CN113412130A - 用于诊断和治疗癌症及其他疾病的对促肿瘤癌症相关成纤维细胞的识别和靶向 - Google Patents

用于诊断和治疗癌症及其他疾病的对促肿瘤癌症相关成纤维细胞的识别和靶向 Download PDF

Info

Publication number
CN113412130A
CN113412130A CN201980091486.5A CN201980091486A CN113412130A CN 113412130 A CN113412130 A CN 113412130A CN 201980091486 A CN201980091486 A CN 201980091486A CN 113412130 A CN113412130 A CN 113412130A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cell
caf
cells
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980091486.5A
Other languages
English (en)
Inventor
拉古·卡尔卢里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Texas System
Original Assignee
University of Texas System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Texas System filed Critical University of Texas System
Publication of CN113412130A publication Critical patent/CN113412130A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/54—Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)

Abstract

本文中提供了靶向TP‑CAF的药剂，例如抗体或嵌合抗原受体。提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的TP‑CAF中和剂。所述方法可还包括向所述患者施用有效量的化学治疗或免疫治疗。所述方法可包括施用与免疫检查点阻断治疗组合的IL‑6信号传导抑制剂。

Description

用于诊断和治疗癌症及其他疾病的对促肿瘤癌症相关成纤维 细胞的识别和靶向
相关申请的引用
本申请要求2018年12月8日提交的美国临时申请号62/777,101的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
序列表的引用
本申请包括已通过EFS-Web以ASCII格式提交并且在此通过引用整体并入的序列表。于2019年12月6日创建的所述ASCII拷贝命名为UTFCP1429WO_ST25.txt并且大小为2.0千字节。
发明背景
1.技术领域
本发明一般地涉及医学领域。更具体地，其涉及通过靶向促肿瘤癌症(tumor-promoting cancer)相关成纤维细胞和/或通过抑制IL-6信号传导，与免疫检查点阻断治疗组合来治疗癌症的方法。
2.相关技术的描述
成纤维细胞在具有推断的调节PDAC进展的能力的肿瘤中积累(LeBleu&Kalluri，2018；Kalluri，2016)。其共同被称为癌症相关成纤维细胞(cancer associatedfibroblast，CAF)。CAF可通过与免疫细胞和癌细胞的合作来发挥协调针对癌症的宿主应答的功能，并影响PDAC的进展和/或针对治疗的应答。随着对其在塑造肿瘤免疫微环境中作用的越来越多的认识，PDAC中CAF的生物学正在不断发展(Kalluri，2016；Neesse et al.，2015；Ohlund et al.，2014)。αSMA+CAF在PDAC的经遗传改造的小鼠模型(geneticallyengineered mouse model，GEMM)中发挥抑制肿瘤的功能，并且其使肿瘤浸润性T细胞极化(Ozdemir et al.，2014)。
最近的研究强调了PDAC中CAF的不同亚型，其由FAP的表达限定，FAP作为免疫极化子(polarizer)发挥作用以抑制PDAC肿瘤，可能通过CXCL12(SDF1)(Feig et al.，2013)以及CCL2信号传导(Yang et al.，2016)。FAP蛋白的丧失延迟了小鼠中PDAC疾病的进展(Loet al.，2017)；然而，靶向FAP+CAF也可产生恶病质的表型、骨毒性和贫血(Roberts etal.，2013；Tran et al.，2013)。因此，需要通过靶向CAF来诊断和治疗癌症的新方法。
发明概述
为了提供PDAC CAF的全面和功能性定义，使用新的GEMM、多种CAF生物标志物的多光谱成像分析以及分离的CAF群以及人和小鼠PDAC肿瘤的单细胞RNA测序来确定CAF的特征和功能。发现CAF在肿瘤微环境内是功能上异质性的并且具有相反的功能。另外，αSMA+CAF来源白细胞介素6(IL-6)被鉴定为在化学治疗和免疫检查点阻断期间T细胞介导的抗肿瘤应答的负调节子。
成纤维细胞是包含抑肿瘤成纤维细胞/间充质细胞和促肿瘤成纤维细胞/间充质细胞的异质群。与促肿瘤成纤维细胞特异性相关的数种基因/蛋白质不存在于抑肿瘤成纤维细胞/间充质细胞中。因此，可识别和靶向这些已鉴定基因/蛋白质的治疗剂可与化学治疗、放射治疗和免疫检查点阻断协同作用。另外，在自体T细胞或者自体或同种异体NK细胞中的TP-CAF特异性CAR-T构建体可用作免疫治疗方法。也可采用ShRNA、siRNA和CRISPR-CAS-9靶向。通过一条臂靶向TP-CAF和通过另一条臂靶向CD3的双特异性抗体可导致TP-CAF的免疫靶向以控制癌症进展。
在一个实施方案中，本文中提供了包含与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的抗体或抗体片段或嵌合抗原受体的组合物。所述蛋白质可以是以下的任何一种：
Apoe；Fth1；Ftl1；Tmsb4x；Rpl41；Rps29；Actb；Rps27；Rps28；Lyz2；Rpl37a；mt-Atp6；mt-Co1；Rps19；Rpl13；Rplp0；Rpl32；Fau；Rpl18a；mt-Co3；Cd74；Rpl35；Rps18；Rpl39；Rpl13a；Rpl37；Tmsb10；Rps23；Rpl35a；Rplp1；Rps15a；Rpl36；Gm8730；Cxcl2；Rps5；Rps27a；Gm10260；Rps16；Rps24；Rpl38；Rps4x；Rplp2；Rps9；Rpl17；Rps11；Rpl10；Rps6；Cebpb；Rps14；Rpl26；Rps8；Rpl34；S100a8；Rpl6；Gm9843；Rps3a1；mt-Nd1；Rps27rt；Rpl14；Rpl27a；Rpl9；Rps7；Rpl23；Rpl19；Rps3；H2-Aa；Tyrobp；Cst3；Tpt1；mt-Co2；Eef1a1；Rpl11；Rpl8；Wfdc17；Pfn1；Rpl3；Rps13；S100a9；Rpl21；Rpl24；Rpl23a；Rps26；C1qa；Rps18-ps3；Fcer1g；Rpl36a；Rps15；Uba52；Gm11808；Gm2000；Rpl15；Rps20；Rpl27；Rpl10a；Rps10；H2-D1；B2m；H2-Ab1；Rpl31；Ccl6；Wdr89；Rpl28；Rps12；Rpl18；Rpl29；Rpsa；Oaz1；Btg1；Rps21；Rps17；C1qc；Ctsd；Psap；Rpl4；Rps25；Ctsb；Cox8a；C1qb；Atox1；H2afz；Ctss；Rpl12；Cfl1；Actg1；Cox4i1；Rpl10-ps3；Rpl7；Gpx1；Cyba；Gm10116；Gm9493；H3f3a；Rpl30；Atp5e；Rpl23a-ps3；Srgn；Cd14；Rpl9-ps6；Rpl13-ps3；Arpc1b；Rpl6l；Thbs1；Trf；mt-Nd4；Il1b；Rpl22；Sh3bgrl3；Sepp1；Shfm1；Lgals3；Npc2；Sat1；Pim1；Rps12-ps3；Sub1；Cd52；Gm10076；Gng5；Cstb；Rps26-ps1；Msrb1；Cox6b1；Rpl36al；Arpc2；Pf4；Lamp1；Naca；Ucp2；Prdx5；Snrpg；Gm10073；Id2；Bcl2a1b；H2-K1；Pabpc1；Fxyd5；Lgmn；Rpl27-ps3；Ndufa2；Ctsz；Cox6a1；Uqcr11；Npm1；Gnb2l1；Eif3f；Ccl8；Ube2d3；Fcgr3；Cotl1；Gm10263；AA467197；Uqcrq；Gnai2；Ubl5；D8Ertd738e；Ndufa3；Ccl3；Sdcbp；Serinc3；Fcgr2b；Tomm7；Atp6v1g1；Cox7a2l；Clta；Grn；Ccrl2；Atp5g2；G0s2；Ptpn18；Smdt1；Bri3；Jchain；Rgs10；Atp6v0e；Rap1b；Rbm39；Laptm5；Rpl5；Atp6v0b；Serp1；Akr1a1；Mcl1；Ccl7；Ccl9；Eer1b2；Marcksl1；Mrp152；Cd53；Atp5k；Pnrc1；Myeov2；Sdc4；Clec4n；Tma7；Cdc42；Rnaset2a；Rac2；2010107E04Rik；Arpc3；Alox5ap；Vamp8；Zfp3612；Tspo；Ctsh；Atp6v1f；Coro1a；Ninj1；Ccl4；Rnf149；Tgfbi；Fosl2；mt-Nd2；Ms4a6c；Ndufa6；Pcbp2；Klf13；Eif3h；Ostf1；Hilpda；Fam49b；Trem2；Ctsc；Rgs1；Mafb；Prelid1；Fabp5；Ndufa1；Cox17；Eno1；Gm2a；Hnrnpf；Gdi2；Eif3e；Retnlg；Picalm；Ndufb7；Cox5a；Kdm6b；Acp5；Arhgdib；Plaur；Arg1；Srp9；Tomm20；Timm13；Crem；Lst1；Arpc5；Bola2；Hmgb2；Hexa；Gm10036；Cxcl16；Mtdh；Lcp1；Spi1；Gm6576；Sh3glb1；Ndufb8；Gdpd3；Hn1；Cirbp；Plek；Hspe1；Bcl2a1d；Capza2；Ctsa；Efhd2；Gm42418；Gm8186；Tpd52；Tra2b；Actr3；Sptssa；Brk1；Ppp1ca；Ndufv3；Erdr1；Arpc4；Cdk2ap2；Zfos1；Snx3；Ccl17；Ap2s1；Rac1；Cxcr4；Eif5；和Pitpna。
在一些方面中，所述抗体片段是重组scFv(单链可变片段)抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或Fv片段。在一些方面中，所述抗体是嵌合抗体或是双特异性抗体。在一些方面中，所述嵌合抗体是人源化抗体。在一些方面中，所述双特异性抗体与(1)TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质和(2)CD3二者结合。在一些方面中，所述抗体或抗体片段与细胞毒性剂缀合。在一些方面中，所述抗体或抗体片段与诊断剂缀合。在一个实施方案中，本文中提供了杂交瘤或经改造细胞，其编码本发明实施方案中任一个的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本文中提供了药物制剂，其包含一种或更多种本发明实施方案中任一个的抗体或抗体片段或嵌合抗原受体。
在一个实施方案中，本文中提供了治疗有此需要的患者的方法，所述方法包括施用有效量的与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的抗体或抗体片段或嵌合抗原受体。所述蛋白质可以是以下的任何一种：
Apoe；Fth1；Ftl1；Tmsb4x；Rpl41；Rps29；Actb；Rps27；Rps28；Lyz2；Rpl37a；mt-Atp6；mt-Co1；Rps19；Rpl13；Rplp0；Rpl32；Fau；Rpl18a；mt-Co3；Cd74；Rpl35；Rps18；Rpl39；Rpl13a；Rpl37；Tmsb10；Rps23；Rpl35a；Rplp1；Rps15a；Rpl36；Gm8730；Cxcl2；Rps5；Rps27a；Gm10260；Rps16；Rps24；Rpl38；Rps4x；Rplp2；Rps9；Rpl17；Rps11；Rpl10；Rps6；Cebpb；Rps14；Rpl26；Rps8；Rpl34；S100a8；Rpl6；Gm9843；Rps3a1；mt-Nd1；Rps27rt；Rpl14；Rpl27a；Rpl9；Rps7；Rpl23；Rpl19；Rps3；H2-Aa；Tyrobp；Cst3；Tpt1；mt-Co2；Eef1a1；Rpl11；Rpl8；Wfdc17；Pfn1；Rpl3；Rps13；S100a9；Rpl21；Rpl24；Rpl23a；Rps26；C1qa；Rps18-ps3；Fcer1g；Rpl36a；Rps15；Uba52；Gm11808；Gm2000；Rpl15；Rps20；Rpl27；Rpl10a；Rps10；H2-D1；B2m；H2-Ab1；Rpl31；Ccl6；Wdr89；Rpl28；Rps12；Rpl18；Rpl29；Rpsa；Oaz1；Btg1；Rps21；Rps17；C1qc；Ctsd；Psap；Rpl4；Rps25；Ctsb；Cox8a；C1qb；Atox1；H2afz；Ctss；Rpl12；Cfl1；Actg1；Cox4i1；Rpl10-ps3；Rpl7；Gpx1；Cyba；Gm10116；Gm9493；H3f3a；Rpl30；Atp5e；Rpl23a-ps3；Srgn；Cd14；Rpl9-ps6；Rpl13-ps3；Arpc1b；Rpl61；Thbs1；Trf；mt-Nd4；Il1b；Rpl22；Sh3bgrl3；Sepp1；Shfm1；Lgals3；Npc2；Sat1；Pim1；Rps12-ps3；Sub1；Cd52；Gm10076；Gng5；Cstb；Rps26-ps1；Msrb1；Cox6b1；Rpl36al；Arpc2；Pf4；Lamp1；Naca；Ucp2；Prdx5；Snrpg；Gm10073；Id2；Bcl2a1b；H2-K1；Pabpc1；Fxyd5；Lgmn；Rpl27-ps3；Ndufa2；Ctsz；Cox6a1；Uqcr11；Npm1；Gnb2l1；Eif3f；Ccl8；Ube2d3；Fcgr3；Cotl1；Gm10263；AA467197；Uqcrq；Gnai2；Ubl5；D8Ertd738e；Ndufa3；Ccl3；Sdcbp；Serinc3；Fcgr2b；Tomm7；Atp6v1g1；Cox7a2l；Clta；Grn；Ccrl2；Atp5g2；G0s2；Ptpn18；Smdt1；Bri3；Jchain；Rgs10；Atp6v0e；Rap1b；Rbm39；Laptm5；Rpl5；Atp6v0b；Serp1；Akr1a1；Mcl1；Ccl7；Ccl9；Eef1b2；Marcksl1；Mrpl52；Cd53；Atp5k；Pnrc1；Myeov2；Sdc4；Clec4n；Tma7；Cdc42；Rnaset2a；Rac2；2010107E04Rik；Arpc3；Alox5ap；Vamp8；Zfp3612；Tspo；Ctsh；Atp6v1f；Coro1a；Ninj1；Ccl4；Rnf149；Tgfbi；Fosl2；mt-Nd2；Ms4a6c；Ndufa6；Pcbp2；Klf13；Eif3h；Ostf1；Hilpda；Fam49b；Trem2；Ctsc；Rgs1；Mafb；Prelid1；Fabp5；Ndufa1；Cox17；Eno1；Gm2a；Hnrnpf；Gdi2；Eif3e；Retnlg；Picalm；Ndufb7；Cox5a；Kdm6b；Acp5；Arhgdib；Plaur；Arg1；Srp9；Tomm20；Timm13；Crem；Lst1；Arpc5；Bola2；Hmgb2；Hexa；Gm10036；Cxcl16；Mtdh；Lcp1；Spi1；Gm6576；Sh3glb1；Ndufb8；Gdpd3；Hn1；Cirbp；Plek；Hspe1；Bcl2a1d；Capza2；Ctsa；Efhd2；Gm42418；Gm8186；Tpd52；Tra2b；Actr3；Sptssa；Brk1；Ppp1ca；Ndufv3；Erdr1；Arpc4；Cdk2ap2；Zfos1；Snx3；Ccl17；Ap2s1；Rac1；Cxcr4；Eif5；和Pitpna。
在一些方面中，与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的抗体或抗体片段或嵌合抗原受体是本发明实施方案中任一个的抗体或抗体片段或嵌合抗原受体。在一些方面中，患者患有癌症。在一些方面中，所述癌症已被确定为包含FAP+CAF。在一些方面中，所述癌症是胰腺癌。在一些方面中，所述方法是抑制胰腺癌转移的方法。在一些方面中，所述方法是抑制胰腺癌生长的方法。在一些方面中，所述方法还包括施用至少第二抗癌治疗。在一些方面中，所述第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。
在一个实施方案中，本文中提供了嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)多肽，其从N端到C端包含抗原结合结构域；铰链结构域；跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述CAR多肽与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合。所述蛋白质可以是以下的任何一种：
Apoe；Fth1；Ftl1；Tmsb4x；Rpl41；Rps29；Actb；Rps27；Rps28；Lyz2；Rpl37a；mt-Atp6；mt-Co1；Rps19；Rpl13；Rplp0；Rpl32；Fau；Rpl18a；mt-Co3；Cd74；Rpl35；Rps18；Rpl39；Rpl13a；Rpl37；Tmsb10；Rps23；Rpl35a；Rplp1；Rps15a；Rpl36；Gm8730；Cxcl2；Rps5；Rps27a；Gm10260；Rps16；Rps24；Rpl38；Rps4x；Rplp2；Rps9；Rpl17；Rps11；Rpl10；Rps6；Cebpb；Rps14；Rpl26；Rps8；Rpl34；S100a8；Rpl6；Gm9843；Rps3a1；mt-Nd1；Rps27rt；Rpl14；Rpl27a；Rpl9；Rps7；Rpl23；Rpl19；Rps3；H2-Aa；Tyrobp；Cst3；Tpt1；mt-Co2；Eef1a1；Rpl11；Rpl8；Wfdc17；Pfnl；Rpl3；Rps13；S100a9；Rpl21；Rpl24；Rpl23a；Rps26；C1qa；Rps18-ps3；Fcer1g；Rpl36a；Rps15；Uba52；Gm11808；Gm2000；Rpl15；Rps20；Rpl27；Rpl10a；Rps10；H2-D1；B2m；H2-Ab1；Rpl31；Ccl6；Wdr89；Rpl28；Rps12；Rpl18；Rpl29；Rpsa；Oaz1；Btg1；Rps21；Rps17；C1qc；Ctsd；Psap；Rpl4；Rps25；Ctsb；Cox8a；C1qb；Atox1；H2afz；Ctss；Rpl12；Cfl1；Actg1；Cox4i1；Rpl10-ps3；Rpl7；Gpx1；Cyba；Gm10116；Gm9493；H3f3a；Rpl30；Atp5e；Rpl23a-ps3；Srgn；Cd14；Rpl9-ps6；Rpl13-ps3；Arpc1b；Rpl61；Thbs1；Trf；mt-Nd4；Il1b；Rpl22；Sh3bgrl3；Sepp1；Shfm1；Lgals3；Npc2；Sat1；Pim1；Rps12-ps3；Sub1；Cd52；Gm10076；Gng5；Cstb；Rps26-ps1；Msrb1；Cox6b1；Rpl36al；Arpc2；Pf4；Lamp1；Naca；Ucp2；Prdx5；Snrpg；Gm10073；Id2；Bcl2a1b；H2-K1；Pabpc1；Fxyd5；Lgmn；Rpl27-ps3；Ndufa2；Ctsz；Cox6a1；Uqcr11；Npm1；Gnb2l1；Eif3f；Ccl8；Ube2d3；Fcgr3；Cotl1；Gm10263；AA467197；Uqcrq；Gnai2；Ubl5；D8Ertd738e；Ndufa3；Ccl3；Sdcbp；Serinc3；Fcgr2b；Tomm7；Atp6v1g1；Cox7a21；Clta；Grn；Ccrl2；Atp5g2；G0s2；Ptpn18；Smdt1；Bri3；Jchain；Rgs10；Atp6v0e；Rap1b；Rbm39；Laptm5；Rpl5；Atp6v0b；Serp1；Akr1a1；Mcl1；Ccl7；Ccl9；Eef1b2；Marcksl1；Mrpl52；Cd53；Atp5k；Pnrc1；Myeov2；Sdc4；Clec4n；Tma7；Cdc42；Rnaset2a；Rac2；2010107E04Rik；Arpc3；Alox5ap；Vamp8；Zfp36l2；Tspo；Ctsh；Atp6v1f；Coro1a；Ninj1；Ccl4；Rnf149；Tgfbi；Fosl2；mt-Nd2；Ms4a6c；Ndufa6；Pcbp2；Klf13；Eif3h；Ostf1；Hilpda；Fam49b；Trem2；Ctsc；Rgs1；Mafb；Prelid1；Fabp5；Ndufa1；Cox17；Enol；Gm2a；Hnrnpf；Gdi2；Eif3e；Retnlg；Picalm；Ndufb7；Cox5a；Kdm6b；Acp5；Arhgdib；Plaur；Arg1；Srp9；Tomm20；Timm13；Crem；Lst1；Arpc5；Bola2；Hmgb2；Hexa；Gm10036；Cxcl16；Mtdh；Lcp1；Spi1；Gm6576；Sh3glb1；Ndufb8；Gdpd3；Hn1；Cirbp；Plek；Hspe1；Bcl2a1d；Capza2；Ctsa；Efhd2；Gm42418；Gm8186；Tpd52；Tra2b；Actr3；Sptssa；Brk1；Ppp1ca；Ndufv3；Erdr1；Arpc4；Cdk2ap2；Zfos1；Snx3；Ccl17；Ap2s1；Rac1；Cxcr4；Eif5；和Pitpna。
在一些方面中，所述抗原结合结构域包含来自与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的第一抗体的HCDR序列和来自与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的第二抗体的LCDR序列。在一些方面中，所述抗原结合结构域包含来自与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的抗体的HCDR序列和LCDR序列。在一些方面中，所述铰链结构域是CD8a铰链结构域或IgG4铰链结构域。在一些方面中，所述跨膜结构域是CD8a跨膜结构域或CD28跨膜结构域。在一些方面中，所述胞内信号传导结构域包含CD3z胞内信号传导结构域。
在一个实施方案中，本文中提供了核酸分子，其编码任一本发明实施方案中任一个的CAR多肽。在一些方面中，编码所述CAR多肽的序列与表达控制序列有效连接。在一个实施方案中，本文中提供了分离的免疫效应细胞，其包含根据本发明实施方案中任一个的CAR多肽或本发明实施方案中任一个的核酸。在一些方面中，将所述核酸整合到所述细胞的基因组中。在一些方面中，所述细胞是T细胞。在一些方面中，所述细胞是NK细胞。在一些方面中，所述细胞是人细胞。在一个实施方案中，本文中提供了药物组合物，其包含在可药用载体中的根据本发明实施方案中任一个的细胞群。
在一个实施方案中，本文中提供了治疗对象的方法，其包括施用抗肿瘤有效量的表达根据本发明实施方案中任一个的CAR多肽的嵌合抗原受体(CAR)T细胞。在一些方面中，所述CAR T细胞是同种异体细胞。在一些方面中，所述CAR T细胞是自体细胞。在一些方面中，所述CAR T细胞与所述对象HLA匹配。在一些方面中，所述对象患有癌症。在一些方面中，所述癌症是胰腺癌。
在一个实施方案中，本文中提供了治疗对象的方法，其包括施用抗肿瘤有效量的表达根据本发明实施方案中任一个的CAR多肽的嵌合抗原受体(CAR)NK细胞。在一些方面中，所述CAR NK细胞是同种异体细胞。在一些方面中，所述CAR NK细胞是自体细胞。在一些方面中，所述CAR NK细胞与所述对象HLA匹配。在一些方面中，所述对象患有癌症。在一些方面中，所述癌症是胰腺癌。
在一个实施方案中，本文中提供了诊断患者患有疾病的方法，所述方法包括使从所述对象获得的癌组织与本发明实施方案中任一个的抗体或抗体片段接触，并检测所述抗体或抗体片段与所述组织的结合，其中如果所述抗体或抗体片段与所述组织结合，则所述患者被诊断为患有癌症。
在一个实施方案中，本文中提供了治疗患有疾病的对象的方法，所述方法包括施用抗肿瘤有效量的组合物，所述组合物包含抑制IL-6信号传导的药剂、吉西他滨和免疫检查点阻断治疗。在一些方面中，所述疾病是癌症。在一些方面中，所述癌症先前未能响应于免疫检查点阻断治疗。在一些方面中，所述方法还包括施用有效量的与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的抗体或抗体片段或嵌合抗原受体。在一些方面中，所述癌症是胰腺癌。在一些方面中，所述方法是抑制胰腺癌转移的方法。在一些方面中，所述方法是抑制胰腺癌生长的方法。在一些方面中，所述方法还包括施用至少第二抗癌治疗。在一些方面中，所述第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。
如本文中使用的，就指定组分而言“基本上不含”在本文中用于意指指定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非故意污染产生的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分之量的组合物。
如本文中在说明书中使用的，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文中在权利要求书中使用的，当与词语“包含/包括”联合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。
除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义。本文中使用的“另一”可意指至少第二或更多。
在本申请通篇，术语“约”用于表示值包括用来确定所述值的装置、方法的固有误差变化，或者研究对象之间存在的变化。
根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实施例虽然指示了本发明的一些优选实施方案，但是仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得明显。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的一些具体实施方案的详细描述参考这些附图中的一个或更多个可更好地理解本发明。
图1A至D。PDAC肿瘤中的CAF异质性。图1A。PKT肿瘤中的代表性基质细胞组成(n＝11只小鼠)。这些数据也在图4E中示出。图1B。通过免疫荧光标记人PDAC中的αSMA和FAP进行的共定位的量化(n＝2名患者，标准差表示跨视野的染色分布的变化)。图1C至D。在PKT；LSL-YFP；αSMA-RFP GEM的肿瘤中，αSMA-RFP+细胞、YFP+癌细胞和FAP-APC免疫标记细胞的表征。n＝1只小鼠，分选的细胞群随后用于scRNA seq分析(图2A至C)。GEM：经遗传改造的小鼠，Neg：阴性，s+：单阳性，Vim：波形蛋白，scRNA seq：单细胞RNA测序。关于小鼠GEM命名，参见表1。
图2A至B。αSMA+和FAP+CAF限定了具有免疫样转录组谱的不同成纤维细胞亚群。图2A。通过流式细胞术(图1D)从PKT肿瘤中富集的αSMA+和FAP+细胞的scRNA seq分析，以t-SNE图表示，具有来自αSMA+富集的细胞的簇(1、2、3、4和6，左图)和来自FAP+富集的细胞的簇(3、5、7，左图)。簇3包含在αSMA+与FAP+富集的细胞之间具有共有的转录组特征的细胞的簇。还定义了功能簇(1至9，右图)并列出了组定义。图2B。对特定的αSMA+和FAP+簇进行了比较分析，并基于每个簇中富集的转录物确定了基因网络。scRNA seq：单细胞RNA测序，RBC：红细胞，ECM：胞外基质。
图3。通过人PDAC肿瘤的scRNA测序捕获的细胞异质性。未分级的人PDAC肿瘤的scRNA seq分析以t-SNE图表示，评价了两名患者(PDAC 1和PDAC 2)。对于PDAC2，进行了两种不同的流式细胞术细胞分选(PDAC 2A、PDAC2B；技术重复)，并随后合并到PDAC 2中用于后续分析。scRNA seq：单细胞RNA测序。
图4A至E。通过选择性耗竭αSMA+与FAP+CAF对PDAC进展的不同结果。图4A。描绘了在有和没有αSMA+或FAP+细胞耗竭的情况下，指定组在对PKT GEM的胰腺肿瘤切片进行H&E染色之后的组织学特征的条形图。耗竭通过在携带αSMA-TK和FAP-TK转基因的PKT小鼠中进行GCV施用来实现。对照包括携带转基因并施用有PBS或未经注射的PKT小鼠，以及没有转基因并施用GCV的PKT小鼠。FAP-TK，n＝5，而对照，n＝8；αSMA-TK，n＝11，而对照，n＝17。描述了均值+/-均值标准误。使用曼恩-惠特尼检验(Mann-Whitney test)来评价统计学显著性。图4B。描绘了对PKT肿瘤中αSMA和FAP进行的免疫组织化学(IHC)的量化以及指定组中的相关量化的条形图。FAP-TK，n＝6，而对照，n＝7；αSMA-TK，n＝5，而对照，n＝5只小鼠。使用曼恩-惠特尼检验来评价统计学显著性。图4C至D。在αSMA+与FAP+细胞耗竭的情况下，在PKT小鼠的肿瘤中通常被下调或上调的基因(图4C)和相关途径(图4D)的重叠。FAP-TK，n＝3，而对照，n＝3；αSMA-TK，n＝3，而对照，n＝3只小鼠。图4E。PKT肿瘤(也在图1A中示出)和耗竭αSMA+或FAP+细胞的PKT肿瘤中的间充质细胞组成。FAP-TK，n＝7；αSMA-TK，n＝5，对照，n＝4。对照(FAP-TK对照，n＝7，αSMA-TK对照，n＝4二者的组合对照)，n＝11。48.3％*：通过未配对双尾t检验评价的显著差异。条形图描绘了对αSMA基质耗竭的定量，曼恩-惠特尼检验。描绘了均值+/-标准差。GEM：经遗传改造的小鼠，GCV：更昔洛韦，IRS：免疫反应评分。关于小鼠GEM命名，参见表1。
图5A至H。来自αSMA+CAF的IL-6赋予癌细胞对吉西他滨的抗性。图5A。来自PKT肿瘤的αSMA+和FAP+富集的细胞的scRNA seq分析以t-SNE图表示，并示出了细胞数目(在括号中)和表达IL-6的细胞百分比。条形图总结了从scRNA seq获得的数据，其支持了IL-6转录物主要在αSMA+细胞中富集。图5B。指定细胞中IL-6转录物的qPCR定量。细胞从3只不同的小鼠获得。使用未配对双尾t检验来评价统计学显著性。图5C。在指定的GEM中对胰腺肿瘤的H&E切片的肿瘤组织学表型的量化。在每列中，从上到下的部分表示坏死、不良、良好、PanIN和正常。双因素ANOVA。图5D。指定的GEM随时间的存活。对数秩检验。参见图6C。图5E。肿瘤中IL-6转录物的qPCR定量，n＝每组4只小鼠。从左到右，条表示KPPF、KPPF；IL-6smaKO和KPPF；IL-6-/-。使用未配对双尾t检验来评价统计学显著性。图5F。指定的GEM随时间的存活。在y轴上的50％存活标记处从左到右，线表示KPPF Gem、KPPF Gem IL-6、KPPF；IL-6smaKO和KPPF；IL-6-/-。对数秩检验。参见图6C。图5G。肿瘤中IL-6和Acta2(αSMA)转录物的qPCR定量，n＝每组3只小鼠。使用未配对双尾t检验来评价统计学显著性。图5H。在指定的GEM中，在对磷酸化Stat3(phospho-Stat3)进行免疫组织化学之后的每个视野中phospho-Stat3+细胞数目的定量分析。条从左到右表示KPPF、KPPF；IL-6smaKO、KPPF；IL-6-/-、KPPF Gem和KPPF；IL-6smaKOGem。n＝每组5只小鼠，单因素ANOVA。示出了均值+/-均值标准误。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005，****P＜0.001，ns：不显著。scRNAseq：单细胞RNA测序，GEM：经遗传改造的小鼠，Gem：吉西他滨，qPCR：定量PCR，nd：未检测到。关于小鼠GEM命名，参见表1。
图6A至D。瘤内T细胞的基质IL-6极化的益处与吉西他滨同时实现。图6A。指定的GEM和处理组中的肿瘤免疫浸润部分。数据表示为均值+/-均值标准误，未配对单尾t检验。图6B。指定的实验组中小鼠的存活。在y轴上的25％存活标记处，从左到右，线表示KPPFGem、KPPF Gem CP、KPPF；IL-6-/-Gem和KPPF；IL-6-/-Gem CP。对数秩检验，参见图6C。图6C。GEM和处理组的概述以及选定组中小鼠的存活分析。对数秩检验。图6D。评价了在具有高(IL-6HI)和低(IL-6LO)IL-6转录物水平的肿瘤中FOXP3、GADH和ACTA2(αSMA)转录物水平的TCGA数据集分析。未配对双尾t检验。*P＜0.05，***P＜0.005，ns：不显著。Gem：吉西他滨，aIL-6：抗IL-6抗体，CP：抗CTLA-4和抗PD1抗体。关于小鼠GEM命名，参见表1。
图7A至B。用于限定图1E至F中所示的设门的对照和设门策略。肿瘤细胞设门策略和FAP同种型对照(图7A)，未经染色的脾细胞用作内源性荧光(αSMA-RFP和YFP)设门的阴性对照(图7B)。
图8A至E。图8A。在有和没有αSMA细胞耗竭的情况下PKP小鼠的存活曲线(PKP对照是没有αSMA-TK转基因并施用有GCV的PKP小鼠)。箭头指示了当开始GCV处理时。在约75天时降至0％存活的线表示PKPαSMA耗竭。对数秩检验。图8B。描绘了在有和没有αSMA+细胞耗竭、年龄匹配或终点的情况下，基于PKP GEM的胰腺肿瘤切片的H&E染色的指定组的组织学特征的条形图。对照包括携带转基因而无GCV的PKP小鼠或/和施用GCV且无转基因的PKT小鼠。年龄匹配对照，n＝9；对照濒死(实验终点)，n＝11，αSMA-TK，n＝12只小鼠。使用双因素ANOVA评价统计学显著性。图8C。肿瘤负荷表示为肿瘤重量比体重的百分比。对照，n＝8；FAP-TK，n＝9只小鼠。未配对双尾t检验。图8D。指定小鼠的肿瘤中FAP+细胞的流式细胞术评价和图示(每组一只小鼠)。图8E。肿瘤组织病理学评分。对照，n＝4；FAP-TK，n＝4只小鼠。均值+/-标准差，曼恩-惠特尼检验。除非另有说明，否则数据表示为均值+/-均值标准误。*P＜0.05，***P＜0.005，****，P＜0.001，ns：不显著。GEM：经遗传改造的小鼠，GCV：更昔洛韦，关于小鼠GEM命名，参见表1。
图9A至E。图9A。在给予GCV的非荷瘤小鼠中随时间的体重测量结果。WT(底部线)：野生型同窝对照，n＝3；FAP-TK(顶部线)，n＝4只小鼠。图9B。在终点处的胰腺、脾、股四头肌(quadriceps muscle，QM)和腓肠肌(gastroecmius muscle，GM)重量。WT：野生型同窝对照，n＝3；FAP-TK，n＝4只小鼠。图9C。PKT小鼠脾脏中FAP+细胞的流式细胞术。图9D。使用流式细胞术对非荷瘤小鼠骨髓中的αSMA-RFP+(n＝2只小鼠)和FAP免疫标记细胞(n＝3只小鼠)进行的评价。图9E。与非荷瘤对照小鼠(n＝6)相比，荷瘤小鼠(PKT，n＝3)骨髓中FAP+细胞的频率提高。描绘了均值+/-均值标准误，未配对的双尾t检验，*P＜0.05，ns：不显著。GCV：更昔洛韦，关于小鼠命名，参见表1。
图10A至C。图10A。在所列时间点，来自KPPF GEM的代表性H&E染色、CK19和αSMA免疫标记的胰腺、肺和肝切片。比例尺：100μm。图10B。在所列时间点，来自KPPC GEM的代表性H&E染色的胰腺切片。比例尺：100μm。图10C。在KPPF；αSMA-Cre；R26ConfettiGEM的胰腺肿瘤中GFP、RFP、YFP和CFP以及细胞核的代表性免疫荧光捕获。比例尺：20μm。GEM：经遗传改造的小鼠，wks：周，ADM：腺泡到导管化生(Acinar to ductal metaplasia)，关于小鼠GEM命名，参见表1。
图11A至F。图11A。从KPPF；αSMA-Cre；R26DualGEM收获的肿瘤来源癌细胞和成纤维细胞的示意图；图11B。通过qPCR在所列GEM的肿瘤中IL-1β的表达。从左到右，条表示KPPF、KPPF；IL-6smaKO和KPPF；IL-6-/-。n＝每组小鼠数。图11C至E。从所列器官和GEM中纯化的DNA的PCR产物的电泳迁移。产品检测通过预期泳道中的基因重组确认IL-6的特异性缺失。图11F。对来自KPPF；αSMA-Cre；R26DualGEM的肿瘤中FAP和αSMA进行免疫标记的共定位的量化。n＝4只小鼠。示出了均值+/-均值标准误，ns：不显著，GEM：经遗传改造的小鼠，qPCR：定量PCR，关于小鼠GEM命名，参见表1。
图12A至C。图12A。在所列GEM中的肿瘤负荷。从左到右，条表示KPPF、KPPF；IL-6smaKO和KPPF；IL-6-/-。图12B。在指定GEM中的转移发生率。图12C。来自所列GEM中H&E染色的胰腺切片的组织病理学特征的量化。在每列中，从上到下的部分表示PanIN和正常。GEM：经遗传改造的小鼠，ns：不显著，关于小鼠GEM命名，参见表1。
图13A至C。图13A。在所列的疾病进展时间点，KPF小鼠的代表性H&E染色和CK19免疫标记的胰腺，以及肝和肺转移的H&E染色切片(黑色箭头)。比例尺：100μm。图13B。所列GEM的胰腺的代表性H&E染色切片。比例尺：100μm。图13C。所列GEM的存活，参见图6C。在略小于400天时与x轴相交的线表示KPF。对数秩检验。GEM：经遗传改造的小鼠，ns：不显著，关于小鼠GEM命名，参见表1。
图14A至D。图14A。所列GEM的存活，参见图6C。对数秩检验。图14B。在濒死终点，所列GEM的胰腺的H&E染色切片的组织病理学特征的量化。在每列中，从上到下的部分表示坏死、不良、良好、PanIN和正常。KPPF GEM，n＝6；KPPF；IL-6smaKO Gem，n＝5只小鼠。双因素ANOVA。图14C。指定GEM中的肿瘤负荷。KPPF Gem(左列)，n＝8；KPPF；IL-6smaKO Gem(右列)，n＝11只小鼠。未配对双尾t检验。图14D。来自所列GEM的胰腺的αSMA免疫标记切片的αSMA+面积百分比的定量。n＝每组5只小鼠，单因素ANOVA。*P＜0.05，**P＜0.01，***，P＜0.005，****，P＜0.001，ns：不显著。数据表示为均值+/-均值标准误。GEM：经遗传改造的小鼠，Gem：吉西他滨，关于小鼠GEM命名，参见表1。
图15A至B。图15A。来自对phospho-ERK1/2和phospho-Akt进行免疫标记的所列GEM的胰腺切片的染色面积百分比的定量。n＝每组5只小鼠，单因素ANOVA。图15B。来自对CD31、Ki67、切割的胱天蛋白酶3进行免疫标记并针对MTS进行染色的所列GEM的胰腺切片的染色面积百分比的定量。n＝每组5只小鼠，单因素ANOVA。*P＜0.05，**P＜0.01，***，P＜0.005，****，P＜0.001，ns：不显著。GEM：经遗传改造的小鼠，Gem：吉西他滨，关于小鼠GEM命名，参见表1。
图16A至D。用于免疫分型分析的对于肿瘤(图16A)和脾(图16B)的流式细胞术分析的设门策略。用于T细胞组(图16C)和髓样细胞组(图16D)的对于肿瘤流式细胞术分析的设门策略。
图17A至C。指定的GEM中所列免疫细胞的另外的免疫分型结果，评价了肿瘤(图17A)、脾(图17B)和外周血(图17C)。
发明详述
胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinomas，PDAC)中的结缔组织生成性反应(desmoplastic reaction)涉及免疫细胞和成纤维细胞的显著积累。成纤维细胞是间充质细胞，其有助于组织修复和再生，并作为针对癌症的宿主应答的一部分在肿瘤中积累。这样的癌症相关成纤维细胞(CAF)的起源和功能多样性在很大程度上仍然未知。αSMA+细胞是PDAC中具有抑肿瘤特性的主要CAF群(TS-CAF)，其与表现出促肿瘤活性的FAP+CAF(TP-CAF)相反。虽然TS-CAF主要调节胞外基质(extracellular matrix，ECM)的产生、促进细胞-ECM黏附并调节适应性免疫，但TP-CAF表现出向促炎、趋化因子分泌表型倾斜的谱系，并表现出可用作抑制TP-CAF的诊断和治疗靶标的独特基因的表达。此外，CAF共有淋巴细胞谱系和髓样谱系的特征性的不同基因表达谱。尽管αSMA+CAF来源的白细胞介素6(IL-6)不影响PDAC进展，但其有助于化学抗性并减弱免疫检查点阻断治疗的潜力。从αSMA+CAF中特异性缺失IL-6增强了对化学治疗和检查点阻断治疗的敏感性。总而言之，这些研究确定了在PDAC进展期间功能异质成纤维细胞的复杂网络，其具有重要的治疗意义。因此，本文中提供了用于控制肿瘤生长的CAF靶标。
使用遗传小鼠模型的结果确定了PDAC CAF是异质群，其中αSMA+CAF作为PDAC中的优势群出现。这些研究完全避免了使用细胞培养系统来得出这一结论，这作为使研究与人PDAC生物学更相关的努力。αSMA+CAF和FAP+CAF在PDAC进展中具有不同的功能(Feig etal.，2013；Lo et al.，2017；Kraman et al.，2010)。令人感兴趣的是，FAP+CAF表示骨髓来源的祖细胞，其可产生αSMA+CAF。令人惊讶的是，如通过scRNA-Seq限定的αSMA+CAF和FAP+CAF的特性反映了不同的免疫细胞样转录组。αSMA+CAF包含产生和重塑细胞的胶原亚群，以及显示出巨噬细胞样和T细胞样转录组的细胞亚群。相比之下，FAP+CAF包含具有中性粒细胞样和B细胞样转录组的细胞亚群。αSMA+CAF和FAP+CAF的亚群显示出单核细胞和树突细胞样转录组。这些发现是令人感兴趣的，因为其强调了间充质细胞谱系和造血细胞谱系之间可能的重叠。PDAC肿瘤微环境中丰富的细胞因子环境调节免疫细胞募集和表型成熟，并且CAF暴露于该环境可导致免疫细胞相关转录物的诱导。可能的是，某些CAF可促进前馈信号传导环以操纵瘤内免疫应答。在缺乏特定CAF群的情况下，某些免疫细胞的分化/活化可在PDAC中受到阻碍或限制。或者，CAF可在肿瘤中执行免疫细胞功能。
αSMA+CAF来源的IL-6赋予化学抗性并在肿瘤微环境中负调节T细胞。在这方面，在基于类器官的研究中，强调了CAF的亚群，以代表包括IL-6产生在内的免疫调节表型(Ohlund et al.，2017)。虽然总的来说，αSMA+CAF在PDAC进展中作为肿瘤抑制(肿瘤抑制或TS-CAF)出现，但在吉西他滨治疗应激的背景下，癌细胞“利用”由αSMA+CAF产生的IL-6来促进其存活。可想到，由αSMA+CAF产生的IL-6在非治疗条件下用于自我保护目的，但也被癌细胞利用用于诱导在针对吉西他滨治疗的抗性的情况下实现的促存活信号传导途径。先前的研究已报道，IL-6信号传导在化学治疗的背景下通过JAK/STAT信号传导途径向癌细胞传递促存活信号(Wormann et al.，2016；Nagathihalli et al.，2016)。已观察到在αSMA+CAF产生的IL-6缺失之后PDAC免疫微环境的显著极化；然而，Teff和Treg频率的这样的变化不会影响PDAC进展。当与吉西他滨组合时，免疫检查点阻断治疗是无效的；然而，当与IL-6信号传导抑制组合时，实现了这样的组合益处，表明IL-6是PDAC中免疫检查点阻断治疗的关键抑制子。当与吉西他滨诱导的细胞死亡和可能的新抗原产生组合时，IL-6的抑制可能有利于效应T细胞的出现，这可增强免疫检查点阻断的效力。
I.抗体及其产生
“分离的抗体”是已经从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白性溶质。在一些具体实施方案中，将抗体纯化至：(1)按抗体重量计高于95％(如通过劳里法(Lowry method)确定)，并且最特别地按重量计大于99％；(2)通过使用旋杯测序仪(spinning cup sequenator)足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)使用考马斯蓝(Coomassie blue)或银染在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE鉴定的均质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为将不存在抗体天然环境的至少一种组分。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
基本的四链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本异四聚体单元以及称为J链的另外多肽组成，并因此包含10个抗原结合位点，而分泌型IgA抗体可聚合形成包含2至5个基本4链单元以及J链的多价组装物。在IgG情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链则通过一个或更多个二硫键彼此连接，这取决于H链同种型。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N端均具有可变区(VH)，随后是α和γ链中的每一条的三个恒定结构域(CH)，以及对于mu和同种型的四个CH结构域。每条L链在N端均具有可变区(VL)，随后是在其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链与重链可变区之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和特性，参见例如Basic andClinical Immunology，8th edition，Daniel P.Stites，Abba I.Terr and TristramG.Parslow(eds.)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，page 71，and Chapter 6。
可将来自任何脊椎动物物种的L链基于其恒定结构域(CL)的氨基酸序列分为两种明显独特类型(称为κ和λ)之一。取决于其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别或同种型。存在5种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别具有命名为α、δ、ε、γ和mu的重链。它们的γ和α类别基于CH序列和功能的相对较小差异进一步分为亚类，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的”是指在抗体之间，V结构域的某些区段在序列方面差异很大的事实。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非在可变区的110个氨基酸跨度中均匀分布。相反，V区由被具有极度变异性的较短区域(称为“高变区”，每个区域的长度均为9至12个氨基酸)隔开的15至30个氨基酸的相对不变的链段(称为框架区(framework region，FR))组成。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，其主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，这形成了环，其连接β-折叠结构，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密邻近地保持在一起，并且与来自另一链的高变区一起促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应物功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(antibody dependentcellular cytotoxicity，ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(antibody-dependent cellularphagocytosis，ADCP)、抗体依赖性嗜中性粒细胞吞噬(antibody-dependent neutrophilphagocytosis，ADNP)和抗体依赖性补体沉积(antibody-dependent complementdeposition，ADCD)。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，当根据Kabat编号体系进行编号时，VL中在约第24至34位(L1)、第50至56位(L2)和第89至97位(L3)残基附近，以及VH中在约第31至35位(H1)、第50至65位(H2)和第95至102位(H3)附近；Kabat et al.，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))；和/或来自“高变环”的那些残基(例如，当根据Chothia编号体系进行编号时，VL中第24至34位(L1)、第50至56位(L2)和第89至97位(L3)残基，以及VH中第26至32位(H1)、第52至56位和第95至101位(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；和/或来自“高变环”/CDR的那些残基(例如，当根据IMGT编号体系进行编号时，VL中第27至38位(L1)、第56至65位(L2)和第105至120位(L3)残基，以及VH中第27至38位(H1)、第56至65位(H2)和第105至120位(H3)；Lefranc，M.P.etal.Nucl.Acids Res.27：209-212(1999)，Ruiz，M.et al.Nucl.Acids Res.28：219-221(2000))。任选地，抗体在以下位点中的一处或更多处具有对称插入：当根据AHo进行编号时，VL中的第28位、第36位(L1)，第63位、第74至75位(L2)和第123位(L3)，以及VsubH中的第28位、第36位(H1)，第63位、第74至75位(H2)和第123位(H3)；Honneger，A.and Plunkthun，A.J.Mol.Biol.309：657-670(2001))。
“种系核酸残基”意指天然存在于编码恒定区或可变区的种系基因中的核酸残基。“种系基因”是存在于生殖细胞(即，注定要变成卵或在精子中的细胞)中的DNA。“种系突变”是指在单细胞阶段在生殖细胞或合子中发生的特定DNA的可遗传变化，并且当传递至后代时，这样的突变会被并入在身体的每个细胞中。种系突变与在单个体细胞中获得的体细胞突变相反。在一些情况下，将使编码可变区的种系DNA序列中的核苷酸突变(即，体细胞突变)，并用不同的核苷酸替代。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上均质的抗体群体的抗体，即，除可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，包含该群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，是针对单一抗原位点的。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体的优点在于其可在不受其他抗体污染下合成。修饰语“单克隆”不应理解为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，可用于本公开内容的单克隆抗体可通过首先由Kohler etal.，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可在对抗原特异性B细胞(响应于感染或免疫接种的抗原特异性浆母细胞)进行单细胞分选，或在从大批分选的抗原特异性集合中的单细胞中捕获连接的重链和轻链之后，在细菌、真核动物或植物细胞中使用重组DNA方法来制造(参见，例如，美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用描述于例如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中的技术从噬菌体抗体文库中分离。
B.一般方法
将理解的是，与TP-CAF高表达的蛋白质结合的单克隆抗体将具有数种应用。这些包括产生诊断试剂盒，其用于检测和诊断癌症，以及用于治疗癌症。在这些情况下，可将这样的抗体与诊断或治疗剂连接，将其用作竞争性测定中的捕获剂或竞争剂，或者在无与其连接的另外的试剂的情况下将其单独使用。可使抗体突变或对其进行修饰，如下文进一步讨论。用于制备和表征抗体的方法是本领域公知的(参见，例如，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；美国专利4,196,265)。
用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的那些路线相同的路线开始。这两种方法的第一步是对合适的宿主进行免疫接种或鉴定由于之前的自然感染或用经许可的或实验性疫苗进行疫苗接种而免疫接种的对象。如本领域中公知的，用于免疫接种的给定组合物的免疫原性可不同。因此，通常有必要加强宿主的免疫系统，如可通过使肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。示例性且优选的载体是钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。其他白蛋白例如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。用于使多肽与载体蛋白缀合的方式是本领域中公知的，并且包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺和双-重氮联苯胺(bis-biazotized benzidine)。同样如本领域中公知的，特定免疫原组合物的免疫原性可通过使用称为佐剂的免疫应答的非特异性刺激剂来增强。动物中示例性且优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包含经杀伤结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫应答的非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂，以及在人中包括明矾、CpG、MFP59以及免疫刺激分子的组合(“佐剂系统”，例如AS01或AS03)。诱导癌症特异性B细胞的另外的接种实验形式也是可能的，包括纳米粒疫苗，或者作为DNA或RNA基因在物理递送系统(例如脂质纳米粒或金生物珠上)中递送，以及以针、基因枪、经皮电穿孔装置递送的基因编码抗原。抗原基因还可如通过复制可行或缺陷型病毒载体所编码的进行携带，所述病毒载体例如腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、疱疹病毒或甲病毒复制子，或者作为替代地病毒样颗粒。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫接种的动物而变化。可使用多种途径来施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可通过在免疫接种之后的不同点对经免疫接种的动物采血来监测多克隆抗体的产生。也可给予第二、加强注射。重复加强免疫和滴定过程直到达到合适的效价。当获得期望的免疫原性水平时，可对经免疫接种的动物取血，分离血清并储存，和/或可将动物用于产生MAb。
在免疫接种之后，选择具有产生抗体之潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)用于mAb产生方案。这些细胞可从活检的脾、淋巴结、扁桃体或腺样体、骨髓穿刺或活检、来自黏膜器官(例如肺或GI道)的组织活检，或者从循环血液中获得。然后，使来自经免疫接种动物或免疫人之抗体产生B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞的细胞融合，其通常是与经免疫接种动物为同一物种的永生化骨髓瘤细胞或者是人或人/小鼠嵌合细胞。适合用于产生杂交瘤的融合程序的骨髓瘤细胞系优选地不产生抗体、具有高融合效率且具有酶缺陷，这随后使其不能在仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中生长。如本领域技术人员已知的，可使用许多骨髓瘤细胞中的任一种。HMMA2.5细胞或MFP-2细胞是这样的细胞的特别可用的实例。
用于产生抗体产生脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的方法通常包括：在存在促进细胞膜融合的一种或更多种试剂(化学或电学)的情况下使体细胞与骨髓瘤细胞以2∶1的比例混合，但是该比例可分别为约20∶1至约1∶1而不等。在一些情况下，用爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus，EBV)转化人B细胞作为初始步骤提高了B细胞尺寸，从而增强与相对较大尺寸骨髓瘤细胞的融合。通过EBV的转化效率通过在转化培养基中使用CpG和Chk2抑制剂药物增强。或者，可通过与表达CD40配体(CD154)的经转染细胞系在包含另外的可溶性因子(例如IL-21和人B细胞活化因子(B cell Activating Factor，BAFF，TNF超家族的II型成员)的培养基中共培养来使人B细胞活化。已经描述了使用仙台病毒(Sendaivirus)进行的融合方法以及使用聚乙二醇(PEG)(例如37％(v/v)PEG)的那些。电学上诱导融合方法的使用也是合适的，并且存在更好效率的过程。融合程序通常会在约1×10-6至1×10-8的低频率下产生可生存的杂合体，但是采用优化程序，人们可获得接近200分之1的融合效率。然而，融合的相对低效率并不造成问题，因为通过在选择培养基中培养，活的融合杂合体与亲本未融合细胞(特别是在正常情况下将持续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)区分开来。选择培养基通常是在组织培养基中包含阻断核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶二者的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，培养基补充有次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，培养基补充有次黄嘌呤。如果B细胞来源是EBV转化的人B细胞系，则添加哇巴因(ouabain)以清除未与骨髓瘤融合的EBV转化系。
优选的选择培养基是HAT或具有哇巴因的HAT。只有能够进行核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶(例如，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT))中有缺陷，因此其不能存活。B细胞可进行该途径，但是其在培养中具有有限的寿命并且通常在约2周内死亡。因此，只有可在选择培养基中存活的细胞才是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂合体。当用于融合的B细胞的来源是EBV转化的B细胞系时，此时还可将哇巴因用于杂合体的药物选择，因为EBV转化的B细胞对药物杀伤敏感，而选择所使用的骨髓瘤配偶体对哇巴因具有抗性。
培养提供了从中选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。通常如下进行杂交瘤的选择：通过在微量滴定板中进行单克隆稀释来培养细胞，随后针对期望反应性测试单个克隆上清液(在约2至3周之后)。测定应灵敏、简单并且迅速，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、斑点免疫结合测定等。然后将选择的杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术分选进行单细胞分选，并克隆到单独抗体产生细胞系中，所述克隆然后可无限增殖以提供mAb。细胞系可以以两种基本方式用于MAb产生。可将杂交瘤样品注射(通常注射到腹膜腔中)到动物(例如，小鼠)中。任选地，在注射之前将动物用烃，特别是油(例如，姥鲛烷(四甲基十五烷))致敏(prime)。当以这种方式使用人杂交瘤时，注射免疫缺损的小鼠(例如SCID小鼠)是最佳的，以防止肿瘤排斥。经注射动物出现分泌由融合细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可放出动物的体液例如血清或腹水以提供高浓度mAb。也可在体外培养单个细胞系，其中mAb自然地分泌到培养基中，从中可容易地获得高浓度的mAb。或者，可在体外使用人杂交瘤细胞系以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。可将细胞系调整为在不含血清的培养基中生长，以优化回收高纯度人单克隆免疫球蛋白的能力。
如果期望的话，以任一种方式产生的MAb可进一步使用过滤、离心和多种色谱方法(例如FPLC或亲和色谱)进行纯化。本公开内容的单克隆抗体的片段可通过以下方法由经纯化的单克隆抗体获得：其包括用酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化，和/或通过经化学还原切割二硫键。或者，本公开内容所涵盖的单克隆抗体片段可使用自动化肽合成仪合成。
还在考虑之中的是，可使用分子克隆方法来产生单克隆抗体。可使用顺磁珠选择或流式细胞术分选对标记有目的抗原的单B细胞进行物理分选，然后可从单细胞中分离RNA，并通过RT-PCR扩增抗体基因。或者，可将抗原特异性的大批分选的细胞群分离成微囊泡，以及使用重链和轻链扩增子的物理连接，或者从囊泡中对重链和轻链基因进行通用条码编码，从单细胞中回收匹配的重链和轻链可变基因。来自单细胞的匹配的重链和轻链基因也可通过使用带有RT-PCR引物和用于以一个条码/细胞标记转录物的条码的细胞穿透纳米粒处理细胞从抗原特异性B细胞群体中获得。抗体可变基因也可通过杂交瘤系的RNA提取来分离，通过RT-PCR获得抗体基因，并将其克隆到免疫球蛋白表达载体中。或者，由从细胞系分离的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库，并使用病毒抗原通过淘选选择表达合适抗体的噬菌粒。这种方法相对于常规杂交瘤技术的优点是：可在单轮中产生和筛选多达约104倍的抗体，并且通过H链和L链组合产生了新的特异性，这进一步提高了发现合适抗体的机会。
教导产生可用于本公开内容的抗体的其他美国专利(各自通过引用并入本文)包括美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法产生嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备；以及美国专利4,867,973，其描述了抗体-治疗剂缀合物。
C.本公开内容的抗体
根据本公开内容的抗体可在第一种情况下通过其结合特异性来定义。通过使用本领域技术人员公知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，本领域技术人员可确定这样的抗体是否落入本发明权利要求书的范围内。例如，给定抗体结合的表位可由位于抗原分子内的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个)氨基酸的单个连续序列组成(例如，结构域中的线性表位)。或者，表位可由位于抗原分子内的多个不连续的氨基酸(或氨基酸序列)组成(例如，构象性表位)。
本领域普通技术人员已知的多种技术可用于确定抗体是否“与多肽或蛋白质内的一个或更多个氨基酸相互作用”。一些示例性技术包括例如常规的交叉阻断测定，例如描述于Antibodies，Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)中的那些。交叉阻断可在多种结合测定(例如ELISA、生物层干涉术或表面等离振子体共振)中测量。另一些方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)MethodsMol.Biol.248：443-63)、肽切割分析、使用单颗粒重建的高分辨率电子显微术技术、cryoEM或层析成像(tomography)、晶体学研究和NMR分析。另外，可采用方法，例如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰(Tomer(2000)Prot.Sci.9：487-496)。可用于鉴定抗体与之相互作用的多肽内氨基酸的另一种方法是通过质谱检测氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换法涉及氘标记目的蛋白质，随后将抗体与经氘标记的蛋白质结合。接下来，将蛋白质/抗体复合体转移至水，并且与不属于界面一部分的氨基酸中的可交换质子相比，受抗体复合体保护的氨基酸中的可交换质子以更慢的速率经历氘至氢反向交换。作为结果，与不包含在界面中的氨基酸相比，形成蛋白质/抗体界面的一部分的氨基酸可保留氘，并因此表现出相对较高的质量。在抗体解离之后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示对应于抗体与之相互作用的特定氨基酸的经氘标记的残基。参见，例如，Ehring(1999)AnalyticalBiochemistry 267：252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。
术语“表位”是指抗原上B和/或T细胞对其应答的位点。B细胞表位可由蛋白质的三级折叠并列的连续氨基酸或不连续氨基酸二者形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常以独特的空间构象包含至少3个，并且更通常至少5或8至10个氨基酸。
修饰辅助谱分析(Modification-Assisted Profiling，MAP)(也称为基于抗原结构的抗体谱分析(Antigen Structure-based Antibody Profiling，ASAP))是根据每种抗体与化学或酶修饰的抗原表面的结合谱的相似性将针对同一抗原的大量单克隆抗体(mAb)进行分类的方法(参见US 2004/0101920，其通过引用以其整体特定地并入本文)。每个类别可反映与由另一类别表示的表位明显不同或与其部分重叠的独特的表位。该技术允许快速过滤遗传上相同的抗体，使得表征可集中在遗传上独特的抗体上。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可有助于鉴定产生具有所期望特征的mAb的稀有杂交瘤克隆。MAP可用于将本公开内容的抗体分选为结合不同表位的抗体组。
本公开内容包括可与相同表位或表位的一部分结合的抗体。同样，本公开内容还包括与本文中所述的任何具体示例性抗体竞争与靶标或其片段结合的抗体。通过使用本领域已知的常规方法，人们可容易地确定抗体是否与参考抗体结合相同的表位，或与参考抗体竞争结合。例如，为了确定受试抗体与参考是否结合相同的表位，允许参考抗体在饱和条件下与靶标结合。接下来，评估受试抗体与靶分子结合的能力。如果在与参考抗体饱和结合之后，受试抗体能够与靶分子结合，则可得出结论，受试抗体与不同于参考抗体的表位结合。在另一方面，如果在与参考抗体饱和结合之后，受试抗体不能与靶分子结合，则受试抗体可与和参考抗体结合的表位相同的表位结合。
如果两种抗体各自竞争性地抑制(阻断)彼此与抗原的结合，则两种抗体与相同或重叠的表位结合。即，1、5、10、20或100倍过量的一种抗体将另一种抗体的结合抑制了至少50％，但优选75％、90％或甚至99％，如在竞争性结合测定中所测得的(参见，例如，Junghans et al.，Cancer Res.1990 50：1495-1502)。或者，如果抗原中降低或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变都降低或消除了另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果降低或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变降低或消除了另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表位。
然后可进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)，以确定观察到的受试抗体结合的缺乏实际上是否由于结合与参考抗体相同的表位，或者空间阻断(或其他现象)是否是缺乏观察到的结合的原因。该分选的实验可使用ELISA、RIA、表面等离振子体共振、流式细胞术或本领域可用的任何其他定量或定性抗体结合测定进行。用EM或晶体学进行的结构研究也可表明竞争结合的两种抗体是否识别相同的表位。
在另一方面中，抗体可由其包含另外的“框架”区的可变序列定义。此外，抗体序列可不同于这些序列，任选地使用以下更详细讨论的方法。例如，核酸序列可在以下方面不同于上述那些：(a)可变区可与轻链和重链的恒定结构域分离；(b)核酸可不同于上述那些同时不影响由其编码的残基；(c)核酸可以以给定百分比，例如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性不同于上述核酸；(d)核酸可由于在高严格性条件下进行杂交的能力而不同于上述核酸，如通过低盐和/或高温条件所例示的，例如由约50℃至约70℃的温度下约0.02M至约0.15M NaCl提供的；(e)氨基酸可以以给定百分比，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性不同于上述氨基酸；或者(f)氨基酸可通过允许保守替换(以下讨论)而不同于上述那些。
当比较多核苷酸和多肽序列时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列在比对最大对应性时相同，则这两个序列被称为“相同”，如下所述。两个序列之间的比较通常通过在比较窗上比较序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。本文中使用的“比较窗”是指至少约20个连续位置(通常为30至约75、40至约50个)的区段，其中在将两个序列最佳比对之后，可将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
用于比较的序列的最佳比对可使用生物信息学软件的Lasergene套件中的Megalign程序(DNASTAR，Inc.，Madison，Wis.)使用默认参数来进行。该程序体现了描述于以下参考文献中的数种比对方案：Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary changein proteins--Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff，M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical ResearchFoundation，Washington D.C.Vol.5，Suppl.3，pp.345-358；Hein J.(1990)UnifiedApproach to Alignment and Phylogeny pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.；Higgins，D.G.and Sharp，P.M.(1989)CABIOS5：151-153；Myers，E.W.and Muller W.(1988)CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor 11：105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.and Sokal，R.R.(1973)Numerical Taxonomy--the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，Calif.；Wilbur，W.J.and Lipman，D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.，Sci.USA 80：726-730。
或者，用于比较的序列的最佳比对可通过以下来进行：Smith and Waterman(1981)Add.APL.Math 2：482的局部同一性算法、通过Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同一性比对算法、通过Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的检索相似性方法、通过这些算法(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.，Madison，Wis.)的计算机实施或通过检查。
适合于确定序列同一性和序列相似性的百分比的算法的一个特定实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1977)Nucl.Acids Res.25：3389-3402和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。BLAST和BLAST 2.0可例如与本文中所述的参数一起使用，以确定本公开内容的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。抗体序列的重排性质和每个基因的可变长度需要多轮BLAST检索以寻找单一抗体序列。而且，不同基因的人工组装是困难且容易出错的。序列分析工具IgBLAST(万维网网址为ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)鉴定与种系V、D和J基因的匹配，重排接界的细节，Ig V结构域框架区和互补决定区的描述。IgBLAST可分析核苷酸或蛋白质序列，并且可分批处理序列，并允许同时对种系基因数据库和其他序列数据库进行检索，以使可能错过最佳匹配的种系V基因的机会最小化。
在一个举例说明性实例中，对于核苷酸序列，可使用参数M(匹配残基对的奖励评分；总是＞0)和N(错配残基的惩罚评分；总是＜0)来计算累积评分。在以下情况下，将停止单词命中在每个方向上的扩展：累积比对评分从其最大实现值下降了量X；累积评分变为零或更低，由于一个或更多个负评分残基比对的累积；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，以及期望(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对，(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝-4，以及对两条链的比较。
对于氨基酸序列，可使用评分矩阵来计算累积评分。在以下情况下，将停止单词命中在每个方向上的扩展：累积比对评分从其最大实现值下降了量X；累积评分变为零或更低，由于一个或更多个负评分残基比对的累积；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。
在一种方法中，通过在至少20个位置的比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中与两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的多核苷酸或多肽序列的一部分可包含20％或更低，通常为5％至15％，或10％至12％的添加或缺失(即空位(gap))。百分比通过以下来计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置数目，将匹配位置数目除以参考序列中位置的总数目(即窗大小)，并将结果乘以100，以得出序列同一性的百分比。
定义抗体的另一种方式是作为下述抗体及其抗原结合片段的任一种的“衍生物”。术语“衍生物”是指与抗原免疫特异性地结合但相对于“亲本”(或野生型)分子包含1、2、3、4、5或更多个氨基酸替换、添加、缺失或修饰的抗体或其抗原结合片段。这样的氨基酸替换或添加可引入天然存在的(即，DNA编码的)或非天然存在的氨基酸残基。术语“衍生物”涵盖例如如具有改变的CH1、铰链、CH2、CH3或CH4区域的变体，以便形成例如具有表现出增强的或受损的效应物或结合特征的变体Fc区的抗体等。术语“衍生物”另外涵盖非氨基酸修饰，例如可被糖基化(例如，具有改变的甘露糖、2-N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、唾液酸、5-N-乙酰神经氨酸、5-羟乙酸神经氨酸等含量)，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，被已知的保护/阻断基团衍生化，蛋白水解切割，与细胞配体或其他蛋白质连接等的氨基酸，在一些实施方案中，改变的碳水化合物修饰调节以下中的一项或更多项：抗体增溶、促进抗体的亚细胞运输和分泌、促进抗体组装、构象完整性和抗体介导的效应物功能。在一个具体实施方案中，相对于缺乏碳水化合物修饰的抗体，改变的碳水化合物修饰增强了抗体介导的效应物功能。导致抗体介导的效应物功能改变的碳水化合物修饰是本领域公知的(例如，参见Shields，R.L.et al.(2002)“Lack Of Fucose On Human IgG N-LinkedOligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-DependentCellular Toxicity，”J.Biol.Chem.277(30)：26733-26740；Davies J.et al.(2001)“Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line：Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCCThrough Higher Affinity For FC Gamma RIII，”Biotechnology&Bioengineering 74(4)：288-294)。改变碳水化合物含量的方法是本领域技术人员已知的，参见，例如，Wallick，S.C.et al.(1988)“Glycosylation Of A VH Residue Of A MonoclonalAntibody Against Alpha(1----6)Dextran Increases Its Affinity For Antigen，”J.Exp.Med.168(3)：1099-1109；Tao，M.H.et al.(1989)“Studies Of AglycosylatedChimeric Mouse-Human IgG.Role Of Carbohydrate In The Structure And EffectorFunctions Mediated By The Human IgG Constant Region，”J.Immunol.143(8)：2595-2601；Routledge，E.G.et al.(1995)“The Effect Of Aglycosylation On TheImmunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody，”Transplantation 60(8)：847-53；Elliott，S.et al.(2003)“Enhancement OfTherapeutic Protein In Vivo Activities Through Glycoengineering，”NatureBiotechn0l.21：414-21；Shields，R.L.et al.(2002)“Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity，”J.Biol.Chem.277(30)：26733-26740)。
可产生具有经改造序列或糖基化状态的衍生抗体或抗体片段，以赋予在以下中的优选的活性水平：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、抗体依赖性嗜中性粒细胞吞噬(ADNP)或抗体依赖性补体沉积(ADCD)功能，如通过基于珠的或基于细胞的测定或者在动物模型中进行的体内研究所测量的。
衍生抗体或抗体片段可通过使用本领域技术人员已知的技术进行化学修饰来修饰，所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、制剂、衣霉素代谢合成等。在一个实施方案中，抗体衍生物将具有与亲本抗体相似或相同的功能。在另一个实施方案中，相对于亲本抗体，抗体衍生物将表现出改变的活性。例如，与亲本抗体相比，衍生抗体(或其片段)可更紧密地与其表位结合或对蛋白水解更具抗性。
D.抗体序列的改造
在多个实施方案中，可出于多种原因，例如改善表达、改善交叉反应性或降低脱靶结合而选择对所鉴定抗体的序列进行改造。经修饰抗体可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，所述技术包括通过标准分子生物技术表达或多肽的化学合成。用于重组表达的方法在本文件的其他地方提出。以下是用于抗体改造的相关目标技术的一般讨论。
可培养杂交瘤，然后裂解细胞，并提取总RNA。可使用随机六聚体和RT一起来产生RNA的cDNA拷贝，并随后使用预期扩增所有人可变基因序列的PCR引物的多重混合物进行PCR。可将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中，然后使用标准载体引物通过自动化DNA测序进行测序。可使用从杂交瘤上清液收集并使用G蛋白柱通过FPLC纯化的抗体进行结合和中和的测定。
可通过以下产生重组全长IgG抗体：将来自克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆到IgG质粒载体中，将其转染到293(例如Freestyle)细胞或CHO细胞中，并可从293或CHO细胞上清液中收集和纯化抗体。另一些合适的宿主细胞系统包括细菌(例如大肠杆菌(E.coli))、昆虫细胞(S2、Sf9、Sf29、High Five)、植物细胞(例如具有或不具有针对类人聚糖进行改造的烟草)、藻类或多种非人转基因环境，例如小鼠、大鼠、山羊或牛。
还预期了出于随后抗体纯化和出于宿主处理二者目的的编码抗体的核酸的表达。抗体编码序列可以是RNA，例如天然RNA或经修饰RNA。经修饰RNA预期了赋予mRNA以提高的稳定性和低免疫原性，从而促进治疗上重要的蛋白质的表达的某些化学修饰。例如，就翻译能力而言，N1-甲基-假尿苷(N1mΨ)优于数种其他核苷修饰及其组合。除关闭免疫/eIF2α磷酸化依赖性翻译的抑制之外，并入的N1mΨ核苷酸还通过提高mRNA上核糖体停顿和密度来显著改变翻译过程的动态。经修饰mRNA的核糖体负载提高通过促进同一mRNA上的核糖体再循环或从头重新核糖体募集，使它们更易于起始。在接种RNA之后，这样的修饰可用于增强体内抗体表达。RNA，无论是天然的还是经修饰的，均可作为裸RNA或在递送载剂(例如脂质纳米粒)中递送。
或者，可将编码抗体的DNA用于相同目的。将DNA包含在含有在为其设计的宿主细胞中具有活性的启动子的表达盒中。表达盒有利地包含在可复制载体，例如常规质粒或微载体中。载体包括病毒载体，例如预期了痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒和慢病毒。还预期了编码抗体基因的复制子，例如基于VEE病毒或辛德毕斯病毒(Sindbis virus)的甲病毒复制子。这样的载体的递送在期望体内表达时可通过针通过肌内、皮下或皮内途径，或者通过经皮电穿孔来进行。
与最终cGMP制造过程在相同宿主细胞和细胞培养过程中产生的抗体的迅速可用性具有降低过程开发计划的持续时间的潜力。Lonza已经开发了使用在CDACF培养基中培养的合并转染子用于在CHO细胞中迅速产生少量(多至50g)抗体的一般方法。尽管比真正的瞬时系统稍慢，但是其优点包括更高的产物浓度和与生产细胞系使用相同的宿主和过程。在一次性生物反应器中表达模型抗体之GS-CHO库的生长和生产力的实例为：在以补料分批模式进行的一次性袋状生物反应器培养(5L工作体积)中，在转染后9周内达到了2g/L的收获抗体浓度。
抗体分子将包含例如通过mAb的蛋白水解切割产生的片段(例如F(ab’)、F(ab’)2)或者例如可通过重组方式产生的单链免疫球蛋白。F(ab’)抗体衍生物是单价的，而F(ab’)2抗体衍生物是二价的。在一个实施方案中，这样的片段可彼此组合，或者与其他抗体片段或受体配体组合以形成“嵌合”结合分子。明显地，这样的嵌合分子可包含能够与同一分子的不同表位结合的取代基。
在一些相关实施方案中，抗体是所公开抗体的衍生物，例如，包含与所公开抗体中CDR序列相同的CDR序列的抗体(例如，嵌合抗体或CDR接枝抗体)。或者，可希望进行修饰，例如向抗体分子中引入保守变化。在进行这样的变化时，可预期氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。氨基酸亲水指数在赋予蛋白质以相互作用生物学功能中的重要性是本领域中通常了解的。已接受的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其转而限定了蛋白质与另一些分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
本领域中还应理解的是，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)声称：蛋白质的最大局部平均亲水性(如受其邻近氨基酸的亲水性支配)与蛋白质的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中所详述的，已向氨基酸残基分配了以下亲水性值：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)；含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性非芳族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性芳族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
应理解的是，氨基酸可被替换为具有类似亲水性的另一氨基酸，并且产生在生物学或免疫学上修饰的蛋白质。在这样的变化中，优选亲水性值在±2内的氨基酸的替换，特别优选在±1内的那些，并且甚至更特别优选在±0.5内的那些。
如上文概括的，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。预期多个前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本公开内容还预期了同种型修饰。通过修饰Fc区域以具有不同同种型，可实现不同功能。例如，改变为IgG1可提高抗体依赖性细胞细胞毒性，转换为A类可改善组织分布，以及转换为M类可改善价位。
替代地或另外地，将氨基酸修饰与改变IL-23p19结合分子的Fc区的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)功能的一种或更多种另外的氨基酸修饰组合在一起可以是有用的。特别令人感兴趣的结合多肽可以是与C1q结合并显示出补体依赖性细胞毒性的结合多肽。可修饰具有预先存在的Clq结合活性，任选地还具有介导CDC能力的多肽，使得增强这些活性中的一种或两种。改变Clq和/或修饰其补体依赖性细胞毒性功能的氨基酸修饰描述于例如WO/0042072中，其通过引用并入于此。
可例如通过修饰C1q结合和/或FcγR结合并由此改变CDC活性和/或ADCC活性来设计具有改变的效应物功能的抗体的Fc区。“效应物功能”负责激活或减弱生物活性(例如，在对象中)。效应物功能的一些实例包括但不限于：C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(Antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如B细胞受体BCR)等。这样的效应物功能可能需要待与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合的Fc区，并可使用多种测定(例如Fc结合测定、ADCC测定、CDC测定等)进行评估。
例如，可产生抗体的具有改善的C1q结合和改善的FcγRIII结合(例如，具有改善的ADCC活性和改善的CDC活性二者)的变体Fc区。或者，如果期望降低或消除效应物功能，则可将变体Fc区改造为具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性。在另一些实施方案中，可提高这些活性中的仅一种，并且任选地，另一种活性也降低(例如，产生具有改善的ADCC活性，但是降低的CDC活性的Fc区变体，反之亦然)。
FcRn结合。还可引入Fc突变以及对其进行改造，以改变其与新生Fc受体(FcRn)的相互作用并改善其药动学特性。已经描述了具有与FcRn的结合改善的人Fc变体的集合。人IgG1上FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点的高分辨率映射以及具有与FcγR的结合改善的IgG1变体的设计(J.Biol.Chem.276∶6591-6604)。已知可导致半衰期提高的许多方法，包括可通过包括以下的技术产生的氨基酸修饰：丙氨酸扫描诱变、随机诱变以及评估与新生Fc受体(FcRn)结合和/或体内行为的筛选。诱变之后的计算策略也可用于选择氨基酸突变中之一以进行突变。
因此，本公开内容提供了具有与FcRn的最佳结合的抗原结合蛋白的变体。在一个具体实施方案中，抗原结合蛋白的所述变体在所述抗原结合蛋白的Fc区中包含至少一个氨基酸修饰，其中与所述亲本多肽相比，所述修饰选自Fc区的第226位、第227位、第228位、第230位、第231位、第233位、第234位、第239位、第241位、第243位、第246位、第250位、第252位、第256位、第259位、第264位、第265位、第267位、第269位、第270位、第276位、第284位、第285位、第288位、第289位、第290位、第291位、第292位、第294位、第297位、第298位、第299位、第301位、第302位、第303位、第305位、第307位、第308位、第309位、第311位、第315位、第317位、第320位、第322位、第325位、第327位、第330位、第332位、第334位、第335位、第338位、第340位、第342位、第343位、第345位、第347位、第350位、第352位、第354位、第355位、第356位、第359位、第360位、第361位、第362位、第369位、第370位、第371位、第375位、第378位、第380位、第382位、第384位、第385位、第386位、第387位、第389位、第390位、第392位、第393位、第394位、第395位、第396位、第397位、第398位、第399位、第400位、第401403位、第404位、第408位、第411位、第412位、第414位、第415位、第416位、第418位、第419位、第420位、第421位、第422位、第424位、第426位、第428位、第433位、第434位、第438位、第439位、第440位、第443位、第444位、第445位、第446位和第447位，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中EU索引的编号。在本公开内容的另一方面中，修饰是M252Y/S254T/T256E。
另外，多个出版物描述了用于通过将FcRn结合多肽引入到分子中或者通过将分子与保留了FcRn结合亲和力但针对其他Fc受体的亲和力已大大降低的抗体融合，或与抗体的FcRn结合结构域融合来获得半衰期被修饰的生理活性分子的方法。
衍生抗体可用于改变亲本抗体在哺乳动物(特别是在人中)的半衰期(例如血清半衰期)。这样的改变可导致半衰期大于15天，优选大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月。本公开内容的抗体或其片段在哺乳动物中，优选在人中的半衰期提高导致所述抗体或抗体片段在哺乳动物中的更高的血清效价，并因此降低了所述抗体或抗体片段的施用频率和/或降低了待施用的所述抗体或抗体片段的浓度。具有提高的体内半衰期的抗体或其片段可通过本领域技术人员已知的技术来产生。例如，具有提高的体内半衰期的抗体或其片段可通过对被鉴定为参与Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基进行修饰(例如，替换、缺失或添加)来产生。
Beltramello et al.(2010)先前报道了通过产生其中用丙氨酸残基替换CH2结构域的1.3和1.2位的亮氨酸残基(根据C结构域的IMGT独特编号)来使mAb(由于其倾向于增强登革病毒(dengue virus)感染)中和的修饰。该修饰(也称为“LALA”突变)消除了与FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa结合的抗体。比较变体和未经修饰的重组mAb的其中和和增强四种登革病毒血清型的感染的能力。LALA变体保留了与未经修饰的mAb相同的中和活性，但完全没有增强活性。因此，在当前公开的抗体的情况下预期了这种性质的LALA突变。
糖基化改变。本公开内容的一个具体实施方案是包含无唾液酸、半乳糖或岩藻糖的基本上均质的聚糖的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其二者可分别与重链或轻链恒定区连接。前述基本上均质的聚糖可与重链恒定区共价连接。
本公开内容的另一个实施方案包含具有新Fc糖基化模式的mAb。分离的单克隆抗体或其抗原结合片段存在于以GNGN或G1/G2糖型表示的基本上均质的组合物中。Fc糖基化在治疗性mAb的抗病毒和抗癌特性中发挥重要作用。本公开内容与示出了在体外无岩藻糖的抗HIV mAb的抗慢病毒细胞介导的病毒抑制提高的最近研究一致。具有缺乏核芯岩藻糖的均质聚糖的本公开内容的该实施方案显示针对特定病毒的保护提高了高于两倍。消除核芯岩藻糖显著改善了自然杀伤(NK)细胞介导的mAb的ADCC活性，但显示对多形核细胞(polymorphonuclear cell，PMN)的ADCC活性具有相反的作用。
与不具有基本上均质的GNGN糖型和具有含G0、G1F、G2F、GNF、GNGNF或GNGNFX糖型的相同抗体相比，包含由GNGN或G1/G2糖型表示的基本上均质的组合物的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段表现出对FcγRI和FcγRIII的提高的结合亲和力。在本公开内容的一个实施方案中，所述抗体以1×10-8M或更小的Kd从FcγRI解离和以1×10-7M或更小的Kd从FcγRIII解离。
Fc区的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。O-连接糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸(最通常为丝氨酸或苏氨酸)的连接，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。用于将碳水化合物部分与天冬酰胺侧链肽序列酶促连接的识别序列是天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中这些肽序列中任一个的存在均会产生潜在的糖基化位点。
糖基化模式可例如通过缺失一个或更多个存在于多肽中的糖基化位点和/或添加一个或更多个不存在于多肽中的糖基化位点来改变。通过改变氨基酸序列以使其包含一个或更多个上述三肽序列，方便地实现了将糖基化位点添加至抗体的Fc区(对于N-连接的糖基化位点)。示例性的糖基化变体具有重链的残基Asn 297的氨基酸替换。该改变也可通过向原始多肽的序列添加一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基替换原始多肽的序列来进行(对于O-连接的糖基化位点)。另外，将Asn 297改变为Ala可去除糖基化位点之一。
在某些实施方案中，抗体在表达β(1，4)-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III(GnTIII)的细胞中表达，使得GnT III将GlcNAc添加至IL-23p19抗体。用于以这样的方式产生抗体的方法提供于WO/9954342、WO/03011878、专利公开US 2003/0003097A1和Umana et al.，Nature Biotechnology，17：176-180，February 1999中。可使用基因组编辑技术(例如成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeat，CRISPR))，将细胞系改变以增强或降低或消除某些翻译后修饰，例如糖基化。例如，CRISPR技术可用于在用于表达重组单克隆抗体的293或CHO细胞中消除编码糖基化酶的基因。
单克隆抗体蛋白质序列缺陷(liability)的消除。可改造从人B细胞获得的抗体可变基因序列，以增强其可制造性和安全性。潜在的蛋白质序列缺陷可通过检索与包含以下的位点相关的序列基序来鉴定：
1)未配对的Cys残基，
2)N-连接糖基化，
3)Asn脱酰胺化，
4)Asp异构化，
5)SYE截短，
6)Met氧化，
7)Trp氧化，
8)N端谷氨酸，
9)整合素结合，
10)CD11c/CD18结合，或
11)片段化。
这样的基序可通过改变编码重组抗体的cDNA的合成基因来消除。
在开发治疗性抗体领域中的蛋白质改造工作清楚地揭示了某些序列或残基与溶解度差异相关(Femandez-Escamilla et al.，Nature Biotech.，22(10)，1302-1306，2004；Chennamsetty et al.，PNAS，106(29)，11937-11942，2009；Voynov et al.，Biocon.Chem.，21(2)，385-392，2010)。文献中来自溶解度改变突变的证据表明与另一些亲水性残基，例如天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸相比，一些亲水性残基例如天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸更有利地显著有助于蛋白质溶解度。
稳定性。可对抗体进行改造以增强生物物理特性。可使用平均表观熔融温度，使用升高温度来使抗体解折叠以确定相对稳定性。差示扫描量热法(Differential ScanningCalorimetry，DSC)测量分子的热容量Cp(使该分子升温每度所需的热)作为温度的函数。可使用DSC研究抗体的热稳定性。mAb的DSC数据是特别令人感兴趣的，因为其有时解析了mAb结构内单独结构域的解折叠，从而在热谱图中产生多至三个峰(来自Fab、CH2和CH3结构域的解折叠)。通常来说，Fab结构域的解折叠产生最强峰。Fc部分的DSC谱和相对稳定性显示了人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类的特征差异(Garber and Demarest，Biochem.Biophys.Res.Commun.355，751-757，2007)。还可使用圆二色性(circulardichroism，CD)(用CD分光计进行)来确定平均表观熔融温度。将以0.5nm的增量在200至260nm中测量抗体的远紫外CD谱。最终谱可确定为20次累积的平均值。在背景减除之后可计算出残基椭圆率值。抗体(0.1mg/mL)的热解折叠可在235nm在25至95℃下以及以1℃/分钟的加热速率进行监测。可使用动态光散射(dynamic light scattering，DLS)来评估聚集的倾向性。DLS用于表征多种颗粒(包括蛋白质)的尺寸。如果体系尺寸不分散，则可确定颗粒的平均有效直径。该测量取决于颗粒核芯的尺寸、表面结构的尺寸和颗粒浓度。因为DLS基本上测量了由于颗粒引起的散射光强度的波动，所以可确定颗粒的扩散系数。商业DLA仪器中的DLS软件显示不同直径的颗粒群。可使用DLS方便地进行稳定性研究。通过确定颗粒的流体动力学半径是否提高，样品的DLS测量可显示颗粒是否随时间推移聚集或是否随温度变化而聚集。如果颗粒聚集，则可看到半径更大的更大的颗粒群。取决于温度的稳定性可通过控制原位温度来分析。毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)技术包括用于确定抗体稳定性特征的已证实方法。可使用iCE方法解析由于脱酰胺化、C端赖氨酸、唾液酸化、氧化、糖基化以及可导致蛋白质pI改变的蛋白质的任何其他变化而引起的抗体蛋白质电荷变体。可使用Protein Simple Maurice仪器在毛细管柱(cIEF)中通过高通量的自由溶液等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)评价每种表达的抗体蛋白质。可每30秒进行全柱UV吸收检测，以实时监测聚焦在等电点(pI)的分子。这种方法在消除对转移步骤需要的同时将传统凝胶IEF的高分辨率与基于柱的分离中存在的定量和自动化的优点相组合。该技术对表达的抗体进行同一性、纯度和异质性谱的可再现、定量分析。结果确定了在吸光度和天然荧光检测模式二者下的抗体上的电荷异质性和分子尺寸，以及其中检测灵敏度降至0.7μg/mL。
溶解度。可确定抗体序列的固有溶解度评分。固有溶解度评分可使用CamSolIntrinsic(Sormanni et al.，J Mol Biol 427，478-490，2015)进行计算。可通过在线程序评价每个抗体片段(例如scFv)的HCDR3中第95至102位残基(Kabat编号)的氨基酸序列，以计算溶解度评分。也可使用实验室技术确定溶解度。存在多种技术，包括将冻干的蛋白质添加至溶液直至溶液变得饱和并达到溶解度极限，或者通过在具有合适的分子量截止值的微浓缩器中通过超滤进行浓缩。最直接的方法是诱导无定形沉淀，其使用涉及使用硫酸铵进行蛋白质沉淀的方法来测量蛋白质溶解度(Trevino et al.，J Mol Biol，366：449-460，2007)。硫酸铵沉淀提供有关相对溶解度值的快速且准确的信息。硫酸铵沉淀产生具有明确水相和固相的沉淀的溶液，并且需要相对少量的蛋白质。使用通过硫酸铵诱导无定形沉淀进行的溶解度测量也可在不同的pH值下容易地进行。蛋白质溶解度是高度pH依赖性的，并且pH被认为是影响溶解度的最重要的非固有因素。
自身反应性。通常认为，应在个体发生期间通过阴性选择消除自身反应性克隆；然而，已经清楚的是，具有自身反应性特性的许多人天然存在的抗体在成体成熟库中仍然存在。已经注意到，在早期B细胞发育期间抗体中的HCDR3环通常富含正电荷并且表现出自身反应性模式(Wardemann et al.，Science 301，1374-1377，2003)。可通过评估显微镜下与人来源细胞结合的水平(使用黏附的HeLa或HEp-2上皮细胞)以及流式细胞术细胞表面染色(使用悬浮的Jurkat T细胞和293S人胚肾细胞)来测试给定抗体的自身反应性。也可使用对与组织阵列中组织的结合的评估来考察自身反应性。
优选残基(“人相似性”)。对来自血液供体的人B细胞进行B细胞库深度测序正在许多最近研究中大规模进行。关于人抗体库重要部分的序列信息有助于对健康人中常见的抗体序列特征进行统计学评估。利用人重组抗体可变基因参考数据库中有关抗体序列特征的知识，可估计抗体序列的“人相似性”(Human Likeness，HL)的位置特异性程度。已表明HL可用于开发临床应用的抗体，例如治疗性抗体或作为疫苗的抗体。目的是提高抗体的人相似性，以降低将导致抗体药物的效力显著下降或可诱导严重的健康影响的潜在的不良作用和抗抗体免疫应答。可评估总共约4亿个序列的三个健康人血液供体的组合抗体库的抗体特征，并创建了聚焦于抗体的高变区的新“相对人相似性”(rHL)评分。rHL评分使人们容易地区分人序列(正评分)与非人序列(负评分)。可对抗体进行改造，以消除人库中不常见的残基。
E.单链抗体
单链可变片段(scFv)是用短(通常丝氨酸、甘氨酸)接头连接在一起的免疫球蛋白重链和轻链可变区的融合物。这种嵌合分子虽然去除了恒定区并且引入了接头肽但是保留了原始免疫球蛋白的特异性。这种修饰通常不改变特异性。历史上产生这些分子是为了有利于噬菌体展示，其中将抗原结合结构域表达为单个肽非常方便。或者，可由来源于杂交瘤或B细胞的亚克隆重链和轻链直接产生scFv。单链可变片段缺少存在于完全抗体分子中的恒定Fc区，并且因此缺少用于纯化抗体的常见结合位点(例如，蛋白A/G)。这些片段通常可使用蛋白L纯化/固定，因为蛋白L与κ轻链的可变区相互作用。
柔性接头通常由促进螺旋和转角的氨基酸残基(例如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸)构成。然而，其他残基也可很好地作用。Tang et al.(1996)使用噬菌体展示作为从蛋白质接头文库中快速选择用于单链抗体(scFv)的专用接头的方式。构建随机接头文库，其中用于重链和轻链可变结构域的基因通过编码具有可变组成的18-氨基酸多肽的区段连接。在丝状噬菌体上展示scFv库(约5×106个不同成员)并且用半抗原进行亲和选择。所选择变体的群体表现出结合活性显著提高，但是保留了相当大的序列多样性。随后筛选1054个单独变体产生了以可溶性形式有效产生的催化活性scFv。序列分析揭示，所选择栓链(tether)的仅有的共同特征是：VHC末端之后的2个残基是接头中的保守脯氨酸以及在其他位置处有大量的精氨酸和脯氨酸。
本公开内容的重组抗体还可涉及允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。这样的序列包括来源于IgA的那些，其允许与J链联合形成多聚体。另一个多聚化结构域是Gal4二聚化结构域。在另一些实施方案中，可用允许两个抗体组合的试剂(例如生物素/抗生物素蛋白)对链进行修饰。
在一个独立的实施方案中，可通过使用非肽接头或化学单元连接受体轻链和重链来产生单链抗体。通常来说，使轻链和重链在不同细胞中产生，纯化，并且随后以合适的方式连接在一起(即，通过合适的化学桥将重链的N端与轻链的C端连接)。
使用交联试剂形成将两个不同分子的官能团系住的分子桥，例如，稳定和凝结剂。然而，预期可产生相同类似物的二聚体或多聚体或者包含不同类似物的异聚复合体。为了以逐步方式连接两个不同化合物，可使用异-双官能交联剂，其消除了不想要的均聚物形成。
一种示例性的异-双官能交联剂包含两个反应性基团：一个与伯胺基(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)反应并且另一个与硫醇基团(例如，吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)反应。通过伯胺反应基，交联剂可与一个蛋白质(例如，所选择的抗体或片段)的赖氨酸残基反应，并且通过硫醇反应基，已经系在第一蛋白质上的交联剂与另一蛋白质(例如，选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。
优选地，使用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知多种类型含二硫键的接头可成功用于使靶向剂和治疗剂/预防剂缀合。包含在空间上受阻之二硫键的接头可证明在体内提供更高稳定性，从而防止靶向肽在到达作用位点之前释放。因此，这些接头是一组连接剂。
另一种交联试剂是SMPT，这是一种包含二硫键的双官能交联剂，该二硫键由于邻近的苯环和甲基而在“空间上受阻”。认为二硫键的空间位阻发挥了保护键不被可存在于组织和血液中的硫醇盐阴离子(例如谷胱甘肽)攻击的功能，并且从而有助于防止缀合物在连接的药剂递送到靶部位之前解偶联。
与许多其他已知的交联试剂一样，SMPT交联试剂也能够使官能团例如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)交联。另一种可能的交联剂类型包括含有可切割二硫键的异-双官能光反应性叠氮基苯，例如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰氨基)乙基-1，3’-二硫代丙酸酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应，并且叠氮基苯(光分解之后)非选择性地与任何氨基酸残基反应。
除了受阻交联剂，非受阻交联剂也可据此使用。不预期包含或产生被保护的二硫化物的话，其他有用的交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷。这样的交联剂的使用是本领域中非常了解的。另一个实施方案涉及使用柔性接头。
美国专利4,680,338描述了可用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物，特别是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物的双官能接头。美国专利5,141,648和5,563,250公开了包含在多种温和条件下可切割之不稳定键的可切割缀合物。这种接头特别可用，因为目的药剂可直接与接头键合，并且其切割导致活性剂的释放。特别的用途包括向蛋白质例如抗体或药物添加游离氨基或游离巯基。
美国专利5,856,456提供了用于连接多肽成分以制备融合蛋白(例如，单链抗体)的肽接头。接头的长度为多至约50个氨基酸；包含带电氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)接着是脯氨酸，出现至少一次；并且以更高的稳定性和聚集降低为特征。美国专利5,880,270公开了可用于多种免疫诊断和分离技术的含氨基氧基的接头。
F.多特异性抗体
在某些实施方案中，本公开内容的抗体是双特异性或多特异性的。双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可与单个抗原的两个不同表位结合。其他这样的抗体可将第一抗原结合位点与第二抗原的结合位点组合。或者，可将抗原特异性臂与和白细胞上的触发分子(例如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))结合的臂组合，以便将细胞防御机制集中和定位至受感染细胞。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于受感染细胞。这些抗体具有抗原结合臂和与细胞毒性剂(例如，皂草毒蛋白(saporin)、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)结合的臂。可将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’).sub.2双特异性抗体)。WO 96/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体，并且美国专利No.5,837,234公开了双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。WO98/02463中示出了双特异性抗ErbB2/Fcα抗体。美国专利No.5,821,337教导了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。
用于制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein etal.，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，因此这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生了十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱步骤而完成的正确分子的纯化相当繁琐，并且产物产率较低。在WO 93/08829和Traunecker et al.，EMBO J.，10：3655-3659(1991)中公开了类似的操作。
根据不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选地，融合是与Ig重链恒定结构域(包含铰链区、CH2区和CH3区的至少一部分)进行的。优选使得包含轻链键合所必需位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要的话)免疫球蛋白轻链的DNA插入到分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。在当构建中使用的不等比率的三条多肽链的提供了期望双特异性抗体的最佳产率时的一些实施方案中，这为调节三个多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等的比率的表达导致高产率时，或者当比率对所期望链组合的产率没有显著影响时，可将两条或全部三条多肽链的编码序列插入单个表达载体中。
在该方法的一个具体实施方案中，双特异性抗体由一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一个臂中杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现，这种不对称结构促进了期望双特异性化合物相对于不希望的免疫球蛋白链组合而分离，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了简易的分离方式。该方法在WO 94/04690中公开。对于产生双特异性抗体的另外的细节，参见例如Sureshet al.，Methods in Enzymology，121：210(1986)。
根据美国专利No.5,731,168中描述的另一种方法，可对一对抗体分子之间的界面进行改造，以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包括CH3结构域的至少一部分。在该方法中，将来自第一抗体分子的界面的一个或更多个小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)。通过将较大的氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)，在第二抗体分子的界面上产生了与一种或更多种大的侧链相同或类似尺寸的补偿“腔”。这提供了关于异二聚体的产率与其他不希望的最终产品(例如同二聚体)相比而提高的机制。
双特异性抗体包括交联或“异缀合”抗体。例如，异缀合物中的一种抗体可与抗生物素蛋白偶联，另一种与生物素偶联。例如，已提出这样的抗体以将免疫系统细胞靶向不希望的细胞(美国专利No.4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。杂缀合物抗体可使用任何方便的交联方法来制成。合适的交联剂是本领域公知的，并连同许多交联技术在美国专利No.4,676,980中公开。
关于从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如，可使用化学键联来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science，229：81(1985)描述了操作，其中完整的抗体被蛋白水解切割以产生F(ab’)2片段。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下被还原，以稳定邻位二硫醇并阻止分子间二硫化物形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将一种Fab’-TNB衍生物转化为Fab’-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab’-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶选择性固定化的试剂。
存在促进从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段的技术，该片段可进行化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。每个Fab’片段分别从大肠杆菌中分泌出，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶标的裂解活性。
还已描述了多种关于从重组细胞培养物中制备和直接分离双特异性抗体片段的技术(Merchant et al.，Nat.Biotechnol.16，677-681(1998))。例如，已使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体(Kostelny et al.，J.Immunol.，148(5)：1547-1553，1992)。通过基因融合，将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab’部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异二聚体。该方法也可用于抗体同二聚体的产生。Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术为制造双特异性抗体片段提供了替代机制。片段包含通过接头连接至VL的VH，该接头太短而无法允许在同一链上的两个结构域之间的配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被追与另一片段的互补的VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还已报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制造双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.，152：5368(1994)。
在一个具体实施方案中，双特异性或多特异性抗体可形成为DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合体(参见，例如，美国专利No.7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143和7,666,400，其各自的实施例部分通过引用并入本文。)通常来说，该技术利用了cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基的二聚化及对接结构域(dimerization and docking domain，DDD)序列与来源于多种AKAP蛋白中任何一种的锚定结构域(anchor domain，AD)序列之间发生的特异性和高亲和力结合相互作用(Baillie et al.，FEBSLetters.2005；579：3264；Wong and Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。DDD和AD肽可与任何蛋白质、肽或其他分子连接。因为DDD序列自发地二聚化并与AD序列结合，所以该技术允许在可与DDD或AD序列连接的任何选择的分子之间形成复合体。
预期了具有多于二价的抗体。例如，可制备三特异性抗体(Tutt et al.，J.Immunol.147：60，1991；Xu et al.，Science，358(6359)：85-90，2017)。多价抗体可比二价抗体更快速地被表达抗体与其结合的抗原的细胞内化(和/或分解代谢)。本公开内容的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)，其可通过重组表达编码抗体多肽链的核酸来容易地产生。多价抗体可包含二聚化结构域以及三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含Fc区或铰链区(或由其组成)。在这种情况下，抗体将包含Fc区和Fc区氨基端的三个或更多个抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含3个至约8个，但优选4个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(并且优选两条多肽链)，其中所述一条或更多条多肽链包含两个或更多个可变区。例如，一条或更多条多肽链可包含VD1-(X1).sub.n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变区，VD2是第二可变区，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，一条或更多条多肽链可包含VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选还包含至少2个(并且优选4个)轻链可变区多肽。本文中的多价抗体可例如包含约2至约8个轻链可变区多肽。在此预期的轻链可变区多肽包含轻链可变区，并且任选地还包含CL结构域。
电荷修饰在多特异性抗体的情况下特别有用，其中Fab分子中的氨基酸替换导致降低轻链与不匹配的重链的错配(Bence-Jones型副产物)，其可在产生基于Fab的双/多特异性抗原结合分子的情况下发生，其中在该分子的一条(或更多条，如果分子包含多于两个的抗原结合Fab分子的话)结合臂中VH/VL进行交换(另参见PCT公开no.WO 2015/150447，特别是其中的实施例，通过引用以其整体并入本文)。
G.嵌合抗原受体
嵌合抗原受体分子是重组融合蛋白，并由其结合抗原并通过存在于其胞质尾中的免疫受体激活基序(immunoreceptor activation motif，ITAM)来转导激活信号的能力而辨别。利用抗原结合部分(例如，由单链抗体(scFv)产生)的受体构建体具有“通用”的另外的优势，因为其以HLA独立的方式结合靶细胞表面上的天然抗原。
嵌合抗原受体可通过本领域已知的任何方法产生，尽管优选地其是使用重组DNA技术产生的。编码嵌合抗原受体的数个区域的核酸序列可通过标准分子克隆技术(基因组文库筛选、PCR、引物辅助连接、来自酵母和细菌的scFv文库、位点-定向诱变等)来制备并组装成完整的编码序列。可将所得编码区插入表达载体中，并用于转化合适的表达宿主同种异体或自体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。
本文中所述的CAR的一些实施方案包括编码抗原特异性嵌合抗原受体(chimericantigen receptor，CAR)多肽的核酸，该嵌合抗原受体(CAR)多肽包含胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含一个或更多个信号传导基序的胞外结构域。在某些实施方案中，CAR可识别包含一种或更多种抗原之间的共享空间的表位。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含：a)胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，和c)包含抗原结合结构域的胞外结构域。任选地，CAR可包含位于跨膜结构域和抗原结合结构域之间的铰链结构域。在某些方面中，一些实施方案的CAR还包含将CAR的表达引导至细胞表面的信号肽。例如，在一些方面中，CAR可包含来自GM-CSF的信号肽。
在某些实施方案中，当存在少量的肿瘤相关抗原时，CAR还可与膜结合细胞因子共表达以改善持久性。例如，CAR可与膜结合IL-15共表达。
根据CAR结构域的排列和结构域中使用的特定序列，表达CAR的免疫效应细胞可针对靶细胞具有不同水平的活性。在一些方面中，可将不同的CAR序列引入免疫效应细胞中以产生经改造细胞，所选用于升高的SRC的经改造细胞和经测试活性以鉴定CAR构建体的所选细胞预测具有最大的治疗效力。
1.抗原结合结构域
在某些实施方案中，抗原结合结构域可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，该特异性来源于与受体结合的肽(例如，细胞因子)。“互补决定区(complementarity determining region，CDR)”是在抗原受体(例如，免疫球蛋白和T细胞受体)蛋白的可变结构域中发现的短氨基酸序列，其与抗原互补并因此向受体提供针对该特定抗原的特异性。抗原受体的每条多肽链均包含三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。由于抗原受体通常由两条多肽链构成，因此对于可与抗原接触的每个抗原受体有6个CDR——每条重链和轻链均包含三个CDR。因为在CDR中发现了大多数与免疫球蛋白和T细胞受体相关的序列变异，所以有时将这些区域称为高变结构域。其中，CDR3显示出最大的可变性，因为它是由VJ(在重链和TCRαβ链的情况下为VDJ)区的重组编码的。
预期了CAR核酸，特别地，scFv序列是人基因，以增强对人患者的细胞免疫治疗。在一个具体的实施方案中，提供了全长CAR cDNA或编码区。抗原结合区或结构域可包含来源于特定小鼠或人或人源化单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段。该片段也可以是抗原特异性抗体的任何数量的不同抗原结合结构域。在一个更具体的实施方案中，该片段是由针对人密码子使用而优化的序列编码的抗原特异性scFv，以在人细胞中表达。在某些方面中，CAR的VH和VL结构域被接头序列(例如Whitlow接头)隔开。可根据一些实施方案修饰或使用的CAR构建体还可在国际(PCT)专利公开No.WO/2015/123642(通过引用并入本文)中提供。
如先前所述，原型CAR编码包含与跨膜结构域和一个或更多个胞质信号传导结构域(例如共刺激结构域和信号传导结构域)偶联的来源于一种单克隆抗体(mAb)的VH和VL结构域的scFv。因此，CAR可包含与目的抗原(例如肿瘤相关抗原)结合的抗体的LCDR1至3序列和HCDR1至3序列。然而，在另一些方面中，鉴定了与目的抗原结合的两种或更多种抗体，并且构建了CAR，其包含：(1)与抗原结合的第一抗体的HCDR1至3序列；和(2)与抗原结合的第二抗体的LCDR1至3序列。包含来自两种不同抗原结合抗体的HCDR和LCDR序列的这样的CAR可具有与抗原的特定构型(例如，相对于正常组织与癌细胞优先相关的构型)优先结合的优势。
或者，显示出可使用来源于不同mAb的VH和VL链来改造CAR，以产生一组CAR+T细胞。CAR的抗原结合结构域可包含第一抗体的LCDR1至3序列和第二抗体的HCDR1至3序列的任何组合。
2.铰链结构域
在某些方面中，一些实施方案的CAR多肽可包含位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链结构域。在一些情况下，铰链结构域可包含在CAR多肽中，以在抗原结合结构域和细胞表面之间提供足够的距离，或者以减轻可能不利地影响CAR基因经修饰的T细胞的抗原结合或效应功能的可能的位阻。在一些方面中，铰链结构域包含与Fc受体(例如FcγR2a或FcγR1a)结合的序列。例如，铰链序列可包含与Fc受体结合的来自人免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE)的Fc结构域。在某些方面中，铰链结构域(和/或CAR)不包含野生型人IgG4 CH2和CH3序列。
在一些情况下，CAR铰链结构域可来源于人免疫球蛋白(Ig)恒定区或其包含Ig铰链的一部分，或者来源于人CD8α跨膜结构域和CD8a-铰链区。在一个方面，CAR铰链结构域可包含抗体同种型IgG4的铰链-CH2-CH3区。在一些方面中，可在抗体重链CH2结构域中引入点突变以降低CAR-T细胞或任何其他CAR经修饰的细胞的糖基化和非特异性Fcγ受体结合。
在某些方面中，一些实施方案的CAR铰链结构域包含Ig Fc结构域，其包含相对于野生型Ig Fc结构域的至少一个突变，所述突变降低了Fc受体结合。例如，CAR铰链结构域可包含IgG4-Fc结构域，其包含相对于野生型IgG4-Fc结构域的至少一个突变，所述突变降低了Fc受体结合。在一些方面中，CAR铰链结构域包含相对于野生型IgG4-Fc序列在对应于L235和/或N297位具有突变(例如氨基酸缺失或替换)的IgG4-Fc结构域。例如，CAR铰链结构域可包含相对于野生型IgG4-Fc序列具有L235E和/或N297Q突变的IgG4-Fc结构域。在另一些方面中，CAR铰链结构域可包含在L235位具有替换为亲水性氨基酸(例如R、H、K、D、E、S、T、N或Q)或者与“E”的特性类似的氨基酸(例如D)的氨基酸替换的IgG4-Fc结构域，在某些方面中，CAR铰链结构域可包含在N297位具有替换为与“Q”的特性类似的氨基酸(例如S或T)的氨基酸替换的IgG4-Fc结构域。
在某些具体方面中，铰链结构域包含与IgG4铰链结构域、CD8a铰链结构域、CD28铰链结构域或经改造铰链结构域具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
3.跨膜结构域
抗原特异性胞外结构域和胞内信号传导结构域可通过跨膜结构域连接。可用作跨膜结构域的一部分的多肽序列包括但不限于：人CD4跨膜结构域、人CD28跨膜结构域、跨膜人CD3ζ结构域或半胱氨酸突变的人CD3ζ结构域，或者来自其他人跨膜信号传导蛋白(例如CD16和CD8和红细胞生成素受体)的其他跨膜结构域。在一些方面中，例如，跨膜结构域包含与美国专利公开No.2014/0274909中提供的那些(例如CD8和/或CD28跨膜结构域)或美国专利公开No.8,906,682中提供的那些(例如CD8α跨膜结构域)之一具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，所述两个美国专利均通过引用并入本文。在本发明中特别使用的跨膜区可来源于(即，包含以下的至少一个跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。在某些具体方面中，跨膜结构域可与CD8a跨膜结构域或CD28跨膜结构域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
4.胞内信号传导结构域
一些实施方案的嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域负责经改造以表达嵌合抗原受体的免疫细胞的至少一种正常效应功能的激活。术语“效应功能”是指分化细胞的特化功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。初始、记忆或记忆型T细胞中的效应功能包括抗原依赖性增殖。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应功能信号并指导细胞进行特化功能的蛋白质部分。在一些方面中，胞内信号传导结构域来源于天然受体的胞内信号传导结构域。这样的天然受体的一些实例包括T细胞受体的ζ链或其任何同源物(例如β、6、γ或ε)、MB1链、B29、Fc RIII、Fc则，和信号传导分子(例如CD3ζ和CD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40)的组合，及其组合，以及其他类似的分子和片段。可使用活化蛋白家族其他成员的胞内信号传导部分。尽管通常将使用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下，将不必使用整个胞内多肽。就胞内信号传导结构域的截短部分可应用的程度而言，可使用这样的截短部分代替完整链，只要它仍转导效应功能信号即可。因此，术语“胞内信号传导结构域”意指包括当CAR与靶标结合时足以转导效应功能信号的胞内信号传导结构域截短部分。在一个优选的实施方案中，人CD3ζ胞内结构域用作用于一些实施方案的CAR的胞内信号传导结构域。
在一些具体实施方案中，CAR中的胞内受体信号传导结构域包括T细胞抗原受体复合体的那些，例如CD3的ζ链，还例如单独或与CD3ζ相连的FcγRIII共刺激信号传导结构域、CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2。在一些具体实施方案中，胞内结构域(其可称为胞质结构域)包含TCRζ链、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12和CD40中的一种或更多种的一部分或全部。在一些实施方案中，在胞内结构域中使用内源性T细胞受体复合体的任何一部分。可使用一个或多个胞质结构域，因为所谓的第三代CAR具有用于叠加或协同作用的融合在一起的至少两个或三个信号传导结构域，例如CD28和4-1BB可组合在CAR构建体中。
在一些实施方案中，CAR包括另外的其他共刺激结构域。其他共刺激结构域可包括但不限于CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10和4-1BB(CD137)中的一种或更多种。除了由CD3ζ引发的主要信号之外，由插入人CAR中的人共刺激受体提供的另外的信号对于T细胞的完全活化是重要的，并且可帮助改善体内持久性和过继免疫治疗的治疗成功。
在某些具体方面中，胞内信号传导结构域包含与CD3ζ胞内结构域、CD28胞内结构域、CD137胞内结构域，或者包含与4-1BB胞内结构域融合的CD28胞内结构域的结构域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
H.ADC
抗体药物缀合物或ADC是新类别的被设计为治疗患有疾病的人的靶向治疗的高度强效生物药物。ADC是由通过具有不稳定键的稳定化学接头与生物活性细胞毒性/抗病毒载荷或药物连接的抗体(完整的mAb或抗体片段，例如单链可变片段或scFv)构成的复合分子。抗体药物缀合物是生物缀合物和免疫缀合物的实例。
通过将单克隆抗体独特的靶向能力与细胞毒性药物的癌症杀伤能力相结合，抗体-药物缀合物允许灵敏地区分健康组织和患病组织。这意味着，与传统的全身性方法相反，抗体-药物缀合物靶向并攻击患病细胞，因此健康细胞受到的影响没那么严重。
在基于ADC的抗肿瘤治疗的开发中，将抗癌药物(例如细胞毒素(cell toxin)或细胞毒素(cytotoxin))与特异性靶向某些细胞标志物(例如，理想地仅在受感染细胞中或受感染细胞上发现的蛋白质)的抗体偶联。抗体在体内追踪这些蛋白质并将其自身附着于癌细胞表面。抗体与靶蛋白(抗原)之间的生化反应触发肿瘤细胞中的信号，肿瘤细胞然后吸收或内化抗体以及细胞毒素。ADC内化之后，细胞毒性药物被释放并杀伤细胞或损害细胞复制。由于这种靶向，与其他药剂相比，理想地该药物具有更低的副作用并给予更宽的治疗窗。
抗体和细胞毒性剂之间的稳定连接是ADC的一个关键方面。接头基于包括二硫化物、腙或肽(可裂解)或硫醚(不可裂解)的化学基序，并控制细胞毒性剂的分布和向靶细胞的递送。在临床前和临床试验中，已证明可裂解和不可裂解类型的接头是安全的。本妥昔单抗(Brentuximab vedotin)包含将强效且高毒性的抗微管剂，合成的抗肿瘤剂单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E)或MMAE，递送至人特异性CD30阳性恶性细胞的酶敏感的可裂解接头。MMAE由于其高毒性(其通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂)，因此不能用作单一药剂化学治疗药物。然而，与抗CD30单克隆抗体(cAC10，肿瘤坏死因子或TNF受体的一种细胞膜蛋白)连接的MMAE的组合被证明在胞外流体中是稳定的，可被组织蛋白酶裂解，并且用于治疗是安全的。曲妥珠单抗美坦新(Trastuzumab emtansine)作为另一种批准的ADC，是微管形成抑制剂美登素(DM-1)(美登素的衍生物)与抗体曲妥珠单抗(
Figure BDA0003199771920000471
/Genentech/Roche)通过稳定的、不可裂解的接头连接的组合。
更好和更稳定的接头的可用性已改变了化学键的功能。接头的类型(可裂解的或不可裂解的)为细胞毒性(抗癌)药物提供了特定的特性。例如，不可裂解的接头将药物保留在细胞内。作为结果，整个抗体、接头和细胞毒性剂进入靶癌细胞，在那里抗体被降解至氨基酸水平。所得的复合体(氨基酸、接头和细胞毒性剂)现成为活性药物。相反，可裂解的接头被宿主细胞中的酶催化，在那里释放细胞毒性剂。
目前在开发中的另一种类型的可裂解接头在细胞毒性药物和裂解位点之间添加了额外的分子。该接头技术允许研究人员创建具有更高灵活性的ADC，而不必担心改变裂解动力学。研究人员还在开发基于Edman降解的肽裂解的新方法，该方法是对肽中的氨基酸进行测序的方法。ADC开发的未来方向还包括位点特异性缀合(TDC)的开发，以进一步改善稳定性和治疗指数以及发射α的免疫缀合物和抗体缀合的纳米粒。
I.BiTE
双特异性T细胞衔接器(Bi-specific T-cell engager，BiTE)是一类人工双特异性单克隆抗体，已被研究用作抗癌药物。其指导宿主的免疫系统，更具体地T细胞的细胞毒性活性，来针对受感染细胞。BiTE是Micromet AG的注册商标。
BiTE是融合蛋白，由不同抗体的两个单链可变片段(scFv)或者来自约55千道尔顿的单条肽链上的四个不同基因的氨基酸序列组成。scFv中的一个通过CD3受体与T细胞结合，另一个通过特定分子与受感染细胞结合。
与其他双特异性抗体一样，与普通的单克隆抗体不同，BiTE在T细胞和靶细胞之间形成连接。这导致T细胞独立于MHC I或共刺激分子的存在，通过产生例如穿孔素和颗粒酶的蛋白质对受感染细胞发挥细胞毒性活性。这些蛋白质进入受感染细胞并引发细胞的凋亡。该作用模仿了在T细胞攻击受感染细胞期间观察到的生理过程。
J.胞内抗体
在一个具体实施方案中，抗体是适合在细胞内发挥作用的重组抗体——这样的抗体被称为“胞内抗体(intrabody)”。这些抗体可通过多种机制，例如通过改变胞内蛋白质运输，干扰酶的功能以及阻断蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA的相互作用来干扰靶向功能。在许多方面中，它们的结构模仿或类似于以上所讨论的单链和单结构域抗体的那些。实际上，单转录物/单链是重要的特征，其允许在靶细胞中进行胞内表达，并且还使蛋白质跨细胞膜转运更为可行。然而，还需要另外的特征。
影响胞内抗体治疗的实施的两个主要问题是递送(包括细胞/组织靶向)和稳定性。关于递送，已采用了多种方法，例如组织定向的递送、细胞类型特异性启动子的使用、基于病毒的递送以及细胞通透性/膜易位肽的使用。一种递送方式包括使用基于脂质的纳米粒或外排体，如美国专利申请公开2018/0177727所教导的，其通过引用以其整体并入于此。关于稳定性，方法通常是通过暴力(brute force)筛选，包括涉及噬菌体展示并且可包括序列成熟或共有序列的开发的方法，或者更定向的修饰，例如插入稳定序列(例如Fc区、伴侣蛋白序列、亮氨酸拉链)和二硫化物替换/修饰。
胞内抗体可需要的另外的特征是胞内靶向的信号。已设计了可将胞内抗体(或其他蛋白质)靶向至亚细胞区域(例如细胞质、细胞核、线粒体和ER)的载体，并且是可商购的(Invitrogen Corp.)。
K.纯化
本公开内容的抗体可以是经纯化的。本文中使用的术语“纯化的”意在指可与其他组分分离的组合物，其中蛋白质被纯化至相对于其可天然获得状态的任何程度。因此，经纯化的蛋白质也指这样的蛋白质，其脱离了其可天然存在的环境。当使用术语“基本上纯化的”时，该指定是指这样的组合物，其中蛋白质或肽形成该组合物的主要组分，例如构成组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术在一个水平上涉及将细胞环境粗分级至多肽级分和非多肽级分。在使多肽与其他蛋白质分离之后，可使用色谱和电泳技术进一步纯化目的多肽以实现部分纯化或完全纯化(或纯化至均质)。特备适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚集。其他用于蛋白质纯化的方法包括用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性进行沉淀，然后进行离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱；以及这些技术与其他技术的组合。
在纯化本公开内容的抗体中，可需要在原核或真核表达系统中表达多肽并使用变性条件提取蛋白质。可使用与多肽的标记部分结合的亲和柱从其他细胞组分纯化多肽。如本领域中通常已知的，认为进行各纯化步骤的顺序可改变，或者可省略某些步骤，并且仍然获得适合制备基本上纯化的蛋白质或肽的方法。
通常，使用与抗体的Fc部分结合的试剂(即，蛋白A)对完全抗体进行分级。或者，可使用抗原以同时纯化和选择合适的抗体。这样的方法通常使用结合在支持物(例如柱、过滤器或珠)上的选择剂。使抗体与支持物结合，除去(例如，冲洗掉)污染物，并通过施加条件(盐、热等)释放抗体。
根据本公开内容，本领域技术人员将知道多种用于对蛋白质或肽之纯化程度进行定量的方法。这些包括例如确定活性级分的比活性，或者通过SDS/PAGE分析来评估级分中多肽的量。另一种用于评估级分纯度的方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性比较，并且因此计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于根据纯化而选择的特定测定技术，以及所表达蛋白质或肽是否表现出可检测活性。
已知多肽的迁移可随着不同的SDS/PAGE条件而改变，有时候显著地改变。因此，应理解的是，在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子量可改变。
L.抗体缀合物
本公开内容的抗体可与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物。为了提高抗体分子作为诊断剂或治疗剂的效力，常规地与至少一种期望的分子或部分连接或共价结合或复合。这样的分子或部分可以是但不限于至少一种效应分子或报道分子。效应分子包括具有期望活性，例如细胞毒活性的分子。已与抗体连接的效应分子的一些非限制性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗性酶、放射性核素、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报道分子被定义为可使用测定检测的任何部分。已经与抗体缀合的报道分子的一些非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、光亲和分子、着色颗粒或配体，例如生物素。
通常优选使用抗体缀合物作为诊断剂。抗体诊断剂通常属于两类：用于体外诊断例如用于多种免疫测定的那些，以及用于通常称为“抗体指导的成像”的体内诊断方案的那些。许多合适的显像剂是本领域中已知的，其与抗体连接的方法也如此(参见，例如，美国专利5,021,236、4,938,948和4,472,509)。所使用的成像部分可以是顺磁性离子、放射性同位素、荧光染料、可NMR检测物质和X-射线显像剂。
在顺磁性离子的情况下，可通过以下示例性离子来提及：例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，其中特别优选钆。在另一些情况(例如X-射线成像)下可用的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)和特别是铋(III)。
在用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可提及砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和/或钇90。在某些实施方案中通常优选使用125I，并且也通常优选锝99m和/或铟111，因为其能量低和适用于长距离检测。本公开内容的放射性标记的单克隆抗体可根据本领域公知的方法产生。例如，可通过与碘化钠和/或碘化钾和化学氧化剂(例如次氯酸钠)或酶促氧化剂(例如乳过氧化物酶)接触来使单克隆抗体碘化。根据本公开内容的单克隆抗体可通过配体交换过程用锝99m标记，例如，通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，并将抗体施加于该柱。或者，可使用直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐、还原剂(例如SNCl2)、缓冲溶液(例如邻苯二甲酸钠钾溶液)和抗体进行。通常用于使作为金属离子存在的放射性同位素与抗体结合的中间官能团是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
在预期作为缀合物使用的荧光标记之中包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、CascadeBlue、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green500、Oregon Green 514、Pacific Blue、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红(Texas Red)。
在本公开内容中预期的另外类型的抗体是主要意图体外使用的那些，其中抗体与第二结合配体和/或在与显色底物接触之后产生着色产物的酶(酶标签)连接。合适的酶的一些实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素以及抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白化合物。这样的标记的使用对于本领域技术人员是公知的，并且在例如美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中描述。
分子与抗体的位点特异性连接的另一种已知方法包括使抗体与基于半抗原的亲和标记反应。实质上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸反应，从而破坏该位点并阻断特异性抗原反应。然而，这可能是不利的，因为其导致通过抗体缀合物的抗原结合丧失。
包含叠氮基的分子也可用于经由通过低强度紫外光产生的反应性氮宾中间体来与蛋白质形成共价键。特别地，已经使用嘌呤核苷酸的2-叠氮类似物和8-叠氮类似物作为定点光探针以鉴定粗制细胞提取物中的核苷酸结合蛋白。2-叠氮核苷酸和8-叠氮核苷酸还已被用于对经纯化蛋白质的核苷酸结合结构域进行图谱绘制并且可用作抗体结合剂。
用于使抗体与其缀合部分连接或缀合的数种方法是本领域中已知的。一些连接方法涉及使用金属螯合物复合体，其使用例如与抗体连接的有机螯合剂，例如二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-氯-对-甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(tetrachloro-3α-6α-diphenylglycouril-3)(美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体还可在存在偶联剂例如戊二醛或高碘酸盐的情况下与酶反应。与荧光素标记的缀合物在存在这些偶联剂的情况下或通过与异硫氰酸酯反应来制备。在美国专利4,938,948中，使用单克隆抗体实现了乳腺肿瘤的成像并且使用接头例如甲基-对羟基苯甲亚氨酸酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯使可检测成像部分与抗体结合。
在另一些实施方案中，预期通过使用不改变抗体结合位点的反应条件选择性地将巯基引入免疫球蛋白的Fc区中来使免疫球蛋白衍生化。据公开，根据这种方法产生的抗体缀合物表现出改善的寿命、特异性和灵敏度(美国专利5,196,066，其通过引用并入本文)。在文献中也已经公开了效应分子或报道分子的位点特异性连接，其中报道分子或效应分子与Fc区中的糖残基缀合。已经报道该方法产生目前处于临床评价之中的在诊断和治疗方面有希望的抗体。
II.治疗方法
本发明实施方案的某些方面可用于预防或治疗与TP-CAF的存在相关的疾病或病症，例如胰腺导管腺癌。TP-CAF的功能可通过任何合适的药物来降低。例如，这样的物质可以是抗TP-CAF抗体或嵌合抗原受体。另外，本发明实施方案可用于通过施用与免疫检查点阻断治疗组合、并且还任选地与标准护理化学治疗组合的IL-6信号传导抑制剂来治疗先前已经对免疫检查点阻断治疗具有抗性的癌症。
“治疗”及其变化形式是指出于获得疾病或健康相关病症的治疗性益处的目的而向对象施用或应用治疗剂或者对对象进行程序或模式(modality)。例如，治疗可包括单独或者与化学治疗、免疫治疗或放射治疗、手术进行、或其任何组合的施用组合施用药学有效量的靶向TP-CAF的抗体。
本文中使用的术语“对象”是指对其进行主题方法的任何个体或患者。通常来说，对象是人，尽管本领域技术人员将理解，对象可以是动物。因此，另一些动物，包括哺乳动物，例如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、农场动物(包括牛、马、山羊、绵羊、猪等)以及灵长类(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)均包括在对象的定义之内。
本申请通篇使用的术语“治疗益处”或“治疗有效”是指对于该病症的医学治疗而言促进或增强对象的福祉的任何事物。这包括但不限于降低疾病(例如癌症)体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可涉及例如降低肿瘤的尺寸、降低肿瘤的侵袭力、降低癌症的生长速率或预防转移。癌症的治疗还可指延长患有癌症的对象的存活。
本文中使用的术语“癌症”可用于描述实体瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些实施方案中，癌症可起源于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、肛门、牙龈(gum)、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。
癌症可具体地是以下组织学类型，尽管其不限于这些：恶性肿瘤；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌肿瘤；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌(endometroid carcinoma)；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳房佩吉特病(paget’s disease，mammary)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌W/鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；sertoli细胞癌；恶性莱迪希细胞瘤(leydig cell tumor)；恶性脂质细胞瘤；恶性神经节细胞瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；皮肤丝球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾胚细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤(brenner tumor)；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(ewing’s sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病(hodgkin’s disease)；霍奇金副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥散性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样霉菌病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸细胞性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。尽管如此，还认识到本发明也可用于治疗非癌性疾病(例如，真菌感染、细菌感染、病毒感染、神经退行性疾病和/或遗传紊乱)。
A.制剂和施用
本公开内容提供了药物组合物，其包含选择性靶向TP-CAF的抗体。这样的组合物包含预防或治疗有效量的抗体或其片段以及可药用载体。在一个具体实施方案中，术语“可药用的”意指由联邦或州政府的监管机构批准或者在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物并且更特别地用于人。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、赋形剂或载剂。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物是静脉内施用时，水是特定的载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。另一些合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
如果需要的话，组合物还可包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。经口制剂可包含标准载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药用剂的一些实例在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中描述。这样的组合物将包含预防或治疗有效量的抗体或其片段(优选以纯化的形式)以及合适量的载体，以便向患者提供用于适当施用的形式。制剂应适合于施用方式，其可以是经口、静脉内、动脉内、颊内、鼻内、雾化、支气管吸入、直肠内、经阴道、表面或通过机械通气递送。
抗体的被动转移通常将涉及静脉内或肌内注射的使用。抗体的形式可以是单克隆抗体(MAb)。这样的免疫通常仅持续短的时间段，并且还存在对于超敏反应和血清病，特别是来自于非人来源的γ-球蛋白的超敏反应和血清病的潜在风险。抗体将被配制在适合于注射(即无菌且可注射的)的载体中。
通常来说，本公开内容的组合物的成分以单位剂型分开提供或混合在一起提供，例如，作为在指示活性剂的量的密封容器(例如安瓿或药袋(sachette))中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物提供。当组合物通过输注施用时，可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶进行分配。当通过注射施用组合物时，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水以便可在施用之前将成分混合。
本公开内容的组合物可被配制为中性或盐形式。可药用盐包括与阴离子形成的那些，所述阴离子例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些；以及与阳离子形成的那些，所述阳离子例如来源于钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
B.试剂盒与诊断
在一些实施方案的多个方面中，设想试剂盒包含治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂。本发明实施方案预期用于制备和/或施用一些实施方案的治疗的试剂盒。试剂盒可包含一个或更多个密封的小瓶，其包含本发明实施方案的任何药物组合物。试剂盒可包含例如至少一种抗TP-CAF抗体以及用于制备、配制和/或施用一些实施方案的组分或进行本发明方法的一个或更多个步骤的试剂。在一些实施方案中，试剂盒还可包含合适的容器，所述容器是不会与试剂盒的组分反应的容器，例如eppendorf管、测定板、注射器、瓶或管。容器可由可灭菌材料(例如塑料或玻璃)制成。
试剂盒还可包含说明单，其概述了本文中所述方法的程序性步骤，并且将遵循与本文中所述或本领域普通技术人员已知的基本上相同的程序。指令信息可在包含机器可读指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行该机器可读指令时，导致显示递送药学有效量的治疗剂的真实或虚拟程序。
C.ADCC
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞对抗体包被的靶细胞的裂解的一种免疫机制。靶细胞是通常通过Fc区N端的蛋白质部分与抗体或其包含该Fc区的片段特异性结合的细胞。“具有提高/降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体”意指如通过本领域普通技术人员已知的任何合适方法所确定的具有提高/降低的ADCC的抗体。
本文中使用的术语“提高/降低的ADCC”定义为：在靶细胞周围的介质中的抗体的给定浓度下，通过如上定义的ADCC的机制，在给定时间内裂解的靶细胞数目的提高/降低；和/或在靶细胞周围的介质中，通过ADCC机制，在给定时间内实现给定数量的靶细胞裂解所需的抗体浓度的降低/提高。ADCC的提高/降低是相对于使用相同标准的产生、纯化、配制和储存方法(其是本领域技术人员已知的)由同一类型的宿主细胞(但其是未经改造的)产生的相同抗体介导的ADCC。例如，由通过本文中所述方法改造以具有改变的糖基化模式(例如，以表达糖基转移酶GnTIII或其他糖基转移酶)的宿主细胞产生的抗体所介导的ADCC的提高是相对于由通过同一类型的未经改造宿主细胞产生的相同抗体介导的ADCC。
D.CDC
补体依赖性细胞毒性(CDC)是补体系统的功能。其是免疫系统中的过程，通过破坏病原体的膜来杀伤病原体而没有免疫系统的抗体或细胞的参与。存在三种主要过程。所有这三种过程都将一种或更多种膜攻击复合体(membrane attack complex，MAC)插入病原体中，这引起致死的胶体-渗透肿胀，即CDC。其是抗体或抗体片段具有细胞毒性作用的机制之一。
E.组合治疗
在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及与第二或另外的治疗(例如化学治疗或免疫治疗)组合的针对TP-CAF以抑制其活性的抗体或抗体片段。这样的治疗可应用于治疗与TP-CAF相关的任何疾病。例如，疾病可以是癌症。
包括组合治疗在内的方法和组合物增强了治疗或保护作用，和/或提高了另一抗癌或抗过度增殖治疗的治疗作用。治疗和预防方法以及组合物可以以有效地实现期望作用(例如杀伤癌细胞和/或抑制细胞过度增殖)的组合量提供。该过程可涉及使细胞与抗体或抗体片段和第二治疗二者接触。组织、肿瘤或细胞可与包含一种或更多种药剂(即抗体或抗体片段或抗癌剂)的一种或更多种组合物或一种或更多种药理制剂接触，或者通过使组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物提供1)抗体或抗体片段，2)抗癌剂，或3)抗体或抗体片段和抗癌剂二者。此外，预期了可将这样的组合治疗与化学治疗、放射治疗、手术治疗或免疫治疗结合使用。
术语“接触”和“暴露”当应用于细胞时在本文中用于描述将治疗性构建体以及化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或者与靶细胞直接并置放置的过程。为了实现细胞杀伤，例如，将两种药剂以有效杀伤细胞或阻止其分裂的组合量递送至细胞。
治疗性抗体可在相对于抗癌治疗之前、期间、之后或以多种组合施用。施用可以以同时至数分钟至数天至数周的间隔进行。在抗体或抗体片段与抗癌剂分开提供给患者的一些实施方案中，通常将确保每次递送的时间之间有意义的时间段没有到期，以使得两种化合物仍然能够对患者发挥有利的组合作用。在这样的情况下，预期在彼此相隔约12小时至24小时或72小时内，并且更特别地，在彼此相隔约6小时至12小时内，可为患者提供抗体治疗和抗癌治疗。在一些情况下，可期望将治疗时间段显著延长，其中分开施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
在某些实施方案中，疗程将持续1至90天或更长(该这样的范围包括中间天数)。预期可在第1天至第90天(该这样的范围包括中间天数)的任意天或其任何组合给予一个药剂，以及在第1天至第90天(该这样的范围包括中间天数)的任意天或其任何组合给予另一药剂。在单日(24小时时期)内，可给予患者一次或多次施用一种或更多种药剂。此外，在疗程之后，预期存在未施用抗癌治疗的时间段。该时间段可持续1至7天，和/或1至5周，和/或1至12个月或更长(该这样的范围包括中间天数)，取决于患者的状况，例如其预后、体力(strength)、健康等。预期将根据需要重复治疗周期。
可采用多种组合。对于以下的实例，抗体治疗是“A”，并且抗癌治疗是“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
预期到药剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本发明实施方案的任何化合物或治疗将遵循用于施用这样的化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测归因于组合治疗的毒性的步骤。
1.化学治疗
根据本发明实施方案，可使用广泛多种的化学治疗剂。术语“化学治疗”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物通过其在细胞内的活性模式(例如其是否影响细胞周期和在什么阶段影响细胞周期)进行分类。或者，药剂可基于其直接交联DNA、嵌入DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。
化学治疗剂的一些实例包括包括烷化剂类，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三甲蜜胺；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱类(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓虫素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；五加素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇类；海绵抑制素；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1)；达因霉素，包括达因霉素A；二膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素类；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类(例如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺类，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素类；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱类，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、漆斑菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DFMO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨、卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法尼基-蛋白质转移酶抑制剂、反铂，以及上述任意一种的可药用的盐、酸或衍生物。
2.放射治疗
导致DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常被称为γ射线、X射线和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素的那些。还预期了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)以及UV辐照。很可能所有这些因素均对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损害。X射线的剂量范围为从50至200伦琴的日剂量持续延长的时间段(3至4周)到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发出的辐射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
3.免疫治疗
技术人员将理解的是，免疫治疗可与一些实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0003199771920000591
是这样的一个实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可用作治疗的效应物或者其可募集其他细胞以实际上影响细胞杀伤。抗体还可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且仅用作靶向剂。或者，效应物可以是携带直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应物细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在免疫治疗的一个方面中，肿瘤细胞必须具有适用于靶向(即，不存在于大多数其他细胞上)的一些标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些肿瘤标志物中的任何一种可适用于本发明实施方案的上下文中的靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化的路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、层黏连蛋白受体、erb B和p155。免疫治疗的另一个方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子，其包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趋化因子，例如MIP-1、MCP-1、IL-8；以及生长因子，例如FLT3配体。
目前正在研究或应用的免疫治疗的一些实例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169)；细胞因子治疗，例如干扰素α、β和γ，IL-1，GM-CSF和TNF；基因治疗，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(美国专利5,824,311)。预期可将一种或更多种抗癌治疗与本文中所述的抗体治疗一起使用。
在一些实施方案中，免疫治疗可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点或调高信号(例如，共刺激分子)或调低信号。可通过免疫检查点阻断被靶向的抑制性免疫检查点包括：腺苷A2A受体(A2A receptor，A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞弱化子(B and Tlymphocyte attenuator，BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(killer-cellimmunoglobulin，KIR)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG3)、程序性死亡1(programmed death 1，PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3，TIM-3)和T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体、或者特别地可以是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718，其通过引用并入本文)。可使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别地，可使用嵌合的、人源化的或人形式的抗体。如技术人员将知道的，替代和/或等同的名称可用于本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如，已知拉立珠单抗(lambrolizumab)也以替代和等同的名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)而为人所知。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中，PD-1配体结合伴侣是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中，PDL1结合伴侣是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中，PDL2结合伴侣是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利No.8,735,553、8,354,509和8,008,449中，其全部通过引用并入本文。用于本文中提供的方法的另一些PD-1轴拮抗剂是本领域已知的，例如描述于美国专利公开No.20140294898、2014022021和20110008369中，其全部通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDLl或PDL2的胞外部分或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003199771920000611
)是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。派姆单抗，也称为MK-3475、Merck 3475、拉立珠单抗、
Figure BDA0003199771920000612
和SCH-900475，是描述于WO2009/114335中的抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT或hBAT-1，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。
可在本文中提供的方法中被靶向的另一免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登录号为L15006。CTLA-4见于T细胞表面上并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时用作“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，该超家族在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28相似，并且两个分子均与抗原呈递细胞上的CD80和CD86结合，分别还称为B7-1和B7-2。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28则传递刺激信号。胞内CTLA4也见于调节性T细胞中并且可能对调节性T细胞的功能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达提高。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域中公知的方法产生。或者，可使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，公开于以下中的抗CTLA-4抗体可用于本文中公开的方法中：美国专利No.8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为替西术单抗(tremelimumab)；原名西木单抗(ticilimumab))，美国专利No.6,207,156；Hurwitz et al.(1998)Proc Natl Acad SciUSA 95(17)：10067-10071；Camacho et al.(2004)J Clin Oncology 22(145)：摘要No.2505(抗体CP-675206)；以及Mokyr et al.(1998)Cancer Res 58：5301-5304。每个前述出版物的教导均通过引用并入于此。也可使用与这些本领域公认的抗体中任一者竞争用于与CTLA-4结合的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请No.WO2001014424、WO2000037504和美国专利No.8,017,114中；其全部通过引用并入本文。
示例性的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0003199771920000621
)或其抗原结合片段和变体(参见例如WO 01/14424)。在另一些实施方案中，抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与如上述的抗体竞争结合CTLA-4上的同一表位和/或与之结合。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的另一些分子包括CTLA-4配体和受体，所述CTLA-4配体和受体例如描述于美国专利No.5844905、5885796和国际专利申请No.WO1995001994和WO1998042752中，其全部通过引用并入本文；以及免疫黏附素，所述免疫黏附素例如描述于美国专利No.8329867中，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，免疫治疗可以是过继免疫治疗，其涉及转移离体产生的自体抗原特异性T细胞。用于过继免疫治疗的T细胞可通过抗原特异性T细胞的扩增或通过遗传工程进行的T细胞的重定向来产生(Park，Rosenberg et al.2011)。已表明肿瘤特异性T细胞的分离和转移成功治疗黑素瘤。通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移，已成功地在T细胞中产生了新的特异性(Jena，Dotti et al.2010)。CAR是由与单一融合分子中的一个或更多个信号传导结构域缔合的靶向部分组成的合成受体。一般而言，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，该结构域包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻片段和可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功使用。第一代CAR的信号传导结构域来源于CD3ζ的胞质区或Fc受体γ链。CAR已成功地使T细胞针对来自多种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原重定向。
在一个实施方案中，本申请提供了用于治疗癌症的组合治疗，其中所述组合治疗包含过继T细胞治疗和检查点抑制剂。在一个方面中，过继T细胞治疗包含自体和/或同种异体T细胞。在另一个方面中，自体和/或同种异体T细胞靶向肿瘤抗原。
4.手术
约60％患有癌症的人将经历某种类型的手术，其包括预防性、诊断性或阶段性、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括其中将全部或部分癌组织物理地去除、切除和/或破坏，并且可与另一些治疗(例如本发明实施方案的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗)结合使用的切除术。肿瘤切除术是指物理去除至少一部分肿瘤。除肿瘤切除术之外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微控制的手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤之后，可在体内形成腔。治疗可通过灌注、直接注射或向该区域局部应用另外的抗癌治疗来实现。可重复这样的治疗，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可具有多种剂量。
5.另外的药剂
预期可将其他药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的治疗效力。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、提高过度增殖细胞对凋亡诱导剂敏感性的药剂或其他生物药剂。通过升高GAP连接数提高胞间信号传导，将提高对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在另一些实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖效力。预期细胞黏附抑制剂提高本发明实施方案的效力。细胞黏附抑制剂的一些实例是黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。还预期可将提高过度增殖细胞对凋亡的敏感性的另一些药剂，例如抗体c225，与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗效力。
III.实施例
包括以下实施例以表明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表了本发明人发现在本发明的实施中良好发挥作用的技术，并且因此可被认为构成了用于其实践的优选模式。然而，本领域技术人员应理解，根据本公开内容，可对公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
材料和方法
小鼠。表1中列出了指定特定经遗传改造的小鼠(genetically engineered mice，GEM)的所有缩略词。FSF-KrasG12D/+(Schonhuber et al.，2014)、Pdxl-Flp(Schonhuber etal.，2014)、Trp53frt/+(Lee et al.，2012)、LSL-KrasG12D/+(Hingorani et al.，2005)、Pdxl-Cre(Hingorani et al.，2005)、αSMA-Cre(LeBleu et al.，2013)、αSMA-RFP(LeBleu etal.，2013)、Rosa26-loxP-Stop-loxP-YFP(Ozdemir et al.，2014)、Tgfbr2loxP/loxP(Ijichiet al.，2006)和L-6loxP/loxP(Quintana et al.，2013)小鼠品系先前已有记载。Rosa26-CAG-loxP-frt-Stop-frt-FireflyLuc-EGFP-loxP-RenillaLuc-tdTomato(称为R26Dual)、FSF-KrasG12D/+、Pdxl-Flp和Trp53frt/+品系由D.Saur友情提供，而R26R-Brainbow2.1/Confetti(称为R26Confetti)品系购自Jackson Laboratory(货号013731)。IL-6-/-品系通过将L-6loxP /loxP品系与CMV-Cre品系(Jackson Laboratory；货号006054)杂交来产生。FAP-TK转基因品系是新产生的：使用NotI和AgeI将FAP启动子侧翼的5kb序列和部分外显子1(Ex1)克隆到pORF-HSV1-TK载体(Invivogen)中。使用NotI和SwaI从载体中释放出序列经确认的FAP-TK构建体，然后进行纯化并将其注射到受精卵中。在C57Bl/6遗传背景下产生转基因小鼠。如先前所述(Kamerkar et al.，2017)，将这些小鼠培育成PDAC GEM或原位植入689KPC癌细胞。使小鼠保持在混合的遗传背景下，并对雄性和雌性小鼠二者进行评价。每周两次以40mg/kg体重向小鼠腹膜内(i.p.)给予吉西他滨(G-4177，LC Laboratories)。吉西他滨处理在35日龄时开始。以50mg/kg体重(每25g小鼠约1.5mg)每天i.p.施用更昔洛韦(GCV；sud-gcv，Invivogen)。向28至30日龄的PKT小鼠和50至51日龄的PKP小鼠施用GCV。从PKT；αSMA-TK GEM中分析的一些组织来自先前公开的小鼠(Ozdemir et al.，2014)。对照组接受磷酸盐缓冲盐水而不是GCV，或者不进行注射。在原位肿瘤模型(689KPC)中，在肿瘤植入之后15天施用GCV，并在肿瘤植入之后40天时使小鼠安乐死。每周两次以200μg/小鼠的剂量i.p.施用抗IL-6抗体(MP5-20F3；BioXCell)。处理在35日龄时开始。每隔3天(在35日龄时开始)，每次以100μg/小鼠的剂量i.p.施用抗CTLA-4(BE0131，克隆9H10，BioXCell)和抗PD1(BE0273，29F.1A12，BioXCell)抗体，共注射3次。所有小鼠均在标准饲养条件下饲养。研究人员对组分配并非不知情，但对表型的组织学评估结果不知情。未使用随机化方法并且没有动物被排除在分析之外。实验终点限定为当动物发展为导致其死亡或需要安乐死的明显疾病迹象时。
多重染色组织切片的多光谱成像。先前已发表了使用Nuance和inform成像软件进行多重染色操作、光谱解混合和细胞分割(Carstens et al.，2017)。用于多重染色的抗体浓度可在表1中找到。用Vectra多光谱成像系统使用Vectra软件版本3.0.3(Perkin Elmer)使多重染色的载片成像。使用4x物镜对每个组织切片进行整体扫描，并使用Phenochart软件(Perkin Elmer)选择多至80个区域(以20x)以进行多光谱成像。在每个发射滤光片立方体(emission filter cube)的范围内，对于每10nm的发射光谱，对每个多重场(multiplexfield)进行扫描。用于多光谱成像的滤光片立方体是DAPI(440至600nm)、FITC(520nm至680nm)、Cy3(570至690nm)、Texas Red(580至700nm)和Cy5(680至720nm)。使用Nuance成像分析软件(Perkin Elmer)，使用来自具有相应荧光团的单标志物染色的载片的多光谱图像来生成光谱库。库包含所有荧光团的发射光谱峰，并用于通过使用inform2.2成像分析软件将每个多光谱图像解混合(光谱解混合)为其单独的六个组分。随后基于核DAPI复染将所有光谱解混合的图像立方体分割成单独细胞。然后使用R算法处理包括所有标志物的单独细胞表达水平在内的细胞分割信息，其中基于先前使用inForm软件确定的染色阳性阈值来鉴定每个细胞的标志物阳性。在不同组群之间调整不同标志物的检测阈值，以确保在所有对照中阳性信号的捕获一致。每个组群中的所有图像都使用相同的染色阳性阈值进行处理。PKT组合的对照肿瘤中的间充质细胞组成(图1A和4E)包括FAP-TK对照，n＝7，和αSMA-TK对照，n＝4。图4E中列出的百分比差异是耗竭组及各自对照组之间的比较，并且如果使用组合对照进行比较，则这些结果是相似的。抗体来源和稀释详述于表2中。
免疫荧光标记和免疫组织化学。所有抗体、来源和稀释都列于表2中。对于EGFP/tdTomato可视化，将来自KPPF；αSMA-Cre；R26Dual和KPPF；αSMA-Cre；R26Confetti小鼠的组织在4℃下在4％多聚甲醛中固定过夜，并在4℃下在30％蔗糖中平衡过夜。然后将组织包埋在O.C.T.化合物(TissueTek)中并加工成5μm厚的冷冻切片。将切片用4％冷水鱼明胶(Aurion)封闭1小时，并在4℃下用抗αSMA抗体(随后是AlexaFluor647二抗)或FAP抗体随后是AlexaFluor405二抗)免疫染色过夜。然后用Vectashield封片剂(Vector Laboratories)将载片封片至玻璃盖玻片，并在LSM800共聚焦激光扫描显微镜和ZEN软件(Zeiss)下进行可视化。对于内源性EYFP和RFP荧光的可视化，将来自PKTY；αSMA-RFP小鼠的组织在4℃下在4％多聚甲醛中固定过夜，并在4℃下在30％蔗糖中平衡过夜。然后将组织包埋在O.C.T.化合物(TissueTek)中并加工成5μm厚的切片。将切片在冷丙酮中固定，用DAPI封片剂封片，并用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1000)用20x 0.85 NA UPLSAPO物镜使用405、488和559nm的激光进行可视化。用FLUOVIEW FV100软件版本4.0.3.4(Olympus)获取图像。
在基于柠檬酸盐的抗原修复(pH＝6)之后，如先前所述(Zheng et al.，2015)处理福尔马林固定、石蜡包埋(formalin-fixed，paraffin-embedded，FFPE)的切片用于免疫组织化学(IHC)染色。对于小鼠FFPE切片中的FAP染色，基于柠檬酸盐的抗原修复(antigenretrieval)在pH 7.4下进行。用M.O.M.试剂盒(Vector Laboratories)按照制造商的说明，对αSMA进行染色。对于所有其他染色，将切片与生物素化山羊抗兔和链霉亲和素HRP(Biocare Medical)一起孵育，各自进行10分钟。对于所有染色，用苏木精进行复染，并在200×放大倍数下在10个视野中检查DAB阳性。切割的胱天蛋白酶-3染色通过对每个400×视野中显示出的阳性核的细胞数目进行计数来量化。使用NIH ImageJ分析软件对图像的阳性区域进行量化(αSMA、CD31、CK19、切割的胱天蛋白酶-3、Ki67、MTS、phospho-Akt、phospho-ERK1/2、phospho-Stat3)。对于人FFPE切片中的αSMA和FAP双免疫荧光，将第二抗绵羊Alexa Fluor 488和抗小鼠Alexa Fluor 534抗体在RT下孵育30分钟。对于FAP-TK和对照肿瘤切片上的αSMA和FAP IHC，根据每个切片的分布和强度评分的总和获得免疫反应评分(immunoreactive score，IRS)，其建立在1至4的标度上(Meyerholz&Beck，2018)。
流式细胞术。为了分析来自PKTY；αSMA-RFP小鼠的肿瘤的YFP、αSMA-RFP和FAP免疫标记的细胞，将肿瘤切碎并在37℃下在DMEM培养基中的胶原酶IV(4mg/mL)和分散酶(4mg/mL)中消化1小时。然后将经消化的组织通过70μm筛网随后通过40μm筛网过滤，离心，并在室温下在ACK裂解缓冲液中孵育3分钟。用Zenon Alexa Fluor 647兔IgG标记试剂盒根据制造商的说明将FAP与其对应的同种型抗体偶联。将样品用在FACS缓冲液中的抗体和fixableviability dye eFluor 780在冰上染色30分钟，随后洗涤，然后在BD LSR Fortessa X20上进行分析。对于分选实验，在BD FACS Aria上分析和分选样品。对野生型、αSMA-RFP和FAP-TK小鼠的从长骨冲洗的骨髓和脾也进行了FAP免疫标记。在染色之前，将脾切碎并通过40μm筛网过滤，并将脾和骨髓二者在室温下在ACK裂解缓冲液中孵育3分钟。未染色和单染色的样品用于补偿对照。有关抗体、来源和稀释的细节列于表2中。
为了表征免疫浸润，将肿瘤(来自用盐水或吉西他滨处理2周的2.5月龄小鼠)称重，用gentleMACS分离器切碎，并在37℃下在DMEM培养基中在含有1mg/mL释放酶TL(Roche)和0.2mg/mL DNase I的2mL溶液中消化30分钟。将脾称重并通过100μm筛网过滤。将外周血用EDTA管收集，用ACK裂解缓冲液孵育5分钟，然后进行筛网过滤。将组织裂解物在免疫染色之前通过100μm筛网过滤。将随后的单细胞悬液用Fixable Viability Dye eFluor 780(eBioscience)和表2中指定的抗体染色。通过FlowJo 10.1分析阳性细胞百分比，并对CD45阳性进行设门。未染色、仅Viability染色和单染色的珠(eBioscience)用作补偿对照。使用前向散射(forward scatter，FSC)高度(forward scatter height，FSC-H)和FSC面积(FSCarea，FSC-A)事件特征对单峰进行设门。设门策略示出于图16A至D中。
组织病理学评分。将小鼠组织在10％中性缓冲福尔马林中固定，包埋于石蜡中，并以5μm厚度切片。使用Gomori三色染色试剂盒(38016SS2，Leica Biosystems)对切片进行苏木精和伊红(haematoxylin and eosin，H&E)染色和/或Masson三色染色(Masson’strichrome staining，MTS)。通过对H&E染色切片的所列组织病理学表型的相对百分比进行评分以盲法方式来进行组织病理学评估。将原位肿瘤的肿瘤评分归为1(轻微受累(involvement))至4(广泛受累)的标度，这评价了整个胰腺的H&E切片的相关肿瘤受累。在肝和肺的H&E染色组织切片中检查显微转移。阳性(一个组织中有一个或更多个病变)通过CK19染色证实。用Leica DM 1000 LED显微镜和MC120 HD显微镜相机以及Las V4.4软件(Leica)获得图像。
scRNA测序。对PKTY；αSMA-RFP小鼠的肿瘤进行处理以获得单细胞悬液(参见流式细胞术方法部分)。单细胞凝胶乳液包珠(GEM)(Single cell Gel Bead-In-Emulsion)生成和条码化、GEM-RT后清理以及cDNA扩增、文库构建和Illumina就绪测序文库生成均按照制造商的指南进行准备。高灵敏度dsDNA Qubit试剂盒用于估计cDNA和文库浓度。HS DNABioanalyzer用于对cDNA进行定量。DNA 1000 Bioanalyzer用于对文库进行定量。单细胞RNA-Seq数据通过MD Anderson癌症中心的测序和微阵列设备处理。通过使用Cell Ranger软件流水按照制造商的指南生成“cloupe”文件。使用10X Genomics’Loupe Cell Browser软件进行进一步数据分析。在MD Anderson癌症中心的测序和微阵列设备处，使用1OXGenomics’s Chromium控制器和单细胞3’试剂试剂盒v2对来自未分级肿瘤的1118个细胞、来自αSMA-RFP分选样品的961个细胞和来自FAP-APC分选样品的340个细胞进行包封。捕获和裂解之后，合成并扩增cDNA以构建Illumina测序文库。在MD Anderson癌症中心的测序和微阵列设备处用Illumina Nextseq 500方法对来自约1,000个细胞/样品的文库进行测序。运行格式对于读段1为26个循环，对于索引1为8个循环，且对于读段2为124个循环。细胞评分中的分数读段(fraction read)为83.6至93.2％。检测到的中位基因/细胞为872多至2870个基因/细胞。其他QC度量(样品映射％、读段/细胞、RNA读段中的QC30)评分全部均＞65％。scRNA测序数据通过MD Anderson癌症中心的测序和微阵列设备处理。通过使用10XGenomics’Loupe Cell Browser软件进行进一步数据分析。将使用Loupe Cell Browser软件被鉴定为αSMA+或FAP+簇中前100个差异调节基因的基因映射到独创性途径分析(ingenuity pathway analysis，IPA)网络上。人“正常”胰腺与胰腺肿瘤相距至少1.5cm，并且与PDAC1或PDAC2(来自不同患者)不匹配。PDAC1样品接受了8个循坏的吉西他滨/abraxane。PDAC2样品用folfirinox处理。对于人肿瘤和正常邻近样品，在MD Anderson癌症中心的测序和微阵列设备处使用10X Genomics’铬控制器和单细胞3’试剂试剂盒v2对来自正常人胰腺的214个细胞、来自人PDAC1的562个细胞、来自人PDAC 2A的218个细胞和来自PDAC 2B的110个细胞进行包封。在MD Anderson癌症中心的测序和微阵列设备处用Illumina Nextseq 500方法对每次运行具有最大5,000个细胞的文库进行测序。细胞评分中的分数读段为66％至92.4％。检测到的中位基因/细胞对于正常人胰腺为45，对于人PDAC1为2,547，对于人PDAC2A为506，且对于人PDAC2B为542。转录组的映射百分比为34.7％多至58.5％。RNA读段评分中的QC30全部均＞65％。通过使用10X Genomics’Loupe CellBrowser软件进行进一步数据分析。
从PDAC组织中分离原代胰腺腺癌细胞和肌成纤维细胞。原代PDAC细胞和肌成纤维细胞系的建立如先前所述在稍作修改的情况下进行(Zheng et al.，2015)。将来自KPPF；IL-6smaKO/WT；R26Dual小鼠的新鲜PDAC组织用无菌柳叶刀切碎，在37℃下用胶原酶IV(17104019，Gibco，4mg/mL)/分散酶II(17105041，Gibco，4mg/mL)/DMEM消化1小时，通过70μm细胞滤器过滤，重悬于DMEM/20％FBS中，并随后接种在I型胶原包被的皿(354401，Corning)上。将细胞在含有20％FBS和1％青霉素/链霉素/两性霉素B(penicillin/streptomycin/amphotericin B，PSA)抗生素混合物的DMEM培养基中培养。表达Pdxl的癌细胞和表达αSMA的肌成纤维细胞分别通过基于EGFP和tdTomato信号的FACS(BD FACSAriaTMII分选器)来进一步纯化。随后将分选的细胞保持在体外。所有研究均在培养少于25代的细胞中进行。使用DNA Mini试剂盒(51304 QIAGEN)从这些原代细胞系中提取DNA。
基因表达分析和全局基因表达谱。使用RNeasy Mini试剂盒(74104，QIAGEN)按照指示从KPPF、KPPF；IL-6smaKO和KPPF；IL-6-/-小鼠的PDAC肿瘤组织中提取RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(4368814，Applied Biosystems)合成cDNA。将检测到的基因的表达水平相对于Gapdh持家基因的表达水平归一化。相对表达数据表示为倍数变化(2ΔΔCt)，其中将对照组相对于1的倍数值归一化。对ΔCt进行统计分析。用于检测到的基因的引物序列在下面列出。小鼠基因和引物如下：
GAPDH F 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′(SEQ ID NO：1)；GAPDH R 5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′(SEQ ID NO：2)；IL-6F 5′-GCTTAATTACACATGTTCTCTGGGAAA-3′(SEQ ID NO：3)；IL-6 R 5′-CAAGTGCATCATCGTTGTTCATAC-3′(SEQ ID NO：4)；IL-1β F5′-GGGCTGCTTCCAAACCTTTG-3′(SEQ ID NO：5)；IL-1β R 5′-TGATACTGCCTGCCTGAAGCTC-3′(SEQ ID NO：6)；αSMA(Acta2)F 5′-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3′(SEQ ID NO：7)；αSMA R5′-TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3′(SEQ ID NO：8).
还从施用有GCV或PBS的年龄匹配的PKT；αSMA-TK和PKT；FAP-TK小鼠(n＝每组中3只小鼠)的肿瘤中分离出总RNA。RNA提取使用QIAGEN RNeasy Mini试剂盒进行，并提交至MDAnderson癌症中心的微阵列核心设备。使用Affymetrix MTA 1.0基因芯片进行基因表达分析。来自R Bioconductor的Limma包(Smyth，2005)用于表达阵列的分位数归一化，并用于分析TK组(PKT；αSMA-TK和PKT-FAP-TK组)及其各自的对照(PKT-αSMA-TK对照和PKT；FAP-TK对照)组之间的差异基因表达(p≤0.05且倍数变化≥1.2)。使用基因集富集分析(Gene SetEnrichment Analysis，GSEA)(Subramanian et al.，2005)对TK组与对照组之间的差异表达途径进行分析。基因表达微阵列数据保存在GEO中，其可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE120577获得。
TCGA数据分析。在用Cancer Genomics的cBioPortal(可在万维网cbioportal.org/获得)下载相关mRNA表达数据(RNA Seq V2 RSEM)之后，分析了来自癌症基因组图谱(TCGA)数据库的179例胰腺腺癌病例的mRNA表达谱(Cerami et al.，2012)。所有病例根据其相对IL-6mRNA水平(相对于ACTB持家基因归一化)分为两组(IL-6-高和IL-6-低)。
统计分析。用于所呈现的比较分析的统计检验列于图例中。使用GraphPad Prism(GraphPad软件)进行统计分析。在GraphPad Prism的情况下，Kaplan-Meier图用于存活分析，并且对数秩Mantel-Cox检验用于评价统计差异。除非在图例中说明，否则误差棒表示均值的标准误(standard error ofthe mean，sem)。统计显著性限定为P＜0.05。
实施例1-PDAC成纤维细胞基质是异质性的
为了限定与PDAC病变的结缔组织生成性反应相关的成纤维细胞亚群，将Ptflacre /+；LSL-KrasG12D/+；Tgfbr2loxP/loxP(PKT)经遗传改造的小鼠(GEM，表1；n＝11)自发产生的胰腺肿瘤针对原型间充质基因产物进行免疫标记(LeBleu&Kalluri，2018)。这些包括α-平滑肌肌动蛋白(Acat2，αSMA)、血小板生长因子受体α(Pdgfra，PDGFRα)、成纤维细胞特异性蛋白1(S100A4，Fsp1)和波形蛋白(Vim，在本文中也称为Vim)。由于在多重染色操作中抗FAP抗体的标记不佳，因此成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein，FAP)鉴定可不包括在内。使用对多重切片采用的相同的光谱解混合算法分析单染色对照，并且在不同荧光团之间显示出无重叠。结合DAPI核染色和细胞角蛋白8(CK8)上皮免疫标记，量化多重免疫荧光分析显示，所选间充质标志物捕获了肿瘤中所有细胞的约36.27％，其余细胞为癌细胞(CK8+；53.59％)或未标记细胞(10.14％)。未标记细胞可能包含未在间充质染色组中捕获的血管细胞和免疫细胞。尽管注意到癌细胞表达成纤维细胞标志物(可用上皮间充质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)程序标记细胞)，但通过排除表达上皮标志物(CK8)的细胞，随后的分析限于间充质基质。对相对间充质标志物重叠以限定不同间充质细胞亚型的分析显示，这些肿瘤中的主要间充质细胞群是αSMA+细胞(30.40％)，随后是PDGFRα+细胞(图1A)。高至69％的间充质基质由表达αSMA、PDGFRα或二者的细胞构成，并且没有波形蛋白和Fsp1(图1A)。PDGFRα的表达与其他间充质标志物(αSMA、波形蛋白或Fsp1)重叠，且波形蛋白表达是最混杂的标志物，显示出与所评价的所有其他间充质标志物的共阳性(图1A)。该分析表明，由标志物的限定的组表征的PDAC中的成纤维细胞特征确定了高异质性的成纤维细胞组成，其中由αSMA特异性标记的成纤维细胞作为主要的间充质种类。值得注意的是，使用PDAC组织切片的免疫标记，在鼠(Ozdemir et al.，2014)和人PDAC基质中观察到αSMA和FAP的重叠最小(图1B)。此外，用癌细胞(LSL-YFP)和αSMA+CAF(αSMA-RFP转基因)的谱系追踪对PKT小鼠进行了改造，这使得流式细胞术能够捕获癌细胞(YPF)和αSMA+CAF(YFP-、RFP+)。这些肿瘤的内源性YFP和RFP(αSMA)信号的流式细胞术分析以及FAP免疫标记(APC标记)也揭示了在基质细胞中αSMA与FAP表达之间重叠最小(图1C)。
实施例2-scRNA-Seq分析将αSMA+和FAP+鉴定为PDAC中CAF的不同亚群
为了进一步解决PDAC中成纤维细胞的功能异质性，对来自PKT肿瘤的未分级细胞进行单细胞RNA测序(scRNA-Seq)。维数降低和t-SNE图中特定基因表达谱的描绘表明，单细胞分离主要产生免疫细胞(髓样(Itgam；Itgb2；S100a8；Ccl3；Apoe；Itgax；Adgre1)和淋巴样(Ptprc；Cd3d；Cd4；Gzmb；Cd8a；Cd19；CD69；CD79a；MS4a2；Cd3e；Cd79b)谱系)，以及上皮细胞(Krt19；Muc1；Krt18；Muc5ac)和成纤维细胞(Vim；Acta2；Fap；Thy1；Col3a1；S100a4；C3；Des；Cxcl12；Pecam1；Pdgfra；Pdgfrb)的较小簇(描绘)。为了富集αSMA+和FAP+成纤维细胞，用纯化的αSMA-RFP+和FAP+(经免疫标记的)成纤维细胞进行流式细胞术，然后进行scRNA-Seq(图1D，图7A至B)。不同的细胞簇分别从αSMA+和FAP+富集的群中出现，其中在两者之间具有一个观察到的共同簇(簇3)(图2A，左图)。αSMA+富集的簇(簇1、2、4和6)包括经历上皮间充质转化(EMT)的癌细胞(CK19、CD18、Muc1)(簇2)和其他基质细胞(簇1、4和6)(图2A)。在αSMA+富集的簇中，观察到具有T淋巴细胞基因标签(gene signature)(CD3、CD4、CD8)的细胞簇(簇4)、具有巨噬细胞基因标签(CCL5、CCL22)的细胞簇(簇6)和具有胶原/胞外基质(ECM)基因标签(Col1α1、MMP、Lox)的细胞簇(簇1)(图2A)。相比之下，在FAP+富集的簇中，观察到具有B淋巴细胞基因标签(CD79a/b、CD19)的细胞簇(簇5)和具有中性粒细胞样基因标签(NGP、Retnlg)的细胞簇(簇7)(图2A)。αSMA+和FAP+分选的细胞共有的簇呈现出髓样基因表达标签(F4/80、Mac-1、CD11c；图2A)。描述破碎细胞(mtRNA)或红细胞污染物(Hba/Hbb)的簇8和9是较小的簇，并在随后的分析中被忽略(图2A)。在αSMA+和FAP+分选的CAF的限定簇中分别观察到的T和B淋巴细胞基因标签表明与CAF中免疫细胞相关的基因表达。其在细胞簇之间的非随机模式不支持来自基于流式细胞术的αSMA+和FAP+细胞富集的潜在免疫细胞污染物。此外，仅有少数癌细胞具有在FAP+分选的细胞中捕获的EMT程序基因标签。
接下来，限定了αSMA+和FAP+CAF(不包括在αSMA+分选的细胞中捕获的癌细胞)并确定在这些亚群中富集的基因(图2B)。αSMA+CAF富集有与黏着斑、ECM受体相互作用和PI3K-Akt信号传导相关的转录物，而FAP+间充质细胞富集有与免疫和趋化因子信号传导、以及溶酶体和吞噬体活性相关的转录物(图2B)。在αSMA中上调且在FAP中下调的一些示例性基因包括Col3a1、Dcn、Serpinh1、Col1a1、Crlf1、Mgp、Acta2、Fstl1、Myl9、Ctgf、Igfbp5、Sparc、Bgn、Serpinf1、Igfbp7、Cpxm1、Tnc、Col1a2、Loxl1、Rbp1、Sparcl1、Postn、Col5a2、Col6a1、Mfap2、Lum、CCl11、Aebp1、Rarres2、Gm13889、Mylk、Ndufa412、Oaf、Gpx8、Mfap4、Ccdc80、Mmp2、Serping1、Cyr61、Mfap5、Col4a2、Fxyd6、Sfrp1、Rasl11a、Mdk、Cald1、Serpine2、Lox、Snhg18、Cygb、Tagln、Penk、Cdh11、Col8a1、Ppic、Rgs5、Tpm2、Rxyd1、Itm2a和Prkcdbp。在αSMA中下调且在FAP中上调的一些示例性基因包括S100a9、S100a8、Jchain、Ccl3、Ccl6、Wfdc17、Il1b、Rac2、Ctss、Cd52、Retnig、Spi1、Lcp1、C1qc、Ccl4、Tyrobp、Clec4n、Fcgr2b、C1qa、Bcl2a1b、Ms4a6c、Laptm5、C1qb、Plek、Bcl2a1d、Coro1a、Lyz2、H2-Aa、Pf4、Fcer1g、Ptpn18、Ccl8、Arg1、Rgs1、Ccl9、Ccl17、Ccl14、H2-Ab1、Cxcr4、Cd74、Srgn、Apoe、Csf1r、AA467197、Alox5ap、Fcgr3、Cd53、Ccrl2、Acp5、Cxcl2、Ucp2、Rgs10、Tpd52、Lgals3、Tgfbi、Fam49b、Trem2、Lst1、Mafb和Msrb1。这些数据进一步强调了与αSMA+和FAP+CAF相关的转录组是不同的，并且表明了αSMA+CAF在胞外基质重塑中的作用以及FAP+CAF在调节肿瘤免疫应答中的作用。
人PDAC肿瘤的scRNA-Seq分析还揭示了在免疫和上皮簇中的富集，这些簇在患者间的捕获具有异质性(图3)。来自从两名不同患者(PDAC 1和PDAC 2)获得的PDAC肿瘤的单细胞转录组分析显示出在技术重复(PDAC 2A和PDAC 2B)中的相似簇；然而，PDAC 1簇主要由免疫细胞(PTPRC、CD69)组成，而PDAC 2簇富集有上皮细胞(CK19、MUC1、CK18)。当在健康人胰腺的scRNA-Seq分析中捕获活细胞时，仍可检测到αSMA+间充质细胞，但其检测频率低。
实施例3-αSMA+和FAP+CAF在PDAC进展中表现出相反的功能
先前已经报道了用于靶向PDAC GEM中增殖的αSMA+间充质细胞的遗传方法，其中αSMA+CAF的耗竭加速了PDAC进展(Ozdemir et al.，2014)。这些发现和其他发现也强调了PDAC CAF的潜在抗肿瘤功能(Ozdemir et al.，2014；Feig et al.，2013；Kraman et al.，2010；Rhim et al.，2014)。根据这样的报道并在αSMA+和FAP+CAF的不同转录组谱的指导下，生成了具有特异性耗竭αSMA+CAF(αSMA-TK)能力的PKT GEM，以及具有特异性耗竭FAP-TK+CAF能力的PKT GEM。与αSMA+细胞类似，FAP-TK转基因能够在更昔洛韦施用之后特异性耗竭增殖的FAP表达细胞。αSMA+CAF的耗竭导致更具侵袭性的PDAC表型(图4A至B)。当PKP GEM(Ptflacre/+；LSL-KrasG12D/+；Trp53R172H/+)中的αSMA+CAF耗竭时，也观察到类似的表型以及存活降低(图8A至B)。相比之下，FAP+CAF的耗竭导致PDAC表型的抑制(图4A至B，图8C至D)。当与对照小鼠相比时，当在原位植入PDAC肿瘤的背景下FAP+CAF耗竭时，也观察到较低的肿瘤负荷(图8E)。
先前的研究表明FAP靶向与小鼠中恶病质表型的发展有关(Roberts et al.，2013；Tran et al.，2013)。遗传靶向策略(限于活跃增殖的细胞)与体重随时间的减轻不相关，与肌肉萎缩(muscle wasting)也不相关(图9A至B)。在遗传策略的情况下未注意到健康小鼠脾中的FAP+细胞丧失(图9C)。根据从肿瘤来源αSMA+和FAP+CAF获得的表明淋巴细胞和髓样基因标签的scRNA-Seq结果(图2A)，确定了健康小鼠骨髓中αSMA+和FAP+细胞的频率。αSMA+和FAP+细胞是未分级股骨和胫骨骨髓冲洗物中的少量细胞群(小于1.5％)(图9D)。有趣的是，当与健康对照小鼠相比时，在携带PDAC的小鼠中，骨髓中的FAP+细胞频率升高，提高了骨髓作为PDAC肿瘤中FAP+CAF的可能来源(图9E)。
实施例4-αSMA+和FAP+CAF耗竭对PDAC转录组的不同影响
为了破译支持αSMA+和FAP+CAF在PDAC进展中的相反功能的机制，进行了对照、αSMA+细胞耗竭肿瘤和FAP+细胞耗竭肿瘤的全局转录组分析。αSMA+或FAP+CAF耗竭之后共同和非重叠基因的比较分析显示，对于下调和上调基因二者，重叠最小(图4C)。为了确定这样的不同的转录组谱是否与特定的生物学过程相关，评价了由限定基因集的转录水平变化限定的途径的重叠。在αSMA+CAF耗竭肿瘤中，基因表达变化很大程度上与和核糖体活性、溶酶体活性和吞噬活性、趋化因子信号传导、VEGF信号传导以及B和T细胞受体信号传导相关途径的上调相关(717个上调途径，图4D)。有趣的是，这些途径在FAP+CAF耗竭的肿瘤中下调，强调了PDAC中αSMA+和FAP+CAF的相反功能(98个下调途径，图4D)。尽管该评价无法区分与肿瘤中特定细胞类型相关的转录组变化，但注意到当FAP+CAF耗竭时，在肿瘤转录组中，溶酶体活性和吞噬活性以及趋化因子信号传导途径下调(图4D)。在从PDAC肿瘤富集的FAP+CAF的scRNA-Seq分析中也发现了相同途径的富集(图2B)。这些结果表明，在FAP+CAF耗竭肿瘤中的下调途径反映了与通过scRNA-Seq分析观察到的FAP+细胞相关的变化。在FAP+CAF耗竭的肿瘤中的上调途径包括细胞质运输(ARF6)、细胞黏附和ECM降解(图4D)。有趣的是，从PDAC肿瘤中富集的αSMA+细胞的scRNA-Seq分析表明其可能参与ECM-细胞表面受体相互作用和细胞黏附(图2B)。这些数据支持了以下观点：FAP+CAF的耗竭通过炎症减弱(图4A)以及通过与αSMA+CAF相关的抗肿瘤活性的上调(图4A、4C)产生改善的PDAC组织病理学。在耗竭αSMA+CAF或FAP+CAF的肿瘤中共同上调的途径包括缺氧诱导因子-1(hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1)、P53和凋亡途径，并且没有鉴定出共同下调的途径，这支持了对耗竭αSMA+CAF或FAP+CAF的肿瘤的转录组的不同影响(图4C)。
实施例5-αSMA+和FAP+CAF的耗竭以不同方式重塑PDAC肿瘤基质
为了明确PDAC中αSMA+与FAP+CAF的耗竭的影响，在肿瘤中测量了每个CAF亚群(在图1A中限定)的频率的相对变化。当αSMA+CAF耗竭时，总CAF群(如通过该测定捕获的)显著降低(所检查的CAF降低了约48％)，而FAP+CAF的耗竭略微降低了CAF群(约11.2％的降低，图4E)。在αSMA+或FAP+CAF耗竭的二种情况下，CAF亚群的组成显著改变。与当FAP+CAF耗竭时相比，当αSMA+CAF耗竭时这些变化更加明显(图4E)，强调了它们对PDAC肿瘤微环境和进展的不同影响。在所有αSMA+CAF中，αSMA+CAF耗竭主要降低了αSMA+PDGFRα+亚群，而FAP+CAF耗竭增强了αSMA+CAF，但保留了共表达αSMA的CAF的大多数其他亚群的频率(图4E)。此外，αSMA+CAF耗竭还导致了FSP1+细胞(FSP1+细胞以及FSP1+和αSMA+细胞)频率的提高，而FAP+CAF耗竭与Vim+CAF的提高相关，但与PDGFRα+CAF频率(PDGFRα+、PDGFRα+Vim+和PDGFRα+αSMA+)的总体降低相关(图4E)。FAP+CAF的耗竭导致了αSMA+CAF频率的维持，从而可能保留其肿瘤抑制特性(图4A)。αSMA+和FAP+CAF的scRNA-Seq表明，与FAP+簇相比，在αSMA+簇中有复杂的间充质基因表达重叠。这些结果表明，αSMA+簇捕获了更加异质和复杂的CAF群，并且因此，FAP+CAF可构成更像祖细胞的间充质细胞群。这些发现(图4E)，以及PDAC GEM的遗传靶向研究和基因表达谱(图4A至D)，支持了PDAC中αSMA+和FAP+CAF的不同功能，其中αSMA+CAF显示出肿瘤抑制(TS)-CAF功能而FAP+CAF显示出肿瘤促进(TP)-CAF功能。
实施例6-αSMA+CAF来源的IL-6赋予了针对吉西他滨的抗性
来自PDAC肿瘤的αSMA+CAF或FAP+CAF的scRNA-Seq分析强调了其异质性表型，并呈现出不同的转录组谱，让人联想到数种免疫细胞类型，包括髓样和淋巴细胞谱系(图2A)。这些数据，以及与PDAC肿瘤中αSMA+CAF或FAP+CAF耗竭相关的表型变化和转录组变化，支持了αSMA+CAF和FAP+CAF以不同方式调节肿瘤免疫的观点。根据表明了基质IL-6作为免疫细胞极化的关键介质的研究(Lesina et al.，2014)，查询scRNA-Seq数据以限定富含IL-6转录物的CAF亚群。IL-6转录物主要与αSMA+CAF富集簇相关(46％的αSMA+细胞与3％的FAP+细胞对高IL-6转录物水平呈阳性，图5A)。为了研究αSMA+CAF来源的IL-6对PDAC进展的功能贡献，生成了GEM，其中两个不同的基因重组系统(翻转酶或Cre介导的重组酶，表1)独立驱动癌症形成(Pdxl-Flp；FSF-KrasG12D/+；TP53frt/frt；KPPF)以及αSMA+CAF中的条件基因重组(αSMA-Cre；目的floxed基因)(Chen et al.，2018)。KPPF小鼠呈现出与可比较的Cre驱动模型(Pdxl-Cre；LSL-KrasG12D/+；TP53loxP/loxP；KPPC)相似的疾病进展(图10A至B)。通过捕获与PDAC相关的结缔组织生成性反应中的GFP、RFP、YFP和CFP荧光细胞，使KPPF；αSMA-Cre；R26Confetti报道小鼠的αSMA+CAF中的重组可视化(图10C)。使用KPPF；αSMA-Cre；R26Dual报道小鼠(表1)，证实了纯化的tdTomato+成纤维细胞中IL-6转录物的富集，并且注意到与癌细胞相比，αSMA+CAF中的IL-6表达更高(图5B)。此外，KPPF；αSMA-Cre；R26Dual报道小鼠被培育成条件性IL-6基因敲除等位基因(KPPF；IL-6smaKO)，有效地消除了αSMA+CAF中的IL-6转录(图5B)。KPPF小鼠也与系统性IL-6敲除小鼠(KPPF；IL-6-/-)一起培育。当与KPPF对照相比时，疾病进展和PDAC组织学在条件性和系统性IL6敲除小鼠二者中相似(图5C至D，图12A至C)(Wormann et al.，2016)。与KPPF对照肿瘤相比，IL-6水平在KPPF；IL-6smaKO小鼠的肿瘤中显著降低，而在KPPF；IL-6-/-肿瘤中不存在(图5E)。IL-1β转录物水平没有改变(对照，图11A)。在肿瘤和对照器官中通过PCR反应捕获的基因组重组事件也证实了用于确保αSMA+细胞中IL-6条件性缺失的遗传策略的特异性(图11B至D)。有趣的是，约～65％的αSMA-Cre谱系追踪(tdTomato+)CAF与αSMA免疫荧光染色共定位(图11E)。
IL-6的系统性丧失或IL-6的αSMA+细胞特异性丧失不影响KPF小鼠(对于p53丧失是杂合的)中的疾病进展(图13A至C)。与未经处理的KPPF小鼠相比，对缺乏p53(KPPF)的患有PDAC肿瘤的小鼠的吉西他滨处理没有显示出益处，但具有降低的IL-6(抗IL-6中和抗体，αIL-6)或不存在IL-6(IL-6-/-)的小鼠响应于吉西他滨处理，其中总体存活提高(图5D、5F、图14A)。关键的是，IL-6的αSMA+CAF特异性缺失(IL-6smaKO)足以使吉西他滨处理之后的总体存活提高，类似于缺乏全部IL-6(IL-6-/-)的KPPF小鼠(图5F)。这些结果表明，αSMA+CAF来源的IL-6赋予肿瘤针对吉西他滨的抗性。在吉西他滨处理的背景下，IL-6从αSMA+CAF中丧失导致组织病理学改善以及肿瘤负荷降低(图14B至C)。值得注意的是，IL-6转录水平和阳性细胞，以及αSMA转录水平和αSMA+CAF在吉西他滨处理之后升高(图5G，图14D)。用吉西他滨处理的小鼠肿瘤中的癌细胞显示出磷酸化Stat3、ERK1/2和Akt水平升高，并且这些变化随着IL-6从αSMA+CAF中丧失而显著减弱(图5H，图15A)。与对照相比，具有IL-6的αSMA+CAF特异性丧失的小鼠中的吉西他滨处理没有显著影响肿瘤胶原沉积、脉管系统或癌细胞增殖；然而，切割的胱天蛋白酶-3(指示凋亡)在用吉西他滨处理的小鼠中升高，并且在用吉西他滨处理同时具有IL-6的αSMA+CAF特异性丧失的小鼠中进一步升高(图15B)。
实施例7-当结合IL-6抑制和吉西他滨处理时对免疫检查点阻断的机会性应答
该报告中收集的结果表明，当肿瘤遇到用化学治疗剂例如吉西他滨进行的处理时，αSMA+CAF(增强IL-6)启动了自我保护/促存活程序。在这样的情况下，癌细胞可使用αSMA+CAF产生的IL-6来诱导促存活信号，并且还操纵免疫系统来诱导免疫抑制。为了解决该假设，评价了在有和没有吉西他滨治疗的情况下KPPF、KPPF；IL-6-/-和KPPF；IL-6smaKO小鼠的肿瘤、脾和外周血的免疫组成(图16A至C)。与脾和外周血免疫频率相比，瘤内免疫细胞频率主要受到了IL-6丧失的影响(图6A，图17A至C)。吉西他滨处理对IL-6的瘤内T细胞频率影响最小。调节性T细胞(Treg)和效应T细胞(Teff)的数目显著改变，在KPPF；IL-6-/-和KPPF；IL-6smaKO小鼠二者中Teff/Treg比率升高(图6A)。此外，与对照KPPF小鼠相比，在KPPF；IL-6-/-和KPPF；IL-6smaKO小鼠中CD11b+PD-L1+细胞的频率显著降低(图6A)。重要的是，虽然αSMA+CAF来源的IL-6的丧失足以提高Teff/Treg比率并抑制免疫抑制性CD11b+PD-L1+细胞的频率，但这样的肿瘤免疫谱没有转化为小鼠存活的改善(图6B至C)。然而，当与用吉西他滨处理的对照KPPF小鼠相比时，在用吉西他滨处理的KPPF；IL-6-/-和KPPF；IL-6smaKO小鼠中观察到总体存活提高。这样的益处可部分归因于由于IL-6的丧失引起的改善的肿瘤免疫。接下来，在IL-6丧失的背景下测试了免疫检查点阻断的双重抑制(抗CTLA4和抗PD-1；αCP)的治疗性益处。结果表明IL-6丧失与吉西他滨以及抗CTLA4以及抗PD-1治疗的组合产生了显著益处(图6B至C)。这种与IL-6抑制同时进行的组合治疗成为最有效的组合，对提高患有PDAC的小鼠的总体存活具有显著影响(图6B至C)。
在TCGA数据库中报道的胰腺癌转录组分析中评价了肿瘤IL-6。基于中位IL-6表达水平，将患者分为两组；IL-6高(n＝90例)和IL-6低(n＝89例)。有趣的是，IL-6高的组中的肿瘤也显示出高FOXP3 mRNA水平，而GAPDH和ACTA2(αSMA)转录物没有显著改变(图6D)。这些数据支持了以下观点：人PDAC肿瘤中IL-6的转录上调与潜在提高的Treg相关(图6A)。
表1.经遗传改造的小鼠(GEM)命名
Figure BDA0003199771920000781
Figure BDA0003199771920000782
表2.抗体
抗体/应用 来源(目录号，克隆) 稀释
αSMA/IF(冷冻的) DAKO，M0851 1∶200
FAP/IF(冷冻的) Abcam，ab53066 1∶200
αSMA/IHC DAKo，M0851 1∶200
CD31/IHC Abcam，ab28364 1∶300
CK19/IHC Abcam，ab52625 1∶100
切割的胱天蛋白酶-3/IHC Cell Signaling，9661 1∶200
Ki67/IHC Thermo Scientific，RM-9106 1∶400
phospho-Akt/IHC Abcam，Ser473，ab81283 1∶400
phospho-ERK 1/2/IHC Cell Signaling，Thr202/Tyr204.4695 1∶400
phospho-Stat3/IHC Cell Signaling，Tyr705.9145 1∶200
FAP/IHC Abcam，ab28244 1∶50
FAP/IHC(人) R&D，AF3715 1∶20
αSMA/TSA DAKO，M0851 1∶2000
Fsp1/TSA DAKO，A5114 1∶6000
CK8/TSA DSHB，Troma-I 1∶50
波形蛋白/TSA Cell Signaling，CS5741 1∶1000
PDGFRα/TSA R&D，AF1062 1∶200
FAP/FC Abcam，ab28244 1∶100
兔IgG，多克隆/FC Abcam，171870 1∶100
Zenon AF647 IgG标记试剂盒/FC ThermoFisher Scientific，Z25308 1∶100
Fixable Viability Dye eFluor 780/FC eBioscience，65-0865-14 1∶1000
CD45.2Paeifie Blue/FC BioLegend，103126(30-F11) 1∶100
CD3 PE-Cy7/FC eBioscience，25-0031-82-(145-2c11) 1∶200
CD3 Alexa Fluor 700/FC eBioscience，56-0032-82(17A2) 1∶50
FoxP3 Alexa Fluor 700/FC eBioscience，56-5773-82(FJK-16s) 1∶50
CD11e eFluor 615/FC eBioscience，42-0114-82(N418) 1∶50
NK1.1 PE/FC eBioscience，12-5941-83(PK136) 1∶200
CD4 Qdot 605/FC BioLegend，100548(RM4-5) 1∶200
CD8 BV650/FC BioLegend，100742(53-6.7) 1∶200
CD11b BV570/FC BioLegend，BD，562950(M1/70) 1∶200
CD19 Qdot655/FC BioLegend，115541(6D5) 1∶100
Ly6C APC/FC BD Biosciences，560595(AL-21) 1∶200
Ly6G PE-Cy7/FC BD Biosciences，560601(1A8) 1∶200
Ki-67 PE/FC BD Biosciences，558616(B56) 1∶100
IF：对冷冻切片或FFPE进行的免疫荧光，IHC：对FFPE进行的免疫组织化学(FFPE：福尔马林固定石蜡包埋)
FC：流式细胞术
TSA：酪胺信号放大(多光谱成像)
DSHB：爱荷华大学发育研究杂交瘤库(Development Studies Hybridoma Bank，University of Iowa)。
***
根据本公开内容，不需要过度实验就可进行和实施本文中公开和要求保护的所有方法。尽管已经按照一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员明显的是，可对本文中所述方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行改变，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，明显的是，可用某些在化学和生理学两个方面均相关的试剂替代本文中所述的试剂，同时实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这样的类似替代和修改被认为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献就其提供补充本文中所阐述的那些操作或细节的示例性操作或其他细节的程度特别地通过引用并入本文。
Carstens et al.，“Spatial computation of intratumoral T cellscorrelates with survival of patients with pancreatic cancer，”Nat.Commun.，8：15095(2017).
Cerami et al.，“The cBio cancer genomics portal：an open platform forexploring multidimensional cancer genomics data，”CancerDiscov.，2：401-404(2012).
Chen et al.，“Dual reporter genetic mouse models of pancreatic canceridentify an epithelial-to-mesenchymal transition-independent metastasisprogram，”EMBO Mol.Med.，10：e9085(2018).
Feig et al.，“Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreaticcancer，”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，110：20212-20217(2013).
Hingorani et al.，“Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promotechromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductaladenocarcinoma in mice，”Cancer Cell，7：469-483(2005).
Ijichi et al.，“Aggressive pancreatic ductal adenocarcinoma in micecaused by pancreas-specific blockade of tfansforming growth factor-betasignaling in cooperation with active Kras expression，”Genes Dev.，20：3147-3160(2006).
Kalluri，“The biology and function of fibroblasts in cancer，”Nat.Rev.Cancer，16：582-598(2016).
Kamerkar et al.，“Exosomes facilitate therapeutic targeting ofoncogenic KRAS in pancreatic cancer，”Nature，546：498-503(2017).
Kraman et al.，“Suppression of antitumor immunity by stromal cellsexpressing fibroblast activation protein-alpha，”Science，330：827-830(2010).
LeBleu et al.，“Origin and function of myofibroblasts inkidneyfibrosis，”Nat.Med.，19：1047-1053(2013).
LeBleu&Kalluri，“A peek into cancer-associated fibroblasts：origins，functions and translationalimpact，”Dis.Model Mech.，11：dmm029447(2018).
Lee et al.，“Generation of primary tumors with Flp recombinase in FRT-flanked p53 mice，”Dis.ModelMech.，5：397-402(2012).
Lesina et al.，“Interleukin-6 in inflammatory and malignant diseasesof the pancreas，”Semin.Immunol.，26：80-87(2014).
Lo et al.，“Fibroblast activation protein augments progression andmetastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma，”JCI Insight，2：92232(2017).
Meyerholz&Beck，“Principles and approaches for reproducible scoring oftissue stains in research，”Lab.Invest.，98：844-855(2018).
Nagathihalli et al.，“Pancreatic stellate cell secreted IL-6stimulates STAT3 dependent invasiveness of pancreatic intraepithelialneoplasia and cancer cells，”Oncotarget，7：65982-65992(2016).
Neesse et al.，“Stromal biology and therapy in pancreatic cancer：achanging paradigm，”Gut，64：1476-1484(2015).
Ohlund et al.，“Fibroblast heterogeneity in the ccancer wound，”J.Exp.Med.，211：1503-1523(2014).
Ohlund et al.，“Distinct populatiohs of inflammatory fibroblasts andmyofibroblasts in pancreatic cancer，”J.Exp.Med.，214：579-596(2017).
Ozdemir et al.，“DepletioB of carccinoma-assocciated fibroblasts andfibrosis induces immunosuppression and accelerates panccreas cancer withreducced survival，”Cancer Cell，25：719-734(2014).
Quintana et al.，“Astrocyte-specific deficiency of interleukin-6 andits receptor reveal specific roles in survival，body weight and behavior，”Brain，Behavior，and Immunity，27：162-173(2013).
Rhim et al.，“Stromal elements act to restrain，rather than support，panccreatic ducctal adenocarcinoma，”Cancer Cell，25：735-747(2014).
Roberts et al.，“Depletion of stromal cells expressing fibroblastactivation protein-alpha from skeletal muscle and bone marrow results incachexia and anemia，”J.Exp.Med.，210：1137-1151(2013).
Schonhuber et al.，“A next-generation dual-recombinase system fortime-and host-specific targeting of pancreatic cancer，”Nat.Med.，20：1340-1347(2014).
Smyth，“limma：Linear Models for Microarray Data，”In：Gentleman R.，CareyV.J.，Huber W.，Irizarry R.A.，Dudoit S.(eds)，Bioinformatics and ComputationalBiology Solutions Using R and Bioconductor，Statistics for Biology and Health，Springer，New York，NY(2005).
Subramanian et al.，“Gene set enrichment analysis：a knowledge-basedapproach for interpreting genome-wide expression profiles，”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，102：15545-15550(2005).
Tran et al.，“Immune targeting of fibroblast activation proteintriggers recognition of multipotent bone marrow stromal cells and cachexia，”J.Exp.Med.，210：1125-1135(2013).
Wormann et al.，“Loss of P53 Function Activates JAK2-STAT3 Signalingto Promote Pancreatic Tumor Growth，Stroma Modification，and GemcitabineResistance in Mice and Is Associated With Patient Survival，”Gastroenterology，151：180-193.e12(2016).
Yang et al.，“FAP Promotes Immunosuppression by Cancer-AssociatedFibroblasts in the Tumor Microenvironment via STAT3-CCL2 Signaling，”CancerRes.，76：4124-4135(2016).
Zheng et al.，“Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable formetastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer，”Nature，527：525-530(2015).
序列表
<110> Board of Regents, The University of Texas System
<120> 用于诊断和治疗癌症及其他疾病的对促肿瘤癌症相关成纤维细胞的识别和靶向
<130> UTFC.P1429WO
<140> 未知
<141> 2019-12-06
<150> US 62/777,101
<151> 2018-12-08
<160> 8
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 1
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
gcttaattac acatgttctc tgggaaa 27
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
caagtgcatc atcgttgttc atac 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 5
gggctgcttc caaacctttg 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
tgatactgcc tgcctgaagc tc 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
gtcccagaca tcagggagta a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 8
tcggatactt cagcgtcagg a 21

Claims (54)

1.治疗患有疾病的对象的方法，所述方法包括施用抗肿瘤有效量的组合物，所述组合物包含抑制IL-6信号传导的药剂、吉西他滨和免疫检查点阻断治疗。
2.权利要求1所述的方法，其中所述疾病是癌症。
3.权利要求2所述的方法，其中所述癌症先前未能响应于免疫检查点阻断治疗。
4.权利要求1所述的方法，其还包括施用有效量的与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的抗体或抗体片段或嵌合抗原受体，或施用抗肿瘤有效量的表达CAR多肽的嵌合抗原受体(CAR)T细胞，所述CAR多肽从N端到C端包含抗原结合结构域；铰链结构域；跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述CAR多肽与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合。
5.权利要求2所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
6.权利要求5所述的方法，其还被限定为抑制胰腺癌转移的方法。
7.权利要求5所述的方法，其还被限定为抑制胰腺癌生长的方法。
8.权利要求1所述的方法，其还包括施用至少第二抗癌治疗。
9.权利要求8所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。
10.组合物，其包含与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的抗体或抗体片段或嵌合抗原受体。
11.权利要求10所述的组合物，其中所述抗体片段是重组scFv(单链可变片段)抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或Fv片段。
12.权利要求10所述的组合物，其中所述抗体是嵌合抗体或是双特异性抗体。
13.权利要求12所述的组合物，其中所述嵌合抗体是人源化抗体。
14.权利要求12所述的组合物，其中所述双特异性抗体与(1)TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质和(2)CD3二者结合。
15.权利要求10至14中任一项所述的组合物，其中所述抗体或抗体片段与细胞毒性剂缀合。
16.权利要求10至14中任一项所述的组合物，其中所述抗体或抗体片段与诊断剂缀合。
17.杂交瘤或经改造细胞，其编码权利要求10至16中任一项所述的抗体或抗体片段。
18.药物制剂，其包含一种或更多种权利要求10至16中任一项所述的抗体或抗体片段或嵌合抗原受体。
19.治疗有此需要的患者的方法，所述方法包括施用有效量的与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的抗体或抗体片段或嵌合抗原受体。
20.权利要求19所述的方法，其中与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的所述抗体或抗体片段或嵌合抗原受体是权利要求10至16中任一项所述的抗体或抗体片段或嵌合抗原受体。
21.权利要求19所述的方法，其中所述患者患有癌症。
22.权利要求21所述的方法，其中所述癌症患者已被确定为包含FAP+CAF。
23.权利要求21所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
24.权利要求23所述的方法，其还被限定为抑制胰腺癌转移的方法。
25.权利要求23所述的方法，其还被限定为抑制胰腺癌生长的方法。
26.权利要求19所述的方法，其还包括施用至少第二抗癌治疗。
27.权利要求26所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。
28.嵌合抗原受体(CAR)多肽，其从N端到C端包含抗原结合结构域；铰链结构域；跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述CAR多肽与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合。
29.权利要求28所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含来自与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的第一抗体的HCDR序列和来自与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的第二抗体的LCDR序列。
30.权利要求28所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含来自与TP-CAF表达而TS-CAF不表达的蛋白质结合的抗体的HCDR序列和LCDR序列。
31.权利要求28所述的多肽，其中所述铰链结构域是CD8a铰链结构域或IgG4铰链结构域。
32.权利要求28所述的多肽，其中所述跨膜结构域是CD8a跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
33.权利要求28所述的多肽，其中所述胞内信号传导结构域包含CD3z胞内信号传导结构域。
34.核酸分子，其编码权利要求28至33中任一项所述的CAR多肽。
35.权利要求34所述的核酸分子，其中编码所述CAR多肽的序列与表达控制序列有效连接。
36.分离的免疫效应细胞，其包含根据权利要求28至33中任一项所述的CAR多肽或权利要求35所述的核酸。
37.权利要求36所述的细胞，其中将所述核酸整合到所述细胞的基因组中。
38.权利要求36所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
39.权利要求36所述的细胞，其中所述细胞是NK细胞。
40.权利要求36所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
41.药物组合物，其包含在可药用载体中的根据权利要求36所述的细胞群。
42.治疗对象的方法，其包括施用抗肿瘤有效量的表达根据权利要求28至33中任一项所述的CAR多肽的嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
43.权利要求42所述的方法，其中所述CAR T细胞是同种异体细胞。
44.权利要求42所述的方法，其中所述CAR T细胞是自体细胞。
45.权利要求42所述的方法，其中所述CAR T细胞与所述对象HLA匹配。
46.权利要求42所述的方法，其中所述对象患有癌症。
47.权利要求46所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
48.治疗对象的方法，其包括施用抗肿瘤有效量的表达根据权利要求28至33中任一项所述的CAR多肽的嵌合抗原受体(CAR)NK细胞。
49.权利要求48所述的方法，其中所述CAR NK细胞是同种异体细胞。
50.权利要求48所述的方法，其中所述CAR NK细胞是自体细胞。
51.权利要求48所述的方法，其中所述CAR NK细胞与所述对象HLA匹配。
52.权利要求48所述的方法，其中所述对象患有癌症。
53.权利要求52所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
54.诊断患者患有疾病的方法，所述方法包括使从对象获得的癌组织与权利要求10至16中任一项所述的抗体或抗体片段接触，并检测所述抗体或抗体片段与所述组织的结合，其中如果所述抗体或抗体片段与所述组织结合，则所述患者被诊断为患有癌症。
CN201980091486.5A 2018-12-08 2019-12-06 用于诊断和治疗癌症及其他疾病的对促肿瘤癌症相关成纤维细胞的识别和靶向 Pending CN113412130A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862777101P 2018-12-08 2018-12-08
US62/777,101 2018-12-08
PCT/US2019/065008 WO2020118216A1 (en) 2018-12-08 2019-12-06 Identification and targeting of tumor promoting carcinoma associated fibroblasts for diagnosis and treatment of cancer and other diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113412130A true CN113412130A (zh) 2021-09-17

Family

ID=70973537

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980091486.5A Pending CN113412130A (zh) 2018-12-08 2019-12-06 用于诊断和治疗癌症及其他疾病的对促肿瘤癌症相关成纤维细胞的识别和靶向

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220144938A1 (zh)
EP (1) EP3890802A4 (zh)
JP (1) JP2022511096A (zh)
KR (1) KR20210102331A (zh)
CN (1) CN113412130A (zh)
AU (1) AU2019392915A1 (zh)
CA (1) CA3121933A1 (zh)
WO (1) WO2020118216A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114533884A (zh) * 2022-04-20 2022-05-27 澳门大学 一种联合治疗癌症的药物及s100a9-cxcl12信号抑制剂的应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023049909A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Synergy Imt, Inc. Composition of recombinant antigen binding molecules and method of making and using thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017040686A1 (en) * 2015-09-01 2017-03-09 University Of Miami Identification of circulating cancer associated fibroblasts
WO2018013918A2 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI786044B (zh) * 2016-05-13 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 藉由投予ｐｄ-１抑制劑治療皮膚癌之方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017040686A1 (en) * 2015-09-01 2017-03-09 University Of Miami Identification of circulating cancer associated fibroblasts
WO2018013918A2 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAI-BO XING 等，: "Suppression of IL-6 Gene by shRNA Augments Gemcitabine Chemosensitization in Pancreatic Adenocarcinoma Cells", 《BIOMED RESEARCH INTERNATIONAL》, vol. 2018, pages 1 - 10, XP055957238, DOI: 10.1155/2018/3195025 *
KAKARLA S等，: "Antitumor Effects of Chimeric Receptor Engineered Human T Cells Directed to Tumor Stroma", 《MOLECULAR THERAPY》, vol. 21, no. 8, pages 1611 - 1620, XP055324842, DOI: 10.1038/mt.2013.110 *
MACE TA 等，: "IL-6 and PD-L1 antibody blockade combination therapy reduces tumour progression in murine models of pancreatic cancer", 《GUT》, vol. 57, no. 2, pages 320 - 332, XP055596424, DOI: 10.1136/gutjnl-2016-311585 *
石远凯主编: "《2014中国肿瘤内科进展 中国肿瘤医师教育》", 30 June 2014, 中国协和医科大学出版社, pages: 35 - 36 *
章晓联著: "《免疫学及实验技术新进展》", 30 June 2018, 中华医学电子音像出版社, pages: 245 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114533884A (zh) * 2022-04-20 2022-05-27 澳门大学 一种联合治疗癌症的药物及s100a9-cxcl12信号抑制剂的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022511096A (ja) 2022-01-28
EP3890802A1 (en) 2021-10-13
US20220144938A1 (en) 2022-05-12
CA3121933A1 (en) 2020-06-11
KR20210102331A (ko) 2021-08-19
AU2019392915A1 (en) 2021-07-15
WO2020118216A1 (en) 2020-06-11
EP3890802A4 (en) 2023-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2765410C2 (ru) Способы лечения рака, включающие связывающие tigit агенты
US20140294765A1 (en) Lsr antibodies, and uses thereof for treatment of cancer
US20230139944A1 (en) Targeting alpha3beta1 integrin for treatment of cancer and other diseases
CN113412130A (zh) 用于诊断和治疗癌症及其他疾病的对促肿瘤癌症相关成纤维细胞的识别和靶向
US20230014398A1 (en) Anti-b7-h3 monoclonal antibody and methods of use thereof
US20220389106A1 (en) Anti-epha10 antibodies and methods of use thereof
CN113747917A (zh) 针对MHC结合的人Dickkopf-1肽的单克隆抗体及其应用
KR20220042128A (ko) 골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-cd53 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도
TW202110891A (zh) 抗psgl-1組合物及其用於調節骨髓細胞發炎表型之方法及用途
US20220144926A1 (en) Identification and targeting of pathogenic extracellular matrix for diagnosis and treatment of cancer and other diseases
US20230128075A1 (en) Monoclonal antibodies targeting hsp70 and therapeutic uses thereof
US20230040928A1 (en) Antibodies having specificity to her4 and uses thereof
CN115698070A (zh) Cd5l结合抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination