CN101434652A - 一种拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体及其制备方法 - Google Patents
一种拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体及其制备方法，所述的人工抗原为拟除虫菊酯类农药人工抗原化合物，包含大部分拟除虫菊酯类农药的共性结构，所述的人工抗体为用所述抗原化合物通过免疫动物制备能与两种以上拟除虫菊酯农药发生特异性免疫反应的多克隆免疫球蛋白G。本发明的优势在于制备拟除虫菊酯类农药人工抗原的半抗原易于获得，对环境友好，因而人工抗原制备成本低，在制备的人工抗原中同时保留了拟除虫菊酯类农药共同具有的酯键结构，有利于制备出高质量抗体；本发明提供的抗体具有灵敏度高和识别多种拟除虫菊酯类农药的优点；本发明的抗体可用于开发农产品及食品中拟除虫菊酯类农药多残留免疫快速分析技术、方法和产品。
Description
技术领域
本发明涉及选择一种具有-COOH的、又包含拟除虫菊酯类农药大部分共性结构的化合物作为半抗原制备的拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体及其制备方法。
背景技术
农药残留问题已经成为当今社会普遍关注的热点问题。拟除虫菊酯类农药是三大类杀虫剂之一，具有杀虫谱广、毒性中等、蓄积性等特点。随着高毒性的有机磷、氨基甲酸酯农药品种的禁用或限用，拟除虫菊酯类农药的使用越来越广泛，但这类农药残留问题也日益显现。拟除虫菊酯类农药残留超标问题是我国茶叶等农产品出口贸易中最多见的问题。因此，监控拟除虫菊酯类农药残留意义重大。
农药残留检测技术特别是快速检测技术是对农药残留进行监控的有效手段。免疫分析技术是农药残留快速检测技术研究的热点，其研究流程分为(1)农药半抗原设计与合成，(2)农药人工抗原制备，(3)农药抗体制备，(4)农药残留免疫分析方法建立、应用评价等四个部分。农药人工抗原与抗体是农药残留免疫分析技术的核心试剂。因此，农药人工抗原与抗体的制备方法是农药残留免疫分析技术研究的重要内容。
根据拟除虫菊酯类农药杀虫机理的差异，该类农药通常被学者们划分为两类，即I型拟除虫菊酯类农药和II型拟除虫菊酯类农药。I型拟除虫菊酯类农药不含有氰基，其结构通式如下：
可见，R基团以外的不带氰基的酯和二苯氧基结构为I型拟除虫菊酯类农药共性结构。这类农药品种主要有氯菊酯、苯醚菊酯、戊菊酯等。II型拟除虫菊酯类农药含有氰基，其结构通式如下：
可见，R基团以外的带氰基的酯和二苯氧基结构为II型拟除虫菊酯类农药共性结构。这类农药品种主要有溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯等。
当前，农药残留免疫分析技术研究已经从以单一农药残留为研究对象向以一类或多种农药残留为研究对象转变。在拟除虫菊类农药通用抗原与抗体制备方面，Lee等人(1998年发表在《Journal of Agricultural Food and Chemistry》期刊上)针对II型拟除虫菊酯农药的结构特点，合成了不同连接臂位点的半抗原，生产了多种多克隆抗体，建立了拟除虫菊酯农药多残留免疫分析方法，该ELISA方法对I型和II型共15种拟除虫菊酯农药(含代谢产物)有很强的灵敏度，IC50都在1ppm以下。Mak等人(2005年发表在《Analytica Chimica Acta》期刊上)合成了2种结构的II拟除虫菊酯类免疫用半抗原，并制备了相应的人工抗原和抗体，建立的拟除虫菊酯类农药通用ELISA方法对多种农药检测灵敏度都有明显提高。Watanabe等人(2001年发表在《Analytica Chimica Acta》期刊上)以氯菊酯(Permethrin)衍生物作为免疫用半抗原，并制备相应的抗原与抗体，建立了I型拟除虫菊酯的多残留ELISA方法，该方法对9种I型拟除虫菊酯农药有交叉反应。骆爱兰等人(2005年发表在《中国农业科学》)以菊酯类农药的合成中间体间苯氧基苯甲酸为半抗原建立通用ELISA方法，该方法对氯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯和氰戊菊酯的IC50分别为4.1、4.2、4.3、4.9、9.0、77.4ppm。
目前国外已经报道的拟除虫菊酯类农药人工抗原制备方法中，与载体蛋白偶联的半抗原的合成条件十分苛刻，而且合成步骤较多，人工抗原的获得难度大，制备成本高；国内报道的拟除虫菊酯类农药人工抗原虽然易于获得，但其制备的抗体的分析灵敏度较低。本专利内容是利用一种非常容易得到的新的半抗原制备拟除虫菊酯类农药人工抗原，所制备的人工抗原能够通过免疫动物制备得到高质量的可用于农药残留分析的抗体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，提供一种以能保留拟除虫菊酯类农药大部分共性结构的化合物作为半抗原制备的拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体及其制备方法，且制备方法简便。
本发明人工抗原、抗体的技术方案为：
所述的人工抗原为拟除虫菊酯类农药人工抗原化合物，包含大部分拟除虫菊酯类农药的共性结构，又具有与氨基酸偶联的-COOH，它的分子结构式为
其中R＝H或CN；所述的人工抗体为用所述抗原化合物通过免疫动物制备所得到的多克隆抗体，是用分子结构式为
其中R＝H或CN的拟除虫菊酯类农药人工抗原免疫动物所得到的、能与两种以上拟除虫菊酯农药发生特异性免疫反应的多克隆免疫球蛋白G。
按上述方案，所述的人工抗原是以
为半抗原，其中R＝H或CN，与蛋白质共价偶联合成，中半抗原与蛋白质的结合比在3～120:1，蛋白质为牛血清白蛋白或血蓝蛋白或卵清蛋白。
按上述方案，所述的制备多克隆抗体的免疫动物为白兔。
上述人工抗原、抗体制备方法的技术方案为：
1)先合成半抗原化合物，所述的半抗原化合物为拟除虫菊酯类半抗原化合物，其结构式为：
其中R＝H或CN；
2)以合成半抗原化合物与蛋白质偶联制备人工抗原，包括免疫抗原和包被抗原，方法如下：
将0.05-0.1mmol的半抗原化合物
等摩尔量的N，N-二环己基碳二亚胺和等摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺溶解在0.1-1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，4-30℃下搅拌反应2-15小时，反应结束后，将反应混合物放在0-4℃环境中3小时以上，然后离心分层，取上清液0.1-1mL并缓慢加入到2-8mL浓度为10-30mg/mL的蛋白质碳酸盐缓冲溶液中，在搅拌下反应4-15小时，待反应完成后，装入透析袋，用pH7.4的常规磷酸盐缓冲液作透析液透析68次，其中每隔4-10小时换一次透析液，最后一次透析后透析袋中即为制备的拟除虫菊酯类人工抗原溶液，亦即(其中R＝H或CN)
溶液，可经分装后冻存；
3)以上述合成的人工抗原溶液免疫动物制备拟除虫菊酯类多克隆抗体——免疫球蛋白G。
按上述方案，所述的拟除虫菊酯类半抗原化合物的合成方法为：
将间苯氧基苯甲醇(或α-氰基间苯氧基苯甲醇)溶解在二氯甲烷中，配成浓度为0.3～3mol/L的溶液，待冷却至反应温度后加入反应容器中；将丁二酸酐溶解在二氯甲烷中，配成浓度为0.3～3mol/L的溶液，待冷却至反应温度后向反应容器中滴加，滴加完后搅拌反应2～15小时，反应温度为0～40℃，反应原料间苯氧基苯甲醇和丁二酸酐的摩尔比为1:0.5～2，反应结束后即生成拟除虫菊酯类半抗原化合物
其中R＝H或CN；所述的间苯氧基苯甲醇或为α-氰基间苯氧基苯甲醇。
按上述方案，制备人工抗原中所用的蛋白质为牛血清白蛋白或血蓝蛋白，制备出的人工抗原为免疫抗原；所用的蛋白质为卵清蛋白，制备出的人工抗原为包被抗原。
按上述方案，所述的人工抗原溶液免疫动物制备拟除虫菊酯类多克隆抗体——免疫球蛋白G的方法为：
选择体重2-3kg约3个月龄健康的白兔，采用皮内、皮下或大腿肌肉部位注射人工抗原，每次每只被免疫白兔的抗原用量为0.2-4mg，第一次免疫的抗原用完全佐剂乳化后再免疫，以后的抗原均用不完全佐剂乳化后再免疫；每次免疫后第7-10天耳缘静脉采血，常规方法制备抗血清，抗血清经适当稀释后采用间接酶联免疫吸附分析即间接ELISA方法测定抗血清效价，待效价大于或等于100000:1以后，白兔颈动脉采血，常规方法制备大批量抗血清，这些抗血清即为拟除虫菊酯类多克降抗体，经分装后冻存。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供了一种简单有效的拟除虫菊酯类农药人工抗原及其制备方法，与已有报道的拟除虫菊酯类农药人工抗原相比，木发明的优势在于制备拟除虫菊酯类农药人工抗原的半抗原易于获得，对环境友好，因而人工抗原制备成本低，在制备的人工抗原中同时保留了拟除虫菊酯类农药共同具有的酯键结构，有利于制备出高质量抗体；2、本发明提供的抗体具有灵敏度高和识别多种拟除虫菊酯类农药的优点；3、本发明所提供的高质量拟除虫菊酯类农药人工抗原和抗体，可用于开发农产品及食品中溴氰菊酯、氯氰菊酯、功夫菊酯、苯醚菊酯、氯菊酯等拟除虫菊酯类农药多残留免疫快速分析技术、方法和产品。
具体实施方式
以下进一步说明本发明的实施例。
实施例1
1)半抗原合成方法如下：
将1.63g(5mmol)α-氰基间苯氧基苯甲醇溶解在5mL二氯甲烷中，配成浓度为1mol/L的溶液，待冷却至反应温度后加入反应瓶中；将0.62g(6mmol)丁二酸酐溶解在2mL二氯甲烷中，配成浓度为3mol/L的溶液，待冷却至反应温度后向反应瓶中滴加，滴加完后搅拌反应12小时，反应温度为14℃，反应原料α-氰基间苯氧基苯甲醇和丁二酸酐的摩尔比为1:1.2。反应结束后即生成拟除虫菊酯类半抗原
(其中R＝CN)。
采用电喷雾质谱和核磁共振两种方法对生成的I型拟除虫菊酯类通用半抗原进行结构鉴定，鉴定结果为：ESI-MS：324(M-H)-(100％)；1H NMR(CDCl3)δ 2.683-2.752(m，4H，CH2CH2)，6.384(s，2H，CH2)，7.027-7.406(m，9H，ArH)，与理论值基本吻合，证明半抗原合成成功。
2)以合成出的半抗原化合物与蛋白质偶联制备人工抗原，包括免疫抗原与包被抗原，方法如下：
将0.053g(0.16mmol)以上合成的半抗原
(其中R＝CN)、等摩尔量的N，N-二环己基碳二亚胺和等摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺溶解在0.4mL的N，N-二甲基甲酰胺中，20℃下搅拌反应4小时，反应结束后，将反应混合物放在4℃环境中3小时以上，然后离心分层，取上清液0.32mL，均分为两等份，并分别缓慢加入到3mL浓度为20mg/mL牛血清白蛋白和3mL浓度为25mg/mL卵清蛋白的碳酸盐缓冲溶液中，在搅拌下反应12小时，待反应完成后，装入透析袋，用pH7.4的常规磷酸盐缓冲液作透析液透析8次，其中每隔8小时换一次透析液，最后一次透析后透析袋中即为制备的拟除虫菊酯类人工抗原溶液，亦即免疫抗原
(其中R＝CN，protein为牛血清白蛋白)的溶液和包被抗原
(其中R＝CN，protein为卵清蛋白)的溶液，经分装后在-20℃冻存。
人工抗原的鉴定：按合成以上拟除虫菊酯类人工抗原所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外光谱(200-400nm)扫描测定，通过比较三者278nm的吸光值并建立不同半抗原和载体蛋白比例下吸光值变化的标准曲线计算结合比。经计算，免疫抗原半抗原
(其中R＝CN，protein为牛血清白蛋白)的半抗原与载体蛋白的结合比为27:1，包被抗原
(其中R＝CN，protein为卵清蛋白)的半抗原与载体蛋白的结合比为15:1。
3)以上合成的免疫抗原(其中R＝CN，protein为牛血清白蛋白)溶液免疫动物制备拟除虫菊酯类多克隆抗体——免疫球蛋白G，方法如下：
选择体重2-3kg约3个月龄健康的新西兰白兔，采用皮内、皮下或大腿肌肉部位注射人工抗原，每次每只被免疫新西兰白兔的免疫抗原用量为2mg，第一次免疫的免疫抗原用弗氏完全佐剂乳化后再免疫，以后的免疫抗原均用弗氏不完全佐剂乳化后再免疫。每次免疫后第8天耳缘静脉采血，常规方法制备抗血清，抗血清经适当稀释后采用间接酶联免疫吸附分析即间接ELISA方法测定抗血清效价，待效价大于100000:1以后，新西兰白兔颈动脉采血，常规方法制备大批量抗血清，这些抗血清即为拟除虫菊酯类多克隆抗体，经分装后冻存。
以上抗体效价测定：间接非竞争每年免疫吸附分析方法操作如下：用pH9.6常规碳酸盐缓冲液稀释包被抗原
(其中R＝CN，protein为卵清蛋白)到1μg/mL，并以每孔50μL的量加入酶联分析板中，37℃包被2小时后，常规磷酸盐-吐温洗涤缓冲液洗涤3次；每孔加入100μL浓度为3％(mg/mL)脱脂奶粉，在37℃下封闭2小时，常规磷酸盐吐温洗涤缓冲液洗涤3次；每孔加入50μL逐级稀释的拟除虫菊酯类多克隆抗体，37℃下反应1小时，常规磷酸盐-吐温洗涤缓冲液洗涤6次；每孔加入50μL辣根过氧化物酶标记的羊抗兔，37℃下反应1小时，常规磷酸盐-吐温洗涤缓冲液洗涤6次；每孔加入50μL四甲基联苯胺的常规显色液，37℃下暗处反应12分钟；每孔加入25μL 2mol/L的硫酸终止反应；最后到酶联仪上在450nm波长下读数，结果如下表：
| 抗血清稀释倍数 | 吸光值 | 对应的阴性对照值 |
| 1600 | 1.424 | 0.298 |
| 6400 | 1.372 | 0.134 |
| 16000 | 1.304 | 0.140 |
| 64000 | 1.193 | 0.085 |
| 160000 | 1.086 | 0.091 |
| 640000 | 0.184 | 0.066 |
数据表明，此实施例制备的拟除虫菊酯类多克隆抗体效价很高。
以上抗体识别特异性测定：采用间接竞争酶联免疫吸附分析方法，选择拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯、氯氰菊酯和功夫菊酯、氨基甲酸酯类农药克百威和甲萘威、有机磷类农药对硫磷和甲胺磷，共7种农药用于交叉反应测定，以评价抗体识别特异性。在间接竞争酶联免疫吸附分析方法中，抗体稀释200000倍，并与等体积的一系列梯度浓度的农药标准品混匀，然后再以每孔50μL的量加入酶联分析板中，其他与间接非竞争酶联吸附分析方法的操作相同。根据测定结果制作测定曲线，然后找出50％抑制率时对应的农药浓度，即IC50，将生产上最常用的溴氰菊酯农药交叉反应率定为100％，计算出抗体对其他农药的交叉反应率，交叉反应率越大说明抗体该供试农药的识别能力越强，从而评价抗体识别特异性。结果见下表：
结果表明，该实施例制备的抗体对拟除虫菊酯类农药具有很强的识别特异性。
实施例2
1)根据本申请人已申请的发明专利《I型拟除虫菊酯类农药通用半抗原及其合成方法》(申请号：)中的方法合成半抗原，合成方法如下：
将间苯氧基苯甲醇1.18g(5mmol)溶解于二氯甲烷5mL，配成1mol/L的溶液，冷却至18℃，待冷却至18℃后加入反应瓶中；将丁二酸酐1.02g(10mmol)溶解于二氯甲烷10mL，配成1mol/L的溶液，冷却至18℃后向反应瓶中滴加，滴加完后搅拌反应15小时，反应温度为18℃，反应原料间苯氧基苯甲醇和丁二酸酐的摩尔比为1:2。反应结束后采用旋转蒸发的方法除去大部分有机溶剂，然后采用硅胶柱色谱的方法进行纯化，得白色固体产物1.47g(4.9mmol)，产率98％，反应结束后即生成拟除虫菊酯类半抗原
(其中R＝H)。
采用电喷雾质谱和核磁共振两种方法对步骤1)生成的拟除虫菊酯类通用半抗原进行结构鉴定，鉴定结果为：ESI-MS：299(M-H)-(100％)；1H NMR(CDCl3)δ 2.664-2.704(m，4H，CH2CH2)，5.109(s，2H，CH2)，6.940-7.360(m，9H，ArH)，与理论值基本吻合，证明半抗原合成成功。
2)以合成出的半抗原化合物与蛋白质偶联制备人工抗原，包括免疫抗原与包被抗原，方法如下：
将0.042g(0.14mmol)以上合成的半抗原
(其中R＝H)、等摩尔量的N，N-二环己基碳二亚胺和等摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺溶解在0.4mL的N，N-二甲基甲酰胺中，20℃下搅拌反应4小时，反应结束后，将反应混合物放在4℃环境中3小时以上，然后离心分层，取上清液0.32mL，均分为两等份，并分别缓慢加入到3mL浓度为20mg/mL牛血清白蛋白和3mL浓度为25mg/mL卵清蛋白的碳酸盐缓冲溶液中，在搅拌下反应12小时，待反应完成后，装入透析袋，用pH7.4的常规磷酸盐缓冲液作透析液透析8次，其中每隔8小时换一次透析液，最后一次透析后透析袋中即为制备的拟除虫菊酯类人工抗原溶液，亦即免疫抗原
(其中R＝H，protein为牛血清白蛋白)的溶液和包被抗原
(其中R＝H，protein为卵清蛋白)的溶液，经分装后在-20℃冻存。
人工抗原的鉴定：按合成以上拟除虫菊酯类人工抗原所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外光谱(200-400nm)扫描测定，通过比较三者278nm的吸光值并建立不同半抗原和载体蛋白比例下吸光值变化的标准曲线计算结合比。经计算，免疫抗原半抗原(其中R＝H，protein为牛血清白蛋白)的半抗原与载体蛋白的结合比为23:1，包被抗原
(其中R＝H，protein为卵清蛋白)的半抗原与载体蛋白的结合比为14:1。
3)以上合成的免疫抗原
(其中R＝H，protein为牛血清白蛋白)溶液免疫动物制备拟除虫菊酯类多克隆抗体——免疫球蛋白G，方法如下：
选择体重2-3kg约3个月龄健康的新西兰白兔，采用皮内、皮下或大腿肌肉部位注射人工抗原，每次每只被免疫新西兰白兔的免疫抗原用量为2mg，第一次免疫的免疫抗原用弗氏完全佐剂乳化后再免疫，以后的免疫抗原均用弗氏不完全佐剂乳化后再免疫。每次免疫后第8天耳缘静脉采血，常规方法制备抗血清，抗血清经适当稀释后采用间接酶联免疫吸附分析即间接ELISA方法测定抗血清效价，待效价大于100000:1以后，新西兰白兔颈动脉采血，常规方法制备大批量抗血清，这些抗血清即为拟除虫菊酯类多克隆抗体，经分装后冻存。
以上抗体效价测定：间接非竞争每年免疫吸附分析方法操作如下：用pH9.6常规碳酸盐缓冲液稀释包被抗原(其中R＝H，protein为卵清蛋白)到1μg/mL，并以每孔50μL的量加入酶联分析板中，37℃包被2小时后，常规磷酸盐-吐温洗涤缓冲液洗涤3次；每孔加入100μL的浓度为3％(mg/mL)脱脂奶粉，在37℃下封闭2小时，常规磷酸盐-吐温洗涤缓冲液洗涤3次；每孔加入50μL逐级稀释的拟除虫菊酯类多克隆抗体，37℃下反应1小时，常规磷酸盐-吐温洗涤缓冲液洗涤6次；每孔加入50μL辣根过氧化物酶标记的羊抗兔，37℃下反应1小时，常规磷酸盐-吐温洗涤缓冲液洗涤6次；每孔加入50μL四甲基联苯胺的常规显色液，37℃下暗处反应12分钟；每孔加入25μL2mol/L的硫酸终止反应；最后到酶联仪上在450nm波长下读数，结果如下表：
| 抗血清稀释倍数 | 吸光值 | 对应的阴性对照值 |
| 1600 | 1.562 | 0.101 |
| 6400 | 1.503 | 0.067 |
| 16000 | 0.646 | 0.062 |
| 64000 | 0.388 | 0.058 |
| 160000 | 0.127 | 0.041 |
| 640000 | 0.092 | 0.042 |
数据表明，此实施例制备的拟除虫菊酯类多克隆抗体效价很高。
以上抗体识别特异性测定：采用间接竞争酶联免疫吸附分析方法，选择拟除虫菊酯类农药氯菊酯和苯醚菊酯、氨基甲酸酯类农药克百威和甲萘威、有机磷类农药对硫磷和甲胺磷，共6种农药用于交叉反应测定，以评价抗体识别特异性。在间接竞争酶联免疫吸附分析方法中，抗体稀释12000倍，并与等体积的一系列梯度浓度的农药标准品混匀，然后再以每孔50μL的量加入酶联分析板中，其他与间接非竞争酶联吸附分析方法的操作相同。根据测定结果制作测定曲线，然后找出50％抑制率时对应的农药浓度，即IC50，将生产上最常用的氯菊酯农药交叉反应率定为100％，计算出抗体对其他农药的交叉反应率，交叉反应率越大说明抗体对该供试农药的识别能力越强，从而评价抗体识别特异性。结果见下表：
结果表明，该实施例制备的抗体对拟除虫菊酯类农药具有很强的识别特异性。
实施例3
1)拟除虫菊酯类半抗原
(其中R＝CN)的合成与鉴定与同实施例1的步骤1)相同。
2)以合成出的半抗原化合物与蛋白质偶联制备人工抗原，包括免疫抗原与包被抗原，方法如下：
将0.11g(0.32mmol)以上合成的半抗原
(其中R＝CN)、等摩尔量的N，N-二环己基碳二亚胺和等摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺溶解在0.6mL的N，N-二甲基甲酰胺中，20℃下搅拌反应4小时，反应结束后，将反应混合物放在4℃环境中过夜(大于10小时)，然后离心，取上清液0.48mL，均分为两等份，并分别缓慢加入到3mL浓度为15mg/mL血蓝蛋白的碳酸盐缓冲溶液中，在搅拌下反应14小时，待反应完成后，装入透析袋，用pH7.4的常规磷酸盐缓冲液作透析液透析8次，其中每隔8小时换一次透析液，最后一次透析后透析袋中即为制备的拟除虫菊酯类人工抗原溶液，亦即免疫抗原
(其中R＝CN，protein为血蓝蛋白)的溶液，经分装后在-20℃冻存。包被抗原的制备与鉴定同实施例1步骤2)。
人工免疫抗原的鉴定：按合成以上拟除虫菊酯类人工抗原所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外光谱(200-400nm)扫描测定，通过比较三者278nm的吸光值并建立不同半抗原和载体蛋白比例下吸光值变化的标准曲线计算结合比。经计算，免疫抗原
(其中R＝CN，protein为血蓝蛋白)的半抗原与载体蛋白的结合比为86:1。
3)以合成出的
(其中R＝H或CN)溶液免疫动物制备拟除虫菊酯类多克隆抗体——免疫球蛋白G，方法如下：
选择体重2-3kg约3个月龄健康的新西兰白兔，采用皮内、皮下或大腿肌肉部位注射人工抗原，每次每只被免疫新西兰白兔的抗原用量为2mg，第一次免疫的抗原用弗氏完全佐剂乳化后再免疫，以后的抗原均用弗氏不完全佐剂乳化后再免疫。每次免疫后第7-10天耳缘静脉采血，常规方法制备抗血清，抗血清经适当稀释后采用间接酶联免疫吸附分析即间接ELISA方法测定抗血清效价，待效价大于100 000:1以后，新西兰白兔颈动脉采血，常规方法制备大批量抗血清，这些抗血清即为拟除虫菊酯类多克隆抗体，经分装后冻存。
以上抗体效价测定：间接非竞争每年免疫吸附分析方法操作如下：用pH9.6常规碳酸盐缓冲液稀释包被抗原
(其中R＝CN，protein为卵清蛋白)到1μg/mL，并以每孔50μL的量加入酶联分析板中，37℃包被2小时后，常规磷酸盐-吐温洗涤缓冲液洗涤3次；每孔加入100μL浓度为3％(mg/mL)脱脂奶粉，在37℃下封闭2小时，常规磷酸盐-吐温洗涤缓冲液洗涤3次；每孔加入50μL逐级稀释的拟除虫菊酯类多克隆抗体，37℃下反应1小时，常规磷酸盐-吐温洗涤缓冲液洗涤6次；每孔加入50μL辣根过氧化物酶标记的羊抗兔，37℃下反应1小时，常规磷酸盐-吐温洗涤缓冲液洗涤6次；每孔加入50μL四甲基联苯胺的常规显色液，37℃下暗处反应12分钟；每孔加入25μL2mol/L的硫酸终止反应；最后到酶联仪上在450nm波长下读数，结果如下表：
| 抗血清稀释倍数 | 吸光值 | 对应的阴性对照值 |
| 1600 | 1.604 | 0.202 |
| 6400 | 1.533 | 0.113 |
| 16000 | 0.978 | 0.086 |
| 64000 | 0.518 | 0.063 |
| 160000 | 0.203 | 0.051 |
| 640000 | 0.091 | 0.048 |
数据表明，此实施例制备的拟除虫菊酯类多克隆抗体效价很高。
以上抗体识别特异性测定：采用间接竞争酶联免疫吸附分析方法，选择拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯、氯氰菊酯和功夫菊酯、氨基甲酸酯类农药克百威和甲萘威、有机磷类农药对硫磷和甲胺磷，共7种农药用于交叉反应测定，以评价抗体识别特异性。在间接竞争酶联免疫吸附分析方法中，抗体稀释16000倍，并与等体积的一系列梯度浓度的农药标准品混匀，然后再以每孔50μL的量加入酶联分析板中，其他与间接非竞争酶联吸附分析方法的操作相同。根据测定结果制作测定曲线，然后找出50％抑制率时对应的农药浓度，即IC50，将生产上最常用的溴氰菊酯农药交叉反应率定为100％，计算出抗体对其他农药的交叉反应率，交叉反应率越大说明抗体该供试农药的识别能力越强，从而评价抗体识别特异性。结果见下表：
结果表明，该实施例制备的抗体对拟除虫菊酯类农药具有很强的识别特异性。
Claims (7)
1、一种拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体，其特征在于所述的人工抗原为拟除虫菊酯类农药人工抗原化合物，包含大部分拟除虫菊酯类农药的共性结构，它的分子结构式为
分子结构式中R＝H或CN；所述的人工抗体为用所述抗原化合物通过免疫动物制备所得到的多克隆抗体，所述的人工抗体是能与两种以上拟除虫菊酯农药发生特异性免疫反应的多克隆免疫球蛋白G。
2、按权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体，其特征在于所述的人工抗原是以
为半抗原，其中R＝H或CN，与蛋白质共价偶联合成，其中半抗原与蛋白质的结合比在3～120:1，蛋白质为牛血清白蛋白或血蓝蛋白或卵清蛋白。
3、按权利要求1或2所述的拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体，其特征在于所述的制备多克隆抗体的免疫动物为白兔。
4、一种如权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体的制备方法，其特征在于
1)先合成半抗原化合物，所述的半抗原化合物为拟除虫菊酯类半抗原化合物，其分子结构式为：
其中R＝H或CN；
2)以合成半抗原化合物与蛋白质偶联制备人工抗原，包括免疫抗原和包被抗原，方法如下：
将0.05-01mmol的半抗原化合物
等摩尔量的N，N-二环己基碳二亚胺和等摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺溶解在0.1-1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，4-30℃下搅拌反应2-15小时，反应结束后，将反应混合物放在0-4℃环境中3小时以上，然后离心分层，取上清液0.1-1mL并缓慢加入到2-8mL浓度为10-30mg/mL的蛋白质碳酸盐缓冲溶液中，在搅拌下反应4-15小时，待反应完成后，装入透析袋，用pH7.4的常规磷酸盐缓冲液作透析液透析6-8次，其中每隔4-10小时换一次透析液，最后一次透析后透析袋中即为制备的拟除虫菊酯类人工抗原溶液，亦即(其中R＝H或CN)
溶液，可经分装后冻存；
3)以上述合成的
人工抗原溶液免疫动物制备拟除虫菊酯类多克隆抗体——免疫球蛋白G。
5、按权利要求4所述的拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体的制备方法，其特征在于所述的拟除虫菊酯类半抗原化合物的合成方法为：
将间苯氧基苯甲醇(或α-氰基间苯氧基苯甲醇)溶解在二氯甲烷中，配成浓度为0.3～3mol/L的溶液，待冷却至反应温度后加入反应容器中；将丁二酸酐溶解在二氯甲烷中，配成浓度为0.3～3mol/L的溶液，待冷却至0～40℃后向反应容器中滴加，滴加完后搅拌反应2～15小时，反应温度为0～40℃，反应原料间苯氧基苯甲醇和丁二酸酐的摩尔比为1:0.5～2，反应结束后即生成拟除虫菊酯类半抗原化合物
其中R＝H或CN；所述的间苯氧基苯甲醇或为α-氰基间苯氧基苯甲醇。
6、按权利要求4所述的拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体的制备方法，其特征在于制备人工抗原中所用的蛋白质为牛血清白蛋白或血蓝蛋白，制备出的人工抗原为免疫抗原；所用的蛋白质为卵清蛋白，制备出的人工抗原为包被抗原。
7、按权利要求4所述的拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体的制备方法，其特征在于所述的人工抗原溶液免疫动物制备拟除虫菊酯类多克隆抗体——免疫球蛋白G的方法为：
选择体重2-3kg约3个月龄健康的白兔，采用皮内、皮下或大腿肌肉部位注射人工抗原，每次每只被免疫白兔的抗原用量为0.2-4mg，第一次免疫的抗原用完全佐剂乳化后再免疫，以后的抗原均用不完全佐剂乳化后再免疫；每次免疫后第7-10天耳缘静脉采血，常规方法制备抗血清，抗血清经适当稀释后采用间接酶联免疫吸附分析即间接ELISA方法测定抗血清效价，待效价大于或等于100000:1以后，白兔颈动脉采血，常规方法制备大批量抗血清，这些抗血清即为拟除虫菊酯类多克隆抗体，经分装后冻存。
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