CN109627338A - 一种新型抗人pd-l1抗体及其应用 - Google Patents

一种新型抗人pd-l1抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗人PD‑L1的单克隆抗体，还提供了用于表达PD‑L1抗体的编码本发明抗体的核酸序列。本发明进一步提供了确认抗体体外功能的方法。本发明中的抗体提供了一种用于诊断多种癌症的免疫组化试剂。

Description

一种新型抗人PD-L1抗体及其应用
技术领域
本发明主要涉及PD-L1单克隆抗体及其组合物，以及使用抗PD-L1抗体对人类疾病的免疫组化诊断。
背景技术
程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1，PD-L1)，也称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，是人类中由CD274基因编码的蛋白质。PD-L1是一种40kDa的1型跨膜蛋白，据推测其在特定事件如妊娠，组织同种异体移植，自身免疫性疾病和其他疾病状态如肝炎中在抑制免疫系统中起主要作用。通常，免疫系统对与外源或内源性危险信号相关的外来抗原起反应，这引发抗原特异性CD8+T细胞和/或CD4+辅助细胞的增殖。PD-L1与PD-1或B7.1的结合传递抑制信号，其减少淋巴结中抗原特异性T细胞的增殖，同时减少调节性T细胞(抗炎，抑制性T细胞)中的细胞凋亡。
在所有免疫检查点中，PD-L1-PD-1途径因其在许多恶性肿瘤中作为治疗靶标被证明具有的价值而脱颖而出。目前，针对PD-L1-PD-1轴的抗体正在1000多种临床中进行评估，并已被批准用于癌症，包括黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、头和鳞状细胞癌(HNSCC)和Merkel细胞癌、宫颈癌、胃癌、肠癌等MSI-H(高度微卫星不稳定)或DNA错配修复缺陷，具有广谱抗肿瘤功能，目前肺癌PD-1靶点治疗性抗体主要有Keytruda和Opdivo，两者对肺癌患者治疗有效率约20％，接受PD-1抗体治疗的晚期肺癌患者5年生存率提高5-6倍。为此，筛选出治疗有效的候选患者具有重要临床意义，同时还可避免盲目用药。此外，PD-L1表达与多种肿瘤预后相关，其检测可以预测存活期。
目前临床上通常用免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)实验检测肿瘤组织内肿瘤细胞中PD-L1的表达情况，而该实验的核心为特异性结合PD-L1蛋白的单克隆抗体，其性能直接决定检测的特异性和灵敏度。此外，PD-L1阴性仍存在不可靠性，检测结果可能因为抗体不同和组织样本不同而异。同时，肿瘤组织异质性，低表达以及诱导基因也可能导致抽样误差或假阴性，特别是免疫组化染色分析，其临床PD-L1组织表达临界值读取存在主观因素。因此，目前PD-L1-IHC阳性仍然是一种不完全反应生物标志物，不能作为筛选PD-1-PD-L1抑制剂治疗患者的“确定性”指标，需要不断发掘精确、简便可行、具有系统性的多组分预测标志物。因此，开发出一种特异性强和高灵敏度的结合人PD-L1抗体的单克隆抗体具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种抗人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与如SEQ ID NO:1-4所示的任一氨基酸序列特异性结合。
本发明中的抗人PD-L1抗体或其抗原结合片段与PD-L1的亲和常数为6×10-7mol/L或更低。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，以及
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，
其中轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，轻链可变区CDR3序列包含选自由SEQID NO:7和SEQ ID NO:17所组成的组中的氨基酸序列，
重链可变区CDR1序列包含选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所组成的组中的氨基酸序列，重链可变区CDR2序列包含选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15所组成的组中的氨基酸序列，重链可变区CDR3序列包含选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16所组成的组中的氨基酸序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，以及
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，
其中轻链可变区CDR1序列包含与SEQ ID NO:5具有80％以上序列同一性的氨基酸序列，轻链可变区CDR2序列包含与SEQ ID NO:6具有80％以上序列同一性的氨基酸序列，轻链可变区CDR3序列包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:17具有80％以上序列同一性的氨基酸序列，
重链可变区CDR1序列包含与SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:14具有80％以上序列同一性的氨基酸序列，重链可变区CDR2序列包含与SEQ ID NO:9、或SEQ IDNO:12、或SEQ ID NO:15具有80％以上序列同一性的氨基酸序列，重链可变区CDR3序列包含与SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:16具有80％以上序列同一性的氨基酸序列。
在一个具体实施例中，所述轻链可变区CDR1序列包含与SEQ ID NO:5具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列，轻链可变区CDR2序列包含与SEQ ID NO:6具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列，轻链可变区CDR3序列包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:17具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列，
重链可变区CDR1序列包含与SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:14具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列，重链可变区CDR2序列包含与SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:15具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列，重链可变区CDR3序列包含与SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:13、或SEQ IDNO:16具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列，且所述抗人PD-L1抗体或其抗原结合片段与PD-L1的亲和常数为6×10-7mol/L或更低。
在一个实施例中，所述轻链可变区还包括如SEQ ID NO:18所示的骨架区FR1、如SEQ ID NO:19所示的骨架区FR2、如SEQ ID NO:20所示的骨架区FR3和如SEQ ID NO:21所示的骨架区FR4；所述重链链可变区还包括如SEQ ID NO:22所示的骨架区FR1、如SEQ ID NO:23所示的骨架区FR2、如SEQ ID NO:24所示的骨架区FR3和如SEQ ID NO:25所示的骨架区FR4。
在一个实施例中，所述轻链可变区还包括与SEQ ID NO:18具有80％以上序列同一性的骨架区FR1、与SEQ ID NO:19具有80％以上序列同一性的骨架区FR2、与SEQ ID NO:20具有80％以上序列同一性的骨架区FR3和与SEQ ID NO:21具有80％以上序列同一性的骨架区FR4；所述重链链可变区还包括与SEQ ID NO:22具有80％以上序列同一性的骨架区FR1、与SEQ ID NO:23具有80％以上序列同一性的骨架区FR2、与SEQ ID NO:24具有80％以上序列同一性的骨架区FR3和与SEQ ID NO:25具有80％以上序列同一性的骨架区FR4，抗人PD-L1抗体或其抗原结合片段与PD-L1的亲和常数为6×10-7mol/L或更低。
在一个具体实施例中，所述轻链可变区还包括与SEQ ID NO:18具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的骨架区FR1、与SEQ ID NO:19具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的骨架区FR2、与SEQ ID NO:20具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的骨架区FR3和与SEQ ID NO:21具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的骨架区FR4；所述重链链可变区还包括与SEQ ID NO:22具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的骨架区FR1、与SEQ IDNO:23具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的骨架区FR2、与SEQ ID NO:24具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的骨架区FR3和与SEQ ID NO:25具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的骨架区FR4，所述抗人PD-L1抗体或其抗原结合片段与PD-L1的亲和常数为6×10-7mol/L或更低。
在一个具体实施例中，如前任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是鼠源抗体、人源化抗体、合成抗体、或嵌合抗体。
在一个具体实施例中，如前任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、多克隆抗体、或双特异性抗体。
其中所述抗体或其抗原结合片段可与表达PD-L1的癌症组织或免疫细胞特异性结合，所述癌症包括肺癌、黑色素瘤、NSCLC、经典霍奇金淋巴瘤、HNSCC、肾细胞癌、尿路上皮癌、头颈部癌、胃癌、血液恶性肿瘤、前列腺癌、子宫颈癌、脑癌、肝细胞癌和结直肠癌的一种以上。
另一方面，本发明进一步提供了一种核酸分子，其编码如前任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明进一步提供了一种克隆或表达载体，其包含如前所述的核酸分子。
本发明进一步提供了一种宿主细胞，其包含一个以上如前所述的克隆或表达载体。
本发明进一步提供了一种用于生产如前任一项所述的抗体或其抗原结合片段的过程，包括培养如前所述的宿主细胞，并且分离所述抗体。
本发明还提供了一种转基因鼠，其表达如前任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种从如前所述的转基因鼠制备的杂交瘤，其特征在于，所述杂交瘤产生所述抗体。
本发明还提供了一种药物组合物，包含如前任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
再一方面，本发明进一步提供了一种偶联物，包含连接至治疗剂、荧光物质、放射性同位素、或酶的如前任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施例中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′,4′,5′,7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红的一种以上。
在一个实施例中，所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr的一种以上。
在一个实施例中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶的一种以上。
本发明进一步提供了一种组合物，其包含如前任一项所述的偶联物和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明进一步提供了如前任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如前任一项所述的偶联物在制备用于组织免疫组化试剂中的应用。
本发明进一步提供了如前任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如前任一项所述的偶联物在制备用于诊断癌症和/或免疫关联疾病的产品的应用。
在一个实施例中，所述癌症包括肺癌、黑色素瘤、NSCLC、经典霍奇金淋巴瘤、HNSCC、肾细胞癌、尿路上皮癌、头颈部癌、胃癌、血液恶性肿瘤、前列腺癌、子宫颈癌、脑癌、肝细胞癌和结直肠癌的一种以上。
在一个实施例中，检测PD-L1的方法包括流式细胞术、免疫印迹(Western blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组化(IHC)和免疫细胞化学(ICC)的一种以上。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于制备抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(a)提供：
(i)一个轻链可变区的抗体序列，其包含选自SEQ ID NO:5所示的CDR1序列，选自SEQ ID NO:6所示的CDR2序列以及选自由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:17所组成的组中的CDR3序列；和/或
(ii)一个重链可变区的抗体序列，其包含选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所组成的组中的CDR1序列，选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15所组成的组中的CDR2序列以及选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16所组成的组中的CDR3序列；并且
(b)表达抗体序列成为蛋白质。
发明的有益效果
本发明中的PD-L1抗体与人PD-L1蛋白的结合具有特异性强、检测灵敏度高的特点。该抗体适合用于肺癌等恶性肿瘤组织标本中的免疫组化检测中，可提高检测的准确度。
附图说明
图1示出单克隆抗体在PD-L1阳性细胞即转染PD-L1质粒的HEK-293T上的IHC检测结果图，其中一抗为实施例中制备的PD-L1单克隆抗体WD-160、WD-161、WD-162、WD-163，使用浓度为1μg/mL；IgG为阴性对照。
图2示出单克隆抗体在PD-L1阳性细胞即转染PD-L1质粒的HEK-293T上的WesternBlot检测结果图，其中一抗为实施例中制备的PD-L1单克隆抗体WD-160、WD-161、WD-162、WD-163，使用浓度为1μg/mL。
图3示出实施例中制备的PD-L1单克隆抗体WD-160、WD-161、WD-162、WD-163和安捷伦Dako的PD-L1(Clone 22C3)单克隆抗体在扁桃体的免疫组化检测代表性结果图，一抗使用浓度为1μg/mL；IgG为阴性对照。
图4示实施例中制备的PD-L1单克隆抗体WD-160、WD-161、WD-162、WD-163和安捷伦Dako的PD-L1(Clone 22C3)单克隆抗体在扁桃体的免疫组化检测中表达强度的统计图，***代表p<0.001。
图5示出实施例中制备的PD-L1单克隆抗体WD-160、WD-161、WD-162、WD-163和安捷伦Dako的PD-L1(Clone 22C3)单克隆抗体在非小细胞肺癌的免疫组化检测结果图，一抗使用浓度为1μg/mL；IgG为阴性对照。
图6示示出实施例中制备的PD-L1单克隆抗体WD-160、WD-161、WD-162、WD-163和安捷伦Dako的PD-L1(Clone 22C3)单克隆抗体在非小细胞肺癌的免疫组化检测中表达强度的统计图，***代表p<0.001。
具体实施方式
下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。
如本文中所使用，术语“程序性死亡配体1”、“PD-配体1”、“PD-L1”、“PD L1”、“B7同源物1”、“B7-H1”、“CD274”可互换使用，包括变体、同种型、人PD-L1的物种同源物和具有PD-L1的至少一个共同表位的类似物。
如本文中所使用，术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”是指包含至少两条重链(H)和两条轻链(L)并通过二硫键相互连接的，或其抗原结合部分的蛋白质。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，CH1，CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区的。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，与更保守的称为构架区(FR)的区域散布。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。
术语“抗体”，在本申请中所用的是指免疫球蛋白或其片段或它们的衍生物，并且包括其包含的抗原结合位点的任何多肽，而不管其是否是在体外或体内产生，即包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体。该术语包括，但不限于，多克隆、单克隆、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化(humanized)、单链的、嵌合的(chimeric)、双功能的(bifunctional)、合成的、异构形式的(isoforms)、重组的、杂合的、突变的、嫁接的抗体。术语“抗体”还包括抗体片段例如Fab、F(ab')2、FV、scFv、Fd、dAb和其它保留抗原结合功能的抗体片段，即，能够与PD-L1的特异性结合。通常情况下，这样的片段将包括抗原结合片段。抗体的类型可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。
术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”和“结合片段”是指一种抗体分子，其包含负责具体的抗体和抗原之间的结合的氨基酸。例如，其中的抗原是大的，抗原结合片段只结合抗原的一部分。即抗原分子中负责与抗原结合片段特异性相互作用的部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。
抗原结合片段通常包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，然而，它不一定必须包括两者。例如，一个所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域组成，但仍保留了完整抗体的一些抗原结合功能。本发明中抗体或抗原结节片段可以为一种功能性衍生物，即指氨基酸替换的变体，例如取代、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同或相似活性的抗体或片段，一个功能性衍生物保留有可检测的结合蛋白活性，因其具有与本发明所述的结合蛋白完全相同的CDR序列，因此具有相类似的生物活性。在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段的抗原结合结构域与本发明中所述CDR氨基酸序列具有至少80％、或85％、或90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的序列同一性。
本发明中抗体或抗原结节片段可以为一种功能片段，其指对于PD-L1具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗体片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。抗体片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的骨架区构成。通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
具体实施例：
实施例1PD-L1单克隆抗体的制备和筛选
1.抗原制备
PD-L1抗原为人PD-L1蛋白的胞质区，具体序列选自SEQ ID NO:1-4所示。其中SEQID NO:1-4之间具有序列同一性。
SEQ ID NO 1：MDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
SEQ ID NO 2：CGIQDTNSKKQSDTHLEET
SEQ ID NO 3：DTNSKKQSDTHLEET
SEQ ID NO 4：LGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
2.免疫
将上述具体序列的PD-L1抗原分别与完全弗氏完全佐剂混合并乳化，分别采用皮下注射方法免疫不同BALB/c小鼠，间隔两周后以含有抗原的不完全弗氏佐剂乳化进行第二次免疫。免疫两次后取血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取与SEQ IDNO:1-4抗原免疫一一对应的抗体效价最高的小鼠分别进行细胞融合。
3.细胞融合
骨髓瘤细胞采用鼠来源的FO鼠骨髓瘤样细胞株，融合时处于对数生长期；取已免疫鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，滴加50％PEG1500，加入不完/全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到96孔板中，放于培养箱中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养。
4.筛选和克隆
融合7-10天内挑选细胞克隆，使用PD-L1抗原进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株分别为WD-160、WD-161、WD-162、WD-163。
5.细胞上清单抗的制备与纯化
将细胞株WD-160用含15％血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中培养，扩倍至约4×107个时，800rpm离心5分钟，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基。继续培养1-2周后，收取细胞悬液，取上清，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，单抗WD-160、WD-161、WD-162和WD-163亚型为IgG，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装(100μL/管，浓度为1mg/mL)、保存在4-8℃。
6.杂交瘤抗体核酸全长测序
依据试剂TriZol说明书，从杂交瘤细胞中分离出总RNA，依据PrimeSeCpTTM第一链cDNA合成试剂盒说明书，将总RNA逆转录成cDNA，根据特异性引物扩增VH、VL、CH和CL的抗体片段，将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中、测序。
其中，WD-160的轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-7所示(SEQ ID NO 5：QSLLYSNGKTF；SEQ ID NO 6：LVS；SEQ ID NO 7：VQGTHFPHT)；重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8-10所示(SEQID NO 8：GYSFTDYS；SEQ ID NO 9：IDPSKGNT；SEQ ID NO 10：SRGDYSAWFAY)。WD-161轻链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-7所示；WD-161重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11-13所示(SEQ ID NO11：GYSFTDYS；SEQ ID NO 12：IDPSKGNT；SEQ ID NO 13：SRGDYSAWFAY)；WD-162轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-7所示；WD-162重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:14-16所示(SEQ ID NO 14：EYEFPSQD；SEQ ID NO 15：INSDGGRT；SEQ ID NO 16：GRLKKLVQRTWFAY)。WD-163轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5、6、17所示(SEQ ID NO 17：QHIRELTRSEGGPSWK)；WD163重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:8-10所示。
WD-160至163的轻链可变部分的骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-L4分别如SEQ IDNO:18-21(SEQ ID NO 18：DVVMTQTPLTLSITIGQPASISCKSS；SEQ ID NO 19：LHWLLLRPGQSPKRLIY；SEQ ID NO 20：KLGSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYC；SEQ ID NO21：FGGGTKLEIKR)。WD-160至163的重链可变部分的骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4分别如SEQ ID NO:22-25所述(SEQ ID NO 22：EIQLQQSGPDLVKPGASVTVSCKAS；SEQ ID NO 23：LCWVKQSLGKSLEWIGY；SEQ ID NO 24：GYNQKFKGKATLTVDKSSNTAFMHLNSLTSEDSAVYFC；SEQ IDNO 25：WGQGTLVTVSA)。WD-160至163的轻链恒定部分如SEQ ID NO:26(ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC)。WD-160至163的重链恒定部分如SEQ ID NO:27(SEQ ID NO 27：AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDV LTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDF FPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK)。
实施例2.单克隆抗体PD-L1作为一抗的免疫组化检测
1.样本准备：将福尔马林固定石蜡包埋切片于60℃恒温箱中烤片1～2小时，室温保存备用。
2.脱蜡与水化：
石蜡切片置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×2次；
去除多余的液体后，置无水乙醇中，浸泡3分钟×2次；
去除多余的液体后，置95％乙醇中，浸泡3分钟；
去除多余的液体后，置85％乙醇中，浸泡3分钟；
去除多余的液体后，置70％乙醇中，浸泡3分钟；
纯化水冲洗3分钟×2次。
3.抗原修复：推荐使用pH9.0EDTA高温热修复法，如果使用自动修复仪可设置98℃高温修复20分钟，让切片自然冷却至室温。用免疫组化笔将待测组织圈起来，纯化水冲洗2次，每次3分钟。
4.内源性过氧化物酶灭活：滴适量内源性过氧化物酶阻断剂完全覆盖组织，室温孵育10分钟后，纯化水冲洗2次，每次3分钟，PBS冲洗一次。
5.一抗及空白对照抗体孵育：加入1～3滴PD-L1单克隆抗体或空白对照抗体完全覆盖组织，常温孵育1小时后，PBS冲洗3次每次5分钟。
6.二抗孵育：依照所用二抗染色系统DAB染色液试剂盒的说明书进行二抗孵育，完毕后PBS洗片3次，每次五分钟，纯化水洗1次。
7.DAB显色：依照所用试剂说明书进行配制DAB显色液，滴适量配制好的DAB显色液完全覆盖组织，依据颜色变化终止染色，纯化水冲洗3次。
8.苏木素衬染：依照苏木素厂家说明书操作步骤及建议对切片进行衬染，PBS或自来水冲洗返蓝。
9.脱水透明：依次浸泡梯度酒精70％，85％，95％，100％，100％，每次3分钟；两次二甲苯透明，每次10钟。
10.封片：用中性树胶对样品进行封片。
由图1结果可见，PD-L1蛋白在过表达PD-L1质粒的HEK-293T细胞中呈特异性细胞膜和细胞质表达，而在过表达空载体的HEK-293T细胞中无特异性着色，说明实施例1制备的PD-L1抗体具有很好的特异性。
由图2结果可见，在过表达PD-L1质粒的HEK-293T裂解中，PD-L1抗体能够检测到PD-L1蛋白的条带，而在HEK-293T裂解液组中则无条带，说明实施例1制备的PD-L1抗体具有很好的特异性。
由图3和图4结果可见，PD-L1蛋白在扁桃体组织中呈特异性细胞膜和细胞质表达，并且WD-160组、WD-161组、WD-162组和WD-163组的PD-L1信号均显著强于安捷伦Dako的PD-L1(Clone 22C3)组。同等抗体浓度下,WD160染色阳性信号较安捷伦Dako的PD-L1(Clone22C3)组染色阳性信号显著增强较弱，意味着本抗体灵敏度更高，在产品设计中可以使用更低的抗体浓度，降低生产成本，使得检测更加灵敏的同时有更低的背景。抗体灵敏度高使得在IHC染色中信号更强，病理医生主观评分更容易，对于检测区分免疫组织或免疫相关疾病更准确。由图5和图6结果可见，PD-L1蛋白在非小细胞肺癌组织中呈特异性细胞膜和细胞质表达，并且WD-160组、WD-161组、WD-162组和WD-163组的PD-L1信号均显著强于安捷伦Dako的PD-L1(Clone 22C3)组。Dako的PD-L1(Clone 22C3)组染色阳性信号较弱，在一些恶性程度较低或者早期癌症组织中会存在检测灵敏度低的问题，而本发明的抗体由于其特异性好，阳性信号强等特点，在IHC染色中评分更容易，对于检测区分癌症更准确。
实施例3.亚型鉴定
通过ELISA方法检测WD160、WD161、WD162和WD163抗体的亚型。结果显示WD-160、WD-161、WD-162和WD-163抗体的亚型为IgG1。
实施例4.亲和力测定
1.从4℃中取出如序列SEQ ID NO:1-4的PD-L1的多肽抗原。恢复至室温。配置不同多肽摩尔浓度，取100μL/孔加到96孔送样板上。
2.本实施例将WD-160、WD-161、WD-162、WD-163抗体稀释成初始质量浓度0.125μg/mL，抗体分子量为150kD，摩尔浓度约为0.83nmol/L。
3.将稀释好的抗体添加有多肽的96孔送样板上，100μL/孔，与系列倍比稀释的抗原吹打混匀。盖上封板膜，37℃孵育1小时，使反应达到平衡。
4.将酶标板从37℃取出，倒空液体，冲洗3次，拍干水分。
5.将稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，100μL/孔加入酶标板中，37℃孵育1小时。
6.将酶标板从37℃取出，倒空液体，冲洗5次，拍干水分。
7、每孔100μL加入TMB显色液，室温反应6分钟。
8、每孔50μL 2M H2SO4终止显色。
9、在酶标仪上于450nm读取OD值，整理数据，分析结果
结果显示，在多肽摩尔浓度0.82μmol/L时，WD-160抗体亲和力常数为：6×10-7(mol/L)。
以上，基于本发明的实施方式进行了说明，但本发明不限定于此，本领域的技术人员应该明白，在本发明的主旨的范围内能够以进行变形和变更的方式实施，这样的变形和变更的方式，理应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州药明泽康生物科技有限公司
百奇生物科技（苏州）有限公司
<120> 一种新型抗人PD-L1抗体及其应用
<130> AJ3477PI1901
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asp Val Lys Lys Cys Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln
1 5 10 15
Ser Asp Thr His Leu Glu Glu Thr
20
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Cys Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu
1 5 10 15
Glu Glu Thr
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met
1 5 10 15
Met Asp Val Lys Lys Cys Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln
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Ser Asp Thr His Leu Glu Glu Thr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser
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<212> PRT
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<400> 19
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Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
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1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Leu Cys Trp Val Lys Gln Ser Leu Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asn Thr Ala Phe Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
1 5 10 15
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
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Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
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Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Thr Leu Ser
50 55 60
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Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr
115 120 125
Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys
130 135 140
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val
145 150 155 160
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
165 170 175
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
180 185 190
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val
210 215 220
Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser
225 230 235 240
Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu
245 250 255
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro
260 265 270
Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val
275 280 285
Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu
290 295 300
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys

Claims (23)

1.一种抗人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与如SEQ IDNO:1-4所示的任一氨基酸序列特异性结合。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，以及
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，
其中轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，轻链可变区CDR3序列包含选自由SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:17所组成的组中的氨基酸序列，
重链可变区CDR1序列包含选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所组成的组中的氨基酸序列，重链可变区CDR2序列包含选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12和SEQID NO:15所组成的组中的氨基酸序列，重链可变区CDR3序列包含选自由SEQ ID NO:10、SEQID NO:13和SEQ ID NO:16所组成的组中的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区还包括如SEQ ID NO:18所示的骨架区FR1、如SEQ ID NO:19所示的骨架区FR2、如SEQ ID NO:20所示的骨架区FR3和如SEQ ID NO:21所示的骨架区FR4；所述重链链可变区还包括如SEQ ID NO:22所示的骨架区FR1、如SEQ ID NO:23所示的骨架区FR2、如SEQ ID NO:24所示的骨架区FR3和如SEQ IDNO:25所示的骨架区FR4。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是鼠源抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
5.如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或多克隆抗体。
6.如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段可与表达PD-L1的癌症组织或免疫细胞特异性结合，所述癌症包括肺癌、黑色素瘤、NSCLC、经典霍奇金淋巴瘤、HNSCC、肾细胞癌、尿路上皮癌、头颈部癌、胃癌、血液恶性肿瘤、前列腺癌、子宫颈癌、脑癌、肝细胞癌和结直肠癌的一种以上。
7.一种核酸分子，其编码如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
8.一种克隆或表达载体，其包含如权利要求7所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞，其包含一个以上如权利要求8所述的克隆或表达载体。
10.一种用于生产如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的过程，包括培养如权利要求9所述的宿主细胞，并且分离所述抗体。
11.一种转基因鼠，其表达如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
12.一种从如权利要求11所述的转基因鼠制备的杂交瘤，其特征在于，所述杂交瘤产生所述抗体。
13.一种药物组合物，包含如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
14.一种偶联物，包含连接至治疗剂、荧光物质、放射性同位素、或酶的如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
15.如权利要求14所述的偶联物，其中所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′,4′,5′,7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红的一种以上。
16.如权利要求14所述的偶联物，其中所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr的一种以上。
17.如权利要求14所述的偶联物，其中所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶的一种以上。
18.一种组合物，其包含如权利要求14至17中任一项所述的偶联物和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
19.如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求14至17中任一项所述的偶联物在制备用于检测组织中PD-L1水平的试剂中的应用。
20.如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求14至17中任一项所述的偶联物在制备用于诊断癌症和/或免疫关联疾病的产品中的应用。
21.如权利要求20所述应用，其中所述癌症包括肺癌、黑色素瘤、NSCLC、经典霍奇金淋巴瘤、HNSCC、肾细胞癌、尿路上皮癌、头颈部癌、胃癌、血液恶性肿瘤、前列腺癌、子宫颈癌、脑癌、肝细胞癌和结直肠癌的一种以上。
22.如权利要求19至21任一项所述应用，其中检测PD-L1的方法包括流式细胞术、免疫印迹、酶联免疫吸附、免疫组化、免疫细胞化学的一种以上。
23.一种用于制备抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(a)提供：
(i)一个轻链可变区的抗体序列，其包含选自SEQ ID NO:5所示的CDR1序列，选自SEQID NO:6所示的CDR2序列以及选自由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:17所组成的组中的CDR3序列；和/或
(ii)一个重链可变区的抗体序列，其包含选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:14所组成的组中的CDR1序列，选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15所组成的组中的CDR2序列以及选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16所组成的组中的CDR3序列；并且
(b)表达抗体序列成为蛋白质。
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