CN113365663A - 单链嵌合多肽和其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了单链嵌合多肽，其包括：(i)第一靶标结合域；(ii)可溶性组织因子域；和(iii)第二靶标结合域。本文还提供了使用这些单链嵌合多肽的方法和编码这些单链嵌合多肽的核酸。

Description

单链嵌合多肽和其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求以下美国专利申请的优先权：2018年8月30日提交的美国专利申请序列号62/725,038、2019年3月12日提交的美国专利申请序列号62/817,244；2018年10月17日提交的美国专利申请序列号62/746,832；2018年10月23日提交的美国专利申请序列号62/749,506；2019年3月12日提交的美国专利申请序列号62/817,241；2019年3月11日提交的美国专利申请序列号62/816,683；以及2019年7月31日提交的美国专利申请序列号62/881,039；它们各自通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及生物技术领域，更具体地说，涉及抗原结合分子。
背景技术
组织因子(TF)是263个氨基酸的整体膜糖蛋白，分子量约为46kDa，是外在凝血路径的触发蛋白，是体内凝血的主要引发剂。通常不与循环血液接触的组织因子在暴露于循环凝血丝氨酸蛋白酶因子后引发凝血级联反应。血管损伤暴露了表达组织因子的内皮下细胞，从而引起与预先存在的血浆因子VIIa(FVIIa)形成钙依赖性高亲和力复合物。丝氨酸蛋白酶FVIIa结合到组织因子促进了FX快速裂解为FXa和FIX快速裂解为FIXa。所得FXa和活性膜表面的蛋白水解活性于是无法有效地将少量凝血酶原转化为凝血酶。Fxa产生的凝血酶引发血小板活化，并且将微量的原辅因子：因子V(FV)和因子VIII(FVIII)活化成为活性辅因子：因子Va(FVa)和因子VIIIa(FVIIIa)。FIXa与FVIIIa在血小板表面上复合，形成内在液化酶(tenase)复合物，从而引起FXa快速产生。FXa与FVa复合，在活化的血小板表面上形成凝血酶原酶复合物，其引起凝血酶原快速裂解为凝血酶。
除了组织因子-FVIIa复合物外，最近的研究表明，组织因子-FVIIa-FXa复合物也能够活化FVIII，从而在初始阶段提供额外水平的FVIIIa。外在路径首要之处在于通过有限量的凝血酶的活化来引发凝血，而内在路径通过显著扩增初始信号来维持凝血。
细胞表面表达的许多组织因子被“加密”，为了完全参与凝血，必须被“解密”。目前，细胞表面组织因子“解密”的机制尚不清楚，但是，阴离子磷脂的暴露在此过程中起着重要作用。健康细胞会主动将阴离子磷脂(例如磷脂酰丝氨酸(PS))隔离到质膜的内部小叶上。在细胞损伤、活化或胞质Ca2+水平增加之后，这种双层不对称性消失，导致外部小叶上PS暴露增加，从而增加了细胞表面组织因子-FVIIa复合物的比活性。已知PS暴露会降低组织因子-FVIIa复合物活化FIX和FX的表观Km，但其它机制可能包括组织因子或组织因子-FVIIa的构象重排以及随后的底物结合位点暴露。
发明内容
本发明基于以下发现：可溶性组织因子可以用作包括抗原结合域的嵌合多肽的支架。基于此发现，本文提供了单链嵌合多肽，其包括：(i)第一靶标结合域；(ii)可溶性组织因子域；和(iii)第二靶标结合域。本文还提供了组合物，其包括本文所述的任一种单链嵌合多肽、编码本文所述的任一种单链嵌合多肽的核酸，以及细胞，所述细胞包括编码本文所述的任一种单链嵌合多肽的任一种核酸。本文还提供了刺激免疫细胞的方法和治疗有需要的受试者(包括使用本文所述的任一种单链嵌合多肽)的方法。本文还提供了产生本文所述的任一种单链嵌合多肽的方法。本文描述了任一种单链嵌合多肽的其它用途。
因此，本文提供了单链嵌合多肽，其包含：
(i)第一靶标结合域；
(ii)可溶性组织因子域；和
(iii)第二靶标结合域。在一些实施例中，第一靶标结合域和可溶性组织因子域彼此直接邻接。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于第一靶标结合域与可溶性组织因子域之间的接头序列。在一些实施例中，可溶性组织因子域与第二靶标结合域彼此直接邻接。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含在可溶性组织因子域和第二靶标结合域之间的接头序列。在一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域彼此直接邻接。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于第一靶标结合域和第二靶标结合域之间的接头序列。在一些实施例中，第二靶标结合域和可溶性组织因子域彼此直接邻接。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于第二靶标结合域和可溶性组织因子域之间的接头序列。在一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域包含相同的氨基酸序列。在一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域特异性结合到不同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域中的一个或两个都是抗原结合域。在一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域各自是抗原结合域。在一些实施例中，抗原结合域包含scFv或单域抗体。在一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域中的一个或两个都结合到选自由以下组成的群组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26a、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、a UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体，及CD28的受体。在一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域中的一个或两个是可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白。在一些实施例中，可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白选自由以下组成的群组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF、FLT3L、MICA、MICB和ULP16结合蛋白。在一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域中的一个或两个是可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体。在一些实施例中，可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155或可溶性CD28。在一些实施例中，可溶性组织因子域是人可溶性组织因子域。在一些实施例中，人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:9至少80％一致的序列。在一些实施例中，人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:9至少90％一致的序列。在一些实施例中，人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:9至少95％一致的序列。在一些实施例中，人可溶性组织因子域的单链嵌合多肽不包含以下中的一个或多个：位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置20对应的氨基酸位置的赖氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置22对应的氨基酸位置的异亮氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置45对应的氨基酸位置的色氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置58对应的氨基酸位置的天冬氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置94对应的氨基酸位置的酪氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置135对应的氨基酸位置的精氨酸；以及位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置140对应的氨基酸位置的苯丙氨酸。在一些实施例中，人可溶性组织因子域不包含以下中的任一个：位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置20对应的氨基酸位置的赖氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置22对应的氨基酸位置的异亮氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置45对应的氨基酸位置的色氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置58对应的氨基酸位置的天冬氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置94对应的氨基酸位置的酪氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置135对应的氨基酸位置的精氨酸；以及位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置140对应的氨基酸位置的苯丙氨酸。在一些实施例中，可溶性组织因子域不能结合因子VIIa。在一些实施例中，可溶性组织因子域不将非活性因子X转化为因子Xa。在一些实施例中，单链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的凝血。在一些实施例中，单链嵌合多肽在其N端和/或C端进一步包含一个或多个其它靶标结合域。在一些实施例中，单链嵌合多肽在其N端包含一个或多个其它靶标结合域。在一些实施例中，一个或多个其它靶标结合域直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于至少一个其它靶标结合域之一与第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽在其C端包含一个或多个其它靶标结合域。在一些实施例中，一个或多个其它靶标结合域之一直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于至少一个其它靶标结合域之一与第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽在其N端和C端包含一个或多个其它靶标结合域。在一些实施例中，位于N端的一个或多个其它抗原结合域之一直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于N端的一个或多个其它抗原结合域之一与第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。在一些实施例中，C端的一个或多个其它抗原结合域之一直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于C端的一个或多个其它抗原结合域之一与第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域中的两个或更多个特异性地结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域中的两个或更多个特异性地结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域中的两个或更多个包含相同的氨基酸序列。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域各自特异性地结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域各自特异性地结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域各自包含相同的氨基酸序列。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域特异性结合到不同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个靶标结合域中的一个或多个是抗原结合域。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域各自是抗原结合域。在一些实施例中，抗原结合域包含scFv或单域抗体。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个靶标结合域中的一个或多个特异性地结合到选自由以下组成的群组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26a、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-D的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体，及CD28的受体。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子蛋白。在一些实施例中，可溶性白介素或细胞因子蛋白选自由以下组成的群组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF、FLT3L、MICA、MICB，和ULP16结合蛋白。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子受体。在一些实施例中，可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155、可溶性CD122、可溶性CD3，或可溶性CD28。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含位于其N末端的信号序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含位于单链嵌合多肽的N末端或C末端的肽标签。
本文还提供了包含上述任一种单链嵌合多肽的组合物。在一些实施例中，所述组合物是医药组合物。在一些实施例中，单链嵌合多肽在试剂盒内包含至少一剂组合物。
本文还提供了一种刺激免疫细胞的方法，所述方法包括：使免疫细胞与有效量的上述任一种单链嵌合多肽或组合物接触。在一些实施例中，所述方法包括体外接触免疫。在一些实施例中，所述方法包括从受试者获得免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。在一些实施例中，所述方法包括体内接触免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的群组：未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、记忆T细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀手细胞。在一些实施例中，免疫细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。在一些实施例中，所述方法进一步包括在接触步骤之后将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括将免疫细胞施用于有需要的受试者。在一些实施例中，所述方法包括鉴定或诊断受试者是否患有与年龄有关的疾病或病状。在一些实施例中，与年龄相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。在一些实施例中，所述方法包括鉴定或诊断受试者是否患有癌症。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施例中，所述方法包括诊断或鉴定受试者是否患有感染性疾病。在一些实施例中，感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
本文还提供了诱导或增加免疫细胞增殖的方法，所述方法包括：使免疫细胞与有效量的本文讨论的任一种单链嵌合多肽或组合物接触。在一些实施例中，所述方法包括体外接触免疫细胞。在一些实施例中，所述方法包括从受试者获得免疫细胞。在一些实施例中，所述进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。在一些实施例中，所述方法包括体内接触免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的群组：未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、记忆T细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀手细胞。在一些实施例中，免疫细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。在一些实施例中，所述方法进一步包括在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括将免疫细胞施用于有需要的受试者。在一些实施例中，所述方法包括鉴定或诊断受试者是否患有与年龄有关的疾病或病状。在一些实施例中，与年龄相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。在一些实施例中，所述方法包括鉴定或诊断受试者是否患有癌症。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施例中，所述方法包括诊断或鉴定受试者是否患有感染性疾病。在一些实施例中，感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
本文还提供了诱导免疫细胞分化成记忆或记忆样免疫细胞的方法，所述方法包括：使免疫细胞与有效量的上述任一种单链嵌合多肽或组合物接触。在一些实施例中，所述方法包括体外接触免疫细胞。在一些实施例中，所述方法包括从受试者获得免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。在一些实施例中，所述方法包括体内接触免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞选自由以下组成的群组：未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、记忆T细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀手细胞。在一些实施例中，所述方法包括基因修饰免疫细胞以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。在一些实施例中，所述方法进一步包括在接触步骤之后将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括将免疫细胞施用于有需要的受试者。在一些实施例中，所述方法包括鉴定或诊断受试者是否患有与年龄有关的疾病或病状。在一些实施例中，与年龄相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease)、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。在一些实施例中，所述方法包括鉴定或诊断受试者是否患有癌症。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施例中，所述方法包括诊断或鉴定受试者是否患有感染性疾病。在一些实施例中，感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
本文还提供了一种在有需要的受试者中杀死癌细胞、被感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的上述任一种单链嵌合多肽或组合物。在一些实施例中，所述方法包括鉴定或诊断受试者是否患有癌症。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施例中，所述方法鉴定或诊断受试者是否患有衰老相关的疾病或病状。在一些实施例中，与衰老相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
本文还提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的上述任一种单链嵌合多肽或组合物。在一些实施例中，所述方法包括鉴定或诊断受试者是否患有癌症。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施例中，所述方法包括鉴定或诊断受试者是否患有衰老相关的疾病或病状。在一些实施例中，与衰老相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。在一些实施例中，所述方法包括诊断或鉴定受试者是否患有感染性疾病。在一些实施例中，感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
本文还提供了编码上述任一种单链嵌合多肽的核酸。一些实施例包括包含上述核酸的载体。在一些实施例中，载体是表达载体。一些实施例包括包含上述核酸或载体的细胞。
本文还提供了产生单链嵌合多肽的方法，所述方法包括：在足以引起单链嵌合多肽产生的条件下、在培养基中培养细胞；和从细胞和/或培养基中回收单链嵌合多肽。一些实施例包含根据上文所述产生的单链嵌合多肽。在本文提供的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，人可溶性组织因子域不引发血液凝结。在本文提供的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子域包含人可溶性野生型组织因子或由人可溶性野生型组织因子组成。
在一些实施例中，突变型人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96至少80％一致的序列。在一些实施例中，人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96至少90％一致的序列。在一些实施例中，人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96至少95％一致的序列。在一些实施例中，人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96至少100％一致的序列。在一些实施例中，人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97至少80％一致的序列。在一些实施例中，人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97至少90％一致的序列。在一些实施例中，人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97至少95％一致的序列。在一些实施例中，人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97至少100％一致的序列。
如本文所用，术语“嵌合”是指多肽包括最初来源于两个不同来源(例如两种天然存在的不同蛋白质，例如来自相同或不同物种)的氨基酸序列(例如结构域)。举例而言，嵌合多肽可以包括来自至少两种天然存在的不同人蛋白质的结构域。在一些实例中，嵌合多肽可包括作为合成序列(例如scFv)的结构域和来源于天然存在的蛋白质(例如天然存在的人蛋白质)的结构域。在一些实施例中，嵌合多肽可以包括至少两个不同的作为合成序列(例如两个不同scFv)的结构域。
“抗原结合域”是能够特异性结合到一种或多种不同抗原的一个或多个蛋白质结构域(例如，由来自单一多肽的氨基酸形成或由来自两种或更多种多肽(例如相同或不同的多肽)的氨基酸形成)。在一些实例中，抗原结合域能够以与天然存在的抗体相似的特异性和亲和力结合到抗原或表位。在一些实施例中，抗原结合域可以是抗体或其片段。在一些实施例中，抗原结合域可包括替代支架。抗原结合域的非限制性实例在本文中描述。抗原结合域的其它实例是本领域已知的。
“可溶性组织因子域”是指与缺少跨膜域和胞内域的野生型哺乳动物组织因子蛋白(例如野生型人组织因子蛋白)的区段具有至少70％一致性((例如至少75％一致性、至少80％一致性、至少85％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或100％一致性)的多肽。本文描述了可溶性组织因子域的非限制性实例。
术语“可溶性白介素蛋白”在本文中用于指成熟并且分泌的白介素蛋白或其生物活性片段。在一些实例中，可溶性白介素蛋白可包括与成熟和分泌的哺乳动物野生型白介素蛋白(例如人野生型白介素蛋白)至少70％一致、至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致并且保持其生物活性的序列。可溶性白介素蛋白的非限制性实例在本文中描述。
术语“可溶性细胞因子蛋白”在本文中用于指成熟和分泌的细胞因子蛋白或其生物活性片段。在一些实例中，可溶性细胞因子蛋白可包括与成熟和分泌的哺乳动物野生型白介素蛋白(例如人野生型白介素蛋白)至少70％一致、至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致并且保持其生物活性的序列。可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例在本文中描述。
术语“可溶性白介素受体”在本文中以最广泛的意义使用，是指一种多肽，其缺乏能够结合一个或多个其天然配体(例如，在生理条件下，例如在室温下、在磷酸盐缓冲盐水中)的跨膜域(和任选的胞内域)。举例来说，可溶性白介素受体可包括与野生型白介素受体的胞外域至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)并且保持其特异性结合到一个或多个其天然配体的能力、但缺少其跨膜域(并且任选地，还缺少其胞内域)的序列。本文描述了可溶性白介素受体的非限制性实例。
术语“可溶性细胞因子受体”在本文中以最广泛的意义使用，是指一种多肽，其缺乏能够结合一个或多个其天然配体(例如在生理条件下，例如在室温下、在磷酸盐缓冲液中)的跨膜域(和任选的胞内域)。举例来说，可溶性细胞因子受体可包括与野生型细胞因子受体的胞外域至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)并且保持其特异性结合到一个或多个其天然配体的能力、但缺少其跨膜域(并且任选地，还缺少其胞内域)的序列。本文描述了可溶性细胞因子受体的非限制性实例。
术语“抗体”在本文中以其最广泛的意义使用，并且包括某些类型的免疫球蛋白分子，其包括一个或多个特异性结合到抗原或表位的抗原结合域。抗体具体包括例如完整抗体(例如完整免疫球蛋白)、抗体片段和多特异性抗体。抗原结合域的一个实例是由VH-VL二聚体形成的抗原结合域。本文描述了抗体的其它实例。抗体的其它实例是本领域已知的。
“亲和力”是指抗原结合位点与其结合伴侣(例如抗原或表位)之间的非共价相互作用力的总和。除非另有说明，否则如本文所用，“亲和力”是指固有结合亲和力，其反映了抗原结合域的成员与抗原或表位之间的1：1相互作用。分子X对其伴侣Y的亲和力可以用解离平衡常数(KD)表示。对解离平衡常数有贡献的动力学组分在下文中更详细地描述。亲和力可以通过本领域已知的常规方法来测量，包括本文所述的方法。亲和力可例如使用表面等离子体共振(SPR)技术(例如
Figure BDA0003044956670000121
)或生物层干涉测量法(例如
Figure BDA0003044956670000122
)来测定。测定对抗原结合域和其相应抗原或表位的亲和力的其它方法是本领域已知的。
如本文所用，“单链多肽”是指单条蛋白质链。
术语“一对亲和结构域”是以小于1×10-7M(例如小于1×10-8M、小于1×10-9M、小于1×10-10M或小于1×10-11M)的KD彼此特异性结合的两个不同的蛋白质结构域。在一些实例中，一对亲和结构域可以是一对天然存在的蛋白质。在一些实施例中，一对亲和结构域可以是一对合成蛋白。亲和结构域对的非限制性实例在本文中描述。
术语“表位”是指特异性结合到抗原结合域的抗原的一部分。表位可以例如由表面可及的氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，对前者的结合可能会消失，而对后者的结合则不会消失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基。鉴别与抗原结合域结合的表位的方法是本领域已知的。
“免疫效应细胞”是指哺乳动物的免疫系统的细胞，其能够直接或间接地识别哺乳动物中的病原性细胞(例如，癌细胞)和/或引起所述细胞的细胞停滞或细胞死亡。免疫效应细胞的非限制性实例包括巨噬细胞、T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞和T辅助细胞)、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。免疫效应细胞的另外实例是本领域已知的。
术语“治疗”是指改善病症的至少一种症状。在一些实例中，所治疗的病症是癌症，并且改善癌症的至少一种症状包括减少异常增殖、基因表达、信号传导、翻译和/或因子的分泌。一般来说，治疗方法包括向需要或已确定为需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物减少病症的至少一种症状。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文描述用于本发明的方法和材料；还可使用其它在本领域已知的合适的方法和材料。材料、方法和实例仅具说明性，而非旨在限制性。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献通过引用以其整体并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包括定义)为准。
本发明的其它特征和优点将通过以下详细描述和附图以及通过权利要求变得显而易见。
附图说明
图1是示例性αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽的示意图。
图2是色谱，其显示了示例性αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽从抗组织因子抗体亲和柱中的洗脱。
图3是色谱，其显示了负载有示例性αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽的Superdex 200 Increase 10/300GL凝胶过滤柱的洗脱。
图4是使用抗组织因子抗体亲和柱纯化的示例性αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(4-12％NuPage Bis-Tris凝胶)电泳图。
图5是显示了使用实例1所述方法执行的ELISA定量示例性αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽的曲线图。纯化的组织因子用作对照。
图6是显示了示例性αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽刺激从两位供者的血液分离出的CD4+ T细胞表达CD25的能力的曲线图。如实例2所述进行实验。
图7是显示了示例性αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽刺激从两位供者的血液分离出的CD8+ T细胞表达CD25的能力的曲线图。如实例2所述进行实验。
图8是显示了示例性αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽刺激从两位供者的血液分离出的CD4+ T细胞表达CD69的能力的曲线图。如实例2所述进行实验。
图9是示例性IL-2/TF/IL-2单链嵌合多肽的示意图。
图10显示了使用32Dβ细胞增殖分析测得的IL-2/TF IL-2中的IL-2活性与重组IL-2的比较。
图11显示了使用CTLL-2细胞增殖分析测得的IL-2/TF/IL-2中的IL-2活性与重组IL-2的比较。
图12显示了喂食标准食物或高脂肪饮食且经PBS对照物(未处理)或IL-2/TF/IL-2处理的ApoE-/-小鼠的空腹血糖水平。
图13显示了喂食标准食物或高脂肪饮食且经PBS对照物(未处理)或经IL-2/TF/IL-2处理的ApoE-/-小鼠的血液淋巴细胞中的CD4+CD25+FoxP3+ T调控细胞比率。
图14是曲线图，其显示了在抗TF抗体树脂上结合和洗脱后，含有IL-2/TF/IL-2蛋白的细胞培养上清液的色谱特征。
图15显示了IL-2/TF/IL-2的分析型SEC特征。
图16A和16B显示了IL-2/TF/IL-2在脱糖基化之前和之后的还原型SDS-PAGE分析。图16A显示了IL-2/TF/IL-2在脱糖基化之前的还原型SDS-PAGE分析。图16B显示了IL-2/TF/IL-2在脱糖基化之后的还原型SDS-PAGE分析。
图式17A和17B显示了使用IL-2/TF/IL-2对C57BL/6小鼠进行免疫刺激的结果。图17A显示了IL-2/TF/IL-2处理之后的脾脏重量。图17B显示了IL-2/TF/IL-2处理之后的免疫细胞类型的百分比。
图18显示了经IL-2/TF/IL-2处理的小鼠中的CD4+ T细胞的CD25表达上调。
图19显示了IL-2/TF/IL-2在C57BL/6小鼠中的药物动力学。
图20A和20B显示了IL-2/TF/IL-2在减轻ApoE-/-小鼠中高脂肪诱导的动脉粥样硬化斑形成方面的作用。图20A显示了喂食标准食物或高脂肪饮食且经PBS对照物或IL-2/TF/IL-2处理的ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑的代表性视图。图20B显示了每组的动脉粥样硬化斑的定量分析结果。
图21显示了与对照物处理的小鼠相比，IL-2/TF/IL-2处理的小鼠的空腹葡萄糖水平。
图22显示了经IL-2/TF/IL-2处理的小鼠和对照物处理的小鼠的血淋巴细胞中的CD4+CD25+FoxP3+Tregs百分比。
图23是示例性IL-15/TF/IL-15单链嵌合多肽的示意图。
图24显示了通过32Dβ细胞增殖分析测得的IL-15/TF/IL-15中的IL-15活性与重组IL-15的比较。
图25是曲线图，其显示了在抗TF抗体树脂上结合和洗脱后，含有IL-15/TF/IL-15蛋白的细胞培养上清液的色谱特征。
图26A和26B显示了IL-15/TF/IL-15在脱糖基化之前和之后的还原型SDS-PAGE分析。图26A显示了IL-15/TF/IL-15在脱糖基化之前的还原型SDS-PAGE分析。图26B显示了IL-15/TF/IL-15在脱糖基化之后的还原型SDS-PAGE分析。
图27A-27C是一组图，其显示了C57BL/6小鼠在2t2处理之后的免疫刺激。
图28A-28C是一组图，其显示了喂食西方饮食且经2t2处理的ApoE-/-小鼠中的Tregs、NK细胞和CD8+ T细胞的体内刺激。
图29A和29B是一组图，其显示了2t2在C57BL/6小鼠中诱导脾细胞增殖。
图30A和30B是一组图，其显示了喂食西方饮食且经2t2处理的ApoE-/-小鼠中的NK细胞和CD8+ T细胞的体内诱导增殖。
图31A-31C是一组图，其显示了2t2改善了ApoE-/-小鼠被西方饮食诱导的高血糖症。
图32显示了用2t2处理后CD44记忆T细胞的上调。
图33显示了用单链或多链嵌合多肽处理后因子X(FX)活化的图。
图34A-34C显示了CD4+CD25hiTreg细胞、CD4+CD25-Tcon细胞或CD8+Tcon细胞中的人血液淋巴细胞pStat5a应答作为对2t2或IL2处理的应答。图34A显示了CD4+CD25hiTreg细胞中的pSTAT5应答。图34B显示了CD4+CD25-Tcon细胞中的pSTAT5应答。图34C显示了CD8+Tcon细胞中的pSTAT5应答。
具体实施方式
本文提供了单链嵌合多肽，其包括：(i)第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一个靶标结合域)、(ii)可溶性组织因子域(例如本文所述或所属领域中已知的任一个示例性可溶性组织因子域)，以及(iii)第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一个靶标结合域)。
本文还提供了组合物，其包括本文所述的任一种单链嵌合多肽、编码本文所述的任一种单链嵌合多肽的核酸，以及细胞，所述细胞包括编码本文所述的任一种单链嵌合多肽的任一种核酸。本文还提供了刺激免疫细胞的方法和治疗有需要的受试者(包括使用本文所述的任一种单链嵌合多肽)的方法。本文还提供了产生本文所述的任一种单链嵌合多肽的方法。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实例中，单链嵌合多肽可以具有以下总长度：约50个氨基酸至约3000个氨基酸，约50个氨基酸至约2500个氨基酸，约50个氨基酸至约2000个氨基酸，约50个氨基酸至约1500个氨基酸，约50个氨基酸至约1000个氨基酸，约50个氨基酸至约950个氨基酸，约50个氨基酸至约900个氨基酸，约50个氨基酸至约850个氨基酸，约50个氨基酸至约800个氨基酸，约50个氨基酸至约750个氨基酸，约50个氨基酸至约700个氨基酸，约50个氨基酸至约650个氨基酸，约50个氨基酸至约600个氨基酸，约50个氨基酸至约550个氨基酸，约50个氨基酸至约500个氨基酸，约50个氨基酸至约480个氨基酸，约50个氨基酸至约460个氨基酸，约50个氨基酸至约440个氨基酸，约50个氨基酸至约420个氨基酸，约50个氨基酸至约400个氨基酸，约50个氨基酸至约380个氨基酸，约50个氨基酸至约360个氨基酸，约50个氨基酸至约340个氨基酸，约50个氨基酸至约320个氨基酸，约50个氨基酸至约300个氨基酸，约50个氨基酸至约280个氨基酸，约50个氨基酸至约260个氨基酸，约50个氨基酸至约240个氨基酸，约50个氨基酸至约220个氨基酸，约50个氨基酸至约200个氨基酸，约50个氨基酸至约150个氨基酸，约50个氨基酸至约100个氨基酸，约100个氨基酸至约3000个氨基酸，约100个氨基酸至约2500个氨基酸，约100个氨基酸至约2000个氨基酸，约100个氨基酸至约1500个氨基酸，约100个氨基酸至约1000个氨基酸，约100个氨基酸至约950个氨基酸，约100个氨基酸至约900个氨基酸，约100个氨基酸至约850个氨基酸，约100个氨基酸至约800个氨基酸，约100个氨基酸至约750个氨基酸，约100个氨基酸至约700个氨基酸，约100个氨基酸至约650个氨基酸，约100个氨基酸至约600个氨基酸，约100个氨基酸至约550个氨基酸，约100个氨基酸至约500个氨基酸，约100个氨基酸至约480个氨基酸，约100个氨基酸至约460个氨基酸，约100个氨基酸至约440个氨基酸，约100个氨基酸至约420个氨基酸，约100个氨基酸至约400个氨基酸，约100个氨基酸至约380个氨基酸，约100个氨基酸至约360个氨基酸，约100个氨基酸至约340个氨基酸，约100个氨基酸至约320个氨基酸，约100个氨基酸至约300个氨基酸，约100个氨基酸至约280个氨基酸，约100个氨基酸至约260个氨基酸，约100个氨基酸至约240个氨基酸，约100个氨基酸至约220个氨基酸，约100个氨基酸至约200个氨基酸，约100个氨基酸至约150个氨基酸，约150个氨基酸至约3000个氨基酸，约150个氨基酸至约2500个氨基酸，约150个氨基酸至约2000个氨基酸，约150个氨基酸至约1500个氨基酸，约150个氨基酸至约1000个氨基酸，约150个氨基酸至约950个氨基酸，约150个氨基酸至约900个氨基酸，约150个氨基酸至约850个氨基酸，约150个氨基酸至约800个氨基酸，约150个氨基酸至约750个氨基酸，约150个氨基酸至约700个氨基酸，约150个氨基酸至约650个氨基酸，约150个氨基酸至约600个氨基酸，约150个氨基酸至约550个氨基酸，约150个氨基酸至约500个氨基酸，约150个氨基酸至约480个氨基酸，约150个氨基酸至约460个氨基酸，约150个氨基酸至约440个氨基酸，约150个氨基酸至约420个氨基酸，约150个氨基酸至约400个氨基酸，约150个氨基酸至约380个氨基酸，约150个氨基酸至约360个氨基酸，约150个氨基酸至约340个氨基酸，约150个氨基酸至约320个氨基酸，约150个氨基酸至约300个氨基酸，约150个氨基酸至约280个氨基酸，约150个氨基酸至约260个氨基酸，约150个氨基酸至约240个氨基酸，约150个氨基酸至约220个氨基酸，约150个氨基酸至约200个氨基酸，约200个氨基酸至约3000个氨基酸，约200个氨基酸至约2500个氨基酸，约200个氨基酸至约2000个氨基酸，约200个氨基酸至约1500个氨基酸，约200个氨基酸至约1000个氨基酸，约200个氨基酸至约950个氨基酸，约200个氨基酸至约900个氨基酸，约200个氨基酸至约850个氨基酸，约200个氨基酸至约800个氨基酸，约200个氨基酸至约750个氨基酸，约200个氨基酸至约700个氨基酸，约200个氨基酸至约650个氨基酸，约200个氨基酸至约600个氨基酸，约200个氨基酸至约550个氨基酸，约200个氨基酸至约500个氨基酸，约200个氨基酸至约480个氨基酸，约200个氨基酸至约460个氨基酸，约200个氨基酸至约440个氨基酸，约200个氨基酸至约420个氨基酸，约200个氨基酸至约400个氨基酸，约200个氨基酸至约380个氨基酸，约200个氨基酸至约360个氨基酸，约200个氨基酸至约340个氨基酸，约200个氨基酸至约320个氨基酸，约200个氨基酸至约300个氨基酸，约200个氨基酸至约280个氨基酸，约200个氨基酸至约260个氨基酸，约200个氨基酸至约240个氨基酸，约200个氨基酸至约220个氨基酸，约220个氨基酸至约3000个氨基酸，约220个氨基酸至约2500个氨基酸，约220个氨基酸至约2000个氨基酸，约220个氨基酸至约1500个氨基酸，约220个氨基酸至约1000个氨基酸，约220个氨基酸至约950个氨基酸，约220个氨基酸至约900个氨基酸，约220个氨基酸至约850个氨基酸，约220个氨基酸至约800个氨基酸，约220个氨基酸至约750个氨基酸，约220个氨基酸至约700个氨基酸，约220个氨基酸至约650个氨基酸，约220个氨基酸至约600个氨基酸，约220个氨基酸至约550个氨基酸，约220个氨基酸至约500个氨基酸，约220个氨基酸至约480个氨基酸，约220个氨基酸至约460个氨基酸，约220个氨基酸至约440个氨基酸，约220个氨基酸至约420个氨基酸，约220个氨基酸至约400个氨基酸，约220个氨基酸至约380个氨基酸，约220个氨基酸至约360个氨基酸，约220个氨基酸至约340个氨基酸，约220个氨基酸至约320个氨基酸，约220个氨基酸至约300个氨基酸，约220个氨基酸至约280个氨基酸，约220个氨基酸至约260个氨基酸，约220个氨基酸至约240个氨基酸，约240个氨基酸至约3000个氨基酸，约240个氨基酸至约2500个氨基酸，约240个氨基酸至约2000个氨基酸，约240个氨基酸至约1500个氨基酸，约240个氨基酸至约1000个氨基酸，约240个氨基酸至约950个氨基酸，约240个氨基酸至约900个氨基酸，约240个氨基酸至约850个氨基酸，约240个氨基酸至约800个氨基酸，约240个氨基酸至约750个氨基酸，约240个氨基酸至约700个氨基酸，约240个氨基酸至约650个氨基酸，约240个氨基酸至约600个氨基酸，约240个氨基酸至约550个氨基酸，约240个氨基酸至约500个氨基酸，约240个氨基酸至约480个氨基酸，约240个氨基酸至约460个氨基酸，约240个氨基酸至约440个氨基酸，约240个氨基酸至约420个氨基酸，约240个氨基酸至约400个氨基酸，约240个氨基酸至约380个氨基酸，约240个氨基酸至约360个氨基酸，约240个氨基酸至约340个氨基酸，约240个氨基酸至约320个氨基酸，约240个氨基酸至约300个氨基酸，约240个氨基酸至约280个氨基酸，约240个氨基酸至约260个氨基酸，约260个氨基酸至约3000个氨基酸，约260个氨基酸至约2500个氨基酸，约260个氨基酸至约2000个氨基酸，约260个氨基酸至约1500个氨基酸，约260个氨基酸至约1000个氨基酸，约260个氨基酸至约950个氨基酸，约260个氨基酸至约900个氨基酸，约260个氨基酸至约850个氨基酸，约260个氨基酸至约800个氨基酸，约260个氨基酸至约750个氨基酸，约260个氨基酸至约700个氨基酸，约260个氨基酸至约650个氨基酸，约260个氨基酸至约600个氨基酸，约260个氨基酸至约550个氨基酸，约260个氨基酸至约500个氨基酸，约260个氨基酸至约480个氨基酸，约260个氨基酸至约460个氨基酸，约260个氨基酸至约440个氨基酸，约260个氨基酸至约420个氨基酸，约260个氨基酸至约400个氨基酸，约260个氨基酸至约380个氨基酸，约260个氨基酸至约360个氨基酸，约260个氨基酸至约340个氨基酸，约260个氨基酸至约320个氨基酸，约260个氨基酸至约300个氨基酸，约260个氨基酸至约280个氨基酸，约280个氨基酸至约3000个氨基酸，约280个氨基酸至约2500个氨基酸，约280个氨基酸至约2000个氨基酸，约280个氨基酸至约1500个氨基酸，约280个氨基酸至约1000个氨基酸，约280个氨基酸至约950个氨基酸，约280个氨基酸至约900个氨基酸，约280个氨基酸至约850个氨基酸，约280个氨基酸至约800个氨基酸，约280个氨基酸至约750个氨基酸，约280个氨基酸至约700个氨基酸，约280个氨基酸至约650个氨基酸，约280个氨基酸至约600个氨基酸，约280个氨基酸至约550个氨基酸，约280个氨基酸至约500个氨基酸，约280个氨基酸至约480个氨基酸，约280个氨基酸至约460个氨基酸，约280个氨基酸至约440个氨基酸，约280个氨基酸至约420个氨基酸，约280个氨基酸至约400个氨基酸，约280个氨基酸至约380个氨基酸，约280个氨基酸至约360个氨基酸，约280个氨基酸至约340个氨基酸，约280个氨基酸至约320个氨基酸，约280个氨基酸至约300个氨基酸，约300个氨基酸至约3000个氨基酸，约300个氨基酸至约2500个氨基酸，约300个氨基酸至约2000个氨基酸，约300个氨基酸至约1500个氨基酸，约300个氨基酸至约1000个氨基酸，约300个氨基酸至约950个氨基酸，约300个氨基酸至约900个氨基酸，约300个氨基酸至约850个氨基酸，约300个氨基酸至约800个氨基酸，约300个氨基酸至约750个氨基酸，约300个氨基酸至约700个氨基酸，约300个氨基酸至约650个氨基酸，约300个氨基酸至约600个氨基酸，约300个氨基酸至约550个氨基酸，约300个氨基酸至约500个氨基酸，约300个氨基酸至约480个氨基酸，约300个氨基酸至约460个氨基酸，约300个氨基酸至约440个氨基酸，约300个氨基酸至约420个氨基酸，约300个氨基酸至约400个氨基酸，约300个氨基酸至约380个氨基酸，约300个氨基酸至约360个氨基酸，约300个氨基酸至约340个氨基酸，约300个氨基酸至约320个氨基酸，约320个氨基酸至约3000个氨基酸，约320个氨基酸至约2500个氨基酸，约320个氨基酸至约2000个氨基酸，约320个氨基酸至约1500个氨基酸，约320个氨基酸至约1000个氨基酸，约320个氨基酸至约950个氨基酸，约320个氨基酸至约900个氨基酸，约320个氨基酸至约850个氨基酸，约320个氨基酸至约800个氨基酸，约320个氨基酸至约750个氨基酸，约320个氨基酸至约700个氨基酸，约320个氨基酸至约650个氨基酸，约320个氨基酸至约600个氨基酸，约320个氨基酸至约550个氨基酸，约320个氨基酸至约500个氨基酸，约320个氨基酸至约480个氨基酸，约320个氨基酸至约460个氨基酸，约320个氨基酸至约440个氨基酸，约320个氨基酸至约420个氨基酸，约320个氨基酸至约400个氨基酸，约320个氨基酸至约380个氨基酸，约320个氨基酸至约360个氨基酸，约320个氨基酸至约340个氨基酸，约340个氨基酸至约3000个氨基酸，约340个氨基酸至约2500个氨基酸，约340个氨基酸至约2000个氨基酸，约340个氨基酸至约1500个氨基酸，约340个氨基酸至约1000个氨基酸，约340个氨基酸至约950个氨基酸，约340个氨基酸至约900个氨基酸，约340个氨基酸至约850个氨基酸，约340个氨基酸至约800个氨基酸，约340个氨基酸至约750个氨基酸，约340个氨基酸至约700个氨基酸，约340个氨基酸至约650个氨基酸，约340个氨基酸至约600个氨基酸，约340个氨基酸至约550个氨基酸，约340个氨基酸至约500个氨基酸，约340个氨基酸至约480个氨基酸，约340个氨基酸至约460个氨基酸，约340个氨基酸至约440个氨基酸，约340个氨基酸至约420个氨基酸，约340个氨基酸至约400个氨基酸，约340个氨基酸至约380个氨基酸，约340个氨基酸至约360个氨基酸，约360个氨基酸至约3000个氨基酸，约360个氨基酸至约2500个氨基酸，约360个氨基酸至约2000个氨基酸，约360个氨基酸至约1500个氨基酸，约360个氨基酸至约1000个氨基酸，约360个氨基酸至约950个氨基酸，约360个氨基酸至约900个氨基酸，约360个氨基酸至约850个氨基酸，约360个氨基酸至约800个氨基酸，约360个氨基酸至约750个氨基酸，约360个氨基酸至约700个氨基酸，约360个氨基酸至约650个氨基酸，约360个氨基酸至约600个氨基酸，约360个氨基酸至约550个氨基酸，约360个氨基酸至约500个氨基酸，约360个氨基酸至约480个氨基酸，约360个氨基酸至约460个氨基酸，约360个氨基酸至约440个氨基酸，约360个氨基酸至约420个氨基酸，约360个氨基酸至约400个氨基酸，约360个氨基酸至约380个氨基酸，约380个氨基酸至约3000个氨基酸，约380个氨基酸至约2500个氨基酸，约380个氨基酸至约2000个氨基酸，约380个氨基酸至约1500个氨基酸，约380个氨基酸至约1000个氨基酸，约380个氨基酸至约950个氨基酸，约380个氨基酸至约900个氨基酸，约380个氨基酸至约850个氨基酸，约380个氨基酸至约800个氨基酸，约380个氨基酸至约750个氨基酸，约380个氨基酸至约700个氨基酸，约380个氨基酸至约650个氨基酸，约380个氨基酸至约600个氨基酸，约380个氨基酸至约550个氨基酸，约380个氨基酸至约500个氨基酸，约380个氨基酸至约480个氨基酸，约380个氨基酸至约460个氨基酸，约380个氨基酸至约440个氨基酸，约380个氨基酸至约420个氨基酸，约380个氨基酸至约400个氨基酸，约400个氨基酸至约3000个氨基酸，约400个氨基酸至约2500个氨基酸，约400个氨基酸至约2000个氨基酸，约400个氨基酸至约1500个氨基酸，约400个氨基酸至约1000个氨基酸，约400个氨基酸至约950个氨基酸，约400个氨基酸至约900个氨基酸，约400个氨基酸至约850个氨基酸，约400个氨基酸至约800个氨基酸，约400个氨基酸至约750个氨基酸，约400个氨基酸至约700个氨基酸，约400个氨基酸至约650个氨基酸，约400个氨基酸至约600个氨基酸，约400个氨基酸至约550个氨基酸，约400个氨基酸至约500个氨基酸，约400个氨基酸至约480个氨基酸，约400个氨基酸至约460个氨基酸，约400个氨基酸至约440个氨基酸，约400个氨基酸至约420个氨基酸，约420个氨基酸至约3000个氨基酸，约420个氨基酸至约2500个氨基酸，约420个氨基酸至约2000个氨基酸，约420个氨基酸至约1500个氨基酸，约420个氨基酸至约1000个氨基酸，约420个氨基酸至约950个氨基酸，约420个氨基酸至约900个氨基酸，约420个氨基酸至约850个氨基酸，约420个氨基酸至约800个氨基酸，约420个氨基酸至约750个氨基酸，约420个氨基酸至约700个氨基酸，约420个氨基酸至约650个氨基酸，约420个氨基酸至约600个氨基酸，约420个氨基酸至约550个氨基酸，约420个氨基酸至约500个氨基酸，约420个氨基酸至约480个氨基酸，约420个氨基酸至约460个氨基酸，约420个氨基酸至约440个氨基酸，约440个氨基酸至约3000个氨基酸，约440个氨基酸至约2500个氨基酸，约440个氨基酸至约2000个氨基酸，约440个氨基酸至约1500个氨基酸，约440个氨基酸至约1000个氨基酸，约440个氨基酸至约950个氨基酸，约440个氨基酸至约900个氨基酸，约440个氨基酸至约850个氨基酸，约440个氨基酸至约800个氨基酸，约440个氨基酸至约750个氨基酸，约440个氨基酸至约700个氨基酸，约440个氨基酸至约650个氨基酸，约440个氨基酸至约600个氨基酸，约440个氨基酸至约550个氨基酸，约440个氨基酸至约500个氨基酸，约440个氨基酸至约480个氨基酸，约440个氨基酸至约460个氨基酸，约460个氨基酸至约3000个氨基酸，约460个氨基酸至约2500个氨基酸，约460个氨基酸至约2000个氨基酸，约460个氨基酸至约1500个氨基酸，约460个氨基酸至约1000个氨基酸，约460个氨基酸至约950个氨基酸，约460个氨基酸至约900个氨基酸，约460个氨基酸至约850个氨基酸，约460个氨基酸至约800个氨基酸，约460个氨基酸至约750个氨基酸，约460个氨基酸至约700个氨基酸，约460个氨基酸至约650个氨基酸，约460个氨基酸至约600个氨基酸，约460个氨基酸至约550个氨基酸，约460个氨基酸至约500个氨基酸，约460个氨基酸至约480个氨基酸，约480个氨基酸至约3000个氨基酸，约480个氨基酸至约2500个氨基酸，约480个氨基酸至约2000个氨基酸，约480个氨基酸至约1500个氨基酸，约480个氨基酸至约1000个氨基酸，约480个氨基酸至约950个氨基酸，约480个氨基酸至约900个氨基酸，约480个氨基酸至约850个氨基酸，约480个氨基酸至约800个氨基酸，约480个氨基酸至约750个氨基酸，约480个氨基酸至约700个氨基酸，约480个氨基酸至约650个氨基酸，约480个氨基酸至约600个氨基酸，约480个氨基酸至约550个氨基酸，约480个氨基酸至约500个氨基酸，约500个氨基酸至约3000个氨基酸，约500个氨基酸至约2500个氨基酸，约500个氨基酸至约2000个氨基酸，约500个氨基酸至约1500个氨基酸，约500个氨基酸至约1000个氨基酸，约500个氨基酸至约950个氨基酸，约500个氨基酸至约900个氨基酸，约500个氨基酸至约850个氨基酸，约500个氨基酸至约800个氨基酸，约500个氨基酸至约750个氨基酸，约500个氨基酸至约700个氨基酸，约500个氨基酸至约650个氨基酸，约500个氨基酸至约600个氨基酸，约500个氨基酸至约550个氨基酸，约550个氨基酸至约3000个氨基酸，约550个氨基酸至约2500个氨基酸，约550个氨基酸至约2000个氨基酸，约550个氨基酸至约1500个氨基酸，约550个氨基酸至约1000个氨基酸，约550个氨基酸至约950个氨基酸，约550个氨基酸至约900个氨基酸，约550个氨基酸至约850个氨基酸，约550个氨基酸至约800个氨基酸，约550个氨基酸至约750个氨基酸，约550个氨基酸至约700个氨基酸，约550个氨基酸至约650个氨基酸，约550个氨基酸至约600个氨基酸，约600个氨基酸至约3000个氨基酸，约600个氨基酸至约2500个氨基酸，约600个氨基酸至约2000个氨基酸，约600个氨基酸至约1500个氨基酸，约600个氨基酸至约1000个氨基酸，约600个氨基酸至约950个氨基酸，约600个氨基酸至约900个氨基酸，约600个氨基酸至约850个氨基酸，约600个氨基酸至约800个氨基酸，约600个氨基酸至约750个氨基酸，约600个氨基酸至约700个氨基酸，约600个氨基酸至约650个氨基酸，约650个氨基酸至约3000个氨基酸，约650个氨基酸至约2500个氨基酸，约650个氨基酸至约2000个氨基酸，约650个氨基酸至约1500个氨基酸，约650个氨基酸至约1000个氨基酸，约650个氨基酸至约950个氨基酸，约650个氨基酸至约900个氨基酸，约650个氨基酸至约850个氨基酸，约650个氨基酸至约800个氨基酸，约650个氨基酸至约750个氨基酸，约650个氨基酸至约700个氨基酸，约700个氨基酸至约3000个氨基酸，约700个氨基酸至约2500个氨基酸，约700个氨基酸至约2000个氨基酸，约700个氨基酸至约1500个氨基酸，约700个氨基酸至约1000个氨基酸，约700个氨基酸至约950个氨基酸，约700个氨基酸至约900个氨基酸，约700个氨基酸至约850个氨基酸，约700个氨基酸至约800个氨基酸，约700个氨基酸至约750个氨基酸，约750个氨基酸至约3000个氨基酸，约750个氨基酸至约2500个氨基酸，约750个氨基酸至约2000个氨基酸，约750个氨基酸至约1500个氨基酸，约750个氨基酸至约1000个氨基酸，约750个氨基酸至约950个氨基酸，约750个氨基酸至约900个氨基酸，约750个氨基酸至约850个氨基酸，约750个氨基酸至约800个氨基酸，约800个氨基酸至约3000个氨基酸，约800个氨基酸至约2500个氨基酸，约800个氨基酸至约2000个氨基酸，约800个氨基酸至约1500个氨基酸，约800个氨基酸至约1000个氨基酸，约800个氨基酸至约950个氨基酸，约800个氨基酸至约900个氨基酸，约800个氨基酸至约850个氨基酸，约850个氨基酸至约3000个氨基酸，约850个氨基酸至约2500个氨基酸，约850个氨基酸至约2000个氨基酸，约850个氨基酸至约1500个氨基酸，约850个氨基酸至约1000个氨基酸，约850个氨基酸至约950个氨基酸，约850个氨基酸至约900个氨基酸，约900个氨基酸至约3000个氨基酸，约900个氨基酸至约2500个氨基酸，约900个氨基酸至约2000个氨基酸，约900个氨基酸至约1500个氨基酸，约900个氨基酸至约1000个氨基酸，约900个氨基酸至约950个氨基酸，约950个氨基酸至约3000个氨基酸，约950个氨基酸至约2500个氨基酸，约950个氨基酸至约2000个氨基酸，约950个氨基酸至约1500个氨基酸，约950个氨基酸至约1000个氨基酸，约1000个氨基酸至约3000个氨基酸，约1000个氨基酸至约2500个氨基酸，约1000个氨基酸至约2000个氨基酸，约1000个氨基酸至约1500个氨基酸，约1500个氨基酸至约3000个氨基酸，约1500个氨基酸至约2500个氨基酸，约1500个氨基酸至约2000个氨基酸，约2000个氨基酸至约3000个氨基酸，约2000个氨基酸至约2500个氨基酸，或约2500个氨基酸至约3000个氨基酸。图1中描绘了本文中所提供的示例性单链嵌合多肽的图。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)与可溶性组织因子域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域)彼此直接邻接。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性第一靶标结合域)与可溶性组织因子域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域)与第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)彼此直接邻接。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于可溶性组织因子域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域)与第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)与第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性示例性靶标结合域)彼此直接邻接。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)与第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，
第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)与可溶性组织因子域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域)彼此直接邻接。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)与可溶性组织因子域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性可溶性组织因子域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR(SEQ ID NO:1)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽由核酸编码，所述核酸包括与CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGTGGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGCCAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGCTCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGGTCCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGAACTCGTGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCTCCTATGTGATCCAGTGGGTCAAACAGAAGCCCGGACAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAACCCTTACAACGACTATACCAAATACAACGAGAAGTTTAAGGGAAAGGCTACTTTAACCTCCGACAAAAGCTCCATCACAGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAACATCCGAGGACAGCGCTCTGTACTATTGCGCCCGGTGGGGCGACGGCAATTACTGGGGACGGGGCACAACACTGACCGTGAGCAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGCGGCTCCGACATCGAGATGACCCAGTCCCCCGCTATCATGTCCGCCTCTTTAGGCGAGCGGGTCACAATGACTTGTACAGCCTCCTCCAGCGTCTCCTCCTCCTACTTCCATTGGTACCAACAGAAACCCGGAAGCTCCCCTAAACTGTGCATCTACAGCACCAGCAATCTCGCCAGCGGCGTGCCCCCTAGGTTTTCCGGAAGCGGAAGCACCAGCTACTCTTTAACCATCTCCTCCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACCTACTTTTGTCACCAGTACCACCGGTCCCCCACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGACAAAGAGG(SEQ ID NO:2)至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列
MKWVTFISLLFLFSSAYSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR(SEQ ID NO:3)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽由核酸编码，所述核酸包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCTTATTATTTTTATTCAGCTCCGCCTATTCCCAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGTGGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGCCAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGCTCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGGTCCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGAACTCGTGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCTCCTATGTGATCCAGTGGGTCAAACAGAAGCCCGGACAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAACCCTTACAACGACTATACCAAATACAACGAGAAGTTTAAGGGAAAGGCTACTTTAACCTCCGACAAAAGCTCCATCACAGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAACATCCGAGGACAGCGCTCTGTACTATTGCGCCCGGTGGGGCGACGGCAATTACTGGGGACGGGGCACAACACTGACCGTGAGCAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGCGGCTCCGACATCGAGATGACCCAGTCCCCCGCTATCATGTCCGCCTCTTTAGGCGAGCGGGTCACAATGACTTGTACAGCCTCCTCCAGCGTCTCCTCCTCCTACTTCCATTGGTACCAACAGAAACCCGGAAGCTCCCCTAAACTGTGCATCTACAGCACCAGCAATCTCGCCAGCGGCGTGCCCCCTAGGTTTTCCGGAAGCGGAAGCACCAGCTACTCTTTAACCATCTCCTCCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACCTACTTTTGTCACCAGTACCACCGGTCCCCCACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGACAAAGAGG(SEQ ID NO:4)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列
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在一些实施例中，单链嵌合多肽由核酸编码，所述核酸包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列
GTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCCGAACTGGTCAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCTCCTACGTCATCCAATGGGTGAAGCAGAAGCCCGGTCAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAATCCCTACAACGATTACACCAAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACTCTGACAAGCGACAAGAGCTCCATTACCGCCTACATGGAGTTTTCCTCTTTAACTTCTGAGGACTCCGCTTTATACTATTGCGCTCGTTGGGGCGATGGCAATTATTGGGGCCGGGGAACTACTTTAACAGTGAGCTCCGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGAGGATCTGGCGGTGGAGGCAGCGACATCGAGATGACACAGTCCCCCGCTATCATGAGCGCCTCTTTAGGAGAACGTGTGACCATGACTTGTACAGCTTCCTCCAGCGTGAGCAGCTCCTATTTCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCTCCTCCCCTAAACTGTGTATCTACTCCACAAGCAATTTAGCTAGCGGCGTGCCTCCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCAGCACCTCTTACTCTTTAACCATTAGCTCTATGGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTTTTGCCATCAGTACCACCGGTCCCCTACCTTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGACCAAGCGGAGCGGCACCACCAACACAGTGGCCGCCTACAATCTGACTTGGAAATCCACCAACTTCAAGACCATCCTCGAGTGGGAGCCCAAGCCCGTTAATCAAGTTTATACCGTGCAGATTTCCACCAAGAGCGGCGACTGGAAATCCAAGTGCTTCTATACCACAGACACCGAGTGCGATCTCACCGACGAGATCGTCAAAGACGTGAAGCAGACATATTTAGCTAGGGTGTTCTCCTACCCCGCTGGAAACGTGGAGAGCACCGGATCCGCTGGAGAGCCTTTATACGAGAACTCCCCCGAATTCACCCCCTATCTGGAAACCAATTTAGGCCAGCCCACCATCCAGAGCTTCGAACAAGTTGGCACAAAGGTGAACGTCACCGTCGAAGATGAGAGGACTTTAGTGCGGAGGAACAATACATTTTTATCCTTACGTGACGTCTTCGGCAAGGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCTAGCTCCTCCGGCAAGAAGACCGCCAAGACCAATACCAACGAATTTTTAATTGACGTGGACAAGGGCGAGAACTACTGCTTCTCCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACAGTGAACCGGAAGTCCACCGACTCCCCCGTGGAGTGCATGGGCCAAGAGAAGGGAGAGTTTCGTGAGCAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCTATTATGAGCGCTAGCCCCGGTGAAAAGGTGACTATGACATGCAGCGCCAGCTCTTCCGTGAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGTCCGGCACCAGCCCTAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTCCCCGCTCACTTTCGGGGCTCCGGCTCCGGAACAAGCTACTCTCTGACCATCAGCGGCATGGAAGCCGAGGATGCCGCTACCTATTACTGTCAGCAGTGGAGCTCCAACCCCTTCACCTTTGGATCCGGCACCAAGCTCGAGATTAATCGTGGAGGCGGAGGTAGCGGAGGAGGCGGATCCGGCGGTGGAGGTAGCCAAGTTCAGCTCCAGCAAAGCGGCGCCGAACTCGCTCGGCCCGGCGCTTCCGTGAAGATGTCTTGTAAGGCCTCCGGCTATACCTTCACCCGGTACACAATGCACTGGGTCAAGCAACGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATTGGCTATATCAACCCCTCCCGGGGCTATACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAAGCCACCCTCACCACCGACAAGTCCAGCAGCACCGCTTACATGCAGCTGAGCTCTTTAACATCCGAGGATTCCGCCGTGTACTACTGCGCTCGGTACTACGACGATCATTACTGCCTCGATTACTGGGGCCAAGGTACCACCTTAACAGTCTCCTCC(SEQ ID NO:6)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列
MKWVTFISLLFLFSSAYSVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKRSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:7)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽由核酸编码，所述核酸包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列
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这些嵌合多肽、核酸、载体、细胞和方法的非限制性方面在下文描述，并且可在无限制的情况下以任何组合使用。这些嵌合多肽、核酸、载体、细胞和方法的另外方面是本领域已知的。
组织因子
人组织因子是263个氨基酸的跨膜蛋白，其含有三个结构域：(1)219个氨基酸的N端胞外域(残基1-219)；(2)22个氨基酸的跨膜域(残基220-242)；和(3)21个氨基酸的胞质C端尾(残基242-263)((UniProtKB标识符编号：P13726)。胞质尾在Ser253和Ser258处含有两个磷酸化位点，在Cys245处含有一个S-棕榈酰化位点。没有发现胞质域的缺失或突变影响组织因子凝血活性。组织因子在蛋白质胞内域中Cys245处具有一个S-棕榈酰化位点。Cys245位于胞内域的氨基酸端，并且靠近膜表面。组织因子跨膜域由单跨度的α-螺旋构成。
由两个纤连蛋白III型结构域构成的组织因子的胞外域通过六氨基酸接头与跨膜域连接。这一接头提供构象灵活性，以使组织因子胞外域与其跨膜域和胞质域解偶联。每个组织因子纤连蛋白III型模块均由两个重叠的β折叠构成，其中顶层折叠结构域含有三个反平行的β链，而底层折叠含有四个β链。链βA与βB、βC与βD以及βE与βF之间通过β环连接β链，所有这些链在两个模块中均具有保守的构象。有三个短的α螺旋段连接β链。组织因子的独特特征是链β10与链β11之间的17个氨基酸的β发夹，这不是纤连蛋白超家族的共同成分。N端结构域还在β6F与β7G之间包含一个12个氨基酸的环，所述环不存在于C端结构域，并且是组织因子特有的。这种纤连蛋白III型结构域结构是免疫球蛋白样家族蛋白质折叠的的特征，并且在广泛多种细胞外蛋白中是保守的。
一旦酶原FVII与组织结合形成活性组织因子-FVIIa复合物，就可通过有限的蛋白水解将其迅速转化为FVIIa。FVIIa以大约0.1nM(血浆FVII的1％)的浓度作为酶循环，也可直接结合到组织因子。组织因子与FVIIa在组织因子-FVIIa复合物上的变构相互作用极大地提高了FVIIa的酶促活性：小的发色肽基底物的水解速率提高约20到100倍，并且天然大分子底物FIX和FX的活化速率提高接近一百万倍。与结合到组织因子时FVIIa活性位点的变构活化相一致，磷脂双层上组织因子-FVIIa复合物的形成(即，当磷脂酰-L-丝氨酸暴露在膜表面时)以Ca2+依赖的方式提高FIX或FX活化的速率1000倍。相对于游离FVIIa，组织因子-FVIIa-磷脂复合物对FX活化的大约百万倍总体增加是凝血级联反应的关键调节点。
FVII是约50kDa的单链多肽，由406个氨基酸残基组成，具有N端富含γ-羧基谷氨酸(GLA)的结构域，两个表皮生长因子样结构域(EGF1和EFG2)和C端丝氨酸蛋白酶结构域。FVII通过在EGF2与蛋白酶结构域之间的短接头区中Ile-154-Arg152键的特异性蛋白水解裂解而被活化为FVIIa。这种裂解引起轻链和重链通过Cys135和Cys262的单个二硫键固定在一起。FVIIa通过其N端GLA结构域以Ca2+依赖性方式结合磷脂膜。GLA结构域的C端紧邻芳香族堆叠和两个EGF结构域。芳香族堆叠将GLA连接到结合单个Ca2+离子的EGF1结构域。占用这一Ca2+结合位点会增加FVIIa酰胺分解活性和组织因子缔合。催化三联体由His193、Asp242和Ser344组成，并且FVIIa蛋白酶域内单个Ca2+离子的结合对其催化活性至关重要。FVII对FVIIa的蛋白水解活化释放了Ile153处新形成的氨基端，使其向后折叠并且插入活化袋中，与Asp343的羧酸盐形成盐桥，以生成氧阴离子孔。这一盐桥的形成对于FVIIa活性至关重要。但是，在蛋白水解活化后，游离的FVIIa中不会发生氧阴离子孔的形成。结果，FVIIa以酶原样状态循环，血浆蛋白酶抑制剂不能很好识别所述状态，使其以大约90分钟的半衰期循环。
FVIIa活性位点在膜表面上方的组织因子介导的定位对于FVIIa朝向同源底物很重要。游离FVIIa当结合到膜、其活性位点定位在膜表面上方约
Figure BDA0003044956670000321
时采取稳定的伸展结构。FVIIa结合到组织因子后，FVa活性位点重新定位于更接近膜的约
Figure BDA0003044956670000322
处。这种调节可帮助FVIIa催化三联体与靶标底物裂解位点正确对齐。使用无GLA结构域的FVIIa，已显示活性位点仍位于膜上方相似的距离，证明即使在没有FVIIa-膜相互作用的情况下，组织因子也能够完全支持FVIIa活性位点定位。另外的数据显示，只要组织因子胞外域以某种方式系栓到膜表面，组织因子就支持完全FVIIa蛋白水解活性。然而，将FVIIa的活性位点提高到膜表面上方大于
Figure BDA0003044956670000323
会大大降低组织因子-FVIIa复合物活化FX的能力，但不会减少组织因子-FVIIa的酰胺水解活性。
丙氨酸扫描诱变已用于评定组织因子胞外域中特定氨基酸侧链对与FVIIa相互作用的作用(Gibbs等人,《生物化学(Biochemistry)》33(47):14003-14010,1994；Schullek等人,《生物化学杂志(J Biol Chem)》269(30):19399-19403,1994)。丙氨酸取代鉴别出有限数量的残基位置，在这些位置处，丙氨酸置换引起对FVIIa结合的亲和力降低5到10倍。发现这些残基侧链中的大多数在晶体结构中充分暴露于溶剂，与大分子配体相互作用一致。FVIIa配体结合位点位于两个模块之间边界处的宽广区上。在C模块中，位于突出的B-C环上的残基Arg135和Phe140提供与FVIIa的独立接触。Leu133位于手指状结构的基底部，并且挤入两个模块之间的裂缝中。这提供由Lys20、Thr60、Asp58和Ile22组成的重要结合残基的主要簇的连续性。Thr60仅部分暴露于溶剂，并且可能起局部结构作用，而不是与配体显著接触。结合位点延伸到模块间角的凹面，其涉及Glu24和Gln110，并且可能涉及更远的残基Val207。结合区从Asp58延伸到由Lys48、Lys46、Gln37、Asp44和Trp45形成的凸表面区。Trp45和Asp44不会独立地与FVIIa相互作用，表明Trp45位置处的突变效应可能反映这一侧链对邻近Asp44和Gln37侧链的局部堆积的结构重要性。相互作用区进一步包括两个表面暴露的芳香族残基Phe76和Tyr78，其在N模块中形成疏水簇的一部分。
组织因子-FVIIa的已知生理底物是FVII、FIX和FX以及某些蛋白酶活化的受体。突变分析已鉴别出许多残基，当突变时，所述残基支持对小肽基底物的完全FVIIa酰胺分解活性，但缺少支持大分子底物(即，FVII、FIX和FX)活化的能力(Ruf等人,《生物化学杂志》267(31):22206-22210,1992；Ruf等人,《生物化学杂志》267(9):6375-6381,1992；Huang等人,《生物化学杂志》271(36):21752-21757,1996；Kirchhofer等人,《生物化学》39(25):7380-7387,2000)。已显示在残基159-165处的组织因子环区和在这一柔性环中或附近的残基对于组织因子-FVIIa复合物的蛋白水解活性至关重要。这定义了提出的组织因子的底物结合位点外区，所述区与FVIIa活性位点相距甚远。甘氨酸残基被稍大的残基丙氨酸取代会大大损害组织因子-FVIIa的蛋白水解活性。这表明甘氨酸提供的柔性对于用于组织因子大分子底物识别的残基159-165的环至关重要。
还证明了残基Lys165和Lys166对于底物识别和结合很重要。这些残基中的任何一个突变为丙氨酸均会引起组织因子辅助因子功能的显著降低。在大多数组织因子-FVIIa结构中，Lys165和Lys166彼此背对，Lys165指向的FVIIa，而Lys166指向晶体结构中的底物结合位点外区。FVIIa的Lys165和Gla35之间的推定盐桥形成将支持组织因子与FVIIa的GLA结构域相互作用调节底物识别的观点。这些结果表明，组织因子胞外域的C端部分直接与FIX和FX的GLA结构域、可能的邻近EGF1结构域相互作用，并且FVIIa GLA结构域的存在可直接或间接调节这些相互作用。
可溶性组织因子域
在本文所述的任一种单链嵌合多肽、组合物或方法的一些实施例中，可溶性组织因子域可以是缺乏信号序列、跨膜域和胞内域的野生型组织因子多肽。在一些实例中，可溶性组织因子域可以是组织因子突变体，其中野生型组织因子多肽缺少信号序列、跨膜域和胞内域，并且已在所选择的氨基酸处被进一步修饰。在一些实例中，可溶性组织因子域可以是人可溶性组织因子域。在一些实例中，可溶性组织因子域可以是小鼠可溶性组织因子域。在一些实例中，可溶性组织因子域可为大鼠可溶性组织因子域。人可溶性组织因子域、小鼠可溶性组织因子域、大鼠可溶性组织因子域和突变型可溶性组织因子域的非限制性实例显示如下。示例性人可溶性组织因子域(SEQ ID NO:9)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
编码人可溶性组织因子域的示例性核酸(SEQ ID NO:10)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
示例性小鼠可溶性组织因子域(SEQ ID NO:11)
agipekafnltwistdfktilewqpkptnytytvqisdrsrnwknkcfsttdtecdltdeivkdvtwayeakvlsvprrnsvhgdgdqlvihgeeppftnapkflpyrdtnlgqpviqqfeqdgrklnvvvkdsltlvrkngtfltlrqvfgkdlgyiityrkgsstgkktnitntnefsidveegvsycffvqamifsrktnqnspgsstvcteqwksflge
示例性大鼠可溶性组织因子域(SEQ ID NO:12)
Agtppgkafnltwistdfktilewqpkptnytytvqisdrsrnwkykctgttdtecdltdeivkdvnwtyearvlsvpwrnsthgketlfgthgeeppftnarkflpyrdtkigqpviqkyeqggtklkvtvkdsftlvrkngtfltlrqvfgndlgyiltyrkdsstgrktntthtneflidvekgvsycffaqavifsrktnhkspesitkcteqwksvlge
示例性突变型人可溶性组织因子域(SEQ ID NO:96)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFATALEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECALTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVARNNTALSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
示例性突变型人可溶性组织因子域(SEQ ID NO:97)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFATALEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDAKSKCFYTTDTECALTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLAENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVARNNTALSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
在一些实施例中，可溶性组织因子域可以包括与SEQ ID NO:9、11、12、96或97至少70％一致、至少72％一致、至少74％一致、至少76％一致、至少78％一致、至少80％一致、至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的序列。在一些实施例中，可溶性组织因子域可包括SEQ ID NO:9、11、12、96或97的序列，其N端有一到二十个氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸)已去除和/或其C端有一到二十个氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸)已去除。
如本领域中可了解，本领域技术人员将理解，在不同哺乳动物物种之间保守的氨基酸的突变更可能降低蛋白质的活性和/或结构稳定性，而在不同哺乳动物物种之间不具保守性的氨基酸的突变不太可能降低蛋白质的活性和/或结构稳定性。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实例中，可溶性组织因子域不能结合到因子VIIa。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实例中，可溶性组织因子域不将非活性因子X转化为因子Xa。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽不刺激哺乳动物的血液凝结。
在一些实例中，可溶性组织因子域可以是人可溶性组织因子域。在一些实施例中，可溶性组织因子域可以是小鼠可溶性组织因子域。在一些实施例中，可溶性组织因子域可以是大鼠可溶性组织因子域。
在一些实例中，可溶性组织因子域不包括以下中的一个或多个(例如二、三、四、五、六或七个)：位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置20对应的氨基酸位置的赖氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置22对应的氨基酸位置的异亮氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置45对应的氨基酸位置的色氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置58对应的氨基酸位置的天冬氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置94对应的氨基酸位置的酪氨酸；位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置135对应的氨基酸位置的精氨酸；以及位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置140对应的氨基酸位置的苯丙氨酸。在一些实施例中，突变型可溶性组织因子具有SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:97的氨基酸序列。
在一些实例中，可溶性组织因子域可由核酸编码，所述核酸包括与SEQ ID NO:10至少70％一致、至少72％一致、至少74％一致、至少76％一致、至少78％一致、至少80％一致、至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的序列。
在一些实施例中，可溶性组织因子域可具有以下总长度：约20个氨基酸至约220个氨基酸，约20个氨基酸至约215个氨基酸，约20个氨基酸至约210个氨基酸，约20个氨基酸至约205个氨基酸，约20个氨基酸至约200个氨基酸，约20个氨基酸至约195个氨基酸，约20个氨基酸至约190个氨基酸，约20个氨基酸至约185个氨基酸，约20个氨基酸至约180个氨基酸，约20个氨基酸至约175个氨基酸，约20个氨基酸至约170个氨基酸，约20个氨基酸至约165个氨基酸，约20个氨基酸至约160个氨基酸，约20个氨基酸至约155个氨基酸，约20个氨基酸至约150个氨基酸，约20个氨基酸至约145个氨基酸，约20个氨基酸至约140个氨基酸，约20个氨基酸至约135个氨基酸，约20个氨基酸至约130个氨基酸，约20个氨基酸至约125个氨基酸，约20个氨基酸至约120个氨基酸，约20个氨基酸至约115个氨基酸，约20个氨基酸至约110个氨基酸，约20个氨基酸至约105个氨基酸，约20个氨基酸至约100个氨基酸，约20个氨基酸至约95个氨基酸，约20个氨基酸至约90个氨基酸，约20个氨基酸至约85个氨基酸，约20个氨基酸至约80个氨基酸，约20个氨基酸至约75个氨基酸，约20个氨基酸至约70个氨基酸，约20个氨基酸至约60个氨基酸，约20个氨基酸至约50个氨基酸，约20个氨基酸至约40个氨基酸，约20个氨基酸至约30个氨基酸，约30个氨基酸至约220个氨基酸，约30个氨基酸至约215个氨基酸，约30个氨基酸至约210个氨基酸，约30个氨基酸至约205个氨基酸，约30个氨基酸至约200个氨基酸，约30个氨基酸至约195个氨基酸，约30个氨基酸至约190个氨基酸，约30个氨基酸至约185个氨基酸，约30个氨基酸至约180个氨基酸，约30个氨基酸至约175个氨基酸，约30个氨基酸至约170个氨基酸，约30个氨基酸至约165个氨基酸，约30个氨基酸至约160个氨基酸，约30个氨基酸至约155个氨基酸，约30个氨基酸至约150个氨基酸，约30个氨基酸至约145个氨基酸，约30个氨基酸至约140个氨基酸，约30个氨基酸至约135个氨基酸，约30个氨基酸至约130个氨基酸，约30个氨基酸至约125个氨基酸，约30个氨基酸至约120个氨基酸，约30个氨基酸至约115个氨基酸，约30个氨基酸至约110个氨基酸，约30个氨基酸至约105个氨基酸，约30个氨基酸至约100个氨基酸，约30个氨基酸至约95个氨基酸，约30个氨基酸至约90个氨基酸，约30个氨基酸至约85个氨基酸，约30个氨基酸至约80个氨基酸，约30个氨基酸至约75个氨基酸，约30个氨基酸至约70个氨基酸，约30个氨基酸至约60个氨基酸，约30个氨基酸至约50个氨基酸，约30个氨基酸至约40个氨基酸，约40个氨基酸至约220个氨基酸，约40个氨基酸至约215个氨基酸，约40个氨基酸至约210个氨基酸，约40个氨基酸至约205个氨基酸，约40个氨基酸至约200个氨基酸，约40个氨基酸至约195个氨基酸，约40个氨基酸至约190个氨基酸，约40个氨基酸至约185个氨基酸，约40个氨基酸至约180个氨基酸，约40个氨基酸至约175个氨基酸，约40个氨基酸至约170个氨基酸，约40个氨基酸至约165个氨基酸，约40个氨基酸至约160个氨基酸，约40个氨基酸至约155个氨基酸，约40个氨基酸至约150个氨基酸，约40个氨基酸至约145个氨基酸，约40个氨基酸至约140个氨基酸，约40个氨基酸至约135个氨基酸，约40个氨基酸至约130个氨基酸，约40个氨基酸至约125个氨基酸，约40个氨基酸至约120个氨基酸，约40个氨基酸至约115个氨基酸，约40个氨基酸至约110个氨基酸，约40个氨基酸至约105个氨基酸，约40个氨基酸至约100个氨基酸，约40个氨基酸至约95个氨基酸，约40个氨基酸至约90个氨基酸，约40个氨基酸至约85个氨基酸，约40个氨基酸至约80个氨基酸，约40个氨基酸至约75个氨基酸，约40个氨基酸至约70个氨基酸，约40个氨基酸至约60个氨基酸，约40个氨基酸至约50个氨基酸，约50个氨基酸至约220个氨基酸，约50个氨基酸至约215个氨基酸，约50个氨基酸至约210个氨基酸，约50个氨基酸至约205个氨基酸，约50个氨基酸至约200个氨基酸，约50个氨基酸至约195个氨基酸，约50个氨基酸至约190个氨基酸，约50个氨基酸至约185个氨基酸，约50个氨基酸至约180个氨基酸，约50个氨基酸至约175个氨基酸，约50个氨基酸至约170个氨基酸，约50个氨基酸至约165个氨基酸，约50个氨基酸至约160个氨基酸，约50个氨基酸至约155个氨基酸，约50个氨基酸至约150个氨基酸，约50个氨基酸至约145个氨基酸，约50个氨基酸至约140个氨基酸，约50个氨基酸至约135个氨基酸，约50个氨基酸至约130个氨基酸，约50个氨基酸至约125个氨基酸，约50个氨基酸至约120个氨基酸，约50个氨基酸至约115个氨基酸，约50个氨基酸至约110个氨基酸，约50个氨基酸至约105个氨基酸，约50个氨基酸至约100个氨基酸，约50个氨基酸至约95个氨基酸，约50个氨基酸至约90个氨基酸，约50个氨基酸至约85个氨基酸，约50个氨基酸至约80个氨基酸，约50个氨基酸至约75个氨基酸，约50个氨基酸至约70个氨基酸，约50个氨基酸至约60个氨基酸，约60个氨基酸至约220个氨基酸，约60个氨基酸至约215个氨基酸，约60个氨基酸至约210个氨基酸，约60个氨基酸至约205个氨基酸，约60个氨基酸至约200个氨基酸，约60个氨基酸至约195个氨基酸，约60个氨基酸至约190个氨基酸，约60个氨基酸至约185个氨基酸，约60个氨基酸至约180个氨基酸，约60个氨基酸至约175个氨基酸，约60个氨基酸至约170个氨基酸，约60个氨基酸至约165个氨基酸，约60个氨基酸至约160个氨基酸，约60个氨基酸至约155个氨基酸，约60个氨基酸至约150个氨基酸，约60个氨基酸至约145个氨基酸，约60个氨基酸至约140个氨基酸，约60个氨基酸至约135个氨基酸，约60个氨基酸至约130个氨基酸，约60个氨基酸至约125个氨基酸，约60个氨基酸至约120个氨基酸，约60个氨基酸至约115个氨基酸，约60个氨基酸至约110个氨基酸，约60个氨基酸至约105个氨基酸，约60个氨基酸至约100个氨基酸，约60个氨基酸至约95个氨基酸，约60个氨基酸至约90个氨基酸，约60个氨基酸至约85个氨基酸，约60个氨基酸至约80个氨基酸，约60个氨基酸至约75个氨基酸，约60个氨基酸至约70个氨基酸，约70个氨基酸至约220个氨基酸，约70个氨基酸至约215个氨基酸，约70个氨基酸至约210个氨基酸，约70个氨基酸至约205个氨基酸，约70个氨基酸至约200个氨基酸，约70个氨基酸至约195个氨基酸，约70个氨基酸至约190个氨基酸，约70个氨基酸至约185个氨基酸，约70个氨基酸至约180个氨基酸，约70个氨基酸至约175个氨基酸，约70个氨基酸至约170个氨基酸，约70个氨基酸至约165个氨基酸，约70个氨基酸至约160个氨基酸，约70个氨基酸至约155个氨基酸，约70个氨基酸至约150个氨基酸，约70个氨基酸至约145个氨基酸，约70个氨基酸至约140个氨基酸，约70个氨基酸至约135个氨基酸，约70个氨基酸至约130个氨基酸，约70个氨基酸至约125个氨基酸，约70个氨基酸至约120个氨基酸，约70个氨基酸至约115个氨基酸，约70个氨基酸至约110个氨基酸，约70个氨基酸至约105个氨基酸，约70个氨基酸至约100个氨基酸，约70个氨基酸至约95个氨基酸，约70个氨基酸至约90个氨基酸，约70个氨基酸至约85个氨基酸，约70个氨基酸至约80个氨基酸，约80个氨基酸至约220个氨基酸，约80个氨基酸至约215个氨基酸，约80个氨基酸至约210个氨基酸，约80个氨基酸至约205个氨基酸，约80个氨基酸至约200个氨基酸，约80个氨基酸至约195个氨基酸，约80个氨基酸至约190个氨基酸，约80个氨基酸至约185个氨基酸，约80个氨基酸至约180个氨基酸，约80个氨基酸至约175个氨基酸，约80个氨基酸至约170个氨基酸，约80个氨基酸至约165个氨基酸，约80个氨基酸至约160个氨基酸，约80个氨基酸至约155个氨基酸，约80个氨基酸至约150个氨基酸，约80个氨基酸至约145个氨基酸，约80个氨基酸至约140个氨基酸，约80个氨基酸至约135个氨基酸，约80个氨基酸至约130个氨基酸，约80个氨基酸至约125个氨基酸，约80个氨基酸至约120个氨基酸，约80个氨基酸至约115个氨基酸，约80个氨基酸至约110个氨基酸，约80个氨基酸至约105个氨基酸，约80个氨基酸至约100个氨基酸，约80个氨基酸至约95个氨基酸，约80个氨基酸至约90个氨基酸，约90个氨基酸至约220个氨基酸，约90个氨基酸至约215个氨基酸，约90个氨基酸至约210个氨基酸，约90个氨基酸至约205个氨基酸，约90个氨基酸至约200个氨基酸，约90个氨基酸至约195个氨基酸，约90个氨基酸至约190个氨基酸，约90个氨基酸至约185个氨基酸，约90个氨基酸至约180个氨基酸，约90个氨基酸至约175个氨基酸，约90个氨基酸至约170个氨基酸，约90个氨基酸至约165个氨基酸，约90个氨基酸至约160个氨基酸，约90个氨基酸至约155个氨基酸，约90个氨基酸至约150个氨基酸，约90个氨基酸至约145个氨基酸，约90个氨基酸至约140个氨基酸，约90个氨基酸至约135个氨基酸，约90个氨基酸至约130个氨基酸，约90个氨基酸至约125个氨基酸，约90个氨基酸至约120个氨基酸，约90个氨基酸至约115个氨基酸，约90个氨基酸至约110个氨基酸，约90个氨基酸至约105个氨基酸，约90个氨基酸至约100个氨基酸，约100个氨基酸至约220个氨基酸，约100个氨基酸至约215个氨基酸，约100个氨基酸至约210个氨基酸，约100个氨基酸至约205个氨基酸，约100个氨基酸至约200个氨基酸，约100个氨基酸至约195个氨基酸，约100个氨基酸至约190个氨基酸，约100个氨基酸至约185个氨基酸，约100个氨基酸至约180个氨基酸，约100个氨基酸至约175个氨基酸，约100个氨基酸至约170个氨基酸，约100个氨基酸至约165个氨基酸，约100个氨基酸至约160个氨基酸，约100个氨基酸至约155个氨基酸，约100个氨基酸至约150个氨基酸，约100个氨基酸至约145个氨基酸，约100个氨基酸至约140个氨基酸，约100个氨基酸至约135个氨基酸，约100个氨基酸至约130个氨基酸，约100个氨基酸至约125个氨基酸，约100个氨基酸至约120个氨基酸，约100个氨基酸至约115个氨基酸，约100个氨基酸至约110个氨基酸，约110个氨基酸至约220个氨基酸，约110个氨基酸至约215个氨基酸，约110个氨基酸至约210个氨基酸，约110个氨基酸至约205个氨基酸，约110个氨基酸至约200个氨基酸，约110个氨基酸至约195个氨基酸，约110个氨基酸至约190个氨基酸，约110个氨基酸至约185个氨基酸，约110个氨基酸至约180个氨基酸，约110个氨基酸至约175个氨基酸，约110个氨基酸至约170个氨基酸，约110个氨基酸至约165个氨基酸，约110个氨基酸至约160个氨基酸，约110个氨基酸至约155个氨基酸，约110个氨基酸至约150个氨基酸，约110个氨基酸至约145个氨基酸，约110个氨基酸至约140个氨基酸，约110个氨基酸至约135个氨基酸，约110个氨基酸至约130个氨基酸，约110个氨基酸至约125个氨基酸，约110个氨基酸至约120个氨基酸，约110个氨基酸至约115个氨基酸，约115个氨基酸至约220个氨基酸，约115个氨基酸至约215个氨基酸，约115个氨基酸至约210个氨基酸，约115个氨基酸至约205个氨基酸，约115个氨基酸至约200个氨基酸，约115个氨基酸至约195个氨基酸，约115个氨基酸至约190个氨基酸，约115个氨基酸至约185个氨基酸，约115个氨基酸至约180个氨基酸，约115个氨基酸至约175个氨基酸，约115个氨基酸至约170个氨基酸，约115个氨基酸至约165个氨基酸，约115个氨基酸至约160个氨基酸，约115个氨基酸至约155个氨基酸，约115个氨基酸至约150个氨基酸，约115个氨基酸至约145个氨基酸，约115个氨基酸至约140个氨基酸，约115个氨基酸至约135个氨基酸，约115个氨基酸至约130个氨基酸，约115个氨基酸至约125个氨基酸，约115个氨基酸至约120个氨基酸，约120个氨基酸至约220个氨基酸，约120个氨基酸至约215个氨基酸，约120个氨基酸至约210个氨基酸，约120个氨基酸至约205个氨基酸，约120个氨基酸至约200个氨基酸，约120个氨基酸至约195个氨基酸，约120个氨基酸至约190个氨基酸，约120个氨基酸至约185个氨基酸，约120个氨基酸至约180个氨基酸，约120个氨基酸至约175个氨基酸，约120个氨基酸至约170个氨基酸，约120个氨基酸至约165个氨基酸，约120个氨基酸至约160个氨基酸，约120个氨基酸至约155个氨基酸，约120个氨基酸至约150个氨基酸，约120个氨基酸至约145个氨基酸，约120个氨基酸至约140个氨基酸，约120个氨基酸至约135个氨基酸，约120个氨基酸至约130个氨基酸，约120个氨基酸至约125个氨基酸，约125个氨基酸至约220个氨基酸，约125个氨基酸至约215个氨基酸，约125个氨基酸至约210个氨基酸，约125个氨基酸至约205个氨基酸，约125个氨基酸至约200个氨基酸，约125个氨基酸至约195个氨基酸，约125个氨基酸至约190个氨基酸，约125个氨基酸至约185个氨基酸，约125个氨基酸至约180个氨基酸，约125个氨基酸至约175个氨基酸，约125个氨基酸至约170个氨基酸，约125个氨基酸至约165个氨基酸，约125个氨基酸至约160个氨基酸，约125个氨基酸至约155个氨基酸，约125个氨基酸至约150个氨基酸，约125个氨基酸至约145个氨基酸，约125个氨基酸至约140个氨基酸，约125个氨基酸至约135个氨基酸，约125个氨基酸至约130个氨基酸，约130个氨基酸至约220个氨基酸，约130个氨基酸至约215个氨基酸，约130个氨基酸至约210个氨基酸，约130个氨基酸至约205个氨基酸，约130个氨基酸至约200个氨基酸，约130个氨基酸至约195个氨基酸，约130个氨基酸至约190个氨基酸，约130个氨基酸至约185个氨基酸，约130个氨基酸至约180个氨基酸，约130个氨基酸至约175个氨基酸，约130个氨基酸至约170个氨基酸，约130个氨基酸至约165个氨基酸，约130个氨基酸至约160个氨基酸，约130个氨基酸至约155个氨基酸，约130个氨基酸至约150个氨基酸，约130个氨基酸至约145个氨基酸，约130个氨基酸至约140个氨基酸，约130个氨基酸至约135个氨基酸，约135个氨基酸至约220个氨基酸，约135个氨基酸至约215个氨基酸，约135个氨基酸至约210个氨基酸，约135个氨基酸至约205个氨基酸，约135个氨基酸至约200个氨基酸，约135个氨基酸至约195个氨基酸，约135个氨基酸至约190个氨基酸，约135个氨基酸至约185个氨基酸，约135个氨基酸至约180个氨基酸，约135个氨基酸至约175个氨基酸，约135个氨基酸至约170个氨基酸，约135个氨基酸至约165个氨基酸，约135个氨基酸至约160个氨基酸，约135个氨基酸至约155个氨基酸，约135个氨基酸至约150个氨基酸，约135个氨基酸至约145个氨基酸，约135个氨基酸至约140个氨基酸，约140个氨基酸至约220个氨基酸，约140个氨基酸至约215个氨基酸，约140个氨基酸至约210个氨基酸，约140个氨基酸至约205个氨基酸，约140个氨基酸至约200个氨基酸，约140个氨基酸至约195个氨基酸，约140个氨基酸至约190个氨基酸，约140个氨基酸至约185个氨基酸，约140个氨基酸至约180个氨基酸，约140个氨基酸至约175个氨基酸，约140个氨基酸至约170个氨基酸，约140个氨基酸至约165个氨基酸，约140个氨基酸至约160个氨基酸，约140个氨基酸至约155个氨基酸，约140个氨基酸至约150个氨基酸，约140个氨基酸至约145个氨基酸，约145个氨基酸至约220个氨基酸，约145个氨基酸至约215个氨基酸，约145个氨基酸至约210个氨基酸，约145个氨基酸至约205个氨基酸，约145个氨基酸至约200个氨基酸，约145个氨基酸至约195个氨基酸，约145个氨基酸至约190个氨基酸，约145个氨基酸至约185个氨基酸，约145个氨基酸至约180个氨基酸，约145个氨基酸至约175个氨基酸，约145个氨基酸至约170个氨基酸，约145个氨基酸至约165个氨基酸，约145个氨基酸至约160个氨基酸，约145个氨基酸至约155个氨基酸，约145个氨基酸至约150个氨基酸，约150个氨基酸至约220个氨基酸，约150个氨基酸至约215个氨基酸，约150个氨基酸至约210个氨基酸，约150个氨基酸至约205个氨基酸，约150个氨基酸至约200个氨基酸，约150个氨基酸至约195个氨基酸，约150个氨基酸至约190个氨基酸，约150个氨基酸至约185个氨基酸，约150个氨基酸至约180个氨基酸，约150个氨基酸至约175个氨基酸，约150个氨基酸至约170个氨基酸，约150个氨基酸至约165个氨基酸，约150个氨基酸至约160个氨基酸，约150个氨基酸至约155个氨基酸，约155个氨基酸至约220个氨基酸，约155个氨基酸至约215个氨基酸，约155个氨基酸至约210个氨基酸，约155个氨基酸至约205个氨基酸，约155个氨基酸至约200个氨基酸，约155个氨基酸至约195个氨基酸，约155个氨基酸至约190个氨基酸，约155个氨基酸至约185个氨基酸，约155个氨基酸至约180个氨基酸，约155个氨基酸至约175个氨基酸，约155个氨基酸至约170个氨基酸，约155个氨基酸至约165个氨基酸，约155个氨基酸至约160个氨基酸，约160个氨基酸至约220个氨基酸，约160个氨基酸至约215个氨基酸，约160个氨基酸至约210个氨基酸，约160个氨基酸至约205个氨基酸，约160个氨基酸至约200个氨基酸，约160个氨基酸至约195个氨基酸，约160个氨基酸至约190个氨基酸，约160个氨基酸至约185个氨基酸，约160个氨基酸至约180个氨基酸，约160个氨基酸至约175个氨基酸，约160个氨基酸至约170个氨基酸，约160个氨基酸至约165个氨基酸，约165个氨基酸至约220个氨基酸，约165个氨基酸至约215个氨基酸，约165个氨基酸至约210个氨基酸，约165个氨基酸至约205个氨基酸，约165个氨基酸至约200个氨基酸，约165个氨基酸至约195个氨基酸，约165个氨基酸至约190个氨基酸，约165个氨基酸至约185个氨基酸，约165个氨基酸至约180个氨基酸，约165个氨基酸至约175个氨基酸，约165个氨基酸至约170个氨基酸，约170个氨基酸至约220个氨基酸，约170个氨基酸至约215个氨基酸，约170个氨基酸至约210个氨基酸，约170个氨基酸至约205个氨基酸，约170个氨基酸至约200个氨基酸，约170个氨基酸至约195个氨基酸，约170个氨基酸至约190个氨基酸，约170个氨基酸至约185个氨基酸，约170个氨基酸至约180个氨基酸，约170个氨基酸至约175个氨基酸，约175个氨基酸至约220个氨基酸，约175个氨基酸至约215个氨基酸，约175个氨基酸至约210个氨基酸，约175个氨基酸至约205个氨基酸，约175个氨基酸至约200个氨基酸，约175个氨基酸至约195个氨基酸，约175个氨基酸至约190个氨基酸，约175个氨基酸至约185个氨基酸，约175个氨基酸至约180个氨基酸，约180个氨基酸至约220个氨基酸，约180个氨基酸至约215个氨基酸，约180个氨基酸至约210个氨基酸，约180个氨基酸至约205个氨基酸，约180个氨基酸至约200个氨基酸，约180个氨基酸至约195个氨基酸，约180个氨基酸至约190个氨基酸，约180个氨基酸至约185个氨基酸，约185个氨基酸至约220个氨基酸，约185个氨基酸至约215个氨基酸，约185个氨基酸至约210个氨基酸，约185个氨基酸至约205个氨基酸，约185个氨基酸至约200个氨基酸，约185个氨基酸至约195个氨基酸，约185个氨基酸至约190个氨基酸，约190个氨基酸至约220个氨基酸，约190个氨基酸至约215个氨基酸，约190个氨基酸至约210个氨基酸，约190个氨基酸至约205个氨基酸，约190个氨基酸至约200个氨基酸，约190个氨基酸至约195个氨基酸，约195个氨基酸至约220个氨基酸，约195个氨基酸至约215个氨基酸，约195个氨基酸至约210个氨基酸，约195个氨基酸至约205个氨基酸，约195个氨基酸至约200个氨基酸，约200个氨基酸至约220个氨基酸，约200个氨基酸至约215个氨基酸，约200个氨基酸至约210个氨基酸，约200个氨基酸至约205个氨基酸，约205个氨基酸至约220个氨基酸，约205个氨基酸至约215个氨基酸，约205个氨基酸至约210个氨基酸，约210个氨基酸至约220个氨基酸，约210个氨基酸至约215个氨基酸，或约215个氨基酸至约220个氨基酸。
在一些实施例中，可溶性组织因子域可以包含或由人可溶性野生型组织因子(或其任何序列)组成。
接头序列
在一些实施例中，接头序列可为柔性接头序列。能够使用的接头序列的非限制性实例描述于Klein等人，《蛋白质工程、设计和选择(Protein Engineering,Design&Selection)》第27卷，第10期，第325-330页，2014；Priyanka等人，《蛋白质科学(ProteinSci.)》，2013年2月；22(2):153-167。在一些实例中，接头序列是合成接头序列。
在一些实施例中，本文所述的任一种单链嵌合多肽可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如相同或不同的接头序列，例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。在一些实施例中，本文所述的任一种单链嵌合多肽可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如相同或不同的接头序列，例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
在一些实施例中，接头序列可以具有以下总长度：1个氨基酸至约100个氨基酸，1个氨基酸至约90个氨基酸，1个氨基酸至约80个氨基酸，1个氨基酸至约70个氨基酸，1个氨基酸至约60个氨基酸，1个氨基酸至约50个氨基酸，1个氨基酸至约45个氨基酸，1个氨基酸至约40个氨基酸，1个氨基酸至约35个氨基酸，1个氨基酸至约30个氨基酸，1个氨基酸至约25个氨基酸，1个氨基酸至约24个氨基酸，1个氨基酸至约22个氨基酸，1个氨基酸至约20个氨基酸，1个氨基酸至约18个氨基酸，1个氨基酸至约16个氨基酸，1个氨基酸至约14个氨基酸，1个氨基酸至约12个氨基酸，1个氨基酸至约10个氨基酸，1个氨基酸至约8个氨基酸，1个氨基酸至约6个氨基酸，1个氨基酸至约4个氨基酸，约2个氨基酸至约100个氨基酸，约2个氨基酸至约90个氨基酸，约2个氨基酸至约80个氨基酸，约2个氨基酸至约70个氨基酸，约2个氨基酸至约60个氨基酸，约2个氨基酸至约50个氨基酸，约2个氨基酸至约45个氨基酸，约2个氨基酸至约40个氨基酸，约2个氨基酸至约35个氨基酸，约2个氨基酸至约30个氨基酸，约2个氨基酸至约25个氨基酸，约2个氨基酸至约24个氨基酸，约2个氨基酸至约22个氨基酸，约2个氨基酸至约20个氨基酸，约2个氨基酸至约18个氨基酸，约2个氨基酸至约16个氨基酸，约2个氨基酸至约14个氨基酸，约2个氨基酸至约12个氨基酸，约2个氨基酸至约10个氨基酸，约2个氨基酸至约8个氨基酸，约2个氨基酸至约6个氨基酸，约2个氨基酸至约4个氨基酸，约4个氨基酸至约100个氨基酸，约4个氨基酸至约90个氨基酸，约4个氨基酸至约80个氨基酸，约4个氨基酸至约70个氨基酸，约4个氨基酸至约60个氨基酸，约4个氨基酸至约50个氨基酸，约4个氨基酸至约45个氨基酸，约4个氨基酸至约40个氨基酸，约4个氨基酸至约35个氨基酸，约4个氨基酸至约30个氨基酸，约4个氨基酸至约25个氨基酸，约4个氨基酸至约24个氨基酸，约4个氨基酸至约22个氨基酸，约4个氨基酸至约20个氨基酸，约4个氨基酸至约18个氨基酸，约4个氨基酸至约16个氨基酸，约4个氨基酸至约14个氨基酸，约4个氨基酸至约12个氨基酸，约4个氨基酸至约10个氨基酸，约4个氨基酸至约8个氨基酸，约4个氨基酸至约6个氨基酸，约6个氨基酸至约100个氨基酸，约6个氨基酸至约90个氨基酸，约6个氨基酸至约80个氨基酸，约6个氨基酸至约70个氨基酸，约6个氨基酸至约60个氨基酸，约6个氨基酸至约50个氨基酸，约6个氨基酸至约45个氨基酸，约6个氨基酸至约40个氨基酸，约6个氨基酸至约35个氨基酸，约6个氨基酸至约30个氨基酸，约6个氨基酸至约25个氨基酸，约6个氨基酸至约24个氨基酸，约6个氨基酸至约22个氨基酸，约6个氨基酸至约20个氨基酸，约6个氨基酸至约18个氨基酸，约6个氨基酸至约16个氨基酸，约6个氨基酸至约14个氨基酸，约6个氨基酸至约12个氨基酸，约6个氨基酸至约10个氨基酸，约6个氨基酸至约8个氨基酸，约8个氨基酸至约100个氨基酸，约8个氨基酸至约90个氨基酸，约8个氨基酸至约80个氨基酸，约8个氨基酸至约70个氨基酸，约8个氨基酸至约60个氨基酸，约8个氨基酸至约50个氨基酸，约8个氨基酸至约45个氨基酸，约8个氨基酸至约40个氨基酸，约8个氨基酸至约35个氨基酸，约8个氨基酸至约30个氨基酸，约8个氨基酸至约25个氨基酸，约8个氨基酸至约24个氨基酸，约8个氨基酸至约22个氨基酸，约8个氨基酸至约20个氨基酸，约8个氨基酸至约18个氨基酸，约8个氨基酸至约16个氨基酸，约8个氨基酸至约14个氨基酸，约8个氨基酸至约12个氨基酸，约8个氨基酸至约10个氨基酸，约10个氨基酸至约100个氨基酸，约10个氨基酸至约90个氨基酸，约10个氨基酸至约80个氨基酸，约10个氨基酸至约70个氨基酸，约10个氨基酸至约60个氨基酸，约10个氨基酸至约50个氨基酸，约10个氨基酸至约45个氨基酸，约10个氨基酸至约40个氨基酸，约10个氨基酸至约35个氨基酸，约10个氨基酸至约30个氨基酸，约10个氨基酸至约25个氨基酸，约10个氨基酸至约24个氨基酸，约10个氨基酸至约22个氨基酸，约10个氨基酸至约20个氨基酸，约10个氨基酸至约18个氨基酸，约10个氨基酸至约16个氨基酸，约10个氨基酸至约14个氨基酸，约10个氨基酸至约12个氨基酸，约12个氨基酸至约100个氨基酸，约12个氨基酸至约90个氨基酸，约12个氨基酸至约80个氨基酸，约12个氨基酸至约70个氨基酸，约12个氨基酸至约60个氨基酸，约12个氨基酸至约50个氨基酸，约12个氨基酸至约45个氨基酸，约12个氨基酸至约40个氨基酸，约12个氨基酸至约35个氨基酸，约12个氨基酸至约30个氨基酸，约12个氨基酸至约25个氨基酸，约12个氨基酸至约24个氨基酸，约12个氨基酸至约22个氨基酸，约12个氨基酸至约20个氨基酸，约12个氨基酸至约18个氨基酸，约12个氨基酸至约16个氨基酸，约12个氨基酸至约14个氨基酸，约14个氨基酸至约100个氨基酸，约14个氨基酸至约90个氨基酸，约14个氨基酸至约80个氨基酸，约14个氨基酸至约70个氨基酸，约14个氨基酸至约60个氨基酸，约14个氨基酸至约50个氨基酸，约14个氨基酸至约45个氨基酸，约14个氨基酸至约40个氨基酸，约14个氨基酸至约35个氨基酸，约14个氨基酸至约30个氨基酸，约14个氨基酸至约25个氨基酸，约14个氨基酸至约24个氨基酸，约14个氨基酸至约22个氨基酸，约14个氨基酸至约20个氨基酸，约14个氨基酸至约18个氨基酸，约14个氨基酸至约16个氨基酸，约16个氨基酸至约100个氨基酸，约16个氨基酸至约90个氨基酸，约16个氨基酸至约80个氨基酸，约16个氨基酸至约70个氨基酸，约16个氨基酸至约60个氨基酸，约16个氨基酸至约50个氨基酸，约16个氨基酸至约45个氨基酸，约16个氨基酸至约40个氨基酸，约16个氨基酸至约35个氨基酸，约16个氨基酸至约30个氨基酸，约16个氨基酸至约25个氨基酸，约16个氨基酸至约24个氨基酸，约16个氨基酸至约22个氨基酸，约16个氨基酸至约20个氨基酸，约16个氨基酸至约18个氨基酸，约18个氨基酸至约100个氨基酸，约18个氨基酸至约90个氨基酸，约18个氨基酸至约80个氨基酸，约18个氨基酸至约70个氨基酸，约18个氨基酸至约60个氨基酸，约18个氨基酸至约50个氨基酸，约18个氨基酸至约45个氨基酸，约18个氨基酸至约40个氨基酸，约18个氨基酸至约35个氨基酸，约18个氨基酸至约30个氨基酸，约18个氨基酸至约25个氨基酸，约18个氨基酸至约24个氨基酸，约18个氨基酸至约22个氨基酸，约18个氨基酸至约20个氨基酸，约20个氨基酸至约100个氨基酸，约20个氨基酸至约90个氨基酸，约20个氨基酸至约80个氨基酸，约20个氨基酸至约70个氨基酸，约20个氨基酸至约60个氨基酸，约20个氨基酸至约50个氨基酸，约20个氨基酸至约45个氨基酸，约20个氨基酸至约40个氨基酸，约20个氨基酸至约35个氨基酸，约20个氨基酸至约30个氨基酸，约20个氨基酸至约25个氨基酸，约20个氨基酸至约24个氨基酸，约20个氨基酸至约22个氨基酸，约22个氨基酸至约100个氨基酸，约22个氨基酸至约90个氨基酸，约22个氨基酸至约80个氨基酸，约22个氨基酸至约70个氨基酸，约22个氨基酸至约60个氨基酸，约22个氨基酸至约50个氨基酸，约22个氨基酸至约45个氨基酸，约22个氨基酸至约40个氨基酸，约22个氨基酸至约35个氨基酸，约22个氨基酸至约30个氨基酸，约22个氨基酸至约25个氨基酸，约22个氨基酸至约24个氨基酸，约25个氨基酸至约100个氨基酸，约25个氨基酸至约90个氨基酸，约25个氨基酸至约80个氨基酸，约25个氨基酸至约70个氨基酸，约25个氨基酸至约60个氨基酸，约25个氨基酸至约50个氨基酸，约25个氨基酸至约45个氨基酸，约25个氨基酸至约40个氨基酸，约25个氨基酸至约35个氨基酸，约25个氨基酸至约30个氨基酸，约30个氨基酸至约100个氨基酸，约30个氨基酸至约90个氨基酸，约30个氨基酸至约80个氨基酸，约30个氨基酸至约70个氨基酸，约30个氨基酸至约60个氨基酸，约30个氨基酸至约50个氨基酸，约30个氨基酸至约45个氨基酸，约30个氨基酸至约40个氨基酸，约30个氨基酸至约35个氨基酸，约35个氨基酸至约100个氨基酸，约35个氨基酸至约90个氨基酸，约35个氨基酸至约80个氨基酸，约35个氨基酸至约70个氨基酸，约35个氨基酸至约60个氨基酸，约35个氨基酸至约50个氨基酸，约35个氨基酸至约45个氨基酸，约35个氨基酸至约40个氨基酸，约40个氨基酸至约100个氨基酸，约40个氨基酸至约90个氨基酸，约40个氨基酸至约80个氨基酸，约40个氨基酸至约70个氨基酸，约40个氨基酸至约60个氨基酸，约40个氨基酸至约50个氨基酸，约40个氨基酸至约45个氨基酸，约45个氨基酸至约100个氨基酸，约45个氨基酸至约90个氨基酸，约45个氨基酸至约80个氨基酸，约45个氨基酸至约70个氨基酸，约45个氨基酸至约60个氨基酸，约45个氨基酸至约50个氨基酸，约50个氨基酸至约100个氨基酸，约50个氨基酸至约90个氨基酸，约50个氨基酸至约80个氨基酸，约50个氨基酸至约70个氨基酸，约50个氨基酸至约60个氨基酸，约60个氨基酸至约100个氨基酸，约60个氨基酸至约90个氨基酸，约60个氨基酸至约80个氨基酸，约60个氨基酸至约70个氨基酸，约70个氨基酸至约100个氨基酸，约70个氨基酸至约90个氨基酸，约70个氨基酸至约80个氨基酸，约80个氨基酸至约100个氨基酸，约80个氨基酸至约90个氨基酸，或约90个氨基酸至约100个氨基酸。
在一些实施例中，接头富含甘氨酸(Gly或G)残基。在一些实施例中，接头富含丝氨酸(Ser或S)残基。在一些实施例中，接头富含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施例中，接头具有一个或多个甘氨酸-丝氨酸残基对(GS)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GS对。在一些实施例中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Ser(GGGS)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGGS序列。在一些实施例中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGGGS序列。在一些实施例中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Ser-Gly(GGSG)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGSG序列。
在一些实施例中，接头序列可包含以下或由以下组成：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:13)。在一些实施例中，接头序列可由包含以下或由以下组成的核酸编码：GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，接头序列可以包含或由GGGSGGGS(SEQ ID NO:15)组成。
靶标结合域
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和/或另外的一个或多个靶标结合域可以是抗原结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性抗原结合域)、可溶性白介素或细胞因子蛋白(例如本文所述的任一种示例性可溶性白介素蛋白或可溶性细胞因子蛋白)，以及可溶性白介素或细胞因子受体(例如本文所述的任一种示例性可溶性白介素受体或可溶性细胞因子受体)。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性第一靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性第二靶标结合域)和一个或多个其它靶标结合域中的一个或多个能够独立地各自特异性地结合到选自由以下组成的群组的靶标：CD16a、CD28、CD3(例如CD3α、
Figure BDA0003044956670000481
CD3δ、
Figure BDA0003044956670000482
和CD3...中的一个或多个)、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26a、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白(例如ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6)、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体，和CD28的受体。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和/或一个或多个其它靶标结合域可以独立地各自具有以下氨基酸总数：约5个氨基酸至约1000个氨基酸，约5个氨基酸至约950个氨基酸，约5个氨基酸至约900个氨基酸，约5个氨基酸至约850个氨基酸，约5个氨基酸至约800个氨基酸，约5个氨基酸至约750个氨基酸，约5个氨基酸至约700个氨基酸，约5个氨基酸至约650个氨基酸，约5个氨基酸至约600个氨基酸，约5个氨基酸至约550个氨基酸，约5个氨基酸至约500个氨基酸，约5个氨基酸至约450个氨基酸，约5个氨基酸至约400个氨基酸，约5个氨基酸至约350个氨基酸，约5个氨基酸至约300个氨基酸，约5个氨基酸至约280个氨基酸，约5个氨基酸至约260个氨基酸，约5个氨基酸至约240个氨基酸，约5个氨基酸至约220个氨基酸，约5个氨基酸至约200个氨基酸，约5个氨基酸至约195个氨基酸，约5个氨基酸至约190个氨基酸，约5个氨基酸至约185个氨基酸，约5个氨基酸至约180个氨基酸，约5个氨基酸至约175个氨基酸，约5个氨基酸至约170个氨基酸，约5个氨基酸至约165个氨基酸，约5个氨基酸至约160个氨基酸，约5个氨基酸至约155个氨基酸，约5个氨基酸至约150个氨基酸，约5个氨基酸至约145个氨基酸，约5个氨基酸至约140个氨基酸，约5个氨基酸至约135个氨基酸，约5个氨基酸至约130个氨基酸，约5个氨基酸至约125个氨基酸，约5个氨基酸至约120个氨基酸，约5个氨基酸至约115个氨基酸，约5个氨基酸至约110个氨基酸，约5个氨基酸至约105个氨基酸，约5个氨基酸至约100个氨基酸，约5个氨基酸至约95个氨基酸，约5个氨基酸至约90个氨基酸，约5个氨基酸至约85个氨基酸，约5个氨基酸至约80个氨基酸，约5个氨基酸至约75个氨基酸，约5个氨基酸至约70个氨基酸，约5个氨基酸至约65个氨基酸，约5个氨基酸至约60个氨基酸，约5个氨基酸至约55个氨基酸，约5个氨基酸至约50个氨基酸，约5个氨基酸至约45个氨基酸，约5个氨基酸至约40个氨基酸，约5个氨基酸至约35个氨基酸，约5个氨基酸至约30个氨基酸，约5个氨基酸至约25个氨基酸，约5个氨基酸至约20个氨基酸，约5个氨基酸至约15个氨基酸，约5个氨基酸至约10个氨基酸，约10个氨基酸至约1000个氨基酸，约10个氨基酸至约950个氨基酸，约10个氨基酸至约900个氨基酸，约10个氨基酸至约850个氨基酸，约10个氨基酸至约800个氨基酸，约10个氨基酸至约750个氨基酸，约10个氨基酸至约700个氨基酸，约10个氨基酸至约650个氨基酸，约10个氨基酸至约600个氨基酸，约10个氨基酸至约550个氨基酸，约10个氨基酸至约500个氨基酸，约10个氨基酸至约450个氨基酸，约10个氨基酸至约400个氨基酸，约10个氨基酸至约350个氨基酸，约10个氨基酸至约300个氨基酸，约10个氨基酸至约280个氨基酸，约10个氨基酸至约260个氨基酸，约10个氨基酸至约240个氨基酸，约10个氨基酸至约220个氨基酸，约10个氨基酸至约200个氨基酸，约10个氨基酸至约195个氨基酸，约10个氨基酸至约190个氨基酸，约10个氨基酸至约185个氨基酸，约10个氨基酸至约180个氨基酸，约10个氨基酸至约175个氨基酸，约10个氨基酸至约170个氨基酸，约10个氨基酸至约165个氨基酸，约10个氨基酸至约160个氨基酸，约10个氨基酸至约155个氨基酸，约10个氨基酸至约150个氨基酸，约10个氨基酸至约145个氨基酸，约10个氨基酸至约140个氨基酸，约10个氨基酸至约135个氨基酸，约10个氨基酸至约130个氨基酸，约10个氨基酸至约125个氨基酸，约10个氨基酸至约120个氨基酸，约10个氨基酸至约115个氨基酸，约10个氨基酸至约110个氨基酸，约10个氨基酸至约105个氨基酸，约10个氨基酸至约100个氨基酸，约10个氨基酸至约95个氨基酸，约10个氨基酸至约90个氨基酸，约10个氨基酸至约85个氨基酸，约10个氨基酸至约80个氨基酸，约10个氨基酸至约75个氨基酸，约10个氨基酸至约70个氨基酸，约10个氨基酸至约65个氨基酸，约10个氨基酸至约60个氨基酸，约10个氨基酸至约55个氨基酸，约10个氨基酸至约50个氨基酸，约10个氨基酸至约45个氨基酸，约10个氨基酸至约40个氨基酸，约10个氨基酸至约35个氨基酸，约10个氨基酸至约30个氨基酸，约10个氨基酸至约25个氨基酸，约10个氨基酸至约20个氨基酸，约10个氨基酸至约15个氨基酸，约15个氨基酸至约1000个氨基酸，约15个氨基酸至约950个氨基酸，约15个氨基酸至约900个氨基酸，约15个氨基酸至约850个氨基酸，约15个氨基酸至约800个氨基酸，约15个氨基酸至约750个氨基酸，约15个氨基酸至约700个氨基酸，约15个氨基酸至约650个氨基酸，约15个氨基酸至约600个氨基酸，约15个氨基酸至约550个氨基酸，约15个氨基酸至约500个氨基酸，约15个氨基酸至约450个氨基酸，约15个氨基酸至约400个氨基酸，约15个氨基酸至约350个氨基酸，约15个氨基酸至约300个氨基酸，约15个氨基酸至约280个氨基酸，约15个氨基酸至约260个氨基酸，约15个氨基酸至约240个氨基酸，约15个氨基酸至约220个氨基酸，约15个氨基酸至约200个氨基酸，约15个氨基酸至约195个氨基酸，约15个氨基酸至约190个氨基酸，约15个氨基酸至约185个氨基酸，约15个氨基酸至约180个氨基酸，约15个氨基酸至约175个氨基酸，约15个氨基酸至约170个氨基酸，约15个氨基酸至约165个氨基酸，约15个氨基酸至约160个氨基酸，约15个氨基酸至约155个氨基酸，约15个氨基酸至约150个氨基酸，约15个氨基酸至约145个氨基酸，约15个氨基酸至约140个氨基酸，约15个氨基酸至约135个氨基酸，约15个氨基酸至约130个氨基酸，约15个氨基酸至约125个氨基酸，约15个氨基酸至约120个氨基酸，约15个氨基酸至约115个氨基酸，约15个氨基酸至约110个氨基酸，约15个氨基酸至约105个氨基酸，约15个氨基酸至约100个氨基酸，约15个氨基酸至约95个氨基酸，约15个氨基酸至约90个氨基酸，约15个氨基酸至约85个氨基酸，约15个氨基酸至约80个氨基酸，约15个氨基酸至约75个氨基酸，约15个氨基酸至约70个氨基酸，约15个氨基酸至约65个氨基酸，约15个氨基酸至约60个氨基酸，约15个氨基酸至约55个氨基酸，约15个氨基酸至约50个氨基酸，约15个氨基酸至约45个氨基酸，约15个氨基酸至约40个氨基酸，约15个氨基酸至约35个氨基酸，约15个氨基酸至约30个氨基酸，约15个氨基酸至约25个氨基酸，约15个氨基酸至约20个氨基酸，约20个氨基酸至约1000个氨基酸，约20个氨基酸至约950个氨基酸，约20个氨基酸至约900个氨基酸，约20个氨基酸至约850个氨基酸，约20个氨基酸至约800个氨基酸，约20个氨基酸至约750个氨基酸，约20个氨基酸至约700个氨基酸，约20个氨基酸至约650个氨基酸，约20个氨基酸至约600个氨基酸，约20个氨基酸至约550个氨基酸，约20个氨基酸至约500个氨基酸，约20个氨基酸至约450个氨基酸，约20个氨基酸至约400个氨基酸，约20个氨基酸至约350个氨基酸，约20个氨基酸至约300个氨基酸，约20个氨基酸至约280个氨基酸，约20个氨基酸至约260个氨基酸，约20个氨基酸至约240个氨基酸，约20个氨基酸至约220个氨基酸，约20个氨基酸至约200个氨基酸，约20个氨基酸至约195个氨基酸，约20个氨基酸至约190个氨基酸，约20个氨基酸至约185个氨基酸，约20个氨基酸至约180个氨基酸，约20个氨基酸至约175个氨基酸，约20个氨基酸至约170个氨基酸，约20个氨基酸至约165个氨基酸，约20个氨基酸至约160个氨基酸，约20个氨基酸至约155个氨基酸，约20个氨基酸至约150个氨基酸，约20个氨基酸至约145个氨基酸，约20个氨基酸至约140个氨基酸，约20个氨基酸至约135个氨基酸，约20个氨基酸至约130个氨基酸，约20个氨基酸至约125个氨基酸，约20个氨基酸至约120个氨基酸，约20个氨基酸至约115个氨基酸，约20个氨基酸至约110个氨基酸，约20个氨基酸至约105个氨基酸，约20个氨基酸至约100个氨基酸，约20个氨基酸至约95个氨基酸，约20个氨基酸至约90个氨基酸，约20个氨基酸至约85个氨基酸，约20个氨基酸至约80个氨基酸，约20个氨基酸至约75个氨基酸，约20个氨基酸至约70个氨基酸，约20个氨基酸至约65个氨基酸，约20个氨基酸至约60个氨基酸，约20个氨基酸至约55个氨基酸，约20个氨基酸至约50个氨基酸，约20个氨基酸至约45个氨基酸，约20个氨基酸至约40个氨基酸，约20个氨基酸至约35个氨基酸，约20个氨基酸至约30个氨基酸，约20个氨基酸至约25个氨基酸，约25个氨基酸至约1000个氨基酸，约25个氨基酸至约950个氨基酸，约25个氨基酸至约900个氨基酸，约25个氨基酸至约850个氨基酸，约25个氨基酸至约800个氨基酸，约25个氨基酸至约750个氨基酸，约25个氨基酸至约700个氨基酸，约25个氨基酸至约650个氨基酸，约25个氨基酸至约600个氨基酸，约25个氨基酸至约550个氨基酸，约25个氨基酸至约500个氨基酸，约25个氨基酸至约450个氨基酸，约25个氨基酸至约400个氨基酸，约25个氨基酸至约350个氨基酸，约25个氨基酸至约300个氨基酸，约25个氨基酸至约280个氨基酸，约25个氨基酸至约260个氨基酸，约25个氨基酸至约240个氨基酸，约25个氨基酸至约220个氨基酸，约25个氨基酸至约200个氨基酸，约25个氨基酸至约195个氨基酸，约25个氨基酸至约190个氨基酸，约25个氨基酸至约185个氨基酸，约25个氨基酸至约180个氨基酸，约25个氨基酸至约175个氨基酸，约25个氨基酸至约170个氨基酸，约25个氨基酸至约165个氨基酸，约25个氨基酸至约160个氨基酸，约25个氨基酸至约155个氨基酸，约25个氨基酸至约150个氨基酸，约25个氨基酸至约145个氨基酸，约25个氨基酸至约140个氨基酸，约25个氨基酸至约135个氨基酸，约25个氨基酸至约130个氨基酸，约25个氨基酸至约125个氨基酸，约25个氨基酸至约120个氨基酸，约25个氨基酸至约115个氨基酸，约25个氨基酸至约110个氨基酸，约25个氨基酸至约105个氨基酸，约25个氨基酸至约100个氨基酸，约25个氨基酸至约95个氨基酸，约25个氨基酸至约90个氨基酸，约25个氨基酸至约85个氨基酸，约25个氨基酸至约80个氨基酸，约25个氨基酸至约75个氨基酸，约25个氨基酸至约70个氨基酸，约25个氨基酸至约65个氨基酸，约25个氨基酸至约60个氨基酸，约25个氨基酸至约55个氨基酸，约25个氨基酸至约50个氨基酸，约25个氨基酸至约45个氨基酸，约25个氨基酸至约40个氨基酸，约25个氨基酸至约35个氨基酸，约25个氨基酸至约30个氨基酸，约30个氨基酸至约1000个氨基酸，约30个氨基酸至约950个氨基酸，约30个氨基酸至约900个氨基酸，约30个氨基酸至约850个氨基酸，约30个氨基酸至约800个氨基酸，约30个氨基酸至约750个氨基酸，约30个氨基酸至约700个氨基酸，约30个氨基酸至约650个氨基酸，约30个氨基酸至约600个氨基酸，约30个氨基酸至约550个氨基酸，约30个氨基酸至约500个氨基酸，约30个氨基酸至约450个氨基酸，约30个氨基酸至约400个氨基酸，约30个氨基酸至约350个氨基酸，约30个氨基酸至约300个氨基酸，约30个氨基酸至约280个氨基酸，约30个氨基酸至约260个氨基酸，约30个氨基酸至约240个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至约400个氨基酸，约180个氨基酸至约350个氨基酸，约180个氨基酸至约300个氨基酸，约180个氨基酸至约280个氨基酸，约180个氨基酸至约260个氨基酸，约180个氨基酸至约240个氨基酸，约180个氨基酸至约220个氨基酸，约180个氨基酸至约200个氨基酸，约180个氨基酸至约195个氨基酸，约180个氨基酸至约190个氨基酸，约180个氨基酸至约185个氨基酸，约185个氨基酸至约1000个氨基酸，约185个氨基酸至约950个氨基酸，约185个氨基酸至约900个氨基酸，约185个氨基酸至约850个氨基酸，约185个氨基酸至约800个氨基酸，约185个氨基酸至约750个氨基酸，约185个氨基酸至约700个氨基酸，约185个氨基酸至约650个氨基酸，约185个氨基酸至约600个氨基酸，约185个氨基酸至约550个氨基酸，约185个氨基酸至约500个氨基酸，约185个氨基酸至约450个氨基酸，约185个氨基酸至约400个氨基酸，约185个氨基酸至约350个氨基酸，约185个氨基酸至约300个氨基酸，约185个氨基酸至约280个氨基酸，约185个氨基酸至约260个氨基酸，约185个氨基酸至约240个氨基酸，约185个氨基酸至约220个氨基酸，约185个氨基酸至约200个氨基酸，约185个氨基酸至约195个氨基酸，约185个氨基酸至约190个氨基酸，约190个氨基酸至约1000个氨基酸，约190个氨基酸至约950个氨基酸，约190个氨基酸至约900个氨基酸，约190个氨基酸至约850个氨基酸，约190个氨基酸至约800个氨基酸，约190个氨基酸至约750个氨基酸，约190个氨基酸至约700个氨基酸，约190个氨基酸至约650个氨基酸，约190个氨基酸至约600个氨基酸，约190个氨基酸至约550个氨基酸，约190个氨基酸至约500个氨基酸，约190个氨基酸至约450个氨基酸，约190个氨基酸至约400个氨基酸，约190个氨基酸至约350个氨基酸，约190个氨基酸至约300个氨基酸，约190个氨基酸至约280个氨基酸，约190个氨基酸至约260个氨基酸，约190个氨基酸至约240个氨基酸，约190个氨基酸至约220个氨基酸，约190个氨基酸至约200个氨基酸，约190个氨基酸至约195个氨基酸，约195个氨基酸至约1000个氨基酸，约195个氨基酸至约950个氨基酸，约195个氨基酸至约900个氨基酸，约195个氨基酸至约850个氨基酸，约195个氨基酸至约800个氨基酸，约195个氨基酸至约750个氨基酸，约195个氨基酸至约700个氨基酸，约195个氨基酸至约650个氨基酸，约195个氨基酸至约600个氨基酸，约195个氨基酸至约550个氨基酸，约195个氨基酸至约500个氨基酸，约195个氨基酸至约450个氨基酸，约195个氨基酸至约400个氨基酸，约195个氨基酸至约350个氨基酸，约195个氨基酸至约300个氨基酸，约195个氨基酸至约280个氨基酸，约195个氨基酸至约260个氨基酸，约195个氨基酸至约240个氨基酸，约195个氨基酸至约220个氨基酸，约195个氨基酸至约200个氨基酸，约200个氨基酸至约1000个氨基酸，约200个氨基酸至约950个氨基酸，约200个氨基酸至约900个氨基酸，约200个氨基酸至约850个氨基酸，约200个氨基酸至约800个氨基酸，约200个氨基酸至约750个氨基酸，约200个氨基酸至约700个氨基酸，约200个氨基酸至约650个氨基酸，约200个氨基酸至约600个氨基酸，约200个氨基酸至约550个氨基酸，约200个氨基酸至约500个氨基酸，约200个氨基酸至约450个氨基酸，约200个氨基酸至约400个氨基酸，约200个氨基酸至约350个氨基酸，约200个氨基酸至约300个氨基酸，约200个氨基酸至约280个氨基酸，约200个氨基酸至约260个氨基酸，约200个氨基酸至约240个氨基酸，约200个氨基酸至约220个氨基酸，约220个氨基酸至约1000个氨基酸，约220个氨基酸至约950个氨基酸，约220个氨基酸至约900个氨基酸，约220个氨基酸至约850个氨基酸，约220个氨基酸至约800个氨基酸，约220个氨基酸至约750个氨基酸，约220个氨基酸至约700个氨基酸，约220个氨基酸至约650个氨基酸，约220个氨基酸至约600个氨基酸，约220个氨基酸至约550个氨基酸，约220个氨基酸至约500个氨基酸，约220个氨基酸至约450个氨基酸，约220个氨基酸至约400个氨基酸，约220个氨基酸至约350个氨基酸，约220个氨基酸至约300个氨基酸，约220个氨基酸至约280个氨基酸，约220个氨基酸至约260个氨基酸，约220个氨基酸至约240个氨基酸，约240个氨基酸至约1000个氨基酸，约240个氨基酸至约950个氨基酸，约240个氨基酸至约900个氨基酸，约240个氨基酸至约850个氨基酸，约240个氨基酸至约800个氨基酸，约240个氨基酸至约750个氨基酸，约240个氨基酸至约700个氨基酸，约240个氨基酸至约650个氨基酸，约240个氨基酸至约600个氨基酸，约240个氨基酸至约550个氨基酸，约240个氨基酸至约500个氨基酸，约240个氨基酸至约450个氨基酸，约240个氨基酸至约400个氨基酸，约240个氨基酸至约350个氨基酸，约240个氨基酸至约300个氨基酸，约240个氨基酸至约280个氨基酸，约240个氨基酸至约260个氨基酸，约260个氨基酸至约1000个氨基酸，约260个氨基酸至约950个氨基酸，约260个氨基酸至约900个氨基酸，约260个氨基酸至约850个氨基酸，约260个氨基酸至约800个氨基酸，约260个氨基酸至约750个氨基酸，约260个氨基酸至约700个氨基酸，约260个氨基酸至约650个氨基酸，约260个氨基酸至约600个氨基酸，约260个氨基酸至约550个氨基酸，约260个氨基酸至约500个氨基酸，约260个氨基酸至约450个氨基酸，约260个氨基酸至约400个氨基酸，约260个氨基酸至约350个氨基酸，约260个氨基酸至约300个氨基酸，约260个氨基酸至约280个氨基酸，约280个氨基酸至约1000个氨基酸，约280个氨基酸至约950个氨基酸，约280个氨基酸至约900个氨基酸，约280个氨基酸至约850个氨基酸，约280个氨基酸至约800个氨基酸，约280个氨基酸至约750个氨基酸，约280个氨基酸至约700个氨基酸，约280个氨基酸至约650个氨基酸，约280个氨基酸至约600个氨基酸，约280个氨基酸至约550个氨基酸，约280个氨基酸至约500个氨基酸，约280个氨基酸至约450个氨基酸，约280个氨基酸至约400个氨基酸，约280个氨基酸至约350个氨基酸，约280个氨基酸至约300个氨基酸，约300个氨基酸至约1000个氨基酸，约300个氨基酸至约950个氨基酸，约300个氨基酸至约900个氨基酸，约300个氨基酸至约850个氨基酸，约300个氨基酸至约800个氨基酸，约300个氨基酸至约750个氨基酸，约300个氨基酸至约700个氨基酸，约300个氨基酸至约650个氨基酸，约300个氨基酸至约600个氨基酸，约300个氨基酸至约550个氨基酸，约300个氨基酸至约500个氨基酸，约300个氨基酸至约450个氨基酸，约300个氨基酸至约400个氨基酸，约300个氨基酸至约350个氨基酸，约350个氨基酸至约1000个氨基酸，约350个氨基酸至约950个氨基酸，约350个氨基酸至约900个氨基酸，约350个氨基酸至约850个氨基酸，约350个氨基酸至约800个氨基酸，约350个氨基酸至约750个氨基酸，约350个氨基酸至约700个氨基酸，约350个氨基酸至约650个氨基酸，约350个氨基酸至约600个氨基酸，约350个氨基酸至约550个氨基酸，约350个氨基酸至约500个氨基酸，约350个氨基酸至约450个氨基酸，约350个氨基酸至约400个氨基酸，约400个氨基酸至约1000个氨基酸，约400个氨基酸至约950个氨基酸，约400个氨基酸至约900个氨基酸，约400个氨基酸至约850个氨基酸，约400个氨基酸至约800个氨基酸，约400个氨基酸至约750个氨基酸，约400个氨基酸至约700个氨基酸，约400个氨基酸至约650个氨基酸，约400个氨基酸至约600个氨基酸，约400个氨基酸至约550个氨基酸，约400个氨基酸至约500个氨基酸，约400个氨基酸至约450个氨基酸，约450个氨基酸至约1000个氨基酸，约450个氨基酸至约950个氨基酸，约450个氨基酸至约900个氨基酸，约450个氨基酸至约850个氨基酸，约450个氨基酸至约800个氨基酸，约450个氨基酸至约750个氨基酸，约450个氨基酸至约700个氨基酸，约450个氨基酸至约650个氨基酸，约450个氨基酸至约600个氨基酸，约450个氨基酸至约550个氨基酸，约450个氨基酸至约500个氨基酸，约500个氨基酸至约1000个氨基酸，约500个氨基酸至约950个氨基酸，约500个氨基酸至约900个氨基酸，约500个氨基酸至约850个氨基酸，约500个氨基酸至约800个氨基酸，约500个氨基酸至约750个氨基酸，约500个氨基酸至约700个氨基酸，约500个氨基酸至约650个氨基酸，约500个氨基酸至约600个氨基酸，约500个氨基酸至约550个氨基酸，约550个氨基酸至约1000个氨基酸，约550个氨基酸至约950个氨基酸，约550个氨基酸至约900个氨基酸，约550个氨基酸至约850个氨基酸，约550个氨基酸至约800个氨基酸，约550个氨基酸至约750个氨基酸，约550个氨基酸至约700个氨基酸，约550个氨基酸至约650个氨基酸，约550个氨基酸至约600个氨基酸，约600个氨基酸至约1000个氨基酸，约600个氨基酸至约950个氨基酸，约600个氨基酸至约900个氨基酸，约600个氨基酸至约850个氨基酸，约600个氨基酸至约800个氨基酸，约600个氨基酸至约750个氨基酸，约600个氨基酸至约700个氨基酸，约600个氨基酸至约650个氨基酸，约650个氨基酸至约1000个氨基酸，约650个氨基酸至约950个氨基酸，约650个氨基酸至约900个氨基酸，约650个氨基酸至约850个氨基酸，约650个氨基酸至约800个氨基酸，约650个氨基酸至约750个氨基酸，约650个氨基酸至约700个氨基酸，约700个氨基酸至约1000个氨基酸，约700个氨基酸至约950个氨基酸，约700个氨基酸至约900个氨基酸，约700个氨基酸至约850个氨基酸，约700个氨基酸至约800个氨基酸，约700个氨基酸至约750个氨基酸，约750个氨基酸至约1000个氨基酸，约750个氨基酸至约950个氨基酸，约750个氨基酸至约900个氨基酸，约750个氨基酸至约850个氨基酸，约750个氨基酸至约800个氨基酸，约800个氨基酸至约1000个氨基酸，约800个氨基酸至约950个氨基酸，约800个氨基酸至约900个氨基酸，约800个氨基酸至约850个氨基酸，约850个氨基酸至约1000个氨基酸，约850个氨基酸至约950个氨基酸，约850个氨基酸至约900个氨基酸，约900个氨基酸至约1000个氨基酸，约900个氨基酸至约950个氨基酸，或约950个氨基酸至约1000个氨基酸。
本文所述的任一种靶标结合域能够以小于1×10-7M、小于1×10-8M、小于1×10-9M、小于1×10-10M、小于1×10-11M、小于1×10-12M或小于1×10-13M的解离平衡常数(KD)结合到其靶标。在一些实施例中，本文提供的抗原结合蛋白构建体能够以约1×10-3M至约1×10- 5M、约1×10-4M至约1×10-6M、约1×10-5M至约1×10-7M、约1×10-6M至约1×10-8M、约1×10-7M至约1×10-9M、约1×10-8M至约1×10-10M，或约1×10-9M至约1×10-11M(包括端点)的KD结合到鉴定的抗原。
本文所述的任一种靶标结合域能够结合到其靶标，其KD在约1pM至约30nM之间(例如约1pM至约25nM，约1pM至约20nM，约1pM至约15nM，约1pM至约10nM，约1pM至约5nM，约1pM至约2nM，约1pM至约1nM，约1pM至约950pM，约1pM至约900pM，约1pM至约850pM，约1pM至约800pM，约1pM至约750pM，约1pM至约700pM，约1pM至约650pM，约1pM至约600pM，约1pM至约550pM，约1pM至约500pM，约1pM至约450pM，约1pM至约400pM，约1pM至约350pM，约1pM至约300pM，约1pM至约250pM，约1pM至约200pM，约1pM至约150pM，约1pM至约100pM，约1pM至约90pM，约1pM至约80pM，约1pM至约70pM，约1pM至约60pM，约1pM至约50pM，约1pM至约40pM，约1pM至约30pM，约1pM至约20pM，约1pM至约10pM，约1pM至约5pM，约1pM至约4pM，约1pM至约3pM，约1pM至约2pM，约2pM至约30nM，约2pM至约25nM，约2pM至约20nM，约2pM至约15nM，约2pM至约10nM，约2pM至约5nM，约2pM至约2nM，约2pM至约1nM，约2pM至约950pM，约2pM至约900pM，约2pM至约850pM，约2pM至约800pM，约2pM至约750pM，约2pM至约700pM，约2pM至约650pM，约2pM至约600pM，约2pM至约550pM，约2pM至约500pM，约2pM至约450pM，约2pM至约400pM，约2pM至约350pM，约2pM至约300pM，约2pM至约250pM，约2pM至约200pM，约2pM至约150pM，约2pM至约100pM，约2pM至约90pM，约2pM至约80pM，约2pM至约70pM，约2pM至约60pM，约2pM至约50pM，约2pM至约40pM，约2pM至约30pM，约2pM至约20pM，约2pM至约10pM，约2pM至约5pM，约2pM至约4pM，约2pM至约3pM，约5pM至约30nM，约5pM至约25nM，约5pM至约20nM，约5pM至约15nM，约5pM至约10nM，约5pM至约5nM，约5pM至约2nM，约5pM至约1nM，约5pM至约950pM，约5pM至约900pM，约5pM至约850pM，约5pM至约800pM，约5pM至约750pM，约5pM至约700pM，约5pM至约650pM，约5pM至约600pM，约5pM至约550pM，约5pM至约500pM，约5pM至约450pM，约5pM至约400pM，约5pM至约350pM，约5pM至约300pM，约5pM至约250pM，约5pM至约200pM，约5pM至约150pM，约5pM至约100pM，约5pM至约90pM，约5pM至约80pM，约5pM至约70pM，约5pM至约60pM，约5pM至约50pM，约5pM至约40pM，约5pM至约30pM，约5pM至约20pM，约5pM至约10pM，约10pM至约30nM，约10pM至约25nM，约10pM至约20nM，约10pM至约15nM，约10pM至约10nM，约10pM至约5nM，约10pM至约2nM，约10pM至约1nM，约10pM至约950pM，约10pM至约900pM，约10pM至约850pM，约10pM至约800pM，约10pM至约750pM，约10pM至约700pM，约10pM至约650pM，约10pM至约600pM，约10pM至约550pM，约10pM至约500pM，约10pM至约450pM，约10pM至约400pM，约10pM至约350pM，约10pM至约300pM，约10pM至约250pM，约10pM至约200pM，约10pM至约150pM，约10pM至约100pM，约10pM至约90pM，约10pM至约80pM，约10pM至约70pM，约10pM至约60pM，约10pM至约50pM，约10pM至约40pM，约10pM至约30pM，约10pM至约20pM，约15pM至约30nM，约15pM至约25nM，约15pM至约20nM，约15pM至约15nM，约15pM至约10nM，约15pM至约5nM，约15pM至约2nM，约15pM至约1nM，约15pM至约950pM，约15pM至约900pM，约15pM至约850pM，约15pM至约800pM，约15pM至约750pM，约15pM至约700pM，约15pM至约650pM，约15pM至约600pM，约15pM至约550pM，约15pM至约500pM，约15pM至约450pM，约15pM至约400pM，约15pM至约350pM，约15pM至约300pM，约15pM至约250pM，约15pM至约200pM，约15pM至约150pM，约15pM至约100pM，约15pM至约90pM，约15pM至约80pM，约15pM至约70pM，约15pM至约60pM，约15pM至约50pM，约15pM至约40pM，约15pM至约30pM，约15pM至约20pM，约20pM至约30nM，约20pM至约25nM，约20pM至约20nM，约20pM至约15nM，约20pM至约10nM，约20pM至约5nM，约20pM至约2nM，约20pM至约1nM，约20pM至约950pM，约20pM至约900pM，约20pM至约850pM，约20pM至约800pM，约20pM至约750pM，约20pM至约700pM，约20pM至约650pM，约20pM至约600pM，约20pM至约550pM，约20pM至约500pM，约20pM至约450pM，约20pM至约400pM，约20pM至约350pM，约20pM至约300pM，约20pM至约250pM，约20pM至约20pM，约200pM至约150pM，约20pM至约100pM，约20pM至约90pM，约20pM至约80pM，约20pM至约70pM，约20pM至约60pM，约20pM至约50pM，约20pM至约40pM，约20pM至约30pM，约30pM至约30nM，约30pM至约25nM，约30pM至约30nM，约30pM至约15nM，约30pM至约10nM，约30pM至约5nM，约30pM至约2nM，约30pM至约1nM，约30pM至约950pM，约30pM至约900pM，约30pM至约850pM，约30pM至约800pM，约30pM至约750pM，约30pM至约700pM，约30pM至约650pM，约30pM至约600pM，约30pM至约550pM，约30pM至约500pM，约30pM至约450pM，约30pM至约400pM，约30pM至约350pM，约30pM至约300pM，约30pM至约250pM，约30pM至约200pM，约30pM至约150pM，约30pM至约100pM，约30pM至约90pM，约30pM至约80pM，约30pM至约70pM，约30pM至约60pM，约30pM至约50pM，约30pM至约40pM，约40pM至约30nM，约40pM至约25nM，约40pM至约30nM，约40pM至约15nM，约40pM至约10nM，约40pM至约5nM，约40pM至约2nM，约40pM至约1nM，约40pM至约950pM，约40pM至约900pM，约40pM至约850pM，约40pM至约800pM，约40pM至约750pM，约40pM至约700pM，约40pM至约650pM，约40pM至约600pM，约40pM至约550pM，约40pM至约500pM，约40pM至约450pM，约40pM至约400pM，约40pM至约350pM，约40pM至约300pM，约40pM至约250pM，约40pM至约200pM，约40pM至约150pM，约40pM至约100pM，约40pM至约90pM，约40pM至约80pM，约40pM至约70pM，约40pM至约60pM，约40pM至约50pM，约50pM至约30nM，约50pM至约25nM，约50pM至约30nM，约50pM至约15nM，约50pM至约10nM，约50pM至约5nM，约50pM至约2nM，约50pM至约1nM，约50pM至约950pM，约50pM至约900pM，约50pM至约850pM，约50pM至约800pM，约50pM至约750pM，约50pM至约700pM，约50pM至约650pM，约50pM至约600pM，约50pM至约550pM，约50pM至约500pM，约50pM至约450pM，约50pM至约400pM，约50pM至约350pM，约50pM至约300pM，约50pM至约250pM，约50pM至约200pM，约50pM至约150pM，约50pM至约100pM，约50pM至约90pM，约50pM至约80pM，约50pM至约70pM，约50pM至约60pM，约60pM至约30nM，约60pM至约25nM，约60pM至约30nM，约60pM至约15nM，约60pM至约10nM，约60pM至约5nM，约60pM至约2nM，约60pM至约1nM，约60pM至约950pM，约60pM至约900pM，约60pM至约850pM，约60pM至约800pM，约60pM至约750pM，约60pM至约700pM，约60pM至约650pM，约60pM至约600pM，约60pM至约550pM，约60pM至约500pM，约60pM至约450pM，约60pM至约400pM，约60pM至约350pM，约60pM至约300pM，约60pM至约250pM，约60pM至约200pM，约60pM至约150pM，约60pM至约100pM，约60pM至约90pM，约60pM至约80pM，约60pM至约70pM，约70pM至约30nM，约70pM至约25nM，约70pM至约30nM，约70pM至约15nM，约70pM至约10nM，约70pM至约5nM，约70pM至约2nM，约70pM至约1nM，约70pM至约950pM，约70pM至约900pM，约70pM至约850pM，约70pM至约800pM，约70pM至约750pM，约70pM至约700pM，约70pM至约650pM，约70pM至约600pM，约70pM至约550pM，约70pM至约500pM，约70pM至约450pM，约70pM至约400pM，约70pM至约350pM，约70pM至约300pM，约70pM至约250pM，约70pM至约200pM，约70pM至约150pM，约70pM至约100pM，约70pM至约90pM，约70pM至约80pM，约80pM至约30nM，约80pM至约25nM，约80pM至约30nM，约80pM至约15nM，约80pM至约10nM，约80pM至约5nM，约80pM至约2nM，约80pM至约1nM，约80pM至约950pM，约80pM至约900pM，约80pM至约850pM，约80pM至约800pM，约80pM至约750pM，约80pM至约700pM，约80pM至约650pM，约80pM至约600pM，约80pM至约550pM，约80pM至约500pM，约80pM至约450pM，约80pM至约400pM，约80pM至约350pM，约80pM至约300pM，约80pM至约250pM，约80pM至约200pM，约80pM至约150pM，约80pM至约100pM，约80pM至约90pM，约90pM至约30nM，约90pM至约25nM，约90pM至约30nM，约90pM至约15nM，约90pM至约10nM，约90pM至约5nM，约90pM至约2nM，约90pM至约1nM，约90pM至约950pM，约90pM至约900pM，约90pM至约850pM，约90pM至约800pM，约90pM至约750pM，约90pM至约700pM，约90pM至约650pM，约90pM至约600pM，约90pM至约550pM，约90pM至约500pM，约90pM至约450pM，约90pM至约400pM，约90pM至约350pM，约90pM至约300pM，约90pM至约250pM，约90pM至约200pM，约90pM至约150pM，约90pM至约100pM，约100pM至约30nM，约100pM至约25nM，约100pM至约30nM，约100pM至约15nM，约100pM至约10nM，约100pM至约5nM，约100pM至约2nM，约100pM至约1nM，约100pM至约950pM，约100pM至约900pM，约100pM至约850pM，约100pM至约800pM，约100pM至约750pM，约100pM至约700pM，约100pM至约650pM，约100pM至约600pM，约100pM至约550pM，约100pM至约500pM，约100pM至约450pM，约100pM至约400pM，约100pM至约350pM，约100pM至约300pM，约100pM至约250pM，约100pM至约200pM，约100pM至约150pM，约150pM至约30nM，约150pM至约25nM，约150pM至约30nM，约150pM至约15nM，约150pM至约10nM，约150pM至约5nM，约150pM至约2nM，约150pM至约1nM，约150pM至约950pM，约150pM至约900pM，约150pM至约850pM，约150pM至约800pM，约150pM至约750pM，约150pM至约700pM，约150pM至约650pM，约150pM至约600pM，约150pM至约550pM，约150pM至约500pM，约150pM至约450pM，约150pM至约400pM，约150pM至约350pM，约150pM至约300pM，约150pM至约250pM，约150pM至约200pM，约200pM至约30nM，约200pM至约25nM，约200pM至约30nM，约200pM至约15nM，约200pM至约10nM，约200pM至约5nM，约200pM至约2nM，约200pM至约1nM，约200pM至约950pM，约200pM至约900pM，约200pM至约850pM，约200pM至约800pM，约200pM至约750pM，约200pM至约700pM，约200pM至约650pM，约200pM至约600pM，约200pM至约550pM，约200pM至约500pM，约200pM至约450pM，约200pM至约400pM，约200pM至约350pM，约200pM至约300pM，约200pM至约250pM，约300pM至约30nM，约300pM至约25nM，约300pM至约30nM，约300pM至约15nM，约300pM至约10nM，约300pM至约5nM，约300pM至约2nM，约300pM至约1nM，约300pM至约950pM，约300pM至约900pM，约300pM至约850pM，约300pM至约800pM，约300pM至约750pM，约300pM至约700pM，约300pM至约650pM，约300pM至约600pM，约300pM至约550pM，约300pM至约500pM，约300pM至约450pM，约300pM至约400pM，约300pM至约350pM，约400pM至约30nM，约400pM至约25nM，约400pM至约30nM，约400pM至约15nM，约400pM至约10nM，约400pM至约5nM，约400pM至约2nM，约400pM至约1nM，约400pM至约950pM，约400pM至约900pM，约400pM至约850pM，约400pM至约800pM，约400pM至约750pM，约400pM至约700pM，约400pM至约650pM，约400pM至约600pM，约400pM至约550pM，约400pM至约500pM，约500pM至约30nM，约500pM至约25nM，约500pM至约30nM，约500pM至约15nM，约500pM至约10nM，约500pM至约5nM，约500pM至约2nM，约500pM至约1nM，约500pM至约950pM，约500pM至约900pM，约500pM至约850pM，约500pM至约800pM，约500pM至约750pM，约500pM至约700pM，约500pM至约650pM，约500pM至约600pM，约500pM至约550pM，约600pM至约30nM，约600pM至约25nM，约600pM至约30nM，约600pM至约15nM，约600pM至约10nM，约600pM至约5nM，约600pM至约2nM，约600pM至约1nM，约600pM至约950pM，约600pM至约900pM，约600pM至约850pM，约600pM至约800pM，约600pM至约750pM，约600pM至约700pM，约600pM至约650pM，约700pM至约30nM，约700pM至约25nM，约700pM至约30nM，约700pM至约15nM，约700pM至约10nM，约700pM至约5nM，约700pM至约2nM，约700pM至约1nM，约700pM至约950pM，约700pM至约900pM，约700pM至约850pM，约700pM至约800pM，约700pM至约750pM，约800pM至约30nM，约800pM至约25nM，约800pM至约30nM，约800pM至约15nM，约800pM至约10nM，约800pM至约5nM，约800pM至约2nM，约800pM至约1nM，约800pM至约950pM，约800pM至约900pM，约800pM至约850pM，约900pM至约30nM，约900pM至约25nM，约900pM至约30nM，约900pM至约15nM，约900pM至约10nM，约900pM至约5nM，约900pM至约2nM，约900pM至约1nM，约900pM至约950pM，约1nM至约30nM，约1nM至约25nM，约1nM至约20nM，约1nM至约15nM，约1nM至约10nM，约1nM至约5nM，约2nM至约30nM，约2nM至约25nM，约2nM至约20nM，约2nM至约15nM，约2nM至约10nM，约2nM至约5nM，约4nM至约30nM，约4nM至约25nM，约4nM至约20nM，约4nM至约15nM，约4nM至约10nM，约4nM至约5nM，约5nM至约30nM，约5nM至约25nM，约5nM至约20nM，约5nM至约15nM，约5nM至约10nM，约10nM至约30nM，约10nM至约25nM，约10nM至约20nM，约10nM至约15nM，约15nM至约30nM，约15nM至约25nM，约15nM至约20nM，约20nM至约30nM，和约20nM至约25nM)。
本文所述的任一种靶标结合域能够结合到其靶标，其KD在约1nM至约10nM之间(例如约1nM至约9nM，约1nM至约8nM，约1nM至约7nM，约1nM至约6nM，约1nM至约5nM，约1nM至约4nM，约1nM至约3nM，约1nM至约2nM，约2nM至约10nM，约2nM至约9nM，约2nM至约8nM，约2nM至约7nM，约2nM至约6nM，约2nM至约5nM，约2nM至约4nM，约2nM至约3nM，约3nM至约10nM，约3nM至约9nM，约3nM至约8nM，约3nM至约7nM，约3nM至约6nM，约3nM至约5nM，约3nM至约4nM，约4nM至约10nM，约4nM至约9nM，约4nM至约8nM，约4nM至约7nM，约4nM至约6nM，约4nM至约5nM，约5nM至约10nM，约5nM至约9nM，约5nM至约8nM，约5nM至约7nM，约5nM至约6nM，约6nM至约10nM，约6nM至约9nM，约6nM至约8nM，约6nM至约7nM，约7nM至约10nM，约7nM至约9nM，约7nM至约8nM，约8nM至约10nM，约8nM至约9nM，和约9nM至约10nM)。
可使用本领域中已知的多种不同方法来测定本文所述的任一种抗原结合蛋白构建体的KD值(例如电泳迁移率迁移分析、滤膜结合分析、表面等离子体共振和生物分子结合动力学分析等)。
抗原结合域
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域特异性结合到相同的抗原。在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域特异性结合到相同的表位。在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域包括相同的氨基酸序列。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域特异性结合到不同的抗原。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域中的一个或两个是抗原结合域。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域各自是抗原结合域。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，抗原结合域包括或是scFv或单域抗体(例如VHH或VNAR域)。
在一些实例中，抗原结合域(例如，本文所述的抗原结合域中的任一种)可特异性结合到以下中的任一种：CD16a(参见例如美国专利第9,035,026号中所述的那些)、CD28(参见例如美国专利第7,723,482号中所述的那些)、CD3(参见例如美国专利第9,226,962号中所述的那些)、CD33(参见例如美国专利第8,759,494号中所述的那些)、CD20(参见例如WO2014/026054中所述的那些)、CD19(参见例如美国专利第9,701,758号中所述的那些)、CD22(参见例如WO 2003/104425中所述的那些)，CD123(参见例如WO 2014/130635中所述的那些)、IL-1R(参见例如美国专利第8,741,604号中所述的那些)、IL-1(参见例如WO 2014/095808中所述的那些)、VEGF(参见例如美国专利第9,090,684号中所述的那些)、IL-6R(参见例如美国专利第7,482,436号中所述的那些)、IL-4(参见例如美国专利申请公开第2012/0171197号中所述的那些)、IL-10(参见例如美国专利申请公开第2016/0340413号中所述的那些)、PDL-1(参见例如Drees等人,《蛋白质表达和纯化(Protein Express.Purif.)》94:60-66,2014中所述的那些)、TIGIT(参见例如美国专利申请公开第2017/0198042号中所述的那些)、PD-1(参见例如美国专利第7,488,802号中所述的那些)、TIM3(参见例如美国专利第8,552,156号中所述的那些、CTLA4(参见例如WO 2012/120125中所述的那些)、MICA(参见例如WO 2016/154585中所述的那些)、MICB(参见例如美国专利第8,753,640号中所述的那些)、IL-6(参见例如Gejima等人,《人抗体(Human Antibodies)》11(4):121-129,2002中所述的那些)、IL-8(参见例如美国专利第6,117,980号中所述的那些)、TNFα(参见例如Geng等人,《免疫学研究(Immunol.Res.)》62(3):377-385,2015中所述的那些)、CD26a(参见例如WO2017/189526中所述的那些)、CD36(参见例如美国专利申请公开第2015/0259429号中所述的那些)、ULBP2(参见例如美国专利第9,273,136号中所述的那些)、CD30(参见例如Homach等人,《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》48(5):497-501,1998中所述的那些)、CD200(参见例如美国专利第9,085,623号中所述的那些)、IGF-1R(参见例如美国专利申请公开第2017/0051063号中所述的那些)、MUC4AC(参见例如WO 2012/170470中所述的那些)、MUC5AC(参见例如美国专利第9,238,084号中所述的那些)、Trop-2(参见例如WO 2013/068946中所述的那些)、CMET(参见例如Edwardraja等人,《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》106(3):367-375,2010中所述的那些)、EGFR(参见例如Akbari等人,《蛋白质表达和纯化》127:8-15,2016中所述的那些)、HER1(参见例如美国专利申请公开第2013/0274446号中所述的那些)、HER2(参见例如Cao等人,《生物技术快报(Biotechnol.Lett.)》37(7):1347-1354,2015中所述的那些)、HER3(参见例如美国专利第9,505,843号中所述的那些)、PSMA(参见例如Parker等人,《蛋白质表达和纯化》89(2):136-145,2013中所述的那些)、CEA(参见例如WO 1995/015341中所述的那些)、B7H3(参见例如美国专利第9,371,395号中所述的那些)、EPCAM(参见例如WO 2014/159531中描述的那些)、BCMA(参见例如Smith等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》26(6):1447-1456,2018中所述的那些)、P-钙粘着蛋白(参见例如美国专利第7,452,537号中所述的那些)、CEACAM5(参见例如美国专利第9,617,345号中所述的那些)、UL16结合蛋白(参见例如WO 2017/083612中所述)、HLA-DR(参见例如Pistillo等人,《实验和临床免疫遗传学(Exp.Clin.Immunogenet.)》14(2):123-130,1997中所述的那些)、DLL4(参见例如WO 2014/007513中所述的那些)、TYRO3(参见例如WO 2016/166348中所述的那些)、AXL(参见例如WO 2012/175692中所述的那些)、MER(参见例如WO 2016/106221中所述的那些)、CD122(参见例如美国专利申请公开第2016/0367664号中所述的那些)、CD155(参见例如WO 2017/149538中所述的那些)，或PDGF-DD(参见例如美国专利第9,441,034号中所述的那些)。
存在于本文所述的任一种单链嵌合多肽中的抗原结合域各自独立地选自由以下组成的群组：VHH域、VNAR域和scFv。
在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域，和/或一个或多个其它抗原结合域中的一个或多个可以是抗CD3 scFv。在一些实施例中，抗CD3 scFv可以包括重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包括与QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:16)至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列，所述轻链可变域包括与QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR(SEQ ID NO:17)至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列。在一些实施例中，scFv(例如本文所述的任一种scFv)可以包括介于重链可变域与轻链可变域之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。在一些实施例中，抗CD3 scFv可以包括：由核酸编码的重链可变域，所述核酸包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列；
CAAGTTCAGCTCCAGCAAAGCGGCGCCGAACTCGCTCGGCCCGGCGCTTCCGTGAAGATGTCTTGTAAGGCCTCCGGCTATACCTTCACCCGGTACACAATGCACTGGGTCAAGCAACGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATTGGCTATATCAACCCCTCCCGGGGCTATACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAAGCCACCCTCACCACCGACAAGTCCAGCAGCACCGCTTACATGCAGCTGAGCTCTTTAACATCCGAGGATTCCGCCGTGTACTACTGCGCTCGGTACTACGACGATCATTACTGCCTCGATTACTGGGGCCAAGGTACCACCTTAACAGTCTCCTCC(SEQ ID NO:18)；和/或由核酸编码的轻链可变域，所述核酸包括与CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCTATTATGAGCGCTAGCCCCGGTGAAAAGGTGACTATGACATGCAGCGCCAGCTCTTCCGTGAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGTCCGGCACCAGCCCTAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTCCCCGCTCACTTTCGGGGCTCCGGCTCCGGAACAAGCTACTCTCTGACCATCAGCGGCATGGAAGCCGAGGATGCCGCTACCTATTACTGTCAGCAGTGGAGCTCCAACCCCTTCACCTTTGGATCCGGCACCAAGCTCGAGATTAATCGT(SEQ ID NO:19)至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列。
在一些实施例中，抗CD3 scFv可以包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:20)。在一些实施例中，抗CD3 scFv可以包括存在于SEQ ID NO:20中的六个CDR。
在一些实施例中，抗CD3 scFv可以包括由核酸序列编码的序列，所述核酸序列与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)
CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCTATTATGAGCGCTAGCCCCGGTGAAAAGGTGACTATGACATGCAGCGCCAGCTCTTCCGTGAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGTCCGGCACCAGCCCTAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTCCCCGCTCACTTTCGGGGCTCCGGCTCCGGAACAAGCTACTCTCTGACCATCAGCGGCATGGAAGCCGAGGATGCCGCTACCTATTACTGTCAGCAGTGGAGCTCCAACCCCTTCACCTTTGGATCCGGCACCAAGCTCGAGATTAATCGTGGAGGCGGAGGTAGCGGAGGAGGCGGATCCGGCGGTGGAGGTAGCCAAGTTCAGCTCCAGCAAAGCGGCGCCGAACTCGCTCGGCCCGGCGCTTCCGTGAAGATGTCTTGTAAGGCCTCCGGCTATACCTTCACCCGGTACACAATGCACTGGGTCAAGCAACGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATTGGCTATATCAACCCCTCCCGGGGCTATACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAAGCCACCCTCACCACCGACAAGTCCAGCAGCACCGCTTACATGCAGCTGAGCTCTTTAACATCCGAGGATTCCGCCGTGTACTACTGCGCTCGGTACTACGACGATCATTACTGCCTCGATTACTGGGGCCAAGGTACCACCTTAACAGTCTCCTCC(SEQ ID NO:21)。
在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和/或一个或多个其它抗原结合域中的一个或多个可以是抗CD28 scFv。在一些实施例中，抗CD28 scFv可以包括重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包括与DIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR(SEQID NO:22)至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列，所述轻链可变域包括与VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSS(SEQ ID NO:23)至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列。在一些实施例中，抗CD28 scFv可以包括重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域由包括与GACATCGAGATGACACAGTCCCCCGCTATCATGAGCGCCTCTTTAGGAGAACGTGTGACCATGACTTGTACAGCTTCCTCCAGCGTGAGCAGCTCCTATTTCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCTCCTCCCCTAAACTGTGTATCTACTCCACAAGCAATTTAGCTAGCGGCGTGCCTCCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCAGCACCTCTTACTCTTTAACCATTAGCTCTATGGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTTTTGCCATCAGTACCACCGGTCCCCTACCTTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGACCAAGCGG(SEQ ID NO:24)至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列的核酸编码，所述轻链可变域由包括与GTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCCGAACTGGTCAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCTCCTACGTCATCCAATGGGTGAAGCAGAAGCCCGGTCAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAATCCCTACAACGATTACACCAAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACTCTGACAAGCGACAAGAGCTCCATTACCGCCTACATGGAGTTTTCCTCTTTAACTTCTGAGGACTCCGCTTTATACTATTGCGCTCGTTGGGGCGATGGCAATTATTGGGGCCGGGGAACTACTTTAACAGTGAGCTCC(SEQ IDNO:25)至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列的核酸编码。
在一些实施例中，抗CD28 scFv可以包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR(SEQ ID NO:26)。在一些实施例中，抗CD28 scFv可以包括存在于SEQ IDNO:26中的六个CDR。
在一些实施例中，抗CD28 scFv可以包括由核酸序列编码的序列，所述核酸序列与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)
GTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCCGAACTGGTCAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCTCCTACGTCATCCAATGGGTGAAGCAGAAGCCCGGTCAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAATCCCTACAACGATTACACCAAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACTCTGACAAGCGACAAGAGCTCCATTACCGCCTACATGGAGTTTTCCTCTTTAACTTCTGAGGACTCCGCTTTATACTATTGCGCTCGTTGGGGCGATGGCAATTATTGGGGCCGGGGAACTACTTTAACAGTGAGCTCCGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGAGGATCTGGCGGTGGAGGCAGCGACATCGAGATGACACAGTCCCCCGCTATCATGAGCGCCTCTTTAGGAGAACGTGTGACCATGACTTGTACAGCTTCCTCCAGCGTGAGCAGCTCCTATTTCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCTCCTCCCCTAAACTGTGTATCTACTCCACAAGCAATTTAGCTAGCGGCGTGCCTCCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCAGCACCTCTTACTCTTTAACCATTAGCTCTATGGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTTTTGCCATCAGTACCACCGGTCCCCTACCTTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGACCAAGCGG(SEQ ID NO:27)。
在一些实施例中，本文所述的任一种抗原结合域是BiTe、(scFv)2、纳米抗体(nanobody)、纳米抗体-HAS、DART、TandAb、单链双功能抗体(scDiabody)、单链双功能抗体-CH3、scFv-CH-CL-scFv、HSAbody、单链双功能抗体-HAS或串联scFv。可用于任一种单链嵌合多肽中的抗原结合域的其它实例是本领域已知的。
VHH域是可在骆驼科动物中发现的单一单体抗体可变域。VNAR域是可在软骨鱼中发现的单一单体抗体可变域。VHH域和VNAR域的非限制性方面描述于例如Cromie等人,《医药化学当前话题(Curr.Top.Med.Chem.)》15:2543-2557,2016；De Genst等人,《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》30:187-198,2006；De Meyer等人,《生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)》32:263-270,2014；Kijanka等人,《纳米医学(Nanomedicine)》10:161-174,2015；Kovaleva等人,《生物疗法专家观点(Expert.Opin.Biol.Ther.)》14:1527-1539,2014；Krah等人,《免疫药理学和免疫毒理学(Immunopharmacol.Immunotoxicol.)》38:21-28,2016；Mujic-Delic等人,《药理科学趋势(Trends Pharmacol.Sci.)》35:247-255,2014；Muyldermans,《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》74:277-302,2001；Muyldermans等人,《生物化学科学趋势(Trends Biochem.Sci.)》26:230-235,2001；Muyldermans,《生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)》82:775-797,2013；Rahbarizadeh等人,《免疫学研究(Immunol.Invest.)》40:299-338,2011；Van Audenhove等人,《E生物医学(EBioMedicine)》8:40-48,2016；Van Bockstaele等人,《研究药物当前观点(Curr.Opin.Investig.Drugs)》10:1212-1224,2009；Vincke等人,《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》911:15-26,2012；和Wesolowski等人,《医学微生物学和免疫学(Med.Microbiol.Immunol.)》198:157-174,2009。
在一些实施例中，本文所述的单链嵌合多肽中的每个抗原结合域都是VHH域，或至少一个抗原结合域是VHH域。在一些实施例中，本文所述的单链嵌合多肽中的每个抗原结合域都是VNAR域，或至少一个抗原结合域是VNAR域。在一些实施例中，本文所述的单链嵌合多肽中的每个抗原结合域都是scFv域，或至少一个抗原结合域是scFv域。DART描述于例如Garber,《自然综述：药物发现(Nature Reviews Drug Discovery)》13:799-801,2014中。
在一些实施例中，本文所述的任一种抗原结合域能够结合到选自以下组成的群组的抗原：蛋白质、碳水化合物、脂质和其组合。
抗原结合域的其它实例和方面是本领域已知的。
可溶性白介素或细胞因子蛋白
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域与第二靶标结合域中的一种或两种都可以是可溶性白介素蛋白、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白。在一些实施例中，可溶性白介素或可溶性细胞因子蛋白选自以下群组：IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF、FLT3L。可溶性IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF和FLT3L的非限制性实例在下文提供。
人可溶性IL-2(SEQ ID NO:28)
aptssstkkt qlqlehllld lqmilnginn yknpkltrml tfkfympkka telkhlqcleeelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiistlt
人可溶性IL-3(SEQ ID NO:29)
apmtqttplkt swvncsnmid eiithlkqpp lplldfnnln gedqdilmen nlrrpnleafnravkslqna saiesilknl lpclplataa ptrhpihikd gdwnefrrkl tfylktlena qaqqttlslaif
人可溶性IL-7(SEQ ID NO:30)
dcdiegkdgkqyesv lmvsidqlld smkeigsncl nnefnffkrh icdankegmflfraarklrq flkmnstgdf dlhllkvseg ttillnctgq vkgrkpaalg eaqptkslee nkslkeqkklndlcflkrll qeiktcwnki lmgtkeh
人可溶性IL-8(SEQ ID NO:31)
egavlprsak elrcqcikty skpfhpkfik elrviesgph canteiivkl sdgrelcldpkenwvqrvve kflkraens
人可溶性IL-10(SEQ ID NO:32)
spgqgtqsensc thfpgnlpnm lrdlrdafsr vktffqmkdq ldnlllkesl ledfkgylgcqalsemiqfy leevmpqaen qdpdikahvn slgenlktlr lrlrrchrfl pcenkskave qvknafnklqekgiykamse fdifinyiea ymtmkirn
人可溶性IL-12β(p40)(SEQ ID NO:33)
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
编码人可溶性IL-12β(p40)的核酸(SEQ ID NO:34)
ATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAACTGGACTGGTATCCCGATGCTCCCGGCGAAATGGTGGTGCTCACTTGTGACACCCCCGAAGAAGACGGCATCACTTGGACCCTCGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGAAAGACCCTCACAATCCAAGTTAAGGAGTTCGGAGACGCTGGCCAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGCTCAGCCATTCCTTATTATTATTACACAAGAAGGAAGACGGAATCTGGTCCACCGACATTTTAAAAGATCAGAAGGAGCCCAAGAATAAGACCTTTTTAAGGTGTGAGGCCAAAAACTACAGCGGTCGTTTCACTTGTTGGTGGCTGACCACCATTTCCACCGATTTAACCTTCTCCGTGAAAAGCAGCCGGGGAAGCTCCGACCCTCAAGGTGTGACATGTGGAGCCGCTACCCTCAGCGCTGAGAGGGTTCGTGGCGATAACAAGGAATACGAGTACAGCGTGGAGTGCCAAGAAGATAGCGCTTGTCCCGCTGCCGAAGAATCTTTACCCATTGAGGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAACTCAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATTAAGCCCGATCCTCCTAAGAATTTACAGCTGAAGCCTCTCAAAAATAGCCGGCAAGTTGAGGTCTCTTGGGAATATCCCGACACTTGGAGCACACCCCACAGCTACTTCTCTTTAACCTTTTGTGTGCAAGTTCAAGGTAAAAGCAAGCGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTTACCGACAAAACCAGCGCCACCGTCATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCAGCGTGAGGGCTCAAGATCGTTATTACTCCAGCAGCTGGTCCGAGTGGGCCAGCGTGCCTTGTTCC
人可溶性IL-12α(p35)(SEQ ID NO:35)
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
编码人可溶性IL-12α(p35)的核酸(SEQ ID NO:36)
CGTAACCTCCCCGTGGCTACCCCCGATCCCGGAATGTTCCCTTGTTTACACCACAGCCAGAATTTACTGAGGGCCGTGAGCAACATGCTGCAGAAAGCTAGGCAGACTTTAGAATTTTACCCTTGCACCAGCGAGGAGATCGACCATGAAGATATCACCAAGGACAAGACATCCACCGTGGAGGCTTGTTTACCTCTGGAGCTGACAAAGAACGAGTCTTGTCTCAACTCTCGTGAAACCAGCTTCATCACAAATGGCTCTTGTTTAGCTTCCCGGAAGACCTCCTTTATGATGGCTTTATGCCTCAGCTCCATCTACGAGGATTTAAAGATGTACCAAGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCTAAACGGCAGATCTTTTTAGACCAGAACATGCTGGCTGTGATTGATGAGCTGATGCAAGCTTTAAACTTCAACTCCGAGACCGTCCCTCAGAAGTCCTCCCTCGAGGAGCCCGATTTTTACAAGACAAAGATCAAACTGTGCATTTTACTCCACGCCTTTAGGATCCGGGCCGTGACCATTGACCGGGTCATGAGCTATTTAAACGCCAGC
示例性人可溶性IL-12(SEQ ID NO:37)
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
编码示例性人可溶性IL-12的核酸(SEQ ID NO:38)
ATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAACTGGACTGGTATCCCGATGCTCCCGGCGAAATGGTGGTGCTCACTTGTGACACCCCCGAAGAAGACGGCATCACTTGGACCCTCGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGAAAGACCCTCACAATCCAAGTTAAGGAGTTCGGAGACGCTGGCCAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGCTCAGCCATTCCTTATTATTATTACACAAGAAGGAAGACGGAATCTGGTCCACCGACATTTTAAAAGATCAGAAGGAGCCCAAGAATAAGACCTTTTTAAGGTGTGAGGCCAAAAACTACAGCGGTCGTTTCACTTGTTGGTGGCTGACCACCATTTCCACCGATTTAACCTTCTCCGTGAAAAGCAGCCGGGGAAGCTCCGACCCTCAAGGTGTGACATGTGGAGCCGCTACCCTCAGCGCTGAGAGGGTTCGTGGCGATAACAAGGAATACGAGTACAGCGTGGAGTGCCAAGAAGATAGCGCTTGTCCCGCTGCCGAAGAATCTTTACCCATTGAGGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAACTCAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATTAAGCCCGATCCTCCTAAGAATTTACAGCTGAAGCCTCTCAAAAATAGCCGGCAAGTTGAGGTCTCTTGGGAATATCCCGACACTTGGAGCACACCCCACAGCTACTTCTCTTTAACCTTTTGTGTGCAAGTTCAAGGTAAAAGCAAGCGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTTACCGACAAAACCAGCGCCACCGTCATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCAGCGTGAGGGCTCAAGATCGTTATTACTCCAGCAGCTGGTCCGAGTGGGCCAGCGTGCCTTGTTCCGGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCTCGTAACCTCCCCGTGGCTACCCCCGATCCCGGAATGTTCCCTTGTTTACACCACAGCCAGAATTTACTGAGGGCCGTGAGCAACATGCTGCAGAAAGCTAGGCAGACTTTAGAATTTTACCCTTGCACCAGCGAGGAGATCGACCATGAAGATATCACCAAGGACAAGACATCCACCGTGGAGGCTTGTTTACCTCTGGAGCTGACAAAGAACGAGTCTTGTCTCAACTCTCGTGAAACCAGCTTCATCACAAATGGCTCTTGTTTAGCTTCCCGGAAGACCTCCTTTATGATGGCTTTATGCCTCAGCTCCATCTACGAGGATTTAAAGATGTACCAAGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCTAAACGGCAGATCTTTTTAGACCAGAACATGCTGGCTGTGATTGATGAGCTGATGCAAGCTTTAAACTTCAACTCCGAGACCGTCCCTCAGAAGTCCTCCCTCGAGGAGCCCGATTTTTACAAGACAAAGATCAAACTGTGCATTTTACTCCACGCCTTTAGGATCCGGGCCGTGACCATTGACCGGGTCATGAGCTATTTAAACGCCAGC
人可溶性IL-15(SEQ ID NO:39)
Nwvnvisdlkki edliqsmhid atlytesdvh psckvtamkc fllelqvisl esgdasihdtvenliilann slssngnvte sgckeceele eknikeflqs fvhivqmfin ts
人可溶性IL-17(SEQ ID NO:40)
gitiprn pgcpnsedkn fprtvmvnln ihnrntntnp krssdyynrs tspwnlhrnedperypsviw eakcrhlgci nadgnvdyhm nsvpiqqeil vlrrepphcp nsfrlekilv svgctcvtpivhhva
人可溶性IL-18(SEQ ID NO:41)
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED
编码人可溶性IL-18的核酸(SEQ ID NO:42)
TACTTCGGCAAACTGGAATCCAAGCTGAGCGTGATCCGGAATTTAAACGACCAAGTTCTGTTTATCGATCAAGGTAACCGGCCTCTGTTCGAGGACATGACCGACTCCGATTGCCGGGACAATGCCCCCCGGACCATCTTCATTATCTCCATGTACAAGGACAGCCAGCCCCGGGGCATGGCTGTGACAATTAGCGTGAAGTGTGAGAAAATCAGCACTTTATCTTGTGAGAACAAGATCATCTCCTTTAAGGAAATGAACCCCCCCGATAACATCAAGGACACCAAGTCCGATATCATCTTCTTCCAGCGGTCCGTGCCCGGTCACGATAACAAGATGCAGTTCGAATCCTCCTCCTACGAGGGCTACTTTTTAGCTTGTGAAAAGGAGAGGGATTTATTCAAGCTGATCCTCAAGAAGGAGGACGAGCTGGGCGATCGTTCCATCATGTTCACCGTCCAAAACGAGGAT
人可溶性IL-21(SEQ ID NO:43)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
编码人可溶性IL-21的核酸(SEQ ID NO:44)
CAGGGCCAGGACAGGCACATGATCCGGATGAGGCAGCTCATCGACATCGTCGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTTCTGCCTGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGTCCGCCTTCTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAGCTGAAGTCCGCCAACACCGGCAACAACGAGCGGATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACAAACGCCGGCAGGAGGCAGAAGCACAGGCTGACCTGCCCCAGCTGTGACTCCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGGTTCAAGTCCCTGCTGCAGAAGATGATCCATCAGCACCTGTCCTCCAGGACCCACGGCTCCGAGGACTCC
人可溶性PDGF-DD(SEQ ID NO:45)
rdtsatpqsasi kalrnanlrr desnhltdly rrdetiqvkg ngyvqsprfp nsyprnllltwrlhsqentr iqlvfdnqfg leeaendicr ydfvevedis etstiirgrw cghkevppri ksrtnqikitfksddyfvak pgfkiyysll edfqpaaase tnwesvtssi sgvsynspsv tdptliadal dkkiaefdtvedllkyfnpe swqedlenmy ldtpryrgrs yhdrkskvdl drlnddakry sctprnysvn ireelklanvvffprcllvq rcggncgcgt vnwrsctcns gktvkkyhev lqfepghikr rgraktmalv diqldhhercdcicssrppr
人可溶性SCF(SEQ ID NO:46)
egicrnrvtnnvkdv tklvanlpkd ymitlkyvpg mdvlpshcwi semvvqlsdsltdlldkfsn iseglsnysi idklvnivdd lvecvkenss kdlkksfksp eprlftpeef frifnrsidafkdfvvaset sdcvvsstls pekdsrvsvt kpfmlppvaa sslrndssss nrkaknppgd sslhwaamalpalfsliigf afgalywkkr qpsltraven iqineednei smlqekeref qev
人可溶性FLT3L(SEQ ID NO:47)
tqdcsfqhspissd favkirelsd yllqdypvtv asnlqdeelc gglwrlvlaq rwmerlktvagskmqgller vnteihfvtk cafqpppscl rfvqtnisrl lqetseqlva lkpwitrqnf srclelqcqpdsstlpppws prpleatapt apqpplllll llpvglllla aawclhwqrt rrrtprpgeq vppvpspqdlllveh
示例性的可溶性细胞表面蛋白包括可溶性MICA、MICB和ULP16结合蛋白(例如ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5或ULBP6)。以下列出了可溶性MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6的示例性序列。
人可溶性MICA(SEQ ID NO:48)
ephslry nltvlswdgs vqsgfltevh ldgqpflrcd rqkcrakpqg qwaedvlgnktwdretrdlt gngkdlrmtl ahikdqkegl hslqeirvce ihednstrss qhfyydgelf lsqnletkewtmpqssraqt lamnvrnflk edamktkthy hamhadclqe lrrylksgvv lrrtvppmvn vtrseasegnitvtcrasgf ypwnitlswr qdgvslshdt qqwgdvlpdg ngtyqtwvat ricqgeeqrf tcymehsgnhsthpvpsgkv lvlqshwqtf hvsavaaaai fviiifyvrc ckkktsaaeg pelvslqvld qhpvgtsdhrdatqlgfqpl msdlgstgst ega
人可溶性MICB(SEQ ID NO:49)
aephslry nlmvlsqdes vqsgflaegh ldgqpflryd rqkrrakpqg qwaedvlgaktwdtetedlt engqdlrrtl thikdqkggl hslqeirvce ihedsstrgs rhfyydgelf lsqnletqestvpqssraqt lamnvtnfwk edamktkthy ramqadclqk lqrylksgva irrtvppmvn vtcsevsegnitvtcrassf yprnitltwr qdgvslshnt qqwgdvlpdg ngtyqtwvat rirqgeeqrf tcymehsgnhgthpvpsgkv lvlqsqrtdf pyvsaampcf viiiilcvpc ckkktsaaeg pelvslqvld qhpvgtgdhrdaaqlgfqpl msatgstgst ega
人可溶性ULBP1(SEQ ID NO:50)
wvdthclcydfiit pksrpepqwc evqglvderp flhydcvnhk akafaslgkk vnvtktweeqtetlrdvvdf lkgqlldiqv enlipieplt lqarmscehe ahghgrgswq flfngqkfll fdsnnrkwtalhpgakkmte kweknrdvtm ffqkislgdc kmwleeflmy weqmldptkp pslapg
人可溶性ULBP2(SEQ ID NO:51)
gradphslcyditvi pkfrpgprwc avqgqvdekt flhydcgnkt vtpvsplgkklnvttawkaq npvlrevvdi lteqlrdiql enytpkeplt lqarmsceqk aeghssgswq fsfdgqifllfdsekrmwtt vhpgarkmke kwendkvvam sfhyfsmgdc igwledflmg mdstlepsag aplams
人可溶性ULBP3(SEQ ID NO:52)
dahslwynfti ihlprhgqqw cevqsqvdqk nflsydcgsd kvlsmghlee qlyatdawgkqlemlrevgq rlrleladte ledftpsgpl tlqvrmscec eadgyirgsw qfsfdgrkfl lfdsnnrkwtvvhagarrmk ekwekdsglt tffkmvsmrd ckswlrdflm hrkkrlepta pptmapg
人可溶性ULBP4(SEQ ID NO:53)
hslcfnftik slsrpgqpwc eaqvflnknl flqynsdnnm vkplgllgkk vyatstwgeltqtlgevgrd lrmllcdikp qiktsdpstl qvemfcqrea erctgaswqf atngeksllf damnmtwtvinheaskiket wkkdrgleky frklskgdcd hwlreflghw eampeptvsp vnasdihwss sslpdrwiilgafillvlmg ivlicvwwqn gewqaglwpl rts
人可溶性ULBP5(SEQ ID NO:54)
gladp hslcyditvi pkfrpgprwc avqgqvdekt flhydcgskt vtpvsplgkklnvttawkaq npvlrevvdi lteqlldiql enyipkeplt lqarmsceqk aeghgsgswq lsfdgqifllfdsenrmwtt vhpgarkmke kwendkdmtm sfhyismgdc tgwledflmg mdstlepsag apptmssg
人可溶性ULBP6(SEQ ID NO:55)
rrddp hslcyditvi pkfrpgprwc avqgqvdekt flhydcgnkt vtpvsplgkklnvtmawkaq npvlrevvdi lteqlldiql enytpkeplt lqarmsceqk aeghssgswq fsidgqtfllfdsekrmwtt vhpgarkmke kwendkdvam sfhyismgdc igwledflmg mdstlepsag aplamssg
在一些实施例中，可溶性IL-12蛋白可以包括：与SEQ ID NO:33至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的第一序列，以及与SEQ ID NO:35至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的第二序列。在一些实施例中，可溶性IL-12可进一步包括介于第一序列和第二序列之间的接头序列(例如本文所述的或本领域已知的任一种示例性接头序列)。
在一些实施例中，可溶性IL-12蛋白由第一核酸和第二核酸序列编码，所述第一核酸编码与SEQ ID NO:34至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的第一序列，所述第二核酸序列与SEQ ID NO:36至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的第二序列。在一些实施例中，编码可溶性IL-12蛋白的核酸进一步包括介于第一核酸与第二核酸之间的编码接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)的核酸序列。
在一些实施例中，可溶性IL-12蛋白包括与SEQ ID NO:37至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列。在一些实施例中，可溶性IL-12蛋白由核酸编码，所述核酸包括与SEQID NO:38至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列。
在一些实施例中，可溶性IL-18蛋白可以包括与SEQ ID NO:41至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列。在一些实施例中，可溶性IL-18蛋白由核酸编码，所述核酸包括与SEQID NO:42至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列。
在一些实施例中，可溶性IL-21蛋白可以包括与SEQ ID NO:43至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列。在一些实施例中，可溶性IL-21蛋白由核酸编码，所述核酸包括与SEQID NO:44至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列。
可溶性白介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的其它实例是所属领域中已知的。
可溶性受体
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域中的一个或两个是可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体，或可溶性细胞表面受体。在一些实施例中，可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)(参见例如Yung等人，《美国呼吸与重症医学杂志(Am.J.Resp.Crit.Care Med.)》194(9):1140-1151,2016中所述的那些)、可溶性TGF-βRIII(参见例如Heng等人，《胎盘(Placenta)》57:320，2017中所述的那些)，或可溶性NKG2D(参见例如Cosman等人，《免疫(Immunity)》14(2):123-133，2001；Costa等人，《免疫学前沿(Front.Immunol.)》第9卷，论文1150，2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150)。在一些实施例中，可溶性细胞表面受体是可溶性NKp30(参见例如Costa等人，《免疫学前沿(Front.Immunol.)》第9卷，论文1150，2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150)、可溶性NKp44(参见例如Costa等人，《免疫学前沿(Front.Immunol.)》第9卷，论文1150，2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150中所述的那些)、可溶性NKp46(参见例如Mandelboim等人，《自然(Nature)》409:1055-1060，2001；Costa等人，《免疫学前沿(Front.Immunol.)》第9卷，论文1150，2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150)、可溶性DNAM1(参见例如Costa等人，《免疫学前沿(Front.Immunol.)》，第9卷，论文1150，2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150中所述的那些)、scMHCI(参见例如Washburn等人，《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》6(3):e18439，2011中所述的那些)、scMHCII(参见例如Bishwajit等人，《细胞免疫学(CellularImmunol.)》170(1):25-33,1996中所述的那些)、scTCR(参见例如Weber等人，《自然》356(6372):793-796，1992中所述的那些)、可溶性CD155(参见例如Tahara-Hanaoka等人，《国际免疫学(Int.Immunol.)》16(4):533-538，2004中所述的那些)或可溶性CD28(参见例如Hebbar等人，《临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)》136:388-392，2004)。
在一些实施例中，可溶性TGFβRII受体可以包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的第一序列：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ IDNO:56)；以及与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的第二序列：IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ ID NO:56)。在一些实施例中，可溶性TGFβRII受体可以进一步包括介于第一序列与第二序列之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
在一些实施例中，可溶性TGFβRII受体由第一核酸和第二核酸序列编码，所述第一核酸编码与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的第一序列：ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCACGATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGAT(SEQ ID NO:57)，所述第二核酸序列编码与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的第二序列：
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCACGATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGAT(SEQ ID NO:57)。在一些实施例中，编码可溶性TGFβRII受体的核酸进一步包括介于第一核酸与第二核酸之间的编码接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)的核酸序列。
在一些实施例中，可溶性TGFβRII受体包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ IDNO:60)。在一些实施例中，可溶性TGFβRII受体由核酸编码，所述核酸包括与以下至少70％一致(例如至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCACGATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCACAATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC(SEQ ID NO:61)。
可溶性白介素受体和可溶性细胞因子受体的其它实例是所属领域中已知的。
其它抗原结合域
本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例可以进一步包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其N端和/或C端的其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其N端的其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽N端的一个或多个其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)之一可以直接邻接第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)，或可溶性组织因子域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于单链嵌合多肽N端的至少一个其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)之一与第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)或可溶性组织因子域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域)之间。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其C端的其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽C端的一个或多个其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)之一直接邻接第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)，或可溶性组织因子域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性可溶性组织因子域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于单链嵌合多肽C端的至少一个其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)之一与第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)或可溶性组织因子域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域)之间。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽包含一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其N端和其C端的其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽N端的一个或多个其它抗原结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)之一直接邻接第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)，或可溶性组织因子域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于N端的一个或多个其它抗原结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)之一与第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)或可溶性组织因子域(例如任一种示例性可溶性组织因子域)之间。在一些实施例中，位于C端的一个或多个其它抗原结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)之一直接邻接第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)，或可溶性组织因子域(例如任一种示例性可溶性组织因子域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于C端的一个或多个其它抗原结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)之一与第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)或可溶性组织因子域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域)之间。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)和一个或多个其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)特异性地结合到相同抗原。在一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)和一个或多个其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)特异性地结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)和一个或多个其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)包括相同的氨基酸序列。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)各自特异性地结合到相同抗原。在一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)各自特异性地结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)其它靶标结合域各自包含相同的氨基酸序列。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)特异性地结合到不同抗原。
在任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个靶标结合域中的一个或多个是抗原结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性抗原结合域)。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域各自是抗原结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性抗原结合域)。在一些实施例中，抗原结合域可包括scFv或单域抗体。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)和一个或多个靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)中的一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)特异性地结合到选自由以下组成的群组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26a、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体和CD28的受体。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)和一个或多个其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)中的一个或多个是可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白。可溶性白介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例包括：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF和FLT3L。可溶性细胞表面蛋白的非限制性实例包括：MICA、MICB和ULP16结合蛋白。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)、第二靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)和一个或多个其它靶标结合域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合域)中的一个或多个是可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体。可溶性白介素受体和可溶性细胞因子受体的非限制性实例包括：可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)和可溶性TGF-βRIII。可溶性细胞表面受体的非限制性实例包括：可溶性NKG2D、可溶性NK30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155、可溶性CD122、可溶性CD3和可溶性CD28。
信号序列
在一些实施例中，单链嵌合多肽包括其N末端的信号序列。如本领域普通技术人员将理解，信号序列是存在于许多内源产生的蛋白质的N端的氨基酸序列，其将蛋白质引导到分泌路径(例如，蛋白质被引导以存在于某些细胞内细胞器中、存在于细胞膜中或从细胞中分泌)。信号序列是异质的，并且其一级氨基酸序列差异很大。但是，信号序列的长度典型地为16至30个氨基酸，并且包括亲水、通常带正电荷的N端区、中央疏水域和含有信号肽酶的裂解位点的C端区。
在一些实施例中，单链嵌合多肽包括具有氨基酸序列MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQID NO:62)的信号序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽包括由核酸序列
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC(SEQ ID NO:63)、ATGAAGTGGGTCACATTTATCTCTTTACTGTTCCTCTTCTCCAGCGCCTACAGC(SEQ ID NO:64)或
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC(SEQ ID NO:65)编码的信号序列。
在一些实施例中，单链嵌合多肽包括具有氨基酸序列MKCLLYLAFLFLGVNC(SEQ IDNO:66)的信号序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽包括具有氨基酸序列MGQIVTMFEALPHIIDEVINIVIIVLIIITSIKAVYNFATCGILALVSFLFLAGRSCG(SEQ ID NO:67)的信号序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽包括具有氨基酸序列MPNHQSGSPTGSSDLLLSGKKQRPHLALRRKRRREMRKINRKVRRMNLAPIKEKTAWQHLQALISEAEEVLKTSQTPQNSLTLFLALLSVLGPPVTG(SEQ ID NO:68)的信号序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽包括具有氨基酸序列MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLCQGVVS(SEQ ID NO:69)的信号序列。本领域普通技术人员将知道适用于单链嵌合多肽的其它信号序列。
在一些实施例中，单链嵌合多肽包括约10到100个氨基酸长度的信号序列。例如，信号序列可具有约10至100个氨基酸的长度，约15至100个氨基酸的长度，约20至100个氨基酸的长度，约25至100个氨基酸的长度，约30至100个氨基酸的长度，约35至100个氨基酸的长度，约40至100个氨基酸的长度，约45至100个氨基酸的长度，约50至100个氨基酸的长度，约55至100个氨基酸的长度，约60至100个氨基酸的长度，约65至100个氨基酸的长度，约70至100个氨基酸的长度，约75至100个氨基酸的长度，约80至100个氨基酸的长度，约85至100个氨基酸的长度，约90至100个氨基酸的长度，约95至100个氨基酸的长度，约10至95个氨基酸的长度，约10至90个氨基酸的长度，约10至85个氨基酸的长度，约10至80个氨基酸的长度，约10至75个氨基酸的长度，约10至70个氨基酸的长度，约10至65个氨基酸的长度，约10至60个氨基酸的长度，约10至55个氨基酸的长度，约10至50个氨基酸的长度，约10至45个氨基酸的长度，约10至40个氨基酸的长度，约10至35个氨基酸的长度，约10至30个氨基酸的长度，约10至25个氨基酸的长度，约10至20个氨基酸的长度，约10至15个氨基酸的长度，约20至30个氨基酸的长度，约30至40个氨基酸的长度，约40至50个氨基酸的长度，约50至60个氨基酸的长度，约60至70个氨基酸的长度，约70至80个氨基酸的长度，约80至90个氨基酸的长度，约90至100个氨基酸的长度，约20至90个氨基酸的长度，约30至80个氨基酸的长度，约40至70个氨基酸的长度，约50至60个氨基酸的长度，或介于两者之间的任何范围。在一些实施例中，信号序列具有约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸的长度。
在一些实施例中，本文公开的信号序列中的任一种可在其N端和/或C端包括一个或多个其它氨基酸(例如，1、2、3、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)，只要信号序列的功能保持完整即可。举例来说，具有氨基酸序列MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO:62)的信号序列可以包括一个或多个位于N端或C端的其它氨基酸，同时仍保持将单链嵌合多肽导向分泌路径的能力。
在一些实施例中，单链嵌合多肽包括引导单链嵌合多肽进入细胞外空间的信号序列。此类实施例可用于产生相对容易分离和/或纯化的单链嵌合多肽。
肽标签
在一些实施例中，单链嵌合多肽包括肽标签(例如在单链嵌合多肽的N末端或C末端)。在一些实施例中，单链嵌合多肽包括两个或更多个肽标签。
可以纳入单链嵌合多肽中的示例性肽标签包括(但不限于)AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE；SEQ ID NO:70)、钙调蛋白标签(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL；SEQ IDNO:71)、聚谷氨酸盐标签(EEEEEE；SEQ ID NO:72)、E标签(GAPVPYPDPLEPR；SEQ ID NO:73)、FLAG标签(DYKDDDDK；SEQ ID NO:74)、HA标签、来自血球凝集素的肽(YPYDVPDYA；SEQ IDNO:75)、his标签(HHHHH(SEQ ID NO:76)；HHHHHH(SEQ ID NO:77)；HHHHHHH(SEQ ID NO:78)；HHHHHHHH(SEQ ID NO:79)；HHHHHHHHH(SEQ ID NO:80)；或HHHHHHHHHH(SEQ ID NO:81))、myc标签(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:82)、NE标签(TKENPRSNQEESYDDNES；SEQ ID NO:83)、S标签(KETAAAKFERQHMDS；SEQ ID NO:84)、SBP标签(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP；SEQ ID NO:85)、Softag 1(SLAELLNAGLGGS；SEQ ID NO:86)、Softag 3(TQDPSRVG；SEQ ID NO:87)、Spot标签(PDRVRAVSHWSS；SEQ ID NO:88)、Strep标签(WSHPQFEK；SEQ ID NO:89)、TC标签(CCPGCC；SEQ ID NO:90)、Ty标签(EVHTNQDPLD；SEQ IDNO:91)、V5标签(GKPIPNPLLGLDST；SEQ ID NO:92)、VSV标签(YTDIEMNRLGK；SEQ ID NO:93)，和Xpress标签(DLYDDDDK；SEQ ID NO:94)。在一些实施例中，组织因子蛋白是肽标签。
可以纳入单链嵌合多肽中的肽标签可以用于与单链嵌合多肽有关的多种应用中的任一种。例如，肽标签可用于纯化单链嵌合多肽。作为一个非限制性实例，单链嵌合多肽可以包括myc标签；并且可以使用识别myc标签的抗体纯化。识别myc标签的抗体的一个非限制性实例是9E10，其可从非商业的开发研究融合瘤库(Developmental Studies HybridomaBank)获得。作为另一个非限制性实例，单链嵌合多肽可包括组氨酸标签，并可使用镍或钴螯合物纯化。本领域普通技术人员将知道其它合适的标签和结合这些标签以便纯化单链嵌合多肽的试剂。在一些实施例中，纯化后，从单链嵌合多肽中去除肽标签。在一些实施例中，纯化后，不从单链嵌合多肽中去除肽标签。
可以纳入单链嵌合多肽中的肽标签可用于例如单链嵌合多肽的免疫沉淀、单链嵌合多肽的成像(例如通过蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术和/或免疫细胞化学)和/或单链嵌合多肽的增溶。
在一些实施例中，单链嵌合多肽包括约10到100个氨基酸长度的肽标签。例如，肽标签可以具有约10至100个氨基酸的长度，约15至100个氨基酸的长度，约20至100个氨基酸的长度，约25至100个氨基酸的长度，约30至100个氨基酸的长度，约35至100个氨基酸的长度，约40至100个氨基酸的长度，约45至100个氨基酸的长度，约50至100个氨基酸的长度，约55至100个氨基酸的长度，约60至100个氨基酸的长度，约65至100个氨基酸的长度，约70至100个氨基酸的长度，约75至100个氨基酸的长度，约80至100个氨基酸的长度，约85至100个氨基酸的长度，约90至100个氨基酸的长度，约95至100个氨基酸的长度，约10至95个氨基酸的长度，约10至90个氨基酸的长度，约10至85个氨基酸的长度，约10至80个氨基酸的长度，约10至75个氨基酸的长度，约10至70个氨基酸的长度，约10至65个氨基酸的长度，约10至60个氨基酸的长度，约10至55个氨基酸的长度，约10至50个氨基酸的长度，约10至45个氨基酸的长度，约10至40个氨基酸的长度，约10至35个氨基酸的长度，约10至30个氨基酸的长度，约10至25个氨基酸的长度，约10至20个氨基酸的长度，约10至15个氨基酸的长度，约20至30个氨基酸的长度，约30至40个氨基酸的长度，约40至50个氨基酸的长度，约50至60个氨基酸的长度，约60至70个氨基酸的长度，约70至80个氨基酸的长度，约80至90个氨基酸的长度，约90至100个氨基酸的长度，约20至90个氨基酸的长度，约30至80个氨基酸的长度，约40至70个氨基酸的长度，约50至60个氨基酸的长度，或介于两者之间的任何范围。在一些实施例中，肽标签具有约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸的长度。
纳入单链嵌合多肽中的肽标签可以具有任何合适的长度。例如，肽标签可以具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸的长度。在单链嵌合多肽包括两个或更多个肽标签的实施例中，两个或更多个肽标签可以具有相同或不同的长度。在一些实施例中，本文公开的任何肽标签可在N端和/或C端包括一个或多个其它氨基酸(例如，1、2、3、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)，只要肽标签的功能保持完整即可。例如，具有氨基酸序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:82)的myc标签可包括一个或多个其它氨基酸(例如，在肽标签的N端和/或C端)，同时仍保留与抗体(例如，9E10)结合的能力。
单链嵌合多肽A型的示例性实施例
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和/或第二靶标结合域可以独立地特异性结合到CD3(例如人CD3)或CD28(例如人CD28)。在一些实施例中，第一靶标结合域特异性结合到CD3(例如人CD3)，而第二靶标结合域特异性结合到CD28(例如人CD28)。在一些实施例中，第一靶标结合域特异性结合到CD28(例如人CD28)，而第二靶标结合域特异性结合到CD3(例如人CD3)。
在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和可溶性组织因子域彼此直接邻接。在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括介于第一靶标结合域与可溶性组织因子域之间的接头序列(例如本文所述的任一种示例性接头)。
在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子域与第二靶标结合域彼此直接邻接。在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括介于可溶性组织因子域和第二靶标结合域之间的接头序列(例如，本文所述的任一种示例性接头)。
在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域中的一个或两个是抗原结合域。在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域各自是抗原结合域(例如，本文所述的任一种示例性抗原结合域)。在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，抗原结合域包括scFv或单域抗体。
特异性结合到CD3的scFv的非限制性实例可以包括与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:20)。
在一些实施例中，特异性结合到CD3的scFv可以由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGTGGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGCCAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGC(SEQ ID NO:99)。
特异性结合到CD28的scFv的非限制性实例可以包括与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR(SEQ ID NO:26)。
在一些实施例中，特异性结合到CD28的scFv可以由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
GTCCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGAACTCGTGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCTCCTATGTGATCCAGTGGGTCAAACAGAAGCCCGGACAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAACCCTTACAACGACTATACCAAATACAACGAGAAGTTTAAGGGAAAGGCTACTTTAACCTCCGACAAAAGCTCCATCACAGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAACATCCGAGGACAGCGCTCTGTACTATTGCGCCCGGTGGGGCGACGGCAATTACTGGGGACGGGGCACAACACTGACCGTGAGCAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGCGGCTCCGACATCGAGATGACCCAGTCCCCCGCTATCATGTCCGCCTCTTTAGGCGAGCGGGTCACAATGACTTGTACAGCCTCCTCCAGCGTCTCCTCCTCCTACTTCCATTGGTACCAACAGAAACCCGGAAGCTCCCCTAAACTGTGCATCTACAGCACCAGCAATCTCGCCAGCGGCGTGCCCCCTAGGTTTTCCGGAAGCGGAAGCACCAGCTACTCTTTAACCATCTCCTCCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACCTACTTTTGTCACCAGTACCACCGGTCCCCCACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGACAAAGAGG(SEQ ID NO:101)。
在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和/或第二靶标结合域是可溶性受体(例如可溶性CD28受体或可溶性CD3受体)。在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子域可以是本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR(SEQ ID NO:1)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGTGGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGCCAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGCTCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGGTCCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGAACTCGTGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCTCCTATGTGATCCAGTGGGTCAAACAGAAGCCCGGACAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAACCCTTACAACGACTATACCAAATACAACGAGAAGTTTAAGGGAAAGGCTACTTTAACCTCCGACAAAAGCTCCATCACAGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAACATCCGAGGACAGCGCTCTGTACTATTGCGCCCGGTGGGGCGACGGCAATTACTGGGGACGGGGCACAACACTGACCGTGAGCAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGCGGCTCCGACATCGAGATGACCCAGTCCCCCGCTATCATGTCCGCCTCTTTAGGCGAGCGGGTCACAATGACTTGTACAGCCTCCTCCAGCGTCTCCTCCTCCTACTTCCATTGGTACCAACAGAAACCCGGAAGCTCCCCTAAACTGTGCATCTACAGCACCAGCAATCTCGCCAGCGGCGTGCCCCCTAGGTTTTCCGGAAGCGGAAGCACCAGCTACTCTTTAACCATCTCCTCCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACCTACTTTTGTCACCAGTACCACCGGTCCCCCACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGACAAAGAGG(SEQ ID NO:2)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
MKWVTFISLLFLFSSAYSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR(SEQ ID NO:3)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCTTATTATTTTTATTCAGCTCCGCCTATTCCCAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGTGGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGCCAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGCTCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGGTCCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGAACTCGTGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCTCCTATGTGATCCAGTGGGTCAAACAGAAGCCCGGACAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAACCCTTACAACGACTATACCAAATACAACGAGAAGTTTAAGGGAAAGGCTACTTTAACCTCCGACAAAAGCTCCATCACAGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAACATCCGAGGACAGCGCTCTGTACTATTGCGCCCGGTGGGGCGACGGCAATTACTGGGGACGGGGCACAACACTGACCGTGAGCAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGCGGCTCCGACATCGAGATGACCCAGTCCCCCGCTATCATGTCCGCCTCTTTAGGCGAGCGGGTCACAATGACTTGTACAGCCTCCTCCAGCGTCTCCTCCTCCTACTTCCATTGGTACCAACAGAAACCCGGAAGCTCCCCTAAACTGTGCATCTACAGCACCAGCAATCTCGCCAGCGGCGTGCCCCCTAGGTTTTCCGGAAGCGGAAGCACCAGCTACTCTTTAACCATCTCCTCCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACCTACTTTTGTCACCAGTACCACCGGTCCCCCACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGACAAAGAGG(SEQ ID NO:4)。
单链嵌合多肽B型的示例性实施例
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和/或第二靶标结合域可以独立地特异性结合到IL-2受体(例如人IL-2受体)。
在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和可溶性组织因子域彼此直接邻接。在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括介于第一靶标结合域与可溶性组织因子域之间的接头序列(例如本文所述的任一种示例性接头)。
在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子域与第二靶标结合域彼此直接邻接。在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括介于可溶性组织因子域和第二靶标结合域之间的接头序列(例如本文所述的任一种示例性接头)。
在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域是人可溶性IL-2蛋白。特异性结合到IL-2受体的IL-2蛋白的非限制性实例可以包括与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:28)。
在一些实施例中，特异性结合到IL-2受体的IL-2蛋白可以由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACT(SEQ ID NO:106)。
在一些实施例中，特异性结合到IL-2受体的IL-2蛋白可以由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
GCCCCCACCTCCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCCCTCGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGTCCAAGAATTTCCATTTAAGGCCCCGGGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTTTTAGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATCATCTCCACTTTAACC(SEQ ID NO:107)在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子域可以是本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:108)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
GCCCCCACCTCCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCCCTCGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGTCCAAGAATTTCCATTTAAGGCCCCGGGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTTTTAGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATCATCTCCACTTTAACCAGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACT(SEQ ID NO:109)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
MKWVTFISLLFLFSSAYSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:110)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCCGCCCCCACCTCCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCCCTCGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGTCCAAGAATTTCCATTTAAGGCCCCGGGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTTTTAGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATCATCTCCACTTTAACCAGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACT(SEQID NO:111)。
单链嵌合多肽C型的示例性实施例
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和/或第二靶标结合域可以独立地特异性结合到IL-15受体(例如人IL-15受体)。
在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和可溶性组织因子域彼此直接邻接。在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括介于第一靶标结合域与可溶性组织因子域之间的接头序列(例如本文所述的任一种示例性接头)。
在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子域与第二靶标结合域彼此直接邻接。在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括介于可溶性组织因子域和第二靶标结合域之间的接头序列(例如本文所述的任一种示例性接头)。
在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合域和第二靶标结合域是人可溶性IL-15蛋白。特异性结合到IL-15受体的IL-15蛋白的非限制性实例可以包括与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:39)。
在一些实施例中，特异性结合到IL-15受体的IL-15蛋白可以由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
AACTGGGTGAACGTGATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAGGATTTAATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACTCTGTACACTGAGAGCGACGTGCACCCTAGCTGCAAGGTGACTGCCATGAAGTGCTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGCGATGCCAGCATCCACGACACTGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAACAACTCTTTAAGCAGCAACGGCAACGTGACAGAGAGCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTTTACAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACTAGC(SEQ ID NO:112)。
在一些实施例中，特异性结合到IL-15受体的IL-15蛋白可以由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC(SEQ ID NO:113)在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子域可以是本文所述的任一种示例性可溶性组织因子域。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:114)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
AACTGGGTGAACGTGATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAGGATTTAATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACTCTGTACACTGAGAGCGACGTGCACCCTAGCTGCAAGGTGACTGCCATGAAGTGCTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGCGATGCCAGCATCCACGACACTGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAACAACTCTTTAAGCAGCAACGGCAACGTGACAGAGAGCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTTTACAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACTAGCAGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGAACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC(SEQ ID NO:115)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列：
MKWVTFISLLFLFSSAYSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:116)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽由与以下至少80％一致(例如至少82％一致、至少84％一致、至少86％一致、至少88％一致、至少90％一致、至少92％一致、至少94％一致、至少96％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致)的序列编码：
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAGGATTTAATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACTCTGTACACTGAGAGCGACGTGCACCCTAGCTGCAAGGTGACTGCCATGAAGTGCTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGCGATGCCAGCATCCACGACACTGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAACAACTCTTTAAGCAGCAACGGCAACGTGACAGAGAGCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTTTACAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACTAGCAGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGAACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC(SEQ ID NO:117)。
组合物/试剂盒
本文还提供了组合物(例如医药组合物)，其包括本文所述的任何单链嵌合多肽、任一种细胞或任一种核酸中的至少一种。在一些实施例中，组合物包括本文所述的任一种单链嵌合多肽中的至少一种。在一些实施例中，组合物包括任一种免疫细胞(例如本文所述的任一种免疫细胞，例如使用本文所述的任一种方法产生的任一种免疫细胞)。
在一些实施例中，将医药组合物配制成用于不同的给药途径(例如静脉内、皮下)。在一些实施例中，医药组合物可包括药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲盐水)。
可将医药组合物的单次或多次施用给予有需要的受试者，例如取决于：受试者所需和耐受的剂量和频率。配制物应提供足够量的活性剂以有效治疗、预防或改善病状、疾病或症状。
本文还提供了试剂盒，其包括本文所述的任一种单链嵌合多肽、组合物、核酸或细胞(例如免疫细胞)。在一些实施例中，试剂盒可包括用于进行本文所述的任一种方法的说明书。在一些实施例中，试剂盒可包括至少一次剂量的本文所述的任一种医药组合物。
核酸/载体
本文还提供了编码本文所述的任一种单链嵌合多肽的核酸。本文还提供了载体，其包括编码本文所述的任一种单链嵌合多肽的任一种核酸。
本文所述的任一种载体可以是表达载体。例如，表达载体可以包括与编码单链嵌合多肽的序列可操作地连接的启动子序列。
载体的非限制性实例包括质粒、转座子、粘粒和病毒载体(例如任何腺病毒载体(例如pSV或pCMV载体)、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体)，以及任何
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载体。载体可例如包括足够的用于表达的顺式作用元件；其它表达元件可由宿主哺乳动物细胞或在体外表达系统中提供。技术人员将能够选择合适的载体和哺乳动物细胞以制备本文所述的任一种单链嵌合多肽。
细胞
本文还提供了细胞(例如本文所述或本领域已知的任一种示例性细胞)，其包含编码本文所述的任一种单链嵌合多肽的本文所述的任一种核酸。
本文还提供了细胞(例如本文所述或本领域已知的任一种示例性细胞)，其包括编码本文所述的任一种单链嵌合多肽的本文所述的任一种载体。
在本文所述的任一种方法的一些实施例中，细胞可以是真核细胞。如本文所用，术语“真核细胞”是指具有明显的膜结合核的细胞。这类细胞可包括例如哺乳动物(例如啮齿动物、非人灵长类动物或人)、昆虫、真菌或植物细胞。在一些实施例中，真核细胞是酵母细胞，例如啤酒酵母。在一些实施例中，真核细胞是高级真核生物，例如哺乳动物、禽类、植物或昆虫细胞。哺乳动物细胞的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢细胞和人胚胎肾细胞(例如HEK293细胞)。
将核酸和表达载体引入细胞(例如真核细胞)的方法是本领域已知的。可用于将核酸引入细胞中的方法的非限制性实例包括脂质转染、转染、电穿孔、显微注射、磷酸钙转染、基于树状大分子的转染、阳离子聚合物转染、细胞挤压、声致穿孔、光学转染、刺穿感染、流体动力学递送、磁转染、病毒转导(例如腺病毒和慢病毒转导)和纳米颗粒转染。
制备单链嵌合多肽的方法
本文还提供了产生本文所述的任一种单链嵌合多肽的方法，其包括在足以引起单链嵌合多肽产生的条件下、在培养基中培养本文所述的任一种细胞；从细胞和/或培养基中回收单链嵌合多肽。
可使用本领域众所周知的技术(例如硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀、离子交换色谱(阴离子或阳离子)、基于疏水相互作用的色谱、金属亲和色谱、配体亲和色谱和尺寸排阻色谱)从培养基或细胞(例如真核细胞)中回收单链嵌合多肽。
培养细胞的方法是本领域众所周知的。可将细胞在有利于增殖、分化和生长的条件下体外维持。简单来说，可通过使细胞(例如任何细胞)与细胞培养基接触来培养细胞，所述细胞培养基包括必需的生长因子和补充剂以支持细胞活力和生长。
本文还提供了通过本文所述的任一种方法产生的单链嵌合多肽(例如本文所述的任一种单链嵌合多肽)。
刺激免疫细胞的方法
本文还提供了刺激免疫细胞(例如本文所述或本领域已知的任一种示例性免疫细胞)的方法，其包括使免疫细胞与有效量的本文所述的任一种单链嵌合多肽或本文所述的任一种组合物(例如医药组合物)接触。在一些实例中，免疫细胞在体外接触(例如在足以引起对免疫细胞的刺激的条件下在合适的液体培养基中)。
在一些实例中，免疫细胞预先已获自受试者(例如哺乳动物，例如人)。这些方法的一些实施例进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。
在一些实例中，免疫细胞在体内接触。在此类实施例中，将单链嵌合多肽以足以引起受试者中的免疫细胞受到刺激的量施用于受试者(例如哺乳动物，例如人)。
在本文所述的任一种方法的一些实例中，免疫细胞可以是未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、记忆T细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或自然杀手细胞，或其组合。
在一些实例中，免疫细胞先前已经过基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。在一些实例中，免疫细胞(例如本文所述的任一种免疫细胞)先前已经过基因修饰以表达共刺激分子(例如CD28)。
这些方法的一些实施例可以进一步包括在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞(例如本文所述的任一种免疫细胞)。这些方法的一些实施例可以进一步包括在接触步骤之后，将编码共刺激分子(例如CD28)的核酸引入免疫细胞(例如本文所述的任一种免疫细胞)中。
这些方法的一些实施例可以进一步包括将治疗有效量的免疫细胞施用于有需要的受试者(例如本文所述的任一位示例性受试者)。
在一些实例中，受试者可以是被鉴别或诊断患有与年龄相关的疾病或病状的受试者。与年龄有关的疾病或病症的非限制性实例包括：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
在一些实例中，受试者可以是已被鉴别或诊断患有癌症的受试者。癌症的非限制性实例包括：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在一些实例中，受试者可以是已被诊断或鉴别患有感染性疾病的受试者。感染性疾病的非限制性实例包括感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒或流感病毒。
可使用本领域已知的方法来测定免疫细胞的活化。例如，可以通过检测免疫细胞活化后分泌的细胞因子和趋化因子的水平来测定免疫细胞的活化。免疫细胞活化后分泌或上调的细胞因子、趋化因子和调节分子的非限制性实例包括：IL-2、IFN-γ、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22、IL-33、白三烯B4、CCL5、TNFα、颗粒酶、穿孔素、TGFβ、STAT3、ROR...T、FOXP3、STAT6和GATA3。这些细胞因子和趋化因子或调节分子的检测可使用免疫分析(例如酶联免疫吸附分析)和定量PCR进行。举例来说，免疫细胞的活化能够引起以下增加约1％到约800％(例如约1％至约750％，约1％至约700％，约1％至约650％，约1％至约600％，约1％至约550％，约1％至约500％，约1％至约450％，约1％至约400％，约1％至约350％，约1％至约300％，约1％至约280％，约1％至约260％，约1％至约240％，约1％至约220％，约1％至约200％，约1％至约180％，约1％至约160％，约1％至约140％，约1％至约120％，约1％至约100％，约1％至约90％，约1％至约80％，约1％至约70％，约1％至约60％，约1％至约50％，约1％至约45％，约1％至约40％，约1％至约35％，约1％至约30％，约1％至约25％，约1％至约20％，约1％至约15％，约1％至约10％，约1％至约5％，约5％至约800％，约5％至约750％，约5％至约700％，约5％至约650％，约5％至约600％，约5％至约550％，约5％至约500％，约5％至约450％，约5％至约400％，约5％至约350％，约5％至约300％，约5％至约280％，约5％至约260％，约5％至约240％，约5％至约220％，约5％至约200％，约5％至约180％，约5％至约160％，约5％至约140％，约5％至约120％，约5％至约100％，约5％至约90％，约5％至约80％，约5％至约70％，约5％至约60％，约5％至约50％，约5％至约45％，约5％至约40％，约5％至约35％，约5％至约30％，约5％至约25％，约5％至约20％，约5％至约15％，约5％至约10％，约10％至约800％，约10％至约750％，约10％至约700％，约10％至约650％，约10％至约600％，约10％至约550％，约10％至约500％，约10％至约450％，约10％至约400％，约10％至约350％，约10％至约300％，约10％至约280％，约10％至约260％，约10％至约240％，约10％至约220％，约10％至约200％，约10％至约180％，约10％至约160％，约10％至约140％，约10％至约120％，约10％至约100％，约10％至约90％，约10％至约80％，约10％至约70％，约10％至约60％，约10％至约50％，约10％至约45％，约10％至约40％，约10％至约35％，约10％至约30％，约10％至约25％，约10％至约20％，约10％至约15％，约15％至约800％，约15％至约750％，约15％至约700％，约15％至约650％，约15％至约600％，约15％至约550％，约15％至约500％，约15％至约450％，约15％至约400％，约15％至约350％，约15％至约300％，约15％至约280％，约15％至约260％，约15％至约240％，约15％至约220％，约15％至约200％，约15％至约180％，约15％至约160％，约15％至约140％，约15％至约120％，约15％至约100％，约15％至约90％，约15％至约80％，约15％至约70％，约15％至约60％，约15％至约50％，约15％至约45％，约15％至约40％，约15％至约35％，约15％至约30％，约15％至约25％，约15％至约20％，约20％至约800％，约20％至约750％，约20％至约700％，约20％至约650％，约20％至约600％，约20％至约550％，约20％至约500％，约20％至约450％，约20％至约400％，约20％至约350％，约20％至约300％，约20％至约280％，约20％至约260％，约20％至约240％，约20％至约220％，约20％至约200％，约20％至约180％，约20％至约160％，约20％至约140％，约20％至约120％，约20％至约100％，约20％至约90％，约20％至约80％，约20％至约70％，约20％至约60％，约20％至约50％，约20％至约45％，约20％至约40％，约20％至约35％，约20％至约30％，约20％至约25％，约25％至约800％，约25％至约750％，约25％至约700％，约25％至约650％，约25％至约600％，约25％至约550％，约25％至约500％，约25％至约450％，约25％至约400％，约25％至约350％，约25％至约300％，约25％至约280％，约25％至约260％，约25％至约240％，约25％至约220％，约25％至约200％，约25％至约180％，约25％至约160％，约25％至约140％，约25％至约120％，约25％至约100％，约25％至约90％，约25％至约80％，约25％至约70％，约25％至约60％，约25％至约50％，约25％至约45％，约25％至约40％，约25％至约35％，约35％至约800％，约35％至约750％，约35％至约700％，约35％至约650％，约35％至约600％，约35％至约550％，约35％至约500％，约35％至约450％，约35％至约400％，约35％至约350％，约35％至约300％，约35％至约280％，约35％至约260％，约35％至约240％，约35％至约220％，约35％至约200％，约35％至约180％，约35％至约160％，约35％至约140％，约35％至约120％，约35％至约100％，约35％至约90％，约35％至约80％，约35％至约70％，约35％至约60％，约35％至约50％，约35％至约45％，约35％至约40％，约40％至约800％，约40％至约750％，约40％至约700％，约40％至约650％，约40％至约600％，约40％至约550％，约40％至约500％，约40％至约450％，约40％至约400％，约40％至约350％，约40％至约300％，约40％至约280％，约40％至约260％，约40％至约240％，约40％至约220％，约40％至约200％，约40％至约180％，约40％至约160％，约40％至约140％，约40％至约120％，约40％至约100％，约40％至约90％，约40％至约80％，约40％至约70％，约40％至约60％，约40％至约50％，约40％至约45％，约45％至约800％，约45％至约750％，约45％至约700％，约45％至约650％，约45％至约600％，约45％至约550％，约45％至约500％，约45％至约450％，约45％至约400％，约45％至约350％，约45％至约300％，约45％至约280％，约45％至约260％，约45％至约240％，约45％至约220％，约45％至约200％，约45％至约180％，约45％至约160％，约45％至约140％，约45％至约120％，约45％至约100％，约45％至约90％，约45％至约80％，约45％至约70％，约45％至约60％，约45％至约50％，约50％至约800％，约50％至约750％，约50％至约700％，约50％至约650％，约50％至约600％，约50％至约550％，约50％至约500％，约50％至约450％，约50％至约400％，约50％至约350％，约50％至约300％，约50％至约280％，约50％至约260％，约50％至约240％，约50％至约220％，约50％至约200％，约50％至约180％，约50％至约160％，约50％至约140％，约50％至约120％，约50％至约100％，约50％至约90％，约50％至约80％，约50％至约70％，约50％至约60％，约60％至约800％，约60％至约750％，约60％至约700％，约60％至约650％，约60％至约600％，约60％至约550％，约60％至约500％，约60％至约450％，约60％至约400％，约60％至约350％，约60％至约300％，约60％至约280％，约60％至约260％，约60％至约240％，约60％至约220％，约60％至约200％，约60％至约180％，约60％至约160％，约60％至约140％，约60％至约120％，约60％至约100％，约60％至约90％，约60％至约80％，约60％至约70％，约70％至约800％，约70％至约750％，约70％至约700％，约70％至约650％，约70％至约600％，约70％至约550％，约70％至约500％，约70％至约450％，约70％至约400％，约70％至约350％，约70％至约300％，约70％至约280％，约70％至约260％，约70％至约240％，约70％至约220％，约70％至约200％，约70％至约180％，约70％至约160％，约70％至约140％，约70％至约120％，约70％至约100％，约70％至约90％，约70％至约80％，约80％至约800％，约80％至约750％，约80％至约700％，约80％至约650％，约80％至约600％，约80％至约550％，约80％至约500％，约80％至约450％，约80％至约400％，约80％至约350％，约80％至约300％，约80％至约280％，约80％至约260％，约80％至约240％，约80％至约220％，约80％至约200％，约80％至约180％，约80％至约160％，约80％至约140％，约80％至约120％，约80％至约100％，约80％至约90％，约90％至约800％，约90％至约750％，约90％至约700％，约90％至约650％，约90％至约600％，约90％至约550％，约90％至约500％，约90％至约450％，约90％至约400％，约90％至约350％，约90％至约300％，约90％至约280％，约90％至约260％，约90％至约240％，约90％至约220％，约90％至约200％，约90％至约180％，约90％至约160％，约90％至约140％，约90％至约120％，约90％至约100％，约100％至约800％，约100％至约750％，约100％至约700％，约100％至约650％，约100％至约600％，约100％至约550％，约100％至约500％，约100％至约450％，约100％至约400％，约100％至约350％，约100％至约300％，约100％至约280％，约100％至约260％，约100％至约240％，约100％至约220％，约100％至约200％，约100％至约180％，约100％至约160％，约100％至约140％，约100％至约120％，约120％至约800％，约120％至约750％，约120％至约700％，约120％至约650％，约120％至约600％，约120％至约550％，约120％至约500％，约120％至约450％，约120％至约400％，约120％至约350％，约120％至约300％，约120％至约280％，约120％至约260％，约120％至约240％，约120％至约220％，约120％至约200％，约120％至约180％，约120％至约160％，约120％至约140％，约140％至约800％，约140％至约750％，约140％至约700％，约140％至约650％，约140％至约600％，约140％至约550％，约140％至约500％，约140％至约450％，约140％至约400％，约140％至约350％，约140％至约300％，约140％至约280％，约140％至约260％，约140％至约240％，约140％至约220％，约140％至约200％，约140％至约180％，约140％至约160％，约160％至约800％，约160％至约750％，约160％至约700％，约160％至约650％，约160％至约600％，约160％至约550％，约160％至约500％，约160％至约450％，约160％至约400％，约160％至约350％，约160％至约300％，约160％至约280％，约160％至约260％，约160％至约240％，约160％至约220％，约160％至约200％，约160％至约180％，约180％至约800％，约180％至约750％，约180％至约700％，约180％至约650％，约180％至约600％，约180％至约550％，约180％至约500％，约180％至约450％，约180％至约400％，约180％至约350％，约180％至约300％，约180％至约280％，约180％至约260％，约180％至约240％，约180％至约220％，约180％至约200％，约200％至约800％，约200％至约750％，约200％至约700％，约200％至约650％，约200％至约600％，约200％至约550％，约200％至约500％，约200％至约450％，约200％至约400％，约200％至约350％，约200％至约300％，约200％至约280％，约200％至约260％，约200％至约240％，约200％至约220％，约220％至约800％，约220％至约750％，约220％至约700％，约220％至约650％，约220％至约600％，约220％至约550％，约220％至约500％，约220％至约450％，约220％至约400％，约220％至约350％，约220％至约300％，约220％至约280％，约220％至约260％，约220％至约240％，约240％至约800％，约240％至约750％，约240％至约700％，约240％至约650％，约240％至约600％，约240％至约550％，约240％至约500％，约240％至约450％，约240％至约400％，约240％至约350％，约240％至约300％，约240％至约280％，约240％至约260％，约260％至约800％，约260％至约750％，约260％至约700％，约260％至约650％，约260％至约600％，约260％至约550％，约260％至约500％，约260％至约450％，约260％至约400％，约260％至约350％，约260％至约300％，约260％至约280％，约280％至约800％，约280％至约750％，约280％至约700％，约280％至约650％，约280％至约600％，约280％至约550％，约280％至约500％，约280％至约450％，约280％至约400％，约280％至约350％，约280％至约300％，约300％至约800％，约300％至约750％，约300％至约700％，约300％至约650％，约300％至约600％，约300％至约550％，约300％至约500％，约300％至约450％，约300％至约400％，约300％至约350％，约350％至约800％，约350％至约750％，约350％至约700％，约350％至约650％，约350％至约600％，约350％至约550％，约350％至约500％，约350％至约450％，约350％至约400％，约400％至约800％，约400％至约750％，约400％至约700％，约400％至约650％，约400％至约600％，约400％至约550％，约400％至约500％，约400％至约450％，约450％至约800％，约450％至约750％，约450％至约700％，约450％至约650％，约450％至约600％，约450％至约550％，约450％至约500％，约500％至约800％，约500％至约750％，约500％至约700％，约500％至约650％，约500％至约600％，约500％至约550％，约550％至约800％，约550％至约750％，约550％至约700％，约550％至约650％，约550％至约600％，约600％至约800％，约600％至约750％，约600％至约700％，约600％至约650％，约650％至约800％，约650％至约750％，约650％至约700％，约700％至约800％，约700％到约750％，或约750％到约800％)：本文所述的任一种细胞因子或趋化因子或调节分子中的一种或多种(例如任一种IL-2、IFN-γ、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22、IL-33、白三烯B4、CCL5、TNFα、颗粒酶、穿孔素、TGFβ、STAT3、ROR...T、FOXP3、STAT6和GATA3中的一种或多种)(例如相较于与本文所述的任一种单链嵌合多肽不接触的对照组的一种或多种细胞因子和趋化因子的水平)。
诱导或增加免疫细胞增殖的方法
本文还提供了诱导或增加免疫细胞(例如本文所述或本领域已知的任一种示例性免疫细胞)增殖的方法，其包括使免疫细胞与有效量的本文所述的任一种单链嵌合多肽或本文所述的任一种组合物(例如医药组合物)接触。在一些实例中，免疫细胞在体外接触(例如在足以引起对免疫细胞的刺激的条件下在合适的液体培养基中)。
在一些实例中，免疫细胞预先已获自受试者(例如哺乳动物，例如人)。这些方法的一些实施例进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。
在一些实例中，免疫细胞在体内接触。在此类实施例中，将单链嵌合多肽以足以引起受试者中的免疫细胞受到刺激的量施用于受试者(例如哺乳动物，例如人)。
在本文所述的任一种方法的一些实例中，免疫细胞可以是未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、记忆T细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或自然杀手细胞，或其组合。
在一些实例中，免疫细胞先前已经过基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。在一些实例中，免疫细胞(例如本文所述的任一种免疫细胞)先前已经过基因修饰以表达共刺激分子(例如CD28)。
这些方法的一些实施例可以进一步包括在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞(例如本文所述的任一种免疫细胞)。这些方法的一些实施例可以进一步包括在接触步骤之后，将编码共刺激分子(例如CD28)的核酸引入免疫细胞(例如本文所述的任一种免疫细胞)中。
这些方法的一些实施例可以进一步包括将治疗有效量的免疫细胞施用于有需要的受试者(例如，本文所述的任一位示例性受试者)。
在一些实例中，受试者可以是被鉴别或诊断患有与年龄相关的疾病或病状的受试者。与年龄有关的疾病或病症的非限制性实例包括：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
在一些实例中，受试者可以是已被鉴别或诊断患有癌症的受试者。癌症的非限制性实例包括：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在一些实例中，受试者可以是已被诊断或鉴别患有感染性疾病的受试者。感染性疾病的非限制性实例包括感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒或流感病毒。
免疫细胞增殖的检测可使用本领域已知的方法进行，例如流式细胞术(例如荧光辅助流式细胞术)、显微镜检查和免疫荧光显微镜检查，例如通过比较未与单链嵌合多肽接触的样品中的免疫细胞浓度的增加速率和与本文所述的任一种单链嵌合多肽接触的类似样品中的免疫细胞浓度的增加速率)。
在其它实例中，免疫细胞的增殖可以间接地通过检测由增殖免疫细胞分泌的一种或多种细胞因子或趋化因子或调节分子(例如IL-2、IFN-γ、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22、IL-33、白三烯B4、CCL5、TNFα、颗粒酶、穿孔素、TGFβ、STAT3、ROR...T、FOXP3、STAT6和GATA3中的一种或多种)水平的提高(例如相较于未与本文所述的任一种单链嵌合多肽接触的对照组的一种或多种细胞因子和趋化因子的水平)来检测。
在一些实施例中，相较于不与本文所述的任一种单链嵌合多肽接触的类似对照样品中的免疫细胞浓度的增加速率，本文提供的方法可引起本文所述的任一种单链嵌合多肽接触的样品中的免疫细胞浓度的增加速率提高(例如约1％到约800％增幅或本文所述的此范围的任一种子范围)。
诱导免疫细胞分化的方法
本文还提供了诱导免疫细胞(例如本文所述或本领域已知的任一种示例性免疫细胞)分化成记忆或记忆样免疫细胞的方法，其包括使免疫细胞与有效量的本文所述的任一种单链嵌合多肽或本文所述的任一种组合物(例如医药组合物)接触。在一些实例中，免疫细胞在体外接触(例如在足以引起对免疫细胞的刺激的条件下在合适的液体培养基中)。
在一些实例中，免疫细胞预先已获自受试者(例如哺乳动物，例如人)。这些方法的一些实施例进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。
在一些实例中，免疫细胞在体内接触。在此类实施例中，将单链嵌合多肽以足以引起刺激受试者中的免疫细胞受到的量施用于受试者(例如哺乳动物，例如人)。
在本文所述的任一种方法的一些实例中，免疫细胞可以是未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或自然杀手细胞，或其组合。
在一些实例中，免疫细胞先前已经过基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。在一些实例中，免疫细胞(例如本文所述的任一种免疫细胞)预先已经过基因修饰以表达共刺激分子(例如CD28)。
这些方法的一些实施例可以进一步包括在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞(例如本文所述的任一种免疫细胞)。这些方法的一些实施例可以进一步包括在接触步骤之后，将编码共刺激分子(例如CD28)的核酸引入免疫细胞(例如本文所述的任一种免疫细胞)中。
这些方法的一些实施例可以进一步包括将治疗有效量的免疫细胞施用于有需要的受试者(例如本文所述的任一位示例性受试者)。
在一些实例中，受试者可以是被鉴别或诊断患有与年龄相关的疾病或病状的受试者。与年龄有关的疾病或病症的非限制性实例包括：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
在一些实例中，受试者可以是已被鉴别或诊断患有癌症的受试者。癌症的非限制性实例包括：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在一些实例中，受试者可以是已被诊断或鉴别患有感染性疾病的受试者。感染性疾病的非限制性实例包括感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒或流感病毒。
在一些实例中，免疫细胞是NK细胞，并且记忆NK细胞的检测可包括例如检测CD25、CD69、CD62L、IL-12、IL-18、IL-33、STAT4、STAT5、Zbtb32、DNAM-1、NKp30、NKp40、NKp46、BIM、Noxa、SOCS1、BNIP3、BNIP3L、IFN-γ、CXCL16、CXCR6、NKG2D、TRAIL、CD49、Ly49D、CD49b和Ly79H中的一种或多种的水平提高。O'Sullivan等人，《免疫(Immunity)》43:634-645,2015中描述了对NK记忆细胞和其检测方法的说明。
在一些实例中，免疫细胞是T细胞，并且记忆T细胞的检测可包括例如检测CD45RO、CCR7、L-选择素(CD62L)、CD44、CD45RA、整合素αeβ7、CD43、CD27、CD28、IL-7Rα、CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1中的一种或多种的表达水平。在一些实例中，免疫细胞是B细胞，并且记忆B细胞的检测可以包括例如CD27表达水平的检测。记忆或记忆样免疫细胞的其它类型和标记是本领域已知的。
治疗方法
本文还提供了治疗有需要的受试者(例如本文所述或本领域已知的任一位示例性受试者)的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的任一种单链嵌合多肽或本文所述的任一种组合物(例如医药组合物)。
在这些方法的一些实施例中，受试者已被鉴别或诊断患有癌症。癌症的非限制性实例包括：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施例中，这些方法能够使受试者的癌症的一种或多种症状的数目、严重性或频率降低(例如，与治疗前的受试者的癌症的一种或多种症状的数目、严重性或频率相比)。在一些实施例中，这些方法能够使受试者的一种或多种实体肿瘤的体积减少(例如，约1％减少至约99％减少，约1％减少至约95％减少，约1％减少至约90％减少，约1％减少至约85％减少，约1％减少至约80％减少，约1％减少至约75％减少，约1％减少至约70％减少，约1％减少至约65％减少，约1％减少至约60％减少，约1％减少至约55％减少，约1％减少至约50％减少，约1％减少至约45％减少，约1％减少至约40％减少，约1％减少至约35％减少，约1％减少至约30％减少，约1％减少至约25％减少，约1％减少至约20％减少，约1％减少至约15％减少，约1％减少至约10％减少，约1％减少至约5％减少，约5％减少至约99％减少，约5％减少至约95％减少，约5％减少至约90％减少，约5％减少至约85％减少，约5％减少至约80％减少，约5％减少至约75％减少，约5％减少至约70％减少，约5％减少至约65％减少，约5％减少至约60％减少，约5％减少至约55％减少，约5％减少至约50％减少，约5％减少至约45％减少，约5％减少至约40％减少，约5％减少至约35％减少，约5％减少至约30％减少，约5％减少至约25％减少，约5％减少至约20％减少，约5％减少至约15％减少，约5％减少至约10％减少，约10％减少至约99％减少，约10％减少至约95％减少，约10％减少至约90％减少，约10％减少至约85％减少，约10％减少至约80％减少，约10％减少至约75％减少，约10％减少至约70％减少，约10％减少至约65％减少，约10％减少至约60％减少，约10％减少至约55％减少，约10％减少至约50％减少，约10％减少至约45％减少，约10％减少至约40％减少，约10％减少至约35％减少，约10％减少至约30％减少，约10％减少至约25％减少，约10％减少至约20％减少，约10％减少至约15％减少，约15％减少至约99％减少，约15％减少至约95％减少，约15％减少至约90％减少，约15％减少至约85％减少，约15％减少至约80％减少，约15％减少至约75％减少，约15％减少至约70％减少，约15％减少至约65％减少，约15％减少至约60％减少，约15％减少至约55％减少，约15％减少至约50％减少，约15％减少至约45％减少，约15％减少至约40％减少，约15％减少至约35％减少，约15％减少至约30％减少，约15％减少至约25％减少，约15％减少至约20％减少，约20％减少至约99％减少，约20％减少至约95％减少，约20％减少至约90％减少，约20％减少至约85％减少，约20％减少至约80％减少，约20％减少至约75％减少，约20％减少至约70％减少，约20％减少至约65％减少，约20％减少至约60％减少，约20％减少至约55％减少，约20％减少至约50％减少，约20％减少至约45％减少，约20％减少至约40％减少，约20％减少至约35％减少，约20％减少至约30％减少，约20％减少至约25％减少，约25％减少至约99％减少，约25％减少至约95％减少，约25％减少至约90％减少，约25％减少至约85％减少，约25％减少至约80％减少，约25％减少至约75％减少，约25％减少至约70％减少，约25％减少至约65％减少，约25％减少至约60％减少，约25％减少至约55％减少，约25％减少至约50％减少，约25％减少至约45％减少，约25％减少至约40％减少，约25％减少至约35％减少，约25％减少至约30％减少，约30％减少至约99％减少，约30％减少至约95％减少，约30％减少至约90％减少，约30％减少至约85％减少，约30％减少至约80％减少，约30％减少至约75％减少，约30％减少至约70％减少，约30％减少至约65％减少，约30％减少至约60％减少，约30％减少至约55％减少，约30％减少至约50％减少，约30％减少至约45％减少，约30％减少至约40％减少，约30％减少至约35％减少，约35％减少至约99％减少，约35％减少至约95％减少，约35％减少至约90％减少，约35％减少至约85％减少，约35％减少至约80％减少，约35％减少至约75％减少，约35％减少至约70％减少，约35％减少至约65％减少，约35％减少至约60％减少，约35％减少至约55％减少，约35％减少至约50％减少，约35％减少至约45％减少，约35％减少至约40％减少，约40％减少至约99％减少，约40％减少至约95％减少，约40％减少至约90％减少，约40％减少至约85％减少，约40％减少至约80％减少，约40％减少至约75％减少，约40％减少至约70％减少，约40％减少至约65％减少，约40％减少至约60％减少，约40％减少至约55％减少，约40％减少至约50％减少，约40％减少至约45％减少，约45％减少至约99％减少，约45％减少至约95％减少，约45％减少至约90％减少，约45％减少至约85％减少，约45％减少至约80％减少，约45％减少至约75％减少，约45％减少至约70％减少，约45％减少至约65％减少，约45％减少至约60％减少，约45％减少至约55％减少，约45％减少至约50％减少，约50％减少至约99％减少，约50％减少至约95％减少，约50％减少至约90％减少，约50％减少至约85％减少，约50％减少至约80％减少，约50％减少至约75％减少，约50％减少至约70％减少，约50％减少至约65％减少，约50％减少至约60％减少，约50％减少至约55％减少，约55％减少至约99％减少，约55％减少至约95％减少，约55％减少至约90％减少，约55％减少至约85％减少，约55％减少至约80％减少，约55％减少至约75％减少，约55％减少至约70％减少，约55％减少至约65％减少，约55％减少至约60％减少，约60％减少至约99％减少，约60％减少至约95％减少，约60％减少至约90％减少，约60％减少至约85％减少，约60％减少至约80％减少，约60％减少至约75％减少，约60％减少至约70％减少，约60％减少至约65％减少，约65％减少至约99％减少，约65％减少至约95％减少，约65％减少至约90％减少，约65％减少至约85％减少，约65％减少至约80％减少，约65％减少至约75％减少，约65％减少至约70％减少，约70％减少至约99％减少，约70％减少至约95％减少，约70％减少至约90％减少，约70％减少至约85％减少，约70％减少至约80％减少，约70％减少至约75％减少，约75％减少至约99％减少，约75％减少至约95％减少，约75％减少至约90％减少，约75％减少至约85％减少，约75％减少至约80％减少，约80％减少至约99％减少，约80％减少至约95％减少，约80％减少至约90％减少，约80％减少至约85％减少，约85％减少至约99％减少，约85％减少至约95％减少，约85％减少至约90％减少，约90％减少至约99％减少，约90％减少至约95％减少，或约95％减少至约99％减少)(例如，与治疗之前或治疗开始时的一种或多种实体肿瘤的体积相比)。在一些实施例中，这些方法可减少(例如，约1％减少至约99％减少，或本文所述的这一范围的任何子范围)在受试者中发生转移或发生一种或多种另外的转移的风险(例如，相较于在治疗之前的受试者或施用不同疗法的相似受试者或受试者群体中发生转移或发生一种或多种另外的转移的风险)。
在这些方法的一些实例中，受试者已被鉴别或诊断患有与衰老相关的疾病或病状。与衰老有关的疾病和病状的非限制性实例包括：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。在一些实例中，这些方法可引起受试者中与衰老相关的疾病或病状的一种或多种症状的数目、严重性或频率降低(例如，相较于治疗前受试者中与衰老相关的疾病或病状的一种或多种症状的数目、严重性或频率)。在一些实例中，与治疗前的受试者中的衰老细胞的数目相比，所述方法能够使例如受试者中的衰老细胞的数目降低(例如，受试者中与衰老相关的疾病或病症中所涉及和/或牵涉的一种或多种特定组织中衰老细胞的数目降低)(例如，约1％降低至约99％降低，约1％降低至约95％降低，约1％降低至约90％降低，约1％降低至约85％降低，约1％降低至约80％降低，约1％降低至约75％降低，约1％至约70％降低，约1％降低至约65％降低，约1％降低至约60％降低，约1％降低至约55％降低，约1％降低至约50％降低，约1％降低至约45％降低，约1％降低至约40％降低，约1％降低至约35％降低，约1％降低至约30％降低，约1％降低至约25％降低，约1％降低至约20％降低，约1％降低至约15％降低，约1％降低至约10％降低，约1％降低至约5％降低，约5％降低至约99％降低，约5％降低至约95％降低，约5％降低至约90％降低，约5％降低至约85％降低，约5％降低至约80％降低，约5％降低至约75％降低，约5％至约70％降低，约5％降低至约65％降低，约5％降低至约60％降低，约5％降低至约55％降低，约5％降低至约50％降低，约5％降低至约45％降低，约5％降低至约40％降低，约5％降低至约35％降低，约5％降低至约30％降低，约5％降低至约25％降低，约5％降低至约20％降低，约5％降低至约15％降低，约5％降低至约10％降低，约10％降低至约99％降低，约10％降低至约95％降低，约10％降低至约90％降低，约10％降低至约85％降低，约10％降低至约80％降低，约10％降低至约75％降低，约10％至约70％降低，约10％降低至约65％降低，约10％降低至约60％降低，约10％降低至约55％降低，约10％降低至约50％降低，约10％降低至约45％降低，约10％降低至约40％降低，约10％降低至约35％降低，约10％降低至约30％降低，约10％降低至约25％降低，约10％降低至约20％降低，约10％降低至约15％降低，约15％降低至约99％降低，约15％降低至约95％降低，约15％降低至约90％降低，约15％降低至约85％降低，约15％降低至约80％降低，约15％降低至约75％降低，约15％至约70％降低，约15％降低至约65％降低，约15％降低至约60％降低，约15％降低至约55％降低，约15％降低至约50％降低，约15％降低至约45％降低，约15％降低至约40％降低，约15％降低至约35％降低，约15％降低至约30％降低，约15％降低至约25％降低，约15％降低至约20％降低，约20％降低至约99％降低，约20％降低至约95％降低，约20％降低至约90％降低，约20％降低至约85％降低，约20％降低至约80％降低，约20％降低至约75％降低，约20％至约70％降低，约20％降低至约65％降低，约20％降低至约60％降低，约20％降低至约55％降低，约20％降低至约50％降低，约20％降低至约45％降低，约20％降低至约40％降低，约20％降低至约35％降低，约20％降低至约30％降低，约20％降低至约25％降低，约25％降低至约99％降低，约25％降低至约95％降低，约25％降低至约90％降低，约25％降低至约85％降低，约25％降低至约80％降低，约25％降低至约75％降低，约25％至约70％降低，约25％降低至约65％降低，约25％降低至约60％降低，约25％降低至约55％降低，约25％降低至约50％降低，约25％降低至约45％降低，约25％降低至约40％降低，约25％降低至约35％降低，约25％降低至约30％降低，约30％降低至约99％降低，约30％降低至约95％降低，约30％降低至约90％降低，约30％降低至约85％降低，约30％降低至约80％降低，约30％降低至约75％降低，约30％至约70％降低，约30％降低至约65％降低，约30％降低至约60％降低，约30％降低至约55％降低，约30％降低至约50％降低，约30％降低至约45％降低，约30％降低至约40％降低，约30％降低至约35％降低，约35％降低至约99％降低，约35％降低至约95％降低，约35％降低至约90％降低，约35％降低至约85％降低，约35％降低至约80％降低，约35％降低至约75％降低，约35％至约70％降低，约35％降低至约65％降低，约35％降低至约60％降低，约35％降低至约55％降低，约35％降低至约50％降低，约35％降低至约45％降低，约35％降低至约40％降低，约40％降低至约99％降低，约40％降低至约95％降低，约40％降低至约90％降低，约40％降低至约85％降低，约40％降低至约80％降低，约40％降低至约75％降低，约40％至约70％降低，约40％降低至约65％降低，约40％降低至约60％降低，约40％降低至约55％降低，约40％降低至约50％降低，约40％降低至约45％降低，约45％降低至约99％降低，约45％降低至约95％降低，约45％降低至约90％降低，约45％降低至约85％降低，约45％降低至约80％降低，约45％降低至约75％降低，约45％至约70％降低，约45％降低至约65％降低，约45％降低至约60％降低，约45％降低至约55％降低，约45％降低至约50％降低，约50％降低至约99％降低，约50％降低至约95％降低，约50％降低至约90％降低，约50％降低至约85％降低，约50％降低至约80％降低，约50％降低至约75％降低，约50％至约70％降低，约50％降低至约65％降低，约50％降低至约60％降低，约50％降低至约55％降低，约55％降低至约99％降低，约55％降低至约95％降低，约55％降低至约90％降低，约55％降低至约85％降低，约55％降低至约80％降低，约55％降低至约75％降低，约55％至约70％降低，约55％降低至约65％降低，约55％降低至约60％降低，约60％降低至约99％降低，约60％降低至约95％降低，约60％降低至约90％降低，约60％降低至约85％降低，约60％降低至约80％降低，约60％降低至约75％降低，约60％至约70％降低，约60％降低至约65％降低，约65％降低至约99％降低，约65％降低至约95％降低，约65％降低至约90％降低，约65％降低至约85％降低，约65％降低至约80％降低，约65％降低至约75％降低，约65％至约70％降低，约70％降低至约99％降低，约70％降低至约95％降低，约70％降低至约90％降低，约70％降低至约85％降低，约70％降低至约80％降低，约70％降低至约75％降低，约75％降低至约99％降低，约75％降低至约95％降低，约75％降低至约90％降低，约75％降低至约85％降低，约75％降低至约80％降低，约80％降低至约99％降低，约80％降低至约95％降低，约80％降低至约90％降低，约80％降低至约85％降低，约85％降低至约99％降低，约85％降低至约95％降低，约85％降低至约90％降低，约90％降低至约99％降低，约90％降低至约95％降低或约95％降低至约99％降低)。
在这些方法的一些实例中，受试者已被诊断或鉴别患有感染性疾病。感染性疾病的非限制性实例包括感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。在一些实施例中，这些方法可引起受试者中感染滴度(例如病毒滴度)的降低(例如，与治疗前受试者中的感染滴度相比)。在一些实施例中，这些方法可引起受试者中感染性疾病(例如病毒感染)的一种或多种症状的数目、严重性或频率降低(例如，与治疗之前受试者中感染性疾病的一种或多种症状的数目、严重性或频率相比)。
术语“受试者”是指任何哺乳动物。在一些实施例中，受试者或“需要治疗的受试者”可为犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、马科动物(例如，马)、绵羊、牛、猪、山羊、灵长类动物，例如猿猴(例如，猴(例如狨猴、狒狒)或猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩或长臂猿)或人；或啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠、仓鼠或大鼠)。在一些实施例中，受试者或“需要治疗的受试者”可为非人哺乳动物，尤其可使用常规用作证明在人中的治疗功效的模型的哺乳动物(例如，鼠、兔、猪、犬或灵长类动物)。
杀死癌细胞、受感染细胞或衰老细胞的方法
本文还提供了杀死有需要的受试者(例如本文所述或本领域已知的任一位示例性受试者)的癌细胞(例如本文所述或本领域已知的任一种示例性癌症类型)、受感染细胞(例如被本文所述或本领域已知的任一种示例性病毒感染的细胞)、或衰老细胞(例如衰老癌细胞、衰老纤维母细胞或衰老内皮细胞)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的任一种单链嵌合多肽或本文所述的任一种组合物(例如医药组合物)。
在这些方法的一些实施例中，受试者已被鉴别或诊断患有癌症。癌症的非限制性实例包括：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法的一些实例中，受试者已被鉴别或诊断患有与衰老相关的疾病或病状。与衰老有关的疾病和病状的非限制性实例包括：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
在这些方法的一些实例中，受试者已被诊断或鉴别患有感染性疾病。感染性疾病的非限制性实例包括感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
衰老细胞
衰老是不可逆的生长停滞的一种形式，伴随着表型变化、对细胞凋亡的抗性和损伤感知信号传导路径的活化。细胞衰老最初描述为培养的人纤维母细胞失去了增殖能力，在约50群体翻倍后到达永久停滞(称为海弗利克极限(Hayflick limit))。衰老被认为是可由广泛范围的内在和外在伤害，包括氧化和遗传毒性应激、DNA损伤、端粒损耗、致癌活化、线粒体功能障碍或化疗剂诱导的应激反应。
衰老细胞保持代谢活性，并且可通过其分泌表型影响组织止血、疾病和衰老。衰老被认为是生理过程，并且对促进伤口愈合、组织稳态、再生和纤维化调节很重要。例如，在伤口愈合期间观察到衰老细胞的瞬时诱导，并且其有助于伤口愈合。衰老的最重要作用之一可能是其在肿瘤抑制中的作用。但是，衰老细胞的积累也驱动衰老和与衰老相关的疾病和病状。衰老表型还可触发慢性炎性反应，并且因此增强慢性炎症病状以促进肿瘤生长。衰老与衰老之间的联系最初是基于衰老细胞在衰老组织中积累的观察结果。转基因模型的使用已使得能够在许多年龄相关的病理中系统地检测衰老细胞。选择性消除衰老细胞的策略展现衰老细胞确实可在衰老和相关病理中起因果作用。
衰老细胞显示重要且独特的特性，包括形态、染色质组织、基因表达和代谢的变化。存在与细胞衰老相关的几种生化和功能特性，如(i)细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制子p16和p21的表达增加，(ii)存在衰老相关的β-半乳糖苷酶，即溶酶体活性的标记，(iii)出现衰老相关的异染色质灶和核纤层蛋白B1水平下调，(iv)对由抗凋亡BCL家族蛋白表达增加引起的凋亡的抗性，和(v)CD26(DPP4)、CD36(清道夫(Scavenger)受体)、叉头盒4(FOXO4)和分泌性载体膜蛋白4(SCAMP4)上调。衰老细胞还表达炎症特征，即所谓的衰老相关分泌表型(SASP)。通过SASP，衰老细胞产生广泛范围的炎性细胞因子(IL-6、IL-8)、生长因子(TGF-β)、趋化因子(CCL-2)和基质金属蛋白酶(MMP-3、MMP-9)，其以细胞自主方式运作以增强衰老(自分泌效应)，并且与微环境通信并调节微环境(旁分泌效应)。SASP因子可通过触发衰老监视，即免疫介导的衰老细胞清除来促进肿瘤抑制。但是，慢性炎症也是肿瘤发生的已知驱动因素，并且越来越多的证据表明，慢性SASP也可促进癌症和与衰老相关的疾病。
衰老细胞的分泌概况取决于环境。例如，人纤维母细胞中不同的线粒体功能障碍诱导的线粒体功能障碍相关衰老(MiDAS)引起缺乏IL-1依赖性炎症因子的SASP出现。NAD+/NADH比率的降低活化AMPK信号传导，其通过活化p53诱导MiDAS。结果，p53抑制NF-κB信号传导，其为促炎性SASP的关键诱导因素。相反，由人细胞中持续性DNA损伤引起的细胞衰老诱导炎性SASP，其依赖于共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶的活化，而不依赖于p53的活化。特别地，IL-6和IL-8的表达和分泌水平提高。还展现了由异位表达p16INK4a和p21CIP1引起的细胞衰老诱导人纤维母细胞的衰老表型，且不存在炎性SASP，表明生长停滞本身并不刺激SASP。
衰老的最主要特征之一是稳定生长停滞。这是通过两个重要路径，即p16/Rb和p53/p21实现的，这两个路径均为肿瘤抑制的关键。DNA损伤引起：(1)染色质中γH2Ax(组蛋白编码基因)和53BP1(DNA损伤反应中涉及)的高沉积：这引起激酶级联反应的活化，最终引起p53活化，和(2)p16INK4a和ARF(均由CDKN2A编码)和P15INK4b(由CDKN2B编码)的活化：p53诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制子(p21)的转录，并且与p16INK4a和p15INK4b两者一起阻断细胞周期进展的基因(CDK4和CDK6)。这最终引起成视网膜细胞瘤蛋白(Rb)磷酸化不足，并且使细胞周期停滞在G1期。
在正常衰老的情况下，选择性杀死衰老细胞已显示可显著改善小鼠的健康寿命，并且改善与年龄相关的疾病或癌症疗法的结果(Ovadya,《临床研究杂志(J ClinInvest.)》128(4):1247-1254,2018)。在自然界中，衰老细胞通常被先天免疫细胞去除。衰老的诱导不仅阻止了受损/改变的细胞的潜在增殖和转化，而且还通过产生SASP因子(主要起自然杀伤(NK)细胞的化学引诱物(如IL-15和CCL2)和巨噬细胞的化学引诱物(如CFS-1和CCL2)的作用)促进组织修复。这些先天免疫细胞介导消除应激细胞的免疫监视机制。衰老细胞通常上调NK细胞活化受体NKG2D和DNAM1配体，其属于应激诱导性配体家族：防御感染性疾病和恶性肿瘤的一线免疫的重要组分。受体活化后，NK细胞接着可通过其溶胞机构特异性诱导衰老细胞的死亡。已经指出NK细胞在免疫监视肝纤维化(Sagiv，《致癌基因(Oncogene)》32(15)：1971-1977，2013)、肝细胞癌(Iannello，《实验医学杂志(J Exp Med)》210(10)：2057-2069，2013)、多发性骨髓瘤(Soriani，《血液(Blood)》113(15)：3503-3511，2009)以及甲羟戊酸路径功能障碍所应激的神经胶质瘤细胞(Ciaglia，《国际癌症杂志(IntJ Cancer)》142(1)：176-190，2018)的衰老细胞方面的作用。子宫内膜细胞经历急性细胞衰老，并且不会分化成蜕膜细胞。分化的蜕膜细胞分泌IL-15，并且从而募集子宫NK细胞以靶向并消除未分化的衰老细胞，因此有助于重塑和年轻化子宫内膜(Brighton，《E生命(Elife)》6：e31274，2017)。以类似的机制，在肝纤维化过程中，表达p53的衰老肝卫星细胞使驻留库普弗(Kupfer)巨噬细胞和新浸润的巨噬细胞的极化偏向促炎性M1表型，其显示衰老活性。已显示F4/80+巨噬细胞在清除小鼠子宫衰老细胞以维持产后子宫功能中起关键作用。
衰老细胞主要通过上调NKG2D(在NK细胞上表达)的配体、趋化因子和其它SASP因子来募集NK细胞。肝纤维化的体内模型已显示活化的NK细胞有效清除衰老细胞(Krizhanovsky，《细胞(Cell)》134(4)：657-667，2008)。研究已描述多种模型来研究衰老，包括肝纤维化(Krizhanovsky，《细胞》134(4)：657-667，2008)、骨关节炎(Xu，《老年学杂志：A系列，生物科学与医学(J Gerontol A Biol Sci Med Sci)》72(6)：780-785，2017)和帕金森氏病(Chinta，《细胞报告(Cell Rep)》22(4)：930-940，2018)。用于研究衰老细胞的动物模型描述于：Krizhanovsky，《细胞》134(4)：657-667，2008；Baker,《自然》479(7372)：232-236，2011；Farr，《自然·医学(Nat Med)》23(9)：1072-1079，2017；Bourgeois，《欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Lett)》592(12)：2083-2097，2018；Xu，《自然·医学》24(8)：1246-1256，2018)。
其它治疗剂
本文所述的任一种方法的一些实施例可进一步包括向受试者(例如本文所述的任一位受试者)施用治疗有效量的一种或多种其它治疗剂。一种或多种其它治疗剂能够与单链嵌合多肽(例如本文所述的任一种单链嵌合多肽)或免疫细胞基本上同时施用于受试者(例如以单一配制物或两种或更多种配制物的形式施用于受试者)。在一些实施例中，可以在施用单链嵌合多肽(例如，本文所述的任何单链嵌合多肽)或免疫细胞之前向受试者施用一种或多种其它治疗剂。在一些实施例中，一种或多种其它治疗剂能够在单链嵌合多肽(例如本文所述的任一种单链嵌合多肽)或免疫细胞施用于受试者之后施用于受试者。
其它治疗剂的非限制性实例包括：抗癌药物、活化受体激动剂、免疫检查点抑制剂、用于阻断HLA特异性抑制受体的试剂、糖原合酶激酶(GSK)3抑制剂和抗体。
抗癌药的非限制性实例包括抗代谢药物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲氨蝶呤(methotrexate)、6-硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)、奈拉滨(nelarabine)、喷司他汀(pentostatin)或培美曲塞(pemetrexed))、植物碱(例如，长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、喜树碱(camptothecin)、9-甲氧基喜树碱、狗牙花定碱(coronaridine)、紫杉醇(taxol)、乌檀根碱(naucleaoral)、二异戊二烯基化吲哚生物碱(diprenylated indolealkaloid)、山矢车菊碱(montamine)、希什金矢车菊碱(schischkiniin)、原小蘖碱(protoberberine)、小蘖碱(berberine)、血根碱(sanguinarine)、白屈菜红碱(chelerythrine)、白屈菜碱(chelidonine)、鹅掌楸碱(liriodenine)、山岗蠹吾碱(clivorine)、β-咔啉、脱甲氧基娃儿藤碱(antofine)、娃儿藤碱(tylophorine)、白叶藤碱(cryptolepine)、新白叶藤碱(neocryptolepine)、紫堇诺灵碱(corynoline)、依兰碱(sampangine)、咔唑、文珠兰碱(crinamine)、高山网球花碱(montanine)、玫瑰树碱(ellipticine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenisopide)、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)或吖啶酮生物碱)、蛋白酶体抑制剂(例如，乳胞素(lactacystin)、双硫仑(disulfiram)、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、马里佐米(marizomib)(盐孢菌素(salinosporamide)A)、奥普佐米(oprozomib)(ONX-0912)、地兰佐米(delanzomib)(CEP-18770)、环氧霉素(epoxomicin)、MG132、β-羟基β-甲基丁酸盐、硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)或埃沙佐米(ixazomib))、抗肿瘤抗生素(例如，阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、放线菌素(actinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素(mitomycin)或博来霉素(bleomycin))、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(例如，伏立诺他(vorinostat)、帕比诺他(panobinostat)、贝林司他(belinostat)、吉韦诺他(givinostat)、阿贝辛他(abexinostat)、缩肽(depsipeptide)、恩替诺特(entinostat)、苯基丁酸盐、丙戊酸、曲古抑菌素(trichostatin)A、达西司他(dacinostat)、莫西司他(mocetinostat)、普瑞司他(pracinostat)、烟酰胺(nicotinamide)、坎比诺尔(cambinol)、替诺文(tenovin)1、替诺文6、斯汀诺(sirtinol)、利可司他(ricolinostat)、替非司他(tefinostat)、凯维林(kevetrin)、奎西司他(quisinostat)、雷米诺他(resminostat)、泰克地那林(tacedinaline)、西达本胺(chidamide)或赛利司他(selisistat))、酪氨酸激酶抑制剂(例如，阿昔替尼(axitinib)、达沙替尼(dasatinib)、恩可非尼(encorafinib)、厄洛替尼(erlotinib)、伊马替尼(imatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕唑帕尼(pazopanib)和舒尼替尼(sunitinib))和化疗剂(例如，全反式维甲酸、阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、去氧氟尿苷、埃博霉素(epothilone)、羟脲、伊马替尼、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星(valrubicin)、维罗非尼(vemurafenib)和来那度胺(lenalidomide))。化疗剂的另外实例包括烷化剂，例如二氯甲二乙胺、环磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、噻替派(thiotepa)、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)、白消安(busulfan)、六甲蜜胺(altretamine)、丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、卡莫司汀(carmustine)、罗莫司汀(lumustine)、链脲霉素(streptozocin)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)。
活化受体激动剂的非限制性实例包括活化和增强NK细胞的细胞毒性的活化受体的任何激动剂，包括抗CD16抗体(例如抗CD16/CD30双特异性单克隆抗体(BiMAb))和基于Fc的融合蛋白。检查点抑制剂的非限制性实例包括抗PD-1抗体(例如MEDI0680)、抗PD-L1抗体(例如BCD-135、BGB-A333、CBT-502、CK-301、CS1001、FAZ053、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316、抗PD-L1/CTLA-4双特异性抗体KN046、抗PD-L1/TGFβRII融合蛋白M7824、抗PD-L1/TIM-3双特异性抗体LY3415244、阿特珠单抗(atezolizumab)或阿维鲁单抗(avelumab))、抗TIM3抗体(例如TSR-022、Sym023或MBG453)和抗CTLA-4抗体(例如AGEN1884、MK-1308，或抗CTLA-4/OX40双特异性抗体ATOR-1015)。用于阻断HLA特异性抑制受体的试剂的非限制性实例包括莫那力单抗(monalizumab)(例如抗HLA-E NKG2A抑制受体单克隆抗体)。GSK3抑制剂的非限制性实例包括替格鲁西布(tideglusib)或CHIR99021。可用作其它治疗剂的抗体的非限制性实例包括抗CD26抗体(例如YS110)、抗CD36抗体和可结合到NK细胞上的Fc受体(例如CD16)并活化所述受体的任何其它抗体或抗体构建体。在一些实施例中，另外的治疗剂可以是胰岛素或二甲双胍。
实例
本发明在以下实例中进行了进一步描述，所述实例不限制权利要求书中所述的本发明范围。
实例1.示例性单链嵌合多肽的产生产生示例性单链嵌合多肽(αCD3scFv/TF/αCD28scFv)(图1)，其包括：作为抗CD3 scFv的第一靶标结合域、人可溶性组织因子域，和作为抗CD28 scFv的第二靶标结合域。这种单链嵌合多肽的核酸和氨基酸序列如下所示。
编码示例性单链嵌合多肽(αCD3scFv/TF/αCD28scFv)的核酸(SEQ ID NO:4)
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCTTATTATTTTTATTCAGCTCCGCCTATTCC
(αCD3轻链可变区)
CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGT
(接头)
GGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGC
(αCD3重链可变区)
CAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGC
(人组织因子219形式)
TCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(αCD28轻链可变区)
GTCCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGAACTCGTGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCTCCTATGTGATCCAGTGGGTCAAACAGAAGCCCGGACAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAACCCTTACAACGACTATACCAAATACAACGAGAAGTTTAAGGGAAAGGCTACTTTAACCTCCGACAAAAGCTCCATCACAGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAACATCCGAGGACAGCGCTCTGTACTATTGCGCCCGGTGGGGCGACGGCAATTACTGGGGACGGGGCACAACACTGACCGTGAGCAGC
(接头)
GGAGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGCGGCTCC
(αCD28轻链可变区)
GACATCGAGATGACCCAGTCCCCCGCTATCATGTCCGCCTCTTTAGGCGAGCGGGTCACAATGACTTGTACAGCCTCCTCCAGCGTCTCCTCCTCCTACTTCCATTGGTACCAACAGAAACCCGGAAGCTCCCCTAAACTGTGCATCTACAGCACCAGCAATCTCGCCAGCGGCGTGCCCCCTAGGTTTTCCGGAAGCGGAAGCACCAGCTACTCTTTAACCATCTCCTCCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACCTACTTTTGTCACCAGTACCACCGGTCCCCCACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGACAAAGAGG
示例性单链嵌合多肽(αCD3scFv/TF/αCD28scFv)(SEQ ID NO:3)
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(αCD3轻链可变区)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD3重链可变区)
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(αCD28轻链可变区)
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSS
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD28重链可变区)
DIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR
产生第二示例性单链嵌合多肽(αCD28scFv/TF/αCD3scFv)(图2)，其包括：作为抗CD28 scFv的第一靶标结合域、人可溶性组织因子域，和作为抗CD3 scFv的第二靶标结合域。这种单链嵌合多肽的核酸和氨基酸序列如下所示。
编码示例性单链嵌合多肽(αCD28scFv/TF/αCD3scFv)的核酸(SEQ ID NO:8)
(信号肽)
ATGAAATGGGTCACCTTCATCTCTTTACTGTTTTTATTTAGCAGCGCCTACAGC
(αCD28轻链可变区)
GTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCCGAACTGGTCAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCTCCTACGTCATCCAATGGGTGAAGCAGAAGCCCGGTCAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAATCCCTACAACGATTACACCAAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACTCTGACAAGCGACAAGAGCTCCATTACCGCCTACATGGAGTTTTCCTCTTTAACTTCTGAGGACTCCGCTTTATACTATTGCGCTCGTTGGGGCGATGGCAATTATTGGGGCCGGGGAACTACTTTAACAGTGAGCTCC
(接头)
GGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGAGGATCTGGCGGTGGAGGCAGC
(αCD28重链可变区)
GACATCGAGATGACACAGTCCCCCGCTATCATGAGCGCCTCTTTAGGAGAACGTGTGACCATGACTTGTACAGCTTCCTCCAGCGTGAGCAGCTCCTATTTCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCTCCTCCCCTAAACTGTGTATCTACTCCACAAGCAATTTAGCTAGCGGCGTGCCTCCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCAGCACCTCTTACTCTTTAACCATTAGCTCTATGGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTTTTGCCATCAGTACCACCGGTCCCCTACCTTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGACCAAGCGG
(人组织因子219形式)
AGCGGCACCACCAACACAGTGGCCGCCTACAATCTGACTTGGAAATCCACCAACTTCAAGACCATCCTCGAGTGGGAGCCCAAGCCCGTTAATCAAGTTTATACCGTGCAGATTTCCACCAAGAGCGGCGACTGGAAATCCAAGTGCTTCTATACCACAGACACCGAGTGCGATCTCACCGACGAGATCGTCAAAGACGTGAAGCAGACATATTTAGCTAGGGTGTTCTCCTACCCCGCTGGAAACGTGGAGAGCACCGGATCCGCTGGAGAGCCTTTATACGAGAACTCCCCCGAATTCACCCCCTATCTGGAAACCAATTTAGGCCAGCCCACCATCCAGAGCTTCGAACAAGTTGGCACAAAGGTGAACGTCACCGTCGAAGATGAGAGGACTTTAGTGCGGAGGAACAATACATTTTTATCCTTACGTGACGTCTTCGGCAAGGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCTAGCTCCTCCGGCAAGAAGACCGCCAAGACCAATACCAACGAATTTTTAATTGACGTGGACAAGGGCGAGAACTACTGCTTCTCCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACAGTGAACCGGAAGTCCACCGACTCCCCCGTGGAGTGCATGGGCCAAGAGAAGGGAGAGTTTCGTGAG
(αCD3轻链可变区)
CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCTATTATGAGCGCTAGCCCCGGTGAAAAGGTGACTATGACATGCAGCGCCAGCTCTTCCGTGAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGTCCGGCACCAGCCCTAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTCCCCGCTCACTTTCGGGGCTCCGGCTCCGGAACAAGCTACTCTCTGACCATCAGCGGCATGGAAGCCGAGGATGCCGCTACCTATTACTGTCAGCAGTGGAGCTCCAACCCCTTCACCTTTGGATCCGGCACCAAGCTCGAGATTAATCGT
(接头)
GGAGGCGGAGGTAGCGGAGGAGGCGGATCCGGCGGTGGAGGTAGC
(αCD3重链可变区)
CAAGTTCAGCTCCAGCAAAGCGGCGCCGAACTCGCTCGGCCCGGCGCTTCCGTGAAGATGTCTTGTAAGGCCTCCGGCTATACCTTCACCCGGTACACAATGCACTGGGTCAAGCAACGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATTGGCTATATCAACCCCTCCCGGGGCTATACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAAGCCACCCTCACCACCGACAAGTCCAGCAGCACCGCTTACATGCAGCTGAGCTCTTTAACATCCGAGGATTCCGCCGTGTACTACTGCGCTCGGTACTACGACGATCATTACTGCCTCGATTACTGGGGCCAAGGTACCACCTTAACAGTCTCCTCC
示例性单链嵌合多肽(αCD28scFv/TF/αCD3scFv)(SEQ ID NO:7)
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(αCD28轻链可变区)
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSS
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD28重链可变区)
DIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(αCD3轻链可变区)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD3重链可变区)
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
将编码αCD3scFv/TF/αCD28scFv的核酸克隆到经修饰的逆转录病毒表达载体中，如此前所述(Hughes等人，《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》16：457-72，2005)。将编码αCD3scFv/TF/αCD28scFv的表达载体转染到CHO-K1细胞中。表达载体在CHO-K1细胞中的表达允许分泌出溶性αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽(称为3t28)，所述多肽通过抗TF抗体亲和和其它色谱方法进行纯化。
抗组织因子抗体亲和柱用于纯化αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽。抗组织因子抗体亲和柱连接到GE Healthcare AKTA Avant系统。除洗脱步骤为2mL/min外，所有步骤均使用4mL/min的流速。
使用1M Tris碱将包括αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽的细胞培养收集物调节到pH 7.4并且负载到经5个柱体积的PBS平衡的抗TF抗体亲和柱(上文所述)上。上样后，用5个柱体积的PBS洗涤柱，然后用6个柱体积的0.1M乙酸(pH 2.9)洗脱。收集A280洗脱峰，然后通过添加1M Tris碱中和至pH 7.5-8.0。然后使用具有30KDa分子量截断值的Amicon离心过滤器，使中和的样品在PBS中缓冲交换。图2中的数据表明抗组织因子抗体亲和柱能够结合包含人类可溶性组织因子域的αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽。缓冲交换的蛋白质样品在2-8℃下存储，用于进一步的生化分析和生物活性测试。
每次洗脱之后，使用6个柱体积的0.1M甘氨酸(pH 2.5)剥离抗组织因子抗体亲和柱。然后使用10个柱体积的PBS、0.05％NaN3中和所述柱，并且在2-8℃下存储。
使用与AKTA Avant系统(得自通用电气医疗集团(GE Healthcare))连接的Superdex 200 Increase 10/300GL凝胶过滤柱(得自通用电气医疗集团)，对αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽进行分析型尺寸排阻色谱(SEC)。用2个柱体积的PBS平衡所述柱。使用0.8mL/min的流速。使用毛细管回路，将两百微升的αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽(1mg/mL)注射到柱上。注射单链嵌合多肽后，使1.25个柱体积的PBS流入柱中。SEC色谱如图3所示。数据显示存在3个蛋白质峰，可能代表呈单体和二聚体或其它不同形式的αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽。
为了测定αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽的纯度和蛋白质分子量，利用标准的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(4-12％NuPage Bis-Tris凝胶)电泳(SDS-PAGE)方法、在还原型条件下分析从抗组织因子antibody亲和柱纯化的αCD3scFv/TF/αCD28scFv蛋白质样品。凝胶用InstantBlue染色约30分钟且纯化水脱色整夜。图4显示了使用抗组织因子抗体亲和柱纯化的αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽的SDS凝胶。结果表明，纯化的αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽在还原型SDS凝胶中具有预期的分子量(72kDa)。
实例2.αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽的功能表征
基于ELISA的方法证实了αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽形成。使用ELISA检测αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽，其中一种抗TF单克隆抗体用于捕捉且不同的抗TF单克隆抗体用于检测(图5)。将具有相似浓度的纯化组织因子蛋白用作对照。
进一步进行体外实验，以确定αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽是否能够活化人外周血单核细胞(PBMC)。从血库获得新鲜的人白细胞，并使用密度梯度Histopaque(Sigma)分离出外周血单核细胞(PBMC)。对细胞进行计数且以0.2×106个/mL的浓度再悬浮于平底96孔板中的0.2mL完全培养基(RPMI 1640(Gibco)，其补充有2mM L-谷氨酰胺(赛默生命技术公司(Thermo Life Technologies))、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和10％FBS(Hyclone))中。细胞在37℃、5％CO2下用0.01nM到1000nM的αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽刺激3天。72小时之后，收集细胞且表面用CD4-488、CD8-PerCP Cy5.5、CD25-BV421、CD69-APCFire750、CD62L-PE Cy7和CD44-PE(Biolegend)染色30分钟。表面染色之后，用含0.5％BSA(EMD密理博(EMD Millipore))和0.001％叠氮化钠(西格玛(Sigma))的FACS缓冲液(1×PBS(Hyclone))洗涤细胞(室温下，1500RPM，5分钟)。两次洗涤后，将细胞再悬浮于
Figure BDA0003044956670001433
FACS缓冲液中且通过流式细胞术(Celesta-BDBioscience)分析。图6和7中的数据表明αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽能够刺激CD8+和CD4+ T细胞。
进一步进行实验，其中对使用Histopaque(西格玛)分离出的PBMC进行计数且以0.2×106/mL再悬浮于平底96孔板中的0.2mL完全培养基(RPMI 1640(Gibco)，其补充有2mML-谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和10％FBS(Hyclone))中。细胞在37℃、5％CO2下用0.01nM到1000nM的αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽刺激3天。72小时之后，收集细胞且表面用CD4-488、CD8-PerCPCy5.5、CD25-BV421、CD69-APCFire750、CD62L-PE Cy7和CD44-PE(Biolegend)染色30分钟。表面染色之后，用含0.5％BSA(EMD密理博(EMD Millipore))和0.001％叠氮化钠(西格玛(Sigma))的FACS缓冲液(1×PBS(Hyclone))洗涤细胞(室温下，1500RPM，5分钟)。两次洗涤后，将细胞再悬浮于
Figure BDA0003044956670001434
FACS缓冲液中且通过流式细胞术(Celesta-BD Bioscience)分析。数据再次表明αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽能够刺激CD4+ T细胞的活化(图8)。
实例3.示例性单链嵌合多肽IL-2/TF/IL-2的产生和表征
产生了示例性的单链嵌合多肽，其包括结合至IL-2受体的第一靶标结合域、人可溶性组织因子域和结合至IL-2受体的第二靶标结合域(IL-2/TF/IL-2)(图9)。这种单链嵌合多肽的核酸和氨基酸序列如下所示。
编码示例性单链嵌合多肽(IL-2/TF/IL-2)的核酸(SEQ ID NO:111)
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(第一IL-2片段)
GCCCCCACCTCCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCCCTCGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGTCCAAGAATTTCCATTTAAGGCCCCGGGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTTTTAGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATCATCTCCACTTTAACC
(人组织因子219形式)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(第二IL-2片段)
GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACT
示例性单链嵌合多肽(IL-2/TF/IL-2)(SEQ ID NO:110)
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人类IL-2)
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人类IL-2)
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
将编码IL-2/TF/IL-2的核酸克隆到经修饰的逆转录病毒表达载体中，如此前所述(Hughes等人，《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》16：457-72，2005)。将编码IL-2/TF/IL-2的表达载体转染到CHO-K1细胞中。表达载体在CHO-K1细胞中的表达允许分泌出可溶性IL-2/TF/IL-2单链嵌合多肽(称为2t2)，所述多肽能够通过抗TF抗体亲和和其它色谱方法来纯化。
IL-2和IL-2/TF/IL-2以类似方式促进含有IL-2Rβ和共用γ链的32Dβ细胞增殖
为了评估IL-2/TF/IL-2中的IL-2活性，对IL-2/TF/IL-2与重组IL-2促进表达IL-2Rβ和共用γ链的32Dβ细胞增殖进行比较。IL-2依赖性32Dβ细胞用IMDM-10％FBS洗涤5次且以每孔2×104个细胞接种于孔中。将IL-2/TF/IL-2或IL-2的连续稀释液添加到细胞中(图10)。将细胞在CO2培育箱中在37℃下培育3天。通过在第3天向每个孔中添加10μl WST1且在CO2培育箱中在37℃下再培育3小时来检测细胞增殖。通过测量450nm吸光度来分析甲臜染料的产生量。如图10所示，IL-2/TF/IL-2和IL-2以类似方式活化32Dβ细胞。IL-2/TF/IL-2和IL-2的EC50分别是158.1pM和140pM。
相较于IL-2，IL-2/TF/IL-2促进含有IL-2Rαβγ的CTLL-2细胞增殖的能力改善
为了评估IL-2/TF/IL-2中的IL-2活性，对IL-2/TF/IL-2与重组IL-2促进表达IL-2Rα、IL-2Rβ和共用γ链的CTLL-2细胞增殖进行比较。IL-2依赖性CTLL-2细胞用IMDM-10％FBS洗涤5次且以每孔2×104个细胞接种于孔中。将IL-2/TF/IL-2或IL-2的连续稀释液添加到细胞中(图11)。在CO2培育箱中在37℃下培育细胞3天。通过在第3天向每个孔中添加10μlWST1且在CO2培育箱中在37℃下再培育3小时来检测细胞增殖。通过测量450nm吸光度来分析甲臜染料的产生量。如图3所示，IL-2/TF/IL-2促进CTLL-2细胞增殖比IL-2强4-5倍。IL-2/TF/IL-2的EC50是123.2pM，IL-2是548.2pM。
IL-2/TF/IL-2抑制了ApoE-/-小鼠的高脂诱导高血糖症恶化
向六周龄雌性ApoE-/-小鼠(杰克逊实验室(Jackson Lab))喂食标准饮食或含有21％脂肪、0.15％胆固醇、34.1％蔗糖、19.5％酪蛋白和15％淀粉的高脂饮食(TD88137，哈兰实验室(Harlan Laboratories))并且在标准条件下维持。第7周，将高脂饮食喂养的小鼠随机分为对照组和处理组。然后，小鼠通过皮下注射3mg/kg剂量接受IL-2/TF/IL-2(处理组)或PBS(饮食组和对照组)。给药后的第三天，将小鼠禁食整夜，并通过眼眶后静脉神经丛穿刺收集血样。使用OneTouch血糖仪测量整夜空腹血糖水平。如图12所示，结果表明IL-2/TF/IL-2注射有效地抑制了ApoE-/-小鼠中葡萄糖水平的增加。
IL-2/TF/IL-2使血液淋巴细胞中的CD4+CD25+FoxP3+ T调节性(Treg)细胞比率显著上调
向六周龄雌性ApoE-/-小鼠(杰克逊实验室)喂食标准饮食或含有21％脂肪、0.15％胆固醇、34.1％蔗糖、19.5％酪蛋白和15％淀粉的高脂肪饮食(TD88137，哈兰实验室)并且在标准条件下维持。第7周，将高脂饮食喂养的小鼠随机分为对照组和处理组。然后，小鼠通过皮下注射3mg/kg剂量接受IL-2/TF/IL-2(处理组)或PBS(饮食组和对照组)。给药后的第三天，通过眼眶后静脉丛穿刺来收集整夜空腹的血液样品且与ACK溶解缓冲液(赛默飞世尔科技)一起在37℃下培育5分钟。然后将样品再悬浮于FACS缓冲液(1×PBS(Hyclone)，其含有0.5％BSA(EMD密理博)和0.001％叠氮化钠(西格玛))中且表面用FITC-抗CD4和APC-抗CD25抗体(BioLegend)染色30分钟。将表面染色的样品进一步固定，并用Fix/Perm缓冲液(BioLegend)进行预金属化，并用PE-抗Foxp3抗体(BioLegend)进行细胞内染色。染色后，将细胞用FAC缓冲液洗涤两次，然后在室温下以1500RPM离心5分钟。通过流式细胞术(Celesta-BD Bioscience)分析细胞。如图13所示，相较于未处理组(饮食组为0.4％±0.16且高脂饮食组为0.46％±0.09)，IL-2/TF/IL-2处理使血液淋巴细胞中的Treg群体显著增加(3.5％±0.32)。
抗TF抗体亲和柱纯化IL-2/TF/IL-2的洗脱色谱
将从细胞培养物中收获的IL-2/TF/IL-2负载到用5个柱体积的PBS平衡的抗TF抗体亲和柱上。上样后，用5个柱体积的PBS洗柱，然后用6个柱体积的0.1M乙酸(pH 2.9)洗脱。收集A280洗脱峰，并且然后用1M Tris碱中和到pH 7.5-8.0。然后使用具有30KDa分子量截断值的Amicon离心过滤器，使中和的样品在PBS中缓冲交换。如图14所示，抗TF抗体亲和柱与包含TF作为融合域的IL-2/TF/IL-2结合。将缓冲交换的蛋白质样品在2-8℃下存储，以用于进一步生化分析和生物活性测试。每次洗脱后，使用6个柱体积的0.1M甘氨酸(pH 2.5)剥离抗TF抗体亲和柱。然后使用5个柱体积的PBS和7个柱体积的20％乙醇中和所述柱，以用于存储。抗TF抗体亲和柱连接到通用电气医疗集团AKTA Avant系统。除洗脱步骤外，所有步骤的流速均为4mL/min，洗脱步骤的流速为2mL/min。
IL-2/TF/IL-2的分析型尺寸排阻色谱(SEC)分析
为了使用分析型尺寸排阻色谱(SEC)分析IL-2/TF/IL-2，将Superdex 200Increase 10/300 GL凝胶过滤柱(得自通用电气医疗集团)连接到AKTA Avant系统(得自通用电气医疗集团)。用2个柱体积的PBS平衡所述柱。流速是0.7mL/min。使用毛细管回路将含有IL-2/TF/IL-2于PBS中的样品注入Superdex 200柱中并且通过SEC进行分析。样品的SEC色谱如图15所示。SEC结果表明IL-2/TF/IL-2有两个蛋白质峰。
IL-2/TF/IL-2的还原型SDS-PAGE
为了测定蛋白质的纯度和分子量，在还原条件下通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(4-12％NuPage Bis-Tris凝胶)电泳(SDS-PAGE)方法分析用抗TF抗体亲和柱纯化的IL-2/TF/IL-2蛋白样品。电泳后，将凝胶用InstantBlue染色约30分钟，接着在纯化水中脱色整夜。
为了验证IL-2/TF/IL-2蛋白在CHO细胞中翻译后经历糖基化，使用来自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)的蛋白质脱糖基化混合物II试剂盒，根据制造商说明书进行脱糖基化实验。图16A和16B显示了未脱糖基化(红色轮廓的泳道1)和脱糖基化(黄色轮廓的泳道2)状态的样品的还原型SDS-PAGE分析。结果显示，当在CHO细胞中表达时，IL-2/TF/IL-2蛋白被糖基化。脱糖基化后，纯化的样品在还原型SDS凝胶中以预期的分子量(56kDa)跑电泳。泳道M负载10μL SeeBlue Plus2预染标准液。
IL-2/TF/IL-2的体内表征
将IL-2/TF/IL-2以不同剂量皮下注射到C57BL/6小鼠中，以测定IL-2/TF/IL-2的体内免疫刺激活性。小鼠用0.1、0.4、2和10mg/kg的对照溶液(PBS)或IL-2/TF/IL-2皮下处理。处理后第3天将经处理的小鼠安乐死。处理后第3天收集小鼠脾脏并称重。制备单一脾细胞悬浮液，且所制备的脾细胞针对CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞(用荧光染料偶联的抗CD4、抗CD8和抗NK1.1抗体)染色，且通过流式细胞术分析。结果表明，基于脾脏重量，IL-2/TF/IL-2尤其在0.1-10mg/kg时有效扩增脾细胞(图17A)。在2和10mg/kg时，CD8+ T细胞百分比高于对照物处理的小鼠(图17B)。在所有测试剂量下，NK细胞百分比高于对照物处理的小鼠(图17B)。
已知IL-2上调免疫细胞对CD25的表达。我们因此获知了经IL-2/TF/IL-2处理的小鼠中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞的CD25表达。C57BL/6小鼠用IL-2/TF/IL-2皮下处理，如上述段落中所述。脾细胞用荧光染料偶联的抗CD4、抗CD8、CD25和NK1.1单克隆抗体染色。通过流式细胞术分析脾细胞亚群的CD25表达(MFI)。如图18所示，在测试的剂量和时间点(第3天)，IL-2/TF/IL-2显著上调CD4+ T细胞对CD25的表达，但CD8+ T细胞或NK细胞则不然。
还研究了IL-2/TF/IL-2在C57BL/6小鼠中的药代动力学。将IL-2/TF/IL-2以1mg/kg皮下注射到C57BL/6小鼠中。在如图19所示的多个时间点从小鼠尾静脉抽血，并且制备血清。用ELISA测定IL-2/TF/IL-2浓度(捕获：抗组织因子抗体；检测：生物素化的抗人IL-2抗体，然后是SA-HRP和ABTS底物)。用PK Solutions 2.0(Summit Research Services)计算，IL-2/TF/IL-2的半衰期为1.83小时。
IL-2/TF/IL-2减弱了ApoE-/-小鼠中的高脂肪诱导动脉粥样硬化斑形成
向六周龄雌性ApoE-/-小鼠(杰克逊实验室)喂食标准饮食或高脂肪饮食(21％脂肪、0.15％胆固醇、34.1％蔗糖、19.5％酪蛋白和15％淀粉)(TD88137，哈兰实验室)并且在标准条件下维持。第7周，将高脂饮食(HFD)喂养的小鼠随机分为对照组和处理组。然后以每周3mg/kg的剂量皮下施用于小鼠IL-2/TF/IL-2(处理组)或PBS(饮食组和对照组)，持续4周。第12周，通过异氟烷对所有小鼠实施安乐死。收集主动脉，纵向打开且使用正面方法，用苏丹IV溶液(0.5％)染色。然后用Image J软件定量斑面积相对于总主动脉面积的百分比(红色，如图20A所示)。图20A显示了来自每组的动脉粥样硬化斑的代表性视图。图20B显示了每组的动脉粥样硬化斑的定量分析结果。对照组(HF饮食)的斑面积百分比远高于处理组(HFD+IL-2/TF/IL-2)：10.28％对4.68％。
IL-2/TF/IL-2抑制2型糖尿病恶化
向雄性BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J(db/db(杰克逊实验室))小鼠喂食标准饮食，并让其随意饮水。在六周龄时，将小鼠随机分为对照组和处理组。处理组每两周一次以皮下注射方式接受3mg/kg的IL-2/TF/IL-2，而对照组仅接受媒剂(PBS)。使用OneTouch血糖仪每周测量整夜空腹血糖水平。结果表明，IL-2/TF/IL-2有效抑制BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J小鼠血糖水平的升高。
首次注射后，IL-2/TF/IL-2显著上调了血液淋巴细胞中的CD4+CD25+FoxP3+ T调节细胞的比率
向雄性BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J(db/db)(杰克逊实验室)小鼠喂食标准饮食并让其随意饮水。在六周龄时，将小鼠随机分为对照组和处理组。处理组每两周一次以皮下注射方式接受3mg/kg的IL-2/TF/IL-2，而对照组仅接受媒剂(PBS)。首次注射药物后的第四天，收集整夜空腹血样，并与ACK溶解缓冲液(赛默飞世尔科技)在37℃下培育5分钟。然后将样品再悬浮于FACS缓冲液(1×PBS(Hyclone)，其含有0.5％BSA(EMD密理博)和0.001％叠氮化钠(西格玛))中且表面用FITC-抗CD4和APC-抗CD25抗体(BioLegend)染色30分钟。将表面染色的样品进一步固定，并用Fix/Perm缓冲液(BioLegend)进行预金属化，并用PE-抗Foxp3抗体(BioLegend)进行细胞内染色。染色后，将细胞用FAC缓冲液洗涤两次，并通过流式细胞仪(Celesta-BD Bioscience)进行分析。测量了血液淋巴细胞中CD4+CD25+FoxP3+Tregs的百分比。如图22所示，结果表明IL-2/TF/IL-2显著上调了血液淋巴细胞中Treg的比率。*p<0.05
实例4.示例性单链嵌合多肽IL-15/TF/IL-15的产生和表征
产生了第二示例性单链嵌合多肽，其包括结合至IL-15受体的第一靶标结合域、人可溶性组织因子域和结合至IL-15受体的第二靶标结合域(IL-15/TF/IL-15或IL-15/TF/IL-15)(图23)。这种单链嵌合多肽的核酸和氨基酸序列如下所示。
编码示例性单链嵌合多肽(IL-15/TF/IL-15)的核酸(SEQ ID NO:117)
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(第一IL-15片段)
AACTGGGTGAACGTGATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAGGATTTAATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACTCTGTACACTGAGAGCGACGTGCACCCTAGCTGCAAGGTGACTGCCATGAAGTGCTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGCGATGCCAGCATCCACGACACTGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAACAACTCTTTAAGCAGCAACGGCAACGTGACAGAGAGCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTTTACAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACTAGC
(人组织因子219形式)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(第二IL-15片段)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
示例性单链嵌合多肽(IL-15/TF/IL-15)(SEQ ID NO:116)
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
将编码IL-15/TF/IL-15的核酸克隆到经修饰的逆转录病毒表达载体中，如此前所述(Hughes等人，《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》16：457-72，2005)。将编码IL-15/TF/IL-15的表达载体转染到CHO-K1细胞中。表达载体在CHO-K1细胞中的表达允许分泌出可溶性IL-15/TF/IL-15单链嵌合多肽(称为15t15)，其可通过抗TF抗体亲和和其它色谱方法进行纯化。
IL-15/TF/IL-15促进含有IL-2Rβ和共用γ链的32Dβ细胞增殖
对IL-15/TF/IL-15中的IL-15与重组IL-15在表达IL2Rβ和共用γ链的32Dβ细胞中的活性进行比较。IL-15依赖性32Dβ细胞用IMDM-10％FBS洗涤五次，并以每孔2×104个细胞接种到孔中。将IL-15/TF/IL-15或IL-15的连续稀释液添加到细胞中(图24)。在CO2培育箱中在37℃下培育细胞3天。通过在第3天向每个孔中添加10μl WST1且在CO2培育箱中在37℃下再培育3小时来检测细胞增殖。通过测量450nm吸光度来分析甲臜染料的产生量。如图24所示，IL-15/TF/IL-15促进32Dβ细胞增殖不如IL-15有效。IL-15/TF/IL-15和IL-15的EC50分别是161.4pM和1.6pM。
抗TF抗体亲和柱纯化IL-15/TF/IL-15的洗脱色谱
将从细胞培养物中收获的IL-15/TF/IL-15负载到经5个柱体积的PBS平衡的抗TF抗体亲和柱上。上样后，用5个柱体积的PBS洗柱，然后用6个柱体积的0.1M乙酸(pH 2.9)洗脱。收集A280洗脱峰，并且然后用1M Tris碱中和到pH 7.5-8.0。然后使用具有30KDa分子量截断值的Amicon离心过滤器，使中和的样品在PBS中缓冲交换。如图25所示，抗TF抗体亲和柱与包含TF作为融合域的IL-15/TF/IL-15结合。将缓冲交换的蛋白质样品在2-8℃下存储，以用于进一步生化分析和生物活性测试。每次洗脱后，使用6个柱体积的0.1M甘氨酸(pH2.5)剥离抗TF抗体亲和柱。然后使用5个柱体积的PBS和7个柱体积的20％乙醇中和所述柱，以用于存储。抗TF抗体亲和柱连接到通用电气医疗集团AKTA Avant系统。除洗脱步骤外，所有步骤的流速均为4mL/min，洗脱步骤的流速为2mL/min。
IL-15/TF/IL-15的还原型SDS-PAGE
为了测定蛋白质的纯度和分子量，在还原条件下通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(4-12％NuPage Bis-Tris凝胶)电泳(SDS-PAGE)方法分析用抗TF抗体亲和柱纯化的IL-15/TF/IL-15(15t15)蛋白样品。电泳后，将凝胶用InstantBlue染色约30分钟，接着在纯化水中脱色整夜。
为了验证IL-15/TF/IL-15蛋白在CHO细胞中翻译后经历糖基化，使用来自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)的蛋白质脱糖基化混合物II试剂盒和制造商说明书进行脱糖基化实验。图26A和26B显示了非脱糖基化(红色轮廓的泳道1)和脱糖基化(黄色轮廓的泳道2)状态下的样品的还原型SDS-PAGE分析。结果表明，当在CHO细胞中表达时，IL-15/TF/IL-15蛋白被糖基化。脱糖基化后，纯化的样品在还原型SDS凝胶中以预期的分子量(50kDa)跑电泳。泳道M负载10μL SeeBlue Plus2预染标准物。
实例5：IL-2/TF/IL-2(2t2)对体内NK细胞的刺激
进行了一组实验以确定2t2构建体对C57BL/6小鼠免疫刺激的影响。在这些实验中，对照溶液(PBS)或2t2以0.1、0.4、2和10mg/kg皮下处理C57BL/6小鼠。处理后第3天将经处理的小鼠安乐死。测量脾脏重量并制备单一脾细胞悬浮液。脾细胞悬浮液用偶联的抗CD4、抗CD8和抗NK1.1(NK)抗体染色。通过流式细胞术分析CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞的百分比，以及淋巴细胞亚群上的CD25表达。图27A表明基于脾脏重量，特别是在0.1-10mg/kg的剂量水平下，2t2有效地扩增脾细胞。处理后，在2和10mg/kg下，2t2处理的小鼠中的CD8+ T细胞的百分比高于对照物处理的小鼠(图27B)。在所有测试的2t2剂量下，2t2处理的小鼠中NK细胞的百分比也高于对照物处理的小鼠(图27B)。另外，以0.4到10mg/kg处理之后，2t2使CD4+ T细胞对CD25的表达显著上调，但CD8+ T细胞和NK细胞则不然(图27C)。
进行了一组实验以测定2t2构建体对西方饮食喂养的ApoE-/-小鼠的免疫刺激的影响。在这些实验中，给6周龄雌性B6.129P2-ApoEtm1Unc/J小鼠(杰克逊实验室)喂食含有21％脂肪、0.15％胆固醇、34.1％蔗糖，19.5％酪蛋白和15％淀粉的西方饮食(TD88137，EnvigoLaboratories)。西方饮食8周后，向小鼠皮下注射3mg/kg的2t2。处理后第三天，将小鼠禁食16小时，并且然后通过眼眶后静脉丛穿刺收集血样。将血液与10μL 0.5M EDTA混合，并且抽取20μL血液用于淋巴细胞亚群分析。将红血细胞用ACK(0.15M NH4Cl，1.0mM KHCO3，0.1mMNa2EDTA，pH 7.4)溶解，并且将淋巴细胞在4℃下在FACS染色缓冲液(PBS中1％BSA)中用抗小鼠CD8a和抗小鼠NK1.1抗体染色30分钟。将细胞洗涤一次并用BD FACS Celesta分析。对于Treg染色，在4℃下在FACS染色缓冲液中，用抗小鼠CD4和抗小鼠CD25抗体将ACK处理的血液淋巴细胞染色30分钟。将细胞洗涤一次并再悬浮于固定/通透性工作溶液中，并且在室温下培育60分钟。将细胞洗涤一次并再悬浮于通透缓冲液中。将样品在室温下以300-400×g离心5分钟，并且然后弃去上清液。将细胞沉淀再悬浮于残余体积中，并且用1×通透缓冲液将体积调节到约100μL。将抗Foxp3抗体添加到细胞中，并且将细胞在室温下培育30分钟。将通透缓冲液(200μL)添加到细胞中，并且将细胞在室温下以300-400×g离心5分钟。将细胞再悬浮于流式细胞术染色缓冲液中，并且在流式细胞仪上进行分析。图28B-28C表明，用2t2处理增加了用西方饮食喂养的ApoE-/-小鼠中NK细胞和CD8+T细胞的百分比。图28A表明2t2处理也增加了Treg细胞的百分比。
实例6：体内免疫细胞增殖的诱导
进行了一组实验以测定2t2构建体对C57BL/6小鼠免疫细胞刺激的影响。在这些实验中，对照溶液(PBS)或2t2以0.1、0.4、2和10mg/kg皮下处理C57BL/6小鼠。处理后第3天将经处理的小鼠安乐死。测量脾脏重量并制备单一脾细胞悬浮液。将脾细胞悬浮液用偶联的抗CD4、抗CD8和抗NK1.1(NK)抗体染色。通过流式细胞术分析CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞的百分比。图29A表明，基于脾脏重量，特别是在0.1-10mg/kg下，2t2处理有效地使脾细胞扩增。在2和10mg/kg时，CD8+ T细胞百分比高于对照物处理的小鼠(图29B)。在所有测试的2t2剂量下，NK细胞的百分比均高于对照物处理的小鼠(图29B)。这些结果表明，2t2处理能够诱导C57BL/6小鼠的CD8+ T细胞和NK细胞增殖。
进行了一组实验以测定2t2构建体对西方饮食喂养的ApoE-/-小鼠的免疫刺激的影响。在这些实验中，给6周龄雌性B6.129P2-ApoEtm1Unc/J小鼠(杰克逊实验室)喂食含有21％脂肪、0.15％胆固醇、34.1％蔗糖，19.5％酪蛋白和15％淀粉的西方饮食(TD88137，EnvigoLaboratories)。西方饮食8周后，向小鼠皮下注射3mg/kg的2t2。处理后三天，将小鼠禁食16小时，并且然后通过眼眶后静脉丛穿刺收集血样。将血液与10μL 0.5M EDTA混合，并且抽取20μL血液用于淋巴细胞亚群分析。将红血细胞用ACK(0.15M NH4Cl，1.0mM KHCO3，0.1mMNa2EDTA，pH 7.4)溶解，并且将淋巴细胞在4℃下在FACS染色缓冲液(PBS中1％BSA)中用抗小鼠CD8a和抗小鼠NK1.1抗体染色30分钟。将细胞洗涤一次并在室温下再悬浮于固定缓冲液(BioLegend目录号420801)中20分钟。将细胞以350×g离心5分钟，将固定的细胞再悬浮于细胞内染色通透洗涤缓冲液(BioLegend目录号421002)中，并且然后以350×g离心5分钟。然后在室温下将细胞用抗Ki67抗体染色20分钟。将细胞用细胞内染色通透洗涤缓冲液洗涤两次，并且以350×g离心5分钟。然后将细胞再悬浮于FACS染色缓冲液中。用BD FACSCelesta分析淋巴细胞亚群。图30A和30B表明用2t2处理ApoE-/-小鼠也诱导了NK和CD8+ T细胞增殖(Ki67阳性染色)。
实例7：糖尿病的治疗
进行了一组实验，以研究2t2对西方饮食诱发的ApoE-/-小鼠高血糖症的改善作用。在这些实验中，给6周龄雌性B6.129P2-ApoEtm1Unc/J小鼠(杰克逊实验室)喂食含有21％脂肪、0.15％胆固醇、34.1％蔗糖，19.5％酪蛋白和15％淀粉的西方饮食(TD88137，EnvigoLaboratories)。西方饮食8周后，向小鼠皮下注射3mg/kg的2t2。处理后三天，将小鼠禁食16小时，并且然后通过眼眶后静脉丛穿刺收集血样。用血糖仪(OneTouch UltraMini)和GenUltimated测试条，使用一滴新鲜血液检测血糖。如图31A所示，2t2处理显著降低了西方饮食诱发的高血糖症(p<0.04)。用Eve Technologies的小鼠大鼠代谢阵列(Mouse RatMetabolic Array)分析血浆胰岛素和抵抗素水平。HOMA-IR使用以下公式计算：稳态模型评估-胰岛素抵抗＝葡萄糖(mg/dL)*胰岛素(mU/mL)/405。如图31B所示，与未处理组相比，2t2处理降低了胰岛素抵抗。如图31C所示，与未处理组相比，2t2(p<0.02)使抵抗素水平显著降低，这可能与2t2诱导的胰岛素抵抗降低有关(图31B)。
实例8.CD44记忆T细胞上调
C57BL/6小鼠以皮下途径用2t2处理。对经处理的小鼠实施安乐死，并在处理后第4天(TGFRt15-TGFRs)或第3天(2t2)制备单一脾细胞悬浮液。将制备的脾细胞用荧光染料偶联的抗CD4、抗CD8和抗CD44抗体染色，并且通过流式细胞术分析CD4+ T细胞或CD8+ T细胞中CD44高T细胞的百分比。结果表明2t2上调了记忆标记CD44在CD4+和CD8+ T细胞上的表达(图32)。这些发现表明2t2能够诱导小鼠T细胞分化为记忆T细胞。
实例9.用单链或多链嵌合多肽处理后的组织因子凝血分析
在使用单链或多链嵌合多肽处理后，进行了一组实验以评估血液凝结。为了引发凝血级联路径，组织因子(TF)与因子VIIa(FVIIa)结合以形成TF/FVIIa复合物。然后，TF/FVIIa复合物结合因子X(FX)，并且将FX转化为FXa。
一种测量血液凝结的分析包括测量因子X(FX)的活化。简单来说，在钙和磷脂的存在下，TF/VIIa将凝血因子X(FX)活化为因子Xa(FXa)。与不含跨膜域的TF219相比，含有TF的跨膜域的TF243将FX活化为FXa的活性更高。通过使用FXa特异性发色底物S-2765(Diapharma，俄亥俄州西切斯特)测量FXa活性来确定TF/VIIa依赖性的FX活化。S-2765的颜色变化可通过分光光度法进行监测，并且与FXa的蛋白水解活性成比例。
在这些实验中，将多链嵌合多肽(18t15-12s、小鼠(m)21t15、21t15-TGFRs和21t15-7s)的FX活化与阳性对照(因诺维)或TF219进行比较。将TF219(或含TF219的多链嵌合多肽)/FVIIa复合物以等摩尔浓度(各0.1nM)在96孔ELISA板的圆底孔中以50μL的体积混合，之后添加10μL 180nM FX。在37℃下培育15分钟(在此期间FX转化为Fxa)后，向每个孔中添加8μL 0.5M EDTA(其螯合钙，并且从而终止TF/VIIa活化FX)以停止FX活化。接下来，将10μL的3.2mM S-2765底物加入反应混合物中。紧接着，测量405nm板吸光度，并且记录为0时的吸光度。然后将板在37℃下培育10-20分钟。培育后，通过读取405nm吸光度来监测颜色变化。使用发色底物S-2765通过FXa活性测得的FX活化结果如图33所示。在这个实验中，因诺维(Innovin)是含有脂质化重组人TF243的商业凝血酶原试剂，被用作FX活化的阳性对照。用纯化水将因诺维复水到约10nM TF243。接下来，通过将等体积的0.2nM FVIIa与0.2nM因诺维混合来制造0.1nM TF/VIIa复合物。因诺维展现非常强效的FX活化活性，而TF219和含TF219的多链嵌合多肽具有非常低的FX活化活性，从而证实TF219在TF/FVIIa复合物中对于体内活化天然底物FX不具有活性。
实例10：2t2诱导Treg细胞
通过Ficoll Paque Plus(GE17144003)从5mL全血白细胞层中分离出健康供体(供体163)的外周血单核细胞(PBMC)。然后用ACK溶解PBMC以去除红血细胞。细胞用IMDM-10％FBS洗涤并计数。将1.8×106个细胞
Figure BDA0003044956670001551
接种于流量管中且与
Figure BDA0003044956670001552
的浓度递减的2t2或IL2(15000、1500、150、15、1.5、0.15或0pM)和
Figure BDA0003044956670001553
的预染色抗体(抗CD8-BV605和抗CD127-AF647)一起培育。将细胞在水浴中于37℃培育30分钟。在水浴中，在37℃下，历时10分钟添加
Figure BDA0003044956670001558
预温热的BD Phosflow固定缓冲液I(目录号557870，Becton DickinsonBiosciences)以中止刺激。将细胞(4.5×105个细胞/
Figure BDA0003044956670001554
)转移到V形96孔板中且离心，随后在冰上用
Figure BDA0003044956670001555
的-20℃预冷却BD Phosflow Perm缓冲液III(Cat#BD Biosciences)渗透30分钟。细胞然后充分地用
Figure BDA0003044956670001556
的FACS缓冲液洗涤2次且用一组荧光抗体(抗CD25-PE、CD4-PerCP-Cy5.5、CD56-BV421、CD45RA-PE-Cy7和pSTAT5a-AF488)染色以区分不同的淋巴细胞亚群且评估pSTAT5a状态。将细胞离心并再悬浮于
Figure BDA0003044956670001557
FACS缓冲液中用于FACSCelesta分析。如图C1A中所示，6pM的2t2足以诱导CD4+CD25hi Treg细胞中的Stat5a发生磷酸化，而诱导相同的淋巴细胞群中的Stat5a发生磷酸化需要43.11pM的IL-2。相比之下，2t2诱导CD4+CD25-Tcon和CD8+Tcon细胞中的Stat5a发生磷酸化的活性小于IL2(图34B)或活性等同于IL2(图34C)。这些结果表明，在活化人PBMC中的Treg方面，2t2优于IL2，且在人血液淋巴细胞pStat5a应答方面，2t2展现的Treg选择性相较于IL-2增大。
其它实施例
应理解，虽然已结合其具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点以及修改均处于以下权利要求书的范围内。
A.示例性实施例
实施例A1.一种单链嵌合多肽，其包含：
(i)第一靶标结合域；
(ii)可溶性组织因子域；和
(iii)第二靶标结合域。
实施例A2.实施例A1的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域和可溶性组织因子域彼此直接邻接。
实施例A3.实施例A1的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于第一靶标结合域与可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例A4.实施例A1到A3中任一项的单链嵌合多肽，其中所述可溶性组织因子域和所述第二靶标结合域彼此直接邻接。
实施例A5.实施例A1到A3中任一项的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于可溶性组织因子域和第二靶标结合域之间的接头序列。
实施例A6.实施例A1的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域和第二靶标结合域彼此直接邻接。
实施例A7.实施例A1的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于第一靶标结合域和第二靶标结合域之间的接头序列。
实施例A8.实施例A6或A7的单链嵌合多肽，其中第二靶标结合域和可溶性组织因子域彼此直接邻接。
实施例A9.实施例A6或A7的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于第二靶标结合域和可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例A10.实施例A1到A9中任一项的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域特异性结合到相同的抗原。
实施例A11.实施例A10的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域特异性结合到相同的表位。
实施例A12.实施例A11的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域和第二靶标结合域包含相同的氨基酸序列。
实施例A13.实施例A1到A9中任一项的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域特异性结合到不同的抗原。
实施例A14.实施例A1到A13中任一项的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域中的一个或两个是抗原结合域。
实施例A15.实施例A14的单链嵌合多肽，其中所述第一靶结合域和所述第二靶结合域各自是抗原结合域。
实施例A16.实施例A13的单链嵌合多肽，其中抗原结合域包含scFv或单域抗体。
实施例A17.实施例A1到A16中任一项的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域中的一个或两个结合到选自由以下组成的群组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26a、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体，和CD28的受体。
实施例A18.实施例A1到A16中任一项的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域中的一个或两个是可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白。
实施例A19.实施例A18的单链嵌合多肽，其中所述可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白选自由以下组成的群组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF、FLT3L、MICA、MICB和ULP16结合蛋白。
实施例A20.实施例A1到A16中任一项的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域中的一个或两个是可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体。
实施例A21.实施例A20的单链嵌合多肽，其中所述可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NK30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155或可溶性CD28。
实施例A22.实施例A1到A21中任一项的单链嵌合多肽，其中所述可溶性组织因子域是人可溶性组织因子域。
实施例A23.实施例A22的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQID NO:9至少80％一致的序列。
实施例A24.实施例A23的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQID NO:9至少90％一致的序列。
实施例A25.实施例A24的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQID NO:9至少95％一致的序列。
实施例A26.实施例A22到A25中任一项的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域不包含以下一种或多种：
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置20对应的氨基酸位置的赖氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置22对应的氨基酸位置的异亮氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置45对应的氨基酸位置的色氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置58对应的氨基酸位置的天冬氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置94对应的氨基酸位置的酪氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置135对应的氨基酸位置的精氨酸；以及
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置140对应的氨基酸位置的苯丙氨酸。
实施例A27.实施例A26的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域不包含以下任何一种：
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置20对应的氨基酸位置的赖氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置22对应的氨基酸位置的异亮氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置45对应的氨基酸位置的色氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置58对应的氨基酸位置的天冬氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置94对应的氨基酸位置的酪氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置135对应的氨基酸位置的精氨酸；以及
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置140对应的氨基酸位置的苯丙氨酸。
实施例A28.实施例A1到A27中任一项的单链嵌合多肽，其中所述可溶性组织因子域不能结合因子VIIa。
实施例A29.实施例A1到A28中任一项的单链嵌合多肽，其中所述可溶性组织因子域不将非活性因子X转化为因子Xa。
实施例A30.实施例A1到A29中任一项的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的血液凝结。
实施例A31.实施例A1到A30中任一项的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含位于其N端和/或C端的一个或多个其它靶标结合域。
实施例A32.实施例A31的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽包含位于其N端的一个或多个其它靶标结合域。
实施例A33.实施例A32的单链嵌合多肽，其中一个或多个其它靶标结合域直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。
实施例A34.实施例A33的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于所述至少一个其它靶标结合域之一与所述第一靶标结合域、所述第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例A35.实施例A31的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽包含位于其C端的一个或多个其它靶标结合域。
实施例A36.实施例A35的单链嵌合多肽，其中一个或多个其它靶标结合域之一直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。
实施例A37.实施例A35的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于所述至少一个其它靶标结合域之一与所述第一靶标结合域、所述第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例A38.实施例A31的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽包含位于其N端和C端的一个或多个其它靶标结合域。
实施例A39.实施例A38的单链嵌合多肽，其中位于N端的一个或多个其它抗原结合域之一直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。
实施例A40.实施例A38的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于N端的一个或多个其它抗原结合域之一与第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例A41.实施例A38的单链嵌合多肽，其中位于C端的一个或多个其它抗原结合域之一直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。
实施例A42.实施例A38的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于C端的一个或多个其它抗原结合域之一与第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例A43.实施例A31到A42中任一项的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域中的两个或更多个特异性结合到相同的抗原。
实施例A44.实施例A43的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域中的两个或更多个特异性地结合到相同的表位。
实施例A45.实施例A44的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域中的两个或更多个包含相同的氨基酸序列。
实施例A46.实施例A43的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域各自特异性地结合到相同的抗原。
实施例A47.实施例A46的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域各自特异性结合到相同的表位。
实施例A48.实施例A47的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域各自包含相同的氨基酸序列。
实施例A49.实施例A31到A42中任一项的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域特异性结合到不同的抗原。
实施例A50.实施例A31到A49中任一项的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个靶标结合域中的一个或多个是抗原结合域。
实施例A51.实施例A50的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域各自是抗原结合域。
实施例A52.实施例A51的单链嵌合多肽，其中抗原结合域包含scFv或单域抗体。
实施例A53.实施例A31到A52中任一项的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域、第二靶标结合域和一种或多种靶标结合域中的一种或多种特异性地结合到选自由以下组成的群组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26a、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体，和CD28的受体。
实施例A54.实施例A31到A52中任一项的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域中的一个或多个是可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白。
实施例A55.实施例A54的单链嵌合多肽，其中所述可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白选自由以下组成的群组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF、FLT3L、MICA、MICB和ULP16结合蛋白。
实施例A56.实施例A31到A52中任一项的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域中的一个或多个是可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体。
实施例A57.实施例A56的单链嵌合多肽，其中所述可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NK30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155、可溶性CD122、可溶性CD3或可溶性CD28。
实施例A58.实施例A1到A57中任一项的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含位于其N端的信号序列。
实施例A59.实施例A1到A58中任一项的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含位于所述单链嵌合多肽的N端或C端的肽标签。
实施例A60.一种组合物，其包含实施例A1到A59的任何单链嵌合多肽。
实施例A61.实施例A60的组合物，其中所述组合物是医药组合物。
实施例A62.一种试剂盒，其包含至少一次剂量的实施例A60或A61的组合物。
实施例A63.一种刺激免疫细胞的方法，所述方法包含：
使免疫细胞与有效量的实施例A1到A59的任一种单链嵌合多肽或实施例A60或A61的组合物接触。
实施例A64.实施例A63的方法，其中免疫细胞在体外接触。
实施例A65.实施例A64的方法，其中所述免疫细胞预先获自受试者。
实施例A66.实施例A65的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。
实施例A67.实施例A63的方法，其中免疫细胞在体内接触。
实施例A68.实施例A63到A67中任一项的方法，其中所述免疫细胞选自由以下组成的群组：未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、记忆T细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀手细胞。
实施例A69.实施例A63到A68中任一项的方法，其中所述免疫细胞先前已经过基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。
实施例A70.实施例A63到A68中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞。
实施例A71.实施例A63到A70中任一项的方法，其中所述方法进一步包括将免疫细胞施用于有需要的受试者。
实施例A72.实施例A71的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有与年龄有关的疾病或病状。
实施例A73.实施例A72的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
实施例A74.实施例A71的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断患有癌症。
实施例A75.实施例A74的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
实施例A76.实施例A71的方法，其中所述受试者已被诊断或鉴定患有感染性疾病。
实施例A77.实施例A76的方法，其中所述感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
实施例A78.一种诱导或增加免疫细胞增殖的方法，所述方法包含：
使免疫细胞与有效量的实施例A1到A59的任一种单链嵌合多肽或实施例A60或A61的组合物接触。
实施例A79.实施例A88的方法，其中所述免疫细胞在体外接触。
实施例A80.实施例A79的方法，其中所述免疫细胞预先获自受试者。
实施例A81.实施例A80的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。
实施例A82.实施例A78的方法，其中所述免疫细胞在体内接触。
实施例A83.实施例A78到A82中任一项的方法，其中所述免疫细胞选自由以下组成的群组：未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、记忆T细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀手细胞。
实施例A84.实施例A78到A83中任一项的方法，其中所述免疫细胞预先已经过基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。
实施例A85.实施例A78到A83中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞。
实施例A86.实施例A78到A85中任一项的方法，其中所述方法进一步包括将免疫细胞施用于有需要的受试者。
实施例A87.实施例A86的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有与年龄有关的疾病或病状。
实施例A88.实施例A87的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
实施例A89.实施例A86的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有癌症。
实施例A90.实施例A89的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
实施例A91.实施例A86的方法，其中所述受试者已经被诊断或鉴定患有感染性疾病。
实施例A92.根据实施例A86所述的方法，其中所述感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
实施例A93.一种诱导免疫细胞分化成记忆或记忆样免疫细胞的方法，所述方法包含：
使免疫细胞与有效量的实施例A1到A59的任一种单链嵌合多肽或实施例A60或A61的组合物接触。
实施例A94.实施例A93的方法，其中所述免疫细胞在体外接触。
实施例A95.实施例A94的方法，其中所述免疫细胞预先获自受试者。
实施例A96.实施例A95的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。
实施例A97.实施例A93的方法，其中所述免疫细胞在体内接触。
实施例A98.实施例A93到A97中任一项的方法，其中所述免疫细胞选自由以下组成的群组：未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀手细胞。
实施例A99.实施例A93到A98中任一项的方法，其中所述免疫细胞预先已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。
实施例A100.实施例A93到A98中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞。
实施例A101.实施例A93到A100中任一项的方法，其中所述方法进一步包括将免疫细胞施用于有需要的受试者。
实施例A102.实施例A101的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有与年龄有关的疾病或病状。
实施例A103.实施例A102的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
实施例A104.实施例A101的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有癌症。
实施例A105.实施例A104的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
实施例A106.实施例A101的方法，其中所述受试者已经被诊断或鉴定患有感染性疾病。
实施例A107.实施例A106的方法，其中所述感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
实施例A108.一种在有需要的受试者中杀死癌细胞、被感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的实施例A1到A59的任一种单链嵌合多肽或实施例A60或A61的组合物。
实施例A109.实施例A108的方法，其中所述受试者已被鉴别或诊断患有癌症。
实施例A110.实施例A109的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
实施例A111.实施例A108的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有衰老相关的疾病或病状。
实施例A112.实施例A111的方法，其中所述与衰老相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
实施例A113.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的实施例A1到A59的任一种单链嵌合多肽或实施例A60或A61的组合物。
实施例A114.实施例A113的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有癌症。
实施例A115.实施例A114的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
实施例A116.实施例A113的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有衰老相关的疾病或病状。
实施例A117.实施例A116的方法，其中所述与衰老相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
实施例A118.实施例A113的方法，其中所述受试者已经被诊断或鉴定患有感染性疾病。
实施例A119.实施例A118的方法，其中所述感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
实施例A120.一种核酸，其编码实施例A1到A59中任一项的任一种单链嵌合多肽。
实施例A121.一种载体，其包含实施例A120的核酸。
实施例A122.实施例A121的载体，其中所述载体是表达载体。
实施例A123.一种细胞，其包含实施例A120的核酸或实施例A121或A122的载体。
实施例A124.一种产生单链嵌合多肽的方法，所述方法包括：
在足以引起单链嵌合多肽产生的条件下、在培养基中培养实施例A123的细胞；和
从细胞和/或培养基中回收单链嵌合多肽。
实施例A125.一种通过实施例A124的方法产生的单链嵌合多肽。
实施例A126.实施例A26的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96至少80％一致的序列。
实施例A127.实施例A126的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96至少90％一致的序列。
实施例A128.实施例A127的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96至少95％一致的序列。
实施例A129.实施例A128的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96 100％一致的序列。
实施例A130.实施例A26的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97至少80％一致的序列。
实施例A131.实施例A130的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97至少90％一致的序列。
实施例A132.实施例A131的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97至少95％一致的序列。
实施例A133.实施例A132的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97 100％一致的序列。
B.示例性实施例
实施例B1.一种单链嵌合多肽，其包含：
(i)第一靶标结合域；
(ii)可溶性组织因子域；和
(iii)第二靶标结合域，
其中：
第一靶标结合域和第二靶标结合域各自特异性结合到IL-2受体；或
第一靶标结合域和第二靶标结合域各自特异性结合到IL-15受体。
实施例B2.实施例B1的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域和可溶性组织因子域彼此直接邻接。
实施例B3.实施例B1的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于第一靶标结合域与可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例B4.实施例B1到B3中任一项的单链嵌合多肽，其中所述可溶性组织因子域与第二靶标结合域彼此直接邻接。
实施例B5.实施例B1到B3中任一项的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于可溶性组织因子域和第二靶标结合域之间的接头序列。
实施例B6.实施例B1的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域和第二靶标结合域彼此直接邻接。
实施例B7.实施例B1的单链嵌合多肽，其中该单链嵌合多肽进一步包含在第一靶标结合域和第二靶标结合域之间的接头序列。
实施例B8.实施例B6或B7的单链嵌合多肽，其中第二靶标结合域和可溶性组织因子域彼此直接邻接。
实施例B9.实施例B6或B7的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于第二靶标结合域和可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例B10.实施例B1到B9中任一项的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域均为可溶性白介素蛋白。
实施例B11.实施例B10的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和第二靶标结合域是可溶性IL-2蛋白。
实施例B12.实施例B11的单链嵌合多肽，其中所述可溶性IL-2蛋白是人可溶性IL-2蛋白。
实施例B13.实施例B12的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性IL-2蛋白包含SEQ IDNO:28。
实施例B14.实施例B10的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域和第二靶标结合域是可溶性IL-15蛋白。
实施例B15.实施例B14的单链嵌合多肽，其中所述可溶性IL-15蛋白是人可溶性IL-15蛋白。
实施例B16.实施例B15的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性IL-15蛋白包含SEQ IDNO:39。
实施例B17.实施例B1到B16中任一项的单链嵌合多肽，其中所述可溶性组织因子域是人可溶性组织因子域。
实施例B18.实施例B17的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQID NO:9至少80％一致的序列。
实施例B19.实施例B18的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQID NO:9至少90％一致的序列。
实施例B20.实施例B19的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQID NO:9至少95％一致的序列。
实施例B21.实施例B17到B20中任一项的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域不包含以下一种或多种：
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置20对应的氨基酸位置的赖氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置22对应的氨基酸位置的异亮氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置45对应的氨基酸位置的色氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置58对应的氨基酸位置的天冬氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置94对应的氨基酸位置的酪氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置135对应的氨基酸位置的精氨酸；以及
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置140对应的氨基酸位置的苯丙氨酸。
实施例B22.实施例B21的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域不包含以下中的任一种：
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置20对应的氨基酸位置的赖氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置22对应的氨基酸位置的异亮氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置45对应的氨基酸位置的色氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置58对应的氨基酸位置的天冬氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置94对应的氨基酸位置的酪氨酸；
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置135对应的氨基酸位置的精氨酸；以及
位于与人成熟野生型组织因子蛋白的氨基酸位置140对应的氨基酸位置的苯丙氨酸。
实施例B23.实施例B1到B22中任一项的单链嵌合多肽，其中所述可溶性组织因子域不能结合因子VIIa。
实施例B24.实施例B1到B23中任一项的单链嵌合多肽，其中所述可溶性组织因子域不将非活性因子X转化为因子Xa。
实施例B25.实施例B1到B24中任一项的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的血液凝结。
实施例B26.实施例B1到B25中任一项的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含一个或多个位于其N端和/或C端的其它靶标结合域。
实施例B27.实施例B26的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽包含一个或多个位于其N端的其它靶标结合域。
实施例B28.实施例B27的单链嵌合多肽，其中一个或多个其它靶标结合域直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。
实施例B29.实施例B28的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于至少一个其它靶标结合域之一与第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例B30.实施例B26的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽包含位于其C端的一个或多个其它靶标结合域。
实施例B31.实施例B30的单链嵌合多肽，其中一个或多个其它靶标结合域之一直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。
实施例B32.实施例B30的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于至少一个其它靶标结合域之一与第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例B33.实施例B26的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽包含位于其N端和C端的一个或多个其它靶标结合域。
实施例B34.实施例B33的单链嵌合多肽，其中位于N端的一个或多个其它抗原结合域之一直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。
实施例B35.实施例B33的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于N端的一个或多个其它抗原结合域之一与第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例B36.实施例B33的单链嵌合多肽，其中C端的一个或多个其它抗原结合域之一直接邻接第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域。
实施例B37.实施例B33的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于C端的一个或多个其它抗原结合域之一与第一靶标结合域、第二靶标结合域或可溶性组织因子域之间的接头序列。
实施例B38.实施例B26到B37中任一项的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域各自特异性结合到IL-2受体或IL-15受体。
实施例B39.实施例B38的单链嵌合多肽，其中第一靶标结合域、第二靶标结合域和一个或多个其它靶标结合域各自包含相同的氨基酸序列。
实施例B40.实施例B26到B37中任一项的单链嵌合多肽，其中所述一个或多个其它靶标结合域是抗原结合域。
实施例B41.实施例B40的单链嵌合多肽，其中所述抗原结合域包含scFv或单域抗体。
实施例B42.实施例B26到B37、B40和B41中任一项的单链嵌合多肽，其中所述一个或多个其它靶标结合域特异性地结合到选自由以下组成的群组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26a、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体，和CD28的受体。
实施例B43.实施例B6到B37、B40和B41中任一项的单链嵌合多肽，其中所述一个或多个其它靶标结合域是可溶性白介素或细胞因子蛋白。
实施例B44.实施例B43的单链嵌合多肽，其中所述可溶性白介素或细胞因子蛋白选自由以下组成的群组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD和SCF。
实施例B45.实施例B6到B37、B40和B41中任一项的单链嵌合多肽，其中所述一个或多个其它靶标结合域是可溶性白介素或细胞因子受体。
实施例B46.实施例B45的单链嵌合多肽，其中所述可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)和可溶性TGF-βRIII。
实施例B47.实施例B1到B46中任一项的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含位于其N端的信号序列。
实施例B48.实施例B1到B47中任一项的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含位于所述单链嵌合多肽的N端或C端的肽标签。
实施例B49.一种组合物，其包含实施例B1至B48的任一种单链嵌合多肽。
实施例B50.实施例B49的组合物，其中所述组合物是医药组合物。
实施例B51.一种试剂盒，其包含至少一次剂量的实施例B49或B50的组合物。
实施例B52.一种刺激免疫细胞的方法，所述方法包含：
使免疫细胞与有效量的实施例B1到B48的任一种单链嵌合多肽或实施例B49或B50的组合物接触。
实施例B53.实施例B52的方法，其中所述免疫细胞在体外接触。
实施例B54.实施例B53的方法，其中所述免疫细胞预先从受试者获得。
实施例B55.实施例B54的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。
实施例B56.实施例B52的方法，其中免疫细胞在体内接触。
实施例B57.实施例B52到B56中任一项的方法，其中所述免疫细胞选自由以下组成的群组：未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、记忆T细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀手细胞。
实施例B58.实施例B52到B57中任一项的方法，其中所述免疫细胞预先已经过基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。
实施例B59.实施例B52到B57中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞。
实施例B60.实施例B52到B59中任一项的方法，其中所述方法进一步包括将免疫细胞施用于有需要的受试者。
实施例B61.实施例B60的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有与年龄有关的疾病或病状。
实施例B62.实施例B61的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
实施例B63.实施例B60的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有癌症。
实施例B64.实施例B63的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
实施例B65.实施例B60的方法，其中所述受试者已被诊断或鉴定患有感染性疾病。
实施例B66.实施例B65的方法，其中所述感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
实施例B67.一种诱导或增加免疫细胞增殖的方法，所述方法包含：
使免疫细胞与有效量的实施例B1到B48的任一种单链嵌合多肽或实施例B49或B50的组合物接触。
实施例B68.实施例B67的方法，其中所述免疫细胞在体外接触。
实施例B69.实施例B68的方法，其中所述免疫细胞预先获自受试者。
实施例B70.实施例B60的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。
实施例B71.实施例B67的方法，其中所述免疫细胞在体内接触。
实施例B72.实施例B67到B71中任一项的方法，其中所述免疫细胞选自由以下组成的群组：未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、记忆T细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀手细胞。
实施例B73.实施例B67到B72中任一项的方法，其中所述免疫细胞预先已经过基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。
实施例B74.实施例B67到B72中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞。
实施例B75.实施例B67到B74中任一项的方法，其中所述方法进一步包括将免疫细胞施用于有需要的受试者。
实施例B76.实施例B75的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有与年龄有关的疾病或病状。
实施例B77.实施例B76的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
实施例B78.实施例B75的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有癌症。
实施例B79.实施例B78的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
实施例B80.实施例B75的方法，其中所述受试者已经被诊断或鉴定患有感染性疾病。
实施例B81.实施例B75的方法，其中所述感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
实施例B82.一种诱导免疫细胞分化成记忆或记忆样免疫细胞的方法，所述方法包含：
使免疫细胞与有效量的实施例B1到B48的任一种单链嵌合多肽或实施例B49或B50的组合物接触。
实施例B83.实施例B82的方法，其中所述免疫细胞在体外接触。
实施例B84.实施例B83的方法，其中所述免疫细胞预先从受试者获得。
实施例B85.实施例B84的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之前从受试者获得免疫细胞。
实施例B86.实施例B82的方法，其中所述免疫细胞在体内接触。
实施例B87.实施例B82到B86中任一项的方法，其中所述免疫细胞选自由以下组成的群组：未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀手细胞。
实施例B88.实施例B82到B87中任一项的方法，其中所述免疫细胞预先已经过基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。
实施例B89.实施例B82到B87中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入免疫细胞。
实施例B90.实施例B82到B89中任一项的方法，其中所述方法进一步包括将免疫细胞施用于有需要的受试者。
实施例B91.实施例B90的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有与年龄有关的疾病或病状。
实施例B92.实施例B91的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
实施例B93.实施例B90的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断患有癌症。
实施例B94.实施例B93的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
实施例B95.实施例B90的方法，其中所述受试者已被诊断或鉴定患有感染性疾病。
实施例B96.实施例B95的方法，其中所述感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
实施例B97.一种在有需要的受试者中杀死癌细胞、被感染的细胞或衰老细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的实施例B1到B48的任一种单链嵌合多肽或实施例B49或B50的组合物。
实施例B98.实施例B97的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有癌症。
实施例B99.实施例B98的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
实施例B100.实施例B97的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有与衰老相关的疾病或病状。
实施例B101.实施例B100的方法，其中所述与衰老相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
实施例B102.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的实施例B1到B48的任一种单链嵌合多肽或实施例B49或B50的组合物。
实施例B103.实施例B102的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有癌症。
实施例B104.实施例B103的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
实施例B105.实施例B102的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有与衰老相关的疾病或病状。
实施例B106.实施例B105的方法，其中所述与衰老相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
实施例B107.实施例B102的方法，其中所述受试者已经被诊断或鉴定患有感染性疾病。
实施例B108.实施例B107的方法，其中所述感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
实施例B109.一种核酸，其编码实施例B1到B48中任一项的任一种单链嵌合多肽。
实施例B110.一种载体，其包含实施例B109的核酸。
实施例B111.实施例B110的载体，其中所述载体是表达载体。
实施例B112.一种细胞，其包含实施例B109的核酸或实施例B110或B111的载体。
实施例B113.一种产生单链嵌合多肽的方法，所述方法包括：
在足以引起单链嵌合多肽产生的条件下在培养基中培养实施例B112的细胞；和
从细胞和/或培养基中回收单链嵌合多肽。
实施例B114.一种通过实施例B113的方法产生的单链嵌合多肽。
实施例B115.实施例B21的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96至少80％一致的序列。
实施例B116.实施例B115的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96至少90％一致的序列。
实施例B117.实施例B116的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96至少95％一致的序列。
实施例B118.实施例B117的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:96 100％一致的序列。
实施例B119.实施例B21的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97至少80％一致的序列。
实施例B120.实施例B119的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97至少90％一致的序列。
实施例B121.实施例B120的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97至少95％一致的序列。
实施例B122.实施例B121的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQ ID NO:97 100％一致的序列。

Claims (42)

1.一种单链嵌合多肽，其包含：
(i)第一靶标结合域；
(ii)可溶性组织因子域；和
(iii)第二靶标结合域。
2.根据权利要求1所述的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述可溶性组织因子域彼此直接邻接。
3.根据权利要求1所述的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于所述第一靶标结合域与所述可溶性组织因子域之间的接头序列。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的单链嵌合多肽，其中所述可溶性组织因子域和所述第二靶标结合域彼此直接邻接。
5.根据权利要求1到3中任一项所述的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含介于所述可溶性组织因子域与所述第二靶标结合域之间的接头序列。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域特异性结合到相同的抗原。
7.根据权利要求6所述的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域特异性地结合到相同的表位。
8.根据权利要求7所述的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域包含相同的氨基酸序列。
9.根据权利要求1到5中任一项所述的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域特异性结合到不同的抗原。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域中的一个或两个是抗原结合域。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域中的一个或两个结合到选自由以下组成的群组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26a、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGFDD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体，和CD28的受体。
12.根据权利要求1到10中任一项所述的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域中的一个或两个是可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白。
13.根据权利要求12所述的单链嵌合多肽，其中所述可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白选自由以下组成的群组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-D、SCF、FLT3L、MICA、MICB，和ULP16结合蛋白。
14.根据权利要求1到10中任一项所述的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合域和所述第二靶标结合域中的一个或两个是可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体。
15.根据权利要求14所述的单链嵌合多肽，其中所述可溶性白介素受体、所述可溶性细胞因子受体或所述可溶性细胞表面受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155或可溶性CD28。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的单链嵌合多肽，其中所述可溶性组织因子域是人可溶性组织因子域。
17.根据权利要求16所述的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域包含与SEQID NO:9至少80％一致的序列。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽进一步包含位于其N端和/或C端的一个或多个其它靶标结合域。
19.一种组合物，其包含根据权利要求1到18中任一项所述的单链嵌合多肽。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述组合物是医药组合物。
21.一种试剂盒，其包含至少一次剂量的根据权利要求19或20所述的组合物。
22.一种刺激免疫细胞的方法，所述方法包含：
使免疫细胞与有效量的根据权利要求1至18所述的任一种单链嵌合多肽或根据权利要求19或20所述的组合物接触。
23.一种诱导或增加免疫细胞增殖的方法，所述方法包含：
使免疫细胞与有效量的根据权利要求1至18所述的任一种单链嵌合多肽或根据权利要求19或20所述的组合物接触。
24.一种诱导免疫细胞分化成记忆或记忆样免疫细胞的方法，所述方法包含：
使免疫细胞与有效量的根据权利要求1至18所述的任一种单链嵌合多肽或根据权利要求19或20所述的组合物接触。
25.根据权利要求22到24中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞在体外接触。
26.根据权利要求22到24中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞在体内接触。
27.根据权利要求22到26中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞选自由以下组成的群组：未成熟胸腺细胞、周边血液淋巴细胞、初始T细胞、多能Th细胞前体、淋巴祖细胞、Treg细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞、Th2细胞、Th1细胞、Th3细胞、γδT细胞、αβT细胞、肿瘤浸润性T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀手T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀手细胞。
28.根据权利要求22到27中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞预先已经过基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。
29.根据权利要求22到28中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述免疫细胞施用于有需要的受试者。
30.一种在有需要的受试者中杀死癌细胞、被感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到18所述的的任一种单链嵌合多肽或根据权利要求19或20所述的组合物。
31.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到18所述的任一种单链嵌合多肽或根据权利要求19或20所述的组合物。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述受试者已经被鉴定或诊断患有癌症、与衰老相关的疾病或病状，或感染性疾病。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：实体肿瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰脏癌、前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述与衰老相关的疾病或病状选自由以下组成的群组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰脏炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退化症、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂质营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗塞、肌肉减少症、伤口愈合、秃发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、多发性硬化症和肾功能不全。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述感染性疾病是感染人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒。
36.一种核酸，其编码任一种根据权利要求1到18中任一项所述的单链嵌合多肽。
37.一种载体，其包含根据权利要求36所述的核酸。
38.一种细胞，其包含根据权利要求36所述的核酸或根据权利要求37所述的载体。
39.一种产生单链嵌合多肽的方法，所述方法包括：
在足以引起所述单链嵌合多肽产生的条件下在培养基中培养根据权利要求38所述的细胞；和
从所述细胞和/或培养基中回收所述单链嵌合多肽。
40.一种单链嵌合多肽，其通过根据权利要求39所述的方法产生。
41.根据权利要求16所述的单链嵌合多肽，其中所述人可溶性组织因子域不引发血液凝结。
42.根据权利要求1至18中任一项所述的单链嵌合多肽，其中所述可溶性组织因子域包含或由来自人野生型可溶性组织因子的序列组成。
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