CN103275225A - 高亲合力抗cd31/cd146双特异单克隆抗体及其应用 - Google Patents

高亲合力抗cd31/cd146双特异单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体及其应用，将所述CD146的免疫抗原肽的第347位的半胱氨酸替换为亮氨酸，第386位的半胱氨酸替换为赖氨酸，利用所述免疫抗原肽获得高亲和力的抗CD146单克隆抗体；利用所述CD31的免疫抗原肽获得抗CD31单克隆抗体；利用所述抗CD146单克隆抗体的Fab片段基因与所述抗CD31单克隆抗体的Fab片段基因，克隆表达并用多肽链来形成共价结构，形成了所述高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体。本发明与现有的抗CD146抗体相比，具有高特异性和高亲和力的特点，利用该抗体可以与载体偶联后用于捕获血液中的循环内皮细胞，具有显著的高结合效率，可以应用于循环内皮细胞检测系统中。

Description

高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药体外诊断领域，具体涉及一种高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体及其应用。
背景技术
CD31和CD146是循环内皮细胞表面的特异标志物。循环内皮细胞在血液中数量极少，在循环内皮细胞检测时需要高亲合力抗体来捕获，通常是利用抗CD146抗体来进行捕获。事实上抗体的亲合力在捕获过程中起着决定性的作用，但现有的商业上的抗CD146抗体，其特异性和亲和力相对不高，捕获血液中的循环内皮细胞的效率较低。在循环内皮细胞检测计数过程中，达到＞98％以上的捕获效率是决定结果正确性的关键因素。利用现有的市场上可买到的抗体很难到这一要求。如果要研发检测试剂盒，必须要有自主知识产权的高亲和力捕获抗体。另外，如果将两种特异标志物同时识别，能够广泛结合带任何一种或同时两种标志物的细胞，并易于形成免疫反应网络，提高捕获效率。
发明内容
本发明针对目前商业上抗CD146抗体其特异性和亲和力相对不高，捕获血液中的循环内皮细胞的效率较低的问题，本发明公开了一种高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体及其应用，能显著增加捕获效率，可以被应用在循环内皮细胞检测系统中。
为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
一种高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体，所述抗体对CD31和CD146同时具有特异性；
所述CD146的免疫抗原肽第341-390的序列为ERLNLSCSIPGAPPANFTIQ KEDTIVSQTQ DFTKIASKSD SGTYICTAGI；
所述CD31的免疫抗原肽序列为QTVESSGLYTLQSILKA；
将所述CD146的免疫抗原肽的第347位的半胱氨酸替换为亮氨酸，第386位的半胱氨酸替换为赖氨酸，利用所述免疫抗原肽获得高亲和力的抗CD146单克隆抗体；利用所述CD31的免疫抗原肽获得抗CD31单克隆抗体；将所述抗CD146单克隆抗体的Fab片段基因与所述抗CD31单克隆抗体的Fab片段基因克隆，并利用基因工程表达后，应用多肽链将单独的Fv(single chain Fv，scFv)片段结合形成单独的共价结构，制备出所述双特异性单克隆抗体。
进一步的，所述CD146氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，所述CD31氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。
一种高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体用于循环内皮细胞检测系统中的应用，利用所述抗体，可以与载体偶联后用于捕获血液中的循环内皮细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过构建抗CD31/CD146双特异单克隆抗体来作为今后捕获循环内皮细胞的工具。与现有的商业上的抗CD146抗体相比，本发明具有高特异性和高亲和力的特点，利用所述抗体，可以与载体偶联后用于捕获血液中的循环内皮细胞，可以应用于循环内皮细胞检测系统中。
在ELISA生物学实验中看到，该抗体的滴度可达到1∶64000(针对CD146抗原肽)和1∶32000(针对CD31抗原肽)。
ELISA生物学实验对比结果：
抗体 100ng/ml 32ng/ml 10ng/ml 3ng/ml 1ng/ml 0
Kb1228 2.213 1.534 0.795 0.454 0.232 0.037
Abcam EPR3208 1.674 0.745 0.438 0.247 0.077 0.037
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明所述高亲合力双特异单克隆抗体的合成示意图；
图2为在放大100倍下所述高亲合力双特异单克隆抗体在生物学实验中特异地结合血管内皮细胞的显微镜图；
图3为用Kb1228染色后流式细胞仪分析人脐带血内皮细胞表面CD146的表达图；
图4为用Abcam EPR3208染色后流式细胞仪分析人脐带血内皮细胞表面CD146的表达图。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
参见图1所示，一种高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体，所述抗体对CD31和CD146同时具有特异性；
所述CD146的免疫抗原肽第341-390的序列为ERLNLSCSIPGAPPANFTIQ KEDTIVSQTQ DFTKIASKSD SGTYICTAGI；
所述CD31的免疫抗原肽序列为QTVESSGLYTLQSILKA；
将所述CD146的免疫抗原肽的第347位的半胱氨酸替换为亮氨酸，第386位的半胱氨酸替换为赖氨酸，利用所述免疫抗原肽获得高亲和力的抗CD146单克隆抗体；利用所述CD31的免疫抗原肽获得抗CD31单克隆抗体；将所述抗CD146单克隆抗体的Fab片段基因与所述抗CD31单克隆抗体的Fab片段基因克隆，并利用基因工程表达后，应用多肽链将单独的Fv(single chain Fv，scFv)片段结合形成单独的共价结构，制备出所述双特异性单克隆抗体。
进一步的，所述CD146氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，所述CD31氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。
一种高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体用于循环内皮细胞检测系统中的应用，利用所述抗体，可以与载体偶联后用于捕获血液中的循环内皮细胞。
将CD146和CD31的Fab基因克隆并入于用于CHO表达载体pNOW-Ab，对各抗体选择出显示高生产率的克隆。
抗体滴度生物学实验结果：
Figure BSA00000892675900051
参见图2所示，用Kb1228染色人脐带血内皮细胞。免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜所示细胞表面蛋白，DNA用TOP-RO-3染色，放大倍数1000×。从图2中可以看出所述高亲合力双特异单抗在生物学实验中能够特异地结合血管内皮细胞。
参见图3、图4所示，流式细胞仪分析人脐带血内皮细胞表面CD146的表达，细胞用Kb1228和Abcam EPR3208染色(0.1ug/ml)4C，15分钟。结果显示，Kb1288染色效率明显高于Abcam EPR3208。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
Figure ISA00000892676100011
Figure 1

Claims (3)

1.一种高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体，其特征在于：所述抗体对CD31和CD146同时具有特异性；
所述CD146的免疫抗原肽第341-390的序列为ERLNLSCSIPGAPPANFTIQ KEDTIVSQTQ DFTKIASKSD SGTYICTAGI；
所述CD31的免疫抗原肽序列为QTVESSGLYTLQSILKA；
将所述CD146的免疫抗原肽的第347位的半胱氨酸替换为亮氨酸，第386位的半胱氨酸替换为赖氨酸，利用所述免疫抗原肽获得高亲和力的抗CD146单克隆抗体；利用所述CD31的免疫抗原肽获得抗CD31单克隆抗体；将所述抗CD146单克隆抗体的Fab片段基因与所述抗CD31单克隆抗体的Fab片段基因克隆，并利用基因工程表达后，应用多肽链将单独的Fv片段结合形成单独的共价结构，制备出所述双特异性单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体，其特征在于：所述CD146氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，所述CD31氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。
3.一种高亲合力抗CD31/CD146双特异单克隆抗体用于循环内皮细胞检测系统中的应用。
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