CN107446047A - 一种双功能性组织因子人源化抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属抗体工程技术领域，提供一种双功能性组织因子人源化抗体及其制备方法，该抗体人源化程度高，与组织因子（Tissue factor,TF）亲和力和特异性强，具有抑制凝血和抑制肿瘤细胞增值活性的双功能性TF人源化抗体。双功能性组织因子人源化抗体基因含有1347bp核苷酸组成的重链基因HC，642bp核苷酸组成的轻链基因LC，重链基因HC序列为SEQ ID NO:1，轻链基因LC序列为SEQ ID NO:2。本发明制备的TF人源化抗体人源化程度高达98%以上，同时保持良好的抗原亲和力，特异性结合TF后具有抑制凝血和肿瘤细胞生长的功能。

Description

一种双功能性组织因子人源化抗体及其制备方法
技术领域
本发明属于抗体工程技术领域，具体涉及一种双功能性组织因子人源化抗体及其制备方法。
背景技术
组织因子(tissue factor, TF)是凝血反应的起始蛋白，通过结合凝血因子Ⅶ形成复合体从而启动机体外源凝血途径触发生理性凝血。临床研究显示，TF与动脉粥样硬化病(atherosclerosis, AS)的整个病理过程及临床并发症均有密切关系，决定着动脉粥样硬化斑块的促凝活性，可促进动脉粥样硬化血栓形成和触发心肌梗死。TF同时具有信号传导受体的功能，通过介导多种信号传导能够参与肿瘤血管生成，促进肿瘤的浸润与转移。研究结果已证实，TF在恶性黑色素瘤（Guan M等 Clin Biochem, 2002, 35(4): 321-325）、胰腺癌(Nitori N等Clin Cancer Res, 2005, 11(7): 2531- 2539)、乳腺癌(Ueno T等Br Jcancer, 2000, 83 (2): 164-170)、肺癌及结肠癌(Donati MB等Pathophsiol haemostThromb, 2003, 33 (suppl 1): 22-25)等肿瘤细胞表面都过量表达，与肿瘤的生长、转移关系密切。因此，靶向TF分子介导免疫攻击肿瘤血管，抑制肿瘤血管生成，或者抑制TF的凝血活性，减少血栓的形成，是目前肿瘤和心脑血管疾病的研究热点。
佐藤功等报道抗TF抗体用于治疗弥散性血管内凝血综合症（公开号：CN1303431A），丹麦的P-O·弗瑞斯克加尔德报道抗TF抗体可以抑制TF与凝血因子VII结合从而阻断凝血（公开号:CN 1575302A）。Ishibashi（Cancer Res. 2000, 60 (22): 6531）等报道，转移性黑色素瘤细胞表面的TF表达比非转移性黑色素瘤细胞高1000倍，而使用抗体阻断转移性黑色素瘤细胞TF的受体功能后，发现裸鼠肺部血管的肿瘤细胞数减少，肺转移灶减少。Huang(Science, 1997, 275(5229): 547-550)和Versteeg (Mol Med, 2004, 10(16): 6)等的动物模型研究也证明：TF抗体与TF结合后，可以靶向性抑制肿瘤血管的生成，导致肿瘤坏死。可见，利用TF抗体的靶向性和特异性，抑制TF凝血活性和阻断TF信号传导途径，是目前探索治疗血栓和肿瘤的重要策略之一。专利CN200910227865.0通过经典的杂交瘤技术获得了一株可特异性抑制凝血活性和肿瘤生长、转移的鼠源抗TF单克隆抗体。但鼠源单克隆抗体具有较强的免疫原性，容易产生人抗鼠抗体（HAMA）反应引起危险的免疫应答，且易被降解在人体内半衰期较短而影响疗效。专利CN103342752A从CN200910227865.0获得的一株抗组织因子杂交瘤细胞株出发，制备了一种分子量小、对肿瘤组织穿透力强、免疫原性低的抗人TF单链抗体（single chain variable fragment, scFv）。该单链抗体可特异性结合肿瘤细胞高表达的组织因子，抑制肿瘤的生长和转移。然而单链抗体无法有效启动依赖于抗体恒定区结合位点的补体依赖的细胞毒（complement dependentcytotoxicity, CDC）及抗体依赖的细胞毒（antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity, ADCC）作用，较大程度的较低了抗体的生物学效应。
鼠源抗体的人源化改造是解决上述问题的主要技术手段。所谓的人源化抗体即是在鼠源单克隆抗体氨基酸序列基础上，通过基因克隆和DNA重组技术将其部分或全部为人源序列取代而重新表达的抗体，该抗体同时保留亲本鼠源单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有应用于人体临床。提高抗体人源化水平是显著降低亲本鼠源单克隆抗体免疫原性的关键，然而人源化水平的提高则极易导致抗体亲和力和特异性的降低。如何平衡抗体人源化水平和亲和力、特异性的维持，是抗体人源化改造的技术瓶颈，也是困扰人源化抗体临床应用的主要问题。抗体的可变区是其维持亲和力和特异性的功能区，特别是其中的抗体互补决定区（CDR）是在抗体框架区（FR）的支持下与抗原分子上的表位氨基酸相互作用，决定了抗原的特异性和亲和力。通过FR区改造，在保持抗体特异性和亲和力的基础上最大程度的提高人源化水平，是人源化抗体制备需要解决的主要技术问题。
发明内容
本发明目的是克服上述已有技术的不足，提供一种双功能性组织因子人源化抗体及其制备方法，双功能性是指该抗体具有既抑制凝血又抑制肿瘤细胞增殖的功能。
本发明由如下技术方案实现的：
一种双功能性组织因子人源化抗体，所述双功能性组织因子人源化抗体基因含有1347bp核苷酸组成的重链基因HC，642bp核苷酸组成的轻链基因LC，重链基因HC序列为SEQID NO:1，轻链基因LC序列为SEQ ID NO:2。
所述重链基因HC编码449个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。所述轻链基因LC编码214个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
所述双功能性组织因子人源化抗体的制备方法为：以专利201310181618.8中制备的TF单链抗体表达载体phoA-VH-Linker-VL-His为模板，PCR扩增获得抗体重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL，将其翻译成氨基酸序列，然后将氨基酸序列在NCBI-Blastp数据库中人抗体序列进行比对，选择与可变区VL和VH相似性最高的人抗体序列，作为人源化改造的参考模板，确定需要突变的氨基酸位点，设计人源化改造的基因，完成人源化改造，筛选与TF特异性结合的基因序列，分别构建表达载体；表达载体转至CHO细胞中表达，获得与TF特异性结合的人源化抗体；所得与TF特异性结合的人源化抗体经过抗体亲和力、人源化程度和活性试验的综合评估，最终获得双功能性组织因子人源化抗体。
具体制备方法为：
（1）双功能性TF人源化抗体可变区基因克隆：以专利201310181618.8中制备的TF单链抗体原核可溶表达载体phoA-VH-Linker-VL-His为模板，PCR获得VH和VL基因序列，然后克隆到pUC57载体上，构建出pUC57-VH 和pUC57-VL载体，测序鉴定；PCR扩增引物序列如下：
VH-F：5’TCTAGAAAGCTTGCCGCCACCATGGAGATCCAG 3’
VH-R：5’GGATCCGAATTCTTATGAGGAGACTGTGAGA 3’
VL-F：5’ TCTAGAAAGCTTGCCGCCACCATGGACAT 3’
VL-R：5’GGATCCGAATTCTTATTTCAGCTCCAGCTTG 3’
所述VH-F的起始TCTAGAAAGCTT序列和VL-F的起始TCTAGAAAGCTT序列中含有XbaI和HindIII的酶切位点；所述VH-R的起始GGATCCGAATTC序列和VL-R的起始GGATCCGAATTC序列中含有BamHI和EcoRI的酶切位点；
（2）TF鼠源抗体的序列分析和人源化改造：获得TF单链抗体重链可变区VH、轻链可变区VL氨基酸序列后，将鼠源抗体VL和VH的氨基酸序列作为探针在NCBI-Blastp工具上进行序列比对，在Genbank上找到与可变区VL和VH相似性最高的人抗体序列，作为人源化FR区改造的参考模板，确定需要突变的氨基酸位点，合成若干人源化抗体序列，将其分别构建表达载体；经过抗体亲和力和活性试验检测，获得人源化改造的氨基酸序列；
其中：VH需要替换的氨基酸如下：FR1区中的氨基酸I 2突变成V，Q19突变成K，T24突变成A，S28突变成T；FR2区中的氨基酸H41突变成P，S44突变成G；FR3区中的氨基酸T77突变成S，F80突变成Y，H82突变成Q，D89突变成E，F95突变成Y；
VL需要替换的氨基酸如下：FR1区中的氨基酸A9突变成S，Q11突变成L，L15突变成V，E17突变成D，S18突变成R；FR2区中的氨基酸S43突变成A；FR3区中的氨基酸K70突变成D，S72突变成T，K74突变成T，A80突变成P，V84突变成A，N85突变成T；FR4区中的氨基酸A100突变成Q，L106突变成I，突变后合成TF人源化抗体重链和轻链序列，然后构建其表达载体；
(3)TF人源化抗体表达载体的构建：TF人源化抗体重链基因即hHC序列合成后，Sal I和Asc I双酶切hHC基因和同样双酶切pinsulator4X-MSA载体进行连接，然后将连接产物pinsulator4X-hHC-dhfr转化至感受态E.coli DH5α中，TF人源化抗体轻链基因即hLC基因序列合成后，NotI和BciI双酶切hLC基因和同样双酶切pCAGGS-IRES-AscI载体进行连接，然后将连接产物pCAGGS-hLC-IRES-AscI转化至感受态E.coli DH5α；氨苄青霉素筛选阳性克隆，酶切鉴定；
重组质粒pinsulator4X-hHC-dhfr和pCAGGS-hLC-IRES-AscI鉴定正确后，Sal I和MauBI双酶切pinsulator4X-hHC-dhfr，电泳回收酶切vector片段；Sal I和AscI双酶切pCAGGS-hLC-IRES-AscI，电泳回收insert片段，然后将两个回收片段连接成pinsulator4X-CAG-TFIgG-dhfr表达载体，转入感受态E.coli DH5α中，氨苄青霉素筛选阳性克隆，酶切测序鉴定；
（4）TF人源化抗体的表达及纯化：利用脂质体转染技术将表达载体pinsulator4X-CAG-TFIgG-dhfr导入CHO-dhfr-细胞中，用甲氨蝶呤即MTX加压筛选，获得稳定分泌TF人源化抗体的阳性细胞株；建立了稳定细胞株后，扩大细胞培养，细胞上清液进行重组proteinA亲和纯化和凝胶柱纯化，获得TF人源化抗体；
（5）TF人源化抗体活性的评价：用Western blot和间接ELISA鉴定TF人源化抗体与TF的结合能力；间接ELISA测定TF人源化抗体结合TF的亲和力；凝血酶原时间即PT测定TF人源化抗体抗凝血活性；细胞增殖实验利用CCK-8法检测TF人源化抗体抑制肿瘤细胞生长活性。
本发明的TF人源化抗体与TF保持高度特异性结合，并且具有较强的抗凝和抗肿瘤活性，有望开发为抗凝血或治疗特定肿瘤的药物。
本发明与现有技术相比，优势在于：通过专利CN 103342752 A抗人组织因子单链抗体获得抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列，通过序列比对完成FR区定点突变人源化改造，构建成pinsulator4X-CAG-TFIgG-dhfr表达载体，最终实现了人源化抗体在CHO细胞中的表达，制备了既抑制凝血又抑制肿瘤细胞增殖的双功能性TF人源化抗体。本发明制备的TF人源化抗体人源化程度高达90%以上，同时保持良好的抗原亲和力，特异性结合TF后具有抑制凝血和肿瘤细胞生长的功能。
附图说明
图1为Sal I和Asc I双酶切pinsulator4X-hHC-dhfr载体的1%的琼脂糖凝胶电泳结果，图中：M为1 Kb DNA maker，1和2为酶切电泳条带；图2为Not I和Bci I双酶切pCAGGS-hLC-IRES-AscI载体的1%的琼脂糖凝胶电泳结果，图中：M为1 Kb DNA maker，1为酶切电泳条带；图3为TF人源化抗体表达载体图谱；图4为SwaI酶切表达载体pinsulator4X-CAG-TFIgG-dhfr的1%的琼脂糖凝胶电泳结果，图中：M为1 Kb DNA maker，1为酶切电泳条带；图5为OD450-OD650酶标仪测定标准品人IgG1的标准曲线；图6为TF人源化抗体A柱纯化电泳结果；图7为TF人源化抗体凝胶纯化电泳结果；图8为TF人源化抗体Western Blot结果，图中：１为TF鼠源抗体；２为空白对照；３为ＴＦ人源化抗体；图9为TF人源化抗体相对亲和力检测结果；图10为荧光标记TF人源化抗体鉴定人肿瘤细胞表面抗原TF表达；图11为TF人源化抗体对肿瘤细胞增殖的影响和对肿瘤细胞的抑制率。
具体实施方式
实施例1：TF鼠源性抗体的序列分析和人源化改造
（1）TF鼠源性抗体可变区序列分析
以TF单链抗体（CN 103342752 A）制备的载体phoA-VH-Linker-VL-His为模板，PCR扩增获得VH和VL基因序列。然后克隆到pUC57载体上，构建出pUC57-VH 和pUC57-VL载体。PCR反应体系：10 µM引物分别各取2 µl，30 ng模板，Prime STARR Max Premix 取25µl，H2O 20 µl，总反应体系为50µl。PCR反应条件：94℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃再延伸10 min；1%琼脂糖电泳胶回收VH和VL目的片段。
克隆VH和VL的引物如下：
VH-F：5’TCTAGAAAGCTTGCCGCCACCATGGAGATCCAG 3’
VH-R：5’GGATCCGAATTCTTATGAGGAGACTGTGAGA 3’
VL-F：5’ TCTAGAAAGCTTGCCGCCACCATGGACAT 3’
VL-R：5’GGATCCGAATTCTTATTTCAGCTCCAGCTTG 3’
所述VH-F的起始TCTAGAAAGCTT序列和VL-F的起始TCTAGAAAGCTT序列中含有XbaI和HindIII的酶切位点；所述VH-R的起始GGATCCGAATTC序列和VL-R的起始GGATCCGAATTC序列中含有BamHI和EcoRI的酶切位点；
（2）TF鼠源性抗体的人源化改造
人源化改造的主要目标是可变区中FR序列。将抗体可变区VL和VH的氨基酸序列在NCBI-Blastp工具上进行序列比对，在Genbank上找到与可变区VL和VH相似性最高的人抗体序列，作为抗体FR区人源化改造的参考模板，确定需要突变的氨基酸位点，设计人源化改造序列，序列见表1。
TF鼠源抗体人源化改造方案：
根据表1中的序列合成9条人源化抗体VH序列：1）FR1-a－FR2－FR3-a；2）FR1-a－FR2－FR3-b；3）FR1-a－FR2－FR3-b；4）FR1-b－FR2－FR3-a；5）FR1-b－FR2－FR3-b；6）FR1-b－FR2－FR3-c；7）FR1-c－FR2－FR3-a；8）FR1-c－FR2－FR3-b；9）FR1-c－FR2－FR3-c。
根据表1中的序列合成12条人源化抗体VL序列：1）FR1-a－FR2－FR3-a－FR4；2）FR1-a－FR2－FR3-b－FR4 ；3）FR1-a－FR2－FR3-c－FR4；4）FR1-a－FR2－FR3-d－FR4；5）FR1-b－FR2－FR3-a－FR4；6）FR1-b－FR2－FR3-b－FR4；7）FR1-b－FR2－FR3-c－FR4；8）FR1-b－FR2－FR3-d－FR4；9）FR1-c－FR2－FR3-a－FR4；10）FR1-c－FR2－FR3-b－FR4；11）FR1-c－FR2－FR3-c－FR4；12）FR1-c－FR2－FR3-d－FR4。
以上合成的9条重链VH序列和12条轻链VL序列随机组合，分别构建108种表达载体。所构建的表达载体瞬时转染CHO细胞，ELISA方法和PT方法检测人源化抗体与TF抗原亲和力和抑制凝血活性。
根据检测结果最终获得亲和力最高和抑制凝血活性强的人源化抗体，其组合重链VH为FR1-a－FR2－FR3-a，其序列为：
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
His Phe Asn Val Tyr Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Asp Asn Gly Ile Thr Phe Tyr
50 55 60
Asp Glu Asn Phe Met Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
65 70 75
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp
80 85 90
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val Thr Thr Ala Val Asp
95 100 105
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
110 115
轻链VL为FR1-a－FR2－FR3-a－FR4，其序列为：
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Thr Gln Thr Leu Asp
20 25 30
Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu
80 85 90
Val Tyr Ser Ser Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
95 100 105
Ile Lys。
改造的氨基酸序列为：VH需要替换的氨基酸如下：FR1区中的氨基酸I 2突变成V，Q19突变成K，T24突变成A，S28突变成T；FR2区中的氨基酸H41突变成P，S44突变成G；FR3区中的氨基酸T77突变成S，F80突变成Y，H82突变成Q，D89突变成E，F95突变成Y；
VL需要替换的氨基酸如下：FR1区中的氨基酸A9突变成S，Q11突变成L，L15突变成V，E17突变成D，S18突变成R；FR2区中的氨基酸S43突变成A；FR3区中的氨基酸K70突变成D，S72突变成T，K74突变成T，A80突变成P，V84突变成A，N85突变成T；FR4区中的氨基酸A100突变成Q，L106突变成I。
表1：TF抗体人源化改造序列
实施例2： pinsulator4X-CAG-TFIgG-dhfr表达载体的构建
hHC基因序列合成后，Sal I和Asc I分别双酶切hHC基因片段和 pinsulator4X-MSA载体， 1 %琼脂糖凝胶电泳，胶回收insert1片段（1425 bp）和vector1片段（11938 bp），二者在4℃下连接过夜形成连接产物。hLC基因序列合成后，Not I和Bci I分别双酶切hLC基因和pCAGGS-IRES-AscI载体，电泳胶回收insert2片段（720 bp）和vector2片段（6838 bp），二者在4℃下连接过夜形成连接产物。将连接产物转入感受态E.coli DH5α中，氨苄青霉素筛选单菌落。单菌落于37℃过夜培养，从菌体中提取质粒，酶切鉴定。
Sal I和Asc I双酶切pinsulator4X-hHC-dhfr载体，1%的琼脂糖凝胶电泳（如图1所示），电泳结果与理论值（1425 bp，11938bp）一致。Not I和Bci I双酶切pCAGGS-hLC-IRES-AscI载体，1%的琼脂糖凝胶电泳（如图2所示），电泳结果与理论值（720 bp，6838bp）一致。
以上重组质粒鉴定正确后，Sal I和MauB I双酶切pinsulator4X-hHC-dhfr，1 %琼脂糖凝胶电泳回收酶切结果vector 3 (13349 bp)片段；Sal I和AscI双酶切pCAGGS-hLC-IRES-AscI，电泳回收insert 3（4179）片段。然后将vector 3和insert 3连接成pinsulator4X-CAG-TFIgG-dhfr表达载体（结果见图3），转入感受态E.coli DH5α中，氨苄筛选单菌落。在37℃，180rpm转速下，单菌落过夜培养，收集菌体，提取质粒，酶切鉴定和测序分析。
SwaI酶切表达载体pinsulator4X-CAG-TFIgG-dhfr，1%的琼脂糖凝胶电泳结果见图4，根据电泳结果显示，电泳结果与理论值（2890 bp，14638bp）一致。
对获得的载体测序结果显示：pinsulator4X-CAG-TFIgG-dhfr载体轻链基因LC测序结果与TF抗体人源化后基因合成的LC序列比对结果：Score=1186 bits(642)；Expect=0.0；Identities=642/642（100%）；Gaps=0/642(0%)；Strand=Plus/Plus；显示了被测序列与基因合成的LC基因序列完全一致。
pinsulator4X-CAG-TFIgG-dhfr载体重链基因HC测序结果与TF抗体人源化后基因合成的HC序列比对结果：Score=2484 bits(1344)；Expect=0.0；Identities=1344/1344（100%）；Gaps=0/1344(0%)；Strand=Plus/Plus；结果显示了被测序列与基因合成的HC基因序列完全一致。
实施例3 ：TF人源化抗体表达及纯化
1.TF人源化抗体表达
CHO-dhfr-细胞以6×105的密度接种到6孔板中过夜培养。转染复合物的准备：A管中加入25 ul Opti-MEM和4 ul Lipofectamine3000，室温震荡1-2 s，B管中加入25 ul Opti-MEM和2 ug质粒。以上两个管混匀，静置5 min，然后加入6孔培养板。24 h后，胰蛋白酶消化细胞至培养皿中，加入终浓度为50 um的MTX进行细胞加压筛选，15-20天之后，挑取单细胞簇于6孔板中培养。当细胞汇合度达到90 %时，转接于T25培养瓶生长。细胞密度达到每毫升5×105细胞量时，传入锥形瓶中，37℃，5 % CO2，130 rpm震荡培养，培养10-15天后，收集细胞上清，ELISA检测上清中抗体的含量。
ELISA检测方法：1）以2 ug/ml的浓度在96孔板中包被羊抗人IgG Fc，4℃放置过夜。第二天，PBST洗板3次，加入100 ul的封闭液室温封闭1 h，PBST洗板3次。2）分别加入50ul标准品人IgG1(起始浓度为0.4-1 ug/ml，1：2封闭液稀释，12个梯度)和细胞上清（起始浓度1：200,1：2稀释，12个梯度）室温反应1h，PBST洗板3次。3）加入50 ul生物素标记的鼠抗人的IgG(1︰4000)室温反应0.5 h ，PBST洗板3次。4）加入50 ul HRP标记的链霉素室温反应0.5 h，PBST洗板3次。然后加入50 ulTMB室温反应2 min后，加入50 ul 2 N H2SO4终止反应，OD450-OD650酶标仪测定。
检测结果：根据如图5所示标准曲线计算细胞上清液中TF人源化抗体的表达量为32 ug/ml。
2.TF人源化抗体纯化
（1）细胞液预处理：收集细胞上清液调节pH值为9.0后，4℃，10000rpm离心20 min。0.22µm膜过滤。
（2）Mabselet proteinA纯化：5倍柱体积的平衡液（20 mM Tris·HCl 0.15 MNaCl PH 9.0）平衡A柱，细胞上清以2 ml/min的流速经过A柱，记录吸收峰值，上样完成后，用5倍柱体积平衡液顶洗直至基线，100 mM PH3.0甘氨酸·盐酸洗脱液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，再用平衡液清洗A柱。收集液用1 M Tris 调节PH值为7.0。目的蛋白SDS-PAGE电泳分析结果见图6。
（3）凝胶柱(HiLoad 26/600 Superdex2000 Prep grade)纯化：蛋白A柱纯化的TF人源化抗体离心浓缩至浓度为3 mg/ml后，利用AKTA系统凝胶分离蛋白，流速为1 ml/min。收集目的蛋白峰，测定含量，电泳分析。结果见图7。
纯化结果分析：有杂带的细胞液经过蛋白A柱和凝胶层析纯化后，获得均一的蛋白质。根据抗体分子量推断和SDS-PAGE结果显示50KD位置为 TF人源化抗体重链条带，25KD位置为TF人源化抗体轻链条带。
实施例4：TF人源化抗体活性评价
（1） Westernblot鉴定TF人源化抗体与TF的结合能力
TF抗原（27.4 KD）以12 %的分离胶进行SDS-PAGE电泳，通过转膜和依次加入适当稀释的TF鼠源抗体和TF人源化抗体及AP标记的羊抗人的IgG和羊抗鼠的IgG，孵育1 h，TBST洗膜3次，AP染液染色，结果见图8。
从以上结果证明：应用人源化改造技术，成功将鼠源抗体人源化。同时，与TF鼠源抗体比较，TF人源化抗体与TF的结合高度特异性。
（2） TF人源化抗体相对亲和力的测定
将TF鼠源性抗体和人源化抗体分别用1% BSA稀释成不同浓度(2 ug/L 、5 ug/L、10ug/L、20 ug/L、40 ug/L、80 ug/L、160 ug/L、310 ug/L、630 ug/L、1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L )，用间接ELISA方法检测。即以10 ug/ml浓度包被TF抗原4℃过夜，依次加入不同浓度的抗体（每稀释度设2个复孔，37℃水浴中1 h，PBST洗涤洗3次，每次3 min）及1：1000 HRP标记羊抗鼠IgG或1：10000羊抗人IgG，水浴及洗涤同上，最后，加DAB工作液显色及2 mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪于波长450 nM测定吸光值A。结果以与TF抗原结合出现50 %饱和度时的抗体浓度，即为该株抗体的相对亲和力，结果见图9。
从结果上分析，以曲线趋于平坦时的A450值作为100%，即TF与抗体的结合已达到饱和状态，取曲线上50%饱和度相对应的抗体浓度，即为抗体的相对亲和力。亲和力越大，所需抗体的量越低。TF鼠源抗体和TF人源化抗体的相对亲和力基本相似为0.08 mg/L，实验证明，经过人源化改造的TF抗体与TF的结合能力没有降低。
（3）PT测定TF人源化抗体凝血活性
TF人源化抗体的功能之一就是特异性结合TF，抑制TF活性，阻断凝血途径。PT检测广泛用于测量TF依赖的凝血时间。原理主要是在人血浆中TF与FVIIa复合体，然后复合体激活FX转变成FXa，FXa激活凝血酶原转变成凝血酶，最终形成凝血块。标准的PT检测是脂化TF加入血浆中启动血液凝固，通过血凝仪测定凝血时间。
在PT检测中，将一定量的TF人源化抗体加入血浆中，PT时间延长，此试验有力的证明此人源化抗体能特异性结合抑制TF的活性。
PT检测步骤：
a：配制PT试剂：Hepes测定液:TF脂化样=100:1，并用Hepes测定液将PT试剂稀释成50%、25%、12.5%、6.25%、3.12%不同浓度，测定TF相对活性凝血时间（见表2）。
b：用PBS稀释不同浓度的TF人源抗体（0 nM,3.9 nM,7.8 nM ,15.6 nM,31.2 nM,62.4 nM），在100%TF活性下测定PT。
c：将PT试剂放入37 ℃水浴中，预热10 min后测定。
d：在血凝杯中加入40 ul正常人血浆和10 ul PBS或者不同浓度的TF人源化抗体，放入血凝仪中预热，待仪器预热好后，加入100 ul PT试剂，记录PT结果，结果见表３。
表2： TF相对活性的PT凝血时间
表３：TF抗体浓度对PT凝血时间的影响
从以上结果看，相比TF鼠源抗体，TF人源化抗体在凝血活性上没有差别。同时，TF人源化抗体的浓度为15.6 nM时，抑制TF活性达到94%。
（4）CCK-8测定TF人源化抗体抗肿瘤活性
1）荧光标记抗体鉴定人肿瘤细胞表面抗原组织因子表达
采用荧光标记抗体检测肿瘤细胞：铺板，将肿瘤细胞HCT116、SW620、 BXPC-3、HEK293、HL7702、HT29，分别调整细胞浓度至20000，15000，10000，5000/孔，每个浓度设3个重复孔，96孔板中每孔加入100μL；细胞贴壁后，弃上清加入免疫染色固定液（碧云天P0089）50μL/每孔，室温固定25min。固定后用PBST清洗两次；封闭：每孔加入200μL 的3% BSA，37度封闭60min；荧光标记的抗体孵育：37度孵育90min，1:1000-1:2000稀释TF抗体；PBST清洗；激发光495nm，发射光529nm读数。
实验结果如图10所示，肿瘤细胞SW620、BXPC-3、HCT116细胞表面都有不同程度组织因子表达，而正常细胞HL7702、HEK293表面几乎无组织因子表达，胰腺癌细胞BXPC-3比肠癌细胞SW620的表达量高100倍，胰腺癌细胞BXPC-3细胞表面组织因子表达量最高。
2）利用CCK-8测定人源化组织因子单克隆抗体对肿瘤细胞增殖的影响
培养细胞生长至对数期，调整细胞浓度至5×104个/ml，取100μl细胞液接种到96孔板，铺板， 37℃培养箱中培养，12h后，加入不同浓度人源化组织（0 ug/ml,7.5 ug/ml,15 ug/ml,30 ug/ml,60 ug/ml,120 ug/ml）因子抗体，同样浓度的样本设5个重复。37℃培养箱中培养24h后，每孔加入10ul CCK-8，培养3小时，测定450nm吸光度。
如图11结果所示，人源化组织因子抗体对人正常肝细胞HL7702和人胚肾细胞HEK293的增殖无明显影响，而对组织因子高表达的胰腺癌细胞BXPC-3和肠癌细胞SW620的增殖有明显的抑制作用。人源化组织因子抗体抑制肠癌细胞SW620DE IC50为120μg/ml，对胰腺癌细胞的IC50为60μg/ml。
序列表
<110> 山西省生物研究所；太原博奥特生物技术有限公司
<120> 一种双功能性组织因子人源化抗体及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggtgcagc tgcagcagag cggccccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc cacttcaacg tgtactgggt gaggcagagc 120
cccggcaagg gcctggagtg gatcggctac atcgaccccg acaacggcat caccttctac 180
gacgagaact tcatgggcaa ggccaccctg accgtggaca agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga acagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagggacgtg 300
accaccgccg tggacttctg gggccagggc accaccctga ccgtgagcag cgagttcgcc 360
agcaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420
accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg 480
aacagcggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 540
ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
agctgcgaca agacccacac ctgccccccc tgccccgccc ccgagctgct gggcggcccc 720
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag gacccccgag 780
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagccca gggaggagca gtacaacagc 900
acctacaggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cccgccccca tcgagaagac catcagcaag 1020
gccaagggcc agcccaggga gccccaggtg tacaccctgc cccccagcag ggacgagctg 1080
accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1200
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag caggtggcag 1260
cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320
aagagcctga gcctgagccc cggcaag 1347
<210> 2
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgcc tggccaccca gaccctggac acctggctgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc cccagctgct gatctacgcc gccacctacc tggccgacgg cgtgcccagc 180
aggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagctg gtgtacagca gccccagcac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggagatcaa gaggaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642
<210> 3
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Val Gly Leu Gly Gly Ser Gly Pro Gly Leu Val Leu Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Leu Val Ser Cys Leu Ala Ser Gly Thr Thr Pro Thr His Pro
20 25 30
Ala Val Thr Thr Val Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ala Pro Ala Ala Gly Ile Thr Pro Thr Ala Gly Ala Pro
50 55 60
Met Gly Leu Ala Thr Leu Thr Val Ala Leu Ser Ser Ser Thr Ala Thr
65 70 75 80
Met Gly Leu Ala Ser Leu Thr Ser Gly Ala Ser Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Val Thr Thr Ala Val Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Gly Pro Ala Ser Thr Leu Gly Pro Ser Val Pro
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Leu Ala Thr Pro Pro Gly Pro Val Thr Val Ser Thr
145 150 155 160
Ala Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Pro Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gly Ser Ser Gly Leu Thr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gly Thr Thr Ile Cys Ala Val Ala His Leu Pro
195 200 205
Ser Ala Thr Leu Val Ala Leu Leu Val Gly Pro Leu Ser Cys Ala Leu
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Pro Leu Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ala Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Ala Thr Pro Gly Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Gly Ala
260 265 270
Pro Gly Val Leu Pro Ala Thr Thr Val Ala Gly Val Gly Val His Ala
275 280 285
Ala Leu Thr Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Ala Ser Thr Thr Ala Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gly Ala Thr Leu Ala Gly Leu Gly
305 310 315 320
Thr Leu Cys Leu Val Ser Ala Leu Ala Leu Pro Ala Pro Ile Gly Leu
325 330 335
Thr Ile Ser Leu Ala Leu Gly Gly Pro Ala Gly Pro Gly Val Thr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Ala Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Leu Gly Pro Thr Pro Ser Ala Ile Ala Val Gly Thr Gly
370 375 380
Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ala Ala Thr Leu Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Ser Pro Pro Leu Thr Ser Leu Leu Thr Val Ala Leu
405 410 415
Ser Ala Thr Gly Gly Gly Ala Val Pro Ser Cys Ser Val Met His Gly
420 425 430
Ala Leu His Ala His Thr Thr Gly Leu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Leu
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Ile Gly Met Thr Gly Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Ala Ala Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Thr Gly Thr Leu Ala Thr Thr
20 25 30
Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu Ala Pro Gly Leu Leu Ile
35 40 45
Thr Ala Ala Thr Thr Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Pro Thr Ile Ser Ser Leu Gly Pro
65 70 75 80
Gly Ala Pro Ala Thr Thr Thr Cys Gly Leu Val Thr Ser Ser Pro Ser
85 90 95
Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu Ala Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Pro Ser Thr Pro Gly Gly Ser Ala Gly Gly Leu Leu Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Ala Ala Pro Thr Pro Ala Gly Ala
130 135 140
Leu Val Gly Thr Leu Val Ala Ala Ala Leu Gly Ser Gly Ala Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ser Val Thr Gly Gly Ala Ser Leu Ala Ser Thr Thr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Leu Ala Ala Thr Gly Leu His Leu Val Thr
180 185 190
Ala Cys Gly Val Thr His Gly Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Ser
195 200 205
Pro Ala Ala Gly Gly Cys
210

Claims (5)

1.一种双功能性组织因子人源化抗体，其特征在于：所述双功能性组织因子人源化抗体基因含有1347bp核苷酸组成的重链基因HC，642bp核苷酸组成的轻链基因LC，重链基因HC序列为SEQ ID NO:1，轻链基因LC序列为SEQ ID NO:2。
2.根据权利要求1所述的一种双功能性组织因子人源化抗体，其特征在于：所述重链基因HC编码449个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
3.根据权利要求1所述的一种双功能性组织因子人源化抗体，其特征在于：所述轻链基因LC编码214个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
4.制备权利要求1至3任意一项一种双功能性组织因子人源化抗体的方法，其特征在于：以专利201310181618.8中制备的TF单链抗体表达载体phoA-VH-Linker-VL-His为模板，PCR扩增获得抗体重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL，将其翻译成氨基酸序列，然后将氨基酸序列在NCBI-Blastp数据库中人抗体序列进行比对，选择与可变区VL和VH相似性最高的人抗体序列，作为人源化改造的参考模板，确定需要突变的氨基酸位点，设计人源化改造的基因，完成人源化改造，筛选与TF特异性结合的基因序列，分别构建表达载体；表达载体转至CHO细胞中表达，获得与TF特异性结合的人源化抗体；所得与TF特异性结合的人源化抗体经过抗体亲和力、人源化程度和活性试验的综合评估，最终获得双功能性组织因子人源化抗体。
5.根据权利要求4所述的制备双功能性组织因子人源化抗体的方法，其特征在于：具体制备方法为：
（1）双功能性组织因子的人源化抗体可变区基因克隆：以专利201310181618.8中制备的TF单链抗体原核可溶表达载体phoA-VH-Linker-VL-His为模板，PCR获得VH和VL基因序列，然后克隆到pUC57载体上，构建出pUC57-VH 和pUC57-VL载体，测序鉴定；PCR扩增引物序列如下：
VH-F：5’TCTAGAAAGCTTGCCGCCACCATGGAGATCCAG 3’
VH-R：5’GGATCCGAATTCTTATGAGGAGACTGTGAGA 3’
VL-F：5’ TCTAGAAAGCTTGCCGCCACCATGGACAT 3’
VL-R：5’GGATCCGAATTCTTATTTCAGCTCCAGCTTG 3’
所述VH-F的起始TCTAGAAAGCTT序列和VL-F的起始TCTAGAAAGCTT序列中含有XbaI和HindIII的酶切位点；所述VH-R的起始GGATCCGAATTC序列和VL-R的起始GGATCCGAATTC序列中含有BamHI和EcoRI的酶切位点；（2）TF鼠源抗体的序列分析和人源化改造：获得TF单链抗体重链可变区VH、轻链可变区VL氨基酸序列后，将鼠源抗体VL和VH的氨基酸序列作为探针在NCBI-Blastp工具上进行序列比对，在Genbank上找到与可变区VL和VH相似性最高的人抗体序列，作为人源化FR区改造的参考模板，确定需要突变的氨基酸位点，合成若干人源化抗体序列，将其分别构建表达载体；经过抗体亲和力和活性试验检测，获得人源化改造的氨基酸序列；
其中：VH需要替换的氨基酸如下：FR1区中的氨基酸I 2突变成V，Q19突变成K，T24突变成A，S28突变成T；FR2区中的氨基酸H41突变成P，S44突变成G；FR3区中的氨基酸T77突变成S，F80突变成Y，H82突变成Q，D89突变成E，F95突变成Y；
VL需要替换的氨基酸如下：FR1区中的氨基酸A9突变成S，Q11突变成L，L15突变成V，E17突变成D，S18突变成R；FR2区中的氨基酸S43突变成A；FR3区中的氨基酸K70突变成D，S72突变成T，K74突变成T，A80突变成P，V84突变成A，N85突变成T；FR4区中的氨基酸A100突变成Q，L106突变成I，突变后合成TF人源化抗体重链和轻链序列，然后构建其表达载体；
（3）TF人源化抗体表达载体的构建：TF人源化抗体重链基因即hHC序列合成后，Sal I和Asc I双酶切hHC基因和同样双酶切pinsulator4X-MSA载体进行连接，然后将连接产物pinsulator4X-hHC-dhfr转化至感受态E.coliDH5α中，TF人源化抗体轻链基因即hLC基因序列合成后，NotI和BciI双酶切hLC基因和同样双酶切pCAGGS-IRES-AscI载体进行连接，然后将连接产物pCAGGS-hLC-IRES-AscI转化至感受态E.coli DH5α；氨苄青霉素筛选阳性克隆，酶切鉴定，测序分析；
重组质粒pinsulator4X-hHC-dhfr和pCAGGS-hLC-IRES-AscI鉴定正确后，Sal I和MauBI双酶切pinsulator4X-hHC-dhfr，电泳回收酶切载体片段；Sal I和AscI双酶切pCAGGS-hLC-IRES-AscI，电泳回收插入片段，然后将两个回收片段连接成pinsulator4X-CAG-TFIgG-dhfr表达载体，转入感受态E.coli DH5α中，氨苄青霉素筛选阳性克隆，酶切测序鉴定；
（4）TF人源化抗体的表达及纯化：利用脂质体转染技术将表达载体pinsulator4X-CAG-TFIgG-dhfr导入CHO-dhfr-细胞中，用甲氨蝶呤即MTX加压筛选，获得稳定分泌TF人源化抗体的阳性细胞株；建立了稳定细胞株后，扩大细胞培养，细胞上清液进行重组proteinA亲和纯化和凝胶柱纯化，获得TF人源化抗体；
（5）TF人源化抗体活性的评价：用Western blot和间接ELISA鉴定TF人源化抗体与TF的结合能力；间接ELISA测定TF人源化抗体结合TF的亲和力；凝血酶原时间即PT测定TF人源化抗体抗凝血活性；细胞增殖实验利用CCK-8法检测TF人源化抗体抑制肿瘤细胞生长活性。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003037911A2 (en) * 2001-10-29 2003-05-08 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
CN101928345A (zh) * 2010-06-21 2010-12-29 中国科学技术大学 一种人源化抗体及其人源化改造方法
CN103145834A (zh) * 2013-01-17 2013-06-12 广州泰诺迪生物科技有限公司 一种抗体人源化改造方法
CN103342752A (zh) * 2013-05-16 2013-10-09 太原博奥特生物技术有限公司 一种抗人组织因子单链抗体及其制备方法
CN106255703A (zh) * 2014-02-03 2016-12-21 国立研究开发法人国立癌症研究中心 抗组织因子单克隆抗体

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003037911A2 (en) * 2001-10-29 2003-05-08 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
CN101928345A (zh) * 2010-06-21 2010-12-29 中国科学技术大学 一种人源化抗体及其人源化改造方法
CN103145834A (zh) * 2013-01-17 2013-06-12 广州泰诺迪生物科技有限公司 一种抗体人源化改造方法
CN103342752A (zh) * 2013-05-16 2013-10-09 太原博奥特生物技术有限公司 一种抗人组织因子单链抗体及其制备方法
CN106255703A (zh) * 2014-02-03 2016-12-21 国立研究开发法人国立癌症研究中心 抗组织因子单克隆抗体

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王业荣等: "人源化抗体制备及其应用研究进展", 《生物技术通论》 *

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