TR201808018T4

TR201808018T4 - Anti-B7-H3 antikoru.

Info

Publication number: TR201808018T4
Application number: TR2018/08018T
Authority: TR
Inventors: Takahashi Shu; Matsuoka Tatsuji; Murakami Kenji; Takizawa Takeshi; Hirotani Kenji; Urano Atsushi; Fukuchi Keisuke; Yazawa Mitsuhiro
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2011-04-25
Filing date: 2012-04-24
Publication date: 2018-06-21
Also published as: AU2012248470B2; IL229061B; JP2016165294A; IL229061A0; JPWO2012147713A1; ZA201307983B; CA2834136A1; MX2013012285A; MY173377A; TWI561531B; EP2703486B1; US20160368990A1; PT2703486T; KR102030987B1; TW201249869A; CO6811812A2; US9371395B2; CA2834136C; AU2012248470A1; WO2012147713A1

Abstract

Mevcut buluş, bir tümör üzerinde bir terapötik etkiye sahip olan bir antikor ile ilgilidir. Yani, buluş bir anti-tümör aktivite göstermesi için B7-H3'ü bağlayan bir antikor ile ilgilidir. Buluşun bir amacı, bir tümör üzerinde bir terapötik etkiye sahip olan bir farmasötik sağlamaktır. Bir anti-tümör aktivite göstermesi için B7-H3'ü bağlayan bir anti-B7-H3 antikoru elde etme ile, bir tümörü tedavi etmek için antikoru ve benzerlerini içeren bir farmasötik bileşim elde edilir.

Description

TARIFNAME ANTI-B7-H3 ANTIKORU Teknik Saha Mevcut bulus, B7-H3'ü baglayan ve bir tümör için bir terapötik ve/veya önleyici ajan olarak yararli olan bir antikor ile ilgilidir ve ayrica bir tümörü tedavi etmenin ve/veya önlemenin bir yönteminde kullanimi için antikor ile de ilgilidir.

Teknigin Altyapisi B7-H3, bir tek-geçisli transmembran yapiya sahip olan bir proteindir (Patent-disi belge 1). B7-H3'ün N-ucu ekstraselüler alani, iki varyant içerir. Varyant 1, iki yerin her birinde sirasiyla bir V-benzeri ve bir C-benzeri lg alani içerir ve Varyant 2, bir yerinde sirasiyla bir V-benzeri ve bir C-benzeri lg alani içerir. B7-H3'ün N-ucu intraselüler alani 45 amino asit içerir.

B7-H3 için bir reseptör olarak, bir tek-geçisli transmembran yapiya sahip olan TLT-2 bildirilmistir (Patent-disi belge 2). Bununla birlikte, burada ayrica, TLT-2'nin B7-H3 için bir reseptör olmadigini direten bir rapor da vardir (Patent-disi belge 3). Önceki rapora göre, reseptör B7-H3'e baglandiginda, CD8-pozitif T hücrelerinin aktivasyonu güçlendirilir.

B7-H3'ün çogu kanser tipinde, özellikle küçük-hücreli-olmayan akciger kanserinde, böbrek kanserinde, ürotelyal karsinomda, kolorektal kanserde, prostat kanserinde, gliyoblastom multiformede, ovaryan kanserde ve pankreatik kanserde asiri-eksprese edildigi klinik olarak bildirilmistir (Patent-disi belgeler 4 ila 11). Ilaveten, prostat kanserinde, B7-H3'ün ekspresyonunun yogunlugunun klinikopatolojik malignite, örnegin, tümör hacmi, ekstraprostatik invazyon veya Gleason skoru ile pozitif bir sekilde korele oldugu ve ayrica kanser progresyonu ile de korele oldugu bildirilmistir (Patent-disi belge 8). Benzer sekilde, gliyoblastom multiformede, B7-H3'ün ekspresyonu olaysiz sag kalim ile negatif bir sekilde koreledir (Patent-disi belge 9) ve pankreatik kanserde, B7-H3'ün ekspresyonu, lenf nodu metastazi ve patolojik progresyon ile koreledir (Patent-disi belge 11). Ovaryan kanserde, B7-H3'ün ekspresyonu, lenf nodu metastazi ve patolojik progresyon ile koreledir.

Ilaveten, B7-H3 genine karsi bir B7-H3-pozitif kanser hücresi hattina siRNA uygulama ile, fibronektine yapiskanligin azaltildigi ve böylece hücre göçünün ve matrijel invazyonunun azaltildigi bildirilmistir (Patent-disi belge 12). Ilaveten, gliyoblastom multiformede, B7-H3'ün ekspresyonunun NK hücresi-aracili hücre ölümünden kaçmaya olanak sagladigi bildirilmistir (Patent-disi belge 13).

Diger taraftan, B7-H3'ün yalnizca kanser hücrelerinde degil ayni zamanda tümörlerde veya çevreleyen damarlarda da ek3prese edildigi bildirilmistir (Patent-disi belgeler 5 ve 14). BY-H3 ovaryan kanser kan damarlarinda eksprese edildiginde, sag kalim oraninin düsürüldügü bildirilmistir.

B7 familyasi moleküllerinin, immün sistem ile ilgili oldugu öne sürülmüstür. B7-H3'ün, monositlerde, dentritik hücrelerde ve aktive edilmis T hücrelerinde eksprese edildigi bildirilmistir (Patent-disi belge 15). Sitotoksik T hücreleri aktive edildiginde, B7-H3'ün CD4-pozitif veya CD8-pozitif T hücrelerinin proliferasyonunu kostimüle ettigi bildirilmistir. Bununla birlikte, burada ayrica B'I-H3'ün bir kostimülatör rol oynamadigina yönelik bir rapor da vardir (Patent-disi belge 1).

B7-H3 moleküllerinin, otoimmün hastaliklar ile ilgili oldugu bildirilmistir. Romatizmada ve diger otoimmün hastaliklarda, BY-H3'ün fibroblast-benzeri sinoviositler ve aktive edilmis T-hücreleri arasindaki etkilesimde önemli bir rol oynadigi (Patent-disi belge 16) ve BY-H3'ün, sitokinler aktive edilmis makrofajlardan salindiginda bir kostimülatör faktör olarak islev gösterdigi ve böylelikle sepsisin meydana gelmesi ile ilgili oldugu (Patent-disi belge 17) bildirilmistir. Ilaveten, bir anti-BT-HS antikorunu indüksiyon fazi sirasinda astimin bir fare modeline uygulama ile, rejyonel lenf nodlarinda Th2 hücresi- aracili sitokin üretiminin bir anti-fare B7-H3 antikorunu uygulanmasi yoluyla baskilanmasindan dolayi astimin Iyilestirildigi bildirilmistir (Patent-disi belge 18).

B7-H3 açisindan, fare B7-H3'üne karsi bir antikorun intra-tümöral infiltre eden CD8- pozitif T hücrelerini güçlendirdigi ve tümör büyümesini baskiladigi bildirilmistir (Patent- disi belge 14). Ilaveten, BT-H3 varyant 1'i taniyan bir antikorun adenokarsinom üzerinde bir in vivo anti-tümör etki gösterdigini açiklayan bir patent vardir (Patent belgesi 1). tanimayan bir monoklonal antikor TES7'yi açiklar.

Patent belgesi 2, insan B7-homologu 3'ün 4lg alan izoformunu, 4Ig-B7-H3'ü, baglayan bir monoklonal antikor 8H9'u açiklar.

Bu çalismalara ragmen, bir anti-B7-H3 antikoru için bir in vivo anti-tümör etki gösteren bir epitop simdiye kadar açiklanmamistir ve BT-H3'ün ekstraselüler alaninin bir spesifik amino asit dizisinin kanseri tedavi etmek amaciyla bir monoklonal antikor için bir epitop olarak kullanisli olduguna yönelik rapor yoktur.

Antikorlar ayni antijen için spesifik olsa bile, antikorlarin özellikleri, antikorlarin epitoplarindaki veya dizilerindeki farkliliklardan dolayi çesitlilik gösterebilir. Antikorlarin özelliklerindeki farkliliktan dolayi, insanlara klinik olarak uygulanmakta olduklarinda, antikorlar tibbi ajanin etkililigi, terapötik yanitin sikligi, yan etkilerin insidansi veya ilaç direnci, vb. açisindan farkli reaksiyonlar gösterir.

B7-H3'e karsi antikorlar ile ilgili olarak ayrica, esi benzeri görülmemis özelliklere sahip olan bir antikorun olusturulmasi da güçlü bir sekilde talep edilmektedir.

Ilgili Teknik Belgeler Patent Belgesi Patent-disi Belgeler Patent-disi Belge 2: Proceedings of the National Academy of Sciences of the Patent-disi Belge 7: Cancer Immunology, Immunotherapy, 2010, vol. 59, pp. 1163-1171 Patent-disi Belge 13: Proceedings of the National Academy of Sciences of the Patent-disi Belge 19: American Association for Cancer Research. Proceedings of the Annual Meeting, April 2008, vol. 49, page 606.

Bulusun Kisa Açiklamasi Bulus tarafindan Çözülecek olan Problemler Bulusun bir amaci, bir tümör üzerinde bir terapötik etkiye sahip olan bir farmasötik içinde kullanilacak olan bir antikor ve antikorun bir fonksiyonel fragmanini saglamaktir ve bir tümörü tedavi etmenin bir yönteminde kullanim için bir antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini saglamaktir ve benzerleridir.

Problemleri Çözmek için Araçlar Mevcut bulusun sahipleri, yukaridaki amaci basarmak amaciyla yogun çalismalar yapmistir ve sonuç olarak, bunlar bir anti-tümör aktivite göstermesi için B7-H3'ü spesifik olarak baglayan bir antikor buldular ve böylelikle bulusu tamamladilar. Yani, bulus, asagidaki buluslari içerir. (1) Asagidaki özelliklere sahip olma ile karakterize edilen bir antikor veya bunun bir fonksiyonel fragmani: (a) B7-H3'ü spesifik olarak baglama, burada B7-H3, SEQ ID NO: 6 veya 10 ile temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir moleküldür ve antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani, IgC2'den olusan bir polipeptidi baglar, burada IgCZ, BY-H3'ün bir alanidir; (b) bir antikor-bagimli hücre-aracili fagositoz (ADCP) aktivitesine sahip olma; (0) bir in vivo anti-tümör aktivitesine sahip olma ve (d) B7-H3'ü baglamak için M30 antikoruna karsi bir kompetitif inhibitör aktiviteye sahip olma, burada M30 antikoru, SEQ ID NO: 51'in 20 ila 471 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir agir zincir ve SEO lD NO: 53'ün 23 ila 235 arasindaki rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir hafif zincir içerir. (2) Yukaridaki (1)'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, her biri B7-H3'ün bir alani olan lgCt'i ve lgC2'yi baglar. (3) Yukaridaki (1)'e veya (2)'ye göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, burada IgCZ, SEQ ID NO: 6'da 358 ila 456 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir alandir. (4) Yukaridaki (2)'ye göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, burada IgCt, SEQ ID NO: 6'da 140 ila 244 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir alandir. (5) Yukaridaki (1) ila (4) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, bir antikor-bagimli hücresel sitotoksisite (ADCC) aktivitesine ve/veya bir kompleman-bagimli sitotoksisite (CDC) aktivitesine sahiptir. (6) Yukaridaki (1) ila (5) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, burada tümör, kanserdir. (7) Yukaridaki (6)'ya göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, kanser, akciger kanseridir, meme kanseridir, prostat kanseridir, pankreatik kanserdir, kolorektal kanserdir, bir melanomdur, karaciger kanseridir, ovaryan kanserdir, idrar kesesi kanseridir, mide kanseridir, özofajiyal kanserdir veya böbrek kanseridir. (8) Yukaridaki (1) ila (7) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikonin bir fonksiyonel fragmani olup, agir zincirin tamamlayicilik belirleme bölgeleri olarak SEQ ID NO: 92 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRH1, SEQ ID NO: 93 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRH2 ve SEQ ID NO: 94 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRH3 içerir ve hafif zincirin tamamlayicilik belirleme bölgeleri olarak SEQ ID NO: 95 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRL1, SEQ ID NO: 96 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRL2 ve SEQ ID NO: 97 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRL3 içerir. (9) Yukaridaki (1) ila (8) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, SEQ ID NO: 51'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 53'te 23 ila 130 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içerir. (10) Yukaridaki (1) ila (9) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, burada bir sabit bölge, bir insan-kaynakli sabit bölgedir. (11) Yukaridaki (10)'a göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, burada SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 59 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir içerir. (12) Yukaridaki (1) ila (11) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, beserilestirilmistir. (13) Yukaridaki (12)'ye göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, asagidakileri içerir: (a) SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (b) SEQ ID NO: 87'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (c) SEQ ID NO: 89'da 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (d) SEQ lD NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (e) (a) ila (d) arasindaki dizilerin herhangi biri ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip olan bir amino asit dizisinden ve (f) burada (a) ila (d) arasindaki dizilerin herhangi birinde bir veya bir kaç amino asidin silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir amino asit dizisinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve (g) SEQ ID NO: ?1'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (h) SEQ lD NO: 73'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (i) SEQ ID NO: 75'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (j) SEQ ID NO: ?7'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (k) SEQ ID NO: 79'da 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (I) SEO ID NO: 81'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (m) SEQ ID NO: 83'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (n) (9) ila (m) arasindaki dizilerin herhangi biri ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip olan bir amino asit dizisinden ve (o) burada (9) ila (m) arasindaki dizilerin herhangi birinde bir veya bir kaç amino asidin silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir amino asit dizisinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisinden olusan bir (14) Yukaridaki (13)'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir degisken bölgesi ve bir hafif zincir degisken bölgesi içerir: SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: ?1'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 73'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 75'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEQ ID NO: ?7'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 79'da 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 81'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 83'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 71'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 73'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 75'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: ?7'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi. (15) Yukaridaki (13)'e veya (14)'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir ve bir hafif zincir içerir: SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 71'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 73'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEQ ID NO: ??'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEQ lD NO: ?9'da 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 81'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEQ lD NO: 83'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?1'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?3'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO asit dizisinden olusan bir hafif zincir ve SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEQ ID NO: ?7'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir. (16) Yukaridaki (13) ila (15) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir ve bir hafif zincir içerir: SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?1 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?3 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ lD NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?5 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?7 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden dizisinden dizisinden dizisinden dizisinden dizisinden dizisinden dizisinden dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO lD NO: 79 ile temsil edilen bir amino olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 81 ile temsil edilen bir amino olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 83 ile temsil edilen bir amino olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 71 ile temsil edilen bir amino olusan bir hafif zincir; SEQ lD NO: 91 ile temsil edilen bir amino olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 73 ile temsil edilen bir amino dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 75 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir ve SEO ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO lD NO: 77 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir. (17) Yukaridaki (1) ila (16) arasindakilerin herhangi birine göre antikorun fonksiyonel fragmani olup, burada fonksiyonel fragman Fab, F(ab)2, Fab' ve Fv'den olusan gruptan seçilir. (18) Yukaridaki (1) ila (16) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, bir birinci ve bir ikinci agir zincir içerir, burada birinci ve ikinci agir zincirin her biri bagimsiz bir sekilde asagidaki (i) ila (iii) arasindan seçilir: (i) bir tam-boy agir zincir; (ii) burada agir zincirin karboksil ucundan 1 amino asidin silindigi bir agir zincir veya (iii) burada agir zincirin karboksil ucundan 2 amino asidin silindigi bir agir tercihen, burada birinci ve ikinci agir zincirin her biri madde (ii)'den seçilir. (19) Yukaridaki (18)'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, burada birinci ve ikinci agir zincirin her biri bagimsiz bir sekilde maddeler (ii)'den veya (iii)'ten seçilir ve burada agir zincirin karboksik ucunda yer alan amino asit rezidüsü amidatlanir, tercihen burada amino asit rezidüsü, bir prolin rezidüsüdür. (20) Yukaridaki (1) ila (19) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, burada antikor veya antikorun fonksiyonel fragmani, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir modifikasyon içeren bir modifiye edilmis varyanttir: bir kimyasal kismin bir amino asit rezidüsüne baglantisi, bir N-bagli veya O-bagli karbonhidrat zinciri, N-bagli veya O-bagli glikosilasyon, N- veya C-ucu isleme, deamidasyon, bir aspartik asit rezidüsünün izomerizasyonu, bir metiyonin rezidüsünün oksidasyonu ve bir metiyonin rezidüsünün N-ucuna eklenmesi. (21) Yukaridaki (1) ila (20) arasindakilerin herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, burada bir glikanin modifikasyonu, bir antikor-bagimli hücresel sitotoksik aktiviteyi güçlendirmek için regüle edilir. (22) Bir polinükleotid olup, yukaridaki (1) ila (17) arasindakilerin herhangi birine göre antikoru veya antikorun birfonksiyonel fragmanini sifreler. arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 52'de 67 ila 390 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi (24) Yukaridaki (22)'ye veya (23)'e göre polinükleotid olup, SEQ ID NO: 62 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 58 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi içerir. (25) Yukaridaki (22)'ye veya (23)'e göre polinükleotid olup, asagidakileri içerir: (a) SEO ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (b) SEQ ID NO: 86`da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (C) SEQ ID NO: 88'de 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (d) SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden ve (e) (a) ila (d) arasindaki nükleotid dizilerinin herhangi birine komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir polinükleotide sert kosullar altinda hibridize olan bir polinükleotid içeren bir nükleotid dizisinden olusan gruptan seçilen bir nükleotid dizisi ve (f) SEQ ID NO: 70`te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (g) SEQ ID NO: ?2'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (h) SEQ ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (i) SEQ ID NO: 76'da 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (j) SEQ ID NO: ?8'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (k) SEQ ID NO: 80'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (I) SEQ ID NO: 82'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden ve (m) (f) ila (l) arasindaki nükleotid dizilerinin herhangi birine komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir polinükleotide sert kosullar altinda hibridize olan bir polinükleotid içeren bir nükleotid dizisinden olusan gruptan seçilen bir nükleotid dizisi. (26) Yukaridaki (25)'e göre polinükleotid olup, asagidakilerden olusan gruptan seçilen nükleotid dizileri içerir: SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 72'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 76'da 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 78'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO lD NO: 80'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 82'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO lD NO: SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 76'da 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi. (27) Yukaridaki (25)'e veya (26)'ya göre polinükleotid olup. asagidakilerden olusan gruptan seçilen nükleotid dizileri içerir: SEQ ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?0'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?2'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?6'da 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: ?8'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 80'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84`te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 82'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ile 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO lD NO: SEQ ID NO: 90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 72'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ile 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: 74'te 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?6'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi. (28) Yukaridaki (25) ila (27) arasindakilerin herhangi birine göre polinükleotid olup, asagidakilerden olusan gruptan seçilen nükleotid dizileri içerir: SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: ?0 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?2 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?4 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: 76 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?8 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 80 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: 82 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 72 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 90 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 76 ile temsil edilen bir nükleotid (29) Bir ekspresyon vektörü olup, yukaridaki (22) ila (28) arasindakilerin herhangi birine göre bir polinükleotid içerir. (30) Bir konak hücre olup, yukaridaki (29)'a göre ekspresyon vektörü ile transforme (31) Yukaridaki (30)'a göre konak hücre olup, burada konak hücre, bir ökaryotik hücredir. (32) Bir antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini üretmenin bir yöntemi olup, karakterize edici özelligi, yukaridaki (30)'a veya (31)'e göre konak hücreyi kültürlemenin bir adimini ve kültürleme adiminda elde edilen bir kültürlenmis Üründen arzu edilen bir antikoru veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini toplamanin bir adimini içermesidir. (33) Bir farmasötik bilesim olup, karakterize edici özelligi, yukaridaki (1) ila (21) arasindakilere göre antikorlarin veya antikorlarin fonksiyonel fragmanlarinin en az birini Içermesidir. (34) Yukaridaki (33)'e göre farmasötik bilesim olup, bir tümörü tedavi etmek içindir. (35) Bir tümörü tedavi etmek için bir farmasötik bilesim olup, karakterize edici özelligi, yukaridaki (1) ila (21) arasindakilere göre antikorlarin veya antikorlarin fonksiyonel fragmanlarinin en az birini ve kanser için en az bir terapötik ajan içermesidir. (36) Yukaridaki (1) ila (21) arasindakilere göre antikor veya antikorun fonksiyonel fragmani olup, bir tümörü tedavi etmenin bir yönteminde kullanim içindir. (37) Bir tümörü tedavi etmenin bir yönteminde kullanim için yukaridaki (1) ila (21) arasindakilere göre antikor veya antikorun fonksiyonel fragmani olup, yöntem antikoru veya fonksiyonel fragmani ve kanser için en az bir terapötik ajani es- zamanli olarak, ayri ayri veya sirali olarak bir bireye uygulamayi içerir. (38) Yukaridaki (34)'e veya (35)'e göre kullanim için farmasötik bilesim veya yukaridaki (36)'ya veya (37)'ye göre kullanim için antikor veya fonksiyonel fragman (39) Yukaridaki (38)'e göre farmasötik bilesim, antikor veya fonksiyonel fragman olup, burada kanser, akciger kanseridir, meme kanseridir, prostat kanseridir, pankreatik kanserdir, kolorektal kanserdir, bir melanomduri karaciger kanseridir, ovaryan kanserdir, idrar kesesi kanseridir, mide kanseridir, özofajiyal kanserdir veya böbrek kanseridir.

Bulusun Avantaji Bulusa göre, kanser için, BT-H3'ü baglayan ve kanser hücrelerine karsi bir anti-tümör aktivitesine sahip olan bir antikor içeren bir terapötik ajan veya benzeri elde edilebilir.

Sekillerin Kisa Açiklamasi aktivitesinin varligini veya yoklugunu gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=3). hücrelerine karsi ADCP aktivitesinin varligini veya yoklugunu gösteren bir gösterimdir. hücrelerine ve BY-HS-eksprese eden 293 hücrelerine karsi ADCC aktivitesinin varligini veya yoklugunu gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=3). Sekilde, "sahte", M30'un bos vektör ile transfekte edilmis 293 hücrelerine karsi ADCC aktivitesini gösterir ve "B7H3", M30'un B7-H3-eksprese eden 293 hücrelerine karsi ADCC aktivitesini gösterir. aktivitesinin varligini veya yoklugunu gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=3). reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun baglama özelligini gösterir ve düz çizgi. bir M30 antikorunun baglama özelligini gösterir. reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun baglama özelligini gösterir ve düz çizgi, bir M30 antikorunun baglama özelligini gösterir. reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun baglama özelligini gösterir ve düz çizgi, bir M30 antikorunun baglama özelligini gösterir. reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun baglama özelligini gösterir ve düz çizgi, bir M30 antikorunun baglama özelligini gösterir. karsi reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun baglama özelligini gösterir ve düz çizgi, bir M30 antikorunun baglama özelligini gösterir. reaktivitesini gösteren bir gösterimdir. Kesikli çizgi, bir kontrol antikorunun baglama özelligini gösterir ve düz çizgi, bir M30 antikorunun baglama özelligini gösterir. edilmis farelere karsi anti-tümör aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=10). aktivitesini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=8). ilaveten, "mm^3", "mm3" ifadesini gösterir. karsi ADCP aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=4). ile implante edilmis farelere karsi anti-tümör aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=9). varyant 1 antijeninin bir ekstraselüler alan polipeptit antijenini baglama için M30'a karsi kompetitif inhibitör aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=3). varyant 2 antijeninin bir ekstraselüler alan polipeptit antijenini baglama için M30'a karsi kompetitif inhibitör aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=3). antikorunun NCl-H322 hücrelerine karsi ADCP aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata Çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=4). hücrelerine karsi ADCC aktivitelerini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=3).

(SEQ ID NO: 28).

(SEQ ID NO: 29). gösterir (SEO ID NO: 50). gösterir (SEQ ID NO: 51). gösterir (SEO ID NO: 52). gösterir (SEQ ID NO: 53). sabit bölgesinin ve bir Insan poII-A ekleme sinyalinin bir nükleotid dizisini gösterir (SEQ ID NO: 56). nükleotid dizisini gösterir (SEQ ID NO: 57). dizisini gösterir (SEO ID NO: 58). dizisini gösterir (SEQ ID NO: 59). dizisini gösterir (SEQ ID NO: 62). dizisini gösterir (SEQ ID NO: 63).

(SEQ ID NO: 70). gösterir (SEQ ID NO: 71).

(SEO ID NO: 72). gösterir (SEO ID NO: 73).

(SEO ID NO: 74). gösterir (SEO ID NO: 75).

(SEO ID NO: 76). gösterir (SEO ID NO: 77).

(SEO ID NO: 78). gösterir (SEO ID NO: 79).

(SEO ID NO: 80). gösterir (SEO ID NO: 81).

(SEO ID NO: 82). gösterir (SEO ID NO: 83).

(SEO ID NO:84). gösterir (SEO ID NO: 85).

(SEO ID NO: 86). gösterir (SEO ID NO: 87).

(SEO ID NO:88). gösterir (SEQ ID NO: 89).

(SEQ ID NO: 90). gösterir (SEQ ID NO: 91). 231 hücreleri ile implante edilmis farelere karsi anti-tümör aktivitesini gösteren bir gösterimdir. Sekildeki hata çubuklari, standart hatalari temsil eder (n=6).

Bulusu Uygulama Modu Burada kullanildigi sekliyle, "kanser" ve “tümör“ terimleri ayni anlamda kullanilir.

Burada kullanildigi sekliyle, "gen" terimi, yalnizca DNA'yi degil ayni zamanda bunun mRNA'sini, bunun cDNA'sini ve bunun cRNA'sini da içerir.

Burada kullanildigi sekliyle, "polinükleotid" terimi, bir nükleik asit ile ayni anlamda kullanilir ve ayrica DNA'yi, RNA'yi, problari, oligonükleotidleri ve primerleri de içerir.

Burada kullanildigi sekliyle, "polipeptit" ve "protein" terimleri, ayrim olmadan kullanilir.

Burada kullanildigi sekliyle, "hücre" terimi ayrica, bir hayvan bireyi içindeki hücreleri ve kültürlenmis hücreleri de içerir.

Burada kullanildigi sekliyle, "B7-H3", B7-H3 proteini ile ayni anlamda kullanilir ve ayrica, B7-H3 varyant 1'i ve/veya B7-H3 varyant 2'yi de ifade eder.

Burada kullanildigi sekliyle, "hücre yaralanmasi" terimi, burada hücrelerde bazi formda patolojik degisime neden olunan bir hâli ifade eder ve hücre yaralanmasi dogrudan yaralanma ile sinirlandirilmaz ve hücrelerin yapisina ve fonksiyonuna hasarin tüm çesitlerini, örnegin, DNA klevajini, baz-dimer olusumunu, kromozomal klevaji, hücre bölünme mekanizmasina hasari ve çesitli enzimatik aktivitelerde bir düsüsü, içerir.

Burada kullanildigi sekliyle, "sitotoksik aktivite" terimi, yukarida-tarif edilen hücre yaralanmasina neden olma aktivitesini ifade eder.

Burada kullanildigi sekliyle, "antikor-bagimli hücre-aracili fagositoz aktivitesi" terimi, örnegin, tümör hücrelerini, bir antikor tarafindan aracilik edilen monositler veya makrofajlar ile fagositoz etme aktivitesi anlamina gelir. Terim ayrica, "antikor-bagimli fagositoz aktivitesi" olarak da adlandirilir.

Burada kullanildigi sekliyle, "antikor-bagimli hücresel sitotoksisite aktivitesi" terimi, örnegin, tümör hücrelerine, bir antikor tarafindan aracilik edilen NK hücreleri ile hasar verme aktivitesi anlamina gelir.

Burada kullanildigi sekliyle, "kompleman-bagimli sitotoksisite aktivitesi" terimi, örnegin, tümör hücrelerine, bir antikor tarafindan aracilik edilen kompleman ile hasar verme aktivitesi anlamina gelir.

Burada kullanildigi sekliyle, "bir antikorun fonksiyonel fragmani" terimi, bir antikorun bir antijen-baglama aktivitesine sahip olan bir parsiyel fragmanini ifade eder, burada Fab, F(ab')2, scFv ve benzerlerini içeren fragman antikorun bir tam veya parsiyel fonksiyonuna sahiptir. Terim ayrica, indirgeme kosullari altinda F(ab')2'ye muamele etme ile elde edilen bir antikorun bir degisken bölgesi içindeki bir tek-degerlikli fragman olan Fab' molekülünü de içerir. Bununla birlikte, terim, fragman bir antijen için bir baglama afinitesine sahip oldugu sürece bu moleküller ile sinirlandirilmaz. ilaveten, bu fonksiyonel fragmanlar yalnizca, bir antikor proteininin bir tam-boy molekülüne uygun bir enzim ile muamele etme ile elde edilen bir fragmani degil ayni zamanda bir genetik olarak modifiye edilmis antikor geni kullanilarak uygun bir konak hücre içinde üretilen bir proteini de içerir.

Burada kullanildigi sekliyle, "Fab'" terimi, yukarida tarif edildigi üzere indirgeme kosullari altinda F(ab')2'ye muamele etme ile elde edilen bir antikorun bir degisken bölgesi içindeki bir tek-degerlikli fragmani ifade eder. Bununla birlikte, bir genetik olarak modifiye edilmis antikor geni kullanilarak üretilen Fab' da, bulusun Fab' terimine dâhil Burada kullanildigi sekliyle, "epitop" terimi, bunu bir spesifik anti-B7-H3 antikorunun bagladigi B7-H3'ün bir parsiyel peptit veya bir parsiyel tersiyer yapisini ifade eder.

Yukarida-tarif edilen B7-H3'ün bir parsiyel peptidi olan epitop, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinen bir yöntem, örnegin, bir immüno-analiz, ile belirlenebilir ve örnegin, asagidaki yöntem kullanilabilir. Ilk olarak, bir antijenin çesitli parsiyel yapilari üretilir. Parsiyel yapilarin üretilmesinde, bir bilinen oligopeptit sentez teknigi kullanilabilir. Örnegin, C ucundan veya N ucundan BY-Hß'ü sirali bir sekilde kisaltma ile elde edilen uygun sekilde kisaltilmis uzunluklara sahip olan bir dizi polipeptit, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen bir genetik rekombinasyon teknigi kullanilarak üretilir. Bundan sonra, bu polipeptitlere karsi bir antikorun reaktivitesi incelenir ve bir tanima yeri kabaca belirlenir. Akabinde, daha kisa uzunluklara sahip olan peptitler sentezlenir ve antikorun bu peptitler ile reaktivitesi incelenir, böylece epitop belirlenebilir. ilaveten, bunu bir spesifik antikorun bagladigi bir antijenin bir parsiyel tersiyer yapisi olan epitop, antikora bitisik uzanan antijenin amino asit rezidülerini X- isini yapisal analizi ile tanimlama ile belirlenebilir.

Burada kullanildigi sekliyle, "ayni epitopu baglayan antikorlar“ ifadesi, ortak bir epitopu baglayan farkli antikorlari ifade eder. Bir ikinci antikor bunu bir birinci antikorun bagladigi bir parsiyel peptidi veya bir parsiyel tersiyer yapiyi bagladiginda, birinci antikorun ve Ikinci antikorun ayni epitopu bagladigi belirlenebilir. ilaveten, bir ikinci antikorun bir antijeni baglamak için bir birinci antikor ile rekabet ettigini (yani, ikinci antikorun birinci antikor ve antijen arasindaki baglamayi inhibe ettigini) konfirme etme ile, spesifik epitop dizisi veya yapisi belirlenmemis olsa bile, birinci antikorun ve ikinci antikorun ayni epitopu bagladigi belirlenebilir. ilaveten, birinci antikor ve ikinci antikor ayni epitopu bagladiginda ve ayrica birinci antikor bir özel aktiviteye, örnegin, bir anti- tümör aktivitesine, sahip oldugunda, ikinci antikorun da ayni aktiviteye sahip olmasi beklenir. Bu dogrultuda, bir ikinci anti-B7-H3 antikoru, bunu bir birinci anti-B7-H3 antikorunun bagladigi bir parsiyel peptidi bagladiginda, birinci antikorun ve ikinci antikorun B7-H3'ün ayni epitopunu bagladigi belirlenebilir. Ilaveten, bir ikinci anti-B7- H3 antikorunun BY-H3'ü baglamak için bir birinci anti-B7-H3 antikoru ile rekabet ettigini konfirme etme ile, birinci antikorun ve ikinci antikorun B7-H3'ü ayni epitopunu baglayan antikorlar oldugu belirlenebilir.

Burada kullanildigi sekliyle, "CDR" terimi, bir tamamlayicilik belirleme bölgesini (CDR) ifade eder ve bir antikor molekülünün her bir agir ve hafif zincirinin üç tamamlayicilik belirleme bölgesine (CDR'Iere) sahip oldugu bilinir. CDR ayrica. hiper-degisken bölge olarak da adlandirilir ve bir antikorun her bir agir ve hafif zincirinin bir degisken bölgesi içinde bulunur. Bu, bunun primer yapisinda olagan disi bir sekilde yüksek degiskenlige sahip olan bir yerdir ve burada polipeptidin her bir agir ve hafif zincirinin primer yapisinda üç ayri CDR vardir. Bu spesifikasyonda, bir antikorun CDR'Ieri açisindan, agir zincirin CDR'Ierii agir zincirin amino asit dizisinin amino-ucu tarafindan CDRH1, CDRH2 ve CDRH3 ile temsil edilir ve hafif zincirin CDR'Ieri, hafif zincirin amino asit dizisinin amino-ucu tarafindan CDRL1. CDRL2 ve CDRL3 ile temsil edilir. Bu yerler, tersiyer yapida birbirine yakindir ve bunu antikorun bagladigi bir antijen için özgüllügü Burada kullanildigi sekliyle, "hibridizasyon sert kosullar altinda gerçeklesir" ifadesi, burada hibridizasyonun bunun altinda, bir piyasada satilan hibridizasyon çözeltisi ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech, Inc. firmasi tarafindan üretilir) içinde 68°C'de hibridizasyon gerçeklestirme ile veya üzerine immobilize edilmis DNA'ya sahip olan bir filtre kullanilarak 0,7 ile 1,0 M NaCI varliginda 68°C'de hibridizasyon gerçeklestirme, akabinde 0,1 ila 2 x SSC çözeltisi (1 x SSC çözeltisi, 150 mM NaCI'den ve 15 mM sodyum sitrattan olusturulur) kullanilarak 68°C`de yikama gerçeklestirme ile tanimlamanin basarilabildigi kosullar altinda veya buna es-deger kosullar altinda gerçeklestirildigi bir prosesi ifade eder. 1. B7-H3 B7-H3, bir kostimülatör molekül olarak antijen-sunan hücreler üzerinde eksprese edilen B7 familyasinin bir üyesidir ve immün aktiviteyi güçlendirmek veya baskilamak için T hücreleri üzerindeki bir reseptör üzerinde etki ettigi düsünülür.

B7-H3, bir tek-geçisli transmembran yapisina sahip olan bir proteindir ve BY-H3'ün N- ucu ekstraselüler alani iki varyant içerir. B7-H3 varyant 1 (4Ig-B7-H3) sirasiyla iki yerinde bir V-benzeri veya C-benzeri lg alani içerir ve B7-H3 varyant 2 (2Ig-BT-H3) sirasiyla bir yerinde bir V-benzeri veya C-benzeri lg alani içerir.

Bulusun ürünlerini yapmak için kullanilacak olan B7-H3 için oldugu gibi, BT-H3, bir insanin veya bir insan-olmayan memelinin (örnegin, bir siçanin veya birfarenin) B7-H3- eksprese eden hücrelerinden dogrudan saflastirilabilir ve kullanilabilir veya yukarida- tarif edilen hücrelerin bir hücre membrani fraksiyonu hazirlanabilir ve kullanilabilir. ilaveten, BY-H3 bunun in vitro sentezi veya genetik mühendisligi yoluyla bir konak hücre içinde bunun üretilmesi ile elde edilebilir. Bu tarz genetik mühendisliginde, spesifik olarak, B7-H3 cDNA'si B7-H3 cDNA'sini eksprese edebilen bir vektöre entegre edildikten sonra, B7-H3, bunu transkripsiyon veya translasyon için gerekli olan enzimleri, substratlari ve enerji maddelerini içeren bir çözelti içinde sentezleme ile veya B7-H3'ü bir baska prokaryotik veya ökaryotik transforme edilmis konak hücre içinde eksprese etme ile elde edilebilir.

Bir insan B7-H3 varyant 1 geninin bir açik okuma çerçevesinin (ORF) nükleotid dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 5 ile temsil edilir ve bunun amino asit dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 6 ile temsil edilir. ilaveten, SEQ ID NO.'Iari: 5'in ve 6'nin dizileri Sekil 13'te gösterilir.

Bir insan BY-H3 varyant 2 geninin bir ORF'sinin nükleotid dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 9 ile temsil edilir ve bunun amino asit dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 10 ile temsil edilir. ilaveten, SEQ lD NO.'Iari: 9'un ve 10'un dizileri Sekil 14'te gösterilir. ilaveten, burada B7-H3'ün yukarida-tarif edilen amino asit dizilerinin herhangi birinde bir veya bir kaç amino asidin sübstüte edildigi, silindigi ve/veya eklendigi bir amino asit dizisinden olusan ve ayrica proteininkine es-deger olan bir biyolojik aktiviteye de sahip olan bir protein de, B7-H3'e dâhil edilir.

Bundan sinyal dizisinin uzaklastirildigi matür insan B7-H3 varyant 1, SEQ ID NO: 6 ile temsil edilen amino asit dizisinin 27 ila 534 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisine karsilik gelir. ilaveten, bundan sinyal dizisinin uzaklastirildigi matür insan B7-H3 varyant 2'si, SEQ ID NO: 10 ile temsil edilen amino asit dizisinin 27 ila 316 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisine karsilik gelir.

B7-H3 varyant 1'de, ilgili alanlar, N ucundan itibaren lgV1, IgC1, IgV2 ve IgCZ sirasinda bulunur ve Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 6'da, IgV1, 27 ila 139 arasindaki amino asit numaralarina karsilik gelir, IgC1, 140 ila 244 arasindaki amino asit numaralarina karsilik gelir, IgV2, 245 ila 357 arasindaki amino asit numaralarina karsilik gelir ve IgC2, 358 ila 456 arasindaki amino asit numaralarina karsilik gelir. ilaveten, BT-H3 varyant 2'de, ilgili alanlar, N ucundan itibaren IgV1 ve IgCZ sirasinda bulunur ve Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 10'da, IgV1, 27 ila 140 arasindaki amino asit numaralarina karsilik gelir ve !902, 141 ila 243 arasindaki amino asit numaralarina karsilik gelir.

B7-H3 cDNA'si, örnegin, burada bir sablon olarak B7-H3 cDNA'sini eksprese eden bir cDNA kütüphanesi ve B7-H3 cDNA'sini spesifik olarak çogaltan primerler kullanilarak bir polimeraz zincir reaksiyonunun (bundan SOnra "PCR" olarak ifade edilir) gerçeklestirildigi bir PCR denilen yöntem, ile elde edilebilir (Saiki, R. K. et al., Science, nükleotid dizisine komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir polinükleotide sert kosullar altinda hibridize olan ve B7-H3'ünkine es-deger olan bir biyolojik aktiviteye sahip olan bir proteini sifreleyen bir polinükleotid de, B7-H3 cDNA'sina dâhil edilir. ilaveten, insan veya fare B7-H3 Iokusundan transkribe edilen bir uç-birlestirme varyanti olan bir polinükleotid veya buna komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir polinükleotide sert kosullar altinda hibridize olan ve B'I-H3'ünkine es-deger olan bir biyolojik aktiviteye sahip olan bir proteini sifreleyen bir polinükleotid de BY-H3 cDNA'sina dâhil edilir. ilaveten, burada Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 6 veya 10 ile temsil edilen amino asit dizisinde bir veya bir kaç amino asidin sübstüte edildigi, silindigi veya eklendigi bir amino asit dizisinden veya bu dizilerin her birinden sinyal dizisini uzaklastirma ile elde edilen bir amino asit dizisinden olusan ve B7-H3'ünkine es-deger olan bir biyolojik aktiviteye sahip olan bir protein de, B7-H3'e dâhil edilir. ilaveten, fare veya insan B7-H3 asit dizisinden veya burada yukaridaki amino asit dizisinde bir veya bir kaç amino asidin sübstüte edildigi, silindigi veya eklendigi bir amino asit dizisinden olusan ve B7- H3'ünkine es-deger olan bir biyolojik aktiviteye sahip olan bir protein de, B7-H3'e dâhil 2. Anti-B7-H3 antikorunun üretilmesi Burada tarif edildigi üzere B7-H3'e karsi bulusun antikoru, bir hayvani B7-H3 veya B7- H3'ün amino asit dizisinden seçilen bir gelisigüzel polipeptit ile immünize etme ve yaygin prosedürlere göre in vivo üretilen antikoru toplama ve saflastirma ile elde edilebilir. Bir antijen olarak kullanilacak olan B7-H3'ün biyolojik türü, insanoglu ile sinirlandirilmaz ve bir hayvan. insanlar disindaki bir hayvandan. örnegin, bir fareden veya bir siçandan, türetilen B7-H3 ile immünize edilebilir. Bu durumda, elde edilen heterolog B7-H3'ü ve insan BT-Hß'ünü bir antikor baglamasi arasindaki çapraz- reaktiviteyi inceleme ile, bir insan hastaligi için uygulanabilir olan bir antikor seçilebilir. ilaveten, bir monoklonal antikor, B7-H3'e karsi bir antikor üreten antikor-üreten hücreleri bilinen yöntemlere göre miyelom hücreler ile kaynastirma ile olusturulan bir Bu arada, bir antijen olarak kullanilacak olan B7-H3 genetik mühendisligi kullanilarak bir konak hücre içinde B7-H3 genini eksprese etme ile elde edilebilir.

Spesifik olarak, B7-H3 genini eksprese edebilen bir vektör üretilir ve elde edilen vektör geni eksprese etmesi için bir konak hücre içine transfekte edilir ve akabinde eksprese edilen B7-H3 saflastirilir. Bundan sonra, B7-H3'e karsi bir antikor elde etmenin bir yöntemi spesifik olarak tarif edilecektir. (1) Antijenin preparasyonu Anti-B7-H3 antikoru üretmek için kullanilacak olan antijenin örnekleri, B7-H3'ü, B7- H3'ün ardisik en az 6 amino asidini içeren bir parsiyel amino asit dizisinden olusan bir polipeptidi ve buna verilen bir amino asit dizisini veya tasiyiciyi ekleme ile elde edilen bir türevi içerir.

B7-H3, insan tümör dokularindan veya tümör hücrelerinden dogrudan saflastirilabilir ve kullanilabilir. ilaveten, B7-H3 bunu in vitro sentezleme ile veya bunu genetik mühendisligi ile bir konak hücre içinde üretme ile elde edilebilir.

Bu tarz genetik mühendisligi açisindan, spesifik olarak, B7-H3 cDNA'si B7-H3 cDNA'sini eksprese edebilen bir vektör içine entegre edildikten sonra, B7-H3, bunu transkripsiyon ve translasyon için gerekli olan enzimleri. substratlari ve enerji maddelerin içeren bir çözelti içinde sentezleme ile veya B7-H3'ü bir baska prokaryotik veya ökaryotik transforme edilmis konak hücre içinde eksprese etme ile elde edilebilir. ilaveten, antijen ayrica, bir membran proteini olan B7-H3'ün ekstraselüler alanini uygun bir konak-vektör sisteminde bir antikorun sabit bölgesine baglama ile elde edilen bir füzyon proteinini eksprese etme ile bir sekretuvar protein olarak da elde edilebilir.

B7-H3 cDNA'si, örnegin, bir sablon olarak B7-H3 cDNA'sini eksprese eden bir cDNA kütüphanesi ve B7-H3 cDNA'sini spesifik olarak çogaltan primerler kullanilarak bir polimeraz zincir reaksiyonunun (bundan sonra "PCR" olarak ifade edilir) gerçeklestirildigi bir PCR denilen yöntem, ile elde edilebilir(bakiniz, Saiki, R. K. et al., Polipeptidin in vitro sentezi için sistem olarak, örnegin, Roche Diagnostics, Inc. firmasi tarafindan üretilen Rapid Translation System (RTS), örnek olarak gösterilebilir, ancak bununla sinirlandirilmaz.

Prokaryotik konak hücrelerin örnekleri, Escherichia co/i'yi ve Baci'llus subtili's'i içerir.

Konak hücreleri bir hedef gen ile transforme etmek için, konak hücreler, bir replikon, yani, konak ile uyumlu olan bir türden türetilen bir replikasyon orijini ve bir regülatör dizi, içeren bir plazmid vektörü ile transforme edilir. Ilaveten, vektör tercihen, transforme edilmis hücreye fenotipik selektivite verebilen bir diziye sahiptir. Ökaryotik konak hücrelerin örnekleri, omurgali hücrelerini, böcek hücrelerini ve maya hücrelerini içerir. Omurgali hücreler olarak, örnegin, simian COS hücreleri (Gluzman, Y., Cell, (, mürin fibroblastlari NIH3T3 (ATCC No: CRL-1658) ve Çin hamsteri ovaryan hücrelerinin (CHO hücrelerinin; ATCC: CCL- 61) dihidrofolat redüktaz-kusurlu suslari (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. birlikte, hücreler bunlarla sinirlandirilmaz.

Bu sekilde elde edilen transformant, yaygin prosedürlere göre kültürlenebilir ve transformanti kültürleme ile, bir hedef polipeptit intraselüler veya ekstraselüler olarak üretilir.

Kültürleme için kullanilacak olan uygun bir vasat, kullanilan konak hücrelere bagli olarak yaygin bir sekilde kullanilan çesitli kültür vasatlarindan seçilebilir. Escherichia coli kullanildiginda, örnegin, gerektiginde bir antibiyotik, örnegin, amfilisin veya IPMG ile takviye edilmis bir LB vasati kullanilabilir.

Bu tarz kültürleme yoluyla transformant tarafindan intraselüler veya ekstraselüler olarak üretilen bir rekombinant protein, proteinin fiziksel veya kimyasal özelliklerinden yararlanilan bilinen çesitli ayirma yöntemlerinin herhangi biri ile ayrilabilir ve saflastirilabilir.

Yöntemlerin spesifik örnekleri, yaygin bir protein çökelticisi ile muameleyi, ultrafiltrasyonu, sivi kromatografinin çesitli tiplerini, örnegin, moleküler elek kromatografisini (jel filtrasyonunu), emilim kromatografisini, iyon degisim kromatografisini ve afinite kromatografisini, diyalizi ve bunlarin bir kombinasyonunu ilaveten, alti histidinli rezidülerin bir etiketini eksprese edilecek olan bir rekombinant proteine tutturma ile, protein bir nikel afinite kolonu ile verimli bir sekilde saflastirilabilir.

Alternatif olarak, lgG Fc bölgesini eksprese edilecek olan bir rekombinant proteine tutturma ile, protein bir protein A kolonu ile verimli bir sekilde saflastirilabilir.

Yukarida-tarif edilen yöntemleri birlestirme ile, çok miktardaki bir hedef polipeptit yüksek verimde ve yüksek saflikta kolaylikla üretilebilir. (2) Anti-B7-H3 monoklonal antikorunun üretilmesi B7-H3'ü spesifik olarak baglayan antikorun örnekleri, B7-H3'ü spesifik olarak baglayan bir monoklonal antikoru içerir ve bu tarz bir antikoru elde etmenin bir yöntemi asagida tarif edilir.

Bir monoklonal antikorun üretilmesi genel olarak, asagidaki operasyonel adimlari gerektirir: (a) bir antijen olarak kullanilacak olan bir biyopolimeri saflastirma; (b) bir hayvani antijenin enjeksiyonu ile immünize etme ile antikor-üreten hücreler hazirlama, kan alma, dalagin kesip çikarildigini belirlemek için bunun antikor titresini analiz etme; (c) miyelom hücreleri (bundan sonra "miyelom" olarak ifade edilir) hazirlama; (d) antikor-üreten hücreleri miyelom ile kaynastirma; (e) bir arzu edilen antikoru üreten hibridomlarin bir grubunu tarama; (f) hibridomlari tek hücre klonlarina bölme (klonlama): (g) opsiyonel olarak, bir monoklonal antikorun büyük bir miktarini üretmek için hibridomu kültürleme veya hibridOm ile implante edilmis bir hayvani yetistirme; (h) bu sekilde üretilen monoklonal antikoru biyolojik aktivite ve baglama özgüllügü için inceleme veya antikorun özelliklerini bir etiketlenmis antikor reaktifi olarak inceleme ve benzerleri.

Bundan sonra, bir monoklonal antikoru üretmenin yöntemi yukaridaki adimlari takip ederek detayli bir sekilde tarif edilecektir, bununla birlikte, yöntem bununla sinirlandirilmaz ve örnegin, dalak hücrelerinden ve miyelom hücrelerinden baska antikor-üreten hücreler kullanilabilir. (a) Antijenin saflastirilmasi Antijen olarak, yukarida tarif edildigi sekilde yöntem ile hazirlanan B7-H3 veya bunlarin bir parsiyel peptidi kullanilabilir. ilaveten, B7-H3'ü eksprese eden rekombinant hücrelerden hazirlanan bir membran fraksiyonu veya B7-H3'ü eksprese eden rekombinant hücrelerin kendisi ve ayrica burada tarif edildigi üzere proteinin teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen bir yöntem ile kimyasal olarak sentezlenmis bir parsiyel peptidi de antijen olarak kullanilabilir. (b) Antikor-üreten hücrelerin preparasyonu Adim (a)'da elde edilen antijen bir adjuvan, örnegin, Freund komplet veya inkomplet adjuvani veya alüminyum potasyum sülfat, ile karistirilir ve elde edilen karisim bir deneysel hayvani immünize etmek için bir immünojen olarak kullanilir. Deneysel hayvan olarak, bilinen bir hibridom üretim yönteminde kullanilan herhangi bir hayvan herhangi bir sorun olmadan kullanilabilir. Spesifik olarak, örnegin, bir fare, bir siçan, bir keçi, koyun, sigir, bir at veya benzerleri kullanilabilir. Bununla birlikte, ekstrakte edilmis antikor-üreten hücreler ile kaynastirilacak olan miyelom hücrelerin kolay erisilebilirligi bakis açisiyla, bir fare veya bir siçan tercihen immünize edilecek olan hayvan olarak kullanilir. ilaveten, kullanilan olan farenin veya siçanin susu özel olarak sinirlandirilmaz ve bir fare durumunda, örnegin, çesitli suslar, örnegin, A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, CSH, SYBL, CS7BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB ve 129 ve benzerleri kullanilabilir ve bir siçan durumunda, örnegin, Wistar, Low, Lewis, Sprague Dawley, ACI, BN, Fischer ve benzerleri kullanilabilir.

Bu fareler ve siçanlar deneysel hayvan besIeyicileri/distribütörleri, örnegin, CLEA Japan, Inc. ve Charles River Laboratories Japan, Inc. firmalari, tarafindan piyasada satilir.

Bunlar arasinda, asagida tarif edilen miyelom hücreleri ile kaynastirmanin uygunlugu dikkate alindiginda, bir fare durumunda, BALB/c susu ve bir siçan durumunda, Wistar ve Low suslari immünize edilecek olan hayvan olarak özellikle tercih edilir.

Ilaveten, insanlar ve fareler arasindaki antijenik homoloji dikkate alindiginda, otoantikorlari uzaklastirmak için azaltilmis biyolojik fonksiyona sahip olan bir fare, yani, bir otoimmün hastaligi olan bir fare, kullanmak ayrica tercih edilir. immünizasyon zamaninda bu tarz farenin veya siçanin yasi tercihen, 5 ila 12 haftadir, daha tercihen 6 ila 8 haftadir.

Bir hayvani BT-H3 ile veya bunun bir rekombinanti ile immünize etmek için, örnegin, mesela, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. ve Mayer, M. M., Experimental lmmunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) ve benzeri kaynaklarda, detayli bir sekilde tarif edilen bilinen bir yöntem kullanilabilir.

Bu immünizasyon yöntemleri arasinda, burada tarif edildigi üzere bir tercih edilen spesifik yöntem, örnegin, asagidaki sekildedir.

Söyle ki, ilk olarak, antijen görevi gören bir membran proteini fraksiyonu veya antijeni eksprese etmeye neden olan hücreler bir hayvana intradermal veya intraperitoneal olarak uygulanir.

Bununla birlikte, uygulamanin her iki yolunun kombinasyonu, immünizasyon etkililigini arttirmak için tercih edilir ve intradermal uygulama ilk yarida gerçeklestirildiginde ve intraperitoneal uygulama ikinci yarida veya yalnizca son dozlamda gerçeklestirildiginde, immünizasyon etkililigi özel olarak arttirilabilir.

Antijenin uygulama planlamasi, immünize edilecek olan hayvanin tipine, münferit farkliliklara veya benzerlerine bagli olarak çesitlilik gösterir. Bununla birlikte, genel olarak, burada antijenin 3 ila 6 kere uygulandigi ve dozlam araliginin 2 ila 6 hafta oldugu bir uygulama planlamasi tercih edilir ve burada antijenin 3 ila 4 kere uygulandigi ve dozlam araliginin 2 ila 4 hafta oldugu bir uygulama planlamasi daha çok tercih edilir. ilaveten, antijenin dozu, hayvanin tipine, münferit farkliliklara veya benzerlerine bagli olarak çesitlilik gösterir, bununla birlikte, doz genel olarak, 0,05 ile 5 mg'a, tercihen yaklasik 0,1 ile 0,5 mg'a ayarlanir.

Bir destekleyici immünizasyon, yukarida tarif edildigi üzere antijenin uygulanmasindan 1 ila 6 hafta, tercihen 2 ila 4 hafta, daha tercihen 2 ila 3 hafta sonra gerçeklestirilir.

Destekleyici immünizasyonu gerçeklestirme zamaninda antijenin dozu, hayvanin tipine veya boyutuna veya benzerlerine bagli olarak çesitlilik gösterir, bununla birlikte, örnegin, bir fare durumunda doz genel olarak 0,05 ile 5 mg'a, tercihen 0,1 ila 0,5 mg'a, daha tercihen yaklasik 0,1 ile 0,2 mg'a ayarlanir.

Dalak hücreleri ve antikor-üreten hücreleri içeren Ienfositler, destekleyici immünizasyonan 1 ila 10 gün, tercihen 2 ila 5 gün, daha tercihen 2 ila 3 gün sonra immünize edilmis hayvandan aseptik olarak uzaklastirilir. Bu sirada, antikor titresi ölçülür ve bir yeterli bir sekilde arttirilmis antikor titresine sahip olan bir hayvan antikor- üreten hücrelerin bir tedarik kaynagi olarak kullanildiginda, müteakip prosedür daha verimli bir sekilde yürütülebilir.

Burada kullanilacak olan antikor titresini ölçme yönteminin örnekleri, bir RIA yöntemini ve bir ELISA yöntemini içerir, ancak yöntem bunlarla sinirlandirilmaz. Örnegin, bir ELISA yöntemi kullanildiginda, burada tarif edildigi üzere antikor titresinin ölçümü asagida tarif edildigi sekilde prosedürlere göre yürütülebilir.

Ilk olarak, bir saflastirilmis veya parsiyel olarak saflastirilmis antijen bir kati fazin yüzeyine, örnegin, ELISA için bir 96-kuyucuklu plakaya, adsorbe edilir ve buna adsorbe edilmis antijene sahip Olmayan kati fazin yüzeyi antijen ile ilgili olmayan bir protein, örnegin, bovin serum albümini (bundan sonra "BSA" olarak ifade edilir), ile kaplanir.

Yüzey yikandiktan sonra, yüzey, örnek içindeki antikorun antijeni baglamasina olanak saglamak için bir primer antikor olarak bir seri olarak seyreltilmis örnek (örnegin, fare serumu) ile temas ettirilir. ilaveten, bir sekonder antikor olarak, bir fare antikoruna karsi bir enzim ile etiketlenmis bir antikor eklenir ve bunun fare antikorunu baglamasina izin verilir. Yikamadan sonra, enzim için bir substrat eklenir ve absorbansta sübstratin parçalanmasi veya benzeri ile indüklenen renk gelisiminden dolayi gerçeklesen bir degisim ölçülür ve antikor titresi ölçüme göre hesaplanir.

Antikor-üreten hücrelerin immünize edilmis hayvanin dalak hücrelerinden veya hücreleri durumunda, burada antikor-üreten hücrelerin, bir paslanmaz çelik elek ile filtrasyon yoluyla hücreleri elde etmek için dalagi homojenize etme ve hücreleri Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) içinde süspanse etme ile ayrildigi bir genel yöntem kullanilabilir. (c) Miyelom hücrelerinin (bundan sonra "miyelom" olarak adlandirilir) preparasyonu Hücre füzyonu için kullanilacak olan miyelom hücreleri özel olarak sinirlandirilmaz ve uygun hücreler bilinen hücre hatlarindan seçilebilir. Bununla birlikte, bir hibridom kaynastirilmis hücrelerden seçilirken kolaylik hesaba katildiginda, seleksiyon prosedürü belirlenmis olan bir HGPRT (hipoksantin-guanin fosforibosil transferaz) kusurlu sus kullanmak tercih edilir.

Daha spesifik olarak, bu tarz bir HGPRT-kusurlu susun örnekleri, farelerden türetilmis siçanlardan türetilmis 'ü ve insanlardan türetilmis ve 'i içerir. Bu HGPRT-kusurlu suslar, örnegin, American Type Culture Collection'da (ATCC) (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'nda) veya benzerlerinde, mevcuttur.

Bu hücre suslari, uygun bir vasat, örnegin, bir 8-azaguanin vasati [glutamin, 2- merkaptoetanol, gentamisin ve fetal bovin serumu ile takviye edilen bir RPMI 1640 vasatina 8-azaguanin ekleme ile elde edilen bir vasat (bundan sonra "FBS" olarak ifade edilir)], Iscove's Modified Dulbecco Medium (bundan sonra "IMDM" olarak ifade edilir) veya Dulbecco's Modified Eagle Medium (bundan sonra "DMEM" olarak ifade edilir) içinde alt-kültürlenir. Bu durumda, hücre füzyonunu gerçeklestirmeden 3 ila 4 gün önce, hücreler, hücre füzyonu gününde en az 2 x 107 hücreyi garanti etmek için bir normal vasat [örnegin, %10 FBS Içeren bir ASF104 vasati (Ajinomoto Co., Ltd. tarafindan üretilmistir)] içinde alt-kültürlenir. (d) Hücre füzyonu Antikor-üreten hücreler ve miyelom hücreleri arasindaki füzyon, hücrelerin sag kalim oraninin asiri bir sekilde düsürülmedigi kosullar altinda bilinen bir yönteme göre (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. l. ll. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. ve Mayer, M. M., Experimental bir sekilde gerçeklestirilebilir.

Bu tarz bir yöntem olarak, örnegin, burada antikor-üreten hücrelerin ve miyelom hücrelerinin yüksek bir konsantrasyonda bir polimer, örnegin, polietilen glikol, içeren bir çözelti içinde karistirildigi bir kimyasal yöntem, elektrik stimülasyonu kullanilan bir fiziksel yöntem veya benzerleri kullanilabilir. Bu yöntemler arasinda, kimyasal yöntemin spesifik bir örnegi, asagida tarif edilir.

Söyle ki, yüksek bir konsantrasyonda bir polimer içeren çözelti içinde polietilen glikolün kullanildigi durumda, antikor-üreten hücreler ve miyelom hücreleri 1500 ila 6000, daha tercihen 2000 ila 4000, araliginda bir moleküler agirliga sahip olan bir polietilen glikol dakika, tercihen 5 ila 8 dakika, boyunca karistirilir. (e) Hibridomlarin bir grubunun seçilmesi Yukarida-tarif edilen hücre füzyonu ile elde edilen hibridomlari seçme yöntemi özel olarak sinirlandirilmaz. Genel olarak, bir HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin) Bu yöntem, hibridomlar aminopterin varliginda sag kalamayan bir HGPRT-kusurlu susun miyelom hücreleri kullanilarak elde edildiginde etkilidir.

Söyle ki, kaynasmamis hücreleri ve hibridomlari bir HAT vasati Içinde kültürleme ile yalnizca, aminopterine dirençli olan hibridomlarin selektif bir sekilde sag kalmasina ve çogalmasina izin verilir. (f) Tek hücre klonuna bölme (klonlama) Hibridomlar için bir klonlama yöntemi olarak, bilinen bir yöntem, örnegin, bir metilselüloz yöntemi, bir yumusak agaroz yöntemi veya bir sinirlayici seyreltme yöntemi, kullanilabilir (bakiniz, örnegin, Barbara, B. M. ve Stanley, M. 8.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Bu yöntemler arasinda, özel olarak, bir üç-boyutlu kültür yöntemi, örnegin, bir metilselüloz, tercih edilir. Örnegin, hücre füzyonu ile üretilen hibridomlarin grubu, bir metilselüloz vasati, örnegin, CIonaCeIl-HY Selection Medium D (StemCeII Technologies, inc., tarafindan üretilir, #03804), içinde süspanse edilir ve kültürlenir.

Akabinde, olusan hibridom kolonileri toplanir, böylece monoklonal hibridomlar elde edilebilir. Toplanan ilgili hibridom kolonileri kültürlenir ve elde edilen bir hibridom kültürü süpernatanti içinde bir kararli antikor titresine sahip oldugu konfirme edilmis olan bir hibridom bir BY-H3 monoklonal antikoru-üreten hibridom susu olarak seçilir.

Bu sekilde olusturulan hibridom susunun örnekleri, B7-H3 hibridomu M30'u içerir. Bu arada, bu spesifikasyonda, B7-H3 hibridomuM30 tarafindan üretilen bir antikor, "M30 antikoru" veya basit bir sekilde "M30" olarak ifade edilir.

M30 antikorunun agir zinciri, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 51 ile temsil edilen bir amino asit dizisine sahiptir. ilaveten, M30 antikorunun hafif zinciri, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 53 ile temsil edilen bir amino asit dizisine sahiptir. Bu arada, Dizi Listesi'nde SEQ asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sinyal dizisidir, 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir degisken bölgedir ve 142 ila 471 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sabit bölgedir. ilaveten, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 53 ile temsil edilen hafif zincir amino asit dizisinde, 1 ila 22 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sinyal dizisidir, 23 ila 130 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir degisken bölgedir ve 131 ila 235 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sabit bölgedir.

Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 51 ile temsil edilen agir zincir amino asit dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 50 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi tarafindan sifrelenir. Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 50 ile temsil edilen nükleotid dizisinde, 1 ila 57 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir sinyal dizisini sifreler, 58 ila 423 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir degisken bölgesini sifreler ve 424 ila 1413 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir sabit bölgesini sifreler.

Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 53 ile temsil edilen hafif zincir amino asit dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 52 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi tarafindan sifrelenir. Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 52 ile temsil edilen nükleotid dizisinde, 1 ila 66 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir sinyal dizisini sifreler, 67 ila 390 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir degisken bölgesini sifreler ve 391 ila 705 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir sabit bölgesini sifreler. (g) Hibridomu kültürleme ile monoklonal antikorun preparasyonu Bu sekilde seçilen hibridomu kültürleme ile, bir monoklonal antikor verimli bir sekilde elde edilebilir. Bununla birlikte, kültürlemeden önce, bir hedef monoklonal antikoru üreten bir hibridomun taramasini gerçeklestirmek tercih edilir.

Bu tarz taramada, bilinen bir yöntem kullanilabilir.

Burada tarif edildigi üzere antikorun ölçümü, örnegin, yukarida tarif edilen madde (b)'de açiklanan bir ELISA yöntemi, ile yürütülebilir.

Yukarida tarif edilen yöntem ile elde edilen hibridom, sivi nitrojen içinde bir dondurulmus hâlde veya -80°C'de veya altinda bir dondurucuda saklanabilir.

Klonlamanin tamamlanmasindan sonra, vasat bir HAT vasatindan bir normal vasata degistirilir ve hibridom kültürlenir.

Büyük-ölçekli kültür, bir büyük kültür sisesi kullanilarak rotasyon kültürü ile veya döndürücü (spinner) kültür ile gerçeklestirilir. Büyük-ölçekli kültür ile elde edilen süpernatanttan, burada tarif edildigi üzere proteini spesifik olarak baglayan bir monoklonal antikor, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen yöntemler, örnegin, jel filtrasyonu, kullanilarak saflastirma ile elde edilebilir. ilaveten, hibridom, hibridom olarak ayni sustaki bir farenin (örnegin, yukarida-tarif edilen BALB/c'nin) abdominal kavitesine veya hibridomu çogaltmak için bir Nu/Nu faresine enjekte edilir, böylece bulusun monoklonal antikorunu büyük bir miktarda içeren assitler elde edilebilir.

Hibridomun abdominal kaviteye uygulandigi durumlarda, bir mineral yagi, örnegin, 2,6,10,14-tetrametil pentadekan (pristan) bundan 3 ila 7 gün önce uygulandiginda, assitlerin daha büyük miktarlari elde edilebilir. Örnegin, bir immunosüpresan T hücrelerini inaktive etmek için hibridom olarak ayni sustan bir farenin abdominal kavitesine önceden enjekte edilmistir. Bundan 20 gün sonra, 106 ila 107 hibridom klon hücresi bir serumsuz vasat (0,5 ml) içinde süspanse edilir ve süspansiyon farenin abdominal kavitesine uygulanir. Genel olarak, abdomen genisletilir ve assitler ile doldurulur, assitler fareden toplanir. Bu yöntem ile, monoklonal antikor kültür çözeltisi içindekine kiyasla yaklasik 100 kat veya daha yüksek olan bir konsantrasyonda elde edilebilir.

Yukarida-tarif edilen yöntem ile elde edilen monoklonal antikor, örnegin, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978), kaynaginda tarif edilen bir yöntem ile saflastirilabilir.

Bu sekilde elde edilen monoklonal antikor, B7-H3 için yüksek antijen özgüllügüne sahiptir. (h) Monoklonal antikorun analizi Bu sekilde elde edilen monoklonal antikorun izotipi veya alt-sinifi asagida oldugu sekilde belirlenebilir.

Ilk olarak, tanimlama yönteminin örnekleri, bir Ouchterlony yöntemini, bir ELISA yöntemini ve bir RIA yöntemini içerir.

Bir Ouchterlony yöntemi basittir, ancak monoklonal antikorun konsantrasyonu düsük oldugunda, bir kondensasyon operasyonu gereklidir.

Diger taraftan, bir ELISA yöntemi veya bir RIA yöntemi kullanildiginda, kültür süpernatantini bir antijen-adsorbe edilmis kati faz ile dogrudan reaksiyona sokma ve sekonder antikorlar olarak immünoglobülin izotiplerinin ve alt-siniflarinin çesitli tiplerine karsilik gelen antikorlari kullanma ile, monoklonal antikorun izotipi ve alt-sinifi tanimlanabilir.

Buna ek olarak, daha basit bir yöntem olarak, piyasada satilan bir tanimlama kiti (örnegin, Bio-Rad Laboratories, Inc. firmasi tarafindan üretilen Mouse Typer Kit) veya benzerleri de kullanilabilir. ilaveten, bir proteinin kantitatif belirlenmesi, Folin Lowry yöntemi veya 280 nm'de absorbansa dayanan bir hesaplama yöntemi [ = immünoglobülin 1 mg/ml] ile gerçeklestirilebilir. ilaveten, monoklonal antikor (2)'deki (a) ila (h) arasindaki adimlari tekrar gerçeklestirme ile ayri ve bagimsiz bir sekilde elde edildiginde bile, M30 antikorununkine es-deger olan bir sitotoksik aktiviteye sahip olan bir antikor elde etmek mümkündür. Bu tarz bir antikorun bir örnegi olarak, M30 antikoru ile ayni epitopu baglayan bir antikor örnek olarak gösterilebilir. M30, IgC1 veya IgC2 alani içindeki bir epitopu tanir, bu B7-H3 ekstraselüler alani içindeki bir alandir ve lgCt alanini veya özellikle, B7-H3'ün [901 veya IgCZ alaninda bulunan bir epitop örnek olarak gösterilebilir. Bir yeni üretilmis monoklonal antikor, M30 antikorunun bagladigi bir parsiyel peptit yapisini veya bir parsiyel tersiyer yapiyi bagladiginda, monoklonal antikorun M30 antikoru ile ayni epitopu bagladigi belirlenebilir. ilaveten, monoklonal antikorun B7-H3'ü baglamak için M30 antikoru ile rekabet ettigini (yani, monoklonal antikorun M30 antikoru ve B7-H3 arasindaki baglamayi inhibe ettigini) konfirme etme ile, spesifik epitop dizisi veya yapisi belirlenmemis olsa bile, monoklonal antikorun M30 antikoru ile ayni epitopu bagladigi belirlenebilir. Monoklonal antikorun M30 antikoru ile ayni epitopu bagladigi konfirme edildiginde, monoklonal antikorun M30 antikorununkine es-deger olan bir sitotoksik aktiviteye sahip olmasi güçlü bir sekilde beklenir. (3) Diger antikorlar Bulusun antikoru, B7-H3'e karsi yalnizca yukarida-tarif edilen monoklonal antikorlari degil ayni zamanda insanlara heterolog antijenisiteyi azaltma amaciyla yapay modifikasyon ile elde edilen bir rekombinant antikoru, Örnegin, bir kimerik antikoru, bir beserilestirilmis antikoru ve bir insan antikorunu, da içerir. Bu antikorlar, bilinen yöntemler kullanilarak üretilebilir.

Bu tarz bir kimerik antikor olarak, burada antikor degisken ve sabit bölgelerinin farkli türlerden türetildigi bir antikor, örnegin, burada bir fare- veya siçan-kaynakli antikor degisken bölgesinin bir insan-kaynakli sabit bölgeye baglandigi bir kimerik antikor, Bir fare anti-insan B7-H3 antikoru M30'dan türetilen bir kimerik antikor, SEQ ID NO: 51'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisinin bir agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 53'ün 23 ila 130 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisinin bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikordur ve bir gelisigüzel insan-kaynakli sabit bölgeye sahip olabilir. Bu tarz bir kimerik antikorun bir örnegi olarak, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 63'ün 1 ila 471 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisinin bir agir zincirinden ve Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 59'un 1 ila 233 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisinin bir hafif zincirinden olusan bir antikor örnek olarak gösterilebilir. Bu sirada, Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 63 ile temsil edilen agir zincir dizisinde, 1 ila 19 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sinyal dizisidir, 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir degisken bölgedir ve 142 ila 471 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sabit bölgedir. ilaveten, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen hafif zincir amino asit dizisinde, 1 ila 20 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sinyal dizisidir, 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir degisken bölgedir ve 129 ila 233 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sabit bölgedir.

Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen agir zincir amino asit dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 62 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi tarafindan sifrelenir. Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 62 ile temsil edilen nükleotid dizisinde, 1 ila 57 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir sinyal dizisini sifreler, 58 ila 423 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir degisken bölgesini sifreler ve 424 ila 1413 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir sabit bölgesini sifreler.

Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen hafif zincir amino asit dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 58 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi tarafindan sifrelenir. Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 58 ile temsil edilen nükleotid dizisinde, 1 ila 60 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir sinyal dizisini sifreler, 61 ila 384 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir degisken bölgesini sifreler ve 385 ila 699 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir sabit bölgesini sifreler.

Bu tarz bir beserilestirilmis antikor olarak, bir insan-kaynakli antikora yalnizca bir tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) entegre etme ile elde edilen bir antikor (bakiniz, ayni zamanda CDR dizisini bir CDR-greftleme yöntemi ile bir insan antikoruna grefte etme ile elde edilen bir antikor (WO 90/07861) örnek olarak verilebilir.

Bununla birlikte, M30 antikorundan türetilen beserilestirilmis antikor, beserilestirilmis antikor M30 antikorunun CDR dizilerinin 6 tipinin tümüne sahip oldugu ve bir anti-tümör aktivitesine sahip oldugu sürece bir spesifik beserilestirilmis antikor ile sinirlandirilmaz.

Bu arada, M30 antikorunun agir zincir degisken bölgesi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 92 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRH1'e (NYVMH), Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 93 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRH2'ye (YINPYNDDVKYNEKFKG) ve Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 94 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRH3'e (WGYYGSPLYYFDY) sahiptir. Ilaveten, M30 antikorunun hafif zincir degisken bölgesi, Dizi Listesi'nde SEQ lD NO: 95 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRL1'e (RASSRLIYMH), Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 96 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRL2'ye (ATSNLAS) ve Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 97 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRLS'e (QQWNSNPPT) sahiptir.

Fare antikoru M30'un beserilestirilmis antikorunun bir örnegi olarak, (1) Dizi Listesi'nde rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinin, (2) yukarida tarif edilen amino asit dizisi (1) ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip bir amino asit dizisinin ve (3) burada yukarida tarif edilen amino asit dizisinde (1) bir veya bir kaç amino asidisin silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir amino asit dizisinin herhangi birinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirin ve (4) Dizi Listesi'nde SEQ asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinin, (5) yukarida tarif edilen amino asit dizisi (4) ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip bir amino asit dizisinin ve (6) burada yukarida tarif edilen amino asit dizisinde (4) bir veya bir kaç amino asidisin silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir amino asit dizisinin herhangi birinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirin bir gelisigüzel kombinasyonu örnek olarak gösterilebilir.

Bu arada, burada kullanildigi sekliyle "bir kaç" terimi, 1 ila 10'u, 1 ila 9'u, 1 ila 8'i, 1 ila Bu spesifikasyonda amino asit sübstitüsyonu olarak, bir konservatif amino asit sübstitüsyonu tercih edilir. Konservatif amino asit sübstitüsyonu, amino asit yan zincirleri ile ilgili olan bir amino asitler grubu içinde gerçeklesen bir sübstitüsyonu ifade eder. Tercih edilen amino asit gruplari asagidaki sekildedir: bir asidik grup (aspartik asit ve glutamik asit); bir bazik grup (Iizin, arjinin ve histidin); bir polar-olmayan grup (alanin, valin, Iösin, izolösin, prolin, fenilalanin, metiyonin ve triptofan) ve bir yüksüz polar familya (glisin, asparajin, glutamin, sistein, serin, treonin ve tirozin). Daha çok tercih edilen amino asit gruplari asagidaki sekildedir: bir alifatik hidroksi grubu (serin ve treonin); bir amid-içeren grup (asparajin ve glutamin): bir alifatik grup (alanin, valin, asit sübstitüsyonu tercihen, orijinal amino asit dizisine sahip olan bir maddenin özelliklerini bozmayan bir grup içinde gerçeklestirilir.

Yukarida tarif edilen bir agir zincirin ve bir hafif zincirin tercih edilen bir kombinasyonuna sahip olan bir antikor olarak, SEQ ID NO: 85'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'in 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 73'ün 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 75'in 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 77'nin 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 79'un 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 81'in 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 83'ün 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 91'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'in 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 91'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 73'ün 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 91'in 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 75'in 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor ve SEO ID NO: 91'in ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 77'nin 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor örnek olarak gösterilebilir.

Yukarida tarif edilen bir agir zincirin ve bir hafif zincirin daha çok tercih edilen bir kombinasyonuna sahip olan bir antikor olarak, SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 73'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 75'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: 77'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: 79'da 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 81'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 83'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEQ ID NO: 73'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: 75'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir antikor ve SEO ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincirden ve SEO ID NO: ?7'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir gösterilebilir.

Dahasi, yukarida tarif edilen bir agir zincirin ve bir hafif zincirin tercih edilen bir kombinasyonuna sahip olan bir antikor olarak, SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'in bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 73'ün bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 75'in bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 77'nin bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 79'un bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 81'in bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 85'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 83`ün bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEO lD NO: 91'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 71'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 73'ün bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 91'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID NO: 75'in bir amino asit dizisini içeren bir hafif zincirden olusan bir antikor ve SEO ID NO: 91'in bir amino asit dizisini içeren bir agir zincirden ve SEO ID olarak gösterilebilir.

Yukarida-tarif edilen agir zincir amino asit dizisi ile yüksek bir homolojiye sahip olan bir diziyi yukarida-tarif edilen hafif zincir amino asit dizisi ile yüksek bir homolojiye sahip olan bir dizi ile birlestirme ile, yukarida-tarif edilen antikorlarin her birininkine es-deger olan bir sitotoksik aktiviteye sahip olan bir antikoru seçmek mümkündür. Bu tarz bir homoloji genel olarak, %95 veya daha fazla olan bir homolojidir, en tercihen %99 veya daha fazla olan bir homolojidir. ilaveten, burada agir zincir veya hafif zincir amino asit dizisinde bir veya bir kaç amino asit rezidüsünün sübstüte edildigi, silindigi veya eklendigi bir amino asit dizisini birlestirme ile, yukarida-tarif edilen antikorlarin her birininkine es-deger olan bir sitotoksik aktiviteye sahip olan bir antikoru seçmek de mümkündür.

Iki amino asit dizisi arasindaki homoloji, Blast algoritmasi versiyon 2.2.2'nin varsayilan parametreleri kullanilarak belirlenebilir (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and FSI-BLAST: a new generation of protein database search Bu arada, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 85, 87, 89 veya 91 ile temsil edilen agir zincir amino asit dizisinde, 1 ila 19 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sinyal dizisidir, 20 ila 141 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir degisken bölgedir ve 142 ila 471 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sabit bölgedir. hafif zincir amino asit dizisinde, 1 ila 20 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sinyal dizisidir, 21 ila 128 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir degisken bölgedir ve 129 ila 233 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan amino asit dizisi bir sabit bölgedir.

Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 85, 87, 89 veya 91 ile temsil edilen agir zincir amino asit dizileri, Dizi Listesi'nde sirasiyla SEQ lD NO: 84, 86, 88 veya 90 ile temsil edilen nükleotid dizileri tarafindan sifrelenir. ilaveten, SEQ ID NO.'Iari: 84 ve 85 ile temsil edilen diziler Sekil 34'te, SEQ ID NO.'Iari: 86 ve 87 ile temsil edilen diziler Sekil 35'te, SEQ ID NO.'Iari: 88 ve 89 ile temsil edilen diziler Sekil 36'da ve SEO ID NO.'Iari: 90 ve 92 ile temsil edilen diziler Sekil 37'de gösterilir. Yukaridaki nükleotid dizilerinin her birinde, 1 ila 57 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi, antikorun agir zincir sinyal dizisini sifreler, 58 ila 423 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir degisken bölgesini sifreler ve 424 ila 1413 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun agir zincir sabit bölgesini sifreler. ile temsil edilen nükleotid dizileri tarafindan sifrelenir. ilaveten, SEQ lD NO.'Iari: 70 ve 71 ile temsil edilen diziler Sekil 27'de, SEQ ID NO.'Iari: 72 ve 73 ile temsil edilen diziler Sekil 28'de, SEQ ID NO.'Iari: 74 ve 75 ile temsil edilen diziler Sekil 29'da SEO lD temsil edilen diziler Sekil 31'de, SEQ ID NO.'Iari: 80 ve 81 ile temsil edilen diziler Sekil 32'de ve SEO ID NO.'Iari: 82 ve 83 ile temsil edilen diziler Sekil 33'te gösterilir.

Yukaridaki nükleotid dizilerinin her birinde, 1 ila 60 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi, antikorun hafif zincir sinyal dizisini sifreler, 61 ila 384 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir degisken bölgesini sifreler ve 385 ila 699 arasindaki nükleotidlerden olusan nükleotid dizisi antikorun hafif zincir sabit bölgesini sifreler.

Bu nükleotid dizilerinin herhangi biri ve bir baska antikorun bir nükleotid dizisi arasindaki homoloji ayrica, Blast algoritmasi kullanilarak da belirlenebilir. ilaveten, bulusun antikoru, M30 antikoru ile ayni epitopu baglayan bir insan antikorunu içerir. Bir anti-B7-H3 insan antikoru, yalnizca, bir insan kromozomundan türetilen bir antikorun bir gen dizisine sahip olan bir insan antikorunu ifade eder. Anti-B7-H3 insan antikoru, bir insan antikorunun agir ve hafif zincir genlerini içeren bir insan kromozomu fragmanina sahip olan bir insan antikoru-üreten fare kullanilan bir yöntem ile elde Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and lijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Bu tarz bir insan antikoru-üreten fare asagida oldugu sekilde spesifik olarak olusturulabilir. Burada endojen immünoglobülin agir ve hafif zincir gen Iokuslarinin bozuldugu ve yerine, insan immünoglobülini agir ve hafif zincir gen Iokuslarinin bir maya yapay kromozom (YAC) vektörü veya benzeri vasitasiyla uygulandigi bir genetik olarak modifiye edilmis hayvan, bir nakavt hayvan ve bir transgenik hayvan üretme ve bu hayvanlari çiftlestirme ile olusturulur. ilaveten, bir rekombinant DNA teknigine göre, bir insan antikorunun bu tarz bir agir zincirinin ve bir hafif zincirinin her birini sifreleyen cDNA'Iar ve tercihen bu tarz cDNA'Iari içeren bir vektör kullanilmasi ile, ökaryotik hücreler transforme edilir ve bir rekombinant insan monoklonal antikoru üreten bir transformant hücre kültürlenir, böylece antikor ayrica kültür süpernatantindan da elde edilebilir.

Burada, konak olarak, örnegin, ökaryotik hücreler, tercihen memeli hücreleri, örnegin, CHO hücreleri, lenfositler veya miyelom hücreleri, kullanilabilir. ilaveten, bir insan antikoru kütüphanesinden seçilen bir faj gösterimi-kaynakli insan antikorunu elde etmenin bir yöntemi (bakiniz, Wormstone, I. M. et al., lnvestigative Örnegin, burada bir insan antikorunun bir degisken bölgesinin bir tek-Zincirli antikor (scFv) olarak bir fajin yüzeyi üzerinde eksprese edildigi ve bir antijeni baglayan bir fajin kullanilabilir.

Bunun bir antijeni baglamasina göre seçilen fajin genini analiz etme ile, bir antijeni baglayan bir insan antikorunun degisken bölgesini sifreleyen bir DNA dizisi belirlenebilir.

Bir antijeni baglayan scFv'nin DNA dizisi belirlendiginde, diziyi içeren bir ekspresyon vektörü hazirlama ve vektörü eksprese etmek için uygun bir konak içine uygulama ile Bir yeni üretilmis insan antikoru, M30 antikorunun bagladigi bir parsiyel peptit yapisini veya bir parsiyel tersiyer yapiyi bagladiginda, insan antikorunun M30 antikoru ile ayni epitopu bagladigi belirlenebilir. ilaveten, insan antikorunun BT-H3'ü baglamak için M30 antikoru ile rekabet ettigini (yani, insan antikorunun M30 antikoru ve BT-H3 arasindaki baglamayi inhibe ettigini) konfirme etme ile, spesifik epitop dizisi veya yapisi belirlenmemis olsa bile, insan antikorunun M30 antikoru ile ayni epitopu bagladigi belirlenebilir. Insan antikorunun M30 antikoru ile ayni epitopu bagladigi konfirme edildiginde, insan antikorunun M30 antikorununkine es-deger olan bir sitotoksik aktiviteye sahip olmasi güçlü bir sekilde beklenir.

Yukarida-tarif edilen yöntemler ile elde edilen kimerik antikorlar, beserilestirilmis antikorlar veya insan antikorlari, Örnek 3'te gösterilen bir yöntem veya benzerleri ile bunlarin antijen-baglama özellikleri için degerlendirilir ve bir tercih edilen antikor seçilebilir.

Antikorlarin özelliklerinin karsilastirilmasinda kullanim için bir baska indeksin bir örnegi olarak, antikorlarin kararliligi örnek olarak verilebilir. Bir diferansiyel tarama kalorimetresi (DSC), proteinlerin bagil konformasyonel kararliliginin bir avantajli indeksi olarak kullanilacak olan bir termal denatürasyon orta-nokta sicakligini (Tm) çabuk ve dogru bir sekilde ölçebilen bir cihazdir. Bir DSC kullanarak Tm degerleri ölçme ve degerleri karsilastirma ile, termal kararliliktaki bir farklilik karsilastirilabilir. Antikorun saklama kararliliginin antikorlarin termal kararliligi ile biraz korelasyon gösterdigi bilinir (Lori Burton et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265- 273) ve bir tercih edilen antikor, bir indeks olarak termal kararliligin kullanilmasi ile seçilebilir. Antikorlari seçmek için diger indekslerin örnekleri, asagidaki özellikleri içerir: uygun bir konak hücredeki verim yüksektir ve bir sulu çözelti içinde agregat- olusturabilirlik düsüktür. Örnegin, en yüksek verimi gösteren bir antikor her zaman en yüksek termal kararliligi göstermez ve bundan dolayi, yukarida-tarif edilen indekslere göre kapsamli degerlendirme yapma ile insanlara uygulama için en uygun olan bir antikoru seçmek gereklidir. ilaveten, burada bir antikorun tam-boy agir ve hafif zincir dizilerinin uygun bir baglayici kullanilarak baglandigi, böylece bir tek-Zincirli immünoglobülinin elde edildigi, bir Shirrmann, T. et al., mAbs (2010), 2, (1) pp. 1-4). Bu tarz bir tek-Zincirli immünoglobülini dimerize etme ile, elde edilen dimer, kendisi bir tetramer olan bir antikorunkilere benzeyen bir yapiya ve bir aktiviteye sahip olabilir. ilaveten, bulusun antikoru, bir tek agir zincir degisken bölgesine sahip olan ve bir hafif zincir dizisine sahip olmayan bir antikor olabilir. Bu tarz bir antikor, bir tek alanli antikor (sdAb) veya bir nanobodi olarak adlandirilir ve gerçekte, bu tarz bir antikor develerde ve lamalarda gözlenir ve bunun bir antijen-baglama afinitesine sahip oldugu bildirilmistir göre antikorun fonksiyonel fragmaninin bir tipi olarak da yorumlanabilir.

Bulusa, antikorun bir modifiye edilmis varyanti veya antikorun bir fonksiyonel fragmani da dâhil edilir. Modifiye edilmis varyant, bulusun antikorunu veya antikorunun bir fonksiyonel fragmanini kimyasal veya biyolojik modifikasyona tabi tutma ile elde edilen bir varyanti ifade eder. Bu tarz bir kimyasal olarak modifiye edilmis varyantin örnekleri, bir kimyasal kismi bir amino asit iskeletine baglama ile kimyasal olarak modifiye edilmis varyantlari, bir N-bagli veya O-bagli karbonhidrat zinciri ile kimyasal olarak modifiye edilmis varyantlari, vb. içerir. Bu tarz bir biyolojik olarak modifiye edilmis varyantin örnekleri, translasyondan sonra modifikasyon (örnegin, N-bagli veya O-bagli glikosilasyon, N- veya C-ucu isleme, deamidasyon, aspartik asidin izomerizasyonu veya metiyoninin oksidasyonu) ile elde edilen varyantlari ve bir prokaryotik konak hücrede eksprese edilme ile burada bir metiyonin rezidüsünün N ucuna eklenmis oldugu varyantlari içerir. ilaveten, böylece bulusun antikorunun veya burada tarif edildigi üzere bir antijenin saptanmasina veya izolasyonuna olanak saglamak amaciyla etiketlenmis olan bir antikor, örnegin, bir enzim ile etiketlenmis antikor, bir flüoresans ile etiketlenmis antikor ve afinite ile etiketlenmis antikor da, modifiye edilmis varyant anlamina dâhil edilir.

Bulusun antikorunun veya antikorunun bir fonksiyonel fragmaninin bu tarz bir modifiye edilmis varyanti, bulusun orijinal antikorunun veya antikorunun bir fonksiyonel fragmaninin kararliligi ve kanda alikonulmasini iyilestirmek, bunun antijenisitesini azaltmak, bu tarz bir antikoru veya bir antijeni saptamak veya izole etmek ve benzeri için kullanislidir. ilaveten, bulusun antikoruna bagli olan bir glikanin modifikasyonunu (glikosilasyonunu, defükosilasyonunu, vb.) regüle etme ile, antikor-bagimli hücresel sitotoksik aktiviteyi güçlendirmek mümkündür. Antikorlarin bir glikaninin modifikasyonunu regüle etmek açiklar. Bununla birlikte, teknik, bunlarla sinirli degildir. Bulusun antikoruna veya antikorunun fonksiyonel fragmanina, burada bir glikanin modifikasyonunun regüle edildigi bir antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani da dâhil edilir.

Bir antikorun ilk olarak bir antikor genini izole etme ve akabinde geni uygun bir konak içine uygulama ile üretildigi durumlarda, uygun bir konagin ve uygun bir ekspresyon vektörünün bir kombinasyonu kullanilabilir. Antikor geninin spesifik örnekleri, bu spesifikasyonda tarif edilen bir antikorun bir agir zincir dizisini sifreleyen bir genin ve bunun bir hafif zincir dizisini sifreleyen bir genin bir kombinasyonunu içerir. Bir konak hücre transforme edildiginde, agir zincir dizisi genini ve hafif zincir dizisi genini ayni ekspresyon vektörüne ve ayrica ayri ayri farkli ekspresyon vektörlerine yerlestirmek mümkündür. Ökaryotik hücrelerin konak olarak kullanildiginda durumlarda, hayvan hücreleri, bitki hücreleri ve ökaryotik mikroorganizmalar kullanilabilir. Bu tarz hayvan hücreleri olarak, memeli hücreleri, örnegin, simian COS hücreleri (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. hamsteri ovaryan hücrelerinin (CHO hücrelerinin; ATCC: GOL-61) dihidrofolat redüktaz-kusurlu suslari (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Prokaryotik hücrelerin kullanildigi durumlarda, örnegin, Escherichia coli ve Bacillus subtilis örnek olarak verilebilir.

Arzu edilen bir antikorun veya antikorun bir fonksiyonel fragmaninin bir genini transformasyon yoluyla bu hücrelere uygulama ve bu sekilde transforme edilmis hücreleri in vitro kültürleme ile, antikor elde edilebilir. Yukarida-tarif edilen kültür yönteminde, verim bazen antikorun dizisine bagli olarak çesitlilik gösterebilir ve böylece bir farmasötik olarak kolaylikla üretilen bir antikoru bir es-deger baglama aktivitesine sahip olan antikorlar arasindan bir indeks olarak verim kullanilarak seçmek mümkündür. Bundan dolayi, bulusun antikoruna veya antikorunun fonksiyonel fragmanina, bir antikoru veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini üretmenin transforme edilmis konak hücreyi kültürlemenin bir adimini ve arzu edilen bir antikoru veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini kültürleme adiminda elde edilen bir kültürlenmis üründen toplamanin bir adimini içerme ile karakterize edilen bir yöntemi ile elde edilen bir antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani da dâhil edilir.

Bu arada, bir kültürlenmis memeli hücresinde üretilen bir antikorun agir zincirinin karboksil ucundaki bir lizin rezidüsünün silindigi bilinir (Journal of Chromatography A, antikorun agir zincirinin karboksil ucundaki iki amino asit rezidüsünün (glisinin ve lizinin) silindigi ve karboksil ucunda yeni yer alan bir prolin rezidüsünün amidatlandigi dizisinin bu tarz silinmesi ve modifikasyonu antikorun antijen-baglama afinitesini ve efektör fonksiyonunu (kOmplemanin aktivasyonunu, antikor-bagimli hücresel sitotoksisiteyi, vb.) etkilemez. Bundan dolayi, bulusa bu tarz modifikasyona tabi tutulan bir antikor ve antikorun bir fonksiyonel fragmani da dâhil edilir ve burada agir zincirin karboksil ucunda bir veya iki amino asidin silinmis oldugu bir silinme varyanti, silinme varyantinin amidasyonu ile elde edilen bir varyant (öregin, burada karboksil ucu prolin rezidüsünün amidatlandigi bir agir zincir) ve benzerleri örnek olarak verilebilir. Bulusa göre antikorun agir zincirinin karboksil ucunda bir silinmeye sahip olan silinme varyantinin tipi, antijen-baglama afinitesi ve efektör fonksiyon korundugu sürece yukaridaki varyantlar ile sinirlandirilmaz. Bulusa göre antikoru olusturan iki agir zincir, bir tam-boy agir zincirden ve yukarida-tarif edilen silinme varyantindan olusan gruptan seçilen bir tipte olabilir veya bunlardan seçilen kombinasyon hâlindeki iki tipten olabilir.

Her bir silinme varyantinin miktarinin orani, bulusa göre antikoru üreten kültürlenmis memeli hücrelerinin tipinden ve kültür kosullarindan etkilenebilir, bununla birlikte, karboksil ucundaki bir amino asit rezidüsünün bulusa göre antikora ana bilesenler olarak dâhil edilen iki agir zincirin ikisinde de silindigi bir durum örnek olarak verilebilir.

Bulusun antikorunun izotipi konusunda sinirlandirma yoktur ve bunlarin örnekleri, IgG (IgG1, IgGZ, IgG3, lgG4), lgM, lgA(lgA1, IgA2), lgD ve lgE'yi içerir ve bunlarin tercih edilen örnekleri, IgG'yi ve IgM'yi içerir ve ilaveten bunlarin daha çok tercih edilen örnekleri, IgG1'i ve lgG2'yi içerir. ilaveten, bulusun antikoru antikorun veya bunun bir modifiye edilmis fragmaninin bir antijen-baglama yerine sahip olan antikorun bir fonksiyonel fragmani olabilir. Antikorun fragmani, antikora bir proteaz, örnegin, papain veya pepsin, ile muamele etme veya antikor genini bir genetik mühendisligi teknigine göre modifiye etme ve modifiye edilmis geni kültürlenmis uygun hücrelerde eksprese etme ile elde edilebilir. Bu antikor fragmanlari arasinda, antikorun fonksiyonlarinin tümüne veya bir kismina sahip olan bir fragman, bunun asagidaki fonksiyonlara sahip olmasi sartiyla, antikorun bir fonksiyonel fragmani olarak adlandirilabilir: (a) B7-H3'ü spesifik olarak baglama, burada BT-H3, SEQ ID NO: 6 veya 10 ile temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir moleküldür ve antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani IgCZ'den olusan bir polipeptidi baglar, burada IgC2, B7-H3'ün bir alanidir; (b) bir antikor-bagimli hücre-aracili fagositoz (ADCP) aktivitesine sahip olma; (o) bir in vivo anti-tümör aktivitesine sahip olma ve (d) BY-H3'ü baglamak için M30 antikoruna karsi bir kompetitif inhibitör aktiviteye sahip olma, burada M30 antikoru, SEQ lD NO: 51'in 20 ila 471 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 53'ün 23 ila 235 arasindaki rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir hafif zincir içerir.

Antikorun fonksiyonlari olarak, genellikle antijen-baglama aktivitesi, bir antijenin aktivitesini nötralize etmenin bir aktivitesi, bir antijenin aktivitesini güçlendirmenin bir aktivitesi, antikor-bagimli hücresel sitotoksisite (ADCC) aktivitesi ve kompleman- bagimli sitotoksisite (CDC) aktivitesi örnek olarak verilebilir. Yukaridan asikar olacagi üzere, bulusa göre antikorun ve antikorun fonksiyonel fragmaninin fonksiyonu, B7- H3'ün bir spesifik baglama aktivitesidir, burada B7-H3, SEQ ID NO: 6 veya 10 ile temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir moleküldür ve antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani IgCZ'den olusan bir polipeptidi baglar, burada IgCZ, BY-H3'ün bir alanidir; bir antikor-bagimli hücre-aracili fagositoz (ADCP) aktivitesidir; bir in vi'vo anti- tümör aktivitesidir veBY-H3'ü baglamak için M30 antikoruna karsi bir kompetitif inhibitör aktivitedir, burada M30 antikoru, SEO ID NO: 51'in 20 ila 471 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 53`ün 23 ila 235 arasindaki rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir hafif zincir içerir.

Sitotoksik aktiviteye (anti-tümör aktivitesine) tümör hücrelerine karsi bir ADCP aktivitesinin aracilik etmesi tercih edilir. ilaveten, bulusun antikoru ADCP aktivitesine ek olarak ADCC aktivitesine ve/veya CDC aktivitesine sahip olabilir. Özel olarak, bir güncel olarak mevcut anti-tümör antikoru içeren bir farmasötigin bir proliferatif sinyali bloke etmek için tümör hücreleri üzerinde dogrudan etki ettigi, bir hücre ölümü sinyalini indüklemek için tümör hücreleri üzerinde dogrudan etki ettigi, anjiyogenezi baskilandigi, NK hücreleri tarafindan aracilik edilen ADCC aktivitesini indükledigi ve kompleman tarafindan aracilik edilen CDC aktivitesini indükledigi, böylece tümör sahipleri, bu basvurunun bulusuna göre anti-B7-H3 antikorunun ADCP aktivitesinin bir güncel olarak mevcut anti-tümör antikoru içeren bir farmasötigin aktivitesi olarak bildirildiginden haberdar degildir. Antikorun fragmaninin örnekleri, Fab'i, F(ab')2'yi Fv, tek-Zincirli Fv'yi (scFv), burada agir zincirin ve hafif zincirin Fv molekülleri uygun bir baglayici vasitasiyla baglanir, bir diabodiyi (diabodileri), bir lineer antikoru ve antikorun fragmanindan olusan bir polispesifik antikoru içerir. Ilaveten, indirgeme kosullari altinda F(ab')2'ye muamele etme ile elde edilen bir antikorun bir degisken bölgesindeki bir tek- degerlikli fragman olan Fab' da antikorun fragmanina dâhil edilir.

Ilaveten, bulusun antikoru en az iki farkli antijen tipine özgüllügü olan bir polispesifik antikor olabilir. Genel olarak, bu tarz bir antikor, iki antijen tipini baglar (yani, bir bispesifik antikordur), bununla birlikte, burada kullanildigi sekliyle, "polispesifik antikor", iki veya daha fazla (örnegin, üç) antijen tipine özgüllüge sahip olan bir antikoru içerir.

Bulusun polispesifik antikoru, bir tam-boy antikor veya bu tarz bir antikorun birfragmani (örnegin, bir F(ab')2 bispesifik antikor) olabilir. Bispesifik antikor, iki antikor tipinin agir ve hafif Zincirlerini (HL çiftlerini) baglama ile üretilebilir veya ayrica bispesifik antikor- üreten kaynastirilmis hücreleri hazirlamak amaciyla farkli monoklonal antikorlar üreten 539).

Bulusun antikoru, bir tek-Zincirli antikor olabilir (ayrica scFv olarak da ifade edilir). Tek- zincirli antikor, antikorun agir zincir degisken bölgesini ve hafif zincir degisken bölgesini bir polipeptit baglayici vasitasiyla baglama ile elde edilebilir (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg ve Moore tarafindan vasitasiyla baglama ile üretilen bir BiscFv fragmani da bispesifik antikor olarak kullanilabilir.

Bir tek-Zincirli antikor üretmenin bir yöntemi, bu teknik alanda bilinir (bakiniz, örnegin, . Bu scFv'de, agri zincir degisken bölgesi ve hafif zincir degisken bölgesi bir konjugat olusturmayan bir baglayici vasitasiyla, tercihen bir polipeptit baglayici vasitasiyla baglanir (Huston, J. degisken bölgesi ve hafif zincir degisken bölgesi ayni antikordan veya farkli antikorlardan türetilebilir.

Degisken bölgeleri baglamak için kullanilacak olan polipeptit baglayici olarak, örnegin, 12 ila 19 rezidüden olusan belirli bir tek-Zincirli peptit kullanilir.

Bir scFv'yi sifreleyen bir DNA, yukarida-tarif edilen antikorun agir zincirini veya agir zincir degisken bölgesini sifreleyen bir DNA ve bunun hafif zincirini veya hafif zincir degisken bölgesini sifreleyen DNA arasindan seçilen bir DNA`nin tümünü veya arzu edilen kismini içeren bir sablon olarak bir DNA kullanilarak ve ayrica sablon DNA'nin her iki ucunu tanimlayan bir primer çifti de kullanilarak PCR yoluyla amplifikasyon gerçeklestirme ve böylece bunun söz konusu iki ucunu agir zincirin ve hafif zincirin her birine baglamak için ilaveten bir polipeptit baglayici kismini sifreleyen bir DNA'yi ve polipeptidin her iki ucunu tanimlayan bir primer çiftini birlestirme ile amplifikasyon gerçeklestirme ile elde edilebilir. ilaveten, bir scFv'yi sifreleyen DNA üretildiginde, bunu içeren bir ekspresyon vektörü ve ekspresyon vektörü ile transforme edilmis bir konak yaygin prosedürlere göre elde edilebilir. ilaveten, elde edilen konagi kullanma ile, bir scFv yaygin prosedürlere göre elde edilebilir. Bunun bir antikor fragmani, bir geni elde etme ve geni yukarida tarif edilene benzer bir sekilde eksprese etme ile bir konak içinde üretilebilir.

Bulusun antikoru, bir antijen için bunun afinitesini arttirmak amaciyla multimerize edilebilir. Multimerize edilecek olan antikor, antikorun bir tipi veya ayni antijenin çok sayida epitopunu taniyan çok sayida antikor olabilir. Antikorun multimerizasyonunun bir yöntemi olarak, IgG CH3 alanini iki scFv molekülüne baglama, streptavidine baglama, bir heliks-dönüs-heliks motifinin uygulanmasi ve benzerleri örnek olarak verilebilir.

Bulusun antikoru, farkli amino asit dizilerine sahip olan çok sayida anti-B7-H3 antikoru tipinin bir karsimi olan bir poliklonal antikor olabilir. Poliklonal antikorun bir örnegi olarak, farkli CDR'ye sahip olan çok sayida antikor tipinin bir karisimi örnek olarak verilebilir. Bu tarz bir poliklonal antikor olarak, farkli antikorlar üreten hücrelerin bir karisimini kültürleme ve akabinde elde edilen kültürden antikorlari saflastirma ile elde Bir modifiye edilmis antikor olarak, çesitli molekül tiplerinin herhangi birine, örnegin, polietilen glikole (PEG), baglanmis bir antikor da kullanilabilir. ilaveten, bulusun antikoru, bu antikorlarin herhangi biri ve bir baska tibbi ajan arasinda olusturulan bir konjugat (immünokonjugat) formunda olabilir. Bu tarz bir antikorun örnekleri, burada antikorun bir radyoaktif materyale veya bir farmakolojik etkiye sahip olan bir bilesige konjuge edildigi bir konjugati içerir (Nature Biotechnology (2005) 23, pp. 1137-1146). Bunlarin örnekleri, indiyum (1”In)-kapromab pendetidi, teknetiyum (99mTc)-nofetumomab merpentani, indiyum (mim-ibritumomabi, itriyum (9°Y)- ibritumomabi ve iyodür (131I)-tositumomabi içerir.

Elde edilen antikor, homojeniteye kadar saflastirilabilir. Antikorun ayrilmasi ve saflastirilmasi, bir geleneksel protein ayirma ve saflastirma yöntemi kullanilarak gerçeklestirilebilir. Örnegin, antikor kolon kromatografisini, filtre filtrasyonunu, ultrafiltrasyonu, tuz presipitasyonunu, diyalizi, preparatif poliakrilamid jel elektroforezini, izoelektrik odaklama elektroforezini ve benzerlerini uygun bir sekilde seçme ve birlestirme ile ayrilabilir ve saflastirilabilir (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow ve David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), ancak yöntem bunlarla sinirland irilmaz.

Bu tarz kromatografinin örnekleri, afinite kromatografisini, iyon degisim kromatografisini, hidrofobik kromatografiyi, jel filtrasyon kromatografisini, ters faz kromatografisini ve adsorpsiyon kromatografisini içerir.

Bu tarz kromatografi, sivi kromatografi, örnegin, HPLC veya FPLC, kullanilarak gerçeklesti rilebilir.

Afinite kromatografisinde kullanilacak olan bir kolon olarak, bir Protein A kolonu ve bir Protein G kolonu örnek olarak verilebilir. Örnegin, bir kolon olarak, bir Protein A kolonu, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) ve benzerlerini kullanma örnek olarak verilebilir. ilaveten, üzerine immobilize edilmis bir antijene sahip olan bir tasiyici kullanilmasi ile, antikor ayrica antikorun antijeni baglama özelliginden yararlanilarak da saflastirilabilir. 3. Anti-BY-H3 antikoru içeren farmasötik Yukaridaki "2. Anti-B7-H3 antikorunun üretilmesi" maddesinde tarif edilen yöntem ile elde edilen antikorlar kanser hücrelerine karsi bir sitotoksik aktivite gösterir ve böylelikle bir farmasötik, özellikle kanser için bir terapötik ajan ve/veya önleyici ajan olarak kullanilabilir.

Bir antikor tarafindan in vitro sergilenen sitotoksik aktivite, hücre büyümesinin inhibitör aktivitesini ölçme ile belirlenebilir. Örnegin, B7-H3'ü asiri-eksprese eden bir kanser hücre hatti kültürlenir, bir antikorfarkli konsantrasyonlarda kültür sistemine eklenir ve odak olusumuna, koloni olusumuna ve sferoid büyümeye karsi herhangi bir inhibitör aktivite ölçülebilir.

Bir antikorun kanser üzerindeki in vivo terapötik etkisi deneysel hayvanlar kullanilarak, örnegin, antikoru B7-H3'ü asiri-eksprese eden bir tümör hücre hatti ile implante edilmis çiplak farelere uygulama ve kanser hücrelerindeki herhangi bir degisimi ölçme, ile belirlenebilir.

Kanser tipinin örnekleri, akciger kanserini, böbrek kanserini, üroteliyal karsinomu, kolorektal kanseri, prostat kanserini, gliyoblastom multiformeyi, ovaryan kanserini, pankreatik kanseri, meme kanserini, bir melanomu, karaciger kanserini, Idrar kesesi kanserini, mide kanserini ve özofajiyal kanseri içerir, bununla birlikte, kanser tipi, muamele edilecek olan kanser hücresi B7-H3'ü eksprese ettigi sürece, bunlarla sinirland irilmaz.

Bulusa göre farmasötik bilesimin preparasyonunda kullanilacak olan bir kabul edilebilir madde tercihen, farmasötik bilesimin uygulanacagi bir birey için doz ve konsantrasyon açisindan toksik-degildir.

Bulusun farmasötik bilesimi farmasötik kullanim için, bunun pH'ini, ozmotik basincini, viskozitesini, seffafligini, rengini, izotonisitesini, aseptik durumunu, kararliligini, çözünürlügünü, salim hizini, emilim hizini ve geçirgenligini degistirebilen veya idame ettirebilen bir madde içerebilir. Farmasötik kullanim için bu tarz bir maddenin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, amino asitler, örnegin, glisin, alanin, glutamin, asparajin, arjinin ve lizin; antimikrobiyal ajanlar; antioksidanlar, örnegin, askorbik asit, sodyum sülfat ve sodyum hidrojen sülfit; tamponlar, örnegin, fosfat, sitrat, borat tamponlari, sodyum hidrojen karbonat ve Tris-HCI çözeltileri; dolgular, örnegin, mannitol ve glisin; selatlama ajanlari, örnegin, etilendiamin tetraasetat (EDTA): kompleks olusturma ajanlari, örnegin, kafein, polivinilpirrolidin, ß-siklodekstrin ve hidroksipropil-ß-siklodekstrin; genisleticiler, örnegin, glikoz, mannoz ve dekstrin; baska karbonhidratlar, örnegin, monosakkaritler ve disakkaritler; renklendirme ajanlari; aromalar; diluentler; emülsifiye etme ajanlari; hidrofilik polimerler, örnegin, polivinilpirrolidin; koruyucular, örnegin, düsük-moleküler agirlikli polipeptitler, tuz- olusturma karsi iyonlari, benzalkonyum klorür, benzoik asit, salisilik asit, timerosal, fenetil alkol, metilparaben, propilparaben, klorheksidin, sorbik asit ve hidrojen peroksit; çözücüler, örnegin, gliserin, propilen glikol ve polietilen glikol; seker alkolleri, örnegin, mannitol ve sorbitol; süspanse etme ajanlari; sürfaktanlar, örnegin, sorbitan ester, polisorbat 20 ve polisorbat 80 dâhil polisorbatlar, Triton, trometamin, Iesitin ve kolesterol; kararlilik güçlendirme ajanlari, örnegin, sükroz ve sorbitol; elastisite güçlendirme ajanlari, örnegin, sodyum klorür, potasyum klorür ve mannitol ve sorbitol; tasima ajanlari; eksipiyanlar ve/veya farmasötik adjuvanlar, içerir. Farmasötik kullanim için bu maddelerin miktari tercihen, anti-BY-H3 antikorunun agirliginin 0,001 ila 100 kati, özel olarak tercihen 0,1 ila 10 kati araligindadir. Teknikte uzmanligi olan kisiler uygun sekilde, bilesimin buna uygulandigi hastaliga, uygulanacak olan uygulama yoluna veya benzerlerine bagli olarak bir preparasyon içinde farmasötik bilesimin tercih edilen bir formülasyonunu belirleyebilir.

Farmasötik bilesim içindeki eksipiyan veya tasiyici bir sivi veya bir kati formunda olabilir. Uygun bir eksipiyan veya tasiyici enjekte edilebilir su, fizyolojik salin, bir yapay beyin-omurilik sivisi veya parenteral uygulama için yaygin bir sekilde kullanilan bir baska madde olabilir. ilaveten, nötral fizyolojik salin veya serum albümini içeren fizyolojik salin de bir tasiyici olarak kullanilabilir. Farmasötik bilesim, pH`i 7,0 ila 8,5 araliginda olan bir Tris tamponu, pH'u 4,0 ila 5,5 araliginda olan bir asetat tamponu veya pH'i 3,0 ila 6,2 araliginda olan bir sitrat tamponu içerebilir. ilaveten, bu tarz bir tampon sorbitol veya bir baska bilesik ile takviye edilebilir.

Bulusun farmasötik bilesiminin örnekleri, anti-B7-H3 antikoru içeren bir farmasötik bilesimi ve anti-B7-h3 antikor ve kanser için en az bir terapötik ajan içeren bir farmasötik bilesimi içerir. Bulusun farmasötik bilesimi, bir seçilmis bilesime ve bir gerekli safliga sahip olan bir tibbi ajan olarak bir Iiyofilize edilmis ürün veya bir sivi formunda hazirlanir. Anti-B7-H3 antikoru içeren farmasötik bilesim ve anti-B7-H3 antikor ve kanser için en az bir terapötik ajan içeren farmasötik bilesim, uygun bir eksipiyan, örnegin, sükroz, kullanilarak bir Iiyofilize edilmis ürün seklinde de olusturulabilir.

Yukarida-tarif edilen farmasötik bilesimde, anti-B7-H3 antikoru ile birlikte katilacak olan kanser için terapötik ajan, anti-B7-H3 antikoru ile es-zamanli olarak, anti-B7-H3 antikorundan ayri olarak veya anti-B7-H3 antikoru ile sirali olarak uygulanabilir veya terapötik ajan ve anti-B7-H3 antikoru farkli dozaj araliklarinda uygulanabilir. Kanser için bu tarz bir terapötik ajanin örnekleri, abraksani, karboplatini, sisplatini, gemsitabini, irinotekani (CPT-11), paklitakseli, pemetreksedi, sorafenibi, vinblastini ve WO analoglarini (örnegin, Iöprorelini ve goserelini), estramustin fosfati, östrojen antagonistlerini (örnegin, tamoksifeni ve raloksifeni) ve aromataz inhibitörlerini (örnegin, anastrozolü, Ietrozolü ve eksemestani) içerir, bununla birlikte, ajan bir anti-tümör aktivitesine sahip olan bir tibbi ajan oldugu sürece, bunlarla sinirlandirilmaz.

Farmasötik bilesimin uygulanacagi bir birey özel olarak sinirlandirilmaz, bununla birlikte, memeliler tercih edilir ve insanlar daha çok tercih edilir.

Bulusun farmasötik bilesim, parenteral uygulama Için ve oral uygulama yoluyla gastrointestinel emilim için hazirlanabilir. Bir preparasyonun bilesimi ve konsantrasyonu, uygulama yöntemine bagli olarak belirlenebilir. Bulusun farmasötik bilesimine dâhil edilen anti-B7-H3 antikorunun B7-H3 için afinitesi daha yüksek oldukça, yani, bunun B7-H3 için ayrilma sabiti (Kd degeri) daha düsük oldukça, insanlar için doz düsürüldügünde bile, anti-B7-H3 antikoru bunun ilaç etkinligini daha çok gösterebilir. Dolayisiyla, bulusun farmasötik bilesiminin insanlar için dozu ayrica, bu sonuca göre de belirlenebilir. Doz için oldugu gibi, bir insan anti-B7-H3 antikorunun insanlara uygulandigi durumda, antikor yaklasik 0,001 ila 100 mg/kg olan bir dozda 1 ila 180 günlük araliklarla bir veya bir kaç kez uygulanabilir. Bulusun farmasötik bilesiminin dozaj formunun örnekleri, infüzyonlari içeren enjeksiyonlari. süpozituvarlari. trans-nazal ajanlari, dil-alti ajanlarini ve perkütanöz adsorbentleri içerir.

Bundan sonra, bulus Örnekler'e atfen daha spesifik bir sekilde tarif edilecektir, bununla birlikte, bulus bunlarla sinirlandirilmaz. Örnekler Asagidaki Örnekler'de gen manipülasyonuna iliskin ilgili operasyonlarin (Sambrook, J., Fritsch, E. F. ve Maniatis, T. tarafindan yazilmis, 1989'da Cold Spring Harbor Laboratory Press tarafindan basilmis) "Molecular Cloning" kaynaginda tarif edilen yöntemlere göre gerçeklestirildigi veya piyasada satilan reaktiflerin veya kitlerin kullanilmasi durumunda, bunlarin, aksi ifade edilmedikçe, bunlara eklenmis talimatlara göre kullanildigi göz önünde bulundurulmalidir. Örnek 1. Plazmidin üretilmesi 1)-1 Insan BY-H3 ekspresyon vektörünün üretilmesi 1)-1-1 Tam-boy insan B7-H3 varyant 1 için ekspresyon vektörünün üretilmesi Bir PCR reaksiyonu, bir sablon olarak LNCaP hücrelerinin (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)) toplam RNA'sindan sentezlenen bir cDNA kullanilarak ve ayrica asagidaki primer seti kullanilarak gerçeklestirilmistir, böylece insan B7-H3 varyant 1'i sifreleyen bir CDNA çogaltilmistir: '-ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-S' (Dizi Listesi'nde SEQ Listesi'nde SEQ ID NO: 2).

Bunu takiben, bu sekilde elde edilen PCR ürünü MagExtractor PCR & Gel cleanup (TOYOBO, Co., Ltd.) kullanilarak saflastirilmistir. Akabinde, PCR ürünü restriksiyon enzimleri (Nhel ve Notl) ile sindirilmistir, bunu MagExtractor PCR & Gel cleanup (TOYOBO, Co., Ltd.) kullanilarak saflastirma izlemistir. Bir pCDNA3.1(+) plazmid DNA'si ayni restriksiyon enzimleri (Nhel ve Notl) ile sindirilmistir, bunu MagExtractor PCR & Gel cleanup (TOYOBO, Co., Ltd.) kullanilarak saflastirma izlemistir.

Elde edilen saflastirilmis DNA çözeltileri karistirilmistir ve ilaveten, buna Ligation high (TOYOBO, Co., Ltd.) eklenmistir ve elde edile karisim Iigasyonu gerçeklestirmek için 16°C'de 8 saat boyunca inkübe edilmistir. Elde edilen reaksiyon karisimi, transformasyonu gerçeklestirmek için E. coli DH50i kompetan hücrelerine (Invitrogen Corporation) eklenmistir.

Elde edilen koloniler üzerinde PCR primerleri ve BGH geri primeri kullanilarak koloni direkt PCR gerçeklestirilmistir ve bir aday klon seçilmistir.

Elde edilen aday klon bir sivi vasat (LB/Amp) içinde kültürlenmistir ve bir plazmid DNA'si MagExtractor -Plasmid- (TOYOBO, Co., Ltd.) kullanilarak ekstrakte edilmistir.

Elde edilen plazmid DNA'si bir sablon olarak kullanilarak, asagidaki Primer 3 ve Primer 4 arasindaki bir dizi, dizi analizi ile belirlenmistir ve diziler elde edilen klon ve saglanan CDS dizisi arasinda karsilastirilmistir: Primer 3 (CMV promotör primeri): '-cgcaaatgggcggtaggcgtg-B' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 3) ve Primer 4 (BGH geri primeri): '-tagaaggcacagtcgagg-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 4).

Dizi konfirme edildikten sonra, elde edilen klon 200 ml LB/Amp vasati içinde kültürlenmistir ve bir plazmid, Plasmid Midi V-100 kiti (VioGene, Inc.) kullanilarak ekstrakte edilmistir.

Bu sekilde elde edilen vektör, "pcDNA3.1-B7-H3" olarak adlandirilmistir. Bu vektör içine klonlanmis B7-H3 varyant 1 geninin ORF bölgesinin dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ varyant 1'in amino asit dizisi, Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 6 ile temsil edilir. 1)-1-2 Tam-boy insan BY-H3 varyant 2 için ekspresyon vektörünün üretilmesi PCR, bir sablon olarak LNCaP hücrelerinin toplam RNA'sindan sentezlenen bir cDNA kullanilarak ve ayrica asagidaki primer seti kullanilarak gerçeklestirilmistir, böylece insan B7-H3 varyant 2'yi sifreleyen bir cDNA çogaltilmistir: Listesi'nde SEQ ID NO: 7) '-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcggctatttcttgt-S' (Dizi Listesi'nde SEQ lD NO: Saflastirma, Örnek 1)-1-1'deki ile ayni sekilde gerçeklestirilmistir ve saflastirmadan sonra PCR ürünü bir Gateway BP reaksiyonu ile bir a pDONR221 vektörüne (lnvitrogen Corporation) entegre edilmistir, böylece E. coli TOP10 (lnvitrogen Corporation) transforme edilmistir.

Transformasyondan sonra elde edilen klonlar için, içeri yerlestirmenin boyutu koloni PCR ile konfirme edilmistir. Burada içeri yerlestirmenin boyutunun konfirme edildigi 8 klon için, içeri yerlestirmenin 3' ucundaki ve 5' ucundaki DNA dizisi vektör tarafindan içeri yerlestirme tarafina dogru her iki uç için bir dizileme reaksiyonu gerçeklestirme ile konfirme edilmistir. Dizisi konfirme edilmis giris klonu ve bir Gateway destinasyon vektörü pcDNA-DEST4O (lnvitrogen Corporation) arasinda bir Gateway LR reaksiyonu gerçeklestirilmistir. E. coli TOP10 transformasyonundan sonra elde edilen klon için, içeri yerlestirmenin boyutu koloni PCR ile konfirme edilmistir. Burada içeri yerlestirmenin boyutunun konfirme edildigi klon için, içeri yerlestirmenin 3' ucundaki ve ' ucundaki DNA dizisi, söz konusu içeri yerlestirmenin dogru bir sekilde içeri yerlestirildigini konfirme etmek için analiz edilmistir. Klonun bu sekilde üretilen plazmidinin en az 1 mg'i, PureLink HiPure Plasmid Megaprep Kit (lnvitrogen Corporation) kullanilarak saflastirilmistir.

Bu sekilde elde edilen vektör, "pcDNA-DEST40-B7-H3 varyant 2" olarak adlandirilmistir. Bu vektör içine klonlanmis B7-H3 varyant 2 geninin ORF bölgesinin dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 9'de 1 ila 948 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilir. ilaveten, B7-H3 varyant 2`nin amino asit dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: ile temsil edilir. 1)-2 B7-H3 parsiyel proteini için ekspresyon vektörünün üretilmesi Örnek 1)-1-1'in B7-H3 varyant 1'i ile iliskili olan B7-H3 tam-boy plazmidin bir sablon olarak kullanilmasi ile, asagidaki bölgelerin her biri, PCR ile çogaltilmistir. Söz konusu her bir bölgeyi gösteren numaralar, B7-H3'ün SEQ ID NO: 5 ile temsil edilen nükleotid numaralarini gösterir. Primer, Gateway att dizisine ek olarak 3' ucunda bir durdurma kodonu içermesi için tasarlanmistir.

Asagidaki 1), 2) ve 3) bölgelerinin her biri, iki bölgeyi çogaltma ve akabinde bir fragman olusturmak için bölgeleri PCR ile baglama ile hazirlanmistir. Söyle ki, bölge 1) için, amplifikasyon Primerler 7 ve 12 ve Primerler 15 ve 11 kullanilarak gerçeklestirilmistir ve elde edilen PCR ürünleri ilaveten Primerler 7 ila 11 kullanilarak çogaltilmistir. Bölge 2) için amplifikasyon Primerler 8 ve 13 ve Primerler 15 ve 11 kullanilarak gerçeklestirilmistir ve elde edilen PCR ürünleri ilaveten Primerler 8 ila 11 kullanilarak çogaltilmistir. Bölge 3) için, amplifikasyon Primerler 9 ve 14 ve Primerler 15 ve 11 kullanilarak gerçeklestirilmistir ve elde edilen PCR ürünleri ilaveten Primerler 9 ila 11 kullanilarak çogaltilmistir. Bölge 4) için, amplifikasyon Primerler 10 ve 11 kullanilarak gerçeklestirilmistir. Bölge 5) için, amplifikasyon Primerler 8 ve 11 kullanilarak gerçeklestirilmistir. Bölge 6) için, amplifikasyon Primerler 9 ve 11 kullanilarak gerçeklesti rilmistir.

Söz konusu bölgeler Primer numarasi ve baz dizisi '-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggagccctggaggtccaggtc-B' (Dizi Listesi'nde Listesi'nde SEQ ID NO: 12) '-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggagccgtggaggtccaggtc-B' (Dizi Listesi'nde Listesi'nde SEQ ID NO: 14) '-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaggctatttcttgtccatcatc-3' (Dizi Listesi'nde '-gggaatgtcataggctgcccggccacctgcaggctgacggcag-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID '-gggaatgtcataggctgccctgtggggcttctctggggtgtg-B' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: '-gggaatgtcataggctgcccggccacctgcaggctgacggcag-s' (Dizi Listesi'nde SEQ ID '-gggcagcctatgacattccccccagag-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 19) Saflastirma, Örnek 1)-1-1'deki ile ayni sekilde gerçeklestirilmistir ve saflastirmadan sonra çogaltilmis ürünlerin her biri bir Gateway BP reaksiyonu ile bir a pDONR221 vektörüne entegre edilmistir, böylece E. coli TOP10 (Invitrogen Corporation) transforme edilmistir. Transformasyondan sonra elde edilen klonlar için, içeri yerlestirmenin boyutu koloni PCR ile konfirme edilmistir.

Burada içeri yerlestirmenin boyutunun konfirme edildigi klonlarin her biri için, içeri yerlestirmenin 3' ucundaki ve 5' ucundaki DNA dizisi vektör tarafindan içeri yerlestirme tarafina dogru her iki uç için bir dizileme reaksiyonu gerçeklestirme ile konfirme edilmistir.

Söz konusu içeri yerlestirmeye sahip oldugu konfirme edilen klonlar için, içeri yerlestirmenin toplam DNA dizisi ayrica, asagidaki primer kullanilarak da konfirme edilmistir. Dizi analizinin bir sonucu olarak, dizilerin tümünün söz konusu dizilerin bilgisine tamamen özdes oldugu konfirme edilmistir.

Dizisi konfirme edilmis giris klonlarinin her biri ve pFLAG-myc-CMV-19-DEST (Invitrogen Corporation) arasinda bir Gateway LR reaksiyonu gerçeklestirilmistir. E. coli DH1OB (Invitrogen Corporation) transformasyonundan sonra elde edilen klonlar için, içeri yerlestirmenin boyutu koloni PCR ile konfirme edilmistir.

Burada içeri yerlestirmenin boyutunun konfirme edildigi klonlarin her biri için, içeri yerlestirmenin 3' ucundaki ve 5' ucundaki DNA dizisi, söz konusu içeri yerlestirmenin dogru bir sekilde içeri yerlestirildigini konfirme etmek Için analiz edilmistir. Bundan sonra, yukaridaki 1) ila 6) arasindaki bölgelerin her birini entegre etme ile elde edilen ekspresyon vektörleri sirasiyla, "B7-H3 IgV1", "BY-HS IgCi", "B7-H3 IgV2", "BY-HS Her biri bu vektör içine klonlanmis olan B7-H3 IgV1, B7-H3 IgCt, BT-H3 IgV2, B7-H3 ve B7-H3 IgV2-C2'nin amino asit dizileri Dizi Listesi'nde sirasiyla SEQ ID NO.'Iari: 21, diziler Sekil 15'te gösterilir, SEQ ID NO.'lari: 22 ve 23 ile temsil edilen diziler Sekil 16'da gösterilir, SEQ ID NO.'Iari: 24 ve 25 ile temsil edilen diziler Sekil 17'de gösterilir, SEO ve 29 ile temsil edilen diziler Sekil 19'da gösterilir ve SEO ID NO.'Iari: 30 ve 31 ile temsil edilen diziler Sekil 20'de gösterilir. 1)-3 B7 familyasi genleri için ekspresyon vektörlerinin üretilmesi (Bir pCMVö-XL-4 ekspresyon vektörüne (B7 familyasi genleri olan) B7RP-1'in, B7-H1'in ve B7-DC'nin her birini entegre etme ile elde edilen gen ekspresyon vektörleri olan) pCMVö-XL-4-BYRP-1, pCMVG-XL-4-B7-H1 ve pCMVö-XL-4-B7-DC'nin tümü OriGene, B7 familyasi genleri olan CD80'in, CD86'nin ve B7-H4'ün her birini eksprese eden vektörler asagida oldugu sekilde üretilmistir.

Bir pENTR/221 giris vektörüne CD80'in, CD86'nin ve B7-H4'ün her birini entegre etme lnvitrogen Corporation firmasindan satin alinmistir.

Dizisi konfirme edilmis giris klonlarinin her biri ve cDNA3.1-DEST (Invitrogen Corporation) arasinda bir Gateway LR reaksiyonu gerçeklestirilmistir. E. coli DH1OB transformasyonundan sonra elde edilen klonlar için, içeri yerlestirmenin boyutu koloni PCR ile konfirme edilmistir. Burada içeri yerlestirmenin boyutunun konfirme edildigi klonlarin her biri için, içeri yerlestirmenin 3' ucundaki ve 5' ucundaki DNA dizisi, söz konusu içeri yerlestirmenin dogru bir sekilde içeri yerlestirildigini konfirme etmek için analiz edilmistir. genlerinin ORF bölgelerinin nükleotid dizileri Dizi Listesi'nde sirasiyla SEQ ID NO.'lari: 41 ve 43 ile temsil edilir. Örnek 2. Monoklonal antikorun üretilmesi ve antikoru tarama 2)-1 ImmünizasyOn 4 ila 6 haftalik BALB/cAnNCrICrlj fareleri (Charles River Laboratories Japan, Inc.), FchII KO fareleri (Taconic, Inc., IBL Co., Ltd.) veya GANP fareleri (Transgenic, Inc.) kullanilmistir. Günler O'da, 7'de, 15'te ve 24'te, versen (Invitrogen Corporation) ile sökülmüs LNCaP hücreleri, MCF7 hücreleri (ATCC) veya AsPC1 hücreleri (ATCC) her bir farenin dorsal bölgesine 5 x 106 hücre/fare olan bir dozda subkütan olarak uygulanmistir. Gün 31'de, ayni hücreler her bir fareye 5 x 106 hücre olan bir dozda intravenöz olarak uygulanmistir. Gün 34'te, dalak her bir fareden kesip çikarilmistir ve hibridomlarin üretilmesi için kullanilmistir. 2)-2 Hibridomlarin üretilmesi Dalak hücreleri ve fare miyelom P, PEG 4000 (IBL Co., Ltd. firmasi tarafindan üretilmistir) kullanilarak hücre füzyonuna tabi tutulmustur, böylece hibridomlar üretilmistir.

Sonuç olarak, LNCaP hücreleri ile immünize edilmis farelerden elde edilen 9639klon, MCF7 hücreleri ile immünize edilmis farelerden elde edilen 4043 klon ve AsPC1 hücreleri ile immünize edilmis farelerden elde edilen 3617 klon hibridomlar olarak olusturulmustur. Her bir hibridomun elde edilen kültür süpernatanti kullanilarak, bir antikor-üreten hibridom bir CDC analizi ile taranmistir. 2)-3 Antikorun CDC analizi ile taranmasi Gün O'da, LNCaP hücreleri veya MCF7 hücreleri her bir 80 uL için 5000 hücreye seyreltilmistir ve elde edilen çözelti 80 pI/kuyucuk olarak bir 96-kuyucuklu plakaya eklenmistir. Akabinde, hücreler gece boyu kültürlenmistir. Hibridom kültürü süpernatanti, içine hücrelerin ekildigi plakaya 20 uI/kuyucuk olarak eklenmistir ve plaka 1 saat boyunca 4°C'de beklemeye birakilmistir. Bir seyreltilmis ve liyofilize edilmis tavsan komplemanina (Cedarlane Laboratories), buz üzerindeki her bir viyale 1 ml steril su eklenmistir ve viyal 1 dakika boyunca beklemeye birakilmistir, bunu karistirma izlemistir ve akabinde elde edilen karisim 19 mL %O,1 BSA/RPMI 1640 vasati (BSA, Sigma Co., Ltd.) ile karistirilmistir. Bir reaksiyonun, 37°C'de 1 saat boyunca Plaka, oda sicakligina dönmesi için oda sicakliginda 30 dakika birakilmistir. 120 pL CeIITiter-Glo reaktifi (Promega Corporation) her bir kuyucuga eklenmistir ve bir reaksiyonun oda sicakliginda 10 dakika boyunca ilerlemesine izin verilmistir.

Lüminesansin miktari, bir plaka okuyucu (ARVO HTS, PerkinEImer, Inc.) kullanilarak ölçülmüstür. Düsük Iüminesans gösteren bir kuyucukta, kompleman-bagimli hücre ölümünün indüklendigi belirlenmistir. Bu tarz kompleman-bagimli hücre ölümünü indüklemis bir kültür süpernatanti üreten bir hibridom seçilmistir.

Sonuç olarak, LNCaP ile immünizasyondan türetilen klonlardan elde edilen 24 klon, MCF7 ile immünizasyondan türetilen klonlardan elde edilen 36 klon ve AsPC1 ile immünizasyondan türetilen klonlardan elde edilen 3 klon tarama ile pozitif klonlar olarak elde edilmistir. Örnek 3. Antijenin tanimlanmasi 3)-1 Immüno-çökeltilmis maddenin tanimlanmasi 3)-1-1 Immüno-presipitasyon MCF7 hücreleri, 5 ila 10 x 108 hücre olarak kültürlenmistir. Bu hücreler, bir hücre kaziyici ile sökülmüstür ve sökülmüs hücreler toplanmistir ve -80°C'de dondurarak- saklanmistir. Dondurarak-saklanmis hücreler, %1 NP-40 (Sigma-Aldrich Co., Ltd.) ve bir proteaz inhibitörü (F. Hoffmann-La Roche, Ltd.) içeren ve 4°C'ye sogutulmus bir lizis tamponunun 10 ml'si eklenmistir ve hücre peleti, baloncuklarin olusumundan kaçinilan bir sekilde bir pipet ile buz üzerinde Iize edilmistir. Tamamen Iize edildikten sonra, pelet rpm'de 4°C'de 20 dakika boyunca sentrifüj edilmistir ve elde edilen süpernatant, bir 15 ml'lik Falkon tüpe transfer edilmistir. 500 pl protein G-Sepharose 4FF biyeleri (Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.) üç kere yikanmistir ve bir lizis tamponu ile tampon degisimine tabi tutulmustur. 500 pl protein G-Sepharose 4FF bilyeleri çözündürülmüs örnek süpernatinatina buz üzerinde eklenmistir ve elde edilen karisim 4°C'de gece boyu rotari karistirmaya tabi tutulmustur. Örnekler, Poly-Prep kromatografi kolonlarindan (Bio-Rad Laboratories, Inc.) geçirilmistir ve bir asagiya-geçirilmis fraksiyon bir immüno-presipitasyon örnegi olarak kullanilmistir.

Immüno-presipitasyon için kullanilacak olan bir antikor çözeltisinin 3 ug'i, fosfat tamponlu salin (PBS) ile tampon degisimine tabi tutulmus 50 pl protein G-Sepharose 4FF biyelerine eklenmistir (bir ve elde edilen karisim 4°C'de 1 ila 16 saat boyunca rotari karistirmaya tabi tutulmustur, böylece antikor bilyelere baglanmistir. immüno-presipitasyOn örnegine, antikorun baglandigi bilyeler eklenmistir ve elde edilen karisim 4°C'de 3 saat boyunca rotari karistirmaya tabi tutulmustur.

Kolon, bir bos 15 mI'Iik Falkon tüpe transfer edilmistir ve bir Iizis tamponunun 6,5 ml'si buna eklenmistir. Bu prosedür, 4 kere tekrar edilmistir.

Kolonun çikisina baslik koyulmustur, bir Iizis tamponun 500 pl'si ile pipetaj yapilmistir ve bilyeler bir 1,5 mI'Iik tüpe toplanmistir. Bu prosedür iki kere tekrar edilmistir. 4°C'de 5000 rpm'de 1 dakika boyunca Sentrifügasyondan sonra, süpernatant dikkatli bir sekilde uzaklastirilmistir. Akabinde, bir elüsyon tamponunun (10 mM glisin-HCI, pH 2,0) 90 iJI'si buna eklenmistir, bunu vorteksleme ve sentrifügasyon izlemistir. 1,5 mI'Iik spin kolonunun kolonu ayrilmistir ve 10 pl 1 M Tris-HCI (pH 8,5) buna eklenmistir ve kolon orijinal yerine geri koyulmustur. Bir elüsyon fraksiyonu buna transfer edilmistir ve 10000 rpm'de 1 dakika boyunca sentrifügasyon gerçeklestirilmistir, böylece bir örnegin 100 pl'si elde edilmistir.

Elde edilen örnek, asagidaki 3)-1-2'de gösterildigi üzere bir sivi faz sindirim teknigi ile 3)-1-2 Kütle spektrometri analizi ile antijenin tanimlanmasi Yaygin prosedürlere öre, immüno-presipitasyon yöntemi ile elde edilen fraksiyon, bir sivi faz sindirim teknigi yoluyla tripsin (modifiye edilmis tripsin, Promega Corporation) ekleme ile 37°C'de 16 saat boyunca bir sindirim reaksiyona tabi tutulmustur. Elde edilen sindirilmis peptitler bir sivi kromatografisi (LC)/tandem kütle spektrometresine (MS/MS) (Thermo Fisher Scientific K.K.) tabi tutulmustur. Elde edilen kütle spektral verileri veri tabani arastirma yazilimi (Mascot, Matrix Science K.K.) kullanilarak analiz edilmistir. Veri tabani olarak, International Protein Index (IPI) kullanilmistir. Sonuç olarak, 34 antijen tipi tanimlanmistir.

Tanimlanmis antijenlerin karakteristiklerinden, bibliyografik bilgi geri-alimi, B7-H3'ün bir hücre membrani proteini olmasina dayanarak gerçeklestirilmistir ve B7-H3 (CD278) antijenine (BY-HB varyant 1) odaklanarak, asagida 3)-2 ve 3)-3'te tarif edilen deneyler gerçeklestirilmistir. 3)-2 Antijen-genini eksprese eden hücrelerin preparasyonu NIH-, bir kollajen tip I-kapli flask (IWAKI Co., Ltd. tarafindan üretilmistir) içine 5 x içeren DMEM vasati (Invitrogen Corporation) içinde 37°C ve %5'Iik C02 kosullari altinda gece boyu kültürlenmistir.

Sonraki gün, NIH--1- 2'de üretilen pcDNA-DEST40-B7-H3 varyant 2'nin ve bir bos vektör olan pcDNA- DEST40'in her biri ile Lipofectamine kullanilarak transfekte edilmistir ve 37°C ve %5'Iik 002 kosullari altinda gece boyu ilaveten kültürlenmistir.

Sonraki gün, transfekte edilmis NIH-3T3 hücrelerine tripsin ile muamele edilmistir ve bu süspanse edilmistir. Bu sekilde elde edilen hücre süspansiyonu bir akis sitometrik analizde kullanilmistir. 3)-3 Akis sitometrik analiz MS ile tanimlanan BT-H3 varyant 1'i immüno-çökelten hibridom tarafindan üretilen antikorun, BT-H3 için, baglama özgüllügü bir akis sitometrik yöntem ile konfirme edilmistir. Örnek 3)-2'de hazirlanan hücre süspansiyonu sentrifüj edilmistir ve süpernatant uzaklastirilmistir. Akabinde, hibridom kültürü süpernatanti hücreleri süspanse etmek için. her bir vektör ile transfekte edilmis NIH-3T3 hücrelerine eklenmistir ve hücreler 4°C'de 1 saat boyunca beklemeye birakilmistir.

Hücreler %5 FBS içeren PBS ile iki kere yikandiktan sonra, %5 FBS içeren PBS ile 1000-kat seyreltilmis fare IgG'ye (tam molekül) (ICN Pharmaceuticals, Inc. tarafindan üretilmistir, #55493) floresin-konjuge edilmis keçi lgG fraksiyonu, hücreleri süspanse etmek için buna eklenmistir ve hücreler 4°C'de 1 saat boyunca beklemeye birakilmistir.

Hücreler %5 FBS içeren PBS ile iki kere yikandiktan sonra, hücreler 2 pg/ml 7- aminoaktinomisin D (lnvitrogen Corporation (Molecular Probes) tarafindan üretilmistir) ile takviye edilmis %5 FBS içeren PBS içinde yeniden-süspanse edilmistir ve saptama bir akis sitometresi (FCSOO, Beckman Coulter, Inc.) kullanilarak gerçeklestirilmistir.

Veriler, Flowjo (Tree Star, Inc.) kullanilarak analiz edilmistir. 7-Aminoaktinomisin D-pozitif ölü hücreler bir kapi kullanilarak çikarilmistir. Akabinde, canli hücrelerin FITC flüoresans yogunlugu histogramlari olusturulmustur.

Kontrol görevi gören bos vektör ile transfekte edilmis NlH-3T3 hücrelerinin flüoresans yogunlugu histogramina kiyasla B7-H3 varyant 1 eksprese eden NIH-3T3 hücrelerinin ve BY-H3 varyant 2 eksprese eden NIH-3T3 hücrelerinin flüoresans yogunlugu histogramlarinda daha yüksek bir flüoresans yogunlugu veren bir örnek üreten bir hibridom, bir anti-B7-H3 antikoru-üreten hibridom olarak seçilmistir. hibridomlarindan türetilen antikorlarin BY-HS varyant 1 ve BT-HS varyant 2 ile çapraz- reaktiviteye sahip oldugu bulunmustur. 3)-4 Monoklonal antikorun kanser hücresi hattini baglama özelliginin konfirmasyonu Örnek 3)-3'te B'I-HS varyant 1'i ve B7-H3 varyant 2`yi bagladigi konfirme edilen monoklonal antikorlarin B7-H3 varyant 1'i ve B7-H3 varyant 2'yi asiri-eksprese eden kanser hücrelerini baglayip baglamadigi Örnek 3)-3'teki ile ayni sekilde bir akis sitometrik yöntem ile incelenmistir.

Transfekte edilmis NIH-3T3 hücrelerinin yerine, bir insan meme kanseri hücre hatti kullanilmistir. Sonuç olarak, olusturulan monoklonal antikorlarin tümünün bu kanser hücre hatlarini bagladigi konfirme edilmistir. 3)-5 Monoklonal antikorun izotip belirlemesi Monoklonal antikorlarin izotipleri, bir Fare monoklonal izotipleme kiti (Serotec Co., Ltd. tarafindan üretilmistir) kullanilarak belirlenmistir. Sonuç olarak, anti-B7-H3 antikoru- üreten hibridomlardan (L7, L8, L11, M30 ve M31) türetilen antikorlarin izotiplerinin tümünün IgG2a oldugu belirlenmistir. 3)-6 Monoklonal antikorun preparasyonu Monoklonal antikor, bir hibridom veya bir hibridom kültürü süpematanti ile implante edilmis bir farenin assitlerinden saflastirilmistir (bundan sonra, bir "antikor saflastirma için baslangiç materyali" olarak ifade edilir).

Fare assitleri asagidaki sekilde hazirlanmistir. Ilk olarak, 7 ila 8 haftalik BALB/cAJcI- nu/nu (CLEA Japan, Inc.) farelerine pristan (Sigma Co., Ltd. tarafindan üretilmistir) ile muamele edilmistir ve yaklasik 3 hafta sonra, fizyolojik salin ile yikanmis bir hibridom her bir fare için 1 x 107 hücre olarak abdominal kavite içine implante edilmistir. 1 ila 2 hafta sonra, abdominal kavitede biriken assitler toplanmistir ve bir 0,22 um'lik filtre yoluyla sterilize edilmistir ve elde edilen materyal, antikor saflastirma için bir baslangiç materyali olarak kullanilmistir.

Hibridom kültürü süpematanti, CELLine (BD Biosciences, Inc. tarafindan üretilmistir) kullanilarak hazirlanmistir. Kültürleme, CIonaCelI-HY Growth Medium E'nin (StemCeIl Technologies, Inc. tarafindan üretilmistir, #03805) vasat olarak kullanilmasi disinda üreticinin protokolüne göre gerçeklestirilmistir. Toplanan kültür süpematanti, bir 0,45 pm'lik filtre yoluyla filtrelenmistir ve elde edilen materyal antikor saflastirma için bir baslangiç materyali olarak kullanilmistir.

Antikor, Recombinant Protein A rPA50'yi (RepliGen Corporation tarafindan üretilmistir) FormyI-Cellulofine (Seikagaku Corporation tarafindan üretilmistir) (bundan sonra Healthcare Bio-Sciences Corporation tarafindan üretilmistir) üzerine immobilize etme ile elde edilen bir afinite kolonu ile saflastirilmistir. FormyI-Cellulofine Protein A durumunda, antikor saflastirma için baslangiç materyali, bir baglama tamponu (3 M NaCI, 1,5 M glisin, pH 8,9) ile 3-kat seyreltilmistir ve elde edilen çözelti bir kolona eklenmistir, akabinde, kolon baglama tamponu ile yikanmistir, bunu 0,1 M sitrik asit (pH 4,0) ile elüsyon izlemistir. Diger taraftan, Hitrap MabSelect SuRe (GE Healthcare Corporation) durumunda, antikor saflastirma için baslangiç materyali bir kolona eklenmistir ve kolon PBS ile yikanmistir, bunu 2 M Arjinin-HCI (pH 4,0) ile elüsyon izlemistir.

Ayristirilmis antikor çözeltisi nötralize edildikten sonra, tampon PBS ile degistirilmistir.

Antikorun konsantrasyonu, POROS G 20 um Column PEEK, 4,6 mm x 100 mm, 1,7 ml'ye (Applied Biosystems, Inc.) baglanmis antikoru ayristirma ve eluatin absorbansini (O.D. 280 nm) ölçme ile elde edilmistir. Spesifik olarak, PBS ile seyreltilmis bir antikor örnegi, bir dengeleme tamponu (30,6 mM sodyum dihidrojen fosfat/12 sulu, 19,5 mM monopotasyum fosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,0) ile dengelenmis POROS G 20 um'ye eklenmistir. Akabinde, kolon dengelem tamponu ile yikanmistir ve kolona baglanmis antikor akabinde bir eluent (% ile ayristirilmistir.

Eluatin absorbansinin (O.D. 280 nm) pik alani ölçülmüstür ve konsantrasyon asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: Antikor örneginin konsantrasyonu (mgfml) = (Antikor örneginin pik alani) (referans standardin (insan lth'inin) pik alani) x Referans standardin konsantrasyonu (mgi'ml) x Örnegin seyreltme faktörü. ilaveten, elde edilen antikora dâhil edilen endotoksinin konsantrasyonu, Endospecy ES-50M Set (Seikagaku Corporation, #020150) ve bir endotoksin referans standardi CSE-L Set (Seikagaku Corporation, #020055) kullanilarak ölçülmüstür ve 1 EU/mg veya daha az oldugu konfirme edilmistir. Elde edilen antikor, müteakip deneyde kullanilmistir. Örnek 4. Anti-B7-H3 antikorunun özellikleri 4)-1 ADCP aktivitesi 1,5 mi tiyoglikollat, bir BaIb/c-nu/nu faresinin (disi, 6 ila 10 haftalik) (Charles River Laboratories Japan, Inc.) abdominal kavitesine uygulanmistir. Bundan 5 gün sonra, makrofajlar abdominal kaviteden toplanmistir. Makrofajlar 500 uL/kuyucuk (1 x 105 hücre/kuyucuk) olarak bir 24-kuyucuklu plakaya eklenmistir ve 37°C'de gece boyu kültürlenmistir. Bu sekilde hazirlanan makrofajlar, efektör hücreler olarak kullanilmistir.

Hedef hücreler olarak kullanilacak olan NCI-H322 hücrelerinin etiketlenmesi, PKH26 boya etiketleme kiti (Sigma Co., Ltd.) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Hedef hücreler, TrypLE (Invitrogen Corporati0n) ile sökülmüstür ve PBS ile iki kere yikanmistir.

Hücreler, 1 x 107 hücre/ml'de Diluent C içinde süspanse edilmistir. PKH26 boya stoku (1 mM), Diluent C ile 8 uM`ye seyreltilmistir ve bundan hemen sonra, seyreltilmis boya çözeltisi hücre süspansiyonunkine esit olan bir miktarda buna eklenmistir. Elde edilen karisim 5 dakika boyunca oda sicakliginda birakilmistir. Akabinde, 1 ml serum buna eklenmistir ve ilaveten, serum içeren bir vasat buna eklenmistir ve yikama iki kere gerçeklestirilmistir. Bu sekilde hazirlanan hücreler hedef hücreler olarak kullanilmistir. Örnek 3)-6'da elde edilen antikor, bir kültür çözeltisi ile 20 ug/ml'ye seyreltilmistir. Bunu dagitilmistir ve karistirilmistir. Elde edilen karisim 30 dakika boyunca buz üzerinde beklemeye birakilmistir. Süpernatant uzaklastirilmistir ve hücreler bir kültür çözeltisi ile iki kere yikanmistir ve bir kültür çözeltisinin 500 ul'si içinde süspanse edilmistir.

Süpernatant efektör hücrelerden uzaklastirilmistir ve antikor ile muamele edilmekte olan ve kültür çözeltisi içinde süspanse edilmis hücreler buna eklenmistir ve bununla karistirilmistir. Akabinde, hücreler bir C02 inkübatörü içinde 3 saat boyunca kültürlenmistir. Bundan sonra, hücreler Tripsin-EDTA ile sökülmüstür ve toplanmistir.

Toplanmis hücrelere, bir FITC-etiketlenmis anti-fare CD11b antikoru (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) eklenmistir ve elde edilen karisim 30 dakika boyunca buz üzerinde beklemeye birakilmistir. Süpernatant uzaklastirilmistir ve hücreler bir kültür çözeltisi ile iki kere yikanmistir. Toplanan hücreler bir kültür çözeltisinin 300 ul'si içinde süspanse edilmistir ve FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) ile analiz edilmistir. CD11b-pozitif makrofajlarda, bir PKH26-pozitif fraksiyon fagositoz- pozitif hücreler (n=3) olarak degerlendirilmistir. vermesi için makrofajlar tarafindan NCI-H322 hücrelerinin fagositozunu indüklemistir.

ADCP aktivitesine sahip oldugu gösterilmistir.

Ayni sekilde, piyasada satilan anti-B7-H3 antikorlari elde edilmistir ve bunun ADCP aktivitesi ölçülmüstür. Bir siçan anti-insan B7-H3 antikoru MIH35 (eBioscience Company), bir fare anti-insan B7-H3 antikoru , MIH42 (Serotec Co., Ltd.) ve DCN7O (Biolegend Company) elde edilmistir. Bu antikorlarin Örnek 3)-3'teki ile ayni sekilde B7-H3'ü bagladigi konfirme edilmistir. Bu antikorlar kullanilarak, ADCP aktivitesi yukaridaki yöntem ile ölçülmüstür.

Sonuç olarak, Sekil 2'de gösterildigi üzere, 1 ug/ml'de eklenmis oldugunda, MIH35, için makrofajlar tarafindan NCI-H322 hücrelerinin fagositozunu indüklemistir. Bu dogrultuda, MIH35'in, MIH42'nin ve DCN70'in neredeyse hiç ADCP aktivitesi göstermedigi ortaya çikarilmistir.

Bu sonuçlardan, tarama ile elde edilen B7-H3'ü taniyan M30 klonlarinin piyasada satilan B7-H3 antikorlarina kiyasla göze çarpan bir sekilde daha yüksek ADCP aktivitesine sahip oldugu gösterilmistir. 4)-2 ADCC aktivitesi 4)-2-1 Efektör hücrelerin preparasyonu Dalak, bir çiplak CAnN.Cg-Foxn1"U/CrICrlj faresinden (Charles River Laboratories Japan, Inc.) aseptik olarak kesip çikarilmistir. Kesip çikarilmis dalak iki lam cami ile homojenize edilmistir ve BD Pharm Lyse (BD Biosciences, Ltd. tarafindan üretilmistir, dalak hücreleri %10 Fetal Bovin Serumu, Ultra-düsük IgG (Invitrogen Corporation tarafindan üretilmistir) içeren fenol kirmizisi-içermeyen RPMI 1640 (Invitrogen Corporation tarafindan üretilmistir) (bundan sonra "ADCC vasati" olarak kisaltilmistir) içinde süspanse edilmistir ve hücre süspansiyonu bir hücre süzgeciden (por boyutu: 40 um, BD Biosciences, Ltd. tarafindan üretilmistir) geçirilmistir. Akabinde. canli hücreler bir tripan mavisi boya dislama analizi ile sayilmistir. Dalak hücre süspansiyonu sentrifüj edildikten sonra, vasat uzaklastirilistir ve hücreler 1,5 x 107 hücre/ml olan bir canli hücre yogunlugunda ADCC vasati içinde yeniden-süspanse edilmistir ve efektör hücreler olarak kullanilmistir. 4)-2-2 Hedef hücrelerin preparasyonu Örnek 3)-3'teki ile ayni sekilde hazirlanan B7-H3-eksprese eden 293 hücrelerine (ATCC) ve bos vektör ile transfekte edilmis 293 hücrelerine tripsin ile muamele edilmistir ve muamele edilmis her bir hücre tipi, RPMI 1640 (lnvitrogen Corporation) içeren %10 FBS ile yikanmistir ve akabinde RPMI 1640 içeren %10 FBS içinde yeniden-süspanse edilmistir. Her bir hücre tipi (4 x 106 hücre), bir 0,22 um'lik filtre yoluyla sterilize edilmis kromiyum-51 ( ile karistirilmistir ve etiketleme 37°C ve %5'lik CO2 kosullari altinda 1 saat boyunca gerçeklestirilmistir. Etiketlenmis hücreler RPMI 1640 (lnvitrogen Corporation) içeren %10 FBS ile üç kere yikanmistir ve hücreler ADCC vasati içinde 2 x 105 hücre/ml'de yeniden-süspanse edilmistir ve hedef hücreler olarak kullanilmistir. 4)-2-3 51Cr salim analizi 2 X 105 hücre/ml olan bir hücre yogunlugundaki hedef hücreler, bir 96-kuyucuklu U- sekilli tabanli mikro-plaka içinde 50 pI/kuyucuk olarak dagitilmistir. M30'un veya bir izotip kontrol antikorunun (mIgG2a) (eBioscience Company) 50 ul'si buna eklenmistir, ADCC vasati ile seyreltilmistir, böylece efektör hücrelerin eklenmesinden sonra antikorun nihai konsantrasyonu, 2,5 ug/ml'dir. Akabinde, plaka 4°C'de 1 saat boyunca beklemeye birakilmistir. Bundan sonra, 1,5 x 107 hücre/ml olan bir hücre yogunlugundaki efektör hücrelerin 100 ul'si buna eklenmistir ve hücreler 37°C ve %5'lik CO2 kosullari altinda gece boyu kültürlenmistir. Sonraki gün, süpernatant bir LumaPlate (PerkinEImer, Inc. tarafindan üretilmistir) içinde toplanmistir ve bundan yayilan gama radyasyonu bir gama sayici kullanilarak ölçülmüstür. ADCC aktivitesi tarafindan neden olunan hücre Iizisinin yüzdesi, asagidaki denkleme göre hesaplanmistir.

Hücre lizisinin yüzdesi (9st.) = (A-B) (os) x 100 A: örnek kuyucugundan radyasyon sayimi B: (Antikorun ve efektör hücrelerin eklenmedigi kuyucuklardan) ortalama spontan radyasyon emisyon sayimi (n=3). ADCC vasatinin antikor ekleme zamaninda 50 pl olan bir miktarda ve efektör hücreleri ekleme zamaninda 100 pl olan bir miktarda eklenmesi disinda, örnek kuyucugu için olan ile ayni prosedür gerçeklestirilmistir.

C: (Hedef hücrelerin bir sürfaktan ile çözündügü kuyucuklardan) ortalama maksimum radyasyon emisyon sayimi (n=3). Antikor ekleme zamaninda 50 ul olan bir miktarda ADCC vasatinin eklenmesi ve efektör hücreleri ekleme zamaninda 100 pl %2 (hacim/hacim) Triton X-1OO içeren ADCC vasatinin eklenmesi disinda, örnek kuyucugu için olan ile ayni prosedür gerçeklestirilmistir.

Gösterilen veriler üç-kopya hâlindeki ölçümlerin bir ortalamasidir ve hata çubuklari standart sapmalari temsil eder. P degeri, Student t-testi kullanilarak hesaplanmistir. Ölçüm sonuçlari Sekil 3'te gösterilir. hücre lizisi yüzdesi olan hücre lizisi aktivitesi göstermistir ve bundan dolayi, M30 antikorunun B7-H3-eksprese eden 293 hücrelerine karsi ADCC aktivitesine sahip oldugu gösterilmistir. 4)-3 CDC aktivitesi Örnek 2)-3'teki ile ayni sekilde bir deney gerçeklestirilmistir. Degerlendirmede kullanim için hücreler olarak, NCI-H322 hücreleri kullanilmistir. (Antibiyotikler: penisilin ve streptomisin içeren) RPMI -6'da elde antikoru (mlgGZa) eklenmistir, böylece komplemanin eklenmesinden sonra antikorun nihai konsantrasyonu 25 pg/ml'dir ve elde edilen karisim, 4°C`de 1 saat boyunca beklemeye birakilmistir. Buna, RPMI 1640 ile %30'a seyreltilmis olan tavsan komplemani (Cedarlane Laboratories tarafindan üretilmistir, #CL3051) eklenmistir, böylece komplemanin nihai konsantrasyonu %5'tir ve elde edilen karisim 37°C ve sicakliginda 30 dakika boyunca beklemeye birakilmistir. Hücre viabilitesini ölçmek için, CeIITiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation tarafindan üretilmistir) kültür çözeltisininkine esit olan bir miktarda buna eklenmistir ve elde edilen karisim oda sicakliginda 10 dakika boyunca karistirilmistir. Bundan sonra, asagidaki denkleme göre hesaplanmistir.

Hücre viabilitesi [%1 = ia-bé .i' [Iz-b:: x 100 a: Örnek kuyucugundan Iüminesansin miktari b: (Hücrelerin ve antikorun eklenmedigi kuyucuklardan) arka-plan Iüminesansinin ortalama miktari (n=3). Hücre ekimi zamaninda hücre süspansiyonu yerine (antibiyotikler: penisilin ve streptomisin içeren) RPMI 1640 içeren %10 FBS'nin bir esit miktarinin eklenmesi ve antikoru ekleme zamaninda antikor seyreltme çözeltisininkine esit olan bir miktarda (antibiyotikler: penisilin ve streptomisin içeren) RPMl 1640 içeren %10 FBS'nin eklenmesi disinda örnek kuyucugu için olan ile ayni prosedür gerçeklestirilmistir. c: Antikorun eklenmedigi kuyucuklardan Iüminesansin ortalama miktari (n=3).

Antikoru ekleme zamaninda antikor seyreltme çözeltisininkine esit olan bir miktarda (antibiyotikler: penisilin ve streptomisin içeren) RPMI 1640 içeren %10 FBS'nin eklenmesi disinda örnek kuyucugu için olan ile ayni prosedür gerçeklestirilmistir. Ölçüm sonuçlari Sekil 4'te gösterilir. Gösterilen veriler üç-kopya hâlindeki ölçümlerin bir ortalamasidir ve hata çubuklari standart sapmalari temsil eder. Sonuç olarak, kontrol ve M31 antikorlarinin NCl-H322 hücrelerine karsi CDC aktivitesine sahip oldugu gösterilmistir. 4)-4 Baglama alaninin belirlenmesi M30'un hangi BT-H3 alanini bagladigi Örnek 3)-3'teki ile ayni sekilde bir akis sitometrik yöntem ile incelenmistir. Örnek 1)-1-3'te hazirlanan BT-H3 parsiyel proteinleri için ekspresyon vektörlerinin her biri ile transfekte edilmis NIH-3T3 hücreleri kullanilmistir.

B7-H3 IgV2'yi baglamamistir. amino asit numaralari ile temsil edilen amino asit dizisini) ve C2 alanini (SEO ID NO: 6'de 358 ila 456 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen amino asit dizisini) bagladigi gösterilmistir. Ayni sekilde ayrica, L8'in, L11'in ve M31'in Ci alanini ve C2 alanini bagladigi ve L7'nin V1 alanini (SEO ID NO: 6'de 27 ila 139 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen amino asit dizisini) ve V2 alanini (SEO ID NO: 6'da 245 ila 357 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen amino asit dizisini) bagladigi da gösterilmistir.

Bu dogrultuda, M30'un, her biri B7-H3 ekstraselüler alaninda bir alan olan, IgCl alani ve/veya IgC2 alani içindeki bir epitop tanidigi ve IgC1 alanini veya IgC2 alanini veya her ikisini bagladigi gösterilmistir. 4)-5 Antijen özgüllügü M30'un antijen özgüllügü, Örnek 3)-3'teki ile ayni sekilde bir akis sitometrik yöntem ile incelenmistir. proteinleri için, Örnek 1)-1-4'te hazirlanan ekspresyon vektörlerinin her biri ile transfekte edilmis 293T hücreleri kullanilmistir.

Sonuç olarak, M30'un, B7 familyasi molekülleri olan. CD80. CD86, B7-RP-1. BT-Hl, B7-DC ve B7-H4'ü baglamadigi gösterilmistir. Örnek 5. Iri vivo anti-tümör etkisi )-1 Anti-BT-H3 antikorunun in vivo anti-tümör etkisi NCI-H322 hücreleri bir kültür flaskindan bir tripsin muamelesi ile sökülmüstür ve RPMl 1640 (lnvitrogen Corporation) içeren %10 FBS içinde süspanse edilmistir, bunu sentrifügasyon izlemistir ve süpematant uzaklastirilmistir. Hücreler ayni vasat ile iki kere yikanmistir ve akabinde fizyolojik salin (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. tarafindan üretilmistir) içinde süspanse edilmistir. Akabinde, hücreler 6 haftalik BALB/cAJcI-nu/nu (CLEA Japan, lnc.) farelerinin bir grubunun her birinin aksiller bölgesine 1 X 107 hücre/fare olan bir doza subkütan olarak implante edilmistir. dozda intraperitoneal olarak uygulanmistir. Kontrol için, PBS antikorunkine esit olan bir hacimde (500 pl) intraperitoneal olarak uygulanmistir. Tümör hacmi günler 10'da, etkisi incelenmistir.

Sonuç olarak, M30 ve M31 uygulama gruplarinda, tümör büyümesi PBS uygulama grubuna kiyasla anlamli bir sekilde baskilanmistir (Gün 45'te tümör hacmi açisindan PBS uygulama grubuna kiyasla M30 ve M31 için P degerleri sirasiyla P<0,05'tir ve P<0,01'dir. P degerleri Student t-testi kullanilarak hesaplanmistir). Ilaveten, L7, L8, (antikor uygulama grubundaki ortalama tümör hacmi) / (PBS uygulama grubundaki etkisine sahip oldugu gözlenmistir (Sekil 6).

Yukaridaki sonuçlardan, M30 ve M31 antikorlarinin bir B7-H3 antijenini taniyan ve bir anti-tümör etkisi gösteren antikorlar oldugu ortaya çikarilmistir. )-2 Makrofajlarin deplesyonu kosullari altinda i'n vivo anti-tümör etkisi In vivo makrofajlari tüketmek Için, klodronat-enkapsüle edilmis Iipozomlar üretilmistir.

KIodronat-enkapsüle edilmis Iipozomlari in vivo uygulama ile, makrofajlarin in vivo rapordaki yönteme göre, klodronat-enkapsüle edilmis Iipozomlar üretilmistir asagidaki deneyde kullanilmistir.

NCI-H322 hücreleri bir kültür flaskindan bir tripsin muamelesi ile sökülmüstür ve RPMl 1640 (lnvitrogen Corporation) içeren %10 FBS içinde süspanse edilmistir, bunu sentrifügasyon izlemistir ve süpematant uzaklastirilmistir. Hücreler ayni vasat ile iki kere yikanmistir ve akabinde fizyolojik salin (PBS, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. tarafindan üretilmistir) içinde süspanse edilmistir. Akabinde, hücreler 6 haftalik her bir BALB/cAJcI-nu/nu (CLEA Japan, lnc.) faresinin aksiller bölgesine 1 x 107 hücre/fare olan bir doza subkütan olarak implante edilmistir. Implantasyon günü, gün -14 olarak alinmistir ve gruplama gün 0'da yapilmistir.

Farelerde makrofajlarin in vivo tüketilecegi bir grupta, klodronat-enkapsüle edilmis intravenöz olarak enjekte edilmistir. ilaveten, negatif kontrol grubunda, PBS ayni intravenöz olarak enjekte edilmistir. mg/kg) olan bir dozda her iki gruba intraperitoneal olarak uygulanmistir. PBS ayni ul) her iki gruba intraperitoneal olarak uygulanmistir. anti-tümör etkisi Incelenmistir (n=8).

Sonuçlar Tablolar 1'de ve 2'de ve Sekil 7'de gösterilir.

Son 2' GL'mS Gun 15 Tumor hacmi Clod Iip + PBS , Clod Iip 4.13:- _ , , , , , Tumor hacmi CIodIip+PBS , , R 5 ,- . .

PBS intravenöz uygulama + M30 antikoru intraperitoneal uygulama grubunda (PBS + M30 uygulama grubunda), tümör büyümesi, negatif kontrol görevi gören PBS intravenöz uygulama + PBS intraperitoneal uygulama grubu (PBS + PBS uygulama grubu) ile karsilastirildiginda anlamli bir sekilde baskilanmistir. Daha spesifik olmasi için, Gün 36'da tümör hacmi açisindan PBS + PBS uygulama grubu ile karsilastirildiginda PBS + M30 uygulama grubu için P degeri, P<0,05'tir (P degeri, Student t-testi kullanilarak hesaplanmistir). Ilaveten, gün 36'da tümör büyümesi inhibisyonu orani (= / (PBS + PBS uygulama grubunda ortalama tümör hacmi) x 100) %49,8'dir (Tablo 2).

Diger taraftan, kIodronat-enkapsüle edilmis Iipozom intravenöz uygulama + PBS intraperitoneal uygulama grubunda (Clod Iip + PBS uygulama grubunda) ve klodronat- enkapsüle edilmis Iipozom intravenöz uygulama + M30 antikoru intraperitoneal uygulama grubunda (Clod Iip + M30 uygulama grubunda), tümör büyümesinin baskilanmasi gözlenmemistir. Daha spesifik olmak için, gün 36`da tümör hacmi açisindan PBS + PBS uygulama grubu ile karsilastirildiginda Clod Iip + PBS uygulama grubu ve Clod Iip + M30 uygulama grubu için P degerleri sirasiyla P=O,52'dir ve P=1'dir (P degerleri, Student t-testi kullanilarak hesaplanmistir). ilaveten, gün 36'da tümör büyümesi inhibisyonu orani (= 100 - (Clod Iip + PBS uygulama grubunda veya Clod Iip + M30 uygulama grubunda ortalama tümör hacmi) / (PBS + PBS uygulama grubunda ortalama tümör hacmi) x 100) sirasiyla, -%21,2'dir ve -%1,4'tür (Tablo 2).

Tümör büyümesi inhibisyonu orani Gün Gün Gün Gün Gün Yukaridaki sonuçlardan, M30 antikorunun anti-tümör etkisinin klodronat-enkapsüle edilmis Iipozomlari uygulama ile baskilandigi gösterilmistir ve bundan dolayi, M30 antikorunun anti-tümör etkisinin agirlikli olarak makrofajlar tarafindan aracilik edilen bir etki oldugu ortaya çikarilmistir. Örnek 6. Fare antikoru M30 cDNA'sinin klonlanmasi ve dizinin belirlenmesi 6)-1 Fare antikoru M30'un agir ve hafif zincirlerinin N-ucu amino asit dizilerinin belirlenmesi Fare antikoru M30'un agir ve hafif zincirlerinin N-ucu amino asit dizilerini belirlemek için, Örnek 3)-6'da saflastirilan fare antikoru M30, SDS-PAGE ile ayrilmistir. Jel içindeki protein, ayirmadan sonra jelden bir PVDF membranina (por boyutu: 0,45 um, tamponu (25 mM NaCl, 10 mM sodyum borat tamponu, pH 8,0) ile yikanmistir ve bundan sonra bir boya çözeltisine (%50 metanol, %20 asetik asit, %0,05 Coomassie parlak mavisi) içine 5 dakika boyunca daldirilma ile boyanmistir, bunu %90 metanol ile boyasindan arindirma izlemistir. PVDF membrani üzerinde görsellestirilen agir zincire karsilik gelen bandin (daha küçük mobilitesi olan bandin) ve hafif zincire karsilik gelen bandin (daha büyük mobilitesi olan bandin) kisimlari kesip çikarilmistir.

Hafif zincire karsilik gelen bandin kismi, küçük bir miktardaki bir %05 polivinilpirrolidon/100 mM asetik asit çözeltisi içinde 37°C'de 30 dakika boyunca inkübe edilmistir, bunu su ile iyice yikama izlemistir. Bunu takiben, modifiye edilmis N-ucu rezidüsü, Pfu Pyroglutamate Aminopeptidase Kit'i (TaKaRaBio, Inc.) kullanilarak uzaklastirilmistir, bunu su ile yikama ve hava ile kurutma izlemistir. Akabinde, Procise (tescilli ticari marka) CLC Protein Sequencer Model 4920LC (Applied Biosystems, Inc.) kullanilarak bir otomatik Edman yöntemi (bakiniz, Edman et al., (1967) Eur. J.

Biochem. 1, 80) ile bunlarin ilgili N-ucu amino asit dizilerini tanimlamak için bir girisimde bulunulmustur.

Sonuç olarak, fare antikoru M30'un agir zincirine karsilik gelen bandin N-ucu amino asit dizisinin EVQLQQSGPE (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 44) oldugu belirlenmistir ve bunun hafif zincirine karsilik gelen bandin N-ucu amino asit dizisinin 6)-2 Fare antikoru M30'u üreten hibridomdan elde edilen mRNA'nin preparasyonu Fare antikoru MSO'un agir zincirinin ve hafif zincirinin her birini sifreleyen cDNA'Iari klonlamak için, mRNA, Quick Prep mRNA Purification Kit'i (GE Healthcare Corporation) kullanilarak fare antikoru M30'u üreten hibridomdan hazirlanmistir. 6)-3 Fare antikorun M30 cDNA'sinin klonlanmasi ve dizinin belirlenmesi Fare antikoru M30'un agir ve hafif zincirlerinin izotiplerinin Örnek 3)-5'te bulunan y2a ve K olduguna yönelik bulgulara ve Örnek 1-1'de belirlenen agir ve hafif zincirlerin N-ucu amino asit dizilerine ve antikorlarin amino asit dizilerinin veri tabanina (bakiniz, Kabat, E. A. et al., (1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. I and IIi U.S. Department of Health and Human Services) atfen, bir antikor geni kodlama bölgesinin 5'-ucu bölgesinin ve bunun bir durdurma kodonu içeren 3'-ucu bölgesinin her birine hibridize olan bir kaç oligonükleotid primeri sentezlenmistir ve agir zinciri sifreleyen bir CDNA ve hafif zinciri sifreleyen bir CDNA Örnek 6)-2'de hazirlanan mRNA ve TaKaRa One Step RNA PCR Kit'i (AMV) (TaKaRa Bio, Inc.) kullanilarak çogaltilmistir. Sonuç olarak, antikorun agir zincirini sifreleyen cDNA ve antikorun hafif zincirini sifreleyen CDNA asagidaki primer setleri ile çogaltilabilir.

Agir zincir için primer seti '-aagaattcatggaatggagttggata-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 46) '-aagatatctcatttacccggagtccgggagaa-B' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO:) Hafif zincir için primer seti '-aagaattcatggattttctggtgcag-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 48) '-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 49) PCR ile çogaltilan agir zinciri sifreleyen cDNA'nin ve hafif zinciri sifreleyen cDNA'nin her biri, pEF kullanilarak çogaltilmistir ve klonlanan agir zincirin ve hafif zincirin nükleotid dizilerinin her biri, bir gen dizisi analizörü ("ABI PRISM 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems" veya Dizileme reaksiyonunda, GeneAmp kullanilmistir.

Fare antikoru M30'un agir zincirini sifreleyen cDNA'nin belirlenen nükleotid dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 50 ile temsil edilir ve bunun amino asit dizisi, SEQ ID NO: 51 ile temsil edilir. ilaveten, SEQ ID NO.'Iari: 50'nin ve 51'in dizileri Sekil 21'de gösterilir.

Fare antikoru M30'un hafif zincirini sifreleyen cDNA'nin belirlenen nükleotid dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 52 ile temsil edilir ve bunun amino asit dizisi, SEQ lD NO: 53 ile temsil edilir. ilaveten, SEQ ID NO.'Iari: 52'nin ve 53'ün dizileri Sekil 22'de gösterilir. ilaveten, agir zincirin ve hafif zincirin amino asit dizileri, antikorlarin amino asit dizilerinin veri tabani olan, KabatMan (bakiniz, PROTEINS: Structure, Function and olarak, fare antikoru M30'un agir zincirinde, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 51'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen amino asit dizisinin degisken bölge oldugu bulunmustur. Ayrica, fare antikoru M30'un hafif zincirinde, Dizi Listesi'nde SEÇ) ID NO: 53'te 23 ila 130 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen amino asit dizisinin degisken bölge oldugu bulunmustur. Örnek 7. Kimerik antikor M30'un (cM3O antikorunun) üretilmesi 7)-1 Kimerik ve beserilestirilmis hafif zincir ekspresyon vektörü pEF6KCL'nin yapilmasi Bir sablon olarak bir pEFG/V5-HisB plazmidi (Invitrogen Corporation) kullanilarak ve ayrica asagidaki primerler de kullanilarak PCR gerçeklestirme ile, BGHpA'nin (Dizi pozisyonu: 2174) hemen downstream kismi ila Smal (Dizi pozisyonu: 2958) arasindaki bir DNA fragmani (f1 replikasyon orijini ve SV4O promotörü ve orijini içeren, bundan sonra "fragman A" olarak ifade edilen, bir DNA fragmani) elde edilmistir. '-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 54) '-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 55) Elde edilen fragman A ve bir insan K zinciri sekretuvar sinyalini, bir insan K zinciri sabit bölgesini ve bir insan poIi-A ekleme sinyalini sifreleyen bir DNA dizisi içeren bir DNA fragmani (SEQ lD NO: 56, bundan sonra "fragman B" olarak ifade edilir, SEQ ID NO: 56'nin dizisi ayrica Sekil 23'te de gösterilir) kesisen uzanti PCR ile birbirine baglanmistir. Burada fragman A'nin ve fragman B'nin birbirine baglandigi, bu sekilde elde edilen DNA fragmani, Kpnl ve Smal restriksiyon enzimleri ile sindirilmistir, bu Kpnl ve Smal restriksiyon enzimleri ile sindirilmis bir pEFGNS-HisB (Invitrogen Corporation) plazmidine baglanmistir, böylece EF1 promotörüne downstream bir sinyal dizisine, bir klonlama yerine, bir insan K zinciri sabit bölgesine ve bir Insan poIi-A ekleme sinyali dizisine sahip olan bir kimerik ve beserilestirilmis hafif zincir ekspresyon vektörü pEFGKCL yapilmistir. 7)-2 pEF1KCL'nin yapilmasi Yukarida-tarif edilen yöntem ile elde edilen pEFöKCL'yi Kpnl ve Smal restriksiyon enzimleri ile yarma ile elde edilen bir DNA fragmani, Kpnl ve Smal ile sindirilmis pEF1/myc-HisB'ye (Invitrogen Corporation) baglanmistir, böylece bir pEF1KCL plazmidi yapilmistir. 7)-3 Kimerik ve beserilestirilmis agir zincir ekspresyon vektörü pEF1FCCU'nun yapilmasi Insan lgG1'inin bir sinyal dizisinin ve bir sabit bölgesinin amino asitlerini sifreleyen bir DNA dizisi içeren bir DNA fragmani (SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:57'nin dizisi ayrica Sekil 24'te de gösterilir) Nhel ve Pmel restriksiyon enzimleri ile sindirilmistir ve Nhel ve Pmel ile sindirilmis pEF1KCL plazmidine baglanmistir, böylece EF1 promotörüne downstream bir sinyal dizisine, bir klonlama yerine, bir insan agir zincir sabit bölgesine ve bir insan poli-A ekleme sinyali dizisine sahip olan bir kimerik veya beserilestirilmis agir zincir ekspresyon vektörü pEF1FCCU yapilmistir. 7)-4 M30 kimerasi-tipi hafif zincir ekspresyon vektörünün yapilmasi Bir sablon olarak fare antikoru M30'un hafif zincirini sifreleyen cDNA kullanilarak ve ayrica KOD-Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.) ve asagidaki primer seti de kullanilarak, hafif zincir degisken bölgesini sifreleyen cDNA'yi içeren bir bölge çogaltilmistir. Çogaltilmis ürünü Ndel ve BsiWI restriksiyon enzimleri ile yarma ile elde edilen bir DNA fragmani, Ndel ve BsiWI restriksiyon enzimleri ile yarilmis yerden evrensel kimerik ve beserilestirilmis antikor hafif zincir ekspresyon vektörü (pEFGKCL) içine yerlestirilmistir, böylece bir M30-kimerasi-tipi hafif zincir ekspresyon vektörü yapilmistir. Bu sekilde elde edilen ekspresyon vektörü, "pEFGKCL/MBOL" olarak adlandirilmistir. M30- kimerasi-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 58 ile temsil edilir ve bunun amino asit dizisi, SEQ ID NO: 59 ile temsil edilir. SEQ ID NO.'Iari: 58'in ve 59'un dizileri Sekil 25'te gösterilir. Bu arada, Dizi Listesi`nde SEQ lD NO: 59 ile temsil edilen cM30 antikoru hafif zincirinin amino asit dizisinde pozisyon 128'deki bir treonin rezidüsü, hafif zincir degisken bölgesinin karboksil ucunda yer alir ve Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 53 ile temsil edilen M30 antikoru hafif zincirinin amino asit dizinde pozisyon 130'daki bir alanin rezidüsüne karsilik gelir, bununla birlikte, SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen amino asit dizisinde, rezidü hâlihazirda, bir insan antikoru hafif zincirinden türetilen bir treonin rezidüsü ile sübstüte edilmistir.

Hafif zincir için primer seti '-aaacatatggccaaattgttctctcccagtctccaacaatcc-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: '-aaacgtacgtttcagctccagcttggtcccagtaccg-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 61) 7)-5 M30 kimerasi-tipi agir zincir ekspresyon vektörünün yapilmasi Bir sablon olarak fare antikoru M30'un agir zincirini sifreleyen cDNA kullanilarak, KOD- Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.) ve asagidaki primer seti A kullanilarak PCR gerçeklestirme ile elde edilen bir DNA fragmani, asagidaki primer seti C kullanilarak kesisim uzanti PCR yoluyla asagidaki primer seti B kullanilarak PCR gerçeklestirme ile elde edilen bir DNA fragmanina baglanmistir, böylece degisken bölge içindeki Blpl uzaklastirilmistir ve ayrica agir zincir degisken bölgesini sifreleyen cDNA'yi içeren bir bölge de çogaltilmistir. Çogaltilmis ürünü Blpl restriksiyon enzimi ile yarma ile elde edilen bir DNA fragmani, Blpl restriksiyon enzimi ile yarilmis yerden evrensel kimerik ve beserilestirilmis antikor agir zincir ekspresyon vektörü (pEF1FCCU) içine yerlestirilmistir, böylece bir M30-kimerasi-tipi agir zincir ekspresyon vektörü yapilmistir.

Bu sekilde elde edilen ekspresyon vektörü “pEF1FCCU/M3OH" olarak adlandirilmistir.

M30 kimerasi-tipi agir zincirin nükleotid dizisi, Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 62 ile temsil edilir ve bunun amino asit dizisi, SEQ ID NO: 63 ile temsil edilir. Ilaveten, SEQ ID NO.'Iari: 62'nin ve 63'ün dizileri Sekil 26'da gösterilir.

Primer seti A '-aaagctgagcgaggtccagctgcagcagtctggacctgag-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: '-gaggtcaggctgctgagttccatgtaggctgtgctg-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 65) Primer seti B '-cagcacagcctacatggaactcagcagcctgacctc-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO:66) '-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccag-3' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: Primer seti C '-aaagctgagcgaggtccagctgcagcagtctggacctgag-3' (Dizi Listesi'nde SEQ lD NO: '-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccag-S' (Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 7)-6 Kimerik antikor M30'un preparasyonu 7)-6-1 Kimerik antikor M30'un üretilmesi Logaritmik büyüme fazindaki 1,2 x 109 hücre FreeSter 293F hücresi (Invitrogen Corporation) 1,2 L'Iik taze FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corporation) içine ekilmistir ve 37°C'de %8'Iik bir C02 inkübatörü içinde 90 rpm'de çalkalama ile 1 saat boyunca kültürlenmistir. 3,6 mg polietilenimin (Polyscience #24765), 20 ml Opti- Pro SFM vasati (Invitrogen Corporation) içinde çözünmüstür. Bunu takiben, PureLink HiPure Plasmid Kit'i (Invitrogen Corporation) ile hazirlanan pEF1FCCU/M30H (0,4 mg) ve pEF6KCL/M30L (0,8 mg) 20 ml Opti-Pro SFM vasati içinde süspanse edilmistir.

Akabinde, elde edilen ekspresyon vektörleri/Opti-Pro SFM karma sivisinin 20 ml'si, elde edilen polietilenimin/Opti-Pro SFM karma sivisinin 20 ml'sine eklenmistir ve elde edilen karisim hafif bir sekilde karistirilmistir ve akabinde 5 dakika boyunca beklemeye birakilmistir. Bundan sonra, karisim FreeStyle 293F hücrelerine eklenmistir ve 90 rpm'de çalkalama kültürü 37°C'de %8'Iik bir 002 inkübatörü içinde 7 gün boyunca gerçeklestirilmistir. Elde edilen kültür süpernatanti, bir tek-kullanimlik kapsül filtre (Advantec #CCS-045-E1 H) ile filtreden geçirilmistir. pEF1FCCU/M30H'nin ve pEF6KCL/M30L'nin bir kombinasyonu ile elde edilen bir kimerik antikor M30, "cM30" veya "CMSO antikoru" olarak adlandirilmistir. Örnek 7)-6-1'de elde edilen kültür süpernatanti, rProtein A afinite kromatografisini (4 ila 6°C`de) (GE Healthcare Japan Corporation) ve seramik hidroksiapatiti (oda sicakliginda) içeren bir iki-adimli proses ile saflastirilmistir. rProtein A afinite kromatografisi ile saflastirmadan sonra ve seramik hidroksiapatit ile saflastirmadan sonra oda sicakliginda bir tampon degisim adimi gerçeklestirilmistir. Ilk olarak, 1100 ila 1200 ml kültür süpernatanti, PBS ile dengelenmis MabSeIect SuRe'ya (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation tarafindan üretilmistir, seri hâlde baglanmis iki HiTrap kolonu (hacim: 1 ml)) uygulanmistir. Tüm kültür çözeltisi kolona döküldükten sonra, kolon 15 ila 30 ml PBS ile yikanmistir. Bunu takiben, elüsyon bir 2 M arjinin hidroklorür çözeltisi (pH 4,0) ile gerçeklestirilmistir ve antikoru içeren bir fraksiyon toplanmistir. Fraksiyon, bir tuzundan arindirma kolonuna (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation tarafindan üretilmistir, seri hâlde baglanmis iki HiTrap tuzundan arindirma kolonu (hacim: 5 ml)) uygulanmistir, böylece tampon, pH 6,5'te 5 mM sodyum fosfat, 50 mM MES ve 20 mM NaCI içeren bir tampon ile degistirilmistir. ilaveten, tampon degisimine tabi tutulan antikor çözeltisi, pH 6,5'te 5 mM NaPi, 50 mM MES ve 20 mM NaCl içeren bir tampon ile dengelenmis bir seramik hidroksiapatit kolonuna (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT2-1 hidroksiapatit kolonu (hacim: 2 ml)) uygulanmistir. Akabinde, sodyum klorür ile lineer konsantrasyon gradyanli elüsyon gerçeklestirilmistir ve antikoru içeren bir fraksiyon toplanmistir.

Fraksiyon, bir tuzundan arindirma kolonuna (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation tarafindan üretilmistir, seri hâlde baglanmis iki HiTrap tuzundan arindirma kolonu (hacim: 5 ml)) uygulanmistir, böylece sivi, (10 mM sitrat tamponu ve 140 mM sodyum klorür, pH 6,0) içeren CBS ile degistirilmistir.

Son olarak, elde edilen çözelti Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (fraksiyonel moleküler agirlik: 30 K, Sartorius Co., Ltd., 4°C'de) kullanilarak konsantre edilmistir ve elde edilen çözelti bir saflastirilmis örnek olarak kullanilmistir. Örnek 8. cM30 antikorunun aktivitesi 8)-1 cM30 antikorunun B7-H3'ü baglama aktivitesi M30 antikoru veya CM3O antikoru ve B7-H3 antijeni arasindaki afinite bir yüzey plazmon rezonansi (SPR) cihazi (GE Healthcare Corporation) ile ölçülmüstür. Yaygin prosedürlere göre, bir anti-fare IgG veya bir anti-insan IgG antikoru bir sensör çipi üzerine immobilize edilmistir ve akabinde, M30 antikoru örnegi veya cM30 antikoru buna baglanmistir. Bundan sonra, bir rekombinant B7-H3 varyant 2 antijeninin bir ekstraselüler alan polipeptidi (R&D Systems, Inc. tarafindan üretilmistir, #2318-83- OSO/CF) farkli konsantrasyonlarda buna eklenmistir ve bir yürütme tamponu (fosfat tamponu, % içinde antikora baglanmis antijenin miktari zamanla ölçülmüstür. Ölçülen miktar, özel yazilim (BIAevaluation Versiyon 4.1, GE Healthcare Corporation) ile analiz edilmis ve bir ayrilma sabiti hesaplanmistir. olan bir ayrilma sabiti ile rekombinant BY-H3 antijenine baglandigi bulunmustur. Bu sonuçlardan, M30 antikorunun ve cM30 antikorunun B7-H3 antijenini bagladigi ve bunlarin baglama afinitelerinin büyük ölçüde esit oldugu konfirme edilmistir. 8)-2 cM30 antikorunun ADCP aktivitesi Bir saglikli süjenin periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'Ieri) yaygin prosedürlere göre izole edilmistir ve RPMI içeren %10 FBS içinde süspanse edilmistir ve akabinde bir flask içine ekilmistir. Hücreler bir 002 inkübatörü içinde gece boyu kültürlenmistir. Kültür süpernatanti uzaklastirilmistir ve flaska tutturulmus olan hücrelere, M-CSF ve GM-CSF ile takviye edilmis RPMI içeren %10 FBS eklenmistir ve hücreler 2 hafta boyunca kültürlenmistir. Hücreler TrypLE ile sökülmüstür ve toplanmistir. Akabinde, hücreler olarak bir 24-kuyucuklu plakaya eklenmistir ve 37°C'de gece boyu kültürlenmistir. Bu sekilde hazirlanan hücreler efektör hücreler olarak kullanilmistir.

Hedef hücreler olarak kullanilacak olan NCl-H322 hücrelerinin etiketlenmesi, PKH26 boya etiketleme kiti (Sigma Co., Ltd.) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Hedef hücreler, TrypLE ile sökülmüstür ve PBS ile iki kere yikanmistir. Hücreler, 1 x 107 hücre/ml'de Diluent C içinde süspanse edilmistir. PKH26 boya stoku (1 mM), Diluent C ile 8 uM'ye seyreltilmistir ve bundan hemen sonra, seyreltilmis boya çözeltisi hücre süspansiyonunkine esit olan bir miktarda buna eklenmistir. Elde edilen karisim 5 dakika boyunca oda sicakliginda birakilmistir. Akabinde, 1 ml serum buna eklenmistir ve ilaveten, serum içeren bir vasat buna eklenmistir ve yikama iki kere gerçeklestirilmistir.

M30 antikorunun ve cM30 antikorunun her biri bir kültür çözeltisi ile 20 ug/ml'ye Seyreltilmistir. Bunu takiben, hedef hücreler 2 x 106 hücre/100 ul/tüp olarak dagitilmistir ve karistirilmistir. Elde edilen karisim 30 dakika boyunca buz üzerinde beklemeye birakilmistir. Süpernatant uzaklastirilmistir ve hücreler bir kültür çözeltisi ile iki kere yikanmistir ve bir kültür çözeltisinin 500 ul'si içinde süspanse edilmistir. Süpernatant efektör hücrelerden uzaklastirilmistir ve antikor ile muamele edilmekte olan ve kültür çözeltisi içinde süspanse edilmis hücreler buna eklenmistir ve bununla karistirilmistir.

Akabinde, hücreler bir C02 inkübatörü içinde 3 saat boyunca kültürlenmistir. Bundan sonra, hücreler Tripsin-EDTA ile sökülmüstür ve toplanmistir. Toplanmis hücrelere, bir FITC-etiketlenmis anti-fare CD11b antikoru (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) eklenmistir ve elde edilen karisim 30 dakika boyunca buz üzerinde beklemeye birakilmistir. Süpernatant uzaklastirilmistir ve hücreler bir kültür çözeltisi ile iki kere yikanmistir. Toplanan hücreler bir kültür çözeltisinin 300 ul'si Içinde süspanse edilmistir ve FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) ile analiz edilmistir. CD11b- pozitif makrofajlarda, bir PKH26-pozitif fraksiyon fagositoz-pozitif hücreler olarak degerlendirilmistir.

Sonuç olarak, Sekil 8'de gösterildigi üzere, M30 antikoru ve cM30 antikoru 10 ug/ml'de eklendiginde, makrofajlar tarafindan NCI-H322 hücrelerinin fagositozu sirasiyla %33 ± 1'e ve %35 ± 2'ye indüklenmistir. Bu dogrultuda, cM30 antikorunun NCI-H322 hücrelerine karsi M30 antikoru ile ayni sekilde bir ADCP aktivitesine sahip oldugu gösterilmistir. Benzer bir deneysel sonuç ayrica, MDA-MB- karsi bir ADCP aktivitesi için de elde edilmistir. 8)-3 cM30 antikorunun in vivo anti-tümör etkisi MDA-MB-231 hücreleri bir kültür flaskindan bir tripsin muamelesi ile sökülmüstür ve RPMI içeren %10 FBS içinde süspanse edilmistir, bunu sentrifügasyon izlemistir ve süpematant uzaklastirilmistir. Hücreler ayni vasat ile iki kere yikanmistir ve akabinde BD Matrigel Basement Membrane Matrix (BD Biosciences, Inc. tarafindan üretilmistir) içinde süspanse edilmistir. Akabinde, hücreler 6 haftalik her bir farenin (CB17/Icr-Prkdc[scid]/CrICrlj, Charles River Laboratories Japan, Inc.) aksiller bölgesine 5 x 106 hücre/fare olan bir doza subkütan olarak implante edilmistir. Implantasyon günü gün 0 olarak alinmistir ve günler 14'te, 21'de, mg/kg) olan bir dozda intraperitoneal olarak uygulanmistir. Tümör hacmi günler 14'te, ve antikoru uygulamanin anti-tümör etkisi incelenmistir.

Sonuç olarak, M30 ve cM30 antikoru uygulama gruplarinda, tümör büyümesi, burada antikorun uygulanmadigi muamele edilmemis grup ile karsilastirildiginda anlamli bir sekilde baskilanmistir. Gün 52'de tümör agirligi açisindan muamele edilmemis grup ile karsilastirildiginda M30 antikoru ve CM3O antikoru için P degerlerinin her ikisi de, P<0,001'dir. P degerleri, Dunnett çoklu karsilastirma testi kullanilarak hesaplanmistir. ilaveten, gün 52'de tümör büyümesi inhibisyonu orani (= 100 - (antikor uygulama grubunda ortalama tümör hacmi) / (muamele edilmemis grupta ortalama tümör hacmi) dogrultuda, cM30 antikorunun M30 antikoru ile ayni sekilde çok güçlü bir in w'vo anti- tümör etkisine sahip oldugu gözlenmistir (Sekil 9). Örnek 9. Fare anti-insan B7-H3 antikorunun beserilestirilmis antikorunun #M30 tasarlanmasi 9)-1 Beserilestirilmis M30 antikorunun tasarlanmasi 9)-1-1 M30 degisken bölgelerinin moleküler modellenmesi M30 degisken bölgelerinin moleküler modellenmesi, genel olarak homoloji modellemesi kaydedilmis insan immünoglobülininin degisken bölgelerinin primer dizileri (X-isini kristal yapilarindan türetilen üç-boyutlu yapilar mevcuttur), Örnek 6-3'te belirlenen M30 degisken bölgeleri ile karsilastirilmistir.

Sonuç olarak, SBKY, çerçevede benzer sekilde bir silinmeye sahip olan antikorlar arasinda M30 hafif zincir degisken bölgesi ile en yüksek dizi homolojisine sahip olan bir dizi olarak seçilmistir. Ilaveten, 3DGG, M30 agir zincir degisken bölgesi ile en yüksek dizi homolojisine sahip olan bir dizi olarak seçilmistir.

Bir çerçeve bölgesinin üç-boyutlu yapisi, M30 hafif zincirine karsilik gelen BBKY koordinatlarini M30 agir zincirine karsilik gelen 3DGG koordinatlari ile birlestirme ile bir 93), CDRH3'ünkiIere (SEO ID NO: 94), CDRL1'inkiIere (SEO ID NO: 95), CDRL2'ninkiIere (SEO ID NO: 96) ve CDRL3'ünkiIere (SEO ID NO: 97) en çok benzeyen konformasyonlari tanimlayan koordinatlar olarak sirasiyla 2HOJ, 1BBD, 1090, 2FBJ, 1LNK ve 1TET seçilmistir ve çerçeve modeline katilmistir.

Son olarak, enerji açisindan M30 degisken bölgesinin bir olasi moleküler modelini elde etmek amaciyla, dezavantajli interatomik temasi dislamak için bir enerji hesaplamasi yapilmistir. Yukaridaki prosedür, piyasada satilan protein tersiyer yapisi tahmin programi Primer ve koordinat arama programi MacroModel (Schrodinger, LLC) kullanilarak yürütülmüstür. 9)-1-2 Beserilestirilmis M30'un amino asit dizisinin tasarlanmasi Bir beserilestirilmis M30 antikoru, genel olarak CDR greftleme olarak bilinen bir Bir akseptör antikor, çerçeve bölgesi içindeki amino asit homolojisine göre seçilmistir.

M30'un çerçeve bölgesinin dizisi, antikor amino asit dizilerinin Kabat Database (Nuc.

Sonuç olarak, bir mAb49'CL antikoru (NCBI içindeki GenBank: D16838.1 ve D16837.1), çerçeve bölgesindeki %70'Iik bir dizi homolojisine göre bir akseptör olarak seçilmistir. mAb49'CL'nin çerçeve bölgesindeki amino asit rezidüleri, MSO'un amino asit rezidüleri ile hizalanmistir ve farkli amino asitlerin kullanildigi pozisyonlar tanimlanmistir. Bu rezidülerin pozisyonlari, yukarida yapilan M30`un üç-boyutlu modeli kullanilarak analiz edilmistir. Akabinde, akseptör üzerine grefte edilecek olan donör rezidüleri Queen et göre seçilmistir. Seçilen bazi donör rezidülerini akseptör antikora transfer etme ile, beserilestirilmis M30 antikoru dizileri asagidaki Örnek'te tarif edildigi üzere yapilmistir. 9)-2 M30 agir zincirinin beserilestirilmesi 9)-2-1 M30-H1-tipi agir zincir: Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 63 ile temsil edilen cM30 agir zincirinin 20 (glutamik asit), 106 (treonin), 110 (serin), 136 (treonin) ve amino asit numaralarini sirasiyla glutamin, valin, alanin, valin, Iizin, serin, valin, arjinin, alanin, metiyonin, arjinin, valin, izolösin, alanin, glutamik asit, treonin, arjinin, treonin, Iösin ve valin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 agir zinciri, "M30-H1-tipi agir zincir" olarak adlandirilmistir.

M30-H1-tipi agir zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 85 ile temsil edilir. 9)-2-2 M30-H2-tipi agir zincir: Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen CM3O agir zincirinin 20 (glutamik asit), (treonin), 110 (serin), 136 (treonin) ve amino asit numaralarini sirasiyla glutamin, valin, alanin, valin, Iizin, serin, valin, arjinin, alanin, arjinin, valin, izolösin, alanin, glutamik asit, treonin, arjinin, treonin, Iösin ve valin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 agir zinciri "M30-H2-tipi agir zincir" olarak adlandirilmistir.

M30-H2-tipi agir zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 87 ile temsil edilir. 9)-2-3 M30-H3-tipi agir zincir: Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen cM30 agir zincirinin 24 (glutamin), 28 amino asit numaralarini sirasiyla valin, alanin, valin, lizin, serin, valin, alanin, izolösin, alanin, glutamik asit, treonin, arjinin, treonin, Iösin ve valin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 agir zinciri "M30-H3-tipi agir zincir" olarak adlandirilmistir.

M30-H3-tipi agir zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 89 ile temsil edilir. 9)-2-4 M30-H4-tipi agir zincir: Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen cM30 agir zincirinin 24 (glutamin), 28 (treonin), 110 (serin), 136 (treonin) ve amino asit numaralarini sirasiyla valin, alanin, valin, Iizin, serin, valin, alanin, treonin, arjinin, treonin, lösin ve valin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 agir zinciri "M30-H4-tipi agir zincir" olarak adlandirilmistir.

M30-H4-tipi agir zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 91 ile temsil edilir. 9)-3 M30 hafif zincirinin beserilestirilmesi 9)-3-1 M30-L1 -tipi hafif zincir: Dizi Listesinde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen cM3O hafif zincirinin 21 (glutamin), 25 amino asit numaralarini sirasiyla glutamik asit, treonin, alanin, treonin, lösin, arjinin, alanin, lösin, serin, glutamin, alanin, arjinin, lösin, lösin, izolösin, aspartik asit, fenilalanin, treonin, Iösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M3O hafif zinciri "M30-L1- tipi hafif zincir" olarak adlandirilmistir.

M30-L1-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 71 ile temsil edilir. 9)-3-2 M30-L2-tipi hafif zincir: Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen cM3O hafif zincirinin 21 (glutamin), 25 amino asit numaralarini sirasiyla glutamik asit, treonin, alanin, treonin, Iösin, arjinin, alanin, Iösin, serin, glutamin, alanin, arjinin, Iösin, izolösin, aspartik asit, treonin, Iösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 hafif zinciri "M30-L2-tipi hafif zincir" olarak adlandirilmistir.

M30-L2-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 73 ile temsil edilir. 9)-3-3 M30-L3-tipi hafif zincir: Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen cM30 hafif zincirinin 29 (treonin), 30 alanin, Iösin, alanin, Iösin, izolösin, treonin, Iösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 hafif zinciri M30-L3-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 75 ile temsil edilir. 9)-3-4 M30-L4-tipi hafif zincir: Dizi Listesi'nde SEQ lD NO: 59 ile temsil edilen CM30 hafif zincirinin 21 (glutamin)i 25 (treonin), amino asit numaralarini sirasiyla glutamik asit, treonin, alanin, treonin, Iösin, arjinin, alanin, Iösin, serin, glutamin, alanini arjinin, Iösin, izolösin, aspartik asit, fenilalanin, treonin, serin, Iösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 hafif zinciri M30-L4-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEO ID NO: 77 ile temsil edilir. 9)-3-5 M30-L5-tipi hafif zincir: Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 59 ile temsil edilen CM3O hafif zincirinin 29 (treonin), 30 amino asit numaralarini sirasiyla alanin, treonin, Iösin, arjinin, alanin, Iösin, alanin, izolösin, treonin, lösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 hafif zinciri "M30-L5-tipi hafif zincir" olarak adlandirilmistir.

M30-L5-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 79 ile temsil edilir. 9)-3-6 M30-L6-tipi hafif zincir: Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 59 ile temsil edilen CM30 hafif zincirinin 21 (glutamin), 25 treonin, Iösin, arjinin, alanin, Iösin, serin, glutamin, alanin, arjinin, Iösin, izolösin, aspartik asit, fenilalanin, treonin, Iösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M3O hafif zinciri "M30-L6- tipi hafif zincir" olarak adlandirilmistir.

M30-L6-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEQ ID NO: 81 ile temsil edilir. 9)-3-7 M30-L7-tipi hafif zincir: Dizi Listesi'nde SEO lD NO: 59 ile temsil edilen cM30 hafif zincirinin 21 (glutamin), 25 arjinin, alanin, lösin, serin, glutamin, alanin, arjinin, lösin, izolösin, aspartik asit, treonin, lösin, prolin, fenilalanin, valin, glutamin, valin ve izolösin ile sübstüte etme ile tasarlanan bir beserilestirilmis M30 hafif zinciri "M30-L7-tipi hafif zincir" olarak adlandirilmistir.

M30-L7-tipi hafif zincirin amino asit dizisi, SEO ID NO: 83 ile temsil edilir. (Örnek 10) Beserilestirilmis antikorun üretilmesi ekspresyon vektörlerinin yapilmasi Dizi Listesi'nde SEO ID NO: 71'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari, SEO lD arasindaki amino asit numaralari, SEO ID NO: 77'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari, SEO ID NO: 79'da 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari, SEO ID geni içeren DNA'lar, amino asit dizilerine göre yukaridaki SEO ID NO.'lara karsilik sentezlenmistir (GENEART, Inc. Artificial Gene Synthesis Service). Akabinde, sentezlenmis DNA'lari Ndel ve BsiWl restriksiyon enzimleri ile yarma ile elde edilen DNA fragmanlarinin her biri, Ndel ve BsiWI restriksiyon enzimleri ile yarilan yerden evrensel kimerik ve beserilestirilmis antikor hafif zincir ekspresyon vektörüne L6 ve M30-L7-tipi hafif zincir ekspresyon vektörleri yapilmistir.

Bu sekilde elde edilen ekspresyon vektörleri sirasiyla, "pEFöKCL/M30-L1", yapilmasi Dizi Listesi'nde SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari, SEQ ID arasindaki amino asit numaralari veya SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino zincir degisken bölgesini sifreleyen bir geni içeren DNA'Iar, amino asit dizilerine göre yukaridaki SEQ ID NO.'Iara karsilik gelen nükleotid dizilerine göre SEQ ID NO.'Iari: 84, 86, 88 ve 90'e göre sentezlenmistir (GENEART, Inc. Artificial Gene Synthesis Service).

Akabinde, sentezlenmis DNA'Iari Blpl restriksiyon enzimi ile yarma ile elde edilen DNA fragmanlarinin her biri, Blpl restriksiyon enzimi ile yarilan yerden evrensel beserilestirilmis antikor agir zincir ekspresyon vektörüne (pEF1FCCU) yerlestirilmistir, yapilmistir.

Bu sekilde elde edilen ekspresyon vektörleri sirasiyla, "pEF1FCCU/M30-H1", adlandirilmistir. )-3 Beserilestirilmis antikorun üretilmesi Logaritmik büyüme fazindaki 1,2 x 109 hücre FreeSter 293F hücresi (Invitrogen Corporation) 1,2 L'Iik taze FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corporation) içine ekilmistir ve 37°C'de %8'Iik bir C02 inkübatörü içinde 90 rpm'de çalkalama ile 1 saat boyunca kültürlenmistir. 3,6 mg polietilenimin (Polyscience #24765), 20 ml Opti- Pro SFM vasati (Invitrogen Corporation) içinde çözünmüstür. Bunu takiben, PureLink HiPure Plasmid Kit'i (Invitrogen Corporation) ile hazirlanan bir agir zincir ekspresyon vektörü (0,4 mg) ve bir hafif zincir ekspresyon vektörü (0.8 mg) 20 ml Opti-Pro SFM vasati içinde süspanse edilmistir. Akabinde, elde edilen ekspresyon vektörleri/Opti-Pro SFM karma sivisinin 20 ml'si, elde edilen polietilenimin/Opti-Pro SFM karma sivisinin ml'sine eklenmistir ve elde edilen karisim hafif bir sekilde karistirilmistir ve akabinde dakika boyunca beklemeye birakilmistir. Bundan sonra, karisim FreeStyle 293F hücrelerine eklenmistir ve 90 rpm'de çalkalama kültürü 37°C'de %8'lik bir 002 inkübatörü içinde 7 gün boyunca gerçeklestirilmistir. Elde edilen kültür süpernatanti, bir tek-kullanimlik kapsül filtre (Advantec #CCS-045-E1 H) ile filtreden geçirilmistir. pEF1FCCU/M30-H1'in ve pEF6KCL/M30-L2'nin bir kombinasyonu ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru "M30-H1-L2" olarak adlandirilmistir, M30'un pEF1FCCU/M30- H1'in ve pEF6KCL/M30-L3'ün bir kombinasyonu ile elde edilen bir beserilestirilmis pEFGKCL/M30-L4`ün bir kombinasyonu ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru L1'in bir kombinasyonu ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru "M30-H4-L1" olarak bir bBSerilestirilmis antikoru adlandirilmistir, antikoru olarak adlandirilmistir, adlandirilmistir, kombinasyonu adlandirilmistir, kombinasyonu adlandirilmistir, kombinasyonu adlandirilmistir, kombinasyonu adlandirilmistir, kombinasyonu adlandirilmistir kombinasyonu adlandirilmistir. ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru "M30-H4-L2" olarak M30'un pEF1FCCU/M30-H4'ün ve pEFöKCL/MSO-Lß'ün bir ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru "M30-H4-L3" M30'un pEF1FCCU/M30-H4'ün ve pEFGKCL/MSO-L4'ün bir ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru "M30-H4-L4" olarak ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru " M30-H1-L5" olarak ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru " M30-H1-L6" olarak ve M30'un pEF1FCCU/M30-H1'in ve pEFöKCL/M30-L7'nin bir ile elde edilen bir beserilestirilmis antikoru " M30-H1-L7" olarak )-4 Beserilestirilmis antikorun saflastirilmasi Örnek 10)-3'te elde edilen kültür süpernatanti, rProtein A afinite kromatografisini (4 ila 6°C`de) ve seramik hidroksiapatiti (oda sicakliginda) içeren bir iki-adimli proses ile saflastirilmistir. rProtein A afinite kromatografisi ile saflastirmadan sonra ve seramik hidroksiapatit ile saflastirmadan sonra oda sicakliginda bir tampon degisim adimi gerçeklesti rilmistir.

Ilk olarak, 1100 ila 1200 ml kültür süpernatanti, PBS ile dengelenmis MabSelect SuRe'ya (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation tarafindan üretilmistir, seri hâlde baglanmis iki HiTrap kolonu (hacim: 1 ml)) uygulanmistir. Tüm kültür çözeltisi kolona döküldükten sonra, kolon 15 ila 30 ml PBS ile yikanmistir. Bunu takiben, elüsyon bir 2 M arjinin hidroklorür çözeltisi (pH 4,0) ile gerçeklestirilmistir ve antikoru içeren bir fraksiyon toplanmistir. Fraksiyon, bir tuzundan arindirma kolonuna (GE Healthcare Bio- Sciences Corporation tarafindan üretilmistir, seri hâlde baglanmis iki HiTrap tuzundan arindirma kolonu (hacim: 5 ml)) uygulanmistir, böylece tampon, pH 6,5'te 5 mM sodyum fosfat, 50 mM MES ve 20 mM NaCI içeren birtampon ile degistirilmistir. ilaveten, tampon degisimine tabi tutulan antikor çözeltisi, pH 6,5'te 5 mM NaPi, 50 mM MES ve 20 mM NaCl içeren bir tampon ile dengelenmis bir seramik hidroksiapatit kolonuna (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT2-1 hidroksiapatit kolonu (hacim: 2 ml)) uygulanmistir. Akabinde, sodyum klorür ile lineer konsantrasyon gradyanli elüsyon gerçeklestirilmistir ve antikoru içeren bir fraksiyon toplanmistir.

Son olarak, elde edilen çözelti Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (fraksiyonel moleküler agirlik: 30 K, Sartorius Co., Ltd., 4°C'de) kullanilarak konsantre edilmistir ve elde edilen çözelti bir saflastirilmis örnek olarak kullanilmistir. )-5 Beserilestirilmis antikorun B7-H3 antijenini baglama özelligi Beserilestirilmis M30 antikorunun bir antijen olan insan BY-H3'ünü baglama özelligi bir yüzey plazmon rezonansi (SPR) cihazi (Biacore, Inc.) ile ölçülmüstür. Yaygin prosedürlere göre, bir anti-insan IgG antikoru bir sensör çipi üzerine immobilize edilmistir ve akabinde, yukarida 10)-4'te elde edilen beserilestirilmis M30 antikorlarinin saflastirilmis örneklerinin her biri buna baglanmistir. Bundan sonra, B?-H3 varyant 2 antijeninin bir ekstraselüler alan polipeptidi (R&D Systems, Inc. tarafindan üretilmistir, (fosfat tamponu, % içinde antikora baglanmis antijenin miktari zamanla ölçülmüstür. Ölçülen miktar, özel yazilim (BIAevaluation) ile analiz edilmistir ve bir ayrilma sabiti (Kd[M]) hesaplanmistir. Ölçüm, her bir ölçüm operasyonu için bir pozitif kontrol olarak CM30 antikoru kullanilarak gerçeklestirilmistir. Sonuçlar, Tablo 3'te gösterildigi sekildedir. Beserilestirilmis M30 antikorlarinin tümü, B7-H3 antijenine karsi M30-H1-L1 8,7E-O8 M30-H1-L2 1,0E-O7 M30-H1-L3 1,0E-07 M30-H1-L4 1,6E-O8 M30-H4-L1 1,3E-07 M30-H4-L2 1,4E-O7 M30-H4-L3 1,6E-O7 M30-H4-L4 1,2E-08 M30-H1-L5 1,9E-09 M30-H1-L6 3,4E-09 M30-H1-L7 2,7E-09 cM3O 7,3E-10 Örnek 11. cM30 antikorunun ve beserilestirilmis M30 antikorunun B7-H3 antijenini baglamak için M30 antikoruna karsi kompetitif inhibitör aktivitelerinin cM30 antikorunun ve beserilestirilmis M30 antikorunun (M30-H1-L4 antikorunun) B7- H3 varyant 1'i ve varyant 2'yi baglamak için M30 antikoruna karsi kompetitif inhibitör aktiviteleri asagidaki yöntem ile ölçülmüstür.

EZ-Link Sulfo-NHS-LC Biotinylation Kit (Thermo Scientific Corporation tarafindan üretilmistir, #21435) kullanilarak ve eklenmis protokole göre, ilgili fare monoklonal antikorlari M30 biyotinlenmistir (bundan sonra, ilgili biyotinlenmis M30 antikorlari bir tampon olarak, BD OPTI EIA (BD Biosciences, Inc., #550536) tüm durumlarda kullanilmistir.

B7-H3 varyant 1'in ekstraselüler alan polipeptidinin (R&D Systems, Inc. tarafindan (R&D Systems, Inc. tarafindan üretilmistir, # 2318-83-050/CF) her biri, bir kaplama tamponu ile 0,5 ug/ml'ye seyreltilmistir ve elde edilen çözelti bir immüno-plaka (Nunc, Akabinde, plakalar 4°C'de gece boyu beklemeye birakilmistir, böylece protein plakaya adsorbe olmustur. Sonraki gün, bir analiz diluenti 200 uL/kuyucuk olacak sekilde dagitilmistir ve plaka oda sicakliginda 4 saat boyunca beklemeye birakilmistir.

Her bir kuyucuktaki çözelti uzaklastirildiktan sonra, 5 ug/ml'deki biyotinlenmis antikorun ve her bir konsantrasyondaki (O ug/ml, 1 ug/ml, Sug/ml, 25 tig/ml, 50 ug/ml veya 125 ug/ml) bir etiketlenmemis antikorun bir karma çözelti, bir analiz diluenti içinde 100 uL/kuyucuk olacak sekilde dagitilmistir ve plaka oda sicakliginda 1 saat boyunca beklemeye birakilmistir.

Her bir kuyucuk bir yikama tamponu ile iki kere yikandiktan sonra, bir analiz diluenti ile 500-kat seyreltilmis olan bir streptavidin-yaban turpu peroksidaz konjugati (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation tarafindan üretilmistir, #RPN1231V) 100 uL/kuyucuk olacak sekilde eklenmistir ve plaka oda sicakliginda 1 saat boyunca beklemeye birakilmistir.

Her bir kuyucuktaki çözelti uzaklastirildiktan ve her bir kuyucuk bir yikama tamponu ile iki kere yikandiktan sonra, bir substrat çözeltisi 100 uL/kuyucuk olacak sekilde eklenmistir ve reaksiyon karisimi karistirilirken bir renk gelisimi reaksiyonunun ilerlemesine izin verilmistir. Renk gelisiminin tamamlanmasindan sonra, bir bloke etme tamponu, renk gelisimi reaksiyonunu durdurmak için 100 uL/kuyucuk olacak sekilde buna eklenmistir. Akabinde, bir plaka okuyucu kullanilarak 450 nm'de bir absorbans ölçülmüstür.

Sonuç olarak, yalnizca bM30'un eklendigi kuyucugun absorbansi, B7-H3 varyant 1'in ekstraselüler alaninin polipeptidinin eklendigi plakada 2.36 ± 0.05'tir (ortalama ± standart sapma (n=12)) ve BY-HS varyant 2'nin ekstraselüler alaninin polipeptidinin eklendigi plakada 1,90 ± 0,20'dir (ortalama ± standart sapma (n=12)).

Sekil 10'un grafiklerindeki absorbanslarin her biri, bir ortalama ± standart sapma (n=3) olarak ifade edilir. Kontrol IgG, bM30'un B7-H3'ü baglamasini inhibe etmemistir.

Diger taraftan, bM30'un B7-H3'ü baglamasinin, hem B7-H3 varyant 1'in ekstraselüler alaninin polipeptidinin eklendigi plakada hem de B7-H3 varyant 2'nin ekstraselüler alaninin polipeptidinin eklendigi plakada M30 antikorunun kendisi, cM30 antikoru, M30 antikorunun bir kimerik antikoru ve M30-H1-L4, bir beserilestirilmis antikor, tarafindan inhibe edildigi gösterilmistir.

Yani, cM30 antikorunun ve beserilestirilmis antikorun (M30-H1-L4 antikorunun), B7-H3 antijeninin M30 antikoru ile ayni epitopunu tanidigi gösterilmistir. Örnek 12. Beserilestirilmis M30 antikorunun aktivitesi 12)-1 Beserilestirilmis M30 antikorunun ADCP aktivitesi Bir saglikli süjenin PBMC'Ieri yaygin prosedürlere göre izole edilmistir ve RPMI 1640 içeren %10 FBS Içinde süspanse edilmistir ve akabinde bir flask içine ekilmistir.

Hücreler bir (302 inkübatörü içinde gece boyu kültürlenmistir. Kültür süpernatanti uzaklastirilmistir ve flaska tutturulmus olan hücrelere, M-CSF ve GM-CSF ile takviye edilmis RPMI içeren %10 FBS eklenmistir ve hücreler 2 hafta boyunca kültürlenmistir. Hücreler TrypLE ile sökülmüstür ve toplanmistir. Akabinde, hücreler olarak bir 24-kuyucuklu plakaya eklenmistir ve 37°C'de gece boyu kültürlenmistir. Bu sekilde hazirlanan hücreler efektör hücreler olarak kullanilmistir.

Hedef hücreler olarak kullanilacak olan NCI-H322 hücrelerinin etiketlenmesi, PKH26 boya etiketleme kiti (Sigma Co., Ltd.) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Hedef hücreler, TrypLE ile sökülmüstür ve PBS ile iki kere yikanmistir. Hücreler, 1 x 107 hücre/ml'de Diluent C içinde süspanse edilmistir. PKH26 boya stoku (1 mM), Diluent C ile 8 uM'ye seyreltilmistir ve bundan hemen sonra, seyreltilmis boya çözeltisi hücre süspansiyonunkine esit olan bir miktarda buna eklenmistir. Elde edilen karisim 5 dakika boyunca oda sicakliginda birakilmistir. Akabinde, 1 ml serum buna eklenmistir ve ilaveten, serum içeren bir vasat buna eklenmistir ve yikama iki kere gerçeklestirilmistir. antikorunun) her biri RPMI içeren %10 FBS ile 20 pg/ml'ye seyreltilmistir. Bunu takiben, hedef hücreler (NCI-H322 hücreleri) 2 x 106 hücre/100 til/tüp olarak dagitilmistir ve karistirilmistir. Elde edilen karisim 30 dakika boyunca buz üzerinde beklemeye birakilmistir. Süpernatant uzaklastirilmistir ve hücreler bir kültür çözeltisi ile iki kere yikanmistir ve bir kültür çözeltisinin 500 pl'si içinde süspanse edilmistir.

Süpernatant efektör hücrelerden uzaklastirilmistir ve M30 antikoru, cM30 antikoru veya beserilestirilmis M30 antikoru (M30-H1-L4 antikoru) ile muamele edilmekte olan ve kültür çözeltisi içinde süspanse edilmis hücreler buna eklenmistir ve bununla karistirilmistir. Akabinde, hücreler bir 002 inkübatörü içinde 3 saat boyunca kültürlenmistir.

Bundan sonra, hücreler Tripsin-EDTA ile sökülmüstür ve toplanmistir.

Toplanmis hücrelere, bir HTC-etiketlenmis anti-fare CD11b antikoru (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) eklenmistir ve elde edilen karisim 30 dakika boyunca buz üzerinde beklemeye birakilmistir.

Süpernatant uzaklastirilmistir ve hücreler bir kültür çözeltisi ile iki kere yikanmistir.

Toplanan hücreler bir kültür çözeltisinin 300 ul'si içinde süspanse edilmistir ve FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) ile analiz edilmistir. CD11b-pozitif makrofajlarda, bir PKH26-pozitif fraksiyon fagositoz-pozitif hücreler olarak degerlendirilmistir.

Sonuçlar Sekil 11'de gösterilir.

Beserilestirilmis M30 antikoru (M30-H1-L4 antikoru) eklemesi yapilan grupta, M30 antikoru veya cM30 antikoru eklemesi yapilan gruplarda olan ile ayni sekilde NCl-H322 hücrelerine karsi ADCP aktivitesi gözlenmistir. 12)-2 Beserilestirilmis M30 antikorunun ADCC aktivitesi Bir saglikli süjenin PBMC'Ieri yaygin prosedürlere göre izole edilmistir ve RPMI 1640 içeren %10 FBS içinde süspanse edilmistir ve akabinde bir flask içine ekilmistir.

Hücreler bir 002 inkübatörü içinde gece boyu kültürlenmistir.

Yüzen hücreler toplanmistir, bunu bir yikama prosedürü izlemistir ve elde edilen hücreler periferik kan Ienfositleri (PBL'Ier) olarak kullanilmistir. Elde edilen PBL'Ier %10 Fetal Bovin Serumu (Invitrogen Corporation tarafindan üretilmistir) içeren fenol kirmizisi-içermeyen RPMI (bundan sonra "ADCC vasati" olarak kisaltilmistir) içinde süspanse edilmistir ve hücre süspansiyonu bir hücre süzgeciden (por boyutu: 40 um, BD Biosciences, Ltd. tarafindan üretilmistir) geçirilmistir. Akabinde, canli hücreler bir tripan mavisi boya dislama analizi ile sayilmistir. PBL'Ierin süspansiyonu sentrifüj edildikten sonra, vasat uzaklastirilistir ve hücreler 2,5 x 106 hücre/ml olan bir canli hücre yogunlugunda ADCC vasati içinde yeniden-süspanse edilmistir ve efektör hücreler olarak kullanilmistir.

NCI-H322 hücrelerine tripsin ile muamele edilmistir ve muamele edilmis hücreler RPMI yeniden-süspanse edilmistir. Hücreler (4 x 106 hücre), bir 0,22 pm'lik filtre yoluyla sterilize edilmis kromiyum-51 ( ile karistirilmistir ve etiketleme 37°C ve %5'lik C02 kosullari altinda 1 saat boyunca gerçeklestirilmistir. Etiketlenmis hücreler ADCC vasati ile üç kere yikanmistir ve hücreler ADCC vasati içinde 2 x 105 hücre/ml'de yeniden-süspanse edilmistir ve hedef hücreler olarak kullanilmistir. 2 x 105 hücre/ml olan bir hücre yogunlugundaki hedef hücreler. bir 96-kuyucuklu U- sekilli tabanli mikro-plaka içinde 50 uI/kuyucuk olarak dagitilmistir. cM30 antikorunun böylece efektör hücrelerin eklenmesinden sonra antikorun nihai konsantrasyonu, 1, 10, efektör hücrelerin 100 ul'si buna eklenmistir ve hücreler 37°C ve %5'lik C02 kosullari altinda 4 saat boyunca kültürlenmistir. Süpernatant bir LumaPlate (PerkinElmer. Inc. tarafindan üretilmistir) içinde toplanmistir ve bundan yayilan gama radyasyonu bir gama sayici kullanilarak ölçülmüstür. ADCC aktivitesi tarafindan neden olunan hücre Hücre |IIJSII1II`I yüzdesi [95::: = IZ-'lrBIflC~B}X1ÜÜ A: örnek kuyucugundan radyasyon sayimi B: (Antikorun ve efektör hücrelerin eklenmedigi kuyucuklardan) ortalama spontan radyasyon emisyon sayimi (n=3). ADCC vasatinin antikor ekleme zamaninda 50 pl olan bir miktarda ve efektör hücreleri ekleme zamaninda 100 pl olan bir miktarda eklenmesi disinda, örnek kuyucugu için olan ile ayni prosedür gerçeklestirilmistir.

Sonuçlar Tablo 4'te ve Sekil 12'de gösterilir.

Gösterilen veriler üç kopya hâlindeki ölçümlerin bir ortalamasidir ve hata çubuklari standart sapmalari temsil eder. P degeri, Student t-testi kullanilarak hesaplanmistir.

M30-H1-L4 antikoru eklemesi yapilan grupta, cM30 antikoru eklemesi yapilan grupta olan ile ayni sekilde ADCC aktivitesi gözlenmistir. Ayrica, diger beserilestirilmis M30 ADCC aktivitesine sahip oldugu gözlenmistir.

H1-L4 12)-3 Beserilestirilmis M30 antikorunun in vivo anti-tümör etkisi MDA-MB-231 hücreleri bir kültür flaskindan bir tripsin muamelesi ile sökülmüstür ve RPMI 1640 (lnvitrogen Corporation) vasati içeren %10 FBS içinde süspanse edilmistir, bunu sentrifügasyon izlemistir ve süpernatant uzaklastirilmistir. Hücreler ayni vasat ile iki kere yikanmistir ve akabinde BD Matrigel Basement Membrane Matrix (BD Biosciences, Inc. tarafindan üretilmistir) içinde süspanse edilmistir. Akabinde, hücreler 6 haftalik farelerin (FOX CHASE SCID C.B.17/lcr-scid/soidJcl, CLEA Japan, Inc.) bir grubunun her birinin aksiller bölgesine 5 x 106 hücre/fare olan bir doza subkütan olarak implante edilmistir. Implantasyon günü gün 0 olarak alinmistir ve günler 14'te, 21'de, intraperitoneal olarak uygulanmistir. Tümör hacmi günler 14'te, 18'de, 21'de, 25'te, anti-tümör etkisi incelenmistir. mg/kg'da uygulama gruplarinda, tümör büyümesi, burada antikorun uygulanmadigi muamele edilmemis grup ile karsilastirildiginda anlamli bir sekilde baskilanmistir. uygulama gruplarinda, Gün 49'da tümör agirligi açisindan muamele edilmemis grup ile karsilastirildiginda tümör büyümesi inhibisyonu orani (= 100 - (antikor uygulama grubunda ortalama tümör agirligi) / (muamele edilmemis grupta ortalama tümör P degerleri, Dunnett çoklu karsilastirma testi kullanilarak hesaplanmistir. antikorunun tümör büyümesi inhibisyonu orani (= 100 - (antikor uygulama grubunda ortalama tümör hacmi) / (muamele edilmemis grupta ortalama tümör hacmi) x 100) antikorunun (M30-H1-L4 antikorunun) M30 antikoru ve CM3O antikoru ile ayni sekilde çok güçlü bir in vivo anti-tümör etkisine sahip oldugu gözlenmistir ve etkinin bir doz- yanit seklinde gösterildigi konfirme edilmistir (Sekil 38).

Endüstriyel Uygulanabilirlik Bulusun anti-BT-HS antikoru, anti-tümör aktivitesine sahiptir ve anti-BT-H3 antikorunu içeren farmasötik bilesim bir anti-kanser ajani olabilir.

Dizi Listesi Serbest Metin COOJNCDU'l-ÄQJNA PCR primeri 14 PCR primeri 15 B7-H3 IgV1'in amino asit dizisi B7-H3 IgC1'in amino asit dizisi B7-H3 IgV2'nin nükleotid dizisi B7-H3 IgV2'nin amino asit dizisi B7-H3 IgCZ'nin nükleotid dizisi B7-H3 IgCZ'nin amino asit dizisi B7-H3 IgC1-V2-C2'nin nükleotid dizisi B7-H3 IgC1-V2-C2'nin amino asit dizisi BT-H3 IgV2-C2'nin nükleotid dizisi B7-H3 IgV2-CZ'nin amino asit dizisi B7RP-1'in nükleotid dizisi B7RP-1'in amino asit dizisi B7-H1'in nükleotid dizisi B7-H1'in amino asit dizisi B7-DC'riin nükleotid dizisi B7-DC'nin amino asit dizisi CD80'in nükleotid dizisi CD80'in amino asit dizisi CD86'nin nükleotid dizisi CDSG'nin amino asit dizisi B7-H4'ün nükleotid dizisi B7-H4'ün amino asit dizisi fare antikoru M30 agir zincirinin N-ucu amino asit dizisi fare antikoru M30 hafif zincirinin N-ucu amino asit dizisi PCR primeri 16 PCR primeri 17 PCR primeri 18 PCR primeri 19 M30 antikoru agir zincirini sifreleyen cDNA'nin nükleotid dizisi M30 antikoru agir zincirinin amino asit dizisi M30 antikoru hafif zincirini sifreleyen cDNA'nin nükleotid dizisi SEO ID NO: 53: M30 antikoru hafif zincirinin amino asit dizisi SEO ID NO: 54: PCR primeri 20 SEO ID NO: 55: PCR primeri 21 SEO ID NO: 56: insan K zinciri sekretuvar sinyalini, insan K zinciri sabit bölgesini ve insan poIi-A ilave sinyalini sifreleyen DNA dizisi SEO ID NO: 57: insan IgG1'inin sinyal dizisinin ve sabit bölgesinin amino asitlerini sifreleyen DNA dizisini içeren DNA fragmani SEO ID NO: 58: M30 antikoru kimerasi-tipi hafif zinciri sifreleyen cDNA'nin nükleotid dizisi SEO ID NO: 59: M30 antikoru kimerasi-tipi hafif zincirin amino asit dizisi SEO ID NO: 60: PCR primeri 22 SEO ID NO: 61: PCR primeri 23 SEO ID NO: 62: M30 antikoru kimerasi-tipi agir zinciri sifreleyen cDNA'nin nükleotid dizisi M30 antikoru kimerasi-tipi agir zincirin amino asit dizisi PCR primeri 24 PCR primeri 25 PCR primeri 26 PCR primeri 27 PCR primeri 28 PCR primeri 29 M30-L1-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi M30-L1-tipi hafif zincirin amino asit dizisi M30-L2-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi M30-L2-tipi hafif zincirin amino asit dizisi M30-L3-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi M30-L3-tipi hafif zincirin amino asit dizisi M30-L4-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi M30-L4-tipi hafif zincirin amino asit dizisi M30-L5-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi M30-L5-tipi hafif zincirin amino asit dizisi M30-L6-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi M30-L6-tipi hafif zincirin amino asit dizisi M30-L7-tipi hafif zincirin nükleotid dizisi M30-L7-tipi hafif zincirin amino asit dizisi M30-H1-tipi agir zincirin nükleotid dizisi M30-H1-tipi agir zincirin amino asit dizisi M30-H2-tipi agir zincirin nükleotid dizisi M30-H2-tipi agir zincirin amino asit dizisi M30-H3-tipi agir zincirin nükleotid dizisi M30-H3-tipi agir zincirin amino asit dizisi M30-H4-tipi agir zincirin nükleotid dizisi M30-H4-tipi agir zincirin amino asit dizisi M30 antikoru CDRH1 amino asit dizisi M30 antikoru CDRH2 amino asit dizisi M30 antikoru CDRH3 amino asit dizisi M30 antikoru CDRL1 amino asit dizisi M30 antikoru CDRL2 amino asit dizisi M30 antikoru CDRL3 amino asit dizisi DIZI LISTESI <110> Daiichi Sankyo Company, Limited <120> Anti B7-H3 antikoru <130> DSPCT-FP1214 <160> 97 <170> Patentln versiyonu 3.4 <210> 1 <211> 46 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 1 <210> 2 <211> 66 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 2 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 3 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 4 <210> 5 <211> 1815 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 itgctgcqlc GÖOTOCCÖQQ SCCtüCtCQû qgcaCCQatg fngiigccna ctquitatct tgnaangcai tccqouattt qcafgaccnt CCGUCLÂCCQ ciudqaccct gcaqiatlcc ccctqçcatg qcagctgnca CQCIIK a! QCC guccctqqag CCLQCQSÇEO ocaqceqqat ggagqtccng qgagcacain qqoclaecct Qqatchcac Otuqqtqacc iqizgntggi ççtgtqcatq aaggisntqa qqctctolca QCQUUÜCtGC caigaiiziq actaqlqgil CLgaaQacce igctqgtgca tzocqaacca qonvaogqqa lutlctgqca agncaqacct CCLgqqagca öîlÜQLUÜCê caqcttigct qçachqclq Uîücaücttc ÖQQÜGüCJCQ ringgfgacn QQÖ\GQUCJQ qciocczatq QGIQÇJQJJC gcagcnictq LJCCâlQCll ctgztgtitç <210> 6 <211> 534 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Lou Gly A1; :4.3 Mp mis. Cya Inn› 'I'hr Gly Yil Pro clu Asp Pro Vai ?al Ala Lan V4- CLy Cyi Cyu Sex Ph: Sat Pro Slm Piv Gly Phe Set Cl; Gly Cin Asp C;n Ciy Sar Ala Tyr Ala Asu Pro kap Lan Lan Aia Cln Sly kan ula Sar Lan Ar; ?:1 Ala Asp C;i Giy Sa: Pha Ttr Cys Pho 115 120 Pro Sar Mat Thr ;nu Cin Pro Ann Lya Asp ;an Vai ?tr 110 Thr Cy: Sor Sor Ty: Cin GLy Ty: 3-.- r 3'i`0 1.921 1191: 3..!! 1' ri; 21:?) 91“) I' 435 440 445 Ala His Gly Ser Val rh: ile ?hr Gly Gln Pro Met ?hr Ph: ?:0 Pro 450 455 (63 Gîu Ala !eu Trp Ve] Phr Va] Gly !en Set Va] Cyg !en ,Iç &la !eu Ley Vii Ala ben AL. Pho Val Cye Trp Arg ;yi Iio Lys Gln Sor Cya Glu Glu Glu han Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Giu Gîy Sor Lys Thr Ala La: Cin Pro Lou Ly: HL: San Asp Sar Ly: Glu Asp <210> 7 <21 1 > 59 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 7 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 8 <210> 9 <211> 948 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ntgqtgcqca qaqaitqciu <210> 10 <211> 316 q:ctcicaqg cngatqncac YQÜQCGICCQ tccczcciqa tqgcnnlggn <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 qaccctgqig ctaccoquc CütqGQQQtü Ccaqçltqüü caaaçnnqnt GÇtUIQCûCQ tgggtgcaqn ctqagnctqq tqgcgqacgi thaqozqtt cqautoqcac crgtcaccit QQEQG$ÜGCt crgtgnggaq 56.:: G 1 '1' 1.el) <210> 11 <211> 52 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri 1.::: 14%“. 721!' <400> 11 <210> 12 <211> 55 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 12 <210>13 <211> 52 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 13 <210> 14 <211> 55 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 14 <210> 15 <211> 54 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 15 <210> 16 <211> 43 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 16 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 17 <210> 18 <211> 43 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 18 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 19 <210> 20 <211> 576 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 accrtgtgnt <210> 21 <211> 191 ÖLQQQQGQVO <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 ccagtçqtqq quvovcdqct caaaqciqtu ciczqvtw; tçqcacngct gçcaqcciat (ÇCâqCCîCl QCÜÜGIUÜCC lqcaw::qct Gly Ala Leu Glu ?al Gln ?al Pro Glu Asp Pr: Val Val Ala Leu Va; l 5 IC' 1'› Cly ?hr Asp Ala ?by ;an :y: Cys Sar Pha Süt Pro Giu Pro Cly Pha 2D 25 JC Ser Leu Ala Gln ;cu Ann Lcu ile ':p Sin ;:1 rh: Asp ?hr Lya Gln SC 55 60 70 75 80 Ala Glv Gln Pro Mat ?hr Phe Pro ?:0 GLu AL: Lou 115 120 .7 Cly Lan Sat V1; :ya ;nu Ile Ala Lau Lüu Vnl A;a Lan Ala ?ne Va; Cys ?tp Arg by: IL: :yi :in So: Cys CLu CLi C;i lan Al: Cly A1: Glu Asp Gln hap G-y Glu giy Glu Gly Sex ;ya !hr Alu Lan Sin ?:0 16.5 110 11': Lcu Lys Hiz Ser Azp Sor iys Glu Asp Asp Gly nin Glu :lc Ala 180 IES ;90 <210> 22 <211> 552 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 acggtgannn tzacgtgctc cagcticcig qgctiscctq aggctqagqt gttcrggcng ;28 çgnînnaiga <210> 23 <211> 183 gnaancnnql cracnquqva Yntgrntcat 93t9195993 cagcnntqna <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 gntgcigcag Qtctatqira tgcacrqcrg qnntclgaia cantckgaci QtuCdüatçQ ÇQZLIÇICIC uqqccrzqtq Crttcgigtg csccticaqc 1ga1gqacaa <210> 24 <211> 576 <212> DNA 11'_- <213> Homo sapiens <400> 24 - :3111 711:' 91:09 54'i!` <210> 25 <211>191 aqqtccnqvt schcqtqcu GLOQQQGÜOG <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 cuctçugqiu CCVUIQOtQV ccqgisctqc QAQOGUGQCC Caggtsgccs tckqlciqlc ccuzaçtqqq (CGItÇCâCl tccaqccicl OCLOOIQÜCC 613( Mu C1; Aip <210> 26 <211> 534 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 <210> 27 <211>177 qaaanrncgt caguagetqa quctvvcauc qntgcigcag iqaqqccctu 610 Ala qtqacuacçt twvtvaccq 1.0311 '.' rj.: cquaçutqvc gtgcgiatgq gCîCrgtfAC 939Ct919°9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 91'e) (31)' <210> 28 <211> 1188 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 .A161 1111'.

QGIGQÜCRQQ SQQBQGÖQCC lgctL0gtqa nccitcacqt itqisobtcc <210> 29 <211> 395 tzncqtgctc qzaaccccgt CÜGCBÜÜRQC qsatscwqqa Craqcatqnc csctqaetgq <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 caacçlqaâc CQIQIQCtOU agnnqntqnl qitgcqcaci CSOÜICÜCIQ qcluccglca aucoaqqec: isgacczgcg CQCaqatqqc BOQGCCCÜQI fggtqnacag C?9°CQGUQQ tQUQVUCGîQ lqqecaacça qqtqçsccta trtcancqaa UCBQGEZQGQ chciquca (31 i_i 1" ri: (31 :i Pxv Glu Asp P› Val Val Als Leu Vsl Gly Thr Aap Alu ?hi ben Aiq 1GB IDÜ 155 :53 GLy Ar: Asp Gln GLy Ser Al: Tyr Ala Asn Arq Thr Ala Lcu Fha Prc 165 170 175 Agp les LQJ Alo Bin Gly Aga Ala Ser ben Aiq len üln Afg vol Arg 150 185 193 val Ala Asp Glu GLy Ser ?he Thr Cv: Fhe vil Ser Ile Arq Asp Fhe 195 200 2U5 Zly Hür AL; kia Val Sai LaJ nin ?31 Ala Ala Drn Ty: Sar Lys Pro her Met ?hr Lou GL& Pro kan ;ya Asp Lou Arq Pro Gly Asp Thr Val 2.: 2`0 31* 263 Tht Ile Thr Cya Sor Eur ?yt Ara Gly Tyr Pr: GLU Alu GLu VII ?bu 245 250 255 frp Cln Asp Gly Gin Gly Val Pro Lan Thr Cly Ajn Val ?hr Th: Son 260 265 273 Gln Met A-: han G;i Gln Uly ;eu ?ne Asp Val M;s Se: Va; Leu Ara 275 ZEÜ 285 vii Vii Lou Gly A-: Ann Ciy ?hr Ty: Sar Cys Ldu Vii Arg Asn Prc 29( 295 309 Va] bu: G“.û (Un Aip ÂIA Zilin Cly Rßr 'i'iiî ?Tir !îi'i 'Nu .'1'. (ila Fm Met Tir Ph: Pro Pr; Ciu hi: ;eu Trp Va- In: Vu- Ciy Lou Se: Vai 325 330 !15 Cya Lan 3;» A1: Lan ;eu Vol &lo Lv“ Alo Ph” Vol Üye 340 305 355 360 165 Gly Glu Gly Glu GLy Ser Lys Th: Ala Leu GL: Pr: Lan Lys Mia Ser 370 375 383 Asp Ser Lys Glu Asp Asp Giy Gln 010 Ile Ata 185 @en 395 <210> 30 <211> 873 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 99395591?? tagünqctqa içcqcctatç ictggcaizg <210> 31 <211> 290 qcagcqutqc QCLBCCCLOG qctqqeqaoa <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Auaqctqqtq OOCIQRQQLO gcaqitgqc: lQCQdGiQÇC cnuaqtttcu qaqiiçcauct CHUUIQVCCQ llCtQQCGQÇ atmacuqqçu tgqcaciqct ccvuaqqccç tçqcaciagq cgqzgancat çêthçLuCc açuctatqac QVBCCSQOOC cangtqntcc tQLOCCCCLÇ GGQGQCtQÖç GI r'i Loêu ?hr A1& %15. 1.343 A1: ?he 1.el› GLn 110 Ala 1L`I0 34) 1' 71'. x' D 110“.- Y 43':- 21.“.- .31 .f 111:' 111:( 22'!) ' nci <210> 32 <211> 909 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 utchqctoü iccqtaqtqß achtqctqu tgectcesac <210> 33 <211> 302 qcnqtzutqv aigtcagaq: QüutCQUdcq <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 qitgqtaggu caceqtctlc caqtiucqvz agugacgigq atqctçcggq tlqaacatqs qtaadcuttq qctqtçaotc ucavccttcq gqqulLuîa cqvucauqtç CCROICCGZQ gtçtavitcu uqnqadcutu A8:: VAI 110:` 111.; <210> 34 <211> 873 1 l'." U 1091.! (31 r.

M5::. 111:' 1911' 21'!) 0.37` <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 qtcasggttc laciqacaqo aagcnaaqts <210> 35 <211> 290 tnuaaiaaca açcgaittic ingtcatctg tqggagncat <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 attaçicctq qitgaaggac 9941935??? gicaigcaqt cttatratgn Wagqngacq accticzqqc CÖQCLSLCÇC qtgtaucgct giccitcaaq trnaafgtqa aaatqtuqcn (çqgaashqc qcntqitcsq tcczgigtgq ccigcinacr ICCSSIZEZJC qcizaqtaqc ctatgvtgqt Lqoogçczac qqiuaaccat aiqgactcnc rarnttnuqf 5111› (111; A8 i'i <210> 36 <211> 909 <212> DNA 11.1: <213> Homo sapiens <400> 36 12!)i 2'3'5 611". 23”?' 908ICCCJQQ igcgtqctga <210> 37 <211> 302 JQQIICIQBQ Lgcaqaatqa RQGÖCÜEQGC <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 gALggfiggü GCCKJQCCKNC caacgrgtan IÇZCQQCÖÇC cantaucqq: agnzcctzgg atqctqcgqç Caüüâtüacc tgqatciata tlQûâCâtÜC qtgaiciitq CRQGCBQOSB qtqgücntaç gcaqcctzcg agctcaqntg aaaacçtgqa uqçvcttqta cqqcçscutq naqncîqntg qiçuatcutq 5131'.' <210> 38 <211> 867 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 As 1“. 1421; arggqcnnca taairtcqra igcagnaain <210> 39 <211> 288 aigtqgciic trtdctqvca rqgatitnaa <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 gqgnnnatca auagçaqiag fazginaaac qnccttcauc fcßtCCJûÇT çaquçcacat aaccinagct gfnnararcr gtqitiicca tquctazqat tqacgtzat: Cünîffntff cçtgaccaig 1.911 1.35› (311; (31)* 2 7 ."i <210> 40 <211> 990 <212> DNA 1-21:: 1.). t. <213> Homo sapiens <400> 40 atgçitcccc aauiataiqg inatqtggia <210> 41 <211> 329 atgtttcntz <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 qgtatnctta tLttqêltco qtatciatgt cnctqntghi qqcaangaçn qacaqtiqça qtgtacatai qtLllqctaO gcigtactrn ttgtqizqçc aqictqcaqn antttgacnq CEGQCtICâç cagaiczqti tgnccnicrh achquctcq cacaqsaatg tCûâCCîqBö crqtattcrg 9 x* C› 121:.: <210> 42 <211> 849 <212> DNA 3" x'o <213> Homo sapiens <400> 42 301:` 17':) 111: (51.] . 131 l.: itggsttcnc icaqcaQLqL gctaaoctlq GGCGCGQJCL <210> 43 <211> 282 tggqqcaqnt chqtaLqaL <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 cattçqqqig Cgtgntacnn tqoaqccllc atttcnggqa çaiqçaatcc Wav-tanga ttczcçqaaq alLoccaaaç QCBCItCîOÇ gîßtCßîclt tqaqcbgcac nçqcttggtn gqacialaal cacagtçîîc caçczttqaq ztacctçatq 1.611 Ala Ser Ser Giu ?hr Lsu arc Cya Giu &14 165 ITÜ PE: ?tr Va; Va; frp Ala Sa: Cin Vai Asp 180 155 Glu Val Ser Ann Thi Ser Phe Gln Lev han 1931 2111:' Lya Val Va; Set Vol ;en Ty: Ann Val Thx 210 215 Oy& Mar 11& Giu &sn Agp Ile Ala Lys Ala 225 230 745 259 Lys &la Sar Lan :ya Val Sa: Sar ?ha ?ha 260 265 Lcu Pro Lcu Ser Pra Ty: lcu Met Lou Lyi 21& ZHD <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Giu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Giu <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 131 i'i <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 46 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 47 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 48 <210> 49 <211> 32 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400>49 <210> 50 <211>1413 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 50 VÜUCHQUVEU tnagcnaaia aqciqlctqg olgtqqc.ca CGBICBJQCC caLgtqLqu aiuuqtcagt icctçoqclg ÇOLQÇGLÜLQ Ctgtcigqai Qîaqttîâtt tqcatsgtca tatoqrcdçu aczqtqnaaq qcacciczct tcuctçaqcc accaggictç CçCCCALcqa acLacsâqaa açqgtctgca ccactcigng qioqilqtcc gcaqaigcct aqccticatg GIQ'JWKJt BL` açtgaccttq CÄCIQGÖCCJ <210> 51 <211> 471 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 GlL: Trt* 1.811 1.921 L; 1 -,i 611.' . "4.1 1' z (2 2'3!] 1-)'8 1.0:) 1' 'kp 77'. i' (31 i_i <210> 52 <211> 705 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 52 gctqaaqaig CLgccactia agctggaqci ttaetqccag aLctçqaqu Va 1 TI". r Asp ÇÜCBCAtCCö cagiqqaala çcctcautco tcaciizciq GGQQGéOââq cnqaqtqgaq cacqttcqçg QdâCdâClLC <210> 53 <211> 235 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 (31'i <210> 54 <211> 28 . .3;y A8 1“. <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 54 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 55 <210> 56 <211> 1704 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> insan kappa zinciri sekresyon sinyali, insan kappa zinciri sabit bölgesi ve insan poli A ek sinyali <400> 56 lqttcatçlc gtacqqtqvc OUGÂOÜQQQG igcinaaggt qcttcaaciu equcrcctcu CBÜCQCCCta qtgttuatrt tiovvccccu qcgcitotçq incagggcct tttaaicqvq coucçuqcav qachtqace qactaCQdqa 99999“99'* icagçcgtça tuqttacqrq agtccachL tgqaeaqtsc <210> 57 tggiqcaaqg Llattkttqt cnchtqicc gttcngattz cLitaataqt tCJQCJBCCû <211> 1120 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> cngtqgcaca aggtqntcta agtgctzrin qtaqcçchc qitaqicgqt lccaaactçq tgxaqggccr itzaigcgcq achcucqct tcaagczcti aqcatocate <223> insan IgG1 sinyal dizisi ve sabit bölgesi <400> 57 ÜCQÜGQYCII catgcaignc gncgtgaqnc $atailgcça <210> 58 <211> 699 tcucnqccrc tqqtcadiqg QCGEQCTCGC Qßaatatcqg <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> cqaaeccqtg C$QÜÇÖQQGQ QCECQCKCSÜ cigtcczca; ttcaiîtggt CöqîdCOJCû BQCGÇQîÇÇC <223> Kimerik M30'un hafif zinciri <400> 58 anqccaadçq agaaqigcct cqtqaizcau Cîtûcfoatg ÜÇLÜQICGQC CÇECTICICB QûCQdQCâOC ngaqiggcca schtQBCCq BÜCI CCCCCIJ <210> 59 <211> 233 igctqiiacg iggtqzagtg ICÜCCRÜOâQ <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> ttatçrcucu CIICBGCÖQQ CLQiClQCJI <223> Kimerik M30'un hafif zinciri <400> 59 CKCCJÇQQQA CACCCâCQtl SQCLQêAL&â agqtgaucca cgcazitggc giiegtcoca CQQLGCLOÜÜ ctlciacccç ctccciqgag <210> 60 <211> 42 (31)' 1.213' 1 ..1 '1 1.02: (311; <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 60 <210> 61 <211> 37 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 61 <210> 62 <211> 1413 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Kimerik M30'un agir zinciri <400> 62 Qtccnuctqc OUÜCBGOOÜC uqctqgaict tcaqgnatnt qçaccctciq tçgticgtqq BOCGQCGCQL iagçiqtaca BLCÜCCQIQQ tQQCIOCGQQ ECCCIOGHQB <210> 63 <211> 471 aquaqtctqg ingqcaaggc Ctaaquccc qtgannaaac cachoLqu aqtgciaqqc <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> auctqnqctq quccichvc ovwoacqta qqtgcitaat caocqtcclc CaüCCtQdCC tcagicanat chqtciatt aagganzact eceqaqaâCG qtaatQCÖIû <223> Kimerik M30'un agir zinciri <400> 63 anaqcigctt accctçaoqt qaaqntqtcu thgaücqrq UâQdGtîüaO QCLOÖGLQQC aLccccqoaç (21;,i ~ v5.1 De 1.: .11' 1.1:: 14:11 110_- 1431; 370 375 Asn Cln Va; Sar Lou ?hr :ya !nu Val Lys CLy 335 390 395 405 #IU Lya !eu Tlf Vaî Agp Lys her Arq Trp G1h GIn 435 449 Cys Ser Va; Mel. Has Glu &la Mu Kis Asn Kia 465 470 <210> 64 <211> 40 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 64 <210> 65 <211> 36 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 65 <210> 66 <211> 36 <212> DNA <213> Yapay Dizi 91'.? <220> <223> PCR primeri <400> 66 <210> 67 <21 1 > 39 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 67 <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 68 <210> 69 <211> 39 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> PCR primeri <400> 69 <210> 70 <21 1 > 699 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 70 qagalcgtqc <210> 71 <211> 233 tqacccoqiq tgtuctactq agnagqaciq actacqaqni tcnccnngaq <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> ccaqcuqtçq gcicanggtq iqcaicctçg ganccntccq GtOUtQIUCU acczicngcc <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 71 çccclqcha çvtatrnqca trzcteqqct fqîtcatcrr cgcatizgqc 1.1.1: ' I: i'i <210> 72 <211> 699 1 C' [I 52;:: 12.11 5024: <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 72 ntgvtqctqc igcqtgac: ogetccectq <210> 73 <211> 233 aqucccaqvt qiclqlqqat anmtcnngcg tqaaqlccçç actacqagan CCGCCGRQBQ <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> gaacanggtq CIZCÂGCQÇQ acectqâcca <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 73 Met Val Lcu Gln rh: Gin Val Phe Ile Ser Lei Lei ieu Gly Ala Tyr GI? GLu !la ?al Lan Ttt Gln Sar Pro Ala ogatctucqv occctqcha Lchgaaiaa aggtqanccn <210> 74 <211> 699 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize hafif zinciri 1.021 73'.: <400> 74 COOLlCOKQC oacthqccq igaqiggcza agdqfgacng aoctccccçq <210> 75 <211> 233 QCSUCÄQCÇQ LqLaCLaclq agnaqgaciq ICÜCCÜGQGQ <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> ccaQCAQtçq caagqiaaçn gcaciigqtg ctqmctciqa <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 75 gccclqchi chnqaazaa agtccqggia agqtgaccci iüruccaçooc ctccciqgag <210> 76 <211> 699 (31 L: *311: (31!] (- r' 2.911 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 76 oaqaLchQC iccaiuqt:u ganqaqcaoc <210> 77 <211> 233 lQüCCCdQBQ iqaaqLccqg <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> CCCCBICÖQÇ cLotchtqa <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 77 ccachgcst cgcatazgqc clLetAcccc ctcccigqag 1.el: <210> 78 <211> 699 0.181 .'10 . .'10 I' <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 78 GQCQL'CÇCL'R Qacthucsq savunucacc eucqtqaccq <210> 79 <211> 233 LQLaCLactQ anitcaigcq tqadqtucqv isgtqcagtg <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> aquaucutqv Qtvütqtucc GCCfÖCêQCC açarim:: at <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 79 uccctçcha ccagcçvudt cqçccaçggc <210> 80 <211> 699 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 80 .1.5 gagitcgtqc <210> 81 <211> 233 aaatcsaqcv <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> IRCQCCCOCÇ <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 81 gccctçchi GQÇCQBCCCR cqcatazqçc ctcecaçeaq <210> 82 <211> 699 1' (f: 1141) 2011' 1 'Tiji 542-: 1.113! -4 "JJ <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 82 gagaicgtqc çactlcgcsg accinqgt:q OUCOtÜâCCG <210> 83 <211> 233 Lqacccagiq QGCCLCLÜJK 9:?9C13C99 tqLaclath inatcaagcg tqadqtucçv iggtqcagtq BQCGQQRCEQ <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> ccagciçtçq ctqzclciqi 8GCîßCêOCC açarim:: at <223> M30'un hümanize hafif zinciri <400> 83 cciqcçqcal îQâQCöQCâc 9993C5999Ç ctccciqgag <210> 84 <211> 1413 (11)! 1.41: 131 :'i 1.:: 'J 72".: 59'i!' <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize agir zinciri <400> 84 ntgiiaci:: ÇCQCJSCtÇQ Oocuocacas CCCaaOtClL qaacbctci: gLgclqqacL <210> 85 <211> 471 QCQUCLaCdC qcnacgtgaa Qtüßîgtff! csccqiaqtg Cttcqnctec ctgchquc quqcataaL CtLClKCCIC CICGtQCfCC qCCQlütacL tagqwccaqi aagqaciacL Cögqlqaaca 3C199?1969 izgacgacqt aequcttcta lcaccqzqça GQQCtCîQCR giaqticaac cçLqaccqtq achcLqqçq qçaqciqtac CÖOQBQCGQQ <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize agir zinciri <400> 85 A1..) 6;',1 2.1: '.i 1.3', A151; 50':: 97:(- (3111 i.`i <210> 86 <211> 1413 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize agir zinciri <400> 86 igctggaazt tgqticqtaq aicaqnangt tccaiigcsi scecoqasqa qCQQCLacac ÜCCIQCOQGO crqccztqqu cigqcgcczt Agnaanmggt gamacqtctz qzrirtct I.`Cf2t Cgccqaagtg aigcqtctt: tuncauqccc vvtavucqtv ggtqcitaat cautçvccaq tacngAtqc qCCQlQiâCL gtqcicacct ccnaiqgaca uçucicquav caggtqtaci cctquqoacu açvtqunda ccnzcahgat acuctçuuqt acnagçictç actecaoquc CÇÖUQGCCCl atogqçctac Crnrcçgacc tcnnaqngac <210> 87 <211> 471 <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize agir zinciri <400> 87 Met Lyß Hin Lou frp Phe Pho Leu Lou Leu Val 9::. Cly ar s.: vii Lys 'mi 50: Üye Lys AL: .hr Asn Tyr Va; Met Mi: Trp Val Ara GLn AL: Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ty: Aan Rep 6% 70 35 Git. Lys ?to by: '3;', Ari; 'i'ai 'nir Ile Thr Ala 100 155 Asp ?yt Tip Gly Gin Giy rh: Lou Vil Thr Vsi Lys Giy Pro Sat 'Jul Ph. Pro Lou Aia Pro Sa: Gly Lily Tr.: Ala K.: ;cu Lily Ey: Lou Vi'. ;7: 165 170 Pro "'41 'Hzr Vu; Tip Ami Ser Gly Ala 2402') 195 200 7): 1' 11'.: 1.8.› Met - -ê -3 Val Ty: val 56!` Lou Tlir Vil Mp <210> 88 <211> 1413 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize agir zinciri <400> 88 99951999:: rnagnntcca igctggaazt hnagqactnt qgacccicao tgqticqwq tccaiigcsi scecoqasqa ÜCCIQCOQGO crqccztqqu cigqcgcczt qzrirtct I.`Cf2t aigcgýnttn aagcqtggfq tuncauqccc ggtqcitaat cageqLcclc cautçvccaq CtCGIQClCC aaqaaicrcg qccgangagi qCquqiaCL canctqgcan gtqcicacct uçucicquav caggtqtaci tçcclqgtca gcigraqngt ccagcaqntr açvtqundu ccczcaLuat acuctçuuqt aaquclLctd actecaoquc qaigqrgtrc rgnctAnatq gagnacntcr Gövduttqaq gqigcagta: chuaaLuqc lcecaçeuac CJGCCJCIBÇ <210> 89 <211> 471 <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize agir zinciri <400> 89 Met Lyß Hin Lou frp Phe Pho Leu Lou Leu Val Val Lan Sar Giu Vmi Sin Lan Vai Gin Sar Giy Pro Gly Ser Ser Val :y: Val Ser Cys Lya A1: .hr Asn Tyr Va; Met Mi: Trp Val Lya GLn AL: Glh Trp Ile Giy Tyr !lo Asn Pro Tyr Aan Asp Gii'. Lys ?to by: 5;-,i ;ya Ala 'mi- 110 '1111' ua îhr Ala Tyr Me: GLi ;eu 30: Su: Leu Arq Sir 100 155 Tyr Tv: Cv: A1: Arq er Gly Ty: Tyr GL; Set 11& 120 Asp ?yt Tip Gly Gin Giy rh: Lou Vil Thr Vsi Lys Gly Pro Sar Vai Ph& pro Lan Ala Prn Sar Gly Gly Thr Ala AL: ;cu Sly Ey: Lou Va; ;7: 165 170 Pro 731 Th: Va; _ Asu Se: Gly Ala LGJ ›-4 i`J Ala Vnl Lan :In Sa: Sar Cly Lan 11'.: -3 Val 4.7-“ 1:: l I'i <210> 90 <211> 1413 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize agir zinciri <400> 90 99951999:: rnagnntcca igctggaazt hnagqactnt qgacccicao tgqticqwq tccaiigcsi scecoqasqa ÜCCIQCOQGO crqccztqqu cigqcgcczt qzrirtct I.`Cf2t Cggcticat: aigcgtnttc tuncauuCCU qvtqgucqtv cagçqLCClC ct ccduigaan cagcctoâcc caGQGVUUÖV aaqaaicrcg aqcganaagi qCquqiaCL canctqgcan gtqcicacct uçucicquav caggtqtaci tçcclqgtca gcigraqngt ccagcaqntt açvtqundu ccczcaLuat acuctçuuqt aaquclLctd actecaoquc qaigqrgtrc OGêuQGCCCl rgnctAnatq gagnacntcr Gövduttqaq gqigcagta: chuaaLuqc lcecaçeuac CJGCCJCIBÇ <210> 91 <211> 471 <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> <223> M30'un hümanize agir zinciri <400> 91 Met Lyß Hin Lou frp Phe Pho Leu Lou Leu Vel Val Lan Sar Giu Vai Sin Lan Val Gin Sar Giy Sin ?tp Ila Giy Ty: Iia Asu Pro Ty: han Asp 65 70 ?5 Glu Lys Fta ßy: G;y ;ya Ala îh: Gln Thr Sat 100 155 11& 120 Asp Ty: Trp Giy G;n Giy rn: Lou Vai Th: vii Lys Gly Pro Sex Vol Phe Pro Lou Ala Pro 50: 145 150 15& Gly Gly Thr Ala 510 LG“ Sly Cyo Iéu VA; ;ya 165 lfû Fr: Val Ttr Va; Sar frp Asn Se: Glv Ala ;au 159 155 193 200 Val Vai Ttr Va; Fta Sar Sar Sa: Lau Cly ?hr 1.el: (411,: > 61'; (31', 54`i!` G 1 1.1 (3111 <210> 92 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 92 <210> 93 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 93 1",': II.: Ann Prc Ty: Mu Asp Pulp Vil Lyi Ty: !un Glu Ly: Ph: Lya 1 5 10 15 <210> 94 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 94 Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 95 Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ile 'I'yr Met His <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 96 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 97 Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Pro Thr

Claims

ISTEMLER . Bir antikor veya bunun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi asagidaki özelliklere sahip olmasi ile karakterize edilmesidir: (a) B7-H3'ü spesifik olarak baglama, burada BY-H3, SEQ ID NO: 6 veya 10 ile temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir moleküldür ve antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani, IgC2'den olusan bir polipeptidi baglar, burada lgCZ, B7-H3'ün bir alanidir; (b) bir antikor-bagimli hücre-aracili fagositoz (ADCP) aktivitesine sahip (o) bir in vivo anti-tümör aktivitesine sahip olma ve (d) B7-H3'ü baglamak için MSO antikoruna karsi bir kompetitif inhibitör aktiviteye sahip olma, burada M3O antikoru, SEQ lD NO: 51'in 20 ila 471 arasindaki amino asit rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 53'Ün 23 ila 235 arasindaki rezidülerinden olusan bir amino asit dizisi içeren bir hafif zincir içerir. . Istem 1'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi her biri BY-H3'ün bir alani olan IgC1'i ve IgC2'yi baglamasidir. . Istem 1'e veya 2'ye göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi lgC2, SEQ ID NO: 6'da 358 ila 456 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisi içeren bir alan olmasidir. . Istem 2'ye göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi edilen bir amino asit dizisi içeren bir alan olmasidir. . Istem 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi bir antikor-bagimli hücresel sitotoksisite (ADCC) aktivitesine ve/veya bir kompleman-bagimli sitotoksisite (CDC) aktivitesine sahip olmasidir. . Istem 1 ila 5'ten herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi tümörün kanser olmasidir. Istem 6'ya göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi kanser, akciger kanseridir, meme kanseridir, prostat kanseridir, pankreatik kanserdir, kolorektal kanserdir, bir melanomduri karaciger kanseridir, ovaryan kanserdir, idrar kesesi kanseridir, mide kanseridir, özofajiyal kanserdir veya böbrek kanseridir. Istem 1 ila 7'den herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi agir zincirin tamamlayicilik belirleme bölgeleri olarak SEO ID NO: 92 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRH1, SEQ NO: 94 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRH3 içermesidir ve hafif zincirin tamamlayicilik belirleme bölgeleri olarak SEQ ID NO: 95 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRL1, SEQ ID NO: 96 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRL2 ve SEO ID NO: 97 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan CDRL3 içerir. Istem 1 ila 8'den herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi SEQ ID NO: 51'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 53`te 23 ila 130 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi içermesidir. Istem 1 ila 9'dan herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi bir sabit bölge, bir insan-kaynakli sabit bölge olmasidir. Istem 10'a göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi SEQ ID NO: 63 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 59 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir içermesidir. Istem 1 ila 11'den herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi beserilestirilmesidir. 13. istem 12'te göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi asagidakileri içermesidir: (a) SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (b) SEQ ID NO: 87'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (c) SEQ ID NO: 89'da 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (d) SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (e) (a) ila (d) arasindaki dizilerin herhangi biri ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip olan bir amino asit dizisinden ve (f) burada (a) ila (d) arasindaki dizilerin herhangi birinde bir veya bir kaç amino asidin silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir amino asit dizisinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve (g) SEQ ID NO: 71'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (h) SEQ ID NO: 73'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (i) SEQ ID NO: 75'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (j) SEQ ID NO: 77'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (k) SEQ ID NO: 79'da 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (1) SEQ ID NO: 81'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (m) SEQ ID NO: 83'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden, (n) (9) ila (m) arasindaki dizilerin herhangi biri ile en az %95 veya daha fazla olan bir homolojiye sahip olan bir amino asit dizisinden ve (o) burada (9) ila (m) arasindaki dizilerin herhangi birinde bir veya bir kaç amino asidin silindigi, sübstüte edildigi veya eklendigi bir amino asit dizisinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisinden olusan bir Istem 13'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir degisken bölgesi ve bir hafif zincir degisken bölgesi içerir: SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: ?1'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ lD NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEQ ID NO: 73'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 75'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: ?7'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 79'da 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 81'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 83'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEQ ID NO: ?1'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 73'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 75'te 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi; ve SEO ID NO: 91'de 20 ila 141 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: ?7'de 21 ila 128 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir degisken bölgesi. Istem 13'e veya 14'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir ve bir hafif zincir içermesidir: SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ lD NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?3'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?5`te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?7'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ lD NO: 85'te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?9'da 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 85`te 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 81'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 83'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?1'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEQ ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: ?3'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO lD NO: 75'te 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; ve SEO ID NO: 91'de 20 ila 471 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 77'de 21 ila 233 arasindaki amino asit numaralari ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir. istem 13 ila 15'ten herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir ve bir hafif zincir içermesidir: SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 71 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 73 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 75 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 77 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 79 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 81 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 85 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 83 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO lD NO: 71 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; SEO ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO SEO ID NO: 75 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir; ve SEO ID NO: 91 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 77 ile temsil edilen bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir. Istem 1 ila 16'dan herhangi birine göre antikorun fonksiyonel fragmani olup, özelligi fonksiyonel fragman Fab, F(ab)2, Fab' ve Fv'den olusan gruptan seçilir. Istem 1 ila 16”dan herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi bir birinci ve bir ikinci agir zincir içermesidir, burada birinci ve ikinci agir zincirin her biri bagimsiz bir sekilde asagidaki (i) ila (iii) arasindan seçilir: (i) bir tam-boy agir zincir; (ii) burada agir zincirin karboksil ucundan 1 amino asidin silindigi bir agir zincir; veya (iii) burada agir zincirin karboksil ucundan 2 amino asidin silindigi bir agir tercihen, burada birinci ve ikinci agir zincirin her biri madde (ii)'den seçilir. istem 18'e göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi birinci ve ikinci agir zincirin her biri bagimsiz bir sekilde maddeler (ii)'den veya (iii)'ten seçilir ve burada agir zincirin karboksik ucunda yer alan amino asit rezidüsü amidatlanir, tercihen burada amino asit rezidüsü, bir prolin rezidüsüdü r. istem 1 ila 19”dan herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi antikor veya antikorun fonksiyonel fragmani, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir modifikasyon içeren bir modifiye edilmis varyant olmasidir: bir kimyasal kismin bir amino asit rezidüsüne baglantisi, bir N-bagli veya O-bagli karbonhidrat zinciri, N-bagli veya O-bagli glikosilasyon, N- veya C-ucu isleme, deamidasyon, bir aspartik asit rezidüsünün izomerizasyonu, bir metiyonin rezidüsünün oksidasyonu ve bir metiyonin istem 1 ila 20'den herhangi birine göre antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmani olup, özelligi bir glikanin modifikasyonu, bir antikor-bagimli hücresel sitotoksik aktiviteyi güçlendirmek için regüle edilmesidir: Bir polinükleotid olup, istem 1 ila 17'den herhangi birine göre antikoru veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini sifreler. .Istem 22'ye göre polinükleotid olup, özelligi SEO ID NO: 50'de 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 52'de 67 ila 390 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi içermesidir. istem 22'ye veya 23'e göre polinükleotid olup, özelligi SEQ ID NO: 62 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 58 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi içermesidir. Istem 22'ye veya 23'e göre polinükleotid olup, özelligi asagidakileri içermesidir: (a) SEQ ID NO: 84`te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (b) SEQ ID NO: 86'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (c) SEQ lD NO: 88'de 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (d) SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden ve (e) (a) ila (d) arasindaki nükleotid dizilerinin herhangi birine komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir polinükleotide sert kosullar altinda hibridize olan bir polinükleotid içeren bir nükleotid dizisinden olusan gruptan seçilen bir nükleotid dizisi; ve (f) SEQ ID NO: 70'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (g) SEQ ID NO: 72'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (h) SEQ ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (i) SEQ lD NO: 76'da 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (j) SEQ ID NO: ?8'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (k) SEQ ID NO: 80'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden, (I) SEQ ID NO: 82'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisinden ve (m) (f) ila (l) arasindaki nükleotid dizilerinin herhangi birine komplementer olan bir nükleotid dizisinden olusan bir polinükleotide sert kosullar altinda hibridize olan bir polinükleotid içeren bir nükleotid dizisinden olusan gruptan seçilen bir nükleotid dizisi. istem 25'e göre polinükleotid olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen nükleotid dizileri içermesidir: SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 72'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 76'da 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?8'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 80'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 82'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ lD NO: 70'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?2'de 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; ve SEQ lD NO: 90'da 58 ila 423 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEQ ID NO: 76'da 61 ila 384 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi. 27. Istem 25'e veya 26'ya göre polinükleotid olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen nükleotid dizileri içermesidir: SEO ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?0'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84'te 58 ile 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?2'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO lD NO: 76'da 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84'te 58 ile 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: ?8'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ ID NO: 84'te 58 ile 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 80`de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84'te 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 82'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70`de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 72'de 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74'te 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO lD NO: 90'da 58 ila 1413 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 76'da 61 ila 699 arasindaki nükleotid numaralari ile temsil edilen bir nükleotid dizisi. Istem 25 ila 27'den herhangi birine göre polinükleotid olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen nükleotid dizileri içermesidir: SEO ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 70 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 74 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO bir nükleotid dizisi; SEO lD NO: 84 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 80 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEQ bir nükleotid dizisi; SEO ID NO: 90 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 72 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi; SEO bir nükleotid dizisi ve SEO ID NO: 90 ile temsil edilen bir nükleotid dizisi ve SEO Bir ekspresyon vektörü olup, özelligi Istem 22 ila 28'den herhangi birine göre bir polinükleotid içermesidir. Bir konak hücre olup, özelligi istem 29'e göre ekspresyon vektörü ile transforme edilmesidir. Istem 30'a göre konak hücre olup, özelligi konak hücre, bir ökaryotik hücre olmasidir. Bir antikor veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini üretmenin bir yöntemi olup, özelligi istem 30'e veya 31'e göre konak hücreyi kültürlemenin bir adimini ve kültürleme adiminda elde edilen bir kültürlenmis üründen arzu edilen bir antikoru veya antikorun bir fonksiyonel fragmanini toplamanin bir adimini içermesi ile karakterize edilmesidir. Bir farmasötik bilesim olup, özelligi istemler 1 ila 21'e göre antikorlarin veya antikorlarin fonksiyonel fragmanlarinin en az birini içermesi ile karakterize edilmesidir. Istem 33'e göre farmasötik bilesim olup, özelligi bir tümörü tedavi etmek yönelik olmasidir. Bir tümörü tedavi etmek için bir farmasötik bilesim olup, özelligi istemler 1 ila 21'e göre antikorlarin veya antikorlarin fonksiyonel fragmanlarinin en az birini ve kanser için en az bir terapötik ajan içermesi ile karakterize edilir. Istemler 1 ila 21'e göre antikor veya antikorun fonksiyonel fragmani olup, özelligi bir tümörü tedavi etmenin bir yönteminde kullanim yönelik olmasidir. Bir tümörü tedavi etmenin bir yönteminde kullanim için 1 ila 21 arasindaki istemlere göre antikor veya antikorun fonksiyonel fragmani olup, yöntem antikoru veya fonksiyonel fragmani ve kanser için en az bir terapötik ajani es- zamanli olarak, ayri ayri veya sirali olarak bir bireye uygulamayi içermesidir. Istem 34'e veya 35'e göre kullanim için farmasötik bilesim veya istem 36'ya veya 37'ye göre kullanim için antikor veya fonksiyonel fragman olup, özelligi tümörün kanser olmasidir. istem 38'e göre farmasötik bilesim, antikor veya fonksiyonel fragman olup, özelligi kanser, akciger kanseridir, meme kanseridir, prostat kanseridir, pankreatik kanserdir, kolorektal kanserdir, bir melanomdur, karaciger kanseridir, ovaryan kanserdir, idrar kesesi kanseridir, mide kanseridir, özofajiyal kanserdir