CN108640992A - 抗人pd1抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗人PD1抗体及其应用。本发明利用哺乳动物细胞表达系统表达出重组的PD1作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。发明人通过进行对大量样本的筛选，得到了杂交瘤细胞株，其分泌产生与PD1特异性结合的特异性单克隆抗体，对PD1有很高的亲和力，并且该单克隆抗体能够十分有效地阻断PD1与PDL1的结合。本发明提供的鼠抗人PD1单克隆抗体的重链、轻链可变区，增加了新的抗人PD1单抗的序列，丰富了抗体的类型，对肿瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病的治疗具有广泛的应用前景。

Description

抗人PD1抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗人PD1单克隆抗体及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤生长微环境的形成，不仅依赖其自身分泌的一些细胞因子，还能够通过某些信号通路，逃避免疫监视及调控，从而使机体对肿瘤细胞的免疫耐受，进而导致肿瘤的快速进展。
PD1为免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，为CD28超家族成员，是一种免疫抑制分子，其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来，由日本京都大学本庶佑教授1992年发现。PD1蛋白在活化的T细胞，B细胞等都有表达。相较于CD28超家族其他成员，PD1表达更具广泛性，就此而言，似可说明其在免疫应答中的作用比CD28超家族其他成员复杂。PD1分子最显著的特征是细胞质区的尾部含有两个酪氨酸残基，分别参与组成免疫受体酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(Immunoreceptor tyrosine-based switch motifs，ITSM)结构域。ITIM能使细胞质段的磷酸化得到恢复，发挥拮抗抗原受体的功能，而ITSM上的酪氨酸残基在PD1的负性调节中是必需的。它与配体PD-L1及PD-L2互相作用，可导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，从而使肿瘤细胞逃脱机体的免疫监控。PD-L1属于B7-H1分子家族，表达于正常的T细胞、B细胞、DC细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、活化的血管内皮细胞。在许多人类肿瘤细胞表面，如肺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肾细胞癌等中也能够检测到PD-L1的表达，同时研究发现癌组织较正常组织中的PD-L1表达水平明显上调。阻断这一通路，增加T细胞的活化，以杀伤肿瘤细胞成为新的免疫治疗方向。鉴于各项药物临床研究的出色结果，美国FDA就已批准PD1抑制剂Nivolumab(Opdivo)用于不可切除或转移性，且对其他治疗药物反应不佳的恶性黑色素及转移性鳞状非小细胞肺癌的治疗；Pembrolizumab(Keytruda，MK-3475)用于含铂化疗期间或之后疾病进展且肿瘤表达PD-L1蛋白的转移性非小细胞肺癌及不可切除/转移的黑色素瘤。
PD1单克隆抗体药物具有广泛的应用前景和惊人的肿瘤治疗效果，鼠抗人单克隆抗体经过人源化改造后，可用于多种类型肿瘤的治疗，主要包括：非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、肝癌、血液癌症、三阴性乳腺癌、胃癌、胰腺癌等。而开发更好的抗体序列，则能增加抗体的药代动力学，并减少PD1抗体产生自身中和抗体，从而达到减少副作用，增加抗肿瘤治疗的疗效。因此，开发与PD1具有一定亲和力的抗体药物，用于癌症的免疫治疗，使其具有更好的治疗效果，更低的毒副作用，具有非常重要的意义。目前，尚需要开发新的抗PD1抗体序列，能有效地阻断PD1与PDL1的结合，并具有更优化的药代动力学参数，以便为将来的药物研发和癌症治疗做铺垫。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种抗人PD1抗体或其抗原结合片段；
本发明还提供了该抗体在制备PD1分子阻滞药物中的用途。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种抗人PD1抗体或其抗原结合片段，包含重链和轻链可变区序列，所述抗人PD1抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:14，15，16，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，18，19；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:22，23，24，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:28，29；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:25，26，27，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，18，21；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:25，30，27，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO:31，32，33；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:14，20，16，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，18，21；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:22，23，24，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:34，35，36；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:25，26，27，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:37，35，38；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:39，23，40，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:41，42。
进一步地，抗人PD1抗体或其抗原结合片段经过改造后，其为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
分离的核酸分子，其编码上述的抗体或功能性片段。
进一步地，所述核酸分子的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:67，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:69；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:43，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:45；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:47，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:49；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:51，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:53；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:55，轻链可变区氨基酸序列为SEQID NO:57；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:59，轻链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO:61；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:63，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:65；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:71，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:73。
表达载体，包含上述的核酸分子。
宿主细胞，其包上述的表达载体。
产生抗人PD1抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许产生所述抗体或其功能性片段的条件下培养上述的宿主细胞，以及回收产生的所述抗体或其功能性片段。
药物组合物，其包含上述的抗体或其功能性片段，以及可药用载体。
上述的抗体或其功能性片段，核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物在制备PD1分子阻滞药物中的用途。
本发明具有以下优点：本发明利用哺乳动物细胞表达系统表达出重组的PD1作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。发明人通过进行对大量样本的筛选，得到了杂交瘤细胞株，其分泌产生与PD1特异性结合的特异性单克隆抗体，对PD1有很高的亲和力，并且该单克隆抗体能够十分有效地阻断PD1与PDL1的结合。本发明提供的人源化PD1单克隆抗体的重链、轻链可变区，丰富了抗体序列的类型，对肿瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病的治疗具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
1.本发明鼠抗人PD1抗体制备方法，包括以下步骤：
S1.细胞融合：包括以下子步骤：
(1)小鼠免疫：根据免疫量(约66.67ug/只)计算出所用人重组PD1蛋白(His标签)的体积，并与等体积弗氏完全佐剂混合乳化完全，皮下多点注射进行免疫小鼠，以后每两周免疫一次，从第二次免疫时改用弗氏不完全佐剂进行乳化，并于从第二次免疫一周后耳缘静脉采血进行间接ELISA检测小鼠产生抗体水平，若效价检测未达标则继续免疫，反之若效价检测达标(1:10万)即可眼部取全血，取小鼠脾细胞做细胞融合。融合之前取空白Balb/c小鼠制备饲养层。取小鼠巨噬细胞做成悬液，1000rpm/min，5min后弃上清，细胞沉淀加入到准备好的100mL HT培养液中，混匀后加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。24h后观察细胞生长状态，细胞贴壁紧密，呈多形性，折光性好方可使用。
(2)SP2/0细胞制备：3瓶处于对数生长期的SP2/0细胞弃上清(头天该细胞已换液重悬处理)，每瓶用5mL无血清1640培养基重悬，共计15mL细胞悬液收集于一50mL离心管。
(3)免疫脾细胞的制备：取免疫的小鼠，眼部取全血并无菌取脾细胞。
(4)细胞融合：将1×108个脾细胞与2-5×107个骨髓瘤(SP2/0-Ag14)细胞融合，50％PEG作融合剂。
S2.培养筛选：将融合细胞以HAT选择培养基培养并观察集落，待集落生长至细胞培养皿孔底1/5～1/7时半量换HT培养基，培养12h后包被PD1(Fc标签)，ELISA送检，所述培养是在质量百分比浓度为5％的CO2、37℃的条件下培养。利用ELISA反应筛选出单克隆杂交瘤细胞中分泌结合PD1胞外结构域蛋白抗体的克隆；
S3.细胞建株：将步骤S2筛选出的细胞转移至24孔，待细胞增殖到均匀铺满24孔底面时，取上清做抗体阻断实验，以验证该单克隆抗体是否能够阻断人源PD1和人源PDL1的结合，如果能够阻断两者结合，则该单克隆抗体即为我们需要的抗体，分泌该抗体的杂交瘤细胞即为我们需要的细胞，选择能够分泌阻断人源PD1和人源PDL1结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞进行建株；建株优先次序：单集落所亚整板全阳中，a.单集落；b.疑似单集落；c.实在无单集落均呈现散落分布的简单集落。
建株后的杂交瘤细胞株，每株冻存5支，于液氮罐内进行保存，冻存液为90％血清+10％DMSO。目前以此方法获得8株杂交瘤细胞：1D2、1G4、1H10、1H11、2C3、2E8、2G7，以及7B6。此8株细胞上清对PD1和PDL1的阻断结果如下表1：
表1：ELISA竞争法检测小鼠杂交瘤细胞培养上清阻断人PD1蛋白和PDL1蛋白的结合
克隆 OD450 OD450 平均值
1D2 0.102 0.146 0.124
1G4 0.102 0.132 0.117
1H10 0.096 0.115 0.1055
1H11 0.112 0.098 0.105
2C3 0.104 0.098 0.101
2E8 0.151 0.107 0.129
2G7 0.108 0.112 0.11
7B6 0.097 0.086 0.0915
SP2/0 0.736 0.754 0.745
从表1中可以看出，此8株细胞均有阻断PD1和PDL1结合的能力。
S4.抗体纯化：采用Fc亲和层析柱纯化。纯化原理在于IgG是一种抗体，含有Fc片段，而Fc片段与Protein A之间具备特异性的作用力，能相互结合。IgG抗体可以与凝胶上的Protein A以这样的形式作用，从而将IgG抗体与其他杂质分离开。先将来自T75瓶中所培养的单克隆杂交瘤细胞的培养上清液低速离心(3000rpm，20min)，去掉细胞沉淀，混匀，从中取15mL 0.22μm滤膜过滤，将滤液加载到Protein A亲和层析柱上纯化。经紫外分光光度计检测，15mL滤膜过滤后滤液的蛋白浓度为：0.2mg/mL，30kD超滤离心管离心浓缩至5mL，浓度为：0.58mg/mL。Protein A亲和层析柱上纯化具体步骤如下所示：
(1)材料准备
A.结合/冲洗缓冲液：PBS(20mM，150mM NaCl，pH 7.0)。
B.样品：待纯化血清。
C.洗脱液：0.1～0.2M甘氨酸·盐酸缓冲液，150mM NaCl，pH 3.0。
D.中和液：1M磷酸钠或者1M Tris·HCl(pH 8.5～9.0)。
E.Protein A Beads。
F.G250。
G.保存液：20％乙醇。
(2)层析柱预处理
A.平衡Protein A Beads至室温。
B.将内径为1.0cm，长度为10cm的层析柱固定在支架上，底部装好滤芯。盖好底盖，向层析柱内加入2.5mL凝胶悬液。
C.移去底盖让保存液流掉。
D.以10倍柱床体积的结合/冲洗缓冲液冲洗层析柱。
(3)样品纯化
A.样品处理：将细胞上清3000rpm离心5分钟，收集上清，然后用0.22μm滤膜过滤，超滤管浓缩。
B.上样：将处理好的细胞上清液加入层析柱，置静音混匀器翻转混匀反应2～4小时。
C.移去顶盖与底盖，让细胞上清液流出，收集穿透液。
D.以结合/冲洗缓冲液冲洗样品中未结合组分，以G250检测直至将柱床冲洗干净。
E.洗脱：往层析柱内加入洗脱液洗脱。用G250蛋白染色液鉴定是否有蛋白洗脱下来。当出现蛋白时，用1mL离心管收集抗体，直到G250染色液显示无抗体流出为止。每管加50μL中和液中和。
F.根据洗脱时G250的颜色确定抗体所在的管，合并这些离心管内的蛋白，进行透析或脱盐以便贮存。
将透析除盐的抗体溶液浓缩，接着进行下面的抗原抗体结合实验和阻断实验。
以间接ELISA法检测建株的小鼠抗体与包被在96-孔板上的重组人PD1胞膜外蛋白的结合力强弱。
具体步骤如下：
1)包被抗原：PD1-hFc筛选抗原0.25μg/mL，0.5M CBS碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释，100μL/孔，4℃包被过夜；
2)2％干酪素(0.5M CBS，pH 9.6稀释)，200μL/孔，37℃封闭2h，0.1M PBST(Tween-20,0.5％)洗涤3次，轻轻拍干；
3)一抗：1μg/mL，以PBST作为稀释液，1:3梯度将细胞上清中的抗体稀释6个梯度浓度，空白对照组为PBST，37℃孵育1h；
4)二抗：PBST洗涤3次，轻轻拍干，每孔100μL加入1:5000稀释的HRP酶标羊抗鼠IgG(H+L)
二抗，37℃孵育1h；
显色：PBST洗涤5次，轻轻拍干，每孔100μL加入TMB显色剂，室温反应5～10min；
显色终止：50μL/孔，加入2M H2SO4溶液终止显色反应；
读数：用NOVOStar酶标仪，在450nm处检测各孔的吸光值。表2为纯化样本2G7、1D2，以及1G4，对人类PD1蛋白的结合实验结果。
表2：ELISA法检测小鼠杂交瘤细胞培养上清与人PD1蛋白的结合
由表2可以看出，2G7、1D2，1G4、1H10、1H11、2C3、2E8，以及7B6以及对人类PD1蛋白均有很强的亲和力，在低浓度下就能与PD1蛋白进行结合。
2.PD1抗体体外阻断PD1与PDL1的结合实验
PDL1表达于肿瘤细胞表面，而PD1表达于T细胞表面，PDL1与配体PD1的结合，会抑制T细胞的增殖。PD1抗体通过与PD1的结合，从而阻断了PD1与PDL1的信号结合通路，从而促进了T细胞的增殖。PD1与PDL1的结合阻断实验用于检测PD1抗体对信号结合通路的阻断活性。
本实验将PD1融合蛋白(Fc标签，北京义翘神州)包被于96孔板，预加本发明的PD1抗体，进行孵育反应；稍后再加入生物素标记的PDL1蛋白，接着再孵育反应。洗板5次，检测生物素标记的PDL1结合量，间接计算得到PD1抗体阻断两者结合的IC50(定义为使人PD1与人PD-L1的结合减少50％所需的抗体浓度)。具体步骤如下：
1)包被抗原：在96孔酶标板上包被PD1-hFc抗原1μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜；
2)PBST洗板3次，轻轻拍干，加入2％干酪素(CBS稀释),200μL/孔,37℃封闭2h，1×PBST(Tween-20,0.5％)洗涤3次；
3)一抗：4μg/mL，用样本稀释液PBST(pH 7.4，0.05％吐温-20)以1:2梯度稀释待测PD1一抗6个梯度浓度，空白对照组为PBS，90μL/孔加入到包被好的酶标板上，于4℃预孵育1h；
4)配体：加入生物素化PDL1溶液10μg/mL，10μL/孔，于振荡器上混匀，于37℃孵育1h；
5)二抗：PBST洗涤6次，轻轻拍干。每孔100μL加入1:400稀释的亲和素化那根过氧化物酶二抗，37℃孵育50min；
6)显色：PBST洗涤6次，轻轻拍干；每孔100μL加入TMB显色剂，室温反应5－10min；
7)终止：50μL/孔加入2M H2SO4终止反应；
8)读数：在NOVOStar酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。以2G7为例，计算PD1抗体对配体PDL1结合阻断的IC50值。
实验结果如表3所示。
表3：PD1抗体体外阻断PD1与PDL1的结合实验
由表3可以看出，2G7、1D2、1G4、1H10、1H11、2C3、2G4，以及7B6均能有效阻断PD1和PDL1的结合。于是，接下来，将分泌这些较好抗体的细胞株进行基因克隆。
3.基因克隆与测序
以2G7为例说明，其他类同。在T25细胞培养瓶中将分泌PD1单抗的鼠类杂交瘤克隆培养至3×105至10×105个细胞的密度。使用培养细胞总RNA提取试剂盒(产品编号DP430,天根,中国,北京)分离总细胞RNA，在二次去离子水中再悬浮RNA，藉由Nanodrop(Thermofisher,中国,上海)测量浓度基于先前所报告的序列(Brocks等人,2001Mol Med7:461-469),藉由生工生物(中国,上海)合成用于单抗cDNA克隆的PCR引物。使用逆转录酶(产品编号KR106-02,天根,屮国,北京)合成第一链cDNA。使用PCR试剂盒(产品编号Ap221-12,Transgen Biotech,中国,北京)进行PD1单抗cDNA的PCR扩增。将PCR产物连入载体(pGM-TFast Vector))(pGMT-TA Cloning Kit，产品编号VT307,Transgen Biotech,中国,北京)，随后测序(Genscript，中国，南京)。其中，重组质粒pGM-T-VH或pGM-T-VL的构建如下：
(1)抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段的制备
提基因之前，先检测小鼠单克隆抗体亚型，再根据亚型使用不同的引物进行扩增。亚型鉴定后得知，所获得的8个杂交瘤细胞株均为IgG1亚型。根据此亚型，从抗PD1小鼠单克隆抗体细胞株中提取总RNA，用逆转录试剂盒，以小鼠单克隆抗体的mRNA为模板逆转录合成其cDNA片段；分别以VH或VL的cDNA为模板，共设计两对PCR扩增引物，PCR合成分别扩增出两条DNA片段:VH和VL。
VH的一对PCR扩增引物序列分别如下：
上游引物(下划线为Sph I酶切位点)：
IgG1:5’-atgga gca tgc ATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC-3’(SEQ ID：1)
IgG2A:5’-atgga gca tgc CTT GAC CAG GCA TCC TAG AGT CA-3’(SEQ ID：2)
IgG2B:5’-atgga gca tgc AGG GGC CAG TGG ATA GAC TGA TGG-3’(SEQ ID：3)
IgM:5’-atgga gca tgc GAC ATT TGG GAA GGA CTG ACT CTC-3’(SEQ ID：4)
下游引物(下划线为EcoR I酶切位点)，以下7种引物每次扩增重链基因时均要添加：
5’MH1:5’-ctt ccg gaa ttc SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC-3’(SEQ ID：5)
5’MH2:5’-ctt ccg gaa ttc SAR GTN MAG CTG SAG SAG TCW GG-3’(SEQ ID：6)
5’MH3:5’-ctt ccg gaa ttc CAG GTT ACT CTG AAA GWG TST G-3’(SEQ ID：7)
5’MH4:5’-ctt ccg gaa ttc GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC-3’(SEQ ID：8)
5’MH5:5’-ctt ccg gaa ttc CAG GTC CAA CTV CAG CAR CC-3’(SEQ ID：9)
5’MH6:5’-ctt ccg gaa ttc GAG GTG AAS STG GTG GAA TC-3’(SEQ ID：10)
5’MH7:5’-ctt ccg gaa ttc GAT GTG AAC TTG GAA GTG TC-3’(SEQ ID：11)
VL的一对PCR扩增引物序列分别如下：
上游引物(下划线为Nde I酶切位点)：
Kc:5’-gggttt cat atg GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3’(SEQ ID：12)
下游引物(下划线为Sac I酶切位点)：
Mk:5’-aaggc gag ctc GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3’(SEQ ID：13)
按照逆转录酶FastQuant RT试剂盒说明做RT(逆转录)，合成cDNA第一链：
42℃，3min后，立即置于冰上。
反转录反应体系配置：
逆转录反应：42℃、15min
95℃、5min
4℃、5min
2个PCR体系，分别扩增：
1)重链可变区DNA扩增：
轻链可变区DNA扩增：
PCR循环参数：94℃3min，[94℃30s，55℃30s，72℃1min]30个循环后，72℃5min，4℃保存。
扩增产物依次通过1％琼脂糖凝胶电泳切胶纯化、DNA抽提试剂盒回收，扩增产物片段大小重链基因片段约为：400bp，轻链基因片段大小约为：380bp。
按照pGMT-TACloning Kit(产品编号VT307,Transgen Biotech,中国,北京)试剂盒说明书，将PCR产物连入载体(pGM-T Fast Vector)，随后测序(Genscript,中国,南京)。通过基因测序，获得基因片段VH序列(重链可变区)和VL序列(轻链可变区)，此为小鼠抗人PD1克隆细胞株2G7的cDNA基因片段。
测序结果为：2G7抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：67所示，其抗体轻链可变区的核甘酸序列如SEQ ID：69所示。
同样，根据此方法获得其他7个杂交瘤细胞株的测序结果分别为：
1D2抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：43所示，其抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：45所示。
1G4抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：47所示，其抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：49所示。
1H10抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：51所示，其抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：53所示。
1H11抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：55所示，其抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：57所示。
2C3抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：59所示，其抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：61所示。
2E8抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：63所示，其抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：65所示。
7B6抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：71所示，其抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID：73所示。
将上述核苷酸序列翻译成氨基酸序列：
1D2抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：44所示，其抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：46所示。
1G4抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：48所示，其抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：50所示。
1H10抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：52所示，其抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：54所示。
1H11抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：56所示，其抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：58所示。
2C3抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：60所示，其抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：62所示。
2E8抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：64所示，其抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：66所示。
2G7抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：68所示，其抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：70所示。
7B6抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：72所示，其抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID：74所示。
进一步，将上述氨基酸序列进行抗原结合位点分析，得到以下氨基酸序列：
1D2：重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:14，15，16，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，18，19；
1G4：重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:22，23，24，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:28，29；
1H10：重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:25，26，27，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，18，21；
1H11：重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:25，30，27，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:31，32，33；
2C3：重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:14，20，16，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，18，21；
2E8：重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:22，23，24，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:34，35，36；
2G7：重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:25，26，27，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:37，35，38；
7B6：重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:39，23，40，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:41，42。
本发明所提供的氨基酸序列，亦可能通过剔除、增加、替换或者截短的方式进行氨基酸残基修饰，获得变体，取得更好的效果，例如亲和力增加、更加稳定、半衰期延长；同时，本发明提供的抗体，亦可与其他抗体或者药物联合使用，可对某一疾病的治疗产生协同效应；还有，本发明提供的抗体或者某一种或者多种抗原结构域，可能对某一癌症或者感染性疾病存在特别好的治疗作用；最后，本发明提供的抗体或者抗原结合域所形成的药物，亦可通过一定的实验优化，形成特定剂量、特定途径，以及特定剂型的产品，服务于广大患者。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南燕山源创生物科技有限公司
<120> 抗人PD1抗体及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9190
<212> DNA
<213> 脱氧核糖核酸(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atntnvrsna tggagcatgc atagacagat gggggtgtcg ttttggcatg gagcatgcct 60
tgaccaggca tcctagagtc aatggagcat gcaggggcca gtggatagac tgatggatgg 120
agcatgcgac atttgggaag gactgactct cmscatrnsa cgtrcttccg gaattcsarg 180
tnmagctgsa gsagtcmsca trnsacgtrc ttccggaatt csargtnmag ctgsagsagt 240
cwggcttccg gaattccagg ttactctgaa agwgtstgct tccggaattc gaggtccarc 300
tgcaacartc cttccggaat tccaggtcca actvcagcar cccttccgga attcgaggtg 360
aasstggtgg aatccttccg gaattcgatg tgaacttgga agtgtcgggt ttcatatggg 420
atacagttgg tgcagcatca aggcgagctc gayattgtgm tsacmcarwc tmcayrrhrs 480
nhrnryayrr ysysysyrhr argyyyryry rhryrarhay rrayryrshr hrtnyraars 540
narysnnrrg ysaryrryaa yrrysysysy rhrhrhrsyr yasryarrgy ysnhrsyrys 600
rsrhryrhhr hrsnyrstrr aahrryyyrg yrhryrharr srrgyhrhrr hryrtsysrr 660
ysrysarraa hrryryrgyr hryrhnsayh raaayrrarh rrgshrnnyr rryrrnrasr 720
snysnhryry rysarsnrgh rhnyrsrnra srsnysnhry rsrnrhrsar rhrhrshysy 780
srshrryrrr syrsrryrra ratggagcat gcatagacag atgggggtgt cgttttggct 840
gcagagacag tgactagagt cccttggccc cagtaaacaa accaggcata agtactaccg 900
tagtaccccc ctctggcaca gtaatagacc gcagagtcct cagatgtcaa gctgctgagt 960
tgcatgtagg ctgtgatgga ggattcatct gcagtcaatg tggccttgtc cttgaacttc 1020
tgagtgtact taatatcacc atctccagga taaatagccc caatccattc cagaccctgt 1080
ccaggcctct gttttaccca ctgcagccag aagttactaa aactgtagcc agaggccttg 1140
caggacaacc tcactgaagc cccaggtctt gccagttcag ccccagactg ctgcagctgg 1200
acttggaatt ccggaagarh nannnryaar gryarargry sysaryyrrh rsnhrnrays 1260
nrgrynyrya yrrysysysy rhrnyshyss ysahrhrasr rhrayrtnrr hrrsraayry 1320
rysargyyyr yryrhryrar hayrrynyhr ahraraaysh rhrrrrayra ysrgggtttc 1380
atatgggata cagttggtgc agcatcagcc cgttttattt ccagcttggt cccccctccg 1440
aacgtgtacg gaaccttcct actttgctga cagaaataca ttgcaatatc atcctcctcc 1500
acaggatgga tgttgaggct gaagtctgtc ccagacccag tgccactaaa cctggcaggg 1560
accccagatt caacgttgga tgcagcatag atgaggagtt tgggtggctg tcctggtttc 1620
tgttggaacc actgcattaa agtagtgtca taatattcaa cactttcact ggctctgcag 1680
gagatggtgg ctctctgccc tagagacaca gccagagaag ctggagtctg tgtgagcaca 1740
atatcgagct cgccttaysa hrnhrraraa rynrgahrry srgarrayry rshrhrtnrh 1800
nnysrynrry syraarsnar yararghryh ryryhrshrs nsrassatyr hysnnrrgys 1860
aryrhrhyyy hrysysrgas aarhrarsty sratggagca tgcatagaca gatgggggtg 1920
tcgttttggc tgcagaaaca gtgaccagag tcccttggcc ccaggagccc gtactgtcgc 1980
ttttggaaca gtagtatatg gcagtgtcat caattcgcag actgttcatt tgaaagaaaa 2040
cttggttctt ggagttgtcc ctggtgatgc tcagtctgga catgaaagct gcattgtagt 2100
ctgtgtttcc acctctccat atcactccca gccactccag accctttcct ggagactggc 2160
gaacccaatg aacaccatag tcagttaatg agaaaccaga gactgtgcag gttatggtca 2220
ggctctgtga gggctgcact aggccaggtc cagactgctg cagctgaacc tggaattccg 2280
gaagrhnann nryryanrrn rhrhryshra ryhrhrsyry asrargnrry ysyryarrgy 2340
ysnhrsyrsn aahtrrgrhr rgssnryssn nahhntsnrr gsshrayryr ysrysrsrhr 2400
yrrynyhrah raraayshrh rrrrayrays rgggtttcat atgggataca gttggtgcag 2460
catcagcccg tttcagctcc agcttggtcc cagcaccgaa cgtgtcagag gatagttcca 2520
ctggtggcag taataaatgg cagcatcttc agcctccatg ctgctgattg tgagagagta 2580
agaggtccca gacccactga cactgaagcg agctgggact ccagaagcca gtttggatat 2640
ttcacaaatc catggtttgg gggaggtgcc tgacttctgg tggtaacagt gcatgtaact 2700
aaaacttgag ttggcactgc agttatggtg accttttgtc ccagagatgc agctgggatg 2760
tctggagttt gtgtgatcac aatatcgagc tcgccttrgr gargyrysss hrsnrrgsrr 2820
ysryhrysys ssnysrasnr rhryrtsysy rsnysryhrr rysrrysrys aryararghr 2880
aryryhrryr rhrrrtasaa yryryssnrs nyrrhrrgra yrrrratgga gcatgcagac 2940
agatgggggt gtcgttttgg ctgcagagac agtgaccaga gtcccttggc cccagaaagg 3000
aaacccccga ggatcggggc ttacacagta atacaaggcc gtgtcctcag atctcagact 3060
gttcatttgc aggtacaggt tgttcttggc attgtctctg gagatggtga atcgcccctt 3120
cacactgtct ggaaagtagg tgtaacgacc accaccacta atggttgcga cccactccag 3180
cctcttctcc ggagtctggc gaacccaaga catgtcataa ttagagaaag taaatccaga 3240
ggctgcacag gagagtttca gggaccctcc aggcttcata aagcctcccc ctgactgctg 3300
cagcttaact tggaattccg gaagrhnays nnryyyhtys ryyrysrysa aryhhrhrsn 3360
yrstrrargn hrrysrgraa hrryyyrgyr hryrhrsray syrghhrrrg ssnayssnsn 3420
yrntsnrrgr shrayryrys arrsrrgyhr hrynyhrahr araayshrhr rrragggttt 3480
catatgggat acagttggtg cagcatcagc ccgttttatt tccagcttgg tcccccctcc 3540
gaacgtgtac ggaaccttcc tactttgctg acagaaatac attgcaatat catcctcctc 3600
cacaggatgg atgttgaggc tgaagtctgt cccagaccca gtgccactaa acctggcagg 3660
gaccccagat tcaacgttgg atgcagcata gatgaggagt ttgggtggct gtcctggttt 3720
ctgttggaac cactgcatta aagtagtgtc ataatattca acactttcac tggctctgca 3780
ggagatggtg gctctctgcc ctagagacac agccagagaa gctgtagttt gtgtgatcac 3840
aatatcgagc tcgccttays ahrnhrhrar aarynrgahr rysrgarray ryrshrhrtn 3900
rhnnysrynr rysyraarsn aryararghr yhryryhrsh rsnsrassat yrhysnnrrg 3960
ysaryrhrhy yyhrysysrg asaarhrars tysratggag catgcataga cagatggggg 4020
tgtcgttttg gctgcagaga cagtgaccag agtcccttgg ccccagaaag gaaacccccg 4080
aggatcgggg cttacacagt aatacaaggc cgtgtcctca gacctcagac tgttcatttg 4140
caggtacagg ttgttcttgg cattgtctct ggagatggtg aatcgcccct tcacactgtc 4200
tggaaagtag gtgtaacgac cactaccact aatggttgcg acccactcca gcctcttctc 4260
cggagtctgg cgaacccaag acatgtcata attagagaaa gtaaatccag aggctgcaca 4320
ggagagtctc agggarrgry saaryhhrhr snyrstrrar gnhrrysrgr aahrryryrg 4380
yrhryrhrsr aysyrghhrr rgssnayssn snyrntsnrr grshrayryr ysarrsrrgy 4440
hrhrynyhra hraraayshr hrrrrayray srgggtttca tagggataca gttggtgcag 4500
catcagcccg ttttatttcc aactttgtcc ccgagccgaa cgtaagagga tagctgctat 4560
attgctgaca gaaataatct gccaagtctt cagactgcac attgctaatg gtgagagtga 4620
aatctgtccc agatccactg cctgtgaagc gatcagggac tccagtgtgc cgggtggatg 4680
cccagtaaat cagaagttta ggagattgtc ctggtttctg atgataccag gctacagcag 4740
tacccacatc ctgactggcc ttgcaggtga tgctgaccct gtctcctact gatgtggaca 4800
ggaatttgga gactgggtga tcacaatgtc gagctcgcct tayshrhrra ysrgarhrys 4860
ysarnsayhr aaaryrsnys rynrrysyrr arhrrgshry arsrghhryr yryhrshhrh 4920
rrsnanrsas yrhysnnyrr ryrrhrhyry hrysysrgas aarhraratg gagcatgcat 4980
agacagatgg gggtgtcgtt ttggctgcag agacagtgac tagagtccct tggccccagt 5040
aaacaaacca ggcataagta ctaccgtagt acccccctct ggcacagtaa tagaccgcag 5100
agtcctcaga tgtcaagctg ctgagttgca tgtaggctgt gatggaggat tcatctgcag 5160
tcaatgtggc cttgtccttg aacttctgag tgtacttaat atcaccatct ccaggataaa 5220
cagccccaat ccattccaga ccctgtccag gcctctgttt tacccactgc agccagaagt 5280
tactaaaact gtagccagaa gccttgcagg acaacctcac tgaagcccca ggtcttgcca 5340
gttcagcccc tgactgctgc agctttactt ggaattccgg aagarhnays nnryaargry 5400
arargrysys aryyrrhrsn hrnraysnrg rynyryaayr rysysysyrh rnyshyssys 5460
ahrhrasrrh rayrtnrrhr rsraayryry sargyyyryr yrhryrarha yrrynyhrah 5520
raraayshrh rrrragggtt tcatatggga tacagttggt gcagcatcag cccgttttat 5580
ttccagcttg gtcccccctc cgaacgtgta cggaaccttc ctactttgct gacagaaata 5640
cattgcaata tcatcctcct ccacaggatg gatgttgagg ctgaagtctg tcccagaccc 5700
agtgccacta aacctggcag ggaccccaga ttcaacgttg gatgcagcat agatgaggag 5760
tttgggtggc tgtcctggtt tctgttggaa ccactgcatt aaagtagtgt cataatattc 5820
aacactttca ctggctctgc aggagatggt ggctctctgc cctagagaca cagccagaga 5880
agctgtagtt tgtgtgatca caatatcgag ctcgccttay sahrnhrhra raarynrgah 5940
rrysrgarra yryrshrhrt nrhnnysryn rrysyraars naryarargh ryhryryhrs 6000
hrsnsrassa tyrhysnnrr gysaryrhrh yyyhrysysr gasaarhrar stysratgga 6060
gcatgcatag acagaggggg tgtcgttttg gctgcagaaa cagtgaccag agtcccttgg 6120
ccccaggagc ccgtactgtc gcttttggaa cagtagtata tggcagtgtc atcaattcgc 6180
agactgttca tttgaaagaa aacttggttc ttggagttgt ccctggtgat gctcagtctg 6240
gacatgaaag ctgcattgta gtctgtgttt ccacctctcc atatcactcc cagccactcc 6300
agaccctttc ctggagactg gcgaacccaa tgaacaccat agtcagttaa tgagaaacca 6360
gagactgtgc aggttatggt caggctctgt gagggctgca ctaggccagg tccagactgc 6420
tgcagcttaa cttggaattc cggaarhnay snnryryanr rnrhrhrysh raryhrhrsy 6480
ryasrargnr ryysyryarr gyysnhrsyr snaahtrrgr hrrgssnrys snnahhntsn 6540
rrgsshrayr yrysrysrsr hryrrynyhr ahraraaysh rhrrrrtsar gggtttcata 6600
tgggatacag ttggtgcagc atcagcccgt ttcagctcca gcttggtccc agcaccgaac 6660
gtgagaggaa tatgtgaacc ttgaaagcag taataaactc ccagatcctc tgcctccact 6720
ctcctgatct tgagtgtgaa atctgtccct gatccactgc cactgaacct gtctgggacc 6780
ccagaaaatc ggttggaaac tttgtagatc aggagctttg gagactggcc tggtttctgc 6840
aggtaccatt ctaaataggt gtttccatta ctatggacaa tactctgact agatctgcaa 6900
gagatggagg cttgatctcc aagactgaca ggcagggaga gtggagattg tgtgagcaca 6960
atatcgagct cgccttysah rnrrrrarys narrysrgrr nrasrsnysn hryrryrnys 7020
rynrrysyry sarsnrghry arsrghryry ryhrshhrys rgrgaasyay ryryshnyrs 7080
rhrhyayhry sysrgasaar hrarstysra tggagcatgc atagacagat gggggtgtcg 7140
ttttggctgc agagacagtg accagagtcc cttggcccca gaaaggaaac ccccgaggat 7200
cggggcttac acagtaatac aaggccgtgt cctcagacct cagactgttc atttgcaggt 7260
acaggttgtt cttggcattg tctctggaga tggtgaatcg ccccttcaca ctgtctggaa 7320
agtaggtgta acgaccacca ccactaatgg ttgcgaccca ctccagcctc ttctccggag 7380
tctggcgaac ccaagacatg tcataattag agaaagtaaa tccagaggct gcacaggaga 7440
gtttcaggga ccctccaggc ttcataaagc ctcccccaga ttccaccagg ttcacctcga 7500
attccggaag arhasnaryy yhtysryyry srysaaryhh rhrsnyrstr rargnhrrys 7560
rgraahrryy yrgyrhryrh rsraysyrgh hrrrgssnay ssnsnyrnts nrrgrshray 7620
ryrysarrsr rgyhrhryny hrahraraay shrhrrrray raysrgggtt tcatatggga 7680
tacagttggt gcagcatcag cccgtttgat ttccagcttg gtgcctccac cgaacgtcgg 7740
aggaacatgt gtactttgag agcagaaata aactcccaga tcctcagcct ccactctgct 7800
gatcttgagt gtgaaatctg tccctgatcc actgccactg aacctgtctg ggaccccaga 7860
aaatcggttg gaaactttgt agatcaggag ctttggagac tggcctggct tctgcaggta 7920
ccaatgtaaa taggtgtttc cattactgtg tacaaggctc tgactagatc tgcaagagat 7980
ggaggcttga tctccaagac tgacaggcag ggagagtgga gtttgggtga tcacaatatc 8040
gagctcgcsa hrnhrrrrar ysnarrysrg rrnrasrsny snhryrsryr nysrynrrys 8100
yrysarsnrg hryarsrghr yryryhrshh rysrrgaasy ayrhysrnrh rsarrhrhyy 8160
yhrysysrga saarhrarst ysratggagc atgcatagac agatgggggt gtcgttttgg 8220
ctgcagagac agtgaccaga gtcccttggc cccaggagcc cgaggtgtcg ctcttggcac 8280
agtagtatat ggcagtgtca tcaggtcgca gactgttcat tttaaaaaaa acttgattct 8340
tggagttgtc cttggtgatg ctcaatctgg acacgaaagg ttcattgtag tctgtgttgc 8400
cacctctcca tatcactccc agccactcca gaccctttcc tggagactgg cgaacccaat 8460
gaataccaaa gtcagttaat gagaaaccag agactgtgca cgttatggac aggctctgtg 8520
agggctgcac taggccaggt ccagactgct gcagcttaac ttggaattcc ggaagarhna 8580
ysnnryryan rrnrrhrysh raryhrhrsh ysrargnrry ysyryarrgy ysnhrsyrsn 8640
rharrgrhry sssnryssnn ahhystsnrr grsshrayry rysaysrshr ryrrynyhra 8700
hraraayshr hrrrrayray srgggtttca tatgggatac agttggtgca gcatcagccc 8760
gtatcagctc cagcttggtc ccagtaccga acgtgtaaga ggataactcc actgctggca 8820
gaaataaatg gcagcatttt cagcctccat gcttatgaat gtgagagaat aagaggtccc 8880
agacccactg ccactgaagc gagctgggac tccagaagcc agtaaggaaa tctcataaat 8940
ccatggtttg ggggaggtgg ctgacttctg ctggtaccag tgaatgtaaa tatcacttga 9000
gctgacacag caggtgatgg tgaccttttg ccccagagat gtagctgtga tggctgtaga 9060
ttgtgtgagc acaatatcga sahrnrhrah rahrrynysa hrhrysysar rrsyrsryrn 9120
nysrahrrry srryrrarya rarghryryr yhrryrrhrh rtasnaayrh ysnnrryrrh 9180
rrgrayrrrr 9190

Claims (9)

1.一种抗人PD1抗体或其抗原结合片段，包含重链和轻链可变区序列，其特征在于，所述抗人PD1抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:14，15，16，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，18，19；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:22，23，24，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:28，29；或重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO:25，26，27，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，18，21；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:25，30，27，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:31，32，33；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:14，20，16，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，18，21；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:22，23，24，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:34，35，36；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:25，26，27，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:37，35，38；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:39，23，40，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:41，42。
2.如权利要求1所述的一种抗人PD1抗体或其抗原结合片段，经过改造后，其为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
3.分离的核酸分子，其编码权利要求1或2中所述的抗体或功能性片段。
4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:67，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:69；或重链可变区氨基酸序列为SEQID NO:43，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:45；或重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO:47，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:49；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:51，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:53；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:55，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:57；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:59，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:61；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:63，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:65；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:71，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:73。
5.表达载体，包含权利要求3所述的核酸分子。
6.宿主细胞，其包含权利要求5所述的表达载体。
7.产生鼠抗人PD1抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许产生所述抗体或其功能性片段的条件下培养包含权利要求6所述的宿主细胞，以及回收产生的所述抗体或其功能性片段。
8.药物组合物，其包含权利要求1或2所述的抗体或其功能性片段，以及可药用载体。
9.权利要求1和2所述的抗体或其功能性片段，权利要求3和4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的宿主细胞、权利要求8所述的药物组合物在制备PD1分子阻滞药物中的用途。
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