TW202126696A - 抗epha10抗體及其使用方法 - Google Patents

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明奇 洪
車鍾豪
詹立全
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美國德州系統大學評議委員會
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Abstract

本文提供靶向EphA10之藥劑，諸如抗體、抗體藥物結合物或嵌合抗原受體。本文提供治療癌症之方法，該等方法包括向有需要之病患投與有效量之EphA10靶向藥劑。如果該癌症表現出經增加之EphA10含量，則可選擇該病患進行治療。

Description

抗EPHA10抗體及其使用方法
本發明大體上係關於醫學、免疫學及癌症生物學之領域。更特定言之，本發明涉及靶向EphA10之抗體及其使用方法。
EphA10係肝配蛋白受體(受體酪胺酸激酶(RTK)之最大子家族)之成員，及在發育、血管生成及細胞分化中具有重要作用。儘管先前研究已揭示肝配蛋白受體之功能，但很大程度上仍未定義EphA10之功能。最近，發現敲除腫瘤細胞中之EphA10顯著減少腫瘤生長及增加免疫活性BALB/c小鼠之存活，但在重症聯合免疫缺陷(SCID)小鼠中對腫瘤生長無影響(參見Yang等人，2018之圖3A及B)。此等發現意味著EphA10敲除之抗腫瘤效應可與免疫相關(Yang等人，2018)。事實上，相較於對照，腫瘤中EphA10敲除降低PD-LI (重要之免疫檢查點蛋白)之含量，及始終增強CD8+ CTL群體、GB釋放量，及凋亡標誌物(裂解之凋亡蛋白酶3 (CCA3))之含量(參見Yang等人，2018之圖3C)。此等資料表明EphA10上調PD-LI表現及阻斷EphA10可活化CD8+ CTL以誘導抗腫瘤活性。然而，出於治療目的，需用於阻斷EphA10之方式。
在一項實施例中，本文提供單株抗體或抗體片段，其中該等抗體或抗體片段包含： 包含來自純系4抗體之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含來自純系4抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)； 包含來自純系8抗體之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含來自純系8抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；或 包含來自純系9抗體之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含來自純系9抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。
在一項實施例中，本文提供單株抗體或抗體片段，其中該等抗體或抗體片段包含： 包含來源於SEQ ID NO: 19之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含來源於SEQ ID NO: 20之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)； 包含來源於SEQ ID NO: 21之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含來源於SEQ ID NO: 22之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；或 包含來源於SEQ ID NO: 23之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含來源於SEQ ID NO: 24之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。
在一項實施例中，本文提供單株抗體或抗體片段，其中該等抗體或抗體片段包含： 包含SEQ ID NO: 10之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 11之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 12之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 1之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 3之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)； 包含SEQ ID NO: 13之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 14之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 15之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 4之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 5之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 6之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；或 包含SEQ ID NO: 16之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 17之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 18之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 7之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 8之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 9之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。
在一些態樣中，該等抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 19具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 20具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該等抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 21具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 22具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該等抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 23具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 24具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。
在一些態樣中，該等抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 19具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 20具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該等抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 21具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 22具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該等抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 23具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 24具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。
在一些態樣中，該等抗體或抗體片段包含具有根據SEQ ID NO: 19之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 20之序列之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該等抗體或抗體片段包含具有根據SEQ ID NO: 21之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 22之序列之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該等抗體或抗體片段包含具有根據SEQ ID NO: 23之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 24之序列之輕鏈可變序列。
在一些態樣中，該等抗體可結合至EphA10。在一些態樣中，該等抗體或抗體片段係人類化抗體。在一些態樣中，該等抗體片段係單價scFv (單鏈片段可變)抗體、二價scFv、Fab片段、F(ab’)2 片段、F(ab’)3 片段、Fv片段或單鏈抗體。在一些態樣中，該等抗體係嵌合抗體、雙特異性抗體或BiTE。在一些態樣中，該等抗體係IgG抗體或重組IgG抗體或抗體片段。
在一些態樣中，該等抗體係結合或融合至顯像劑或細胞毒性劑。在一些態樣中，該等抗體係經標記。在一些態樣中，該標記係螢光標記、酶標記或放射性標記。
在一項實施例中，本文提供單株抗體或抗體片段，其等與根據本發明實施例中之任何一者之單株抗體或抗體片段競爭結合至相同抗原決定基。
在一項實施例中，本文提供結合至由本發明實施例中之任何一者之抗體識別之EphA10上之抗原決定基之單株抗體或抗體片段。
在一項實施例中，本文提供編碼本發明實施例中之任何一者之抗體分子之抗體重鏈及/或輕鏈可變區之經分離之核酸。在一些態樣中，該等經分離之核酸包含與SEQ ID NO: 19、21或23具有至少85%同一性之核苷酸序列。在一些態樣中，該等經分離之核酸包含與SEQ ID NO: 20、22或23具有至少85%同一性之核苷酸序列。
在一項實施例中，本文提供包含本發明實施例中之任何一者之核酸之表現載體。
在一項實施例中，本文提供包含編碼本發明實施例中之任何一者之抗體或抗體片段之核酸之雜交瘤或經改造細胞。
在一項實施例中，本文提供包含本發明實施例中之任何一者之核酸之雜交瘤或經改造細胞。
在一項實施例中，本文提供製造本發明實施例中之任何一者之單株抗體或抗體片段之方法，該方法包括在容許該抗體之表現之條件下培養本發明實施例中之一者之雜交瘤或經改造細胞及視需要自培養物分離該抗體。
在一項實施例中，本文提供包含本發明實施例中之任何一者之一或多種抗體或抗體片段之醫藥調配物。
在一項實施例中，本文提供治療患有癌症之病患之方法，該方法包括向有需要之受試者投與有效量之本發明實施例中之任何一者之抗體或抗體片段。在一些態樣中，相對於對照病患，已確定該癌症表現高含量之EphA10。在一些態樣中，該等方法係用於增強細胞毒性T細胞介導之抗腫瘤免疫之方法。在一些態樣中，該等方法係用於增加對免疫療法之敏感性之方法。在一些態樣中，該癌症係肺癌、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌、乳癌或卵巢癌。在一些態樣中，該病患為女性。在一些態樣中，該等方法進一步包括投與至少第二抗癌療法。在一些態樣中，該第二抗癌療法係化學療法、免疫療法、放射療法、基因療法、手術、激素療法、抗血管生成療法或細胞介素療法。
在一項實施例中，本文提供包含結合至人類EphA10之抗原結合域之嵌合抗原受體(CAR)蛋白。在一些態樣中，該抗原結合域係人類化抗原結合域。在一些態樣中，該抗原結合域包含： 包含SEQ ID NO: 10之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 11之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 12之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 1之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 3之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)； 包含SEQ ID NO: 13之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 14之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 15之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 4之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 5之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 6之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；或 包含SEQ ID NO: 16之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 17之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 18之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 7之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 8之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 9之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。
在一些態樣中，該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 19具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 20具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 21具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 22具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 23具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 24具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。
在一些態樣中，該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 19具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 20具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 21具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 22具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 23具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 24具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。
在一些態樣中，該抗原結合域包含具有根據SEQ ID NO: 19之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 20之序列之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該抗原結合域包含具有根據SEQ ID NO: 21之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 22之序列之輕鏈可變序列。在一些態樣中，該抗原結合域包含具有根據SEQ ID NO: 23之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 24之序列之輕鏈可變序列。
在一些態樣中，該等CAR進一步包含鉸鏈域、跨膜域及細胞內傳訊域。在一些態樣中，鉸鏈域係CD8a鉸鏈域或IgG4鉸鏈域。在一些態樣中，該跨膜域係CD8a跨膜域或CD28跨膜域。在一些態樣中，該細胞內傳訊域包含CD3z細胞內傳訊域。
在一項實施例中，本文提供編碼本發明實施例中之任何一者之CAR之核酸分子。在一些態樣中，編碼該CAR之序列係可操作地連接至表現控制序列。在一些態樣中，該等核酸係表現載體。
在一項實施例中，本文提供包含編碼包含結合至人類EphA10之抗原結合域之嵌合抗原受體(CAR)之核酸分子之經改造細胞。在一些態樣中，該核酸分子編碼本發明實施例中之任何一者之CAR。在一些態樣中，該細胞係T細胞。在一些態樣中，該細胞係NK細胞。在一些態樣中，該核酸係整合至該細胞之基因體內。在一些態樣中，該細胞係人類細胞。
在一項實施例中，本文提供包含根據本發明實施例中之任何一者之細胞之群體於醫藥上可接受之載劑中之醫藥組合物。
在一項實施例中，本文提供治療有需要之人類病患之癌症之方法，包括向該病患投與抗腫瘤有效量之細胞療法，該細胞療法包含根據本發明實施例中之任何一者之一或多種細胞。在一些態樣中，該等細胞係同種異體細胞。在一些態樣中，該等細胞係自體細胞。在一些態樣中，該等細胞係與受試者匹配之HLA。在一些態樣中，該癌症係肺癌、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌、乳癌或卵巢癌。在一些態樣中，該病患為女性。在一些態樣中，該等方法進一步包括投與至少第二抗癌療法。在一些態樣中，該第二抗癌療法係化學療法、免疫療法、放射療法、基因療法、手術、激素療法、抗血管生成療法或細胞介素療法。
在一項實施例中，將病患診斷為患有表現EphA10之癌症之方法，該方法包括使自該病患獲得之癌症組織與本發明實施例中之任何一者之抗體或抗體片段接觸及偵測該抗體或抗體片段對該組織之結合，其中若該抗體或抗體片段結合至該組織，則將該病患診斷為患有表現EphA10之癌症。在一些態樣中，該等方法進一步包括向診斷為患有表現EphA10之癌症之病患投與有效量之本發明實施例中之任何一者之抗體或抗體片段或包含根據本發明實施例中之任何一者之一或多種細胞之細胞療法。在一些態樣中，偵測包括進行ELISA、免疫印漬術、免疫組織化學、多光譜螢光細胞成像、質譜流式細胞術(CyTOF)或成像質譜分析術。
在一項實施例中，本文提供偵測病患之癌症之進展之方法，該方法包括使自該病患獲得之癌症組織與本發明實施例中之任何一者之抗體或抗體片段接觸及偵測該抗體或抗體片段對該組織之結合，其中若該抗體或抗體片段結合至該組織，則認為該癌症係進行性癌症。
在一項實施例中，本文提供選擇患有癌症之病患以使用抗EphA10抗體治療之方法，該方法包括(a)確定該癌症是否表現EphA10，及(b)若該癌症表現EphA10，則選擇該病患用於治療。在一些態樣中，步驟(a)包括(i)自該病患獲得或已獲得生物樣本；及(ii)對該生物樣本進行或已進行分析以確定EphA10是否表現於該癌症中。在一些態樣中，該等方法進一步包括向所選病患投與有效量之本發明實施例中之任何一者之抗體或抗體片段或包含根據本發明實施例中之任何一者之一或多種細胞之細胞療法。在一些態樣中，EphA10是否表現於癌症中係藉由偵測該樣本中之EphA10蛋白確定。在一些態樣中，該蛋白質係藉由質譜術、流式細胞術、西方墨點法、免疫組織化學、ELISA或RIA偵測。在一些態樣中，該蛋白質係藉由使癌症之樣本與本發明實施例中之任何一者之抗體接觸偵測。
在一項實施例中，本文提供用於偵測EphA10於細胞之表面上、組織中、器官中或生物樣本中之存在之方法，該方法包括(a)在容許發生抗體分子及EphA10之相互作用之條件下使該細胞、組織、器官或生物樣本與本發明實施例中之任何一者之抗體接觸；及(b)偵測該細胞、組織、器官或樣本中該抗體分子與EphA10間之複合物之形成。在一些態樣中，該接觸及偵測係活體外的。在一些態樣中，該接觸係活體內的及該偵測係活體外的。在一些態樣中，該顯像劑係螢光團或發色團。在一些態樣中，該接觸及偵測係活體內的。在一些態樣中，該顯像劑係放射性核種。在一些態樣中，該偵測係藉由PET、SPECT或超極化MRI。在一些態樣中，該方法係偵測轉移之方法。在一些態樣中，該樣本係組織生檢、細針抽吸物、血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、糞便、唾液或身體分泌物。在一些態樣中，該樣本包含循環性腫瘤細胞。
在一項實施例中，本文提供抗體分子、醫藥組合物或經改造細胞用於治療受試者之癌症。
在一項實施例中，本文提供抗體分子、醫藥組合物或經改造細胞在製造用於治療受試者之癌症之藥物中之用途。
如本文使用，就規定組分而言，本文使用「大體上不含」以意謂無規定組分已有目的地調配成組合物及/或僅作為污染物或以痕量存在。因此，來自於組合物之任何意外污染物之規定組分之總量係遠低於0.05%，較佳低於0.01%。最佳係其中規定組分之量無法以標準分析方法偵測之組合物。
如本文在說明書中使用，「一」或「一個」可意謂一或多個。如本文在申請專利範圍中使用，當結合詞語「包含」使用時，詞語「一」或「一個」可意謂一個或超過一個。
儘管本發明支持僅提及替代方案及「及/或」之定義，但除非明確指示僅提及替代方案或替代方案互相排斥，否則申請專利範圍中使用術語「或」以意謂「及/或」。如本文使用之「另一」可意謂至少第二或更多。
在整個本申請案中，術語「約」係用於指示值包括裝置之誤差之固有變差、用於測定該值之方法、研究對象間存在之變化或於規定值之10%內之值。
本發明之其他目標、特徵及優點將自以下實施方式變得顯而易見。然而，應瞭解儘管指示本發明之較佳實施例，但實施方式及特定實例僅以實例說明之，因為於本發明之精神及範圍內之各種變化及修飾對熟習此項技術者而言將自本實施方式變得顯而易見。
相關申請案之參照
本申請案主張2019年9月20日申請之美國臨時申請案第62/903,194號之優先權，該案之全部內容係以引用之方式併入本文中。 序列表之參照
本申請案含有序列表，其已經由EFS-Web以ASCII格式遞交並以全文引用之方式併入本文中。2020年8月3日建立之該ASCII副本名為UTFCP1470TW_ST25.txt及大小為10.4千字節。
先前研究已顯示在除睪丸、腸及腦外之大多數組織中，EphA10 mRNA不存在或可偵測到極低含量之EphA10 mRNA且該EphA10蛋白係僅在睪丸但非其他正常組織中偵測到(Nagano等人，2014)。當使用TCGA RNA定序資料庫在正常組織與腫瘤組織間比較EphA10 mRNA含量時，發現相較於正常組織，EphA10 mRNA含量係在乳房、肺、前列腺、胃及甲狀腺腫瘤中顯著增加。特定言之，已知EphA10蛋白係表現於乳腫瘤之四個子類型之60%中(Nagano等人，2014)。此外，該等EphA10蛋白含量係與惡性腫瘤正相關(Li等人，2017)。
因此，因為EphA10係高度表現於腫瘤組織而非正常組織中，及因為EphA10阻斷促進抗腫瘤T細胞免疫，所以預期靶向EphA10之治療抗體在各種癌症類型中，尤其在雌性癌症(諸如乳癌及卵巢癌)中具有全身性且持久之抗腫瘤效應而無副作用。特定言之，該等抗體靶向在腫瘤組織中阻斷T細胞之滲透及活性之EphA10傳訊，藉此改善抗腫瘤免疫。換而言之，EphA10阻斷可藉由阻斷PD-L1/PD-1抑制傳訊增強CTL活性但亦增加CTL滲透至腫瘤組織內。
未進一步瞭解EphA10之作用，產生抗人類EphA10 (hu-EphA10)抗體並獲得在針對癌症免疫療法之治療應用中具有高潛力之三個純系。純系4、8及9證實活體內特異性及穩定性，其等係治療抗體之關鍵特徵。另外，腫瘤之此特異性靶向可應用至嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法及CAR-NK細胞療法，因為其防止脫靶效應。在已建立之三個抗體純系中，純系9已滿足抗體藥物結合物(ADC)之所有要求，因為其具有特異性且經內化。由於EphA10在各種癌症類型中高表現但在正常組織中不高，所以預期抗EphA10 (純系9)-ADC在具有高EphA10表現之癌症中具有高治療效用及低副作用。 I. 定義
如本文使用之「核酸」、「核酸序列」、「寡核苷酸」、「多核苷酸」或其他語法等同物意謂共價連接在一起之至少兩個核苷酸，脫氧核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物。多核苷酸係任何長度包括(例如20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等)之聚合物。本文描述之多核苷酸一般含有磷酸二酯鍵，儘管在一些情況下，包括核酸類似物，其等可具有至少一個不同之鍵聯，例如，胺基磷酸酯、硫磷酸酯、二硫磷酸酯或O-甲基亞磷醯胺鍵聯，及肽核酸主鏈及鍵聯。可製備天然生成之多核苷酸及類似物之混合物；或者，可製備不同之多核苷酸類似物之混合物，及天然生成之多核苷酸及類似物之混合物。下列為多核苷酸之非限制性實例：基因或基因片段、外顯子、內含子、傳訊RNA (mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核糖核酸酵素、cDNA、cRNA、重組多核苷酸、分支鏈多核苷酸、質體、載體、任何序列之經分 離之DNA、任何序列之經分離之RNA、核酸探針及引子。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。若存在，則對核苷酸結構之修飾可在組裝聚合物之前或之後給予。核苷酸之序列可由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可在聚合後經進一步修飾，諸如藉由與標記組分結合。該術語亦包括雙-及單股分子。除非本文另有規定或要求，否則該術語多核苷酸包含雙股形式及已知或預測構成該雙股形式之兩種互補單股形式中之各者。多核苷酸包含四種核苷酸鹼基之特定序列：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，及當該多核苷酸為RNA時，胸腺嘧啶為尿嘧啶(U)。因此，術語「多核苷酸序列」係多核苷酸分子之字母表示。除非本文另有指示，否則特定之多核苷酸序列亦意味著包含其經保守修飾之變體(例如，簡併密碼子取代)及互補序列及明確指示之序列。具體言之，簡併密碼子取代可由產生其中一或多個所選(或所有)密碼子之第三位置係以混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代之序列達成。
本文使用之術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」係指胺基酸殘基之聚合物。此等術語亦適用於其中一或多個胺基酸殘基係對應之天然生成之胺基酸之人造化學模擬物之胺基酸聚合物，及適用於天然生成之胺基酸聚合物、彼等含有經修飾之殘基者及非天然生成之胺基酸聚合物。在目前情況下，術語「多肽」包含抗體或其片段。
在如本文使用之重組核酸技術、微生物學、免疫學、抗體改造及分子及細胞生物學之領域中使用之其他術語將由適用領域中之一般技術者通常瞭解。 II.  抗體及抗體之修飾
本文提供具有來自如表1及表2中分別闡述之重鏈及輕鏈之純系配對之CDR之單株抗體。此等抗體可使用本文描述之方法產生。
本發明之單株抗體具有數種應用，包括產生用於偵測EphA10及用於治療與EphA10之增加之含量相關聯之疾病之診斷套組。在此等內文中，吾人可將此等抗體連接至診斷或治療劑，在競爭性分析中使用其等作為捕獲劑或競爭者，或單獨使用其等而無結合至其等之另外藥劑。如下文進一步討論，該等抗體可經突變或修飾。此項技術中熟知用於製備及表徵抗體之方法(參見，例如，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；美國專利4,196,265)。
「抗體」係免疫球蛋白分子，其可通過位於該免疫球蛋白分子之可變區中之至少一個抗原識別位點特異性結合至標靶(諸如醣、多核苷酸、脂質、多肽等)。如本文使用，該術語不僅包含完整之多株或單株抗體，但亦包含其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、Fd、Fd'、單鏈抗體(ScFv)、雙功能抗體、線性抗體)、其突變體、天然生成之變體、包含具有所需特異性之抗原識別位點之抗體部分之融合蛋白、人類化抗體、嵌合抗體及包含所需特異性之抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他經修飾之構型。
「經分離之抗體」係已自其天然環境之組分分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染物組分係干擾該抗體之診斷或治療用途之材料，及可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在特定實例中，該抗體係經純化至：(1)如藉由勞立法測定，大於抗體之95重量%，及最特定言之超過99重量%；或(2)藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或銀染純化至均質。經分離之抗體包括於重組細胞內之原位抗體，因為該抗體之天然環境之至少一種組分將係不存在的。然而，通常，經分離之抗體將藉由至少一個純化步驟製備。
基本四鏈抗體單元係包含兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈之異四聚體醣蛋白。如本文使用之術語「重鏈」係指較大免疫球蛋白次單元，其通過其胺基端區與免疫球蛋白輕鏈結合。該重鏈包含可變區(VH )及恆定區(CH )。該恆定區進一步包含CH 1、鉸鏈、CH 2及CH 3域。在IgE、IgM及IgY之情況下，該重鏈包含CH 4域但不具有鉸鏈域。熟習此項技術者將知曉重鏈分類為伽瑪、繆、阿爾法、德爾塔或伊蒲賽龍 (γ、μ、α、δ、ε)，及其中一些子類別(例如，γ1至γ4、α1至α2)。此鏈之性質將該抗體之「類別」分別確定為IgG、IgM、IgA IgD或IgE。該等免疫球蛋白子類別(同型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等係經充分表徵及已知賦予功能專化。
如本文使用之術語「輕鏈」係指較小免疫球蛋白次單元，其與重鏈之胺基端區結合。與重鏈相同，輕鏈包含可變區(VL )及恆定區(CL )。輕鏈基於其等恆定域(CL )之胺基酸序列係分類為卡帕或拉姆達 (κ、λ)。一對此等可與一對各種重鏈中之任何一者結合以形成免疫球蛋白分子。輕鏈之含義中亦包含λ可變區(V-λ)連接至κ恆定區(C-κ)或κ可變區(V-κ)連接至λ恆定區(C-λ)之輕鏈。
例如，IgM抗體由5個基本異四聚體單元及稱為J鏈之另外多肽構成，及因此含有10個抗原結合位點，而分泌之IgA抗體可聚合以形成包含基本4鏈單元及J鏈中之2至5者之多價集群。在IgG之情況下，該4鏈單元係一般約150,000道爾頓。各L鏈係由一個共價雙硫鍵連接至H鏈，而該等兩個H鏈係由一或多個雙硫鍵彼此連接，取決於該H鏈同型。各H及L鏈亦具有規則間隔之鏈內雙硫鍵。各H鏈於N端具有可變區(VH )，接著就α及γ鏈中之各者而言三個恆定域(CH )及就μ及同型而言四個CH 域。各L鏈於N端具有可變區(VL )，接著於其另一端具有恆定域(CL )。該VL 係與該VH 對齊及該CL 係與重鏈之第一恆定域(CH 1)對齊。據信特定之胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變區之間形成界面。VH 及VL 配對在一起形成單一抗原結合位點。就不同類別之抗體之結構及性質而言，參見，例如，Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P. Stites、Abba I. Terr及Tristram G. Parslow (編)，Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994，第71頁，及第6章。
抗體之「可變區」係指單獨或組合之抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。術語「可變」係指可變區之某些片段之序列在抗體中廣泛不同之事實。輕(VL )及重(VH )鏈部分之可變區介導抗原結合及界定特定抗體針對其特定抗原之特異性。然而，可變性在整個可變區上不均勻分佈。相反，該等可變區由稱為框架區(FR)之相對不變延伸經稱為互補決定區(CDR)或高變區之極端可變性之較短區分開構成。天然重鏈及輕鏈之可變區各包含四個FR，主要採取β-折疊構型，由形成環之三個CDR連接，形成連接β-折疊結構之環及在一些情況下形成該β-折疊結構之一部分。該等CDR與抗原之形狀互補及決定該抗體針對抗原之親和力及特異性。VL 及VH 兩者中存在六個CDR。各鏈中之CDR係由FR緊密結合在一起，及與來自其他鏈之CDR一起有助於抗體之抗原結合位點之形成(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。
當本文使用術語「高變區」時係指負責抗原結合之抗體之胺基酸殘基。該高變區一般包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如，當根據Kabat編號系統編號時，VL 中約殘基24至34 (L1)、50至56 (L2)及89至97 (L3)，及VH 中約31至35 (H1)、50至65 (H2)及95至102 (H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991))；及/或來自「高變環」之彼等殘基(例如，當根據Chothia編號系統編號時，VL 中殘基24至34 (L1)、50至56 (L2)及89至97 (L3)，及VH 中26至32 (H1)、52至56 (H2)及95至101 (H3)；Chothia及Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；及/或來自「高變環」/CDR之彼等殘基(例如，當根據IMGT編號系統編號時，VL 中殘基27至38 (L1)、56至65 (L2)及105至120 (L3)，及VH 中27至38 (H1)、56至65 (H2)及105至120 (H3)；Lefranc，M. P.等人，Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999)、Ruiz，M.等人，Nucl. Acids Res. 28:219-221 (2000))。視需要，當根據Aho編號時，該抗體於以下位置VL 中之28、36 (L1)、63、74至75 (L2)及123 (L3)，及Vsub H中之28、36 (H1)、63、74至75 (H2)及123 (H3)中之一或多者處具有對稱插入；Honneger，A.及Plunkthun，A. J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001))。如本文使用，CDR可係指由此等編號方法中之任何一者或由方法之組合或由其他所需方法定義之CDR。另外，可使用高度保守之核心、邊界及高變區之新穎定義。
抗體之「恆定區」係指單獨或組合之抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。輕鏈(CL )及重鏈(在IgM及IgE之情況下，CH 1、CH 2或CH 3或CH 4)之恆定區賦予重要之生物性質諸如分泌、經胎盤活動性、Fc受體結合、補體結合及類似物。按照慣例，恆定區域之編號因其等變得更遠離抗體之抗原結合位點或胺基端而增加。該等恆定區不直接參與將抗體結合至抗原，但顯示各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、抗體依賴性中性粒細胞吞噬作用(ADNP)及抗體依賴性補體沈積(ADCD)。
抗體可為抗體片段。「抗體片段」包含完整抗體之僅一部分，一般包括該完整抗體之抗原結合位點並因此保留結合抗原之能力。本發明定義包含之抗體片段之實例包括：(i)具有VL 、CL 、VH 及CH1 域之Fab片段；(ii) Fab'片段，其係具有一或多個半胱胺酸殘基於CH1 域之C端之Fab片段；(iii)具有VH 及CH 1域之Fd片段；(iv) Fd'片段，其具有VH 及CH 1域及一或多個半胱胺酸殘基於CH 1域之C端；(v)具有單一抗體之VL 及VH 域之Fv片段；(vi)由VH 域構成之dAb片段；(vii)經分離之CDR區；(viii) F(ab')2 片段，包括兩個Fab'片段於鉸鏈區由雙硫鍵連接之二價片段；(ix)單鏈抗體分子(例如，單鏈Fv；scFv)；(x)具有兩個抗原結合位點之「雙功能抗體」，其包含重鏈可變域(VH )連接至輕鏈可變域(VL )於相同多肽鏈中；(xi)包含與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區之一對縱排Fd片段(VH -CH 1-VH -CH 1)之「線性抗體」。
抗體可為嵌合抗體。「嵌合抗體」係指彼等其中重鏈及輕鏈之胺基酸序列中之各者之一部分係與來源於特定物種或屬於特定類別之抗體中之對應序列同源，而該等鏈之剩餘片段係與另一抗體中之對應序列同源之抗體。例如，嵌合抗體可為包含來自非人類供體之抗原結合序列移植至異源性非人類、人類或人類化序列(例如，框架及/或恆定域序列)之抗體。通常，在此等嵌合抗體中，輕鏈及重鏈兩者之可變區模擬來源於一種哺乳動物之抗體之可變區，而恆定部分係與來源於另一種哺乳動物之抗體中之序列同源。例如，已開發以人類起源之相似域置換單株抗體之輕鏈及重鏈恆定域，使外源抗體之可變區保持完整之方法。或者，「完全人類」單株抗體係在針對人類免疫球蛋白基因轉基因之小鼠中產生。亦已開發藉由重組構築具有嚙齒動物(例如，小鼠)及人類胺基酸序列兩者之抗體可變域將單株抗體之可變域轉化為更人類形式之方法。在「人類化」單株抗體中，僅高變CDR係來源於小鼠單株抗體，及框架及恆定區係來源於人類胺基酸序列(參見美國專利第5,091,513及6,881,557號，其等係以引用之方式併入本文中)。據認為以人類抗體之對應位置中發現之胺基酸序列置換嚙齒動物特有之抗體中之胺基酸序列將降低在治療使用期間之不良免疫反應之可能性。產生抗體之雜交瘤或其他細胞亦可經受基因突變或其他變化，其等可改變或可不改變由雜交瘤產生之抗體之結合特異性。 A.     單株抗體
如本文使用之術語「單株抗體」係指自大體上均質之抗體之群體獲得之抗體，即，組成該群體之個別抗體除可少量存在之可能之天然生成之突變外係相同的。單株抗體係高度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與包括針對不同抗原決定位(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相反，各單株抗體係針對抗原上之單一抗原決定位。除其等特異性外，單株抗體係有利的，因為其等可被合成而不受其他抗體污染。修飾語「單株」不應解釋為需藉由任何特定方法產生抗體。例如，適用於本發明中之單株抗體可藉由由Kohler等人，Nature，256:495 (1975)首先描述之雜交瘤方法論製備，或可使用重組DNA方法在細菌、真核動物或植物細胞(參見，例如，美國專利第4,816,567號)中在抗原特異性B細胞(對感染或免疫作用產生反應之抗原特異性成漿細胞)之單一細胞分選後製備，或自大量經分選之抗原特異性集合中之單一細胞捕獲經連接之重鏈及輕鏈。例如，單株抗體亦可使用Clackson等人，Nature，352:624-628 (1991)及Marks等人，J. Mol. Biol.，222:581-597 (1991)中描述之技術自噬菌體抗體庫分離。
用於產生各種類型(包括人類化、嵌合及完全人類)之單株抗體之方法係為此項技術中熟知且高度可預測。例如，下列美國專利及專利申請案提供此等方法之可行描述：美國專利申請案第2004/0126828及2002/0172677號；及美國專利案第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；及6,891,024號，其等係各以引用之方式併入本文中。 B.     單鏈抗體
單鏈可變片段(scFv)係免疫球蛋白之重鏈及輕鏈之可變區經短連接子連接在一起之融合體。儘管移除恆定區並併入連接肽，但此嵌合分子仍保留原始免疫球蛋白之特異性。此修飾通常使特異性不變。scFv可自來源於雜交瘤或B細胞之經子選殖之重鏈及輕鏈直接產生。單鏈可變片段缺乏完整抗體分子中發現之恆定Fc區，及因此，用於純化抗體之常見結合位點(例如，蛋白A/G)。此等片段可通常使用蛋白L純化/固定化，因為蛋白L與卡帕輕鏈之可變區相互作用。
可撓性連接子一般包含促進螺旋及轉彎之胺基酸殘基諸如丙胺酸、絲胺酸及甘胺酸。然而，其他殘基亦可發揮作用。例如，該連接子可具有脯胺酸殘基於VH C端後兩個殘基處及具有大量精胺酸及脯胺酸於其他位置。
單鏈抗體亦可藉由使用非肽連接子或化學單元連接受體輕鏈及重鏈產生。一般而言，該等輕鏈及重鏈將在不同細胞中產生，純化，並接著以適當之方式連接在一起(即，該重鏈之N端係經由適當之化學橋結合至該輕鏈之C端)。
交聯試劑係用於形成連接兩個不同分子之官能基之分子橋，例如，穩定劑及凝結劑。然而，經考慮可產生相同類似物或包含不同類似物之異源性複合物之二聚體或多聚體。為以逐步方式連接兩種不同之化合物，可使用異雙功能交聯劑，其等消除非所需之均聚物形成。
例示性異雙功能交聯劑含有兩個反應性基團：一個與一級胺基(例如，N-羥基琥珀醯亞胺)反應及另一個與巰基(例如，吡啶基二硫化物、馬來醯亞胺、鹵素等)反應。通過一級胺-反應性基團，該交聯劑可與一種蛋白質(例如，所選抗體或片段)之離胺酸殘基反應，及通過巰基-反應性基團，已連接至第一蛋白質之交聯劑與另一種蛋白質(例如，選擇劑)之半胱胺酸殘基(游離之硫氫基)反應。
較佳將採用在血液中具有合理穩定性之交聯劑。已知多種類型之含有二硫鍵之連接子，其等可成功用於結合靶向藥劑及治療劑/預防劑。含有空間位阻之雙硫鍵之連接子可證明產生活體內更大穩定性，在到達作用位點前，防止釋放靶向肽。因此，此等連接子係一組連接劑。
例如，SMPT係含有由相鄰苯環及甲基「空間位阻」之雙硫鍵之雙功能交聯劑。據信該雙硫鍵之空間位阻發揮保護該鍵免受硫醇根陰離子(諸如可存在於組織及血液中之麩胱甘肽)攻擊之功能，及藉此幫助在將附著劑遞送至靶位點前防止結合物之去偶。與許多其他已知交聯試劑一樣，SMPT交聯試劑賦予交聯官能基(諸如半胱胺酸或一級胺(例如，離胺酸之ε胺基)之SH)之能力。另一可能類型之交聯劑包括含有可裂解雙硫鍵之異雙功能光反應性苯疊氮諸如乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀醯亞胺基-2-(對疊氮基水楊基醯胺基)酯。N-羥基-琥珀醯亞胺基與一級胺基反應及苯疊氮(一經光分解)與任何胺基酸殘基非選擇性反應。
除受阻交聯劑外，非受阻連接子亦可同此一起採用。認為不含有或產生受保護之二硫化物之其他有用之交聯劑包括SATA、SPDP及2-亞胺基四氫噻吩。此項技術中熟知此等交聯劑之用途。亦可使用可撓性連接子。
美國專利4,680,338描述適用於產生配體與含胺聚合物及/或蛋白質之結合物，尤其適用於與螯合劑、藥物、酶、可偵測標記及類似物形成抗體結合物之雙功能連接子。美國專利5,141,648及5,563,250揭示含有在各種溫和條件下可裂解之不穩定鍵之可裂解結合物。此連接子尤其有用，因為受關注之藥劑可直接結合至該連接子，及裂解導致活性劑之釋放。特定用途包括將游離胺基或游離硫氫基添加至蛋白質諸如抗體或藥物。
美國專利5,856,456提供適用於連接多肽成分以製備融合蛋白(例如，單鏈抗體)之肽連接子。該連接子長度高達約50個胺基酸，含有出現至少一次帶電胺基酸(較佳精胺酸或離胺酸)，接著脯胺酸，及以更大穩定性及減少之聚集為特徵。美國專利5,880,270揭示適用於各種免疫診斷及分離技術中之含有胺氧基之連接子。 C.     雙特異性及多特異性抗體
抗體可為雙特異性或多特異性的。「雙特異性抗體」係對至少兩個不同抗原決定基具有特異性之抗體。例示性雙特異性抗體可結合至單一抗原之兩個不同抗原決定基。其他此等抗體可組合第一抗原結合位點及第二抗原之結合位點。或者，抗原特異性臂可與結合至白血球上之觸發分子(諸如T細胞受體分子(例如，CD3)或IgG之Fc受體(FcγR)諸如FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)及FcγRIII (CD16))之臂組合，以將細胞防禦機制聚焦並集中至受感染之細胞。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑集中至受感染之細胞。此等抗體具有抗原結合臂及結合細胞毒性劑(例如，皂草素(saporin)、抗干擾素-α、長春花生物鹼、蓖麻毒素A鏈、甲胺蝶呤(methotrexate)或放射性同位素半抗原)之臂。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段(例如，F(ab')2 雙特異性抗體)。Taki等人，(2015)描述雙特異性抗EphA10/抗CD3抗體。
此項技術中已知用於製造雙特異性抗體之方法。全長雙特異性抗體之傳統產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中該等兩個鏈具有不同之特異性。因為免疫球蛋白重鏈及輕鏈隨機分配，所以此等雜交瘤(四源雜交瘤)產生十個不同抗體分子之可能混合物，其等中僅一個具有正確之雙特異性結構。通常藉由親和層析步驟完成之正確分子之純化係相當麻煩的且產品產率低。
根據不同之方法，具有所需結合特異性(抗體-抗原組合位點)之抗體可變區係融合至免疫球蛋白恆定域序列。較佳地，該融合係與Ig重鏈恆定域，其包含鉸鏈、CH2 及CH3 區之至少一部分。較佳具有含有輕鏈結合必需之位點之第一重鏈恆定區(CH1 )，存在於該等融合體之至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及視需要免疫球蛋白輕鏈之DNA插入不同表現載體內，及共轉染至合適之宿主細胞內。當在構築中使用比率不等之三個多肽鏈提供最佳產率之所需雙特異性抗體時，此為調節三個多肽片段之相互比例提供更大靈活性。然而，當至少兩個多肽鏈以等比率表現導致高產率或當比率對所需鏈組合之產率無顯著影響時，可能將兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列插入單一表現載體內。
雙特異性抗體可包含具有第一結合特異性之雜合免疫球蛋白重鏈於一個臂中，及雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)於另一臂中。此不對稱結構促進自非所需之免疫球蛋白鏈組合分離所需雙特異性化合物，因為僅一半雙特異性分子中存在免疫球蛋白輕鏈提供輕易之分離方法。此方法係揭示於WO 94/04690中。就產生雙特異性抗體之其他細節而言，參見，例如，Suresh等人，Methods in Enzymology, 121:210 (1986)。
根據美國專利第5,731,168號中描述之另一方法，一對抗體分子間之界面可經改造以最大化自重組細胞培養物回收之異二聚體之百分率。較佳界面包含CH3 域之至少一部分。在此方法中，來自第一抗體分子之界面之一或多個小胺基酸側鏈係經較大側鏈(例如，酪胺酸或色胺酸)置換。與大側鏈相同或相似尺寸之補償性「腔室」係藉由以較小之胺基酸側鏈(例如，丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈在第二抗體分子之界面上產生。此提供用於增加異二聚體超過其他非所需之最終產品(諸如同二聚體)之產率之機制。
雙特異性抗體包括交聯或「雜結合物」抗體。例如，雜結合物中之抗體之一者可偶合至抗生物素蛋白，另一者偶合至生物素。例如，已提出此等抗體將免疫系統細胞靶向至非所需細胞(美國專利第4,676,980號)。雜結合物抗體可使用任何便利之交聯方法製備。合適之交聯劑係為此項技術中熟知及揭示於美國專利第4,676,980號中，連同許多交聯技術一起。
用於自抗體片段產生雙特異性抗體之技術亦已描述於文獻中。例如，雙特異性抗體可使用化學鍵聯製備。Brennan等人，Science, 229: 81 (1985)描述其中完整抗體係經蛋白水解裂解以產生F(ab')2 片段之程序。此等片段係在二硫酚複合劑亞砷酸鈉之存在下減少以穩定相鄰二硫酚及防止分子間二硫化物形成。然後將產生之Fab'片段轉化為硫硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然後藉由以巰基乙胺還原將Fab'-TNB衍生物中之一者再轉化為Fab'-硫醇並與等莫耳量之其他Fab'-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。產生之雙特異性抗體可用作選擇性固定酶之藥劑。
存在促進自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段之技術，該等Fab'-SH片段可化學偶合以形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J. Exp. Med.，175: 217-225 (1992)描述人類化雙特異性抗體F(ab')2 分子之產生。各Fab'片段係分別自大腸桿菌分泌並經受活體外定向化學偶合以形成雙特異性抗體。因此形成之雙特異性抗體可結合至過表現ErbB2受體之細胞及正常人類T細胞，以及觸發人類細胞毒性淋巴細胞針對人類乳腫瘤標靶之裂解活性。
亦已描述用於直接自重組細胞培養物製造及分離雙特異性抗體片段之各種技術(Merchant等人，Nat. Biotechnol. 16, 677-681 (1998))。例如，雙特異性抗體已使用白胺酸拉錬產生(Kostelny等人，J. Immunol., 148(5):1547-1553, 1992)。藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉錬肽連接至兩個不同抗體之Fab'部分。抗體同二聚體係在鉸鏈區處還原以形成單體及然後再氧化以形成抗體異二聚體。此方法亦可用於產生抗體同二聚體。由Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:6444-6448 (1993)描述之「雙功能抗體」技術已為製造雙特異性抗體片段提供替代方案機制。該等片段包含VH 經連接子連接至VL ，該連接子太短以至於不容許相同鏈上之兩個域間之配對。因此，迫使一個片段之VH 及VL 域與另一片段之互補VL 及VH 域配對，藉此形成兩個抗原結合位點。亦已報導藉由使用單鏈Fv (sFv)二聚體製造雙特異性抗體片段之另一策略。參見Gruber等人，J. Immunol., 152:5368 (1994)。
雙特異性或多特異性抗體可形成為DOCK-AND-LOCK™ (DNL™)複合物(參見，例如，美國專利第7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143及7,666,400號)。一般而言，該技術利用發生在cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)之調節(R)次單元之二聚化及對接域(DDD)序列與來源於各種AKAP蛋白中之任何一者之及錨定域(AD)序列之間之特異性及高親和力結合相互作用(Baillie等人，FEBS Letters. 2005; 579: 3264；Wong及Scott，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5: 959)。DDD及AD肽可結合至任何蛋白質、肽或其他分子。因為該等DDD序列自發二聚化及結合至該AD序列，所以該技術容許在可結合至DDD或AD序列之任何所選分子間形成複合物。
考慮具有超過二價之抗體。例如，可製備三特異性抗體(Tutt等人，J. Immunol. 147: 60, 1991；Xu等人，Science, 358(6359):85-90, 2017)。該等抗體亦可涉及允許受體之二聚化或多聚化之序列或部分。此等序列包括彼等來源於IgA者，其等允許結合J鏈一起形成多聚體。另一多聚化域為Gal4二聚化域。
多價抗體可比二價抗體更快速地被表現該抗體結合之抗原之細胞內化(及/或異化)。本發明之抗體可為具有三個或更多個抗原結合位點之多價抗體(例如，四價抗體)，其等可藉由編碼該抗體之多肽鏈之核酸之重組表現容易地產生。該多價抗體可包含二聚化域及三個或更多個抗原結合位點。較佳之二聚化域包含Fc區或鉸鏈區(或由Fc區或鉸鏈區構成)。在此情況下，該抗體將包含Fc區及三個或更多個抗原結合位點於該Fc區胺基端。多價抗體可包含三個至約八個(例如四個)抗原結合位點(或由三個至約八個(例如四個)抗原結合位點構成)。該多價抗體包含至少一個多肽鏈(及較佳兩個多肽鏈)，其中該多肽鏈包含兩個或更多個可變區。例如，該多肽鏈可包含VD1-(X1).sub.n-VD2-(X2)n -Fc，其中VD1係第一可變區，VD2係第二可變區，Fc係Fc區之一個多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，及n係0或1。例如，該(等)多肽鏈可包含：VH-CH1-可撓性連接子-VH-CH1-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文之多價抗體可進一步包含至少兩個(及較佳四個)輕鏈可變區多肽。本文之多價抗體可(例如)包含約兩個至約八個輕鏈可變區多肽。本文考慮該等輕鏈可變區多肽包含輕鏈可變區，及視需要進一步包含CL 域。
電荷修飾尤其適用於多特異性抗體之內文中，其中Fab分子中之胺基酸取代導致減少輕鏈與不匹配重鏈之錯配(本週氏蛋白(Bence-Jones)型副產物)，其可發生在產生基於Fab之雙/多特異性抗原結合分子中及在其等結合臂之一者(或多者，在包含超過兩個抗原結合Fab分子之分子之情況下)中具有VH/VL交換(亦參見PCT公開案第WO 2015/150447號，尤其其中之實例，係以全文引用之方式併入本文中)。 D.     BiTE
雙特異性T細胞銜接蛋白(BiTE®)係引導將宿主之免疫系統(更具體言之T細胞之細胞毒性活性)靶向患病細胞之人造雙特異性單株抗體。BiTE係由不同抗體之兩個單鏈可變片段(scFv)，或來自四個不同基因之胺基酸序列，在約55千道爾頓之單一肽鏈上構成之融合蛋白。該等scFv中之一者經由CD3受體結合至T細胞，及另一者經由特定分子結合至受感染之細胞。
諸如其他雙特異性抗體，及不同於一般單株抗體，BiTE在T細胞與靶細胞之間形成連接。此使得T細胞藉由產生諸如穿孔素及粒子酶之蛋白質而對靶細胞發揮細胞毒性活性，與MHC I或共刺激分子之存在無關。此等蛋白質進入該等靶細胞內並引發凋亡。此作用模擬在T細胞攻擊受感染之細胞期間觀測到之生理過程。 E.     抗體結合物
本發明之抗體可連接至至少一種藥劑以形成抗體結合物。該結合物可為(例如)結合至另一蛋白質、醣、脂質或混合部分分子之抗體。此等抗體結合物包括(但不限於)包括將該抗體連接至一或多種聚合物之修飾。例如，抗體可連接至一或多種水溶性聚合物。對水溶性聚合物之鍵聯降低該抗體將在水性環境(諸如生理環境)中沈積之可能性。基於包括(但不限於)該聚合物/抗體結合物是否將用於治療病患，及若如此，該抗體之醫藥概況(例如，半衰期、劑量、活性、抗原性及/或其他因素)之考量，熟習此項技術者可選擇合適之水溶性聚合物。
為增加抗體分子作為診斷或治療劑之效用，習知連接或共價結合或複合至少一個所需分子或部分。此分子或部分可為(但不限於)至少一個效應分子或報導分子。效應分子包含具有所需活性(例如，細胞毒性活性)之分子。已結合至抗體之效應分子之非限制性實例包括毒素、抗腫瘤劑、治療性酶、放射性核種、抗病毒劑、螯合劑、細胞介素、生長因子及寡核苷酸多核苷酸。相反，報導分子定義為可使用分析偵測之任何部分。已結合至抗體之報導分子之非限制性實例包括酶、放射性標記、半抗原、螢光標記、磷光分子、化學發光分子、發色團、光親和力分子、有色粒子或配體、酶(例如，其催化比色或螢光反應)、受質、固體基質(諸如生物素)。抗體可包含此等標記中之任何一者之一、二或更多者。
抗體結合物可用於將細胞毒性劑遞送至靶細胞。此類型之細胞毒性劑可改善抗體介導之細胞毒性，及包括諸如直接或間接刺激細胞死亡之細胞介素之部分、放射性同位素、化學治療藥物(包括前藥)、細菌毒素(例如，假單胞菌外毒素、白喉毒素等)、植物毒素(例如，蓖麻毒素、白樹毒素等)、化學結合物(例如，美登醇毒素、瑞奧西汀(auristatin)、α-鵝膏蕈鹼、蒽環毒素、鈣鏈菌素等)、放射性結合物、酶結合物(例如，核糖核酸酶結合物、粒子酶抗體定向酶/前藥療法)，及類似物。
抗體結合物亦用作診斷劑。抗體診斷一般分為兩種類別，彼等適用於活體外診斷中者，諸如適用於各種免疫分析中者，及彼等用於活體內診斷方案者，一般稱為「抗體定向成像」。許多適當之顯像劑為此項技術中已知，及用於將其等結合至抗體之方法亦為此項技術中已知(參見，例如，美國專利5,021,236、4,938,948及4,472,509)。使用之成像部分可為順磁離子、放射性同位素、螢光色素、NMR可偵測物質及X射線顯像劑。
經考慮用作結合物之順磁離子包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)及/或鉺(III)，及釓係尤其較佳的。適用於其他情境(諸如X射線成像)中之離子包括(但不限於)鑭(III)、金(III)、鉛(II)及鉍(III)。
經考慮用作結合物之放射性同位素包括砹211 、14 碳、51 鉻、36 氯、57 鈷、58 鈷、銅67 、152 Eu、鎵67 、3 氫、碘123 、碘125 、碘131 、銦111 、59 鐵、32 磷、錸186 、錸188 、75 硒、35 硫、鎝99m 及/或釔90 。125 I係通常較佳的。鎝99m 及/或銦111 由於其等能量低且適用於長程偵測係亦通常較佳的。經放射性標記之本發明之單株抗體可根據此項技術中熟知的方法產生。例如，單株抗體可藉由與碘化鈉及/或碘化鉀及化學氧化劑(諸如次氯酸鈉)或酶氧化劑(諸如乳過氧化物酶)接觸碘化。根據本發明之單株抗體可經鎝99m 標記，其係藉由配體交換過程，例如，藉由以亞錫溶液還原高鎝酸鹽，使經還原之鎝螯合至交聯葡聚糖(Sephadex)管柱上及將該抗體施用至此管柱。或者，可使用直接標記技術，例如，藉由培養高鎝酸鹽、還原劑(諸如SNCl2 )、緩衝溶液(諸如鄰苯二甲酸鈉鉀鹽溶液)及該抗體。通常用於將以金屬離子形式存在之放射性同位素結合抗體之中間官能基係二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
經考慮用作結合物之螢光標記包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、瀑布藍(Cascade Blue)、Cy3、Cy5、6-FAM、異硫氰酸螢光素、HEX、6-JOE、俄勒岡綠488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、太平洋藍(Pacific Blue)、REG、羅丹明綠(Rhodamine Green)、羅丹明紅(Rhodamine Red)、腎造影劑(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基羅丹明及/或德州紅(Texas Red)。
本發明中考慮之另外類型之抗體係彼等旨在主要供活體外使用者，其中將該抗體連接至二級結合配體及/或連接至酶(酶標籤)，其一經與顯色受質接觸即將產生有色產物。合適之酶之實例包括脲酶、鹼性磷酸酶、(辣根)過氧化氫酶或葡萄糖氧化酶。較佳之二級結合配體係生物素及抗生物素蛋白及鏈黴親和素化合物。
此項技術中已知數種方法可用以將抗體連接或結合至其結合物部分。一些結合方法涉及使用金屬螯合複合物，採用(例如)有機螯合劑，諸如結合至該抗體之二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)；乙二胺四乙酸；N-氯-對甲苯磺醯胺；及/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3 (美國專利4,472,509及4,938,948)。單株抗體亦可與酶在偶合劑(諸如戊二醛或過碘酸鹽)之存在下反應。與螢光素標誌物之結合物係在此等偶合劑之存在下或藉由與異硫氰酸鹽反應製備。在美國專利4,938,948中，乳腫瘤之成像係使用單株抗體達成及可偵測之成像部分係使用連接子(諸如甲基-對羥基苯甲亞胺酸鹽或N-琥珀醯亞胺基-3-(4-羥苯基)丙酸鹽)結合至該抗體。
將分子位點特異性結合至抗體之另一已知方法包括抗體與基於半抗原之親和標記之反應。基本上，基於半抗原之親和標記與抗原結合位點中之胺基酸反應，藉此破壞此位點及阻斷特異性抗原反應。然而，此可為不利的，因為其由抗體結合物導致抗原結合之損失。
含有疊氮基之分子亦可用於通過由低強度紫外線產生之反應性氮烯中間物形成對蛋白質之共價鍵。特定言之，嘌呤核苷酸之2-及8-疊氮基類似物已用作定點光探針來識別粗細胞提取物中之核苷酸結合蛋白。該等2-及8-疊氮基核苷酸亦已用於圖譜分析經純化之蛋白質之核苷酸結合域及可用作抗體結合劑。
亦考慮使用不改變抗體組合位點之反應條件，藉由將硫氫基選擇性引入免疫球蛋白之Fc區中衍生化免疫球蛋白。根據此方法論產生之抗體結合物係經揭示以顯示經改善之壽命、特異性、及敏感性(美國專利5,196,066，其係以引用之方式併入本文中)。效應分子或報導分子之位點特異性結合亦已揭示於文獻中，其中該報導或效應分子係結合至Fc區中之醣殘基。已報導此方法以產生當前在臨床評估中診斷上及治療上有前景之抗體。 F.     抗體藥物結合物
抗體藥物結合物或ADC係設計為用於治療患病者之靶向療法之高度有效之生物醫藥藥物之新穎類別。ADC係複合分子，其包含抗體(全mAb或抗體片段，諸如scFv)經由具有不穩定鍵之穩定化學連接子連接至生物活性細胞毒性/抗病毒有效載荷或藥物。抗體藥物結合物係生物結合物及免疫結合物之實例。
藉由組合單株抗體獨特之靶向能力及細胞毒性藥物之殺癌能力，抗體藥物結合物容許靈敏辨別健康組織與患病組織。此意謂與傳統之系統方法相反，抗體藥物結合物靶向並攻擊患病細胞使得健康細胞受影響較少。
在研發基於ADC之抗腫瘤療法中，將抗癌藥物(例如，細胞毒素(cell toxin或cytotoxin))偶合至特異性靶向某個細胞標誌物(例如，理想地，僅在患病細胞中或患病細胞上發現之蛋白質)之抗體。抗體在體內追蹤此等蛋白質並使其等結合至患病細胞之表面。抗體與靶蛋白(抗原) 之間之生物化學反應在靶細胞中觸發信號，然後與細胞毒素一起吸收或內化該抗體。在將ADC內化後，細胞毒性藥物係經釋放並殺死細胞或損害細胞複製。由於此靶向，理想地，相較於其他藥劑，該藥物具有更低之副作用並產生更廣之治療窗。
抗體與細胞毒性劑之間之穩定連接係ADC之關鍵態樣。連接子係基於包括二硫化物、腙或肽(可裂解)或硫醚(不可裂解)之化學基序並控制細胞毒性劑對靶細胞之分佈及遞送。已證明可裂解及不可裂解類型之連接子在臨床前及臨床試驗中係安全的。布倫妥昔單抗維多汀(Brentuximab vedotin)包括將有效及劇毒抗微管劑單甲基瑞奧西汀E或MMAE (合成抗腫瘤劑)遞送至人類特異性CD30陽性惡性細胞之酶敏感性可裂解連接子。因為其劇毒MMAE，藉由阻斷微管蛋白之聚合抑制細胞分裂，因此無法用作單一藥劑化學治療藥物。然而，證明連接至抗CD30單株抗體(cAC10，腫瘤壞死因子或TNF受體之細胞膜蛋白)之MMAE之組合在細胞外液中係穩定的，可由組織蛋白酶裂解且對療法而言係安全的。曲妥珠單抗恩坦辛(Trastuzumab emtansine) (另一經批准之ADC)係微管形成抑制劑美登素(mertansine) (DM-1) (美登素(maytansine)之衍生物)及由穩定、不可裂解連接子結合之抗體曲妥珠單抗(Herceptin®/Genentech/Roche)之組合。
更好且更穩定連接子之可用度已改變化學鍵之功能。連接子之類型(可裂解或不可裂解)為細胞毒性(例如，抗癌)藥物提供特定性質。例如，不可裂解連接子使藥物保留於細胞內。因此，整個抗體、連接子及細胞毒性劑進入靶細胞內，其中該抗體在靶細胞中降解至胺基酸之層級。所得複合物(胺基酸、連接子及細胞毒性劑)現成為活性藥物。相反，可裂解連接子係由酶在宿主細胞中催化，藉此釋放細胞毒性劑。
另一類型之可裂解連接子在細胞毒性藥物與裂解位點之間添加另外分子。此連接子技術容許研究人員產生具有更大可撓性之ADC而無需擔心改變裂解動力學。研究人員亦正基於埃德曼(Edman)降解研發肽裂解之新穎方法。研發ADC中之其他方向亦包括研發位點特異性結合(TDC)以進一步改善穩定性及治療指數及發射α之免疫結合物及抗體結合之奈米粒子。 G.     內抗體
在一特定實施例中，該抗體係適用於在細胞內部發揮作用之重組抗體，此等抗體稱為「內抗體」。此等抗體可藉由各種機制干擾靶功能，諸如藉由改變細胞內蛋白質運輸，干擾酶功能及阻斷蛋白質-蛋白質或蛋白質-DNA相互作用。在許多方面，其等結構模擬上文討論之單鏈及單域抗體之彼等結構或與其結構相似。事實上，單一轉錄本/單鏈係允許靶細胞中之細胞內表現之重要特徵，及亦使得跨細胞膜蛋白質轉運更可行。然而，仍需另外特徵。內抗體可需之另外特徵係細胞內靶向之信號。可將內抗體(或其他蛋白質)靶向次細胞區(諸如細胞質、細胞核、粒線體及ER)之載體已經設計且可購買獲得(Invitrogen公司)。
影響內抗體療法之實施之兩個主要問題係遞送，包括細胞/組織靶向，及穩定性。關於遞送，亦採用各種方法，諸如組織定向遞送，使用細胞類型特異性啟動子，基於病毒之遞送，使用細胞滲透性/膜易位肽，及使用胞外體遞送。一種遞送方式包括使用基於脂質之奈米粒子，或胞外體，如美國專利申請公開案2018/0177727中教示，其係以全文引用之方式併入本文中。關於穩定性，該方法係一般由蠻力篩選，包括涉及噬菌體顯示之方法及可包括共有序列之序列成熟或發展，或更直接之修飾諸如插入穩定序列(例如，Fc區、配偶體蛋白序列、白胺酸拉錬)及二硫化物置換/修飾。 H.     抗體之產生及純化
用於產生單株抗體之方法一般沿與彼等用於製備多株抗體者相同之線開始。此等方法中之兩者之第一步驟係適當之宿主之免疫。如此項技術中熟知，用於免疫之給定組合物之免疫原性可變化。因此，通常有必要增強宿主免疫系統，如可藉由將肽或多肽免疫原偶合至載劑達成。例示性及較佳載劑係匙孔血藍蛋白(KLH)及牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白(諸如卵白蛋白，小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白)亦可用作載劑。用於將多肽結合至載體蛋白之方式係為此項技術中熟知及包括戊二醛、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯、碳二亞胺及雙重氮聯苯胺。如此項技術中亦熟知，特定免疫原組合物之免疫原性可藉由使用免疫反應之非特異性刺激劑(稱為佐劑)增強。動物中之例示性及較佳佐劑包括完全弗氏佐劑(含有殺死結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )之免疫反應之非特異性刺激劑)，不完全弗氏佐劑及氫氧化鋁佐劑，及在人類中包括明礬、CpG、MFP59及免疫刺激分子之組合(「佐劑系統」，諸如AS01或AS03)。誘導抗原特異性B細胞之接種之另外實驗形式係可能的，包括奈米粒子疫苗，或在物理遞送系統(諸如脂質奈米粒子或在金基因槍珠上)中作為DNA或RNA基因遞送，及用針、基因槍或經皮電穿孔裝置遞送之基因編碼之抗原。該抗原基因亦可如由複製勝任型(replication-competent)或缺陷病毒載體(諸如腺病毒、腺相關病毒、痘病毒、皰疹病毒或α病毒複製子，或者病毒樣粒子)編碼攜載。
用於產生產生抗體之細胞及骨髓瘤細胞之雜合體之方法通常包括在促進細胞膜融合之藥劑(化學或電)之存在下，以2:1比例(然而比例可自約20:1至約1:1變化)混合體細胞及骨髓瘤細胞。在一些情況下，以愛潑斯坦巴爾(Epstein Barr)病毒(EBV)轉形人類B細胞作為初始步驟增加該等B細胞之尺寸，增強與相對較大尺寸之骨髓瘤細胞之融合。EBV之轉形效率係藉由在轉形培養基中使用CpG及Chk2抑制劑藥物增強。或者，人類B細胞可藉由在含有另外可溶性因子(諸如IL-21及人類B細胞活化因子(BAFF) (TNF超家族之II型成員))之培養基中與表現CD40配體(CD154)之經轉染之細胞系共培養活化。亦已知使用仙台病毒或聚乙二醇(PEG)之融合方法。使用電誘導之融合方法亦係適當的。融合程序通常在低頻率(約1 x 10-6 至1 x 10-8 )下產生活雜合體，但以最佳程序，吾人可達成接近200分之1之融合效率。然而，相對較低之融合效率不構成問題，因為藉由在選擇性培養基中培養，經融合之活雜合體係自親代輸注細胞(尤其將通常繼續無限分裂之輸注骨髓瘤細胞)分化。該選擇性培養基係一般含有在組織培養基中阻斷核苷酸之從頭合成之藥劑者。例示性及較佳藥劑係胺基蝶呤(aminopterin)、甲胺蝶呤及偶氮絲胺酸。胺基蝶呤及甲胺蝶呤阻斷嘌呤及嘧啶兩者之從頭合成，而偶氮絲胺酸阻斷僅嘌呤合成。在使用胺基蝶呤或甲胺蝶呤之情況下，該培養基係用次黃嘌呤及胸苷補充作為核苷酸(HAT培養基)之來源。在使用偶氮絲胺酸之情況下，該培養基係用次黃嘌呤補充。若B細胞來源係EBV轉形之人類B細胞系，則添加烏巴苷(Ouabain)，以消除未融合至骨髓瘤之EBV轉形之細胞系。
較佳之選擇培養基係HAT或具有烏巴苷之HAT。僅可操作核苷酸補救途徑之細胞可在HAT培養基中存活。骨髓瘤細胞在補救途徑之關鍵酶(例如，次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT))中存在缺陷，及其等無法存活。B細胞可操作此途徑，但其等在培養物中具有有限壽命及一般於約兩週內死亡。因此，僅可在選擇性培養基中存活之細胞係彼等自骨髓瘤及B細胞形成之雜合體。當用於融合之B細胞之來源係EBV轉形之B細胞系時，此處，烏巴苷亦可用於藥物選擇雜合體，因為EBV轉形之B細胞易受藥物殺死，而使用之骨髓瘤配偶體經選擇為烏巴苷抗性的。
培養提供雜交瘤群體，自其選擇特定雜交瘤。通常，雜交瘤之選擇係藉由通過在微孔盤中單一純系稀釋培養細胞，接著針對所需反應性測試個別純系上清液(約二至三週後)進行。分析應係靈敏、簡單且快速，諸如放射免疫分析、酶免疫分析、細胞毒性分析、斑塊分析、斑點免疫結合分析及類似物。然後選擇之雜交瘤係經連續稀釋或藉由流式細胞分選進行單一細胞分選並選殖至個別產生抗體之細胞系內，然後該等純系可無限繁殖以提供單株抗體。該等細胞系可用於以兩種基本方式產生單株抗體。可將雜交瘤之樣本注射(通常至腹腔內)至動物(例如，小鼠)內。視需要，該等動物可在注射前用烴，尤其油諸如姥鮫烷(四甲基十五烷)致敏。當以此方式使用人類雜交瘤時，最佳注射免疫功能不全小鼠(諸如SCID小鼠)以防止腫瘤排斥。經注射之動物發展分泌由經融合之細胞雜合體產生之特異性單株抗體之腫瘤。然後可抽取該動物之體液(諸如血清或腹水)以提供高濃度之單株抗體。該等個別細胞系亦可活體外培養，其中將該等單株抗體天然分泌至培養基內，其等在該培養基中可容易以高濃度獲得。或者，人類雜交瘤細胞系可活體外使用以在細胞上清液中產生免疫球蛋白。該等細胞系可適用於在無血清培養基中生長以最佳化回收高純度人類單株免疫球蛋白之能力。
可培養雜交瘤，然後溶解細胞，並提取總RNA。無規六聚體可與RT一起使用以產生RNA之cDNA拷貝，及然後使用預期擴增所有人類可變基因序列之PCR引子之多重混合物進行PCR。可將PCR產物選殖至pGEM-T Easy載體內，然後藉由自動化DNA定序使用標準載體引子定序。結合及中和之分析可使用自雜交瘤上清液收集並藉由FPLC使用蛋白G管柱純化之抗體進行。
重組全長IgG抗體可藉由將來自選殖載體之重鏈及輕鏈Fv DNA子選殖至IgG質體載體內，轉染至293 (例如，Freestyle)細胞或CHO細胞內來產生，及抗體可自該293或CHO細胞上清液收集並純化。其他適當之宿主細胞系統包括細菌(諸如大腸桿菌)、昆蟲細胞(S2、Sf9、Sf29、High Five)、植物細胞(例如，煙草，有或無針對人類樣聚醣改造)、藻類，或在各種非人類轉基因內文中，諸如小鼠、大鼠、山羊或奶牛。
出於後續抗體純化及宿主之免疫之目的，亦考慮編碼抗體之核酸之表現。抗體編碼序列可為RNA，諸如天然RNA或經修飾之RNA。經修飾之RNA考慮賦予mRNA增加之穩定性及低免疫原性之某些化學修飾，藉此促進治療上重要之蛋白質之表現。例如，就轉譯能力而言，N1-甲基-假尿苷(N1mΨ)優於數種其他核苷修飾及其等組合。除關閉轉譯之免疫/eIF2α磷酸化依賴性抑制外，併入之N1mΨ核苷酸藉由增加核醣體停頓及mRNA之密度顯著改變轉譯過程之動力學。經修飾之mRNA之增加之核醣體負載藉由有利於在相同mRNA上核醣體回收或從頭核醣體募集使得其等更容易起始。此等修飾可用於在用RNA接種後增強活體內抗體表現。該RNA (無論天然或經修飾)均可作為裸RNA或在遞送媒介物(諸如脂質奈米粒子)中遞送。
或者，編碼抗體之DNA可用於相同目的。該DNA係包括於表現匣中，該表現匣包含在為其設計之宿主細胞中具有活性之啟動子。該表現匣係有利地包括於可複製載體(諸如習知質體或迷你載體)中。經考慮，載體包括病毒載體，諸如痘病毒、腺病毒、皰疹病毒、腺相關病毒及慢病毒。亦考慮編碼抗體基因之複製子，諸如基於VEE病毒或辛德畢斯(Sindbis)病毒之α病毒複製子。當需活體內表現時，此等載體之遞送可由針通過肌內、皮下或皮內途徑，或藉由經皮電穿孔進行。
或者，可使用分子選殖方法以產生單株抗體。經受關注之抗原標記之單一B細胞可使用順磁珠選擇或流式細胞分選進行物理分選，然後RNA可自單一細胞分離及抗體基因藉由RT-PCR擴增。或者，可將細胞之抗原特異性大批分選之群體分離成微泡，及使用重鏈及輕鏈擴增子之物理鍵聯，或來自囊泡之重鏈及輕鏈基因之通用條碼，自單一細胞回收經匹配之重鏈及輕鏈可變基因。來自單一細胞之經匹配之重鏈及輕鏈基因亦可藉由用攜載RT-PCR引子之細胞滲透性奈米粒子及用於標記轉錄本之條碼及每個細胞一個條碼處理細胞自抗原特異性B細胞中群體獲得。該等抗體可變基因亦可藉由雜交瘤系之RNA提取分離及該等抗體基因藉由RT-PCR獲得並選殖至免疫球蛋白表現載體內。或者，組合之免疫球蛋白噬菌粒庫係自細胞系分離之RNA製備及表現適當抗體之噬菌粒係藉由使用病毒抗原淘選進行選擇。此方法優於習知雜交瘤技術之優點在於可單輪產生並篩選多達約104 倍抗體，及由H及L鏈組合產生新特異性，此進一步增加發現適當抗體之機率。
各以引用之方式併入本文中之教示產生適用於本發明之抗體之其他美國專利包括美國專利5,565,332，其描述使用組合之方法產生嵌合抗體；美國專利4,816,567，其描述重組免疫球蛋白製劑；及美國專利4,867,973，其描述抗體-治療劑結合物。
藉由任何方式產生之單株抗體可(視需要)使用過濾、離心及各種層析方法(諸如FPLC或親和層析術)純化。本發明之單株抗體之片段可自經純化之單株抗體藉由包括用酶(諸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化及/或藉由化學還原裂解雙硫鍵之方法獲得。或者，本發明包含之單株抗體片段可使用自動化肽合成器合成。
本發明之抗體可經純化。如本文使用，術語「經純化」旨在係指組合物可與其他組分分離，其中蛋白質相對於其天然可獲得之狀態係經純化至任何程度。因此，經純化之蛋白質亦係指無法存在於其天然存在之環境中之蛋白質。在使用術語「大體上經純化」之情況下，此名稱將係指其中該蛋白質或肽形成組合物之主要組分之組合物，諸如構成該組合物中蛋白質之約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或更多。
熟習此項技術者熟知蛋白質純化技術。此等技術在一定程度上涉及將細胞環境粗分級分離為多肽及非多肽溶離份。已自其它蛋白質分離多肽，受關注之多肽可使用層析及電泳技術進一步純化以達成部分或完全純化(或純化至均質)。尤其適合製備純肽之分析方法係離子交換層析術、排阻層析術；聚丙烯醯胺凝膠電泳；等電聚焦。用於蛋白質純化之其他方法包括用硫酸銨、PEG、抗體及類似物沈澱或藉由熱變性，接著離心；凝膠過濾、逆相、羥基磷灰石及親和層析術；及此等及其他技術之組合。
在純化本發明之抗體中，可希望在原核或真核表現系統中表現多肽並使用變性條件提取蛋白質。該多肽可使用親和管柱自其他細胞組分純化，親和管柱結合至該多肽經標記之溶離份。如此項技術中一般已知，據信進行各種純化步驟之順序可變化，或某些步驟可省略，且仍導致適用於製備大體上經純化之蛋白質或肽之方法。
通常，完整抗體係利用結合該抗體之Fc部分之藥劑(即，蛋白A)分級分離。或者，抗原可用於同時純化並選擇適當抗體。此等方法通常利用結合至撐體(諸如管柱、過濾器或珠)之選擇劑。抗體係結合至撐體，移除(例如，沖走)污染物，及藉由應用條件(鹽、熱等)釋放該等抗體。
鑒於本發明，熟習此項技術者將已知用於定量蛋白質或肽之純化程度之各種方法。此等包括(例如)確定活性溶離份之比活性，或藉由SDS/PAGE分析評估溶離份內多肽之量。用於評估溶離份純度之另一方法係計算該溶離份之比活性，將其與初始提取物之比活性比較，並因此計算純度。當然，用於表示活性量之實際單位將取決於選擇用於純化之特定分析技術及經表現之蛋白質或肽是否顯示可偵測活性。
已知多肽之遷移可隨SDS/PAGE之不同條件改變，有時顯著改變。因此，應知曉在不同之電泳條件下，經純化或經部分純化之表現產物之視分子量可變化。 I. 抗體之修飾
抗體之序列可出於各種原因進行修飾，諸如經改善之表現、經改善之交叉反應性或減少之脫靶結合。經修飾之抗體可藉由熟習此項技術者已知的任何技術製備，包括通過標準分子生物技術之表現，或多肽之化學合成。
例如，吾人可能希望作出修飾，諸如將保守變化引入抗體分子內。在作出此等變化中，可考慮胺基酸之親水指數。親水胺基酸指數在對蛋白質賦予互動式生物功能中之重要性係此項技術中普遍瞭解(Kyte及Doolittle，1982)。公認胺基酸之相對親水特性有助於所得蛋白質之二級結構，其進一步定義該蛋白質與其他分子(例如，酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原及類似物)之相互作用。
相似胺基酸之取代可基於親水性有效作出。以引用之方式併入本文中之美國專利4,554,101指出蛋白質之最大局部平均親水性(如由其相鄰胺基酸之親水性控制)與該蛋白質之生物性質相關。如美國專利4,554,101中詳細描述，已將下列親水性值分配至胺基酸殘基：鹼性胺基酸：精胺酸(+3.0)、離胺酸(+3.0)、及組胺酸(-0.5)；酸性胺基酸：天冬胺酸(+3.0 ± 1)、麩胺酸(+3.0 ± 1)、天冬醯胺酸(+0.2)及麩醯胺酸(+0.2)；親水性非離子胺基酸：絲胺酸(+0.3)、天冬醯胺酸(+0.2)、麩醯胺酸(+0.2)及蘇胺酸(-0.4)、含硫胺基酸：半胱胺酸(-1.0)及甲硫胺酸(-1.3)；疏水性非芳族胺基酸：纈胺酸(-1.5)、白胺酸(-1.8)、異白胺酸(-1.8)、脯胺酸(-0.5 ± 1)、丙胺酸(-0.5)及甘胺酸(0)；疏水性芳族胺基酸：色胺酸(-3.4)、苯丙胺酸(-2.5)及酪胺酸(-2.3)。
胺基酸可取代另一具有相似親水性者並產生經生物或免疫修飾之蛋白質。在此等變化中，親水性值於± 2內之胺基酸之取代係較佳的，彼等於± 1內者係尤其佳的，及彼等於± 0.5內者係甚至更尤其佳的。
胺基酸取代一般係基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性，例如，其等疏水性、親水性、電荷、尺寸及類似物。考慮各種前述特性之例示性取代係為熟習此項技術者熟知且包括：精胺酸及離胺酸；麩胺酸及天冬胺酸；絲胺酸及蘇胺酸；麩醯胺酸及天冬醯胺酸；及纈胺酸、白胺酸及異白胺酸。
本發明亦考慮同型修飾。藉由修飾Fc區以具有不同同型，可達成不同功能。例如，變為IgG1 可增加抗體依賴性細胞毒性，轉換為A類可改善組織分佈，及轉換為M類可改善效價。
吾人可設計效應功能改變之抗體之Fc區，例如，藉由修飾C1q結合及/或FcγR結合及藉此改變CDC活性及/或ADCC活性。「效應功能」負責活化或減弱生物活性(例如，在受試者中)。效應功能之實例包括(但不限於)：C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)之下調等。此等效應功能可需Fc區與結合域(例如，抗體可變域)組合且可使用各種分析(例如，Fc結合分析、ADCC分析、CDC分析等)評估。
例如，吾人可產生具有經改善之C1q結合及經改善之FcγRIII結合(例如，具有經改善之ADCC活性及經改善之CDC活性兩者)之抗體之變體Fc區。或者，若需減少或消除效應功能，則變體Fc區可經改造以具有降低之CDC活性及/或降低之ADCC活性。在其他實施例中，可增加此等活性中僅一者，及視需要亦降低其他活性(例如，以產生具有經改善之ADCC活性，但降低之CDC活性之Fc區變體且反之亦然)。
經分離之單株抗體或其抗原結合片段可含有大體上均質之聚醣而無唾液酸、半乳糖或岩藻醣。上述大體上均質之聚醣可共價結合至重鏈恆定區。
單株抗體可具有新穎Fc醣化模式。Fc區之醣化通常為N-連接或O-連接。N-連接係指將醣部分結合至天冬醯胺酸殘基之側鏈。O-連接之醣化係指將糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者結合至羥基胺基酸，儘管亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸，但最常用絲胺酸或蘇胺酸。用於將醣部分酶結合至天冬醯胺酸側鏈肽序列之識別序列係天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸，其中X係除脯胺酸外之任何胺基酸。因此，多肽中存在此等肽序列產生潛在醣化位點。
醣化模式可(例如)藉由刪除多肽中發現之一或多個醣化位點，及/或添加多肽中不存在之一或多個醣化位點改變。將醣化位點添加至抗體之Fc區係藉由改變胺基酸序列使得其含有上文描述之三肽序列中之一或多者(對於N-連接之醣化位點)便利地完成。例示性醣化變體具有重鏈之殘基Asn 297之胺基酸取代。該改變亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至原始多肽之序列或替換為一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基(對於O-連接之醣化位點)作出。另外，Asn 297變為Ala可移除醣化位點中之一者。
經分離之單株抗體或其抗原結合片段可存在於由GNGN或G1/G2糖型表示之大體上均質組合物中，相較於無大體上均質GNGN糖型但具有含有G0、G1F、G2F、GNF、GNGNF或GNGNFX之糖型之相同抗體，其針對FcγRI及FcγRIII顯示增加之結合親和力。Fc醣化在治療性mAb之抗病毒及抗癌性質中發揮重要作用。核心岩藻醣之消除顯著改善由自然殺手(NK)細胞介導之mAb之ADCC活性但似乎對多形核細胞(PMN)之ADCC活性具有相反效應。
經分離之單株抗體或其抗原結合片段可表現於表現β (1,4)-N-乙醯基胺基葡萄糖胺基轉移酶III (GnT III)之細胞中，使得GnT III將GlcNAc添加至抗體。用於以此方式產生抗體之方法係提供於WO/9954342及WO/03011878中。可改變細胞系以增強或減少或消除某些轉譯後修飾，諸如醣化，使用基因體編輯技術諸如規律成簇間隔短回文重複(CRISPR)。例如，CRISPR技術可用於消除在用於表現單株抗體之293或CHO細胞中編碼醣化酶之基因。
可改造自人類B細胞獲得之抗體可變基因序列以增強其等可製造性及安全性。潛在蛋白序列庫可藉由搜索與含有以下之位點相關聯之序列基序識別： 1)     未配對之Cys殘基， 2)     N-連接之醣化， 3)     Asn脫醯胺， 4)     Asp異構化， 5)     SYE截斷， 6)     Met氧化， 7)     Trp氧化， 8)     N端麩胺酸， 9)     整合素結合， 10)   CD11c/CD18結合，或 11)   片段化 此等基序可藉由改變包含編碼抗體之cDNA之合成基因消除。
抗體可經改造以增強溶解度。例如，相較於其他殘基(諸如天冬醯胺酸、麩醯胺酸、蘇胺酸、離胺酸及精胺酸)，一些親水性殘基(諸如天冬胺酸、麩胺酸及絲胺酸)顯著更有利於蛋白質溶解度。
已廣泛進行來自血液供體之人類B細胞之B細胞庫深度定序。有關人類抗體庫之重要部分之序列資訊促進健康人類中常見之抗體序列特徵之統計評估。以有關人類重組抗體可變基因參考資料庫中抗體序列特徵之知識，可評估抗體序列之「人類相似性」 (HL)之位置特異性程度。已顯示HL適用於抗體在臨床用途中之發展，諸如治療抗體或作為疫苗之抗體。目標係增加抗體之人類相似性以減少潛在副作用及抗抗體免疫反應，其等將導致抗體-藥物之效用顯著降低或可誘導嚴重之健康影響。吾人可評估總計約4億序列之三個健康人類血液供體之組合抗體庫之抗體特性及產生新穎「相對人類相似性」 (rHL)分數，其專注於該抗體之高變區。該rHL分數容許吾人容易區分人類(陽性分數)與非人類序列(陰性分數)。抗體可經改造以消除人類庫中不常見之殘基。 J. 抗體之表徵
根據本發明之抗體首先可由其等結合特異性定義。熟習此項技術者，藉由使用熟習此項技術者熟知的技術評估給定抗體之結合特異性/親和力可確定此等抗體是否落於本申請專利範圍之範圍內。例如，給定抗體結合之抗原決定基可由位於抗原分子中之3或更多(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)個胺基酸之單一連續序列構成(例如，域中之線性抗原決定基)。或者，該抗原決定基可由位於抗原分子中之複數個非連續胺基酸(或胺基酸序列)構成(例如，構象抗原決定基)。
可使用此領域中之一般技術者已知的各種技術以確定抗體是否「與多肽或蛋白質內之一或多個胺基酸相互作用」。例示性技術包括(例如)例行性交叉阻斷分析，諸如Antibodies, Harlow及Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)中描述者。交叉阻斷可在各種結合分析諸如ELISA、生物層干涉術或表面電漿子共振中量測。其他方法包括丙胺酸掃描突變分析、肽印跡分析(Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63)、肽裂解分析、使用單粒子重構之高解析度電子顯微術技術、cryoEM或斷層攝影術、晶體學研究及NMR分析。另外，可採用諸如抗原決定基切除、抗原決定基提取及抗原之化學修飾之方法(Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496)。可用於識別與抗體相互作用之多肽內之胺基酸之另一方法係藉由質譜術偵測之氫/氘交換。一般而言，該氫/氘交換方法涉及氘標記受關注之蛋白質，接著將抗體結合至經氘標記之蛋白質。接著，將蛋白質/抗體複合物轉移至水及於受該抗體複合物保護之胺基酸內之可交換質子以比非界面一部分之胺基酸內之可交換質子更低之速率經受氘-至-氫反交換。因此，形成蛋白質/抗體界面一部分之胺基酸可保留氘及因此相較於該界面中不包括之胺基酸，顯示相對更高之質量。在該抗體解離後，靶蛋白經受蛋白酶裂解及質譜術分析，藉此揭示經氘標記之殘基，其等對應於與該抗體相互作用之特定胺基酸。參見，例如，Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259；Engen及Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A。
術語「抗原決定基」係指使B及/或T細胞反應之抗原上之位點。B細胞抗原決定基可自連續胺基酸或藉由蛋白質之三級折疊並列之非連續胺基酸兩者形成。自連續胺基酸形成之抗原決定基係通常在曝露於變性溶劑時保留，而藉由三級折疊形成之抗原決定基係通常一經用變性溶劑處理即丟失。抗原決定基通常包括至少3，及更通常，至少5或8至10個呈獨特之空間構形之胺基酸。
修飾輔助圖譜分析(MAP)，亦稱為基於抗原結構之抗體圖譜分析(ASAP)係根據各抗體對經化學或酶修飾之抗原表面之結合概況之相似性分類大量針對相同抗原之單株抗體之方法(參見US 2004/0101920，其係以全文引用之方式明確併入本文中)。各分類可反映與由另一分類表示之抗原決定基明顯不同或部分重疊之獨特抗原決定基。此技術容許快速過濾基因相同之抗體，使得表徵可集中於基因不同之抗體。當應用至雜交瘤篩選時，MAP可促進產生具有所需特性之單株抗體之罕見雜交瘤純系之識別。MAP可用於將本發明之抗體分類成結合不同抗原決定基之抗體組。
本發明包括可結合至相同抗原決定基或相同抗原決定基之部分之抗體。吾人可藉由使用此項技術中已知的例行性方法容易確定抗體是否與參考抗體結合至相同抗原決定基，或與其競爭結合。例如，為確定測試抗體是否與參考抗體結合至相同抗原決定基，容許該參考抗體在飽和條件下結合至靶分子。接著，評估測試抗體結合至該靶分子之能力。若該測試抗體在與該參考抗體飽和結合後可結合至該靶分子，則可得出結論相較於該參考抗體，該測試抗體結合至不同之抗原決定基。另一方面，若該測試抗體在與該參考抗體飽和結合後無法結合至該靶分子，則該測試抗體可結合至與該參考抗體結合之抗原決定基相同之抗原決定基。
為確定抗體是否與本文揭示之EphA10抗體競爭結合，上文描述之結合方法論係在兩個方向上進行：在第一方向上，容許本文揭示之EphA10抗體在飽和條件下結合至EphA10蛋白，接著評估該測試抗體對該EphA10蛋白之結合。在第二方向上，容許該測試抗體在飽和條件下結合至EphA10蛋白，接著評估本文揭示之EphA10抗體對該EphA10蛋白之結合。在兩個方向上，若僅第一(飽和)抗體可結合至該EphA10蛋白，則可得出結論該測試抗體及本文揭示之EphA10抗體競爭結合至EphA10。如由此領域中之一般技術者將知曉，與參考抗體競爭結合之抗體可不一定與該參考抗體結合至相同抗原決定基，但可藉由結合重疊或相鄰抗原決定基空間上阻斷該參考抗體之結合。
若各者競爭性抑制(阻斷)另一者對抗原之結合，則兩個抗體結合至相同或重疊之抗原決定基。即，如在競爭性結合分析中量測，1、5、10、20或100倍過量之一個抗體抑制另一者之結合至少50%，但較佳75%、90%或甚至99% (參見，例如，Junghans等人，Cancer Res. 1990 50:1495-1502)。或者，若減少或消除一個抗體之結合之抗原中基本上所有胺基酸突變減少或消除另一者之結合，則兩個抗體具有相同之抗原決定基。若減少或消除一個抗體之結合之一些胺基酸突變減少或消除另一者之結合，則兩個抗體具有重疊之抗原決定基。
然後，可進行另外之例行性實驗(例如，肽突變及結合分析)以證實觀測到之測試抗體之結合之缺乏事實上是否係由於與參考抗體結合至相同抗原決定基或空間阻斷(或另一現象)是否負責觀測到之結合之缺乏。此類實驗可使用ELISA、RIA、表面電漿子共振、流式細胞術或此項技術中可獲得之任何其他定量或定性抗體結合分析進行。
在另一態樣中，抗體可由其等可變序列定義，其等包括另外「框架」區。表3中提供之此等表示完整可變區。此外，該等抗體序列可不同於此等序列，視需要使用下文中更詳細討論之方法。例如，核酸序列與彼等上文列舉者之不同之處可在於：(a)可變區可與輕鏈及重鏈之恆定域分離，(b)該等核酸可不同於彼等上文列舉者同時不影響藉此編碼之殘基，(c)該等核酸可不同於彼等上文列舉者給定百分率，例如，70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性，(d)該等核酸可由於在高嚴格條件下，如由低鹽及/或高溫條件例示，諸如由約0.02 M至約0.15 M NaCl在約50℃至約70℃之溫度下提供之雜合能力而不同於彼等上文列舉者，(e)該等胺基酸可不同於彼等上文列舉者給定百分率，例如，80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性，或(f)該等胺基酸可藉由允許保守取代不同於彼等上文列舉者。
如下文描述，當比較多核苷酸及多肽序列時，若當針對最大對應比對時，兩個序列中之核苷酸或胺基酸之序列係相同的，則兩個序列視為「相同的」。兩個序列間之比較係通常藉由在比較窗口上比較該等序列進行以識別及比較序列相似性之局部區。如本文使用，「比較視窗」係指至少約20個連續位置，通常30至約75、40至約50個連續位置之片段，其中在最佳化比對兩個序列後，序列可與具有相同數量之連續部分之參考序列進行比較。
用於比較之序列之最佳化比對可使用Lasergene生物資訊軟體套件(DNASTAR，Inc.，Madison，Wis.)中之Megalign程式，使用系統內定參數進行。或者，用於比較之序列之最佳化比對可藉由Smith及Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482之局部同一性演算法、藉由Needleman及Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443之同一性比對演算法、藉由搜索Pearson及Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444之相似性方法、藉由此等演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics軟體包，Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.中之GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA)或藉由檢查進行。
適用於測定百分率序列同一性及序列相似性之演算法之一個特定實例為BLAST及BLAST 2.0 演算法，其等分別描述於Altschul等人，(1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402及Altschul等人，(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410中。BLAST及BLAST 2.0可(例如)以本文描述之參數使用，以測定本發明之多核苷酸及多肽之百分率序列同一性。用於進行BLAST分析之軟體可通過美國國家生物技術資訊中心公開獲得。抗體序列之重排性質及各基因之可變長度需針對單一抗體序列進行多輪BLAST搜索。同樣地，不同基因之手動組裝係困難且易出錯的。序列分析工具IgBLAST (在ncbi.nlm.nih.gov/igblast/下之萬維網)識別對種系V、D及J基因之匹配、於重排連接處之細節、Ig V域框架區及互補決定區之描述。IgBLAST可分析核苷酸或蛋白序列及可分批處理序列且容許同時針對種系基因資料庫及其他序列資料庫搜索以最小化可能錯失最佳匹配種系V基因之機率。
在一種方法中，「序列同一性之百分率」係藉由在至少20個位置之比較視窗上比較兩個經最佳化比對之序列測定，其中相較於用於兩個序列之最佳化比對之參考序列(其等不包含添加或刪除)，該比較視窗中之多核苷酸或多肽序列部分可包含20%或更低，通常5至15%，或10至12%之添加或刪除(即，空隙)。該百分率係藉由測定兩個序列中均出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基之位置之數量以產生匹配位置之數量，匹配位置之數量除以參考序列中位置之總數量(即，視窗尺寸)及結果乘以100以產生序列同一性之百分率進行計算。
定義抗體之又另一方法係如本文提供之抗體及其等抗原結合片段中之任何一者之「衍生物」。衍生抗體或抗體片段可藉由化學修飾使用熟習此項技術者已知的技術修飾，該等技術包括(但不限於)衣黴素之特定化學裂解、乙醯化、調配、代謝合成等。在一項實施例中，抗體衍生物將具有與親代抗體相似或相同之功能。在另一實施例中，相對於親代抗體，抗體衍生物將顯示經改變之活性。例如，相較於親代抗體，衍生抗體(或其片段)可更緊密結合至其抗原決定基或更耐蛋白水解。
術語「衍生物」係指免疫特異性結合至抗原但相對於「親代」 (或野生型)分子，包含一、二、三、四、五或更多個胺基酸取代、添加、刪除或修飾之抗體或其抗原結合片段。此等胺基酸取代或添加可引入天然生成(即，經DNA編碼)或非天然生成之胺基酸殘基。術語「衍生物」包含(例如)諸如具有經改變之CH1、鉸鏈、CH2、CH3或CH4區以便於形成(例如)具有顯示增強或受損之效應物或結合特性之變體Fc區之抗體等之變體。術語「衍生物」另外包含非胺基酸修飾，例如，可經醣化(例如，具有經改變之甘露糖、2-N-乙醯基葡萄糖胺、半乳糖、岩藻醣、葡萄糖、唾液酸、5-N-乙醯基神經胺糖酸、5-乙二醇神經胺糖酸等之內容物)、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、由已知保護/阻斷基團衍生化、蛋白水解裂解、連接至細胞配體或其他蛋白質等之胺基酸。在一些實施例中，經改變之醣修飾調節下列中之一或多者：抗體之增溶、次細胞運輸之促進及抗體之分泌、抗體組裝、構象完整性及抗體介導之效應功能之促進。在一特定實施例中，相對於缺乏醣修飾之抗體，經改變之醣修飾增強抗體介導之效應功能。導致經改變之抗體介導之效應功能之醣修飾係為此項技術中熟知。
吾人可確定抗體之生物物理性質。吾人可使用高溫使抗體展開以使用平均視熔化溫度確定相對穩定性。示差掃描熱析法(DSC)量測作為溫度之函數之分子之熱容量Cp (使其升溫所需之熱量，每度)。吾人可使用DSC以研究抗體之熱穩定性。mAb之DSC資料係尤其受關注的，因為其有時解析個別域於mAb結構內之展開，在溫度記錄圖中產生三個峰(來自Fab、CH 2及CH 3域之展開)。通常Fab域之展開產生最強峰。Fc部分之DSC概況及相對穩定性針對人類IgG1 、IgG2 、IgG3 及IgG4 子類別顯示特性差異(Garber及Demarest，Biochem. Biophys. Res. Commun. 355, 751-757, 2007)。吾人亦可使用以CD分光計進行之圓偏光二色性(CD)測定平均視熔化溫度。在0.5 nm之增量下量測抗體在200至260 nm之範圍內之遠紫外CD光譜。最終光譜可測定為20個聚集物之平均值。殘基橢圓率值可在減去背景後計算。抗體(0.1 mg/mL)之熱展開可在235 nm下自25至95℃及在1℃/min之加熱速率下監測。吾人可使用動態光散射(DLS)評估聚集物之傾向。DLS係用於表徵各種粒子(包括蛋白質)之尺寸。若系統在尺寸上未分散，則可測定粒子之平均有效直徑。此量測取決於粒子核之尺寸、表面結構之尺寸及粒子濃度。由於DLS基本上量測由於粒子造成之散射光強度之波動，因此可量測該等粒子之擴散係數。商業DLA儀器中之DLS軟體顯示在不同直徑下之粒子群體。穩定性研究可使用DLS便利地進行。樣本之DLS量測可藉由測定粒子之流體動力學半徑是否增加顯示該等粒子是否經時或隨溫度變化聚集。若粒子聚集，則吾人可見具有較大半徑之粒子之較大群體。取決於溫度之穩定性可藉由原位控制溫度分析。毛細管電泳(CE)技術包括用於確定抗體穩定性之特徵之行之有效之方法論。吾人可使用iCE方法解析由於可導致蛋白質pI變化之該蛋白質之脫醯胺、C端離胺酸、唾液酸化、氧化、醣化及任何其他變化產生之抗體-蛋白質電荷變體。經表現之抗體蛋白中之各者可由毛細管柱(cIEF)中之高通量、自由溶液等電聚焦(IEF)，使用Protein Simple Maurice儀器評估。全柱UV吸收偵測可每30秒進行一次以即時監測在等電點(pI)下聚焦之分子。此方法組合傳統凝膠IEF之高解析度及基於管柱之分離中發現之定量及自動化之優勢，同時消除對移動步驟之需求。該技術針對經表現之抗體產生同一性、純度及異質性概況之可再現、定量分析。結果針對抗體識別電荷異質性及分子尺寸，以吸光度及天然螢光偵測模式及偵測之靈敏度降至0.7 µg/mL。
吾人可確定抗體序列之固有溶解度分數。該等固有溶解度分數可使用CamSol Intrinsic計算(Sormanni等人，J Mol Biol 427, 478-490, 2015)。各抗體片段(諸如scFv)之HCDR3中殘基95至102 (Kabat編號)之胺基酸序列可經由線程式評估以計算溶解度分數。吾人亦可使用實驗室技術測定溶解度。存在各種技術，包括將凍乾蛋白添加至溶液，直至該溶液變得飽和並藉由超濾在微濃縮器中以合適之分子量截止點達成溶解度臨限值或濃度。最簡單方法係誘導非晶型沈澱，其使用涉及使用硫酸銨之蛋白質沈澱之方法量測蛋白質溶解度(Trevino等人，J Mol Biol, 366: 449-460, 2007)。硫酸銨沈澱給出有關相對溶解度值之快速且準確之資訊。硫酸銨沈澱產生水相及固相界限清晰之沈澱溶液及需相對少量之蛋白質。使用由硫酸銨誘導非晶型沈澱進行之溶解度量測亦可在不同pH值下容易地進行。蛋白質溶解度係高度pH依賴性的，且pH視為影響溶解度之最重要之外在因素。
一般而言，據認為自體反應性純系應在個體發生期間藉由陰性選擇消除；然而，已變得很明顯具有自體反應性性質之許多人類天然生成之抗體仍留存於成人成熟庫中，及該自體反應性可增強許多抗體對病原體之抗病毒功能。已注意到在早期B細胞發展期間抗體中之HCDR3環通常富含正電荷及顯示自體反應性模式(Wardemann等人，Science 301, 1374-1377, 2003)。吾人可藉由在顯微術(使用黏附之HeLa或HEp-2上皮細胞)及流式細胞術細胞表面染色(使用懸浮Jurkat T細胞及293S人類胎腎細胞)中評估對人類起源細胞之結合程度測試給定抗體之自體反應性。自體反應性亦可使用在組織陣列中評估對組織之結合調查。 III.   嵌合抗原受體
嵌合抗原受體(CAR)分子係重組融合蛋白及特徵在於其等能夠結合抗原並經由其等細胞質尾中存在之免疫受體活化基序(ITAM)轉導活化信號以活化經基因修飾之免疫效應細胞用於殺死、增生及細胞介素產生。利用抗原結合部分(例如，自單鏈抗體(scFv)產生)之受體構築體提供變得「通用」之另外優勢在於其等以HLA獨立性方式結合靶細胞表面上之天然抗原。
本文描述之CAR之實施例包括編碼抗原特異性CAR多肽之核酸，該抗原特異性CAR多肽包含細胞內傳訊域、跨膜域及包含抗原結合域之細胞外域。CAR可識別在一或多個抗原間包含共用空間之抗原決定基。視需要，CAR可包含位於跨膜域與抗原結合域之間之鉸鏈域。CAR可進一步包含將該CAR之表現引導至細胞表面之信號肽。例如，CAR可包含來自GM-CSF之信號肽。CAR亦可與膜結合之細胞介素共表現以改善持久性。例如，CAR可與膜結合之IL-15共表現。
取決於CAR域之排佈及該等域中使用之特定序列，表現該CAR之免疫效應細胞可針對靶細胞具有不同之活性程度。可將不同之CAR序列引入免疫效應細胞內以產生經改造細胞，針對高SRC選擇該等經改造細胞，及測試該等經選擇之細胞之活性以識別經預測具有最大治療效用之CAR構築體。
儘管較佳嵌合抗原受體係使用重組DNA技術產生，但其可藉由此項技術中已知的任何方式產生。編碼該嵌合抗原受體之幾個區之核酸序列可經製備並藉由分子選殖之標準技術(基因體庫篩選、PCR、引子輔助連接、來自酵母及細菌之scFv庫、定點誘變等)組裝至完整編碼序列內。所得編碼區可插入表現載體內並用於轉化合適之表現宿主同種異體或自體免疫效應細胞，諸如T細胞或NK細胞。
嵌合構築體可作為裸DNA或在合適之載體中引入免疫效應細胞內。藉由電穿孔使用裸DNA穩定轉染細胞之方法係為此項技術中已知。參見，例如，美國專利第6,410,319號。裸DNA一般係指在適用於表現之方向上編碼質體表現載體中含有之嵌合受體之DNA。或者，可使用病毒載體(例如，逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或慢病毒載體)以將嵌合構築體引入免疫效應細胞內。適用於根據本發明之方法之載體在免疫效應細胞中係非複製的。已知許多載體係基於病毒的，其中維持在細胞中之病毒之拷貝數足夠低至維持該細胞之存活率，諸如，舉例而言，基於HIV、SV40、EBV、HSV或BPV之載體。 A.     抗原結合域
抗原結合域可包含單株抗體之互補決定區、單株抗體之可變區及/或其抗原結合片段。抗原結合區或域可包含來源於特定小鼠、人類或人類化單株抗體之單鏈可變片段(scFv)之VH及VL鏈之片段。該片段亦可為任何數量之抗原特異性抗體之不同抗原結合域。該片段可為由針對人類密碼子用法以在人類細胞中表現最佳化之序列編碼之抗原特異性scFv。在某些態樣中，CAR之VH及VL域係由連接子序列(諸如Whitlow連接子)隔開。
原型CAR編碼包含來源於一個單株抗體(mAb)之VH及VL域，偶合至跨膜域及一或多個細胞質傳訊域(例如，共刺激域及傳訊域)之scFv。因此，CAR可包含結合至EphA10之抗體之LCDR1-3序列及HCDR1-3序列。在其他態樣中，然而，結合至受關注之抗原之兩個或更多個抗體係經識別及CAR係經構築，包含：(1)結合至該抗原之第一抗體之HCDR1-3序列；及(2)結合至該抗原之第二抗體之LCDR1-3序列。包含來自兩個不同抗原結合抗體之HCDR及LCDR序列之此CAR可具有優先結合至抗原之特定構型(例如，相比於正常組織，優先與癌細胞相關聯之構型)之優勢。
或者，CAR可使用來源於不同mAb之VH及VL鏈改造以產生一組CAR+免疫效應細胞。CAR之抗原結合域可含有第一抗體之LCDR1-3序列及第二抗體之HCDR1-3序列之任何組合。 B.     鉸鏈域
CAR多肽可包括鉸鏈域位於抗原結合域與跨膜域之間。在一些情況下，鉸鏈域可包括於CAR多肽中以在抗原結合域與細胞表面之間提供足夠之距離或減輕可不利影響CAR修飾之免疫效應細胞之抗原結合或效應功能之可能之空間位阻。該鉸鏈域可包含結合至Fc受體(諸如FcγR2a或FcγR1a)之序列。例如，該鉸鏈序列可包含來自結合至Fc受體之人類免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE)之Fc域。
CAR鉸鏈域可來源於人類免疫球蛋白(Ig)恆定區或其部分(包括Ig鉸鏈)，或來源於人類CD8 α跨膜域及CD8a-鉸鏈區。CAR鉸鏈域可包含抗體同型IgG4之鉸鏈-CH2 -CH3 區。該鉸鏈域(及/或CAR)可不包含野生型人類IgG4 CH2及CH3序列。可將點突變引入抗體重鏈CH2 域中以減少CAR修飾之免疫效應細胞之醣化及非特異性Fc γ受體結合。
CAR鉸鏈域可包含相對於野生型Ig Fc域包含減少Fc-受體結合之至少一個突變之Ig Fc域。例如，該CAR鉸鏈域可包含相對於野生型IgG4-Fc域包含減少Fc-受體結合之至少一個突變之IgG4-Fc域。CAR鉸鏈域可包含相對於野生型IgG4-Fc序列，在對應於L235及/或N297之位置具有突變(諸如胺基酸刪除或取代)之IgG4-Fc域。例如，CAR鉸鏈域可包含相對於野生型IgG4-Fc序列具有L235E及/或N297Q突變之IgG4-Fc域。CAR鉸鏈域可包含於位置L235具有胺基酸取代親水性胺基酸(諸如R、H、K、D、E、S、T、N或Q)或與「E」具有相似性質之胺基酸之IgG4-Fc域(諸如D)。CAR鉸鏈域可包含具有於位置N297胺基酸取代與「Q」具有相似性質之胺基酸之IgG4-Fc域(諸如S或T)。
鉸鏈域可包含與IgG4鉸鏈域、CD8a鉸鏈域、CD28鉸鏈域或經改造鉸鏈域具有約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。 C.     跨膜域
抗原特異性細胞外域及細胞內傳訊域可由跨膜域連接。可用作跨膜域之一部分之多肽序列包括(但不限於)人類CD4跨膜域、人類CD28跨膜域、跨膜人類CD3ζ域、半胱胺酸突變之人類CD3ζ域或來自其他人類跨膜傳訊蛋白(諸如CD16、CD8)及促紅細胞生成素受體之其他跨膜域。例如，該跨膜域可包含與彼等美國專利公開案第2014/0274909號(例如，CD8及/或CD28跨膜域)或美國專利案第8,906,682號(例如，CD8α跨膜域)中揭示者中之一者具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列，該等公開案及專利案均以引用之方式併入本文中。跨膜區可來源於(即，包含至少以下之跨膜區) T細胞受體(CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154)之α、β或ζ鏈。在某些特定態樣中，該跨膜域可與CD8a跨膜域或CD28跨膜域具有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。 D.     細胞內傳訊域
CAR之細胞內傳訊域負責活化經改造以表現該CAR之免疫細胞之正常效應功能中之至少一者。術語「效應功能」係指分化細胞之專業功能。T細胞之效應功能(例如)可為溶細胞活性或輔助活性，包括細胞介素之分泌。原始、記憶或記憶型T細胞中之效應功能包括抗原依賴性增生。因此術語「細胞內傳訊域」係指蛋白質之一部分，其轉導效應功能信號並引導細胞進行專業功能。該細胞內傳訊域可來源於天然受體之細胞內傳訊域。此等天然受體之實例包括T細胞受體之ζ鏈或其同源物中之任何一者(例如，β、δ、γ或ε)、MB1鏈、B29、Fc RIII、Fc RI，及傳訊分子之組合，諸如CD3ζ及CD28、CD27、4-1BB/CD137、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12、CD40、OX40/CD134及其組合，及其他相似分子及片段。可使用活化蛋白之家族之其他成員之細胞內傳訊部分。
儘管可採用整個細胞內傳訊域，但在許多情況下將未必需要使用整個細胞內多肽。在一定程度上可使用細胞內傳訊域之截斷部分，此截斷部分可替代完整鏈使用，只要其仍轉導效應功能信號。因此術語「細胞內傳訊域」意謂包括一經CAR結合至標靶，即足以轉導效應功能信號之細胞內傳訊域之截斷部分。可採用一或多個細胞質域，因為所謂之第三代CAR具有針對加性或協同效應融合在一起之至少二或三個傳訊域，例如CD28及4-1BB可組合於CAR構築體中。在某些特定態樣中，該細胞內傳訊域包含與CD3ζ細胞內域、CD28細胞內域、CD137細胞內域或包含融合至4-1BB細胞內域之CD28細胞內域之域具有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。 E.     免疫效應細胞
免疫效應細胞可為T細胞(例如，調節T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或γ-δ T細胞)、自然殺手(NK)細胞、不變之NK細胞或NKT細胞。本文亦提供產生並改造該等免疫效應細胞之方法及針對過繼細胞療法使用並投與該等細胞之方法，在此情況下該等細胞可為自體或同種異體的。因此，該等免疫效應細胞可用作免疫療法，諸如以靶向癌細胞。
免疫效應細胞可自受試者(尤其人類受試者)分離。該等免疫效應細胞可自受關注之受試者，諸如疑似患有特定疾病或病症之受試者、疑似具有患有特定疾病或病症之傾向之受試者、正經歷針對特定疾病或病症之療法之受試者、為健康志願者或健康供體之受試者獲得，或自血庫獲得。免疫效應細胞可自存在於受試者中之任何組織或器官(包括(但不限於)血液、臍帶血、脾、胸腺、淋巴結、骨髓、在手術過程中移除及/或曝露之組織及經由生檢程序獲得之組織)收集、富集及/或純化。經分離之免疫效應細胞可直接使用，或其等可儲存一段時間，諸如藉由冷凍。
富集、分離及/或純化免疫效應細胞之組織/器官可自活體及非活體受試者分離，其中該等非活體受試者為器官供體。自臍帶血分離之免疫效應細胞可具有增強之免疫調節能力，諸如藉由CD4-或CD8陽性T細胞抑制量測。該等免疫效應細胞可自混合血液，尤其混合臍帶血分離，用於增強免疫調節能力。該混合血液可來自2個或更多個來源，諸如3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個來源(例如，供體受試者)。
免疫細胞之群體可自需此療法或罹患與降低之免疫效應細胞活性相關聯之疾病之受試者獲得。因此，該等細胞對需此療法之受試者而言將係自體的。或者，免疫效應細胞之群體可自供體，較佳同種異體供體獲得。同種異體供體細胞可或可不與人類-白血球-抗原(HLA)相容。為與受試者相容，同種異體細胞可經處理以降低免疫原性。 1.  T細胞
免疫效應細胞可為T細胞。該等T細胞可來源於血液、骨髓、淋巴、臍帶或淋巴器官。該等T細胞可為人類T細胞。該等T細胞通常為原代細胞，諸如彼等直接自受試者分離及/或自受試者分離並冷凍者。該等細胞可包括T細胞或其他細胞類型之一或多種子集，諸如全T細胞群體、CD4+ 細胞、CD8+ 細胞，及其子群體，諸如彼等由功能、活化狀態、成熟度、分化潛力、擴增、再循環、定位、持久能力、抗原-特異性、抗原受體之類型、特定器官或隔室中之存在、標誌物或細胞介素分泌概況及/或分化程度定義者。參考待治療之受試者，該等細胞可為同種異體及/或自體的。就現有技術而言，該等細胞可來源於分化多能及/或多潛能細胞，諸如幹細胞，諸如誘導分化多能幹細胞(iPSC)。
T細胞(例如，CD4+ 及/或CD8+ T細胞)之子類型及子群體為原始T (TN )細胞、效應T細胞(TEFF )、記憶T細胞及其子類型，諸如幹細胞記憶T (TSCM )、中央記憶T (TCM )、效應記憶T (TEM )，或終末分化之效應記憶T細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、未成熟之T細胞、成熟T細胞、輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變之T (MAIT)細胞、天然生成及過繼調節T (Treg)細胞、輔助性T細胞，諸如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助性T細胞、α/β T細胞及δ/γ T細胞。
可富集或消除T細胞群體中之一或多者中之針對對於特定標誌物(諸如表面標誌物)呈陽性或對於特定標誌物呈陰性之細胞。在一些情況下，此等標誌物係彼等在T細胞之某些群體(例如，非記憶細胞)上不存在或以相對較低含量表現但在T細胞之某些其他群體(例如，記憶細胞)上存在或以相對較高含量表現者。
藉由在非T細胞(諸如B細胞、單核球或其他白血球(諸如CD14))上所表現之標誌物之陰性選擇技術，可自PBMC樣本分離出T細胞。在一些態樣中，使用CD4+ 或CD8+ 選擇步驟以分離CD4+ 輔助性及CD8+ 細胞毒性T細胞。此等CD4+ 及CD8+ 群體可藉由陽性或陰性選擇一或多個原始、記憶及/或效應T細胞子群體上所表現或表現至相對較高程度之標誌物進一步分為子群體。
可諸如藉由基於與個別子群體相關聯之表面抗原之陽性或陰性選擇，進一步富集或消除CD8+ T細胞中之原始、中央記憶、效應記憶及/或中央記憶幹細胞。可進行中央記憶T (TCM )細胞之富集以增加效用，諸如以改善投與後之長期存活、擴增及/或移植，在一些態樣中，此在此等子群體中尤為穩健。
T細胞可為自體T細胞。在此方法中，自病患獲得腫瘤樣本並獲得單一細胞懸浮液。該單一細胞懸浮液可以任何合適之方式獲得，例如，機械方式(使用(例如) gentleMACS™解離器，Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.分解腫瘤)或酶方式(例如，膠原酶或DNase)。將腫瘤酶消化物之單一細胞懸浮液培養在介白素-2 (IL-2)中培養。培養該等細胞直至匯合(例如，約2×106 個淋巴細胞)，例如，約5至約21天，較佳約10至約14天。
經培養之T細胞可合併並快速擴增。快速擴增在約10至約14天提供抗原特異性T細胞之數量增加至少約50倍(例如，50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更大)。更佳地，快速擴增在約10至約14天內提供至少約200倍(例如，200、300、400、500、600、700、800、900倍或更大)之增加。
擴增可藉由如此項技術中已知的許多方法中之任何一者完成。例如，利用非特異性T細胞受體刺激在飼養淋巴細胞及介白素-2 (IL-2)或介白素-15 (IL-15) (IL-2較佳)之存在下可迅速擴增T細胞。該非特異性T細胞受體刺激可包括約30 ng/ml OKT3，一種小鼠單株抗CD3抗體(購買自Ortho-McNeil®, Raritan, N.J.)。或者，T細胞可藉由以癌症之一或多個抗原(包括其抗原部分，諸如抗原決定基，或細胞)活體外刺激外周血單核細胞(PBMC)迅速擴增，抗原可視需要自載體諸如人類白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，在T細胞生長因子(諸如300 IU/ml IL-2或IL-15 (IL-2較佳))之存在下表現。活體外誘導之T細胞係藉由以脈衝至表現HLA-A2之抗原呈遞細胞上之癌症之相同抗原再刺激迅速擴增。或者，該等T細胞可用例如經輻射之自體淋巴細胞或用經輻射之HLA-A2+同種異體淋巴細胞及IL-2再刺激。
自體T細胞可經修飾以表現促進該等自體T細胞之生長及活化之T細胞生長因子。合適之T細胞生長因子包括(例如)介白素(IL)-2、IL-7、IL-15及IL-12。合適之修飾方法係為此項技術中已知。參見，例如，Sambrook等人，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，第3版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001；及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994。在特定態樣中，經修飾之自體T細胞表現高含量的T細胞生長因子。T細胞生長因子編碼序列諸如IL-12之T細胞生長因子編碼序列及啟動子在此項技術中可容易獲得，其等對T細胞生長因子編碼序列之可操作鍵聯促進高含量表現。 2.  NK細胞
免疫效應細胞可為自然殺手(NK)細胞。自然殺手(NK)細胞係針對各種腫瘤細胞、受病毒感染之細胞，及骨髓及胸腺中之一些正常細胞具有自發細胞毒性之淋巴細胞之子群體。NK細胞係針對經轉形及受病毒感染之細胞之早期先天免疫反應之關鍵效應物。NK細胞構成人類外周血中約10%之淋巴細胞。當在介白素2 (IL-2)之存在下培養淋巴細胞時，發展強細胞毒性反應性。NK細胞因為其等較大尺寸及特性嗜苯胺藍顆粒存在於其等細胞質中所以係稱為大顆粒淋巴細胞之效應細胞。NK細胞在骨髓、淋巴結、脾、扁桃腺及胸腺中分化及成熟。NK細胞可在人類中根據特定表面標誌物(諸如CD16、CD56及CD8)偵測到。NK細胞不表現T細胞抗原受體、泛T標誌物CD3或表面免疫球蛋白B細胞受體。
NK細胞之刺激係通過來源於細胞表面活化及抑制受體之信號之串擾達成。NK細胞之活化狀態係藉由自一系列經種系編碼之活化及抑制受體接收之細胞內信號之平衡調節。當NK細胞遇到異常細胞(例如，腫瘤或受病毒感染之細胞)且活化信號佔主導時，該等NK細胞可通過定向分泌含有穿孔素及粒子酶之溶細胞顆粒或參與含有死亡域之受體迅速誘導靶細胞之凋亡。經活化之NK細胞亦可分泌I型細胞介素，諸如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，其等活化先天及過繼免疫細胞及其他細胞介素。由NK細胞在早期先天免疫反應中產生此等溶性因子顯著影響其他造血細胞之募集及功能。同樣地，通過物理接觸及細胞介素之產生，NK細胞係具有樹突狀細胞及中性粒細胞之調節串擾網路中之核心參與者以促進或抑制免疫反應。
NK細胞可藉由此項技術中熟知的方法來源於人類外周血單核細胞(PBMC)、未受刺激之白細胞分離術產品(PBSC)、人類胚胎幹細胞(hESC)、經誘導之分化多能幹細胞(iPSC)、骨髓或臍帶血。在某些態樣中，該等NK細胞係經離體分離及擴增。例如，CB單核細胞可藉由聚蔗糖密度梯度離心分離並在具有IL-2及人造抗原呈遞細胞(aAPC)之生物反應器中培養。7天後，該細胞培養物可消除表現CD3之任何細胞並再培養另外7天。該等細胞可再次消除CD3並經表徵以測定CD56+ /CD3- 細胞或NK細胞之百分率。在其他方法中，臍帶CB可用於藉由CD34+ 細胞之分離並藉由在含有SCF、IL-7、IL-15及IL-2之培養基中培養分化為CD56+ /CD3- 細胞來衍生NK細胞。 F.     免疫效應細胞之改造
免疫效應細胞(例如，自體或同種異體T細胞(例如，調節T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或γ-δ T細胞)、NK細胞、不變之NK細胞或NKT細胞)可經基因改造以表現抗原受體諸如嵌合抗原受體(CAR)。例如，宿主細胞(例如，自體或同種異體T細胞)可經修飾以表現針對EphA10具有抗原特異性之CAR。在特定實施例中，NK細胞係經改造以表現CAR。可將多個CAR (諸如針對不同抗原之CAR)添加至單一細胞類型(諸如T細胞或NK細胞)。
細胞可包含經由基因改造引入以編碼一或多個抗原受體之一或多個核酸，及此等核酸之基因改造產物。該等核酸可為異源性的，即，正常不存在於細胞或自細胞獲得之樣本中，諸如自另一有機體或細胞獲得者，例如，其不為改造中之細胞及/或此細胞來源之有機體中通常發現的。該等核酸可不為天然生成的，諸如非天然存在之核酸(例如，嵌合)。 IV.    醫藥調配物
本發明提供包含選擇性靶向EphA10之抗體之醫藥組合物。此等組合物包含預防或治療有效量之抗體或其片段及醫藥上可接受之載劑。本文亦提供包含表現CAR之免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物及調配物。
片語「醫藥上或藥理上可接受」係指當視需要向動物(諸如人類)投與時，不產生不利、過敏或其他不良反應之分子實體及組合物。鑒於本發明，熟習此項技術者應知曉包含抗體或另外活性成分之醫藥組合物之製備。此外，對於動物(例如，人類)投與，應瞭解製劑應滿足如FDA生物標準辦公室要求之無菌、熱原性、一般安全及純度標準。
如本文使用，「醫藥上可接受之載劑」包括任何及所有水性溶劑(例如，水、酒精/水溶液、食鹽水溶液、非經腸媒劑，諸如氯化鈉、林格氏葡萄糖等)、非水性溶劑(例如、丙二醇、聚乙二醇、植物油及可注射有機酯，諸如油酸乙酯)、分散介質、塗料、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如、抗菌劑或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、藥物、藥物穩定劑、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、流體及營養補充劑，諸如此項技術中之一般技術者已知的材料及其組合。醫藥組合物中之各種組分之pH及精確濃度係根據熟知參數調節。
活性成分可經調配用於非經腸投與，例如，經調配用於經由靜脈內、肌內、皮下或甚至腹膜內途徑注射。通常，此等組合物可製備成液體溶液或懸浮液；倘若在注射前添加液體，則亦可製備適用於製備溶液或懸浮液之固體形式；且亦可乳化該等製劑。
本發明實施例之治療組合物係以可注射組合物之形式(諸如液體溶液或懸浮液)有利地投與；亦可製備適用於在注射前溶於或懸浮於液體中之固體形式。亦可乳化此等製劑。
適用於可注射用途之醫藥形式包括無菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇之調配物；及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。在所有情況下，該形式必須為無菌的且必須流動至其可容易注射之程度。其在製造及儲存之條件下亦應為穩定的及必須針對微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用防腐。
蛋白質組合物可調配成中性或鹽形式。醫藥上可接受之鹽包括酸加成鹽(與該蛋白質之游離胺基形成)及其等係與無機酸形成，諸如，例如，鹽酸或磷酸，或與諸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸及類似物之有機酸形成。與游離羧基形成之鹽亦可來源於無機鹼，諸如，例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，及諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因及類似物之有機鹼。
醫藥組合物可包括溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及類似物)，其合適之混合物，及植物油。適當之流動性可(例如)藉由使用塗料(諸如卵磷脂)、在分散液之情況下藉由維持所需粒度，及藉由使用表面活性劑維持。微生物之作用之預防可由各種抗菌劑及抗真菌劑，例如，對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及類似物實現。在許多情況下，其將較佳包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收之藥劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)實現。
組合物視需要亦可含有少量潤濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。此等組合物可採取溶液、懸浮液、乳液，錠劑、丸劑、膠囊、粉末、持續釋放調配物及類似物之形式。經口調配物可包括標準載劑諸如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適藥劑之實例係描述於Remington’s Pharmaceutical Sciences中。此等組合物將含有預防或治療有效量之抗體或其片段，較佳以純化形式，連同合適量之載劑一起，以便於提供適用於向病患投與之形式。
抗體之被動轉移一般涉及使用靜脈內或肌內注射。抗體之形式可為單株抗體。此免疫一般持續僅較短時間，及亦存在過敏反應及血清病之潛在風險，尤其來自非人類起源之γ球蛋白。該等抗體將調配於適用於注射之載劑(即，無菌且可注射的)中。
一般而言，本發明之組合物之成分係單獨或以單位劑型混合在一起供應，例如，作為乾燥凍乾粉或無水濃縮物於密封容器(諸如指示活性劑之量之安瓿或小藥囊)中。在該組合物待藉由輸注投與之情況下，其可以含有無菌醫藥級水或生理鹽水之輸注瓶分配。在該組合物係藉由注射投與之情況下，可提供注射用無菌水或生理鹽水之安瓿使得可在投與前混合成分。
在某些實施例中，醫藥組合物可包含(例如)至少約0.1%之活性成分。在其他實施例中，活性成分可包含約2重量%至約75重量%之單位，或約25%至約60%，例如，及其中可推導之任何範圍。
術語「單位劑量」或「劑量」係指適用於受試者中之物理離散單位，各單位含有經計算產生與其投與(即，適當之途徑及治療方案)相關聯之上文討論之所需反應之預定量治療組合物。待投與之量根據治療之數量及單位劑量兩者取決於所需效應。向病患或受試者投與之本發明實施例之組合物之實際劑量可由物理及生理因素確定，諸如該受試者之體重、年齡、健康及性別、治療中之疾病之類型、疾病滲透之程度、先前或同時進行之治療干預、該病患之自發症、投與途徑及特定治療物質之效用、穩定性及毒性。例如，劑量亦可包含每次投與約1 μg/kg/體重至約1000 mg/kg/體重 (此範圍包括中間劑量)或更多，及其中可推導之任何範圍。在自本文列舉之數字推導之範圍之非限制性實例中，可投與約5 μg/kg/體重至約100 mg/kg/體重，約5 μg/kg/體重至約500 mg/kg/體重等之範圍。在任何情況下，負責投與之醫師將確定組合物中活性成分之濃度及適用於個別受試者之劑量。 V.          治療方法
本發明實施例之某些態樣可用於預防或治療與EphA10含量升高相關聯之疾病或疾患，諸如癌症，諸如肺癌、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌、乳癌或卵巢癌。EphA10發揮作用可減少任何合適之藥物。較佳地，此等物質將為抗EphA10抗體、EphA10特異性CAR T細胞或EphA10特異性CAR NK細胞。
「治療(Treatment)及(treating)」係指出於獲得疾病或健康相關病症之治療益處之目的，向受試者投與或施用治療劑或對受試者進行程序或方式。例如，治療可包括投與醫藥上有效量之靶向EphA10之抗體，單獨或與化學療法、免疫療法或放射療法、進行手術或其任何組合之投與組合。
如本文使用之術語「受試者」係指其中進行標的方法之任何個體或病患。一般而言，該受試者為人類，儘管如由彼等熟習此項技術者將知曉，受試者可為動物。因此，其他動物，包括哺乳動物，諸如嚙齒動物(包括小鼠、大鼠、倉鼠及豚鼠)、貓、狗、兔、農場動物(包括奶牛、馬、山羊、綿羊、豬等)、及靈長類動物(包括猴、黑猩猩、猩猩及大猩猩)係包括於受試者之定義內。
如整個本申請案中使用之術語「治療益處」或「治療有效」係指促進或增強受試者關於此病症之醫療之福祉之任何一者。此包括(但不限於)疾病之徵象或症狀之頻率或嚴重性之減小。例如，癌症之治療可涉及(例如)腫瘤尺寸之減小、腫瘤侵入力之減小、癌症生長速率之減小或轉移之預防。癌症之治療亦可係指延長患有癌症之受試者之存活。
如本文使用，術語「癌症」可用於描述實體瘤、轉移性癌症或非轉移性癌症。在某些實施例中，該癌症可起源於膀胱、血、骨、骨髓、腦、乳房、結腸、食管、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、牙齦、頭、腎、肝、肺、鼻咽、頸、卵巢、胰、前列腺、皮膚、胃、睪丸、舌或子宮。
癌症可具體為以下組織學類型，但其不限於此等：贅瘤，惡性；癌；癌，未分化；巨細胞及梭形細胞癌；小細胞癌；乳頭狀癌；鱗狀細胞癌；淋巴上皮癌；基底細胞癌；毛母質癌；移行細胞癌；乳頭狀移行細胞癌；腺癌；胃泌素瘤，惡性；膽管癌；肝細胞癌；合併肝細胞癌及膽管癌；小梁腺癌；腺樣囊性癌；腺瘤性息肉中之腺癌；腺癌、家族性息肉病；實體癌；類癌瘤，惡性；鰓泡狀腺癌；乳頭狀腺癌；嫌色細胞癌；嗜酸細胞癌；嗜酸腺癌；嗜鹼細胞癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾泡腺癌；乳頭狀及濾泡腺癌；非包膜硬化性癌；腎上腺皮質癌；子宮內膜癌；皮膚附屬器癌；頂泌腺癌；皮脂腺癌；宮頸腺癌；黏液表皮樣癌；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀漿液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；印戒細胞癌；浸潤性導管癌；髓樣癌；小葉癌；炎性癌；佩吉特病(paget’s disease)，乳房；腺泡細胞癌；腺鱗狀癌；腺癌w/鱗狀化生；胸腺瘤，惡性；卵巢間質腫瘤，惡性；鞘細胞瘤，惡性；粒膜細胞瘤，惡性；及成骨細胞瘤，惡性；塞爾托利細胞癌(sertoli cell carcinoma)；萊迪希細胞瘤(leydig cell tumor)，惡性；脂質細胞瘤，惡性；副神經節瘤，惡性；乳腺外副神經節瘤，惡性；嗜鉻細胞瘤；血管球肉瘤；惡性黑色素瘤；無黑色素黑色瘤；淺表擴散性黑色素瘤；巨大色素痣中之惡性黑色素瘤；上皮樣細胞黑素瘤；藍痣，惡性；肉瘤；纖維肉瘤；纖維性組織細胞瘤，惡性；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；肺泡橫紋肌肉瘤；間質肉瘤；混合瘤，惡性；苗勒氏混合瘤；腎母細胞瘤；肝母細胞瘤；癌肉瘤；間葉瘤，惡性；布倫納瘤(brenner tumor)，惡性；葉狀瘤，惡性；滑膜肉瘤；間皮瘤，惡性；無性細胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，惡性；卵巢甲狀腺瘤，惡性；絨毛膜癌；中腎瘤，惡性；血管肉瘤；血管內皮瘤，惡性；卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma)；血管外皮細胞瘤，惡性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮質骨肉瘤；軟骨肉瘤；軟骨母細胞瘤，惡性；間充質軟骨肉瘤；骨巨細胞瘤；尤文氏肉瘤(ewing’s sarcoma)；牙源性腫瘤，惡性；釉質成牙本質肉瘤；成釉細胞瘤，惡性；成釉細胞纖維肉瘤；松果體瘤，惡性；脊索瘤；膠質瘤，惡性；室管膜瘤；星形細胞瘤；原生質星形細胞瘤；纖維狀星形細胞瘤；星形母細胞瘤；膠質母細胞瘤；少突膠質細胞瘤；少突膠質母細胞瘤；原始神經外胚層；小腦肉瘤；神經節細胞瘤；神經母細胞瘤；視網膜母細胞瘤；嗅神經源性腫瘤；腦膜瘤，惡性；神經纖維肉瘤；神經鞘瘤，惡性；顆粒細胞瘤，惡性；惡性淋巴瘤；霍奇金氏病(hodgkin’s disease)；霍奇金氏；副肉芽腫；惡性淋巴瘤，小淋巴細胞；惡性淋巴瘤，大細胞，擴散性；惡性淋巴瘤，濾泡性；蕈樣肉芽腫；其他特定非霍奇金氏淋巴瘤；惡性組織細胞增多症；多發性骨髓瘤；肥大細胞肉瘤；免疫增生性小腸疾病；白血病；淋巴性白血病；漿細胞白血病；紅白血病；淋巴肉瘤細胞白血病；骨髓性白血病；嗜鹼性白血病；嗜酸性粒細胞白血病；單核球白血病；肥大細胞白血病；巨核母細胞白血病；髓樣肉瘤；及毛細胞白血病。然而，亦知曉本發明亦可用於治療非癌性疾病(例如，真菌感染、細菌感染、病毒感染、神經退行性疾病及/或遺傳性疾病)。
在某些實施例中，本發明實施例之組合物及方法涉及針對EphA10之抗體或抗體片段，與第二或另外療法(諸如化學療法或免疫療法)組合。此療法可用於治療與高EphA10相關聯之任何疾病。例如，該疾病可為癌症。
方法及組合物(包括組合療法)增強治療或保護效應，及/或增加另一抗癌或抗過度增生療法之治療效應。治療性及預防性方法及組合物可以有效達成所需效應(諸如殺死癌細胞及/或抑制細胞增生)之組合量提供。此方法可涉及使細胞與抗體或抗體片段及第二療法接觸。組織、腫瘤或細胞可與一或多種包含該等藥劑(即，抗體或抗體片段或抗癌劑)中之一或多者之組合物或醫藥調配物接觸，或藉由使該組織、腫瘤及/或細胞與兩種或更多種不同之組合物或調配物接觸，其中一種組合物提供1)抗體或抗體片段，2)抗癌劑，或3)抗體或抗體片段及抗癌劑。同樣地，經考慮此組合療法可結合化學療法、放射療法、手術療法或免疫療法一起使用。
當應用至細胞時，本文使用術語「接觸」及「曝露」以描述將治療構築體及化學治療或放射治療劑遞送至標靶細胞或與該靶細胞直接相鄰放置之方法。為達成殺死細胞，例如，兩種藥劑係以有效殺死細胞或防止其分裂之組合量遞送至該細胞。
抗體可相對於抗癌治療之前、期間、之後或以各種組合投與。該等投與可在同時至分鐘至數天至數週之範圍內變化之間隔內。在抗體或抗體片段與抗癌劑分開提供給病患之實施例中，吾人將大體上確保顯著之期間不在各遞送時間之間失效，使得兩種化合物將仍可對病患發揮有利組合之效應。在此等實例中，經考慮吾人可於彼此之約12至24或72 h內，且更特定言之，於彼此之約6至12 h內向病患提供抗體療法及抗癌療法。在一些情況下，可需顯著延長治療之期間，個別投與之間間隔數天(2、3、4、5、6或7)至數週(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在某些實施例中，治療過程將持續1至90天或以上(此範圍包括中間天數)。經考慮一種藥劑可在第1天至第90天(此範圍包括中間天數)中之任何一天或其任何組合給藥，及另一藥劑係在第1天至第90天(此範圍包括中間天數)中之任何一天或其任何組合給藥。於單日(24小時週期)內，病患可接受藥劑之一或多次投與。此外，在一治療過程後，經考慮存在其中不投與抗癌治療之期間。此期間可持續1至7天，及/或1至5週，及/或1至12個月或以上(此範圍包括中間天數)，取決於該病患之情況，諸如其等預後、力量、健康等。預期視需要將重複治療週期。
可採用各種組合。對於下文實例，抗體療法為「A」及抗癌療法為「B」： A/B/A   B/A/B   B/B/A   A/A/B   A/B/B   B/A/A   A/B/B/B   B/A/B/B B/B/B/A   B/B/A/B   A/A/B/B   A/B/A/B   A/B/B/A   B/B/A/A B/A/B/A   B/A/A/B   A/A/A/B   B/A/A/A   A/B/A/A   A/A/B/A
向病患投與本發明實施例之任何化合物或療法將遵循用於投與此等化合物之一般方案，考慮該等藥劑之毒性(若存在)。因此，在一些實施例中，存在監測歸因於組合療法之毒性之步驟。 A.     化學療法
許多化學治療劑可根據本發明實施例使用。術語「化學療法」係指使用藥物治療癌症。「化學治療劑」係用於意謂經投與以治療癌症之化合物或組合物。此等藥劑或藥物係由其等於細胞內之活性模式分類，例如，其等是否影響細胞週期及其等影響細胞週期所處之階段。或者，藥劑可基於其直接交聯DNA、插入DNA內或藉由影響核酸合成誘導染色體及有絲分裂畸變之能力分類。
化學治療劑之實例包括烷化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美多巴(meturedopa)及烏多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷醯胺(triethiylenethiophosphoramide)及三羥甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；產乙酸素(尤其泡番荔枝辛(bullatacin)及布來那酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似物拓撲替康)；苔蘚抑素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；念珠藻素(特別念珠藻素1及念珠藻素8)；朵拉司他汀(dolastatin)；杜卡黴素(duocarmycin) (包括合成類似物、KW-2189及CB1-TM1)；軟珊瑚醇(eleutherobin)；潘克拉汀(pancratistatin)；肉質網囊素(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、鹽酸甲氧乙胺(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)，及尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及拉尼莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γlI及卡奇黴素ωI1)；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸酯，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；及新制癌菌素發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authrarnycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C、卡拉比辛(carabicin)、卡米黴素(carminomycin)、嗜碳菌素(carzinophilin)、染色體黴素(chromomycinis)、放線菌素D、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、阿黴素(doxorubicin) (包括嗎啉基-阿黴素、氰基嗎啉基-阿黴素、2-吡咯基-阿黴素及脫氧阿黴素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、馬賽黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)，諸如絲裂黴素C、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalarnycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、波非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎拉黴素(quelamycin)、羅多黴素(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)及佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)及三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)及硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脫氧尿苷、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)及氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸曲他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)及睪內酯(testolactone)；抗腎上腺素，諸如米托坦(mitotane)及曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如弗林酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達拉酸(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elformithine)；乙酸降鈣素(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；洛尼達寧(lonidainine)；美登醇(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidanmol)；硝曲克林(nitraerine)；噴司他汀(pentostatin)；菲納姆(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣複合物；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；毛黴菌素(trichothecene) (尤其T-2毒素、維拉卡林A (verracurin A)、漆斑菌素A (roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；葛胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside) (「Ara-C」)；環磷醯胺；紫杉烷(taxoid)，例如，紫杉醇(paclitaxel)及多西他賽吉西他濱(docetaxel gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑配合物，諸如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春花堿(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide) (VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新堿(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基蝶呤；卡培他濱(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (例如，CPT-11)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲醯鳥胺酸(difluorometlhylornithine) (DFMO)；維甲酸(retinoid)，諸如視黃酸(retinoic acid)；卡培他濱(capecitabine)；卡鉑(carboplatin)、丙卡巴肼、普可黴素(plicomycin)、吉西他濱(gemcitabien)、諾維本(navelbine)、法尼基-蛋白質轉移酶抑制劑、反式鉑，及上文中之任何一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。 B.     放射療法
引起DNA破壞及已廣泛使用之其他因素包括通常稱為γ射線、X射線及/或向腫瘤細胞定向遞送放射性同位素者。DNA破壞因素之其他形式亦經考慮，諸如微波、質子射柱輻射(美國專利5,760,395及4,870,287)及UV輻射。所有此等因素最有可能影響對DNA、DNA之前體、DNA之複製及修復及染色體之組裝及維持引起廣泛之損傷。X射線之劑量範圍在50至200侖琴之每日劑量歷時延長之期間(3至4 wk)，至2000至6000侖琴之單一劑量之範圍內。放射性同位素之劑量範圍廣泛變化及取決於該同位素之半衰期、發射之輻射物之強度及類型及腫瘤細胞之攝取。 C.     免疫療法
熟習技工應瞭解免疫療法可與本發明實施例之方法組合或結合使用。在癌症治療之情境中，免疫治療一般依賴於使用免疫效應細胞及分子以靶向並破壞癌細胞。利妥昔單抗(Rituximab) (RITUXAN®)為此實例。免疫效應物可為(例如)對腫瘤細胞之表面上之一些標誌物具特異性之抗體。該抗體單獨可用作療法之效應物或其可募集其他細胞以實際上影響殺死細胞。該抗體亦可結合至藥物或毒素(化學治療劑、放射性核種、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)並僅用作靶向藥劑。或者，該效應物可為攜載與腫瘤細胞標靶直接或間接相互作用之表面分子之淋巴細胞。各種效應細胞包括細胞毒性T細胞及NK細胞。
在免疫療法之一項態樣中，腫瘤細胞必須攜載易於靶向，即，大多數其他細胞上不存在之一些標誌物。存在許多腫瘤標誌物及在本發明實施例之內文中此等中之任何一者可適用於靶向。常見腫瘤標誌物包括B細胞成熟抗原、CD20、癌胚抗原、酪胺酸酶(p97)、gp68、GPRC5D、TAG-72、HMFG、唾液酸路易士抗原、MucA、MucB、PLAP、層黏連蛋白受體、erb B及p155。免疫療法之替代態樣係組合抗癌效應及免疫刺激效應。亦存在免疫刺激分子，包括：細胞介素(諸如IL-2、IL-4、IL-12)、GM-CSF、γ-IFN、趨化介素(諸如MIP-1、MCP-1、IL-8)及生長因子(諸如FLT3配體)。
當前在研究中或在使用中之免疫療法之實例為免疫佐劑，例如，牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis )、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum )、二硝基氯苯及芳族化合物(美國專利5,801,005及5,739,169；Hui及Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)；細胞介素療法，例如，干擾素α、β及γ、IL-1、GM-CSF及TNF (Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因療法，例如，TNF、IL-1、IL-2及p53 (Qin等人，1998；Austin-Ward及Villaseca，1998；美國專利5,830,880及5,846,945)；及單株抗體，例如，抗CD20、抗神經節苷脂GM2及抗p185 (Hollander，2012；Hanibuchi等人，1998；美國專利5,824,311)。經考慮一或多種抗癌療法可與本文描述之抗體療法一起採用。
在一些態樣中，本文描述之組合包括減少腫瘤免疫抑制之藥劑，諸如趨化介素(C-X-C基序)受體2 (CXCR2)抑制劑。在一些實施例中，CXCR2抑制劑為丹日新(danirixin) (CAS註冊編號：954126-98-8)。丹日新亦稱為GSK1325756或1-(4-氯-2-羥基-3-哌啶-3-基磺醯基苯基)-3-(3-氟-2-甲基苯基)脲。丹日新係揭示(例如)於Miller等人，Eur J Drug Metab Pharmacokinet (2014) 39:173-181；及Miller等人，BMC Pharmacology and Toxicology (2015), 16:18中。在一些實施例中，該CXCR2抑制劑為雷帕利辛(reparixin) (CAS註冊編號：266359-83-5)。雷帕利辛亦稱為複吸素(repertaxin)或(2R)-2-[4-(2-甲基丙基)苯基]-N-甲基磺醯基丙醯胺。雷帕利辛係CXCR1/2之非競爭性變構抑制劑。雷帕利辛係揭示(例如)於Zarbock等人，British Journal of Pharmacology (2008), 1-8中。在一些實施例中，該CXCR2抑制劑為納瓦利辛(navarixin)。納瓦利辛亦稱為MK-7123、SCH527123、PS291822或2-羥基-N,N-二甲基-3-[[2-[[(1R)-1-(5-甲基呋喃-2-基)丙基]胺基]-3,4-二側氧基環丁烯-1-基]胺基]苯甲醯胺。納瓦利辛係揭示(例如)於Ning等人，Mol Cancer Ther. 2012；11(6):1353-64中。在一些實施例中，該CXCR2抑制劑為AZD5069，亦稱為N-[2-[[(2,3-二氟苯基)甲基]巰基]-6-{[(1R,2S)-2,3-二羥基-1-甲基丙基]氧基}-4-嘧啶基]-1-氮雜環丁烷磺醯胺。在一些實施例中，該CXCR2抑制劑係抗CXCR2抗體，諸如彼等揭示於WO2020/028479中者。
在一些態樣中，本文描述之組合包括活化樹突狀細胞之藥劑，諸如，例如，TLR激動劑。如本文定義之「TLR激動劑」係活化如Bauer等人，2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9237-9242中描述之鐸樣受體之任何分子。TLR激動劑可為小分子、重組蛋白、抗體或抗體片段、核酸或蛋白質。在某些實施例中，該TLR激動劑為重組、天然配體、免疫刺激核苷酸序列、小分子、經純化之細菌提取物或經滅活之細菌製劑。
已描述來源於微生物之TLR之數種激動劑，諸如脂多醣、肽聚糖、鞭毛蛋白及脂磷壁酸(Aderem等人，2000, Nature 406:782-787；Akira等人，2001, Nat. Immunol. 2: 675-680)。此等配體中之一些可活化不同之樹突狀細胞子集，其等表現TLR之不同模式(Kadowaki等人，2001, J. Exp. Med. 194: 863-869)。因此，TLR激動劑可為具有TLR激動劑性質之微生物藥劑之任何製劑。未轉譯之DNA之某些類型已顯示藉由活化TLR刺激免疫反應。特定言之，含有CpG基序之免疫刺激寡核苷酸已經廣泛揭示及報導活化淋巴細胞(參見，美國專利第6,194,388號)。如本文使用之「CpG基序」係定義為未甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸。含有CpG基序之免疫刺激寡核苷酸亦可根據本發明之方法用作TLR激動劑。該免疫刺激核苷酸序列可藉由結構修飾(諸如硫磷酸酯修飾) 穩定或可囊封於陽離子脂質體中以改善活體內藥物動力學及腫瘤靶向。
在一些實施例中，免疫療法可為免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點調高信號(例如，共刺激分子)或調低信號。免疫檢查點調高信號(例如，共刺激分子)或調低信號。可由免疫檢查點阻斷靶向之免疫檢查點蛋白包括腺苷A2A受體(A2AR)、B7-H3 (亦稱為CD276)、B及T淋巴細胞弱化子(BTLA)、CCL5、CD27、CD38、CD8A、CMKLR1、細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA-4，亦稱為CD152)、CXCL9、CXCR5、糖皮質素誘導之腫瘤壞死因子受體相關蛋白質(GITR)、HLA-DRB1、ICOS (亦稱為CD278)、HLA-DQA1、HLA-E、吲哚胺2,3-二氧酶1 (IDO1)、殺手細胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴細胞活化基因-3 (LAG-3，亦稱為CD223)、Mer酪胺酸激酶(MerTK)、NKG7、OX40 (亦稱為CD134)、程式性死亡1 (PD-1)、程式性死亡-配體1 (PD-L1，亦稱為CD274)、PDCD1LG2、PSMB10、STAT1、具有Ig及ITIM域之T細胞免疫受體(TIGIT)、T細胞免疫球蛋白域及黏蛋白域3 (TIM-3)，及T細胞活化之V-域Ig抑制物(VISTA，亦稱為C10orf54)。特定言之，該等免疫檢查點抑制劑靶向PD-1軸及/或CTLA-4。
免疫檢查點抑制劑可為藥物，諸如小分子、配體或受體之重組形式，或抗體，諸如人類抗體(例如，國際專利公開案WO2015/016718；Pardoll，Nat Rev Cancer, 12(4): 252-264, 2012；兩者均以引用之方式併入本文中)。可使用免疫檢查點蛋白或其類似物之已知抑制劑，特定言之可使用抗體之嵌合、人類化或人類形式。如熟習技工應知曉，替代方案及/或等效名稱可用於本發明提及之某些抗體中。此等替代方案及/或等效名稱在本發明之內文中可互換使用。例如，已知蘭博利單抗(lambrolizumab)亦以替代方案及等效名稱MK-3475及彭布羅利珠單抗(pembrolizumab)已知。
在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係抑制PD-1結合至其配體結合配偶體之分子。在一特定態樣中，該等PD-1配體結合配偶體為PD-L1及/或PD-L2。在另一實施例中，PD-L1結合拮抗劑係抑制PD-L1結合至其結合配偶體之分子。在一特定態樣中，PD-L1結合配偶體為PD-1及/或B7-1。在另一實施例中，PD-L2結合拮抗劑係抑制PD-L2結合至其結合配偶體之分子。在一具體態樣中，PD-L2結合配偶體為PD-1。該拮抗劑可為抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。例示性抗體係描述於美國專利第8,735,553、8,354,509及8,008,449號中，其等均以引用之方式併入本文中。用於本文提供之方法中之其他PD-1軸拮抗劑係此項技術中已知的，諸如描述於美國專利申請公開案第2014/0294898、 2014/022021及2011/0008369號中，其等均以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係抗PD-1抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)。在一些實施例中，該抗PD-1抗體係選自由納武單抗(nivolumab)、彭布羅利珠單抗及CT-011組成之群。在一些實施例中，該PD-1結合拮抗劑係免疫黏附素(例如，包含PD-L1或PD-L2之細胞外或PD-1結合部分融合至恆定區(例如，免疫球蛋白序列之Fc區)之免疫黏附素)。在一些實施例中，該PD-1結合拮抗劑為AMP- 224。納武單抗(亦稱為MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558及OPDIVO® )係描述於WO2006/121168中之抗PD-1抗體。彭布羅利珠單抗(亦稱為MK-3475、Merck 3475、蘭博利單抗、KEYTRUDA® 及SCH-900475)係描述於WO2009/114335中之抗PD-1抗體。CT-011(亦稱為hBAT或hBAT-1)係描述於WO2009/101611中之抗PD-1抗體。AMP-224(亦稱為B7-DCIg)係描述於WO2010/027827及WO2011/066342中之PD-L2-Fc融合可溶性受體。
在本文提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點蛋白係細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA-4)，亦稱為CD152。人類CTLA-4之完整cDNA序列具有基因庫登錄編號L15006。CTLA-4係在T細胞之表面上發現且當結合至抗原呈遞細胞之表面上之CD80或CD86時，用作「關閉」開關。CTLA-4係與T細胞共刺激蛋白CD28相似，及兩個分子均結合至抗原呈遞細胞上之CD80及CD86，亦分別稱為B7-1及B7-2。CTLA-4將抑制信號傳遞至T細胞，而CD28傳遞刺激信號。細胞內CTLA-4係亦在調節T細胞中發現且對其等功能而言可為重要的。通過T細胞受體及CD28之T細胞活化導致CTLA-4 (B7分子之抑制受體)之表現增加。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗CTLA-4抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。適用於本方法中之抗人類-CTLA-4抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知的方法產生。或者，可使用公認之抗CTLA-4抗體。例如，美國專利第8,119,129號；PCT公開案第WO 01/14424、WO 98/42752、WO 00/37504號(CP675,206，亦稱為曲美單抗(tremelimumab)；原名替卡單抗(ticilimumab))；美國專利第6,207,156號；Hurwitz等人，(1998) Proc Natl Acad Sci USA，95(17): 10067-10071；Camacho等人，(2004) J Clin Oncology，22(145):摘要編號2505 (抗體CP-675206)；及Mokyr等人，(1998) Cancer Res, 58:5301-5304中揭示之抗CTLA-4抗體可用於本文揭示之方法中。上述公開案中之各者之教示係以引用之方式併入本文中。亦可使用與此等公認之抗體中之任何一者競爭結合至CTLA-4之抗體。例如，人類化CTLA-4抗體係描述於國際專利申請案第WO2001/014424、WO2000/037504號及美國專利第8,017,114號中；所有均以引用之方式併入本文中。
例示性抗CTLA-4抗體係伊匹單抗(ipilimumab) (亦稱為10D1、MDX-010、MDX-101及Yervoy®)或其抗原結合片段及變體(參見，例如，WO 01/14424)。在其他實施例中，該抗體包含伊匹單抗之重鏈及輕鏈CDR或VR。因此，在一項實施例中，該抗體包含伊匹單抗之VH區之CDR1、CDR2及CDR3域，及伊匹單抗之VL區之CDR1、CDR2及CDR3域。在另一實施例中，該抗體與上文提及之抗體競爭結合及/或結合至CTLA-4上之相同抗原決定基。在另一實施例中，該抗體與上文提及之抗體具有至少約90%可變區胺基酸序列同一性(例如，與伊匹單抗具有至少約90%、95%或99%可變區同一性)。用於調節CTLA-4之其他分子包括諸如描述於美國專利第5844905、5885796號及國際專利申請案第WO1995001994及WO1998042752號中之CTLA-4配體及受體；所有均以引用之方式併入本文中，及諸如描述於美國專利第8329867號中之免疫黏附素，其係以引用之方式併入本文中。
在本文提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點蛋白係淋巴細胞-活化基因3 (LAG-3)，亦稱為CD223。人類LAG-3之完整蛋白序列具有基因庫登錄編號NP-002277。LAG-3係在經活化之T細胞、天然殺手細胞、B細胞及漿細胞樣樹突狀細胞之表面上發現。當結合至抗原呈遞細胞之表面上之MHC II類時，LAG-3用作「關閉」開關。LAG-3之抑制活化效應T細胞及抑制劑調節T細胞。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑係抗LAG-3抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。適用於本方法中之抗人類-LAG-3抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知的方法產生。或者，可使用公認之抗LAG-3抗體。例示性抗LAG-3抗體係瑞拉利單抗(relatlimab) (亦稱為BMS-986016)或其抗原結合片段及變體(參見，例如，WO 2015/116539)。其他例示性抗LAG-3抗體包括TSR-033 (參見，例如，WO 2018/201096)、MK-4280及REGN3767。MGD013係描述於WO 2017/019846中之抗LAG-3/PD-1雙特異性抗體。FS118係描述於WO 2017/220569中之抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體。
在本文提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點蛋白係T細胞活化之V-域Ig抑制物(VISTA)，亦稱為C10orf54。人類VISTA之完整蛋白序列具有基因庫登錄編號NP_071436。VISTA係在白血球上發現並抑制T細胞效應功能。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑係抗VISTA3抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。適用於本方法中之抗人類-VISTA抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知的方法產生。或者，可使用公認之抗VISTA抗體。例示性抗VISTA抗體為JNJ-61610588 (亦稱為恩伐地單抗(onvatilimab)) (參見，例如，WO 2015/097536、WO 2016/207717、WO 2017/137830、WO 2017/175058)。VISTA亦可以小分子CA-170抑制，其選擇性靶向PD-L1及VISTA (參見，例如，WO 2015/033299、WO 2015/033301)。
在本文提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點蛋白係吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)。人類IDO之完整蛋白序列具有基因庫登錄編號NP_002155。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑係小分子IDO抑制劑。例示性小分子包括BMS-986205、依帕多司他(epacadostat) (INCB24360)及納伏昔莫德(navoximod) (GDC-0919)。
在本文提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點蛋白係CD38。人類CD38之完整蛋白序列具有基因庫登錄編號NP_001766。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑係抗CD38抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。適用於本方法中之抗人類-CD38抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知的方法產生。或者，可使用公認之抗CD38抗體。例示性抗CD38抗體為達拉他單抗(daratumumab) (參見，例如，美國專利案第7,829,673號)。
在本文提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點蛋白係ICOS，亦稱為CD278。人類ICOS之完整蛋白序列具有基因庫登錄編號NP_036224。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑係抗ICOS抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。適用於本方法中之抗人類-ICOS抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知的方法產生。或者，可使用公認之抗ICOS抗體。例示性抗ICOS抗體包括JTX-2011 (參見，例如，WO 2016/154177、WO 2018/187191)及GSK3359609 (參見，例如，WO 2016/059602)。
在本文提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點蛋白係具有Ig及ITIM域之T細胞免疫受體(TIGIT)。人類TIGIT之完整蛋白序列具有基因庫登錄編號NP_776160。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑係抗TIGIT抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。適用於本方法中之抗人類-TIGIT抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知的方法產生。或者，可使用公認之抗TIGIT抗體。例示性抗TIGIT抗體為MK-7684 (參見，例如，WO 2017/030823、WO 2016/028656)。
在本文提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點蛋白係OX40，亦稱為CD134。人類OX40之完整蛋白序列具有基因庫登錄編號NP_003318。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑係抗OX40抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。適用於本方法中之抗人類-OX40抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知的方法產生。或者，可使用公認之抗OX40抗體。例示性抗OX40抗體為PF-04518600 (參見，例如，WO 2017/130076)。ATOR-1015係靶向CTLA4及OX40之雙特異性抗體(參見，例如，WO 2017/182672、WO 2018/091740、WO 2018/202649、WO 2018/002339)。
在本文提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點蛋白係糖皮質素誘導之腫瘤壞死因子受體相關蛋白質(GITR)，亦稱為TNFRSF18及AITR。人類GITR之完整蛋白序列具有基因庫登錄編號NP_004186。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑係抗GITR抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。適用於本方法中之抗人類-GITR抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知的方法產生。或者，可使用公認之抗GITR抗體。例示性抗GITR抗體為TRX518 (參見，例如，WO 2006/105021)。
在一些實施例中，免疫療法可為過繼性免疫療法，其涉及離體產生之自體抗原特異性T細胞之轉移。用於過繼性免疫療法之T細胞可藉由擴增抗原特異性T細胞或通過基因改造重定向T細胞產生(Park, Rosenberg等人，2011)。腫瘤特異性T細胞之分離及轉移已顯示成功治療黑色素瘤。T細胞中之新穎特異性已通過轉基因T細胞受體或嵌合抗原受體(CAR)之基因轉移成功產生(Jena、Dotti等人，2010)。CAR係由與單一融合分子中之一或多個傳訊域相關聯之靶向部分構成之合成受體。一般而言，CAR之結合部分由單鏈抗體(scFv)之抗原結合域構成，包含單株抗體之輕鏈及可變片段經由可撓性連接子連接。亦已成功使用基於受體或配體域之結合部分。第一代CAR之傳訊域係來源於CD3ζ或Fc受體γ鏈之細胞質區。CAR已成功容許T細胞重定向表現於來自各種惡性腫瘤(包括淋巴瘤及實體瘤)之腫瘤細胞之表面之抗原(Jena、Dotti等人，2010)。
在一項實施例中，本申請案提供組合療法用於治療癌症，其中組合療法包含過繼性T細胞療法及檢查點抑制劑。在一項態樣中，該過繼性T細胞療法包含自體及/或同種異體T細胞。在另一態樣中，該自體及/或同種異體T細胞係靶向腫瘤抗原。 D.     手術
約60%患有癌症之人將經歷一些類型之手術，其包括預防性、診斷性或分階段、治癒性及姑息性手術。治癒性手術包括其中癌組織中之所有或部分係經物理移除、切除及/或破壞之切除術且可結合其他療法諸如本發明實施例之治療、化學療法、放射療法、激素療法、基因療法、免疫療法及/或替代療法一起使用。腫瘤切除術係指物理移除腫瘤之至少一部分。除外腫瘤切除術外，藉由手術進行之治療包括雷射手術、冷凍手術、電外科手術及顯微鏡控制之手術(莫氏手術(Mohs’ surgery))。
一經切除癌細胞、組織或腫瘤之一部分或所有，體內即可形成腔室。治療可藉由對該區域灌注、直接注射或局部施用另外抗癌療法完成。此治療可(例如)每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4及5週或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月重複。此等治療之劑量亦可變化。 E.     其他藥劑
經考慮其他藥劑可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改善治療之治療效用。此等另外藥劑包括影響細胞表面受體及GAP連接之上調之藥劑、細胞抑制劑及分化劑、細胞黏附之抑制劑、增加過度增生細胞對細胞凋亡誘導物之敏感性之藥劑或其他生物藥劑。藉由提高GAP連接之數量增加細胞間傳訊將增加對相鄰過度增生細胞群體之抗過度增生效應。在其他實施例中，細胞抑制劑或分化劑可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改善該等治療之抗過度增生效用。細胞黏附之抑制劑係經考慮以改善本發明實施例之效用。細胞黏附抑制劑之實例係點狀黏著激酶(FAK)抑制劑及洛伐他汀(Lovastatin)。經進一步考慮增加過度增生細胞對細胞凋亡之敏感性之其他藥劑(諸如抗體c225)可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改善治療效用。 VI.   偵測之方法
在一些態樣中，本發明涉及用於偵測EphA10之表現之免疫偵測方法。各種分析形式係經考慮用於偵測蛋白產物，包括(例如)免疫組織化學、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫放射量分析、螢光免疫分析、化學發光分析、生物發光分析、斑點印跡雜交、FACS分析及西方墨點法，僅舉幾例。各種有用之免疫偵測方法之步驟已描述於科學文獻中。一般而言，免疫結合方法包括獲得樣本並使該樣本與對待偵測之蛋白質具特異性之抗體接觸，視情況而定，可在有效容許形成免疫複合物之條件下。一般而言，免疫複合物形成之偵測係為此項技術中熟知及可通過應用許多方法達成。此等方法一般基於標記或標誌物之偵測，諸如彼等放射性、螢光、生物及酶標籤中之任何一者。當然，如此項技術中已知，吾人可通過使用第二結合配體(諸如第二抗體及/或生物素/抗生物素蛋白配體結合佈置)發現另外優勢。
偵測中採用之抗體可本身連接至可偵測標記，其中然後吾人將簡單偵測此標記，藉此容許確定組合物中初級免疫複合物之量。或者，於初級免疫複合物內經結合之第一抗體可藉由使用對該抗體具有結合親和力之第二結合配體偵測。在此等情況下，該第二結合配體可連接至可偵測標記。該第二結合配體本身通常為抗體，因此其可稱為「二級」抗體。使該等初級免疫複合物與經標記之二級結合配體或抗體，在足以容許形成二級免疫複合物之有效條件及期間下接觸。然後一般清洗該等二級免疫複合物以移除任何經非特異性結合標記之二級抗體或配體，及然後偵測該等二級免疫複合物中殘餘之標記。
如本文使用，術語「樣本」係指適用於本發明提供之偵測方法之任何樣本。該樣本可為包括適用於偵測或分離之材料之任何樣本。樣本之來源包括血液、肋膜積液、腹膜液、尿液、唾液、惡性腹水、支氣管-肺泡灌洗液、滑液及支氣管洗滌物。在一項態樣中，該樣本係血液樣本，包括(例如)全血或其任何部分或組分。適用於與本發明一起使用之血液樣本可自已知的任何來源提取，其包括血細胞或其組分，諸如靜脈、動脈、外周、組織、臍帶及類似物。例如，樣本可使用熟知及例行性臨床方法獲得並處理(例如，用於抽取並處理全血之程序)。在一項態樣中，例示性樣本可為自患有癌症之受試者抽取之外周血。在一些態樣中，生物樣本包含複數個細胞。在某些態樣中，該生物樣本包含新鮮或冷凍組織。在具體態樣中，該生物樣本包含福爾馬林固定、石蠟包埋之組織。在一些態樣中，該生物樣本係組織生檢、細針抽吸物、血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、糞便、唾液、循環性腫瘤細胞、胞外體或抽吸物及身體分泌物(諸如汗液)。在一些態樣中，該生物樣本含有無細胞DNA。 VII.  套組
在本發明實施例之各種態樣中，預期套組含有治療劑及/或其他治療及遞送劑。在一些實施例中，提供套組用於製備及/或投與本發明實施例之療法。該套組可包含含有本發明實施例之醫藥組合物中之任何一者之一或多個密封小瓶。該套組可包括(例如)至少一個EphA10抗體或EphA10特異性CAR構築體，及試劑以製備、調配及/或投與本發明實施例之組分或進行本發明方法之一或多個步驟。在一些實施例中，該套組亦可包含合適之容器，其係將不與該套組之組分反應之容器，諸如微量離心管、分析盤、注射器、瓶或管。該容器可由可滅菌材料(諸如塑膠或玻璃)製成。
套組可進一步包括概述本文闡述方法之程序步驟之說明單且將大體上遵循與本文描述或此領域中之一般技術者已知程序相同之程序。指示資訊可在含有機器可讀指令之電腦可讀媒體中，當使用電腦執行時，引起顯示遞送醫藥有效量之治療劑之真實或虛擬程式。 VIII.   實例
包括下列實例以證實本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應知曉以下實例中揭示之技術表示由發明人發現在本發明之實務中充分發揮作用之技術，及因此可視為構成用於其實務之較佳模式。然而，鑒於本發明，熟習此項技術者應知曉可在本文揭示之特定實施例中作出許多變化及仍獲得類似或相似結果而不背離本發明之精神及範圍。 實例1：靶向EphA10之治療抗體之產生
EphA10係高度表現於腫瘤組織而非正常相鄰組織中。乳癌、肺腺癌及卵巢癌之人類病患樣本之腫瘤區及相鄰組織中EphA10之蛋白表現含量係顯示於圖1H中。
就用於免疫中而言，重組hu-EphA10 Fc嵌合體蛋白[細胞外域(Glu34-Ala565)]係自293T細胞純化及用於小鼠之初級免疫中。免疫小鼠係以表現hu-EphA10之L細胞加強以增加識別hu-EphA10之完整結構之機率及排除Fc識別群體。B細胞係自免疫小鼠之脾分離並用於產生雜交瘤純系。1,000個純系中有九個係通過基於ELISA之初次篩選(使用Fc蛋白之陰性篩選及針對hu-EphA10 Fc蛋白及表現hu-EphA10之L細胞之陽性篩選)選擇。六個候選者係係通過二次篩選(免疫螢光染色及流式細胞術)重新選擇。最終候選者(純系4、8及9)係選自使用其他EphA同功型之陰性篩選及活體內抗體追蹤分析(圖1A)。純系4、8及9係經表徵為lgGl κ同型(圖1B)。所有三個純系均對hu-EphA10而非EphA家族之其他同功型具有高特異性(圖1C)。
為獲得最終三個候選者之可變區之序列，總RNA係使用TRizol®試劑套組根據製造商之說明書自雜交瘤細胞分離。然後總RNA係使用同型特異性反義引子或通用引子遵循PrimeScriptTM第1股cDNA合成套組之手冊逆轉錄為cDNA。重鏈及輕鏈之抗體片段係根據GenScript之cDNA端之快速擴增(RACE)之標準操作程序擴增。經擴增之抗體片段係分別選殖至標準選殖載體內。進行菌落PCR以篩選具有正確尺寸之插入物之純系。獲得共有序列。各純系之互補決定區(CDR)及可變區係提供於表1至3中。 表1：EphA10抗體之輕鏈可變序列之CDR。
抗體名稱 CDR1 (SEQ ID NO:) CDR2 (SEQ ID NO:) CDR3 (SEQ ID NO:)
純系4 RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 1) NVKTLTE (SEQ ID NO: 2) QHHYVTPPT (SEQ ID NO: 3)
純系8 RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO: 4) LASNLES (SEQ ID NO: 5) QQNNEYPWT (SEQ ID NO: 6)
純系9 SASSSVSYMY (SEQ ID NO: 7) STSNLAS (SEQ ID NO: 8) QQRNSYPPT (SEQ ID NO: 9)
表2：EphA10抗體之重鏈可變序列之CDR。
抗體名稱 CDR1 (SEQ ID NO:) CDR2 (SEQ ID NO:) CDR3 (SEQ ID NO:)
純系4 YYWMN (SEQ ID NO: 10) EIRLKSNNYATHYAESVKG (SEQ ID NO: 11) YYGSSAWFAY (SEQ ID NO: 12)
純系8 SYDIT (SEQ ID NO: 13) WIYPGDGSTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 14) GGRLPYFDY (SEQ ID NO: 15)
純系9 TYWIE (SEQ ID NO: 16) EILPGSGRTNYKEKFKD (SEQ ID NO: 17) DWY (SEQ ID NO: 18)
表3：抗體可變區之蛋白序列。
抗體名稱 鏈 可變序列 SEQ ID NO:
純系4 重 EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSYYWMNWVR QSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDD SKSSVYLQMNNLRAEDSGIYYCTFYYGSSAWFAYWGQG TLVTVSA 19
輕 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQ KQGKSPQLLVYNVKTLTEGVPSRFSGSGSGTQFSLKID SLQPEDFGSYYCQHHYVTPPTFGAGTKLELK 20
純系8 重 QVQLQQSGPELVKPGPLVKISCKASGYTFTSYDITWVK QRPGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKGKATLTADKSS STAYMQLSSLTSENSAVYFCARGGRLPYFDYWGQGTTL TVSS 21
輕 NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMH WYQQKPGQPPKLLIYLASNLESAVPARFSGSGSRTDFT LTIDPVEADDAATYYCQQNNEYPWTFGGGTKLEIK 22
純系9 重 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSTYWIEWVK QRPGHGLEWIGEILPGSGRTNYKEKFKDKATFTANTSS TTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAIDWYWGQGTTLTVSS 23
輕 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMYWFQQK PGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISR MEAEDAATYYCQQRNSYPPTFGGGTKLEIK 24
流式細胞術分析及免疫螢光染色分析兩者均顯示此等三個純系活體內維持相對完整之結構。當進行流式細胞術(圖1D)及免疫螢光染色(圖1E)時，純系4、8及9特異性偵測癌細胞上之hu-EphA10，意謂此等純系具有活體內識別hu-EphA10之完整結構之高潛力。
如預期，來自抗體活體內追蹤分析之結果顯示所有三個純系之抗體均可以長半衰期活體內特異性靶向表現EphA10之腫瘤(圖1F)。對攜載表現hu-EphA10之MDA-MB-231腫瘤之裸小鼠注射經螢光染料(Alexa 647)標記之各純系之抗體，及在注射後第3及6天偵測螢光信號。在注射對照lgG1-Alexa 647之組中未偵測到螢光信號，而在注射純系4、8及9之抗hu-EphA10-Alexa 647之組中偵測到受限於腫瘤塊之強螢光信號。該等螢光信號在注射後維持超過6天，指示此等抗體活體內特異且穩定，及因此適用於發展為治療抗體。另外，所有三個純系對腫瘤之特異性靶向因為其可防止脫靶效應所以具有其等應用於CAR-T及CAR-NK中之較大優勢。
亦顯示所有三個純系活體內減少腫瘤生長(圖1G)。攜載4T1腫瘤之BALB/cJ小鼠係經個別抗EphA10抗體(150 µg/小鼠)處理。圖1G提供指示在個別抗體治療下之各小鼠中之腫瘤進展之瀑布圖。 實例2：抗EphA10用於抗體藥物結合物(ADC)之應用
抗體藥物結合物(ADC)係使用靶向癌症特異性膜蛋白之單株抗體移除癌細胞而無全身毒性之新穎治療方法。作為ADC之原理，在降解期間自抗體釋放毒素，藉此殺死癌細胞。因此，用於ADC之抗體在其等結合至靶膜蛋白時必須內化且在內化後在溶酶體中降解。
因為EphA10之腫瘤特異性表現，所以其係ADC療法之誘人標靶。因此，抗hu-EphA10純系4、8及9係藉由抗體內化分析檢查，及發現純系9顯示強內化活性。抗EphA10抗體係用pHrodo染料標記，其在溶酶體中具有紅色螢光(圖2A)。抗EphA10 (純系9)係以劑量依賴性方式顯示內化活性(圖2B)。為顯示內化抗體之溶酶體定位，內化分析係與溶酶體免疫染色組合。紅色信號係與綠色溶酶體標誌物信號重疊，指示抗EphA10 (純系9)係經運輸至該溶酶體(圖2C)。
為證實抗EphA10 (純系9)之內化係由特定內吞途徑介導，已知調節抗體誘導之內化之格形蛋白介導及胞膜窖介導之途徑兩者均藉由用靶向各途徑之特定抑制劑連同抗EphA10 (純系9)一起處理進行阻斷。甲基-J3-環糊精(J3-CD)及pitstop係對格形蛋白介導之內吞具特異性之抑制劑而金雀異黃酮及菲律賓菌素III係對胞膜窖介導之途徑具特異性。代納索爾(Dynasore)抑制兩種途徑。結果指示抗EphA10 (純系9)之內化係由格形蛋白途徑抑制劑部分阻斷但由胞膜窖介導之途徑抑制劑及代納索爾完全抑制(圖2D)，表明胞膜窖介導之途徑主要調節抗EphA10 (純系9)之內化。
鑒於本發明，可作出並執行本文揭示及主張之方法中之所有而無需過度實驗。儘管已根據較佳實施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者將顯而易見變化可應用至本文描述之方法及應用於本文描述之方法之步驟或步驟之順序中而不背離本發明之概念、精神及範圍。更具體言之，將顯而易見與化學及生理學相關之某些藥劑可替代本文描述之藥劑同時將達成相同或相似結果。熟習此項技術者顯而易見之所有此等相似替代物及修飾認為係於如由隨附申請專利範圍定義之本發明之精神、範圍及概念內。 參考文獻 下列參考文獻係以引用之方式明確併入本文內，在一定程度上其等提供對彼等本文闡述者補充之例示性程序或其他細節。 Li等人，「Isoform expression patterns of EPHA10 protein mediate breast cancer progression by regulating the E-Cadherin and β-catenin complex」，Oncotarget, 8:30344-30356, 2017。 Nagano等人，「Ephrin receptor A10 is a promising drug target potentially useful for breast cancers including triple negative breast cancers」，J. Cont. Rel., 189:72-79, 2014。 Taki等人，「A Novel Bispecific Antibody against Human CD3 and Ephrin Receptor A10 for Breast Cancer Therapy」，PLoS ONE, 10:e0144712, 2015。 Yang等人，「Juxtacrine Signaling Inhibits Antitumor Immunity by Upregulating PD-L1 Expression」，Cancer Res., 78:3761-3768, 2018。
下列圖式形成本說明書之一部分且經包括以進一步證實本發明之某些態樣。本發明可藉由參考此等圖式中之一或多者與本文呈現之特定實施例之詳細說明之組合更好地瞭解。
圖1A至H：靶向EphA10之治療抗體之產生。(圖1A)產生靶向EphA10之抗體之方法。(圖1B)各純系之lgG同型之表徵。N，陰性對照；P，陽性對照；HC，重鏈；LC，輕鏈。(圖1C)使用Fc蛋白(陰性對照)、其他EphA同功型及hu-EphA10(陽性對照)之ELISA篩選。(圖1D) BT-549模擬及BT-549 hu EphA10穩定細胞中EphA10之FAC分析。資料表示平均值 ± S.D. n = 3。(圖1E) BT-549模擬及BT-549 hu EphA10穩定細胞中hu-EphA10之免疫染色。Hoechst係用於核對比染色。比例尺，50 µm。(圖1F)活體內抗體追蹤分析。藉由i.p.注射向小鼠(nu/nu)投與純系4、8及9之lgG1-Alexa 647及抗hu-EphA10-Alexa 647 (150 µg/小鼠)。螢光信號係在使用IVIS lumina注射後第3及6天偵測。(圖1G)在使用個別抗EphA10抗體(150 µg/小鼠)治療之BALB/cJ小鼠中之4T1腫瘤之生長。瀑布圖指示在個別抗體治療下之各小鼠中之腫瘤進展。各組中經歷穩定疾病、部分反應或完全反應之小鼠之數量係顯示於括號中。各圖中之灰盒及箭頭指示治療之持續時間及時間。#：第15天死亡之小鼠。CR：完全反應，PD：進行性疾病，SD：穩定疾病，PR：部分反應。(圖1H) IHC分析中EphA10之蛋白表現含量及來自乳癌(匹配，n =11)、肺腺癌(匹配，n =50)及卵巢癌(不匹配，n = 40)之人類病患樣本之相鄰組織或腫瘤區中之代表性影像。原始放大率，×400。誤差槓表示平均值± SD。**P ＜ 0.01，****P ＜ 0.0001，未配對之t測試。
圖2A至D：抗EphA10 (純系9)作為抗體藥物結合物(ADC)之應用。(圖2A)闡述抗EphA10-pHrodo抗體如何工作之模型。(圖2B)紅色螢光之強度係由IncuCyte®活細胞分析系統實時監測。來自抗體處理(500 ng)後24小時各時間點之代表性資料。比例尺，200 µm。(圖2C) BT-549 hu-EphA10穩定細胞系係用抗EphA10 (純系9)-pHrodo (500 ng)處理24小時及溶酶體示蹤劑(75 nM)處理16小時。比例尺，50 µm；放大影像，5 µm。(圖2D) BT-549 hu-EphA10穩定細胞系係用指示劑抑制劑預處理1小時，然後用抗EphA10 (純系9)-pHrodo (500 ng)處理24小時。β-CD，2.5 mM；pitstop，30 µM；代納索爾(dynasore)，150 µM；金雀異黃酮，200 µM；及菲律賓菌素III (filipin III)，5 µM。
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Claims (93)

  1. 一種單株抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： 包含SEQ ID NO: 10之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 11之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 12之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 1之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 3之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)； 包含SEQ ID NO: 13之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 14之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 15之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 4之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 5之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 6之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；或 包含SEQ ID NO: 16之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 17之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 18之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 7之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 8之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 9之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。
  2. 如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 19具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 20具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。
  3. 如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 21具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 22具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。
  4. 如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 23具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 24具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。
  5. 如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 19具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 20具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。
  6. 如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 21具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 22具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。
  7. 如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 23具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 24具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。
  8. 如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含具有根據SEQ ID NO: 19之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 20之序列之輕鏈可變序列。
  9. 如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含具有根據SEQ ID NO: 21之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 22之序列之輕鏈可變序列。
  10. 如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含具有根據SEQ ID NO: 23之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 24之序列之輕鏈可變序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之單株抗體或抗體片段，其中該抗體可結合至EphA10。
  12. 如請求項1至11中任一項之單株抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段係人類化抗體。
  13. 如請求項1至12中任一項之單株抗體或抗體片段，其中該抗體片段係單價scFv (單鏈片段可變)抗體、二價scFv、Fab片段、F(ab’)2 片段、F(ab’)3 片段、Fv片段或單鏈抗體。
  14. 如請求項1至12中任一項之單株抗體或抗體片段，其中該抗體係嵌合抗體、雙特異性抗體或BiTE。
  15. 如請求項1至14中任一項之單株抗體或抗體片段，其中該抗體係IgG抗體或重組IgG抗體或抗體片段。
  16. 如請求項1至15中任一項之單株抗體或抗體片段，其中該抗體係結合或融合至顯像劑或細胞毒性劑。
  17. 如請求項1至15中任一項之單株抗體或抗體片段，其中該抗體係經標記。
  18. 如請求項17之單株抗體或抗體片段，其中該標記係螢光標記、酶標記或放射性標記。
  19. 一種單株抗體或抗體片段，其與如請求項1至15中任一項之單株抗體或抗體片段競爭結合至相同抗原決定基。
  20. 一種單株抗體或抗體片段，其結合至由如請求項1至15中任一項之抗體識別之EphA10上之抗原決定基。
  21. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至15、19及20中任一項之抗體分子之抗體重鏈及/或輕鏈可變區。
  22. 如請求項21之經分離之核酸，其包含與SEQ ID NO: 19、21或23具有至少85%同一性之核苷酸序列。
  23. 如請求項21之經分離之核酸，其包含與SEQ ID NO: 20、22或23具有至少85%同一性之核苷酸序列。
  24. 一種表現載體，其包含如請求項21至23中任一項之核酸。
  25. 一種雜交瘤或經改造細胞，其包含編碼如請求項1至15、19及20中任一項之抗體或抗體片段之核酸。
  26. 一種雜交瘤或經改造細胞，其包含如請求項21至23中任一項之核酸。
  27. 一種製造如請求項1至15、19及20中任一項之單株抗體或抗體片段之方法，該方法包括在容許該抗體表現之條件下培養如請求項25或26之雜交瘤或經改造細胞，並視需要自培養物分離該抗體。
  28. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至20中任一項之一或多個抗體或抗體片段。
  29. 一種治療患有癌症之病患之方法，該方法包括向有需要之受試者投與有效量之如請求項1至20中任一項之抗體或抗體片段。
  30. 如請求項29之方法，其中相對於對照病患，該癌症係經確定可表現出高含量之EphA10。
  31. 如請求項29之方法，其經進一步界定為用以增強細胞毒性T細胞介導之抗腫瘤免疫之方法。
  32. 如請求項29之方法，其經進一步界定為用以增加對免疫療法之敏感性之方法。
  33. 如請求項29之方法，其中該癌症係肺癌、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌、乳癌或卵巢癌。
  34. 如請求項29之方法，其中該病患為女性。
  35. 如請求項29之方法，其進一步包括投與至少第二抗癌療法。
  36. 如請求項35之方法，其中該第二抗癌療法係化學療法、免疫療法、放射療法、基因療法、手術、激素療法、抗血管生成療法或細胞介素療法。
  37. 一種嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor；CAR)蛋白，其包含結合至人類EphA10之抗原結合域。
  38. 如請求項37之CAR蛋白，其中該抗原結合域包含： 包含SEQ ID NO: 10之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 11之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 12之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 1之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 3之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)； 包含SEQ ID NO: 13之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 14之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 15之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 4之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 5之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 6之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；或 包含SEQ ID NO: 16之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 17之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 18之VHCDR3胺基酸序列之重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 7之VLCDRl胺基酸序列、SEQ ID NO: 8之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 9之VLCDR3胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。
  39. 如請求項37之CAR，其中該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 19具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 20具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。
  40. 如請求項37之CAR，其中該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 21具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 22具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。
  41. 如請求項37之CAR，其中該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 23具有至少70%、80%或90%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 24具有至少70%、80%或90%同一性之輕鏈可變序列。
  42. 如請求項37之CAR，其中該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 19具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 20具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。
  43. 如請求項37之CAR，其中該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 21具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 22具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。
  44. 如請求項37之CAR，其中該抗原結合域包含與SEQ ID NO: 23具有至少95%同一性之重鏈可變序列及與SEQ ID NO: 24具有至少95%同一性之輕鏈可變序列。
  45. 如請求項37之CAR，其中該抗原結合域包含具有根據SEQ ID NO: 19之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 20之序列之輕鏈可變序列。
  46. 如請求項37之CAR，其中該抗原結合域包含具有根據SEQ ID NO: 21之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 22之序列之輕鏈可變序列。
  47. 如請求項37之CAR，其中該抗原結合域包含具有根據SEQ ID NO: 23之序列之重鏈可變序列及具有根據SEQ ID NO: 24之序列之輕鏈可變序列。
  48. 如請求項37至47中任一項之CAR，其中該CAR可結合至EphA10。
  49. 如請求項37至48中任一項之CAR，其中該抗原結合域係人類化抗原結合域。
  50. 如請求項37至49中任一項之CAR，其進一步包含鉸鏈域、跨膜域及細胞內傳訊域。
  51. 如請求項50之CAR，其中該鉸鏈域係CD8a鉸鏈域或IgG4鉸鏈域。
  52. 如請求項50之CAR，其中該跨膜域係CD8a跨膜域或CD28跨膜域。
  53. 如請求項50之CAR，其中該細胞內傳訊域包含CD3z細胞內傳訊域。
  54. 一種核酸分子，其編碼如請求項37至53中任一項之CAR。
  55. 如請求項54之核酸分子，其中編碼該CAR之該序列係可操作地連接至表現控制序列。
  56. 如請求項54之核酸分子，其經進一步定義為表現載體。
  57. 一種經改造細胞，其包含編碼包含結合至人類EphA10之抗原結合域之嵌合抗原受體(CAR)之核酸分子。
  58. 如請求項57之細胞，其中該核酸分子編碼如請求項37至53中任一項之CAR。
  59. 如請求項57之細胞，其中該細胞係T細胞。
  60. 如請求項57之細胞，其中該細胞係NK細胞。
  61. 如請求項57之細胞，其中該核酸係整合至該細胞之基因體內。
  62. 如請求項57之細胞，其中該細胞係人類細胞。
  63. 一種醫藥組合物，其包含根據請求項57至62中任一項之細胞之群體於醫藥上可接受之載劑中。
  64. 一種治療有需要之人類病患中癌症之方法，其包括向該病患投與抗腫瘤有效量之細胞療法，該細胞療法包含根據請求項57至62中任一項之一或多種細胞。
  65. 如請求項64之方法，其中該等細胞係同種異體細胞。
  66. 如請求項64之方法，其中該等細胞係自體細胞。
  67. 如請求項64之方法，其中該等細胞係與受試者匹配之HLA。
  68. 如請求項64之方法，其中該癌症係肺癌、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌、乳癌或卵巢癌。
  69. 如請求項64之方法，其中該病患為女性。
  70. 如請求項64之方法，其進一步包括投與至少第二抗癌療法。
  71. 如請求項70之方法，其中該第二抗癌療法係化學療法、免疫療法、放射療法、基因療法、手術、激素療法、抗血管生成療法或細胞介素療法。
  72. 一種將病患診斷為患有表現EphA10之癌症之方法，該方法包括使自該病患獲得之癌症組織與如請求項1至18中任一項之抗體或抗體片段接觸及偵測該抗體或抗體片段對該組織之結合，其中若該抗體或抗體片段結合至該組織，則將該病患診斷為患有表現EphA10之癌症。
  73. 如請求項72之方法，其進一步包括向該診斷為患有表現EphA10之癌症之病患投與有效量之如請求項1至18中任一項之抗體或抗體片段或包含根據請求項57至62中任一項之一或多種細胞之細胞療法。
  74. 如請求項72之方法，其中偵測包括進行ELISA、免疫印漬術、免疫組織化學、多光譜螢光細胞成像、質譜流式細胞術(CyTOF)或成像質譜分析術。
  75. 一種偵測病患中癌症之進展之方法，該方法包括使自該病患獲得之癌症組織與如請求項1至18中任一項之抗體或抗體片段接觸及偵測該抗體或抗體片段對該組織之結合，其中若該抗體或抗體片段結合至該組織，則認為該癌症係進行性癌症。
  76. 一種選擇患有癌症之病患以使用抗EphA10抗體治療之方法，該方法包括(a)確定該癌症是否表現EphA10，及(b)若該癌症表現EphA10，則選擇該病患用於治療。
  77. 如請求項76之方法，其中步驟(a)包括(i)自該病患獲得或已獲得生物樣本；及(ii)對該生物樣本進行或已進行分析以確定EphA10是否表現於該癌症中。
  78. 如請求項76或77之方法，其進一步包括向該所選病患投與有效量之如請求項1至18中任一項之抗體或抗體片段或包含根據請求項50至55中任一項之一或多種細胞之細胞療法。
  79. 如請求項76或77之方法，其中EphA10是否表現於該癌症中係藉由偵測該樣本中之EphA10蛋白確定。
  80. 如請求項79之方法，其中該蛋白質係藉由質譜術、流式細胞術、西方墨點法、免疫組織化學、ELISA或RIA偵測。
  81. 如請求項79之方法，其中該蛋白質係藉由使該癌症之樣本與如請求項1至18中任一項之抗體接觸偵測。
  82. 一種用於偵測EphA10於細胞之表面上、組織中、器官中或生物樣本中之存在之方法，該方法包括(a)在容許發生該抗體分子及EphA10之相互作用之條件下使該細胞、組織、器官或生物樣本與如請求項1至18中任一項之抗體接觸；及(b)在該細胞、組織、器官或樣本中偵測該抗體分子與EphA10之間之複合物之形成。
  83. 如請求項82之方法，其中該接觸及偵測係活體外的。
  84. 如請求項82之方法，其中該接觸係活體內的及該偵測係活體外的。
  85. 如請求項83或84之方法，其中該顯像劑係螢光團或發色團。
  86. 如請求項82之方法，其中該接觸及偵測係活體內的。
  87. 如請求項86之方法，其中該顯像劑係放射性核種。
  88. 如請求項86之方法，其中該偵測係藉由PET、SPECT或超極化MRI。
  89. 如請求項86至88中任一項之方法，其中該方法係偵測轉移之方法。
  90. 如請求項82至85中任一項之方法，其中該樣本係組織生檢、細針抽吸物、血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、糞便、唾液或身體分泌物。
  91. 如請求項90之方法，其中該樣本包含循環性腫瘤細胞。
  92. 如請求項1至20中任一項之抗體分子、如請求項56之醫藥組合物、如請求項57至62中任一項之細胞或如請求項63之醫藥組合物，其等用於治療受試者中之癌症。
  93. 一種如請求項1至20中任一項之抗體分子、如請求項56之醫藥組合物、如請求項57至62中任一項之細胞或如請求項63之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療受試者之癌症之藥物。
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