CN104974256A

CN104974256A - 一种抗噻虫啉单克隆抗体及其用途

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Publication number: CN104974256A
Application number: CN201510174884.7A
Authority: CN
Inventors: 王鸣华; 华修德; 殷维; 施海燕
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-04-10
Filing date: 2015-04-10
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2035-04-10
Also published as: CN104974256B

Abstract

本发明涉及一种抗噻虫啉单克隆抗体及其应用，尤其是一种可特异性识别噻虫啉的单克隆抗体，以及所述单克隆抗体的用途，属于生物学领域。将其人工抗原免疫BALB/c雌性小鼠，将骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾脏细胞进行细胞融合，制备得到杂交瘤细胞；通过系列筛选和亚克隆得到能稳定分泌抗噻虫啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株；再将该杂交瘤细胞株注射小鼠腹内制得腹水；采用辛酸-硫酸铵法纯化小鼠腹水，制得噻虫啉的特异性单克隆抗体。这种抗体与其他化合物不发生交叉反应。用该抗体建立的酶联免疫层析分析方法可用于快速、灵敏、方便和廉价检测环境和农产品中噻虫啉残留。

Description

一种抗噻虫啉单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及一种抗噻虫啉单克隆抗体，尤其是一种可特异性识别噻虫啉的单克隆抗体，及该单克隆抗体的用途，属于生物技术领域。

背景技术

噻虫啉(Thiacloprid)，化学名(3-((6-氯-3-吡啶基)甲基)-1，3-噻唑啉-2-亚基)氰胺，是一种新型氯代烟碱类杀虫剂，由拜耳农化公司开发，对刺吸式和咀嚼式口器害虫有特效。作用机理与其它传统杀虫剂有所不同，通过与烟碱乙酰胆碱受体结合，干扰昆虫神经系统正常传导，引起神经通道的阻塞，造成乙酰胆碱的大量积累，从而使昆虫异常兴奋，全身痉挛、麻痹而死。具有较强的触杀、胃毒和内吸作用，噻虫啉与常规杀虫剂没有交互抗性，因而可用于抗性治理，广泛应用于那些对有机磷类、氨基甲酸酯类、除虫菊酯类已产生抗性的农林业害虫的防治。然而大量研究证实新烟碱类杀虫剂对蜜蜂和其他授粉昆虫具有较高毒性以及对生态系统有污染。2013年，欧盟委员会决定在一些开花作物上3种新烟碱类杀虫剂被禁用两年。因此，监测环境和农业的样品中噻虫啉的农药残留有非常重要的意义。

目前对噻虫啉的残留检测，主要采用仪器分析方法，如液相色谱分析法。虽然仪器分析方法灵敏度高、准确性强，但检测仪器昂贵、样品前处理较繁琐、检测费时费力、难以满足大量样品快速简便检测的需要。

免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，在大量样品快速筛选和现场监测中显示出独特优势。ELISA是一种将酶催化反应和免疫反应相结合的免疫标记测定技术，有酶催化反应的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性，在灵敏度方面有很大的优势。ELISA作为一种快速灵敏的检测方法，在许多小分子免疫分析中已得到较成熟的应用。通过制备针对噻虫啉的特异性抗体，建立噻虫啉免疫学检测方法。该发明方法的完成，将解决噻虫啉抗体制备关键技术，建立噻虫啉的ELISA快速检测技术。该发明不仅为食品安全检测，而且为我国农产品等的出入境检测提供有效的技术手段和检测方法。对我国农产品的可持续发展和食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。目前国内外尚未见有关噻虫啉的单克隆抗体的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种特异性识别噻虫啉的单克隆抗体及其对环境或农产品中的噻虫啉进行免疫检测的用途。

技术方案

(1)将式(I)所示的免疫半抗原偶联BSA制备得到免疫原；

(2)用免疫原免疫BALB/c小鼠，免疫剂量为100μL免疫原/只，共免疫五次；首次免疫由等体积的免疫原和弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射，之后用等体积免疫抗原和弗氏不完全佐剂乳化；从第三次免疫开始，每次免疫后尾静脉采血，测定效价；

(3)待效价稳定后，将骨髓瘤细胞SP2/0与上述效价最好的小鼠脾脏细胞进行细胞融合，脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0的比例为10∶1，制备得到杂交瘤细胞；

(4)通过系列筛选和亚克隆得到能稳定分泌抗噻虫啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株；再将该杂交瘤细胞株注射小鼠腹内制得腹水；

(5)采用辛酸-硫酸铵法纯化小鼠腹水，得到所述的单克隆抗体。

所述的单克隆抗体在制备用于检测噻虫啉的检测工具中的应用。所述检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

本发明具有以下有益效果：(1)新颖：抗噻虫啉单克隆抗体为国内外首次报道；(2)实用：利用本发明提供的抗噻虫啉单克隆抗体实现的ic-ELISA具有操作简单快速(只需要2-3小时)、分析成本低、分析容量大、安全可靠、容易普及推广，特别适用于大批量样品检测和现场监测，可以与传统仪器分析方法互为补充；(3)特异性强：产生的抗体特异性识别噻虫啉，与其他烟碱类杀虫剂没有交叉反应；(4)准确度高：利用本发明提供的抗噻虫啉单克隆抗体实现的ELISA在农产品中的添加回收率为80.3-116.3％，变异系数低于9.8％，符合残留分析标准；(5)灵敏度高：利用本发明提供的抗噻虫啉单克隆抗体实现的ic-ELISA的抑制中浓度(IC₅₀)为26.3μg/L，检测限(IC₁₀，LOD)为1.4μg/L，线性范围为2.5-200μg/L。

附图说明

图1为ELISA检测噻虫啉，OD值与噻虫啉浓度的曲线；横坐标为噻虫啉的浓度，单位为mg/L；纵坐标为OD值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例一：抗噻虫啉单克隆抗体的制备

1、小鼠免疫：

(1)将式(I)所示的免疫半抗原偶联BSA(牛血清白蛋白)制备得到免疫原；

(2)初次免疫：取6～8周龄健康BALB/c雌性小鼠，将制备得到的免疫原用PBS缓冲液配置成1mg/mL后与等体积弗氏完全佐剂(FCA)混合，充分乳化后，每只小鼠经腹腔注射200μL(即100μg免疫原)；

(3)加强免疫：初次免疫隔三周后，取免疫原(与首次免疫等剂量)和等体积的弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化后，每只小鼠经腹腔注射200μL，以后每隔两周，加强免疫一次，共免疫4次；在进行细胞融合前3d对小鼠注射免疫原，注射剂量与首次免疫剂量相同(不含任何佐剂)，具体免疫方案见表1。

表1

2、抗血清的制备及融合小鼠的选择：BALB/c小鼠从第三次免疫开始，每次免疫7～10天后进行小鼠尾静脉采血，37℃放置45min后于4℃冰箱放置30min，12000rpm离心10min，得到的上清液即为抗血清。另取未经免疫的BALB/c小鼠得到阴性血清作为对照。用间接非竞争酶联免疫吸附分析法测定抗血清的效价(血清的稀释倍数即为效价)，第五次免疫后，选择效价最好的小鼠进行细胞融合。

3、细胞融合：待免疫抗血清效价稳定后，将生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0与上述抗血清效价最好的小鼠脾脏细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞。通过系列筛选和亚克隆，最后得到一株能稳定分泌抗噻虫啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株，再将该杂交瘤细胞株注射小鼠腹内制得腹水，得到腹水后，采用辛酸-硫酸铵法提纯抗体。

3.1、细胞融合的具体过程如下：

(1)将约1×10⁸个脾细胞与1×10⁷个骨髓瘤细胞SP2/0(比例约为10∶1)混合于50mL离心管中，1000rpm离心10min，弃上清液，再用DMEM基础培养液洗涤一次；

(2)弃上清，用滴管吸净残留在离心管口的培养液，以免影响PEG(聚乙二醇)的浓度；

(3)用手指轻轻弹离心管底部的沉淀细胞团，使沉淀松散均匀，随后将离心管置于37℃水浴锅中；

(4)用注射器准确吸取1mL 37℃预热的50％PEG1500，在60s内将1mL PEG滴加到离心管中，采用先慢后快的原则，边加边轻轻晃动，加完静置1min；

(5)然后逐滴加入37℃预热的DMEM基础培养液，终止PEG作用，遵照先慢后快的原则滴加至30mL，37℃静置10min，800rpm离心8min，弃上清；

(6)用5mL HAT培养液将细胞轻轻悬浮，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞分散开；

(7)补加HAT培养液到60mL，分装于预先铺有饲养细胞96孔细胞培养板中。每孔加入100μL，医用胶带封边标记，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

上述步骤得到的杂交瘤细胞的培养过程为：将融合后的细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，第二天检查有无污染。在融合后5～7d首次换液，并根据情况每3～4d更换培养液一次，换液时吸去1/2～2/3培养液，加入等量新鲜的培养液。所用的培养液应该根据培养时间的不同而有所不同。在融合后第5～7d用HAT培养液，第7～14d用HT培养液换出HAT培养液，三周后换用普通的细胞完全培养液。

3.2、筛选的具体过程如下：

(1)非竞争间接ELISA法初筛：用一定浓度的包被原(式(I)半抗原与卵清蛋白偶联制得的复合物)包被酶标板，3％脱脂奶粉封闭，取杂交瘤细胞的培养上清，采用非竞争间接ELISA法初步进行筛选(其中一抗为杂交瘤细胞上清，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以骨髓瘤细胞上清为阴性对照)，选取呈阳性的细胞孔，细胞上清留存用于下一步检测，呈阴性的孔若重复一次后仍为阴性则可舍弃。

(2)间接竞争ELISA法筛选：对于上一步呈阳性的细胞孔则采用间接竞争ELISA法进行进一步的确认。对噻虫啉有明显的竞争性抑制反应的孔即为产生抗噻虫啉抗体的阳性孔，应立即扩大培养并进行克隆化。对于无竞争性抑制反应的孔重复一次后仍为相同结果的则可以淘汰。

3.3、阳性杂交瘤细胞的单克隆化：

(1)将待克隆化的杂交瘤细胞用移液器反复吹打均匀后取少许细胞悬浮至24孔细胞培养板中，然后用培养液倍比稀释5～6个孔；

(2)当细胞贴壁生长后，计数几个孔的细胞；

(3)根据细胞计数结果，从密度适宜的孔中取出适量的细胞悬液(约含100个杂交瘤细胞)至50mL离心管中，将培养液补至20mL。每孔200μl接种于96孔细胞培养板中，注意操作过程中要不断混匀细胞悬液，以防止细胞分布不匀，理论上使每孔约含1个杂交瘤细胞；

(4)将培养板置于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱中培养。一般7天左右即可在倒置显微镜下观察细胞克隆生长，注意记录各孔细胞生长情况并记录每孔细胞群落的数量；

(5)对有细胞生长的孔要适时进行筛选，方法同3.2。对于呈阳性的细胞孔应尽可能取单克隆孔进行再次克隆化，重复2-3次，直至筛选阳性率达100％。

3.4、小鼠腹水的制备：BALB/c雌性小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡致敏，7～14天后注射1～2×10⁶个杂交瘤细胞。接种后7～10天左右，小鼠腹腔明显膨大，用注射器腹腔抽取腹水，每隔1～3天取1次，4000rpm离心15min，收集上清液，-20℃保存待净化。

4、单克隆抗体的纯化：采用辛酸-硫酸铵法纯化小鼠腹水，具体的操作步骤如下：

(1)小鼠腹水用4倍体积醋酸钠缓冲液稀释(0.06mM，pH 4.0)，用0.1M NaOH调节pH至4.5；

(2)室温下边搅拌边滴加辛酸(33μL/mL血清稀释液)，加完后继续搅拌30min，静置2h(4℃)，离心30min(4℃，10000r/min)，收集上清液；

(3)用PBS(0.1M，pH 7.4)以1∶10稀释上清液，用1M NaOH调整pH至7.4，预冷15min(4℃)，计算溶液总体积；

(4)缓慢加入(NH₄)₂SO₄ 0.277g/mL，边加边搅拌，再继续搅拌反应30min，静置2h(4℃)；

(5)离心30min(4℃，12000r/min)，弃上清液，沉淀物用少量PBS(0.01M，pH 7.4)溶解，用含生理盐水于4℃透析3天，每天换液3～5次；

(6)将透析后的抗体分装，冻存于-20℃。

经纯化制成的抗体效价为2×10⁶

5、抗体可变区氨基酸序列的测定：

5.1提取mRNA：

(1)收集细胞瓶里的杂交瘤细胞，弃上清，加TRIZOL试剂1ml，立即吹打(观察：液体变粘稠，细胞脱壁)。

(2)将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的1.5ml离心管中，加新开的氯仿0.2ml，轻摇20秒。

(3)室温静置5分钟后，12000rpm，15min，4℃，离心。然后取上清无色水相到离心管(DEPC处理过)，加等体积新开的异丙醇，颠倒离心管数次，混匀后室温下静置10分钟。

(4)12000rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清，75％乙醇1.0ml洗涤(用DEPC水新配制)后，7500rpm，5min，4℃离心，重复两次洗涤。

(5)去上清，点离，用小吸管吸干液体。气干沉淀5～10分钟，DEPC处理水20～30μL加入，中枪打匀，55～60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。

(6)1.2％琼脂糖电泳，155V，30min。

5.2反转录：用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)反转录得到cDNA，-20℃冻存。

5.3DNA片段扩增及测序：用Trans-Tap酶试剂盒(北京全式金生物有限公司)，以cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的DNA片段，进行测序(北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司)。

PCR条件：轻链：95℃，5min---94℃，30s---49℃，30s---72℃，30s---重复循环30次---72℃，8min---12℃，终止；

重链：95℃，5min---94℃，30s---60℃，30s---72℃，30s---重复循环30次---72℃，8min---12℃，终止。

5.4抗体可变区氨基酸序列的确定：

(1)抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的序列：

MHMAHPVSCFLSCISGAEGHHLIQGQQKCQYIWLMLYALEPTETRTATQTPHLSCIQPRIWGPCQVQWQWVWDRLHPQHPSCGGGGCCNLLLSAHMGAYTFGGGTKLEIKR；

(2)抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的序列：

AWSPLRTCKLPNVLTVIGCSILLLHRDVEGEVCPRPTATEPGRDPRFVGYKIDEESGWLSWFLLVPVHITIARCTDTFAGPVDGGPLPQRY。

6、噻虫啉ic-ELISA的建立

6.1方法原理：

采用间接竞争免疫分析方法。将式1所示半抗原与OVA(鸡卵白蛋白)偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体(96孔酶标板)上，制备成固相抗原，然后加入待测农药和相应抗体。固相抗原，待测农药，与抗体进行竞争结合反应，待测农药含量多，被结合在固相抗原上的抗体就少，反之结合在固相抗原的抗体多，反应后加入酶标二抗(只能与结合在固相抗原上的抗体相结合)，最后用底物进行显色加以测定，当抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，显色就减弱，结合率降低，反之，则显色增强，结合率升高，因而可根据已知量农药的标准曲线和待检样品的结合率，推算出待测农药的浓度。

6.2抗原抗体工作浓度：

ic-ELISA抗原抗体工作浓度的确定用方阵滴定法，选择OD值为1.0时的抗原抗体稀释浓度。经实验，包被抗原浓度2μg/mL，抗体浓度0.31μg/mL作为最适工作浓度。

6.3间接竞争免疫反应程序：

(1)包被：用CBS缓冲液(0.05M，pH 9.6)将包被抗原稀释至最适浓度，100μL/孔加入96孔酶标板(Maxisorp^TM透明聚乙烯板)，37℃温育2h；

(2)封闭：取出包被好的酶标板，弃去包被液，用0.5％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液(PBST)洗涤后，加入用PBS缓冲溶液稀释的1.0％的OVA的PBS(0.01M，pH 7.4)封闭液200μL/孔，于37℃温箱中温育60min。

(3)加样：取经封闭和洗涤后的酶标板，加入系列浓度的噻虫啉标准液或待测样品提取液50μL/孔，再加入抗体稀释液50μL/孔，同时设置空白对照和阴性对照，37℃温育1h。

(4)加酶标二抗：弃去孔内液体，用PBST溶液洗涤。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠10000倍稀释液100μL/孔，37℃温育1h，弃去孔内液体，用PBST溶液洗涤。

(5)显色反应：加入四甲基联苯胺(TMB)-H₂O₂底物溶液100μL/孔，37℃温箱中温育15min，用50μL/孔2M H₂SO₄终止反应。在iMarkTM酶标仪上测定490nm波长下的吸光值(A)。

6.4标准曲线和灵敏度：

根据OD值与噻虫啉浓度作图即得到标准曲线(图1)，计算抑制中浓度(IC₅₀)及最低检测限(IC₁₀，LOD)。计算出抑制中浓度(IC₅₀)及最低检测限(IC₁₀，LOD)分别为26.3μg/L和1.4μg/L，线性范围为2.5-200μg/L。

6.5抗体的特异性：

抗体的特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗体的特异性越好。

表2所示，制备的抗体与其他烟碱类杀虫剂均没有明显交叉反应(CR％＜0.3％)。从而可知，所制备的抗体特异性强，可以用于噻虫啉的分析。

表2

农药	IC₅₀(mg/L)	交叉反应率(％)
			噻虫啉	0.0263	100
啶虫脒	＞10	＜0.3
			吡虫啉	＞10	＜0.3
噻虫胺	＞10	＜0.3
			呋虫胺	＞10	＜0.3
烯啶虫胺	＞10	＜0.3
			氯噻啉	＞10	＜0.3
吡蚜酮	＞10	＜0.3

本发明建立的噻虫啉残留的免疫分析方法符合农药残留分析标准。该方法可用于农产品中噻虫啉的残留检测，且前处理方法较仪器分析方法简单，适合大批量检测和现场监测。

Claims

1.一种抗噻虫啉的单克隆抗体，其特征在于：

(1)抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的序列：

(2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的序列：

2.权利要求1所述单克隆抗体在检测噻虫啉中的应用。