噻螨酮半抗原及其制备方法、噻螨酮抗原、抗体及其应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域。更具体地,本发明涉及一种噻螨酮半抗原及其制备方法、噻螨酮抗原、噻螨酮抗体以及上述半抗原、抗原和抗体在免疫学检测中的应用。
背景技术
噻螨酮(Hexythiazos),属于噻唑烷酮类杀螨剂。噻螨酮对多种植物害螨具有强烈的杀卵、杀幼若螨的特性,对成螨无效,但对接触到药液的雌成虫所产的卵具有抑制孵化的作用。噻螨酮以触杀作用为主,对植物组织有良好的渗透性,无内吸作用,对作物、哺食螨和益虫安全。此外,经动物急性毒性试验发现,大鼠急性经口LD50>5000mg/kg,大鼠急性经皮LD50>5000mg/kg,低毒,因此可取代对哺乳动物毒性高、有残留和环境问题的有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯和有机氯杀虫剂。
我国规定噻螨酮在梨果中最高残留限量值(MRL)为0.5mg/kg。欧盟规定噻螨酮在茶中的残留限量值(MRL)为4mg/kg。目前,噻螨酮的检验方法有高效液相色谱法(LC)、气质联用法(GC/MS)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS),上述检测方法具有精度高、分离效率高、选择性好、假阳性率低、重现性好等优点,但操作复杂、设备昂贵,对操作人员技术要求高,且不能立即显示结果等问题,不适用于快速的在线检测和监控。
免疫学检测分析方法是一种以抗原抗体的特异性识别、可逆性结合反应为基础的分析方法,具有灵敏度高、特异性高,对仪器的要求不高、快速、操作简便、成本低等优点,目前被广泛地用于食品等中的有害物质的检测中。然而,建立免疫学检测分析技术并将其应用于检测噻螨酮农药残留量的关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体,而要实现这一目标,前提条件就是设计并合成出合适的噻螨酮半抗原。但是,目前尚未有关于噻螨酮半抗原合成的相关报道。
因此,本领域亟需设计和开发出一种合适的噻螨酮半抗原,藉此来实现通过免疫学检测分析方法来检测噻螨酮农药残留。
发明内容
有鉴于此,本发明设计并合成了一种噻螨酮半抗原、由此提供了相应的抗原、抗体、及其免疫学检测中的应用,以及包括上述抗原和抗体的免疫学检测装置。
根据本发明的第一方面,本发明提供了一种噻螨酮半抗原,所述噻螨酮半抗原的结构式如式(I)所示:
其中n为1、2或3。
根据本发明的第二方面,本发明提供了制备本发明的第一方面所述的噻螨酮半抗原的方法,所述方法包括如下步骤:
1)在碱性条件下,使4-羟基苯丙酮与卤代C3-C5烯烃反应,得到中间体1;优选地,将4-羟基苯丙酮与卤代C3-C5烯烃溶解在二甲基甲酰胺中,再加入碳酸钾,并于60-90℃反应,直至反应结束;优选地,4-羟基苯丙酮、卤代C3-C5烯烃、碳酸钾的摩尔比为1:(1-2):(1-5);所述卤代C3-C5烯烃为3-卤代丙烯、4-卤代丁烯、5-卤代戊烯;
2)使中间体1发生肟化反应,得到中间体2;优选地,使中间体1与盐酸羟胺发生肟化反应,得到中间体2;优选地,中间体1与盐酸羟胺的摩尔比为1:(0.9-3);
3)使中间体2与甲磺酰氯反应,然后在甲醇钠的作用下发生重排反应,得到中间体3;优选地,将中间体2溶解于甲苯中,然后加入三乙胺,降温至-5℃至5℃,滴加甲磺酰氯,然后保温反应0.5-1.5h,加水,搅拌20-40min,分层除去水相;加入甲醇钠溶液以及相转移催化剂,于-5℃至5℃下反应,直至反应结束,加水,搅拌20-40min,分层除去水相,加入浓盐酸,保温反应0.5-1.5h,得到中间体3;优选地,中间体2、三乙胺、甲磺酰氯与相转移催化剂的摩尔比为1:(0.9-2):(0.9-2):(0.05-0.5);
4)使中间体3发生羰基的还原反应,得到中间体4;优选地,中间体3的反应溶剂为甲醇,还原剂为硼氢化钠或硼氢化钾;优选地,中间体3与硼氢化钠或硼氢化钾的摩尔比为1:(1-2);
5)在碱性条件下,使中间体4与CS2发生环化反应,得到中间体5;优选地,中间体4的反应溶剂为20%KOH溶液,反应温度为50-70℃;优选地,中间体4、KOH与CS2的摩尔比为1:(0.8-1.5):(0.8-5);
6)使中间体5发生碳硫双键的氧化反应,得到中间体6;优选地,在H2O2的作用下,在CH3ONa的甲醇溶液中,使中间体5发生碳硫双键的氧化反应;优选地,中间体5、CH3ONa与H2O2的摩尔比为1:(1-5):(1.5-14);
7)使中间体6发生碳碳双键的氧化反应,得到中间体7;优选地,在三氯化钌、高碘酸钠的作用下,使中间体6发生碳碳双键的氧化反应;优选地,中间体6、高碘酸钠、三氯化钌反应的摩尔比为1:(1-3):(0.07-0.5);
以及
8)在二氮杂二环的作用下,使中间体7与环己基异氰酸酯反应,得到式(I)所示的化合物,即为噻螨酮半抗原;优选地,中间体7、二氮杂二环、环己基异氰酸酯的摩尔比为1:(1-1.5):(0.9-3)。
根据本发明的第三方面,本发明提供了一种噻螨酮抗原,所述噻螨酮抗原包括:本发明的第一方面所述的噻螨酮半抗原,以及与所述噻螨酮半抗原偶联的载体蛋白。
根据本发明的第四方面,本发明提供了一种噻螨酮抗体,所述噻螨酮抗体为特异性针对本发明的第三方面所述的噻螨酮抗原的抗体。
根据本发明的第五方面,本发明提供了本发明的第一方面所述的噻螨酮半抗原、本发明的第三方面所述的噻螨酮抗原和本发明的第四方面所述的噻螨酮抗体在免疫学检测中的应用。
根据本发明的第六方面,本发明提供了一种噻螨酮胶体金层析检测装置,包括试纸条和反应杯,其中,所述试纸条包括反应膜,所述反应膜上有检测线和质控线,并且其中,所述检测线包被有本发明的第三方面所述的噻螨酮抗原,并且其中,所述反应杯中含有胶体金标记的本发明的第四方面所述的噻螨酮抗体。
根据本发明的第七方面,本发明提供了一种检测样品中噻螨酮的方法,所述方法包括使用本发明的第六方面所述的胶体金层析检测装置对样品中的噻螨酮进行检测。
本发明的有益效果:
本发明提供了一种噻螨酮半抗原,以及制备该噻螨酮半抗原的方法,同时还提供了相应的噻螨酮抗原和噻螨酮抗体,此外还将其应用于免疫学检测中,并且由此提出了噻螨酮胶体金层析检测装置和检测样品中噻螨酮的方法。
在制备噻螨酮半抗原的方法中,通过多步合成来制备噻螨酮半抗原,所制备的噻螨酮半抗原最大程度地保留了噻螨酮的特征结构,增强了噻螨酮半抗原的免疫性,并且同时通过进行适当的化学修饰引入了与载体蛋白偶联的活性基团-羧基,为后续建立噻螨酮的各种免疫分析方法提供基础。本发明的噻螨酮半抗原的制备,使用的化学试剂容易得到,实验操作过程容易掌握,每步反应产率较高,并且与仪器方法相比较,其检测成本较低。
此外,本发明提供的噻螨酮胶体金层析检测装置利用层析式免疫胶体金原理,通过试纸条中检测线与质控线之间的比色来半定量检测诸如水果或蔬菜等中的噻螨酮农药残留。该检测装置能够快速、准确地检测出诸如水果或蔬菜等中的噻螨酮农药残留,能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。
与现有技术相比,本发明提供的免疫学检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、保质期长等优点。本发明可应用于需要进行噻螨酮农药残留的快速检测的各个领域中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
图1是根据本发明的实施方案的胶体金层析检测装置中的试纸条的剖面结构示意图。
图2是根据本发明的实施方案的胶体金层析检测装置中的微孔反应杯的示意图。
图3是根据本发明的实施方案的结果判定的示意图。
图4是根据本发明的实施方案的噻螨酮半抗原的质谱图。
图5-1是根据本发明的实施方案的载体蛋白BSA、噻螨酮半抗原、相应的噻螨酮抗原的吸收曲线。
图5-2是根据本发明的实施方案的载体蛋白OVA、噻螨酮半抗原、相应的噻螨酮抗原的吸收曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图,对本发明进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案,而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案,本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案,都属于本发明保护的范围。
免疫学检测分析方法是一种利用抗原抗体特异性结合反应来检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法,建立小分子化合物的免疫学检测分析方法的关键是能够生产出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体,而生产这样的抗体的关键在于人工抗原或者人工半抗原的设计和合成。结合到本发明,建立噻螨酮的免疫学检测分析方法的关键步骤就是要设计并合成出合适的噻螨酮半抗原。
因此,根据本发明的第一方面,本发明提供了一种噻螨酮半抗原,其中,所述噻螨酮半抗原的结构如式(I)所示:
其中n为1、2或3。
如本领域技术人员所理解的,所谓半抗原,是指这样的一类小分子物质:其单独存在时并不能诱导免疫应答,即不具备免疫原性,但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性,从而诱导免疫应答。这类小分子物质可与应答效应产物结合,具备抗原性,即免疫反应性,但是不具有免疫原性。
具体到本发明,容易理解,噻螨酮半抗原针对噻螨酮抗体(单抗隆抗体或多克隆抗体均可)具有免疫反应性,但是不具备免疫原性。换言之,噻螨酮半抗原可以与其相对应的噻螨酮抗体结合发生抗原-抗体反应;然而,在将该噻螨酮半抗原接种到动物体内进行免疫时,不能单独刺激动物产生相应的抗体。
然而,由于噻螨酮小分子(如下式(Ⅱ)所示,CAS号:78587-05-0)上没有可以直接与载体偶联的活性基团,因此需先在噻螨酮小分子上的适当位置进行适当的化学修饰,以引入合适的连接臂和与载体蛋白偶联的活性基团。但是需要注意的是,该修饰应尽可能地少,并且尽可能多地保留能与抗体结合的位点,并且不同结构的连接臂、不同的偶联方法或连接臂的引入位置,都影响后续建立的免疫学方法检测的灵敏度和特异性。目前,尚未有关于制备噻螨酮半抗原的相关报道。
因此,根据本发明的第二方面,本发明提供了一种噻螨酮半抗原的制备方法,所述包括如下步骤:
1)在碱性条件下,使4-羟基苯丙酮与卤代C3-C5烯烃反应,得到中间体1;
2)使中间体1发生肟化反应,得到中间体2;
3)使中间体2与甲磺酰氯反应,然后在甲醇钠的作用下发生重排,得到中间体3;
4)使中间体3发生羰基的还原反应,得到中间体4;
5)在碱性条件下,使中间体4与CS2发生环化反应,得到中间体5;
6)使中间体5发生碳硫双键的氧化反应,得到中间体6;
7)使中间体6发生碳碳双键的氧化反应,得到中间体7;
8)在二氮杂二环(DBU)的作用下,使中间体7与环己基异氰酸酯反应,得到式(I)所示的化合物,即为目标产物。
在上述制备方法中,具体的反应过程如下所示:
其中,X为卤素,例如氟、氯、溴、碘,n为1、2或3。
在一个实施方案中,在步骤1)中,将4-羟基苯丙酮与卤代C3-C5烯烃溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中,再加入碳酸钾,并于60-90℃反应,直至反应结束,得到中间体1。具体地,将4-羟基苯丙酮、3-溴丙烯溶解于二甲基甲酰胺中,再加入碳酸钾,于60-90℃反应,直至反应结束,然后冷却至室温,加水,用乙酸乙酯萃取,有机相减压旋蒸,除去溶剂,得到中间体1。在一个优选的实施方案中,4-羟基苯丙酮、卤代C3-C5烯烃、碳酸钾的摩尔比为1:(1-2):(1-5)。所述卤代C3-C5烯烃为3-卤代丙烯、4-卤代丁烯、5-卤代戊烯。
如本领域技术人员所理解的,“卤代”是指氢原子被卤素原子诸如F、Cl、Br、I取代。结合到发明,“卤代C3-C5烯烃”是指C3-C5烯烃的氢原子被卤素原子诸如F、Cl、Br、I取代所形成的烯烃。
在一个实施方案中,在步骤2)中,使中间体1与盐酸羟胺发生肟化反应。在本发明中,反应溶剂为甲醇,当然也可以使用本领域已知的可用于肟化反应的其他溶剂来代替甲醇,诸如乙醇,本发明不对此作进一步的限定。具体地,将中间体1与盐酸羟胺溶解于甲醇中,回流反应若干小时,反应完后将其调为中性,蒸干溶剂,加水,用乙酸乙酯萃取,再将有机相蒸干,得到中间体2。在本发明中,使用NaOH溶液将其调为中性,当然也可以使用本领域已知的其他碱性溶剂,诸如KOH等,本发明对此不作进一步的限定。在一个优选的实施方案中,中间体1与盐酸羟胺的摩尔比为1:(0.9-3)。
在一个实施方案中,在步骤3)中,将中间体2溶解于甲苯中,然后加入三乙胺,降温至-5℃至5℃,滴加甲磺酰氯,保温反应0.5-1.5h,加水,搅拌20-40min,分层除去水相;加入甲醇钠溶液以及相转移催化剂,于-5℃至5℃下反应,直至反应结束,加水,搅拌20-40min,分层除去水相,加入浓盐酸,保温反应0.5-1.5h,抽滤,得到中间体3。进一步地,在步骤3)中,将中间体2溶解于甲苯中,然后加入三乙胺,降温至0℃,滴加甲磺酰氯,然后保温反应1h,加水,搅拌30min,分层除去水相;加入甲醇钠溶液以及相转移催化剂,于0℃下反应,直至反应结束,加水,搅拌30min,分层除去水相,加入浓盐酸,保温反应1h,抽滤,干燥得到酮胺盐酸盐,即为中间体3。在一个优选的实施方案中,中间体2、三乙胺、甲磺酰氯与相转移催化剂的摩尔比为1:(0.9-2):(0.9-2):(0.05-0.5)。
如所理解的,相转移催化剂是可以帮助反应物从一相转移到能够发生反应的另一相当中从而加快异相系统反应速率的一类催化剂。在本发明中,相转移催化剂可以为四丁基溴化铵、四丁基溴氟化铵、四丁基氯化铵、四丁基碘化铵中的一种或多种。当然,也可以使用本领域已知的可用于上述步骤3)的其他相转移催化剂,本发明对此不作进一步的限定。
在一个实施方案中,在步骤4)中,中间体3的反应溶剂为甲醇,还原剂为硼氢化钠或者硼氢化钾。具体地,将中间体3溶解于甲醇中,分批加入硼氢化钠,反应结束后直接蒸干溶剂,得到中间体4。当然也可以使用本领域已知的可用于还原反应的其他溶剂来代替甲醇,诸如乙醇。在一个优选的实施方案中,中间体3与硼氢化钠或硼氢化钾的摩尔比为1:(1-2)。
在一个实施方案中,在步骤5)中,中间体4的反应溶剂为20%KOH溶液,反应温度为50-70℃。具体地,将中间体4溶解于20%KOH溶液中,加入CS2,并将溶液调至微酸性,例如pH范围为5-6,于50-70℃反应,直至反应结束,冷却至室温,然后用乙酸乙酯萃取,有机相蒸干,然后过柱纯化,得到中间体5。在一个优选的实施方案中,中间体4、KOH与CS2的摩尔比为1:(0.8-1.5):(0.8-5)。
在一个实施方案中,在步骤6)中,在H2O2的作用下,在甲醇钠(CH3ONa)的甲醇溶液中,使中间体5发生碳硫双键的氧化反应。具体地,将中间体5溶解于甲醇中,室温下将20%甲醇钠的甲醇溶液缓慢滴加,搅拌均匀后,在不高于40℃下,滴加30%-50%H2O2,保温反应后,得到中间体6。进一步地,降温至5℃。当然也可以使用本领域已知的其他溶剂来代替甲醇,诸如乙醇。优选地,在保温反应结束后,取样,通过TLC检测反应情况,从而确认反应是否完全。在一个优选的实施方案中,中间体5、CH3ONa与H2O2的摩尔比为1:(1-5):(1.5-14)。
在一个实施方案中,在步骤7)中,在三氯化钌、高碘酸钠的作用下,使中间体6发生碳碳双键的氧化反应。具体地,将中间体6溶解于乙腈的水溶液中,加入三氯化钌、高碘酸钠,回流反应,直至反应结束,然后蒸干溶剂,加水,用乙酸乙酯萃取,有机相蒸干后过柱纯化,得到中间体7。在一个优选的实施方案中,中间体6、高碘酸钠、三氯化钌反应的摩尔比为1:(1-3):(0.07-0.5)。
在一个实施方案中,在步骤8)中,反应溶剂为四氢呋喃,反应温度为70-90℃。具体地,将中间体7溶解于四氢呋喃中,加入DBU、环己基异氰酸酯,于70-90℃反应,搅拌过夜,待反应结束后,蒸干溶剂,加水及少量6N HCl将溶液调为微酸性,例如pH范围为5-6,用乙酸乙酯萃取2-3遍,合并有机相,蒸干后过柱纯化,得到式(I)的化合物。进一步地,反应温度为80℃。在一个优选的实施方案中,中间体7、DBU、环己基异氰酸酯的摩尔比为1:(1-1.5):(0.9-3)。
在一个实施方案中,噻螨酮半抗原的制备方法包括如下步骤:
1)将4-羟基苯丙酮与卤代C3-C5烯烃溶解在二甲基甲酰胺中,再加入碳酸钾,并于60-90℃反应,直至反应结束,得到中间体1;
2)使中间体1与盐酸羟胺发生肟化反应,得到中间体2;
3)使中间体2先与甲磺酰氯反应,然后在甲醇钠的作用下发生重排反应,得到中间体3;
4)在硼氢化钠的作用下,使中间体3发生羰基的还原反应,得到中间体4;
5)在碱性条件下,使中间体4与CS2发生环化反应,得到中间体5;
6)在H2O2的作用下,使中间体5发生氧化反应,得到中间体6;
7)在三氯化钌、高碘酸钠的作用下,使中间体6发生碳碳双键的氧化反应,得到中间体7;
8)在DBU作用下,使中间体7与环己基异氰酸酯反应,得到式(I)所示的化合物,即为噻螨酮半抗原。
进一步地,噻螨酮半抗原的制备方法包括如下步骤:
1)将4-羟基苯丙酮、3-溴丙烯溶解于DMF中,再加入碳酸钾,于60-90℃反应,直至反应结束,然后冷却至室温,加水,用乙酸乙酯萃取,有机相减压旋蒸,除去溶剂,得到中间体1-1;
2)将中间体1-1与盐酸羟胺溶解于甲醇中,回流反应若干小时,反应完后用NaOH溶液将其调为中性,蒸干溶剂,加水,用乙酸乙酯萃取,再将有机相蒸干,得到中间体2-1;
3)将中间体2-1溶解于甲苯中,然后加入三乙胺,降温至0℃,滴加甲磺酰氯,滴加完毕后,保温反应1h,加水,搅拌30min,分层除去水相;加入甲醇钠溶液以及相转移催化剂,于0℃下反应,直至反应结束,加水,搅拌30min,分层除去水相,加入浓盐酸,保温反应1h,抽滤,干燥得到酮胺盐酸盐,即为中间体3-1;
4)将中间体3-1溶解于甲醇中,分批加入硼氢化钠,反应结束后直接蒸干溶剂,得到中间体4-1;
5)将中间体4-1溶解于20%KOH溶液中,加入CS2,并将溶液调制微酸性,例如pH范围为5-6,于50-70℃反应,直至反应结束,然后冷却至室温,然后用乙酸乙酯萃取,有机相蒸干后过柱纯化,得到中间体5-1;
6)将中间体5-1溶解于甲醇中,室温下将20%甲醇钠的甲醇溶液缓慢滴加,搅拌均匀后,在不高于40℃下,滴加30%-50%H2O2,保温反应,直至反应结束,得到中间体6-1;
7)将中间体6-1溶解于乙腈的水溶液中,加入三氯化钌、高碘酸钠,回流反应,直至反应结束,然后蒸干溶剂,加水,用乙酸乙酯萃取,有机相蒸干后过柱纯化,得到中间体7-1;
8)将中间体7-1溶解于四氢呋喃中,加入DBU、环己基异氰酸酯,于80℃反应,搅拌过夜,待反应结束后,蒸干溶剂,加水及少量6N HCl将溶液调为微酸性,例如pH范围为5-6,用乙酸乙酯萃取2-3遍,合并有机相,蒸干后过柱纯化,得到式(I)的化合物,即为目标物。
在上述制备方法中,具体的反应过程如下所示:
本发明所制备的噻螨酮半抗原在保留噻螨酮基本结构的基础上引入连接臂结构和用于偶联大分子的活性基团,这样既有利于其与大分子偶联,又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量较小的噻螨酮基本结构,避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别。
如上所述,噻螨酮半抗原仅具有免疫反应性,而不具有免疫原性,并不能单独地刺激动物产生相应的抗体。因此,为了赋予噻螨酮半抗原以免疫原性,需要将噻螨酮半抗原与大分子蛋白质等载体偶联、结合或者交联在一起,由此产生既具有免疫反应性又具有免疫原性的噻螨酮偶联抗原。半抗原与载体分子之间的偶联、结合或者交联方法是本领域已知的。
因此,根据本发明的第三方面,本发明提供了一种噻螨酮抗原,包含本发明第一方面提供的噻螨酮半抗原,以及与所述噻螨酮半抗原偶联的载体蛋白。
本发明所提及的术语“载体”是任何能够与半抗原偶联、结合或者交联并由此产生既具有免疫原性又具有免疫反应性的物质,包括例如大分子蛋白质或者非抗原性的多聚赖氨酸等。作为示例,可以使用的载体包括,但不限于,大分子蛋白质,例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。
抗原在进入机体后,刺激B细胞,诱导细胞的增殖和分化,继而产生特异性抗体。结合到本发明,利用噻螨酮半抗原与载体蛋白偶联后得到的噻螨酮抗原去免疫动物,刺激动物免疫应答,从而产生特异性更强、灵敏度更高的抗体。
因此,根据本发明的第四方面,提供了一种噻螨酮抗体,该噻螨酮抗体为特异性针对本发明第三方面提供的噻螨酮抗原的抗体。
噻螨酮抗体可以为单克隆抗体或者多克隆抗体。另外,可以采用本领域普通技术人员已知的方法来制备噻螨酮抗体。例如,在噻螨酮抗体为多克隆抗体的情况下,可以通过采用噻螨酮抗原免疫接种哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等,随后分离血清获得。在噻螨酮抗体为单克隆抗体的情况下,可以通过制造和培养杂交瘤细胞并收集培养基获得单克隆抗体,或者可以将由此制备获得的杂交瘤细胞通过腹腔注射接种到哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等的体内,在被接种动物的腹部明显膨大时收集腹水,由此获得单克隆抗体。
如本领域技术人员所能理解的,对于噻螨酮抗体的来源,并没有特别的限制,其可以来源于任何哺乳动物,包括例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等,但不限于此。在一个具体的实施方案中,噻螨酮抗体为来源于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)的多克隆或者单克隆抗体。
基于免疫学检测的需要,申请人将本发明的第一方面所述的噻螨酮半抗原、本发明的第三方面所述的噻螨酮抗原、本发明的第四方面所述的噻螨酮抗体应用于免疫学检测中,以检测噻螨酮农药残留量。
因此,根据本发明的第五方面,提供了本发明的第一方面所述的噻螨酮半抗原、本发明的第三方面所述的噻螨酮抗原、本发明的第四方面所述的噻螨酮抗体在免疫学检测中的应用。
根据本发明的第六方面,提供了一种噻螨酮胶体金层析检测装置,包括试纸条和反应杯,其中,试纸条包括反应膜,反应膜上有检测线和质控线,并且其中,检测线包被有本发明的第三方面所述的噻螨酮抗原,并且其中,反应杯中含有胶体金标记的本发明的第四方面所述的噻螨酮抗体(简称“金标抗体”)。
根据本发明的一些实施方案,试纸条还可以包括诸如底板、样品吸收垫和吸水垫的其他组件。在这种情况下,在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫。在本发明中,样品吸收垫可以为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚醋膜;反应膜可以为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜;吸水垫可以为吸水滤纸或滤油纸;底板可以为不吸水的韧性材料例如硬质塑胶条如PVC底板或不吸水硬纸条或其它硬质不吸水材料。
在本发明中,反应膜包含检测线和质控线。通常情况下,将检测线设置在靠近样品吸收垫一侧。检测线由噻螨酮抗原(在本发明中即噻螨酮半抗原-载体蛋白偶联物)在反应膜上进行线性点样制得。质控线可以通过将抗原或者抗体在反应膜上进行线性点样获得。
在本发明的一个实施方案中,质控线由本发明提供的噻螨酮抗体的第二抗体点样获得。在胶体金标记的噻螨酮抗体移动至质控线时,其会与形成该质控线的第二抗体发生结合反应,由此显现颜色。
如果质控线显色,则指示该检测系统成立,检测结果可用。相反,如果质控线不显色,则指示该检测系统不成立,检测结果不可用。
如上所述,反应杯中含有胶体金标记的本发明第四方面提供的噻螨酮抗体,所述噻螨酮抗体特异性地针对本发明第三方面的噻螨酮抗原。
噻螨酮抗体只要能够与噻螨酮抗原发生抗原-抗体结合反应即可,而不管它是单克隆抗体还是多克隆抗体。然而,正如本领域技术人员可以理解的那样,从需要更高特异性的角度上考虑,单克隆抗体是更合适的。因此在本发明中,噻螨酮抗体优选地为单克隆抗体。
在本发明中,质控线的点样制备可以根据胶体金标记的噻螨酮抗体的类型来进行。具体地,若胶体金标记的噻螨酮抗体为噻螨酮单克隆抗体,则该质控线可以采用羊抗鼠抗抗体进行线性点样制得,若胶体金标记的噻螨酮抗体为噻螨酮多克隆抗体时,则该质控线可以采用羊抗兔抗抗体进行线性点样制得。
在本发明的一个实施方案中,本发明提供了一种噻螨酮胶体金层析检测装置,包括试纸条和反应杯,如图1所示,试纸条包含底板以及在其上依次铺设的样品吸收垫、反应膜和吸水纸,该反应膜在样品吸收垫至吸水纸方向上包括检测线和质控线,检测线由噻螨酮抗原制备获得;如图2所示,反应杯包含胶体金标记的噻螨酮抗体,噻螨酮抗体为特异性地针对噻螨酮抗原的鼠源单克隆抗体,并且质控线为针对该噻螨酮抗体的羊抗鼠抗抗体。
在本发明的一个实施方案中,可以通过下述制备方法来制备本发明的噻螨酮胶体金层析检测装置:制备反应膜,采用本发明的噻螨酮抗原在反应膜上进行线性点样制备检测线,并采用针对噻螨酮抗体的羊抗鼠抗抗体通过线性点样制备质控线;在底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品吸收垫、反应膜和吸水纸,由此组装成试纸条;将本发明的胶体金标记的噻螨酮抗体加入微孔反应杯、冻干后,将微孔反应杯加上微孔塞。该制备方法中使用到的各成分或者组件如上文针对本发明的噻螨酮胶体金层析检测装置所描述。
根据本发明的第七方面,本发明提供了一种检测样品中噻螨酮的方法,该方法使用本发明提供的噻螨酮胶体金层析检测装置进行检测。
在本发明中,该样品可以为任何疑似噻螨酮残留量超标的样品,其可以是蔬菜或水果等。
根据本发明的一些实施方案,在采用本发明的方法检测样品中的噻螨酮之前,可以根据样品的不同对其进行前处理,处理方法为本领域已知的用于检测的样品处理的一般方法,在此不对其进行特别限定。
在进一步的方案中,在对样品进行预处理之后,将其滴加至微孔反应杯中,混匀后,将试纸条插入微孔反应杯,待检样品溶液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散,若观察到质控线显现出紫红色条带,则指示该检测系统成立、可用。图3示出了根据本发明的一些实施例的采用本发明提供的方法检测噻螨酮的判定结果,判断方法如下:
(1)若检测线(T线)不显色,或者与质控线(C线)相比显色更浅,则表明样品中含有噻螨酮。因为待检样品液中含有噻螨酮时,扩散过程中待检样品液中的噻螨酮可与金标抗体相结合,进而完全封闭金标抗体上噻螨酮的抗原结合点,阻止金标抗体与反应膜上的噻螨酮抗原结合,T线不显色或T线颜色比C线颜色更浅,而抗抗体则可与金标抗体结合,C线显色。
(2)若检测线同质控线一样显现出紫红色条带,并且检测线的颜色深度与质控线的颜色深度相当或者更深,则表明样品不含噻螨酮。因为待检样品液中不含噻螨酮时,金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭,进而金标抗体会与反应膜上的噻螨酮抗原偶联结合,T线显色,同时抗抗体也可与金标抗体结合,C线亦显色,此时,T线颜色比C线颜色深或颜色相同。
(3)若反应膜上T线和C线均未显色,则试纸条失效。
本发明的有益效果:
本发明提供了一种噻螨酮半抗原,以及制备该噻螨酮半抗原的方法,同时还提供了相应的噻螨酮抗原和噻螨酮抗体,此外还将其应用于免疫学检测中,并且由此提出了噻螨酮胶体金层析检测装置和检测样品中噻螨酮的方法。
在制备噻螨酮半抗原的方法中,通过多步合成来制备噻螨酮半抗原,所制备的噻螨酮半抗原最大程度地保留了噻螨酮的特征结构,增强了噻螨酮半抗原的免疫性,并且同时通过进行适当的化学修饰引入了与载体蛋白偶联的活性基团-羧基,为后续建立噻螨酮的各种免疫分析方法提供基础。本发明的噻螨酮半抗原的制备,使用的化学试剂容易得到,实验操作过程容易掌握,每步反应产率较高,并且与仪器方法相比较,其检测成本较低。
此外,本发明提供的噻螨酮胶体金层析检测装置利用层析式免疫胶体金原理,通过试纸条中检测线与质控线之间的比色来半定量检测诸如水果或蔬菜等中的噻螨酮农药残留。该检测装置能够快速、准确地检测出诸如水果或蔬菜等中的噻螨酮农药残留,能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。
与现有技术相比,本发明提供的免疫学检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、保质期长等优点。本发明可应用于需要进行噻螨酮农药残留的快速检测的各个领域中。
下面结合附图和实施例对本发明进行更为具体和详细的描述,实施例仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明。若无特殊说明,本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1:噻螨酮半抗原的制备与鉴定
实施例1-1
制备:1)称取15g 4-羟基苯丙酮、13g 3-溴丙烯溶解于100ml DMF中,再加入15g碳酸钾,于60-90℃反应,直至反应结束,冷却至室温,加水,用乙酸乙酯萃取,有机相减压旋蒸,除去溶剂,得到17.3g中间体1-1;
2)将15g中间体1-1与5.3g盐酸羟胺用甲醇溶解后,回流反应若干小时,反应完之后用NaOH溶液将其调为中性,蒸干溶剂,有大量固体析出,加水洗涤、晾干,得到19.1g中间体2-1。
3)将18g中间体2-1在甲苯中溶解后加入8.9g三乙胺,降温至0℃,滴加10g甲磺酰氯,滴加完毕后,保温反应1h,加水,搅拌30min,分层除去水相;加入4.8g甲醇钠溶液以及1.5g四丁基溴化铵,于0℃下反应,直至反应结束,加水,搅拌30min,分层除去水相,加入20ml浓盐酸,保温反应1h,抽滤,干燥得到酮胺盐酸盐12g,即为中间体3-1。
4)将10g中间体3-1用甲醇溶解后分批加入1.85g硼氢化钠,反应结束后,直接蒸干溶剂,得到中间体4-1。
5)将10g中间体4-1用2.25g 20%KOH溶液溶解后,加入3.1g CS2,在55℃下搅拌反应过夜,反应结束后,冷却至室温,减压旋蒸,蒸出未反应的CS2,加入6N HCl将溶液调为微酸性,例如pH范围为5-6,用乙酸乙酯萃取2-3遍,合并有机相蒸干,过柱纯化,得到12.5g中间体5-1。
6)将约2.4g中间体5-1溶于25ml甲醇,室温下,将12ml 20%甲醇钠的甲醇溶液缓慢滴加,搅拌0.5h;然后在不高于40℃下缓慢滴加4.1g 30%的H2O2,滴加完毕,室温下继续反应2h,反应结束后用6N HCl将溶液pH调为中性,蒸除甲醇后有大量白色沉淀析出,过滤,蒸馏水洗涤后烘干,得到白色固体1.5g,即为中间体6-1。
7)将上步得到的1.5g中间体6-1投入250mL单口烧瓶中,加入乙腈25mL、水38mL,然后加入高碘酸钠1.3g,再加入三氯化钌0.1g,最后加入四氯化碳25mL。将混合体系加热60℃回流2h。然后蒸干溶剂,加水,用乙酸乙酯萃取,有机相蒸干后,过柱纯化,得到1.1g中间体7-1。
8)将1.1g中间体7-1用10ml四氢呋喃溶解后,加入0.62g DBU、0.51g环己基异氰酸酯,于80℃反应搅拌过夜,待反应结束后,蒸干溶剂,加水及少量6N HCl将溶液调为微酸性,例如pH范围为5-6,用乙酸乙酯萃取2-3遍,合并有机相,蒸干后,过柱纯化,得到白色固体1.2g。
鉴定:采用质谱法来鉴定噻螨酮半抗原,所得到的质谱图如图4所示。从质谱图可以看出,半抗原的分子离子峰为m/z 391.3[M-H]-,且为最高峰,与噻螨酮半抗原的分子量(392.14)相符,表明成功合成了噻螨酮半抗原。
实施例1-2
制备:1)称取15g 4-羟基苯丙酮、16g 4-溴丁烯溶解于100ml DMF中,再加入30g碳酸钾,60-90℃反应,直至反应结束,然后冷却至室温,加水,用乙酸乙酯萃取,有机相减压旋蒸,除去溶剂,得到17.5g中间体1-2。
2)将15g中间体1-2与6.6g盐酸羟胺用甲醇溶解后,回流反应若干小时,反应完之后用NaOH溶液将其调为中性,蒸干溶剂,有大量固体析出,加水洗涤、晾干,得到19.0g中间体2-2。
3)将18g中间体2-2在甲苯中溶解后加入14g三乙胺,降温至0℃,滴加12g甲磺酰氯,滴加完毕后,保温反应1h,加水,搅拌30min,分层除去水相;加入5.0g甲醇钠溶液以及2.5g四丁基溴化铵,0℃下反应,直至反应结束,加水,搅拌30min,分层除去水相,加入20ml浓盐酸,保温反应1h,抽滤,干燥,得到12.2g酮胺盐酸盐,即为中间体3-2。
4)将10g中间体3-2用甲醇溶解后分批加入2.3g硼氢化钠,反应结束后直接蒸干溶剂备用,得到中间体4-2。
5)将10g中间体4-2用2.8g 20%KOH溶液溶解后,加入3.8g CS2,在55℃下搅拌反应过夜,反应结束后,冷却至室温,减压旋蒸,蒸出未反应的CS2,加入6N HCl将溶液调为微酸性,例如pH范围为5-6,用乙酸乙酯萃取2-3遍,合并有机相蒸干,过柱纯化,得到12.4g中间体5-2。
6)将约4.8g中间体5-2溶于50ml甲醇,室温下将26ml 20%甲醇钠的甲醇溶液缓慢滴加,搅拌0.5h;然后在不高于40℃下缓慢滴加8.5g 30%的双氧水,滴加完毕,室温下继续反应2h,反应结束后用6N HCl将溶液pH调为中性,蒸除甲醇后有大量白色沉淀析出,过滤,蒸馏水洗涤后烘干,得到3.2g白色固体,即为中间体6-2。
7)将上步得到的3.0g中间体6-2投入250mL单口烧瓶中,加入乙腈25mL、水38mL,然后加入高碘酸钠2.8g,再加入三氯化钌0.3g,最后加入四氯化碳25mL。将混合体系加热60℃回流2h。然后蒸干溶剂,加水,用乙酸乙酯萃取,有机相蒸干后过柱纯化,得到2.1g中间体7-2。
8)将2.0g中间体7-2用20ml四氢呋喃溶解后,加入1.3g DBU、1.8g环己基异氰酸酯于80℃反应搅拌过夜,待反应结束后,蒸干溶剂,加水及少量6N HCl将溶液调为微酸性,例如pH范围为5-6,用乙酸乙酯萃取2-3遍,合并有机相,蒸干后过柱纯化,得到白色固体1.5g。
经质谱法鉴定,步骤8)所得的白色固体为噻螨酮半抗原。
实施例2:噻螨酮抗原的制备与鉴定
制备:取实施例1-1制备的噻螨酮半抗原0.25mmol溶于4mL二甲基甲酰胺(DMF)中,搅拌加入0.5mmol二环己基碳二亚胺(DCC)和0.35mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。4℃下磁力搅拌反应过夜,离心后上清液为A液,称取BSA180mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH=8.0)中。加入DMF 1.5mL,搅拌溶解制备B液,磁力搅拌下,A液逐渐滴入B液中,4℃下反应12h。离心后,取上清液,4℃下用生理盐水透析3天,每天更换3次透析液。得到的全抗原以2mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中。同时还以同样的方式制备了以OVA为载体蛋白的噻螨酮抗原。
鉴定:将载体蛋白BSA、OVA、噻螨酮半抗原、相应的噻螨酮抗原用pH=7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液,以0.01mol/L pH=7.4PBS调零,用紫外分光光度计在波长200nm~800nm范围内扫描,得到载体蛋白BSA、OVA、噻螨酮半抗原、相应的噻螨酮抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线,比较偶联前后的各物质的最高吸光值,结果表明免疫原的吸收曲线与噻螨酮半抗原、BSA、OVA明显不同,是一种BSA或OVA和噻螨酮半抗原的累加吸收特征,这表明噻螨酮半抗原与载体蛋白BSA、OVA偶联成功,见图5-1和图5-2。
实施例3:噻螨酮抗体的制备
3.1动物免疫
利用实施例2得到的噻螨酮免疫抗原,免疫4只6周龄BALB/C小鼠,免疫剂量为200μg/只,加强免疫三次后,使其产生抗血清。
3.2细胞融合和克隆化
在无菌条件下,取免疫BALB/C小鼠脾脏制备脾细胞,数量配比按脾细胞:骨髓瘤细胞(SP2/0)=8﹕1进行融合,经3次以上的克隆培养和检测,筛选得到稳定分泌抗噻螨酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3.3细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成5×106个/mL的细胞悬液,在液氮中长期保存。复苏时从液氮灌中取出冻存管,快速放入37℃温水浴中,并轻轻摇动使其尽快融化,离心去除冻存液后,移入细胞培养瓶内培养。
3.4单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法:将杂交瘤细胞置于细胞培养基中,在37℃条件下进行培养,用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化,得到单克隆抗体,-20℃保存。
该细胞培养基为向RPMI 1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠,使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%(质量百分含量),使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%(质量百分含量);所述细胞培养基的pH为7.4。
实施例4:噻螨酮胶体金层析检测装置的制备
4.1胶体金的制备
取1%氯金酸溶液1mL,加99mL超纯水成终浓度0.01%的氯金酸溶液,加热沸腾后,取1%柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中,继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色,颜色稳定后继续加热5min,室温冷却,补充失水至原体积。
4.2胶体金标记的单克隆抗体的制备
调节胶体金溶液pH值至7.5,用恒速搅拌器均匀搅拌,同时逐滴加入噻螨酮的单克隆抗体,1h后加入抗体量相当的聚乙二醇(PEG),充分反应30min后加入抗体量相当的BSA,加完后,继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min获得均一性金标抗体沉淀,再加磷酸盐缓冲液(PBS)重悬备用。
4.3胶体金检测装置的制备:
制备硝酸纤维素膜:在该硝酸纤维素膜上将实施例2制备的噻螨酮抗原进行线性点样,由此形成检测线;并将羊抗鼠抗抗体(以羊作为免疫动物,以实施例3制备的鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫获得)进行线性点样,由此形成质控线。
制备试纸条:在PVC底板上,沿同一方向依次将样品吸收垫(玻璃纤维棉)、制备好的硝酸纤维素膜和吸水垫(吸水滤纸)依次搭接粘连,由此获得试纸条。
制备微孔反应杯:将所制备的胶体金标记的单克隆抗体加入至微孔反应杯中,冻干,由此形成所需的微孔反应杯。
噻螨酮胶体金层析检测装置:将所得到的试纸条和所得到的微孔反应杯组合的一起,形成本发明的噻螨酮胶体金层析检测装置。
实施例5:噻螨酮农药残留量的检测
5.1样品前处理
取2g±0.1g剪碎或搅碎后的样品加入到15mL或50mL离心管中;量取并加入8mL样品提取液,充分震荡混匀,即为待测液。
5.2用实施例4制备的噻螨酮胶体金层析检测装置进行检测
取出胶体金层析检测装置中的微孔反应杯置于板架中;拧开试剂瓶的上盖,垂直滴入8~10滴(约200μL)稀释液于微孔反应杯;用塑料吸管上下抽吸1~3次混匀;将试纸条插入到微孔反应杯中,于20~40℃反应3分钟;从微孔反应杯中取出测试条,并进行结果判读。
5.3判读检测结果
阴性(-):若T线颜色比C线颜色深或颜色相同,表示样品中不含噻螨酮化学成分或其残留量低于本产品的检出限。
阳性(+):若T线颜色比C线颜色浅,或只有C线显色(T线不显色),表示样品中含有噻螨酮化学成分在本产品的检出限附近或高于本产品的检出限。
无效:T和C线均未显色,表明试纸条失效,建议更换试纸条重复测定。
实施例6.噻螨酮胶体金层析检测装置的灵敏度
设置一系列的浓度梯度,噻螨酮浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.5、1mg/L,用噻螨酮胶体金层析检测装置进行测试,测试后使用仪器比较检测线与质控线颜色深浅。当噻螨酮浓度为0.1mg/L时,检测线颜色深度为质控线的90%以下,因此其灵敏度为0.1mg/L。
选取0.1mg/L平行实验5次,统计检测限颜色深度与质控线颜色深度的比例,其CV值小于15%。
实施例7.噻螨酮胶体金层析检测装置的特异性
在阴性的液体样品中,分别加入噻螨酮0.1mg/L、丙溴磷0.5mg/L、克百威0.02mg/L、甲氰菊酯2mg/L、啶虫脒0.2mg/L、氟虫腈2mg/L。
实验结果发现,只有加入噻螨酮的样品检出为阳性,而加入有机磷类农药(丙溴磷)、氨基甲酸酯类农药(克百威)、菊酯类农药(甲氰菊酯)、杀虫剂类农药(啶虫脒)、杀菌剂类农药(氟虫腈)的样品检出结果为阴性,说明本检测装置对噻螨酮的特异性好,对其它类型农药无交叉反应。
实施例8.噻螨酮胶体金层析检测装置的保质期测定
用三批常规生产的产品分别做保质期实验,放置于室内室温环境保持,每隔1个月取8个装置,用质控样本检测,分别做阴性,0.1mg/L,0.5mg/L和1mg/L样品,重复三次,观察数据变化,考察保质期时间。
阴性显色从13个月开始下降,在1年时间内产品品质无明显变化,因此确定保质期为1年。
以上仅为本发明的较佳实施方案而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。