CN106267232A - 一种小分子udp糖基转移酶抗体多肽与长春新碱偶联的结合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小分子UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物，属于抗体偶联药物领域。其特征在于：长春新碱和UDP糖基转移酶抗体多肽的偶联结合物；所述UDP糖基转移酶抗体多肽为全新序列。所述的UDP糖基转移酶抗体多肽采用化学合成法制备。所述的长春新碱‑半琥珀酸酯与UDP糖基转移酶抗体多肽偶联采用碳化二亚胺化。所述偶联结合物，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。有益效果在于促进长春新碱的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。

Description

一种小分子UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱偶联的结 合物

技术领域

本发明是抗体偶联药物领域。具体来说，本发明涉及UDP糖基转移酶抗体多肽偶联抗肿瘤药物长春新碱的结合物。

背景技术

长春新碱(Vincristine，Oncovin，VCR)是夹竹桃科植物长春花中提取出的生物碱，因抗肿瘤作用良好，目前其制剂作为临床抗肿瘤药物。临床用于急性白血病，尤其是儿童急性白血病，对急性淋巴细胞白血病疗效显著。恶性淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌，尤文肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病、消化道癌、黑色素瘤及多发性骨髓瘤等。

尽管长春新碱被广泛的应用于癌症的化疗方案，但由于化疗存在着比较严重的骨髓抑制，肠胃道反应和肝肾损伤等。现在研究进展往长春新碱脂质体方向，用来降低长春新碱的神经毒性。脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。但是，脂质体剂型本身存在不稳定性，因此，始终未用于临床。

抗肿瘤抗体通过化学修饰与效应分子偶联，这些偶联物既有特异性识别肿瘤抗原的能力，也保留了效应分子杀伤肿瘤细胞的毒性，注射于肿瘤患者体内，可定向地浓聚到肿瘤部位，选择性杀伤肿瘤细胞。因此，发明人希望能够将长春新碱与特异性的抗体偶联，从而产生肿瘤细胞的靶向作用，提高疗效，减少毒副作用。

糖基转移酶(glycoprotein glucosyltransferase)在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。葡萄糖基转移酶是在酶反应中只转移葡萄糖基的酶(Glu-酶)，葡萄糖苷转移酶是转移时连葡萄糖的糖苷键一起转移着的酶。UDP-糖基转移酶是糖蛋白、糖脂中糖链生物合成的关键酶之一。UDP-糖基转移酶的表达和细胞的周期密切有关.在细胞分化阶段，许多糖基转移酶的基因是表达的，为此出现了一系列糖类异质体作为分化抗原；一旦发育成熟，在细胞表面出现了另一些糖链异质体。如果糖基转移酶在成熟细胞中活性很高，就会产生癌变，同时出现了早期的分化抗原。在N-糖苷键连接的糖链中多聚N-乙酞乳糖胺链的出现被看成是肿瘤的重要标志，这类糖链可以降低细胞和基质间的粘着，有利于癌细胞的进一步的入侵。因此，UDP-糖基转移酶活性的非正常表达与肿瘤、免疫系统等疾病的发生、发展有密切关系，其抑制剂可以用于抗肿瘤、抗免疫系统等疾病的新药研发。

研究发现，UDP糖基转移酶在肿瘤细胞表面高表达，因此，UDP糖基转移酶抗体可以靶向作用于肿瘤细胞表面，且本身具有抗肿瘤的作用。目前常用的抗体仍以鼠源单抗为多，且分子量较大，具有抗原性，长期用于人体会产生中和反应，降低药效。因此，本发明提供了一种特异性强，纯度较高的小分子UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱偶联的结合物，促进长春新碱的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。

发明内容

发明目的

本发明提供一种特异性强，纯度较高的小分子UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱偶联的结合物，促进长春新碱的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。

技术方案

本发明的技术方案在于提供一种小分子UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物，其特征在于：(1)用长春新碱、琥珀酸酐和三乙基胺用100ml乙酰乙酯溶解，加热回流1小时；(2)蒸馏去溶剂，残余物用5％NaHCO3水溶液溶解；(3)乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行酸化，至pH2.0-3.0；(4)用氯仿-已烷结晶，得固形物；(5)取2.5g半琥珀酸酯溶于6.5ml亚硫酰氯，65℃，加热30分钟，减压蒸发，干燥1小时；(6)将上述产物溶于15ml N，N-二甲基-乙酸乙酰胺中，室温搅拌反应2小时；(7)65℃，真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来，得长春新碱-半琥珀酸酯；(8)长春新碱-半琥珀酸酯与UDP糖基转移酶抗体多肽偶联，即得。所述的UDP糖基转移酶抗体多肽采用化学合成法制备。所述的长春新碱-半琥珀酸酯与UDP糖基转移酶抗体多肽偶联采用碳化二亚胺化。所述偶联结合物，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。优选为在制备用于治疗乳腺癌和子宫癌药物中的应用。

有益效果

本发明的小分子UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物，可用于促进长春新碱的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。有益效果在于(1)提高长春新碱在体内肿瘤组织的浓度；同时降低长春新碱在全血，以及心、肝、脾、肺、肾、脑等组织的分布；(2)显著性抑制肿瘤细胞的增殖；(3)降低长春新碱的毒性；(4)小分子UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物能与肿瘤细胞的特异性结合；(5)在荷瘤小鼠体内，提高生存率。

具体实施方式

多肽由上海生工吉尔合成。

实施例1

制备UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物：用长春新碱、琥珀酸酐和三乙基胺用100ml乙酰乙酯溶解，加热回流1小时；蒸馏去溶剂，残余物用5％NaHCO3水溶液溶解；乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行酸化，至pH2.0；用氯仿-已烷结晶，得固形物；取2.5g半琥珀酸酯溶于6.5ml亚硫酰氯，65℃，加热30分钟，减压蒸发，干燥1小时；将上述产物溶于15ml N，N-二甲基-乙酸乙酰胺中，室温搅拌反应2小时；65℃，真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来，得长春新碱-半琥珀酸酯；长春新碱-半琥珀酸酯与UDP糖基转移酶抗体多肽采用碳化二亚胺化偶联，冻干，即得。

实施例2

用人乳腺癌移植瘤模型检测UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物的体内活力。

6-8w龄SCID雌性小鼠，小鼠随机分成5组每组10只。(1)空白组；(2)结合物低剂量组；(3)结合物中剂量组；(4)结合物高剂量组；(5)长春新碱阳性组。建立人乳腺癌移植瘤模型，在接种乳腺癌细胞后的第7天，分别尾静脉给药给药。给药方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组为结合物设3个剂量：0.125、0.25、0.5μmol/Kg，阳性组为0.5μmol/Kg的长春新碱，每天给药，连续14天。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，结合物可有效地保护荷瘤小鼠，在剂量0.125、0.25、0.5μmol/Kg时可以提高荷瘤小鼠的生存率，生存率分别为68.7，86.2，92.0％。

实施例3

子宫癌细胞的体外增殖率实验：采用MTT比色法。将对数生长的人子宫癌细胞，以1.0×10⁵加入96孔培养板中，培养24h；实验分为5组，分别为空白组、阳性组和低中高剂量的实施例1得到的UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物；分别加入相同体积的DMEM培养基(HyClone，含胎牛血清20％)，长春新碱(1mmol/ml)和UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物(25、50、100μmol/ml)。每孔设五个复孔，培养48h，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式成子宫癌细胞抑制率＝(1—实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。长春新碱阳性组和实施例1的偶联结合物实验组的子宫癌细胞的抑制率分别为43.8±7.6、58.9±9.2、79.5±10.3％(p＜0.05)。

实施例4

用人子宫癌移植瘤模型检测UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物的体内分布。

6-8w龄SCID雌性小鼠，小鼠随机分成3组，每组6只。(1)空白组；(2)结合物组；(3)长春新碱阳性组。建立人子宫癌移植瘤模型，在接种子宫癌细胞后的第7天，分别尾静脉给药给药。给药方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组为2mmol/Kg剂量的结合物，阳性组为2mmol/Kg的长春新碱，每天给药，连续7天。14天后，将小鼠处死后，分别取全血，以及心、肝、脾、肺、肾、脑、肿瘤等组织。全血肝素抗凝，将肝素抗凝血离心沉淀血细胞，取上清血浆0.5ml，加入2.67％HCLO4，离心沉淀血浆蛋白，上清水浴加热100℃20分钟，待测；各组织经过匀浆、除蛋白、离心后，取上清。采用HPLC法，测定小鼠血浆及各组织上清中长春新碱的浓度。提取方法：在血浆及组织的上清中加入5ml二氯甲烷，充分混匀、萃取，离心，取上清，将有机溶剂挥去，再以200μl流动相溶解。色谱条件：C18色谱柱(15cm，5μm*4.6mm)，流动相：0.04磷酸缓冲液-甲醇(4.5：5.5，pH3.0)，流速：1ml/min，检测波长：254nm，进样量20μl测定。计算小鼠血浆及各组织中长春新碱的浓度。

表1 结合物在肿瘤模型动物中血浆及组织分布浓度

*P<0.05，**P<0.01与阳性组相比。

实验结果见表1，与长春新碱阳性组比较，UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物组体内肿瘤组织中的浓度明显升高，(p＜0.01)，而心、肝、脾、肺、肾、脑等组织，以及血浆中长春新碱浓度明显降低，尤其是血浆中的药物浓度将为6.47±1.46ng/ml(p＜0.01)，有显著性差异。

实施例5

UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物的的毒性作用。采用实施例1结合物，测定半数致死量：取60只小鼠随机分为6组，每组l0只。各组小鼠先禁食12h，分别腹腔注射不同剂量的实施例2结合物，剂量分别为125、250、500、1000、2000、5000mg/Kg，给受试药物后再禁食3-4小时。此后连续观察2周，有无死亡现象，计算半数致死量LD50。并观察皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主及中枢神经系统行为表现。

结果：实施例1结合物对小鼠的半数致死量LD50为2054.9mg/kg。

实施例6

结合物与乳腺癌细胞的结合率：采用ELISA方法，将对数生长的人乳腺癌细胞，以1.0×10⁵加入96孔酶标板上，4℃，包被过夜；PBS三次洗板后，将实施例1的结合物，按浓度梯度0、25、50、100μmol/ml分别加入96孔板中，同时每孔加入定量的抗UDP糖基转移酶抗体竞争结合，37℃，孵育2小时时间后；PBS三次洗板后，再加入偶联辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗人IgG抗体，37℃，孵育1小时；再PBS三次洗板后，加入ABC溶液，孵育10-20分钟，最后用流水终止反应；显微镜观察，所述实施例1结合物与肿瘤细胞结合的细胞呈棕黑色，为阳性细胞，采用计算机软件计算呈阳性细胞的数量。

结果：实施例1结合物与乳腺癌细胞结合的数量随剂量递增，与空白组相比有显著性差异，剂量为100μmol/ml时，阳性细胞数量达到272.1±56.4(p＜0.05)。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州普罗达生物科技有限公司

<120> 一种UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱偶联的结合物

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Pro Pro Asp Gly Cys Asn Ala Phe Val Val Ile His Lys Lys His Thr

1 5 10 15

Cys Lys Ile Asn Glu Ile Lys Lys Leu Leu Lys Lys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Thr Arg Pro Tyr Leu Phe Lys Gly Asp His Lys Phe Pro Thr Asn Lys

35 40 45

Glu Asn Val Val Ile Leu Tyr Ala Glu Met

50 55

Claims (7)

1.一种小分子UDP糖基转移酶抗体多肽与长春新碱的偶联结合物，其特征在于：长春新碱和UDP糖基转移酶抗体多肽的偶联结合物；所述UDP糖基转移酶抗体多肽的序列为SEQ IDNO：1。

2.根据权利要求1所述偶联结合物的制备，其特征在于：步骤包括：（1）用长春新碱、琥珀酸酐和三乙基胺用100 ml乙酰乙酯溶解，加热回流1小时；（2）蒸馏去溶剂，残余物用5%NaHCO3水溶液溶解；（3）乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行酸化，至pH2.0；（4）用氯仿-已烷结晶，得固形物；（5）取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亚硫酰氯，65℃，加热30分钟，减压蒸发，干燥1小时；（6） 将上述产物溶于15ml N，N-二甲基-乙酸乙酰胺中，室温搅拌反应2小时；（7）65℃，真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来，得长春新碱-半琥珀酸酯；（8）长春新碱-半琥珀酸酯与UDP糖基转移酶抗体多肽偶联，即得。

3.根据权利要求2所述偶联结合物，其特征在于：所述的UDP糖基转移酶抗体多肽采用化学合成法制备。

4.根据权利要求2所述偶联结合物，其特征在于：所述的长春新碱-半琥珀酸酯与UDP糖基转移酶抗体多肽偶联采用碳化二亚胺化。

5.根据权利要求1-4任一所述偶联结合物，其特征在于：在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述偶联结合物，其特征在于：在制备用于治疗乳腺癌药物中的应用。

7.根据权利要求5所述偶联结合物，其特征在于：在制备用于治疗子宫癌药物中的应用。