CN115215811B - 丙硫菌唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用 - Google Patents

丙硫菌唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了丙硫菌唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用，涉及丙硫菌唑的半抗原、抗原、抗体、胶体金层析检测装置及其制备和检测丙硫菌唑的应用。本发明提供的检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、保质期长等优点。本发明提供由丙硫菌唑半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物后使其机体产生的特异性针对丙硫菌唑的抗体，其效价高，对丙硫菌唑的最低检测限为0.1μg/mL、IC50值为12.5 ng/mL，符合GB 2763‑2021《食品安全国家标准食品中最大农药残留限量》丙硫菌唑的限量规定。因此，本发明可应用于对蔬菜、水果中丙硫菌唑的残留含量的快速检测。

Description

丙硫菌唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测的免疫学检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种丙硫菌唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和在免疫学检测中的应用。
背景技术
免疫学检测分析方法是一种以抗原抗体的特异性识别、可逆性结合反应为基础的分析方法，具有灵敏度高、特异性高、对仪器的要求不高、快速、操作简便、成本低等优点。然而，建立免疫学检测分析技术并将其应用于检测蔬菜、水果中的丙硫菌唑，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是设计并合成出合适的丙硫菌唑半抗原。但是，目前尚未有关于丙硫菌唑半抗原合成的相关报道。
因此，亟需设计和开发出一种合适的丙硫菌唑半抗原，并由此建立相应的丙硫菌唑快速检测方法，实现通过免疫学方法来快速检测蔬菜、水果中的丙硫菌唑。
发明内容
本发明的目的在于提供了丙硫菌唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用。
根据本发明的一个方面，提供了丙硫菌唑的半抗原，其结构如式（Ⅰ）所示：
Figure 329795DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ），其中，n为-CH2基团的数目，n选自1~5的整数。
根据本发明的另一个方面，提供了制备丙硫菌唑的半抗原的方法，包括以下步骤：
S1. 将丙硫菌唑与卤代酯发生反应，得到第一中间体，第一中间体的结构式如式（Ⅱ）所示：
Figure 683416DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅱ）；
其中，n为-CH2基团的数目，n选自1~5的整数；
R为甲基、乙基、丙基或叔丁基；
S2，第一中间体与氢氧化锂发生碱性水解反应，得到丙硫菌唑半抗原，其结构式如式（Ⅰ）所示。
在一些实施方式中，步骤S1中丙硫菌唑与卤代酯的摩尔比为1:（1-2），卤代酯中的卤代原子为F、Cl、Br或I，所述卤代酯为6-卤代己酸甲酯、6-卤代己酸乙酯、6-卤代己酸丙酯、6-卤代己酸叔丁酯、5-卤代戊酸甲酯、5-卤代戊酸乙酯、5-卤代戊酸丙酯、5-卤代戊酸叔丁酯、4-卤代丁酸甲酯、4-卤代丁酸乙酯、4-卤代丁酸丙酯、4-卤代丁酸叔丁酯、3-卤代丙酸甲酯、3-卤代丙酸乙酯、3-卤代丙酸丙酯、3-卤代丙酸叔丁酯、2-卤代乙酸甲酯、2-卤代乙酸乙酯、2-卤代乙酸丙酯或2-卤代乙酸叔丁酯中的一种。
在一些实施方式中，步骤S2中第一中间体与氢氧化锂的摩尔比为1:（3-7）。
根据本发明的再一个方面，提供了丙硫菌唑抗原，丙硫菌唑抗原为丙硫菌唑的半抗原与载体蛋白的偶联物，载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
根据本发明的第四个方面，提供了丙硫菌唑抗体，是由丙硫菌唑抗原经动物免疫制备得到，丙硫菌唑抗体为丙硫菌唑单克隆抗体。
根据本发明的第五个方面，提供了丙硫菌唑半抗原、丙硫菌唑抗原在丙硫菌唑的免疫学检测中的应用。
根据本发明的第六个方面，提供了丙硫菌唑抗体在丙硫菌唑的免疫学检测中的应用。
根据本发明的第七个方面，提供了丙硫菌唑胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，试纸条包括反应膜，反应膜设有检测区和质控区，检测区包被有丙硫菌唑抗原，反应杯中含有胶体金标记的丙硫菌唑抗体。
根据本发明的第八个方面，提供了一种检测样品中丙硫菌唑的方法，该方法为使用丙硫菌唑胶体金层析检测装置对样品中的丙硫菌唑进行检测，其中样品为蔬菜或水果。
本发明的有益效果：本发明提供的丙硫菌唑半抗原的制备方法，使用的化学试剂容易得到、操作过程简单、合成步骤简洁有效、反应产率较高、并且检测成本较低。本发明利用层析式免疫胶体金原理，通过试纸条中检测线与质控线之间的比色来定性检测样品中丙硫菌唑的含量，应用时不需要使用液相色谱或质谱等大型仪器，达到快速检测的目的。与现有技术相比，本发明提供的检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、保质期长等优点。本发明提供由丙硫菌唑半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物后使其机体产生的特异性针对抗丙硫菌唑的抗体，效价高，对丙硫菌唑的最低检测限为0.1 μg/mL、IC50值为12.5 ng/mL，符合最新颁布的国家标准GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中最大农药残留限量》丙硫菌唑的限量规定。因此，本发明可应用于对蔬菜、水果中丙硫菌唑的残留含量的快速检测。
附图说明
图1为本发明的一种实施方案的丙硫菌唑半抗原的质谱图。
图2为本发明的一种实施方案的丙硫菌唑半抗原的合成流程图。
图3为本发明的一种实施方案的丙硫菌唑单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图。
图4为本发明的一种实施方案的丙硫菌唑胶体金层析检测装置的试纸条的剖面结构示意图。
图5为本发明的一种实施方案的丙硫菌唑胶体金层析检测装置的微孔反应杯的结构示意图。
图6为本发明的一种实施方案的丙硫菌唑胶体金层析检测装置的结果判定示意图。
图7为本发明的一种实施方案的载体蛋白、丙硫菌唑半抗原、丙硫菌唑免疫用抗原、丙硫菌唑包被用抗原的吸收曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，提供了一种丙硫菌唑半抗原，其结构如下所示：
Figure 356974DEST_PATH_IMAGE003
（Ⅰ），
其中，n为-CH2基团的数目，n选自1~5的整数。
如本领域技术人员所理解的，所谓半抗原，是指这样的一类小分子物质：其单独存在时并不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，从而诱导免疫应答。这类小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，即免疫反应性，但是不具有免疫原性。
具体到本发明，容易理解，丙硫菌唑半抗原针对丙硫菌唑抗体（单抗隆抗体或多克隆抗体均可）具有免疫反应性，但是不具备免疫原性。换言之，丙硫菌唑半抗原可以与其相对应的丙硫菌唑抗体结合发生抗原-抗体反应；然而，在将该丙硫菌唑半抗原接种到动物体内进行免疫时，不能单独刺激动物产生相应的抗体。
然而，由于丙硫菌唑小分子（如下式（Ⅳ）所示，CAS号：178928-70-6）上没有可以直接与载体偶联的活性基团，因此需先在丙硫菌唑小分子上的适当位置进行适当的化学修饰，以引入合适的连接臂和与载体蛋白偶联的活性基团。目前，尚未有关于制备丙硫菌唑半抗原的相关报道。
Figure 87033DEST_PATH_IMAGE004
（Ⅳ）。
因此，根据本发明的第二方面，本发明提供了制备丙硫菌唑半抗原的方法，包括以下步骤：
S1，将丙硫菌唑与卤代酯发生反应，得到第一中间体；
S2，第一中间体与氢氧化锂发生碱性水解反应，得到丙硫菌唑半抗原。
在上述制备方法中，具体的反应过程见图2。
在一些实施方式中，步骤S1中丙硫菌唑与卤代酯的摩尔比为1:（1-2），卤代原子为F、Cl、Br或I，卤代酯为6-卤代己酸甲酯、6-卤代己酸乙酯、6-卤代己酸丙酯、6-卤代己酸叔丁酯、5-卤代戊酸甲酯、5-卤代戊酸乙酯、5-卤代戊酸丙酯、5-卤代戊酸叔丁酯、4-卤代丁酸甲酯、4-卤代丁酸乙酯、4-卤代丁酸丙酯、4-卤代丁酸叔丁酯、3-卤代丙酸甲酯、3-卤代丙酸乙酯、3-卤代丙酸丙酯、3-卤代丙酸叔丁酯、2-卤代乙酸甲酯、2-卤代乙酸乙酯、2-卤代乙酸丙酯或2-卤代乙酸叔丁酯。
如本领域技术人员所理解的，本发明所提及的“卤代”是指氢原子被卤素原子诸如F、Cl、Br、I取代。具体地，“4-卤代丁酸甲酯”是指丁酸甲酯的4位上的氢原子被卤素原子诸如F、Cl、Br或I取代后得到的化合物。
在一些实施方式中，步骤S2中第一中间体与氢氧化锂的摩尔比为1:（3-7）。
本发明所制备的丙硫菌唑半抗原在保留丙硫菌唑基本结构的基础上引入连接臂结构和用于偶联大分子的活性基团，这样既有利于其与大分子偶联，又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量较小的丙硫菌唑基本结构，避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别。
在制备丙硫菌唑半抗原的方法中，通过多步合成来制备丙硫菌唑半抗原，所制备的丙硫菌唑半抗原最大程度地保留了丙硫菌唑分子的特征结构，增强了丙硫菌唑半抗原的免疫性，并且同时通过进行适当的化学修饰引入了与载体蛋白偶联的活性基团-羧基，将合成的半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，利用人工抗原免疫动物获得抗体，为后续建立丙硫菌唑的各种免疫分析方法提供原材料。
如上所述，丙硫菌唑半抗原仅具有免疫反应性，而不具有免疫原性，并不能单独地刺激动物产生相应的抗体。因此，为了赋予丙硫菌唑半抗原以免疫原性，需要将丙硫菌唑半抗原与大分子蛋白质等载体偶联、结合或者交联在一起，由此产生既具有免疫反应性又具有免疫原性的丙硫菌唑抗原。
因此，根据本发明的第三方面，本发明提供了一种丙硫菌唑抗原，丙硫菌唑抗原为丙硫菌唑的半抗原与载体蛋白的偶联物。
本发明所提及的术语“载体蛋白”是任何能够与半抗原偶联、结合或者交联并由此产生既具有免疫原性又具有免疫反应性的物质，包括例如大分子蛋白质或者非抗原性的多聚赖氨酸等。作为示例，可以使用的载体蛋白包括，但不限于，大分子蛋白质，例如牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、鸡卵清白蛋白（OVA）、血蓝蛋白（KLH）。
抗原在进入机体后，刺激B细胞，诱导细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。具体到本发明，利用本发明的丙硫菌唑半抗原与载体蛋白偶联后得到的丙硫菌唑抗原去免疫动物，刺激动物免疫应答，从而可以产生特异性更强、灵敏度更高的抗体。
因此，根据本发明的第四方面，提供了一种丙硫菌唑抗体，该丙硫菌唑抗体由丙硫菌唑抗原经动物免疫制备得到，为特异性针对本发明第三方面提供的丙硫菌唑抗原的抗体。
丙硫菌唑抗体可以为单克隆抗体或者多克隆抗体。另外，可以采用本领域普通技术人员已知的方法来制备丙硫菌唑抗体。例如，在丙硫菌唑抗体为多克隆抗体的情况下，可以通过采用丙硫菌唑抗原免疫接种哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物（不包括人类）等，随后分离血清获得。在丙硫菌唑抗体为单克隆抗体的情况下，可以通过制造和培养杂交瘤细胞并收集培养基获得单克隆抗体，或者可以将由此制备获得的杂交瘤细胞通过腹腔注射接种到哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物（不包括人类）等的体内，在被接种动物的腹部明显膨大时收集腹水，由此获得单克隆抗体。
如本领域技术人员所能理解的，对于丙硫菌唑抗体的来源，并没有特别的限制，其可以来源于任何哺乳动物，包括例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物（不包括人类）等，但不限于此。在一个具体的实施方案中，丙硫菌唑抗体为来源于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物（不包括人类）的多克隆或者单克隆抗体。
基于免疫学检测的需要，发明人将本发明的第一方面所述的丙硫菌唑半抗原、本发明的第三方面所述的丙硫菌唑抗原、本发明的第四方面所述的丙硫菌唑抗体应用于免疫学检测中，以检测样品中是否添加丙硫菌唑或丙硫菌唑的含量。
因此，根据本发明的第五方面，提供了本发明的第一方面所述的丙硫菌唑半抗原、本发明的第三方面所述的丙硫菌唑抗原在免疫学检测中的应用。
根据本发明的第六方面，提供了本发明的第四方面所述的丙硫菌唑抗体在免疫学检测中的应用。
根据本发明的第七方面，提供了一种丙硫菌唑胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，其中，试纸条包括反应膜，反应膜上有检测区和质控区，均呈与试纸条的长相垂直的条带状，检测区位于近于有MAX标记的一端，质控区位于远离有MAX标记的一端。在发明中，检测区包被有本发明的第三方面所述的丙硫菌唑抗原，反应杯中含有胶体金标记的本发明的第四方面所述的丙硫菌唑抗体（简称“金标抗体”）。在一个实施方案中，丙硫菌唑胶体金层析检测装置为丙硫菌唑胶体金层析检测试纸盒。
在一个具体的实施方案中，微孔反应杯内冻干有丙硫菌唑单克隆抗体-胶体金标记物，微孔反应杯具有微孔塞。
丙硫菌唑抗体只要能够与丙硫菌唑抗原发生抗原-抗体结合反应即可，而不管它是单克隆抗体还是多克隆抗体。然而，正如本领域技术人员可以理解的那样，从需要更高特异性的角度上考虑，单克隆抗体是更合适的。因此在本发明中，丙硫菌唑抗体优选地为单克隆抗体。
在本发明中，质控区的点样制备可以根据胶体金标记的丙硫菌唑抗体的类型来进行。具体地，若胶体金标记的丙硫菌唑抗体为丙硫菌唑单克隆抗体，则该质控区可以采用羊抗鼠抗体进行线性点样制得，若胶体金标记的丙硫菌唑抗体为丙硫菌唑多克隆抗体时，则该质控区可以采用羊抗兔抗体进行线性点样制得。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种丙硫菌唑胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，试纸条如图4所示，包含底板以及在其上按顺序粘贴的样品吸收垫、反应膜和吸水垫，该反应膜在样品吸收垫至吸水垫方向上包括检测区和质控区，检测区由丙硫菌唑抗原制备获得；反应杯如图5所示，包含胶体金标记的丙硫菌唑抗体，丙硫菌唑抗体为特异性地针对丙硫菌唑抗原的单克隆抗体，并且质控区为针对该丙硫菌唑抗体的羊抗鼠抗体。
在本发明的一个实施方案中，可以通过下述制备方法来制备本发明的丙硫菌唑胶体金层析检测装置：制备反应膜，采用本发明的丙硫菌唑抗原在反应膜上进行线性点样制备检测区，并采用针对丙硫菌唑抗体的羊抗鼠抗体通过线性点样制备质控区；在底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品吸收垫、反应膜和吸水垫，由此组装成试纸条；将本发明的胶体金标记的丙硫菌唑抗体加入微孔反应杯、冻干后，将微孔反应杯加上微孔塞。该制备方法中使用到的各成分或者组件如上文针对本发明的丙硫菌唑胶体金层析检测装置所描述。
本发明提供的丙硫菌唑胶体金层析检测装置利用层析式免疫胶体金原理，通过试纸条中检测区与质控区之间的比色来半定量检测诸如蔬菜或水果等样品中的丙硫菌唑残留量。该检测装置能够短时间内快速、准确地检测出诸如蔬菜、水果等农产品中的丙硫菌唑残留量，以确定是否超过GB 2763限量要求。
根据本发明的第八方面，本发明提供了一种检测样品中丙硫菌唑的方法，该方法使用本发明的第七方面提供的丙硫菌唑胶体金层析检测装置对样品进行检测。在本发明中，该样品可以为任何疑似丙硫菌唑超过GB 2763限量要求的样品，样品可以是蔬菜或水果等农产品。
根据本发明的一些实施方案，在采用本发明的方法检测样品中的丙硫菌唑之前，可以根据样品的不同对其进行前处理，处理方法为本领域已知的用于检测的样品处理的一般方法，在此不对其进行特别限定。
以下通过具体的实施案例对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场可购买的原料、试剂。
实施例1
本实施例中丙硫菌唑选择国药集团化学试剂有限公司供应的98%的丙硫菌唑，碳酸钾选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯碳酸钾，N，N-二甲基甲酰胺选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯N，N-二甲基甲酰胺，4-溴丁酸甲酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的98% 4-溴丁酸甲酯，甲醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯甲醇，氢氧化锂选择国药集团化学试剂有限公司供应的99%一水氢氧化锂，浓盐酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的36%-38%盐酸，乙酸乙酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙酸乙酯，氢氧化钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氢氧化钠，以下实施例2-10均采用本实施例1中的试剂。
实施例2 丙硫菌唑的半抗原的合成
丙硫菌唑的半抗原的制备方法，包括以下步骤：
S1.向反应容器中加入丙硫菌唑、DMF、无水碳酸钾，在80℃下搅拌5min，然后加入4-溴丁酸甲酯，丙硫菌唑与4-溴丁酸甲酯的摩尔比为1:（1~2），继续80℃下搅拌过夜，反应结束后，冷却至室温，减压旋蒸，蒸出DMF，加入甲醇溶解后除去不溶物，蒸干后过柱纯化得到无色油状物，即得到第一中间体，第一中间体的结构式如式（Ⅱ）所示；
S2. 向干净单口瓶中依次加入第一中间体和甲醇，室温搅拌，加入质量体积分数为10%的氢氧化锂溶液，第二中间体与氢氧化锂的摩尔比为1:（3~7），室温搅拌，将反应液40℃减压蒸馏除去部分甲醇，剩余物中加入纯化水，用乙酸乙酯洗涤，取水层，用6N盐酸液调节pH值至4~5，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液蒸馏至干，得无色透明油状物，过柱层析，分出目标液，蒸馏至干，得到丙硫菌唑半抗原，其结构如式（Ⅰ）所示。
采用质谱法鉴定丙硫菌唑的半抗原，所得到的质谱图见图1。从质谱图可以看出，丙硫菌唑的半抗原的分子离子峰为EI-MS（negative）m/z：452.02[M+Na]+，其与该丙硫菌唑半抗原的分子量429.07相符，表明成功合成了式（Ⅰ）所示的丙硫菌唑的半抗原，其中n=3。本实施例中丙硫菌唑半抗原的合成流程图见图2。
实施例3 丙硫菌唑免疫用抗原、丙硫菌唑包被用抗原的合成
3.1 丙硫菌唑免疫用抗原的制备：
称量50mg丙硫菌唑半抗原，溶于2.5ml DMF中，加入25mg NHS、30mg EDC.HCl，室温反应6h，制备得到活化液；取45mg BSA溶于3ml 0.1M PH9.0的硼酸缓冲液，加入1ml DMF，0.6ml上述活化液，室温反应4h后用PBS（0.01 mol/L，pH =7.4的磷酸盐缓冲液）透析，每4 h换液1次，换液7~ 8 次，透析后4000转/min离心5min，取上清液，制备得到丙硫菌唑免疫用抗原，即丙硫菌唑半抗原-BSA偶联物，于-20℃保存。
3.2丙硫菌唑包被用抗原的制备：
称取3.8 mg丙硫菌唑半抗原溶于200μL无水DMF中，然后依次加入3μL三正丁胺和1.6μL氯甲酸异丁酯，室温下搅拌反应1 h，制备得到反应液；将22 mg OVA溶于2 ml碳酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢滴加100μL上述反应液，室温下搅拌反应3h，然后透析，离心，制备得到丙硫菌唑包被用抗原，即丙硫菌唑半抗原-OVA偶联物，于-20℃保存备用。
鉴定：将载体蛋白、丙硫菌唑半抗原、丙硫菌唑免疫用抗原、丙硫菌唑包被用抗原，用pH=7. 4，0.01 mol/L的PBS缓冲液配成0.5mg/ml的溶液，以pH=7. 4，0.01mol/L的PBS缓冲溶液调零，用紫外分光光度计在波长200~400nm范围内扫描，得到载体蛋白、丙硫菌唑半抗原、丙硫菌唑免疫用抗原、丙硫菌唑包被用抗原见图7。
实施例4 丙硫菌唑单克隆抗体的制备及纯化
4.1 动物免疫
选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫，将实施例3中得到的丙硫菌唑免疫用抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为180 μg/只；时隔4周后进行加强免疫，剂量为90μg/只，用不完全弗氏佐剂混合乳化，之后多次的加强免疫时间间隔3周；冲刺免疫时剂量再减半，为45 μg/只，完全抗原用生理盐水稀释，对小鼠进行腹腔注射。小鼠第三次免疫后可进行断尾采血检测，通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测小鼠血清的效价和IC50，选择效价高、IC50低的小鼠进行融合；
4.2 细胞融合和克隆化
取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按10：1的数量配比比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌丙硫菌唑单克隆抗体的丙硫菌唑单克隆杂交瘤细胞株；
4.3 细胞冻存和复苏
将丙硫菌唑单克隆杂交瘤细胞用冻存液制成5×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
4.4 单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将丙硫菌唑单克隆杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到丙硫菌唑单克隆抗体，-20℃保存。其中，细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的质量百分含量为20%，使碳酸氢钠在细胞培养基中的质量百分含量为0.2%，细胞培养基的pH为7.4。
实施例5 羊抗鼠抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗体。
实施例6 基于丙硫菌唑单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线的建立
6.1 包被及封闭
用包被液（pH 9.6、0.1 mol/L碳酸盐缓冲液）将丙硫菌唑包被原稀释至62.5ng/mL，37℃包被过夜。第二天用磷酸吐温缓冲液PBST（0.01M PBS，0.06% Tween-20 (v/v)）洗两次后，加入2%的脱脂奶粉，每孔120 μL 37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干60 min，用密封袋装于4℃待用。
6.2 标准曲线的建立
1）试验方法
将包好的酶标板，每孔加入一系列不同浓度（0.01ng/mL，0.1 ng/mL，1.0 ng/mL，10 ng/mL ，100 ng/mL）的50 μL的丙硫菌唑标准品和50 μL浓度为2.0 μg/mL丙硫菌唑单克隆抗体，37°C孵育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的酶标二抗（羊抗鼠IgG -HRP），37℃孵育40 min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入100 μL TMB底物液，37℃避光显色10 min；加入50 μL终止液（2M H2SO4）终止反应；用酶标仪读取450 nm处的吸收光度值。以丙硫菌唑标准品浓度对横坐标，B/B0（加入丙硫菌唑的微孔的OD450值/未加入丙硫菌唑的微孔的OD450值）为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
2）试验结果
基于丙硫菌唑单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线图见图3。从图中可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，对丙硫菌唑的最低检测限为0.1 μg/mL、IC50值为12.5ng/mL，检测灵敏度较高。
实施例7 丙硫菌唑胶体金层析检测装置的制备
7.1 胶体金溶液的制备
用双蒸去离子水将质量分数1%的氯金酸溶液稀释成0.01%（质量分数），取100ml0.01%的氯金酸溶液置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.0 ml 1%柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，得到胶体金溶液，4℃保存。制备好的胶体金溶液外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物；
7.2 丙硫菌唑单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金溶液的pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入20~60 μg丙硫菌唑单克隆抗体的标准，向胶体金溶液中加入实施例4制备得到的丙硫菌唑单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，静置10min后，加入10%牛血清白蛋白（BSA）溶液，使其在胶体金溶液中的体积百分含量为1%，静置10min。以12000rpm，在4℃条件下离心40min，弃上清液，用体积为初始胶体金溶液体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，制备得到丙硫菌唑单克隆抗体-胶体金标记物，置于4℃保存备用；
复溶缓冲液：含体积百分含量0.3%~0.5%牛血清白蛋白、质量百分含量0.1%~0.3%吐温-20、质量百分含量3%~6%海藻糖，pH= 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液；
7.3微孔反应杯的制备
向微孔反应杯中加入100μL丙硫菌唑单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥6h，即可取出，得到冻干有丙硫菌唑单克隆抗体-胶体金标记物的微孔反应杯，密封保存，其中丙硫菌唑单克隆抗体-胶体金标记物冻干量为0.20~0.50μg/ml；
7.4 样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白的0.02mol/L的磷酸盐缓冲液中浸泡2h，50℃烘干2h备用。0.02mol/L的磷酸盐缓冲液的pH为7.2，其中牛血清白蛋白的体积百分含量为1.0%；
7.5 反应膜的制备
包被过程：用磷酸缓冲液将丙硫菌唑包被用抗原（丙硫菌唑半抗原-OVA偶联物）稀释到浓度为10mg/ml，用金标喷金点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区（T区），包被浓度为0.5 mg/ml；用浓度0. 01mol/L，pH= 7.4的磷酸盐缓冲液将实施例5制备的羊抗鼠抗体浓度稀释到10mg/ml，用金标喷金点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区（C区），包被浓度为1.0 mg/ml。将包被好的反应膜置于50℃条件下干燥6h，实验时选取显色亮、竞争性好的包被原作为生产备用。
7.6丙硫菌唑胶体金层析检测装置的制备
7.6.1 试纸条的组装
将样品吸收垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在底板上，其中，底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，吸水垫为吸水滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜。样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐。
7.6.2 丙硫菌唑胶体金层析检测试纸盒的组装
将上述步骤7.6.1得到的试纸条与上述步骤7.3得到的微孔反应杯组装成试纸盒，在2-8℃的环境中贮存，有效期12个月。
实施例8 一种检测样品中丙硫菌唑的方法
8.1 样品提取液的配制
分别称取氯化钠8 g、氯化钾0.2 g、磷酸氢二钠1.44 g、磷酸二氢钾0.24 g于1000mL烧杯中，加水充分搅拌溶解后定容至1000 mL。
8.2 样品前处理
称取2.0g±0.01g均质的蔬菜样品或水果样品至50mL聚苯乙稀离心管中，加入上述样品提取液8mL，盖上盖子，涡旋混合器混匀或手动上下振荡混匀30 s，静置分层或4000r/min离心1 min，取上清液为待测液。
8.3 测定步骤
吸取200 μL上述待测液于微孔反应杯中，上下抽吸5~10次使混合均匀。室温温育3min，将试纸条插入到反应杯中，室温温育3min，取出试纸条，轻轻刮去试纸条下端的样品垫，并进行结果判读。
8.4 结果判定
通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。
阳性：当质控区（C）显示出条带，检测区（T）不显色，判为阳性，即样品中有丙硫菌唑，用“ + ”表示；
阴性：当质控区和检测区均显示出条带，判为阴性，即样品中没有丙硫菌唑，用“-”表示；
无效：当质控区（C）不显示条带，试纸失效，具体如图5所示。
实施例9 丙硫菌唑胶体金层析检测装置的灵敏度和假阴性率
选取经SN/T 5442-2022 《出口植物源食品中丙硫菌唑及其代谢物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》测试不含丙硫菌唑的马铃薯、玉米笋和蓝莓作为空白样品，以GB2763-2021中规定豇豆、番茄、蓝莓的最高残留限量（MRL）0.2 mg/kg，0.2 mg/kg和1.5 mg/kg，为关注浓度。添加水平为1倍关注浓度、2倍关注浓度，考察灵敏度和假阴性率。两个添加浓度水平的样品，每个浓度水平各50 份试样，按实施例8中检测方法进行检测，检测结果见下表1。
表1 丙硫菌唑胶体金层析检测装置的灵敏度和假阴性率检测结果
Figure 411704DEST_PATH_IMAGE005
由表1可知，本实施例中的检测方法对样品中粉唑醇残留的检测灵敏度≥95%，假阴性率为≤5%。
实施例10 丙硫菌唑胶体金层析检测装置的特异性和假阳性
选用豇豆、番茄和蓝莓的空白样品，采用空白基质加标的方式，制备成2个浓度水平（0.5倍关注浓度、空白基质）的样品各50份。采用实施例8中检测方法对样品进行检测，检测结果见下表2。
表2 丙硫菌唑胶体金层析检测装置的特异性和假阳性检测结果
Figure 139488DEST_PATH_IMAGE006
由表2可知，本实施例中的检测方法的特异性≥90%，假阳性率为≤10%。上述结果表明本发明的检测丙硫菌唑的胶体金层析检测装置具有良好的特异性，能够准确地检测出蔬菜、水果样品中的丙硫菌唑，因此可以对蔬菜、水果样品中的丙硫菌唑残留进行快速检测。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.丙硫菌唑的半抗原，其特征在于，其结构如式（Ⅰ）所示：
Figure 396816DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ），其中，n为-CH2基团的数目，n选自1~5的整数。
2.制备权利要求1所述的丙硫菌唑的半抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将丙硫菌唑与卤代酯发生反应，得到第一中间体，所述第一中间体的结构式如式（Ⅱ）所示：
Figure 782798DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅱ）；
其中，n为-CH2基团的数目，n选自1~5的整数；
R为甲基、乙基、丙基或叔丁基；
S2，所述第一中间体与氢氧化锂发生碱性水解反应，得到所述丙硫菌唑的半抗原，其结构式如式（Ⅰ）所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中丙硫菌唑与卤代酯的摩尔比为1:（1-2），所述卤代酯中的卤代原子为F、Cl、Br或I，所述卤代酯为6-卤代己酸甲酯、6-卤代己酸乙酯、6-卤代己酸丙酯、6-卤代己酸叔丁酯、5-卤代戊酸甲酯、5-卤代戊酸乙酯、5-卤代戊酸丙酯、5-卤代戊酸叔丁酯、4-卤代丁酸甲酯、4-卤代丁酸乙酯、4-卤代丁酸丙酯、4-卤代丁酸叔丁酯、3-卤代丙酸甲酯、3-卤代丙酸乙酯、3-卤代丙酸丙酯、3-卤代丙酸叔丁酯、2-卤代乙酸甲酯、2-卤代乙酸乙酯、2-卤代乙酸丙酯或2-卤代乙酸叔丁酯中的一种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中第一中间体与氢氧化锂的摩尔比为1:（3-7）。
5.丙硫菌唑抗原，其特征在于，所述丙硫菌唑抗原为权利要求1所述的丙硫菌唑的半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
6.权利要求1所述的丙硫菌唑的半抗原、权利要求5所述的丙硫菌唑抗原在丙硫菌唑的免疫学检测中的应用。
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