CN105646715B

CN105646715B - 一种抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN105646715B
Application number: CN201610033741.9A
Authority: CN
Inventors: 李莹莹; 王庆; 曾伟伟; 王英英; 刘春�; 郑树城; 石存斌; 宋新建; 黄琦雯
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2016-01-19
Filing date: 2016-01-19
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2036-01-19
Also published as: CN105646715A

Abstract

本发明公开了抗锦鲤IgM的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。所述抗锦鲤IgM的单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC NO：C2015218的杂交瘤细胞株A5‑E10分泌产生的。利用所述的单克隆抗体可以用于锦鲤或普通鲤鱼某病原或水产疫苗特异性抗体的检测，从而进行疾病的早期诊断和疫苗使用效果的评价，对锦鲤或普通鲤鱼疾病流行病学调查、病原诊断具有较高的临床使用及推广价值，为其他养殖鱼类疾病的防治提供参考。

Description

一种抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其应用。

背景技术

锦鲤作为观赏鱼的一个大类，体型优美、色彩艳丽，在国内已大量养殖，是目前休闲渔业的主要品种。随着养殖环境越来越恶劣，锦鲤的各种传染性疾病例如鲤春病毒血症、疱疹病毒性乳头瘤、锦鲤疱疹病毒病等开始广泛传播，亟需各种疫病检测方法的建立，而抗锦鲤免疫球蛋白IgM单克隆抗体的成功制备将为锦鲤各种疫病的免疫学诊断提供重要材料。

抗体是脊椎动物的免疫系统在抗原的刺激下，由淋巴细胞所产生的可与相应的抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，哺乳动物中已经报道的免疫球蛋白包括：免疫球蛋白M(IgM)，免疫球蛋白D(IgD)，免疫球蛋白A(IgA)，免疫球蛋白E(IgE)和免疫球蛋白G(IgG)，鱼类虽然是低等的脊椎动物，但是其免疫系统同样可以产生不同类型的免疫球蛋白，硬骨鱼类中已经报道的免疫球蛋白包括IgM、IgD、IgZ和IgT，IgM是一类存在于所有有颌类脊椎动物中的抗体。

当前，对于锦鲤疱疹病毒的检测，最为常用的方法是基于PCR扩增技术的各种分子生物学检测方法，具有较高的敏感性和特异性。但这些分子生物学方法都是检测病毒的核酸存在与否，方法单一，经常导致假阳性和假阴性结果，难于对该病做到定量检测与确诊。因此，急需其它方法来弥补分子生物学检测方法的不足，如各种免疫学（血清学）检测方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一株杂交瘤细胞株A5-E10，已于2016年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2015218。

本发明的另一个目的是提供一种由上述保藏编号为CCTCC NO：C2015218的杂交瘤细胞株分泌产生的抗锦鲤免疫球蛋白IgM单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供一种锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体，其可特异性识别锦鲤免疫球蛋白IgM，效价高于1:10000。所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C2015218的杂交瘤细胞株分泌产生。

一株杂交瘤细胞株，已于2016年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINACENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2015218，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。

上述的单克隆抗体在制备用于检测锦鲤免疫球蛋白IgM的免疫检测工具中的应用。

上述的单克隆抗体在制备用于检测锦鲤疱疹病毒的免疫检测工具中的应用。

所述免疫检测工具包括试剂、试剂盒、芯片或试纸。

一种锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测试剂盒，其包括上述的抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体。

所述试剂盒中还包括：包被液、标准血清、洗涤液、HRP标记羊抗鼠抗体、TMB显色液和终止液。

一种锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测方法，包括如下步骤：

（1）加样：将待检样品加入包被有KHV病毒的酶标板中；

（2）温育：用封板膜封板后置36～38℃温箱中孵育

（3）洗涤：将样品从每个孔中吸出，用PBST 洗涤；

（4）加入鼠抗锦鲤IgM 抗体：将稀释好的抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体加入上述步骤（3）洗涤好的酶标板中；

（5）温育、洗涤，同步骤（2）和（3）；

（6）加入二抗：将稀释好的HRP标记羊抗鼠抗体加入上述步骤（5）中洗涤好的酶标板中；

（7）温育、洗涤，同步骤（2）和（3）；

（8）显色：往反应孔中加入TMB 显色剂，36～38℃避光显色；

（9）测定及结果判断。

本发明的有益效果是：

本发明的杂交瘤细胞株及所分泌的抗锦鲤IgM单克隆抗体具有以下优点：

1）本发明的杂交瘤细胞株由SP2/0细胞骨髓瘤细胞与免疫了锦鲤免疫球蛋白IGM的小鼠脾细胞融合而获得；

2）该杂交瘤细胞株能够无限增殖并持续产生抗锦鲤免疫球蛋白IGM单克隆抗体；

3）本发明的抗锦鲤免疫球蛋白IGM单克隆抗体可以特异性识别锦鲤免疫球蛋白IGM；

4）本发明的抗锦鲤免疫球蛋白IGM单克隆抗体特异性强效价高。

附图说明

图1为纯化的锦鲤免疫球蛋白的SDS-PAGE胶检测图（1为Marker，2为锦鲤IgM）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1抗锦鲤免疫球蛋白IGM单克隆抗体的制备和纯化

材料与方法

实验材料

试验锦鲤来源于中国水产科学研究院珠江水产研究所，体长20cm；其他化学试剂为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。

1锦鲤IgM纯化

1.1断尾采取锦鲤血液，置于玻璃管中，于室温下凝固，先于37℃下放置2h，再于4℃放置过夜，待血清充分析出后，3000g/min 离心 10min,取其上清。

1.2纯化：将鱼血清12000rpm离心20 min，取上清；对上清液测量体积；边搅拌边慢慢加入饱和硫酸铵溶液到上清液中，至最终饱和度为33%；将溶液放在磁力搅拌器上搅拌过夜（4℃），使蛋白质充分沉淀；蛋白质溶液 10000 rpm离心30min（4℃），将上清移至干净管中，沉淀用适量的1XPBS溶解，放入透析袋（8000-14000kd）在1XPBS透析 24-48小时（4℃），每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸铵；透析后溶液5000rpm离心10min，上清转到干净管中，并取小样备用；在之前的硫酸铵沉淀离心上清溶液中，继续缓慢添加饱和硫酸铵至饱和度为50%；将溶液放在磁力搅拌器上搅拌过夜（4℃），使蛋白质充分沉淀；蛋白质溶液 10000 rpm离心30min（4℃），将上清移至干净管中，沉淀备用；将沉淀溶于少量1XPBS中，沉淀溶解后放入透析袋在1XPBS透析 24-48小时（4℃），每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸铵；透析之后的溶液5000rpm离心10min，取上清转到干净管中，并取小样备用；对两次饱和度的留取小样进行电泳检测；之后将50%硫酸铵沉淀的透析上清过Protein A柱进行纯化（通过填料和上清混合后于摇床上摇晃反应4h）。

1.3纯化后IgM的检测：通过SDS-PAGE电泳检测血清中IgM的纯化效果，样品与等体积样品缓冲液混合后后，100℃沸水水浴3-5min，经离心后上样。分离胶浓度为12%，电泳电压为100V，电泳时间为1h，电泳后用考马斯亮蓝染色。

检测结果表明，经Protein A亲和层析柱纯化的样品进行SDS-PAGE检测，得到大小约为75kD与25kD的两条带，与预期的锦鲤IgM重链和轻链分子量相近。

2 动物免疫

以上述纯化的锦鲤IgM为特异性抗原免疫6周龄BALB/c小鼠，取6只6周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射抗原，第一次免疫将抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，100ug /只；两周后进行第二次免疫，抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，皮下注射，50ug /只；两周后进行第三次免疫，免疫方法及剂量同第二次免疫。第三次免疫一周后，小鼠断尾采血测其效价，第三次免疫两周后，选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的抗原加强免疫，3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。

3小鼠融合

3.1小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞融合

将生长状态良好的SP2/0细胞，吹打下来后，1000rpm离心5min；弃去上清，用20-40ml预热的1640培养液重悬，1000rpm离心5min；重复上述步骤；弃去上清，加入适量预热的1640培养液重悬沉淀；取50ul细胞悬液与150ul台盼蓝混匀后，于显微镜下检活计数；每个融合取1×10⁷个细胞，与处理好的1×10⁸个脾细胞在进口的50ml离心管中混合均匀后，1350rpm离心7min；用抽液泵抽干上清；有节奏的在超净台桌面上敲打离心管底部，使沉淀松动呈糜状；沿着离心管底部的管壁，缓慢加入1ml预热的PEG，并用枪头顺时针方向搅拌，同时离心管保持逆时针方向转动。该步骤需在60-90s内完成；将离心管静置30-60s；沿管壁缓慢滴加5ml预热的1640培养液，再逐渐加快速度，加入15ml预热的1640培养液，再加入20ml SP2/0骨髓瘤细胞培养液；1200rpm离心5min；弃去上清，将细胞重悬至100ml预热的含15% FBS 1*HAT的1640细胞培养液中，100ul/孔的量将混合细胞悬液铺到96孔细胞培养板上。然后将培养板置37°C 5% CO2培养箱内培养；5 d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基；10 d后用预热的HT换出HAT；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行ELISA检测,两次检测结果为阳性设为阳性克隆孔。

3.2多克隆细胞株的 ELSIA检测

包板：用Coating buffer稀释抗原至1ug/ml，以50ul/孔的量铺到酶标板上，轻轻振摇使包被液铺满孔底，4℃包被过夜；次日弃去包被液，用PBST以200ul/孔洗1遍，在吸水纸上拍干；

封闭：以60ul/孔加入1% BSA，37℃封闭1h；

一抗（加样）：将稀释好的样品以50ul/孔加入到酶标板上，同时设置好阳性对照与阴性对照（对照组需做复孔），37℃作用1h；用PBST以200ul/孔清洗2遍；

二抗：用1%BSA稀释HRP标记的羊抗鼠二抗，1:10000稀释，以50ul/孔加入到酶标板上，37℃作用45min；用PBST以200ul/孔清洗3遍；

显色：每孔加入100ul的TMB显色液（临用前配）；37℃孵育15min；

终止反应：每孔加入100ul的2M H₂SO₄以终止反应；

读数：在酶标仪上测定OD450nm读数；分析所得数据，一般ELSIA>0.3认为是阳性，如果阳性值较多的，则会从高挑选，一般会选ELSIA>1.0的阳性值。结果筛选出46个阳性细胞株；对其中8个利用WesternBlot检测方法进一步筛选多克隆细胞株，根据结果选择条带最亮的6个细胞株进行挑选单克隆细胞株。

4单细胞克隆株的筛选

4.1单克隆细胞株的ELSIA检测

ELISA检测方法同3.2。

结果筛选出31个阳性细胞株；对其中9个利用Western Blot检测方法进一步筛选单克隆细胞株，根据结果选择条带最亮两个单克隆细胞株制备腹水。

4.2单细胞克隆株的亚型分析

包板：用Coating buffer稀释抗原至1ug/ml，以50ul/孔的量铺到酶标板上，轻轻振摇使包被液铺满孔底，4℃包被过夜；次日弃去包被液，用PBST以200ul/孔洗1遍，在吸水纸上拍干；封闭：以60ul/孔加入1%BSA，37℃封闭1h；将稀释好的羊抗鼠分型二抗以50ul/孔加入到酶标板上， 37℃作用1h；用PBST以200ul/孔清洗2遍；加二抗：用1%BSA稀释羊抗鼠HRP二抗1:10000稀释，以50ul/孔加入到酶标板上，37℃作用45min；用PBST以200ul/孔清洗3遍；显色：每孔加入100ul的TMB显色液（临用前配）；37℃孵育15min；终止反应：每孔加入100ul的2M H₂SO₄以终止反应；读数：在酶标仪上测定OD450nm读数；结果发现A5-E10单克隆细胞株为IgG2a，κchain。

杂交瘤细胞株A5-E10，已于2016年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2015218。

4.3单细胞克隆株的腹水效价分析

ELISA检测方法同3.2。

结果发现将腹水稀释比例为1:240000时的吸光值都大于1。

5单抗纯化

取4只BALB/C小鼠，每只注射0.5ml石蜡油，7天后取杂交瘤细胞（效价较高同时细胞状态好）重悬于无血清培养基中，按1×10⁶个细胞/0.5ml/只量注射石蜡小鼠，注射细胞约7-14d后收集腹水。用50mM PBS预处理protein G亲和层析柱；将腹水样品上柱，收集流穿液；加入PH3.0、0.1M 甘氨酸-HCl洗脱，通过SDS-PAGE胶检测纯化后抗体的纯度。结果表明，通过protein G亲和柱纯化的抗体，其效价高于1:10000（表1）。

表1 单抗效价分析

实施例2锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测方法的建立

1. 抗原工作浓度的确定

将纯化的锦鲤疱疹病毒用包被液（pH8.6）稀释为50μg/mL、30μg/mL、10μg/mL 浓度梯度，包被96孔酶标板，每孔加入100uL，4℃ 湿盒包被过夜。每孔加入300 μL 10%的脱脂乳进行封闭，37℃温箱中孵育1 h，用PBST 洗涤3 次，每次3-5 min。将抗KHV阳性血清、锦鲤阴性血清进行1：300倍稀释，每孔加入100 uL进行ELISA方阵试验，37℃温箱中孵育1 h，用PBST 洗涤3 次，每次3-5 min。将上述制备的鼠抗锦鲤IgM 抗体1:2000，每孔100uL，37℃温箱中孵育1h，用PBST 洗涤3 次，每次3-5 min。加入50 μL显色底物（TMB），37℃避光显色10min。用50 μL 2mol/L H₂SO₄终止反应。测定各孔OD₄₅₀nm值，确定抗原工作浓度。

方阵滴定结果表明，当抗原包被浓度为50μg/mL P/N值最大，阳性血清OD_450nm值高于1.0，阴性血清OD_450nm值小于0.2。因此，确定抗原的最适包被浓度为50 μg/mL。

2. 最佳封闭液和封闭时间的确定

分别选择1%脱脂奶粉、2.5%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉、10%脱脂奶粉和1% BSA为封闭液进行封闭试验。选择最佳封闭液在37℃温箱中分别封闭30min、60min、90min、120min，确定最佳封闭时间。

结果表明，用10%脱脂奶粉作为封闭液的P/N值最高，而且阳性血清OD_450nm值大于1.0，阴性血清OD_450nm值小于0.2，封闭效果最好。在37℃条件下封闭60min 时P/N值最高。

3. 锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测方法的建立

（1）包被：采用包被液将纯化的KHV病毒稀释到50μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃ 湿盒包被过夜。

（2）封闭：每孔加入300 μL 10%的脱脂乳进行封闭

（3）样品准备：用一次性注射器采取锦鲤血液，置于离心管中，于室温下凝固，先于37℃下放置2h，再于4℃放置过夜，待血清充分析出后，3000g/min 离心 10min,取其上清，作为检测样品。

（4）加样：将上述步骤（5）制备的检测样品用PBST（pH7.4)按1:300进行稀释，将稀释好的样品按100μL/孔的量加入上述步骤封闭好的酶标板中。

（5）温育：用封板膜封板后置37℃温箱中孵育1h。

（6）洗涤：将样品从每个孔中吸出，用PBST 洗涤3 次，每次3-5 min。

（7）鼠抗锦鲤IgM 抗体的稀释：将鼠抗锦鲤IgM 抗体用PBST（pH7.4)作1:2000稀释。

（8）加入鼠抗锦鲤IgM 抗体：将稀释好的鼠抗锦鲤IgM 抗体按100 uL/孔的量加入上述步骤（6）中洗涤好的酶标板中。

（9）温育：同步骤（5）；

（10）洗涤：同步骤（6）；

（11）酶标二抗的稀释：将酶标二抗用PBST（pH7.4)作1:5000稀释。

（12）加入二抗：将稀释好的酶标二抗按100μL/孔的量加入上述步骤（10）中洗涤好的酶标板中。

（13）温育：同步骤（5）；

（14）洗涤：同步骤（6）；

（15）显色：加入新鲜配制的底物溶液（TMB:H₂O₂=1:1) 50μL/孔,用封板膜封板后置37℃避光显色10min。

（16）终止：加入50uL/孔2M 的H₂SO₄终止液，终止反应。

（17）测定：采用波长450nm的酶标仪测定OD值。

（18）结果判断：OD_450nm≥0.20时判定为阳性

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

Claims

1.一种抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C2015218的杂交瘤细胞株分泌产生。

2.一株杂交瘤细胞株，已于2015年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2015218。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测锦鲤免疫球蛋白IgM的免疫检测工具中的应用。

4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于辅助检测锦鲤疱疹病毒的免疫检测工具中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具包括试剂、试剂盒、芯片或试纸。

6.一种锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测试剂盒，其包括权利要求1所述的单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：包被液、标准血清、洗涤液、HRP标记羊抗鼠抗体、TMB显色液和终止液。

8.一种非疾病诊断的锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测方法，包括如下步骤：

(1)加样：将待检样品加入包被有KHV病毒的酶标板中；

(2)温育：用封板膜封板后置36～38℃温箱中孵育

(3)洗涤：将样品从每个孔中吸出，用PBST洗涤；

(4)加入鼠抗锦鲤IgM抗体：将稀释好的权利要求1所述的单克隆抗体加入上述步骤(3)洗涤好的酶标板中；

(5)温育、洗涤，同步骤(2)和(3)；

(6)加入二抗：将稀释好的HRP标记羊抗鼠抗体加入上述步骤(5)中洗涤好的酶标板中；

(7)温育、洗涤，同步骤(2)和(3)；

(8)显色：往反应孔中加入TMB显色剂，36～38℃避光显色；

(9)测定及结果判断。