CN106255703A - 抗组织因子单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种对组织因子的新型抗体。另外，本发明提供一种利用该抗体作为靶标结合因子的医药组合物。本发明的抗体能够发挥向表达组织因子的细胞的内化能力。

Description

抗组织因子单克隆抗体
技术领域
本发明涉及抗组织因子单克隆抗体和利用该抗体的医药组合物。
背景技术
本说明书包括作为本申请优先权的基础的日本专利申请2014-18586号的说明书和/或附图所记载的内容。将本说明书所引用的所有刊物、专利和专利申请直接作为参考并入至本说明书中。
通常，若通过口服或静脉内注射将药物进行全身给药，则不仅是对作为投药对象物的病灶部位，而且对正常组织也供给药物。其结果，确认到因药物给药所造成的副作用，有时需要变更或中断治疗方法。对此，以降低副作用为目的，已开发有对给药对象物固有的受体、配体、酶等分子标记具有特异性结合能力的所谓分子靶向药物的药物(例如专利文献1)。
另一方面，组织因子(以下有时称为“TF”)为外源性凝血的起始因子，因血管损伤等而促进产生。通常反应中的TF表现为局部性且暂时性的。然而，已知在胰腺癌、胃癌等许多实体癌中，在肿瘤组织内的癌细胞、血管内皮细胞和单核细胞、巨噬细胞等的细胞表面，TF持续性地表达增强。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利公开公报2012/0039989
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的一个目的在于提供对TF的新型抗体。另外，本发明的另一个目的在于提供利用该抗体作为靶标结合因子的医药组合物。
用于解决课题的方法
本发明的发明者等人发现具有向细胞的内化能力的新型的抗TF单克隆抗体，进而想到通过使用该抗体作为靶标结合因子，能够将药物高选择性地送达于表面表达TF的细胞，从而完成了本发明。
即，根据本发明，提供与组织因子结合的以下的单克隆抗体。
一种抗人类组织因子单克隆抗体，其含有：具有分别含序列编号3、4和5所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号6、7和8所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2、3的轻链可变区；
一种抗人类组织因子单克隆抗体，其含有：具有分别含序列编号11、12和13所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号14、15和16所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2、3的轻链可变区；或
一种抗小鼠组织因子单克隆抗体，其含有：具有分别含序列编号19、20和21所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号22、23和24所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2、3的轻链可变区。
根据本发明的另一方面，提供一种单克隆抗体，其结合至与上述单克隆抗体所结合的组织因子的表位相同的表位。
根据本发明的再一方面，提供一种抗体的片段，其含有上述单克隆抗体的一部分，能够与组织因子结合。
根据本发明的再一方面，提供一种医药组合物，其含有作为靶标结合因子的上述单克隆抗体或抗体的片段、与药物。
根据本发明的再一方面，提供一种药物传递用组合物，其含有作为靶标结合因子的上述单克隆抗体或抗体的片段。
发明的效果
本发明的单克隆抗体能够识别表达TF的细胞，且具有向该细胞的内化能力。因此，通过利用该抗体作为靶标结合因子，能够有效地将药物传递至该细胞。
附图说明
图1是表示内化测定的结果的显微镜照片。
图2是表示抗凝血作用评价的结果的图表。
图3是表示杀细胞效果确认试验的结果的图表。
图4是表示抗肿瘤效果确认试验中的肿瘤体积变动的图表。
图5是表示抗肿瘤效果确认试验中的体重变动的图表。
图6是表示内化测定的结果的显微镜照片。
图7是表示小鼠B16黑色素瘤细胞及其TF强制表达细胞中，TF的mRNA表达量相对于GAPDH的mRNA表达量的比例的图表。
图8是通过FACS解析所得的直方图(histogram)。
具体实施方式
[A.单克隆抗体]
根据本发明，提供一种与TF结合的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体代表性地能够与TF结合，且具有向表达TF的细胞的内化能力。TF是血液凝固的第III因子，作为跨膜型的糖蛋白而表达于细胞表面。本发明中，TF优选为人类TF(hTF)。hTF的全长氨基酸序列已知为GenBankACCESSION_AAA61152(序列编号1)。本发明中，也提供对小鼠TF(mTF)的单克隆抗体。利用抗mTF单克隆抗体作为药物的靶标结合因子，可有效用于使用小鼠的试验或研究。mTF的全长氨基酸序列，已知为GenBankACCESSION_AAA63400(序列编号2)。
本说明书中，所谓内化，是指抗体与细胞表面的抗原形成免疫复合体后，被摄入至细胞内的现象。抗TF单克隆抗体是否具有内化能力，能够通过例如下述方法判断：使结合了标记物质的抗体与表面表达TF的细胞接触，确认该标记物质是否转移至细胞内的方法；在使结合了具有细胞毒性的物质的抗体与表面表达TF的细胞接触时，确认是否有细胞死亡或诱导细胞增殖抑制的方法等。更具体而言，能够通过实施例中记载的内化测定，确认有无抗体的内化能力。
作为上述在表面表达TF的细胞，可使用任意适当的细胞，可列举例如肿瘤组织内的细胞。相对于正常组织中的TF的表达通常为局部性且暂时性的表达，肿瘤组织内的癌细胞、血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞等的细胞表面中，TF的表达持续性地增强。作为癌细胞的具体例，可列举例如胰腺癌细胞、胃癌细胞等。
本说明书中，所谓单克隆抗体是指单一克隆的抗体产生细胞所产生的抗体。单克隆抗体具有均匀的一级结构，识别同一表位。本发明的单克隆抗体具有由使相同的2条重链与相同的2条轻链通过二硫键结合而成的四聚体所构成的基本结构。本发明的抗TF单克隆抗体可为IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的任意同种型，优选为IgG。
本发明的抗TF单克隆抗体所识别的表位，优选存在于TF的细胞外区域。
本发明的抗TF单克隆抗体对于TF的解离常数(KD)，达到例如5×10-9M以下、进而1×10-9M以下、尤其2×10-10M以下。解离常数例如可使用表面等离子体共振法进行测定。
本发明的抗TF单克隆抗体可具有或不具有抗凝血作用。抗凝血作用的有无或其程度，能够通过凝血酶原时间(PT)判断。若为不具有抗凝血作用或抗凝血作用低的抗TF单克隆抗体，则难以被血凝块等所捕捉，故在作为药物的靶标结合因子利用时可提升药物对靶标部位的送达性，其结果能够适当地发挥药效。本发明的抗TF单克隆抗体在形成为抗原抗体复合体的状态下的凝血延长时间比(PBS相对比)，优选为3以下、更优选为2以下、进一步优选为1～1.5。形成为抗原抗体复合体的状态下的凝血延长时间比可通过实施例记载的方法确定。
[A-1.抗hTF单克隆抗体]
第一实施方式中，本发明的抗hTF单克隆抗体含有：具有分别含序列编号3、4和5所述的氨基酸序列的互补性决定区(CDR)1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号6、7和8所述的氨基酸序列的CDR1、2和3的轻链可变区。作为其具体例，可优选例示具有含序列编号9所述的氨基酸序列的重链可变区、和含序列编号10所述的氨基酸序列的轻链可变区的抗hTF单克隆抗体。
第二实施方式中，本发明的抗hTF单克隆抗体含有：具有分别含序列编号11、12和13所述的氨基酸序列的CDR1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号14、15和16所述的氨基酸序列的CDR1、2和3的轻链可变区。作为其具体例，可优选例示具有含序列编号17所述的氨基酸序列的重链可变区、和含序列编号18所述的氨基酸序列的轻链可变区的抗hTF单克隆抗体。
上述第一或第二实施方式所例示的各单克隆抗体的改变体，也可包括于本发明的抗hTF单克隆抗体中。作为该改变体，可列举例如重链可变区和/或轻链可变区包含1个或数个(例如1～10个、优选为1～5个)氨基酸的取代、插入、添加和/或缺失的单克隆抗体。这种改变体也能够合适地与hTF结合，且具有向表达hTF的细胞的内化能力。
作为上述单克隆抗体的改变体的具体例，可列举具有：含有与序列编号9所述的氨基酸序列优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上相同的氨基酸序列的重链可变区；和含有与序列编号10所述的氨基酸序列优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上相同的氨基酸序列的轻链可变区的单克隆抗体。另外，作为其他改变体的具体例，可列举具有：含有与序列编号17所述的氨基酸序列优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上相同的氨基酸序列的重链可变区；和含有与序列编号18所述的氨基酸序列优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上相同的氨基酸序列的轻链可变区的单克隆抗体。这些改变体优选能够与hTF结合，且具有向表达hTF的细胞的内化能力。
上述单克隆抗体的改变体在所对应的单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少1个CDR中，也可含有1个或数个、例如1、2或3个、优选为1个或2个、更优选为1个氨基酸的取代、插入、添加和/或缺失。改变体的各CDR具有与所对应的单克隆抗体的各CDR优选为90～100％的相同性，更优选为95～100％、进一步优选为98～100％、最优选为100％的相同性。另外，改变体的重链和轻链的CDR1～3全体具有与所对应的单克隆抗体的重链和轻链的CDR1～3全体优选为90～100％的相同性，更优选为95～100％、进一步优选为98～100％、最优选为100％的相同性。
第三实施方式中，本发明的抗hTF单克隆抗体可为结合至与上述第一或第二实施方式所例示的单克隆抗体所结合的hTF的表位为相同表位的单克隆抗体。该结合至相同表位的抗体能够通过竞争ELISA法等公知方法获得。竞争ELISA法中，例如，相较于不存在被测抗体下的对照抗体(即，第一或第二实施方式所例示的单克隆抗体)的结合活性，当被测抗体使对照抗体的结合性降低30％以上、优选为40％以上、更优选为50％以上时，该被测抗体能够称为结合至与对照抗体实质上相同的表位的抗体。该结合至相同表位的抗体，优选为能够与hTF结合，且具有向表达hTF的细胞的内化能力。另外，该实施方式中，该结合至相同表位的抗体，也可为上述第一或第二实施方式所例示的单克隆抗体的改变体。
上述说明的本发明的抗hTF单克隆抗体，可为人型嵌合抗体或人源化抗体。
所谓人型嵌合抗体，是指连接了来自非人类哺乳动物的抗体的可变区与来自人类的抗体的恒定区的抗体。由此，本发明的人型嵌合抗体可为通过将上述第一、第二或第三实施方式所例示的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区分别连接至人重链恒定区和人轻链恒定区而获得的嵌合抗体。
具体而言，作为本发明的人型嵌合抗体的例子，可列举将分别含有序列编号3、4和5所述的氨基酸序列作为重链CDR1、2和3的重链可变区、和分别含有序列编号6、7和8所述的氨基酸序列作为轻链CDR1、2和3的轻链可变区，分别连接至人重链恒定区和人轻链恒定区的嵌合抗体。作为该嵌合抗体的具体例，可列举将含有序列编号9所述的氨基酸序列的重链可变区、和含有序列编号10所述的氨基酸序列的轻链可变区，分别连接至人重链恒定区和人轻链恒定区的嵌合抗体。
作为本发明的人型嵌合抗体的其他例子，可列举将分别含有序列编号11、12和13所述的氨基酸序列作为重链CDR1、2和3的重链可变区、和分别含有序列编号14、15和16所述的氨基酸序列作为轻链CDR1、2和3的轻链可变区，分别连接至人重链恒定区和人轻链恒定区的嵌合抗体。作为该嵌合抗体的具体例，可列举将含有序列编号17所述的氨基酸序列的重链可变区、和含有序列编号18所述的氨基酸序列的轻链可变区，分别连接至人重链恒定区和人轻链恒定区的嵌合抗体。
人型嵌合抗体的重链恒定区，只要属于人类免疫球蛋白(以下记载为hIg)即可，优选属于hIgG类。同样地，人型嵌合抗体的轻链恒定区，只要属于hIg即可，可为κ类或λ类的任一种。
所谓人源化抗体，是指将来自非人类哺乳动物的抗体的CDR移植至来自人类的抗体的可变区的适当位置的抗体。因此，本发明的人源化抗体，可为具有上述第一、第二或第三实施方式所例示的单克隆抗体的重链和轻链的CDR1～3作为重链和轻链的CDR1～3，其他区域来自人类抗体的人类抗体。
作为本发明的人源化抗体的具体例，可列举：重链的CDR1、2和3分别由序列编号3、4和5所述的氨基酸序列所构成，轻链的CDR1、2和3分别由序列编号6、7和8所述的氨基酸序列所构成，其他区来自人类抗体的人源化抗体；重链的CDR1、2和3分别由序列编号11、12和13所述的氨基酸序列所构成，轻链的CDR1、2和3分别由序列编号14、15和16所述的氨基酸序列所构成，其他区来自人类抗体的人源化抗体。
人源化抗体的重链，只要属于hIg即可，优选属于hIgG类。同样地，人源化抗体的轻链，只要属于hIg即可，可为κ类或λ类的任一种。
[A-2.抗mTF单克隆抗体]
一个实施方式中，本发明的抗mTF单克隆抗体含有：具有分别含序列编号19、20和21所述的氨基酸序列的CDR1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号22、23和24所述的氨基酸序列的CDR1、2和3的轻链可变区。作为其具体例，可优选例示具有含序列编号25所述的氨基酸序列的重链可变区、含序列编号26所述的氨基酸序列的轻链可变区的抗mTF单克隆抗体。
上述例示的单克隆抗体的改变体，也可包括于本发明的抗mTF单克隆抗体中。作为该改变体，可列举例如重链可变区和/或轻链可变区包含1个或数个(例如1～10个、优选为1～5个)氨基酸的取代、插入、添加和/或缺失的单克隆抗体。这种改变体也能够合适与mTF结合，且具有向表达mTF的细胞的内化能力。
作为上述单克隆抗体的改变体的具体例，可列举具有：含有与序列编号25所述的氨基酸序列优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上相同的氨基酸序列的重链可变区；和含有与序列编号26所述的氨基酸序列优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上相同的氨基酸序列的轻链可变区的单克隆抗体。这种改变体优选能够与mTF结合，且具有向表达mTF的细胞的内化能力。
上述单克隆抗体的改变体，在所对应的单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少1个CDR中，也可含有1个或数个、例如1、2或3个、优选为1个或2个、更优选为1个氨基酸的取代、插入、添加和/或缺失。改变体的各CDR具有与所对应的单克隆抗体的各CDR优选为90～100％的相同性，更优选为95～100％、进一步优选为98～100％、最优选为100％的相同性。另外，改变体的重链和轻链的CDR1～3全体，具有与所对应的单克隆抗体的重链和轻链的CDR1～3全体优选为90～100％的相同性，更优选为95～100％、进一步优选为98～100％、最优选为100％的相同性。
其他实施方式中，本发明的抗mTF单克隆抗体可为结合至与上述例示的单克隆抗体所结合的mTF的表位为相同表位的单克隆抗体。该结合至相同表位的抗体，优选为能够与mTF结合，且具有向表达mTF的细胞的内化能力。该实施方式中，该结合至相同表位的抗体，也可为上述例示的单克隆抗体的改变体。另外，该结合至相同表位的抗体的获取方法如上所述。
[B.单克隆抗体的制造方法]
B-1.使用杂交瘤的单克隆抗体的制作
本发明的单克隆抗体例如可通过从以抗原进行了免疫的动物所得的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合而制备杂交瘤，从所得到的杂交瘤中选择产生目标抗体的杂交瘤，使所选择的杂交瘤产生抗体，由此而获得。
B-1-1.抗原的制备
作为动物的免疫所使用的抗原，可使用例如TF(全长TF)或其部分肽或者在表面表达TF的细胞。hTF例如可根据日本特开平9-302000号所述的方法等将来自人类胎盘的hTF进行精制而获得。另外，例如可通过基因工程的方法或化学合成法得到TF或其部分肽。部分肽可视需要与任意适当的载体蛋白结合而使用。另外，hTF的mRNA序列在GenBank NM_001993.4(序列编号27)中为公知。另外，mTF的mRNA序列在GenBank M57896.1(序列编号28)中为公知。
B-1-2.抗体产生细胞的制备
将如上述所得的抗原与任意适当的佐剂混合，给药至小鼠、大鼠、马、猴、兔、山羊、绵羊等非人类哺乳动物进行免疫。测定经免疫的动物对于抗原的抗体滴度，对抗体滴度高的动物施行末次免疫。从末次免疫日经数日后，采集脾脏细胞、淋巴节细胞等的抗体产生细胞。免疫方法和抗体产生细胞的采集方法的细节，已为本领域技术人员所公知，故省略其详细说明。抗体滴度例如可使用从动物采集的血液，通过ELISA法等的酶免疫测定法(EIA)、放射性免疫测定法(RIA)等进行测定。
B-1-3.细胞融合
作为与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞，可使用来自小鼠、大鼠等的动物，本领域技术人员一般可取得的任意适当的细胞株。优选使用具有抗药性、并具有以未融合的状态无法于选择培养基(例如含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷的培养基(HAT培养基))生存，而仅能够以经融合的状态生存的性质的骨髓瘤细胞。细胞融合可使用PEG法、电融合法等任意适当的方法进行。接着，将细胞融合处理后的细胞在选择培养基(例如HAT培养基)中悬浮和稀释，用培养板的各孔进行培养。
B-1-4.杂交瘤的筛选和克隆
上述细胞融合后的培养的结果，选择形成了集落的细胞作为杂交瘤。接着，将所选择的杂交瘤在例如微量滴定板中进行培养，采集所得的培养上清液测定对抗原的反应性。对抗原的反应性可通过EIA、RIA等测定。该测定的结果，选择对抗原显示反应性的细胞，通过有限稀释法等将单克隆抗体产生杂交瘤分离。
B-1-5.由杂交瘤制备单克隆抗体
单克隆抗体通过以任意适当的培养基培养上述杂交瘤，从所得到的培养上清液进行精制的方法；将杂交瘤注入至小鼠、大鼠等的非人类哺乳动物的腹腔内在腹水中进行培养，从所得到的腹水进行精制的方法等，能够制备。抗体的精制可视需要与例如硫酸铵盐析法、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、抗免疫球蛋白柱、蛋白A柱等的亲和性柱色谱法等组合使用而进行。
B-2.利用基因工程方法制作单克隆抗体
本发明的单克隆抗体例如可利用由上述杂交瘤等的抗体产生细胞所克隆的抗体基因，通过基因工程方法予以制作。
B-2-1.编码可变区的基因的克隆
从产生目标抗体的杂交瘤提取总mRNA，使用反转录酶由所得到的总mRNA，以与抗体基因共同的序列作为引物合成编码抗体可变区的cDNA。该cDNA的合成和扩增可使用例如5’-RACE法进行，此时，可于cDNA的两末端导入任意适当的限制酶位点。由所得到的PCR产物精制目标DNA片段，与载体DNA连接并导入至大肠杆菌等中，由此制备所需的重组载体。接着，通过脱氧法等公知方法确认目标抗体基因的碱基序列。
B-2-2.向宿主细胞导入抗体基因
如上所述将所克隆的编码可变区的DNA与编码所需的抗体恒定区的DNA连接，将其结合到表达载体。或者也可将编码可变区的DNA结合到含有编码所需恒定区的DNA的表达载体。将这样所得到的表达载体导入至任意适当的宿主细胞，由此，能够使抗体表达。此时，也可将重链或轻链分别结合到表达载体，将这2个表达载体同时导入至相同的宿主细胞；或将编码重链或轻链的DNA结合到单一的表达载体并导入至宿主细胞。另外，编码可变区的DNA也可通过根据B-2-1项确定的碱基序列，利用人工基因合成服务等进行全合成而获得。作为宿主细胞，可列举例如动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母、细菌等。
B-2-3.由宿主细胞制备单克隆抗体
单克隆抗体通过将导入了上述表达载体的宿主细胞以任意适当的培养基进行培养，由所得到的培养基上清液进行精制而获得。抗体的精制方法如上所述。
B-3.嵌合抗体的制作
人型嵌合抗体例如可将与上述同样操作得到的单克隆抗体的编码可变区的DNA与编码人类抗体的恒定区的DNA连接，将其结合到表达载体并导入至宿主中，使其表达而获得(例如WO95/14041)。
B-4.人源化抗体的制作
人源化抗体可以通过使用所谓CDR移植技术，以使非人类哺乳动物的抗体的CDR连接至人类抗体框架区的方式移植至人类抗体，由此获得。使非人类哺乳动物(例如小鼠)的抗体的CDR移植至人类框架区的方法已为公知，可列举例如重叠延伸PCR法。
一般而言，CDR移植技术中，选择与非人类哺乳动物的抗体的框架区相同性高的人类框架区，对于CDR的功能维持较有利。因此，优选利用由与所移植的CDR相邻的框架区的氨基酸序列相同性高的氨基酸序列所构成的人类框架区。
[C.抗体片段]
本发明还提供抗体的片段，其含有A项所述的单克隆抗体的一部分，能够与组织因子结合。本发明的抗体的片段中，代表性地具有向表达组织因子的细胞的内化能力。作为该抗体片段，可列举例如含有Fab、F(ab')2、Fab'、单链抗体(scFv)、二硫键稳定性抗体(dsFv)、双特异性抗体(Diabody，二聚体V区片段)、CDR的肽等。
Fab能够将上述单克隆抗体进行木瓜蛋白酶处理而获得。另外，能够通过将编码上述单克隆抗体的Fab的DNA插入至任意适当的表达载体，将该载体导入至宿主细胞，使其表达而获得。
F(ab')2能够将上述单克隆抗体进行胃蛋白酶处理而获得。另外，也能够通过将编码上述单克隆抗体的F(ab')2的DNA插入至任意适当的表达载体，将该载体导入至宿主细胞，使其表达而获得。
Fab'是将F(ab')2的铰链间的S-S键切断而得到的抗体片段。Fab'能够通过对上述F(ab')2进行还原剂二硫苏糖醇处理而获得。另外，也能够将编码Fab'的DNA插入至任意适当的表达载体，将该载体导入至宿主细胞，使其表达而获得。
scFv是仅将重链和轻链的可变区以适当的肽接头予以连接得到的。scFv能够通过根据编码上述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA，构建scFv表达载体，将该载体导入至宿主细胞，使其表达而获得。
dsFv是将重链可变区和轻链可变区中各1个氨基酸残基取代为半胱氨酸残基的多肽，经由S-S键而结合得到的。各区中的半胱氨酸残基的导入位置可根据由分子建模所预测的立体结构而确定。dsFv能够根据编码上述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA，构建dsFV表达载体，将该载体导入至宿主细胞，使其表达而获得。
双特异性抗体是以8个氨基酸残基以下的短肽接头所连接的scFv的二聚物，具有2价的抗原结合活性。2价的抗原结合活性可以相同或彼此不同。双特异性抗体能够通过根据编码上述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA，构建由8个氨基酸残基以下的肽接头所连接的scFv的表达载体，将该载体导入至宿主细胞，使其表达而获得。
含有CDR的肽含有重链可变区或轻链可变区的CDR的至少一个。含有CDR的肽也可使多个CDR直接或经由适当的肽接头而结合。含有CDR的肽能够通过将编码上述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的CDR的DNA插入至任意适当的表达载体，将该载体导入至宿主细胞，使其表达而获得。另外，也能够通过Fmoc法、tBoc法等的化学合成法而获得。
[D.医药组合物]
本发明的医药组合物含有作为靶标结合因子的A项所述的单克隆抗体或C项所述的抗体的片段、与药物。通过利用上述单克隆抗体或该抗体的片段(以下有时称为“单克隆抗体等”)作为靶标结合因子，能够将药物高效地送达至表面表达TF的细胞内。
在第一实施方式中，上述单克隆抗体等可为与药物结合的状态。另外，在该实施状态中，视需要也可进一步使高分子化合物结合至单克隆抗体等。
作为上述药物，根据治疗对象的疾病等而选择任意适当的药物。可列举例如核酸医药、抗体医药、基因治疗药等的生物药物和细胞毒素、细胞毒性药物等的细胞毒分子。
作为核酸医药，可列举例如质粒DNA、siRNA、micro RNA、shRNA、反义核酸、诱饵核酸、适体和核酶位点。
作为细胞毒素，可列举例如紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷(Etoposide)、替尼泊苷(Tenoposide)、长春花新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟蒽二酮、二羟蒽酮(Mitoxantrone)、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、四卡因、利多卡因、心得安(propranolol)、嘌呤霉素、倍癌霉素(duocarmycin)、刺孢霉素、美登素、澳瑞他汀(Auristatin)或这些的衍生物。
作为细胞毒性药物，可列举例如氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(Cytarabine)、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(Dacarbazine)等的代谢拮抗物质；二氯甲基二乙胺、硫替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、亚硝基脲氮芥(BSNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、环磷酰胺、二甲磺酸丁酯、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素、顺-二氯二氨合铂(II)等的烷化剂；柔红霉素、阿霉素等的蒽环类药物；放线菌素、博来霉素、光神霉素、氨茴霉素(AMC)等的抗生素和长春花新碱、长春花碱等的抗有丝分裂剂。
药物或高分子化合物与单克隆抗体等的结合，可通过该技术领域中公知的方法进行。例如可通过使各自具有的官能团或视需要所导入的官能团反应而进行。作为该官能团的组合，可列举例如氨基与羧基、羧基与羟基、顺丁烯二酰亚胺基与硫醇基、硫醇基与硫醇基、酰肼基与酮基、酰肼基与醛基、氨基与醛基、硫醇基与羧基、氨基与方酸衍生物、二烯基醛基与氨基、卤代酯与硫醇基、叠氮化物与炔等。另外，例如在药物为蛋白质或肽的情况，也可为通过基因工程方法与单克隆抗体等的融合蛋白。另外，在药物具有电荷的情况，也可经由离子键结合。
作为上述高分子化合物，可以选择任意适当的高分子化合物。作为具体例可列举聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇等。通过使这种高分子化合物结合，可提升血液中稳定性。
高分子化合物的结合部位在不损害单克隆抗体等的抗原结合活性和内化能力的下，可为任意适当的部位。
第二实施方式中，上述单克隆抗体等可为与DDS载体材料结合的状态。作为该DDS载体材料，可优选地使用能形成内包药物的纳米颗粒(例如，平均粒径优选为10nm～400nm、更优选为20nm～300nm、进一步优选为30nm～150nm的颗粒)者。根据这种DDS载体材料，可形成内包药物的纳米颗粒，故能够提升生体内的该药物的稳定性，或能够缓释化。进而，能够通过单克隆抗体等将药物可靠地送达至目标细胞内。
单克隆抗体等结合于DDS载体材料的任意适当的位置。由适当发挥靶标结合性的观点而言，优选使单克隆抗体等以在DDS载体材料形成的纳米颗粒的外表面露出的方式结合。单克隆抗体等与DDS载体材料间的结合，可通过例如使各自具有的官能团或视需要所导入的官能团反应而进行。关于官能团的优选组合如上所述。
作为上述DDS载体材料，可列举例如具有亲水性链段与疏水性链段的嵌段共聚物等的聚合物胶束形成材料、磷脂质等的脂质体形成材料、明胶、胶原蛋白、透明质酸、褐藻酸等的天然高分子，聚乙二醇、聚乙烯醇等的合成高分子等的纳米水凝胶胶囊形成材料，聚乙醇酸、聚乳酸和这些的共聚物等的纳米球形成材料。其中，优选使用具有亲水性链段与疏水性链段的嵌段共聚物。通过在具有亲水性链段和疏水性链段的嵌段共聚物的亲水性链段中结合单克隆抗体等而作成靶标结合性嵌段共聚物，可得到能够以高可靠性将药物送达至靶细胞内的聚合物胶束。
作为上述药物，可使用与第一实施方式相同的药物。第二实施方式中，药物可直接使用，也可使其结合至具有亲水性链段和疏水性链段的嵌段共聚物的疏水性链段，以药物结合嵌段共聚物的形态使用。
[E.药物传递用组合物]
本发明的药物传递用组合物含有A项所述的单克隆抗体或C项所述的抗体的片段。上述单克隆抗体或该抗体的片段可作为对表达TF的细胞的靶标结合因子利用，进而能够发挥向该细胞的内化能力。因此，通过使用本发明的药物传递用组合物进行药物给药，能够高效地将药物送达至表面表达TF的细胞内。
[F.本发明的抗TF单克隆抗体的用途]
本发明的抗TF单克隆抗体，代表性地用于与组织因子相关的疾病(例如，伴随组织因子在组织或细胞表面的表达增强的疾病)的治疗。作为与组织因子相关的疾病，可列举例如癌、炎症、血栓症等。由于TF在各种癌组织中持续性地表达增强，故不论癌种类均可用于其治疗。另外，例如胰腺癌中，报告有高表达TF的患者的预后不良，也可有效地利用于以这种患者为对象的治疗中。
本发明的医药组合物的给药途径，优选为皮下、静脉、动脉、局部等的非口服给药，特别优选为静脉内注射。给药量可视药物种类、用法、患者年龄、性别、患者的健康状态等而适当决定。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明。本发明并不受这些实施例任何限定。另外，“份”和“％”是指“重量份”和“重量％”。
[实施例1抗hTF单克隆抗体及其片段]
[抗原的制备]
使含有hTF全长氨基酸序列的33位～251位的氨基酸序列的重组蛋白质在大肠杆菌中表达，使用由镍柱精制而得的重组hTF(序列编号29)作为抗原。
[对大鼠的免疫]
将重组hTF 50μg与弗氏完全佐剂(Difco)一起对6周龄Wister雌大鼠3只进行腹腔内给药，作为首次免疫。在其14天后将重组hTF50μg与Sigma Adjuvant System(Sigma)一起给药，作为追加免疫。以后，每21天进行相同的追加免疫5次。再于126天后，将以PBS所稀释的重组hTF 10μg进行腹腔给药，并将重组hTF 40μg进行尾静脉给药，作为末次免疫。
[杂交瘤的制备]
在末次免疫的3天后摘取脾脏，回收脾脏细胞。使用50％浓度的聚乙醇4000(Merck)使脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞(p3X63Ag8.653)融合，以HAT培养基进行选择。
[产抗体杂交瘤的筛选]
在细胞融合8天后进行产抗体杂交瘤的筛选。用于筛选的免疫测定如下。在进行ELISA法时，在96孔微量滴定板(Nunc公司制)的各孔中依50μL/孔添加含有重组hTF 1μg/mL的50mM碳酸缓冲液(pH8)，于4℃固定一晚或于室温固定2小时。将这些孔以300μL的清洗液(0.05％Tween20/25mM Tris/140mM NaCl/2.5mM KCl，pH7.4)清洗3次后，以200μL加入阻断缓冲液(0.05％Tween20/1％BSA/100mM NaH2PO4/140mM NaCl，pH5)并于4℃静置1晚或于室温静置1小时以进行阻断。于如此所得到的hTF固相化板的各孔添加50μL杂交瘤培养上清液并于室温反应1小时。将各孔以300μL清洗液清洗3次后，以50μL加入以阻断缓冲液稀释为5,000倍的HRP标记抗小鼠IgG抗体(Bethyl)并反应30分钟。反应后，将各孔以300μL清洗液清洗3次，以100μL添加3.7mM邻苯二胺/25mM柠檬酸/130mM NaH2PO4/0.006％H2O2(pH5.0)，使其显色。于10～15分钟后以30μL/孔添加2当量浓度硫酸使反应停止。以微孔板吸光检测仪测定吸光度(490nM)。另外，免疫沉淀ELISA法通过将重组hTF与杂交瘤培养上清液混合，以hTF定量夹心ELISA测定混合液中的未结合hTF的量而实施。进而，依照通常方法实施流式细胞仪法，测定杂交瘤培养上清液对hTF表达细胞的反应性。
上述测定的结果，选择显示与hTF的强亲和性的杂交瘤，对这些克隆进行2次有限稀释法，由此构建产生与hTF结合的单克隆抗体的杂交瘤克隆。
[抗体的制备]
将所构建的各杂交瘤以含有5％的量的去除了源自牛的IgG的牛血清的RPMI1640培养基等进行大量培养，得到培养上清液。或者将各杂交瘤于ICR裸小鼠的腹腔内进行大量培养，采集腹水。将所得到的培养上清液或腹水供于Protein G亲和性柱色谱，精制IgG单克隆抗体。
[内化测定]
将如上述所得到的各单克隆抗体供于以下的内化测定。
在4腔室培养玻片(BD)以5×104细胞/腔室接种TF高表达的人类胰腺癌细胞BxPC3，以RPMI 1640培养基，于37℃、5％CO2环境下培养12小时。以PBS清洗3次后，将用Alexa647荧光标记试剂盒(Invitrogen)所标记的30μg的抗体以1ml的RPMI 1640培养基稀释并投加至各腔室，培养3小时。在该3小时的培养中，从培养开始经过2小时后，以最终浓度成为75nM的方式在培养液中加入Lysotracker RED-DND99(Invitrogen)，然后再培养1小时。接着，以PBS清洗3次后，以4％多聚甲醛予以固定，以DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行核染色后，由FluoromountG(Southern Biotech)进行封片。接着，使用荧光显微镜(Keyence)观察各细胞。将观察结果示于图1。
如图1(a)和(b)所示，在2个单克隆抗体(No.1849、No.1859)中，由于标记物质转移至细胞内，故确认到这些单克隆抗体具有内化能力。另一方面，关于图1(c)所示的抗体，未确认到内化能力。另外，对于这些抗体，使用小鼠单克隆抗体分型ELISA试剂盒(BDBiosciences公司制)确定抗体的亚型，结果No.1849为IgG2b、No.1859为IgG2a。
[编码可变区的DNA序列、氨基酸序列和CDR序列的确定]
1.抗hTF单克隆抗体(No.1849)
由产生抗hTF单克隆抗体(No.1849)的杂交瘤，依照常规方法提取总RNA，接着，由所得到的总RNA合成cDNA。
以所合成的cDNA作为模板，以PCR法得到编码抗hTF单克隆抗体(No.1849)的重链可变区和轻链可变区的DNA片段。具体而言，从下述引物一览中，分别使用以下引物1～19的混合引物和引物20作为重链可变区克隆用的正义引物和反义引物；分别使用以下引物22～38的混合引物和引物39作为轻链可变区克隆用的正义引物和反义引物，进行PCR。
[引物一览]
引物1(序列编号30)
NNCCATGGCCGAGGTRMAGCTTCAGGAGTC
引物2(序列编号31)
NNCCATGGCCGAGGTBCAGCTBCAGCAGTC
引物3(序列编号32)
NNCCATGGCCGAGGTGCAGCTGAAGSASTC
引物4(序列编号33)
NNCCATGGCCGAGGTCCARCTGCAACARTC
引物5(序列编号34)
NNCCATGGCCGAGGTYCAGCTBCAGCARTC
引物6(序列编号35)
NNCCATGGCCGAGGTYCARCTGCAGCAGTC
引物7(序列编号36)
NNCCATGGCCGAGGTCCACGTGAAGCAGTC
引物8(序列编号37)
NNCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATC
引物9(序列编号38)
NNCCATGGCCGAGGTGAWGYTGGTGGAGTC
引物10(序列编号39)
NNCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTC
引物11(序列编号40)
NNCCATGGCCGAGGTGCAMCTGGTGGAGTC
引物12(序列编号41)
NNCCATGGCCGAGGTGAAGCTGATGGARTC
引物13(序列编号42)
NNCCATGGCCGAGGTGCARCTTGTTGAGTC
引物14(序列编号43)
NNCCATGGCCGAGGTRAAGCTTCTCGAGTC
引物15(序列编号44)
NNCCATGGCCGAGGTGAARSTTGAGGAGTC
引物16(序列编号45)
NNCCATGGCCGAGGTTACTCTRAAAGWGTSTG引物17(序列编号46)
NNCCATGGCCGAGGTCCAACTVCAGCARCC
引物18(序列编号47)
NNCCATGGCCGAGGTGAACTTGGAAGTGTC
引物19(序列编号48)
NNCCATGGCCGAGGTGAAGGTCATCGAGTC
引物20(序列编号49)
TGTGCAGACCCTCGTGGACCACGGAGCA
引物21(序列编号50)
GGACTCTGGGRTCATTTACCMGGAGAGT
引物22(序列编号51)
NNNNGTCGACGCTCGAYATCCAGCTGACTCAGCC
引物23(序列编号52)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTGTTCTCWCCCAGTC
引物24(序列编号53)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTGTGMTMACTCAGTC
引物25(序列编号54)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTGTGYTRACACAGTC
引物26(序列编号55)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTGTRATGACMCAGTC
引物27(序列编号56)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTMAGATRAMCCAGTC
引物28(序列编号57)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTCAGATGAYDCAGTC
引物29(序列编号58)
NNNNGTCGACGCTCGAYATYCAGATGACACAGAC
引物30(序列编号59)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTGTTCTCAWCCAGTC
引物31(序列编号60)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTGWGCTSACCCAATC
引物32(序列编号61)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTSTRATGACCCARTC
引物33(序列编号62)
NNNNGTCGACGCTCGAYRTTKTGATGACCCARAC
引物34(序列编号63)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTGTGATGACBCAGKC
引物35(序列编号64)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTGTGATAACYCAGGA
引物36(序列编号65)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTGTGATGACCCAGWT
引物37(序列编号66)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTGTGATGACACAACC
引物38(序列编号67)
NNNNGTCGACGCTCGAYATTTTGCTGACTCAGTC
引物39(序列编号68)
CCTTAGGAGGGAAGATTGGAAGGAGCT
另外，上述碱基序列中，R是指G或A，Y是指T或C，M是指A或C，K是指G或T，S是指G或C，W是指A或T，B是指G、C或T，D是指A、G或T，V是指A、G或C，N是指A、T、G或C。
将上述所得到的各PCR产物依照常规方法克隆到载体中，确定碱基序列。
如上所述确定的抗hTF单克隆抗体(No.1849)的重链可变区和轻链可变区的碱基序列分别如序列编号69和70所记载。另外，该重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如序列编号9和10所记载。另外，通过将这些氨基酸序列与已知的抗体的氨基酸序列的数据库(IMGT的网站：http://www.imgt.org/)进行比较以调查同源性，CDR的氨基酸序列确定如下。
[表1]
2.抗hTF单克隆抗体(No.1859)
除了从产生抗hTF单克隆抗体(No.1859)的杂交瘤提取总RNA，以及使用引物21作为重链可变区克隆用的反义引物以外，其余与上述同样地进行，确定抗hTF单克隆抗体(No.1859)的重链可变区和轻链可变区的碱基序列。
所确定的抗hTF单克隆抗体(No.1859)的重链可变区和轻链可变区的碱基序列分别如序列编号71和72所记载。另外，该重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如序列编号17和18所记载。另外，这些可变区中的CDR的氨基酸序列确定如下。
[表2]
[通过表面等离子体共振法的结合活性评价]
将抗hTF单克隆抗体(No.1849、No.1859)固相化于Biacore公司的CM5芯片表面。将各抗体固相化后的CM5芯片安装于SPR装置，在其流路流通含有精制hTF的含抗原缓冲液。通过此测定系统求得各抗体与hTF的解离常数。另外，测定条件如下。
SPR装置：Biacore 2000(Biacore公司)
含抗原缓冲液：以最终浓度25μg/ml含有hTF的10mM醋酸缓冲液(pH5.0)
电泳缓冲液：HBS-EP buffer(10mM HEPES，pH7.5，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20(Tween 20)，pH7.4)。
上述测定的结果，各抗体与hTF的解离常数(KD)是：No.1849为9.139×10-11、No.1859为1.894×10-10。
[抗凝血作用评价]
如以下操作，测定抗hTF单克隆抗体(No.1849和No.1859)的凝血酶原时间。
在重组hTF抗原350ng中添加抗体3μg，加入PBS直到总量成为5μl。一边以37℃、600rpm进行振荡，一边进行15分钟抗原抗体反应。在反应液中添加以3.8％柠檬酸钠进行了抗凝血处理的人血浆50μl、25mM CaCl2 100μl，同时以37℃、600rpm一边振荡，一边进行培养，测量形成血纤维蛋白凝结为止的时间(凝血酶原时间)。将代替反应液而使用PBS的对照组中的凝血酶原时间设为1时的各抗体的凝血延长时间比(凝血酶原时间比)示于表3和图2。
[表3]
No.1849 No.1859 对照组(PBS)
凝血延长时间比 5.535 1.222 1
如表3和图2所示，No.1859的凝血延长时间比为1.222，可知抗凝血作用极小。
[实施例2医药组合物]
[单克隆抗体与药物的结合]
如以下操作得到结合了单甲基澳瑞他汀(MMAE)的抗hTF单克隆抗体(No.1849)(以下称为“hTF-MMAE”)。
在H-Cit-OH(1.18g，6.74mmol)和NaHCO3(566mg，6.74mmol)的水溶液(18mL)加入Fmoc-Val-OSu(2.80g，6.42mmol)的DMF(18mL)溶液，再加入THF(9mL)，搅拌整夜。通过15％柠檬酸水溶液(40mL)使反应停止，利用AcOEt/i-PrOH(9/1)混合溶液(100mL，2mL×2)对水层进行提取。将合并的有机层以水(70mL)清洗，进行减压浓缩。将残渣的固体用二乙醚清洗，得到白色固体的二肽(3.11g，97％)。
在Fmoc-Val-Cit-OH(3.00g，6.04mmol)和对氨基苄醇(1.49g，12.1mmol)的二氯甲烷(70mL)和甲醇(30mL)的溶液中，加入1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)(2.99g，12.1mmol)。1天后，再加入EEDQ(1.50g，6.04mmol)，搅拌整夜。将反应液浓缩，将残渣以二乙醚清洗，得到目标物(2.51g，69％)。
将Fmoc-Val-Cit-PAB-OH(2.00g，3.32mmol)溶解于二甲基甲酰胺(20mL)，加入双-对硝苯基碳酸酯(2.02mg，6.65mmol)与二异丙基乙胺(0.87mL，4.98mmol)。搅拌整夜后，将反应溶液进行减压浓缩，对残渣以醋酸乙酯和二乙醚进行清洗，得到对硝苯基碳酸酯体(1.73g，68％)。
在对硝苯基碳酸酯体(1.28g，1.67mmol)和HOBt(376mg，2.78mmol)的二甲基甲酰胺(3.4mL)和吡啶(0.85mL)的溶液中加入MMAE(1.00g，1.39mmol)。24小时后，将反应液通过Sephadex LH20(溶剂CHCl3：MeOH＝1：1)进行精制，得到Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAE(1.44g，77％)。
在Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAE(1.44g，1.07mmol)的二甲基甲酰胺溶液(20mL)中加入Et2NH(5mL)。搅拌整夜后，将反应液进行减压浓缩，对残渣以醋酸乙酯和二乙醚进行清洗，得到淡黄色固体(960mg，80％)。
在H-Val-Cit-PABC-MMAE(960mg，0.855mmol)的二氯甲烷溶液(20mL)中加入在N末端具有顺丁烯二酰亚胺基的Mal-PEG12-OSu(814mg，0.94mmol)和二异丙基乙胺(0.45mmol，2.57mmol)。搅拌整夜，将反应液以Sephadex LH20(CHCl3：MeOH＝1：1)和分子筛HPLC进行精制，得到作为无色油的Mal-PEG12-Val-Cit-PABC-MMAE(以下有时称为“顺丁烯二酰亚胺MMAE化合物”)(769mg，48％)。
使用含有5mM EDTA的PBS以及含有150mM NaCl和5mM EDTA的100mM磷酸缓冲液(pH6.0)，制备pH6.4的缓冲液，使用所得到的缓冲液以抗体浓度成为1.0mg/ml的方式制备抗体溶液。在该抗体溶液加入二硫苏糖醇(DTT)使最终浓度成为1～10mM，以26～37℃进行反应30～45分钟。接着，以Amicon Ultra(MWCO：30,000)从反应液去除反应试剂。进行吸收测定，结果抗体的回收率为80～99％。另外，由5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DNTB)的SH基的定量结果，可知每1个抗体得到3～5个SH基。
接着，使用含有5mM EDTA的PBS以及含有150mM NaCl和5mM EDTA的100mM磷酸缓冲液(pH6.0)，制备pH6.4的缓冲液，使用所得到的缓冲液将上述反应液稀释成蛋白质浓度0.5mg/ml。在该稀释液中以1：4的摩尔比(抗体：顺丁烯二酰亚胺MMAE化合物)混合上述顺丁烯二酰亚胺MMAE化合物后，于室温反应1小时，然后于4℃反应一晚。
然后，利用Amicon Ultra(MWCO：30,000)从反应液去除反应试剂后，将溶剂置换为PBS。利用Amicon Ultra回收蛋白质，结果为60～90％的回收率。
如上述操作，得到每1个抗体添加了3～5个MMAE的hTF-MMAE。
[杀细胞效果确认试验]
在96孔板分别加入人胰腺癌细胞(BxPC3)3×103个，用含有10％FCS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI培养基进行培养。在各孔中以成为各种药物浓度的方式添加hTF-MMAE，算出添加后72小时的细胞存活率。
此外，作为比较试验，代替hTF-MMAE，使用以与上述同样的方式在不在人类癌细胞中表达的对于小鼠TF的单克隆抗体(mTF)上结合了MMAE的mTF-MMAE进行相同试验，算出细胞存活率。将以阴性对照(无药物样本的添加)的细胞存活率设为100％时的各细胞存活率的比例(％)示于图3。
如图3所示，相较于mTF-MMAE，hTF-MMAE显示了明显优越的杀细胞效果。由此可知，通过使药物结合至抗hTF单克隆抗体(No.1849)，能够提升对于在表面表达hTF的细胞内的转移性，能够发挥高的药效。
[抗肿瘤效果确认试验]
在4周龄裸小鼠(BALBc nu/nu，雌)的背部皮下移植1×107个/100μL的人类胰腺癌细胞(BxPC3)，在肿瘤体积(根据肿瘤径所算出)为约200mm3时开始治疗，以治疗开始当天作为Day0，于Day0、4和8将药物进行尾静脉给药各1次(共计给药3次)。药物使用hTF-MMAE，作为对照，给药生理食盐水(各组：N＝7)。药物的给药量每1次为10mg/kg(抗体量：约200μg/只)。然后，每周2次测量肿瘤径和体重直到Day30。将肿瘤体积和体重相对于Day0的肿瘤体积和体重的比分别示于图4和5。
如图4所示，hTF-MMAE显示了明显优异的抗肿瘤效果。其结果与由in vitro所确认的杀细胞效果一致。另外，如图5所示，在给药了hTF-MMAE的组中未确认到体重减少。
[实施例3抗mTF单克隆抗体及其片段]
[抗原的制备]
使大肠杆菌表达含有mTF全长氨基酸序列的30位～251位的氨基酸序列的重组蛋白质，使用由镍柱精制而得的重组mTF(序列编号73)作为抗原。
[对大鼠的免疫]
将重组mTF 50μg和弗氏完全佐剂(Difco)一起对6周龄Wister雌大鼠3只进行腹腔内给药，作为首次免疫。在其14天后将重组mTF50μg和Sigma Adjuvant System(Sigma)一起给药，作为追加免疫。以后每21天进行相同的追加免疫7次。再于207天后，将以PBS所稀释的重组mTF 10μg进行腹腔给药，并将重组mTF 40μg进行尾静脉给药，作为末次免疫。
[杂交瘤的制备]
在末次免疫的3天后摘取脾脏，回收脾脏细胞。使用50％浓度的聚乙醇4000(Merck)使脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞(p3X63Ag8.653)融合，以HAT培养基进行选择。
[产抗体杂交瘤的筛选]
在细胞融合8天后进行产抗体杂交瘤的筛选。用于筛选的免疫测定如下。在进行ELISA法时，在96孔微量滴定板(Nunc公司制)的各孔中以50μL/孔添加含有重组mTF 1μg/mL的50mM碳酸缓冲液(pH8)，于4℃固定一晚或于室温固定2小时。将这些孔以300μL的清洗液(0.05％Tween20/25mM Tris/140mM NaCl/2.5mM KCl，pH7.4)清洗3次后，以200μL加入阻断缓冲液(0.05％Tween20/1％BSA/100mM NaH2PO4/140mM NaCl，pH5)并于4℃静置1晚或于室温静置1小时以进行阻断。在这样所得到的mTF固相化板的各孔添加50μL杂交瘤培养上清液并于室温反应1小时。将各孔以300μL清洗液清洗3次后，以50μL加入以阻断缓冲液稀释为5,000倍的HRP标记抗小鼠IgG抗体(Bethyl)反应30分钟。反应后，将各孔以300μL清洗液清洗3次，以10μL添加3.7mM邻苯二胺/25mM柠檬酸/130mM NaH2PO4/0.006％H2O2(pH5.0)，使其显色。于10～15分钟后以30μL/孔添加2当量浓度硫酸使反应停止。以微孔板吸光检测仪测定吸光度(490nM)。另外，免疫沉淀ELISA法通过将重组mTF与杂交瘤培养上清液混合，以mTF定量夹心ELISA测定混合液中的未结合mTF的量而实施。进而，依照通常方法实施流式细胞仪法，测定杂交瘤培养上清液对hTF表达细胞的反应性。
上述测定的结果，选择显示与mTF的强亲和性的杂交瘤，对这些克隆进行2次有限稀释法，由此构建产生与mTF结合的单克隆抗体的杂交瘤克隆。
[抗体的制备]
将所构建的各杂交瘤以含有5％的量的去除了源自牛的IgG的牛血清的RPMI1640培养基等进行大量培养，得到培养上清液。或者将各杂交瘤在ICR裸小鼠的腹腔内进行大量培养，采集腹水。将所得到的培养上清液或腹水供于Protein G亲和性柱色谱，精制IgG单克隆抗体。
[内化测定]
将如上述所得到的各单克隆抗体供于以下的内化测定。
在4腔室培养玻片(BD)以5×104细胞/腔室接种小鼠B16黑色素瘤细胞与其TF强制表达细胞，以RPMI 1640培养基，于37℃、5％CO2环境下培养12小时。以PBS清洗3次后，将由Alexa647荧光标记试剂盒(Invitrogen)所标记的30μg的抗体以1ml的RPMI 1640培养基稀释并投加至各腔室，培养3小时。在该3小时的培养中，从培养开始经过2小时后，以最终浓度成为75nM的方式在培养液中加入Lysotracker RED-DND99(Invitrogen)，然后再培养1小时。接着，以PBS清洗3次后，以4％多聚甲醛予以固定，以DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行核染色后，以FluoromountG(Southern Biotech)进行封片。接着，使用荧光显微镜(Keyence)观察各细胞。将观察结果示于图6。
如图6所示，在单克隆抗体(No.1157)中，由于经荧光标记的抗体(红色)转移至细胞内，故确认到该单克隆抗体具有向表达mTF的细胞的内化能力。另外，于图6中，推测经荧光标记的抗体(红色)转移至内部的细胞为TF强制表达的小鼠B16黑色素瘤细胞，抗体未转移至内部的细胞为通常的小鼠B16黑色素瘤细胞(作为参考，将TF强制表达的小鼠B16黑色素瘤细胞中的TF表达量的增强程度示于图7。图7是表示小鼠B16黑色素瘤细胞及其TF强制表达细胞中，TF的mRNA表达量相对于GAPDH的mRNA表达量的比例的图表)。
[编码可变区的DNA序列、氨基酸序列和CDR序列的确定]
除了由产生抗mTF单克隆抗体(No.1157)的杂交瘤提取总RNA以外，其余与抗hTF单克隆抗体(No.1849)的重链可变区和轻链可变区的碱基序列的确定方法同样地进行，确定抗mTF单克隆抗体(No.1157)的重链可变区和轻链可变区的碱基序列。
所确定的抗mTF单克隆抗体(No.1157)的重链可变区和轻链可变区的碱基序列分别如序列编号74和75所记载。另外，该重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如序列编号25和26所记载。另外，这些可变区中的CDR的氨基酸序列如下确定。
[表4]
[实施例4嵌合抗体的制作]
将编码实施例1所克隆的抗hTF单克隆抗体(No.1849)的重链可变区和轻链可变区的DNA片段，以PCR进行扩增。将重链的可变区DNA片段插入至表达人IgG1重链恒定区的克隆载体(pFUSEss_CHIg-hG1e2(invivoGen))中，将轻链的可变区DNA片段插入至表达人类kappa轻链恒定区的克隆载体(pFUSE2ss_CLIg_hk(invivoGen))中，得到表达载体。将所得到的表达载体使用Lipofectamine LTX Reagent(Invitrogen)转染至CHO-K1细胞。接着，使用10μg/mL杀稻瘟菌素S(Blastcidin S)(科研制药)和300μg/mL Zeocin(Invitrogen)进行药剂筛选，得到双抗性细胞株。
将所得细胞株以含有Ham's F12K(wako)、10％FBS、1％青霉素、链霉素(Invitrogen)、10μg/mL杀稻瘟菌素S和300μg/mL Zeocin的培养基进行维持培养。接着，通过使用96孔板的有限稀释法克隆抗hTF人型嵌合抗体的稳定表达细胞株(No.1849嵌合克隆)。
将所克隆的细胞株(No.1849嵌合克隆)的培养上清液供于ELISA，结果可确认到与hTF的反应性。另外，将所克隆的细胞株的培养上清液供于流式细胞仪解析(FACS)，结果能够确认到对人类结肠腺癌细胞(DLD-1)的反应性。具体而言，如图8所示，培养上清液显示对hTF表达细胞DLD-1的特异反应性(图8中，(1)、(2)和(3)分别表示使用了大鼠抗hTF单克隆抗体(No.1849)、No.1849嵌合克隆的培养上清液和小鼠的同种型-对照组的解析结果)。
[编码嵌合抗体的DNA序列、氨基酸序列的确定]
由No.1849嵌合克隆提取载体，依照常规方法确定该载体所编码的抗hTF人型嵌合抗体(No.1849)的重链和轻链的碱基序列和氨基酸序列。所确定的嵌合抗体的重链和轻链的碱基序列分别如序列编号76和77所记载。另外，所确定的嵌合抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如序列编号78和79所记载。
产业上的可利用性
本发明的单克隆抗体或其片段能够适合利用于DDS的领域。

Claims (9)

1.一种单克隆抗体，其与组织因子结合，该单克隆抗体的特征在于，其为：
抗人类组织因子单克隆抗体，含有：具有分别含序列编号3、4和5所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号6、7和8所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的轻链可变区；
抗人类组织因子单克隆抗体，含有：具有分别含序列编号11、12和13所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号14、15和16所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的轻链可变区；或
抗小鼠组织因子单克隆抗体，含有：具有分别含序列编号19、20和21所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的重链可变区；和具有分别含序列编号22、23和24所述的氨基酸序列的互补性决定区1、2和3的轻链可变区。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其为：
抗人类组织因子单克隆抗体，含有：含有序列编号9所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列的重链可变区；和含有序列编号10所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列的轻链可变区；
抗人类组织因子单克隆抗体，含有：含有序列编号17所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列的重链可变区；和含有序列编号18所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列的轻链可变区；或
抗小鼠组织因子单克隆抗体，含有：含有序列编号25所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列的重链可变区；和含有序列编号26所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列的轻链可变区。
3.一种单克隆抗体，其特征在于：
结合至与权利要求1所述的单克隆抗体所结合的组织因子的表位相同的表位。
4.如权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体，其特征在于：
具有向表达组织因子的细胞的内化能力。
5.如权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体，其特征在于：
其为人型嵌合抗体或人源化抗体。
6.一种抗体的片段，其特征在于：
含有权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体的一部分，能够与组织因子结合。
7.如权利要求6所述的抗体的片段，其特征在于：
具有向表达组织因子的细胞的内化能力。
8.一种医药组合物，其特征在于，含有：
作为靶标结合因子的权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体或权利要求6或7所述的抗体的片段、与药物。
9.一种药物传递用组合物，其特征在于，含有：
作为靶标结合因子的权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体或权利要求6或7所述的抗体的片段。
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