CN102504013B - 一种靶向抗癌转移化学药物padm及制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向抗癌转移化学药物PADM及制备方法和用途，其具体结构为Ac-Phe-Lys-PABC-ADM·HCl，经过纯化分析得到高纯度PADM盐酸盐。步骤是：（1）Fmoc-Lys（MMT），（2）Lys（MMT），（3）Ac-Phe-Lys（MMT），（4）Ac-Phe-Lys（MMT）-PABOH，（5）Ac-Phe-Lys（MMT）-PAB-PNP，（6）Ac-Phe-Lys（MMT）-PABC-ADM，（7）Ac-Phe-Lys-PABC-ADM·HCl，残留物经二氯甲烷处理后经过滤得到最终产品。一种靶向抗癌转移化学药物PADM在制备治疗或预防胃癌腹膜转移癌药物中的应用。简单易行，工艺稳定，产率比较高，PADM具有高效抗癌功能。
Description
技术领域
本发明属于化学药物领域，本发明涉及一种靶向Cathepsin B(Cat B)抗癌转移的化合物PADM(Ac-Phe-Lys-PABC-ADM·HCl)，同时涉及该靶向治疗药物的制备方法，还涉及其在治疗胃癌腹膜转移癌中的应用，PADM在胃癌腹膜转移癌裸鼠模型中能高效抑制腹膜转移癌形成，并显著降低毒副作用，具有开发成治疗胃癌腹膜转移癌及其它高表达Cat B恶性肿瘤药物的应用价值。
背景技术
胃癌是最常见的全球性恶性肿瘤，尤其是发展中国家，在男性肿瘤患者中胃癌发生率和死亡率分列第二和第三，女性患者中发生和死亡率均列第四。在我国，胃癌死亡率位列各大肿瘤第三位。胃癌综合防治与人民群众的生命健康息息相关。
早期胃癌可以通过根治性手术治疗得要很好的治疗。但在我国，由于缺少必要的早期筛查计划，且公众自我预防意识不足，约80％的胃癌患者在确诊或手术探查时已经发生重要脏器，尤其是腹腔内种植转移。传统胃癌治疗方法包括手术治疗、局部放疗、辅助化疗等，这些方案在一定程度上能够延长患者生存期。但国际合作研究，包括INT-0116试验、MAGIC试验以及ACTS-GC试验均表明，单纯手术治疗或手术联合术前或术后放化疗，不能够控制腹腔内复发转移。MAGIC试验表明含有蒽环类抗癌药物如阿霉素(Adriamycin，ADM)的化疗方案对胃癌有效。
阿霉素作为一种重要的传统化疗药物，毒副作用严重，主要包括心脏毒性、骨髓抑制、肝脏毒性等，临床应用严重受限。国内外大量研究表明组织蛋白酶B(Cathepsin B，Cat B)与胃癌等恶性实体瘤侵袭转移密切相关。Cat B具有以下主要特性，即主要分布于恶性肿瘤细胞胞浆及包膜表面，在肿瘤侵袭前锋部位含量最高，而正常组织细胞表达水平极低或不表达，同时Cat B能够特异酶解特定修饰肽段Phe-Lys。本发明即基于Cat B的特性，在ADM分子上合成添加一段Cat B特异酶解修饰基，形成新药PADM(Ac-Phe-Lys-PABC-ADM·HCl)。PADM本身不具细胞杀伤能力，在外周血中稳定，对正常或不表达Cat B细胞无(低)毒副作用；而在肿瘤组织尤其在肿瘤侵袭前锋部位，大量高活性Cat B特异酶解修饰肽段释放大量ADM分子；ADM被肿瘤细胞摄取，从而实现靶向杀伤肿瘤细胞的目的。
通过化学合成修饰ADM分子形成PADM，其具有靶向作用于Cat B，发挥抗癌及癌转移作用，有望改善胃癌患者生存质量，控制复发转移，延长患者生存期。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种靶向作用于Cat B的抗癌转移化学药PADM(Ac-Phe-Lys-PABC-ADM·HCl)。PADM易于合成，在血液中稳定存在，在肿瘤组织中能够发挥高效杀伤肿瘤细胞并抗癌转移，同时显著降低毒副作用。PADM对高表达Cat B恶性肿瘤组织具有靶向杀伤作用，具备阿霉素高效抗癌功能，避免了阿霉素严重心脏毒性。
本发明的另一个目的是在于提供了一种靶向抗癌转移化学药物PADM的制备方法。该方法操作方便易行，条件稳定，易于生产和制备高纯度PADM。操作方便，经济适用，具有很好的靶向抗癌能力。
本发明的再一个目的是在于提供了一种靶向抗癌转移化学药物PADM在胃癌腹膜转移癌治疗中的用途，PADM在胃癌腹膜转移癌裸鼠模型中能高效抑制腹膜转移癌形成，与传统阿霉素相比，显著降低毒副作用。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种靶向抗癌转移化学药物PADM，其具体分子式为C52H59N5O16.HCl，其具体结构为Ac-Phe-Lys-PABC-ADM·HCl，经过纯化分析得到高纯度PADM盐酸盐。结构为：
盐酸盐PADM的设计合成，主要基于Cat B与肿瘤发生发展的高度相关性，及Cat B在肿瘤组织中的分布特点，根据Cat B特异酶解Phe-Lys肽段的生物学特性，在ADM分子上合成Cat B特异酶解修饰肽段形成前体药。PADM具体结构为Ac-Phe-Lys-PABC-ADM·HCl，其中Ac(Acetyl)为乙酰基，Phe(Phenylalanyl)为苯丙胺酰基，Lys(Lysyl)为赖氨酸酰基，PABC为对氨基苄氧羰基，ADM为阿霉素分子。PADM为一种盐酸盐，能够很好溶解于水，在人血清中能够稳定存在，在含Cat B孵育液中能够快速释放ADM(t1/2＝16min)。
一种靶向抗癌转移化学药物PADM的制备方法。其步骤是：
(1)Fmoc-Lys(MMT)芴甲氧羰基-赖氨酸(4-甲氧基三苯基甲基)1：
在一个500ml三颈反应瓶中加入Fmoc-Lys盐酸盐(23.78g，56.42mmol)、无水二氯甲烷(250ml)、二异丙基乙胺(10.3ml，1.05eq)和三甲基氯硅烷(15ml，2.1eq)。将此混合物加热至80℃回流并保持1小时，然后将混合物冷却至4℃，尔后加入二异丙基乙胺(31ml，3.1eq)和4-甲氧基三苯甲基氯(18.29g，1.05eq)。将反应混合物在25℃下搅拌15小时。溶剂蒸发后，将残留物用pH＝5缓冲溶液、水和盐水洗涤3次，然后用硫酸纳干燥、过滤，蒸发后得到浅黄色粉末状产品(34.7g，96％)。
(2)Lys(MMT)赖氨酸(4-甲氧基三苯基甲基)2：
在一个250ml圆底三颈反应瓶内加入第一步的中间体Fmoc-Lys(MMT)(5.25g，8.19mmol)、二氯甲烷和乙腈(40ml∶40ml)，然后再加入二乙胺(80ml)。反应混合物在25℃下搅拌2小时，蒸馏除去溶剂，残留物用热乙腈洗涤，然后加入特丁基甲醚处理。固体产物用二氯甲烷和甲醇溶解(1∶1)得到一混合溶液。过滤除去不溶物，尔后蒸干滤液得到中间体Lys(MMT)(3.2g，94％)。
(3)Ac-Phe-Lys(MMT)乙酰基-苯丙胺酰基-赖氨酸(4-甲氧基三苯基甲基)3：
在一个250ml的三颈圆底烧瓶内加入水(25ml)和1，2-二甲氧基乙烷(70ml)。于氮气保护下加入上一步反应产物Lys(MMT)(4.09g，9.78mmol)和氢氧化锂(410.4mg，1eq)。然后在搅拌中加入Ac-Phe-OSu(Acetyl-L-Phenylalanyl-N-Oxysuccinimmide，2.9g，1.0eq)溶液(70ml 1，2-二甲氧基乙烷)。反应混合物搅拌4小时成为一均相溶液。反应进行到18小时后，蒸发至干。残留物用乙酸乙酯提取，用pH＝4缓冲溶液洗涤，然后再用水和盐水洗涤。干燥浓缩后产生浅黄色固体产物(5.35g，90％)。
(4)Ac-Phe-Lys(MMT)-PABOH乙酰基-苯丙胺酰基-赖氨基(4-甲氧基三苯基甲基)-对氨基苯甲醇4：
在一个250ml三颈圆底烧瓶中加入Ac-Phe-Lys(MMT)(5.31g，8.74mmol)，二氯甲烷(120ml)和特丁基二碳酸酯(2.86g，1.5eq)。于氮气保护下再加入吡啶(0.74ml，1.05eq)。反应混合物在25℃下搅拌15分钟后，加入对氨基苯甲醇(1.61g，1.5eq)。反应混合物在25℃下搅拌18小时后，蒸发溶剂至干。残留物在高真空下干燥后，用特丁基甲醚处理，固体产物用特丁基甲醚连续洗涤5次。产品经真空干燥后为5.24g(84％)。
(5)Ac-Phe-Lys(MMT)-PAB-PNP乙酰基-苯丙胺酰基-赖氨基(4-甲氧基三苯基甲基)-对氨基苯甲氧基-对硝基苯碳酸酯5：
在氮气保护下，往一个250ml三颈圆底烧瓶中加入Ac-Phe-Lys(MMT)-PABOH(5.1g，7.1mmol)，二对硝基苯碳酸酯(6.5g，3eq)和新鲜分子筛(10g)。然后在25℃下再加入二氯甲烷(120ml)和二异丙基乙胺(3.7ml，3eq)。反应混合物在25℃下搅拌18小时，尔后过滤除去固体杂质。滤液蒸干后于高真空下干燥6小时。粗产品可以经重结晶进一步纯化(二氯甲烷20ml和特丁基甲醚40ml)，固体产物经过滤，洗涤，和真空干燥得4.2g(67％)。
(6)Ac-Phe-Lys(MMT)-PABC-ADM乙酰基-苯丙胺酰基-赖氨基(4-甲氧基三苯基甲基)-对氨基苄氧羰基-阿霉素6：
在氮气保护下，往一个250ml三颈圆底烧瓶内加入Ac-Phe-Lys(MMT)-PABC-PNP(1.1g，1.25mmol)，阿霉素盐酸盐(763.4mg，1.05eq)，二甲基甲酰胺(60ml)二异丙基乙胺(0.23ml，1.05eq)。反应混合物在25℃下搅拌48h后，在加入400ml乙酸乙酯，有机相用水洗涤4次，然后蒸发至干。粗产品经层析柱纯化(二氯甲烷∶甲醇为20∶1到15∶1)得到桔黄色固体产品(0.56g，60％)。所述的有机相：甲醇、乙腈、氯仿、环己烷、二氯甲烷、四氢呋喃、正丁醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、四氯化碳、正己烷等。
(7)Ac-Phe-Lys-PABC-ADM·HCl乙酰基-苯丙胺酰基-赖氨基-对氨基苄氧羰基-阿霉素盐酸盐7：
在氮气保护下往一个250ml三颈圆底烧瓶中加入1.89g(1.48mmol)Ac-Phe-Lys(MMT)-PABC-ADM，茴香醚(16ml，100eq)和二氯甲烷(50ml)。反应混合物在25℃下搅拌中加入二氯醋酸(1.22ml，10eq)。反应混合物在搅拌2小时后倒入乙酸乙酯(400ml)中，然后在搅拌2小时，所得桔黄色固体经过滤后再用乙酸乙酯洗涤5次。固体粗产品溶解在甲醇(80ml)中，所得溶液缓慢经过离子交换树脂住(AG2-X8离子交换树脂Cl 50g)。所含产品组分离后蒸发至干。残留物经二氯甲烷处理后经过滤得到最终产品。产品在真空干燥10小时后得到1.51gAc-Phe-Lys-PABC-ADM·HCl(98％，HPLC 99.03％Area)。获得了一种靶向抗癌转移化学药物PADM。
一种靶向抗癌转移化学药物PADM在治疗或预防胃癌腹膜转移癌药物中的应用，包括以下内容：
(1)体外杀伤SGC-7901胃癌细胞：对数生长期的胃癌细胞，0.25％(0.25g胰酶/100mlPBS)胰酶消化，用含胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释，接种于24孔板，每孔接种1×105个细胞，培养48h后(Day 1，D1)取三孔细胞计数，分别设对照组(100μl生理盐水)、ADM组(0.5μg/ml)、ADM组(1.0μg/ml)、PADM组(0.9μg/ml)、PADM组(1.8μg/ml)、PADM组(3.6μg/ml)，继续培养，每天各取细胞消化并用计数板计数，连续6天，绘制细胞生长曲线(图1)。证明PADM在体外对肿瘤细胞具有一定杀伤作用。
(2)安全剂量大，毒副作用少：BALB/c-裸小鼠4只，分为剂量A组和B组，每组2只。参照ADM腹腔给药LD50＝13.6μg/g。A组分别于第1、8、15、22天，给予24μg/g、12μg/g、24μg/g、36μg/gPADM；B组分别于第1、8、15、22天，给予36μg/g、18μg/g、36μg/g、54μg/g PADM，均为A组1.5倍(24μg/g PADM＝13.4μg/g ADM)。每3天称量体重(图2)，观察动物状态，动物濒死时放血处死，取心、肝、肾行组织病理学检查(图3)，表明PADM安全剂量范围很大，对重要脏器心、肝、肾毒性较小。
(3)SGC-7901胃癌腹膜癌模型建立：BALB/c-nu/nu小鼠6只，4只皮下注射SGC-7901细胞5×106/0.2ml，2只腹腔注射SGC-7901细胞1×107/0.4ml。待皮下瘤形成，腹腔内形成腹水后，无菌获取肿瘤组织，用腹水匀浆，形成悬液，调整细胞浓度为1×107/ml。29只裸鼠腹腔注射匀浆0.2ml(Day 0，DO)，D8随机分为对照组(n＝9)、ADM组(n＝10)、PADM组(n＝10)
(4)具有高效抗癌效果：上述三实验组，分别于D8、D12、D16、D20、D24、D28、D32、D36给予生理盐水(10ml/kg)、ADM(2mg/kg)、PADM(7.2mg/kg)；D16、D24、D32给药前尾静脉采血80μl，EDTA抗凝行血常规检测。每2天观察动物状态，每4天称量裸鼠体重。D40实验终止。在裸鼠濒死或研究终点时，采取放血处死，血液凝固后4℃离心分离血清，部分行血生化检查，余-80℃冰箱存储备用。将裸鼠解剖检查腹膜癌情况，取心、肺、肝、脾、肾、肠等脏器进行常规病理学检查。腹膜癌转移程度按实验性腹膜癌指数(experimental Peritoneal Carcinomatosis Index，ePCI)表示，具体如下：将小鼠腹腔分为I区，横膈；II区，肝、脾、胃韧带及相应脏器；III区，小肠、结肠及系膜，腹壁；IV区，盆腔、泌尿生殖系统及直肠。各区肿瘤结节按下列标准评分：0分，无肉眼可见结节；1分，肿瘤结节直径≤2mm；2分，2mm＜肿瘤结节直径≤5mm；3分，肿瘤结节直径＞5mm；血性腹水1分，无血性腹水0分；将上述各区积分总和为ePCI。图4表明PADM在目前实验剂量下能够达到甚至优于ADM疗效，并能够抑制肺转移。
(5)对动物毒副反应轻：体重变化曲线(图5A)，实验终止裸鼠整体状况(图5B)，血常规动态检测(表1)，肝肾功能指标和病理检查(图6、图7)，充分证明PADM对动物整体状况影响小，避免骨髓抑制，对肝肾无明显毒性。
(6)显著降低心脏毒性：心功能指标和病理检查(图8)，表明PADM的心脏毒性明显弱于ADM，能够很好的保护心功能。
表1.ADM和PADM对外周血的影响
*P＜0.05，ADM&PADM vs Control，at the same timepoint；
#P＜0.05，PADM vs ADM，at the same time point.
RBC(红细胞)，HGB(血红蛋白)，PLT(血小板)，WBC(白细胞)，LYM(淋巴细胞)，NEU(中性粒细胞)
本发明通过在阿霉素分子氨基上添加一段Cat B特异酶解片段，形成阿霉素前体药。该新型化合物在外周血及正常低表达Cat B组织中无或低毒性，从而降低了阿霉素的副作用；同时该前体药在肿瘤组织细胞中，被活性Cat B酶解释放出阿霉素分子，达到靶向杀伤肿瘤细胞目的。
本发明具有如下特点：(1)PADM合成相对简单易行，制备工艺稳定，产率比较高；(2)PADM具有高效抗癌功能，与对照组相比，腹膜结节形成明显减少，ePCI评分显著降低(P＝0.003)；(3)PADM显著降低了ADM常见毒性，包括整体状态，PADM治疗组体重(23.61±0.80)显著优于ADM组(18.40±2.97g)(P＝0.000)，而与对照组(24.32±1.40g)无差异，和心脏毒性，CK和CK-MB均显著低于ADM组(P＝0.023和0.023)，而与正常对照相比差异不具有统计学意义等等。
附图说明
图1为一种PADM体外对SGC-7901细胞作用结果示意图。
表明PADM在体外对细胞有一定杀伤能力。
图2为一种PADM急性毒性动物体重变化示意图。
提示PADM对动物体重和整体状态影响较小。
图3为一种PADM急性毒性动物重要脏器病理示意图。
表明PADM对机体重要脏器心、肝、肾毒性弱。A1、A2和A3分别为低剂量组心、肝、肾病理切片HE染色，B1、B2和B3分别为高剂量组心、肝、肾病理切片HE染色，均未见显著损伤。
图4为一种PADM对胃癌腹膜转移癌疗效示意图。
显示出PADM良好的抗癌效果，在现有剂量水平下与传统药物阿霉素相当，甚至更优，并且能够抑制肺转移。A为ePCI评分，PADM和ADM组显著低于对照组。B为裸小鼠腹膜整体观，可见PADM和ADM组腹膜结节均显著减少。C为对照组肺内转移灶，PADM和ADM组均未见转移病例。
图5为一种PADM治疗胃癌腹膜转移癌整体毒副作用示意图。
从整体上显示PADM对动物副作用明显弱与传统阿霉素。A体重变化曲线，ADM组体重明显下降，PADM组与对照组相比体重保持良好。B实验终点动物整体观，ADM组状态明显弱于对照组和PADM组。
图6为一种PADM治疗胃癌腹膜转移癌肝肾功能生化指标示意图。
表明PADM对肝肾功能损伤小，优于传统阿霉素。
图7为一种PADM治疗胃癌腹膜转移癌肝肾病理检查示意图。
PADM治疗组肝脏损伤程度轻，未见明显肾脏毒性。A1、A2和A3分别为对照组、ADM组和PADM组肝脏组织病理切片HE染色。B1、B2和B3分别为对照组、ADM组和PADM组肾脏组织病理切片HE染色。
图8为一种PADM治疗胃癌腹膜转移癌心功能生化和病理检查示意图。
充分表明PADM的心脏毒性显著弱于传统阿霉素。A1、A2和A3分别为心功能三个重要指标具体数据，ADM组均显著高于对照和PADM组。B1、B2和B3分别为对照组、ADM组和PADM组典型心脏组织病理切片HE染色。
具体实施方式
实施实例1：
一种靶向抗癌转移化学药物PADM的制备方法，其步骤是：
(1)Fmoc-Lys(MMT)芴甲氧羰基-赖氨酸(4-甲氧基三苯基甲基)1：
在一个500ml三颈反应瓶中加入Fmoc-Lys盐酸盐(23.78g，56.42mmol)、无水二氯甲烷(250ml)、二异丙基乙胺(10.3ml，1.05eq)和三甲基氯硅烷(15ml，2.1eq)。将此混合物加热至80℃回流并保持1小时，然后将混合物冷却至4℃，尔后加入二异丙基乙胺(31ml，3.1eq)和4-甲氧基三苯甲基氯(18.29g，1.05eq)。将反应混合物在25℃下搅拌15小时。溶剂蒸发后，将残留物用pH＝5缓冲溶液、水和盐水洗涤3次，然后用硫酸纳干燥、过滤，蒸发后得到浅黄色粉末状产品(34.7g，96％)。
1H-NMR(CDCl3)分析结果：δ1.26，1.68(m，2H，4H)，2.45(m，2H)，3.71(S，3H)，4.05-4.40(m，4H)，6.81(d，2H)，7.15-7.77(m，20H)。MS(FAB)641(MH)+，663(M+Na)+，679(M+K)+。HRMS Calc：641.3015，Found：641.3001。
(2)Lys(MMT)赖氨酸(4-甲氧基三苯基甲基)2：
在一个250ml圆底三颈反应瓶内加入第一步的中间体Fmoc-Lys(MMT)(5.25g，8.19mmol)、二氯甲烷和乙腈(40ml∶40ml)，然后再加入二乙胺(80ml)。反应混合物在25℃下搅拌2小时，蒸馏除去溶剂，残留物用热乙腈洗涤，然后加入特丁基甲醚处理。固体产物用二氯甲烷和甲醇溶解(1∶1)得到一混合溶液。过滤除去不溶物，尔后蒸干滤液得到中间体Lys(MMT)(3.2g，94％)。
1H-NMR(DMSO-d6)分析结果：δ1.34，1.57，1.72(m，6H)，2.05(m，2H)，3.38(m，1H)，3.68(s，3H)，3.71(d，2H)，7.03-7.40(m，12H)。MS(FAB)419.2(MH)+，441.4(M+Na)+，457.4(M+K)+。Anal.Calc，C26H30N2O3·0.5H2O：C-73.04％，H-7.31％，N-6.55％。Found：C-73.62％，H-7.59，N-6.56％。
(3)Ac-Phe-Lys(MMT)乙酰基-苯丙胺酰基-赖氨酸(4-甲氧基三苯基甲基)3：
在一个250ml的三颈圆底烧瓶内加入水(25ml)和1，2-二甲氧基乙烷(70ml)。于氮气保护下加入上一步反应产物Lys(MMT)(4.09g，9.78mmol)和氢氧化锂(410.4mg，1eq)。然后在搅拌中加入Ac-Phe-OSu(Acetyl-L-Phenylalanyl-N-Oxysuccinimmide，2.9g，1.0eq)溶液(70ml 1，2-二甲氧基乙烷)。反应混合物搅拌4小时成为一均相溶液。反应进行到18小时后，蒸发至干。残留物用乙酸乙酯提取，用pH＝4缓冲溶液洗涤，然后再用水和盐水洗涤。干燥浓缩后产生浅黄色固体产物(5.35g，90％)。
1H-NMR(CDCl3/CD3OD)分析结果：δ1.22(m，2H)，1.58(m，3H)，1.71(m，1H)，1.82(s，3H)，2.49(m，2H)，3.00(m，2H)，3.75(s，3H)，4.26(t，1H)，4.63(t，1H)，6.82(d，2H)，7.10-7.43(m，17H)。MS(ESI)608.5(MH)+。Anal.Calc，C37H41N3O5·2.5H2O：C-68.08％，H-7.10％，N-6.44％。Found：C-68.39％，H-7.10％，N-6.23％。
(4)Ac-Phe-Lys(MMT)-PABOH乙酰基-苯丙胺酰基-赖氨基(4-甲氧基三苯基甲基)-对氨基苯甲醇4：
在一个250ml三颈圆底烧瓶中加入Ac-Phe-Lys(MMT)(5.31g，8.74mmol)，二氯甲烷(120ml)和特丁基二碳酸酯(2.86g，1.5eq)。于氮气保护下再加入吡啶(0.74ml，1.05eq)。反应混合物在25℃下搅拌15分钟后，加入对氨基苯甲醇(1.61g，1.5eq)。反应混合物在25℃下搅拌18小时后，蒸发溶剂至干。残留物在高真空下干燥后，用特丁基甲醚处理，固体产物用特丁基甲醚连续洗涤5次。产品经真空干燥后为5.24g(84％)。
1H-NMR(CDCl3/CD3OD)分析结果：δ1.31(m，1H)，1.50(m，1H)，1.89(m和s，7H)，2.18(m，2H)，3.00(m，2H)，3.74(s，3H)，4.40(t，1H)，4.61(s，2H)，4.68(m，1H)，6.67(d，1H)，6.77(d，2H)，7.00-7.55(m，21H)，8.92(br，1H)。MS(ESI)713.6(MH)+，735.7(M+Na)+。Anal.Calc C44H48N4O5·0.5H2O：C-73.21％，H-6.84％，N-7.76％。Found：C-73.48％，H-7.07％，N-7.71％。
(5)Ac-Phe-Lys(MMT)-PAB-PNP乙酰基-苯丙胺酰基-赖氨基(4-甲氧基三苯基甲基)-对氨基苯甲氧基-对硝基苯碳酸酯5：
在氮气保护下，往一个250ml三颈圆底烧瓶中加入Ac-Phe-Lys(MMT)-PABOH(5.1g，7.1mmol)，二对硝基苯碳酸酯(6.5g，3eq)和新鲜分子筛(10g)。然后在25℃下再加入二氯甲烷(120ml)和二异丙基乙胺(3.7ml，3eq)。反应混合物在25℃下搅拌18小时，尔后过滤除去固体杂质。滤液蒸干后于高真空下干燥6小时。粗产品可以经重结晶进一步纯化(二氯甲烷20ml和特丁基甲醚40ml)，固体产物经过滤，洗涤，和真空干燥得4.2g(67％)。
1H-NMR(CDCl3/CD3OD)分析结果：δ1.31(m，1H)，1.50(m，1H)，1.89(m和s，7H)，2.18(m，2H)，3.00(m，2H)，3.74(s，3H)，4.40(t，1H)，4.61(s，2H)，4.68(m，1H)，6.67(d，1H)，6.77(d，2H)，7.00-7.55(m，21H)，8.92(br，1H)。MS(ESI)713.6(MH)+，735.7(M+Na)+。Anal.Calc C44H48N4O5·0.5H2O：C-73.21％，H-6.84％，N-7.76％。Found：C-73.48％，H-7.07％，N-7.71％。
(6)Ac-Phe-Lys(MMT)-PABC-ADM乙酰基-苯丙胺酰基-赖氨基(4-甲氧基三苯基甲基)-对氨基苄氧羰基-阿霉素6：
在氮气保护下，往一个250ml三颈圆底烧瓶内加入Ac-Phe-Lys(MMT)-PABC-PNP(1.1g，1.25mmol)，阿霉素盐酸盐(763.4mg，1.05eq)，二甲基甲酰胺(60ml)二异丙基乙胺(0.23ml，1.05eq)。反应混合物在25℃下搅拌48h后，在加入400ml乙酸乙酯，有机相用水洗涤4次，然后蒸发至干。粗产品经层析柱纯化(二氯甲烷∶甲醇为20∶1到15∶1)得到桔黄色固体产品(0.56g，60％)。
1H-NMR(DMF-d7)分析结果：δ1.25(d，3H)，1.41(m，2H)，1.56(m，2H)，1.87(m和s，4H)，2.09(m，4H)，2.34(m，4H)，3.12(m，4H)，3.63(brs，1H)，3.78(s，3H)，3.92(m，1H)，4.11(s，3H)，4.33(m，1H)，4.51(m，1H)，4.68(m，1H)，4.81(s，2H)，4.90(m，1H)，5.00(brs，2H)，5.13(brs，1H)，5.40(brs，1H)，5.61(s，1H)，6.78(d，1H)，6.89(d，2H)，7.28(m，17H)，7.50(d，4H)，7.71(m，3H)，8.05(m，3H)，9.98(s，1H)。MS(ESI)1280.3(M-H)-，1282.4(MH)+。Anal.Calc C72H75N5O17·2H2O：C-65.59％，H-6.04％，N-5.31％。Found：C-65.46％，H-5.99％，N-5.25％。
(7)Ac-Phe-Lys-PABC-ADM·HCl乙酰基-苯丙胺酰基-赖氨基-对氨基苄氧羰基-阿霉素盐酸盐7：
在氮气保护下往一个250ml三颈圆底烧瓶中加入1.89g(1.48mmol)Ac-Phe-Lys(MMT)-PABC-ADM，茴香醚(16ml，100eq)和二氯甲烷(50ml)。反应混合物在25℃下搅拌中加入二氯醋酸(1.22ml，10eq)。反应混合物在搅拌2小时后倒入乙酸乙酯(400ml)中，然后在搅拌2小时，所得桔黄色固体经过滤后再用乙酸乙酯洗涤5次。固体粗产品溶解在甲醇(80ml)中，所得溶液缓慢经过离子交换树脂住(AG2-X8离子交换树脂Cl 50g)。所含产品组分离后蒸发至干。残留物经二氯甲烷处理后经过滤得到最终产品。产品在真空干燥10小时后得到1.51gAc-Phe-Lys-PABC-ADM·HCl(98％，HPLC 99.03％Area)。获得了一种靶向抗癌转移化学药物PADM。
1H-NMR(DMF-d7)分析结果：δ1.21(d，3H)，1.52(m，2H)，1.80(s和m，9H)，2.22(m，1H)，2.39(m，1H)，3.03(m，6H)，3.60(m，1H)，3.87(m，1H)，4.05(s，3H)，4.30(m，1H)，4.52(m，1H)，4.67(m，1H)，4.74(s，2H)，4.91(m，2H)，5.11(brs，1H)，5.38(brs，1H)，5.60(brs，1H)，6.75(d，1H)，7.26(m，7H)，7.71(m，3H)，7.91(m，1H)，8.32(d，1H)，8.45(br，3H)，10.21(brs，1H)。MS(ESI)1010.5(MH)+。Anal.calc C52H60N5O16Cl·2.5H2O：C-57.22％，H-6.00％，N-6.41％。Found：C-57.16％，H-6.03％，N-6.34％.
实施实例2：PADM在制备治疗或预防胃癌腹膜转移癌的药物中的试验。
一种靶向抗癌转移化学药物PADM在制备治疗或预防胃癌腹膜转移癌药物中的应用。包括以下内容：体外细胞实验，体内毒性实验和胃癌腹膜转移癌动物模型实验。
(1)体外细胞实验：
体外杀伤SGC-7901胃癌细胞：对数生长期的胃癌细胞，0.25％(0.25g胰酶/100ml PBS)胰酶消化，用含胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释，接种于24孔板，每孔接种1×105个细胞，培养48h后(Day 1，D1)取三孔细胞计数，分别设对照组(100μl生理盐水)、ADM组(0.5μg/ml)、ADM组(1.0μg/ml)、PADM组(0.9μg/ml)、PADM组(1.8μg/ml)、PADM组(3.6μg/ml)，继续培养，每天各取细胞消化并用计数板计数，连续6天，绘制细胞生长曲线(图1)。
(2)体内毒性实验：
BALB/c-裸小鼠4只，分为剂量A组和B组，每组2只。参照ADM腹腔给药LD50＝13.6μg/g。A组分别于第1、8、15、22天，给予24μg/g、12μg/g、24μg/g、36μg/g PADM；B组分别于第1、8、15、22天，给予36μg/g、18μg/g、36μg/g、54μg/g PADM，均为A组1.5倍(24μg/g PADM＝13.4μg/g ADM)。每3天称量体重(图2)，观察动物状态，动物濒死时放血处死，取心、肝、肾行组织病理学检查(图3)。
(3)胃癌腹膜转移癌动物模型实验：
A.BALB/c-nu/nu小鼠6只，4只皮下注射SGC-7901细胞5×106/0.2ml，2只腹腔注射SGC-7901细胞1×107/0.4ml。待皮下瘤形成，腹腔内形成腹水后，无菌获取肿瘤组织，用腹水匀浆，形成悬液，调整细胞浓度为1×107/ml。29只裸鼠腹腔注射匀浆0.2ml(Day 0，DO)，D8随机分为对照组(n＝9)、ADM组(n＝10)、PADM组(n＝10)，建立胃癌腹膜转移癌模型。
B.对照组、ADM组和PADM组，分别于D8、D12、D16、D20、D24、D28、D32、D36给予生理盐水(10ml/kg)、ADM(2mg/kg)、PADM(7.2mg/kg)；D16、D24、D32给药前尾静脉采血80μl，EDTA抗凝行血常规检测。每2天观察动物状态，每4天称量裸鼠体重。D40实验终止。在裸鼠濒死或研究终点时，采取放血处死，血液凝固后4℃离心分离血清，部分行血生化检查，余-80℃冰箱存储备用。将裸鼠解剖检查腹膜癌情况，取心、肺、肝、脾、肾、肠等脏器进行常规病理学检查。腹膜癌转移程度按实验性腹膜癌指数(experimentalPeritoneal Carcinomatosis Index，ePCI)表示，具体如下：将小鼠腹腔分为I区，横膈；II区，肝、脾、胃韧带及相应脏器；III区，小肠、结肠及系膜，腹壁；IV区，盆腔、泌尿生殖系统及直肠。各区肿瘤结节按下列标准评分：0分，无肉眼可见结节；1分，肿瘤结节直径≤2mm；2分，2mm＜肿瘤结节直径≤5mm；3分，肿瘤结节直径＞5mm；血性腹水1分，无血性腹水0分；将上述各区积分总和为ePCI(图4)。
C.毒副作用评估。动物整体状态评估包括体重变化曲线(图5A)和实验终止裸鼠整体状况(图5B)。血常规动态检测(表1)，肝肾功能指标和病理检查(图6、7)，心功能指标和病理检查(图8)。
Claims (1)
1.一种靶向抗癌转移化学药物PADM在制备治疗胃癌腹膜转移癌药物中的应用，所述的PADM为：
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| Firestone, Raymond A.Cathepsin B-sensitive dipeptide prodrugs. 1. A model study of structural requirements for efficient release of doxorubicin.《Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters》.1998,第8卷(第23期),第3341页. |
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