CN108588033A - 杂交瘤细胞株、cd31单克隆抗体、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞株、CD31单克隆抗体、制备方法及应用，该单克隆抗体采用纯化的CD31重组胞外区蛋白作为免疫原免疫动物体；将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫后的所述动物体的B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞；筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆，对所述阳性克隆进行细胞克隆化，筛选出稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞。其分泌产生的抗人CD31单克隆抗体具有特异性强、亲和力高、稳定性好、效价高的特点。

Description

杂交瘤细胞株、CD31单克隆抗体、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，并且更具体地，涉及到一种可产生CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株，CD31单克隆抗体，以及该抗体的制备方法和应用。

背景技术

白细胞分化抗原31，(Cluster Of Differentiation 31，CD31)，是一种分子量为130KDa的糖蛋白，也称为血小板内皮细胞粘附因子 -1(PECAM)。

CD31蛋白主要表达于内皮细胞的胞质和胞膜，血小板、单核细胞、粒细胞、B淋巴细胞也有表达，常用于良、恶性血管源性肿瘤的诊断和鉴别诊断，也可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。CD31 抗体染色血管内皮细胞后，可清楚地确定肿瘤血管的轮廓，能够容易地找到血管，从而减少寻找范围，提高检验效率。

研究发现，肿瘤的生长与转移依赖于肿瘤新生血管的形成，恶性肿瘤生长早期无血管形成，随着瘤体的增大，肿瘤内出现微小的新生血管，肿瘤将进一步获得增殖的能力，并具有侵袭、转移的潜能，组织内血管新生的程度与肿瘤的生长、侵袭和转移有密切关系。此外，肿瘤血管不同于正常血管，血管内皮细胞形态异常、间距增大，肿瘤组织的微血管密度不仅可以定量反应肿瘤血管生长情况，还能预测肿瘤生长、转移和复发趋势。CD31作为血管内皮细胞标记物，可通过标记CD31蛋白精确定位肿瘤血管。因此，血管内皮标志CD31在肿瘤生长和转移中作用的深入研究，可以为肿瘤的治疗和预测提供帮助。

免疫组织化学(IHC)是通过抗体与所识别的组织或细胞中的抗原成分的特异性结合，利用化学反应使标记于抗体上的示踪剂(如荧光素、酶、生物素、重金属离子等)显色，对组织切片或细胞薄片上的抗原(多肽及蛋白质)进行定性、定位的染色技术。近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的成功研发，更主要的是对肿瘤分子机制认识的不断深入，免疫组化在肿瘤的分子诊断与鉴别中的应用价值受到了普遍的认可。

在免疫组化中，CD31是主要用于证明内皮细胞组织的存在，用于评估肿瘤血管生成，反应肿瘤生长的程度。主要用于良恶性血管源性肿瘤的诊断和鉴别诊断，亦可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。目前抗肿瘤血管生成治疗已成为肿瘤治疗的常用方法，检测肿瘤血管生长情况也备受关注。目前国内外CD31抗体多以多克隆抗体为主，单克隆抗体制备成本高，稳定性较差，因此，获得稳定、特异性强、活性高的用于免疫组化检测的CD31单克隆抗体对于临床诊断和科学研究有重要意义。

发明内容

本发明针对上述问题，目的在于提供一种可产生CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株，CD31单克隆抗体，以及该抗体的制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明实施例公开了一株可产生CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其于2018年3月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201822。

另一方面，本发明的实施例还公开了一种CD31单克隆抗体的制备方法，其包括：

步骤(1)采用真核表达的CD31重组胞外区蛋白作为免疫原免疫动物体；

具体地，可采用胞外重组CD31蛋白作为免疫原，所述重组CD31 蛋白为人工程细胞表达的CD31蛋白。对Balb/c小鼠进行首次免疫、第二次免疫、第三次免疫和加强免疫，其中首次免疫将CD31蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合做免疫原，第二次免疫和第三次免疫将CD31蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化混合做免疫原，所述加强免疫将CD31蛋白作为免疫原，各免疫原的量和注射体积均不发生改变。

步骤(2)将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫后的所述动物体的B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞；

具体地，可将骨髓瘤细胞SP2/0与Balb/c小鼠脾脏B淋巴细胞以一定比例混合，以聚乙二醇1450为促融合剂，形成融合的杂交瘤细胞，以未免疫的雌性Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞，以含 1×HAT的1640培养基为选择培养基，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养。

步骤(3)筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆，对所述阳性克隆进行细胞克隆化，筛选出稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞；

具体地，可采用间接ELISA法进行筛选，用CD31重组胞外区蛋白包被酶标板，酶标仪检测450nm波长检出阳性克隆，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，筛选出能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。

步骤(4)获得CD31单克隆抗体。

进一步地，步骤(4)中，所述获得CD31单克隆抗体包括：

在动物体内接种所述稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞，生产腹水抗体进行纯化，得到CD31单克隆抗体；或者

体外培养所述稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞，分离纯化培养液，得到CD31单克隆抗体。

进一步地，步骤(3)中，所述筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆包括：

用CD31重组胞外区蛋白包被酶标板，用酶标仪检测450nm波长检出阳性克隆。

进一步地，步骤(3)中，所述克隆化采用有限稀释法进行。

第三方面，本发明实施例还提供由上述方法制备得到的CD31单克隆抗体。

第四方面，本发明实施例还公开了上述的CD31单克隆抗体在免疫组化病理诊断剂上的应用。

进一步地，应用于免疫组化检测时，以肿瘤组织免疫组化染色，筛选出可以与人的CD31分子特异性反应的单克隆抗体，可以用于良恶性血管源性肿瘤的诊断和鉴别，也可以用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。

本发明的有益效果是：

本发明获得的CD31单克隆抗体与现有技术常用的单克隆抗体免疫组化结果相比，准确率高，效价高，阳性强度高于市面上一般抗体，符合临床检测标准，可对预测肿瘤生长、转移和复发趋势，以及肿瘤治疗提供帮助。高活性的CD31单克隆抗体对于临床诊断和科学研究有重要意义，

其应用人的CD31蛋白为免疫原，免疫动物体如Balb/c小鼠，采用细胞融合技术，通过ELISA筛选获得稳定分泌CD31单抗的杂交瘤细胞，克隆号为4H3。可通过收集腹水或体外培养纯化获得抗体，对肝细胞癌、肾上腺嗜铬瘤、上皮样血管肉瘤组织免疫组化染色，染色背景清晰，无非特异性染色，本发明对内皮细胞标志CD31具有高识别能力。

附图说明

图1A-图1C为本发明的几种克隆号(2-A10、4-H3、10-A6)对应的单克隆抗体用于肝细胞癌组织免疫组化实验的部分阳性结果(放大400倍)，显示4H3对应的单克隆抗体在相同条件下表达效果最佳。

图2A-图2C为本发明的克隆号为4H3的单克隆抗体与中杉公司、迈新公司抗体在肾上腺嗜铬瘤免疫组化的部分阳性结果(放大400 倍)，显示本发明与商品用抗体对抗原定位一致，特异性一致。

图3为本发明的单克隆抗体在上皮样血管肉瘤组织免疫组化的部分阳性结果，其中，3A为所述阳性结果放大40倍的显微图，3B为所述阳性结果放大200倍的显微图，3C为所述阳性结果放大400倍的显微图。

图4为Western blot(免疫印迹法)验证本发明所述4H3单抗的特异性，M为蛋白Marker，应用纯化的4H3单克隆抗体可以在WB 中特异地检出CD31重组蛋白(北京义翘：10148-H08H)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所公开的可稳定产生CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏信息如下：

分类命名：抗人CD31杂交瘤细胞株4-H3(IgG2b)；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；

地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学；

保藏日期：2018年3月9日；

保藏号：CCTCC NO：C201822；

培养物名称及注明的鉴别特征：抗人CD31杂交瘤细胞株4-H3 (IgG2b)。

本发明一实施例所公开的CD31单克隆抗体的制备方法，包括采用真核表达的CD31蛋白作为免疫原，通过细胞融合技术制备杂交瘤抗体细胞株并纯化相应的CD31单克隆抗体，以免疫组织化学染色，从所述的CD31单克隆抗体中筛选出针对血管内皮细胞标志CD31抗原结合最佳的CD31单克隆抗体。

主要试剂及耗材：

实施例1CD31单克隆抗体的制备

1)免疫原制备

采用真核表达的CD31蛋白作为免疫原，真核表达的CD31蛋白为人工程细胞表达的CD31蛋白(购自北京神州义翘，货号： 10148‐H08H)，免疫雌性Balb/c小鼠，获取脾脏淋巴细胞用于杂交瘤融合实验。

2)免疫原免疫Balb/c小鼠

将纯化的重组CD31蛋白溶解，测定蛋白含量后用pH7.4的 10mmol/LPBS将其稀释到1.0mg/mL。选取5只6‐8周龄、体重相等的雌性Balb/c小鼠。首次免疫以CD31蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合为免疫原；每间隔两周进行第二次免疫和第三次免疫，佐剂改用弗氏不完全佐剂；融合前3天进行加强免疫，以CD31为免疫原，不加佐剂，腹腔注射。每次免疫量均为50ug/只，注射体积不变。

3)免疫Balb/c小鼠血清效价测定

将CD31蛋白稀释成最佳工作浓度2μg/mL，按100μl/孔加入酶标板，4℃过夜包被，洗涤5min×5次，最后将孔板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液控干。第三次免疫7天后尾静脉取血20μl，2000rpm离心30min，取上清以1μl与999μl抗体稀释液混匀，从1:1000至 1:1024000进行倍比稀释，按100μl/孔加入稀释过的被检血清，同时以小鼠免疫前血清1:100稀释做阴性对照，以抗体稀释液做空白对照， 37℃作用1h，洗涤5min×5次；将辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体以1:6000稀释，100μl/孔，37℃作用1h，洗涤5min×5次；按100μl/孔加底物显色液，室温暗处3-5min；50μl/孔加终止液观察结果，用酶联免疫检测仪记录450mm读数，以空白对照孔凋零后测各孔OD值，选择血清效价达到1:128000以上的最高者用于细胞融合。

4)脾脏B淋巴细胞和SP2/0细胞悬液、饲养细胞的制备

脾脏B淋巴细胞的制备：取一只免疫好的雌性Balb/c小鼠，摘除眼球放血处死，无菌操作取出脾脏，浸泡在干净的PBS溶液中，培养皿中加入10mLPBS溶液，放一个200目细胞筛，将脾脏取出放于细胞筛中，用注射器的内芯研磨，不时用PBS溶液冲洗细胞筛，使脾脏细胞穿过网孔悬浮于溶液中，将脾脏细胞移至10mL离心管中， 1500rpm水平离心10min，去上清。加红细胞裂解液2mL，重悬，37℃作用2min；离心弃上清，PBS洗涤一次，将细胞用10mL不完全培养基重悬混匀并计数。

SP2/0细胞悬液的制备：将SP2/0细胞从液氮中取出，迅速放入 37℃水浴中，不断摇晃，直至细胞溶液完全溶解，1000rpm水平离心 10min，弃上清，5mL完全培养基重悬沉淀，把细胞悬液转移到50mL 培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长良好后用含8-AG的选择培养基筛选细胞一周；融合前2天传代一次，使融合当天细胞处于对数生长期。融合当天收集细胞离心，弃上清，沉淀用不完全培养基洗涤后，10mL不完全培养基重悬细胞并计数。

饲养细胞的制备：取一只未免疫的雌性Balb/c小鼠，摘除眼球放血处死，75％乙醇浸泡消毒5min，剪开腹膜，用预冷的不完全培养基冲洗腹腔，收集洗液吸至50mL离心管中。重复冲洗腹腔3次，收集洗液，室温下1000rpm水平离心10min，去上清，10mL不完全培养基重悬细胞并计数。

6)细胞融合

将骨髓瘤细胞悬液和脾脏B淋巴细胞悬液按细胞数1:7混合在一支50mL离心管中，补加30mL不含血清的RPMI-1640培养基(Roswell Park Memorial Institute 1640)，充分混匀，1500rpm离心10min，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状。用滴管吸取1mL预温的PEG1450 溶液，在1min钟左右完成，在离心管口约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管使轻柔的混合细胞(不用吹打)。静置细胞 1min，逐渐加入37℃预温的不含血清的1640培养基29ml终止融合 (PEG与培养基共同体积为30mL)，15min左右完成，边加边转动离心管使轻柔地混合细胞；静置5min，1500rmp离心5min，弃上清，加入10ml融合1640培养基轻柔重悬细胞，将融合细胞按100μl/孔接种至已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，每块培养板留6孔接种 SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养48小时后，以每孔加入新鲜的100μl 2×HAT选择培养基。融合后第隔4-5天可补加1×HAT选择培养基100μl，在2～5周可见到克隆群。

7)特异性杂交细胞瘤的筛选

培养10天后，镜下检测生长出克隆细胞孔为融合阳性孔，计算融合率。采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆：以CD31 蛋白(2ug/mL)包被酶标板，50μl/孔，4℃过夜，洗涤5min×5次。控干液体，按50μl/孔加入0.2％的PBST(含0.2％吐温的pH7.4的磷酸盐缓冲液)和50μl细胞上清，以PBST为空白对照，以SP2/0细胞培养上清为阴性对照，以小鼠的免疫血清为阳性对照，37℃孵育1h，洗涤5min×5次；每孔加入100μl的0.1％的PBST稀释的酶标记羊抗小鼠IgG抗体(1：3000)，37℃孵育30min，洗涤5min×5次。控干液体，按100μl/孔加入新鲜配制的底物显色剂，室温暗处反应3‐5min，按50μl/孔加终止液终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。OD值明显高于阴性对照2.1倍以上者定为阳性，阳性克隆采用有限稀释法进行亚克隆培养，连续进行三次以上的克隆化筛选直至获得高特异性抗CD68单克隆杂交瘤细胞株，并扩大化培养。

结果为以人工程细胞表达的CD31蛋白为免疫原，先后免疫 Balb/c小鼠7只，共融合7次，先后共筛选获得高亲和力的CD31抗体20株，经过3次克隆化检测筛选，得到分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经过传代培养2个月以上均能稳定分泌CD31单克隆抗体，最终冻存于液氮罐。

8)CD31单克隆抗体腹水制备

筛选出阳性克隆后，采用有限稀释法对阳性孔进行克隆化培养，经过两到三轮的克隆化培养，获得能够稳定的产生高效价单抗的杂交瘤细胞克隆，逐渐转移到24孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中扩大培养至液氮冻存。将6‐8周龄的小鼠用石蜡油处理约10天后，每只小鼠注射5×10⁵个杂交瘤细胞，10‐14天采用抽取或者杀死小鼠的方式获得腹水用于纯化抗体。

9)腹水中纯化抗体

采集腹水，3000rpm/min离心15min，除去细胞成分(或冻存过程中形成的固体物质等；取上层清亮的腹水，等量加入pH7.2巴比妥缓冲液盐水(VBS 0.04mol/l巴比妥，0.15mol/l NaCl，0.8mmol/lMg2+， 0.3mmol/lCa2+)稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30min，不时摇动；3000g离心20min，脂质等通过该法除去，即可得澄清的单克隆抗体腹水。

(1)配置抗体纯化所需Buffer：

Binding Buffer(A液)：100mmol/l磷酸钠、100mmol/L柠檬酸钠， pH7.0；

Elution Buffer(B液)：100mmol/l磷酸钠、100mmol/L柠檬酸钠， pH3.0；

Assemble Buffer(C液)：1mmol/L Tris-HCl，pH9.0。

(2)将单抗腹水与A液以1:10比例混合，0.45um滤膜过滤等待上样。

(3)选用HiTrap rProtein A HP柱接入AKTA Explorer，分别用 A、B液平衡管道；

(4)从A管上样，再用B液洗脱纯化柱，收集洗脱峰至事先加入C液的EP管中。若洗脱液pH值偏低，用C液调节洗脱蛋白的pH 至7.0-8.0防止变性，利用分光光度计测定管中蛋白质的含量，将CD31 单克隆抗体分装冷冻保存。

10)单克隆抗体类型鉴定

采用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(Mouse Monoclonal Antibody IsotypingReagents，ISO2‐1KT，购自美国Sigma公司)进行亚类鉴定，按说明书操作。结果表明，本发明CD31单克隆抗体类型为IgG2b型。

11)ELISA鉴定CD31单克隆抗体的特异性

将CD31蛋白稀释成最佳工作浓度2μg/mL，按100μl/孔加入 ELISA条板，4℃包被过夜，次日弃抗原液洗涤5min×5次。将CD31 单克隆抗体从1:1000至1:1024000进行倍比稀释，按100μl/孔加入对应条孔，37℃作用1h，洗涤5min×5次；将HRP标记羊抗小鼠二抗以1:3000稀释，100μl/孔，37℃作用30min，洗涤5min×5次；按100μl/ 孔加底物显色液，室温暗处3-5min；50μl/孔加终止液观察结果，用酶联免疫检测仪记录450mm读数。结果显示，本发明CD31单克隆抗体具有较好的特异性。

实施例2与CD31抗原结合最佳CD31单克隆抗体的筛选

免疫组化(酶标记抗体间接法)的技术方案，将获得的一组CD31 抗体以相同条件染色同一组织连续切片，筛选出抗体中筛选出特异性最强、效价最高的抗体，并检测本发明的CD31单克隆抗体在肿瘤组织上的表达情况。

1)肝细胞癌组织石蜡切片，将所述石蜡切片常规脱蜡和水化：将切片置于65℃恒温箱中烘烤切片30min，二甲苯浸泡15min×2次；无水乙醇浸泡10min×2次；依次放入95％酒精、85％酒精、75％酒精各浸泡5min；蒸馏水浸洗5min×3次；

2)抗原修复：

在不锈钢高压锅内加入500mL柠檬酸修复液(pH6.0)，盖上高压锅盖子但不进行锁定，将切片置于耐高温塑料架上，待修复液沸腾后置于锅内，锁定锅盖加压，上汽后开始计时，2min30s后移除热源，自来水冲洗降温至待小阀门降下后打开盖子，自然冷却至室温。蒸馏水浸洗5min×3次，PBS浸洗5min×3次。

柠檬酸修复液配置方法：

A液(0.1mol/L柠檬酸三钠)：称取柠檬酸三钠14.7g加蒸馏水 500mL溶解；

B液(0.1mol/L柠檬酸)：称取柠檬酸4.2g加蒸馏水200mL溶解；

取A液41mL、B液9mL，加蒸馏水定容至500mL即为0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)。

3)切片置于3％H₂O₂-甲醇37℃恒温箱中阻断30min；PBS浸洗 5min×3次；

3％H₂O₂-甲醇配置方法：量取甲醇20mL、30％H₂O₂20mL，加蒸馏水定容至200mL。

4)擦干组织，组化笔画圈，滴加山羊血清白蛋白，37℃作用封闭30min，倾去，勿洗；

5)滴加相同稀释度的不同CD31单克隆抗体，同时以PBS为阴性对照，4℃过夜；次日于37℃恒温箱复温30min，PBS浸洗5min×3 次；

6)甩去多余液体，滴加标记有HRP的羊抗鼠二抗，37℃恒温箱中孵育30min；PBS浸洗5min×3次；

7)滴加DAB显色液(现用现配)，显微镜下控制染色，自来水冲洗终止；

8)苏木素复染细胞核，盐酸酒精分化，氨水返蓝；

9)脱水及透明：依次放入75％酒精、85％酒精、95％酒精各浸泡3min；无水乙醇浸泡10min×2次；二甲苯浸泡15min×2次；

10)中性树胶封片。

对肝细胞癌组织石蜡切片进行染色，对比相同浓度下和稀释度效果最明显的CD31抗体被认为是与CD31抗原结合最佳的CD31抗体。

如图1所示，对所制备的CD31单克隆抗体均以相同稀释度分别染肝细胞癌石蜡组织切片，4H3对应的单克隆抗体在相同的条件下染色效果最佳，阳性率最高。通过严格的筛选，得到最优质的抗体。

实施例3对比CD31单克隆抗体免疫组化检测特异性

选择购买国内北京中杉和福州迈新的CD31的单克隆抗体，采用说明书和摸索的4H3最佳条件，分别染相同的肿瘤组织切片，对比染色情况，确定其特异性是否一致，具体操作如下：

1)肾上腺嗜铬瘤、上皮样血管肉瘤石蜡组织切片，将所述石蜡切片常规脱蜡和水化：将切片置于65℃恒温箱中烘烤30min，二甲苯浸泡15min，两次；无水乙醇浸泡10min，两次；依次放入95％酒精、 85％酒精、75％酒精各浸泡5min；蒸馏水浸洗5min×3次；

2)抗原修复：0.01M柠檬酸修复液(pH6.0)，高压修复2min30s；蒸馏水浸洗5min×3次；

3)3％H₂O₂-甲醇中37℃阻断30min；PBS浸洗5min×3次；

4)擦干组织，组化笔画圈，滴加山羊封闭血清，37℃作用封闭 30min，倾去，勿洗；

5)分别滴加中杉公司、迈新公司CD31单克隆抗体和本发明4H3 对应的CD31单克隆抗体，同时以PBS为阴性对照，4℃过夜；次日 37℃复温30min，PBS浸洗5min×3次；

6)甩去多余液体，滴加酶标记标记羊抗小鼠二抗，37℃作用 30min；PBS浸洗5min×3次；

7)滴加DAB显色液，镜下控制染色，自来水终止；

8)苏木素复染细胞核，盐酸酒精分化，氨水返蓝；

9)脱水及透明：依次放入75％酒精、85％酒精、95％酒精各浸泡3min；无水乙醇浸泡10min×2次；二甲苯浸泡15min×2次；

10)中性树胶封片。

结果如图2所示，图2A对应的CD31的单克隆抗体4H3染肾上腺嗜铬瘤的阳性结果，图2B-2C对应的分别为中杉公司和迈新公司染肾上腺嗜铬瘤的阳性结果；结果显示，本发明的4H3对应的CD31 单克隆抗体具有与中杉公司和迈新公司的CD31单克隆抗体相近的染色效果，染色区域及染色定位上结果一致，因此本发明的4H3对应的CD31单克隆抗体能够特异性识别内皮细胞，证明本发明的CD31 单克隆抗体具有较好的识别CD31抗原的效果及特异性，是CD31特异性的单克隆抗体。

图3为4H3单克隆抗体染上皮样血管肉瘤的结果。

以上实施例分别进行了本发明对肝细胞癌、肾上腺嗜铬瘤、上皮样血管肉瘤的免疫组化实验，组化结果显示在不同肿瘤中均有良好的表达效果，表明采用本发明提供抗体应用于免疫组化检测，能很好地检测CD31在肿瘤组织中的表达量和表达位置，便于从免疫组化图中直接判读内皮细胞在肿瘤组织中的定位和定量，从而判断出肿瘤中血管情况。本发明所述CD31单克隆抗体4H3具有良好的特异性，可用于免疫组织化学(IHC)方法中对良恶性血管源性肿瘤的诊断和鉴别诊断，亦可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究，属于生物检测领域。

实施例4Western blot(免疫印迹法)验证本发明所述4H3单抗的特异性

选择重组的CD31真核蛋白(北京义翘，10148-H08H)进行免疫印迹实验，具体操作如下：蛋白上样量为2ug，选用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转或半干转移凝胶蛋白带至PVDF膜，5％奶粉溶液 (0.5％PBST配置)室温摇床封闭1h。将本发明所述抗体稀释比例 1:1000孵育4℃过夜或室温1h,PBST清洗15min×3次，室温孵育二抗(奶粉溶液配置)1h。再次洗膜，加入ECL发光试剂按操作凝胶成像(美国BIO-RAD公司Chemi DocTM MP Imaging System)进行化学发光图像数据的采集，结果如图4所示，本发明所述4H3抗体识别真核蛋白，特异性强。

综上所述，本发明所公开的杂交瘤细胞株产生的CD31单克隆抗体具有特异性强、亲和力高、稳定性好、效价高的特点：

1)准确率高，识别能力强。本发明纯化的CD31单克隆抗体分别对肝细胞癌、肾上腺嗜铬瘤、上皮样血管肉瘤组织免疫组化染色，对比染色结果显示本发明无非特异性染色，阳性对照比对阳性率无明显差异，证明本发明对CD31蛋白具有高识别能力。显示本发明的抗体有更高的灵敏性，细胞定位准确，检测结果更可靠，适用于要求严苛的IHC应用，可显著提高诊断的准确度。

2)特异性强，稳定性良好。本发明所述CD31抗体为IgG 2b型单克隆抗体。单克隆抗体与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的特异性和均一性，不易造成非特异性背景和交叉反应的问题。虽有不少技术公司致力于单克隆抗体的研发与生产，质量依然参差不齐，抗体稳定性不易控制。实验结果证明，本发明CD31单克隆抗体染色阳性强度高于市面上一般抗体，4℃下存放连续免疫组化检测其特异性及亲和力，阳性率无明显改变，该抗体稳定性良好。

3)成本低，效价高，易于推广应用。本发明为自主研发制备，筛选出稳定生产CD31单克隆抗体的细胞系。纯化抗体效价高，以国内外常用抗体推荐稀释度(1：100～1:200)与本发明抗体高稀释度 (1:600～1：1000)对同种组织连续切片染色，对比染色过程，本发明抗体显色时间更短，显色时间平均在20s以内；对比染色结果，背景更加清晰，降低了信噪比，有利于提高研究和临床检测效率。经调查发现，研究人员和临床免疫组化工作者更偏好于使用国外进口一抗，如Abcam、CST等，但购买周期耗时较长且价格较为昂贵，国内常用的即用型抗体也备受关注，但效价却差强人意，且存在着免疫组化试剂盒的配套使用的局限性。实施方案实验结果证明，本发明所述 CD31单克隆抗体可具有上述抗体所不具备的优势，稳定细胞系标准化生产，批次之间差异较小，重复检验有保证，符合临床检测标准。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种可产生CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，于2018年3月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201822。

2.一种CD31单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：

步骤(1)采用纯化的CD31重组胞外区蛋白作为免疫原免疫动物体；

步骤(2)将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫后的所述动物体的B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞；

步骤(3)筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆，对所述阳性克隆进行细胞克隆化，筛选出稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞；

步骤(4)获得CD31单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆通过ELISA法进行。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述动物体为Balb/c小鼠。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述获得CD31单克隆抗体包括：

在动物体内接种所述稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞，生产腹水抗体进行纯化，得到CD31单克隆抗体；或者

体外培养所述稳定分泌CD31单克隆抗体的杂交瘤细胞，分离纯化培养液，得到CD31单克隆抗体。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆包括：

用CD31重组胞外区蛋白包被酶标板，用酶标仪检测450nm波长检出阳性克隆。

7.根据权利要求2或6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述克隆化采用有限稀释法进行。

8.一种CD31单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1-6任意一项制备。

9.权利要求7所述的CD31单克隆抗体在免疫组化病理诊断剂上的应用。

10.根据权利要求8所述的CD31单克隆抗体的应用，其特征在于，应用于免疫组化检测时，以肿瘤组织免疫组化染色，筛选出可以与人的CD31分子特异性反应的单克隆抗体。