeni baglama özelliginden yararlanilarak da saflastirilabilir.
3. Anti-BY-H3 antikoru içeren farmasötik
Yukaridaki "2. Anti-B7-H3 antikorunun üretilmesi" maddesinde tarif edilen yöntem ile
elde edilen antikorlar kanser hücrelerine karsi bir sitotoksik aktivite gösterir ve
böylelikle bir farmasötik, özellikle kanser için bir terapötik ajan ve/veya önleyici ajan
olarak kullanilabilir.
Bir antikor tarafindan in vitro sergilenen sitotoksik aktivite, hücre büyümesinin inhibitör
aktivitesini ölçme ile belirlenebilir.
Örnegin, B7-H3'ü asiri-eksprese eden bir kanser hücre hatti kültürlenir, bir antikorfarkli
konsantrasyonlarda kültür sistemine eklenir ve odak olusumuna, koloni olusumuna ve
sferoid büyümeye karsi herhangi bir inhibitör aktivite ölçülebilir.
Bir antikorun kanser üzerindeki in vivo terapötik etkisi deneysel hayvanlar kullanilarak,
örnegin, antikoru B7-H3'ü asiri-eksprese eden bir tümör hücre hatti ile implante edilmis
çiplak farelere uygulama ve kanser hücrelerindeki herhangi bir degisimi ölçme, ile
belirlenebilir.
Kanser tipinin örnekleri, akciger kanserini, böbrek kanserini, üroteliyal karsinomu,
kolorektal kanseri, prostat kanserini, gliyoblastom multiformeyi, ovaryan kanserini,
pankreatik kanseri, meme kanserini, bir melanomu, karaciger kanserini, Idrar kesesi
kanserini, mide kanserini ve özofajiyal kanseri içerir, bununla birlikte, kanser tipi,
muamele edilecek olan kanser hücresi B7-H3'ü eksprese ettigi sürece, bunlarla
sinirland irilmaz.
Bulusa göre farmasötik bilesimin preparasyonunda kullanilacak olan bir kabul edilebilir
madde tercihen, farmasötik bilesimin uygulanacagi bir birey için doz ve konsantrasyon
açisindan toksik-degildir.
Bulusun farmasötik bilesimi farmasötik kullanim için, bunun pH'ini, ozmotik basincini,
viskozitesini, seffafligini, rengini, izotonisitesini, aseptik durumunu, kararliligini,
çözünürlügünü, salim hizini, emilim hizini ve geçirgenligini degistirebilen veya idame
ettirebilen bir madde içerebilir. Farmasötik kullanim için bu tarz bir maddenin örnekleri,
bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, amino asitler, örnegin, glisin, alanin, glutamin,
asparajin, arjinin ve lizin; antimikrobiyal ajanlar; antioksidanlar, örnegin, askorbik asit,
sodyum sülfat ve sodyum hidrojen sülfit; tamponlar, örnegin, fosfat, sitrat, borat
tamponlari, sodyum hidrojen karbonat ve Tris-HCI çözeltileri; dolgular, örnegin,
mannitol ve glisin; selatlama ajanlari, örnegin, etilendiamin tetraasetat (EDTA):
kompleks olusturma ajanlari, örnegin, kafein, polivinilpirrolidin, ß-siklodekstrin ve
hidroksipropil-ß-siklodekstrin; genisleticiler, örnegin, glikoz, mannoz ve dekstrin; baska
karbonhidratlar, örnegin, monosakkaritler ve disakkaritler; renklendirme ajanlari;
aromalar; diluentler; emülsifiye etme ajanlari; hidrofilik polimerler, örnegin,
polivinilpirrolidin; koruyucular, örnegin, düsük-moleküler agirlikli polipeptitler, tuz-
olusturma karsi iyonlari, benzalkonyum klorür, benzoik asit, salisilik asit, timerosal,
fenetil alkol, metilparaben, propilparaben, klorheksidin, sorbik asit ve hidrojen peroksit;
çözücüler, örnegin, gliserin, propilen glikol ve polietilen glikol; seker alkolleri, örnegin,
mannitol ve sorbitol; süspanse etme ajanlari; sürfaktanlar, örnegin, sorbitan ester,
polisorbat 20 ve polisorbat 80 dâhil polisorbatlar, Triton, trometamin, Iesitin ve
kolesterol; kararlilik güçlendirme ajanlari, örnegin, sükroz ve sorbitol; elastisite
güçlendirme ajanlari, örnegin, sodyum klorür, potasyum klorür ve mannitol ve sorbitol;
tasima ajanlari; eksipiyanlar ve/veya farmasötik adjuvanlar, içerir. Farmasötik kullanim
için bu maddelerin miktari tercihen, anti-BY-H3 antikorunun agirliginin 0,001 ila 100
kati, özel olarak tercihen 0,1 ila 10 kati araligindadir. Teknikte uzmanligi olan kisiler
uygun sekilde, bilesimin buna uygulandigi hastaliga, uygulanacak olan uygulama
yoluna veya benzerlerine bagli olarak bir preparasyon içinde farmasötik bilesimin tercih
edilen bir formülasyonunu belirleyebilir.
Farmasötik bilesim içindeki eksipiyan veya tasiyici bir sivi veya bir kati formunda
olabilir. Uygun bir eksipiyan veya tasiyici enjekte edilebilir su, fizyolojik salin, bir yapay
beyin-omurilik sivisi veya parenteral uygulama için yaygin bir sekilde kullanilan bir
baska madde olabilir. ilaveten, nötral fizyolojik salin veya serum albümini içeren
fizyolojik salin de bir tasiyici olarak kullanilabilir. Farmasötik bilesim, pH`i 7,0 ila 8,5
araliginda olan bir Tris tamponu, pH'u 4,0 ila 5,5 araliginda olan bir asetat tamponu
veya pH'i 3,0 ila 6,2 araliginda olan bir sitrat tamponu içerebilir. ilaveten, bu tarz bir
tampon sorbitol veya bir baska bilesik ile takviye edilebilir.
Bulusun farmasötik bilesiminin örnekleri, anti-B7-H3 antikoru içeren bir farmasötik
bilesimi ve anti-B7-h3 antikor ve kanser için en az bir terapötik ajan içeren bir
farmasötik bilesimi içerir. Bulusun farmasötik bilesimi, bir seçilmis bilesime ve bir
gerekli safliga sahip olan bir tibbi ajan olarak bir Iiyofilize edilmis ürün veya bir sivi
formunda hazirlanir. Anti-B7-H3 antikoru içeren farmasötik bilesim ve anti-B7-H3
antikor ve kanser için en az bir terapötik ajan içeren farmasötik bilesim, uygun bir
eksipiyan, örnegin, sükroz, kullanilarak bir Iiyofilize edilmis ürün seklinde de
olusturulabilir.
Yukarida-tarif edilen farmasötik bilesimde, anti-B7-H3 antikoru ile birlikte katilacak olan
kanser için terapötik ajan, anti-B7-H3 antikoru ile es-zamanli olarak, anti-B7-H3
antikorundan ayri olarak veya anti-B7-H3 antikoru ile sirali olarak uygulanabilir veya
terapötik ajan ve anti-B7-H3 antikoru farkli dozaj araliklarinda uygulanabilir. Kanser için
bu tarz bir terapötik ajanin örnekleri, abraksani, karboplatini, sisplatini, gemsitabini,
irinotekani (CPT-11), paklitakseli, pemetreksedi, sorafenibi, vinblastini ve WO
analoglarini (örnegin, Iöprorelini ve goserelini), estramustin fosfati, östrojen
antagonistlerini (örnegin, tamoksifeni ve raloksifeni) ve aromataz inhibitörlerini (örnegin,
anastrozolü, Ietrozolü ve eksemestani) içerir, bununla birlikte, ajan bir anti-tümör
aktivitesine sahip olan bir tibbi ajan oldugu sürece, bunlarla sinirlandirilmaz.
Farmasötik bilesimin uygulanacagi bir birey özel olarak sinirlandirilmaz, bununla
birlikte, memeliler tercih edilir ve insanlar daha çok tercih edilir.
Bulusun farmasötik bilesim, parenteral uygulama Için ve oral uygulama yoluyla
gastrointestinel emilim için hazirlanabilir. Bir preparasyonun bilesimi ve
konsantrasyonu, uygulama yöntemine bagli olarak belirlenebilir. Bulusun farmasötik
bilesimine dâhil edilen anti-B7-H3 antikorunun B7-H3 için afinitesi daha yüksek
oldukça, yani, bunun B7-H3 için ayrilma sabiti (Kd degeri) daha düsük oldukça,
insanlar için doz düsürüldügünde bile, anti-B7-H3 antikoru bunun ilaç etkinligini daha
çok gösterebilir. Dolayisiyla, bulusun farmasötik bilesiminin insanlar için dozu ayrica,
bu sonuca göre de belirlenebilir. Doz için oldugu gibi, bir insan anti-B7-H3 antikorunun
insanlara uygulandigi durumda, antikor yaklasik 0,001 ila 100 mg/kg olan bir dozda 1
ila 180 günlük araliklarla bir veya bir kaç kez uygulanabilir. Bulusun farmasötik
bilesiminin dozaj formunun örnekleri, infüzyonlari içeren enjeksiyonlari. süpozituvarlari.
trans-nazal ajanlari, dil-alti ajanlarini ve perkütanöz adsorbentleri içerir.
Bundan sonra, bulus Örnekler'e atfen daha spesifik bir sekilde tarif edilecektir, bununla
birlikte, bulus bunlarla sinirlandirilmaz.
Örnekler
Asagidaki Örnekler'de gen manipülasyonuna iliskin ilgili operasyonlarin (Sambrook, J.,
Fritsch, E. F. ve Maniatis, T. tarafindan yazilmis, 1989'da Cold Spring Harbor
Laboratory Press tarafindan basilmis) "Molecular Cloning" kaynaginda tarif edilen
yöntemlere göre gerçeklestirildigi veya piyasada satilan reaktiflerin veya kitlerin
kullanilmasi durumunda, bunlarin, aksi ifade edilmedikçe, bunlara eklenmis talimatlara
göre kullanildigi göz önünde bulundurulmalidir.
Örnek 1. Plazmidin üretilmesi
1)-1 Insan BY-H3 ekspresyon vektörünün üretilmesi
1)-1-1 Tam-boy insan B7-H3 varyant 1 için ekspresyon vektörünün üretilmesi
Bir PCR reaksiyonu, bir sablon olarak LNCaP hücrelerinin (Amerikan Tipi Kültür
Koleksiyonu (ATCC)) toplam RNA'sindan sentezlenen bir cDNA kullanilarak ve ayrica
asagidaki primer seti kullanilarak gerçeklestirilmistir, böylece insan B7-H3 varyant 1'i
sifreleyen bir CDNA çogaltilmistir:
'-ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-S' (Dizi Listesi'nde SEQ
Listesi'nde SEQ ID NO: 2).
Bunu takiben, bu sekilde elde edilen PCR ürünü MagExtractor PCR & Gel cleanup
(TOYOBO, Co., Ltd.) kullanilarak saflastirilmistir. Akabinde, PCR ürünü restriksiyon
enzimleri (Nhel ve Notl) ile sindirilmistir, bunu MagExtractor PCR & Gel cleanup
(TOYOBO, Co., Ltd.) kullanilarak saflastirma izlemistir. Bir pCDNA3.1(+) plazmid
DNA'si ayni restriksiyon enzimleri (Nhel ve Notl) ile sindirilmistir, bunu MagExtractor
PCR & Gel cleanup (TOYOBO, Co., Ltd.) kullanilarak saflastirma izlemistir.
Elde edilen saflastirilmis DNA çözeltileri karistirilmistir ve ilaveten, buna Ligation high
(TOYOBO, Co., Ltd.) eklenmistir ve elde edile karisim Iigasyonu gerçeklestirmek için
16°C'de 8 saat boyunca inkübe edilmistir. Elde edilen reaksiyon karisimi,
transformasyonu gerçeklestirmek için E. coli DH50i kompetan hücrelerine (Invitrogen
Corporation) eklenmistir.
Elde edilen koloniler üzerinde PCR primerleri ve BGH geri primeri kullanilarak koloni
direkt PCR gerçeklestirilmistir ve bir aday klon seçilmistir.
Elde edilen aday klon bir sivi vasat (LB/Amp) içinde kültürlenmistir ve bir plazmid
DNA'si MagExtractor -Plasmid- (TOYOBO, Co., Ltd.) kullanilarak ekstrakte edilmistir.
Elde edilen plazmid DNA'si bir sablon olarak kullanilarak, asagidaki Primer 3 ve Primer
4 arasindaki bir dizi, dizi analizi ile belirlenmistir ve diziler elde edilen klon ve saglanan
CDS dizisi arasinda karsilastirilmistir:
Primer 3 (CMV promotör primeri):
'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-B' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 3) ve
Primer 4 (BGH geri primeri):
'-tagaaggcacagtcgagg-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 4).
Dizi konfirme edildikten sonra, elde edilen klon 200 ml LB/Amp vasati içinde
kültürlenmistir ve bir plazmid, Plasmid Midi V-100 kiti (VioGene, Inc.) kullanilarak
ekstrakte edilmistir.
Bu sekilde elde edilen vektör, "pcDNA3.1-B7-H3" olarak adlandirilmistir. Bu vektör
içine klonlanmis B7-H3 varyant 1 geninin ORF bölgesinin dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ
varyant 1'in amino asit dizisi, Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 6 ile temsil edilir.
1)-1-2 Tam-boy insan BY-H3 varyant 2 için ekspresyon vektörünün üretilmesi
PCR, bir sablon olarak LNCaP hücrelerinin toplam RNA'sindan sentezlenen bir cDNA
kullanilarak ve ayrica asagidaki primer seti kullanilarak gerçeklestirilmistir, böylece
insan B7-H3 varyant 2'yi sifreleyen bir cDNA çogaltilmistir:
Listesi'nde SEQ ID NO: 7)
'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcggctatttcttgt-S' (Dizi Listesi'nde SEQ lD NO:
Saflastirma, Örnek 1)-1-1'deki ile ayni sekilde gerçeklestirilmistir ve saflastirmadan
sonra PCR ürünü bir Gateway BP reaksiyonu ile bir a pDONR221 vektörüne
(lnvitrogen Corporation) entegre edilmistir, böylece E. coli TOP10 (lnvitrogen
Corporation) transforme edilmistir.
Transformasyondan sonra elde edilen klonlar için, içeri yerlestirmenin boyutu koloni
PCR ile konfirme edilmistir. Burada içeri yerlestirmenin boyutunun konfirme edildigi 8
klon için, içeri yerlestirmenin 3' ucundaki ve 5' ucundaki DNA dizisi vektör tarafindan
içeri yerlestirme tarafina dogru her iki uç için bir dizileme reaksiyonu gerçeklestirme ile
konfirme edilmistir. Dizisi konfirme edilmis giris klonu ve bir Gateway destinasyon
vektörü pcDNA-DEST4O (lnvitrogen Corporation) arasinda bir Gateway LR reaksiyonu
gerçeklestirilmistir. E. coli TOP10 transformasyonundan sonra elde edilen klon için,
içeri yerlestirmenin boyutu koloni PCR ile konfirme edilmistir. Burada içeri
yerlestirmenin boyutunun konfirme edildigi klon için, içeri yerlestirmenin 3' ucundaki ve
' ucundaki DNA dizisi, söz konusu içeri yerlestirmenin dogru bir sekilde içeri
yerlestirildigini konfirme etmek için analiz edilmistir. Klonun bu sekilde üretilen
plazmidinin en az 1 mg'i, PureLink HiPure Plasmid Megaprep Kit (lnvitrogen
Corporation) kullanilarak saflastirilmistir.
Bu sekilde elde edilen vektör, "pcDNA-DEST40-B7-H3 varyant 2" olarak
adlandirilmistir. Bu vektör içine klonlanmis B7-H3 varyant 2 geninin ORF bölgesinin
dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 9'de 1 ila 948 arasindaki nükleotid numaralari ile
temsil edilir. ilaveten, B7-H3 varyant 2`nin amino asit dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO:
ile temsil edilir.
1)-2 B7-H3 parsiyel proteini için ekspresyon vektörünün üretilmesi
Örnek 1)-1-1'in B7-H3 varyant 1'i ile iliskili olan B7-H3 tam-boy plazmidin bir sablon
olarak kullanilmasi ile, asagidaki bölgelerin her biri, PCR ile çogaltilmistir. Söz konusu
her bir bölgeyi gösteren numaralar, B7-H3'ün SEQ ID NO: 5 ile temsil edilen nükleotid
numaralarini gösterir. Primer, Gateway att dizisine ek olarak 3' ucunda bir durdurma
kodonu içermesi için tasarlanmistir.
Asagidaki 1), 2) ve 3) bölgelerinin her biri, iki bölgeyi çogaltma ve akabinde bir fragman
olusturmak için bölgeleri PCR ile baglama ile hazirlanmistir. Söyle ki, bölge 1) için,
amplifikasyon Primerler 7 ve 12 ve Primerler 15 ve 11 kullanilarak gerçeklestirilmistir ve
elde edilen PCR ürünleri ilaveten Primerler 7 ila 11 kullanilarak çogaltilmistir. Bölge 2)
için amplifikasyon Primerler 8 ve 13 ve Primerler 15 ve 11 kullanilarak
gerçeklestirilmistir ve elde edilen PCR ürünleri ilaveten Primerler 8 ila 11 kullanilarak
çogaltilmistir. Bölge 3) için, amplifikasyon Primerler 9 ve 14 ve Primerler 15 ve 11
kullanilarak gerçeklestirilmistir ve elde edilen PCR ürünleri ilaveten Primerler 9 ila 11
kullanilarak çogaltilmistir. Bölge 4) için, amplifikasyon Primerler 10 ve 11 kullanilarak
gerçeklestirilmistir. Bölge 5) için, amplifikasyon Primerler 8 ve 11 kullanilarak
gerçeklestirilmistir. Bölge 6) için, amplifikasyon Primerler 9 ve 11 kullanilarak
gerçeklesti rilmistir.
Söz konusu bölgeler
Primer numarasi ve baz dizisi
'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggagccctggaggtccaggtc-B' (Dizi Listesi'nde
Listesi'nde SEQ ID NO: 12)
'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggagccgtggaggtccaggtc-B' (Dizi Listesi'nde
Listesi'nde SEQ ID NO: 14)
'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaggctatttcttgtccatcatc-3' (Dizi Listesi'nde
'-gggaatgtcataggctgcccggccacctgcaggctgacggcag-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID
'-gggaatgtcataggctgccctgtggggcttctctggggtgtg-B' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO:
'-gggaatgtcataggctgcccggccacctgcaggctgacggcag-s' (Dizi Listesi'nde SEQ ID
'-gggcagcctatgacattccccccagag-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 19)
Saflastirma, Örnek 1)-1-1'deki ile ayni sekilde gerçeklestirilmistir ve saflastirmadan
sonra çogaltilmis ürünlerin her biri bir Gateway BP reaksiyonu ile bir a pDONR221
vektörüne entegre edilmistir, böylece E. coli TOP10 (Invitrogen Corporation) transforme
edilmistir. Transformasyondan sonra elde edilen klonlar için, içeri yerlestirmenin boyutu
koloni PCR ile konfirme edilmistir.
Burada içeri yerlestirmenin boyutunun konfirme edildigi klonlarin her biri için, içeri
yerlestirmenin 3' ucundaki ve 5' ucundaki DNA dizisi vektör tarafindan içeri yerlestirme
tarafina dogru her iki uç için bir dizileme reaksiyonu gerçeklestirme ile konfirme
edilmistir.
Söz konusu içeri yerlestirmeye sahip oldugu konfirme edilen klonlar için, içeri
yerlestirmenin toplam DNA dizisi ayrica, asagidaki primer kullanilarak da konfirme
edilmistir. Dizi analizinin bir sonucu olarak, dizilerin tümünün söz konusu dizilerin
bilgisine tamamen özdes oldugu konfirme edilmistir.
Dizisi konfirme edilmis giris klonlarinin her biri ve pFLAG-myc-CMV-19-DEST
(Invitrogen Corporation) arasinda bir Gateway LR reaksiyonu gerçeklestirilmistir. E. coli
DH1OB (Invitrogen Corporation) transformasyonundan sonra elde edilen klonlar için,
içeri yerlestirmenin boyutu koloni PCR ile konfirme edilmistir.
Burada içeri yerlestirmenin boyutunun konfirme edildigi klonlarin her biri için, içeri
yerlestirmenin 3' ucundaki ve 5' ucundaki DNA dizisi, söz konusu içeri yerlestirmenin
dogru bir sekilde içeri yerlestirildigini konfirme etmek Için analiz edilmistir. Bundan
sonra, yukaridaki 1) ila 6) arasindaki bölgelerin her birini entegre etme ile elde edilen
ekspresyon vektörleri sirasiyla, "B7-H3 IgV1", "BY-HS IgCi", "B7-H3 IgV2", "BY-HS
Her biri bu vektör içine klonlanmis olan B7-H3 IgV1, B7-H3 IgCt, BT-H3 IgV2, B7-H3
ve B7-H3 IgV2-C2'nin amino asit dizileri Dizi Listesi'nde sirasiyla SEQ ID NO.'Iari: 21,
diziler Sekil 15'te gösterilir, SEQ ID NO.'lari: 22 ve 23 ile temsil edilen diziler Sekil 16'da
gösterilir, SEQ ID NO.'Iari: 24 ve 25 ile temsil edilen diziler Sekil 17'de gösterilir, SEO
ve 29 ile temsil edilen diziler Sekil 19'da gösterilir ve SEO ID NO.'Iari: 30 ve 31 ile
temsil edilen diziler Sekil 20'de gösterilir.
1)-3 B7 familyasi genleri için ekspresyon vektörlerinin üretilmesi
(Bir pCMVö-XL-4 ekspresyon vektörüne (B7 familyasi genleri olan) B7RP-1'in, B7-H1'in
ve B7-DC'nin her birini entegre etme ile elde edilen gen ekspresyon vektörleri olan)
pCMVö-XL-4-BYRP-1, pCMVG-XL-4-B7-H1 ve pCMVö-XL-4-B7-DC'nin tümü OriGene,
B7 familyasi genleri olan CD80'in, CD86'nin ve B7-H4'ün her birini eksprese eden
vektörler asagida oldugu sekilde üretilmistir.
Bir pENTR/221 giris vektörüne CD80'in, CD86'nin ve B7-H4'ün her birini entegre etme
lnvitrogen Corporation firmasindan satin alinmistir.
Dizisi konfirme edilmis giris klonlarinin her biri ve cDNA3.1-DEST (Invitrogen
Corporation) arasinda bir Gateway LR reaksiyonu gerçeklestirilmistir. E. coli DH1OB
transformasyonundan sonra elde edilen klonlar için, içeri yerlestirmenin boyutu koloni
PCR ile konfirme edilmistir. Burada içeri yerlestirmenin boyutunun konfirme edildigi
klonlarin her biri için, içeri yerlestirmenin 3' ucundaki ve 5' ucundaki DNA dizisi, söz
konusu içeri yerlestirmenin dogru bir sekilde içeri yerlestirildigini konfirme etmek için
analiz edilmistir.
genlerinin ORF bölgelerinin nükleotid dizileri Dizi Listesi'nde sirasiyla SEQ ID NO.'lari:
41 ve 43 ile temsil edilir.
Örnek 2. Monoklonal antikorun üretilmesi ve antikoru tarama
2)-1 ImmünizasyOn
4 ila 6 haftalik BALB/cAnNCrICrlj fareleri (Charles River Laboratories Japan, Inc.),
FchII KO fareleri (Taconic, Inc., IBL Co., Ltd.) veya GANP fareleri (Transgenic, Inc.)
kullanilmistir. Günler O'da, 7'de, 15'te ve 24'te, versen (Invitrogen Corporation) ile
sökülmüs LNCaP hücreleri, MCF7 hücreleri (ATCC) veya AsPC1 hücreleri (ATCC) her
bir farenin dorsal bölgesine 5 x 106 hücre/fare olan bir dozda subkütan olarak
uygulanmistir. Gün 31'de, ayni hücreler her bir fareye 5 x 106 hücre olan bir dozda
intravenöz olarak uygulanmistir. Gün 34'te, dalak her bir fareden kesip çikarilmistir ve
hibridomlarin üretilmesi için kullanilmistir.
2)-2 Hibridomlarin üretilmesi
Dalak hücreleri ve fare miyelom P, PEG 4000 (IBL Co.,
Ltd. firmasi tarafindan üretilmistir) kullanilarak hücre füzyonuna tabi tutulmustur,
böylece hibridomlar üretilmistir.
Sonuç olarak, LNCaP hücreleri ile immünize edilmis farelerden elde edilen 9639klon,
MCF7 hücreleri ile immünize edilmis farelerden elde edilen 4043 klon ve AsPC1
hücreleri ile immünize edilmis farelerden elde edilen 3617 klon hibridomlar olarak
olusturulmustur. Her bir hibridomun elde edilen kültür süpernatanti kullanilarak, bir
antikor-üreten hibridom bir CDC analizi ile taranmistir.
2)-3 Antikorun CDC analizi ile taranmasi
Gün O'da, LNCaP hücreleri veya MCF7 hücreleri her bir 80 uL için 5000 hücreye
seyreltilmistir ve elde edilen çözelti 80 pI/kuyucuk olarak bir 96-kuyucuklu plakaya
eklenmistir. Akabinde, hücreler gece boyu kültürlenmistir. Hibridom kültürü
süpernatanti, içine hücrelerin ekildigi plakaya 20 uI/kuyucuk olarak eklenmistir ve plaka
1 saat boyunca 4°C'de beklemeye birakilmistir. Bir seyreltilmis ve liyofilize edilmis
tavsan komplemanina (Cedarlane Laboratories), buz üzerindeki her bir viyale 1 ml
steril su eklenmistir ve viyal 1 dakika boyunca beklemeye birakilmistir, bunu karistirma
izlemistir ve akabinde elde edilen karisim 19 mL %O,1 BSA/RPMI 1640 vasati (BSA,
Sigma Co., Ltd.) ile karistirilmistir. Bir reaksiyonun, 37°C'de 1 saat boyunca
Plaka, oda sicakligina dönmesi için oda sicakliginda 30 dakika birakilmistir. 120 pL
CeIITiter-Glo reaktifi (Promega Corporation) her bir kuyucuga eklenmistir ve bir
reaksiyonun oda sicakliginda 10 dakika boyunca ilerlemesine izin verilmistir.
Lüminesansin miktari, bir plaka okuyucu (ARVO HTS, PerkinEImer, Inc.) kullanilarak
ölçülmüstür. Düsük Iüminesans gösteren bir kuyucukta, kompleman-bagimli hücre
ölümünün indüklendigi belirlenmistir. Bu tarz kompleman-bagimli hücre ölümünü
indüklemis bir kültür süpernatanti üreten bir hibridom seçilmistir.
Sonuç olarak, LNCaP ile immünizasyondan türetilen klonlardan elde edilen 24 klon,
MCF7 ile immünizasyondan türetilen klonlardan elde edilen 36 klon ve AsPC1 ile
immünizasyondan türetilen klonlardan elde edilen 3 klon tarama ile pozitif klonlar olarak
elde edilmistir.
Örnek 3. Antijenin tanimlanmasi
3)-1 Immüno-çökeltilmis maddenin tanimlanmasi
3)-1-1 Immüno-presipitasyon
MCF7 hücreleri, 5 ila 10 x 108 hücre olarak kültürlenmistir. Bu hücreler, bir hücre
kaziyici ile sökülmüstür ve sökülmüs hücreler toplanmistir ve -80°C'de dondurarak-
saklanmistir. Dondurarak-saklanmis hücreler, %1 NP-40 (Sigma-Aldrich Co., Ltd.) ve
bir proteaz inhibitörü (F. Hoffmann-La Roche, Ltd.) içeren ve 4°C'ye sogutulmus bir lizis
tamponunun 10 ml'si eklenmistir ve hücre peleti, baloncuklarin olusumundan kaçinilan
bir sekilde bir pipet ile buz üzerinde Iize edilmistir. Tamamen Iize edildikten sonra, pelet
rpm'de 4°C'de 20 dakika boyunca sentrifüj edilmistir ve elde edilen süpernatant, bir 15
ml'lik Falkon tüpe transfer edilmistir.
500 pl protein G-Sepharose 4FF biyeleri (Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.) üç
kere yikanmistir ve bir lizis tamponu ile tampon degisimine tabi tutulmustur. 500 pl
protein G-Sepharose 4FF bilyeleri çözündürülmüs örnek süpernatinatina buz üzerinde
eklenmistir ve elde edilen karisim 4°C'de gece boyu rotari karistirmaya tabi
tutulmustur.
Örnekler, Poly-Prep kromatografi kolonlarindan (Bio-Rad Laboratories, Inc.)
geçirilmistir ve bir asagiya-geçirilmis fraksiyon bir immüno-presipitasyon örnegi olarak
kullanilmistir.
Immüno-presipitasyon için kullanilacak olan bir antikor çözeltisinin 3 ug'i, fosfat
tamponlu salin (PBS) ile tampon degisimine tabi tutulmus 50 pl protein G-Sepharose
4FF biyelerine eklenmistir (bir ve elde edilen karisim 4°C'de 1 ila 16 saat
boyunca rotari karistirmaya tabi tutulmustur, böylece antikor bilyelere baglanmistir.
immüno-presipitasyOn örnegine, antikorun baglandigi bilyeler eklenmistir ve elde edilen
karisim 4°C'de 3 saat boyunca rotari karistirmaya tabi tutulmustur.
Kolon, bir bos 15 mI'Iik Falkon tüpe transfer edilmistir ve bir Iizis tamponunun 6,5 ml'si
buna eklenmistir. Bu prosedür, 4 kere tekrar edilmistir.
Kolonun çikisina baslik koyulmustur, bir Iizis tamponun 500 pl'si ile pipetaj yapilmistir
ve bilyeler bir 1,5 mI'Iik tüpe toplanmistir. Bu prosedür iki kere tekrar edilmistir.
4°C'de 5000 rpm'de 1 dakika boyunca Sentrifügasyondan sonra, süpernatant dikkatli
bir sekilde uzaklastirilmistir. Akabinde, bir elüsyon tamponunun (10 mM glisin-HCI, pH
2,0) 90 iJI'si buna eklenmistir, bunu vorteksleme ve sentrifügasyon izlemistir. 1,5 mI'Iik
spin kolonunun kolonu ayrilmistir ve 10 pl 1 M Tris-HCI (pH 8,5) buna eklenmistir ve
kolon orijinal yerine geri koyulmustur. Bir elüsyon fraksiyonu buna transfer edilmistir ve
10000 rpm'de 1 dakika boyunca sentrifügasyon gerçeklestirilmistir, böylece bir örnegin
100 pl'si elde edilmistir.
Elde edilen örnek, asagidaki 3)-1-2'de gösterildigi üzere bir sivi faz sindirim teknigi ile
3)-1-2 Kütle spektrometri analizi ile antijenin tanimlanmasi
Yaygin prosedürlere öre, immüno-presipitasyon yöntemi ile elde edilen fraksiyon, bir
sivi faz sindirim teknigi yoluyla tripsin (modifiye edilmis tripsin, Promega Corporation)
ekleme ile 37°C'de 16 saat boyunca bir sindirim reaksiyona tabi tutulmustur. Elde
edilen sindirilmis peptitler bir sivi kromatografisi (LC)/tandem kütle spektrometresine
(MS/MS) (Thermo Fisher Scientific K.K.) tabi tutulmustur. Elde edilen kütle spektral
verileri veri tabani arastirma yazilimi (Mascot, Matrix Science K.K.) kullanilarak analiz
edilmistir. Veri tabani olarak, International Protein Index (IPI) kullanilmistir. Sonuç
olarak, 34 antijen tipi tanimlanmistir.
Tanimlanmis antijenlerin karakteristiklerinden, bibliyografik bilgi geri-alimi, B7-H3'ün bir
hücre membrani proteini olmasina dayanarak gerçeklestirilmistir ve B7-H3 (CD278)
antijenine (BY-HB varyant 1) odaklanarak, asagida 3)-2 ve 3)-3'te tarif edilen deneyler
gerçeklestirilmistir.
3)-2 Antijen-genini eksprese eden hücrelerin preparasyonu
NIH-, bir kollajen tip I-kapli flask (IWAKI Co., Ltd. tarafindan
üretilmistir) içine 5 x
içeren DMEM vasati (Invitrogen Corporation) içinde 37°C ve %5'Iik C02 kosullari
altinda gece boyu kültürlenmistir.
Sonraki gün, NIH--1-
2'de üretilen pcDNA-DEST40-B7-H3 varyant 2'nin ve bir bos vektör olan pcDNA-
DEST40'in her biri ile Lipofectamine kullanilarak
transfekte edilmistir ve 37°C ve %5'Iik 002 kosullari altinda gece boyu ilaveten
kültürlenmistir.
Sonraki gün, transfekte edilmis NIH-3T3 hücrelerine tripsin ile muamele edilmistir ve bu
süspanse edilmistir. Bu sekilde elde edilen hücre süspansiyonu bir akis sitometrik
analizde kullanilmistir.
3)-3 Akis sitometrik analiz
MS ile tanimlanan BT-H3 varyant 1'i immüno-çökelten hibridom tarafindan üretilen
antikorun, BT-H3 için, baglama özgüllügü bir akis sitometrik yöntem ile konfirme
edilmistir. Örnek 3)-2'de hazirlanan hücre süspansiyonu sentrifüj edilmistir ve
süpernatant uzaklastirilmistir. Akabinde, hibridom kültürü süpernatanti hücreleri
süspanse etmek için. her bir vektör ile transfekte edilmis NIH-3T3 hücrelerine
eklenmistir ve hücreler 4°C'de 1 saat boyunca beklemeye birakilmistir.
Hücreler %5 FBS içeren PBS ile iki kere yikandiktan sonra, %5 FBS içeren PBS ile
1000-kat seyreltilmis fare IgG'ye (tam molekül) (ICN Pharmaceuticals, Inc. tarafindan
üretilmistir, #55493) floresin-konjuge edilmis keçi lgG fraksiyonu, hücreleri süspanse
etmek için buna eklenmistir ve hücreler 4°C'de 1 saat boyunca beklemeye birakilmistir.
Hücreler %5 FBS içeren PBS ile iki kere yikandiktan sonra, hücreler 2 pg/ml 7-
aminoaktinomisin D (lnvitrogen Corporation (Molecular Probes) tarafindan üretilmistir)
ile takviye edilmis %5 FBS içeren PBS içinde yeniden-süspanse edilmistir ve saptama
bir akis sitometresi (FCSOO, Beckman Coulter, Inc.) kullanilarak gerçeklestirilmistir.
Veriler, Flowjo (Tree Star, Inc.) kullanilarak analiz edilmistir.
7-Aminoaktinomisin D-pozitif ölü hücreler bir kapi kullanilarak çikarilmistir. Akabinde,
canli hücrelerin FITC flüoresans yogunlugu histogramlari olusturulmustur.
Kontrol görevi gören bos vektör ile transfekte edilmis NlH-3T3 hücrelerinin flüoresans
yogunlugu histogramina kiyasla B7-H3 varyant 1 eksprese eden NIH-3T3 hücrelerinin
ve BY-H3 varyant 2 eksprese eden NIH-3T3 hücrelerinin flüoresans yogunlugu
histogramlarinda daha yüksek bir flüoresans yogunlugu veren bir örnek üreten bir
hibridom, bir anti-B7-H3 antikoru-üreten hibridom olarak seçilmistir.
hibridomlarindan türetilen antikorlarin BY-HS varyant 1 ve BT-HS varyant 2 ile çapraz-
reaktiviteye sahip oldugu bulunmustur.
3)-4 Monoklonal antikorun kanser hücresi hattini baglama özelliginin
konfirmasyonu
Örnek 3)-3'te B'I-HS varyant 1'i ve B7-H3 varyant 2`yi bagladigi konfirme edilen
monoklonal antikorlarin B7-H3 varyant 1'i ve B7-H3 varyant 2'yi asiri-eksprese eden
kanser hücrelerini baglayip baglamadigi Örnek 3)-3'teki ile ayni sekilde bir akis
sitometrik yöntem ile incelenmistir.
Transfekte edilmis NIH-3T3 hücrelerinin yerine, bir insan meme kanseri hücre hatti
kullanilmistir. Sonuç olarak, olusturulan monoklonal antikorlarin tümünün bu kanser
hücre hatlarini bagladigi konfirme edilmistir.
3)-5 Monoklonal antikorun izotip belirlemesi
Monoklonal antikorlarin izotipleri, bir Fare monoklonal izotipleme kiti (Serotec Co., Ltd.
tarafindan üretilmistir) kullanilarak belirlenmistir. Sonuç olarak, anti-B7-H3 antikoru-
üreten hibridomlardan (L7, L8, L11, M30 ve M31) türetilen antikorlarin izotiplerinin
tümünün IgG2a oldugu belirlenmistir.
3)-6 Monoklonal antikorun preparasyonu
Monoklonal antikor, bir hibridom veya bir hibridom kültürü süpematanti ile implante
edilmis bir farenin assitlerinden saflastirilmistir (bundan sonra, bir "antikor saflastirma
için baslangiç materyali" olarak ifade edilir).
Fare assitleri asagidaki sekilde hazirlanmistir. Ilk olarak, 7 ila 8 haftalik BALB/cAJcI-
nu/nu (CLEA Japan, Inc.) farelerine pristan (Sigma Co., Ltd. tarafindan üretilmistir) ile
muamele edilmistir ve yaklasik 3 hafta sonra, fizyolojik salin ile yikanmis bir hibridom
her bir fare için 1 x 107 hücre olarak abdominal kavite içine implante edilmistir. 1 ila 2
hafta sonra, abdominal kavitede biriken assitler toplanmistir ve bir 0,22 um'lik filtre
yoluyla sterilize edilmistir ve elde edilen materyal, antikor saflastirma için bir baslangiç
materyali olarak kullanilmistir.
Hibridom kültürü süpematanti, CELLine (BD Biosciences, Inc. tarafindan üretilmistir)
kullanilarak hazirlanmistir. Kültürleme, CIonaCelI-HY Growth Medium E'nin (StemCeIl
Technologies, Inc. tarafindan üretilmistir, #03805) vasat olarak kullanilmasi disinda
üreticinin protokolüne göre gerçeklestirilmistir. Toplanan kültür süpematanti, bir 0,45
pm'lik filtre yoluyla filtrelenmistir ve elde edilen materyal antikor saflastirma için bir
baslangiç materyali olarak kullanilmistir.
Antikor, Recombinant Protein A rPA50'yi (RepliGen Corporation tarafindan üretilmistir)
FormyI-Cellulofine (Seikagaku Corporation tarafindan üretilmistir) (bundan sonra
Healthcare Bio-Sciences Corporation tarafindan üretilmistir) üzerine immobilize etme
ile elde edilen bir afinite kolonu ile saflastirilmistir. FormyI-Cellulofine Protein A
durumunda, antikor saflastirma için baslangiç materyali, bir baglama tamponu (3 M
NaCI, 1,5 M glisin, pH 8,9) ile 3-kat seyreltilmistir ve elde edilen çözelti bir kolona
eklenmistir, akabinde, kolon baglama tamponu ile yikanmistir, bunu 0,1 M sitrik asit
(pH 4,0) ile elüsyon izlemistir. Diger taraftan, Hitrap MabSelect SuRe (GE Healthcare
Corporation) durumunda, antikor saflastirma için baslangiç materyali bir kolona
eklenmistir ve kolon PBS ile yikanmistir, bunu 2 M Arjinin-HCI (pH 4,0) ile elüsyon
izlemistir.
Ayristirilmis antikor çözeltisi nötralize edildikten sonra, tampon PBS ile degistirilmistir.
Antikorun konsantrasyonu, POROS G 20 um Column PEEK, 4,6 mm x 100 mm, 1,7
ml'ye (Applied Biosystems, Inc.) baglanmis antikoru ayristirma ve eluatin absorbansini
(O.D. 280 nm) ölçme ile elde edilmistir. Spesifik olarak, PBS ile seyreltilmis bir antikor
örnegi, bir dengeleme tamponu (30,6 mM sodyum dihidrojen fosfat/12 sulu, 19,5 mM
monopotasyum fosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,0) ile dengelenmis POROS G 20 um'ye
eklenmistir. Akabinde, kolon dengelem tamponu ile yikanmistir ve kolona baglanmis
antikor akabinde bir eluent (% ile ayristirilmistir.
Eluatin absorbansinin (O.D. 280 nm) pik alani ölçülmüstür ve konsantrasyon asagidaki
denkleme göre hesaplanmistir:
Antikor örneginin konsantrasyonu (mgfml) = (Antikor örneginin pik alani) (referans standardin
(insan lth'inin) pik alani) x Referans standardin konsantrasyonu (mgi'ml) x Örnegin seyreltme
faktörü.
ilaveten, elde edilen antikora dâhil edilen endotoksinin konsantrasyonu, Endospecy
ES-50M Set (Seikagaku Corporation, #020150) ve bir endotoksin referans standardi
CSE-L Set (Seikagaku Corporation, #020055) kullanilarak ölçülmüstür ve 1 EU/mg
veya daha az oldugu konfirme edilmistir. Elde edilen antikor, müteakip deneyde
kullanilmistir.
Örnek 4. Anti-B7-H3 antikorunun özellikleri
4)-1 ADCP aktivitesi
1,5 mi tiyoglikollat, bir BaIb/c-nu/nu faresinin (disi, 6 ila 10 haftalik) (Charles River
Laboratories Japan, Inc.) abdominal kavitesine uygulanmistir. Bundan 5 gün sonra,
makrofajlar abdominal kaviteden toplanmistir. Makrofajlar 500 uL/kuyucuk (1 x 105
hücre/kuyucuk) olarak bir 24-kuyucuklu plakaya eklenmistir ve 37°C'de gece boyu
kültürlenmistir. Bu sekilde hazirlanan makrofajlar, efektör hücreler olarak kullanilmistir.
Hedef hücreler olarak kullanilacak olan NCI-H322 hücrelerinin etiketlenmesi, PKH26
boya etiketleme kiti (Sigma Co., Ltd.) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Hedef hücreler,
TrypLE (Invitrogen Corporati0n) ile sökülmüstür ve PBS ile iki kere yikanmistir.
Hücreler, 1 x 107 hücre/ml'de Diluent C içinde süspanse edilmistir. PKH26 boya stoku
(1 mM), Diluent C ile 8 uM`ye seyreltilmistir ve bundan hemen sonra, seyreltilmis boya
çözeltisi hücre süspansiyonunkine esit olan bir miktarda buna eklenmistir. Elde edilen
karisim 5 dakika boyunca oda sicakliginda birakilmistir. Akabinde, 1 ml serum buna
eklenmistir ve ilaveten, serum içeren bir vasat buna eklenmistir ve yikama iki kere
gerçeklestirilmistir. Bu sekilde hazirlanan hücreler hedef hücreler olarak kullanilmistir.
Örnek 3)-6'da elde edilen antikor, bir kültür çözeltisi ile 20 ug/ml'ye seyreltilmistir. Bunu
dagitilmistir ve karistirilmistir. Elde edilen karisim 30 dakika boyunca buz üzerinde
beklemeye birakilmistir. Süpernatant uzaklastirilmistir ve hücreler bir kültür çözeltisi ile
iki kere yikanmistir ve bir kültür çözeltisinin 500 ul'si içinde süspanse edilmistir.
Süpernatant efektör hücrelerden uzaklastirilmistir ve antikor ile muamele edilmekte
olan ve kültür çözeltisi içinde süspanse edilmis hücreler buna eklenmistir ve bununla
karistirilmistir. Akabinde, hücreler bir C02 inkübatörü içinde 3 saat boyunca
kültürlenmistir. Bundan sonra, hücreler Tripsin-EDTA ile sökülmüstür ve toplanmistir.
Toplanmis hücrelere, bir FITC-etiketlenmis anti-fare CD11b antikoru (Becton,
Dickinson and Company, Ltd.) eklenmistir ve elde edilen karisim 30 dakika boyunca
buz üzerinde beklemeye birakilmistir. Süpernatant uzaklastirilmistir ve hücreler bir
kültür çözeltisi ile iki kere yikanmistir. Toplanan hücreler bir kültür çözeltisinin 300 ul'si
içinde süspanse edilmistir ve FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) ile
analiz edilmistir. CD11b-pozitif makrofajlarda, bir PKH26-pozitif fraksiyon fagositoz-
pozitif hücreler (n=3) olarak degerlendirilmistir.
vermesi için makrofajlar tarafindan NCI-H322 hücrelerinin fagositozunu indüklemistir.
ADCP aktivitesine sahip oldugu gösterilmistir.
Ayni sekilde, piyasada satilan anti-B7-H3 antikorlari elde edilmistir ve bunun ADCP
aktivitesi ölçülmüstür. Bir siçan anti-insan B7-H3 antikoru MIH35 (eBioscience
Company), bir fare anti-insan B7-H3 antikoru , MIH42
(Serotec Co., Ltd.) ve DCN7O (Biolegend Company) elde edilmistir. Bu antikorlarin
Örnek 3)-3'teki ile ayni sekilde B7-H3'ü bagladigi konfirme edilmistir. Bu antikorlar
kullanilarak, ADCP aktivitesi yukaridaki yöntem ile ölçülmüstür.
Sonuç olarak, Sekil 2'de gösterildigi üzere, 1 ug/ml'de eklenmis oldugunda, MIH35,
için makrofajlar tarafindan NCI-H322 hücrelerinin fagositozunu indüklemistir. Bu
dogrultuda, MIH35'in, MIH42'nin ve DCN70'in neredeyse hiç ADCP aktivitesi
göstermedigi ortaya çikarilmistir.
Bu sonuçlardan, tarama ile elde edilen B7-H3'ü taniyan M30 klonlarinin piyasada
satilan B7-H3 antikorlarina kiyasla göze çarpan bir sekilde daha yüksek ADCP
aktivitesine sahip oldugu gösterilmistir.
4)-2 ADCC aktivitesi
4)-2-1 Efektör hücrelerin preparasyonu
Dalak, bir çiplak CAnN.Cg-Foxn1"U/CrICrlj faresinden (Charles River Laboratories
Japan, Inc.) aseptik olarak kesip çikarilmistir. Kesip çikarilmis dalak iki lam cami ile
homojenize edilmistir ve BD Pharm Lyse (BD Biosciences, Ltd. tarafindan üretilmistir,
dalak hücreleri %10 Fetal Bovin Serumu, Ultra-düsük IgG (Invitrogen Corporation
tarafindan üretilmistir) içeren fenol kirmizisi-içermeyen RPMI 1640 (Invitrogen
Corporation tarafindan üretilmistir) (bundan sonra "ADCC vasati" olarak kisaltilmistir)
içinde süspanse edilmistir ve hücre süspansiyonu bir hücre süzgeciden (por boyutu: 40
um, BD Biosciences, Ltd. tarafindan üretilmistir) geçirilmistir. Akabinde. canli hücreler
bir tripan mavisi boya dislama analizi ile sayilmistir. Dalak hücre süspansiyonu sentrifüj
edildikten sonra, vasat uzaklastirilistir ve hücreler 1,5 x 107 hücre/ml olan bir canli
hücre yogunlugunda ADCC vasati içinde yeniden-süspanse edilmistir ve efektör
hücreler olarak kullanilmistir.
4)-2-2 Hedef hücrelerin preparasyonu
Örnek 3)-3'teki ile ayni sekilde hazirlanan B7-H3-eksprese eden 293 hücrelerine
(ATCC) ve bos vektör ile transfekte edilmis 293 hücrelerine tripsin ile muamele
edilmistir ve muamele edilmis her bir hücre tipi, RPMI 1640 (lnvitrogen Corporation)
içeren %10 FBS ile yikanmistir ve akabinde RPMI 1640 içeren %10 FBS içinde
yeniden-süspanse edilmistir. Her bir hücre tipi (4 x 106 hücre), bir 0,22 um'lik filtre
yoluyla sterilize edilmis kromiyum-51 ( ile karistirilmistir ve etiketleme 37°C
ve %5'lik CO2 kosullari altinda 1 saat boyunca gerçeklestirilmistir. Etiketlenmis hücreler
RPMI 1640 (lnvitrogen Corporation) içeren %10 FBS ile üç kere yikanmistir ve hücreler
ADCC vasati içinde 2 x 105 hücre/ml'de yeniden-süspanse edilmistir ve hedef hücreler
olarak kullanilmistir.
4)-2-3 51Cr salim analizi
2 X 105 hücre/ml olan bir hücre yogunlugundaki hedef hücreler, bir 96-kuyucuklu U-
sekilli tabanli mikro-plaka içinde 50 pI/kuyucuk olarak dagitilmistir. M30'un veya bir
izotip kontrol antikorunun (mIgG2a) (eBioscience Company) 50 ul'si buna eklenmistir,
ADCC vasati ile seyreltilmistir, böylece efektör hücrelerin eklenmesinden sonra
antikorun nihai konsantrasyonu, 2,5 ug/ml'dir. Akabinde, plaka 4°C'de 1 saat boyunca
beklemeye birakilmistir. Bundan sonra, 1,5 x 107 hücre/ml olan bir hücre
yogunlugundaki efektör hücrelerin 100 ul'si buna eklenmistir ve hücreler 37°C ve %5'lik
CO2 kosullari altinda gece boyu kültürlenmistir. Sonraki gün, süpernatant bir
LumaPlate (PerkinEImer, Inc. tarafindan üretilmistir) içinde toplanmistir ve bundan
yayilan gama radyasyonu bir gama sayici kullanilarak ölçülmüstür. ADCC aktivitesi
tarafindan neden olunan hücre Iizisinin yüzdesi, asagidaki denkleme göre
hesaplanmistir.
Hücre lizisinin yüzdesi (9st.) = (A-B) (os) x 100
A: örnek kuyucugundan radyasyon sayimi
B: (Antikorun ve efektör hücrelerin eklenmedigi kuyucuklardan) ortalama spontan
radyasyon emisyon sayimi (n=3). ADCC vasatinin antikor ekleme zamaninda 50 pl
olan bir miktarda ve efektör hücreleri ekleme zamaninda 100 pl olan bir miktarda
eklenmesi disinda, örnek kuyucugu için olan ile ayni prosedür gerçeklestirilmistir.
C: (Hedef hücrelerin bir sürfaktan ile çözündügü kuyucuklardan) ortalama
maksimum radyasyon emisyon sayimi (n=3). Antikor ekleme zamaninda 50 ul olan
bir miktarda ADCC vasatinin eklenmesi ve efektör hücreleri ekleme zamaninda 100
pl %2 (hacim/hacim) Triton X-1OO içeren ADCC vasatinin eklenmesi disinda, örnek
kuyucugu için olan ile ayni prosedür gerçeklestirilmistir.
Gösterilen veriler üç-kopya hâlindeki ölçümlerin bir ortalamasidir ve hata çubuklari
standart sapmalari temsil eder. P degeri, Student t-testi kullanilarak hesaplanmistir.
Ölçüm sonuçlari Sekil 3'te gösterilir.
hücre lizisi yüzdesi olan hücre lizisi aktivitesi göstermistir ve bundan dolayi, M30
antikorunun B7-H3-eksprese eden 293 hücrelerine karsi ADCC aktivitesine sahip
oldugu gösterilmistir.
4)-3 CDC aktivitesi
Örnek 2)-3'teki ile ayni sekilde bir deney gerçeklestirilmistir. Degerlendirmede kullanim
için hücreler olarak, NCI-H322 hücreleri kullanilmistir. (Antibiyotikler: penisilin ve
streptomisin içeren) RPMI -6'da elde
antikoru (mlgGZa) eklenmistir, böylece komplemanin eklenmesinden sonra antikorun
nihai konsantrasyonu 25 pg/ml'dir ve elde edilen karisim, 4°C`de 1 saat boyunca
beklemeye birakilmistir. Buna, RPMI 1640 ile %30'a seyreltilmis olan tavsan
komplemani (Cedarlane Laboratories tarafindan üretilmistir, #CL3051) eklenmistir,
böylece komplemanin nihai konsantrasyonu %5'tir ve elde edilen karisim 37°C ve
sicakliginda 30 dakika boyunca beklemeye birakilmistir. Hücre viabilitesini ölçmek için,
CeIITiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation tarafindan
üretilmistir) kültür çözeltisininkine esit olan bir miktarda buna eklenmistir ve elde edilen
karisim oda sicakliginda 10 dakika boyunca karistirilmistir. Bundan sonra,
asagidaki denkleme göre hesaplanmistir.
Hücre viabilitesi [%1 = ia-bé .i' [Iz-b:: x 100
a: Örnek kuyucugundan Iüminesansin miktari
b: (Hücrelerin ve antikorun eklenmedigi kuyucuklardan) arka-plan Iüminesansinin
ortalama miktari (n=3). Hücre ekimi zamaninda hücre süspansiyonu yerine
(antibiyotikler: penisilin ve streptomisin içeren) RPMI 1640 içeren %10 FBS'nin bir
esit miktarinin eklenmesi ve antikoru ekleme zamaninda antikor seyreltme
çözeltisininkine esit olan bir miktarda (antibiyotikler: penisilin ve streptomisin içeren)
RPMl 1640 içeren %10 FBS'nin eklenmesi disinda örnek kuyucugu için olan ile
ayni prosedür gerçeklestirilmistir.
c: Antikorun eklenmedigi kuyucuklardan Iüminesansin ortalama miktari (n=3).
Antikoru ekleme zamaninda antikor seyreltme çözeltisininkine esit olan bir miktarda
(antibiyotikler: penisilin ve streptomisin içeren) RPMI 1640 içeren %10 FBS'nin
eklenmesi disinda örnek kuyucugu için olan ile ayni prosedür gerçeklestirilmistir.
Ölçüm sonuçlari Sekil 4'te gösterilir. Gösterilen veriler üç-kopya hâlindeki ölçümlerin bir
ortalamasidir ve hata çubuklari standart sapmalari temsil eder. Sonuç olarak, kontrol
ve M31 antikorlarinin NCl-H322 hücrelerine karsi CDC aktivitesine sahip oldugu
gösterilmistir.
4)-4 Baglama alaninin belirlenmesi
M30'un hangi BT-H3 alanini bagladigi Örnek 3)-3'teki ile ayni sekilde bir akis sitometrik
yöntem ile incelenmistir. Örnek 1)-1-3'te hazirlanan BT-H3 parsiyel proteinleri için
ekspresyon vektörlerinin her biri ile transfekte edilmis NIH-3T3 hücreleri kullanilmistir.
B7-H3 IgV2'yi baglamamistir.
amino asit numaralari ile temsil edilen amino asit dizisini) ve C2 alanini (SEO ID NO:
6'de 358 ila 456 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen amino asit dizisini)
bagladigi gösterilmistir. Ayni sekilde ayrica, L8'in, L11'in ve M31'in Ci alanini ve C2
alanini bagladigi ve L7'nin V1 alanini (SEO ID NO: 6'de 27 ila 139 arasindaki amino
asit numaralari ile temsil edilen amino asit dizisini) ve V2 alanini (SEO ID NO: 6'da 245
ila 357 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen amino asit dizisini) bagladigi
da gösterilmistir.
Bu dogrultuda, M30'un, her biri B7-H3 ekstraselüler alaninda bir alan olan, IgCl alani
ve/veya IgC2 alani içindeki bir epitop tanidigi ve IgC1 alanini veya IgC2 alanini veya
her ikisini bagladigi gösterilmistir.
4)-5 Antijen özgüllügü
M30'un antijen özgüllügü, Örnek 3)-3'teki ile ayni sekilde bir akis sitometrik yöntem ile
incelenmistir.
proteinleri için, Örnek 1)-1-4'te hazirlanan ekspresyon vektörlerinin her biri ile
transfekte edilmis 293T hücreleri kullanilmistir.
Sonuç olarak, M30'un, B7 familyasi molekülleri olan. CD80. CD86, B7-RP-1. BT-Hl,
B7-DC ve B7-H4'ü baglamadigi gösterilmistir.
Örnek 5. Iri vivo anti-tümör etkisi
)-1 Anti-BT-H3 antikorunun in vivo anti-tümör etkisi
NCI-H322 hücreleri bir kültür flaskindan bir tripsin muamelesi ile sökülmüstür ve RPMl
1640 (lnvitrogen Corporation) içeren %10 FBS içinde süspanse edilmistir, bunu
sentrifügasyon izlemistir ve süpematant uzaklastirilmistir. Hücreler ayni vasat ile iki
kere yikanmistir ve akabinde fizyolojik salin (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
tarafindan üretilmistir) içinde süspanse edilmistir. Akabinde, hücreler 6 haftalik
BALB/cAJcI-nu/nu (CLEA Japan, lnc.) farelerinin bir grubunun her birinin aksiller
bölgesine 1 X 107 hücre/fare olan bir doza subkütan olarak implante edilmistir.
dozda intraperitoneal olarak uygulanmistir. Kontrol için, PBS antikorunkine esit olan bir
hacimde (500 pl) intraperitoneal olarak uygulanmistir. Tümör hacmi günler 10'da,
etkisi incelenmistir.
Sonuç olarak, M30 ve M31 uygulama gruplarinda, tümör büyümesi PBS uygulama
grubuna kiyasla anlamli bir sekilde baskilanmistir (Gün 45'te tümör hacmi açisindan
PBS uygulama grubuna kiyasla M30 ve M31 için P degerleri sirasiyla P<0,05'tir ve
P<0,01'dir. P degerleri Student t-testi kullanilarak hesaplanmistir). Ilaveten, L7, L8,
(antikor uygulama grubundaki ortalama tümör hacmi) / (PBS uygulama grubundaki
etkisine sahip oldugu gözlenmistir (Sekil 6).
Yukaridaki sonuçlardan, M30 ve M31 antikorlarinin bir B7-H3 antijenini taniyan ve bir
anti-tümör etkisi gösteren antikorlar oldugu ortaya çikarilmistir.
)-2 Makrofajlarin deplesyonu kosullari altinda i'n vivo anti-tümör etkisi
In vivo makrofajlari tüketmek Için, klodronat-enkapsüle edilmis Iipozomlar üretilmistir.
KIodronat-enkapsüle edilmis Iipozomlari in vivo uygulama ile, makrofajlarin in vivo
rapordaki yönteme göre, klodronat-enkapsüle edilmis Iipozomlar üretilmistir asagidaki
deneyde kullanilmistir.
NCI-H322 hücreleri bir kültür flaskindan bir tripsin muamelesi ile sökülmüstür ve RPMl
1640 (lnvitrogen Corporation) içeren %10 FBS içinde süspanse edilmistir, bunu
sentrifügasyon izlemistir ve süpematant uzaklastirilmistir. Hücreler ayni vasat ile iki
kere yikanmistir ve akabinde fizyolojik salin (PBS, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
tarafindan üretilmistir) içinde süspanse edilmistir. Akabinde, hücreler 6 haftalik her bir
BALB/cAJcI-nu/nu (CLEA Japan, lnc.) faresinin aksiller bölgesine 1 x 107 hücre/fare
olan bir doza subkütan olarak implante edilmistir. Implantasyon günü, gün -14 olarak
alinmistir ve gruplama gün 0'da yapilmistir.
Farelerde makrofajlarin in vivo tüketilecegi bir grupta, klodronat-enkapsüle edilmis
intravenöz olarak enjekte edilmistir. ilaveten, negatif kontrol grubunda, PBS ayni
intravenöz olarak enjekte edilmistir.
mg/kg) olan bir dozda her iki gruba intraperitoneal olarak uygulanmistir. PBS ayni
ul) her iki gruba intraperitoneal olarak uygulanmistir.
anti-tümör etkisi Incelenmistir (n=8).
Sonuçlar Tablolar 1'de ve 2'de ve Sekil 7'de gösterilir.
Son 2' GL'mS Gun 15
Tumor hacmi
Clod Iip + PBS ,
Clod Iip 4.13:- _ , , , , ,
Tumor hacmi
CIodIip+PBS , , R 5 ,- . .
PBS intravenöz uygulama + M30 antikoru intraperitoneal uygulama grubunda (PBS +
M30 uygulama grubunda), tümör büyümesi, negatif kontrol görevi gören PBS
intravenöz uygulama + PBS intraperitoneal uygulama grubu (PBS + PBS uygulama
grubu) ile karsilastirildiginda anlamli bir sekilde baskilanmistir. Daha spesifik olmasi
için, Gün 36'da tümör hacmi açisindan PBS + PBS uygulama grubu ile
karsilastirildiginda PBS + M30 uygulama grubu için P degeri, P<0,05'tir (P degeri,
Student t-testi kullanilarak hesaplanmistir). Ilaveten, gün 36'da tümör büyümesi
inhibisyonu orani (= /
(PBS + PBS uygulama grubunda ortalama tümör hacmi) x 100) %49,8'dir (Tablo 2).
Diger taraftan, kIodronat-enkapsüle edilmis Iipozom intravenöz uygulama + PBS
intraperitoneal uygulama grubunda (Clod Iip + PBS uygulama grubunda) ve klodronat-
enkapsüle edilmis Iipozom intravenöz uygulama + M30 antikoru intraperitoneal
uygulama grubunda (Clod Iip + M30 uygulama grubunda), tümör büyümesinin
baskilanmasi gözlenmemistir. Daha spesifik olmak için, gün 36`da tümör hacmi
açisindan PBS + PBS uygulama grubu ile karsilastirildiginda Clod Iip + PBS uygulama
grubu ve Clod Iip + M30 uygulama grubu için P degerleri sirasiyla P=O,52'dir ve P=1'dir
(P degerleri, Student t-testi kullanilarak hesaplanmistir). ilaveten, gün 36'da tümör
büyümesi inhibisyonu orani (= 100 - (Clod Iip + PBS uygulama grubunda veya Clod Iip
+ M30 uygulama grubunda ortalama tümör hacmi) / (PBS + PBS uygulama grubunda
ortalama tümör hacmi) x 100) sirasiyla, -%21,2'dir ve -%1,4'tür (Tablo 2).
Tümör büyümesi inhibisyonu orani Gün Gün Gün Gün Gün
Yukaridaki sonuçlardan, M30 antikorunun anti-tümör etkisinin klodronat-enkapsüle
edilmis Iipozomlari uygulama ile baskilandigi gösterilmistir ve bundan dolayi, M30
antikorunun anti-tümör etkisinin agirlikli olarak makrofajlar tarafindan aracilik edilen bir
etki oldugu ortaya çikarilmistir.
Örnek 6. Fare antikoru M30 cDNA'sinin klonlanmasi ve dizinin belirlenmesi
6)-1 Fare antikoru M30'un agir ve hafif zincirlerinin N-ucu amino asit dizilerinin
belirlenmesi
Fare antikoru M30'un agir ve hafif zincirlerinin N-ucu amino asit dizilerini belirlemek
için, Örnek 3)-6'da saflastirilan fare antikoru M30, SDS-PAGE ile ayrilmistir. Jel
içindeki protein, ayirmadan sonra jelden bir PVDF membranina (por boyutu: 0,45 um,
tamponu (25 mM NaCl, 10 mM sodyum borat tamponu, pH 8,0) ile yikanmistir ve
bundan sonra bir boya çözeltisine (%50 metanol, %20 asetik asit, %0,05 Coomassie
parlak mavisi) içine 5 dakika boyunca daldirilma ile boyanmistir, bunu %90 metanol ile
boyasindan arindirma izlemistir. PVDF membrani üzerinde görsellestirilen agir zincire
karsilik gelen bandin (daha küçük mobilitesi olan bandin) ve hafif zincire karsilik gelen
bandin (daha büyük mobilitesi olan bandin) kisimlari kesip çikarilmistir.
Hafif zincire karsilik gelen bandin kismi, küçük bir miktardaki bir %05
polivinilpirrolidon/100 mM asetik asit çözeltisi içinde 37°C'de 30 dakika boyunca inkübe
edilmistir, bunu su ile iyice yikama izlemistir. Bunu takiben, modifiye edilmis N-ucu
rezidüsü, Pfu Pyroglutamate Aminopeptidase Kit'i (TaKaRaBio, Inc.) kullanilarak
uzaklastirilmistir, bunu su ile yikama ve hava ile kurutma izlemistir. Akabinde, Procise
(tescilli ticari marka) CLC Protein Sequencer Model 4920LC (Applied Biosystems, Inc.)
kullanilarak bir otomatik Edman yöntemi (bakiniz, Edman et al., (1967) Eur. J.
Biochem. 1, 80) ile bunlarin ilgili N-ucu amino asit dizilerini tanimlamak için bir
girisimde bulunulmustur.
Sonuç olarak, fare antikoru M30'un agir zincirine karsilik gelen bandin N-ucu amino
asit dizisinin EVQLQQSGPE (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 44) oldugu belirlenmistir ve
bunun hafif zincirine karsilik gelen bandin N-ucu amino asit dizisinin
6)-2 Fare antikoru M30'u üreten hibridomdan elde edilen mRNA'nin preparasyonu
Fare antikoru MSO'un agir zincirinin ve hafif zincirinin her birini sifreleyen cDNA'Iari
klonlamak için, mRNA, Quick Prep mRNA Purification Kit'i (GE Healthcare Corporation)
kullanilarak fare antikoru M30'u üreten hibridomdan hazirlanmistir.
6)-3 Fare antikorun M30 cDNA'sinin klonlanmasi ve dizinin belirlenmesi
Fare antikoru M30'un agir ve hafif zincirlerinin izotiplerinin Örnek 3)-5'te bulunan y2a ve
K olduguna yönelik bulgulara ve Örnek 1-1'de belirlenen agir ve hafif zincirlerin N-ucu
amino asit dizilerine ve antikorlarin amino asit dizilerinin veri tabanina (bakiniz, Kabat,
E. A. et al., (1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. I and IIi
U.S. Department of Health and Human Services) atfen, bir antikor geni kodlama
bölgesinin 5'-ucu bölgesinin ve bunun bir durdurma kodonu içeren 3'-ucu bölgesinin her
birine hibridize olan bir kaç oligonükleotid primeri sentezlenmistir ve agir zinciri
sifreleyen bir CDNA ve hafif zinciri sifreleyen bir CDNA Örnek 6)-2'de hazirlanan mRNA
ve TaKaRa One Step RNA PCR Kit'i (AMV) (TaKaRa Bio, Inc.) kullanilarak
çogaltilmistir. Sonuç olarak, antikorun agir zincirini sifreleyen cDNA ve antikorun hafif
zincirini sifreleyen CDNA asagidaki primer setleri ile çogaltilabilir.
Agir zincir için primer seti
'-aagaattcatggaatggagttggata-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 46)
'-aagatatctcatttacccggagtccgggagaa-B' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO:)
Hafif zincir için primer seti
'-aagaattcatggattttctggtgcag-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 48)
'-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 49)
PCR ile çogaltilan agir zinciri sifreleyen cDNA'nin ve hafif zinciri sifreleyen cDNA'nin
her biri, pEF kullanilarak
çogaltilmistir ve klonlanan agir zincirin ve hafif zincirin nükleotid dizilerinin her biri, bir
gen dizisi analizörü ("ABI PRISM 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems" veya
Dizileme reaksiyonunda, GeneAmp kullanilmistir.
Fare antikoru M30'un agir zincirini sifreleyen cDNA'nin belirlenen nükleotid dizisi, Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 50 ile temsil edilir ve bunun amino asit dizisi, SEQ ID NO: 51
ile temsil edilir. ilaveten, SEQ ID NO.'Iari: 50'nin ve 51'in dizileri Sekil 21'de gösterilir.
Fare antikoru M30'un hafif zincirini sifreleyen cDNA'nin belirlenen nükleotid dizisi, Dizi
Listesi'nde SEQ ID NO: 52 ile temsil edilir ve bunun amino asit dizisi, SEQ lD NO: 53
ile temsil edilir. ilaveten, SEQ ID NO.'Iari: 52'nin ve 53'ün dizileri Sekil 22'de gösterilir.
ilaveten, agir zincirin ve hafif zincirin amino asit dizileri, antikorlarin amino asit
dizilerinin veri tabani olan, KabatMan (bakiniz, PROTEINS: Structure, Function and
olarak, fare antikoru M30'un agir zincirinde, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 51'de 20 ila
141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen amino asit dizisinin degisken
bölge oldugu bulunmustur. Ayrica, fare antikoru M30'un hafif zincirinde, Dizi Listesi'nde
SEÇ) ID NO: 53'te 23 ila 130 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen amino
asit dizisinin degisken bölge oldugu bulunmustur.
Örnek 7. Kimerik antikor M30'un (cM3O antikorunun) üretilmesi
7)-1 Kimerik ve beserilestirilmis hafif zincir ekspresyon vektörü pEF6KCL'nin
yapilmasi
Bir sablon olarak bir pEFG/V5-HisB plazmidi (Invitrogen Corporation) kullanilarak ve
ayrica asagidaki primerler de kullanilarak PCR gerçeklestirme ile, BGHpA'nin (Dizi
pozisyonu: 2174) hemen downstream kismi ila Smal (Dizi pozisyonu: 2958) arasindaki
bir DNA fragmani (f1 replikasyon orijini ve SV4O promotörü ve orijini içeren, bundan
sonra "fragman A" olarak ifade edilen, bir DNA fragmani) elde edilmistir.
'-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 54)
'-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 55)
Elde edilen fragman A ve bir insan K zinciri sekretuvar sinyalini, bir insan K zinciri sabit
bölgesini ve bir insan poIi-A ekleme sinyalini sifreleyen bir DNA dizisi içeren bir DNA
fragmani (SEQ lD NO: 56, bundan sonra "fragman B" olarak ifade edilir, SEQ ID NO:
56'nin dizisi ayrica Sekil 23'te de gösterilir) kesisen uzanti PCR ile birbirine
baglanmistir. Burada fragman A'nin ve fragman B'nin birbirine baglandigi, bu sekilde
elde edilen DNA fragmani, Kpnl ve Smal restriksiyon enzimleri ile sindirilmistir, bu Kpnl
ve Smal restriksiyon enzimleri ile sindirilmis bir pEFGNS-HisB (Invitrogen Corporation)
plazmidine baglanmistir, böylece EF1 promotörüne downstream bir sinyal dizisine, bir
klonlama yerine, bir insan K zinciri sabit bölgesine ve bir Insan poIi-A ekleme sinyali
dizisine sahip olan bir kimerik ve beserilestirilmis hafif zincir ekspresyon vektörü
pEFGKCL yapilmistir.
7)-2 pEF1KCL'nin yapilmasi
Yukarida-tarif edilen yöntem ile elde edilen pEFöKCL'yi Kpnl ve Smal restriksiyon
enzimleri ile yarma ile elde edilen bir DNA fragmani, Kpnl ve Smal ile sindirilmis
pEF1/myc-HisB'ye (Invitrogen Corporation) baglanmistir, böylece bir pEF1KCL
plazmidi yapilmistir.
7)-3 Kimerik ve beserilestirilmis agir zincir ekspresyon vektörü pEF1FCCU'nun
yapilmasi
Insan lgG1'inin bir sinyal dizisinin ve bir sabit bölgesinin amino asitlerini sifreleyen bir
DNA dizisi içeren bir DNA fragmani (SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:57'nin dizisi ayrica
Sekil 24'te de gösterilir) Nhel ve Pmel restriksiyon enzimleri ile sindirilmistir ve Nhel ve
Pmel ile sindirilmis pEF1KCL plazmidine baglanmistir, böylece EF1 promotörüne
downstream bir sinyal dizisine, bir klonlama yerine, bir insan agir zincir sabit bölgesine
ve bir insan poli-A ekleme sinyali dizisine sahip olan bir kimerik veya beserilestirilmis
agir zincir ekspresyon vektörü pEF1FCCU yapilmistir.
7)-4 M30 kimerasi-tipi hafif zincir ekspresyon vektörünün yapilmasi
Bir sablon olarak fare antikoru M30'un hafif zincirini sifreleyen cDNA kullanilarak ve
ayrica KOD-Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.) ve asagidaki primer seti de kullanilarak, hafif
zincir degisken bölgesini sifreleyen cDNA'yi içeren bir bölge çogaltilmistir. Çogaltilmis
ürünü Ndel ve BsiWI restriksiyon enzimleri ile yarma ile elde edilen bir DNA fragmani,
Ndel ve BsiWI restriksiyon enzimleri ile yarilmis yerden evrensel kimerik ve
beserilestirilmis antikor hafif zincir ekspresyon vektörü (pEFGKCL) içine yerlestirilmistir,
böylece bir M30-kimerasi-tipi hafif zincir ekspresyon vektörü yapilmistir. Bu sekilde
elde edilen ekspresyon vektörü, "pEFGKCL/MBOL" olarak adlandirilmistir. M30-
kimerasi-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 58 ile temsil edilir
ve bunun amino asit dizisi, SEQ ID NO: 59 ile temsil edilir. SEQ ID NO.'Iari: 58'in ve
59'un dizileri Sekil 25'te gösterilir. Bu arada, Dizi Listesi`nde SEQ lD NO: 59 ile temsil
edilen cM30 antikoru hafif zincirinin amino asit dizisinde pozisyon 128'deki bir treonin
rezidüsü, hafif zincir degisken bölgesinin karboksil ucunda yer alir ve Dizi Listesi'nde
SEQ ID NO: 53 ile temsil edilen M30 antikoru hafif zincirinin amino asit dizinde
pozisyon 130'daki bir alanin rezidüsüne karsilik gelir, bununla birlikte, SEQ ID NO: 59
ile temsil edilen amino asit dizisinde, rezidü hâlihazirda, bir insan antikoru hafif
zincirinden türetilen bir treonin rezidüsü ile sübstüte edilmistir.
Hafif zincir için primer seti
'-aaacatatggccaaattgttctctcccagtctccaacaatcc-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO:
'-aaacgtacgtttcagctccagcttggtcccagtaccg-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 61)
7)-5 M30 kimerasi-tipi agir zincir ekspresyon vektörünün yapilmasi
Bir sablon olarak fare antikoru M30'un agir zincirini sifreleyen cDNA kullanilarak, KOD-
Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.) ve asagidaki primer seti A kullanilarak PCR gerçeklestirme
ile elde edilen bir DNA fragmani, asagidaki primer seti C kullanilarak kesisim uzanti
PCR yoluyla asagidaki primer seti B kullanilarak PCR gerçeklestirme ile elde edilen bir
DNA fragmanina baglanmistir, böylece degisken bölge içindeki Blpl uzaklastirilmistir
ve ayrica agir zincir degisken bölgesini sifreleyen cDNA'yi içeren bir bölge de
çogaltilmistir. Çogaltilmis ürünü Blpl restriksiyon enzimi ile yarma ile elde edilen bir
DNA fragmani, Blpl restriksiyon enzimi ile yarilmis yerden evrensel kimerik ve
beserilestirilmis antikor agir zincir ekspresyon vektörü (pEF1FCCU) içine
yerlestirilmistir, böylece bir M30-kimerasi-tipi agir zincir ekspresyon vektörü yapilmistir.
Bu sekilde elde edilen ekspresyon vektörü “pEF1FCCU/M3OH" olarak adlandirilmistir.
M30 kimerasi-tipi agir zincirin nükleotid dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 62 ile temsil
edilir ve bunun amino asit dizisi, SEQ ID NO: 63 ile temsil edilir. Ilaveten, SEQ ID
NO.'Iari: 62'nin ve 63'ün dizileri Sekil 26'da gösterilir.
Primer seti A
'-aaagctgagcgaggtccagctgcagcagtctggacctgag-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO:
'-gaggtcaggctgctgagttccatgtaggctgtgctg-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 65)
Primer seti B
'-cagcacagcctacatggaactcagcagcctgacctc-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO:66)
'-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccag-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO:
Primer seti C
'-aaagctgagcgaggtccagctgcagcagtctggacctgag-3' (Dizi Listesi'nde SEQ lD NO:
'-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccag-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO:
7)-6 Kimerik antikor M30'un preparasyonu
7)-6-1 Kimerik antikor M30'un üretilmesi
Logaritmik büyüme fazindaki 1,2 x 109 hücre FreeSter 293F hücresi (Invitrogen
Corporation) 1,2 L'Iik taze FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corporation)
içine ekilmistir ve 37°C'de %8'Iik bir C02 inkübatörü içinde 90 rpm'de çalkalama ile 1
saat boyunca kültürlenmistir. 3,6 mg polietilenimin (Polyscience #24765), 20 ml Opti-
Pro SFM vasati (Invitrogen Corporation) içinde çözünmüstür. Bunu takiben, PureLink
HiPure Plasmid Kit'i (Invitrogen Corporation) ile hazirlanan pEF1FCCU/M30H (0,4 mg)
ve pEF6KCL/M30L (0,8 mg) 20 ml Opti-Pro SFM vasati içinde süspanse edilmistir.
Akabinde, elde edilen ekspresyon vektörleri/Opti-Pro SFM karma sivisinin 20 ml'si,
elde edilen polietilenimin/Opti-Pro SFM karma sivisinin 20 ml'sine eklenmistir ve elde
edilen karisim hafif bir sekilde karistirilmistir ve akabinde 5 dakika boyunca beklemeye
birakilmistir. Bundan sonra, karisim FreeStyle 293F hücrelerine eklenmistir ve 90
rpm'de çalkalama kültürü 37°C'de %8'Iik bir 002 inkübatörü içinde 7 gün boyunca
gerçeklestirilmistir. Elde edilen kültür süpernatanti, bir tek-kullanimlik kapsül filtre
(Advantec #CCS-045-E1 H) ile filtreden geçirilmistir.
pEF1FCCU/M30H'nin ve pEF6KCL/M30L'nin bir kombinasyonu ile elde edilen bir
kimerik antikor M30, "cM30" veya "CMSO antikoru" olarak adlandirilmistir.
Örnek 7)-6-1'de elde edilen kültür süpernatanti, rProtein A afinite kromatografisini (4 ila
6°C`de) (GE Healthcare Japan Corporation) ve seramik hidroksiapatiti (oda
sicakliginda) içeren bir iki-adimli proses ile saflastirilmistir. rProtein A afinite
kromatografisi ile saflastirmadan sonra ve seramik hidroksiapatit ile saflastirmadan
sonra oda sicakliginda bir tampon degisim adimi gerçeklestirilmistir. Ilk olarak, 1100 ila
1200 ml kültür süpernatanti, PBS ile dengelenmis MabSeIect SuRe'ya (GE Healthcare
Bio-Sciences Corporation tarafindan üretilmistir, seri hâlde baglanmis iki HiTrap kolonu
(hacim: 1 ml)) uygulanmistir. Tüm kültür çözeltisi kolona döküldükten sonra, kolon 15
ila 30 ml PBS ile yikanmistir. Bunu takiben, elüsyon bir 2 M arjinin hidroklorür çözeltisi
(pH 4,0) ile gerçeklestirilmistir ve antikoru içeren bir fraksiyon toplanmistir. Fraksiyon,
bir tuzundan arindirma kolonuna (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation tarafindan
üretilmistir, seri hâlde baglanmis iki HiTrap tuzundan arindirma kolonu (hacim: 5 ml))
uygulanmistir, böylece tampon, pH 6,5'te 5 mM sodyum fosfat, 50 mM MES ve 20 mM
NaCI içeren bir tampon ile degistirilmistir.
ilaveten, tampon degisimine tabi tutulan antikor çözeltisi, pH 6,5'te 5 mM NaPi, 50 mM
MES ve 20 mM NaCl içeren bir tampon ile dengelenmis bir seramik hidroksiapatit
kolonuna (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT2-1 hidroksiapatit kolonu
(hacim: 2 ml)) uygulanmistir. Akabinde, sodyum klorür ile lineer konsantrasyon
gradyanli elüsyon gerçeklestirilmistir ve antikoru içeren bir fraksiyon toplanmistir.
Fraksiyon, bir tuzundan arindirma kolonuna (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation
tarafindan üretilmistir, seri hâlde baglanmis iki HiTrap tuzundan arindirma kolonu
(hacim: 5 ml)) uygulanmistir, böylece sivi, (10 mM sitrat tamponu ve 140 mM sodyum
klorür, pH 6,0) içeren CBS ile degistirilmistir.
Son olarak, elde edilen çözelti Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (fraksiyonel
moleküler agirlik: 30 K, Sartorius Co., Ltd., 4°C'de) kullanilarak konsantre edilmistir ve
elde edilen çözelti bir saflastirilmis örnek olarak kullanilmistir.
Örnek 8. cM30 antikorunun aktivitesi
8)-1 cM30 antikorunun B7-H3'ü baglama aktivitesi
M30 antikoru veya CM3O antikoru ve B7-H3 antijeni arasindaki afinite bir yüzey
plazmon rezonansi (SPR) cihazi (GE Healthcare Corporation) ile ölçülmüstür. Yaygin
prosedürlere göre, bir anti-fare IgG veya bir anti-insan IgG antikoru bir sensör çipi
üzerine immobilize edilmistir ve akabinde, M30 antikoru örnegi veya cM30 antikoru
buna baglanmistir. Bundan sonra, bir rekombinant B7-H3 varyant 2 antijeninin bir
ekstraselüler alan polipeptidi (R&D Systems, Inc. tarafindan üretilmistir, #2318-83-
OSO/CF) farkli konsantrasyonlarda buna eklenmistir ve bir yürütme tamponu (fosfat
tamponu, % içinde antikora baglanmis antijenin miktari zamanla
ölçülmüstür. Ölçülen miktar, özel yazilim (BIAevaluation Versiyon 4.1, GE Healthcare
Corporation) ile analiz edilmis ve bir ayrilma sabiti hesaplanmistir.
olan bir ayrilma sabiti ile rekombinant BY-H3 antijenine baglandigi bulunmustur. Bu
sonuçlardan, M30 antikorunun ve cM30 antikorunun B7-H3 antijenini bagladigi ve
bunlarin baglama afinitelerinin büyük ölçüde esit oldugu konfirme edilmistir.
8)-2 cM30 antikorunun ADCP aktivitesi
Bir saglikli süjenin periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'Ieri) yaygin prosedürlere
göre izole edilmistir ve RPMI içeren %10 FBS içinde
süspanse edilmistir ve akabinde bir flask içine ekilmistir. Hücreler bir 002 inkübatörü
içinde gece boyu kültürlenmistir. Kültür süpernatanti uzaklastirilmistir ve flaska
tutturulmus olan hücrelere, M-CSF ve GM-CSF ile takviye edilmis RPMI içeren %10 FBS eklenmistir ve hücreler 2 hafta boyunca
kültürlenmistir. Hücreler TrypLE ile sökülmüstür ve toplanmistir. Akabinde, hücreler olarak bir 24-kuyucuklu plakaya eklenmistir ve
37°C'de gece boyu kültürlenmistir. Bu sekilde hazirlanan hücreler efektör hücreler
olarak kullanilmistir.
Hedef hücreler olarak kullanilacak olan NCl-H322 hücrelerinin etiketlenmesi, PKH26
boya etiketleme kiti (Sigma Co., Ltd.) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Hedef hücreler,
TrypLE ile sökülmüstür ve PBS ile iki kere yikanmistir. Hücreler, 1 x 107 hücre/ml'de
Diluent C içinde süspanse edilmistir. PKH26 boya stoku (1 mM), Diluent C ile 8 uM'ye
seyreltilmistir ve bundan hemen sonra, seyreltilmis boya çözeltisi hücre
süspansiyonunkine esit olan bir miktarda buna eklenmistir. Elde edilen karisim 5 dakika
boyunca oda sicakliginda birakilmistir. Akabinde, 1 ml serum buna eklenmistir ve
ilaveten, serum içeren bir vasat buna eklenmistir ve yikama iki kere gerçeklestirilmistir.
M30 antikorunun ve cM30 antikorunun her biri bir kültür çözeltisi ile 20 ug/ml'ye
Seyreltilmistir. Bunu takiben, hedef hücreler 2 x 106 hücre/100 ul/tüp olarak dagitilmistir
ve karistirilmistir. Elde edilen karisim 30 dakika boyunca buz üzerinde beklemeye
birakilmistir. Süpernatant uzaklastirilmistir ve hücreler bir kültür çözeltisi ile iki kere
yikanmistir ve bir kültür çözeltisinin 500 ul'si içinde süspanse edilmistir. Süpernatant
efektör hücrelerden uzaklastirilmistir ve antikor ile muamele edilmekte olan ve kültür
çözeltisi içinde süspanse edilmis hücreler buna eklenmistir ve bununla karistirilmistir.
Akabinde, hücreler bir C02 inkübatörü içinde 3 saat boyunca kültürlenmistir. Bundan
sonra, hücreler Tripsin-EDTA ile sökülmüstür ve toplanmistir. Toplanmis hücrelere, bir
FITC-etiketlenmis anti-fare CD11b antikoru (Becton, Dickinson and Company, Ltd.)
eklenmistir ve elde edilen karisim 30 dakika boyunca buz üzerinde beklemeye
birakilmistir. Süpernatant uzaklastirilmistir ve hücreler bir kültür çözeltisi ile iki kere
yikanmistir. Toplanan hücreler bir kültür çözeltisinin 300 ul'si Içinde süspanse edilmistir
ve FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) ile analiz edilmistir. CD11b-
pozitif makrofajlarda, bir PKH26-pozitif fraksiyon fagositoz-pozitif hücreler olarak
degerlendirilmistir.
Sonuç olarak, Sekil 8'de gösterildigi üzere, M30 antikoru ve cM30 antikoru 10 ug/ml'de
eklendiginde, makrofajlar tarafindan NCI-H322 hücrelerinin fagositozu sirasiyla %33 ±
1'e ve %35 ± 2'ye indüklenmistir. Bu dogrultuda, cM30 antikorunun NCI-H322
hücrelerine karsi M30 antikoru ile ayni sekilde bir ADCP aktivitesine sahip oldugu
gösterilmistir. Benzer bir deneysel sonuç ayrica, MDA-MB-
karsi bir ADCP aktivitesi için de elde edilmistir.
8)-3 cM30 antikorunun in vivo anti-tümör etkisi
MDA-MB-231 hücreleri bir kültür flaskindan bir tripsin muamelesi ile sökülmüstür ve
RPMI içeren %10 FBS içinde süspanse edilmistir, bunu
sentrifügasyon izlemistir ve süpematant uzaklastirilmistir. Hücreler ayni vasat ile iki
kere yikanmistir ve akabinde BD Matrigel Basement Membrane Matrix (BD
Biosciences, Inc. tarafindan üretilmistir) içinde süspanse edilmistir. Akabinde, hücreler
6 haftalik her bir farenin (CB17/Icr-Prkdc[scid]/CrICrlj, Charles River Laboratories
Japan, Inc.) aksiller bölgesine 5 x 106 hücre/fare olan bir doza subkütan olarak
implante edilmistir. Implantasyon günü gün 0 olarak alinmistir ve günler 14'te, 21'de,
mg/kg) olan bir dozda intraperitoneal olarak uygulanmistir. Tümör hacmi günler 14'te,
ve antikoru uygulamanin anti-tümör etkisi incelenmistir.
Sonuç olarak, M30 ve cM30 antikoru uygulama gruplarinda, tümör büyümesi, burada
antikorun uygulanmadigi muamele edilmemis grup ile karsilastirildiginda anlamli bir
sekilde baskilanmistir. Gün 52'de tümör agirligi açisindan muamele edilmemis grup ile
karsilastirildiginda M30 antikoru ve CM3O antikoru için P degerlerinin her ikisi de,
P<0,001'dir. P degerleri, Dunnett çoklu karsilastirma testi kullanilarak hesaplanmistir.
ilaveten, gün 52'de tümör büyümesi inhibisyonu orani (= 100 - (antikor uygulama
grubunda ortalama tümör hacmi) / (muamele edilmemis grupta ortalama tümör hacmi)
dogrultuda, cM30 antikorunun M30 antikoru ile ayni sekilde çok güçlü bir in w'vo anti-
tümör etkisine sahip oldugu gözlenmistir (Sekil 9).
Örnek 9. Fare anti-insan B7-H3 antikorunun beserilestirilmis antikorunun #M30
tasarlanmasi
9)-1 Beserilestirilmis M30 antikorunun tasarlanmasi
9)-1-1 M30 degisken bölgelerinin moleküler modellenmesi
M30 degisken bölgelerinin moleküler modellenmesi, genel olarak homoloji modellemesi
kaydedilmis insan immünoglobülininin degisken bölgelerinin primer dizileri (X-isini
kristal yapilarindan türetilen üç-boyutlu yapilar mevcuttur), Örnek 6-3'te belirlenen M30
degisken bölgeleri ile karsilastirilmistir.
Sonuç olarak, SBKY, çerçevede benzer sekilde bir silinmeye sahip olan antikorlar
arasinda M30 hafif zincir degisken bölgesi ile en yüksek dizi homolojisine sahip olan bir
dizi olarak seçilmistir. Ilaveten, 3DGG, M30 agir zincir degisken bölgesi ile en yüksek
dizi homolojisine sahip olan bir dizi olarak seçilmistir.
Bir çerçeve bölgesinin üç-boyutlu yapisi, M30 hafif zincirine karsilik gelen BBKY
koordinatlarini M30 agir zincirine karsilik gelen 3DGG koordinatlari ile birlestirme ile bir
93), CDRH3'ünkiIere (SEO ID NO: 94), CDRL1'inkiIere (SEO ID NO: 95),
CDRL2'ninkiIere (SEO ID NO: 96) ve CDRL3'ünkiIere (SEO ID NO: 97) en çok
benzeyen konformasyonlari tanimlayan koordinatlar olarak sirasiyla 2HOJ, 1BBD,
1090, 2FBJ, 1LNK ve 1TET seçilmistir ve çerçeve modeline katilmistir.
Son olarak, enerji açisindan M30 degisken bölgesinin bir olasi moleküler modelini elde
etmek amaciyla, dezavantajli interatomik temasi dislamak için bir enerji hesaplamasi
yapilmistir. Yukaridaki prosedür, piyasada satilan protein tersiyer yapisi tahmin
programi Primer ve koordinat arama programi MacroModel (Schrodinger, LLC)
kullanilarak yürütülmüstür.
9)-1-2 Beserilestirilmis M30'un amino asit dizisinin tasarlanmasi
Bir beserilestirilmis M30 antikoru, genel olarak CDR greftleme olarak bilinen bir
Bir akseptör antikor, çerçeve bölgesi içindeki amino asit homolojisine göre seçilmistir.
M30'un çerçeve bölgesinin dizisi, antikor amino asit dizilerinin Kabat Database (Nuc.
Sonuç olarak, bir mAb49'CL antikoru (NCBI içindeki GenBank: D16838.1 ve
D16837.1), çerçeve bölgesindeki %70'Iik bir dizi homolojisine göre bir akseptör olarak
seçilmistir.
mAb49'CL'nin çerçeve bölgesindeki amino asit rezidüleri, MSO'un amino asit rezidüleri
ile hizalanmistir ve farkli amino asitlerin kullanildigi pozisyonlar tanimlanmistir. Bu
rezidülerin pozisyonlari, yukarida yapilan M30`un üç-boyutlu modeli kullanilarak analiz
edilmistir. Akabinde, akseptör üzerine grefte edilecek olan donör rezidüleri Queen et
göre seçilmistir. Seçilen bazi donör rezidülerini akseptör antikora transfer etme ile,
beserilestirilmis M30 antikoru dizileri asagidaki Örnek'te tarif edildigi üzere yapilmistir.
9)-2 M30 agir zincirinin beserilestirilmesi
9)-2-1 M30-H1-tipi agir zincir:
Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 63 ile temsil edilen cM30 agir zincirinin 20 (glutamik asit),
106 (treonin), 110 (serin), 136 (treonin) ve amino asit numaralarini sirasiyla
glutamin, valin, alanin, valin, Iizin, serin, valin, arjinin, alanin, metiyonin, arjinin, valin,
izolösin, alanin, glutamik asit, treonin, arjinin, treonin, Iösin ve valin ile sübstüte etme ile
tasarlanan bir beserilestirilmis M30 agir zinciri, "M30-H1-tipi agir zincir" olarak
adlandirilmistir.
M30-H1-tipi agir zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 85 ile temsil edilir.
9)-2-2 M30-H2-tipi agir zincir:
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen CM3O agir zincirinin 20 (glutamik asit),
(treonin), 110 (serin), 136 (treonin) ve amino asit numaralarini sirasiyla
glutamin, valin, alanin, valin, Iizin, serin, valin, arjinin, alanin, arjinin, valin, izolösin,
alanin, glutamik asit, treonin, arjinin, treonin, Iösin ve valin ile sübstüte etme ile
tasarlanan bir beserilestirilmis M30 agir zinciri "M30-H2-tipi agir zincir" olarak
adlandirilmistir.
M30-H2-tipi agir zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 87 ile temsil edilir.
9)-2-3 M30-H3-tipi agir zincir:
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen cM30 agir zincirinin 24 (glutamin), 28
amino asit numaralarini sirasiyla valin, alanin, valin, lizin, serin, valin, alanin, izolösin,
alanin, glutamik asit, treonin, arjinin, treonin, Iösin ve valin ile sübstüte etme ile
tasarlanan bir beserilestirilmis M30 agir zinciri "M30-H3-tipi agir zincir" olarak
adlandirilmistir.
M30-H3-tipi agir zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 89 ile temsil edilir.
9)-2-4 M30-H4-tipi agir zincir:
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen cM30 agir zincirinin 24 (glutamin), 28
(treonin), 110 (serin), 136 (treonin) ve amino asit numaralarini sirasiyla
valin, alanin, valin, Iizin, serin, valin, alanin, treonin, arjinin, treonin, lösin ve valin ile
sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 agir zinciri "M30-H4-tipi agir
zincir" olarak adlandirilmistir.
M30-H4-tipi agir zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 91 ile temsil edilir.
9)-3 M30 hafif zincirinin beserilestirilmesi
9)-3-1 M30-L1 -tipi hafif zincir:
Dizi Listesinde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen cM3O hafif zincirinin 21 (glutamin), 25
amino asit numaralarini sirasiyla glutamik asit, treonin, alanin,
treonin, lösin, arjinin, alanin, lösin, serin, glutamin, alanin, arjinin, lösin, lösin, izolösin,
aspartik asit, fenilalanin, treonin, Iösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve
izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M3O hafif zinciri "M30-L1-
tipi hafif zincir" olarak adlandirilmistir.
M30-L1-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 71 ile temsil edilir.
9)-3-2 M30-L2-tipi hafif zincir:
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen cM3O hafif zincirinin 21 (glutamin), 25
amino asit numaralarini sirasiyla glutamik asit, treonin, alanin, treonin, Iösin, arjinin,
alanin, Iösin, serin, glutamin, alanin, arjinin, Iösin, izolösin, aspartik asit, treonin, Iösin,
prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir
beserilestirilmis M30 hafif zinciri "M30-L2-tipi hafif zincir" olarak adlandirilmistir.
M30-L2-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 73 ile temsil edilir.
9)-3-3 M30-L3-tipi hafif zincir:
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen cM30 hafif zincirinin 29 (treonin), 30
alanin, Iösin, alanin, Iösin, izolösin, treonin, Iösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin,
valin ve izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 hafif zinciri
M30-L3-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 75 ile temsil edilir.
9)-3-4 M30-L4-tipi hafif zincir:
Dizi Listesi'nde SEQ lD NO: 59 ile temsil edilen CM30 hafif zincirinin 21 (glutamin)i 25
(treonin), amino asit numaralarini sirasiyla glutamik asit,
treonin, alanin, treonin, Iösin, arjinin, alanin, Iösin, serin, glutamin, alanini arjinin, Iösin,
izolösin, aspartik asit, fenilalanin, treonin, serin, Iösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin,
valin ve izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 hafif zinciri
M30-L4-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEO ID NO: 77 ile temsil edilir.
9)-3-5 M30-L5-tipi hafif zincir:
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen CM3O hafif zincirinin 29 (treonin), 30
amino asit numaralarini sirasiyla alanin, treonin, Iösin, arjinin, alanin, Iösin,
alanin, izolösin, treonin, lösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve izolösin ile
sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 hafif zinciri "M30-L5-tipi hafif
zincir" olarak adlandirilmistir.
M30-L5-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 79 ile temsil edilir.
9)-3-6 M30-L6-tipi hafif zincir:
Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 59 ile temsil edilen CM30 hafif zincirinin 21 (glutamin), 25
treonin, Iösin, arjinin, alanin, Iösin, serin, glutamin, alanin, arjinin, Iösin, izolösin,
aspartik asit, fenilalanin, treonin, Iösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve
izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M3O hafif zinciri "M30-L6-
tipi hafif zincir" olarak adlandirilmistir.
M30-L6-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 81 ile temsil edilir.
9)-3-7 M30-L7-tipi hafif zincir:
Dizi Listesi'nde SEO lD NO: 59 ile temsil edilen cM30 hafif zincirinin 21 (glutamin), 25
arjinin, alanin, lösin, serin, glutamin, alanin, arjinin, lösin, izolösin, aspartik asit, treonin,
lösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve izolösin ile sübstüte etme ile
tasarlanan bir beserilestirilmis M30 hafif zinciri "M30-L7-tipi hafif zincir" olarak
adlandirilmistir.
M30-L7-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEO ID NO: 83 ile temsil edilir.
(Örnek 10) Beserilestirilmis antikorun üretilmesi
ekspresyon vektörlerinin yapilmasi
Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 71'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari, SEO lD
arasindaki amino asit numaralari, SEO ID NO: 77'de 21 ila 128 arasindaki amino asit
numaralari, SEO ID NO: 79'da 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari, SEO ID
geni içeren DNA'lar, amino asit dizilerine göre yukaridaki SEO ID NO.'lara karsilik
sentezlenmistir (GENEART, Inc. Artificial Gene Synthesis Service). Akabinde,
sentezlenmis DNA'lari Ndel ve BsiWl restriksiyon enzimleri ile yarma ile elde edilen
DNA fragmanlarinin her biri, Ndel ve BsiWI restriksiyon enzimleri ile yarilan yerden
evrensel kimerik ve beserilestirilmis antikor hafif zincir ekspresyon vektörüne
L6 ve M30-L7-tipi hafif zincir ekspresyon vektörleri yapilmistir.
Bu sekilde elde edilen ekspresyon vektörleri sirasiyla, "pEFöKCL/M30-L1",
yapilmasi
Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari, SEQ ID
arasindaki amino asit numaralari veya SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino
zincir degisken bölgesini sifreleyen bir geni içeren DNA'Iar, amino asit dizilerine göre
yukaridaki SEQ ID NO.'Iara karsilik gelen nükleotid dizilerine göre SEQ ID NO.'Iari: 84,
86, 88 ve 90'e göre sentezlenmistir (GENEART, Inc. Artificial Gene Synthesis Service).
Akabinde, sentezlenmis DNA'Iari Blpl restriksiyon enzimi ile yarma ile elde edilen DNA
fragmanlarinin her biri, Blpl restriksiyon enzimi ile yarilan yerden evrensel
beserilestirilmis antikor agir zincir ekspresyon vektörüne (pEF1FCCU) yerlestirilmistir,
yapilmistir.
Bu sekilde elde edilen ekspresyon vektörleri sirasiyla, "pEF1FCCU/M30-H1",
adlandirilmistir.
)-3 Beserilestirilmis antikorun üretilmesi
Logaritmik büyüme fazindaki 1,2 x 109 hücre FreeSter 293F hücresi (Invitrogen
Corporation) 1,2 L'Iik taze FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corporation)
içine ekilmistir ve 37°C'de %8'Iik bir C02 inkübatörü içinde 90 rpm'de çalkalama ile 1
saat boyunca kültürlenmistir. 3,6 mg polietilenimin (Polyscience #24765), 20 ml Opti-
Pro SFM vasati (Invitrogen Corporation) içinde çözünmüstür. Bunu takiben, PureLink
HiPure Plasmid Kit'i (Invitrogen Corporation) ile hazirlanan bir agir zincir ekspresyon
vektörü (0,4 mg) ve bir hafif zincir ekspresyon vektörü (0.8 mg) 20 ml Opti-Pro SFM
vasati içinde süspanse edilmistir. Akabinde, elde edilen ekspresyon vektörleri/Opti-Pro
SFM karma sivisinin 20 ml'si, elde edilen polietilenimin/Opti-Pro SFM karma sivisinin
ml'sine eklenmistir ve elde edilen karisim hafif bir sekilde karistirilmistir ve akabinde
dakika boyunca beklemeye birakilmistir. Bundan sonra, karisim FreeStyle 293F
hücrelerine eklenmistir ve 90 rpm'de çalkalama kültürü 37°C'de %8'lik bir 002
inkübatörü içinde 7 gün boyunca gerçeklestirilmistir. Elde edilen kültür süpernatanti, bir
tek-kullanimlik kapsül filtre (Advantec #CCS-045-E1 H) ile filtreden geçirilmistir.
pEF1FCCU/M30-H1'in ve pEF6KCL/M30-L2'nin bir kombinasyonu ile elde edilen bir
beserilestirilmis antikoru "M30-H1-L2" olarak adlandirilmistir, M30'un pEF1FCCU/M30-
H1'in ve pEF6KCL/M30-L3'ün bir kombinasyonu ile elde edilen bir beserilestirilmis
pEFGKCL/M30-L4`ün bir kombinasyonu ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru
L1'in bir kombinasyonu ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru "M30-H4-L1" olarak
bir bBSerilestirilmis antikoru adlandirilmistir,
antikoru
olarak adlandirilmistir,
adlandirilmistir,
kombinasyonu
adlandirilmistir,
kombinasyonu
adlandirilmistir,
kombinasyonu
adlandirilmistir,
kombinasyonu
adlandirilmistir,
kombinasyonu
adlandirilmistir
kombinasyonu
adlandirilmistir.
ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru "M30-H4-L2" olarak
M30'un pEF1FCCU/M30-H4'ün ve pEFöKCL/MSO-Lß'ün bir
ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru "M30-H4-L3"
M30'un pEF1FCCU/M30-H4'ün ve pEFGKCL/MSO-L4'ün bir
ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru "M30-H4-L4" olarak
ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru " M30-H1-L5" olarak
ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru " M30-H1-L6" olarak
ve M30'un pEF1FCCU/M30-H1'in ve pEFöKCL/M30-L7'nin bir
ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru " M30-H1-L7" olarak
)-4 Beserilestirilmis antikorun saflastirilmasi
Örnek 10)-3'te elde edilen kültür süpernatanti, rProtein A afinite kromatografisini (4 ila
6°C`de) ve seramik hidroksiapatiti (oda sicakliginda) içeren bir iki-adimli proses ile
saflastirilmistir. rProtein A afinite kromatografisi ile saflastirmadan sonra ve seramik
hidroksiapatit ile saflastirmadan sonra oda sicakliginda bir tampon degisim adimi
gerçeklesti rilmistir.
Ilk olarak, 1100 ila 1200 ml kültür süpernatanti, PBS ile dengelenmis MabSelect
SuRe'ya (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation tarafindan üretilmistir, seri hâlde
baglanmis iki HiTrap kolonu (hacim: 1 ml)) uygulanmistir. Tüm kültür çözeltisi kolona
döküldükten sonra, kolon 15 ila 30 ml PBS ile yikanmistir. Bunu takiben, elüsyon bir 2
M arjinin hidroklorür çözeltisi (pH 4,0) ile gerçeklestirilmistir ve antikoru içeren bir
fraksiyon toplanmistir. Fraksiyon, bir tuzundan arindirma kolonuna (GE Healthcare Bio-
Sciences Corporation tarafindan üretilmistir, seri hâlde baglanmis iki HiTrap tuzundan
arindirma kolonu (hacim: 5 ml)) uygulanmistir, böylece tampon, pH 6,5'te 5 mM
sodyum fosfat, 50 mM MES ve 20 mM NaCI içeren birtampon ile degistirilmistir.
ilaveten, tampon degisimine tabi tutulan antikor çözeltisi, pH 6,5'te 5 mM NaPi, 50 mM
MES ve 20 mM NaCl içeren bir tampon ile dengelenmis bir seramik hidroksiapatit
kolonuna (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT2-1 hidroksiapatit kolonu
(hacim: 2 ml)) uygulanmistir. Akabinde, sodyum klorür ile lineer konsantrasyon
gradyanli elüsyon gerçeklestirilmistir ve antikoru içeren bir fraksiyon toplanmistir.
Fraksiyon, bir tuzundan arindirma kolonuna (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation
tarafindan üretilmistir, seri hâlde baglanmis iki HiTrap tuzundan arindirma kolonu
(hacim: 5 ml)) uygulanmistir, böylece sivi, (10 mM sitrat tamponu ve 140 mM sodyum
klorür, pH 6,0) içeren CBS ile degistirilmistir.
Son olarak, elde edilen çözelti Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (fraksiyonel
moleküler agirlik: 30 K, Sartorius Co., Ltd., 4°C'de) kullanilarak konsantre edilmistir ve
elde edilen çözelti bir saflastirilmis örnek olarak kullanilmistir.
)-5 Beserilestirilmis antikorun B7-H3 antijenini baglama özelligi
Beserilestirilmis M30 antikorunun bir antijen olan insan BY-H3'ünü baglama özelligi bir
yüzey plazmon rezonansi (SPR) cihazi (Biacore, Inc.) ile ölçülmüstür. Yaygin
prosedürlere göre, bir anti-insan IgG antikoru bir sensör çipi üzerine immobilize
edilmistir ve akabinde, yukarida 10)-4'te elde edilen beserilestirilmis M30 antikorlarinin
saflastirilmis örneklerinin her biri buna baglanmistir. Bundan sonra, B?-H3 varyant 2
antijeninin bir ekstraselüler alan polipeptidi (R&D Systems, Inc. tarafindan üretilmistir,
(fosfat tamponu, % içinde antikora baglanmis antijenin miktari zamanla
ölçülmüstür. Ölçülen miktar, özel yazilim (BIAevaluation) ile analiz edilmistir ve bir
ayrilma sabiti (Kd[M]) hesaplanmistir. Ölçüm, her bir ölçüm operasyonu için bir pozitif
kontrol olarak CM30 antikoru kullanilarak gerçeklestirilmistir. Sonuçlar, Tablo 3'te
gösterildigi sekildedir. Beserilestirilmis M30 antikorlarinin tümü, B7-H3 antijenine karsi
M30-H1-L1 8,7E-O8
M30-H1-L2 1,0E-O7
M30-H1-L3 1,0E-07
M30-H1-L4 1,6E-O8
M30-H4-L1 1,3E-07
M30-H4-L2 1,4E-O7
M30-H4-L3 1,6E-O7
M30-H4-L4 1,2E-08
M30-H1-L5 1,9E-09
M30-H1-L6 3,4E-09
M30-H1-L7 2,7E-09
cM3O 7,3E-10
Örnek 11. cM30 antikorunun ve beserilestirilmis M30 antikorunun B7-H3
antijenini baglamak için M30 antikoruna karsi kompetitif inhibitör aktivitelerinin
cM30 antikorunun ve beserilestirilmis M30 antikorunun (M30-H1-L4 antikorunun) B7-
H3 varyant 1'i ve varyant 2'yi baglamak için M30 antikoruna karsi kompetitif inhibitör
aktiviteleri asagidaki yöntem ile ölçülmüstür.
EZ-Link Sulfo-NHS-LC Biotinylation Kit (Thermo Scientific Corporation tarafindan
üretilmistir, #21435) kullanilarak ve eklenmis protokole göre, ilgili fare monoklonal
antikorlari M30 biyotinlenmistir (bundan sonra, ilgili biyotinlenmis M30 antikorlari
bir tampon olarak, BD OPTI EIA (BD Biosciences, Inc., #550536) tüm durumlarda
kullanilmistir.
B7-H3 varyant 1'in ekstraselüler alan polipeptidinin (R&D Systems, Inc. tarafindan
(R&D Systems, Inc. tarafindan üretilmistir, # 2318-83-050/CF) her biri, bir kaplama
tamponu ile 0,5 ug/ml'ye seyreltilmistir ve elde edilen çözelti bir immüno-plaka (Nunc,
Akabinde, plakalar 4°C'de gece boyu beklemeye birakilmistir, böylece protein plakaya
adsorbe olmustur. Sonraki gün, bir analiz diluenti 200 uL/kuyucuk olacak sekilde
dagitilmistir ve plaka oda sicakliginda 4 saat boyunca beklemeye birakilmistir.
Her bir kuyucuktaki çözelti uzaklastirildiktan sonra, 5 ug/ml'deki biyotinlenmis antikorun
ve her bir konsantrasyondaki (O ug/ml, 1 ug/ml, Sug/ml, 25 tig/ml, 50 ug/ml veya 125
ug/ml) bir etiketlenmemis antikorun bir karma çözelti, bir analiz diluenti içinde 100
uL/kuyucuk olacak sekilde dagitilmistir ve plaka oda sicakliginda 1 saat boyunca
beklemeye birakilmistir.
Her bir kuyucuk bir yikama tamponu ile iki kere yikandiktan sonra, bir analiz diluenti ile
500-kat seyreltilmis olan bir streptavidin-yaban turpu peroksidaz konjugati (GE
Healthcare Bio-Sciences Corporation tarafindan üretilmistir, #RPN1231V) 100
uL/kuyucuk olacak sekilde eklenmistir ve plaka oda sicakliginda 1 saat boyunca
beklemeye birakilmistir.
Her bir kuyucuktaki çözelti uzaklastirildiktan ve her bir kuyucuk bir yikama tamponu ile
iki kere yikandiktan sonra, bir substrat çözeltisi 100 uL/kuyucuk olacak sekilde
eklenmistir ve reaksiyon karisimi karistirilirken bir renk gelisimi reaksiyonunun
ilerlemesine izin verilmistir. Renk gelisiminin tamamlanmasindan sonra, bir bloke etme
tamponu, renk gelisimi reaksiyonunu durdurmak için 100 uL/kuyucuk olacak sekilde
buna eklenmistir. Akabinde, bir plaka okuyucu kullanilarak 450 nm'de bir absorbans
ölçülmüstür.
Sonuç olarak, yalnizca bM30'un eklendigi kuyucugun absorbansi, B7-H3 varyant 1'in
ekstraselüler alaninin polipeptidinin eklendigi plakada 2.36 ± 0.05'tir (ortalama ±
standart sapma (n=12)) ve BY-HS varyant 2'nin ekstraselüler alaninin polipeptidinin
eklendigi plakada 1,90 ± 0,20'dir (ortalama ± standart sapma (n=12)).
Sekil 10'un grafiklerindeki absorbanslarin her biri, bir ortalama ± standart sapma (n=3)
olarak ifade edilir. Kontrol IgG, bM30'un B7-H3'ü baglamasini inhibe etmemistir.
Diger taraftan, bM30'un B7-H3'ü baglamasinin, hem B7-H3 varyant 1'in ekstraselüler
alaninin polipeptidinin eklendigi plakada hem de B7-H3 varyant 2'nin ekstraselüler
alaninin polipeptidinin eklendigi plakada M30 antikorunun kendisi, cM30 antikoru, M30
antikorunun bir kimerik antikoru ve M30-H1-L4, bir beserilestirilmis antikor, tarafindan
inhibe edildigi gösterilmistir.
Yani, cM30 antikorunun ve beserilestirilmis antikorun (M30-H1-L4 antikorunun), B7-H3
antijeninin M30 antikoru ile ayni epitopunu tanidigi gösterilmistir.
Örnek 12. Beserilestirilmis M30 antikorunun aktivitesi
12)-1 Beserilestirilmis M30 antikorunun ADCP aktivitesi
Bir saglikli süjenin PBMC'Ieri yaygin prosedürlere göre izole edilmistir ve RPMI 1640
içeren %10 FBS Içinde süspanse edilmistir ve akabinde bir flask içine ekilmistir.
Hücreler bir (302 inkübatörü içinde gece boyu kültürlenmistir. Kültür süpernatanti
uzaklastirilmistir ve flaska tutturulmus olan hücrelere, M-CSF ve GM-CSF ile takviye
edilmis RPMI içeren %10 FBS eklenmistir ve hücreler 2 hafta
boyunca kültürlenmistir. Hücreler TrypLE ile sökülmüstür ve toplanmistir. Akabinde,
hücreler olarak bir 24-kuyucuklu plakaya
eklenmistir ve 37°C'de gece boyu kültürlenmistir. Bu sekilde hazirlanan hücreler efektör
hücreler olarak kullanilmistir.
Hedef hücreler olarak kullanilacak olan NCI-H322 hücrelerinin etiketlenmesi, PKH26
boya etiketleme kiti (Sigma Co., Ltd.) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Hedef hücreler,
TrypLE ile sökülmüstür ve PBS ile iki kere yikanmistir. Hücreler, 1 x 107 hücre/ml'de
Diluent C içinde süspanse edilmistir. PKH26 boya stoku (1 mM), Diluent C ile 8 uM'ye
seyreltilmistir ve bundan hemen sonra, seyreltilmis boya çözeltisi hücre
süspansiyonunkine esit olan bir miktarda buna eklenmistir. Elde edilen karisim 5 dakika
boyunca oda sicakliginda birakilmistir. Akabinde, 1 ml serum buna eklenmistir ve
ilaveten, serum içeren bir vasat buna eklenmistir ve yikama iki kere gerçeklestirilmistir.
antikorunun) her biri RPMI içeren %10 FBS ile 20
pg/ml'ye seyreltilmistir. Bunu takiben, hedef hücreler (NCI-H322 hücreleri) 2 x 106
hücre/100 til/tüp olarak dagitilmistir ve karistirilmistir. Elde edilen karisim 30 dakika
boyunca buz üzerinde beklemeye birakilmistir. Süpernatant uzaklastirilmistir ve
hücreler bir kültür çözeltisi ile iki kere yikanmistir ve bir kültür çözeltisinin 500 pl'si
içinde süspanse edilmistir.
Süpernatant efektör hücrelerden uzaklastirilmistir ve M30 antikoru, cM30 antikoru veya
beserilestirilmis M30 antikoru (M30-H1-L4 antikoru) ile muamele edilmekte olan ve
kültür çözeltisi içinde süspanse edilmis hücreler buna eklenmistir ve bununla
karistirilmistir. Akabinde, hücreler bir 002 inkübatörü içinde 3 saat boyunca
kültürlenmistir.
Bundan sonra, hücreler Tripsin-EDTA ile sökülmüstür ve toplanmistir.
Toplanmis hücrelere, bir HTC-etiketlenmis anti-fare CD11b antikoru (Becton,
Dickinson and Company, Ltd.) eklenmistir ve elde edilen karisim 30 dakika boyunca
buz üzerinde beklemeye birakilmistir.
Süpernatant uzaklastirilmistir ve hücreler bir kültür çözeltisi ile iki kere yikanmistir.
Toplanan hücreler bir kültür çözeltisinin 300 ul'si içinde süspanse edilmistir ve FACS
Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) ile analiz edilmistir. CD11b-pozitif
makrofajlarda, bir PKH26-pozitif fraksiyon fagositoz-pozitif hücreler olarak
degerlendirilmistir.
Sonuçlar Sekil 11'de gösterilir.
Beserilestirilmis M30 antikoru (M30-H1-L4 antikoru) eklemesi yapilan grupta, M30
antikoru veya cM30 antikoru eklemesi yapilan gruplarda olan ile ayni sekilde NCl-H322
hücrelerine karsi ADCP aktivitesi gözlenmistir.
12)-2 Beserilestirilmis M30 antikorunun ADCC aktivitesi
Bir saglikli süjenin PBMC'Ieri yaygin prosedürlere göre izole edilmistir ve RPMI 1640
içeren %10 FBS içinde süspanse edilmistir ve akabinde bir flask içine ekilmistir.
Hücreler bir 002 inkübatörü içinde gece boyu kültürlenmistir.
Yüzen hücreler toplanmistir, bunu bir yikama prosedürü izlemistir ve elde edilen
hücreler periferik kan Ienfositleri (PBL'Ier) olarak kullanilmistir. Elde edilen PBL'Ier %10
Fetal Bovin Serumu (Invitrogen Corporation tarafindan üretilmistir) içeren fenol
kirmizisi-içermeyen RPMI (bundan
sonra "ADCC vasati" olarak kisaltilmistir) içinde süspanse edilmistir ve hücre
süspansiyonu bir hücre süzgeciden (por boyutu: 40 um, BD Biosciences, Ltd.
tarafindan üretilmistir) geçirilmistir. Akabinde, canli hücreler bir tripan mavisi boya
dislama analizi ile sayilmistir. PBL'Ierin süspansiyonu sentrifüj edildikten sonra, vasat
uzaklastirilistir ve hücreler 2,5 x 106 hücre/ml olan bir canli hücre yogunlugunda ADCC
vasati içinde yeniden-süspanse edilmistir ve efektör hücreler olarak kullanilmistir.
NCI-H322 hücrelerine tripsin ile muamele edilmistir ve muamele edilmis hücreler RPMI
yeniden-süspanse edilmistir. Hücreler (4 x 106 hücre), bir 0,22 pm'lik filtre yoluyla
sterilize edilmis kromiyum-51 ( ile karistirilmistir ve etiketleme 37°C ve %5'lik
C02 kosullari altinda 1 saat boyunca gerçeklestirilmistir. Etiketlenmis hücreler ADCC
vasati ile üç kere yikanmistir ve hücreler ADCC vasati içinde 2 x 105 hücre/ml'de
yeniden-süspanse edilmistir ve hedef hücreler olarak kullanilmistir.
2 x 105 hücre/ml olan bir hücre yogunlugundaki hedef hücreler. bir 96-kuyucuklu U-
sekilli tabanli mikro-plaka içinde 50 uI/kuyucuk olarak dagitilmistir. cM30 antikorunun
böylece efektör hücrelerin eklenmesinden sonra antikorun nihai konsantrasyonu, 1, 10,
efektör hücrelerin 100 ul'si buna eklenmistir ve hücreler 37°C ve %5'lik C02 kosullari
altinda 4 saat boyunca kültürlenmistir. Süpernatant bir LumaPlate (PerkinElmer. Inc.
tarafindan üretilmistir) içinde toplanmistir ve bundan yayilan gama radyasyonu bir
gama sayici kullanilarak ölçülmüstür. ADCC aktivitesi tarafindan neden olunan hücre
Hücre |IIJSII1II`I yüzdesi [95::: = IZ-'lrBIflC~B}X1ÜÜ
A: örnek kuyucugundan radyasyon sayimi
B: (Antikorun ve efektör hücrelerin eklenmedigi kuyucuklardan) ortalama spontan
radyasyon emisyon sayimi (n=3). ADCC vasatinin antikor ekleme zamaninda 50 pl
olan bir miktarda ve efektör hücreleri ekleme zamaninda 100 pl olan bir miktarda
eklenmesi disinda, örnek kuyucugu için olan ile ayni prosedür gerçeklestirilmistir.
C: (Hedef hücrelerin bir sürfaktan ile çözündügü kuyucuklardan) ortalama
maksimum radyasyon emisyon sayimi (n=3). Antikor ekleme zamaninda 50 ul olan
bir miktarda ADCC vasatinin eklenmesi ve efektör hücreleri ekleme zamaninda 100
pl %2 (hacim/hacim) Triton X-1OO içeren ADCC vasatinin eklenmesi disinda, örnek
kuyucugu için olan ile ayni prosedür gerçeklestirilmistir.
Sonuçlar Tablo 4'te ve Sekil 12'de gösterilir.
Gösterilen veriler üç kopya hâlindeki ölçümlerin bir ortalamasidir ve hata çubuklari
standart sapmalari temsil eder. P degeri, Student t-testi kullanilarak hesaplanmistir.
M30-H1-L4 antikoru eklemesi yapilan grupta, cM30 antikoru eklemesi yapilan grupta
olan ile ayni sekilde ADCC aktivitesi gözlenmistir. Ayrica, diger beserilestirilmis M30
ADCC aktivitesine sahip oldugu gözlenmistir.
H1-L4
12)-3 Beserilestirilmis M30 antikorunun in vivo anti-tümör etkisi
MDA-MB-231 hücreleri bir kültür flaskindan bir tripsin muamelesi ile sökülmüstür ve
RPMI 1640 (lnvitrogen Corporation) vasati içeren %10 FBS içinde süspanse edilmistir,
bunu sentrifügasyon izlemistir ve süpernatant uzaklastirilmistir. Hücreler ayni vasat ile
iki kere yikanmistir ve akabinde BD Matrigel Basement Membrane Matrix (BD
Biosciences, Inc. tarafindan üretilmistir) içinde süspanse edilmistir. Akabinde, hücreler
6 haftalik farelerin (FOX CHASE SCID C.B.17/lcr-scid/soidJcl, CLEA Japan, Inc.) bir
grubunun her birinin aksiller bölgesine 5 x 106 hücre/fare olan bir doza subkütan olarak
implante edilmistir. Implantasyon günü gün 0 olarak alinmistir ve günler 14'te, 21'de,
intraperitoneal olarak uygulanmistir. Tümör hacmi günler 14'te, 18'de, 21'de, 25'te,
anti-tümör etkisi incelenmistir.
mg/kg'da uygulama gruplarinda, tümör büyümesi, burada antikorun uygulanmadigi
muamele edilmemis grup ile karsilastirildiginda anlamli bir sekilde baskilanmistir.
uygulama gruplarinda, Gün 49'da tümör agirligi açisindan muamele edilmemis grup ile
karsilastirildiginda tümör büyümesi inhibisyonu orani (= 100 - (antikor uygulama
grubunda ortalama tümör agirligi) / (muamele edilmemis grupta ortalama tümör
P degerleri, Dunnett çoklu karsilastirma testi kullanilarak hesaplanmistir.
antikorunun tümör büyümesi inhibisyonu orani (= 100 - (antikor uygulama grubunda
ortalama tümör hacmi) / (muamele edilmemis grupta ortalama tümör hacmi) x 100)
antikorunun (M30-H1-L4 antikorunun) M30 antikoru ve CM3O antikoru ile ayni sekilde
çok güçlü bir in vivo anti-tümör etkisine sahip oldugu gözlenmistir ve etkinin bir doz-
yanit seklinde gösterildigi konfirme edilmistir (Sekil 38).
Endüstriyel Uygulanabilirlik
Bulusun anti-BT-HS antikoru, anti-tümör aktivitesine sahiptir ve anti-BT-H3 antikorunu
içeren farmasötik bilesim bir anti-kanser ajani olabilir.
Dizi Listesi Serbest Metin
COOJNCDU'l-ÄQJNA
PCR primeri 14
PCR primeri 15
B7-H3 IgV1'in amino asit dizisi
B7-H3 IgC1'in amino asit dizisi
B7-H3 IgV2'nin nükleotid dizisi
B7-H3 IgV2'nin amino asit dizisi
B7-H3 IgCZ'nin nükleotid dizisi
B7-H3 IgCZ'nin amino asit dizisi
B7-H3 IgC1-V2-C2'nin nükleotid dizisi
B7-H3 IgC1-V2-C2'nin amino asit dizisi
BT-H3 IgV2-C2'nin nükleotid dizisi
B7-H3 IgV2-CZ'nin amino asit dizisi
B7RP-1'in nükleotid dizisi
B7RP-1'in amino asit dizisi
B7-H1'in nükleotid dizisi
B7-H1'in amino asit dizisi
B7-DC'riin nükleotid dizisi
B7-DC'nin amino asit dizisi
CD80'in nükleotid dizisi
CD80'in amino asit dizisi
CD86'nin nükleotid dizisi
CDSG'nin amino asit dizisi
B7-H4'ün nükleotid dizisi
B7-H4'ün amino asit dizisi
fare antikoru M30 agir zincirinin N-ucu amino asit dizisi
fare antikoru M30 hafif zincirinin N-ucu amino asit dizisi
PCR primeri 16
PCR primeri 17
PCR primeri 18
PCR primeri 19
M30 antikoru agir zincirini sifreleyen cDNA'nin nükleotid dizisi
M30 antikoru agir zincirinin amino asit dizisi
M30 antikoru hafif zincirini sifreleyen cDNA'nin nükleotid dizisi
SEO ID NO: 53: M30 antikoru hafif zincirinin amino asit dizisi
SEO ID NO: 54: PCR primeri 20
SEO ID NO: 55: PCR primeri 21
SEO ID NO: 56: insan K zinciri sekretuvar sinyalini, insan K zinciri sabit bölgesini
ve insan poIi-A ilave sinyalini sifreleyen DNA dizisi
SEO ID NO: 57: insan IgG1'inin sinyal dizisinin ve sabit bölgesinin amino
asitlerini sifreleyen DNA dizisini içeren DNA fragmani
SEO ID NO: 58: M30 antikoru kimerasi-tipi hafif zinciri sifreleyen cDNA'nin
nükleotid dizisi
SEO ID NO: 59: M30 antikoru kimerasi-tipi hafif zincirin amino asit dizisi
SEO ID NO: 60: PCR primeri 22
SEO ID NO: 61: PCR primeri 23
SEO ID NO: 62: M30 antikoru kimerasi-tipi agir zinciri sifreleyen cDNA'nin
nükleotid dizisi
M30 antikoru kimerasi-tipi agir zincirin amino asit dizisi
PCR primeri 24
PCR primeri 25
PCR primeri 26
PCR primeri 27
PCR primeri 28
PCR primeri 29
M30-L1-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi
M30-L1-tipi hafif zincirin amino asit dizisi
M30-L2-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi
M30-L2-tipi hafif zincirin amino asit dizisi
M30-L3-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi
M30-L3-tipi hafif zincirin amino asit dizisi
M30-L4-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi
M30-L4-tipi hafif zincirin amino asit dizisi
M30-L5-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi
M30-L5-tipi hafif zincirin amino asit dizisi
M30-L6-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi
M30-L6-tipi hafif zincirin amino asit dizisi
M30-L7-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi
M30-L7-tipi hafif zincirin amino asit dizisi
M30-H1-tipi agir zincirin nükleotid dizisi
M30-H1-tipi agir zincirin amino asit dizisi
M30-H2-tipi agir zincirin nükleotid dizisi
M30-H2-tipi agir zincirin amino asit dizisi
M30-H3-tipi agir zincirin nükleotid dizisi
M30-H3-tipi agir zincirin amino asit dizisi
M30-H4-tipi agir zincirin nükleotid dizisi
M30-H4-tipi agir zincirin amino asit dizisi
M30 antikoru CDRH1 amino asit dizisi
M30 antikoru CDRH2 amino asit dizisi
M30 antikoru CDRH3 amino asit dizisi
M30 antikoru CDRL1 amino asit dizisi
M30 antikoru CDRL2 amino asit dizisi
M30 antikoru CDRL3 amino asit dizisi
DIZI LISTESI
<110> Daiichi Sankyo Company, Limited
<120> Anti B7-H3 antikoru
<130> DSPCT-FP1214
<160> 97
<170> Patentln versiyonu 3.4
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 1
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 2
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 3
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 4
<210> 5
<211> 1815
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
itgctgcqlc
GÖOTOCCÖQQ
SCCtüCtCQû
qgcaCCQatg
fngiigccna
ctquitatct
tgnaangcai
tccqouattt
qcafgaccnt
CCGUCLÂCCQ
ciudqaccct
gcaqiatlcc
ccctqçcatg
qcagctgnca
CQCIIK a! QCC
guccctqqag
CCLQCQSÇEO
ocaqceqqat
ggagqtccng
qgagcacain
qqoclaecct
Qqatchcac
Otuqqtqacc
iqizgntggi
ççtgtqcatq
aaggisntqa
qqctctolca
QCQUUÜCtGC
caigaiiziq
actaqlqgil
CLgaaQacce
igctqgtgca
tzocqaacca
qonvaogqqa
lutlctgqca
agncaqacct
CCLgqqagca
öîlÜQLUÜCê
caqcttigct
qçachqclq
Uîücaücttc
ÖQQÜGüCJCQ
ringgfgacn
QQÖ\GQUCJQ
qciocczatq
QGIQÇJQJJC
gcagcnictq
LJCCâlQCll
ctgztgtitç
<210> 6
<211> 534
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Ala Lou Gly A1; :4.3 Mp mis. Cya Inn› 'I'hr Gly
Yil Pro clu Asp Pro Vai ?al Ala Lan V4- CLy
Cyi Cyu Sex Ph: Sat Pro Slm Piv Gly Phe Set
Cl; Gly Cin Asp C;n Ciy Sar Ala Tyr Ala Asu
Pro kap Lan Lan Aia Cln Sly kan ula Sar Lan
Ar; ?:1 Ala Asp C;i Giy Sa: Pha Ttr Cys Pho
115 120
Pro Sar Mat Thr ;nu Cin Pro Ann Lya Asp ;an
Vai ?tr 110 Thr Cy: Sor Sor Ty: Cin GLy Ty:
3-.- r
3'i`0
1.921
1191:
3..!!
1' ri;
21:?)
91“) I'
435 440 445
Ala His Gly Ser Val rh: ile ?hr Gly Gln Pro Met ?hr Ph: ?:0 Pro
450 455 (63
Gîu Ala !eu Trp Ve] Phr Va] Gly !en Set Va] Cyg !en ,Iç &la !eu
Ley Vii Ala ben AL. Pho Val Cye Trp Arg ;yi Iio Lys Gln Sor Cya
Glu Glu Glu han Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Giu Gîy
Sor Lys Thr Ala La: Cin Pro Lou Ly: HL: San Asp Sar Ly: Glu Asp
<210> 7
<21 1 > 59
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 7
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 8
<210> 9
<211> 948
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
ntgqtgcqca
qaqaitqciu
<210> 10
<211> 316
q:ctcicaqg
cngatqncac
YQÜQCGICCQ
tccczcciqa
tqgcnnlggn
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
qaccctgqig
ctaccoquc
CütqGQQQtü
Ccaqçltqüü
caaaçnnqnt
GÇtUIQCûCQ
tgggtgcaqn
ctqagnctqq
tqgcgqacgi
thaqozqtt
cqautoqcac
crgtcaccit
QQEQG$ÜGCt
crgtgnggaq
56.::
G 1 '1'
1.el)
<210> 11
<211> 52
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
1.:::
14%“.
721!'
<400> 11
<210> 12
<211> 55
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 12
<210>13
<211> 52
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 13
<210> 14
<211> 55
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 14
<210> 15
<211> 54
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 15
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 16
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 17
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 18
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 19
<210> 20
<211> 576
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
accrtgtgnt
<210> 21
<211> 191
ÖLQQQQGQVO
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
ccagtçqtqq
quvovcdqct
caaaqciqtu
ciczqvtw;
tçqcacngct
gçcaqcciat
(ÇCâqCCîCl
QCÜÜGIUÜCC
lqcaw::qct
Gly Ala Leu Glu ?al Gln ?al Pro Glu Asp Pr: Val Val Ala Leu Va;
l 5 IC' 1'›
Cly ?hr Asp Ala ?by ;an :y: Cys Sar Pha Süt Pro Giu Pro Cly Pha
2D 25 JC
Ser Leu Ala Gln ;cu Ann Lcu ile ':p Sin ;:1 rh: Asp ?hr Lya Gln
SC 55 60
70 75 80
Ala Glv Gln Pro Mat ?hr Phe Pro ?:0 GLu AL: Lou
115 120 .7
Cly Lan Sat V1; :ya ;nu Ile Ala Lau Lüu Vnl A;a Lan Ala ?ne Va;
Cys ?tp Arg by: IL: :yi :in So: Cys CLu CLi C;i lan Al: Cly A1:
Glu Asp Gln hap G-y Glu giy Glu Gly Sex ;ya !hr Alu Lan Sin ?:0
16.5 110 11':
Lcu Lys Hiz Ser Azp Sor iys Glu Asp Asp Gly nin Glu :lc Ala
180 IES ;90
<210> 22
<211> 552
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
acggtgannn tzacgtgctc cagcticcig qgctiscctq aggctqagqt gttcrggcng ;28
çgnînnaiga
<210> 23
<211> 183
gnaancnnql
cracnquqva
Yntgrntcat
93t9195993
cagcnntqna
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
gntgcigcag
Qtctatqira
tgcacrqcrg
qnntclgaia
cantckgaci
QtuCdüatçQ
ÇQZLIÇICIC
uqqccrzqtq
Crttcgigtg
csccticaqc
1ga1gqacaa
<210> 24
<211> 576
<212> DNA
11'_-
<213> Homo sapiens
<400> 24
- :3111
711:'
91:09
54'i!`
<210> 25
<211>191
aqqtccnqvt
schcqtqcu
GLOQQQGÜOG
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
cuctçugqiu
CCVUIQOtQV
ccqgisctqc
QAQOGUGQCC
Caggtsgccs
tckqlciqlc
ccuzaçtqqq
(CGItÇCâCl
tccaqccicl
OCLOOIQÜCC
613( Mu
C1; Aip
<210> 26
<211> 534
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
<210> 27
<211>177
qaaanrncgt
caguagetqa
quctvvcauc
qntgcigcag
iqaqqccctu
610 Ala
qtqacuacçt
twvtvaccq
1.0311 '.' rj.:
cquaçutqvc
gtgcgiatgq
gCîCrgtfAC
939Ct919°9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
91'e)
(31)'
<210> 28
<211> 1188
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
.A161
1111'.
QGIGQÜCRQQ
SQQBQGÖQCC
lgctL0gtqa
nccitcacqt
itqisobtcc
<210> 29
<211> 395
tzncqtgctc
qzaaccccgt
CÜGCBÜÜRQC
qsatscwqqa
Craqcatqnc
csctqaetgq
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
caacçlqaâc
CQIQIQCtOU
agnnqntqnl
qitgcqcaci
CSOÜICÜCIQ
qcluccglca
aucoaqqec:
isgacczgcg
CQCaqatqqc
BOQGCCCÜQI
fggtqnacag
C?9°CQGUQQ
tQUQVUCGîQ
lqqecaacça
qqtqçsccta
trtcancqaa
UCBQGEZQGQ
chciquca
(31 i_i
1" ri:
(31 :i
Pxv Glu Asp P› Val Val Als Leu Vsl Gly Thr Aap Alu ?hi ben Aiq
1GB IDÜ 155 :53
GLy Ar: Asp Gln GLy Ser Al: Tyr Ala Asn Arq Thr Ala Lcu Fha Prc
165 170 175
Agp les LQJ Alo Bin Gly Aga Ala Ser ben Aiq len üln Afg vol Arg
150 185 193
val Ala Asp Glu GLy Ser ?he Thr Cv: Fhe vil Ser Ile Arq Asp Fhe
195 200 2U5
Zly Hür AL; kia Val Sai LaJ nin ?31 Ala Ala Drn Ty: Sar Lys Pro
her Met ?hr Lou GL& Pro kan ;ya Asp Lou Arq Pro Gly Asp Thr Val
2.: 2`0 31* 263
Tht Ile Thr Cya Sor Eur ?yt Ara Gly Tyr Pr: GLU Alu GLu VII ?bu
245 250 255
frp Cln Asp Gly Gin Gly Val Pro Lan Thr Cly Ajn Val ?hr Th: Son
260 265 273
Gln Met A-: han G;i Gln Uly ;eu ?ne Asp Val M;s Se: Va; Leu Ara
275 ZEÜ 285
vii Vii Lou Gly A-: Ann Ciy ?hr Ty: Sar Cys Ldu Vii Arg Asn Prc
29( 295 309
Va] bu: G“.û (Un Aip ÂIA Zilin Cly Rßr 'i'iiî ?Tir !îi'i 'Nu .'1'. (ila Fm
Met Tir Ph: Pro Pr; Ciu hi: ;eu Trp Va- In: Vu- Ciy Lou Se: Vai
325 330 !15
Cya Lan 3;» A1: Lan ;eu Vol &lo Lv“ Alo Ph” Vol Üye
340 305
355 360 165
Gly Glu Gly Glu GLy Ser Lys Th: Ala Leu GL: Pr: Lan Lys Mia Ser
370 375 383
Asp Ser Lys Glu Asp Asp Giy Gln 010 Ile Ata
185 @en 395
<210> 30
<211> 873
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
99395591??
tagünqctqa
içcqcctatç
ictggcaizg
<210> 31
<211> 290
qcagcqutqc
QCLBCCCLOG
qctqqeqaoa
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Auaqctqqtq
OOCIQRQQLO
gcaqitgqc:
lQCQdGiQÇC
cnuaqtttcu
qaqiiçcauct
CHUUIQVCCQ
llCtQQCGQÇ
atmacuqqçu
tgqcaciqct
ccvuaqqccç
tçqcaciagq
cgqzgancat
çêthçLuCc
açuctatqac
QVBCCSQOOC
cangtqntcc
tQLOCCCCLÇ
GGQGQCtQÖç
GI r'i Loêu ?hr
A1& %15.
1.343
A1: ?he
1.el› GLn
110 Ala
1L`I0
34) 1'
71'. x'
D 110“.-
Y 43':-
21.“.-
.31 .f
111:'
111:(
22'!)
' nci
<210> 32
<211> 909
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
utchqctoü
iccqtaqtqß
achtqctqu
tgectcesac
<210> 33
<211> 302
qcnqtzutqv
aigtcagaq:
QüutCQUdcq
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
qitgqtaggu
caceqtctlc
caqtiucqvz
agugacgigq
atqctçcggq
tlqaacatqs
qtaadcuttq
qctqtçaotc
ucavccttcq
gqqulLuîa
cqvucauqtç
CCROICCGZQ
gtçtavitcu
uqnqadcutu
A8:: VAI
110:`
111.;
<210> 34
<211> 873
1 l'." U
1091.!
(31 r.
M5::.
111:'
1911'
21'!)
0.37`
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
qtcasggttc
laciqacaqo
aagcnaaqts
<210> 35
<211> 290
tnuaaiaaca
açcgaittic
ingtcatctg
tqggagncat
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
attaçicctq
qitgaaggac
9941935???
gicaigcaqt
cttatratgn
Wagqngacq
accticzqqc
CÖQCLSLCÇC
qtgtaucgct
giccitcaaq
trnaafgtqa
aaatqtuqcn
(çqgaashqc
qcntqitcsq
tcczgigtgq
ccigcinacr
ICCSSIZEZJC
qcizaqtaqc
ctatgvtgqt
Lqoogçczac
qqiuaaccat
aiqgactcnc
rarnttnuqf
5111›
(111;
A8 i'i
<210> 36
<211> 909
<212> DNA
11.1:
<213> Homo sapiens
<400> 36
12!)i
2'3'5
611".
23”?'
908ICCCJQQ
igcgtqctga
<210> 37
<211> 302
JQQIICIQBQ
Lgcaqaatqa
RQGÖCÜEQGC
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
gALggfiggü
GCCKJQCCKNC
caacgrgtan
IÇZCQQCÖÇC
cantaucqq:
agnzcctzgg
atqctqcgqç
Caüüâtüacc
tgqatciata
tlQûâCâtÜC
qtgaiciitq
CRQGCBQOSB
qtqgücntaç
gcaqcctzcg
agctcaqntg
aaaacçtgqa
uqçvcttqta
cqqcçscutq
naqncîqntg
qiçuatcutq
5131'.'
<210> 38
<211> 867
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
As 1“.
1421;
arggqcnnca
taairtcqra
igcagnaain
<210> 39
<211> 288
aigtqgciic
trtdctqvca
rqgatitnaa
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
gqgnnnatca
auagçaqiag
fazginaaac
qnccttcauc
fcßtCCJûÇT
çaquçcacat
aaccinagct
gfnnararcr
gtqitiicca
tquctazqat
tqacgtzat:
Cünîffntff
cçtgaccaig
1.911
1.35›
(311;
(31)*
2 7 ."i
<210> 40
<211> 990
<212> DNA
1-21::
1.). t.
<213> Homo sapiens
<400> 40
atgçitcccc
aauiataiqg
inatqtggia
<210> 41
<211> 329
atgtttcntz
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
qgtatnctta
tLttqêltco
qtatciatgt
cnctqntghi
qqcaangaçn
qacaqtiqça
qtgtacatai
qtLllqctaO
gcigtactrn
ttgtqizqçc
aqictqcaqn
antttgacnq
CEGQCtICâç
cagaiczqti
tgnccnicrh
achquctcq
cacaqsaatg
tCûâCCîqBö
crqtattcrg
9 x* C›
121:.:
<210> 42
<211> 849
<212> DNA
3" x'o
<213> Homo sapiens
<400> 42
301:`
17':)
111: (51.]
. 131 l.:
itggsttcnc
icaqcaQLqL
gctaaoctlq
GGCGCGQJCL
<210> 43
<211> 282
tggqqcaqnt
chqtaLqaL
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
cattçqqqig
Cgtgntacnn
tqoaqccllc
atttcnggqa
çaiqçaatcc
Wav-tanga
ttczcçqaaq
alLoccaaaç
QCBCItCîOÇ
gîßtCßîclt
tqaqcbgcac
nçqcttggtn
gqacialaal
cacagtçîîc
caçczttqaq
ztacctçatq
1.611
Ala Ser Ser Giu ?hr Lsu arc Cya Giu &14
165 ITÜ
PE: ?tr Va; Va; frp Ala Sa: Cin Vai Asp
180 155
Glu Val Ser Ann Thi Ser Phe Gln Lev han
1931 2111:'
Lya Val Va; Set Vol ;en Ty: Ann Val Thx
210 215
Oy& Mar 11& Giu &sn Agp Ile Ala Lys Ala
225 230
745 259
Lys &la Sar Lan :ya Val Sa: Sar ?ha ?ha
260 265
Lcu Pro Lcu Ser Pra Ty: lcu Met Lou Lyi
21& ZHD
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 44
Giu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Giu
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 45
131 i'i
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 46
<210> 47
<211> 32
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 47
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 48
<210> 49
<211> 32
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400>49
<210> 50
<211>1413
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 50
VÜUCHQUVEU
tnagcnaaia
aqciqlctqg
olgtqqc.ca
CGBICBJQCC
caLgtqLqu
aiuuqtcagt
icctçoqclg
ÇOLQÇGLÜLQ
Ctgtcigqai
Qîaqttîâtt
tqcatsgtca
tatoqrcdçu
aczqtqnaaq
qcacciczct
tcuctçaqcc
accaggictç
CçCCCALcqa
acLacsâqaa
açqgtctgca
ccactcigng
qioqilqtcc
gcaqaigcct
aqccticatg
GIQ'JWKJt BL`
açtgaccttq
CÄCIQGÖCCJ
<210> 51
<211> 471
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 51
GlL: Trt*
1.811
1.921
L; 1 -,i
611.'
. "4.1
1' z (2
2'3!]
1-)'8
1.0:)
1' 'kp
77'. i'
(31 i_i
<210> 52
<211> 705
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 52
gctqaaqaig
CLgccactia
agctggaqci
ttaetqccag
aLctçqaqu
Va 1 TI". r Asp
ÇÜCBCAtCCö
cagiqqaala
çcctcautco
tcaciizciq
GGQQGéOââq
cnqaqtqgaq
cacqttcqçg
QdâCdâClLC
<210> 53
<211> 235
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 53
(31'i
<210> 54
<211> 28
. .3;y
A8 1“.
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 54
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 55
<210> 56
<211> 1704
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> insan kappa zinciri sekresyon sinyali, insan kappa zinciri sabit bölgesi ve
insan poli A ek sinyali
<400> 56
lqttcatçlc
gtacqqtqvc
OUGÂOÜQQQG
igcinaaggt
qcttcaaciu
equcrcctcu
CBÜCQCCCta
qtgttuatrt
tiovvccccu
qcgcitotçq
incagggcct
tttaaicqvq
coucçuqcav
qachtqace
qactaCQdqa
99999“99'*
icagçcgtça
tuqttacqrq
agtccachL
tgqaeaqtsc
<210> 57
tggiqcaaqg
Llattkttqt
cnchtqicc
gttcngattz
cLitaataqt
tCJQCJBCCû
<211> 1120
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
cngtqgcaca
aggtqntcta
agtgctzrin
qtaqcçchc
qitaqicgqt
lccaaactçq
tgxaqggccr
itzaigcgcq
achcucqct
tcaagczcti
aqcatocate
<223> insan IgG1 sinyal dizisi ve sabit bölgesi
<400> 57
ÜCQÜGQYCII
catgcaignc
gncgtgaqnc
$atailgcça
<210> 58
<211> 699
tcucnqccrc
tqqtcadiqg
QCGEQCTCGC
Qßaatatcqg
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
cqaaeccqtg
C$QÜÇÖQQGQ
QCECQCKCSÜ
cigtcczca;
ttcaiîtggt
CöqîdCOJCû
BQCGÇQîÇÇC
<223> Kimerik M30'un hafif zinciri
<400> 58
anqccaadçq
agaaqigcct
cqtqaizcau
Cîtûcfoatg
ÜÇLÜQICGQC
CÇECTICICB
QûCQdQCâOC
ngaqiggcca
schtQBCCq
BÜCI CCCCCIJ
<210> 59
<211> 233
igctqiiacg
iggtqzagtg
ICÜCCRÜOâQ
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
ttatçrcucu
CIICBGCÖQQ
CLQiClQCJI
<223> Kimerik M30'un hafif zinciri
<400> 59
CKCCJÇQQQA
CACCCâCQtl
SQCLQêAL&â
agqtgaucca
cgcazitggc
giiegtcoca
CQQLGCLOÜÜ
ctlciacccç
ctccciqgag
<210> 60
<211> 42
(31)'
1.213'
1 ..1 '1
1.02:
(311;
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 60
<210> 61
<211> 37
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 61
<210> 62
<211> 1413
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Kimerik M30'un agir zinciri
<400> 62
Qtccnuctqc
OUÜCBGOOÜC
uqctqgaict
tcaqgnatnt
qçaccctciq
tçgticgtqq
BOCGQCGCQL
iagçiqtaca
BLCÜCCQIQQ
tQQCIOCGQQ
ECCCIOGHQB
<210> 63
<211> 471
aquaqtctqg
ingqcaaggc
Ctaaquccc
qtgannaaac
cachoLqu
aqtgciaqqc
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
auctqnqctq
quccichvc
ovwoacqta
qqtgcitaat
caocqtcclc
CaüCCtQdCC
tcagicanat
chqtciatt
aagganzact
eceqaqaâCG
qtaatQCÖIû
<223> Kimerik M30'un agir zinciri
<400> 63
anaqcigctt
accctçaoqt
qaaqntqtcu
thgaücqrq
UâQdGtîüaO
QCLOÖGLQQC
aLccccqoaç
(21;,i
~ v5.1
De 1.:
.11'
1.1::
14:11
110_-
1431;
370 375
Asn Cln Va; Sar Lou ?hr :ya !nu Val Lys CLy
335 390 395
405 #IU
Lya !eu Tlf Vaî Agp Lys her Arq Trp G1h GIn
435 449
Cys Ser Va; Mel. Has Glu &la Mu Kis Asn Kia
465 470
<210> 64
<211> 40
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 64
<210> 65
<211> 36
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 65
<210> 66
<211> 36
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
91'.?
<220>
<223> PCR primeri
<400> 66
<210> 67
<21 1 > 39
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 67
<210> 68
<211> 40
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 68
<210> 69
<211> 39
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> PCR primeri
<400> 69
<210> 70
<21 1 > 699
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 70
qagalcgtqc
<210> 71
<211> 233
tqacccoqiq
tgtuctactq
agnagqaciq
actacqaqni
tcnccnngaq
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
ccaqcuqtçq
gcicanggtq
iqcaicctçg
ganccntccq
GtOUtQIUCU
acczicngcc
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 71
çccclqcha
çvtatrnqca
trzcteqqct
fqîtcatcrr
cgcatizgqc
1.1.1:
' I: i'i
<210> 72
<211> 699
1 C' [I
52;::
12.11
5024:
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 72
ntgvtqctqc
igcqtgac:
ogetccectq
<210> 73
<211> 233
aqucccaqvt
qiclqlqqat
anmtcnngcg
tqaaqlccçç
actacqagan
CCGCCGRQBQ
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
gaacanggtq
CIZCÂGCQÇQ
acectqâcca
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 73
Met Val Lcu Gln rh: Gin Val Phe Ile Ser Lei Lei ieu
Gly Ala Tyr GI? GLu !la ?al Lan Ttt Gln Sar Pro Ala
ogatctucqv
occctqcha
Lchgaaiaa
aggtqanccn
<210> 74
<211> 699
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
1.021
73'.:
<400> 74
COOLlCOKQC
oacthqccq
igaqiggcza
agdqfgacng
aoctccccçq
<210> 75
<211> 233
QCSUCÄQCÇQ
LqLaCLaclq
agnaqgaciq
ICÜCCÜGQGQ
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
ccaQCAQtçq
caagqiaaçn
gcaciigqtg
ctqmctciqa
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 75
gccclqchi
chnqaazaa
agtccqggia
agqtgaccci
iüruccaçooc
ctccciqgag
<210> 76
<211> 699
(31 L:
*311:
(31!]
(- r'
2.911
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 76
oaqaLchQC
iccaiuqt:u
ganqaqcaoc
<210> 77
<211> 233
lQüCCCdQBQ
iqaaqLccqg
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
CCCCBICÖQÇ
cLotchtqa
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 77
ccachgcst
cgcatazgqc
clLetAcccc
ctcccigqag
1.el:
<210> 78
<211> 699
0.181
.'10 .
.'10 I'
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 78
GQCQL'CÇCL'R
Qacthucsq
savunucacc
eucqtqaccq
<210> 79
<211> 233
LQLaCLactQ
anitcaigcq
tqadqtucqv
isgtqcagtg
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
aquaucutqv
Qtvütqtucc
GCCfÖCêQCC
açarim:: at
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 79
uccctçcha
ccagcçvudt
cqçccaçggc
<210> 80
<211> 699
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 80
.1.5
gagitcgtqc
<210> 81
<211> 233
aaatcsaqcv
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
IRCQCCCOCÇ
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 81
gccctçchi
GQÇCQBCCCR
cqcatazqçc
ctcecaçeaq
<210> 82
<211> 699
1' (f:
1141)
2011'
1 'Tiji
542-:
1.113!
-4 "JJ
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 82
gagaicgtqc
çactlcgcsg
accinqgt:q
OUCOtÜâCCG
<210> 83
<211> 233
Lqacccagiq
QGCCLCLÜJK
9:?9C13C99
tqLaclath
inatcaagcg
tqadqtucçv
iggtqcagtq
BQCGQQRCEQ
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
ccagciçtçq
ctqzclciqi
8GCîßCêOCC
açarim:: at
<223> M30'un hümanize hafif zinciri
<400> 83
cciqcçqcal
îQâQCöQCâc
9993C5999Ç
ctccciqgag
<210> 84
<211> 1413
(11)!
1.41:
131 :'i
1.:: 'J
72".:
59'i!'
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize agir zinciri
<400> 84
ntgiiaci::
ÇCQCJSCtÇQ
Oocuocacas
CCCaaOtClL
qaacbctci:
gLgclqqacL
<210> 85
<211> 471
QCQUCLaCdC
qcnacgtgaa
Qtüßîgtff!
csccqiaqtg
Cttcqnctec
ctgchquc
quqcataaL
CtLClKCCIC
CICGtQCfCC
qCCQlütacL
tagqwccaqi
aagqaciacL
Cögqlqaaca
3C199?1969
izgacgacqt
aequcttcta
lcaccqzqça
GQQCtCîQCR
giaqticaac
cçLqaccqtq
achcLqqçq
qçaqciqtac
CÖOQBQCGQQ
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize agir zinciri
<400> 85
A1..)
6;',1
2.1: '.i
1.3',
A151;
50'::
97:(-
(3111
i.`i
<210> 86
<211> 1413
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize agir zinciri
<400> 86
igctggaazt
tgqticqtaq
aicaqnangt
tccaiigcsi
scecoqasqa
qCQQCLacac
ÜCCIQCOQGO
crqccztqqu
cigqcgcczt
Agnaanmggt
gamacqtctz
qzrirtct I.`Cf2t
Cgccqaagtg
aigcqtctt:
tuncauqccc
vvtavucqtv
ggtqcitaat
cautçvccaq
tacngAtqc
qCCQlQiâCL
gtqcicacct
ccnaiqgaca
uçucicquav
caggtqtaci
cctquqoacu
açvtqunda
ccnzcahgat
acuctçuuqt
acnagçictç
actecaoquc
CÇÖUQGCCCl
atogqçctac
Crnrcçgacc
tcnnaqngac
<210> 87
<211> 471
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize agir zinciri
<400> 87
Met Lyß Hin Lou frp Phe Pho Leu Lou Leu Val
9::. Cly ar s.: vii Lys 'mi 50: Üye Lys AL:
.hr Asn Tyr Va; Met Mi: Trp Val Ara GLn AL:
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ty: Aan Rep
6% 70 35
Git. Lys ?to by: '3;', Ari; 'i'ai 'nir Ile Thr Ala
100 155
Asp ?yt Tip Gly Gin Giy rh: Lou Vil Thr Vsi
Lys Giy Pro Sat 'Jul Ph. Pro Lou Aia Pro Sa:
Gly Lily Tr.: Ala K.: ;cu Lily Ey: Lou Vi'. ;7:
165 170
Pro "'41 'Hzr Vu; Tip Ami Ser Gly Ala 2402')
195 200
7): 1'
11'.:
1.8.› Met - -ê
-3 Val Ty:
val 56!` Lou
Tlir Vil Mp
<210> 88
<211> 1413
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize agir zinciri
<400> 88
99951999::
rnagnntcca
igctggaazt
hnagqactnt
qgacccicao
tgqticqwq
tccaiigcsi
scecoqasqa
ÜCCIQCOQGO
crqccztqqu
cigqcgcczt
qzrirtct I.`Cf2t
aigcgýnttn
aagcqtggfq
tuncauqccc
ggtqcitaat
cageqLcclc
cautçvccaq
CtCGIQClCC
aaqaaicrcg
qccgangagi
qCquqiaCL
canctqgcan
gtqcicacct
uçucicquav
caggtqtaci
tçcclqgtca
gcigraqngt
ccagcaqntr
açvtqundu
ccczcaLuat
acuctçuuqt
aaquclLctd
actecaoquc
qaigqrgtrc
rgnctAnatq
gagnacntcr
Gövduttqaq
gqigcagta:
chuaaLuqc
lcecaçeuac
CJGCCJCIBÇ
<210> 89
<211> 471
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize agir zinciri
<400> 89
Met Lyß Hin Lou frp Phe Pho Leu Lou Leu Val
Val Lan Sar Giu Vmi Sin Lan Vai Gin Sar Giy
Pro Gly Ser Ser Val :y: Val Ser Cys Lya A1:
.hr Asn Tyr Va; Met Mi: Trp Val Lya GLn AL:
Glh Trp Ile Giy Tyr !lo Asn Pro Tyr Aan Asp
Gii'. Lys ?to by: 5;-,i ;ya Ala 'mi- 110 '1111' ua
îhr Ala Tyr Me: GLi ;eu 30: Su: Leu Arq Sir
100 155
Tyr Tv: Cv: A1: Arq er Gly Ty: Tyr GL; Set
11& 120
Asp ?yt Tip Gly Gin Giy rh: Lou Vil Thr Vsi
Lys Gly Pro Sar Vai Ph& pro Lan Ala Prn Sar
Gly Gly Thr Ala AL: ;cu Sly Ey: Lou Va; ;7:
165 170
Pro 731 Th: Va; _ Asu Se: Gly Ala LGJ
›-4 i`J
Ala Vnl Lan :In Sa: Sar Cly Lan
11'.:
-3 Val
4.7-“
1:: l I'i
<210> 90
<211> 1413
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize agir zinciri
<400> 90
99951999::
rnagnntcca
igctggaazt
hnagqactnt
qgacccicao
tgqticqwq
tccaiigcsi
scecoqasqa
ÜCCIQCOQGO
crqccztqqu
cigqcgcczt
qzrirtct I.`Cf2t
Cggcticat:
aigcgtnttc
tuncauuCCU
qvtqgucqtv
cagçqLCClC
ct ccduigaan
cagcctoâcc
caGQGVUUÖV
aaqaaicrcg
aqcganaagi
qCquqiaCL
canctqgcan
gtqcicacct
uçucicquav
caggtqtaci
tçcclqgtca
gcigraqngt
ccagcaqntt
açvtqundu
ccczcaLuat
acuctçuuqt
aaquclLctd
actecaoquc
qaigqrgtrc
OGêuQGCCCl
rgnctAnatq
gagnacntcr
Gövduttqaq
gqigcagta:
chuaaLuqc
lcecaçeuac
CJGCCJCIBÇ
<210> 91
<211> 471
<212> PRT
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> M30'un hümanize agir zinciri
<400> 91
Met Lyß Hin Lou frp Phe Pho Leu Lou Leu Vel
Val Lan Sar Giu Vai Sin Lan Val Gin Sar Giy
Sin ?tp Ila Giy Ty: Iia Asu Pro Ty: han Asp
65 70 ?5
Glu Lys Fta ßy: G;y ;ya Ala îh: Gln Thr Sat
100 155
11& 120
Asp Ty: Trp Giy G;n Giy rn: Lou Vai Th: vii
Lys Gly Pro Sex Vol Phe Pro Lou Ala Pro 50:
145 150 15&
Gly Gly Thr Ala 510 LG“ Sly Cyo Iéu VA; ;ya
165 lfû
Fr: Val Ttr Va; Sar frp Asn Se: Glv Ala ;au
159 155
193 200
Val Vai Ttr Va; Fta Sar Sar Sa: Lau Cly ?hr
1.el:
(411,:
> 61';
(31',
54`i!`
G 1 1.1
(3111
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 92
<210> 93
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 93
1",': II.: Ann Prc Ty: Mu Asp Pulp Vil Lyi Ty: !un Glu Ly: Ph: Lya
1 5 10 15
<210> 94
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 94
Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 95
Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ile 'I'yr Met His
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 96
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 97
Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Pro Thr
Claims (1)
- ISTEMLER . Bir antikor veya bunun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi asagidaki özelliklere sahip olmasi ile karakterize edilmesidir: (a) B7-H3'ü spesifik olarak baglama, burada BY-H3, SEQ ID NO: 6 veya 10 ile temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir moleküldür ve antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani, IgC2'den olusan bir polipeptidi baglar, burada lgCZ, B7-H3'ün bir alanidir; (b) bir antikor-bagimli hücre-aracili fagositoz (ADCP) aktivitesine sahip (o) bir in vivo anti-tümör aktivitesine sahip olma ve (d) B7-H3'ü baglamak için MSO antikoruna karsi bir kompetitif inhibitör aktiviteye sahip olma, burada M3O antikoru, SEQ lD NO: 51'in 20 ila 471 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 53'Ün 23 ila 235 arasindaki rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir hafif zincir içerir. . Istem 1'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi her biri BY-H3'ün bir alani olan IgC1'i ve IgC2'yi baglamasidir. . Istem 1'e veya 2'ye göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi lgC2, SEQ ID NO: 6'da 358 ila 456 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir alan olmasidir. . Istem 2'ye göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi edilen bir amino asit dizisi içeren bir alan olmasidir. . Istem 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi bir antikor-bagimli hücresel sitotoksisite (ADCC) aktivitesine ve/veya bir kompleman-bagimli sitotoksisite (CDC) aktivitesine sahip olmasidir. . Istem 1 ila 5'ten herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi tümörün kanser olmasidir. Istem 6'ya göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi kanser, akciger kanseridir, meme kanseridir, prostat kanseridir, pankreatik kanserdir, kolorektal kanserdir, bir melanomduri karaciger kanseridir, ovaryan kanserdir, idrar kesesi kanseridir, mide kanseridir, özofajiyal kanserdir veya böbrek kanseridir. Istem 1 ila 7'den herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi agir zincirin tamamlayicilik belirleme bölgeleri olarak SEO ID NO: 92 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRH1, SEQ NO: 94 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRH3 içermesidir ve hafif zincirin tamamlayicilik belirleme bölgeleri olarak SEQ ID NO: 95 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRL1, SEQ ID NO: 96 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRL2 ve SEO ID NO: 97 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRL3 içerir. Istem 1 ila 8'den herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi SEQ ID NO: 51'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 53`te 23 ila 130 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içermesidir. Istem 1 ila 9'dan herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi bir sabit bölge, bir insan-kaynakli sabit bölge olmasidir. Istem 10'a göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 59 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir içermesidir. Istem 1 ila 11'den herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi beserilestirilmesidir. 13. istem 12'te göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi asagidakileri içermesidir: (a) SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (b) SEQ ID NO: 87'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (c) SEQ ID NO: 89'da 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (d) SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (e) (a) ila (d) arasindaki dizilerin herhangi biri ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip olan bir amino asit dizisinden ve (f) burada (a) ila (d) arasindaki dizilerin herhangi birinde bir veya bir kaç amino asidin silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir amino asit dizisinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve (g) SEQ ID NO: 71'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (h) SEQ ID NO: 73'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (i) SEQ ID NO: 75'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (j) SEQ ID NO: 77'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (k) SEQ ID NO: 79'da 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (1) SEQ ID NO: 81'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (m) SEQ ID NO: 83'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (n) (9) ila (m) arasindaki dizilerin herhangi biri ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip olan bir amino asit dizisinden ve (o) burada (9) ila (m) arasindaki dizilerin herhangi birinde bir veya bir kaç amino asidin silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir amino asit dizisinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisinden olusan bir Istem 13'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir degisken bölgesi ve bir hafif zincir degisken bölgesi içerir: SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: ?1'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ lD NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEQ ID NO: 73'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 75'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: ?7'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 79'da 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 81'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 83'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEQ ID NO: ?1'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 73'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 75'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; ve SEO ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: ?7'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi. Istem 13'e veya 14'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir ve bir hafif zincir içermesidir: SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ lD NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?3'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?5`te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?7'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ lD NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?9'da 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85`te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 81'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 83'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?1'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?3'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO lD NO: 75'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; ve SEO ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 77'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir. istem 13 ila 15'ten herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir ve bir hafif zincir içermesidir: SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 71 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 73 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 75 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 77 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 79 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 81 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 83 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO lD NO: 71 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO SEO ID NO: 75 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; ve SEO ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 77 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir. Istem 1 ila 16'dan herhangi birine göre antikorun fonksiyonel fragmani olup, özelligi fonksiyonel fragman Fab, F(ab)2, Fab' ve Fv'den olusan gruptan seçilir. Istem 1 ila 16”dan herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi bir birinci ve bir ikinci agir zincir içermesidir, burada birinci ve ikinci agir zincirin her biri bagimsiz bir sekilde asagidaki (i) ila (iii) arasindan seçilir: (i) bir tam-boy agir zincir; (ii) burada agir zincirin karboksil ucundan 1 amino asidin silindigi bir agir zincir; veya (iii) burada agir zincirin karboksil ucundan 2 amino asidin silindigi bir agir tercihen, burada birinci ve ikinci agir zincirin her biri madde (ii)'den seçilir. istem 18'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi birinci ve ikinci agir zincirin her biri bagimsiz bir sekilde maddeler (ii)'den veya (iii)'ten seçilir ve burada agir zincirin karboksik ucunda yer alan amino asit rezidüsü amidatlanir, tercihen burada amino asit rezidüsü, bir prolin rezidüsüdü r. istem 1 ila 19”dan herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi antikor veya antikorun fonksiyonel fragmani, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir modifikasyon içeren bir modifiye edilmis varyant olmasidir: bir kimyasal kismin bir amino asit rezidüsüne baglantisi, bir N-bagli veya O-bagli karbonhidrat zinciri, N-bagli veya O-bagli glikosilasyon, N- veya C-ucu isleme, deamidasyon, bir aspartik asit rezidüsünün izomerizasyonu, bir metiyonin rezidüsünün oksidasyonu ve bir metiyonin istem 1 ila 20'den herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi bir glikanin modifikasyonu, bir antikor-bagimli hücresel sitotoksik aktiviteyi güçlendirmek için regüle edilmesidir: Bir polinükleotid olup, istem 1 ila 17'den herhangi birine göre antikoru veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini sifreler. .Istem 22'ye göre polinükleotid olup, özelligi SEO ID NO: 50'de 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 52'de 67 ila 390 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi içermesidir. istem 22'ye veya 23'e göre polinükleotid olup, özelligi SEQ ID NO: 62 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 58 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi içermesidir. Istem 22'ye veya 23'e göre polinükleotid olup, özelligi asagidakileri içermesidir: (a) SEQ ID NO: 84`te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (b) SEQ ID NO: 86'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (c) SEQ lD NO: 88'de 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (d) SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden ve (e) (a) ila (d) arasindaki nükleotid dizilerinin herhangi birine komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir polinükleotide sert kosullar altinda hibridize olan bir polinükleotid içeren bir nükleotid dizisinden olusan gruptan seçilen bir nükleotid dizisi; ve (f) SEQ ID NO: 70'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (g) SEQ ID NO: 72'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (h) SEQ ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (i) SEQ lD NO: 76'da 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (j) SEQ ID NO: ?8'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (k) SEQ ID NO: 80'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (I) SEQ ID NO: 82'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden ve (m) (f) ila (l) arasindaki nükleotid dizilerinin herhangi birine komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir polinükleotide sert kosullar altinda hibridize olan bir polinükleotid içeren bir nükleotid dizisinden olusan gruptan seçilen bir nükleotid dizisi. istem 25'e göre polinükleotid olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen nükleotid dizileri içermesidir: SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 72'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 76'da 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?8'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 80'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 82'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ lD NO: 70'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?2'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; ve SEQ lD NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: 76'da 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi. 27. Istem 25'e veya 26'ya göre polinükleotid olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen nükleotid dizileri içermesidir: SEO ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?0'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84'te 58 ile 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?2'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO lD NO: 76'da 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84'te 58 ile 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?8'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ile 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 80`de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 82'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70`de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 72'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO lD NO: 90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 76'da 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi. Istem 25 ila 27'den herhangi birine göre polinükleotid olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen nükleotid dizileri içermesidir: SEO ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO bir nükleotid dizisi; SEO lD NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 80 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 90 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 72 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 90 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO Bir ekspresyon vektörü olup, özelligi Istem 22 ila 28'den herhangi birine göre bir polinükleotid içermesidir. Bir konak hücre olup, özelligi istem 29'e göre ekspresyon vektörü ile transforme edilmesidir. Istem 30'a göre konak hücre olup, özelligi konak hücre, bir ökaryotik hücre olmasidir. Bir antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini üretmenin bir yöntemi olup, özelligi istem 30'e veya 31'e göre konak hücreyi kültürlemenin bir adimini ve kültürleme adiminda elde edilen bir kültürlenmis üründen arzu edilen bir antikoru veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini toplamanin bir adimini içermesi ile karakterize edilmesidir. Bir farmasötik bilesim olup, özelligi istemler 1 ila 21'e göre antikorlarin veya antikorlarin fonksiyonel fragmanlarinin en az birini içermesi ile karakterize edilmesidir. Istem 33'e göre farmasötik bilesim olup, özelligi bir tümörü tedavi etmek yönelik olmasidir. Bir tümörü tedavi etmek için bir farmasötik bilesim olup, özelligi istemler 1 ila 21'e göre antikorlarin veya antikorlarin fonksiyonel fragmanlarinin en az birini ve kanser için en az bir terapötik ajan içermesi ile karakterize edilir. Istemler 1 ila 21'e göre antikor veya antikorun fonksiyonel fragmani olup, özelligi bir tümörü tedavi etmenin bir yönteminde kullanim yönelik olmasidir. Bir tümörü tedavi etmenin bir yönteminde kullanim için 1 ila 21 arasindaki istemlere göre antikor veya antikorun fonksiyonel fragmani olup, yöntem antikoru veya fonksiyonel fragmani ve kanser için en az bir terapötik ajani es- zamanli olarak, ayri ayri veya sirali olarak bir bireye uygulamayi içermesidir. Istem 34'e veya 35'e göre kullanim için farmasötik bilesim veya istem 36'ya veya 37'ye göre kullanim için antikor veya fonksiyonel fragman olup, özelligi tümörün kanser olmasidir. istem 38'e göre farmasötik bilesim, antikor veya fonksiyonel fragman olup, özelligi kanser, akciger kanseridir, meme kanseridir, prostat kanseridir, pankreatik kanserdir, kolorektal kanserdir, bir melanomdur, karaciger kanseridir, ovaryan kanserdir, idrar kesesi kanseridir, mide kanseridir, özofajiyal kanserdir
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161478878P | 2011-04-25 | 2011-04-25 | |
JP2011097645 | 2011-04-25 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TR201808018T4 true TR201808018T4 (tr) | 2018-06-21 |
Family
ID=47072232
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TR2018/08018T TR201808018T4 (tr) | 2011-04-25 | 2012-04-24 | Anti-B7-H3 antikoru. |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9371395B2 (tr) |
EP (1) | EP2703486B1 (tr) |
JP (2) | JP5917498B2 (tr) |
KR (1) | KR102030987B1 (tr) |
CN (1) | CN103687945B (tr) |
AU (1) | AU2012248470B2 (tr) |
CA (1) | CA2834136C (tr) |
CO (1) | CO6811812A2 (tr) |
DK (1) | DK2703486T3 (tr) |
ES (1) | ES2667568T3 (tr) |
HR (1) | HRP20180640T1 (tr) |
HU (1) | HUE038685T2 (tr) |
IL (1) | IL229061B (tr) |
LT (1) | LT2703486T (tr) |
MX (1) | MX344773B (tr) |
MY (1) | MY173377A (tr) |
PL (1) | PL2703486T3 (tr) |
PT (1) | PT2703486T (tr) |
RS (1) | RS57279B1 (tr) |
RU (1) | RU2668170C2 (tr) |
SG (1) | SG194620A1 (tr) |
SI (1) | SI2703486T1 (tr) |
TR (1) | TR201808018T4 (tr) |
TW (1) | TWI561531B (tr) |
WO (1) | WO2012147713A1 (tr) |
ZA (1) | ZA201307983B (tr) |
Families Citing this family (79)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102030987B1 (ko) * | 2011-04-25 | 2019-11-11 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | 항 b7-h3항체 |
US9790282B2 (en) | 2013-03-25 | 2017-10-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-CD276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors |
JP6636016B2 (ja) * | 2014-05-29 | 2020-01-29 | スプリング バイオサイエンス コーポレーション | 抗b7−h3抗体及びその診断用途 |
JP6613304B2 (ja) | 2014-09-17 | 2019-12-04 | ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ, アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー, デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ | 抗cd276抗体(b7h3) |
EP3237006B1 (en) * | 2014-12-22 | 2023-08-16 | Systimmune, Inc. | Bispecific tetravalent antibodies and methods of making and using thereof |
IL290959B2 (en) | 2015-06-29 | 2023-04-01 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Preparations containing antibody-drug conjugates and methods for their production |
IL258322B2 (en) * | 2015-09-24 | 2023-10-01 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Antibodies against GARP, nucleotides encoding them, and vectors, cells and preparations containing them, methods for their preparation and uses thereof |
WO2017062619A2 (en) | 2015-10-08 | 2017-04-13 | Macrogenics, Inc. | Combination therapy for the treatment of cancer |
GEP20217328B (en) | 2015-12-14 | 2021-12-10 | Macrogenics Inc | Bispecific molecules having immunoreactivity with pd-1 and ctla-4, and methods of use thereof |
SG10201601719RA (en) | 2016-03-04 | 2017-10-30 | Agency Science Tech & Res | Anti-LAG-3 Antibodies |
EP3442574A4 (en) | 2016-04-15 | 2019-12-11 | MacroGenics, Inc. | NOVEL B7-H3 BINDING MOLECULES, THEIR ANTIBODY-MEDICINAL CONJUGATES AND METHODS OF USE |
SG10201603721TA (en) | 2016-05-10 | 2017-12-28 | Agency Science Tech & Res | Anti-CTLA-4 Antibodies |
AU2017278325A1 (en) | 2016-06-07 | 2019-01-24 | Macrogenics, Inc. | Combination therapy |
TWI762487B (zh) * | 2016-06-08 | 2022-05-01 | 美商艾伯維有限公司 | 抗-b7-h3抗體及抗體藥物結合物 |
JP2019526529A (ja) * | 2016-06-08 | 2019-09-19 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 抗b7−h3抗体及び抗体薬物コンジュゲート |
EP3469000A1 (en) * | 2016-06-08 | 2019-04-17 | AbbVie Inc. | Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates |
TW201825524A (zh) * | 2016-09-20 | 2018-07-16 | 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司 | 新型抗-pcsk9抗體 |
US10093731B2 (en) | 2017-02-24 | 2018-10-09 | Kindred Biosciences, Inc. | Anti-IL31 antibodies for veterinary use |
IL268836B2 (en) | 2017-02-24 | 2024-04-01 | Macrogenics Inc | Bispecific molecules that bind CD137 and cancer antigens and their uses |
WO2018161872A1 (zh) * | 2017-03-06 | 2018-09-13 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗b7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 |
US10899837B2 (en) | 2017-03-31 | 2021-01-26 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | B7-H3 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof |
TW201909926A (zh) * | 2017-08-04 | 2019-03-16 | 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 | B7h3抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途 |
CR20200138A (es) | 2017-08-25 | 2020-06-14 | Five Prime Therapeutics Inc | Anticuerpos de b7-h4 y métodos para usarlos |
KR20200098590A (ko) | 2017-12-12 | 2020-08-20 | 마크로제닉스, 인크. | 이중특이적 cd16-결합 분자 및 질환 치료에서의 그것의 용도 |
CN110090306B (zh) * | 2018-01-31 | 2023-04-07 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 双醛连接臂的配体-药物偶联物、其制备方法及其应用 |
US11685781B2 (en) | 2018-02-15 | 2023-06-27 | Macrogenics, Inc. | Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease |
CA3091801A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-06 | Five Prime Therapeutics, Inc. | B7-h4 antibodies and methods of use thereof |
WO2019225787A1 (ko) * | 2018-05-24 | 2019-11-28 | 에이비엘바이오 주식회사 | 항-b7-h3 항체 및 그 용도 |
US20210251994A1 (en) | 2018-06-15 | 2021-08-19 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors |
CN117024593A (zh) * | 2018-07-10 | 2023-11-10 | 国立大学法人神户大学 | 抗SIRPα抗体 |
WO2020018964A1 (en) | 2018-07-20 | 2020-01-23 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors |
AU2019319906A1 (en) * | 2018-08-08 | 2021-03-04 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Proteins binding NKG2D, CD16 and a tumor-associated antigen |
CN113365663A (zh) | 2018-08-30 | 2021-09-07 | Hcw生物科技公司 | 单链嵌合多肽和其用途 |
EP3844181A1 (en) | 2018-08-30 | 2021-07-07 | HCW Biologics, Inc. | Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof |
WO2020047462A2 (en) | 2018-08-30 | 2020-03-05 | HCW Biologics, Inc. | Methods of treating aging-related disorders |
CN110950953B (zh) * | 2018-09-26 | 2022-05-13 | 福州拓新天成生物科技有限公司 | 抗b7-h3的单克隆抗体及其在细胞治疗中的应用 |
AU2019351427A1 (en) | 2018-09-30 | 2021-04-15 | Changzhou Hansoh Pharmaceutical Co., Ltd. | Anti-B7H3 antibody-exatecan analog conjugate and medicinal use thereof |
CN110305213B (zh) * | 2018-11-09 | 2023-03-10 | 泰州复旦张江药业有限公司 | 一种抗b7-h3抗体及其制备方法、其偶联物和应用 |
CN113330034A (zh) * | 2018-11-16 | 2021-08-31 | 阿尔伯特爱因斯坦医学院 | 针对B7-H3的IgV结构域的单克隆抗体及其用途 |
WO2020140094A1 (en) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | Gigagen, Inc. | Anti-b7-h3 binding proteins and methods of use thereof |
CN109851673B (zh) * | 2019-01-22 | 2023-07-25 | 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 | 一种抗人b7-h3单克隆抗体的制备方法及其免疫组化检测方法及其应用及其试剂盒 |
EP3962493A2 (en) | 2019-05-03 | 2022-03-09 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor |
AU2020294797A1 (en) | 2019-06-21 | 2021-12-23 | HCW Biologics, Inc. | Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof |
AU2020299305A1 (en) * | 2019-07-03 | 2022-01-06 | Crystal Bioscience Inc. | Anti-B7-H3 antibody and methods of use thereof |
KR20210006637A (ko) * | 2019-07-09 | 2021-01-19 | 주식회사 와이바이오로직스 | B7-h3(cd276)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 |
EP4023245A4 (en) | 2019-08-28 | 2023-08-30 | Azusapharma Sciences, Inc. | BIFIDOBACTERIUM SPP. WITH EXPRESSION AND SECRETION OF DIABODY-TYPE BSAB |
EP4039702A1 (en) * | 2019-09-16 | 2022-08-10 | Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd. | Anti-b7-h3 antibody and application thereof |
CN110642948B (zh) * | 2019-10-09 | 2021-06-29 | 达石药业(广东)有限公司 | B7-h3纳米抗体、其制备方法及用途 |
EP3822288A1 (en) * | 2019-11-18 | 2021-05-19 | Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts | Antibodies targeting, and other modulators of, the cd276 antigen, and uses thereof |
WO2021097800A1 (en) * | 2019-11-22 | 2021-05-27 | Abl Bio Inc. | Anti-pd-l1/anti-b7-h3 multispecific antibodies and uses thereof |
EP4076434A1 (en) | 2019-12-17 | 2022-10-26 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly |
US20210268022A1 (en) | 2020-02-11 | 2021-09-02 | HCW Biologics, Inc. | Methods of activating regulatory t cells |
JP2023513573A (ja) | 2020-02-11 | 2023-03-31 | エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド | 加齢性および炎症性疾患を治療する方法 |
JP2023519106A (ja) | 2020-02-11 | 2023-05-10 | エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド | クロマトグラフィー樹脂およびその使用 |
CN113527487A (zh) * | 2020-04-22 | 2021-10-22 | 复星凯特生物科技有限公司 | 抗人b7-h3的单克隆抗体及其应用 |
US20230174666A1 (en) | 2020-04-29 | 2023-06-08 | HCW Biologics, Inc. | Anti-cd26 proteins and uses thereof |
WO2021247003A1 (en) | 2020-06-01 | 2021-12-09 | HCW Biologics, Inc. | Methods of treating aging-related disorders |
AU2021283199A1 (en) | 2020-06-01 | 2023-01-05 | HCW Biologics, Inc. | Methods of treating aging-related disorders |
US12024545B2 (en) | 2020-06-01 | 2024-07-02 | HCW Biologics, Inc. | Methods of treating aging-related disorders |
CN113754766A (zh) * | 2020-06-02 | 2021-12-07 | 明慧医药(上海)有限公司 | 抗b7-h3抗体及其制备和应用 |
CN116096906A (zh) | 2020-06-29 | 2023-05-09 | 旗舰创业创新五公司 | 工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途 |
CN111662384B (zh) * | 2020-06-30 | 2021-04-09 | 广州百暨基因科技有限公司 | 抗b7h3抗体及其应用 |
IL303048A (en) | 2020-11-24 | 2023-07-01 | Novartis Ag | BCL-XL inhibitor antibody-drug conjugates and methods of using them |
CA3203257A1 (en) * | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Li Li | Anti-b7-h3 antibody and uses thereof |
JP2024508081A (ja) | 2021-02-09 | 2024-02-22 | メディリンク セラピューティクス(スーチョウ)カンパニー,リミティド | 生物活性物質コンジュゲート、その調製方法及びその使用 |
AU2022246895A1 (en) | 2021-03-31 | 2023-10-19 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer |
EP4363059A1 (en) | 2021-06-29 | 2024-05-08 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof |
EP4373505A1 (en) | 2021-07-19 | 2024-05-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Combination of checkpoint inhibitors and an oncolytic virus for treating cancer |
CN114380910B (zh) * | 2022-01-07 | 2023-04-28 | 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 | 靶向人b7-h3分子的人源化单克隆抗体及其应用 |
WO2023159102A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Combinations of checkpoint inhibitors and oncolytic virus for treating cancer |
WO2023168363A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | HCW Biologics, Inc. | Method of treating pancreatic cancer |
WO2023221975A1 (zh) * | 2022-05-18 | 2023-11-23 | 苏州宜联生物医药有限公司 | 包含蛋白降解剂类生物活性化合物的抗体药物偶联物及其制备方法和用途 |
TW202408588A (zh) | 2022-05-20 | 2024-03-01 | 瑞士商諾華公司 | 抗體-藥物結合物抗腫瘤化合物及其使用方法 |
WO2023223097A1 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Novartis Ag | Antibody drug conjugates |
US20240174732A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-05-30 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer |
WO2024106939A1 (ko) * | 2022-11-15 | 2024-05-23 | 주식회사 셀랩메드 | B7-h3에 특이적으로 결합하는 항체 |
CN116041518A (zh) * | 2022-12-26 | 2023-05-02 | 北京清辉联诺生物科技有限责任公司 | 靶向b7-h3的抗体或抗体片段、以及其在嵌合抗原受体免疫细胞疗法领域的应用 |
WO2024151687A1 (en) | 2023-01-09 | 2024-07-18 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Genetic switches and their use in treating cancer |
WO2024148521A1 (zh) * | 2023-01-10 | 2024-07-18 | 周田弘 | 重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因、重组载体、宿主细胞、药物组合物及其应用 |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5260203A (en) | 1986-09-02 | 1993-11-09 | Enzon, Inc. | Single polypeptide chain binding molecules |
US5091513A (en) | 1987-05-21 | 1992-02-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
AU665190B2 (en) | 1990-07-10 | 1995-12-21 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
WO1993006213A1 (en) | 1991-09-23 | 1993-04-01 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
ATE463573T1 (de) | 1991-12-02 | 2010-04-15 | Medimmune Ltd | Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken |
EP0656941B1 (en) | 1992-03-24 | 2005-06-01 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
GB9313509D0 (en) | 1993-06-30 | 1993-08-11 | Medical Res Council | Chemisynthetic libraries |
CA2177367A1 (en) | 1993-12-03 | 1995-06-08 | Andrew David Griffiths | Recombinant binding proteins and peptides |
DK2180007T4 (da) * | 1998-04-20 | 2017-11-27 | Roche Glycart Ag | Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet |
ES2571230T3 (es) | 1999-04-09 | 2016-05-24 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional |
WO2002010187A1 (en) | 2000-07-27 | 2002-02-07 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | B7-h3 and b7-h4, novel immunoregulatory molecules |
EP2314686B2 (en) | 2000-10-06 | 2023-06-21 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions |
CA2427858A1 (en) * | 2000-11-03 | 2002-05-10 | University Of Vermont And State Agricultural College | Compositions for inhibiting grb7 |
HU230378B1 (hu) | 2001-11-01 | 2016-03-29 | Uab Research Foundation | Anti-DR5 ellenanyagok és anti-DR4 ellenanyagok és más terápiás ágensek kombinációi |
BRPI0406678A (pt) | 2003-01-07 | 2005-12-20 | Symphogen As | Método para produzir proteìnas policlonais recombinantes |
US20050002935A1 (en) * | 2003-04-17 | 2005-01-06 | Vincent Ling | Use of B7-H3 as an immunoregulatory agent |
WO2006016276A2 (en) * | 2004-08-03 | 2006-02-16 | Innate Pharma S.A. | Therapeutic and diagnostic methods and compositions targeting 4ig-b7-h3 and its counterpart nk cell receptor |
US7592429B2 (en) | 2005-05-03 | 2009-09-22 | Ucb Sa | Sclerostin-binding antibody |
CN101104639A (zh) * | 2006-07-10 | 2008-01-16 | 苏州大学 | 抗人b7-h3单克隆抗体的制备及其应用 |
CA2668800A1 (en) | 2006-11-08 | 2008-06-05 | Macrogenics West, Inc. | Tes7 and antibodies that bind thereto |
JP2010523478A (ja) * | 2007-03-22 | 2010-07-15 | スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ | モノクローナル抗体8h9の使用 |
KR102030987B1 (ko) * | 2011-04-25 | 2019-11-11 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | 항 b7-h3항체 |
-
2012
- 2012-04-24 KR KR1020137027860A patent/KR102030987B1/ko active Application Filing
- 2012-04-24 CN CN201280030835.0A patent/CN103687945B/zh active Active
- 2012-04-24 TR TR2018/08018T patent/TR201808018T4/tr unknown
- 2012-04-24 AU AU2012248470A patent/AU2012248470B2/en active Active
- 2012-04-24 JP JP2013512363A patent/JP5917498B2/ja active Active
- 2012-04-24 HU HUE12776528A patent/HUE038685T2/hu unknown
- 2012-04-24 TW TW101114495A patent/TWI561531B/zh active
- 2012-04-24 US US13/455,021 patent/US9371395B2/en active Active
- 2012-04-24 RU RU2013152164A patent/RU2668170C2/ru active
- 2012-04-24 EP EP12776528.7A patent/EP2703486B1/en active Active
- 2012-04-24 SI SI201231272T patent/SI2703486T1/en unknown
- 2012-04-24 MY MYPI2013003891A patent/MY173377A/en unknown
- 2012-04-24 WO PCT/JP2012/060904 patent/WO2012147713A1/ja active Application Filing
- 2012-04-24 ES ES12776528.7T patent/ES2667568T3/es active Active
- 2012-04-24 LT LTEP12776528.7T patent/LT2703486T/lt unknown
- 2012-04-24 SG SG2013079199A patent/SG194620A1/en unknown
- 2012-04-24 MX MX2013012285A patent/MX344773B/es active IP Right Grant
- 2012-04-24 DK DK12776528.7T patent/DK2703486T3/en active
- 2012-04-24 RS RS20180646A patent/RS57279B1/sr unknown
- 2012-04-24 CA CA2834136A patent/CA2834136C/en active Active
- 2012-04-24 PL PL12776528T patent/PL2703486T3/pl unknown
- 2012-04-24 PT PT127765287T patent/PT2703486T/pt unknown
-
2013
- 2013-10-18 ZA ZA2013/07983A patent/ZA201307983B/en unknown
- 2013-10-24 IL IL229061A patent/IL229061B/en active IP Right Grant
- 2013-11-22 CO CO13275282A patent/CO6811812A2/es active IP Right Grant
-
2016
- 2016-04-06 JP JP2016076911A patent/JP6224759B2/ja active Active
- 2016-06-20 US US15/187,209 patent/US20160368990A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-04-23 HR HRP20180640TT patent/HRP20180640T1/hr unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TR201808018T4 (tr) | Anti-B7-H3 antikoru. | |
JP7345578B2 (ja) | 新規抗pd-l1抗体 | |
CN109563169B (zh) | 抗hla-g特异性抗体 | |
JPWO2020138489A1 (ja) | 新規抗ccr8抗体 | |
AU2007318483B2 (en) | Anti-human Dlk-1 antibody showing anti-tumor activity in vivo | |
JP2022515318A (ja) | 抗体及びその用途 | |
TW201741340A (zh) | Cd47抗體及使用其之方法 | |
KR20210013165A (ko) | GUCY2c에 특이적인 항체 및 이의 용도 | |
WO2016191246A2 (en) | T cell receptor-like antibodies specific for a prame peptide | |
JP7022067B2 (ja) | Foxp3由来のペプチドに特異的なt細胞受容体様抗体 | |
EP3561057A1 (en) | Anti-cd3 antibody, and molecule containing said antibody | |
KR20210142638A (ko) | Cd3 항원 결합 단편 및 이의 응용 | |
CN113164780A (zh) | 抗lap抗体变体及其用途 | |
CN113508139A (zh) | 结合人lag-3的抗体、其制备方法和用途 | |
WO2021097800A1 (en) | Anti-pd-l1/anti-b7-h3 multispecific antibodies and uses thereof | |
TWI818916B (zh) | 抗cd147抗體、及其用途與製造方法 | |
CN113412130A (zh) | 用于诊断和治疗癌症及其他疾病的对促肿瘤癌症相关成纤维细胞的识别和靶向 | |
JP2023546743A (ja) | 抗cd73抗体及びその使用 | |
CN114651011A (zh) | 靶向cd43的独特癌相关表位的单克隆抗体 | |
EP4293047A1 (en) | Anti-pd-l1 antibody and use thereof | |
RU2790326C2 (ru) | Анти-сd3-антитело и молекула, содержащая это антитело | |
CN117285628A (zh) | 抗vista抗体及其应用 | |
CN115698070A (zh) | Cd5l结合抗体及其用途 | |
TW201927336A (zh) | 細胞毒性t細胞耗竭用組成物 | |
NZ616809B2 (en) | Anti-b7-h3 antibody |