CN108456662A

CN108456662A - 针对肝癌相关抗原dlk1为靶点的car-t构建方法

Info

Publication number: CN108456662A
Application number: CN201810042639.4A
Authority: CN
Inventors: 韩泽广; 翟杨杨
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2018-01-16
Filing date: 2018-01-16
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2038-01-16
Also published as: CN108456662B

Abstract

本发明公开了针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR‑T构建方法。本发明选择肝癌相关抗原DLK1的单链抗体重组于T细胞中，经基因工程改造后的T细胞被进一步激活，进而增强T细胞对肝癌细胞的杀伤力；所述DLK1的单链抗体是通过分泌DLK1单克隆抗体的杂交瘤细胞株中获得RNA，并经反转录后得到cDNA；设计重链可变区和轻链可变区的PCR引物；以所述cDNA为模板，进行重链和轻链可变区的扩增和拼接获得的。本发明的检测方法具有相对敏感性和特异性，并能降低T细胞对正常细胞识别带来的副作用。本发明对CAR‑T细胞免疫疗法在肝癌免疫治疗方面提供一定的研究基础。

Description

针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR-T构建方法

技术领域

本发明涉及新兴生物治疗技术领域，尤其涉及针对针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR-T细胞构建方法。

背景技术

原发性肝癌是常见恶性肿瘤之一，大部分为肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)，它在恶性肿瘤的发病率中排名第六，致死率为第三。在我国，肝癌的发病率和死亡率位居癌症中的第二位。因为缺乏早期预防诊疗措施，又因其恶性程度高，进展快，目前，对肝细胞癌的治疗手段主要集中在化学疗法和外科手术切除，疗效也并不明显，特别是对晚期肝癌患者，一般生存期只有几个月。肝癌的发生发展是一个多阶段、多因素累积的作用，以及多个基因参与和突变的结果，其具体病因和发病机制尚未清楚。已知的多种参与原发性肝癌的可能的外因有病毒性肝炎，肝硬化，黄曲霉素，饮用水污染和一些化学致癌物质如亚硝胺类等。另外，机体内部的基因突变，染色体重排，表观遗传修饰等等都参与了肝癌的发生与发展。因此，寻找可能的与肝癌发生发展相关的基因并探索相应的可能的诊疗手段就成为各国医学工作者的共同目标。

随着近数十年，肿瘤免疫治疗的发展，特别是过继免疫疗法CAR-T(chimericantigen receptor T cell)在血液瘤中的应用中表现出令人可喜的治疗效果，特别对复发、难治的B淋巴细胞白血病病人，缓解达到90％以上。但在实体瘤的应用方面，由于缺乏肿瘤特异性抗原和实体瘤本身的肿瘤异质性和肿瘤微环境更为复杂，CAR-T治疗实体瘤方面在临床上尚未取得较好的疗效。

目前针对CD19的两种CAR-T疗法已被美国FDA批准上市，分别是Novartis(诺华)的Kymriah和Kite制药的Yescarta，分别用于治疗难治或复发性急性淋巴细胞白血病和侵袭性非霍奇金淋巴瘤。CAR-T治疗的方法是通过提取人外周血中的T细胞，在体外对TCR进行相关基因工程改造，最后再回输到患者体内，以达到抗肿瘤治疗的目的。在肝癌方面，目前研究最的是针对GPC-3(Glypican3)抗原进行的CAR-T研究。国内也有相关的研究机构正在开展相关进一步的临床研究，但尚没有好的临床数据公布。

本发明选择肝癌相关抗原DLK1(Delta like homolog 1)，它是我们前期发现的肝癌干细胞标志物基因，表达于干细胞的细胞膜。DLK1位于人的第14号染色体，作为印迹基因，参与细胞的生长、分化等相关生命活动。人DLK1蛋白是由383个(小鼠385个，大鼠383个)氨基酸组成的穿膜蛋白，其结构和氨基酸序列与无脊椎动物如果蝇的Delta、Notch、Serrate，线虫的Lin-12和glpl，以及哺乳动物Notch蛋白的对应结构有着高度同源性。DLK1的特点是在细胞膜外区域拥有6串表皮生长因子(EGF)样重复片段和一段信号序列。该重复片段是一段由35～40个氨基酸组成的结构域，拥有6个半胱氨酸的保守间隔。DLK1 N端所连接糖链的大小变化使其分子量分布在45～60kDa之间。FA1(fetal antigen 1)最早从人羊水中分离所得，是一种含有225～262个氨基酸的单链糖蛋白，被认为是DLK1蛋白胞外部分的大片段蛋白酶切水解产物，即其溶解形式。在正常组织中，DLK1蛋白高表达于胚胎时期，随着细胞的成熟与分化，其表达量逐渐减低，依次为肾上腺、卵巢和睾丸组织。在肝癌病人的血清中检测到高表达的DLK1蛋白，并且DLK1蛋白包含膜蛋白和分泌蛋白两种形式。

嵌合抗原受体T细胞可以特异性识别肿瘤细胞表面的抗原，并激活T细胞自身对肿瘤细胞的杀伤能力。联合肿瘤相关抗原的单克隆抗体上重链和轻链可变区序列和T细胞信号激活结构域，CAR-T细胞能够直接识别过表达的肿瘤细胞表面抗原。本发明针对DLK1的细胞外端作为免疫抗原，得到单克隆抗体，并测序后得到单链抗体序列(scFv)，能够特异性识别高表达的DLK1蛋白对应的肝肿瘤细胞，进一步激活的T细胞发挥杀伤肿瘤细胞的作用。因为其他组织中的DLK1表达相对肿瘤组织中低，能够降低因脱靶效应带来的副作用，进一步提高机体的耐受力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR-T细胞构建方法。它可以为肝癌免疫治疗研究及其临床应用提供一定的研究基础。

本发明要解决的技术问题之一是提供能与天然的DLK1或变性的DLK1特异结合的单克隆抗体。

本发明要解决的技术问题之二是提供本发明的DLK1单链抗体的制备方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供本发明的DLK1-CAR载体构建方法。

本发明要解决的技术问题之四是提供用于针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR-T构建方法的慢病毒上清。

本发明要解决的技术问题之五是提供上述慢病毒上清的制备方法：通过将20微克DLK1-CAR载体与慢病毒的包装质粒(pSPAX2为15微克，pMD2.G为5微克)，在30微升转染试剂Lip2000的作用下，转导293T细胞，48小时后收集细胞培养液，经超高速离心得到沉淀，再经RPMI1640培养基(不含血清)重悬后得到。

本发明要解决的技术问题之六是提供上述针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR-T构建方法的DLK1-CAR-T细胞：通过将DLK1-CAR载体病毒上清在促感染试剂polybrene(感染时终浓度为5微克每毫升)的作用下，感染人外周血T淋巴细胞。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

第一方面，本发明涉及一种分泌DLK1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株是通过包含如下步骤的方法制备而得：

S1、选取重组人DLK1蛋白胞外端(24aa-303aa)为免疫原；

S2、动物免疫：通过小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗人DLK1单克隆抗体的小鼠；

S3、挑取分泌高效价的抗人DLK1单克隆抗体的SP2/0和Balb/c小鼠脾脏细胞，在体外与小鼠骨髓瘤细胞融合；

S4、酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞；

S5、阳性杂交瘤细胞经亚克隆鉴定得到稳定分泌抗人DLK1单克隆抗体的杂交瘤单克隆细胞，即所述杂交瘤细胞株。经ELISA、免疫印迹、流式细胞术，免疫组化等多种方法鉴定，证实其所分泌的单克隆抗体能够特异识别并结合人DLK1。

优选的，所述杂交瘤细胞株包括保藏编号分别为CGMCC No.11596或CGMCCNo.11595的SP2/0和Balb/c小鼠脾细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株。

第二方面，本发明涉及一种DLK1单克隆抗体，所述DLK1单克隆抗体由本发明所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

第三方面，本发明涉及一种DLK1单链抗体的制备方法，所述方法包括如下步骤：

A1、从本发明所述的杂交瘤细胞株中获得RNA，并经反转录后得到cDNA；

A2、设计重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的PCR引物；

A3、以所述cDNA为模板，进行重链和轻链可变区的扩增和拼接。

优选的，步骤A1具体为：杂交瘤细胞复苏后采用Trizol提取RNA，经反转录酶的作用下，反转录为cDNA。

优选的，步骤A2中，根据基因框架结构设计合成重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的PCR引物。

优选的，步骤A3具体为：以步骤A1中的cDNA为模板，采用步骤A2中的引物扩增出抗体的重链和轻链可变区基因；重叠延伸PCR方法将接头(linker)拼接到重链和轻链可变区之间，并连接成单链抗体。

第四方面，本发明涉及一种DLK1-CAR载体，将上述的制备方法制得的DLK1单链抗体构建到CAR表达载体上，获得DLK1-CAR载体。

优选的，所述构建具体包括如下步骤：

B1、空载体线性化：CAR载体(pCDH-CAR3-GFP-Puro)经BamH I单酶切后载体线性化；

B2、经无缝克隆的方法，将DLK1单链抗体基因序列插入到CAR表达载体上，并测序验证插入序列是否正确；

第五方面，本发明涉及一种用于针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR-T构建方法中的慢病毒上清，将上述的DLK1-CAR载体与慢病毒的包装质粒pSPAX2和pMD2.G共转染于293T细胞，感染后收集病毒上清，即所述慢病毒上清。

第六方面，本发明涉及一种用于针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR-T构建方法的DLK1 CAR-T细胞，是经过基因工程改造的T细胞，包括胞外抗原识别区，跨膜区和胞内信号激活域；所述胞外抗原识别区为上述制备方法制得的DLK1单链抗体序列，所述跨膜区为CD8α，所述胞内信号激活域为CD28、4-1BB和CD3ζ。

第七方面，本发明涉及一种DLK1 CAR-T细胞的构建方法，将上述的慢病毒上清在促感染试剂polybrene的作用下，感染人外周血T淋巴细胞，构建获得所述DLK1 CAR-T细胞。

第八方面，本发明涉及一种上述的DLK1 CAR-T细胞在制备抗肝癌药物中的用途。

本发明的一种可分泌DLK1单克隆抗体的杂交瘤细胞系代号为29A7D11C8B7-019，分类命名为SP2/0和Balb/c小鼠脾细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2015年11月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.11596，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的另一种可分泌DLK1单克隆抗体的杂交瘤细胞系代号为27B1C2E3G8-020，分类命名为SP2/0和Balb/c小鼠脾细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2015年11月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.11595，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明针对DLK1的细胞外端作为免疫抗原，得到单克隆抗体，并测序后得到单链抗体序列(scFv)，能够特异性识别高表达的DLK1蛋白对应的肝肿瘤细胞，进一步激活的T细胞发挥杀伤肿瘤细胞的作用。因为其他组织中的DLK1表达相对肿瘤组织中低，并且能够降低因细胞因子释放带来的副作用，提高机体的耐受力。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

1、本发明的选择针对肝癌中表达相对较高的抗原DLK1为靶点，经基因工程改造将DLK1单链抗体序列转导到T细胞中，成功构建DLK1 CAR-T细胞，对肝癌细胞有一定的杀伤力，对其他正常细胞损伤影响较小，并且能够降低因T细胞的脱靶效应带来的副作用；

2、本发明的技术优势在于要比现有的针对肝癌其他靶点的CAR-T疗法，提高了DLK1阳性肝癌细胞被T细胞杀伤的灵敏度，对CAR-T在肝癌治疗方面提供更可靠的参考意义。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明实施例1中ELISA法鉴定检测杂交瘤细胞上清液与重组DLK1蛋白结合的标准曲线图；

图2为本发明实施例2中DNA琼脂糖电泳图谱显示的DLK1单链抗体基因；

图3为本发明实施例2中DAN单链抗体的碱基序列；

图4为本发明实施例3中DLK1-CAR载体构建示意图；

图5为本发明实施例4中DLK1 CAR-T细胞对肝癌细胞HepG2杀伤能力的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、稳定分泌抗DLK1单克隆抗体的杂交瘤细胞系的建立与筛选鉴定

步骤1.重组人DLK1蛋白(免疫抗原)的制备

利用PCR技术构建表达载体pcDNA3.1B-DLK1，为了更加方便地应用于基因表达，本实验室将此空载质粒pcDNA3.1B进行人工改造。具体做法是在其序列的5’端删除了BGH序列并加入T7启动子，Xho I、Not I、EcoRV和EcoR I酶切位点，并引入了3个flag标签。从人基因组中扩增得到编码人DLK1分泌区序列(DLK1 soluble region，24-303aa)的基因片断，前边加入kappa信号肽序列，后边加入His 6 tag标签序列，构建插入片段kappa sp-DLK1soluble reg-His 6 tag，经序列测定鉴定正确，用限制性内切酶处理后，将其克隆到表达载体pCPC(KpnI/NotI)(购买获得)中。获得表达质粒pCPC-DLK1-His，转染293-E/CHOE细胞株，筛选出高效表达细胞株。高效表达细胞株经扩增培养，表达分离纯化后，获得纯度95％以上的DLK1-His蛋白。

步骤2、动物免疫：

将上述纯化的重组人DLK1蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射5只Balb/c，5只SJL小鼠(100ul/只，共100ug DLK1蛋白)。首次免疫2-3周后，小鼠再给予皮下多点注射DLK1蛋白与不完全佐剂混合液加强免疫。加强免疫2-3次后，取少量小鼠血清，用包被DLK1蛋白的96-孔酶标板以ELISA法检测小鼠血清中抗DLK1蛋白抗体的效价，效价高者小鼠脾细胞用于下一步的细胞融合。

步骤3、细胞融合：

在DLK1蛋白末次免疫后3天，无菌制备小鼠脾细胞悬液，与S/P 20小鼠骨髓瘤细胞(购自中国科学院上海生命科学院细胞保藏中心)以10：1的比例在50％PEG-1500(美国Sigma公司产品)作用下融合。融合按常规法(Kohler G.and Milstein C：Nature 1975；256：495-497)，PEG用量1ml，1分钟内缓慢加完。反应90秒后，以无血清的RPMI-1640培养基终止反应，1000rpm离心10min，去除上清液，再将离心沉淀下的细胞以含10％HAT(H为次黄嘌呤、A氨基碟呤、T胸腺嘧啶核苷，为Sigma公司产品)的RPMI 1640-10％FCS培养基将细胞浓度调节至1×10⁶个/ml，加入96孔平底细胞培养板(每孔200ul)，于37℃，5％C0₂培养箱中培养2-3周。

步骤4、酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞：

以重组人DLK1蛋白(1μg/ml，pH 7.4，PBS液)包被酶标板，37℃包被2小时或4℃过夜；2％牛血清白蛋白(BSA)封闭，4℃过夜。经PBS-0.1％Tween20液洗涤后加入待检杂交瘤细胞培养上清(以未融合的S/P 20骨髓瘤细培养上清为阴性对照)37℃孵育2小时；经PBS-0.1％Tween20液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠Ig(Sigma公司产品)，37℃孵育1小时；再经PBS-0.1％Tween20液充分洗涤后，加入TMB底物液显色10-15min，以0.1M HCl终止反应。在plus384酶标仪(M.D公司产品)中读取450nm处OD值。测得的OD 450值比阴性对照高5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存。

步骤5、阳性杂交瘤细胞的亚克隆化-有限稀释法

将上述初筛得到的阳性细胞以RPMI-1640-10％FCS培养基稀释至每孔1-10个细胞，铺于96-孔细胞培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养2-3周。待克隆长成，取上清液以ELISA再次检测鉴定抗DLK1抗体的分泌。经检测鉴定，获得多个抗体分泌阳性细胞株。其中，经再次亚克隆鉴定，本实施例获得的多株能稳定分泌抗DLK1单克隆抗体的杂交瘤细胞株包括保藏编号为CGMCC No.11596和CGMCC No.11595的细胞株。图1为以ELISA法鉴定检测杂交瘤细胞上清液与重组DLK1蛋白结合，结果证明该杂交瘤细胞上清液含高效价抗DLK1蛋白的单克隆抗体。该单克隆抗体经鉴定分别为IgG1类。该杂交瘤细胞株再经大量扩增、长期传代培养并冻存。下表1为图1曲线对应的数据。

表1

	牛血清组	BSA组
			r2	0.9855	0.9943
应用范围	0.02-5ng/ml	0.02-5ng/ml

实施例2、DLK1单链抗体的制备

1.提取杂交瘤细胞株RNA，经反转录酶作用反转录成cDNA

复苏杂交瘤细胞株，选用Trizol法提取RNA；定量后取2μg RNA在反转录酶(Takarg反转录试剂盒)的作用下，将RNA反转录成cDNA。

2、以上述为cDNA为模板，重链可变区引物VH Mix和轻链可变区引物VL Mix(扩增引物来自于Novagen公司提供的试剂盒，货号为69831-3)分别在DNApolymerase作用下，扩增出重链和轻链可变区基因；

P1：重链可变区基因序列VH：

CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCTGAGTTGGTGAAACCTGGAGCTTCAATGAAGATATCCTGCGAGGTTTCTGGCTACACCTTCACTGACCATACTCTTCACTGGATGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATATATTTATCCTAAAGATGGTATTACCAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGTCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGTGGTTACTTCGGTAATAGCCCTTTTGCTTACCGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：1)

P2：轻链可变区基因序列VL：

GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC(SEQ ID NO：2)

2.1配制下列反应体系(以50μl为例)

表2

名称	体积(μl)
		VH Mix or VL Mix	45
DNA polymerase	0.3
		cDNA	1
H₂O	3.7

VH Mix：为小鼠抗体重链扩增体系

VL Mix：为小鼠抗体轻链扩增体系

2.2 PCR反应扩增条件

表3

2.3琼脂糖电泳后，回收PCR产物

3.连接重链和轻链可变区基因，形成scFv单链抗体基因。DNA琼脂糖电泳图谱结果如图2所示。

3.1配制下列反应体系(以50μl为例)

表4

名称	体积(μl)
		scFv Mix	45
DNA polymerase	0.3
		VH	2
VL	2
		H₂O	0.7

scFv Mix为单链抗体连接扩增体系

3.2 PCR反应扩增条件

表5

实施例4、DLK1 CAR载体构建和慢病毒上清生产

1.DLK1 CAR载体构建

1.1载体线性化：CAR蛋白表达载体经BamH I单酶切后载体被线性化；

1.2根据同源重组的原理，设计PCR引物，采用无缝克隆的方式将scFv单链抗体基因插入到CAR载体中，构建成DLK1 CAR载体；

PCR引物序列：

P3：DLK1-scFv-F：TCCACGCCGCCAGGCCGGCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCT(SEQ ID NO：3)

P4：DLK1-scFv-R：AGACCGGCACGAAGGATCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGC(SEQ ID NO：4)

1.3经无缝克隆的方法，将DLK1单链抗体序列插入到CAR表达载体上，并测序验证序列是否正确，DLK1-CAR载体插入片段示意图如图3所示，DLK1单链抗体基因序列如图4所示，包括VH重链可变区，Linker连接区和VL轻链可变区。

2.慢病毒上清生产

2.1慢病毒包装，将CAR表达载体和DLK1-CAR载体分别与慢病毒包装质粒pSPAX2和pMD2.G共转染于293T细胞中，感染48小时后收集病毒上清。以10cm直径的细胞培养皿为例，需转染的CAR表达载体或者DLK1-CAR载体各为20微克，pSPAX2为15微克，pMD2.G为5微克，Lip2000为30微升；

2.2慢病毒上清浓缩：上述步骤2.1中获得的病毒上清经超高速离心，28000rpm，4度，离心2小时，沉淀用RPMI1640培养液重悬后，分装成小管，-20度保存，待用；

2.3慢病毒上清滴度检测，采用孔稀释法测定慢病毒滴度

2.3.1测定前一天，传代293T细胞于96孔板中，每孔100微升，细胞数为4乘10的4次方个；

2.3.2第二天，病毒稀释液的配制如下：另取一个96孔板，每孔加入90微升稀释液(DMEM培养液含0.5％胎牛血清和8微克每毫升的Polybrene)；

2.3.3取待测的病毒液10微升加入90微升稀释液，混匀后，加入到上述步骤A2-3-2的第一个孔中，混匀后，取10微升到第二个孔中，后面的孔依次进行同样的操作直到最后一个孔，从第二个孔开始每孔病毒原液量为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4；

2.3.4吸去上述步骤A2-3-1中的细胞孔中90微升培养基，加入步骤A2-3-3中稀释好的病毒溶液，24小时后，每孔补充加入100微升培养基；

2.3.5 4天后观察GFP的荧光表达情况，计算滴度：例如，在病毒稀释液为10^-4的孔中观察到有2个带有GFP的细胞，则病毒滴度为带有荧光细胞数和病毒原液量的比值2/10^-4＝2×10⁴TU/μl，即2×10⁷TU/ml。

实施例5、DLK1 CAR-T细胞对肝癌细胞HepG2杀伤能力的检测。

1.人外周血淋巴细胞分离：Ficoll密度梯度离心法

1.1第一天，取人静脉外周血5毫升各一管，每管分别加入250微升CD4阳性T细胞分离试剂和CD8阳性T细胞分离试剂，室温孵育20分钟；

1.2向每管加入等体积的稀释液(PBS含2％胎牛血清)，混匀后缓慢加入含有Ficoll分离液的离心管中，室温离心，250g，20分钟；离心后吸取血浆与Ficoll分离液之间的白细胞层，向沉淀中加入5倍体积的稀释液(PBS含2％胎牛血清)，室温离心，100g，10分钟；

1.3并重复上述操作一次，所得沉淀用T细胞培养基(RPMI1640培养基含10％胎牛血清和30IU/ml IL-2)重悬，并计数待用。

2.T细胞激活：将上述步骤1得到的CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞，以1：1的比例混合后，加入Dynabeads(CD3/CD28)，激活T细胞。(按照每1×10⁶个细胞数，加入20微升Dynabeads(CD3/CD28))；

3.慢病毒感染活化的T细胞

3.1激活48小时后，去除beads，每孔加入50-100微升病毒上清，补充培养基(RPMI1640培养基含10％胎牛血清和30IU/ml IL-2)并加入促感染试剂polybrene，使其终浓度为5微克每毫升，放入培养箱，培养过夜；

3.2次日换液，吸去一半培养液，丢弃后加入新的培养基(RPMI1640培养基含10％胎牛血清和30IU/ml IL-2)；

3.3继续培养7-10天后，DLK1 CAR-T细胞构建成功，进一步开展相关功能实验(期间每隔两天补充新的培养基)；

4.DLK1 CAR-T细胞对肝癌细胞的杀伤实验

4.1第一天，传代HepG2细胞于96孔板中，每孔100微升，细胞数为1乘10的4次方个；

4.2第二天，将上述的转导后的DLK1 CAR-T细胞(效应细胞)与HepG2(靶细胞)分别以不同的比例2∶1、1∶1和1∶2加入中对应的孔中，体积为100微升，并设置对照组，共同孵育16-20小时后，取上清，检测细胞乳酸脱氢酶的释放程度，结果表明DLK1 CAR-T细胞对肝癌细胞(HepG2)有一定的杀伤能力，如图5所示。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR-T构建方法

<130> DAG35446

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1 重链可变区基因序列VH

<400> 1

caggtccagc tgcagcagtc tggcgctgag ttggtgaaac ctggagcttc aatgaagata 60

tcctgcgagg tttctggcta caccttcact gaccatactc ttcactggat gaaacagagg 120

cctgaacagg gcctggaatg gattggatat atttatccta aagatggtat taccaagtac 180

aatgagaagt tcaaggtcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagtggttac 300

ttcggtaata gcccttttgc ttaccggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357

<210> 2

<211> 330

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P2 轻链可变区基因序列VL

<400> 2

gacattgagc tcacccagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300

tcggaggggg caccaagctg gaaatcaaac 330

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P3 DLK1-scFv-F

<400> 3

tccacgccgc caggccggca ggtccagctg cagcagtct 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P4 DLK1-scFv-R

<400> 4

agaccggcac gaaggatcgt ttgatttcca gcttggtgc 39

Claims

1.一种分泌DLK1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株是通过包含如下步骤的方法制备而得：

S1、选取重组人DLK1蛋白胞外端为免疫原；

S4、酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞；

S5、阳性杂交瘤细胞经亚克隆鉴定得到稳定分泌抗人DLK1单克隆抗体的杂交瘤单克隆细胞，即所述杂交瘤细胞株。

2.一种DLK1单克隆抗体，其特征在于，所述DLK1单克隆抗体由如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

3.一种DLK1单链抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A1、从如权利要求1所述的杂交瘤细胞株中获得RNA，并经反转录后得到cDNA；

A2、设计重链可变区和轻链可变区的PCR引物；

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤A3具体为：以步骤A1中的cDNA为模板，采用步骤A2中的引物扩增出抗体的重链和轻链可变区基因；重叠延伸PCR方法将接头拼接到重链和轻链可变区之间，并连接成单链抗体。

5.一种DLK1-CAR载体，其特征在于，将如权利要求3所述的制备方法制得的DLK1单链抗体构建到CAR表达载体上，获得DLK1-CAR载体。

6.如权利要求5所述的DLK1-CAR载体，其特征在于，所述构建具体包括如下步骤：

B1、空载体线性化：CAR载体经BamH I单酶切后载体线性化；

B2、经无缝克隆的方法，将DLK1单链抗体基因序列插入到CAR表达载体上，并测序验证插入序列是否正确。

7.一种用于针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR-T构建方法中的慢病毒上清，其特征在于，将如权利要求5或6所述的DLK1-CAR载体与慢病毒的包装质粒pSPAX2和pMD2.G共转染于293T细胞，感染后收集病毒上清，即所述慢病毒上清。

8.一种用于针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR-T构建方法的DLK1 CAR-T细胞，是经过基因工程改造的T细胞，其特征在于，包括胞外抗原识别区，跨膜区和胞内信号激活域；所述胞外抗原识别区为如权利要求3所述制备方法制得的DLK1单链抗体序列，所述跨膜区为CD8α，所述胞内信号激活域为CD28、4-1BB和CD3ζ。

9.一种DLK1 CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，将如权利要求7所述的慢病毒上清在促感染试剂polybrene的作用下，感染人外周血T淋巴细胞，构建获得所述DLK1 CAR-T细胞。

10.一种如权利要求8或9所述的DLK1 CAR-T细胞在制备抗肝癌药物中的用途。