CN105461808A

CN105461808A - 单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN105461808A
Application number: CN201510989886.1A
Authority: CN
Inventors: 冯晓; 金磊; 王英武; 尉继征; 陈宇珩; 王成忠; 张士权
Original assignee: JINSAI DRUG CO Ltd CHANGCHUN
Current assignee: Jinsai Drug Co., Ltd., Changchun
Priority date: 2015-12-24
Filing date: 2015-12-24
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2035-12-24
Also published as: CN105461808B

Abstract

本发明属于抗体药物的技术领域，具体涉及鼠抗人PD-L1单克隆抗体及其应用。本发明提供的抗体是来源于鼠杂交瘤细胞并经过PD-L1亲和力筛选的，鼠源抗体对猴PD-L1或/和人PD-L1的亲和力和特异性优异，可呈剂量依赖性阻断人PD-L1与人PD-1的结合，有效的促进T淋巴细胞增殖，刺激淋巴瘤细胞IL-2和IFNγ的分泌。同时抗PD-L1通过阻断PD-1/PD-L1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增殖，发挥杀伤肿瘤细胞的作用。阻断PD-1和PD-L1信号通路的治疗以其良好的疗效和安全性走在了免疫治疗的前列，成为近两年肺癌治疗领域的热门靶点。

Description

单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体药物领域，特别涉及单克隆抗体及其应用。

背景技术

PD-L1：

程序性死亡受体-1(programmeddeath-1PD-1)蛋白最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中利用削减杂交的方法得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡-1受体。目前发现的PD-1的配体被证实有两个，分别是PD-L1(又称B7-H1，属于B7超家族)和PD-L2(又称B7-DC)。人PD-L1基因定位于染色体9P24，其开放阅读框编码一个含有290个氨基酸的I型跨膜蛋白，由胞外区IgV、IgC结构域、疏水性跨膜结构域、30个氨基酸片段且带电荷的胞内区组成。人PD-L1的胞外段与B7-1，B7-2具有较高的同源性，且该肽段含有4个明显的半胱氨残基，便于其胞外段的重链和轻链形成二硫键结构。人PD-L1mRNA主要表达于胎盘(特别是合体滋养层和外绒毛状的细胞滋养层)、心脏(鼠中表达较低)、肝脏、肺、肾、骨骼肌等非淋巴组织和少数造血组织(一些骨髓造血细胞以及白血病细胞系)，但在淋巴结和脾脏等淋巴组织的表达量甚微。PD-L1蛋白广泛表达于抗原提呈细胞、活化T、B细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层、心肌内皮和胸腺皮质上皮细胞。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，且许多肿瘤组织较正常组织中的PD-L1表达水平明显上调。

PD-1/PD-L1参与肿瘤免疫的逃逸机制

肿瘤免疫逃逸的机制包括：肿瘤细胞膜表面相容性复合物(MHC)类分子的表达下调，缺少免疫共刺激分子，分泌免疫抑制性细胞因子，表达死亡配体或表达抑制性配体等^[2]。许多肿瘤细胞系及肿瘤细胞高表达PD-L1分子，其与淋巴细胞表面的PD-1分子结合后，削弱了机体的抗肿瘤免疫应答，从而导致肿瘤免疫逃逸的发生。另外，肿瘤微环境由肿瘤细胞、血管、组织液、间质细胞和少量浸润的淋巴细胞构成。肿瘤微环境还存在一些炎性细胞因子，如IFN-α和IFN-γ等，这些细胞因子可促进肿瘤细胞表面PD-L1的表达，在肿瘤的免疫逃逸过程中发挥了重要作用。

之前的研究认为，肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte，TIL)与肿瘤细胞特异性结合后，可杀伤肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞凋亡，从而起到抗肿瘤的作用。但随着研究的深入，人们发现肿瘤细胞高表达PD-L1分子，而TIL细胞高表达PD-1分子。肿瘤细胞表达的PD-L1与TIL表达的PD-1结合后，可抑制TIL细胞的活化并诱导其凋亡，从而抑制机体的抗肿瘤免疫，导致肿瘤免疫逃逸的发生。

治疗性抗PD-L1抗体

PD-L1广泛表达在造血系统和非造血系统肿瘤细胞表面。最初的研究发现，PD-L1主要表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，但是随着研究的深入，发现除了淋巴细胞，PD-L1也表达于其他多种组织如胸腺、心脏、胎盘等的内皮细胞，以及胰岛的β细胞等。在临床前的动物实验模型中，用针对PD-1和其配体PD-L1两个靶点的单克隆抗体阻断PD-1通路，能激发细胞毒活性并抑制肿瘤细胞的生长。目前作用于PD-1/PD-L1的这些药物虽然彼此在作用机制上有些许不同，但每个药物都设计为阻断PD-1和它的配体的相互作用，从而使T细胞的“开关”保持在“开”的位置。

到目前为止，应用免疫组织化学方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤等人类肿瘤组织中检测到PD-L1蛋白的表达，且PD-L1的表达水平和患者的临床病理特征及预后紧密相关。

抗PD-L1单抗的临床研究

随着人们对肿瘤分子发生机制研究的不断深入，越来越多的学者把癌症的发生发展归因于一系列的肿瘤细胞的免疫逃逸策略。分子免疫治疗将会是除手术及化学药物治疗之外的另一有效的治疗手段。目前生物治疗在肿瘤治疗中的作用逐年提高，生物治疗在防止肿瘤复发、治疗晚期癌症及其并发症等诸多方面具有诸多优势，但是安全性也是现在关注的重点。期中抗PD-L1单抗是临床上非常具有前景的单抗之一。

鼠源单克隆抗体技术(杂交瘤技术)

杂交瘤技术的基本原理

小鼠骨髓瘤细胞能在体内外无限增殖和分泌无抗体活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾细胞具有产生抗体的能力，但不能无限增殖。因此，采用融合剂将这两种细胞融合成杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞具有亲代细胞的主要特征，既能在人工培养的条件下无限增殖，又能产生特异性的抗体。由于每一个被免疫的淋巴细胞只能对某个单一的抗原决定簇产生特异性抗体，因而在将其克隆化后产生的单克隆细胞系，就能产生大量单一的高纯度抗体，即“单克隆抗体”。

细胞融合培养时加入HAT(H-次黄嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶)选择系统，目的是保证只有杂交瘤细胞的生长。融合细胞能在HAT选择性培养基上生长的原理是：在HAT系统中，A阻断了核酸合成的主要途径，这时正常细胞可以通过“补救途径”，由胸腺嘧啶激酶(TK)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)利用T和H合成核酸。骨髓瘤细胞，因缺乏HGPRT不能利用“补救途径”，所以在HAT系统中不能存活。而骨髓瘤细胞和脾细胞的杂交细胞，从正常的脾细胞获得了HGPRT，能够存活，正常脾细胞没有在体外长期生长的能力。

杂交瘤技术的优、缺点

由于鼠源单克隆抗体是单细胞繁殖的细胞所产生的抗体，具有特异性强，纯度高，可以大规模工厂化生产等优点，从而使免疫分析技术准确性高，重复性好，方法简便。但该技术所需仪器设备昂贵，加之实验程序较为复杂，又因单克隆抗体针对某一抗原决定簇，抗原化合价常常不能与抗原形成网络沉淀，不能用于沉淀衍生出来的免疫技术。

杂交瘤技术的应用

20世纪70年代中期以细胞融合为基础的鼠杂交瘤技术的问世，由此制备出的单克隆抗体是抗单一抗原决定簇的抗体，具有高度的特异性和均一性，且能使得人们能够大量获得鼠源单抗，这成为抗体研究领域的一次重大革命。早期的鼠源单抗在临床上有多方面的应用，如感染性疾病和肿瘤的治疗、体内定位诊断、免疫调节等。

第一个应用单抗治疗的病例发生在1982年，Levy等制备了针对一位B淋巴细胞瘤患者瘤细胞的独特性单抗，患者经此抗体治疗后，病情缓解，瘤体消失。此次临床治疗的成功，使治疗性单抗成为生物医学的研究热点，许多以单抗为研究对象的公司也随之相继成立。1986年，应用此技术制备的第一个单克隆抗体药物OKT3被美国FDA批准上市，被用于治疗器官移植后的免疫排斥。但由于抗体是鼠源的，在病人中引发了严重的免疫反应，这就大大阻碍了抗体药物的发展。

人源单克隆抗体技术

随着抗体被用来开发成药物，它的一些特征也被严格考量，如免疫原性、亲和力、稳定性、效应功能、半衰期、组织渗透性及其分布等。在鼠源MAb生产变得成熟时，研究者便预想通过常规的杂交瘤技术生产人源MAb，但由于人杂交瘤细胞系不能稳定的生产高产量的抗体，并且对于很多抗原来说，人的体内免疫是不可行的。这样，基因工程抗体由然而生，1994年，第一个嵌合抗体ReoPro获准上市，临床应用表明其免疫原性远优于鼠源抗体，这就掀起了继杂交瘤单克隆抗体之后抗体工程研究领域的又一次革命。特别是90年代中期以来，为进一步降低免疫反应的发生，多种人源化改造技术被成功开发并得以应用，各种各样的基因工程抗体及抗体库不断出现，使得大规模生产医用人源化抗体成为可能。从1997年开始，大批的单抗药物被FDA批准上市。

单抗人源化改造技术的应用打破了抗体药物产业化的瓶颈。迄今，按照人源化程度的高低大体可分为三种技术：人鼠嵌合、人源化和全人源，其基因中人源序列占比分别为75％、95％和100％。其中嵌合抗体是将鼠杂交瘤单克隆抗体基因的可变区和人的恒定区连接在一起，然后在哺乳动物细胞中进行表达产生；而人源化抗体则是除了将抗体的恒定区换成人源的之外，更进一步的将可变区的FR区转换成人源的，从而降低免疫原性；而全人源抗体制备则是有四种途径，一种从采集的病人血样中构建Fab或者ScFv文库，并通过噬菌体展示筛选抗体库，来产生人源MAb。2002年，第一个全人源MAb阿达木单抗(Humira)就是通过噬菌体展示开发出来的。第二种生产人源抗体的策略是用含有人免疫球蛋白基因位点的转基因小鼠，进行免疫，可以产生人抗体的免疫应答，这样通过传统的杂交瘤技术可以来生产人源MAb。第三种途径是通过分离培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，然后用抗原进行免疫刺激，产生免疫应答，然后再和人类骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，经筛选得到人源单克隆抗体，并立即进行分子克隆抗体基因，使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体，这种抗体完全是在人细胞环境中生成的。第四类途径是通过分离和低密度(约500B细胞每96孔)培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，对培养上清进行抗原特异性筛选，对阳性孔B细胞进行分子克隆获得人抗体基因，再使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体。

随着人源化和全人源抗体技术的成熟，如何提高抗体的亲和力成了目前所有基因工程抗体药物需要解决的关键问题。这是因为增加一个抗体的亲和力将降低抗体药物的剂量并起到更好的生物活性，还可能使其治疗更多的疾病及降低剂量相关的毒性。此外，费用也将大大降低。多项独立的研究表明，抗体亲和力和生物学活性在达到极限值之前是成线性关系的。围绕这一问题人们已经从不同的方向展开了研究，提高抗体亲和力的途径基本有两条途径，其中一个途径是通过随机突变CDR或是整个的VR，然后从这个大量的突变体库里筛选更高亲和力的抗体；另一个途径是通过集中突变或是建模模拟体内亲和力成熟的热点区域，建立一个小的突变体库。综合起来说，当进行体外抗体亲和力成熟时，应考虑4个主要方面：①在抗体基因的何处导入突变；②如何导入突变；③如何从较低亲和力的抗体中选择稀有的更高亲和力抗体。④如何鉴别更高亲和力抗体。

总之，单抗是特异性很强的药物，人源化单抗很好地解决了免疫原性等问题，它在治疗肿瘤或其他疾病领域比其化学药物的副作用低得多。所以，长远地说，人源化单抗有着广阔的前景。从商业的角度来讲，治疗性人源抗体的市场也是巨大的。随着基因组学和蛋白组学的发展，越来越多的基因及其相关蛋白的发掘，与肿瘤和其他疾病相关的抗原就成为了治疗性抗体研究的主要靶标，治疗性人源单抗将在人类疾病治疗中扮演重要角色。

发明内容

有鉴于此，本发明提供单克隆抗体及其应用。作为抗PD-L1的新抗体，能够结合人PD-L1及猴PD-L1，可呈剂量依赖性阻断人PD-L1与人PD-1的结合；结合细胞表面PD-L1并剂量依赖性阻断细胞表面人PDL-1与人PD-1的结合；促进T细胞的增殖，刺激淋巴细胞IL-2和IFNγ的分泌。通过阻断PD-1/PD-L1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增殖，发挥杀伤肿瘤细胞的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗PD-L1单克隆抗体，其具有：

(Ⅰ)、重链可变区如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列；或

(Ⅱ)、轻链可变区如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列；或

(Ⅲ)、(Ⅰ)或(Ⅱ)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；

(Ⅳ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述抗PD-L1单克隆抗体的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。

在本发明的一些具体实施方案中，所述抗PD-L1单克隆抗体具有：

(ⅰ)氨基酸序列为SEQIDNO:1的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:4的轻链可变区；或

(ⅱ)氨基酸序列为SEQIDNO:1的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:5的轻链可变区；或

(ⅲ)氨基酸序列为SEQIDNO:1的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:6的轻链可变区；或

(ⅳ)氨基酸序列为SEQIDNO:2的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:4的轻链可变区。

(Ⅴ)氨基酸序列为SEQIDNO:2的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:5的轻链可变区。

(Ⅵ)氨基酸序列为SEQIDNO:2的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:6的轻链可变区。

(Ⅶ)氨基酸序列为SEQIDNO:3的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:4的轻链可变区。

(Ⅷ)氨基酸序列为SEQIDNO:3的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:5的轻链可变区。

(Ⅸ)氨基酸序列为SEQIDNO:3的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:6的轻链可变区。

本发明还提供了编码所述抗PD-L1单克隆抗体的核苷酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸具有

(Ⅰ)如SEQIDNo.7或8或9所示的重链可变区的核苷酸序列；如SEQIDNo.10或11或12所示的轻链可变区的核苷酸序列；或

(Ⅱ)如SEQIDNo.7或8或9所示的重链可变区的核苷酸序列的互补序列；如SEQIDNo.10或11或12所示的轻链可变区的核苷酸序列的互补序列；或

(Ⅲ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或

(Ⅳ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸具有与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸具有与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。

本发明还提供了一种表达载体，包括所述核苷酸。

本发明还提供了一种经所述表达载体转化获得的细胞。

本发明还提供了一种结合物，包含与同位素、免疫毒素和/或化学药物共价连接的所述抗PD-L1单克隆抗体。

本发明还提供了一种偶联物，其由所述抗PD-L1单克隆抗体和/或所述结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。

本发明还提供了所述抗PD-L1单克隆抗体和/或所述结合物和/或所述偶联物在制备治疗疾病的药物中的应用；

所述疾病为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤或黑素瘤。

本发明还提供了一种药物组合物，包括所述抗PD-L1单克隆抗体和/或如所述结合物和/或所述偶联物。

本发明还提供了一种试剂盒，包括所述抗PD-L1单克隆抗体和/或所述结合物和/或所述偶联物。

本发明提供了一种抗PD-L1单克隆抗体，其具有：

(Ⅰ)、重链可变区如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或

(Ⅱ)、轻链可变区如SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的氨基酸序列；或

本发明还提供了如所述的抗PD-L1单克隆抗体和/或如所述的结合物和/或如所述的偶联物治疗疾病的方法，所述疾病为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤或黑素瘤。

本发明提供的PD-L1单抗能有效抑制局部肿瘤生长；阻断PD-1/PD-L1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增殖，发挥杀伤肿瘤细胞的作用；阻断肿瘤细胞上相关PD-L1信号可上调浸润CD8+T细胞IFN-γ的分泌，表明PD-1/PD-L1信号通路的阻断在以诱导免疫应答为目的的肿瘤免疫应答中发挥作用；选择抗PD-L1单抗配合肿瘤疫苗进行肿瘤免疫治疗可有效加强肿瘤疫苗的免疫激活。目前，抗PD-1/PD-L1治疗以其良好的疗效和安全性走在了免疫治疗的前列，成为近两年肺癌治疗领域的热门靶点，有益于人类疾病的治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1～图2分别为候选抗体与humanPDL-1及monkeyPDL-1结合亲和力测试结果；结果表明上述抗体均与humanPDL-1及monkeyPDL-1有良好的结合活性；

图3～图4为候选抗体与monkeyPDL-1结合亲和力测试结果；结果表明H017-6F11.3.2、H017-9C10.2.8、H017-9F7.5.4.10、H017-1B8.4.3.1、H018-17B5.5.1与monkeyPDL-1有良好的结合活性；

图5～图7为候选抗体剂量依赖性阻断人PDL-1与人PD-1的结合；结果表明H017-9C10.2.8、H017-2F12.2.2、H018-13H10.2.6、H017-1B8.4.3.1、H018-17B5.5.1的阻断效应较强，将会对上述抗体进行细胞学的相关实验验证活性；

图8为候选抗体H017-6F11.3.2、H017-9C10.2.8、H017-9F7.5.4.10、H018-17B5.5.1与HCC827细胞表面PDL-1结合EC50的测定结果；其中，图8(A)示抗体H017-6F11.3.2及H017-9C10.2.8与HCC827细胞表面PDL-1结合EC50的测定结果；图8(B)示H017-9F7.5.4.10及H018-17B5.5.1与HCC827细胞表面PDL-1结合EC50的测定结果；图8(C)示PD1-mFc及PD1-hFc与HCC827细胞表面PDL-1结合EC50的测定结果；结果显示，抗体能有效地结合宿主细胞HCC827表面的靶标PDL-1蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系，各剂量的荧光强度如本图所示；通过分别对结合的抗体进行荧光定量分析和曲线模拟，得到抗体的结合效率EC50；

图9为候选抗体6F11，9C10，17B5，9F7剂量依赖性阻断细胞表面人PDL-1与人PD-1的结合；其中，图9(A)示pcAb剂量依赖性阻断细胞表面人PDL-1与人PD-1的结合；图9(B)示9C10剂量依赖性阻断细胞表面人PDL-1与人PD-1的结合；图9(C)示9F7剂量依赖性阻断细胞表面人PDL-1与人PD-1的结合；图9(D)示17B5剂量依赖性阻断细胞表面人PDL-1与人PD-1的结合；图9(E)示6F11剂量依赖性阻断细胞表面人PDL-1与人PD-1的结合；结果显示，抗体能有效地阻断表面表达PDL1的293T细胞与PD-1的结合，并且其阻断效率呈剂量依赖关系，各剂量的荧光强度见表5；通过分别对结合的抗体进行荧光定量分析和曲线模拟，得到抗体的阻断效应EC50；

图10为候选抗体H017-6F11.3.2、H017-9C10.2.8、H017-9F7.5.4.10、H018-17B5.5.1的T淋巴细胞增殖实验；结果显示6F11，9C10，17B5，9F7均能够有效的促进T淋巴细胞增殖；

图11～图12为候选抗体6F11，9C10，17B5，9F7对淋巴细胞反应的实验；结果显示抗体6F11，9C10，17B5，9F7可以刺激T细胞IL-2和IFNγ的分泌，分泌量呈剂量依赖关系；

图13～图14为重组抗体与humanPDL-1结合亲和力测定实验；结果显示重组6F11，

9C10，17B5抗体均能够与humanPDL-1结合。

具体实施方式

本发明公开了单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种鼠抗人PD-L1单克隆抗体，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为：

SeqIDNO:1

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYIHWMRQRPEQGLEWIGRIDPANDNTKYDPKFQGKATVTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGLRLRYFDVWGAGTTVTVSS

SeqIDNO:2

QVQLKQSGFGLVLPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGLIWSGGGTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKINSLQANDTAIYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSS

SeqIDNO:3

QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYKFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNPNYDEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARERWMDSWGQGTSVTVSS中的一个，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为

SeqIDNO:4

DIQMTQTPSSLSASLGGKVTITCKASQDIHKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDFSFSISNLEPEDFETYYCLQYENLLPTFGGGTKLEIK

SeqIDNO:5

DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTTIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESVSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPLTFGAGTKLEIK

SeqIDNO:6

DIQMTQTASSLSASLGDRVTISCSASQGIFNYLNWYQQKPDGTVTVLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIK

在本发明的一些实施例中，其中所述抗体的重链可变区和轻链可变区为：

1)氨基酸序列为SeqIDNO:1的重链可变区，和氨基酸序列为SeqIDNO:4的轻链可变区；

2)氨基酸序列为SeqIDNO:1的重链可变区，和氨基酸序列为SeqIDNO:5的轻链可变区；

3)氨基酸序列为SeqIDNO:1的重链可变区，和氨基酸序列为SeqIDNO:6的轻链可变区；

4)氨基酸序列为SeqIDNO:2的重链可变区，和氨基酸序列为SeqIDNO:4的轻链可变区；

5)氨基酸序列为SeqIDNO:2的重链可变区，和氨基酸序列为SeqIDNO:5的轻链可变区；

6)氨基酸序列为SeqIDNO:2的重链可变区，和氨基酸序列为SeqIDNO:6的轻链可变区；

7)氨基酸序列为SeqIDNO:3的重链可变区，和氨基酸序列为SeqIDNO:4的轻链可变区；

8)氨基酸序列为SeqIDNO:3的重链可变区，和氨基酸序列为SeqIDNO:5的轻链可变区；

9)氨基酸序列为SeqIDNO:3的重链可变区，和氨基酸序列为SeqIDNO:6的轻链可变区。

本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的抗体。

本发明还提供了一种载体，所述载体中包含所述的多核苷酸。

本发明还提供了一种抗人PD-L1的结合物，所述结合物包含与同位素、免疫毒素和/或化学药物共价连接的所述的抗体。

本发明还提供了一种偶联物，所述偶联物为所述的抗体或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联而形成的。

本发明还提供了所述的抗体、所述的结合物或所述的偶联物在制备用于治疗下述疾病的药物中的应用，所述疾病为：乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的抗体、所述的结合物和/或所述的偶联物。

本发明还提供了一种用于诊断乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤的试剂盒，所述试剂盒包含所述的抗体、所述的结合物和/或所述的偶联物。

本发明的抗体的重链恒定区分别6F11为鼠IgG2b，9C10和17B5都为鼠IgG1，轻链恒定区为鼠κ链的恒定区，重链可变区的氨基酸序列为SeqIDNO:1、SeqIDNO:2、SeqIDNO:3中的一个，轻链可变区的氨基酸序列为SeqIDNO:4、SeqIDNO:5、SeqIDNO:6中的一个。

其中优选9种抗体，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为：

重链可变区轻链可变区

1)SeqIDNO:1SeqIDNO:4；

2)SeqIDNO:1SeqIDNO:5；

3)SeqIDNO:1SeqIDNO:5；

4)SeqIDNO:2SeqIDNO:4；

5)SeqIDNO:2SeqIDNO:5；

6)SeqIDNO:2SeqIDNO:6；

7)SeqIDNO:3SeqIDNO:4；

8)SeqIDNO:3SeqIDNO:5；

9)SeqIDNO:3SeqIDNO:6.

本发明还提供了编码重链可变区和轻链可变区的氨基酸的核苷酸，具有：

(Ⅳ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。

其中：6F11(RE)VH：如SEQIDNO:7所示：

GAAGTCCAGCTGCAGCAGAGTGGGGCCGAGCTGGTGAAACCAGGGGCTTCCGTCAAGCTGTCTTGCACTGCAAGCGGATTCAACATCAAAGACACCTACATTCACTGGATGCGGCAGAGACCCGAGCAGGGACTGGAATGGATCGGCCGAATTGACCCCGCCAACGATAATACAAAGTACGACCCTAAATTTCAGGGCAAGGCCACTGTGACCGCTGATACAAGCTCCAATACTGCTTATCTGCAGCTGTCTAGTCTGACCAGCGAGGACACAGCAGTGTACTATTGTGCCAGAGGGCTGAGGCTGCGCTATTTCGATGTCTGGGGCGCCGGAACCACAGTGACCGTCTCATCC；

9C10(RE)VH：如SEQIDNO:8所示：

CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCTGGGTTTGGCCTGGTGCTGCCCTCTCAGAGTCTGTCAATCACCTGCACAGTCTCAGGGTTCAGCCTGACATCCTACGGAGTGCACTGGGTCAGGCAGTCCCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGCTGGGACTGATTTGGTCTGGCGGGGGAACTGACTATAACGCCGCTTTTATCAGTCGGCTGAGCATTTCCAAGGATAACTCTAAGAGTCAGGTGTTCTTTAAAATCAACTCTCTGCAGGCAAATGACACCGCCATCTACTATTGTGCTCGGCAGCTGGGGCTGAGAGCCATGGATTACTGGGGACAGGGCACTAGCGTGACCGTCAGCTCC；

17B5(RE)Hv：如SEQIDNO:9所示：

CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGCCGAGCTGATGAAACCAGGCGCTAGCGTGAAAATCTCCTGCAAGGCAACCGGGTACAAATTCAGCTCCTATTGGATTGAGTGGGTCAAGCAGAGGCCAGGACACGGACTGGAGTGGATCGGAGAAATTCTGCCCGGAAGCGGCAACCCTAATTACGACGAAAAGTTCAAAGGCAAGGCCACCTTTACAGCTGATACATCTAGTAACACTGCCTATATGCAGCTGTCAAGCCTGACAAGTGAGGACTCAGCAGTGTACTATTGTGCCCGGGAAAGATGGATGGATTCTTGGGGGCAGGGAACTTCCGTGACCGTCTCCTCC；

6F11(RE)VL：如SEQIDNO:10所示：

GACATTCAGATGACTCAGACTCCTTCAAGTCTGTCAGCCAGCCTGGGCGGGAAGGTGACCATCACATGCAAAGCATCCCAGGACATCCACAAGTACATTGCCTGGTATCAGCATAAGCCTGGGAAAGGACCACGGCTGCTGATCCACTACACTTCAACCCTGCAGCCAGGCATTCCCAGCCGGTTCTCCGGCTCTGGGAGTGGAAGAGACTTCAGCTTCAGCATTTCCAACCTGGAGCCCGAAGATTTCGAGACCTACTATTGCCTGCAGTATGAAAATCTGCTGCCTACTTTTGGAGGCGGGACCAAGCTGGAGATCAAA；

9C10(RE)VL：如SEQIDNO:11所示：

GACATCCTGCTGACACAGAGTCCTGCTATCCTGTCAGTGAGCCCAGGAGAGCGGGTCTCCTTCTCTTGCAGAGCTAGTCAGTCAATCGGCACCACAATTCACTGGTACCAGCAGAGGACCAACGGGTCTCCACGCCTGCTGATCAAGTATGCAAGCGAATCCGTGTCTGGCATTCCCTCCAGATTCAGTGGATCAGGCAGCGGGACAGACTTTACTCTGAGCATCAACTCCGTCGAGTCTGAAGACATTGCCGATTACTATTGCCAGCAGTCCAATTCTTGGCCTCTGACTTTCGGAGCAGGCACCAAGCTGGAGATCAAA；

17B5(RE)VL：如SEQIDNO:12所示：

GACATTCAGATGACTCAGACCGCCTCTTCACTGTCAGCAAGCCTGGGGGACCGGGTGACTATCTCCTGCTCTGCCAGTCAGGGAATTTTCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCTGATGGCACCGTGACAGTCCTGATCTACTATACCTCTCGGCTGCACAGTGGGGTCCCATCAAGATTTTCAGGAAGCGGCTCCGGGACCGACTACAGCCTGACAATCTCCAACCTGGAGCCAGAAGATATTGCCACATACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCCTATACTTTCGGCGGGGGAACCAAGCTGGAGATCAAA。

本领域技术人员将知晓的是，上述抗体中的保守性氨基酸替换并不会实质性地影响抗体的亲和力和结构，尤其是所述保守性替换发生在恒定区时。本领域技术人员还知晓，根据上述抗体的氨基酸序列可以设计出编码其的核苷酸序列，并且针对不同的表达宿主对该核苷酸序列进行优化。为了治疗、检测、实验或其他目的，本发明的抗体可以与同位素、免疫毒素和/或化学药物共价连接，还可以与固体介质、半固体介质偶联，还可以使用本发明的抗体的功能性片段，这在本领域中是已知的。

本发明提供了一种方法，使用该方法制造鼠抗人单克隆抗体。该方法所克服的最重要的技术难点是(1)淋巴细胞体外有效免疫技术；(2)杂交瘤特异性和功能性的筛选；(3)重组抗体的制备。

所述抗体的制造及相关检测方法如下：首先构建humanPD-L1与TEV-mlgG2aFc融合蛋白的重组表达载体pcDNA3.1-PDL1-TEV-mlgG2aFc，将重组质粒转染FreeStyle293-FCells细胞培养表达，将细胞上清通过ProteinA柱进行纯化，得到纯化的蛋白即抗原humanPDL-1-mFc融合蛋白，SDS-PAGE鉴定融合蛋白。以抗原与佐剂的体积为1:1的比例对免疫原PDL1-mFc进行乳化，首次免疫使用弗氏完全佐剂进行乳化抗原，第二次免疫开始，使用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下5点注射，每只小鼠注射的抗原的量为50μg，每个注射点注射的体积为50μL。在第二次免疫后10天，对小鼠剪尾采集少量血液样本进行血清效价检测，经间接ELISA检测血清效价滴度达到1:81000或者以上，小鼠进行加强免疫。共进行3组免疫，每组为5只小鼠。取加强免疫后的小鼠脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生临时稳定的鼠杂交瘤细胞，培养上清中含有其分泌的抗体。通过细胞抗体ELISA竞争力筛选，初筛、复筛后筛选到候选抗体。通过有限稀释的方法将阳性克隆孔亚克隆化，筛选出保持抗原特异性的单克隆细胞株26个，并冻存细胞株，-80℃冻存过夜后，液氮保存。根据ELISA检测结果综合评估筛选出最好的9个细胞生长孔，对其细胞上清进行纯化得候选抗体，候选抗体均进行了以下测试：与humanPD-L1结合亲和力测定；与monkeyPD-L1结合亲和力测定；剂量依赖性阻断人PD-L1与PD1的结合；与细胞表面PD-L1结合(FACS)；剂量依赖性阻断细胞表面人PD-L1与人PD1的结合(FACS)；Tcellproliferation实验；混合淋巴细胞反应(MLR)及重组抗体的与humanPD-L1结合亲和力测定(ELISA)。根据测试的实验数据，筛选出3个可以进行成药研究的抗人PD-L1单克隆抗体，H017-6F11.3.2、H017-9C10.2.8、H018-17B5.5.1。这3个鼠抗人抗体在体外与human与monkeyPD-L1具有良好的结合活性，能够阻断humanPD-L1与PD-1的结合，同时能够促进免疫细胞的增殖和活化。

本发明提供的单克隆抗体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：杂交瘤和载体的制备

1.抗原和淋巴细胞的准备及免疫

1.1抗原准备：

1.1.1表达人源PDL1蛋白的293F细胞的制备

融合人源PDL1氨基酸序列与TEV-mlgG2aFc氨基酸序列，氨基酸序列设计如SEQIDNo.13所示：

FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERKLENLYFQGPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

上述设计的融合蛋白(PDL1-TEV-mIgG2aFc)所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化，并委托金斯瑞公司合成优化后的DNA，克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得pUC57simple-PDL1-TEV-mIgG2aFc质粒。

酶切(XbaI和BamHI)质粒pUC57simple-PDL1-TEV-mIgG2aFc和载体pcDNA3.1，电泳回收得到的融合基因片段PDL1-TEV-mIgG2aFc并与pcDNA3.1载体进行连接反应重组构建获得pcDNA3.1-PDL1-TEV-mIgG2aFc。

将上面构建的重组质粒pcDNA3.1-PDL1-TEV-mIgG2aFc转染FreeStyle^TM293-FCells细胞7天后，将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤。

1.1.2表达人源PDL1蛋白纯化

根据厂家提供的操作方法采用ProteinA柱(蛋白纯化液相色谱系统/AKTAPurifier10,GE)进行纯化，得到纯化的humanPDL-1-mIgG2aFc融合蛋白。AKTA用超纯水冲洗干净连接1mlrProtianAFastFlow预装柱到AKTA上；清洗：用1MHAC清洗5个柱体积。平衡：20mMPB0.15MNaCl(pH7.0)平衡5个柱体积。

上样：将细胞表达上清样品1000rpm×5min离心，取上清，8000rpm×30min离心，取20ml离心后上清上样，流速0.2ml/min。平衡：20mMPB0.15MNaCl(pH7.0)平衡5个柱体积，0.2ml/min。清洗：20mMPB1MNaCl(pH7.0)清洗5个柱体积。平衡：20mMPB0.15MNaCl(pH7.0)平衡5个柱体积。

洗脱：20mM枸橼酸钠缓冲液(pH3.0)洗脱，流速0.2ml/min。UV280至100mAu时开始收集，降至100mAu时停止收集。用1MTris将样品pH调节至pH6～8。

1.2淋巴细胞的准备

1.2.1小鼠的免疫：

以抗原与佐剂的体积为1:1的比例对免疫原PDL1-mFc进行乳化，首次免疫使用弗氏完全佐剂乳化抗原，第二次免疫开始，使用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下5点注射，每只小鼠注射的抗原的量为50μg，每个注射点注射的体积为50μL。

在第二次免疫后10天，对小鼠剪尾采集少量血液样本进行血清效价检测，经间接ELISA检测血清效价滴度达到1:81000或者以上，小鼠进行加强免疫。

共进行3组免疫，每组为5只小鼠。

1.2.2淋巴细胞的获取：

处死经过加强免疫的小鼠，解剖分离出脾脏并在细胞筛网上研磨制备成单细胞悬液，与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14以5:1的比例混合，离心敲散细胞团后在37℃水浴中缓慢滴加PEG/DMSOSOLUTION作用完成细胞融合，离心处理后用含1×HAT，15％胎牛血清，1×青链霉素的IMDM培养基进行重悬并且铺到96孔细胞培养板中培养。

2.鼠杂交瘤细胞的制备及检测

2.1饲养细胞的准备

剪开正常BALB/C小鼠(已处死)的腹部皮肤。暴露腹膜。用注射器注入和吸出IMDM培养基，洗涤出腹腔巨噬细胞，收集于离心管中1500rmp/min离心3min，取下层褐色沉淀。按上述步骤获取3只正常小鼠的腹腔巨噬细胞。

2.2骨髓瘤细胞准备

提前一周复苏SP2/0-Ag14，并用含1×8-氮鸟嘌呤的完全培养基培养，融合前两天换用15％胎牛血清的IMDM培养，维持SP2/0的密度为70％-80％至融合当天。

2.3细胞融合及HAT筛选：

脾细胞的制备：处死免疫小鼠，收集鼠1、鼠2(记为L1、L2)的免疫血清。剪开免疫小鼠的腹部侧面的皮肤和腹膜，暴露脾脏。用剪尖剔除周围组织，获取脾脏，用细胞滤网使消毒后的脾脏形成单细胞悬液。L₁、L₂两管混合。

细胞融合前处理：收集培养瓶内的SP2/0，重复1500rpm/min离心后弃上清并重悬两次，然后进行活细胞计数。1500rpm/min离心脾细胞悬液，弃上清后培养基重悬，然后进行活细胞计数。最后计得SP2/0活细胞数，脾细胞活细胞数。

细胞融合：取1/5的脾细胞加入到SP2/0悬液中，1500rpm/min离心后倒净上清，震散细胞沉淀，最后管内细胞比例为脾细胞：SP2/0＝4.8:1。于细胞沉淀的管内缓慢滴加1mlPEG1500，并使管底在37℃水中划圈摇动，上述操作时间控制在1min左右，静置反应30s，于管内由慢到快地加入37℃预热的IMDM培养基，终止反应。将终止反应后的细胞悬液800rpm/min离心3min后弃去上清，轻轻震散细胞沉淀。共进行2次融合。

HAT培养基筛选：配制含1×HAT、1×青-链霉素、15％胎牛血清和85％IMDM培养基的HAT筛选培养基。用上述的HAT筛选培养基重悬鼠杂交瘤细胞和饲养细胞，并混合两者。按300ul/孔将细胞悬液加到20块96孔细胞培养板中，置于37℃细胞培养箱中培养。

2.4扩大培养

将检测后稳定的阳性细胞株96孔细胞转入24孔中培养，待长满于24孔后转入25cm²培养瓶中培养。

2.5有限稀释法亚克隆、细胞扩大培养

吹起阳性克隆孔的细胞并混匀，吸取少量用于活细胞计数。根据细胞浓度从孔中吸取约1000个细胞，以5.4ml上述培养完全培养基混匀，加入96孔细胞培养板的1-3列；以6.2ml完全培养基补加到吸出的细胞悬液中，加入96孔细胞培养板的4-7列；以6.8ml完全培养基补加到吸出的细胞悬液中，加入96孔细胞培养板的8-12列。每块96孔板中理论上应用1000个细胞，并从左到右细胞浓度递减，置37℃CO₂培养箱中培养。

2.6亚类的鉴定

包板羊抗鼠IgG(Fc)，2ug/ml，4℃过夜，BSA封闭，加入待测细胞上清，37℃，2小时，加入酶标亚类二抗IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，κ，λ(SouthernBiotechnology)，显色，A450读数，判断所测细胞株的亚类为IgG2b或IgG1，κ。在加液前每步都用PBST洗涤3次。从被亚克隆的每个鼠杂交瘤细胞株中由步骤

2.7细胞冻存

冻存液配制：90％胎牛血清，10％DMSO。重悬培养瓶内细胞，以1500rpm/min离心3min后弃去上清，细胞计数后以每管5×10⁶细胞数冻存于冻存盒内，-80℃过夜，次日转入液氮中。

2.8单克隆杂交瘤基因保存

杂交瘤进行亚克隆后，筛选出保持抗原特异性的单克隆细胞株H017-9H10.4.7、H017-6F11.3.2、H017-9C10.2.8、H017-2F12.2.2、H017-9F7.5.4.10、H017-6H3.5.1.3.5、H017-13H10.2.6、H017-1B8.4.3.1、H018-17B5.5.1。立即提取RNA,并反转录成cDNA,于-80℃永久保存。

实施例2：阳性对照抗体(PCAB)的制备

1.PCAb抗体序列如下：

PCABH，如SEQIDNo.14所示：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYGFSWVRQAPGQGLEWMGWITAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTVYMELRSLRSDDTAVYYCARDYFYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

PCABL，如SEQIDNo.15所示：

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLVWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

2.将上述的抗体序列所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化，并委托金斯瑞公司合成优化后的DNA，克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得pUC57simple-PCABH，pUC57simple-PCABL质粒.

3.将质粒pUC57simple-PCABH，pUC57simple-PCABL进行酶切后(XbaI和BamHI)，电泳回收得到的基因片段PCABH，PCABL并与pcDNA3.1载体进行连接反应重组构建获得pcDNA3.1-PCABH，pcDNA3.1-PCABL。

4.将上面构建的重组质粒pcDNA3.1-PCABH，pcDNA3.1-PCABL转染FreeStyle^TM293-F细胞7天后，将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，根据厂家提供的操作方法采用ProteinA柱(蛋白纯化液相色谱系统/AKTAPurifier10,GE)进行纯化，得到纯化后的抗体PCAB。

实施例:3：细胞表面表达PDL1蛋白的293T细胞的制备

1.设计、合成PCR扩增引物(10uM，均合成于GenScript)：

PDL1正向引物：

KF021ZP2PDL1-F：

5’-CGCGGATCCGCCGCCACCATGAGGATTTTCG-3’，如SEQIDNo.:16所示；

PDL1反向引物：

KF021ZP2PDL1-R：

5’-CCGCTCGAGGGTTTCTTCCAGATGGGTATCGGACTGC-3’，如SEQIDNo.17所示；

参照uniprot数据库设计PDL1全长表达序列，见seqIDNO:18，在金斯瑞进行密码子优化后进行基因合成，并以合成的PUC57simple-KF021ZP2PDL1为模板，以

KF021ZP2PDL1-F和KF021ZP2PDL1-R为正反向引物，用PhusionDNA聚合酶进行PCR扩增获取KF021ZP2PDL1片段。

PDL1全长氨基酸序列如SEQIDNO:18所示：

MPLLLLLPLLWAGALAYPYDVPDYAGGGGSFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET。

PDL1全长核酸序列SEQIDNO:19

ATGCCACTGCTGCTCTTGCTGCCTCTGCTTTGGGCTGGAGCTCTGGCTTATCCTTACGACGTGCCTGACTACGCCGGTGGAGGCGGTAGCTTTACTGTCACGGTTCCCAAGGACCTATATGTGGTAGAGTATGGTAGCAATATGACAATTGAATGCAAATTCCCAGTAGAAAAACAATTAGACCTGGCTGCACTAATTGTCTATTGGGAAATGGAGGATAAGAACATTATTCAATTTGTGCATGGAGAGGAAGACCTGAAGGTTCAGCATAGTAGCTACAGACAGAGGGCCCGGCTGTTGAAGGACCAGCTCTCCCTGGGAAATGCTGCACTTCAGATCACAGATGTGAAATTGCAGGATGCAGGGGTGTACCGCTGCATGATCAGCTATGGTGGTGCCGACTACAAGCGAATTACTGTGAAAGTCAATGCCCCATACAACAAAATCAACCAAAGAATTTTGGTTGTGGATCCAGTCACCTCTGAACATGAACTGACATGTCAGGCTGAGGGCTACCCCAAGGCCGAAGTCATCTGGACAAGCAGTGACCATCAAGTCCTGAGTGGTAAGACCACCACCACCAATTCCAAGAGAGAGGAGAAGCTTTTCAATGTGACCAGCACACTGAGAATCAACACAACAACTAATGAGATTTTCTACTGCACTTTTAGGAGATTAGATCCTGAGGAAAACCATACAGCTGAATTGGTCATCCCAGAACTACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAGGACTCACTTGGTAATTCTGGGAGCCATCTTATTATGCCTTGGTGTAGCACTGACATTCATCTTCCGTTTAAGAAAAGGGAGAATGATGGATGTGAAAAAATGTGGCATCCAAGATACAAACTCAAAGAAGCAAAGTGATACACATTTGGAGGAGACGTAA。

BamHI,XhoI双酶切KF021ZP2PDL1片段及载体pLenti6.3/V5-GW/lacZ，T4连接酶连接回收的酶切片段及载体，将连接产物转化Stbl3感受态细胞，涂布带有Amp抗性的平板筛选，并挑单克隆进行PCR及酶切鉴定。将鉴定为阳性的克隆培养过夜，取800ul过夜培养的菌液混合400ul的50％甘油，混匀后于-80℃保存备用。

大提PLenti-PDL1质粒。按1％接菌量将菌种接到5ml含有100ug/mLAmp的LB液体培养基中，置于220rpm，37℃恒温振荡摇床活化培养4-6h,然后按10％接到盛有500ml带Amp抗性的LB液体培养基的2L三角瓶中，220rpm，37℃恒温摇床培养过夜；取质粒步骤按照PureYieldTMplasmidMaxiprepSystem试剂盒说明书；

2.293T包装PDL-1病毒和Western-blot检测PDL-1表达

转染前一天在6孔细胞培养板中按每孔1×10⁶个细胞铺板；

稀释质粒DNA：将2ugPLenti-PDL1质粒和2ugVirapowerTMpackagingmix用20ulOpti-MEM培养基稀释；

稀释Lipofectamine2000：将12ugLipofectamine2000用200ulOpti-MEM培养基稀释；将稀释好的DNA与稀释好的Lipofectamine2000混合，混匀后室温孵育20min；将温孵育后的混合样品加入到含有2ml细胞培养液的6孔板中，放在CO2培养箱中培养；

6h后去掉原有细胞培养液，换为新鲜的完全培养基；CO₂培养箱继续培养48h；

收集病毒上清并用0.45um滤膜过滤；取过滤后的病毒上清加入到铺有1X10⁶个细胞的6孔板中，并加入终浓度为6ug/ml的Hexadimethrinebromide(polybrene)；第二天早上去掉原有培养液，换为新鲜的完全培养液；待细胞长满后消化至10cm平皿中继续培养；

用胰酶分别消化正常的293T细胞及感染了PDL1的293T细胞，分别取200万细胞；用RIPA裂解液裂解细胞30min,每个10min剧烈震荡使细胞充分裂解14,000rpm，15min离心收集上清取80ul样品加入20ul5XLoadingBuffer，沸水浴10min。用12％SDS-PAGE胶上样电泳。按照IBlotGeltransferDevice使用说明转膜7min。转膜完毕后，转移到5％脱脂奶粉封闭1h。移去封闭液，加入预先配好的一抗，4℃孵育过夜。移去一抗，用PBST洗膜3遍，每次10min；加入预先配制好的二抗，室温孵育1h；移去二抗，用PBST洗膜3遍，每遍10min。将预先配制好的显色液均匀滴加到膜上，用凝胶成像仪曝光观察结果。

实施例4：单克隆抗体制备及鉴定

1.采用体外培养法制备抗体

将含有15％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基复苏并使用小瓶培养H017-9H10.4.7、H017-6F11.3.2、H017-9C10.2.8、H017-2F12.2.2、H017-9F7.5.4.10、H017-6H3.5.1.3.5、H017-13H10.2.6、H017-1B8.4.3.1、H018-17B5.5.1,待细胞转至中瓶后换含有10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基培养，中瓶补至20ml后转滚瓶培养至200ml。

2.抗体纯化

取出在滚瓶培养了7天左右的细胞上清，经0.22um混合纤维素微孔滤膜真空过滤后，4℃保存，ProteinA亲和层析进行抗体纯化。上样：用PBS平衡纯化柱后，细胞培养上清直接上样；流洗：pH7.4PBS流洗，冲至UV280基线为0；洗脱：pH3.50.1M柠檬酸溶液，每段2ml收集洗脱液，每管加入100ul1MTris溶液；浓缩收集液，使用PBS洗脱至初始成分比例小于0.1％。跑SDS-PAGE胶核实纯化抗体纯度。

实施例5：亲和力测定及竞争性ELISA检测

1.与humanPDL-1结合亲和力测定(ELISA)

包被：PDL1-hFc用CBS稀释成1μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔50μL，4℃下孵育过夜。封闭：洗板三次后用1％BSA+PBS封闭，每孔300μL，37℃下孵育2小时。加抗体：洗板三次后，9个本发明制得的单克隆抗体和阳性对照抗体分别用PBS稀释成1μg/ml起始作1:3梯度稀释A～G等7个浓度梯度，每个样品设2次重复，第H组加PBS做空白对照。每孔100μl，37℃下孵育30分钟。加二抗：洗板三次后，分别对应加入GoatAntiMouseIgG(H+L),HRP(1:5000)和GoatAntiHumanF(ab’)₂，HRP(1:5000)，每孔50μL，37℃下孵育30分钟。显色：洗板四次后，加TMB显色液，每孔50μL，室温下避光显色5分钟。终止：直接加终止液终止反应，每孔50μL。检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据。数据处理：将原始数据输入到软件SoftMaxPro6.2.1中进行数据处理。结果如表1、图1、图2所示。

表1数据结果

抗体名称	与humanPDL-1结合EC50(nM)
		H017-9H10.4.7	0.306
H017-6F11.3.2	0.049
		H017-9C10.2.8	0.079
H017-2F12.2.2	0.094
		H017-9F7.5.4.10	0.054
H017-6H3.5.1.3.5	0.11
		H018-13H10.2.6	0.076
H017-1B8.4.3.1	0.051
		H018-17B5.5.1	0.133
阳性对照抗体	0.316

图1～图2为候选抗体分别与人PDL-1结合亲和力测试结果；结果表明上述抗体均与人PDL-1有良好的结合活性。

2.与monkeyPDL-1结合亲和力测定(ELISA)

包被：MonkeyPDL1-his用CBS稀释成1μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔50μL，4℃下孵育过夜。封闭：洗板三次后用1％BSA+PBS封闭，每孔300μL，37℃下孵育2小时。加抗体：洗板三次后，本发明提供的9个抗体和阳性对照抗体分别用PBS稀释成1μg/ml起始作1:3梯度稀释A～G等7个浓度梯度，每个样品设2次重复，第H组加PBS做空白对照。每孔100μl，37℃下孵育30分钟。加二抗：洗板三次后，分别对应加入GoatAntiMouseIgG(H+L),HRP(1:5000)和GoatAntiHumanIgG(H+L),HRP(1:5000)，每孔50μL，37℃下孵育30分钟。显色：洗板四次后，加TMB显色液，每孔50μL，室温下避光显色5分钟。终止：直接加终止液终止反应，每孔50μL。检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据。数据处理：将原始数据输入到软件SoftMaxPro6.2.1中进行数据处理。结果如表2、图3、图4所示。

表2数据结果

抗体名称	结合EC50(nM)
		H017-9H10.4.7	55.63
H017-6F11.3.2	0.123
		H017-9C10.2.8	0.191
H017-2F12.2.2	17.69
		H017-9F7.5.4.10	0.117
H017-6H3.5.1.3.5	5.798
		H018-13H10.2.6	8.08E+06
H017-1B8.4.3.1	0.333
		H018-17B5.5.1	0.7
PcAb	0.727

图3～图4为候选抗体与猴PDL-1结合亲和力测试结果；结果表明H017-6F11.3.2、H017-9C10.2.8、H017-9F7.5.4.10、H017-1B8.4.3.1、H018-17B5.5.1与猴PDL-1有良好的结合活性。

3.剂量依赖性阻断人PDL-1与人PD-1的结合(ELISA)

包被：PDL1-mFc用CBS稀释成1μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔50μL，4℃下孵育过夜。封闭：洗板三次后用1％BSA+PBS封闭，每孔300μL，37℃下孵育2小时。加抗体：洗板三次后，抗体分别用PBST稀释成6μg/ml(终浓度为3μg/ml)起始作1:3梯度稀释A～G等7个浓度梯度，每个样品设2次重复，第H组加PBST做空白对照(空白对照即为0点)，分两块酶标板做。每孔50μl，37℃下孵育15分钟。加PD1-hFc：将PD1-hFc用PBST稀释成4μg/ml(终浓度为：2μg/ml)，每孔50μl，与抗体充分混匀，37℃下孵育30分钟。加二抗：洗板三次后，分别对应加入GoatAntiHumanIgG(H+L),HRP(1:5000)，每孔50μL，37℃下孵育30分钟。显色：洗板四次后，加TMB显色液，每孔50μL，室温下避光显色5分钟。终止：直接加终止液终止反应，每孔50μL。检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据。数据处理：将原始数据输入到软件SoftMaxPro6.2.1中进行数据处理。结果如表3、图5～图7所示(图中的数据为最终计算所得数据)。

表3数据结果

图5～图7为候选抗体剂量依赖性阻断人PDL-1与人PD-1的结合；结果表明H017-9C10.2.8、H017-2F12.2.2、H018-13H10.2.6、H017-1B8.4.3.1、H018-17B5.5.1的阻断效应较强，将会对上述抗体进行细胞学的相关实验验证活性。

4.与细胞表面PDL-1结合的测定(FACS)

常规胰酶消化细胞获取表面表达PDL1的293T细胞，对其进行细胞计数；取适量细胞，4000rpm/min离心5min，并用PBS洗一次；PBS悬浮细胞，将细胞浓度稀释为2.0×10⁶，并将抗体稀释成100μL工作液，与细胞稀释液等体积混合，冰上孵育30min；4000rpm/min离心5min，并用PBS洗一次；将羊抗鼠二抗或羊抗人二抗按1:500稀释后，每管加入100μL，冰上避光孵育30min；4000rpm/min离心5min，并用PBS洗一次；每管加入300μLPBS，转移至流式上样管中，上机测试。结果见表4、图8所示。

表4数据结果

图8为候选抗体H017-6F11.3.2、H017-9C10.2.8、H017-9F7.5.4.10、H018-17B5.5.1与HCC827细胞表面PDL-1结合EC50的测定结果；结果显示，抗体能有效地结合宿主细胞HCC827表面的靶标PDL-1蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系，各剂量的荧光强度如本图所示；通过分别对结合的抗体进行荧光定量分析和曲线模拟，得到抗体的结合效率EC50。

5.剂量依赖性阻断细胞表面人PDL-1与PD-1的结合(FACS)

取适量细胞，4000rpm/min离心5min，并用PBS洗一次；PBS悬浮细胞，将细胞浓度稀释为2.0×10⁶，并将抗体稀释成100μL工作液，与细胞稀释液等体积混合，冰上孵育30min；常规胰酶消化细胞获取293T细胞，对其进行细胞计数；每管加入适量的PD1-hFc，使其终浓度为20nM，冰上孵育1h；4000rpm/min离心5min，并用PBS洗一次；将羊抗人二抗按1:500稀释后，每管加入100μL，冰上避光孵育30min；4000rpm/min离心5min，并用PBS洗一次；每管加入300μLPBS，转移至流式上样管中，上机测试。结果如表5、图9所示。

表5数据结果

图9为候选抗体6F11，9C10，17B5，9F7剂量依赖性阻断细胞表面人PDL-1与人PD-1的结合；结果显示，抗体能有效地阻断表面表达PDL1的293T细胞与PD-1的结合，并且其阻断效率呈剂量依赖关系，各剂量的荧光强度见下表。通过分别对结合的抗体进行荧光定量分析和曲线模拟，得到抗体的阻断效应EC50。

实施例6：Tcellproliferation实验

收集PBMC细胞，计数，收集2×10⁷个；离心300g，10min，去上清，用40μlBuffer重悬细胞；加入20μlCD4+Tcellbiotin-antibodycocktail,4℃孵育10min；放置好磁架，用1mlbuffer平衡好柱子，并将混合液过柱；用1mlbuffer洗涤，用15ml离心管收集洗出来的细胞；配置包被液(Anti-CD3，0.5mg/ml；PDL1-hFc，4.58mg/ml)

0.2μg/mlanti-CD3(500μlPBS+0.2μlanti-CD3)

0.6μg/mlanti-CD3(500μlPBS+0.6μlanti-CD3)

2μg/mlanti-CD3(500μlPBS+2μlanti-CD3)

0.6μg/mlPDL1-hFc(500μlPBS+0.6μlPDL1-hFc)

2μg/ml(500μlPBS+21.6μlPDL1-hFc)

6μg/ml(500μlPBS+65μlPDL1-hFc)

按照表6包被：

表6包被设置

Anti-CD3(μg/ml)	0	0	0.1	0.3	1	0	0	0	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
																PDL1-hFc(μg/ml)	0	0	0	0	0	0.3	1	3	1	1	1	1	1	1	1
PHA(μl/ml))	0	50	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

加入抗体后，加入PBS，保证每孔总体积为50μl，4度过夜；去掉包被液，用PBS洗3次，加入100μl1×10⁵个/孔CD4+Tcell；加入抗体，在培养箱孵育5天，加入100μlcelltiter试剂，检测荧光值。

如图10所示：图10为候选抗体H017-6F11.3.2、H017-9C10.2.8、H017-9F7.5.4.10、H018-17B5.5.1的T淋巴细胞增殖实验；结果显示6F11，9C10，17B5，9F7均能够有效的促进T淋巴细胞增殖。

实施例7：混合淋巴细胞反应(MLR)

生物安全柜中操作以下实验。将血液缓冲液A和B按1:9的比例混合均匀得到血液缓冲液；将30ml血液缓冲液分别与新鲜血液按1:1混合均匀；往50ml离心管中加入15mlFicollplaque分离液，按3:4的比例缓慢加入新鲜血液于分离液的液面上，即每管加入混合血液20ml；每管配平后在离心机中420g离心30min；小心吸取离心后的中间白膜状细胞层，该层为PBMC；按细胞体积：血液缓冲液＝1:4的比例加入血液换成液混匀；离心160g，15min，小心弃去上清液；加入血液稀释缓冲液20ml，洗涤2次；加入5mlRPML1640完全培养基(含10％FBS)重悬PBMC；细胞计数后，按2×10⁶/ml接种到6孔细胞培养板中，置于细胞培养箱培养4h；收集悬浮的PBMC细胞，贴壁的细胞用PBS洗1次；每孔细胞中加入完全培养基2ml，然后加入GM-CSF2μl，IL-42μl，置于37度细胞培养箱培养2天；2天后，半量换液，然后加入GM-CSF2μl，IL-42μl，置于37度细胞培养箱培养2天；2天后，加入GM-CSF2μl，IL-42μl，置于37度细胞培养箱继续培养3天；吹打诱导成熟的DC细胞，并用RPML-1640完全培养基洗涤细胞1次，进行细胞计数后，稀释DC细胞密度至1×10⁵/ml，按照试验要求的设计进行铺板，每孔加入细胞体积100μl(96孔板)，即1×10⁴/孔；同时，收集新鲜血液，进行PBMC分离纯化工作，步骤同上；将收集到的T细胞进行细胞计数，并稀释成1×10⁶/ml，加入100μl(96孔板)，即1×10⁵/孔与诱导成熟的DC细胞进行混合培养；按照试验要求设计阴性对照组(T细胞或DC细胞+IgG1)、阳性对照组(T细胞+DC细胞+PcAb)、试验组(T细胞+DC细胞+100ul不同浓度(100nM,10nM,1nM)的本发明提供的抗体6F11，9C10，17B5，9F7)，将细胞置于37度细胞培养箱培养5天；5天后取细胞上清进行IL-2和IFNgamma检测，用ELISA试剂盒进行定量检测，具体操作按照试剂盒说明书进行。

所述血液缓冲液A组分包括：

所述血液缓冲液B包括：

结果如图11～图12所示。图11-图12为候选抗体6F11，9C10，17B5，9F7对淋巴细胞反应的实验；结果显示抗体6F11，9C10，17B5，9F7可以刺激T细胞IL-2和IFNγ的分泌，分泌量呈剂量依赖关系。

实施例8：cDNA的调取和重组抗体的制备

cDNA的调取

经免疫、融合以及单克隆化后，基于亲和力实验结果选取6F11、9C10、17B5单克隆抗体细胞株为模板进行cDNA的调取。

抗体基因重链和轻链的序列分析。三株单克隆抗体mRNA采用Invitrogen公司的reagent试剂盒(15596-026)试剂盒待确定进行提取；接着采用Takara公司的5’RACEFULL试剂盒(D315)，以mRNA为模板，反转录为第一链cDNA，其中重链以恒定区设计引物(mIgGR)进行RT-PCR，轻链以恒定区设计引物(mIgKR)进行RT-PCR。mIgGR和mIgKR的序列如下:

mIgGR：CTCAGGGAARTARCCYTTGAC，(如SEQIDNO:28所示)；

mIgKR：TCACTGCCATCAATCTTCCAC，(如SEQIDNO:29所示)；

琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR片段进行TA克隆后调单克隆进行PCR鉴定，鉴定引物为M13-F和M13-R，鉴定正确热菌株中选取部分样品送至Invitrogen测序。最终确定蛋白序列为：

6F11VH(如SEQIDNO:20所示):EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYIHWMRQRPEQGLEWIGRIDPANDNTKYDPKFQGKATVTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGLRLRYFDVWGAGTTVTVSS；

6F11VL(如SEQIDNO:21所示):DIQMTQTPSSLSASLGGKVTITCKASQDIHKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDFSFSISNLEPEDFETYYCLQYENLLPTFGGGTKLEIK；

9C10VH(如SEQIDNO:22所示):

QVQLKQSGFGLVLPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGLIWSGGGTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKINSLQANDTAIYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSS；

9C10VL(如SEQIDNO:23所示):

DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTTIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESVSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPLTFGAGTKLEIK；

17B5VH(如SEQIDNO:24所示):

QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYKFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNPNYDEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARERWMDSWGQGTSVTVSS；

17B5VL(如SEQIDNO:25所示):

DIQMTQTASSLSASLGDRVTISCSASQGIFNYLNWYQQKPDGTVTVLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKR；

鉴定引物M13-F，如下：

5'TGTAAAACGACGGCCAGT3'，(如SEQIDNO:26所示)；

鉴定引物M13-R，如下：

5'CAGGAAACAGCTATGACC3'，(如SEQIDNO:27所示)。

实施例9：重组抗体的与humanPDL-1结合亲和力测定(ELISA)

包被：PDL1-hFc和PDL1-mFc分别用CBS稀释成1μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔50μL，4℃下孵育过夜。封闭：洗板三次后用1％BSA+PBS封闭，每孔300μL，37℃下孵育2小时。加抗体：洗板三次后，6F11、9C10、17B53个重组抗体和阳性对照抗体分别用PBS稀释成1μg/ml起始作1:3梯度稀释A～G等7个组，第H组加PBS做空白对照。每孔100μl，37℃下孵育30分钟。加二抗：洗板三次后，分别对应加入GoatAntiMouseIgG(H+L),HRP(1:5000)，GoatAntiHumanF(ab’)₂，HRP(1:5000)，GoatAntiHumanIgG(H+L),HRP(1:5000)，每孔50μL，37℃下孵育30分钟。显色：洗板四次后，加TMB显色液，每孔50μL，室温下避光显色5分钟。终止：直接加终止液终止反应，每孔50μL。检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据。数据处理：将原始数据输入到软件SoftMaxPro6.2.1中进行数据处理。

结果如图13～图14所示。图13-图14为重组抗体与humanPDL-1结合亲和力测定实验；结果显示重组6F11，9C10，17B5抗体均能够与humanPDL-1结合。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种抗PD-L1单克隆抗体，其特征在于，其具有：

(Ⅰ)、重链可变区如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列；

(Ⅱ)、轻链可变区如SEQIDNo.4或SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列；或

2.根据权利要求1所述的抗PD-L1单克隆抗体，其特征在于，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。

3.根据权利要求1或2所述的抗PD-L1单克隆抗体，其特征在于，其具有：

(ⅳ)氨基酸序列为SEQIDNO:2的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:4的轻链可变区；

(Ⅴ)氨基酸序列为SEQIDNO:2的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:5的轻链可变区；

(Ⅵ)氨基酸序列为SEQIDNO:2的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:6的轻链可变区；

(Ⅶ)氨基酸序列为SEQIDNO:3的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:4的轻链可变区；

(Ⅷ)氨基酸序列为SEQIDNO:3的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:5的轻链可变区；

4.编码如权利要求1至3任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体的核苷酸，其特征在于，具有

(Ⅳ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。

5.根据权利要求4所述的核苷酸，其特征在于，具有与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。

6.一种表达载体，其特征在于，包括如权利要求4或5所述的核苷酸，及其表达载体转化获得的细胞。

7.一种结合物，其特征在于，包含与同位素、免疫毒素和/或化学药物共价连接的如权利要求1至3任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体。

8.一种偶联物，其特征在于，其由根据权利要求1至3任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体和/或权利要求7所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。

9.根据权利要求1至3任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体和/或如权利要求7所述的结合物和/或如权利要求8所述的偶联物在制备治疗疾病的药物中的应用；

10.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体和/或如权利要求7所述的结合物和/或如权利要求8所述的偶联物。

11.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体和/或如权利要求7所述的结合物和/或如权利要求8所述的偶联物。

12.一种如权利要求1至3任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体和/或如权利要求7所述的结合物和/或如权利要求8所述的偶联物治疗疾病的方法，所述疾病为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤或黑素瘤。