CN103342752A - 一种抗人组织因子单链抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种抗人组织因子单链抗体及其制备方法，目的是具有分子量小、对肿瘤组织穿透力强、免疫原性低的特点；该单链抗体采用逆转录聚合酶链式反应技术，从中国专利CN200910227865.0中制备的抗组织因子杂交瘤细胞株出发，扩增获得抗体的轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH，然后用一段连接序列Linker连接而成的单链抗体，其核苷酸序列为SEQIDNO:1；该单链抗体的制备方法：（1）抗人组织因子单链抗体的基因克隆，（2）抗人组织因子单链抗体原核可溶表达载体的构建，（3）抗人组织因子单链抗体在MM294细菌中表达及纯化，（4）抗人组织因子单链抗体的活性鉴定。

Description

一种抗人组织因子单链抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程抗体领域，具体涉及一种抗人组织因子单链抗体的制备及其应用。

背景技术

组织因子(tissue factor, TF)为一个跨膜糖蛋白，是引起凝血反应的起始蛋白质，能激活和启动外源凝血途径，在生理性止血中起着重要作用。近年来的研究发现，组织因子不仅在凝血途径中起着重要作用，在各种恶性肿瘤中也常常异常表达。临床研究表明，多种肿瘤细胞都不同程度地过度表达TF，且TF的表达与肿瘤细胞的转移能力呈高度正相关。TF通过形成TF/VIIa复合物，激活或上调细胞因子IL-8 、CCN1、VEGF 等的表达从而影响肿瘤的侵袭和转移。因此，研究阻断或调节TF活性的途径，特异性地抑制病态组织中的TF，是当前该领域研究的热点。

单克隆抗体具有高效、低毒和靶向性强的特点，在恶性肿瘤的治疗中越来越受到人们的关注。以组织因子作为新的靶蛋白，利用组织因子抗体的靶向性和抗原抗体的特异性，抑制TF活性，阻断细胞信号传导途径，从而减弱肿瘤细胞的生长和转移，是目前探索治疗肿瘤的重要策略之一。已有文献报道，组织因子鼠源性单克隆抗体经动物实验证明，对黑色素瘤、肺癌等有较好的疗效，特别是对造血系统肿瘤如白血病、非霍奇金淋巴瘤等疗效更好。Huang(Science,1997, 275(5229):547-550.)和Versteeg (Mol Med,2004,10(16):6.)等的动物模型研究也证明：TF抗体与TF结合后，可以靶向性抑制肿瘤血管的生成，导致肿瘤坏死。但鼠源单克隆抗体具有较强的免疫原性，容易产生人抗鼠抗体（HAMA）放应而降低疗效；而人源性抗体制备尚存在许多技术障碍，为其临床应用带来了困难。单链抗体（single chain variable fragment, scFv）是将抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽（Linker）重组而成的一种小分子基因工程抗体，它在保持原有抗体良好的抗原结合能力的同时，具有分子量低，穿透力强，体内循环半衰期短以及免疫原性低等优势，可通过特异性结合肿瘤表面的TF应用于癌症治疗。同时单链抗体还可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异性抗体的基础元件。

发明内容

本发明目的是克服上述已有技术的不足，提供一种分子量小、对肿瘤组织穿透力强、免疫原性低的抗人组织因子（TF）单链抗体（scFv）及其制备方法。

本发明是采用逆转录聚合酶链式反应技术，从中国专利CN 200910227865.0中制备的抗组织因子杂交瘤细胞株出发，扩增获得抗体的轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH，然后用一段连接序列Linker连接而成的单链抗体，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

所述的单链抗体基因含有354个核苷酸组成的重链可变区基因VH，其序列为SEQ ID NO:2。所述的抗体重链可变区基因VH编码 118个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

所述的单链抗体基因含有321个核苷酸组成的轻链可变区基因VL，其序列为SEQ ID NO:3。所述的抗体轻链可变区基因VL编码 107个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

本发明抗人组织因子单链抗体的制备方法，其步骤如下：

（1）抗人组织因子单链抗体的基因克隆

利用CN200910227865.0制备的抗人组织因子单克隆抗体杂交瘤细胞株，TRIZOLLS试剂提取细胞总RNA。RT-PCR方法分别以VL-F/VL-R和VH-F/VH-R扩增鼠源抗人组织因子单抗的轻、重链可变区基因片段VL和VH；合成双链Linker，对应的编码核苷酸序列为：GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG。以上步获得的VH、VL 和双链Linker为模板，VH-F、VL-R为引物，扩增VH-Linker-VL 基因片段，并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；

PCR扩增引物序列如下：     

VH-F： GCCATGGCCATGGAGATCCAGCTGCAGCAGTCTG（含NcoI和保护碱基） 

VH-R： TGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGAGAG

VL-F： GGCGGTGGCGGATCGGACATTCAGATGACCCA

VL-R： GGATCCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAG（含BamHI）

Linker-F：CTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGC

GGTGGCGGATCG

Linker-R：TGGGTCATCTGAATGTCCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGA

ACCGCCTCCACC

（2）抗人组织因子单链抗体原核可溶表达载体的构建

选择phoA-6his质粒（由山西省生物研究所保存）作为表达载体，该质粒通过碱性磷酸酶启动子及信号序列将外源蛋白表达至细胞周质间。NcoⅠ和BamHⅠ双酶切phoA-6his质粒和VH-Linker-VL PCR产物用后，连接，转化至E.coli DH5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，酶切鉴定，测序分析；

（3）抗人组织因子单链抗体在MM294细菌中表达及纯化

重组表达载体转化MM294大肠杆菌，LB培养基摇菌后稀释菌至低磷酸盐（0.1mmol/L）诱导培养基中培养；培养24 h后，离心收集菌体。菌体与蛋白提取缓冲液按1：5比例混匀，高压匀浆破碎，低温高速离心，收集上清；采用Ni sepharose^TM 6 Fast Flow亲和层析纯化；纯化样经SDS-PAGE凝胶电泳分析； 

（4）抗人组织因子单链抗体的活性鉴定

以中国专利CN200510012414.7制备的截断型人重组组织因子TF₂₄₃为抗原，利用非竞争ELISA法测定抗TF单链抗体蛋白与TF的结合特异性：选取96孔酶标板， pH9.6碳酸盐缓冲液包被TF₂₄₃，4℃保存过夜后明胶封闭。甩干后依次加入单链抗体蛋白、HRP酶标二抗、邻苯二胺(OPD)，492 nm处酶标仪测定；

本发明抗人组织因子单链抗体可与TF₂₄₃保持高特异性结合，有望作为一种肿瘤治疗的抗体物质。

本发明通过中国专利CN200910227865.0所制备的抗人组织因子单克隆抗体杂交瘤细胞株获得了一个新的抗人组织因子单克隆抗体的VH基因和VL基因，同时利用编码亲水性多肽接头的DNA片段(GGGGS)₃将该单克隆抗体的轻、重链可变区基因连接后，转入phoA载体导入大肠杆菌，实现单链抗体的可溶表达。抗人TF scFv的制备在保持其与抗原TF高特异性结合的基础上，实现了高亲和力、低副作用、强穿透力的改造，具有分子量小、对肿瘤组织穿透力强、免疫原性低的特点。该单链抗体可被作为药物或药物运载工具，利用其对肿瘤的高度特异性结合，实现靶向性和选择性治疗，可特异性结合肿瘤细胞高表达的组织因子，抑制肿瘤的生长和转移，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为提取总RNA电泳图；图中1、2、3分别是三次提取的总RNA样品。

图2为RT-PCR电泳图；图中，Mr为 100 bp DNA marker；1为VH 基因RT-PCR 产物（354bp）；2为VL基因RT-PCR 产物（321bp）。

图3为VH-Linker-VLPCR扩增电泳图；Mr为Tans 2K Plus DNA marker；1为VH-Linker-VL 基因PCR产物（735bp）。

图4为phoA-VH-Linker-VL-His双酶切鉴定；Mr为Tans 2K Plus DNA marker；1为重组质粒经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切。

图5为抗人组织因子单链抗体纯化样电泳图；图中，M为标准蛋白质分子量，1为抗人组织因子单链抗体Ni柱纯化样。

具体实施方式

实施例1：抗人组织因子单链抗体的基因克隆

本发明构建了一种抗人组织因子单链抗体基因，它是采用逆转录聚合酶链式反应技术，从专利CN 200910227865.0制备的抗组织因子杂交瘤细胞株出发，扩增获得抗体的轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH，然后用一段连接序列Linker连接而成的单链抗体，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；该单链抗体基因含有354个核苷酸组成的重链可变区基因，其序列为SEQ ID NO:2；含有321个核苷酸组成的轻链可变区基因，其序列为SEQ ID NO:3。

其制备方法如下：

（1）总RNA的提取及cDNA第一链的合成

选择专利CN200910227865.0制备的抗人组织因子单克隆抗体(anti-TF mouse MAb)杂交瘤细胞株，采用含10% FBS的DMEM常规培养，待细胞对数期生长旺盛时，离心收集细胞约5×10⁶ 个/ml，TRIZOLLS试剂提取细胞总RNA。结果显示总RNA完整未降解（见图1），符合实验要求。参照Promega公司的试剂盒使用说明操作，用Dnase酶处理过的总RNA作为模版，取RNA样品4 μl，以Oligo（dT）合成cDNA第一链，逆转录酶MLV 3 μl，5×RT buffer缓冲液10 μl，dNTP 10 μl，Rnase 2 μl， DEPC水加至50 μl反应体系，经70℃ 10min、0℃ 60min、42℃ 60min反应。

（2）抗人TF单链抗体VH和VL基因克隆

以上步逆转录反应产物cDNA为模板，VH-F、VH-R为引物，扩增重链可变区基因。反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸2 min，反应循环27次，72℃再延伸10 min。同样以cDNA为模板，VL-F、VL- R为引物，扩增重链可变区基因。反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸2 min，反应循环27次，72℃再延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定抗人TF单链抗体VH基因为354bp，而VL基因为321bp（见图2）。

（3）VH、VL的拼接

采用(GGGGS)₃作为Linker连接抗人组织因子scFv重链和轻链，其对应的编码核苷酸序列为：GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG。利用合成引物Linker-F/ Linker-R合成双链Linker，反应体系如下：9 μL 100 μM Linker-F、9 μL 100 μM Linker-R和2 μM 10×Buffer混合均匀，逐渐降温合成Linker。以上步获得的VH、VL 和双链Linker为模板，VH-F、VL-R为引物，扩增VH-Linker-VL 基因片段并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，VH-Linker-VL扩增产物为735bp（见图3）。

各步PCR扩增引物序列如下：     

VH-F： GCCATGGCCATGGAGATCCAGCTGCAGCAGTCTG（含NcoI和保护碱基） 

VH-R： TGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGAGAG

VL-F： GGCGGTGGCGGATCGGACATTCAGATGACCCA

VL-R： GGATCCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAG（含BamHI）

Linker-F：CTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGC

GGTGGCGGATCG

Linker-R：TGGGTCATCTGAATGTCCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGA

ACCGCCTCCACC

实施例2：抗人组织因子单链抗体原核可溶表达载体的构建

利用克隆的抗人组织因子单链抗体基因，连接至原核表达载体phoA质粒（3076bp），构建了重组表达质粒phoA-VH-Linker-VL-His。该重组质粒具有氨苄青霉素抗性，约3811bp，利用碱性磷酸酶启动，含在低磷培养诱导下可分泌表达抗人组织因子单链抗体。

其制备方法如下：

将VH-Linker-VL PCR产物用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳并用凝胶回收试剂盒回收酶切产物。phoA-His 表达载体（本实验室保存）同样经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳，回收大片段。将VH-Linker-VL酶切产物片段，与经同样双酶切的phoA-His质粒于16℃连接反应过夜，构建重组质粒phoA-VH-Linker-VL –His。以重组质粒转化E.coli DH5α，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选单菌落，扩增后小量抽提质粒，并NcoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。结果显示：经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切phoA-VH-Linker-VL –His重组质粒后，获得3076bp的空载和735bp的VH-Linker-VL片段（见图4）。

phoA-VH-Linker-VL-His重组质粒经测序其插入片段VH-Linker-VL基因序列如图 5。

实施例3：抗人组织因子单链抗体在MM294细菌中表达及纯化 

 抗人组织因子单链抗体原核可溶表达载体经转化大肠杆菌、诱导表达和纯化后，可获得含246个氨基酸的抗人组织因子单链抗体蛋白。该蛋白含抗人组织因子单克隆抗体重链可变区编码的118个氨基酸、轻链可变区编码的107个氨基酸、连接Linker编码的15个氨基酸以及6个his标签氨基酸，其分子量约为32KD。

其制备方法如下：

（1）重组工程菌的构建

 表达载体转化于感受态MM294大肠杆菌中，筛选阳性克隆接种于LB培养基中，37 ℃过夜培养。次日收集菌体离心，洗涤后，以5 %的比例分别接种于低磷（0.1mmol/L）培养基（配方：5.0 g/L胰蛋白胨，1.0 g/L酶母提取物，3g/L(NH₄)₂SO_4,，5g/LNaCl_,，1g/LMgSO₄，4 g/L葡萄糖）中培养诱导，24 h后，钼酸盐法测磷含量耗尽。6000r/min离心10 min，收集菌体。

（3）抗人组织因子单链抗体纯化

 收集低磷酸盐诱导培养菌体与蛋白提取缓冲液按1：5比例混匀，800bar高压匀浆破碎，4 ℃、12000rpm高速离心，收集上清并用0.22 μm的过滤器过滤上清。采用Ni sepharose^TM 6 Fast Flow亲和层析纯化抗人TF单链抗体：先用平衡液缓冲液（20 mM Tris、500 mM 氯化钠、20 mM 咪唑pH 7.8）平衡Ni sepharose^TM 6 Fast Flow柱，然后以1 mL/min的流速上样。上样后再用平衡缓冲液洗至基线，然后用洗脱缓冲液（20 mM Tris、500 mM 氯化钠、50 mM 咪唑pH 7.8）洗脱杂蛋白，最后用洗脱缓冲液（20 mM Tris、500 mM 氯化钠、250 mM 咪唑pH 7.8）洗脱目的蛋白峰。最后用500 mmol/L的咪唑洗柱。纯化样经12% SDS-PAGE凝胶电泳分析，其分子量约为32KD（见图 5），与理论值一致。

实施例4：抗人组织因子单链抗体的活性鉴定

制备的抗人组织因子单链抗体是否与组织因子的特异性结合，是其发挥作用的关键。以TF₂₄₃作为包被抗原、以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，利用非竞争ELISA法测定纯化的抗人组织因子单链抗体与组织因子的特异性结合。结果显示其与TF₂₄₃特异性结合，而与其他无关蛋白无作用。

其检测方法如下：

非竞争ELISA法测定抗TF单链抗体蛋白与TF的结合特异性：选取96孔酶标板，以专利CN200510012414.7制备的截断型人重组组织因子TF₂₄₃为抗原， pH9.6碳酸盐缓冲液包被，10μg/孔，100μL /孔。4℃过夜后加3%明胶，200μL/孔，37 ℃封闭1h。甩干后加入不同稀释度的单链抗体蛋白100μL /孔，37 ℃孵育1.5h。PBST清洗后加入酶标二抗（HRP标记）100μL /孔，37 ℃孵育1.5h。最后加底物邻苯二胺(OPD)反应，H₂SO₄终止。492 nm处酶标仪测定。PBS为阴性对照，PBSTB为阳性对照。结果表明：抗人TF单链抗体依然保持对TF抗原的免疫反应性。

Claims (7)

1.一种抗人组织因子单链抗体，其特征是采用逆转录聚合酶链式反应技术，从中国专利CN 200910227865.0中制备的抗组织因子杂交瘤细胞株出发，扩增获得抗体的轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH，然后用一段连接序列Linker连接而成的单链抗体，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.如权利要求1所述的抗人组织因子单链抗体，其特征是所述的单链抗体基因含有354个核苷酸组成的重链可变区基因VH，其序列为SEQ ID NO:2。

3.如权利要求1所述的抗人组织因子单链抗体，其特征是所述的单链抗体基因含有321个核苷酸组成的轻链可变区基因VL，其序列为SEQ ID NO:3。

4.如权利要求1或2所述的抗人组织因子单链抗体，其特征是所述的抗体重链可变区基因VH编码 118个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

5.如权利要求1或3所述的抗人组织因子单链抗体，其特征是所述的抗体轻链可变区基因VL编码 107个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

6.如权利要求1所述一种抗人组织因子单链抗体，其特征是所述的单链抗体与TF₂₄₃保持高特异性结合，作为一种肿瘤治疗的抗体物质。

7.如权利要求1所述抗人组织因子单链抗体的制备方法，其特征是：

（1）抗人组织因子单链抗体的基因克隆

利用CN200910227865.0制备的抗人组织因子单克隆抗体杂交瘤细胞株，TRIZOLLS试剂提取细胞总RNA；RT-PCR方法分别以VL-F/VL-R和VH-F/VH-R扩增鼠源抗人组织因子单抗的轻链可变区VL、重链可变区VH基因片段；合成双链Llinker，对应的编码核苷酸序列为：GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG；以上步获得的VH、VL 和双链Linker为模板，VH-F、VL-R为引物，扩增VH-Linker-VL 基因片段，并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；

PCR扩增引物序列如下：     

VH-F： GCCATGGCCATGGAGATCCAGCTGCAGCAGTCTG（含NcoI和保护碱基） 

VH-R： TGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGAGAG

VL-F： GGCGGTGGCGGATCGGACATTCAGATGACCCA

VL-R： GGATCCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAG（含BamHI）

Linker-F：CTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGC

GGTGGCGGATCG

Linker-R：TGGGTCATCTGAATGTCCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGA

ACCGCCTCCACC

（2）抗人组织因子单链抗体原核可溶表达载体的构建

选择phoA-6his质粒（由山西省生物研究所保存）作为表达载体，该质粒通过碱性磷酸酶启动子及信号序列将外源蛋白表达至细胞周质间；NcoⅠ和BamHⅠ双酶切phoA-6his质粒和VH-Linker-VL PCR产物用后，连接，转化至E.coli DH5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，酶切鉴定，测序分析；

（3）抗人组织因子单链抗体在MM294细菌中表达及纯化 

重组表达载体转化MM294大肠杆菌，LB培养基摇菌后稀释菌至低磷酸盐（0.1mmol/L）诱导培养基中培养；培养24 h后，离心收集菌体；菌体与蛋白提取缓冲液按1：5比例混匀，高压匀浆破碎，低温高速离心，收集上清；采用Ni sepharose^TM 6 Fast Flow亲和层析纯化；纯化样经SDS-PAGE凝胶电泳分析； 

（4）抗人组织因子单链抗体的活性鉴定

以中国专利CN200510012414.7制备的截断型人重组组织因子TF₂₄₃为抗原，利用非竞争ELISA法测定抗组织因子单链抗体蛋白与TF₂₄₃的结合特异性：选取96孔酶标板， pH9.6碳酸盐缓冲液包被TF₂₄₃，4℃保存过夜后明胶封闭；甩干后依次加入单链抗体蛋白、HRP酶标二抗、邻苯二胺(OPD)，492 nm处酶标仪测定。

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