CN112386701A - 抑制pd-l1的表达的抗肿瘤联合用药物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ATM抑制剂和NEMO抑制剂组合在制备抑制PD‑L1的表达的药物中的应用。以及活性成分包括ATM抑制剂和NEMO抑制剂的抑制PD‑L1的表达的抗肿瘤的联合用药物。本发明所述的ATM和NEMO抑制剂与CPT联合用药能够降低肿瘤细胞PD‑L1蛋白质表达水平，减少肿瘤细胞表面结合的PD‑1，激活T细胞杀伤肿瘤的活性，从而提高抗肿瘤免疫力，抑制肿瘤在体内的生长。

Description

抑制PD-L1的表达的抗肿瘤联合用药物及其应用

技术领域

本发明属于本发明涉及医药生物学领域，特别是涉及抑制PD-L1的表达的抗肿瘤的联合用药物及其应用。

背景技术

人PD-L1基因编码290个氨基酸(1-18位氨基酸为信号肽，19-238位氨基酸为胞外段，239-259位氨基酸为跨膜段，260-290位氨基酸为胞内段)。它是一个Ⅰ型膜蛋白，在T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞及肿瘤细胞上表达。研究表明，当PD-L1与PD-1结合后，将会通过激活具有SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2。削弱ZAP-70活化，并抑制TCR下游信号传递，从而起到抑制T细胞活化的作用。因而，PD-1/PD-L1免疫疗法是通过阻断二者间的相互作用来提高免疫应答，具有治疗多种类型肿瘤及感染性疾病的潜力。

程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)是CD28超家族成员，为一种重要的免疫抑制分子，主要表达在激活的T细胞和B细胞上。PD-1与其配体PD-Ls(programmeddeath-1ligands，主要是PD-L1与PD-L2)结合能够抑制T细胞的增殖、活化和相关细胞因子的分泌，使机体免受自身免疫系统的攻击。但在机体的肿瘤微环境中，肿瘤细胞高表达PD-L1，与T细胞上的PD-1发生结合后，诱导T细胞的衰竭，抑制T细胞的功能，使其无法有效激活免疫系统，引起肿瘤细胞的免疫逃逸。目前，以PD-L1为靶点的抗体药物，已经在临床上展示出了出色的应用前景。比如罗氏的全人IgG1单克隆抗体MPDL3280A，它能够阻断PD-L1与PD-1和CD80的结合，并且通过对其Fc片段的工程化改造削弱了抗体介导的细胞毒作用来提高安全性。在1期临床试验中，PD-L1表达阳性的转移性膀胱癌患者接受了12周MPDL3280A治疗后产生了52％的响应率，不良反应均为低级别的疲劳和恶心，没有证据显示其具有肾脏毒性。在黑色素瘤患者中，同样观察到了对药物的持续响应，因此MPDL3280A被FDA授予了突破疗法地位。其在晚期肾细胞癌和非小细胞肺癌患者中的临床研究也在同步进行。另一个PD-L1单克隆抗体，辉瑞与默克共同开发的Avelmab，同样正在转移性默克尔细胞癌患者中进行有效性和安全性评价。

不仅如此，研究表明一些病毒感染也与PD-L1/PD-1信号通路息息相关。例如，在慢性HIV感染中，PD-1被发现在特异性识别HIV的CD8+T细胞表面高表达，病毒通过激活PD-L1/PD-1信号途径，使得特异性识别HIV的CD8+T细胞活性受到抑制，细胞因子的分泌能力及T细胞自身的增殖能力大大削弱，引起了获得性的免疫功能缺陷。由此可见，阻断PD-L1/PD-1信号通路，在这一类疾病的治疗中，同样具备相当的应用价值。

目前，人源化PD-L1单克隆抗体价格昂贵，存在特异性、亲和性和稳定性要求高，肿瘤组织定位等技术困难，同时不能对病人进行精准治疗。

ATM蛋白激酶属于磷脂酰肌醇3-激酶的相关激酶家族中的一员，是DNA损伤后修复反应的主要组织者，ATM在介导DNA损伤级联反应中起关键作用，化疗药物和放射治疗通常引起DNA损伤，进而诱导PD-L1表达的上调。目前已经开发出一系列针对ATM活化的抑制剂，最常用的如KU-55933。KU-55933是一种有效的，特异性ATM抑制剂，KU-55933能有效抑制ATM依赖的磷酸化作用。在细胞试验中KU-55933抑制ATM的IC50/K_i为12.9nM/2.2nM，与DNA-PK，PI3K/PI4K，ATR和mTOR相比，对ATM具有高度选择性。

DNA损伤应激情况下NF-κB必要分子(NF-κB essential molecule，NEMO)磷酸化，活化IKK复合物。进而导致NF-κB的活化以及NF-κB引起的PD-L1的上调，目前已经有了针对IKK调节亚单位NEMO的结合肽(NEMO Binding Domain Peptide,NBD)，具有细胞穿透性的NBD多肽进入细胞后可与NEMO特异性结合从而阻断IKK复合物的组装并下调IKK活性,抑制NF-кB活性，进而调控免疫应答，炎性反应等。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抑制PD-L1的表达的药物及其应用。

实现上述目的的技术方案如下。

ATM抑制剂和NEMO分子抑制剂组合在制备抑制PD-L1的表达的药物中的应用。

ATM抑制剂和NEMO分子抑制剂组合作为PD-L1的表达剂在制备治疗与PD-L1相关的肿瘤的药物中的应用。

ATM抑制剂和NEMO分子抑制剂组合在制备防治诱导性治疗导致的DNA损伤和PD-L1高表达的药物中的应用。

在其中一个实施例中，诱导性治疗为肿瘤患者的化疗或放射治疗。

本发明的另一目的是提供抗肿瘤的联合用药物。

抑制PD-L1的表达的抗肿瘤的联合用药物，其活性成分包括ATM抑制剂和NEMO分子抑制剂，所述ATM抑制剂与所述NEMO分子抑制剂分别成为独立的给药单元，或所述ATM抑制剂与所述NEMO分子抑制剂共同形成组合的给药单元。

在其中一个实施例中，所述抗肿瘤的联合用药物中活性成分还包括有化疗药物或放射治疗药物，所述化疗药物或放射治疗药物与所述ATM抑制剂与所述NEMO分子抑制剂分别成为独立的给药单元，或共同形成组合的给药单元。

在其中一个实施例中，所述肿瘤选自脑癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、骨癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肉瘤、黑色素瘤、癌和淋巴瘤。

在其中一个实施例中，ATM抑制剂选自KU60019、抑制剂KU55933、抑制剂CP-466722、抑制剂AZD6738或抑制剂ETP46464。

在其中一个实施例中，所述NEMO抑制剂选自NBD(NEMO Binding Domain Peptide,NBD)-多肽联合或用于抑制NEMO活化的多肽及化合物分子。

发明人经过研究发现，化疗和放射治疗肿瘤细胞，DNA损伤明显增加，导致免疫抑制受体PD-L1表达明显升高，PD-L1的升高与ATM主导的NF-кB家族关键分子NEMO的活化相关，应用ATM抑制剂和NEMO分子抑制剂均可抑制PD-L1的表达，尤其是这两类抑制剂与化疗药物、放射治疗药物联合应用，可抑制治疗后的免疫抑制，增强治疗效果。将为肿瘤、病毒感染及多种免疫系统相关疾病的治疗带来全新的方法，具备巨大的应用潜力和市场价值。

本发明提供了一种ATM和NEMO分子抑制剂联合用药在肿瘤中的应用治疗患者肿瘤的的方法，所述肿瘤源自PD-L1高表达揭示ATM和NEMO介导的DNA损伤通路与PDL-1表达的关系，以ATM激酶活性为指标来衡量肿瘤免疫逃逸的可能性。抑制DNA损伤通路中的关键分子，进而增强T细胞的活化作用，对肿瘤生长具有显著的抑制作用。

附图说明

图1是实施例1中化疗药物诱导PD-L1表达的结果示意图。

图2是实施例1中先施用NEMO抑制剂和ATM抑制剂，能有效抑制化疗药物诱导的PD-L1表达的结果示意图。

图3是实施例1中ATM抑制剂、NEMO抑制剂和化疗药物联合使用有效抑制化疗药物诱导的PD-L1表达的结果示意图。

图4是实施例1中先施用NEMO抑制剂和ATM抑制剂，能有效抑制放疗诱导的PD-L1表达的结果示意图。

图5是实施例1中ATM抑制剂、NEMO抑制剂和放疗联合应用有效抑制放射线诱导的PD-L1表达的结果示意图。

图6是实施例1中比较ATM抑制剂和NEMO抑制剂与化疗药物联合用药与ATM抑制剂+NEMO抑制剂与化疗药物联合用药对PD-L1表达的影响的示意图。

图7是实施例2中ATM抑制剂和NEMO抑制剂与化疗药物联合用药对小鼠前列腺瘤荷瘤小鼠体内肿瘤生长的的抑制作用的结果示意图。

图8是本发明ATM抑制剂和NEMO抑制剂联合抑制PD-L1在肿瘤细胞的表达的示意图。

具体实施方式

除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、药剂学、细胞生物学、其属于本领域技术范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

PD-L1的表达已经在几种人类癌症中发现，包括人肺癌、卵巢癌、结肠癌、黑色素瘤和各种骨髓瘤(Iwai等(2002)，PNAS 99：12293-7；Ohigashi等(2000，Cl in Cancer Res11：2947-53)。己有的结果显示，肿瘤细胞高表达的PD-L1通过增加T细胞的凋亡从而在肿瘤的免疫逃逸中起着重要的作用。

所述PD-L1相关疾病选自下组：肿瘤、炎症反应性疾病、病毒感染，心血管及多种免疫系统相关疾病或其组合；所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

本发明所述实体瘤癌选自脑癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、骨癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肉瘤、黑色素瘤、癌和淋巴瘤等。

KU-55933(ATM Kinase Inhibitor)是一种有效的，特异性ATM抑制剂，与DNA-PK，PI3K/PI4K，ATR和mTOR相比，对ATM具有高度选择性。

KU-60019是一种改进的KU-55933类似物，并且是高度有效的放射增敏剂。

AZ31是一种选择性的ATM抑制剂，IC50小于0.0012μM。它具有良好的选择性，对ATM的选择性比对DNA-PK和PI3Kα高。

AZ32是ATM kinase的特异性抑制剂，在小鼠中具有良好的血脑屏障通透性，它具有充分的选择性和高细胞透性。

CP-466722是一种有效的，可逆的ATM抑制剂，不影响ATR，且抑制PI3K或PIKK家族成员。

ETP46464是一种有效的、选择性的mTOR和ATR抑制剂，也是ATM抑制剂。

本发明所述“组合”是指ATM抑制剂和NEMO分子抑制剂，可以单独形成给药单元，也可以在一起形成混合形式的给药单元。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

化疗药物是一种治疗肿瘤的药物。化疗药物可杀灭肿瘤细胞。这些药物能作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，抑制或杀死肿瘤细胞。本发明所述化疗药物包括但不限于喜树碱、环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、阿霉素、氮芥、长春新碱、甲基苄肼、泼尼松龙、达卡巴嗪、博来霉素、依托泊苷、顺铂、表柔比星、卡培他滨、亚叶酸、放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、硼替佐米、卡铂、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、二氯甲基二乙胺、巯嘌呤、米托蒽醌、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、戊柔比星、长春碱、长春地辛、长春瑞滨或奥沙利铂。在本发明的一些实施例中，所述化疗药物是喜树碱。

本发明的一个实施例中提供了一种ATM抑制剂和NEMO分子抑制剂联合用药在肿瘤治疗中的应用，通过抑制DNA损伤通路关键分子ATM和NEMO这两个靶点来抑制PD-L1在肿瘤细胞的表达，该方法可与放疗和化疗药物联合用药，能够产生T细胞活化及抗肿瘤等生物学效应。参见图8。

以下将结合具体实施例和附图对本发明的载双功能化纳米粒微针及其制备与应用做进一步详细的说明，本领域技术人员应当理解，下面所描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

一、实验方法

1 PC-3前列腺癌细胞的培养

前列腺癌PC-3细胞用10％FBS RMPI1640完全培养基培养，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中，待细胞长至60％-70％，用0.25％胰酶-0.02％EDTA消化液消化传代培养。

细胞处理:(1)对数生长期PC-3细胞加入不同浓度喜树碱(camptothecin,CPT)(Sigma,C9911)0,10,20,30μm处理6小时后，收集PC-3细胞检测PD-L1表达等指标；(2)对数生长期细胞PC-3先加入ATM抑制剂KU55399(Selleck,S1092)和NEMO抑制肽NBD(EnzoBiochem,BML-P607-0500)处理2小时，然后加入10μm CPT处理6小时，收集PC-3细胞检测PD-L1表达等指标；(3)对数生长期细胞PC-3加入10μm CPT处理,同时加入ATM抑制剂KU55399或NEMO抑制肽NBD，处理6小时后，收集PC-3细胞检测PD-L1表达等指标；(4)对数生长期细胞PC-3先加入ATM抑制剂KU55399和NEMO抑制肽NBD处理2小时然后放入生物辐射仪一次放射线10Gy照射,收集PC-3细胞检测PD-L1表达等指标。(5)对数生长期PC-3细胞放入生物辐射仪一次放射线10Gy照射,同时加入ATM抑制剂KU55399或NEMO抑制肽NBD，收集PC-3细胞检测PD-L1表达等指标。

2流式细胞术检测肿瘤细胞PD-L1的表达水平

收集细胞，调整密度为10⁶/ml，加1μl的PE标记的抗CD274抗体，避光孵育30min，PBS洗3遍，1000rpm/min离心10min，流式细胞仪检测分析PD-L1的表达水平。

3 Western-blotting检测ATM和PD-L1蛋白的表达水平

收集肿瘤细胞，加入100ul细胞蛋白抽提试剂RIPA，在冰上静置1-2min，用刮刀快速刮下细胞，裂解完全后12000rpm，离心15min，吸取上清液于另一干净预冷标记好的EP管中，调节蛋白浓度，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将样品蛋白质分离，再转移到PVDF膜上，加入ATM、磷酸化ATM、PD-L1、GAPDH等抗体孵育过夜，再与HRP偶联的第二抗体反应1小时，洗涤，加入化学发光底物来检测电泳分离的特异性目的靶蛋白。

二、实验结果

1、化疗药物诱导PD-L1表达

不同浓度喜树碱(CPT)0，10，20，30μm处理前列腺癌PC3细胞6小时后，收集细胞，利用Westernblot和流式技术检测ATM，磷酸化ATM,PD-L1的蛋白表达水平。结果表明化疗药物CPT可显著增加ATM，磷酸化ATM，PD-L1的表达，且CPT药物浓度与ATM,磷酸化ATM,PD-L1蛋白表达呈剂量依赖性关系(图1A-C)。说明化疗能引起ATM依赖的PD-L1升高，引起免疫抑制，进而降低化疗效率。

2:先施用NEMO抑制剂和ATM抑制剂，能有效抑制化疗药物诱导的PD-L1表达

前列腺癌PC3细胞先加入ATM抑制剂KU55399和NEMO抑制肽NBD处理2小时后，加入化疗药物CPT 10μm处理6小时，收集细胞，利用Western blot和流式技术检测PD-L1的蛋白表达水平。结果表明CPT处理可显著提高PC3细胞膜表面PD-L1表达(未加CPT组9.8％，CPT组34.9％；P<0.001)。与CPT单独处理组比较，10μm KU55399和100μm NBD联合用药组使PD-L1水平从34.9％降为22.3％(P<0.01)，20μm KU55399和100μmNEMO抑制肽NBD联合用药组使PD-L1水平从34.9％降为18.3％(P<0.001)(图2.A-C)，显示ATM和NEMO抑制剂联合用药能有效抑制剂化学药物治疗引起的PD-L1升高。

3、ATM抑制剂、NEMO抑制剂和化疗药物联合使用有效抑制化疗药物诱导的PD-L1表达

前列腺癌PC3细胞加入CPT10μm，同时加入ATM抑制剂KU55399和NEMO抑制肽NBD处理6小时后，利用流式技术检测PD-L1的蛋白表达水平变化。结果表明CPT处理可显著提高PC3细胞膜表面PD-L1表达(未加CPT组16.9％，CPT组47.3％；P<0.001)。与CPT单独处理组比较，10μm KU55399和100μm NBD联合用药组使PD-L1表达从47.3％降为37.9％(P<0.05)，20μm KU55399和100μmNBD联合用药组使PD-L1表达从47.3％降为11.6％(P<0.001)(图3)。显示ATM和NEMO抑制剂联合用药能有效抑制剂化学药物治疗引起的PD-L1升高。

4:先施用NEMO抑制剂和ATM抑制剂，能有效抑制放疗诱导的PD-L1表达

前列腺癌PC3细胞细胞先加入ATM抑制剂KU55399和NEMO抑制肽NBD处理2小时后，然后利用一次放射10Gy处理细胞，Westernblot检测PD-L1的蛋白表达水平变化。结果表明放射线处理可显著提高PC3细胞膜表面PD-L1表达(未放疗组1.2，放疗组3.3；P<0.001)。与单独放疗组(irradiation)比较，10μm KU55399和100μm NBD联合用药组使PD-L1蛋白从3.3降到1.8(P<0.01)，20μm KU55399和100μm NBD联合用药组使PD-L1表达从3.3降为0.9(P<0.001)(图4)，显示ATM抑制剂和NEMO抑制剂联合用药能有效抑制剂放射线处理引起的PD-L1升高(图4)。

5、ATM抑制剂、NEMO抑制剂和放疗联合应用有效抑制放射线诱导的PD-L1表达

前列腺癌PC3细胞放射线10Gy照射，同时加入ATM抑制剂KU55399和NEMO抑制蛋白肽NBD处理6小时后，利用流式技术检测PD-L1的蛋白表达水平变化。结果表明放疗可显著提高PC3细胞膜表面PD-L1表达(未放疗组16.1％，放疗组53.2％；P<0.001)。与单独放疗组(irradiation)比较，10μm KU55399和100μm NBD联合用药组使PD-L1蛋白水平从53.2％降到28.2％(P<0.001)，20μm KU55399和100μm NBD联合用药组使PD-L1表达从53.2％降为13.9％(P<0.001)(图5)。显示ATM和NEMO抑制剂联合用药能有效抑制剂放疗引起的PD-L1升高。

6、比较ATM抑制剂+放疗、NEMO抑制剂+放疗，以及ATM抑制剂+NEMO抑制剂+放疗联合应用对PD-L1表达的抑制作用。

前列腺癌PC3细胞加入喜树碱CPT20μm，分别加入ATM抑制剂KU55399、NEMO抑制肽NBD、KU55399+NBD处理6小时后，利用流式技术检测PD-L1的蛋白表达水平变化。结果表明CPT处理可显著提高PC3细胞膜表面PD-L1表达(未加CPT组33.1％，CPT组96.1％；P<0.001)。与CPT单独处理组比较，100μmNBD使PD-L1表达从96.1％降为28.3％(P<0.01)20μm KU55399使PD-L1表达从96.1％降为25.7％(P<0.01)，10μm KU55399+100μm NBD联合用药组使PD-L1表达从96.1％降为16.7％(P<0.001)(图6)。显示ATM和NEMO抑制剂联合用药比ATM抑制剂和NEMO抑制肽单独用药更能有效抑制化学药物治疗引起的PD-L1升高(图6)。

实施例2ATM抑制剂和NEMO抑制剂对小鼠前列腺瘤荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制作用。

实验方法：

常规培养PC-3前列腺癌细胞，取对数生长期细胞，弃去培养液，PBS缓冲液洗净。加入0.25％胰酶-0.02％EDTA消化液消化细胞。获得单细胞悬液。1000rpm/min离心10min)，用PBS洗两遍。计数调整细胞浓度为5*10⁷/mL。事先准备好NSG小鼠，将PC-3细胞悬液注入小鼠的右侧背部，每只打0.1mL(5*10⁶个细胞/只)，待成瘤达到8*8mm时，将NSG小鼠分组给药。将上述成瘤为8*8mm的前列腺癌小鼠，随机分为6组。(1)腹腔注射DMSO(二甲基亚砜)做为对照，每天称重以及称量肿瘤的长径和短径，连续两周；(2)CPT(4mg/kg，每4日给一次，给药3次单独给ATM抑制剂KU55399组：按体重腹腔注射KU55399100ug/kg，每3日给一次，给药4次。每天称重以及称量肿瘤的长径跟短径，连续两周；(3)腹腔注射NEMO的结合肽NBD(100ug/kg，每3日给药，给药4次)+CPT(4mg/kg),每4日给一次，给药3次。

(4)腹腔注射ATM抑制剂KU55399(100ug/kg，每3日给药，给药4次)+CPT(4mg/kg，每4日给一次，给药3次，每天称重以及称量肿瘤的长径跟短径，连续两周；(5)腹腔注射NEMO的结合肽NBD(100ug/kg，每3日给药，给药4次)+腹腔注射ATM抑制剂KU55399100ug/kg，每3日给一次，给药4次+CPT(4mg/kg)，每4日给一次，给药3次。按体重1mg/kg尾静脉给药，每天称重以及称量肿瘤的长径跟短径，连续两周。

疗效及机制观察：

1瘤体积测量(Volume)

实验性黑色素瘤小鼠每天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，记录并按瘤块体积＝长径×短径²/2。公式换算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。

2瘤重测量及抑瘤率计算

实验性黑色素瘤小鼠观察两周后，颈椎脱臼处死，取下瘤块，用分析天平称量肿瘤重量，计算抑瘤率。计算公式为：抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重*100％。

实验结果显示与DMSO对照组比较，CPT处理可显降低肿瘤的体积和重量(#P＜0.05)；与CPT单独处理组比较，ATM抑制剂KU55399和CPT联合用药组、NEMO的结合肽NBD和CPT联合用药组,ATM抑制剂KU55399+NEMO的结合肽NBD和CPT联合用药组均能显著抑制前列腺癌在NSG小鼠体内体积和重量的生长(^***P＜0.001)(图7)，其中KU55399+NBD+CPT联合用药组抑瘤效果明显高于ATM抑制剂KU55399+CPT联合用药组、NEMO的结合肽NBD+CPT联合用药组(图7)。以抑瘤率计算，与DMSO对照组比较CPT单独处理组抑瘤率为29.2％；NBD+CPT组为53.6％；KU55399+CP组为59.5％；NBD+KU55399+CPT组为82.1％。抑瘤率NBD+KU55399+CPT组明显强于NBD+CPT和KU55399+CPT组。#与DMSO对照组比较P＜0.05；与CPT单独处理组比较^**P＜0.01，^***P＜0.001。

综上所述，本发明所述的ATM和NEMO抑制剂与喜树碱(CPT)，ATM和NEMO抑制剂与放疗联合用药能够降低肿瘤细胞PD-L1蛋白质表达水平，减少肿瘤细胞表面结合的PD-1，激活T细胞杀伤肿瘤的活性，从而提高抗肿瘤免疫力，抑制肿瘤在体内的生长。因此ATM和NEMO抑制剂作为新的PD-L1靶向分子，可用于增强肿瘤免疫治疗的效果。尤其与DNA损伤类治疗如放疗和化疗联合用药，可特异性抑制DNA损伤引起的PD-L1的上调和免疫抑制，因而ATM抑制剂和NEMO抑制剂在肿瘤中的应用十分重要的意义和应用价值。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.ATM抑制剂和NEMO抑制剂组合在制备抑制PD-L1的表达的药物中的应用。

2.ATM抑制剂和NEMO抑制剂组合作为PD-L1的表达剂在制备治疗与PD-L1相关的肿瘤的药物中的应用。

3.ATM抑制剂和NEMO抑制剂组合在制备防治诱导性治疗导致的DNA损伤和PD-L1高表达的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述诱导性治疗为肿瘤患者的化疗或放射治疗。

5.抑制PD-L1的表达的抗肿瘤联合用药物，其特征是，其活性成分包括ATM抑制剂和NEMO抑制剂，所述ATM抑制剂与所述NEMO抑制剂分别成为独立的给药单元，或所述ATM抑制剂与所述NEMO抑制剂共同形成组合的给药单元。

6.根据权利要求5所述的抑制PD-L1的表达的抗肿瘤的联合用药物，其特征是，所述抗肿瘤的联合用药物中活性成分还包括有化疗药物或放射治疗药物，所述化疗药物或放射治疗药物与所述ATM抑制剂与所述NEMO抑制剂分别成为独立的给药单元，或共同形成组合的给药单元。

7.根据权利要求5所述的抑制PD-L1的表达的抗肿瘤联合用药物，其特征是，所述肿瘤选自脑癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、骨癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肉瘤、黑色素瘤、癌和淋巴瘤至少一种。

8.根据权利要求5-7任一项所述的抑制PD-L1的表达的抗肿瘤联合用药物，其特征是，所述ATM抑制剂选自KU60019、抑制剂KU55933、抑制剂CP-466722、抑制剂AZD6738和抑制剂ETP46464中的至少一种。

9.根据权利要求5-7任一项所述的抑制PD-L1的表达的抗肿瘤的联合用药物，其特征是，所述NEMO抑制剂选自NBD-多肽联合或用于抑制NEMO活化的多肽及化合物分子。

10.根据权利要求5-7任一项所述的抑制PD-L1的表达的抗肿瘤的联合用药物，其特征是，所述ATM抑制剂为抑制剂KU55933，所述NEMO抑制剂为NBD-多肽。

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