CN103910796A

CN103910796A - 一种全人源抗狂犬病毒的中和抗体

Info

Publication number: CN103910796A
Application number: CN201310007039.1A
Authority: CN
Inventors: 李姝�; 余小玲; 王月明; 廖化新
Original assignee: BEIJING TAINUODI BIOTECHNOLOGY Co Ltd; GUANGZHOU TAINUODI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Changchun BCHT Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2013-01-08
Filing date: 2013-01-08
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2033-01-08
Also published as: CN103910796B

Abstract

本发明公开了一种全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体，该抗体的重链具有如序列表中SEQIDNO1所示的氨基酸序列，抗体的轻链具有如序列表中SEQIDNO5所示的氨基酸序列；该抗体的重链可变区的互补决定区CDR具有如下序列：CDR1:SEQIDNO2；CDR2:SEQIDNO3；以及CDR3:SEQIDNO4；该抗体的轻链可变区的互补决定区CDR具有如下序列：CDR1:SEQIDNO6；CDR2:SEQIDNO7；以及CDR3:SEQIDNO8。本发明的有益效果：本发明提供的抗体特点是全人源，特异性好，亲和力高，中和效果好，价格低廉，可以作为生物工程抗体类药物快速地建立狂犬病毒的免疫保护力，用于在急性感染后的被动免疫治疗；该抗体还可用于制备狂犬病毒检测试剂，发现有效中和抗原表位及开发狂犬病毒重组蛋白及亚单位疫苗。

Description

一种全人源抗狂犬病毒的中和抗体

技术领域

本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种人源的单克隆抗体，尤其涉及一种全人源抗狂犬病毒的中和抗体。

背景技术

狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人畜共患传染病，病死率大于90%。本病广泛分布于世界各地，我国是狂犬病的高发区，居亚洲（亚洲是世界高发区）第二位。

人体一旦被犬或其他携带狂犬病毒的动物咬伤，最有效的方法是尽快使用抗狂犬病毒的中和性抗体或者抗病毒学清，迅速启动被动的免疫保护力，以达到快速清除入侵到体内的狂犬病毒的目的。

已经有动物源或人源的抗病毒血清应用：最早应用的是马源的抗狂犬病毒血清（ERIG）。因为是异源性血清，ERIG的副反应极大，可引起血清病或过敏性休克。现在使用的大部分是人源的抗狂犬病毒免疫球蛋白（HRI），是从接种了狂犬疫苗的正常人血，经浓缩提纯而来，已经有少数几家公司生产，但因为是血液制品，要用免疫的人的血液来进行生产，产量有限，成本极高，价格昂贵，而且与所有的血液制品一样，有传染其他疾病的可能。

相对于多抗血清及提纯的免疫球蛋白来说，单克隆抗体（mAb）具有非常显著的优势，单克隆抗体不存在血液制品的这些缺陷，而且可以高效表达与生产、生产标准化、质量控制容易、成本需求低廉、不存在交叉污染。但鼠源的单克隆抗体如果作为药物应用于人体会引起严重的人抗鼠抗体（HAMA）反应，不能直接应用，必须要进行人源化改造，生产周期长，成功率有限。

目前，开发人源的单克隆抗体主要有噬菌体展示技术，转基因动物，记忆性 B 细胞永生化等技术，其中噬菌体展示技术可以高通量的获得库容量较大的抗体库，且抗体易于纯化，但是得到的抗体往往亲和力不高、治疗效果不好；转基因老鼠方法的明显优势是操作简易、抗体获取方便，缺点是有知识产权以及动物模型的限制，使应用该技术生产的抗体成本高昂；而记忆性 B 细胞永生化方法生产抗体实验程序较为复杂，大多数还处于基础研究阶段，技术手段还没有达到稳定生产的程度。

发明内容

本发明的目的是提供一种全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体，与现有的其他抗狂犬病毒血清或抗体相比具有亲和力高，全人源，无副作用，中和效果好，成本低廉，成分清晰，实现生产标准化，质量控制简单等。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

本发明利用单细胞RT-PCR与抗体筛选平台从注射了狂犬疫苗的正常人血细胞中分离出来的全人源的抗狂犬病毒的中和抗体，并构建了该抗体的表达载体，表达了高纯度的全人源抗体蛋白。

本发明所述的一种全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体，该抗体的重链可变区的互补决定区CDR具有如下序列：CDR1:序列表中SEQ ID NO 2；CDR2:序列表中SEQ ID NO 3；以及CDR3:序列表中SEQ ID NO 4；该抗体的轻链可变区的互补决定区CDR具有如下序列：CDR1:序列表中SEQ ID NO 6；CDR2:序列表中SEQ ID NO 7；以及CDR3:序列表中SEQ ID NO 8。

本发明所述的全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体的重链具有如序列表中SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列，该抗体的轻链具有如序列表中SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列。

本发明还包括对上述抗体的氨基酸序列通过对氨基酸残基的添加、删除、修改形成的包含有本发明所述抗体的CDR区序列并具有相同功能或改造及优化的一切抗体，包括人源与非人源抗体、改造的单链（scFv）抗体；以及含有本发明所述的单个重链CDR区的其他抗体片段或含有本发明所述的单个轻链CDR区的其他抗体片段。

本发明所述的全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体可用于狂犬病预防或治疗药剂中以及狂犬病毒检测试剂中。

本发明的有益效果：本发明提供的全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体特点是全人源，特异性好，亲和力高，中和效果好，无副作用，价格低廉，可以作为生物工程抗体类药物快速地建立狂犬病毒的免疫保护力，用于在急性感染后的被动免疫治疗。此外，该抗体还可用于制备狂犬病毒检测试剂，发现有效中和抗原表位及开发狂犬病毒重组蛋白及亚单位疫苗。

附图说明

下面根据附图对本发明作进一步详细说明。

图1为本发明的实施例的抗体TRN006结合活性测定表；

图2为本发明的实施例的抗体TRN006流式细胞术图表。

具体实施方式

本发明的实施例所述的全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体TRN006的制备过程包括以下步骤：

1．淋巴细胞分离与单个记忆性B细胞分选

从两名注射了狂犬疫苗(狂犬疫苗，诺华批号：1928)，并产生了保护性抗体的志愿者身上采集100ml静脉血于含有肝素的抗凝管中，利用密度离心法分离单个核细胞（PBMC），细胞计数后利用BD FACSria流式细胞仪(BD Biosciences, San Jose, CA)从PBMC分选CD3-，CD14-，CD16-，CD19+，CD27+的单个B细胞到含有RT反应体系的96孔PCR板中，使每个孔含有一个记忆性B细胞，PCR板-80℃冻存备用。

2．用RT-PCR的方法从单个B细胞中分离抗体可变区基因

1)反转录合成cDNA第一条链：将含有单个B细胞的96孔板加入0.5 μM的各亚型重链与轻链的恒定区引物与Superscript III反转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，37℃孵育1小时；2) PCR分离抗体基因：50μl体系中含有5μl的RT反应产物，HotStar Taq Plus酶 (Invitrogen,Carlsbad,CA)，dNTPs，及0.5 μM的各亚型重链与轻链抗体的特异性引物，反应条件：预变性95℃ 5min，然后进行35个PCR循环，每个循环为：95℃×30s，55℃×60s，72℃×90s，最后用72℃延伸7min。PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

3．重组抗体的表达载体的构建

将凝胶电泳鉴定为阳性，且重链与轻链可匹配成对的抗体可变区基因PCR产物利用TA克隆的方法连接到pcDNA3.3载体上(已经改造并含有抗体leader与恒定区)，将连接产物转化DH5α感受态细菌中，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养16小时，随即挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR鉴定，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链或轻链基因的转化子。

4．抗体表达与ELISA筛选

将配对的重链与轻链基因表达载体用PolyFect (Qiagen, Valencia, CA)转染试剂共转染293T细胞，转染后6-8小时换含有2%FCS新鲜培养基，并在37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养72小时。ELISA筛选：以狂犬疫苗为抗原，并用包被液将抗原10倍稀释后包被96孔ELISA板，每孔100μl 4℃过夜包被，用封闭液常温封闭2个小时。将100μl的瞬时转染上清作为一抗常温孵育2个小时，用HRP标记的羊抗人IgG (1:2000稀释) 作为二抗常温孵育1个小时，加入底物显色液100μl /孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸钠中止反应，用450nm/630nm波长进行比色。

5．抗体中和实验

将ELISA筛选到的有结合活性的抗体，用WHO推荐的快速荧光灶抑制实验法(RFFIT)检测抗体与狂犬病毒的中和活性，阳性对照为商业化抗狂犬病毒血清标准品(240 IU/ml)。将系列稀释的抗体及抗病毒血清标准品与100 TCID50狂犬病毒(CVS株)于96孔培养板中混均，37℃孵育1小时，然后加入BSR细胞，放37℃培养24小时，于48小时进行染色观察。PBS洗两次，加入80%丙酮，4℃孵育15min后，PBS洗一次晾干后，每孔加入100μl FITC标记的抗体。37℃孵育1h，PBS洗2次，荧光显微镜蓝色激光激发观察。

6．抗体大量表达与纯化

将中和实验鉴定的有中和活性的编号为TRN006抗体重链与轻链的表达载体共转染生长于175 cm²细胞培养瓶的293T细胞，转染后6-8小时换含有2%FCS新鲜培养基，并在37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养72小时。收集转染上清，4000rpm离心1小时，利用蛋白（Protein） A亲和层析法进行纯化。

衍生抗体片段

由于抗体与抗原分子的结合主要取决于抗体的互补决定区（CDR区），所以经由本发明所描述的抗体除了抗体TRN006外还包括由抗体TRN006的CDR序列衍生出来的其他抗体片段：

1．CDR区移植的人源与非人源抗体片段

CDR移植技术，就指将某一抗体的互补决定区（CDR区）移植到其他抗体的框架区上，以改变该抗体的类型，而保持抗体特异性与亲和力的一种方法，利用该方法可以对抗体进行人源化改造，或其他动物源化改造，或改变抗体的亚型。所以本发明还包括将本发明的抗体CDR区序列移植到其他抗体的框架区所得到的抗体，包括人源与非人源抗体，并具有与TRN006抗体相同功能的抗体片段。

2．抗体恒定区单个点突变或多个点组合突变改造的抗体片段

抗体恒定区尤其是在框架区上的点突变常常用于对抗体特性进行改造，以优化抗体的性能，包括热稳定性与水溶性的进一步提高，优化抗体的FC段以延长其半衰期等。抗体恒定区的改造包括：恒定区包括框架区与FC段的单个点突变或多个点组合突变，所以本发明还包括在抗体TRN006或其CDR移植的抗体片段上利用单点突变或多点组合突变对抗体恒定区进行改造及优化后的抗体片段。

3．CDR区单个点突变或多个点组合突变改造的抗体片段

CDR区是抗体与抗原的特异性结合的区域，但并不是所有的CDR氨基酸都参与同抗原分子表位的特异性结合，所以CDR区有一定的改造空间，对CDR区利用单个点突变或多个点组合突变进行改造，有可能在不影响抗体功能的情况下，进一步对抗体性能进行优化，如进一步提高人源化程度，进一步提高抗体亲和力等。本发明还包括在抗体TRN006抗体或其CDR移植抗体片段上利用单点突变或多点组合突变对CDR区部分氨基酸进行改造与优化后的抗体片段。

4．含有本发明所描述的抗体单个重链或单个轻链CDR区的抗体片段

组成抗体的轻链与重链常常并不都参与同抗原的特异性结合，一些抗体如HIV的中和抗体M36，是由单个重链所组成，其与HIV gp120分子的结合只与重链的三个CDR区有关。对一些抗体进行链置换操作，即将某一抗体的重链或轻链替换成其他抗体相应的片段或者单独表达的重链可变区或轻链可变区，也有可能具有与原来亲本抗体相同的功能，链置换也同样是改造抗体的重要手段。所以本发明还包括含有抗体TRN006，或其CDR移植抗体片段，或其恒定区与CDR区氨基酸改造的抗体的单个重链CDR区或单个轻链CDR区的抗体片段。

5．由本发明所述抗体重链可变区与轻链可变区组成的单链抗体scFv

单链抗体（scFv）是指利用基因重组技术，将抗体的重链可变区与轻链可变区利用一个柔性Linker连接起来并表达的抗体片段，表达的scFv抗体具有与原来抗体相同的功能。由于scFv抗体较小，所以在表达与生产，抗体穿透性能等方面与传统抗体相比具有一定的优势。所以本发明还包括将抗体TRN006，或其CDR移植抗体，或恒定区与CDR区改造的抗体，或含有本发明抗体CDR区的单个重链与单个轻链的一切抗体可变区进行连接，得到的scFv抗体。

实施效果

1.ELISA 测定结合活性

用前文提到的相同的ELISA方法对表达纯化的抗体的结合活性进行检测：以狂犬疫苗为抗原，并用包被液将抗原10倍稀释后包被ELISA 96孔板，每孔100μl 4℃过夜包被，并用封闭液常温封闭2个小时。将起始浓度为100μg/ml TRN006抗体上清稀释10倍后作为一抗进行系列稀释，加一抗常温孵育2个小时，同时用未转染的细胞上清作为阴性抗体对照，用HRP标记的羊抗人IgG (1:2000稀释) 作为二抗常温孵育1个小时，加入底物显色液100μl /孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸钠中止反应，用450nm/630nm波长进行比色，结果如图1所示：把表达纯化的抗体TRN006进行大于50,000倍稀释后(抗体浓度约为：0.0024μg/ml)，TRN006抗体依然可以与抗原有结合。

2.流式细胞术

狂犬病毒G蛋白(rabies virus G protein，RVG)是狂犬病毒的主要保护性抗原，可以刺激机体产生中和抗体，将RVG的基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，用PolyFect (Qiagen，Valencia，CA)转染试剂转染293T细胞，取1×10⁵转染后48-72小时的293T细胞，300×g离心10min，去上清，加入10μl商业化人抗狂犬病毒血清或抗体TRN006，并用表达的其他人源单克隆抗体作为阴性对照，4℃染色孵育45min后用PBS洗两次，然后加入FITC标记的羊抗人IgG抗体，4℃染色孵育30min后PBS洗两次，用BD FACSria流式细胞仪进行分析，结果如图2所示：绿色曲线为细胞本底，(A)为标准品血清，其平均荧光强度（MFI）为210，是阴性对照(B)的20倍左右，而(C)是抗体TRN006的染色结果，其MFI是标准品血清17倍左右，是阴性对照抗体的300倍左右。说明抗体TRN006是狂犬病毒G蛋白特异性的有功能的抗体。

3．中和实验

用前文提到的WHO推荐的快速荧光灶抑制实验法（RFFIT）对表达纯化的抗体的中和病毒活性进行检测，并根据Reed & Muench法计算抗体保护效价(单位为IU/ml)。抗体TRN006 (3.8 mg/ml)其保护效价约为3040 IU/ml说明表达的重组抗体TRN006是高纯度的具有狂犬病毒中和活性的全人源单克隆抗体。

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

序列表

<110>北京泰诺迪生物科技有限公司

<120>全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体

<130>PI121104

<160>8

<210>1

<211>450

<212> PRT

<213>人工序列

<400>1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Thr

20 25 30

Thr Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg His Ser Val Thr Ala Ala Tyr Phe Asn Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Thr Thr Ser Tyr

1 5 10

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr

1 5

<210>4

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Ala Arg His Ser Val Thr Ala Ala Tyr Phe Asn Tyr

1 5 10

<210>5

<211>214

<212> PRT

<213>人工序列

<400>5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

His Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Glu Gly Ile Ser Ser Trp

1 5

<210>7

<211>3

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

Gly Ala Ser

1

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr

1 5

Claims

1.一种全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体，其特征在于：该抗体的重链的可变区具有如序列表中SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列；该抗体的轻链的可变区具有如序列表中SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体，其特征在于：该抗体的重链具有如序列表中SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；该抗体的轻链具有如序列表中SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列。

3.含有权利要求1或2所述的全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体序列的人源与非人源抗体片段或单链抗体（scFv）片段。

4.根据权利要求3所述的抗体片段，其特征在于：所述抗体片段具有单个重链的CDR区。

5.根据权利要求3所述的抗体片段，其特征在于：所述抗体片段具有单个轻链的CDR区。

6.编码权利要求 1-5任一项所述的抗体氨基酸的核苷酸序列。

7.含有权利要求 6 所述的核苷酸序列的 DNA 片段或载体。

8.权利要求1或2所述的全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体在制备狂犬病预防或治疗药剂中的用途。

9.权利要求1或2所述的全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体在制备狂犬病毒检测试剂中的用途。

10.权利要求1或2所述的全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体在发现有效中和抗原表位及开发狂犬病毒重组蛋白及亚单位疫苗中的用途。