CN104371009B - GnRH多肽‑甲氨蝶呤偶联物、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种下式所示的GnRH‑甲氨蝶呤偶联物，其可由GnRH多肽或其类似物与甲氨蝶呤或其衍生物制得。本发明还提供了GnRH‑甲氨蝶呤偶联物的制备方法和其在制备抗肿瘤药物方面的用途，本发明的GnRH‑甲氨蝶呤偶联物制备工艺简单，产率高，易纯化，且在抗肿瘤方面具有良好的肿瘤靶向性，能够将药物浓集于肿瘤部位。

Description

GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物、其制备方法及用途。

背景技术

恶性肿瘤是一类严重危害人类身心健康、影响社会劳动力的疾病，给众多家庭及社会带来了沉重的经济负担。据统计，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。我国近20年来癌症发病率上升了69％，死亡率上升了29％，每年癌症新发病例为220万，因癌症死亡人数为160万。每四五个死者中就有一个死于癌症，癌症已成为威胁人类生命健康的主要杀手。而前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤，其发病率随年龄的增长而增加，已成为严重威胁人类健康的恶性疾病。在美国癌症学会公布的统计报告中，2009年美国大约有19.228万名男性被诊断为前列腺癌，约有2.736万前列腺癌患者死亡；2012年前列腺癌发病率在男性肿瘤中排名第一，死亡率排名第二，仅次于肺癌；虽然我国前列腺癌发病率明显低于欧美发达国家，但近年来，随着我们国家的发展，生产力水平的提高，我国人们的物质生活水平已明显提高、膳食结构发生了重大改变、医疗水平有了很大的提高、诊断技术不断提高、生活方式和工作方式发生改变、人均寿命延长以及人口老龄化等，我国前列腺癌发病率逐年上升。2012年中国肿瘤登记年报的统计数据表明：中国前列腺癌发病率约为17.35/10万，在男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中排名第一位。近十年来，前列腺癌在我国的发病率呈明显上升趋势，已经成为发病率增长最快的肿瘤之一，前列腺癌已经严重影响人们的生活质量。如何研究特效药治疗恶性前列腺癌、提高患者的生存质量和生存时间，已成为当前医药工作者研究的重点和热点。

目前，传统治疗前列腺癌的方法有手术治疗、放疗和化疗，但是手术治疗只能切除外在的肿瘤，对于通过淋巴途径转移、血液途径转移或浸润的正常组织肿瘤细胞却无能为力；放疗则是只能进行局部照射，而且在杀死肿瘤组织时也会对正常组织有影响；化学治疗是全身治疗，但是对肿瘤细胞不具有肿瘤特异性，在杀死肿瘤细胞时也会杀死正常细胞，而且对于潜伏期的肿瘤细胞无杀伤力。针对这些传统治疗癌症的方法存在的缺陷,一些专家学者提出了靶向给药这一概念。其实早在1897年Paul Ehrlich's提出了"魔术子弹"(magicbullet)的假说，即利用抗体进行“靶向治疗”，即药物只作用于肿瘤细胞而对正常细胞没有损伤。但是由于受当时单克隆抗体制备极其困难以及各种条件的限制，靶向治疗这一概念没有得到推广。直到1975年克勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)提出杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的单克隆抗体。靶向药物才又再次引起了医药研发工作者的关注。随着后面几十年的发展，靶向治疗已成为治疗肿瘤的一种重要手段。靶向治疗是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点(该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段)，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为“生物导弹”。靶向给药系统不但能将治疗药物最大限度地运送到病变部位，使治疗药物在病灶区浓集，病灶区的药物浓度超出常规制剂的数倍乃至数百倍，疗效显著提高；同时还可以减少药物的用量，从而降低药物的不良反应，而且便于控制给药的速度和方式，达到高效低、毒的治疗效果。因此近年来能提高疗效且大幅度减低患者毒副作用的肿瘤靶向药物的研发和临床应用受到了广泛关注，肿瘤靶向药物开始逐渐成为临床“新宠”。

甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是一种抗代谢性广谱抗肿瘤药，属细胞周期特异性药物，主要作用于细胞周期的S期。由于四氢叶酸是在体内合成嘌呤核苷酸和嘧啶脱氧核苷酸的重要辅酶，MTX作为一种叶酸还原酶抑制剂，主要抑制二氢叶酸还原酶而使二氢叶酸不能被还原成具有生理活性的四氢叶酸，从而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成过程中一碳基团的转移受阻，导致DNA的生物合成受到明显抑制。此外，本药也可抑制胸腺核苷酸合成酶，但抑制RNA与蛋白质合成的作用较弱。低剂量MTX(每天2.5-5mg)即能明显抑制增殖的淋巴样细胞，特别是激活的T淋巴细胞。MTX还有很强的抗炎作用。大剂量MTX具有抗肿瘤作用。能选择性抑制增殖中的细胞，阻止免疫母细胞的分裂增殖，对细胞免疫及体液免疫均有抑制作用。20世纪40年代即用于治疗儿童白血病，50年代始用于银屑病的治疗。现在主要用于头颈部癌、肺癌、各种软组织肉瘤、银屑病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌、睾丸癌和前列腺癌等肿瘤的治疗，不良反应主要为骨髓抑制、肝脏毒性和胃肠道毒性。

虽然甲氨蝶呤是临床上常用的抗肿瘤药物，但长期应用出现的耐药性及对正常组织器官的毒副作用，限制了甲氨蝶呤在临床上的应用。

发明内容

促性腺激素释放激素(Gonadotropin releasing hormone,GnRH)主要由下丘脑弓状核分泌细胞产生的十肽激素，调控人体激素水平及生殖功能。有研究发现，肿瘤细胞表面GnRH受体受到广泛关注。前列腺癌肿瘤细胞表面亦高表达GnRH受体，而正常前列腺组织则是低表达或不表达GnRH受体。由此，为解决现有技术中存在的上述问题，本发明选择了临床上常用广谱抗肿瘤药物MTX，与GnRH多肽通过共价键偶联，形成GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物。

本发明一方面提供了一种GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物，其由GnRH多肽或其类似物与甲氨蝶呤或其衍生物制得。

对所述GnRH多肽或其类似物没有特殊限定，只要其能够与甲氨蝶呤或其衍生物发生偶联反应即可。例如，所述GnRH多肽或其类似物可以包含能够与甲氨蝶呤或其衍生物发生偶联反应的活性基团。所述活性基团例如为氨基，例如，D-Lys单元中的氨基。

优选的，所述GnRH多肽或其类似物中至少包含一个D-Lys单元。

在一个优选实施方式中，所述GnRH多肽或其类似物可以指的是R₁-His-Trp-Ser-Tyr-R-Leu-Arg-Pro-R₂，如下面结构式所示：

其中

R₁可以为P-Glu或AC，其中AC是用来封闭末端NH₂的乙酸酐；

R可以为D-Lys，D-Lys(Ahx)或D-Lys(miniPEG)，其中Ahx为6-氨基己酸，miniPEG为分子量400以下的聚乙二醇；

R₂可以为NH₂，NHEt,Gly-NH₂或Gly-NHEt，其中Gly-NHEt为甘氨酸-乙胺。

在一个更优选的实施方式中，所述GnRH多肽或其类似物为pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-NH₂，其分子式为：C₅₇H₈₁N₁₇O₁₂，分子量为：1196.36；其化学结构式为：

本发明中的GnRH多肽或其类似物可用常规的多肽制备方法制备，或者从多肽生产公司定制，例如可以从上海吉尔生化有限公司定制。

对甲氨蝶呤或其衍生物没有特殊限定，只要其能够与所述GnRH多肽或其类似物发生偶联反应即可。例如，在GnRH多肽或其类似物含有氨基(例如D-Lys单元中的氨基)的情况下，所述甲氨蝶呤或其衍生物可以通过酰胺化反应与GnRH多肽或其类似物发生偶联反应。特别地，所述甲氨蝶呤或其衍生物可以选自甲氨蝶呤、其药学上可接受的盐、酰卤(例如酰氯)和酯。

一种优选的GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物具有如下结构：

其化学式为C₇₇H₁₀₁N₂₅O₁₆。

本发明还提供了所述GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的制备方法，所述方法包括使GnRH多肽或其类似物与甲氨蝶呤或其衍生物发生偶联反应。

对用GnRH多肽或其类似物与甲氨蝶呤或其衍生物发生偶联反应制备本发明的GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的方法没有具体限定，只要能够使得两者能够偶联在一起即可。例如，在GnRH多肽或其类似物含有氨基(例如D-Lys单元中的氨基)的情况下，所述偶联反应可以通过酰胺化反应，使得甲氨蝶呤或其衍生物中的羧基或酯基与GnRH多肽或其类似物中的氨基反应而偶联在一起。

在一个优选的实施方式中，通过使甲氨蝶呤活性酯与GnRH多肽或其类似物的D-Lys上的氨基发生酰胺化反应制备得到本发明的一种GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物。所述酰胺化反应中，甲氨蝶呤活性酯与GnRH多肽或其类似物的摩尔比可以为1.1:1-2:1，例如1.5:1，反应温度可以为25℃-45℃，例如25℃，以及反应时间可以为4-24小时，例如4小时，反应溶剂例如可以为DMF。

此外，上述GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的合成还可以包括纯化步骤，优选地，所述纯化步骤如下进行：反应后，向反应混合物中缓慢加入乙醚进行沉淀，终止反应，静置24h，过滤沉淀，用乙醚等有机溶剂洗涤沉淀，将沉淀溶解于DMF溶液后，通过反相制备液相纯化，旋转蒸发除去有机溶剂，旋蒸温度控制在35℃左右，然后将浓缩的水溶液冷冻干燥，冷冻温度为-40℃以下，得到GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物。

上述的甲氨蝶呤活性酯指的是对甲氨蝶呤或其衍生物的γ-位羧基进行酯化活化得到的活性酯。对该活性酯没有特殊限定，只要在活化后能够促进在该位置与GnRH多肽或其类似物的D-Lys上的氨基发生酰胺化反应即可。特别地，所述甲氨蝶呤活性酯可以为将甲氨蝶呤通过它的γ-位羧基与N-羟基丁酰亚胺经缩合反应形成的甲氨蝶呤活性酯。

如下反应式所示：

更特别地，上述甲氨蝶呤活性酯的合成包括以下步骤：

(1)将甲氨蝶呤与羰基活化试剂反应以活化γ-位羧基；所述甲氨蝶呤与羰基活化试剂的摩尔比可以为约1:3；所述羰基活化试剂可以选自EDC.HCl、DCC和DIC等；反应温度可以为25℃-45℃，例如25℃；反应溶剂例如可以为DMSO；反应时间可以为1.5-2.5h；

(2)向上步反应混合物中加入NHS和DMAP，所述甲氨蝶呤与NHS的摩尔比可以为1:2-1:4，所述DMAP与甲氨蝶呤的摩尔比可以为1.5:1-1:2，例如为1:2，以及反应时间可以为4-24小时，例如24小时。

上述甲氨蝶呤活性酯的合成可以用TLC跟踪反应，反应优选在无水无氧和避光条件下进行。

上述甲氨蝶呤活性酯的合成还可以包括纯化步骤：反应后，将反应混合物过滤，干燥，除去溶剂，硅胶柱色谱分离提纯，得到甲氨蝶呤活性酯。所述硅胶柱色谱的洗脱液为乙酸乙酯/石油醚(V/V＝1:6)。

本发明的另一方面还提供了所述GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物在制备用于治疗癌症的抗肿瘤药物中的用途。所述癌症例如为头颈部癌、肺癌、各种软组织肉瘤、银屑病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌、睾丸癌和前列腺癌等，优选为前列腺癌。

本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的所述GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物和任选的药学上可接受的载体。

本发明中，除非另有说明，所用的缩写具有如下含义：

EDC.HCl，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，CAS号：25952-53-8；

DCC，N'-二环己基碳二亚胺，CAS号：538-75-0；

DIC，N,N-二异丙基碳二亚胺，CAS号：693-13-0；

DMSO，二甲基亚砜，CAS号：67-68-5；

NHS，N-羟基琥珀酰亚胺，CAS号，6066-82-6；

DMAP，4-二甲氨基吡啶，CAS号：1122-58-3；

DMF，N,N-二甲基甲酰胺，CAS号：68-12-2。

本发明中，除非另有说明，所使用的数值范围包括在该范围内的所有数值以及其中的任一子范围。

附图说明

图1为GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物液相色谱图；

图2为GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物质谱图；

图3为GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物核磁共振氢谱图；

图4为实施例8.1荷瘤裸鼠体重变化曲线；

图5为实施例8.2荷瘤裸鼠脏器系数变化曲线；

图6为实施例8.3荷瘤裸鼠肿瘤体积变化曲线；

图7为实施例8.3荷瘤裸鼠相对肿瘤增殖率变化曲线；

图8为实施例8.4荷瘤裸鼠的肿瘤块的图片；

图9为实施例8.5荷瘤裸鼠血清PSA、PCNA、T和DHT的变化曲线；

图10为实施例8.6荷瘤裸鼠病理组织学(肿瘤)检查照片：A、阴性对照组：肿瘤正常；B、GnRH多肽组：肿瘤正常；C、比卡鲁胺组：肿瘤生长不良；D、甲氨蝶呤组：肿瘤生长不良；E、高剂量组：肿瘤钙化；F、中剂量组：肿瘤钙化；G、低剂量组：肿瘤钙化；

图11为实施例8.6荷瘤裸鼠病理组织学(肺脏)检查照片：A、阴性对照组：肺脏正常；B、GnRH多肽组：肺脏微小癌细胞灶；C、比卡鲁胺组：肺脏微小癌细胞灶；D、甲氨蝶呤组：肺脏正常；E、高剂量组：肺脏正常；F、中剂量组：肺脏正常；G、低剂量组：肺脏正常；

图12为实施例8.6荷瘤裸鼠病理组织学(肝脏)检查照片：A、阴性对照组：肝脏正常；B、GnRH多肽组：肝脏微小癌细胞灶；C、比卡鲁胺组：肝脏微小癌细胞灶；D、甲氨蝶呤组：肝脏正常；E、高剂量组：肝脏正常；F、中剂量组：肝脏正常；G、低剂量组：肝脏正常；

图13为实施例8.6荷瘤裸鼠病理组织学(肾脏)检查照片：A、阴性对照组：肾脏正常；B、GnRH多肽组：肾脏正常；C、比卡鲁胺组：肾脏正常；D、甲氨蝶呤组：肾脏正常；E、高剂量组：肾脏正常；F、中剂量组：肾脏正常；G、低剂量组：肾脏正常；

图14为实施例8.6荷瘤裸鼠病理组织学(淋巴结)检查照片：A、阴性对照组：淋巴结癌细胞浸润；B、GnRH多肽组：淋巴结癌细胞浸润；C、比卡鲁胺组：淋巴结癌细胞浸润；D、甲氨蝶呤组：淋巴结癌细胞浸润；E、高剂量组：淋巴结癌细胞浸润；F、中剂量组：淋巴结癌细胞浸润；G、低剂量组：淋巴结癌细胞浸润。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。

实施例中所使用的GnRH多肽，分子式为：C₅₇H₈₁N₁₇O₁₂，分子量为：1196.36，序列为：pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-NH₂。生产厂家为：上海吉尔生化有限公司，批号为：20131015。

实施例1甲氨蝶呤活性酯的制备

实施例1平行设定三组(实施例1.1、1.2、1.3)，甲氨蝶呤454mg(1mmol)溶解于20mLDMSO，加入575.1mg(3mmol)的EDC.HCl试剂，分别在25℃、35℃和45℃下反应两小时，两小时后加345.27mg(3mmol)NHS和61.22mg(0.5mmol)DMAP，整个反应在无水无氧和避光的条件下进行，用薄层色谱(TLC)跟踪反应，反应24h后终止反应，抽滤，除去未反应的固体试剂，然后用乙醚丙酮混合溶剂稀释反应液，无水MgSO4干燥24h，抽滤，旋蒸去溶剂，硅胶柱色谱(V乙酸乙酯:V石油醚＝1:6)分离提纯，得黄色液体，称量得甲氨蝶呤活性酯的重量，计算反应产率，结果见表1。

表1实施例1三种温度下制备甲氨蝶呤活性酯产率

随着反应温度增加，反应产率略有增加，但是增加不明显。实施例1的三种反应温度下，甲氨蝶呤活性酯的产率均在78％以上，从反应的操作的简单方便上而言，在25℃室温更加容易控制。

实施例2甲氨蝶呤活性酯的制备

实施例2平行设定三组(实施例2.1、2.2、2.3)，甲氨蝶呤423.66mg(0.93mmol)溶解于20mLDMSO，加入534.8mg(2.79mmol)的EDC.HCl试剂，在室温下反应时间分别为2小时，2小时候后加入321.12mg(2.79mmol)NHS和57.42mg(0.47mmol)DMAP，整个反应在无水无氧和避光的条件下进行，用TLC跟踪反应，之后实施例2.1、2.2和2.3三组反应的反应时间分别设为4小时，12小时和24小时后，终止反应，过滤除去未反应完的固体试剂，然后用乙醚丙酮混合溶剂稀释反应液，无水MgSO4干燥24h，抽滤，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱(V乙酸乙酯:V石油醚＝1:6)分离提纯，得黄色液体，称量得甲氨蝶呤活性酯的重量，计算反应产率，结果见表2。

表2实施例2三种反应时间制备甲氨蝶呤活性酯产率

表2数据可见，4小时，12小时和24小时三组反应得到的甲氨蝶呤活性酯的重量分别为：237.44mg，278.19mg和389.73mg；理论产量为512.90mg；三组反应时间的反应产率分别为：46.29％(4小时)，54.24％(12小时)和75.99％(24小时)反应时间越长，反应产率越高。

实施例3甲氨蝶呤活性酯的制备

实施例3平行设定三组(实施例3.1、3.2、3.3)，甲氨蝶呤448.6mg(0.988mmol)溶解于20mLDMSO(含0.2mL的三乙胺)，加入465mg(2.96mmol)的EDC.HCl试剂，室温下反应两小时，两小时后加入345.27mg(3mmol)NHS，实施例3.1、3.2和3.3分别加入DMAP的量为61.1mg(0.5mmol)、122.2mg(1.0mmol)和183.3mg(1.5mmol)，整个反应在无水无氧和避光的条件下进行，用TLC跟踪反应，反应24h后终止反应，过滤除去未反应完的固体试剂，然后用乙醚丙酮混合溶剂稀释反应液，无水MgSO4干燥24h，抽滤，旋蒸去溶剂，硅胶柱色谱(V乙酸乙酯:V石油醚＝1:6)分离提纯，得黄色液体，称量得甲氨蝶呤活性酯的重量，计算反应产率，结果见表3。

表3实施例3三种催化剂用量制备甲氨蝶呤活性酯产率

实施例3使用三种催化剂用量得到甲氨蝶呤活性酯的重量分别为：418.37mg，369.28mg和408.76mg；理论产量为544.88mg；反应产率分别为：76.78％(0.5mmolDMAP)，67.77％(1.0mmolDMAP)和75.02％(1.5mmolDMAP)；从表3，当DMAP和甲氨蝶呤的摩尔比为1:2的时候，反应产率更高。

实施例4GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的制备

实施例4-6为将甲氨蝶呤活性酯制备GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的制备，实施例4-6所使用的甲氨蝶呤活性酯为实施例1.1制备得到的。

实施例4平行设定三组(实施例4.1、4.2、4.3)，将12.13mg(22μmol)的甲氨蝶呤活性酯溶解在2000μLDMF(含20μl三乙胺)中，然后把23.93mg(20μmol)GnRH多肽溶解于DMF中，实施例4.1、4.2、4.3三组反应分别在25℃、35℃和45℃下反应3小时；缓慢加入乙醚进行沉淀，终止反应，然后静置24h，抽滤，除去上清液，将沉淀用乙醚洗涤三次，然后溶解在DMF溶液中，通过反相制备液相纯化得到GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物。将各个收集管合并，在35℃左右旋转蒸发除去有机溶剂，然后通过冷冻干燥机冷冻干燥24h，除去有机溶剂，称量得GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物，称重，计算反应产率，结果见表4。

表4实施例4三种温度下GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物产率

三种温度条件下分别得到GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的重量分别为：16.18mg、17.36mg及18.12mg；理论产量为32.66mg；反应产率为：49.54％(25℃),53.15％(35℃)和55.48％(45℃)。从表4可见，三种反应温度下的产物得率没有显著性差异，从反应的操作的简单方便上而言，在25℃室温更加容易控制。

实施例5GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的制备

实施例5平行设定三组(实施例5.1、5.2、5.3)，将60.78mg(110μmol)甲氨蝶呤活性酯溶解在10mLDMF(含100μL三乙胺)中，然后把119.82mg(100μmol)GnRH多肽溶解于DMF中，在25℃下反应，实施例5.1、5.2、5.3三组反应分别反应4小时，6小时及24小时；反应终止时缓慢加入乙醚进行沉淀，终止反应，然后静置24h，抽滤，除去上清液，将沉淀用乙醚洗涤三次，然后溶解在DMF溶液中，通过反相制备液相纯化得到GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物。将各个收集管合并，低温下蒸发干燥，然后冷冻干燥24h，称量得GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物称重，计算反应产率，结果见表5。

表5实施例5三种反应时间GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物产率

实施例5.1、5.2和5.3得到的GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的重量分别为：82.15mg、80.17mg及84.38mg；理论产量为163.28mg；反应产率为：50.31％(4小时)，49.10％(12小时)和51.68％(24小时)。从表5可见，随着反应时间的延长，产物得率基本一致，没有显著性差异。

实施例6GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的制备

实施例6平行设定三组(实施例6.1、6.2、6.3)，甲氨蝶呤活性酯与GnRH多肽的摩尔比分别为：1.1:1、1.5:1及2:1，具体的为：GnRH多肽重量均为131.60mg(110μmol)，实施例6.1、6.2和6.3的甲氨蝶呤活性酯的重量分别为66.73mg(121μmol)、91.00mg(165μmol)和121.33mg(220μmol)；然后在25℃下反应，反应时间3小时；反应终止是缓慢加入乙醚进行沉淀，终止反应，然后静置24h，抽滤，除去上清液，将沉淀用乙醚洗涤三次，然后溶解在DMF溶液中，通过反相制备液相纯化得到GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物。将各个收集管合并，低温下蒸发干燥，然后冷冻干燥24h，称量得GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物、称重，计算反应产率，结果见表6。

表6实施例6三种原料比例GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物产率

实施例6.1、6.2和6.3得到的GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的重量分别为：92.17mg、160.78mg及162.35mg；理论产量为179.61mg；反应产率为：51.32％(1.1:1),89.52％(1.5:1)和90.38％(2:1)。从表6可见，活性酯与甲氨蝶呤不同摩尔比进行反应，甲氨蝶呤活性酯与GnRH多肽比例为1.1:1所得到的目标产物的产率51.32％，当甲氨蝶呤活性酯与GnRH多肽的比例提高时，产率显著性提高，尤其是当反应物比例为1.5时，产率达到90.39％，发明人在实验中发现当甲氨蝶呤活性酯比例进一步提高时，产率则没有再太大变化。

实施例7GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的分析

以实施例6.3制得的GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物进行分离纯化，

纯化条件：

对纯化得到的GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物进行液相色谱分析、质谱解析和核磁共振氢谱解析。

实施例7.1液相色谱分析

通过对纯化后的GnRh多肽-甲氨蝶呤偶联物的液相色谱分析，GnRH-MTX偶联物的终产物纯度为98.35％。液相色谱图见图1。

实施例7.2质谱解析

采用大电喷雾电离源(ESI)正离子检测方式，得到本品的[M+2H]²⁺817峰，确定本品分子量为1632，与GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的分子量相符。质谱图见图2。

实施例7.3核磁共振氢谱解析

仪器型号：Bruker,AVANCE III 400MHz UltraShield-PlusTM digital NMRspectrometer；

测试条件：溶剂：CDCl₃；

测试项目：¹H；

测试结果：核磁共振氢谱图见图3。

GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的化学结构式为：

化学位移综合解析：δ＝11.309～11.319ppm为-COOH的羟基峰，提示分子中存在一个羧基(36号羧基)，δ＝13.412～13.445ppm未咪唑环上的氢(为结构编号中的82号)，提示分子结构中含有咪唑氢；δ＝8.032～8.127ppm为CONH上的NH峰，且NH的一断为羰基，一端为CH或CH₂，从积分情况上看提示存在8个-CO-NH-CH(或-CO-NH-CH₂)，在原来GnRH多肽上存在7个这样的-CO-NH-CH(或-CO-NH-CH₂)基团，这表明通过偶联新生了一个-CO-NH-CH(或-CO-NH-CH₂)基团，提示化合物偶联成功，且仅仅与甲氨蝶呤上的γ羧基进行了缩合反应。

实施例8GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的抗肿瘤活性测试

以实施例7纯化后的GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物(缩写为GnRH-MTX)进行抗肿瘤活性测试。

对照品1：甲氨蝶呤(缩写为MTX)，厂家为浙江湖州展望药业股份有限公司，批号为20130105。

对照品2：GnRH多肽，厂家为上海吉尔生化有限公司，批号为20131015。

对照品3：比卡鲁胺，厂家为武汉大华伟业医药化工有限公司，批号为G00001-120901。

肿瘤模型的建立：前列腺癌细胞PC-3，来源为中国科学院上海细胞和生化科学研究所，前列腺癌细胞PC-3是肿瘤药理学研究中公认的标准细胞，其癌细胞表达GnRH受体。细胞培养：于10％的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的F12培养基培养。细胞株培养条件：37℃，5％的CO₂培养箱中培养，传2-3代用于接种。取对数期生长的前列腺癌细胞以0.25％的胰酶消化后，加入新鲜培养液重悬制成细胞悬液，1000rpm离心5分钟后重悬于PBS溶液中，调整细胞密度，用台盼蓝排除法检验细胞存活率大于90％的细胞悬液可用。取上述方法制备的细胞悬液以2×10⁷个细胞，0.2ml/只接种至BALB/c雄性裸小鼠的颈背部皮下，形成一小皮丘表明接种成功，共接种70只裸鼠。过2～3周，裸鼠皮下长出肿瘤，等肿瘤长至60mm³大小时，可算接种成功，此时裸鼠称为荷瘤裸鼠。

分组方法：即选取肿瘤长至10mm×10mm左右的荷瘤鼠70只，雄性，随机分为阴性对照组、比卡鲁胺对照组、甲氨蝶呤组、GnRH多肽组、GnRH-MTX偶联物低、中、高剂量组，每组10只；

药物配制方法如下，给药剂量见表7。

稀释剂1：生理盐水，用碳酸氢钠调节PH至7.8；

稀释剂2：称量0.86g碳酸氢钠，溶于1000mL水中，摇匀，用冰乙酸调节PH值为5.8；

阴性对照组：称量0.86g碳酸氢钠，溶于1000mL水中，摇匀，用冰乙酸调节PH值为5.8；

比卡鲁胺组：精密称取35mg比卡鲁胺于10mL容量瓶中，然后用DMF溶液，摇匀，定容至刻度即可；

甲氨蝶呤组：精密称取甲氨蝶呤12.00mg置于25mL容量瓶中，用稀释剂1溶解，摇匀，即可；

多肽组：精密称取GnRH多肽31.61mg置于25mL容量瓶中，用生理盐水溶解，摇匀，即可；

高剂量组：精密称取GnRH-MTX偶联药物43.14mg置于25mL容量瓶中用稀释剂2溶解，摇匀，即可；

中剂量组：用移液管精密移取高剂量组溶液5mL，于25mL容量瓶中，用稀释剂2溶解，摇匀，即可；

低剂量组：用移液管精密移取中剂量组溶液5mL，于25mL容量瓶中，用稀释剂2溶解，摇匀，即可。

表7对荷瘤(PC-3)裸鼠药效学测试给药剂量

注：1)本表为各动物体重为20g/只时的供试品配制方法，实验过程中根据动物体重新调整供试品的配制量；2)甲氨蝶呤临床用剂量为0.4mg/kg，静注，每周两次；折算成小鼠等效剂量约为4.8mg/kg，静注，每三天一次；3)GnRH多肽偶联物高剂量组给药剂量按照甲氨蝶呤临床用量的等摩尔给药，给药剂量的剂距是5倍。

给药频率：每周两次；给药途径：尾静脉注射；给药量：0.2mL/只；给药时间：9:00-11:00；给药期限：30天。

测试给药后各组荷瘤裸鼠的体重、脏器系数、肿瘤体积、相对肿瘤增殖率、血清PSA、PCNA、T和DHT等方面的参数变化及并进行脏器病理组织学检查。

实施例8.1荷瘤裸鼠的体重变化

测试结果见图4。GnRH-MTX偶联物对裸鼠体重的影响：给予药物过程中，各给药组动物均有不同程度的体重下降，给药前各组裸鼠体重分别为：阴性对照组28.17±2.04g、比卡鲁胺组28.30±1.53g、甲氨蝶呤组25.34±0.94g、GnRH组26.04±1.89g、低剂量组27.67±1.42g、中剂量组27.12±2.22g和高剂量组27.14±1.91g；给药结束时各组裸鼠体重分别为：阴性对照组27.19±1.41g、比卡鲁胺组26.55±1.41g、甲氨蝶呤组22.53±1.66g、GnRH组24.99±1.47g、低剂量组25.97±1.52、中剂量组24.74±1.07g和高剂量组25.53±2.72g；给予药物后对动物一般情况的影响：给药期间，各给药组体重与阴性对照组体重的相比，体重基本无明显变化，无统计意义(P＞0.05)；在给药期供试品对动物体重影响结果见图4。从图上可以看出阴性对照组在给药期间裸鼠体重一直比较平稳；而甲氨蝶呤组在给药期间则是体重逐渐下降；高剂量组裸鼠体重也是比较平稳，数据表明高剂量组药物没有毒性或者说毒性较小，不影响动物体重生长，同时表明甲氨蝶呤组药物毒性较大，给药后致使动物体重逐渐下降，说明甲氨蝶呤和多肽化学偶联之后靶向效果较为明显，起到了减毒增效的作用。

实施例8.2荷瘤裸鼠的脏器系数变化

结果见图5。给药结束后，取各个脏器，各实验动物组平均体重是在22.53g～27.19g之间，甲氨蝶呤组体重略有所下降，从给药前25.34g下降至22.53g，其余各组在整个给药期间体重基本平稳；各实验动物组肝脏重量在是0.633g～0.953g之间，脏器系数是在2.81％～3.73％，甲氨蝶呤肝脏重量及肝脏脏器系数较其他组略低，与阴性对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，其余各组(GnRH多肽组，比卡鲁胺组、高剂量组，中剂量组及低剂量组)肝脏重量及肝脏脏器系数与阴性对照组比较无显著性差异(P＞0.05)；各实验动物组肺脏重量在是0.135g～0.148g之间，肺脏脏器系数是在0.54％～0.60％，各实验动物组(甲氨蝶呤组，GnRH多肽组，比卡鲁胺组、高剂量组，中剂量组及低剂量组)肺脏重量及肺脏脏器系数与阴性对照组比较无显著性差异(P＞0.05)；各实验动物组肾脏重量在是0.282g～0.364g之间，肾脏脏器系数是在1.25％～1.43％，各实验动物组(甲氨蝶呤、GnRH多肽组，比卡鲁胺组、高剂量组，中剂量组及低剂量组)肺脏重量及肺脏脏器系数与阴性对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。

实施例8.3荷瘤裸鼠的肿瘤体积和相对肿瘤增殖率变化

结果见图6。给药初期，第一次给药时，各组裸鼠平均肿瘤体积为：阴性对照组61.28±8.37mm³，比卡鲁胺组60.23±8.98mm³，甲氨蝶呤组63.38±9.37mm³，GnRH多肽组62.49±8.37mm³，低剂量组65.38±10.49mm³，中剂量组64.78±9.48mm³，高剂量组62.77±11.49mm³；给药结束时(第30天)，各组肿瘤体积如下：阴性对照组1837.49±31.98mm³，比卡鲁胺组463.55±26.36mm³，甲氨蝶呤组700.39±25.73mm³，GnRH多肽组1794.58±20.55mm³，低剂量组797.33±14.35mm³，中剂量组650.18±18.37mm³，高剂量组580.37±13.28mm³。在给药期间，各组裸鼠平均肿瘤体积都随着时间增长而增长，阴性对照组和GnRH多肽组增长较为迅速，而其余各组的增长速度较阴性对照组而言增速较为缓慢；从第二次给药起(给药第三天)，GnRH多肽组肿瘤体积与阴性对照组体积比较无统计学意义(P＞0.05)，其余各给药组(甲氨蝶呤组、比卡鲁胺组、低剂量组、中剂量组和高剂量组)肿瘤体积与阴性对照组进行比较与显著性差异(P＜0.05)；与未偶联之前的甲氨蝶呤组进行比较，高剂量组和比卡鲁胺组，从第二次给药起即第三天起，其肿瘤体积就具有显著性差异(P＜0.05)；而中剂量组、低剂量组刚开始给药时，与阴性对照组相比较肿瘤体积没有显现出显著性差异(P＞0.05)；待给药一段时间后(中剂量组第十天起，第剂量组第二十四天起)，中、低剂量组的肿瘤体积与甲氨蝶呤组的肿瘤体积相比较亦出现显著性差异(P＜0.05)。结果见图7。给药初期，给完第一次药时(即给药第三天)，各组相对肿瘤增殖率(T/C)(％)为：比卡鲁胺组64.25％，甲氨蝶呤组78.43％，GnRH多肽组95.80％，低剂量组79.23％，中剂量组75.68％，高剂量组64.44％；给药结束时(第30天)，各组相对肿瘤增殖率(T/C)如下：比卡鲁胺组25.67％，甲氨蝶呤组36.85％，GnRH多肽组95.77％，低剂量组40.67％，中剂量组33.47％，高剂量组30.84％。从图3-9上可以看到，在整个给药期间，除多肽组外，其余各个给药组的相对肿瘤增殖率是逐渐下降的，这说明注射药物对裸鼠肿瘤的增殖是起到了一定的抑制作用的，且同一时点T/C值：比卡鲁胺组<高剂量组<中剂量组<甲氨蝶呤组<低剂量组，这表明比卡鲁胺组的抑瘤效果最好，高剂量组的抑瘤效果其次，其抑瘤效果与比卡鲁胺组接近；甲氨蝶呤组抑瘤效果介于低剂量组和中剂量组之间，与低剂量组接近，高、中、低三个剂量组的抑瘤效果呈剂量效应关系。比卡鲁胺组和高剂量组的相对肿瘤增殖率与甲氨蝶呤组相比较具有统计学意义，有显著性差异(P＜0.05)，中、低剂量组与甲氨蝶呤组相对肿瘤增殖率相比较不具有统计学意义(P>0.05)。

实施例8.4荷瘤裸鼠的肿瘤瘤重和抑瘤率变化

结果见表8。

表8荷瘤裸鼠肿瘤瘤重及抑瘤率情况

本实验共给药十次，第十次给药后次日处死动物，剥去肿瘤块，称重并采集图片；比卡鲁胺组的抑瘤率为：79.47％；甲氨蝶呤组的抑瘤率为：69.54％；多肽组的抑瘤率为：9.27％；而低、中和高剂量组抑瘤率分别为67.55％、76.82％和79.47％，并且低、中和高剂量组的呈良好的剂量效应关系，上述实验数据表明GnRH多肽组没有抑瘤，但是与甲氨蝶呤通过化学键偶联之后的GnRH-MTX偶联物对肿瘤的抑制作用明显，甲氨蝶呤组的抑瘤效果类似于GnRH-MTX偶联物的低剂量组，GnRH-MTX中剂量组和高剂量组的抑瘤效果优于甲氨蝶呤组，这说明甲氨蝶呤和GnRH多肽偶联之后，要发挥相同的抑瘤作用可以用更小的药量，从而可以减少甲氨蝶呤的毒副作用，从而可以起到减毒增效的效果。各个药物组的抑瘤率与甲氨蝶呤组相比较，低剂量组的抑瘤效果没有明显统计学意义(P>0.05)；但是多肽组、比卡鲁胺组、中剂量组和高剂量组均具有明显统计学意义(P<0.05)，具体的实验结果如下表6和图5所示。各组裸鼠采血完毕之后，剥离肿瘤块，用卫生棉将血迹擦拭干净，按照分组摆好图片，拍照，保存，肿瘤块图片见图8。

实施例8.5荷瘤裸鼠血清PSA、PCNA、T和DHT变化

结果见图9。

GnRH偶联物对裸鼠血清PSA、PCNA、T和DHT含量的影响(见表7和图7)：与阴性对照组相比，仅比卡鲁胺组PSA含量有所给药后各实验动物组对裸鼠血清PSA、PCNA、T和DHT含量的影响见表7和图7。与阴性对照组相比，除GnRH多肽组外，其余各组(比卡鲁胺组、甲氨蝶呤组、高剂量组、中剂量组和低剂量组)PSA和PCNA含量均有所下降，具有统计学意义(P<0.05)；这表明给药后药物起到一定的治疗作用，能够起到降低血清PSA和PCNA含量的左右；高、中和低剂量组的PSA含量与甲氨蝶呤组的PSA含量相比较，具有显著统计学意义(P<0.05)，它们几组之间PSA含量排序为：高剂量组PSA含量<中剂量组PSA含量<甲氨蝶呤组PSA含量<低剂量组。从此方面角度讲，甲氨蝶呤和GnRH多肽偶联形成偶联物之后，偶联药物疗效高于游离的甲氨蝶呤的疗效。血清PCNA含量的变化情况类似于PSA含量变化情况。与阴性对照组相比，GnRH多肽组、比卡鲁胺组、甲氨蝶呤组、低、中和高剂量组睾酮和双氢睾酮含量略有浮动，但是无明显统计学意义(P>0.05)；与甲氨蝶呤组相比，比卡鲁胺组、GnRH多肽组、低、中和高剂量组的睾酮和双氢睾酮含量亦产生波动，但是变化无规律，无明显统计学意义(P>0.05)。

实施例8.6荷瘤裸鼠病理组织学检查

实验结束时处死裸鼠，取肿瘤、肺、肝、肾组织及肿瘤局部淋巴结组织进行病理组织学检查。

(1)肿瘤：见图10。比卡鲁胺组4只裸鼠肿瘤生长不良、细胞增殖度低；高剂量组2只裸鼠肿瘤生长不良，中、低剂量组和甲氨蝶呤各1只裸鼠坏死灶钙化组织。其余阴性对照组、GnRH多肽组、比卡鲁胺组、甲氨蝶呤组、低剂量组、中剂量组和高剂量组肿瘤生长良好，癌细胞可见较多核分裂相，瘤内可见坏死灶，灶周可见大量中性粒细胞；

(2)肺脏：见图11。比卡鲁胺组和GnRH多肽组各有1只裸鼠可见肺微小癌细胞灶，其余阴性对照组、GnRH多肽组、比卡鲁胺组、甲氨蝶呤组、中剂量组和高剂量组未见明显病变；

(3)肝脏：见图12。比卡鲁胺组1只裸鼠肝小叶边缘可见微小癌细胞灶，其余阴性对照组、GnRH多肽组、比卡鲁胺组、甲氨蝶呤组、低剂量组、中剂量组和高剂量组肝小叶均结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心反射状排列，未见明显病变；

(4)肾脏：见图13。阴性对照组、GnRH多肽组、比卡鲁胺组、甲氨蝶呤组、低剂量组、中剂量组和高剂量组肾脏肾小管和肾小球结果清晰，排列整齐，未见明显病变；

(5)淋巴结：见图14。阴性对照组6只裸鼠淋巴结肿大，镜下可见癌细胞浸润；GnRH多肽组8只裸鼠淋巴结肿大，镜下可见癌细胞浸润；比卡鲁胺组8只裸鼠淋巴结肿大，镜下可见癌细胞浸润；甲氨蝶呤组6只裸鼠淋巴结肿大，镜下可见癌细胞浸润；低剂量组9只裸鼠淋巴结肿大，镜下可见癌细胞浸润；中剂量组9只裸鼠淋巴结肿大，镜下可见癌细胞浸润；高剂量组7只裸鼠淋巴结肿大，镜下可见癌细胞浸润。

以上实施方式仅为发明的示例性实施方式，不能用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这些修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物的制备方法，其特征在于：所述GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物具有如下结构：

所述方法包括使GnRH多肽与甲氨蝶呤活性酯发生偶联反应，

在GnRH多肽含有D-Lys单元中的氨基的情况下，通过使甲氨蝶呤活性酯与GnRH多肽的D-Lys上的氨基发生酰胺化反应制备得到所述GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物；

还包括如下纯化步骤：反应后，向反应混合物中缓慢加入乙醚进行沉淀，终止反应，静置24h，过滤沉淀，用乙醚洗涤沉淀，将沉淀溶解于DMF溶液后，通过反相制备液相纯化，旋转蒸发除去有机溶剂，然后将浓缩的水溶液冷冻干燥，冷冻温度为-40℃以下，得到GnRH多肽-甲氨蝶呤偶联物；

甲氨蝶呤活性酯与GnRH多肽的摩尔比为1.5:1；反应温度为25℃；反应时间为4小时；

所述甲氨蝶呤活性酯的合成包括如下步骤：

(1)将甲氨蝶呤与羰基活化试剂反应以活化γ-位羧基；所述甲氨蝶呤与羰基活化试剂的摩尔比为1:3；所述羰基活化试剂选自EDC.HCl、DCC和DIC；反应温度为25℃；反应溶剂为DMSO；反应时间为1.5-2.5h；

(2)向上步反应混合物中加入NHS和DMAP，所述甲氨蝶呤与NHS的摩尔比为1:2-1:4，所述DMAP与甲氨蝶呤的摩尔比为1:2，以及反应时间为24小时。