CN101258166A - 与steap-1蛋白结合的抗体及其衍生的分子 - Google Patents

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Abstract

本文描述了能与新的STEAP－1蛋白及其变体结合的抗体以及由其衍生的分子，其中STEAP－1在正常成年组织中表现出组织特异性表达，并且在表I所列的癌症中异常表达。因此，STEAP－1提供了癌症的诊断、预测、预防和/或治疗靶。可以使用STEAP－1基因或其片段或其编码的蛋白质或其变体或其片段来引发体液或细胞免疫应答；与STEAP－1反应的抗体或T细胞可用于主动或被动免疫。

Description

与STEAP-1蛋白结合的抗体及其衍生的分子
对于由联邦政府出资的研究项目所作发明的权利的声明
对本发明不适用。
技术领域
本文所述的发明涉及能结合被称作STEAP-1的蛋白质的抗体及其结合片段以及由它们衍生的分子。本发明还涉及可用于治疗表达STEAP-1的癌症的诊断、预测、预防和治疗方法以及组合物。
背景技术
癌症是仅次于冠状疾病的导致人类死亡的第二大病因。世界上每年有数百万人死于癌症。据美国癌症学会报道，仅在美国，癌症每年导致50万以上的健康人死亡，每年诊断出的新病例超过120万。尽管由心脏病所致的死亡已显著减少，但由癌症导致的死亡却普遍呈上升趋势。预测在下个世纪早期，癌症将成为导致死亡的首要原因。
在世界范围内，有几种癌症突显为主要杀手。具体地说，肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌和膀胱癌成为癌症死亡主要原因的代表。这些癌症和事实上所有其它癌症都具有共同的致死特征。除了极少数的例外，癌症的转移疾病也是致死性的。另外，即便有些癌症患者起初从原发性癌症中生还，但它们共同的体验表明它们的生活已发生明显变化。很多患者担心癌症很可能会复发或治疗会失败，因而感到非常焦虑。很多癌症患者在治疗后感到身体虚弱。另外，很多癌症患者还会遭遇癌症复发。
在世界范围内，前列腺癌在男性最易发癌症中列第四位。在北美和北欧，前列腺癌是男性中最常见的癌症，是导致男性死于癌症的第二大病因。仅在美国，每年死于此病的男人远远超过30,000人-仅次于肺癌。尽管这些数字的数量级很大，但针对转移的前列腺癌仍无有效的治疗方法。外科前列腺切除术、放疗、激素脱离疗法、外科阉割和化疗仍是主要的治疗形式。不幸的是这些疗法对很多人都不起效果，并且经常与不良的后果有关。
在诊断方面，缺乏可准确检测早期、定位前列腺肿瘤的肿瘤标记显著限制了前列腺癌的诊断和治疗。尽管血清前列腺特异性抗原(PSA)测定法已成为很有用的工具，但人们普遍认为该方法在几个重要的方面缺乏特异性和普遍实用性。
能在小鼠体内重演疾病的不同阶段的前列腺癌异体移植物的产生推进了鉴定前列腺癌其它特异性标记的进程。LAPC(Los Angeles Prostate Cancer)异体移植物是前列腺癌异体移植物，它能在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中幸免于死，并能表现出模拟从雄激素依赖型转变为雄激素非依赖型的能力(Klein et al.，1997，Nat.Med.3：402)。最新鉴定的前列腺癌标记包括PCTA-1(Su et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7252)、前列腺-特异性膜(PSM)抗原(Pinto et al.，Clin Cancer Res 1996 Sep 2(9)：1445-51)、STEAP(Hubert，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.1999 Dec 7；96(25)：14523-8)和前列腺干细胞抗原(PSCA)(Reiter et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：1735)。
尽管以前鉴定的标记，如PSA，PSM，PCTA和PSCA对诊断和治疗前列腺癌起到一定作用，但是，为了进一步完善诊断和治疗，仍需要鉴定前列腺和相关癌症的其它标记和治疗靶。
肾细胞癌(RCC)造成了约3％的成年人恶性肿瘤。一旦腺瘤的直径达到2至3cm，就存在恶变的可能。在成年人中，两种主要的恶性肾肿瘤是肾细胞腺癌以及肾盂或输尿管的移行细胞癌。据估计，美国的肾细胞腺癌的发病率超过29,000例，1998年，有11,600多位患者死于该病。移行细胞癌较少发生，美国每年的发病率约为500例。
几十年来，外科手术是肾细胞腺癌的主要疗法。直至最近，任何全身性疗法都对付不了转移疾病。借助于全身性疗法，特别是免疫疗法的最新进展，可以进攻性地接近适当患者体内的转移肾细胞癌，并且有可能伴有持久的反应。然而，这些患者仍需要有效的疗法。
在美国的所有癌症新病例中，膀胱癌约占男性肿瘤的5％(在常见肿瘤中名列第五)和女性肿瘤的3％(在常见肿瘤中名列第八)。发病率随着老年人群的逐渐增加而缓慢增加。据估计，1998年有54,500个病例，包括39,500位男性和15,000位女性。在美国，受年龄调节的发病率为：每100,000位男性有32位患者，每100,000位女性有8位患者。与女性的吸烟模式相关联，历史性的男性/女性患病比例3∶1可能会降低。据估计，1998年有11,000位患者死于膀胱癌(7,800位男性和3,900位女性)。膀胱癌的发病率和死亡率随着年龄的增加而急剧增加，随着种群老龄化的出现，这将成为日益严重的问题。
大多数膀胱癌在膀胱中复发。膀胱癌的治疗方法为联合使用膀胱经尿道切除术(TUR)以及膀胱内化学疗法或免疫疗法。膀胱癌的多病灶和复发特征显出TUR的局限性。仅通过TUR不能治愈大多数的肌肉-受侵癌症。膀胱根治切除术和尿流改道术是消除癌症的最有效方法，但不可否认的是，它们对泌尿和性功能有影响。因此，十分需要有利于膀胱癌患者的治疗形式。
据估计，2000年美国有130,200例结肠直肠癌发生，包括93,800例结肠癌和36,400例直肠癌。结肠直肠癌是男性和女性第三多发的癌症。1992-1996年，发病率显著降低(每年下降2.1％)。研究表明发病率的下降可能应归功于筛查和切除息肉，防止息肉发展成为侵害性癌症。据估计，2000年有56,300位患者死亡(47,700位死于结肠癌，8,600位死于直肠癌)，约占所有美国癌症死亡人数的11％。
目前，最普遍的结肠直肠癌疗法是外科手术，对于尚未扩散的癌症而言，经常是可治愈的。对于癌症已深度穿入肠壁或已扩散至淋巴结的大多数患者而言，在手术前或手术后应给予化学疗法或化学疗法加放疗。结肠癌患者有时需要永久性结肠造口术(在腹部开一个小口以排出体内废物)，而直肠癌患者较少需要该手术。结肠直肠癌患者仍需要有效的诊断和治疗形式。
据估计，2000年新出现164,100个肺和支气管癌病例，占所有美国癌症诊断病例的14％。男性肺和支气管癌的发病率显著降低，从1984年每100,000人中高达86.5人患病至1996年的70.0人患病。在上个世纪九十年代，女性发病率的增加速度开始减缓。1996年，女性的发病率为每100,000人中42.3人患病。
据估计，2000年肺和支气管癌导致156,900人死亡，占所有癌症死亡人数的28％。1992-1996年，男性中的肺癌死亡率显著下降(每年下降1.7％)，而女性中的死亡率仍然逐渐增加(每年增加0.9％)。自1987年以来，与乳腺癌相比，每年死于肺癌的妇女更多，对于40岁以上的妇女来说，肺癌是女性癌症死亡的主要病因。前30年降低吸烟人数的比例最有可能导致肺癌发病率和死亡率的降低；然而，相对于男性而言，减少女性吸烟模式的工作有些滞后。值得关注的是，尽管成人烟草使用率的下降速度趋于缓慢，但年轻人中的烟草使用率再次呈逐渐增加的趋势。
可根据癌症的类型和阶段，确定肺和支气管癌的治疗选择，其包括外科手术、放疗和化疗。对于多种固定于局部的癌症来说，通常选择的疗法是外科手术。由于在发现癌症之前，癌症通常已扩散，经常需要在外科手术的同时联合使用放疗和化疗。对于小细胞肺癌而言，可以选择的疗法是仅用化疗或将化疗与放疗联合；通过使用此方案，高百分比患者的病情减轻，在有些情况下，这种好的疗效会长时间保持。然而，肺和支气管癌不断需要有效的治疗和诊断方法。
预计2000年美国妇女中会出现约182,800例新的乳腺癌侵害病例。另外，预计2000年会诊断出约1,400例新的男性乳腺癌病例。自上个世纪八十年代每年约增加4％之后，妇女乳腺癌的发病率在九十年代已停止增长，维持在每100,000人中约110.6个病例。
仅在美国，据估计2000年有41,200人(40,800名女性，400名男性)死于乳腺癌。乳腺癌在女性癌症死亡中名列第二。根据最新的数据，在1992-1996年，死亡率显著降低，在年轻白人和黑人妇女中死亡率的降低最为显著。死亡率的降低可能是早期检测和改进疗法的结果。
考虑到就医环境和患者的选择，乳腺癌疗法包括肿块切除术(局部切除肿瘤)和摘除胳膊下方的淋巴结；乳房切除术(手术切除乳房)和摘除胳膊下方的淋巴结；放疗；化疗；或激素疗法。经常联合使用两种或多种疗法。多项研究表明对于早期乳腺癌而言，肿块切除术加放疗之后的长期存活率类似于改良根治性乳房切除术之后的存活率。重建术的显著进步给乳房切除术后的乳房重建提供了几种选择。最近，已在乳房切除术的同时进行乳房重建。
针对周围有足够量的正常乳腺组织的原位导管癌(DCIS)的局部切除术可防止DCIS的局部复发。对乳房进行放疗和/或他莫昔芬可减少其余乳腺组织发生DCIS的机会。这一点至关重要，因为如果对DCIS不加治疗，即可发展为侵害性乳腺癌。然而，这些疗法有严重的副作用或后遗症。因此，需要有效的乳腺癌疗法。
据估计，2000年美国有23,100例新的卵巢癌病例。占妇女所有癌症的4％，并在妇产科癌症中名列第二。在1992-1996年，卵巢癌发病率显著降低。据估计，2000年有14,000人死于卵巢癌。与任何其它女性生殖系统癌症相比，卵巢癌导致更多患者死亡。
外科手术、放疗和化疗是可选择的卵巢癌疗法。外科手术通常包括摘除一个或两个卵巢，输卵管(输卵管卵巢切除术)和子宫(子宫切除术)。对一些很早期的肿瘤，特别是对那些希望生孩子的年轻妇女而言，仅需要摘除染病的卵巢。对晚期卵巢癌而言，应尝试摘除所有腹内病灶以增强化疗的效果。卵巢癌仍需要有效的治疗方法。
据估计，2000年美国有28,300例新的胰腺癌病例。在过去的20年内，男性胰腺癌的发病率下降。女性胰腺癌的发病率基本保持不变，但人数已开始下降。2000年美国约有28,200人死于胰腺癌。在过去的20年内，男性死亡率有微弱但显著的下降趋势(每年约下降0.9％)，而女性死亡率略有增加。
外科手术、放疗和化疗是可选择的胰腺癌疗法。这些疗法可以延长很多患者的存活期和/或减轻它们的症状，但不可能治愈大多数患者。显然，还需要其它针对癌症的治疗和诊断方法。包括将抗体、疫苗和小分子用作治疗方式。另外，还需要将这些治疗方式用作研究工具以诊断、检测、监测和促进所有癌症治疗和研究领域的技术状态。
发明简述
本发明提供了能与STEAP-1蛋白及其多肽片段结合的抗体及其结合片段和由它们衍生的分子。本文所用术语STEAP-1与8P1D4是同义词。本发明包括多克隆和单克隆抗体、鼠和其它哺乳动物抗体、嵌合抗体、人源化和全人抗体以及用可测标记或治疗剂标记的抗体。在一些实施方案中，需满足的前提条件是：不编码图2的完整核酸序列和/或不制备图2的完整氨基酸序列。在某些实施方案中，编码了图2的完整核酸序列和/或制备了图2的完整氨基酸序列，它们中的任一种皆为其各自的人单位剂量形式。
本发明还提供了检测多种生物样品中STEAP-1多核苷酸和蛋白质的存在和状况的方法，以及鉴定表达STEAP-1的细胞的方法。本发明的实施方案提供了监测具有或怀疑具有某些形式的生长调节异常，如癌症的组织或血液样品中是否具有STEAP-1基因产物的方法。
本发明还提供了多种用于治疗表达STEAP-1的癌症，如表I所列组织的癌症的免疫原性或治疗性的组合物和策略，包括目的在于抑制STEAP-1转录、翻译、加工或功能的疗法以及癌症疫苗。一方面，本发明提供了用于治疗人受试者中表达STEAP-1的癌症的组合物和包括使用该组合物的方法，其中组合物含有适用于人的载体，以及人单位剂量的一种或多种可抑制STEAP-1产生或功能的药剂。优选载体是独特的人载体。在本发明的另一方面，药剂是能与STEAP-1蛋白发生免疫反应的组成成分。所述组成成分的非限制性例子包括但不限于抗体(如单链、单克隆、多克隆、人源化、嵌合或人抗体)，其功能等同物(可以是天然的，也可以是合成的)及其组合。抗体可以与诊断或治疗组成成分偶联。另一方面，药剂是本文定义的小分子。
另一方面，药剂含有一种或多种含有细胞毒T淋巴细胞(CTL)表位的肽和/或一种或多种含有辅助性T淋巴细胞(HTL)表位的肽，前一表位能与人体内的I类HLA分子结合以引发针对STEAP-1的CTL反应，后一表位能与人体内的II类HLA分子结合以引发HTL反应。本发明的肽可以位于相同的或一种或多种分开的多肽分子上。在本发明的另一方面，药剂含有一种或多种核酸分子，所述核酸分子表达一种或多种上文所述的能刺激CTL或HTL反应的肽。在本发明的另一方面，一种或多种核酸分子可表达能与上述STEAP-1发生免疫反应的组成成分。一种或多种核酸分子也可以是或编码抑制STEAP-1产生的分子。所述分子的非-限制性例子包括但不限于与产生STEAP-1所必需的核苷酸序列互补的分子(如反义序列或与产生STEAP-1所必需的核苷酸双螺旋形成三股螺旋的分子)或能有效裂解STEAP-1mRNA的核酶。
本发明的另一个实施方案是抗体表位，其含有肽区域或编码肽区域的寡核苷酸，并具有下述的1，2，3，4或5个特征：
i)图3中特定肽的至少5个氨基酸长的肽区域，其长度以任何整数增长直至达到图3所示蛋白质的全长，它包括在图5的亲水性分布图中，数值等于或大于0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，或等于1.0的氨基酸位置；
ii)图3中特定肽的至少5个氨基酸长的肽区域，其长度以任何整数增长直至达到图3所示蛋白质的全长，它包括在图6的亲/疏水性分布图中，数值等于或小于0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，或等于0.0的氨基酸位置；
iii)图3中特定肽的至少5个氨基酸长的肽区域，其长度以任何整数增长直至达到图3所示蛋白质的全长，它包括在图7的可及残基百分比分布图中，数值等于或大于0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，或等于1.0的氨基酸位置；
iv)图3中特定肽的至少5个氨基酸长的肽区域，其长度以任何整数增长直至达到图3所示蛋白质的全长，它包括在图8的平均柔性分布图中，数值等于或大于0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，或等于1.0的氨基酸位置；或
v)图3中特定肽的至少5个氨基酸长的肽区域，其长度以任何整数增长直至达到图3所示蛋白质的全长，它包括在图9的β-转角分布图中，数值等于或大于0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，或等于1.0的氨基酸位置。
本发明还涉及被称为STEAP-1的基因，目前，已发现该基因在表I所列的癌症中超表达。对正常组织中STEAP-1基因表达的Northern印迹表达分析显示出该基因在成人组织中的受限表达模式。本文提供了STEAP-1的核苷酸(图2)和氨基酸(图2和图3)序列。STEAP-1在正常成人组织中的组织-相关分布模式，以及在表I所列组织中观察到的超表达显示出STEAP-1至少在某些癌症中异常地超表达，因此，STEAP-1可用作诊断、预防、预测和/或治疗如表I所列组织的癌症的靶标。
本发明提供了与全部或部分STEAP-1基因、mRNA和/或编码序列(优选它们为分离形式)相对应或互补的多核苷酸，包括编码STEAP-1-相关蛋白质及其长度为4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，或大于25个邻接氨基酸的片段，STEAP-1-相关蛋白质的至少30，35，40，45，50，55，60，65，70，80，85，90，95，100或大于100个邻接氨基酸，以及肽/蛋白质本身的多核苷酸；DNA，RNA，DNA/RNA杂合体和相关分子，与STEAP-1基因或mRNA序列或其部分互补或与之具有至少90％同源性的多核苷酸或寡核苷酸，以及能与STEAP-1基因，mRNA或编码STEAP-1的多核苷酸杂交的多核苷酸或寡核苷酸。本发明还提供了分离cDNA和编码STEAP-1的基因的方法。还提供了含有STEAP-1多核苷酸的重组DNA分子，被所述分子转化或转导的细胞以及用于表达STEAP-1基因产物的宿主-载体系统。
附图说明
图1.436个核苷酸长的STEAP-1SSH序列。
图2.STEAP-1变体1(也称为“STEAP-1v.1”或“STEAP-1变体1”)的cDNA和氨基酸序列示于图2A。下划线的是起始甲硫氨酸。开放阅读框从核酸66延伸至1085，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体2(也称为“STEAP-1v.2”)的cDNA和氨基酸序列示于图2B。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体3(也称为“STEAP-1v.3”)的cDNA和氨基酸序列示于图2C。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至944，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体4(也称为“STEAP-1v.4”)的cDNA和氨基酸序列示于图2D。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体5(也称为“STEAP-1v.5”)的cDNA和氨基酸序列示于图2E。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体6(也称为“STEAP-1v.6”)的cDNA和氨基酸序列示于图2F。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体7(也称为“STEAP-1v.7”)的cDNA和氨基酸序列示于图2G。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体8(也称为“STEAP-1v.8”)的cDNA和氨基酸序列示于图2H。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体9(也称为“STEAP-1v.9”)的cDNA和氨基酸序列示于图2I。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体10(也称为“STEAP-1v.10”)的cDNA和氨基酸序列示于图2J。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体11(也称为“STEAP-1v.11”)的cDNA和氨基酸序列示于图2K。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体12(也称为“STEAP-1v.12”)的cDNA和氨基酸序列示于图2L。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体13(也称为“STEAP-1v.13”)的cDNA和氨基酸序列示于图2M。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体14(也称为“STEAP-1v.14”)的cDNA和氨基酸序列示于图2N。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体15(也称为“STEAP-1v.15”)的cDNA和氨基酸序列示于图2O。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体16(也称为“STEAP-1v.16”)的cDNA和氨基酸序列示于图2P。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。
STEAP-1变体17(也称为“STEAP-1v.17”)的cDNA和氨基酸序列示于图2Q。下划线的是起始甲硫氨酸的密码子。开放阅读框从核酸96延伸至872，其中包括终止密码子。除非另有说明，本文所用的STEAP-1包括其所有的变体，包括图10、11和/或12所示的变体。
图3.
STEAP-1v.1的氨基酸序列示于图3A；它具有339个氨基酸。
STEAP-1v.2的氨基酸序列示于图3B；它具有258个氨基酸。
STEAP-1v.3的氨基酸序列示于图3C；它具有282个氨基酸。
STEAP-1v.4的氨基酸序列示于图3D；它具有258个氨基酸。
除非另有说明，本文所用的STEAP-1包括其所有的变体，包括图10、11和/或12所示的变体。
图4.图4A.STEAP-1v.1与小鼠TNFα-诱导的肥胖-相关蛋白(gi｜16905133|)的氨基酸序列比对。图4B.STEAP-1v.1与大鼠pHyde蛋白(gi｜21717655|)的氨基酸序列比对。图4C.显示了STEAP-1与小鼠前列腺的6个跨膜上皮细胞抗原(gi|20820492|)之间的同源性。
图5.通过ExPasy分子生物学服务器，从位于万维网URLch/cgi-bin/protscale.pl的ProtScale站点可进入使用Hopp和Woods的方法(HoppT.P.，Woods K.R.，1981.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828)的计算机算法序列分析，通过此分析测定出STEAP-1变体1(图5(a))、STEAP-1变体3(图5(b))的亲水性氨基酸分布图。
图6.通过ExPasy分子生物学服务器，从位于万维网URLexpasy.ch/cgi-bin/protscale.pl的ProtScale站点可进入使用Kyte和Doolittle的方法(Kyte J.，Doolittle R.F.，1982.J.Mol.Biol.157：105-132)的计算机算法序列分析，通过此分析测定出STEAP-1变体1(图6(a))、STEAP-1变体3(图6(b))的亲/疏水性氨基酸分布图。
图7.通过ExPasy分子生物学服务器，从位于万维网URLexpasy.ch/cgi-bin/protscale.pl的ProtScale站点可进入使用Janin的方法(JaninJ.，1979Nature 277：491-492)的计算机算法序列分析，通过此分析测定出STEAP-1变体1(图7(a))、STEAP-1变体3(图7(b))的可及氨基酸残基百分比分布图。
图8.通过ExPasy分子生物学服务器，从位于万维网URLexpasy.ch/cgi-bin/protscale.pl的ProtScale站点可进入使用Bhaskaran和Ponnuswamy的方法(Bhaskaran R.，and Ponnuswamy P.K.，1988.Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255)的计算机算法序列分析，通过此分析测定出STEAP-1变体1(图8(a))、STEAP-1变体3(图8(b))的平均柔性氨基酸分布图。
图9.通过ExPasy分子生物学服务器，从位于万维网URLexpasy.ch/cgi-bin/protscale.pl的ProtScale站点可进入使用Deleage和Roux的方法(Deleage，G.，Roux B.1987Protein Engineering 1：289-294)的计算机算法序列分析，通过此分析测定出STEAP-1变体1(图9(a))、STEAP-1变体3(图9(b))的β-转角氨基酸分布图。
图10.STEAP-1SNP变体的序列比对图。变体STEAP-1v.4至v.17是与STEAP-1v.2相比有单个核苷酸差异的变体。尽管分开显示这些SNP变体，但它们也可以任意组合出现，并且可出现于任何含有碱基对的转录物变体，如STEAP-1v.1和v.3。编号与STEAP-1v.2中的相对应。黑色框显示出与STEAP-1v.2相同的序列。黑框上方显示出SNP。
图11.STEAP-1转录变体的外显子组成。该图显示出不含poly A尾的转录变体的结构。变体STEAP-1v.1，v.2和v.3是共享相同外显子2和3的转录变体。与其它两个转录变体的第一个外显子相比，STEAP-1v.1的第一个外显子的5’末端要短30个碱基。STEAP-1v.2的第四个外显子与STEAP-1v.1的外显子4、内含子4和外显子5的组合相同。与STEAP-1v.1相比，变体STEAP-1v.3具有另一个从STEAP-1v.1的内含子4上剪接下来的外显子。内含子和外显子的长度不成比例。
图12.STEAP-1蛋白质变体的序列比对图。蛋白质变体对应于核苷酸变体。图10中的核苷酸变体STEAP-1v.5至v.17编码与STEAP-1v.2相同的蛋白质。由图11中所示的转录物变体STEAP-1v.1和v.3翻译的蛋白质的第169位可含有氨基酸F(Phe)或L(Leu)。黑框上方显示出单个氨基酸差异。黑框表示与STEAP-1v.1相同的序列。填写方式不同的黑框表示不同的序列。黑框下方的编号对应于STEAP-1v.1。
图13.图13(a)-(c).STEAP-1蛋白质变体的二级结构和跨膜结构域预测。使用可从位于www.expasy.ch/tools/的ExPasy分子生物学服务器进入的HNN-Hierarchical Neural Network法(Guermeur，1997，http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_nn.html)预测STEAP-1蛋白质变体1(SEQ ID NO：46)、变体2(SEQ ID NO：47)和变体3(SEQ ID NO：48)的二级结构(分别示于图13a-13c)。该方法可由一级蛋白质序列预测α螺旋、伸展链和无规卷曲的存在和位置。图中还列出了给定二级结构中的蛋白质百分比。图13(d)，13(f)和13(h)：基于利用TMBASE(K.Hofmann，W.Stoffe.TMBASE-跨越膜的蛋白质区段数据库，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 374：166，1993)的Hofmann和Stoffel的TMpred算法，分别图解显示出STEAP-1变体1-3存在跨膜区的可能性和方向(分别示于图13(d)，13(f)和13(h))。图13(e)，13(g)和13(i)：基于Sonnhammer，von Heijne和Krogh的TMHMM算法(Erik L.L.Sonnhammer，Gunnar von Heijne，and Anders Krogh：A hidden Markov modelfor predicting transmembrane helices in protein sequences.In Proc.of Sixth Int.Conf.on Intelligent Systems for Molecular Biology，p 175-182Ed J.Glasgow，T.Littlejohn，F.Major，R.Lathrop，D.Sankoff，and C.Sensen Menlo Park，CA：AAAI Press，1998)，分别图解显示出STEAP-1变体1-3存在跨膜区的可能性以及胞外和胞内方向(分别示于图13(e)，13(g)和13(i))。可从位于www.expasy.ch/tools/的ExPasy分子生物学服务器进入TMpred和TMHMM算法。
图14.图14a.胃癌患者样品中的STEAP-1表达。RNA提取自正常胃(N)和10个不同的胃癌患者样品(T)。用STEAP-1序列探测以每个泳道10μg总RNA获得的Northern印迹。结果表明：在胃肿瘤组织中，约有1.6kb STEAP-1强表达。下方的一组电泳表示显示出RNA样品质量的印迹的溴化乙锭染色情况。图14b.直肠癌患者组织中的STEAP-1表达。RNA提取自正常直肠(N)，直肠癌患者肿瘤(T)和直肠癌转移(M)。用STEAP-1序列探测以10μg总RNA获得的Northern印迹。结果表明：STEAP-1在直肠癌患者组织中强表达。下方的一组电泳表示显示出RNA样品质量的印迹的溴化乙锭染色情况。图14c.人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的STEAP-1表达。由HUVEC细胞、LAPC-4AD和LAPC-9AD前列腺癌异体移植物以及人脑组织制备第一链cDNA。通过使用针对肌动蛋白和GAPDH的引物的PCR进行归一化。使用针对STEAP-1的引物以27和30轮扩增循环进行半-定量PCR(A)。以使用针对肌动蛋白的引物的PCR作为对照(B)。结果表明：STEAP-1在HUVEC细胞中强表达，所述表达与在前列腺癌异体移植物组织中检测到的表达类似。STEAP-1在HUVEC细胞中的表达表明靶向STEAP-1也能靶向肿瘤新血管的内皮细胞。图14(d)和图14(e).正常和癌症组织中的STEAP-1表达。由正常组织(膀胱、脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、前列腺、脾脏、骨骼肌、睾丸、胰腺、结肠和胃)和患者癌症样品库(前列腺癌库、膀胱癌库、肾癌库、结肠癌库、肺癌库、卵巢癌库、乳腺癌库、癌症转移库、胰腺癌库、前列腺癌异体移植物库和前列腺转移至淋巴结库)制备第一链cDNA。通过使用肌动蛋白引物的PCR进行归一化。使用针对STEAP-1的引物，以26和30轮扩增循环进行半-定量PCR。图14d显示出RT-PCR琼脂糖凝胶图。在图14e中，使用Alphalmager软件定量PCR产物。结果显示出在所有被检测的正常组织中，正常前列腺中的STEAP-1强表达。在前列腺癌库、膀胱癌库、肾癌库、结肠癌库、肺癌库、卵巢癌库、乳腺癌库和胰腺癌库中检测到STEAP-1表达的上调。在癌症转移库、前列腺癌异体移植物库和前列腺转移至淋巴结库中检测到STEAP-1的强表达。图14(f).淋巴瘤患者样品中的STEAP-1表达。由一系列淋巴瘤患者样品制备第一链cDNA。通过使用针对肌动蛋白的引物的PCR进行归一化。使用针对STEAP-1的引物，以26和30轮扩增循环进行半-定量PCR。在琼脂糖凝胶上电泳样品，使用Alphalmager软件定量PCR产物。如果分别在第26轮或第30轮扩增循环时检测到信号，将表达记录为“强”或“中等”，如果在第30轮扩增循环时仍然没有信号，则将表达记录为“无”。结果表明：在受试的11个肿瘤样品中，有8个样品(72.7％)中有STEAP-1表达。
图15.用MAb M2/92.30对STEAP-1进行特异性细胞表面染色。左边的试验组：用抗-STEAP MAb M2/92.30(10μg/ml)染色的稳定表达STEAP-1(深色线)或对照新霉素抗性基因(浅色线)的重组3T3和Ratl细胞的FACS分析。用山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二试剂检测与细胞表面结合的MAb。然后对经染色的细胞进行FACS分析。与各自的对照细胞相比，Rat1-STEAP1和3T3-STEAP1细胞的荧光转变表明：MAb M2/92.30特异性结合细胞表面的STEAP1。右边的试验组：经MAb M2/92.30染色的3T3-STEAP1细胞的荧光显微术显示出明亮的细胞表面荧光。
图16.STEAP1M2/92.30MAb识别人前列腺癌异体移植物细胞表面的STEAP-1。用10μg/ml MAb M2/92.30或对照抗-KLH MAb染色LAPC9前列腺癌细胞。用山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二Ab检测与细胞表面结合的MAb。然后对经染色的细胞进行FACS分析。这些结果表明：抗-STEAP1 MAbM2/120.545特异性结合在前列腺癌异体移植物细胞中表达的内源性细胞表面STEAP1。
图17.STEAP1 M2/92.30MAb识别小鼠STEAP-1。用编码鼠STEAP1cDNA的pcDNA3.1或用空白载体瞬时转染293T细胞。2天后，收集细胞并用抗-STEAP1MAb M2/92.30(10μg/ml)染色细胞，用山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二试剂检测与细胞表面结合的MAb。然后对细胞进行FACS分析。与用空白载体转染的细胞相比，用鼠STEAP1转染的293T细胞的荧光转变表明：MAb M2/92.30特异性结合鼠STEAP1蛋白。
图18.STEAP1/120.545MAb识别细胞表面的STEAP-1。A试验组和B试验组：用MAb M2/120.545(10μg/ml)染色3T3-neo(A，涂黑的直方图)和3T3-STEAP1细胞(A，未涂黑的直方图)以及Rat1-neo(B，涂黑的直方图)和Rat1-STEAP细胞(B，未涂黑的直方图)。用山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二Ab检测与细胞表面结合的MAb。然后对细胞进行FACS分析。与其各自的neo对照相比，3T3-STEAP1和Rat1-STEAP1细胞的荧光转变表明：MAbM2/120.545特异性结合细胞表面的STEAP1。C试验组：用MAb M2/120.545或对照抗-KLH MAb染色LNCaP细胞，如上所述对经染色的细胞进行FACS分析。D试验组：经M2/120.545染色的LNCaP细胞的荧光显微术显示出明亮的细胞表面荧光。这些结果表明：M2/120.545MAb特异性结合在LNCaP细胞中表达的内源性细胞表面STEAP1。
图19.图19(a).M2/X92.30VH克隆#2的cDNA(SEQ ID NO：49)和氨基酸序列(SEQ ID NO：50)。图19(b).M2/X92.30VL克隆#2的cDNA(SEQ ID NO：51)和氨基酸序列(SEQ ID NO：52)。图19(c).M2/X92.30VL克隆#6的cDNA(SEQ ID NO：53)和氨基酸序列(SEQ ID NO：54)。图19(d).M2/X 120.545VL克隆#8的cDNA(SEQ ID NO：55)和氨基酸序列(SEQ ID NO：56)。
图20.图20a.M2/X92.30VH克隆#2的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)。图20b.M2/X92.30VL克隆#2的氨基酸序列(SEQ ID NO：58)。图20c.M2/X92.30VL克隆#6的cDNA(SEQ ID NO：59)和氨基酸序列(SEQ ID NO：60)。图20d.M2/X92.30VL克隆#2(SEQ ID NO：61)和M2/M92.30VL克隆#6(SEQ ID NO：62)的氨基酸序列比对。图20e.M2/X 120.545VL克隆#8的氨基酸序列(SEQ IDNO：63)。下划线的是信号肽序列。
图21.STEAP1 M2/92.30MAb识别人前列腺癌和膀胱癌异体移植物细胞表面的STEAP-1。用10μg/ml MAb M2/92.30或对照抗-KLH MAb染色UGB1膀胱癌细胞(左边的试验组)和LAPC9前列腺癌细胞(右边的试验组)。用山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二Ab检测与细胞表面结合的MAb。然后对经染色的细胞进行FACS分析。这些结果表明：抗-STEAP1 MAb M2/92.30特异性结合在膀胱癌和前列腺癌异体移植物细胞中表达的内源性细胞表面STEAP1。
图22.用STEAP1/92.30MAb内化STEAP-1。于4℃，用M2/92.30MAb(10μg/ml)染色3T3-STEAP1细胞，洗涤，然后于4℃与山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二Ab保温。将一半细胞移至37℃放置30分钟，将另一半细胞仍放置于4℃。然后用荧光显微镜观察经上述处理的细胞。维持于4℃的细胞显示出明亮的“环状”细胞表面荧光。转移至37℃的细胞未显示出“环状”细胞表面荧光，点状和聚集荧光的出现表明帽化和内化。
图23.用STEAP1M2/120.545MAb内化STEAP-1。于4℃，用M2/120.545MAb(10μg/ml)染色PC3-STEAP1细胞，洗涤，然后与山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二Ab保温。将一半细胞移至37℃放置30分钟，将另一半细胞仍放置于4℃。然后用荧光显微镜观察经上述处理的细胞。维持于4℃的细胞显示出明亮的“环状”细胞表面荧光。转移至37℃的细胞未显示出“环状”细胞表面荧光，点状和聚集荧光的出现表明帽化和内化。
图24.STEAP-1内化。使用抗-小鼠IgG-皂草素(saporin)偶联物(AdvancedTargeting Systems，San Diego，CA)阐明鼠Steap-1M2/120.545经由LNCaP细胞表面Steap-1的表达进入靶细胞。使用下述方法：将LNCaP细胞以5000个细胞/90μl/孔的密度铺于96孔培养板并保温过夜。在细胞培养基中加入第二免疫毒素偶联物(抗-小鼠IgG-皂草素和抗-山羊IgG-皂草素)或抗-小鼠IgG，使其终浓度为100ng/ml。加入浓度范围为1-1000ng/ml的第一抗体。将培养板保温72小时，通过MTT试验测定存活力。结果表明：M2/120.545和抗-小鼠IgG-皂草素的存在会杀死LNCaP细胞。仅用第二抗体(抗-小鼠IgG)或非特异性第二抗体偶联物(抗-山羊IgG-皂草素)未检测到效果。仅用受试浓度达1μg/ml的第一抗体(M2/120.545)未观察到毒性。
图25.用抗-STEAP-1MAb M2/92.30和M2/120.545免疫沉淀STEAP1。在RIPA缓冲液(25mM Tris-Cl pH7.4；150mM NaCl，0.5mM EDTA，1％TritonX-100，0.5％脱氧胆酸，0.1％SDS和蛋白酶抑制剂混合物)中裂解3T3-STEAP1和3T3-neo细胞。用G蛋白琼脂糖凝胶珠预清除细胞裂解物，然后于室温与5μg MAb M2/92.30或M2/120.545保温2小时。加入G蛋白珠，将混合物再保温1小时。洗涤免疫复合物，并溶解于SDS-PAGE样品缓冲液。然后对溶解的样品进行SDS-PAGE，并使用兔抗-STEAP pAb进行Western印迹分析。同时电泳被STEAP1转染的293T细胞的全细胞裂解物以用作阳性对照。仅在得自3T3-STEAP1细胞的样品中观察到约为37kD的免疫反应带，这表明M2/92.30和M2/120.545MAb都能特异性免疫沉淀STEAP1。
图26.STEAP-1MAb对小鼠体内LAPC9人前列腺癌异体移植物生长的作用。以两个不同的剂量100μg和500μg检测STEAP-1 M2/92.30和M2/120.545。将PBS和抗-KLH MAb用作对照。研究对象由6组小鼠组成，每组10只小鼠。从注射肿瘤细胞那天开始，给小鼠每周两次腹膜内注射MAb，总共注射12次。每周两次通过测径器测量监测肿瘤大小。取最长的尺寸(L)和与之垂直的尺寸(W)，以使用公式W2×L/2计算肿瘤体积。使用商用ELISA试剂盒测定每只动物在治疗第40天时的血清PSA浓度。使用Kruskal-Wallis试验和Mann-Whitney U试验评价组与组之间肿瘤生长和PSA水平的差异。所有试验都是双侧的，且á＝0.05。数据表明STEAP-1M2/92.30和M2/120.545能显著延缓剂量-依赖型肿瘤中的人前列腺异体移植物的生长。
图27.STEAP-1MAb对小鼠体内LAPC9人前列腺癌异体移植物生长的作用。以两个不同的剂量100μg和500μg检测STEAP-1 M2/92.30和M2/120.545。将PBS和抗-KLH MAb用作对照。研究对象由6组小鼠组成，每组10只小鼠。从注射肿瘤细胞那天开始，给小鼠每周两次腹膜内注射MAb，总共注射12次。每周两次通过测径器测量监测肿瘤大小。取最长的尺寸(L)和与之垂直的尺寸(W)，以使用公式W2×L/2计算肿瘤体积。使用商用ELISA试剂盒测定每只动物在治疗第40天时的血清PSA浓度。使用Kruskal-Wallis试验和Mann-Whitney U试验评价组与组之间肿瘤生长和PSA水平的差异。所有试验都是双侧的，且á＝0.05。结果表明STEAP-1 M2/92.30和M2/120.545能显著延缓剂量-依赖型肿瘤中的人前列腺异体移植物的生长。
图28.STEAP-1诱导的ERK-1和ERK-2磷酸化。左边的试验组：仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1转染PC3细胞。在0.5％FBS中将细胞培养过夜，然后用含或不含10μg/ml MEK抑制剂PD98058的10％FBS刺激细胞5分钟。通过12.5％SDS-PAGE分辨细胞裂解物，并用抗-磷酸-ERK(Cell Signaling)和抗-ERK(Zymed)进行Western印迹。右边的试验组：仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1转染NIH-3T3细胞。按上述处理细胞，但FBS中不含MEK抑制剂。另外，用10mg/ml Na salycilate处理NIH-3T3-Neo细胞。STEAP-1的表达诱导血清中的ERK-1和ERK-2磷酸化，上游MEK激酶抑制剂PD98058抑制STEAP-1的表达。
图29.STEAP-1介导细胞间通讯。仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1或对照基因转染PC3细胞。用1mg/ml葡聚糖-德克萨斯红标记受体细胞，用2.5μg/ml钙黄绿素AM标记供体细胞。于37℃将供体(绿色)和受体(红色)细胞共培养18-24小时，通过显微术分析荧光染料的共-定位。左边的试验组：PC3-Neo细胞既作供体又作受体。中间的试验组：PC3-STEAP-1细胞既作供体又作受体。右边的试验组：PC3-对照细胞既作供体又作受体。STEAP-1诱导钙黄绿素转运至含有葡聚糖-德克萨斯红的细胞，这表明STEAP-1有利于细胞间通讯。
图30.细胞通讯需要供体和受体细胞上表达STEAP-1。仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1转染PC3细胞。用1mg/ml葡聚糖-德克萨斯红标记受体细胞，用2.5μg/ml钙黄绿素AM标记供体细胞。于37℃将供体(绿色)和受体(红色)细胞共培养18-24小时，通过显微术分析荧光染料的共-定位。上方的试验组：光学显微术；下方的试验组：UV荧光。左边的试验组：PC3-Neo细胞既作供体又作受体。中间的试验组：PC3-Neo是供体细胞，PC3-STEAP-1是受体细胞。右边的试验组：PC3-STEAP-1细胞既作供体又作受体。仅当供体和受体细胞上都表达STEAP-1时，才能检测到细胞间通讯。
图31.STEAP-1/120.545MAb对间隙连接(gap junction)的作用。仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1转染PC3细胞。用1mg/ml葡聚糖-德克萨斯红标记受体细胞，用2.5μg/ml钙黄绿素AM标记供体细胞。于37℃将供体(绿色)和受体(红色)细胞共培养18-24小时，通过显微术分析荧光染料的共-定位。在所有实验中，将相同细胞用作供体和受体。使细胞与所示量的STEAP-1/120.545 MAb保温10分钟，然后铺平板，在培养物中保留MAb达24小时再作分析。STEAP1/120.545以依赖于剂量的方式诱导STEAP-1介导的间隙连接。
图32.通过STEAP-1MAb和RNAi抑制ERK-1和ERK-2磷酸化。仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1和MAb转染PC3细胞。用含有STEAP-1 siRNA的pPUR-U6-27-STEAP-1载体稳定转染PC3-STEAP-1细胞。于37℃，在0.1％FBS中使细胞饥饿18小时，不加或加入10μg/ml M2/92.30MAb，置于冰上放置10分钟，再于室温放置3分钟，然后用10％FBS刺激5分钟。用RIPA缓冲液裂解细胞，通过12.5％SDS-PAGE分辨全细胞裂解物，并通过Western印迹检测蛋白质。用兔抗血清(Cell Signaling)检测磷酸-ERK，用兔抗-ERK(Zymed)检测ERK。用绵羊抗-STEAP-1检测STEAP-1，用抗-几动蛋白MAb(Santa Cruz)检测肌动蛋白。10％血清能诱导ERK-1和ERK-2磷酸化，而M2/92.30MAb和STEAP-1siRNA却能抑制ERK-1和ERK-2磷酸化。
图33.STEAP-1siRNA对细胞间通讯的作用。仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1转染PC3细胞。为了进行RNAi击倒，用含有STEAP-1 siRNA的pPUR-U6-27-STEAP-1载体或空白载体稳定转染PC3-STEAP-1细胞。用1mg/ml葡聚糖-德克萨斯红标记受体细胞，用2.5μg/ml钙黄绿素AM标记供体细胞。于37℃将供体(绿色)和受体(红色)细胞共培养18-24小时，通过显微术分析荧光染料的共-定位。在所有实验中，将相同细胞用作供体和受体。在PC3-STEAP-1细胞中稳定表达的特异性STEAP-1RNAi能降低STEAP-1诱导的细胞间通讯。
发明详述
章节概述
I.)定义
II.)STEAP-1多核苷酸
II.A.)STEAP-1多核苷酸的用途
II.A.1)监测基因异常
II.A.2)反义实施方案
II.A.3.)引物和引物对
II.A.4.)分离编码STEAP-1的核酸分子
II.A.5.)重组核酸分子和宿主-载体系统
III.)STEAP-1-相关蛋白质
III.A.)携有基元的蛋白质的实施方案
III.B.)STEAP-1-相关蛋白质的表达
III.C.)STEAP-1-相关蛋白质的修饰
III.D.)STEAP-1-相关蛋白质的用途
IV.)STEAP-1抗体
V.)STEAP-1细胞免疫反应
VI.)STEAP-1转基因动物
VII.)检测STEAP-1的方法
VIII.)监测STEAP-1-相关基因及其产物之状态的方法
IX.)鉴定与STEAP-1相互作用的分子
X.)治疗方法和组合物
X.A.)抗癌疫苗
X.B.)STEAP-1用作基于抗体之疗法的靶标
X.C.)STEAP-1用作细胞免疫反应的靶标
X.C.1.小基因疫苗
X.C.2.CTL肽与辅助肽的组合
X.C.3.CTL肽与T细胞引发剂的组合
X.C.4.含有用CTL和/或HTL肽脉冲的DC的疫苗组合物
X.D.)过继免疫疗法
X.E.)以治疗或预防为目的的疫苗的施用
X.I.)STEAP-1的诊断和预测实施方案
XII.)抑制STEAP-1蛋白质的功能
XII.A.)用胞内抗体抑制STEAP-1
XII.B.)用重组蛋白质抑制STEAP-1
XII.C.)抑制STEAP-1转录或翻译
XII.D.)有关治疗策略的一般性考虑
XIII.)STEAP-1调制剂的鉴定、表征和应用
XIV.)RNAi和小的干扰RNA(siRNA)的治疗用途
XV.)制备所需的试剂盒/材料
I.)定义
除非另有说明，本文所用的所有技术术语、注释和其它科学术语或专用名词与本发明所属技术领域的技术人员所一般理解的意思相同。在有些情况下，为了清楚说明和/或易于引用，本文定义了具有公知含义的术语，本文所述定义的内容与本领域一般理解的意思没有什么本质的不同。本文所描述或引用的很多技术和方法是易于理解的，本领域技术人员使用常规的方法学，例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd.edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.中所述的被广泛使用的分子克隆方法学，可以一般性地使用这些技术和方法。除非另有说明，适当时可根据厂商定义的方法和/或参数，一般性地进行包括使用商购试剂盒和试剂的方法。
术语“晚期前列腺癌”、“局部晚期前列腺癌”、“晚期疾病”和“局部晚期疾病”指的是已经由前列腺囊扩散的前列腺癌，包括美国泌尿协会(AUA)系统下的C期疾病、Whitmore-Jewett系统下的C1-C2期疾病和TNM(肿瘤、淋巴结、转移)系统下的T3-T4和N+期疾病。一般说来，不推荐给局部晚期疾病患者进行外科手术，与患有临床上定位(局限于器官)的前列腺癌的患者相比，这些患者的结果要差很多。在临床上，局部晚期疾病的特点是在前列腺外侧边缘上方可触及硬物，或者前列腺基底上方不对称或有硬物存在。目前，如果肿瘤侵入或渗入前列腺囊，扩散至手术边缘或侵入精囊，可在根治性前列腺切除术之后对局部晚期前列腺癌进行病理学诊断。
本文中的“改变天然糖基化模式”指的是(通过除去构成糖基化之基础的糖基化位点或经化学和/或酶学方法消除糖基化)缺失天然STEAP-1序列中存在的一个或多个糖组成成分，和/或添加一个或多个天然STEAP-1序列中原本不存在的糖基化位点。另外，该术语包括天然蛋白质糖基化性质上的变化，包括所存在的不同糖组成成分性质和比例的变化。
术语“类似物”指的是与另一种分子结构类似或具有类似或相应特征的分子(如STEAP-1-相关蛋白质)。例如，STEAP-1蛋白的类似物可以被特异性结合STEAP-1的抗体或T细胞特异性结合。
除非另有说明，术语“抗体”的含义是最宽泛的。因此，“抗体”可以是天然的或人工制备的，例如通过常规杂交瘤技术产生的单克隆抗体。抗-STEAP-1抗体包括单克隆和多克隆抗体以及含有这些抗体的抗原-结合结构域和/或一个或多个互补决定区的片段。本文所用术语“抗体”指的是能特异性结合STEAP-1和/或表现出所需生物活性的任何形式的抗体或其片段，它特别地覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们能特异性结合STEAP-1和/或表现出所需生物活性即可。任何特异性抗体都可用于本文提供的方法和组合物。因此，在一个实施方案中，术语“抗体”包括一种分子，其含有至少一个得自轻链免疫球蛋白分子的可变区和至少一个得自重链分子的可变区，它们合起来形成靶抗原的特异性结合位点。在一个实施方案中，抗体是IgG抗体。例如，抗体是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4抗体。可在细胞培养物、噬菌体或包括但不限于奶牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴、黑猩猩、猿的多种动物中产生可用于本发明方法和组合物中的抗体。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体是哺乳动物抗体。可使用噬菌体技术分离最初的抗体或产生具有经改变的特异性或亲合力特征的变体。此技术是本领域中常规的和众所周知的技术。在一个实施方案中，通过本领域已知的重组技术生产抗体。例如，通过用含有编码抗体的DNA序列的载体转染宿主细胞来生产重组抗体。可使用一个或多个载体将表达至少一个VL和一个VH区的DNA序列转染至宿主细胞。有关重组产生和生产抗体的技术可参见例如：Delves，ANTIBODY PRODUCTION：ESSENTIALTECHNIQUES(Wiley，1997)；Shephard，et al.，MONOCLONAL ANTIBODIES(Oxford University Press，2000)；Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(Academic Press，1993)；CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley&Sons，最新版)。可通过重组技术修饰本发明的抗体以使抗体介导所需功能的效力变得更强。因此，使用重组技术通过取代来修饰的抗体也落入本发明的范围之内。取代通常是保守取代。例如，抗体恒定区中的至少一个氨基酸可被不同的残基所替代。参见例如美国专利5,624,821、美国专利6,194,551、WO 9958572；和Angal，etal.，Mol.Immunol.30：105-08(1993)。氨基酸中的修饰包括氨基酸的缺失、添加、取代。在有些情况下，进行这种改变是为了降低不必要的活性，例如补体-依赖型的细胞毒性。经常通过共价或非共价地连接能提供可测信号的物质来标记抗体。多种标记和偶联技术是已知的，科技和专利文献中已有广泛报道。可筛选这些抗体以结合正常或有缺陷的STEAP-1。参见例如ANTIBODY ENGINEERING：A PRACTICAL APPROACH(Oxford UniversityPress，1996)。下述体外和体内试验可鉴定出具有所需生物活性的适当抗体，所述体外试验包括但不限于：增殖、迁移、粘附、软琼脂生长、血管发生、细胞间通讯、细胞凋亡、转运、信号转导，体内试验如抑制肿瘤生长。本文提供的抗体也可用于诊断用途。作为捕获或非-中和抗体，可筛选它们与特异性抗原结合但不会抑制抗原的受体-结合或生物活性的能力。作为中和抗体，抗体可用于竞争性结合试验。它们也可用于定量STEAP-1或其受体。
“抗体片段”被定义为能与其靶标结合的至少部分免疫球蛋白分子可变区，即抗原-结合区。在一个实施方案中，它特别地覆盖单个抗-STEAP-1抗体及其克隆(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)和具有多表位特异性的抗-STEAP-1抗体组合物。本发明方法和组合物中的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。抗体可以是与抗原结合的抗体片段形式，包括Fab片段、F(ab’)2片段、单链可变区等。可使用本领域众所周知的方法产生完整分子的片段，包括酶促消化和重组技术。
本文所用的任何形式的“抗原”都可用于产生特异于STEAP-1的抗体。因此，引发抗原可以是单个表位、多个表位或仅为完整的蛋白质或完整蛋白质与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂的组合。引发抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白质(如用被至少一部分抗原转染的细胞进行免疫)或可溶性蛋白质(如仅用蛋白质的胞外结构域部分进行免疫)。可在经基因修饰的细胞中生产抗原。编码抗原的DNA可以是基因组或非-基因组的(如cDNA)，并编码至少一部分胞外结构域。本文所用术语“部分”指的是恰好构成所需抗原的免疫原性表位的最少数目的氨基酸或核酸。可以使用任何适于转化所需细胞的基因载体，包括但不限于腺病毒载体、质粒和非-病毒载体，如阳离子脂质。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物中的抗体特异性结合所需STEAP-1的胞外结构域的至少一部分。
本文提供的抗体或其抗原结合片段可以与“生物活性剂”偶联。本文所用术语“生物活性剂”指的是任何能结合抗原和/或增强或介导合乎需要的增强细胞杀伤毒素的生物学作用的合成或天然化合物。
在一个实施方案中，可用于本发明的结合片段是有生物活性的片段。本文所用术语“有生物活性”指的是抗体或抗体片段能结合所需的抗原表位并能直接或间接发挥生物学作用。直接作用包括但不限于调制、刺激和/或抑制生长信号，调制、刺激和/或抑制抗-细胞凋亡信号，调制、刺激和/或抑制细胞凋亡或坏死信号，调制、刺激和/或抑制ADCC级联和调制、刺激和/或抑制CDC级联。
“双特异性”抗体也可用于本发明的方法和组合物。本文所用术语“双特异性抗体”指的是对至少两个不同的抗原表位具有结合特异性的抗体，一般是单克隆抗体。在一个实施方案中，表位得自相同的抗原。在另一个实施方案中，表位得自两个不同的抗原。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的，例如，通过共-表达两个免疫球蛋白重链/轻链对可以重组产生双特异性抗体。参见例如Milstein et al.，Nature 305：537-39(1983)。或者，使用化学键制备双特异性抗体。参见例如Brennan，et al.，Science 229：81(1985)。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见例如Hollinger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48(1993)，Gruber，et al.，J.Immunol.152：5368(1994)。
本文的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与得自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而其余链与得自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，还包括所述抗体的片段，只要它们能特异性结合靶抗原和/或表现出所需的生物活性即可(美国专利4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
术语“密码子最优化的序列”指的是通过替换任何使用频率低于约20％的密码子，针对特定宿主物种而最优化的核苷酸序列。本文将除了密码子最优化以外，通过消除错误的聚腺苷酸化序列，消除外显子/内含子剪接信号，消除转座子-样重复序列和/或最优化GC含量而被最优化以在给定宿主物种中表达的核苷酸序列称为“表达增强的序列”。
“组合文库”是通过混合多种化合物“构件”(如试剂)进行化学合成或生物合成而产生的多种化合物的集合。例如，线性组合化合物文库，如多肽(如突变蛋白)文库是通过以每一种可能的方式混合一套被称为化合物构件的具有给定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数目)的氨基酸而形成的。通过组合混合化合物构件即可合成多种化合物(Gallop et al.，J.Med.Chem.37(9)：1233-1251(1994))。
组合文库的制备和筛选是本领域技术人员众所周知的技术。所述组合化合物文库包括但不限于肽文库(参见例如美国专利5,010,175，Furka，Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)，Houghton et al.，Nature，354：84-88(1991))，peptoid(PCT公开号WO91/19735)，编码肽(PCT公开号WO 93/20242)，随机生物-寡聚体(PCT公开号WO92/00091)，苯并二氮杂卓(美国专利5,288,514)，diversomer，如乙内酰脲、苯并二氮杂卓和二肽(Hobbs et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993))，插烯多肽(Hagihara et al.，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))，具有β-D-葡萄糖支架的非肽类肽模拟物(Hirschmann et al.，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))，小化合物文库的类似有机合成(Chen et al.，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))，寡氨基甲酸酯(Cho，et al.，Science 261：1303(1993))，和/或肽基膦酸酯(Campbell et al.，J.Org.Chem.59：658(1994))。一般可参见Gordon et al.，J.Med.Chem.37：1385(1994)，核酸文库(参见例如Stratagene，Corp.)，肽核酸文库(参见例如美国专利5,539,083)，抗体文库(参见例如Vaughn et al.，Nature Biotechnology 14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)，糖类文库(参见例如Liang et al.，Science 274：1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)，以及小有机分子文库(参见例如苯并二氮杂卓，Baum，C&EN，Jan 18，page 33(1993)；类异戊二烯，美国专利5,569,588；噻唑烷二酮(thiazolidinone)和间噻唑烷酮(metathiazanone)，美国专利5,549,974；吡咯烷，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮杂卓，美国专利5,288,514等)。
制备组合文库的仪器可以商购(参见例如357NIPS，390NIPS，AdvancedChem Tech，Louisville KY；Symphony，Rainin，Woburn，MA；433A，AppliedBiosystems，Foster City，CA；9050，Plus，Millipore，Bedford，NIA)。已开发出多种众所周知的机器人系统用于溶液相化学。这些系统包括自动化工作站，如由Takeda Chemical Industries，LTD.(Osaka，Japan)开发的自动化合成仪，以及多种利用机器手的机器人系统(Zymate H，Zymark Corporation，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett-Packard，Palo Alto，Calif.)，所述机器人系统能模拟化学家进行的人工合成操作。上述任一种仪器都适用于本发明。(必要时)对这些仪器进行改装以使它们能按本文所述的方式操作，这一点对相关领域的熟练技术人员而言是显而易见的。另外，多种组合文库本身也是可以商购的(参见例如ComGenex，Princeton，NJ；Asinex，Moscow，RU；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；ChemStar，Ltd，Moscow，RU；3D Pharmaceuticals，Exton，PA；MartekBiosciences，Columbia，MD等)。
本文所用术语“保守取代”指氨基酸取代是本领域技术人员已知的，一般不会改变所得分子的生物活性。本领域技术人员一般认为在多肽的非-必需区进行单个氨基酸取代不会显著改变生物活性(参见例如Watson，et al.，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，p.224(第4版1987))。优选根据表III(a-b)所列的那些进行例举的取代。例如，所述改变包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任何一种取代任何其它的疏水氨基酸；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)和反之；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)和反之；以及用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)和反之。其它取代也可被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境以及它在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)经常可以互换使用，丙氨酸(A)和缬氨酸(V)也是如此。相对疏水的甲硫氨酸(M)经常可与亮氨酸和异亮氨酸互换使用，有时可与缬氨酸互换使用。在氨基酸残基的显著特征为其电荷的位置处，赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常可以互换使用，这两个氨基酸残基pK的差异不显著。在特殊的环境中，其它改变也可被认为是“保守的”(参见例如本文的表III(a)；page 13-15“Biochemistry”2nd ED.Lubert Stryer ed(Stanford University)；Henikoff et al.，PNAS 1992 Vol 89 10915-10919；Lei etal.，J Biol Chem 1995May 19；270(20)：11882-6)。其它取代也是允许的，可以凭经验或根据已知的保守取代确定这些取代。
术语“细胞毒性剂”指的是能抑制或防止细胞表达活性、细胞功能和/或导致细胞被破坏的物质。该术语欲包括放射性同位素、化学治疗剂和毒素，如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的有酶促活性的毒素，包括其片段和/或变体。细胞毒性剂的例子包括但不限于auristatin、auristatine、金霉素(auromycin)、美登木素生物碱(maytansinoids)、钇(yttrium)、铋(bismuth)、蓖麻毒蛋白(ricin)、蓖麻毒蛋白A-链、combrestatin、倍癌霉素(duocarmycin)、dolostatin、阿霉素(doxorubicin)、道诺红菌素(daunorubicin)、紫杉酚(taxol)、顺式铂氨(cisplatin)、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素(mitomycin)、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(etoposide)、tenoposide、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙素(colchicine)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracin dione)、放线菌素(actionmycin)、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白(abrin)、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、白树毒素(gelonin)、丝裂吉霉素(mitogellin).局限曲霉素(retstrictocin)、酚毒素(phenomycin)、依诺霉素(neomycin)、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素(crotin)、加利车霉素(calicheamicin)、Sapaonariaoffcinalis抑制剂、糖皮质激素、其它化学治疗剂以及放射性同位素，如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32和放射性同位素Lu，包括Lu177。抗体也可与抗-癌前药激活酶偶联，所述酶能将前药转变为其活性形式。
本文所用术语“双特异抗体”指的是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在相同多肽链(VH-VL)中含有与轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。通过使用长度很短以至于相同链上的两个结构域之间不能配对的接头，所述结构域只能与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双特异抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48(1993)。
“基因产物”在本文中用于表示肽/蛋白质或mRNA。例如，“本发明的基因产物”在本文中有时被称为“癌症氨基酸序列”、“癌症蛋白质”、“表I所列癌症的蛋白质”、“癌症mRNA”、“表I所列癌症的mRNA”等。在一个实施方案中，癌症蛋白质由图2的核酸编码。癌症蛋白质可以是片段，或者是图2的核酸所编码的全长蛋白质。在一个实施方案中，使用癌症氨基酸序列测定序列同一性或相似性。在另一个实施方案中，序列是图2的核酸所编码蛋白质的天然等位基因变体。在另一个实施方案中，序列是本文详细描述的序列变体。
“异偶联物”抗体可用于本发明的方法和组合物。本文所用术语“异偶联物抗体”指的是两个共价连接的抗体。可使用合成蛋白质化学领域的已知方法制备这种抗体，包括使用交联剂。参见例如美国专利4,676,980。
测定特定核酸或蛋白质产物的存在、缺乏、含量或其它特性的“高通量筛选”试验是本领域技术人员众所周知的。类似地，结合试验和报道基因测定法也是众所周知的。因此，例如，美国专利5,559,410公开了蛋白质的高通量筛选法；美国专利5,585,639公开了核酸结合的高通量筛选法(即阵列)；而美国专利5,576,220和5,541,061公开了高通量筛选配体/抗体结合的方法。
另外，高通量筛选系统可以商购(参见例如Amersham Biosciences，Piscataway，NJ；Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA等)。这些系统的整个操作流程一般是自动进行的，包括所有样品和试剂的移取、分液、定时保温和最终对适用于测定法的检测仪中的微量培养板进行读数。这些成型的系统提供了高流通量和快速起动以及高水平的灵活性和可定制性。这些系统的制造商提供了针对多种高通量系统的详细操作方法。因此，例如，Zymark公司提供了技术公报，其中描述了用于检测基因转录调制、配体结合等的筛选系统。
术语“同系物”指的是与另一种分子有同源性的分子，例如，在相应位置具有相同或相似化合物残基序列的分子。
在一个实施方案中，本文提供的抗体是“人抗体”。本文所用术语“人抗体”指的是这样一种抗体，其中实质上整个轻链和重链序列，包括互补决定区(CDR)都得自人基因。在一个实施方案中，通过三源杂交瘤技术、人B-细胞技术(参见例如Kozbor，et al.，Immunol.Today 4：72(1983))、EBV转化技术(参见例如Cole et al.MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY 77-96(1985))或使用噬菌体展示(参见例如Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))制备人单克隆抗体。在具体实施方案中，在转基因小鼠中产生人抗体。制备部分至完整人抗体的技术是本领域已知的，可使用任何此类技术。根据一个特别优选的实施方案，在经改造可表达人重链和轻链抗体基因的转基因小鼠中制备完整的人抗体序列。有关制备能生产人抗体的转基因小鼠的描述可参见例如WO 02/43478和美国专利6,657,103(Abgenix)及其同族专利。然后使得自能产生所需抗体的转基因小鼠的B细胞融合以制备能连续产生抗体的杂交瘤细胞系。参见例如美国专利5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；和5,545,806；以及Jakobovits，Adv.Drug Del.Rev.31：33-42(1998)；Green，et al.，J.Exp.Med.188：483-95(1998)。
“人白细胞抗原”或“HLA”是人I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白(参见例如Stites，et al.，IMMUNOLOGY，8TH ED.，Lange Publishing，LosAltos，CA(1994))。
本文所用术语“人源化抗体”指的是含有非-人(如鼠)抗体序列以及人抗体序列的抗体形式。所述抗体是嵌合抗体，其含有得自非-人免疫球蛋白的最少序列。一般说来，人源化抗体基本上含有至少一个，一般为两个可变结构域中的全部结构域，其中全部或基本上全部的高变环与非-人免疫球蛋白的相对应，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体也任选含有至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般含有至少一部分人免疫球蛋白恒定区。参见例如Cabilly，美国专利号4,816,567；Queen et al.(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033；和ANTIBODYENGINEERING：A PRACTICAL APPROACH(Oxford University Press 1996)。
有关多核苷酸的上下文中使用的术语“杂交”指的是常规的杂交条件，优选例如在50％甲酰胺/6×SSC/0.1％SDS/100μtg/ml ssDNA中的杂交，其中杂交温度高于37℃，在0.1×SSC/0.1％SDS中的洗涤温度高于55℃。
术语“分离的”或“生物纯的”指的是基本上或实质上不含通常与天然状态的物质相伴存在的组分的物质。因此，本发明的分离的肽优选不含通常与处于原位环境中的肽相关的物质。例如，当一种多核苷酸基本上与污染的多核苷酸分离开时，即可将其称为“分离的”，所述污染的多核苷酸对应于除STEAP-1基因以外的基因或与之互补，或者编码除STEAP-1基因产物或其片段以外的多肽。本领域技术人员能容易地使用核酸分离方法来获得分离的STEAP-1多核苷酸。当利用物理、机械或化学方法，从通常与STEAP-1蛋白相关的细胞组分中提取出STEAP-1蛋白时，即可认为该蛋白质是“分离的”。本领域技术人员能容易地利用标准的纯化方法来获得分离的STEAP-1蛋白。或者，可通过化学方法制备分离的蛋白质。
适当的“标记”包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光组成成分、化学发光组成成分、磁性颗粒等。教导所述标记的使用的专利包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。另外，本文提供的抗体可用作荧光体的抗原结合成分。参见例如Zeytun et al.，Nat.Biotechnol.21：1473-79(2003)。
术语“哺乳动物”指的是被归为哺乳动物的任何生物，包括小鼠、大鼠、兔、狗、猫、奶牛、马和人。在本发明的一个实施方案中，哺乳动物是小鼠。在本发明的另一个实施方案中，哺乳动物是人。
术语“转移的前列腺癌”和“转移疾病”指的是已扩散至局部淋巴结或远端位点的前列腺癌，欲包括AUA系统下的D期疾病和TNM系统下的TxNxM+期疾病。与局部晚期前列腺癌的情况相同，一般不给转移疾病的患者进行外科手术，激素(雄激素脱离)疗法是优选的治疗形式。已转移的前列腺癌患者在治疗开始后的12至18个月内，最终发展成为对雄激素不起反应的状态。在发展成为此状态后的6个月内，约有半数对雄激素没反应的患者死亡。前列腺癌转移的最常见位点是骨。前列腺癌的骨转移经常是成骨细胞而不是骨质溶解(即导致网状骨形成)。骨转移最常见于脊柱，其次是股骨、骨盆、肋支袈、头骨和肱骨。其它常见的转移位点包括淋巴结、肺、肝脏和脑。一般通过开口或腹腔镜检查下的盆腔淋巴结切除术、全身放射性核素扫描、骨骼X射线照像术和/或骨损害活检来诊断转移的前列腺癌。
本文所用术语“调制剂”或“受试化合物”或“候选药物”或语义等同的术语描述的是任何欲测定其直接或间接改变癌症表型或癌症序列(如核酸或蛋白质序列)的表达，或癌症序列的作用(如信号转导、基因表达、蛋白质相互作用等)的能力的分子，例如蛋白质、寡肽、小有机分子、多糖、多核苷酸等。一方面，调制剂可中和本发明癌症蛋白质的作用。“中和”指的是蛋白质活性受到抑制或阻断，以及随后对细胞的作用。另一方面，调制剂通过中和所述蛋白质的水平可中和本发明的基因及其相应蛋白质的作用。在优选实施方案中，调制剂改变本文所提供核酸或蛋白质的表达分布图或下游的效应物途径。在一个实施方案中，调制剂抑制癌症表型，例如使之成为正常组织指纹。在另一个实施方案中，调制剂诱导癌症表型。一般说来，平行电泳多种具有不同试剂浓度的受试混合物，从而获得针对不同浓度的差异反应。一般将其中一个浓度用作阴性对照，即作为零浓度或低于检测水平。
调制剂、候选药物或受试化合物包含多个化合物类别，但一般为有机分子，优选为分子量大于100至小于约2,500道尔顿的小的有机化合物。优选的小分子小于2000，或小于1500或小于1000或小于500道尔顿。候选药物含有与蛋白质进行结构上的相互作用，特别是氢键所必需的官能团，一般至少包括胺、羰基、羟基或羧基，优选含有至少两个化学官能团。候选药物经常含有被一个或多个上述官能团取代的碳环或杂环结构和/或芳族或聚芳族结构。调制剂还含有生物分子，例如肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物及其组合。特别优选的是肽。一类调制剂是肽，例如约5至约35个氨基酸的肽，优选约5至约20个氨基酸的肽，特别优选约7至约15个氨基酸的肽。优选癌症调制蛋白是可溶性的，包括非-跨膜区，和/或具有N-末端Cys以有助于溶解性。在一个实施方案中，片段的C-末端保持为游离的酸，而N-末端是游离的胺以有助于与半胱氨酸偶联。在一个实施方案中，本发明的癌症蛋白质与本文所述的免疫原性的药物偶联。在一个实施方案中，癌症蛋白质与BSA偶联。本发明的肽，例如具有优选长度的肽可以互相连接或与其它氨基酸连接以产生较长的肽/蛋白质。调制肽可以是上文所述天然蛋白质的消化物、随机肽或“偏性”随机肽。在优选实施方案中，基于肽/蛋白质的调制剂是本文所定义的抗体或其片段。
癌症调制剂也可以是核酸。核酸调制剂可以是天然核酸、随机核酸、或“偏性”随机核酸。例如，可以在与上文所述针对蛋白质的方法相类似的方法中使用原核或真核基因组的消化物。
本文所用术语“单克隆抗体”指的是由一群基本上均一的抗体获得的抗体，即除了可能存在极少量的天然突变外，各个含有抗体群的抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的抗单个抗原表位的抗体。相反，常规的(多克隆)抗体制品一般包括抗(或特异于)不同表位的多种抗体。在一个实施方案中，在含有多个抗原表位的单个抗原中，多克隆抗体含有多个具有不同的表位特异性、亲和性或亲合力的单克隆抗体。修饰词“单克隆”表示得自基本上均一的抗体群的抗体的特征，不应解释为需要通过任何特定的方法产生抗体。例如，可通过Kohler et al.，Nature 256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法，或通过重组DNA法(参见例如美国专利4,816,567)制备用于本发明的单克隆抗体。也可使用例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)所述的技术，从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。经ELISA测定，这些单克隆抗体的结合Kd通常约为1M，更通常至少约为300nM，一般至少约为30nM，优选至少约为10nM，更优选至少约为3nM或更高。
在STEAP-1-相关蛋白质的生物基元中提及的“基元”指的是形成蛋白质部分一级序列的任何氨基酸模式，它与特定的功能(例如蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-DNA相互作用等)或修饰(例如磷酸化、糖基化或酰胺化)，或定位(例如分泌序列，核定位序列等)相关，或者是与体液或细胞免疫原性相关联的序列。基元可以是邻接的或能排列至一般与某些功能或特性相关的某些位置处。在HLA基元的上下文中，“基元”指的是能被特定HLA分子识别的限定长度的肽中的残基模式，通常对I类HLA基元而言，所述肽的长度为约8至约13个氨基酸，对II类HLA基元而言，所述肽的长度为约6至约25个氨基酸。对于由每个人HLA等位基因编码的每个蛋白质而言，与HLA结合的肽基元一般是不同的，不同之处在于一级和二级锚残基的模式。
“药物赋形剂”包括如下所述的物质：佐剂、载体、pH-调制剂和缓冲剂、滋补调制剂、润湿剂、防腐剂等。
“药物可接受”指的是无毒、惰性和/或与人或其它哺乳动物生理上相容的组合物。
术语“多核苷酸”指的是长度至少为10个碱基或碱基对的核苷酸聚合物形式，它可以是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一种核苷酸的修饰形式，它包括单链和双链形式的DNA和/或RNA。在本领域中，该术语经常与“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可含有本文所述的核苷酸序列，其中图2所示的胸苷(T)也可以是尿嘧啶(U)；该定义与DNA和RNA化学结构之间的差异相关，与RNA中4个主要碱基之一是尿嘧啶(U)而不是胸苷(T)这一观察结果特别相关。
术语“多肽”指的是至少约为4，5，6，7或8个氨基酸的聚合物。在整个说明书中，使用了标准的三字母或单字母氨基酸名称。在本领域中，该术语经常与“肽”或“蛋白质”互换使用。
HLA“一级锚残基”是肽序列特定位置处的氨基酸，它可提供免疫原性肽与HLA分子之间的接触点。一般将限定长度的肽内部的1至3个，通常为2个一级锚残基定义为免疫原性肽的“基元”。据认为这些残基适合与HLA分子的肽结合沟密切接触，其侧链掩埋于结合沟的特殊袋中。例如，在一个实施方案中，针对I类HLA分子的一级锚残基位于本发明的8，9，10，11或12残基肽表位的第2位(自氨基末端位置起)和羧基末端的位置。或者，在另一个实施方案中，与II类HLA分子结合的肽一级锚残基彼此间隔，而不是位于肽的末端，其中肽的长度一般至少为9个氨基酸。表IV中列出了每个基元和超基元的一级锚位置。例如，通过改变表IV所示一级和/或二级锚位置中的特定残基的存在或缺乏，即可产生类似肽。可以使用所述类似肽来调制含有特定HLA基元或超基元的肽的结合亲和性和/或群体覆盖范围。
“放射性同位素”包括但不限于下述例子(表IV(I)也列出了非限制性用途的例子)。
本文提及核酸和蛋白质时所用的“随机化”或语义等同的词指的是：每种核酸和蛋白质分别由实质上随机的核苷酸和氨基酸组成。这些随机的肽(或本文所述的核酸)可在任何位置掺入任何核苷酸或氨基酸。可以设计合成方法以产生随机化的蛋白质或核酸，从而在序列长度上形成所有或大多数可能的组合，进而形成随机化的候选生物活性蛋白质剂文库。
在一个实施方案中，文库是“完全随机化的”，在任何位置处都没有序列偏好或不变的序列。在另一个实施方案中，文库是“偏性随机”文库。即，序列内的一些位置保持不变，或只有有限数目的可能性。例如，核苷酸或氨基酸残基只在有限的类别，例如疏水氨基酸、亲水残基、有空间偏性(小或大)的残基中随机化，用于产生核酸结合结构域，产生交联用的半胱氨酸，SH-3结构域所用的脯氨酸，磷酸化位点所用的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或组氨酸等，或者对嘌呤有偏好等。
“重组”DNA或RNA分子是已经在体外进行过分子操作的DNA或RNA分子。
本文所用术语“单链Fy”或“scFv”或“单链”抗体指的是含有抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于多肽单链上。Fv多肽一般在VH和VL结构域之间还含有多肽接头，从而使sFv形成所需的能与抗原结合的结构。有关sFv的综述，参见Pluckthun，THE PHARMACOLOGY OFMONOCLONAL ANTIBODIES，vol.113，Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
“小分子”的非限制性例子包括与STEAP-1结合或相互作用的化合物，包括激素、神经肽、趋化因子、添味剂、磷脂在内的配体及其能结合优选能抑制STEAP-1蛋白质功能的功能等同物。所述非限制性小分子的分子量优选小于约10kDa，更优选小于约9，约8，约7，约6，约5或约4kDa。在某些实施方案中，小分子与STEAP-1蛋白在生理上相关或与之结合；天然代谢途径中不存在所述小分子；和/或相对于非水溶液而言，所述小分子更容易溶于水溶液。
本文所用术语“特异性的”指的是抗体选择性地与靶抗原表位结合。在给定的一套条件下，通过比较与适当抗原的结合和与不相关抗原或抗原混合物的结合来测定抗体的结合特异性。如果与不相关抗原或抗原混合物相比，抗体结合的适当抗原至少多2，5，7倍，优选为10倍，那么可认为抗体是特异性的。在一个实施方案中，特异性抗体是仅与STEAP-1抗原结合而不与不相关抗原结合的抗体。在另一个实施方案中，特异性抗体是结合人STEAP-1抗原，而不结合与STEAP-1抗原具有70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高氨基酸同源性的非-人STEAP-1抗原的抗体。在另一个实施方案中，特异性抗体是结合人STEAP-1抗原，结合鼠STEAP-1抗原，但结合人抗原的程度更高的抗体。在另一个实施方案中，特异性抗体是结合人STEAP-1抗原，结合灵长类动物STEAP-1抗原，但结合人抗原的程度更高的抗体。在另一个实施方案中，特异性抗体是结合人STEAP-1抗原和任何非-人STEAP-1抗原，但结合人抗原或其任何组合的程度更高的抗体。
本领域技术人员易于测定杂交条件的“严紧度”，一般根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算严紧度。一般说来，较长的探针需要较高的温度维持适当退火，而较短的探针需要较低的温度。当低于其解链温度的环境中存在互补链时，杂交一般取决于变性核酸序列重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所需的同源性越高，可使用的相对温度越高。结果，较高的相对温度倾向于使反应条件更加严紧，而较低的温度会使反应条件较不严紧。有关杂交反应严紧度的其它细节和解释，可参见Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
本文所定义的“严紧条件”或“高严紧条件”的特征如下，但并不局限于此：(1)利用低离子强度和高温洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中使用变性剂，如甲酰胺，例如含0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，42℃；或(3)利用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、经超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，42℃，洗涤时用0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)，42℃和50％甲酰胺，55℃，接着于55℃在含有EDTA的0.1×SSC中进行高-严紧度的洗涤。“中度严紧条件”描述于，但不限于Sambtook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press，1989，包括使用严紧度比上述条件低的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中度严紧条件的例子是：于65℃在含有1％牛血清白蛋白、0.5M磷酸钠(pH7.5)、1.25mM EDTA和7％SDS 5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)的溶液中保温过夜，接着于50℃，用2×SSC/1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS洗涤滤膜。必要时本领域技术人员懂得如何调整温度、离子强度等以顺应诸如探针长度等的因素。
HLA“超基元”是由两个或多个HLA等位基因所编码的HLA分子共有的肽结合特异性。表IV(f)列出了不同人群中HLA-超级类型的整体表型频率。多个超级类型的非限制性组分如下：
A2：A*0201，A*0202，A*0203，A*0204，A*0205，A*0206，A*6802，A*6901，A*0207
A3：A3，A11，A31，A*3301，A*6801，A*0301，A*1101，A*3101
B7：B7，B*3501-03，B*51，B*5301，B*5401，B*5501，B*5502，B*5601，B*6701，B*7801，B*0702，B*5101，B*5602
B44：B*3701，B*4402，B*4403，B*60(B*4001)，B61(B*4006)
A1：A*0102，A*2604，A*3601，A*4301，A*8001
A24：A*24，A*30，A*2403，A*2404，A*3002，A*3003
B27：B*1401-02，B*1503，B*1509，B*1510，B*1518，B*3801-02，B*3901，B*3902，B*3903-04，B*4801-02，B*7301，B*2701-08
B58：B*1516，B*1517，B*5701，B*5702，B58
B62：B*4601，B52，B*1501(B62)，B*1502(B75)，B*1513(B77)
表IV(g)列出了不同HLA-超级类型组合提供的经计算的群体覆盖范围。
本文所用的“治疗”一词和语义相关的术语指的是对任何疾病后果的任何改善，例如存活期延长、发病率降低，和/或减轻与所选择的治疗形式相伴随的副作用；本领域易于理解的是：虽然完全根除疾病不是治疗行为所必需的，但仍是优选的。
“转基因动物”(例如小鼠或大鼠)是细胞中含有转基因的动物，所述转基因被导入动物或出生前(例如胚胎阶段)动物的祖先。“转基因”是整合至细胞基因组中的DNA，由所述细胞发育成转基因动物。
本文所用的HLA或细胞免疫反应“疫苗”是含有或编码本发明的一种或多种肽的组合物。所述疫苗有多个实施方案，例如一种或多种单个肽的混合物；由多表位肽所包含的一种或多种肽；或编码所述单个肽或多肽的核酸，例如编码多表位肽的小基因。“一种或多种肽”包括从1至150种或更多种的任何整数种肽，例如至少为2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145或150种或更多种本发明的肽。任选通过脂化、添加靶向或其它序列来修饰肽或多肽。本发明的I类HLA肽可与II类HLA肽混合或连接，以便于活化细胞毒T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞。HLA疫苗也可含有肽-脉冲的抗原呈递细胞，例如树状细胞。
术语“变体”指的是与所述类型或规范有差异的分子，例如在具体描述的蛋白质(如图2或图3所示的STEAP-1蛋白)的相应位置有一个或多个不同氨基酸残基的蛋白质。类似物是一例变体蛋白质。剪接同种型和单核苷酸多态性(SNP)是另一例变体。
本发明的“STEAP-1-相关蛋白质”包括本文具体鉴定的那些蛋白质以及等位基因变体、保守取代变体、类似物和同系物，根据本文概述的方法或本领域中易于获得的方法，无需进行过度的实验即可分离/产生和鉴定出它们。还包括不同STEAP-1蛋白的部分或其片段组合而成的融合蛋白，以及STEAP-1蛋白和异源多肽的融合蛋白。将所述STEAP-1蛋白通称为STEAP-1-相关蛋白质，本发明的蛋白质或STEAP-1。术语“STEAP-1-相关蛋白质”指的是4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25或25个氨基酸以上；或至少为30，35，40，45，50，55，60，65，70，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，225，250，275，300，325，330，335，339或更多个氨基酸的多肽片段或STEAP-1蛋白质序列。
II.)STEAP-1多核苷酸
一方面，本发明提供了与全部或部分STEAP-1基因、mRNA和/或编码序列(优选它们为分离形式)相对应或互补的多核苷酸，包括编码STEAP-1-相关蛋白质及其片段的多核苷酸，DNA，RNA，DNA/RNA杂合体和相关分子，与STEAP-1基因或mRNA序列或其部分互补的多核苷酸或寡核苷酸，以及能与STEAP-1基因，mRNA或编码STEAP-1的多核苷酸杂交的多核苷酸或寡核苷酸(通称为“STEAP-1多核苷酸”)。在本节中提到的所有情况下，图2中的T也可以是U。
STEAP-1多核苷酸的实施方案包括：具有图2所示序列的STEAP-1多核苷酸，具有图2所示的STEAP-1核苷酸序列，其中T是U的STEAP-1多核苷酸；具有图2所示多核苷酸序列的至少10个邻接核苷酸的STEAP-1多核苷酸；或具有图2所示多核苷酸序列的至少10个邻接核苷酸，其中T是U的STEAP-1多核苷酸。例如，STEAP-1核苷酸的实施方案包括但不限于：
(I)含有图2所示序列，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(II)含有图2A所示核苷酸残基第66位至核苷酸残基第1085位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(IH)含有图2B所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(IV)含有图2C所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第944位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(V)含有图2D所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(VI)含有图2E所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(VII)含有图2F所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(VIII)含有图2G所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(IX)含有图2H所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(X)含有图2I所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(XI)含有图2J所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(XII)含有图2K所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(XIII)含有图2L所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(XIV)含有图2M所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(XV)含有图2N所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(XVI)含有图2O所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(XVII)含有图2P所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(XVIII)含有图2Q所示核苷酸残基第96位至核苷酸残基第872位的序列，包括终止密码子，实质上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(XIX)编码与图2A-Q所示的完整氨基酸序列至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同源的STEAP-1-相关蛋白质的多核苷酸；
(XX)编码与图2A-Q所示的完整氨基酸序列至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％相同的STEAP-1-相关蛋白质的多核苷酸；
(XXI)编码2002年9月6日递交的美国专利申请10/236,878(其具体内容列入本文作为参考)中的表V-XVIII和XXII-LI所示的至少一种肽的多核苷酸；
(XXII)编码图3A所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至339个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图5的亲水性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXIII)编码图3A所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至339个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图6的亲/疏水性分布图中数值小于0.5的氨基酸位置；
(XXIV)编码图3A所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至339个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图7的可及残基百分比分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXV)编码图3A所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至399个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图8的平均柔性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXVI)编码图3A所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至339个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图9的β-转角分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXVII)编码图3B和3D所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至258个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图5的亲水性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXVIII)编码图3B和3D所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至258个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图6的亲/疏水性分布图中数值小于0.5的氨基酸位置；
(XXIX)编码图3B和3D所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至258个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图7的可及残基百分比分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXX)编码图3B和3D所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至258个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图8的平均柔性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXXI)编码图3B和3D所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至258个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图9的β-转角分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXXII)编码图3C所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至282个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图5的亲水性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXXIII)编码图3C所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至282个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图6的亲/疏水性分布图中数值小于0.5的氨基酸位置；
(XXXIV)编码图3C所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至282个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图7的可及残基百分比分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXXV)编码图3C所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至282个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图8的平均柔性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXXVI)编码图3C所示肽的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸长，以任何整数延长至282个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述肽区域中包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图9的β-转角分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXXVII)与(I)-(XXXVI)中任何一种多核苷酸完全互补的多核苷酸；
(XXXVIII)与(I)-(XXXVII)中任何一种多核苷酸完全互补的多核苷酸；
(XXXIX)由(I)-(XXXVIII)中任何一种多核苷酸编码的肽；和
(XL)含有(I)-(XXXVIII)中任何一种多核苷酸或(XXXIX)的肽以及药物赋形剂，和/或以人用单位剂量形式存在的组合物；
(XLI)在调制表达STEAP-1之细胞的方法中使用(I)-(XXXVIII)中任何一种多核苷酸或(XXXIX)的肽或(XL)的组合物的方法；
(XLII)在诊断、预防、预测或治疗携有表达STEAP-1之细胞的个体的方法中使用(I)-(XXXVIII)中任何一种多核苷酸或(XXXIX)的肽或(XL)的组合物的方法；
(XLIII)在诊断、预防、预测或治疗携有表达STEAP-1之细胞的个体的方法中使用(I)-(XXXVIII)中任何一种多核苷酸或(XXXIX)的肽或(XL)的组合物的方法，所述细胞得自表I所列组织的癌症；
(XLIV)在诊断、预防、预测或治疗癌症的方法中使用(I)-(XXXVIII)中任何一种多核苷酸或(XXXIX)的肽或(XL)的组合物的方法；
(XLV)在诊断、预防、预测或治疗表I所列组织的癌症的方法中使用(I)-(XXXVIII)中任何一种多核苷酸或(XXXIX)的肽或(XL)的组合物的方法；和
(XLVI)在鉴定或表征表达STEAP-1之细胞的调制剂的方法中使用(I)-(XXXVIII)中任何一种多核苷酸或(XXXIX)的肽或(XL)的组合物的方法。
应将本文所用的范围理解成具体公开了所有整数的情况。
本文公开的本发明的典型实施方案包括编码STEAP-1mRNA序列(以及与所述序列互补的序列)的特定部分的STEAP-1多核苷酸，例如编码如下所述蛋白质和/或其片段的多核苷酸：
(a)STEAP-1变体1的4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，225，250，275，300，325，330，335，339或更多个邻接的氨基酸；与其它变体相关的最大长度是：变体2，258个氨基酸；变体3，282个氨基酸和变体4，258个氨基酸。
例如，本文公开的本发明的代表性实施方案包括：编码图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸1至约氨基酸10的多核苷酸及其编码的肽本身，编码图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸10至约氨基酸20的多核苷酸，编码图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸20至约氨基酸30的多核苷酸，编码图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸30至约氨基酸40的多核苷酸，编码图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸40至约氨基酸50的多核苷酸，编码图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸50至约氨基酸60的多核苷酸，编码图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸60至约氨基酸70的多核苷酸，编码图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸70至约氨基酸80的多核苷酸，编码图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸80至约氨基酸90的多核苷酸，编码图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸90至约氨基酸100的多核苷酸，以约10个氨基酸的级别增加，到图2或图3所示的羧基末端氨基酸处为止。因此，编码STEAP-1蛋白羧基末端的100个氨基酸，氨基酸序列的一部分(约10个氨基酸)的多核苷酸都是本发明的实施方案。其中应理解每个特定的氨基酸位置公开的是加上或减去5个氨基酸残基的该位置。
编码相对较长的STEAP-1蛋白部分的多核苷酸也落入本发明的范围。例如，通过本领域众所周知的多种技术可以产生编码图2或图3所示STEAP-1蛋白或变体的约氨基酸1(或20或30或40等)至约氨基酸20(或30，或40或50等)的多核苷酸。这些多核苷酸片段可包括图2所示STEAP-1序列的任何部分。
本文公开的本发明的其它说明性实施方案包括STEAP-1多核苷酸片段，其编码STEAP-1蛋白或变体序列(包括表V-XVIII和XXII-LI所示STEAP-1蛋白或变体的携有基元的亚序列)中所含的一个或多个生物基元。在另一个实施方案中，本发明的典型多核苷酸片段编码与已知分子具有同源性的STEAP-1蛋白或变体的一个或多个区域。在本发明的另一个实施方案中，典型的多核苷酸片段可编码一个或多个STEAP-1蛋白或变体N-糖基化位点，cAMP和cGMP-依赖型蛋白质激酶磷酸化位点，酪蛋白激酶II磷酸化位点或N-十四烷酰化位点和酰胺化位点。
需说明的是：为了测定表V-XVIII和表XXII-LI(通称为HLA肽表)所示的任何肽各自相对于其亲代蛋白质，如变体1，变体2等的起始位置，可参考三个因素：特定的变体，HLA肽表中肽的长度和表LII中列出的检索肽。一般说来，使用唯一的检索肽来获得针对特定变体的HLA肽。表LII中列出了每个检索肽相对于其各自的亲代分子的位置。因此，如果检索肽自“X”位开始，必须给表V-XVIII和表XXII-LI中的每个位置加上数值“X减1”，以获得HLA肽在其亲代分子中的实际位置。例如，如果特定的检索肽自其亲代分子的第150位开始，必须在每个HLA肽氨基酸位置处加上150-1，即149，以计算出该氨基酸在亲代分子中的位置。
II.A.)STEAP-1多核苷酸的用途
II.A.1.)监测基因异常
上文所述的多核苷酸具有多种不同的具体用途。将人STEAP-1基因作图于题为“STEAP-1的染色体作图”的实施例中所示的染色体位置。例如，由于STEAP-1基因作图于该染色体，可以使用编码STEAP-1蛋白不同区域的多核苷酸来鉴定该染色体位点的细胞遗传异常，例如被鉴定为与多种癌症相关的异常。在某些基因中，包括重排的多种染色体异常被鉴定为多种不同癌症中的常见细胞遗传异常(参见例如Krajinovic et al.，Mutat.Res.382(3-4)：81-83(1998)；Johansson et al.，Blood 86(10)：3905-3914(1995)和Finger et al.，P.N.A.S.85(23)：9158-9162(1988))。因此，编码STEAP-1蛋白特定区域的多核苷酸提供了新的工具，它可用于以优于从前的准确度来描述编码STEAP-1的染色体区域中可能会导致恶性表型的细胞遗传异常。在本上下文中，这些多核苷酸能满足本领域扩展染色体筛选的敏感性，从而鉴定出更细微和较罕见的染色体异常的需求(参见例如Evans et al.，Am.J.Obstet.Gynecol 171(4)：1055-1057(1994))。
另外，由于已证实STEAP-1在前列腺癌和其它癌症中高表达，可以在评价STEAP-1基因产物在正常对癌症组织中的状况的方法中使用STEAP-1多核苷酸。一般使用编码STEAP-1蛋白特定区域的多核苷酸来评价STEAP-1基因特定区域，如含有一个或多个基元的区域中微扰(如导致抗原等的丧失的缺失、插入、点突变或改变)的存在。例举的试验包括RT-PCR试验以及单链构象多态性(SSCP)分析(参见例如Marrogi et al.，J.Cutan.Pathol.26(8)：369-378(1999))，它们都利用编码蛋白质特定区域的多核苷酸来检测蛋白质内的这些区域。
II.A.2)反义实施方案
本文公开的本发明欲包括的其它具体核酸-相关实施方案是基因组DNA、cDNA、核酶和反义分子以及基于可选择主链或包括可选择碱基的核酸分子，它们可以是天然来源的或合成的，并包括能抑制STEAP-1的RNA或蛋白质表达的分子。例如，反义分子可以是RNA或其它分子，包括肽核酸(PNA)或非-核酸分子，例如以依赖于碱基对的方式与DNA或RNA特异性结合的硫代磷酸酯衍生物。本领域技术人员使用本文公开的STEAP-1多核苷酸和多核苷酸序列可以容易地获得这些类别的核酸分子。
反义技术必需施用能与位于细胞内的靶多核苷酸结合的外源性寡核苷酸。术语“反义”指的是寡核苷酸与其细胞内的靶，如STEAP-1互补这一事实。参见例如Jack Cohen，Oligodeoxynucleotides，Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，1989；and Synthesis 1：1-5(1988)。本发明的STEAP-1反义寡核苷酸包括表现出增强的癌症细胞生长抑制作用的衍生物，如S-寡核苷酸(硫代磷酸酯衍生物或S-oligo，参见Jack Cohen，文献同上)。S-oligo(核苷硫代磷酸酯)是寡核苷酸(O-oligo)的等电类似物，其中磷酸基团的非桥连氧原子被硫原子取代。通过用硫转运试剂3H-1，2-苯并二硫代-3-酮-1，1-二氧化物处理相应的O-oligo，即可制备本发明的S-oligo。参见例如Iyer，R.P.et al.，J.Org.Chem.55：4693-4698(1990)；and Iyer，R.P.et al.，J.Am.Chem.Soc.112：1253-1254(1990)。本发明的其它STEAP-1反义寡核苷酸包括本领域已知的吗啉代反义寡核苷酸(参见例如Partridge et al.，1996，Anbsense&NucleicAcid Drug Development 6：169-175)。
本发明的STEAP-1反义寡核苷酸一般可以是与STEAP-1基因组序列的前100个5’密码子或后100个3’密码子或相应的mRNA互补和稳定杂交的RNA或DNA。不需要绝对互补，但优选高水平的互补。使用与该区域互补的寡核苷酸能选择性地与STEAP-1mRNA杂交，而不与蛋白质激酶的其它调节亚单位所特有的mRNA杂交。在一个实施方案中，本发明的STEAP-1反义寡核苷酸是具有与STEAP-1mRNA杂交之序列的反义DNA分子的15至30-聚体片段。任选STEAP-1反义寡核苷酸是与STEAP-1的前10个5’密码子或后10个3’密码子中的区域互补的30-聚体寡核苷酸。或者，对反义分子进行修饰以利用核酶来抑制STEAP-1的表达，参见例如L.A.Couture & D.T.Stinchcomb；Trends Genet 12：510-515(1996)。
II.A.3.)引物和引物对
本发明的这些核苷酸的其它具体实施方案包括引物和引物对，它们可以特异性地扩增本发明的多核苷酸或其任何特定部分，还包括探针，它们可以与本发明的核酸分子或其任何部分选择性地或特异性地杂交。可以用可测标记，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶标记探针。所述探针和引物可用于检测样品中STEAP-1多核苷酸的存在，并可用作检测表达STEAP-1蛋白之细胞的工具。
所述探针的例子包括含有图2所示的全部或部分人STEAP-1cDNA序列的多核苷酸。实施例中还描述了能特异性扩增STEAP-1mRNA的引物对的例子。本领域技术人员懂得基于本文提供的序列可以制备很多种不同的引物和探针，并将它们有效地用于扩增和/或检测STEAP-1mRNA。
本发明的STEAP-1多核苷酸可用于多种目的，包括但不限于用作探针和引物以扩增和/或检测STEAP-1基因、mRNA或其片段；用作试剂以诊断和/或预测前列腺癌和其它癌症；用作能介导STEAP-1多肽表达的编码序列；用作调制或抑制STEAP-1基因表达和/或STEAP-1转录物翻译的工具；和用作治疗剂。
本发明包括使用本文所述的任何探针从天然来源，如人或其它哺乳动物中鉴定和分离出STEAP-1或STEAP-1相关核酸序列，本发明还包括分离的核酸序列本身，所述序列可含有所用探针的全部或大多数序列。
II.A.4.)分离编码STEAP-1的核酸分子
本文所述的STEAP-1 cDNA序列能分离其它编码STEAP-1基因产物的多核苷酸，以及分离编码STEAP-1基因产物同系物，或者STEAP-1基因产物的剪接同种型、等位基因变体和突变体形式的多核苷酸，以及分离编码STEAP-1-相关蛋白质的类似物的多核苷酸。用于分离编码STEAP-1基因的全长cDNA的多种分子克隆方法是众所周知的(参见例如Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor Press，New York，1989；Current Protocols in Molecular Biology.Ausubel et al.，Eds.，Wiley and Sons，1995)。例如，可以方便地使用可使用商购克隆系统(如Lambda ZAP Express，Stratagene)的λ噬菌体克隆方法学。通过用经标记的STEAP-1 cDNA或其片段进行探测，即可鉴定出含有STEAP-1基因cDNA的噬菌体克隆。例如，在一个实施方案中，可以合成STEAP-1 cDNA(如图2)或其部分，并将它们用作探针以获取对应于STEAP-1基因的重叠和全长cDNA。通过用STEAP-1DNA探针或引物筛选基因组DNA文库，细菌人工染色体文库(BAC)，酵母人工染色体文库(YAC)等，即可分离出STEAP-1基因本身。
II.A.5.)重组核酸分子和宿主-载体系统
本发明还提供了含有STEAP-1多核苷酸，其片段、类似物或同系物的重组DNA或RNA分子，包括但不限于噬菌体、质粒、噬粒、粘粒、YAC、BAC以及多种本领域众所周知的病毒和非-病毒载体，本发明还提供了被所述重组DNA或RNA分子转化或转染的细胞。产生所述分子的方法是众所周知的(参见例如Sambrook et al.，1989，文献同上)。
本发明还提供了在适当的原核或真核宿主细胞内含有重组DNA分子的宿主-载体系统，所述重组DNA分子含有STEAP-1多核苷酸、其片段、类似物或同系物。适当真核宿主细胞的例子包括酵母细胞、植物细胞、或动物细胞，如哺乳动物细胞或昆虫细胞(如可被杆状病毒感染的细胞，如Sf9或HighFive细胞)。适当哺乳动物细胞的例子包括多种前列腺癌细胞系，如DU145和TsuPr1，其它可转染或转导的前列腺癌细胞系，原代细胞(PrEC)，以及多种常规用于表达重组蛋白质的哺乳动物细胞(如COS、CHO、293、293T细胞)。更具体地，可以使用本领域常规使用和公知的任何一种宿主-载体系统，使用含有STEAP-1编码序列或其片段、类似物或同系物的多核苷酸产生STEAP-1蛋白或其片段。
适于表达STEAP-1蛋白或其片段的多种宿主-载体系统是可以获得的(参见例如Sambrook et al.，1989，文献同上；Current Protocols in MolecularBiology，1995，文献同上)。用于哺乳动物表达的优选载体包括但不限于pcDNA 3.1myc-His-tag(Invitrogen)和逆转录病毒载体pSRαtkneo(Muller etal.，1991，MCB 11：1785)。使用这些表达载体，可以在包括例如293，293T，rat-1，NIH 3T3和TsuPr1的几种前列腺癌和非-前列腺细胞系中表达STEAP-1。本发明的宿主-载体系统可用于产生STEAP-1蛋白或其片段。可以使用所述宿主-载体系统研究STEAP-1和STEAP-1突变或类似物的功能特性。
通过被编码STEAP-1-相关核苷酸的构建体转染的哺乳动物细胞，可以产生重组人STEAP-1蛋白或其类似物或同系物或片段。例如，用编码STEAP-1或其片段、类似物或同系物的表达质粒转染293T细胞，在293T细胞中表达STEAP-1-相关蛋白质，使用标准的纯化方法(例如使用抗-STEAP-1抗体进行亲和纯化)分离重组STEAP-1蛋白。在另一个实施方案中，将STEAP-1编码序列亚克隆至逆转录病毒载体pSRαMSVtkneo，并用于感染多种哺乳动物细胞系，如NIH 3T3，TsuPr1，293和rat-1，从而建立表达STEAP-1的细胞系。也可以使用本领域众所周知的多种其它表达系统。编码与STEAP-1编码序列框内连接的前导肽的表达构建体可用于产生分泌形式的重组STEAP-1蛋白。
如本文所讨论的，遗传密码的丰余性允许STEAP-1基因序列中出现变异。特别地，本领域已知特定的宿主种类经常具有特殊的密码子偏好，因此可以将公开的序列修改为所需宿主偏好的序列。例如，优选的类似物密码子序列一般以使用频率较高的密码子替代罕见密码子(即在所需宿主的已知序列中使用频率低于约20％的密码子)。例如，利用可得自互联网，如URLdna.affrc.go.jp/-nakamura/codon.html上的密码子使用表，计算出特定物种的密码子偏好。
已知其它序列修饰可增强细胞宿主中的蛋白质表达。所述修饰包括除去编码错误聚腺苷酸化信号、外显子/内含子剪接位点信号、转座子-样重复的序列和/或其它为人们所熟知的对基因表达有害的序列。参照宿主细胞中表达的已知基因进行计算，将序列的GC含量调整为给定细胞宿主的平均水平。可能的话，对序列进行修饰以避免推测的发夹二级mRNA结构。其它有用的修饰包括如Kozak，Mol.Cell Biol.，9：5073-5080(1989)所述，在开放阅读框的起点处添加翻译起始共有序列。本领域技术人员懂得真核生物核糖体仅在邻近5’的AUG密码子处起始翻译这一一般性原则仅在罕见的条件下被废除(参见例如Kozak PNAS 92(7)：2662-2666，(1995)and Kozak NAR 15(20)：8125-8148(1987))。
III.)STEAP-1-相关蛋白质
本发明的另一方面提供了STEAP-1-相关蛋白质。STEAP-1蛋白的具体实施方案包括具有图2或图3，优选图2A所示人STEAP-1的全部或部分氨基酸序列的多肽。或者，STEAP-1蛋白的实施方案包括在图2或图3所示STEAP-1氨基酸序列中具有改变的变体、同系物或类似物。
STEAP-1多肽的实施方案包括：具有图2所示序列的STEAP-1多肽；具有图2所示STEAP-1的肽序列，其中T是U的多肽；具有图2所示序列的至少10个邻接氨基酸的多肽；或具有图2所示序列的至少10个邻接氨基酸，其中T是U的多肽。例如，STEAP-1肽的实施方案包括但不限于：
(I)含有图2A-Q或图3A-D所示氨基酸序列，实质上由其组成，或由其组成的蛋白质；
(II)与图2A-Q或图3A-D所示的全部氨基酸序列至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同源的STEAP-1-相关蛋白质；
(III)与图2A-Q或图3A-D所示的全部氨基酸序列至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％相同的STEAP-1-相关蛋白质；
(IV)含有2002年9月6日提交的美国专利申请10/236,878(具体内容全文列入本文作为参考)中的表V至LI中所示的至少一种肽的蛋白质，任选的附加条件是该蛋白质不是图2所示的完整蛋白质；
(V)含有表V至XVIII中所示的至少一种肽的蛋白质，所述肽也出现在表XXII至LI中，任选的附加条件是该蛋白质不是图2所示的完整蛋白质；
(VI)含有选自表V至LI中所示肽的至少两种肽的蛋白质，任选的附加条件是该蛋白质不是图2所示的完整蛋白质；
(VII)含有选自表V至LI中所示肽的至少两种肽的蛋白质，附加条件是该蛋白质不是图2所示氨基酸序列中的邻接序列；
(VIII)含有选自表V至XVIII中所示肽的至少一种肽和选自表XXII至LI中所示肽的至少一种肽的蛋白质，附加条件是该蛋白质不是图2所示氨基酸序列中的邻接序列；
(IX)含有图3A所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至339个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图5的亲水性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(X)含有图3A所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至339个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图6的亲/疏水性分布图中数值小于0.5的氨基酸位置；
(XI)含有图3A所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至339个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图7的可及残基百分比分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XII)含有图3A所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至339个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图8的平均柔性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XIII)含有图3A所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34个氨基酸，以任何整数分别延长至339个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图9的β-转角分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XIV)含有图3B或3D所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至258个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图5的亲水性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XV)含有图3B或3D所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至258个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图6的亲/疏水性分布图中数值小于0.5的氨基酸位置；
(XVI)含有图3B或3D所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至258个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图7的可及残基百分比分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XVII)含有图3B或3D所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至258个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图8的平均柔性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XVIII)含有图3B或3D所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34个氨基酸，以任何整数分别延长至258个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图9的β-转角分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XIX)含有图3C所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至282个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图5的亲水性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XX)含有图3C所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至282个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图6的亲/疏水性分布图中数值小于0.5的氨基酸位置；
(XXI)含有图3C所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至282个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图7的可及残基百分比分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXII)含有图3C所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个氨基酸，以任何整数分别延长至282个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图8的平均柔性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXIII)含有图3C所示蛋白质的至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34个氨基酸，以任何整数分别延长至282个氨基酸的多肽，所述多肽包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个在图9的β-转角分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；
(XXIV)在表V-XVIII和XXII至LI中总共出现过至少两次的肽；
(XXV)在表VI-XVIII和XXII至LI中总共出现过至少三次的肽；
(XXVI)在表V-XXVIII和XXII至LI中总共出现过至少四次的肽；
(XXVII)在表V-XVIII和XXII至LI中总共出现过至少五次的肽；
(XXVIII)在表V-XVIII中出现过至少一次，在表XXII至LI中出现过至少一次的肽；
(XXIX)在表V-XVIII中出现过至少一次，在表XXII至LI中出现过至少两次的肽；
(XXX)在表V-XVIII中出现过至少两次，在表XXII至LI中出现过至少一次的肽；
(XXXI)在表V-XVIII中出现过至少两次，在表XXII至LI中出现过至少两次的肽；
(XXXII)含有下述的1，2，3，4或5个特征的肽，或编码所述肽的寡核苷酸：
i)图3中特定肽的至少5个氨基酸长的区域，其长度以任何整数增长直至达到图3所示蛋白质的全长，它包括在图5的亲水性分布图中，数值等于或大于0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，或等于1.0的氨基酸位置；
ii)图3中特定肽的至少5个氨基酸长的区域，其长度以任何整数增长直至达到图3所示蛋白质的全长，它包括在图6的亲/疏水性分布图中，数值等于或小于0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，或等于0.0的氨基酸位置；
iii)图3中特定肽的至少5个氨基酸长的区域，其长度以任何整数增长直至达到图3所示蛋白质的全长，它包括在图7的可及残基百分比分布图中，数值等于或大于0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，或等于1.0的氨基酸位置；
iv)图3中特定肽的至少5个氨基酸长的区域，其长度以任何整数增长直至达到图3所示蛋白质的全长，它包括在图8的平均柔性分布图中，数值等于或大于0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，或等于1.0的氨基酸位置；或
v)图3中特定肽的至少5个氨基酸长的区域，其长度以任何整数增长直至达到图3所示蛋白质的全长，它包括在图9的β-转角分布图中，数值等于或大于0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，或等于1.0的氨基酸位置。
(XXXIII)含有(I)-(XXXII)的肽或其抗体或结合区域以及药物赋形剂和/或以人用单位剂量形式存在的组合物。
(XXXIV)在调制表达STEAP-1之细胞的方法中使用(I)-(XXXII)的肽或其抗体或结合区域或(XXXIII)的组合物的方法。
(XXXV)在诊断、预防、预测或治疗携有表达STEAP-1之细胞的个体的方法中使用(I)-(XXXII)的肽或其抗体或结合区域或(XXXIII)的组合物的方法；
(XXXVI)在诊断、预防、预测或治疗携有表达STEAP-1之细胞的个体的方法中使用(I)-(XXXII)的肽或其抗体或结合区域或(XXXIII)的组合物的方法，所述细胞得自表I所列组织的癌症；
(XXXVII)在诊断、预防、预测或治疗癌症的方法中使用(I)-(XXXII)的肽或其抗体或结合区域或(XXXIII)的组合物的方法；
(XXXVIII)在诊断、预防、预测或治疗表I所列组织的癌症的方法中使用(I)-(XXXII)的肽或其抗体或结合区域或(XXXIII)的组合物的方法；和
(XXXIX)在鉴定或表征表达STEAP-1之细胞的调制剂的方法中使用(I)-(XXXII)的肽或其抗体或结合区域或(XXXIII)的组合物的方法。
应将本文所用的范围理解成具体公开了所有整数的情况。
本文公开的本发明的典型实施方案包括编码STEAP-1mRNA序列(以及与所述序列互补的序列)的特定部分的STEAP-1多核苷酸，例如编码如下所述蛋白质和/或其片段的多核苷酸：
(a)STEAP-1变体1的4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，225，250，275，300，325，330，335，339或更多个邻接的氨基酸；与其它变体相关的最大长度是：变体2，258个氨基酸；变体3，282个氨基酸；变体4，258个氨基酸。
一般说来，人STEAP-1的天然等位基因变体共有高水平的结构同一性和同源性(例如90％或更高的同源性)。通常，STEAP-1蛋白的等位基因变体在本文所述的STEAP-1序列内含有保守的氨基酸取代，或含有来自STEAP-1同系物中相应位置的氨基酸的取代。一类STEAP-1等位基因变体是与特定STEAP-1氨基酸序列的至少一小部分共有高水平的同源性，但仍含有与所述序列本质上的不同点的蛋白质，所述不同点如非-保守取代、截短、插入或移码。在比较蛋白质序列时，术语相似性、同一性和同源性各自具有遗传学领域所公知的不同含义。另外，定向进化同源性和平行进化同源性是描述一种生物中给定蛋白质家族成员与另一种生物中相同家族成员的关系的重要概念。
表II中提供了氨基酸缩写。可以在蛋白质中进行频繁的保守氨基酸取代而不会改变蛋白质的构象或功能。本发明的蛋白质可含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15个保守的取代。
本文公开的本发明的实施方案包括多种为本领域所接受的STEAP-1蛋白变体或类似物，例如具有氨基酸插入、缺失和取代的多肽。使用本领域已知的方法，如定点诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变即可制备STEAP-1变体。可以对克隆的DNA进行定点诱变(Carter et al.，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller et al.，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987))、盒诱变(Wells et al.，Gene，34：315(1985))、限制性选择诱变(Wells et al.，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986))或其它已知的技术以产生STEAP-1变体DNA。
也可使用扫描氨基酸分析来鉴定沿着与特定生物活性，如蛋白质-蛋白质相互作用有关的邻接序列的一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸是相对较小的、中性的氨基酸。所述氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。其中优选丙氨酸作为扫描氨基酸，因为它消除了β碳上的侧链，不太可能改变变体的主链构象。优选丙氨酸的另一个原因是它是最常见的氨基酸。另外，经常在被掩盖和暴露的位置发现丙氨酸(Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman&Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976))。如果丙氨酸取代不能产生足够量的变体，则可使用同配氨基酸。
本文所定义的STEAP-1变体、类似物或同系物具有区别性特征，它们具有至少一个能与STEAP-1蛋白“交叉反应”的表位，所述STEAP-1蛋白具有图3的氨基酸序列。所述“交叉反应”指的是与STEAP-1变体特异性结合的抗体或T细胞也能与具有图3所示氨基酸序列的STEAP-1蛋白特异性结合。当多肽不再含有任何能被与原始STEAP-1蛋白特异性结合的抗体或T细胞所识别的表位时，该多肽不再是图3所示蛋白质的变体。本领域技术人员懂得识别蛋白质的抗体与不同大小的表位结合，级别约为4或5个氨基酸的一组邻接或不邻接氨基酸被认为是最小表位的典型氨基酸数目。参见例如Nairet al.，J.Immunol.2000，165(12)：6949-6955；Hebbes et al.，Mol Immunol(1989)26(9)：865-73；Schwartz et al.，J Immunol(1985)135(4)：2598-608。
其它类STEAP-1-相关蛋白质变体与图3的氨基酸序列或其片段共享70％，75％，80％，85％或90％或更高的同源性。另一特殊类别的STEAP-1蛋白变体或类似物含有一种或多种本文所述或本领域已知的STEAP-1生物基元。因此，本发明包括相对于原始片段而言具有经改变的功能(如免疫原性)特性的STEAP-1片段类似物(核酸或氨基酸)。应懂得本文所述或本领域已知的基元适用于图2或图3的核酸或氨基酸序列。
如本文所讨论的，本发明的实施方案包括多肽，其含有图2或图3所示STEAP-1蛋白全长氨基酸序列的部分序列。例如，本发明的代表性实施方案包括具有图2或图3所示STEAP-1蛋白的任意4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或更多个邻接氨基酸的肽/蛋白质。
另外，本文公开的本发明的代表性实施方案包括：贯穿全部的STEAP-1氨基酸序列，由图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸1至约氨基酸10组成的多肽，由图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸10至约氨基酸20组成的多肽，由图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸20至约氨基酸30组成的多肽，由图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸30至约氨基酸40组成的多肽，由图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸40至约氨基酸50组成的多肽，由图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸50至约氨基酸60组成的多肽，由图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸60至约氨基酸70组成的多肽，由图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸70至约氨基酸80组成的多肽，由图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸80至约氨基酸90组成的多肽，由图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸90至约氨基酸100组成的多肽等。另外，由图2或图3所示STEAP-1蛋白的约氨基酸1(或20或30或40等)至约氨基酸20(或130或140或150等)组成的多肽也是本发明的实施方案。应懂得本段落中的起始和终止位置指的是特定的位置以及该位置加上或减去5个残基的位置。
使用标准的肽合成技术或使用本领域众所周知的化学裂解法可以产生STEAP-1-相关蛋白质。或者，可以使用重组法产生编码STEAP-1-相关蛋白质的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子提供了产生STEAP-1蛋白(或其变体、同系物或类似物)的限定片段的工具。
III.A.)携有基元的蛋白质的实施方案
本文公开的本发明的其它说明性实施方案包括STEAP-1多肽，其含有图2或图3所示STEAP-1多肽序列内所含一种或多种生物基元的氨基酸残基。多种基元是本领域已知的，通过多个公知的互联网站点可以评价蛋白质中是否存在所述基元(参见例如URL网址：pfam.wustl.edu/；searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html；psort.ims.u-tokyo.ac.jp/；cbs.dtu.dk/；ebi.ac.uk/interpro/scan.html；expasy.ch/tools/scnpsitl.html；EpimatrixTM和EpimerTM，Brown University，brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimafix/epimatrix.html；和BIMAS，bimas.dcrt.nih.gov/.)。
表V-XVIII和XXII-LI中列出并鉴定了所有STEAP-1变体蛋白质的携有基元的亚序列。
表IV(h)列出了几种基于pfam检索(参见URL网址pfam.wusti.edu/)的常见基元。表IV(h)中的各栏列出了(1)基元名称的缩写，(2)在基元家族不同成员中发现的同一性百分比，(3)基元名称或描述和(4)最常见的功能；如果基元与位置相关，还包括位置信息。
上文所讨论的STEAP-1基元与生长异常调节有关，而且STEAP-1在某些癌症中过表达(参见例如表I)，鉴于此观察结果，可以使用含有上文所讨论的一种或多种STEAP-1基元的多肽来阐明恶性表型的特殊特征。例如，已知酪蛋白激酶II，cAMP和camp依赖型蛋白质激酶以及蛋白质激酶C是与恶性表型发展有关的酶(参见例如Chen et al.，Lab Invest.，78(2)：165-174(1998)；Gaiddon et al.，Endocrinology 136(10)：4331-4338(1995)；Hall et al.，NucleicAcids Research 24(6)：1119-1126(1996)；Peterziel et al.，Oncogene 18(46)：6322-6329(1999)and O’Brian，Oncol.Rep.5(2)：305-309(1998))。另外，糖基化和十四酰化也是与癌症和癌症进展有关的蛋白质修饰(参见例如Dennis etal.，Biochem.Biophys.Acta 1473(1)：21-34(1999)；Raju et al.，Exp.Cell Res.235(1)：145-154(1997))。酰胺化是另一种与癌症和癌症进展有关的蛋白质修饰(参见例如Treston et al.，J.Nab.Cancer Inst.Monogr.(13)：169-175(1992))。
在另一个实施方案中，本发明的蛋白质含有一种或多种根据为本领域所接受的方法鉴定的免疫活性表位，如表V-XVIII和XXII-LI所示的肽。使用特殊的算法可确定CTL表位，从而鉴定出STEAP-1蛋白内能最佳地与特定HLA等位基因结合的肽(例如表IV；EpimatrixTM and EpimerTM，BrownUniversity，URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html；and BIMAS，URL bimas.dcrt.nih.gov/.)。另外，鉴定与HLA分子有足够结合亲和性并且与成为免疫原性表位有关的肽的方法是本领域众所周知的，无需经过过度的实验即可实施。另外，鉴定可用作免疫原性表位的肽的方法是本领域众所周知的，无需经过过度的实验即可在体外或体内实施该方法。
另外，本领域已知为了调制免疫原性而产生所述表位的类似物的原理。例如，可以以携有CTL或HTL基元(参见例如表IV的HLAI类和HLAII类基元/超基元)的表位开始。通过换下一个特定位置处的氨基酸，用该位置特有的另一个氨基酸取代之，即可制备类似表位。例如，以表IV定义的残基为基础，用任何其它残基，如优选的残基取代有害的残基；用优选的残基取代较不优选的残基；或用另一个优选的残基取代原来出现的优选残基。取代可发生在肽中的一级锚位置或其它位置；参见例如表IV。
多篇参考文献反映了有关鉴定和产生所需蛋白质及其类似物中的表位的技术。参见例如Chesnut et al.，WO97/33602；Sette，Immunogenetics 199950(3-4)：201-212；Sette et al.，J.Immunol.2001 166(2)：1389-1397；Sidney et al.，Hum.Immunol.199758(1)：12-20；Kondo et al.，Immunogenetics199745(4)：249-258；Sidney et al.，J.Immunol.1996157(8)：3480-90；and Falk et al.，Nature351：290-6(1991)；Hunt et al.，Science 255：1261-3(1992)；Parker et al.，J.Immunol.149：3580-7(1992)；Parker et al.，J.Immunol.152：163-75(1994)；Kastet al.，1994 152(8)：3904-12；Borras-Cuesta et al.，Hum.Immunol.200061(3)：266-278；Alexander et al.，J.Immunol.2000 164(3)：1625-1633；Alexanderet al.，PMID：7895164，UI：95202582；O’Sullivan et al.，J.Immunol.1991 147(8)：2663-2669；Alexander et al.，Immunity 19941(9)：751-761 and Alexander et al.，Immunol.Res.199818(2)：79-92。
本发明的相关实施方案包括含有表IV(a)，IV(b)，IV(c)，IV(d)和IV(h)所示的不同基元，和/或表V-XVIII和XXII-LI的一种或多种推测CTL表位，和/或表XLVIII-LI的一种或多种推测HTL表位，和/或本领域已知的一种或多种T细胞结合基元的组合的多肽。优选实施方案在基元内或多肽的间插序列内都不含插入、缺失或取代。另外，在这些基元的任一侧包括多个N-末端和/或C-末端氨基酸残基的实施方案是合乎需要的(例如，包括多肽结构的较大部分，其中包含有基元)。通常，位于基元任一侧的N-末端和/或C-末端氨基酸残基的数目约为1至100个氨基酸残基，优选为5至约50个氨基酸残基。
本发明包括多种形式(优选为分离形式)的STEAP-1-相关蛋白质。纯化的STEAP-1蛋白分子基本上不含其它有损于STEAP-1与抗体、T细胞或其它配体的结合的蛋白质或分子。分离和纯化的性质和水平取决于欲实现的用途。STEAP-1-相关蛋白质的实施方案包括纯化的STEAP-1-相关蛋白质和功能性的、可溶的STEAP-1-相关蛋白质。在一个实施方案中，功能性的、可溶的STEAP-1蛋白或其片段保留了与抗体、T细胞或其它配体结合的能力。
本发明还提供了含有图2或图3所示STEAP-1氨基酸序列的生物活性片段的STEAP-1蛋白。所述蛋白质表现出原始STEAP-1蛋白的特性，例如引发产生能特异性结合原始STEAP-1蛋白相关表位的能力；能被抗体结合；能导致HTL或CTL激活；和/或被也能与原始蛋白质特异性结合的HTL或CTL识别。
使用多种本领域众所周知的分析技术，包括例如Chou-Fasman，Gamier-Robson，Kyte-Doolittle，Eisenberg，Karplus-Schultz或Jameson-Wolf分析法，或基于免疫原性，即可推测和/或鉴定出含有特别令人感兴趣之结构的STEAP-1-相关多肽。含有所述结构的片段可特别地用于产生亚单位-特异性抗-STEAP-1抗体或T细胞，或用于鉴定与STEAP-1结合的细胞因子。例如，使用Hopp，T.P.and Woods，K.R.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828的方法，可以产生亲水性分布图并鉴定出免疫原性的肽片段。使用Kyte，J.and Doolittle，R.F.，1982，J.Mol.Biol.157：105-132的方法，可以产生亲/疏水性分布图并鉴定出免疫原性的肽片段。使用Janin J.，1979.Nature 277：491-492的方法，可以产生可及残基百分比(％)分布图并鉴定出免疫原性的肽片段。使用Bhaskaran R.，Ponnuswamy P.K.，1988，Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255的方法，可以产生平均柔性分布图并鉴定出免疫原性的肽片段。使用Deleage，G.，Roux B.，1987，Protein Engineering 1：289-294的方法，可以产生β-转角分布图并鉴定出免疫原性的肽片段。
使用特殊的算法可确定CTL表位，从而鉴定出STEAP-1蛋白内能最佳地与特定HLA等位基因结合的肽(例如通过使用SYFPEITHI站点www.URLsyfpeithi.bmi-heidelberg.com/；表IV(A)-(E)；EpimatrixTM and EpimerTM，BrownUniversity，URL(brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html)；and BIMAS，URL bimas.dcrt.nih.gov/.)。阐明了这些表位，即可推测出人MHCI类分子，如HLA-A1，A2，A3，A11，A24，B7和B35环境中呈递的STEAP-1肽表位(参见例如表V-XVIII，XXII-LI)。具体地说，除了位于URLsyfpeithi.bmi-heidelberg.com/的SYFPEITHI站点外，还将STEAP-1蛋白的完整氨基酸序列和其它变体的相关部分(即对HLAI类分子而言，推测在点突变的任一侧或在外显子的连接处有9个侧翼残基，对HLAII类分子而言，推测在点突变的任一侧或在对应于该变体的外显子连接处有14个侧翼残基)输入上文所述Bioinformatics and Molecular Analysis Section(BIMAS)站点中的HLA肽基元检索算法中。
Ken Parker博士根据HLAI类分子，特别是HLA-A2的沟中特定肽序列的结合研究出HLA肽基元检索算法(参见例如Falk et al.，Nature 351：290-6(1991)；Hunt et al.，Science 255：1261-3(1992)；Parker et al.，J.Immunol.149：3580-7(1992)；Parker et al.，J.Immunol.152：163-75(1994))。该算法能够定位得自完整蛋白质序列的8-聚体、9-聚体和10-聚体肽，并将它们与HLA-A2以及多种其它HLAI类分子推测的结合按级别排列。很多种HLAI类结合肽是8-、9-、10或11-聚体。例如，对I类HLA-A2而言，表位优选在第2位含有亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)，并在C-末端含有缬氨酸(V)或亮氨酸(L)(参见例如Parkeret al.，J.Immunol.149：3580-7(1992))。STEAP-1推测结合肽的选定结果示于本文的表V-XVIII和XXII-LI。在表V-XVIII和XXII-XLVIII中，显示了针对每个家族成员的选定候选9-聚体和10-聚体及其位置、每个特定肽的氨基酸序列和估计的结合评分。在表XLVIII-LI中，显示了针对每个家族成员的选定候选15-聚体及其位置、每个特定肽的氨基酸序列和估计的结合评分。结合评分相当于37℃，pH6.5时所估计的含肽复合物解离所需时间的一半。推测具有最高结合评分的肽与细胞表面HLAI类分子的结合最紧密，结合的时间也最长，因此是T-细胞识别的最佳免疫原性靶。
通过使抗原-加工有缺陷的细胞系T2上的HLA表达稳定化，即可评价肽与HLA等位基因的实际结合情况(参见例如Xue et al.，Prostate 30：73-8(1997)and Peshwa et al.，Prostate 36：129-38(1998))。通过在抗原呈递细胞，如树状细胞的存在下刺激CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)，可以在体外评价特定肽的免疫原性。
应懂得通过BIMAS位点、EimerTM和EpimatrixTM位点推测，或通过本领域已知或已成为本领域的一部分的HLAI类或II类基元，如表IV中所示的基元特化(或使用万维网站点URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/，或BIMAS，bimas.dcrt.nih.gov/测定)的每一种表位都“适用于”本发明的STEAP-1蛋白。本文所用的“适用于”指的是凭视觉或通过基于计算机的模式发现法来评价STEAP-1蛋白，这些技术是本领域技术人员可以掌握的。每一种携有HLAI类基元、长度为8，9，10或11个氨基酸残基的STEAP-1蛋白亚序列，或携有HLAII类基元、长度为9或更多个氨基酸残基的亚序列也落入本发明的范围。
III.B.)表达STEAP-1-相关蛋白质
在下文实施例描述的实施方案中，可以方便地在被可商购的表达载体转染的细胞(如293T细胞)中表达STEAP-1，所述表达载体如编码STEAP-1、具有C-末端6×His和MYC标记的CMV-驱动表达载体(pcDNA3.1/mycHIS，Invitrogen或Tag5，GenHunter Corporation，Nashville TN)。Tag5载体提供了IgGK分泌信号，该信号有利于在转染细胞中产生分泌的STEAP-1蛋白。例如，按照标准技术使用镍柱，可以从培养基中纯化出分泌的HIS-标记的STEAP-1。
III.C.)修饰STEAP-1-相关蛋白质
STEAP-1-相关蛋白质的修饰，如共价修饰包括在本发明的范围之内。一种类型的共价修饰包括使STEAP-1多肽的目的氨基酸残基与有机衍生试剂反应，所述试剂能与STEAP-1蛋白的选定侧链或N-或C-末端残基反应。本发明范围所包含的另一种STEAP-1多肽共价修饰包括改变本发明蛋白质的天然糖基化模式。另一种STEAP-1共价修饰包括以美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式，将STEAP-1多肽与多种非蛋白质类聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯中的一种连接。
也可以修饰本发明的STEAP-1-相关蛋白质以形成含有与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的STEAP-1的嵌合分子。可以通过化学或重组的方法合成所述嵌合分子。嵌合分子可具有与另一种肿瘤-相关抗原或其片段融合的本发明的蛋白质。或者，本发明的蛋白质可含有STEAP-1序列(氨基酸或核酸)片段的融合物，以产生在其整个长度上不与图2或图3所示氨基酸或核酸序列直接同源的分子。所述嵌合分子可含有多个相同的STEAP-1亚序列。嵌合分子可含有STEAP-1-相关蛋白质与多聚组氨酸表位标记的融合物，所述融合物可提供表位与固定化的镍选择性结合，嵌合分子还可含有STEAP-1-相关蛋白质与细胞因子或生长因子的融合物。表位标记一般位于STEAP-1蛋白的氨基或羧基末端。在另一个实施方案中，嵌合分子可含有STEAP-1-相关蛋白质与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(也称为“免疫粘附素”)而言，所述融合物可以是与IgG分子Fc区域的融合物。Ig融合物优选包括用可溶(跨膜结构域缺失或失活)形式的STEAP-1多肽取代Ig分子内的至少一个可变区。在优选实施方案中，免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的绞链区，CH2和CH3，或绞链区，CH1、CH2和CH3区。关于产生免疫球蛋白融合物，可参见例如1995年6月27日颁布的美国专利5,428,130。
III.D.)STEAP-1-相关蛋白质的用途
本发明的蛋白质具有多种不同的具体用途。由于STEAP-1在前列腺癌和其它癌症中高表达，可以在评价正常对癌症组织中STEAP-1基因产物状况的方法中使用STEAP-1-相关蛋白质，从而阐明恶性表型。一般使用得自STEAP-1蛋白特定区域的多肽评价区域(如含有一种或多种基元的区域)中微扰(如缺失、插入、点突变等)的存在。例举的试验利用靶向STEAP-1-相关蛋白质的抗体或T细胞，以评价正常对癌症组织中该区域的特征或引发针对表位的免疫应答，所述蛋白质含有STEAP-1多肽序列所含一种或多种生物基元的氨基酸残基。或者，使用STEAP-1-相关蛋白质来筛选与STEAP-1的该区域相互作用的因子，所述蛋白质含有STEAP-1蛋白的一种或多种生物基元的氨基酸残基。
STEAP-1蛋白的片段/亚序列可特别地用于产生和鉴定结构域-特异性抗体(例如识别STEAP-1蛋白的胞外或胞内表位的抗体)，用于鉴定与STEAP-1或其特殊结构域结合的试剂或细胞因子，和用于多种治疗和诊断目的，包括但不限于诊断试验、癌症疫苗和制备所述疫苗的方法。
由STEAP-1基因或其类似物、同系物或片段编码的蛋白质具有多种用途，包括但不限于产生抗体和用于鉴定与STEAP-1基因产物结合的配体和其它试剂和细胞组分的方法中。针对STEAP-1蛋白或其片段产生的抗体可用于诊断和预测试验，以及用于处理特征在于表达STEAP-1蛋白的人类癌症(如表I所列的癌症)的显象方法学。所述抗体可在细胞内表达并用于治疗所述癌症之患者的方法中。也可使用STEAP-1-相关核酸或蛋白质来产生HTL或CTL反应。
可以使用多种可用于检测STEAP-1蛋白的免疫学试验，包括但不限于多种类型的放射免疫测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫荧光试验(ELIFA)、免疫细胞化学方法等。可以标记抗体，并将其用作能检测表达STEAP-1之细胞的免疫显象试剂(例如用于放射闪烁照相显象法)。如本文进一步地描述，STEAP-1蛋白也可特别地用于产生癌症疫苗。
IV.)STEAP-1抗体
另一方面，本发明提供了与STEAP-1-相关蛋白质结合的抗体。在生理条件下，优选的抗体特异性结合STEAP-1-相关蛋白质，但并不结合(或微弱地结合)不是STEAP-1-相关蛋白质的肽或蛋白质。在本文中，生理条件的例子包括：1)磷酸缓冲盐水；2)含有25mM Tris和150mM NaCl的Tris-缓冲盐水；或3)普通盐水(0.9％NaCl)；4)动物血清，如人血清；或5)1)至4)的任意组合；优选这些反应在pH7.5时发生，或者在pH7.0至8.0的范围内发生，或者在pH6.5至8.5的范围内发生；这些反应在4℃至37℃的温度下发生。例如，与STEAP-1结合的抗体可以结合STEAP-1-相关蛋白质，例如其同系物或类似物。
本发明的STEAP-1抗体可特别地用于癌症(参见例如表I)诊断和预测试验和显象方法学。类似地，所述抗体可用于治疗、诊断和/或预测前列腺癌和其它也能表达或过表达STEAP-1的癌症。另外，细胞内表达的抗体(如单链抗体)能用于治疗与STEAP-1表达有关的癌症，如晚期或转移前列腺癌或其它晚期或转移的癌症。
本发明还提供了多种可用于检测和定量STEAP-1和突变的STEAP-1-相关蛋白质的免疫学试验。适当时，所述试验包括一种或多种能识别和结合STEAP-1-相关蛋白质的STEAP-1抗体。这些试验在本领域众所周知的多种免疫学试验，包括但不限于多种类型的放射免疫测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫荧光试验(ELIFA)等中进行。
本发明的免疫学非-抗体试验还包括T细胞免疫原性试验(抑制或刺激)以及主要组织相容性复合物(MHC)结合试验。
另外，本发明还提供了能检测前列腺癌和其它能表达STEAP-1的癌症的免疫显象方法，包括但不限于使用经标记STEAP-1抗体的放射闪烁照相显象法。所述试验在临床上可用于检测、监测和预测表达STEAP-1的癌症，如前列腺癌。
STEAP-1抗体也可用于纯化STEAP-1-相关蛋白质和分离STEAP-1同系物和相关分子的方法中。例如，纯化STEAP-1-相关蛋白质的方法包括：在允许STEAP-1抗体与STEAP-1-相关蛋白质结合的条件下，将已与固体基质偶联的STEAP-1抗体与含有STEAP-1-相关蛋白质的裂解液或其它溶液一起保温；洗涤固体基质以清除杂质；从偶联的抗体上洗脱STEAP-1-相关蛋白质。本发明的STEAP-1抗体的其它用途包括产生模拟STEAP-1蛋白的抗-独特型抗体。
多种制备抗体的方法是本领域众所周知的。例如，通过用分离或免疫偶联形式的STEAP-1-相关蛋白质、肽或片段免疫适当的哺乳动物宿主，即可制备抗体(Antibodies：A Laboratory Manual，CSH Press，Eds.，Harlow，andLane(1988)；Harlow，Antibodies，Cold Spring Harbor Press，NY(1989))。另外，也可使用STEAP-1的融合蛋白，如STEAP-1 GST-融合蛋白。在具体的实施方案中，先产生含有图2或图3的全部或大部分氨基酸序列的GST融合蛋白，再将其用作免疫原以产生适当的抗体。在另一个实施方案中，合成STEAP-1-相关蛋白质并将其用作免疫原。
另外，使用本领域已知的裸DNA免疫技术(含或不含纯化的STEAP-1-相关蛋白质或表达STEAP-1的细胞)以产生针对编码的免疫原的免疫应答(有关评述可参见Donnelly et al.，1997，Ann.Rev.Immunol.15：617-648)。
可以分析图2或图3所示的STEAP-1蛋白氨基酸序列，以选择出STEAP-1蛋白的特定区域用于产生抗体。例如，使用STEAP-1氨基酸序列的疏水性和亲水性分析，以鉴定出STEAP-1结构中的亲水性区域。使用本领域已知的多种其它方法，可以容易地鉴定出显示出免疫原结构的STEAP-1蛋白区域以及其它区域和结构域，所述方法如Chou-Fasman，Gamier-Robson，Kyte-Doolittle，Eisenberg，Karplus-Schultz或Jameson-Wolf分析。使用Hopp，T.P.and Woods，K.R.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828的方法，可以产生亲水性分布图。使用Kyte，J.and Doolittle，R.F.，1982，J.Mol.Biol.157：105-132的方法，可以产生亲/疏水性分布图。使用Janin J.，1979，Nature 277：491-492的方法，可以产生可及残基百分比(％)分布图。使用Bhaskaran R.，PonnuswamyP.K.，1988，Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255的方法，可以产生平均柔性分布图。使用Deleage，G.，Roux B.，1987，Protein Engineering 1：289-294的方法，可以产生β-转角分布图。因此，由这些程序或方法中的任一种鉴定出的每个区域都落入本发明的范围内。本文提供的实施例将进一步阐明产生STEAP-1抗体的方法。制备用作免疫原的蛋白质或多肽的方法是本领域众所周知的。制备蛋白质与载体，如BSA、KLH或其它载体蛋白质的免疫原性偶联物的方法也是本领域众所周知的。在一些情况下，使用例如碳二亚胺试剂进行直接偶联；在其它情况下，诸如Pierce Chemical Co.，Rockford，IL提供的连接试剂是有效的。经常通过在适当长的时间内注射并使用适当的佐剂来施用STEAP-1免疫原，这一点是本领域技术人员可以理解的。在免疫程序中，可以检测抗体滴度以测定是否形成了足够量的抗体。
通过多种本领域众所周知的方法可以产生STEAP-1单克隆抗体。例如，使用Kohler和Milstein的标准杂交瘤技术或公知的无限增殖化产生抗体的B细胞的修饰技术，制备能分泌所需单克隆抗体的无限增殖细胞系。通过抗原为STEAP-1-相关蛋白质的免疫测定筛选出能分泌所需抗体的无限增殖细胞系。当鉴定出适当的无限增殖细胞培养物时，可以扩充细胞，并从体外培养物或腹水中产生抗体。
也可以通过重组方法产生本发明的抗体或片段。也可以在多种来源的嵌合或互补决定区(CDR)移植抗体中产生与STEAP-1蛋白的所需区域特异性结合的区域。也可以产生人源化或人STEAP-1抗体，并优选将它们用于治疗目的。通过用一个或多个非人抗体CDR取代相应的人抗体序列，从而使鼠和其它非人抗体人源化的方法是众所周知的(参见例如Jones et al.，1986，Nature 321：522-525；Riechmann et al.，1988，Nature 332：323-327；Verhoeyen etal.，1988，Science 239：1534-1536)。也参见Carter et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285和Sims et al.，1993，J.Immunol.151：2296。
产生完整人单克隆抗体的方法包括噬菌体展示和转基因法(有关评述可参见Vaughan et al.，1998，Nature Biotechnology 16：535-539)。使用利用了大型人Ig基因组合文库(即噬菌体展示)的克隆技术，可以产生完整的人STEAP-1单克隆抗体(Griffiths and Hoogenboom，Building an in vitro immune system：human antibodies from phage display libraries.In：Protein Engineering ofAntibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man，Clark，M.(Ed.)，Nottingham Academic，pp 45-64(1993)；Burton and Barbas，Human Antibodies from combinatorial libraries.Id.，pp 65-82)。按照1997年12月3日公开的Kucherlapati和Jakobovits等的PCT专利申请W098/24893所述，使用经基因工程改造后含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠也可以制备完整的人STEAP-1单克隆抗体(也可参见Jakobovits，1998，Exp.Opin.Invest.Drugs 7(4)：607-614；2000年12月19日颁布的美国专利6,162,963；2000年11月12日颁布的6,150,584；和2000年9月5日颁布的6,114,598)。该方法避免了噬菌体展示技术所需的体外操作，并能有效产生高亲和性的真正的人抗体。
适当时，使用STEAP-1-相关蛋白质、表达STEAP-1的细胞或其提取物，通过多种众所周知的方法，包括Western印迹、免疫沉淀、ELISA和FACS分析确定STEAP-1抗体与STEAP-1-相关蛋白质的反应性。STEAP-1抗体或其片段可被可测标记标记或与第二种分子偶联。适当的可测标记包括但不限于放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。另外，使用本领域公知的方法产生特异于两个或多个STEAP-1表位的双-特异性抗体。通过本领域已知的交联技术也可以产生同二聚体抗体(例如Wolff et al.，Cancer Res.53：2560-2565)。
在一个实施方案中，本发明提供的单克隆抗体由2004年2月6日保藏于位于10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209的美国典型培养物保藏中心，ATCC保藏号分别为PTA-5802和PTA-5803的小鼠杂交瘤X92.1.30.1.1(1)和小鼠杂交瘤X120.545.1.1产生。
V.)STEAP-1细胞免疫反应
T细胞识别抗原的机理已被描述。本发明的有效肽表位疫苗组合物能在世界种群范围内的很多种族中诱导治疗或预防性的免疫反应。为了理解本发明的组合物诱导细胞免疫反应的数值和效力，本文提供了与免疫学相关的技术的简单评述。
将HLA分子和肽抗原的复合物用作被HLA-受限的T细胞识别的配体(Buus，S.et al.，Cell 47：1071，1986；Babbitt，B.P.et al.，Nature 317：359，1985；Townsend，A.and Bodmer，H.，Annu.Rev.Immunol.7：601，1989；Germain，R.N.，Annu.Rev.Immunol.11：403，1993)。通过研究单个氨基酸被取代的抗原类似物并测序内源性结合、天然加工的肽，鉴定出对应于特异性结合HLA抗原分子所需基元的关键残基，并示于表IV(参见例如Southwood，et al.，J.Immunol.160：3363，1998；Rammensee，et al.，Immunogenetics 41：178，1995；Rammensee et al.，SYFPEITHI，access via World Wide Web at URL(134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm)；Sette，A.and Sidney，J.Curr.Opin.Immunol.10：478，1998；Engelhard，V.H.，Curr.Opin.Immunol.6：13，1994；Sette，A.and Grey，H.M.，Curr.Opin.Immunol.4：79，1992；Sinigaglia，F.andHammer，J.Curr.Biol.6：52，1994；Ruppert et al.，Cell 74：929-937，1993；Kondoet al.，J.Immunol.155：4307-4312，1995；Sidney et al.，J.Immunol.157：3480-3490，1996；Sidney et al.，Human Immunol 45：79-93，1996；Sette，A.and Sidney，J.Immunogenetics 1999Nov，50(3-4)：201-12，Review)。
另外，对HLA-肽复合物的X-射线晶体学分析揭示出HLA分子的肽结合裂缝/沟内的袋，它以等位基因-特异性的方式容纳肽配体携有的残基，这些残基反过来决定了含有这些残基的肽的HLA结合能力(参见例如Madden，D.R.Annu.Rev.Immunol.13：587，1995；Smith，et al.，Immunity 4：203，1996；Fremont et al.，Immunity 8：305，1998；Stern et al.，Structure 2：245，1994；Jones，E.Y.Curr.Opin.Immunol 9：75，1997；Brown，J.H.et al.，Nature 364：33，1993；Guo，H.C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8053，1993；Guo，H.C.et al.，Nature 360：364，1992；Silver，M.L.et al.，Nature 360：367，1992；Matsumura，M.et al.，Science 257：927，1992；Madden et al.，Cell 70：1035，1992；Fremont，D.H.et al.，Science 257：919，1992；Saper，M.A.，Bjorkman，P.J.and Wiley，D.C.，J.Mol.Biol.219：277，1991.)。
因此，I类和II类等位基因-特异性HLA结合基元或I类或II类超基元的定义能够鉴定出蛋白质内与结合特定HLA抗原有关的区域。
因此，通过鉴定HLA基元的过程，已鉴定出基于表位的候选疫苗；通过HLA-肽结合试验可进一步评价候选疫苗，以测定表位及其相应HLA分子的结合亲和性和/或结合时间。可进行其它的确证工作，从而在这些候选疫苗中选择出在种群覆盖和/或免疫原性方面具有优选特性的表位。
可利用多种策略评价细胞免疫原性，包括：
1)评价得自正常个体的原代T细胞培养物(参见例如Wentworth，P.A.etal.，Mol Immunol 32：603，1995；Celis，E.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2105，1994；Tsai，V.et al.，J.Immunol.158：1796，1997；Kawashima，I.et al.，Human Immunol59：1，1998)。该方法包括在体外，在存在抗原呈递细胞时，用受试肽刺激得自正常受试者的外周血淋巴细胞达几周时间。特异于所述肽的T细胞在此时间内被激活，使用例如涉及到肽致敏靶细胞的淋巴因子-或51Cr-释放试验可以检测所述T细胞。
2)免疫HLA转基因小鼠(参见例如Wentworth，P.A.et al.，J.Immunol.26：97，1996；Wentworth，P.A.et al.，Int.Immunol 8：651，1996；Alexander，J.et al.，J.Immunol.159：4753，1997)。例如，在所述方法中，将处于不完全弗氏佐剂中的肽皮下施用于HLA转基因小鼠。免疫几周后，取出脾细胞，在受试肽的存在下体外培养脾细胞约1周。使用例如涉及到肽致敏靶细胞和表达内源产生之抗原的靶细胞的51Cr-释放试验检测肽-特异性T细胞。
3)阐明经有效免疫接种的免疫个体和/或慢性病患者的回忆T细胞反应(参见例如Rehermann，B.et al.，J.Exp.Med.181：1047，1995；Doolan，D.L.etal.，Immunity 7：97，1997；Bertoni，R.et al.，J.Clin.Invest.100：503，1997；Threlkeld，S.C.et al.，J.Immunol.159：1648，1997；Diepolder，H.M.et al.，J.Virol.71：6011，1997)。因此，通过培养PBL检测回忆反应，所述PBL得自因疾病而暴露于抗原，因而产生了“自然”免疫应答的受试者，或得自已进行过针对该抗原的免疫接种的患者。在受试肽与抗原呈递细胞(APC)的存在下，在体外将受试者的PBL培养1-2周以激活“记忆”T细胞(与“原初”T细胞相比)。在培养结束时，使用例如涉及到肽致敏靶、T细胞增殖或淋巴因子释放的51Cr-释放试验检测T细胞活性。
VI.)STEAP-1转基因动物
也可以使用编码STEAP-1-相关蛋白质的核酸产生转基因动物或“敲除”动物，所述动物反过来可用于开发和筛选在治疗上有用的试剂。根据已建立的技术，可以使用编码STEAP-1的cDNA克隆编码STEAP-1的基因组DNA。然后将克隆的基因组序列用于产生转基因动物，所述动物含有表达编码STEAP-1之DNA的细胞。产生转基因动物，特别是诸如小鼠或大鼠之类的动物的方法是本领域的常规技术，其描述于例如1988年4月12日颁布的美国专利4,736,866和1989年9月26日颁布的美国专利4,870,009。通常，特定的细胞成为掺入组织-特异性增强子的STEAP-1转基因的目标。
可以使用包括一拷贝编码STEAP-1的转基因的转基因动物来检查编码STEAP-1的DNA表达增加所起的作用。所述动物可用作测试动物，用于检测据认为可防止动物遭受与所述DNA过表达有关的病理学疾病的试剂。根据本发明的此方面，用试剂治疗动物，与携有转基因的未治疗动物相比，病理学疾病发病率的降低可表示对病理学疾病的潜在治疗性干预。
或者，可以使用STEAP-1的非-人同系物来构建STEAP-1“敲除”动物，作为编码STEAP-1的内源性基因和导入动物胚胎细胞中的、编码STEAP-1的经改变基因组DNA之间同源重组的结果，所述动物具有缺损的或经改变的编码STEAP-1的基因。例如，可以根据已建立的技术，使用编码STEAP-1的cDNA来克隆编码STEAP-1的基因组DNA。编码STEAP-1的基因组DNA的一部分可以被缺失或被另一种基因，如编码可用于监测整合的选择标记的基因所取代。通常，载体(的5’和3’末端)包括几千个碱基的未改变侧翼DNA(有关同源重组载体的描述，可参见例如Thomas and Capecchi，Cell，51：503(1987))。将载体导入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，选择其中的导入DNA已与内源性DNA发生同源重组的细胞(Li et al.，Cell，69：915(1992))。然后将选定的细胞注射至动物(如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合体(参见例如Bradley，in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A PracticalApproach，E.J.Robertson，ed.(IRL，Oxford，1987)，pp.113-152)。然后将嵌合胚胎植入适当的假孕雌性养育动物体内，胚胎最终只能长成“敲除”动物。通过标准技术可鉴定出生殖细胞中携有同源重组DNA的子代，将其用于繁殖动物，其中动物的所有细胞都含有经同源重组的DNA。例如，敲除动物的特征在于能够防御某些病理学疾病，或因缺乏STEAP-1多肽而产生病理学疾病。
VII.)检测STEAP-1的方法
本发明的另一方面涉及检测STEAP-1多核苷酸和STEAP-1-相关蛋白质的方法，以及鉴定表达STEAP-1之细胞的方法。STEAP-1的表达分布图使其成为转移疾病的诊断标记。因此，STEAP-1基因产物的状况所提供的信息可用于预测多种因素，包括对晚期疾病的易感性、发展速率和/或肿瘤攻击力。如本文所详细讨论的，可通过本领域众所周知的多种方法分析患者样品中的STEAP-1基因产物状况，所述方法包括免疫组化分析、包括原位杂交的多种Northern印迹技术、(例如在激光-捕获微-解剖样品上进行的)RT-PCR分析、Western印迹分析和组织阵列分析。
更特别地，本发明提供了检测生物样品，如血清、骨、前列腺和其它组织、尿、精液、细胞制品等中的STEAP-1多核苷酸的试验。可测的STEAP-1多核苷酸包括例如STEAP-1基因或其片段、STEAP-1 mRNA、可变剪接变体STEAP-1 mRNA、和含有STEAP-1多核苷酸的重组DNA或RNA分子。多种扩增STEAP-1多核苷酸和/或检测其存在的方法是本领域众所周知的，可用于本发明此方面的实践中。
在一个实施方案中，检测生物样品中的STEAP-1 mRNA的方法包括：使用至少一个引物通过逆转录产生所述样品的cDNA；使用STEAP-1多核苷酸作为有义和反义引物扩增所产生的cDNA，以扩增出STEAP-1 cDNA；检测所扩增的STEAP-1 cDNA的存在。任选测定扩增的STEAP-1 cDNA的序列。
在另一个实施方案中，检测生物样品中STEAP-1基因的方法包括：首先分离样品的基因组DNA；使用STEAP-1多核苷酸作为有义和反义引物扩增分离的基因组DNA；并检测扩增的STEAP-1基因的存在。可由STEAP-1核苷酸序列(参见例如图2)设计出任何数目的适当有义和反义探针组合，并将它们用于此目的。
本发明还提供了检测组织或其它生物样品，如血清、精液、骨、前列腺、尿、细胞制品等中是否存在STEAP-1蛋白的试验。检测STEAP-1-相关蛋白质的方法也是众所周知的，包括例如免疫沉淀、免疫组化分析、Western印迹分析、分子结合试验、ELISA、ELIFA等。例如，检测生物样品中STEAP-1-相关蛋白质的存在的方法包括：首先使样品与STEAP-1抗体、其STEAP-1-反应片段、或含有STEAP-1抗体的抗原-结合区域的重组蛋白质接触；然后检测样品中STEAP-1-相关蛋白质的结合。
鉴定表达STEAP-1的细胞的方法也落入本发明的范围。在一个实施方案中，鉴定表达STEAP-1基因之细胞的试验包括检测细胞中STEAP-1 mRNA的存在。检测细胞中的特定mRNA的方法是众所周知的，包括例如使用互补DNA探针的杂交试验(如使用经标记STEAP-1核糖探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)，以及多种核酸扩增试验(如使用STEAP-1特异性互补引物的RT-PCR和其它扩增型检测法，如分支DNA、SISBA、TMA等)。或者，鉴定表达STEAP-1基因之细胞的试验包括检测细胞中或由细胞分泌的STEAP-1-相关蛋白质的存在。多种检测蛋白质的方法是本领域众所周知的，可用于检测STEAP-1-相关蛋白质和表达STEAP-1-相关蛋白质的细胞。
STEAP-1表达分析也可用作鉴定和评价调制STEAP-1基因表达之药剂的工具。例如，STEAP-1表达在前列腺癌中显著上调，STEAP-1在表I所列组织的癌症中表达。鉴定能抑制癌症细胞中的STEAP-1表达或过表达的分子或生物试剂具有治疗价值。例如，通过使用经RT-PCR、核酸杂交或抗体结合定量STEAP-1表达的筛选，即可鉴定出所述药剂。
VIII.)监测STEAP-1-相关基因及其产物之状态的方法
已知癌症发生是一个多步骤的过程，其中细胞生长逐渐被异常调节，细胞由正常的生理状态发展成为前癌状态，然后发展成为癌症状态(参见例如Alers et al.，Lab Invest.77(5)：437-438(1997)and Isaacset al.，Cancer Surv.23：19-32(1995))。在此上下文中，在生物样品中查找被异常调节的细胞生长的证据(如癌症中的异常STEAP-1表达)能够在诸如癌症的病理学状态发展成为治疗选择更加局限和或预测较差的阶段之前早期检测出所述异常生理状态。在所述查找过程中，可将例如感兴趣生物样品中的STEAP-1状态与相应正常样品(例如得自该个体或另一个未受病理学影响的个体的样品)中的STEAP-1状态相比较。生物样品中STEAP-1状态的改变(与正常样品相比)提供了细胞生长被异常调节的证据。除了使用未受病理学影响的生物样品作为正常样品外，也可以使用预定的标准值，如预定的正常mRNA表达水平(参见例如Grever et al.，J.Comp.Neurol.1996Dec 9；376(2)：306-14和美国专利5,837,501)来比较样品中的STEAP-1状态。
根据为其领域所接受的含义使用此上下文中的术语“状态”，该术语指的是基因及其产物的情况或状态。通常，本领域技术人员使用多个参数评价基因及其产物的情况或状态。所述参数包括但不限于基因产物表达的位置(包括表达STEAP-1的细胞的位置)和水平，以及表达的基因产物(如STEAP-1 mRNA、多核苷酸和多肽)的生物活性。一般说来，STEAP-1状态的改变包括STEAP-1和/或表达STEAP-1之细胞的位置的改变，和/或STEAP-1 mRNA和/或蛋白质表达的增加。
通过多种本领域众所周知的方法，包括但不限于免疫组化分析、原位杂交、在激光捕获微-解剖样品上进行的RT-PCR分析、Western印迹分析和组织阵列分析可以分析样品中的STEAP-1状态。评价STEAP-1基因和基因产物之状态的一般方法可参见例如Ausubel等于1995年编辑的Current ProtocolsIn Molecular Biology第2(Northern印迹)、4(Southern印迹)、15(免疫印迹)和18(PCR分析)单元。因此，通过本领域技术人员可利用的多种方法来评价生物样品中的STEAP-1状态，所述方法包括但不限于基因组Southern分析(用于检查例如STEAP-1基因中的微扰)、STEAP-1 mRNA的Northern分析和/或PCR分析(用于检查例如STEAP-1mRNA多核苷酸序列或表达水平的变化)，以及Western和/或免疫组化分析(用于检查例如多肽序列的变化、样品中多肽定位的变化、STEAP-1蛋白表达水平的变化和/或STEAP-1蛋白与多肽结合配对物的结合的变化)。可测STEAP-1多核苷酸包括例如STEAP-1基因或其片段、STEAP-1mRNA、可变剪接变体STEAP-1 mRNA、和含有STEAP-1多核苷酸的重组DNA或RNA分子。
STEAP-1的表达分布图使其成为局部和/或转移疾病的诊断标记，并提供了有关生物样品生长或致癌潜能的信息。特别是，STEAP-1的状态提供的信息可用于预测对特殊疾病时期、发展和/或肿瘤攻击性的易感性。本发明提供了测定STEAP-1状态和诊断表达STEAP-1之癌症，如表I所列组织的癌症的方法和试验。例如，由于相对于正常前列腺组织而言，前列腺癌和其它癌症中的STEAP-1 mRNA表达水平非常高，可以使用评价生物样品中STEAP-1 mRNA转录物或蛋白质水平的试验来诊断与STEAP-1异常调节有关的疾病，所述试验可提供用于确定适当治疗选择的预测信息。
STEAP-1表达状态提供的信息包括发育异常细胞、前癌和癌症细胞的存在、时期和位置，能预测对各个疾病时期的易感性和/或评价肿瘤的攻击性。另外，STEAP-1表达分布图使其可用作转移疾病的显象试剂。因此，本发明一方面涉及多种分子预测和诊断方法，所述方法可用于检查生物样品中的STEAP-1状态，所述样品例如得自患有或怀疑患有特征在于异常调节的细胞生长的病理学，如癌症的个体。
如上所述，通过本领域众所周知的多种方法可检查生物样品中的STEAP-1状态。例如，通过评价样品中是否存在表达STEAP-1的细胞(例如表达STEAP-1 mRNA或蛋白质的细胞)，即可检查取自身体特定位置的生物样品中的STEAP-1状态。例如，由于生物样品中STEAP-1状态的改变经常与异常调节的细胞生长有关，因此，当在通常不含有表达STEAP-1的细胞的生物样品(如淋巴结)中发现所述细胞时，该检查即可提供细胞生长受异常调节的证据。具体地说，异常调节的细胞生长的一个标志是癌症细胞从最初的器官(如前列腺)转移至身体的不同区域(如淋巴结)。在此上下文中，受异常调节的细胞生长的证据是重要的，因为在大多数前列腺癌患者中可以检测到隐藏的淋巴结转移，所述转移与已知的疾病进展预测因子有关(参见例如Murphy et al.，Prostate 42(4)：315-317(2000)；Su et al.，Semin.Surg.Oncol.18(1)：17-28(2000)and Freeman et al.，J Urol 1995 Aug 154(2Pt1)：474-8)。
一方面，本发明提供了通过测定得自怀疑患有与异常调节细胞生长有关之疾病(如增生或癌症)的个体的细胞所表达STEAP-1基因产物的状态，然后将所测定的状态与相应的正常样品中的STEAP-1基因产物状态比较，从而监测STEAP-1基因产物的方法。相对于正常样品而言，受试样品中存在异常STEAP-1基因产物提供了个体细胞内存在受异常调节的细胞生长的指示。
另一方面，本发明提供了可用于测定个体中是否存在癌症的试验，其包括检测受试细胞或组织样品中STEAP-1 mRNA或蛋白质表达相对于相应正常细胞或组织表达水平而言的显著增加。例如，可评价包括但不限于表I所列组织中是否存在STEAP-1 mRNA。任何这些组织中显著STEAP-1表达的存在可用于表示癌症的出现、存在和/或严重性，因为相应的正常组织不表达或仅表达较低水平的STEAP-1mRNA。
在相关实施方案中，在蛋白质水平而不是核酸水平上测定STEAP-1状态。例如，所述方法包括测定受试组织样品中由细胞表达的STEAP-1蛋白水平，将所测定的水平与相应正常样品中表达的STEAP-1水平相比较。在一个实施方案中，使用例如免疫组化法评价STEAP-1蛋白的存在。可以在针对此目的的本领域众所周知的多种试验形式中使用能检测STEAP-1蛋白表达的STEAP-1抗体或结合配对物。
在另一个实施方案中，可评价生物样品中STEAP-1核苷酸和氨基酸序列的状态以鉴定出这些分子结构中的微扰。所述微扰包括插入、缺失、取代等。所述评价是有用的，因为能在大量与生长被异常调节的表型有关的蛋白质中观察到核苷酸和氨基酸序列中的微扰(参见例如Marrogi et al.，1999，J.Cutan.Pathoi.26(8)：369-378)。例如，STEAP-1序列中的突变可以表示肿瘤的存在或加强。因此，所述试验具有诊断和预测的价值，其中STEAP-1的突变表示功能的潜在损失或肿瘤生长的增加。
多种可用于观察核苷酸和氨基酸序列中的微扰的试验是本领域众所周知的。例如，通过本文所讨论的Northern、Southern、Western、PCR和DNA测序法可观察到STEAP-1基因产物的核酸或氨基酸序列的大小和结构。另外，其它可用于观察核苷酸和氨基酸序列中的微扰的方法，如单链构象多态性分析也是本领域众所周知的(参见例如1999年9月7日颁布的美国专利5,382,510和1995年1月17日颁布的5,952,170)。
另外，可以检查生物样品中STEAP-1基因的甲基化状态。基因5’调节区中CpG岛的异常脱甲基化和/或过度甲基化经常发生于无限增殖化和转化细胞中，并可改变多种基因的表达。例如，pi-类谷胱甘肽S-转移酶(在正常前列腺中表达但在＞90％的前列腺癌中不表达的蛋白质)的启动子过度甲基化似乎能永久地沉默该基因的转录，并且是前列腺癌中最经常被检测到的基因组改变(De Marzo et al.，Am.J.Pathol.155(6)：1985-1992(1999))。另外，该改变存在于至少70％高级别的前列腺上皮内肿瘤(PIN)中(Brooks et al.，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.，1998，7：531-536)。在另一个例子中，通过脱氧-氮胞苷诱导类淋巴母细胞中的LAGE-1肿瘤特异性基因(在正常前列腺中不表达，但在25-50％的前列腺癌中表达)的表达，暗示肿瘤表达是脱甲基化引起的(Lethe et al.，Int.J.Cancer 76(6)：903-908(1998))。多种检查基因甲基化状态的试验是本领域众所周知的。例如，可以在Southern杂交法中使用对甲基化敏感的限制性酶来评价CpG岛的甲基化状态，所述酶不能裂解含有甲基化CpG位点的序列。另外，MSP(甲基化特异性PCR)可快速描绘给定基因的CpG岛中存在的所有CpG位点的甲基化状态。该方法包括起初用亚硫酸氢钠(可将所有未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶)修饰DNA，接着使用特异于甲基化对非甲基化DNA的引物进行扩增。涉及甲基化干预的方法也可参见例如Current Protocols In Molecular Biology，Unit 12，Frederick M.Ausubelet al.，eds.，1995。
基因扩增是另一种可用于评价STEAP-1状态的方法。可基于本文提供的序列，使用适当的经标记探针，直接通过例如常规的Southern印迹或定量mRNA转录的Northern印迹(Thomas，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205)、点印迹(DNA分析)或原位杂交来测定样品中的基因扩增。或者，使用能识别特异性双链体，包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体的抗体。反过来标记抗体，进行双链体与表面结合的试验，使得通过表面双链体的形成，可以检测与双链体结合的抗体的存在。
使用例如Northern、点印迹或RT-PCR分析检测STEAP-1表达，可以方便地分析出活检组织或外周血中是否存在癌细胞。RT-PCR可扩增的STEAP-1mRNA的存在提供了存在癌症的指示。RT-PCR试验是本领域众所周知的。最近，外周血中肿瘤细胞的RT-PCR检测试验被评价，以用于多种人实体肿瘤的诊断和处理。在前列腺癌领域，所述试验包括用于检测表达PSA和PSM之细胞的RT-PCR试验(Verkaik et al.，1997，Urol.Res.25：373-384；Ghossein etal.，1995，J.Clin.Oncol.13：1195-2000；Heston et al.，1995，Clin.Chem.41：1687-1688)。
本发明的另一方面是评价个体对处于发展中的癌症的易感性。在一个实施方案中，预测对癌症的易感性的方法包括检测组织样品中的STEAP-1mRNA或STEAP-1蛋白，其存在表示对癌症易感，其中STEAP-1 mRNA表达的水平与易感性的程度相关。在具体实施方案中，检查前列腺或其它组织中是否存在STEAP-1，样品中存在STEAP-1表示对前列腺癌易感(或出现或存在前列腺肿瘤)。类似地，可以评价生物样品中STEAP-1核苷酸和氨基酸序列的完整性以鉴定出这些分子结构中的微扰，如插入、缺失、取代等。样品中STEAP-1基因产物内一种或多种微扰的存在表示对癌症的易感性(或肿瘤的出现或存在)。
本发明还包括评价肿瘤攻击性的方法。在一个实施方案中，评价肿瘤攻击性的方法包括：测定肿瘤细胞所表达的STEAP-1 mRNA或STEAP-1蛋白的水平，将所测定的水平与取自相同个体的相应正常组织或正常组织参照样品中表达的STEAP-1 mRNA或STEAP-1蛋白的水平相比较，其中相对于正常样品而言，肿瘤样品的STEAP-1 mRNA或STEAP-1蛋白表达水平显示出攻击性水平。在具体实施方案中，通过测定肿瘤细胞表达STEAP-1的水平来评价肿瘤的攻击性，较高的表达水平表示肿瘤更具攻击性。另一个实施方案是评价生物样品中STEAP-1核苷酸和氨基酸序列的完整性以鉴定出这些分子结构中的微扰，如插入、缺失、取代等。一种或多种微扰的存在表示肿瘤更具攻击性。
本发明的另一个实施方案涉及观察个体的恶性肿瘤在整个时间内的发展的方法。在一个实施方案中，观察个体的恶性肿瘤在整个时间内的发展的方法包括：测定肿瘤样品中的细胞所表达的STEAP-1 mRNA或STEAP-1蛋白的水平，将所测定的水平与在不同时间取自相同个体的等同组织样品中表达的STEAP-1 mRNA或STEAP-1蛋白的水平相比较，其中在整个时间内肿瘤样品中的STEAP-1 mRNA或STEAP-1蛋白表达水平提供了有关癌症发展的信息。在具体实施方案中，通过测定肿瘤细胞中在整个时间内的STEAP-1表达来评价癌症的发展进程，其中在整个时间内表达的增加表示癌症的发展。也可以评价生物样品中STEAP-1核苷酸和氨基酸序列的完整性以鉴定出这些分子结构中的微扰，如插入、缺失、取代等，其中一种或多种微扰的存在表示癌症的发展。
上述诊断方法可以与本领域已知的多种预测和诊断方法中的任何一种联合使用。例如，本发明的另一个实施方案涉及观察STEAP-1基因和STEAP-1基因产物的表达(或STEAP-1基因和STEAP-1基因产物中的微扰)与恶性肿瘤相关因子之间的一致性的方法，所述方法可用于诊断和预测组织样品状态。可以利用多种与恶性肿瘤相关的因子，例如恶性肿瘤相关基因的表达(如对前列腺癌等而言的PSA、PSCA和PSM表达)以及总体细胞学观察(参见例如Bocking et al.，1984，Anal.Quant.Cytol.6(2)：74-88；Epstein，1995，Hum.Pathol.26(2)：223-9；Thorson et al.，1998，Mod.Pathol.11(6)：543-51；Baisden et al.，1999，Am.J.Surg.Pathol.23(8)：918-24)。例如，由于一套与疾病相符的特定因子的存在可提供对于诊断和预测组织样品状态而言至关重要的信息，因此，观察STEAP-1基因和STEAP-1基因产物的表达(或STEAP-1基因和STEAP-1基因产物中的微扰)与另一个恶性肿瘤相关因子之间的一致性的方法是有用的。
在一个实施方案中，观察STEAP-1基因和STEAP-1基因产物的表达(或STEAP-1基因和STEAP-1基因产物中的微扰)与另一个恶性肿瘤相关因子之间的一致性的方法必需检测组织样品中STEAP-1 mRNA或蛋白质的过表达，检测组织样品中PSA mRNA或蛋白质的过表达(或PSCA或PSM表达)，和观察STEAP-1 mRNA或蛋白质与PSA mRNA或蛋白质过表达(或PSCA或PSM表达)之间的一致性。在具体实施方案中，检测前列腺组织中STEAP-1和PSAmRNA的表达，其中样品中STEAP-1和PSA mRNA过表达的一致性表示前列腺癌的存在，前列腺癌易感性或前列腺肿瘤的出现或状态。
本文描述了检测和定量STEAP-1 mRNA或蛋白质表达的方法，标准的核酸和蛋白质检测和定量技术是本领域众所周知的。检测和定量STEAP-1mRNA的标准方法包括：使用经标记STEAP-1核糖探针的原位杂交，使用STEAP-1多核苷酸探针的Northern印迹和相关技术，使用STEAP-1特异性引物的RT-PCR分析，和其它扩增型检测法，如分支DNA、SISBA、TMA等。在具体实施方案中，使用半-定量的RT-PCR检测和定量STEAP-1 mRNA表达。能扩增STEAP-1的任何数目的引物都可用于此目的，包括但不限于本文具体描述的多种引物套。在具体实施方案中，可以在活检组织的免疫组化试验中使用与野生型STEAP-1蛋白特异性反应的多克隆或单克隆抗体。
IX.)鉴定与STEAP-1相互作用的分子
本文公开的STEAP-1蛋白和核酸序列使本领域技术人员可以鉴定出与STEAP-1相互作用的蛋白质、小分子和其它试剂，以及经由多种为本领域所接受的方法中的任一种被STEAP-1激活的途径。例如，可以利用一种所谓的相互作用陷阱系统(也称为“双-杂合试验”)。在所述系统中，分子与介导报道基因表达的转录因子相互作用，并重建所述转录因子，由此测定报道基因的表达。其它系统通过重建真核转录激活物来鉴定体内蛋白质-蛋白质相互作用。参见例如1999年9月21日颁布的美国专利5,955,280；1999年7月20日颁布的5,925,523；1998年12月8日颁布的5,846,722和1999年12月21日颁布的6,004,746。有关基于基因组预测蛋白质功能的算法也是本领域已知的(参见例如Marcotte，et al.，Nature 402：4November 1999，83-86)。
或者可以筛选肽文库以鉴定与STEAP-1蛋白序列相互作用的分子。在所述方法中，通过筛选编码随机或受控氨基酸集合的文库，鉴定出与STEAP-1结合的肽。将文库编码的肽表达成噬菌体包被蛋白的融合蛋白，然后筛选与STEAP-1蛋白结合的噬菌体颗粒。
因此，无需先知道任何有关预期配体或受体分子结构的信息，也可鉴定出具有多种用途的肽，如治疗、预测或诊断试剂。可用于鉴定与STEAP-1蛋白序列相互作用的分子的典型肽文库和筛选方法公开于例如1998年3月3日颁布的5,723,286和1998年3月31日颁布的5,733,731。
或者，表达STEAP-1的细胞系可用于鉴定由STEAP-1介导的蛋白质-蛋白质相互作用。可使用免疫沉淀技术检测所述相互作用(参见例如HamiltonB.J.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1999,261：646-51)。使用抗-STEAP-1抗体可从表达STEAP-1的细胞系中免疫沉淀STEAP-1蛋白。或者，可在经改造后可表达STEAP-1与His-tag的融合物(上述载体)的细胞系中使用抗His-tag抗体。通过诸如Western印迹、蛋白质的35S-甲硫氨酸标记、蛋白质微量测序、银染和二维凝胶电泳的方法，可以检测免疫沉淀复合物的蛋白质结合情况。
通过所述筛选试验的相关实施方案即可鉴定出与STEAP-1相互作用的小分子和配体。例如，可以鉴定出能妨碍蛋白质功能的小分子，包括能妨碍STEAP-1介导磷酸化和去磷酸化、与DNA或RNA分子的相互作用(作为细胞周期调节、第二信使信号传导或肿瘤发生的指示)之能力的分子。类似地，鉴定出能调制STEAP-1-相关离子通道、蛋白质泵或细胞通讯功能的小分子，并将它们用于治疗患有表达STEAP-1之癌症的患者(参见例如Hille，B.，IonicChannels of Excitable Membranes 2nd Ed.，Sinauer Assoc.，Sunderland，MA，1992)。另外，基于其结合STEAP-1和激活报道构建体的能力鉴定出调节STEAP-1功能的配体。典型的方法讨论于例如1999年7月27日颁布的美国专利5,928,868，其包括形成杂合配体的方法，其中至少一个配体是小分子。在说明性的实施方案中，使用经改造可表达STEAP-1与DNA-结合蛋白的融合蛋白的细胞共表达杂合配体/小分子和cDNA文库转录激活物蛋白质的融合蛋白。细胞还含有报道基因，在第一和第二融合蛋白彼此的近侧调节报道基因的表达，该事件仅当杂合配体结合两种杂合蛋白质上的靶位点时才会发生。选择表达报道基因的细胞，并鉴定未知的小分子或未知的配体。该方法提供了鉴定能激活或抑制STEAP-1的调制剂的方法。
本发明的实施方案包括筛选能与图2或图3所示STEAP-1氨基酸序列相互作用的分子的方法，所述方法包括下述步骤：使分子群体与STEAP-1氨基酸序列接触，在有利于相互作用的条件下使分子群体与STEAP-1氨基酸序列相互作用，测定与STEAP-1氨基酸序列相互作用的分子的存在，然后将不与STEAP-1氨基酸序列相互作用的分子同与STEAP-1氨基酸序列相互作用的分子分开。在具体实施方案中，该方法进一步包括纯化、表征和鉴定与STEAP-1氨基酸序列相互作用的分子。使用鉴定的分子调制STEAP-1行使的功能。在优选实施方案中，STEAP-1氨基酸序列与肽文库接触。
X.)治疗方法和组合物
将STEAP-1鉴定为一般在有限的一套组织中表达，但也在如表I所列的癌症中表达的蛋白质开发了多种治疗所述癌症的治疗方法。
值得注意的是，靶向抗肿瘤疗法是有用的，即便当正常组织，甚至是重要的正常器官组织表达靶向的蛋白质时，该疗法也是有用的。重要器官是维持生命所必需的，如心脏或结肠。不重要的器官是摘除后个体仍可存活的器官。不重要器官的例子是卵巢、乳腺和前列腺。
例如，Herceptin
Figure A20048004342700821
是经FDA批准的由抗体组成的药物，所述抗体能与被不同地称作HER2，HER2/neu和erb-b-2的蛋白质进行免疫反应。该药物被Genentech推向市场，是一种在商业上很成功的抗肿瘤剂。2002年Herceptin
Figure A20048004342700822
的销售额达到近4亿美元。Herceptin
Figure A20048004342700823
可治疗HER2阳性转移乳腺癌。然而，HER2的表达并不局限于该肿瘤。多种正常组织也表达该蛋白质。特别是已知正常肾脏和心脏中存在HER2/neu，因此这些组织存在于Herceptin的所有人受体中。Latif，Z.，et al.，B.J.U.International(2002)89：5-9也证实了正常肾脏中HER2/neu的存在。如该篇文献(该文评价了抗-HER2抗体如Herceptin是否优选指示肾细胞癌)中所示，良性肾组织既产生蛋白质也产生mRNA。HER2/neu蛋白在良性肾组织中显著地强烈地超表达。尽管HER2/neu在诸如心脏和肾脏的重要组织中表达，Herceptin仍是非常有用的、经FDA批准的、在商业上获得成功的药物。Herceptin对心脏组织的作用，即“心脏毒性”仅仅是治疗的副作用。当仅用Herceptin治疗患者时，只有很低百分比的患者会出现显著的心脏毒性。为了使心脏毒性最小化，对于用HER2/neu治疗有更严格的准入要求。在进行治疗之前，要评价对心脏病的易感性等因素。
特别值得注意的是，尽管肾组织表现出正常的表达，甚至可能比心脏组织的表达更高，肾脏却没有可察觉的Herceptin副作用。另外，在表达HER2的正常组织的多种阵列中，很少会出现任何副作用。只有心脏组织会出现一些可察觉的副作用。HER2/neu表达特别显著的组织，如肾脏不是任何副作用的基础。
另外，已发现靶向表皮生长因子受体(EGFR)；Erbitux(ImClone)的抗肿瘤疗法有有利的治疗效果。EGFR也在多种正常组织中表达。使用抗-EGFR治疗剂之后，正常组织中仅有很有限的副作用。与EGFR治疗相伴的副作用一般是在接受治疗的100％患者中观察到严重的皮疹。
因此，正常组织，甚至是重要的正常组织中靶蛋白质的表达不会妨碍该蛋白质的靶向药剂用作某些超表达该蛋白质的肿瘤的治疗剂。例如，在重要器官中的表达本身不是有害的。另外，被认为是非必需的器官，如前列腺和卵巢可以被摘除而不会影响死亡率。最终，由于免疫优待，正常器官中的表达不会影响一些重要器官。受到免疫优待的器官通过血液-器官屏障而得到保护，免受血液的影响，从而使免疫疗法无法到达该器官。受到免疫优待的器官的例子是脑和睾丸。
因此，抑制STEAP-1蛋白活性的治疗方法对患有表达STEAP-1的癌症患者是有用的。这些治疗方法一般分为三类。第一类调制STEAP-1的功能，因为它涉及肿瘤细胞生长，导致肿瘤细胞生长的抑制或延迟或诱导其杀伤。第二类包括多种抑制STEAP-1蛋白与其结合配对物或其它蛋白质结合或缔合的方法。第三类包括多种抑制STEAP-1基因转录或STEAP-1 mRNA翻译的方法。
X.A.)抗-癌疫苗
本发明提供了含有STEAP-1-相关蛋白质或STEAP-1-相关核酸的癌症疫苗。由于STEAP-1的表达，癌症疫苗能防止和/或治疗表达STEAP-1的癌症，而对非-靶组织的影响很小或无影响。在疫苗中使用能产生细胞-介导的体旋免疫应答的肿瘤抗原作为抗-癌疗法是本领域众所周知的，并且已用于使用人PSMA和啮齿动物PAP免疫原的前列腺癌疫苗中(Hodge et al.，1995，Int.J.Cancer 63：231-237；Fong et al.，1997，J.Immunol.159：3113-3117)。
通过利用STEAP-1-相关蛋白质，或编码STEAP-1的核酸分子和能表达和呈递STEAP-1免疫原(一般含有多种T细胞表位或抗体)的重组载体，可以容易地实施该方法。本领域技术人员懂得多种传递免疫反应表位的疫苗系统是本领域已知的(参见例如Heryin et al.，Ann Med 1999Feb 31(1)：66-78；Maruyama et al.，Cancer Immunol Immunother 2000Jun 49(3)：123-32)。简单地说，所述的在哺乳动物中产生(例如细胞-介导的和/或体液)免疫应答的方法包括下述步骤：将哺乳动物免疫系统暴露于免疫反应表位(如图3所示STEAP-1蛋白或其类似物或同系物中存在的表位)，以使哺乳动物产生特异于该表位的免疫应答(例如产生特异性识别该表位的抗体)。在优选的方法中，STEAP-1免疫原含有生物基元，参见例如表V-XVIII和XXII-LI，或大小范围得自图5、图6、图7、图8和图9所示STEAP-1的肽。
可通过多种方法组合和传递完整的STEAP-1蛋白，其免疫原性区域或其表位。所述疫苗组合物可包括例如脂肽(例如Vitiello，A.et al.，J.Clin.Invest.95：341，1995)，包裹于聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)微球体中的肽组合物(参见例如Eldridge，et al.，Molec.Immunol.28：287-294，1991；Alonso etal.，Vaccine 12：299-306，1994；Jones et al.，Vaccine 13：675-681.1995)，包含于免疫刺激复合物(ISCOMS)中的肽组合物(参见例如Takahashi et al.，Nature344：873-875，1990；Hu et al.，Clin Exp Immunol.113：235-243，1998)，多抗原肽系统(MAP)(参见例如Tam，J.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5409-5413，1988；Tam，J.P.，J.Immunol.Methods 196：17-32，1996)，配制成多价肽的肽；用于弹道传递系统的肽，典型晶体化的肽，病毒传递载体(Perkus，M.E.et al.，In：Concepts in vaccine development，Kaufmann，S.H.E.，ed.，p.379，1996；Chakrabarti，S.et al.，Nature 320：535，1986；Hu，S.L.et al.，Nature320：537，1986；Kieny，M-P.et al.，AIDS Biol Technology 4：790，1986；Top，F.H.et al.，J.Infect Dis.124：148，1971；Chanda，P.K.et al.，Virology 175：535，1990)，病毒或合成来源的颗粒(例如Kofier，N.et al.，J.Immunol.Methods.192：25，1996；Eldridge，J.H.et al.，Sem.Hematol.30：16，1993；Falo，L.D.，Jr.etal.，Nature Med.7：649，1995)，佐剂(Warren，H.S.，Vogel，F.R.，and Chedid，L.A.Annu.Rev.Immunol.4：369，1986；Gupta，R.K.et al.，Vaccine 11：293，1993)，脂质体(Reddy，R.et al.，J.Immunol.148：1585，1992；Rock，K.L.，Immunol.Today 17：131，1996)，或裸露的或吸附于颗粒的cDNA(Ulmer，J.B.et al.，Science 259：1745，1993；Robinson，H.L.，Hunt，L.A.，and Webster，R.G.，Vaccine 11：957，1993；Shiver，J.W.et al.，In：Concepts in vaccine development，Kaufmann，S.H.E.，ed.，p.423，1996；Cease，K.B.，and Berzofsky，J.A.，Annu.Rev.Immunol.12：923，1994 and Eldridge，J.H.et al.，Sem.Hemato.30：16，1993)。也可以使用毒素-靶向传递技术，也已知为受体介导的靶向，如AvantImmunotherapeutics，Inc.(Needham，Massachusetts)的技术。
对STEAP-1-相关癌症的患者而言，本发明的疫苗组合物也可以与其它用于癌症的疗法，如外科手术、化疗、药物疗法、放疗等联合使用，包括与免疫佐剂，如IL-2、IL-12、GM-CSF等联合使用。
细胞疫苗：
使用特殊算法即可测定CTL表位，以鉴定出STEAP-1蛋白中与相应HLA等位基因结合的肽(参见例如表IV；EimerTM and EpimatrixTM，BrownUniversity(URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html)；和BIMAS，(URL bimas.dcrt.nih.gov/；SYFPEITHI at URLsyfpeithi.bmi-heidelberg.com/)。在优选实施方案中，STEAP-1免疫原含有一种或多种使用本领域众所周知的技术鉴定的氨基酸序列，如表V-XVIII和XXII-LI所示的序列或被HLAI类基元/超基元特化的8，9，10或11个氨基酸的肽(如表IV(A)，表IV(D)或表IV(E))和/或含有HLAII类基元/超基元的至少9个氨基酸的肽(如表IV(B)或表IV(C))。本领域技术人员应懂得HLAI类结合沟必需封闭末端，使得只有特定大小范围的肽适合进入沟内并且被结合，通常，I类HLA表位的长度为8，9，10或11个氨基酸。相反，HLAII类结合沟必需开放末端，因此，约9个或更多个氨基酸的肽可以被HLAII类分子结合。由于HLA I类和II类之间结合沟的差异，HLAI类基元是长度特异性的，即I类基元的第2位是肽的氨基至羧基方向的第二个氨基酸。II类基元的氨基酸位置仅是相对于彼此而言的，而不是相对于整个肽而言的，即可以在携有基元之序列的氨基和/或羧基末端结合其它的氨基酸。HLAII类表位的长度经常为9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25个氨基酸，或长于25个氨基酸。
多种在哺乳动物中产生免疫应答的方法是本领域已知的(例如作为产生杂交瘤的第一步)。在哺乳动物中产生免疫应答的方法包括将哺乳动物的免疫系统暴露于蛋白质(如STEAP-1蛋白)上的免疫原性表位以产生免疫应答。典型的实施方案由在宿主中产生抗STEAP-1免疫应答的方法组成，通过使宿主与足够量的至少一种STEAP-1B细胞或细胞毒T-细胞表位或其类似物接触；至少间隔一段时间之后，使宿主与STEAP-1B细胞或细胞毒T-细胞表位或其类似物再次-接触即可实施此方法。具体实施方案由产生抗STEAP-1-相关蛋白质或人造多表位肽的免疫应答的方法组成，所述方法包括：给人或另一种哺乳动物施用疫苗制品中包含的STEAP-1免疫原(如STEAP-1蛋白或其肽片段，STEAP-1融合蛋白或类似物等)。通常，所述疫苗制品还含有适当的佐剂(参见例如美国专利6,146,635)或通用的辅助表位，如PADRETM肽(EpimmuneInc.，San Diego，CA；参见例如Alexander et al.，J.Immunol.2000164(3)；164(3)：1625-1633；Alexander et al.，Immunity 19941(9)：751-761 andAlexander et al.，Immunol.Res.1998 18(2)：79-92)。另一种可选择的方法包括通过给个体的肌肉或皮肤体内施用DNA分子，在个体中产生抗STEAP-1免疫原的免疫应答，所述DNA分子含有编码STEAP-1免疫原的DNA序列，所述DNA序列与控制DNA序列表达的调节序列可操作相连；其中DNA分子被细胞摄取，DNA序列在细胞中表达，从而产生抗免疫原的免疫应答(参见例如美国专利5,962,428)。任选也施用基因疫苗促进剂，如阴离子脂质；皂苷；凝集素；雌激素化合物；羟化低级烷基；二甲基亚砜；和尿素。另外，为了产生针对靶抗原的应答，可以施用模拟STEAP-1的抗独特型抗体。
核酸疫苗：
本发明的疫苗组合物包括核酸-介导的疫苗。可以给患者施用编码本发明蛋白质的DNA或RNA。可使用基因免疫法产生针对表达STEAP-1之癌症细胞的预防性或治疗性体液和细胞免疫应答。可以将含有编码STEAP-1-相关蛋白质/免疫原的DNA和适当调节序列的构建体直接注射至个体的肌肉或皮肤，使肌肉或皮肤细胞摄取构建体，并表达编码的STEAP-1蛋白/免疫原。或者，疫苗含有STEAP-1-相关蛋白质。STEAP-1-相关蛋白质免疫原的表达导致产生针对携有STEAP-1蛋白之细胞的预防性或治疗性体液和细胞免疫力。可以使用多种本领域已知的预防和治疗性基因免疫技术(有关评述可参见国际互联网地址genweb.com公开的信息和参考文献)。基于核酸的传递描述于例如Wolff et.al.，Science 247：1465(1990)以及美国专利5,580,859、5,589,466、5,804,566、5,739,118、5,736,524、5,679,647和WO98/04720。基于DNA的传递技术的例子包括“裸露的DNA”、促进(bupivicaine、聚合物、肽-介导的)传递、阳离子脂质复合物和颗粒-介导(“基因枪”)或压力-介导的传递(参见例如美国专利5,922,687)。
为了进行治疗或预防性免疫，可经由病毒或细菌载体表达本发明的蛋白质。可用于本发明实践的多种病毒基因传递系统包括但不限于痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、腺病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、腺-伴随病毒、慢病毒和新培斯病毒(参见例如Restifo，1996，Curr.Opin Immunol.8：658-663；Tsang et al.，J.Nat.Cancer Inst.87：982-990(1995))。也可通过将编码STEAP-1-相关蛋白质的裸露DNA导入患者(例如肌内或皮内)来利用非-病毒传递系统诱导抗-肿瘤应答。
将痘苗病毒用作例如表达编码本发明肽的核苷酸序列的载体。通过导入宿主，重组痘苗病毒表达蛋白质免疫原性肽，籍此引发宿主免疫应答。用于免疫接种方案的痘苗病毒载体和方法描述于例如美国专利4,722,848。另一种载体是BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG载体描述于Stover et al.，Nature 351：456-460(1991)。根据本文的描述，多种可用于治疗性施用或免疫接种本发明肽的其它载体，例如腺和腺-伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌载体、脱毒的炭疽毒素载体等对于本领域技术人员而言是显而易见的。
因此，可使用基因传递系统传递STEAP-1-相关核酸分子。在一个实施方案中，利用了全长人STEAP-1cDNA。在另一个实施方案中，利用了编码特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)和/或抗体表位的STEAP-1核酸分子。
来自体内的疫苗：
可以利用多种来自体内的策略产生免疫应答。一种方法包括使用抗原呈递细胞(APC)，如树状细胞(DC)为患者的免疫系统呈递STEAP-1抗原。树状细胞表达MHCI类和II类分子、B7共刺激物和IL-12，因此是高度特化的抗原呈递细胞。在前列腺癌中，用前列腺-特异性膜抗原(PSMA)肽脉冲的自身树状细胞被用于I期临床试验以刺激前列腺癌患者的免疫系统(Tjoa et al.，1996，Prostate 28：65-69；Murphy et al.，1996，Prostate 29：371-380)。因此，在MHCI类或MHCII类分子环境中，可使用树状细胞将STEAP-1肽呈递给T细胞。在一个实施方案中，用能与MHCI类和/或II类分子结合的STEAP-1肽脉冲自身树状细胞。在另一个实施方案中，用完整的STEAP-1蛋白脉冲树状细胞。另一个实施方案包括使用多种本领域已知的工具载体，如腺病毒(Arthuret al.，1997，Cancer Gene Ther.4：17-25)、逆转录病毒(Henderson et al.，1996，Cancer Res.56：3763-3770)、慢病毒、腺-伴随病毒、DNA转染(Ribas et al.，1997，Cancer Res.57：2865-2869)或得自肿瘤的RNA转染(Ashley et al.，1997，J.Exp.Med.186：1177-1182)对树状细胞中的STEAP-1基因过表达进行改造。也可改造表达STEAP-1的细胞以使其表达免疫调制剂，如GM-CSF并用作免疫剂。
X.B.)STEAP-1用作基于抗体之疗法的靶
STEAP-1是有吸引力的基于抗体之治疗策略的靶。本领域已知多种靶向细胞外和细胞内分子的抗体策略(参见例如补体和ADCC介导的杀伤以及内体的使用)。由于相对于相应的正常细胞而言，多种谱系的癌症细胞表达STEAP-1，准备全身性施用STEAP-1-免疫反应组合物，该组合物表现出极好的敏感性，未表现出由免疫反应组合物与非-靶器官和组织的结合导致的毒性、非-特异性和/或非-靶作用。与STEAP-1结构域特异性反应的抗体作为与毒素或治疗剂的偶联物，或作为能抑制细胞增殖或功能的裸露抗体，可用于全身性治疗表达STEAP-1的癌症。
可将STEAP-1抗体导入患者以使抗体与STEAP-1结合并调制功能，如与结合配对物的相互作用，随后介导肿瘤细胞的破坏和/或抑制肿瘤细胞的生长。所述抗体发挥治疗作用的机理包括补体-介导的细胞裂解、依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性、调制STEAP-1的生理功能、抑制配体结合或信号转导途径、调制肿瘤细胞分化、改变肿瘤血管生成因子分布和/或细胞凋亡。例如，Rituxan用于非-何杰氏淋巴瘤，Herceptin
Figure A20048004342700882
用于转移的乳腺癌，Erbitux
Figure A20048004342700883
用于结肠直肠癌。
本领域技术人员懂得可以使用抗体特异性靶向和结合免疫原性分子，例如图2或图3所示STEAP-1序列的免疫原性区域。另外，本领域技术人员懂得抗体与细胞毒性剂的偶联是常规技术(参见例如Slevers et al.，Blood 93：113678-3684(June 1，1999))。例如，当通过使细胞毒性和/或治疗剂与特异于细胞所表达分子(如STEAP-1)的抗体偶联而将它们直接传递至细胞时，细胞毒性剂将对所述细胞发挥其已知的生物学作用(即细胞毒性)。
使用抗体-细胞毒性剂偶联物以杀死细胞的多种组合物和方法是本领域已知的。在癌症的上下文中，典型的方法必需给患有肿瘤的动物施用生物有效量的偶联物，所述偶联物含有与靶向剂(如抗-STEAP-1抗体)连接的选定细胞毒性剂和/或治疗剂，所述靶向剂与表达的标记(如STEAP-1)结合，易于结合或定位于细胞表面。典型的实施方案是将细胞毒性剂和/或治疗剂传递至表达STEAP-1的细胞的方法，所述方法包括使细胞毒性剂与免疫特异性结合STEAP-1表位的抗体偶联，并将细胞暴露于抗体-细胞毒性剂偶联物。另一个说明性的实施方案是治疗怀疑患有转移癌症的个体的方法，所述方法包括给所述个体非肠道施用药物组合物的步骤，所述组合物含有治疗有效量的与细胞毒性剂和/或治疗剂偶联的抗体。
可根据多种已成功用于治疗其它类型的癌症的方法来进行使用抗-STEAP-1抗体的癌症免疫疗法，所述癌症包括但不限于：结肠癌(Arlen et al.，1998，Crit.Rev.Immunol.18：133-138)，多发性骨髓瘤(Ozaki et al.，1997，Blood90：3179-3186，Tsunenari et al.，1997，Blood 90：2437-2444)，胃癌(Kasprzyk etal.，1992，Cancer Res.52：2771-2776)，B-细胞淋巴瘤(Funakoshi et al.，1996，J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.19：93-101)，白血病(Zhong et al.，1996，Leuk.Res.20：581-589)，结肠直肠癌(Moun et al.，1994，Cancer Res.54：6160-6166；Velders et al.，1995，Cancer Res.55：4398-4403)和乳腺癌(Shepard et al.，1991，J.Clin.Immunol.11：117-127)。一些治疗方法包括使裸露的抗体与毒素或放射性同位素偶联，如Y91或I131分别与抗-CD20抗体偶联(例如ZevalinTM，IDEC Pharmaceuficals Corp.or BexxarTM，CoulterPharmaceuficals)，而其它治疗方法包括共同施用抗体和其它治疗剂，如同时施用HerceptinTM(trastuzumab)与paclitaxel(Genentech，Inc.)。抗体可与治疗剂偶联。例如，为了治疗前列腺癌，可以在施用STEAP-1抗体的同时使用放疗、化疗或激素脱离疗法。另外，抗体可与毒素偶联，所述毒素如刺孢霉素(如MylotargTM，Wyeth-Ayerst，Madison，NJ，一种与抗-肿瘤抗生素刺孢霉素偶联的重组人源化IgG4κ抗体)或美登木素生物碱(如基于taxane的肿瘤-激活前体药物，TA P，platform，ImmunoGen，Cambridge，MA，也可参见例如美国专利5,416,064)。
尽管STEAP-1抗体疗法可用于所有阶段的癌症，但抗体疗法特别适于晚期或转移癌症。对已接受一轮或多轮化疗的患者进行本发明的抗体疗法。或者，对未接受过化疗的患者进行本发明的抗体疗法与化疗或放疗方案。另外，抗体疗法能使相伴随的化疗剂量降低，对于不能很好耐受化疗药剂之毒性的患者更是如此。Fan等(Cancer Res.53：4637-4642，1993)，Prewett等(International J.of Onco.9：217-224，1996)和Hancock等(Cancer Res.51：4575-4580，1991)描述了多种抗体与化疗剂的联合使用。
尽管STEAP-1抗体疗法可用于所有阶段的癌症，但抗体疗法特别适于晚期或转移癌症。对已接受一轮或多轮化疗的患者进行本发明的抗体疗法。或者，对未接受过化疗的患者进行本发明的抗体疗法与化疗或放疗方案。另外，抗体疗法能使相伴随的化疗剂量降低，对于不能很好耐受化疗药剂之毒性的患者更是如此。
优选使用肿瘤组织的免疫组化评价、定量STEAP-1显象或其它能可靠表示STEAP-1表达的存在和水平的技术来评价癌症患者中STEAP-1表达的存在和水平。为此优选对肿瘤活检或手术样品进行免疫组化分析。对肿瘤组织进行免疫组化分析的方法是本领域众所周知的。
治疗前列腺癌和其它癌症的抗-STEAP-1单克隆抗体包括能引发强有力的抗肿瘤免疫应答或直接具有细胞毒性的单克隆抗体。在这一点上，抗-STEAP-1单克隆抗体(MAb)能通过补体-介导的或依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)机理引起肿瘤细胞裂解，这两种机理都需要免疫球蛋白分子的完整Fc部分，以与补体蛋白质上的效应细胞Fc受体位点相互作用。另外，对肿瘤生长直接发挥生物学作用的抗-STEAP-1 MAb可用于治疗表达STEAP-1的癌症。直接细胞毒MAb的作用机理包括：抑制细胞生长、调制细胞分化、调制肿瘤血管生成因子分布和诱导细胞凋亡。使用任何一种评价细胞死亡的体外试验，如ADCC、ADMMC、补体-介导的细胞裂解等来评价特定抗-STEAP-1MAb发挥抗-肿瘤作用的机理，所述试验一般是本领域已知的。
在一些患者中，使用鼠或其它非-人单克隆抗体，或人/小鼠嵌合MAb可诱导抗-非人抗体的中度至强烈的免疫应答。这会导致抗体从循环中被清除且效力降低。在大多数严重病例中，所述免疫应答可导致免疫复合物的广泛形成，所述复合物可潜在导致肾衰竭。因此，用于本发明的治疗方法的优选单克隆抗体是那些全人或人源化，并以高亲和性与靶STEAP-1抗原特异性结合，但在患者中表现出低抗原性或无抗原性的单克隆抗体。
本发明的治疗方法期望单独施用抗-STEAP-1 MAb以及联合或混合使用不同的MAb。所述MAb混合物由于含有靶向不同表位的MAb、利用不同效应物机理或直接联合细胞毒MAb与依赖免疫效应物功能性的MAb而具有某些优点。所述MAb组合可表现出协同治疗作用。另外，抗-STEAP-1 MAb可以与包括但不限于多种化学治疗剂、雄激素-阻断剂、免疫调制剂(如1L-2，GM-CSF)、外科手术或放疗的其它治疗形式相伴使用。可以施用“裸露”或未偶联形式的抗-STEAP-1MAb，或者使治疗剂与所述MAb偶联。
可经由任何能将抗体传递至肿瘤细胞的途径施用抗-STEAP-1抗体制剂。给药途径包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、肿瘤内、皮内等。治疗一般包括经由可接受的给药途径，如静脉内注射(IV)重复施用抗-STEAP-1抗体制品，剂量范围一般约为0.1，.2，.3，.4，.5，.6，.7，.8，.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20或25mg/kg体重。一般说来，每周10-1000mg MAb是有效的并且能被较好地耐受。
基于用HerceptinTM MAb治疗转移的乳腺癌的临床经验，可接受的剂量方案是原始静脉内负荷剂量约为4mg/kg患者体重，接着，每周的静脉内剂量约为2mg/kg抗-STEAP-1MAb制品。优选以90分钟或更长时间的输注施用原始负荷剂量。如果原始剂量能被较好地耐受，以30分钟或更长时间的输注施用周期维持剂量。本领域技术人员懂得多种因素可影响具体病例的理想剂量方案。所述因素包括例如所用Ab或MAb的结合亲和性和半寿期、患者中的STEAP-1表达水平、循环流出STEAP-1抗原的程度、所需的稳态抗体浓度水平、治疗频率和与本发明的治疗方法联合使用的化学治疗剂或其它药剂的影响、以及特定患者的健康状况。
任选评价患者的给定样品中STEAP-1的水平(例如循环STEAP-1抗原和/或表达STEAP-1的细胞的水平)，以辅助确定最有效的剂量方案等。所述评价也可用于治疗过程中的监测，并可用于与其它参数(如膀胱癌疗法中的尿细胞学和/或ImmunoCyt水平，或类似地，前列腺癌疗法中的血清PSA水平)的评价相结合来评价治疗是否成功。
在抗-癌疗法中，抗-独特型抗-STEAP-1抗体也可用作疫苗以引发针对表达STEAP-1-相关蛋白质的细胞的免疫应答。特别是，产生抗-独特型抗体的方法是本领域众所周知的；可以容易地改动此方法以产生模拟STEAP-1-相关蛋白质上的表位的抗-独特型抗-STEAP-1抗体(参见例如Wagner et al.，1997，Hybridoma 16：33-40；Foon et al.，1995，J.Clin Invest.96：334-342；Herlyn et al.，1996，Cancer Immunol.Immunother.43：65-76)。所述抗-独特型抗体可用于癌症疫苗策略。
X.C.)STEAP-1用作细胞免疫应答的靶
本发明的其它实施方案是疫苗和制备疫苗的方法，所述疫苗含有免疫原性有效量的一种或多种本文所述的HLA-结合肽。另外，本发明的疫苗包含一种或多种所要求肽的组合物。肽可以单独存在于疫苗中。或者，肽可以作为含有多拷贝相同肽的同聚物存在，或作为与多种肽的异聚物存在。聚合物的优点是能增强免疫反应，当使用不同的肽表位组成聚合物时，还能诱导产生与病原体生物的不同抗原决定簇或免疫应答所靶向的肿瘤-相关肽反应的抗体和/或CTL。组合物可以是抗原的天然区域，通过例如重组或化学合成即可制备所述组合物。
可与本发明疫苗一起使用的载体是本领域众所周知的，包括例如甲状腺球蛋白、如人血清白蛋白的白蛋白、破伤风类毒素、如聚L-赖氨酸和聚L-谷氨酸的聚氨基酸、流感病毒、乙肝病毒核心蛋白质等。疫苗可含有生理可耐受的(即可接受的)稀释剂，如水、或盐水，优选为磷酸缓冲盐水。疫苗一般还包括佐剂。如不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾的佐剂是本领域众所周知的佐剂材料的例子。另外，如本文所公开的，通过使本发明的肽与脂质，如tripalmitoyl-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)偶联，可以引发CTL反应。另外，已发现诸如含有合成的胞嘧啶-硫代磷酸化-鸟嘌呤(CpG)的寡核苷酸的佐剂可将CTL反应增强10至100倍(参见例如Davila and Celis，J.Immunol.165：539-547(2000))。
通过经由注射、气溶胶、口服、经皮、经粘膜、胸膜内、鞘内或其它适当途径用本发明的肽组合物进行免疫接种，宿主的免疫系统通过产生大量特异于所需抗原的CTL和/或HTL对疫苗作出反应。结果，宿主至少对后来产生的表达或过表达STEAP-1抗原的细胞产生了部分免疫力，或当抗原是肿瘤-相关抗原时，至少能获得一些治疗上的益处。
在一些实施方案中，需要组合使用I类肽组分与能诱导或促进针对靶抗原的中和抗体和或辅助T细胞反应的组分。所述组合物的优选实施方案含有本发明的I类和II类表位。所述组合物的另一个可选择的实施方案含有本发明的I类和/或II类表位以及交叉反应的HTL表位，如PADRETM(Epimmune，San Diego，CA)分子(描述于例如美国专利5,736,142)。
本发明的疫苗也可包括抗原-呈递细胞(APC)，如树状细胞(DC)作为呈递本发明肽的载体。在活动化和收集树状细胞之后，可以在体外产生疫苗组合物，从而在体外进行树状细胞的荷载。例如，用例如根据本发明的小基因转染树状细胞，或用肽脉冲树状细胞。接着可以将树状细胞施用于患者以在体内引发免疫反应。无论是基于DNA或肽的疫苗组合物也可以与树状细胞活动化联合体内给药，从而在体内进行树状细胞的荷载。
优选地，当选择包括在用于疫苗的多表位合成物中的表位阵列时，或选择包括在疫苗中和/或由核酸如小基因编码的离散表位时，采用下述原则。优选平衡下列原则的每一种以进行选择。包括在给定疫苗组合物的多个表位可以是，但不一定是获得表位的天然抗原中的邻近序列。
1.)选择表位，所述表位经给药后可模拟经观察与肿瘤清除相关的免疫应答。对HLAI类而言，这包括来自至少一个肿瘤相关抗原(TAA)的3-4个表位。对HLAII类而言，采用类似的原理；由至少一个TAA再选择3-4个表位(参见例如Rosenberg et al.，Science 278：1447-1450)。来自一个TAA的表位可以与来自一个或多个其它TAA的表位联合使用，以生产靶向肿瘤的疫苗，所述肿瘤具有频繁表达的TAA的不同表达模式。
2.)选择表位，所述表位具有已确定与免疫原性相关的必须的结合亲和性：对HLAI类而言，IC50为500nM或更低，通常为200nM或更低；对II类而言，IC50为1000nM或更低。
3.)选择足够的携有超基元的肽或足够的携有等位基因特异性基元的肽阵列来给予广泛的种群覆盖面。例如，优选具有至少80％的种群覆盖面。MonteCarlo分析，一种本领域已知的统计评估，可以被用于评估种群覆盖的范围或冗余。
4.)当从癌症相关抗原中选择表位时，由于患者可以已产生对天然表位的耐受性，选择类似物通常是有益的。
5.)特别相关的表位指的是“嵌套表位”。在给定肽序列至少两个表位的重叠处出现嵌套表位。嵌套肽序列可以包括B细胞、HLAI类和/或HLAII类表位。当提供嵌套表位时，一个通常的目的是每个序列提供最大数目的表位。因此，一方面是为了避免提供比肽序列中氨基端表位的氨基端和羧基端表位的羧基端长的肽。当提供一个多表位序列，例如含有嵌套表位的序列时，筛选序列以确定其不具有病理的或其它有害的生物特性通常是很重要的。
6.)如果制备多表位蛋白质或制备小基因时，目的是产生最小的包含感兴趣表位的肽。这一原则与选择具有嵌套表位的肽时采用的原则如果不相同也是类似的。然而，对于人工的多表位肽，最小化的目的与在多表位蛋白质的表位间整合任意间隔序列的需要相平衡。例如，可以引入间隔氨基酸残基以避免连接表位(被免疫系统识别的表位，不存在于靶抗原中，且只由人工并列表位产生)，或辅助表位间的裂解，从而增强表位呈递。通常应当避免连接表位，因为接受者可能对非天然表位产生免疫应答。特别关注的是身为“决定簇表位”的连接表位。决定簇表位可能导致强烈的应答，从而使对其它表位的免疫应答减低或抑制。
7.)当同一靶蛋白的多个变体的序列存在时，也可以基于它们的保守性选择潜在的肽表位。例如，保守性的原则可定义为，HLAI类结合肽的全序列或II类结合肽的整个9-聚体核心，在被评价特异性蛋白质抗原的指定比例的序列中保守。
X.C.1.小基因疫苗
可以使用多种不同的允许同时传递多个表位的方法。编码本发明的肽的核酸是本发明的特别有用的实施方案。根据前一部分列出的指南，优选在包含在小基因中的表位。优选的施用编码本发明肽的核酸的方式使用了编码含有一个或多个本发明表位的肽的小基因构建体。
多表位小基因的应用如下文和Ishioka et al.，J.Immunol.162：3915-3925，1999；An，L.and Whitton，J.L.，J.Virol.71：2292，1997；Thomson，S.A.et al.，J.Immunol.157：822，1996；Whitton，J.L.et al.，J.Virol.67：348，1993；Hanke，R.et al.，Vaccine 16：426，1998所述。例如，可对多表位DNA质粒进行改造，所述质粒编码得自STEAP-1的携有超基元和/或基元的表位，PADRE
Figure A20048004342700941
通用辅助T细胞表位或得自STEAP-1的多个HTL表位(参见例如表V-XVIII和XXII至LI)，以及内质网转运信号序列。疫苗也可以包括得自其它TAA的表位。
多表位小基因的免疫原性可以在转基因小鼠中确定，以评估CTL诱导的针对受试表位的反应。另外，体内DNA编码的表位的免疫原性可以与特定CTL系针对用DNA质粒转染的靶细胞的体外反应相关联。因此，这些实验可以表明小基因用于：1.)产生CTL应答以及2.)诱导的CTL识别表达编码表位的细胞。
例如，为产生编码选择表位的DNA序列(小基因)以在人细胞中表达，表位的氨基酸序列可以被反向翻译。人密码子使用表可以用来指导每个氨基酸的密码子选择。这些编码表位的DNA序列可以直接连接，使得当被翻译时可产生连续的多肽序列。为了最优化表达和/或免疫原性，可以向小基因设计中加入附加的元件。可以反向翻译并包含在小基因序列中的氨基酸序列实例包括：HLAI类表位，HLAII类表位，抗体表位，遍在蛋白化信号序列和/或内质网靶向信号。另外，CTL和HTL表位的HLA呈递可以通过包括合成的(例如多聚丙氨酸)或天然的与CTL或HTL表位相邻的侧翼序列来改善，这些含有表位的较大的肽也在本发明的范围内。
可以通过装配编码小基因正链和负链的寡核苷酸将小基因序列转化为DNA。可以在适宜的条件下用众所周知的技术合成、磷酸化、纯化和退火重叠寡核苷酸(长30-100个碱基)。寡核苷酸的末端可以用例如T4 DNA连接酶连接，这一合成的编码表位多肽的小基因可以克隆入一个所需的表达载体。
优选将本领域技术人员已知的标准调节序列包括在载体中以确保靶细胞中的表达。需要一些载体元件：具有下游克隆位点共小基因插入的启动子；有效终止转录的聚腺苷酸信号；大肠杆菌复制起点；以及大肠杆菌选择标记(如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。为此可采用多种启动子，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子，其它合适的启动子序列可参见例如美国专利5,580,859和5,589,466。
可能需要其它的载体修饰来优化小基因的表达和免疫原性。在一些情况下，有效的基因表达需要内含子，一个或多个合成或天然的内含子可以掺入小基因的转录区域。为增加小基因的表达，也可以考虑包括mRNA稳定序列和在哺乳动物细胞中复制所需的序列。
一旦选择了表达载体，将小基因克隆入启动子下游的多接头区域。将该质粒转化至适宜的大肠杆菌菌株，用标准技术制备DNA。用限制性图谱和DNA序列分析确定小基因的方向和DNA序列以及载体中包括的其它所有元件。含有正确质粒的细菌细胞可以保存为主细胞库和工作细胞库。
另外，免疫刺激序列(ISS或CpG)似乎在DNA疫苗的免疫原性中起作用。如果需要提高免疫原性，这些序列可以包括在载体中，位于小基因编码序列的外部。
在一些实施方案中，可以采用允许同时产生小基因编码表位和第二种蛋白质(包括在内以提高或降低免疫原性)的双顺反子表达载体。共表达可以有益地提高免疫应答的蛋白质或多肽的实例包括：细胞因子(如IL-2，TL-12，GM-CSF)、细胞因子诱导分子(如LeIF)、共刺激分子，或对于HTL应答而言的pan-DR结合蛋白(PADRETM，Epimmune，San Diego，CA)。辅助(HTL)表位可以与细胞内靶向信号相结合，并与表达的CTL表位分开表达；这允许指引HTL表位进入与CTL表位不同的细胞区室。必要时，这有助于HTL表位更有效地进入HLAII类途径，因此改善HTL诱导。与HTL或CTL诱导相反，通过共表达免疫抑制分子(例如TGF-β)特异性降低免疫应答在某些疾病中是有益的。
可以通过例如在大肠杆菌中发酵然后纯化来制备治疗量的质粒。根据众所周知的技术，将工作细胞库的等分试样用于接种生长培养基，生长至在摇瓶或生物反应器中饱和。质粒DNA可以用标准的生物分离技术纯化，例如QIAGEN Inc.(Valencia，Califomia)提供的固相阴离子交换树脂。如果需要，可以用凝胶电泳或其它方法从开环和线性形式中分离出超螺旋DNA。
可以用多种制剂制备纯化的质粒DNA用于注射。最简单是将冷冻的DNA在无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中重建。已知为“裸DNA”的该方法目前在临床试验中被用于肌内(IM)注射。为使小基因DNA疫苗的免疫治疗效果最大化，需要一个可选择的配制纯化质粒DNA的方法，已经描述了多种方法，也可以使用新技术。阳离子脂质、糖脂和融合脂质体也可以用在配方中(参见例如WO93/24640；Mannino&Gould-Fogerite，BioTechniques 6(7)：682(1988)；美国专利5,279,833；WO91/06309；和Felgner，et al.，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 84：7413(1987))。另外，总称为保护性、有活性的、非凝聚化合物(PINC)的肽和化合物可以与纯化的质粒DNA复合以影响例如稳定性、肌内分散或到达特定器官或细胞类型的变量。
靶细胞致敏可以用作小基因编码的CTL表位的表达和HLAI类呈递的功能性分析。例如，将质粒DNA引入适宜用作标准CTL铬释放试验的靶的哺乳动物细胞系。所用转染方法将依赖于最终的配方。电穿孔可以用于“裸”DNA，而阳离子脂质允许介导体外转染。表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒可以被共转染以用荧光激活的细胞分选(FACS)富集转染的细胞。接着将这些细胞用硌-51(51Cr)标记，并用作表位特异性CTL系的靶细胞；通过51Cr释放检测到的细胞裂解暗示小基因编码的CTL表位的产生和HLA呈递。可以用与评估HTL活性类似的方式评估HTL表位的表达。
体内免疫原性是功能性测定小基因DNA配方的第二种方法。用DNA产物免疫表达合适的人HLA蛋白的转基因小鼠。给药剂量和途径依赖于配方(例如，PBS中的DNA用IM，与脂质复合的DNA用腹膜内(i.p.)注射)。免疫后21天，收集脾细胞并在编码每个被测定表位的肽的存在下重新刺激一周。然后，对于CTL效应细胞，用标准技术对荷载有肽的经51Cr标记的靶细胞的细胞裂解进行分析。用带有与小基因编码的表位相对应的肽表位的HLA致敏的靶细胞的裂解显示了DNA疫苗用于体内诱导CTL的功能。用类似方式在转基因小鼠内确定HLT表位的免疫原性。
可选地，核酸可以用所述的弹道传递方式给药，例如美国专利5,204,253。采用这一技术，施用仅含有DNA的颗粒。在进一步可选的实施方案中，DNA可以被粘附在颗粒上，例如金粒。
小基因也可以用现有技术中已知的其它细菌或病毒传递系统传递，例如，编码本发明表位的表达构建体可以掺入病毒载体，例如痘苗病毒。
X.C.2.CTL肽与辅助肽的组合
含有本发明CTL肽的疫苗组合物可以被修饰，例如类推以提供需要的属性，例如提高的血清半寿期、扩大的种群覆盖率或提高的免疫原性。
例如，肽诱导CTL活性的能力可以通过将肽与含有至少一个可以诱导T辅助细胞应答的表位的序列连接而提高。尽管CTL肽可以直接与T辅助肽相连，通常是CTL表位/HTL表位偶联物通过间隔分子相互连接。间隔分子通常由相对较小的中性分子，如在生理条件下基本上不带电的氨基酸或氨基酸类似物组成。间隔分子通常选自例如Ala，Gly或其它非极性氨基酸或中性极性氨基酸的中性间隔分子。可以理解：任选的间隔分子不必由相同的残基组成，因此可以是异源或同源的寡聚体。当出现时，间隔分子通常至少有1或2个残基，更常见的是3到6个残基，有时为10个或更多的残基。CTL肽表位可以与T辅助肽表位直接连接或通过间隔分子在CTL肽的氨基端或羧基端连接。免疫原性肽或T辅助肽的氨基端均可被酰化。
在某些实施方案中，T辅助肽被大多数基因不同的种群中存在的T辅助细胞识别。这可以通过选择结合许多、大多数或所有的HLAII类分子的肽来完成。结合许多HLAII类分子的氨基酸的例子包括来自抗原的序列，例如破伤风类毒素830-843(QYIKANSKFIGITE；SEQ ID NO：64)、恶性疟原虫环孢子(CS)蛋白378-398(DIEKKIAKMEKASSVFNWNS；SEQ ID NO：65)以及链球菌18kD蛋白116-131(GAVDSILGGVATYGAA；SEQ ID NO：66)。其它的实例包括携有DR1-4-7超基元或任一DR3基元的肽。
可选地，可以松弛HLA限制形式，用自然界中没有发现的氨基酸序列制备能够刺激T辅助淋巴细胞的合成肽(参见例如PCT公开号W95/07707)。这些被称为Pan-DR-结合表位的合成化合物(例如PADRETM，Epimmune，Inc.，San Diego，CA)最优选被设计为与大多数HLA-DR(人HLA II类)分子结合。例如，pan-DR-结合表位肽具有通式：XKXVAAWTLKAAX(SEQ ID NO：67)，这里“X”指环己基丙氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸，以及为D-丙氨酸或L-丙氨酸，已经发现所述肽可以与大多数HLA-DR等位基因结合，并刺激大多数个体的T辅助淋巴细胞(不论其HLA类型如何)的应答。一个可选的pan-DR结合表位包含所有的“L”天然氨基酸，并可以以编码表位的核酸的形式提供。
HTL肽表位也可以被修饰来改变其生物特性。例如，它们可以被修饰为包含D-氨基酸来提高它们对蛋白酶的抗性，因此延长了它们的血清半寿期。或它们可以与其它分子，例如脂质、蛋白质、糖类等偶联以提高它们的生物活性。例如，T辅助肽可以与一个或更多棕榈酸链的氨基或羧基端连接。
X.C.3.CTL肽与T细胞引发剂的组合
在一些实施方案中，也许需要将至少一种能引发B淋巴细胞或T淋巴细胞的成分包括在本发明的药物组合物中。已经确定脂质是一种可以在体内引发CTL的试剂。例如，棕榈酸残基可以连接到赖氨酸残基的ε-和α-氨基基团，然后经由例如一个或更多个连接残基例如Gly，Gly-Gly-，Ser，Ser-Ser等连接到免疫原性肽上。脂化肽可以直接在微胶粒或颗粒中，掺入脂质体，或在如不完全弗氏佐剂的佐剂中乳化以进行给药。在优选的实施方案中，一种显著有效的免疫原性组合物含有与Lys的ε-和α-氨基基团结合的棕榈酸，其通过接头，例如Ser-Ser，与免疫原性肽的氨基端结合。
作为另一个脂质引发CTL应答的例子，大肠杆菌脂蛋白，例如与适合的肽共价连接的tripalmitoyl-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)可以用来引发病毒特异性的CTL(参见例如Deres et al.，Nature 342：561，1989)。本发明的肽可以与P3CSS偶联，例如，给予个体脂肽以特异性引发针对靶抗原的免疫应答。另外，由于中和抗体的诱导也可以用与P3CSS偶联的表位引发，两个这样的组合物可以联合使用从而更有效地引发体液和细胞介导的应答。
X.C.4.含有用CTL和/或HTL肽脉冲的DC的疫苗组合物
本发明的疫苗组合物实施方案包括给患者血液中的PBMC或从中分离的DC来自体外地施用携有表位的肽的混合物。可以使用有助于收集DC的药物，例如，ProgenipoietinTM(Pharmacia-Monsanto，St.Louis，MO)或GM-CSF/IL-4。在用肽脉冲DC后，以及再输注于患者之前，冲洗DC以去除未结合的肽。在该实施方案中，疫苗包含肽脉冲的DC，在其表面存在与HLA分子复合的脉冲肽表位。
DC可以用肽混合物来自体外地脉冲，其中一些刺激针对STEAP-1的CTL应答。任选地，辅助T细胞(HTL)肽，例如天然或人工松弛限制的HLAII类肽，可以包括在内以便于CTL应答。因此本发明的疫苗可用来治疗表达或过表达STEAP-1的癌症。
X.D.过继免疫疗法
抗原性STEAP-1相关肽也可用于来自体外地引发CTL和/或HTL应答，得到的CTL或HTL细胞可以用来治疗那些对其它常规形式的治疗没有反应，或对治疗性疫苗肽或本发明的核酸没有反应的肿瘤患者。通过在组织培养物中将患者的或遗传相容的CTL或HTL前体细胞与抗原呈递细胞(APC)来源，如树状细胞，和适宜的免疫原性肽共同保温，诱导对特定抗原的来自体外的CTL或HTL应答。在合适的保温时间后(通常大约7-28天)，其中前体细胞被活化并扩展为效应细胞，将细胞回输至患者体内，在那里它们将破坏(CTL)或促进破坏(HTL)它们特异性的靶细胞(例如，肿瘤细胞)。转染的树状细胞也可以用作抗原呈递细胞。
X.E.为了治疗或预防的目的施用疫苗
本发明的药物和疫苗组合物通常用于治疗和/或预防表达或过表达STEAP-1的癌症。在治疗性应用中，以足够引发针对抗原的有效B细胞、CTL和/或HTL应答，和治愈或至少部分遏制或减缓症状和/或并发症的量，给患者施用肽和/或核酸组合物。足够完成这些目的的量被定义为“治疗有效剂量”。这种应用的有效量取决于例如，施用的特定组合物、给药的方式，被治疗疾病的阶段和严重程度、患者的体重和一般健康状况以及开药医师的判断。
对于药物组合物，本发明的免疫原性肽或编码它们的DNA，通常被给与已经患有表达STEAP-1的肿瘤的个体。肽或编码它们的DNA可以单独或作为一个或多个肽序列的融合物给药。可以单独用免疫原性肽或适当时与其它疗法，如外科手术联合治疗患者。
对于治疗性应用，给药通常应该从STEAP-1相关癌的首次诊断开始。然后加强剂量直到至少症状实质上减轻以及一段时间以后。给与患者的疫苗组合物的实施方案(即包括但不限于如肽混合物，多表位多肽，小基因或TAA-特异性CTL或脉冲树状细胞的实施方案)可依照疾病的阶段或患者的健康状态调整。例如，在表达STEAP-1的肿瘤患者中，含有STEAP-1-特异性CTL的疫苗可以在患有更高阶段疾病的患者体内，比可选择的实施方案更有效地杀灭肿瘤细胞。
提供一定量的通过足以有效刺激细胞毒T细胞应答的给药模式传递的肽表位一般是重要的；根据本发明的此实施方案，也可提供刺激辅助T细胞应答的组合物。
起始治疗性的免疫剂量通常在单位剂量的范围内，较低值大约为1，5，50，500或1,000μg，较高的值约为10,000；20,000；30,000或50,000μg。人的剂量值范围典型地为大约500μg到大约50,000μg每70公斤患者体重。遵照数周至数月的加强方案，大约1.0μg到50,000μg的加强剂量的肽，依照通过测量从患者血液中获得的CTL和HTL比活性确定的患者应答和情况而给药。给药应该持续直到至少临床症状或实验检测表明肿瘤已经被除去或缩小并达一段时间之后。根据本领域已知的方法学调整剂量、给药途径和剂量时间表。
在某些实施方案中，本发明的肽和组合物在严重的疾病状态中使用，即威胁生命的或可能威胁生命的情形。在这种情形下，本发明的优选组合物中存在最小量的外来物质和肽的相对无毒的性质的结果，治疗医师可能和觉得需要相对于规定的剂量给予实质上超量的肽组合物。
本发明的疫苗组合物也能被单纯用作预防剂。通常起始预防免疫的利量为单位剂量，较低值约为1，5，50，500或1000μg，较高值约为10,000；20,000；30,000或50,000μg。通常的人用剂量值为大约500μg到大约50,000μg每70公斤患者体重。在首次施用疫苗后，以确定的大约4周至6个月的间隔，给予约1.0μg到50,000μg的加强剂量的肽。可以通过测量从患者的血样获得的CTL和HTL比活来评估疫苗的免疫原性。
治疗性处理的药物组合物可以非肠道、局部、口服、鼻饲、鞘内或局部(如乳膏或局部软膏)给药。优选地，药物组合物被非肠道给药，例如，静脉内、皮下、皮内或肌内给药。因此，本发明提供了含有溶解或悬浮在可接受载体，优选为含水载体中的免疫原性肽溶液的非肠道给药组合物。
可以采用多种含水载体，例如水、缓冲水、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些成分可用传统又众所周知的灭菌技术消毒，或进行无菌过滤。产生的水溶液可被包装以备使用或冻干，在给药之前将冻干的制剂与无菌溶液混合。
组合物可包含药物可接受的接近生理条件所需的辅助物质，如pH-调节和缓冲剂、渗透压调制剂、润湿剂、防腐剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨聚糖单十二酸酯、三乙醇胺油酸盐等。
本发明的肽在药物制剂中的浓度可以有很大的不同，即从占重量小于约0.1％，通常为或至少为大约2％到多达20％至50％或更多，而且将根据选择的特定给药模式，主要通过液体体积、粘度等进行选择。
组合物的人单位剂量形式通常包括在含有人单位剂量可接受载体的药物组合物中，在一个实施方案中，所述载体是含水载体，以本领域技术人员已知的用于将这种组合物施用于人类的体积/用量进行给药(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，17Edition，A.Gennaro，Editor，MackPublishing Co.，Easton，Pennsylvania，1985)。例如，对于一个70公斤的患者，起始免疫的肽剂量可为大约1到大约50,000μg，通常为100-5,000μg。例如，对于核酸来说，可以使用在多个位点以0.5-5毫克的量IM(或SC或ID)给药的裸核酸形式的表达载体进行初次免疫。核酸(0.1到1000μg)也能用基因枪给药。在3-4周的保温期后，施用加强剂量的药物。加强剂量可以是以5×107到5×109pfu剂量给药的重组禽痘病毒。
对于抗体，治疗通常包括抗STEAP-1抗体制剂经由多种可接受的给药途径，例如静脉内注射(IV)的重复给药，剂量范围通常约为0.1到约10mg/kg体重。大体上，每周剂量为10-500mg MAb是有效的并能被较好耐受。而且，约为4毫克/公斤患者体重的起始IV荷载剂量，接着每周大约2毫克/公斤IV剂量的抗STEAP-1 MAb制剂代表了可接受的剂量方案。如本领域熟练技术人员所知，各种因素能影响特定病例的理想剂量。这些因素包括例如组合物的半寿期、Ab的结合亲和力、物质的免疫原性、患者中STEAP-1的表达程度、STEAP-1抗原循环流出的程度、所需的稳态浓度水平、治疗的频率和与本发明治疗方法联合使用的化疗或其它试剂的影响、以及特定患者的健康状态。非限制的优选人单位剂量为例如：500μg-1mg，1mg-50mg，50mg-100mg，100mg-200mg，200mg-300mg，400mg-500mg，500mg-600mg，600mg-700mg，700mg-800mg，800mg-900mg，900mg-1g或1mg-700mg。在某些实施方案中，剂量范围为2-5mg/kg体重，例如接着施用1-3mg/kg的每周剂量；0.5mg，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10mg/kg体重，接着例如在2，3或4个星期中施用每周剂量；0.5-10mg/kg体重，例如在2，3或4个星期中施用每周剂量；每周225，250，275，300，325，350，375，400mg/m2身体表面积；每周1-600mg/m2身体表面积；每周225-400mg/m2身体表面积；然后可以实行2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多周的每周剂量。
在一个实施方案中，多核苷酸的人单位剂量形式包含能提供任何治疗效果适当剂量范围或有效量。如本领域技术人员所知，治疗效果取决于多个因素，包括多核苷酸序列、多核苷酸的分子量和给药途径。通常由医师或其它的保健专业人士根据本领域已知的多种参数，如症状严重程度、患者病史等来选择剂量。通常，对大约20个碱基的多核苷酸而言，剂量值范围可选自例如独立挑选的下限，如大约0.1，0.25，0.5，1，2，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，200，300，400或500mg/kg直至独立挑选的比下限大的上限，如大约60，80，100，200，300，400，500，750，1000，1500，2000，3000，4000，5000，6000，7000，8000，9000或10,000mg/kg。例如，剂量可能为大约下列任何一项：0.1至100mg/kg，0.1至50mg/kg，0.1至25mg/kg，0.1至10mg/kg，1至500mg/kg，100至400mg/kg，200至300mg/kg，1至100mg/kg，100至200mg/kg，300至400mg/kg，400至500mg/kg，500至1000mg/kg，500至5000mg/kg或500至10,000mg/kg。通常，与更直接地将核酸应用于生病组织相比，非肠道途径给药需要较高剂量的多核苷酸，增加长度的多核苷酸也是如此。
在一个实施方案中，人单位剂量形式的T细胞含有能提供任意治疗效果的适当剂量范围或有效量。如本领域普通技术人员所知，治疗效果依赖于多个因素。通常由医师或其它的保健专业人士根据已知的多种参数，如症状严重程度，患者病史等来选择剂量。剂量可以为大约104个个细胞至大约106个细胞，大约106个细胞至大约108个细胞，大约108个至大约1011个细胞，或大约108个至大约5×1010个细胞，也可以为大约106个细胞/m2至大约1010个细胞/m2，或大约106个细胞/m2至大约108个细胞/m2。
本发明的蛋白质和/或编码蛋白质的核酸也可以通过脂质体给药，所述脂质体可用于：1)使蛋白质靶向特定的组织，如淋巴组织；2)选择性靶向疾病细胞；或3)增加肽组合物的半寿期。脂质体包括乳剂、泡沫、微胶粒、不溶解的单层、液晶、磷脂分散剂、薄片层等。在这些制剂中，被传递的肽可作为脂质体的一部分单独地、或与能和淋巴细胞中普遍存在的受体结合的分子，例如结合CD45抗原的单克隆抗体，或与其它治疗性的或免疫原性组合物联合被掺入。因此，用本发明所需的肽填充或修饰的脂质体可被递送到淋巴细胞的位点，在那儿脂质体输送肽组合物。本发明所用的脂质体由标准的小泡形成脂质形成，通常包括中性和带负电的磷脂和固醇，例如胆固醇。脂质的选择通常考虑例如，脂质体大小、血流中脂质体的酸易变性和稳定性。多种方法可用来制备脂质体，如Szoka et al.，Ann Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)和美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369所描述的。
为靶向免疫系统的细胞，掺入脂质体的配体包括例如特异性针对所需免疫系统细胞的细胞表面决定簇的抗体或其片段。含肽脂质体悬浮液可以静脉内、局部、外用等方式，以根据给药方式、传递的肽和治疗疾病的阶段调整的剂量给药。
对于固体组合物，可采用传统的无毒固体载体，包括例如药学等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，通过组合任意通常采用的赋形剂，例如前面所列的载体，和通常为10％-95％的活性成分，即一种或多种本发明的肽，更优选其浓度为25％-75％，来制备药物可接受的无毒组合物。
对于气溶胶给药，免疫原性肽优选以精细分开的形式与表面活性剂和推进剂一起应用。肽通常的重量百分比为大约0.01％-20％，优选大约1％-10％。表面活性剂当然必须是无毒的，并优选可溶解在推进剂中。这类试剂的代表是含有6到22个碳原子的脂肪酸，例如，己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric和油酸与多羟基脂肪醇或其环酐形成的酯或部分酯。可以采用混合酯，如混合或天然的甘油脂。表面活性剂可构成组合物重量的大约0.1％-20％，优选大约0.25-5％。组合物的平衡通常使用推进剂。必要时，载体也可包括在内，如用于鼻内传递的卵磷脂。
XI.)STEAP-1诊断和预测的实施方案
如本文公开的，STEAP-1多核苷酸、多肽、反应性细胞毒T细胞(CTL)、反应性辅助T细胞(HTL)和抗多肽抗体被用于广为人知的诊断、预测和治疗性的分析，该分析用于确定与异常细胞生长有关的疾病，如癌症，特别是表I中所列的癌症(参见例如题为“正常组织和患者样品中STEAP-1的表达分析”的实施例中所述的组织表达特异性模式和在某些癌症中的过表达)。
STEAP-1可以类推至前列腺相关抗原PSA，PSA是医疗实践者多年采用的识别和监测前列腺癌存在的原型标记(参见例如Merrill et al.，J.Urol.163(2)：503-5120(2000)；Polascik et al.，J.Urol.Aug；162(2)：293-306(1999)and Fortier et al.，J.Nat.Cancer Inst.91(19)：1635-1640(1999))。在类似的上下文中也可以使用多种其它诊断标记，包括p53和K-ras(参见例如Tulchinsky etal.，Int J Mol Med 1999 Jul 4(1)：99-102 and Minimoto et al.，Cancer Detect Prey2000；24(1)：1-12)。因此，STEAP-1多核苷酸和多肽(以及用来识别这些分子存在的STEAP-1多核苷酸探针和抗STEAP-1抗体)和它们的特性的公开使本领域技术人员在与这些应用类似的方法，例如在多种用于确定癌症相关疾病的诊断试验中利用这些分子。
利用STEAP-1多核苷酸、多肽、反应性T细胞和抗体的诊断方法的典型实施方案与那些已经确立的利用例如PSA多核苷酸、多肽、反应性T细胞和抗体的诊断试验类似。例如，正如PSA多核苷酸被用作探针(例如在Northern分析中，参见例如Sharief et al.，Biochem.Mol.Biol.Int.33(3)：567-74(1994))和引物(例如在PCR分析中，参见例如Okegawa et al.，J.Urol.163(4)：1189-1190(2000))，以在监测PSA过表达或前列腺癌转移的方法中观察PSAmRNA的存在和/或水平。本文所述的STEAP-1多核苷酸可以用同样的方式检测STEAP-1的过表达或前列腺和其它表达该基因的癌症的转移。可选地，正如在监测PSA蛋白过表达的方法中，PSA多肽可用来生产针对PSA的特异性抗体，从而用来观察PSA蛋白的存在或水平(参见例如Stephan et al.，Urology 55(4)：560-3(2000))或前列腺细胞的转移(参见例如Alanen et al.，Pathol.Res.Pract.192(3)：233-7(1996))，本文所述的STEAP-1可以用来生产抗体，用来检测STEAP-1过表达或前列腺细胞和其它表达该基因的癌细胞的转移。
具体地，因为转移涉及到癌细胞从原始器官(例如肺或前列腺等)向身体不同区域(例如淋巴结)移动，确定生物样品中表达STEAP-1多核苷酸和/或多肽的细胞的存在的分析可以用来提供转移的证据。例如，当来自异常含有STEAP-1表达细胞的组织(淋巴结)的生物样品被发现包含STEAP-1表达细胞时，例如在LAPC4和LAPC9(分别分离自淋巴结和骨转移的异体移植物)中可见的STEAP-1表达时，这一发现预示了转移。
可选地，例如，当异常表达STEAP-1或以不同水平表达STEAP-1的生物样品中的细胞被发现表达STEAP-1或STEAP-1表达增强时(参见例如表I中所列癌症和患者样品中的STEAP-1表达等，如附图中所示)，STEAP-1多核苷酸和/或多肽可以用来提供癌症的证据。在这样的分析中，技术人员可以进一步希望通过检测生物样品中第二组织限制性标记(除STEAP-1之外)，例如PSA，PSCA等的存在来产生辅助的转移证据(参见例如Alanen et al.，Pathol.Res.Pract.192(3)：233-237(1996))。
使用免疫组化鉴定组织切片中STEAP-1多肽的存在，结果表明该组织中某些细胞的状态有所改变。本领域技术人员清楚地知道抗体探测癌细胞所表达多肽的能力可用于诊断疾病的存在、病程、进展和/或肿瘤的侵占性。所述抗体还可检测与相应非-恶性组织相比，癌细胞中的多肽的有所改变的分布。
鉴于疾病状态下亚细胞蛋白质定位有所改变的现象，STEAP-1多肽和免疫原性组合物也是有用的。细胞由正常改变为疾病状态导致细胞形态学的变化，并且常常与亚细胞蛋白质定位/分布的变化有关。例如，在正常细胞中以极性方式表达的细胞膜蛋白质在患病时有所改变，导致蛋白质以非-极性的方式分布于整个细胞表面。
通过使用免疫组化方法，以MUC1和Her2蛋白的表达阐明了在疾病状态下亚细胞蛋白质定位有所改变的现象。正常上皮细胞除了一些糖蛋白的核上定位外，还具有典型的MUC1顶端分布，而恶性损害经常表现出无极性的染色模式(Diaz et al.，The Breast Journal，7；40-45(2001)；Zhang et al.，ClinicalCancer Research，4；2669-2676(1998)：Cao，et al.，The Journal ofHistochemistry and Cytochemistry，45：1547-1557(1997))。此外，正常乳腺上皮细胞为Her2蛋白阴性，或者仅表现出基底外侧分布，而恶性细胞可在整个细胞表面表达蛋白质(De Potter，et al.，International Journal of Cancer，44；969-974(1989)：McCormick，et al.，117；935-943(2002))。或者，蛋白质分布可由仅定位于表面变为包括疾病状态下的弥散的胞质表达。用MUC1可观察到这样的例子(Diaz，et al.，The Breast Journal，7：40-45(2001))。
通过免疫组化方法检测到的细胞中蛋白质定位/分布的改变也能提供与某些治疗方式的有利性相关的有价值的信息。最后一点可由下述情况阐明：在正常组织中蛋白质可以是细胞内的，但在恶性细胞中却位于细胞表面；细胞表面定位使得细胞能顺利地接受基于抗体的诊断和治疗方案。当STEAP-1发生这种蛋白质定位改变时，STEAP-1蛋白和与其相关的免疫应答非常有用。因此，确定24P4C12是否发生亚细胞蛋白质定位改变的能力使STEAP-1蛋白和与其相关的免疫应答非常有用。使用STEAP-1组合物能使本领域技术人员作出重要的诊断和治疗决定。
当正常情况下不会产生STEAP-1的组织中出现了该多肽时，特异于STEAP-1的免疫组化试剂也可用于检测表达STEAP-1的肿瘤的转移。
正如PSA多核苷酸片段和多核苷酸变体被熟练技术人员用在监测PSA的方法中，STEAP-1多核苷酸片段和多核苷酸变体可以用类似的方式应用。特别是，监测PSA的方法中使用的典型PSA多核苷酸是由PSA cDNA序列片段组成的探针或引物。对此举例说明，PCR扩增PSA多核苷酸所用的引物必须包括比全长PSA序列短的序列以在多聚酶链反应中发挥功能。在PCR反应的上下文中，熟练技术人员通常制备多个不同的可以用作引物的多核苷酸片段以扩增感兴趣多核苷酸的不同部分或最优化扩增反应(参见例如Caetano-Anolles，G.Biotechniques 25(3)：472-476，478-480(1998)；Robertsonet al.，Methods Mol.Biol.98：121-154(1998))。另一这种片段应用的示例在题为“正常组织和患者样品中STEAP-1的表达分析”的实施例中提供，STEAP-1多核苷酸片段用作探针来显示癌细胞中STEAP-1的表达。另外，不同的多核苷酸序列通常还用作PCR和Northern分析中相应mRNA的引物和探针(参见例如Sawai et al.，Fetal Diagn.Ther.1996Nov-Dec 11(6)：407-13 and CurrentProtocols In Molecular Biology，Volume 2，Unit 2，Frederick M.Ausubel et aleds.，1995))。在高度严紧性的条件下，能够结合靶多核苷酸序列的多核苷酸片段和变体(例如图2中显示的STEAP-1多核苷酸或其变体)是有用的。
而且，含有可以被抗体或T细胞识别的表位的PSA多核苷酸被用于监测PSA的方法中，所述抗体或T细胞可以与该表位特异性结合。STEAP-1多肽片段和多肽类似物或变体也可以以类似的方式被利用。使用多肽片段或多肽变体生产抗体(如抗PSA抗体或T细胞)的实践是本领域典型的，可以使用多种系统，例如被实践者利用的融合蛋白(参见例如Current Protocols InMolecular Biology，Volume 2，Unit16，Frederick M.Ausubel et al.，eds.，1995)。在此上下文中，每个表位的功能为提供与抗体或T细胞反应的结构。典型地，为产生针对感兴趣多肽不同部分的免疫应答，熟练技术人员可生产多种不同的多肽片段(参见例如美国专利5,840,501和美国专利5,939,533)。例如，优选利用含有一个本文讨论的STEAP-1基元或携有基元的亚序列的多肽，本领域熟练技术人员基于本领域可以用到的基元能容易地鉴定所述多肽。这种情况下，只要多肽片段、变体或类似物含有能够产生特异性针对靶多肽序列(例如图3中所示的STEAP-1多肽)的抗体或T细胞的表位，它们通常是有用处的。
如本文所示，STEAP-1多核苷酸和多肽(以及用来识别这些分子存在的STEAP-1多核苷酸探针和抗STEAP-1抗体或T细胞)表现出特定的性质，使它们在诊断例如表I所列的癌症中是有用的。为了评估本文描述的疾病例如前列腺癌的存在或开始，检测STEAP-1基因产物存在的诊断试验被用于鉴定患者以进行预防性措施或进一步监测，正如利用PSA所成功实现的。而且，在例如基于单独检测PSA不能作出对前列腺起源转移的明确诊断等情况下，这些材料满足了现有技术对具有和PSA相似或补充性质的分子的需要(参见例如Alanen et al.，Pathol.Res.Pract.192(3)：233-237(1996))。因而，如STEAP-1多核苷酸和多肽的物质(以及用来识别这些分子存在的STEAP-1多核苷酸探针和抗STEAP-1抗体)需要被用来确定前列腺来源的转移。
最后，除了它们在诊断分析中的应用，本文公开的STEAP-1多核苷酸还有一些其它应用，例如它们在鉴定与癌发生相关的STEAP-1基因作图的染色体区域中的染色体异常中的应用(见下面题为“STEAP-1的染色体作图”的实施例)。而且，除了它们在诊断分析中的应用，这里公开的STEAP-1相关蛋白质和多核苷酸还具有其它的应用，例如在不明来源组织的法医鉴定方面的应用(参见例如Takahama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28；80(1-2)：63-9)。
另外，本发明的STEAP-1相关蛋白质或多核苷酸可用于治疗以高表达STEAP-1为特征的病理疾病。例如，图2或图3中的氨基酸或核酸序列，或它们的片段可用来产生对STEAP-1抗原的免疫应答。可采用与STEAP-1反应的抗体或其它分子来调制该分子的功能，因此提供治疗性的效益。
XII.)抑制STEAP-1蛋白的功能
本发明包括多种抑制STEAP-1与其结合配对物结合或与其它蛋白质结合的方法和组合物以及抑制STEAP-1功能的方法。
XII.A.)用细胞内抗体抑制STEAP-1
在一个方法中，通过基因转移技术将编码与STEAP-1特异性结合的单链抗体的重组载体引入表达STEAP-1的细胞。相应地，编码的单链抗STEAP-1抗体在细胞内表达，与STEAP-1蛋白结合并因此抑制其功能。生产这种细胞内单链抗体的方法是广为人知的。这种细胞内抗体，也被称为“内体(intrabodies)”，是特异性靶向细胞内的特定区室的，在治疗的抑制活性集中的地方提供控制。这一技术已经成功地应用于现有技术中(综述见Richardsonand Marasco，1995，TIBTECH vol.13)。内体已经表现出实质上减弱了其它冗余的细胞表面受体的表达(参见例如Richardson et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3137-3141；Beerli et al.，1994，J.Biol.Chem.289：23931-23936；Deshane et al.，1994，Gene Ther.1：332-337)。
单链抗体包括通过柔性接头多肽连接的重链和轻链可变区，并作为单个多肽被表达。任选地，单链抗体作为与轻链恒定区连接的轻链可变区片段被表达。通过生物工程技术将熟知的细胞内运输信号引入编码这种单链抗体的重组多肽载体，以使内体精确靶向所需的胞内区室。例如通过生物工程技术在靶向内质网的内体中掺入前导肽，和任选的如KDEL氨基酸基元的C端ER保留信号。在欲在细胞核内发挥活性的内体中通过生物工程技术加入核定位信号。为了将内体限制在质膜的胞质溶胶面，脂质组成成分被加入内体。内体也可以用于在胞质溶胶中发挥功能，例如胞质溶胶内体被用于隔离胞质溶胶内的因子，从而抑制它们向它们天然的细胞位置转运。
在一个实施方案中，内体被用于捕获细胞核内的STEAP-1，从而抑制其在细胞核内的活性。为了到达所需的靶，核靶向信号被引入这种STEAP-1内体。设计这种STEAP-1内体来与特定的STEAP-1结构域结合。在另一实施方案中，与STEAP-1蛋白特异性结合的胞质溶胶内体被用于抑制STEAP-1进入细胞核，从而抑制其在细胞核内发挥生物活性(例如抑制STEAP-1与其它因子形成转录复合物)。
为了特异性介导这种内体在一定细胞内的表达，将内体的转录置于合适的肿瘤特异性启动子和/或增强子的调控下。例如，为了使内体表达特异性靶向前列腺，可以利用PSA启动子和/或增强子(参见例如美国专利5,919，652，1999年7月6日出版)。
XII.B.)用重组蛋白质抑制STEAP-1
在另一方法中，重组分子与STEAP-1结合并因此抑制STEAP-1的功能。例如，这些重组分子防止或抑制STEAP-1与其结合配对物靠近/结合或与其它蛋白质结合。例如，这种重组分子可以包括例如STEAP-1特异性抗体分子的活性部分。在一个特定的实施方案中，STEAP-1结合配对物的STEAP-1结合结构域被改造成二聚体融合蛋白，因此该融合蛋白包含2个与人IgG，如人IgG1的Fc部分连接的STEAP-1配体结合结构域。这种IgG部分可以包含例如CH2和CH3结构域以及铰链区，但是没有CH1结构域。这种二聚体融合蛋白以可溶解的形式给予患有与STEAP-1表达相关的癌症患者，籍此，该二聚体融合蛋白与STEAP-1特异性结合，并阻断STEAP-1与其结合配对物的相互作用。用已知的抗体连接技术将这种二聚体融合蛋白进一步与多聚体蛋白质组合。
XII.C.)抑制STEAP-1的转录和翻译
本发明也包含抑制STEAP-1基因转录的多种方法和组合物。类似地，本发明也提供了抑制STEAP-1 mRNA翻译成蛋白质的方法和组合物。
在一个方法中，抑制STEAP-1基因转录的方法包括使STEAP-1基因与STEAP-1反义多核苷酸接触。在另一方法中，抑制STEAP-1mRNA翻译的方法包括使STEAP-1 mRNA与反义多核苷酸接触。在另一方法中，STEAP-1特异性核酶被用来裂解STEAP-1 mRNA，从而抑制翻译。这种基于反义和核酶的方法也可以被导入STEAP-1基因的调节区，如STEAP-1启动子和/或增强子元件。类似地，能够抑制STEAP-1基因转录因子的蛋白质被用来抑制STEAP-1 mRNA转录。多种用于前述方法中的多核苷酸和组合物已经在上面描述。反义和核酶分子在抑制转录和翻译中的应用在现有技术中已经广为人知。
其它干扰STEAP-1转录活性的抑制STEAP-1转录的因子也可以用来治疗表达STEAP-1的癌症。类似地，干扰STEAP-1加工的因子也可用于治疗表达STEAP-1的癌症。利用这种因子的癌症治疗方法也在本发明的范围内。
XII.D.)治疗策略的一般性考虑
基因转移和基因治疗技术可以用来将治疗性多核苷酸分子转移到合成STEAP-1的肿瘤细胞中(即反义、核酶、编码内体的多核苷酸和其它的STEAP-1抑制分子)。现有技术中已知有多种基因治疗方法。可以用这些基因治疗方法将编码STEAP-1反义多核苷酸、核酶、能够干扰STEAP-1转录的因子等的重组载体传递到靶肿瘤细胞中。
上述的治疗方法可以与其它多种外科手术、化疗或放疗方案结合。使用本发明的治疗方法可以使化疗(或其它治疗)降低使用剂量以及/或降低治疗频率，这对所有患者特别是那些对化疗剂毒性无法较好耐受的患者有利。
可以用多种体外和体内分析系统评估特定组合物(例如，反义、核酸酶、内体)或这些组合物的组合的抗肿瘤活性。评估治疗活性的体外试验包括细胞生长试验，软琼脂试验和其它可以指示肿瘤增殖活动的试验，能够确定治疗性组合物抑制STEAP-1与其结合配对物结合程度的结合试验等等。
在体内，STEAP-1治疗性组合物的效果可以在合适的动物模型中评估。例如，可以采用异体的前列腺癌模型，其中人前列腺癌外植体或者继代移种的异体移植组织被引入无免疫应答的动物，例如裸鼠或SCID小鼠(Klein etal.，1997，Nature Mediane 3：402-408)。例如，PCT专利申请W098/16628和美国专利6,107,540中描述了多种人前列腺癌的异体移植物模型，所述模型能够重演原始肿瘤的发育，微转移，和疾病晚期阶段的骨转移特征的形成。用测量肿瘤形成抑制、肿瘤衰退或转移的试验可以预测功效。
评价细胞凋亡促进的体内试验有助于评估治疗性组合物。在一个实施方案中，可以检测用治疗性组合物治疗的含有肿瘤异体移植物的小鼠中是否存在细胞凋亡病灶，并与未治疗的携有异体移植物的对照小鼠相比较。被治疗小鼠的肿瘤中发现细胞凋亡病灶的程度提供了组合物治疗效果的指示。
在前述方法的实践中用到的治疗性组合物可以被配制成含有适于所需传递方法的载体的药物组合物。适合的载体包括当与治疗性组合物混合时，可保留治疗性组合物的抗肿瘤活性，且通常不与患者的免疫系统反应的任意物质。例子包括但不限于多种标准药物载体的任意一种，例如无菌磷酸缓冲盐水溶液，抑菌水等(一般参见Remington’s Pharmaceutical Sciences 16thEdition，A.Osal.，Ed.，1980)。
治疗制剂可以被溶解和通过任意能够将治疗组合物传递到肿瘤位点的途径给药。潜在有效的给药途径包括但并不限于：静脉内、非肠道、腹膜内、肌内、肿瘤内、皮内、器官内、邻位等。优选的静脉内注射的制剂包含保存在防腐抑菌水、无菌未防腐水中的治疗性组合物，和/或包含稀释于含有0.9％无菌氯化钠的聚氯乙烯或聚乙烯袋中供注射，USP的治疗性组合物。治疗性的蛋白质制品可以冻干，作为无菌粉末保存，优选在真空中保存，然后在注射前重新用抑菌水(含有防腐剂，例如苯甲醇)或无菌水重建。
用前述方法治疗癌症的剂量和给药方案将随着方法和靶癌症的改变而变化，且通常依赖于现有技术中所知的多种其它因素。
XIII.)STEAP-1调制剂的鉴定、表征和应用
鉴定和利用调制剂的方法
在一个实施方案中，进行筛选以鉴定能诱导或抑制特定表达分布图、抑制或诱导特定途径的调制剂，优选由此产生相关表型的调制剂。在另一个实施方案中，已经鉴定了在特定状态下重要的差异表达基因，进行筛选以鉴定改变单独的基因表达(无论是增加还是降低)的调制剂。在另一个实施方案中，进行筛选以鉴定改变差异表达基因所表达产物的生物功能的调制剂。另外，已经鉴定了特定状态下基因的重要性，进行筛查以鉴定结合和/或调制基因产物的试剂。
此外，筛选对候选试剂反应的基因。鉴定出调制剂(那些抑制癌症表达模式从而导致正常表达模式，或导致如正常组织中的基因表达的癌症基因的调制剂)之后，进行筛选来鉴定那些对试剂反应而被特异性调制的基因。比较正常的组织和用药剂治疗过的癌症的表达分布图，揭示了那些不能在正常组织或癌组织中表达，但可以在经药剂治疗过的组织表达的基因，反之亦然。用本文描述的方法鉴定这些药剂-特异性序列并将其用于癌症基因或蛋白质。特别地，这些序列和它们编码的蛋白质被用于标记或鉴别用药剂治疗过的细胞。除此之外，生产针对药剂诱导的蛋白的抗体，并用于将新疗法靶向经治疗的癌症组织样品。
调制剂相关的鉴定和筛选试验：
基因表达相关试验
本发明的蛋白质、核酸和抗体可用于筛选试验。癌症-相关蛋白质、抗体、核酸、修饰的蛋白质和含有这些序列的细胞可用于筛选试验，例如评价候选药物对“基因表达分布图”、多肽表达分布图或生物功能的改变的影响。在一个实施方案中，表达分布图优选与高通量的筛选技术联合应用，以便用候选药剂治疗后追踪监测基因表达的状况(如Davis，GF，et al.，J BiolScreen 7：69(2002)；Zlokarnik，et al.，Science 279：84-8(1998)；Heid，GenomeRes 6：986-94，1996)。
癌症蛋白质、抗体、核酸、修饰蛋白质和包含天然的或修饰的癌症蛋白质或基因的细胞被用于筛选试验。即，本发明包括筛选组合物的方法，该组合物调制癌症的表型或本发明的癌症蛋白质生理学功能。对基因本身进行或通过评估候选药物对“基因表达分布图”或生物功能的影响。在一个实施方案中，表达分布图优选与高通量的筛选技术联合应用，以便用候选药剂治疗后追踪监测基因表达的状况，参见Zlokamik，文献同上。
针对本发明的基因和蛋白质实行了多种试验。试验在各个核酸或蛋白质水平上进行。也就是说，鉴定出在癌症中上调的特定基因，筛选受试化合物调制基因表达或者结合本发明中的癌症蛋白质的能力。这种情况下的“调制”包括基因表达的提高或降低。优选的调制量依赖于癌症中正常组织对癌组织的基因表达的初始变化，变化至少是10％，优选50％，更优选为100-300％，在某些实施方案中达300-1000％或更高。因此，与正常组织相比，如果一个基因在癌组织中显示出4倍的增加，经常需要4倍的减少；同样地，与正常组织相比，在癌组织中10倍的减少经常需要被测试化合物表达的10倍目标值的增加。增加癌症中可见的基因表达类型的调制剂也是有用的，例如，在进一步分析中用作上调的靶标。
通过使用核酸探针和基因表达水平的量化来监测基因表达的量，或者，可选地，例如通过使用癌症蛋白质的抗体和标准的免疫测定监测基因产物本身。蛋白质组学和分离技术也可进行表达的量化。
鉴定修饰基因表达的化合物的表达监测
在一个实施方案中，同时监测多个个体的基因表达，即表达分布图。这些分布图典型地包括图2中的一个或多个基因。在该实施方案中，例如，在生物芯片上固定癌的核酸探针来检测并量化特定细胞中的癌序列。可选择地，可以用PCR。因此，可以使用微滴板上的一系列孔，其中所需的孔中分散有引物。然后进行PCR反应并对每个孔进行分析。
进行表达监测来鉴定能调制一个或多个癌相关序列表达的化合物，如图2中显示的多核苷酸序列。通常，在分析之前往细胞中加入受试调制剂。而且，也提供筛选来鉴定药剂，所述药剂能调制癌症、调制本发明的癌症蛋白质、与本发明的癌症蛋白质结合或者干扰本发明的癌症蛋白与抗体或其它结合配对物的结合。
在一个实施方案中，高通量的筛选方法包括提供含大量潜在治疗化合物(候选化合物)的文库。这种“组合化学文库”随后用一种或多种试验来筛选以鉴定显示出所需特征性活性的文库成员(特殊化合物种类或亚类)。如此鉴定的化合物可用作常规的“主导化合物”作为筛选用化合物或治疗剂。
在某些实施方案中，筛选组合文库中潜在的能与癌症多肽结合或能调制活性的调制剂。按照惯例，通过鉴定具有一些所需性质或活性，例如抑制活性的化合物(被称为主导化合物)，制备主导化合物的变体，以及评估这些变体化合物的特性和活性，可产生新的有可利用性质的化学个体。通常，采用高通量筛查(HTS)方法来进行这种分析。
如上所述，基因表达监测可便利地用于检验候选调制剂(例如蛋白质、核酸或小分子)。加入候选药剂后，使细胞保温一段时间，要分析的含有靶序列的样品被加入生物芯片。
如果需要，用已知的技术制备靶序列。例如，用已知的裂解缓冲液等处理样品以裂解细胞，电穿孔，适当时进行纯化和/或扩增如PCR。例如，进行标记物与核酸共价连接的体外转录。通常，核酸用生物素-FITC或PE，或用cy3或cy5标记。
靶序列可以用例如荧光，化学发光物质，化学药品，或放射性信号标记，从而提供检测靶序列与探针的特异性结合的方式。标记也可以是酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，当提供合适的底物时，会产生可检测的产物。可选地，该标记是被标记的化合物或小分子，例如酶抑制剂，该抑制剂与酶结合但并不被其催化或改变。该标记也可以是组成成分或化合物，例如与链霉亲和素特异性结合的表位标记或生物素，至于生物素的例子，如上所述标记链霉亲和素，从而提供针对结合的靶序列的可测信号。未结合的经标记链霉亲和素通常在分析之前除去。
如本领域技术人员所知，这些试验可以是直接的杂交试验或可以包括“夹心试验”，包括使用多种探针，如美国专利5,681,702；5,597,909；5,545,730；5,594,117；5,591,584；5,571,670；5,580,731；5,571,670；5,591,584；5,624,802；5,635,352；5,594,118；5,359,100；5,124,246；和5,681,697中所略述的。在这一实施方案中，通常如上文所述制备靶核酸，然后在使杂交复合物形成的条件下，加入含有大量核酸探针的生物芯片中。
本发明中运用了多种杂交条件，包括如上指出的高度、中度和低度严紧性条件。试验通常在严紧性条件下进行，使只有当靶存在时才能形成标记探针杂交复合物。可以通过调整热力学可变的步骤参数来控制严紧度，包括但不限于温度、甲酰胺浓度、盐浓度、离液序列高的盐浓度pH、有机溶剂浓度等。这些参数也可以用来控制非特异性结合，如美国专利5,681,697中大体指出的。因此，在较高严紧度条件下进行某些步骤来降低非特异性结合是令人满意的。
本文简述的反应可以经多种途径完成。反应成分可以以不同的顺序同时或相继加入，下面有略述的优选的实施方案。另外，反应可以包括多种其它试剂。包括盐、缓冲液、中性蛋白质(如白蛋白)、去污剂等，可以用来促进最佳的杂交和检测，和/或降低非特异性或背景相互作用。也可以合适地应用其它提高试验效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂，核酶抑制剂，抗微生物试剂等，这取决于样品的制备方法和靶的纯度。分析试验数据来确定不同基因的表达水平，以及不同状态间的表达水平改变，形成基因表达分布图。
生物活性相关试验
本发明提供了鉴定或筛选调制本发明中癌症相关基因或蛋白质活性的方法。这些方法包括在含有本发明癌症蛋白质的细胞中加入如前文详细说明的受试化合物，细胞含有编码本发明癌症蛋白质的重组核酸。在另一实施方案中，在大量细胞中检测候选制剂库。
一方面，试验在生理学信号存在或不存在或之前或之后暴露的情况下评估，上述信号包括例如激素、抗体、肽、抗原、细胞因子、生长因子、作用潜力、包括化疗、放疗、致癌物质或其它细胞(即细胞-细胞接触)的药剂。在另一例子中，鉴定在细胞周期的不同阶段进行。调制本发明基因或蛋白质的化合物被以这种方式鉴别出来。具有药学活性的化合物能够增强或干扰本发明癌症蛋白质的活性。一旦被鉴定，评估类似的结构来识别化合物的关键结构特征。
在一个实施方案中，提供了调制(如抑制)癌细胞分裂的方法；该方法包括给与癌症调制剂。在进一步的实施方案中，提供了治疗癌症细胞或患癌症个体的方法；该方法包括施用癌症调制剂。
在一个实施方案中，提供了调制表达本发明基因的细胞状态的方法。本文使用的状态包括为本领域所接受的参数，例如细胞的生长、增殖、存活，器官功能，细胞凋亡，衰老，定位，酶活性，信号传导等。在一个实施方案中，癌症抑制剂是前文讨论的抗体。在另一实施方案中，癌症抑制剂是反义分子。如本文所述，细胞生长、增殖和转移的试验是本领域熟练技术人员已知的。
鉴定调制剂的高通量筛查
鉴定合适调制剂的试验应当是高通量筛选。因此，优选的试验检测癌症基因转录的增强或抑制，多肽表达的抑制或增强，和多肽活性的抑制和增强。
在一个实施方案中，高通量筛查方法中评估的调制剂是蛋白质，通常为天然蛋白质或天然蛋白质的片段。因此，利用例如含有蛋白质的细胞提取物，或随机的或直接消化的蛋白质细胞提取物。通过这种方式，制备蛋白质文库供本发明的方法筛选。在该实施方案中特别优选的是细菌，真菌，病毒，以及哺乳动物蛋白质文库，优选后者，特别优选人蛋白质。特别有价值的检测化合物靶向靶所属的蛋白质种类，例如酶的底物，或配体和受体。
用软琼脂生长和集落形成来鉴定和表征调制剂
正常细胞需要粘附于固体基质上生长。当细胞被转化，它们失去这一表型，并脱离基质生长。例如，转化的细胞可以在搅动的悬浮培养物或悬浮的半固态培养基，如半固态琼脂或软琼脂上生长。当用肿瘤抑制基因转染转化的细胞时，可以重新建立正常的表型并再次需要吸附于固体基质生长。试验中软琼脂生长或集落形成用来鉴定癌症序列的调制剂，当在宿主细胞中表达时，所述调制剂抑制异常细胞的增殖和分化。调制剂降低或消除宿主细胞在固态或半固态培养基例如琼脂中悬浮生长的能力。
悬浮试验中的软琼脂生长或集落形成技术描述于Freshney，Culture ofAnimal Cells a Manual ofBasic Technique(3rd ed.，1994)。也可参见Garkavtsevet al.，(1996)，文献同上的方法部分。
评估接触抑制和生长密度限制来鉴定和表征调制剂
正常细胞通常以平铺和有组织的方式在细胞培养物中生长直至它们接触到其它的细胞。当细胞相互接触时，它们被接触抑制并停止生长。然而转化的细胞并不受接触抑制，且继续生长至高密度无规则的病灶。因此，与相应的正常细胞相比，转化的细胞可生长至一个更高饱和度的密度。这可以通过无规单层细胞或细胞集落的形成在形态学上检测出来。可选地，在饱和密度下，(3H)-胸苷的标记指数被用来检测生长的密度限制。类似地，MTT或Alamar蓝实验可以揭示细胞的增殖能力和调制剂对其影响的能力，参见Freshney(1994)，文献同上。当用肿瘤抑制基因转染转化的细胞后，可以产生正常的表型，变为受接触抑制并生长为较低的密度。
在这一实验中，饱和密度下的3H-胸苷标记指数是检测生长密度限制的优选方法。用癌症相关序列转染转化的宿主细胞，并在非限制培养基的条件下以饱和密度生长24小时。通过掺入cpm确定用3H-胸苷标记的细胞的百分比。
将不依赖于接触的生长用来鉴定癌症序列，所述序列导致异常的细胞增殖和转化。调制剂可以降低或消除不依赖于接触的生长，使细胞恢复正常表型。
评估生长因子或血清依赖性以鉴定和表征调制剂
与其正常配对物相比，转化细胞具有较低的血清依赖性(参见例如Temin，J.Natl.CancerInst.37：167-175(1966)；Eagle et al.，J.Exp.Med 131：836-879(1970))；Freshney，文献同上。这部分是由于转化细胞释放的多种生长因子。可以比较转化宿主细胞与对照细胞的生长因子和血清依赖性水平。例如，在鉴定和表征调制本发明的癌症相关序列的化合物的方法中监测细胞的生长因子和血清依赖性水平。
用肿瘤特异性的标记水平来鉴定和表征调制剂
与其正常配对物相比，肿瘤细胞释放某些因子(下文称为“肿瘤特异性标记”)的量增加。例如，人神经胶质瘤释放了比正常脑细胞增高的纤溶酶原激活物(PA)(参见例如Gullino，Angiogenesis，Tumor Vasculari-zation，andPotential Interference with Tumor Growth，in Biological Responses in Cancer，pp.178-184(Mihich(ed.)1985))。类似地，肿瘤细胞释放的肿瘤血管生成因子(TAF)比其正常配对物增高。(参见例如Folkman，Angiogenesis and Cancer，Sem CancerBiol.(1992))，而内皮细胞瘤释放bFGF(Ensoli，B et al)。
多种检测这些因子释放的技术由Freshney(1994)，文献同上描述。也可参见Unkless et al.，J.Biol.Chem.249：4295-4305(1974)；Strickland&Beers，J.Biol.Chem.251：5694-5702(1976)；Whur et al.，Br.J.Cancer 42：305-312(1980)；Gullino，Angiogenesis，Tumor Vascularization，and Potential interferencewith Tumor Growth，in Biological Responses in Cancer，pp.178-184(Mihich(ed.)1985)；Freshney，Anticancer Res.5：111-130(1985)。例如，在鉴定和表征调制本发明癌症相关序列的化合物的方法中监测肿瘤特异性标记水平。
侵入Matrigel来鉴定和表征调制剂
侵入Matrigel或细胞外基质组分的程度可以用作鉴定和表征调制癌症相关序列的化合物的试验。肿瘤细胞表现出恶性度与细胞侵入Matrigel或一些其它细胞外基质组分之间的正相关性。在这一试验中，肿瘤发生细胞通常用作宿主细胞。这些宿主细胞中肿瘤抑制基因的表达将降低宿主细胞的进攻性。可以采用前述的Cancer Res.1999；59：6010；Freshney(1994)中的技术。简要地说，通过采用被Matrigel或其它细胞外基质组分包被的过滤器来检测宿主细胞的进攻水平。渗透入凝胶，或穿透至过滤器的末端被认为具有进攻性，并通过移动的细胞数和距离，或通过预先用125I标记细胞并在过滤器远端或盘的底部计数放射性来进行组织学分级，参见例如前述的Freshney(1984)，文献同上。
评估体内肿瘤的生长来鉴定和表征调制剂
在转基因或免疫抑制生物体中检测癌症相关序列对细胞生长的影响。通过多种为本领域所接受的方法制备转基因生物体。例如，制备如小鼠的哺乳动物的敲除转基因生物体，其中癌症基因被破坏或插入了癌症基因。经由同源重组，在小鼠基因组的内源性癌基因位点插入标记基因或其它异源性基因，以制备敲除转基因小鼠。这种小鼠也可通过用突变型癌症基因取代内源性癌基因而制备，或者通过使内源性癌症基因突变而制备，如通过暴露于致癌物质。
为制备转基因的嵌合动物，如小鼠，往胚胎干细胞的核中导入DNA构建体。含有新改造的遗传损伤的细胞被注射入宿主小鼠的胚胎中，将胚胎重新植入雌性受体。这些胚胎中的一部分发育成为具有生殖细胞的嵌合小鼠，这些细胞中的一些来源于突变的细胞系。因此，通过饲养该嵌合鼠，可能获得包含引入的遗传损伤的小鼠新品系(参见例如Capecchi et al.，Science 244：1288(1989))。嵌合小鼠可依照以下文献获得：2002年4月2日出版的美国专利6,365,797；出版于2000年8月22日的美国专利6,107,540；Hoganet al.，Manipulating the Mouse Embryo：A laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)and Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：APractical Approach，Robertson，ed.，IRL Press，Washington，D.C.，(1987)。
可选地，可以采用多种免疫抑制或免疫缺陷宿主动物。例如，遗传性无胸腺的“裸”鼠(参见例如Giovanella et al.，J.Natl.Cancer Inst.52：921(1974))、SCID鼠、切除胸腺的小鼠或经照射的小鼠(参见例如Bradley et al.，Br.J.Cancer 38：263(1978)；Selby et al.，Br.J.Cancer 41：52(1980))均可以用作宿主。注射入同基因宿主的可移植肿瘤细胞(通常大约106个细胞)在高比例的病例中产生进攻性肿瘤，而类似起源的正常细胞则不会。在长出进攻性肿瘤的宿主中，表达癌症相关序列的细胞被皮下或原位注射。然后小鼠被分成组，包括对照组和治疗试验组(例如，用调制剂治疗)。在适宜长度的时间后，优选4-8周，检测肿瘤的生长(例如，通过体积或它的两个最大的尺寸，或重量)并与对照相比较。具有统计学显著性的缩小的肿瘤(采用例如Student’s T检验)被称为有生长抑制。
鉴定和表征调制剂的体外试验
鉴定具有调制活性的化合物的试验可在体外进行。例如，首先使癌症多肽与潜在的调制剂接触并保温一段合适的时间，例如，从0.5到48小时。在一个实施方案中，通过测量蛋白质或mRNA的水平在体外确定癌症多肽水平。使用与癌症多肽或其片段选择性结合的抗体，采用例如Western印迹，ELISA等的免疫分析来检测蛋白质水平。采用例如PCR、LCR的扩增方法或例如优选为Northern杂交、RNAse保护、点印迹的杂交分析来检测mRNA。如本文所述，用直接或间接标记的检测试剂，例如经荧光或放射性标记的核酸、放射性或酶标记的抗体等来检测蛋白质或mRNA水平。
可选地，可以采用癌症蛋白质启动子设计报告基因系统，该癌症蛋白质启动子与诸如萤光素酶、绿色荧光蛋白、CAT或P-gal的报道基因可操作相连。通常将报道基因构建体转染至细胞。用潜在的调制剂处理后，根据本领域技术人员已知的标准技术检测报道基因的转录、翻译或活性的量(Davis GF，见前文；Gonzalez，J.&Negulescu，P.Curr.Opin.Biotechnol.1998：9：624)。
如上所述，可以对各个基因和基因产物进行体外筛选。也就是说，先鉴定出对特定状态至关重要的特殊差异表达的基因，再筛选基因或基因产物本身的表达调制剂。
在一个实施方案中，筛选特定基因的表达调制剂。通常，仅评价一个或几个基因的表达。在另一个实施方案中，设计筛选以首先发现能结合差异表达蛋白质的化合物。然后评价这些化合物调制差异表达活性的能力。另外，一旦鉴定出原始的候选化合物，可进一步筛选变体以更好地评价结构活生关系。
签定和表征调制剂的结合试验
在本发明的结合试验中，一般使用本发明的纯化或分离的基因产物。例如，产生针对本发明蛋白质的抗体，进行免疫测定以确定蛋白质的量和/或位置。或者，在试验中使用含有癌症蛋白质的细胞。
因此，方法包括混合本发明的癌症蛋白质和候选化合物，如配体，并测定化合物与本发明的癌症蛋白质的结合。优选实施方案利用了人癌症蛋白质；也可以开发和使用人类疾病的动物模型。另外，本领域技术人员懂得也可以使用其它类似的哺乳动物蛋白质。另外，在一些实施方案中，使用了变异或衍生的癌症蛋白质。
一般说来，本发明的癌症蛋白质或配体非-弥散性地与不溶性支持物结合。支持物可以是例如具有接受分离样品之区域的支持物(微滴板、阵列等)。不溶性支持物可由任何能结合合成物的成分制成，所述支持物能容易地与可溶性材料分开，要不然就是可以与整个筛选方法相容。所述支持物的表面可以是固体或孔状，并且可以是任何方便的形状。
适当不溶性支持物的例子包括微滴板、阵列、膜和珠。它们一般由玻璃、塑料(如聚苯乙烯)、多糖、尼龙、硝酸纤维素或TeflonTM等制成。微滴板和阵列特别方便，因为可以使用少量试剂和样品同时进行大量试验。对于合成物与支持物结合的特定方式没有特别限制，只要它能与试剂和本发明的整个方法相容、能保持合成物的活性并且是非弥散的即可。优选的结合方法包括使用抗体，所述抗体当使蛋白质与支持物结合、直接结合于“粘性”或离子支持物、化学交联表面蛋白质合成或试剂等时，不会在空间上封闭配体结合位点或激活序列。使蛋白质或配体/结合剂与支持物结合之后，通过洗涤除去过量的未结合材料。然后通过与牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或其它无毒蛋白质或其它组成成分保温来封闭样品接受区域。
一旦本发明的癌症蛋白质与支持物结合，在试验中添加受试化合物。或者，使候选结合剂与支持物结合，然后添加本发明的癌症蛋白质，结合剂包括特异性抗体、筛选化学文库鉴定出的非-天然结合剂、肽类似物等。
特别令人感兴趣的是鉴定对人细胞低毒的药剂的试验。为此可以使用多种试验，包括增殖试验、cAMP试验、体外标记的蛋白质-蛋白质结合试验、电泳迁移率转变试验、蛋白质结合的免疫测定、功能试验(磷酸化试验等)等。
可以用多种方法测定受试化合物(配体、结合剂、调制剂等)与本发明的癌症蛋白质的结合。可以标记受试化合物，通过例如使本发明的全部或部分癌症蛋白质与固体支持物结合，添加经标记的候选化合物(如荧光标记)，洗下过量试剂并测定固体支持物上是否存在标记来直接测定结合。适当时可以利用多种封闭和洗涤步骤。
在某些实施方案中，仅标记一种组分，例如仅标记本发明的蛋白质或配体。或者，用不同的标记物标记一种以上的组分，如用I125标记蛋白质，用氟标记化合物。邻近试剂，如淬灭或能量转移试剂也是有用的。
鉴定和表征调制剂的竞争性结合试验
在一个实施方案中，通过与“竞争剂”的竞争结合试验来测定“受试化合物”的结合。竞争剂是与靶分子(如本发明的癌症蛋白质)结合的结合组成成分。竞争剂包括如抗体、肽、结合配对物、配体等的化合物。在某些情况下，受试化合物与竞争剂之间的竞争结合置换了受试化合物。在一个实施方案中，受试化合物被标记。在蛋白质中加入受试化合物，竞争剂，或这两者，维持足够长的时间以使它们结合。在有利于最佳活性的温度下，一般为4至40℃进行保温。通常最优化保温时间以有利于快速高通量筛选；一般0至1小时就足够了。通常需除去或洗去过量的试剂。然后加入第二种组分，测定是否存在经标记组分以显示结合。
在一个实施方案中，首先加入竞争剂再加入受试化合物。置换竞争剂表示受试化合物与癌症蛋白质结合，因此能结合并潜在调制癌症蛋白质的活性。在此实施方案中，可以标记任一种组分。因此，例如，如果标记竞争剂，后-测试化合物洗涤溶液中存在标记表示被受试化合物置换。或者，如果标记受试化合物，支持物上存在标记表示置换。
在可选择的实施方案中，首先加入受试化合物，保温并洗涤，接着加入竞争剂。缺乏竞争剂结合表示：与竞争剂相比，受试化合物以更高的亲和性与癌症蛋白质结合。因此，如果标记受试化合物，支持物上标记的存在合并竞争剂结合的缺乏表示受试化合物结合因此潜在调制本发明的癌症蛋白质。
因此，竞争结合方法包括差异筛选以鉴定出能调制本发明癌症蛋白质活性的药剂。在此实施方案中，该方法包括在第一个样品中混合癌症蛋白质和竞争剂。第二个样品含有受试化合物、癌症蛋白质和竞争剂。测定两个样品中的竞争剂结合，两个样品之间结合的改变或差异表示存在能与癌症蛋白质结合并潜在调制其活性的药剂。即，如果相对于第一个样品而言，第二个样品中的竞争剂结合是不同的，该药剂即能与癌症蛋白质结合。
或者，使用差异筛选鉴定出能与天然癌症蛋白质结合，但不能与经修饰的癌症蛋白质结合的候选药物。例如，制作癌症蛋白质的结构模型，并将其用于理性药物设计以合成能与该位点相互作用的药剂，一般不与位点经修饰的蛋白质结合的药剂。另外，通过筛选药物增强或降低所述蛋白质活性的能力也可鉴定出能影响天然癌症蛋白质活性的候选药物。
在此试验中使用了阳性对照和阴性对照。优选在至少三份试验中进行对照和受试样品试验以获得统计学显著的结果。所有样品的保温时间足以使药剂与蛋白质结合。保温之后，从样品中洗去非-特异性结合的物质，测定结合的，通常是经标记的药剂的量。例如，当利用放射性标记时，可在闪烁计数器中计数样品以测定结合化合物的量。
筛选试验中可包括多种其它试剂。其包括如盐、中性蛋白质(如白蛋白)、去污剂等的试剂，所述试剂有利于最佳蛋白质-蛋白质结合和/或降低非-特异性或背景相互作用。也可以使用能改善试验效率的试剂，如蛋白酶抑制剂、核酶抑制剂、抗-微生物药剂等。以能提供所需结合的次序添加组分的混合物。
使用多核苷酸下调或抑制本发明的蛋白质
如WO91/04753所述，通过与配体-结合分子形成偶联物，将癌症的多核苷酸调制剂导入含有靶核苷酸序列的细胞中。适当的配体-结合分子包括但不限于细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子或其它与细胞表面受体结合的配体。优选配体结合分子的偶联实质上不会干扰配体结合分子结合其相应分子或受体的能力，或妨碍有义或反义寡核苷酸或其偶联形式进入细胞。或者，可如WO90/10448所述，通过例如形成多核苷酸-脂质复合物将癌症的多核苷酸调制剂导入含有靶核酸序列的细胞中。应懂得除了治疗方法外，还可以在上文所述的筛选试验中使用反义分子或敲除和嵌入(knock in)模型。
抑制性和反义核苷酸
在某些实施方案中，通过使用反义多核苷酸或抑制性的小核RNA(snRNA)，即互补于并优选能特异性杂交编码mRNA核酸序列，如本发明的癌症蛋白质，mRNA或其亚序列的核酸可下调或完全抑制癌症-相关蛋白质的活性。反义多核苷酸与mRNA的结合降低了mRNA的翻译和/或稳定性。
在本发明的上下文中，反义多核苷酸可含有天然核苷酸，或由天然亚单位或其密切同系物形成的合成核苷酸。反义多核苷酸也可具有经改变的糖组成成分或糖内连键。例如硫代磷酸酯和本领域已知的其它含硫组分。本发明还包括类似物，只要它们能有效地与本发明的核苷酸杂交即可。参见例如Isis Pharmaceuticals，Carlsbad，CA；Sequitor，Inc.，Natick，MA。
使用重组方法可容易地合成所述反义多核苷酸，或者也可以在体外合成所述多核苷酸。所述合成的仪器可购自几个厂商，包括AppliedBiosystems。其它寡核苷酸，如硫代磷酸酯和烷基化衍生物的制备也是本领域技术人员众所周知的。
本文使用的反义分子包括反义或有义寡核苷酸。例如，可使用有义寡核苷酸通过与反义链结合来阻断转录。反义和有义寡核苷酸含有能结合癌症分子的靶mRNA(有义)或DNA(反义)序列的单链核酸序列(RNA或DNA)。本发明的反义或有义寡核苷酸含有一般至少约为12个核苷酸，优选约为12至30个核苷酸的片段。基于编码给定蛋白质的cDNA序列获得反义或有义寡核苷酸的能力描述于例如Stein&Cohen(Cancer Res.48：2659，(1988))和vander Krol et al.，(BioTechniques 6：958(1988))。
核酶
除了反义多核苷酸以外，也可使用核酶靶向和抑制癌症-相关核苷酸序列的转录。核酶是能催化裂解其它RNA分子的RNA分子。已描述了不同类型的核酶，包括I组核酶、锤头核酶、发夹核酶、Rnase P和斧头核酶(有关不同核酶之特性的评述参见例如Castanotto et al.，Adv.in Pharmacology 25：289-317(1994))。
发夹核酶的一般性特征描述于例如Hampel et al.，Nucl.Acids Res.18：299-304(1990)；欧洲专利公开号0360257；美国专利5,254,678。制备方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如WO94/26877；Ojwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6340-6344(1993)；Yamada et al.，Human Gene Therapy1：39-45(1994)；Leavitt et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 92：699-703(1995)；Leavitt et al.，Human Gene Therapy 5：1151-120(1994)和Yamada et al.，Virology205：121-126(1994))。
在表型筛选中使用调制剂
在一个实施方案中，给一群具有相关癌症表达分布图的癌症细胞施用受试化合物。本文的“施用”或“接触”指的是以特定的方式在细胞中加入调制剂，使调制剂通过摄取和细胞内作用或通过细胞表面的作用对细胞发挥作用。在一些实施方案中，将编码蛋白质试剂(即肽)的核酸导入病毒构建体，如腺病毒或逆转录病毒构建体，并加入至细胞中，从而完成肽剂的表达，参见例如PCT US97/01019。也可使用可调节的基因治疗系统。一旦给细胞施用了调制剂，必要时洗涤细胞，优选使细胞在生理条件下保温一段时间。然后收集细胞，产生新的基因表达分布图。因此，例如，针对癌症组织筛选调制，如诱导或抑制癌症表型的药剂。至少一个基因，优选多个基因表达分布图的改变表示该药剂对癌症活性起作用。类似地，改变生物功能或信号传导途径是调制剂活性的显示。通过限定癌症表型的特征，设计能改变表型的新药的筛选。使用此方法，不必知道药物靶，也不必将药物靶呈现在原始基因/蛋白质表达筛选平台上，也不必改变靶蛋白质转录物的水平。调制剂抑制功能可用作替代标记。
如上所述，需进行筛选以评价基因或基因产物，也就是说，先鉴定出对特定状态至关重要的特殊差异表达的基因，再筛选基因或基因产物本身的表达调制剂。
使用调制剂影响本发明的肽
使用多种试验测定癌症多肽活性或癌症表型。例如，通过检测上述参数测定调制剂对癌症多肽功能的影响。使用影响活性的生理学改变评估受试化合物对本发明多肽的影响。当使用完整细胞或动物测定功能结果时可评价多种作用，例如对与实体肿瘤相关的癌症而言，可评价肿瘤生长、肿瘤转移、新血管生成、激素释放、已知和未鉴定的基因标记的转录改变(如通过Northern印迹)、细胞代谢的改变(如细胞生长或pH改变)和细胞内第二信使(如cGNIP)的改变。
鉴别特征性癌症相关序列的方法
多种基因序列的表达与癌症相关，相应地，鉴定了基于突变或变异癌症基因的疾病。在一个具体实施方案中，本发明提供了鉴定含有变异癌症基因的细胞的方法，例如，确定细胞中至少一个内源性癌症基因全部或部分序列的存在。这可通过运用任意数目的测序技术来完成。本发明包括鉴定个体癌症基因型的方法，例如，确定个体中至少一种本发明的基因的全部或部分序列的存在。这通常在个体的至少一种组织，例如表I所列组织中进行，还可以包括对多种组织或同一组织不同样品的评估。该方法可以包括将已测序基因的序列与已知癌症基因，即野生型基因进行比较，来确定家族成员、同源性、突变或变异的存在，然后可将该基因的全部或部分序列与已知癌症基因的序列进行比较来确定是否有差异存在。这可以通过任何数目的已知同源性程序进行，如BLAST，Bestfit等。如本文所述，患者癌症基因和已知癌症基因序列之间差异的存在与疾病状态或疾病状态倾向相关。
在一个优选实施方案中，用癌症基因作为探针来确定基因组中癌症基因拷贝的数目。用癌症基因作探针来确定其在染色体上的位置。特别是，当在癌症基因的基因座中鉴定出如易位等的染色体异常时，如染色体定位的信息可以应用于提供诊断或预测。
XIV.)RNAi和小的干扰RNA(siRNA)的治疗用途
本发明还涉及至少包括STEAP-1编码区或5’UTR区的片段的siRNA寡核苷酸，特别是双链RNA，或其互补物，或任何特异于STEAP-1序列的反义寡核苷酸。在一个实施方案中，使用所述寡核苷酸阐明STEAP-1的功能，或使用所述寡核苷酸筛选或评价STEAP-1功能或表达的调制剂。在另一个实施方案中，使用siRNA转染降低STEAP-1的基因表达，进而使内源性表达抗原的经转化癌细胞的增殖能力显著降低；通过使用例如与降低的增殖能力有关的细胞生存能力代谢读出值测定，用特异性STEAP-1 siRNA处理的细胞显示出降低的存活率。因此，STEAP-1 siRNA组合物含有对应于STEAP-1蛋白的核酸ORF序列或其亚序列的siRNA(双链RNA)；这些亚序列的长度一般为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35或多于35个邻接的RNA核苷酸，并且含有与mRNA编码序列的至少一部分互补和不互补的序列。在优选实施方案中，亚序列的长度为19-25个核苷酸，最优选长度为21-23个核苷酸。
RNA干扰是体外和体内沉默基因的新方法，因此，小的双链RNA(siRNA)是有价值的治疗剂。目前，siRNA沉默特异性基因活性的能力已在疾病的动物模型中得以体现，并且也可用于人。例如，已证实将针对特定靶标的siRNA的溶液流体灌注至小鼠体内具有疗效。
Song等的先遣工作表明：一种纯天然的核酸，即小的干扰RNA(siRNA)甚至无需经过进一步的化学修饰即可用作治疗剂(Song，E.，et al.，“RNAinterference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis”Nat.Med.9(3)：347-51(2003))。此项工作首次提供了给动物灌注siRNA可缓解疾病的体内证据。在该项工作中，作者给小鼠注射了经设计可沉默FAS蛋白(一种细胞死亡受体，当其在炎性反应中被过度活化时，可诱导肝细胞和其它细胞死亡)的siRNA。第二天，给动物施用特异于Fas的抗体。在随后的几天内，对照小鼠死于急性肝衰竭，而80％以上经siRNA处理的小鼠未患严重疾病，并且得以存活。这些小鼠的约80％至90％肝细胞掺入了裸露的siRNA寡核苷酸。另外，RNA分子可发挥作用达10天，3周后才失去作用。
当用于治疗人时，通过能诱导长期RNAi活性的有效系统传递siRNA。对临床应用的主要告诫是应将siRNA传递给适当的细胞。肝细胞似乎特别能接受外源性RNA。目前，由于肝脏是核酸分子和病毒载体容易靶向的器官，因此，位于肝脏的靶标格外引人注目。然而，其它组织和器官的靶标也是优选的。
用能够促进跨细胞膜转运的化合物配制siRNA，以此改善治疗过程中siRNA的施用。本发明的另一个实施方案是经化学修饰的合成siRNA，所述siRNA能抵抗核酶的作用，具有血清稳定性，与之相伴地，RNAi作用的持续时间延长。
因此，siRNA技术是通过将针对STEAP-1的siRNA分子传递给患有如表I所列癌症的个体来治疗人类恶性肿瘤的方法。施用siRNA可导致表达STEAP-1的癌细胞的生长减弱，并且提供了抗-肿瘤疗法，降低了与恶性肿瘤相关的发病率和/或死亡率。
当在体外或体内测定时，这种基因产物击倒(knockdown)形式的效力是显著的。通过(如上所述)给培养物中的细胞使用siRNA，或者当使用体外方法检测降低的STEAP-1蛋白表达时，给癌症患者活检样品的等分试样使用siRNA，即可容易地阐明体外效力。
XV.)试剂盒/产品物件
为了用于本文描述的实验室、预测、预防、诊断和治疗应用，试剂盒也在本发明的范围之内。所述试剂盒可以包括载体、包装或容器，容器可以被分隔为小室以盛放一个或多个容器如小瓶、试管等，每个容器分别含有本方法所用到的一种独立成分，以及写有使用(如本文所述的应用)说明的标签或插页。例如，容器可以含有经可测标记或能被可测标记的探针。这种探针可以是分别特异于本发明的蛋白质或基因或信息的抗体或多核苷酸。当该方法利用核酸杂交来检测目标核酸时，试剂盒也可以包括含有扩增目标核酸序列的核苷酸的容器。试剂盒可包括含有报道分子的容器，如与报道分子如酶、荧光或放射性同位素标记结合的生物素结合蛋白，例如亲和素或链霉亲和素；所述报道分子可与例如核酸或抗体一起使用。该试剂盒可以包括图2或图3所示的全部或部分氨基酸序列或其类似物，或者编码所示氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明的试剂盒通常包括上述的容器及一个或多个与之相关的其它容器，其中含有符合商业和用户需要的材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器；载体、包装、容器、小瓶、和/或试管标签，其上列有供使用的内容物和/或说明，以及写有使用说明的包装插页。
容器可以贴有或附有标签来说明组合物用于特定的治疗或非治疗的应用，如预测、预防、诊断或实验室应用，也可以说明如本文所述的体内或体外应用的指示。指示和/或其它信息也可以包括在试剂盒所附或所贴的插页或标签上。标签可以贴于容器上或与之相关联。当字母、数字或其它组成标签的文字铸模或蚀刻在容器上时，标签置于容器上；当标签存在于盛放容器的贮器或载体中时，标签与所述的容器相关联，例如作为包装的插页。标签可以说明组合物用于诊断、治疗、预防或预测疾病，如表I所示组织的肿瘤。
术语“试剂盒”与“产品物件”可以被用作同义词。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种包含如氨基酸序列、小分子、核酸序列和/或抗体的组合物的产品物件，例如，用于诊断、预测、预防和/或治疗如表I中所列举组织的肿瘤的材料。产品物件通常包括至少一个容器及至少一个标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器以及试管。容器可以由多种材料制成，如玻璃或塑料。该容器可以包含氨基酸序列、小分子、核酸序列、细胞群体和/或抗体。在一个实施方案中，容器包含用于检测细胞中mRNA表达分布图的多核苷酸，同时含有用于此目的的试剂。在另一个实施方案中，容器包含用于评价STEAP-1在细胞和组织中的蛋白质表达，或用于相关的实验室、预测、诊断、预防和治疗目的的抗体、其结合片段或特异性结合蛋白；所述容器可贴有或附有所述应用的说明和/或指示，也可包括用于这些目的的试剂和其它组合物或工具。在另一个实施方案中，容器中含有用于引发细胞或体液免疫应答的物质以及相关的说明和/或指示。在另一个实施方案中，容器中含有用于过继免疫疗法的物质，如细胞毒T细胞(CTL)或辅助T细胞(HTL)，以及相关的说明和/或指示；容器中也可包括用于此目的的试剂和其它组合物或工具。
容器也可以选择性地包含用于有效地治疗、诊断、预测或预防某种疾病的组合物，同时可以含有无菌接口(如容器可以是一个静脉内溶液袋或一个具有用皮下注射针穿孔的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂可以是能够特异性结合STEAP-1和调制其功能的抗体。
产品物件可以进一步包括第二容器，其含有药学上可接受的缓冲液，例如磷酸缓冲盐水，林格氏溶液和/或葡萄糖溶液。它可以进一步包括其它符合商业和用户需要的材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和/或附有使用指示和/或说明的包装插页。
实施例：
通过以下的一些实施例对本发明的不同方面进行进一步描述和举例说明，所有实施例不应被理解为对本发明范围的限制。
实施例1：通过SSH分离STEAP-1基因的cDNA片段
材料与方法
LAPC异体移植物：
LAPC异体移植物得自Charles Sawyers博士(UCLA)，按文献所述产生(Klein et al.，1997，Nature Med.3：402-408；Craft et al.，1999，Cancer Res.59：5030-5036)。分别在未去势或经去势的雄性SCID小鼠中培养雄激素依赖型和非依赖型LAPC-4异体移植物(分别为LAPC-4AD和AI)以及LAPC-9异体移植物(分别为LAPC-9AD和AI)，并在受体雄性小鼠中将所述异体移植物传代为小的组织块。LAPC-4AI异体移植物得自LAPC-4AD肿瘤，而LAPC-9AI异体移植物得自LAPC-9AD肿瘤。为了产生AI异体移植物，将携有LAPC AD肿瘤的雄性小鼠去势并维持2-3个月。在重新长出LAPC肿瘤之后，收集肿瘤并在去势的雄性小鼠或雌性SCID小鼠中传代。
按下述在胫骨内培养LAPC-4AD异体移植物。将皮下生长的LAPC-4AD异体移植物肿瘤组织浸泡在1×Iscoves培养基中，同时将所述组织切成1-2mm3的切片，然后以1.3K rpm离心切碎的组织4分钟，将上清液重新悬浮于10ml冰冷的1×Iscoves培养基中，以1.3K rpm离心4分钟。然后将沉淀物重新悬浮于含有1％链霉蛋白酶E的1×Iscoves培养基中，室温保温20分钟，同时温和地摇摆搅动，接着在冰上保温2-4分钟。以1.3K rpm离心滤液4分钟，通过重新悬浮于10ml Iscoves并再次离心，从吸出的沉淀物中除去链霉蛋白酶。然后将细胞块铺于PrEGM培养基并培养过夜。收集细胞，过滤，用RPMI洗两次，然后计数。在冰上，将约50,000个细胞与等体积的冰冷的Matrigel混合，用27号针头将混合物外科注射至SCID小鼠的近侧胫骨干骺端。10-12周后，回收骨髓中长出的LAPC-4肿瘤。
细胞系和组织：
人细胞系(如HeLa)得自ATCC，维持于含有5％胎牛血清的DMEM中。用于RNA和蛋白质分析的人组织得自位于UCLA(Los Angeles，CA)的HumanTissue Resource Center(HTRC)和QualTek，Inc.(Santa Barbara，CA)。
RNA分离：
在Trizol试剂(Life Technologies，Gibco BRL)中，以10ml试剂/g组织或10ml试剂/108个细胞匀浆肿瘤组织和细胞系，以分离总RNA。用Qiagen′sOligotex mRNA迷你型和中型试剂盒由总RNA纯化Poly A RNA，用分光光度分析(O.D.260/280nm)对总RNA和mRNA进行定量，并通过凝胶电泳进行分析。
寡核苷酸：
使用下列经HPLC纯化的寡核苷酸。
DPNCDN(cDNA合成引物)：
5’TTTTGATCAAGCTT303’(SEQ ID NO：68)
衔接子1：
5’CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3’(SEQ ID NO：69)
3’GGCCCGTCCTAG5’(SEQ ID NO：70)
衔接子2：
5’GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3’(SEQ ID NO：71)
3’CGGCTCCTAG5’(SEQ ID NO：72)
PCR引物1：
5’CTAATACGACTCACTATAGGGC3’(SEQ ID NO：73)
巢式引物(NP)1：
5’TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3’(SEQ ID NO：74)
巢式引物(NP)2：
5’AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3’(SEQ ID NO：75)
抑制扣除杂交：
抑制扣除杂交(SSH)用来鉴定对应于基因的cDNA，与良性前列腺增生(BPH)相比，在雄激素依赖型前列腺癌中，所述基因可被上调。
如上所述，使用CLONTECH的PCR-选择cDNA扣除试剂盒，并以1ng寡核苷酸RSACDN作为引物，由2μg从异体移植物和BPH组织分离的poly(A)+RNA合成对应于LAPC-4AD异体移植物(试验)和BPH组织(驱动)的双链cDNA。第一和第二链的合成按试剂盒中使用手册所描述的程序进行(CLONTECH Protocol No.PT1117-1，目录号K1804-1)。得到的cDNA用Rsa I在37℃消化3小时。消化后的cDNA用苯酚/氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀。
由4∶1比例的经Rsa I消化的BPH cDNA与源自小鼠肝脏的经消化cDNA混合产生驱动cDNA(BPH)，以确保从试验cDNA(LAPC-4AD)中扣除鼠基因。
将1μl用Rsa I消化的LAPC-4AD cDNA(400ng)稀释于5μl水中以产生试验cDNA(LAPC-4AD)。然后于16℃，在总体积为10μl的分别的连接反应中，使用400u T4DNA连接酶(CLONTECH)将稀释的cDNA(2μl，160ng)连接到2μl衔接子1和衔接子2(10μM)上过夜。以1μl 0.2M EDTA和72℃加热5分钟终止连接。
通过在两个分别含有1.5μl(20ng)与衔接子1-和衔接子2-连接的试验cDNA的试管中各加入1.5μl(600ng)驱动cDNA以进行第一轮杂交。在4μl的终体积中，用矿物油覆盖样品，在MJ Research热循环仪中98℃变性1.5分钟，然后在68℃杂交8小时。然后使两次杂交的产物与另外的1μl新鲜变性的驱动cDNA昆合，68℃杂交过夜。然后将第二轮杂交产物在200μl 20mM Hepes，pH8.3，50mM NaCl，0.2mM EDTA中稀释，70℃加热7分钟，-20℃保存。
由SSH产生的基因片段的PCR扩增、克隆和测序：
为扩增由SSH反应产生的基因片段，进行两轮PCR扩增反应。在首次PCR反应中，将1μl稀释的最终杂交混合物加入至1μl PCR引物1(10μM)，0.5μl dNTP混合物(10μM)，2.5μl 10×反应缓冲液(CLONTECH)和0.5μl 50×高级cDNA聚合酶混合物(CLONTECH)中，终体积为25μl。PCR 1在以下条件下进行：75℃5分钟，94℃25秒，然后94℃10秒，66℃30秒，72℃1.5分钟共27轮循环。每个实验分别完成5个独立的首次PCR反应。收集产物并用水按1∶10稀释。在第二轮PCR反应里，从收集并稀释的首次PCR反应物中取出1μl加入同样的反应混合物中，就像在PCR1中那样，除了用引物NP1和NP2(10μM)代替了PCR引物1。PCR 2以94℃10秒，68℃30秒，和72℃1.5分钟共进行10-12个循环。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析。
用T/A载体克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物插入pCR2.1。对转化的大肠杆菌进行蓝/白及氨苄青霉素选择。挑选白色菌落排列在96孔板内，在液体培养物中生长过夜。为了鉴定插入物，使用PCR1的条件，并以NP1和NP2作为引物对1ml细菌培养物进行PCR扩增，使用2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
将细菌克隆储存于96孔板的20％甘油中。制备质粒DNA，进行测序，在GenBank、dbEST和NCI-CGAP数据库中进行核酸同源性检索。
RT-PCR表达分析：
使用Gibco-BRL的Superscript Preamplification系统，可用寡(dT)12-18引发，由1μg mRNA产生第一链cDNA。采用厂家的方法，包括在42℃下与逆转录酶保温50分钟，然后在37℃下用RNAse H处理20分钟。在完成反应之后，在标准化之前可用水将体积增加至200μl。来自16个不同的正常人组织的第一链cDNA可由Clontech获得。
来自多种组织的第一链cDNA的标准化通过运用引物5’atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3’(SEQ ID NO：76)和5’agccacacgcagctcattgtagaagg 3’(SEQ ID NO：77)扩增β-肌动蛋白来进行。
在50μl总体积中扩增第一链cDNA(5μl)，其中含有0.4μM引物，0.2μM每种dNTP，1×PCR缓冲液(Clontech，10mM Tris-HCL，1.5mM MgCl2，50mMKCl，pH8.3)以及1×Klentaq DNA聚合酶(Clontech)。在18、20和22轮循环时分别取5μl PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。采用MJ Research热循环仪进行PCR反应，反应条件如下：起始变性可以是94℃15秒，然后以94℃15秒，65℃2分钟，72℃5秒进行18、20和22轮循环。最终在72℃延伸2分钟。在琼脂糖凝胶电泳之后，将来自多种组织的283bp的β-肌动蛋白带的强度用视觉进行检验比较。计算在22轮PCR循环后使得所有组织的β-肌动蛋白条带强度相等的第一链cDNA的稀释倍数。需要进行三轮的标准化才能达到在22轮PCR循环后所有组织的条带强度相等。
为了确定STEAP-1基因的表达水平，通过使用下述引物对进行25、30和35轮扩增循环的PCR分析5μl标准化的第一链cDNA：
5’ACT TTG TTG ATG ACC AGG ATT GGA 3’(SEQ ID NO：78)
5’CAG AAC TTC AGC ACA CAC AGG AAC 3’(SEQ ID NO：79)
可以通过比较产生亮条带强度的循环数下的PCR产物进行半-定量表达分析。
结果
按上文“材料与方法”中所述进行几个SSH实验，分离出大量候选基因片段克隆。对所有候选克隆进行测序，并针对主要的公共基因和EST数据库中的所有序列进行同源性分析，以提供与相应基因的同一性有关的信息，并辅助决定分析某个特定基因的差异表达。一般说来，通过RT-PCR和/或Northern分析对与被检索的任何数据库中的任何已知序列没有同源性，因而被认为是新的基因的基因片段，以及与先前被测序的已表达序列标志(EST)显示出同源性的基因片段进行差异表达分析。
一个被称为STEAP-1的cDNA克隆的长度为436bp，它与NCI-CGAP肿瘤基因数据库中的EST序列显示出同源性。随后使用此cDNA分离编码STEAP-1基因的全长cDNA，并将其重新命名为STEAP-1。STEAP-1 cDNA核苷酸序列对应于图1所示STEAP-1 cDNA序列中的核苷酸残基150至585。另一个被称为28P3E1的克隆的长度为561bp，它与NCI-CGAP肿瘤基因数据库或其它数据库中的多个EST序列显示出同源性。部分28P3E1序列(356bp)与得自人胎儿组织的EST相同。获得并测序全长STEAP-1 cDNA之后可以明显地看出此克隆也对应于STEAP-1(更具体地对应于图1所示STEAP-1核苷酸序列的残基622至3’末端)。
实施例2：分离编码STEAP-1的全长cDNA
使用436bp的STEAP-1基因片段(参见题为“通过SSH分离STEAP-1基因的cDNA片段”的实施例)分离另外的编码8P1D4/STEAP-1基因的cDNA。简单地说，用由436bp的STEAP-1cDNA产生的经标记探针筛选正常的人前列腺cDNA文库(Clontech)。一个阳性克隆，即克隆10的长度为1195bp，其编码339个氨基酸的蛋白质，其具有的核苷酸和编码的氨基酸序列与任何已知的人基因或蛋白质没有显著的同源性(如国际申请WO98/53071中所述与大鼠肾损伤蛋白质具有同源性)。编码的蛋白质含有至少6个推测的暗示着细胞表面定向的跨膜基元。这些结构特征被称为“STEAP”，即“前列腺的6个跨膜上皮细胞抗原”(Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate)。
随后鉴定其它的“STEAP”蛋白，将STEAP-1基因产物重新命名为“STEAP-1”。STEAP-1 cDNA和编码的氨基酸序列示于图2A-Q。1998年8月26日将STEAP-1 cDNA克隆10以质粒STEAP-1克隆10.1的形式保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)(10801 University Blvd.，Manassas，VA20110-2209USA)，保藏号为ATCC98849。使用EcoRI/Xbal双消化(EcoRI消化5’末端，XbaI消化3’末端)可从中切下STEAP-1 cDNA克隆。
实施例3：STEAP-1的染色体作图
染色体的定位能指示疾病致病基因。可采用一些染色体作图方法，包括荧光原位杂交(FISH)、人/仓鼠辐射杂合体(RH)试验组(Walter et al.，1994；Nature Genetics 7：22；Research Genetics，Huntsville AI)、可得自Cornell研究所(Camden，New Jersey)的人-啮齿动物体细胞杂合体试验组、和利用BLAST同源性对基因组克隆进行测序和作图的基因组阅读器(NCBI，Bethesda，Maryland)。
利用STEAP-1序列和NCBI BLAST工具将STEAP-1作图于染色体7q21(在万维网的网址为：ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi？F＝HsBlast.html&&ORG＝Hs))。
实施例4：STEAP-1的表达分析
图14(a)-(e)显示了STEAP-1在胃癌患者样品中的表达。图14(a).RNA提取自正常的胃(N)和10个不同的胃癌患者样品(T)。用STEAP-1序列探测以每个泳道10μg总RNA获得的Northern印迹。结果显示出约1.6kb的STEAP-1在胃肿瘤组织中强表达。下方的一组电泳表示显示出RNA样品质量的印迹的溴化乙锭染色情况。
图14(b)显示出STEAP-1在直肠癌患者组织中表达。RNA提取自正常直肠(N)，直肠癌患者肿瘤(T)和直肠癌转移(M)。用STEAP-1序列探测以10μg总RNA获得的Northern印迹。结果表明：STEAP-1在直肠癌患者组织中强表达。下方的一组电泳表示显示出RNA样品质量的印迹的溴化乙锭染色情况。
通过RT-PCR分析STEAP-1的表达，结果证明STEAP-1在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中强表达(图14(c))。由HUVEC细胞、LAPC-4AD和LAPC-9AD前列腺癌异体移植物以及人脑组织制备第一链cDNA。通过使用针对肌动蛋白和GAPDH的引物的PCR进行归一化。使用针对STEAP-1的引物以27和30轮扩增循环进行半-定量PCR。以使用针对肌动蛋白的引物的PCR作为对照。结果表明STEAP-1在HUVEC细胞中强表达，所述表达与在前列腺癌异体移植物组织中检测到的表达类似。STEAP-1在HUVEC细胞中的表达表明靶向STEAP-1也能靶向肿瘤新血管的内皮细胞。图14(d)显示了RT-PCR琼脂糖凝胶图。在图14(e)中，使用Alphalmager软件定量PCR产物。结果显示出在所有被检测的正常组织中，正常前列腺中的STEAP-1强表达。在前列腺癌库、膀胱癌库、肾癌库、结肠癌库、肺癌库、卵巢癌库和乳腺癌库中检测到STEAP-1表达的上调。在癌症转移库、前列腺癌异体移植物库和前列腺转移至淋巴结库中检测到STEAP-1的强表达。
图14(f).淋巴瘤患者样品中的STEAP-1表达。由一系列淋巴瘤患者样品制备第一链cDNA。通过使用针对肌动蛋白的引物的PCR进行归一化。使用针对STEAP-1的引物，以26和30轮扩增循环进行半-定量PCR。在琼脂糖凝胶上电泳样品，使用Alphalmager软件定量PCR产物。如果分别在第26轮或第30轮扩增循环时检测到信号，将表达记录为“强”或“中等”，如果在第30轮扩增循环时仍然没有信号，则将表达记录为“无”。结果表明：在受试的11个肿瘤样品中，有8个样品(72.7％)中有STEAP-1表达。
实施例5：STEAP-1的剪接变体
转录变体是来自通过可变转录或可变剪接产生的来自同一基因的成熟mRNA的变体。可变转录物是来自相同的基因但是在不同点开始转录的转录物。剪接变体是得自相同转录物但剪接不同的mRNA变体。在真核生物中，当多-外显子基因由基因组DNA转录时，原始RNA经过剪接产生功能性的mRNA，它只有外显子，用来翻译成氨基酸序列。相应地，一个给定的基因可以有零个或多个可变转录物，每个转录物有零个或多个剪接变体。每个转录变体都有独特的外显子组成，而且与原始转录物相比，可有不同的编码和/或非编码(5’或3’末端)部分。转录变体可以编码具有相同或相似功能的相似或不同的蛋白质，或能编码具有不同功能的蛋白质，而且可以同时在相同的组织中、或同时在不同的组织中、或在不同时间在相同的组织中、或不同时间在不同的组织中表达。转录变体编码的蛋白质可有相似或不同的细胞或细胞外定位，例如，分泌的相对于细胞内的。
可以通过多种为本领域所接受的方法来鉴定转录变体。例如，可变转录物和剪接变体可以通过全长克隆实验，或采用全长转录物和EST序列来鉴定。首先，所有人类的EST聚集成簇，相互之间表现出直接或间接的同一性。其次，相同聚簇中的EST被进一步分组为亚簇，并且装配为共有序列。将原始基因序列与共有序列或其它的全长序列相比较。每个共有序列都是该基因的潜在剪接变体(参见例如Kan，Z.，et al.，Gene structure prediction andalternative splicing analysis using genomically aligned ESTs，Genome Research，2001 May，11(5)：889-900)。即使变体被鉴定为不是全长克隆，通过采用本领域已知的技术，变体的该部分对产生抗原和进一步克隆全长剪接变体是很有用的。
另外，本领域已知基于基因组序列鉴定转录变体的计算机程序。基于基因组的转录变体鉴定程序包括FgenesH(A.Salamov and V.Solovyev，“Abinitio gene finding in Drosophila genomic DNA，”Genome Research.2000 April；10(4)：516-22)；Grail(URL compbio.ornl.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm)和GenScan(URL genes.mit.edu/GENSCAN.html)。有关剪接变体鉴定方案的一般性讨论可以参见例如：Southan，C.，A genomic perspective on humanproteases，FEBS Lett.2001 Jun 8；498(2-3)：214-8；de Souza，S.J.，et al.，Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORFexpressed sequence tags，Proc Natl Acad Sci U S A.2000Nov 7；97(23)：12690-3。
为进一步确认转录变体的参数，可使用本领域已知的多种技术，例如全长克隆、proteomic确认、基于PCR的确认以及5’RACE确认等(参见例如：Proteomic确认：Brennan，S.O.，et al.，Albumin banks peninsula：a newtermination variant characterized by electrospray mass spectrometry，BiochemBiophys Acta.1999Aug 17；1433(1-2)：321-6；Ferranti P，et al.，Differentialsplicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(sl)-casein，Eur J Biochem.1997 Oct 1；249(1)：1-7。基于PCR的确认：WellmannS，et al.，Specific reverse transcription-PCR quantification of vascularendothelial growth factor(VEGF)splice variants by LightCycler technology，Clin Chem.2001Apr；47(4)：654-60；Jia，H.P.，et al.，Discovery of new humanbeta-defensins using a genomics-based approach，Gene.2001 Jan 24；263(1-2)：211-8。基于PCR的和5’RACE确认：Brigle，K.E.，et al.，Organization of themurine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms，Biochem Biophys Acta.1997Aug 7；1353(2)：191-8)。
本领域已知癌症中的基因组区域被调制了。当基因所作图的基因组区域在特定癌症中被调制时，可变的转录物或基因剪接变体也被调制。本文揭示的是STEAP-1具有与癌症相关的特定表达分布图。在相同或不同组织中，STEAP-1的可变转录物和剪接变体也与癌症相关，因此可以用作肿瘤相关标记/抗原。
表LIII显示出被称为STEAP-1v.1的原始转录物的外显子组成。使用全长基因和EST序列，鉴定出两个被称为STEAP-1v.2和v.3的转录变体。如图11所示，与STEAP-1v.1相比，STEAP-1v.2的转录变体无法剪接下来STEAP-1v.1的内含子4，而变体STEAP-1v.3从STEAP-1v.1的内含子4上剪接下来另一个外显子。理论上，外显子在空间次序上的每个不同组合，如外显子2和3是潜在的剪接变体。图11图解显示了转录变体外显子的序列比对。
实施例6：STEAP-1的单核苷酸多态性
单核苷酸多态性(SNP)是核苷酸序列特定位置的单个碱基对改变。在基因组中任何给定的点，均有四种可能的核苷酸碱基对：A/T、C/G、G/C和T/A。基因型指的是个体基因组中一个或多个位置的特定碱基对序列。单元型指同一DNA分子上(或高等生物的同一染色体上)多个位置的碱基对序列，通常在提及一个基因或几个紧密连锁基因时使用。在cDNA上发生的SNP尔为cSNP。这种cSNP可以改变基因所编码蛋白质的氨基酸，因此改变蛋白质的功能。一些SNP可导致遗传病；其它的可造成表型的数量变化和影响个体对包括饮食和药物的环境因素的反应。因此，SNP和/或等位基因组合(被称为单元型)有许多应用，包括诊断遗传病、确定药物反应和剂量、鉴定造成疾病的基因、以及分析个体间遗传关系(P.Nowotny，J.M.Kwon and A.M.Goate，“SNP ahaJysis to dissect human traits”，Curr.Opin.Neurobiol.2001 Oct；11(5)：637-641；M.Pirmohamed and B.K.Park，“Genetic susceptibility toadverse drug reactions，”Trends Pharmacol.Sci.2001 Jun；22(6)：298-305；J.H.Riley，C.J.Allan，E.Lai and A.Roses，“The use of single nucleotidepolymorphisms in the isolation of common disease genes，”Pharmacogenomics.2000 Feb；1(1)：39-47；R.Judson，J.C.Stephens and A.Windemuth，“Thepredictive power of haplotypes in clinical response，”Pharmacogenomics.2000feb；1(1)：15-26)。
SNP可以通过多种为本领域所接受的方法来鉴定(P.Bean，“Thepromising voyage of SNP target discovery，”Am.Clin.Lab.2001 Oct-Nov；20(9)：18-20；K.M.Weiss，“In search of human variation，”Genome Res.1998Jul；8(7)：691-697；M.M.She，“Enabling large-scale pharmacogenefic studies byhigh-throughput mutation detection and genotyping technologies，”Clin.Chem.2001 Feb；47(2)：164-172)。例如，可以通过以凝胶为基础的方法对显示多态性的DNA片段进行测序，如限制性片段长度多态性(RFLP)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)来鉴定SNP。也可以通过对收集自不同个体的DNA样品直接测序或通过比较来自不同DNA样品的序列来发现SNP。随着公共和私人数据库的序列数据的迅速累积，可以运用计算机程序比较序列来发现SNP(Z.Gu，L.Hillier and P.Y.Kwok，“Single nucleotide polymorphism hunting incyberspace，”Hum.Mutat.1998；12(4)：221-225)。SNP可以被确定，且个体的基因型或单元型可以通过一系列方法确定，包括直接测序和高通量微阵列(P.Y.Kwok，“Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms，”Annu.Rev.Genomics Hum.Genet 2001；2：235-258；M.Kokoris，K.Dix，K.Moynihan，J.Mathis，B.Erwin，P.Grass，B.Hines and A.Duesterhoeft，“High-throughputSNP genotyping with the Masscode system，”Mol.Diagn.2000 Dec；5(4)：329-340)。
运用上述方法，鉴定出得自克隆GTH9的转录物STEAP-1v.2的14个SNP，分别位于602(C/G)，386(C/T)，1087(T/G)，1447(T/C)，1621(A/T)，1625(G/T)，1716(C/A)，2358(C/T)，2646(T/G)，2859(T/G)，2908(A/T)，3006(G/C)，3107(C/T)和3180(A/T)。具有可选择等位基因的转录物或蛋白质分别被命名为变体STEAP-1v.4，v.5，v.6，v.7，v.8，v.9，v.10，v.11，v.12，v.13，v.14，v.15，v.16和v.17。图10图解显示了SNP变体的序列比对。图12图解显示了对应于核苷酸变体的蛋白质变体的序列比对。尽管在这里分开表示这些SNP的等位基因，但它们可以以不同的组合(单元型)出现并可在任一含有该SNP序列上下文的转录变体(如STEAP-1v.1和v.3)中出现。例如，前两个SNP也存在于STEAP-1v.3的相同位置，但在STEAP-1v.1中分别位于572和356位。
实施例7：在原核系统中生产重组STEAP-1
为了在原核细胞中表达重组STEAP-1和STEAP-1变体，将全长或部分STEAP-1和STEAP-1变体cDNA序列克隆入多种本领域已知的表达载体的任何一种。使用全长cDNA，或STEAP-1、其变体或其类似物的任意8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30或更多个邻接的氨基酸。
A.体外转录和翻译构建体：
pCRII：为了生产原位检测RNA的STEAP-1有义和反义RNA探针，制备编码STEAP-1 cDNA全长或片段的pCRII构建体(Invitrogen，Carlsbad CA)。pCRII载体在插入序列的侧翼具有Sp6和T7启动子，可启动STEAP-1 RNA的转录，用作RNA原位杂交实验的探针。这些探针可用于分析细胞和组织中STEAP-1在RNA水平的表达。表示STEAP-1基因的cDNA氨基酸编码区域的经转录STEAP-1RNA用于体外翻译系统，如TnTTM Coupled ReticulolysateSystem(Promega，Corp.，Madison，WI)来合成STEAP-1蛋白。
B.细菌构建体：
pGEX构建体：为了在细菌中生产与谷胱甘肽S-转移酶(GST)蛋白融合的重组STEAP-1蛋白，将全部或部分STEAP-1 cDNA或变体克隆入GST融合载体的pGEX家族(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。这些构建体允许氨基末端融合了GST和羧基末端融合了6个组氨酸表位(6×His)的重组STEAP-1蛋白序列可控制地表达。GST和6×His标记允许通过适宜的亲和基质纯化来自诱导细菌的重组融合蛋白，并允许运用抗GST和抗His抗体来识别融合蛋白。6×His标记通过在例如，开放阅读框(ORF)克隆引物的3’末端添加6个组氨酸密码子来产生。可以使用蛋白酶裂解位点，例如pGEX-6P-1内的PreScissionTM识别位点，这样可以允许GST标记从STEAP-1相关蛋白上裂解下来。氨苄青霉素抗性基因和pBR322起点允许在大肠杆菌中选择和维持pGEX质粒。
pMAL构建体：为了在细菌中生产融合了麦芽糖-结合蛋白(MBP)的重组STEAP-1蛋白，通过克隆到pMAL-c2X和pMAL-p2X载体(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)上，将全部或部分的STEAP-1 cDNA蛋白质编码序列与MBP基因融合。这些构建体允许氨基端融合了MBP和羧基端融合了6个组氨酸表位标记的重组STEAP-1蛋白序列可控制地表达。MBP和6×His标记允许通过适宜的亲和基质纯化来自诱导细菌的重组蛋白质，并允许运用抗MBP和抗His抗体来识别融合蛋白。6×His表位标签通过在克隆引物的3’端添加6个组氨酸密码子来产生。Xa因子识别位点允许将pMAL标记从STEAP-1中裂解下来。pMAL-c2X和pMAL-p2X载体被最优化从而分别在细胞质或细胞周质内表达重组蛋白。细胞周质表达增强了蛋白质通过二硫键的折叠。
pET构建体：为了在细菌细胞中表达STEAP-1，将全部或部分的STEAP-1cDNA蛋白质编码序列克隆到pET家族的载体中(Novagen，Madison，WI)。这些载体允许在细菌中严密控制地表达重组STEAP-1蛋白，所述蛋白质可以与提高溶解性的蛋白质，例如NusA和硫氧还蛋白(Trx)以及有助于纯化和检测重组蛋白质的表位标记例如6×His和S-TagTM融合，也可以不与它们融合。例如，采用pET NusA融合系统43.1来生产构建体，使得STEAP-1蛋白的区域被表达成与NusA氨基末端的融合蛋白。
C.酵母构建体：
pESC构建体：为了在酵母种酿酒酵母中表达STEAP-1以生产重组蛋白质和进行功能研究，将全部或部分STEAP-1cDNA蛋白质编码序列克隆到pESC家族的载体中，每个载体包含4个选择标记HIS3，TRP1，LEU2，和URA3的一个(Stratagene，La Jolla，CA)。这些载体允许在同一酵母细胞内由同一质粒可控制地表达直至2个包含FlagTM或Myc表位标记的不同基因或克隆序列。这个系统可用于确定STEAP-1的蛋白质-蛋白质相互作用。另外，酵母中的表达产生类似的翻译后修饰，例如糖基化和磷酸化，当在真核细胞中表达时可发现这些修饰。
pESP构建体：为了在酵母种Saccharomyces pombe中表达STEAP-1，将全部或部分的STEAP-1cDNA蛋白质编码序列克隆到pESP家族的载体中。这些载体允许氨基端或羧基端融合了有助于纯化重组蛋白质的GST的STEAP-1蛋白序列可控制地高表达。FlagTM表位标记允许运用抗FlagTM抗体来检测重组蛋白质。
实施例8：在高等真核系统中生产重组STEAP-1
A.哺乳动物构建体：
为了在真核细胞中表达重组STEAP-1，将全长或部分STEAP-1 cDNA序列克隆到本领域已知的表达载体的任何一种。这些构建体中表达了一个或多个下列STEAP-1区域：STEAP-1v.1，v.4的氨基酸1至339，v.2的氨基酸1至258，v.3的氨基酸1至282，或STEAP-1、其变体或类似物的任意8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50或更多个邻接氨基酸。在某些实施方案中，特定的STEAP-1变体的区域被表达，其编码与任何其它变体的该位置上的氨基酸不同的特定位置上的氨基酸。在其它实施方案中，STEAP-1变体的区域被表达，所述区域部分或完全位于该变体独特的序列内。
该构建体可以被转染至多种哺乳动物细胞的任意一种，如293T细胞中。可以用本文描述的抗STEAP-1多克隆血清来检测被转染的293T细胞裂解产物。
pcDNA4/HisMax构建体：为了在哺乳动物细胞中表达STEAP-1，将STEAP-1的ORF，或其一部分克隆入pcDNA4/HisMax Version A(Invitrogen，Carlsbad，CA)。采用巨细胞病毒(CMV)启动子和SP16翻译增强子来驱动蛋白质的表达。重组蛋白质的氨基末端融合有XpressTM和6个组氨酸(6×His)表位。pcDNA4/HisMax载体也含有牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸信号和转录终止序列来提高mRNA的稳定性，同时含有在表达大T抗原的细胞系中用于附加型复制和简单载体拯救的SV40起点。Zeocin抗性基因允许对表达蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因和ColE1起点允许在大肠杆菌中选择和维持质粒。
pcDNA3.1/MycHis构建体：为了在哺乳动物细胞中表达STEAP-1，将具有共有Kozak翻译起始位点的STEAP-1ORF，或其一部分克隆入pcDNA3.1/MycHis Version A(Invitrogen，Carlsbad，CA)。蛋白质的表达通过巨细胞病毒(CMV)启动子来驱动。重组蛋白质的羧基末端融合有myc表位和6×His表位。pcDNA3.1/MycHis载体也包含牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸信号和转录终止序列来提高mRNA的稳定性，同时含有在表达大T抗原的细胞系中用于附加型复制和简单载体拯救的SV40起点。应用新霉素抗性基因，因为可它允许对表达蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因和ColE1起点允许在大肠杆菌中选择和维持质粒。
pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO构建体：为了在哺乳动物细胞中表达STEAP-1，并允许采用荧光检测重组蛋白质，将具有共有Kozak翻译起始位点的STEAP-1ORF，或其一部分克隆入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen，CA)。蛋白质的表达通过巨细胞病毒(CMV)启动子来驱动。重组蛋白质的羧基末端融合有绿色荧光蛋白(GFP)，有助于非侵入性的体内检测和细胞生物学研究。pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体也包含牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸信号和转录终止序列来提高mRNA的稳定性，同时含有在表达大T抗原的细胞系中用于附加型复制和简单载体拯救的SV40起点。新霉素抗性基因允许对表达蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因和ColE1起点允许在大肠杆菌中选择和维持质粒。氨基末端融合有GFP的其它构建体在pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO中制成，其跨越了全长的STEAP-1蛋白。
PAPtag：将STEAP-1的ORF，或其一部分克隆入pAPtag-5(GenHunterCorp.Nashville，TN)。该构建体产生了羧基末端融合了碱性磷酸酶而氨基末端融合了IgGκ信号序列的STEAP-1蛋白。同时还制备了具有氨基末端IgGκ信号序列的碱性磷酸酶与STEAP-1蛋白氨基末端融合的构建体。使得到的重组STEAP-1蛋白最优化，以分泌至被转染哺乳动物细胞的培养基中，并可用于鉴定与STEAP-1蛋白相互作用的蛋白质，如配体或受体。蛋白质的表达通过CMV启动子来驱动，重组蛋白质也含有在羧基末端融合的有助于纯化和检测的myc和6×His表位。载体上的Zeocin抗性基因允许对表达重组蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因允许在大肠杆菌中选择质粒。
pTag5：一将STEAP-1ORF或其一部分克隆入pTag-5。该载体与pAPtag类似但没有融合碱性磷酸酶。该构建体产生的STEAP-1蛋白在氨基末端具有IgGκ信号序列，同时羧基末端具有有助于检测和亲和纯化的myc和6×His表位标记。将得到的重组STEAP-1蛋白最优化，以分泌入被转染哺乳动物细胞的培养基，并可用作鉴定与STEAP-1蛋白相互作用的蛋白质，如配体或受体的免疫原或配体。蛋白质的表达通过CMV启动子来驱动，载体上的Zeocin抗性基因允许对表达蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因允许在大肠杆菌中选择质粒。
PsecFc：将STEAP-1 ORF或其一部分也克隆入psecFc。通过将人免疫球蛋白Gl(IgG)Fc(铰链区，CH2，CH3区)克隆至pSecTag2(Invitrogen，California)来装配psecFc载体。该构建体在STEAP-1蛋白的羧基末端产生IgG1 Fc融合蛋白，而在N末端融合了IgGκ信号序列。也使用了利用鼠IgG1 Fc区域的STEAP-1融合蛋白。将得到的重组STEAP-1蛋白最优化以分泌入被转染哺乳动物细胞的培养基，并可用作鉴定与STEAP-1蛋白相互作用的蛋白质，如配体或受体的免疫原。蛋白质的表达通过CMV启动子来驱动，载体上的潮霉素抗性基因允许对表达重组蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因允许在大肠杆菌中选择质粒。
pSRα构建体：为了产生组成型表达STEAP-1的哺乳动物细胞系，将STEAP-1 ORF或其一部分克隆入pSRα构建体。通过将pSRα构建体转染至293T-10A1包装系，或分别将pSRα和辅助质粒(包含缺失的包装序列)共转染至293细胞，来产生兼嗜性和亲嗜性逆转录病毒。使用所述逆转录病毒感染多种哺乳动物细胞系，导致克隆基因STEAP-1整合至宿主细胞系。蛋白质的表达通过长末端重复序列(LTR)驱动，载体上存在的新霉素抗性基因允许对表达蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因和ColE1起点允许在大肠杆菌中选择和维持质粒。因此逆转录病毒载体可以用于感染和生产多种使用如PC3，NIH 3T3，TsuPr1，293或rat-1细胞的细胞系。
另外制备了使STEAP-1序列的羧基端融合如FLAGTM标记的表位标记的pSRα构建体，从而允许使用抗Flag抗体来检测。例如，将FLAGTM序列5’gattac aag gat gac gac gat aag 3’(SEQ ID NO：80)加入ORF 3’末端的克隆引物。另外制备了pSRα构建体，来生产全长STEAP-1蛋白的氨基端和羧基端GFP和myc/6×His融合蛋白。
其它的病毒载体：另外制备了用于病毒介导的STEAP-1传递和表达的构建体。在病毒传递系统如腺病毒载体和疱疹病毒扩增子载体中获得了导致STEAP-1高水平表达的高病毒滴度。通过PCR扩增STEAP-1编码序列或其片段，并亚克隆至AdEasy穿梭载体(Stratagene)。根据厂家说明进行重组和病毒包装来生产腺病毒载体。可选地，将STEAP-1编码序列或其片段克隆至HSV-1载体(Imgenex)来生产疱疹病毒载体。然后将这些病毒载体用于感染多种细胞系如PC3，NIH 3T3，293或rat-1细胞。
受调节的表达系统：为了调控哺乳动物细胞中STEAP-1的表达，将STEAP-1的编码序列或其部分克隆入受调节的哺乳动物表达系统如T-Rex系统(Invitrogen)、GeneSwitch系统(Invitrogen)和紧密调节的Ecdysone系统(Sratagene)。这些系统允许对重组STEAP-1依赖于时间和浓度的效应进行研究。然后可将这些载体用于控制多种细胞系，如PC3，NIH 3T3，293或rat-1细胞中的STEAP-1表达。
B.杆状病毒表达系统
为了在杆状病毒表达系统中产生重组STEAP-1蛋白，将STEAP-1 ORF或其部分克隆入杆状病毒转移载体pBlueBac 4.5(Invitrogen)中，所述载体的N末端提供了His-标记。具体地说，将pBlueBac-STEAP-1与辅助质粒pBac-N-Blue(Invitrogen)共转染入SF9(草地夜蛾)昆虫细胞来生产重组杆状病毒(详见Invitrogen操作手册)。然后从细胞上清液中收集杆状病毒并用斑点分析进行纯化。
然后通过用纯化的杆状病毒感染HighFive昆虫细胞(Invitrogen)来生产重组STEAP-1蛋白。可以用抗STEAP-1或抗-His标记抗体检测重组STEAP-1蛋白。可以纯化STEAP-1蛋白，将其用于多种基于细胞的分析或作为免疫原来生产STEAP-1特异性的多克隆和单克隆抗体。
实施例9：抗原性分布图和二级结构
图5(a)-9(a)和5(b)-9(b)分别图解描述了STEAP-1变体1和3的5种氨基酸分布图，对每个变体的评估可以通过访问位于万维网(URL.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl)的ProtScale网站的ExPasy分子生物学服务器获得。
这些分布图：图5(a)和(b)，亲水性(Hopp T.P.，Woods K.R.，1981.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828)；图6(a)和(b)，亲/疏水性(Kyte J.，Doolittle R.F.，1982.J.Mol.Biol.157：105-132)；图7(a)和(b)，可及残基百分比(JaninJ.，1979Nature 277：491-492)；图8(a)和(b)，平均柔性(Bhaskaran R.，and Ponnuswamy P.K.，1988.Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255)；图9(a)和(b)，β-转角(Deleage，G.，Roux B.1987 Protein Engineering 1：289-294)以及任何其它可在本领域，如在ProtScale站点获得的分布图可用来鉴定STEAP-1蛋白的抗原性区域。应用下述分析用的ProtScale参数来生成STEAP-1的上述每一个氨基酸分布图：1)窗口大小为9；2)与窗口中心相比窗口边缘占100％的权重；以及3)氨基酸分布图的数值标准化至介于0和1之间。
使用亲水性(图5(a)和(b))，亲/疏水性(图6(a)和(b))和可及残基百分比(图7(a)和(b))分布图来确定亲水性(即亲水性和可及残基百分比值大于0.5，亲/疏水性分布图上的值小于0.5)氨基酸片段。这些区域很可能暴露于水环境，出现在蛋白质的表面，因此可以用于免疫识别，如被抗体识别。
平均柔性(图8(a)和(b))和β转角(图9(a)和(b))分布图可确定不受二级结构如β折叠和α折叠约束的氨基酸片段(即，β-转角分布图和平均柔性分布图的数值大于0.5)。这些区域也很可能暴露于蛋白质的表面，因此可以用于免疫识别，如被抗体识别。
通过例如图5(a)和(b)，图6(a)和(b)，图7(a)和(b)，图8(a)和(b)和/或图9(a)和(b)所示的分布图显示出来的STEAP-1蛋白和变体蛋白质的抗原性序列可用于制备或者是肽或是编码肽的核酸的免疫原，用以产生治疗和诊断用的抗STEAP-1抗体。该免疫原可以是图2和3中所列STEAP-1蛋白变体的任意5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50或50个以上邻接的氨基酸，或相应的编码它们的核酸。特别地，本发明的肽免疫原可含有图2和3中的以任何整数增加但至少为5个氨基酸的肽区域，其中包括在图5(a)和(b)的亲水性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；图2和3中的以任何整数增加但至少为5个氨基酸的肽区域，其中包括在图6(a)和(b)的亲/疏水性分布图中数值小于0.5的氨基酸位置；图2和3中的以任何整数增加但至少为5个氨基酸的肽区域，其中包括在图7(a)和(b)的可及残基百分比分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；图2和3中的以任何整数增加但至少为5个氨基酸的肽区域，其中包括在图8(a)和(b)的平均柔性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；以及图2和3中的以任何整数增加但至少为5个氨基酸的肽区域，其中包括在图9(a)和(b)的β-转角分布图中数值大于0.5的氨基酸位置。本发明的肽免疫原也可以包括编码前述任一个的核酸。
本发明所有的免疫原、肽或核酸均可以包含在人的单位剂量形式中，或包含在包括与人体生理学相容的药物赋形剂的组合物中。
可运用通过ExPasy分子生物学服务器访问(万维网网址为.expasy.ch/tools/)的HNN-等级神经网络法(Guermeur，1997，http://pbil.ibCP.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_nn.html)，由各自的一级氨基酸序列来预测STEAP-1变体1和变体3的二级结构，即α螺旋、延伸链和无规卷曲的推测的出现和位置。分析显示STEAP-1变体1由64.60％的α螺旋，4.72％的延伸链和30.68％无规卷曲(图13a)组成，STEAP-1变体2由62.79％的α螺旋，3.10％的延伸链和34.11％的无规卷曲(图13b)组成，STEAP-1变体3由58.87％的α螺旋，5.32％延伸链和35.82％的无规卷曲(图13c)组成。
对STEAP-1变体跨膜结构域可能的存在的分析采用通过ExPasy分子生物学服务器访问(万维网网址为.expasy.ch/tools/)的多种跨膜预测算法进行。图中显示的是对变体1的分析结果，描述了运用TMpred程序(图13d)以及TMHMM程序(图13e)测定的6个跨膜结构域的存在和位置。图中还显示了对变体2的分析结果，描述了运用TMpred程序测定的4个跨膜结构域(图13f)的存在和位置，以及运用TMHMM程序测定的3个跨膜结构域(图13g)的存在和位置。图中还显示了对变体3的分析结果，描述了运用TMpred程序预测的4个跨膜结构域(图13h)的存在，以及运用TMHMM程序预测的3个跨膜结构域(图13i)的存在。每个程序的结果，即编码跨膜结构域的氨基酸总结于表XX。
实施例10：生产STEAP-1多克隆抗体
多克隆抗体可以在哺乳动物中生成，例如通过一次或多次注射免疫剂，以及需要时注射佐剂。典型地，免疫剂和/或佐剂通过多重皮下或腹膜内注射给哺乳动物注射。另外，为用全长STEAP-1蛋白变体免疫，采用计算机算法来设计免疫原，根据氨基酸序列分析，所述免疫原包括抗原性特征和被免疫宿主的免疫系统识别的特征(参见题为“抗原性分布图和二级结构”的实施例)。这样的区域被预测为有亲水性、柔性、有β-转角构象并暴露在蛋白质表面(参见例如图5(a)和(b)，图6(a)和(b)，图7(a)和(b)，图8(a)和(b)和/或图9(a)和(b)中显示STEAP-1蛋白变体1和3的该区域的氨基酸分布图)。
例如，包含STEAP-1蛋白变体的亲水性、柔性、β-转角区域的重组细菌融合蛋白或肽被用作抗原，在新西兰白兔(New Zealand White rabbits)中生产多克隆抗体，或如题为“产生STEAP-1单克隆抗体(MAb)”的实施例所述产生单克隆抗体。例如，所述区域包括但并不限于STEAP-1变体1，2和3的氨基酸1-40，氨基酸143-165和氨基酸180-220，STEAP-1变体1的氨基酸312-339，以及STEAP-1变体3的氨基酸250-282。将免疫剂与已知的对免疫哺乳动物具有免疫原性的蛋白质偶联是有益的。这种免疫原性蛋白质的实例包括但并不限于匙孔戚血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白以及大豆胰蛋白酶抑制剂。在一个实施方案中，编码STEAP-1变体3的氨基酸250-282的肽与KLH偶联。然后将该肽用作免疫原。可选择地，免疫剂可以包括全部或部分的STEAP-1变体蛋白质、其类似物或融合蛋白。例如，可以用重组DNA技术使STEAP-1变体1氨基酸序列与任一种本领域众所周知的融合蛋白配对物相融合，所述配对物如谷胱甘肽S转移酶(GST)和经HIS标记的融合蛋白。在另一个实施方案中，用重组技术和pGEX表达载体将STEAP-1变体1的氨基酸250-282与GST融合，表达、纯化并用来免疫兔。采用适宜的亲和基质从诱导的细菌中纯化该融合蛋白。
其它可以利用的重组细菌融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白、LacZ、硫氧还蛋白、NusA或免疫球蛋白的恒定区(参见题为“在原核系统中生产STEAP-1”的部分，以及Current Protocols In Molecular Biology，Volume 2，Unit16，Frederick M.Ausubul et al.，eds.，1995；Linsley，P.S.，Brady，W.，Urnes，M.，Grosmaire，L.，Damle，N.，and Ledbetter，L.(1991)J.Exp.Med.174，561-566)。
除了细菌来源的融合蛋白，也采用了哺乳动物表达的蛋白质抗原。这些抗原由哺乳动物表达载体如Tag5和Fc-融合载体表达(参见题为“在真核生物系统中生产重组STEAP-1”的部分)，并保留翻译后修饰，如在天然蛋白质中发现的糖基化等。在一个实施方案中，将STEAP-1变体1的氨基酸185-218克隆入Tag5哺乳动物分泌载体，并在293T细胞中表达。通过金属螯合层析由稳定表达重组载体的293T细胞的组织培养物上清中纯化重组蛋白质。然后将纯化的Tag5STEAP-1变体1蛋白用作免疫原。
在免疫操作期间，在佐剂中混匀或乳化抗原对提高宿主动物的免疫应答是有益的。免疫佐剂的实例包括但并不限于完全弗氏佐剂(CFA)和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质体A，合成海藻糖dicorynomycolate)。
在典型的操作中，起先用200μg，典型地为100-200μg与完全弗氏佐剂(CFA)混合的与KLH偶联的融合蛋白或肽对兔进行皮下免疫。接着用200μg，典型地为100-200μg处于不完全弗氏佐剂(IFA)中的免疫原给兔每2周皮下注射一次。每次免疫后大约7-10天取血检验，用ELISA监测抗血清滴度。
为了检验免疫血清，如用STEAP-1变体1蛋白质的GST-融合物免疫获得的兔血清的反应性和特异性，将全长STEAP-1变体1cDNA克隆入pCDNA 3.1myc-his表达载体(Invitrogen，参见题为“在真核系统中生产重组STEAP-1”的实施例)。将构建体转染至293T细胞后，用抗STEAP-1血清和抗His抗体(Santa Cruz Biotechnologies，Santa Cruz，CA)检测细胞裂解液，从而用Western印迹技术确定对变性STEAP-1蛋白的特异反应性。另外，通过荧光显微术、流式细胞仪和对293T和其它重组表达STEAP-1的细胞的免疫沉淀反应检测免疫血清，确定对天然蛋白质的特异性识别。也可进行应用内源性表达STEAP-1的细胞的Western印迹、免疫沉淀、荧光显微术和流式细胞仪技术以检测反应性和特异性。
通过流经包含单独的或处于其它不相关融合蛋白中的融合配对物的亲和柱来耗损与融合配对物序列反应的抗体，籍此纯化用STEAP-1变体融合蛋白，如GST和MBP融合蛋白免疫兔获得的抗血清。例如，首先通过流经与GST蛋白共价结合的AffiGel基质(BioRad，Hercules，Calif.)柱纯化由GST-STEAP-1变体1融合蛋白获得的抗血清。然后通过流经由与MBP-STEAP-1融合蛋白共价结合的AffiGel基质组成的柱子亲和纯化抗血清。接着，进一步通过G蛋白亲和层析来纯化血清以分离IgG组分。通过流经由原始蛋白质免疫原或游离肽组成的柱基质来亲和纯化得自其它被His标记的抗原和肽免疫的兔的血清和耗尽融合配对物的血清。
实施例11：产生STEAP-1单克隆抗体(MAb)
在一个实施方案中，STEAP-1变体的治疗性MAb包含与特异性针对每个变体蛋白质或特异性针对变体间共同序列的表位反应的MAb，所述MAb会结合、内化、破坏或调制STEAP-1变体的生物学功能，例如，那些会破坏与配体和结合配对物的相互作用的MAb。用于生产这种MAb的免疫原包括那些经设计编码或包含胞外结构域或全部STEAP-1蛋白变体序列的区域，经推测含有功能性基元的区域以及由氨基酸序列的计算机分析推测具有抗原性的STEAP-1蛋白变体的区域(参见例如图5(a)-(b)，图6(a)-(b)，图7(a)-(b)，图8(a)-(b)或图9(a)-(b)，以及题为“抗原性分布图和二级结构”的实施例)。免疫原包括肽、重组细菌蛋白质以及哺乳动物表达的Tag 5蛋白和人和鼠IgGFC融合蛋白。另外，使用pTAG5蛋白、编码pTAG5的DNA载体、经改造可高水平表达各个STEAP-1变体的细胞，例如293T-STEAP-1变体1或3T3，RAT或300.19-STEAP-1变体1鼠前B细胞来免疫小鼠。
为了生产STEAP-1变体的MAb，首先用与完全弗氏佐剂混合的10-50μg蛋白质免疫原或107个表达STEAP-1的细胞腹膜内(IP)或足垫内免疫小鼠。所用其它佐剂的例子是Titermax(Sigma)和Immuneasy(Qiagen)。接着用与不完全弗氏佐剂混合的10-50μg蛋白质免疫原或107个细胞每2-4周IP免疫小鼠一次。可选地，将MPL-TDM佐剂用于免疫。除上述蛋白和基于细胞的免疫策略外，可采用基于DNA的免疫规程，其中编码STEAP-1变体序列的哺乳动物表达载体被用于通过直接注射质粒DNA来免疫小鼠。例如，STEAP-1变体1的氨基酸序列185-218被克隆入Tag5哺乳动物分泌载体，且重组载体被用作免疫原。在另外一个例子中，同样的氨基酸被克隆入Fc融合分泌载体，其中STEAP-1变体1序列的氨基末端与IgK前导序列融合，羧基末端与人或鼠IgG Fc区域的编码序列融合。然后将这一重组载体用作免疫原。该质粒免疫操作程序可与由同一载体表达的纯化蛋白质以及表达各个STEAP-1变体的细胞联合使用。在另外一个例子中，通过使用编码氨基酸250-282的肽产生抗STEAP-1变体3的单克隆抗体。将此肽与KLH偶联并用作免疫原。对游离肽进行ELISA以鉴定出免疫反应性克隆。使用重组和内源性表达STEAP-1变体1的细胞，通过Western印迹、免疫沉淀和流式细胞仪监测抗全长STEAP-1变体1蛋白的单克隆抗体的反应性和特异性。
在免疫操作的过程中，每次注射后7-10天取血检验，监测免疫反应的滴度和特异性。一旦通过ELISA、Western印迹、免疫沉淀、荧光显微术和流式细胞仪技术确定已获得适宜的反应性和特异性，便采用本领域众所周知的操作程序(参见例如，Harlow and Lane，1988)进行融合与杂交瘤的产生。
采用标准技术确定STEAP-1变体1特异性单克隆抗体的结合亲和性。亲和性检测能定量抗体与表位结合的强度，并用于帮助确定哪种STEAP-1变体单克隆抗体优选用于诊断或治疗性应用，这一点是本领域技术人员所熟知的。BlAcore系统(Uppsala，Sweden)是用于测定结合亲和性的优选方法。BIAcore系统采用表面胞质基因组共振(SPR，Welford K.1991，Opt.Quant.Elect.23：1；Morton and Myszka，1998，Methods in Enzymology 295：268)来监测生物分子实时的相互作用，BlAcore分析能便利地生成缔合速率常数、解离速率常数、平衡解离常数以及亲和常数。
为了产生特异于其它STEAP-1变体的单克隆抗体，将免疫原设计成能编码变体所特有的氨基酸序列。在一个实施方案中，合成编码STEAP-1变体所特有的氨基酸的肽，使其与KLH偶联并用作免疫原。在另一个实施方案中，制备肽或细菌融合蛋白，其包含通过变体中的可变剪接产生的独特序列。然后选择杂交瘤，该杂交瘤能识别各个变体特异性的抗原，也能识别细胞中表达的全长变体蛋白质。所述选择利用了上文所述的免疫测定法，如Western印迹、免疫沉淀和流式细胞仪。
在一个实施方案中，本发明提供了被称为X92.1.30.1.1(1)(a.k.a.M2/92.30)和X120.545.1.1(a.k.a.M2.120.545)的单克隆抗体。鉴定出M2/92.30和M2/120.545，已证实它们能与细胞表面STEAP-1反应和结合(参见图15和18)。图16显示出抗-STEAP-1MAb M2/92.30能结合膀胱癌和前列腺癌异体移植物细胞中表达的内源性细胞表面STEAP-1。另外，如图17所示，M2/92.30能与鼠STEAP-1反应和结合。
被称为X92.1.30.1.1(1)(a.k.a.M2/92.30)和X120.545.1.1(a.k.a.M2.120.545)的抗体已于2004年2月6日(经联邦快递)寄送至美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，保藏号分别为PTA-5802和PTA-5803。
使用下述方法克隆M2/92.30和M2/120.545抗体。用Trizol试剂(LifeTechnologies，Gibco BRL)裂解杂交瘤细胞。纯化和定量总RNA。使用Gibco-BRL Superscript Preamplification系统，以寡(dT)12-18引发由总RNA产生第一链cDNA。将PCR产物克隆至pCRScript载体(Stratagene，La Jolla)。对几个克隆进行测序，测定可变重链(“VH”)和可变轻链(“VL”)区域。图19(a)-19(d)和图20(a)-(e)列出了M2/92.30和M2/120.545可变重链和可变轻链区域的核酸和氨基酸序列。
实施例12：鉴定STEAP-1抗体
A.细胞表面结合
适当时，使用STEAP-1-相关蛋白质、表达STEAP-1的细胞或其提取物，通过多种众所周知的方法，包括Western印迹、免疫沉淀、ELISA和FACS分析确定STEAP-1抗体与STEAP-1-相关蛋白质的反应性。如图15所示，对用抗-STEAP MAb M2/92.30(10μg/ml)染色的稳定表达STEAP-1或对照的重组3T3和Rat1细胞进行FACS分析，用山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二试剂检测与细胞表面结合的MAb。然后对经染色的细胞进行FACS分析。与各自的对照细胞相比，Rat1-STEAP1和3T3-STEAP1细胞的荧光转变表明：M2/92.30特异性结合细胞表面的STEAP1。
另外，用10μg/ml MAb M2/92.30或对照抗-KLH MAb染色UGB1膀胱癌细胞和LAPC9前列腺癌细胞。用山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二Ab检测与细胞表面结合的MAb 92.30。然后对经染色的细胞进行FACS分析。这些结果表明：抗-STEAP1 MAb M2/92.30特异性结合在膀胱癌和前列腺癌异体移植物细胞中表达的内源性细胞表面STEAP1(图21)。
STEAP1 M2/92.30也表现出可结合鼠STEAP-1蛋白(参见图17)。在此实验中，用编码鼠STEAP1 cDNA的pcDNA3.1或用空白载体瞬时转染293T细胞。48小时后，收集细胞并用抗-STEAP1 MAb M2/92.30(10μg/ml)染色细胞，用山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二试剂检测与细胞表面结合的MAb 92.30。然后对细胞进行FACS分析。STEAP-1 M2/92.30显示出能特异性结合表达STEAP-1的293T细胞。
STEAP-1 M2/120.545还显示出能特异性结合STEAP-1(参见图18)。用MAb M2/120.545(10μg/ml)染色3T3-neo(A组，涂黑的直方图)和3T3-STEAP1细胞(A组，未涂黑的直方图)以及Rat1-neo(B组，涂黑的直方图)和Rat1-STEAP细胞(B组，未涂黑的直方图)，用山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二Ab检测与细胞表面结合的MAb。然后对细胞进行FACS分析。与其各自的neo对照相比，3T3-STEAP1和Rat1-STEAP1细胞的荧光转变表明：MAbM2/120.545特异性结合细胞表面的STEAP1。在C试验组中，用MAbM2/120.545或对照抗-KLH MAb染色LNCaP细胞，如上所述对经染色的细胞进行FACS分析。在D试验组中，经M2/120.545染色的LNCaP细胞的荧光显微术显示出明亮的细胞表面荧光。
通过免疫沉淀测定M2/92.30和M2/120.545的反应性和特异性。图25显示出：在RIPA缓冲液(25mM Tris-Cl pH7.4；150mM NaCl，0.5mM EDTA，1％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸，0.1％SDS和蛋白酶抑制剂混合物)中裂解3T3-STEAP1和3T3-neo细胞。用G蛋白琼脂糖凝胶珠预清除细胞裂解物，然后于室温与5μg MAb M2/92.30或M2/120.545保温2小时。加入G蛋白珠，将混合物再保温1小时。洗涤免疫复合物，并溶解于SDS-PAGE样品缓冲液。然后对溶解的样品进行SDS-PAGE，并使用兔抗-STEAP pAb进行Western印迹分析。同时电泳被STEAP1转染的293T细胞的全细胞裂解物以用作阳性对照。仅在得自3T3-STEAP1细胞的样品中观察到约为37kD的免疫反应带，这表明M2/92.30和M2/120.545MAb都能特异性免疫沉淀STEAP1。
B.STEAP-1抗体内化
基于使用单克隆抗体向特定的细胞靶传递毒素的免疫疗法被认为是一种恶性肿瘤疗法的形式。普遍的原理是使用能与抗原或受体结合的分子向癌细胞传递毒素或抗肿瘤药物，相对于正常组织而言，所述抗原或受体只在靶细胞上表达或过表达。
免疫毒素由与毒素共价连接的细胞选择性配体(通常为单克隆抗体或细胞因子)组成。抗体或配体与细胞表面受体的相互作用引起内化。在受限的细胞内小泡区室中，毒素组成成分泄漏至细胞溶胶，在此它催化性地改变了重要的细胞功能，导致细胞死亡。参见Frankel AE.，Increased Sophisticationof Immunotoxins，Clinical cancer research 8：942-944，(2002)and Allen TM，Ligand-Targeted Therapeutics in Anti-cancer Therapy.Nature Reviews.2：750-760，(2002)。
皂草素是核糖体失活蛋白(RIP)，它能催化大的核糖体RNA中特异性腺嘌呤残基的体外脱嘌呤作用。Endo Y，et.al.，Mechanism of Action of the ToxinLectin Ricin on Eukaryotic Cells；The Site and Characteristics of theModification in 28S RNA Caused by the Toxin，J.Biol.Chem.262，5908-5912，(1987)。它通常不能进入细胞，除非与适当的载体分子复合。使皂草素与能识别肿瘤抗原的单克隆抗体共价偶联会产生既具有癌细胞选择性又可被内化的免疫毒素。参见Flavell，DJ，Sapoin Immunotoxins，Curr.Top.Microbiol.Immunol.234：51-61，(1998)and Flavell DJ，et.al.，Therapy of Human T-cellAcute Lymphoblastic Leukemia with a Combination of Anti-CD7andAnti-CD38-Saporin Immunotoxins is Significantly Better than Therapy withEach Individual Immunotoxins.Br.J.Cancer 84：571-578，(2001)。最近，这些分子已进入白血病和多发性骨髓瘤的I期临床试验。Foon KA.MonoclonalAntibody Therapies for Lymohomas.CancerJ.6：273-278，(2000)。
图22显示了STEAP-1 M2/92.30的内化。在此实验中，于4℃，用M2/120.545MAb(10μg/ml)染色PC3-STEAP1细胞，洗涤，然后与山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二Ab保温。将一半细胞移至37℃放置30分钟，将另一半细胞仍放置于4℃。然后用荧光显微镜观察经上述处理的细胞。维持于4℃的细胞在细胞表面周围显示出明亮的染色。转移至37℃的细胞的周围未显示出染色，点状和聚集荧光的出现表明帽化和内化。
图23显示了STEAP1 M2/120.545MAb内化STEAP-1。于4℃，用M2/120.545MAb(10μg/ml)染色PC3-STEAP1细胞，洗涤，然后与山羊抗-小鼠IgG-PE偶联第二Ab保温。将一半细胞移至37℃放置30分钟，将另一半细胞仍放置于4℃。然后用荧光显微镜观察经上述处理的细胞。维持于4℃的细胞显示出明亮的“环状”细胞表面荧光。转移至37℃的细胞未显示出“环状”细胞表面荧光，点状和聚集荧光的出现表明帽化和内化。
一种选择用于免疫毒素传递的适当候选抗体的方法利用与药物或毒素分子偶联的第二抗体进行杀伤。第二偶联抗体背负着第一抗体，从而可评价第一抗体内化并移动至适当的细胞内区室的能力。一旦偶联物被内化，皂草素从靶向剂上脱离并灭活核糖体以消除靶细胞。Kohls MD and LappiDA.MAb-ZAP：A Tool for Evaluating Antibody Efficacy for Use in anImmunotoxin.Bio Techniques.28(1)：162-165(2000)。
为了使用上述方法选择适当的候选抗体，使用第二免疫毒素抗-小鼠IgG-皂草素偶联物(Advanced Targeting Systems，San Diego，CA)阐明鼠Steap-1 M2/120.545经由LNCaP细胞表面Steap-1的表达进入靶细胞。使用下述方法。将LNCaP细胞以5000个细胞/90μl/孔的密度铺于96孔培养板并保温过夜。在细胞培养基中加入第二免疫毒素偶联物(抗-小鼠IgG-皂草素和抗-山羊IgG-皂草素)或抗-小鼠IgG，使其终浓度为100ng/ml。在每孔中加入10μl。加入浓度范围为1-1000ng/ml的第一抗体。将培养板保温72小时，通过MTT试验测定存活力。图24中的结果表明：抗-小鼠IgG-皂草素的存在会杀死LNCaP细胞。仅用第二抗体(抗-小鼠IgG)或非特异性第二抗体偶联物(抗-山羊IgG-皂草素)未检测到效果。仅用受试浓度达1μg/ml的第一抗体(M2/120.545)未观察到毒性。
实施例13：HLAI类和II类结合试验
根据公开的方法，使用纯化的HLA分子进行HLAI类和II类结合试验(例如，PCT公开号WO94/20127和WO94/03205；Sidney et al.，Current Protocols inImmunology 18.3.1(1998)；Sidney，et al.，J.Immunol.154：247(1995)；Sette，etal.，Mol.Immunol.31：813(1994))。简而言之，如其所述，将纯化的MHC分子(5-500nM)与多种未标记的肽抑制剂和1-10nM 125I放射性标记的探针肽共同保温。保温后，通过凝胶过滤将MHC-肽复合物与游离肽分开，确定结合肽组分。典型地，在预试验中，在固定量的经放射性标记的肽的存在下滴定每个MHC制品以确定结合10-20％的总放射性所需的HLA分子浓度。所有后序的抑制和直接结合试验都用这些HLA浓度进行。
由于在这些条件下，[标记]＜[HLA]而IC50≥[HLA]，故测出的IC50值为合理的真正KD的近似值。典型地，肽抑制剂在浓度为120μg/ml-1.2ng/ml时可被检测出来，并在2-4个完全独立的实验中检测。为了能够比照从不同实验中得出的数据，通过用阳性抑制对照的IC50除以每个受试肽(典型地为经放射性标记的探针肽的未标记版本)的IC50，计算出每个肽的相对结合数值。为了数据库的用途和内部实验的比较，编辑了相对结合值。随后，通过用阳性抑制对照IC50的nM值除以感兴趣肽的相对结合，将这些值变回至IC50nM值。这种数据编辑方法对比较在不同的天数或者用不同份额的纯化MHC测定的肽来说是精确的和一致的。
上面概述的结合分析可用来分析携有HLA超基元和/或HLA基元的肽(见表IV)。
实施例14：“小基因”多表位DNA质粒的构建
本实施例讨论小基因表达质粒的构建。小基因质粒当然可以包含本文所述的各种构型的B细胞，CTL和/或HTL表位或表位类似物。
小基因表达质粒通常包括多个CTL和HTL肽表位。在此实施例中，使用携有HLA-A2、-A3、-B7超基元的肽表位以及携有HLA-A1和-A24基元的肽表位与携有DR超基元的表位和/或DR3表位。选择携有HLAI类超基元或基元的来源于STEAP-1的肽表位，使得多种超基元/基元被提供以确保广泛的种群覆盖范围。类似地，HLAII类表位选自STEAP-1以提供广泛的种群覆盖范围，即携有HLA DR-1-4-7超基元的表位和携有HLA DR-3基元的表位均被选择包含在该小基因构建体中。接着，将所选择的CTL和HTL表位掺入小基因而在表达载体中表达。
这种构建体还可以包括将HTL表位引导至内质网的序列。例如，li蛋白可以与如本领域所述的一种或多种HTL表位融合，其中去除该li蛋白中的CLIP序列并替换以HLAII类表位序列，从而将HLAII类表位引导至内质网，在此，表位与HLAII类分子结合。
此实施例举例说明用于构建携有小基因的表达质粒的方法。其它可用于小基因合成物的表达载体为本领域技术人员所知且是可得的。
本实施例中小基因DNA质粒包含共有Kozak序列和共有鼠κ-Ig轻链信号序列，接着的是根据本文公开的原理选择的CTL和/或HTL表位。该序列编码由pcDNA 3.1-Myc-His载体编码的与Myc和His抗体表位标记融合的开放读码框。
合成并经HPLC纯化重叠寡核苷酸，所述重叠寡核苷酸可以例如平均约为70个核苷酸长并有15个核苷酸重叠。该寡核苷酸编码选择的肽表位和合适的接头核苷酸、Kozak序列以及信号序列。最终的多表位小基因经三套PCR反应延长重叠的寡核苷酸而装配。使用Perkin/Elmer 9600PCR仪，并使用下列条件总共进行30轮循环：95℃15秒，退火温度(低于各引物对最低的计算Tm 5℃)30秒，以及72℃1分钟。
例如，按如下方法制备小基因：对于最先的PCR反应，两种寡核苷酸各取5μg经退火和延伸：在一个实例中使用8个寡核苷酸，即，四对引物，寡核苷酸1+2，3+4，5+6，以及7+8合并于100μl的反应液中，该反应液中包含Pfu聚合酶缓冲液(1×＝10mM KCL，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-氯化物，pH8.75，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，100μg/ml BSA)，0.25mM各种dNTP，以及2.5U的Pfu聚合酶。该全长二聚物产品经凝胶纯化，包含1+2和3+4产物以及5+6和7+8产物的两个反应经混合、退火、并延伸10个循环。然后混合两个反应的一半，并且在加入侧翼引物之前进行5个循环的退火和延伸以扩增全长产物。该全长产物经凝胶纯化并克隆至pCR-blunt(Invitrogen)，通过测序筛选各克隆。
实施例15：质粒构建体及其诱导免疫原性的程度
在体外通过用表达表位的核酸构建体转导或转染APC，然后确定APC所进行的表位呈递，证实质粒构建体，例如根据前面实施例构建的质粒，能够诱导的免疫原性的程度。这样的研究确定了“抗原性”并允许使用人类APC。该试验通过定量细胞表面表位-HLAI型复合物的密度，确定在被T细胞识别的环境中APC呈递该表位的能力。通过直接测定从APC上洗脱的肽的量进行定量(参见例如Sijts et al.，J.Immunol.156：683-692，1996；Demotz etal.，Nature 342：682-684，1989)；或通过测定患病或经转染的靶细胞诱导的裂解或淋巴因子释放量，然后确定获得相等水平的裂解或淋巴因子释放所需的肽浓度来估算肽-HLAI类复合物的数目(参见例如，Kageyama et al.，J.Immunol.154：567-576，1995)。
或者，通过向小鼠体内注射并随后在体外评价CTL和HTL的活性而证实免疫原性，所述的活性分别使用细胞毒性和增殖试验进行分析，例如，Alexander et al，在Immunity 1：751-761，1994中进行了详细描述。
例如，为了证实包含至少一个HLA-A2超基元肽的DNA小基因构建体在体内诱导CTL的能力，使用例如100μg的裸露cDNA对HLA-A2.1/Kb转基因小鼠进行肌内免疫。作为比较由cDNA免疫诱导的CTL水平的方法，对照组动物仍使用包括多表位的实际肽组合物进行免疫，所述多个表位因由小基因编码而被合成为单个多肽。
用各组合物(小基因或多表位肽中编码的肽表位)刺激免疫动物的脾细胞两次，然后在引51Cr释放试验中测定肽-特异的细胞毒活性。结果显示了针对A2-限制性表位的CTL应答的量级，由此表明该小基因疫苗和多表位疫苗的体内免疫原性。
因此，发现该小基因能引发抗HLA-A2超基元肽表位的免疫应答，这与多表位肽疫苗的作用相同。还使用其它的HLA-A3和HLA-B7转基因小鼠模型进行类似的分析以评价由HLA-A3和HLA-B7基元或超基元表位诱导的CTL，借此还发现该小基因能引发针对所提供的表位的合适的免疫应答。
为了证实编码II类表位的小基因在体内诱导HTL的能力，使用例如100μg的质粒DNA肌内免疫DR转基因小鼠，或对于那些与合适的小鼠MHC分子交叉反应的表位而言用I-Ab-限制性小鼠。作为比较由DNA免疫诱导的HTL水平的方法，对照动物组仍使用在完全弗氏佐剂中乳化的实际肽组合物进行免疫。由免疫动物的脾细胞中纯化出CD4+T细胞，即HTL，并用各组合物(小基因中编码的肽)刺激。使用3H-胸苷掺入增殖试验测量HTL应答(参见例如Alexander et al.，Immunity 1：751-761，1994)。结果表明HTL应答的量级，由此证明该小基因在体内的免疫原性。
使用引发加强免疫方案证实如上文实施例所述构建的DNA小基因可用作与促进剂联合使用的疫苗。该促进剂可以由重组蛋白质(例如Bamett et al.，Aids Res.and Human Retroviruses 14 Supplement 3：S299-S309，1998)或重组痘苗病毒，例如，能表达编码完整的所需蛋白质的小基因或DNA的痘苗病毒(参见例如Hanke et al.，Vaccine 16：439-445，1998；Sedegah et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 95：7648-53，1998；Hanke and Mcmichael，Immunol.Letters66：177-181，1999；and Robinson et al.，Nature Med.5：526-34，1999)组成。
例如，起初在转基因小鼠中评价用于引发加强免疫方案的DNA小基因的效能。在这些实施例中，使用100μg编码免疫原性肽的DNA小基因肌内免疫A2.1/Kb转基因小鼠，该免疫原性肽包括至少一个携有HLA-A2超基元的肽。保温期(3-9周)后，使用107pfu/小鼠的表达与该DNA小基因编码序列相同的序列的重组痘苗病毒腹膜内加强免疫小鼠。对照小鼠使用不含该小基因序列的100μg DNA或重组痘苗病毒进行免疫，或使用编码小基因的DNA进行免疫，但不进行痘苗病毒加强免疫。在为期两周的额外保温后，立即使用ELISPOT试验测定小鼠脾细胞的肽-特异活性。此外，在体外使用小基因和重组痘苗病毒编码的A2-限制性肽表位刺激脾细胞，然后在α、β和/或γIFN ELISA中测试肽-特异活性。
人们发现，与单独使用DNA相比，用于引发加强免疫方案的小基因能对HLA-A2超基元肽引发更强的免疫应答。还可使用HLA-A11或HLA-B7转基因小鼠模型进行这样的分析，从而评价由HLA-A3或HLA-B7基元或超基元表位诱导的CTL。引发加强免疫方案在人类中的使用描述于下文题为“使用引发加强免疫方案诱导CTL应答”的实施例中。
实施例16：得自多抗原的多表位疫苗组合物
本发明的STEAP-1肽表位用于与其它靶肿瘤相关抗原的表位联合使用，以产生可用于预防或治疗表达STEAP-1和此类其它抗原的癌症的疫苗组合物。例如，疫苗组合物可以作为单一多肽提供，该单一多肽中掺入了STEAP-1的多个表位和与肿瘤相关的抗原，该抗原通常被与STEAP-1表达相关的靶癌症表达，疫苗组合物还可以作为组合物给药，该组合物为包含一种或多种离散表位的混合物式组合物。或者，该疫苗可以作为小基因构建体或作为在体外已经装载肽表位的树状细胞给药。
实施例17：使用肽评价免疫应答
本发明的肽可以用来分析免疫应答，以确定针对STEAP-1的特定抗体、CTL或HTL的存在。这样的分析可以使用Ogg等在Science 279：2103-2106，1998中所述的方法进行。在此实施例中，根据本发明的肽被用作诊断或预测目的的试剂，而非用作免疫原。
在此实施例中，高灵敏度的人类白细胞抗原四聚体复合物(“四聚体”)被用于截面分析，例如，分析处于不同病期或经包括包含A*0201基元的STEAP-1肽免疫后的HLA-A*0201-阳性个体的STEAP-1 HLA-A*0201-特异性CTL的频率。四聚体复合物的合成已有描述(Musey et al.，N.Engl.J.Med.337：1267，1997)。简而言之，通过原核表达系统合成纯化的HLA重链(这些实施例中的A*0201)和β2-微球蛋白。通过缺失该跨膜-胞质尾和在COOH末端增加包含BirA酶促生物素化位点的序列而修饰该重链。通过稀释重新折叠该重链、β2-微球蛋白、以及肽。通过快速蛋白质液相层析分离45-kD的重折叠产物，随后在生物素(Sigma，St.Louis，Missouri)、腺苷5’三磷酸和镁存在下被BirA生物素化。以1∶4摩尔比加入链霉亲和素-藻红蛋白偶联物，并且浓缩该四聚体产品至1mg/ml。所得产品称为四聚体-藻红蛋白。
为了分析患者血样，将约100万PBMC以300g离心5分钟，并再悬浮于50μl的冷磷酸缓冲盐水。使用四聚体-藻红蛋白、抗-CD8-三色和抗-CD38进行三-色分析。在冰上保温PBMC以及四聚体和抗体30至60分钟，冲洗两次后用甲醛固定。应用Gates以容纳＞99.98％的对照样品。四聚体的对照包括A*0201-阴性个体以及A*0201-阳性非患病供体。通过流式细胞仪测定经四聚体染色的细胞百分比。结果显示了PBMC样品中包含表位-限制性CTL的细胞数目，由此容易地指示对于STEAP-1表位免疫应答的程度，并因此指示暴露于STEAP-1或暴露于会引起预防或治疗性应答的疫苗的状态。
实施例18：使用引发加强免疫方案诱导免疫应答
引发加强免疫方案潜在的原理与用于证实DNA疫苗在转基因小鼠中的效能的原理，例如上文题为“质粒构建体及其降低免疫原性的程度”的实施例中所述的原理相似，该方案还可以用于将疫苗施用于人类。这些疫苗的给药方案可以包括初始给药，例如裸露的DNA，接着使用编码疫苗的重组病毒或存在于佐剂中的重组蛋白质/多肽或肽混合物进行加强免疫。
例如，可以使用裸露核酸形式的表达载体，例如题为““小基因”多表位DNA质粒的构建”的实施例中构建的表达载体进行首次免疫，所述载体以0.5-5mg的量在多位点IM(或SC或ID)给药。还可以使用基因枪施用该核酸(0.1至1000μg)。保温3-4周后，给予加强免疫剂量。该加强剂可以是以5-107至5×109pfu的剂量给药的重组禽痘病毒。另一种重组病毒，例如MVA、金丝雀痘病毒、腺病毒或腺伴随病毒也可以用作加强剂，或可以施用多表位蛋白质或肽的混合物。为了评价疫苗效能，在免疫之前以及施用初始疫苗和加强剂量的疫苗后的间歇取得患者血样。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从新鲜的肝素化血液分离出外周血单核细胞，在冷冻介质中等分试样，并冷冻贮存。测试样品的CTL和HTL活性。
分析结果表明：产生了足以实现抗STEAP-1的治疗或保护性免疫力的应答量级。
实施例19：互补多核苷酸
与编码STEAP-1序列互补的序列或其任何部分可用于检测、减少或抑制天然STEAP-1的表达。虽然已经描述了使用含有约15至30个碱基对的寡核苷酸，实质上较小或较大的序列片断也可以使用相同的方法。使用例如OLIGO4.06软件(National Biosciences)和STEAP-1的编码序列设计合适的寡核苷酸。为了抑制转录，由最独特的5’序列设计互补寡核苷酸，并将其用于防止启动子与编码序列结合。为了抑制翻译，设计防止核糖体与编码STEAP-1的转录物结合的互补寡核苷酸。
实施例20：使用STEAP-1-特异性抗体纯化天然或重组STEAP-1
通过使用STEAP-1特异性抗体的免疫亲和层析基本纯化天然或重组的STEAP-1。通过共价偶联抗-STEAP-1抗体与活化的层析树脂，例如CNBr-活化的SEPHAROSE(Amersham Pharmacia Biotech)构建免疫亲和柱。偶联后，根据厂商说明封闭和冲洗树脂。
使包含STEAP-1的介质通过免疫亲和柱，在允许优先吸附STEAP-1的条件下冲洗该柱(例如，存在去污剂的高离子强度缓冲液)。在破坏抗体/STEAP-1结合的条件下洗脱该柱(例如pH2至pH3的缓冲液，或高浓度的离液剂，例如尿素或硫氰根离子)，并收集GCR.P。
实施例21：鉴定与STEAP-1相互作用的分子
用121I Bolton-Hunter试剂标记STEAP-1或其生物活性片断(参见例如Bolton et al.，(1973)Biochem.J.133：529)。使预先排列于多孔板的孔中的候选分子与经标记的STEAP-1一起保温，冲洗，然后分析任一含有标记的STEAP-1复合物的孔。不同浓度的STEAP-1所获得的数据被用于计算各种数值，包括数目、亲和性、以及STEAP-1与候选分子的缔合。
实施例22：STEAP-1肿瘤生长促进的体内分析
通过评价肿瘤进展以及表达或缺乏STEAP-1的细胞的生长体内评价STEAP-1蛋白对肿瘤细胞生长的影响。例如，在SCID小鼠的两肋皮下注射1×106包含tkNeo空载体或STEAP-1的3T3或前列腺癌细胞系(如PC3细胞)。至少可以使用两种策略：(1)在启动子的调节下组成型表达STEAP-1，所述启动子如得自病毒基因组或异源哺乳动物启动子的组成型启动子，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒(UK2,211,504，公开于1989年7月5日)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)，异源哺乳动物启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，条件是所述启动子与宿主细胞系统相容，和(2)在可诱导的载体系统，例如蜕皮素、四环素等控制下可调节地表达，条件是所述启动子与宿主细胞系统相容。然后通过测径器监测可触及的肿瘤表现出的肿瘤体积，接着随着时间推移测定是否表达STEAP-1的细胞以更快的速率生长以及是否由表达STEAP-1的细胞生成的肿瘤显示了变化了的攻击特征(例如增强的转移、血管化，对化疗药物的反应性降低)。
此外，可向小鼠原位移植1×105个同样的细胞从而测定是否STEAP-1对前列腺的局部生长有影响，以及是否STEAP-1对细胞的转移能力，特别是转移至淋巴结以及骨的能力具有影响(Miki T et al.，Oncol Res.2001；12：209；FuX et al.，Int J Cancer.1991，49：938)。通过胫骨内注射前列腺肿瘤细胞可以评估STEAP对骨肿瘤形成和生长的影响。
该分析还有助于测定候选治疗合成物对STEAP-1的抑制效果，所述合成物如STEAP-1内体、STEAP-1反义分子以及核酶。
实施例23：STEAP-1单克隆抗体介导的体内肿瘤抑制
STEAP-1在癌症组织中的显著表达、表面定位以及其在正常组织中的受限表达使得STEAP-1成为抗体治疗的出色靶点。相似地，STEAP-1是基于T细胞免疫治疗的靶点。因此，通过使用重组细胞系，如PC3-STEAP-1和3T3-STEAP-1(参见例如Kaighn，M.E.et al.，Invest Urol，1979，17(1)：p.16-23)以及人前列腺异体移植物模型，如LAPC 9AD(Saffran et al.，PNAS 1999，10：1073-1078)评价抗-STEAP-1 MAb在人前列腺癌异体移植小鼠模型中的疗效。
在例如小鼠原位前列腺癌异体移植物模型中研究抗体对肿瘤生长和转移形成的效能。如本实施例中所讨论的，抗体可以是未偶联的，或可以与其它药物相偶联，这一点是本领域技术人员能理解的。抗-STEAP-1 MAb抑制肺和前列腺异体移植物的形成。抗-STEAP-1 MAb还阻碍了已建立的原位肿瘤的生长并延长了荷瘤小鼠的存活时间。结果表明抗-STEAP-1 MAb在治疗局部或晚期前列腺癌中的有效性(参见例如Saffran，D.et al.，PNAS 10：1073-1078或万维网URL.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698)。
给予抗-STEAP-1MAb可以导致阻碍已建立的原位肿瘤的生长并抑制向远处位点的转移，从而显著延长荷瘤小鼠的存活时间。这些研究显示STEAP-1是免疫治疗的有吸引力的靶点，并表明了抗-STEAP-1MAb治疗局部或转移性前列腺癌的治疗潜力。该实施例表明未偶联的STEAP-1单克隆抗体能有效抑制生长于SCID小鼠体内的人前列腺癌异体移植物的生长；相应地，所述有效的单克隆抗体的联合也是有效的。
使用多个未偶联的STEAP-1MAb抑制肿瘤
材料和方法
STEAP-1单克隆抗体：
如题为“产生STEAP-1单克隆抗体(MAb)”的实施例中的描述，产生针对STEAP-1的单克隆抗体。用ELISA、Western印迹、FACS以及免疫沉淀法表征此抗体结合STEAP-1的能力。由ELISA和Western分析测定的抗-STEAP-1MAb表位作图数据识别STEAP-1蛋白上的表位。用这些抗体进行前列腺癌组织和细胞的免疫组化分析。
通过G蛋白Sepharose层析从腹水或杂交瘤组织培养物上清液中纯化单克隆抗体，对着PBS进行透析，过滤消毒，并于-20℃贮存。通过Bradford试验(Bio-Rad，Hercules，CA)测定蛋白质。制备治疗用单克隆抗体或包含各个单克隆抗体的混合物的混合物，并用于治疗接受皮下或原位注射UM-UC3和CaLul肿瘤异体移植物的小鼠。
细胞系和异体移植物
前列腺癌细胞系PC3和LNCaP细胞系以及成纤维细胞系NIH 3T3(美国典型培养物保藏中心)分别维持于补充有L-谷氨酰胺和10％FBS的RPMI或DMEM中。
如Hubert，R.S.et al.，Proc Natl Acad Sci U S A，1999.96(25)：p.14523-8所述，通过逆转录病毒基因转移生成PC3-STEAP-1和3T3-STEAP-1细胞群体。
通过s.c套针植入物(Craft，N.et al.，Nat Med.1999，5：280)将表达野生型雄激素受体并生成前列腺特异性抗原(PSA)的LAPC-9异体移植物传入6至8周龄雄性ICR-重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠(Taconic Farms)体内。按Craft等所述制备LAPC-9肿瘤细胞的单细胞悬浮液。
异体移植物小鼠模型
在雄性SCID小鼠右肋注射与Matrigel(Collaborative Research)以1∶1的稀释度混合的1×106个癌症细胞，从而生成皮下(s.c.)肿瘤。为了测试抗体对肿瘤形成的效能，在注射肿瘤细胞的同一天开始腹膜内注射抗体。作为对照，给小鼠注射纯化的小鼠IgG(ICN)或PBS；或识别人细胞不表达的无关抗原的纯化了的单克隆抗体。在前期研究中，没有发现小鼠IgG或PBS之间对肿瘤生长的差异。肿瘤大小通过测径器测定，肿瘤体积由长度×宽度×厚度计算。s.c肿瘤直径大于1.5cm的小鼠被处死。
使用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉后进行原位注射。对于前列腺原位研究，切开一穿过腹部的切口暴露出前列腺，LAPC或PC3肿瘤细胞(5×105)与Matrigel的混合物以10μl的体积被注射入前列腺囊。为了监测肿瘤生长，每周对小鼠进行触诊并采集小鼠血样以测定PSA水平。为了合适的治疗将小鼠分组，腹膜内注射抗STEAP-1或对照MAb。
抗-STEAP-1MAb抑制表达STEAP-1的异体移植癌肿瘤的生长
使用LNCaP和LAPC9原位模型测试抗-STEAP-1MAb对肿瘤形成的影响。与s.c.肿瘤模型相比，需要分别将肿瘤细胞直接注射入小鼠前列腺的原位模型导致局部肿瘤生长，远处位点转移的发展，小鼠健康的恶化，以及随后的死亡(Saffran，D.et al.，PNAS，文献同上)。这些特征使得原位模型更能代表人类疾病的进程并允许我们跟踪MAb对临床上相关终点的疗效。
相应地，将肿瘤细胞注射入小鼠前列腺中，2天后，将小鼠分成两组，使用a)200-500μg的抗-STEAP-1Ab或b)PBS治疗，每周三次，持续二至五周。
原位癌症模型的主要优势在于研究转移发展的能力。通过IHC分析肺部切片研究荷有已建立的原位肿瘤的小鼠中的转移的形成，该研究使用抗肿瘤特异性细胞表面蛋白的抗体，如针对前列腺癌的抗-CK20(Lin S.et al.，Cancer Detect Prev.2001；25：202)。
异体移植物癌症模型的另一个优势在于能研究新血管形成和血管发生。肿瘤生长部分依赖于新血管的发生。尽管毛细血管系统和生长中的血管网络源自宿主，但新血管结构的启动和构造受异体移植物肿瘤的调节(Davidoff AM et al.，Clin Cancer Res.2001；7：2870；Solesvik O et al.，Eur JCancer Clin Oncol.1984，20：1295)。根据本领域已知的方法，例如通过对肿瘤组织及其周围的微环境进行IHC分析来研究抗体和小分子对新血管形成的作用。
在4周时间内，注射1000μg抗-STEAP-1MAb或PBS以对荷有已建立的原位肿瘤的小鼠进行给药。两组小鼠均允许建立高肿瘤负荷，从而确保小鼠肺转移形成的高频率。然后处死小鼠，通过IHC分析它们的膀胱、肝脏、骨和肺中是否存在肿瘤细胞。这些研究在异体移植物小鼠模型中证明了抗-STEAP-1抗体对前列腺癌的起始和发展具有广泛的抗肿瘤效能。抗-STEAP-1抗体抑制肿瘤的形成，并阻碍已建立的肿瘤的生长，从而延长所治疗小鼠的存活时间。此外，抗-STEAP-1MAb显示了对局部前列腺肿瘤扩散至远处位点的引人注目的抑制作用，甚至在大肿瘤负荷存在时同样起效。因此，抗-STEAP-1 MAb对多数临床上相关终点(肿瘤生长)、存活的延长以及健康有效。
STEAP-1 MAb对小鼠体内人前列腺癌异体移植物生长的作用
使用5-6周龄的雄性ICR-SCID小鼠(Charles River Laboratory，Wilmington，MA)。使用NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals中所述的方法，在受控的环境中维持小鼠。使用LAPC-9AD雄激素依赖型人前列腺癌肿瘤建立异体移植物模型。无菌解剖常规维持于SCID小鼠的母肿瘤，磨碎，并使用链霉蛋白酶(Calbiochem，San Diego，CA)消化。于37℃保温过夜以产生细胞悬浮液，从而获得均一的单细胞悬浮液。
以两个不同的剂量100μg和500μg检测STEAP-1M2/92.30和M2/120.545。将PBS和抗-KLH MAb用作对照。研究对象由6组小鼠组成，每组10只小鼠。从注射肿瘤细胞那天开始，给小鼠每周两次腹膜内注射MAb，总共注射12次。
每周两次通过测径器测量监测肿瘤大小。取最长的尺寸(L)和与之垂直的尺寸(W)，以使用公式W2×L/2计算肿瘤体积。使用商用ELISA试剂盒测定每只动物在治疗第40天时的血清PSA浓度。使用Kruskal-Wallis试验和Mann-Whitney U试验评价组与组之间肿瘤生长和PSA水平的差异。所有试验都是双侧的，且á＝0.05。
图26和图27的实验结果表明STEAP-1 M2/92.30和M2/120.545能以依赖于剂量的方式显著延缓人前列腺异体移植物的生长。
实施例24：抗-STEAP-1抗体对人类的治疗和诊断应用
抗-STEAP-1单克隆抗体可安全有效地用于人类的诊断、预防、预测和/或治疗目的。使用抗-STEAP-1 MAb对癌组织和癌异体移植物进行的Western印迹和免疫组化分析显示肿瘤中有强烈染色，而正常组织中显著减低或检测不到。在癌中和转移性疾病中检测的STEAP-1证明MAb作为诊断和/或预测指示剂的有用性。因此抗-STEAP-1抗体可用于诊断应用，例如肾活检样品的免疫组化分析以检测可疑患者是否患有癌症。
如流式细胞仪所测定的，抗-STEAP-1 MAb特异地结合癌细胞。因此，抗-STEAP-1抗体被用于诊断性的全身显象，例如放免液闪法和放射免疫疗法(参见例如Potamianos S.et al.，Anticancer Res 20(2A)：925-948(2000))以检测显示有STEAP-1表达的局部和转移的癌。STEAP-1细胞外结构域脱落或释放于细胞外环境，如用碱性磷酸二酯酶B10所观察到的那样(Meerson，N.R.，Hepatology 27：563-568(1998))，允许通过抗-STEAP-1抗体在可疑患者的血浆和/或尿样中诊断性监测STEAP-1。
特异结合STEAP-1的抗-STEAP-1抗体被用于治疗表达STEAP-1的肿瘤。抗-STEAP-1抗体以非偶联模式应用或以偶联模式应用，其中在偶联模式中，抗体与本领域所熟知的多种治疗或显像模式中的一种，例如前药、酶或放射性同位素结合。在临床前研究中，在SCID小鼠癌异体移植模型，例如肾癌模型AGS-K3和AGS-K6中测试了未偶联的和偶联的抗-STEAP-1抗体对肿瘤预防和生长抑制的效能(参见例如题为“STEAP-1单克隆抗体介导的对膀胱和肺肿瘤的体内抑制”的实施例)。偶联的和未偶联的抗-STEAP-1抗体被用作人类临床试验的治疗形式，可单独使用或与其它的治疗方法联合应用，在如下实施例中进行了描述。
实施例25：在体内通过使用人抗-STEAP-1抗体治疗和诊断人癌症的人 类临床试验
本发明所使用的抗体会识别STEAP-1上的表位，被用于治疗例如表I中所列出的某些肿瘤。基于多种因素，包括STEAP-1的表达水平，如表I中所列出的肿瘤是目前优选的适应症。与各适应症相结合，成功地推行了三种临床方法。
I.)辅助治疗：在辅助治疗中，使用抗-STEAP-1抗体联合化疗或抗肿瘤药物和/或放疗治疗患者。通过在标准一线和二线治疗中加入抗-STEAP-1抗体，根据标准方案治疗基本的癌靶，例如表I所列出的癌症。方案设计的有效性通过降低肿瘤的重量以及降低标准化疗剂的常规剂量的能力而进行评价。这些剂量的降低通过降低化疗药物的剂量-相关毒性而允许额外的和/或延长的治疗。在几种辅助临床试验中，抗-STEAP-1抗体与化疗或抗肿瘤药物阿霉素(晚期前列腺癌)、顺铂(晚期头颈癌和肺癌)、紫杉醇(乳腺癌)和多柔比星(临床前)联合使用。
II.)单一疗法：关于抗-STEAP-1抗体在肿瘤单一疗法中的应用，给予患者抗体而不给予化疗或抗肿瘤药物。在一个实施方案中，单一疗法在临床上用于广泛转移性疾病患者的末期癌症。患者的病情显示出稳定性。试验证明了对顽固性癌症患者的效果。
III.)显象剂：通过将放射性核素(例如，碘或钇(I131，Y90))与抗-STEAP-1抗体相连，该免疫标记的抗体可用作诊断和/或显象剂。在这一作用中，标记抗体定位于实体瘤以及表达STEAP-1的细胞的转移病灶。关于抗-STEAP-1抗体作为显象剂的应用，该抗体被用作外科治疗实体瘤的辅剂，包括手术前筛选以及手术后追踪测定肿瘤残留和/或复发。在一个实施方案中，(111In)-STEAP-1抗体用作I期临床试验的显象剂，其中患者的肿瘤表达STEAP-1(类比参见例如Divgi et al.，J.Natl.Cancer Inst 83：97-104(1991))。
给药的剂量和途径
如本领域技术人员所理解的，剂量的考虑可以通过与临床类似产品的比较而确定。因此，可在5至400mg/m2的剂量范围内施用抗-STEAP-1抗体，所述剂量是与安全性研究相关的较低剂量。相对于已知抗体对于其靶点的亲和力的抗-STEAP-1抗体的亲和力是本领域技术人员确定类似剂量方案的一个参数。此外，与嵌合抗体相比，身为全人抗体的抗-STEAP-1抗体清除得更慢；相应地，用于患者的全人抗-STEAP-1抗体的剂量可以较低，大概在50至300mg/m2的范围内，此时仍然有效。以mg/m2表示剂量，而不同于常规的mg/kg的剂量表示方式，这是基于表面积的衡量方法，也是可用于包括从婴儿至成年人所有体形大小的患者的方便的剂量衡量方法。
三种独特的释放方法有助于传递抗-STEAP-1抗体。常规的静脉内传递是一种用于许多肿瘤的标准传递技术。但是，对于腹腔内的肿瘤、例如卵巢瘤、胆管瘤、其它导管瘤等，腹膜内给药被证明是有效的，因为能在肿瘤处聚集高剂量的抗体并能使抗体清除降至最低。在相似的方法中，某些实体瘤具有适合区域性灌注的脉管系统。区域性灌注允许肿瘤位点处有高剂量的抗体并使抗体的短期清除降至最低。
临床开发计划(CDP)
概述：CDP追随并发展了抗-STEAP-1抗体的治疗方法连同辅助治疗、单一治疗以及作为显像剂。在重复剂量中，试验最初证明了安全性随后证实了有效性。试验为公开标记，比较了标准化疗与标准治疗加抗-STEAP-1抗体。如所理解的，可用于选择患者的一个标准是通过活检测定的其肿瘤中STEAP-1的表达水平。
对于任何基于蛋白质或抗体灌输的治疗，安全性考虑主要涉及(i)细胞因子释放综合征，即，低血压、发热、振颤、寒战；(ii)对材料的免疫原应答的发生(即，接受抗体治疗的患者产生人抗体，或HAHA应答)；以及，(iii)对于表达STEAP-1的正常细胞的毒性。标准测试和追踪观察被用于监测上述各种安全性考虑。发现抗-STEAP-1抗体用于人类是安全的。
实施例26：人类临床试验：使用人抗-STEAP-1抗体的单一治疗
抗-STEAP-1抗体对于上述辅助治疗是安全的，II期人类临床试验确定了单一治疗的效能和最佳剂量。这样的试验已经完成，并进行了相同的安全性和结果分析，与上述辅助治疗不同的是患者在接受抗-STEAP-1抗体剂量的同时没有接受化疗剂。
实施例27：人类临床试验：用抗-STEAP-1抗体进行诊断显像
由于上述辅助治疗在上述安全性标准内是安全的，再次进行关于抗-STEAP-1抗体用作诊断显象剂的临床试验。设计的方案与本领域描述的方案基本相似，例如Divgi et al.，J.Natl.CancerInst.83：97-104(1991)。发现该抗体用作诊断形式时是安全有效的。
实施例28：使用人抗-STEAP-1抗体和化疗、放疗和/或激素脱离疗法的 人类临床试验辅助疗法
启动I期人类临床试验以评价关于治疗实体瘤的人抗-STEAP-1抗体的六种静脉内剂量的安全性，这些实体瘤如表I所列组织的癌症。在此项研究中，评价了用于辅助抗肿瘤或化疗或激素脱离药物治疗时单一剂量的抗-STEAP-1抗体的安全性，其中所述药物如本文所定义，例如，但不限于：顺铂、托泊替康、多柔比星、阿霉素、紫杉醇、Lupron、Zoladex、Eulexin、Casodex、Anandron等。试验设计包括：在根据下表的疗程内，传递六种单一剂量的抗-STEAP-1抗体，该抗体剂量从约25mg/m2升至约275mg/m2。
            第0天   第7天   第14天   第21天   第28天   第35天
MAb剂量     25      75      125      175      225      275
            mg/m2   mg/m2   mg/m2    mg/m2    mg/m2    mg/m2
化学治疗    +       +       +        +        +        +
(标准剂量)
每次给予抗体和化疗剂后，对患者进行严密追踪。特别地，评价患者的上述安全性考虑：(i)细胞因子释放综合征，即，低血压、发热、振颤、寒战；(ii)对材料的免疫原应答的发生(即，接受抗体治疗的患者产生人抗体，或HAHA应答)；以及(iii)对于表达STEAP-1的正常细胞的毒性。标准测试和追踪观察被用于监测上述各安全性考虑。还评价患者的临床结果，特别是由MRI或其它显象证明的瘤重的降低。
抗-STEAP-1抗体被证明是安全有效的，II期试验确定了效能并优化了最佳剂量。
实施例29：潜在信号转导途径的鉴定和确认
已报道许多哺乳动物蛋白与信号转导分子相互作用并参与调节信号转导途径(J Neurochem.2001；76：217-223)。特别是纤连蛋白，它与控制细胞有丝分裂发生的MAPK信号转导级联有关(Jiang F，Jia Y，Cohen I.Blood.2002，99：3579)。另外，STEAP-1蛋白含有几个磷酸化位点(参见表XXI)，显示出与特定信号转导级联的关联性。使用免疫沉淀和Western印迹技术，鉴定与STEAP-1相关并且介导信号转导事件的蛋白质。STEAP-1可调节几种已知在癌症生物学中起作用的途径，包括磷脂途径，如P13K、AKT等，粘附和迁移途径，包括FAK、Rho、Rac-1、连环蛋白等，以及促有丝分裂/存活的级联，例如ERK、p38等(CellGrowth Differ.2000，11：279；J Biol Chem.1999，274：801；Oncogene.2000，19：3003，J.Cell Biol.1997，138：913)。为了测定STEAP-1的表达是否足以调节在静止的PC3细胞中不具活性的特定的信号转导途径，在前列腺癌细胞系PC3中研究这些基因对活化p38MAPK级联的作用。P38激酶的活化依赖于其对酪氨酸和丝氨酸残基的磷酸化。磷酸-p38MAb可区分磷酸化p38和非磷酸化状态的p38。在经改造的PC3细胞系中，使用该磷酸-特异性Ab来研究p38的磷酸化状态。
仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1转染PC3细胞。在0.5％FBS中将细胞培养过夜，然后用含或不含10μg/ml MEK抑制剂PD98058的10％FBS刺激细胞5分钟。通过12.5％SDS-PAGE分辨细胞裂解物，并用抗-磷酸-ERK(Cell Signaling)和抗-ERK(Zymed)进行Western印迹。仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1转染NIH-3T3细胞。按上述处理细胞，但FBS中不含MEK抑制剂。另外，用10mg/ml Na salycilate处理NIN-3T3-Neo细胞。STEAP-1的表达诱导血清中的ERK-1和ERK-2磷酸化，上游MEK激酶抑制剂PD98058抑制STEAP-1的表达。
在另一套实验中，检查了前列腺癌细胞系PC3中STEAP-1的表达是否足以活化有丝分裂MAPK途径，即ERK级联。ERK的活化依赖于其对酪氨酸和丝氨酸残基的磷酸化。磷酸-ERK MAb可区分磷酸化ERK和非磷酸化状态的ERK。在经改造的PC3细胞系中，使用该磷酸-特异性Ab来研究ERK的磷酸化状态。将表达活化形式的Ras的PC3细胞用作阳性对照。
结果表明：尽管对照neo基因的表达对ERK磷酸化没有作用，但PC3细胞中STEAP-1的表达足以诱导ERK磷酸化的增加(图28)。使用抗-ERKWestern印迹进一步证实了这些结果，这些结果还表明STEAP-1能活化ERK途径。
由于FBS含有几种对受体-介导的ERK活化起作用的组分，我们检查了低水平和最适水平的FBS中STEAP-1的作用。在0.1％或10％FBS中将表达neo或STEAP-1的PC3细胞培养过夜。通过抗-磷酸-ERKWestern印迹分析细胞。此实验表明STEAP-1能在0.1％FBS中诱导ERK磷酸化，并且证实在缺乏其它刺激物时，STEAP-1的表达足以诱导ERK信号转导级联的活化。
为了证实STEAP-1直接或间接激活细胞内已知的信号转导途径，在表达各个基因的细胞中进行基于萤光素酶(luc)的转录报道基因试验。这些转录报道基因包含针对已知转录因子的共有序列-结合位点，所述位点位于已被较好表征的信号转导途径的下游。报道基因，这些相关转录因子、信号传导途径和活化刺激物的例子列于下文。
1.NFkB-luc，NFkB/Rel；Ik-激酶/SAPK；生长/细胞凋亡/应力
2.SRE-luc，SRF/TCF/ELK1；MAPK/SAPK；生长/分化
3.AP-1-luc，FOS/JUN；MAPK/SAPK/PKC；生长/细胞凋亡/应力
4.ARE-luc，雄激素受体；类固醇/MAPK；生长/分化/细胞凋亡
5.p53-luc，p53；SAPK；生长/分化/细胞凋亡
6.CRE-luc，CREB/ATF2；PKA/p38；生长/细胞凋亡/应力
7.TCF-luc，TCF/Lef；连环蛋白，粘附/侵入
可在显示mRNA表达的细胞中测试基因介导的效果。可通过脂质介导的转染(TFX-50，Promega)导入萤光素酶报道质粒。通过保温细胞提取物和萤光素底物测定萤光素酶活性，该活性为相对转录活性的指示，在发光计中监测反应的发光。
对由STEAP-1激活的信号传导途径作图，并用于治疗靶点的鉴定和确认。当STEAP-1与细胞信号传导有关时，其被用作诊断、预测、预防和/或治疗目的的靶点。
实施例30：STEAP-1参与小分子转运和细胞间通讯
细胞间通讯是维持器官完整和内环境稳定所必需的，在肿瘤形成和发展过程中，这两者都不能被调节。可使用两种试验(J.Biol.Chem.2000，275：25207)测定细胞间通讯。在第一种试验中，在未经标记的受体细胞存在下保温荷载有荧光染料的细胞，在荧光显微镜下检查细胞群体。此定性试验测定的是相邻细胞之间的染料交换。在第二种试验系统中，按上述处理供体和受体细胞群体，通过FACS分析进行受体细胞群体的定量测定。使用这两个检测系统，将表达STEAP-1的细胞与不表达STEAP-1的对照相比较，发现STEAP-1能增强细胞通讯。图29阐明STEAP-1介导小分子钙黄绿素在相邻细胞之间的转移，从而调节前列腺癌细胞中的细胞间通讯。在此实验中，用葡聚糖-德克萨斯红标记受体PC3细胞，用钙黄绿素AM(绿色)标记供体PC3细胞。于37℃将供体(绿色)和受体(红色)细胞共培养，通过显微术分析德克萨斯红和钙黄绿素的共-定位。结果表明尽管PC3对照细胞(没有可测的STEAP-1蛋白表达)表现出很少的钙黄绿素转移，但STEAP-1的表达使得小分子可以在细胞之间转移，从而使起初为红色的受体细胞染上棕色，并且共-定位了红色和绿色分子。能调制由STEAP-1介导的细胞间通讯的小分子和/或抗体可用作表达STEAP-1的癌症的治疗剂。图30阐明STEAP-1的表达是供体和受体群体发生小分子转移所必需的。在此实验中，仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1转染PC3细胞。用1mg/ml葡聚糖-德克萨斯红标记受体细胞，用2.5μg/ml钙黄绿素AM标记供体细胞。于37℃将供体(绿色)和受体(红色)细胞共培养18-24小时，通过显微术分析荧光染料的共-定位。上方的试验组：光学显微术；下方的试验组：UV荧光。左边的试验组：PC3-Neo细胞既作供体又作受体。中间的试验组：PC3-Neo是供体细胞，PC3-STEAP-1是受体细胞。右边的试验组：PC3-STEAP-1细胞既作供体又作受体。仅当供体和受体细胞上都表达STEAP-1时，才能检测到细胞间通讯。
结果表明：共培养对照PC3和PC3细胞不能介导钙黄绿素转移。类似地，共-保温对照PC3和PC3-STEAP-1不能转移钙黄绿素。然而，相同细胞中共-定位绿色和红色色素表明：共培养PC3-STEAP-1供体和PC3-STEAP-1受体细胞能介导小分子转移。总之，图29和30所示的数据阐明STEAP-1介导小分子转移，并通过形成功能与间隙连接类似的细胞间通讯通道来调节细胞间通讯。
另外，还证实了STEAP-1M2/120.545对间隙连接的作用(参见图31)。在此实验中，仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1转染PC3细胞。用1mg/ml葡聚糖-德克萨斯红标记受体细胞，用2.5μg/ml钙黄绿素AM标记供体细胞。于37℃将供体(绿色)和受体(红色)细胞共培养18-24小时，通过显微术分析荧光染料的共-定位。在所有实验中，将相同细胞用作供体和受体。使细胞与所示量的STEAP-1/120.545MAb保温10分钟，然后铺平板，在培养物中保留MAb达24小时再作分析。STEAP1/120.545以依赖于剂量的方式诱导STEAP-1介导的间隙连接。结果表明STEAP1/120.545以依赖于剂量的方式诱导STEAP-1介导的间隙连接。
因此，由于STEAP-1在细胞间通讯和小分子转运中起作用，可将其用作诊断、预测、预防和/或治疗目的的靶标或标记。
实施例31：RNA干扰(RNAi)
RNA干扰(RNAi)技术被用于多种与肿瘤学相关的细胞试验中。RNAi是由双链RNA(dsRNA)激活的转录后基因沉默机制。RNAi诱导特异性mRNA降解，导致蛋白质表达发生改变，随后会改变基因的功能。在哺乳动物细胞中，这些被称为短的干扰RNA(siRNA)的dsRNA具有正确的组成，用以激活目的在于特异性降解一些mRNA的RNAi途径。参见Elbashir S.M.，et al.，Duplexes of 21-nucleotide RNAs Mediate RNA interference in CulturedMammalian Cells，Nature 411(6836)：494-8(2001)。因此，RNAi技术在哺乳动物细胞中被成功用于沉默靶向的基因。
细胞增殖失控是癌细胞的标志；因此，在细胞存活/增殖试验中评价STEAP-1的作用是相关的。相应地，使用RNAi研究STEAP-1抗原的功能。为了产生STEAP-1的siRNA，使用能预测寡核苷酸的算法，所述寡核苷酸表现出至关重要的分子参数(G:C含量，解链温度等)，当被导入细胞时，能显著降低STEAP-1蛋白的表达水平。相应地，STEAP-1 siRNA的一个靶向序列是：5’AAGCTCATTCTAGCGGGAAAT 3’(SEQ ID NO：81)。根据此实施例，所使用的STEAP-1 siRNA组合含有对应于STEAP-1蛋白核酸ORF序列或其亚序列的siRNA(双链，短的干扰RNA)。因此，按此方式使用的siRNA亚序列一般长度为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35或35个以上邻接的RNA核苷酸。这些siRNA序列与mRNA编码序列的至少一部分互补和非-互补。在优选实施方案中，亚序列的长度为19-25个核苷酸，最优选长度为21-23个核苷酸。在优选实施方案中，这些siRNA在表达STEAP-1抗原的细胞中能击倒该蛋白质，并且具有下述的功能性作用。
使用存活/增殖MTS试验(测定细胞代谢活性)，在多个细胞系中检测选定的siRNA(STEAP-1.b oligo)。基于四氮唑的比色试验(即MTS)只检测活细胞，由于活细胞具有代谢活性，因此可将四氮唑盐还原为有色的formazan化合物；然而死细胞却不能如此。另外，使用下述方法，STEAP-1.b oligo在表达STEAP-1抗原的细胞中能击倒该蛋白质，并且具有下述的功能性作用。
哺乳动物siRNA转染：在siRNA转染前一天，以2×103个细胞/孔的密度将不同的细胞系铺于80μl(96孔培养板的形式)培养基(添加有10％FBS w/o抗生素的RPMI 1640)中以进行存活/MTS试验。与STEAP-1特异性siRNA oligo相平行地，在每个实验中包括下述序列作为对照：a)用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)和退火缓冲液(无siRNA)转染的模拟转染细胞；b)萤光素酶-4特异性siRNA(靶向的序列：5’-AAGGGACGAAGACGAACACUUCTT-3’)(SEQ ID NO：82)；和c)Eg5特异性siRNA(靶向的序列：5’-AACTGAAGACCTGAAGACAATAA-3’)(SEQ ID NO：83)。SiRNA的终浓度为10nM，Lipofectamine 2000的终浓度为1μg/ml。
方法如下：首先用OPTIMEM(无血清转染培养基，Invitrogen)稀释siRNA至0.1uM μM(10倍浓缩)并于室温保温5-10分钟。针对转染总数，将Lipofectamine 2000稀释至10μg/ml(10倍浓缩)并于室温(RT)保温5-10分钟。使适量的经稀释的10倍浓缩的Lipofectamine 2000以1∶1的比例与经稀释的10倍浓缩的siRNA混合，并于RT下保温20-30”(5倍浓缩的转染溶液)。将20μl 5倍浓缩的转染溶液加至各个样品中，37℃保温96小时再作分析。
MTS试验：MTS试验是在基于四氮唑化合物[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑，内盐；MTS(b)]和电子偶联试剂(吩嗪ethosulfate；PES)的增殖、细胞毒性或化学敏感性试验中测定活细胞数目的比色法。通过在培养物孔中直接加入少量Solution Reagent，保温1-4小时，然后用96-孔培养板读数器记录490nm下的光吸收值以进行试验。通过490nm下的光吸收值测定的有色formazan产物的量与线粒体活性和/或培养物中活细胞的数目直接成比例。
为了了解STEAP-1在细胞中的功能，通过转染内源性表达STEAP-1的细胞系来沉默STEAP-1。如图32所示，ERK-1和ERK-2磷酸化都能被10％血清诱导，并能被M2/92.30MAb和STEAP-1 siRNA抑制。在此实验中，仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1和MAb转染PC3细胞。为了RNAi击倒，用含有STEAP-1 siRNA的pPUR-U6-27-STEAP-1载体稳定转染PC3-STEAP-1细胞。于37℃，在0.1％FBS中使细胞饥饿18小时，不加或加入10μg/ml M2/92.30MAb，置于冰上放置10分钟，再于室温放置3分钟，然后用10％FBS刺激5分钟。用RIPA缓冲液裂解细胞，通过12.5％SDS-PAGE分辨全细胞裂解物，并通过Western印迹检测蛋白质。用兔抗血清(CellSignaling)检测磷酸-ERK，用兔抗-ERK(Zymed)检测ERK。用绵羊抗-STEAP-1检测STEAP-1，用抗-肌动蛋白MAb(Santa Cruz)检测肌动蛋白。
另外，如图33所示，在PC3-STEAP-1细胞中稳定表达的特异性STEAP-1RNAi能降低STEAP-1诱导的细胞间通讯。在此实验中，仅用新霉素抗性基因或用位于pSRα载体中的STEAP-1转染PC3细胞。为了进行RNAi击倒，用含有STEAP-1 siRNA的pPUR-U6-27-STEAP-1载体或空白载体稳定转染PC3-STEAP-1细胞。用1mg/ml葡聚糖-德克萨斯红标记受体细胞，用2.5μg/ml钙黄绿素AM标记供体细胞。于37℃将供体(绿色)和受体(红色)细胞共培养18-24小时，通过显微术分析荧光染料的共-定位。在所有实验中，将相同细胞用作供体和受体。
本发明的另一个实施方案是分析STEAP-1相关细胞增殖的方法，该方法测定DNA合成以作为增殖的标记。使用经标记的DNA前体(即3H-胸苷)，测定它们在DNA中的掺入量。经标记前体在DNA中的掺入与培养物中出现的细胞分裂的量直接成比例。另一种用于测定细胞增殖的方法是进行克隆发生试验。在这些试验中，将限定数目的细胞铺于适当的基质上，对经siRNA处理后生长一段时间所形成的集落数目进行计数。
在STEAP-1癌症靶证实中，考虑将细胞凋亡和细胞周期分布图研究补充到细胞存活/增殖分析中。细胞凋亡过程的生化标志是基因组DNA的片段化，这是一个导致细胞死亡的不可逆事件。观察细胞中片段化DNA的方法是通过免疫测定法(即细胞死亡检测ELISA)免疫检测与组蛋白-复合的DNA片段，所述测定法检测的是凋亡细胞的胞质中与组蛋白-复合的DNA片段(单-和寡-核小体)的富集。此试验不需要预先标记细胞，并可检测在体外未增殖的细胞(即新鲜分离的肿瘤细胞)中的DNA降解。
引发细胞凋亡的最重要的效应分子是半胱天冬酶。半胱天冬酶是蛋白酶，当其被激活时，可裂解天冬氨酸残基羧基末端位点处的多个底物，通过激活介导很早期的细胞凋亡。所有半胱天冬酶都被合成为酶原，激活包括在天冬氨酸残基处的裂解。特别地，半胱天冬酶3似乎在启动细胞凋亡的细胞事件中起着关键作用。测定半胱天冬酶3激活的试验检测的是细胞凋亡的早期事件。RNAi处理之后，利用Western印迹检测有活性的半胱天冬酶3的存在或在凋亡细胞中发现的产物(即PARP)的蛋白酶裂解，结果进一步支持细胞凋亡的活性诱导。由于导致细胞凋亡的细胞机制是复杂的，各有其自身的优点和局限性。考虑到其它标准/终点，如细胞形态学、染色质凝聚、膜起泡，凋亡体有助于进一步支持细胞死亡为细胞凋亡。由于不是所有的能调节细胞生长的基因靶都是抗-细胞凋亡的，测定透化细胞的DNA含量以获得DNA含量分布图或细胞周期分布图。凋亡细胞的核含有很少的DNA，因为所述DNA从核中漏到胞质中(亚-G1群体)。另外，由于不同量的G0/G1，S和G2/M期DNA的存在，DNA染色剂(即二碘化丙锭)的使用也使细胞群体中细胞周期的不同期之间出现分化。在这些研究中，亚群体可被定量。
对于STEAP-1基因而言，RNAi研究有利于了解基因产物在癌症途径中的贡献。这种有活性的RNAi分子可用于鉴定试验，以筛选出能作为有活性的抗-肿瘤治疗剂的MAb。另外，给癌症患者施用作为治疗剂的siRNA以降低几种癌症类型，包括表I所列的癌症的恶性生长。当STEAP-1在细胞存活、细胞增殖、肿瘤发生或细胞凋亡中起作用时，它可用作诊断、预测、预防和/或治疗目的的靶标。
实施例32：调制STEAP-1的功能
离子转运在调节细胞生长、细胞内透性、分子运输和信号转导中起着重要作用(Minke B.Cell Mol Neurobiol.2001，21：629；Golovina et al.，Am JPhysiol Heart Circ Physiol.2001，280：H746)，这些是与肿瘤疾病特别相关的功能。细胞间通讯能调节稳态、细胞增殖和细胞死亡(Evans WH，Martin PE.MolMembr Biol.2002 19：121；Carruba G，et al.，Ann N Y Acad Sci.2002，963：156)，这些功能也与肿瘤疾病特别相关。
使用对照细胞系和表达STEAP-1的细胞系鉴定出STEAP-1功能的抑制剂。例如，在存在和缺乏MAb或小分子抑制剂时保温PC3和PC3-STEAP-1细胞。使用上文所述的离子流出、细胞通讯、增殖和信号转导试验研究这些MAb或小分子抑制剂的作用。
可通过多种机制调制由转运蛋白介导的信号转导和生物输出，所述机制包括抑制受体和配体结合、离子拮抗剂、蛋白质相互作用、调节离子和小分子转运蛋白等(Tang W et al.，Front Biosci 2002，7：1583)。使用对照细胞系和表达STEAP-1的细胞系鉴定出STEAP-1功能的调制剂(抑制剂或增强剂)。例如，在存在和缺乏MAb或小分子调制剂时保温PC3和PC3-STEAP-1细胞。考虑到本文公开的STEAP-1的功能，用于本发明上下文的身为离子通道封闭剂的调制剂包括如氨氯地平、甘葡环烃、二氢吡啶、thianines、nifedine、维拉帕米及其衍生物的化合物(Tanaka Y，Shigenobu K.Cardiovasc Drug Rev.2001，19：297；Djuric D，Mitrovic V，Jakovljevic V. Arineimitteltorschung.2002，52：365；Kourie JI，Wood HB.Prog Biophys Mol Biol.2000；73：91)；用于本发明上下文的身为细胞通讯抑制剂的调制剂包括如β-甘草次酸、类维生素A、TPA的化合物(Krutovskikh VA et al.，Oncogene.2002，21：1989；Rudkin et al.，J SurgRes.2002，103：183；Ruch J et al.，J Cell Biochem.2001，83：163)。相应地，使用上文实施例所述的离子流出、细胞通讯、增殖和信号转导试验研究MAb或小分子抑制剂的作用。
当MAb和小分子能调制，例如抑制STEAP-1的转运和肿瘤发生功能时，它们即可用于预防、预测、诊断和/或治疗目的。
在本申请各处引用了多个网站的数据内容，出版物，专利申请和专利。(引用了网站的Uniform Resource Locator，或ULR，在万维网上的地址)。各参考文献中公开的内容皆全文列入本文作为参考。
本发明不限于本文公开的实施方案的范围，这些实施方案仅为单独阐明本发明的各个方面，任何功能等同的实施方案均在本发明的范围内。除本文描述的，本发明的模式和方法的各种变化，对于参照前文描述和教导的熟练技术人员而言都是显而易见的，同样欲落入本发明的范围内，这样的变化或其它实施方案可在不偏离本发明的实际范围和精神的情况下实施。
表格：
表1：当处在恶性状态时表达STEAP-1的组织
前列腺
膀胱
肾脏
结肠
肺
胰腺
卵巢
乳腺
胃
直肠
淋巴瘤
表II：氨基酸缩写
  单字母   三字母   氨基酸
  F   Phe   苯丙氨酸
  L   Leu   亮氨酸
  S   Ser   丝氨酸
  Y   Tyr   酪氨酸
  C   Cys   半胱氨酸
  W   Trp   色氨酸
  P   Pro   脯氨酸
  H   His   组氨酸
  Q   Gln   谷氨酰胺
  R   Arg   精氨酸
  I   Ile   异亮氨酸
  M   Met   甲硫氨酸
  T   Thr   苏氨酸
  N   Asn   天冬酰胺
  K   Lys   赖氨酸
  V   Val   缬氨酸
  A   Ala   丙氨酸
  D   Asp   天冬氨酸
  E   Glu   谷氨酸
  G   Gly   甘氨酸
表III(a)：氨基酸取代矩阵
根据GCG软件9.0BLOSUM62氨基酸取代矩阵(块取代矩阵(blocksubstitution matrix))修改。值越高，越有可能在相关的天然蛋白中发现取代。(参见互联网址：URLikp.unibe.ch/manual/blosum62.html)
A  C  D  E  F  G  H  I  K  L  M  N  P  Q  R  S  T  V  W  Y  .
4  0 -2 -1 -2  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1  1  0  0 -3 -2  A
   9 -3 -4 -2 -3 -3 -1 -3 -1 -1 -3 -3 -3 -3 -1 -1 -1 -2 -2  C
      6  2 -3 -1 -1 -3 -1 -4 -3  1 -1  0 -2  0 -1 -3 -4 -3  D
         5 -3 -2  0 -3  1  3 -2  0 -1  2  0  0 -1 -2 -3 -2  E
            6 -3 -1  0 -3  0  0 -3 -4 -3 -3 -2 -2 -1  1  3  F
               6 -2 -4 -2 -4 -3  0 -2 -2 -2  0 -2 -3 -2 -3  G
                  8 -3 -1 -3 -2  1 -2  0  0 -1 -2 -3 -2  2  H
                     4 -3  2  1 -3 -3 -3 -3 -2 -1  3  3 -1  I
                        5 -2 -1  0 -1  1  2  0 -1 -2 -3 -2  K
                           4  2 -3 -3 -2 -2 -2 -1  1 -2 -1  L
                              5 -2 -2  0 -1 -1 -1  1 -1 -1  M
                                 6 -2  0  0  1  0 -3 -4 -2  N
                                    7 -1 -2 -1 -1 -2 -4 -3  P
                                       5  1  0 -1 -2 -2 -1  Q
                                          5 -1 -1 -3 -3 -2  R
                                             4  1 -2 -3 -2  S
                                                5  0 -2 -2  T
                                                   4 -3 -1  V
                                                     11  2  W
                                                         7  Y
表III(b)
  原始残基   保守取代
  Ala(A)   Gly；Ser；Val
  Arg(R)   Lys
  Asn(N)   Gln；His
  Asp(D)   Glu
  Cys(C)   Ser
  Gln(Q)   Asn；His
  Glu(E)   Asp
  Gly(G)   Ala；Pro
  His(H)   Asn；Gln
  Ile(I)   Leu；Val
  Leu(L)   Ile；Val
  Lys(K)   Arg；Gln；Glu
  Met(M)   Leu；Tyr；Ile；Val
  Phe(F)   Met；Leu；Tyr
  Ser(S)   Thr
  Thr(T)   Ser
  Trp(W)   Tyr
  Tyr(Y)   Trp；Phe
  Val(V)   Ile；Leu；Ala
表IV：
HLAI类/II类基元/超基元
表IV(A)：HLAI类超基元/基元
Figure A20048004342701771
粗体的残基为优选的残基，斜体的残基次之：当一种肽在每一个一级(primary)锚位置具有上表所指明的基元或超基元的一级锚时，可以认为这种肽携有基元。
表IV(B)：HLAII类超基元
  1   6   9
  W，F，Y，V，I，L   A，V，I，L，P，C，S，T   A，V，I，L，C，S，T，M，Y
表IV(C)：HLAII类基元
Figure A20048004342701781
斜体的残基表示较不优选(less preferred)的残基或“耐受”的残基。
表IV(D)：HLAI类超基元
Figure A20048004342701782
斜体的残基表示较不优选的残基或“耐受”的残基。
表IV(E)：HLAI类基元
Figure A20048004342701791
表IV(F)：
Figure A20048004342701802
表IV(G)：
由不同的HLA-超型组合所提供的人群覆盖率计算值
Figure A20048004342701811
Figure A20048004342701812
Figure A20048004342701821
表IV(I)医疗同位素举例：
同位素    用途描述
锕-225    参见钍-229(Th-229)
(AC-225)
锕-227    镭-223(Ra-223)之父代，为α辐射源，可用于治疗由癌症(即乳腺癌和前
(AC-227)  列腺癌)导致的骨架转移和癌症放射免疫疗法
铋-212    参见钍-228(Th-228)
(Bi-212)
铋-213    参见钍-229(Th-229)
(Bi-213)
镉-109    癌症检测
(Cd-109)
钴-60     癌症放射疗法、食品辐射器和消毒医用品的放射源
(Co-60)
铜-64     用于癌症疗法和SPECT显象的阳离子发射体
(Cu-64)
铜-67     用于癌症放射免疫疗法和诊断研究(即乳腺癌、结肠癌和淋巴瘤)的β/γ
(Cu-67)   发射体
镝-166    癌症放射免疫疗法
(Dy-166)
铒-169    治疗类风湿性关节炎，特别是与手指和脚趾相关的小关节
(Er-169)
铕-152    食品辐射和消毒医用品的放射源
(Eu-152)
铕-154    食品辐射和消毒医用品的放射源
(Eu-154)
钆-153    骨质疏松检测和核医学质量保证装置
(Gd-153)
金-198    卵巢癌、前列腺癌和脑癌的植入和腔内疗法
(Au-198)
钬-166    靶向骨骼疗法中的多发性骨髓瘤疗法，癌症放射免疫疗法，骨髓剥离
(Ho-166)  和类风湿性关节炎疗法
碘-125    骨质疏松检测，诊断显象，示踪药物，脑癌治疗，放射性标记，肿瘤
(I-125)   显象，脑受体作图，间质放射疗法，治疗前列腺癌的近距离放射疗法，
          测定肾小球滤过率(GFR)，测定血浆体积，测定腿部深静脉血栓形成
碘-131    甲状腺功能评价，甲状腺疾病检测，治疗甲状腺癌以及其它非-恶性甲
(I-131)   状腺疾病(即格雷夫斯病、甲状腺肿和甲状腺功能亢进)，使用放射免疫
          疗法治疗白血病、淋巴瘤和其它形式的癌症(例如乳腺癌)
铱-192    近距离放射疗法，治疗脑和脊髓瘤，治疗阻滞动脉(即动脉硬化和再狭
(Ir-192)  窄)，以及乳腺癌和前列腺癌的植入
镥-177    癌症放射免疫疗法和治疗阻滞动脉(即动脉硬化和再狭窄)
(Lu-177)
钼-99     锝-99m(Tc-99m)之父代，可用于显象脑、肝脏、肺、心脏和其它器官。
(Mo-99)   目前，Tc-99m是应用最广泛的放射性同位素，它可用于多种与脑、心
          脏、肝脏、肺有关的癌症和疾病的诊断显象；也可用于检测腿部的深
          静脉血栓形成
锇-194    癌症放射免疫疗法
(Os-194)
钯-103    治疗前列腺癌
(Pd-103)
铂-195m    研究化学治疗药物顺式铂氨的生物分布和代谢
(Pt-195m)
磷-32      治疗真性红细胞增多症(血细胞疾病)和白血病，诊断/治疗骨癌；治疗
(P-32)     结肠、前列腺和肝癌；放射性标记体外研究用的核酸，诊断表面肿瘤，
           治疗阻滞动脉(即动脉硬化和再狭窄)，以及腔内疗法
磷-33      治疗白血病，诊断/治疗骨疾病，放射性标记，以及治疗阻滞动脉(即动
(P-33)     脉硬化和再狭窄)
镭-223     参见锕-227(Ac-227)
(Ra-223)
铼-186     减轻骨癌疼痛，治疗类风湿性关节炎，诊断淋巴瘤和骨癌、乳腺癌、
(Re-186)   结肠癌和肝癌并使用放射免疫疗法对其进行治疗
铼-188     诊断癌症并使用放射免疫疗法治疗癌症，减轻骨癌疼痛，治疗类风湿
(Re-188)   性关节炎，和治疗前列腺癌
铑-105     癌症放射免疫疗法
(Rh-105)
钐-145     治疗眼癌
(Sm-145)
钐-153     癌症放射免疫疗法和减轻骨癌疼痛
(Sm-153)
钪-47      癌症放射免疫疗法和减轻骨癌疼痛
(Sc-47)
硒-75      用于脑研究的放射性示踪元素，通过γ-闪烁扫描术显象肾上腺皮质，侧
(Se-75)    定位分泌类固醇的肿瘤，前列腺扫描，检测甲状旁腺功能亢进，测定
           内源库中胆汁酸损失的速率
锶-85      骨癌检测和脑扫描
(Sr-85)
锶-89      减轻骨癌疼痛，治疗多发性骨髓瘤和成骨细胞疗法
(Sr-89)
锝-99m     参见钼-99(Mo-99)
(Tc-99m)
钍-228    铋-212(Bi-212)之父代，是用于癌症放射免疫疗法的α发射体
(Th-228)
钍-229    锕-225(Ac-225)之父代，铋-213(Bi-213)之祖代，是用于癌症放射免疫
(Th-229)  疗法的α发射体
铥-170    血液辐射器的γ源，植入医用装置的能量源
(Tm-170)
锡-117m   癌症免疫疗法和减轻骨癌疼痛
(Sn-117m)
钨-188    铼-188(Re-188)之父代，用于癌症诊断/治疗，减轻骨癌疼痛，治疗类
(W-188)   风湿性关节炎和治疗阻滞动脉(即动脉硬化和再狭窄)
氙-127    脑病的神经显象，高分辨率的SPECT研究，肺功能检测和脑血流研究
(Xe-127)
镱-175    癌症放射免疫疗法
(Yb-175)
钇-90     得自辐射中的钇-89(Y-89)的微种，用于治疗肝癌
(Y-90)
钇-91     钇-90(Y-90)的γ-发射标记，可用于癌症放射免疫疗法(即淋巴瘤、乳腺
(Y-91)    癌、结肠癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌和不能手术的
          肝癌)
表V-XVIII：示于2002年9月6日提交的美国专利申请号10/236,878，其具体内容全文列入本文作为参考。
表XIX：经常出现的基元
  名称   平均同一性％   描述   潜在的功能
  zf-C2H2   34％   锌指，C2H2型   核酸结合蛋白，具有转录因子功能，可能还有核定位功能
  细胞色素_b_N   68％   细胞色素b(N-末端)/b6/petB   膜结合型氧化酶，产生过氧化物
  Ig   19％   免疫球蛋白结构域   结构域都有100个氨基酸，且包括保守的结构域内二硫键
  WD40   18％   WD结构域，G-β重复   约40个残基的串联重复，每一个重复包含一个Trp-Asp基元。在信号传导和蛋白相互作用中发挥功能
  PDZ   23％   PDZ结构域   可能在将信号传导分子靶向亚膜位点时发挥功能
  LRR   28％   亮氨酸丰富重复   短序列基元，参与蛋白-蛋白相互作用
  P激酶   23％   蛋白激酶结构域   保守的催化核心，是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶共有的，含ATP结合位点和催化位点
  PH   16％   PH结构域   Pleckstrin同源物，参与细胞内信号传导，或作为细胞骨架的组成
  EGF   34％   EGF-样结构域   30-40个氨基酸，在膜结合蛋白的胞外区或在分泌蛋白中发现
  Rvt   49％   逆转录酶(RNA-依赖性DNA聚合酶)
  Ank   25％   Ank重复   胞质蛋白，将完整膜蛋白与细胞骨架相连
  Oxidored_q1   32％   NADH-泛醌/塑体醌(复合物1)，各种链   膜相连型。参与质子跨膜转位
  Efhand   24％   EF手(hand)   钙结合区，是由12个残基组成的环，两侧均有12个残基的α螺旋区
  Rvp   79％   逆转录病毒天冬氨酰蛋白酶   天冬氨酰蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶，中心是催化性天冬氨酰残基
  胶原   42   胶原三联体螺旋重复(20个拷贝)   细胞外结构蛋白，参与形成结缔组织。其序列由G-X-Y组成，多肽链形成三联体螺旋
  Fn3   20％   纤连蛋白III型结构域   位于受体的胞外配体结合区中，约有200个氨基酸残基，其中有两对参与形成二硫键的半胱氨酸
  7tm_1   19％   7跨膜受体(视紫红质家族)   7个疏水跨膜区，其N-末端位于细胞外，C-末端位于胞浆中。通过G蛋白传递信号。
表XX：STEAP-1的基元和翻译后修饰
N-糖基化位点
143-146NGTK(SEQ ID NO：84)
331-334NKTE(SEQ ID NO：85)
蛋白激酶C磷酸化位点
3-5SrK
160-162TrK
187-189SyR
246-248TwR
酪蛋白激酶II磷酸化位点
3-6SrkD(SEQ ID NO：86)
8-11TnqE(SEQ ID NO：87)
240-243SvsD(SEQ ID NO：88)
246-249TwrE(SEQ ID NO：89)
酪氨酸激酶磷酸化位点
19-27RRNLEEDDY(SEQ ID NO：90)
N-豆蔻酰化位点
133-138GVIAAI(SEQ ID NO：91)
265-270GTIHAL(SEQ ID NO：92)
二分核靶向序列
4-20RKDITNQEELWKMKPRR(SEQ ID NO：93)
表XXI：STEAP-1的蛋白质特征
Figure A20048004342701881
表XXII-LI：示于2002年9月6日提交的美国专利申请号10/236,878，其具体内容全文列入本文作为参考。
表LII：检索肽
STEAP1变体1：
9体，12体和15体：aa1-339(SEQ ID NO：94)
MESRKDITNQ EELWKMKPRR NLEEDDYLHK DTGETSMLKR PVLLHLHQTA HADEFDCPSE    60
LQHTQELFPQ WHLPIKIAAI IASLTFLYTL LREVIHPLAT SHQQYFYKIP ILVINKVLPM   120
VSITLLALVY LPGVIAAIVQ LHNGTKYKKF PHWLDKWMLT RKQFGLLSFF FAVLHAIYSL   180
SYPMRRSYRY KLLNWAYQQV QQNKEDAWIE HDVWRMEIYV SLGIVGLAIL ALLAVTSIPS   240
VSDSLTWREF HYIQSKLGIV SLLLGTIHAL IFAWNKWIDI KQFVWYTPPT FMIAVFLPIV   300
VLIFKSILFL PCLRKKILKI RHGWEDVTKI NKTEICSQL                          339
变体2：
9体aa247-258(SEQ ID NO：95)
WREFHYIQVNNI
10体aa246-258(SEQ ID NO：96)
TWREFHYIQVNNI
15体aa241-258(SEQ ID NO：97)
VSDSLTWREFHYIQVNNI
变体3：
9体aa247-(SEQIDNO：98)
WREFHYIQIIHKKSDVPESLWDPCLTRFKGLNLIQS
10体aa246-(SEQ ID NO：99)
TWREFHYIQIIHKKSDVPESLWDPCLTRFKGLNLIQS
15体aa241-(SEQ ID NO：100)
VSDSLTWREFHYIQIIHKKSDVPESLWDPCLTRFKGLNLIQS
变体4：
9体aa160-176(SEQ ID NO：101)
RKQFGLLSLFFAVLHAI
10体aa159-177(SEQ ID NO：102)
TRKQFGLLSLFFAVLHAIY
15体aa154-182(SEQ ID NO：103)
DKWMLTRKQFGLLSLFFAVLHAIYSLSYP
表LIII：STEAP-1(8P1D4)变体1的外显子组成
  外显子编号   起点   终点
  1   1   34
  2   35   149
  3   150   662
  4   663   827
  5   828   1176

Claims (44)

1. 含有能特异性结合STEAP-1蛋白(SEQ ID NO：)的抗原结合位点的抗体或其片段。
2. 权利要求1的抗体或片段，其中抗体是单克隆抗体。
3. 权利要求2的抗体或片段，其中抗体被称为X92.1.30.1.1(1)，其ATCC保藏号为PTA-5802。
4. 权利要求2的抗体或片段，其中抗体被称为X120.545.1.1，其ATCC保藏号为PTA-5803。
5. 权利要求2的抗体或片段，其中单克隆抗体是人源化抗体。
6. 权利要求1的抗体或片段，其中片段是Fab，F(ab’)2，Fv或Sfv片段。
7. 权利要求1的抗体或片段，其中抗体是人抗体。
8. 权利要求1的抗体或片段，其中抗原结合位点是鼠抗原结合结构域。
9. 权利要求1的抗体或片段，其是通过重组产生的。
10. 权利要求9的抗体或片段，其中重组蛋白质含有抗原结合区。
11. 权利要求1的抗体或片段，其中抗体与可测标记、毒素或治疗剂偶联。
12. 权利要求11的抗体或片段，其中可测标记是放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
13. 权利要求12的抗体或片段，其中放射性同位素包括212Bi，131I，131In，90Y，186Re，211At，125I，188Re，153Sm，213Bi，32P或Lu。
14. 权利要求11的抗体或片段，其中毒素包括蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A-链、阿霉素、道诺红菌素、美登木素生物碱、紫杉酚、溴化乙锭、丝裂霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、白树毒素、丝裂吉霉素、局限曲霉素、酚毒素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、加利车霉素、Sapaonaria offcinalis抑制剂、糖皮质激素、auristatin、金霉素、钇、铋、combrestatin、倍癌霉素、dolostatin、cc1065或顺式铂氨。
15. 权利要求1的抗体或片段，其中抗原结合位点特异性结合图2蛋白质(SEQ ID NO：)的氨基酸内的表位。
16. 产生权利要求2的单克隆抗体的转基因动物。
17. 产生权利要求2的单克隆抗体的杂交瘤。
18. 含有编码权利要求2的抗体的多核苷酸的载体。
19. 权利要求18的载体，其为含有重链和轻链可变区的单链。
20. 含有人单位剂量形式的权利要求1的抗体或片段的药物组合物。
21. 检测生物样品中STEAP-1蛋白的存在的测定法，所述方法包括使样品与权利要求1的抗体接触，并检测样品中STEAP-1蛋白(SEQ ID NO：)的结合。
22. 抑制受试者体内表达STEAP-1(SEQ ID NO：)的细胞的生长的方法，所述方法包括给所述受试者施用编码单链单克隆抗体的载体，以使载体将单链单克隆抗体编码序列传递给癌症细胞，并使编码的单链抗体在细胞内表达，其中所述载体含有与STEAP-1蛋白特异性结合的单克隆抗体的重链和轻链可变区。
23. 将细胞毒性剂或诊断剂传递给表达STEAP-1蛋白(SEQ ID NO：)的细胞的方法，所述方法包括：
提供与权利要求1的抗体或片段偶联的细胞毒性剂或诊断剂以形成抗体-药剂或片段-药剂偶联物；和
使细胞暴露于抗体-药剂或片段-药剂偶联物。
24. 权利要求23的方法，其中细胞毒性剂或诊断剂选自可测标记、毒素和治疗剂。
25. 权利要求24的方法，其中可测标记是放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
26. 权利要求25的方法，其中放射性同位素包括212Bi，131I，131In，90Y，186Re，211At，125I，188Re，153Sm，213Bi，32P或Lu。
27. 权利要求24的方法，其中毒素包括蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A-链、阿霉素、道诺红菌素、美登木素生物碱、紫杉酚、溴化乙锭、丝裂霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、白树毒素、丝裂吉霉素、局限曲霉素、酚毒素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、加利车霉素、Sapaonaria offcinalis抑制剂、糖皮质激素、auristatin、金霉素、钇、铋、combrestatin、倍癌霉素、dolostatin、cc1065或顺式铂氨。
28. 检测生物样品中STEAP-1蛋白(SEQ ID NO：)的方法，所述方法包括下述步骤：
提供生物样品和对照样品；
使生物样品和对照样品与特异性结合STEAP-1蛋白的权利要求1的抗体接触；和
测定生物样品和对照样品中存在的STEAP-1蛋白与抗体的复合物的量。
29. 权利要求28的方法，进一步包括从患有或怀疑患有表I所列癌症的患者中取生物样品和对照样品。
30. 含有STEAP-1 siRNA(双链RNA)的组合物，所述siRNA对应于编码图2所示蛋白质的核酸或其亚序列，其中亚序列的长度为19，20，21，22，23，24或25个邻接的RNA核苷酸，并且含有与mRNA编码序列的至少一部分互补和不互补的序列。
31. 鉴定能调制细胞增殖的分子的方法，所述方法包括：
(a)将分子导入含有核酸的系统，所述核酸含有选自下列的核苷酸序列：
(i)SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(ii)编码由图3所示氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列；
(iii)编码与图3所示氨基酸序列的同一性为90％或更高的多肽的核苷酸序列；和
(iv)上述(i)，(ii)或(iii)的核苷酸序列的片段；或将受试分子导入含有由(i)，(ii)，(iii)或(iv)的核苷酸序列编码的蛋白质的系统；和
(b)测定分子和核苷酸序列或蛋白质之间的相互作用存在与否，分子和核苷酸序列或蛋白质之间的相互作用的存在可将分子鉴定为能调制细胞增殖的分子。
32. 权利要求31的方法，其中系统是体内的。
33. 权利要求31的方法，其中系统是体外的。
34. 权利要求31的方法，其中分子含有能特异性结合(i)，(ii)，(iii)或(iv)的核苷酸序列所编码蛋白质的抗体或抗体片段。
35. 权利要求31的方法，其中分子是含有STEAP-1 siRNA(双链RNA)的组合物，所述siRNA对应于编码图2所示蛋白质的核酸或其亚序列，其中亚序列的长度为19，20，21，22，23，24或25个邻接的RNA核苷酸，并且含有与mRNA编码序列的至少一部分互补和不互补的序列。
36. 治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括给经诊断患有癌症的受试者施用通过权利要求31的方法鉴定出的分子，由所述分子抑制或阻碍受试者体内的癌症。
37. 权利要求36的方法，其中癌症是表I所列的癌症。
38. 鉴定治疗表I所列癌症的治疗剂的方法，所述方法包括：
(a)将分子导入含有核酸的系统，所述核酸含有选自下列的核苷酸序列：
(i)SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(ii)编码由图3所示氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列；
(iii)编码与图3所示氨基酸序列的同一性为90％或更高的多肽的核苷酸序列；和
(iv)上述(i)，(ii)或(iii)的核苷酸序列的片段；或将受试分子导入含有由(i)，(ii)，(iii)或(iv)的核苷酸序列编码的蛋白质的系统；和
(b)测定分子和核苷酸序列或蛋白质之间的相互作用存在与否，分子和核苷酸序列或蛋白质之间的相互作用的存在可将分子鉴定为能治疗表I所列癌症的治疗剂。
39. 权利要求38的方法，其中系统是体外的。
40. 权利要求38的方法，其中系统是体内的。
41. 权利要求38的方法，其中分子含有能特异性结合(i)，(ii)，(iii)或(iv)的核苷酸序列所编码蛋白质的抗体或抗体片段。
42. 权利要求38的方法，其中分子是含有STEAP-1 siRNA(双链RNA)的组合物，所述siRNA对应于编码图2所示蛋白质的核酸或其亚序列，其中亚序列的长度为19，20，21，22，23，24或25个邻接的RNA核苷酸，并且含有与mRNA编码序列的至少一部分互补和不互补的序列。
43. 治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括给经诊断患有癌症的受试者施用通过权利要求38的方法鉴定出的分子，由所述分子抑制或阻碍受试者体内的癌症。
44. 权利要求43的方法，其中癌症是表I所列的癌症。
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