CN115819404A - 农产品中吡蚜酮的快速检测装置及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了农产品中吡蚜酮的快速检测装置及其检测方法，涉及吡蚜酮的免疫用半抗原、包被用半抗原、抗原、抗体、胶体金层析检测装置及其制备和检测吡蚜酮的应用。本发明提供的检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、保质期长等优点。本发明提供由吡蚜酮免疫用半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物后使其机体产生的特异性针对吡蚜酮的抗体，其效价高，对吡蚜酮的最低检测限为0.1μg/mL、IC₅₀值为10.5 ng/mL。因此，本发明可应用于对农产中吡蚜酮的含量的快速检测，能够满足监管部门、检测机构对吡蚜酮的现场快速检测需求，具有很重要的现实意义。

Description

农产品中吡蚜酮的快速检测装置及其检测方法

技术领域

本发明涉及农产品安全检测的技术领域，更具体地，本发明涉及一种农产品中吡蚜酮的快速检测装置及其检测方法。

背景技术

吡蚜酮是防治蚜虫和粉虱的新型杂环类杀虫剂，其制剂在我国被广泛应用于水稻、棉花、蔬菜、果树等多种作物的害虫防治。吡蚜酮的使用也可能对食品安全、生态环境以及人类健康构成潜在风险。已有研究结果表明，一定剂量的吡蚜酮可导致动物体重增长缓慢，肝、肾和脾等和体重的比值增高，血液红细胞数目下降，对大鼠具有发育毒性，也可能存在潜在的内分泌干扰效应，并引起小鼠和大鼠的肝脏肿瘤。

目前，关于吡蚜酮的检测方法有气相色谱-氮磷检测器和高效液相色谱-紫外检测器，超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法，主要涉及水果、蔬菜、稻米和土壤等，上述方法中所用仪器设备操作复杂、成本高、对操作人员技术要求高，且不能立即显示结果，不适用于基层管理部门对怀疑对象进行快速地在线检测和监控。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。

建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测农产品中的吡蚜酮残留量，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件是需要能够合成、制备出合适的吡蚜酮半抗原。但是，目前尚未有针对吡蚜酮半抗原以及相关快检产品的报道。

因此，亟需设计和开发出合适的吡蚜酮半抗原，并由此建立相应的农产品中吡蚜酮快速检测方法，实现通过免疫学方法来快速检测蔬农产品中的吡蚜酮。

发明内容

本发明的目的在于提供了吡蚜酮免疫用半抗原、包被用半抗原、免疫用抗原、包被用抗原、抗体、检测装置及其制备和检测方法。

根据本发明的一个方面，提供了吡蚜酮的免疫用半抗原，其结构如式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）。

根据本发明的另一个方面，提供了制备吡蚜酮免疫用半抗原的方法，包括以下步骤：

S1. 三光气与乙酰肼在碱性条件下发生成环反应，得到中间体1：

；

S2. 将丙酮和液溴在冰浴下反应，生成溴代丙酮，将溴代丙酮与中间体1在60℃条件下反应，得到中间体2：

；

S3. 将中间体2用甲醇溶解后，加热至回流，滴加水合肼，滴毕，升浴温至80℃，搅拌至TLC监控中间体2基本反应完全，得到中间体3：

；

S4. 将中间体3溶于甲醇，室温搅拌滴入浓盐酸，滴毕后升高反应温度至70℃，搅拌水解，水解完成后，加入10%氢氧化钠溶液调节pH值至中性，得到中间体4：

；

S5. 将6-氯烟醛溶于DMSO，室温搅拌，再依次加入氢氧化钾和3-巯基丙酸，加热至100℃，搅拌反应1-2h，降温至室温，搅拌，过柱层析，纯化后得到中间体5：

；

S6. 向中间体4中，滴入中间体5的甲醇溶液，室温搅拌6h，过滤，滤饼用5ml甲醇洗涤，抽干，室温晾干，得淡黄色固体，即吡蚜酮的免疫用半抗原：

。

根据本发明的再一个方面，提供了吡蚜酮包被用半抗原，其结构如式（Ⅱ）所示：

（Ⅱ）。

根据本发明的第四个方面，提供了制备吡蚜酮包被用半抗原的方法，包括以下：

1）按照制备吡蚜酮免疫用半抗原的方法中S1~S4的步骤，制备得到中间体4；

2）向中间体4中加入甲醇溶解的对醛基苯甲酸，室温搅拌，反应变黄色浑浊，升高反应温度至70℃，搅拌，TLC监控所述中间体4基本反应完全，降至室温，搅拌过滤，滤饼用5ml冷甲醇洗涤，抽干，室温晾干，得浅黄色固体，即吡蚜酮包被用半抗原，

。

根据本发明的第五个方面，提供了吡蚜酮免疫用抗原，吡蚜酮免疫用抗原为吡蚜酮的免疫用半抗原与载体蛋白的偶联物，载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。

根据本发明的第六个方面，提供了吡蚜酮包被用抗原，吡蚜酮包被用抗原为吡蚜酮的包被用半抗原与载体蛋白的偶联物，载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。

根据本发明的第七个方面，提供了吡蚜酮抗体，是由吡蚜酮免疫用抗原经动物免疫制备得到，吡蚜酮抗体为吡蚜酮单克隆抗体。

根据本发明的第八个方面，提供了吡蚜酮免疫用半抗原、吡蚜酮包被用半抗原、吡蚜酮免疫用抗原、吡蚜酮包被用抗原在吡蚜酮的免疫学检测中的应用。

根据本发明的第九个方面，提供了吡蚜酮胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，试纸条包括反应膜，反应膜设有检测区和质控区，检测区包被有吡蚜酮包被用抗原，反应杯中含有胶体金标记的吡蚜酮抗体。

根据本发明的第十个方面，提供了一种快速检测农产品中吡蚜酮的方法，该方法为使用吡蚜酮胶体金层析检测装置对农产品中的吡蚜酮进行检测。

本发明的有益效果：本发明提供的吡蚜酮免疫用半抗原、包被用半抗原的制备方法，使用的化学试剂容易得到、操作过程简单、合成步骤简洁有效、反应产率较高、并且检测成本较低。本发明利用层析式免疫胶体金原理，通过试纸条中检测线与质控线之间的比色来定性检测农产品中吡蚜酮的含量，应用时不需要使用液相色谱或质谱等大型仪器，达到快速检测的目的。与现有技术相比，本发明提供的检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、保质期长等优点。本发明提供由吡蚜酮半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物后使其机体产生的特异性针对吡蚜酮的抗体，效价高，对吡蚜酮的最低检测限为0.1 μg/mL、IC₅₀值为10.5 ng/mL。因此，本发明可应用于对农产中吡蚜酮的含量的快速检测，能够满足监管部门、检测机构对吡蚜酮的现场快速检测需求，具有很重要的现实意义。

附图说明

图1为本发明的一种实施方案的吡蚜酮免疫用半抗原的质谱图。

图2为本发明的一种实施方案的吡蚜酮包被用半抗原的质谱图。

图3为本发明的一种实施方案的基于吡蚜酮单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线。

图4为本发明的一种实施方案的吡蚜酮胶体金检测装置的结构示意图。

具体实施方式

通过具体的实施案例对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场可购买的原料、试剂。

实施例1

本实施例中吡蚜酮选择国药集团化学试剂有限公司供应的97%的吡蚜酮，三光气选择国药集团化学试剂有限公司供应的98%三光气，1，2-二氯乙烷选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯1，2-二氯乙烷，吡啶选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯吡啶，乙酰肼选择国药集团化学试剂有限公司供应的98%乙酰肼，丙酮选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯丙酮，液溴选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯液溴，三乙胺选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯三乙胺，乙酸乙酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙酸乙酯，水合肼选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯85%水合肼溶液，甲醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯甲醇，浓盐酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的36%-38%盐酸，氢氧化钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氢氧化钠，6-氯烟醛选择国药集团化学试剂有限公司供应的96%的6-氯烟醛，3-巯基丙酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的99%的3-巯基丙酸，对醛基苯甲酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的96%的对醛基苯甲酸，N-二甲基甲酰胺选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯N，N-二甲基甲酰胺；

三光气的二氯乙烷溶液：将2.8g三光气溶于5ml1，2-二氯乙烷中，即可，以下实施例2-11均采用本实施例1中的试剂。

实施例2 吡蚜酮免疫用半抗原的合成

吡蚜酮免疫用半抗原的制备方法，包括以下步骤：

S1. 向100ml干净单口瓶中依次加入10.24g三光气和40ml 1，2-二氯乙烷，置于冰浴下搅拌，加入100mg吡啶，继续搅拌30min，分次1小时内加入5.0g乙酰肼，加毕后升至室温，再升温至50℃，加入三光气的二氯乙烷溶液（将2.8g三光气溶于5ml 1，2-二氯乙烷中即可），反应30min后继续升温至80℃，再加入三光气的二氯乙烷溶液（将2.8g三光气溶于5ml1，2-二氯乙烷中即可），在80℃继续反应1-2h，将反应液趁热过滤，滤渣用20ml 1，2-二氯乙烷洗涤，得滤液，浓缩至体积约20ml，置于冰水浴中搅拌1-2h，过滤，得滤饼，用5ml冷1，2-二氯乙烷洗涤，抽干，于60℃下鼓风干燥，得白色固体8.48g，即中间体1；

S2. 向250ml干净单口瓶中依次加入85ml丙酮、1滴液溴，加热至50℃后褪色，将反应体系置于冰浴下搅拌，在2小时内缓慢滴加14.90g液溴，滴毕后升温至室温搅拌1h，向反应体系中加入30ml三乙胺，搅拌至室温后过滤，滤渣用20ml丙酮洗涤，得滤液，即溴代丙酮；

向另一250ml干净单口瓶中依次加入85ml制备得到的溴代丙酮、8.48g中间体1，升高反应温度至60℃，搅拌，TLC监控中间体1反应完全后，降低反应温度至40℃，过滤，滤渣用40ml丙酮洗涤，50℃减压蒸馏至无明显溶剂流出，剩余油状物中加入80ml乙酸乙酯和80ml纯化水，搅拌分液，取有机层，水层再用80ml乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，蒸馏脱溶，得棕黄色固体7.74g，即中间体2；

S3. 向另一100ml干净单口瓶中依次加入7.74g中间体2、24ml甲醇，加热至回流，滴加2ml水合肼，滴毕，升高浴温至80℃，搅拌至TLC监控中间体2基本反应完全，降至室温搅拌，将反应体系置于冰浴下搅拌1-2h，过滤，滤渣用20ml甲醇洗涤，滤液蒸馏除溶剂，得棕色透明油状物6.6g，过柱层析，分出目标液，蒸馏除溶剂，得淡黄色固体2.63g，即中间体3；

S4. 向50ml干净单口瓶中依次加入500mg中间体3和3ml甲醇，室温搅拌至溶解，15-30min内滴入400mg浓盐酸，滴毕后升高反应温度至70℃搅拌，TLC监控中间体3基本反应完全，降温至室温搅拌，将反应体系用10%氢氧化钠溶液调节pH至中性，得到的中间体4；

S5. 向另一100ml干净单口瓶中依次加入1.00g 6-氯烟醛和20ml DMSO，室温搅拌至溶解，再依次加入960mg氢氧化钾和765mg 3-巯基丙酸，加热至100℃，TLC监控至6-氯烟醛基本反应完全，降温至室温搅拌，将反应体系升温至60℃减压脱溶剂，剩余物中加入50ml纯化水，用6N盐酸调节pH至3-4，再用乙酸乙酯萃取，合并有机层，加入无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液过柱层析，分出目标液，蒸馏除溶剂，得黄色油状物810mg，即中间体5；

S6. 向另一50ml干净单口瓶中加入步骤S4中制备的中间体4溶液，在15min内将中间体5的甲醇溶液滴加完毕，中间体5的甲醇溶液由810mg中间体5溶于5ml甲醇中制备得到，室温搅拌6h，将反应液过滤，滤饼用5ml甲醇洗涤，抽干，室温晾干，得淡黄色固体406mg，即为吡蚜酮免疫用半抗原。采用质谱法鉴定吡蚜酮免疫用半抗原，对吡蚜酮免疫用半抗原进行51次MCA扫描叠加后，得到的质谱图见说明书附图1。从质谱图可以看出，吡蚜酮的免疫用半抗原的分子离子峰为EI-MS（positive）m/z：322.2 [M+H]⁺ ，表明成功合成了式（Ⅰ）所示的吡蚜酮免疫用半抗原。

实施例3 吡蚜酮包被用半抗原的合成

吡蚜酮包被用半抗原的制备方法，包括以下步骤：

1）按照实施例2的方法中S1~S4的步骤，制备得到中间体4；

2）向50ml干净单口瓶中依次加入3ml上述中间体4溶液和5.0ml甲醇，室温搅拌溶解，加入450mg对醛基苯甲酸，升高反应温度至70℃，搅拌，TLC监控中间体4基本反应完全，降至室温，搅拌，将反应体系置于冰浴下搅拌1h，过滤，滤饼用5ml冷甲醇洗涤，抽干，室温晾干，得浅黄色固体567mg，即吡蚜酮包被用半抗原。采用质谱法鉴定吡蚜酮包被用半抗原，对吡蚜酮包被用半抗原进行33次MCA扫描叠加后，得到的质谱图见说明书附图2。从质谱图可以看出，吡蚜酮包被用半抗原的分子离子峰为EI-MS（negative）m/z：259.3 [M-H]^- ，表明成功合成了式（Ⅱ）所示的吡蚜酮包被用半抗原。

实施例4 吡蚜酮免疫用抗原、包被用抗原的制备

利用实施例2制备的吡蚜酮免疫用半抗原、实施例3制备的吡蚜酮包被用半抗原分别制备吡蚜酮免疫用抗原和吡蚜酮包被用抗原。

具体地，取0.1mmol 吡蚜酮免疫用半抗原溶于2mLDMF中，搅拌加入0.2mmolEDC.HCl和0.15mmol NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），于4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后收集上清液为A液；称取140mg牛乳铁蛋白（LF）溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS（pH8.0）中，加入DMF1mL，搅拌溶解制备得到B液，在磁力搅拌下，将A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，得到的免疫用抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中，冻存于-20℃冰箱中，即吡蚜酮免疫用半抗原-LF偶联物。

采用同样的方法，用BSA代替牛乳铁蛋白，制备得到包被用抗原，即吡蚜酮包被用半抗原-BSA偶联物。

实施例5 吡蚜酮单克隆抗体的制备及纯化

使用实施例4中制备得到的吡蚜酮免疫用抗原，经鉴定后免疫10只8周龄BALB/C小鼠，加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用两倍剂量的吡蚜酮免疫用抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清IPMI1640培养基，1100r/min离心5min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中；将1mL 50%PEG-4000缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min后，前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基 1mL，后30s加入2mL，然后快速加入27mL终止融合过程，1100r/min离心5min，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，在37℃、体积分数5%的CO₂条件下培养，7天后换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备；

采用体内诱生腹水法生产吡蚜酮单克隆抗体。选4只经产昆明小鼠，腹腔注射液体石蜡油 0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞3-5×10⁶/只，10天后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水，用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，得到吡蚜酮单克隆抗体，经紫外法测定吡蚜酮单克隆抗体的含量。

实施例6 基于吡蚜酮单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线的建立

6.1 包被及封闭

用包被液（pH 9.6、0.1 mol/L碳酸盐缓冲液）将吡蚜酮包被用抗原稀释至50 ng/mL，37℃包被过夜，第二天用PBST（0.01M PBS，0.06% Tween-20(v/v)）洗两次后，加入2%的脱脂奶粉，每孔120μL 37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干60 min，用密封袋装于4℃待用。

6.2 标准曲线的建立

1）试验方法

将包好的酶标板，每孔加入一系列不同浓度（1.4ng/mL、4.1ng/mL、12.3ng/mL、37ng/mL、111 ng/mL、333 ng/mL、1000ng/mL）的50μL的吡蚜酮标准品和50μL浓度为2.0μg/mL吡蚜酮单克隆抗体，37°C孵育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的酶标二抗（羊抗鼠IgG -HRP），37℃孵育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入100 μLTMB底物液，37℃避光显色10 min；加入50μL终止液(2M H₂SO₄) 终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收光度值。以吡蚜酮标准品浓度对横坐标，B/B0（加入吡蚜酮的微孔的OD₄₅₀值/未加入吡蚜酮的微孔的OD₄₅₀值）为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

2）试验结果

基于吡蚜酮单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线图见图3。从图中可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，对吡蚜酮的最低检测限为0.1μg/mL、IC50值为10.5 ng/mL，检测灵敏度较高。

实施例7 吡蚜酮胶体金层析检测装置的制备

7.1 胶体金溶液的制备

用双蒸去离子水将质量分数1%的氯金酸溶液稀释成0.01%（质量分数），取100ml0.01%的氯金酸溶液置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.0 ml 1%柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，得到胶体金溶液，4℃保存。制备好的胶体金溶液外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物；

7.2 吡蚜酮单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金溶液的pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入20~60 μg吡蚜酮单克隆抗体的标准，向胶体金溶液中加入实施例4制备得到的吡蚜酮单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，静置10min后，加入10%牛血清白蛋白（BSA）溶液，使其在胶体金溶液中的体积百分含量为1%，静置10min。以12000rpm，在4℃条件下离心40min，弃上清液，用体积为初始胶体金溶液体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，制备得到吡蚜酮单克隆抗体-胶体金标记物，置于4℃保存备用；

复溶缓冲液：含体积百分含量0.3%~0.5%牛血清白蛋白、质量百分含量0.1%~0.3%吐温-20、质量百分含量3%~6%海藻糖，pH= 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液；

7.3微孔反应杯的制备

向微孔反应杯中加入100μL吡蚜酮单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥6h，即可取出，得到冻干有吡蚜酮单克隆抗体-胶体金标记物的微孔反应杯，密封保存，其中吡蚜酮单克隆抗体-胶体金标记物冻干量为0.20~0.50μg/ml；

7.4 样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白的0.02mol/L的磷酸盐缓冲液中浸泡2h，50℃烘干2h备用。0.02mol/L的磷酸盐缓冲液的pH为7.2，其中牛血清白蛋白的体积百分含量为1.0%；

7.5 反应膜的制备

包被过程：用磷酸缓冲液将吡蚜酮包被用抗原（吡蚜酮包被用半抗原-BSA偶联物）稀释到浓度为10mg/ml，用金标喷金点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区（T区），包被浓度为0.5 mg/ml；用浓度0. 01mol/L，pH= 7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗体浓度稀释到10mg/ml，用金标喷金点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区（C区），包被浓度为1.0mg/ml。将包被好的反应膜置于50℃条件下干燥6h，实验时选取显色亮、竞争性好的包被原作为生产备用。

7.6吡蚜酮胶体金层析检测装置的制备

7.6.1 试纸条的组装

将样品吸收垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在底板上，其中，底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，吸水垫为吸水滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜。样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐。

7.6.2 吡蚜酮胶体金层析检测试纸盒的组装

将上述步骤7.6.1得到的试纸条与上述步骤7.3得到的微孔反应杯组装成试纸盒，在2-8℃的环境中贮存，有效期12个月。

实施例8 一种快速检测农产品中吡蚜酮的方法

8.1 样品提取液的配制

称取0.085M的四硼酸钠溶解到水中，定容至1L，充分溶解后用HCl调pH至8.2即可。

8.2 样品前处理

称取2.0g±0.01g均质的农产品至50mL聚苯乙稀离心管中，加入上述样品提取液8mL，盖上盖子，涡旋混合器混匀或手动上下振荡混匀30 s，静置分层或4000 r/min离心1min，取上清液为待测液。

8.3 测定步骤

吸取200 μL上述待测液于微孔反应杯中，上下抽吸5~10次使混合均匀。室温温育3min，将试纸条插入到反应杯中，室温温育3min，取出试纸条，轻轻刮去试纸条下端的样品垫，并进行结果判读。

8.4 结果判定

通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。

阳性：当质控区（C）显示出条带，检测区（T）不显色，判为阳性，即农产品中有吡蚜酮，用“ + ”表示；

阴性：当质控区和检测区均显示出条带，判为阴性，即农产品中没有吡蚜酮或农产品中的吡蚜酮含量低于检出限，用“-”表示；

无效：当质控区（C）不显示条带，试纸失效。

实施例9 吡蚜酮胶体金层析检测装置的灵敏度和假阴性率

选取经SN/T 3860-2014 《出口食品中吡蚜酮残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》测试不含吡蚜酮的洋葱、甘蓝和番茄作为空白样品，以GB 2763-2021中规定洋葱、甘蓝和番茄的最高残留限量（MRL）0.5 mg/kg，0.2 mg/kg和0.2mg/kg，为关注浓度。添加水平为1倍关注浓度、2倍关注浓度，考察灵敏度和假阴性率。两个添加浓度水平的样品，每个浓度水平各50份试样，按实施例8中检测方法进行检测，检测结果见下表1。

表1 吡蚜酮胶体金层析检测装置的灵敏度和假阴性率检测结果

由表1可知，本实施例中的检测方法对农产品中吡蚜酮的检测灵敏度≥95%，假阴性率为≤5%。

实施例10 吡蚜酮胶体金层析检测装置的特异性和假阳性

选用洋葱、甘蓝和番茄的空白样品，采用空白基质加标的方式，制备成2个浓度水平（0.5倍关注浓度、空白基质）的样品各50份。采用实施例8中检测方法对样品进行检测，检测结果见下表2。

表2 吡蚜酮胶体金层析检测装置的特异性和假阳性检测结果

由表2可知，本实施例中的检测方法的特异性≥90%，假阳性率为≤10%。上述结果表明本发明的吡蚜酮的胶体金层析检测装置具有良好的特异性，能够准确地检测出农产品中含有的吡蚜酮，因此可以对农产品中的吡蚜酮进行快速检测。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.吡蚜酮的免疫用半抗原，其特征在于，其结构如式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）。

2.制备权利要求1所述的吡蚜酮的免疫用半抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 三光气与乙酰肼在碱性条件下发生成环反应，得到中间体1：

；

S2. 将丙酮和液溴在冰浴下反应，生成溴代丙酮，将溴代丙酮与所述中间体1在60℃条件下反应，得到中间体2：

；

S3. 将所述中间体2用甲醇溶解后，加热至回流，滴加水合肼，滴毕，升浴温至80℃，搅拌至TLC监控所述中间体2基本反应完全，得到中间体3：

；

S4. 将所述中间体3溶于甲醇，室温搅拌滴入浓盐酸，滴毕后升高反应温度至70℃，搅拌水解，水解完成后，加入10%氢氧化钠溶液调节pH值至中性，得到中间体4：

；

S5. 将6-氯烟醛溶于DMSO，室温搅拌，再依次加入氢氧化钾和3-巯基丙酸，加热至100℃，搅拌反应1-2h，降温至室温，搅拌，过柱层析，纯化后得到中间体5：

；

S6. 向所述中间体4中，滴入所述中间体5的甲醇溶液，室温搅拌6h，过滤，滤饼用5ml甲醇洗涤，抽干，室温晾干，得淡黄色固体，即吡蚜酮的免疫用半抗原：

。

3.吡蚜酮的包被用半抗原，其特征在于，其结构如式（Ⅱ）所示：

（Ⅱ）。

4.制备权利要求3所述的吡蚜酮包被用半抗原的方法，其特征在于，包括以下：

1）按照权利要求2所述的制备吡蚜酮免疫用半抗原的方法中S1~S4的步骤，制备得到中间体4；

2）向所述中间体4中加入甲醇溶解的对醛基苯甲酸，室温搅拌，反应变黄色浑浊，升高反应温度至70℃，搅拌，TLC监控所述中间体4基本反应完全，降至室温，搅拌过滤，滤饼用5ml冷甲醇洗涤，抽干，室温晾干，得浅黄色固体，即吡蚜酮包被用半抗原，

。

5.吡蚜酮免疫用抗原，其特征在于，所述吡蚜酮免疫用抗原为权利要求1所述的吡蚜酮免疫用半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。

6.吡蚜酮包被用抗原，其特征在于，所述吡蚜酮包被用抗原为权利要求3所述的吡蚜酮包被用半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。

7.吡蚜酮抗体，其特征在于，所述吡蚜酮抗体是由权利要求5所述的吡蚜酮免疫用抗原经动物免疫制备得到，所述吡蚜酮抗体为吡蚜酮单克隆抗体。

8.权利要求1所述的吡蚜酮免疫用半抗原、权利要求3所述的吡蚜酮包被用半抗原、权利要求5所述的吡蚜酮免疫用抗原、权利要求6所述的吡蚜酮包被用抗原在吡蚜酮的免疫学检测中的应用。

9.吡蚜酮胶体金层析检测装置，其特征在于，所述检测装置包括试纸条和工作液，其中所述试纸条中的检测线包被有如权利要求6所述的吡蚜酮包被用抗原；所述工作液中包含有胶体金标记的权利要求7所述的吡蚜酮抗体。

10.一种快速检测农产品中吡蚜酮的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求9所述的吡蚜酮胶体金层析检测装置对农产品中的吡蚜酮进行检测。

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