CN113980129A - 一组il-11单克隆抗体及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肿瘤、炎症以及组织纤维化治疗和分子免疫学领域；具体涉及一组抗白细胞介素‑11(IL‑11)的单克隆抗体及其医药用途。本发明通过杂交瘤技术获得了一组在阻断IL‑11信号传导方面具有优异效果的抗IL‑11单克隆抗体，并成功地对其进行了人源化改造。所述抗体在制备应用于破坏肿瘤微环境，调节机体免疫功能的相关药物，尤其是治疗癌症以及肝和肺组织纤维化相关药物方面具有广阔的应用前景。

Description

一组IL-11单克隆抗体及其医药用途
技术领域
本发明属于肿瘤、炎症以及组织纤维化治疗和分子免疫学领域，涉及IL-11抗体及其用途，具体地，本发明涉及到多种IL-11单克隆抗体。
背景技术
白细胞介素-11(IL-11)，又称脂肪生成抑制因子，是一种细胞因子，于1990年首次克隆(Paul SR,et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:7512)。IL-11基因位于人类19号染色体和小鼠7号染色体上(Morris JC,et al.(1996)Exp Hematol24:1369；McKinley D,etal.(1992)Genomics 13:814)，人和鼠的IL-11在氨基酸序列上有88％的同源性。虽然IL-11富含脯氨酸残基并缺乏半胱氨酸残基，但该细胞因子对热稳定，熔点温度在90℃左右(Czupryn M,et al.(1995)Ann NY Acad Sci 762:152)。IL-11的结构特征是由两对反平行的α-螺旋组成了四螺旋束基序，其构象呈上-上-下-下排列(Putoczki,TL,et al.(2014)Acta Crystallographica D 70:2277)。IL-11可刺激巨核细胞生成以及增加血小板计数，重组人IL-11(Neumega)被美国食品药品监督管理局批准用于化疗诱导的血小板减少症的治疗(Neben TY,et al.(1993)Blood 81:901；Gordon MS,et al.(1996)Blood 87:3615)。
IL-11是白介素-6(IL-6)细胞因子家族的成员，它通过与广泛表达的信号转导受体gp130和非信号转导的特异性受体(IL-11R)的相互作用，影响细胞内信号转导通路(Matadeen R,et al.(2007)Structure 15:441)。IL-11受体α链(IL-11Rα)与IL-11低亲和力结合(亲和力常数Kd为10-50nmol/L)，并负责配体结合的特异性(Hilton DJ,et al.(1994)EMBO J.13,4765)。IL-11/IL-11Ra复合物触发两个gp130分子的结合，导致高亲和力受体(Kd 0.4-3.0nmol/L)的形成(Yin T,et al.(1993)J.Immunol.151:2555)，并通过Janus激酶/STAT3、ERK/RAS、mTor/PI3K等信号通路转导信号(Hilton DJ,et al(1994)EMBOJ.13:4765；David J,et al.(1997)Blood 90:4403；Dahmen H,et al.(1998)Biochem.J.331:695)。IL-11分子中有三个位点参与和受体亚基的相互作用。位点-I由AB-环(AB-loop)末端的氨基酸以及D-螺旋(D-helix)羧基末端的氨基酸构成，与IL-11Rα链的相互作用有关。位点-II，由来自A-螺旋和C-螺旋的氨基酸组成，而位点-III由D-螺旋的氨基末端部分和AB-环起始部位的残基组成。位点-II和位点-III参与了和gp130的结合(Grotzinger J,et al.(1997)Proteins 27:96；Tacken I,et al.(1999)Eur.JBiochem.265:645；Harmegnies D,et al(2003)Biochem.J.375:23；Barton VA,et al.(1999)JBC 274:5755)。
IL-11是一种多效细胞因子，对造血系统和非造血系统，包括肝、胃肠道、肺、心脏、中枢神经系统、骨、关节和免疫系统显示出多种作用(Schwertschlag US,et al.(1999)Leukemia 13:1307)。IL-11信号机制突变或缺陷与许多疾病有关，包括头盖骨缝合线过早闭合，牙齿异常，如多生牙或延迟萌牙(Nieminen,et al.(2011)American J of HumanGenetics 89:67)，溃疡性结肠炎(Klein W,et al.(2002)Genes&Immunity 3:494)，Hirschsprung病(Haase MG,et al.(2018)Gene 677:163；Kim LH,et al.(2015)Neurogastroenterology&Motility 27:1371)，以及慢性阻塞性肺疾病(Klein W,et al.(2004)Electrophoresis 25:804)。另一方面，IL-11的表达升高与人类各种造血和上皮源性癌症有关。黑色素瘤、肝脏、乳腺、胃、结肠和非小细胞肺癌等肿瘤细胞能够产生IL-11(Putoczki TL,et al.(2013)Cancer Cell 24:257；Luis-Ravelo D,et al.(2013)Oncogene 33:5090；Furugaki K,et al.(2011)Clin.Exp.Metastasis 28:649；Gao YB,etal.(2103)J.Cancer Res.Clin.Oncol.139:669；Putoczki TL,et al.(2015)Immunotherapy 7:441)。IL-11可以通过直接作用于癌细胞和间接作用于肿瘤微环境来促进癌症发展，包括促进血管生成、缺氧条件下肿瘤细胞的生存、对细胞凋亡和化疗的拮抗，以及促进骨和软组织(如肝和肺)中早期微转移癌细胞的生长和存活(Johnstone CN,etal.(2015)Cytokine&Growth Factor Reviews 26:489)。相反，抑制IL-11信号可以显著降低肿瘤负荷(Putoczki TL,et al.(2013)Cancer Cell 24:257)，针对IL-11或其同源受体(IL-11Rα和gp130)的抗体在一些癌症的小鼠模型中有效(Kapina MA,et al.(2011)PLoSOne 6:e21878)。考虑到gp130基因敲除小鼠胚胎的致死性，靶向IL-11或IL-11Rα可能比靶向gp130产生更少的副作用(Yoshida K,et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:407)。
在肝脏疾病中观察到明显的IL-11上调，并发现IL-11能够通过激活肝星状细胞(肝内肌成纤维细胞的前体)，促进肝纤维化(Tsuchida T,et al(2017)Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.14:397)。对于患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或原发性胆道胆管炎的患者，IL-11抗体治疗对肝纤维化、炎症和脂肪变性有显著的有益作用(Cook SA,et al.(2020)Annu.Rev.Med.71:263)。IL-11升高也与哮喘、特发性肺纤维化和硬皮病相关性肺间质疾病有关(Lindahl GE,et al.(2013)Respir.Res.14:80；Ng B,et al.(2019)Sci.Transl.Med.11:eaaw1237；Strikoudis A,et al.(2019)Cell Rep.27:3709)，而且IL-11表达水平与纤维化程度正相关，与肺功能呈负相关。在小鼠肺纤维化模型中，抗IL-11治疗可显著降低和逆转肺胶原蛋白水平，并具有抗炎作用(Minshall E,et al.(2000)J.Allergy Clin.Immunol.105:232)。用特异性抗体阻断IL-11信号，可以减轻肺结核感染小鼠的组织病理学以及中性粒细胞对肺组织的浸润，并降低肺部IL-11和其他不属于Th1轴的关键炎性细胞因子的水平(Kapina MA,et al.(2011)PLoS One 6:e21878)。
尽管IL-11是一种多功能细胞因子，在正常细胞信号传导和各种病理状态中发挥着不同的作用，但IL-11基因缺失的个体仅导致头骨和牙齿轻微的发育异常，而在身体的其他方面表现健康且寿命正常，说明靶向IL-11信号通路在临床治疗上的副作用可能非常有限，因此具有较高的安全性。
发明内容
针对以上问题，本发明采用杂交瘤技术获得了一组抗IL-11单克隆抗体，这些抗体在阻断IL-11与其受体α链(IL-11Rα)或者与其功能受体复合物IL-11Rα/gp130的相互作用方面具有优异效果，并成功对其进行了人源化改造。这些抗体在制备应用于阻断或调节IL-11信号传导、以及治疗癌症、炎症以及组织纤维化的相关药物方面有巨大的应用前景。
本发明提供的鼠源或人源化IL-11抗体或功能性片段，包括了重链序列和轻链序列。抗人IL-11鼠源抗体，重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列信息如下：10C2重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、2；16E12重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4；18B6重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：5、6；16F3重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：7、8；14E1重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：9、10；6B9重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：11、12；26A6重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：13、14；14F6重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：15、16；4A2重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：17、18；1D12重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：19、20；抗体重链、轻链的CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列信息如下：10C2重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：21、22、23，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：24、25、26；16E12重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：27、28、29，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：30、31、32；18B6重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：33、34、35，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：36、37、38；16F3重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQID NO：39、40、41，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：42、43、44；14E1重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：45、46、47，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：48、49、50；6B9重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：51、52、53，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：54、55、56；26A6重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：57、58、59，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：60、61、62；14F6重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：63、64、65，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：66、67、68；4A2重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：69、70、71，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：72、73、74；1D12重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：75、76、77，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：78、79、80。
进一步，抗人IL-11抗体或片段经过改造后，成为人源化抗体。
分离的核酸分子，其编码上述的抗体或功能性片段。
抗人IL-11人源化抗体10C2重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：81，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：82；人源化抗体16E12重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：83，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：84。
本发明公开了对上述人源化抗体10C2和16E12序列的进一步改造，目的是为了进一步提高抗体的人源化程度以及去除潜在的脱酰胺化和异构化位点。
表达载体，包含上述抗体的核酸分子。
药物组合物，其包含上述的抗体或其功能片段，以及药用载体。
上述的抗体或其功能性片段，核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物在制备IL-11抗体免疫功能药物的用途。
本专利采用重组的IL-11作为抗原，免疫小鼠后，将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。通过对大量杂交瘤细胞进行多次克隆及筛选，得到多个单克隆杂交瘤细胞株。这些杂交瘤细胞株可以分泌产生与IL-11特异性结合的单克隆抗体(图1)，这些单克隆抗体能够有效阻断IL-11与IL-11Rα或者与IL-11Rα/gp130的结合(图2，图3)，并能显著抑制IL-11诱导的转录因子STAT3的磷酸化(图4)。进一步地，通过RT-PCR(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction，逆转录聚合酶链式反应)克隆编码抗体轻链和重链可变区的基因，采用互补决定簇嫁接方法(complementarity-determining regionsgraft,CDR-graft)构建人源化抗体，并通过对抗体CDR序列的突变以及亲和力测试，进一步提高人源化抗体的人源化程度。体外功能实验表明，人源化IL-11抗体能特异性结合IL-11蛋白(图5)，可阻断IL-11与IL-11Rα或者与IL-11Rα/gp130结合(图6、图7)，并能显著抑制IL-11诱导的转录因子STAT3的磷酸化(图8)。本专利中使用的阳性对照(PositiveControl)采用了专利US20200031918A1中的3C6抗体序列。与阳性对照相比，本专利中获得的抗体与IL-11结合的亲和力更高，阻断IL-11与其受体结合的活性更强，抑制IL-11诱导的转录因子STAT3的磷酸化作用更显著。
附图说明
图1：用ELSIA方法检测鼠源IL-11单克隆抗体与IL-11结合的EC50
图2：用ELSIA方法检测鼠源IL-11单克隆抗体阻断IL-11与IL-11Rα/gp130结合的IC50
图3：用FACS方法检测鼠源IL-11单克隆抗体阻断IL-11与细胞表面IL-11Rα/gp130受体结合的IC50
图4：用报告基因方法检测鼠源IL-11单克隆抗体抑制IL-11诱导的转录因子STAT3磷酸化的IC50
图5：用ELSIA方法检测人源化IL-11抗体与IL-11结合的EC50
图6：用ELSIA方法检测人源化IL-11抗体阻断IL-11与IL-11Rα/gp130结合的IC50
图7：用FACS方法检测人源化IL-11抗体阻断IL-11与细胞表面IL-11Rα/gp130受体结合的IC50
图8：用报告基因方法检测人源化IL-11抗体抑制IL-11诱导的转录因子STAT3磷酸化的IC50
具体实施方式
实施例1
鼠源杂交瘤抗体的制备
用重组人IL-11作为抗原，与等体积完全弗氏佐剂(Sigma,Cat No:F5581)充分乳化后，经皮下免疫6-8周龄Balb/c小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司)，抗原免疫量为20μg/只。随后每隔2周，用相同剂量的抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma,Cat No:F5506)充分乳化后，经皮下免疫小鼠三次。免疫三次后测定小鼠血清效价。融合前3天经腹腔进行加强免疫。以PEG Hybri-Max(Sigma,Cat No:7181)作为融合剂，将小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞按照4:1的比例混合。将融合后的细胞加入到96孔板中(1×10^5细胞/孔)，每孔含有0.1mL 1XHAT培养基(Invitrogen,Cat No:21060-017)。在第3天加入0.1mL HT(Invitrogen,Cat No:11067-030)培养基，在第7天吸掉96孔板中的培养基，补加0.2mL新鲜的HT培养基。在第9天，收取上清液进行ELISA和FACS检测。
实施例2
与IL-11结合抗体的ELISA筛选
用IL-11包被96孔ELISA板(Corning，Cat No:9018)，置4度过夜。用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次后，加入封闭缓冲液(PBS+1％BSA)(BSA购自Sigma,Cat No:V90093)孵育1小时；洗涤96孔板3次；加入杂交瘤上清孵育1小时，洗涤3次；每孔加入100μL1:10000倍稀释的羊抗鼠IgG二抗(Thermo,Cat No:31432)，室温孵育1小时后洗涤3次；每孔加入100μL TMB(北京百奥赛博，Cat No:ES-002)显色3分钟，再加入100μL/孔的终止液(2NH2SO4)终止反应，用Tecan Spark酶标仪测定各样品的OD450信号。
实施例3
能够阻断IL-11/IL-11Rα复合物与gp130结合的抗体的ELISA筛选。
采用竞争ELISA筛选能够阻断IL-11/IL-11Rα复合物与gp130结合的杂交瘤抗体。用羊抗人IgG抗体(goat anti-human IgG，Jackson,Cat No:109-005-008)包被96孔ELISA板，孵育过夜，用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween 20)洗涤3次后，加入
200μL封闭缓冲液，孵育1小时；洗涤3次后加入100μL 1ug/ml携带人Fc标签的gp130(gp130-hFc)，室温孵育1小时；预先将杂交瘤上清与终浓度为10ng/ml带生物素标记的IL-11(IL-11-Biotin)在4℃孵育30分钟,继续向混合液中加入终浓度为80ng/ml的IL-11Rα，4℃孵育30分钟；将混合液加入96孔ELISA板中，室温孵育1小时；洗涤3次后加入二抗Avidin HRP(Invitrogen，Cat No:18-4100-51)，孵育30分钟，加入TMB显色3分钟，用100μL/孔的终止液(2N H2SO4)终止反应，用Tecan Spark酶标仪测定各样品的OD450信号。
杂交瘤的亚克隆。用有限稀释法，对能够阻断IL-11/IL-11Rα复合物与gp130结合的杂交瘤进行亚克隆，随后再重复采用ELISA方法进行检测筛选，进而获得阳性杂交瘤单克隆。将阳性单克隆杂交瘤置50mL无血清培养基中(Invitrogen,Cat No:12045-076)培养9天，离心收取上清液。用Protein A亲和层析纯化单克隆抗体。纯化后的抗体样品经超滤离心管(Millipore，Cat No:ACS500024)换液浓缩后，用BCA方法测定蛋白浓度，用鳌试剂(厦门鲎试剂生物科技股份有限公司)检测抗体样品的内毒素含量。用ELISA检测纯化的抗体样品与IL-11的结合及其阻断IL-11/IL-11Rα复合物与gp130结合的活性。具体结果见表1-2和图1-2。
表1.用ELSIA方法检测IL-11杂交瘤抗体与IL-11结合的EC50
Figure BDA0002899280230000071
表2.用ELSIA方法检测IL-11杂交瘤抗体阻断IL-11结合IL-11Rα/gp130的IC50
Figure BDA0002899280230000072
实施例4
阻断IL-11与细胞表面IL-11Rα/gp130受体复合物结合的抗体筛选。
用培养基配制浓度为80μg/mL的抗体溶液，再用培养基进行5倍浓度的系列稀释，制备10个稀释浓度的抗体溶液。取25μL各稀释浓度的抗体溶液加入到96孔U底板中。用培养基配制浓度为40ng/mL的IL-11-biotin溶液，取25μL IL-11-biotin溶液加入到上述96孔板中，混匀，置4℃避光孵育1小时。用培养基悬浮293T-IL-11Rα-GP130细胞，细胞密度为4×10^6/mL。取50μL细胞悬液加入到上述96孔板中(2×10^5细胞/孔)，混匀，置4℃避光孵育1小时。在室温下，将96孔板以1500rpm速度离心3分钟，弃上清。各孔加入200μL FACS缓冲液(PBS+3％FBS)，混匀，室温下1500rpm离心3分钟，弃上清。重复洗涤两次。用FACS缓冲液1:4000稀释携带PE标记的抗生物素抗体(PE anti-biotin,Biolegend，Cat No:409004)，取100μL加入到96孔板，混匀，置4℃避光孵育30分钟。将96孔板以1500rpm速度离心3分钟，弃上清。加入FACS缓冲液，洗涤三次。将细胞重悬于200μL FACS缓冲液，用BD C6流式细胞仪检测293T-IL-11Rα/gp130细胞的PE信号。IL-11抗体阻断IL-11与细胞表面IL-11Rα/gp130受体复合物结合的检测结果见表3和图3。
表3.用FACS方法检测IL-11杂交瘤抗体阻断IL-11结合293T-IL-11Rα/gp130细胞的IC50
Figure BDA0002899280230000081
实施例5
具有阻断IL-11信号传导功能的抗IL-11单克隆抗体的筛选
用RPMI1640培养基悬浮DLD1-IL-11R-pSTAT3-Luc细胞，细胞密度为1X10^6cell/mL。取50μL细胞悬液加入96孔板中(5X10^4细胞/孔)，置37℃过夜培养。用培养基配制浓度为4ng/mL的IL-11以及80μg/mL抗体溶液。再用培养基对上述抗体溶液进行5倍浓度的系列稀释，制备10个稀释浓度的抗体溶液。取30μL IL-11溶液分别与30μL系列稀释的IL-11抗体溶液混合，置室温孵育1小时。取50μL上述混合溶液，加入到DLD1-IL-11R-pSTAT3-Luc细胞96孔培养板中，置37℃培养4.5小时。在96孔板中加入25μL Bright-Glo(Promega,Cat No:E2620),混匀，置室温避光孵育3分钟，用Tecan Spark酶标仪测定各样品的发光信号(RFU)。IL-11单克隆抗体抑制IL-11诱导的转录因子STAT3磷酸化的测试结果见表4和图4。
表4.IL-11杂交瘤抗体抑制IL-11诱导的转录因子STAT3磷酸化的IC50
Figure BDA0002899280230000082
实施例6
IL-11抗体可变区基因的克隆
用TRIzon(Cwbiotech,Cat No:CW0580)裂解IL-11单克隆杂交瘤细胞株，提取杂交瘤细胞的总RNA。用HiFi Script cDNA合成试剂盒(Cwbiotech,Cat No:CW2569)将杂交瘤细胞的RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，用简并引物通过PCR方法(Kettleborough et al.(1993)Eur J Immunology 23:206-211；Strebe et al.(2010)Antibody Engineering 1:3-14)扩增抗体的重链和轻链的可变区基因。将PCR扩增产物连接到T/A载体后，转化DH5a感受态细胞，涂板并置37℃过夜培养。从培养板上挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，测定抗体的基因序列。根据Kabat方法分析抗体序列中的互补决定簇(CDR)和骨架区。抗体的重链和轻链的可变区以及CDR氨基酸序列编号见表5。
表5.IL-11杂交瘤抗体序列
Figure BDA0002899280230000083
Figure BDA0002899280230000091
Figure BDA0002899280230000101
Figure BDA0002899280230000111
Figure BDA0002899280230000121
Figure BDA0002899280230000131
实施例7
鼠源IL-11抗体10C2和16E12的人源化
采用互补决定簇嫁接法进行IL-11抗体的人源化改造。首先，在IMGT数据库中分别搜寻与鼠源16E12和10C2抗体的轻、重链可变区序列同源性最高的人胚系抗体(germlineantibody)序列。16E12抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV4-1*01，重链可变区人源化选取IGHV1-2*06。10C2抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV3-20*01，重链可变区人源化选取IGHV1-69*11。保留鼠源抗体的CDR区，将鼠源抗体的框架区(framework)序列用人胚系抗体的框架区序列置换。建立鼠源抗体的结构模型，逐个对比人源抗体与相应鼠源抗体框架区中每个位点的氨基酸，如果框架区的某个位点采用人的氨基酸序列没有导致CDR区域空间结构的破坏或改变，则该位点使用人的氨基酸序列，否则在该位点使用对应的鼠源序列(即回复突变为鼠源序列)。
根据结构模拟，将16E12抗体人源化重链的第48位Met回复突变为Ile，第71位Arg回复突变为Val，第93位Ala回复突变为Thr。将10C2抗体人源化重链的第3位Gln回复突变为His，第25位Ser回复突变为Pro，第27位Gly回复突变为Tyr，第48位Met回复突变为Ile，第67位Val回复突变为Ala，第69位Ile回复突变为Phe，第73位Glu回复突变为Thr，第94位Ala回复突变为Ser。10C2抗体人源化轻链第49位Tyr回复突变为Phe。
10C2人源化抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：81和SEQID NO：82。16E12人源化抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：83和SEQID NO：84(表6)。将10C2和16E12人源化抗体构建为IgG4亚型。
合成编码16E12和10C2人源化抗体轻链和重链的核酸片段，并插入到表达载体pcDNA3.1。用抗体轻链和重链表达质粒各0.1mg共转染200毫升293细胞(细胞密度为1×10^6)，在37度振摇培养6天，离心收集上清液，用Protein A纯化人源化抗体，纯化后的人源化抗体用于活性检测。
为了进一步提高16E12抗体的人源化程度以及去除潜在的脱酰胺化和异构化位点，我们对上述16E12人源化抗体的CDR序列进行了突变。突变的抗体表达纯化后，用Biacore测定了其与IL-11的亲和力(见表7)，结果表明，人源化抗体N54S,N54Q,G55V,G55A,N60A,E61Q,K64Q,N65G,L94H位点的突变并不影响其与IL-11的结合。
表6.IL-11人源化抗体序列
Figure BDA0002899280230000141
实施例8
人源化抗体及其突变体的亲和力检测
测定方法包括如下步骤：以氨基偶联的方式将anti-human IgG固定于CM5芯片上，接着以10μL/min的流速捕获人源化抗体。切换流速到30μL/min，将不同浓度的IL-11抗原(50nM,25nM,12.5nM,6.25nM,3.125nM,1.5625nM)依次流经样品通道和参比通道，结合时间为3min，解离时间为20min。最后用pH1.7的甘氨酸缓冲液再生芯片。人源化抗体亲和力测定具体结果见表7。
表7.人源化IL-11抗体及其突变体与IL-11抗原的亲和力。
Antibody CDR突变位点 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
hu10C2 Wild Type 1.47E+06 2.20E-05 1.49E-11
hu16E12 Wild Type 2.96E+06 4.66E-05 1.58E-11
hu16E12 K64Q N65G 3.68E+06 5.76E-05 1.57E-11
hu16E12 E61Q N65G 2.35E+06 8.54E-05 3.63E-11
hu16E12 N60A N65G 2.81E+06 7.51E-05 2.68E-11
hu16E12 N65G 2.78E+06 5.25E-05 1.89E-11
hu16E12 N54Q 2.78E+06 1.01E-04 3.63E-11
hu16E12 N54S 2.86E+06 7.00E-05 2.45E-11
hu16E12 G55V 2.41E+06 9.32E-06 3.87E-12
hu16E12 G55A 2.96E+06 3.56E-05 1.20E-11
hu16E12 L94H 2.09E+06 3.91E-06 1.87E-12
实施例9
人源化IL-11抗体的活性检测
采用ELISA和FACS检测纯化的人源化抗体样品与IL-11的结合，及其阻断IL-11与IL-11Rα/gp130结合的活性，具体方法参考实施例1-4。用报告基因方法检测IL-11人源化抗体抑制IL-11诱导的转录因子STAT3磷酸化的IC50，具体方法参考实施例5。本专利中使用的阳性对照(Positive Control)采用了专利US20200031918A1中的3C6抗体序列。人源化抗体的活性测定结果见表8-11和图5-8。
表8.用ELSIA方法检测IL-11人源化抗体与IL-11结合的EC50
hu10C2-hIgG4 Hu16E12-hIgG4 Control-3C6
EC50(ng/mL) 65.85 62.41 22477
表9.用ELSIA方法检测IL-11人源化抗体阻断IL-11与IL-11Rα/gp130结合的IC50
hu10C2-hIgG4 hu16E12-hIgG4 Control-3C6
Figure BDA0002899280230000161
表10.用FACS方法检测IL-11人源化抗体阻断IL-11与293T-IL-11Rα/gp130细胞结合的IC50
hu10C2-hIgG4 hu16E12-hIgG4 Control-3C6
IC50(ng/mL) 81.11 67.92 4194
表11.IL-11人源化抗体抑制IL-11诱导的转录因子STAT3磷酸化的IC50
hu10C2-hIgG4 hu16E12-hIgG4 Control-3C6
IC50(ng/mL) 4.858 1.159 177.5
以上实施例的结果表明，本发明所述的抗体或者抗原结合片段，能够有效阻断IL-11与其受体结合、调节IL-11活性、抑制IL-11的信号传导。这些抗体在开发用于预防和治疗肿瘤以及肝和肺组织纤维化相关药物方面具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 东大生物技术（苏州）有限公司
<120> 一组IL-11单克隆抗体及其医药用途
<130> 2020
<160> 84
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10C2重链可变区
<400> 1
Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Pro Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Ser Ser Thr Val Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10C2轻链可变区
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Gly Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16E12重链可变区
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asp Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Glu Ile His Tyr Gly Tyr Asp Lys Gly Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16E12轻链可变区
<400> 4
Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu His Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Ile Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Phe Ser Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<223> 18B6重链可变区
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ser Arg Glu Glu Ile His Tyr Gly Tyr Asp Lys Gly Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工
<223> 18B6轻链可变区
<400> 6
Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gln
85 90 95
Tyr Phe Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16F3重链可变区
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Val Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Val Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16F3轻链可变区
<400> 8
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Leu Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14E1重链可变区
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Tyr Tyr Val Val Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14E1轻链可变区
<400> 10
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<213> 人工
<223> 6B9重链可变区
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg His Tyr Asp Gly Tyr Tyr Gly Gly Ile Leu Asp Phe Ala Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<223> 6B9轻链可变区
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Cys
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu His Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
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<223> 26A6重链可变区
<400> 13
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ala Ser Val Ser Thr Ala His
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 107
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<213> 人工
<223> 26A6轻链可变区
<400> 14
Asn Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14F6重链可变区
<400> 15
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr Gln Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Lys Asn Leu Arg Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Lys Glu Gly Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14F6轻链可变区
<400> 16
Arg Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asp
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ile Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4A2重链可变区
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Lys Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Glu Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Ile Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Gly Leu Trp Asp Val Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4A2轻链可变区
<400> 18
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Val Ser Lys Ala Val Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1D12重链可变区
<400> 19
Glu Val Gln Leu Gln Gln Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ala Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1D12轻链可变区
<400> 20
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Thr
65 70 75 80
Gly Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Arg Gln Asp Tyr Ile Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10C2重链CDR1区
<400> 21
Ser Tyr Trp Ile Glu
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10C2重链CDR2区
<400> 22
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10C2重链CDR3区
<400> 23
Pro Ser Ser Thr Val Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10C2轻链CDR1区
<400> 24
Arg Ala Ser Arg Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Asn Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10C2轻链CDR2区
<400> 25
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10C2轻链CDR3区
<400> 26
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16E12重链CDR1区
<400> 27
Ser Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16E12重链CDR2区
<400> 28
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asp Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16E12重链CDR3区
<400> 29
Glu Glu Ile His Tyr Gly Tyr Asp Lys Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16E12轻链CDR1区
<400> 30
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu His Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16E12轻链CDR2区
<400> 31
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16E12轻链CDR3区
<400> 32
His Gln Tyr Phe Ser Leu Trp Thr
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 18B6重链CDR1区
<400> 33
Asn Tyr Tyr Ile Tyr
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 18B6重链CDR2区
<400> 34
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<223> 18B6重链CDR3区
<400> 35
Glu Glu Ile His Tyr Gly Tyr Asp Lys Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 18B6轻链CDR1区
<400> 36
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 18B6轻链CDR2区
<400> 37
Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<223> 18B6轻链CDR3区
<400> 38
His Gln Tyr Phe Ser Ser Trp Thr
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16F3重链CDR1区
<400> 39
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16F3重链CDR2区
<400> 40
Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Val Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16F3重链CDR3区
<400> 41
Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16F3轻链CDR1区
<400> 42
Ser Ala Ser Ser Ser Leu Asn Tyr Met His
1 5 10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16F3轻链CDR2区
<400> 43
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 16F3轻链CDR3区
<400> 44
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14E1重链CDR1区
<400> 45
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14E1重链CDR2区
<400> 46
Val Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14E1重链CDR3区
<400> 47
Glu Asp Tyr Gly Ser Tyr Tyr Val Val Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14E1轻链CDR1区
<400> 48
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14E1轻链CDR2区
<400> 49
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14E1轻链CDR3区
<400> 50
Gln His Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 6B9重链CDR1区
<400> 51
Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 6B9重链CDR2区
<400> 52
Glu Ile Ser Asn Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<223> 6B9重链CDR3区
<400> 53
His Tyr Asp Gly Tyr Tyr Gly Gly Ile Leu Asp Phe Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 6B9轻链CDR1区
<400> 54
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Cys Ile Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 6B9轻链CDR2区
<400> 55
Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<223> 6B9轻链CDR3区
<400> 56
Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu His Thr
1 5
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 26A6重链CDR1区
<400> 57
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 26A6重链CDR2区
<400> 58
Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<223> 26A6重链CDR3区
<400> 59
Glu Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 26A6轻链CDR1区
<400> 60
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Val
1 5 10
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 26A6轻链CDR2区
<400> 61
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14F6重链CDR1区
<400> 62
Gln Gln Asp Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14F6重链CDR1区
<400> 63
Lys Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14F6重链CDR2区
<400> 64
Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr Gln Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14F6重链CDR3区
<400> 65
Glu Gly Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14F6轻链CDR1区
<400> 66
Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asp Val Val
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14F6轻链CDR2区
<400> 67
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 14F6轻链CDR3区
<400> 68
Gln Gln Asp Tyr Ile Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4A2重链CDR1区
<400> 69
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4A2重链CDR2区
<400> 70
Val Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4A2重链CDR3区
<400> 71
Gly Leu Trp Asp Val Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4A2轻链CDR1区
<400> 72
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Gln
1 5 10
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4A2轻链CDR2区
<400> 73
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4A2轻链CDR3区
<400> 74
Gln Gln Trp Val Ser Lys Ala Val Thr
1 5
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1D12重链CDR1区
<400> 75
Asp Tyr Asn Met Asp
1 5
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1D12重链CDR2区
<400> 76
Glu Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1D12重链CDR3区
<400> 77
Ser Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1D12轻链CDR1区
<400> 78
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala
1 5 10
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1D12轻链CDR2区
<400> 79
Tyr Ala Ser Asn Arg Phe Thr
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 1D12轻链CDR3区
<400> 80
Arg Gln Asp Tyr Ile Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 81
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体10C2重链可变区氨基酸序列
<400> 81
Gln Val His Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Pro Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Ser Ser Thr Val Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体10C2轻链可变区氨基酸序列
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 83
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体16E12重链全长氨基酸序列
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asp Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Glu Ile His Tyr Gly Tyr Asp Lys Gly Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 84
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工
<223> 人源化抗体16E12轻链全长氨基酸序列
<400> 84
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu His Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Phe Ser Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (10)

1.一组抗IL-11单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链的CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：21、27、33、39、45、51、57、63、69、75中的一种；所述重链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、中的一种；所述重链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：23、29、35、41、47、53、59、65、71、77中的一种；所述轻链的CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：24、30、36、42、48、54、60、66、72、78中的一种；所述轻链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：25、31、37、43、49、55、61、67、73、79中的一种；所述轻链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：26、32、38、44、50、56、62、68、74、80中的一种；其中所述抗原结合片段的重链和轻链包含分别跨越所述抗体的重链和轻链的CDR1到CDR3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一组抗IL-11单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19中的一种；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO： 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20中的一种。
3.根据权利要求2所述的一组抗IL-11单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链和轻链经过人源化；所述人源化后的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：81、83中的一种；所述人源化后的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：82、84中的一种。
4.根据权利要求3所述的一组抗IL-11单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，根据采用互补决定簇嫁接法进行IL-11抗体的人源化改造，所述人源化包括将16E12抗体人源化重链的第48位Met回复突变为Ile，第71位Arg回复突变为Val，第93位Ala回复突变为Thr；将10C2抗体人源化重链的第3位Gln回复突变为His，第25位Ser回复突变为Pro，第27位Gly回复突变为Tyr，第48位Met回复突变为Ile，第67位Val回复突变为Ala，第69位Ile回复突变为Phe，第73位Glu回复突变为Thr，第94位Ala回复突变为Ser；10C2抗体人源化轻链第49位Tyr回复突变为Phe。
5.根据权利要要求4所述的一组抗IL-11单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，为进一步提高人源化程度以及去除潜在的脱酰胺化和异构化位点，对于16E12人源化抗体的CDR序列进行突变，其突变位点为N54S, N54Q, G55V, G55A, N60A, E61Q, K64Q, N65G,L94H。
6.如权利要求1-5任一项所述的一组抗IL-11单克隆抗体或其抗原结合片段在制备如下药物中的用途,其特征在于，所述药物包括但不限于用于阻断或调节IL-11信号传导的药物、治疗或者预防癌症的药物、治疗或者预防炎症的药物、治疗或者预防组织纤维化的药物。
7.一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其中，所述单克隆抗体为权利要求1-5任一项所述的一组抗IL-11单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、细胞因子受体片段、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种。
8.权利要求7中所述的单克隆抗体偶联物在制备如下药物中的用途：其特征在于，所述药物包括但不限于用于阻断或调节IL-11信号传导的药物、治疗或者预防癌症的药物、治疗或者预防炎症的药物、治疗或者预防组织纤维化的药物。
9.表达权利要求1-5任一项所述的一组抗IL-11单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子、表达载体、宿主细胞。
10.权利要求9所述的核酸分子、表达载体、宿主细胞在制备如下药物中的用途，其特征在于，所述药物包括但不限于用于阻断或调节IL-11信号传导的药物、治疗或者预防癌症的药物、治疗或者预防炎症的药物、治疗或者预防组织纤维化的药物。
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