CN104914101A

CN104914101A - 一种长春新碱的elisa检测方法

Info

Publication number: CN104914101A
Application number: CN201510313265.1A
Authority: CN
Inventors: 张晓娟; 郭俊岗
Original assignee: Datong Hospital Of Integrated Chinese Traditional Medicine And Western Medicine; Datong Urban Area Beiguan Community Health Service Center
Current assignee: Nanjing Brain Hospital
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2035-06-04
Also published as: CN104914101B

Abstract

本发明公开了一种长春新碱的ELISA检测方法，具体涉及长春新碱ELISA检测方法。本发明所述方法的步骤包括(1)长春新碱人工免疫原和包被抗原的制备；(2)长春新碱抗体的制备；(3)利用长春新碱抗体与包被抗原组合，建立ELISA检测方法。本发明的有益效果在于该检测方法具有特异性强、速度快、灵敏度高、样品处理简单的特点。本发明最低检测限达0.10ng/ml，线性范围为0.10-51.20ng/ml，能够满足临床血浆药物浓度的需要。本发明与长春碱、长春地辛及长春瑞宾没有交叉反应。本发明用于监测服用长春新碱病人血浆中长春新碱的浓度，为临床医生调整给药方案提供参考依据，对提高长春新碱临床治疗的有效性、减少毒副作用有着及其重要的意义。

Description

一种长春新碱的ELISA检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测领域，具体涉及长春新碱ELISA检测方法。

技术背景

长春新碱(Vincristine)是一种双吲哚型生物碱。分子式C46H56N4O10，结构式为：

是以长春碱(长春花中生物碱含量最高的一种化合物)为原料合成的医疗用药，分子量为824.96。长春新碱作为一种常见抗肿瘤药，其疗效比长春碱约高10倍，可用于治疗急性淋巴细胞性白血病，疗效较好，对其他急性白血病、何杰金氏病、淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤和乳腺癌也有疗效。在临床，特别是对造血器官的肿瘤比较有效。其药理机制是能与微管蛋白结合，使细胞分裂(有丝分裂)在中期停止的作用。另外，它对微管蛋白以外的蛋白质，如肌动蛋白及10nm细丝蛋白等也起作用。

然而，由于长春新碱具有较大的神经系统毒性和局部刺激性，限制了其在临床上的应用。研究发现，其临床的毒副作用表现为剂量依赖性的神经毒性，且剂量毒性曲线陡峭，因此，长春新碱具有治疗窗狭窄，且呈剂量依赖性的特点。而且，在临床应用中，多种药物能与长春新碱产生相互作用，影响长春新碱的作用和毒性，如：诱导P糖蛋白MDR3药物可产生药物耐受，降低长春新碱作用；三唑仑通过抑制肝药酶2YP2D6，抑制长春新碱代谢，增加毒性。为了能将药物剂量浓度控制在有效的治疗窗内，减少毒副作用，需要建立一种快速、灵敏检测长春新碱血药浓度的方法，对服用长春新碱的病人监测血浆中长春新碱的浓度，为临床医生调整给药方案提供参考依据，对提高长春新碱临床治疗的有效性、减少毒副作用有着及其重要的意义。

据文献报道，利用毛细管区带电泳和电化学方法结合测定了人体红血球细胞中硫酸长春新碱的动力吸收情况。迄今为止，测定长春新碱的方法有液相色谱法、电分析法、伏安法、毛细管电泳、紫外分光光度法。中国药典规定长春新碱注射液用高效液相色谱法。但是长春新碱在血液中得浓度较低，因此，要达到分析的要求，往往具有样品前处理复杂繁琐、仪器昂贵，以及分析速度慢等特点，不宜进行临床推广和大批样品的检测。

ELISA法(酶联免疫吸附法)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。该方法具有分析速度快、灵敏度高、样品处理简单等特点。

ELISA定量测定人血浆中长春新碱浓度的方法目前国内外尚无文献报道。

发明内容

发明目的

本发明的一个目的是克服现有长春新碱检测技术的不足，提供一种具有特异性强、分析速度快、灵敏度高、样品处理简单的人血浆中长春新碱检测方法。

技术方案

本发明的技术方案为一种长春新碱的ELISA检测方法。本发明步骤包括(1)长春新碱人工免疫原和包被抗原的制备；(2)长春新碱抗体的制备；(3)利用长春新碱抗体与包被抗原组合，建立ELISA检测方法。其中，长春新碱包被抗原和人工抗原的制备，步骤包括：(1)长春新碱分子中的C-4的乙酰氧基脱去乙酰基，得到4-去乙酰-长春新碱；(2)采用琥珀酸酐法，将4-去乙酰-长春新碱的C-4-羟基与琥珀酸酐结合，生成4-长春新碱-半琥珀酸酯；(3)采用碳二亚胺法，将4-长春新碱-半琥珀酸酯与载体蛋白质偶联，得到长春新碱偶联的蛋白质，可作为人工免疫原或包被抗原，所述的载体蛋白质为卵清蛋白、多聚赖氨酸。长春新碱抗体制备，其特征在于，将长春新碱人工免疫原免疫动物，得到长春新碱抗体，所述的免疫动物为大鼠、小鼠和兔。长春新碱ELISA检测方法，步骤包括：(1)将制备的长春新碱包被抗原溶于包被缓冲液中，包被于96孔板上；(2)用100-200μL 5-10％的脱脂乳封闭96孔板，60-90分钟；(3)洗板、拍干后，向孔中加入50-100μL待检含长春新碱的血浆，50-100μL长春新碱抗体稀释液，37℃反应60-90分钟；(4)洗板、拍干后向孔中加入50-200μL酶标二抗溶液，37℃反应30-60分钟；(5)洗板、拍干后向孔中加入底物显色溶液，显色，终止反应。

有益效果

本发明建立的长春新碱检测方法具有特异性强、速度快、灵敏度高、样品处理简单的特点。本发明最低检测限达0.10ng/ml，线性范围为0.10-51.20ng/ml，能够满足临床血浆药物浓度的需要。本发明血浆样本检测的批内、批间精密度分别为8.40、11.37％。本发明与长春碱、长春地辛及长春瑞宾没有交叉反应。本发明用于监测服用长春新碱病人血浆中长春新碱的浓度，为临床医生调整给药方案提供参考依据，对提高长春新碱临床治疗的有效性、减少毒副作用有着及其重要的意义。

附图说明

图1长春新碱浓度检测的标准曲线图

具体实施方式

实施例1

长春新碱-卵清蛋白包被抗原的制备

长春新碱加入20-30％肼乙醇溶液中，室温下反应24小时，过滤，减压浓缩去溶剂，300-400目硅胶柱层析分离，得到4-去乙酰-长春新碱。将4-去乙酰-长春新碱和琥珀酸酐溶于无水吡啶中，60℃减压回流6小时，冷却至室温后有白色沉淀生成，过滤，得到4-长春新碱-半琥珀酸酯。取4-长春新碱-半琥珀酸酯和卵清蛋白溶解在pH 8.0缓冲液中，充分震荡使其溶解，再取乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，充分溶解于pH 8.0缓冲液中。将得到的4-长春新碱-半琥珀酸酯和卵清蛋白混合溶液边震荡边滴加入乙基-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液，在摇床上37℃反应4小时，再用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的小分子，经过透析、纯化、冻干后即得。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，分离得到的偶联长春新碱的卵清蛋白纯度为97.3％。

实施例2

长春新碱-钥孔蓝蛋白人工抗原的制备

长春新碱加入20-30％肼乙醇溶液中，室温下反应24小时，过滤，减压浓缩去溶剂，300-400目硅胶柱层析分离，得到4-去乙酰-长春新碱。将4-去乙酰-长春新碱和琥珀酸酐溶于无水吡啶中，60℃减压回流6小时，冷却至室温后有白色沉淀生成，过滤，得到4-长春新碱-半琥珀酸酯。取4-长春新碱-半琥珀酸酯和卵清蛋白溶解在pH 8.0缓冲液中，充分震荡使其溶解，再取乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，充分溶解于pH 8.0缓冲液中。将得到的4-长春新碱-半琥珀酸酯和钥孔蓝蛋白混合溶液边震荡边滴加入乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液，在摇床上37℃反应4小时，再用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的小分子，经过透析、纯化、冻干后即得。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，分离得到的偶联长春新碱的钥孔蓝蛋白纯度大于98.4％。

实施例3

长春新碱抗体的制备

用偶联的长春新碱-钥孔蓝蛋白免疫新西兰兔。初次免疫取长春新碱-钥孔蓝蛋白冻干粉加1ml生理盐水溶解后再与1ml弗氏完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下四点和腿弯腘淋巴结两点注射新西兰大白兔，每点注射0.3ml。三周后用冻干的长春新碱-钥孔蓝蛋白加1ml生理盐水溶解后与1ml弗氏不完全佐剂混合后同法进行第二次免疫，三周后再免疫一次，共免疫3次。

将免疫后的兔，心脏取血，室温静置1小时，3000rpm离心3min，取出上层抗血清。采用饱和硫酸铵法纯化抗血清，制得长春新碱抗体，分装后保存在-20℃冰箱内。将制备的抗体采用ELISA法测定效价，其效价为1∶180000。

实施例4

ELISA法检测血浆中长春新碱浓度的方法：(1)将制备的长春新碱包被抗原溶于PH9.6的包被缓冲液中，包被于96孔板中，每孔50μL，4℃过夜；(2)用200μL 5％的脱脂乳封闭96孔板，90分钟；(3)洗板、拍干后，向孔中加入50μL待检含长春新碱的血浆，50μL长春新碱抗体稀释液，抗体稀释比例为1∶10000，37℃反应90分钟；(4)洗板、拍干后向孔中加入50μL酶标二抗溶液，37℃反应60分钟；(5)洗板、拍干后向孔中加入底物显色溶液，显色，终止反应，采用酶标仪检测波长为450nm的吸光度。

实施例5

ELISA法检测血浆中长春新碱浓度的特异性

用实施例3建立的检测方法分别检测方法的特异性，即，在加入长春新碱血浆样品同时，分别添加长春碱、长春地辛及长春瑞宾，检测结果制备标准曲线，考察该方法的特异性。加长春碱、长春地辛及长春瑞宾OD450值与标准曲线上空白孔OD450值相近，与长春新碱差异无统计学意义(P＞0.05)，故该方法的特异性较好。

实施例6

ELISA法检测血浆中长春新碱浓度的标准曲线

长春新碱包被抗原包被酶标板，将长春新碱标准品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2ng/mL分别加人酶标板，每一稀释度设3个平行孔，加长春新碱多抗后，加酶标二抗，显色，检测A450值，以长春新碱含量的对数(lnC)为横坐标，相应的A450值(OD)为纵坐标，得标准曲线回归方程OD＝0.3640×lnC+1.4403，r＝0.9912(图1)。可见，采用该方法在0.1-51.2ng/mL浓度范围内具有较好的线性。

实施例7

ELISA法检测血浆中长春新碱浓度的批内和批间精密度

配制高(51.2ng/mL)、中(12.8ng/mL)、低(0.1ng/mL)3个浓度的长春新碱标准溶液，采用实施例3的测定方法，在一次实验中每个浓度点测5孔，计算批内变异系数。连续测5批次，计算批间变异系数。精密度试验结果显示，该检测方法的批内变异系数为8.40％，批间变异系数为11.37％，满足批内精密度小于10％，批间精密度小于15％的要求。见表1、2。

表1 批内精密度测定结果

表2 批间精密度测定结果

实施例8

ELISA法检测血浆中长春新碱浓度的回收率

回收率配制高(51.2ng/mL)、中(12.8ng/mL)、低(0.1ng/mL)3个浓度的长春新碱标准溶液，采用实施例3的测定方法，在一次实验中每个浓度点测5孔，计算平均回收率(回收率＝测定值/理论值×100％)。结果显示，在5次试验中，3个浓度点的回收率分别为(99.03±4.46)％、(96.17±5.91)％和(115.00±7.07)％，满足要求。

实施例9

ELISA法检测血浆中长春新碱浓度的最低检测限

计算10个阴性孔OD的平均值和标准差(SD)，以从标准曲线中找到相应值的最低浓度，即为方法的检测限。根据标准曲线的线性范围确定定量限。通过试验得出此ELISA方法的检测限为0.1ng/mL。以长春新碱浓度的对数(lnC)为横坐标，相应的A450值(OD)为纵坐标作图，可知长春新碱在0.1-51.2ng/mL浓度范围内具有良好的线性，确定此范围为该方法的检测范围，该方法的定量限设为0.1ng/mL。

Claims

1.一种长春新碱ELISA检测方法，其特征在于，步骤包括：(1)长春新碱人工免疫原和包被抗原的制备；(2)长春新碱抗体的制备；(3)利用长春新碱抗体与包被抗原组合，建立ELISA检测方法。

2.根据权利要求1所述的人工免疫原和包被抗原的制备，其特征在于，步骤包括：(1)长春新碱分子中的C-4的乙酰氧基脱去乙酰基，得到4-去乙酰-长春新碱；(2)采用琥珀酸酐法，将4-去乙酰-长春新碱的C-4-羟基与琥珀酸酐结合，生成4-长春新碱-半琥珀酸酯；(3)采用碳二亚胺法，将4-长春新碱-半琥珀酸酯与载体蛋白质偶联，得到长春新碱偶联蛋白质，可作为人工免疫原或包被抗原，所述的载体蛋白质为卵清蛋白、多聚赖氨酸和钥孔血蓝蛋白。

3.根据权利要求1所述的长春新碱抗体制备，其特征在于，长春新碱人工免疫原免疫动物，得到长春新碱抗体，所述的免疫动物为大鼠、小鼠和兔。

4.根据权利要求1所述的ELISA检测方法，其特征在于，步骤包括：(1)将制备的长春新碱包被抗原溶于包被缓冲液中，包被于96孔板上；(2)用100-200μL 5-10％的脱脂乳封闭96孔板，60-90分钟；(3)洗板、拍干后，向孔中加入50-100μL待检含长春新碱的血浆，50-100μL长春新碱抗体稀释液，37℃反应60-90分钟；(4)洗板、拍干后向孔中加入50-200μL酶标二抗溶液，37℃反应30-60分钟；(5)洗板、拍干后向孔中加入底物显色溶液，显色，终止反应。