CN115698070A - Cd5l结合抗体及其用途 - Google Patents

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CN115698070A CN202180038921.5A CN202180038921A CN115698070A CN 115698070 A CN115698070 A CN 115698070A CN 202180038921 A CN202180038921 A CN 202180038921A CN 115698070 A CN115698070 A CN 115698070A
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库志强
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Abstract

本文中提供了抗CD5L单克隆抗体。本文中还提供了使用其治疗疾病或病症例如癌症的方法。

Description

CD5L结合抗体及其用途
优先权要求
本申请要求于2020年4月2日提交的美国临时申请序列号63/004,149的优先权权益，其全部内容在此通过引用并入。
关于联邦资助研究的声明
本发明是根据国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助No.CA217685在政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
对序列表的参考
本申请包含已通过EFS-Web以ASCII格式提交并且在此通过引用整体并入的序列表。创建于2021年4月1日的所述ASCII拷贝命名为UTFCP1501WO_ST25.txt，并且大小为183千字节。
背景
1.技术领域
本公开内容总体上涉及癌症生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及抗CD5L单克隆抗体及其使用方法。
2.相关技术的描述
已知血管生成在肿瘤发展和生长中起重要作用(Folkman,1971)。这个复杂的过程依赖于许多因子的精细协调，所述因子包括血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)及其受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)等(Weis and Cheresh,2011)。许多抗血管生成药物，特别是针对VEGF/VEGFR途径的药物，已被开发并批准用于癌症治疗。虽然许多患者受益于这样的治疗，但几乎所有患者最终都会发生疾病的复发或进展。理解和克服抗VEGF药物的适应性变化代表了进一步增强这些药物的效力并潜在地延迟或预防适应性抗性的机会(Bergers and Hanahan,2008)。
发明概述
在一个实施方案中，本文中提供了单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段的特征在于来自表1和2的克隆配对的重链和轻链CDR序列。
在一些方面中，所述抗体或抗体片段由根据来自表4的克隆配对序列的轻链和重链可变序列编码。在一些方面中，所述抗体或抗体片段由与来自表4的克隆配对序列具有至少70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。在一些方面中，所述抗体或抗体片段由与来自表4的克隆配对序列具有至少95％同一性的轻链和重链可变序列编码。
在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含根据来自表3的克隆配对序列的轻链和重链可变序列。在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含与来自表3的克隆配对可变序列具有至少70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列。在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含与来自表3的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变序列。
在一些方面中，抗体或抗体片段包含：
重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:81的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:82的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:84的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:4的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:5的VLCDR3氨基酸序列；
重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:87的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:88的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:89的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:1的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列；
重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:160的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:161的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:162的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:67的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:10的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:68的VLCDR3氨基酸序列；或者
重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:178的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:179的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:180的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:77的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:10的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:78的VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面中，所述抗体或抗体片段由与SEQ ID NO:266具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:267具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列编码。在一些方面中，所述抗体或抗体片段由与SEQ ID NO:266具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:267具有至少95％同一性的轻链可变序列编码。在一些方面中，所述抗体或抗体片段由根据SEQ ID NO:266的重链可变序列和根据SEQ ID NO:267的轻链可变序列编码。
在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:185具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:186具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:185具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:186具有至少95％同一性的轻链可变序列。在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含具有根据SEQ ID NO:185的序列的重链可变序列和具有根据SEQID NO:186的序列的轻链可变序列。
在一些方面中，所述抗体或抗体片段由与SEQ ID NO:268具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:269具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列编码。在一些方面中，所述抗体或抗体片段由与SEQ ID NO:268具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:269具有至少95％同一性的轻链可变序列编码。在一些方面中，所述抗体或抗体片段由根据SEQ ID NO:268的重链可变序列和根据SEQ ID NO:269的轻链可变序列编码。
在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:188具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:189具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:188具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:189具有至少95％同一性的轻链可变序列。在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含具有根据SEQ ID NO:188的序列的重链可变序列和具有根据SEQID NO:189的序列的轻链可变序列。
在一些方面中，所述抗体或抗体片段由与SEQ ID NO:324具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:325具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列编码。在一些方面中，所述抗体或抗体片段由与SEQ ID NO:324具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:325具有至少95％同一性的轻链可变序列编码。在一些方面中，所述抗体或抗体片段由根据SEQ ID NO:324的重链可变序列和根据SEQ ID NO:325的轻链可变序列编码。
在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:244具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:245具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:244具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:245具有至少95％同一性的轻链可变序列。在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含具有根据SEQ ID NO:244的序列的重链可变序列和具有根据SEQID NO:245的序列的轻链可变序列。
在一些方面中，所述抗体或抗体片段由与SEQ ID NO:338具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:339具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列编码。在一些方面中，所述抗体或抗体片段由与SEQ ID NO:338具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:339具有至少95％同一性的轻链可变序列编码。在一些方面中，所述抗体或抗体片段由根据SEQ ID NO:338的重链可变序列和根据SEQ ID NO:339的轻链可变序列编码。
在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:258具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:259具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:258具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:259具有至少95％同一性的轻链可变序列。在一些方面中，所述抗体或抗体片段包含具有根据SEQ ID NO:258的序列的重链可变序列和具有根据SEQID NO:259的序列的轻链可变序列。
在任何本发明实施方案的一些方面中，所述抗体或抗体片段是人源化抗体，例如其中所述抗体或抗体片段包含具有根据SEQ ID NO:352的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:354的序列的轻链可变序列；具有根据SEQ ID NO:352的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:355的序列的轻链可变序列；具有根据SEQ ID NO:353的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:354的序列的轻链可变序列；或者具有根据SEQ ID NO:353的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:355的序列的轻链可变序列。
在任何本发明实施方案的一些方面中，抗体片段是单价scFv(单链可变片段，single chain fragment variable)抗体、二价scFv、Fab片段、F(ab’)2片段、F(ab’)3片段、Fv片段或单链抗体。在任何本发明实施方案的一些方面中，所述抗体是嵌合抗体或双特异性抗体。在一些方面中，所述抗体是IgG抗体或重组IgG抗体或抗体片段。在任何本发明实施方案的一些方面中，抗体或抗体片段与成像剂或细胞毒性剂缀合或融合。
在一个实施方案中，本文中提供了单克隆抗体或其抗原结合片段，其与根据本发明实施方案中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合相同的表位。在一些方面中，所述抗体或抗体片段是人源化抗体。在一些方面中，抗体片段是单价scFv(单链可变片段)抗体、二价scFv、Fab片段、F(ab’)2片段、F(ab’)3片段、Fv片段或单链抗体。在一些方面中，所述抗体是嵌合抗体或双特异性抗体。在一些方面中，所述抗体是IgG抗体或重组IgG抗体或抗体片段。在一些方面中，抗体与成像剂或细胞毒性剂缀合或融合。
在一个实施方案中，本文中提供了包含治疗有效量的本发明实施方案中任一项的抗体或抗体片段以及可药用稀释剂或载剂的组合物。在一些方面中，提供了用作用于在患者中治疗癌症的药物的组合物。
在一个实施方案中，本文中提供了编码本发明实施方案中任一项的抗体或抗体片段的杂交瘤或工程化细胞。
在一个实施方案中，本文中提供了治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括施用有效量的抗CD5L抗体或抗体片段。在一些方面中，抗CD5L抗体或抗体片段是本发明实施方案中任一项的抗体或抗体片段。
在一些方面中，癌症是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、肝细胞癌、甲状腺癌、子宫癌、食管癌、鳞状细胞癌、白血病、骨肉瘤、黑素瘤、胶质母细胞瘤或神经母细胞瘤。在一些方面中，癌症是卵巢癌。
在一些方面中，另外向患者施用第二抗癌治疗。第二抗癌治疗可以是抗血管生成治疗。抗血管生成治疗可以是抗VEGF治疗。在一些方面中，抗CD5L抗体或抗体片段导致抗血管生成治疗的效力提高。在一些方面中，第二抗癌治疗包括化学治疗、免疫治疗、手术、放射治疗或生物治疗。
在一些方面中，抗CD5L抗体或抗体片段静脉内施用。在一些方面中，患者的癌症已被确定为过表达CD5L。在一些方面中，患者的血清或血浆已被确定为具有升高的CD5L水平。在一些方面中，患者的癌症在抗血管生成治疗之后复发。在一些方面中，患者的癌症已被确定为对抗VEGF治疗具有抗性。
在一个实施方案中，本文中提供了用于检测CD5L的方法，其包括(a)将样品与任何本发明实施方案的抗CD5L抗体或抗体片段一起孵育；以及(b)测量抗CD5L抗体或抗体片段与样品的结合。在一些方面中，样品是血液、血清、血浆、唾液、活检物、尿液或脑脊液。
如本文中使用的，就指定组分而言“基本上不含”在本文中用于意指指定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非故意污染产生的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分之量的组合物。
如本文在说明书中所用的，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文在权利要求书中所用的，当与词语“包含/包括”联合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。
除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义。本文中使用的“另一”可意指至少第二或更多。
在本申请通篇，术语“约”用于表示值包括用来确定所述值的装置、方法的误差的固有变化，所述研究对象之间存在的变化，或者所述值10％之内的值。
本公开内容的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实例虽然指示了本公开内容的一些优选实施方案，但是仅以示例说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域的技术人员来说将变得明显。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个彩色绘制的图。在提出请求并支付必要的费用后，官方将提供带有彩色附图的该专利或专利申请公开的副本。
以下附图构成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过参照这些附图中的一幅或更多幅并结合本文中所示的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容。
图1A至1M。抗VEGF治疗抗性内皮细胞中CD5L的上调促进血管生成和迁移。(图1A)表示在B20治疗过程期间分离肿瘤的时间点的示意图。通过生物发光的增加确定肿瘤进展。(图1B)来自基因表达谱的热图，其表明与B20敏感性肿瘤相比，B20抗性肿瘤中的倍数变化。(图1C)B20敏感性肿瘤和B20抗性肿瘤二者中所选择基因的RNA表达的倍数变化。(图1D)来自对B20敏感(L)和具有抗性(R)的小鼠肿瘤的内皮细胞中的CD5L染色。(图1E)包含CD5L过表达质粒vs.空载体(empty vector，EV)的RF24内皮细胞中的CD5L蛋白表达。(图1F)包含CD5L过表达质粒vs.EV的RF24内皮细胞中的细胞增殖。(图1G和1H)包含CD5L过表达质粒vs.EV的RF24内皮细胞中的管形成(图1G)和细胞迁移(图1H)。(图1I)从包含CD5L过表达质粒的RF24内皮细胞收集的培养物中CD5L的浓度。(图1J至1M)用siCD5L vs.si对照处理的RF24内皮细胞中的CD5L蛋白表达(图1J)、细胞增殖(图1K)、管形成(图1L)和细胞迁移(图1M)。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。条表示平均值±SD。EV——空载体。
图2A至2N。CD5L通过低氧诱导的PPAR-γ过表达而上调。(图2A和2B)包含PPAR-γ过表达质粒vs.(EV)的RF24内皮细胞中的CD5LmRNA(图2A)和蛋白质(图2B)表达。(图2C)使用包含PPAR-γ过表达质粒vs.(EV)的RF24内皮细胞的CD5L启动子构建体激活。(图2D和2E)用siPPAR-γvs.si对照处理的RF24内皮细胞中PPAR-γ和CD5LmRNA(图2D)和蛋白质(图2E)表达。(图2F)用siPPAR-γvs.si对照处理的RF24内皮细胞的CD5L启动子构建体激活。(图2G)在共转染PPAR-γ过表达质粒和包含突变的PPAR-γ结合位点的CD5L启动子构建体之后，RF24内皮细胞中的萤光素酶表达。(图2H和2I)在低氧或常氧条件下培养的RF24内皮细胞中PPAR-γ和CD5L mRNA(图2H)和蛋白质(图2I)表达。(图2J和2K)在用氯化钴(HIF1α稳定剂)处理6小时和30小时的RF24内皮细胞中PPAR-γ和CD5L mRNA(图2J)和蛋白质(图2K)的表达。(图2L)在低氧条件下用YC-1或拓扑替康(topotecan)处理的RF24内皮细胞中PPAR-γ和CD5L mRNA表达。(图2M)在低氧和常氧条件下培养的RF24内皮细胞中CD5L WT启动子构建体的激活。(图2N)在低氧和常氧条件下使用抗PPAR-γ抗体对CD5L启动子的染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。条表示平均值±SD。
图3A至3J。RF24内皮细胞的外源性CD5L处理导致PI3K/AKT信号传导的上调。(图3A)用CD5L蛋白vs.对照处理的RF24内皮细胞的反相蛋白质阵列(reverse phase proteinarray，RPPA)分析。(图3B)在外源性CD5L蛋白处理之后RF24细胞中的通过磷酸-AKT/AKT测量的AKT途径激活。(图3C至3E)用CD5L蛋白以及LY294002(PI3K抑制剂)或DMSO处理的RF24细胞中的AKT途径激活(图3C)、管形成(图3D)和细胞迁移(图3E)。(图3F)用CD5L蛋白处理的RF24细胞中的CD36mRNA表达。(图3G)用siCD36处理的RF24细胞中的AKT途径激活。(图3H)用CD5L蛋白处理的RF24细胞中的PPAR-γmRNA表达。(图3I和3J)RF24细胞在增加浓度的贝伐单抗(bevacizumab)和另外的CD5L蛋白(图3I)或siCD5L(图3J)下的细胞生存力。(ns-不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。条表示平均值±SD。
图4A至4G。PPAR-γ沉默在ID8异种移植模型中抑制肿瘤生长和血管生成。(图4A)野生型(wild-type，WT)和TIE2CrePPARγflox/flox(KO)小鼠的来自各组的代表性小鼠的照片。(图4B和4C)肿瘤重量(g)和肿瘤结节数目(平均值±SD，如误差条所示)。肿瘤重量的显著差异由星号表示(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。(图4D和4E)Ki67和CD31的表达的石蜡载片的统计学分析。检查每张载片五个视野和至少三张载片(每组5张载片，WT和KO)。条表示平均值±SD。**P<0.01和***P<0.001。(图4F)对于B20(抗VEGF治疗)的存活曲线。以5mg/kg的剂量每周两次腹膜内注射B20。(图4G)来自WT vs.TIE2CrePPARγflox/flox(KO)小鼠的肿瘤样品中p-AKT相对于AKT的表达(在AKT相对于黏着斑蛋白归一化之后确定的p-AKT与AKT之比)。
图5A至5I。靶向CD5L的新抗体表现出抗肿瘤和抗血管生成作用。(图5A)来自野生型(WT)和抗CD5L抗体R-35处理的组二者的代表性小鼠的照片。从注射肿瘤之后的第8天开始，直到第35天，用PBS或抗CD5L抗体(10mg/kg)腹膜内处理小鼠。(图5B和5C)肿瘤重量(g；图5B)和肿瘤结节数目(平均值±SEM，如误差条所示；图5C)。(图5D)来自对照vs.抗CD5L抗体处理的组的肿瘤的CD31免疫荧光染色。(图5E和5F)用单独的对照抗体、对照抗体+CD5L蛋白或者R-35抗体+CD5L蛋白处理的RF24细胞的管形成(图5E)和细胞迁移(图5F)。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。除了如上所述的图5B和5C，条表示平均值±SD。(图5G和5H)对于肿瘤细胞注射，腹膜内注射SKOV3ip1细胞(1×106)。对于抗CD5L抗体处理，以10mg/kg体重的剂量每周一次腹膜内注射对照或实验抗体。在用CO2对小鼠实施安乐死之后，记录总肿瘤重量(图5H)和肿瘤结节数目(图5G)。(图5I)在体内实验结束时通过在天平上称量单个小鼠来测量小鼠体重。
图6A至6D。在卵巢癌患者中，CD5L过表达与贝伐单抗抗性和更差的总体存活相关。(图6A和6B)在分类为对贝伐单抗有响应或无响应的卵巢癌患者中通过免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)(图6A)和血清蛋白水平(图6B)测量的CD5L蛋白表达(平均值±SD，如误差条所示)。(图6C)来自人卵巢癌患者的肿瘤内皮细胞中低(上部)和高(下部)CD5L蛋白表达的代表性图像。(图6D)根据如通过IHC测量的CD5L蛋白表达水平(参见图6C)分层的高级别浆液性卵巢癌患者的总体存活的Kaplan Meier曲线。
图7。CD5L诱导AVA抗性的机制。抗VEGF治疗最初可通过减少的血管生成(更少的肿瘤-单血管)来引起肿瘤消退；然而，适应性抗性经常在引起肿瘤生长和提高的血管生成(具有许多血管的较大肿瘤)的时间之后出现。插图示出了肿瘤内皮细胞，其显示出局部肿瘤低氧通过转录因子PPAR-γ的过表达导致CD5L分泌增加。分泌的CD5L与CD36受体结合，这导致AKT途径激活，最终导致增加的细胞增殖和血管生成。
图8。CD5L的启动子序列。PPAR-γ结合位点以红色标识。下部的图表示CD5L启动子构建体，其具有突出显示的PPAR-γ结合中的关键碱基对(CTCT)。(SEQ ID NO:360和361)
图9。AVA抗性小鼠肿瘤内皮细胞的独创性途径分析(Ingenuity PathwayAnalysis，IPA)。针对抗VEGF治疗的抗性与低氧信号传导增加有关。对图1B所示的基因表达谱进行了IPA分析。
图10A至10B。外源性CD5L蛋白处理对RF24内皮细胞的影响。单独的或在添加400ng/ml CD5L蛋白之后的RF24细胞的管形成(图10A)和细胞迁移(图10B)。(**P<0.01，***P<0.001)。条表示平均值±SD。
图11。ELISA滴定以确定CD5L mAb的EC50。人CD5L蛋白(Sino Biologicals)在PBS中于4℃下在96孔高结合板上包被过夜。在3倍滴定中添加一系列抗体浓度的纯化mAb，以与包被在板上的CD5L抗原结合。使用与HRP缀合的抗兔IgG的二抗和TMB底物检测结合的抗体以检测A450 nm。使用GraphPad软件通过应用4-参数拟合计算抗体的结合亲和力来估计EC50。实验有3次重复，误差条表示标准偏差。
图12。CD5L抗体的动力学结合传感图。使用Octet BLI仪器根据制造商说明确定CD5L抗体的动力学结合常数(KD)。
图13。CD5L Ab对C57/BL6小鼠毒性的作用。
图14。经IgG对照和经CD5L Ab处理的C57/BL6小鼠的重要器官的H&E染色。
图15。经CD5L Ab处理的小鼠的器官的CD31染色。
图16。CD5L Ab对荷OVCAR8瘤小鼠的存活的作用。
图17。使用双层推断(Bilayer Inferometry，BLI)Octet方法的人源化CD5L-35HumAb对CD5L的结合亲和力。
发明详述
靶向血管内皮生长因子(VEGF)途径的抗血管生成治疗是对抗肿瘤生长和进展的有力工具；然而，经常产生抗药性。CD5抗原样前体(CD5L)在本文中被确定为响应于抗血管生成治疗而导致适应性抗性出现的重要蛋白质。使用新开发的靶向CD5L的单克隆抗体，CD5L过表达的促血管生成作用在体外和体内两种环境中均有所减弱。此外，癌症患者的CD5L过表达显示与贝伐单抗抗性和较差的总体存活相关。这些发现暗示CD5L是针对抗血管生成治疗的适应性抗性的主要驱动因素，并且靶向CD5L的方式具有重要的临床效用。
抗血管生成治疗是癌症治疗中不可或缺的组成部分。虽然药物例如贝伐单抗(抗VEGF单克隆抗体)已被FDA批准用于癌症治疗，但抗VEGF药物的主要限制是高频率的适应性抗性，这使得治疗无效。随着使用这种药物的适应证增加，这一点特别重要。在本文中，表明了增加的内皮CD5L表达是针对抗VEGF治疗的抗性的重要驱动因素，并且可以使用用于使其作用无效的方式(例如，抗体)来逆转抗性表型。将抗CD5L药物纳入临床试验可揭示延长抗VEGF治疗效力的可行方法。
为了检查对抗VEGF抗体(AVA)治疗的潜在抗性的可能机制，使用小鼠模型来鉴定在初始响应期之后表现出生长的肿瘤。具体地，建立了卵巢癌原位小鼠模型，其被设计成在用靶向小鼠和人VEGF-A二者的抗VEGF抗体B20处理之后产生适应性抗性。检查了在治疗之前、最大响应和肿瘤进展时收集的肿瘤相关内皮细胞的基因组谱，并且发现在进展时CD5L水平显著升高。CD5L(或AIM——由巨噬细胞表达的凋亡抑制剂)先前被确定为炎性应答期间主要由淋巴组织中的巨噬细胞分泌的可溶性蛋白质(Sanjurjo et al.,2015)。虽然此后发现了CD5L的其他作用，但与内皮细胞和血管生成特异性相关的作用仍然是未知的。在此，所呈现的数据表明了针对贝伐单抗的适应性抗性中的CD5L表达。还表明了使用靶向CD5L的抗体来中和CD5L阻断了针对抗血管生成治疗的适应性抗性，这表明抗CD5L是克服针对贝伐单抗和其他抗血管生成治疗的抗性的潜在新治疗策略。
I.本公开内容的一些方面
本文中提供的数据将CD5L确定为AVA抗性的重要调节者，这是以前未认识到的在促进肿瘤血管生成中发挥功能的作用。从概念的角度来看，由于长期VEGF阻断导致的低氧最终通过转录因子PPAR-γ的上调驱动CD5L的过表达。通过对下游途径的分析，表明了肿瘤内皮细胞中在CD5L信号传导增加的情况下的PI3K/AKT途径的显著激活(图7)。重要的是，通过多种方式阻断CD5L可以恢复对抗VEGF治疗的响应。
抗-VEGF药物目前被批准用于治疗许多不同的癌症类型。遗憾的是，尽管这些治疗的初始响应率很高，但大多数患者会在数周至数月内产生抗性疾病。这样的适应性抗性的潜在机制可能是多因素的，并且尚未被完全理解。一种这样的机制涉及在针对AVA治疗的响应中除VEGF之外的促血管生成因子例如成纤维细胞生长因子1和肝配蛋白A1(Casanovaset al,2005)的上调。此外，用AVA化合物治疗的肿瘤通过增加其侵袭潜力而不依赖于新血管产生来适应(Norden et al.,2008,Narayana et al.,2009)。无论确切的机制如何，肿瘤内皮细胞适应其特定微环境的现象现在已被广泛接受。因此，采取了系统性方法，凭此进行来自响应者vs.非响应者小鼠的肿瘤内皮细胞的mRNA谱分析，并将CD5L确定为治疗抗性内皮细胞中最高度表达的mRNA。
最初因其对白细胞的抗凋亡作用而命名(Miyazaki et al.,1999)，CD5L因此被认为是炎性应答的关键调节因子，特别是通过其对巨噬细胞的作用。还已表明其参与多种细胞过程，包括动脉粥样硬化、感染和癌症(Sanjurjo et al.,2015)。尽管CD5L主要由巨噬细胞分泌，但已表明其在免疫系统中具有多种作用。与野生型小鼠相比，缺乏CD5L的小鼠在用热灭活的C.parvum攻击时，肝肉芽肿中的淋巴细胞减少(Kuwata et al.,2003)。此外，使用来自暴露于C.parvum的小鼠的肝T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞的体外研究表明，在用重组CD5L处理之后，凋亡得到显著抑制(Kuwata et al.,2003)。还已表明CD5L在具有CD5L过表达骨髓细胞的转基因小鼠模型中诱导支气管肺泡腺癌的形成(Qu et al.,2009)。令人感兴趣的是，CD5L看起来通过其与CD55、CD59和Crry的相互作用在小鼠肝细胞癌中发挥保护作用，导致随后的补体激活和诱导的肝细胞坏死性死亡(Maehara et al.,2014)。清除剂受体CD36作为CD5L的主要细胞表面受体而被涉及(Kurokawa et al.,2010)并且尽管CD36在内皮细胞上表达，但CD5L在内皮细胞存活中是否起重要作用尚不清楚(Silverstein andFebbraio,2009)。使CD36沉默阻止了与增加的CD5L表达相关的促血管生成表型，这重复了CD5L和完整CD36二者产生AVA抗性的必要性。
通过对卵巢癌组群的分析，确定了CD5L过表达与贝伐单抗抗性之间的临床相关性。这表明肿瘤内皮细胞对CD5L的上调是针对贝伐单抗治疗的适应性抗性机制的必要组成部分。一致地，具有较高CD5L水平的患者也具有较差的总体存活，这可能是由于在抗性环境中观察到的贝伐单抗的降低的抗肿瘤效应。
对抗VEGF治疗的适应性抗性是由肿瘤编程以允许持续存活的复杂机制。随着增加的关于导致这种现象的分子途径的数据出现，仔细选择关键的用于开发新治疗剂的组分以及随后的临床试验将是重要的。CD5L在本文中被确定为针对抗VEGF治疗的适应性响应中的必要蛋白质，并且旨在靶向CD5L的策略可以使进行抗血管生成药物治疗的患者受益。
II.定义
“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点与靶标(例如糖类、多核苷酸、脂质、多肽等)特异性结合的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖了其片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv))、其突变体、天然存在的变体、包含具有所需特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。
“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合位点，并且因此保留了结合抗原的能力。本发明定义涵盖的抗体片段的实例包括：(i)具有VL、CL、VH和CH1结构域的Fab片段；(ii)Fab’片段，其为在CH1结构域的C端具有一个或更多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1结构域以及在CH1结构域的C端的一个或更多个半胱氨酸残基的Fd’片段；(v)具有单个抗体的VL和VH结构域的Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab’)2片段，其为包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab’片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如，单链Fv；scFv)；(x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”，其包含在同一多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)；(xi)“线性抗体”，其包含与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区的一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)。
“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与来源于特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而该链的其余区段与另一个中的相应序列同源。通常来说，在这些嵌合抗体中，轻链和重链二者的可变区模拟来源于一种哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一物种的抗体中的序列同源。例如，可以使用来自非人宿主生物体的容易获得的杂交瘤或B细胞从目前已知的来源方便地产生可变区，而与其组合的恒定区来自例如人细胞制备物。尽管可变区具有易于制备的优点并且特异性不受其来源的影响，而恒定区为人的在注射抗体时引发人对象免疫应答的可能性将比恒定区来自非人来源时低。然而，该定义不限于该具体实例。
抗体的“恒定区”是指单独或组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH1、CH2或CH3，或在IgM和IgE的情况下的CH4)赋予重要的生物学特性，例如分泌、胎盘活动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们变得愈加远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增大。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)部分决定了抗原的识别和特异性。VL和VH各自由通过三个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的四个框架区(FR)组成。CDR与抗原的形状互补，并决定了抗体对抗原的亲和力和特异性。VL和VH二者中有六个CDR。每条链中的CDR通过FR紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。有至少两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(Kabat编号方案；参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th ed,1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.))；以及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Chothia编号方案，其校正了Kabat提出的CDR-L1和CDR-H1中插入和缺失(indel)的位点；参见Al-lazikani et al.(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。也可以使用其他编号方法或方案。如本文所用，CDR可指通过任一种方法或通过两种方法的组合或通过其他期望的方法限定的CDR。另外，可以使用高度保守的核心、边界和高变区的新限定。
如本文所用，术语“重链”是指较大的免疫球蛋白亚基，其通过其氨基末端区域与免疫球蛋白轻链缔合。重链包含可变区(VH)和恒定区(CH)。恒定区进一步包含CH1、铰链、CH2和CH3结构域。在IgE、IgM和IgY的情况下，重链包含CH4结构域但不具有铰链结构域。本领域技术人员将理解，重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些子类(例如，γ1至γ4)。这条链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等已被良好地表征，并且已知赋予功能特化。
如本文所用，术语“轻链”是指与重链的氨基末端区域缔合的较小的免疫球蛋白亚基。与重链一样，轻链包含可变区(VL)和恒定区(CL)。轻链分类为kappa或lambda(κ、λ)。它们中的一对可以与多种重链中任何的一对缔合以形成免疫球蛋白分子。轻链的含义中还涵盖了具有与κ恒定区(C-κ)连接的λ可变区(V-λ)或与λ恒定区(C-λ)连接的κ可变区(V-κ)的轻链。
如本文所用，“核酸”、“核酸序列”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”或其他语法等同物是指共价连接在一起的至少两个核苷酸，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸是任意长度(包括例如20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等)的聚合物。本文所述的多核苷酸通常包含磷酸二酯键，然而在一些情况下包括核酸类似物，其可以具有至少一个不同的键联，例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺键联，以及肽核酸骨架和键联。可以制备天然存在的多核苷酸和类似物的混合物；或者，可以制备不同多核苷酸类似物的混合物，以及天然存在的多核苷酸和类似物的混合物。以下是多核苷酸的一些非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、cRNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构赋予修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合之后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语还包括双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本公开内容的为多核苷酸的任何实施方案涵盖双链形式，也涵盖已知或预测构成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。多核苷酸由以下四种核苷酸碱基的特定序列构成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)(当核苷酸是RNA时代替胸腺嘧啶)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。除非另有说明，否则特定的多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子替换)和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子替换可以通过产生其中将一个或更多个选择的(或全部)密码子的第三位置替换为混合碱基和/或脱氧肌苷残基的序列来实现。
本文使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物。这些术语还适用于其中一个或更多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物，包含经修饰的残基的那些，以及非天然存在的氨基酸聚合物。在当前情况下，术语“多肽”涵盖抗体或其片段。
如本文所用，在重组核酸技术、微生物学、免疫学、抗体工程以及分子和细胞生物学领域中使用的其他术语将由适用领域的普通技术人员通常理解。
III.抗体和抗体修饰
在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如，包含接枝到异源非人、人或人源化序列(例如，框架和/或恒定结构域序列)的来自非人供体的抗原结合序列的抗体。已经开发出用人来源的类似结构域代替单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域而使外源抗体的可变区保持完整的方法。或者，在针对人免疫球蛋白基因转基因的小鼠中产生“完全人”单克隆抗体。还已经开发了通过重组构建具有啮齿动物(例如小鼠)和人氨基酸序列二者的抗体可变结构域来将单克隆抗体的可变结构域转化为更加人形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，仅高变CDR源自小鼠单克隆抗体，而框架区和恒定区源自人氨基酸序列(参见美国专利号5,091,513和6,881,557，其通过引用并入本文)。认为将抗体中啮齿动物特征性的氨基酸序列替换为在人抗体中相应位置处发现的氨基酸序列将降低在治疗使用期间不良免疫反应的可能性。也可对产生抗体的杂交瘤或其他细胞进行遗传突变或其他改变，其可以改变或可以不改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性。
用于在多种动物物种中产生多克隆抗体的方法以及用于产生多种类型(包括人源化、嵌合和完全人)单克隆抗体的方法是本领域中公知并且是高度可预测的。例如，以下美国专利和专利申请提供了这样的方法的可行描述：美国专利申请号2004/0126828和2002/0172677；以及美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；和6,891,024；各自通过引用并入本文。
在某些实施方案中，是抗体缀合物。缀合物可以是例如与其他蛋白质、糖类、脂质或混合部分分子缀合的本公开内容的特异性结合剂(例如抗体)。这样的抗体缀合物包括但不限于包括将其连接至一种或更多种聚合物的修饰。在某些实施方案中，抗体与一种或更多种水溶性聚合物连接。在某些这样的实施方案中，与水溶性聚合物的连接降低了抗体在水性环境(例如生理环境)中沉淀的可能性。在某些实施方案中，治疗性抗体与水溶性聚合物连接。在某些实施方案中，本领域技术人员可以基于以下考虑因素来选择合适的水溶性聚合物，所述考虑因素包括但不限于聚合物/抗体缀合物是否将用于治疗患者，并且如果是的话，则抗体的药理学特性(例如半衰期、剂量、活性、抗原性和/或其他因素)。
在另一些实施方案中，缀合物可以是例如细胞毒性剂。这种类型的细胞毒性剂可以改善抗体介导的细胞毒性，并且包括直接或间接刺激细胞死亡的部分(例如细胞因子)、放射性同位素、化学治疗药物(包括前药)、细菌毒素(例如假单胞菌外毒素、白喉毒素等)、植物毒素(例如蓖麻毒蛋白、多花白树毒蛋白等)、化学缀合物(例如美登木素生物碱毒素、加利车霉素(calechaemicin)等)、放射性缀合物、酶缀合物(例如RNA酶缀合物、颗粒酶抗体导向的酶/前药治疗)等。在将编码毒素的多核苷酸与编码结合剂的多核苷酸连接之后，可以将蛋白质细胞毒素表达为与特异性结合剂的融合蛋白。在另一个替代方案中，可以对特异性结合剂进行共价修饰以包含期望的细胞毒素。
在另一些实施方案中，抗体或其片段可以与报道基团缀合，所述报道基团包括但不限于放射性标记、荧光标记、酶(例如催化比色或荧光测定反应的酶)、底物、固体基质或载体(例如生物素或抗生物素蛋白)。因此，本公开内容提供了包含抗体分子的分子，其中所述分子优选还包含选自放射性标记、荧光标记、酶、底物、固体基质和载体的报道基团。这样的标记是本领域技术人员公知的，例如特别考虑了生物素标记。这样的标记的使用是本领域技术人员公知的，并且描述在例如美国专利号3,817,837；美国专利号3,850,752；美国专利号3,996,345和美国专利号4,277,437中，其各自通过引用并入本文。其他有用的标记包括但不限于放射性标记、荧光标记和化学发光标记。关于使用这样的标记的美国专利包括例如美国专利号3,817,837；美国专利号3,850,752；美国专利号3,939,350和美国专利号3,996,345。本公开内容的任何肽可包含这些标记中的任一种的一种、两种或更多种。
A.单克隆抗体及其产生
“分离的抗体”是已经从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在一些具体实施方案中，抗体被纯化至：(1)通过劳里法(Lowrymethod)确定的抗体的按重量计大于95％，并且最特别地按重量计大于99％；(2)通过使用旋转杯序列分析仪(spinning cup sequenator)足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或者(3)使用考马斯蓝或银染色剂在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE的均质。由于抗体天然环境的至少一种组分将不存在，分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，通常来说，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
基础4-链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基础异四聚体单元以及被称为J链的另外的多肽组成，并且因此包含10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合以形成包含2至5个基础4-链单元以及J链的多价聚集体。在IgG的情况下，4-链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链根据H链同种型通过一个或更多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N端具有可变区(VH)，随后是α和γ链各自的三个恒定结构域(CH)，以及对于μ和同种型是四个CH结构域。每条L链在N端具有可变区(VL)，随后是在其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和特性，参见例如Basic and ClinicalImmunology,8th edition,Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,page 71,and Chapter 6。
来自任何脊椎动物物种的L链可基于其恒定结构域(CL)的氨基酸序列分为两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一。根据其重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别或同种型。存在5种免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别具有命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能的相对较小差异，其γ和α类别进一步分为亚类，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变”是指V结构域的某些区段在抗体之间序列差异很大的事实。V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是均匀地分布于可变区的110个氨基酸跨度中。相反，V区由15至30个氨基酸的称为框架区(frameworkregion，FR)的相对不变的段(stretch)组成，所述相对不变的段被每个9至12个氨基酸长的称为“高变区”的极度可变的较短区域分隔。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，所述四个FR主要采用β-片层构型，被形成环连接的三个高变区连接，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自其他链的高变区一起促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应物功能，例如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellularcytotoxicity，ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(antibody-dependent cellularphagocytosis，ADCP)、抗体依赖性嗜中性粒细胞吞噬(antibody-dependent neutrophilphagocytosis，ADNP)和抗体依赖性补体沉积(antibody-dependent complementdeposition，ADCD)。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，当根据Kabat编号系统编号时，VL中的约第24至34位(L1)、第50至56位(L2)和第89至97位(L3)残基周围，以及VH中的约第31至35位(H1)、第50至65位(H2)和第95至102位(H3)残基周围；Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))；和/或来自“高变环”的那些残基(例如，当根据Chothia编号系统编号时，VL中的第24至34位(L1)、第50至56位(L2)和第89至97位(L3)残基，以及VH中的第26至32位(H1)、第52至56位(H2)和第95至101位(H3)残基；Chothia andLesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；和/或来自“高变环”/CDR的那些残基(例如，当根据IMGT编号系统编号时，VL中的第27至38位(L1)、第56至65位(L2)和第105至120位(L3)残基，以及VH中的第27至38位(H1)、第56至65位(H2)和第105至120位(H3)残基；Lefranc,M.P.et al.Nucl.Acids Res.27:209-212(1999),Ruiz,M.et al.Nucl.Acids Res.28:219-221(2000))。任选地，抗体在以下点中的一个或更多个处具有对称插入：当根据AHo编号时，VL中的28、36(L1)、63、74至75(L2)和123(L3)，以及VsubH中的28、36(H1)、63、74至75(H2)和123(H3)；Honneger,A.and Plunkthun,A.J.Mol.Biol.309:657-670(2001))。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体的群体获得的抗体，即除可能少量存在的可能天然发生的突变外，构成群体的各抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可被合成而不受其他抗体的污染。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，本公开内容中可用的单克隆抗体可通过最初由Kohleret al.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见，例如美国专利号4,816,567)，在对抗原特异性B细胞、响应于感染或免疫接种的抗原特异性浆母细胞进行单细胞分选，或捕获来自大量经分选抗原特异性集合中单细胞的连接的重链和轻链之后。单克隆抗体还可例如使用Clacksonet al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
B.人源化抗体及其产生
当抗体或其片段旨在用于治疗目的时，所述抗体或其片段可能需要将它们“人源化”以减弱任何免疫反应。可以在体外或体内环境中研究这样的人源化抗体。可以产生人源化抗体，例如通过用相应的但非免疫原性部分(即嵌合抗体)替换抗体的免疫原性部分。PCT申请PCT/US86/02269；EP申请184,187；EP申请171,496；EP申请173,494；PCT申请WO86/01533；EP申请125,023；Sun et al.,J.Steroid Biochem.,26(1):83-92,1987；Wood etal.,J.Clin.Lab.Immunol.,17(4):167-171,1985；和Shaw et al.,J.Natl.Cancer Inst.,80(19):1553-1559,1988；这些参考文献全部通过引用并入本文。“人源化”抗体可以通过CDR或CEA替换来产生。Jones et al.,Nature,321:522-525,1986和Beidler et al.,J.Immunol.,141(11):4053-4060,1988，其各自通过引用并入本文。为此，与小鼠单克隆抗体的VH和VL框架同源的人VH和VL序列可以通过在GenBank数据库中检索来确定。然后选择具有最高同源性的人序列作为人源化的接受体。然后将小鼠单克隆的CDR序列转移到所选择的人框架的相应位置。
C.通用方法
应该理解，本公开内容的单克隆抗体具有多种应用。这些包括生产用于检测CD5L的诊断试剂盒以及用于治疗与CD5L水平升高相关的疾病。在这些情况下，可以将这样的抗体与诊断或治疗剂连接，将其在竞争性测定中用作捕获剂或竞争剂，或者单独使用它们而没有与其连接的另外的试剂。如下文进一步讨论的，抗体可以被突变或修饰。用于制备和表征抗体的方法是本领域公知的(参见，例如Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,1988；美国专利4,196,265)。
用于产生单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的方法相同的路线开始。这两种方法的第一步都是对合适的宿主进行免疫接种。如本领域中公知的，用于免疫接种的给定组合物的免疫原性可不同。因此，通常有必要加强宿主的免疫系统，如可通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。一些示例性且优选的载体是钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)和牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)。其他白蛋白如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。用于使多肽与载体蛋白缀合的方式是本领域中公知的，并且包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺(carbodiimyde)和双-偶氮联苯胺(bis-biazotized benzidine)。同样如本领域中公知的，特定免疫原组合物的免疫原性可通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强。动物中的示例性且优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包含经杀伤结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫应答非特异性刺激物)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂，并且在人中，包括明矾、CpG、MFP59以及免疫刺激分子的组合(“佐剂系统”，例如AS01或AS03)。可有另外实验接种形式以诱导抗原特异性B细胞，包括纳米粒疫苗，或作为物理递送系统(例如脂质纳米粒或在金生物弹道珠上)中DNA或RNA基因递送以及利用针、基因枪、经皮电穿孔设备递送的基因编码抗原。抗原基因也可由有复制能力或复制缺陷型病毒载体例如腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、疱疹病毒或甲病毒复制子或替代地病毒样颗粒编码来携带。
用于产生抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括：在存在促进细胞膜融合的试剂(化学的或电的)的情况下使体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比例混合，但是该比例可分别为约20:1到约1:1而不等。在一些情况下，作为初始步骤，用EB病毒(EpsteinBarr virus，EBV)转化人B细胞提高了B细胞的尺寸，从而增强与相对较大尺寸的骨髓瘤细胞的融合。通过在转化培养基中使用CpG和Chk2抑制剂药物增强了EBV的转化效率。或者，可通过在含有另外的可溶性因子例如IL-21和人B细胞活化因子(BAFF)(TNF超家族的II型成员)的培养基中与表达CD40配体(CD154)的转染细胞系共培养来活化人B细胞。Kohler和Milstein(1975；1976)已描述了使用仙台病毒(Sendai virus)的融合方法，并且Gefteretal.(1977)已描述了使用聚乙二醇(PEG)例如37％(v/v)PEG的融合方法。电诱导融合方法的使用也是合适的(Goding,pp.71-74,1986)，并且一些方法具有更好的效率(Yu et al.,2008)。融合方法通常以较低频率(约1×10-6至1×10-8)产生活杂交体，但是利用优化方法可以实现接近1/200的融合效率(Yu et al.,2008)。然而，相对低的融合效率并不造成问题，因为通过在选择培养基中培养，活的融合杂合体与亲本未融合细胞(特别是在正常情况下将持续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)区分开来。选择培养基通常是在组织培养基中包含阻断核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂为氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶二者的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，向培养基补充作为核苷酸来源的次黄嘌呤和胸苷(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，向培养基补充次黄嘌呤。如果B细胞来源是EBV转化的人B细胞系，则添加哇巴因(ouabain)以清除未与骨髓瘤融合的EBV转化系。
优选的选择培养基是HAT或具有哇巴因的HAT。只有能够进行核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶(例如，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT))中有缺陷，因此其不能存活。B细胞可进行该途径，但是其在培养中具有有限的寿命并且通常在约2周内死亡。因此，可在选择培养基中存活的唯一细胞是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂合体。当用于融合的B细胞的来源是EBV转化B细胞系时，此时还可将哇巴因用于杂合体的药物选择，因为EBV转化B细胞对药物杀伤易感，而选择所使用的骨髓瘤配偶体对哇巴因具有抗性。
培养提供了从中选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。通常来说，杂交瘤的选择如下进行：通过在微量滴定板中进行单克隆稀释来培养细胞，随后测试单独的克隆上清液(在约两至三周之后)的期望反应性。测定应灵敏、简单并且迅速，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、斑点免疫结合测定等。然后将选择的杂交瘤系列稀释或通过流式细胞术分选进行单细胞分选，并克隆到单独抗体产生细胞系中，所述克隆然后可无限增殖以提供mAb。细胞系可以以两种基本方式用于MAb产生。可将杂交瘤样品注射(通常注射到腹膜腔中)到动物(例如，小鼠)中。任选地，在注射之前将动物用烃特别是油(例如姥鲛烷(四甲基十五烷))致敏(prime)。当以这种方式使用人杂交瘤时，注射免疫妥协的小鼠(例如SCID小鼠)是最佳的，以防止肿瘤排斥。经注射动物产生分泌由融合细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可取出动物的体液例如血清或腹水以提供高浓度的MAb。也可在体外培养单个细胞系，其中mAb自然地分泌到培养基中，从中可容易地获得高浓度的mAb。或者，可在体外使用人杂交瘤细胞系以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。可将细胞系调整为在不含血清的培养基中生长，以优化回收高纯度的人单克隆免疫球蛋白的能力。
如果期望的话，可使用过滤、离心和多种色谱方法(例如FPLC或亲和色谱)对通过任一种方式产生的mAb进行进一步纯化。本公开内容的单克隆抗体的片段可通过以下方法由经纯化的单克隆抗体获得：其包括用酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化，和/或通过经化学还原切割二硫键。或者，本公开内容所涵盖的单克隆抗体片段可使用自动化肽合成仪合成。
还考虑了可使用分子克隆方法来产生单克隆抗体。可使用顺磁珠选择或流式细胞术分选来物理地分选用目的抗原标记的单B细胞，然后可从单细胞中分离RNA，并通过RT-PCR扩增抗体基因。或者，可将抗原特异性的大量分选的细胞群隔离在微泡中，并使用重链和轻链扩增子的物理连接或对来自囊泡的重链和轻链基因进行共同条码化(commonbarcoding)来从单细胞中回收匹配的重链和轻链可变基因。来自单细胞的匹配的重链和轻链基因也可通过用携带RT-PCR引物和用于以每个细胞一种条码来标记转录物的条码的细胞穿透纳米粒处理细胞来从抗原特异性B细胞群获得。也可以通过杂交瘤系的RNA提取分离抗体可变基因，并通过RT-PCR获得抗体基因并克隆到免疫球蛋白表达载体中。或者，由从细胞系分离的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库，并使用病毒抗原通过淘选选择表达合适抗体的噬菌粒。该方法相对于常规杂交瘤技术的优点是在单轮中可产生并筛选约104倍多的抗体，并且通过H链和L链组合产生新特异性，其进一步提高了发现合适抗体的机会。
教导产生可用于本公开内容的抗体的其他美国专利(各自通过引用并入本文)包括美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法产生嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备；以及美国专利4,867,973，其描述了抗体-治疗剂缀合物。
根据本公开内容的抗体可在第一种情况下通过其结合特异性来限定。通过使用本领域技术人员公知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，本领域技术人员可确定这样的抗体是否落入本发明权利要求书的范围内。例如，给定抗体与之结合的表位可由位于抗原分子内的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个)氨基酸的单个连续序列组成(例如，结构域中的线性表位)。或者，表位可由位于抗原分子内的多个不连续的氨基酸(或氨基酸序列)组成(例如，构象表位)。
本领域普通技术人员已知的多种技术可用于确定抗体是否与多肽或蛋白质内的“一个或更多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规的交叉阻断测定，例如在Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)中描述的那些。交叉阻断可在多种结合测定(例如ELISA、生物层干涉术或表面等离子体共振)中测量。其他方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)MethodsMol.Biol.248:443-63)、肽切割分析、使用单粒子重建的高分辨率电子显微术技术、cryoEM、或断层摄影术(tomography)、晶体学研究和NMR分析。此外，可以使用诸如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰的方法(Tomer(2000)Prot.Sci.9:487-496)。可用于鉴定抗体与之相互作用的多肽内氨基酸的另一种方法是通过质谱检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及氘标记目的蛋白，随后使抗体与氘标记的蛋白质结合。接下来，将蛋白质/抗体复合物转移到水中，并且受抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子以比不是界面一部分的氨基酸内的可交换质子更慢的速率进行氘对氢的反向交换。作为结果，与不包含在界面中的氨基酸相比，形成蛋白质/抗体界面的一部分的氨基酸可保留氘，并且因此表现出相对更高的质量。在抗体解离之后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示氘标记的残基，其对应于抗体与之相互作用的特定氨基酸。参见，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267:252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
术语“表位”是指抗原上B和/或T细胞对其作出响应的位点。B细胞表位可由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并列的非连续氨基酸二者形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。在独特的空间构象中，表位通常包含至少3个并且更通常地至少5或8至10个氨基酸。
修饰辅助谱分析(Modification-Assisted Profiling，MAP)，也称为基于抗原结构的抗体谱分析(Antigen Structure-based Antibody Profiling，ASAP)，是根据每种抗体与化学或酶促修饰的抗原表面的结合特性的相似性对针对同一抗原的大量单克隆抗体(mAb)进行分类的方法(参见US2004/0101920，特别地通过引用整体并入本文)。每个类别可反映与通过另一类别所代表的表位明显不同或部分重叠的独特表位。该技术使得能够快速过滤遗传上相同的抗体，从而使表征可集中在遗传上独特的抗体上。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可有助于鉴定产生具有期望特征的mAb的罕见杂交瘤克隆。MAP可用于将本公开内容的抗体分类为结合不同表位的抗体组。
本公开内容包括可与相同表位或表位的一部分结合的抗体。同样，本公开内容还包括与本文中所述的任何具体示例性抗体竞争与靶标或其片段结合的抗体。通过使用本领域中已知的常规方法，可容易地确定抗体是否与参考抗体结合相同的表位，或与其竞争结合。例如，为了确定受试抗体是否与参考结合相同表位，允许参考抗体在饱和条件下与靶标结合。接下来，评估受试抗体与靶分子结合的能力。如果受试抗体能够与与参考抗体饱和结合之后的靶分子结合，则可得出结论，受试抗体与参考抗体结合不同的表位。在另一方面，如果受试抗体不能与与参考抗体饱和结合之后的靶分子结合，则受试抗体可与与由参考抗体结合的表位相同的表位结合。
在另一个方面中，提供了具有如表2中所示的来自重链和轻链的克隆配对CDR的单克隆抗体。这样的抗体可以使用本文所述的方法产生。
在另一个方面中，抗体可由其包含另外的“框架”区的可变序列来限定。这些在表3和4中提供，这些序列编码或代表完整的可变区。此外，抗体序列可不同于这些序列，任选地使用以下更详细讨论的方法。例如，核酸序列可在以下方面不同于上述那些：(a)可变区可与轻链和重链的恒定结构域分离；(b)核酸可不同于上述那些同时不影响由其编码的残基；(c)核酸可以以给定百分比，例如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性不同于上述核酸；(d)核酸可由于在高严格性条件下进行杂交的能力而不同于上述核酸，如通过低盐和/或高温条件所例示的，例如由约50℃至约70℃的温度下约0.02M至约0.15M NaCl提供的；(e)氨基酸可以以给定百分比，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性不同于上述氨基酸；或者(f)氨基酸可通过允许保守替换(以下讨论)而不同于上述那些。上述各项均适用于如表4所示的核酸序列和表3的氨基酸序列。
当比较多核苷酸和多肽序列时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列在比对最大对应性时相同，则这两个序列被称为“相同”，如下所述。两个序列之间的比较通常通过在比较窗上比较序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。本文中使用的“比较窗”是指至少约20个连续位置(通常为30至约75、40至约50个)的区段，其中在将两个序列最佳比对之后，可将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
用于比较的序列的最佳比对可使用生物信息学软件的Lasergene套件中的Megalign程序(DNASTAR，Inc.，Madison，Wis.)使用默认参数来进行。该程序体现了以下参考文献中描述的数种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary changein proteins--Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical ResearchFoundation,Washington D.C.Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.(1990)UnifiedApproach to Alignment and Phylogeny pp.626-645Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.(1989)CABIOS5:151-153；Myers,E.W.and Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 11:105；Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy--the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,Calif.；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.,Sci.USA80:726-730。
或者，用于比较的序列的最佳比对可以通过以下来进行：Smith and Waterman(1981)Add.APL.Math 2:482的局部同一性算法，Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同一性比对算法，Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性检索方法，这些算法的计算机化实施方式(GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package,GeneticsComputer Group(GCG),575ScienceDr.,Madison,Wis.)或通过检查进行。
适用于确定序列同一性和序列相似性的百分比的算法的一个具体实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述在Altschul et al.(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。BLAST和BLAST 2.0可例如与本文中所述的参数一起使用，以确定本公开内容的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。抗体序列的重排性质和每个基因的可变长度需要多轮BLAST检索以寻找单一抗体序列。而且，不同基因的人工组装是困难且容易出错的。序列分析工具IgBLAST(万维网ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)鉴定与种系V、D和J基因的匹配、重排接界的细节、Ig V结构域框架区和互补决定区的描述。IgBLAST可分析核苷酸或蛋白质序列，并且可分批处理序列，并允许同时对种系基因数据库和其他序列数据库进行检索，以使丢失可能的最佳匹配的种系V基因的机会最小。
在一种方法中，通过在至少20个位置的比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中与两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的多核苷酸或多肽序列的一部分可包含20％或更低，通常为5％至15％，或10％至12％的添加或缺失(即空位(gap))。百分比通过以下来计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置数目，将匹配位置数目除以参考序列中位置的总数目(即窗大小)，并将结果乘以100，即可得出序列同一性的百分比。
限定抗体的又一种方式是作为下述抗体及其抗原结合片段的任一种的“衍生物”。术语“衍生物”是指与抗原免疫特异性地结合但相对于“亲本”(或野生型)分子包含1、2、3、4、5或更多个氨基酸替换、添加、缺失或修饰的抗体或其抗原结合片段。这样的氨基酸替换或添加可引入天然存在的(即，DNA编码的)或非天然存在的氨基酸残基。术语“衍生物”涵盖例如如具有改变的CH1、铰链、CH2、CH3或CH4区域的变体，以便形成例如具有表现出增强的或受损的效应物或结合特征的变体Fc区的抗体等。术语“衍生物”另外涵盖非氨基酸修饰，例如可被糖基化(例如，具有改变的甘露糖、2-N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、唾液酸、5-N-乙酰神经氨酸、5-羟乙酸神经氨酸等含量)，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，被已知的保护/阻断基团衍生化，蛋白水解切割，与细胞配体或其他蛋白质连接等的氨基酸，在一些实施方案中，改变的糖修饰调节以下中的一项或更多项：抗体增溶、促进抗体的亚细胞运输和分泌、促进抗体组装、构象完整性和抗体介导的效应物功能。在一个具体实施方案中，相对于缺乏糖修饰的抗体，改变的糖修饰增强了抗体介导的效应物功能。导致抗体介导的效应物功能改变的糖修饰在本领域中是公知的(例如，参见Shields,R.L.et al.(2002)“Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves BindingTo Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity,”J.Biol.Chem.277(30):26733-26740；Davies J.et al.(2001)“Expression Of GnTIII InA Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line:Expression Of AntibodiesWith Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher AffinityFor FC Gamma RIII,”Biotechnology&Bioengineering 74(4):288-294)。用于改变糖含量的方法是本领域技术人员公知的，参见例如Wallick,S.C.etal.(1988)“Glycosylation OfA VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha(1----6)Dextran IncreasesIts Affinity For Antigen,”J.Exp.Med.168(3):1099-1109；Tao,M.H.et al.(1989)“Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG.Role Of Carbohydrate InThe Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG ConstantRegion,”J.Immunol.143(8):2595-2601；Routledge,E.G.et al.(1995)“The Effect OfAglycosylation On The Immunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3MonoclonalAntibody,”Transplantation 60(8):847-53；Elliott,S.et al.(2003)“Enhancement OfTherapeutic Protein In vivo Activities Through Glycoengineering,”NatureBiotechnol.21:414-21；Shields,R.L.et al.(2002)“Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity,”J.Biol.Chem.277(30):26733-26740)。
可产生具有经改造序列或糖基化状态的衍生抗体或抗体片段，以赋予在以下中的优选的活性水平：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、抗体依赖性嗜中性粒细胞吞噬(ADNP)或抗体依赖性补体沉积(ADCD)功能，如通过基于珠的或基于细胞的测定或者在动物模型中进行的体内研究所测量的。
衍生抗体或抗体片段可通过使用本领域技术人员公知的技术进行化学修饰来修饰，所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、配制、衣霉素的代谢合成等。在一个实施方案中，抗体衍生物将与亲本抗体具有相似或相同的功能。在另一个实施方案中，相对于亲本抗体，抗体衍生物将表现出改变的活性。例如，与亲本抗体相比，衍生抗体(或其片段)可更紧密地与其表位结合或对蛋白水解更具抗性。
在多个实施方案中，可出于多种原因，例如改善表达、改善交叉反应性或降低脱靶结合而选择对所鉴定抗体的序列进行改造。经修饰抗体可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，所述技术包括通过标准分子生物技术表达或多肽的化学合成。用于重组表达的方法在本文件的其他地方提出。以下是用于抗体改造的相关目标技术的一般讨论。
可培养杂交瘤，然后裂解细胞，并提取总RNA。可使用随机六聚体和RT一起来产生RNA的cDNA拷贝，并随后使用预期扩增所有人可变基因序列的PCR引物的多重混合物进行PCR。可将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中，然后使用标准载体引物通过自动化DNA测序进行测序。可使用从杂交瘤上清液收集并使用G蛋白柱通过FPLC纯化的抗体进行结合和中和的测定。
可通过以下产生重组全长IgG抗体：将来自克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆到IgG质粒载体中，将其转染到293(例如Freestyle)细胞或CHO细胞中，并可从293或CHO细胞上清液中收集和纯化抗体。另一些合适的宿主细胞系统包括细菌(例如大肠杆菌(E.coli))、昆虫细胞(S2、Sf9、Sf29、High Five)、植物细胞(例如具有或不具有针对类人聚糖进行改造的烟草)、藻类或多种非人转基因环境，例如小鼠、大鼠、山羊或牛。
还考虑了出于随后抗体纯化和出于对宿主进行免疫接种二者目的的编码抗体的核酸的表达。抗体编码序列可以是RNA，例如天然RNA或经修饰RNA。经修饰RNA考虑了赋予mRNA以提高的稳定性和低免疫原性，从而促进治疗上重要的蛋白质的表达的某些化学修饰。例如，就翻译能力而言，N1-甲基-假尿苷(N1mΨ)优于数种其他核苷修饰及其组合。除关闭免疫/eIF2α磷酸化依赖性翻译抑制之外，并入的N1mΨ核苷酸还通过提高mRNA上核糖体停顿和密度来显著改变翻译过程的动态。经修饰mRNA的核糖体载量提高通过促进同一mRNA上的核糖体再循环或从头重新核糖体募集而使它们更易于起始。这样的修饰可用于在接种RNA之后增强体内抗体表达。RNA，无论是天然的还是经修饰的，均可作为裸RNA或在递送载剂(例如脂质纳米粒)中递送。
或者，可将编码抗体的DNA用于相同目的。将DNA包含在含有在为其设计的宿主细胞中具有活性的启动子的表达盒中。表达盒有利地包含在可复制载体，例如常规质粒或微载体中。载体包括病毒载体，例如考虑了痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒和慢病毒。还考虑了编码抗体基因的复制子，例如基于VEE病毒或辛德毕斯病毒的甲病毒复制子。这样的载体的递送在期望体内表达时可通过针通过肌内、皮下或皮内途径，或者通过经皮电穿孔来进行。
与最终cGMP制造过程在相同宿主细胞和细胞培养过程中产生的抗体的迅速可用性有可能降低过程开发计划的持续时间。Lonza已经开发了使用在CDACF培养基中培养的合并转染子用于在CHO细胞中迅速产生少量(多至50g)抗体的一般方法。尽管比真正的瞬时系统稍慢，但是其优点包括更高的产物浓度和与生产细胞系使用相同的宿主和过程。在一次性生物反应器中表达模型抗体之GS-CHO库的生长和生产力的实例为：在以补料分批模式进行的一次性袋状生物反应器培养(5L工作体积)中，在转染后9周内达到了2g/L的收获抗体浓度。
抗体分子将包含例如通过mAb的蛋白水解切割产生的片段(例如F(ab’)、F(ab’)2)或者例如可通过重组方式产生的单链免疫球蛋白。F(ab’)抗体衍生物是单价的，而F(ab’)2抗体衍生物是二价的。在一个实施方案中，这样的片段可彼此组合，或者与其他抗体片段或受体配体组合以形成“嵌合”结合分子。明显地，这样的嵌合分子可包含能够与同一分子的不同表位结合的取代基。
在一些相关实施方案中，抗体是所公开抗体的衍生物，例如，包含与所公开抗体中CDR序列相同的CDR序列的抗体(例如，嵌合抗体或CDR接枝抗体)。或者，可希望进行修饰，例如向抗体分子中引入保守变化。在进行这种变化时，可考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。氨基酸亲水指数在赋予蛋白质以相互作用生物学功能中的重要性是本领域中通常了解的(Kyte and Doolittle,1982)。公认的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其转而限定了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
本领域中还应理解的是，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)声称：蛋白质的最大局部平均亲水性(如受其邻近氨基酸的亲水性支配)与该蛋白质的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中所详述的，已向氨基酸残基分配了以下亲水性值：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)，含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性非芳族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性芳族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
应理解，氨基酸可被替换为具有类似亲水性的另一氨基酸，并且产生在生物学或免疫学上修饰的蛋白质。在这样的变化中，亲水性值在±2内的氨基酸的替换是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，并且在±0.5之内的那些是甚至更特别优选的。
如以上所概括的，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。预期多个前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本公开内容还考虑了同种型修饰。通过修饰Fc区域以具有不同同种型，可实现不同功能。例如，改变为IgG1可提高抗体依赖性细胞细胞毒性，转换为A类可改善组织分布，以及转换为M类可改善价位。
作为替代或补充，将氨基酸修饰与改变IL-23p19结合分子的Fc区的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)功能的一种或更多种另外的氨基酸修饰组合在一起可以是有用的。特别令人感兴趣的结合多肽可以是与C1q结合并显示出补体依赖性细胞毒性的结合多肽。可修饰具有预先存在的C1q结合活性，任选地还具有介导CDC能力的多肽以使得这些活性中的一种或两种得到增强。改变C1q和/或修饰其补体依赖性细胞毒性功能的氨基酸修饰描述于例如WO/0042072中，其在此通过引用并入。
可例如通过修饰C1q结合和/或FcγR结合并由此改变CDC活性和/或ADCC活性来设计具有改变的效应物功能的抗体的Fc区。“效应物功能”负责激活或减弱生物活性(例如，在对象中)。效应物功能的一些实例包括但不限于：C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。这样的效应物功能可需要待与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合的Fc区，并可以使用多种测定(例如，Fc结合测定、ADCC测定、CDC测定等)进行评估。
例如，可产生抗体的具有改善的C1q结合和改善的FcγRIII结合(例如，具有改善的ADCC活性和改善的CDC活性二者)的变体Fc区。或者，如果期望降低或消除效应物功能，则可将变体Fc区改造为具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性。在另一些实施方案中，可提高这些活性中的仅一种，并且任选地，另一种活性也降低(例如，产生具有改善的ADCC活性但是降低的CDC活性的Fc区变体，反之亦然)。
本公开内容的一个具体实施方案是包含无唾液酸、半乳糖或岩藻糖的基本上均质的聚糖的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其二者可分别与重链或轻链恒定区连接。前述基本上均质的聚糖可与重链恒定区共价连接。
本公开内容的另一个实施方案包括具有新的Fc糖基化模式的mAb。分离的单克隆抗体或其抗原结合片段存在于由GNGN或G1/G2糖型表示的基本上均质的组合物中。Fc糖基化在治疗性mAb的抗病毒和抗癌特性中发挥重要作用。本公开内容与最近的研究一致，该研究显示在体外无岩藻糖抗HIV mAb的抗慢病毒细胞介导的病毒抑制提高。具有缺乏核心岩藻糖的均质聚糖的本公开内容的该实施方案显示出针对特定病毒的保护提高了两倍以上。消除核心岩藻糖显著改善了由自然杀伤(natural killer，NK)细胞介导的mAb的ADCC活性，但显示对多形核细胞(polymorphonuclear cell，PMN)的ADCC活性具有相反的作用。
与不具有基本上均质的GNGN糖型和具有含G0、G1F、G2F、GNF、GNGNF或GNGNFX糖型的相同抗体相比，包含由GNGN或G1/G2糖型表示的基本上均质的组合物的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段表现出对FcγRI和FcγRIII的结合亲和力提高。在本公开内容的一个实施方案中，所述抗体以1×10-8M或更小的Kd从FcγRI解离并且以1×10-7M或更小的Kd从FcγRIII解离。
Fc区的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指糖部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸(最通常为丝氨酸或苏氨酸)的连接，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。用于将糖部分与天冬酰胺侧链肽序列酶促连接的识别序列是天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中这些肽序列中任一个的存在均产生了潜在的糖基化位点。
糖基化模式可例如通过缺失一个或更多个存在于多肽中的糖基化位点和/或添加一个或更多个不存在于多肽中的糖基化位点来改变。通过改变氨基酸序列以使其包含一个或更多个上述三肽序列，方便地实现了将糖基化位点添加至抗体的Fc区(对于N-连接的糖基化位点)。示例性的糖基化变体具有重链的残基Asn 297的氨基酸替换。该改变也可通过向原始多肽的序列添加一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基替换原始多肽的序列来进行(对于O-连接的糖基化位点)。另外，将Asn 297改变为Ala可去除糖基化位点之一。
在某些实施方案中，抗体在表达β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnT III)的细胞中表达，使得GnT III将GlcNAc添加至IL-23p19抗体。用于以这样的方式产生抗体的方法提供于WO/9954342、WO/03011878、专利公开20030003097A1和Umana et al.,NatureBiotechnology,17:176-180,February 1999中。可使用基因组编辑技术例如成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)将细胞系改变以增强或降低或消除某些翻译后修饰，例如糖基化。例如，CRISPR技术可用于在用于表达重组单克隆抗体的293或CHO细胞中消除编码糖基化酶的基因。
可改造从人B细胞获得的抗体可变基因序列以增强其可制造性和安全性。潜在的蛋白质序列倾向性可通过检索与包含以下的位点相关的序列基序来鉴定：
1)未配对的Cys残基，
2)N-连接糖基化，
3)Asn脱酰胺，
4)Asp异构化，
5)SYE截短，
6)Met氧化
7)Trp氧化，
8)N-端谷氨酸，
9)整合素结合，
10)CD11c/CD18结合，或
11)片段化。
这样的基序可通过改变编码重组抗体的cDNA的合成基因来消除。
在开发治疗性抗体领域中的蛋白质改造工作清楚地揭示了某些序列或残基与溶解度差异相关(Fernandez-Escamilla et al.,Nature Biotech.,22(10),1302-1306,2004；Chennamsetty et al.,PNAS,106(29),11937-11942,2009；Voynov et al.,Biocon.Chem.,21(2),385-392,2010)。文献中来自溶解度改变突变的证据表明与另一些亲水性残基，例如天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸相比，一些亲水性残基例如天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸明显更有利地有助于蛋白质溶解度。
可以对抗体进行改造以增强生物物理特性。使用平均表观解链温度，可以使用升高温度使抗体解折叠来确定相对稳定性。差示扫描量热法(DSC)测量作为温度的函数的分子的热容量Cp(将其加热每度所需的热量)。可以使用DSC来研究抗体的热稳定性。mAb的DSC数据是特别引起关注的，因为其有时解析了mAb结构内单个结构域的解折叠，在热谱图中产生多至三个峰(来自Fab、CH2和CH3结构域的解折叠)。通常，Fab结构域的解折叠产生最强的峰。Fc部分的DSC图谱和相对稳定性显示了人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类(Garber andDemarest,Biochem.Biophys.Res.Commun.355,751-757,2007)的特征性差异。还可以使用由CD光谱仪执行的圆二色性(CD)来确定平均表观解链温度。以0.5nm的增量在200至260nm的范围内测量抗体的远UV CD光谱。最终光谱可以确定为20次累积的平均值。可以在背景减除之后计算残基椭圆率值。可以以1℃/min的加热速率从25℃至95℃在235nm下监测抗体(0.1mg/mL)的热解折叠。可以使用动态光散射(DLS)来评估聚集的倾向。DLS用于表征各种颗粒(包括蛋白质)的尺寸。如果系统在尺寸上不分散，则可以确定颗粒的平均有效直径。该测量取决于颗粒核心的尺寸、表面结构的尺寸和颗粒浓度。因为DLS在本质上测量由于颗粒引起的散射光强度的波动，所以可以确定颗粒的分散系数。商用DLA仪器中的DLS软件显示不同直径的颗粒群。使用DLS可以方便地进行稳定性研究。通过确定颗粒的流体动力学半径是否增加，样品的DLS测量可以显示颗粒是否随时间或随温度变化而聚集。如果颗粒聚集，则可以看到具有更大半径的更大颗粒群。可以通过现场控制温度来分析根据温度的稳定性。毛细管电泳(CE)技术包括确定抗体稳定性的特征的已证明方法。可以使用iCE方法解析由于脱酰胺、C端赖氨酸、唾液酸化、氧化、糖基化以及任何其他可导致蛋白质pI改变的蛋白质变化而产生的抗体蛋白质电荷变体。可以使用Protein Simple Maurice仪器通过高通量、自由溶液毛细管柱中等电聚焦(IEF)(cIEF)评估每种表达的抗体蛋白。可以每30秒执行全柱UV吸收检测，以实时监视在等电点(pI)聚焦的分子。这种方法将传统凝胶IEF的高分辨率与基于柱的分离中存在的定量和自动化优势相结合，同时消除了动员步骤的需要。该技术产生了对于表达的抗体的身份、纯度和异质性谱的可再现的、定量分析。结果鉴定了抗体的电荷异质性和分子尺寸，具有吸光度和天然荧光检测两种模式，并且检测灵敏度低至0.7μg/mL。
可以确定抗体序列的固有溶解度评分。固有溶解度评分可以使用CamSolIntrinsic(Sormanni et al.,J Mol Biol 427,478-490,2015)计算。可以通过在线程序评估每个抗体片段(例如scFv)的HCDR3中第95至102位(Kabat编号)残基的氨基酸序列，以计算溶解度评分。也可以使用实验室技术确定溶解度。存在多种技术，包括将冻干蛋白质添加至溶液直至溶液变得饱和并达到溶解度极限，或通过在具有合适的截留分子量的微浓缩器中通过超滤进行浓缩。最直接的方法是诱导无定形沉淀，其使用涉及使用硫酸铵进行蛋白质沉淀的方法来测量蛋白质溶解度(Trevino et al.,JMol Biol,366:449-460,2007)。硫酸铵沉淀给出关于相对溶解度值的快速且准确的信息。硫酸铵沉淀产生具有明确界定水相和固相的沉淀溶液，并且需要相对少量的蛋白质。使用硫酸铵诱导无定形沉淀进行的溶解度测量也可以在不同的pH值下轻松完成。蛋白质的溶解度高度依赖于pH，并且pH被认为是影响溶解度的最重要的外部因素。
通常，认为应该在个体发育过程中通过阴性选择消除自身反应性克隆；然而，已经清楚的是，许多具有自身反应性的人天然存在抗体在成年成熟库中仍然存在，并且自身反应性可以增强许多针对病原体的抗体的抗病毒功能。已经注意到，在早期B细胞发育期间抗体中的HCDR3环通常富含正电荷并且表现出自身反应性模式(Wardemann et al.,Science301,1374-1377,2003)。可以通过在显微镜检查(使用黏附HeLa或HEp-2上皮细胞)和流式细胞术细胞表面染色(使用悬浮Jurkat T细胞和293S人胚肾细胞)中评估与人来源细胞结合的水平来测试给定抗体的自身反应性。自身反应性也可以使用在组织阵列中评估与组织的结合来研究。
在许多最近的研究中，正在大规模进行来自血液供体的人B细胞的B细胞库深度测序。关于人抗体库之重要部分的序列信息有助于对健康人中常见的抗体序列特征进行统计学评估。利用人重组抗体可变基因参考数据库中关于抗体序列特征的知识，可以评估抗体序列的“人相似性”(Human Likeness，HL)的位置特异性程度。HL已被表明可用于临床应用中的抗体(例如治疗性抗体或作为疫苗的抗体)的开发。目的是提高抗体的人相似性，以降低将导致抗体药物的功效显著下降或可诱发严重健康隐患的潜在的不良影响和抗抗体免疫应答。可以评估总共约4亿个序列的三个健康人血液供体的组合抗体库的抗体特征，并创建集中于抗体的高变区的新的“相对人相似性”(rHL)评分。rHL评分使得容易地区分人(正评分)和非人序列(负评分)。可以对抗体进行改造以消除人库中不常见的残基。
在某些实施方案中，本公开内容的抗体可以是经纯化的。如本文中使用的术语“经纯化的”意在指可与其他组分分离的组合物，其中蛋白质被纯化至相对于其可天然获得状态的任何程度。因此，经纯化的蛋白质也指这样的蛋白质，所述蛋白质脱离了其可天然存在的环境。当使用术语“基本上纯化的”时，该指定将指这样的组合物，其中蛋白质或肽形成组合物的主要组分，例如构成组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术在一个水平上包括细胞环境粗分级至多肽和非多肽级分。使多肽与其他蛋白质分离后，可使用色谱和电泳技术进一步纯化目的多肽以实现部分纯化或完全纯化(或纯化至均质)。特别适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚集。其他用于蛋白质纯化的方法包括用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性进行沉淀，然后进行离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱；以及这些技术与其他技术的组合。
在纯化本公开内容的抗体中，可需要在原核或真核表达系统中表达多肽并使用变性条件提取蛋白质。可使用与多肽的标记部分结合的亲和柱从其他细胞组分纯化多肽。如本领域中通常已知的，认为进行各纯化步骤的顺序可改变，或者可省略某些步骤，并且仍然得到适合制备基本上纯化的蛋白质或肽的方法。
通常，使用与抗体的Fc部分结合的试剂(即，蛋白A)对完整抗体分级。或者，可使用抗原以同时纯化和选择合适的抗体。这样的方法通常使用结合在支持物(如柱、过滤器或珠)上的选择剂。抗体与支持物结合，除去(例如，冲掉)污染物，并且通过施加条件(盐、热等)释放抗体。
根据本公开内容，本领域技术人员将知道多种用于量化蛋白质或肽之纯化程度的方法。这些包括例如测定活性级分的比活性，或者通过SDS/PAGE分析来评估级分中的多肽量。另一种用于评估级分的纯度的方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性比较，并从而计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位取决于根据纯化而选择的特定测定技术，以及所表达蛋白质或肽是否表现出可检测活性。
已知多肽的迁移可随着不同的SDS/PAGE条件而改变，有时候显著地改变。因此，应理解的是，在不同的电泳条件下，经纯化的或经部分纯化的表达产物的表观分子量可能改变。
IV.治疗方法
本公开内容提供了用本文中提供的抗CD5L抗体治疗癌症患者的方法。这样的治疗也可以与另外的治疗方案组合，例如化学治疗或免疫治疗。在一些情况下，患者的癌症可过表达CD5L。在一些情况下，患者血清中的CD5L水平可能会升高。在一些情况下，患者的癌症可能具有贝伐单抗抗性。在一些情况下，患者的癌症可能在贝伐单抗治疗之后复发。
本文中使用的术语“对象”是指对其进行主题方法的任何个体或患者。通常来说，对象是人，尽管如本领域技术人员将理解，对象可以是动物。因此，另一些动物，包括哺乳动物，例如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、农场动物(包括牛、马、山羊、绵羊、猪等)和灵长类(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)均包括在对象的定义之内。
贯穿本申请使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指就药物治疗该病症而言促进或增强对象健康的任何情况。这包括但不限于疾病的体征或症状的频率或严重程度降低。例如，癌症的治疗可涉及，例如，降低肿瘤尺寸、降低肿瘤侵袭力、降低癌症生长速率或阻止转移。癌症的治疗还可指延长患癌症对象的存活。
在进行包含抗体的治疗性组合物的临床应用的情况下，制备适合于预期应用的药物或治疗性组合物通常将是有益的。在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在另一些实施方案中，活性化合物可为单位重量的约2％至约75％，或例如约25％至约60％，以及其中可推导的任何范围
本发明实施方案的治疗性组合物有利地以作为液体溶液剂或混悬剂的可注射组合物的形式施用；也可制备适合在注射之前溶解于或混悬于液体中的固体形式。这些制剂还可被乳化。
短语“可药用的或药理学上可接受的”是指适当时当施用于动物(例如人)时不产生不利反应、变态反应或其他不期望反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含抗体或其他活性成分的药物组合物的制备对于本领域技术人员将是已知的。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解，制剂应符合FDA生物学标准办公室(FDA Office of BiologicalStandards)所要求的无菌性、致热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。
如本领域普通技术人员将已知的，本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有的水性溶剂(例如水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外载剂(例如氯化钠、林格右旋糖等))、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯(例如油酸乙酯))、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等张剂、吸收延迟剂、盐类、药物、药物稳定剂、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、流体和营养补充剂，这样的类似材料，及其组合。根据公知的参数调节药物组合物中各种组分的pH和精确浓度。
术语“单位剂量”或“剂量”是指适合用于对象的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的治疗性组合物，所述预定量经计算与其施用(即，合适的途径和治疗方案)联合产生以上讨论的期望响应。根据治疗数量和单位剂量二者，待施用的量取决于所期望的效果。施用于患者或对象的本发明实施方案的组合物的实际剂量可通过身体和生理因素(例如对象的体重、年龄、健康状况和性别，被治疗疾病的类型，疾病渗透程度，先前或同时的治疗性干预，患者的特发病，施用途径，以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性)来确定。例如，剂量还可包含每次施用约1μg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(该这样的范围包括干预剂量)或更多，以及其中可推导的任何范围。在可从本文中所列数字来源的范围的一些非限制性实例中，可施用约5μg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重等的范围。在任何情况下，负责施用的医疗人员将确定组合物中活性成分的浓度和个体对象的合适剂量。
活性化合物可配制成用于肠胃外施用，例如配制成用于通过静脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常来说，这样的组合物可制备成液体溶液或混悬剂；也可制备适合用于在注射前添加液体后制备溶液或混悬剂的固体形式；并且，制剂还可被乳化。
适用于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包含芝麻油、花生油、或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌散剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是达到其可容易地注射之程度的流体。其在制造和储存条件下也应该是稳定的，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。
蛋白质性组合物可配制成中性或盐形式。可药用盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)以及与例如如盐酸或磷酸的无机酸或者例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成的。与游离羧基形成的盐也可以衍生自例如如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物的无机碱，以及例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。
药物组合物可包含溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、以及植物油。可以维持适当的流动性，例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的防止可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等)来产生。在许多情况下，可优选地包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来产生。
本文中所述的方法可用于治疗癌症。通常来说，术语“癌症”或“癌性的”是指或描述哺乳动物中以细胞生长不受控为典型特征的生理病症。更具体地，结合本文中提供的方法治疗的癌症包括但不限于实体瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些实施方案中，癌症可以起源于肺、肾、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、肛门、牙龈(gum)、头、肝、鼻咽、颈、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。
癌症具体地可以是以下组织学类型，但不限于这些：肿瘤，恶性；癌；非小细胞肺癌；肾癌；肾细胞癌；透明细胞肾细胞癌；淋巴瘤；母细胞瘤；肉瘤；癌，未分化；脑膜瘤；脑癌；口咽癌；鼻咽癌；胆道癌；嗜铬细胞瘤；胰岛细胞癌；李-佛美尼肿瘤(Li-Fraumeni tumor)；甲状腺癌；甲状旁腺癌；垂体瘤；肾上腺瘤；成骨肉瘤；神经内分泌瘤；乳腺癌；肺癌；头颈癌；前列腺癌；食管癌；气管癌；肝癌；膀胱癌；胃癌；胰腺癌；卵巢癌；子宫癌；宫颈癌；睾丸癌；结肠癌；直肠癌；皮肤癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；小细胞肺癌；乳头状癌；口腔癌；口咽癌；鼻咽癌；呼吸道癌；尿生殖癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃肠癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌，恶性；支气管-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；顶浆分泌腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；伴有鳞状化生的腺癌；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；支持细胞癌；睾丸间质细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；恶性雀斑样痣黑素瘤；肢端雀斑样痣黑素瘤；结节性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；缪勒式混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌性细胞；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；骨旁骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(ewing’s sarcoma)；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；内分泌或神经内分泌癌或造血癌；松果体瘤，恶性；脊索瘤；中枢或周围神经系统组织癌；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆型星形细胞瘤；纤维星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚叶；小脑肉瘤；节细胞神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；B细胞淋巴瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病(Hodgkin’s disease)；Hodgkin’s；低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿；套细胞淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓系白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓系肉瘤；慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)；急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；和毛细胞白血病。
贯穿本申请使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指就药物治疗该病症而言促进或增强对象健康的任何情况。这包括但不限于疾病的体征或症状的频率或严重程度的降低。例如，癌症的治疗可涉及，例如肿瘤侵袭力降低、癌症生长速率降低或转移防止。癌症的治疗还可指患癌症对象的存活延长。
同样，针对治疗的患者的有效响应或患者的“响应性”是指给予处于患病或病症的风险或者患有疾病或病症的患者的临床或治疗性益处。这样的益处可包括细胞或生物学响应，完全响应，部分响应，稳定的疾病(无进展或复发)或者伴有之后复发的响应。例如，有效响应可在被诊断患有癌症的患者中降低肿瘤尺寸或无进展存活。
关于赘生性病症治疗，根据赘生性病症的阶段，赘生性病症治疗涉及以下治疗中的一种或组合：去除赘生性组织的手术、放射治疗以及化学治疗。另一些治疗方案可与抗癌剂，例如治疗性组合物和化学治疗剂的施用组合。例如，待用这样的抗癌剂治疗的患者还可接受放射治疗和/或可经历手术。
对于疾病的治疗，治疗性组合物的合适剂量将取决于如上所定义的待治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、先前的治疗、患者的临床史和对药剂的响应，以及主治医师的酌处权。该药剂可适合以一次或在系列治疗中施用于患者。
包括组合治疗的方法和组合物提高治疗和保护效果，和/或提高另外的抗癌或抗过度增殖治疗的治疗效果。治疗性和预防性的方法和组合物可以以有效实现期望效果(例如杀伤癌细胞和/或抑制细胞过度增殖)的组合量来提供。可以使组织、肿瘤或细胞与包含一种或更多种药剂的一种或更多种组合物或药理制剂接触，或通过使组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同的组合物或制剂接触。此外，考虑这样的组合治疗可与放射治疗、手术治疗或免疫治疗联合使用。
组合施用可包括以同一剂型同时施用两种或更多种药剂，以分开的剂型同时施用，以及分开施用。即，可将主题治疗性组合物与另外的治疗剂一起配制在同一剂型中并同时施用。或者，可同时施用主题治疗性组合物和另外的治疗剂，其中两种药剂存在于分开的制剂中。在另一替代方案中，可在施用所述治疗剂之后紧接着施用另外的治疗剂，或者反之亦然。在分开施用方案中，主题治疗性组合物和另外的治疗剂可间隔数分钟、或间隔数小时或间隔数天施用。
抗体可以在相对于第二抗癌治疗之前、期间、之后或以各种组合施用。施用可以以同时至间隔数分钟至数天至数周进行。在其中第一治疗与第二治疗分开提供给患者的一些实施方案中，通常将确保每次递送的时间之间有意义的时间段没有到期，以使得两种化合物仍然能够对患者发挥有利组合作用。在这样的情况下，考虑可在彼此的约12小时至24小时或72小时内并且更特别地，在彼此的约6至12小时内为患者提供第一治疗和第二治疗。在一些情况下，可期望显著地延长治疗的时间段，其中各施用之间的间隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在某些实施方案中，治疗过程将持续1至90天或更长(该这样的范围包括间隔天数)。考虑可在第1天至第90天(该这样的范围包括间隔天数)或其任意组合中的任一天给予一种药剂，并且在第1天至第90天(该这样的范围包括间隔天数)或其任意组合中的任一天给予另一种药剂。在一天内(24小时期间)，可给予患者一次或多次药剂施用。此外，在治疗过程之后，考虑存在不施用抗癌治疗的一段时间。该时间段可持续1至7天，和/或1至5周，和/或1至12个月或更长(该这样的范围包括间隔天数)，这取决于患者的状况，例如其预后、强度、健康等。预期治疗周期可根据需要进行重复。
可使用多种组合。对于下面的实例，抗CD5L抗体为“A”，并且另外的抗癌治疗为“B”：
Figure BDA0003969719600000421
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本发明公开内容的任何化合物或治疗将遵循用于施用这样的化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在可归因于组合治疗的监测毒性的步骤。
A.化学治疗
可根据本发明公开内容使用广泛多种的化学治疗剂。术语“化学治疗”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于意指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。通过这些药剂或药物在细胞中的活性模式(例如，它们是否影响细胞周期或在哪个阶段影响细胞周期)对其进行分类。或者，可以基于药剂直接交联DNA、插入DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来对其进行表征。
化学治疗剂的一些实例包括：烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱类(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；卡利抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类(nitrosurea)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；二膦酸盐类(bisphosphonate)，例如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authrarnycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfimromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺类，例如米托坦(mitotane)和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；氨苯吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；埃博霉素类(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登素生物碱类(maytansinoid)，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合体；雷佐生(razoxane)；根毒素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛(docetaxel)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位复合体，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂类；依托泊苷(VP-16)；异磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸(ibandronate)；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine，DFMO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨、诺维本、法呢基蛋白转移酶抑制剂、反铂；以及以上任一种的可药用盐、酸或衍生物。
B.免疫治疗
技术人员将理解，另外的免疫治疗可与本公开内容的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向并破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0003969719600000441
是这样的一个实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物特异的抗体。抗体单独可充当治疗的效应物，或者其可募集其他细胞以实际影响细胞杀死。抗体还可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且仅充当靶向剂。或者，效应物可以是携带直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应物细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在免疫治疗的一个方面中，肿瘤细胞必须具有进行靶向，即，不存在于大多数其他细胞上的一些标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些肿瘤标志物中的任一种可适于在本发明公开内容的背景下靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、层黏连蛋白受体、erb B和p155。免疫治疗的一个替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，其包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趋化因子，例如MIP-1、MCP-1、IL-8；以及生长因子，例如FLT3配体。
目前正在研究或正在使用的免疫治疗的一些实例是免疫佐剂，例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui and Hashimoto,Infection Immun.,66(11):5329-5336,1998；Christodoulides et al.,Microbiology,144(Pt 11):3027-3037,1998)；细胞因子治疗，例如干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski et al.,Clinical Cancer Res.,4(10):2337-2347,1998；Davidson et al.,J.Immunother.,21(5):389-398,1998；Hellstrand et al.,Acta Oncologica,37(4):347-353,1998)；基因治疗，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(24):14411-14416,1998；Austin-Ward and Villaseca,Revista Medica de Chile,126(7):838-845,1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hanibuchi et al.,Int.J.Cancer,78(4):480-485,1998；美国专利5,824,311)。考虑一种或更多种抗癌治疗可与本文中所述的抗体治疗一起使用。
在一些实施方案中，免疫治疗可以是过继免疫治疗，其涉及转移离体产生的自体抗原特异性T细胞。用于过继免疫治疗的T细胞可通过扩增抗原特异性T细胞或通过遗传工程对T细胞进行重定向来产生。已表明肿瘤特异性T细胞的分离和转移在治疗黑素瘤中是成功的。通过对转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的遗传转移成功地产生了T细胞的新特异性。CAR是由与单一融合分子中的一个或更多个信号传导结构域缔合的靶向部分组成的合成受体。一般而言，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，该结构域包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻链片段和可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功使用。第一代CAR的信号传导结构域来源于Fc受体γ链或CD3ζ的胞质区。CAR已成功地使T细胞针对来自多种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原重定向。
在一个实施方案中，本申请提供了用于治疗癌症的组合治疗，其中所述组合治疗包含过继T细胞治疗和检查点抑制剂。在一个方面中，过继T细胞治疗包含自体和/或同种异体T细胞。在另一个方面中，自体和/或同种异体T细胞靶向肿瘤抗原。上面更详细地讨论了检查点抑制剂。
免疫调节剂包括免疫检查点抑制剂、共刺激分子的激动剂和免疫抑制分子的拮抗剂。免疫调节剂可以是药物，例如小分子、配体或受体的重组形式，或者抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开WO2015/016718；Pardoll，Nat Rev Cancer,12(4)：252-264,2012；二者均通过引用并入本文)。可使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可使用嵌合、人源化或人形式的抗体。如技术人员将知晓的，替代和/或等同名称可用于本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如，已知，兰罗利珠单抗(lambrolizumab)也以替代和等同名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)为人所知。
共刺激分子是与免疫细胞表面上的受体相互作用的配体，例如CD28、4-1BB、OX40(也称为CD134)、ICOS和GITR。作为一个实例，人OX40的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_003318。在一些实施方案中，免疫调节剂是抗OX40抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。适用于本发明方法中的抗人OX40抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域中公知的方法来产生。或者，可使用本领域中公认的抗OX40抗体。示例性抗OX40抗体是PF-04518600(参见，例如，WO 2017/130076)。ATOR-1015是靶向CTLA4和OX40的双特异性抗体(参见，例如，WO 2017/182672、WO2018/091740、WO 2018/202649、WO 2018/002339)。
在本文中提供的方法中可靶向的另一共刺激分子是ICOS，也称为CD278。人ICOS的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_036224。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗ICOS抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。适用于本发明方法中的抗人ICOS抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域中公知的方法来产生。或者，可使用本领域中公认的抗ICOS抗体。示例性抗ICOS抗体包括JTX-2011(参见，例如，WO2016/154177、WO 2018/187191)和GSK3359609(参见，例如，WO2016/059602)。
在本文中提供的方法中可靶向的另一共刺激分子是糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)，也称为TNFRSF18和AITR。人GITR的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_004186。在一些实施方案中，免疫调节剂是抗GITR抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。适用于本发明方法的抗人GITR抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法来产生。或者，可使用本领域公认的抗GITR抗体。示例性抗GITR抗体是TRX518(参见，例如，WO 2006/105021)。
可被免疫检查点阻断剂靶向的免疫检查点蛋白包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减子(B and Tlymphocyte attenuator，BTLA)、CCL5、CD27、CD38、CD8A、CMKLR1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein4，CTLA-4，也称为CD152)、CXCL9、CXCR5、HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-E、杀伤细胞免疫球蛋白(killer-cell immunoglobulin，KIR)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3，也称为CD223)、Mer酪氨酸激酶(Mer tyrosinekinase，MerTK)、NKG7、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1，也称为CD274)、PDCD1LG2、PSMB10、STAT1、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(T cell immunoreceptorwith Ig and ITIM domain，TIGIT)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(T-cellimmunoglobulin domain and mucin domain 3，TIM-3)、以及T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA，也称为C10orf54)。特别地，靶向PD-1轴和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂已获得FDA对多种癌症类型的广泛批准。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。在另一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PD-L2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号8,735,553、8,354,509和8,008,449中，其全部通过引用并入本文。用于本文中提供的方法中的另一些PD-1轴拮抗剂是本领域公知的，例如描述于美国专利申请公开号2014/0294898、2014/022021和2011/0008369中，其全部通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003969719600000481
)是描述于WO2006/121168中的抗PD-1抗体。派姆单抗(也称为MK-3475、Merck 3475、兰罗利珠单抗、
Figure BDA0003969719600000482
和SCH-900475)是描述于WO2009/114335中的抗PD-1抗体。CT-011(也称为hBAT或hBAT-1)是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224(也称为B7-DCIg)是描述于WO2010/027827和WO2011/066342中的PD-L2-Fc融合可溶性受体。
在本文中提供的方法中可靶向的另一免疫检查点蛋白是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞表面上并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时充当“关闭”开关。CTLA-4与T细胞共刺激蛋白CD28类似，并且这两种分子与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)结合。CTLA-4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。胞内CTLA-4也存在于调节性T细胞中并且对其功能可能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达提高。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法产生。或者，可使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，公开于以下中的抗CTLA-4抗体可用于本文中公开的方法中：美国专利号8,119,129；PCT公开号WO 01/14424、WO98/42752、WO 00/37504(CP675,206，也称为tremelimumab；以前称为ticilimumab)；美国专利号6,207,156；Hurwitz etal.(1998)Proc Natl Acad Sci USA,95(17):10067-10071；Camacho et al.(2004)J ClinOncology,22(145):Abstract No.2505(抗体CP-675206)；以及Mokyr et al.(1998)CancerRes,58:5301-5304。每个前述出版物的教导在此通过引用并入。也可使用与这些本领域公认的抗体中任一者竞争与CTLA-4结合的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请号WO2001/014424、WO2000/037504和美国专利号8,017,114中；所有均通过引用并入本文。
示例性的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0003969719600000491
)或其抗原结合片段和变体(参见例如WO01/14424)。在另一些实施方案中，抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体竞争与CTLA-4上的相同表位结合和/或结合至CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。用于调节CTLA-4的其他分子包括例如美国专利号US5844905、US5885796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752(所有均通过引用并入本文)中描述的CTLA-4配体和受体，以及例如美国专利号8329867(通过引用并入本文)中描述的免疫黏附素。
在本文中提供的方法中可靶向的另一免疫检查点蛋白是淋巴细胞激活基因3(LAG-3)，也称为CD223。人LAG-3的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP-002277。LAG-3存在于激活的T细胞、自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突细胞的表面上。LAG-3在与抗原呈递细胞表面上的MHC II类结合时充当“关闭”开关。LAG-3的抑制激活效应T细胞和抑制剂调节性T细胞二者。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗LAG-3抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。适用于本发明方法的抗人LAG-3抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法产生。或者，可使用本领域公认的抗LAG-3抗体。示例性的抗LAG-3抗体是relatlimab(也称为BMS-986016)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，WO 2015/116539)。另一些示例性抗LAG-3抗体包括TSR-033(参见，例如，WO 2018/201096)、MK-4280和REGN3767。MGD013是描述于WO 2017/019846中的抗LAG-3/PD-1双特异性抗体。FS118是描述于WO 2017/220569中的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体。
在本文中提供的方法中可靶向的另一免疫检查点蛋白是T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)，也称为C10orf54。人VISTA的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_071436。VISTA存在于白细胞上并抑制T细胞效应物功能。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗VISTA3抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。适用于本发明方法的抗人VISTA抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法来产生。或者，可使用本领域公认的抗VISTA抗体。示例性抗VISTA抗体是JNJ-61610588(也称为onvatilimab)(参见，例如，WO 2015/097536、WO 2016/207717、WO 2017/137830、WO 2017/175058)。VISTA也可以被小分子CA-170抑制，其选择性地靶向PD-L1和VISTA二者(参见例如WO 2015/033299、WO 2015/033301)。
本文中提供的方法中可靶向的另一免疫检查点蛋白是CD38。人CD38的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_001766。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CD38抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。适用于本发明方法的抗人CD38抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法来产生。或者，可使用本领域公认的抗CD38抗体。示例性抗CD38抗体是达雷妥尤单抗(daratumumab)(参见，例如，美国专利号7,829,673)。
本文中提供的方法中可靶向的另一免疫检查点蛋白是具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。人TIGIT的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_776160。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗TIGIT抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。适用于本发明方法的抗人TIGIT抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法来产生。或者，可使用本领域公认的抗TIGIT抗体。示例性的抗TIGIT抗体是MK-7684(参见，例如，WO 2017/030823、WO 2016/028656)。
可针对免疫调节而靶向的其他免疫抑制性分子包括STAT3和吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)。例如，人IDO的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_002155。在一些实施方案中，免疫调节剂是小分子IDO抑制剂。示例性的小分子包括BMS-986205、epacadostat(INCB24360)和navoximod(GDC-0919)。
C.放射治疗
导致DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常被称为γ射线、X射线的那些和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV辐照。最可能的是所有这些因素均会对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及对染色体的组装和维持产生广泛的损伤。X射线的剂量范围为从50至200伦琴的日剂量持续延长的一段时间(3至4周)到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射的辐射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
D.手术
大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，其包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括其中将所有或部分的癌组织物理地去除、切除和/或破坏的切除术，并且可与另一些治疗，例如本发明公开内容的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗结合使用。肿瘤切除是指物理去除至少一部分的肿瘤。除肿瘤切除术外，手术治疗包括激光手术、冷冻手术，电外科手术和显微控制的手术(莫氏手术(Mohs'surgery))。
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成腔。治疗可通过灌注、直接注射或在该区域局部施用另外的抗癌治疗来完成。可重复这种治疗，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4周和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以是不同的剂量。
E.其他药剂
考虑可将其他药剂与本发明公开内容的某些方面组合使用以改善治疗的治疗效力。这些其他药剂包括影响细胞表面受体与间隙连接的上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、提高过度增殖细胞对细胞凋亡诱导剂之敏感性的药剂、或其他生物药剂。通过升高间隙连接数来提高细胞间信号传导可提高对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在另一些实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可与本发明公开内容的某些方面组合使用以改善治疗的抗过度增殖效力。考虑细胞黏附抑制剂以改善本发明公开内容的效力。细胞黏附抑制剂的一些实例是黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑提高过度增殖细胞对细胞凋亡之敏感性的其他药剂(例如抗体c225)可与本发明公开内容的某些方面组合使用以改善治疗效力。
V.药盒
在一些实施方案的多个方面，设想药盒包含治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂。在一些实施方案中，本发明实施方案考虑了用于制备和/或施用一些实施方案的治疗的药盒。药盒可包含一个或更多个密封的小瓶，其包含本发明一些实施方案的任何药物组合物。药盒可包含例如至少一种抗CD5L抗体以及用于制备、配制和/或施用一些实施方案的组分或进行本发明方法的一个或更多个步骤的试剂。在一些实施方案中，药盒还可包含合适的容器，所述容器是不会与药盒的组分反应的容器，例如埃彭道夫管、测定板、注射器、瓶或管。容器可由可灭菌材料(例如塑料或玻璃)制成。
药盒还可包含说明书，其概述了本文中所述方法的程序性步骤，并且将遵循与本文中所述或本领域普通技术人员已知的基本上相同的程序。指令信息可在包含机器可读指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行该机器可读指令时使显示递送药学有效量的治疗剂的真实或虚拟程序。
VI.实施例
以下实施例被包括在内以展示本公开内容的一些优选实施方案。本领域技术人员应当理解的是，以下实施例中公开的技术表示由发明人发现在本公开内容的实践中较好地工作的技术，并因此可以被视为构成针对其实践的一些优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当认识到在不偏离本公开内容的精神和范围的情况下可以在已公开的具体实施方案中作出许多修改并且仍获得同样或类似的结果。
实施例1-材料和方法
Figure BDA0003969719600000531
Figure BDA0003969719600000541
Figure BDA0003969719600000551
细胞系和培养物。如前所述(Pradeep et al.,2015)培养人上皮卵巢癌细胞系SKOV3ip1和小鼠卵巢癌细胞系ID8。将人永生化脐带内皮细胞(RF24)在含有补充剂(非必需氨基酸、丙酮酸钠、MEM维生素和谷氨酰胺；Life Technologies,Grand Island,NY)的MEM培养基中培养。在具有95％湿度的5％ CO2培养箱中在37℃下进行细胞培养。对于体内注射，首先将细胞用PBS洗涤两次，随后进行胰蛋白酶消化并在4℃下以1,200rpm离心5分钟。然后在无血清Hank’s平衡盐溶液(Life Technologies)中重建细胞。将只有具有>95％生存力的单细胞悬液用于体内实验(通过台盼蓝排除来确定)。
定量实时逆转录酶PCR验证。使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)使用50ng从细胞中分离的总RNA进行定量实时逆转录酶PCR。通过使用Verso cDNA试剂盒(ThermoScientific)从0.5至1.0μg总RNA合成互补DNA(cDNA)。通过使用报道的引物(表1)和SYBRGreen ER qPCR Super Mix Universal(Invitrogen，Carlsbad，CA)用Bio-Rad热循环仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)以一式三份进行定量PCR(qPCR)分析。使用2-ΔΔCT方法来进行定量，其相对于对照归一化为百分比倍数变化(Donninger et al.,2004)。
表1：定量PCR引物列表
Figure BDA0003969719600000571
siRNA构建体和递送。siRNA从Sigma-Aldrich(Woodlands，TX)订购。我们的siRNA对照由非沉默siRNA组成，其与任何基于BLAST检索的已知人mRNA不具有序列同源性。如前所述(Landen et al.,2005)进行体外瞬时转染。简言之，将siRNA(4μg)与10μLLipofectamine 2000转染试剂(Lipofectamine)在室温下孵育20分钟，随后在80％汇合下添加至培养在10cm板中的细胞。
反相蛋白质阵列(RPPA)和Western印迹分析。将RF24细胞在存在或不存在人重组CD5L蛋白(Sino Biological，Beijing，China)的情况下进行培养。然后提交相应的细胞裂解物以进行RPPA分析。如先前报道(Pradeep et al.,2015,Haemmerle et al.,2017)进行Western印迹分析。在用人重组CD5L蛋白处理之后收集RF24细胞的细胞裂解物，并使用抗人CD5L、p-AKT、AKT和PPAR-γ抗体，随后使用与辣根过氧化物酶缀合的合适二抗进行AKT信号传导的激活。实验以一式两份进行并重复至少两次。
细胞增殖测定。使用Click-iT EdU测定试剂盒(Invitrogen)进行细胞增殖实验。将细胞接种到6孔板中，并在不含酚红的Opti-MEM中培养48小时。然后收获细胞以评估CD5L蛋白或siRNA CD5L处理之后的增殖。
酶联免疫吸附测定。使用CD5L ELISA试剂盒(Mybiosource，San Diego，CA，USA)按照制造商对细胞培养基和人血液样品二者的建议来确定CD5L表达水平。
慢病毒介导的CD5L过表达。pLenti-C-mGFP-人CD5L载体(RC206528L2)购自Origene(Rockville，MD)。将HEK293T细胞用pLenti-C-mGFP-人CD5L载体和包装质粒共转染。在48小时之后，收集包含感染性病毒颗粒的上清液，使用0.45μm过滤器过滤，并将其在-80℃下等分储存。为了产生异位过表达CD5L的细胞，将RF24细胞与病毒颗粒一起孵育48小时。然后用PBS洗涤细胞并在培养基中进一步培养。在48小时之后，使用FACS Aria II分选仪收集GFP阳性细胞。
RF24细胞中贝伐单抗抗性的诱导。贝伐单抗抗性细胞系来源于通过持续暴露于贝伐单抗的原始亲本RF24细胞系。将RF24细胞用贝伐单抗(1mg/ml，IC50)处理72小时。然后去除该培养基，并使细胞恢复7天。在存在IC50浓度的贝伐单抗的情况下持续维持细胞。
药物敏感性测定(MTT)。将细胞(5×103)接种在96孔板中，并允许其在37℃下黏附过夜。简言之，在用贝伐单抗处理细胞72小时之后，将MTT试剂[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑
Figure BDA0003969719600000581
溴化物]添加至每个孔，并在37℃下孵育4小时。将二甲基亚砜(DMSO)添加至每个孔并在定轨振荡器上混合5分钟。在450nm处记录吸光度，并基于72小时时的细胞增殖量度来计算对对贝伐单抗的敏感性。
细胞迁移测定。使用涂覆有0.1％明胶的Transwell 0.4μm孔的聚碳酸酯膜插入物在存在或不存在hCD5L siRNA或抗CD5L抗体的情况下检查RF24细胞的迁移。在用hCD5LsiRNA转染48小时之后或用抗CD5L抗体(40μg/ml)处理之后，将MEM无血清培养基中的RF24细胞(1.0×105)接种到Transwell 0.4μm孔的聚碳酸酯膜插入物(Corning，Lowell，MA)的上室中。如上所示，在接种之前，还将CD5L蛋白(400ng/ml)添加至细胞悬液。然后将插入物置于在下室中包含含有15％血清的MEM培养基作为化学引诱物的24孔板中。在使细胞在湿润室中迁移6小时之后，用苏木精对已迁移的细胞进行染色，并通过光学显微术在每个样品五个随机视野(×200原始放大率)下进行计数。实验以一式两份进行并重复三次。
管形成测定。将Matrigel(12.5mg/mL)在4℃下解冻，并将50μL快速添加至96孔板的每个孔或将10μL添加至15孔板的每个孔，并随后使其在37℃下固化30分钟。然后将孔在37℃下与RF24细胞(5,000至6000个/孔)一起孵育6小时，所述RF24细胞之前已用CD5LsiRNA(48小时)、PI3激酶抑制剂或AKT抑制剂(6小时)或抗CD5L抗体(40μg/ml，在细胞接种时添加)处理。如上所述，在细胞接种时还添加CD5L蛋白(400ng/ml)。实验以一式三份进行并重复至少两次。使用Olympus IX81倒置显微镜，在×100放大率下，每孔拍摄5张图像。对每张图像的结节(定义为形成单点的至少三个细胞)和管(定义为由内皮细胞形成的非分段圆)的数目进行定量。从每组中去除最高和最低值以考虑细胞聚集。
启动子分析和染色质免疫沉淀(ChIP)测定。将RF24细胞在低氧条件下培养16小时。在低氧培养之后，通过使用EZ ChIPTM试剂盒(Millipore，Temecula，CA)按照制造商所述进行ChIP测定。简言之，收集交联的细胞、将其裂解、声处理，并随后用PPAR-γ(Cellsignaling)抗体或IgG对照进行免疫沉淀。用蛋白G琼脂糖珠收集免疫复合物并洗脱。通过在65℃下孵育来逆转交联。然后提取和纯化DNA以用于随后使用基因特异性引物(表1)进行PCR扩增。
卵巢癌的原位体内模型。雌性无胸腺裸鼠(NCr-nu)购自NCI-Frederick癌症研究与发展中心(Frederick，MD)并如前所述进行维护(Landen et al.,2005)。所有小鼠研究均经机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。根据美国实验动物护理认证协会(American Association for Accreditation ofLaboratory Animal Care)陈列的指南和美国公共卫生署关于对实验动物的人道护理和使用政策(US Public Health Service Policy on Human Care and Use of LaboratoryAnimals)对小鼠进行护理。对于肿瘤细胞注射，腹膜内注射SKOV3ip1细胞(1×106)。对于抗CD5L抗体实验，每周一次以10mg/kg体重的剂量腹膜内注射对照或实验抗体。在用CO2对小鼠实施安乐死之后，记录其肿瘤重量和肿瘤结节的数目和分布。进行尸检的个人对处理组分配不知情。将组织标本使用10％缓冲的福尔马林OCT(Miles,Inc.,Elkhart,IN)进行固定或在液氮中速冻。
新的抗CD5L抗体的产生。从两种抗体来源中筛选和选择单克隆抗体。一种来源来自CD5L免疫接种的兔单一B细胞。简言之，用0.5mg重组表达的人CD5L蛋白(SinoBiological)对两只新西兰白兔进行免疫接种。在初始免疫接种之后，以三周的间隔给予动物3次加强剂，直至血清效价达到106。分离单一B细胞并使用ELISA筛选CD5L结合抗体以获得初始阳性命中物。将在Drs.Z.An和N.Zhang联合实验室中制备的人原初scFv噬菌体展示文库(1010多样性)也用作用于选择抗CD5L的单克隆抗体的另一来源。固相淘选法用于通过ELISA选择CD5L结合剂(Bu et al.,2019)。使用先前报道的方法(John et al.,2018)克隆和测序阳性命中物中的抗体可变编码区。用与克隆的可变序列融合的人IgG恒定区序列制备全长抗体重链和轻链构建体以用于在人胚肾自由式293(HEK293F)细胞(Life scienceTechnologies)中表达单克隆抗体。使用我们先前描述的方法(Noh et al.,2017)，使用蛋白A/G亲和树脂将抗体纯化至纯度>95％。
异种移植物的免疫组织化学和免疫荧光染色。如前所述(Thaker et al.,2006,Luet et al.,2010)进行细胞增殖(Ki67，1:200，Zymed，SanFrancisco，CA)和MVD(CD31，1:500，Pharmingen，SanDiego，CA)的免疫组织化学分析。对于统计学分析，对来自5个随机选定的肿瘤/组的切片进行染色，并对5个随机视野/肿瘤进行评分。在×200或×100放大率下拍摄照片。为了定量小鼠肿瘤样品中的MVD，在×200放大率下，在10个随机0.159mm2视野中记录CD31染色阳性的血管数目。为了定量Ki67表达，在×100放大率下，在10个随机0.159mm2视野中计数阳性细胞的数目(Thaker et al.,2006，Lu et al.,2010)。由两名研究人员以不知情方式对所有染色进行量化。对来自我们卵巢癌组群的肿瘤内皮细胞中CD5L表达的分析评分为1(阴性)、2(低)或3(高)。
Tie2-cre:PPAR-γ敲除小鼠。Ppargfl/fl:Tie2-Cre+/-雌性和雄性小鼠由YihongWan博士(德克萨斯大学西南分校)慷慨提供。为了选择性地删除内皮细胞中的PPAR-γ，将雌性与雄性杂交以获得PPAR-γ条件性敲除小鼠。从小鼠的尾活检物中分离基因组DNA。通过使用引物(表1)进行PCR来区分Tie2-cre转基因和floxed PPAR-γ等位基因。对于肿瘤细胞注射，将ID8细胞(1×106)腹膜内注射在Tie2-cre:PPAR-γKO小鼠中。在用CO2对小鼠实施安乐死之后，记录其肿瘤重量和肿瘤结节的数目和分布。进行尸检的个人对处理组分配不知情。将组织标本使用10％缓冲的福尔马林OCT(Miles,Inc.,Elkhart,IN)进行固定或在液氮中速冻。对于B20治疗实验，在自ID8肿瘤注射7天之后，每周两次以5mg/kg体重的剂量给予B20。根据实验设计，持续B20处理，直至达到计划的终点，或者直至小鼠濒临死亡或死亡。
统计学分析。产生Kaplan-Meier存活曲线并与使用对数秩统计进行比较以评估肿瘤血管CD5L表达对人总存活的影响，以及确定我们的Tie2-cre；PPAR-γKO小鼠模型中的存活。对于图4A至4G中的动物实验，将小鼠分配到每个处理组。该样品量提供了80％的效力以检测肿瘤重量的50％降低，置信区间为95％。设计如图5中的体内实验以筛选抗体候选物，每个处理组仅分配7只小鼠。如果分布是正态的，则使用Student t检验(用于比较两组)来比较每组的肿瘤重量和肿瘤结节数目，或者如果分布是非正态的，则使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)进行比较。小于0.05的P值被认为是统计学上显著的。所有统计学测试均是双侧的，并使用用于Windows统计学软件的SPSS版本12(SPSS,Inc.,Chicago,IL)或用于Windows的GraphPad Prism7(GraphPad软件，LaJolla，CA)进行。
实施例2-肿瘤内皮细胞中的适应性基因组变化
为了鉴定参与适应性抗性的可能靶标，使用同基因ID8卵巢癌小鼠模型。用B20抗体处理小鼠并且在表现出敏感性和抗性二者的时间点获得肿瘤(图1A)。然后从敏感性和抗性肿瘤样品中分离内皮细胞，并使用分离的mRNA进行基因表达谱分析。大量基因在来自敏感性与抗性肿瘤的内皮细胞之间表现出差异表达，其中CD5L在抗性内皮细胞中表现出28.48倍高的最大差异(图1B)。然后从阵列中选择基因子集并对其进行qRT-PCR以确定在抗性环境中观察到的CD5L表达提高(图1C)。使用免疫组织化学，发现与来自敏感性肿瘤的那些相比，来自抗性肿瘤的内皮细胞中的CD5L蛋白表达显著更高(图1D)。
接下来，检查了肿瘤内皮细胞中CD5L上调的生物效应。为了确定CD5L在肿瘤血管生成中的功能，产生了过表达CD5L的RF24细胞(图1E)。与对照相比，这些细胞表现出升高的增殖、提高的管形成能力和增加的细胞迁移(图1F和1H)。与CD5L是主要分泌蛋白一致，来自过表达CD5L的RF24细胞的培养物中CD5L的浓度显示出显著高于来自对照RF24细胞(空载体)的培养物(图1I)。为了确定CD5L的过表达是这些观察到的效应的主要来源，用CD5LsiRNA处理对照RF24细胞。与非靶向siRNA相比，在72小时内看到CD5L蛋白水平的超过90％的敲低(图1J)。值得注意的是，与用对照siRNA处理的细胞相比，用CD5L siRNA处理的细胞显示出显著降低的增殖、管形成能力和细胞迁移(图1K和1M)。
实施例2-CD5L通过低氧诱导的PPAR-γ过表达来上调
为了确定肿瘤内皮细胞中CD5L升高的可能机制，检查了CD5L基因转录的调节。在分析CD5L启动子序列时，鉴定了转录因子PPAR-γ的推定结合位点(以红色示出)(图8)。为了测试PPAR-γ是否可以用作CD5L的上游调节子，在RF24内皮细胞中异位表达PPAR-γ。与对照相比，具有升高的PPAR-γ的内皮细胞表现出CD5L mRNA和蛋白质二者的显著提高(图2A和2B)。另外，产生了CD5L启动子构建体(pCD5L WT)，并且当将其转染到过表达PPAR-γ的RF24细胞中时，与野生型RF24细胞相比，发现萤光素酶活性显著提高(图2C)。为了进一步证明PPAR-γ表达是观察到的CD5L表达和启动子活性提高的原因，用PPAR-γsiRNA处理野生型RF24细胞。用PPAR-γsiRNA处理的细胞显示出CD5L mRNA和蛋白质二者的显著降低(图2D和2E)，以及来自CD5L启动子构建体的萤光素酶活性降低(图2F)。接下来，从CD5L启动子构建体中删除PPAR-γ结合位点(pCD5L del)，以确定观察到的CD5L提高是否是由于PPAR-γ特异性结合。在用PPAR-γ表达质粒和pCD5L WT或pCD5L del共转染RF24细胞之后，发现与未突变的启动子相比，突变的PPAR-γ结合位点导致萤光素酶活性显著降低，这表明PPAR-γ直接调节CD5L表达(图2G)。
接下来，寻求确定PPAR-γ上游的任何其他因素在CD5L的上调中是否发挥作用。使用从抗VEGF抗性的内皮细胞产生的初始基因表达数据集，进行了独创性途径分析(IPA)并发现与低氧信号传导蛋白(HIF1A、EPAS1、ARNT)的密切相关性(图9)。为了确定这种关系，将WT RF24细胞在低氧和常氧条件下培养，并且与常氧条件相比，在低氧条件下培养的细胞中发现PPAR-γ和CD5L二者的mRNA和蛋白质水平均显著提高(图2H和2I)。进一步扩展这一发现，将RF24细胞与HIF1A稳定化合物(氯化钴-CoCl2)在常氧条件下孵育6小时和30小时。与6小时以及未处理相比，在CoCl2孵育30小时之后，PPAR-γ和CD5L二者的mRNA表达均显著更高，这进一步表明低氧样条件导致PPAR-γ和CD5L的上调(图2J)。另外，正如预期的那样，在更长的CoCl2孵育时间下，HIF1A和CD5L的蛋白表达也提高(图2K)。为了确定HIF1A阻断是否对PPAR-γ和CD5L导致相反的作用，使用了两种已知的HIF1A抑制剂YC-1和拓扑替康。在用YC-1或拓扑替康处理WT RF24细胞之后，与DMSO对照相比，发现PPAR-γ和CD5L二者的mRNA表达均显著降低(图2L)。此外，与常氧条件相比，CD5L启动子活性(pCD5L WT)在暴露于低氧条件时显著提高(图2M)。最后，在低氧和常氧条件下使用抗PPAR-γ抗体进行CD5L启动子的染色质免疫沉淀(ChIP)分析。与常氧条件相比，PPAR-γ结合位点(位于CD5L启动子的区域1中)在低氧条件下具有显著更高的PPAR-γ倍数富集(图2N)。此外，确定了PPAR-γ对区域1中特定启动子序列的选择性，因为在常氧或低氧条件下，区域2或3中只有最小的结合。
实施例3-外源CD5L提高内皮细胞中的PI3K/AKT信号传导
由于CD5L主要是显示出以旁分泌方式发挥作用的分泌蛋白，因此用CD5L外源处理RF24内皮细胞以确定下游信号传导效应。对经CD5L处理的和未经处理的RF24内皮细胞二者进行反相蛋白质阵列(RPPA)分析，并且经CD5L处理的细胞显示出PI3K/AKT信号传导的激活(图3A)。为了验证这些结果，测量经CD5L处理的RF24细胞中AKT和phosho-AKT的蛋白质水平，将其与未经处理的对照进行比较。与未经处理的细胞相比，用CD5L预处理的RF24细胞具有提高的p-AKT表达(图3B)。此外，在CD5L预处理之后添加PI3K抑制剂LY294002减轻了这些对p-AKT的刺激作用(图3C)。类似地，在CD5L处理之后，RF24细胞的管形成和细胞迁移二者均显著提高(图10A至10B)；然而，这二者都随着PI3K抑制剂的共同添加而显著降低，这确定了PI3K信号传导在CD5L结合的下游效应中的关键作用(图3D和3E)。
接下来，由于先前已报道CD36是巨噬细胞中CD5L的主要受体之一，因此寻求确定CD5L外源处理对CD36表达是否有影响。经CD5L处理的RF24细胞比未经处理的RF24细胞具有显著更高的CD36表达(图3F)，这可能是通过正反馈机制。为了确定CD36是否与PI3K/AKT的CD5L依赖性上调有关，用CD36 siRNA转染RF24细胞并再次用CD5L对其进行外源处理。令人感兴趣地，先前在外源性CD5L处理下看到的p-AKT的上调在CD36受体阻断的条件下被抵消(图3G)。此外，外源性CD5L处理导致PPAR-γ的上调与先前使用内源性CD5L过表达构建体所显示的相同(图3H)。PI3K/AKT途径的上调很可能是对贝伐单抗产生适应性抗性的必要的组分，因为与对照细胞相比，用CD5L外源处理的RF24细胞失去了其对贝伐单抗的敏感性(图3I)。此外，与经si对照处理的细胞相比，用CD5L siRNA处理RF24细胞导致对贝伐单抗的敏感性增强(图3J)。
实施例4-PPAR-γ的沉默抑制血管生成和肿瘤生长
为了进一步探索PPAR-γ和CD5L在肿瘤内皮细胞中的功能，将鼠ID8卵巢癌细胞腹膜内注射到含有内皮细胞特异性PPAR-γ敲除的C57BL/6小鼠以及C57BL/6WT小鼠中(图4A)(Guignabert et al.,2009)。与WT小鼠相比，观察到PPAR-γKO小鼠中肿瘤重量和肿瘤结节数目减少50％(图4B、4C和4D)。此外，与WT小鼠相比，来自PPAR-γKO的肿瘤组织的免疫组织化学(IHC)分析揭示了PPAR-γKO小鼠中细胞增殖和微血管密度的显著降低(图4E和4F)。接下来，进行了同时抗VEGF处理期间PPAR-γKO小鼠与WT小鼠的存活分析。与WT小鼠相比，携带PPAR-γKO的小鼠在接受抗VEGF处理时存活显著提高。与体外数据一致，与来自WT小鼠的肿瘤相比，来自PPAR-γKO小鼠的肿瘤样品的p-AKT表达较低(图4G)。
实施例5-靶向CD5L的新抗体表现出抗肿瘤和抗血管生成作用
考虑到抗VEGF治疗的抗性部分地由CD5L过表达介导这一发现，本发明人旨在开发特异性靶向CD5L并消除其下游效应的抗体。为此，使用两种策略通过筛选从经CD5L抗原免疫接种的兔中分离的单一B细胞和通过淘选人抗体噬菌体展示文库来产生一大组(>350结合命中物)的抗CD5L单克隆抗体。人CD5L蛋白用于抗体产生并在HEK293细胞中表达。该蛋白质具有6XHIS标签，并使用Ni-NTA树脂(Sino Biologicals)将其纯化至>95％纯度。使用标准免疫接种程序在初次致敏免疫接种之后进行3次加强剂来用重组产生的CD5L对兔(NZW，Charles River)进行免疫接种。通过在ELISA中血清的系列稀释对96孔板(max-sorb板，Nunc)上包被的CD5L蛋白的结合来确定抗CD5L血清的效价。当血清效价达到>106时，从经免疫接种的兔中收集外周血样品，以用于使用荧光辅助细胞分选(fluorescence assistedcell sorting，FACS)仪器(BD FACSAriaTM III,BD Biosciences)从新鲜制备的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分离B细胞。将分选的单一B细胞收集在96孔细胞培养板(Fisher Scientific)中，并在具有5％ CO2和95％湿度的细胞培养培养箱中，在具有10％ FBS和添加的细胞因子的RPMI培养基中培养7至10天。测定培养上清液中的抗体的CD5L结合。裂解来自阳性孔的细胞，分离总RNA，并使用superscript逆转录酶II(Invitrogen)根据制造商说明合成cDNA。使用设计的引物组通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增来自重链和轻链二者的抗体可变区的DNA序列，并将其克隆到载体中以对每种抗体的可变区进行测序。DNA和氨基酸序列的可变序列列于表3和表4中。使用IMGT程序(可在万维网在IMGT.org上获得)鉴定抗CD5L单克隆抗体的CDR，并将其列于表2中。
使用哺乳动物表达载体系统在人胚肾(HEK293)细胞(Invitrogen)中将选择的CD5L结合命中物表达为全长人IgG或兔/人嵌合IgG。使用蛋白A亲和树脂通过快速蛋白质液相色谱(fast protein liquid chromatography，FPLC)来纯化抗体。对经纯化的CD5L结合抗体的生物学特性进行表征。
首先使用从B细胞培养物中收集的上清液，通过ELISA筛选单克隆抗体对CD5L的结合。ELISA浓度滴定测定用于确定单克隆抗体组与CD5L抗原的结合亲和力(图11)。通过滴定ELISA来估计单克隆抗体组的结合常数(EC50)并使用四参数曲线拟合用Prism GraphPad程序来分析数据(表6)。
为了进行抗体亲和力测量，将抗体(30μg/mL)加载到蛋白A生物传感器上4分钟。在动力学缓冲液中的短基线之后，将加载的生物传感器暴露于0.1至200nM的一系列重组CD5L蛋白，并使用背景减除来校正传感器漂移(sensor drifting)。所有实验均以1,000rpm在摇动下进行。从仅加载有抗体的参考生物传感器测量背景波长移动。每种抗体的动力学传感图示于图12中。使用ForteBio的数据分析软件将数据拟合至1:1结合模型，以提取缔合速率和解离速率。使用koff/kon之比计算Kd，并且在表7中列出了CD5L mAb的KD的估计值。
使用抗CD5L mAb之间的成对结合竞争以用Octet仪器和蛋白A生物传感器来确定每种mAb的结合表位。表8中总结了表位箱(epitope bin)。
基于对结合亲和力(KD)、CD5L小鼠交叉反应性和结合表位的体外表征，选择了10种抗体以进一步评价抗肿瘤效力。使用原位卵巢癌小鼠异种移植肿瘤模型(SKOV3 iP1)在体内筛选这10种抗体。当与同种型抗体对照相比时，在体内测试的这些抗体中的两种单克隆抗体(H-447和R-35)显示出显著的肿瘤减少(图5A、5B、5C、5G和5H)。用同种型对照抗体处理的小鼠比用有效的抗CD5L抗体处理的小鼠具有更大的肿瘤负荷(图5A)。用两种有效的抗CD5L抗体的处理导致肿瘤的重量和肿瘤结节的数目显著低于对照抗体的(图5B、5C、5G和5H)。抗CD5L mAb显示对小鼠体重没有影响(图5I)。接下来，对来自体内标本的肿瘤血管密度进行审查，并且发现用抗CD5L抗体R-35的处理导致肿瘤血管显著少于对照抗体的处理的(图5D)。同样地，向用CD5L蛋白处理的RF24细胞添加R-35抗体抵消了当用对照抗体加上单独的CD5L蛋白处理RF24细胞时观察到的管形成和细胞迁移的提高(图5E和5F)。
表2.抗CD5L抗体的轻链可变序列的CDR
Figure BDA0003969719600000661
Figure BDA0003969719600000671
Figure BDA0003969719600000681
表3.抗CD5L抗体的重链可变序列的CDR
Figure BDA0003969719600000682
Figure BDA0003969719600000691
Figure BDA0003969719600000701
Figure BDA0003969719600000702
表4.抗CD5L抗体可变区的蛋白质序列
Figure BDA0003969719600000711
Figure BDA0003969719600000721
Figure BDA0003969719600000731
Figure BDA0003969719600000741
Figure BDA0003969719600000751
Figure BDA0003969719600000761
表5.抗CD5L抗体可变区的核苷酸序列
Figure BDA0003969719600000762
Figure BDA0003969719600000771
Figure BDA0003969719600000781
Figure BDA0003969719600000791
Figure BDA0003969719600000801
Figure BDA0003969719600000811
Figure BDA0003969719600000821
Figure BDA0003969719600000831
Figure BDA0003969719600000841
Figure BDA0003969719600000851
Figure BDA0003969719600000861
Figure BDA0003969719600000871
Figure BDA0003969719600000881
Figure BDA0003969719600000891
Figure BDA0003969719600000901
Figure BDA0003969719600000911
Figure BDA0003969719600000921
表6.抗CD5L单克隆抗体的EC50
mAb名称 EC50(μg/ml)
R-1 0.0598
R-3 0.1827
R-4 0.0713
R-5 0.1482
R-6 0.1871
R-9 0.1355
R-10 0.3073
R-11 0.04738
R-13 0.1158
R-14 0.1173
R-17 0.2929
R-18 0.1900
R-21 0.2100
R-23 0.1395
R-29 0.1608
R-33 0.1512
R-34 0.2202
R-35 0.1691
R-36 0.2777
R-39 0.2463
R-40 0.2105
R-43 0.3009
R-45 0.0788
R-49 0.0077
R-51 0.0144
H-7 0.1095
H-118 0.1360
H-119 0.0068
H-447 0.2500
表7.使用Octet(96-Red)仪器确定的与人CD5L的结合亲和力和与鼠CD5L的交叉反应性
抗体名称 人CD5L结合KD(nM)
R-3 2.18
R-40 1.74
R-34 1.35
R-13 1.72
R-45 2.97
R-35 0.78
R-18 1.56
H118 16.5
H007 5.87
H447 28.7
表8.CD5L mAb的表位组
mAb名称 表位箱
R-1 箱1
R-3 箱1
R-4 箱4
R-6 箱1
R-11 箱1
R-13 箱3
R-14 箱1
R-21 箱1
R-23 箱1
R-34 箱2
R-35 箱5
R-40 箱1
R-45 箱4
R-49 箱6
R-50 箱6
R-51 箱6
H007 箱7
H118 箱6
H447 箱8
实施例6-CD5L过表达在卵巢癌患者中与贝伐单抗抗性和较差的总存活相关
为了确定CD5L过表达的潜在临床相关性，对鉴定为贝伐单抗响应者与非响应者的卵巢癌患者所选组群进行了询问。与患有贝伐单抗敏感性疾病的患者相比，患有对贝伐单抗具有抗性的疾病的患者其肿瘤内皮细胞中CD5L表达显著更高(图6A)。此外，与对贝伐单抗治疗敏感的患者相比，那些对贝伐单抗有抗性的患者的血清CD5L水平也显著更高(图6B)。另外，在对包含来自卵巢癌组群的肿瘤样品的组织微阵列(tissue microarray，TMA)进行CD5L的IHC染色。在该组群中，肿瘤内皮细胞中的CD5L表达范围从不存在到低(图6C，上部)到高(图6C，下部)。令人感兴趣地，在具有高级别浆液性组织学的卵巢癌患者中，那些具有高的肿瘤内皮CD5L表达的患者的总存活显著差于具有低表达的患者(图6D)。
实施例7-CD5L抗体(R-35)对OVCAR8肿瘤生长和存活和安全性研究的作用
实验设计。本发明人检查了CD5L抗体(R-35)对正常C57/BL6小鼠的作用。用对照IgG或CD5L Ab处理小鼠两周(每周一次，持续两周)，并在注射后24小时收集血液；评估了CBC(全血细胞计数)和其他血细胞计数。
组织染色。在用IgG对照或CD5L抗体处理小鼠之后，获得重要器官例如肺、肝、肾和脾的H&E染色。两名内部病理学家检查了载片。对这些重要器官组织进行CD31染色以染色血管。
存活测定。评价了单独或与贝伐单抗组合的CD5L抑制对OVCAR8肿瘤生长和存活的作用。将小鼠(n＝10/组)随机分配以用载剂IgG对照、CD5L抗体、贝伐单抗以及CD5L ab与贝伐单抗组合进行处理。将OVCAR8细胞(1×106)注射到小鼠中(腹膜内)。在细胞注射之后第8天开始处理，并且持续到直至小鼠濒临死亡。使用对数秩(Mantel-Cox)检验进行统计学检验。
结果。如图13中所示，经CD5L抗体(R-35)处理的小鼠与经IgG对照抗体处理的动物之间的WBC、ALT、AST和LDH水平没有显著性差异。值表示为平均值±标准误差，n＝4(双尾t检验)。
与经对照IgG处理的动物相比，在CD5L抗体处理之后，重要器官例如肺、肝、肾和脾的H&E染色未显示出任何差异(图14)。本发明人使用CD31抗体对重要器官的血管进行染色并且没有观察到经对照IgG处理组与经CD5L Ab处理组之间的任何显著性差异(图15)。
通过Kaplan-Meier方法分析存活(图16)。与使用对照IgG(65天)、单独CD5L Ab(62天)或单独贝伐单抗(65天)处理的小鼠相比，使用CD5L-Ab与贝伐单抗组合处理的小鼠的总存活最长(120天)(P<.001)。
实施例8-CD5L-35抗体序列的人源化
CD5L-35Hu mAb的表达和纯化。使用ExpiHEK 293细胞用重链和轻链构建体的各相应对(表10)在具有人抗体恒定区(IgG1)序列的哺乳动物表达载体系统中表达人源化单克隆抗体。
使用基于Octet双层干涉术(Bilayer Interferometry，BLI)的方法确定人源化CD5L-35Hu mAb与人CD5L的结合亲和力。(表11)中的动力学结合参数(KD、kon和koff)使用Octet RED96仪器来确定，并且结合曲线示于图17中。简言之，将抗体(30μg/ml)加载到蛋白A生物传感器上，然后将CD5L-His重组产生的蛋白质(Sino Biologicals)与生物传感器以图上所示的浓度孵育，以测量动力学结合速率，随后在动力学缓冲液(ForteBio)中解离以确定解离速率(off rate)。KD使用Octet软件用全局拟合模型来计算。
表9.人源化CD5L-35Hu抗体可变序列
Figure BDA0003969719600000951
Figure BDA0003969719600000961
表10.用于CD5L-35Hu mAb表达的成对的轻链和重链
Figure BDA0003969719600000962
表11.使用BLI方法确定的CD5L-35Hu抗体动力学结合参数
抗体名称 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s) 全R^2
CD5L-35Hu-1 ＜1.0E-12 1.46E+05 ＜1.0E-07 0.999
CD5L-35Hu-2 ＜1.0E-12 1.25E+05 ＜1.0E-07 0.999
CD5L-35Hu-3 ＜1.0E-12 1.19E+05 ＜1.0E-07 1.000
CD5L-35Hu-4 ＜1.0E-12 1.06E+05 ＜1.0E-07 1.000
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根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有方法无需过度实验就可进行和实施。虽然已经根据一些优选实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本公开内容的概念、精神和范围的情况下，可以对本文中所述方法以及本文中所述方法的步骤或步骤序列施加变化。更具体地，明显的是，可用某些在化学和生理学两个方面均相关的试剂替代本文中所述的试剂，同时实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的是所有这样的类似替代和修改被认为在由所附权利要求书所限定的本公开内容的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献就其提供补充本文中所阐述的那些操作或细节的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。
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序列表
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<151> 2020-04-02
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 83
Ala Gly Gly Arg Ile Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 84
Ala Arg Arg Tyr Ser Ser Ser Leu Arg Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 85
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 86
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<212> PRT
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<223> 单克隆抗体区段
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<212> PRT
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<212> PRT
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 107
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 114
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 115
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<212> PRT
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<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 120
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Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 123
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 124
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 125
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 126
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 131
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 132
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 133
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1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 134
Ile Ser Ser Ser Asp Asn Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 135
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 138
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 139
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1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 140
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 141
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1 5
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 142
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1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 143
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1 5 10 15
<210> 144
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 144
Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ile
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 145
Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 146
Ala Arg Gly Ala Gly Thr Thr Trp Ser Ser Phe Asn Leu
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 147
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 148
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Thr Gly Asn Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 149
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 150
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 151
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 152
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 153
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 154
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1 5 10 15
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 155
Gly Phe Ser Phe Ser Gly Gly Tyr Asp
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 156
Ala Arg Gly Ala Tyr Ala Gly Gly Gly Tyr Pro Pro Tyr Phe Asn Phe
1 5 10 15
<210> 157
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 157
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 158
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 158
Thr Phe Pro Ser Gly Ser Ala
1 5
<210> 159
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 159
Ala His Val Gly Ala Thr Thr Gly Arg Asp Phe
1 5 10
<210> 160
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 160
Gly Ile Asp Leu Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 161
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 161
Ile Tyr Ala Ser Gly Asn Ala
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 162
Ala Arg Asn Ile Gly Gly Ser Ser Asn Leu
1 5 10
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 163
Gly Phe Ser Leu Ser Lys Asn Tyr Val
1 5
<210> 164
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 164
Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Asn
1 5
<210> 165
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 165
Ala Arg Trp Asp Tyr Ile Gly Asn Asn Asn Leu
1 5 10
<210> 166
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 166
Gly Ile Asp Leu Ile Ser Tyr Pro
1 5
<210> 167
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 167
Ile Ala Thr Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 168
Ala Arg Arg Trp Ser Ser Ala Tyr Asp Phe
1 5 10
<210> 169
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 169
Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 170
Ile Ala Ile Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 171
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 171
Ala Arg Gly Ala Gly Lys Thr Trp Ser Ser Phe Asn Leu
1 5 10
<210> 172
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 172
Gly Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ser
1 5
<210> 173
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 173
Met Ser Ile Gly Ser Ser Ala
1 5
<210> 174
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 174
Ala Arg Ser Asn Leu Tyr Arg Gly Ala Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 175
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Gln Asp
1 5
<210> 176
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 176
Ile Gly Phe Gly Ser Gly Asn Thr
1 5
<210> 177
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 177
Ala Arg Asp Pro Phe Thr Val Ala Gly Asp Gly Asp Asn Leu
1 5 10
<210> 178
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 178
Gly Phe Ser Ile Asn Asp Phe His
1 5
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 179
Ile Gly Thr Gly Gly Ser Ala
1 5
<210> 180
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 180
Ala Arg Arg Asp Trp Ser Asp Gly Gly Tyr Ser Leu Leu
1 5 10
<210> 181
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 181
Gly Phe Ser Leu Ser Ile Asn Ala
1 5
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 182
Ile Thr Asn Ile Gly Asn Thr
1 5
<210> 183
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 183
Ala Arg Asn Ser Tyr Phe Asp Pro
1 5
<210> 184
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 184
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Arg Ile Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Ser Val Ser Ser
115
<210> 185
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 185
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 186
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 186
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Xaa Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Ser Ser Ser Leu Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Ser Val Ser Ser
115 120
<210> 187
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 187
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Ser Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 188
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 188
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg His Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Ser Ala Val Ala Gly Trp Gly Met Asp Val Trp Gly Lys Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 189
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 189
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Gly
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 190
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 190
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Ala Ser Thr Arg Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 191
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 191
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Gln Ser Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 192
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 192
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Met Ile Ser Ser Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Ile Ile Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Phe
85 90 95
Phe Ala Gly Arg Ser Glu Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 193
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 193
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Asn Lys Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ala Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Thr Tyr Tyr Asp
85 90 95
Ser Gly Trp Tyr Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 194
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 194
Gln Ser Leu Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro Asp Glu Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ile Asp Leu Thr Ser Gly Thr
20 25 30
Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Arg Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Leu Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Arg Ala Phe
85 90 95
Pro Gly Tyr Asn Thr Phe Phe Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Ile Ser Ser
115
<210> 195
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 195
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Asn Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Trp Lys Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Tyr Phe Asn Gly Val
85 90 95
Ser Val Glu Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly
100 105 110
<210> 196
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 196
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Ser Asp Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ala Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Leu
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Tyr Arg Gly
85 90 95
Val Asp Gly Ser Gly Gly Tyr Ala Ala Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115
<210> 197
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 197
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Ala Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Asn Phe Tyr Met Ile Gly
85 90 95
Asp Asp Tyr Gly Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 198
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 198
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Val Ile Asp Val Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Arg Asp Ser
85 90 95
Tyr Leu Asp Tyr Gly Asp Pro Asn Gly Leu Asp Pro Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115
<210> 199
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 199
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Ser Thr Leu Ile Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Tyr Gly Thr Ser
85 90 95
Tyr Met Glu Leu Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 200
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 200
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Thr Ile Asp Val Ser Lys Tyr Ala
20 25 30
Val Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Gly Asn Gly Val Ala Phe Lys Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Ile Ser Ser
115
<210> 201
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 201
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Asp Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Thr Ser Gln Val Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser His Asp Tyr Ile Ser Ser
85 90 95
Ser Gly Met Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 202
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 202
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Met Ser Gly Phe Ser Leu Gly Arg Asp Ala
20 25 30
Leu Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Ile Ala
35 40 45
Phe Ile Asn Asp Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Pro Asn Trp Ala Arg Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val
85 90 95
Gly Ala Glu Tyr Leu Gly Trp Gly Asn Gly Phe Asn Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 203
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 203
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Leu Tyr Asn Lys
20 25 30
Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Glu Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ala Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys
85 90 95
Val Ala Ala Asp Cys Phe Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Lys
<210> 204
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 204
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Gln
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Leu Thr Asn Tyr Ala Thr Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Asp Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ile Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Phe Asp Pro Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 205
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 205
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Tyr Gly Ser Ser Ser
85 90 95
Asn Ala Phe Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 206
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 206
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Tyr Leu Ser Thr His Gly
20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Val Ile Val Thr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Thr Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Pro Gly
85 90 95
Tyr Lys Ser Val Pro Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser
100 105 110
Ser
<210> 207
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 207
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Asn Tyr Gly Ser Ser Ser
85 90 95
Asn Asn Tyr Val Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 208
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 208
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Gly
85 90 95
Tyr Ala Gly Thr Gly Tyr Pro Thr Arg Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115
<210> 209
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 209
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Phe Ser Phe
85 90 95
Ser Asn Tyr Asp Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 210
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 210
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ala Thr His Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Leu Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Asp Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp
85 90 95
Arg Gly Tyr Val Asp Gly Ser Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 211
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 211
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Ala Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ala Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Gly Ser Gly Tyr
85 90 95
Gly Lys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asp Val Val Val Lys
100 105
<210> 212
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 212
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Pro
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Thr Ser Gly Gly Ser Ile Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Asn Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr
85 90 95
Ser Ser Gly Thr Met Met Ser Ser Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 213
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 213
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Tyr Lys Asn
85 90 95
Val Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 214
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 214
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Met Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Asn Thr
20 25 30
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35 40 45
Ile Met Arg Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Phe
85 90 95
Pro Gly Tyr Asn Ser Phe Phe Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Ile Ser Ser
115
<210> 215
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 215
Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly Gly Thr Val Thr
1 5 10 15
Ile Lys Cys Gln Ala Ser His Asn Ile Asn Ser Ala Leu Ala Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser
35 40 45
Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala
65 70 75 80
Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg His Tyr Phe Asp Gly Ala Ser Ala Asp Ile
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 216
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 216
Gln Ser Val Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Tyr Ala Gly Gly Ser Tyr Pro Pro Tyr Phe Asn Leu
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 217
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 217
Glu Xaa Xaa Xaa Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
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100 105 110
<210> 218
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 218
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Val Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg His Ala
85 90 95
Tyr Ser Ile Gly Ser Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile
100 105 110
Ser Ser
<210> 219
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 219
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Pro Ser Ala Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Val Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
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100 105 110
<210> 220
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 220
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
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35 40 45
Thr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Ala Val Thr Tyr Tyr Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 221
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 221
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<210> 222
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 222
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Ser
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<211> 112
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 223
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
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Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Lys Ser
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100 105 110
<210> 224
<211> 119
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 224
Glu Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 225
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 225
Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr
1 5 10 15
Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105
<210> 226
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 226
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Met Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Met Arg Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Thr Ile Ser Ser
115
<210> 227
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 227
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
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100 105 110
<210> 228
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 228
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1 5 10 15
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100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 229
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 229
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Asn Asn Asn Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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<210> 230
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 230
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
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115 120
<210> 231
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 231
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 232
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1 5 10 15
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35 40 45
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100 105 110
Thr Ile Ser Ser
115
<210> 233
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 233
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Val Ser Gln Ser Ile Asp Asn Tyr
20 25 30
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 234
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
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50 55 60
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100 105 110
Ser
<210> 235
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 235
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
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35 40 45
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100 105
<210> 236
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 236
Ser Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
Leu Val Thr Ile Ser Ser
115
<210> 237
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 237
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Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Ser Gly Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105
<210> 238
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 238
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Asn
20 25 30
Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Cys Ile Gly
35 40 45
Phe Ile Asn Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Val Ser Lys Ala Ser Thr Thr Val Thr Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ala Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr
85 90 95
Tyr Ala Gly Ala Asp Trp Asn Met Pro Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 239
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 239
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Gly Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ser Ser Glu Ser Ile Gly Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Phe Thr Tyr Tyr Gly Asn Ser
85 90 95
Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 240
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 240
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Gly Tyr
20 25 30
Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Tyr Ala Gly Gly Gly Tyr Pro Pro Tyr Phe Asn Phe
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 241
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 241
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Asp Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Thr Ser Lys Val Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser His Asp Tyr Ile Ser Ser
85 90 95
Ser Gly Met Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 242
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 242
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser Gly
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Leu Thr Phe Pro Ser Gly Ser Ala Ser Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Val Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala His Val Gly
85 90 95
Ala Thr Thr Gly Arg Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 243
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 243
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Asn
20 25 30
Arg Trp Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser Gly Thr
85 90 95
Ile Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 244
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 244
Ala Ala Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asp Tyr Tyr
20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Asn Ala Tyr Phe Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Asn Val
65 70 75 80
Ala Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asn
85 90 95
Ile Gly Gly Ser Ser Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 245
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 245
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Arg Ile Tyr Asn Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Phe
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Gly Tyr Gly Thr Thr
85 90 95
Tyr Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile
100 105
<210> 246
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 246
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Asn Tyr
20 25 30
Val Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Val Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Asp Tyr Ile Gly Asn Asn Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Ile Ser Ser
115
<210> 247
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 247
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
His Val Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 248
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 248
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ile Ser Tyr Pro
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Ala Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Trp
85 90 95
Ser Ser Ala Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser
100 105 110
Ser
<210> 249
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 249
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Arg Ser Ser Asn
85 90 95
Val Asp Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 250
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 250
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Thr
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Val Ile Ala Ile Asn Gly Gly Thr Val Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ala
85 90 95
Gly Lys Thr Trp Ser Ser Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Ile Ser Ser
115
<210> 251
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 251
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Gly Ser Ser Thr
85 90 95
Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105
<210> 252
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 252
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro Asp Glu Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ser
20 25 30
Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gly Gly Leu Gln Trp Ile Gly
35 40 45
Val Met Ser Ile Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Thr Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser
85 90 95
Asn Leu Tyr Arg Gly Ala Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Ile Ser Ser
115
<210> 253
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 253
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Lys Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Phe Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Arg Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Tyr Gly Ser
85 90 95
Ser Ser Val Asp Arg Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 254
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 254
Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ala Ser Leu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Gln Asp
20 25 30
Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Cys Ile Gly Phe Gly Ser Gly Asn Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Asn
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ser Thr Ser Leu Asn Thr Val Glu Leu
65 70 75 80
Lys Met Thr Gly Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Pro Phe Thr Val Ala Gly Asp Gly Asp Asn Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 255
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 255
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Thr Ile Asn Asn Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Arg Pro Tyr Ile Asn
85 90 95
Asp Gly Ser Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 256
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 256
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Val Ile Asp Val Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Arg Asp Ser
85 90 95
Tyr Leu Asp Tyr Gly Asp Pro Asn Gly Leu Asp Pro Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115
<210> 257
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 257
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Ser Thr Leu Ile Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Tyr Gly Thr Ser
85 90 95
Tyr Met Glu Leu Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 258
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 258
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ile Asn Asp Phe His
20 25 30
Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Met Ile Gly Thr Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Thr Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Asp
85 90 95
Trp Ser Asp Gly Gly Tyr Ser Leu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 259
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 259
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Arg Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Tyr Trp Ser Asp
85 90 95
Val Glu Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Asn
100 105 110
<210> 260
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 260
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ile Asn Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Thr Asn Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Thr Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asn Ser
85 90 95
Tyr Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
100 105 110
<210> 261
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 261
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Asp Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Cys Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile His Lys Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Leu Gly Asp
85 90 95
Asn Ile Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Asn
100 105 110
<210> 262
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 262
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Thr Ile Asp Val Ser Lys Tyr Ala
20 25 30
Val Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Gly Asn Gly Val Ala Phe Lys Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Ile Ser Ser
115
<210> 263
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 263
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Thr Ser Lys Val Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser His Asp Tyr Ile Ser Ser
85 90 95
Ser Gly Met Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu
100 105 110
<210> 264
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 264
acaggtgtcc actcggaggt gcagctggtg cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg 60
gcctcagtga aggtctcctg caaggcttct ggatacacct tcaccggcta ctatatgcac 120
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gatggatcaa ccctaacagt 180
ggtggcacaa actatgcaca gaagtttcag ggcagggtca ccatgaccag ggacacgtcc 240
atcagcacag cctacatgga gctgagcagg ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac 300
tgtgcgggcg gaaggattga tgcttttgat atctggggcc aagggaccac ggtcagcgtc 360
tcctcagcat ccaccaaggg c 381
<210> 265
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 265
acagacgctc gctgcgacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta 60
ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca agtcagagca ttagcagcta tttaaattgg 120
tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct atgctgcatc cagtttgcaa 180
agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 240
agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact tactactgtc aacagagtta cagtaccccg 300
ctcactttcg gcggagggac taaagtggat atcaaacgta cggtggctgc a 351
<210> 266
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<220>
<221> misc_feature
<222> (275)..(275)
<223> n是a、c、g或t
<400> 266
acaggtgtcc actcggaagt gcagctggtg cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg 60
gcctcagtga aggtctcctg caaggcttct ggatacacct tcaccggcta ctatatgcac 120
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gacggatcaa ccctaacagt 180
ggtggcacaa actatgcaca gaagtttcag ggcagggtca ccatgaccag ggacacgtcc 240
atcagcacag cctacatgga gctgagcagg ctganatctg acgacacggc cgtgtattac 300
tgtgcgagaa ggtatagcag cagcttacgc gcttttgata tctggggcca agggacaatg 360
gtcagcgtct cctcagcatc caccaagggc 390
<210> 267
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 267
acagacgctc gctgcgacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta 60
ggagacagag tctccatcac ttgccgggca agtcagagca ttagtagata tttaaattgg 120
tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct atgctgcatc cagtttgcaa 180
agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 240
agtagtctgc aacctgaaga ttttgcaact tattactgtc aacagagtta caggaccccc 300
tacactttta gccaggggac caagctggag atcaaacgta cggtggctgc a 351
<210> 268
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 268
acaggtgtcc actcggaagt gcagctggtg cagtctggag gaggcttggt ccagcctggg 60
gggtccctga gactctcctg tgcagcctct gggttcaccg tcagtagcaa ctacatgagc 120
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggtct cagttattta tagcggtggt 180
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cgattcacca tctccagaca caattccaag 240
aacacgctgt atcttcaaat gaacagcctg agagctgagg acacggccgt gtattactgt 300
gcgagagaat cggcagtggc cgggtggggt atggacgtct ggggcaaagg gaccacggtc 360
accgtctctt cagcatccac caagggc 387
<210> 269
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 269
acagacgctc gctgcgacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta 60
ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca agtcagagca ttagcagcta tttaaattgg 120
tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct atgctgcatc cagtttgcaa 180
agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 240
agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact tactactgtc aacagagtta cagtaccctc 300
gggacgttcg gccaagggac caagctggaa atcaaacgta cggtggctgc a 351
<210> 270
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 270
acaggtgtcc actcggaggt gcagctggtg cagtctggag cagaggtgaa aaagcccggg 60
gagtctctga agatctcctg taagggttct ggatacagct ttaccagcta ctggatcggc 120
tgggtgcgcc agatgcccgg gaaaggcctg gagtggatgg ggatcatcta tcctggtgac 180
tctgatacca gatacagccc gtccttccaa ggccaggtca ccatctcagc cgacaagtcc 240
atcagcaccg cctacctgca gtggagcagc ctgaaggcct cggacaccgc catgtattac 300
tgtgcgagag gtctcgcagc atcgactcgg ttcgacccct ggggccaggg caccctggtc 360
accgtctcct cagcatccac caagggc 387
<210> 271
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 271
acagacgctc gctgcgacgt ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgtc 60
ggagacagag tcaccatcac ttgccggcca agtcagagca ttaacaacta tttaaattgg 120
tatcagcaga aaccagggga agcccctaag ctcctgatct atgctgcatc caatttgcaa 180
agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt ggatccggga cagatttcac tctcaccatc 240
agcagtctgc aacctgaaga ttttggaact tactactgtc aacagagtta cagtatccct 300
ctcactttcg gcggagggac tacagtggaa atcaaacgta cggtggctgc a 351
<210> 272
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 272
acaggtgtcc actcggagca gtcggtggag gagtccgggg gtcgcctggt cacgccgggg 60
acacccctga cactcacctg cacagtctct ggaatcgacc tcagtaatta tgcaataaac 120
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gaatggatcg gaatgattag tagtggtgat 180
gtcacatact acgcgagctg ggcgaaaggc cgattcatca tctccagaac ctcgtcgacc 240
acggtggatc tgaaaatgac cagtccgaca atcgaggaca cggccaccta tttctgtgcc 300
agatttttcg ctggtaggag tgaatccttg tggggccaag gcaccctggt caccgtctct 360
tcagggcaac ctaaggct 378
<210> 273
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 273
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccat cctccgtgtc tgccgctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa ctgccagtcc agtcagagtg ttaataagaa caactactta 120
tcctggtatc aacaaaaacc agggcagcct cccaagctcc taatctattc tgcatccgct 180
ctggcatctg gggtctcatc gcggttcagc ggcagtggat ctgggacaga gttcactctc 240
accatcagcg acgtgcagtg tgacgatgct gccacttact actgtcaagg cacttattat 300
gatagtggtt ggtacaatgc tttcggcgga gggaccgagg tggaaatcaa aggtgatcca 360
gttgcac 367
<210> 274
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 274
acaggtgtcc actcgcagtc gttgaaggag tccgggggtc gcctggtcaa gcctgacgaa 60
accctgacaa tcacctgcac agcctctgga atcgacctca ctagcggtac agtgggctgg 120
ttccgccagg ctccagggaa gggactagaa tggatcggaa ttattcgtgg tagtggtagc 180
acatattacg cgacctgggc gaaaggccga ttcaccatct ccaaaacctc gaccacggtg 240
gatctgaagc tcaccagtcc gacaaccgag gacacggcca cctatctctg tgccagagcc 300
ttccctggtt ataatacttt ctttaacttc tggggccaag gcaccctggt caccatctct 360
tcagggcaac ctaaggct 378
<210> 275
<211> 364
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 275
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccat cctccgtgga ggcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgtcaggcc agtgagagca ttggcaatgc attagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaaa ctcctgatct ggaaggcatc caatctagaa 180
tctggggtcc ccccgcggtt caaaggcagt ggatctggga cagagttcac tctcaccatt 240
agcgacctgg aatgtgccga tgctgccact tactattgtc aaaggtatta tttcaatggt 300
gttagtgttg agatagtttt cggcggaggg accgaggtgg tggtcaaagg tgatccagtt 360
gcac 364
<210> 276
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 276
acaggtgtcc actcggagca gtcggtggag gagtccgggg gtcgcctggt cacgcctggg 60
acacccctga cactcacctg cacagcctct ggattctccc tcagtagcta ctacatgacc 120
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gaatacatcg gaatcattag tgatcgtggt 180
agcacatact acgcgagctg ggcgaaaggc cgattcacca tcgccaaaac ctcgtcgacc 240
acggtggatc tgaaactgac cagtctgaca accgaggaca cggccaccta tttctgttat 300
agaggtgttg atggtagtgg tgggtatgct gccggtgact tgtggggcca aggcaccctg 360
gtcaccatct cttcagggca acctaaggct 390
<210> 277
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 277
acagatgcca gatgcgagct cgtgctgacc cagacaccag cctccgtgga ggcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgtcaggcc agtgaggaca tttatagcta cttcgcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcgtcccagg ctcctgatct atgaagcatc caaagtggca 180
tctggggtcc catcgcggtt caaaggcggt ggatctggga cacaattcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aaaacaattt ttatatgatt 300
ggtgatgatt atggtggtac tttcggcgga gggaccgagg tggaaatcaa aggtgatcca 360
gttgcac 367
<210> 278
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 278
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac agtctctgga ttctccctca gtagttatgc aatgagctgg 120
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tggatcggag tcattgatgt tactggtagg 180
acatactacg cgagctgggc gaaaggccga ttcaccatct ccaaaacctc gaccacggtg 240
gatctgaaaa tcaccagtcc gacaaccgag gacacggcca cctatttctg tggcagagat 300
agctaccttg actatggtga ccccaatggt cttgatccct ggggcccagg caccctggtc 360
accatctcct cagggcaacc taaggct 387
<210> 279
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 279
acagatgcca gatgcgagct cgtgatgacc cagacaccag cctccgtgga ggcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagagca ttggtagtaa tttagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct atactgcatc caatctggcg 180
cctggagtct catcgcggtt caaaggcagt agatctggga cagagtccac tctcatcatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aatgtactta ttatggtact 300
agttatatgg aattaggggc tttcggcgga gggaccgagc tggaaatcaa aggtgatcca 360
gttgcac 367
<210> 280
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 280
acaggtgtcc actcgcagtc gttggaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac agtctctaca atcgacgtca gtaagtatgc agtgatctgg 120
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggaa tacatcggaa tcattagtag tagtggtagc 180
acatactacg cgagctgggc gaaaggccga ttcaccatct ccaaaacctc atcgaccacg 240
gtggatctga aaatgaccag tccgacagcc gaggacacgg ccacctattt ctgtgccaga 300
gggggtaatg gtgtcgcctt taaattatgg ggccaaggca ccctggtcac catctcttca 360
gggcaaccta aggct 375
<210> 281
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 281
acagatgcca gatgcgagct cgatatgacc cagacaccag cctccgtgga ggcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa ttgccaggcc agtgagagca ttaacgatag attagcctgg 120
tatcagctga aaccagggca gcctcccaaa ctcctgatct acgaaacatc ccaagtggaa 180
tctggggtcc catcgcggtt cagcggcagt ggatctggga cacagttcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aaagccatga ttatattagt 300
agtagtggta tgcctttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaaggtga tccagttgca 360
c 361
<210> 282
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 282
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac aatgtctgga ttctccctcg gtagggatgc gctgacctgg 120
gtccgccagg ctccaggaaa ggggctacaa tggatcgcat tcatcaatga tgatggtgac 180
actgactatc caaactgggc gagaggccga ttcaccatct ccaaaacctc gtcgaccacg 240
gtggatctga aaatcaccag tcctacaacc gaggacacgg ccacctattt ctgtgccaga 300
gtgggggctg aatatcttgg ttggggtaat ggttttaatt tgtggggcca aggcaccctg 360
gtcaccatct cctcagggca acctaaggct 390
<210> 283
<211> 370
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 283
acagatgcca gatgcgagct cgatatgacc cagacaccag cctccgtgtc tgcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa ctgccaggcc agtcagagtc tttataataa gaaaaattta 120
gcctggtatc agcagaaacc agggcagcct cccaagctcc tgatctacaa ggcttccact 180
ctggcatctg gggtcccatc gcggttcgaa ggcagtggat ctgggacaga gtacgctctc 240
accatcagcg gcttgcagtg tgacgatgct gccacttact actgtcaagg cgaatttagt 300
tgtgttgctg ctgattgttt ttctttcggc ggagggaccg aggtggtggt caaaggtgat 360
ccagttgcac 370
<210> 284
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 284
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggag acctggtcaa gcctggggca 60
tccctgacac tcacctgtac agcctctgga ttctccttca gtagcagcca gtacatgtgc 120
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg catgcattta tggtggtagt 180
agtggtctca caaactacgc gacctgggcg aaaggccgat tcaccgtctc caaaacctcg 240
tcgaccacgg tgactctgca aatgaccagt ctgacagacg cagacacggc cacgtatttc 300
tgtgcgagag ctattggtcc tacttattat gcttttgatc cctggggccc aggcaccctg 360
gtcaccgtct cttcagggca acctaaggct 390
<210> 285
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 285
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagactccat cctccgtgtc tgcagctgtg 60
ggagacacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtgagagca tttacagtta cttagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct attatacatc cactctggca 180
tctggggtcc catcgcggtt caaaggcagt ggatctggga cagagttcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aaaacactta tggtagtagt 300
agtaatgctt ttccttttgg cggagggacc gaggtggaaa tcaaaggtga tccagttgca 360
c 361
<210> 286
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 286
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac agtctctgga ttctacctca gtacccatgg aatgacctgg 120
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggaa tacatcggag tcattgttac tagtggtaac 180
acatactacg cgacctgggc gactggccga ttcaccatct ccaaaacctc gaccacggtg 240
gatctgaaaa tcaccagtcc gacaaccgag gacacggcca cctatttctg tgccagacct 300
ggttataaaa gtgtcccctt gtggggccaa ggcaccctgg tcaccatctc ttcagggcaa 360
cctaaggct 369
<210> 287
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 287
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccag cctccgtgtc tgcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa ttgccaggcc agtgaggaca tttacagtgg tttgacctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct acagggcatc cactctggca 180
tctggggtcc caccgcggtt caaaggcagt ggatctggga cagaattcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgacga tgctgccact tactactgtc aaaacaatta tggtagtagt 300
agtaataatt atgtttttgc tttcggcgga gggaccgagg tggaaatcaa aggtgatcca 360
gttgcac 367
<210> 288
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 288
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgtac actctctgga atcgacctca gtagctatgc aatgggctgg 120
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggaa tacatcggaa tcattggtgc tagtggtacc 180
acttactacg cgaactgggc gaaaggccga ttcaccatct ccagaacctc gaccacggtg 240
gatctgaaaa tcaccagtcc gacaaccgag gacacggcca cctatttctg tgccagagct 300
ggttatgctg gtactggtta tcctactcgt ttggatctct ggggccaggg caccctggtc 360
accatctctt cagggcaacc taaggct 387
<210> 289
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 289
acagatgcca gatgcgagct cgatatgacc cagacaccag cctccgtgga ggcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagagta ttagtagtag ctacttagcc 120
tggtatcagc agaaaccagg gcagcctccc aagctcctga tctacaaggc atccactctg 180
gaatctgggg tcccatcgcg gttcagcggc agtggatctg ggacagagtt cactctcacc 240
atcagcggcg tgcagtgtga cgatgctgcc acttactact gtctaggcgg ttattttagt 300
tttagtaatt atgattatgg tttcggcgga gggaccgagg tggaaatcaa aggtgatcca 360
gttgcac 367
<210> 290
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 290
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggag acctggtcaa gcctggggca 60
tccctgacac tcacctgcac agcctctgga ttcgacttca gtagcaatac aatgtgctgg 120
gtccgccagg ctccagggaa agggctggaa tatattggat acattagtta tagtggtgct 180
acgcattacg cgagctgggc gaaaggccga ttcaccatct ccaaaacctt gtcgaccacg 240
gtgactctgc aaatgaccag tctgacagac gcggacacgg ccacctattt ctgtgcgaga 300
gatcggggtt atgttgatgg tagttattat ggtgacttta acttgtgggg cccaggcacc 360
ctggtcaccg tctcttcagg gcaacctaag gct 393
<210> 291
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 291
acagatgcca gatgcgagct cgtgatgacc cagactccat cttccgcgtc tgaacctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagagca ttgctagtag attagcctgg 120
tttcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctaatat acagggcatc cactctggaa 180
tctggggtct catcgcggtt caaaggcagt ggatttggga cagagttcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aaagctatta tggtagtggt 300
tatggcaaga ctttcggcgg agggaccgac gtggtggtca aaggtgatcc agttgcac 358
<210> 292
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 292
acaggtgtcc actcgcagtc gctggaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac agtctctgga ttctccctca gtagctatcc aatgagctgg 120
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggaa tggatcggaa tcattactag tggtggtagt 180
atattttacg cgacctgggc gaatggtcga ttcaccatct ccaaaacctc gaccacggtg 240
gatctgaaaa tcaccagtcc gacaaccgag gacacggcca cctatttctg tgccagaggt 300
tatagtagtg gtactatgat gtcttctaac ttgtggggcc aaggcaccct ggtcaccgtc 360
tcctcagggc aacctaaggc t 381
<210> 293
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 293
acagatgcca gatgcgagct cgtgctgacc cagacaccag cctccgtgtc tgaacctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtgagagca ttagtactta cttatcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcgtcccaag ctcctgatct acagggcatc cactctggaa 180
tctggggtcc catcgcggtt caaaggcagt ggatctggga cagagtacac tctcaccatt 240
agcggcgtgc agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aacagggtta tacttataaa 300
aatgttgata atgctttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaaggtga tccagttgca 360
c 361
<210> 294
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 294
acaggtgtcc actcggagca gtcgttggag gagtccgggg gtcgtctggt catgcctgga 60
ggatccctga cactcacctg cacagtctct ggaatcgacc tcagtagcaa tacaatgggc 120
tggttccgcc aggctccagg gaaggggctg gaatggatcg ggattatgcg tggtggtggt 180
agcacatact acgcgacctg ggcgaaaggc cgattcacca tctccaaaac ctcgaccacg 240
gtggatctga aactcaccag tccgacaacc gaggacacgg ccacctattt ctgtgccaga 300
gccttccctg gttataattc tttctttaac ttctggggcc aaggcaccct ggtcaccatc 360
tcttcagggc aacctaaggc t 381
<210> 295
<211> 352
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 295
acagatgcca gatgcaccca gacaccagcc tccgtgtctg aacctgtggg aggcacagtc 60
accatcaagt gccaggccag tcacaacatt aatagtgctt tggcctggta tcagcagaaa 120
ccagggcagc ctcccaagct cctgatctac aaggcatcca ctctggcatc tggggtccca 180
ccgcggttca aaggcagtgg atctgggaca gagttcactc tcaccatcag cgacctggag 240
tgtgccgatg ctgccactta ctactgtcaa aggcattatt tcgatggtgc cagtgctgat 300
atagctttcg gcggagggac cgaggtggaa atcaaaggtg atccagttgc ac 352
<210> 296
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n是a、c、g或t
<400> 296
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgnaggag tccgggggag gcctggtcca gcctgaggga 60
tccctgacac tcacctgcac agcctctgga ttctccttca gtggcggcta caacatgtgc 120
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg catgcattta tgctggtagt 180
agtggtagca cttactacgc gagctgggcg aaaggccgat tcaccatctc caaaacctcg 240
tcaaccacgg tgactctgca aatgaccagt ctgacagccg cggacacggc cacctatttc 300
tgtgcgagag gggcttatgc tggtggtagt taccccccct actttaactt gtggggccca 360
ggcaccctgg tcaccatctc ctcagggcaa cctaaggtt 399
<210> 297
<211> 364
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(26)
<223> n是a、c、g或t
<400> 297
acagatgcca gatgcgagcn cctnnngacc cagacaccag cctccgtgtc tgagcctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagagca ttagaagtta cttagcctgg 120
tatcagcaga aagcagggca gcctcccaag ctcctgatct acagggcatc cactctggca 180
tctggggtcc catcgcggtt caaaggcagt ggatctggga cagagtacac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact tactactgcc aaaatgttta ttatcttagt 300
agtagtacat atggtgcttt cggcggaggg accgaggtgg tggtcaaagg tgatccagtt 360
gcac 364
<210> 298
<211> 376
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 298
acaggtgtcc actcgcgagc agtcggtgaa ggagtccggg ggtcgcctgg tcacgcctgg 60
gacacccctg acactcacct gcacagtctc tggattctcc ctcagtaact atgcaatgag 120
ctgggtccgc caggctccag ggaaggggct ggaatggatc ggaatcattg ttactagtgg 180
tagcacatac tacgcgagct gggcaaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgaccac 240
ggtggatctg aaaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgccag 300
acatgcgtat agtattggtt cgagcttgtg gggccaaggc accctggtca ccatctcttc 360
agggcaacct aaggct 376
<210> 299
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 299
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccac cttctgcgtc tgaacctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtgagagca tcagtgttag attagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct acaaggcatc caatctgcca 180
tctggggtcc catcgcggtt caaaggcagt ggatctggga cagagttcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgacga tgctgccact tattactgtc gcaactatta tgatattagt 300
aataatggtg ctggttttgg cggagggacc gaggtggaaa tcaaaggtga tccagttgca 360
c 361
<210> 300
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 300
acaggtgtcc actcggagca gtcggtgaag gagtccgggg gaggcctctt caagccaacg 60
gataccctga cactcacctg cacagtctct ggaatcgacc tcagtagcta tgcaatgacc 120
tgggtccgcc aggctccagg ggaggggctg gagtggatcg gaaccattag tagtagtggt 180
agcacatact acgcgagctg ggcgaaaggc cgattcacca tctccaaaac ctcgtcgacc 240
acggtggatc tgaaaatgac cagtctgaca gccgcggaca cggccaccta tttctgtgcc 300
agaggatctg gtggtgctgt tacttattat ggcgtgtggg gccaaggcac cctggtcacc 360
gtctcttcag ggcaacctaa ggct 384
<210> 301
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 301
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccag cctccgtgtc tgaacctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagagca ttggtagtag cttagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct acagggcatc cactctggca 180
tctggggtcc catcgcggtt cagtggcagt ggatctggga cagagttcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgccca tgctgccact tactactgtc aaaactatat tagtagtagt 300
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c 361
<210> 302
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 302
acaggtgtcc actcgcagtc ggtggaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac agtctctgga atcgacctca gtagctatgc aatcaactgg 120
gtccgccagg ctccagggga ggggctggaa tggatcggaa tgattagtag tagtgataac 180
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caacctaagg ct 372
<210> 303
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 303
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccag cctccgtgtc tgcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcag ttgccagtcc agtgagagtg tttataagag caactattta 120
tcttggtatc agcaaaaagc agggcagcct cccaagctcc taatctatgc tgcagccact 180
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gttgca 366
<210> 304
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 304
acaggtgtcc actcggagca gtcggtggag gagtccgggg gtcgcctggt cacgcctggg 60
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gaacctgtat ggtacgcgga ctgggcaaaa ggccgattca ccatctccag aacctcgacc 240
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agaaggctgg atggttttgt tagggcttat ctggacttgt ggggccaggg caccctggtc 360
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<210> 305
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 305
acagatgcca gatgcaccca gacaccagcc tccgtggagg cagctgtggg aggcacagtc 60
accatcaaat gccaggccag tgagagtatt agtagttggt tggcctggta tcagcagaaa 120
ccagggcagc ctcccaagct cctgatctat gaagcattca gtctggcctc tggggtccca 180
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<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 306
acaggtgtcc actcggagca gtcggtggag gagtccgggg gtcgtctggt catgcctgga 60
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<210> 307
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 307
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccag cctccgtgtc tgaacctgtg 60
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gca 363
<210> 308
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 308
acaggtgtcc actcggcagc ggtgaaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac agtctctgga ttctccctca gtaactatgc aatggggtgg 120
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<210> 309
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 309
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccag cctccgtgtc tgaacctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagaaca ataataacta cttagcctgg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 310
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<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 311
acagatgcca gatgcgagct cgtgatgacc cagactccag cctccgtgtc tgcagctgtg 60
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<210> 312
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 312
acaggtgtcc actcggagca gtcggtggag gagtccgggg gtcgcctggt aacgcctggg 60
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tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gaatggatcg gaatcattgc tagtaatggt 180
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 313
acagatgcca gatgcgagct cgtgctgacc cagacaccag cctctgtgtc tgaacctgtg 60
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tatcaccaga aaccagggca gcctcccaag cgcctgatct acagggcatc cactctggca 180
tctggggtcc catcgcggtt cagaggcagt ggatctggga cacagttcac tctcaccatc 240
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actaatgctt tcggcggagg gaccgaggtg gtggtcaaag gtgatccagt 350
<210> 314
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 314
acaggtgtcc actcggagca gtcggtggag gagtccgggg gtcgcctggt cacgcctggg 60
acacccctga cactcacctg cacagtctct ggattctccc tcagtagtta tgcaatgaac 120
tgggtccgcc aggctccagg gaagggactg gaatggatcg gactcattta tgctagtggt 180
accactcact acgcgagctg ggtgaatggc cgattcacca tctccaaaac ctcgaccacg 240
gtgactctga aaatgaccag tctgacagcc gcggacacgg ccacctattt ctgtgccaga 300
gatagttata gtactggtaa cttgtggggc caaggcaccc tggtcaccat ctcttcaggg 360
caacctaagg ct 372
<210> 315
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 315
acagatgcca gatgcgagct cgtgctgacc cagacaccag cctccgtgtc tgaacctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagagca tttacagcag tttagtctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct atggtgcgtc caatctggaa 180
tctggggtcc catcgcggtt caaaggcagt ggatctggga cagagtacac tctcaccatc 240
agcggcgtgc agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aatgtagtgg ttataatagt 300
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<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 316
acaggtgtcc actcgagcag ttcggtggag gagtccgggg gaggcctggt caagcctggg 60
gcatccctga cactcacctg cacagcctct ggattctcct tcagtagcgg ctactggatg 120
tgctgggtcc gccaggctcc agggaaggaa ctggagtgga tcgcatgcat tggcgctcgt 180
gatagtggta gcgcttacta cgcgacctgg gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaatc 240
tcgtcgacca cggtgactct gcaaatgacc agtctgacag ccgcggacac ggccacctat 300
ttctgtgcga gatctggtgc tagtttccac tttaaattgt ggggcccagg caccctggtc 360
accatctctt cagggcaacc taaggct 387
<210> 317
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 317
acagatgcca gatgcgagct cgtgctgacc cagacaccag cctccgtgtc tgaacctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagaaca tcggtagcta cttagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct atggtgcgtc caatctggaa 180
tctggggtcc catcgcggtt caaaggcagt ggatctggga cagagtacac tctcaccatc 240
agcggcgtgc agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aatgtagtgg ttataatagt 300
cgtgttttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaaggtg atccagttgc a 351
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<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 318
acaggtgtcc actcgcagtc gctggaggag tccgggggag acctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac agtctctgga ttctccctca gtacctacaa cattcaatgg 120
gtccgccagg ctccagggaa gggtctggaa tgcatcggat tcattaatgg tggtggtagc 180
gcatactacg cgagctgggt gaatggtcga ttcaccgtct ccaaagcctc gaccacggtg 240
actctgaaaa tcaccgctcc gacaaccgag gacacggcca cctatttctg tgccagaggt 300
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accgtctctt cagggcaacc taaggct 387
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 319
acagatgcca gatgcgagct cgtgctgacc cagacacctt cgcccgtgtc tgcaggtgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccagtcc agtgagagca ttggcactgc attagcctgg 120
tatcagcaga aactagggca gcctcccaag ctcctgatct atgctgcagc ccttctggca 180
tctggggtct catcgcggtt caaaggcagc ggatctggga cagagtacac tctcaccatc 240
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agttatggga atgctttcgg cggagggacc gaggtggaaa tcaaaggtga tccagttgca 360
<210> 320
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 320
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggag acctggtcaa gcctgaggga 60
tccctgacac tcacctgcac agcctctgga ttctccttca gtggcggcta cgacatgtgc 120
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg catgcattta tgctggtagt 180
agtggtagca cttactacgc gagctgggcg aaaggccgat tcaccatctc caaaacctcg 240
tcgaccacgg tgactctgca aatgaccagt ctgacagccg cggacacggc cacctatttc 300
tgtgcgagag gggcttatgc tggtggtggt taccccccct actttaattt ctggggccca 360
ggcaccctgg tcaccatctc ttcagggcaa cctaaggct 399
<210> 321
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 321
acagatgcca gatgcgagct cgtgatgacc cagacaccag cctccgtgga ggcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa ttgccaggcc agtgagagca ttaacgatag attagcctgg 120
tatcagctga aaccagggca gcctcccaaa ctcctgatct acgaaacatc caaagtggaa 180
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agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aaagccatga ttatattagt 300
agtagtggta tgcctttcgg cggagggacc gagctggaaa tcaaaggtga tccagttgca 360
<210> 322
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 322
acaggtgtcc actcggagca gtcggtgaag gagtccgggg gtcgcctggt cacgcctggg 60
acacccctaa cactcacctg cacagtctct ggattctccc tcagtagcag tggaatgagc 120
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gtggatctga atctcaccag tccgacaacc gaagacacgg ccacctattt ctgtgcccat 300
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gggcaaccta aggct 375
<210> 323
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 323
acagatgcca gatgcgagct cgtgatgacc cagactgcat cgtccgtgtc tgcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcag ttgccagtcc agtcagaata tttataacaa ccgctggtcc 120
tggtatcagc agaaaccagg gcagcctccc aagctcctga tctaccaggc atccactctg 180
gcatctgggg tcccatcgcg gttcaaaggc agtggatctg ggacacagtt cactctcacc 240
atcagcggcg tgcagtgtga cgatgctgcc acttactact gtgcaggcgg ttatagtggt 300
acgattttta ctttcggcgg agggaccgag ctggaaatca aaggtgatcc agttgca 357
<210> 324
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 324
acaggtgtcc actcggcagc ggtgaaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac agtctctgga atcgacctca gtgactacta catgacctgg 120
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggaa tacatcggaa tcatttatgc tagtggcaac 180
gcatactttg cgagttgggc gaaaggccga ttcaccatct ccagaacctc gtcgaccacg 240
gtggatctga atgtcgccag tccgacaacc gaggacacgg ccacctattt ttgtgccagg 300
aatattggtg gtagtagtaa cttgtggggc caaggcaccc tggtcaccgt ctcttcaggg 360
caacctaagg ct 372
<210> 325
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 325
acagatgcca gatgcgagct cgatatgacc cagacaccag cctccgtgtc tgaacctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtgagagaa tttataataa tttagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaaa ctcctcttct attctgcatc cactctggca 180
tctggggtcc cttcgcgatt caaaggcagt ggatctggga cagagttcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tgcagccatt tactactgtc aatgtactgg ttatggtact 300
acctatgggc ttgttttcgg cggagggacc gaggtggaaa tcaaaggtga tccagttgca 360
<210> 326
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 326
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggag gcctgttcca gcctggggga 60
tccctggcac tcacctgcaa agcctctgga ttctccctca gtaaaaatta cgtgatgtgc 120
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg catgcattta tgctggtgat 180
ggtaacactt actacgtgag ctgggcgaaa ggccgattca ccatctccaa aacctcgtcg 240
accacggtga ctctgcaaat gaccagtctg acagccgcgg acacggccac ctatttctgt 300
gcgagatggg actatattgg taataataat ttgtggggcc caggcaccct ggtcaccatc 360
tcctcagggc aacctaaggc t 381
<210> 327
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 327
acagatgcca gatgcgagct cgtgctgacc cagacaccag cctccgtgga ggcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagacca ttagtagcta cttagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct acagggcatc cactctggca 180
tctggggtcc catcgcggtt caaaggcagt ggatctggga cacagttcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tggtgccact tactactgtc aatgtcctta ttatggtagt 300
agccatgtgg gtgctttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaaggtga tccagttgca 360
<210> 328
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 328
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac agtctctgga atcgacctca ttagctatcc aatgggctgg 120
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggaa tacatcggaa tcattgctac tggtggtagc 180
acatactacg cgagctgggc aaaaggccga ttcaccatct ccacaagctc gaccacggtg 240
gatctgaaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctacttctg tgccagaaga 300
tggagtagtg cttatgactt ctggggccaa ggcaccctgg tcaccatctc ttcagggcaa 360
cctaaggct 369
<210> 329
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 329
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccag cctctgtgga ggtagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagagca ttagtagcta cttagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct attatgcatc cactctggca 180
tctggggtcc catcgcggtt cagcggcagt ggatctggga cagagttcac tctcaccatc 240
agtggcgtgc agtgtgacga tgctgccact tactactgtc aacagggtgc tagaagtagt 300
aatgttgata atattttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaaggtga tccagttgca 360
<210> 330
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 330
acaggtgtcc actcgcagtc gttggaggag tccgggggtc gcctggtaac gcctggagga 60
tccctgacac tcacctgcac agtctctgga atcgacctca gtagttatac aatgggctgg 120
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggaa tggatcggag tcattgctat taatggtggc 180
acagtctacg cgagctgggc gaaaggccga ttcaccatct ccaaaacctc gaccacggtg 240
gatctgaaaa tgaccagtcc gacacccgag gacacggcca cctatttctg tgccagaggt 300
gctggtaaaa cttggtcctc ctttaacttg tggggccaag gcaccctggt caccatctcc 360
tcagggcaac ctaaggct 378
<210> 331
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 331
acagatgcca gatgcgagct cgtgctgacc cagacaccag cctccgtgtc tgaacctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagagca ttggtagtaa tttagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct acagggcatc cactctggaa 180
tctggggtcc catcgcggtt cagcggcagt ggatctggga cagagttcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aaagctatta tggtagtagt 300
actaatgctt tcggcggagg gaccgaggtg gtggtcaaag gtgatccagt tgca 354
<210> 332
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 332
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggtc gcctggtcaa gcctgacgaa 60
accctgacaa tcacctgcac agtgtctgga atcgacctca gtcgctacag catacagtgg 120
gtccgccagg ctccaggggg ggggctgcaa tggatcggtg tcatgagtat cggtagtagc 180
gcatactacg cgaactgggc gaaaggccga ttcaccatct ccaaaacctc gtcgaccacg 240
gtggatctga caatgaccag tctgacagcc gcggacacgg ccacctattt ctgtgccaga 300
agtaatctct accggggggc ttttgatccc tggggcccag gcaccctggt caccatctct 360
tcagggcaac ctaaggct 378
<210> 333
<211> 370
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 333
acagatgcca gatgcgagct cgtgatgacc cagacaccag cctccgtgga ggcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccagtcc agtgagagtg tttataagaa taactactta 120
tcctggtatc aacttaaacc agggcagcct cccaaactcc tcttctattc tgcttccact 180
ctggcatcta gggtcccatc gcggttcagc ggcagtggat ctgggacaca gttcactctc 240
accatcagcg acctggagtg tgacgatgct gccacttact actgtgcagg gtattatggt 300
agtagtagtg ttgatcgtta cactttcggc ggagggaccg aggtggaaat caaaggtgat 360
ccagttgcac 370
<210> 334
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 334
acaggtgtcc actcggagca gctgatggag tccgggggag gcctggtcca gcctggtgca 60
tccctgacac tcacctgcaa agcctctgga ttctccttca gtagcagcca ggacatgtgc 120
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggcct gagtggatcg gatgcattgg ttttggtagt 180
ggtaacacat ggtacgcgag ctgggtgaat ggccgattca ccatctccag aagcaccagc 240
ctaaacacgg tggagctgaa aatgaccggt ctgacagccg cggacacggc cacctatttc 300
tgtgcgagag atccatttac tgttgctggt gatggtgata atttgtgggg cccaggcacc 360
ctggtcaccg tctcctcagg gcaacctaag gct 393
<210> 335
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 335
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccag cctccgtgtc tgaacctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagacca ttaacaatgc attagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct attctgcatc cactctggca 180
tctggggtct catcgcggtt cagcggcagt ggatcaggga cacagttcac tctcaccatc 240
agtggcgtgg agtgtgacga tgctgccact tactactgtg caggctatag accttatatt 300
aatgatggta gtgctttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaaggtga tccagttgca 360
<210> 336
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 336
acaggtgtcc actcggagca gtcggtggag gagtccgggg gtcgcctggt cacgcctggg 60
acacccctga cactcacctg cacagtctct ggattctccc tcagtagtta tgcaatgagc 120
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg gagtcattga tgttactggt 180
aggacatact acgcgagctg ggcgaaaggc cgattcacca tctccaaaac ctcgaccacg 240
gtggatctga aaatcaccag tccgacaacc gaggacacgg ccacctattt ctgtggcaga 300
gatagctacc ttgactatgg tgaccccaat ggtcttgatc cctggggccc aggcaccctg 360
gtcaccatct cctcagggca acctaaggct 390
<210> 337
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 337
acagatgcca gatgcgagct cgtgatgacc cagacaccag cctccgtgga ggcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagagca ttggtagtaa tttagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct atactgcatc caatctggcg 180
cctggagtct catcgcggtt caaaggcagt agatctggga cagagtccac tctcatcatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aatgtactta ttatggtact 300
agttatatgg aattaggggc tttcggcgga gggaccgagg tggtggtcaa aggtgatcca 360
gttgcac 367
<210> 338
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 338
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac agtctctgga ttctccatca atgacttcca catgtgctgg 120
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggaa tacatcggaa tgattggtac tggtggtagc 180
gcatactacg cgacctggac aaaaggccga ttcaccatct ccagaacctc gaccacggtg 240
gatctaaaga tcaccagtcc gacaaccgag gacacggcca cctatttctg tgccagacgg 300
gattggagtg atggtggtta ttcgctatta tggggccaag gcaccctggt caccgtctct 360
tcagggcaac ctaaggct 378
<210> 339
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 339
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccag cctccgtgtc tgaacctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa gtgccaggcc agtcagagca ttcgcaccta cttaaattgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaaa ctcctgatct attctgcatc cactctggca 180
tctgggatcc catcgcggtt caaaggcagt ggatctggga cacagttcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact tattactgtc aacagggata ttattggagt 300
gatgttgaga atactttcgg cggagggacc gaggtggaaa tcaacggtga tccagttgca 360
<210> 340
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 340
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac cgtctctgga ttctccctca gtatcaatgc aataaactgg 120
gtccgccagg ctccagggaa ggggctagaa tggatcggga tcattactaa tattggtaac 180
acatactacg cgagctgggc aaaaggccga ttcaccatct ccagaacctc gaccacggtg 240
gatctgacaa tgaccagtct gacaaccgag gacacggcca cctatttctg tgccagaaac 300
tcttattttg atccctgggg cccaggcacc ctggtcacca tctcttcagg gcaacctaag 360
gct 363
<210> 341
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 341
acagatgcca gatgcgagct cgtgctgacc cagacaccat cccccgtgtc tgcagctgtg 60
ggaggcacag tcagcatcag ttgccaggcc agtcaaagtg ttgatagtaa taactactgt 120
tcctggtatc agcagaaacc agggcagcct cccaagctcc tgatccacaa ggcatccaaa 180
ctggcatctg gggtcccatc gcggttcaaa ggcagtggat ctgggacaca gttcactctc 240
accatcaacg acctggagtg tgacgatgct gccacttact actgtgcagg cggtttgggt 300
gataatattt atgctttcgg cggagggacc gaggtggaaa tcaacggtga tccagttgca 360
<210> 342
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 342
acaggtgtcc actcgcagtc ggtgaaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 60
cccctgacac tcacctgcac agtctctaca atcgacgtca gtaagtatgc agtgatctgg 120
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggaa tacatcggaa tcattagtag tagtggtagc 180
acatactacg cgagctgggc gaaaggccga ttcaccatct ccaaaacctc atcgaccacg 240
gtggatctga aaatgaccag tccgacagcc gaggacacgg ccacctattt ctgtgccaga 300
gggggtaatg gtgtcgcctt taaattatgg ggccaaggca ccctggtcac catctcctca 360
gggcaaccta aggct 375
<210> 343
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗体区段
<400> 343
acagatgcca gatgcgagct cgatctgacc cagacaccag cctccgtgga ggcagctgtg 60
ggaggcacag tcaccatcaa ttgccaggcc agtcagagca tttacagctc tttagcctgg 120
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaaa ctcctgatct acgaaacatc caaagtggaa 180
tctggggtcc catcgcggtt cagcggcagt ggatctggga cacagttcac tctcaccatc 240
agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact tactactgtc aaagccatga ttatattagt 300
agtagtggta tgcctttcgg cggagggacc gagctggaga tcctaggtga tccagttgca 360
<210> 344
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 344
ctgcttgttc tcctgagccc 20
<210> 345
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 345
tcaaagggtc agggttgagc 20
<210> 346
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 346
gccctttggt gactttatgg a 21
<210> 347
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 347
gcagcaggtt gtcttggatg 20
<210> 348
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 348
gagaactgtt atggggctat 20
<210> 349
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 349
ttcaactgga gaggcaaagg 20
<210> 350
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 350
cgcataacca gtgaaacagc attgc 25
<210> 351
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 351
ccctgtgctc agacagaaat gaga 24
<210> 352
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 352
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Asn Ala Tyr Phe Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Thr Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Ile Gly Gly Ser Ser Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 353
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 353
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Asn Ala Tyr Phe Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Thr Asn Thr Val Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Ile Gly Gly Ser Ser Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 354
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 354
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Arg Ile Tyr Asn Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Phe
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Gly Tyr Gly Thr Thr
85 90 95
Tyr Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 355
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 355
Glu Leu Gln Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Arg Ile Tyr Asn Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Phe
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Gly Tyr Gly Thr Thr
85 90 95
Tyr Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 356
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 356
caagtgcagc tggtggagag cggcggaggc gtagtgcaac ccggcagaag cctgagactg 60
agctgcgccg ctagcggcat cgacctgagc gactactaca tgacctgggt gagacaagcc 120
cccggcaagg gcctggagta catcggcatc atctacgcta gcggcaacgc ctacttcgct 180
agctgggcca agggcagatt caccatcagc agagacagca gcaccaacac cctgttcctg 240
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgcgctag aaacatcggc 300
ggcagcagca acctgtgggg ccaaggcacc ctggtgaccg tgagcagc 348
<210> 357
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 357
caagtgcagc tggtggagag cggcggaggc gtagtgcaac ccggcagaag cctgagactg 60
agctgcgccg ctagcggcat cgacctgagc gactactaca tgacctgggt gagacaagcc 120
cccggcaagg gcctggagta catcggcatc atctacgcta gcggcaacgc ctacttcgct 180
agctgggcca agggcagatt caccatcagc agagacaaca gcaccaacac cgtgttcctg 240
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgcgctag aaacatcggc 300
ggcagcagca acctgtgggg ccaaggcacc ctggtgaccg tgagcagc 348
<210> 358
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 358
gccattcagc tgacacagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgcc aagctagcga gagaatctac aacaacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gttctacagc gctagcaccc tggctagcgg cgtgcctagc 180
agattcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgtcagtgc accggctacg gcaccaccta cggcctggtg 300
ttcggcggcg gcaccaaggt ggagatcaag 330
<210> 359
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 359
gagctgcagc tgacacagac ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcaagtgcc aagctagcga gagaatctac aacaacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gttctacagc gctagcaccc tggctagcgg cgtgcctagc 180
agattcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgtcagtgc accggctacg gcaccaccta cggcctggtg 300
ttcggcggcg gcaccaaggt ggagatcaag 330
<210> 360
<211> 754
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成启动子
<400> 360
ataacaaatc tgtatattgg accctctgct tagcagtgag aaagcaggtt tgaagacaat 60
aaagccaggc ctgtatgtgg agattggcac catgaccctg gattatgttt tatgggatat 120
gcctccaagg gcaactctgc atttatccca tggcctctgg cttccaaatt ttctaggcac 180
ttccctctgg ggtaaaggaa tcaaaattgg cttatttccc ttgcaaacca tccttggcga 240
ctaagtactg ccttgtcttc tactgagaga tggccatatt tttggcacct gcctttcctt 300
gtgggaggtg tttcctctgt ttacatagca aaggggctgt aggagagaca gacggagctg 360
gacttacagc agaaccaagt catgatagcc tgtttctatt ttgttttcag catttttccg 420
ccagttctgg ccacctcctt tcctctggaa catgctgatt tcagcaagtc cagctctgtc 480
agctctgccc ccccagtcta ttggtttctg atcatctgat aatgctttgc ctgcactcag 540
gacctgtctt tgtccctcct cttaacatac ttgcagctaa aactaaatat tgctgcttgg 600
ggacctcctt ctagccttaa atttcagctc atcaccttca cctgccttgg tcatggctct 660
gctattctcc ttgatccttg gtgagtatct ctgcacctgt tggtttaggc ttcagagttt 720
tctggcactt tgattaggag aactttctcc ccgc 754
<210> 361
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成启动子
<400> 361
gtcagctctg ccccc 15

Claims (62)

1.单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段的特征在于来自表1和2的克隆配对的重链和轻链CDR序列。
2.权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由根据来自表4的克隆配对序列的轻链和重链可变序列编码。
3.权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由与来自表4的克隆配对序列具有至少70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。
4.权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由与来自表4的克隆配对序列具有至少95％同一性的轻链和重链可变序列编码。
5.权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含根据来自表3的克隆配对序列的轻链和重链可变序列。
6.权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与来自表3的克隆配对可变序列具有至少70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列。
7.权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与来自表3的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变序列。
8.权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含：
重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:81的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:82的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:84的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:4的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:5的VLCDR3氨基酸序列；
重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:87的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:88的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:89的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:1的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列；
重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:160的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:161的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:162的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:67的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:10的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:68的VLCDR3氨基酸序列；或者
重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:178的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:179的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:180的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:77的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:10的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:78的VLCDR3氨基酸序列。
9.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由与SEQ IDNO:266具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:267具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列编码。
10.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由与SEQ IDNO:266具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:267具有至少95％同一性的轻链可变序列编码。
11.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由根据SEQ IDNO:266的重链可变序列和根据SEQ ID NO:267的轻链可变序列编码。
12.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:185具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:186具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。
13.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:185具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:186具有至少95％同一性的轻链可变序列。
14.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含具有根据SEQ ID NO:185的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:186的序列的轻链可变序列。
15.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由与SEQ IDNO:268具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:269具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列编码。
16.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由与SEQ IDNO:268具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:269具有至少95％同一性的轻链可变序列编码。
17.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由根据SEQ IDNO:268的重链可变序列和根据SEQ ID NO:269的轻链可变序列编码。
18.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:188具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:189具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。
19.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:188具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:189具有至少95％同一性的轻链可变序列。
20.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含具有根据SEQ ID NO:188的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:189的序列的轻链可变序列。
21.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由与SEQ IDNO:324具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:325具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列编码。
22.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由与SEQ IDNO:324具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:325具有至少95％同一性的轻链可变序列编码。
23.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由根据SEQ IDNO:324的重链可变序列和根据SEQ ID NO:325的轻链可变序列编码。
24.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:244具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:245具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。
25.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:244具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:245具有至少95％同一性的轻链可变序列。
26.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含具有根据SEQ ID NO:244的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:245的序列的轻链可变序列。
27.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由与SEQ IDNO:338具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:339具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列编码。
28.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由与SEQ IDNO:338具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:339具有至少95％同一性的轻链可变序列编码。
29.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由根据SEQ IDNO:338的重链可变序列和根据SEQ ID NO:339的轻链可变序列编码。
30.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:258具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:259具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。
31.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:258具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:259具有至少95％同一性的轻链可变序列。
32.权利要求8所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含具有根据SEQ ID NO:258的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:259的序列的轻链可变序列。
33.权利要求8至32中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是人源化抗体，例如其中所述抗体或抗体片段包含具有根据SEQ ID NO:352的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:354的序列的轻链可变序列；具有根据SEQ ID NO:352的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:355的序列的轻链可变序列；具有根据SEQ IDNO:353的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:354的序列的轻链可变序列；或者具有根据SEQ ID NO:353的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:355的序列的轻链可变序列。
34.权利要求8至33中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体片段是单价scFv(单链可变片段)抗体、二价scFv、Fab片段、F(ab’)2片段、F(ab’)3片段、Fv片段或单链抗体。
35.权利要求8至33中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体是嵌合抗体或双特异性抗体。
36.权利要求8至35中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体是IgG抗体或重组IgG抗体或抗体片段。
37.权利要求8至36中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体与成像剂或细胞毒性剂缀合或融合。
38.单克隆抗体或其抗原结合片段，其与根据权利要求8至36中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合相同的表位。
39.权利要求38所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是人源化抗体。
40.权利要求38或39所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体片段是单价scFv(单链可变片段)抗体、二价scFv、Fab片段、F(ab’)2片段、F(ab’)3片段、Fv片段或单链抗体。
41.权利要求38至40中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体是嵌合抗体或双特异性抗体。
42.权利要求38至41中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体是IgG抗体或重组IgG抗体或抗体片段。
43.权利要求38至42中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体与成像剂或细胞毒性剂缀合或融合。
44.组合物，其包含治疗有效量的权利要求8至43中任一项所述的抗体或抗体片段，以及可药用稀释剂或载剂。
45.权利要求44所述的组合物，其用作用于在患者中治疗癌症的药物。
46.杂交瘤或工程化细胞，其编码权利要求8至36或38至43中任一项所述的抗体或抗体片段。
47.治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括施用有效量的抗CD5L抗体或抗体片段。
48.权利要求47所述的方法，其中所述抗CD5L抗体或抗体片段是权利要求8至43中任一项所述的抗体或抗体片段。
49.权利要求47或48所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、肝细胞癌、甲状腺癌、子宫癌、食管癌、鳞状细胞癌、白血病、骨肉瘤、黑素瘤、胶质母细胞瘤或神经母细胞瘤。
50.权利要求47或48所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
51.权利要求47至50中任一项所述的方法，其中另外向所述患者施用第二抗癌治疗。
52.权利要求51所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是抗血管生成治疗。
53.权利要求52所述的方法，其中所述抗血管生成治疗是抗VEGF治疗。
54.权利要求52或53所述的方法，其中所述抗CD5L抗体或抗体片段导致所述抗血管生成治疗的效力提高。
55.权利要求51所述的方法，其中所述第二抗癌治疗包括化学治疗、免疫治疗、手术、放射治疗或生物治疗。
56.权利要求46至54中任一项所述的方法，其中所述抗CD5L抗体或抗体片段静脉内施用。
57.权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述患者的癌症已被确定为过表达CD5L。
58.权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述患者的血清或血浆已被确定为具有升高的CD5L水平。
59.权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述患者的癌症在抗血管生成治疗之后复发。
60.权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述患者的癌症已被确定为对抗VEGF治疗具有抗性。
61.用于检测CD5L的方法，其包括：
(a)将样品与权利要求8至43中任一项所述的抗CD5L抗体或抗体片段一起孵育；以及
(b)测量所述抗CD5L抗体或抗体片段与所述样品的结合。
62.权利要求61所述的方法，其中所述样品是血液、血清、血浆、唾液、活检物、尿液或脑脊液。
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