TW201609814A - 新穎之抗ａｄａｍ１７抗體及其用於癌症治療的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關於能夠結合至ADAM17之新穎的抗體，以及還有編碼該抗體之胺基酸和核酸序列。由一個態樣，本發明係有關於新穎的抗體或抗原結合片段，其能結合至ADAM17且具有抗腫瘤活性。本發明亦包含該抗體作為治療癌症的藥物之用途。最後，本發明包含組成物，其含有該抗體，單獨或組合或是結合其他的抗癌化合物，以及其等用於治療癌症之用途。

Description

新穎之抗ADAM17抗體及其用於癌症治療的用途 發明領域
本發明係有關於能夠結合至ADAM17之新穎的抗體，還有編碼該抗體之胺基酸和核酸序列。由一個態樣，本發明係有關於一種新穎的抗體或抗原結合片段，其能結合至ADAM17且具有抗腫瘤活性。本發明亦包含該抗體作為治療癌症的藥物之用途。最後，本發明包含組成物，其含有該抗體，單獨或組合或是結合其他的抗癌化合物，以及其等用於治療癌症之用途。
發明背景
ADAM17(一種含去整合素及金屬蛋白酶領域的蛋白質17(disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17))亦稱為似蛇毒蛋白酶(Snake venom-like protease)、TNF-α轉化酶(TACE)及CD156b，為一種膜結合的金屬蛋白酶，負責一些病理學上重要的物質之細胞外斷裂(胞外領域脫落(ectodomain shedding))。起初鑑識為負責膜結合的前-TNF-α(pro-TNF-α)釋出可溶性蛋白質之斷裂作用的酶(Black R.A.等人，1997(Nature.1997； 385(6618)：729-33)，Moss M.L.等人，1997(Nature.1997；385(6618)：733-6))，ADAM17現在業已於許多膜結合的前驅物蛋白質之胞外領域脫落(ectodomain shedding)方面被描述(Black R.A.等人，1997(Nature.1997；385(6618)：729-33)，Moss M.L.等人，1997(Nature.1997；385(6618)：733-6))。透過ADAM17之胞外領域脫落(ectodomain shedding)會從細胞膜釋放大量的可溶性細胞介素(cytokines)及生長因子，例如：雙調蛋白(Amphiregulin)、肝素結合-類似EGF生長因子(Heparin binding-EGF like growth factor)(HB-EGF)、轉形生長因子α(TGF-α)、表皮調節素(epiregulin)、表皮細胞分裂原(epigen)以及神經調節蛋白(neuregulins)(Arribas J.等人，(Curr Pharm Des.2009；15(20)：2319-35.))。ADAM17亦媒介許多受體之脫落包括；IL-6Rα、IL-1RII、Her4、c-Kit、Notch、Mer、TNF-α RI & II(Arribas,2009)，該處之生理效果可因為受體脫落，或是可溶性配位體陷獲，或是受體轉活化(transactivation)造成的訊息靜默(signal silencing)，如同IL-6Rα及gp130所述(Chalaris A.等人，2011(Eur J Cell Biol.2011；90(6-7)：484-94.))。ADAM17能主動地參與細胞外基質之重塑及細胞-細胞接觸，因為大量的黏著分子和細胞外微環境之成分脫落，例如：L-選滯蛋白(L-selectin)、ICAM-1、VCAM-1、Nectin-4、CD44以及膠原蛋白XVII。ADAM17較不瞭解的活動包括細胞普里昂蛋白質(prion protein)和澱粉樣蛋白之前驅蛋白質之胞外領域脫落。
為免生疑問，於沒有任何載明的情況下，措辭 ADAM17係指序列序列辨識編號29之人類ADAM17。
結構上，ADAM17係由824個胺基酸蛋白所組成，其包含一個前原蛋白領域(preproprotein domain)(aa 1-214)、一個細胞外領域(aa 215-671)、一個跨膜領域(aa 672-692)以及一個細胞質領域(aa 693-824)。
更特別地，細胞外領域由以下組成：序列序列辨識編號30之金屬蛋白酶(MP)領域(對應於ADAM17之aa 215-474)、序列序列辨識編號31之去整合素(DI)領域(對應於ADAM17之aa 475-563)以及序列序列辨識編號32之膜近側(MPD)領域(對應於ADAM17之aa 564-671)。
ADAM17業已被描述為技術上不容易產生拮抗抗體的標的，更確切而言，業已描述複雜的選擇策略，其需要選擇及最佳化特定的黏結物，以產生所欲的特徵。到目前為止，只有描述一個此種特定的拮抗物：抗體D1(A12)因為同時富含去整合素-半胱胺酸(disintegrin-cysteine rich)領域及催化領域，而能夠結合至ADAM17。D1(A12)之拮抗活性係取決於富含去整合素-半胱胺酸領域及催化領域二者之結合，來展現其之拮抗活性。
發明概要
本發明打算要補救有關於標定(targeting)ADAM17且具有有效的抗腫瘤活性之抗體的不足。
於第一個態樣中，本發明係有關於一種抗體或其抗原結合片段，其能夠結合ADAM17。
於一特定態樣中，與先前技藝所述之抗體相反，本文所述之抗體能夠經由一個單一領域來結合ADAM17。換言之，依據本發明的抗體能夠結合單一抗原決定位，反之先前技藝之抗體係與由二個不同分開的領域，富含去整合素-半胱胺酸(disintegrin-cysteine rich)領域及催化領域，所構成的構形抗原決定位結合。
此性質為特別感興趣的，因抗體的結合作用不是仰賴ADAM17之特定構形，根據病人的本質、待治療病況的本質、病人的一般狀況等等(dependant to a particular conformation of ADAM17 according to the nature of the patient,the nature of the condition to be treated,the general state of the patient,etc...)。
於一具體例中，描述一種單株抗體或其抗原結合片段，其結合ADAM17抗原決定位且其抑制ADAM17的至少一個受質之脫落(shedding)，其中該(the said)ADAM17抗原決定位係由一個單一抗原決定位所構成，其被含括於序列序列辨識編號32的膜近側領域(membrane proximal domain)(MPD)之內。
於一具體例中，描述一種單株抗體或其抗原結合片段，其結合ADAM17抗原決定位且其抑制ADAM17的至少一個受質之脫落(shedding)，其中該(the said)ADAM17抗原決定位係由一個抗原決定位所構成，其被含括於序列序列辨識編號32的膜近側領域)(MPD)之內。
一種會結合ADAM17之MPD的抗體可以透過熟 悉此藝者熟知的一些技術來獲得，包括但不限於免疫作用及融合瘤產生、單株B細胞選擇、噬菌體顯示、核糖體顯示、酵母菌顯示、表現的免疫反應定序偶合定標的(targeted)基因合成。可以用ADAM17蛋白或選擇的子領域(sub domain)作為標的抗原來執行各個方法。熟悉此藝者能從結合ADAM17細胞外領域，或者尤其是MPD之抗體族群中，選擇出MPD的結合抗體。隨後的選擇及特徵化也可以代表MPD結合作用之選擇步驟，藉此ADAM17細胞外領域之所有的黏結物，均被選擇性地篩選MPD或選擇的MPD子領域之結合作用。任擇地，所有的選擇步驟可以針對MPD或選擇的MPD子領域來執行，以及結合至天然的ADAM17細胞外領域被使用作為隨後的選擇及特徵化步驟。
依據一特定具體例，該抗體或其之抗原結合片段，係特徵在於其係由一單株抗體所構成。
了解到“單株抗體”意指由密切同源的抗體族群所產生的一抗體。更特別地，除了一些可能天然存在的突變之外，一族群之個別的抗體為同一的，該等天然存在的突變可以以最小比例找到。換言之，一單株抗體係由一單一細胞純株(舉例而言一融合瘤、用編碼該同源的抗體之DNA分子予以轉染的一真核宿主細胞、用編碼該同源的抗體之DNA分子予以轉染的一原核宿主細胞，等等)之生長所產生的一同源的抗體所構成的以及一般係特徵在於一類且只有一類且次分類之重鏈，以及只有一型的輕鏈。單株抗體為高度專一的以及係針對一單一的抗原。
按“結合(binding)”、“結合(binds)”，或類似物，意思是該抗體或其之抗原結合片段，於生理條件下形成一個相對穩定的複合物。判定是否二個分子結合的方法為本技藝熟知的，以及包括舉例而言，平衡透析、表面電漿子共振，及類似物。為免生疑問，此不表示該抗體或其之抗原結合片段於低位準不與另一個抗原結合。作為一個較佳具體例，該抗體或其之抗原結合片段結合其之抗原的親和性，為其結合非專一性分子(BSA、酪蛋白，等等)的親和性之至少二倍。然而，作為另一個較佳具體例，該抗體或其之抗原結合片段僅與該抗原結合。
如同已提及的，膜近側領域(MPD)係由(序列序列辨識編號29的)人類ADAM17之胺基酸領域564-671所構成。於此也提到鼠類ADAM17之對應的MPD亦由胺基酸564-671組成。
依據一特定態樣，本文所述之抗體不會與金屬蛋白酶(MP)領域結合，該MP領域係由序列序列辨識編號29之胺基酸215-474組成。
依據一特定態樣，本文所述之抗體不會與整合素(DI)領域結合，該DI領域係由序列序列辨識編號29之胺基酸475-563組成。
此態樣是令人驚異的，因從未描述、暗示過一種已知為負責脫落活性之拮抗物，及尤其是一種抗體，能夠減少或抑制ADAM17受質的脫落，而不干擾ADAM17的催化領域。換言之，本文所述之抗體能夠於特定病理背景中， 選擇性地減少或抑制ADAM17關於至少一種受質的酵素活性，該病理為癌症。本文所述之抗體的優點可以信賴以下的事實，其似乎不會抑制ADAM17整體的催化活性，因其不會結合催化領域，但是能夠減少或抑制ADAM17對於其受質之全體或部分的酵素活性。
於一具體例中，本申請案所述之抗體係以500pM或更小的IC50，優先為200pM或是更小的IC50，以及更優先為100pM或是更小的IC50，抑制ADAM17的至少一個受質之脫落。
於本發明的上下文內，用詞“IC50”係指劑量反應評估中抗體的濃度，其必須達到最大可達到的抑制作用之一半。進行此IC50的評估可以透過從細胞評估受質脫落，或是用重組型蛋白進行的螢光共振能量轉移(FRET)胜肽斷裂分析法(peptide cleavage assay)。
於一較佳的態樣中，依據本發明的抗體能夠抑制TNF-α(腫瘤壞死因子α)的脫落，以及更佳為具有500pM或更小的IC50，優先為200pM或更小的IC50，以及更優先為100pM或更小的IC50。
於一較佳的態樣中，依據本發明的抗體能夠抑制TGF-α(轉形生長因子α)的脫落，以及更佳為具有500pM或更小的(les)IC50，優先為200pM或更小的IC50，以及更優先為100pM或更小的IC50。
於一較佳的態樣中，依據本發明的抗體能夠抑制雙調蛋白(AREG)的脫落，以及更佳為具有500pM或更小的 IC50，優先為200pM或更小的IC50，以及更優先為100pM或更小的IC50。
於一較佳的態樣中，依據本發明的抗體能夠抑制HB-EGF(肝素-結合類似EGF生長因子)的脫落，以及更佳為具有500pM或更小的(les)IC50，優先為200pM或更小的IC50，以及更優先為100pM或更小的IC50。
於一具體例中，本發明的抗體係特徵在於其抑制選自於下列之ADAM17的至少一個受質之脫落：TNF-α、TGF-α、AREG以及HB-EGF。
於一具體例中，本發明的抗體係特徵在於其係以至少500pM或更小的IC50，優先為200pM或更小的IC50，以及更優先為100pM或更小的IC50，抑制選自於下列之ADAM17的至少一個受質之脫落：TNF-α、TGF-α、AREG以及HB-EGF。
於一具體例中，本發明的抗體係特徵在於其係以至少500pM或更小的IC50，優先為200pM或更小的IC50，以及更優先為100pM或更小的IC50，抑制TNF-α、TGF-α、AREG以及HB-EGF之脫落。
依據另一個態樣，該抗體係特徵在於其係以表面電漿子共振(SPR)判定為大約10nM或更小的Kd，優先為大約5nM或更小的Kd，結合ADAM17抗原決定位。
在另一個具體例中，該抗體係特徵在於其係以表面電漿子共振(SPR)判定為大約10nM或更小的Kd，優先為大約5nM或更小的Kd，以及更優先為大約2nM或更小的Kd， 結合ADAM17抗原決定位。
“Kd”亦稱為“Kd”或“KD”，係指一特定的抗體-抗原複合物之解離常數。Kd=Koff/Kon以及Koff係由抗體從抗體-抗原複合物解離的離開速率常數所構成，且Kon係由抗體結合抗原的位準所構成(Chen Y.等人，1999，J.Mol.Biol.1999；293(4)：865-81)。
於此必須了解到本發明不是關於天然的形式之抗體，亦即其等不是處於其之天然環境，但是是藉由從天然的來源純化所單離或獲得的，或是藉由基因重組或化學合成所獲得的，以及因而其等可以含有如同本文會說明的非天然的胺基酸。
本發明之具體例為一種抗體或其之抗原結合片段，結合至ADAM17之抗原決定位且包含六個CDRs(互補性決定區域)，其中六個CDRs中的至少一個，優先為至少二個，優先為至少三個，優先為至少四個，以及更優先為至少五個係選自於包含序列辨識編號1至6的胺基酸序列之CDRs，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號1至6有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之任何序列。
於本發明另一個具體例中，該抗體、或其之抗原結合片段，包含序列序列辨識編號1至6的六個CDRs，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號1至6有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之任何序列。
於另一個具體例中，本發明係有關於一種單株抗體或其之抗原結合片段，其結合至ADAM17之抗原決定位， 該抗體包含：-一重鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號1、2及3之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；以及-一輕鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號4、5及6之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
於本發明的一個具體例中，該CDR-H1包含序列辨識編號1之序列，其中稱為X1之殘基係選自於極性胺基酸。極性胺基酸優先選自於天冬醯胺酸(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、麩醯胺酸(Gln或Q)、絲胺酸(Ser或S)、麩胺酸(Glu或E)、精胺酸(Arg或R)、離胺酸(Lys或K)、組胺酸(His或H)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)或是酥胺酸(Thr或T)。
於另一個較佳具體例中，殘基X1係選自於小尺寸的極性胺基酸。小尺寸的極性胺基酸優先選自於天冬醯胺酸(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、絲胺酸(Ser或S)或是酥胺酸(Thr或T)。
於另一個較佳具體例中，殘基X1係天冬醯胺酸(Asn或N)。
本申請案之抗體主體係特徵在於CDR-H1為含有序列辨識編號7之胺基酸序列。
於另一個較佳具體例中，殘基X1係天冬胺酸(Asp或D)。
本申請案之抗體主體係特徵在於CDR-H1為含有序列辨識編號8之胺基酸序列。
按措辭抗體的“抗原結合片段”，想要表示任何的 胜肽、多肽或是蛋白，其保留該抗體結合至標的(通常也稱為抗原)的能力，一般而言為相同的抗原決定位，以及包含該抗體的胺基酸序列之至少5個鄰接的胺基酸殘基、至少10個鄰接的胺基酸殘基、至少15個鄰接的胺基酸殘基、至少20個鄰接的胺基酸殘基、至少25個鄰接的胺基酸殘基、至少40個鄰接的胺基酸殘基、至少50個鄰接的胺基酸殘基、至少60個鄰接的胺基酸殘基(amino residues)、至少70個鄰接的胺基酸殘基、至少80個鄰接的胺基酸殘基、至少90個鄰接的胺基酸殘基、至少100個鄰接的胺基酸殘基、至少125個鄰接的胺基酸殘基、至少150個鄰接的胺基酸殘基、至少175個鄰接的胺基酸殘基，或是至少200個鄰接的胺基酸殘基。
於一個較佳具體例中，該抗原結合片段包含該抗體所衍生之至少一個CDR。於再一個較佳具體例中，該抗原結合片段包含該抗體所衍生之2、3、4或5個CDRs，更佳為6個CDRs。
“抗原結合片段”可以選自於，但不限於，以下所構成的群組：Fv、scFv(sc代表單鏈)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或雙價抗體(diabodies)，或是帶有無序胜肽(disordered peptides)例如XTEN(延伸的重組型多肽)或PAS模體(motifs)之融合蛋白，或是藉由化學修飾來增加半生期之任何片段，例如添加聚(亞烷基)二醇(poly(alkylene)glycol)，例如聚(乙二醇)(“聚乙二醇化”)(聚乙二醇化片段稱為Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG) (“PEG”代表聚(乙二醇))，或是藉由併入脂質體來增加半生期之任何片段，該等片段擁有如本發明的抗體之至少一個特徵CDRs。較佳地，該等“抗原結合片段”會由衍生出該等抗原結合片段之抗體可變異重鏈或輕鏈之部份序列構成，或是包含衍生出該等“抗原結合片段之抗體可變異重鏈或輕鏈之部份序列，該部份序列足以保留如同該部份序列起源的抗體相同的結合專一性以及足夠的標的親和性，較佳為該部份序列起源的抗體之抗體標的親和性之至少等於1/100，更佳為至少1/10。
術語"抗原決定位(epitope)"係提及與一抗體結合的一抗原區域。抗原決定位可以定義為結構性的或功能性的。功能性的抗原決定位通常為結構性的抗原決定位的子集，以及具有直接促成交互作用親和性之該等殘基。抗原決定位亦可以為構形的。於某些具體例中，抗原決定位可以包含決定子(determinants)，決定子為分子的化學活性表面聚集，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基基團，或是磺醯基基團，以及於某些具體例中，可以具有三維結構的特徵，及/或特定的電荷特徵。
為免生疑問，措辭“單一抗原決定位”不一定是指線型的抗原決定位。
為免生疑問，於本文中沒有任何相反的表示的情況下，措辭CDRs意指由IMGT所定義之抗體的重鏈和輕鏈之高度可變異區域。
該IMGT獨特成員已經定義，經由比較抗體受體、 鏈種類，或其他物種之變化區域而得已經定義出IMGT獨特的編號來比較可變異領域，不論為抗原受體、鏈類型，或是物種[Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.以及Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)]。於IMGT獨特的編號方面，恆定性胺基酸總是具有相同的位置，譬如，半胱胺酸23(1st-CYS)、色胺酸41(CONSERVED-TRP)、疏水性胺基酸89、半胱胺酸104(2nd-CYS)、苯丙胺酸或色胺酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT獨特的編號提供了框架區域(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)以及互補決定區：CDR1-IMGT：27至38、CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117，的標準化劃界。因間隙表示未被佔用的位置，所以CDR-IMGT的長度(顯示於括號之間且由點分開，例如[8.8.13])變成決定性的資訊。IMGT獨特的編號係使用於2D圖形表示法中，稱為IMGT Colliers de Perles[Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.以及Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)]，以及使用於IMGT/3D結構-DB之3D結構中[Kaas,Q.,Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]。
存在三個重鏈CDR與三個輕鏈CDR。此處，依據 狀況，術語CDR或CDRs用來指示，含括負責該抗體辨識的抗原或抗原決定位的抗體之結合親和性的多數胺基酸殘基，之該等區域的一個或更多個，或者甚至是該等區域的全部。
依據本發明之抗體、或其之抗原結合片段亦可以描述為包含：i)一個含有CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之重鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號1、2及3，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號1、2及3有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列；以及ii)一個含有CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之輕鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號4、5及6，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號4、5及6有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列。
於本發明的意義來說，介於核酸或胺基酸的2個序列之間的“百分比同一性(percentage identity)”或“%同一性(% identity)”意指介於待比較的2個序列之間，在最佳的排列後所獲得的同一核苷酸或胺基酸殘基之百分比，此百分比僅僅為統計上的百分比以及介於2個序列之間的差異係沿著其等的長度隨機分佈。2個核酸或胺基酸序列的比較，傳統上係藉由在最佳排列該等序列之後比較其等來進行，該比較能按節段或係藉由使用“排列視窗”予以實施。用於比較的序列之最佳排列除了可以手工比較來進行之外，還可以透過Smith和Waterman之局部同源性演算法(1981)[Ad.App.Math.2：482]，透過Neddleman和Wunsch之局部同源性 演算法(1970)[J.Mol.Biol.48：443]，透過Pearson和Lipman之相似性搜索的方法(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444]或是透過使用此等演算法的電腦軟體(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI之GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA，或是藉著比較軟體BLAST NR或BLAST P)來進行。
介於2個核酸或胺基酸序列之間的百分比同一性係藉由比較2個最佳排列的序列來決定，其中要比較的核酸或胺基酸序列與2個序列間的最佳排列之參考序列比較之下，可能有加入或刪失。百分比同一性係藉由以下方式來計算：決定在2個序列之間，較佳在2個完整的序列之間，胺基酸、核苷酸或殘基為同一的位置之數量，將同一的位置之數量除以排列視窗內總位置之數量，以及將結果乘上100來獲得2個序列之間的百分比同一性。
舉例而言，可以使用於網址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上可得到的BLAST程式，“BLAST 2序列”(Tatusova等人，“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol.,1999,Lett.174：247-250)，加上預設參數(尤其關於參數“開放空格罰分”：5，以及“擴展空格罰分”：2；經選擇的矩陣為，舉例而言由該程式提議的“BLOSUM 62”矩陣)；介於要比較之2個序列之間的百分比同一性係直接地由該程式來計算。
關於與參考胺基酸序列展現出至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%同一性之胺基酸序列，較佳的實例包括含括參考序列，某些修飾，尤其至少一個胺基酸的刪失、加入或取代，截斷或延伸，的該等胺基酸序列。於一個或更多個連續胺基酸或非連續胺基酸取代的事例中，較佳的取代為經取代的胺基酸係以“均等的”胺基酸來代替。此處，措辭“均等的胺基酸”係意欲表示，很可能代替結構性胺基酸的一者，然而，卻不會修改對應的抗體之生物活性以及在以下所界定之該等特定實例之生物活性，之任何胺基酸。
均等的胺基酸可以憑著其等與其等要取代之胺基酸之結構同源性來決定，或是憑著很可能要產生的各種各樣的抗體之間的生物活性之比較測試的結果來判定。
作為一非限制性實例，以下的表1係總結很可能進行，但不導致對應的經修飾的抗原結合蛋白之生物活性有顯著修飾之可能的取代；於相同的條件下反向取代當然為可能的。
依據本發明之抗體或其之抗原結合片段亦可以描述為包含：i)一個含有CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之重鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號7、2及3，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號7、2及3有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列；以及ii)一個含有CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之輕鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號4、5及6，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號4、5及6有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列。
依據本發明之抗體或其之抗原結合片段亦可以描述為包含：i)一個含有CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之重鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號8、2及3，或是在 最佳的排列後與序列序列辨識編號8、2及3有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列；以及ii)一個含有CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之輕鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號4、5及6，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號4、5及6有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列。
依據再另一個具體例，本發明之抗體或其之抗原結合片段包含一重鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號9，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號9有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列。
依據再另一個具體例，本發明之抗體或其之抗原結合片段包含一重鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號11，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號11有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列。
依據再另一個具體例，本發明之抗體或其之抗原結合片段包含一重鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號12，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號12有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列。
於一個具體例中，該抗體特徵在於其包含一重鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號9、11或12。
依據再另一個具體例，本發明之抗體或其之抗原結合片段包含一輕鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號10，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號10有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之一序列。
於一個具體例中，該抗體特徵在於其包含一輕鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號10。
依據再另一個具體例，本發明之抗體或其之抗原結合片段包含i)一重鏈可變異領域序列，其含有選自於序列辨識編號9、11或12之胺基酸序列，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號9、11或12有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列，以及ii)一輕鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號10，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號10有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列。
更特別地，本發明係有關於一種抗體，該抗體特徵在於其包含一重鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號9、11或12；以及一輕鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號10。
於一個具體例中，該抗體或其之抗原結合片段包含i)一重鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號9，以及ii)一輕鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號10。
於一個具體例中，該抗體或其之抗原結合片段包含i)一重鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號11，以及ii)一輕鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號10。
於一個具體例中，該抗體或其之抗原結合片段包含i)一重鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號12，以及ii)一輕鏈可變異領域序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號10。
於一個具體例中，該抗體係由一種鼠類抗體所構成。於此情況中，其被稱為m1022C3。
於一個具體例中，該抗體係由一種嵌合抗體所構成。於此情況中，其被稱為c1022C3。
於一個具體例中，該抗體係由一種擬人化抗體所構成。於此情況中，其被稱為hz1022C3。
於一個具體例中，該抗體係由一種人類抗體所構成。於此情況中，其被稱為h1022C3。
措辭1022C3也可用來指不考慮其來源的抗體，意思是其含括m/c/h/hz 1022C3。
為了更清楚之故，以下的表2總結對應於本發明的抗體白之各種各樣的胺基酸序列。
在另一個態樣中，該抗體或其之抗原結合片段係由一種嵌合抗體組成。
嵌合抗體為含有衍生自一既定物種的抗體之天然可變異區域(輕鏈與重鏈)，組合以對該既定物種而言為異源的(heterologous)物種之抗體的輕鏈與重鏈的恆定區域者。
該等抗體或其嵌合片段可以藉由使用重組遺傳學技術來製備。舉例而言，可以藉由選殖含有一啟動子及編碼本發明的非人類單株抗體，特別是鼠類之可變異區域的序列，以及編碼人類抗體恆定區域的序列之重組型DNA，來產生嵌合抗體。一種此重組型基因所編碼之依據本發明的嵌合抗體可以是，舉例而言一種小鼠-人類嵌合體(chimera)，這個抗體的專一性是由衍生自鼠類DNA的可變異區域來決定，以及它的同型(isotype)是由衍生自人類DNA的恆定區域而決定。關於製備嵌合抗體的方法參照 Verhoeyn等人(BioEssays,8：74,1988)。
本發明之一個特定的態樣係有關於一種嵌合抗體或其抗原結合片段，其包含：i)一個含有CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之重鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號1、2及3，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號1、2及3有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列；ii)一個含有CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之輕鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號4、5及6，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號4、5及6有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列；以及iii)該抗體亦包含衍生自與小鼠異源的(heterologous)物種的一抗體之輕鏈及重鏈恆定區域(constant regions)。
於本發明的一具體例中，該與小鼠異源的物種為人類(亦可稱為人(man))。
舉例來說，依據本發明的嵌合抗體係特徵在於其包含一重鏈序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號33；及/或一輕鏈序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號35。
舉例來說，依據本發明的嵌合抗體係特徵在於其包含一重鏈序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號34；及/或一輕鏈序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號35。
於一更佳具體例中，依據本發明的嵌合抗體係特徵在於其包含一重鏈序列，其含有胺基酸序列序列辨識編號33或34，以及一輕鏈序列，其含有胺基酸序列序列辨識 編號35。
在另一個態樣中，本發明係有關於一種抗體或其抗原結合片段，其由一種擬人化抗體組成。
“擬人化抗體”意指一種抗體，該抗體含有衍生自非人類來源之抗體的CDR區域，該抗體分子的其它部份衍生自一個(或數個)人類抗體。此外，部份的骨架節段殘基(skeleton segment residue)(稱為FR)可以被修飾而得以保留結合親和性(Jones等人，Nature,321：522-525,1986；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536,1988；Riechmann等人，Nature,332：323-327,1988)。
本發明的擬人化抗體或其等之片段可以藉由熟悉此技藝的人士所熟知的技術(諸如例如，在下列文件中所描述的該等技術：Singer等人，J.Immun.,150：2844-2857,1992；Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.,10：1-142,1992；以及Bebbington等人，Bio/Technology,10：169-175,1992)而製備。此等擬人化抗體對於其等用於涉及在活體外的診斷或預防(preventive)及/或在活體內的治療處理(therapeutic treatment)的方法而言是較佳的。其它的擬人化技術亦為熟悉此技藝的人士所熟知的，諸如，例如，PDL在專利案中所描述的“CDR移植(CDR grafting)”技術：EP 0 451 261、EP 0 682 040、EP 0 939 127、EP 0 566 647或US 5,530,101、US 6,180,370、US 5,585,089以及US 5,693,761。亦可引用US專利5,639,641或6,054,297、5,886,152以及5,877,293。
本發明之一個特定的態樣係有關於一種擬人化抗體或其抗原結合片段，其包含：i)一個含有CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之重鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號1、2及3，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號1、2及3有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列；ii)一個含有CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之輕鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號4、5及6，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號4、5及6有至少80%，較佳為85%、90%、95%與98%的同一性之序列；以及iii)該抗體亦包含衍生自人類抗體的輕鏈及重鏈的恆定區域。
於一個具體例中，描述一種擬人化抗體或其抗原結合片段，其包含：i)一個含有CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之重鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號1、2及3，ii)一個含有CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之輕鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號4、5及6；以及iii)該抗體亦包含衍生自人類抗體的輕鏈及重鏈的恆定區域。
於一個具體例中，描述一種擬人化抗體或其抗原結合片段，其包含：i)一個含有CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之重鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號7、2及3，ii)一個含有CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之輕鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號4、5及6；以及iii)該抗體亦包含衍生自人類抗體的輕鏈及重鏈的恆定區域。
於一個具體例中，描述一種擬人化抗體或其抗原結合片段，其包含：i)一個含有CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之重鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號8、2及3，ii)一個含有CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之輕鏈，其分別含有胺基酸序列序列辨識編號4、5及6；以及iii)該抗體亦包含衍生自人類抗體的輕鏈及重鏈的恆定區域。
在一個較佳方式中，衍生自人類抗體的輕鏈與重鏈的恆定區域分別是λ或κ以及γ-1、γ-2或γ-4區域。
描述一種單株抗體或其抗原結合片段，其特徵在於其係由融合瘤I-4686獲得的單株抗體1022C3所組成，I-4686係於2012年10月18日寄存於法國，75725 Paris Cedex 15，25 Rue du Docteur Roux，巴斯德研究院(Institut Pasteur)CNCM。
依據另一個態樣，本發明係有關於一種能夠分泌如本發明的單株抗體之鼠類融合瘤，尤其為編號I-4686、2012年10月18日提申於法國微生物菌種中心(French collection for microorganism cultures)(法國巴黎巴斯德研究院CNCM)之鼠類來源的融合瘤。該融合瘤係藉由融合Balb/C免疫的小鼠脾細胞和骨髓瘤Sp 2/O-Ag 14株的細胞來獲得。
於一特定的具體例中，本文所述之抗體特徵在於其能夠結合ADAM17之一個單一抗原決定位，其被含括於序列序列辨識編號32的膜近側領域(MPD)之內。
該抗體之另一個較佳性質為其以500pM或更小 的IC50，優先為200pM或更小的IC50，以及更優先為100pM或更小的IC50，抑制ADAM17的至少一個受質之脫落，該ADAM17的至少一個受質優先選自於TNF-α、TGF-α、AREG及/或HB-EGF。
於另一個具體例中，該抗體係特徵在於其係以表面電漿子共振(SPR)判定為大約10nM或更小的Kd，優先為大約5nM或更小的Kd，以及更優先為大約2nM或更小的Kd，結合ADAM17抗原決定位。
本發明的另一個態樣係有關於於一種抑制腫瘤細胞生長及/或增殖的方法，其中該方法包含下列步驟：投藥如上所說明之有效量的抗體或其之抗原結合片段至需要其之病人。
於另一個具體例中，說明一種抗體，其係供一種抑制腫瘤細胞生長及/或增殖的方法來使用，該腫瘤細胞係選自於表現ADAM17的腫瘤細胞。
熟習此藝者可以透過任何已知的技術而容易地判定ADAM17的表現位準，例如細胞測量術、免疫組織化學分析，抗體結合能力(ABC)，等等。
作為一非限制性實例，可以透過藉由細胞測量術抗體結合能力(ABC)來測量ADAM17之標定抗體，來判定表現位準。
在一個具體例中，該腫瘤細胞視為表現ADAM17且有至少5000的ABC。
在另一個具體例中，該腫瘤細胞視為表現 ADAM17且有至少10000的ABC。
本申請案之另一個態樣係有關於鼠類融合瘤I-4686，其係於2012年10月18日寄存於法國巴斯德研究院CNCM。
本發明之另一個態樣係有關於一種經單離之核酸，其特徵在於其係選自於下列的核酸：a)核酸，其編碼如上所述之抗體或其之抗原結合片段；b)核酸，其包含序列序列辨識編號13-28，或是在最佳的排列後與序列序列辨識編號13-28及36至38，展現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的百分比同一性之序列。
本發明係有關於一種經單離之核酸，其特徵在於其係選自於下列的核酸：a)一種DNA或RNA，其編碼如上所述之抗體或其之抗原結合片段；以及b)一種DNA，其包含選自於序列序列辨識編號13-28及36至38所構成的群組之序列中至少一者的序列，較佳包含編碼CDRs H1、H2、H3及L1、L2、L3之6個核酸，或是編碼重鏈及/或輕鏈之核酸，較佳為抗ADAM17抗體可變異領域，其係選自於序列序列辨識編號13-28及36至38所構成的群組。
以下的表3總結關於本發明的抗體之各種各樣的核苷酸序列。
於本說明中交換地使用的術語“核酸”、“核序列(nucleic sequence)”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”以及“核苷酸序列”，意指核苷酸之精確的經修飾或未修飾的序列，其定義含括非天然的核苷酸或不含括非天然的核苷酸的核酸之片段或區域，以及不是一雙股DNA、一單股DNA就是該等DNAs之轉錄產物。
也應該包括於此的是，本發明並非有關於處於其等之天然的染色體環境，亦即天然的狀態，之核苷酸序列。本發明的序列業已經單離及/或純化，亦即，舉例而言其等藉由複製而直接地或間接地採樣，其等之環境已經至少部分地修飾。此處也應該提及經由，藉著舉例而言，宿主細胞之重組遺傳學所獲得的，或是藉由化學合成所獲得之經單離的核酸。
“在最佳的排列後，與一較佳的序列展現出至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的百分比同一性之核序列”意指，相關於參考核序列，呈現某些修飾例如，特別為刪失、截斷、延伸、嵌合融合，及/或取代，尤其點狀的，修飾之核序列。較佳地，此等序列為編碼有如參考序列相同的胺基酸序列，此係有關於遺傳密碼的簡併，或是較佳為於高度嚴苛條件下，很可能與參考序列專一地雜交之互補性序列。
本發明亦說明一種載體，其包含如上所述的一種核酸。
本發明尤其對準選殖及/或表現含括此一核苷酸序列之載體。
本發明的載體較佳含括了允許於一假定的宿主細胞中轉錄/轉譯表現及/或分泌核苷酸序列之元素，導致編碼蛋白的表現/分泌。因此載體必須含括一啟動子、轉譯起始和終止信號，以及合適的轉錄調節區域。於較佳的具體例中，此載體應該能夠以穩定的方式維持於宿主細胞中， 以及可以選擇性地具有特定的信號，該等信號具體指定經轉譯的蛋白之分泌。此等各種各樣的元素係由熟悉此藝者依據所使用的宿主細胞予以選擇以及最佳化。為此目的，核苷酸序列可以插入至所選擇的宿主內之自我複製的載體中，或是為所選擇的宿主之整合性的載體。
此等載體係藉由熟悉此藝者典型使用的方法來製備，以及所產生的純株可以藉由標準的方法，例如脂轉染(lipofection)、電穿孔、熱休克或化學的方法，予以導入至一種合適的宿主內。
載體舉例而言，為質體或是病毒來源的載體。其等係使用來轉形宿主細胞俾以選殖或表現本發明的核苷酸序列。
本發明亦關於一種宿主細胞，其包含如上所述之載體。
宿主細胞可以選自於原核或真核系統之中，例如舉例而言，細菌細胞，而且還有酵母細胞或動物細胞，尤其哺乳動物的細胞。亦可以使用昆蟲或植物細胞。
本申請案之另一個主題係由一種基因轉殖動物構成，但人類例外，其含有至少一個如上所述之抗體轉形的細胞。
本發明因而亦說明一種生產如本說明書之抗體，或其之抗原結合片段的方法，其特徵在於該方法包含下列階段：a)於培養基內及適合的培養條件下培養如上所述之細 胞；以及b)回收從該培養基或從該等培養的細胞從而開始生產的該抗體，或其之抗原結合片段(the recovery of said antibody,or antigen-binding fragment thereof,thus produced starting from the culture medium or said cultured cells)。
依據本發明之經轉形的細胞是在製備依據本發明之重組型多肽的方法中使用。本發明亦包含製備依據本發明之重組型形式之多肽的方法，該等方法係特徵在於該等方法使用本發明之一載體及/或由依據本發明之一載體予以轉形的一細胞。較佳地，由依據本發明之一載體予以轉形的一細胞係於允許前述的多肽之表現以及該重組型胜肽的回收之條件下培養。
如同業已提及的，宿主細胞可以選自於原核或真核系統之中。尤其是，可能鑑別本發明的核苷酸序列，幫助於此原核或真核系統中分泌出的宿主細胞。因此，帶有此一序列之依據本發明的載體可以有利地使用來產生待分泌的重組型蛋白。更確切地，此等有興趣的重組型蛋白之純化，會由於其存在於細胞培養上清液中而獲益，而非宿主細胞內部。
本發明的多肽亦可以藉由化學合成予以製備。此一製備方法亦為本發明的一目的。熟悉此藝者瞭解化學合成的方法，例如固相技術(見尤其Steward等人，1984,Solid phase peptides synthesis,Pierce Chem.Company,Rockford,111,2nd ed.)或顆粒固相技術，藉由片段之縮合或是藉由慣 例的溶液內合成法。本發明亦包含藉由化學合成所獲得的多肽及能夠含括對應的非天然胺基酸之多肽。
本發明亦包含可藉由本發明的方法獲得之抗體，或是其等之抗原結合片段。
本發明係有關於以上所說明的抗體，或其之抗原結合片段，供使用作為一種藥物。
本發明亦有關於一種組成物，其特徵在於該組成物還包含另一種治療有效的化合物，其係由抗腫瘤化合物所構成。
於一具體例中，本申請案係有關於一種組成物，其包含如上所述之抗體。
於一具體例中，該組成物係特徵在於其進一步包含一種治療有效量的細胞毒性劑，作為組合產品。
構成該組合之成分可以同時、分別或連續投藥，以便獲得最大的組合效能；各個投藥於其之持續期間可能會從快速投藥變化成連續灌注。
當使用於本文中，“同時投藥”係指於一單一且唯一的藥物形式內之組成物的二個化合物之投藥。
當使用於本文中，“分別投藥”係指依據本發明的組成物的二個化合物，以各別的藥物形式、同時投藥。
當使用於本文中，“連續投藥”係指依據本發明的組成物的二個化合物，各自於各別的藥物形式內之連續投藥。
當使用於本文中，"治療有效量"係指一個化合物 (或多個化合物)的最小濃度或量，其對於預防、減輕、減少或改良疾病之症狀，或者延長要治療的病人之存活是有效的。治療有效量亦為藥劑之治療上有利作用比起任何毒性或是有害作用更為重要者。更特別地，關於治療癌症方面，治療有效量係指該量具有下列功效：(1)減小腫瘤的尺寸(或較佳為消除)；(2)抑制(也就是，在某種程度上減緩，較佳為停止)腫瘤的轉移；(3)在某種程度上抑制(也就是在某種程度上減緩，較佳為停止)腫瘤的生長；及/或(4)在某種程度上緩解(或較佳為消除)與癌症關連的一個或是更多個症狀。
於一具體例中，該組成物係特徵在於其進一步包含一種治療有效量的細胞毒性劑，作為結合產品(conjugation product)。
於本發明的意義來說，用語“結合(conjugation)”一般係意指一種組成物，其包含實際上連接一種或更多種細胞毒性劑的至少一種如上所述之抗體，因而創造出高度定標的(targeted)化合物。
於一具體例中，該抗體係透過一連接子而以化學方式與細胞毒性劑連接。"連接子"、"連接單元"，或是"連接"意指一種化學部分(moiety)，其包含一個共價鍵或原子鏈，將結合蛋白共價附接至至少一個細胞毒性劑。連接子可以為“不可切割的”或是“可切割的”。
本發明的組成物也可以包含各種稀釋劑、填充劑、鹽類、緩衝劑、安定劑、溶解化劑以及本技藝所熟知的其 他材料。
在另一個具體例中，該組成物為一種藥學組成物，其進一步包含一種藥學上可接受的媒液。
當使用於本文中，"藥學上可接受的媒液"或"藥學上可接受的載劑"包括任何以及全部的生理上相容的溶劑、緩衝劑、鹽類溶液、分散媒介、塗層、抗細菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑以及類似物。載劑的種類可以根據想要的投藥途徑來選擇。在各種具體例中，載劑係適合於靜脈內的、腹膜內的、皮下的、肌肉內的、局部的、經皮的或是口的投藥。藥學上可接受的載劑包括無菌的水溶液或是分散液，以及用於即席製備的無菌可注射溶液或是分散液之無菌粉末。供藥學上活性的物質使用之媒介和製劑係本技藝中所熟知的。用於製備可腹膜內投藥的化合物之方法係熟悉此藝者已知或明瞭的，以及更詳盡地說明於例如，Remington's Pharmaceutical Science，第17版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1985)，以及其之第18版和第19版，其等係併入至本文中以作為參考資料。
按“細胞毒性劑(cytotoxic agent)”或“細胞毒性劑(cytotoxic)”係意指一製劑，當投至個體後，可藉由抑制或防止細胞的功能及/或造成細胞死亡，來治療或預防細胞增殖之發展，較佳為治療或預防該個體體內癌症之發展。
已經單離或合成出許多細胞毒性劑，且有可能抑制細胞增殖，或是即使不是決定性地，至少也是顯著地破壞或減少腫瘤細胞。
更特別地，該細胞毒性劑較佳可由以下組成，但不限於，一種藥物、一種毒素、一種放射性同位素等等。
依據本發明的另一個態樣，說明供一種抑制腫瘤細胞生長及/或增殖的方法來使用之組成物。
本發明亦包含有該組成物用於製備一種藥物的用途，該藥物係打算用於預防或治療癌症。
本發明亦有關於一種如上所述之抗體之用途，或是由如上所述之方法所獲得的抗體之用途，或是如上所述之用於治療癌症的組成物之用途，該癌症係選自於表現ADAM17的癌症。
於一較佳具體例中，該癌症係選自於下列的癌症：卵巢癌、乳癌、腎臟癌、肝癌、胰臟癌、肺癌、頭頸部癌，以及表皮樣癌。
在治療應用方面，本發明之組成物係被投藥至哺乳類，較佳為人類，且呈諸如那些論述於上之一藥學上可接受的劑量，包括該等可被投藥至人類靜脈內如一大丸劑(bolus)者，或者藉由在一段時間內連續灌注，藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑液膜內、椎管內、口腔、局部或吸入路徑之該等。本發明之該組成物亦適合藉由腫瘤內、腫瘤周圍、病灶內，或病灶周圍路徑投藥，以發揮局部以及全身性治療作用。
本發明之其他的特徵和優點顯露於本說明續編部分及實施例和圖示中，以下表示其之說明。
圖示之說明
圖1：FRET胜肽斷裂分析法
圖2：mAb 1022C3對於A431-TGF α-Nluc細胞之TGF α-Nluc釋放的效應。
圖3：mAb 1022C3對於A431-AREG-Nluc細胞之AREG-Nluc釋放的效應。
圖4：mAb 1022C3對於A431-TNF α-Nluc細胞之TNF α-Nluc釋放的效應。
圖5：mAb 1022C3對於A431-HB-EGF-Nluc細胞之HB-EGF-Nluc釋放的效應。
圖6：1022C3變異體之FRET胜肽斷裂分析法。
圖7：醣化的及酵素去醣化的m1022C3與腫瘤細胞株NCI-H1299之結合作用。
圖8：mAb 1022C3對於MCF7細胞之AREG脫落的抑制作用。
圖9：mAb 1022C3對於MCF7細胞之AREG脫落的劑量效應。
圖10：1022C3對於已建立的A431異種移植之活體內活性。
圖11：1022C3對於片段A431異種移植模式之活體內活性。
圖12：m1022C3(鼠類形式)及c1022C3(嵌合形式)對於A431異種移植模式之比較。
圖13：1022C3對於已建立的CaOV-3異種移植之活體內 活性
圖14：1022C3對於已建立的OVISE異種移植之活體內活性。
圖15：1022C3對於已建立的BxPC3異種移植之活體內活性。
圖16：1022C3對於已建立的BICR-22異種移植之活體內活性。
圖17：1022C3對於已建立的JIMT-1異種移植之活體內活性。
圖18：1022C3對於已建立的NCI-H292異種移植之活體內活性。
較佳實施例之詳細說明 實施例1：抗體的產生
為了產生對抗人類ADAM17的鼠類單株抗體(mAbs)，5隻BALB/c小鼠係用15-20μg的人類ADAM17重組型蛋白(R and D Systems，ref：930-ADB，rhADAM17)予以皮下免疫3次。第一次免疫係於完全佛恩得佐劑(Complete Freund’s Adjuvant)(Sigma,St Louis,MD,USA)存在下執行。之後的免疫添加不完全佛恩得佐劑(Sigma)。
於融合之前3天，2隻經免疫的小鼠(根據血清滴定法來選擇)係用15-20μg的rhADAM17蛋白、加上不完全佛恩得佐劑一起予以提升(boost)免疫反應。藉由切碎近端淋巴結的方法來製備淋巴細胞，其等繼而與SP2/0-Ag14骨 髓瘤細胞以1：4的比率(淋巴細胞：骨髓瘤)(ATCC,Rockville,MD,USA)融合。融合協定為Kohler和Milstein所描述的協定(1975)，最後，播種50個96井平盤。融合的細胞繼而接受代謝HAT選擇法。融合大概10天之後，篩選雜交細胞之群落(colonies)。在初級篩選方面，使用ELISA來評估融合瘤上清液對抗人類ADAM17而提升的mAbs之分泌情形。
簡言之，以配於PBS之0.7μg/ml、50μl/井的重組型人類ADAM17蛋白(R and D Systems,ref：930 ADB)來塗覆96井ELISA平盤(Costar 3690,Corning,NY,USA)於4℃過夜。接而用含有0.5%明膠(#22151,Serva Electrophoresis GmbH,Heidelberg,Germany)之PBS於37℃封阻平盤歷時2小時。一旦以輕彈(flicking)平盤方式丟棄飽和緩衝劑，就添加50μl的樣本(融合瘤上清液或純化的抗體)至ELISA平盤，以及於37℃孵育歷時1小時。在清洗三次之後，添加配於含有0.1%明膠和0.05%妥文(Tween)20(w：w)的PBS內、1/5000稀釋之50μl辣根過氧化酶結合的多株山羊抗小鼠IgG(#115-035-164,Jackson Immuno-Research Laboratories,Inc.,West Grove,PA,USA)至平盤、於37℃孵育歷時1小時。清洗ELISA平盤三次，以及添加TMB(#UP664782,Uptima,Interchim,France)受質。在室溫下10min孵育時間之後，使用1M硫酸來停止反應以及測量450nm之光密度。
選擇的融合瘤上清液係藉由FACS分析來評估，能夠結合表現於A172人類腫瘤細胞表面上的ADAM17細胞 形式之mAbs，作為第二次篩選步驟。於流動式細胞測量術的選擇法方面，2x105個細胞係於4℃、予以平盤培養於含有1% BSA和0.01%疊氮化鈉的PBS(FACS緩衝劑)之96井平盤的每個井中。在以2000rpm離心2min之後，移去緩衝液以及添加待測試的融合瘤上清液。在4℃孵育20min之後，清洗細胞二次，以及添加一種以FACS緩衝劑1/500稀釋的Alexa 488-結合的山羊抗小鼠抗體(#A11017,Molecular Probes Inc.,Eugene,USA)且於4℃下孵育歷時20分鐘。在用FACS緩衝劑最後一次清洗之後，添加終濃度40μg/ml之碘化丙啶至各管後，然後透過FACS(Facscalibur,Becton-Dickinson)來分析細胞。含括只含細胞的井及用二級Alexa 488-結合的抗體孵育的細胞作為陰性對照。各實驗中使用同型對照(Sigma,ref M90351MG)。評估至少5000個細胞來計算螢光強度平均值(MFI)。
選擇的融合瘤盡快地藉由限制稀釋法(limiting dilution)予以選殖。各代碼準備一個96井平盤。將調整成8個細胞/ml選殖特定的培養基之100μl體積的細胞懸浮液，裝載於各井內。於第7天，以顯微鏡來檢查井，以再供給平盤100μl選殖特定的培養基之前，確保選殖和平盤培養的效率。於第9-10天，接著篩選融合瘤上清液對rhADAM17蛋白之反應性。經選殖的mAbs接著使用一種分型套組(cat #5300.05,Southern Biotech,Birmingham,AL,USA)予以分型。從各融合瘤獲得的純株選擇一個純株以及予以擴大，來確認其等對rhADAM17及人類腫瘤細胞(A172)之結合專 一性。
實施例2：FRET胜肽斷裂分析法
於一種黑色96-井平盤中，在室溫下用10μl不同濃度的抗-ADAM17 mAb(m1022C3)或不相關的mAb(9G4)來孵育40μl/井的重組型人類ADAM17(R&D Systems,ref：930 ADB)(250ng/ml)歷時10min。接而，添加50μl的10μM受質胜肽溶液，對應於特異斷裂位置各端用5-FAM及TAMRA(5-FAM-SPLAQAVRSSSRK-TAMRA)標定的前-TNF-α(pro-TNF-α)ADAM17。繼而在各種37℃孵育時間(t=0，2，6及24小時)之後，於一種Berthold Mithras平盤讀數器(激發濾光片485nm，發射濾光片530nm，能源燈：7000讀取時間：0.2s/井)上相繼的測量螢光。螢光的增加反映出ADAM17活性，因為未斷裂的受質胜肽上之5-FAM的螢光被TAMRA猝滅。
抗ADAM17 mAb m1022C3顯示出劑量從屬(dose-dependant)之受質胜肽斷裂抑制作用(圖1)。
實施例3：ADAM 17使重組型受質由腫瘤細胞株A431脫落(ADAM 17 shedding of recombinant substrates from tumour cell line A431)
產生穩定轉染的A431細胞株，其等之細胞膜表現各別與NanoLuciferase®(Promega)融合的前-TGF-α(pro-TGF-α)、前-HB-EGF、前-雙調蛋白或是突變的前-TNFα。此等細胞的細胞膜處之ADAM17活性導致與NanoLuciferase®(Promega)融合的成熟受質釋放培養基內。 時間從屬(Time dependant)之測量培養基樣本內的NanoLuciferase活性反映出ADAM17的活性。將A431受質-Nluc細胞以30 000個細胞/井播種於96井培養平盤內。二天之後，移除培養基以及用200μl新鮮的培養基來替換，新鮮的培養基中是經稀釋不同濃度的抗-ADAM17 mAb(m1022C3)或不相關的mAb(9G4)。培養24h(37℃，CO2 5%)之後，從所有的實驗井採集5μl的培養基，以及分布於白色的半區(half-area)96井培養平盤之井內。添加15μl(PBS稀釋的)Nano-GloTM螢光素酶受質(furimazine)之後，於一種Berthold Mithras LB940多重模微量平盤讀數器上於0.1s的期間讀取各實驗的總螢光。
抗ADAM17 mAb m1022C3誘導下列之劑量從屬(dose-dependant)之降低：i)培養基內之TGFα-Nluc釋放(圖2)，ii)培養基內之AREG-Nluc釋放(圖3)，iii)培養基內之TNFα-Nluc釋放(圖4)，以及iv)培養基內之HB-EGF-Nluc釋放(圖5)。mAb m1022C3對於前-TGF-α(pro-TGF-α)、前-HB-EGF、前-雙調蛋白或是突變的前-TNFα之脫落的抑制作用得到的IC50值，與文獻中公開的該等IC50值作比較(表4)。與參考化合物相比，mAb m1022C3對於測試的所有受質，展現出顯著大於10倍，較佳為大於20倍，較佳為大於30倍，較佳為大於40倍，以及較佳為大於50倍之細胞脫落抑制作用。
實施例4：mAb 1022C3結合ADAM17
mAb 1022C3對人類、鼠類和嵌合ADAM17之結合剖面圖係經由西方墨點法及表面電漿子共振來決定。一些ADAM17子領域(sub domain)及人類/鼠類嵌合蛋白係表現為來自HEK293細胞的人類Fc融合蛋白。在SDS-PAGE分離之後測試蛋白A純化的蛋白質之結合作用，接著用m1022C3進行西方墨點分析法及表面電漿子共振。表4中詳述生產的及測試結合作用之蛋白質。參照人類ADAM17：存取編號P78536及鼠類ADAM17：存取編號AAI38421來引用胺基酸位置。所表現的人類起源的ADAM17領域寫成大寫字母，領域或鼠類起源為小寫字型。領域名稱係縮寫如下：P，前領域(pro-domain)；C，催化領域；D，去整合素領域；MPD，膜近側領域。分裂的領域係以其等於蛋白質結構胺基端(Nter)或羧基端(Cter)的位置來表示。
西方墨點結合分析法：
等量的純化的蛋白質係藉由4-15%聚丙烯醯胺凝膠、於非還原的條件下來解析，並轉移至硝基纖維素膜 上。用配於含有0.05%妥文(Tween)20之Tris-緩衝鹽水(TBS)(TBS-T)內之1%脫脂乳粉來進行封阻。接而該膜於室溫下用配於TBS-T之1μg/ml m1022C3抗體、於持續攪拌下孵育歷時1h，然後於室溫下用以TBS-T 1：3000稀釋之山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)-結合的抗-小鼠IgG、於持續攪拌下孵育歷時1h。免疫反應性蛋白質係透過增强的化學發光偵測系統套組(enhanced chemiluminescent detection system kit)、依據製造業者的操作指南來顯現。
BIAcore結合分析法：
實驗係於BIAcore X100裝置上進行。mAb 1022C3使用作為配位體，以及ADAM17片段和嵌合建構物則使用作為分析物。實驗係對於共價連接至CM5感應晶片(BR-1000-12)之二個流動槽的基質之兔抗小鼠的多株抗體(小鼠抗體捕捉套組，BR-1008-38，GE Healthcare)，使用胺基耦合套組(BR-1000-50,GE Healthcare)，使用HBS-EP+緩衝液(BR-1008-26,GE Healthcare)作為流動緩衝液，於25℃以10μl/min進行。此緩衝液亦使用於配位體及分析物之稀釋。
濃度為15μg/ml之mAb 1022C3溶液係於一分鐘內注入該第二流動槽(工作面)。每個循環，於三分鐘內注入濃度為250nM之ADAM17嵌合建構物的其中一者(於c-端位置處帶有人類Fc領域)於二個流動槽中：參考物沒有任何m1022C3(FC1)且工作槽有大約700 RU的m1022C3(FC2)。記錄的信號對應於FC2和FC1反應之間的差異。
正反應係介於90和140 RU之間。負反應全部都低於10 RU。每個循環結束時，於三分鐘內注入用10mM甘胺酸、HCl pH 1.7緩衝液(來自於小鼠抗體捕捉套組)來移除m1022C3。
實施例5：用表面電漿子共振實驗來定義ADAM17細胞外領域對於單株抗體1022C3之結合作用的解離常數。
抗體(配位體)係結合至Biacore CM5感測晶片(GE Healthcare)之第二流動室上，用共價連接至羧甲基聚葡萄醣基質之兔抗小鼠(RAM)IgG(H+L)活化二個流動室。以 二倍稀釋方案獲得(假定分子量為52kDa)濃度範圍從400至12.5nM的可溶性ADAM17(分析物)，以30μl/min的流速、以120s脈衝(association)注入表面上，加上額外的180s延遲用於測量解離相。RAM表面係使用NaOH 30mM、NaCl 150mM及10mM甘胺酸、HCl pH 1.5緩衝液溶液予以再生。各濃度獲得的曲線係雙重參照，首先減去來自於參考物FC1表面(RAM沒有任何小鼠抗-TACE mAb)的訊號，接著減去流動緩衝液注射劑(Biacore HBS-EP緩衝液)得到的訊號。
資料係利用BIAevaluation 3.1軟體、使用1：1朗謬模式(Langmuir model)來處理。配合之適用性(suitability of the fit)係用折射指數(RI)來測量，其必須傾向於零及κ2值。
結果總結於下列的表6中
實施例6：去醣化的CDRH1之結合評估及FRET抑制作用
mAb 1022C3具有座落於CDRH1之N-醣化位置，其於分泌的蛋白質轉譯後修飾。為了決定醣化位置的影響，將m1022C3予以酵素醣化，酵素醣化為將天冬醯胺酸殘基轉換成天冬胺酸的過程。
使用二個醣苷酶以連續的方式將mAb m1022C3去醣化。將1μL的神經胺糖酸苷酶(New England Biolabs, P0720S,50 000U/mL)添加至20μg的1mg/mL mAb溶液，以及將混合物於37℃於溫和攪拌下孵育過夜。繼而添加1μL的胜肽-N-醣苷酶F(New England Biolabs,P0704S,500 000U/mL)接著另一次於37℃孵育步驟過夜。
於FRET胜肽斷裂分析法中活體外評估，m1022C3之酵素去醣化沒有降低m1022C3的抑制活性(圖6)，保留親代mAb抑制作用的位準。
評估酵素去醣化的1022C3關於腫瘤細胞株NCI-H1299的結合作用，以及顯示為業已保留親代抗體之結合能力(圖7)。
實施例7：雙調蛋白脫落分析法
ADAM17係涉及EGFR配位體系列，包括雙調蛋白(AREG)，的脫落作用。為了決定m1022C3是否能夠抑制ADAM17誘發的AREG之斷裂，業已將此配位體分劑於MCF-7雌激素-依賴性乳癌細胞的上清液內。簡言之，16 000個MCF-7細胞業已平盤培養於96井平盤的每個井中，於200μL的完全培養基(RPMI 1640 w/o酚紅+10%SVF+1% L-麩醯胺酸)內。平盤培養四十八小時後，移除培養基，以PBS(磷酸鹽緩衝劑鹽水)清洗細胞，以及將待測試的化合物添加於0.5% SFV培養基內。於此等實驗中，引入TAPI1作為抑制作用之陽性的對照(參考化合物)，以及取決於測試的抗體形式，而含括mIgG1或hIgG1同型對照作為陰性的對照。亦使用PMA作為AREG之脫落的陽性對照。繼而孵育細胞額外的48小時，然後收集上清液，以及AREG劑量藉由ELISA DUO SET定量分析法(R&D Systems)進行。同時，使用Cell Titer Glo luminescent method來評估細胞活力，俾以確定細胞死亡不是AREG釋放過程的原因。
圖8為3個獨立實驗之平均值。圖顯示出，如同預期的，參考化合物TAPI1誘發顯著的AREG脫落抑制作用(62%)，而誘發作為脫落之陽性對照的PMA，於此環境中，能夠誘發戲劇性的AREG脫落。同型對照，或是使用作為TAPI 1溶解化作用媒液之DMSO，均不會干擾AREG的脫落作用。引入作為鼠類同型對照之對照mAb 9G4，對於AREG的脫落作用沒有效應。m1022C3抑制AREG的脫落作用，如同參考化合物一般有效力。接而測試m1022C3之劑量範圍(圖9)。其顯示出m1022C3於低至0.15μg/ml的劑量為活性的。
實施例8：mAb 1022C3之活體內評估
為了所有的活體內評估，使用六至八週大之無胸腺小鼠。其等圈養於無菌、頂上裝置濾網之動物籠中，維持於無菌狀態下，並依據法國與歐洲指導方針操作。
ADAM17表現位準係透過染色來決定，配於FACS緩衝液(含有1% BSA和0.01%疊氮化鈉的PBS)內之1x105個細胞/100μl係用漸增濃度的MAB9301(Clone 111633,R&D systems)於4℃孵育20min.，俾以決定飽和濃度。接而用FACS緩衝液清洗細胞三次。使細胞再懸浮，以及用山羊抗小鼠IgG-Alexa 488抗體(Invitrogen Corporation,Scotland,# A11017)於4℃孵育20min.。接而用FACS緩衝液 清洗細胞三次。標定的細胞繼而再懸浮於100μl的FACS緩衝液內，然後用一種Facscalibur血球計數器(Becton Dickinson,Le Pont-de-Claix,France)來分析。添加碘化丙啶來僅分析活細胞。同時，使用QIFIKIT珠粒、藉由流動式細胞測量術及單株抗體結合，來決定抗體結合及每細胞的抗原密度。QIFIKIT包含一系列的珠粒，直徑為10μm且塗覆不同，但定義良好的量之小鼠mAb分子。該等珠粒模擬細胞具有不同的抗原密度，其等已經用初級小鼠mAb予以標定。量化的抗原係用抗體結合能力(ABC)單位來表達。
8.1 A431異種移植模式：已建立的腫瘤
選擇一種表現ADAM17(ABC=17 000)的表皮樣癌細胞株，A431用於活體內評估。小鼠係於第0天皮下注射10x106個細胞。當腫瘤達到大概200mm3時(腫瘤細胞注射後20天)，將具有可比較的腫瘤尺寸之動物分成二組，每組6隻小鼠，以及腹膜內治療係用20mg/kg之m1022C3單株抗體速效劑量(loading dose)，然後每週10mg/kg的m1022C3單株抗體之維持劑量。對照組只接受媒液，如同此模式執行的先前實驗，用媒液治療的小鼠和注射同型對照的小鼠之間，展現出腫瘤的生長沒有觀察到差異。接著觀察小鼠的異種移植生長速率。以下式來計算腫瘤體積：π/6 X長度X寬度X高度。
獲得的結果總結於圖10中。其等顯示由m1022C3 mAb所媒介之戲劇性的腫瘤抑制作用(於D49時為97%)，全部經治療的小鼠均觀察到腫瘤退化(regression)，且於D49 時6隻小鼠中的2隻小鼠達到完全的退化。
8.2用腫瘤片段A431建立的異種移植模式
為了判定觀察到的mAb m1022C3抗腫瘤活性之穩健性，首先藉由細胞移植術來產生如上所說明之腫瘤。然後當腫瘤體積達到大概200-300mm3時，無菌移除腫瘤，切碎成1mm3的片段，小心地避開壞死的區域，以及接而此等片段使用於繁殖新系列的無胸腺小鼠。此繁殖週期執行3次，俾以使腫瘤的生長和特徵二者穩定，然後產生具有達到大概145mm3(腫瘤細胞注射後14天)的腫瘤之二組小鼠，每組6隻。一組之腹膜內治療係用20mg/kg之m1022C3單株抗體速效劑量(loading dose)，然後每週10mg/kg的m1022C3單株抗體之維持劑量。第二組只接受媒液。接著觀察小鼠的異種移植生長速率。以下式來計算腫瘤體積：π/6 X長度X寬度X高度。
獲得的結果總結於圖11中。片段建立的腫瘤比細胞植入產生的該等腫瘤生長得更快。此觀察與此等腫瘤更侵襲性表現型一致。於此更侵襲性的環境中，該m1022C3仍具有顯著之腫瘤抑制作用於第35天達到73%。
8.3鼠類1022C3(m1022C3)及其之IgG1嵌合形式(c1022C3)關於A431異種移植模式之比較。
為了比較m1022C3及其之IgG1嵌合形式，如上所說明的藉由細胞植入無胸腺小鼠來建立A431異種移植模式。圖12中呈現的結果顯示出該二化合物為可比較的，且m1022C3及c1022C3之腫瘤抑制作用分別達到82%及75%。
8.4 CaOV3異種移植模式：已建立的腫瘤
選擇一種表現ADAM17(ABC=20 000)的卵巢癌細胞株，CaOV-3用於活體內評估。小鼠係於第0天皮下注射7x106個細胞。當腫瘤達到大概120mm3時(腫瘤細胞注射後18天)，將具有可比較的腫瘤尺寸之動物分成二組，每組5隻小鼠，以及腹膜內治療係用10mg/kg之m1022C3單株抗體速效劑量，然後每週5mg/kg的m1022C3單株抗體之維持劑量。對照組只接受媒液，如同此模式執行的先前實驗，用媒液治療的小鼠和注射同型對照的小鼠之間，展現出腫瘤的生長沒有觀察到差異。接著觀察小鼠的異種移植生長速率。以下式來計算腫瘤體積：π/6 X長度X寬度X高度。
獲得的結果總結於圖13中。其等顯示由m1022C3 mAb所媒介之戲劇性的腫瘤抑制作用，全部經治療的小鼠均觀察到腫瘤退化，且自D69以後5隻小鼠中的1隻小鼠達到完全的退化。腫瘤的抑制作用於D84時達到94%。
8.5 OVISE異種移植模式：已建立的腫瘤
選擇一種表現ADAM17(ABC=49 000)的卵巢癌細胞株，OVISE用於活體內評估。小鼠係於第0天皮下注射7x106個細胞。當腫瘤達到大概100mm3時(腫瘤細胞注射後28天)，將具有可比較的腫瘤尺寸之動物分成二組，每組6隻小鼠，以及腹膜內治療係用10mg/kg之m1022C3單株抗體速效劑量，然後每週5mg/kg的m1022C3單株抗體之維持劑量。對照組只接受媒液，如同此模式執行的先前實驗，用媒液治療的小鼠和注射同型對照的小鼠之間，展現出腫瘤 的生長沒有觀察到差異。接著觀察小鼠的異種移植生長速率。以下式來計算腫瘤體積：π/6 X長度X寬度X高度。
獲得的結果總結於圖14中。其等顯示由mAb m1022C3所媒介之戲劇性的腫瘤抑制作用，全部經治療的小鼠均觀察到腫瘤退化，且於D53時腫瘤抑制作用達到58%。
8.6_BxPC3異種移植腫瘤
選擇一種表現ADAM17(ABC=12 600)的胰臟癌細胞株，BxPC3用於活體內評估。小鼠係於第0天皮下注射7x106個細胞。當腫瘤達到大概100mm3時(腫瘤細胞注射後25天)，將具有可比較的腫瘤尺寸之動物分成二組，每組6隻小鼠，以及腹膜內治療係用20mg/kg之m1022C3單株抗體速效劑量，然後每週10mg/kg的m1022C3單株抗體之維持劑量。對照組只接受媒液，如同此模式執行的先前實驗，用媒液治療的小鼠和注射同型對照的小鼠之間，展現出腫瘤的生長沒有觀察到差異。接著觀察小鼠的異種移植生長速率。以下式來計算腫瘤體積：π/6 X長度X寬度X高度。
獲得的結果總結於圖15中。其等顯示由mAb m1022C3所媒介之戲劇性的腫瘤抑制作用，於D47時達到76%。
8.7 BICR-22異種移植模式：已建立的腫瘤
選擇一種表現ADAM17(ABC=16 000)的舌鱗狀細胞癌細胞株，BICR-22用於活體內評估。小鼠係於第0天皮下注射7x106個細胞。當腫瘤達到大概100mm3時(腫瘤細 胞注射後11天)，將具有可比較的腫瘤尺寸之動物分成二組，每組6隻小鼠，以及腹膜內治療係用10mg/kg之m1022C3單株抗體速效劑量，然後每週5mg/kg的m1022C3單株抗體之維持劑量。對照組只接受媒液，如同此模式執行的先前實驗，用媒液治療的小鼠和注射同型對照的小鼠之間，展現出腫瘤的生長沒有觀察到差異。接著觀察小鼠的異種移植生長速率。以下式來計算腫瘤體積：π/6 X長度X寬度X高度。
獲得的結果總結於圖16中。其等顯示由m1022C3 mAb所媒介之戲劇性的腫瘤抑制作用(於D33時為86%)。
8.8 JIMT-1異種移植模式：已建立的腫瘤
選擇一種表現ADAM17(ABC=30 000)，已知對HER2標靶療法有抵抗性的乳癌細胞株，JIMT-1用於活體內評估。小鼠係於第0天皮下注射7x106個細胞。當腫瘤達到大概100mm3時(腫瘤細胞注射後14天)，將具有可比較的腫瘤尺寸之動物分成二組，每組6隻小鼠，以及腹膜內治療係用20mg/kg之m1022C3單株抗體速效劑量，然後每週10mg/kg的m1022C3單株抗體之維持劑量。對照組只接受媒液，如同此模式執行的先前實驗，用媒液治療的小鼠和注射同型對照的小鼠之間，展現出腫瘤的生長沒有觀察到差異。接著觀察小鼠的異種移植生長速率。以下式來計算腫瘤體積：π/6 X長度X寬度X高度。
獲得的結果總結於圖17中。其等顯示由m1022C3 mAb所媒介之腫瘤抑制作用(於D33時為41%)。
8.9 NCI-H292異種移植模式：已建立的腫瘤
選擇一種表現ADAM17(ABC=12 000)的黏液上皮樣肺癌(mucoepidermoid pulmonary carcinoma)細胞株，NCI-H292用於活體內評估。小鼠係於第0天皮下注射7x106個細胞。當腫瘤達到大概150mm3時(腫瘤細胞注射後9天)，將具有可比較的腫瘤尺寸之動物分成二組，每組6隻小鼠，以及腹膜內治療係用20mg/kg之m1022C3單株抗體速效劑量，然後每週10mg/kg的m1022C3單株抗體之維持劑量。對照組只接受媒液，如同此模式執行的先前實驗，用媒液治療的小鼠和注射同型對照的小鼠之間，展現出腫瘤的生長沒有觀察到差異。接著觀察小鼠的異種移植生長速率。以下式來計算腫瘤體積：π/6 X長度X寬度X高度。
獲得的結果總結於圖18中。其等顯示由m1022C3 mAb所媒介之腫瘤抑制作用(於D26時為50%)。
<110> 皮爾法伯製藥公司
<120> 新穎之抗ADAM17抗體及其用於癌症治療的用途
<130> 366743D33276
<150> EP13306860.1
<151> 2013-12-24
<160> 38
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H1(X1)
<220>
<221> 變異體
<222> (5)..(5)
<223> X為N、D、Q、S、E、R、K、H、W、Y或T
<400> 1
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H2
<400> 2
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H3
<400> 3
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-L1
<400> 4
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-L2
<400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-L3
<400> 6
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H1(N)
<400> 7
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H1(D)
<400> 8
<210> 9
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈可變異領域(X1)
<220>
<221> 變異體
<222> (30)..(30)
<223> X為N、D、Q、S、E、R、K、H、W、Y或T
<400> 9
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體輕鏈可變異領域
<400> 10
<210> 11
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈可變異領域(N)
<400> 11
<210> 12
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈可變異領域(D)
<400> 12
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H1(X2)
<220>
<221> 其他特徵
<222> (13)..(15)
<223> nnn為AAC、AAT、GAC、GAT、CAG、CAA、TCG、TCT、TCA、TCC、AGT、 AGC、GAA、GAG、CGA、CGT、CGC、CGG、AGA、AGG、AAA、AAG、CAT、CAC、 TGG、TAT、TAC、ACT、ACC、ACG或是ACA
<400> 13
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H2
<400> 14
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H3
<400> 15
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-L1
<400> 16
<210> 17
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-L2
<400> 17
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-L3
<400> 18
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H1(aac)
<400> 19
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H1(aat)
<400> 20
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H1(gac)
<400> 21
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體CDR-H1(gat)
<400> 22
<210> 23
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈可變異領域(X2)
<220>
<221> 其他特徵
<222> (88)..(90)
<223> nnn為AAC、AAT、GAC、GAT、CAG、CAA、TCG、TCT、TCA、TCC、AGT、 AGC、GAA、GAG、CGA、CGT、CGC、CGG、AGA、AGG、AAA、AAG、CAT、CAC、 TGG、TAT、TAC、ACT、ACC、ACG或是ACA
<400> 23
<210> 24
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈可變異領域(aac)
<400> 24
<210> 25
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈可變異領域(gat)
<400> 25
<210> 26
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體輕鏈可變異領域
<400> 26
<210> 27
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈可變異領域(aat)
<400> 27
<210> 28
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈可變異領域(gac)
<400> 28
<210> 29
<211> 824
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> ADAM17
<400> 29
<210> 30
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> ADAM17之金屬蛋白酶領域
<400> 30
<210> 31
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> ADAM17之去整合素領域
<400> 31
<210> 32
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> ADAM17之膜近側領域
<400> 32
<210> 33
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈嵌合(c)IgG1
<400> 33
<210> 34
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈嵌合(c)IgG1 AlaAla
<400> 34
<210> 35
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體輕鏈嵌合(c)IgG1
<400> 35
<210> 36
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈嵌合(c)
<400> 36
<210> 37
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體重鏈嵌合(c)AlaAla
<400> 37
<210> 38
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 1022C3抗體輕鏈嵌合(c)
<400> 38

Claims (29)

  1. 一種單株抗體或其抗原結合片段，其結合ADAM17(含去整合素及金屬蛋白酶領域的蛋白質17)抗原決定位且其抑制ADAM17的至少一個受質之脫落(shedding)，其特徵在於該ADAM17抗原決定位係由一個抗原決定位所構成，其被含括於序列序列辨識編號32的膜近側領域(membrane proximal domain)(MPD)之內。
  2. 如請求項1之抗體，其特徵在於該抗體係以500pM或更小的IC50，優先為200pM或更小的IC50，以及更優先為100pM或更小的IC50，抑制該ADAM17的至少一個受質之脫落。
  3. 如請求項1或2之抗體，其特徵在於該ADAM17的至少一個受質係選自於TNF-α(腫瘤壞死因子α)、TGF-α(轉形生長因子α)、AREG(雙調蛋白)以及HB-EGF(肝素結合-類似EGF生長因子)。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體，其特徵在於該抗體係以表面電漿子共振(SPR)判定為大約10nM或更小的Kd，優先為大約5nM或更小的Kd，結合該ADAM17抗原決定位。
  5. 一種單株抗體或其之抗原結合片段，其結合至ADAM17之抗原決定位，其特徵在於其包含：i)一重鏈，其分別含有序列辨識編號1、2及3胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；以及 ii)一輕鏈，其分別含有序列辨識編號4、5及6胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
  6. 如請求項5之抗體，其特徵在於該CDR-H1為序列辨識編號7之胺基酸序列。
  7. 如請求項5之抗體，其特徵在於該CDR-H1為序列辨識編號8之胺基酸序列。
  8. 如請求項5之抗體，其特徵在於該抗體包含一重鏈可變異領域序列，其含有序列辨識編號9、11或12胺基酸序列。
  9. 如請求項5之抗體，其特徵在於該抗體包含一輕鏈可變異領域序列，其含有序列辨識編號10胺基酸序列。
  10. 如請求項5之抗體，其特徵在於該抗體包含一重鏈可變異領域序列，其含有序列辨識編號9、11或12胺基酸序列；以及一輕鏈可變異領域序列，其含有序列辨識編號10胺基酸序列。
  11. 如請求項5至10中任一項之抗體，其特徵在於該抗體能夠結合該ADAM17之一個單一抗原決定位，其被含括於序列辨識編號32之序列的膜近側領域(MPD)之內。
  12. 如請求項11之抗體，其特徵在於該抗體係以500pM或更小的IC50，優先為200pM或更小的IC50，以及更優先為100pM或更小的IC50，抑制該ADAM17的至少一個受質之脫落。
  13. 如請求項12之抗體，其特徵在於該ADAM17的至少一個受質係選自於TNF-α、TGF-α、AREG以及HB-EGF。
  14. 如請求項11之抗體，其特徵在於該抗體係以表面電漿子共振(SPR)判定為大約10nM或更小的Kd，優先為大約5nM或更小的Kd，結合該ADAM17抗原決定位。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗體，其係供抑制腫瘤細胞生長及/或增殖的方法來使用。
  16. 如請求項15之抗體，其特徵在於該腫瘤細胞係選自於表現ADAM17的腫瘤細胞。
  17. 一種經單離之核酸，其特徵在於該核酸係選自於下列的核酸：a)一DNA或RNA，其編碼如請求項1至14中任一項之抗體或其之抗原結合片段；以及b)一DNA，其包含選自於序列辨識編號13-28及36至38之序列所構成的群組之序列中的至少一者。
  18. 一種載體，其包含如請求項17之核酸。
  19. 一種宿主細胞，其包含如請求項18之載體。
  20. 一種基因轉殖動物，但人類例外，該基因轉殖動物包含由請求項18之載體所轉形的至少一個細胞。
  21. 一種生產如請求項1至14中任一項之抗體或其之抗原結合片段的方法，其特徵在於該方法包含下列階段：a)於培養基內及適合的培養條件下培養如請求項19之細胞；以及b)回收從該培養基或從該等培養的細胞從而開始生產的該抗體，或其之抗原結合片段。
  22. 一種組成物，其包含如請求項1至14中任一項之抗體。
  23. 如請求項22之組成物，其特徵在於該組成物進一步包含細胞毒性劑，作為組合產品。
  24. 如請求項22之組成物，其特徵在於該組成物進一步包含細胞毒性劑，作為結合產品(conjugation product)。
  25. 如請求項22至24中任一項之組成物，其特徵在於該組成物為藥學組成物，其進一步包含藥學上可接受的媒液。
  26. 如請求項22至25中任一項之組成物，其係供抑制腫瘤細胞生長及/或增殖的方法來使用。
  27. 一種如請求項1至14中任一項之抗體、或是由請求項21之方法所獲得的抗體、或是如請求項22至25中任一項之組成物用於治療癌症之用途。
  28. 如請求項27之用途，其特徵在於該癌症係選自於表現ADAM17的癌症。
  29. 如請求項27或28之用途，其特徵在於該癌症係選自於下列的癌症：卵巢癌、乳癌、腎臟癌、肝癌、胰臟癌、肺癌、頭頸部癌，以及表皮樣癌。
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