CN110256561A - 一组ctla-4单克隆抗体及其医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，具体地，本发明涉及一组抗CTLA‑4的单克隆抗体及其在肿瘤和免疫医学中的应用。本发明通过杂交瘤技术获得了一组在阻断CTLA‑4与CD80/CD86的相互作用方面有优异效果的抗CTLA‑4单克隆抗体，并成功的对其进行了人源化改造。所述抗体在制备阻断，调节CTLA‑4水平相关药物以及治疗癌症相关药物方面表现出巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，具体地，本发明涉及一组抗CTLA-4的单克隆抗体及其在肿瘤和免疫医学中的应用。
技术背景
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4，是一种由CTLA-4基因编码的跨膜蛋白，该基因位于人类第2号染色体2q33。CTLA-4是免疫球蛋白超级家族的一员，由胞外V区，跨膜区和胞浆区组成。CTLA-4与T细胞表面的协同刺激分子受体CD28具有同源性，两者竞争结合其配体B7-1(CD80)或B7-2(CD86)，这类配体主要表达于抗原递呈细胞表面。与CD28相比，CTLA-4与CD80和CD86的结合亲和力更高，因此能够竞争和阻断CD28介导的激活作用。CTLA-4通常表达在抑制性T细胞(Tregs)和活化状态的T细胞表面上，与B7类分子结合后，抑制T细胞的激活，参与免疫反应的负调控,所以CTLA-4在免疫调节中起到非常重要的作用。
T细胞的激活需要两个信号的刺激，第一个信号来自T细胞受体(TCR)特异性结合抗原递呈细胞(APC)表面的抗原肽-MHC复合物，第二个信号通路则需要共刺激分子(如CD28)的参与，当CD28和B7-1/B7-2(CD80/CD86)结合后可以进一步活化T细胞，促进其成熟和增殖。目前的研究表明，在免疫应答过程中，CTLA-4通过下列途径下调T细胞的功能：其一，CTLA-4通过其与CD80/CD86的高亲和力，竞争性阻断CD28与CD80/86共刺激信号的传递，进而抑制T细胞的增殖，减少IL-2的分泌。其二，通过降低CD80/CD86在抗原递呈细胞(APC)的表达水平或者通过反式内吞作用将CD80/CD86分子从抗原递呈细胞(APC)表面移除，从而减少了CD28参与的T细胞激活。其三，CTLA-4可以通过介导树突状细胞结合CD80/CD86并诱导色氨酸降解酶IDO的表达，抑制TCR信号。此外，CTLA-4还可以通过招募抑制性分子结合到免疫突触，诱导产生调节性细胞因子,从而抑制APC和TCR信号的传递。
CTLA-4信号紊乱与疾病的发生和发展密切相关。CTLA-4基因敲除小鼠会出现严重的淋巴组织增生，并且在出生后四周内会因大量的组织浸润和器官破坏而死亡。在过敏性脑脊髓炎(EAE)实验模型中，CTLA-4抗体通过阻断CTLA-4对T细胞的负调控信号，进一步加剧自身免疫性疾病，增加死亡率。
研究表明，CTLA-4通过负向调节免疫反应参与癌症的发生，阻断CTLA-4信号传导可以抑制肿瘤生长。体内实验表明，CTLA-4抗体可以阻断CTLA-4介导的免疫抑制信号而促进机体的免疫功能，可用于治疗肿瘤，如纤维肉瘤，结肠癌和前列腺癌等。CTLA-4阻断性抗体还可与多种治疗方案，如化学疗法、放射疗法、疫苗、以及其他抗体药物联合使用，进一步提高肿瘤的治疗效果。虽然目前已经有少量CTLA-4抗体药物上市但是其核心技术都掌握在国外厂商手中。
因此开发新的具有自主知识产权的阻断CTLA-4与CD80/CD86结合的抗体及其人源化抗体是一个迫切的任务。
发明内容
针对上述问题，本发明通过杂交瘤技术获得了一组在阻断CTLA-4与CD80/CD86的相互作用方面有优异效果的抗CTLA-4单克隆抗体，并成功的对其进行了人源化改造。所述抗体在制备阻断，调节CTLA-4水平相关药物以及治疗癌症相关药物方面有巨大的应用前景。
本发明提供一组CTLA-4单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链的CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：37、43、49中的一种；所述重链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：38、44、50中的一种；所述重链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：39、45、51中的一种；所述轻链的CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：40、46、52中的一种；所述轻链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：41、47、53中的一种；所述轻链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：42、48、54中的一种；其中所述抗原结合片段的重链和轻链包含分别跨越所述抗体的重链和轻链的CDR1到CDR3的氨基酸序列。
进一步的，上述抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35中的一种；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ IDNO：4、8、12、16、20、24、28、32、36中的一种。
进一步的，上述抗体或其抗原结合片段，所述重链和轻链经过人源化；所述人源化重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：55、59、63中的一种；所述人源化轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：56、60、64中的一种。
进一步的，上述抗体或其抗原结合片段，所述人源化重链的全长氨基酸选自SEQID NO：57、61、65中的一种；所述人源化轻链的全长氨基酸选自SEQ ID NO：58、62、66中的一种。
进一步的，本发明公开了编码上述氨基酸片段的DNA序列，所述序列包括SEQ IDNO：1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34。
进一步的，本发明公开了表达上述DNA序列的载体。
进一步的，本发明公开了所述CTLA-4单克隆抗体或其抗原结合片段在制备如下药物中的用途：阻断CTLA-4与B7结合的药物、调节CTLA-4活性或CTLA-4水平的药物、解除CTLA-4对机体免疫抑制的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
进一步的，本发明公开了一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其中，所述单克隆抗体为上述抗CTLA-4单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种。
进一步的，本发明公开了上述单克隆抗体偶联物在制备如下药物中的用途：阻断CTLA-4与B7结合的药物，调节CTLA-4活性或CTLA-4水平的药物、解除CTLA-4对机体免疫抑制的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
进一步的，本发明公开了上述单克隆抗体偶联物在制备预防或者治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明的进步性表现为：本专利采用哺乳动物细胞表达系统制备重组CTLA-4作为抗原免疫小鼠，将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。通过对大量杂交瘤细胞的多次克隆及筛选后，得到一些单克隆杂交瘤细胞株。这些杂交瘤细胞株能够产生和CTLA-4特异性结合的单克隆抗体，并且这些单克隆抗体能够有效阻断CTLA-4与CD80或CD86的结合，并能促进金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)刺激的外周血单核细胞分泌细胞因子IL-2。通过RT-PCR克隆编码抗体轻链和重链可变区的基因，采用互补决定簇嫁接方法构建人源化抗体。体外功能试验表明，这些人源化的CTLA-4抗体能特异性结合CTLA-4蛋白，高效的阻断CTLA-4与CD80或CD86的结合，并能促进T细胞分泌细胞因子IL-2。以上实验结果表明本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包含本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段的单克隆抗体偶联物在制备阻断CTLA-4与B7结合的药物、调节CTLA-4活性或CTLA-4水平的药物、解除CTLA-4对机体免疫抑制的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物，以及在预防和治疗或者辅助治疗肿瘤的药物中有良好的应用前景。
说明书附图
图1为用ELSIA方法检测鼠源CTLA-4单克隆抗体与CTLA-4-hFc蛋白结合的EC50；
图2为用ELSIA方法检测鼠源CTLA-4单克隆抗体阻断配体结合CTLA-4-hFc的IC50；
图3为用FACS方法检测鼠源CTLA-4单克隆抗体结合293T-CTLA-4细胞的EC50；
图4为用FACS方法检测鼠源CTLA-4单克隆抗体阻断配体结合293T-CTLA-4细胞的IC50；
图5为用ELISA方法检测鼠源CTLA-4单克隆抗体对PBMC分泌IL-2的刺激作用；
图6为用ELSIA方法检测人源化CTLA-4抗体与CTLA-4-hFc蛋白结合的EC50；
图7为用ELSIA方法检测人源化CTLA-4抗体阻断配体结合CTLA-4-hFc的IC50；
图8为用FACS方法检测人源化CTLA-4抗体结合293T-CTLA-4细胞的EC50；
图9为用FACS方法检测人源化CTLA-4抗体阻断配体结合293T-CTLA-4细胞的IC50；
图10为用ELISA方法检测人源化CTLA-4抗体对PBMC分泌IL-2的刺激作用。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；本发明所涉及的抗体的氨基酸和核酸序见序列表。
实施例1
鼠源抗体库的构建，包括以下步骤
(1)将人的CTLA-4-ECD-mFc融合蛋白作为抗原，与等体积完全弗氏佐剂(Sigma，Cat No:F5581)充分乳化后，经皮下免疫6-8周龄Balb/c小鼠(购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司)，抗原免疫量为20μg/只。随后每隔2周，用相同剂量的抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma，Cat No:F5506)充分乳化后，经皮下免疫小鼠三次。三次免疫后测定小鼠血清效价，融合前3天经腹腔进行加强免疫。以PEG Hybri-Max(Sigma,Cat No:7181)作为融合剂，将小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞按照4：1的比例混合。将融合后的细胞加入到96孔板中(1x105细胞/孔)，每孔含有0.1mL 1X HAT(Invitrogen，Cat No:21060-017)培养基。在第3天加入0.1mL HT(Invitrogen，Cat No:11067-030)培养基，在第7天吸掉96孔板中的培养基，补加0.2mL新鲜的HT培养基。在第9天，收取上清液进行ELISA和FACS检测。
(2)用CTLA-4-hFc包被96孔ELISA板(Corning，Cat No:9018)，置室温过夜，用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次后，加入封闭缓冲液(PBS+1％BSA(Sigma,Cat No:V90093))孵育1小时；洗涤96孔板3次；加入杂交瘤上清液孵育1小时，洗涤3次；每孔加入100μL 1:400倍稀释的羊抗鼠IgG二抗(Thermo,Cat No:
31432)，室温孵育1小时后洗涤3次；每孔加入100μL TMB(北京百奥赛博，Cat No:ES-002)显色3分钟，再加入100μL/孔的终止液(2N H2SO4)终止反应，用Tecan Spark酶标仪测定各样品的OD405信号。
(3)取50μl在上述ELISA检测中呈阳性的杂交瘤上清与50μl293T-CTLA-4细胞混合(1x105细胞/孔)加入到U形底96孔板中孵育1小时，用FACS缓冲液(PBS+3％FCS)离心洗涤2次后加入1:400倍稀释的PE标记羊抗鼠(Biolegend，Cat No:405307)二抗，孵育30分钟，经FACS缓冲液洗涤后，用BD C6流式细胞仪检测293T-CTLA-4细胞的PE信号。
(4)采用竞争ELISA筛选能够阻断CTLA-4-Fc与CD80-biotin结合的杂交瘤抗体。将CTLA-4-hFc包被在96孔ELISA板上过夜孵育，用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween 20)洗涤3次后，加入200μl封闭缓冲液孵育1小时；将杂交瘤上清或纯化的抗体与CTLA-4-hFc孵育1小时，再加入0.1μg/mL的CD80-biotin孵育1小时，洗涤后加入二抗Avidin HRP(Invitrogen，Cat No:18-4100-51)孵育30分钟，加入TMB显色，用100μL/孔的终止液(2N H2SO4)终止反应，Tecan Spark酶标仪测定各样品的OD405信号。
(5)采用竞争FACS筛选能够阻断CTLA-4-Fc与CD80-biotin结合的杂交瘤抗体。将杂交瘤上清或纯化的抗体与293T-CTLA-4细胞(1x105细胞/孔)在U形底-96孔板中孵育1小时，加入0.1μg/mL的CD80-biotin孵育1小时，离心后用FACS缓冲液洗涤2次，加入anti-biotin-PE(Biolegend，Cat No:409004)孵育30分钟，离心洗涤后，用BD C6流式细胞仪检测293T-CTLA-4细胞的PE信号。
(4)用有限稀释法，对能够阻断CTLA-4与CD80结合的杂交瘤进行亚克隆，随后再重复采用ELISA和FACS方法进行检测筛选，获得9株阳性杂交瘤单克隆。将阳性单克隆杂交瘤置50mL无血清培养基中(Invitrogen，Cat No:12045-076)培养8-9天后，离心收取上清液。用Protein A亲和层析纯化单克隆抗体，纯化后的抗体样品经超滤离心管(Millipore，CatNo:ACS500024)换液浓缩后，用BCA方法测定蛋白浓度，用鳌试剂(厦门鲎试剂生物科技股份有限公司)检测抗体样品的内毒素含量。用ELISA和FACS检测纯化的9个抗体样品，分别为1B3D4、3D2A10、4A2B5、5D5A9、5F6A1、6A4B9、9D3B4、10F8D1、2G6A11与CTLA-4的结合，以及其阻断CTLA-4-Fc与CD80结合的活性，具体方法参考实施例2，具体结果见表1、2、3、4和图1-4.
表1.用ELSIA方法检测鼠源CTLA-4单克隆抗体与CTLA-4-hFc蛋白结合的EC50。
表2.用ELSIA方法检测鼠源CTLA-4单克隆抗体阻断配体结合CTLA-4-hFc的IC50。
表3.用FACS方法检测鼠源CTLA-4单克隆抗体结合
293T-CTLA-4细胞的EC50。
表4.用FACS方法检测鼠源CTLA-4单克隆抗体阻断配体结合293T-CTLA-4细胞的IC50。
根据表1和图1可以看到，用ELISA测定所得到9个抗体与人CTLA-4的结合EC50大多小于1ng/ml,表明上述抗体对人CTLA-4有高度的亲和力。
根据表2和图2可以看到，用ELISA测定所得到9个抗体对人CTLA-4与其配体结合的阻断作用，阻断IC50最低可以低于60ng/ml,表明上述抗体对人CTLA-4与其配体的结合有高度的阻断作用。
根据表3和图3可以看到，用FACS测定所得到9个抗体与人CTLA-4的结合EC50最低的小于8ng/ml,表明上述抗体对人CTLA-4有高度的亲和力。
根据表4和图4可以看到，用ELISA测定所得到9个抗体对人CTLA-4与其配体结合的阻断作用，阻断IC50最低可以低于120ng/ml,表明上述抗体对人CTLA-4与其配体的结合有高度的阻断作用。
综合表1-4和图1-4可以得出，抗体3D2A10、5F6A1、10F8D1在对人CTLA-4的亲和力和对人CTLA-4与其配体结合的阻断作用特别优异。
实施例2
CTLA-4杂交瘤抗体对外周血单核细胞(PBMC)分泌细胞因子的影响实验，包括以下步骤：
(1)在50mL无菌离心管中加入淋巴细胞分离液Histopaque(Sigma,Cat No:1077-1)，然后加入等体积的血液，在室温用1500rpm离心30min。样品在离心管中分成四层，从上至下分别为血浆层，白细胞层，淋巴细胞分离液和红细胞层。将中间的白细胞层收集到新的离心管中，加入5倍体积的洗涤缓冲液(PBS+3％FBS)混匀洗涤，于1500rpm离心10min，共重复洗涤3次，用洗涤缓冲液重悬细胞并计数。
(2)细胞计数后，用完全培养基RPMI1640+10％FCS+2ng/mLSEB重悬PBMC(1×106细胞/mL)。在U底-96孔板中，每孔加入100μL PBMC以及100μl不同浓度的CTLA-4抗体(分别为1B3D4、3D2A10、4A2B5、5D5A9、5F6A1、6A4B9、9D3B4、10F8D1、2G6A11，起始浓度为10μg/mL,4倍系列稀释,依次为2.5μg/mL，0.625μg/mL，0.156μg/mL)，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中孵育72小时，收集上清液，用IL-2ELISA试剂盒(R&D Systems,Cat No:DY202)检测细胞因子的浓度。如图5所示，CTLA-4抗体能够显著促进PBMC分泌IL-2。
实施例3
CTLA-4抗体可变区基因的克隆，包括以下步骤：用TRIzon(Cwbiotech,Cat No:CW0580)裂解CTLA-4单克隆杂交瘤细胞株，提取杂交瘤细胞的总RNA。用HiFi Script cDNA合成试剂盒(Cwbiotech，Cat No:CW2569)将杂交瘤细胞的RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，用简并引物通过PCR方法(Kettleborough et al.(1993)Eur J Immunology 23:206-211；Strebe et al.(2010)Antibody Engineering 1:3-14)扩增抗体的重链和轻链的可变区基因。将PCR扩增产物连接到T/A载体后，转化DH5a感受态细胞，涂板并置37℃过夜培养。从培养板上挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，测定抗体的基因序列。根据抗体的基因序列，分析其互补决定簇(CDR)和骨架区。抗体的重链和轻链的可变区基因序列和氨基酸序列见序列表。
实施例4
人源化CTLA-4抗体10F8D1、3D2A10、5F6A1的制备。
采用互补决定区嫁接法来进行CTLA-4抗体的人源化。首先，在IMGT数据库中分别搜寻与鼠源10F8D1、3D2A10和5F6A1抗体的轻、重链可变区同源性最高的人胚系抗体(germLine antibody)序列。10F8D1抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV4-1*01，重链可变区人源化选取IGHV1-2*02。3D2A10抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV3-15*01，重链可变区人源化选取IGHV2-26*01。5F6A1抗体轻链人源化选取IGLV7-46*01，重链人源化选取IGHV5-51*01。保留鼠源抗体的CDR区，将鼠源抗体的框架区(framework)序列用人胚系抗体的框架区序列置换。其次，建立鼠源抗体的结构模型，逐个对比人源抗体与相应鼠源抗体结构模型中的每个不同氨基酸位点，如果在框架区的某个位点采用人的氨基酸序列没有导致CDR区域空间结构的破坏或改变，则该位点使用人的氨基酸序列，否则在该位点使用对应的鼠源序列(即回复突变为鼠源序列)。根据结构模拟，将10F8D1、3D2A10和5F6A1人源化抗体框架区的部分氨基酸回复突变为鼠源序列。
10F8D1抗体人源化重链的第48位Met回复突变为Ile，第67位Val回复突变为Ala，第69位Met回复突变为Leu，第71位Arg回复突变为Ala，第73位Thr回复突变为Lys，第94位Arg回复突变为Thr。3D2A10抗体人源化轻链的第48位Ile回复突变为Val，第71位Phe回复突变为Tyr。3D2A10抗体人源化重链的第30位Ser回复突变为Thr，第49位Ala回复突变为Gly，第73位Thr回复突变为Asn，第78位Val回复突变为Ala。5F6A1抗体人源化轻链的第36位Phe回复突变为Val，第46位Thr回复突变为Gly，第49位Tyr回复突变为Gly，第57位Trp回复突变为Gly，第69位Gly回复突变为Asp。5F6A1抗体人源化重链的第48位的Met回复突变为Ile，第67位Val回复突变为Ala，第69位Ile回复突变为Leu，第71位Ala回复突变为Val，第94位Arg回复突变为Lys。
3D2A10人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：55和SEQID NO：56。5F6A1人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：59和SEQID NO：60。10F8D1人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64。将3D2A10、5F6A1和10F8D1人源化抗体构建为IgG1亚型。3D2A10人源化完整抗体的重链和轻链氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58。5F6A1人源化完整抗体的重链和轻链氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62。10F8D1人源化完整抗体的重链和轻链氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66。
合成编码3D2A10、5F6A1和10F8D1人源化抗体轻链和重链的核酸序列(见序列表)，并插入到表达载体pcDNA3.1。用抗体轻链和重链表达质粒各0.5mg共转染1升293细胞(细胞密度为1×106)，在37度振摇培养6天，离心收集上清液，用Protein A纯化人源化抗体，纯化后的人源化抗体用于活性检测。
实施例5
人源化CTLA-4抗体10F8D1、3D2A10、5F6A1的活性检测。
采用ELISA和FACS检测纯化的人源化抗体样品与CTLA-4的结合及其阻断CTLA-4-Fc与CD80结合的活性，具体方法参考实施例1。人源化抗体3D2A10、5F6A1和10F8D1的测定结果见表5-8和图6-9。
表5.用ELSIA方法检测人源化CTLA-4抗体与CTLA-4-hFc蛋白结合的EC50。
| ng/mL | 3D2A10 | 5F6A1 | 10F8D1 |
| 结合EC50 | 1.203 | 2.040 | 1.494 |
表6.用ELSIA方法检测人源化CTLA-4抗体阻断配体结合CTLA-4-hFc的IC50。
| ng/mL | 3D2A10 | 5F6A1 | 10F8D1 |
| 阻断IC50 | 352.4 | 807.9 | 387.6 |
表7.用FACS方法检测人源化CTLA-4抗体结合293T-CTLA-4细胞的EC50。
| ng/mL | 3D2A10 | 5F6A1 | 10F8D1 |
| 结合EC50 | 78.83 | 242.6 | 23.09 |
表8.用FACS方法检测人源化CTLA-4抗体阻断配体结合293T-CTLA-4细胞的IC50。
| ng/mL | 3D2A10 | 5F6A1 | 10F8D1 |
| 阻断IC50 | 696.1 | 1546 | 1660 |
根据表5和图6可以看到，用ELISA测定所得到3个人源化抗体对于人CTLA-4的结合EC50在1-2ng/ml之间,表明上述抗体对人CTLA-4有高度的亲和力。
根据表6和图7可以看到，用ELISA测定所得到3个人源化抗体对人CTLA-4与其配体结合的阻断作用，阻断IC50最低可以低于360ng/ml,表明上述抗体对人CTLA-4与其配体的结合有高度的阻断作用。
根据表7和图8可以看到，用FACS测定所得到3个人源化抗体对人CTLA-4的结合EC50最低的小于24ng/ml,表明上述抗体对人CTLA-4有高度的亲和力。
根据表8和图9可以看到，用FACS测定所得到3个人源化抗体对人CTLA-4与其配体结合的阻断作用，阻断IC50最低可以低于700ng/ml,表明上述抗体对人CTLA-4与其配体的结合有高度的阻断作用。
综合表5-8和图6-9可以得出结论，人源化抗体3D2A10、5F6A1、10F8D1在对人CTLA-4的亲和力和对人CTLA-4与其配体结合的阻断作用特别优异。
实施例6
人源化CTLA-4抗体10F8D1、3D2A10、5F6A1外周血单核细胞(PBMC)分泌细胞因子的影响实验。
CTLA-4人源化抗体对外周血单核细胞(PBMC)分泌细胞因子的影响。将CTLA-4人源化抗体以及SEB与人PBMC置37℃培养72小时，收集上清液，检测上清液中IL-2的浓度，具体测定方法参考实施例2。结果如图10，表明人源化的CTLA-4抗体能够显著促进PBMC分泌IL-2。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 东大生物技术（苏州）有限公司
<120> 一组CTLA-4单克隆抗体及其医药用途
<130> 2019
<160> 66
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 342
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>1B3D4 重链可变区 DNA序列
<400> 1
cagctgcagc agtctggggc tgagctggtg aggcctgggt cttcagtgaa actgtcctgc 60
agggcttctg gctacacctt caccagctac tggatgcatt gggtgaagca gaggcctata 120
caaggccttg aatggattgg taacattgac ccttctgata gtgaaactca ctacaatgaa 180
gagttccagg acaaggccac attgactgta gacaactcct ccagcacagc ctacatgcag 240
ctcagcagcc tgacatctga ggactctgca gtctatttct gtgcaagggg gactggttac 300
tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca 342
<210> 2
<211> 321
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>1B3D4 轻链可变区 DNA序列
<400> 2
gatattgtga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60
ctttcctgca gggccagcca aagtatcagt atcaacccac actggtatca acaaaaatca 120
catgagtctc caaggcttct catcaagtat gcttcccagt ccgtctctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca ttatcaacag tgtggagact 240
gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtaacagct ggcctcacac gttcggctcg 300
gggacaaaat tggaaataaa a 321
<210> 3
<211> 114
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>1B3D4 重链可变区 氨基酸序列
<400> 3
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val
1 5 10 15
Lys Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met
20 25 30
His Trp Val Lys Gln Arg Pro Ile Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn
35 40 45
Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Glu Glu Phe Gln Asp
50 55 60
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
85 90 95
Gly Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>1B3D4 轻链可变区 氨基酸序列
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Asn
20 25 30
Pro His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 357
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>3D2A10 重链可变区 DNA序列
<400> 5
caggtgcagt tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60
acctgcacag tctctggttt ctcattaact aactatgctg tacactgggt tcgtcagtct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggatacat agactataat 180
gcagttttca tatccagact gagaatcagc aaggacaatt ccagcagcca agctttcctt 240
aaaatgaaca gtctgcaaag tgatgacaca gccatatatt actgtgccag atcaggggag 300
actgggacct actactttga ctactggggc caaggcacca ttctcacagt ctcctca 357
<210> 6
<211> 321
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>3D2A10 轻链可变区 DNA序列
<400> 6
gaaatccagc tgtctcagtc tccatccacc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gcgcaagtga aaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctattct gcaacaaagt tagcaaatgg tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc agggacacac tattccctca agatcaacag tctgcagtct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtggtc gttcggtgca 300
ggcaccaaac tggaactcaa a 321
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>3D2A10 重链可变区 氨基酸序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Ala Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Tyr Asn Ala Val Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Arg Ile Ser Lys Asp Asn Ser Ser Ser Gln Ala Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Glu Thr Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ile Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>3D2A10 轻链可变区 氨基酸序列
<400> 8
Glu Ile Gln Leu Ser Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Lys Leu Ala Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Ser Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 9
<211> 357
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>4A2B5B5 重链可变区 DNA序列
<400> 9
gatatacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60
acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttttt actggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacataacct ccgacggtat caatgtctac 180
aacccatctc tcaaaaatcg attctccatc actcgtgaca catctaagaa ccaatttttc 240
ctgaagttga attctgtgac tgctgaggac acagctacat attactgtgc aagaaactat 300
ggtaactggg gggctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 10
<211> 318
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>4A2B5B5 轻链可变区 DNA序列
<400> 10
gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 60
atcacttgca gggcaagcca agacattaag aagtatatag gttggttcca acacaagcct 120
ggaaaaggtc ctaggcttct catatattac acatctactt tacagccagg catcccatca 180
aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcaccaa cctggagcct 240
gaagatattg caacctatta ttgtctacag tatgataata tgcacacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaataaaa 318
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>4A2B5B5 重链可变区 氨基酸序列
<400> 11
Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Phe Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Ser Asp Gly Ile Asn Val Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Gly Asn Trp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 106
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>4A2B5B5 轻链可变区 氨基酸序列
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr
20 25 30
Ile Gly Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Thr Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Met His Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 351
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>5D5A9C9 重链可变区 DNA序列
<400> 13
caggttcagc tggaggagtc tggagctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatg 60
tcctgcaaga cttctggata tacattcaca aactacggta taaactgggt gaaacagagg 120
cctggacagg gcctggaatg gattggaaag atttatattg gaaatggtta tactgaatat 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acttcagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgacgac tctgcaatct atttctgtgc acgctgggac 300
cactattcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
<210> 14
<211> 321
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>5D5A9C9 轻链可变区 DNA序列
<400> 14
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgttgtag tctggtatca acaaaaacca 120
ggacaatctc ctaaagtact gatttattcg gcatcttacc ggtacactgg agtccctgat 180
cgcttcgctg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcgggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcaacaa cattatagta ctccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 15
<211> 117
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>5D5A9C9 重链可变区 氨基酸序列
<400> 15
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp His Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>5D5A9C9 轻链可变区 氨基酸序列
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Arg Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 345
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>5F6A1 重链可变区 DNA序列
<400> 17
gaggcccaac tgcagcagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggagcttc aatgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacaccg tgaactgggt gaagcggagc 120
catggagaga accttgagtg gattggactt attaatcctt acaatggagt tactaactat 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240
atggagctcc tcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aaaattggac 300
tacgttgact tctggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 18
<211> 327
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>5F6A1 轻链可变区 DNA序列
<400> 18
caggctgttg tgactcagga atctacactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60
acttgtcgct caagtactgg ggctgttgca actagtaact ttgccaactg ggtccaagaa 120
aagccagatc atttattcac tggtctaata ggtggtacca acaaccgagc tccaggtgtt 180
cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat tacaggggca 240
cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acagcaccca ctgggtgttc 300
ggtggaggaa ccaaactgac tgtccta 327
<210> 19
<211> 115
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>5F6A1 重链可变区 氨基酸序列
<400> 19
Glu Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Val Asn Trp Val Lys Arg Ser His Gly Glu Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Asp Tyr Val Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 109
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>5F6A1 轻链可变区 氨基酸序列
<400> 20
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Thr Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Ala Thr Ser
20 25 30
Asn Phe Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Thr
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 21
<211> 348
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>6A4B9 重链可变区 DNA序列
<400> 21
caggtccagc tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcttc attgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactactgga tgcattgggt gaaacagagg 120
cctatacagg gccttgaatg gattggtaac attgaccctt ctgatagtga gactcactac 180
aatcaagact tcagggacaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcaactca ccagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc tcgaggggga 300
agtttcttcg atgtctgggg cacagggacc acggtcaccg tctcctca 348
<210> 22
<211> 321
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>6A4B9 轻链可变区 DNA序列
<400> 22
gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcact 60
ctttcctgca gggccagcca aagtattaga aacaacctaa actggtttca acaaaaatcg 120
catgagtctc caaggcttct catcaaatat gtttcccatt ccatctctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcaacac tgtggagact 240
gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtgacagct ggcctcacac gttcgggggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 23
<211> 116
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>6A4B9 重链可变区 氨基酸序列
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Ile Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Asp Phe
50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Phe Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>6A4B9 轻链可变区 氨基酸序列
<400> 24
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Val Ser His Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 360
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>9D3B4 重链可变区 DNA序列
<400> 25
caggttcagc tgcagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gataggggct atttatcctg gaaatagtga tactggctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240
atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtac aagagacaaa 300
tttattagta cggtaataga ggactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360
<210> 26
<211> 321
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>9D3B4 轻链可变区 DNA序列
<400> 26
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
agattcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag gctaatatgc ttcctcggac gttcggtgga 300
ggcaccaacc tggaaatcaa a 321
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>9D3B4 重链可变区 氨基酸序列
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Lys Phe Ile Ser Thr Val Ile Glu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>9D3B4 轻链可变区 氨基酸序列
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Asn Met Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 360
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>10F8D1D9 重链可变区 DNA序列
<400> 29
caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aactactgga tgcactgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta ccactactta tactaactac 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca agtcttccag cacagcctac 240
atgcagctga gcagcctgac atatgaggac tctgcagtct attactgtgc aaccacagct 300
caggctacgg gatatggtat ggacttctgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 30
<211> 339
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223>10F8D1D9 轻链可变区 DNA序列
<400> 30
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccactca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagtttt 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>10F8D1D9 重链可变区 氨基酸序列
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Thr Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Thr Ala Gln Ala Thr Gly Tyr Gly Met Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 113
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>10F8D1D9 轻链可变区 氨基酸序列
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Thr Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 33
<211> 357
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223> 2G6A11重链可变区 DNA序列
<400> 33
gaggttaagc tggaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60
acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggagctg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacataagct acgatggtga caataactac 180
aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240
ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagaaactac 300
ggtacctcag gggctctgga ctactggggt caaggaacct cactcaccgt ctcctca 357
<210> 34
<211> 318
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<223> 2G6A11轻链可变区 DNA序列
<400> 34
gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 60
atcacttgca aggcaagcca agacattcac aagtatatag gttggtacca acacaagcct 120
ggaaaaggtc ctaggctgct catatattac acatcaacat tacagccagg catcccatca 180
aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 240
gaagatattg caacttatta ttgtcaacag tatgataatc tattcacgtt cggctcgggg 300
acaaagttgg aaataaaa 318
<210> 35
<211> 119
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223> 2G6A11重链可变区 氨基酸序列
<400> 35
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Asp Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Gly Thr Ser Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 106
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223> 2G6A11轻链可变区 氨基酸序列
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Lys Tyr
20 25 30
Ile Gly Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>3D2A10 重链CDR1区 氨基酸序列
<400> 37
Asn Tyr Ala Val His
1 5
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>3D2A10 重链CDR2区 氨基酸序列
<400> 38
Val Ile Trp Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Tyr Asn Ala Val Phe Ile Ser
1 5 10 15
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>3D2A10 重链CDR3区 氨基酸序列
<400> 39
Asn Tyr Ala Val His
1 5
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>3D2A10 轻链CDR1区 氨基酸序列
<400> 40
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>3D2A10 轻链CDR2区 氨基酸序列
<400> 41
Ser Ala Thr Lys Leu Ala Asn
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>3D2A10 轻链CDR3区 氨基酸序列
<400> 42
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>5F6A1 重链CDR1区 氨基酸序列
<400> 43
Gly Tyr Thr Val Asn
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>5F6A1 重链CDR2区 氨基酸序列
<400> 44
Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>5F6A1 重链CDR3区 氨基酸序列
<400> 45
Leu Asp Tyr Val Asp Phe
1 5
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>5F6A1 轻链CDR1区 氨基酸序列
<400> 46
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Ala Thr Ser Asn Phe Ala Asn
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>5F6A1 轻链CDR2区 氨基酸序列
<400> 47
Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>5F6A1 轻链CDR3区 氨基酸序列
<400> 48
Ala Leu Trp Tyr Ser Thr His Trp Val
1 5
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>10F8D1D9 重链CDR1区 氨基酸序列
<400> 49
Asn Tyr Trp Met His
1 5
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>10F8D1D9 重链CDR2区 氨基酸序列
<400> 50
Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Thr Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>10F8D1D9 重链CDR3区 氨基酸序列
<400> 51
Thr Ala Gln Ala Thr Gly Tyr Gly Met Asp Phe
1 5 10
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>10F8D1D9 轻链CDR1区 氨基酸序列
<400> 52
Lys Ser Thr Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>10F8D1D9 轻链CDR2区 氨基酸序列
<400> 53
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>10F8D1D9 轻链CDR3区 氨基酸序列
<400> 54
Gln Asn Asp Tyr Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 55
<211> 119
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体3D2A10 重链可变区氨基酸序列
<400> 55
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Ala Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Tyr Asn Ala Val Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ala Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Glu Thr Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体3D2A10 轻链可变区氨基酸序列
<400> 56
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Lys Leu Ala Asn Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 449
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体3D2A10 重链全长氨基酸序列
<400> 57
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Ala Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Tyr Asn Ala Val Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ala Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Glu Thr Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 58
<211> 214
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体3D2A10 轻链全长氨基酸序列
<400> 58
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Lys Leu Ala Asn Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 59
<211> 115
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体5F6A1 重链可变区氨基酸序列
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Val Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Asp Tyr Val Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 109
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体5F6A1 轻链可变区氨基酸序列
<400> 60
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Ala Thr Ser
20 25 30
Asn Phe Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Thr
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 61
<211> 445
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体5F6A1 重链全长氨基酸序列
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Val Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Asp Tyr Val Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
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420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 62
<211> 215
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体5F6A1 轻链全长氨基酸序列
<400> 62
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Ala Thr Ser
20 25 30
Asn Phe Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Thr
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 63
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体10F8D1D9 重链可变区氨基酸序列
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Thr Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Thr Ala Gln Ala Thr Gly Tyr Gly Met Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 113
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体10F8D1D9 轻链可变区氨基酸序列
<400> 64
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Thr Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 65
<211> 450
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体10F8D1D9 重链全长氨基酸序列
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Thr Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Thr Ala Gln Ala Thr Gly Tyr Gly Met Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
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450
<210> 66
<211> 220
<212> PRT
<213> 鼠
<220>
<223>人源化抗体10F8D1D9 轻链全长氨基酸序列
<400> 66
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
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195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
Claims (10)
1.一组CTLA-4单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链的CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：37、43、49中的一种；所述重链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：38、44、50中的一种；所述重链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：39、45、51中的一种；所述轻链的CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：40、46、52中的一种；所述轻链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：41、47、53中的一种；所述轻链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：42、48、54中的一种；其中所述抗原结合片段的重链和轻链包含分别跨越所述抗体的重链和轻链的CDR1到CDR3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一组CTLA-4单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35中的一种；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36中的一种。
3.根据权利要求2所述的一组CTLA-4单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链和轻链经过人源化；所述人源化重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：55、59、63中的一种；所述人源化轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：56、60、64中的一种。
4.根据权利要求3所述的一组CTLA-4单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源化重链的全长氨基酸选自SEQ ID NO：57、61、65中的一种；所述人源化轻链的全长氨基酸选自SEQ ID NO：58、62、66中的一种。
5.一种DNA分子，其特征在于编码权利要求1-4任一项所述的氨基酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于包含权利要求5所述的DNA序列以及与该序列相关的表达调控序列。
7.权利要求1-4任一项所述的一组CTLA-4单克隆抗体或其抗原结合片段在制备如下药物中的用途：阻断CTLA-4与B7结合的药物、调节CTLA-4活性或CTLA-4水平的药物、解除CTLA-4对机体免疫抑制的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
8.一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其中，所述单克隆抗体为权利要求1-4任一项所述的一组CTLA-4单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种。
9.权利要求8中所述的单克隆抗体偶联物在制备如下药物中的用途：阻断CTLA-4与B7结合的药物，调节CTLA-4活性或CTLA-4水平的药物、解除CTLA-4对机体免疫抑制的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
10.权利要求8中所述的单克隆抗体偶联物在制备预防和治疗或者辅助治疗肿瘤的药物中的用途。
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