KR102258569B1

KR102258569B1 - 황산화 폴리굴론산 폴리사카라이드 또는 그의 제약 염, 그의 제조 방법 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102258569B1
Application number: KR1020167002769A
Authority: KR
Inventors: 지안 딩; 징 아이; 이 첸; 쉰 후앙
Original assignee: 상하이 인스티튜트 오브 마테리아 메디카 차이니즈 아카데미 오브 싸이언시즈
Priority date: 2013-07-02
Filing date: 2014-07-02
Publication date: 2021-05-28
Also published as: EP3018147A1; CN105358582A; CN104277130A; CN105358582B; PT3018147T; US10058566B2; MX2016000043A; EP3018147B1; TR201809674T4; EA028655B1; US20160367591A1; ES2674976T3; EA201690123A1; ZA201509353B; JP6772318B2; CA2916749C; CA2916749A1; DK3018147T3; SG11201510717SA; JP2016523301A

Abstract

황산화 폴리굴론산 폴리사카라이드 또는 그의 제약 염, 그의 제조 방법, 및 암 성장 및/또는 전이 억제제의 제조에 있어서의 그의 용도가 제공된다. 이러한 황산화 폴리굴론산 폴리사카라이드 또는 그의 제약 염은 암 성장 억제제, 암 전이 억제제, 혈관신생 억제제, 헤파라나제 억제제, C-Met 효소 억제제, 미세소관 중합 억제제, 액틴-탈중합 인자 활성 억제제 및 액틴-응집 억제제 중 하나 이상을 제조하기 위하여 사용될 수 있다.

Description

황산화 폴리굴론산 폴리사카라이드 또는 그의 제약 염, 그의 제조 방법 및 그의 용도 {SULFATED POLYGULONIC ACID POLYSACCHARIDE OR PHARMACEUTICAL SALT THEREOF, PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF}

본 발명은 의약 분야에 관한 것이고, 특히 폴리굴론산 술페이트(polygulonic acid sulfate) 또는 그의 제약상 허용되는 염, 그의 제조 방법, 및 종양 성장 및/또는 전이 억제제의 제조에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.

종양은 인간의 생명과 건강에 심각한 위협을 초래한다. 악성 종양은 도시 주민의 사망 원인 1위이고 농촌 주민의 사망 원인 2위를 차지하고 있으며, 각종 질환 중에서 사망률 1위에 올라와 있다. 종양 전이가 악성의 한 가지 징후이고, 악성 종양의 전이와 재발이 치료 실패의 주요 원인이다. 따라서, 종양 성장과 전이를 억제할 수 있는 항종양 약물을 개발하는 것에 현재 관심이 집중되고 있다.

최근의 연구에 따르면, 사카라이드가 중요한 구조적 구성 및 에너지 공급원 중 한 가지 부류일 뿐만 아니라 중요한 생물학적 기능을 지니고 있다. 이들은 세포-세포 인식과 신호 전달에 관여하고, 유기체 내에서 핵산 이외에 중요한 신호 분자 부류인 것으로 간주된다. 또한, 이들은 종종, 세포 표면 상에서의 신호 인식, 항체-항원 반응, 세포 신호 전달 및 감지에 대한 중요한 인자이기 때문에, 생물학적 활성을 지닌 활성 폴리사카라이드에 관한 연구에 점점 더 많은 관심이 촉구된다. 그러나, 현재까지 사카라이드를 분리하고 그 구조적 특징을 확인하는 데 있어서의 어려움과 그의 복잡한 구조로 인해, 코리올러스 베르시콜로르(coriolus versicolor) 폴리사카라이드, 폴리포루스(polyporus) 폴리사카라이드, 머쉬룸(mushroom) 폴리사카라이드, 쉬조필란(schizophyllan) 폴리사카라이드, 포리아 코코스(Poria cocos) 폴리사카라이드 등만이 임상 목적을 위해 사용되고 있다. 관련 기술분야에서는 생물학적 활성을 지닌 더 많은 종류의 폴리사카라이드를 수득하는 것이 필요하다.

종양의 중증 발병에 따른 실제적 문제점과 치료 상의 어려움은 말할 것도 없이, 탄수화물을 구조적으로 분해하고 제조하는 데 있어서의 어려움과 자연 당의 낮은 활성 문제점에도 불구하고, 본 발명자들은 광범위하고도 집중적인 연구에 근거하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명자들은 폴리굴루론산을, 올리고-굴루론산의 황산화 유도체를 제공하기에 적당한 지속 기간 동안 적당한 온도 하에 술폰화제와 반응시킨 다음, 환원시키기 위해 환원제를 부가하여, 폴리굴론산 술페이트 (본원에서 "PGAS"로서 후술됨)를 수득함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 한 목적은 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하는 것이다. 본 발명의 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염은 종양 성장과 전이에 대한 상당한 억제 효과를 지니고 있고, 그 작용 기전은 헤파라나제(heparanase) 활성, C-Met 효소 활성, 혈관신생, 미세소관 중합, 액틴(actin) 탈중합 인자 등을 억제할 수 있는 그의 능력과 연관이 있다. 바람직하게, 본 발명은 L-굴루론산 단위가 서로 1,4-글리코시드 연결을 통하여 연결되고, 여기서 히드록실 기는 환원성 말단의 위치 1에 위치하고 당 고리는 그의 C-2 위치에서 완전히 황산화된, 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 종양 성장 및/또는 전이 억제제의 제조에 있어서의, 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 종양을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 한 측면에 따라서, 하기 화학식 I의 구조를 갖는 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다:

<화학식 I>

상기 화학식 I에서, n은 0 또는 1 내지 23의 정수를 나타내고, R₁은 SO₃H이며, R₂는 서로 독립적으로, H 또는 SO₃H이며, 단 폴리굴론산 술페이트의 황 함량으로서 계산된 황산화 정도는 5 내지 20 중량%이다.

본 발명의 화학식 I로써 나타낸 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염에서, 폴리굴론산은 1,4-글리코시드 연쇄에 의해 L-굴루론산으로부터 형성되고, 여기서 히드록실 기는 환원성 말단의 위치 1에 위치하고 당 고리는 그의 C-2 위치에서 완전히 황산화되고 그의 C-3 위치에서 부분적으로 황산화된다.

상기 화학식 I에서, n은 0 또는 1 내지 23의 정수, 예를 들어 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23이고; 바람직하게, n은 2 내지 13의 정수이며, 보다 바람직하게 n은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, 가장 바람직하게 n은 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 바람직하게, 황 함량은 7 내지 15 중량%, 보다 바람직하게 9 내지 13 중량%이다. 본 발명에서, 테트라사카라이드 내지 도데카사카라이드 (특히 헥사사카라이드 내지 데카사카라이드)를 이용하고/하거나 황 함량이 7 내지 15 중량% (특히 9 내지 13 중량%)인 경우에, 이들 폴리사카라이드가 신체 세포에 의해 보다 용이하게 인식되고 허용되기 때문에, 보다 우수한 생물학적 효과가 수득된다.

본 발명에서, 폴리굴론산 술페이트의 제약상 허용되는 염은, 예를 들어 이들 화합물의 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염일 수 있으며, 나트륨 염이 바람직하다. 제약상 허용되는 염은 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라서,

하기 화학식 II에 제시된 바와 같은 폴리굴루론산을 술폰화 시약과 반응시킨 다음, 환원제를 통하여 환원시켜, 하기 화학식 I에 제시된 바와 같은 폴리굴론산 술페이트를 수득하는 것

을 포함하는, 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 제조 방법이 제공된다:

<화학식 II>

<화학식 I>

상기 화학식 II에서, m은 0 또는 1 내지 48의 정수를 나타내고;

상기 화학식 I에서, n, R₁ 및 R₂는 상기 정의된 바와 같다.

본 발명에서, 바람직하게 상기 술폰화 시약은 클로로술폰산일 수 있고; 바람직하게, 술폰화 온도는 45 내지 85℃, 보다 바람직하게 60 내지 75℃일 수 있으며, 반응 시간은 1.5 내지 4.5시간, 보다 바람직하게 2 내지 3.5시간, 가장 바람직하게 3시간일 수 있고; 바람직하게, 환원제는 소듐 보로히드라이드, 소듐 시아노보로히드라이드, 니켈-히드라이드 시약, 할로겐-기재 환원제 등이다.

본 발명의 추가 측면은 종양 성장 및/또는 전이 억제제의 제조에 있어서의 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명에서, 용어 "종양"은 악성 종양을 포함한 모든 형태의 종양을 지칭하고, 예를 들어 간암, 위암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 흑색종, 뇌암 등일 수 있다.

본 발명에서, 바람직하게, 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염은 종양 성장 억제제, 종양 전이 억제제, 혈관신생 억제제, 헤파라나제 억제제, C-Met 효소 억제제, 미세소관 중합 억제제, 액틴-탈중합 인자 활성 억제제 및/또는 액틴-응집 억제제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 또한 또 다른 측면에 따라서, 본 발명의 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 바람직하게, 이러한 제약 조성물 내의 활성 성분은 본 발명의 하나 이상의 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진다. 또 다른 이행에서는, 본 발명의 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염 이외에도, 본 발명의 제약 조성물은 활성 성분으로서 하나 이상의 항종양 약물 또는 항종양 아주반트 약물을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 바람직하게, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 담체는 관련 기술분야에서 흔히 사용되는 것일 수 있다.

본 발명에서, 바람직하게, 제약 조성물은 종양 성장 억제제로서 사용될 수 있다.

본 발명에서, 바람직하게, 제약 조성물은 종양 전이 억제제로서 사용될 수 있다.

또한, 바람직하게, 제약 조성물은 혈관신생 억제제, 헤파라나제 억제제, C-Met 효소 억제제, 미세소관 중합 억제제, 액틴-탈중합 인자 활성 억제제 및/또는 액틴-응집 억제제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 또한 또 다른 측면에 따라서, 본 발명의 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 치료 유효량을, 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양을 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명에서, 용어 "유효량"은 목적하는 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안 유효한 양을 지칭할 수 있다. 이러한 유효량은 질환의 유형, 치료하고자 하는 질환의 증상, 투여되는 특이적 표적 기관의 구조, 대상체의 크기, 또는 질환 또는 병태의 중증도와 같은 요인들에 따라서 다양할 수 있다. 특별한 화합물의 유효량은 과도한 실험 없이 통상의 기술자에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.

상기의 관점에서, 종양을 치료하는 데 유효한 약물이 없다는 현 문제점을 해결할 목적으로, 종양과 종양 전이를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염을 사용하는 것이 상당히 중요하다.

도 1은 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 각각의 성분에 대한 칼럼 분리 결과를 도시한 것이다.
도 2는 인간 유방암 MDA-MB-435 동소(orthotopic) 이종 이식편의 성장에 대한 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 억제 효과를 도시한 것이다.
도 3은 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 이종 이식편의 폐 전이에 대한 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 억제 효과를 도시한 것이다. 패널 A는 H&E 염색에 의한 폐에서의 전이의 전형적인 사진 (배율: 200X)을 보여주고; 패널 B는 MDA-MB-435 동소 이종 이식편의 폐 전이에 대한 PGAS의 억제 효과의 정량적 도면이다. 상기 도면 내에서의 데이터는 한 가지 전형적인 실험에서의 평균±SD로서 표현된다. * P < 0.05, **P < 0.01, 처리군 대 대조군.
도 4는 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 이종 이식편에 대한 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 혈관신생 억제 효과를 도시한 것이다. 패널 A는 CD31 염색의 전형적인 사진을 보여주며, 화살표는 양성 염색을 나타내고 (배율: 200X) (패널 A에서: "C"는 대조군이고, "P"는 PGAS 처리군임); 패널 B는 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 이종 이식편에 대한 PGAS의 혈관신생 억제 효과의 정량적 도면이다. 상기 도면 내에서의 데이터는 한 가지 실험에서의 평균±SD로서 표현된다. **P < 0.01, 처리군 대 대조군.
도 5는 뮤린 흑색종 B₁₆F₁₀ 세포의 실험적 폐 전이에 대한 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 억제 효과를 도시한 것이다. 패널 A는 폐에서의 전이의 전형적인 사진을 보여주고; 패널 B는 B₁₆F₁₀의 실험적 폐 전이에 대한 PGAS의 억제 효과의 정량적 도면이다. 상기 도면 내에서의 데이터는 한 가지 전형적인 실험에서의 평균±SD로서 표현된다. 유사한 결과가 적어도 2가지 독립적인 실험으로부터 수득될 수 있다. * P < 0.05, **P < 0.01, 처리군 대 대조군.
도 6은 닭 배아 융모막 (CAM)의 신생혈관증식에 대한 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 억제 효과를 도시한 것이다. 패널 A는 박리제 대조군을 보여주고; 패널 B는 200 ㎍/달걀 PGAS 군을 보여주며; 패널 C는 400 ㎍/달걀 PGAS 군을 보여주고; 패널 D는 800 ㎍/달걀 PGAS 군을 보여준다 (배율: 40X).
도 7은 헤파라나제 활성에 대한 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 억제 효과를 도시한 것이다. 패널 A는 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 헤파라나제 활성의 억제를 나타내는 HPLC 스펙트럼을 보여주고; 패널 B는 상기 패널 A 스펙트럼의 결과로부터 계산된, 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 헤파라나제 활성의 억제율을 보여준다.
도 8은 세포-무함유 시스템에서 튜불린(tubulin) 중합에 대한 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 억제 효과를 도시한 것이다. 패널 A는 시간 의존성을 보여주고, 패널 B는 용량 의존성을 보여준다.
도 9는 세포-무함유 시스템에서 액틴 탈중합에 대한 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 억제 효과를 도시한 것이다.
도 10은 액틴-탈중합 인자의 액틴 탈중합/절단 활성에 대한 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 억제 효과를 도시한 것이다. ##P<0.01, 코필린(Cofilin) 군 대 대조군; **P<0.01, 의료군 대 코필린 군.
도 11은 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 각각의 성분의 종양 전이 억제 활성을 도시한 것이다.

본 발명은 실시양태로써 다음에 추가로 상세히 기재될 것이다. 그러나, 다음 실시양태는 단지 예시 목적으로 제공되고, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.

재료 및 시약

덱스트란을 기준으로 하여 10000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는, 중국 해양 대학교의 란 타이 파마슈티칼스 캄파니 리미티드(Lan Tai Pharmaceuticals Co. Ltd)로부터 구입된 폴리굴루론산. 시노팜 그룹 케미컬 리에이전트 캄파니(Sinopharm Group Chemical Reagent Company)에 의해 공급된, A.R. 등급의 포름아미드, 클로로술폰산 등. 플루카 캄파니(Fluka Company)로부터 구입된 덱스트란 분자량 표준물. 저장성 하이먼 제약 공장(Zhejiang Haimen Pharmaceutical Factory, Zhejiang health medicine accurate (1996) No. 135501)에 의해 제조된 독소루비신 주사제 [아드리아마이신(Adriamycin), ADM], 함량: 10 mg/바이알, 용매: 정상 식염수, 제제: 각각을 투여하기에 앞서 정상 식염수를 이용하여 목적하는 농도가 되도록 희석시킴. 일본의 도쇼 캄파니(TOSOH company)로부터 입수 가능한 TSK 겔 2000SWXL, TSK 겔 G3000SWXL 칼럼; 바이오-래드 캄파니(Bio-Rad company)로부터 입수 가능한 바이오-겔-P6, 바이오-겔-P10; 파마시아 캄파니(Pharmacia company)로부터 입수 가능한 세파덱스 G-10, 세파로스 CL-4B; 시그마 캄파니(SIGMA company)로부터 구입된 튜불린, 액틴.

기기

NICOLET 캄파니(NICOLET company)로부터의 NEXUS-470 지능형 적외선 분광계; 브루커 캄파니(Bruker company)로부터의 DPX-300 NMR 분광계; 북경 롱치다 캄파니 리미티드(Beijing Longzhida Co., Ltd.)로부터의 겔 투과 크로마토그래피 (GPC); 우노칼 코포레이션(Unocal Corporation, 미국)으로부터의 UV-2102 자외선 및 가시광선 분광광도계.

실험적 동물

중국 과학원 상해 약물 연구소에 의해 공급된, 18 내지 22g의 누드 마우스 BALB/cA;

중국 과학원 상해 동물 센터에 의해 공급된, 6 내지 7주령의 C₅₇BL/6 마우스;

상해 센바오(Shenbao) 닭 농장으로부터 구입된 신선한 달걀.

실시예 1: 폴리굴론산 술페이트 ( PGAS )의 제조

온도를 5℃ 아래로 유지시키면서 3 ml 클로로술폰산을 10 ml 포름아미드에 적가하였다. 반응시킨지 20분 후, 1 g 폴리굴루론산을 가하고 65 내지 70℃의 온도에서 3시간 동안 반응시켰다. 2 부피의 80% 에탄올 용액을 상기 반응 생성물에 가하고, 반복해서 진탕시켜 점성 물질을 수득하였다. 부가의 80% 에탄올 용액을 가하고, 상기 단계를 2회 반복하였다. 상기 용액을 경사 제거하고, 물을 가하여 점성 물질을 수득하였다. 이러한 점성 물질을, 1% Na₂CO₃ 용액을 이용하여 pH 7.0이 되도록 조정하고, 2 부피의 95% 에탄올 용액으로 알콜 침전시켰다. 생성된 침전물을 50 내지 60℃의 온도 하에 건조시켜 폴리굴루론산의 황산화 유도체를 수득하였다. 이 유도체를 4 mg/ml 소듐 아세테이트 용액 (pH 7.0) 내로 제제화시키고, 이 용액에 소듐 보로히드라이드를 가하여 50 mM이 되도록 하였다. 이 반응을 30 내지 40℃의 온도 하에 30분 동안 수행하고, 빙조를 이용하여 종결하였다. 0.1 M 아세트산을 이용하여 상기 pH를 조정하고, 반응되지 않은 소듐 보로히드라이드를 방출시키며, pH를 중성이 되도록 조정하였다. 생성된 용액을 반복해서 침전시키고, 에탄올로 세척하며, 건조시켜 조 폴리굴론산 술페이트 (PGAS)를 수득하였다. 이러한 조 PGAS를 10% 용액 내로 제제화하고, 95% 에탄올 용액을 이용하여 침전시켰다. 생성된 침전물을 무수 에탄올로 세척하고, 건조시키며, 5% 용액 내로 제제화하였다. 이 용액을 3 ㎛ 막으로 여과시켜 불순물을 제거하고, 이동 상으로서 물을 사용하고 분획 수집을 이용하여 세파덱스 G-10 칼럼 (15 x 100 cm)에서 탈염시켰다. 용출물을 황산-카르바졸 방법으로 검출하고, 당 함유 성분을 합하며, 감압 하에 농축시키고, 탈염시키며 동결 건조시켜 제련된 폴리굴론산 술페이트를 수득하였다.

상기 제조된 폴리굴론산 술페이트의 황 함량을, 산소 플라스크 연소 방법을 이용하여 결정하였다. 약 25 mg의 샘플을 취하고, 정확하게 칭량하며, 상기 산소 플라스크 연소 방법 후 유기물을 파괴하였다. 1000 ml용 연소 플라스크를 사용하고, 0.1 ml 농축된 과산화수소 용액과 10 ml 물을 흡수성 액체로서 사용하였다. 일단 상기와 같이 발생된 연기가 완전히 흡수되면, 생성된 물질을 빙조 속에 15분 동안 놓아두고, 가열하여 2분 동안 온화하게 비등시키며, 냉각시키고, 50 ml 에탄올-암모늄 아세테이트 완충제 (pH 3.7), 30 ml 에탄올, 및 0.3 ml의 0.1% 알리자린 레드(Alizarin red) 용액을 지시약으로서 함께 부가하며, 과염소산 바륨 적정 용액 (0.05 mol/L)으로 밝은 오렌지-적색이 되도록 적정하였다. 1 ml의 과염소산 바륨 적정 용액 (0.05 mol/L)은 1.603 mg의 S와 등가이다. 시험 결과는 건조된 생성물을 기준으로 하여, 폴리굴론산 술페이트의 황 함량이 11.2 중량%라는 것을 보여준다.

실시예 2: 폴리굴론산 술페이트 ( PGAS )의 구조적 특징 확인

상기 폴리굴론산 술페이트의 제조로부터 비롯되는 분획 내의 사카라이드 성분 상에서 구조적 특징 확인을 수행하였다.

1. UV 흡수 스펙트럼

상기 폴리굴론산 술페이트를 적합한 농도가 되도록 희석시키고, 블랭크로서 증류수를 이용하여, UV-2102 자외선-가시광선 분광광도계를 이용하여 190 nm 내지 400 nm에서 스캐닝하였다. 상기 분획이 자외선 영역에서 특이적 흡수 피크를 나타내지 않은 것으로 밝혀졌으며, 이는 상기 구조 내에 공액 이중 결합이 없다는 것을 나타낸다. 그러나, 190 내지 200 nm 하에서는 비-특이적 흡수가 있었다.

2. 적외선 분광법

0.5 mg PGAS를 KBr 펠릿이 되도록 압착시키고, NEXUS-470 지능형 적외선 분광계를 이용하여 적외선 분광법을 수행하였다. 히드록실 기의 대칭적 신축 진동이 3219.53 cm^-1에 존재하고, 카르복실레이트 내의 카르보닐 기의 대칭적 신축 진동이 1612.58 cm^-1에 존재하며, 히드록실 기의 가위질 진동이 1414.33 cm^-1에 존재하고, 카르복실 기 내의 탄소-산소 결합의 대칭적 신축 진동이 1103.97 cm^-1에 존재하며, C-O-S의 신축 진동 피크가 823.30 cm^-1에 존재하고, 황산화 후 술페이트 내의 S=O의 신축 진동 피크가 1274.62 cm^-1에 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 상기 화합물이 카르복실 기, 히드록실 기 및 술폰 기를 함유하는 주쇄 구조를 갖고 있다는 것을 나타낸다.

3. PGAS의 NMR 분광법

브루커 아우언스(Bruker Auance) DPX-300 NMR 분광계를 이용하여 PGAS의 NMR 분광법 (¹³C-NMR)을 결정하였다. 이러한 스펙트럼에서는, 비-술폰화 C-2 신호 피크가 실질적으로 관찰되지 않지만, 비-술폰화 C-3 신호 피크는 여전히 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이는 위치 C-2에서의 히드록실 기가 비교적 완전히 황산화되고, 위치 C-3에서의 히드록실 기는 부분적으로만 황산화된다는 것을 나타낸다.

4. PGAS의 분자량 및 분자량 분포도

GPC 방법을 이용하여 PGAS의 분자량을 결정하였다. 굴절 지수 검출기를 이용하여 검출을 수행하였으며, 0.5 ml/min의 유량 하에, 35℃의 온도에서 및 25 ㎕의 주사 부피 하에, 분자량 표준물로서 플루카 캄파니로부터의 덱스트란을 이용하고, 크로마토그래피 칼럼으로서 TSK 겔 2000SWXL 칼럼을 이용하며, 이동 상으로서 0.2% 소듐 아지드와 2.84% Na₂SO₄를 함유하는 수용액을 사용한다. PGAS의 중량 평균 분자량이 덱스트란을 기준으로 하여 2513 Da이고, 샘플의 다수 배치에 대한 결정 결과는 그의 중량 평균 분자량이 덱스트란을 기준으로 하여 1500 내지 8500 Da라는 것을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

취합해 보면, 이들 결과는 상기 분획이 폴리굴루론산의 환원성 말단에서 위치 1에 히드록실 기를 갖고 있고, C-2 위치에서 완전히 황산화되며 C-3 위치에서 부분적으로 황산화되는, 하기 화학식 I을 갖는 폴리굴론산 술페이트라는 것을 확증시켜 준다:

<화학식 I>

상기 화학식 I에서, n, R₁ 및 R₂는 상기 정의된 바와 같다.

실시예 3: PGAS의 성분의 분리 및 제조

상기 제조된 PGAS의 샘플을 취하고, 5% 용액 내로 제제화하며, 3 ㎛ 막으로 여과시켜 불순물을 제거하고, 이동 상으로서 0.2 mol/L NH₄HCO₃를 이용하여 바이오-겔-P6 겔 칼럼 (1.6 x 180 cm) 상에서 분리시키며, 분획을 수집하였다. 용출물을 황산-카르바졸 방법으로 검출하고, 당 함유 성분을 수집하며, 허공 부피 성분을 바이오-겔-P10 겔 칼럼 (1.6 x 180 cm) 상에서 추가로 분리하였다. 생성된 생성물을 동결 건조시켜 PGAS의 일련의 사카라이드 성분을 수득하였으며, 이들은 질량 분광법에 의해 확인되었다. 그 결과, PGAS의 디-, 트리-, 테트라-, 펜타-, 헥사-, 헵타-, 옥타-, 노나-, 데카-, 운데카- 및 더 높은 차수의 사카라이드 성분이 생성된 것으로 확증되었다.

하기 실험에서, 실시예 4 내지 11은 실시예 1에서 제조된 생성물을 이용하는 반면, 실시예 12 및 13은 실시예 3에서 제조된 생성물을 이용한다.

실시예 4: 폴리굴론산 술페이트 ( PGAS ) 의 종양 성장 억제 효능의 평가

2.5 x 10⁷개 세포/ml의 농도 하의 지수 성장 기에 있는 인간 유방암 MDA-MB-435 세포 [아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC, 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 구입함]를 4 내지 5주령의 암컷 누드 마우스 (중국 과학원 상해 약물 연구소에 의해 공급된 BALB/cA)의 두 번째 좌측 유방 지방층 내로 접종하였다. 상기 종양이 100 내지 200 mm³의 크기가 되도록 성장한 경우, 상기 동물을 종양 부피에 따라서, 음성 대조군, 독소루비신 주사제 (아드리아마이신, ADM) 처리군 (양성 대조군), 및 5 mg/kg 및 20 mg/kg PGAS 처리군 (PGAS 실험군)으로 균등하게 나누었고, 군당 20마리 마우스가 배정되었다. PGAS 실험군과 양성 대조군에게는 7주 동안 연속해서 매주 1회씩 정맥내 주사함으로써 투여하였고, 음성 대조군에게는 등량의 정상 식염수를 투여하였다. 본 실험에서는, 버니어 캘리퍼(vernier caliper)를 사용하여 1주에 2회씩 종양의 직경을 측정하고, 종양 부피 (V)을 다음 식에 따라서 계산하였다:

상기 식에서, a 및 b는 각각 종양의 길이 및 폭을 나타낸다. 계산식 RTV_t = V_t/V₀[여기서, V₀는 동물을 상이한 투여군으로 나눌 때 (즉, d₀) 측정된 종양 부피가고, V_t는 측정일의 종양 부피가다]를 이용하여, 상기 측정된 결과를 기준으로 하여 상대적 종양 부피 (RTV)을 계산하였다. 항종양 활성의 약력학적 평가 지표는 상대적 종양 증식률 T/C (%)이고, 그의 계산식은 다음과 같다:

T_RTV: 처리군의 RTV; C_RTV: 음성 대조군의 RTV. 효능 평가: T/C % >60%은 효과가 없다는 것을 의미하고; P<0.05의 통계적 유의성을 지닌 T/C % ≤60%는 효과적이라는 것을 의미한다.

투여를 중단한 지 1주 후에 상기 동물을 희생시켰다. 폐 조직을 24시간에 걸쳐 보우인(Bouin) 용액 (포화 피크르산:포름알데히드:빙초산 ＝ 75:25:5)에 고정시키고, 폐 전이가 백색 결절로서 나타나고 폐 조직이 정상 색상으로 회복될 때까지 무수 에탄올에 침지시켰다. 1개의 폐당 폐 전이 결절의 수를 해부 현미경 하에 관찰하고 기록하였다. 동소 종양 조직의 일부를 액체 질소에 놓아두고, 총 RNA 및 단백질의 추출을 위하여 냉동-저장하였다. 폐 및 동소 종양 조직의 일부를 10% 포르말린에 고정시키고, 종양 조직 내에서의 혈관신생을 H&E 염색 및 면역조직화학에 의해 결정하였다.

종양 접종 후 15 내지 20일째에는, 인간 유방암 MDA-MB-435 이종 이식편이 약 100 내지 200 mm³으로 성장하였고, 접종 성공률은 100%이고; 접종 후 8 내지 9주째에는, 상기 종양 보유 누드 마우스의 폐 조직에서 다수의 전이가 나타났고, 전이율은 100%인 것으로 밝혀졌다. 이 시점에, 상기 동물을 희생시키고, 항종양 효과 평가를 수행하였다. 7주 동안 연속해서 매주 1회씩 정맥내 주사함으로써 PGAS 처리를 수행하였다. 5 mg/kg PGAS 처리군은 동소 종양의 성장을 억제할 수 있는 능력을 나타내지만, 종양 억제 효과는 무의미한 수준으로, T/C 값이 67.3%이고; 20 mg/kg PGAS 처리군은 누드 마우스에서 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 이종 이식편의 성장을 상당히 억제할 수 있는 능력을 나타내며, T/C 값은 37.6% 이하였다. 양성 대조군 약물 ADM은 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 종양의 성장을 상당히 억제할 수 있는 능력을 나타내고, 5 mg/kg ADM 처리군은 21.8%의 T/C 값을 갖는다. 이는 PGAS가 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 이종 이식편의 성장을 상당히 억제할 수 있다는 것을 나타낸다 (도 2). 7주 동안 연속해서 매주 1회씩 정맥내 주사함으로써 5 mg/kg 및 20 mg/kg을 투여하는 요법 하에서는, 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 이종 이식편의 폐 전이에 대한 PGAS의 억제율이 각각 60.2% 및 88.4%이다. 폐 전이에 대한 독소루비신 (5 mg/kg)의 억제율은 89.8%이다. 이는 PGAS가 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 이종 이식편의 폐 전이를 상당히 억제할 수 있다는 것을 보여준다 (도 3). 추가로, 생체 내에서 혈관신생에 대한 PGAS의 효과를 면역조직화학적 염색에 의해 평가하였다. 내피 세포 특이적 마커 CD31의 검출은 다수의 소혈관이 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 이종 이식편에서 생성된다는 것을 나타낸다. 대조군과 비교해서 5 mg/kg PGAS 처리군에 대한 이종 이식편 내에서의 소혈관 수의 유의적 변화는 없는 반면, 대조군과 비교해서 20 mg/kg PGAS 처리군에 대한 이종 이식편 내에서의 소혈관 수는 유의적으로 감소되며, 42.1%의 억제율을 수반한다. 이는 PGAS가 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 이종 이식편 내에서의 혈관신생을 상당히 억제할 수 있다는 것을 보여준다 (도 4).

실시예 5: 폴리굴론산 술페이트 ( PGAS ) 의 종양 전이 억제 효능의 평가

6 내지 7주령의 C57BL/6 마우스 (중국 과학원 상해 동물 센터에 의해 공급됨)를 정상 식염수 음성 대조군, 및 5 mg/kg PGAS 처리군과 20 mg/kg PGAS 처리군으로 무작위로 나누었고, 군당 10마리 동물이 배정되었다. 2.5 x 10⁶개 세포/ml의 농도 하의 지수 성장 기에 있는 뮤린 흑색종 B₁₆F₁₀ 세포 [아메리칸 타입 컬처 컬렉션, ATCC (미국 메릴랜드주 록빌)로부터 구입함]를 상기 마우스의 꼬리 정맥 내로 접종하였다. 세포를 접종하기 20분 전에, 상기 PGAS 군에게 복강내 (i.p.) 주사함으로서 1회 투여하였고, 음성 대조군에게는 등량의 정상 식염수를 투여하였다. 11일 후에, 폐를 마우스로부터 꺼내고, 폐 조직을 24시간에 걸쳐 보우인 용액 (포화 피크르산:포름알데히드:빙초산 ＝ 75:25:5)에 고정시켰다. 1개의 폐당 폐 전이 결절의 수를 해부 현미경 하에 관찰하고 기록하였다. 또 다른 한편으론, 폐 조직이 정상 색상으로 회복될 때까지 2일 동안 폐 조직을 무수 에탄올에 추가로 침지시킨 후에 상기 관찰을 수행하였다. 접종한 지 11일 후에, 다수의 전이가 상기 마우스의 폐 조직에서 100%의 전이율로 나타났고, 단일 복강내 주사의 투여 요법에서는, 5 mg/kg PGAS 처리군이 40.81% 이하의 억제율로 상당한 종양 전이 억제를 나타냈으며, 20 mg/kg PGAS 처리군은 82.20% 이하의 억제율로 흑색종 B₁₆F₁₀ 세포의 폐 전이에 대해 보다 유의적인 억제를 나타낸 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 PGAS가 흑색종 B₁₆F₁₀ 세포의 폐 전이를 상당히 억제할 수 있다는 것을 보여준다 (도 5).

본 발명자는 PGAS의 작용 기전을 추가로 연구하였다.

실시예 6: PGAS에 의한 혈관신생 억제의 시험

신선한 달걀 (상해 센바오 닭 농장으로부터 구입됨)을 39℃ 및 50% 습도 하에 인큐베이터 롤(Roll)-X 기저 [라이온 엘렉트릭 캄파니 (Lyon Electric Company; 미국 캘리포니아주)]에 놓아두었다 (가스 챔버 측면 위). 7일 동안 연속적으로 인큐베이션한 후, 상기 달걀에 불을 비추어 닭 배아가 살아있었는지를 확인하고, 융모막의 위치를 결정한 다음 표시하였다. 상기 달걀의 공기 주머니 끝에 하나의 작은 구멍을 만들고, 병아리 배아를 수평으로 놓아두었다 (융모막 위). 이러한 공기 주머니를 고무 피펫 전구로 부드럽게 빨아 들여, 융모막이 붕괴되고 달걀 껍질로부터 분리되도록 한 다음, 일정 기간 동안 정치시켜 두었다. 이어서, 병아리 배아 전반에 걸쳐 1 ㎠의 개방 창 위치를 만들었고, 이러한 개방 창을 눌러 가위로 절단하며, 달걀 껍질로부터 먼지를 날려 버리고, 개방 창에 있는 달걀 껍질을 벗기면, 융모막이 명백하게 가시적이었다. 0.25 x 0.25 x 0.25 (길이 x 폭 x 높이) cm³의 크기를 갖는 젤라틴 스폰지를, 200, 400, 800 ㎍/달걀의 최종 농도 하에 10 ㎕ PGAS 및 비히클 대조군으로 처리한 다음, 대혈관을 수반하지 않는 융모막 내의 부위에 부드럽게 놓아두었다. 작은 창을 멸균성 투명 테이프로 밀봉시키고, 상기 달걀을 48시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 관찰하기 위해 상기 테이프를 벗기고, 사진을 찍은 다음 (배율: 40X), 닭 배아 융모막의 혈관신생에 대한 PGAS의 억제 효과를 평가하였다. PGAS를 함유하는 스폰지에 인접한 융모막에서는, 혈관 밀도가 상당히 감소되고, 농도 의존성 억제 경향이 나타난 것으로 밝혀졌다 (도 6). 이는 PGAS가 혈관신생 억제 효과를 지니고 있다는 것을 보여준다.

실시예 7: PGAS에 의한 헤파라나제 활성 억제의 시험

PCR 증폭 및 유전자 재조합에 의해 인간 태반으로부터 수득된 인간 헤파라나제의 cDNA를 이용하여, 헤파라나제의 친화 칼럼 정제 시스템과 혈청-무함유 곤충 발현 시스템을 확립시키고, 95% 이상의 순도를 갖는 고도의 활성 헤파라나제를 수득하였다. 150 ㎕의 반응 완충제 (50 mM 소듐 아세테이트, pH 4.2)에 0.5 ㎍ FITC-HS (플루오레세인 이소티오시아네이트-표지된 헤파란 술페이트) 및 25 ng/ml의 최종 농도 하의 헤파라나제를 가하고, 또한 각종 농도 하의 PGAS를 가한 다음, 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 100℃에서 5분 후, 10000 rpm 하에 20분 동안 원심분리를 수행하여 불용성 물질을 펠릿화하였다. 상청액을 0.45 ㎛ 필터 막으로 여과시킨 다음, 20 ㎕의 부하 하에, 완충제 50 mM 트리스(Tris)/150 mM NaCl, pH 7.5를 이용하고 0.8 ml/min의 유량 하에, TSK 겔 G3000SWXL 칼럼 상으로 주사하였다. FITC-HS 생성물의 형광 세기를 형광 검출기 (Ex: 485 nm, Em: 538 nm)로 검출하였다. 온전한 FITC-HS 피크의 전방 절반 면적을 감소시킴으로써 상기 효소의 상대적 활성을 평가하여, 헤파라나제 활성에 대한 PGAS의 효과를 결정하였다. PGAS는 헤파라나제 활성을 6.55 ng/ml의 IC₅₀으로 용량-의존적 방식으로 억제하고, 그 용량이 40 ng/ml인 경우에는, 상기 활성이 양성 대조군 헤파린 보다 더 우수한 것으로 밝혀졌다 (도 7).

실시예 8: PGAS에 의한 C-Met 효소 활성 억제의 시험

효소 반응 기질 폴리 (Glu, Tyr)를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 적당한 농도를 갖는 ATP 용액과 폴리굴론산 술페이트 및 c-Met 효소 용액을 가한 다음, 반응을 위해 37℃ 하에 1시간 동안 진탕기 위에 놓아두었다. 이어서, T-PBS 희석된 PY99 항체 함유 5 mg/ml BSA를 가하고, 상기 진탕기 상에서 37℃ 하에 0.5시간 동안 반응시켰다. 추가로, 서양고추냉이 퍼옥시다제-표지된 염소 항-마우스 IgG를 가하고, 진탕기 상에서 37℃ 하에 0.5시간 더 반응시켰다. 최종적으로, 2 mg/ml OPD 현상 용액을 가하고, 25℃ 하의 암실에서 1 내지 10분 동안 반응시키며, 2 M H₂SO₄를 가하여 상기 반응을 종결시켰다. 490 nm 하에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기에 의해 측정하고, 상기 효소 활성 억제율을 계산하였다:

c-Met에 대한, 10 ㎍/ml의 농도 하의 폴리굴론산 술페이트의 효소 활성 억제율은 71.1%인 것으로 밝혀졌으며, 이는 폴리굴론산 술페이트가 c-Met 효소 활성을 억제하는 효과를 지니고 있다는 것을 나타낸다.

실시예 9: PGAS에 의한 튜불린 중합 억제의 시험

각종 농도 하의 10 ㎕ PGAS를 96-웰 플레이트 내로 부가하고, 37℃ 하에 10분 동안 미리 가열하였다. 튜불린 동결 건조된 분말을 PEM 완충제 (100 mM PIPES, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA) 플러스 1 mM GTP, 5% 글리세린에서 희석시켜 12 μM의 농도가 되도록 하였다. 90 ㎕의 상기 용액을 96-웰 플레이트에 가하고, 마이크로플레이트 판독기를 시작하였으며, 온도를 37℃로 설정하고 검출 파장을 340 nm로 설정하였다. 이를 철저하게 혼합하고, 30분 동안 연속해서 분당 1회 판독하였다. 그 결과, PGAS는 세포-무함유 시스템에서 튜불린 중합을 상당히 억제할 수 있고, PGAS의 농도를 2.5 μM에서 40 μM로 증가시킨 경우에는, 억제율이 용량 의존적으로 18.26%에서 73.44%로 증가한 것으로 (8.58 μM의 IC₅₀) 밝혀졌다 (도 8).

실시예 10: PGAS에 의한 액틴 탈중합 억제

피레닐-표지된 액틴을 응집 완충제 (100 mM 트리스-HCl, 20 mM MgCl₂, 500 mM KCl, 2 mM CaCl₂, pH 7.5) 내로 가하고, 37℃ 하에 30분 동안 인큐베이션하여, 그것이 원섬유로 응집되도록 하였다. 이어서, 액틴 탈중합 완충제 (10 mM 트리스-HCl, 0.2 mM CaCl₂, 0.2 mM ATP, pH 8.0) 및 상이한 농도의 PGAS를 희석용으로 가하여, 그를 탈중합시켰다. 형광 마이크로플레이트 판독기를 360 nm의 발광 파장 및 410 nm의 흡광 파장으로 설정하고 37℃의 온도로 설정하였다. 이를 철저하게 혼합하고, 30분 동안 연속해서 분당 1회 판독하였다. 그 결과, PGAS는 세포-무함유 시스템에서 액틴 탈중합 과정을 상당히 억제할 수 있고, 용량 의존성을 나타내는 것으로 (IC₅₀은 10.6 μM임) 밝혀졌다 (도 9).

실시예 11: 코필린의 액틴 탈중합 /절단 활성에 대한 PGAS의 억제

폴리굴론산 술페이트를 세파로스 CL-4B와 커플링하여, 폴리굴론산 술페이트의 친화 크로마토그래피 칼럼을 제조하였다. 이러한 크로마토그래피 칼럼을 이용하여, 폐암 세포주 A549 내에서의 폴리굴론산 술페이트의 결합성 단백질을 추출하고 분리하였다. 질량 분광측정에 의해 확인한 결과, 코필린이 폴리굴론산 술페이트와 강력하게 결합하는 단백질 중 하나인 것으로 밝혀졌다. 추가의 연구 결과, 폴리굴론산 술페이트가 코필린의 액틴 탈중합/절단 활성을 상당히 억제할 수 있는 것으로 나타났다 (도 10). 이는 폴리굴론산 술페이트가 코필린과 결합하여, 코필린의 액틴 탈중합/절단 활성을 억제함으로써, 종양 세포의 세포 이동을 억제하는 기능을 할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 12: PGAS의 당 성분의 활성 결정

실시예 3에서 제조된 PGAS 당 성분의 항종양 활성을 시험하였다. 15 mg/kg 미만의 정맥내 주사 용량에서의 PGAS의 테트라사카라이드 내지 도데카사카라이드 성분 (상기 화학식 I에서 n이 2 내지 10인 것에 상응함)은 누드 마우스 내의 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 이종 이식편의 성장에 대해서 30% 이하의 T/C 값을 나타내고, 그의 폐 전이에 대해서 95% 이상의 억제율을 나타내며; 10 mg/kg 미만의 용량 하에서의 헥사사카라이드 내지 데카사카라이드 성분 (화학식 I에서 n이 4 내지 8인 것에 상응함)은 누드 마우스 내의 인간 유방암 MDA-MB-435 동소 이종 이식편의 성장에 대해서 30% 이하의 T/C 값을 나타내고, 그의 폐 전이에 대해서 95% 이상의 억제율을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과들은 황 함량이 7 내지 15 중량%인 경우에 더 우수하고, 9 내지 13 중량%인 경우에 가장 우수하였다.

실시예 13: PGAS의 당 성분의 종양 전이 억제 활성의 결정

종양 전이에 대한, 실시예 3에서 분리된 상이한 PGAS 당 성분의 효과를 트랜스웰(Transwell) 세포 검정으로 검출하였다. 트립신을 사용하여, 지수적 성장기 하의 시험관 내에서 계대 배양된 유방암 MDA-MB-435 세포를 분해한 다음, 혈청-무함유 배양물로 3회 세척하고, 2 x 10⁶/ml가 되도록 희석하였다. 100 ㎕의 상기 세포 희석물을 트랜스웰 세포 내의 웰의 상부 챔버에 가하고, 600 ㎕의 10% FBS-함유 배양물을 하부 챔버에 가하며, 100 ㎍/ml의 상이한 PGAS 성분을 상부 챔버와 하부 챔버 둘 다에 가하였다. 세포를 37℃ 하에 12시간 동안 5% CO₂-함유 인큐베이터에서 인큐베이션한 후, 배양 배지를 꺼내고, 세포를 90% 에탄올 용액에서 30분 동안 고정시켰다. 세포를 실온 하에 10분 동안 0.1% 크리스털 바이올렛(crystal violet) 용액 (0.1 M 붕산, 0.1% (w/v) 크리스털 바이올렛, 2% 에탄올)으로 염색하고, 깨끗한 물로 세정하며, 면봉으로 닦아내어, 상부 층 내의 이동되지 않은 세포를 제거하였다. 상기 세포를 현미경 하에 관찰하고, 사진을 찍은 다음 기록하였다. 최종적으로, 100 ㎕/웰 하에 10분 동안 10% 아세트산 용액으로 추출을 수행하였고, OD 값을 595 nm 하에 결정하며, 유방암 세포에 대한 상이한 당 성분의 이동 억제율을 계산하였다:

이동 억제율 (%) = (1-OD_처리군/OD_대조군) x 100%

대조군에서의 MDA-MB-435 세포는 FBS의 농도 구배에 따라 12시간 이내에 상부 챔버에서 하부 챔버로 자유롭게 이동할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 크리스털 바이올렛 염색의 사진 결과로부터, 테트라사카라이드 (화학식 I에서, n = 2) 내지 운데카사카라이드 (화학식 I에서, n = 9)의 범위, 및 보다 큰 폴리사카라이드의 상이한 PGAS 당 성분이 종양 세포 이동을 상당히 억제할 수 있는 반면, 디사카라이드 성분 (화학식 I에서, n = 0)과 트리사카라이드 성분 (화학식 I에서, n = 1)은 더 낮은 억제율을 나타내는 것으로 관찰될 수 있으며 (도 11), 이는 각종 PGAS 성분 (특히, 테트라사카라이드 내지 운데카사카라이드 및 보다 큰 폴리성분)이 종양 세포의 전이 억제 효과를 지니고 있다는 것을 나타낸다.

통계 처리

상기 데이터를 대상으로 하여, 스태트뷰(Statview) 소프트웨어를 이용하여 통계적 분석을 수행하였고, 그 결과를 "평균 값 ± SE"로서 표현하였으며, ANOVA를 비교용으로 사용하였다.

상기 약리학적 결과에 따라서, 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 유효량을 제약 담체와 혼합함으로써 통상적인 제제화 수단을 이용하여 제약 조성물을 제조할 수 있다. 이러한 제약 조성물은 종양 치료 약물 및 종양 전이 치료 약물로서 사용될 수 있고, 또한 혈관신생 억제제, 헤파라나제 억제제, C-Met 효소 억제제, 미세소관 중합 억제제 및 액틴-탈중합 억제제로서 사용될 수 있다. 종양과 종양 전이를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 본 발명의 폴리굴론산 술페이트의 용도가 매우 중요한 의미를 갖는다.

Claims

하기 화학식 I의 구조를 갖는 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염.
<화학식 I>

상기 식에서,
n은 0 또는 1 내지 23의 정수를 나타내고,
R₁은 SO₃H이고,
R₂는 서로 독립적으로, H 또는 SO₃H를 나타내며,
단 폴리굴론산 술페이트의 황 함량으로서 계산된 황산화 정도는 5 내지 20 중량%이다.
제1항에 있어서, 화학식 I에서, n이 2 내지 13의 정수인 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제2항에 있어서, 화학식 I에서, n이 3, 4, 5, 6, 7 또는 8인, 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 황 함량이 7 내지 15 중량%인 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제4항에 있어서, 황 함량이 9 내지 13 중량%인 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염.
하기 화학식 II에 제시된 바와 같은 폴리굴루론산을 술폰화 시약과 반응시킨 다음, 환원제를 통하여 환원시켜, 하기 화학식 I에 제시된 바와 같은 제1항에 따른 폴리굴론산 술페이트를 수득하는 것
을 포함하는, 제1항에 따른 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 제조 방법.
<화학식 II>

<화학식 I>

상기 화학식 II에서, m은 0 또는 1 내지 48의 정수를 나타내고;
상기 화학식 I에서, n, R₁ 및 R₂는 제1항에서 정의된 바와 같다.
제6항에 있어서, 술폰화 시약이 클로로술폰산이고/이거나; 술폰화 온도가 45 내지 85℃이고/이거나; 반응 시간이 1.5 내지 4.5시간이고/이거나; 환원제가 소듐 보로히드라이드, 소듐 시아노보로히드라이드, 니켈-히드라이드 시약 또는 할로겐-기재 환원제인 방법.
제7항에 있어서, 술폰화 온도가 60 내지 75℃이고/이거나; 반응 시간이 2 내지 3.5시간인 방법.
제8항에 있어서, 반응 시간이 3시간인 방법.
종양 성장 및/또는 전이를 억제하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 사용 방법.
제10항에 있어서, 종양이 간암, 위암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 흑색종 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
종양 성장 억제제, 종양 전이 억제제, 혈관신생 억제제, 헤파라나제 억제제, C-Met 효소 억제제, 미세소관 중합 억제제, 액틴-탈중합 인자 활성 억제제 및/또는 액틴-응집 억제제의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 사용 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리굴론산 술페이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 치료 유효량을 포함하는, 종양 성장 및/또는 전이를 억제하기 위한 제약 조성물.
종양 성장 및/또는 전이 억제제의 제조에 있어서의, 제13항에 따른 제약 조성물의 사용 방법.
종양 성장 억제제, 종양 전이 억제제, 혈관신생 억제제, 헤파라나제 억제제, C-Met 효소 억제제, 미세소관 중합 억제제, 액틴-탈중합 인자 활성 억제제 및/또는 액틴-응집 억제제의 제조에 있어서의, 제13항에 따른 제약 조성물의 사용 방법.