CN114685387B - 粉唑醇半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用 - Google Patents

粉唑醇半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了粉唑醇半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用，涉及粉唑醇半抗原、粉唑醇抗原、粉唑醇抗体和粉唑醇胶体金层析检测装置及其制备和检测粉唑醇的应用。本发明应用免疫学检测方法，对样品中残留的粉唑醇进行专属检测，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测等优点，能更好的满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要，为相关执法部门快速检测蔬菜、水果中是否残留粉唑醇提供技术支持。

Description

粉唑醇半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用
技术领域
本发明涉及食品安全的免疫学检测技术领域，更具体地，本发明涉及粉唑醇半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用，其检测装置特别适用于蔬菜、水果中粉唑醇残留的快速检测。
背景技术
作为一种低毒、高效杀虫剂，粉唑醇应用广泛，可有效防治粮、棉、果、蔬等作物上的多种害虫。粉唑醇虽然属于低毒杀虫剂，但是使用不当也会造成作物中残留量过高，从而对人体健康造成危害。研究证实，粉唑醇在单一高剂量口服情况下，可导致人体出现痉挛、颤抖和动作不协调等诸多症状。
国内外已报道了粉唑醇在水稻、甘蓝、豇豆和棉花等作物上的残留分析和安全性评价研究，前处理大多采用丙酮、甲醇、石油醚等试剂提取，液液萃取或固相萃取柱净化，相对来说前处理比较繁琐，主要由气相色谱仪（ECD检测器）或液相色谱仪（PDA检测器）进行检测，但过程较复杂，成本较高，很难达到快速检测的目的，不适用于现场快速检测，不能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供了粉唑醇半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用。
根据本发明的一个方面，提供了粉唑醇半抗原，其结构如下所示：
Figure 646195DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）。
根据本发明的另一个方面，制备粉唑醇半抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 二甲硫醚、浓硫酸、甲醇反应后，得到第一反应液；
S2. 向第一反应液中加入2，4-二氟苯酮、叔丁醇、氢氧化钾颗粒，反应，得到第二反应液，对第二反应液进行萃取，洗涤，干燥，过滤后将滤液减压浓缩，得到第一中间体，第一中间体的结构式如式（Ⅱ）所示：
Figure 983636DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅱ）；
S3. 用DMF溶解三氮唑甲酸甲酯，加入60%钠氢，滴入第一中间体的DMF溶液，反应后，浓缩蒸干，加入纯化水萃取，洗涤，浓缩，过柱纯化，得到第二中间体，第二中间体的结构式如式（Ⅲ）所示：
Figure 689424DEST_PATH_IMAGE003
（Ⅲ）；
S4. 加入第二中间体、氢氧化钠、甲醇水溶液，反应后蒸干甲醇，保留水层，调节pH到4~5，萃取，合并有机相，洗涤，干燥，过滤、减压蒸干，得到粉唑醇半抗原，其结构如式（Ⅰ）所示，甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为2:1。
在一些实施方式中，步骤S1中二甲硫醚与浓硫酸、甲醇的摩尔比为1:（0.5-1.5）:（0.2-1），步骤S2中2，4-二氟苯酮与氢氧化钾的摩尔比为1:（5-10）。
在一些实施方式中，步骤S3中第一中间体与三氮唑甲酸甲酯、60%钠氢的摩尔比为1:（1-3）：（1-3），步骤S4中第二中间体与氢氧化钠的摩尔比为1:（1-3）。
根据本发明的再一个方面，提供了粉唑醇抗原，包含粉唑醇半抗原以及与粉唑醇半抗原偶联的载体蛋白，载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白中的一种。
根据本发明的第四个方面，提供了粉唑醇抗体，是由粉唑醇抗原经动物免疫制备得到，粉唑醇抗体为粉唑醇单克隆抗体。
根据本发明的第五个方面，提供了粉唑醇半抗原、粉唑醇抗原、粉唑醇抗体在粉唑醇的免疫学检测中的应用。
根据本发明的第六个方面，提供了粉唑醇胶体金层析检测装置，检测装置包括试纸条和微孔反应杯，试纸条包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫和底板，反应膜设有检测线和质控线，检测线包被有粉唑醇抗原，质控线包被有羊抗鼠抗体，微孔反应杯中含有胶体金标记的粉唑醇抗体。
根据本发明的第七个方面，提供了一种检测样品中粉唑醇残留的方法，该方法为使用粉唑醇胶体金层析检测装置对样品中的粉唑醇进行检测，该方法包括以下步骤：
1）样品前处理；
2）用粉唑醇胶体金层析检测装置进行检测；
3）分析检测结果。
在一些实施方式中，样品为蔬菜或水果。
本发明的有益效果：本发明提供的粉唑醇半抗原的制备方法，使用的化学试剂容易得到、操作过程简单、合成步骤简洁有效、反应产率较高、并且检测成本较低。本发明利用层析式免疫胶体金原理，通过检测卡中检测线与质控线之间的比色来定性检测样本中是否残留有粉唑醇，应用时不需要使用液相色谱或质谱等大型仪器，达到快速检测的目的。本发明应用免疫学检测方法，对样品中残留的粉唑醇进行专属检测，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测等优点，能更好的满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要，为相关执法部门快速检测蔬菜或水果中是否残留粉唑醇提供技术支持。
附图说明
图1为本发明的一种实施方案的粉唑醇半抗原的质谱图。
图2为本发明的一种实施方案的粉唑醇半抗原的合成流程图。
图3为本发明的一种实施方案的粉唑醇胶体金层析检测装置的试纸条的结构示意图。
图4为本发明的一种实施方案的粉唑醇胶体金层析检测装置的微孔反应杯的结构示意图。
图5为本发明的一种实施方案的粉唑醇胶体金层析检测装置的结果判定示意图。
图6为本发明的一种实施方案的载体蛋白、粉唑醇半抗原、粉唑醇半抗原-BSA偶联物、粉唑醇半抗原-OVA偶联物的吸收曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场可购买的原料、试剂。
实施例1
本实施例中二甲硫醚选择国药集团化学试剂有限公司供应的99%的二甲基硫醚，浓硫酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的95%~98%的硫酸，甲醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯甲醇，叔丁醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯叔丁醇，氢氧化钾选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氢氧化钾，无水硫酸钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的99%的无水硫酸钠，60%钠氢选择国药集团化学试剂有限公司供应的60%的氢化钠，氢氧化钠选择选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氢氧化钠，以下实施例2-10均采用本实施例1中的试剂。
实施例2 粉唑醇半抗原的合成与鉴定
粉唑醇半抗原的制备方法，包括以下步骤：
S1. 向反应容器中加入二甲硫醚，在5℃条件下，依次缓慢滴入浓硫酸、甲醇，室温反应4.5h后，得到第一反应液，其中二甲硫醚与浓硫酸、甲醇的摩尔比为1:（0.5-1.5）:（0.2-1）；
S2. 向第一反应液中加入2，4-二氟苯酮，再加入叔丁醇助溶，分批加入氢氧化钾颗粒，2，4-二氟苯酮与氢氧化钾的摩尔比为1:（5-10），在45℃条件下反应过夜，得到第二反应液，将第二反应液倒入纯化水中，加入乙酸酸乙酯萃取3次，饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥处理，过滤后将滤液减压浓缩，得到无色油状物，即为第一中间体，第一中间体的结构式如式（Ⅱ）所示：
Figure 86907DEST_PATH_IMAGE004
（Ⅱ）；
S3. 向干净单口瓶中加入三氮唑甲酸甲酯，用适量DMF溶解，加入60%钠氢，搅拌下滴入第一中间体的DMF溶液，第一中间体与三氮唑甲酸甲酯、60%钠氢的摩尔比为1:（1-3）：（1-3），在80℃条件下反应过夜，反应停止后，浓缩蒸干溶剂，加入纯化水，加入乙酸乙酯萃取3次，饱和食盐水洗涤2次，浓缩，过柱纯化，得到无色油状产物，即为第二中间体，第二中间体的结构式如式（Ⅲ）所示：
Figure 878146DEST_PATH_IMAGE005
（Ⅲ）；
S4. 向干净敞口瓶加入第二中间体、氢氧化钠，第二中间体与NaOH的摩尔比为1:（1-3），加入甲醇水溶液溶清，甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为2:1，在40℃条件下反应5h，蒸干甲醇，保留水层，加入6M盐酸溶液调节水层pH到4~5，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，再用饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥，过滤、减压蒸干溶剂，得到粉唑醇半抗原，其结构如式（Ⅰ）所示。
采用质谱法鉴定粉唑醇半抗原，所得到的质谱图见说明书附图图1。从质谱图可以看出，粉唑醇半抗原的分子离子峰为m/z 343.97[M-H]-，689[2M-H]-且为最高峰，其与该粉唑醇半抗原的分子量345.09相符，表明成功合成了式（Ⅰ）所示的粉唑醇半抗原。
实施例3 粉唑醇免疫用抗原、包被用抗原的制备与鉴定
3.1 粉唑醇免疫用抗原的制备：称量实施例2中制备得到的粉唑醇半抗原30mg，溶于2ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入18mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）、26mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC.HCl），室温反应6h，制备得到活化液；60mg牛血清白蛋白（BSA）溶于2ml 0.05M pH9.0的硼酸缓冲液，加入1ml DMF，0.5ml上述活化液，室温反应4h后用PBS（0.02 mol/L，pH =7.4的磷酸盐缓冲液）透析，每4 h换液1次，换液7~ 8 次，透析后4000转/min离心5min，取上清液，得到粉唑醇半抗原-BSA偶联物，即为粉唑醇免疫用抗原，分装，于-20℃保存。
3.2 粉唑醇包被用抗原的制备：称取10 mg实施例2中制备得到的粉唑醇半抗原溶于1ml无水N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，然后按顺序依次加入3μl二异丙基乙胺和5μl氯甲酸异丁酯，0 ℃反应30 min，制备得到A液；将70 mg鸡卵清白蛋白（OVA），0.1M硼酸缓冲液7 ml溶解，得到B液；将A液滴加到B液中，室温反应4h后用PBS（0.02 mol/L，pH =7.4的磷酸盐缓冲液）透析，每4 h换液1次，换液7~ 8 次，透析后4000转/min离心5min，取上清液，得到粉唑醇半抗原- OVA偶联物，即为粉唑醇包被用抗原，分装，于-20℃保存。
3.3 鉴定：将载体蛋白、粉唑醇半抗原、粉唑醇半抗原-BSA偶联物、粉唑醇半抗原-OVA偶联物，用pH=7. 4，0.01 mol/L的PBS缓冲液配成0.5mg/mL的溶液，以pH=7. 4，0.01mol/L的PBS缓冲溶液调零，用紫外分光光度计在波长200~400nm范围内扫描，得到载体蛋白、粉唑醇半抗原、粉唑醇半抗原-BSA偶联物、粉唑醇半抗原-OVA偶联物的吸收曲线图，见说明书附图图6。
实施例4 粉唑醇单克隆抗体的制备及纯化
4.1动物免疫
选择健康的6~8周龄BALB/c小鼠进行免疫，将实施例3中制备得到的粉唑醇免疫用抗原与弗氏完全佐剂等量混合乳化后，对Balb/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为150 μg/只；时隔4周后进行加强免疫，剂量为75μg/只，用不完全弗氏佐剂混合乳化，之后多次的加强免疫时间间隔3周；冲刺免疫时剂量再减半，为37.5μg/只，完全抗原用生理盐水稀释，对小鼠进行腹腔注射，小鼠第三次免疫后可进行断尾采血检测，通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测小鼠血清的效价和IC50，选择效价高、IC50低的小鼠进行融合。
4.2 细胞融合和克隆化
取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按9：1的数量比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌粉唑醇单克隆抗体的粉唑醇单克隆杂交瘤细胞株。
4.3 细胞冻存和复苏
将粉唑醇单克隆杂交瘤细胞用冻存液制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
4.4 单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将粉唑醇单克隆杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到粉唑醇单克隆抗体，-20℃保存。其中，细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清在细胞培养基中的质量百分含量为15～20%，碳酸氢钠在细胞培养基中的质量百分含量为0.1～0.2%，细胞培养基的pH为7.4。
实施例5 羊抗鼠抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗体。
实施例6 粉唑醇胶体金层析检测装置的制备
该粉唑醇胶体金层析检测装置的制备方法主要包括以下步骤：
1）制备冻干有粉唑醇单克隆抗体−胶体金标记物的微孔反应杯；
2）制备具有包被有粉唑醇半抗原−载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线的反应膜；
3）将2）制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、底板组装成试纸；
4）将1）和3）制备好的冻干有粉唑醇单克隆抗体−胶体金标记物的微孔反应杯和试纸组装。
下面分步详细叙述：
6.1粉唑醇单克隆抗体−胶体金标记物的制备
（1）胶体金溶液的制备
用双蒸去离子水将质量分数1%的氯金酸溶液稀释成0.01%（质量分数），取100ml0.01%的氯金酸溶液置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5 ml 1%柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，得到胶体金溶液，4℃保存。制备好的胶体金溶液外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，在日光下观察颜色为酒红色。
（2）粉唑醇单克隆抗体−胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入20~60μg粉唑醇单克隆抗体的标准，向胶体金溶液中加入实施例4制备得到的粉唑醇单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，静置10min后，加入10%牛血清白蛋白（BSA）溶液，使其在胶体金溶液中的体积百分含量为1%，静置10min。以12000rpm，在4℃条件下离心40min，弃上清液，用体积为初始胶体金溶液体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，制备得到粉唑醇单克隆抗体-胶体金标记物，置于4℃保存备用。
复溶缓冲液：含体积百分含量0.1 %~0.3 %牛血清白蛋白、质量百分含量0.1%~0.2%吐温-20、质量百分含量3%~6%海藻糖，pH= 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
6.2 微孔反应杯的制备
向微孔反应杯中加入100μl粉唑醇单克隆抗体−胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥6h，即可取出，得到冻干有粉唑醇单克隆抗体−胶体金标记物的微孔反应杯，密封保存，粉唑醇单克隆抗体−胶体金标记物冻干量为0.20~0.50μg/mL。
6.3 样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘干2h备用。0.02mol/L的磷酸盐缓冲液的pH为7.2，其中牛血清白蛋白的体积百分含量为0.5%。
6.4 反应膜的制备
将粉唑醇包被用抗原（即粉唑醇半抗原−鸡卵清白蛋白偶联物）包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗体包被在反应膜上构成质控线。
包被过程：用磷酸缓冲液将粉唑醇包被用抗原稀释到浓度为1mg/ml，用金标喷金点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区（T区），包被浓度为0.5 mg/mL；用浓度0.01mol/L，pH= 7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗体浓度稀释到200μg/mL，用金标喷金点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区（C区），包被浓度为0.5 mg/mL。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥6h，作为生产备用。
6.5 粉唑醇胶体金层析检测装置的制备
（1）试纸条的组装
将样品吸收垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在底板上，其中，底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，吸水垫为吸水滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜。样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐。微孔反应杯上具有微孔塞。
（2）粉唑醇胶体金层析检测试纸盒的组装
将上述步骤（1）得到的试纸条与微孔反应杯组装成试纸盒，在2～8℃的环境中贮存，有效期12个月。
实施例7 一种检测样品中粉唑醇残留的方法
7.1 样本提取液的配制
准确称取氯化钠9 g、十二水合磷酸氢二钠6 g、二水合磷酸二氢钠0.4 g，用水溶解并定容至100 ml，即为样品提取液，样品提取液为0.1 mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH值为8.0。
7.2 样品前处理
准确称取制备好的蔬菜试样2 g（精确至0.01 g）至15 ml离心管中，加入8 ml样品提取液，盖上盖子，涡旋混合器混匀或手动上下振荡混匀30 s，静置分层或4000 r/min离心1 min，取上清液为待测液。
7.3 测定步骤
吸取200 μl上述待测液于微孔反应杯中，上下抽吸5~10次使混合均匀。室温温育3min，将试纸条插入到反应杯中，室温温育3min，取出试纸条，轻轻刮去试纸条下端的样品垫，并进行结果判读。
7.4 结果判定
通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。
阳性：当质控区（C）显示出条带，检测区（T）不显色，判为阳性，即样品中有粉唑醇，用“ + ”表示；
阴性：当质控区和检测区均显示出条带，判为阴性，即样品中没有粉唑醇，用“-”表示；
无效：当质控区（C）不显示条带，试纸失效，具体如说明书附图图5所示。
实施例8 粉唑醇胶体金层析检测装置的灵敏度和假阴性率试验
选取经GB/T 20769-2008《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》测试的不含粉唑醇的黄瓜、番茄和李子作为空白样品，依据GB2763-2021中规定黄瓜、番茄和李子最大残留限量(MRL)分别为0.3 mg/kg，0.8 mg/kg和0.4mg/kg，设定黄瓜的方法检出限为0.3 mg/kg，李子的方法检出限为0.4 mg/kg，番茄的方法检出限为0.8 mg/kg，即关注浓度。添加水平为1倍关注浓度、2倍关注浓度，考察灵敏度和假阴性率。两个添加浓度水平的样品，每个浓度水平各50 份试样，按实施例7中检测方法进行检测。检测结果见下表1。
表1 粉唑醇胶体金层析检测装置的灵敏度和假阴性率检测结果
Figure 22207DEST_PATH_IMAGE006
本实施例中的检测方法对样品中粉唑醇残留的灵敏度≥95%，假阴性率为≤5%。
实施例9 粉唑醇胶体金层析检测装置的特异性和假阳性
选用黄瓜、番茄和李子样品，采用空白基质加标的方式，制备成2个浓度水平（0.5倍检测限、空白基质）的样品各50份。采用实施例7中检测方法对样品进行检测，检测结果见下表2。
表2 粉唑醇胶体金层析检测装置的特异性和假阳性检测结果
Figure 582501DEST_PATH_IMAGE007
由表2可知，本实施例中的检测方法的特异性≥90%，假阳性率为≤10%。上述结果表明本发明的检测粉唑醇的试纸盒具有良好的特异性，能够准确地检测出蔬菜、水果样品中的粉唑醇，因此可以对蔬菜、水果样品中的粉唑醇残留进行快速检测。
实施例10 粉唑醇胶体金层析检测装置的保质期测定
用三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境保持，间隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性，0.15 mg/kg，0.3 mg/kg和0.6 mg/kg样品，重复三次，观察产品显色变化，考察保质期时间。
阴性显色从13个月开始下降，这表明在1年时间内产品的品质无明显变化，因此确定保质期为1年。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.粉唑醇半抗原，其特征在于，其结构如式（Ⅰ）所示：
Figure 495690DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）。
2.制备权利要求1所述的粉唑醇半抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 二甲硫醚、浓硫酸、甲醇反应后，得到第一反应液；
S2. 向所述第一反应液中加入2,4’-二氟苯酮、叔丁醇、氢氧化钾颗粒，反应，得到第二反应液，对所述第二反应液进行萃取，洗涤，干燥，过滤后将滤液减压浓缩，得到第一中间体，所述第一中间体的结构式如式（Ⅱ）所示：
Figure 718860DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅱ）；
S3. 用DMF溶解1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯，加入60%钠氢，滴入所述第一中间体的DMF溶液，反应后，浓缩蒸干，加入纯化水萃取，洗涤，浓缩，过柱纯化，得到第二中间体，所述第二中间体的结构式如式（Ⅲ）所示：
Figure 924714DEST_PATH_IMAGE003
（Ⅲ）；
S4. 加入所述第二中间体、氢氧化钠、甲醇水溶液，反应后蒸干甲醇，保留水层，调节pH到4~5，萃取，合并有机相，洗涤，干燥，过滤、减压蒸干，得到粉唑醇半抗原，其结构如式（Ⅰ）所示，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为2:1。
3.根据权利要求2所述的制备权利要求1所述的粉唑醇半抗原的方法，其特征在于，所述步骤S1中二甲硫醚与浓硫酸、甲醇的摩尔比为1:（0.5-1.5）:（0.2-1），所述步骤S2中2,4’-二氟苯酮与氢氧化钾的摩尔比为1:（5-10）。
4.根据权利要求2所述的制备权利要求1所述的粉唑醇半抗原的方法，其特征在于，所述步骤S3中第一中间体与1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯、60%钠氢的摩尔比为1:（1-3）：（1-3），所述步骤S4中第二中间体与氢氧化钠的摩尔比为1:（1-3）。
5.粉唑醇抗原，其特征在于，所述粉唑醇抗原为权利要求1所述的粉唑醇半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白中的一种。
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