CN102621325B - 用于检测血液中多西他赛浓度的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诊断试剂盒，具体的说是一种用于检测血液中多西他赛浓度的诊断试剂盒，包括试剂R1，以及结合有抗人多西他赛抗体的纳米微球试剂R2，还包括多西他赛标准品。本发明同现有技术相比，具有和高效液相色谱法测定多西他赛浓度相似的技术参数比如精密度、准确度、最低检出限等，除此之外本发明相对于高效液相色谱法以及色谱-质谱联用具有可以广泛应用于具有全自动生化分析仪的各级医院，操作简便，成本较低，能够满足大量的血液样本中多西他赛浓度的监测，能够满足临床实时监测癌症患者血液中多西他赛浓度的需要。

Description

用于检测血液中多西他赛浓度的试剂盒

[技术领域]

本发明涉及一种诊断试剂盒，具体的说是一种用于检测血液中多西他赛浓度的诊断试剂盒。

[背景技术]

多西他赛(Docetaxel，泰索帝)是一种新型抗肿瘤药物，属于紫杉类化合物，为白色或近似白色粉状物，其作用机制是加强微管蛋白聚合作用和抑制微观解聚作用，导致形成稳定的非功能性微管束，从而破坏肿瘤细胞的有丝分裂。近年来多西他赛在各种肿瘤的临床治疗方面得到广泛应用。多西他赛分子结构如下：

多西他赛可以应用于乳腺癌，多西他赛是新一代半合成紫衫类抗癌药物，有临床试验结果显示，以多西他赛为基础的辅助化疗方案能提高早期乳腺癌的长期生存率，并降低复发的危险性。近年来术后复发转移的晚期乳腺癌患者在不断增多，如何延长生存期又提高生活质量是临床急需解决的问题。采用以化疗为主综合治疗仍是最佳的选择，尤其是紫杉类药物的问世，使乳腺癌化疗有明显提高。近几年的研究结果均显示：多西他赛作为一线药物治疗乳腺癌在提高患者生存率和改善患者生活质量方面将会有很好的前景。

多西他赛也用于晚期非小细胞肺癌的治疗。晚期非小细胞肺癌的治疗以化疗及对症治疗为主，临床研究表明多西他赛对已耐药肺癌有较好疗效。与治疗晚期非小细胞肺癌的传统药物顺铂相比，多西他赛与顺铂的作用机制不同，且无交叉耐药，对含铂类耐药者亦有效。目前靶向治疗作为新的手段在晚期非小细胞肺癌的治疗中显示了明显的优势。但是尚不足以作为一线治疗应用于临床，而多西他赛是唯一的可以作为一线和二线治疗的药物。综合研究资料显示多西他赛单药一线治疗晚期非小细胞肺癌在保证了疗效的同时，患者的耐受性较好。多西他赛对胃癌有较高的活性，其一、二线单药治疗胃癌的响应率都在20％以上。多西他赛合用顺铂-氟尿嘧啶在晚期胃癌一线治疗中的作用及其价值已然凸现。美国MD an-derson癌症中心研究也认为，以多西他赛为基础的化疗方案，可能是近20年胃癌治疗的最重要进展。

多西他赛虽然虽然在癌症的治疗方面贡献卓越，但是其不良反应依然较为明显。第一、骨髓抑制：中性粒细胞减少是最常见的不良反应而且通常较严重。可逆转且不蓄积。据文献报道，有与中性粒细胞减少相关的发热及感染发生。贫血可见于多数病例，少数病例发生重度血小板减少。第二、过敏反应：部分病例可发生严重过敏反应，其特征为低血压与支气管痉挛，需要中断治疗。部分病例也可发生轻度过敏反应。如脸红、伴有或不伴有瘙痒的红斑、胸闷、背痛、呼吸困难、药物热或寒颤。第三、皮肤反应常表现为红斑，主要见于手、足，也可发在臀部、脸部及胸部的局部皮疹，有时伴有瘙痒。皮疹通常可能在滴注多西他赛后一周内发生，但可在下次滴注前恢复。严重症状如皮疹后出现脱皮则极少发生。可能发生指甲病变，以色素沉着或变淡为特点，有时发生疼痛和指甲脱落。除以上三点主要症状之外，常见的不良反应包括恶心、呕吐、腹泻脱发、关节痛、低血压、肌肉疼痛、肺水肿、心动过速等。

同时多西他赛的血清药物浓度与治疗效果之间有着很高的可变关系。多西他赛在不同个体之间的差异度相差很大，受到许多因素的影响，包括：器官功能、遗传调节、疾病状况、年龄、药物之间的相互作用，药物吸收时间，药物给药方式，而这种差异导致的结果是，不同个体间多西他赛的相同剂量会产生显著不同的临床疗效和不良反应，相同个体间多西他赛的相同剂量在肿瘤的不同阶段会产生显著不同的临床疗效和不良反应。相同的多西他赛剂量的疗效和不良反应基于患者个体的药物清除率和最终的血清药物浓度的变化。在静脉内给药中，依据现有的体表面积给药方式会忽略掉影响给药剂量的其他诸多因素，从而不能达到针对不同个体在疾病的不同阶段的最佳血药浓度即最佳的治疗效果和相对较低的毒副作用。因此快速、准确、高通量、低成本的测定使用多西他赛作为治疗药物的肿瘤患者的血药浓度对于提高肿瘤患者的生存率和降低多西他赛所产生的毒副作用都至关重要。临床医生可以准确的知道药物在患者体内的代谢情况，可以根据不同病人的具体状况来调节给药剂量，并且可以根据同一个肿瘤病人在用多西他赛治疗的过程中，随着疾病发展状况和病人血药代谢情况的变化，随时动态的调整多西他赛的给药剂量。

目前测定血液中多西他赛浓度的方法很多，常用的有高效液相色谱法、色谱-质谱联用，但是都不能满足高通量与低成本的临床需求并广泛的应用于国内的各级医院。本发明所述的乳胶增强免疫比浊法，在准确度、精密度、最低检测限、线性范围均有与上述技术方法有相似的属性。但是由于乳胶增强免疫比浊法可以应用于全自动生化仪，可以广泛应用于临床并且满足各个级别的医院的需要。全自动生化分析仪操作简便，不需要像高效液相色谱法和色谱-质谱联用，配备专门的仪器和技术人才。在各级医院现有的硬件条件和人才储备下可以完成从药物代谢水平上的个性化肿瘤治疗。而高效液相色谱法以及色谱-质谱联用均不能从在现有的医疗体制下大规模应用于临床，并且保持低成本与高通量。

乳胶增强免疫比浊法测定的基本原理是：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过量时，形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与标准物浓度与浊度所得到的曲线对比，即可计算出待检测物的含量。乳胶增强免疫比浊法测定多西他赛浓度的技术中在采用单克隆抗体包被磁珠的过程中可以采用物理吸附法也可以采用化学交联法，因为化学交联法更稳定，本发明中采用化学交联法。

[发明内容]

本发明为了克服现有技术的不足，提供了一种用于检测血液中多西他赛浓度的诊断试剂盒。

为了实现上述目的，本发明设计了一种用于检测血液中多西他赛浓度的诊断试剂盒，包括试剂R1，以及结合有抗人多西他赛抗体的纳米微球试剂R2，还包括多西他赛标准品；

试剂R1，包括缓冲液20-200mmol/L，稳定剂2-20mmol/L，表面活性剂0.2-2mmol/L，无机盐10-500mmol/L，促进剂1-5mmol/L，防腐剂1-5mmol/L；

试剂R2，包括结合有抗多西他赛抗体的纳米微球0.1-10.0mg/ml，缓冲液20-200mmol/L，稳定剂2-20mmol/L，还包括防腐剂1-5mmol/L；

多西他赛标准品，包括缓冲液20-200mmol/L，稳定剂5-20mmol/L，防腐剂2-5mmol/L，0-100umol/L的多西他赛，其余为去离子水。

所述的试剂R1中，缓冲液为MES缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或者甘氨酸缓冲液中的一种，缓冲液的PH值为6.0-8.0；

稳定剂为牛血清白蛋白、EDTA、EGTA、钼酸钠、钼酸铵、谷氨酸钠、或超氧化物歧化酶等中的一种或多种混合物；

无机盐为氯化钾、氯化钠等中的一种或多种混合物；

表面活性剂为吐温-20、吐温-40、吐温-60或Triton X-100中的一种；

促进剂为聚乙二醇6000、聚乙二醇8000等中的一种或多种混合物防腐剂为叠氮化钠。

所述的试剂R2中，纳米微球的直径为50-200nm，纳米微球与紫多西他赛抗体的结合方式为化学交联法。所述的试剂R2中，缓冲液为Mes缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、或甘氨酸缓冲液中的一种，缓冲液的PH值为6.0-8.0；

稳定剂为牛血清白蛋白、EDTA、EGTA、钼酸钠、钼酸铵、谷氨酸钠、超氧化物歧化酶、氯化钾、氯化钠中的一种或多种混合物；

防腐剂为叠氮化钠。

所述的多西他赛标准品中，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、Mes缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种，缓冲液的PH值为6.0-8.0；

稳定剂为牛血清白蛋白、EDTA、EGTA、钼酸钠、钼酸铵、谷氨酸钠、超氧化物歧化酶、氯化钾、氯化钠中的一种或多种混合物；

防腐剂为叠氮钠。

所述纳米微球与紫多西他赛抗体的结合方式为化学交联法，包括乳胶粒子的活化以及多西他赛抗体和纳米微球的结合，具体工艺步骤如下：

纳米微球的活化：

A)、取40-100ug多西他赛抗体加入2400ul PH7.40的缓冲液，混匀备用；

B)、取10-100mg直径为50-200nm乳胶粒子，离心4℃20000rpm 20min，弃去滤液；

C)、加入2000ul浓度为10mM，PH值为7.40磷酸缓冲液，并用超声清洗剂溶解纳米微球，离心清洗三次；

D)加入PH值为7.40的缓冲液，超声，使纳米微球活化浓度为2.5mg/ml；加入10mg-50mg的N-羟基琥珀酰亚胺和6.0mg-30.0mg l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；

E)室温振荡1h-3h；

F)4℃，20000rpm，20min，弃去滤液；

G)加入PH值为7.40的缓冲液，超声处理，用于结合；

多西他赛抗体和纳米微球的结合：

A)加入多西他赛抗体，使纳米微球结合浓度为2.5mg/ml；

B)室温振荡2-16h；

C)4℃高速离心30-90min，弃去上清液；

D)用3000ul，PH值为7.40的缓冲液，超声处理，稳定剂2-20mmol/L，保存溶液至2-8℃。

本发明同现有的技术相比，具有和高效液相色谱法测定多西他赛浓度相似的技术参数比如精密度、准确度、最低检出限等。本发明中所使用的抗体为单克隆抗体，与多西他赛结合而与体内代谢物没有任何实质上的交叉反应性。通过提供多西他赛的特异性抗体，完成对血清中多西他赛的特异性测定，该发明可以精确的检测患者血清中多西他赛的水平。除此之外本发明相对于高效液相色谱法以及色谱-质谱联用具有可以广泛应用于具有全自动生化分析仪的各级医院，操作简便，成本较低，能够满足大量的血液样本中多西他赛浓度的监测，能够满足临床实时监测癌症患者血液中多西他赛浓度的需要。

[附图说明]

图1为本发明实施例一中的数据线形图。

图2为本发明实施例二中的数据线形图。

[具体实施方式]

下面对本发明作进一步描述。

实施例一：

试剂R1：

其余为去离子水，试剂R1的PH值为7.0。

试剂R2，采用化学化学交联法进行制备，包括纳米微球的活化，以及多西他赛抗体和纳米微球的结合，具体步骤如下：

(1)纳米微球的活化

A)取50ug人抗多西他赛抗体加入2400ul，PH值为7.40的缓冲液，混匀备用。

B)取50mg直径为100nm纳米微球，离心4℃，20000rpm，20min，弃去滤液。

C)加入2000ul浓度为10mM磷酸缓冲液，PH7.40用超声清洗剂溶解粒子，离心清洗三次。

D)加入PH值为7.40的缓冲液，超声，使纳米微球活化浓度为2.5mg/ml；加入20mg的N-羟基琥珀酰亚胺和15mg l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

E)室温振荡2h。

F)4℃，20000rpm，20min，弃去滤液。

G)加入PH7.40的缓冲液，超声处理，立刻用于结合。

(2)多西他赛抗体和纳米微球的结合

A)加入多西他赛抗体，使纳米微球结合浓度为2.5mg/ml。

B)室温振荡8h。

C)4℃高速离心60min，弃去上清液。

D)用3000ul，PH值为7.40的缓冲液，超声处理，加入EDTA 4mmol/L，保存溶液至2-8℃，即为试剂R2。

多西他赛标准品：

其余为去离子水和多西他赛，标准品的PH值为7.0。

按照所需的参考校准品浓度，将不同剂量的多西他赛加入上述的标准品溶液中，标准品中的多西他赛的浓度分别为0.0ng/ml，10.0ng/ml，50.0ng/ml，100.0ng/ml，200ng/ml，1000ng/ml。

根据实施实例一所配置的试剂，在生化分析仪上进行测试，其中试剂R1加样200ul，R2加样50ul，样本5ul，主波长320nm，副波长680nm。原始数据如下图1所示：

实施例二：

试剂R1：

其余为去离子水，试剂R1的PH值为7.0。

试剂R2，采用化学化学交联法进行制备，包括纳米微球的活化，以及多西他赛抗体和纳米微球的结合，具体步骤如下：

(1)纳米微球的活化

A)取60ug多西他赛抗体加入2400ul PH7.40的缓冲液，混匀备用。

B)取40mg直径为120nm的纳米微球，离心4℃，20000rpm，20min，弃去滤液。

C)加入2000ul浓度为10mM磷酸缓冲液，PH7.40用超声清洗剂溶解粒子，离心清洗三次。

D)加入PH值为7.40的缓冲液，超声，使乳胶粒子活化浓度为2.5mg/ml；加入25mg的N-羟基琥珀酰亚胺和12mg l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

E)室温振荡2h。

F)4℃，20000rpm，20min，弃去滤液。

G)加入PH7.40的缓冲液，超声处理，用于结合。

(2)多西他赛抗体和纳米微球的结合

A)加入多西他赛抗体，使乳胶粒子结合浓度为2.5mg/ml；

B)室温振荡8h；

C)4℃高速离心40min，弃去上清液；

D)用3000ul，PH值7.40的缓冲液，超声处理，加入EDTA 2mmol/L，保存溶液至2-8℃，即为试剂R2；

多西他赛标准品：

其余为去离子水和多西他赛，标准品的PH值为7.0。

按照所需的参考校准品浓度，将不同剂量的多西他赛加入上述的标准品溶液中，标准品中的多西他赛的浓度分别为0.0ng/ml，10.0ng/ml，50.0ng/ml，100.0ng/ml，200ng/ml，1000ng/ml。

根据实施实例二所配置的试剂，在生化分析仪上进行测试，其中R1加样200ul，R2加样50ul，样本5ul，主波长320nm，副波长680nm。原始数据如下表和图2所示：

实验一：

乳胶增强免疫比浊法与高效液相色谱法测定多西他赛的对比实验。

取120只8周雄性BABLc小鼠，随机分成A、B两组，每组60只，称重，按照5.0mg/kg尾静脉注射多西他赛注射液。之后将A、B两组中的60只BABLc小鼠分成五组，每组12只小鼠。分别在给药后30min、60min、90min、120min和240min分别取其中12只小鼠摘眼球取血，置于离心管中，3000转每分离心10min，分离血清。之后将A、B两组小鼠的血清样本分别用本发明实施实例一所述的乳胶增强免疫比浊法和高效液相色谱法测试血清中的多西他赛浓度。

A、每组小鼠的60个血清样本用乳胶增强免疫比浊法测试血清浓度，实验条件以及实验仪器如实施实例一所述。

B、每组小鼠的60个血清样本用高效液相色谱法测试。测试仪器为安捷伦1200型高效液相色谱仪，DAD检测器，G1311A四元泵，G1329A自动进样器。色谱柱为C-18，检测波长为230nm，流速为1ml/min，流动相为甲醇/乙腈/水＝30/50/20。

如下表所示为乳胶增强免疫比浊法与高效液相色谱法的实验数据对比。

血药浓度-时间数据对比试验(ng/ml)

免疫比浊法相对高效液相色谱法的平均偏离度为2.11％，能够替代高效液相色谱法的要求。表中的测试数据均为12个样本浓度的算术平均值。

实验二：

乳胶增强免疫比浊法与液相色谱-质谱联用测定多西他赛的对比实验。

质谱-色谱联用实验仪器：Varian HPLC-MS/MS，ProStar430自动进样器、ProStar 210输液泵、电喷雾离子源、Varian质谱数据处理系统、安捷伦1200型高效液相色谱仪，DAD检测器，G1311A四元泵，G1329A自动进样器。

质谱-色谱联用实验条件：色谱柱为C-18，检测波长为230nm，流速为1ml/min，流动相为甲醇/乙腈/水＝30/50/20。毛细管电压30V，氮气为干燥器，温度320℃，1.4*10⁵Pa；

乳胶增强免疫比浊法实验条件以及实验仪器如实施实例二所述，制备50.00ng/ml、100.00ng/ml、200.00ng/ml、400.00ng/ml、800.00ng/ml五个浓度的多西他赛样品，分别编号A、B、C、D、E，各平行制备20份，分别用色谱-质谱联用和乳胶增强免疫比浊法测试样本中的血清浓度。

实验数据如下(ng/ml)

免疫比浊法相对色谱-质谱联用的平均偏离度为1.34％，能够替代色谱-质谱联用的要求。表中的测试数据均为20个样本浓度的算术平均值。

除此之外本发明相对于高效液相色谱法以及色谱-质谱联用具有可以广泛应用于具有全自动生化分析仪的各级医院，操作简便，成本较低，能够满足大量的血液样本中多西他赛浓度的监测，能够满足临床实时监测癌症患者血液中多西他赛浓度的需要。

Claims (2)

1.一种用于检测血液中多西他赛浓度的诊断试剂盒，包括试剂R1，以及结合有多西他赛抗体的纳米微球试剂R2，还包括多西他赛标准品；

试剂R1，包括缓冲液20-200mmol/L，稳定剂2-20mmol/L，表面活性剂0.2-2mmol/L，无机盐10-500mmol/L，促进剂1-5mmol/L，防腐剂1-5mmol/L；

试剂R2，包括结合有多西他赛抗体的纳米微球0.1-10.0mg/mL，缓冲液20-200mmol/L，稳定剂2-20mmol/L，还包括防腐剂1-5mmol/L；

多西他赛标准品，包括缓冲液20-200mmol/L，稳定剂5-20mmol/L，防腐剂2-5mmol/L，0-100μmol/L的多西他赛，其余为去离子水；

其中，所述的试剂R1、试剂R2以及多西他赛标准品选自(a)组或(b)组：

(a)试剂R1：

其余为去离子水，试剂R1的pH值为7.0；

试剂R2，采用化学交联法进行制备，包括纳米微球的活化，以及多西他赛抗体和纳米微球的结合,具体步骤如下：

(1)纳米微球的活化

A)取50μg多西他赛抗体加入2400μL，pH值为7.40的缓冲液，混匀备用；

B)取50mg直径为100nm纳米微球，离心4℃，20000rpm，20min，弃去滤液；

C)加入2000μL浓度为10mM磷酸缓冲液，pH7.40用超声清洗剂溶解粒子，离心清洗三次；

D)加入pH值为7.40的缓冲液，超声，使纳米微球活化浓度为2.5mg/mL；加入20mg的N-羟基琥珀酰亚胺和15mg l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；

E)室温振荡2h；

F)4℃，20000rpm，20min，弃去滤液；

G)加入pH7.40的缓冲液，超声处理，立刻用于结合；

(2)多西他赛抗体和纳米微球的结合

A)加入多西他赛抗体，使纳米微球结合浓度为2.5mg/mL；

B)室温振荡8h；

C)4℃高速离心60min，弃去上清液；

D)用3000μL，pH值为7.40的缓冲液，超声处理，加入EDTA4mmol/L，保存溶液至2-8℃，即为试剂R2；

多西他赛标准品：

其余为去离子水和多西他赛，标准品的pH值为7.0；

或

(b)试剂R1：

其余为去离子水，试剂R1的pH值为7.0；

试剂R2，采用化学交联法进行制备，包括纳米微球的活化，以及多西他赛抗体和纳米微球的结合,具体步骤如下：

(1)纳米微球的活化

A)取60μg多西他赛抗体加入2400μL pH7.40的缓冲液，混匀备用；

B)取40mg直径为120nm的纳米微球，离心4℃，20000rpm，20min，弃去滤液；

C)加入2000μL浓度为10mM磷酸缓冲液，pH7.40用超声清洗剂溶解粒子，离心清洗三次；

D)加入pH值为7.40的缓冲液，超声，使乳胶粒子活化浓度为2.5mg/mL；加入25mg的N-羟基琥珀酰亚胺和12mg l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；

E)室温振荡2h；

F)4℃，20000rpm，20min,弃去滤液；

G)加入pH7.40的缓冲液，超声处理，用于结合；

(2)多西他赛抗体和纳米微球的结合

A)加入多西他赛抗体，使乳胶粒子结合浓度为2.5mg/mL；

B)室温振荡8h；

C)4℃高速离心40min，弃去上清液；

D)用3000μL，pH值7.40的缓冲液，超声处理，加入EDTA2mmol/L，保存溶液至2-8℃，即为试剂R2；

多西他赛标准品：

其余为去离子水和多西他赛，标准品的pH值为7.0。

2.根据权利要求1所述的用于检测血液中多西他赛浓度的诊断试剂盒，其特征在于：按照所需的参考校准品浓度，将不同剂量的多西他赛加入上述的标准品溶液中，标准品中的多西他赛的浓度分别为0.0ng/mL,10.0ng/mL，50.0ng/mL，100.0ng/mL，200ng/mL,1000ng/mL。