MXPA01010891A - Composiciones y metodos para el tratamiento contra el cancer mediante la inhibicion selectiva del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf). - Google Patents

Composiciones y metodos para el tratamiento contra el cancer mediante la inhibicion selectiva del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf).

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MXPA01010891A
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MX
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vegf
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antibodies
tumor
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Philip E Thorpe
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Univ Texas
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Abstract

Se describen anticuerpos que especificamente inhiben el enlace del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) con solamente uno (VEGFR2) de los dos receptores VEGF. Los anticuerpos efectivamente inhiben la angiogenesis e inducen la regresion de tumores, y todavia tienen seguridad mejorada debido a su especificidad. La presente invencion proporciona asi nuevas composiciones, metodos y protocolos combinados basados en anticuerpos para tratar cancer y otras enfermedades angiogenicas. Tambien se proporcionan ventajosas composiciones y metodos de inmunoconjugados y profarmacos usando los nuevos anticuerpos especificos para el VEGF.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO CONTRA EL CÁNCER MEDIANTE LA INHIBICIÓN SELECTIVA DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) 1. Campo de la Invención La presente invención se relaciona en general con los campos de anticuerpos, angiogénesis y el tratamiento de tumores. Más particularmente, proporciona anticuerpos anti-VEGF que específicamente inhiben el enlace de VEGF con solamente uno (VEGFR2) de los dos receptores del VEGF. Estos anticuerpos inhiben la angiogénesis e inducen la regresión de tumores, y todavía tienen seguridad mejorada debido a sus propiedades de bloqueo específicas. Las composiciones basadas en anticuerpos y los métodos de la invención también se extienden al uso de inmunoconjugados y otras combinaciones terapéuticas, juegos y métodos, que incluyen aquellos con profármacos . 2. Descripción de la técnica relacionada La resistencia de las células de tumor a las sustancias quimioterapéuticas representa un problema significativo en la oncología clínica. De hecho, esta es una de las principales razones por las cuales muchas de las formas más preponderantes del cáncer humano todavía resiste la intervención quimioterapéutica efectiva, a pesar de ciertos avances en este campo. Otra estrategia de tratamiento contra tumores es el uso de una "inmunotoxina" , en la cual un anticuerpo de célula *í&*kJ? *l.. i «fc x>.*.k-*.**.i.J&?a A^^ia antitumor se usa para administrar una toxina a las células de tumor. Sin embargo, en común con los enfoques quimioterapéuticos, la terapia de inmunotoxinas también padece algunas desventajas cuando se aplica a tumores sólidos. Por ejemplo, células negativas al antígeno o deficientes de antígeno pueden sobrevivir y volver a poblar el tumor o conducir a metástasis adicionales. Otra razón para la resistencia de los tumores sólidos a las terapias basadas en anticuerpos es que la masa de tumor generalmente es impermeable a sustancias macromoleculares tales como anticuerpos e inmunotoxinas (Burrows y colaboradores, 1992; Dvorak y colaboradores, 1991a; Baxter y Jain, 1991) . Tanto las distancias de difusión físicas como la presión intersticial dentro del tumor son limitaciones significativas a este tipo de terapia. Por lo tanto, los tumores sólidos, que conforman más del 90 por ciento de todos los cánceres humanos, se ha demostrado que son resistentes al tratamiento de anticuerpos e inmunotoxinas. Una estrategia más reciente ha sido dirigirse a la vasculatura de los tumores sólidos. Al dirigirse a los vasos sanguíneos de los tumores, en vez de a las mismas células del tumor, se tienen ciertas ventanas porque no es probable dirigir el desarrollo de células resistentes al tumor, y porque las células objetivo son fácilmente accesibles. Más aún, la destrucción de los vasos sanguíneos conduce a una amplificación del efecto antitumor, ya que muchas células de tumor dependen de un solo vaso para su oxígeno y nutrientes (Burrows y Thorpe, 1994a; 1994b) . Las estrategias que se dirigen a los vasos ejemplares se describen en las Patentes de los Estados Unidos 5 de Norteamérica números 5,855,866 y 5,965,132, que particularmente describen la administración dirigida de sustancias anticelulares y toxinas a marcadores de la vasculatura del tumor. Otra versión efectiva del enfoque que se dirige a los 10 vasos es dirigir un factor de coagulación a un marcador expresado o adsorbido dentro de la vasculatura del tumor (Huang y colaboradores, 1997; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,877,289, 6,004,555, y 6,093,399). La administración de coagulantes, en vez de toxinas, a la 15 vasculatura del tumor tiene las ventajas adicionales de inmunogenicidad reducida y aún riesgo más bajo de efectos laterales tóxicos. Como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,877,289, un factor de coagulación preferido para su uso en estos "coaguligandos" 20 específico de tumor es una versión truncada de la proteína que induce la coagulación humana, Factor de Tejido (FT), el iniciador más importante de la coagulación sanguínea. Aunque la administración específica de toxinas y factores de coagulación a los vasos sanguíneos del tumor 25 representa un avance significativo en el tratamiento de tumores, ciertas células periféricas de tumor pueden sobrevivir a la destrucción intratumoral causada por estas terapias. Las estrategias antiangiogénicas por lo tanto serían útiles en combinación con los métodos de destrucción de tumores de las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,855,866 y 5,877,289. Las estrategias de tratamiento de tumor antiangiogénicas se basan en inhibir la proliferación de vasos que brotan, generalmente en la periferia de un tumor sólido. Estas terapias en su mayor parte se aplican para reducir el riesgo de micrometástasis o para inhibir el crecimiento adicional de un tumor sólido después de una intervención más convencional (tales como cirugía o quimioterapia) . La angiogénesis es el desarrollo de nueva vasculatura de los vasos sanguíneos pre-existentes y/o las células de tallo endotelial circulantes (Asahara y colaboradores, 1997; Springer y colaboradores, 1998; Folkman y Shing, 1992) . La angiogénesis representa un papel vital en muchos procesos fisiológicos, tales como la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la menstruación. La angiogénesis también es importante en ciertos eventos patológicos. Además de un papel en el crecimiento de tumores sólidos y metástasis, otras condiciones notables con un componente angiogénico son artritis, psoriasis, y retinopatía diabética (Hanahan y Folkman, 1996, Fidler y Ellis, 1994) . ^^^^^^^^^^j^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^?j^^^^^^^^^^^^^é^^ ^. ^ ****&*;&.&{* *kié» ?.Az - La angiogénesis se regula en tejidos normales y malignos por el equilibrio de estímulos angiogénicos e inhibidores angiogénicos que se producen en el tejido objetivo y en sitios distantes (Fidler y colaboradores, 1998; McNamara y colaboradores, 1998). El factor de crecimiento endotelial vascular-A (VEGF, también conocido como factor de permeabilidad vascular, VPF) es un estimulante primario de angiogénesis. El factor de crecimiento endotelial vascular es una citocina multifuncional que se induce por hipoxia y mutaciones oncogénicas y puede ser producida por una amplia variedad de tejidos (Kerbel y colaboradores, 1998; Mazure y colaboradores, 1996) . El reconocimiento del VEGF como un estímulo primario de angiogénesis en condiciones patológicas ha conducido a varios intentos para bloquear la actividad del VEGF. Los anticuerpos de receptor inhibitorio anti-VEGF, las construcciones de receptor solubles, las estrategias antisentido, los aptámeros ARN contra el VEGF y los inhibidores de receptor tirosina quinasa de VEGF de bajo peso molecular todos se han propuesto para su uso para interferir con el señalamiento de VEGF (Siemeister y colaboradores, 1998). De hecho, los anticuerpos monoclonales contra el VEGF se ha demostrado que inhiben el crecimiento del xenoinjerto de tumores humanos y la formación de ascitas en ratones (Kim y colaboradores, 1993; Asano y colaboradores, 1998; Mesiano y -*-"-*--—* -- , A- %..*.*,. Mu .Jí^ . ? l?¡? colaboradores, 1998; Luo y colaboradores, 1998a; 1998b; Borgstrom y colaboradores, 1996; 1998). Aunque los estudios anteriores minimizan la importancia del VEGF en el crecimiento de tumores sólidos, y su potencial como objetivo para la terapia de tumor, la identificación de sustancias adicionales que inhiben la angiogénesis inducida por VEGF sería benéfico para extender el número de opciones terapéuticas. El desarrollo de sustancias terapéuticas que más específicamente inhiben el enlace receptor VEGF representaría un avance importante, en la medida en que sus efectos antitumor no se comprometieran sustancialmente por la especificidad mejorada. Sumario de la invención La presente invención supera ciertas desventajas en la técnica anterior proporcionando nuevas composiciones y métodos terapéuticos para su uso en tratamiento angiogénico y antitumor. La invención se basa en anticuerpos que específicamente inhiben el enlace del VEGF a solamente uno (VEGFR2) de los dos receptores primarios de VEGF. Estos anticuerpos inhiben la angiogénesis e inducen la regresión del tumor tan efectivamente como otros anticuerpos anti-VEGF, incluyendo aquellos ya en ensayos clínicos, y ya tienen seguridad mejorada debido a sus propiedades de bloqueo específico. Las composiciones y métodos de la invención también se extienden al uso de inmunoconjugados y combinaciones, incluyendo profármacos, usando la categoría específica de anticuerpos provistos. Una ventaja particular de la presente invención es que los anticuerpos proporcionan la inhibición del enlace del VEGF solamente con el VEGFR2, y no con el VEGFR1. Esto contrasta con los anticuerpos anteriores en la técnica anterior, incluyendo A4.6.1, que inhibe el enlace del VEGF tanto con el VEGFR2 como con el VEGFR1. Como el VEGFRl tiene papeles biológicos importantes no conectadas con la angiogénesis, particularmente en la migración y quimiotaxis de macrófagos, y la función de los osteoclastos y condroclastos, la presente capacidad para inhibir solamente la angiogénesis mediada por el VEGFR2 es una ventaja distinta. Esto se traduce en notables beneficios químicos porque los macrófagos todavía son capaces de mediar las respuestas antitumor de la hospedera y el metabolismo del hueso, v.gr., del tratamiento de cánceres pediátricos, no se afecta adversamente. Otra ventaja es que, como el enlace del VEGF con el VEGFR1 se mantiene en presencia de los anticuerpos de la invención, se pueden usar para administrar específicamente sustancias terapéuticas unidas a la vasculatura del tumor en virtud del enlace con el VEGF que está ligado al VEGFR1, el cual está subregulado en el endotelio del tumor. En el contexto de inmunoconjugados, por lo tanto, la presente invención proporciona sustancias que tienen tanto propiedades - - «,.,-a^. aiaÁ-i ? .. tanto angiogénicas como destructivas de tumores dentro de la misma molécula. Todavía otra ventaja existe en la capacidad de las composiciones proporcionadas para neutralizar la señal de 5 supervivencia del VEGF, la cual está mediada a través del VEGFR2. Los anticuerpos simples y conjugados de la invención así forman combinaciones sinérgicas con otras terapias y/o sustancias unidas, particularmente los métodos y sustancias que fallan en lograr la efectividad máxima en vivo debido a la 10 capacidad del VEGF de contrarrestar sus propiedades destructivas . La presente invención de este modo proporciona anticuerpos que específicamente bloquean el enlace del VEGF con el receptor VEGFR2, o que bloquean el enlace del VEGF con 15 esencialmente solamente el receptor VEGFR2. Estos anticuerpos inhiben significativamente el enlace de VEGF con el receptor VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente el enlace del VEGF con el receptor VEGFR1 (Flt-1) . Los anticuerpos de este modo inhiben el enlace del VEGF con el receptor VEGFR2 20 (KDR/Flk-1), no inhiben sustancialmente el enlace del VEGF con el receptor VEGFR1 (Flt-1), exhiben efectos antiangiogénicos y antitumor en vivo y no inhiben significativamente la quimiotaxis de macrófagos, y las funciones de osteoclastos o condroclastos . 25 Los anticuerpos de la invención de este modo sucintamente se denominan "anticuerpos anti-VEGF, que bloquean VEGFR2, que no bloquean VEGFR1". Todavía más sucintamente, se denominan "anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2", lo cual se usa por simplicidad en referencia a todas las composiciones, usos y métodos de la invención. Un "anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2" es un anticuerpo contra el VEGF que bloquea el enlace del VEGF con el receptor VEGFR2. Quedará claro que esos anticuerpos no son anticuerpos contra el mismo receptor VEGFR2. Antes de la presente invención, no había motivación para generar anticuerpos anti-VEGF que específicamente bloquearan el enlace del VEGF con el receptor VEGFR2, pero no con el VEGFRl, tampoco se habían considerado ventajas de estos anticuerpos. De manera importante, ya que el bloqueo de anticuerpos necesita evitar físicamente la interacción de un factor de crecimiento y sus receptores, y como los sitios de enlace de receptores en los factores de crecimiento son de tamaño limitado, nada sugería que estos anticuerpos anti-VEGF, que bloquean el VEGFR2, podrían desarrollarse. Sin embargo, a la luz de los descubrimientos sorprendentes de los inventores descritos en la presente, la técnica ahora está provista con el conocimiento de que estos anticuerpos anti-VEGF inhibitorios específicos se pueden preparar y tienen distintas ventajas. La presente solicitud además describe la metodología para generar anticuerpos anti- VEGF, que bloquean el VEGFR2 candidatos y los aspectos técnicos de rutina de los ensayos requeridos para identificar los anticuerpos específicos reales que bloquean el VEGFR2 de un conjunto de candidatos. A la luz de esta invención, por lo tanto, se puede hacer un rango de anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 y usarse en una variedad de modalidades, incluyendo en la inhibición de angiogénesis y el tratamiento de enfermedades angiogénicas y tumores sin inhibir la señalización de VEGF vía el receptor VEGFRl y sin las desventajas notables y los efectos colaterales asociados con la misma. Como se usa en toda esta solicitud, los términos "un" y "una" se usan en el sentido que significan "cuando menos uno una", "cuando menos una primera", "una o más" o "una pluralidad" de los componentes o pasos mencionados, excepto en casos en donde el límite superior se enuncia específicamente después de eso. Por lo tanto, un "anticuerpo", como se usa en la presente, significa "cuando menos un primer anticuerpo". Los límites y parámetros operables de combinaciones, como con las cantidades de una sola sustancia, serán conocidas para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Los anticuerpos que "específicamente inhiben el enlace de VEGF al receptor del VEGF VEGFR2 (KDR/Flk-1)" ahora se puede identificar por competición y/o ensayos funcionales. Los ensayos preferidos, por simplicidad, son ensayos de competición basados en un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada. En ensayos de competición se mezcla previamente o se mezcla VEGF con distintas cantidades de los anticuerpos de prueba (v.gr., un exceso molar de 100 veces a 1000 veces) y se determina la capacidad de los anticuerpos de prueba para reducir el enlace de VEGF con el VEGFR2. El VEGF puede ser previamente etiquetado y detectado directamente, o se puede detectar usando un anticuerpo anti-VEGF (secundario) o un sistema de detección de anticuerpos secundario y terciario. Un formato de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada de este ensayo de competición es un formato preferido, pero también se puede llevar a cabo cualquier tipo de ensayo de inmunocompetición . El enlace de VEGF con el VEGFR2 en presencia de un anticuerpo completamente irrelevante (que incluye anticuerpos monoclonales anti-VEGF que no bloquean) es el control de alto valor (100 por ciento) en este ensayo de competición. En un ensayo de prueba, una reducción significativa del enlace del VEGF con el VEGFR2 en presencia de un anticuerpo de prueba es indicador de un anticuerpo de prueba que inhibe significativamente el enlace del VEGF con el receptor VEGF VEGFR2 (KDR/Flk-1) . Una reducción significativa es una reducción "reproducible", es decir, una reducción consistentemente observada en el enlace. Una "reducción significativa" en términos de la presente solicitud se define como una reducción reproducible (en el enlace del VEGF con el VEGFR2) de cuando menos aproximadamente 45 por ciento, aproximadamente 50 por ciento, aproximadamente 55 por ciento, aproximadamente 60 por ciento o aproximadamente 65 por ciento en cualquier cantidad entre aproximadamente 100 veces y aproximadamente 1000 veces de excedente molar de anticuerpo sobre el VEGF. Como una característica preferida de la invención esta que los anticuerpos proporcionados no inhiben sustancialmente el enlace del VEGF con el VEGFR1, anticuerpos que exhiben una reducción moderadamente significativa del enlace de VEGF con el VEGFR2 todavía serán útiles, en tanto no inhiban sustancialmente el enlace de VEGF con el VEGFR1. Sin embargo, los anticuerpos más preferidos serán aquellos que tienen una capacidad más significativa para inhibir el enlace del VEGF con el VEGFR2. Estos anticuerpos son los que exhiben una capacidad reproducible de reducir el enlace de VEGF con el VEGFR2 en cuando menos aproximadamente 70 por ciento, aproximadamente 75 por ciento o aproximadamente 80 por ciento en cualquier cantidad entre aproximadamente 100 veces y aproximadamente 1000 veces de exceso molar de anticuerpo sobre el VEGF. Aunque no se requiere para practicar la invención, los anticuerpos que reducen el enlace del VEGF con el VEGFR2 en cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, aproximadamente 90 por ciento, aproximadamente 95 por ciento o aún más de ningún modo se excluyen. ißA Los anticuerpos anti-VEGF, o los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, que inhiben el enlace del VEGF con el receptor de VEGF VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente el enlace de VEGF con el receptor de VEGF 5 VEGFR1 (Flt-1) se confirman fácilmente mediante ensayos de competición simple tales como los descritos anteriormente, pero usando el VEGFR1. La ausencia de una reducción significativa es un "mantenimiento sustancial de enlace" , consistentemente 10 observado, "reproducible" . Un "mantenimiento sustancial de enlace" en términos de la presente solicitud se define como un mantenimiento reproducible (en el enlace del VEGF con el VEGFR1) de cuando menos aproximadamente 60 por ciento, aproximadamente 75 por ciento, aproximadamente 80 por ciento, 15 o aproximadamente 85 por ciento en cualquier cantidad entre aproximadamente 100 veces y aproximadamente 1000 veces de exceso molar de anticuerpo sobre el VEGF. La intención de usar anticuerpos que no inhiben sustancialmente el enlace de VEGF con el VEGFR1 es mantener las 20 funciones biológicas mediadas por el VEGFR1. Por lo tanto, un anticuerpo solamente necesita mantener suficiente enlace del VEGF con el VEGFR1 de manera que una respuesta biológica sea inducida por el VEGF. Sin embargo, los anticuerpos más preferidos serán aquellos que tengan una capacidad más 25 significativa para mantener el enlace del VEGF con el VEGFR1.
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Estos anticuerpos son los que exhiben una capacidad reproducible de mantener el enlace del VEGF con el VEGFR1 a niveles de cuando menos aproximadamente 88 por ciento, aproximadamente 90 por ciento, aproximadamente 92 por ciento, aproximadamente 95 por ciento o aproximadamente 98-99 por ciento en cualquier cantidad entre aproximadamente 100 veces y aproximadamente 1000 veces de exceso molar de anticuerpo sobre el VEGF. Se entenderá que los anticuerpos que más sustancialmente inhiben el enlace de VEGF con el VEGFR2 probablemente puedan tolerar más reducción en el enlace del VEGFR1. Igualmente, cuando un anticuerpo tiene una reducción moderada en el enlace del VEGF con el VEGFR2, el mantenimiento del enlace con el VEGFR1 deberá perseguirse más estrictamente. Otro ensayo de enlace preferido para identificar y/o confirmar que un anticuerpo inhibe el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1), es un ensayo de coprecipitación . Un ensayo de coprecipitación prueba la capacidad de un anticuerpo para bloquear el enlace del VEGF con uno o más receptores en solución. En este ensayo, el VEGF o el VEGF etiquetado detectablemente se incuba con una forma conveniente del receptor. Hay muchos formatos para llevar a cabo los ensayos de inmunoprecipitación o de coprecipitación. En el presente caso, una "forma conveniente del receptor" puede ser el receptor VEGFR2 mismo o el dominio extracelular del receptor. La inmunoprecipitación con él requerirá, así como reactivos estándares, la presencia de un anticuerpo contra el receptor del VEGFR2 o un epítope sobre el dominio extracelular del receptor distinto del sitio al cual se enlaza el VEGF. La presente invención proporciona otras formas "convenientes" de los receptores del VEGF, a saber los dominios extraceluiares de los receptores enlazados con una porción del anticuerpo Fc . Estas construcciones de receptor/Fe se pueden precipitar mediante la incubación con una composición inmunoprecipitante efectiva, tanto como una composición basada en Proteína A. Independientemente del receptor conveniente, los ensayos de inmunoprecipitación o coprecipitación preferiblemente se llevan a cabo con controles. La capacidad del VEGF solo para enlazarse con el receptor elegido deberá ser confirmada mediante la precipitación en ausencia de un anticuerpo anti-VEGF. Preferiblemente, se llevan a cabo incubaciones paralelas en presencia o ausencia del anticuerpo con propiedades de enlace conocidas para que actúen como un control. Más preferiblemente, se ejecutan en paralelo ensayos que usan tanto un anticuerpo de control que bloquea como un anticuerpo de control que no bloquea. Cualquier especie inmunológica enlazada se inmunoprecipita entonces, v.gr., mediante la incubación con una composición de inmunoprecipitación efectiva, tal como una composición de Proteína A o cuentas de sefarosa de Proteína A. El precipitado se prueba para determinar la presencia del VEGF. Cuando el VEGF en la incubación inicial era VEGF etiquetado detectablemente, tal como VEGF radioetiquetado, cualquier VEGF en los inmunoprecipitados se puede detectar directamente. Cualquier VEGF no etiquetado en los inmunoprecipitados se puede detectar por otros medios convenientes, v.gr., por separación en gel y por inmunodetección con un anticuerpo anti-VEGF. La capacidad de un anticuerpo para bloquear el enlace del VEGF con un receptor de VEGF, tal como el VEGFR2, en un ensayo de coprecipitación así se puede fácilmente cuantificar, aunque los resultados cualitativos también son valiosos. La cuantificación se puede lograr mediante la medición directa del VEGF etiquetado o v.gr., por análisis densitométricos del VEGF inmunodetectado . Los anticuerpos que exhiben una capacidad reproducible, es decir, consistentemente observada para inhibir el enlace del VEGF con el VEGFR2 se pueden así detectar, y se pueden elegir anticuerpos útiles de acuerdo con los criterios cuantitativos señalados anteriormente. Los anticuerpos anti-VEGF que no inhiben significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1), también se pueden identificar fácilmente llevando a cabo ensayos de coprecipitación como se describió anteriormente, pero usando el VEGFRl en vez de VEGFR2. Por lo tanto, los anticuerpos anti-VEGF que inhiben el enlace del VEGF MAau áié ?Í&S?» con el receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1) también se pueden identificar fácilmente usando estos métodos. La presente solicitud también proporciona varios ensayos funcionales para identificar y/o confirmar que un anticuerpo inhibe significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) . Estos generalmente se relacionan con la identificación del VEGFR2 como el receptor responsable para ciertas respuestas biológicas definidas. Aunque menos preferido que los ensayos tipo competición anteriores, que se llevan a cabo en sistemas sin células y son más reproducibles, confiables, menos tardados y más efectivos en costo, los siguientes ensayos sin embargo, son útiles en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2, se puede identiiicar probando la capacidad para inhibir el crecimiento celular endotelial mediado por el VEGF (inhibir la actividad mitogénica del VEGF). Cualquier ensayo conveniente se puede emplear usando cualquiera de una variedad de células endoteliale.-s en la presencia del VEGF con o sin anticuerpos de prueba. Preferiblemente, los ensayos duplicados se llevan a cabo en paralelo, tales como aquellos sin VEGF y aquellos con anticuerpos de control o con propiedades definidas (tanto de bloqueo como de no bloqueo) . El crecimiento celular endotelial se puede determinar y preferiblemente cuantificar con precisión mediante cualquier medio aceptable para determinar el número de células, incluyendo los ensayos colorimétricos . Un anticuerpo con una capacidad para inhibir el crecimiento celular endotelial mediado por el VEGF generalmente exhibirá una inhibición consistentemente observada de crecimiento celular endotelial mediado por VEGF de aproximadamente 25 por ciento, 30 por ciento, 35 por ciento, 40 por ciento, 45 por ciento, ó 50 por ciento y así sucesivamente. La inhibición en estos rangos indicará un anticuerpo con propiedades suficientes para inhibir la angiogénesis en vivo. Los anticuerpos con más actividad inhibitoria significativa no se excluyen de la invención. Otros ensayos funcionales para identificar anticuerpos de acuerdo con la presente invención son ensayos para piobar el bloqueo de la fosforilación inducida por el VEGF. Cualquier ensayo conveniente se puede emplear usando cualquiera de una variedad de células endoteliales que expresen cualquier forma de VEGFR2 que pueda ser fosforilable original o recombinante. Las células se incuban con el VEGF en presencia o ausencia del anticuerpo que se va a probar durante un periodo de tiempo conveniente. Preferiblemente, se llevan a cabo en paralelo ensayos duplicados, tales como aquellos sin VEGF y aquellos con anticuerpos de control o con propiedades <Á..í -ll: ±. - Éß í??t . .M»,^444¿i i definidas (tanto de bloqueo como de no bloqueo) . La fosforilación inducida por el VEGF del VEGFR2 se puede determinar y preferiblemente cuantificar con precisión por cualquier medio aceptable, generalmente, el VEGFR2 se inmunoprecipita para análisis posteriores. El grado de fosforilación de VEGFR2 se puede determinar directamente, por ejemplo, las células pueden haber sido incubadas con ATP etiquetado con 32P, permitiendo la cuantificación directa del 32P dentro del VEGFR2 inmunoprecipitado. Preferiblemente, el VEGFR2 inmunoprecipitado se analiza por otros medios, v.gr., mediante por separación en gel y por inmunodetección con un anticuerpo que se enlaza con residuos de fosfotirosina . Un anticuerpo con una capacidad para inhibir la fosforilación inducida por el VEGF del VEGFR2 generalmente exhibirá una reducción consistentemente observada en los niveles del VEGFR2 fosforilado. Todavía otros ensayos funcionales para identificar los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 de acuerdo con la presente invención son ensayos para probar la inhibición de la permeabilidad vascular inducida por el VEGF. Aunque cualquiera de estos ensayos se puede usar, un ensayo particularmente conveniente es el ensayo de permeabilidad de Miles, en donde animales tales como los cobayos se inyectan con un tinte, tal como un tinte azul de Evan, y aparición del tinte en la piel del animal se determina después de la provisión del VEGF en presencia o ausencia de anticuerpos de prueba. Preferiblemente, se llevan a cabo estudios en paralelo, tales como aquellos con VEGF y aquellos con anticuerpos de control o propiedades definidas (tanto de bloqueo como de no bloqueo). La aparición del tinte en la piel del animal es típicamente como manchas, tales como manchas azules, en el lomo del animal, las cuales se pueden fotografiar y medir. Los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 inhibirán la permeabilidad vascular inducida por el VEGF como una inhibición consistentemente observada a bajas concentraciones, tales como cuando se proporciona a un excedente molar de 100 veces, o de 1000 veces, sobre el VEGF. Los anticuerpos que no bloquean el enlace del VEGF con el VEGFR2 no mostrarán ninguna inhibición significativa de la permeabilidad vascular inducida por el VEGF. Generalmente, los anticuerpos que bloquean la permeabilidad inducida por el VEGF solamente a concentraciones altas, tales como a un excedente molar de 10 veces sobre el VEGF, no serán anticuerpos con propiedades de acuerdo con la presente invención. Los ensayos funcionales ampliamente aceptados de angiogénesis y, por lo tanto, las sustancias antiangiogénicas son el ensayo de microbolsas córneas de neovascularización y el ensayo de membrana corioalantoica de pollo el ensayo (MCA) . La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,712,291 se incorpora específicamente en la presente mediante referencia mostrar que los ensayos de microboLsa córnea y de membrana coriooalantoica de pollo son suficientemente predictivos para identificar sustancias para su uso en el tratamiento de un rango extremadamente amplio de enfermedades angiogénicas. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,001,116 también se incorpora específicamente en la presente mediante referencia con piopósitos de describir el ensayo de membrana corioalantoica de pollo. Esencialmente, embriones de pollo fertilizados se íemueven de su cascarón en el día 3 ó 4, y un disco de metilcelulosa que contiene el compuesto de prueba se implanta en la membrana corioalantoica. Los embriones se examinan aproximadamente 48 ahoras después y, si aparece una zona clara avascular alrededor del disco de metilcelulosa, se mide el diámetro de esa zona. Como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,712,291, incorporada específicamente en la presente mediante referencia para este propósito, en el contexto de la presente invención, la aparición de cualquier zona avascular es suficiente para hacer evidente un anticuerpo antiangiogénico . Entre mayor sea la zona, más efectivo es el anticuerpo. El ensayo de microbolsa córnea de neovascularización se puede llevar a cabo usando córneas de rata o de conejo. Este modelo en vivo se acepta ampliamente por ser predictivo de utilidad clínica, como lo evidencian las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,712,291 y 5,871,723, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia con propósitos de evidencia. Aunque no se cree que sea particularmente relevante la presente invención, los ensayos córneos son preferibles sobre los ensayos de membrana corioalantoica de pollo ya que generalmente reconocerán compuestos que son inactivos en sí pero se metabolizan para producir compuestos activos. En la presente invención, se usa el ensayo de microbolsa córnea para identificar una sustancia antiangiogénica. Esto se hace evidente por una reducción significativa en la angiogénesis, como se representa mediante una reducción observada y preferiblemente marcada consistentemente en el número de vasos sanguíneos dentro de la córnea. Estas respuestas preferiblemente se definen como aquellas córneas que muestran solamente un brote ocasional y/o una espiral ahorquillada de pasador que no exhibe evidencia de crecimiento sostenido cuando se pone en contacto con la sustancia de prueba. Los anticuerpos anti-VEGF, que bloquean el VEGFR2 ejemplares (y fragmentos que enlazan antígeno) de la invención incluyen aquellos que: (a) inhiben significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) ; (b) no inhiben significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1) ; (c) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente, la fosforilación inducida por el VEGF del VEGFR2; (d) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente, la permeabilidad vascular inducida por el VEGF; (e) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente, la proliferación de células endoteliales mediadas por el VEGF; (f) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente, la angiogénesis; (g) no inhiben significativamente la estimulación mediada por el VEGFR1 o la activación de macrófagos, osteoclastos o condroclastos; y (h) localizan a la vasculatura de tumor y al estroma del tumor después de la administración a un animal con un tumor vascularizado . Un aspecto particular de la invención se basa en el descubrimiento original, sorprendente de los inventores de anticuerpos que específicamente inhibieron el enlace del VEGF con el receptor del VEGFR2, que tuvieron efectos antitumor significativos en vivo y que no inhibieron el enlace del VEGF con el receptor VEGFR1. En ciertas modalidades, la presente invención así proporciona anticuerpos de especificidad de epítope definido, en donde estos anticuerpos, o fragmentos que se enlazan con antígenos de los mismos, se enlazan esencialmente al mismo epítope como el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . La invención como se reclama se habilita de acuerdo con la presente especificación y las referencias tecnológicas, los conocimientos técnicos y los materiales iniciales fácilmente disponibles. Sin embargo, una muestra de la línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 2C3 fue presentado el 27 de marzo, para recibirlo el 28 de marzo del año 2000, para su depósito en la Colección de Cultivos Tipo Americanos (ATCC-por sus siglas en inglés), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, E.U.A. y se le dio el número de acceso ATCC PTA 1595 el 11 de abril del 2000. Este depósito se hizo con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de micro-organismos para los propósitos de procedimientos de patentes y los reglamentos de los mismos (Tratado de Budapest) . El hibridoma estará disponible por el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest después de la emisión de una Patente de los Estados Unidos con reivindicaciones pertinentes. La disponibilidad del hibridoma depositado no será considerado como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes sobre patentes. Ciertas composiciones preferidas son por lo tanto composiciones que comprenden cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, o cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF purificado, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), las composiciones que comprenden cuando menos un primer anticuerpo monoclonal, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con el VEGF a esencialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y composiciones que comprenden cuando menos un primer anticuerpo monoclonal anti-VEGF, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con el mismo antípote que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . A pesar de esto, ciertas otras composiciones, anticuerpos, métodos, y particularmente el primer y segundo usos médicos de la invención, se refieren a anticuerpos anti-VEGF, o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, que se enlazan al mismo, o sustancialmente al mismo, epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) distinto del anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) mismo. Los términos "que se enlaza con aproximadamente, sustancialmente o esencialmente el mismo, o el mismo, epítope que" el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595 significa que un anticuerpo "reacciona en cruzado" con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). "Los anticuerpos de reacción -^í.^Mi ?^ ii mi^ cruzada" son aquellos que reconocen, se enlazan con o tienen inmunoespecificidad para sustancialmente o esencialmente el mismo, o el mismo, epítope o "sitio epitópico" que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) de manera que son capaces de competir efectivamente con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) para enlazarse con el VEGF. "Los anticuerpos de reacción cruzada 2C3" sucintamente se denominan "anticuerpos parecidos a 2C3" y "anticuerpos basados en 2C3", y estos términos se usan intercambiablemente en la presente y se aplican a composiciones, usos y métodos. La identificación de uno o más anticuerpos que se enlazan con aproximadamente, sustancialmente, esencialmente o con el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) es un asunto técnico directo ahora que 2C3, con sus propiedades ventajosas, se ha proporcionado. Como la identificación de anticuerpos de reacción cruzada se determina en comparación con un anticuerpo de referencia, se entenderá que realmente determinar el epítope al cual el anticuerpo de referencia (2C3) y el anticuerpo de prueba se enlaza no se requiere de ninguna manera con el fin de identificar un anticuerpo que se enlaza con el mismo o sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo mantenimiento 2C3. Sin embargo, información considerable sobre el epítope enlazado por 2C3 se incluye en la presente y se puede realizar además mapeo del epítope, como se describe por Champe y colaboradores, :Aá t*iA?AÍ~ i,» (1995, específicamente incorporado en la presente mediante referencia) . La identificación de anticuerpos de reacción cruzada se puede determinar fácilmente usando cualquiera de una 5 variedad de ensayos de selección inmunológica en los cuales se puede valorar la competición de anticuerpos. Todos estos ensayos son rutinarios en la técnica y se describen adicionalmente en la presente en detalle. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,660,827, emitida el 26 10 de agosto de 1997, se incorpora en la presente específicamente mediante referencia con el propósito de incluir aún un suplemento adicional a las presentes enseñanzas referentes a cómo hacer anticuerpos que se enlazan al mismo sustancialmente el mismo epítope que un anticuerpo dado, tal como el 2C3. 15 Por ejemplo, cuando los anticuerpos de prueba que se van a examinar se obtienen de diferentes animales fuente, o son aún de un isotipo diferente, se puede emplear un simple ensayo de competición en el cual el control (2C3) y los anticuerpos de prueba se mezclan (o preadsorben) y se aplican' a una 20 composición de antígenos de VEGF. Por "composición de antígeno de VEGF" se entiende cualquier composición que contiene un antígeno de VEGF que se enlaza con 2C3 como se describe en la presente, tal como un VEGF libre. De este modo, los protocolos basados en Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada y manchado 25 Western son convenientes para su uso en estos estudios simples de competición. En ciertas modalidades, se podría premezclar los anticuerpos de control (2C3) con cantidades variantes de los anticuerpos de prueba (v.gr., 1:10 ó 1:100) durante un periodo de tiempo antes de aplicar a una composición de antígeno. En otras modalidades, las cantidades de control y variantes de los anticuerpos de prueba simplemente se pueden mezclar durante la exposición a la composición de antígeno. En cualquier caso, usando especies o anticuerpos secundarios isotipo se puede ser capaz de detectar solamente los anticuerpos de control enlazados, el enlace de los cuales se reducirá por la presencia de un anticuerpo de prueba que reconozca sustancialmente el mismo epítope. ?l llevar a cabo un estudio de competición de anticuerpos entre un anticuerpo de control y cualquier anticuerpo de prueba (independientemente de la especie de isotipo) , primero se puede etiquetar el control (2C3) con una etiqueta detectable, tal como, v.gr., biotina o una etiqueta enzimática (o hasta radioactiva) para permitir la identificación posterior. En estos casos, se premezclaría o incubaría los anticuerpos de control etiquetados con los anticuerpos de prueba para ser examinados en varias proporciones (v.gr., 1:10 ó 1:100) y (opcionalmente después de un periodo de tiempo conveniente) luego se probaría la reactividad de los anticuerpos de control etiquetados y se comprobaría esto con un valor de control en el cual ningún anticuerpo de prueba potencialmente competidor se incluiría en la incubación. La prueba de nuevo puede .'¡er cualquiera de una gama de ensayos inmunológicos basados en hibridización de anticuerpos, y los anticuerpos de control se detectarían por medios de detección de su etiqueta, v.gr., usando estreptavidina en el caso de anticuerpos biotinilados o usando un sustrato cromogénico en conexión con una etiqueta enzimática (tal como el sustrato de 3, 3 ' 5, 5 ' -tetrametilbenzidina (TMB) con enzima peroxidasa) o simplemente detectando una etiqueta radioactiva. Un anticuerpo que se enlaza con el mismo epítope que los anticuerpos de control será capaz de competir efectivamente por enlazarse y de este modo reducirá significativamente el enlace de anticuerpo de control, como lo hace evidente una reducción en la etiqueta de enlace. La reactividad de los anticuerpos de control (etiquetados) en ausencia de un anticuerpo completamente irrelevante sería el valor alto de control. El valor bajo del control se obtendría incubando los anticuerpos etiquetados (2C3) con anticuerpos no etiquetados de exactamente el mismo tipo (2C3), cuando la competición ocurriría y reduciría el enlace de los anticuerpos etiquetados. En un ensayo de prueba, una reducción significativa en la reactividad del anticuerpo etiquetado en un presencia de un anticuerpo de prueba es indicador de un anticuerpo de prueba que reconoce el mismo epítope, es decir, uno que "hace reacción cruzada" con el anticuerpo etiquetado (2C3). Una reducción significativa es una reducción " eproducible", es decir, consistentemente observada, en el enlace. Una "reducción significativa" en términos de la presante solicitud se define como una reducción reproducible (en C3 que se enlaza con VEGF en un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada) de cuando menos aproximadamente 70 por ciento, aproximadamente 75 por ciento o aproximadamente 80 por ciento a cualquier proporción entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 1:100. Los anticuerpos con actividades aún más estrictas de bloqueo cruzado exhibirán una reducción reproducible (en el enlace de 2C3 con el VEGF en un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada o en un otro ensayo conveniente) de cuando menos aproximadamente 82 por ciento, aproximadamente 85 por ciento, aproximadamente 88 por ciento, aproximadamente 90 por ciento, aproximadamente 92 por ciento o aproximadamente 95 por ciento a cualquier proporción entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 1:100. El bloqueo cruzado completo o casi completo, tal como el que exhibe una reducción reproducible en el enlace del 2C3 con el VEGF de aproximadamente 99 por ciento, aproximadamente 98 por ciento, aproximadamente 97 por ciento o aproximadamente 96 por ciento, aunque de ningún modo se requiere para practicar la invención, ciertamente no se excluye. La invención se ejemplifica por el anticuerpo monoclonal 2C3, producido por el hibridoma ATCC PTA 1595, o un fragmento que enlaza antígeno de este anticuerpo monoclonal. Un hibridoma que produce un anticuerpo anti-VEGF monoclonal que se enlaza sustancialmente con el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) es otro aspecto de la invención . La invención además proporciona anticuerpos anti-VEGF que se enlazan con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), preparado por un proceso que comprende inmunizar a un animal con cuando menos un primer componente de VEGF inmunogénico y seleccionar del animal inmunizado un anticuerpo que sustancialmente reaccione de manera cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y anticuerpos anti-VEGF que se enlazan sustancialmente con el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , preparado por un proceso que comprende inmunizar a un animal con cuando menos un primer componente de VEGF inmunogénico y seleccionar un anticuerpo anti-VEGF de reacción cruzada a partir del animal inmunizado identificando un anticuerpo que sustancialmente reduce el enlace del anticuerpo 2C3 a VEGF. Los anticuerpos anti-VEGF, o los fragmentos de enlace de antígeno del mismo, que se enlazan con sustancialmente el ?-A&AÁ. »&.É á' &*íAAa^t mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) y que específicamente inhibe el enlace de VEGF con el receptor VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1); y los anticuerpos anti-VEGF, o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, que se enlazan con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) y que inhibe el enlace del VEGF con el receptor de VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1), sin inhibir significativamente el enlace de VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1) forman otros aspectos de la invención. Los anticuerpos con estas combinaciones de propiedades se pueden identificar fácilmente por una o más o una combinación de esta competición de receptor, Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada, ensayos de coprecipitación, y/o ensayos funcionales y los ensayos de reactividad cruzada con 2C3 descritos anteriormente. La guía concerniente a la valoración cuantitativa de los anticuerpos parecidos a 2C3 que consistentemente reduce de manera significativa el enlace del VEGF con el VEGFR2 y que consistentemente no inhibe significativamente el enlace del VEGF con el VEGFR1 es como se describe anteriormente. El 2C3 se muestra aquí que reduce la cantidad del VEGF que se enlaza con los pozos de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada recubiertos con VEGFR2 a aproximadamente 26 por ciento y 19 por ciento, respectivamente, a un excedente molar de 100 veces y 1000 veces sobre el VEGF. Estas figuras se comparan con reducciones en el enlace de VEGF con el VEGFR2 de aproximadamente 74 por ciento y aproximadamente 81 por ciento, respectivamente. El 2C3 en la presente se muestra que mantiene la cantidad del VEGF que se enlaza con los pozos de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada recubiertos con VEGFR2 a aproximadamente 92 por ciento y 105 por ciento, respectivamente, con un excedente molar de 100 veces y 1000 veces sobre el VEGF. De nuevo se entenderá que los anticuerpos parecidos a 2C3 o de reacción cruzada que más sustancialmente inhiben el enlace del VEGF con el VEGFR2 probablemente pueden tolerar más reducción en el enlace de VEGFR1. Igualmente, cuando un anticuerpo tiene una reducción moderada en el enlace del VEGF con el VEGFR2, el mantenimiento del enlace con el VEGFR1 deberá perseguirse más estrictamente. Los anticuerpos anti-VEGF ejemplares adicionales (y fragmentos de enlace de antígeno) de la invención por lo tanto son aquellos que: (a) se enlazan con un epítope de VEGF dependiente no conformalmente, como se valora por el enlace de VEGF en un manchado Western; (b) el enlace de un VEGF libre; (c) inhiben significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1); (d) no inhiben significativamente el enlace del VEGF h-fcjiíiátiá Ai ThfcAi »*AIA ¡á, 4. i*M&* &«m?? to ek?é.Ji con el receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1); (e) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente, la fosforilación inducida por el VEGF del VEGFR2; 5 (f) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente, la permeabilidad vascular inducida por el VEGF; (g) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente, la proliferación de células endoteliales 10 mediadas por el VEGF; (h) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente, la angiogénesis; (i) no inhiben significativamente la estimulación mediada por el VEGFR1 o la activación de macrófagos, 15 osteoclastos o condroclastos; (j) localizan a la vasculatura de tumor y al estroma del tumor después de la administración a un animal con un tumor vascularizado; y (k) se enlaza al mismo o sustancialmente el mismo 20 epítope como el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . En las siguientes descripciones de las composiciones, inmunoconjugados, productos farmacéuticos, combinaciones, cocteles, juegos, primero y segundo usos médicos y todos los métodos de acuerdo con la invención, los términos "anticuerpo" 25 e "inmunoconjugado", o una región que se enlaza con antígeno de los mismos, a menos que se especifique otra cosa o se aclare a partir de la terminología científica, se refiere a un rango de anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 así como anticuerpos de reacción cruzada 2C3 específicos. Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina", como se usan en la presente, se refieren ampliamente a cualquier sustancia de enlace inmunológico, incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales. Dependiendo del tipo de dominio constante en las cadenas pesadas, los anticuerpos se asignan a una de cinco clases principales: IgA, IgD, Ige, IgG e IgM. Varias de éstas se dividen adicionalmente en subclases isotipos, tales como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, y similares. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan , d, e, y, y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones en tres dimensiones de diferentes clases de inmunoglobulina son muy conocidas. En general, cuando anticuerpos distintos de las regiones de enlace con antígenos se usan en la invención, se prefieren IgG y/o IgM debido a que son los anticuerpos más comunes en la situación fisiológica y debido a que se hacen más fácilmente en ambiente de laboratorio. Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos de mamíferos se asignan a uno de dos tipos claramente distintos: kapa (K) y lambda (?) , basados en secuencias de aminoácidos o sus dominios constantes. Esencialmente no hay preferencia de buscar K Ó ? en cadenas ligeras en los anticuerpos de la presente invención. El uso de anticuerpos monoclonales (MAbs) o derivados de los mismos se prefiere más. Los anticuerpos monoclonales se 5 reconoce que tienen ciertas ventajas, v.gr., reproducibilidad y producción a gran escala, lo que las hace convenientes para tratamiento clínico. La invención así proporciona anticuerpos monoclonales de origen murino, humano, de mono, rata, hámster, conejo y hasta sapo o pollo. Los anticuerpos monoclonales 10 murinos, humanos o humanizados generalmente se preferirán. Como se entenderá por los expertos en la técnica, los reactivos de enlace inmunológico abarcados por el término "anticuerpo" se extiende a todos los anticuerpos de todas las especies, y los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, 15 incluyendo anticuerpos diméricos, triméricos y multiméricos; anticuerpos biespecíficos; anticuerpos quiméricos; anticuerpos humanos y humanizados; anticuerpos recombinantes y diseñados técnicamente, y fragmentos de los mismos. El término "anticuerpo" se usa así para referirse a 20 cualquier molécula parecida a anticuerpo que tenga una región de enlace de antígeno, y este término incluye fragmentos de anticuerpos tales como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio simple (DABs) , Fv, scFv (Fv de cadena simple) , anticuerpos lineales, diacuerpos, y similares. Las técnicas 25 para preparar y usar varias construcciones basadas en anticuerpos y fragmentos son muy conocidas en la técnica (véase Kabat y colaboradores, 1991, específicamente incorporada en la presente mediante referencia). Los diacuerpos, en particular, se describen adicionalmente en EP 404, 097 y WO 93/11161, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia; mientras que los anticuerpos lineales se describen adicionalmente en Zapata y colaboradores, (1995), específicamente incorporada en la presente mediante referencia. En ciertas modalidades, las composiciones de la invención comprenden cuando menos un primer anticuerpo anti- VEGF que comprende cuando menos una primera región variable que incluye una región de secuencia de aminoácidos de cuando menos aproximadamente 75 por ciento, más preferiblemente, cuando menos aproximadamente 80 por ciento, más preferiblemente, cuando menos aproximadamente 85 por ciento, más preferiblemente, cuando menos aproximadamente 90 por ciento y más preferiblemente, cuando menos aproximadamente 95 por ciento o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9; en donde el anticuerpo anti-VEGF cuando menos sustancialmente mantiene las propiedades biológicas de los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 de la presente invención, como se ejemplifica por el anticuerpo 2C3. La identidad u homología con respecto a éstas y otras secuencias de anticuerpos anti-VEGF de la presente invención se definen en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidato que son idénticas a las secuencias de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9, o a la secuencia de otro anticuerpo anti-VEGF de la invención, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr la identidad de secuencia porcentual máxima. El mantenimiento de sustancialmente las mismas propiedades biológicos o aún más efectivas del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 usado para la comparación de secuencias es particularmente importante. Estas comparaciones se llevan a cabo fácilmente, v.gr., usando uno o más de los distintos ensayos descritos en detalle en la presente. En ciertas modalidades preferidas, los anticuerpos anti-VEGF de la invención comprenden cuando menos una primera región variable que incluye una región de secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO : 9 , como se ejemplifica por las regiones variables que incluyen una región de secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8. Estas secuencias son las secuencias de Vh y VK del 2C3 ScFv que abarca el CER1-3 (regiones de determinación de complementariedad) de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. En otras modalidades preferidas, se proporcionan anticuerpos de segunda generación que tienen propiedades .Aüteí ....^ <flfei aumentadas o superiores en comparación con un anticuerpo anti- VEGF que bloquea el VEGFR2 original, tal como el 2C3. Por ejemplo, los anticuerpos de segunda generación pueden tener una afinidad de enlace más fuerte, un bloqueo más efectivo o enlace del VEGF con el VEGFR2, un bloqueo más específico del VEGF que se enlaza con el VEGFR2, aún un bloqueo menor del VEGF que se enlaza con el VEGFR1, capacidad aumentada de inhibir la proliferación inducida por el VEGF y/o la migración de células endoteliales, capacidad superior para inhibir, la permeabilidad vascular inducida por el VEGF, y preferiblemente, una capacidad aumentada para inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF en vivo, y para tratar enfermedades angiogénicas que incluyen los tumores vascularizados . Las comparaciones para identificar anticuerpos efectivos de segunda generación se llevan a cabo fácilmente y se cuantifican, v.gr., usando uno o más de los distintos ensayos descritos en detalle en la presente. Los anticuerpos de segunda generación que tienen una propiedad biológica aumentada o actividad de cuando menos aproximadamente 10 veces, preferiblemente, cuando menos aproximadamente 20 veces, y más preferiblemente, cuando menos aproximadamente 50 veces, en comparación con los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 de la presente invención, como se ejemplifica por el anticuerpo 2C3, están considerados por la presente invención. En ciertas modalidades, los anticuerpos empleados serán anticuerpos "humanizados", en parte humanos o humanos. Los anticuerpos "humanizados" generalmente son anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón, rata o de otra especie no humana, que tienen dominios de región variable y/o constante humana ("anticuerpos quiméricos en parte humanos") . Varios anticuerpos monoclonales humanizados para su uso en la presente invención serán anticuerpos quiméricos en donde cuando menos una primera región de enlace de antígeno, o una región de determinación de complementariedad (RDC) , de un ratón, rata o de otro anticuerpo monoclonal no humano se une operativamente con, o se "injerta" en, una región constante de anticuerpo humano o "estructura". Los anticuerpos monoclonales "humanizados" para su uso en la presente también pueden ser anticuerpos monoclonales de especi s no humanas en donde uno o más aminoácidos seleccionados han sido intercambiados por aminoácidos más comúnmente observados en anticuerpos humanos. Esto se puede lograr fácilmente a través del uso de tecnología recombinante de rutina, particularmente mutagénesis específica al sitio. Los anticuerpos completamente humanos, en vez de "humanizados", también se pueden preparar y usar en la presente invención. Estos anticuerpos humanos se pueden obtener de sujetos saludables simplemente obteniendo una población de linfocitos de sangre periférica mezclados de un sujeto humano, incluyendo células que presentan antígeno y células que O?iiÁk. producen anticuerpo, y estimulando la población de células in vi tro mezclando con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra del VEGF. Las células que producen anticuerpos anti-VEGF humano, en cuanto se obtienen, se usan en producción de anticuerpos recombinantes y/o hibridomas. Otras técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos incluyen inmunizar un animal transgénico, preferiblemente un ratón transgénico, lo cual comprende una biblioteca de anticuerpos humanos con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra del VEGF. Esto también genera células que producen anticuerpos anti-VEGF humanas para la manipulación adicional en la producción de anticuerpos recombinantes y/o hibridomas, con la ventaja de que las células de bazo, en vez de las células sanguíneas periféricas, se pueden obtener fácilmente del animal transgénico o ratón. Los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 de acuerdo con la invención se pueden preparar fácilmente por procesos y métodos que comprenden: (a) preparar células que producen anticuerpos candidatos; y (b) seleccionar de las células que producen anticuerpos candidatos un anticuerpo que inhiba significativamente el enlace del VEGF con el VEGFR2 (KDR/Flk-1) y no inhiba significativamente el enlace del VEGF con el .-a.^^^.fe. ri.i.*t&,áto.^^ receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1) . Otros anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden preparar fácilmente seleccionando un anticuerpo que sustancialmente hace reacción cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . Los procesos y métodos preparativos convenientes comprenden: (a) preparar las células que producen anticuerpos candidatos; y (b) seleccionar de las células que producen anticuerpos candidatos un anticuerpo que sustancialmente haga reacción cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . Un proceso para preparar células que producen anticuerpos convenientes y obtener anticuerpos de los mismos se puede llevar a cabo in si t u en un paciente dado. Esto es, simplemente proporcionando una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de VEGF inmunogénico a un paciente dará como resultado la generación adecuada de anticuerpos. De este modo, el anticuerpo todavía se "obtiene" de una célula que produce anticuerpos, pero no ha sido aislada fuera de una hospedera y posteriormente proporcionada a un paciente, siendo capaz de localizar espontáneamente a la vasculatura del tumor y ejercer sus efectos biológicos antitumor. Sin embargo, esas modalidades no se prefieren debido a la marcada falta de especificidad.
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También se pueden obtener células que producen anticuerpos convenientes, y anticuerpos posteriormente aislados y/o purificados, estimulando los linfocitos de la sangre periférica con el VEGF in vi tro . Otros métodos comprenden administrar a un animal una composición inmunizante que comprende cuando menos un primer componente de VEGF inmunogénico y seleccionar del animal inmunizado un anticuerpo que inhiba significativamente el enlace del VEGF con el VEGFR2 (KDR/Flk-1) y no inhiba significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1), y opcionalmente que sustancialmente haga reacción cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). Estos métodos generalmente comprenden: (a) inmunizar un animal administrando al animal cuando menos una dosis, y opcionalmente más de una dosis, de una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra del VEGF inmunogénico (tal como un primer componente de VEGF humano, un componente de VEGF sustancialmente de longitud completa, o un VEGF humano recombinante) ; y (b) obtener una célula que produce anticuerpo conveniente a partir del animal inmunizado, tal como una célula que produce anticuerpo que produzca un anticuerpo que significativamente inhiba el enlace del VEGF con el VEGFR2 (KDR/Flk-1) y no inhiba significativamente el enlace del VEGF con el receptor de VEGF, VEGFR1 (Flt-1), y opcionalmente que sustancialmente haga reacción cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . La cantidad inmunogénicamente efectiva de la muestra o muestras del VEGF se puede administrar como conjugado del VEGF, o en combinación con cualquier adyuvante conveniente, tal como adyuvante completo de Freund. Cualquier técnica empírica o variación se puede emplear para aumentar la inmunogenicidad. El VEGF humano de longitud completa sustancialmente, intacto generalmente se prefiere como un inmunógeno. Independientemente de la naturaleza del proceso de inmunización, o del tipo de animal inmunizado, se obtienen células que producen anticuerpo conveniente a partir del animal inmunizado y, preferiblemente, se manipulan posteriormente por el hombre. "Un animal inmunizado", como se usa en la presente, es un animal no humano, a menos que se exprese claramente de otro modo. Aunque cualquier célula que produzca anticuerpos se puede usar, más preferiblemente, se obtienen células del bazo como la fuente de las células que producen anticuerpos. Las células que producen anticuerpo se pueden usar en los procesos preparativos que comprenden: (a) fusionar una célula que produce anticuerpos anti-VEGF conveniente con una célula inmortal para preparar un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención; y (b) obtener un anticuerpo anti-VEGF conveniente de ^A^^ A<a,A, «afrfa^,...^..^.^M.A^,.^^A^^^^lA^u?t^^^?.?J.il-i acuerdo con la invención a partir del hibridoma. Células que producen anticuerpos anti-VEGF "conveniente", hibridomas y anticuerpos son aquellas que producen, o existen como, anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2, es decir, anticuerpos que inhiben significativamente el enlace del VEGF con el VEGFR2 (KDR/Flk-1) y no inhiben significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF VEGFRl (Flt-1), y opcionalmente, que sustancialmente hacen reacción cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . Los métodos preparativos de anticuerpo monoclonal basados en hibridoma de este modo incluyen aquellos que comprenden : (a) inmunizar un animal administrándole al animal cuando menos una dosis, y opcionalmente más de una dosis, de una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra del VEGF inmunogénico, preferiblemente una muestra de VEGF humano intacto; (b) preparar una colección de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales a partir del animal inmunizado; (c) seleccionar de la colección cuando menos un primer hibridoma que produzca cuando menos un primer anticuerpo monoclonal anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2 de acuerdo con la invención, opcionalmente un anticuerpo anti-VEGF que sustancialmente haga reacción cruzada con el anticuerpo t¿jA^^.Md,„.t -ffe- i ? monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y (d) cultivar el cuando menos primer hibridoma que produce anticuerpos para proporcionar el cuando menos un primer anticuerpo monoclonal anti-VEGF que bloquea el VEGFR2; y preferiblemente (e) obtener el cuando menos un primer anticuerpo monoclonal anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 a partir de cultivar cuando menos un primer hibridoma. Para identificar un anticuerpo anti-VEGF que sustancialmente hace reacción cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), el paso de selección puede comprender : (a) poner en contacto una muestra del VEGF con cantidades efectivas del anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) y un anticuerpo candidato; y (b) determinar la capacidad del anticuerpo candidato para reducir sustancialmente el enlace del anticuerpo 2C3 con la muestra del VEGF; en donde la capacidad de un anticuerpo candidato para reducir sustancialmente el enlace del anticuerpo 2C3 con la muestra del VEGF es indicador de un anticuerpo anti- VEGF que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . El paso de selección además puede comprender: (a) poner en contacto una primera muestra del VEGF con una cantidad de enlace efectivo del anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) para determinar la cantidad de 2C3 que se enlaza con VEGF; (b) poner en contacto una segunda muestra del VEGF con una cantidad de enlace efectivo del anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) en combinación con una cantidad competente efectiva de un anticuerpo candidato y determinar la cantidad de 2C3 que se enlaza con el VEGF en presencia del anticuerpo candidato; y (c) identificar un anticuerpo anti-VEGF que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) seleccionando un anticuerpo candidato que reduzca la cantidad de 2C3 que se enlaza con el VEGF, preferiblemente, cuando menos aproximadamente el 80 por ciento . Como se usan animales no humanos para la inmunización, los anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de un hibridoma así frecuentemente tendrán una conformación no humana. Estos anticuerpos opcionalmente se pueden someter a un proceso de humanización, injerto o mutación, como lo saben los expertos en la técnica y se describe adicionalmente en la presente. De manera alternativa, animales transgénicos, tales como ratones, se pueden usar que comprendan una biblioteca de genes de anticuerpos humanos. La inmunización de estos animales por lo tanto directamente dará como resultado la generación de anticuerpos humanos convenientes. á .i,Á¡-?.? 8h.JE.Aiii Después de la producción de una célula que produzca anticuerpos convenientes, más preferiblemente un hibridoma, ya sea que produzca anticuerpos humanos o no humanos, los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos monoclonales se pueden clonar para preparar un anticuerpo monoclonal "recombinante". Cualquier técnica de clonación recombinante se puede utilizar, incluyendo el uso de PCR® para cebar la síntesis de las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos. Por lo tanto, todavía otros métodos preparativos de anticuerpos monoclonales adecuados incluyen aquellos que comprenden usar las células que producen anticuerpos como sigue: (a) obtener cuando menos una primera molécula de ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-VEGF conveniente o un segmento de una célula que produzca anticuerpos anti-VEGF conveniente preferiblemente un hibridoma; y (b) expresar la molécula de ácido nucleico o segmento en una célula hospedera recombinante para obtener un anticuerpo monoclonal anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2 recombinante de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, otras técnicas recombinantes poderosas están disponibles que se adaptan idealmente a la preparación de anticuerpos monoclonales recombinantes. Estas técnicas recombinantes incluyen los métodos preparativos de anticuerpos monoclonales basados en bibliotecas de fagémidos que comprenden: (a) inmunizar un animal administrando al animal cuando menos una dosis, y opcionalmente más de una dosis, de una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra del VEGF inmunogénico (tal como una muestra de VEGF humana intacta); (b) preparar una biblioteca de fagémidos de inmunoglobulina combinatoria que expresa el ARN aislado de las células que producen anticuerpos, preferiblemente bazo, del animal inmunizado; (c) seleccionar de la biblioteca de fagémidos cuando menos una primera clona que expresa cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2, opcionalmente uno que sustancialmente haga reacción cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); (d) obtener ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-VEGF, que bloquean el VEGFR2 a partir de cuando menos una primera clona seleccionada y expresar los ácidos nucleicos en una célula hospedera recombinante para proporcionar el cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2; y preferiblemente (e) obtener el cuando menos primer anticuerpo anti- VEGF que bloquea el VEGFR2 expresado por los ácidos nucleicos obtenidos de la cuando menos una primera clona seleccionada. De nuevo, en estas técnicas basadas en bibliotecas de fagémidos, los animales transgénicos que tienen bibliotecas de genes de anticuerpos humanos se pueden emplear, produciendo de Í.Í..??. ? --.fe-nt „!, t nrihim .Ai... *.É¡?ti?.? este modo anticuerpos monoclonales humanos recombinantes. Independientemente de la manera de preparación de un primer segmento de ácido nucleico de anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, otros segmentos de ácido nucleico de anticuerpos convenientes se pueden fácilmente preparar por técnica.3 de biología molecular estándares. Con el fin de confirmar que cualquier segmento de ácido nucleico de anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 variante, mutante o de segunda generación es conveniente para su uso en la presente invención, el segmento de ácido nucleico será probado para confirmar la expresión del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, el segmento de ácido nucleico variante, mutante o de segunda generación también será probado para confirmar la hibridización en condiciones de hibridización estándares, más preferiblemente, estrictamente estándares. Las condiciones de hibridización convenientes ejemplares incluyen la hibridización en aproximadamente 7 por ciento de dodecilsulfato de sodio (DSS) aproximadamente 0.5 NaP04, aproximadamente 1 mM EDTA a aproximadamente 50°C; y lavarlo con aproximadamente 1 por ciento de dodecilsulfato de sodio a aproximadamente 42°C. Como una variedad de anticuerpos monoclonales recombinantes, ya sea humanos o no humanos de origen, fácilmente se pueden preparar, los métodos de tratamiento de la invención se pueden ejecutar proporcionando al animal o l¿JULá.á*t??lf, k?..fafc-^.,^«..^d&t,, paciente cuando menos un primer segmento de ácido nucleico que expresa una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 en el paciente. "El segmento de ácido nucleico que expresa un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, parecido a 2C3 o basado en 2C3" generalmente estará en forma de cuando menos una construcción de expresión, y puede estar en forma de una construcción de expresión compuesta dentro de un virus o dentro de una célula hospedera recombinante. Los vectores de terapia de genes preferidos de la presente invención generalmente serán vectores virales, tales como los comprendidos dentro de un retrovirus recombinante, virus de herpes símplex (VHS) adenovirus, virus adeno asociado (VAA) , citomegalovirus (CMV) , y similares. Esta invención además proporciona composiciones que comprenden cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 purificado, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, opcionalmente uno que se enlaza con esencialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . Estas composiciones pueden ser composiciones farmacéuticamente aceptables o composiciones para el uso en estudios de laboratorio. En términos de las composiciones farmacéuticas, se pueden formular preferiblemente para la administración parenteral, tal como para administración intravenosa. La presente invención proporciona varios métodos y usos de los anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, incluyendo los anticuerpos de reacción cruzada con 2C3, parecidos a 2C3 o basados en 2C3. Con respecto a todos los métodos, los términos "un" y "una" se usan para decir "cuando menos uno", "cuando menos un primero", "uno o más" o "una pluralidad de pasos en los métodos citados, excepto cuando se declara específicamente. Esto es particularmente relevante a los pasos de administración en los métodos de tratamiento. De este modo, no solamente se pueden emplear diferentes dosis con la presente invención, sino diferentes números de dosis, v.gr., se pueden usar inyecciones hasta e incluyendo inyecciones múltiples. Se pueden usar terapias combinadas, administradas antes, después o durante la administración del anticuerpo terapéutico anti-VEGF. Varios métodos útiles in vi tro y usos se proporcionan que tienen importantes implicaciones biológicas. Primero se proporcionan métodos y usos, para enlazar el VEGF, los cuales generalmente comprenden poner en contacto de manera efectiva una composición que comprende el VEGF, preferiblemente VEGF libre (no enlazado con receptor) con cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, opcionalmente un anticuerpo que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . Se proporcionan métodos y usos para detectar VEGF que generalmente comprenden poner en contacto una composición de la cual se sospecha que contiene VEGF con cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, opcionalmente uno que se enlaza a sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , en condiciones efectivas para permitir la formación de complejos de VEGF/anticuerpo y detectar los complejos así formados. Los métodos de detección y usos se pueden usar en conexión con las muestras biológicas, v.gr., en diagnóstico para angiogénesis y tumores, y juegos de diagnóstico basados en los mismos también se proporcionan. La presente invención proporciona métodos y usos de preferencialmente o específicamente inhibir el enlace del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2, que generalmente comprenden poner en contacto, en presencia del VEGF una población de células o tejidos que incluyen células endoteliales que expresan el VEGFR2 (KDR/Flk-1) con una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 como opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , o un fragmento que se enlaza con antígeno del mismo, bajo condiciones efectivas para inhibir el enlace del VEGF al receptor de VEGF, VEGFR2. Se proporcionan métodos y usos que inhiben significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, ?±**Má^*?^.A*L** A^»J*^ VEGFR2, sin inhibir significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFRl . Estos métodos comprenden poner en contacto, en la presencia del VEGF, una población de células o tejidos que incluye una población de células endoteliales que expresan el VEGFR2 (KDR/Flk-1) y el VEGFR1 (Flt-1) con una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, opcionalmente un anticuerpo anti-VEGF que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, bajo condiciones efectivas para inhibir el enlace del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2, sin inhibir significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR1. Otros métodos y usos de la invención están en analizar los papeles biológicos de los receptores del VEGF denominados VEGFR2 y VEGFRl, que comprenden los pasos de: (a) poner en contacto una composición biológico o tejido que comprende el VEGF y una población de células que expresan los receptores VEGFR2 (KDR/Flk-1) y VEGFR1 (Flt-1) con una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, opcionalmente un anticuerpo anti-VEGF que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) o un fragmento de enlace de <±±^& tf ltlÍ»Ílá*%il *?í?»*IÍttrÍr----*-*•••• -- ^ «44-j a..?. ,,ji¿,j>>^4 tt-^«^,^ antígeno del mismo; y (b) determinar el efecto del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 en cuando menos una primera respuesta biológica al VEGF; en donde: (i) una alteración en la respuesta biológica en la presencia del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 es indicadora de una respuesta mediada por el receptor VEGFR2; y (ii) el mantenimiento de una respuesta biológica en presencia del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 es indicadora de una respuesta mediada por el receptor del VEGFR1. Se proporcionan métodos y usos de inhibición de la proliferación, incluyendo aquellos que específicamente inhiben la proliferación y/o la migración de células endoteliales inducidas por el VEGF, los cuales generalmente comprenden poner en contacto una población de células o tejidos que incluye una población de células endoteliales y el VEGF con una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de enlace de antígeno del mismo del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, en condiciones efectivas para inhibir la proliferación y/o la migración de células endoteliales inducida por VEGF. Se proporcionan métodos y usos para inhibir la ..,.....MS^^.^~A^t^1i¿^?^^^ .^^ ^? sÍt:?. proliferación y/o migración de células endoteliales inducida por el VEGF, sin inhibir significativamente la quimiotaxis de macrófagos inducidas por el VEGF se proporcionan, los cuales generalmente comprenden poner en contacto una población de células o tejidos que contienen células endoteliales, macrófagos y VEGF con una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, opcionalmente uno que se enlace con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , o un fragmento de enlace de antígeno del anticuerpo anti-VEGF, en condiciones efectivas para inhibir la proliferación y/o la migración de células endoteliales inducidas por el VEGF, sin inhibir significativamente la quimiotaxis de macrófagos inducida por el VEGF. También se proporcionan métodos y usos para inhibir la proliferación y/o la migración de células endoteliales inducida por VEGF y, opcionalmente la angiogénesis, sin inhibir significativamente la estimulación del VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos. Los métodos generalmente comprenden poner en contacto una población de células o tejidos que contienen células endoteliales y cuando menos uno de macrófagos, osteoclastos o condroclastos, con una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento que se enlaza con antígeno del anticuerpo, en condiciones efectivas para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales inducida por VEGF o la angiogénesis, sin inhibir significativamente la estimulación por VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos. Los métodos y usos anteriores se pueden llevar a cabo in vi tro y en vivo, en el último caso, en donde los tejidos o células se localizan dentro de un animal y el anticuerpo anti- VEGF se administra al animal. En ambos métodos, los métodos y usos se vuelven métodos y usos para inhibir la angiogénesis, que comprende poner en contacto un tejido que comprende, una población de, vasos sanguíneos potencialmente angiogénicos, es decir, aquellos potencialmente expuestos al VEGF, con una composición antiangiogénica que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento que enlaza antígeno del mismo, en condiciones efectivas para inhibir la angiogénesis . Cuando se mantienen poblaciones de vasos sanguíneos angiogénicos potencialmente ex vivo, la presente invención tiene utilidad en los programas de descubrimiento de fármacos.
Los ensayos de selección in vi tro, con controles confiables positivos y negativos, son útiles como un primer paso en el desarrollo de fármacos para inhibir o promover la angiogénesis, así como en la delineación de información adicional en el proceso angiogénico. Cuando la población de vasos sanguíneos angiogénicos potencialmente se localiza dentro de un animal o paciente, la composición antiangiogénica se administra al animal como una forma de terapia. "Cantidades biológicamente efectivas", en términos de cada uno de los anteriores métodos inhibitorios por lo tanto son cantidades de anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2, opcionalmente anticuerpos basados en 2C3, efectivos para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por VEGF; para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por VEGF, sin inhibir significativamente la quimiotaxis de macrófagos inducida por VEGF; para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por VEGF o la angiogénesis, sin inhibir significativamente el estímulo por VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos; y sobre todo, para reducir la proliferación y/o migración de células endoteliales vasculares de una manera efectiva para inhibir el crecimiento de vasos sanguíneos o angiogénesis. La invención de este modo proporciona métodos de, y usos en, inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF y, ¿4¿¿¿^M=i¿á^a¡¡^^^ia¡g¡rt^^^^^^^A^ preferiblemente, tratar una enfermedad angiogénica, sin inhibir significativamente el estímulo por VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos. Los métodos generalmente comprenden poner en contacto una población de células o tejidos que contienen células endoteliales y cuando menos uno de macrófagos, osteoclastos o condroclastos, con una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento que enlaza antígeno del anticuerpo, en condiciones efectivas para inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF y para tratar una enfermedad angiogénica sin inhibir significativamente el estímulo por VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos. También se proporcionan métodos y usos para inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF y, preferiblemente, tratar una enfermedad antiangiogénica, sin causar efectos colaterales significativos en el metabolismo de los huesos. Los métodos generalmente comprenden poner en contacto un tejido o una población de vasos angiogénicos que contienen células endoteliales vasculares y cuando menos uno de macrófagos, osteoclastos o condroclastos, con una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento que enlaza antígeno del anticuerpo, en condiciones efectivas para inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF y para tratar una enfermedad angiogénica sin causar efectos colaterales significativos en el metabolismo de los huesos por no discapacitar de manera significativa las actividades de los macrófagos, osteoclastos o condroclastos. Se proporciona la selección ( in vi tro) y la terapia (en vivo) de fármacos antiangiogénicos en términos de animales y pacientes que tienen, o están en riesgo de desarrollar, cualquier enfermedad o padecimiento caracterizado por una vascularización indeseada, inadecuada, aberrante, excesiva y/o patológica. Es muy conocido para los expertos en la técnica que como la angiogénesis aberrante se presenta en un rango amplio de enfermedades y desórdenes, una terapia antiangiogénica dada, que ha mostrado ser efectiva en cualquier sistema de modelo aceptable, se puede usar para tratar el rango entero de enfermedades y desórdenes conectados a la angiogénesis. Los métodos y usos de la presente invención se destinan particularmente para su uso en animales y pacientes que tienen o están en riesgo de desarrollar, cualquier forma de tumor vascularizado; degeneración macular, incluyendo degeneración macular relacionada con la edad; artritis, incluyendo artritis re?matoide; ateroesclerosis y placas ateroescleróticas; retinopatía diabética y otras retinopatías; hiperplasias de tiroides, incluyendo la enfermedad de Grave; hemangioma; glaucoma neovascular; y psoriasis. Los métodos y usos de la invención se destinan adicionalmente para el tratamiento de animales y pacientes que tienen, o están en riesgo de desarrollar, malformaciones arteriovenosas (AVM) , meningioma, y restenosis vascular, incluyendo restenosis que sigue a la angioplastia. Otros objetivos pretendidos de los métodos terapéuticos y usos son animales y pacientes que tienen, o están en riesgo de desarrollar angiofibroma, dermatitis, endometriosis, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, enfermedades inflamatorias y padecimientos, granuloma piogénico, escleroderma, sinovitis, tracoma y adhesiones vasculares . Como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,712,291, específicamente incorporada en la presente mediante referencia, cada uno de los grupos de tratamiento anteriores de alguna manera preferidos de ninguna manera son exhaustivos de los tipos de condiciones que se van a tratar por la presente invención. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,712,291 se incorpora en la presente mediante referencia para ciertos propósitos específicos, incluyendo el propósito de identificar varios otros padecimientos que pueden ser tratados efectivamente por una terapia antiangiogénica; el propósito de mostrar que el tratamiento de todas las enfermedades angiogénicas representa un concepto unificado, una vez que se han definido y reclamado una categoría de compuestos que inhiben la angiogénesis (en el presente caso, anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2, opcionalmente aquellos que se enlazan con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) ) ; y el propósito de mostrar que el tratamiento de todas las enfermedades angiogénicas es habilitado por datos de solamente un sistema de un solo modelo. En todavía otros aspectos, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,712,291, incorporada en la presente mediante referencia, los métodos y usos de la presente invención se destinan para el tratamiento de animales y pacientes que tienen, o están en riesgo de desarrollar, proliferación anormal de tejido fibrovascular, acné rosácea, síndrome de deficiencia inmunoadquirida, oclusión de arterias, queratitis atópica, úlceras bacterianas, enfermedad de Bechets, tumores que llevan sangre, enfermedad obstructiva de la carótida, quemaduras químicas, neovascularización coroidal, inflamación crónica, desprendimiento crónico de la retina, uveítis crónica, vitritis crónica, uso excesivo de lentes de contacto, rechazo de injerto de córnea, neovascularización córnea, neovascularización de injerto de córnea, enfermedad de Crohn, enfermedad de Eales, queratoconjuntivitis epidémica, úlceras de hongos, infecciones por herpes símplex, infecciones por herpes zoster, síndromes de hiperviscosidad, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneración de lípidos, enfermedad de Lyme, queratolisis marginal, úlcera de Mooren, infecciones de microbacterias distintas de lepra, miopía, enfermedad neovascular ocular, fragmentos ópticos, síndrome de Osler-Weber (Osler-Weber-Rendu) , osteoartritis, enfermedad de Pagets, pars planitis, penfigoide, filectenulosis, poliarteritis, complicaciones post-láser, infecciones por protozoarios, pseudoxanthoma elasticum, pterygium keratitis sicca, queratotomía radial, neovascularización retinal, retinopatía de premadurez, fibroplasias retrolentales, sarcoide, escleritis, anemia de célula fusiforme, síndrome de Sogrens, tumores sólidos, enfermedad de Stargarts, enfermedad de Steven Johnson, queratitis límbica superior, sífilis, lupus sistémico, degeneración marginal de Terrien, toxoplasmosis, trauma, tumores de sarcoma de E ing, tumores de neuroblastoma, tumores de osteosarcoma, tumores de retinoblastoma, tumores de rabdomiosarcoma, colitis ulcerativa, oclusión de venas, deficiencia de Vitamina A y sarcoidosis de Wegeners . La presente invención además proporciona métodos y usos para el tratamiento de animales y pacientes que tienen, o están en riesgo de desarrollar, artritis, en común con el y|ÉMj^tt^ ^|i tratamiento de artritis usando sustancias inmunológicas descritas en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,753,230, específicamente incorporada en la presente mediante referencia. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,972,922 también incorporada en la presente específicamente mediante referencia para ejemplificar todavía adicionalmente la aplicación de estrategias antiangiogénicas al tratamiento de angiogénesis no deseada asociada con diabetes, enfermedad de parásitos, cicatrización de heridas anormal, hipertrofia después de cirugía, quemadas, lesiones o traumas, inhibición del crecimiento del cabello, inhibición de la ovulación y formación de corpus luteum, inhibición de implantes e inhibición del desarrollo de embrión en el útero. Todos los padecimientos anteriores se contemplan por lo tanto para el tratamiento mediante los métodos y usos de la presente invención. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,639,757 además incorporada específicamente en la presente mediante referencia para ejemplificar el uso de estrategias antiangiogénicas para el tratamiento general del rechazo a los injertos. El tratamiento de la inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, pre-eclampsia, efusión pericardial, tal como la asociada con pericarditis, y la efusión pleural usando estrategias antiangiogénicas basadas en la inhibición del VEGF se describe en WO 98/45331, específicamente incorporada en la presente mediante referencia. Los animales y los pacientes que tienen, o están en riesgo de desarrollar, cualquiera de los padecimientos anteriores se contemplan por lo tanto para el tratamiento mediante los métodos y usos de la presente invención. Como se describe en WO 98/16551, específicamente incorporada en la presente mediante referencia, las moléculas biológicas que antagonizan la función de VEGF también son convenientes para su uso para tratar enfermedades y padecimientos caracterizados por la permeabilidad vascular indeseable. De conformidad con lo anterior, los anticuerpos que antagonizan el VEGF, los métodos y usos de la presente invención son aplicables al tratamiento de animales y pacientes que tienen, o están en riesgo de desarrollar, enfermedades y padecimientos caracterizados por permeabilidad vascular indeseable, v.gr., edema asociado con tumores del cerebro, ascitas asociados con malignidades, síndrome de Meigs, inflamación de pulmones, síndrome nefrótico, efusión pericardial y efusión pleural y similares. Aunque el tratamiento de todos los casos anteriores se habilita dentro de la presente invención unificada, un aspecto particularmente preferido de los métodos y usos de la presente invención es la aplicación de terapia antiangiogénica a animales y pacientes que tienen, o están en riesgo de desarrollar, un tumor sólido vascularizado, un tumor etastásico o metástasis de un tumor primario. Los métodos de, y usos para inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF, y, preferiblemente, ejercer un efecto antitumor o antitumor mejorado sin inhibir significativamente la estimulación por VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos se proporciona adicionalmente. Los métodos generalmente comprenden poner en contacto un tejido, ambiente de tumor o población de vasos angiogénicos que contienen células endoteliales vasculares y cuando menos uno de macrófagos, osteoclastos o condroclastos, con una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 , opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , o un fragmento que enlaza antígeno del anticuerpo, en condiciones efectivas para inhibir la angiogénesis inducida por VEGF y para ejercer un efecto antitumor o antitumor mejorado sin inhibir significativamente la estimulación por VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos . La presente invención además proporciona métodos y usos de tratar una enfermedad asociada con angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociados con angiogénesis, que comprende administrar a un animal o paciente con esta enfermedad o cáncer una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 , opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , o un fragmento de enlace de antígeno o inmunoconjugado de este anticuerpo anti-VEGF. Esta invención enlaza tanto los métodos angiogénicos que usan anticuerpos no conjugados o desnudos como fragmentos de los mismos, así como métodos que se dirigen a lo vascular usando inmunoconjugados en los cuales el anticuerpo, o fragmento que enlaza antígeno del mismo, se une operativamente a una sustancia terapéutica. A menos que se declare específicamente otra cosa, o se haga claro en términos científicos, los términos "anticuerpo y fragmento del mismo" como se usa en la presente, por lo tanto significa un anticuerpo o fragmento "no conjugado o desnudo", que no está unido a otra sustancia, particularmente a una sustancia terapéutica o de diagnóstico. Estas definiciones no excluyen modificaciones del anticuerpo, tales como, a manera de ejemplo solamente, modificaciones para mejorar la vida medio biológica, la afinidad, la avidez u otras propiedades del anticuerpo, o combinaciones del anticuerpo con otros efectores. Los métodos de tratamiento antiangiogénicos y usos de la invención también abarcan el uso tanto de anticuerpos no conjugados o desnudos como de inmunoconjugados. En los métodos de tratamiento antiangiogénicos basados en inmunoconjugados, el l?,^.¿.á.. ¿¿^4 íÍ¿4¡ anticuerpo, o fragmento que enlaza antígeno del mismo, preferiblemente está unido operativamente a una segunda sustancia antiangiogénica (el mismo anticuerpo anti-VEGF, siendo el primer agente antiangiogénico) . Los agentes antiangiogénicos unidos pueden ser aquellos que tienen un efecto antiangiogénico o indirecto. Los métodos del tratamiento antiangiogénico y usos comprenden administrar a un animal o paciente con una enfermedad asociada con angiogénesis, que incluye todas las formas de cáncer asociadas con angiogénesis, una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 no conjugado o desnudo, o fragmento que enlaza antígeno del mismo, opcionalmente que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . Igualmente, el anticuerpo administrado puede asociarse operativamente con un segundo agente antiangiogénico. Los métodos y usos para tratar cáncer metastásico comprende administrar a un animal o paciente con cáncer metastásico una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 no conjugado o desnudo, o fragmento que enlaza antígeno del mismo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo ^¿.¿AÁ^ .Jíri.i.Éí,. ' A*A ~LA- -- . í.?.A£A^^f ^á^&Sákti»?^Ü^s?i^-'-i^^-u -f epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . Otros métodos son aquellos en donde el anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico . Los métodos y usos para reducir metástasis de un cáncer primario comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 no conjugado o desnudo, o fragmento que enlaza antígeno del mismo, a un animal o paciente que tenga, o fue tratado de, un cáncer primario; en donde el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 no conjugado o desnudo o fragmento del mismo opcionalmente se enlaza a sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . De manera similar, el anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico. Los métodos y usos para tratar una enfermedad asociada con angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociados con la angiogénesis, además comprenden administrar a un animal o paciente con esta enfermedad, v.gr., un tumor vascularizado, cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 no conjugado o desnudo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, en una cantidad JA.Á.iA.iakat^A.^?t* ^^ efectiva para inhibir la angiogénesis dentro del sitio de la enfermedad o tumor vascularizado. Igualmente, el anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico. Los métodos y usos para tratar una enfermedad asociada con angiogénesis, que incluyen todas las formas de cáncer asociados con angiogénesis, además comprenden administrar a un animal o paciente con esta enfermedad o cáncer cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 no conjugado o desnudo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, en una cantidad efectiva para inhibir el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) , inhibiendo de este modo la angiogénesis dentro de la enfermedad o el sitio canceroso. El anticuerpo administrado alternativamente se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico. Los métodos y usos para tratar una enfermedad asociada con angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con angiogénesis, también comprenden administrar a un animal o paciente con un tumor vascularizado una cantidad terapéuticamente efectivas de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 no conjugado o desnudo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente fcJüi.-i.Á.ri t&tfafo ~t- AÁ?Ajat - - » ,>a?,^. „ _» .» < , A A^?tíÍ»^tíl?tMs*i?.?áká£Í»?^rií1?aSHt i el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , o fragmento que enlaza antígeno del mismo; en donde el anticuerpo anti-VEGF sustancialmente inhibe el enlace de VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir -significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1). Igualmente, el anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico. Todavía otros métodos y usos para tratar una enfermedad asociada con angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con angiogénesis, comprenden administrar a un animal o paciente con esta enfermedad, cáncer o tumor vascularizado una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2 no conjugado o desnudo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , o un fragmento de enlace de antígeno del mismo; en donde el anticuerpo anti-VEGF sustancialmente inhibe el enlace de VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1), mediante lo cual se inhibe la angiogénesis dentro del sitio de la enfermedad, cáncer o tumor vascularizado sin discapacitar significativamente la quimiotaxis de macrófagos en el animal. El anticuerpo administrado también se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico. Todavía otros métodos y usos para tratar una enfermedad asociada con angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con angiogénesis, comprenden administrar a un animal o paciente con esta enfermedad, cáncer o tumor vascularizado una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 no conjugado o desnudo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o fragmento que enlaza antígeno del mismo; en donde el anticuerpo anti-VEGF sustancialmente inhibe el enlace de VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1), mediante lo cual se inhibe la angiogénesis dentro del sitio de la enfermedad, cáncer o tumor vascularizado sin deshabilitar significativamente la actividad de macrófagos, osteoclastos y/o condroclastos en el animal. Igualmente, el anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico. Los métodos y usos para tratar una enfermedad asociada con angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con angiogénesis, además comprenden administrar a un animal o paciente con una enfermedad así, v.gr., un tumor vascularizado, cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 no conjugado o desnudo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, en una cantidad efectiva para inhibir la angiogénesis dentro del sitio de la enfermedad o tumor vascularizado sin ejercer una reacción adversa en el metabolismo de los huesos. Los anteriores métodos y usos del tratamiento antiangiogénico generalmente incluye la administración de la composición farmacéuticamente efectiva al animal o paciente sistémicamente, tal como por inyección transdérmica, intramuscular, intravenosa y similares. Sin embargo, cualquier ruta de administración que la sustancia terapéutica localice el sitio o sitios angiogénicos, incluyendo las células endoteliales vasculares intratumorales o el tumor, será aceptable. Por lo tanto, otras rutas convenientes de administración incluyen oral, rectal, nasal, tópica y vaginal. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,712,291, se incorpora específicamente en la presente mediante referencia con propósitos de incluir otras descripciones de las distintas rutas de administración que se pueden incluir en relación con el tratamiento del padecimiento o desorden angiogénico. Para usos y métodos para el tratamiento de artritis, v.gr., se puede emplear administración intrasinovial, como se describe para otras sustancias inmunológicas en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,753,230, específicamente incorporada en la presente mediante referencia. Para condiciones asociadas con el ojo, formulaciones oftálmicas y administración oftálmica se contemplan. "Administración", como se usa en la presente, significa la aprobación o aplicación del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o la terapia basada en 2C3 en una cantidad durante un periodo de tiempo efectivo para ejercer efectos antiangiogénicos y/o antitumor. La administración pasiva de terapia proteinácea generalmente se prefiere, en parte, por su simplicidad y reproducibilidad. Sin embargo, el término "administración" se usa en la presente para referirse a cualquiera y todos los medios mediante los cuales la terapia de anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o la terapia basada en 2C3 se aplican o administran de otro modo en la vasculatura del tumor. "Administración" por lo tanto incluye la provisión de células que producen el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o la terapia basada en 2C3 de una manera efectiva para dar como resultado la entrega al tumor. En estas modalidades, puede ser deseable formular o empacar las células en una membrana selectivamente permeable, estructura o dispositivo implantable, generalmente uno que se pueda remover para cesar la terapia. El anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 exógeno o la *** *"»-»« administración parecida a 2C3 exógena todavía generalmente se preferirá, ya que representa un método no invasivo que permite que la dosis sea fijada y controlada cercanamente. Los métodos y usos terapéuticos de la invención también se extienden a la provisión de ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o terapias basadas en 2C3 de una manera efectiva para dar como resultado su expresión en la vecindad del tumor o su localización en el tumor. Cualquier técnica de terapia de genes se puede emplear, tal como administración de ADN desnudo, genes y vectores recombinantes, administración basada en células, incluyendo las manipulaciones ex vivo de las células del paciente, y similares. En todavía otras modalidades, la invención proporciona métodos para, y usos en, administrar terapias seleccionada o sustancias de diagnóstico a los vasos sanguíneos angiogénicos asociados con la enfermedad. Estas modalidades preferiblemente se usan para administrar sustancias terapéuticas o de diagnóstico seleccionadas al tumor o a la vasculatura intratumoral o estromas, y comprenden administrar a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado una cantidad biológicamente efectiva de una composición que comprende cuando menos un primer inmunoconj ugado en el cual una sustancia de diagnóstico o terapéutica se une operativamente a un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, o un fragmento *-- -•"• • ' -^JT?fflftT^ Uít 'enlaza antígeno del mismo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) . Aunque el entendimiento del mecanismo de la acción que subyace a los aspectos objetivo de la invención no se requiere con el fin de practicar estas modalidades, se cree que los anticuerpos de la invención administran sustancias unidas a la vasculatura angiogénica y de tumor en virtud de enlazarse con el VEGF unido al VEGFR1 expresado en el mismo. Estos métodos y usos de la invención de este modo se refieren a administrar sustancias terapéuticas o de diagnóstico seleccionadas a vasos sanguíneos angiogénicos, vasculatura de tumor o intratumoral, y comprenden administrar a un animal o paciente en necesidad de tratamiento una cantidad biológicamente efectiva efectiva de una composición que comprende un inmunoconj ugado en el cual una sustancia de diagnóstico o terapéutica se une operativamente a cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, o fragmento que enlaza antígeno del mismo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), de una manera efectiva para permitir el enlace del anticuerpo con el VEGF enlazado al VEGFR1 expresado, sobre-expresado o sobre-regulado en los vasos sanguíneos angiogénicos, la vasculatura de tumor o intratumoral, administrando de este modo la sustancia de diagnóstico o terapéutica al VEGF-VEGFR1 en los vasos sanguíneos angiogénicos, y la vasculatura del tumor o intratumoral . La administración de las sustancias terapéuticas seleccionadas a la vasculatura del tumor o intratumoral o estroma actúa para detener el flujo sanguíneo, o específicamente detiene el flujo sanguíneo, en la vasculatura del tumor; para destruir, o destruir específicamente, la vasculatura del tumor; y para inducir necrosis, o necrosis específica en un tumor. Estos métodos y usos de este modo se pueden resumir como métodos para tratar a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado, que comprende administrar al animal o paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende cuando menos un primer inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, operativamente unido a una sustancia terapéutica. Las "cantidades terapéuticamente efectivas" para su uso en la invención son cantidades de anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o inmunoconjugados basados en 2C3 efectivos para eliminar específicamente cuando menos una porción del tumor o de las células endoteliales vasculares intratumorales; ¡jt —l~? ?*? .¿..A. ?líÉ¿~~.*..^ - jm. pg . t , JIk. . .^. 4-.-J» t&tuAA. ß. - -'x^lít»'-MAMAIÍttí&Íiá tíÉ^^^)^ííS?^?kákJ para inducir específicamente apoptosis en cuando menos una porción del tumor o las células endoteliales vasculares intratumorales; específicamente promover la coagulación en cuando menos una porción del tumor o de los vasos sanguíneos 5 intratumorales; específicamente ocluir o destruir cuando menos una porción de los vasos que transportan sangre del tumor; específicamente inducir la necrosis en cuando menos una porción de un tumor; y/o inducir la regresión o remisión del tumor después de la administración a animales o pacientes 10 seleccionados. Estos efectos se logran al mismo tiempo que exhiben poco o ningún enlace, o poco o ninguna eliminación de células endoteliales vasculares en tejidos normales, saludables; poca o ninguna coagulación en, oclusión o destrucción de vasos sanguíneos en tejidos saludables, 15 normales; y ejercer ninguno o efectos colaterales adversos manejables en los tejidos normales, saludables del animal o paciente . Los términos "preferencialmente" y "específicamente", como se usan en la presente en el contexto de promover la 20 coagulación en, o destruir la vasculatura del tumor, y/o en el contexto de enlazar al estroma del tumor y/o causa necrosis del tumor, de este modo significa que el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o los inmunoconjugados basados en 2C3 funcionan para lograr el enlace estromal, la coagulación, la 25 destrucción y/o la necrosis del tumor que se confina sustancialmente al estroma del tumor, la vasculatura y el sitio del tumor, y no se extiende sustancialmente para causar coagulación, destrucción y/o necrosis de tejido en los tejidos normales, saludables del animal o sujeto. La estructura y la función de las células saludables y tejidos por lo tanto se mantiene sustancialmente intacta por la práctica de la invención . Aunque los anticuerpos de la invención efectivamente proporcionan sustancias a la vasculatura angiogénica y del tumor enlazando al VEGF en asociación con el VEGFR1, otros métodos y usos operan en la base de administrar una sustancia terapéutica al estroma del tumor, en donde ejerce un efecto terapéutico sobre los vasos cercanos. Estos métodos y usos comprenden administrar a un animal o paciente con un tumor vascularizado un inmunoconjugado que comprende una sustancia terapéutica operativamente unida a cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, opcionalmente uno que se enlaza sustancialmente al mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) en una cantidad efectiva para enlazar el inmunoconjugado con el VEGF enlazado sin receptor dentro del estroma del tumor. Estos métodos y usos comprenden administrar a un animal o paciente con un tumor vascularizado un inmunoconjugado que comprende una sustancia terapéutica operativamente unida a kᣫdÍMIMft»& cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) en una cantidad efectiva para localizar el inmunoconjugado dentro del estroma del tumor de manera que la sustancia terapéutica unida ejerza un efecto antitumor en la vasculatura del tumor circundante y/o las células del tumor. Las composiciones, así como los métodos y usos de la invención se extienden así a composiciones que comprenden anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2 o inmunoconjugados basados en 2C3 que comprenden cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), operativamente unido a cuando menos una primera sustancia terapéutica o de diagnóstico. EJ anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o los conjugados terapéuticos basados en 2C3 preferiblemente se enlazan a sustancias radioterapéuticas, sustancias antiangiogénicas, sustancias que inducen la apoptosis, fármacos antitubulina, sustancias anticelulares o citotóxicas, o coagulantes (factores de coagulación) . La invención de este modo proporciona un rango de anticuerpos conjugados y fragmentos de los mismos en los cuales el anticuerpo se une operativamente a cuando menos una primera sustancia terapéutica o de diagnóstico. El término "inmunoconjugado" se usa ampliamente para definir la asociación operativa del anticuerpo con otra sustancia efectiva que no pretende referirse únicamente a cualquier tipo de asociación operativa, y particularmente no se limita a la "conjugación" química. Las proteínas de fusión recombinantes se contemplan particularmente. En tanto que la administración o la sustancia objetivo es capaz de enlazarse con el objetivo y la sustancia terapéutica o de diagnóstico es suficientemente funcional después de la administración, el modo de unión será conveniente . Las uniones de sustancias vía las fracciones de carbohidrato o anticuerpos también se contempla. La glicosilación, tanto O-enlazada como N-enlazada, se presenta naturalmente en los anticuerpos . Los anticuerpos recombinantes se pueden modificar para recrear o crear sitios adicionales de glicosilación si se desea, lo cual simplemente se logra mediante el diseño técnico de las secuencias de aminoácidos adecuadas (tales como Asn-X-Ser, Asn-X-Thr, Ser, o Thr) en la secuencia primaria del anticuerpo. Las sustancias actualmente preferidas para su uso en el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o los conjugados terapéuticos basaaos en 2C3 y métodos y usos relacionados son aquellos que complementan o aumentan los efectos del anticuerpo y/o aquellos seleccionados para un tipo particular de tumor o paciente particular, "sustancias terapéuticas que complementan o aumentan los efectos del anticuerpo" incluyen sustancias radioterapéuticas, sustancias antiangiogénicas, sustancias que inducen la apoptosis y fármacos antitubulina, uno o más de estos se preferirán para su uso con la misma. La unión o asociación de las sustancias preferidas con el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 proporciona "inmunoconjugados", en donde estos inmunoconjugados frecuentemente tienen propiedades antitumor aumentadas o hasta sinérgicas. Actualmente las sustancias antiangiogénicas preferidas para su uso de esta manera son la angiostatina, endostatina, cualquiera de angiopoyetinas, vasculoestatina, canstatina y maspina. Los fármacos antitubulina actualmente preferidos incluyen colchicina, taxol, vinblastina, vincristina, vindescina y una o más de las combretastatinas . El uso de sustancias anticelulares y citotóxicas da como resultado las "inmunotoxinas" de anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o basadas en 2C3, mientras que el uso de factores de coagulación da como resultado los "coaguligandos" de anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o coaguligandos basados en 2C3. El uso de cuando menos dos sustancias terapéuticas también se contempla, tal como las combinaciones de una o más sustancias radioterapéuticas, sustancias antiangiogénicas, sustancias que l d?í A. á. , *?*A. tA&&A^L*. ... i. ?,.A&A1e A.*&?íaAli?&A*,< np--M ,¡\. ,*J.i'?r Ía?. A? ÍÍt>ti.A ?.?tfoí'Ji .-í i.tá inducen la apoptosis, fármacos antitubulina, sustancias anticelulares y citotóxicas y factores de coagulación. En ciertas aplicaciones, el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o las terapias basadas en 2Ce se unirán operativamente a sustancias citotóxicas, citoestáticas o sustancias de otro modo anticelulares que tienen la capacidad para eliminar o suprimir el crecimiento o la división celular de las células endoteliales. Las sustancias anticelulares convenientes incluyen sustancias quimioterapéuticas, así como citotoxinas y sustancias citostáticas . Las sustancias citostáticas generalmente son aquellas que interrumpen el ciclo celular normal de una célula objetivo, preferiblemente de manera que la célula se saca del ciclo de la célula. Las sustancias quimioterapéuticas ejemplares incluyen: esteroides; citocinas; antimetabolitos, tales como citosina arabinosida, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina; antraciclinas; mitomicina C; vinca alcaloides; antibióticos; demecolcina; etoposida; mitramicina; y sustancias alquilantes antitumor, tales como clorambucilo o melfalan. Sin duda, cualquiera de las sustancias descritas en la presente en la Tabla C podrían usarse. Ciertas sustancias anticelulares preferidas son inhibidores de la síntesis de ADN, tales como la daunorrubicina, doxorrubicina, adriamicina, y similares . En ciertas aplicaciones terapéuticas, se preferirán i?,A*J& l *ÍAÍ*A..fc-^f^gj-las fracciones de toxinas, debido a la capacidad mucho mayor de la mayoría de las toxinas para administrar un efecto supresor de células, en comparación con otras sustancias potenciales. Por lo tanto, ciertas sustancias anticelulares preferidas para el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o las construcciones de anticuerpos basadas en 2C3 son toxinas derivadas de plantas, hongos o bacterias. Las toxinas ejemplares incluyen epipodofílotoxinas; endotoxina bacteriana de la fracción de lípido A de la endotixina bacteriana; proteínas que inactivan el ribosoma, tales como saporina o gelonina; a-sarcina; aspergilina; restrictocina; ribonucleasas, tales como ribonucleasa placentaria; toxina de difteria y exotoxina de pseudomonas . Las toxinas preferidas son las toxinas de cadena A, tales como la cadena de nema A. La fracción de toxina más preferida f ecuentemente es la cadena de ricina A que ha sido tratada para modificar o remover los residuos de carbohidratos, denominados "cadena A desglicosilada" (dgA) . La cadena de ricina A desglicosilada se prefiere debido a su extremada potencia, vida media más larga, y debido a que es factible económicamente fabricarla en un grado clínico y a escala. También se puede usar la cadena A de ricina recombinante y/o truncada . Para dirigirse a tumores y el tratamiento con inmunotoxinas, las siguientes patentes y solicitudes de patentes se incorporan específicamente en la presente mediante referencia páralos fines de suplementar todavía más las presentes enseñanzas con respecto a las sustancias anticelulares y citotóxicas: Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con números de serie 07/846,349; 08/295,868 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,004,554); 08/205,330 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,855,866); 08/350,212 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,965,132); 08/456,495 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,776,427); 08/457,487 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,863,538); 08/457,229 y 08/457,031 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,660,827) y 08/457,869 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,051,230). El anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 basado en 2C3 u otros de la presente invención se pueden enlazar a un fármaco antitubulina. "Los fármacos antitubulina" como se usa en la presente, significa cualquier fármaco, sustancia, profármaco o combinación de los mismos que inhiben la mitosis celular, preferiblemente inhibiendo directamente o indirectamente las actividades de tubulina necesarias para la mitosis celular, preferiblemente en la polimerización o despolimerización de tubulina. Actualmente los fármacos antitubulina preferidos para riUrmliiraátt-"--' -^fi-fc^--»..!^ M?kiÁLAt su uso con la presente son colchicina; taxanos, tales como taxol; vinca alcaloides, tales como vinblastina, vincristina y vindescina; y combretas atinas . Las combretastatinas ejemplares son combretastatina A, B y/o D, incluyendo A-l, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, B-l, B-2, B-3, B-4, D-1 y D-2 y formas de profármacos de las mismas. La terapia basada en anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o basada en 2C3 puede comprender un componente que es capaz de promover la coagulación, es decir, un coagulante. Aquí, el anticuerpo objetivo puede estar directamente o indirectamente, v.gr., vía otro anticuerpo, enlazado a un factor que directamente o indirectamente estimula la coagulación . Los factores de coagulación preferidos para estos usos son el Factor de Tejido (FT) y derivados del FT, tales como FT truncado (FTt), factor de tejido dimérico, trimérico, polimérico/multimérico, y factor de tejido deficiente en la capacidad para activar el Factor VII. Otros factores de coagulación convenientes incluyen coagulantes dependientes de la vitamina K, tales como Factor II/IIa, Factor VlI/VIIa, Factor IX/IXa y Factor X/Xa; factores de coagulación dependientes de la vitamina K que carecen de la modificación Gla; veneno de serpiente de Russell, activador de Factor X; compuestos que activan las plaquetas, tales como tromboxano A2 y tromboxano A2 sintasa; e inhibidores de fibrinolisis, tales A***á¡Á*?O»*~S ?AHÍ.*A *t.A -». ^Ar??.^ ,^*J*?*w*á* l*é*i¿B*Ull<^^ como la 2-antiplasmina. La dirección al tumor del tratamiento con coaguligandos se describe en las siguientes patentes y solicitudes de patentes, cada una de las cuales se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para los propósitos y suplementar adicionalmente las presentes enseñanzas con respecto a los coaguligandos y los factores de coagulación: Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con números de serie 07/846,349; 08/205,330 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,855,866); 08/350,212 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,965,132); 08/273,567; 08/482,369 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,093,399); 08/485,482; 08/487,427 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,004,555); 08/479,733 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,877,289); 08/472,631; y 08/479,727 y 08/481,904 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,036,955). La preparación de inmunoconjugados e inmunotoxinas generalmente es muy conocida en la técnica (véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,340,535, incorporada en la presente mediante referencia) . Cada una de las siguientes patentes y solicitudes de patentes se incorporan adicionalmente en la presente mediante referencia para los propósitos de suplementar todavía más las presentes enseñanzas con respecto a la generación, purificación y uso de inmunotoxinas: Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con números de serie 07/846,349; 08/295,868 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,004,554); 08/205,330 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,855,866); 08/350,212 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,965,132); 08/456,495 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,776,427); 08/457,487 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,863,538); 08/457,229 y 08/457,031 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,660,827) y 08/457,869 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,051,230). En la preparación de inmunoconjugados e inmunotoxinas, se pueden lograr ventajas a través del uso de ciertos vinculadores . Por ejemplo, vinculadores que contienen un enlace disulfuro que está estéricamente "impedido" frecuentemente se prefieren, debido a su mayor estabilidad en vivo, evitando de este modo la liberación de la fracción de toxina antes de enlazarse al sitio de acción. Generalmente se desea tener un conjugado que permanezca intacto en condiciones encontradas en todos lados en el cuerpo excepto en el sitio destinado de acción, en este punto es deseable que el conjugado tenga buenas características de "liberación". Dependiendo del compuesto de toxina específico usado, puede ser necesario proporcionar un separador péptido operativamente unido al anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o anticuerpo basado en 2C3 y el compuesto de toxina, en donde el separador de péptido es capaz de doblarse en una estructura en ciclo unida con disulfuro. La disociación proteolítica dentro del sitio produciría entonces un polipéptido heterodimérico en donde el anticuerpo y el compuesto de toxina están unidos por solamente un enlace simple disulfuro. Cuando se utilizan otros compuestos de toxina, se puede proporcionar un separador de péptido no disociable para unir operativamente el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 y el compuesto de toxina. Las toxinas que se pueden usar junto con separadores de péptidos o disociables son aquellos que pueden, por sí mismos, convertirse mediante disociación proteolítica, en una forma de ligamento disulfuro citotóxico. Un ejemplo de un compuesto de toxina así es el compuesto de exotoxina de Pseudonomas . Una variedad de sustancias quimioterapéuticas y otras sustancias farmacológicas también se pueden conjugar con éxito al anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o las terapias basadas en 2C3. Las sustancias antineoplásicas ejemplares que han sido conjugadas con anticuerpos incluyen la doxorrubicina, daunomicina, metotrexato y dinblastina. Más aún, la unión de otras sustancias tales como neocarzinostatina, macromicina, Éüf .iAfrf.., , tJ.. . *H*¡ trenimon y -amanitina han sido descritas (véanse las Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,660,827; 5,855,866; y 5,965,132; cada una incorporada en la presente). A la luz del trabajo anterior de uno de los presentes inventores, la preparación de coaguligandos ahora se lleva a cabo fácilmente. La asociación operable de uno o más factores de coagulación con un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 puede ser un enlace directo, tal como los descritos anteriormente para las inmunotoxinas. De manera alternativa, la asociación operativa puede ser una unión indirecta, tal como cuando el anticuerpo se une operativamente a una segunda región de enlace, preferiblemente un anticuerpo o una región de enlace de antígeno de un anticuerpo, que se enlaza con un factor de coagulación. El factor de coagulación deberá unirse al anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o al anticuerpo basado en 2C3 en un sitio distinto de su sitio de coagulación funcional, particularmente cuando se usa un enlace covalente para unir las moléculas. Los coaguligandos indirectamente enlazados frecuentemente se basan en anticuerpos biespecíficos . La preparación de anticuerpos biespecíficos también es muy conocida en la técnica. Un método preparativo incluye la preparación por separado de anticuerpos que tienen especificidad para el componente de tumor objetivo, por un ii.ii-iifruIritfiíiil itUiiiiii ?**¡-^*fej-*^*» lado, y la sustancia coagulante por el otro. Fragmentos F(ab'?)2 pépticos de los dos anticuerpos elegidos se generan entonces, seguidos por la reducción de cada uno para proporcionar fragmentos Fab ' ?SH por separado. Los grupos SH de uno de los dos compañeros para ser acoplados se alquila entonces con un reactivo de reticulación, tal como o-fenilenodimaleimida, para proporcionar grupos maleimida libres en un compañero. Este compañero puede entonces conjugarse con el otro por medio de un enlace de tioéter, para producir el heteroconjugado F(ab'?)2 deseado (Glennie y colaboradores, 1987; incorporado en la presente mediante referencia) . Otros enfoques, tales como la reticulación con SPDP o proteína A también se pueden llevar a cabo. Otro método para producir anticuerpos biespecíficos es mediante la fusión de dos hibridomas para formar un cuadroma . Como se usa en la presente, el término "cuadroma" se usa para describir la fusión productiva de dos hibridomas de células B. Usando ahora técnicas estándares, dos anticuerpos que producen hibridomas se fusionan para dar células hijas, y esas células que han mantenido la expresión de ambos conjuntos de genes de inmunoglobulina de clonotipo se seleccionan. Un método preferido para generar un cuadroma involucra la selección de un mutante deficiente en enzima de cuando menos uno de los hibridomas padres. Esta primera línea celular de hibridoma mutante se fusiona con células de un segundo hibridoma que han sido expuestas letalmente, v.gr., a yodoacetamida, ocultando su supervivencia continuada. La fusión celular permite el rescate del primer hibridoma adquiriendo el gen para su deficiencia de enzima a partir del hibridoma tratado letalmente, y el rescate del segundo hibridoma a través de la fusión del primer hibridoma. Se prefiere, pero no se requiere, la fusión de inmunoglobulinas del mismo isotipo, pero de una subclase diferente. Un anticuerpo de subclase mezclado permite el uso de un ensayo alternativo para el aislamiento de un cuadroma preferido. Las modalidades de identificación de microtitulación, FACS, manchado por inmunofluorescencia, anticuerpos específicos por idiotipo, ensayos de competición de enlace de antígeno, y otros métodos comunes en la técnica de la caracterización de anticuerpos se pueden usar para identificar los cuadromas preferidos. Después del aislamiento del cuadroma, los anticuerpos biespecíficos se purifican de otros productos celulares. Esto puede llevarse a cabo por una variedad de procedimientos de aislamiento de anticuerpos, conocidos para los expertos en la técnica de la purificación de inmunoglobulinas (véanse, v.gr., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988; incorporada en la presente mediante referencia) . Se prefieren columnas de sefarosa de Proteína A o proteína G. En la preparación de inmunoconjugados, inmunotoxinas y coaguligandos, se puede emplear la expresión recombinante.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 elegido o el anticuerpo basado en 2C3, y la sustancia terapéutica, toxina o coagulante, se unen en estructura en un vector de expresión. La expresión recombinante así da como resultado la traducción del ácido nucleico para producir el inmunoconjugado deseado. Reticuladores químicos y puentes de avidina :biotina también pueden unir las sustancias terapéuticas con el anticuerpo anti- VEGF que bloquea el VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3. Las siguientes patentes y solicitudes de patente cada una incorporada en la presente por referencia para los propósitos de suplementar aún más las presentes enseñanzas con respecto a la preparación de coaguligandos, purificación y uso, incluyen coaguligandos de anticuerpos biespecíficos : Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con números de serie 07/846,349; 08/205,330 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,855,866); 08/350,212 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,965,132); 08/273,567; 08/482,369 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,093,399); 08/485,482; 08/487,427 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,004,555); 08/479,733 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,877,289); 08/472,631; y 08/479,727 y 08/481,904 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,036,955).
Los inmunoconjugados con sustancias radioterapéuticas, sustancias antiangiogénicas, sustancias que inducen la apoptosis, fármacos antitubulinas, toxinas y coagulantes, ya sea preparados por conjugación química o expresión recombinante, pueden emplear un enlace liberable biológicamente y/o un separador o vinculador selectivamente disociable. Estas composiciones preferiblemente son razonablemente estables durante la circulación y preferencialmente o específicamente se liberan después de la administración al sitio de la enfermedad o el tumor. Ciertos ejemplos preferidos son separadores sensibles al ácido, en donde los anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 enlazados con colchicina o doxorrubicina se contemplan particularmente. Otros ejemplos preferidos son enlazadores de péptidos que incluyen un sitio de disociación para peptidasas y/o proteinasas que están específicamente o preferencialmente presentes o activas dentro de un sitio de enfermedad, tales como el ambiente de un tumor. La administración del inmunoconjugado al sitio de la enfermedad o el tumor da como resultado la disociación y la liberación relativamente específica del factor de coagulación. Los enlazadores de péptidos que incluyen un sitio de disociación para uroquinasa, prouroquinasa, plasmina, plasminógeno, TGFß, estafiloquinasa, trombina, Factor IXa, Factor Xa o una metaloproteinasa (MMP) , tal como una colegenasa intersticial, una gelatinasa o un estromelisina, se prefieren particularmente, como se describe y habilita por la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,877,289, incorporada en la presente mediante referencia para estos fines, y ejemplificada adicionalmente en la presente en la Tabla B2. El anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 también se puede derivar para introducir grupos funcionales que permiten la unión de la o las sustancias terapéuticas a través de un enlace biológicamente liberable. El anticuerpo objetivo de este modo se puede derivar para introducir cadenas laterales que terminan en hidrozida, hidrazina, grupos de amina primarios o grupos amino secundarios. Sustancias terapéuticas se pueden conjugar a través de un enlace de base de Schiff, un enlace de acil hidrazona o un enlazador de hidrazida (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,474,765 y 5,762,918, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia) . Ya sea basadas principalmente antiangiogénicas o en objetivo vascular, las composiciones y métodos de la presente invención se pueden usar en combinación con otras terapias y diagnósticos. En términos de sustancias biológicas, las sustancias preferiblemente diagnósticas o terapéuticas para su uso "en combinación" con el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 de acuerdo con la presente invención, tal como un anticuerpo basado en 2C3, el término "en combinación" se usa para cubrir una gama amplia de modalidades. La terminología "en combinación", a menos que se declare específicamente de otro modo o se haga claro a partir de terminologías científicas, se aplica entonces a varios formatos de composiciones combinadas, productos farmacéuticos, cocteles, juegos, métodos y primeros y segundos usos médicos. Las modalidades "combinadas" de la invención de este modo incluyen, por ejemplo, cuando el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 es un anticuerpo desnudo y se usa en combinación con una sustancia o sustancia terapéutica que no está operativamente unida al mismo. En estos casos, la sustancia o sustancias terapéutica se puede usar en una forma no dirigida o dirigida. En "la forma no dirigida", la sustancia, particularmente las sustancias terapéuticas, generalmente se usaran de acuerdo con su uso normal en la técnica. En la "forma dirigida", la sustancia generalmente se unirá operativamente a un anticuerpo distinto o región objetivo distinto que administra la sustancia o la sustancia terapéutica al sitio o tumor de enfermedad angiogénica. El uso de estas formas dirigidas de sustancias biológicas, tanto de diagnóstico como de terapia, es bastante normal en la técnica. En otras modalidades "combinadas" de la invención, el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo aate basado en 2C3 es un inmunoconjugado en donde el anticuerpo está por sí mismo operativamente asociado o combinado con la sustancia o sustancia terapéutica. En ciertos ejemplos preferidos, la sustancia, incluyendo la sustancia de diagnóstico y de terapia, serán una "sustancia dirigida a 2C3". La unión operativa incluye todas las formas de unión directa e indirecta como se describe en la presente y se conoce en la técnica . Los usos "combinados", particularmente en términos de los anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o basados en 2C3 en combinación con la sustancia terapéutica, también incluyen composiciones combinadas, productos farmacéuticos, cocteles, juegos, métodos, y primeros y segundos usos médicos en donde la sustancia terapéutica está en forma de un profármaco. En estas modalidades, el componente de activación capaz de convertir el profármaco en la forma funcional del fármaco puede de nuevo asociarse operativamente con los anticuerpos anti-VEGF que bloquean los VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 de la presente invención. En ciertas modalidades preferidas, las composiciones terapéuticas, combinaciones, productos farmacéuticos, cocteles, juegos, métodos y primeros y segundos usos médicos serán "combinaciones de profármacos-2C3" . Como será entendido por los expertos en la técnica, el término de "combinación profármacos 2C3", a menos que se declare otra cosa, significa que el anticuerpo basado en 2C3 se une operativamente con un componente capaz de convertir el profármaco en el fármaco activo, no que el anticuerpo basado en 2C3 se une al mismo profármaco. Sin embargo, no se requiere que las modalidades de profármacos de la invención necesariamente se usen como combinaciones de 2C3 profármaco. De conformidad con lo anterior, los profármacos se pueden usar de cualquier manera como se usan en la técnica, incluyendo en ADEPT y otras formas. De este modo, cuando se describen composiciones combinadas, productos farmacéuticos, cocteles, juegos, métodos y primeros y segundos usos médicos, preferiblemente en términos de sustancias de diagnóstico, y más preferiblemente sustancias terapéuticas, las combinaciones incluyen anticuerpos anti-VEGF que bloquean VEGFR2, tales como anticuerpos basados en 2C3, que son anticuerpos desnudos e inmunoconjugados, y en donde la práctica de las modalidades en vivo de la invención incluye la administración anterior, simultánea o posterior de los anticuerpos desnudos o inmunoconjugado y la sustancia biológica, de diagnóstico o terapéutica; en tanto, en alguna forma conjugada o no conjugada, la provisión global de alguna forma del anticuerpo y de alguna forma de la sustancia biológica, diagnóstica o terapéutica se logra. Las composiciones combinadas particularmente preferidas, métodos y usos de la invención son aquellas que incluyen anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 y HÉl lt!^ rf--|'TlÍ¿*fc-"^^^Mfc*t^a--"^-^,-^^4^^-..-^^4^.a^^^aürn l ^-"-**>- endostatina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,854,205, específicamente incorporada en la presente mediante referencia) . Estas incluyen cuando el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o la construcción 2C3 es un 5 anticuerpo desnudo o inmunoconjugado; y cuando un inmunoconjugado, en donde el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo 2C3 está ligado a endostatina, opcionalmente con angiostatina; en donde el método terapéutico combinado o uso incluyen la administración anterior, simultánea 10 o posterior de endostatina, opcionalmente con angiostatina; en tanto, en alguna forma conjugada o no conjugada, la provisión global del 2C3, endostatina y opcionalmente angiostatina se logre. Los anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 operativamente asociados con 15 colagenasa también se proporcionan, ya que la colagenasa, cuando se administra específicamente al tumor, producirá endostatina in si tu, logrando beneficios similares. Lo anterior y otras explicaciones de los efectos de la presente invención sobre los tumores se hacen por 20 simplicidad para explicar el modo combinado de opcionalmente, tipo de sustancias unidas y similares. Este enfoque descriptivo no deberá interpretarse ya sea como una declaración o una sobre simplificación de las propiedades benéficas de los anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o los anticuerpos 25 basados en 2C3 de la invención. Por lo tanto se entenderá que estos anticuerpos mismos tienen propiedades antiangiogénicas y propiedades de neutralización del VEGF (tales como la neutralización de la función de supervivencia del VEGF) , que inmunoconjugados de estos anticuerpos mantendrán estas propiedades y las combinarán con las propiedades de la sustancia unida; y además, que el efecto combinado del anticuerpo y cualquier sustancia unida típicamente será aumentada y/o magnificada. La invención por lo tanto proporciona composiciones, composiciones farmacéuticas, juegos terapéuticos y cocteles medicinales que comprenden, opcionalmente en cuando menos una primera composición o contenedor, una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2, opcionalmente uno que se enlace con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , o un fragmento de enlace de antígeno o inmunoconjugado de este anticuerpo anti-VEGF; y una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos una segunda sustancia biológica, componente o sistema. La "cuando menos una segunda sustancia biológica, componente o sistema" frecuentemente será una sustancia terapéutica de diagnóstico, componente o sistema, pero puede no serlo. Por ejemplo, la cuando menos una segunda sustancia biológica, componente o sistema puede comprender componentes para la modificación del anticuerpo y/o para unir otras ütfttitt g^^ *^^S¡»^^»^í^^^M?^fi ^^ri sustancias al anticuerpo. Ciertas segundas sustancias biológicas preferidas, componentes o sistemas son profármacos o componentes para hacer y usar profármacos, incluyendo componentes para hacer el mismo profármaco y los componentes para adaptar los anticuerpos de la invención para que funcionen en estas modalidades de profármacos o de ADEPT. Cuando se incluyen sustancias terapéuticas o de diagnóstico como el cuando menos segunda sustancia biológica, componente o sistema, estas terapias y/o sustancias de diagnóstico típicamente serán aquellas para su uso en relación con las enfermedades angiogénicas. Estas sustancias son aquellas convenientes para su uso para tratar o diagnosticar una enfermedad o padecimiento como se describe en cualquiera de las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,712,291, 5,753,230, 5,972,922, 5,639,757, y las publicaciones internacionales WO 98/45331 y WO 98/16551, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia. Cuando la enfermedad que se va a tratar es cáncer, "el cuando menos una segunda sustancia anticáncer" se incluirá en el juego o coctel terapéutico. El término "cuando menos una segunda sustancia anticáncer" se elige en referencia al anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o la construcción de 2C3 que es la primera sustancia anticáncer. Los anticuerpos de la invención de este modo se pueden combinar con sustancias quimioterapéuticas, sustancias radioterapéuticas, citocinas, sustancias antiangiogénicas, sustancias que inducen la apoptosis o inmunotoxinas o coaguligandos anticáncer. "Sustancias quimioterapéuticas", como se usa en la presente, se refieren a las sustancias quimioterapéuticas clásicas o fármacos usados en el tratamiento de malignidades. Este término se usa por simplicidad sin importar el hecho de que otros compuestos se pueden describir técnicamente como sustancias quimioterapéuticas porque ejercen un efecto anticáncer. Sin embargo, "quimioterapéutico" ha llegado a tener un significado distintivo en la técnica y se usa de acuerdo con este significado estándar. Varias sustancias quimioterapéuticas ejemplares se describen en la presente. Las personas con experiencia ordinaria en la técnica fácilmente entenderán los usos y dosis apropiadas de las sustancias quimioterapéuticas, aunque las dosis bien se pueden reducir cuando se usan en combinación con la presente invención. Una nueva clase de fármacos que también se pueden denominar "sustancias quimioterapéuticas" son sustancias que inducen la apoptosis. Cualquiera o más de estos fármacos, incluyendo genes, vectores, construcciones antisentido y ribozimas, según sea lo adecuado, también se pueden usar junto con la presente invención. Los segundas sustancias actualmente preferidas son sustancias antiangiogénicas, tales como angiostatina, endostatina, vasculostatina, canstatina ymaspm. Otras sustancias anticáncer ejemplares incluyen, v.gr., neomicina, podofilotoxinas, TNF-a, antagonistas OLVR3 , ionóforos de calcio, sustancias que inducen al flujo de calcio, y cualquier derivado o profármaco de los mismos. Los fármacos antitubulina actualmente preferidos incluyen colchicina, taxol, vinblastina, vincristina, vindescina, una combretastatma o un derivado o profármaco de los mismos. Las inmunotoxinas o coaguligandos anticáncer además son sustancias anticáncer adecuadas. "Inmunotoxinas o coaguligandos anticáncer", o construcciones de sustancias objetivo/sustancias terapéuticas, se basan en sustancias dirigidas, incluyendo anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, que se enlazan con un componente al que se pueden dirigir o accesible de una célula de tumor, vasculatura del tumor, o estroma de tumor, y que están unidas operativamente a una sustancia terapéutica, que 'incluye sustancias citotóxicas (inmunotoxinas) y factores de coagulación (coaguligandos). Un "componente blanco o accesible" de una célula de tumor, vasculatura de tumor o estroma de tumor, preferiblemente es un componente expresado en la superficie, accesible en la superficie o localizado en la superficie, aunque componentes liberados de células de tumor necróticas o de otro modo dañadas o células endoteliales vasculares también pueden ser blancos, incluyendo antígenos citosólicos y/o de células de tumor nucleares. Se pueden usar sustancias objetivo tanto anticuerpos como no anticuerpos, incluyendo factores de crecimiento tales como el VEGF y FGF; péptidos que contienen el tripéptido R-G- D-, que se enlazan específicamente a la vasculatura del tumor; y otros componentes objetivo tales como las anexinas y los ligandos relacionados. Las inmunotoxinas o coaguligandos de células antitumor pueden comprender anticuerpos ejemplificados por el grupo que consiste en anticuerpos denominados B3 (ATCC HB 10573), 260F9 (ATCC HB 8488), D612 (ATCC HB 9796) y KS1/4, este anticuerpo KS1/4 obtenido de una célula que comprende el vector pGKC2310 (NRRL B-18356) o el vector PG2A52 (NRRL B-18357) . Las sustancias objetivo de células antitumor que comprenden un anticuerpo, o una región de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con un componente intracelular que se libera de una célula de tumor necrótica también se contemplan. Preferiblemente estos anticuerpos son anticuerpos monoclonales, o fragmento de enlace de antígeno de los mismos, que se enlazan con antígenos intracelulares insolubles presentes en células que pueden ser inducidas para ser permeables, o en células fantasmas o sustancialmente todas las células neoplásicas y normales, pero no están presentes o accesibles en el exterior de células vivas normales de un mamífero. Las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,019,368, 4,861,581 y 5,882,626 cada una emitida para Alan Epstein y colegas, se incorporan específicamente en la presente mediante referencia para propósitos de describir todavía adicionalmente y mostrar de qué manera hacer y usar anticuerpos específicos para antígenos intracelulares que se vuelven accesibles a partir de células malignas en vivo. Los anticuerpos descritos son suficientemente específicos para componentes celulares internos de células malignas de mamífero, pero no para componentes celulares externos. Los blancos ejemplares incluyen histones, pero todos los componentes intracelulares específicamente liberados de células de tumor necróticas se abarcan. Después de la administración a un animal o paciente con un tumor vascularizado, esos anticuerpos localizan a las células malignas en virtud del hecho de que los tumores vascularizados naturalmente contienen células de tumor necróticas, debido a los procesos de remodelación de tumores que se presentan en vivo y causan cuando menos una proporción de células malignas se vuelvan necróticas. Además, el uso de estos anticuerpos en combinación con otras terapias que aumentan la necrosis del tumor sirven para aumentar la efectividad de la dirección al blanco y la terapia posterior. Estos tipos de anticuerpos se pueden usar de este modo para asociar directamente o indirectamente con angiopoyetinas y para administrar las angiopoyetinas a células malignas necróticas dentro de los tumores vascularizados, como se describe genéricamente en la presente.
Como también se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,019,368, 4,861,581 y 5,882,626, cada una incorporada en la presente mediante referencia, estos anticuerpos se pueden usar en métodos de diagnóstico combinados (véase lo que sigue) y en métodos para medir la efectividad de terapias antitumor. Estos métodos generalmente incluyen la preparación y administración de una medicina etiquetada de los anticuerpos y la medición del enlace del anticuerpo etiquetado con el blanco componente celular interno enlazado con el tejido necrótico. Los métodos por medio de esto forman imagen del tejido necrótico, en donde una concentración localizada del anticuerpo es indicadora de la presencia de un tumor e indican fantasmas de células que han sido eliminadas por la terapia antitumor. Las inmunotoxinas o coaguligandos de estroma antitumor generalmente comprenden anticuerpos que se enlazan con un componente de tejido conectivo, un componente de membrana de base o un componente de plaqueta activada; como se ejemplifica por el enlace con fibrina, RIBS o LIBS. Las inmunotoxinas o coaguligandos de vasculatura antitumor pueden comprender ligandos, anticuerpos, o fragmentos de los mismos, que se enlazan con un componente expresado en la superficie, accesible en la superficie o localizado en la superficie de los vasos que transportan sangre, preferiblemente los vasos sanguíneos intratumorales, de un tumor vascularizado. ^ ^^iíiá.?^t«w>.sat-l--á- jl« Estos anticuerpos incluyen aquellos que se enlazan con los componentes expresados en la superficie de vasos sanguíneos intratumorales de un tumor vascularizado, que incluyen receptores de superficie de células de vasculaturo intratumoral, tales como endoglina (anticuerpos TEC-4 y TEC-11), un receptor de TGFß, E-selectina, P-selectina, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, un receptor VEGF/VPF, un receptor FGF, un TIE, integrina avß3, pleiotropina, endosialina y proteínas MHC Clase II. Los anticuerpos también se pueden enlazar a componentes inducibles por citocina o inducibles por coagulante de vasos sanguíneos intratumorales. Ciertas sustancias preferidas se enlazarán con aminofosfolípidos, tales como fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina . Otras inmunotoxinas o coaguligandos de vasculatura antitumor pueden comprender anticuerpos, o fragmentos de los mismos, que se enlazan con un ligando o factor de crecimiento que se enlaza con un receptor de superficie de célula de vasculatura intratumoral. Estos anticuerpos incluyen aquellos que se enlazan con VEGF/VPF (anticuerpos GV39 y GV97), FGF, TGFß, un ligando que se enlaza con un TIE, una isoforma de fibronectina asociada a tumor, factor de dispersión/factor de crecimiento de hepatocito (HGF) , factor de plaqueta 4 (PF4), PDGF y TIMP. Los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, también se pueden enlazar a un complejo ligando: receptor o a un complejo de factor de crecimiento: receptor, pero no al k.?i . Á.a.i..¿?i? ?-j^A>a ííi^£máe^ a É*? i^k^i ligando o factor de crecimiento, o al receptor, cuando el ligando o el factor de crecimiento o el receptor no está en el complejo de ligando: receptor o factor de crecimiento: receptor . Las construcciones de sustancias terapéuticas de anticuerpo de vasculatura antitumor o estroma antitumor, de células antitumor pueden comprender sustancias antiangiogénicas, sustancias que inducen la apoptosis, fármacos antitubulina, agentes citotóxicos tales como toxinas derivadas de plantas, hongos o bacterias. Frecuentemente se preferirán la cadena de ricina A y la cadena de ricina A desglicosilada. Las construcciones de sustancias terapéuticas de anticuerpos de vasculatura antitumor o estromas antitumor, células antitumor pueden comprender coagulantes (factores de coagulación que actúan de manera directa o indirecta) o segundas regiones de enlace de anticuerpos que se enlazan con factores de coagulación. La asociación operativa con el Factor de Tejido o derivados del Factor de Tejido tales como Factor de Tejido, frecuentemente se preferirán. En términos de composiciones, los juegos y/o medicamentos de la invención, las cantidades efectivas combinadas de las sustancias terapéuticas se pueden incluir dentro de un solo contenedor o elemento contenedor, o incluir dentro de distintos contenedores o medios contenedores. Los cocteles generalmente se mezclarán entre sí para uso combinado.
'I?JuLá+??iá^ Las sustancias formuladas para administración intravenosa frecuentemente se preferirán. También se pueden incluir componentes para formar imágenes. Los juegos también pueden comprender instrucciones para usar el cuando menos un primer anticuerpo y el uno o más otras sustancias biológicas incluidas . En general, la cuando menos segunda sustancia anticáncer se puede administrar al animal o paciente sustancialmente simultáneamente con el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o la sustancia terapéutica basada en 2C3; tal como a partir de una sola composición farmacéutica o a partir de dos composiciones farmacéuticas administradas casi juntas . De manera alternativa, la cuando menos segunda sustancia anticáncer se puede administrar al animal o paciente en un momento secuencial a la administración del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o la sustancia terapéutica basada en 2C3. "En un tiempo secuencial", como se usa en la presente, significa "escalonado", de manera que cuando menos una segunda sustancia anticáncer se administra al animal o al paciente en un momento distinto a la administración del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2 o la sustancia terapéutica basada en 2C3. Generalmente, las dos sustancias se administran en momentos efectivamente separados para permitir que las dos sustancias ejerzan sus efectos terapéuticos respectivos, es decir, se administran en "intervalos de tiempo biológicamente efectivos". La cuando menos una segunda sustancia anticáncer se puede administrar al animal o paciente en un momento biológicamente efectivo antes del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o la terapia basada en 2C3, o en un momento biológicamente efectivo posterior a esa terapia. De conformidad con lo anterior, la presente invención proporciona métodos para tratar un animal o paciente con un tumor vascularizado, que comprende: (a) someter al animal o paciente a un primer tratamiento que sustancialmente reduzca la carga del tumor; y (b) administrar posteriormente cuando menos una primera sustancia antiangiogénica al animal o paciente en una cantidad efectiva para inhibir la metástasis de cualquier célula de tumor sobreviviente; en donde la primera sustancia antiangiogénica es cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o un fragmento que enlaza antígeno del mismo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) ; opcionalmente en donde el anticuerpo o el fragmento se asocia operativamente con una segunda sustancia antiangiogénica. Los primeros tratamientos preferidos incluyen la resección quirúrgica y la intervención quimioterapéutica. Los antiangiogénicos combinados también se pueden usar, tales como la angiopoyetina 2 o construcciones de angiopoyetina 2 dirigidas al tumor. Otros métodos de tratamiento para animales o pacientes con tumores vascularizados, comprenden: (a) administrar una primera construcción de sustancia terapéutica anticuerpo al animal o paciente en una cantidad efectiva para inducir la necrosis sustancial del tumor; en donde la primera construcción de sustancia terapéutica anticuerpo comprende una sustancia terapéutica enlazada operativamente con un primer anticuerpo, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con el componente expresado en la superficie, accesible en la superficie, o localizado en la superficie de una célula de tumor, vasculatura de tumor o estroma de tumor; y (b) administrar posteriormente un segundo anticuerpo al animal o paciente en una cantidad efectiva para inhibir la metástasis de cualquier célula de tumor sobreviviente; en donde el segundo anticuerpo es cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o un fragmento que enlaza antígeno del mismo, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) ; y además opcionalmente en donde el anticuerpo o el fragmento se asocia operativamente con una segunda sustancia antiangiogénica. En modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona anticuerpos anti-VEGF que f?aí*Ík,i.*t a i*¿ ,i.A. AíJUA. ,., ir^f ?m¡j&&?£*-*~?--'faipltÉm-?t H?& ^^^ bloquea el VEGFR2 y anticuerpos basados en 2C3 para su uso en combinación con profármacos como ADEPT. En estas composiciones, combinación, productos farmacéuticos, juegos, métodos y usos, el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 o fragmento del mismo se modificarán para proporcionar una capacidad de conversión o enzimática, o asociada operativamente con, preferiblemente enlazada covalentemente o conjugada a, cuando menos una primera sustancia de conversión o enzima capaz de convertir cuando menos un profármaco a la forma activa del fármaco. El anticuerpo conjugado-enzima o enzimático o fragmento se combinará con una formulación inicialmente separada del "profármaco". El profármaco será una forma inactiva o débilmente activa de un fármaco que se convierte en forma activa del fármaco al contacto con la capacidad enzimática, y la función de conversión o enzima asociada con el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo 2C3. De conformidad con lo anterior, se proporcionan juegos que comprenden, preferiblemente en composiciones y/o contenedores por separado: (a) una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o anticuerpo basado en 2C3, o fragmento del mismo, que tiene una función enzimática, preferiblemente donde el anticuerpo o fragmento se asocia operativamente con, se enlaza ^Jsa?iáÉ^te afci covalentemente o se conjuga con, cuando menos una primera enzima; y (b) una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer profármaco sustancialmente inactivo que se convierte en un fármaco sustancialmente activo mediante la función enzimática de, o la enzima asociada con, o enlazada a o conjugada con el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo 2C3 o fragmento. La presente invención además proporciona métodos y usos ventajosos que comprenden: (a) administrar a un animal o paciente con un tumor vascularizado una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o anticuerpo basado en 2C3, o fragmento que enlaza antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento tiene una función enzimática, preferiblemente en donde el anticuerpo o fragmento se asocia operativamente con, se enlaza covalentemente con, o se conjuga con, cuando menos una primera enzima; en donde el anticuerpo o fragmento localiza la vasculatura, la vasculatura mtratumoral o estroma del tumor vascularizado después de la administración; y (b) posteriormente administrar al animal o paciente, después de un periodo de tiempo efectivo, una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos una segunda composición AJa-a i-ti-Mi i-»--* .«A¿Ít .'...A*±' farmacéutica que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un profármaco sustancialmente inactivo; en donde el profármaco se convierte en un fármaco sustancialmente activo mediante la función enzimática de, o enzima asociada con, o conjugado con el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo 2C3 o fragmento localizado dentro de la vasculatura, la vasculatura intratumoral o estroma de dicho tumor vascularizado. En otras modalidades, los anticuerpos e inmunoconjugados de la invención se pueden combinar con una o más sustancias de diagnóstico, típicamente sustancias de diagnóstico para su uso en relación con enfermedades angiogénicas. Un rango de composiciones de diagnóstico, juegos y métodos se incluye entonces dentro de la invención. En términos de diagnóstico y tratamiento contra el cáncer, las composiciones de diagnóstico y de formación de imágenes, juegos y métodos de la presente invención incluyen diagnósticos en vivo e in vi tro . Por ejemplo, un tumor vascularizado se le puede formar imagen usando una cantidad diagnósticamente efectiva de un componente de diagnóstico para tumor que comprende cuando menos una primera región de enlace que se enlaza con un componente accesible de una célula tumoral, vasculatura de tumor o estroma de tumor, operativamente unido a una sustancia de formación de imágenes de diagnóstico en vivo.
La formación de imágenes de tumores preferiblemente se lleva a cabo para proporcionar una imagen del estroma y/o la vasculatura de un tumor vascularizado usando un componente de diagnóstico que comprende cuando menos una primera región de enlace que se enlaza con un componente accesible de la vasculatura del tumor o estroma del tumor. Cualquier región de enlace conveniente o anticuerpo se puede emplear, tal como los descritos anteriormente en términos de las construcciones terapéuticas. Ciertas ventajas se proporcionarán usando un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 etiquetado o construcción de anticuerpo basado en 2C3, en donde la imagen formada será para predecir los sitios de enlace de la sustancia terapéutica que se usará. Las sustancias de diagnóstico de tumor en vivo detectablemente etiquetados, ya sea anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 o no, puede comprender un compuesto detectable por rayos X, tal como bismuto (III), oro (III), lantano (III) o plomo (II); un ion radioactivo, tal como cobre67, galio67, galio68, indio111, indio113, yodo123, yodo125, yodo131, mercurio197, mercurio203, renio186, renio188, rubidio97, rubidio103, tecnetio99m o itrio90; un isótopo de resonancia magnética nuclear, tal como cobalto (II), cobre (II), cromo (III), disprosio (III), erbio (III), gadolinio (III), holmio (III), hierro (II), hierro (III), manganeso (II), neodimio (III), níquel (II), samario (III), terbio (III), j ias á ,^ ,¿,¿k vanadio (II) o iterbio (III); o rodamina o fluoresceína. La formación de imagen previa antes del tratamiento de tumores se puede llevar a cabo mediante: (a) administrar al animal o paciente una cantidad diagnósticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende una sustancia de diagnóstico operativamente unida a cuando menos una primera región de enlace que se enlaza con un componente accesible de una célula de tumor, vasculatura de tumor (preferiblemente) o estroma de tumor (preferiblemente) , que incluye sustancias de diagnóstico operativamente unidas a anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o construcciones de anticuerpo basadas en 2C3; y (b) detectar posteriormente la primera región de enlace detectablemente etiquetada (o anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3) unido a las células de tumor, los vasos sanguíneos del tumor (preferiblemente) o el estroma de tumor (preferiblemente) ; mediante esto obtener una imagen del tumor, la vasculatura del tumor y/o el estroma del tumor. El tratamiento para el cáncer también se puede llevar a cabo mediante: (a) formar una imagen de un tumor vascularizado administrando a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado una cantidad diagnósticamente mínima de cuando menos una primera sustancia de enlace de tumor detectablemente ^aßíjgÜ^g^Saj etiquetada, preferiblemente un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, o construcción de anticuerpo basado en 2C3, que comprende una sustancia de diagnóstico operativamente unida a la sustancia de enlace de tumor o al anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3, mediante lo cual se forma una imagen detectable del tumor, de la vasculatura del tumor (preferiblemente) , o estroma de tumor (preferiblemente) ; y (b) administrar posteriormente al mismo animal o paciente una cantidad terapéuticamente optimizada de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 desnudo o anticuerpo 2C3 o construcción de anticuerpo-sustancia terapéutica usando este anticuerpo, causando mediante esto un efecto antitumor. De este modo se proporcionan formulaciones o medicamentos para formación de imágenes y tratamiento, que generalmente comprenden: (a) una primera composición farmacéutica que comprende una cantidad diagnósticamente efectiva de una sustancia de enlace de tumor detectablemente etiquetada, preferiblemente un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, o construcción de anticuerpo basado en 2C3, que comprende una sustancia detectable operativamente unida a una sustancia de enlace con tumor o anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o anticuerpo basado en 2C3; y (b) una segunda composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 desnudo o anticuerpo 2C3 o construcción de anticuerpo - sustancia terapéutica que usa este anticuerpo. La invención también proporciona juegos de diagnóstico in vi tro que comprenden cuando menos una primera composición o composición farmacéutica que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos una sustancia de diagnóstico que se asocia operativamente con cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de enlace de antígeno del mismo. La invención todavía más proporciona juegos combinados en los cuales la sustancia de diagnóstico se destina al uso fuera del cuerpo, preferiblemente en relación con una prueba llevada a cabo en una muestra biológica obtenida del animal o paciente. Como tal, la invención proporciona juegos que comprenden, generalmente en cuando menos dos distintos contenedores, cuando menos una primera composición, composición farmacéutica o coctel medicinal que comprende una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, opcionalmente uno que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) , o un fragmento que enlaza antígeno o inmunoconjugado de este anticuerpo anti-VEGF; y una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos una sustancia de diagnóstico, componente o sistema para el uso in vi tro . La "sustancia de diagnóstico, componente o sistema para su uso in vi tro" será cualquiera sustancia de diagnóstico o combinación de sustancias que permita el diagnóstico de una o más enfermedades que tengan un componente angiogénico. El diagnóstico in vi tro de este modo incluye aquellos convenientes para su uso para generar información de diagnóstico o pronóstico en relación con la enfermedad o padecimiento como se describe en cualquiera de las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,712,291, 5,753,230, 5,972,922, 5,639,757, WO 98/45331 y WO 98/16551, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia. En términos de diagnóstico y tratamiento contra el cáncer, el diagnóstico in vi tro preferiblemente incluirá un componente de diagnóstico que comprende cuando menos una primera región de enlace que se enlaza con un componente accesible de una célula de tumor, vasculatura de tumor (preferiblemente) o estroma de tumor (preferiblemente) operativamente unida a una "sustancia detectable o reportera" directamente o indirectamente detectable mediante una prueba de diagnóstico in vi tro . "Sustancias detectables o reporteras" directamente detectables in vi tro incluyen aquellas tales como radioetiquetas y sustancias reporteras detectables mediante inmunofluorescencia . "Sustancias detectables o reporteras" indirectamente detectables in vi tro incluyen aquellas que funcionan junto con otras sustancias exógenas, tales como enzimas detectables que producen un producto coloreado al contacto con un sustrato cromogénico. La detección indirecta in vi tro también extiende a componentes detectables o reporteros o sistemas que comprenden la primera región de enlace que se enlaza con un componente accesible de unas células de tumor, vasculatura de tumor (preferiblemente) o estroma de tumor (preferiblemente) en combinación con cuando menos un anticuerpo de detección que tiene inmunoespecificidad para la primera región de enlace. El "anticuerpo de detección" preferiblemente es un "anticuerpo secundario" que se une a una sustancia detectable directa o indirecta, tal como una radioetiqueta o enzima. De manera alternativa, un "sistema de detección de anticuerpo secundario y terciario" se puede usar, incluyendo un primer anticuerpo de detección que tiene inmunoespecificidad para la primera región de enlace en combinación con un segundo anticuerpo de detección que tiene inmunoespecificidad para el primer anticuerpo de detección, estando unido el segundo anticuerpo de detección a una sustancia detectable directa o indirecta. Breve descripción de los dibujos Los siguientes dibujos forman parte de la presente ^^^^?^¡¡f^í^*S |gMß¡ especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención será mejor entendida haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en la presente. La Figura 1. 2C3 inhibe el crecimiento mediado por VEGF de las células ABAE . Las células ABAE se cultivaron en presencia de varios anticuerpos indicados y 0.5nM de VEGF. Cultivados después de 4 días se determinó colorimétricamente mediante la conversión enzimática de MTS (reactivo de Owen) a un formazán amarillo. Los resultados se presentan como un porcentaje de formazán en pozos de control que fueron cultivados solamente con VEGF. El fondo se determinó cultivando células sin VEGF o anticuerpo y se sustrato de los pozos de control y de muestra. Los resultados muestran la media aritmética de determinaciones por triplicado, las desviaciones estándares de las cuales siempre fueron menores del 20 por ciento de la media. Se muestran las curvas de crecimiento de los anticuerpos IgG anti-VEGF incluyendo anticuerpos monoclonales 4.6.1 como un control positivo y un IgG de especificidad irrelevante (IgG de control) como un control negativo. Figura 2. 2C3 bloquea el enlace de VEGF como el VEGFR2 pero no con VEGFR1 en el Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada. Los pozos se cubrieron con dominio extracelular del iafcsl » A ?.lui¡Jt?ái? ¿Ji?a&i .
VEGFR1 (Flt-l/Fc) o VEGFR2 (sFlk-1) y entonces se incubaron con VEGF solo a 1 nM o VEGF en presencia del IgG indicado ya sea a 100 nM o a 1000 nM . La placa se incubó con anti-VEGF de conejo (A-20, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) a un µg/ml y se desarrolló usando anticuerpo anticonejo de cabra pero conjugado con peroxidasa. Se realizaron las pruebas en triplicado. El por ciento promedio de enlace en ausencia de anticuerpos se muestra, junto con la desviación estándar. Los asteriscos indican valores que son estadísticamente significativamente diferentes (p<0.002) de aquellos en ausencia del anticuerpo mediante la prueba T en pares de Student. Figura 3A y Figura 3B. 2C3 inhibe el crecimiento en vivo de xenoinjertos de tumor humano. Figura 3A: 1 x 107 NCI-H358 NSCLC células se inyectan subcutáneamente en ratones nu/nu el día 0. Figura 3B: 5 x 106 células A673 de rabdomiosarcoma se inyectaron subcutáneamente en ratones nu/nu el día 0. Los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con la IgG indicada en el día 1 y 2 veces/semana después de eso. 2C3 se dio a una dosis de 100, 10, ó 1 µg/inyección mientras una IgG de control de especificidad irrelevante (Figura 3A) y 3E7 (Figura 3B) también se dieron a 100 µg/inyección. Los tumores se midieron 2-3 veces por semana. La media y el error estándar se mostraron por la duración del estudio en la Figura 3A, mientras que los datos para el último día del estudio (día 26) se muestran en la Figura 3B. lií*A. *¿¡ j.j ^t k^. ?¿?¡?.
Figura . El tratamiento con 2C3 reduce el tamaño de los xenoinjertos de tumor NCI-H358 NSCLC humano establecido. Los ratones que llevaban tumores NCI-H358 subcutáneos, aproximadamente de 300-450 milímetros cúbicos de tamaño, fueron tratados intraperitonealmente con 50 µg o 100 µg de 2C3 (n=14), mAb 4.6.1. (n=5), 3E7 (n=12) o un control IgG (n=9) en los puntos de tiempo indicados. El volumen medio del tumor junto con el SEM durante 116 días se muestra. Figura 5A y Figura 5B. Comparación de tratamiento con 2C3 y 3E7 de xenoinjertos de tumores humanos establecidos. Figura 5A: Ratones que llevaban tumores NCI-H358 subcutáneos, de aproximadamente 450 milímetros cúbicos de tamaño, fueron tratados ya sea con 2C3 (n=6) o 3E7 (n=4) . Los tratamientos (T) fueron 100 µg de la IgG dada intraperitonealmente, excepto por el tratamiento inicial que consistió en 500 µg del IgG dada intravenosamente. El volumen medio del tumor junto con el SEM se muestran. Al final del estudio (día 116), los ratones fueron sacrificados y los tumores se disectaron y se pesaron. El peso medio de tumor para el grupo tratado con 2C3 fue de 0.054 gramos, mientras que el grupo tratado con 3E7 tuvo un peso medio de tumor de 0.545 gramos. Figura 5B: Los ratones que llevaban tumores HT1080 subcutáneos de aproximadamente tamaño de 200-250 milímetros cúbicos fueron tratados intraperitonealmente con 100 µg de 2C3 (n=9) , 3E7 (n=ll), IgG de control (n=ll), o solución salina (n=ll). Los ratones fueron tratados un día si y un día no como se indica (T) . Los ratones no tratados con 2C3 fueron sacrificados el día 26 debido a que más del 50 por ciento de cada grupo tenía tumores grandes ulcerados. El volumen medio de tumor junto con el SE se muestra. Descripción de las modalidades ilustrativas Los tumores sólidos y carcinomas son más del 90 por ciento de todos los cánceres en el hombre. Aunque el uso de anticuerpos monoclonales e inmunotoxinas se ha investigado en la terapia de linfomas y leucemias, estas sustancias han sido desafortunadamente ineficaces en ensayos clínicos contra carcinomas y otros tumores sólidos (Abrams y Oldham, 1985) . Una razón principal para la ineficacia de los tratamientos basados en anticuerpos es que las macromoléculas no se transportan fácilmente a los tumores sólidos. Aun cuando ya están dentro de una masa tumoral, estas moléculas fallan en distribuirse uniformemente, debido a la presencia de uniones fuertes entre las células de tumores, estroma fibroso, gradientes de presión intersticial y barreras del sitio de unión (Dvorak y colaboradores, 1991) . Para desarrollar nuevas estrategias para tratar tumores sólidos, los métodos que involucran dirigirse a la vasculatura del tumor, en vez de a las células del tumor, ofrecen distintas ventajas. Una destrucción efectiva o bloqueo de los vasos del tumor detiene el flujo sanguíneo a través del tumor y da como resultado una avalancha de la muerte celular del tumor. Las construcciones de anticuerpo-toxina y anticuerpo-coagulante han sido ya efectivamente usadas en la dirección específica y destrucción de vasos del tumor, dando como resultado la necrosis del tumor (Burrows y colaboradores, 1992; Burrows y Thorpe, 1993; Publicación Internacional WO 93/17715; WO 96/01653; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; 5,877,289; 5,965,132; 6,051,230; 6,004,555; Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 08/482,369, Derechos de Emisión pagado el 20 de octubre de 1998; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Cuando se usan anticuerpos, factores de crecimiento u otros ligandos de enlace para administrar específicamente un coagulante a la vasculatura del tumor, estas sustancias se denominan "coaguligandos". Un coagulante actualmente preferido para su uso en coaguligandos es el Factor de Tejido truncado (tTF) (Huang y colaboradores, 1997; Publicación Internacional WO 96/01653; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,877,289). El Factor de Tejido es un iniciador importante de la coagulación de la sangre. En sitios de lesiones, el Factor VlI/VIIa en la sangre se pone en contacto con, y se enlaza con, el Factor de Tejido en las células en los tejidos perivasculares. El complejo TF:VIIa, en presencia de la superficie del fosfolípido, activa los factores IX y X. Esto, a su vez, conduce a la formación de trombina y fibrina y, finalmente, un coágulo sanguíneo. Un rango de moléculas objetivo convenientes que están disponibles en el endotelio del tumor, pero muy ausentes del endotelio normal, se han descrito. Por ejemplo, se pueden utilizar objetivos expresados, tales como endoglina, selectina- E, selectina-P, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, un TIE, un ligando reactivo con LAM-1, un receptor VEGF/VPF, un receptor FGF, integrina ?ívß3, pleiotropina o endosialina (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; 5,877,289 y 6,004,555; Burrows y colaboradores, 1992; Burrows y Thorpe, 1993; Huang y colaboradores, 1997; cada una incorporada a la presente mediante referencia) . Otros objetivos inducibles mediante el ambiente del tumor natural o que siguen la intervención del hombre también son entidades dirigibles, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,776,427 y 5,863,538; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Cuando se usa junto con la supresión anterior en tejidos normales y para inducción vascular del tumor, se pueden también emplear los antígenos MHC Clase II como objetivos (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,776,427; 6,004,554 y 6,036,955; cada una incorporada a la presente mediante referencia) . Los objetivos adsorbidos son otro grupo conveniente, tales como VEGF, FGF, TGFß, HGF, PF4, PDGF, TIMP, un ligando que se enlaza con un TIE o una isoforma de fibronectina asociada con un tumor (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,877,289 y 5,965,132; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Las isoformas de fibronectina son ligandos que se enlazan a la familia de integrina de los receptores. Las isoformas de fibronectina asociadas con tumores son componentes dirigibles, tanto de la vasculatura del tumor como del estroma del tumor. Un marcador actualmente preferido para estas aplicaciones dirigidas clínicas es el VEGF asociado-receptor. De hecho, ensambles de complejos de VEGF: receptor son uno de los marcadores más específicos de la vasculatura del tumor observados hasta la fecha (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,877,289; 5,965,132 y 6,051,230; Lin-Ke y colaboradores, 1996; Dvorak y colaboradores, 1991b) . El complejo VEGF: receptor presenta un objetivo atractivo para la administración específica de fármacos y de otros efectores al endotelio del tumor - ya que los tumores son ricos en citocinas y factores de crecimiento y como los receptores VEGF están sobre-regulados bajo las condiciones hipóxicas que se encuentran en la mayoría de los tumores sólidos (Mazure y colaboradores, 1996; Forsythe y colaboradores, 1996; Waltenberger y colaboradores, 1996; Gerber y colaboradores, 1997; Kremer y colaboradores, 1997) .
. ? La sobre-regulación de tanto el ligando como su receptor específicamente en el microambiente del tumor conduce a una alta concentración del receptor ocupado en el endotelio vascular del tumor, en comparación con el endotelio en tejido normal (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,877,289 y 5,965,132). Dvorak y colaboradores, también mostraron que los anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra el término N del VEGF selectivamente manchan los vasos de sangre del tumor después de la inyección en ratones que llevan tumores singeneicos (Lin-Ke y colaboradores, 1996). El papel del VEGF como un objetivo para la intervención clínica no se limita a terapias de inmunotoxinas o coaguligandos. Sin duda, el VEGF es uno de los factores clave involucrados en la angiogénesis de los tumores sólidos (Ferrara, 1995; Potgens y colaboradores, 1995), siendo ambos una sustancia de permeabilidad potente (Senger y colaboradores, 1983; Senger y colaboradores, 1990; Senger y colaboradores, 1986) y mitógeno celular endotelial (Keck y colaboradores, 1989; Connolly y colaboradores, 1989; Thomas, 1996) . El enlace entre el VEGF y la angiogénesis ha conducido a propuestas de varias estrategias terapéuticas dirigidas a la intervención del VEGF (Siemeister y colaboradores, 1998). A. VEGF y receptor de VEGF El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una citocina multifuncional que se induce por hipoxia y JUA.-A Ad?? Jl*fk x. M?VBH.1 Í~ .?**ftf .^ mutaciones oncogénicas. El VEGF es un estimulante primario del desarrollo y mantenimiento de una red vascular en la embriogénesis. Funciona como una potente sustancia que induce a la permeabilidad, una sustancia quimiotáctica celular endotelial, un factor de supervivencia endotelial, un factor de proliferación de células endoteliales (Thomas, 1996; Neufeld y colaboradores, 1999) . Su actividad se requiere para el desarrollo embriónico normal (Fong y colaboradores, 1995; Shalaby y colaboradores, 1995), como la interrupción dirigida de uno o varios alelos del VEGF da como resultado la letalidad embriónica (Carmeliet y colaboradores, 1996, Ferrara y colaboradores, 1996). El VEGF es un factor importante que conduce a la angiogénesis o a la vasculogénesis en numerosos procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la cicatrización de heridas (Frank y colaboradores, 1995; Burke y colaboradores, 1995), la retinopatía diabética (Alón y colaboradores, 1995; Malecaze y colaboradores, 1994), psoriasis (Detmar y colaboradores, 1994), ateroesclerosis (Inoue y colaboradores, 1998), artritis reumatoide (Harada y colaboradores, 1998; Nagashima y colaboradores, 1999) , crecimiento de tumores sólidos (Píate y colaboradores, 1994; Claffey y colaboradores, 1996) . Una amplia variedad de células y tejidos produce VEGF, que existe en cuando menos cinco isoformas (121, 145, 165, 189, y 206 aminoácidos) que son variantes divididas codificadas por el mismo gen (Houck y colaboradores, 1991; Ferrara y colaboradores, 1991; Tischer y colaboradores, 1991) . Las dos isoformas más pequeñas, 121 y 165, son secretadas de las células (Houck y colaboradores, 1991; Anthony y colaboradores, 1994). El VEGF secretado es un dímero obligado de entre 38-46 kDa en el cual los monómeros están enlazados por dos enlaces disulfuro. Los dímeros de VEGF se enlazan con alta afinidad a dos receptores bien caracterizados, VEGFR1 (Flt-1) y el VEGFR2 (KDR/Flk-1), los cuales se expresan selectivamente en células endoteliales (Flt-1) y Flk-1 son los homólogos de ratón) . El Kd del VEGF que se enlaza con el VEGFRl y VEGFR2 tiene de 15-100 pM y 400-800 pM, respectivamente (Terman y colaboradores, 1994) . Una tercera proteína de superficie celular recientemente identificada, neuropilin-1, también se enlaza con el VEGF con alta afinidad (Olander y colaboradores, 1991; De Vries y colaboradores, 1992; Terman y colaboradores, 1992; Soker y colaboradores, 1998) . El VEGFR1 y el VEGFR2 son miembros de la familia de receptor de tirosina quinasa Tipo III (RTK III) que se caracteriza por siete repeticiones parecidos a IgG extraceluiares, un solo dominio de extensión de transmembrana, y un dominio mtracelular de división de tirosina quinasa (Mustonen y Alitalo, 1995) . Hasta muy recientemente, se - a,J«.li4,£.,aias.,{.-i. "•-^í^-~* sMA^lMmmk&&~»?i,?¡ ..,¿liá pensaba que el VEGFRl y el VEGFR2 se expresaban casi exclusivamente en células endoteliales (Mustonen y Alitalo, 1995) . Aunque el VEGFR1 y el VEGFR2 se ha reportado que tienen diferentes funciones con respecto a la proliferación de células endoteliales, la migración y diferenciación (Waltenberger y colaboradores, 1994; Guo y colaboradores, 1995), el papel preciso que cada receptor representa en la biología del VEGF y la homeostasis de las células endoteliales no estuvo claramente definida antes de la presente invención. Estudios recientes usando ratones con genes recortados (knockout) han demostrado que cada uno de VEGF, VEGFR1 y VEGFR2 son esenciales para la vasculogénesis, angiogénesis y desarrollo del embrión (Fong y colaboradores, 1995; shalaby y colaboradores, 1995; Hiratsuka y colaboradores, 1998) . En estudios de recorte de genes letal, los fenotipos asociados con la falta de cada receptor fueron diferentes. La interrupción dirigida del VEGFR2 dio como resultado un embrión que carecía de diferenciación de células endoteliales y falló en formar islas de sangre del saco de yema o ir a través de la vasculogénesis (Shalaby y colaboradores, 1995) . Los mutantes nulos de VEGFR1 mostraron vasculogénesis defectuosa, ensamble desorganizado de células endoteliales, y vasos sanguíneos dilatados (Fong y colaboradores, 1995; Hiratsuka y colaboradores, 1998). El VEGFR1 evidentemente tenía un papel biológico vital. .. .?. ?. aBtta-nfc-tjfcl«<tJiiia-W»iiáw?r«^^A---a^--&-"-J -~a-"*fe¿» ' El VEGFR1 tiene una afinidad más alta para el VEGF que el VEGFR2, aunque tiene una actividad tirosina quinasa más baja. Esto sugiere que el dominio extracelular del VEGFRl es particularmente importante. Esta hipótesis está fuertemente apoyada por resultados de estudios en ratones con genes recortados en los cuales el dominio tirosina quinasa del VEGFRl fue suprimido mientras se dejaba el dominio de enlace del VEGF intacto (Hiratsuka y colaboradores, 1998). Los embriones deficientes de tirosina quinasa VEGFR1 desarrollaron vasos sanguíneos normales y sobrevivieron a término (Hiratsuka y colaboradores, 1998). Además de los anteriores genes recortados (Fong y colaboradores, 1995; Shalaby y colaboradores, 1995), los estudios de Hiratsuka y colaboradores, (1998) indican que el VEGFR1 tiene un papel biológico vital. Sin embargo, la señalización de tirosina quinasa no parece ser un factor crítico. Es interesante notar que los macrófagos de los ratones con genes recortados VEGFRl no exhibieron quimiotaxis inducida por el VEGF (Hiratsuka y colaboradores, 1998; incorporada en la presente mediante referencia) , implicando mediante esto que el VEGFR1 como el receptor responsable para mediar esta respuesta biológica importante al VEGF. Ciertos grupos han reportado que el VEGFR2 es el receptor de señalamiento dominante en la mitogénesis inducida por VEGF, y permeabilidad (Waltenberger y colaboradores, 1994; Zachary, 1998; Korpelainen y Alitalo, 1998). El papel del VEGFR1 en la función celular endotelial es mucho menos clara, aunque funciones en la migración de macrófagos y la quimiotaxis fueron documentadas en los estudios de Hiratsuka y colaboradores, (1998) discutidos anteriormente. Clauss y colaboradores, (1996; incorporada en la presente mediante referencia) también reportaron que el VEGFR1 tiene importantes papeles en la activación de monocito y la quimiotaxis. De hecho, las células de linaje de macrófago/monocito sólo expresan VEGFR1, el cual es el receptor responsable para mediar el reclutamiento de monocitos y la actividad de procoagulantes (Clauss y colaboradores, 1996) . El VEGF que se enlaza con VEGFR1 en los monocitos y macrófagos también actúa elevando el calcio intracelular e induciendo la fosforilación tirosina (Clauss y colaboradores, 1996) . El enlace del dímero VEGF con el receptor VEGF se cree que induce la dimerización del receptor. La dimerización del receptor causa entonces la autotransfosforilación de residuos de tirosina específicos, Y801 e Y1175, e Y1213 e Y1333 en el lado intracelular del VEGFR2 y VEGFR1, respectivamente. Esto conduce a una cascada de transducción de señales, la cual incluye la activación de fosfolipasa Cy (PLCy) y el fosfatidilinositol 3-quinasa (P13K) y un aumento en los iones de calcio intracelulares (Hood y Meininger, 1998; Hood y colaboradores, 1998; Kroll y Waltenberger, 1998).
Los eventos intracelulares más corriente abajo en el señalamiento inducido por VEGF son menos claros, aunque varios grupos han demostrado que el óxido nítrico (NO) se producen después de la activación por el VEGF del VEGFR2 (Hood y Meininger, 1998; Hood y colaboradores, 1998; Kroll y Waltenberger, 1998). La activación del VEGFR2, pero no del VEGFRl, mediante el VEGF también ha mostrado que activa Src y la cascada de quinasa Ras-MAP incluyendo las quinasas MAP, ERK 1 y 2 (Waltenberger y colaboradores, 1994, 1996, Kroll y Waltenberger, 1997) . El papel del VEGFRl en la función celular endotelial es mucho menos clara, particularmente ya que los ratones deficientes de tirosina quinasa Flt-1 son viables y desarrollan vasos normales (Hiratsuka y colaboradores, 1998) . Se ha sugerido que el principal papel biológico del VEGFR1 en el endotelio es como una molécula de enlace de ligando de no señalización, o receptor "decoy" que podría ser requerido para presentar el VEGF al VEGFR2. La conexión entre el VEGF y las condiciones angiogénicas patológicas ha despertado varios intentos para bloquear la actividad del VEGF. Estas incluyen el desarrollo de ciertos anticuerpos neutralizantes contra el VEGF (Kim y colaboradores, 1992; Presta y colaboradores, 1997; Sioussat y colaboradores, 1993; Kondo y colaboradores, 1993; Asano y colaboradores, 1995) . Los anticuerpos contra los receptores de hAAa .^i^-AAiAi-i VEGF también han sido descritos, tales como los descritos en la Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,840,301 y 5,874,542 y, posteriores a la presente invención, el WO 99/40118. Las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,840,302 y 5,874,542 sin duda sugieren que el bloqueo de los receptores VEGF en lugar del VEGF mismo es ventajoso por varias razones. Las construcciones de receptor soluble (Kendall y Thomas, 1993; Aiello y colaboradores, 1995; Lin y colaboradores, 1998; Millauer y colaboradores, 1996), inhibidores de tirosina quinasa (Siemeister y colaboradores, 1998) , estrategias antisentido, aptámeros de ARN y ribozimas contra el VEGF o los receptores del VEGF también se han reportado (Saleh y colaboradores, 1996; Cheng y colaboradores, 1996; Ke y colaboradores, 1998; Parry y colaboradores, 1999; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . B. .Anticuerpos anti-VEGF Bl . Rango de propiedades de anticuerpos La aplicación de varios métodos inhibitorios ha sido demostrada que es cuando menos algo efectiva ya sea en bloquear la angiogénesis y/o suprimir el crecimiento del tumor interfiriendo con el señalamiento del VEGF. De hecho, los anticuerpos monoclonales contra el VEGF se ha mostrado que inhiben el crecimiento de xenoinjertos de tumor humano y la formación de ascitas en ratones (Kim y colaboradores, 1993; ta.4A-t.i- Hf*'"''-* •"aa?--~ -->-'"^-^^j,-44^^..4.t.attt»tttf.»..-^,?ifc.J-«4 -^afe.^.^-!,..fti Asano y colaboradores, 1995; 1998; Mesiano y colaboradores, 1998; Luo y colaboradores, 1998a; 1998b; Borgstrom y colaboradores, 1996; 1998). El anticuerpo A4.6.1 es un anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad capaz de bloquear el enlace del VEGF tanto al VEGFR1 como al VEGFR2 (Kim y colaboradores, 1992; Wiesmann y colaboradores, 1997; Muller y colaboradores, 1998). La mutagénesis de rastreo de alanina y cristalografía de rayos X del VEGF enlazado por el fragmento Fab de A4.6.1 mostró que el epítope en el VEGF que A4.6.1 enlaza se centra alrededor de los aminoácidos 89-94. Estos datos estructurales demuestran que el A .6.1 competitivamente inhibe que el VEGF se enlace con el VEGFR2 pero inhibe que el VEGF se enlace con el VEGFRl más probablemente por el impedimento esférico (Muller y colaboradores, 1998; Keyt y colaboradores, 1996; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . El A4.6.1 se utiliza más extensamente neutralizando el anticuerpo anti-VEGF en la literatura hasta la fecha. Se ha mostrado que inhibe el crecimiento y la permeabilidad vascular inducida por el VEGF de una variedad de tumores humanos en ratones (Brem, 1998; Baca y colaboradores, 1997; Presta y colaboradores, 1997; Mordenti y colaboradores, 1999; Borgstrom y colaboradores, 1999; Ryan y colaboradores, 1999; Lin y colaboradores, 1999; cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia) . El A4.6.1 g-a *¿**ü¿ati3u,A* también inhibe la formación de ascitas en un modelo de ratón de carcinoma de ovario humano bien caracterizado y la diseminación de tumor en un modelo de ratón de metástasis novedoso. El A4.6.1 recientemente ha sido humanizado por técnicas de despliegue de fago monovalente y actualmente está en ensayos clínicos Fase I como una sustancia anticáncer (Brem, 1998; Baca y colaboradores, 1997; Presta y colaboradores, 1997; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . A pesar de algún éxito en la técnica con la neutralización de anticuerpos contra el VEGF, los presentes inventores se dieron cuenta que nuevos anticuerpos, particularmente aquellos con un modo más precisamente definido de interacción con el VEGFR1 (FLT-1) y/o VEGFR2 (KDR/Flk-1) serían benéficos por una variedad de razones. Por ejemplo, el desarrollo de anticuerpos anti-VEGF que selectivamente bloquean la interacción de VEGF con solamente uno de dos de los receptores VEGF permitiría una disección más precisa de las sendas activadas por el VEGF en células que expresan tanto el VEGFR1 como el VEGFR2. Los presentes inventores creyeron que los anticuerpos de especificidad de epítope definida que bloquean el VEGF que se enlaza a solamente un receptor (VEGFR2) bien puede tener beneficios clínicos dependiendo, desde luego, del mantenimiento de sus efectos inhibitorios en un ambiente en vivo. Los estudios de ratones con genes recortados de Hiratsuka y A.?-AA^A. ,.A, tes? uBit.***...¿ t*** *^^^* ^ «tefcj^&j colaboradores, (1998) muestran que tanto el VEGFR1 como el VEGFR2 tienen papeles biológicos importantes. Antes de la presente invención, oportunidades realistas de la intervención terapéutica dirigieron en efectos mediados por la inhibición del VEGF a través de solamente uno de los dos receptores eran obstruidos por la falta de sustancias inhibitorias efectivas, adaptadas . Los presentes inventores primero desarrollaron un rango de nuevos anticuerpos anti-VEGF que tienen varias especificidades y propiedades de epítope. Seis grupos de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales contra el complejo VEGF: receptor (Flk-1) o contra el mismo VEGF se proporcionaron. Cinco de grupos de anticuerpos no interfieren con el enlace del VEGF con su receptor, mientras que uno bloqueó esta interacción (grupo 2C3) e inhibió el crecimiento mediado por VEGF de las células endoteliales. Los anticuerpos de los grupos 3E7, GV39M, y 2C3, todos los cuales localizan selectivamente al tumor después de la inyección intravenosa en los ratones que tienen xenoinjertos de tumores humanos, se prefieren actualmente para su uso en dirigir cómo formar imágenes y tratar la vasculatura o tejido conectivo de los tumores sólidos. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención que reconocen el complejo VEGF: receptor selectivamente localizan a las células endoteliales del tumor después de la inyección en ratones que llevan xenoinjertos de tumores humanos. Los anticuerpos monoclonales del grupo 2C3 localizan conspicuamente al tejido conectivo perivascular del tumor, y también a los vasos del tumor circundantes. Los anticuerpos que reconocen el término N reaccionan con el receptor enlazado VEGF mediante un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada. GV39M y 11B5 despliegan alta especificidad para el VEGF enlazado al receptor, en oposición con el VEGF no enlazado al receptor. Presumiblemente el epítope reconocido por el GV39M y 11B5 en el término N es conformacional y se crea cuando el VEGF se enlaza con su receptor. El hecho de que los anticuerpos sean hongos IgMs, y por lo tanto grandes de tamaño, puede ser importante para su selectividad hacia el complejo de VEGF: receptor. Los anticuerpos anti-N-terminal no exhibieron crecimiento celular endotelial mediado por VEGF. Esto sugiere que el término N del VEGF no está involucrado en la interacción del receptor y que los anticuerpos contra el término N del VEGF no interfieren con el señalamiento mediado por el VEGF. En cambio, el 2C3 inhibe el crecimiento mediado por VEGF de las células endoteliales con un IC50 de 3 n . El 125i- VEGF estudios de enlace estando KDR que expresan ces endoteliales (células ABAE) demostraron que el 2C3 bloquea el VEGF de enlazarse con KDR en una manera dependiente de la concentración. De este modo, 2C3 es capaz de neutralizar KDR (VEGFR2) mediada por la actividad de VEGF in vi tro interfiriendo con el enlace del VEGF con su receptor. Los análisis inmunohistoquímicos revelaron que GV39M, 11B5, 3E7, y 7G3 reaccionan moderadamente hasta fuertemente con el endotelio vascular cuando se aplican directamente a las secciones. El GV39M despliega la especificidad más alta para las células endoteliales de tumor con comparativamente pequeño manchado de células de tumor o de tejido conectivo. 11B5, 3E7 y 7G3 preferencialmente manchan células endoteliales cuando se aplican a bajas concentraciones, pero manchan células de tumor y tejido conectivo distintamente a concentraciones más altas. El patrón de manchado observado con 11B5, 3E7 y 7G3 es típico del tipo de manchado visto cuando se usan anticuerpos policlonales contra el VEGF que no tienen una preferencia por una conformación particular del VEGF (Lin-Ke y colaboradores, 1996; Píate y colaboradores, 1994; Claffey y colaboradores, 1996) . El manchado selectivo del endotelio mediante el GV39M sugiere que se enlaza al complejo de VEGF: receptor sobre estas células y es consistente con la localización de células endoteliales de los receptores y el hecho de que el GV39M se enlaza selectivamente con el VEGF: sFlk-1 en el Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada. De manera similar, los patrones de manchado más amplios del 3E7 y 7G3 son consistentes con su capacidad para reconocer tanto el VEGF libre como enlazado con receptor. Sin embargo, el 11B5 se ha esperado que tenga un patrón de manchado que estuviera más restringido al endotelio debido a que prefiere fuertemente el VEGF: Flk-1 en el Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada de captura (véase la Tabla 2) . Es posible que el 11B5 sea capaz de reconocer que el VEGF que está enlazado a componentes de estroma, dándole un patrón de reactividad más amplio en las secciones del tumor. El 3E7 y GV39M selectivamente localizan en vivo a las células endoteliales vasculares del tejido del tumor, mientras que el 2C3 localiza al tejido conectivo perivascular de los tumores, además del endotelio. Veinticuatro horas después de la inyección intravenosa en ratones que tienen tumor, el 3E7 no fue detectable en el endotelio de ningún tejido excepto el tumor. GV39M, por otrolado, también se enlaza a células endoteliales de células mesangiales en los glomérulos del riñon. La razón para la reactividad del GV39M con los glomérulos del riñon de ratón no es clara. Podría ser que el anticuerpo se enlaza con el complejo de VEGF: receptor en las células endoteliales normales en el riñon (Takahashi y colaboradores, 1995) . Sin embargo, los estudios de localización en cobayos que tienen tumores singeneicos de Línea 10 han mostrado que el GV39M localiza a los vasos sanguíneos del tumor pero no a los glomérulos o a los vasos en otros tejidos normales. La capacidad del 3E7 y GV39M para localizar específicamente al endotelio del tumor probablemente es resultado de cuando menos dos factores. Primero, el complejo VEGF: receptor es relativamente abundante en los vasos sanguíneos del tumor debido a que el microambiente del tumor hipóxico estimula la expresión del VEGF mediante células de tumores y la expresión del receptor VEGF por las células endoteliales. Segundo, los vasos sanguíneos del tumor son más permeables que los vasos sanguíneos normales ( (Yuan y colaboradores, 1996) , lo cual puede permitir al anticuerpo mayor acceso al complejo VEGF: receptor que aparece estar concentrado en la cara abluminal de los vasos (Lin-Ke y colaboradores, 1996; Hong y colaboradores, 1995) . En un estudio anterior por Lin-Ke y colegas (1996), anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra el término N del VEGF de rata se encontró que se localizan a las células endoteliales del tumor después de la inyección en ratones que tienen carcinoma mamario de ratón TA3/St o carcinoma mamario MOT . En cambio, un anticuerpo policlonal de conejo (Ab-618) dirigido contra la proteína del VEGF total no localiza específicamente las células endoteliales en estos tumores o en ningún otro lado en los mismos tumores. Basándose en estos resultados, Lin-Ke y colaboradores, (1996) concluyeron que el término N del VEGF tiene la capacidad de enlazar anticuerpos después de que el VEGF se ha asociado con endotelio microvascular y que el l B?*A?t,?*?. t? ? y *** *.***^* ? ? depósito de células no endoteliales o libre asociadas con el VEGF no es suficiente para concentrar los anticuerpos anti-VEGF dirigidos contra los epítopes que no sean N-terminales (Lin-Ke y colaboradores, 1996) . Los presentes resultados con 3E7 y GV39M, dirigidos contra el término N del VEGF apoyan sus conclusiones . Sin embargo, los resultados de la presente invención de que los anticuerpos del grupo 2C3, dirigidos contra un epítope no N-terminal en el VEGF, localizan tanto a la vasculatura como al tejido conectivo perivascular de tumores sólidos en ratones son notablemente sorprendentes sobre el trabajo de Lin-Ke y colaboradores, (1996) . La presente invención sugiere que un "criadero" de VEGF está presente en el estroma del tumor y, de hecho, permite la concentración del 2C3 en la masa del tumor. Este objetivo estromal del tumor podría no haber sido predecido a partir de un estudio de publicaciones anteriores. Los inventores contemplan que el VEGF puede enlazarse a los heparan sulfato proteoglicanos (HSPG) dentro del tumor, aunque el entendimiento del mecanismo de acción ciertamente no es necesario para practicar la presente invención . Una conclusión temprana de la presente invención es que los anticuerpos de los grupos GV39M y 3E7 localizan selectivamente a las células endoteliales del tumor en ratones, mientras que los anticuerpos del grupo 2C3 localizan a las Afc.l ,a-*^>. '..^ J^^^^-&^^^^é ,A^¡a&^i.^?^? a células endoteliales del tumor y al tejido conectivo perivascular del tumor. Ya que la distribución del VEGF y sus receptores son similares en el ratón y en el hombre, estos anticuerpos se contempla que muestran patrones similares de localización en pacientes con cáncer. De este modo, se consideran el GV39M y el 3E7 para su uso en la administración de sustancias terapéuticas o de diagnóstico a la vasculatura del tumor en hombres, mientras que los anticuerpos del grupo 2C3 se concentran como vehículos para dirigir sustancias terapéuticas o diagnósticas a la vasculatura del tumor y al tejido conectivo del tumor. B2. .Anticuerpos anti-V?GF que bloquea el VEGFR2 y 2C3 Otros estudios sobre anticuerpos del grupo 2C3 revelaron aún más propiedades sorprendentes, resultando en composiciones efectivas y usos de la presente invención. Un descubrimiento importante de esta invención, hecha usando el Ensayo inmunosorbepte de enzima enlazada, ensayos de enlace de receptor y ensayos de activación de receptor, es que los anticuerpos monoclonales del grupo 2C3 selectivamente bloquean la interacción del ,/EGF con VEGFR2 (KDR/Flk-1), pero no del VEGFR1 (Flt-1) . Los anticuerpos 2C3 inhiben la fosforilación inducida por VEGF o VEGFR2 y bloquea la permeabilidad inducida por el VEGF, implicando el VEGFR2 como el receptor responsable de la permeabilidad inducida por el VEGF. Los anticuerpos 2C3 también tienen potente actividad iHÉMÉlfiirri ti ÍTJfflff - ? !s?*Au lt>?»»A?i.a ? .i antitumor, dependiendo el crecimiento de varios tumores sólidos humanos establecidos en modelos animales aceptados en la técnica de cáncer humano. Estos descubrimientos demuestran la utilidad del 2C3 para disectar las sendas que se activan por el VEGF en células que expresan tanto el VEGFR1 como el VEGFR2, así como resaltar la importancia de la actividad del VEGFR2 en el proceso del crecimiento y supervivencia de tumores. De manera más importante, proporcionan un modo único de intervención terapéutica, permitiendo la inhibición específica de la angiogénesis inducida por VEGFR2, sin la inhibición concomitante de quimiotaxis de macrófagos, osteoclastos y la función de condroclastos (mediada por VEGFR1). Los descubrimientos relacionados con 2C3 proporcionan de este modo, por primera vez, la motivación y los medios para hacer y usar anticuerpos anti-VEGF que inhiben el enlace del VEGF solamente con el VEGFR2, y no con el VEGFR1. Estos anticuerpos, sucintamente denominados "anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2", representan un avance en el campo y proporcionan numerosas ventajas, tanto en términos de usos en forma no conjugado o "desnuda" y cuando se conjugan o se asocian con otras sustancias terapéuticas. Los estudios de enlace in vi tro de la presente invención, empleando el Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada y los ensayos de coprecipitación con proteínas ?i* M )ÍAÍ*Á.. i**lk. receptores purificadas, demostraron que 2C3 bloquea el enlace del VEGF con el VEGFR2. Sorprendentemente, aunque el 2C3 no inhibe el enlace del VEGF con el VEGFR1 en ningún sistema de ensayo. Con el fin de confirmar los resultados iniciales, enlazando Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada se repitieron en diferentes configuraciones. En cada configuración, los resultados indicaron que el 2C3 no interfiere con la interacción del VEGF: VEGFR1. Como un control para estos estudios el anticuerpo monoclonal 3E7, un anticuerpo dirigido contra el término NH2 del VEGF, se usó, el cual no bloqueó el VEGF de enlazarse con VEGFR1 o con VEGFR2. El grupo 2C3 de anticuerpos de la presente invención de este modo mejora significativamente sobre otros anticuerpos de bloqueo al VEGF, incluyendo A .6.1. El anticuerpo anti-VEGF A4.6.1 bloquea el enlace del VEGF a ambos receptores VEGF. Estudios cristalográficos y de mutagénesis han demostrado que los epítopes de enlace para el VEGFR2 y el VEGFR1 se concentran hacia los dos polos simétricos del dímero del VEGF (Wiesmann y colaboradores, 1997; Muller y colaboradores, 1997). Los determinantes de enlace en el VEGF que interactúan con los dos receptores se traslapan parcialmente y se distribuyen sobre cuatro segmentos diferentes que se expanden a través de la superficie del dímero (Muller y colaboradores, 1998) . El anticuerpo 4.6.1 se enlaza a una región del VEGF dentro de la región de enlace del receptor o ambos receptores (Muller y .,.-*&^?^*? ^ií.¿ iA^.^^^..?éá colaboradores, 1998). Se propone que el 2C3 se enlaza a una región que está cercana al sitio de enlace del VEGFR2, pero no al sitio de enlace del VEGFR1. Estudios en el efecto del 2C3 sobre la fosforilación inducida por VEGF de los receptores mostró que 2C3 bloquea la fosforilación inducida por VEGF del VEGFR2. Esto también corresponde a datos discutidos anteriormente y solidifca además el papel del VEGFR2 en la proliferación inducida por el VEGF. Similar a los resultados de otros estudios, la fosforilación inducida por el VEGF consistente del VEGFR1 no pudo ser demostrada (De Vries y colaboradores, 1992; Waltenberger y colaboradores, 1994; Davis-Smith y colaboradores, 1996; Landgren y col.. 1998). Por lo tanto, podrían no juzgarse confiablemente si el 2C3 inhibe la fosforilación inducida por el VEGF del VEGFR1. La baja actividad del VEGF en la fosforilación del VEGFR1 ha conducido a otros a sugerir que VEGFR1 podría no ser un receptor de señalamiento en las células endoteliales, sino que podría actuar como un receptor decoy para capturar el VEGF y amplificar su señalamiento vía el VEGFR2 (Hiratsuka y colaboradores, 1998) . Sin embargo, la fosforilación de tirosina del VEGFR1 mediante el enlace del VEGF ha sido reportado por Kupprion y colaboradores, (1998) usando células endoteliales microvasculares (HMEC) y por Sawano y colaboradores, (1996) usando células NIH 3T3 que sobre-expresan el VEGFR1. Adicionalmente, Waltenberger y colaboradores, (1994) han mostrado que la activación del VEGFR1 inducida por el VEGF puede seguirse usando un ensayo de quinasa in vi tro . El efecto del 2C3 sobre la fosforilación inducida por el VEGF del VEGFR1, o la falta del mismo, podría determinarse usando uno de los tipos de células anteriores o un ensayo de quinasa in vi tro . Los datos presentes del Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada de la Figura 2 y los datos de enlace de células demuestran que los anticuerpos 2C3 no bloquean completamente el VEGF de enlazarse con células que expresan tanto al VEGFRl como al VEGFR2. El hecho de que el 2C3 no bloquea el VEGF enlazado con el VEGFRl significa que los anticuerpos 2C3 serán herramientas efectivas para delinear el papel del VEGFR1 en la biología de las células endoteliales y otros tipos de células. Las consecuencias funcionales de la selectividad que 2C3 muestra para bloquear el VEGF de activar sus receptores fue examinada usando el ensayo de permeabilidad de Miles en cobayos. Tanto 2C3 como A4.6.1 inhibieron la permeabilidad inducida por el VEGF cuando el IgG estuvo en cuando menos un excedente molar de 10 veces sobre el VEGF. 3E7 y anticuerpos de control no inhibieron la permeabilidad inducida por el VEGF aún con un exceso molar de 1000 veces. Estos resultados muestran que el VEGFR2 está involucrado en la permeabilidad inducida por el VEGF.
Este hallazgo concuerda con recientes reportes de que una forma novedosa del VEGF-C y dos variantes derivadas del VEGF-E enlazan al VEGFR2 pero no al VEGFR1 , y todavía retienen la capacidad para aumentar la permeabilidad vascular (Joukov y colaboradores, 1998; Ogawa y colaboradores, 1998; Meyer y colaboradores, 1999) . Probablemente, las diferentes formas de VEGF transmiten señales vía el VEGFR2 que causan la producción de NO, lo cual, hace ver, causa el aumento en la permeabilidad vascular (Hood y Granger, 1998; Hood y colaboradores, 1998 Kroll y Waltenberger, 1998; Murohara y colaboradores, 1998 Kupprion y colaboradores, 1998; Sawano y colaboradores, 1996 Fujii y colaboradores, 1997; Parenti y colaboradores, 1998). Esto apunta indirectamente a la participación del VEGFR2 conforme la producción de NO ha sido demostrada como una consecuencia de la activación del VEGFR2. Sin embargo, también hay evidencia de lo contrario, ya que Copuer y colaboradores, (1997), encontraron una fuerte correlación entre la permeabilidad vascular aumentada inducida por el VEGF y el VEGFR1 en vivo. El 2C3 inhibió el crecimiento de múltiples tipos de tumor humano diferentes en vivo. El efecto de 100 µg de 2C3 dados dos veces por semana fue idéntico en ratones que llevaban tumores en NCI-H358 NSCLC y tumores de rabdomiosarcoma A673, donde efectivamente limitaron el crecimiento de los tumores a un módulo pequeño de aproximadamente un tamaño de 150 i? Lá.áJ * - '* •*-'- ~****~A~A.*- -«-milímetros cúbicos. Respuestas similares se vieron en otros modelos de tumor, tales como HT29 y LS174T, ambos adenocarcinomas humanos del colon. La magnitud de la supresión de crecimiento de tumores por el 2C3 es similar al reportado por otros investigadores usando diferentes anticuerpos anti-VEGF neutralizantes (Asano y colaboradores, 1998; Mesiano y colaboradores, 1998) . Un anticuerpo VEGFR2 anti-ratón de rata monoclonal también bloqueó fuertemente el crecimiento de queratinocitos humanos malignos en ratones a través de un mecanismo antiangiogénico (Skobe y colaboradores, 1997). La efectividad del 2C3, siendo similar a lo que otros investigadores han encontrado usando diferentes anticuerpos anti-VEGF, demostró además el papel del VEGF en la angiogénesis del tumor y el crecimiento del tumor. Sin embargo, el 2C3 deberá proporcionar una terapia más segura, basada en las propiedades inhibitorias específicas discutidas en la presente. Para analizar el efecto de inhibir la actividad del VEGF en un escenario que sería más cercano a las condiciones en humanos, ratones que han establecido tumores fueron tratados con 2C3. En este escenario, el tratamiento con 2C3 significativamente hizo más lento el crecimiento de dos agresivos tumores humanos, A673 de rabdomiosarcoma y tumores de adenocarcinoma de colon LS174T. Los anticuerpos 2C3 causaron regresiones significativas de tumores en ratones que tenían .J?**lL.Í*? í.~M* át*?Í¿*t»*~,1*.. tumores NCI-H358 NSCLC. Tumores tratados con 2C3 ó A4.6.1 disminuyeron al 30 por ciento y 35 por ciento respectivamente, de su tamaño original después de aproximadamente 10 semanas de tratamiento. En un estudio en donde el tratamiento se permitió que se extendiera pasando los 100 días, se observaron regresiones aún más significativas. Los resultados sugieren que el VEGF está proporcionando más que justo una señal mitótica para el endotelio del tumor. El hecho de que las regresiones, en vez de la estasis de tumor, fuera observada sugiere que el VEGF está proporcionando más de justo una señal angiogénica para el endotelio del tumor. Benjamín y colaboradores, (1999) recientemente reportaron que los tumores que contienen una gran fracción de vasos sanguíneos inmaduros que tienen todavía que establecer contacto con células periendoteliales y que esos vasos sanguíneos dependen del VEGF para su supervivencia. Es posible que la neutralización del VEGF causa que estos vasos sanguíneos inmaduros sufran apoptosis, reduciendo mediante esto la red vascular existente en el tumor. También es posible que un proceso dinámico de remodelación vascular se presente en tumores, incluyendo tanto la formación de vasos como la regresión de vasos, y esa neutralización del VEGF evita la formación de vasos que conducen a un cambio neto hacia la regresión de los vasos.
El resultado de que 2C3 suprimió el crecimiento del tumor tan completamente como el A4.6.1 (si no es que más) indica un papel dominante para el VEGFR2 en al angiogénesis del tumor. El proceso de pasos múltiples de la angiogénesis requiere la quimiotaxis de célula endotelial, producción de metaloproteinasa, invasión, proliferación y diferenciación. El VEGFR1 puede no tener un papel en estos procesos, o puede ayudar en los procesos enlazando el VEGF y presentándole el receptor de señalamiento, VEGFR2. Las cifras comparables para 2C3 y A4.6.1 en el tratamiento de tumores es muy relevante: 2C3 es ligeramente más efectivo que A4.6.1, aunque sólo se enlaza con VEGFR2 y no con VEGFR1. Los presentes estudios por lo tanto indican que el VEGFRl no representa un papel notable en la angiogénesis de tumor mediada por el VEGF, y además sugiere que los inhibidores específicos para VEGFRl pueden no influenciar la angiogénesis del tumor. Estos resultados también significan que el 2C3 puede ser igualmente o más efectivo que el A4.6.1, mientras que causa menos efectos colaterales. La capacidad para bloquear específicamente el enlace del VEGF con y la activación del VEGFR2 tiene importancia en dos áreas de relevancia clínica. Primero, el VEGFR1 (Flt-1) se cree que representa un papel importante en el reclutamiento de macrófagos y monocitos en el tumor, y estas células expresan el VEGFRl y responden quimiotácticamente al VEGF vía la señalización del VEGFR1 (Clauss y colaboradores, 1996; Hiratsuka y colaboradores, 1998; Akuzawa y colaboradores, 2000) . Después de la activación de macrófagos, la transcripció del gen flt-1 se estimula a través de una inducción de Egr-1, que se enlaza con los sitios de enlace de factor de transcripción traslapantes Egr-1/Spl en el promotor Flt-1 humano, proporcionando evidencia de que el gen flt-1 es un objetivo directo del Egr-1, el fctor de transcripción principalmente inducido en la diferenciación de macrófagos (Akuzawa y colaboradores, 2000). Con el fin de mantener la activación de los macrófagos, como se requiere para producir una respuesta antitumor rigurosa, la inhibición de la señalización del VEGFR1 deberá evitarse. El bloqueo específico del VEGFR1 enfrentado por la presente invención de este modo proporciona ventajas importantes sobre el A .6.1 en la terapia de tumores, ya que la infiltración de macrófagos no será deshabilitada, habilitando a estas células a remover el desperdicio de célula de tumor de los tumores necróticos y promover el encogimiento del tumor. Usando anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2, tal como 2C3, también permitirá la infiltración de macrófagos para contribuir al efecto antitumor global haciendo un efecto citocida directo sobre las células de tumor. Sin duda, la presente invención proporciona únicamente sustancias ventajosas para su uso en todas formas de ?.?AÍ.^áiÍAi^.i?da».^ terapia antiangiogénica, debido a su capacidad para bloquear la actividad angiogénica del VEGF, pero no inhibir otras acciones benéficas del VEGF, mediadas a través del VEGFR1, tales como sobre las células inmunes y de los huesos. Una segunda área de importancia clínica se refiere a la capacidad de los anticuerpos preparados de acuerdo con esta invención para funcionar en vivo sin inhibir los efectos benéficos de los osteoclastos y condroclastos. Esto significa que el uso de la terapia de anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, incluyendo el 2C3, no se asociará con efectos secundarios o sobre los huesos y/o los cartílagos . Estudios en vivo han mostrado que el VEGF se acopla con la remodelación de cartílgos hipertróficos, osificación y angiogénesis durante la formación del hueso endocondral y que el VEGF es esencial para la remoción del cartílago (Gerber y colaboradores, 1999, específicamente incorporada en la presente mediante referencia) . La inactivación del señalamiento del VEGF a través del VEGFR1, mediante la administración de la proteína quimérica de receptor VEGFR1 soluble (Fit- ( 1-3) -IgG) , se mostró que discapacita la formación trabecular del hueso y la expansión de la zona de cqndrocito hipertrófico disminuyendo el reclutamiento y/o la diferenciación de los condroclastos (Gerber y colaboradores, 1999) . Se ha demostrado además que el VEGF puede sustituir ^ ¿Aftfc=-vS el factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF) en el apoyo de la función de osteoclastos en vivo (Niida y colaboradores, 1999; específicamente incorporada en la presente mediante referencia) . En estudios que usan ratones osteopetróticos (op/op) con una deficiencia en osteoclastos resultante de una mutación en el gel M-CSF, la inyección de M-CSF humana recombinante (rhM-CSF) permite el reclutamiento y supervivencia de osteoclastos. En estudios recientes, se ha demostrado que una sola inyección de VEGF humana recombinante igualmente puede inducir el reclutamiento de osteoclastos en ratones op/op (Niida y colaboradores, 1999) . Niida y colaboradores, (1999) reportaron que como los osteoclastos predominantemente expresan VEGFRl, y la actividad de factor de crecimiento de placenta humana recombinante 1 en el reclutamiento de osteoclastos comparable a la del rhVEGF, los efectos benéficos del señalamiento del VEGF en ratones osteopetróticos (op/op) está mediado vía el receptor 1 del VEGF (VEGFR-1) . Estos autores además mostraron que los osteoclastos inducidos por rhM-CSF murieron después de que se inhibió el VEGF (usando una proteína quimérica del receptor VEGFR1, VEGFRl/Fc) , pero estos efectos fueron abrogados por inyecciones concomitantes de rhM-CSF. Los osteoclastos apoyados por rhM-CSF o VEGF endógeno no mostraron siferencia significativa en la actividad en vivo (Niida y colaboradores, 1999) . Los ratones op/op mutantes sufrieron una resolución j^^gjjfcífc relacionada con la edad de osteopetrosis acompañada por un aumento en el número de osteoclastos. En los estudios de Niida y colaboradores, (1999), la mayoría de los osteoclastos desaparecieron después de las inyecciones anticuerpo anti-VEGF, demostrando que el VEGF endógenamente producido es responsable de la aparición de osteoclastos en los ratones mutantes. Además, el rhVEGF reemplazó al rhM-CSF en el soporte de la diferenciación de osteoclastos in vi tro . Estos resultados demuestran que el M-CSF y el VEGF tienen funciones traslapantes en el soporte de la función de osteoclastos y que el VEGF actúa a través del receptor VEGFR1 (Niida y colaboradores, 1999) . De este modo, se puede concluir que el 2C3, el primero de los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 de la invención, no bloquea el VEGF para enlazarse y activar el VEGFRl, pero sí bloquea que el VEGF de enlazarse y activar el VEGFR2. Los efectos antitumor de esta inhibición del VEGFR2 se demuestran claramente. Estos resultados muestran que el VEGFR2 es el receptor del VEGF que media la permeabilidad y sobresalta su papel en la angiogénesis de los tumores. Esta invención por lo tanto valida además la inhibición del VEGF como terapia para el tratamiento de tumores sólidos. En una más importante, la invención proporciona un rango de nuevos anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, tales como los basados en 2C3, para la intervención terapéutica y, en particular, para su uso como fármacos seguros y efectivos para inhibir la angiogénesis en tumores y otras enfermedades. El beneficio de la presente invención no se limita a la falta de efectos secundarios. Aunque estas son características importantes que tendrán beneficios notables, particularmente en el tratamiento de niños y pacientes con padecimientos de los huesos, los anticuerpos de la invención tienen muchas otras ventajas. Por ejemplo, los conjugados de anticuerpos basados en los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 o 2C3 se pueden usar para administrar sustancia terapéutica al ambiente del tumor. De hecho, los anticuerpos 2C3 se muestra en la presente que se enlazan con la vasculatura del tumor y con el estroma del tumor después de la administración en vivo, pero no se enlazan a la vasculatura o al tejido conectivo en los órganos normales o tejidos normales. Las construcciones terapéuticas basadas en los presentes anticuerpos por lo tanto tienen la ventaja de combinar dos funciones dentro de una molécula: las propiedades antiangiogénicas del anticuerpo o fragmento del mismo y las propiedades de la sustancia terapéutica seleccionada para su unión. Ya que el VEGFR2 es el receptor clave en el endotelio, al bloquear el enlace del VEGF con el VEGFR2 es crítico para un efecto antiangiogénico. Aunque el VEGFR1 se expresa en el endotelio, no transduce señal, o es pasivo en este contexto. Por lo tanto, la incapacidad de los anticuerpos de la presente invención para bloquear el enlace del VEGF con el VEGFRl no tiene consecuencia con su efectividad como sustancia antiangiogénica y antitumor. De hecho, en vez de inhibir el enlace del VEGF con el VEGFRl, que ocurre con los anticuerpos de bloqueo de la técnica anterior, la capacidad de los presentes anticuerpo para enlazarse con el VEGF y todavía no perturbar sustancialmente las interacciones entre VEGF-VEGFR1 mejora las propiedades de administración de fármaco de estos nuevos anticuerpos. Los presentes inventores se dieron cuenta que los anticuerpos de bloqueo todavía se esperaría que funcionaran para administrar la sustancia terapéutica del ambiente del tumor enlazando el VEGF localizado en el tumor que no se enlaza con un receptor. Específicamente, entendieron que estos anticuerpos se enlazarán con el VEGF en el estroma del tumor y administrarán la sustancia terapéutica al mismo. Esto proporciona un recipiente de fármaco alrededor del endotelio, causando efectos citotóxicos u otros efectos destructivos en las células endoteliales vasculares y ejerciendo un efecto antitumor. El VEGF asociado con el estroma o con el tejido conectivo no está unido a un receptor VEGF en el sentido clásico, es decir, un receptor de la superficie celular. En vez de eso, el VEGF está unido a uno o más componentes de tejido conectivo, incluyendo proteoglicanos, tales como heparan ^.i-<<l4-á«te»¿-i»Aa«ri^?g-*-- >- 4.?aa-ha^-,.? sulfato proteoglicano, a través de una región básica del VEGF. Estas secuencias (y los exones que las codifican) están careciendo de proteínas VEGF121 (y el ADN sudyacente) , de manera que esta isoforma no deberá estar presente en el estroma en cantidades significaticas . VEGF en el estroma de tumor frecuentemente se denomina "libre", aunque todavía está localizado dentro del tumor, de manera que "libre" esencialmente significa no enlazado con receptor. Los inventores además dedujeron que un anticuerpo que bloquea el enlace del VEGF con uno, pero no com ambos receptores, todavía sería capaz de administrar sustancia terapéutica al ambiente del tumor enlazando al receptor enlazado VEGF en la vasculatura. Esta es una de las características más ventajosas de la presente invención. A saber, la provisión de anticuerpos que bloquean el enlace del VEGF con el VEGFR2, y por lo tanto inhibir la señal angiogénica del VEGF, pero que no bloquean el enlace del VEGF con el VEGFR1. Además de reducir los efectos laterales sistémicos manteniendo la señalización del VEGF vía el VEGFRl en otros tipos de células y tejidos, estos anticuerpos son capaces de localizar el complejo de VEGF-VEGFRl en la vasculatura del tumor y administrar sustancia terapéutica directamente a la misma . Tanto el VEGFR1 como el VEGFR2 están sobre-regulados en las células endoteliales del tumor, en oposición a las «.¡ ¿.?ÍA*.ímí£¡A células endoteliales en los tejidos normales. El VEGFR1 está muy expresado en el endotelio vascular del tumor, lo cual hace que los aspectos de dirección al blanco de la presente invención sean particularmente efectivos. De hecho, el VEGFRl, aunque "no señalante" en el endotelio, se expresa cuando menos a los mismos niveles del VEGFR2, si no es que a niveles más altos. Un factor que se enlace a este fenómeno es que el VEGFR1 está super-regulado como respuesta tanto a la hipoxia como al VEGF, mientras que el VEGFR2 solamente está sobre- regulado como respuesta al VEGF y no está influenciado por la hipoxia . Aunque el papel del VEGFR1 en el endotelio sigue siendo incierto, el VEGFR1 puede actuar como un receptor decay para "capturar" el VEGF y pasar a ligandos sobre el receptor de señalamiento, VEGFR2. Para que esto sea cierto, uno operaría que el receptor decoy tenga una mayor afinidad para el VEGF que el receptor de señalamiento, lo cual sin duda es el caso. A la luz de esto, y también tal vez debido a los niveles de expresión aumentados, los anticuerpos que bloquean el VEGFR2 pero no bloquean al VEGFR1 de esta invención son sustancias de administración ideales para el tratamiento de tumor. Conjugados terapéuticos de estos anticuerpos son capaces de inhibir simultáneamente la angiogénesis antitumor del VEGFR2 y destruir la vasculatura existente administrando la sustancia terapéutica al complejo receptor VEGF-VEGFRl .
Los inventores de ningún modo se limitan al razonamiento científico anterior como una explicación para las propiedades benéficas antiangiogénicas y localizantes del tumor de los presentes anticuerpos. Aunque la utilidad de la invención es autoevidente y no necesita teorías adyacentes para llevarla a la práctica, los inventores han considerado mecanismos alternativos mediante los cuales los anticuerpos que bloquean el VEGFR2 y no al VEGFR1 serán efectivamente y específicamente localizar a la vasculatura del tumor. Estos anticuerpos podrían enlazarse con el VEGF que está asociado con Npn-1 o con otra, proteína de enlace de VEGF todavía no caracterizada en la superficie celular o podría enlazar al VEGF que está enlazado con heparan sulfato proteoglicanos en la superficie de las células endoteliales. La localización de anticuerpo podría aumentarse enlazando con otro miembro de la familia de proteínas del VEGF, es decir, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, que se asocia con los vasos sanguíneos, aunque esto es menos probable. Otra propiedad ventajosa de los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 ó 2C3 de la invención es que estos anticuerpos neutralizan la señal de supervivencia o "efecto protector" del VEGF, el cual está mediado a través del VEGFR2. Además de hacer a los anticuerpos más efectivos por sí, esta propiedad los hace particularmente útiles en combinación con otras sustancias que están impedidas por la función de MjLtJte4l i-Ant4.il.*,.
A3*-: 1 ? ¿ supervivencia del VEGF. Por ejemplo, el VEGF protege el endotelio de la radioterapia. Por lo tanto, tanto los anticuerpos desnudos como los inmunoconjugados de la presente invención son ideales 5 para su uso en combinación con radioterapia. Aún más beneficios son proporcionados por el uso de un anticuerpo así unido a una sustancia radioterapéutica . Este tipo de construcción tendría la triple ventaja de: (1) ejercer un efecto antiangiogénico a través de la porción del anticuerpo; 10 (2) ejercer un efecto destructivo de la vasculatura del tumor a través de la administración de la sustancia radioterapéutica; y (3) evitar la señal de supervivencia típica del VEGF de contra-atacar los efectos de la sustancia radioterapéutica. Otras construcciones con efectos sinérgicos similares 15 son anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 en asociación con fármacos antitubulina o profármacos, sustancias anti- apoptópicas y otras sustancias antiangiogénicas. Las acciones de las sustancias o fármacos que causan apoptosis se antagonizan mediante el VEGF. La presente invención por lo 20 tanto mejora la efectividad de estas sustancias neutralizando al VEGF. Las señales de supervivencia del VEGF también se oponen a endostatina, limitando esta terapia. Por lo tanto, en uso combinado con la endostatina, los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 o 2C3 de la invención neutralizarán el VEGF 25 y amplificarán los efectos antitumor de la endostatina. El 2C3 AltSkí? «.fcfcjfcfc, " - | u otros anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 también se puede usar para administrar específicamente colagenasa al tumor, en donde la colagenasa producirá endostatina en el sitio, logrando beneficios similares. En todas estas combinaciones aumentadas o sinérgicas, los anticuerpos y otras sustancias se pueden administrar por separado, o los segundos agentes se pueden enlazar a los anticuerpos para la administración específico (es decir, la administración dirigida al VEGFR1) . En combinaciones con endostatina, los conjugados químicos o proteínas de fusión recombinante se preferirán, ya que éstas contra-restarán la corta vida media de la endostatina, que actualmente es una limitación de la terapia potencial con endostatina. Las combinaciones con, o las formas dirigidas de, activador de plasminógeno de tejido (tPA) también se pueden emplear. Otras ventajas de la terapia de la presente invención incluye la capacidad para disminuir la presión intersticial. Ya que la permeabilidad aumentada mediada por VEGF contribuye a la presión intersticial, el señalamiento reducido vía el VEGFR2 reducirá tanto la permeabilidad como la presión intersticial. Esto es, a su vez, lo que reduce la barrera a los fármacos que atraviesan por entero el tejido del tumor, ya que las células de tumor distantes de la vasculatura se puedan morir. La terapia prolongada puede también lograrse ya que las presentes composiciones no tienen, o tienen inmunogenicidad tif ' UTri fr ti l -.taifas *¡ste A &!.-*. ,,a.j!^,ji1Éitta¡^-^^ ^ despreciable o baja. B3. Anticuerpos 2C3 secuencias CDR El término "variable" como se usa en la presente en referencia a los anticuerpos, significa que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en anticuerpo entre secuencias, y se usan en enlazar y la especificidad de cada anticuerpo particular con su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en todas las variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados "regiones hipervariables" , tanto en los dominios de la cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones mejor conservadas de los dominios variables se llaman la región de estructura (FR) . Los dominios variables de las cadenas originales pesadas y ligeras cada una comprende cuatro estructuras (FR1, FR2 , FR3 y FR4 , respectivamente) , que adapta en mayor medida una configuración de hoja ß conectado por tres regiones hipervariables, que forman ciclos que comunican, y en algunos casos forman parte de, la estructura de hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana mediante la estructura, y las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de antiangiogénica (Kabat y colaboradores, 1991, específicamente incorporada en la presente mediante referencia) . Los dominios constantes no están interesados directamente en enlazar un anticuerpo con un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo. El término "región hipervariable", como se usa en la presente, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables del enlace de antígenos . La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región de determinación de complementariedad" o "CDR" (es decir, los residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl), 50-56 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat y colaboradores, 1991, específicamente incorporada en la presente mediante referencia) y/o aquellos residuos de un "ciclo hipervariable" (es decir los residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada) . "Estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de región hipervariable como se definen en la presente. El ADN y las secuencias de aminoácidos reducidas de las cadenas Vh y VK del fragmento ScFc de 2C3 se proporciona en la presente como SEQ ID NO: 6, 7, 8 y 9. Estas secuencias abarcan CDRl-3 de las regiones variables y de las cadenas ligeras del anticuerpo.
Como se describe en la presente (Sección C3), con la provisión de información estructural y funcional para una molécula biológica, un rango de moléculas equivalentes o aún mejoradas se puede generar. Esto se aplica a los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 de la presente invención, como se ejemplifica por los anticuerpos 2C3. Aunque el enlace antígeno y otras propiedades funcionales de un anticuerpo se deben conservar, hay un grado extremadamente alto de antígeno alto para hacer anticuerpos equivalentes y aún mejorados en cuanto un anticuerpo de referencia se ha proporcionado. Esta técnica puede, a la luz de las secuencias y la información proporcionada en la presente, aplicarse a la producción de otros anticuerpos que tengan características parecidas, mejoradas o de otro modo deseables. Para anticuerpos equivalentes, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en la constante de anticuerpo o regiones de estructura de dominio variable sin pérdida apreciable de capacidades interactivas. Es preferiblemente que estos cambios se hagan en las secuencias de ADN que codifican las porciones de anticuerpo y que los cambios sean de naturales a conservadores (véase la Sección1 C3, la información de codon en la Tabla A, y los detalles técnicos de apoyo en la mutagénesis específica del sitio) . Naturalmente, hay un límite al número de cambios que deberán hacerse, pero esto será conocido por los expertos en la técnica.
Otros tipos de variantes son anticuerpos con propiedades biológicas liberadas en relación con el anticuerpo padre del cual se generaron. Estas variantes, o compuestos de segunda generación, típicamente son variantes de sustitución que implican uno o más residuos de región hipervariable sustituidos de un anticuerpo padre. Una manera conveniente para generar estas variantes de sustitución es la maduración de afinidad usando el despliegue de fagos. En la maduración de afinidad usando despliegue de fagos, varios sitios de regiones hipervariables (v.gr., 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones posibles de amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se despliegan en una manera monovalente de partículas de fago filamentoso como fusiones al producto del gen III del M13 empacado con cada partícula. Las variantes desplegadas de fago se seleccionan para determinar su actividad biológica (v.gr., afinidad de enlace) como se describe en la presente. Con el fin de identificar los sitios de regiones hipervariables candidatos para la modificación, la mutagénesis de escaneo de alanina se puede realizar, para identificar residuos de regiones hipervariables que contribuyen significativamente al enlace de antígeno. De manera alternativa, o además, se contempla que la estructura de cristal del complejo de antígeno-anticuerpo se delinee y analice para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el VEGF. Estos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos por sustitución. En cuanto se generan otras variantes, el panel de variantes se somete a selección, como se describe en la presente, en los anticuerpos con análogos pero propiedades diferentes o aún superiores en uno o más ensayos relevantes se seleccionan para el desarrollo posterior . Otros aspectos de la invención por lo tanto se refieren a segmentos aislados de ADN y vectores recombinantes que codifican regiones CDR de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, tales como cadenas pesadas y ligeras del 2C3 y la creación y uso de células hospederas recombinantes a través de la aplicación de tecnología de ADN, que expresa esta expresión CDR. La presente invención, de este modo se concierne a segmentos de ADN, aislable de cualquier mamífero, preferiblemente humano o murino, que estén libres de ADN genómico total y sean capaces de expresar regiones CDR de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 tales como cadenas pesadas y ligeras 2C3. Como se usa en la presente, el término "segmento de ADN" se refiere a una molécula de ADN que ha sido aislada libre de ADN genómico total de una especie particular. Incluido dentro del término "segmento de ADN", están los segmentos de ADN y fragmentos menores de estos segmentos, y también vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, y similares. De manera similar, un segmento de ADN que comprende un segmento de codificación o porción de gen aislado que codifica regiones de CDR purificadas de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, tales como cadenas pesadas y ligeras de 2C3, se refieren a un segmento de ADN que incluye esta secuencia de codificación y, en ciertos aspectos, secuencias reguladoras aisladas sustancialmente entre alejadas de otros genes que se presentan naturalmente o secuencias que codifican proteínas. Con respecto a ésto, el término "gen" se usa por simplicidad para referirse a una proteína funcional, polipéptido o unidad que codifica péptido. Como se entenderá por los expertos en la técnica, este término funcional incluye secuencias que codifican anticuerpos y segmentos diseñados técnicamente a menores que expresan, o se pueden adaptar para expresar, proteínas de enlace de antígeno convenientes, polipéptidos o péptidos . "Sustancialmente aisladas alejados de otra secuencia de codificación" significa que el segmento de codificación o porción del gen aislado de interés forma la parte significativa de la región de codificación del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene porciones grandes de ADN que se presenta naturalmente, tal como fragmentos cromosomales grandes ^.UM^A^^^A^-^ u otros genes funcionales o regiones de codificación de ADNc. Desde luego, esto se refiere al segmento de ADN como se aisló originalmente, y no excluye genes o regiones de codificación añadidos después al segmento por la mano del hombre. En modalidades particulares, la invención se refiere a segmentos de codifidación aislados o porciones de gen aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencia de ADN que codifican regiones CDR de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2, tales como las cadenas pesadas y ligeras de 2C3, que comprenden cuando menos una primera región de secuencia que incluye una región de secuencia de aminoácidos de cuando menos aproximadamente 75 por ciento, más preferiblemente, cuando menos aproximadamente 80 por ciento, más preferiblemente, cuando menos aproximadamente 85 por ciento, más preferiblemente, cuando menos aproximadamente 90 por ciento y más preferiblemente, cuando menos aproximadamente 95 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9; en donde las regiones CDR cuando menos sustancialmente mantiene las propiedades biológicas de la región CDR de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9. Como se describe en la presente, las secuencias pueden comprender ciertos aminoácidos equivalentes biológicamente funcionales o "sustituciones conservadoras". Otras secuencias pueden comprender aminoácidos funcionalmente it^jM^-AH^^^*^*-*^"^--»^^ no equivalentes o "sustituciones no conservadoras" deliberadamente diseñadas técnicamente para mejorar las propiedades de la CDR o del anticuerpo que contiene CDR, como se sabe por los expertos en la técnica y se describe adicionalmente en la presente. También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos adicionales de terminal N o C o secuencias 5 ' ó 3 ' , y cada día corresponder a una secuencia de la invención, en tanto la secuencia satisfaga los criterios presentados anteriormente, preferiblemente incluyendo el mantenimiento o mejoramiento de la actividad de proteína biológica en donde en lo que se refiere a la expresión de la proteína. La adición de secuencias terminales incluyen varias secuencias de no codificación que flanquean ya sea las porciones 5' ó 3' o de la región de codificación, y también regiones de control. Los segmentos de ácido nucleico de la presente invención de este modo, se pueden combinar con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de encima de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos de codificación, y similares, tales que la longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto se contempla que un fragmento de ácido nucleico de casi una longitud se puede emplear, ki&^ £¿ .Í? limitando preferiblemente la longitud total por la facilidad de la preparación y uso del protocolo de ADN recombinante pretendido . Los vectores recombinantes por lo tanto forman otros aspectos de la presente invención. Los vectores particularmente útiles se contemplan como los vectores en los cuales la porción de codificación del segmento de ADN se coloca bajo el control de un promotor. Generalmente, aunque no exclusivamente, un promotor recombinante o heterólogo se empleará, es decir, un promotor no asociado normalmente con secuencias de codificación en su ambiente natural. Estos promotores pueden incluir promotores bacterianos, virales, eucarióticos y mamíferos, en tanto el promotor efectivamente dirija la expresión en el segmento de ADN en el tipo célula, organismo, o animal, elegido para la expresión. El uso del promotor y combinaciones de tipos de células para la expresión proteína es conocido por los expertos en la técnica y la biología molecular. Los promotores empleados pueden ser constitutivos o inducibles, y se pueden usar bajo las condiciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas o péptidos recombinantes. La expresión de las secuencias de ácido nucleico de la invención se puede lograr convenientemente por una o más *é3tt¡ .*?¡i ¿ técnicas estándares conocidas para los expertos en la técnica y descritas adicionalmente en la presente. Por ejemplo, la última descripción de la expresión recombinante de las proteínas de fusión se aplica igualmente bien a los anticuerpos y a los fragmentos de anticuerpos que no se asocien operativamente con otra secuencia de codificación al nivel del ácido nucleico. B4. .Anticuerpos Policlonales Los elementos para preparar y caracterizar anticuerpos son muy conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; incorporada en la presente mediante referencia) . Para preparar antisueros policlonales un animal se inmuniza con una composición de VEGF inmunogénico, y los antisueros recolectados de ese animal inmunizado. Un amplio rango de especies animales se puede usar para la producción de antisuero. Típicamente el animal usado para la producción de antisuero es un conejo, ratón, rata, hámster, conejillo de indias o chivo. Debido al volumen relativamente grande de los conejos, un conejo es la elección preferida para la producción de anticuerpos policlonales . La cantidad de composición de inmunógeno VEGF usada en la producción de anticuerpos policlonales varía según la naturaleza del inmunógeno así como el animal usado para la inmunización. Una variedad de rutas se pueden usar para administrar el presente inmunógeno de VEGF; subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa, intraperitoneal e intraesplénica . La producción de anticuerpos policlonales se puede monitorear muestreando sangre del animal inmunizado en varios puntos después de la inmunización. Una segunda inyección de refuerzo, también se le puede dar. El proceso de refuerzo y titulación se repite hasta que se logra una titulación conveniente. Cuando se obtiene un nivel de titulación deseado, el animal inmunizado se puede sangrar y el suero aislar y almacenar. El animal también se puede usar para generar anticuerpos monoclonales. Como es muy conocido en la técnica, la inmunogenicidad de una composición particular se puede aumentar mediante el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes ejemplares incluyen adyuvante de Freund completo, un estimulador específico de la respuesta inmune que contiene Mycobacteri um tuberculosis muertas; adyuvante de Freund incompleto; y adyuvante de hidróxido de aluminio. Puede ser deseado reforzar el sistema inmunológico de la hospedera, lo que se puede lograr asociando el VEGF con, o acoplando el VEGF con, un portador. Los portadores ejemplares son (KLH) y albúmina de suero bovino (ASB) . Otras albúminas tales como la ovalbúmina, albúmina de suero de ratón o la albúmina de suero de conejo también se pueden usar como portadores. Como también se conoce en la técnica, una composición dada puede variar en su inmunogenicidad. Sin embargo, la generación de anticuerpos contra el VEGF no es particularmente difícil. B5. Anticuerpos Monoclonales Varios métodos para generar anticuerpos monoclonales (MAbs) también son muy conocidos ahora en la técnica. Las técnicas de generación de anticuerpos monoclonales más estándares generalmente comienzan a lo largo de las mismas líneas que aquellos para preparar anticuerpos policlonales (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; incorporada en la presente mediante referencia) . Una respuesta de anticuerpo policlonal se inicia inmunizando un animal con una composición de VEGF inmunogénico y, cuando se obtiene un nivel de titulación deseado, el animal inmunizado se puede emplear para generar anticuerpos monoclonales . Los anticuerpos monoclonales pueden ser fácilmente preparados a través del uso de técnicas muy conocidas, tales como las ejemplificadas en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,196,265, incorporada en la presente mediante referencia. Típicamente, esta técnica involucra inmunizar un animal conveniente con la composición de inmunógeno de VEGF seleccionada. La composición inmunizante se administra de una manera efectiva para estimular las células de producción de anticuerpos. Los roedores tales como ratones y ratas son los animales preferidos, sin embargo, el uso de conejos, ovejas y sapos también es posible. El uso de ratas puede proporcionar ciertas ventajas (Goding, 1986, páginas 60-61; incorporada en la presente mediante referencia), pero se prefieren los ratones, siendo el más preferido el ratón BALB/c y éste se usa de manera más rutinaria y generalmente da un porcentaje más alto de fusiones estables. Después de la inmunización, las células somáticas con el potencial para producir anticuerpos de VEGF, específicamente linfocitos B (células B) , se seleccionan para su uso en el protocolo para generar anticuerpos monoclonales. Estas células se pueden obtener a partir de bazos, amígdalas o ganglios linfáticos, o de muestras de sangre periférica. Las células del bazo y las células de la sangre periférica se prefieren, las primeras debido a que son una fuente rica de células que producen anticuerpos que están en la etapa de plasmablasto de división, y las últimas porque la sangre periférica es fácilmente accesible. Frecuentemente, un panel de animales habrán sido inmunizados y el bazo del animal con la titulación de anticuerpos más alta será removido y se obtendrán los linfocitos del bazo homogenizando el bazo con una jeringa. Típicamente, un bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente 5 X 107 hasta 2 X 108 linfocitos. Los linfocitos B que producen anticuerpos anti-VEGF a partir del animal inmunizado se fusionan entonces con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente uno de la misma especie que el animal que fue inmunizado. Las líneas de células de mieloma convenientes para su uso en procedimientos de fusión que produce hibridoma preferiblemente son los que no producen anticuerpos, tienen alta eficiencia de fusión, y deficiencias de enzimas que los vuelven incapaces de crecer en ciertos medios selectivos los cuales soportan el crecimiento de solamente las células fusionadas deseadas (hibridomas) . Cualquiera de un número de células de mieloma se puede usar, como se conoce por los expertos en la técnica (Goding, páginas 65-66, 1986; Campbell, páginas 75-83, 1984; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Por ejemplo, cuando un animal inmunizado es un ratón, uno puede usar PE-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para ratas, uno puede usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, 4B210 o una de las líneas celulares de ratón enlistadas anteriormente; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6, todos son útiles en relación con las fusiones de células humanas. Los métodos para generar híbridos de células de bazo y de ganglios linfáticos que producen anticuerpos y de células de mieloma usualmente comprenden las células somáticas con células de mieloma en una proporción de 4:1, aunque la proporción puede variar de desde aproximadamente 20:1 hasta J?? ^h????.^*^ aproximadamente 1:1, respectivamente, en la presencia de una sustancia o sustancias (químicas o eléctricas) que promueven la fusión de las membranas celulares. Los métodos de fusión usando el virus Sendai se han descrito por Kohler y Milstein (1975; 1976; cada una incorporada en la presente mediante referencia), y aquellos que usan polietilenglicol (PEG), tal como 37 por ciento (volumen/volumen) de polietilenglicol, por Gefter y colaboradores, (1977; incorporada en la presente mediante referencia) . El uso de métodos de fusión inducidos eléctricamente también es adecuado (Goding páginas 71-74, 1996; incorporada en la presente mediante referencia) . Los procedimientos de fusión usualmente producen híbridos viables a bajas frecuencias, aproximadamente 1 x 10"6 hasta 1 x 10~8. Sin embargo, esto no plantea un problema, ya que los híbridos viables, fusionados se diferencian de las células padres no fusionadas (particularmente las células de mieloma no fusionadas que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente) cultivando en un medio selectivo. El medio selectivo generalmente es uno que contiene una sustancia que bloquea la síntesis de novo de los nucleótidos en el medio de cultivo de tejido. Las sustancias ejemplares y preferidas son aminopterina, metotrexato, y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la síntesis de novo tanto de purinas como de pirimidinas, mientras que los bloques de azaserina solamente la síntesis de purina. Cuando se usa aminopterina o metotrexato, los medios se suplementan con hipoxantina y timidina como una fuente de nucleótidos (medio HAT) . Cuando se usa azaserina, los medios se suplementan con hipoxantina. El medio de selección preferido es HAT. Solamente las células capaces de operar sendas salvajes de nucleótidos son capaces de sobrevivir en el medio HAT. Las células de mieloma carecen de enzimas claves de la senda salvaje, es decir, hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT) , y no pueden sobrevivir. Las células B pueden operar esta senda, pero tienen una extensión de vida limitada en cultivo y generalmente mueren dentro de dos semanas. Por lo tanto, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son aquellos híbridos formados a partir de las células B y mieloma. Este cultivo proporciona una población de hibridomas a partir de la cual se seleccionan los hibridomas específicos. Típicamente, la selección de hibridomas se realiza mediante el cultivo de células por dilución de clona única en placas de microtitulación seguidas por probar los sobrenadantes clónales individuales (después de aproximadamente dos a tres semanas) para la reactividad anti-VEGF deseada. La prueba podría ser sensible, simple y rápida, como los radioinmunoensayos, los inmunoensayos de enzimas, los ensayos citotóxicos, los ensayos de placa, los ensayos de inmunoenlace de punto, y similares. Los hibridomas seleccionados se diluirían serialmente y clonarían en líneas celulares que producen anticuerpos anti- VEGF individuales, cuyos clones pueden propagarse indefinidamente para proporcionar anticuerpos monoclonales. Las líneas celulares se pueden explotar a la producción de anticuerpos monoclonales en dos maneras básicas. Una muestra de hibridoma se puede inyectar (frecuentemente en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se usó para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original . El animal inyectado desarrolla tumores secretando el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido de célula fusionada. Los fluidos corporales del animal, tales como suero o fluido de ascitas, se pueden entonces golpear para proporcionar anticuerpos monoclonales a alta concentración. Las líneas celulares individuales podrían también ser cultivadas in vi tro, en donde los anticuerpos monoclonales se secretan naturalmente en el medio de cultivo a partir del cual pueden fácilmente obtenerse en altas concentraciones . Los anticuerpos monoclonales producidos por cualquier medio generalmente se purificarán adicionalmente, por ejemplo, usando filtrado, centrifugación y varios métodos cromatográficos, tales como cromatografía líquida de alto rendimiento o cromatografía por afinidad, todas aquellas técnicas de purificación son muy conocidas para los expertos en la técnica. Las técnicas de purificación involucran el fraccionamiento para separar el anticuerpo deseado de otros componentes de una mezcla. Los métodos analíticos particularmente convenientes para la preparación de anticuerpos incluyen, por ejemplo, cromatografía de proteína A-Sefarosa y/o proteína G-Sefarosa. B6. Anticuerpos de Bibliotecas de Fagémidos La tecnología recombinante ahora permite la preparación de anticuerpos que tienen la especificidad deseada a partir de genes recombinantes que codifican un rango de anticuerpos (Van Dijk y colaboradores, 1989; incorporada en la presente mediante referencia) . Ciertas técnicas recombinantes usan el aislamiento de genes de anticuerpos por selección inmunológica de bibliotecas de expresión de fagos de inmunoglobulina combinatoria preparadas a partir de ARN aislado del bazo de un animal inmunizado (Morrison y colaboradores, 1986; Winter y Milstein, 1991; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Para estos métodos, las bibliotecas de fagémidos de inmunoglobulina combinatoria se preparan a partir de ARN aislado a partir del bazo del animal inmunizado, y los fagémidos que expresan los anticuerpos adecuados se seleccionan por lavado en batea, usando células que expresan el antígeno de las células de control. Las ventajas de este enfoque sobre las técnicas de hibridoma convencionales son que aproximadamente 104 veces tantos anticuerpos se pueden producir y seleccionar en una sola ronda, y que se general nuevas especificidades por la combinación de la cadena H y la cadena L, lo cual aumenta adicionalmente el porcentaje de anticuerpos adecuados generados . Un método para la generación de un gran repertorio de diversas moléculas de anticuerpos en bacterias utilizan el bacteriófago lambda como el vector (Huse y colaboradores, 1989; incorporada en la presente mediante referencia) . La producción de anticuerpos que usan el vector lambda implica la clonación de poblaciones de cadenas pesadas y ligeras de las secuencias de ADN en vectores iniciales por separado. Los vectores se combinan posteriormente aleatoriamente para formar un solo vector que dirige la coexpresión de cadenas pesadas y ligeras para formar fragmentos de anticuerpos. Las secuencias de ADN de cadena pesada y ligera se obtienen por amplificación, preferiblemente por reacción de cadena de polimerasa (PCRMR) o una técnica de amplificación relacionada, de ARNm aislado a partir de células de bazo (ó hibridomas de las mismas) de un animal que ha sido inmunizado con un antígeno seleccionado. Las secuencias de cadena pesada y ligera típicamente se amplifican usando cebadores que incorporan sitios de restricción en los extremos del segmento de ADN amplificado para facilitar la clonación de los segmentos de cadena pesada y ligera en los vectores iniciales. Otro método para la generación y selección de bibliotecas grandes de sitios de combinación de anticuerpos enteros o parcialmente sintéticos, o paratopos, utiliza vectores de despliegue derivados de fago filamentoso, tal como M13, fl o fd. Estos vectores de despliegue de fago filamentoso, conocidos como "fagémidos", producen grandes bibliotecas de anticuerpos monoclonales que tienen diversas y novedosas inmunoespecificidades . La tecnología usa un dominio de ancla de membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso como un medio para enlazar el producto del gen y el gen durante la etapa de ensamble de la réplica de fago filamentoso, y se ha usado para la clonación y expresión de anticuerpos a partir de bibliotecas combinatorias (Kang y colaboradores, 1991; Barbas y colaboradores, 1991) cada una incorporada en la presente mediante referencia). Esta técnica general para el despliegue de fago filamentoso se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,658,727, incorporada en la presente mediante referencia. En un sentido más general, el método proporciona un sistema para la clonación y selección simultánea de especificidades de enlace con ligando preseleccionado a partir de repertorios de genes de anticuerpos usando "un solo sistema de vector. La selección de miembros aislados de la biblioteca para una capacidad de enlace de ligando preseleccionada permite la correlación de la capacidad de enlace de una molécula de anticuerpo expresada con un medio conveniente para aislar el gen que codifica al miembro de la J. Jftii&í-M-afáÜ ?a^**f*****^?i**ii biblioteca . El enlace de la expresión y la selección se llevan a cabo mediante la combinación de dirigirse a un polipéptido de fusión en el periplasma de una célula bacteriana para permitir el ensamble de un anticuerpo funcional, y la dirección de un polipéptido de fusión sobre el recubrimiento de una partícula de fago filamentoso durante el ensamble del fago para permitir la selección conveniente del miembro de interés de la biblioteca. La dirección periplásmica se proporciona por la presencia de un dominio de señal de secreción en un polipéptido de fusión. Tomar como blanco una partícula de fago se proporciona mediante la presencia de un dominio de ancla de membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso (es decir, un dominio de ancla de membrana derivada de cpIII o cpVIII) en un polipéptido de fusión. La diversidad de una biblioteca de anticuerpos combinatorios basados en fagos filamentosos se puede aumentar cambiando de genes de cadenas pesadas y ligeras, alterando una o más de las regiones de determinación de complementariedad de los genes de cadena pesada clonados de biblioteca, o introduciendo mutaciones aleatorias en la biblioteca mediante reacción de cadena de polimerasa propensa a error. Otros métodos para seleccionar bibliotecas de fagémidos se describen en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,580,717; 5,427,908; 5,403,484; y 5,223,409, cada una lÁáAi.A,.Í-zsaáx.i , ^ia.tA^ ^IA..¿Í.AaÍ? incorporada en la presente mediante referencia. Otro método para la selección de grandes bibliotecas de anticuerpos combinatorios se ha desarrollado, utilizando la expresión de poblaciones de diversas secuencias de cadenas pesadas y ligeras en la superficie de un bacteriófago filamentoso, tal como M13, fl o fd (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,698,426; incorporada en la presente mediante referencia) . Dos poblaciones de diversas secuencias de cadenas pesada (He) y ligera (Lc) se sintetizan por la reacción de cadena de polimerasa (PCRMR) . Estas poblaciones se clonan en vectores basados en M13 que contienen los elementos necesarios para la expresión. El vector de cadena pesada contiene una secuencia de proteína de recubrimiento de gen VIII (gVIII), de manera que la traducción de la secuencia de cadena pesada produce las proteínas de fusión gVIII-Hc. Las poblaciones de dos vectores se combinan aleatoriamente, de manera que solamente las porciones del vector que contienen las secuencias He y Lc se unen en un solo vector circular. El vector combinado dirige la coexpresión tanto de las secuencias He y Lc para ensamblar los dos polipéptidos y la expresión de superficie en M13 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,698,426; incorporada en la presente mediante referencia) . El paso de combinación aleatoriamente junta secuencias de codificación He y Lc diferentes dentro de dos poblaciones distintas en un solo vector. Las secuencias de vectores donados de cada vector independiente son necesarias para la producción de un fago viable. También, ya que las secuencias de seudo gVIII están contenidas solamente uno de los dos vectores iniciales, la coexpresión de fragmentos de anticuerpos funcionales como proteínas de fusión gVIII-Hc asociados con Lc no se puede llevar a cabo en la superficie del fago hasta que las secuencias del vector se enlace en un solo vector . La expresión superficial de la biblioteca de anticuerpos se realiza en una cepa supresora de ámbar. Un codón de detención de ámbar entre la secuencia He y la secuencia gVIII desenlaza los dos componentes en una cepa no supresora. Aislando el fago producido a partir de la cepa no supresora e infectando una cepa supresora se enlazarán las secuencias He con la secuencia gVIII durante la expresión. Cultivando la cepa supresora después de la infección se permite la coexpresión en la superficie de M13 de todas las especies de anticuerpos dentro de la biblioteca como proteínas de fusión gVIII (proteínas de fusión gVIII-Fab) . Alternativamente, el ADN se puede aislar a partir de la cepa no supresora y luego introducirse en una cepa supresora para llevar a cabo el mismo efecto . La biblioteca de expresión superficial se selecciona para determinar fragmentos específicos Fab que se enlazan con moléculas preseleccionadas mediante procedimientos de aislamiento por afinidad estándares. Estos métodos incluyen, por ejemplo, lavado con batea (Parmley y Smith, 1988; incorporada en la presente mediante referencia), cromatografía por afinidad y procedimientos de manchado en fase sólida. El lavado con batea se prefiere, debido a que se pueden seleccionar titulaciones altas de fago fácilmente, rápidamente y en volúmenes pequeños. Además, este procedimiento puede seleccionar fragmentos menores de Fab de especies dentro de la población, lo cual de otro modo habría sido indetectable, y amplificar a poblaciones sustancialmente homogéneas. Los fragmentos Fab seleccionados se pueden caracterizar secuenciando los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos después de la amplificación de la población de fagos . Otro método para producir distintas bibliotecas de anticuerpos y seleccionar las especificidades de enlace deseables se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,667,988, y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,759,817, cada una incorporada en la presente mediante referencia. El método implica la preparación de bibliotecas de moléculas de inmunoglobulina heterodimérica en forma de bibliotecas de fagémidos que usan oligonucleótidos degenerados y reacciones de extensión de cebadores para incorporar las degeneraciones en las regiones de RDC de los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras variables de inmunoglobulina, y desplegar los polipéptidos mutagenizados en la superficie del fagémido. Después de eso, la proteína de despliegue se selecciona por su capacidad para enlazarse con un antígeno preseleccionado. El método para producir una molécula de inmunoglobulina heterodimérica generalmente implica (1) introducir un gen de codificación de región V de cadena pesada o ligera de interés en el vector de despliegue de fagémido; (2) introducir un sitio de enlace aleatorizado en el vector de proteína de despliegue de fagémido por la extensión del cebador con un oligonuleótido que contiene regiones de homología con un RDC del gen de región V de anticuerpo y que contiene regiones de regeneración para producir secuencias de codificación aleatorizadas para formar una gran población de vectores de despliegue, cada uno capaz de expresar diferentes sitios de enlace putativos desplegados sobre una proteína de despliegue de superficie de fagémido; (3) expresar la proteína de despliegue y el sitio de enlace sobre la superficie de una partícula de fago filamentoso; y (4) aislar (seleccionar) la partícula de fago expresada en la superficie usando técnicas de afinidad, tales como lavado en batea de partículas de fago contra un antígeno previamente seleccionado, aislando mediante esto una o más especies del fagémido que contiene una proteína de despliegue que contiene un sitio de enlace que se enlaza con un antígeno preseleccionado.
" ¿..-Akíít -i Otra variación de este método para producir diversas bibliotecas de anticuerpos y seleccionar especificidades de enlace deseables se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,702,892, incorporada en la presente mediante referencia. En este método, solamente se emplean secuencias de cadena pesada, las secuencias de cadena pesada se aleatorizan en todas las posiciones del nucleótido, las cuales codifican, ya sea, la región hipervariable RDCI o RDCIII, y la variabilidad genética en las RDCs se genera independientemente de cualquier proceso biológico. En el método, dos bibliotecas se diseñan técnicamente para genéticamente cambiar los motivos de oligonucleótidos dentro del marco estructural de la estructura del gen de cadena pesada. En toda la mutación aleatoria, ya sea de la RDCI o RDCIII, las regiones hipervariables en el gen de cadena pesada se reconstruyeron para dar como resultado una colección de secuencias muy diversas. Las proteínas de cadena pesada codificadas por la colección de secuencias de gen mutados posee el potencial para tener todas las características de enlace de una inmunoglobulina, al mismo tiempo que requiere solamente una de las dos cadenas de inmunoglobulina. Específicamente, el método se practica en ausencia de la proteína de cadena ligera de inmunoglobulina. Una biblioteca de fago que despliega proteínas de cadena pesada modificadas se incuba con un ligando inmovilizado para seleccionar clonas que ¿ÍX-.-AJÍA*.. codifican proteínas recombinantes que específicamente enlazan al ligando inmovilizado. El fago unido se disocia del ligando inmovilizado y se amplifica mediante cultivo en células hospederas bacterianas. Las placas virales individuales, expresando cada una proteína recombinante diferente, se extienden, entonces las clonas individuales se pueden probar para determinar su actividad de enlace. B7. .Anticuerpos de Lin ocitos Humanos La inmunización in vi tro, o la estimulación de antígenos, se puede usar para generar un anticuerpo humano anti-VEGF. Estas técnicas se pueden usar para estimular los lmfocitos de la sangre periférica de sujetos sanos, normales, simplemente estimulando células que producen anticuerpos con el VEGF in vi tro . Esta "inmunización in vi tro" implica la activación específica de antígeno de linfocitos B no inmunizados, generalmente dentro de una población mezclada de linfocitos (cultivos de linfocitos mezclados, MLC) . Las inmunizaciones in vi tro también se pueden soportar por el cultivo de células B y el factor de diferenciación y las linfocinas. Los anticuerpos producidos por estos métodos frecuentemente son anticuerpos IgM (Borrebaeck y colaboradores, 1986; incorporada en la presente mediante referencia) . Otro método se ha descrito (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,681,729, incorporada en la .,«..*-., ..«AaM^m^p^^Ai,^^».^^JAJJJE presente mediante referencia) , en donde los linfocitos humanos que principalmente producen anticuerpos IgG (ó IgA) se pueden obtener. El método implica, en un sentido general, trasplantar linfocitos humanos a un animal inmunodeficiente, de manera que los linfocitos humanos "toman" en el cuerpo del animal; inmunizar el animal con un antígeno deseado, de manera que genere linfocitos humanos que produzcan un anticuerpo específico al antígeno; y recuperar los linfocitos humanos produciendo el anticuerpo a partir del animal. Los linfocitos humanos así producidos se pueden usar para producir un anticuerpo monoclonal inmortalizando los linfocitos humanos que producen el anticuerpo, clonando los linfocitos originados humanos inmortalizados obtenidos que producen el anticuerpo, y recuperando un anticuerpo monoclonal específico al antígeno deseado a partir de los linfocitos originados humanos inmortalizados clonados. Los animales inmunodeficientes que se pueden emplear en esta técnica son aquellos que no exhiben rechazo cuando los linfocitos humanos se trasplantan a los animales. Estos animales se pueden preparar artificialmente mediante tratamientos físicos, químicos o biológicos. Se puede emplear cualquier animal inmunodeficiente . Los linfocitos humanos se pueden obtener a partir de sangre periférica humana, bazo, ganglios linfáticos, amígdalas o similares. La "toma" de los linfocitos humanos trasplantados en ?fi.i..1f^^.?m ^^,.......^^....jn...,^, .*,., ^^A,......ÁJI^?<^.^A^^A^^ .A ?^^.a.^AS^=í^.^i^h^^ los animales se puede alcanzar únicamente administrando los linfocitos humanos a los animales. La ruta de administración no se restringe y puede ser, por ejemplo, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal. La dosis de linfocitos humanos no se restringe, y usualmente puede ser 106 hasta 108 linfocitos por animal. El animal inmunodeficiente se inmuniza entonces con el antígeno de VEGF deseado. Después de la inmunización, los linfocitos humanos se recuperan de la sangre, el bazo, los ganglios linfáticos u otros tejidos linfáticos mediante cualquier método convencional. Por ejemplo, las células mononucleares se pueden separar mediante el método de centrifugación Ficoll-Hypaque (gravedad específica: 1.077), y los monocitos recuperados por el método de adsorción de plato de plástico. Las células contaminantes que se originan del animal inmunodeficiente se pueden remover usando un antisuero específico a las células del animal. El antisuero se puede obtener, por ejemplo, inmunizando un segundo animal distinto con las células del bazo del animal inmunodeficiente, y recuperando el suero del animal inmunizado distinto. El tratamiento con el antisuero se pude llevar a cabo en cualquier etapa. Los linfocitos humanos también se pueden recuperar mediante un método inmunológico empleando una inmunoglobulina humana expresada en la superficie de la célula como un marcador. Mediante estos métodos, se pueden obtener linfocitos humanos que principalmente producen anticuerpos IgG e IgA específicos a uno o más epítopes de VEGF seleccionados. Los anticuerpos monoclonales se obtienen entonces a partir de linfocitos humanos mediante inmortalización, selección, crecimiento celular y producción de anticuerpos. B8. Ratones Transgénicos que Contienen Bibliotecas de Anticuerpos Humanos La tecnología recombinante ahora está disponible para la preparación de anticuerpos. Además de las bibliotecas de expresión de fagos de inmunoglobulina combinatorias descritas anteriormente, otro enfoque de clonación molecular es preparar anticuerpos a partir de ratones transgénicos que contienen bibliotecas de anticuerpos humanos. Estas técnicas se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,545,807, incorporada en la presente mediante referencia. En un sentido más general, estos métodos implican la producción de un animal transgénico que ha insertado en su línea germinal de material genético que codifica para cuando menos parte de una inmunoglobulina de origen humano, o que puede rearreglar para codificar un repertorio de inmunoglobulinas. El material genético insertado se puede producir a partir de una fuente humana, o se puede producir sintéticamente. El material puede codificar cuando menos parte de una inmunoglobulina conocida, o puede modificarse para codificar cuando menos parte de una inmunoglobulina alterada. me** 194 El material genético insertado se expresa en el animal transgénico, dando como resultado la producción de una inmunoglobulina derivada cuando menos en parte del material genético de inmunoglobulina humana insertado. Se encuentra que el material genético se reacomoda en el animal transgénico, de manera que un repertorio de inmunoglobulinas con parte o partes derivadas del material genético insertado se puede producir, aun si el material genético insertado se incorpora en la línea germinal en la posición incorrecta, o con la geometría incorrecta. El material genético insertado puede estar en forma de ADN clonado en vectores procarióticos, tales como plásmidos y/ó cósmidos. Los fragmentos de ADN más grandes se insertan usando vectores de cromosoma artificial de levadura (Burke y colaboradores, 1987; incorporada en la presente mediante referencia) , o mediante la introducción de fragmentos de cromosomas (Richer y Lo, 1989; incorporada en la presente mediante referencia) . El material genético insertado se puede introducir a la hospedera de manera convencional, por ejemplo, mediante la inyección u otros procedimientos en huevos fertilizados o en células de tallo embriónico. En aspectos preferidos, un animal hospedero que inicialmente no lleva el material genético que codifica regiones constantes de inmunoglobulina se utiliza, de manera que el animal transgénico resultante usará solamente el v,.A ?^.**ÁA¡..S ^j?jk? >^* *áaí!UL* JÍ *;4 material genético humano insertado cuando produce inmunoglobulinas. Esto se puede lograr, ya sea, usando un hospedero mutante que se presente naturalmente, que carece del material genético relevante, o haciendo artificialmente mutantes, por ejemplo, en líneas celulares finalmente para crear un hospedero, a partir del cual el material genético relevante se ha removido. Cuando el animal hospedero lleva material genético que codifica regiones constantes de inmunoglobulina, el animal transgénico llevará el material genético que se presenta naturalmente y el material genético insertado, y producirá inmunoglobulinas derivadas del material genético que se presenta naturalmente, el material genético insertado, y mezclas de ambos tipos de material genético. En este caso, la inmunoglobulina deseada se puede obtener seleccionado hibridomas derivados del animal transgénico, por ejemplo, explotando el fenómeno de la exclusión alélica de la expresión del gen de anticuerpo o la pérdida de cromosoma diferencial. En cuanto se ha preparado un animal transgénico conveniente, el animal simplemente se inmuniza con el inmunógeno deseado. Dependiendo de la naturaleza del material insertado, el animal puede producir una inmunoglobulina quimérica, por ejemplo, de origen de ratón/humano mezclados, en donde el material genético de origen extraño codifica solamente parte de la inmunoglobulina; o el animal puede producir una inmunoglobulina completamente extraña, por ejemplo, de origen completamente humano, en donde el material genético del origen extraño codifica una inmunoglobulina entera. Se puede producir antisuero policlonal a partir del animal transgénico después de la inmunización. Las células que producen inmunoglobulina se pueden remover del animal para producir la inmunoglobulina de interés. Preferiblemente, se producen anticuerpos monoclonales a partir del animal transgénico, por ejemplo, fusionando células del bazo a partir del animal con células de mieloma y seleccionando los hibridomas resultantes para elegir aquellos que producen el anticuerpo deseado. En la presente se describen técnicas adecuadas para estos procesos . En un enfoque alternativo, el material genético se puede incorporar en el animal, de manera que el anticuerpo deseado se produce en los fluidos corporales, tales como suero o secreciones externas del animal, tales como leche, calostro o saliva. Por ejemplo, insertando material genético in vi tro que codifica cuando menos parte de una inmunoglobulina humana en un gen de codificación de un mamífero para una proteína de la leche y luego introducir el gen a un huevo fertilizado del mamífero, por ejemplo, mediante inyección, el huevo puede desarrollarse en un mamífero hembra adulto que produce leche que contiene inmuroglobulina derivada cuando menos en parte del material genético de inmunoglobulina humana insertada. El t¿*?Jj¡mfcfl*&£Ski anticuerpo deseado se puede cosechar a partir de la leche. Las técnicas convenientes para llevar a cabo estos procesos se conocen por los expertos en la técnica . Los animales transgénicos anteriores usualmente se emplean para producir anticuerpos humanos de un solo isotipo, más específicamente un isotipo que es esencial para la maduración de las células B, tales como IgM y posiblemente IgD. Otro método preferido para producir anticuerpos anti-aminofosfolípido humanos es usar la tecnología descrita en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 y 5,770,429; cada una incorporada en la presente mediante referencia, en donde se describen animales transgénicos que son capaces de cambiar de un isotipo necesario para el desarrollo de las células B a otros isotipos. En el desarrollo de un linfocito B, la célula inicialmente produce IgM con una especificidad de enlace determinado por las regiones productivamente rearregladas VH y VL. Posteriormente, cada célula B y sus células de progenie sintetizan anticuerpos con las mismas regiones V de cadenas L y H, pero pueden cambiar el isotipo de la cadena H. El uso de regiones constantes mu o delta está muy determinado por separación alterna, permitiendo que se coexpresen IgM e IgD en una sola célula. Los otros isotipos de cadena pesada (gamma, alfa y epsilón) solamente se expresan originalmente después de que el evento de rearreglo del gen borra los exones mu C y delta C. Este proceso de rearreglo de genes, denominado cambio de isotipo, típicamente se presenta por la recombinación entre los llamados segmentos de cambio localizado inmediatamente corriente arriba de cada gen de cadena pesada (excepto delta) . Los segmentos de cambio individuales tienen entre 2 y 10 kb de longitud, y consisten principalmente en secuencias repetidas cortas . Por estas razones, es preferible que los transgenes incorporen secuencias reguladoras de transcripción dentro de aproximadamente 1-2 kb corriente arriba de cada región de cambio que se va a utilizar para el cambio de isotipo. Estas secuencias reguladoras de transcripción preferiblemente incluyen un promotor y un elemento mejorador, y más preferiblemente incluyen la región de flanqueo 5' (es decir, corriente arriba) que se asocia naturalmente (es decir, se presenta en la configuración de línea germinal) con una región de cambio. Aunque una secuencia de franqueo 5' a partir de una región de cambio se puede enlazar operablemente a una región de cambio diferente para la construcción del transgén, en algunas modalidades se prefiere que cada región de cambio incorporada en la construcción de transgén tenga una región de flanqueo 51 que se presenta inmediatamente corriente arriba • en la configuración de línea germinal que se presenta naturalmente. La información de secuencia relacionada con la secuencias de 4t¿fe.- jato«•_. i-..^4H&?.¿iA&A,hÍít» ¿'^-^-' ¿Mlí¡¡k regiones de cambio de inmunoglobulina se conocen (Mills y colaboradores, 1990; Sideras y colaboradores, 1989; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . En el método descrito en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 y 5,770,429, los transgenes de inmunoglobulinas humanas contenidos dentro del animal transgénico funcionan correctamente a través de la senda del desarrollo de célula B, conduciendo al cambio de isotipos. De conformidad con lo anterior, en este método, estos transgenes se construyen para producir cambio de isotipo y uno o más de lo siguiente: (1) nivel alto de expresión específica de tipo de célula, (2) rearreglo de gen funcional, (3) activación de y respuesta a la exclusión alélica, (4) expresión de un repertorio primario suficiente, (5) transducción de señal, (6) hipermutación somática, y (7) dominio de lugar de anticuerpo de transgén durante la respuesta inmune. Un requisito importante para la función de transgén es la generación de un repertorio de anticuerpos primario que sea suficientemente diverso para disparar una segunda respuesta inmune para un rango amplio de antígenos. El gen de cadena pesada rearreglado consiste en un exón de péptido de señal, un exón de región variable y un arreglo en línea de regiones de regiones constantes de dominios múltiples, cada una de las cuales se codifica por o varios exones. Cada uno de los genes i ? ,S*£f-de región constante codifica la porción constante de una clase diferente de inmunoglobulinas. Durante el desarrollo de las células B, las regiones constante proximales a la región V se borran conduciendo la expresión de nuevas clases de cadenas pesadas. Para cada clase de cadena pesada, patrones alternativos de separación de ARN dan lugar tanto a transmembrana como a inmunoglobulinas secretadas. El lugar de cadena pesado humano consiste en aproximadamente 200 segmentos de gen V que se extienden 2 Mb, aproximadamente 30 segmentos de gen D que se extienden aproximadamente 40 kb, seis segmentos J en ramificación con una extensión de 3 kb, y nueve segmentos de gen de región constante esparcidos sobre aproximadamente 300 kb . El lugar entero se extiende aproximadamente 2.5 Mb de la porción distal del brazo largo del cromosoma 14. Los fragmentos de transgén de cadena pesada que contienen miembros de los seis de las familias VH conocidas, los segmentos de gen D y J, así como las regiones constantes mu, delta, gamma 3, gamma 1 y alfa 1 se conocen (Berman y colaboradores 1988; incorporada en la presente mediante referencia) . Los fragmentos genómicos que contienen todos los segmentos de gen necesarios y las secuencias reguladoras a partir de un lugar de cadena ligera humana se construyen similarmente. La expresión de transgenes pesados y ligeros de inmunoglobulina rearreglados con éxito usualmente tiene un efecto dominante suprimiendo el rearreglo de los genes de inmunoglobulina endógenos en el animal no humano transgénico. Sin embargo, en ciertas modalidades, es deseable efectuar la inactivación completa de los lugares Ig endógenos, de manera que las cadenas de inmunoglobulina híbrida que comprenden una región variable humana y una región constante no humana (por ejemplo, murina) no se pueden formar, por ejemplo, mediante el trans-cambio entre el transgén y las secuencias de Ig endógenas. Usando tecnología de célula de tallo embriónico y recombinación homologa, el repertorio de inmunoglobulinas endógenas se puede eliminar fácilmente. Además, la supresión de los genes de inmunoglobulina endógena se puede llevar a cabo usando una variedad de técnicas, tales como tecnología antisentido . En otros aspectos de la invención, puede ser deseable producir una inmunoglobulina trans-cambiada . Los anticuerpos que comprenden estas inmunoglobulinas trans-cambiadas quiméricas se pueden usar para una variedad de aplicaciones en donde es deseable tener una región constante no humana (por ejemplo, murina), por ejemplo, para la retención de funciones efectoras en la hospedera. La presencia de una región constante murina puede presentar ventajas sobre una región constante humana, por ejemplo, para proporcionar funciones efectoras murinas (por ejemplo, fijación de complemento murino, CCDA), de manera que este anticuerpo quimérico se puede probar en un modelo de enfermedad de ratón. Después de probar el animal, la secuencia de codificación de la región variable humana se puede aislar, por ejemplo, mediante amplificación de reacción de cadena de polimerasa o clonación de ADNc a partir de la fuente (clona de hibridoma), y separar en una secuencia que codifica una región constante humana deseada para codificar un anticuerpo de secuencia humana más conveniente para uso terapéutico humano. B9. Anticuerpos Humanizados Los anticuerpos humanos generalmente tienen cuando menos tres ventajas potenciales para su uso en la terapia humana. Primero, debido a que la porción efectora es humana, puede interactuar mejor con las otras partes del sistema inmune humano, por ejemplo, para destruir células objetivo más eficientemente por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (CCDA) . Segundo, el sistema inmune humano no deberá reconocer el anticuerpo como extraño. Tercero, la vida media en la circulación humana será similar a los anticuerpos humanos que se presentan naturalmente, permitiendo que se den dosis más pequeñas y menos frecuentes. Varios métodos para preparar anti-VEGF se proporciona en la presente. Además de los anticuerpos humanos, los anticuerpos "humanizados" tienen muchas ventajas. Los anticuerpos "humanizados" generalmente son anticuerpos monoclonales quiméricos o mutantes de ratón, rata, hámster, conejo u otras especies, que llevan dominios de regiones variables y/ó constantes humanas o cambios específicos. Las técnicas para generar un anticuerpo anti-VEGF denominado "humanizado" son muy conocidas para los expertos en la técnica. Los anticuerpos humanizados también comparten las siguientes ventajas. Primero, la porción efectora todavía es humana. Segundo, el sistema inmune humano no deberá reconocer la estructura o región constante como extraña, y por lo tanto, la respuesta de anticuerpo contra este anticuerpo inyectado deberá ser menor que contra un anticuerpo de ratón extraño totalmente. Tercero, los anticuerpos humanizados inyectados, en oposición con los anticuerpos de ratón inyectados, presumiblemente tendrán una vida media más similar a los anticuerpos humanos que se presentan naturalmente, permitiendo también dosis más pequeñas y menos frecuentes. Varios métodos se han descrito para producir anticuerpos humanizados. El rearreglo controlado de dominios de anticuerpos unidos a través de enlaces de disul'furo de proteínas para formar moléculas de proteínas nuevas, artificiales, o anticuerpos "quiméricos" se pueden utilizar (Konieczny y colaboradores, 1981; incorporada en la presente mediante referencia) . La tecnología de ADN recombinante también se puede usar para construir fusiones de genes entre las secuencias de ADN que codifican dominios de cadenas ligeras y iááiááÁátmáAdA &A ??Íhifi tr tur - - ff"*- M***** ** pesadas variables de anticuerpos de ratón y dominios constantes de cadenas y ligeras de pesadas de anticuerpos humanos (Morrison y colaboradores, 1984; incorporada en la presente mediante referencia) . Las secuencias de ADN que codifican las porciones de enlace de antígeno o las regiones de determinación de complementariedad (RDC) de los anticuerpos monoclonales murinos se pueden injertar mediante medios moleculares en las secuencias de ADN que codifican las estructuras de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos humanos (Riechmann y colaboradores, 1988) . Los productos recombinantes expresados se denominan anticuerpos humanizados o "reformados", y comprenden la estructura de una cadena ligera o pesada de anticuerpos humanos y las porciones de reconocimiento de antígenos, RDC, de un anticuerpo monoclonal murino. Otro método para producir anticuerpos humanizados se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,639,641, incorporada en la presente mediante referencia. El método proporciona, vía renovar la superficie, anticuerpos de roedores humanizados que tienen eficacia terapéutica mejorada debido a la presentación de una superficie humana en la región variable. En el método: (1) alineaciones de posiciones de un depósito de regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos se genera para dar un conjunto de porciones expuestas de superficie de estructura de región variable de cadena pesada y ligera, en donde las posiciones de alineación para todas las regiones variables son cuando menos 98 por ciento aproximadamente idénticas; (2) un conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en superficie de estructura de región variable de cadena pesada y ligera se define para un anticuerpo de roedor (ó fragmento del mismo); (3) un conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en superficie de la estructura de la región variable de cadena pesada y ligera que es casi idéntica al conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en superficie del roedor se identifica; (4) el conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en superficie de la estructura de la región variable de cadena pesada y ligera definidos en el paso (2) se sustituye con el conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en superficie de la estructura de la región variable de cadena pesada y ligera identificada en el paso (3), excepto para los residuos de o aminoácidos que están dentro de 5A de cualquier átomo de cualquier residuo en las regiones de determinación complementarias del anticuerpo de roedor; y (5) el anticuerpo de roedor humanizado que tiene especificidad de enlace se produce . Un método similar para la producción de anticuerpos humanizados se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 y 5,530,101, cada una incorporada en la presente mediante referencia. Estos métodos implican producir inmunoglobulinas humanizadas que tienen una o más regiones de determinación de complementariedad (RDC) y aminoácidos adicionales posibles a partir de una inmunoglobulina de donador y una región de estructura a partir de una inmunoglobulina humana de aceptación. Cada cadena de inmunoglobulina humanizada usualmente comprende, además de la región de determinación de complementariedad, aminoácidos de la estructura de inmunoglobulina de donador que son capaces de interactuar con las regiones de determinación de complementariedad para efectuar afinidad de enlace, tales como uno o más aminoácidos que están inmediatamente adyacentes a una región de determinación de complementariedad en la inmunoglobulina o donadora o aquéllas dentro de aproximadamente 3A predichas por modelación molecular. Las cadenas pesada y ligera se pueden diseñar usando cualquiera, o cualquier combinación, o todos los criterios de posición distintos descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 y 5,530,101, cada una incorporada en la presente mediante referencia. Cuando se combina en un anticuerpo intacto, las inmunoglobulinas humanizadas son sustancialmente no inmunogénicas en humanos y retienen sustancialmente la misma afinidad que la inmunoglobulina donadora al antígeno original. Un método adicional para producir anticuerpos A.kA.* á*?~ ¿iÍ*. humanizados se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,565,332 y 5,733,743, cada una incorporada en la presente mediante referencia. Este método combina el concepto de anticuerpos humanizantes con las bibliotecas de fagémidos también descritas en detalle en la presente. En un sentido general, el método utiliza secuencias del sitio de enlace de antígenos de un anticuerpo o población de anticuerpos dirigidos contra un antígeno de interés. De este modo para un solo anticuerpo de roedor, las secuencias que comprenden parte del sitio de enlace del antígeno del anticuerpo se pueden combinar con diversos repertorios de secuencias de anticuerpos humanos que pueden, en combinación, crear un sitio de enlace de antígeno completo. Los sitios de enlace de antígeno creados por este proceso difieren de los creados por injerto en región de determinación de complementariedad, porque solamente la porción de secuencias del anticuerpo de roedor original es probable que haga contactos con el antígeno de una manera similar. Las secuencias humanas seleccionadas probablemente difieren en secuencia y hacen contactos alternativos con el antígeno de aquellos del sitio de enlace original. Sin embargo, las restricciones impuestas por el enlace de la porción de la secuencia original al antígeno y las formas del antígeno y sus sitios de enlace de antígeno, probablemente conduzcan a nuevos contactos de las secuencias humanas con la misma región o MH*i ??mM**?* epítope del antígeno. Este proceso por lo tanto se ha denominado "selección impresa de epítope" (SIE) . Iniciando con un anticuerpo animal, un proceso da resultado en la selección de anticuerpos que son parcialmente anticuerpos humanos. Estos anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia a los anticuerpos humanos que se van a usar directamente en terapia o después de la alteración de algunos estudios claves. Las diferencias de secuencia entre el componente roedor del anticuerpo seleccionado con las secuencias humanas podría minimizarse reemplazando aquellos residuos que difieren con los residuos de secuencias humanas, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio de residuos individuales, o por injerto en región de determinación de complementariedad de ciclos enteros . Sin embargo, los anticuerpos con secuencias enteramente humanas también se pueden crear. La selección impresa de epítopes por lo tanto ofrece un método para hacer anticuerpos parcialmente humanos o enteramente humanos que se enlazan al mismo epítope que el animal o al mismo epítope que los anticuerpos animales o parcialmente humanos, respectivamente. En la selección impresa de epítope, los repertorios de fragmentos de anticuerpos se pueden desplegar en la superficie de la fase filamentos y los genes que codifican fragmentos con actividades de enlace de antígenos seleccionados por el enlace del fago al antígeno.
"'•A "" ?"**m~*g*ttí \ Métodos adicionales para humanizar anticuerpos contemplados para su uso en la presente invención se describen en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,750,078; 5,502,167; 5,705,154; 5,770,403; 5,698,417; 5,693,493; 5,558,864; 4,935,496 y 4,816,567, cada una incorporada en la presente mediante referencia. Se cree que las publicaciones internacionales WO 98/45331 y WO 98/45332 son particularmente instructivas y se incorporan en la presente mediante referencia para ejemplificar adicionalmente los principios de humanización como anticuerpos anti-VEGF. BIO. Mutagénesis por Reacción de Cadena de Polimerasa La mutagénesis específica del sitio es una técnica útil en la preparación de anticuerpos individuales a través de mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica además proporciona una capacidad lista para preparar y variantes de secuencia de prueba, que incorporan una o más de las siguientes consideraciones, ya sea humanizando o no, introduciendo uno o más cambios de secuencias de nucleótidos en el ADN. Aunque muchos métodos son convenientes para su uso en mutagénesis, el uso de la reacción de cadena de polimerasa (PCRMR) se prefiere generalmente. Esta tecnología ofrece un método rápido y eficiente para introducir las mutaciones deseadas en una secuencia de ADN dada. El siguiente texto particularmente describe el uso de reacción de cadena de polimerasa para introducir mutaciones puntuales en una secuencia, como se puede usar para cambiar el aminoácido codificado por la secuencia dada. Las adaptaciones de este método también son convenientes para introducir sitios de enzimas de restricción en una molécula de ADN. En este método, los oligonucleótidos sintéticos se diseñan para incorporar una mutación puntual en un extremo de un segmento amplificado. Después de la reacción de cadena de polimerasa, los fragmentos amplificados se les achata el extremo tratándolos con fragmentos de Klenow, y los fragmentos con extremo achatado se ligan y subclonan en un vector para facilitar el análisis de la secuencia. Para preparar el ADN en plantilla que se desea mutagenizar, el ADN se subclona en un vector de alto número de copias, tal como pUC19, usando sitios de restricción que flanquean las áreas que se van a mutar. El ADN en plantillas se prepara usando una minipreparación de plásmido. Los cebadores de oligonucleótidos adecuados que se basan en la secuencia padre, pero que contienen la mutación puntual deseada y que están flanqueados en el extremo 5' por un sitio de enzima de restricción, se sintetizan usando un sintetizador automatizado. Generalmente se requiere que el cebador sea homólogo al ADN en plantilla por aproximadamente 15 bases o algo así. Los cebadores se pueden purificar mediante electroforesis de gel de poliacrilamida desnaturalizante, aunque esto no es absolutamente necesario para su uso en la reacción de cadena de polimerasa. El extremo 51 de los oligonucleótidos deberán entonces ser fosforilados. El ADN en plantilla deberá ser amplificado por reacción de cadena de polimerasa, usando los cebadores de oligonucleótidos que contienen las mutaciones puntuales deseadas. La concentración de MgCl2 en el regulador de amplificación generalmente será de apro imadamente 15 mM . Generalmente aproximadamente 20-25 ciclos de reacción de cadena de polimerasa deberá llevarse a cabo como sigue: desnaturalización, 35 segundos a 95°C; hibridización, 2 minutos a 50°C; y extensión, 2 minutos a 72°C. La reacción de cadena de polimerasa generalmente incluirá un último ciclo de extensión de aproximadamente 10 minutos a 72 °C. Después del paso de extensión final, aproximadamente 5 unidades de fragmentos de Klenow deberán añadirse a la mezcla de la reacción e incubarse durante otros 15 minutos a aproximadamente 30°C. La actividad exonucleasa de los fragmentos de Klenow se requiere para hacer que los extremos se laven y conveniente para clonación de extremo romo. La mezcla de la reacción resultante generalmente deberá ser analizada por electroforesis en gel de acrilamida o agarosa no desnaturalizante para verificar que la amplificación ha producido el producto predicho. Luego se procesaría la mezcla de la reacción removiendo la mayoría de los aceites minerales, extrayendo con cloroformo para remover el aceite restante, extrayendo con fenol regulado y luego concentrando mediante precipitación con 100 por ciento de etanol. Enseguida, se digeriría aproximadamente la mitad de los fragmentos amplificados con una enzima de restricción que corta en las secuencias de flanqueo usadas en los oligonucleótidos. Los fragmentos digeridos se purifican en un gel de agarosa de baja gelificación/fusión. Para subclonar los fragmentos y verificar la mutación puntual, se subclonarían los dos fragmentos amplificados en un vector adecuadamente digerido por ligación de extremo romo. Esto se usaría para transformar E . col i , a partir de la cual el ADN del plásmido subsecuentemente podría prepararse usando una mimpreparación . La porción amplificada del ADN de plásmido se analizaría entonces mediante secuenciamiento de ADN para confirmar que se generó la mutación puntual correcta. Esto es importante, ya que la polimerasa de ADN Taq puede introducir mutaciones adicionales en los fragmentos de ADN. La introducción de una mutación puntual también se puede efectuar usando pasos secuenciales de reacción de cadena de polimerasa. En este procedimiento, los dos fragmentos que abarcan la mutación se recuecen entre sí y se extienden mediante síntomas cebadora mutua. Este fragmento se amplifica luego mediante un segundo paso de reacción de cadena de polimerasa, evitando mediante esto la ligación de extremo romo requerida en el protocolo anterior. En este método, la preparación del ADN en plantilla, la generación de los cebadores de oligonucleótidos y la primera amplificación de reacción de cadena de polimerasa se realizan como se describió anteriormente. Sin embargo, en este proceso los oligonucleótidos elegidos deberán ser homólogos al ADN de plantilla para un tramo de aproximadamente entre 15 y 20 bases, y deberá también traslaparse entre sí en aproximadamente 10 bases o más. En la segunda amplificación por reacción de cadena de polimerasa, se usaría cada fragmento amplificado y cada cebador de secuencia de flanqueo y llevaría reacción de cadena de polimerasa durante aproximadamente 20 y aproximadamente 25 ciclos, usando las condiciones que se describieron anteriormente. De nuevo se subclonarían los fragmentos y verificaría que la mutación puntual fue correcta usando los pasos delineados anteriormente. Al usar cualquiera de los métodos anteriores, se prefiere generalmente introducir la mutación amplificando un fragmento tan pequeño como sea posible. Desde luego, los parámetros tales como la temperatura de fusión del oligonucleótido, como generalmente será influenciado por el contenido de GC y la longitud del oligo, deberá considerarse cuidadosamente. La ejecución de estos métodos, y su optimización, si es necesario, será conocido para los expertos en la técnica, y se describirá adicionalmente en distintas publicaciones, tales como Curren t Protocol s in Molecular Biology, 1995, incorporada en la presente mediante referencia. Cuando se realiza mutagénesis específica del sitio, se puede emplear la Tabla A como una referencia. TABLA A Aminoácidos Codones Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU Acido aspártico Asp D GAC GAU Acido glutámico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina lie I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAÁ CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACÁ ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU Triptofano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU Bll. Fragmentos y derivados de anticuerpos Independientemente de la fuente del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2, original, ya sea el anticuerpo intacto, multímeros del anticuerpo, o cualquiera de una variedad de regiones de enlace de antígeno funcionales del anticuerpo se puede usar en la presente invención. Las regiones funcionales ejemplares incluyen fragmentos scFv, Fv, Fab', Fab y F(ab')2 de los anticuerpos anti-VEGF. Las técnicas para preparar estas construcciones son muy conocidas para los expertos en la técnica y se ejemplifican adicionalmente en la presente. La elección de construcción de anticuerpo puede estar influenciada por varios factores. Por ejemplo, la vida media prolongada puede ser resultado de la readsorción activa de anticuerpos intactos dentro del riñon, una propiedad de la pieza Fc de la inmunoglobulina. Los anticuerpos basados en IgG, por lo tanto, se espera que exhiban aclaramiento de sangre más pequeño que sus contrapartes Fab' . Sin embargo, las composiciones basadas en fragmentos Fab' generalmente exhibirán una capacidad mejor de penetración de tejido. Los fragmentos de anticuerpos se pueden obtener mediante la proteolisis de la inmunoglobulina entera mediante la tiol proteasa no específica, papaína. La digestión de papaína produce dos fragmentos de enlace de antígeno idénticos, denominados "fragmentos Fab", cada uno con un solo sitio de enlace de antígeno, y un "fragmento Fc" residual. La papaína primero se debe activar reduciendo el grupo sulfhidrilo en el sitio activo con cisteína, 2-mercaptoetanol o ditiotreitol. Los metales pesados en la enzima de material podrían removerse mediante quelación con AEDT (2 mM) para asegurar la máxima actividad de enzima. La enzima y el sustrato normalmente se mezclan entre sí en una proporción de 1:100 en peso. Después de la incubación, la reacción se puede detener mediante alquilación irreversible del grupo tiol con yodoacetamida o simplemente mediante diálisis. Deberá supervisarse la finalización de la digestión mediante SDS-PAGE y las fracciones distintas separarse mediante cromatografía por intercambio de iones o proteína A Sefarosa. El procedimiento usual para la preparación de fragmentos F(ab')2 a partir de IgG de origen de conejo y humano se limita a la proteólisis mediante la enzima pepsina. Las condiciones, 100 veces exceso de anticuerpo peso/peso en regulador de acetato con pH 4.5, 37°C, sugiere que el anticuerpo se disocia en el lado de la terminal C del enlace disulfuro de la cadena interpesada. Las tasas de digestión de la IgG de ratón pueden variar con la subclase y se deben elegir las condiciones para evitar cantidades significativas de IgG completamente degradada. En particular, IgG2b es susceptible a la degradación completa. Las otras subclases requieren diferentes condiciones de incubación para producir resultados óptimos, todo lo cual se conoce en la técnica. El tratamiento de pepsina de anticuerpos intactos produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígenos y todavía es capaz de reticular antígeno. La digestión de IgG de rata por pepsina requiere condiciones que incluyen diálisis en 0.1 M de regulador de acetato, pH 4.5, y luego incubación durante cuatro horas con 1 por ciento peso/peso de pepsina; la digestión de IgG: e IgG2a se mejora si primero se dializa contra 0.1 M de regulador de formato, pH 2.8, a 4°C, durante 16 horas seguido de regulador de acetato. IgG2b da resultados más consistentes con la incubación en proteasa V8 de estafilococos (3 por ciento peso/peso) en 0.1 M de regulador de fosfato de sodio, pH 7.8, durante cuatro horas a 37°C. Un fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CHl) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el término carboxilo de la cadena pesada dei dominio CH1 incluyendo una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmento Fab' que tenían cisteínas de articulación entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo también se conocen. Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un reconocimiento de antígeno completo y sitio de enlace. Esta región consiste en un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación con covalente estrecha. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio variable simple (o la mitad de un fragmento Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y enlazar antígeno, aunque a una afinidad más baja que el sitio de enlace entero. Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena simple" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptidos. Generalmente, el polipéptido Fv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios de VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para el enlace de antígeno. Las siguientes patentes y solicitudes de patentes |^<^ específicamente se incorporan en la presente mediante referencia para los propósitos de suplementar aún más las presentes enseñanzas con respecto a la preparación y uso de regiones de enlace de antígeno de anticuerpos, incluyendo scFv, Fv, Fab', Fab y los fragmentos F(ab')2 de los anticuerpos anti- VEGF: Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,855,866; 5,965,132; 6,051,230; 6,004,555; y 5,877,289; y Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con número de serie 08/482,369, Derechos de emisión pagados Octubre 20, 1998. La publicación internacional WO 98/45331 también se incorpora en la presente mediante referencia para propósitos de incluir o aún describir adicionalmente y mostrar la preparación de regiones de determinación de complementariedad variable, hipervariable de anticuerpo. "Diacuerpos" son pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de enlace de antígeno, estos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio de variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH - VL) . Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareo entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos se describen en la Patente Europea EP 404,097 y la Publicación Internacional WO 93/11161, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia. Los "anticuerpos lineales" que pueden ser bíespecífieos o monoespecíficos, comprenden un par de segmentos Fd en línea (VH-CH1-VH-CH1) gue forman un par de regiones de enlace de antígeno, como se describe en Zapata y colaboradores, (1995), específicamente incorporada en la presente mediante referencia . Al usar un Fab' o fragmento de enlace de antígeno en el anticuerpo, con los beneficios esperados de la penetración de tejido, se pueden derivar ventajas adicionales de modificar el fragmento para aumentar su vida media. Una variedad de técnicas se puede emplear, tales como la manipulación o modificación de la molécula de anticuerpo misma, y también la conjugación con portadores inertes. Cualquier conjugación para el único propósito de aumentar la vida media, en vez de administrar una sustancia a un objetivo, deberá ser llevado a cabo cuidadosamente porque Fab' y otros fragmentos se eligen para penetrar tejidos. Sin embargo, la conjugación con poliperos que no son proteínas, tales como PEG y similares, se contempla. Las modificaciones distintas de la conjugación por lo tanto se basan en modificar la estructura del fragmento de anticuerpo para volverlo más estable, y/o reducir la tasa de catabolismo en el cuerpo. Un mecanismo para estas modificaciones es el uso de aminoácidos D en lugar de aminoácidos L. Las personas con experiencia ordinaria en la técnica entenderán que la introducción de estas modificaciones necesita seguirse mediante la prueba rigurosa de la molécula resultante para asegurar que todavía retiene las propiedades biológicas deseables. Otras modificaciones de estabilización incluyen el uso de fracciones de adición o de estabilización ya sea en la terminal N o en la terminal C o ambas, lo cual generalmente se usa para prolongar la vida media de las moléculas biológicas. A manera de ejemplo solamente, se puede desear modificar los términos mediante acilación o aminación. Las modificaciones tipo conjugación moderada para su uso en la presente invención incluyen incorporar un epítope de enlace receptor salvaje en el fragmento de anticuerpo. Las técnicas para lograr esto incluyen la mutación de la región adecuada del fragmento de anticuerpo o incorporar el epítope como una etiqueta de péptido que se une al fragmento de anticuerpo. La publicación internacional WO 96/32478 se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para los propósitos de ejemplificar adicionalmente esta tecnología. Los epítopes de enlace receptor salvajes típicamente son regiones de tres o más aminoácidos de uno o dos ciclos del dominio Fc que se transfieren a la posición análoga del fragmento de anticuerpo. El receptor salvaje que se enlaza con epítopes de la WO 98/45331 se incorporan en la presente mediante referencia para su uso con la presente invención.
B12. Enlace y ensayos funcionales Aunque la presente invención tiene utilidad significativa en regímenes de tratamiento con animales y humanos, también tiene otros usos prácticos, incluyendo varios usos in vi tro. Ciertos de estos usos se relacionan con las propiedades de enlace específicos de los anticuerpos o inmunoconjugados. Todos los compuestos de la invención incluyen cuando menos un componente de anticuerpo, se pueden usar virtualmente todas las modalidades de enlace en las que el anticuerpo original se puede usar. La presencia de una sustancia unida, cuando sea relevante, aunque proporciona propiedades ventajosas, no niega la utilidad de las primeras regiones de anticuerpos en cualquier ensayo de enlace. Los ensayos de enlace útiles convenientemente incluyen entonces aquellos comúnmente empleados en la técnica, tales como los inmunomanchados, manchados Western, manchados puntuales, Ría, ensayo inmunosorbente de enzima enlazada, inmunohistoquímica, almacenamiento de células activadas fluorescentes, inmunoprecipitación, cromatografía por afinidad, y similares, como se describe adicionalmente en la presente. Ciertos ensayos de enlace estándares son aquellos en los cuales un antígeno se inmoviliza sobre una matriz de soporte sólida, v.gr., nitrocelulosa, nylon o una combinación de los mismos, tal como en los inmunomanchados, manchados Western y ensayos relacionados. Otros ensayos importantes en los ensayos inmunosorbentes de enzima enlazada. Todos estos ensayos se pueden adaptar fácilmente para su uso en la detección del VEGF, como puede aplicarse en el diagnóstico de una enfermedad angiogénica. Las sustancias de la invención también se pueden usar en conjunción tanto con bloques de tejido frescos congelado como sumergido en parafina, fijado con formalina en la inmunohistoquímica; en la clasificación de células activadas fluorescentes, la citometría de flujo o la microfluorometría de flujo; en inmunoprecipitación; en modalidades de purificación de antígenos, tales como cromatografía de afinidad, aún incluyendo, en casos de anticuerpos biespecíficos, la purificación rápida de un paso de uno o más antígenos al mismo tiempo; y en muchos otros ensayos de enlace que serán muy conocidos para los expertos en la técnica dada la información presentada en la presente. Otros usos prácticos de los presentes anticuerpos son como controles en ensayos funcionales. Estos incluyen muchos ensayos y sistemas in vi tro y ex vivo, así como estudios de modelos animales. Como las propiedades de enlace y funcionales de los anticuerpos de la invención son particularmente específicas, es decir, inhiben el enlace del VEGF con y el señalamiento vía VEGFR2, pero no con el VEGFR1, estos usos de "control" realmente son extremadamente valiosos. Los ensayos que se benefician de esta aplicación práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, los ensayos que se refieren al crecimiento de células endoteliales mediado por VEGF, la fosforilación inducida por el VEGF y la permeabilidad vascular inducida por el VEGF, así como el ensayo de microbolsas córneas de neovascularización y el ensayo de membranas corio alantoicas de pollo. Estos sistemas de ensayo también se pueden desarrollar en escenarios de fármacos in vitro o ex vivo, en donde la presente provisión de materiales biológicos con propiedades bien definidas es particularmente importante. C. Inmunoconjugados Aunque la presente invención proporciona anticuerpos desnudos o no conjugados sorprendentemente efectivos para su uso en métodos antiangiogenicos, el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o los inmunoconjugados, inmunotoxinas y coaguligandos basados en 2C3 también se proporcionan mediante la presente. Las sustancias actualmente preferidas para su uso en los anticuerpos anti-VEGF, que bloquean el VEGFR2, o los conjugados terapéuticos basados en 2C3 y las sustancias radioterapéuticas (ejemplificadas por los radiodiagnósticos descritos en la presnete) , sustancias antiangiogénicas, sustancias que inducen la apoptosis, sustancias antitubulina, sustancias anticelulares o citotóxicas y coagulantes (factores de coagulación) . Para generar inmunoconjugados, las inmunotoxinas y coaguligandos, la expresión recombinante se puede emplear para crear una proteína de fusión, como lo conocen los expertos en la técnica y se describe adicionalmente en la presente. Igualmente, inmunoconjugados, inmunotoxinas y coaguligandos se pueden generar usando puentes de avidina: biotina o cualquiera de las tecnologías de conjugación química y reticulación desarrollada en referencia con los conjugados de anticuerpos. Cl . Sustancias Tóxicas y Anti-Celulares Para ciertas aplicaciones, las sustancias terapéuticas serán sustancias citotóxicas o farmacológicas, particularmente sustancias citotóxicas, citostáticas, o de otro modo anticelulares que tienen la capacidad de matar o suprimir el crecimiento de la división celular de las células endoteliales. En general, estos aspectos de la invención contemplan el uso de cualquier sustancia farmacológica que se pueda conjugar con un anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2 , o anticuerpo parecido al 2C3, se administre en forma activa al endotelio objetivo. Las sustancias anticelulares ejemplares incluyen sustancias quimioterapéuticas, así como citotoxinas. Las sustancias quimioterapéuticas que se pueden usar incluyen: hormonas, tales como esteroides; antimetabolitos, tales como citocina arabinosida, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina; antraciclinas; mitomicina C; vinca alcaloides; demecolcina; etoposida; mitramicina; sustancias alquilantes antitumor, tales como clorambucilo o melfalán. Otras modalidades pueden incluir sustancias tales como citocínas. Básicamente, cualquier sustancia anticelular se puede usar, en tanto pueda conjugarse con éxito a, o asociarse con, un anticuerpo de una manera que permitirá su direccionamiento, internalizacion, liberación y/o presentación a los componentes de sangre en el sitio de las células endoteliales objetivos. Puede haber circunstancias, tales como cuando el antígeno objetivo no se internaliza mediante una vía consistente con intoxicación eficiente mediante el compuesto tóxico, en donde se deseará dirigir sustancias quimioterapéuticas, tales como fármacos antitumor, citocinas, antimetabolitos, sustancias alquilantes, hormonas, y similares. Una variedad de sustancias quimioterapéuticas y otras sustancias farmacológicas ahora se han conjugado con éxito con anticuerpos si muestran que funcionan farmacológicamente, incluyendo la doxorrubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, neocarcinostatina, macromicina, trenimon y a- amanitina . En otras circunstancias, cualquier efecto lateral potencial de la terapia basada en citotoxma se puede eliminar mediante el uso de inhibidores de síntesis de ADN, tales como daunorrubicina, doxorrubicina, adriamicina, y similares. Estas sustancias por lo tanto son ejemplos preferidos de sustancias anticelulares para su uso en la presente invención. En términos de sustancias citostáticas, estos compuestos generalmente interrumpen el ciclo natural de las células de una célula objetivo, preferiblemente de manera que la célula se sale del ciclo de la célula. Una variedad amplia de sustancia citotóxica se sabe que se puede conjugar con anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o anticuerpos basados en 2C3. Ejemplos incluyen numerosas toxinas derivadas de plantas, hongos o bacterias, las cuales, a manera de ejemplo, incluyen varias toxinas de cadena A, particularmente cadena de ricina A; proteína de inactivación de ribosoma, tales como saporín o gelonina; a- sarcina; aspergilina; restrictocina; ribonucleasas, tales como ribonucleasa placentaria; toxina de difteria; y exotoxina de pseudomonas, sólo por nombrar algunas. De las toxinas, se prefieren las cadenas de ricina A. La fracción de toxina más preferida para su uso con la presente es la cadena de toxina A que ha sido tratada para modificar o remover residuos de carbohidratos, denominados cadena A desglicosilada (dgA) . La cadena de ricina A desglicosilada se prefiere debido a su extrema potencia, vida media más prolongada, y debido a que es económicamente factible fabricarla a grado y escala clínico. Puede ser deseable desde un punto de vista farmacológico emplear la molécula más pequeña posible que sin embargo proporcione una respuesta biológica adecuada. Se puede desear emplear péptidos de cadena A más pequeños que proporcionarán una respuesta anticelular adecuada. Con este fin, se ha descubierto que la cadena de ricina A se puede "truncar" mediante la remoción de 30 aminoácidos N-terminales por Nagarase (Sigma) , y todavía retener una actividad de toxina adecuada. Se propone que cuando se desea, esta cadena A truncada se puede emplear en conjugados de acuerdo con la invención . De manera alternativa, se puede encontrar que la aplicación de la tecnología de ADN recombinante a la fracción de cadena A de toxina proporcionará beneficios adicionales de acuerdo con la invención. Para que la clonación y expresión de la cadena A de ricina activa biológicamente se haya logrado, ahora es posible identificar y preparar péptidos más pequeños o de otro modo variantes que sin embargo exhiben una actividad de toxina adecuada. Más aún, el hecho de que la cadena de ricina A ahora ha sido clonada permite la aplicación de mutagénesis dirigida al sitio, a través de lo cual se puede preparar fácilmente y seleccionar péptidos derivados de la cadena A y obtener fracciones útiles adicionales para su uso en relación con la presente invención. C2. Factores de Coagulación El anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2, o los anticuerpos basados en 2C3 de la invención se pueden enlazar a un componente que es capaz de estimular directamente o indirectamente la coagulación, para formar un coaguligando .
Aquí, los anticuerpos se pueden enlazar directamente al coagulante o al factor de coagulación, o se pueden enlazar a una segunda región de enlace que enlaza y después libera el coagulante o el factor de coagulación. Como se usa en la presente, los términos "coagulante" y "factor de coagulación" cada uno se usa para referirse a un componente que es capaz de estimular directamente o indirectamente la coagulación bajo condiciones adecuadas, preferiblemente cuando se proporciona a un ambiente específico en vivo, tal como la vasculatura del tumor. Los factores de coagulación preferidos son las composiciones de Factor de Tejido, tales como el factor de tejido truncado (tTF), las moléculas de factor de tejido diméricas, multiméricas y mutantes. El "Factor de Tejido Truncado" (tTF) se refiere a construcciones de factor de tejido que se vuelven deficientes del enlace con la membrana por la remoción de suficientes secuencias de aminoácidos para efectuar este cambio en propiedad. Una "cantidad suficiente" en este contexto es una cantidad de secuencia de aminoácidos de transmembrana originalmente suficiente para introducir la molécula del factor de tejido en la membrana, o de otro modo mediar el enlace de la membrana funcional de la proteína del factor de tejido. La remoción de esta "cantidad suficiente de secuencia de extensión de la transmembrana" por lo tanto crea una proteína o polipéptido de Factor de Tejido deficiente en capacidad de enlace con la membrana de fosfolípidos, de manera que la proteína es sustancialmente una proteína soluble que no se enlaza significativamente a las membranas de fosfolípidos. El factor de tejido truncado de este modo sustancialmente falla en convertir el Factor VII en Factor Vlla en un ensayo de factor de tejido estándar, y todavía retiene la denominada actividad catalítica que incluye la activación del Factor X en presencia del Factor Vlla. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,504,067 se incorpora específicamente en la presente mediante referencia con los propósitos de describir adicionalmente estas proteínas de Factor de Tejido truncado. Preferiblemente, los Factores de Tejido para su uso en estos aspectos de la presente invención generalmente carecen de la transmembrana y regiones citosólicas (aminoácidos 220-263) de la proteína. Sin embargo, no hay necesidad de que las moléculas del factor de tejido truncado se limiten a moléculas de la longitud exacta de 219 aminoácidos. Las composiciones de Factor de Tejido también pueden ser útiles como dímeros. Cualquiera de las construcciones de Factor de Tejido truncados, mutadas o de otros se pueden preparar en una forma dimérica para su uso en la presente invención. Como será conocido para los expertos en la técnica, estos dímeros de Factor de Tejido se pueden preparar empleando las técnicas estándares de la biología molecular y la expresión i¡4 Aiim?AA.1* ***,**. ¡g^H^H^^H^¡^ recombinante, en las cuales dos regiones de codificación se preparan dentro del marco y se expresan a partir de un vector de expresión. Igualmente, se pueden emplear varias tecnologías de conjugación química en relación con la preparación de 5 dímeros del Factor de Tejido. Los monómeros del Factor de Tejido individuales se pueden derivar antes de la conjugación. Todas estas técnicas serían fácilmente conocidas por los expertos en la técnica. Si se desea, los dímeros o multímeros del Factor de 10 Tejido se pueden unir vía un enlace biológicamente liberable, tal como un enlazador selectivamente - disociable o una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, los enlazadores de péptidos que incluyen un sitio de disociación para una enzima preferencialmente localizada o activa dentro de un ambiente de 15 tumor se contemplan. Formas ejemplares de estos enlazadores de péptidos son aquellos que se disocian mediante uroquinasa, plasmina, trombina, Factor IXa, Factor Xa, o un metaloproteinasa, tal como colagenasa, gelatinasa o estromelisina . 20 En ciertas modalidades, los dímeros del Factor de Tejido además pueden comprender una fracción de inserción de membrana hidrofóbica impedida, para alentar posteriormente la asociación funcional del Factor de Tejido con la membrana de fosfolípidos, pero solamente bajo ciertas condiciones 25 definidas. Como se describe en el contexto de los Factores de ¿¡fe,,--~*->**á2 Tejido truncados, las secuencias de asociación de membrana hidrofóbica generalmente son tramos de aminoácidos que promueven la asociación con el ambiente de fosfolípidos debido a su naturaleza hidrofóbica. Igualmente, se pueden usar ácidos grasos para proporcionar la fracción de inserción de membrana potencial . Estas secuencias de inserción de membrana se pueden localizar ya sea en el término N o el término C de la molécula de Factor de Tejido, o generalmente anexar en cualquier otro punto de la molécula en tanto su unión a la misma no impida las propiedades funcionales de la construcción del Factor de Tejido. El intento de la fracción de inserción impedida es que permanezca no funcional hasta que la construcción del Factor de Tejido se localice dentro del ambiente del tumor, y permita que la unión hidrofóbica se vuelva accesible y hasta además promueva la asociación física con la membrana. De nuevo, se contempla que los enlaces biológicamente liberables y las secuencias selectivamente disociables serán particularmente útiles con respecto a esto, con el enlace o la secuencia solamente siendo disociadas o de otro modo modificadas después de la localización dentro del ambiente del tumor y la expresión a enzimas particulares u otras moléculas bioactivas. En otras modalidades, las construcciones de Factor de Tejido truncado pueden ser multiméricas o poliméricas. En este contexto una "construcción polimérica" contiene 3 o más construcciones de Factor de Tejido. Una "construcción de Factor de Tejido multimérico o polimérico" es una construcción que comprende una primera molécula de Factor de Tejido o un derivado operativamente unido a cuando menos una segunda y una tercera molécula de Factor de Tejido o derivada. Los multímeros pueden comprender entre aproximadamente 3 y aproximadamente 20 de estas moléculas de Factor de Tejido. Las unidades individuales de Factor de Tejido dentro de los multímeros o polímeros pueden también estar enlazadas por enlazadores de péptidos selectivamente disociables u otros enlaces biológicamente liberables como se desea. De nuevo, como con los dímeros de Factor de Tejido discutidos anteriormente, las construcciones pueden fácilmente hacerse usando ya sea manipulación recombinante y expresión o usando química sintética estándar. Todavía otras construcciones de Factor de Tejido útiles en el contexto de la presente invención son aquellos mutantes deficientes en la capacidad para activar el Factor VII. Estos "mutantes de activación de Factor VII" generalmente se definen en la presente como mutantes del Factor de Tejido que se enlazan con el Factor VlI/VIIa funcional, el Factor X proteolíticamente activo, pero están sustancialmente libres de la capacidad del Factor VII proteolíticamente activo. De acuerdo con lo anterior, estas construcciones son mutantes del Factor de Tejido que carecen de la actividad de la activación két^ú^i^t *UM»llUtttA^ del Factor VII. La capacidad de estos mutantes de activación del Factor VII para funcionar promoviendo la coagulación específica del tumor se basa en su administración específica a la 5 vasculatura del tumor, y la presencia del Factor Vlla a niveles bajos en el plasma. Después de la administración de este conjugado de sustancia objetivo - mutante de activación de Factor VII, el mutante se localizará dentro de la vasculatura de un tumor vascularizado . Antes de la localización, el 10 mutante de Factor de Tejido generalmente sería incapaz de promover la coagulación en ningún otro sitio del cuerpo, con base en su incapacidad para convertir el Factor VII en Factor Vlla. Sin embargo, después de la localización y acumulación dentro de la región del tumor, el mutante encontrará entonces 15 suficiente Factor Vlla del plasma con el fin de iniciar la senda de coagulación extrínseca, conduciendo a trombosis específica del tumor. El Factor Vlla exógeno podría también ser administrado al paciente. Uno o más de una variedad de mutantes de activación 20 del Factor VII se pueden preparar y usar en relación con la presente invención. Hay una cantidad significativa de conocimiento científico concerniente a los sitios de reconocimiento de la molécula de Factor de Tejido para el Factor VlI/VIIa. De este modo se entenderá que la región de 25 activación del Factor VII generalmente yace entre 'í-Ti aproximadamente el aminoácido 157 y aproximadamente el aminoácido 167 de la molécula del Factor de Tejido. Sin embargo, se contempla que los residuos fuera de esta región también pueden demostrar ser relevantes a la actividad de activación del Factor VII, y por lo tanto se puede considerar introducir mutaciones en cualquiera o más de los residuos generalmente localizados entre aproximadamente el aminoácido 106 y aproximadamente el aminoácido 209 de la secuencia del Factor de Tejido (Publicación Internacional WO 94/07515; WO 94/28017; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Una variedad de otros factores de coagulación se pueden usar en conexión con la presente invención, como se ejemplifica por las sustancias presentadas más adelante. Trombina, Factor V/Va y derivados, Factor VlI/VIIIa y derivados, Factor IX/IXa y derivados, Factor X/Xa y derivados, Factor Xl/XIa y derivados, Factor XlI/XIIa y derivados, Factor XlII/XIIIa y derivados, Factor X activador y Factor V activador se pueden usar en la presente invención. El activador del Factor X de veneno de víbora de Russell se contempla para su uso en esta invención. Los anticuerpos monoclonales específicos para el activador del Factor X presentes en el veneno de víbora de Russell también han sido producidos, y podrían ser usados para administrar específicamente la sustancia como parte de un ligando de enlace .A^^ ^??M^^M a biespecífico . El tromboxano A2 está formado de endoperóxidos mediante las acciones secuenciales de las enzimas ciclo-oxigenasa y tromboxano sintetasa en microsomas de plaquetas. El tromboxano A2 es generado fácilmente por las plaquetas y es un potente vasoconstrictor, en virtud de su capacidad para producir la agregación de las plaquetas. Tanto el tromboxano A2 como los análogos activos del mismo se contemplan para su uso en la presente invención. La tromboxano sintasa, y otras enzimas que sintetizan las prostaglandinas de activación de plaquetas, también se pueden usar como "coagulantes" en el presente contexto. Los anticuerpos monoclonales, y la purificación por inmunoafinidad de, la tromboxano sintasa se conocen; como también el ADNc de la tromboxano sintasa humana. La o¡2-antiplasmina, o el inhibidor de 0í2-antiplasmina, es un inhibidor de proteinasa naturalmente presente en el plasma humano que funciona para inhibir eficientemente la lisis de los coágulos de fibrina inducidos por el activador plasminógeno. La 2-antiplasmina es un inhibidor particularmente potente, y se contempla para su uso en la presente invención. Conforme está disponible la secuencia de ADNc para la a2-antiplasmina, las proteínas de expresión y/o fusión recombinantes se prefieren. Los anticuerpos monoclonales contra la 2-antiplasmina también están disponibles que se pueden usar por las modalidades de ligando de enlace biespecífico de la invención. Estos anticuerpos podrían ser usados tanto para administrar 2-antiplasmina endógena a un sitio objetivo como para acumular 2-antiplasmina endógena y concentrarla dentro de la región objetivo. C3. Fármacos antitubulina Una gama de fármacos ejerce sus efectos vía la interferencia con la actividad de tubulina. Como las funciones de tubulina son esenciales para la mitosis y la viabilidad celular, ciertos "fármacos antitubulina" son sustancias quimioterapéuticas poderosas. Algunas de los fármacos antitubulina más conocidos y actualmente preferidos para su uso con la presente invención están la colchicina; taxanos, tales como taxol; vinca alcaloides, tales como vinblastina, vincristina y vindescina; y combretastatinas . Otros fármacos antitubulinas son las citocalasinas (incluyendo B, J, E) , dolastatina, auristatina PE, paclitaxel, ustiloxin D, rizoxin, 1069C85, colcemid, albendazol, azatoxin y nocodazol. Como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,892,069, 5,504,074 y 5,661,143, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia, las combretastatinas son derivados de estradiol que generalmente inhiben la mitosis celular. Las combretastatinas ejemplares que se pueden usar junto con la .. A ..«Sai. »..ps*8^^***?**l* L.*>«B*?«fl invención e incluyen aquellas basadas en combretastatina A, B y/o D y las descritas en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,892,069, 5,504,074 y 5,661,143. Las combretastatmas A-l, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, B-l, B-2, B-3 y B-4 son ejemplares de los tipos anteriores. Las Patente de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,669,786 y 5,409,953, se incorporan en la presente mediante referencia para propósitos de describir el aislamiento, la caracterización estructural y la síntesis de cada una de las combretastatinas A-l, A-2, A-3, B-l, B-2, B-3 y B-4 y formulaciones y métodos para usar estas combretastatinas para tratar el crecimiento neoplástico. Cualquiera o más de estas combretastatinas se puede usar junto con la presente invención. La combretastatina A-4, como se describe en las Patente de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,892,069, 5,504,074, 5,661,143 y 4,996,237, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia, también se puede usar con la misma. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,661,122 se incorpora adicionalmente en la presente mediante referencia para describir profármacos de combretastatina A-4 convenientes, que se contemplan para el uso combinado con la presente invención. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,940,726, específicamente incorporada en la presente mediante referencia, particularmente describe lactones macrocíclicos denominados combretastatin D-1 y "Combretastatin D-2", cada una de las cuales se puede usar en combinación con las composiciones y métodos de la presente invención. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,430,062, específicamente incorporada en la presente mediante referencia, se refiere a los derivados de stilbeno y análogos de combretastatin con actividad anticáncer que se pueden usar en combinación con la presente invención. C4. Sustancias Antiangiogénicas La presente invención particularmente proporciona anti-angiogénicos combinados. Las angiopoyetinas, como los miembros de la familia de VEGF, son factores de crecimiento muy específicos para el endotelio vascular (Davis y Yancopoulos, 1999; Holash y colaboradores, 1999; incorporadas en la presente mediante referencia) . Las angiopoyetinas primero descritas fue un agonista o activador receptor que se presenta naturalmente, angiopoyetina-1 (Ang-1), y un antagonista receptor que se presenta naturalmente, angiopoyetina-2 (Ang-2), ambas de estas actúan mediante un receptor quinasa de tirosina de célula endotelial, Tie2. Dos nuevas angiopoyetinas, angiopoyetina-3 (ratón) y angiopoyetina-4 (humana) también se han identificado (Valenzuela y colaboradores, 1999). La angiopoyetina-3 parece actuar como un antagonista (parecida a la Ang-2), mientras que la angiopoyetina-4 parece funcionar como un agonista (como la Ang-1) (Valenzuela y colaboradores, 1999). Una proteína denominada angiopoyetina-3 también fue clonada a partir de corazón humano y se reportó que no tenía efectos mitogénicos sobre células endoteliales (Kim y colaboradores, 1999) . Mientras que la VEGF es necesaria para las etapas iniciales del desarrollo vascular, la angiopoyetina-1 generalmente se requiere para las etapas posteriores de la remodelación vascular. El VEGF de este modo actúa para promover la diferenciación, proliferación de células endoteliales y la formación de vasos primitivos. La angiopoyetina-I actúa, vía el receptor Tie2, para promover el mantenimiento y la estabilización de vasos maduros. La angiopoyetina-1 de este modo es un factor de maduración o estabilización, que se piensa que convierte los vasos inmaduros en vasos maduros promoviendo interacciones entre las células endoteliales y las células de soporte circundantes (Holash y colaboradores, 1999). La angiopoyetina-1 se ha demostrado que aumenta la revascularización en tejido isquémico (Shyu y colaboradores, 1998) y que incrementa la supervivencia de redes vasculares expuestas ya sea a VEGF o una forma de aFGF (Papapetropoulos y colaboradores, 1999). Estos autores también mostraron que la angiopoyetina-1 evita la muerte apoptótica en CEVUH disparada por el retiro de la misma forma de aFGF (Papapetropoulos y colaboradores, 1999). Estos datos son consistentes con el papel directo de la angiopoyetina-1 en las células endoteliales humanas y su interacción con otras moléculas angiogénicas para estabilizar las estructuras vasculares promoviendo la supervivencia de células endoteliales diferenciadas. Como la angiopoyetina-1 imparte una señal de madurez y estabilidad, los inventores cuidadosamente han concebido los aspectos de la presente invención que se relacionan con la administración dirigida de la angiopoyetina-1. Los inventores razonaron que ya que la angiopoyetina-1 es un factor de maduración, volverá los vasos sanguíneos del tumor independientes del factor de crecimiento. Un aspecto de esta invención por lo tanto se refiere al uso de angiopoyetina-1 dirigida al tumor con el fin de cementar las propiedades de falta de respuesta VEGF de los vasos objetivos. Se razona que usando un ligando de enlace de tumor para administración angiopoyetina-1 a los vasos sanguíneos del tumor fácilmente se administraría del orden de 500,000 moléculas de angiopoyetina-1 a un lumen del vaso. Esto sobrepasaría el sistema receptor Tie2, saturando totalmente los receptores T?e2 con el ligando de angiopoyet?na-1. La angiopoyetina-2 de este modo sería incapaz de enlazarse, y así se inhibirían los efectos combinados de la angiopoyetina-2 y el VEGF (véase la discusión más adelante) . La administración de la angiopoyetina-1 al tumor, preferiblemente a la vasculatura del tumor, también se puede usar junto con una variedad de otras estrategias anticáncer, como se describe en detalle en la presente, para lograr un efecto terapéutico combinado. La respuesta típica de un tumor a la terapia que inducen cuando menos alguna necrosis es iniciar la regeneración vascular. Como la señal de la angiopoyetina-1 fuerza los vasos sanguíneos hacia la madurez, sería incapaz de remodelar y no podría compensar la pérdida de masa de tumor inducida por la sustancia terapéutica primaria. Estas observaciones por lo tanto proporcionan otro aspecto preferido de la administración de la angiopoyetina de la invención, a saber el uso combinado de la angiopoyetina-1 que se dirige en combinación con una o más sustancias anticáncer, incluyendo fármacos quimioterapéuticos convencionales. La acción de la angiopoyetina-1 en la administración es fundamentalmente para evitar la remodelación vascular. Ya sea que se use solo, o en terapias de combinación, el valor de la angiopoyetina-1 dirigida se aumenta particularmente por la seguridad inherente en este enfoque terapéutico. No hay un lado malo significativo a la terapia con angiopoyetina-1. Aún en el improbable caso en que la cantidad de la Ang-1 dirigida se dirigiera mal a tejidos que no sean de tumor, todo lo que resultaría sería que la vasculatura en el área objetivo se volvería más estable y/o quieta. En este respecto, el Ang-1 podría ser usada como sustancia anti-inflamatoria .
La angiopoyetina-2 actualmente es una sustancia preferida para su uso en la terapia dirigida a tumores, particularmente en combinación con la inhibición del VEGF de la presente invención. Sin embargo, debido a los efectos diferenciales de la angiopoyetina-2 bajo diferentes condiciones, particularmente con niveles de VEGF variantes, los inventores de nuevo cuidadosamente han concedido los aspectos de la invención que se relacionan con la administración dirigida de angiopoyetina-2. La angiopoyetina-2 también es un ligando para el receptor Tie2, pero generalmente contra-resta la maduración/estabilidad de los vasos sanguíneos mediado por angiopoyetina-1. De este modo es un antagonista de la angiopoyetina-1 y actúa para perturbar la estructura capilar. En condiciones adecuadas, la angiopoyetina-2 imparte una señal negativa a las células objetivo y la desestabilización inducida por la angiopoyetina-2 conduce a la regresión de los vasos . Esta es la primera característica de la angiopoyetina-2 buscada para ser explotada en la administración dirigida de la angiopoyetina-2 a los tumores, preferiblemente a la vasculatura del tumor. Se contempla que simplemente administrando suficiente angiopoyetina-2 la cual es fácilmente lograble usando anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2, tales como 2C3, podría superar cualquier otra señal que estuviera presente en ims^á ^^^^^?m át^A^s á el ambiente del tumor y podría promover la regresión de los vasos. Como hay un interjuego cuidadosamente controlado entre las angiopoyetinas en el ambiente natural, una desviación extrema del sistema en favor de la regresión, mediante el señalamiento perpetuo de angiopoyetina-2 , puede bien ocluir los efectos tanto de la angiopoyetina-1 como del VEGF. El uso de angiopoyetina-2 dirigida al tumor sola por lo tanto se puede usar para tomar ventaja para inducir la regresión de los vasos del tumor, particularmente como un mecanismo temprano de intervención terapéutica. Generalmente, la desestabilización inducida por la angiopoyetina-2 puede conducir ya sea a la regresión o a la regeneración de los vasos. La desestabilización en ausencia de otros estímulos angiogénicos, particularmente el VEGF, lo que conduce a la regresión de los vasos; mientras que la desestabilización en presencia de altos niveles del VEGF facilita la respuesta angiogénica (Holash y colaboradores, 1999). Los vasos que sufren desestabilización como respuesta a la ang?opoyetina-2 se pueden "rescatar" de la regresión mediante la exposición a otros estímulos. La angiopoyetina-2 por lo tanto puede volver a las células endoteliales responsivas a otros estímulos angiogénicas y facilitar una respuesta angiogénica en condiciones definidas. El VEGF, en particular, puede incitar las células desestabilizadas con Ang-2 para que proliferen y formen vasos nuevos primitivos (Asahara *t.*^t.t. t Al& MM., T.?f j ,Y mkíá y colaboradores, 1998; Holash y colaboradores, 1999). Sin duda, la expresión de angiopoyetina-2 en el tejido del tumor se ha reportado (Tanaka y colaboradores, 1999) , en donde se ha presumido que actúa en combinación con VEGF para promover la angiogénesis (Stratman y colaboradores, 1998). La neovascularización iniciada por la angiopoyetina-2 y el VEGF hace de estas moléculas "coangiogénicas" . Un modelo coordinado para explicar los efectos positivos y negativos de la angiopoyetina-2 en los vasos sanguíneos en ciertos tipos de tumor se ha reportado ahora (Holash y colaboradores, 1999). En este modelo, la desestabilización inducida por la angiopoyetina-2 inicialmente causa una regresión significativa de los vasos en tumores que originan mediante cooptar los vasos sanguíneos de la vasculatura hospedera circundante. Los altos niveles de angiopoyetina-2 producidos por las células endoteliales asociadas a los tumores contra-resta la señal de supervivencia aparentemente proporcionada por el bajo nivel, de expresión constitutiva de la angiopoyetina-1. La angiopoyetina-2 de este modo marca los vasos cooptados para la regresión apoptópica (Holash y colaboradores, 1999) . Sin embargo, a pesar de la necrosis del tumor resultante, las células de tumor supervivientes regulan hacia arriba el VEGF para asegurar su supervivencia. La expresión coincidente del VEGF y la angiopoyetina-2 resulta entonces en la angiogénesis robusta en la periferia del tumor, ya que el VEGF nulifica la señal regresiva de la angiopoyetina-2 y de hecho promueve el desarrollo vascular (Holash y colaboradores, 1999) . Aunque aparentemente contradictorio a primera vista, las acciones de la angiopoyetina-2 se pueden explicar y predecir en gran medida con base en otras señales presentes, particularmente VEGF. En ausencia de otra señal angiogénica, la angiopoyetina-2 causa que los vasos se desestabilicen y se vuelvan inmaduros, conduciendo la regresión. En presencia de un estímulo, particularmente el VEGF, la desestabilización causada por la angiopoyetina-2 realmente conduce a la angiogénesis ya que los vasos son "cebados" para recibir estímulos angiogénicos secundarios. Los efectos angiogénicos de varios reguladores se cree que se logran, cuando menos en parte, a través de la regulación de un ciclo de autocrina de actividad de angiopoyetina-2 en las células endoteliales microvasculares (Mandriota and Pepper, 1998) . Los papeles biológicos duales de la angiopoyetina-2 incitaron a los inventores a desarrollar estrategias terapéuticas adicionales que contribuyen con otras señales en el ambiente del tumor, particularmente el VEGF. Como la angiopoyetina-2 y el VEGF actúan en concierto para estimular la angiogénesis, un aspecto preferido de la presente invención es usar la administración de angiopoyetina-2 dirigida al tumor en combinación con los anticuerpos inhibitorios de VEGF presentes. ú ikisÉ Í£it. á . M*.*..¿..t ?tAiii?to.* *.?u*?»*^ Esto asegurará que la angiopoyetina-2 actúa en regresión y no en angiogénesis. A la luz de las anteriores explicaciones, se entenderá que la presente invención proporciona anticuerpos anti-VEGF, que bloquean el VEGFR2, tales como 2C3, que están unidos operativamente, o de otro modo funcionalmente asociados, con cualquiera o más de angiopoyetina-1, angiopoyetina-2, angiopoyetina-3 y/o angiopoyetina-4. Las composiciones ejemplares de angiopoyetina-1 son aquellas de SEQ ID N0:1 (ADN) y SEQ ID NO:2 (proteína), mientras que las composiciones de angiopoyetina-2 están ejemplificadas por SEQ ID NO: 3 (ADN) y SEQ ID NO: (proteína. Siendo la angiopoyetina-3 un antagonista, generalmente se usará co o la angiopoyetina-2 ; y la angiopoyetina-4 agonista se puede usar de 1 amanera de la angiopoyetina-1. El artículo por Valenzuela y colaboradores, (1999) se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para propósitos de suplementar adicionalmente la presente enseñanza con respecto a la angiopoyetina-3 y a la angiopoyetina- . Además, las proteínas de fusión y angiopoyetinas también se consideran para su uso en esta invención. Un ejemplo es la proteína de fusión estable Ang-l-Ang-2 incluida en la presente como SEQ ID NO: 5. Esta proteína contiene los primeros 73 residuos de la angiopoyetina-2, hasta la secuencia DAPLEY, fusionada con la secuencia de angiopoyetina-1 que ii--M-^É=ÍÉ-»¡ «<llifÍt ^^ comienza en el aminoácido 77. También tiene una mutación en la posición 265 en la secuencia de angiopoyetma-1, en donde Cys se reemplaza por Ser. Otros anti-angiogénicos para su uso con la presente incluyen angiostatina y endostatina. La angiostatina se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica 5,776,704; 5,639,725 y 5,733,876, cada una incorporada a la presente como referencia. La angiostatina es una proteína que tiene un peso molecular de entre aproximadamente 38 kD y aproximadamente 45 kD, determinado reduciendo la electroforesis en gel de poliacrilamida, que contiene aproximadamente regiones 1 a 4 de Kringle de una molécula de plasminógeno. La angiostatina generalmente tiene una secuencia de aminoácido sustancialmente similar a la de un fragmento de plasminógeno murino que comienza en el aminoácido número 98 de una molécula de plasminógeno murino intacto. La secuencia de aminoácidos de la angiostatina varía ligeramente entre las especies. Por ejemplo, en la angiostatina humana, la secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a la secuencia del fragmento de plasminógeno murino descrito anteriormente, aunque una secuencia de angiosgatina humana activa puede comenzar en cualquier aminoácido múmero 97 o 99 de una secuencia de aminoácidos de plasminógeno humano intacta. Además, el plasminógeno humano se puede usar, ya que tiene actividad anti-angiogénica similar, como se muestra en un *A-~"^—HriMli Ééi modelo de tumor de ratón. La angiostatina y la endostatina se han vuelto el foco de estudios intensos, ya que son los primeros inhibidores de la angiogénesis que han demostrado la capacidad de no sólo inhibir el crecimiento del tumor, sino también causar regresiones de tumor en ratones. Hay múltiples proteasas que han mostrado producir angiostatina a partir del plasminógeno que incluye elastasa, el macrófago metaloelastasa (MME) , matrilisina (MMP-7), y gelatinasa B/colagenasa tipo IV (MMP-9) de 92 kDA. La MME puede producir angiostatina a partir de plasminógeno en tumores y el factor estimulante de colonia de macrófagos de granulocitos (GMCSF) regula hacia arriba la expresión del MME mediante macrófagos que inducen la producción de angiostatina. El papel de la MME en la generación de angiostatina es soportado por el hallazgo de que la MME está de hecho expresada en muestras técnicas de carcinomas hepatocelulares de pacientes. Otra proteasa que se piensa que es capaz de producir angiostatina es la estromelisina-1 (MMP-3) . La MMP-3 ha demostrado producir fragmentos parecidos a angiostatina a partir de plasminógeno in vi tro . El mecanismo de la acción de la angiostatina actualmente no es claro, se hace la hipótesis de que se enlaza con un receptor superficial de la célula no identificado o sobre células endoteliales que inducen que la célula endotelial sufra muerte . celular programada, o detención mitótica. La endostatina parece ser una sustancia aún más poderosa anti-angiogénesis y anti-tumor, y se prefiere particularmente para enlazarse a anticuerpos anti-VEGF, que bloquean el VEGFR2, tales como el 2C3. La endostatina es efectiva causando regresiones en varios modelos de tumores en ratones. Los tumores no desarrollan resistencia a la endostatina y, después de múltiples ciclos de tratamiento, los tumores entran en un estado latente, durante el cual no aumentan el volumen. En este estado latente, el porcentaje de células de tumor que sufren apoptosis aumentó, produciendo una población que esencialmente permanece del mismo tamaño. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,854,205, para Folkman y O'Reilley, específicamente incorporada en la presente mediante referencia, se refiere a la endostatina y su uso como inhibidor de la proliferación de células endoteliales y angiogénesis. La proteína endostatina corresponde al fragmento de terminal C del tipo colágeno XVIII y la proteína se puede aislar de una variedad de fuentes. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,854,205 también muestra que la endostatina puede tener una secuencia de aminoácidos o de un fragmento de colágeno tipo XVIII, un coláseno tipo XV, o BOVMPE 1 de esterasa pregástrica. Las combinaciones de endostatina con otras proteínas antiangiogénicas, particularmente angiostatina, también se ÜA^AAA.AA^.^? ^^A^^^Á.^??.Í1 describen por la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,854,205, de manera que las composiciones combinadas son capaces de hacer la regresión efectiva de la masa de un tumor dependiente de la angiogénesis. La endostatina y la angiostatina son sustancias preferidas para la administración a tumores de acuerdo con la presente invención. La vasculostatina, canstatina y maspina también son sustancias preferidas. La endostatina, en particular, es una de las sustancias más preferidas. Las proteínas de fusión de endostatin-2C3 se puede preparar, como se describe en la presente. Varias formas de construcciones de endostatin-2C3 enlazadas químicamente también se describen en la presente solicitud. C5. Sustancias que inducen la apoptosis La presente invención también se puede usar para administrar sustancias que inducen apoptosis en cualquier célula dentro del tumor, incluyendo células de tumor y células endoteliales vasculares de tumor. Aunque muchas sustancias anticáncer pueden tener, como parte de su mecanismo de acción, un efecto que induce la apoptosis, ciertas sustancias se han descubierto, diseñado o seleccionado con esto como un mecanismo primario como se describe más adelante. Muchas formas de cáncer tienen reportes de mutación en los genes supresores de tumores, tales como p53. La inactivación de p53 da como resultado una falla para promover la apoptosis. Con esta falla, las células del cáncer progresan en la tumorigénesis, en vez de volverse destinadas para la muerte celular. De este modo, la provisión de los supresores del tumor también se contempla para su uso en la presente invención para estimular la muerte celular. Los supresores de tumor ejemplares incluyen, pero no se limitan a, p53, el gen del Retinoblastoma (Rb) , tumor de Wilm (WTl), bax alfa, enzima que convierte interleucina lb y familia, el gen MEN-1, neurofíbromatosis, tipo 1 (NF1), inhibidor cdk pl6, gen de cáncer colorrectal (DCC), gen de poliposis adenmatosis familial (FAP), en supresor de tumor múltiple (MTS-1), BRCAl y BRCA2. Se prefieren para su uso el p53 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,757,469; 5,6771,78 y 5,756,455; cada una incorporada a la presente mediante referencia), Retinoblastoma, BRCAl (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,750,400; 5,654,155; 5,710,001; 5,756,294; 5,709,999; 5,693,473; 5,753,441; 5,622,829 y 5,747,282; cada una incorporada a la presente mediante referencia) , MEN-1 (número de acceso GenBank U93236) y adenovirus E1A (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,776,743; incorporada a la presente mediante referencia). Otras composiciones que se pueden administrar mediante los anticuerpos anti-VEGF, que bloquean el VEGFR2, tales como el 2C3, incluyen genes que codifican el factor de «JtaS ??L^S. *.**(* m wt M iftiirniifiÉrfi (Mirihui'i necrosis de tumor relacionado con apoptosis que induce ligandos denominados TRAIL, y el polipéptido TRAIL (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,763,223; incorporada a la presente mediante referencia) ; la proteasa asociada con apoptosis de 24 kD de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,605,836 (incorporada en la presente mediante referencia); el factor asociado Fas 1, FAF1 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,750,653; incorporada a la presente mediante referencia) . También se contempla para su uso en estos aspectos de la presente invención la provisión de la enzima que se convierte en interleucina-lß y los miembros de la familia, los cuales se reporta también que estimula la apoptosis. Los compuestos tales como derivados de carbostirilo (Patente de los Estados Unidos Número 5,672,603; y 5,464,833; cada una incorporada a la presente mediante referencia); los péptidos apogénicos ramificados (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,591,717; incorporada en la presente mediante referencia) ; inhibidores de fosfotirosina y análogos de fosfotirosina no hidrolizables (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,565,491; y 5,693,627; cada una incorporada en la presente mediante referencia) ; agonistas de receptores de retinoide RXR (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,399,586; incorporada en la presente mediante referencia); y hasta antioxidantes (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,571,523; incorporada en la presente mediante referencia) también se pueden usar. Los inhibidores de tirosinaquinasa, tales como genisteína, también se pueden enlazar a las sustancias de la presente invención que se dirigen a un receptor superficial de la célula, el VEGFR1 (Como lo apoya la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,587,459; incorporada en la presente mediante referencia) . C6. Equivalentes Biológicamente Funcionales Los equivalentes, o aún mejoramientos, de los anticuerpos basados en 2C3 o cualquier otro anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, también se pueden hacer ahora, generalmente usando los materiales proporcionados anteriormente como punto de partida. Las modificaciones y cambios se pueden hacer en la estructura de un anticuerpo así y todavía obtener una molécula que tiene características parecidas o deseables de otro modo. Por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin pérdida apreciable de capacidad de enlace interactivo. Estas consideraciones también se aplican a toxinas, sustancias anti-angiogénicas , sustancias que inducen la apoptosis, coagulantes y similares. Ya que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína la que define la actividad funcional biológica de la proteína, ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos pueden hacerse en una secuencia de proteína (o desde luego, la secuencia de ADN subyacente) y sin embargo obtener una proteína con propiedades iguales (agonista) . De este modo se contempla que se pueden hacer varios cambios en la secuencia de los anticuerpos o las sustancias terapéuticas (o las secuencias de ADN subyacentes) sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Los equivalentes biológicamente funcionales hechos de la secuencia de ADN subyacente mutada se pueden hacer usando la información de codones proporcionada en la presente en la Tabla A, y los detalles técnicos de soporte en la mutagénesis específica del sitio. También se entiende bien por los expertos en la técnica que, inherente en la definición de una proteína o péptido "equivalente biológicamente funcional", está el concepto de que hay un límite al número de cambios que se pueden hacer dentro de una porción definida de la molécula y todavía dar como resultado una molécula con un nivel aceptable de actividad biológica equivalente. Las proteínas y péptidos biológicamente funcionalmente equivalentes de este modo se definen en la presente como aquellas proteínas y péptidos en los cuales ciertos, no la mayoría ni todos, de los aminoácidos se pueden sustituir. Desde luego, una pluralidad de proteínas/péptidos distintos con diferentes sustituciones fácilmente se pueden hacer y usar de acuerdo con la invención. Las sustituciones de aminoácidos generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Un análisis del tamaño, la forma y el tipo de los sustituyentes de cadenas laterales de aminoácidos revela que la arginina, lisina e histidina todas son residuos cargados positivamente; que la alanina, glicina y serina todas tienen un tamaño similar; y que la fenilalanina, el triptofano y la tirosina todas tienen una forma generalmente similar. Por lo tanto, basándose en estas consideraciones, arginina, lisina e histidina; alanina, glicina y serina; y fenilalanina, triptofano y tirosina; se definen en la presente como equivalentes biológicamente funcionales . Para hacer más cambios cuantitativos, el índice hidropático de los aminoácidos se puede considerar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático con base en sus características de hidrofobicidad y carga, estas son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (- 3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5) . La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva en una proteína generalmente se entiende en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, incorporada en la presente mediante referencia). Se sabe que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático similar o calificación y todavía retienen una actividad biológica similar. Al hacer cambios basándose en el índice hidropático, la sustitución de los aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de 12 se prefiere, aquellos los cuales están dentro de +1 se prefieren particularmente, y aquellos dentro de ±0.5 se prefieren aún más particularmente. De este modo se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y todavía obtener una proteína equivalente biológicamente. Como se detalla en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,554,101 (incorporada en la presente mediante referencia) , los siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 ± 1); glutamato (3.0 ± 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1); alanina (- 0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptofano (-3.4). Al hacer cambios basados en los valores de hidrofilicidad, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de +2 se prefiere, están dentro de ±1 se prefieren particularmente, y aquellos dentro de ±0.5 se prefieren aún más particularmente. C7. Proteínas de Fusión y Expresión Recombinante El anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o los inmunoconjugados basados en 2C3 de la presente invención se pueden preparar fácilmente como proteínas de fusión usando técnicas de biología molecular. Cualquier proteína de fusión se puede diseñar y hacer usando cualquiera de las sustancias terapéuticas descritas en la presente y las conocidas en la técnica. La tecnología de las proteínas de fusión se adapta fácilmente a preparar las proteínas de fusión en las cuales las dos porciones se unen por una secuencia de péptido selectivamente disociable. Las proteínas de fusión actualmente preferidas son las que contienen endostatina. La endostatina, como con cualquier otra terapia, se puede unir al término del anticuerpo o a cualquier punto distinto de las RDC. Las terapias tales como endostatina también se pueden preparar "integralmente", en donde preferiblemente se asocian con un péptido selectivamente disociable para permitir la liberación de la sustancia después de dar en el blanco. El uso de técnicas de ADN recombinante para lograr estos fines es ahora práctica normal para aquellos con experiencia en la técnica. Estos métodos incluyen, por .»JLÍ .AA.,Í A,^ib»?a»mM¿tí^* ?M L*m^S3^ ejemplo, técnicas de ADN recombinantes in vi tro, técnicas sintéticas y recombinación en vivo/recombinación genética. Se puede realizar síntesis de ADN y ARN, adicionalmente, usando sintetizadores automatizados (ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y colaboradores, 1989; incorporado en la presente mediante referencia) . La preparación de esta proteína de fusión generalmente conlleva la preparación de una primera y segunda región de codificación de ADN y la ligación funcional o unión de estas regiones, en cuadros, para preparar una sola región de codificación que codifica la proteína de fusión deseada. En el presente contexto, la secuencia de ADN del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o el anticuerpo parecido al 2C3 se unirá en el marco con la secuencia de ADN que codifica una sustancia terapéutica. No se cree generalmente que sea relevante cual porción de la construcción se prepare como la región terminal N o como la región terminal C. En cuanto la región de codificación deseada se ha producido, se crea un vector de expresión. Los vectores de expresión contienen uno o más promotores corriente arriba de las regiones de ADN insertadas que actúan para promover la transcripción del ADN y de este modo promueve la expresión de la proteína recombinante codificada. Este es el significado de "expresión recombinante". Para obtener una versión conocida como "recombinante" 'Lffl¿*>"J-*".---tt-~-^ .^,,,^1 ^^"*^ del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2, o el inmunoconjugado basado en 2C3, se expresa en una célula recombinante. El diseño técnico de los segmentos del ADN para la expresión en un sistema procariótico o eucariótico se puede realizar mediante técnicas generalmente conocidas para los expertos en expresión recombinante. Se cree que virtualmente cualquier sistema de expresión se puede emplear en la expresión de un anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o construcciones de inmunoconjugados basados en 2C3. Estas proteínas se pueden expresar con éxito en los sistemas de expresión eucariótico, por ejemplo, células CHO, sin embargo, se considera que los sistemas de expresión bacteriana, tales como el pQE-60 de E . coli serán particularmente útiles para la preparación a gran escala y la purificación posterior del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2 o los inmunoconjugados basados en 2C3. Los ADNc también se pueden expresar como sistemas bacterianos, con las proteínas codificadas expresadas como fusiones con ß-galactosida, ubiquitina, glutationa S-transferasa de Schis tosoma japonicum, y similares. Se cree que la expresión bacteriana tendrá ventajas sobre la expresión eucariótíca en términos de facilidad y uso y cantidad de materiales obtenidos mediante estos . En términos de expresión microbiana, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,583,013; Eitflin 'Th I llttfeiiufl.ii i rn»*>-**-»- "^^" **¡ *^t **?*¿*?[l< ^'?~' 5,221,619; 4,785,420; 4,704,362; y 4,366,246 se incorporan en la presente mediante referencia para los propósitos de suplementar aún más la presente descripción en relación con la expresión de genes en células hospederas recombinantes. El anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2, o los inmunoconjugados basados en 2C3 se pueden purificar y formular para la administración humana. De manera alternativa, los ácidos nucleicos que codifican los inmunoconjugados se pueden administrar vía terapia de genes. Aunque el ADN recombinante natural o plásmidos se pueden emplear, el uso de liposomas o de vectores se prefieren. La capacidad de ciertos virus para entrar a las células vía endositosis mediada por receptor y de integrar entre el genoma de la célula hospedera y expresar genes virales establemente y eficientemente los ha hecho candidatos atractivos para la transferencia de genes extraños en células de mamíferos. Los vectores de terapéutica de genes preferidos para su uso en la presente invención generalmente serán vectores virales. Los retrovirus han prometido vectores de administración de genes debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma de la hospedera, transfiriendo una gran cantidad de material genético extraño, infectando un espectro amplio de especies y de tipos celulares y empacarse en líneas celulares especiales. Otros virus, tales como los adenovirus, los virus de herpes símplex (VHS) , el citomegalovirus (CMV) , y .....^ ?^?i?^^ ???i^fA el virus adenoasociado (VAA) , tales como los descritos por la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,139,941 (incorporada en la presente mediante referencia), también se pueden diseñar técnicamente para servir como vectores para la transferencia de genes. Aunque algunos virus que pueden aceptar material genético extraño se limitan en el número de nucleótidos que pueden acomodar y en el rango de células que infectan, estos virus han demostrado que efectúan con éxito la expresión de genes. Sin embargo, los adenovirus no integran su material genético en el genoma de la hospedera y por lo tanto no requieren réplica de hospedera para la expresión de genes, haciéndolos idealmente adecuados para la expresión de genes rápida, eficiente, heteróloga. Las técnicas para preparar los virus infectivos defectivos de réplica son más conocidos en la técnica . En ciertas otras modalidades, el vector de terapéutica de genes será el VHS. Un factor que hace del VHS un vector atractivo es el tamaño y organización del genoma. Debido a que el VHS es grande, la incorporación de múltiples genes o los casetes de expresión es menos problemático que en otros sistemas virales más pequeños. Además, la disponibilidad de diferentes secuencias de control viral con actuación variante (por ejemplo, temporal, fuerza) hace posible controlar la expresión en un grado mayor que en otros sistemas. También es otra ventaja que el virus tenga relativamente pocos mensajes divididos, facilitando adicionalmente las manipulaciones genéticas. El VHS también es relativamente fácil de manipular y se puede cultivar a titulaciones altas. Desde luego, al usar sistemas de administración virales, se desearía purificar el virión suficientemente para volverlo esencialmente libre de contaminantes indeseables, tal como partículas virales de interferencia de defectos o endotoxinas y otros pirógenos de manera que no causen ninguna reacción en la célula, animal o individuo que recibe la construcción del vector. Un medio preferido de purificar al vector implica el uso de gradientes de densidad boyante, tal como centrifugación de gradiente de cloruro de cesio. C8. Con ugados de Anticuerpos El anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 se pueden conjugar con sustancias anticelulares o citotóxicas, para preparar "inmunotoxinas"; o asociarse operativamente con componentes que son capaces de estimular directamente o indirectamente la coagulación, formando de este modo un "coaguligando" . En los coaguligandos, el anticuerpo se puede enlazar directamente con un factor de coagulación directo o indirecto, o se pueden enlazar con una segunda región de enlace que enlaza éstas y luego libera un factor de coagulación directo o indirecto. El enfoque de la "segunda región de enlace" generalmente utiliza un anticuerpo ¿ ?^** *~?A± *??***~>-.^^«^-*fe.^A^. & áÁ d de enlace de coagulante como una segunda región de enlace, dando como resultado de este modo una construcción de anticuerpo biespecífico. La preparación y uso anticuerpos biespecíficos en general es muy conocida en la técnica, y se describe adicionalmente en la presente. En la preparación de inmunotoxinas, coaguligandos y anticuerpos biespecíficos , se puede emplear la expresión recombinante. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo elegido se unen, en cuadro, a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la toxina, coagulante, o segunda región de enlace elegidos para crear una unidad de expresión o vector. La expresión recombinante da como resultado la traducción de un nuevo ácido nucleico, para producir el producto de proteína deseado. Aunque se emplean ácidos nucleicos que codifican anticuerpos, en vez de ligandos que enlazan proteínas, el enfoque recombinante esencialmente es el mismo que el descrito más adelante en la presente. Volviendo a la tecnología de conjugados, la preparación de inmunotoxinas generalmente es muy conocida en la técnica. Sin embargo, se pueden lograr ciertas ventajas a través de la aplicación de cierta tecnología preferida, tanto en la preparación de las inmunotoxinas como en su purificación para la administración clínica posterior. Por ejemplo, aunque las inmunotoxinas basadas en IgG típicamente exhibirán mejor capacidad de enlace y aclaración de sangre más lenta que sus contrapartes Fab', las inmunotoxinas basadas en fragmento Fab' generalmente exhiben mejor capacidad de penetración de tejido en comparación con las inmunotoxinas basadas en IgG. Adicionalmente, aunque numerosos tipos de enlazadores que contienen enlaces disulfuro se conocen que pueden emplearse con éxito para conjugar la fracción de toxina al anticuerpo anti-VEGF que bloquea al VEGFR2 o al anticuerpo basado en 2C3, ciertos enlazadores generalmente se preferirán sobre estos enlazadores, basándose en las características y capacidades farmacológicas diferentes. Por ejemplo, los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que está estéricamente "impedido" se preferirán, debido a su mayor estabilidad en vivo, evitando de este modo la liberación de la fracción de toxina antes del enlace en el sitio de acción. Una variedad amplia de sustancias citotóxicas se conocen que se pueden conjugar con anticuerpos anti-VEGF que bloquea al VEGFR" o a los anticuerpos basados en 2C3, incluyendo toxinas derivadas de plantas, hongos, y bacterias, tales como la cadena de ricina A o cadena A desglicosilada. La reticulación de una cadena A de toxina con una sustancia objetivo, en ciertos casos, requiere un reticulador que presente funciones de disulfuro. La razón para esto no es clara, pero probablemente se debe a una necesidad de ciertas fracciones de toxina de ser fácilmente liberable de la sustancia objetivo en cuanto la sustancia ha "entregado" la ÍSÍ.A. -** ^^. ^*«*¿ > »í ¡tíMtaak ?^. toxina a las células objetivo. Cada tipo de reticulador, así como de qué manera se realiza la reticulación, tenderá a variar la farmacodinámica del conjugado resultante. Finalmente, en casos en donde se contempla toxina liberable, se desea tener un conjugado que permanezca intacto bajo condiciones encontradas en cualquier parte del cuerpo excepto en el sitio de acción pretendido, en este punto es deseable que el conjugado tenga buenas características de "liberación". Por lo tanto, el esquema de reticulación particular, incluye en particular el reactivo de reticulación particular usado en las estructuras que se reticulan, tendrá alguna importancia. Dependiendo del compuesto de toxina específico usado como parte de la proteína de fusión, puede ser necesario proporcionar un separador de péptido operativamente uniendo el anticuerpo y el compuesto de toxina que sea capaz de doblarse en una estructura de sitio de enlace disulfuro. La disociación proteolítica dentro del sitio volvería entonces un polipéptido heterodimérico en donde el anticuerpo y el compuesto de toxinas se enlazan mediante solamente un solo enlace disulfuro. Un ejemplo de esta toxina es la toxina de cadena de ricina A. Cuando se utilizan otros compuestos de toxina, se puede proporcionar un separador de péptido no disociable para unir operativamente el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2, o el anticuerpo basado en 2C3 y el compuesto de toxina I ,.^^^1^.»,^^*^-^-^...*^.=^^^ ^Ai^ ^.i de la proteína de fusión. Las toxinas que se pueden usar junto con los separadores de péptidos no disociables son aquellos los cuales pueden, en sí mismos, convertirse mediante disociación proteolítica, en forma de un disulfuro-enlazado citotóxico. Un ejemplo de este compuesto de toxina es un compuesto de exotoxina de Pseudonomas . Puede haber circunstancias, tales como cuando el antígeno objetivo no internaliza mediante una ruta consistente con la intoxicación eficiente mediante inmunotoxinas, en donde se deseará dirigir sustancias quimioterapéuticas tales como fármacos antitumor, otras citocinas, antimetabolitos, sustancias alquilantes, hormonas, y similares. Una variedad de sustancias quimioterapéuticas y otras sustancias farmacológicas se han conjugado ahora con éxito a los anticuerpos y mostrado que funcionan farmacológicamente. Las sustancias antineoplásicas ejemplares que se han investigado incluyen doxorrubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, y varias otras. Más aún, la unión de otras sustancias tales como neocarcinostatina, macromicina, trenimón y -amanitina se han descrito. Cuando se usan factores de coagulación en relación con la presente invención, cualquier enlace covalente al anticuerpo deberá hacerse en el sitio distinto de su sitio de coagulación funcional. Las composiciones de este modo se "enlazan" de cualquier manera operativa que permita que cada región realice su función pretendida sin deterioro significativo. De este modo, el anticuerpo se enlaza con el VEGF, y el factor de coagulación promueve la formación de coágulos de sangre. C9. Reticuladores bioquímicos Además de la información general proporcionada anteriormente, el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o los anticuerpos basados en 2C3 se pueden conjugar en sustancias anticelulares o citotóxicas usando ciertos reticuladores bioquímicos preferidos. Los reactivos de reticulación se usan para formar puentes moleculares que atan entre sí grupos funcionales de dos moléculas diferentes. Para enlazar dos proteínas diferentes de una manera escalonada, se pueden usar reticuladores hetero-bifuncionales que eliminan la formación de homopolímeros no deseada. Los reticuladores hetero-bifuncionales ejemplares se presentan en la Tabla Bl . t.a.^^.,.» ^.s^^,.,,,»^^ TABLA Bl RETICULADORES HETERO-BIFUNCIONALES Enlazador Reactivo hacia Ventajas y Longitud de Aplicaciones Separación después de Reticulación SMPT Aminas primarias Estabilidad mayor 11.2 A sulfhidrilos SPDP Aminas primarias Tiolación 6.8 A sulfhidrilos Reticulación disociable LC-SPDP Aminas primarias Separador extendido 15.6 A sulfhidrilos Sulfo-LC-SPDP Aminas primarias Separador extendido 15.6 A sulfhidrilos Soluble en agua SMCC Aminas primarias Grupo reactivo 11.6 A sulfhidrilos maleimida estable conjugación enzima- anticuerpo Conjugación proteina Hapten-portador Sulfo-SMCC Aminas primarias Grupo reactivo 11.6 A sulfhidrilos maleimida estable Soluble en agua Conjugación enzima- anticuerpo MBS »Aminas primarias Conjugación enzima- 9.9 A sulfhidrilos anticuerpo Conjugación proteina Hapten-portador Sulfo-MBS Aminas primarias SolubLe en agua 9.9 A sulfhidrilos SIAB Aminas primarias Conjugación enzima- 10.6 A sulfhidrilos anticuerpo Sulfo-SIAB Aminas primarias SolubLe en agua 10.6 A sulfhidrilos SMPB .Aminas primarias Separador extendido 14.5 A sulfhidrilos Conjugación enzima- anticuerpo Sulfo-SMPB Aminas primarias Separador extendido 14.5 A sulfhidrilos Soluble en agua EDC/Sulfo-NHS .Aminas primarias Conjugación Hapten- 0 grupos carboxilo Portador ABH Carbohidratos no Reacciona con grupos 11.9 A selectivos azúcar l» ¿-t.*A*.fel ^*»???3* **«.Jl*,***? ¡Síi Los reticuladores hetero-bifuncionales contienen dos grupos reactivos: uno generalmente reacciona con un grupo amino primario (por ejemplo, N-hidroxi succinimida) y el otro generalmente reacciona con un grupo tiol (por ejemplo, disulfuro de piridilo, maleimidas, halógenos, etcétera,). A través del grupo reactivo amina primario, el reticulador puede actuar con el o los residuos de lisina de una proteína (por ejemplo, el anticuerpo o fragmento seleccionado) y a través del grupo reactivo tiol, el reticulador, ya unido a la primera proteína, reacciona con el residuo cisteína (grupo sulfhidrilo libre) de la otra proteína (por ejemplo, el coagulante) . Las composiciones por lo tanto generalmente tienen, o se derivan para tener, un grupo funcional disponible para propósitos de reticulación. Este requisito no se considera que es limitante porque una amplia variedad de grupo se puede usar de esta manera. Por ejemplo, grupos amina primarios o secundarios, grupos hidrazida o hidrazina, alcohol carboxílico, fosfato, o grupos alquilantes se pueden usar para enlazar o reticular . El separador entre dos grupos reactivos de reticuladores puede tener varias longitudes y composiciones químicas. Un separador más largo permite una flexibilidad mejor de los componentes del conjugado aunque algunos componentes particulares en el puente (por ejemplo, grupo benceno) pueden prestar estabilidad extraordinaria al grupo * % reactivo o una resistencia aumentada del enlace químico a la acción en varios aspectos (por ejemplo, enlace disulfuro resistente a la sustancia reductora) . El uso de separadores péptidos, tales como L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala, también se contempla. Se prefiere que un reticulador que tenga una estabilidad razonable en la sangre se empleará. Numerosos tipos de enlaces disulfuro que contienen enlazadores se conocen que pueden emplearse con éxito para conjugar sustancias objetivo y tóxicos o coagulantes. Los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que esté estéricamente impedido pueden demostrar tener mayor estabilidad en vivo, evitando la liberación de la sustancia antes del enlace en el sitio de acción. Estos enlazadores de este modo son un grupo preferido de las sustancias de enlace. Uno de los reactivos de reticulación más preferidos para su uso en inmunotoxinas es el SMPT, el cual es un reticulador bifuncional que contiene un enlace disulfuro que está "esféricamente impedido" por un anillo benceno adyacente y grupos metilo. Se cree que el impedimento esférico del enlace disulfuro sirve como una función de protección en enlace del ataque de aniones tiolados tales como glutationa que puede estar presente en tejidos y sangre, y mediante esto ayuda a evitar el desacoplamiento del conjugado antes de la administración de la sustancia unida al sitio del tumor. Se ^|¡ yU y^ contempla que la sustancia SMPT también se puede usar en relación con los ligandos biespecíficos de esta invención. El reactivo de reticulación SMPT, como con muchos otros reactivos de reticulación conocidos, presta la habilidad de reticular grupos funcionales tales como el SH de la cisteína o de las aminas primarias (por ejemplo, el grupo amino epsilon de la lisina) . Otro tipo posible de reticulador incluye las fenilazidas fotorreactivas hetero-bifuncionales que contienen un enlace disulfuro disociable tal como el etil-1, 3'- ditiopropionato de sulfosuccinimidil-2- (p-azido salicilamido) . El grupo N-hidroxi-succinimidilo reacciona con grupos amino primarios y el fenilazida (después de la fotolisis) reacciona no selectivamente con cualquier residuo de aminoácido. Además de los reticuladores impedidos, también se pueden emplear enlazadores no impedidos de acuerdo con la presente. Otros reticuladores útiles, no consideran contener o generar un disulfuro protegido, incluyen SATA, SPDP y 2- iminotiolano . El uso de estos reticuladores está bien entendido en la técnica. En cuanto se conjugan, el conjugado se separa de las sustancias objetivo y terapéutica no conjugados y de los otros contaminantes. Un gran número de técnicas de purificación están disponibles para su uso para proporcionar conjugados con un grado suficiente de pureza para volverlos clínicamente útiles. Los métodos de purificación basados en la separación ,- lt.aa.4J t^.,-?,^,^^ por tamaños, tales como la filtración en gel, la permeación en gel o la cromatografía líquida de alto rendimiento, generalmente será de mayor uso. Otras técnicas cromatográficas tales como la separación de Sefarosa Azul, también se pueden usar. CIO. Enlazadores biológicamente liberables Aunque se prefiere que cualquier fracción de enlace tendrá estabilidad razonable en la sangre, para evitar la liberación sustancia de una sustancia unida antes de dirigirse a la enfermedad o sitio del tumor, en ciertos aspectos, el uso de enlaces biológicamente liberables y/o separadores selectivamente disociables o enlazadores se contempla. Los "enlaces biológicamente liberables" y "los separadores o enlazadores selectivamente disociables" todavía tienen una estabilidad razonable en la circulación. Los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 de la presente invención, tales como los anticuerpos parecidos a 2C3, de este modo se pueden enlazar a una o más sustancias terapéuticas vía un enlace biológicamente liberable. Cualquier forma de anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, o "anticuerpo o sustancia objetivo" se puede emplear, incluyendo los anticuerpos intactos, aunque los fragmentos ScFv serán preferidos en ciertas modalidades. Los "enlaces biológicamente liberables" o "enlaces selectivamente hidrolizables" incluyen todos los enlaces que son liberables, disociables o hidrolizables solamente o preferencialmente en ciertas condiciones. Esto incluye enlaces disulfuro y trisulfuro y enlaces de ácido lábiles, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,474,765 y 5,762,918, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia. El uso de un separador sensible al ácido para unión con una sustancia o fármaco terapéutico a un anticuerpo de la invención se contempla particularmente. En estas modalidades, las sustancias o fármacos terapéuticos se liberan dentro de los compartimentos ácidos adentro de una célula. Se contempla que la liberación sensible al ácido pueda ocurrir extracelularmente, pero todavía después de la dirección específica, preferiblemente al sitio del tumor. Ciertos ejemplos actualmente preferidos incluyen anticuerpos parecidos a 2C3 enlazados con colchicina o doxorrubicina vía un separador sensible al ácido. La unión vía las fracciones de carbohidrato de los anticuerpos también se contempla. En estas modalidades, las sustancias terapéuticas o fármacos se liberan dentro de los compartimentos ácidos adentro de una célula. El anticuerpo anti-VEGF objetivo también se puede derivar para introducir grupos funcionales que permitan la unión del o los agentes terapéuticos a través de un enlace biológicamente liberable. El anticuerpo objetivo de este modo se puede derivar para introducir cadenas laterales que terminan en hidrazida, hidrazina, amina primaria o grupos amina secundarios. Las sustancias terapéuticas se pueden conjugar a través del enlace de base de Schiff, un enlace hidrazona o acil hidrazona o un enlazador hidrazida (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,474,765 y 5,762,918, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia) . También se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,474,765 y 5,762,918, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia, el anticuerpo anti-VEGF objetivo se puede unir operativamente a las sustancias terapéuticas a través de uno o más enlaces biológicamente liberables que son enlaces sensibles a enzimas, incluyendo enlaces de péptidos, esteres, amidas, fosfodiésteres y glicosidas. Los aspectos preferidos de la invención se refieren al uso de enlazadores de péptidos que incluyen cuando menos un primer sitio de disociación para una peptidasa y/o proteinasa que se localiza preferencialmente dentro del sitio de la enfermedad, particularmente dentro del ambiente del tumor. La administración mediada por anticuerpo de la sustancia terapéutica unida da como resultado la disociación específicamente dentro del sitio de enfermedad o ambiente del tumor, dando como resultado la liberación específica de la sustancia activa. Ciertos enlazadores de péptidos incluirán un sitio de disociación que es reconocido por una o más enzimas interesadas en la remodelación. Los enlazadores de péptidos que incluyen un sitio de disociación para la uroquinasa, pro-uroquinasa, plasmina, plasminógeno, TGFß, estafiloquinasa, trombina, Factor IXa, Factor Xa o una metaloproteinasa, tal como colagenasa intersticial, una gelatinasa o una estromelisina, se prefieren particularmente. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,004,555, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,877,289, y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con número de serie 08/482,369, de Derechos de emisión pagados el 20 de octubre de 1998, se incorporan específicamente en la presente mediante referencia para el propósito de describir adicionalmente y habilitar cómo hacer y usar las construcciones de sustancias objetivo-sustancia terapéutica que comprenden enlaces biológicamente liberables y enlazadores y péptidos selectivamente disociables. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,877,289, emitida el 2 de marzo de 1999, en particular, se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para el propósito de describir adicionalmente y habilitar de qué manera usar las construcciones de sustancias objetivo-sustancia terapéutica que comprenden un enlazador péptido selectivamente disociable que es disociado por uroquinasa, plasmina, trombina, Factor IXa, g gH ^ ^g jjfc Factor Xa o una metaloproteinasa, tal como una colagenasa intersticial, una gelatinasa o una estromelisina, dentro de un ambiente de tumor. Los enlazadores de péptidos selectivamente disociables actualmente preferidos son aquellos que incluyen un sitio de disociación para plasmina o una metaloproteinasa (también conocida como "metaloproteasas de matriz" o "MMP" ) , tal como una colagenasa intersticial, una gelatinasa o una estromelisina. Los enlazadores de péptidos adicionales que se pueden usar de manera ventajosa en relación con la presente invención incluyen, por ejemplo, los enlistados en la Tabla B2.
TABLA B2 SECUENCIAS DE ENLAZADOR DISOCIABLE ^g^^&u^j Cll. Anticuerpos Biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son particularmente útiles en los aspectos de coaguligandos y anti -angiogénicos combinados de la presente invención. Sin embargo, los anticuerpos biespecíficos en general se pueden emplear, en tanto un brazo se enlace con un VEGF, opcionalmente en sustancialmente el mismo epítope que el 2C3 y el anticuerpo biespecífico se una a una sustancia terapéutica, generalmente en un sitio distinto de los sitios de unión de antígenos. En general, la preparación de anticuerpos biespecíficos también es muy conocida en la técnica. Un método implica la preparación por separado de anticuerpos que tengan especificidad para el antígeno objetivo, por un lado, y (como en la presente) una sustancia coagulante en por el otro. Los fragmentos pépticos F(ab'?)2 se preparan a partir de dos anticuerpos elegidos, seguidos por la reducción de cada uno para proporcionar fragmentos Fab'?SH. Los grupos SH en uno de los dos compañeros que se van a acoplar se alquilan con un reactivo de reticulación tal como o-fenilenodimaleimida para proporcionar grupos maleimida libres sobre el otro compañero. Este compañero se puede conjugar entonces con el otro por medio de un enlace tioéter, para dar el heteroconjugado deseado F(ab'?)2. Otras técnicas se conocen en donde la reticulación con SPDP o la proteína A se lleva a cabo, o se prepara una construcción triespecífica. Otro método para producir anticuerpos biespecíficos es mediante la fusión de dos hibridomas para formar un cuadroma. Como se usa en la presente, el término "cuadroma" se usa para describir la fusión productiva de dos hibridomas de células B. Usando ahora técnicas estándares, dos hibridomas que producen anticuerpos se fusionan para dar células hijas, y estas células que han mantenido la expresión de ambos conjuntos de genes de inmunoglobulina de clonotipo se seleccionan. Un método preferido para generar un cuadroma involucra la selección de un mutante deficiente de enzima de cuando menos uno de los hibridomas padres. Esta primera línea celular de hibridoma mutante se fusiona con células de un segundo hibridoma que ha sido expuesto letalmente, por ejemplo, a yodoacetamida, evitando su supervivencia continuada. La fusión celular permite el rescate del primer hibridoma adquiriendo el gen de su deficiencia de enzima del hibridoma tratado letalmente, y el rescato del segundo hibridoma a través de la fusión con el primer hibridoma. Se prefiere, pero no se requiere, la fusión de inmunoglobulinas del mismo isotipo, pero de una subclase diferente. Un anticuerpo de subclases mezclados permite el uso de un ensayo alternativo del aislamiento de un cuadroma preferido. En mayor detalle, un método de desarrollo de cuadroma y de selección implica obtener una línea de hibridoma que secreta el primer anticuerpo monoclonal elegido y hacer éste deficiente de la enzima metabólica esencial, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT) . Para obtener mutantes deficientes del hibridoma, se cultivan células en presencia de concentraciones crecientes de 8-azaguanina (1 x 10" 7 M hasta 1 x 10~5 M) . Los mutantes se subclonan limitando la dilución y probando su sensibilidad a la hipoxantina/ aminopterina/ timidina (HAT) . El medio de cultivo puede consistir en, por ejemplo, MEMD suplementado con 10 por ciento de SBF, 2 mM L-Glutamina y 1 mM de penicilina-estreptomicina. Una línea celular de hibridoma complementaria que produce el segundo anticuerpo monoclonal deseado se usa para generar los cuadromas mediante técnicas de fusión celular mAf AaÜAi* . «IMÉi . estándares. En resumen, 4.5 x 107 primeras células sensibles a HAT se mezclan con 2.8 x 107 segundas células resistentes al HAT que previamente han sido tratadas con dosis letal de inhibidor bioquímico irreversible yodoacetamida (5 mM en solución salina regulada de fosfato) durante 30 minutos en hielo antes de la fusión. La fusión celular se induce usando polietilenglicol (PEG) y las células se plaquean en placas de microcultivo de 96 pozos. Los cuadromas se seleccionan usando medio que contiene HAT. Los cultivos que contienen anticuerpo biespecífico se identifican usando, por ejemplo, un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada específico del isotipo de fase sólida, y manchado inmunofluorescente específico para el isotipo . En una modalidad de identificación para identificar el anticuerpo biespecífico, los pozos de las placas de microtitulación (Falcon, Becton Dickinson Labware) se cubren con reactivo que específicamente interactúa con uno de los anticuerpos de hibridoma padres y que carece de reactividad cruzada con ambos anticuerpos. Las placas se lavan, bloquean y los sobrenadantes (SN) que se van a probar se añaden a cada pozo. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos horas, los sobrenadantes se descartan, las placas se lavan, y se añaden conjugado de fosfatasa alcalina-anti-anticuerpo durante dos horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan y un sustrato de fosfatasa, por ejemplo, P-Nitrofenil fosfato íá i ,Jwt?ÍiÉ,r - ^ ***»- >. ^^^----a>.<iLtflife^aa, ^ *,„éi*t¿> .^¿g^t»*^.*^ (Sigma, San Luis) se añade a cada pozo. Las placas se incuban, se añade 3N de NaOH a cada pozo para detener la reacción, y se determinan los valores OD410 usando un lector de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada. En otra modalidad de identificación, placas de microtitulación tratadas previamente con poli-L-lisina se usan para enlazar una de las células objetivo a cada pozo, las células se fijan, por ejemplo, usando 1 por ciento de glutaraldehído, y los anticuerpos biespecíficos se prueban para determinar su capacidad de enlace con la célula intacta. Además, FACS, manchado por inmunofluorescencia, anticuerpos específicos de idiotipo, ensayos de competición de enlace de antígeno, y otros métodos comunes en la técnica de caracterización de anticuerpo se pueden usar junto con la presente invención para identificar los cuadromas preferidos. Después del aislamiento del cuadroma, los anticuerpos biespecíficos se purifican de otros productos celulares. Esto se puede llevar a cabo mediante una variedad de procedimiento de aislamiento de proteínas, conocidos por los expertos en la técnica de la purificación de inmunoglobulinas. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son muy conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory' anual , 1988) . Por ejemplo, los sobrenadantes de cuadromas seleccionados se pasan sobre columnas de sefarosa G de proteína A o proteína G para enlazar IgG (dependiendo del isotipo) . Los anticuerpos de enlace se eluyen con por ejemplo, un regulador de citrato pH 5.0. Las fracciones eluídas que contienen los anticuerpos biespecíficos, se dializan contra un regulador isotónico. De manera alternativa, el eluído también se pasa sobre una columna de sefarosa anti-inmunoglobulina . El anticuerpo biespecífico se eluye entonces con 3.5 M de cloruro de magnesio. Los anticuerpos biespecíficos purificados de esta manera se prueban para determinar su actividad de enlace mediante, por ejemplo, un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada específico de isotipo y ensayo de manchado de inmunofluorescencia de las células objetivo, como se describió anteriormente . Los anticuerpos biespecíficos purificados y los anticuerpos padres también se pueden caracterizar y aislar mediante electroforesis SDS-PAGE, seguido por manchado con plata o Coomassie. Esto es posible cuando uno de los anticuerpos padres tiene un peso molecular más alto que el otro. En donde la banda del anticuerpo biespecífico migra a medio camino entre los dos anticuerpos padres, la reducción de las muestras verifica la presencia de cadenas pesadas con dos pesos moleculares aparentes diferentes. D . Composiciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas de la presente invención generalmente comprenderán una cantidad efectiva de cuando menos un primer anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2, o anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3, disuelta o dispersa en un portador farmacéuticamente aceptable o medio acuoso. Terapéuticas combinadas también se contemplan, con el mismo tipo de composiciones farmacéuticas subyacentes se pueden emplear tanto para medicamentos solos como combinados. Las frases "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o de otro modo cuando se administra a un animal, o a un humano, según sea lo adecuado. Los usos veterinarios se incluyen igualmente dentro de la invención y las formulaciones "farmacéuticamente aceptables" incluyen formulaciones tanto para uso clínico como veterinario . Como se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispeí sión, recubrimientos, sustancias antibacterianas y antihongos, sustancias retardadoras isotónicas y de absorción y .similares. El uso de estos medios y sustancias para sustancias activas farmacéuticas es muy conocido en la técnica. Excepto algún medio convencional o sustancia sea incompatible con el ingrediente activo, su uso en las composiciones terapéuticas se contempla. Para la administración humana, las preparaciones deberán cumplir los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y i:¡M ¿^u¡l!í, .^.^AÍ ...,*->... A* *m *^. ***?*?~.A?AALkM pureza que se requieren por la Oficina de Estándares Biológicos de la FDA. Los ingredientes activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones. Las formulaciones de "dosis unitarias" son las que contienen una dosis o subdosis del ingrediente administrado para una administración en un tiempo particular. Por ejemplo, las formulaciones de "dosis unitaria" son las que contienen una dosis diaria o unidad o subdosis diaiia o una dosis semanal o unidad o subdosis semanal y así sucesivamente. DI. Formulaciones Inyectables Los anticuerpos o inmunoconjugados basados en el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al V1.GFR2 o en 2C3 de la presente invención frecuentemente se formularán para la administración parenteral, por ejemplo, formuladas para inyección vía las rutas intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, u otras rutas, incluyendo la administración peristáltica y la instilación directa en un tumor o sitio de enfermedad (administración intracavidad) . La preparación de una composición acuosa que contiene una construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica como un ingrediente activo será conocida para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Típicamente, estas composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensión; las formas solidar, convenientes para su uso para preparar soluciones o suspensiones después de la adición de un líquido antes de la inyección también se pueden preparar; y las preparaciones también se pueden emulsificar. Las formas farmacéuticas convenientes para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones; formulaciones que incluyen aceite de ajonjolí, aceite de cacahuate o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma deberá ser estéril y fluida al grado de que salga de la jeringa. Deberá ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y deberá preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos . Las composiciones de anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o el anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3 se pueden formular en una composición acuosa estéril en una forma neutra o de sal. Las soluciones orno base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua convenientemente mezclada con un tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición acida (formadas con los grupos amino libres de la proteína) , y las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como acético, trifluoroacético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas ug^gBégg^gL^M^Mlg - } con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxidos férricos, y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Los portadores convenientes incluyen solventes y medios de dispersión que contienen, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas convenientes de los mismos, y aceites vegetales. En muchos casos, será preferible incluir sustancias isotónicas, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula en el caso de dispersión y/o por el uso de tensoactivos. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, todas estas preparaciones deberán contener un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos. La prevención de la acción de microorganismos se puede llevar a cabo por varias sustancias antibacterianas y antihongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo mediante el uso de composiciones de sustancias que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Antes de o después de la formulación, el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o el anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3 deberán dializarse extensamente para remover moléculas de peso molecular pequeñas indeseables, y/o liofilizar para la formulación más fácil en el vehículo deseado, cuando sea apropiado. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando las sustancias activas en la cantidad requerida en el solvente adecuado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, como se desee, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los distintos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y técnicas de secado por congelación que producen un polvo de ingrediente activo, más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada estéril previamente de la misma. Las composiciones farmacéuticas convenientes de acuerdo con la invención generalmente incluirán una cantidad de el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o el anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3 mezclado con un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como solución acuosa estéril, para dar un rango de concentraciones finales, ?.M?I£Í?~ , si^^i^?MAi tiíMLáA, dependiendo del uso de destino. Las técnicas de preparación generalmente son muy conocidas en la técnica como se ejemplifica por Remington Pharmaceutical Sciences, 16th Ed . Mack Publishing Company, 1989, incorporada en la presente mediante referencia. Deberá apreciarse que la contaminación por endotoxinas deberá mantenerse mínimamente a un nivel seguro, por ejemplo, menor del 0.5 ng/mg de proteína. Más aún, para la administración humana, la preparación deberá satisfacer esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y estándares de pureza como se requiere por la Oficina de Estándares Biológicos de la FDA. Después de la formulación, las soluciones de anticuerpo o inmunoconjugado se administrarán de una manera compatible con la formulación de la dosis en una cantidad tal que sea efectiva terapéuticamente. D2. Formulaciones de Liberación Sostenida Las formulaciones de soluciones basadas en anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpos o inmunoconjugados basados en 2C3 se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificaciones, tales como del tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se contemplan otras formas aceptables farmacéuticamente, por ejemplo, tabletas, pildoras, cápsulas u otros sólidos para administración oral, supositorios, pesarios, soluciones nasales o rociadores, aerosoles, inhalantes, formas liposomales y similares. El tipo de forma para la administración se acoplará a la enfermedad o padecimiento que se va a tratar. Se pueden usar cápsulas de "liberación lenta" o composiciones o preparaciones farmacéuticas de "liberación sostenida" y son generalmente aplicables. Las formulaciones de liberación lenta generalmente se diseñan para dar un nivel de fármaco constante durante un período extenso y se pueden usar para administrar un anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o un anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3 de acuerdo con la presente invención. Las formulaciones de liberación lenta típicamente se implantan en la vecindad del sitio de enfermedad, por ejemplo, en el sitio del tumor. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo o inmunoconjugado, estas matrices están en forma de artículos con forma, v.gr., películas o microcápsula . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres; hidrogels, por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacr?lato) o poli ( vinilalcohol ) ; poliactidas, v.gr., Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 3, 7773,919; copolímeros de ácido L- glutámico y gama etil-L-glutamato; copolímeros de etileno- acetato de vinilo no degradable; copolímeros de ácido láctico- ácido glicólico degradable, tales como el Lupron Depot® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácído glicólico y acetato de leuprolide) ; y ácido poli- D- (-) -3-hidroxibutípco . Aunque los polímeros tales como el etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten liberar moléculas durante 100 días, ciertas hidrogels liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, reduciendo de este modo la actividad biológica y/o cambiando la inmunogenicidad. Están disponibles estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación involucra LA formación deL enlace S-S a través de intercambio tio-disulfuro, se logra la estabilización modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando los aditivos adecuados, desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas, y similares. D3. Liposomas y Nanoparticulas En ciertas modalidades, también se pueden emplear liposomas y/o nanopartículas con el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o a los anticuerpos o inmunoconjugados basados en 2C3. La formación y uso de los liposomas es generalmente conocido para los expertos en la técnica, como se resume más adelante. s.:...¡ka.ti}a' 'É j*J?.tA?tlC M J Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que están dispersos en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapa concéntrica de láminas múltiples (también denominada vesículas de láminas múltiples (MLV) ) . Las vesículas de láminas múltiples generalmente tienen diámetros de desde 25 nm hasta 4 µm. La sonificación de las vesículas de láminas múltiples da como resultado la formación de vesículas de una sola lámina pequeñas (SUV) con diámetros en el rango de 200 a 500 Á, que contienen una solución acuosa en el núcleo. Los fosfolípidos pueden formar una variedad de estructuras distintos de liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la proporción molar de lípido al agua. En proporciones bajas el liposoma es la estructura preferida. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, de la fuerza iónica y de la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar baja permeabilidad a sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas sufren una transición de fase que altera de manera remarcable su permeabilidad. La transición de fase involucra un cambio desde una estructura ordenada, muy empacada, conocida como estado de gel, a una estructura menos ordenada, empacada flojamente, conocida como estado fluido. Eso se presenta en una temperatura de transición de fase característica y da como resultado un incremento en la permeabilidad a los iones, azúcares y fármacos. ^s g^uuáM^b tsMte Los liposomas interactúan con células vía cuatro mecanismos diferentes: endocitosis por células fagocíticas del sistema reticuloendotelial tales como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, ya sea mediante fuerzas hidrofóbicas o electroestáticas débiles no específicas, o mediante interacciones específicas con componentes de la superficie celular; la fusión con la membrana celular del plasma mediante la inserción de la bicapa de lípidos de liposoma en la membrana del plasma, con liberación simultánea de contenidos liposomales en el citoplasma; y mediante la transferencia de lípidos liposomales a las membranas celulares o subcelulares, o viceversa, sin ninguna asociación del contenido de liposoma. Variando la formulación de liposoma se puede alterar que mecanismo es operativo, aunque más de uno puede operar al mismo tiempo. Las nanocápsulas generalmente atrapan compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar efectos laterales debido a la sobrecarga polimérica intracelular, tal como partículas ultrafinas (con tamaños alrededor de 0.1 mieras) deberán diseñarse usando polímeros capaces de ser degradados en vivo. Las nanopartículas de polialquil- cianoacrilato biodegradables que satisfacen estos requisitos se contemplan para su uso en la presente invención y estas partículas se pueden fabricar fácilmente. D4. Formulaciones Oftálmicas Muchas enfermedades con un componente angiogénico se asocian con el ojo. Por ejemplo, enfermedades asociadas con la neovascularización de la córnea que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, rechazo a injerto córneo, glaucoma neovascular y fibroplasia retrolental, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de Vitamina A, sobreuso de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, queratitis sicca pterigium, sjogrens, acné rosácea, filectenulosis, sífilis, infecciones de microbacteria, degeneración de lípidos, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras de hongos, infecciones por herpes símplex, infecciones por herpes zóster, infecciones por protozoarios, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratolisis marginal, trauma, artritis reumatoide, lupus sistémica, poliarteritis, sarcoidosis de Wegeners, escleritis, enfermedad de Steven Johnson, queratotomía radial de perifigoide, y rechazo a injerto córneo. Las enfermedades asociadas con la neovascularización retinal/coroidal que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, retinopatía diabética, degeneración macular, anima de células fusiformes, sarcoide, sífils, pseudoxanthoma elasticum, enfermedad de Pagets, oclusión de vena, oclusión de arteria, enfermedad obstructiva de carótida, uveítis/vitritis crónica, infecciones microbacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritematosa sistémica, retinopatía de premadurez, enfermedad de Eales, enfermedad de Bechets, infecciones que causan una retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Bests, miopía, pedazos ópticos, enfermedad de Stargarts, pars planitis, desprendimiento de retina crónico, síndrome de hiperviscosidad, toxoplasmosis, trauma y complicaciones post-láser . Otras enfermedades que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas con rubeosis (neovascularización del ángulo) y enfermedades causadas por la proliferación anormal de tejido fíbrovascular o fibroso que incluye todas las formas de vitreo-retinopatía proliferativa, asociada o no con diabetes. El anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 y los anticuerpos basados en 2C3 y los inmunoconjugados de la presente invención se pueden emplear ventajosamente en la preparación de composiciones farmacéuticas convenientes para su uso como soluciones oftálmicas, incluyendo las de administración intravitrea y/o intracameral . Para el tratamiento de cualquiera de los anteriores u otros padecimientos un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o una composición de anticuerpo basado en 2C3 de la invención se administraría al ojo o a los ojos del sujeto que los necesite en forma de una preparación oftálmica preparada de acuerdo con feaeüfcaa «•«^•««-*»-"«- ?ÍÜÚÍIM la práctica farmacéutica convencional, véase por ejemplo "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ava. Edición, páginas 1488 a 1501 (Mack Publishing Co., Easton, PA) . La preparación oftálmica contendrá un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o anticuerpo basado en 2C3 en una concentración de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1 por ciento en peso, preferiblemente de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.5 por ciento en una solución farmacéuticamente aceptable, suspensión o ungüento. Alguna variación en la concentración necesariamente se presentará, dependiendo del compuesto empleado, el estado del sujeto que se va a tratar y similares, y la persona responsable para el tratamiento determinará la concentración más conveniente para el sujeto individual. La preparación oftálmica preferiblemente estará en forma de una solución acuosa estéril que contiene, si se desea, ingredientes adicionales, por ejemplo preservativos, reguladores, agentes de tonicidad, antioxidantes y estabilizantes, sustancias no iónicas humedecedoras o clarificantes, sustancias que aumentan la viscosidad y similares. Los preservativos convenientes para su uso en una solución así incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, clorobutanol, timerosal y similares. Los reguladores convenientes incluyen ácido bórico, bicarbonato de sodio y de potasio, boratos de sodio y de potasio, carbonato de sodio y de potasio, acetato de sodio, bifosfato de sodio y similares, en cantidades suficientes para mantener el pH a entre aproximadamente pH 6 y pH 8, preferiblemente entre aproximadamente pH 7 y pH 7.5. Las sustancias de tonicidad convenientes dextran 40, dextran 70, dextrosa, glicerina, cloruro de potasio, propilenglicol, cloruro de sodio, y similares, de manera que el cloruro de sodio equivalente de la solución oftálmica está en el rango de 0.9 más o menos 0.2 por ciento . Los antioxidantes y estabilizantes convenientes incluyen bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, piosulfito de sodio, tiourea y similares. Sustancias convenientes humedecedoras y clarificantes incluyen polisorbato 80, polisorbato 20, poloxámero 282 y tiloxapol. Las sustancias que aumentan la viscosidad convenientes incluyen dextran 40, dextran 70, gelatina, glicerina, hidroxietilcelulosa, hidroximetilpropilcelulosa, lanolina, metilcelulosa, petrolato, polietilenglicol, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa y similares. La preparación oftálmica se administrará tópicamente al ojo del sujeto que necesita el tratamiento mediante métodos convencionales. Por ejemplo, en forma de gotas o bañando el ojo en la solución oftálmica. D5. Formulaciones tópicas En el sentido más amplio, las formulaciones para la administración tópica incluyen aquellas para la administración í?.».?,.¿.í*.á*? ...... -¿8.--,......9 *****^.*^*.*, ..*^. *.^s^.ii*¿k* &iAt.i en la boca (bucal) y a través de la piel. Los "sistemas de administración tópica" también incluyen parches transdérmicos que contienen el ingrediente que se va a administrar. La administración a través de la piel se puede lograr adicionalmente por iontoforesis o electrotransporte, si se desea . Las formulaciones convenientes para la administración tópica en la boca incluyen lozenges que comprenden los ingredientes en una base con sabor, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente que se va a administrar en un portador líquido conveniente . Las formulaciones convenientes para la administrar tópica en la piel incluyen ungüentos, cremas, gels y pastas que comprenden el ingrediente que se va a administrar en un portador farmacéuticamente aceptable. La formulación del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 para uso tópico, tal como en cremas, ungüentos y gels incluyen la preparación de bases de ungüento oleaginosos o solubles en agua, así como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, estas composiciones pueden incluir aceites vegetales, grasas animales, y más preferiblemente, hidrocarburos semisólidos obtenidos del petróleo. Componentes .AAdAjJ?AA particulares usados pueden incluir ungüento blanco, ungüento amarillo, cero de cetil esteres, ácido oleico, aceite de oliva, parafina, petrolato, petrolato blanco, espermaceti, glicerita de almidón, cera blanca, cera amarilla, lanolina, lanolina anhidra y monoestearato de glicerilo. Varias bases de ungüento solubles en agua también se pueden usar, incluyendo glicol esteres y derivados, polietilenglicoles, polioxil 40 estearato y polisorbatos . Las formulaciones para la administración rectal se pueden presentar como un supositorio con una base conveniente que comprende, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato. Las formulaciones convenientes para la administración vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, gels, pastas, espumas o formulaciones en rocío que contienen además del ingrediente activo vehículos como se conocen en la técnica que son adecuados . D6. Formulaciones nasales La administración local vía las rutas nasal y respiratorias se contempla para tratar varios padecimientos. Estas rutas de administración también son convenientes para administrar sustancias en la circulación sístémica. Las formulaciones de ingredientes activos en portadores convenientes para la administración nasal por lo tanto se incluyen dentro de la invención por ejemplo, soluciones nasales, rocíos, aerosoles e inhalantes. Cuando el vehículo es un sólido, las formulaciones incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el rango de 20 a 500 mieras, que se administra, v.gr., mediante la inhalación rápida a través del pasaje nasal de un contenedor del polvo mantenido cercano a la nariz. Las formulaciones convenientes en donde el portador es un líquido son útiles en la administración nasal. Las soluciones nasales usualmente son soluciones acuosas diseñadas para ser administradas a los pasajes nasales en gotas o rocíos y se preparan de manera que son similares en muchos aspectos a las secreciones nasales, de manera que se mantiene la acción ciliar normal. De este modo, las soluciones nasales acuosas usualmente son isotónicas y ligeramente reguladas para mantener un pH de 5.5 a 6.5. Además, preservativos antimicrobionas similares a los usados en preparaciones oftálmicas, y estabilizantes de fármacos adecuados, si se requiere, se pueen incluir en la formulación. Varias preparaciones nasales comerciales se conocen e incluyen, por ejemplo, antibióticos y antihistaminas y se usan para la profilaxis del asma. Inhalaciones e inhalantes son preparaciones farmacéuticas diseñadas para administrar un fármaco o compuesto en el árbol respiratorio de un paciente. Un vapor o niebla se administra y alcanza el área afectada. Esta ruta también se puede emplear para administrar sustancias a la circulación sistémica. Las inhalaciones se pueden administrar por las vías nasales o respiratoria oral. La administración de soluciones de inhalación sólo es efectiva si las gotas son suficientemente finas y de tamaño uniforme para que la niebla alcance los bronquiolos . Otro grupo de productos, también conocido como inhalaciones, y algunas veces llamado insuflaciones, comprende fármacos en polvo muy fino o líquidos que están llevados a los pasajes respiratorios mediante el uso de sistemas de administración especiales, tales como aerosoles farmacéuticos, que mantienen una solución o suspensión del fármaco en un impulso de gas licuado. Cuando se libera a través de una válvula conveniente y adaptador oral, un medidor de dosis de la inhalación se impulsa hacia la vía respiratoria del paciente. El tamaño de partícula es de mayor importancia a la administración de este tipo de preparación. Se ha reportado que el tamaño óptimo de partícula para la penetración en la cavidad pulmonar es del orden de 0.5 a 7 mieras. Nebulizaciones finas son producidas por aerosoles presurizados y por lo tanto su uso se considera ventajoso. E. Juegos Terapéuticos Esta invención también proporciona juegos terapéuticos que comprenden el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o a los anticuerpos o inmunoconjugados basados en 2C3 para su uso en los presentes métodos de tratamiento. Estos juegos generalmente contendrán; en ? ? s f ,1Í elementos contenedores convenientes, una formulación farmacéuticamente aceptable de cuando menos el anticuerpo anti- VEGF, que bloquea al VEGFR2 o a los anticuerpos o inmunoconjugados basados en 2C3. Los juegos pueden también contener otras formulaciones farmacéuticamente aceptables, ya sea para diagnóstico/formación de imágenes o terapia combinada. Por ejemplo, estos juegos pueden contener cualquiera de uno o más de un rango de fármacos quimioterapéuticos o radioterapéuticos; sustancias anti-angiogénicas; anticuerpos de células anti-tumor; y/o inmunotoxinas o coaguligandos de vasculatura anti-tumor o estroma anti-tumor. Los juegos pueden tener un solo contenedor (medio contenedor) que contiene el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o a los anticuerpos o inmunoconjugados basados en 2C3, con o sin componentes adicionales, o pueden tener distintos contenedores para cada sustancia deseada. Cuando se proporcionan terapéuticos combinados, se puede premezclar una sola solución, ya sea en una combinación equivalente molar, o con un componente en exceso del otro. De manera alternativa, cada uno del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o a los anticuerpos o inmunoconjugados basados en 2C3 y otros componentes de sustancias anticáncer del juego se pueden mantener por separado dentro de contenedores distintos antes de la administración a un paciente. Cuando los componentes del juego se proporcionan en una o más soluciones líquidas, la solución líquida preferiblemente es una solución acuosa, siendo particularmente preferida la solución acuosa estéril. Sin embargo, los componentes del juego se pueden proporcionar como polvos secos. Cuando los reactivos o componentes se proporcionan como polvo seco, el polvo se puede reconstituir mediante la adición de un solvente conveniente. Se considera que el solvente también puede proporcionarse en otro contenedor. Los contenedores del juego generalmente incluyen cuando menos un frasco, tubo de prueba, ampolleta, botella, jeringa u otro elemento contenedor, en el cual el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o a los anticuerpos o inmunoconjugados basados en 2C3, y cualquier otra sustancia deseada, se puede colocar y, preferiblemente, convenientemente fraccionar. Cuando se incluyen componentes separadas, el juego también contendrá generalmente un segundo frasco u otro contenedor en el cual éstos se colocan, permitiendo la administración de dosis diseñadas por separado. Los juegos también pueden contener un segundo/tercer elemento contenedor para contener un regulador farmacéuticamente aceptable u otro diluyente . Los juegos también puede contener un elemento mediante el cual se administra el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o a los anticuerpos o inmunoconjugados basados en 2C3 a un animal o paciente, por ejemplo, una o más AAÍ.?? v?**'.. *• .AS^..AA , a a?¿M^ ti:Á ''t''i-í~'--?a^'i^*t- ¿f****'^ ' agujas o jeringas, o hasta un gotero para ojos, pipeta, u otro de estos aparatos parecidos, a partir de los cuales la formulación se puede inyectar en el animal o aplicarse a una área enferma del cuerpo. Los juegos de la presente invención también típicamente incluirán un medio para contener los frascos, o cualquier otro componente, en confinamiento cerrado para venta comercial, tal como, por ejemplo, contenedores de plástico moldeados por soplado o por inyección en los cuales se colocan y retienen en los frascos y otros aparatos deseados. F. Terapia .Anti-.Angiogénica La presente invención se puede usar para tratar animales y pacientes con angiogénesis aberrante, de manera que contribuye a una variedad de enfermedades y desórdenes . El preponderante y/o clínicamente importante de éstos, fuera del campo de tratamiento de cáncer, incluye artritis, artritis reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Grave, restenosis vascular, incluyendo restenosis después de la angioplastia, malformaciones arteriovenosas meningioma, hemangioma y glaucoma neovascular. Otros objetivos potenciales para intervención incluyen angiofibroma , placas ateroscleróticas, neovascularización de injerto córneo, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, síndrome de Osler-Weber, fibroplasia retrolental de granuloma piogénico, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, Stteitr* *¿?w&zk*tí&* dermatitis, otras enfermedades y desórdenes inflamatorios, y hasta endometriosis. Otras enfermedades y desórdenes que son tratables por la invención, y la base unificante de estos desórdenes angiogénicos, se presentan más adelante. Una enfermedad en la cual participa la angiogénesis es la artritis reumatoide, en donde los vasos sanguíneos en el recubrimiento sinovial de las articulaciones sufre angiogénesis. Además de formar nuevos networks vascular, las células endoteliales liberan factores y especies de oxígeno reactivos que conducen al crecimiento de paño y destrucción de cartílago. Los factores participantes en la angiogénesis pueden contribuir activamente, y ayudar a mantener, el estado crónicamente inflamado de la artritis reumatoide. Los factores asociados con la angiogénesis también tienen un papel en la osteoartritis, contribuyendo a la destrucción de la articulación . Harada y colaboradores, (1998, específicamente incorporada en la presente mediante referencia) mostró que el VEGF participa en la patogénesis de la artritis reumatoide y, además, que la medición de la concentración de suero del VEGF es un método no invasivo, útil para supervisar la actividad de la enfermedad de la artritis reumatoide. Esto apoya los usos terapéuticos y de diagnóstico de la presente invención en relación con la artritis reumatoide. Nagashima y colaboradores, (1999, específicamente incorporada en la presente mediante referencia) describieron los efectos inhibitorios de los fármacos anti-reumáticos sobre el VEGF en células sinoviales reumatoides cultivadas. El VEGF se expresa constitutivamente en el sinovio de la artritis reumatoide. El fármaco anti-reumático conocido, bucilamina (BUC) , se demostró que incluye dentro de su mecanismo de acción la inhibición de la producción del VEGF mediante células sinoviales. De este modo, los efectos anti-reumáticos de la bucilamina son mediados por la supresión de la angiogénesis y la proliferación sinovial en el sinovia artrítico a través de la inhibición de la producción del VEGF por las células sinoviales. El uso de la presente invención como una terapia antiartrítica está apoyado por las acciones inhibitorias del VEGF de esta terapia existente. Otro ejemplo de una enfermedad mediada por angiogénesis es la enfermedad neovascular ocular. La enfermedad se caracteriza por la invasión de nuevos vasos sanguíneos en las estructuras del ojo, tales como la retina o la córnea. Es la causa más común de ceguera y está mezclada en aproximadamente veinte enfermedades de los ojos. En la degeneración macular relacionada con la edad, los problemas visuales asociados están causados por un crecimiento interno de los capilares coloidales a través de defectos en la membrana de Bruch con proliferación de tejido fibrovascular debajo del epitelio del pigmento retinal. El daño angiogénico también se asocia con retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, rechazo a injerto córneo, glaucoma neovascular y fibroplasia retrolental . Otras enfermedades asociadas con neovascularización córnea incluyen, pero no se limitan a, queratoconjuntivitis epidérmica, deficiencia de Vitamina A, sobreuso de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, queratitis sicca pterigium, sjogrens, acné rosácea, filectenulosis, sífilis, infecciones por micobcteria, degeneración de lípidos, quemaduras químicas, úlceras bacterianas. Úlceras de hongos, infecciones por herpes símplex, infecciones por herpes zoster, infecciones por protozoario, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratolisis marginal, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis, trauma, sarcoidosis de egeners, escleritis, enfermedades Steven Johnson, queratotomía radial perifigoide, y rechazo a injerto córneo. Las enfermedades asociadas con la neovascularización retinal/coroidal incluyen, pero no se limitan a, retinopatía diabética, degeneración macular, anemia de células fusiformes, sarcoide, sífils, pseudoxanthoma elasticum, enfermedad de Pagets, oclusión de vena, oclusión de arteria, enfermedad obstructiva de carótida, uveítis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritematosa sistémica, retinopatía de premadurez, enfermedad de Eales, enfermedad de Bechets, infecciones que causan una retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Bests, miopía, manchas ópticas, enfermedad de Stargarts, pars planitis, desprendimiento de retina crónico, síndrome de hiperviscosidad, toxoplasmosis, trauma y complicaciones post- láser . Otras enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas con rubeosis (neovascularización del ángulo) y enfermedades causadas por la proliferación anormal de tejido fibrovascular o fibroso que incluye todas las formas de vitreo-retinopatía proliferativa. La inflamación crónica también involucra angiogénesis patológica. Esta enfermedad se declara como colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn muestra histológicos cambios con el crecimiento interno de nuevos vasos sanguíneos hacia los tejidos inflamados. La bartonellosis, una infección bacteriana encontrada en Sudamérica, puede dar como resultado una etapa crónica que se caracteriza por la proliferación de las células endoteliales vasculares. Otro papel patológico asociado con la angiogénesis se encuentra en la aterosclerosis. Las placas formadas dentro del lumen de los vasos sanguíneos se ha mostrado que tienen actividad estimulatorio angiogénica. La expresión de VEGF en las lesiones ateroscleróticas coronarias humanas se demostró por Inoue y colaboradores, (1998, específicamente incorporada en la presente mediante referencia). Esto hace evidente la significancia patofisiológica del VEGF en la progresión de la aterosclerosos coronaria humana, así como en los procesos de recanalización en enfermedades coronarias obstructivas. La presente invención proporciona un tratamiento efectivo para estas condiciones. Una de las enfermedades angiogénicas más frecuentes en la infancia es el hemangioma. En la mayoría de los casos, los tumores son benignos y disminuyen sin intervención. En casos más severos, los tumores avanzan a formas grandes cavernosas e infiltrativas y crean complicaciones clínicas. Las formas sistémicas de los hemangiomas, las hemangiomatosas, tienen una tasa de mortalidad alta. Existen hemangiomas resistentes a la terapia que no pueden ser tratados con las sustancias terapéuticas actualmente en uso. La angiogénesis también es responsable de daño encontrado en enfermedades hereditarias tal como la enfermedad de Osler-Weber-Rendu, o la telangiectasia hemorrágica hereditaria. Esta es una enfermedad heredada caracterizada por múltiples angiomas pequeños, tumores de sangre o de los vasos a tumores de los vasos sanguíneos o linfáticos. Los angiomas se encuentran en la piel y en las membranas mucosas, frecuentemente acompañados con epistaxis (sangrados de nariz) o sangrado gastrointestinal y a veces con fístula arteriovenosa pulmonar o hepática.
^?*¿^M*i* ie i La angiogénesis también participa en los procesos fisiológicos normales tales como la reproducción y la cicatrización de heridas. La angiogénesis es un paso muy importante en la ovulación y también en la implantación de la blástula después de la fertilización. La prevención de la angiogénesis podría usarse para inducir la amonorrea, para bloquear la ovulación o para evitar la implantación por la blástula . En la cicatrización de heridas, la reparación excesiva o fibroplasia puede ser un efecto colateral perjudicial de los procedimientos quirúrgicos y puede ser causado o exacerbado por la angiogénesis. Las adherencias son una complicación frecuente de la cirugía y conducen a problemas tales como la obstrucción del intestino delgado. Las enfermedades y desórdenes caracterizados por permeabilidad vascular indeseable también pueden ser tratados por la presente invención. Estas incluyen edema asociado con tumores de cerebro, ascitas asociadas con malignidades, síndrome de Meigs, inflamación del pulmón, síndrome nefrótico, efusión pericardial y efusión pleural, como se describe en la publicación internacional WO 98/16551, específicamente incorporada en la presente mediante referencia. Cada una de las enfermedades y desórdenes anteriores, junto con todos los tipos de tumores, como se describe en la siguientes secciones, se pueden tratar efectivamente por la presente invención de acuerdo con el conocimiento en la técnica, como se describe en, v.gr. la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,712,291 (incorporada específicamente en la presente mediante referencia), que resultan beneficios unificados de la aplicación de estrategias antiangiogénicas al tratamiento de enfermedades angiogénicas. Los anticuerpos y/o inmunoconjugados de la invención se utilizan más preferiblemente en el tratamiento de tumores. Los tumores en los cuales la angiogénesis es importante incluyen tumores malignos, y tumores benignos, tales como neuroma acústico, neurofibro a, tracoma y granulomas piogénicos. La angiogénesis es particularmente prominente en la formación de tumores sólidos y la metástasis. Sin embargo, la angiogénesis también se asocia con tumores que lleva la sangre, tales como leucemias y varias enfermedades neoplásicas agudas o crónicas de la médula ósea en la cual la proliferación no restringida de los glóbulos blancos, se presenta, usualmente acompañada por anemia, mala coagulación sanguínea, y agrandamiento de los ganglios linfáticos, el hígado y el bazo. La angiogénesis también representa un papel en las anormalidades en la médula ósea que dan lugar a tumores parecidos a leucemia. La angiogénesis es importante en dos etapas de la metástasis de tumor. En la vascularización del tumor primario, la angiogénesis permite que las células entren a la corriente sanguínea y circulen en todo el cuerpo. Después de que las células de tumor han dejado el sitio primario, y se han asentado en el sitio de metástasis, secundario, la angiogénesis puede presentarse antes de que el nuevo tumor pueda crecer y extenderse. Por lo tanto, la prevención de angiogénesis evita la metástasis de tumores y contener el crecimiento neoplástico en el sitio primario, permitiendo el tratamiento por otras sustancias terapéuticas, particularmente construcciones de sustancias terapéuticas-sustancias objetivo (véase más adelante) . Los métodos de anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 y anticuerpo e inmunoconjugado basados en 2C3 proporcionados por esta invención de este modo, son ampliamente aplicables al tratamiento de cualquier tumor maligno que tiene un componente vascular. Al usar los anticuerpos y/o los inmunoconjugados de la invención en el tratamiento de tumores, particularmente tumores malignos vascularizados, las sustancias se pueden usar solas o en combinación con, v.gr., sustancias quimioterapéuticas, radioterapéuticas, apoptópicas, antiangiogénicas y/o inmunotoxinas o coaguligandos. Los tumores típicamente vascularizados para tratamiento son los tumores sólidos, particularmente los carcinomas, los cuales requieren un componente vascular para la provisión de oxígeno y nutrientes. Los tumores sólidos ejemplares que se pueden tratar usando la invención incluyen, ln8l??Jl***?li±. ¡tOm Í ^ ?Mu^a t.^^|tü tJAIÍLL pero no se limitan a, carcinomas del pulmón, pecho, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótidas, vías biliares, colon, recto, cérvix, útero, endometrio, riñon, vejiga, próstata, tiroides, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de células pequeñas, melanomas, gliomas, glioblastomas, neuroblastomas, y similares. La publicación internacional WO 98/45331 también se incorpora en la presente mediante referencia para ejemplificar adicionalmente la variedad de tipos de tumor que se pueden tratar efectivamente usando un anticuerpo anti-VEGF. El conocimiento del papel de la angiogénesis en el mantenimiento y metástasis de tumores ha conducido a un indicador de pronóstico para cánceres tales como el cáncer de pecho. La cantidad de neovascularización encontrada en el tumor primario se determinó contando la densidad de microvasos en el área de la neurovascularización más intensa en el carcinoma de mama invasivo. Un nivel alto de densidad de microvasos fue encontrado que se correlaciona con la recurrencia del tumor. El control de la angiogénesis por las terapias de la presente invención reducirá o negará la recurrencia de estos tumores. La presente invención se contempla para su uso en el tratamiento de cualquier paciente que presenta un tumor sólido. A la luz de las propiedades específicas de las composiciones basadas en anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, la ' ' * i 3 terapia de la presente invención tendrá efectos secundarios reducidos. Ventajas particulares resultarán en el mantenimiento o mejoramiento de las respuestas inmunes al hospedero contra el tumor, como es mediado por macrófagos, y en la falta de efectos adversos en el tejido de los huesos. La invención de este modo será la terapia antiangiogénica de elección para el tratamiento de cánceres pediátricos y pacientes que tienen, o están en riesgo de desarrollar, osteoporosis y otras deficiencias de huesos. Aunque todas las malignidades y tumores sólidos se pueden tratar por la invención, los anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 y 2C3 de esta invención se contemplan particularmente para su uso para tratar pacientes con tumores más angiogénicos, o pacientes en riesgo de metástasis. La presente invención también pretende ser un tratamiento preventivo o profiláctico. Estos aspectos de la invención incluyen la capacidad de la invención para tratar pacientes que se presentan con un tumor primario que puede tener tumores metastásicos, o células de tumores en las etapas tempranas de la siembra de tumor metastásico. Como una estrategia antiangiogénica, la presente invención también se puede usar para evitar el desarrollo de tumores en sujetos con riesgo moderado o alto para desarrollar un tumor, basándose en pruebas de pronóstico y/o parientes cercanos que sufren de un cáncer hereditario. -. ^í^.,. ...MtMat-M .¡A? HM ÉM¡É¡ ¿ ^áMi Las formas conjugadas o de inmunotoxina de los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 y 2C3 de la invención se contemplan particularmente para su uso para destruir o hacer más pequeños los tumores sólidos. Estos aspectos de la invención se pueden usar junto con los anticuerpos antiangiogénicos no conjugados de la invención, o con otros enfoques antiangiogénicos. Se apreciará fácilmente por los expertos en la técnica que el inmunoconjugado y las formas de profármaco de los presentes métodos de tratamiento tienen la ventaja distintiva de proporcionar una sola sustancia terapéutica con dos propiedades: la propiedad inherente antiangiogénica del anticuerpo y la propiedad terapéutica de la sustancia unida (v.gr., citotóxica, coagulativa, apoptópica, etc.). Las formas de tratamiento conjugados y de profármaco de los anticuerpos presentes de este modo tienen una utilidad increíblemente amplia en todo el campo del tratamiento contra el cáncer. La guía proporcionada en la presente con respecto a los pacientes más convenientes para su uso en relación con la presente invención se pretende como enseñanza de que ciertos perfiles de pacientes pueden ayudar en la selección de pacientes para el tratamiento de la presente invención La preselección de ciertos pacientes, o categoría de pacientes, de ninguna manera niegan la utilidad básica de la presente invención en relación con el tratamiento de todos los pacientes que tengan un tumor vascularizado, u otra enfermedad angiogénica como se describe anteriormente. Una consideración adicional es el hecho de que el asalto sobre el tumor proporcionado por la invención puede predisponer al tumor a otro tratamiento terapéutico, de manera que el tratamiento posterior da como resultado un efecto sinérgico global o aún conduce a la remisión o cura total. No se cree que ningún tipo particular del tumor deberá excluirse del tratamiento usando la presente invención. Sin embargo, el tipo de células de tumor puede ser relevante para el uso de la invención en combinación con otras sustancias terapéuticas secundarias, particularmente quimioterapéuticos y las inmunotoxinas celulares anti-tumor. Tanto el aspecto no conjugado como conjugado de las presentes terapias incluirá un efecto anti-angiogénico que inhibirá la proliferación de la vasculatura del tumor. Los aspectos de tratamiento conjugado y de profármaco destruirán adicionalmente o taparán la vasculatura del tumor.. Como la vasculatura es sustancialmente o enteramente la misma en todos los tumores sólidos, se entenderá que la presente metodología ampliamente o enteramente aplicable al tratamiento de todos los tumores sólidos, independientemente del genotipo particular o genotipo de las mismas células del tumor. La dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2, o las construcciones de anticuerpos o inmunoconjugados basados en 2C3 se pueden determinar fácilmente usando datos de un modelo animal, como se muestra en los estudios detallados en la presente. Los animales experimentales que tiene tumores sólidos frecuentemente se usan para optimizar las dosis terapéuticas adecuadas antes de trasladarlas a un ambiente clínico. Estos modelos se sabe que son muy confiables para predecir estrategias anticáncer eficaces. Por ejemplo, los tumores sólidos que tiene los ratones, tales como los usados en los ejemplo, se usan ampliamente en pruebas preclínicas. Los inventores han usado estos modelos de j atón aceptados en la técnica para determinar rangos de trabajo de las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica que producen efectos anti-tumor benéficos con toxicidad mínima. Para usar anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 no conjugados o anticuerpos basados en 2C3 en terapias antiangiogénicas, se puede uno basar en otros datos publicados con el fin de ayudar en la formulación de dosis para el tratamiento clínico. Por ejemplo, aunque los anticuerpos de la presente invención tienen distintas ventajas sobre los de la técnica, la información en la literatura referente al tratamiento con otros anticuerpos anti-VEGF todavía se puede usar en combinación con los datos y enseñanzas en la presente solicitud para diseñar y/o optimizar protocolos de tratamiento y dosis.
Por ejemplo, Borgstron y colaboradores, (1999), específicamente incorporada en la presente mediante referencia, describen la importancia del VEGF en la angiogénesis del cáncer de mama en vivo usando MAB A4.6.1. Como los anticuerpos parecidos al 2C3 de esta invención exhibieron respuestas antitumor equivalentes o hasta mejoradas en estudios comparativos con A4.6.1, estos anticuerpos también tendrán utilidad significativa en el tratamiento del cáncer de mama. Los inventores además se dieron cuenta, como se apreciará por los expertos en la técnica, que los pacientes con cáncer de mama típicamente con mujeres en los grupos de edad media o avanzada, en donde las preocupaciones con respecto a la osteoporosis también son aparentes. El anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 y los anticuerpos basados en 2C3 de la presente invención de este modo, tienen la ventaja añadida de no causar un efecto adverso en el metabolismo de los huesos, y de esta manera no se preferirán para su uso en pacientes de cáncer de mama que tienen o están en riesgo de desarrollar osteoporosis . El mismo tipo de beneficios hacen que el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 y las terapias basadas en 2C3 los fármacos preferidos para el tratamiento de cánceres pediátricos. En niños con cáncer, la necesidad de continuar el crecimiento de huesos sanos y sustancial es evidente. Como los anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, tales como el 2C3, *\^Á ?*^iimá¿?^.ks*?^z,.-?...^^, - Ma*^ ?l**l*?» famMii no entorpecerán sustancialmente las actividades de los osteoclastos y los condroclastos, que son importantes en desarrollar el hueso, el 2C3 tendrá ventajas importantes sobre otros anticuerpos tales como el A4.6.1. 5 Borgstrom y colaboradores, (1999), específicamente incorporada en la presente mediante referencia, también reportó que el Mab A4.6.1 dio como resultado una regresión significativa de tumores cuando se usó en combinación con doxorrubicina. Esto además apoya el uso combinado de los 0 anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 y sustancias citotóxicas o quimioterapéuticas convencionales para lograr resultados clínicos significativos para tratar una variedad de cánceres. Tanto la combinación de doxorrubicina no conjugada como de profármaco doxorrubicina se contemplan. 5 Ferrara y colaboradores, también reportaron la eficacia y la respuesta a la concentración de un anticuerpo monoclonal anti-VEGF murino en ratones que tienen tumores y la extrapolación al tratamiento humano (Mordenti y colaboradores, 1999, específicamente incorporada en la presente mediante 0 referencia) . Los estudios se diseñaron para evaluar la relación de respuesta a concentración del anticuerpo monoclonal anti-VEGF murino de manera que una concentración eficaz del plasma de la forma humanizada recombinante del anticuerpo podría estimarse en pacientes con cáncer. Mordenti y 5 colaboradores, (1999) concluyeron que la supresión satisfactoria del tumor en ratones sin pelo se logró usando dosis de anticuerpo murino que podría fácilmente aplicarse al sistema humano con el fin de definir regímenes de dosificación clínica efectivas para mantener el anticuerpo terapéutico para uso humano en el rango eficaz requerido. De conformidad con lo anterior los datos de los modelos de ratón aceptados por J a técnica actual también se pueden traducir en dosis adecuadas humanas usando el tipo de análisis reportado en Mordenti y colaboradores, (1999), además de las técnicas conocidas para el artesano experto como se describe en la presente. Los resultados de evaluaciones de seguridad preclínica de una forma recombinante, humanizada del anticuerpo anti-VEGF de Genentech en monos (Ryan y colaboradores, 1999, específicamente incorporada en la presente mediante referencia) sirven para ejemplificar las desventajas o esa terapia candidato particular. Aunque el anticuerpo tenga actividad farmacológica en este animal, los monos en estos estudios exhibieron displasia fiseal caracterizado por un aumento relacionado con la dosis en condrocitos hipertrofiados, formación de placa ósea subcondral, e inhibición de la invasión vascular de la placa de crecimiento. Ninguna de estas desventajas será evidente en el uso del anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 y las terapias basadas en 2C3, que no inhiben el enlace y el señalamiento del VEGF en los condroclastos y condrocitos, el cual está mediado por el gSSÉ iat* - ~..***A^áÉ¡.
VEGFR1. Datos de otro estudio sobre farmacocinética preclínica, de escalamiento y distribución de tejido interespecies del anticuerpo anti-VEGF monoclonal humanizado de Genentech fue reportado por Lin y colaboradores, (1999, específicamente incorporada en la presente mediante referencia) . Estos estudios se llevaron a cabo en ratones, ratas, monos y conejos, el último usando anticuerpo etiquetado con 125I . Los datos farmacocinéticos de los ratones, ratas y monos se usaron para predecir la farmacocinética del anticuerpo de contraparte humanizado usando escalamiento alométrico en humanos. De conformidad con lo anterior, la información de dosificación adecuada se puede desarrollar para el tratamiento de condiciones patológicas humanas, tales como artritis reumatoide, neovascularización ocular y cáncer. Una versión humanizada del anticuerpo anti-VEGF A4.6.1 ha sido empleado en ensayos clínicos como una sustancia anticáncer (Brem, 1998; Baca y colaboradores, 1997; Presta y colaboradores, 1997; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Por lo tanto, estos datos clínicos también se pueden considerar como una fuente de referencia cuando se diseñan dosis terapéuticas para el presente anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 y el tratamiento con 2C3. La presente invención muestra que el 2C3 es efectivo como A4.6.1 en estudios de ratones que tienen tumores, aunque la tajg g te3 ? <O |£¡ lg¿L^^ j^íl especificidad de inhibir solamente las acciones mediadas por el VEGFR2 del VEGF es una ventaja. La publicación internacional WO 98/45331 también incorporada en ía presente mediante referencia para ejemplificar adicionalmente las dosis de los anticuerpos anti-VEGF humanizado que se pueden usar en tratamiento . En términos de usar anticuerpos anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 conjugado o inmunoconjugados basados en 2C3 en terapia de tumores, uno se puede referir a la literatura científica y de patentes sobre el éxito de administrar un rango amplio de terapias a la vasculatura del tumor para lograr un efecto benéfico. A manera de ejemplo, cada una de las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,855,866; 5,877,289; 5,965,132; 6,051,230; 6,004,555; 5,776,427, 6,004,554; y 6,036,955; y la solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con número de serie 08/482,369, Derechos de emisión pagados el 20 de octubre de 1998, se incorporan en la presente mediante referencia con el propósito de describir adicionalmente el uso de estas construcciones de sustancia terapéutica-sustancias objetivo. En el presente caso, las construcciones de sustancia terapéutica-sustancia objetivo incluyen porciones de sustancia objetivo que ejercen un efecto antiangiogénico, lo cual ampliará o de otro modo aumentará la actividad antitumor de la sustancia terapéutica unida.
Como se sabe en la técnica, estos son objetivos realistas que se pueden usar como lineamentos en relación con las pruebas preclínicas antes de proceder al tratamiento clínico. Sin embargo, a la luz del avance de otros anticuerpos anti-VEGF a la clínica, los efectos anti-tumor demostrados en modelos aceptados en la presente, y la seguridad demostrada de las presentes estrategias, la presente invención proporciona una terapia con un rastreo fácil al tratamiento clínico. De este modo las prueba preclínicas se pueden emplear para seleccionar los anticuerpos, dosis o combinaciones más ventajosos . Cualquier dosis de anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3, o medicamento combinado, que dé como resultado cualquier efecto anti-angiogénico, inhibición de la metástasis, destrucción de vasculatura de tumor, trombosis del tumor, necrosis y/o efecto anti-tumor general detectable consistente, definirá una invención útil. La presente invención también puede ser efectiva contra los vasos corriente abajo del tumor, es decir, dirigirse cuando menos a un subconjunto de los vasos de escurrimiento, particularmente como las citocinas liberadas del tumor estarán actuando sobre estos vasos, cambiando su perfil antigénico . Se entenderá también que aún en las circunstancias en donde los efectos anti-angiogénicos o anti-tumor de la dosis de .,. ..^¿k»M k .,.,.^..ÉC.m,.t^ m t ? m Mi iám anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3, o terapia combinada, están hacia el extremo inferiore de este rango, puede ser que esta terapia todavía sea igual o aún más efectiva que otras terapias conocidas en el contexto de los objetivos del tumor o paciente particular. Desafortunadamente es evidente para un clínico que ciertos tumores y padecimientos no se pueden tratar efectivamente en el plazo intermedio o largo plazo, pero no se niega la utilidad de la presente terapia, particularmente cuando es cuando menos tan efectiva como las otras estrategias generalmente propuestas. Para diseñar dosis adecuadas de construcción de anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3 o terapias combinadas, para el tratamiento de tumores vascularizados, se puede fácilmente extrapolar de estudios animales descritos en la presente y el conocimiento en la literatura con el fin de llegar a dosis adecuadas para la administración clínica. Para lograr esta conversión de dosis animales a humanos, se tomará en cuenta la masa de las sustancias administradas por masa unitaria del animal experimenta y, preferiblemente, se tomaría en cuenta las diferencias en el área superficial (m2) del cuerpo entre el animal experimental y el paciente humano. Todos estos cálculos son muy conocidos y de rutina para los expertos en la técnica. Por ejemplo, para tomar una dosis exitosa de 2C3 en los estudios de ratones, y aplicar cálculos estándares basados en la masa y área superficial, las dosis efectivas para su uso en pacientes humanos varían entre aproximadamente 1 miligramo/m2 y aproximadamente 1000 miligramos/m2 de anticuerpo por paciente, o preferiblemente, entre aproximadamente 50 miligramos/m2 y aproximadamente 500 miligramos/m2 de anticuerpo por paciente y mucho más preferiblemente, entre aproximadamente 10 mg/m2 y 100 mg/m2. Estas dosis son adecuadas para los anticuerpos desnudos basados en anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo basado en 2C3, y el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3, aunque las dosis se pefieren para su uso en relación con anticuerpos desnudos o no conjugados para su uso como antiangiogénicos . De conformidad con lo anterior, usando esta información los inventores contemplan que dosis bajas útiles de anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3 para la administración humana estarán entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o aproximadamente 50 miligramos/m2; y las dosis útiles altas de construcciones de estos anticuerpos o inmunoconjugados para la administración humana serán de aproximadamente 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 925, 950, 975 o aproximadamente 1000 miligramos/m2. Las dosis intermedias útiles de anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3 para la administración humana se contempla que esté aproximadamente en medio de los rangos alto y bajo, tales como aproximadamente 55,, 60,, 80, 90 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 525, 550 o aproximadamente 575 mg/m2 o así sucesivamente. Cualquier rango particular que usa cualquier rango de las dosis ejemplares mencionadas anteriormente o cualquier valor intermedio entre los rangos establecidos particulares se contempla. Se entenderá también que el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3 se usará, también se entenderá que cuando se usan los inmunoconjugados coagulantes generalmente se pueden usar a dosis más altas que con las toxinas. En general, los rangos de dosis de entre aproximadamente 10-100 miligramos/m2, aproximadamente 10-90 miligramos/m2, aproximadamente 10-80 miligramos/m2, aproximadamente 20-100 miligramos/m2, aproximadamente 20-90 miligramos/m2, aproximadamente 20-80 miligramos/m2, aproximadamente 30-100 miligramos/m2, aproximadamente 30-90 miligramos/m2, aproximadamente 30-80 miligramos/m2, aproximadamente 15-100 miligramos/m2, 25-100 miligramos/m2, aproximadamente 35-100 miligramos/m2, aproximadamente 150-90 miligramos/m2, aproximadamente 25-90 miligramos/m2, aproximadamente 35-90 mg/m2, o así de anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3 se preferirán. Independientemente de estos rangos declarados, se entenderá que dados los parámetros y la guía detallada presentada aquí, otras variaciones en los rangos activos u óptimos estarán abarcados dentro de la presente invención. Por lo tanto se entenderá que dosis menores pueden ser más adecuadas en combinación con otras sustancias, y que las dosis altas todavía pueden ser toleradas, particularmente dada la seguridad mejorada del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3 que se enlazan solamente al VEGFR2 y todavía la seguridad adicional aumentada de los anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, y los inmunoconjugados coagulante y anti-angiogénico basado en 2C3. El uso de anticuerpos humanos o humanizados de la presente invención (y opcionalmente proteínas coagulantes o anti-angiogénicas humanas) vuelve a la presente invención aún más segura para uso clínico, reduciendo además las oportunidades de toxicidad o efectos secundarios en tejidos secundarios . La intención de los regímenes terapéuticos de la presente invención generalmente es producir efectos anti-tumor significativos al mismo tiempo que todavía se mantienen las dosis por debajo de los niveles asociados con toxicidad inaceptable. Además de variar la dosis misma, el régimen de administración también se puede adaptar para optimizar la estrategia del tratamiento. Un protocolo de tratamiento es administrar entre aproximadamente 1 mg/m2 y aproximadamente 1000 mg/m2, preferiblemente, entre aproximadamente 50 mg/m2 y 500 mg/m2, y más preferiblemente, entre aproximadamente 10 mg/m2 y aproximadamente 100 mg/m2 del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo o inmunoconjugado basado en 2C3, o cóctel que contiene esto, aproximadamente de 1 a 3 veces por semana, preferiblemente mediante administración intramuscular o intravenosa, y más preferiblemente intravenosamente. Para administrar las mismas dosis particulares, se preferiría proporcionar una composición farmacéuticamente aceptable (de acuerdo con los estándares de la FDA de esterilidad, pirogenicidad, pureza y seguridad general) al paciente sistémicamente . La inyección intravenosa se prefiere generalmente, y el método más preferido es emplear una infusión continua durante un período de tiempo de aproximadamente 1 o 2 horas más o menos. Naturalmente, antes del uso de difusión amplia, se llevarán a cabo ensayos clínicos. Los distintos elementos para llevar a cabo un ensayo clínico, incluyendo el tratamiento del paciente y supervisión, serán conocidos por los expertos en la técnica a la luz de la descripción presente. La siguiente información se está presentando como un lineamento general para su uso para establecer estos ensayos. Los pacientes elegidos para los primeros estudios de tratamiento con el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o anticuerpo basado en 2C3 han fallado en responder a cuando menos un curso de terapia convencional, y tendrán enfermedad objetivamente medible como se determina por examen físico, técnicas de laboratorio, y/o procedimiento radiográficos. Cualquier quimioterapia deberá detenerse cuando menos dos semanas antes de entrar en el estudio. Cuando se emplean porciones de anticuerpo o anticuerpos monoclonales murinos, los pacientes deberán no tener historia de alergia a la inmunoglobulina de ratón. Se encontrarán varias ventajas en el uso de catéter venoso central interno con un puerto de lumen triple. El anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o las sustancias basadas en 2C3 deberán filtrarse, por ejemplo, usando un filtro de 0.22 µ, y diluirse adecuadamente, tal como mediante salina, hasta un volumen final de 100 mililitros. Antes del uso, la muestra de prueba deberá también filtrarse de manera similar, y su concentración valorarse antes y después de la filtración determinando el A280. La recuperación esperada deberá estar dentro del rango de 87 por ciento a 99 por ciento, y se pueden determinar los ajustes por pérdida de proteína. El anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o anticuerpos o conjugados basados en 2C3 se pueden administrar durante un período de aproximadamente 4-24 horas, recibiendo cada paciente 2-4 infusiones a intervalos de 2-7 días. La administración también se puede realizar mediante una tasa estable de infusión durante un período de 7 días. La infusión dada a cualquier nivel de dosis deberá ser dependiente de cualquier toxicidad observada. Por lo tanto si se alcanza la toxicidad de grado II después de una sola infusión, en un período particular de tiempo para una infusión de tasa estable, otras dosis deberán detenerse o parar la infusión de tasa estable a menos que mejore la toxicidad. Dosis crecientes del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o sustancias terapéuticas basadas en 2C3 deberán administrarse a grupos de pacientes hasta que aproximadamente el 60 por ciento de los pacientes muestren toxicidad grado III o IV inaceptable en cualquier categoría. Las dosis que sean 2/3 de este valor se definen como dosis seguras. El examen físico, las mediciones del tumor, y las pruebas de laboratorio, deberán, desde luego, realizarse antes del tratamiento y a intervalos hasta de un mes después. Las pruebas de laboratorio deberán incluir cuentas sanguíneas completas, creatinina de suero, creatinina quinasa, electrólitos, urea, nitrógeno, SGOT, bilirrubina, albúmina y proteína de suero total. Las muestras de suero tomadas hasta 60 días después del tratamiento deberán evaluarse mediante radioinmunoensayo para detectar la presencia de las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica administrada, y los anticuerpos contra cualquier porción de las mismas. Los análisis inmunológicos del suero, usando cualquier t. A i Íi*i.l*.A.*M U ini-itiihtT .y*-*— « Jfc^ £¿^ ensayo estándar tal como, por ejemplo, un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada o RÍA permitirá la farmcocinética y la aclaración del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o anticuerpo basado en 2C3 la sustancia terapéutica de anti-aminofosfolípido que será evaluada. Para evaluar las respuestas anti-tumor, los pacientes deberán ser examinados a 48 horas a 1 semana y después 30 días después de la última infusión. Cuando este presente enfermedad palpable, deberán medirse diariamente dos diámetros perpendiculares de todas las masas del tratamiento dentro de una semana después de completar la terapia, y a los 30 días. Para medir enfermedad no palpable, escaneos de tomografía computarizada en serie podrían realizarse a intervalos de 1 centímetro en todo el pecho, abdomen, y pelvis en las 48 horas y hasta 1 semana y de nuevo a los 30 días. Las muestras de tejido deberán también ser evaluadas histológicamente, y/o mediante citometría de flujo, usando biopsias de los sitios de la enfermedad o hasta de muestras de sangre o de fluido si es lo adecuado. Las respuestas clínicas se pueden definir mediante medición aceptable. Por ejemplo, una respuesta completa se puede definir por la desaparición de todo tumor medible 1 mes después del tratamiento. Mientras que una respuesta parcial se puede definir por una reducción al 50 por ciento o mayor de la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todos ..rft^........^ los nodulos de tumor evaluables 1 mes después del tratamiento, sin sitios de tumor mostrando agrandamiento . De manera similar, se puede definir una respuesta mezclada mediante una reducción del producto de diámetros perpendiculares de todas las lesiones medibles por 50 por ciento o más 1 mes después del tratamiento, con avance en uno o más sitios. A la luz de los resultados de ensayos clínicos, tales como los descritos anteriormente, se puede formular todavía un régimen de tratamiento más preciso. Aún, alguna variación en dosis posteriormente puede ser necesaria dependiendo de la condición del sujeto que se está tratando. El médico responsable de la administración, a la luz de la presente descripción, será capaz de determinar la dosis adecuada para el sujeto individual. Esta optimización y ajuste se lleva a cabo de manera rutinaria en la técnica y de ninguna manera refleja una cantidad indebida de experimentación. G. Terapias de combinación Ya sea que se use para tratar enfermedades angiogénicas, tales como artritis, psoriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Grave, restenosis vascular, hemangioma y glaucoma neovascular (u otras enfermedades descritas anteriormente, ) , o tumores sólidos, la presente invención se puede combinar con otras terapias. Los métodos de tratamiento del anticuerpo anti-VEGF, , .IAAAU **,. „ ?rH . Hf lÉlifelitof - -^¿-«¡?S-iüMM ¿ft^^^ que bloquea el VEGFR2 o basado en 2C3 de la presente invención se pueden combinar con cualquier otro método generalmente empleado en el tratamiento del tumor particular, enfermedad o desorden que exhibe el paciente. En tanto no se sepa que el enfoque terapéutico particular es perjudicial a la condición del paciente en sí, y no contrarreste significativamente el tratamiento del anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2 o o tratamiento basado en 2C3, se considera su combinación con la presente invención. En relación con el tratamiento del tumor sólido, la presente invención se puede usar en combinación con enfoques clásicos, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia, y similares. La invención por lo tanto proporciona terapias combinadas en las cuales se usa el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2 o las construcciones basadas en 2C3 simultáneamente con, antes, o después de la cirugía o tratamiento por radiación; o se administran a pacientes con, antes de, o después de sustancias quimioterapéuticas, radioterapéuticas o anti-angiogénicas convencionales, o inmunotoxinas o coaguligandos dirigidos. El uso combinado de la invención con radioterapia, sustancias radioterapéuticas, sustancias anti-angiogénicas, sustancias que inducen la apoptosis y fármacos antitubulina se prefiere particularmente. Muchos ejemplos de estas sustancias se han descrito anteriormente junto con los inmunoconjugados de la presente invención. Cualquiera de las sustancias inicialmente descritas para su uso como una parte de un conjugado terapéutico también se puede usar por separado, pero todavía en combinación operable con la presente invención. Cuando se usan una o más sustancias en combinación con la terapia del anticuerpo anti-VEGF que bloquea al VEGFR2 o basada en 2C3, no hay requisito para que los resultados combinados sean aditivos de los efectos observados cuando se conduce cada tratamiento por separado. Aunque cuando menos efectos aditivos generalmente son deseables, cualquier efecto anti-tumor aumentado por encima de una de las terapias solas será benéfica. También, no hay requisito particular para que el tratamiento combinado exhiba efectos sinérgicos, aunque ciertamente esto es posible y ventajoso. Para practicar la terapia anti-tumor combinada, simplemente se administrarían a un animal un anticuerpo anti-VEGF que bloquea al VEGFR2 o una construcción basada en 2C3 en combinación con otra sustancia anticáncer de una manera efectiva para dar como resultado acciones anti-tumor combinadas dentro del animal. Las sustancias por lo tanto se proporcionarían en cantidades efectivas y por períodos de tiempo efectivas para dar como resultado la presencia combinada dentro de la vasculatura del tumor y sus acciones combinadas en el ambiente del tumor. Para lograr esta meta, las sustancia terapéutica de anticuerpo anti-VEGF que bloquea al VEGFR2 o basada en 2C3 y las sustancias anticáncer se pueden administrar al animal simultáneamente, ya sea en una sola composición, o como dos composiciones distintas usando diferentes rutas de administración . De manera alternativa, el tratamiento de anticuerpo anti-VEGF que bloquea al VEGFR2 o basado en 2C3 puede preceder, o seguir, al tratamiento de sustancia anticáncer en, por ejemplo, intervalos que varían de minutos a semanas y meses. Se aseguraría que la sustancia anti-cáncer y el anticuerpo anti-VEGF que bloquea al VEGFR2 o sustancia basada en 2C3 ejerciera un efecto combinado ventajoso sobre el tumor. La mayoría de las sustancias anti-cáncer serían administradas antes de la terapia anti-angiogénica basada en el anticuerpo anti-VEGF que bloquea al VEGFR2 o basada en 2C3. Sin embargo, cuando se usan inmunoconjugados basados en anticuerpo anti-VEGF que bloquea al VEGFR2 o basados en 2C3, se pueden administrar simultáneamente o subsecuentemente distintas sustancias anti-cáncer. El uso general de combinaciones de sustancias en el tratamiento del cáncer es muy conocido. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,710,134 (incorporada en la presente mediante referencia) describe componentes que inducen necrosis en tumores en combinación con sustancias no tóxicas o "profármacos". Las enzimas que quedan libres por los procesos necróticos disocian el "profármaco" •"—'-•'• -'"'J-" ái ^g¡ fa-fa-j -U tóxico en "fármaco" tóxico, lo cual conduce a la muerte celular del tumor. También, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,747,469 (incorporada en la presente mediante referencia) describe el uso combinado de vectores virales que codifican sustancias que dañan p53 y ADN. Cualquiera de estos enfoques similares se puede usar con la presente invención. En algunas situaciones, puede ser deseable extender el período de tiempo para el tratamiento de manera significativa, en donde varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) , varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8), o aún varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las administraciones respectivas. Esto sería ventajoso en circunstancias en donde un tratamiento se destinó para destruir sustancialmente el tumor, tal como la cirugía o quimioterapia, y otro tratamiento se destina a evitar la micrometástasis o recrecimiento de tumor, tal como la terapia anti-angiogénica. La sustancia anti -angiogénica deberá administrarse en un momento cuidadoso después de la cirugía para permitir la cicatrización efectiva de la herida. También se considera que se usará más de una administración de, ya sea el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 , o la sustancia basada en 2C3 o la sustancia anticáncer. Las sustancias se pueden administrar intercambiablemente, o en días o semanas alternados; o una secuencia de tratamiento de anticuerpo anti-VEGF, que bloquea •'f~h'""tTÜTffff" --"-T ""r*J '^^^-'jf JJí al VEGFR2, o la sustancia basada en 2C3 se puede dar, seguida por una secuencia de terapia de sustancia anticáncer. En cualquier caso, para lograr la regresión del tumor usando una terapia combinada, todo lo gue se requiere es administrar ambas sustancias en una cantidad combinada efectiva para ejercer un efecto anti-tumor, independientemente de los tiempos para la administración . En términos de cirugía, cualquier intervención quirúrgica se puede practicar en combinación con la presente invención. En relación con radioterapia, cualquier mecanismo para inducir daño de ADN localmente dentro de las células del tumor está contemplado, tal como irradiación Y, rayos X, irradiación ultravioleta, microondas y hasta emisiones electrónicas y similares. La administración dirigida de radioisótopos a las células del tumor también se contempla, y esto se puede usar en relación con un anticuerpo objetivo u otros elementos objetivos, y preferiblemente con anticuerpos anti-VEGF, que bloquean al VEGFR2, tal como el 2C3. La terapia de citocinas ha demostrado también ser un compañero efectivo para los regímenes de terapias combinadas. Se pueden emplear varias citocinas en estos enfoques combinados. Ejemplos de citocinas incluyen IL-l IL-lß, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-b, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-ß, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNFa, TNFß, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-a, IFN-ß, IFN-?. Las citocinas se administran de conformidad con regímenes estándares, consistentes con indicaciones clínicas, tales como la condición del paciente y la toxicidad relativa de la citocina. También se usan uteroglobinas para evitar o inhibir la metástasis (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,696,092; incorporada en la presente mediante referencia) . Gl . Sustancias Quimioterapéuticas En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o la sustancia basada en 2C3 de la presente invención se puede administrar en combinación con una sustancia quimioterapéutica. Una variedad de sustancias quimioterapéuticas se pueden usar en los métodos de tratamiento combinado descrito en la presente. Las sustancias quimioterapéuticas contempladas como ejemplares incluyen, v.gr., adriamicín, dactinomicín, mitomicín, carminomicín, daunomicín, doxorrubicín, tamoxifén, taxol, taxotere, vincristina, vinorrelbina, etoposida (VP-16) , 5-fluorouracilo (5FU), citosina arabinosida, ciclofofamida, tiotepa, metotrexato, camptotecín, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatin (CDDP) , aminopterina, combretastatina (s) y derivados y profármacos de los mismos. Como lo entenderán los expertos en la técnica, las dosis adecuadas de sustancias quimioterapéuticas generalmente estarán alrededor de las ya empleadas en terapias clínicas, en ' ? i t. donde se administran las sustancias quimioterapéuticas solas o en combinación con otras sustancias quimioterapéuticas. A manera de ejemplo solamente, sustancias tales como cisplatina, y otros alquilantes de ADN se pueden usar. La cisplatina se ha usado ampliamente para tratar el cáncer, con dosis eficaces usadas en aplicaciones clínicas de 20 miligramos/m2 por 5 días cada tres semanas durante un total de tres cursos. La cisplatina no se absorbe oralmente, y por lo tanto se debe administrar vía inyección intravenosamente, subcutáneamente, intratumoralmente o intraperitonealmente. Otras sustancias útiles incluyen compuestos que interfieren con la réplica de ADN, mitosis y segregación cromosonal. Estos compuestos quimioterapéuticos incluyen adiamicina, también conocida como doxorrubicina, etoposida, verapamil, podofilotoxina, y similares. De uso muy amplio en el escenario clínico para el tratamiento de neoplasmas, estos compuestos se administran a través de inyecciones de bolo intravenosamente a dosis que varían desde 25-75 miligramos/m2 a intervalos de 21 días para la adriamicina, hasta 35-50 miligramos/m2 intravenosamente para etoposida o el doble de la dosis intravenosa oralmente. Las sustancias que interrumpen la síntesis y la fidelidad de precursores de polinucleótidos también se pueden usar. Particularmente útiles son sustancias que han sufrido pruebas extensas y están fácilmente disponibles. Como tales, las sustancias como el 5-fluorouracilo (5-FU) se usan preferencialmente por tejido neoplásico, haciendo esta sustancia particularmente útil para dirigirse a células neoplásicas. Aunque algo tóxico, el 5-FU, es aplicable en un amplio rango de vehículos, incluyendo tópicos, sin embargo, la administración intravenosa con dosis que varían de 3 a 15 miligramos/kg/día se usan comúnmente. Las sustancias quimioterapéuticas ejemplares que son útiles para la terapia combinada se enlistan en la Tabla C. Cada una de las sustancias enlistadas en la presente son ejemplares y de ninguna manera limitantes. El técnico experto puede consultar "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edición, capítulo 33, en particular las páginas 624-652. Variación en la dosis probablemente se presentará dependiendo de la condición que se está tratando. El médico que administra el tratamiento será capaz de determinar la dosis adecuada para el sujeto individual.
TABLA C Sustancias Quimioterapéuticas Útiles en Enfermedad Neoplásica CLASE TIPO DE NOMBRES NO SUSTANCIA COMERCIALES ENFERMEDAD (OTROS NOMBRES) Mecloro- Enfermedad de Hodgkin, etamma (HN2) - linfomas no de Hodgkin. Mostazas de Nitrógeno CiclofosfLeucemias linfoci-ticas amida agudas y crónicas, Ifosfamida enfermedad de Hodgkin, linfomas no de Hodgkin, Sustancias mieloma múltiple, Alquilan -tes neuroblastoma, pecho, ovario, pulmón, tumor de Wilms, cérvix, testículos, sarcomas de tejido suave.
Melfalan (1- Mieloma múltiple, pecho, sarcolisina) ovario.
Cloram- Leucemia linfocitica bucilo crónica, macroglobu- line ia primaria, enfermedad de Hodgkin, linfomas no de Hodgkin.
Hexametil- Ovario melamina Etileni e-nos y metil- melaminas Tiotepa Vejiga, pecho, ovario.
AlquilsulBusulfán Leucemia granulocitica fonatos crónica . (**í í*i , ÍÍ . »t, ^^.-^Imnnn ^f^^?i^it MÁ B L i Carmustina Enfermedad de Hodgkin, (BCNU) linfomas no de Hodgkin, tumores de cerebro primarios, mieloma múltiple, melanoma maligno.
Nitroso- ureas Lomustina Enfermedad de Hodgkin, (CCNU) linfomas no de Hodgkin, tumores de cerebro primario, pulmón de célula pequeña.
Semustina Tumores de cerebro (metil-CCNU) primario, estómago, colon.
Estreptozocin Insulinoma pancreática a (estrepmaligna, carcinoide tozotocina) maligno.
Dacarbazine Melanoma maligno, (DTIC; enfermedad de Hodgkin, Triazinas dimetil- sarcomas de tejido triazenoip?da blando. zolecarboxami da) .
Análogos de Metotrexato Leucemia linfocitica Acido Fólico (ametopterin) aguda, coriocarcinoma, micosis fungoides, pecho, cabeza y cuello, pulmón, sarcoma osteogénico .
Fluoracil (5- Pecho, colon, estómago, A timeta- fluoro- páncreas, ovario, cabeza boli tos uracilo; 5- y cuello, vejiga FU) . urinaria, lesiones de Análogos de Floxuridina piel premalignas Pirimidina (fluorodes- (tópicas) . oxiuridine; FüdR) .
. A^,^*t^?^?át?¿íl¿?i¿*^iád.t?li Dactinomicin Coriocarcinoma, tumor de (actinomicin Wilms, rabdomiosarcoma, D) . testículos, sarcoma de Kaposi .
Antibióticos Daunorrubicin Leucemias granulocítica (daunomicin; agua y linfocítica rubidomicin) . aguda.
Doxorrubicin Sarcomas de tejido blando, osteogénico y otros sarcomas; enfermedad de Hodgkin, linfomas no de Hodgkm, leucemias agudas, pecho, genitourinario, tiroides, pulmón, estómago, neuroblastoma .
Bleo icin Testículos, cabeza y cuello, piel, esófago, pulmón y vías genitourinarias; enfermedad de Hodgkin, linfomas no de Hodgkin.
Plicamicin Testículos, (mitrami- hipercalcemia maligna. cin) .
Mitomicin Estómago, cérvix, colon, (mitomicin C) pecho, páncreas, vejiga, cabeza y cuello.
Enzimas L-Asparagi- Leucemia linfocítica nasa aguda.
ModificadoInterferón Leucemia de célula res de alfa peluda, sarcoma de Respuesta Kaposi, melanoma, Biológica carcinoide, célula renal, ovario, vejiga, linfomas no de Hodgkin, micosis fungoides, mieloma múltiple, leucemia granulocítica crónica.
Complejos de Cisplatin Testículos, ovario, coor-dinación (cis-DDP vejiga, cabeza y cuello, de platino Carboplatin pulmón, tiroides, cérvix, endometrio, neuroblastoma, sarcoma osteogénico .
Antracene- MitoxanLeucemia granulocítica Sustancias diona trona agua, pecho. miscelá-neas Urea Hidroxiurea Leucemia granulocítica sustituida crónica, policitemia vera, trombocitosis esental, melanoma maligno .
Derivado de Procarbazina Enfermedad de Hodgkin. Metilhidra- (N-metil- zina hidrazina, MIH) .
Supresor Mitotane Corteza adrenal adreno- (o,p'-DDD) cortical Aminoglu- Pecho tetimida Adrenocor- Prednisona Leucemias linfocíticas ticoeste- (diversas aguda y crónica, roides preparaciolinfomas no de Hodgkin, nes equivaenfermedad de Hodgkin, lentes dispecho. ponibles) .
Progestinas Hidroxipro- Endometrio, pecho Hormonas y gesterona An tagonistas caproato. Medroxipro- gesterona acétate . Megestrol acetato.
Estrógenos U Dietilestil; Pecho, próstata estrol . inil tradiol (otras preparaciones disponibles) .
AntiestróTamoxifén Pecho geno Andrógenos Propionato de Pecho Testosterona Fluoximes- terona (otras preparaciones disponibles) Anti- Flutamida Próstata andrógeno Análogo de Leuprolida Próstata hormona liberadora de gonadotropina u üuh -BJ *at&amsA? 3,^¡^£ Sgjj^^j G2. Anti-.Angiogénicos En condiciones fisiológicas normales, los humanos y los animales sufren angiogénesis solamente en situaciones restringidas muy específicas. Por ejemplo, la angiogénesis normalmente se observa en la cicatrización de heridas, el desarrollo fetal y embrionario y en la formación del corpus luteum, endometpo y placenta. La angiogénesis no controlada (persistente y/ó no regulada) se relaciona con varios estados de enfermedad, y se presenta durante el crecimiento y metástasis de tumores. Tanto la angiogénesis controlada como la no controlada se piensa que proceden de manera similar. Las células y pericitos endoteliales, rodeados por una membrana de base, forman los vasos sanguíneos capilares. La angiogénesis comienza con la erosión de la membrana de base por las enzimas liberadas por las células endoteliales y los leucocitos. Las células endoteliales, cuya línea del lumen de vasos sanguíneos, sobresalen a través de la membrana de base. Los estimulantes angiogénicos inducen que las células endoteliales migren a través de la membrana de base erosionada. Las células migrantes forman un "brote" fuera del vaso sanguíneo padre, en donde las células endoteliales sufren mitosis y proliferan. Los brotes endoteliales surgen uno con otro para formar ciclos capilares, creando el nuevo vaso sanguíneo. El presente anticuerpo anti-VEGF que blouquea el VEGFR2 o basado en 2C3 de la invención se puede usar en combinación con cualquiera de una o más terapias angiogénicas. Las combinaciones con otras sustancias que inhiben el VEGF se incluyen, tales como otros anticuerpos neutralizantes (Kim y colaboradores, 1992, Presta y colaboradores, 1997, Sioussat y colaboradores, 1993; Kondo y colaboradores, 1993; Asano y colaboradores, 1995), construcciones de receptor soluble (Kendall and Thomas, 1993; Aiello y colaboradores, 1995; Lin y colaboradores, 1998; Millauer y colaboradores, 1996), inhibidores de tirosina quinasa (Siemeister y colaboradores, 1998), estrategias antisentido, aptámeros de ARN y ribozimas contra VEGF o receptores de VEGF (Saleh y colaboradores, 1996, Cheng y colaboradores, 1996, Ke y colaboradores, 1998; Parry y colaboradores, 1999; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Las variantes del VEGF con propiedades antagónicas también se pueden emplear, como se describe en la publicación internacional WO 98/16551, específicamente incorporada en la presente mediante referencia. Las terapias antiangiogénicas se pueden basar en la provisión de una sustancia antiangiogénica o la inhibición de una sustancia angiogénica. La inhibición de sustancias angiogénicas se puede lograr por uno o más de los métodos descritos para inhibir el VEGF, incluyendo anticuerpos neutralizantes, construcciones de receptor soluble, inhibidores de moléculas pequeñas, antisentido, aptámeros de ARN y r oz mas to os se pue en emp ear. Por ejemplo, anticuerpos para la angiogenina se pueden emplear, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,520,914, específicamente incorporada en la presente mediante referencia. 5 En que FGF se conecta con angiogénesis, los inhibidores de FGF también se pueden usar. Ciertos ejemplos son los compuestos que tienen N-acetilglucosamina que alterna en secuencia con 2- O-ácido urónico sulfatado como sus unidades de repetición mayores, incluyendo glicosaminoglicanos, tales como sulfato de 0 archaran. Estos compuestos se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 6,028,061, específicamente incorporada en la presente mediante referencia, y se pueden usar en combinación con la misma. Numerosos inhibidores de tirosina quinasa útiles para 5 el tratamiento de angiogénesis, como se manifiesta en varios estados de enfermedad, se conocen ahora. Estos incluyen, por ejemplo, las 4-aminopirrolo [2, 3-d] pirimidinas de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,639,757, específicamente incorporada en la presente mediante referencia, 0 las cuales también se pueden usar en combinación con la presente invención. Otros ejemplos de moléculas orgánicas capaces de modular la transducción de señal de tirosina quinasa vía el receptor VEGFR2 son los compuestos de quinazolina y composiciones de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,792,771, la cual se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para propósito de describir combinaciones adicionales para su uso con la presente invención en el tratamiento de enfermedades angiogénicas . Los compuestos de otras clases químicas también se ha mostrado que inhiben la angiogénesis y se pueden usar en combinación con la presente invención. Por ejemplo, esteroides tales como los 4, 9 (11) -esteroides angiostáticos y los esteroides C21-oxigenados, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,972,922, específicamente incorporada en la presente mediante referencia, se puede emplear en terapia combinada. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,712,291 y 5,593,990, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia, describen talidomida y compuestos relacionados, precursores, análogos, metabolitos y productos de hidrólisis, los cuales también se pueden usar en combinación con la presente invención para inhibir la angiogénesis. Los compuestos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,712,291 y 5,593,990, se pueden administrar oralmente. Otras sustancias antiangiogénicas ejemplares que son útiles en relación con la terapia combinada se enlistan en la Tabla D. Cada uno de los agentes enlistados en la presente son ejemplares y de ninguna manera limitantes. s.y*?- 353 TABLA D Inhibidores y Reguladores Negativos de Angiogénesis il- áss á JlÜ fc^Baiáfei^-:8aatA ^- 4 i l * " i Ciertos componentes preferidos para su uso para inhibir la angiogénesis son angiostatina, endostatina, vasculostatina, canstatina y maspina. Estas sustancias se describen anteriormente junto con los inmunoconjugados de la presente invención, pero se pueden usar en forma combinada pero no conjugada. Otras sustancias preferidas también descritas anteriormente en forma inmunocunjugada son las angiopoyetinas, particularmente la angiopoyetina-2 , la cual se contempla para el uso combinado con la presente invención. Ciertas terapias anti-angiogénicas se ha demostrado ya que causan regresiones de tumor, incluyendo el polisacárido bacteriano CM101 y el anticuerpo LM609. El CM101 es un polisacárido bacteriano que se ha caracterizado bien por su capacidad para inducir inflamación neovascular en tumores . El CM101 se enlaza con, y se reticulan receptores expresados en endotelio desdiferenciado que estimula la activación del sistema de complemento. También inicia una respuesta inflamatoria conducida por citocina que selectivamente se dirige al tumor. Es una sustancia antipatoangiogénica exclusiva i * J » » * tt » i J-gÉ-Sfe.. que regula hacia abajo la expresión del VEGF y sus receptores. El CM101 actualmente en ensayos clínicos está como un fármaco anticáncer, y se puede usar en combinación con la presente. La trombospondina (TSP-1) y el factor de plaqueta 4 (PF4) también se pueden usar en combinación con la presente invención. Ambos son inhibidores de angiogénesis que se asocian con heparina y se encuentran en alfa-gránulos de plaquetas. La TSP-1 es una glicoproteína de dominios múltiples grande de 450 kDa que es constituyente de la matriz extracelular. La TSP-1 se enlaza con muchas de las moléculas de proteoglicanos encontrados en la matriz extracelular que incluyen, HSPGs, fibronectina, laminina, y diferentes tipos de colágeno. La TSP-1 inhibe la migración de las células endoteliales y la proliferación in vi tro y angiogénesis en vivo. La TSP-1 también suprime el genotipo maligno y la tumorigénesis de células endoteliales transformadas. El gen supresor de tumor p53 se ha demostrado que regula directamente la expresión de la TSP-1, de manera que, la pérdida de la actividad de p53 causa una reducción dramática en la producción de la TSP-1 y un aumento concomitante en la angiogénesis iniciada por tumor. La PF4 es una proteína 70aa que es miembro de la familia CXC ELR de quimiocinas que es capaz de inhibir potentemente la proliferación de células endoteliales in vi tro, y la angiogénesis en vivo. La PF4 administrada intratumoralmente o administrada mediante vector adenoviral es capaz de causar una inhibición del crecimiento del tumor. Los interferones y los inhibidores de metaloproteinasas son dos clases de inhibidores angiogénicos quese presentan naturalmente que se pueden combinar con la presente invención. La actividad anti-endotelial de los interferones se ha conocido ya desde principios de la década de los 80, sin embargo, el mecanismo de inhibición todavía no es claro. Se sabe que puede inhibir la migración de las células endoteliales y que tiene alguna actividad anti-angiogénica en vivo que posiblemente es mediada por una capacidad para inhibir la producción de promotores angiogénicos por las células del tumor. Los tumores vasculares en particular son sensibles a la interferón, por ejemplo, los hemangiomas proliferantes se pueden tratar con éxito con IFN . Los inhibidores de tejido de las metaloproteinasas (TIMPs) son una familia de inhibidores que se presentan naturalmente de metaloproteasas de matriz (MMPs) que también pueden inhibir la angiogénesis y se pueden usar en protocolos de tratamiento combinados. Las MMPs representan un papel clave en el proceso angiogénico, ya que degradan la matriz a través de la cual las células endoteliales y los fibrolastos migran cuando se extienden o remodelan la red vascular. De hecho, un miembro de las MMPs, MMP-2 se ha demostado que se asocia con el endotelio activado a través de la integrina vß3, presumiblemente con este fin. Si esta interacción se interrumpe por un fragmento de MMP-2, en nces la angiogénesis se regula hacia abajo y se inhibe el crecimiento de los tumores. Hay varias sustancias farmacológicas que inhiben la angiogénesis, una o más de las cuales se pueden usar en combinación con la presente invención. Estas incluyen AGM-1470/TNP-470, talidomida, y carboxiamidotriazol (CAÍ) . La fumagilina se ha encontrado que es un potente inhibidor de la angiogénesis en 1990, y desde entonces se han desarrollado los análogos sintéticos de la fumagilina, AGM-1470 y TNP-470. Estos fármacos inhiben la proliferación de células endoteliales in vi tro y la angiogénesis en vivo. La TNP-470 se ha estudiado extensamente en ensayos clínicos humanos con datos que sugieren que la administración a largo plazo es óptima. La talidomida originalmente se usó como un sedante, pero se encontró que es un potente teratógeno y se descontinuó. En 1994 se encontró que la talidomida es un inhibidor de la angiogénesis. La talidomida actualmente está en ensayos clínicos como una sustancia anticáncer, así como un tratamiento de enfermedades vasculares del ojo. El CAÍ es un inhibidor sintético de bajo peso molecular de la angiogénesis que actúa como un bloqueador de canal de calcio que evita la reorganización de la actina, la migración de las células endoteliales y la dispersión sobre colágeno IV. El CAÍ inhibe la neovascularización en concentraciones alcanzables fisiológicas y es muy tolerado oralmente por los pacientes de cáncer. Los ensayos clínicos con CAÍ han producido estabilización de enfermedad en el 49 por ciento de los pacientes de cáncer que tienen enfermedad progresiva antes del tratamiento. La cortisona en presencia de la heparina o fragmentos de heparina ha demostrado inhibir el crecimiento de tumores en ratones bloqueando la proliferación de células endoteliales. El mecanismo involucrado en el efecto inhibitorio aditivo del esteroide y la heparina no es claro, aunque se piensa que la heparina puede incrementar la asimilación del esteroide por las células endoteliales. La mezcla ha demostrado aumentar la disolución de la membrana de base que está por debajo de los capilares recientemente formados, y esto también es una posible explicación del efecto angiostático aditivo. Los conjugados de heparina-cortisol también tienen efectos potentes angiostático y anti-tumor de actividad en vivo. Otros inhibidores de angiogénesis específicos, incluyendo, pero no se limitan a, Factor Ant-invasivo, ácidos retinoicos y paclitaxel (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,716,981; incorporada en la presente mediante referencia); AGM-1470 (Ingber y colaboradores, 1990; incorporada en la presente mediante referencia) ; extracto de cartílago de tiburón (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,618,925; incorporada en la presente mediante referencia) ; poliamida aniónica o oligómeros de poliurea (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,593,664; incorporada en la presente mediante referencia); derivados de oxindol (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,576,330; incorporada en la presente mediante referencia) derivados de estradiol (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,504,074; incorporada en la presente mediante referencia) ; y derivados de tiazolpirimidina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,599,813; incorporada en la presente mediante referencia) también se contemplan para su uso como composiciones anti-angiogénicas para los usos combinados de la presente invención. Las composiciones que comprenden un antagonista de vß3 integrina también se pueden usar para inhibir la angiogénesis en combinación con la presente invención. Como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,766,591 (incorporada en la presente mediante referencia) , los polipéptidos que contienen RGD y sales de los mismos, que incluyen polipéptidos cíclicos, son ejemplos convenientes de antagonistas de integrina avß3. El anticuerpo LM609 contra la integrina avß3 también induce regresiones de tumores. Los antagonistas de integrina avß3, tales como LM609, inducen la apoptosis de las células endoteliales angiogénicas dejando los vasos sanguíneos quietos no afectados. La LM609 u otros antagonistas de ?ívß3 también pueden trabajar inhibiendo la interacción de avß3 y MMP-2, una enzima proteolítica que se piensa que representa un papel importante en la migración de células endoteliales y fibroblastos. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,753,230 se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para describir los anticuerpos contra vß3 (vitronectín ?ívß3) para combinados con la presente invención para inhibir la angiogénesis. La apoptosis del endotelio angiogénico en este caso puede tener un efecto de cascada sobre el resto de la red vascular. Al inhibir la red vascular del tumor de responder completamente a la señal del tumor para extenderse se puede, de hecho, iniciar el colapso parcial o completo de la red, dando como resultado la muerte celular del tumor y pérdida del volumen del tumor. Es posible que la endostatina y la angiostatina funcionen e una manera similar. El hecho de que la LM609 no afecta a los vasos quietos, pero es capaz de causar regresiones de tumor sugiere en gran medida que no todos los vasos sanguíneos en el tumor necesitan ser usados como blanco para el tratamiento, con el fin de obtener un efecto antitumor. Otros métodos de la intervención terapéutica basada en alterar el señalamiento a través del receptor Tie2 también se puede usar en combinación con la presente invención, tal como usar un receptor Tie2 soluble capaz de bloquear la activación de Tie2 (Lin y colaboradores, 1998) . La ^^^b^É- ^ ^ A^^^ ^^í^^A^^^ administración de esta construcción usando terapia de gen adenoviral recombinante se ha mostrado que es efectiva para tratar el cáncer y reducir la metástasis (Lin y colaboradores, 1998) . G3. Sustancias que inducen la apoptosis El anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o la sustancia terapéutica basada en 2C3 también se pueden combinar ventajosamente con métodos para inducir la apoptosis. Varias sustancias que inducen la apoptosis se han descrito anteriormente en relación con los inmunoconjugados de la presente invención. Cualquiera de estas sustancias que inducen la apoptosis se puede usar en combinación con la presente invención sin estar ligado con el anticuerpo de la invención. Aparte de las sustancias que inducen la apoptosis descritas anteriormente como inmunoconjugados, varios oncógenos se han descrito que inhiben la apoptosis, o la muerte celular programada. Los oncógenos ejemplares en esta categoría incluyen, pero no se limitan a bcr-abl, bcl-2 (distinto de bcl-1, ciclín Di; número de acceso del GenBank M14745, X06487; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,650,491 y 5,539,094; cada una incorporada en la presente mediante referencia) , y miembros de la familia que incluyen Bcl-xl, Mcl-1, Bak, Al, A20. La sobreexpresión de bcl-2 se descubrió primero en linfomas de células T. El bcl-2 funciona como un oncógeno enlazando e inactivando Bax, una proteína en la senda ^.A &iA~b*¿¿ Mi iÁ apoptótica. La inhibición de la función de bcl-2 previene la inactivación de Bax, y permite que continúe la senda apoptótica . La inhibición en esta clase de oncógenos, por ejemplo, usando secuencias de nucleótido antisentido, se contempla para su uso en la presente invención para proporcionar aumento de la apoptosis (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,650,491; 5,539,094 y 5,583,034; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . G4. Inmunotoxinas y Coaguligandos Los métodos de tratamiento basados en conjugado anti- aminofosfolípido de la invención se pueden usar en combinación con otras inmunotoxinas y/ó coaguligandos, en donde la porción objetivo de la misma, por ejemplo, el anticuerpo o ligando, se dirige a un marcador relativamente específico de células del tumor, la vasculatura del tumor o el estroma del tumor. En común con las sustancias quimioterapéutica y anti-angiogénicas discutidas anteriormente, el uso combinado de toxinas objetivo distintas o coagulantes generalmente dará como resultado, resultados anti-tumor aditivo, notablemente mayores que aditivos o hasta sinérgicos. Hablando en general, los anticuerpos o ligandos para su uso en estos aspectos adicionales de la invención preferiblemente reconocerán antígenos accesibles al tumor que preferencialmente, o específicamente, se expresan en el sitio del tumor. Los anticuerpos o ligandos también preferiblemente exhibirán propiedades de alta afinidad; y los anticuerpos, ligandos o conjugados de los mismos, no ejercerán efectos laterales en vivo significativos contra tejidos normales que sostienen la vida, tales como uno o más tejidos seleccionados del corazón, riñon, cerebro, hígado, médula ósea, colon, pecho, próstata, tiroide, vesícula biliar, pulmón, adrenales, músculos, fibras nerviosas, páncreas, piel, o los órganos que sostienen la vida o tejido en el cuerpo humano. El término "efectos secundarios significativos" , como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo, ligando o conjugado de anticuerpo, que, cuando se administra en vivo, producirá solamente efectos secundarios despreciables o clínicamente manejables, tales como los normalmente encontrados durante la quimioterapia . Cuando menos una región de enlace de estas segundas sustancias anticáncer empleadas en combinación con la invención será un componente que sea capaz de administrar una toxina o factor de coagulación a la región del tumor, es decir, capaz de localizarse dentro del sitio del tumor. Estas sustancias objetivo se pueden dirigir contra un componente de una célula de tumor, vasculatura de tumor o estroma de tumor. Las sustancias objetivo generalmente se enlazan a un componente localizado en superficie, accesible en superficie o expresado nA -i-a .^^i-t^^^»^| en superficie de una 1|j3É$ila de tumor, vasculatura de tumor o estroma de tumor. Sin embargo, en cuanto comienza la destrucción de la vasculatura del tumor y la célula del tumor, los componentes internos se liberarán, permitiendo la dirección adicional de virtualmente todo componente del tumor. Muchos antígenos de células de tumor se han descrito, cualquiera de los cuales podría emplearse como objetivo en relación con los aspectos combinados de la presente invención. Los antígenos de células de tumor adecuados para dirigir el blanco de inmunotoxinas y coaguligandos adicionales incluyen aquellos reconocidos mediante los anticuerpos B3 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,242,813; incorporada en la presente mediante referencia) ; ATCC HB 10573); KSI/4 Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,975,369; incorporada en la presente mediante referencia; obtenido de una célula que comprende los vectores NRRL B-18356 y/ó NRRL B-18357); 260F9 (ATCC HB 8488); y D612 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,183,756; incorporada en la presente mediante referencia; ATCC HB 9796) . También se puede consultar el Catálogo de ATCC de cualquier año posterior para identificar otras líneas celulares adecuadas que producen anticuerpos de células anti-tumor. Para dirigirse a la vasculatura del tumor, el anticuerpo objetivo o ligando frecuentemente enlazará a un marcador expresado por, absorbido por, inducido en, o de otro .¿ m,.í ^MA.¿ ^ L*.^^miA*A*...,,«, Í^MA» .* ?^ *»*»*-^.* * **- -ffljm-iii ¡¡ i li mil \ |JÜ| | l-llí modo localizado en los vasos sanguíneos intratumorales del tumor vascularizado. Las moléculas objetivo expresadas adecuadas incluyen, por ejemplo, endoglina, E-selectina, P- selectina, VCAM-1, ICAM-1, PSMA (Liu y colaboradores, 1997), un TIE, un ligando reactivo con LAM-1, un receptor VEGF/VPF, un receptor FGF, integrina avß3, pleyotropina y endosialina. Los objetivos adsorbidos convenientes son aquellos tales como VEGF, FGF, TGFß, HGF, PF4, PDGF, TIMP, un ligando que se enlaza con un TIE y las isoformas de fibronectina asociadas con tumores. Los antígenos naturalmente y artificialmente inducibles por citocinas y coagulantes también se pueden usar como blanco, tales como ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, un ligando reactivo con LAM- 1, endoglina, y hasta MHC Clase II (inducible por citocina, por ejemplo, mediante IL-1, TNF-a, IFN-?, IL-4 y/ó TNF-ß; y E- selectina, P-selectina, PDGF e ICAM-1 (inducible por coagulante, por ejemplo, mediante trombina, Factor IX/IXa, Factor X/Xa y/ó plasmina) . Las siguientes patentes y solicitudes de patentes se incorporan específicamente en la presente mediante referencia para los fines de suplementar aún más las presentes enseñanzas con respecto a la preparación y uso de las inmunotoxinas dirigidas contra marcadores expresados, adsorbidos, inducidos o localizados de la vasculatura del tumor: Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con número de serie 08/482,369, Derechos de -" emisión pagados el 20 de octubre de 1998; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,855,866; 5,965,132; 6,051,230; 6,004,555; 5,877,289; 6,004,554; 5,776,427; 5,863,538; 5,660,827 y 6,036,955. Otras composiciones y métodos que se dirigen a la vasculatura del tumor incluyen aquellos que usan de blanco los aminofosfolípidos, tales como la fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, recientemente descubierta que es accesible, a marcadores específicos de los vasos sanguíneos de tumores. La administración de anticuerpos aanti- aminofosfolípidos solos es suficiente para inducir trombosis y regresión del tumor. La presente invención de este modo puede combinarse efectivamente con anticuerpos anti-fosfatidilserina y/o fosfatidiletanolamina; o inmunoconjugados de estos anticuerpos se pueden usar. Las siguientes solicitudes provisionales de patentes se incorporan específicamente en la presente mediante referencia para los propósitos de suplementar aún más las presentes enseñanzas con respecto a la preparación y uso de los anticuerpos anti-aminofosfolípido y inmunotoxinas: solicitud provisional con número de serie 60/092,672 presentada el 13 de julio de 1998, y la solicitud provisional con número de serie 60/092,589, presentada el 13 de julio de 1998. La solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con número de serie 60/092,589 se incorpora además en la presente mediante referencia para el propósito de suplementar adicionalmente las presentes enseñanzas con respecto al uso de conjugados de proteínas de enlace de aminofosfolípidos tales como conjugados de anexina, para su uso para administrar toxinas y coagulantes a los vasos sanguíneos del tumor y para inducir la trombosis y la regresión del tumor. Los objetivos estromales de tumor convenientes incluyen componentes de la matriz o estroma extracelular del tumor, o componentes que se enlazan en la misma; incluyendo los marcadores de membrana base, colágeno tipo IV, laminina, sulfato de heparán, proteoglicano, fibronectinas, plaquetas activadas, LIBS y tenascina. Un objetivo preferido para estos usos es RIBS. Las siguientes patentes y solicitudes de patente se incorporan específicamente en la presente mediante referencia para los propósitos de suplementar adicionalmente las presentes enseñanzas con respecto a la preparación y uso de sustancias objetivo del estroma del tumor: Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de Serie 08/482,369 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,093,399; Derechos de Emisión pagados el 20 de octubre de 1998); 08/485,482; 08/487,427 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,004,555; 08/479,733 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,877,289); 08//472,631; y 08/479,727 y 08/481,904 (Patente de los Estados Unidos de i - ^é i M!?i^^ á, Norteamérica Número 6,036,955). Las segundas sustancias terapéuticas anticáncer se pueden unir operativamente a cualquiera de las sustancias citotóxicas o anticelulares de otro modo descritas en la presente para su uso en las inmunotoxinas basadas en anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o 2C3. Sin embargo, las sustancias anticelulares convenientes también incluyen radioisótopos. Las fracciones de toxina se preferirán, tales como la cadena de ricina A y la cadena A desglicosilada (dgA) . La segunda sustancia objetivo para uso opcional con la invención puede comprender un componente dirigido que sea capaz de promover la coagulación, es decir, un coaguligando . Aquí, el anticuerpo objetivo o ligando se puede directamente o indirectamente, por ejemplo, vía otro anticuerpo, enlazar con cualquier factor que directamente o indirectamente estimule la coagulación, incluyendo cualquiera de los descritos en la presente para su uso en los coaguligandos basados anticuerpos anti-VEGF que bloquean al VEGFR2, o 2C3. Los factores de coagulación preferidos para estos usos son el Factor de Tejido (TF) y derivados del Factor de Tejido, tales como el Factor de Tejido truncado (tTF), Factor de Tejido dimérico y multimérico, y Factor de Tejido mutante deficiente de la capacidad para activar el Factor VII. Las dosis efectivas de las inmunotoxinas y coaguligandos para su uso combinado en el tratamiento de cáncer estará entre aproximadamente 0.1 mg/kg y aproximadamente 2 mg/kg, y preferiblemente, de entre aproximadamente 0.8 mg/kg hasta aproximadamente 1.2 mg/kg, cuando se administra vía la ruta intravenosa a una frecuencia de aproximadamente una vez por semana. Alguna variación en dosificación necesariamente se presentará dependiendo de la condición del sujeto que se está tratando. El médico responsable de la administración determinará la dosis adecuada para el sujeto individual. G5. Terapia ADEPT y de profármaco El anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 de la presente invención se pueden usar en conjunto con profármacos, en donde el anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, o el anticuerpo basado en 2C3 se asocia operativamente con un componente de activación de profármaco, tal como una enzima que activa un profármaco, que convierte un profármaco en la forma más activa después del contacto con el anticuerpo. Esta tecnología generalmente se denomina "ADEPT", y se describe en, v.gr., las publicaciones internacionales WO 95/13095; WO 97/26918, WO 97/24143, y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 4,975,278 y 5,658,568, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia. El término "profármaco" como se usa en la presente, se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia biológicamente o farmacéuticamente activa que ejerce efectos citotóxicos reducidos o de otro modo anticelulares en células objetivo, incluyendo células endoteliales vasculares de tumores, en comparación con el fármaco padre en el cual se basa. Preferiblemente, el profármaco o forma precursora ejerce efectos citotóxicos o anticelulares significativamente reducidos, o más preferiblemente, despreciables en comparación con la forma "original" o padre. Los "profármacos" son capaces de ser activados o convertirse para producir la forma del fármaco padre, más activa. La capacidad técnica para hacer y usar profármacos existe dentro de la experiencia del artesano ordinario.
Willman y colaboradores, (1986) y Stella y colaboradores, (1985) cada una incorporada específicamente en la presente mediante referencia para propósitos de suplementar adicionalmente la descripción de enseñanzas que se refieren a cómo hacer y usar varios profármacos. Las construcciones de profármacos ejemplares que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,975,278), profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos basados en péptido (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,660,829; 5,587,161; 5,405,990; WO 97/07118), modificados de aminoácidos D, profármacos glicosilados (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica ^ÜÜHlli . * -^ '' '& . &í Í í I "* "Sf" "' números 5,561,119, 5,646,298; 4,904,768; 5,041,424), profármacos que contienen ß-lactama, opcionalmente sustituido profármacos que contienen fenoxiacetamida (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,975,278), profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, y hasta 5-fluorocitosina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,975,278) y profármacos 5-fluorouridina y similares, en donde cada una de las patentes se incorpora específicamente en la presente mediante referencia. El tipo de sustancia terapéutica o fármaco citotóxico que se puede usar en forma de profármaco virtualmente no tiene límites. Entre más sustancia citotóxica se preferirán para una forma de administración, sobre, v.gr., la administración de coagulantes, que son menos preferidos para su uso como profármacos. Todo esto se requiere para formar el profármaco es diseñar la construcción de manera que el profármaco sea sustancialmente inactivo y el fármaco "liberado" o activado tenga actividad sustancial, o cuando menos suficiente, para el propósito pretendido. Varios mejoramientos en los profármacos originales también se conocen y contemplan para su uso con la misma, como se describe en la publicación internacional WO 95/03830; la patente europea EP 751,144 (antraciclinas ) ; la publicación internacional WO 97/07097 (ciclopropilindoles) ; y WO 96/20169. Por ejemplo, profármacos con Km reducida se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,621,002, específicamente incorporada en la presente mediante referencia, la cual se puede usar en el contexto de la presente invención. La terapia de profármacos que se puede llevar a cabo intracelularmente también se conoce, como se ejemplifica por WO 96/03151, específicamente incorporada en la presente mediante referencia, y se puede practicar con la misma. Para su uso en ADEPT, la sustancia que activa o convierte el profármaco en el fármaco más activo se une operativamente al anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo parecido a 2C3. El anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o el anticuerpo parecido a 2C3 de este modo, localiza el profármaco convirtiendo la capacidad dentro de sitio angiogénico, preferiblemente, dentro de la vasculatura y estroma del tumor, de manera que el fármaco activo solamente se produce en esas regiones y no en circulación o en los tejidos sanos . Las enzimas que se pueden unir al anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o anticuerpos basados en 2C3 para funcionar en activación profármaco incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina para su uso en combinación con profármacos que contienen fosfato (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,975,278); arilsulfatasa para su uso en combinación con profármacos que contienen sulfato (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número ""'finir r.l tfrftrt?f f A ,**-^-.« -*!-.-. -•^-M«^^-* -~<» >*JL^ . ^*^^. £^ 5,270,196); peptidasas y proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasa (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,660,829; 5,587,161; 5,405,990) y catepsinas (incluyendo catepsina B y L) , para su uso en combinación con profármacos basados en péptido; D-alanilcarboxipeptidasas para su uso en combinación con profármacos modificados con aminoácido D; enzimas que disocian carbohidrato tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa para su uso en combinación con profármacos glicosilados (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,561,119; 5,646,298); ß-lactamasa para su uso en combinación con profármacos que contienen ß-lactama; penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,975,278) o penicilina G amidasa, para su uso en combinación con fármacos derivados en sus amino nitrógenos con fenoxiacetamida o grupos fenilacetamida; y citosina desaminasa (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,338,678; 5,545,548) para su uso en combinación con profármacos basados en 5-fluorocitosina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,975,278), en donde cada una de las patentes se incorpora específicamente en la presente mediante referencia. Anticuerpos con actividad enzimática, conocida como anticuerpos catalíticos o "abzimas", también se pueden emplear para convertir profármacos en fármacos activos. Abzimas 4nu»* á ? ^~*± >*<~** *t* - basadas en anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o anticuerpos parecidos a 2C3 así forman otro aspecto de la presente invención. La capacidad técnica para hacer abzimas también existe dentro de un experto en la técnica, como se ejemplifica por Massey y colaboradores, (1987), específicamente incorporada en la presente mediante referencia para propósitos de suplementar la enseñanza de la abzima. Los anticuerpos catalíticos capaces de catalizar la desintegración de un profármaco en la posición carbamato, tales como un nitrógeno mustard arilo carbamato, se contemplan adicionalmente, como se describe en la patente europea EP 745,673, específicamente incorporada en la presente mediante referencia. H. Diagnóstico y formación de imagen La presente invención además proporciona métodos de diagnóstico y formación de imagen in vi tro y en vivo. Estos métodos son aplicables para su uso para generar información de diagnóstico, pronóstico o formación de imagen para cualquier enfermedad angiogénica, como se ejemplifica por artritis, psoriasis y tumores sólidos, pero incluyendo todas las enfermedades angiogénicas descritas en la presente. Fuera del campo de diagnóstico de formación de imágenes de tumores, estos aspectos de la invención se prefieren más para su uso en pruebas de diagnóstico in vi tro, preferiblemente ya sea cuando las muestras se pueden obtener no invasivamente y probar en ensayos de producción alta y/o cuando el diagnóstico clínico es ambiguo y la confirmación se desea. Hl . Métodos y juegos de inmunodetección En todavía otras modalidades, la presente invención se refiere a métodos de inmunodetección para enlazar, purificar, remover, cuantificar o de otro modo detectar generalmente el VEGF y para diagnosticar enfermedades angiogénicas. Los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 de la presente invención, tales como el 2C3, se pueden emplear para detectar el VEGF en vivo (véase más adelante) , en muestras de tejido aislado, biopsias o frotis y/o en muestras de tejido homogenizado. Estos métodos de inmunodetección tienen utilidad de diagnóstico evidente, pero también tienen aplicaciones para muestras no clínicas tales como titulación de muestras de antígenos, y similares. Los pasos de varios métodos de inmunodetección útiles se han descrito en la literatura científica, tales como, v.gr., Nakamura y colaboradores, (1987, incorporada en la presente mediante referencia) . En general, los métodos de inmunoenlace incluyen obtener una muestra sospechosa de contener VEGF y poner en contacto la muestra con anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2, tales como 2C3, bajo condiciones efectivas para permitir la formación de inmunocomplejos . En estos métodos, el anticuerpo se puede enlazar a un soporte sólido, tal como en forma de una matriz de columna, y la muestra sospechosa de contener VEGF, se aplicará al anticuerpo .^^Mfeti,.-^^^^^ inmovilizado. Más preferiblemente, los métodos de inmunoenlace incluyen métodos para detectar o cuantificar la cantidad de VEGF en una muestra, estos métodos requieren la detección o cuantificación de cualquier complejo inmune formado durante el proceso de enlace. Aquí, uno obtendría una muestra sospechosa de contener VEGF y pondría en contacto la muestra con un anticuerpo de acuerdo con la misma y luego detectaría o cuantificaria la cantidad de complejos inmunes formados bajo las condiciones específicas. La muestra biológica analizada puede ser cualquier muestra que se sospeche que contiene VEGF, generalmente de un animal o paciente sospechoso de tener enfermedad angiogénica. Las muestras pueden ser una sección o espécimen de tejido, una biopsia, un frotis o muestra de prueba de manchado, un extracto de tejido homogenizado o formas separadas o purificadas del mismo . Al poner en contacto la muestra biológica elegida con el anticuerpo en condiciones efectivas y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunes (complejos inmunes primarios) generalmente es cuestión de simplemente añadir una composición de anticuerpo a la muestra e incubar la mezcla durante un periodo de tiempo suficientemente largo para que los anticuerpos formen complejos inmunes, con, es decir que se enlacen con, cualquier VEGF --Í <* A k í í i ^AX presente. Después de este tiempo, la composición de anticuerpo de muestra, tal como un sección de tejido, una placa de ensayo inmunosorbente de enzima enlazada, manchado de punto o manchado Western, generalmente se lavará para remover cualquier especie de anticuerpo basado no específicamente, permitiendo que solamente los anticuerpos específicamente enlazados dentro de los complejos inmunes primarios se detecten. La detección de formación de inmunocomplejos es muy conocida en la técnica y se puede lograr a través de la aplicación de numerosos enfoques. Estos métodos generalmente se basan en la detección de una etiqueta o marcador, tal como cualquier etiqueta o marbete radioactivo, fluorescente, biológico o enzimático conocido en la técnica. Las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,366,241, cada una incorporada en la presente mediante referencia. El uso de enzimas que generan un producto coloreado después del contacto con sustrato cromogénico se prefieren generalmente. El ligando de enlace secundario, tal como un segundo anticuerpo o un arreglo de enlace de ligando biotina/avidina, también se puede usar, como se conoce en la técnica . Los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2, tales como el 2C3, empleados en la detección pueden ellos mismos enlazarse a una etiqueta detectable, en donde uno podría simplemente detectar la etiqueta, permitiendo mediante esto la cantidad de complejos inmunes primarios en la composición se determinen . Preferiblemente, los complejos inmunes primarios se detectan por medio de un segundo ligando de enlace que tiene afinidad de enlace para los anticuerpos de la invención. En estos casos, el segundo ligando de enlace se puede enlazar a una etiqueta detectable. El segundo ligando de enlace mismo frecuentemente es un anticuerpo, y puede de este modo denominarse un anticuerpo "secundario". Los complejos inmunes primarios se ponen en contacto con el ligando de enlace secundario, etiquetado, o anticuerpo bajo condiciones efectivas y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunes secundarios. En los complejos inmunes secundarios generalmente se lavan para remover cualquier anticuerpo ligando secundario etiquetado específicamente unido y la etiqueta restante en los complejos inmunes secundarios se detecta entonces. Otros métodos incluyen la detección de complejos inmunes primarios mediante un enfoque de dos pasos. Un segundo ligando de enlace tal como un anticuerpo, que tiene afinidad de enlace para el primer anticuerpo se usa para formar complejos inmunes secundarios, como se describió anteriormente. Después de lavar, los complejos inmunes secundarios se ponen en contacto con un tercer ligando o anticuerpo de enlace que tiene AIA *?* ^.A^,^^ ~játÉ ,? * timt*j afinidad de enlace para el segundo anticuerpo, de nuevo bajo condiciones efectivas y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunes (complejos inmunes terciarios) . El tercer ligando o anticuerpo se enlaza con una etiqueta detectable, permitiendo la detección de los complejos inmunes terciarios así formados. Este sistema puede proporcionar la amplificación de la señal si se desea. En el diagnóstico clínico o supervisión de los pacientes con enfermedad angiogénica, la detección del VEGF, o un aumento en los niveles del VEGF, en comparación con los niveles en una muestra biológica correspondiente de un sujeto normal es indicadora de un paciente con una enfermedad angiogénica . Sin embargo, como lo saben los expertos en la técnica, este diagnóstico clínico no es probable que se hiciera con base en este método en aislamiento. Aquellos con experiencia en la técnica están muy familiarizados con la diferenciación entre la expresión significativa de un biomarcador, el cual representa una identificación positiva, y la expresión a bajo nivel o de fondo de un biomarcador. Sin duda, los niveles de expresión de fondo frecuentemente se usan para formar un "corte" enzima que aumenta el manchado se calificará como significativo o positivo. H2. Formación de imágenes Estos aspectos de la invención se prefieren para su uso en los métodos para formar imágenes de tumores y el tratamiento de tumor combinado y los métodos de formación de imágenes. Los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2 o anticuerpos basados en 2C3 que están enlazados con una o más sustancias detectables se consideran para su uso en la formación de imágenes en sí, o para formar imágenes previas del tumor para formar una imagen confiable antes del tratamiento. Estas composiciones y métodos también se pueden aplicar a la formación de imágenes y diagnóstico de otra enfermedad o condición angiogénica, particularmente tumores no malignos, aterosclerosis y condiciones en las cuales la imagen interna se desea para el diagnóstico o propósitos de pronóstico o para diseño de tratamiento. El anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2 o los anticuerpos que forman imágenes basados en 2C3 generalmente comprenderán un anticuerpo anti-VEGF, que bloquea el VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 operativamente unido, conjugado con, una etiqueta detectable. Las "etiquetas detectables" son compuestos o elementos que se pueden detectar debido a sus propiedades funcionales específicas, o características químicas, el uso de las cuales permite que el componente al cual estén unidas se detecte, y se cuantifique además si se desea. Preferiblemente, las etiquetas detectables son aquellas detectables en vivo usando métodos no invasivos. En la técnica se conocen muchas sustancias adecuadas para la formación de imágenes, como son los métodos para su unión con anticuerpos y ligandos de enlace (ver, por ejemplo, las Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,021,236 y 4,472,509, ambas incorporadas en la presente mediante referencia) . Ciertos métodos de unión implican el uso de un complejo quelado de metal que emplea, por ejemplo, una sustancia quelante orgánica tal como un DTPA unido al anticuerpo (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,472,509) . Los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer reaccionar con un enzima en presencia de una sustancia de acoplamiento tal como un glutaraldehído o periodato. Los conjugados con marcadores de fluoresceína se preparan en la presencia de estas sustancias de acoplamiento o mediante la reacción con un isotiocianato. Un ejemplo de etiquetas detectables son los iones paramagnéticos. En este caso, los iones convenientes incluyen cromo (III) , manganeso (II) , hierro (III) , hierro (II) , cobalto (II) , níquel (II) , cobre (II) , neodimio (III) , samario (III) , iterbio (III) , gadolinio (III) , vanadio (II) , terbio (III) , disprosio (III), holmio (III), y erbio (III), siendo particularmente preferido el gadolinio. Los iones útiles en otros contextos, tales como para formación de imágenes en rayos X, incluyen pero no se limitan a lantano (III) , oro (III) , plomo (II) , y especialmente bismuto (III) . Las etiquetas fluorescentes incluyen rodamina, ^,,.^., *fii.tt^.-.rf.-^,T.,li.^^ fluoresceína y renografina. La rodamina y la fluoresceína frecuentemente se enlazan vía un intermediario isotiocianato. En el caso de isótopos radioactivos para aplicaciones de diagnóstico, los ejemplos convenientes incluyen "carbono, 51cromo, 36cloro, "cobalto, 58cobalto, 67cobre, 152eu, "galio, 3hidrógeno, 123yodo, 125yodo, 131yodo, n?indio, 59hierro, 32fósforo, 186renio, 188renio, "selenio, "azufre, 99mtecnetio, 90itrio. El 125yodo frecuentemente es el preferido para su uso en ciertas modalidades, y el 99mtecnitio y el mindio frecuentemente también se prefieren debido a su baja energía y conveniencia para detección en rango largo. El anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 etiquetados radioactivamente para su uso en la presente invención se pueden producir de conformidad con métodos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, los grupos funcionales intermediarios que frecuentemente se usan para enlazar iones metálicos radioisotópicos con anticuerpos son ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) y ácido etileno diaminotetracético (EDTA) . Los anticuerpos monoclonales también se pueden yodar en contacto con yoduro de potasio o de sodio y una sustancia oxidante química tal como hipoclorito de sodio, o una sustancia oxidante enzimática tal como lactoperoxidasa. Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden etiquetar con tecnetio99m mediante un proceso de intercambio de ligando, por ejemplo, J?.*Í?A¿Í *?.*m~**. . ^^^¿¿^? i?eAl- ttJ i •ffcr' reduciendo el pertecnato con solución estannosa, quelando el tecnetio reducido sobre una columna de Sefadex y aplicando el anticuerpo a esta columna; o mediante técnicas de etiquetación directas, por ejemplo, incubando pertecnato, una sustancia reductora tal como SNC12, una solución reguladora tal como solución de ftalato de sodio-potasio, y el anticuerpo. Cualquiera del tipo anterior de anticuerpos anti- VEGF, que bloquea al VEGFR2 o basado en 2C3 detectablemente etiquetados y ligandos de enlace de aminofosfolípidos se puede usar en los aspectos de formación de imágenes de la presente invención. Son igualmente convenientes para su uso en diagnóstico in vi tro . Las dosis para las modalidades de formación de imágenes en vivo generalmente son menores que para terapia, pero también dependen de la edad y el peso de un paciente. Una dosis de una vez deberá ser suficiente. El diagnóstico en vivo o los métodos de formación de imagen generalmente comprenden administrar a un paciente una cantidad diagnósticamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF, que bloquea al VEGFR2, o anticuerpo basado en 2C3 que se conjuga con un marcador que es detectable mediante métodos no invasivos. El conjugado de anticuerpo-marcador se deja suficiente tiempo para localizar y enlazarse con el VEGF dentro del tumor. El paciente se expone entonces a un dispositivo de detección para identificar el marcador detectable, formando de este modo una imagen del tumor.
H3. Juegos de diagnóstico En todavía otras modalidades, la presente invención proporciona juegos de diagnóstico, que incluyen tanto juegos de inmunodetección como juegos de imágenes, para su uso con los métodos de inmunodetección y formación de imágenes descritos anteriormente. De conformidad con lo anterior, los anticuerpos anti-VEGF que bloquean el VEGFR2, tales como 2C3, se proporcionan en el juego, generalmente comprendido dentro de un contenedor conveniente. Para la inmunodetección, los anticuerpos se pueden enlazar a un soporte sólido, tal como un pozo de un plato de microtitulación, aunque las soluciones de anticuerpos o polvos para reconstitución se prefieren. Los juegos de inmunodetección preferiblemente comprenden cuando menos un primer reactivo de inmunodetección. Los reactivos de inmunodetección del juego pueden tomar cualquiera de una variedad de formas, incluyendo aquellas etiquetas detectables que se asocian o se enlazan con el anticuerpo dado. Las etiquetas detectables que se asocian con o se unen a un ligando de enlace secundario también se contemplan. Los ligandos secundarios ejemplares son aquellos anticuerpos secundarios que tienen afinidad de enlace para el primer anticuerpo. Los reactivos de inmunodetección convenientes adicionales para su uso en los presentes juegos incluyen los dos reactivos componentes que comprenden un anticuerpo secundario que tiene una afinidad de enlace para el primer anticuerpo, junto con un tercer anticuerpo que tiene afinidad de enlace para el segundo anticuerpo, el tercer anticuerpo está enlazado con una etiqueta detectable. Como se notó anteriormente, varias etiquetas ejemplares son conocidas en la técnica y todas estas etiquetas se pueden emplear en relación con la presente invención. Estos juegos pueden contener conjugados de anticuerpo - etiqueta ya sea en forma completamente conjugada, en la forma de intermediarios, o como fracciones separadas para ser conjugadas por el usuario del juego. Los juegos de formación de imágenes preferiblemente comprenden un anticuerpo anti-VEGF que bloquea el VEGFR2, tal como el 2C3, que ya está unido a una etiqueta detectable en vivo. Sin embargo, la etiqueta y el medio de unión se podría suministrar por separado. Cualquiera de estos juegos puede comprender además sustancias de control, tales como composiciones convenientemente divididas del VEGF, ya sea etiquetado o no etiquetado, que se pueden usar para preparar una curva estándar para un ensayo de detección. Los componentes de los juegos se pueden empacar ya sea en medio acuoso o en forma liofilizada. El medio contenedor de los juegos generalmente incluirá cuando menos un frasco, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio contenedor, en el cual se puede colocar el anticuerpo o antígeno, y preferiblemente, convenientemente dividido. Cuando se proporciona un segundo o tercer ligando de enlace o componente adicional, el juego generalmente también contendrá un segundo, tercero u otro contenedor adicional en el cual este ligando o componente se puede colocar. Los juegos también pueden incluir otros reactivos de diagnóstico para su uso en el diagnóstico de cualquiera o más de las enfermedades angiogénicas. Preferiblemente, se usarán segundos diagnósticos no basados en el enlace con el VEGF. Los juegos de la presente invención también típicamente incluirán un medio para contener el anticuerpo, y cualquier otro contenedor de reactivo en confinamiento cerrado para su venta comercial . Estos contenedores pueden incluir contenedores de plástico moldeados por inyección o por soplado en los cuales se retienen las ampolletas deseadas. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Se apreciará por todos los expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, en este modo se pueden considerar que constituyen modos preteridos para su práctica. Sin embargo, los expertos en el campo deberán, a la luz de la presente descripción, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades - i .^Mi...^í ^.^.a.i^£M >:..!¡L específicas los cuales se describen y pueden obtener un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. EJEMPLO 1 Generación y características únicas del anticuerpo anti-VEGF 2C3 A. Materiales y métodos 1. Inmunógenos Los péptidos que corresponden a los 26 aminoácidos N terminales del VEGF humano (huVEGF; SEQ ID NO: 10) y los 25 aminoácidos N terminales de VEGF de cobayo (gpVEGF; SEQ ID NO: 11) se sintetizaron por la Biopolymers Facility del Howard Hughes Medical Institute en UT Southwestern Medical Center en Dallas. Los péptidos tenían las siguiente secuencia (N a C) : APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYC; SEQ ID NO: 10; y APMAEGEQKPREVVKFMDVYKRSYC; SEQ ID NO: 11. Los péptidos se conjugaron vía la cisteína C-terminal a tiroglobulina usando enlazador succinimidil 4- (N- maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) (Pierce, Rockford, IL) . Los conjugados de control también se prepararon que consistían en L-cisteína enlazada con tiroglobulina. Los conjugados se separaron del péptido libre o enlazador por cromatografía de exclusión de tamaño. El VEGF humano recombinante también se usó por separado como un inmunógeno (obtenido del Dr. S. Ramakrishnan, University of Minnesota, Minneapolis, MN) . 2. Hibridomas Para la producción del anticuerpo anti-gpVEGF que produce hibridomas, ratones C57/B1-6 se inmunizaron con el conjugado de gpVEGF-péptido-tiroglobulina en el adyuvante TiterMax (CytRX Co . , Norcross, GA) . Para la producción de anticuerpos VEGF antihumanos, ratones BALB/c se inmunizaron ya sea con el conjugado huVEGF-péptido-tiroglobulina o con VEGF humano recombinante en TiterMax. Tres días después del refuerzo final se fusionaron los esplenocitos con células de mieloma P3X63AG8.653 (ATCC, Rockville, MD) y se cultivaron como se describe por Morrow y colaboradores, (1990; incorporada en la presente mediante referencia) . 3. Purificación de anticuerpo Los anticuerpos IgG (2C3, 12D7, 3E7) se purificaron de sobrenadante de cultivo de tejido por precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de Proteína A usando el sistema de regulación Pierce ImmunoPure Ginding/Elution (Pierce) . Los anticuerpos IgM (GV39M, 11B5, 7G3) se purificaron a partir de sobrenadante de cultivo de tejido mediante precipitación de sulfato de amonio saturado al 50 por ciento, la resuspensión del aglomerado en solución reguladora de fosfato (pH 7.4) y diálisis contra dH20 para precipitar la euglobulina. El precipitado dH20 se resuspendión en solución ^^^^^g^^g reguladora de fosfato y se fraccionó mediante cromatografía de exclusión de tamaño en una columna de Sefarosa S300 (Pharmacia) . La fracción de IgM fue 85-90 por ciento pura, juzgada por SDS-PAGE. 4. Anticuerpos de control Varios anticuerpos de control se han usado en todos estos estudios incluyendo mAb 4.6.1 (VEGF antihumano de ratón de Genentech, Inc.), Ab-3 (VEGF antihumano de ratón de OncogeneScience, Inc.), A-20 (VEGF antihumano de conejo de Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) , 0X7 (Thyl .1 anti-rata de ratón del Dr. A.F. Williams, MRC Cellular Immunology Unit, Oxford, RU) , MTSA (un IgM de mieloma de ratón de especificidad irrelevante del Dr. E.S. Vitetta, UT- Southwestern, Dallas, TX) , 1A8 (Flk-1 anti-ratón de ratón; Philip E. Thorpe y colaboradores) , MECA 32 (endotelio antiratón de rata del Dr. E. Butcher, Stanford University, Stanford CA) , y TEC 11 (endoglina antihumana de ratón; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,660,827) . 5. Selección inicial Para la selección inicial, platos de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada de 96 pozos (Falcon, Franklin Lakes, NJ) se recubrieron con 250ng ya sea del péptido VEGF o del conjugado VEGF-Cys-tiroglobulina y se bloquearon con hidrolisato ácido de caseína al 5 por ciento (Sigma, St . Louis, MO) . Los sobrenadantes de los hibridomas anti-gpVEGF y los Tísífc" 392 hibridomas del VEGF antihumano inicial se seleccionaron en platos recubiertos de antígeno a través de una técnica Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada indirecta dual (Crowther, 1995) . 5 Los hibridomas que mostraron reactividad preferencial con VEGF péptido tiroglobulina pero ninguna reactividad o reactividad débil con Cys-tiroglobulina se seleccionaron adicionalmente a través de inmunohistoquímica (descrita más adelante) en secciones congeladas de tejido de tumor. 0 6. Inmunohistoquimica Las células de tumor de carcinoma hepatocelular de la línea 10 de cobayos (obrenida del Dr. Ronald Neuman, NIH, Bethesda, MD) se cultivaron en cobayos de cepa 2 (NCI, Bethesda, MD) . Los tumores humanos NCI-H358 de carcinoma de 5 pulmón de células no pequeñas (NSCLC), NCI-H460 NSCLC (ambos obtenidos del Dr. Adi Gazdar, UT Southwestern, Dallas, TX) , adenocarcinoma de colon HT29 (American Type Culture Collection) , y linfoma de Hodgkin L540CY (obtenido del Profesor V. Diehl, Colonia, Alemania) se cultivaron como xenoinjertoss en ratones CB17 SCID (Charles River, Wilmington, MA) . Los tumores se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquida y se almacenaron a -70°C. Las muestras congeladas de especímenes de tumor de pacientes se obtuvo del National Cáncer Institute Cooperative Human Tissue Network (Southern División, Birminghan, AL) . Se realizó la inmunohistoquímica como se describe por Burrows y colaboradores, (1995). 7. .Análisis Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada Sobrenadantes de hibridoma de animales inmunizados con el VEGF se seleccionaron a través de una técnica de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada indirecta diferencial empleando tres antígenos diferentes: VEGF humano solo, complejo VEGF: Flk-1/SEAP, y Flk-1/SEAP solo. Para el VEGF humano solo, ciertos platos de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada se recubrieron con 100 ng de VEGF. Para el flk-1/SEAP solo, otros platos de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada se recubrieron con 500 ng de Flk-1/SEAP, una forma soluble del receptor VEGF de ratón (células que secretan Flk-1/SEAP se obtuvieron del Dr. Ihor Lemischka, Princeton University, Princeton, NJ) . La proteína Flk-1/SEAP se produjo y purificó como se describe por Tessler y colaboradores, (1994). Básicamente, el dominio extracelular del Flk-1 (sFlk-1) se produjo en células de Spodoptera frugiperda (Sf9) y se purificó por técnicas de inmunoafinidad usando un anticuerpo anti-flk-1 monoclonal (1A(). sFÍk-1 se biotiniló y enlazó en platos recubiertos de avidina. Para preparar platos recubiertos con complejo VEGF: Flk-1/SEAP, sFlk-1 purificado se biotiniló y se hizo reaccionar con el VEGF durante la noche a 4°"C en regulador de enlace (lOmM HEPES, 150mM NaCl, 20µg/ml de albúmina de suero um^miÉ?ík^tíss ^M bovino y 0. lµg/ml de heparina) a una proporción molar de sFlk-1 a VEGF de 2.5:1 para alentar la formación de dímeros. El complejo VEGF:sFlk-l se incubó entonces en pozos recubiertos de avidina de una placa de microtitulación de 96 pozos para producir platos recubiertos con VEGF asociados con su receptor. La reactividad de los anticuerpos con VEGF solo, sFlk-1 biotinilado y el complejo VEGF:sFlk-l se determinó entonces en estudios controlados usando los tres antígenos en placas recubiertas de avidina. La reactividad se determinó como se describe anteriormente para la selección inicial . Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada de captura también se desarrolló. En el Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada de captura, platos de microtitulación se recubrieron durante la noche a 4°C con lOOng del anticuerpo indicado. Los pozos se lavaron y bloquearon como anteriormente, luego se incubaron con varias concentraciones de VEGF biotinilado o VEGF: sFlk-1 -biotina. La estreptavidina conjugada con peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.), diluida 1:2000, se usó como una segunda capa y se desarrolló. Estudios de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada de competición se realizaron primero etiquetando los anticuerpos con peroxidasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (EZ-Link Activated Peroxidase, Pierce) . El antígeno usado para los estudios de competición con 12D7, 3E7, 2C3, y 7G3 fue capturado con VEGF-biotina mediante avidina en un plato de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada. Aproximadamente 0.5-2.0µg/ml de anticuerpo de prueba etiquetado con peroxidasa se incubó en el plato en presencia ya sea del regulador solo, un IgG irrelevante, o los otros anticuerpos anti-VEGF de competencia en un exceso de 10-100 veces. El enlace del anticuerpo etiquetado se valoró mediante la adición de sustrato de 3, 3 ' 5, 5 ' -tetrametilbenzidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.). Las reacciones se detuvieron después de 15 minutos con 1M de H3P04 y se leyó espectrofotométricamente a 450nM. El ensayo se hizo en triplicado cuando menos dos veces para cada combinación de anticuerpo etiquetado y competidor. Dos anticuerpos se consideraron estar en el mismo grupo de epítope si se bloqueaban de manera cruzada con el enlace del otro en más del 80 por ciento. El GV39M y 11B5 no retuvieron la actividad de enlace después de la etiquetación con peroxidasa pero toleraron la biotinilación. El GV39M y 11B5 fueron biotinilados y probados contra VEGF: sFlk-1 que habían sido ya sea capturados por el anticuerpo anti-Flk-1 (LAB) o recubiertos directamente en un plato de Ensayo inmuposorbente de enzima enlazada. 8. .Análisis de manchado Western El VEGF reí. ombinante purificado en la presencia de suero de becerro fetal al 5 por ciento fue separado por 12 por ciento SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y de no reducción \m? .**A?*ás~****~ y transferido a nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa se bloqueó usando Sea-Block PP82-41 (East Coast Biologics, Berwick, ME) , y se cebó con anticuerpos primarios usando un aparato minimanchador (Immunetics, Cambridge, MA) . Las membranas se desarrollaron después de la incubación con el anticuerpo secundario conjugado de peroxidasa adecuado mediante quimioluminiscencia aumentada ECL. B. RESULTADOS 1. 2C3 tiene una especificidad de epitope única La Tabla 1 resume la información sobre la clase/subclase de diferentes anticuerpo anti-VEGF, los grupos de epítope que ellos reconocen en el VEGF, y su enlace preferencial con el VEGF o el complejo VEGF: receptor (VEGF: Flk-1). En todos los casos los anticuerpos enlazados al VEGF121 y VEGF165 igualmente bien y produjeron esencialmente los mismos resultados. Los resultados en seguida son para el VEGF165 a menos que se estipule otra cosa. TABLA 1. RESUMEN DE PROPIEDADES DE ANTICUERPO ANTI-VEGF Grupo de Clona Isotipo Inmunógeno Reactividad epitope1 VEGF2 predominante3 1 GV39M IgM,K Gp N-término VEGF: Flk-1 1 11B5 IgM,k Hu N-término VEGF: Flk-1 2 3E7 IgGl,l Hu N-término VEGF y VEGF: Flk-1 2 7G3 Ig,M,k Hu N-término VEGF y VEGF: Flk-1 3 3 1 122DD77 IgGl,k Hu N-término VEGF 4 2C3 IgG2a,k rHu VEGF VEGF "centrado A .6.1 IgGl VEGF alrededor aa 89-94 1. Grupos de epítope se determinaron a través de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada competitivo. 2. Los ratones se inmunizaron con un péptido sintético correspondiente ya sea a los 26 aminoácidos N-terminales del VEGF humano (11B5, 3E7, 7G3, y 12D7), los 25 aminoácidos N-terminales del VEGF de cobayo (GV39M) , o con el VEGF humano recombinante de longitud completa (2C3) . 3. Los anticuerpos se seleccionaron como un indirecto y un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada de captura para su reactividad con el VEGF solo o con VEGF asociado con sFlk-1 (VEGF: Flk-1) . 4. A4.6.1 tiene un epítope precisamente definido, que es distinto del epítope Grupo 4 reconocido por 2C3. Los estudios de A4.6.1 se reportan en Kim y colaboradores, 1992; Wiesmann y colaboradores, 1997; Muller y colaboradores, 1998; y Keyt y colaboradores, 1996, cada uno incorporado en la presente mediante referencia. Los estudios de enlace competitivos usando anticuerpos de prueba biotinilados o etiquetados con peroxidasa y un exceso de 10 a 100 veces de anticuerpos de competencia no etiquetados mostraron que el 2C3 se enlaza a un epítope único. Estos estudios primero revelaron que el GV39M y 11B5 se bloqueaban en cruzado cada uno al enlace del otro con VEGF: Flk-1, y que el 3E7 y el 7G3 se bloqueaban en cruzado con el enlace del otro con VEGF-biotina capturada sobre avidina. El GV39M y 11B5 se asignaron arbitrariamente al grupo epítope 1, mientras que 3E7 y 7G3 se asignaron al epítope grupo 2. El 2C3 y el anticuerpo restante, 12D7, no interfirieron significativamente con el enlace del otro o el enlace del resto de los anticuerpos con VEGF o VEGF: receptor.
El 12D7 se asignó al epítope grupo 3, y el 2C3 se asignó al epítope grupo 4 (Tabla 1) . Como se tabuló anteriormente, el 2C3 de un epítope diferente al anticuerpo A4.6.1. Los estudios de competición de los inventores mostraron que el 2C3 y A4.6.1 no reaccionan de manera cruzada. El epítope reconocido por el A4.6.1 también ha sido definido precisamente y es un epítope continuo centrado alrededor de los aminoácidos 89-94 (Kim y colaboradores, 1992; Wiesmann y colaboradores, 1997, Muller y colaboradores, 1998; Keyt y colaboradores, 1996; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . También hay varias diferencias conocidas entre el 2C3 y el A .6.1 (véase más adelante). 2. 2C3 se puede enlazar con el VEGF libre Hay diferencias marcadas en la capacidad de los anticuerpos en enlazar con el VEGF soluble en forma libre y ¿ ^M M fc^ Ak^lá^k complejada (Tabla 2) . Estos estudios proporcionan mayor evidencia de la naturaleza exclusiva del 2C3. La tabla 2 muestra que el GV39M y 11B5 despliegan una preferencia fuerte para el complejo VEGF: receptor, con la mitad del enlace máximo unido con el VEGF: Flk-1 a 5.5 y 2nM respectivamente en comparación con 400 y 800 nM respectivamente para el VEGF libre en solución. En contraste, el 2C3 y el 12D7 desplegaron una preferencia por el VEGF libre, con el enlace máximo medio obtenido en 1 y 20nM respectivamente en comparación con 150 y 250nM respectivamente para el complejo VEGF: Flk-1. Sin embargo, el 2C3 localiza a la vasculatura del tumor, así como al estroma del tumor, después de la inyección en vivo (véase más adelante) . El 3E7 se enlaza igualmente bien con el VEGF libre y el complejo VEGF: Flk-1 con la mitad del enlace máximo unido a InM para ambos . TABLA 2. CAPTURA DE ENSAYO INMUNOSORBENTE DE ENZIMA ENLAZADA DEL VEGF CONTRA EL VEGF: FLK-1 Clona Concentración Proporción de dando el 50% VEGF/VEGF:Plk-l2 del enlace máximo (nM) 1 VEGF VEGF: Flk-1 GV39M 400* 5.5 72.7 ¿rt ^* ¿ s *i ¿ * ^ 11B5 800* 2 400.0 3E7 0.9 1 0.9 12D7 20 250* 0.1 2C3 1 150 0.007 Mab 0.3 500* 0.0006 4.6. I3 1A8 NR4 1.5 Control NR 600* * Valor extrapolado 1. Los valores de enlace al 50% máximo se determinaron titulando VEGF biotinilado y sFlk-1 biotinilado acomplejado con VEGF en triplicado sobre pozos recubiertos con el anticuerpo indicado y luego d i-sarrollando con avidina etiquetada con peroxidasa. 2. Las proporciones mayores de 1.0 indican una preferencia del anticuerpo por el complejo (VEGF: Flk-1) mientras que las proporciones menores que 1.0 indican una preferencia por el VEGF. 3. Los anticuerpos de control usados incluyeron; 1A8 (anti-Flk-1 de ratón), Mab 4.6.1 (VEGF antihumano de ratón de Genentech) , y un IgM irrelevante como un control negativo. 4. NR = no se detectó reacción. 3. 2C3 reconoce un epitope dependiente no conformacionalmente El análisis de manchado Western mostró que 12D7, 2C3 ^Jt t- «"-fe-• "*•-a-A —-"• *~*>-Jfr***.ff** y 7G3 reaccionan con VEGF121 desnaturalizado y VEGF165 bajo condiciones de reducción y de no reducción. Estos anticuerpos por lo tanto parecen reconocer epítopes que no son dependientes conformacionalmente . En contraste, GV39M, 11B5, y 3E7 no reaccionaron con VEGF en los manchados Western, posiblemente debido a que reconocen un epítope en el término N del VEGF que depende conformacionalmente y se distorsiona bajo condiciones de desnaturalización. El análisis del manchado Western de los anticuerpos anti-VEGF se llevaron a cabo separando el VEGF165 en la presencia de 5 por ciento de suero de becerro fetal usando SDS-PAGE en un gel al 12 por ciento y analizando mediante un protocolo de manchado Western estándar usando la detección de ECL. Los anticuerpos primarios se incubaron con la membrana de microcelulosa usando un aparato de minimanchado de franjas múltiples. Los anticuerpos de control incluyeron: Ab-3, un IgG monoclonal específico para el VEGF de Oncogene Science a lµg/ml, A-20, un anticuerpo anti-VEGF de conejo de Santa Cruz Biotechnology, Inc. a 5µg/ml, y un IgG de especificidad irrelevante a lOµg/ml. Un manchado Western típico para los diferentes anticuerpos, incluyendo 2C3 a 5µg/ml, mostró VEGF dimérico como una banda grande de aproximadamente 42kd. Un multímero de VEGF a aproximadamente 130kd también fue evidente con 12D7, 7G3, y un anticuerpo de control positivo. 4. Inmunohistoquímica de tumor Los tumores examinados a través de inmunohistoquímica fueron tumores humanos de varios tipos a partir de pacientes de cáncer, xenoinjertos de tumores humanos transplantables de varios tipos desarrollados en ratones, cobayos cultivos de tumor Línea 10 en cobayos, y cultivos de tumor 3LL de ratón en ratones (véase la leyenda de la Tabla 3 para los detalles) . La reactividad inmunohistoquímica de 3E7, GV39M, y 11B5 en xenoinjertos NSCLC humanos NCI-H358 se determinó y comparó con anticuerpos de control (un IgG de especificidad irrelevante; A-20, un anticuerpo anti-VEGF de conejo; y MECA 32, un anticuerpo de célula endotelial anti-ratón de rata) . Secciones congeladas de 8 mieras de NCI-H358 de NSCLC humano cultivados en SCID ratones se mancharon usando una técnica de inmunoperoxidasa indirecta y se tiñeron en contraste con hematoxilina. Se determinó que el GV39M y 11B5, los cuales reconocen el epítope grupo 1 en el VEGF, mancharon las células endoteliales vasculares fuertemente y el tejido conectivo perivascular moderadamente en todos los tumores examinados. El epítope de grupo 1 de anticuerpos difirió en su reactividad con las células del tumor, porque el GV39M reaccionó solamente débilmente con células de tumor mientras que el 11B5 reaccionó más fuertemente. Aproximadamente el 80 por ciento de las células endoteliales que fueron manchadas por MECA 32 (ratón) o TEC 11 (humano) también fueron manchadas por GV39M y 11B5. 3E7 y 7G3 , las cuales reconocen el grupo epítope VEGF 2, mostraron reactividad con las células endoteliales vasculares, el tejido conectivo, y las células de tumores en todos los tumores examinados (Tabla 3) . La intensidad del manchado de células endoteliales típicamente fue más fuerte que la célula de tumor o el manchado de tejido conectivo, especialmente cuando se aplicaron anticuerpos a concentraciones bajas (l-2µg/ml) en donde había una selectividad notablemente aumentada para el endotelio vascular. TABLA 3. REACTIVIDAD INMUNOHISTOQUIMICA DE ANTICUERPOS ANTI-VEGF EN SECCIONES DE TUMORES Tinción de Células Endoteliales Gru- Clona1 Reactividad2 xeno- Tumor Hu4 Tumor de Tumor de ES in? ertos3 (varios) cobayo5 ratón6 (varios) (Línea 10) ( 3LL) 1 GV39M EC>CT>TC 3 - 4 + 2 - 3 + 4 + 3 + 1 11B5 EC>CT=TC 3 + 3 + 3 + 3 + 2 3E7 EC>CT=TC 2 + 2 + 2 + 1 - 2 + 2 7G3 EC>CT=TC 3 + 2 - 3 + 3 + 2 + 3 12D7 NR - - - - 4 2C3 NR - - - - El análisis inmunohistoquímico se realizó en secciones congeladas fijadas con acetona de te idos de tumor a través de técnicas de inmunohistoquímica estándares. Las secciones se examinaron microscópicamente y se calificaron por su reactividad como sigue: -, negativo; +/-, muy débil; 1+, débil; 2+, moderado; 3+, fuerte; 4+, muy fuerte. 1. 2C3 y 12D7 se aplicaron a 20µg/ml; todos los demás anticuerpos fueron a 5-10µg/ml. 2. Definiciones de reactividad: EC = endotelio; CT = tejido conectivo; TC = célula de tumor; NR = no reacción. 3. Los xenoinjertos de tumores humanos probados; NCI-H358 NSCLC, NCI-H460 NSCLC, HT29 adenocarcinoma de colon, linfoma de Hodgkin L540. 4. Tumores humanos probados: Sarcoma de tejido blando; linfoma de Hodgkin, carcinomas renales, de pecho, parótidas, colon, pulmón y endometrio. 5. La reactividad con VEGF de cobayo en secciones de tumores de cobayo Línea 10. 6. Reactividad con VEGF de ratón en secciones de tumores de carcinoma de pulmón de Lewis 3LL. 12D7 y 2C3 no mancharon las secciones congeladas de ningún tejido de tumor, probablemente debido a que la fijación de acetona del tejido destruyó el enlace de anticuerpos. Sin embargo, el 2C3 localizó al tejido del tumor después de la inyección en vivo (véase más adelante) . El GV39M, 11B5, 3E7 y 7G3 reaccionaron con la vasculatura de roedor en secciones congeladas del cultivo de ,4*a>..,^...,„^>«,^ -fffltitr^WiTipii-fllllÜiiil tumor línea 10 de cobayo en cobayos y el cultivo de tumor 3LL de ratón en ratones. El GV39M, 11B5, y 7G3 reaccionaron tan fuertemente con la vasculatura de tumor de cobayo y de ratón como lo hicieron con la vasculatura humana en especímenes de tumores humanos. El 3E7 manchó el tumor 3LL de ratón menos intensamente de lo que lo hizo en secciones de tumores de cobayo o humanos, sugiriendo que el 3E7 tiene una afinidad menor para el VEGF de ratón. Estos resultados concuerdan con el análisis mediante Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada indirecto, el cual mostró que todos los anticuerpos excepto el 2C3 reaccionan con VEGF de ratón. EJEMPLO II 2C3 inhibe la migración de células endoteliales A. Materiales y métodos Ensayo de crecimiento de células endoteliales Células, endoteliales aórticas de bovino adulto (ABAE) se plaquearon en platos de cultivo de tejido de 96 pozos a 1500 células/pozo y se cultivaron en presencia de 0.5nM de VEGF humano con adición de varios anticuerpos de muestra y de control. Los pozos de control recibieron medios con o sin VEGF. Después de 4 días de incubación, las células se cuantificaron mediante un MTS (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxilmetoxifenil) -2- ( 4-sulfofenil) -2H-tetrazolio, sal interna) ensayo de conversión, en donde la conversión de MTS a j »*-1Mlitn>- 1», . .^ * .^ «üM|ÜJtÍHiÍÍÍ^<¡ un formazán es proporcional al número de células y se puede seguir por absorbancia a 490nM (Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, Wl) . El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El crecimiento celular se estimó sustrayendo la conversión de MTS en cultivos a los cuales no se añadió VEGF.
Los resultados se expresaron como un porcentaje de la conversión del MTS en los cultivos de control a los cuales solamente se añadió VEGF (Buttke y colaboradores, 1993) . B. Resultados Inhibición del crecimiento de células endoteliales mediado por VEGF Los anticuerpos IgG 3E7 y 12D7, los grupos de reconocimiento de epítope 1-3 en VEGF, no inhibieron el crecimiento mediado por VEGF de células ABAE (Figura 1) , sugiriendo que no son anticuerpos anti-VEGF bloqueadores cuyos epítopes no están implicados en la interacción de VEGF: KDR. El anticuerpo IgM GV39M, también de reconocimiento epítope grupos 1-3 en VEGF, igualmente no inhibió el crecimiento mediado por VEGF de células ABAE y es un anticuerpo anti-VEGF que no bloquea. En cambio, el 2C3 contra el epítope 4 en el VEGF y un anticuerpo anti-VEGF neutralizante de referencia, el Mab 4.6.1, inhibieron el crecimiento de ABAE mediado por VEGF al 50 por ciento en 3nM y InM respectivamente (Figura 1) . Esto indica que el 2C3 puede neutralizar la actividad mitogénica del VEGF. La definición de 2C3 como Mab de bloqueo distingue el 2C3 de un rango de otros anticuerpos además del GV39M, 3E7 y 12D7. Varios anticuerpos anti-VEGF, tales como Ab-3, se sabe que son monoclonales que no bloquean, los cuales son claramente distintos del 2C3. Uno de los anticuerpos Igm, 11B5, fue tóxico a las células ABAE a una concentración de 8nM o mayor. Las células descartadas dentro de 30 minutos y dentro de 24 horas absorbieron el tinte azul tripan. Este efecto aparece ser específico del tipo de células ya que HUVEC, las células endoteliales aórticas porcinas, y las células bEND.3 no fueron afectadas por 11B5 a una 40nM. El efecto tóxico del 11B5 parece ser independiente del factor de crecimiento como ocurrió en ausencia de VEGF añadido y en presencia de factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) . EJEMPLO III 2C3 específicamente localiza a tumores en vivo 1. Materiales y métodos Localización en vivo a xenoinjertos de tumores humanos Los tumores se desarrollaron subcutáneamente en ratones inmunocomprometidos (NCI-H358 NSCLC en ratones nu/nu y adenocarcinoma de colon HT29 en ratones SCID) hasta que el ¡ ^M£j^ j i^i^iiíjitt|ta volumen del tumor fue de aproximadamente 1 centímetro cúbico. lOOµG de anticuerpo no etiquetado para estudios usando ratones SCID, o lOOµg de anticuerpo biotinilado para estudios usando ratones sin pelo, se inyectó intravenosamente vía una vena de la cola. Veinticuatro horas después, los ratones fueron anesteciados, se les hizo perfusión con solución salina regulada de fosfato, y se recolectaron el tumor y los órganos incluyendo el corazón, los pulmones, el hígado, los riñones, intestinos y bazo y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. El tumor y los órganos de cada ratón se seccionaron sobre un criostato y se mancharon para inmunohistoquímicamente determinar el anticuerpo como anteriormente, con la excepción de que los cortes del ratón sin pelo se extendieron usando complejo de estreptavidina-biotina etiquetada con peroxidasa (Dako, Carpintería, CA) y los cortes de los ratones SCID se extendieron usando dos anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, un IgG + IgM anti-ratón de cabra seguido por un IgG anticabra de conejo. B. Resultados Localización en vivo en ratones que tienen tumores La localización en vivo del 2C3, 3E7, y GV39M en xenoinjertos de tumores humanos se determinó. lOOµG de 2C3 biotinilado o IgG de control apareado de isotipo se inyectaron intravenosamente en ratones nu/nu que tenían el NSCLC humano NCI-H358. lOOµg del GV39M y 3E7 o IgG de control apareado isotipo se inyectaron en ratones SCID que tenían adenocarcinomas colónicos humanos HT29. Veinticuatro horas más tarde, los ratones fueron sacrificados, se les extrajo la sangre y los tumores o tejidos se removieron. Secciones congeladas de los tumores y tejidos se analizaron inmunohistoquímicamente para determinar el enlace y la distribución de los anticuerpos (Tabla 4) . TABLA 4. DISTRIBUCIÓN DE TEJIDOS DE ANTICUERPOS ANTI-VEGF EN RATONES QUE TENÍAN TUMOR Anticuerpo Reactividad inmunohistoquímica Corazón Pulmón Hígado Riñon1 Intestino Bazo Tumor2 2C3 3 + 3E7 1-2+ GV39M 2 + 2+ Control3 El análisis inmunohistoquímico se realizó sobre secciones congeladas fijas por acetona de tejido, incluyendo el tumor, de ratones que tenían tumor que habían recibido lOOmg del anticuerpo indicado intravenosamente 24 horas antes del sacrificio. Los cortes se examinaron microscópicamente y se calificaron por reactividad específica como sigue: -, negativo; +/-, muy débil; +, débil; 2+, moderado; 3+, fuerte; 4+, muy fuerte . 1. El GV39M específicamente se enlazó con células **?*fr* .....-^rf fa^ endoteliales o mesangiales en los glomérulos del riñon. 2. E37 y GV39M específicamente se enlazaron con el endotelio vascular del tumor mientras que el 2C3 específicamente se enlazó con el estroma del tumor. 3. Control = IgM de especificidad irrelevante. El 3E7 específicamente localizó al endotelio vascular dentro de los tumores. Aproximadamente 70 por ciento del MECA 32 de los vasos sanguíneos positivos fueron manchados por 3E7 inyectados en vivo. Los vasos sanguíneos mayores que alimentan la microvasculatura fueron positivos para 3E7. Los microvasos pequeños en ambos las trazas de estroma y en los nidos del tumor también fueron positivos para 3E7. La intensidad del machado por 3E7 se incrementó dentro y alrededor de áreas de necrosis focal. En las áreas necróticas del tumor, fue evidente el anticuerpo extravascular, pero en regiones sanas del tumor hubo poca evidencia de manchado extravascular. El endotelio vascular en todos los tejidos normales examinados, incluyendo el riñon, no fue manchado por 3E7. El GV39M también localizó específicamente al endotelio vascular de los tumores. Aproximadamente 80 por ciento de los vasos sanguíneos positivos MECA 32 en el tumor fueron manchados por el GV39M. Los vasos positivos para GV39M se distribuyeron de manera uniforme en todo el tumor incluyendo los vasos sanguíneos grandes, pero también capilares pequeños. Como con el 3E7, la intensidad de manchado de los vasos sanguíneos positivos para GV39M se incrementó en áreas de necrosis focal en el tumor. Sin embargo, a diferencia del 3E7, las células endoteliales o células mesangiales en los glomérulos del riñon también fueron manchadas. Parece que el manchado de los glomérulos por el GV39M es específico del antígeno, ya que el IgM de control de especificidad irrelevante no produjo manchado de los glomérulos. El endotelio vascular en los tejidos distintos del riñon no fue manchado por el GV39M. El 2C3 biotinilado produce manchado intenso de tejido conectivo que rodea la vasculatura del tumor NSCLC humano H358 después de la inyección intravenosa. Las trazas grandes de tejido estromal que conecta con el tumor de anidado de células fue manchado por el 2C3, con la localización más intensa observada en ls trazas más grandes de estroma. No fue posible distinguir el endotelio vascular del tejido conectivo circundante en estas regiones. Sin embargo, las células endoteliales en los vasos no rodeados por estroma, tales como en vasos que corren a través de los nidos de células de tumor mismas, fueron manchados. No hubo manchado detectable por 2C3 en ninguno de los tejidos normales examinados. En el modelo de tumor humano HT29, el 2C3 también se localizó fuertemente al tejido conectivo pero el manchado más intenso se observó en las regiones necróticas del tumor. EJEMPLO IV . ,...^:^^^Aie^jA^^AA^^.á í 2C3 inhibe el enlace del VEGF con el VEGFR2 , pero no con el VEGFR1 A. Materiales y métodos 1. Líneas celulares y anticuerpos Células endoteliales aórticas porcinas (PAE) ya sea con VEGFR1 (PAE/FLT) o VEGFR2 (PAE/.KDR) fueron obtenidos del Dr. Johannes Waltenberger (Ulm, Alemania), preparado como se describe en Waltenberger y colaboradores, (1994, específicamente incorporada en la presente mediante referencia) , y se cultivaron en medio F-12 que contenía suero de becerro fetal al 5 por ciento, L-glutamina, penicilina, y estreptomicina (GPS). Células bEND .3 se obtuvieron del Dr. Werner Risau (Bad Nauheim, Alemania) y se cultivaron en medio DMEM que contenía 5 por ciento de suero de becerro fecal y L- glutamina, penicilina, y estreptomicina. NSCLC NCI-H358 (obtenido del Dr. Adi Gazdar, UT-Southwestern, Dallas, TX) , rabdomiosarcoma humano A673, y fibrosarcoma humano HT1080 (todos del American Type Culture Collection) se cultivaron en medio DMEM que contenía 10 por ciento de suero de becerro fetal y L-glutamina, penicilina y estreptomicina. Los anticuerpos monoclonales anti-VEGF 2C3 y 3E7, y el anticuerpo anti-Flk-1 monoclonal 1A8 , y el anticuerpo anti- Flk-1 policlonal T014, son como se describen anteriormente en el Ejemplo I y en Brekken y colaboradores, (1998) y Huang y colaboradores, (1998) , cada uno específicamente incorporado en ÉjÜÉ MÜI^ÍÉÉI mn\xm m?tw mmá¡ m* la presente mediante referencia. El anticuerpo monoclonal anti-humano VEGF de ratón, fue obtenido del Dr . Jin Kim (Genentech Inc., CA) y ha sido descrito previamente (Kim y colaboradores, 1992; específicamente incorporada en la presente mediante referencia) . Los anticuerpos de control negativos usados fueron 0X7, un anticuerpo Thy 1.1 anti-rata de ratón (Bukovsky y colaboradores, 1983), obtenido del Dr. A.F. Williams (MRC Cellular I munology Unit, Oxford, UK) y C44, un anticuerpo anticolchicina de ratón (Rouan y colaboradores, 1990, obtenido del ATCC) . 2. Análisis Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada El dominio extracelular del VEGFR1 (Flt-l/Fc, R&D Systems, Minneapolis) o VEGFR2 (sFlk-1-biotina) se recubrió directamente en pozos de un plato de microtitulación o se capturó mediante pozos recubiertos con NeutrAvidin (Pierce, Rockford, IL) , respectivamente. El VEGF a una concentración de 1 nM (40 ng/ml) se incubó en los pozos en presencia o ausencia de 100-1000 nM (15 µg-150 µg/ml) de anticuerpos de control o de prueba. Los pozos se incubaron con 1 µg/ml de anticuerpo anti-VEGF de conejo (A-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) . Las reacciones se desarrollaron mediante la adición de anticuerpo anti-conejo de cabra etiquetado con peroxidasa (Dako, Carpintería, CA) y se visualizaron mediante la adición de sustrato 3, 3 ' 5, 5 ' -tetrametilbenzidina (TMB) (kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.). Las reacciones se detuvieron después de 15 minutos con 1 M de H3P04 y se leyeron espectrofotométricamente a 450 nM. El ensayo también se realizó recubriendo pozos de un plato de microtitulación ya sea con IgG de control o de prueba. Los pozos se incubaron con VEGF: Flt-l/Fc o VEGF: sFlk-1-biotina y se desarrollaron ya sea con Fc antihumana de cabra etiquetada con peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) o estreptavidina etiquetada con peroxidasa, respectivamente y se visualizaron como anteriormente. 3. Ensayo de coprecipitación 40 ng de VEGF se preincubó con el f(ab')2 o ya sea 2C3 (20µg) o A4.6.1 (10 y 1 µg) durante 30 minutos en regulador de enlace (DMEM con 1 mM CaCl2, 0.1 mM CuS04, y 0.5 por ciento de triptona) . 200 ng de formas solubles del VEGFR1 (Flt-l/Fc) o VEGFR2 (KDR/Fc, R&D Systems, Minneapolis, MN) se añadieron para un volumen total de 50 µl y se incubaron durante 2 horas. Las construcciones de receptor/Fe se precipitaron usando cuentas de Proteína A-sefarosa y el precipitado se lavó cuatro veces con regulador de enlace. Se añadió regulador de muestra de reducción al aglomerado y el sobrenadante de cada reacción y ambas se analizaron mediante 12 por ciento SDS-PAGE y se transfirieron a membranas PVDF. Las membranas se cebaron con 12D7 (1.0 µg/ml), un anticuerpo anti-VEGF de ratón y se desarrollaron ^^^.a^^^^^^^^^^íi!!,,^^^!! después de la incubación con IgG anti-ratón de cabra etiquetado con peroxidsa (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) mediante sustrato de quimioluminescencia Super Signal (Pierce, Rockford, IL) . Las construcciones de receptor/Fe solubles también se detectaron usando Fc anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.). B . Resultados 1. 2C3 bloquea el enlace del VEGF con el VEGFR2 pero no con el VEGFR1 en análisis Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada El anticuerpo anti-VEGF 2C3 bloqueó que se enlazara el VEGF con el VEGFR2 (KDR/Flk-1) pero no con el VEGFR1 (FLT-1) en el Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada. En presencia de un exceso molar de 100 veces y de 1000 veces de 2C3, la cantidad de VEGF que se enlaza con pozos recubiertos con VEGFR2 redujo al 26 por ciento y 19 por ciento, respectivamente, de la cantidad que se enlaza en ausencia de 2C3 (Figura 2) . En cambio, en presencia de un excedente molar de 100 veces y 1000 veces de 2C3, la cantidad del VEGF que se enlaza con pozos recubiertos con VEGFR1 fue de 92 por ciento y 105 por ciento, respectivamente, de la cantidad que se enlaza en ausencia de 2C3 (Figura 2) . Las cantidades de VEGF que se enlazan con VEGFR1 ó VEGFR2 no fueron afectadas por la presencia de un excedente de 100-1000 veces del anticuerpo anti-VEGF monoclonal que no n Tlftrf' ii n • . -ta^ h L?*^* *-* -*** * *^^*^* Ij? bloquea 3E7 o de una IgG de control de especificidad irrelevante (Figura 2). El A4.6.1 bloqueó el enlace del VEGF con tanto el VEGFR2 (KDR/Flk-1) como con el VEGFR1 (FLT-1) . 2. 2C3 bloquea el enlace del VEGF con el VEGFR2 pero no con el VEGFR1 en solución La capacidad del 2C3 para bloquear el enlace del VEGF con el VEGFRl/Fc o el VEGFR2/Fc en solución fue valorado en ensayos de coprecipitación. 40 ng del VEGF se incubó con 200 ng de dominio extracelular de VEGFR1 enlazado con una porción Fc (Flt-l/Fc) o VEGFR2 (KDR/Fc) enlazado a un en la presencia o ausencia de 2C3 ó 4.6.1 f(ab')2. Las construcciones de receptor/Fe se precipitaron mediante incubación con cuentas de sefarosa Proteína A. El precipitado se lavó y resuspendió en regulador de muestra de reducción y se separó mediante 12 por ciento SDS-PAGE y se transfirió a PVDF. La membrana se bloqueó con PP82 y se sondeó con 12D7 (1 µg/ml) de anticuerpo anti-VEGF de ratón y se desarrolló bajo condiciones de quimioluminescencia estándares. El monómero y dímero VEGF junto con el F(ab')2 se detectaron. VEGF mezclado ya sea con VEGFRl/Fc o VEGFR2/FC se coprecipitaron mediante proteína A-sefarosa mostrando que el VEGF se enlaza a ambos receptores. La adición de 2C3 F(ab')2 bloqueó el enlace del VEGF con el VEGFR2/Fc, pero no con el VEGFRl/Fc. En cambio, el A4.6.1 F(ab')2 bloqueó el enlace del VEGF tanto con el VEGFR2/Fc como con el VEGFRl/Fc. Los U-L-h?-Ífi-t--taÍ-*, **"-***"-"-• -*** ***<».*.-*..AJ-^-^M^. resultados afirman que el 2C3 inhibe el enlace de VEGF con el VEGFR2 pero no con el VEGFR1, mientras que el anticuerpo 4.6.1 inhibe el enlace del VEGF tanto con el VEGFR2 como con el VEGFR1. EJEMPLO V 2C3 bloquea la fosforilación inducida por VEGF del VEGFR2 A. Materiales y métodos Inmunoprecipitación y análisis de manchado Western Células PAE/KDR, PAE/FLT, y bEND.3 se cultivaron en una confluencia de 80-90 por ciento en platos de tejido de 100 milímetros en medio que contenía 5 por ciento de suero. Las células se dejaron sin suero durante 24 horas en medios que contenían 0.1 por ciento de suero. Después del pretratamiento con 100 nM de ortovanadato de sodio en solución regulada de fosfato durante 30 minutos, las células se incubaron con 5 nM (200 ng/ml) de VEGF165, 5 nM (100 ng/ml) bFGF (R&D Systems, Mmneapolis, MN) , o medio condicionado de tumor A673 en la presencia o ausencia de anticuerpos de control o de prueba durante 15 minutos adicionales. Las células se lavaron con solución salina regulada de fosfato en frío hielo conteniendo 10 mM EDTA, 2 mM fluoruro de sodio, y 2 mM de ortovanadato de sodio y se lisaron en regulador de lisis (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 por ciento Nonidet P-40, 0.25 por ciento desoxicolato de sodio, 0.1 por I?AÍ.??.?A Í.L?. I ? ^ H¡¡¡^m . á. *s*utíAat~Aláa*j** ciento CHAPS, 5 mM EDTA, 1.5 mM MgCl2, 2 mM ortovanadato de sodio, 10 por ciento glicerol e inhibidores de proteasa (tabletas de coctel inhibidor de proteasa completa, Boehringer Mannheim) ) . Los lisados se clarificaron mediante centrifugación y el sobrenadante resultante se usó para inmunoprecipitación . VEGFR1 y VEGFR2 fueron inmunoprecipitados incubando los lisados de células durante la noche a 4°C con 5 µg de término N anti-FLT-1 de pollo (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) o 10 µg de T014 (anti-Flk-1 purificado por afinidad), respectivamente. Las reacciones usando el anticuerpo anti-FLT-1 de pollo posteriormente se incubaron con un anticuerpo antipollo de cabra de puente (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) durante 1 hora a 4°C. El complejo inmune se precipitó con Proteína A/G sefarosa, se lavó múltiples veces con 10 por ciento de regulador de lisis (con inhibidores de proteasa añadido) en suero solución salina regulada de fosfato-tween (0.2 por ciento) y se hirvió en SDS de regulador de muestra que contenía 100 mM ß-mercaptoetanol y 8 M de urea. Las muestras se separaron mediante SDS-PAGE y se transformaron en membranas PVDF. Las membranas se bloquearon durante 30-60 minutos con PP81 (East Coast Biologics, Ber ick, ME) y se sondearon para determinar los residuos de fosfotirosina con 0.5 µg/ml de 4G10 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) durante la noche a 4°C. Las membranas PVDF se desarrollaron después de la incubación con IgG anti-ratón de conejo etiquetado con peroxidasa (Dako, Carpintería, CA) mediante sustrato de quimioluminiscencia Super Signal (Pierce, Rockford, IL) . Las membranas PVDF se dividieron con regulador de elución ImmunoPure (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos a 55°C y se volvieron a sondear para determinar los niveles de receptor ya sea con 0.5 µg/ml de anti-FLT-1 de pollo ó 1.0 µg/ml T014 y se desarrollaron como anteriormente después de la incubación con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa adecuado. B . Resultados Bloqueo de fosforilación inducida por el VEGF En estos estudios, células PAE/KDR fueron estimuladas durante 15 minutos, con solución salina regulada de fosfato, bFGF (5 nM, 100 ng/ml), VEGF165 (5 nM, 210 ng/ml), medio condicionado de A673 (CM) , CM en combinación con anticuerpos particulares (CNTL, 2C3, 3E7, A .6.1 separado a 100 nM, 15 µg/ml), ó T014 solo (100 nM, 15 µg/ml). Células PAE/FLT también se estimularon durante 15 minutos con salina regulada de fosfato, VEGF165 (5 nM, 210 ng/ml), medio condicionado de A673 (CM) , CM en combinación con anticuerpos particulares (2C3, 3E7, A4.6.1 por separado a 100 nM, 15 µg/ml), o T014 solo (100 nM, 15 µg/ml) . Las células se incubaron en regulador de lisis y el receptor se inmunoprecipitó, se separó mediante SDS-PAGE '^Efe .áa&Jíe?Ai í S ¿ &A&ú ijM?&í i&M en condiciones de reducción, se transfirió a membranas de PVDF y se sondeó con 4G10 (0.5 µg/ml), anticuerpo anti-fosfo-tirosina de ratón, y se desarrolló bajo condiciones de quimioluminescencia estándares. Las membranas se separaron y se volvieron a sondear con el IgG de inmunoprecipitación para determinar el nivel de proteína receptora en cada franja. Los resultados mostraron que el 2C3, junto con el A4.6.1, un anticuerpo anti-VEGF neutralizante de control, bloquean la fosforilación inducida por el VEGF del VEGFR2 en las células PAE/KDR. Esto está en concordancia con los resultados anteriores que demostraron que tanto el 2C3 como el A .6.1 bloquean el crecimiento mediado por VEGF de células endoteliales (Ejemplo II; Brekken y colaboradores, 1998). Los manchados Western del VEGFR2 en los inmunoprecipitados se llevaron a cabo para demostrar las cantidades de proteína VEGFR2 en cada franja. 3E7, que ve un epítope NH2-terminal del VEGF, no bloquea la fosforilación inducida por el VEGF del VEGFR2 ni tampoco un IgG de control de especificidad irrelevante . El efecto del 2C3 en la fosforilación inducida por el VEGF del VEGFRl no es clara. Como otros investigadores han demostrado, la fosforilación inducida por el VEGF del VEGFR1 en células PAE/FLT es difícil de demostrar, posiblemente debido a la baja actividad quinasa intrínseca del VEGFR1 (De Vries y colaboradores, 1992; Waltenberger y colaboradores, 1994; stt Davis-S yth y colaboradores, 1996; Landgren y colaboradores, 1998) . EJEMPLO VI 2C3 inhibe la permeabilidad inducida por VEGF A. Materiales y métodos Ensayo de permeabilidad de Miles El protocolo seguido fue descrito por Murohara, y colaboradores, (1998; específicamente incorporado en la presente mediante referencia) . Brevemente, cobayos sin pelo IAF, machos, de 400-450 gramos (Charles River, Wilmington, MA) se anesteciaron y luego se inyectaron intravenosamente con 0.5 mililitros de tinte azul de Evan al 0.5 por ciento en solución regulada de fosfato a través de una vena de la oreja. Veinte minutos después 20 ng de VEGF en presencia o ausencia de anticuerpos de control o de prueba se inyectaron intradérmicamente (i.d.) . Las manchas azules resultantes en el lomo del cobayo se fotografiaron y midieron con un calibrador 30 minutos después de las inyecciones íntradérmicas . B. Resultados 2C3 bloquea la permeabilidad inducida por VEGF Para investigar los efectos del 2C3 en la permeabilidad inducida por el VEGF, cobayos sin pelo IAF (cepa Hartley) de 400-450 gramos de tamaño fueron anesteciados e inyectados intravenosamente con 0.5 mililitros de 0.5 por ciento tinte azul de Evan en solución salina regulada de .«_>^ ^fc 4.^-^,4 M».^HHJlüfl i fosfato a través de una vena de la oreja. Veinte minutos después, 25 ng del VEGF en presencia o ausencia de anticuerpos de control o de prueba se inyectó intradérmicamente (i.d.). las manchas azulres resultantes en el lomo del cobayo fueron fotografiadas y medidas con un calibrador 30 minutos después de las inyecciones intradérmicas . Usando este ensayo de permeabilidad de Miles, se encontró que el 2C3, que bloquea el VEGF de activar el VEGFR2, inhibió la permeabilidad inducida por el VEGF en los cobayos. Este efecto fue evidente con 2C3 a un excedente molar de 10 veces, 100 veces, ó 1000 veces sobre el VEGF. A .6.1 que bloquea el VEGF de activar tanto el VEGFRl como el VEGFR2, bloqueó la permeabilidad inducida por el VEGF a un excedente molar de 10 veces (presentes estudios y Kim y colaboradores, 1992) . 3E7, y una IgG de control que no bloquea la interacción del VEGF: VEGFR2 tampoco bloquearon la permeabilidad inducida por el VEGF en el ensayo de permeabilidad de Miles en cobayos. Estos resultados sugieren que la permeabilidad endotelial mediada por el VEGF es mediada, cuando menos en parte, a través de la activación del VEGFR2. Estos resultados de acuerdo con otros investigadores que han mostrado que la actividad tirosina quinasa del VEGFR2 es necesaria para la permeabilidad inducida por el VEGF (Murohara y colaboradores, 1998; Joukov y colaboradores, 1998; Ogawa y colaboradores, 1998) .
EJEMPLO VII Efectos antitumor de 2C3 A. Materiales y métodos 1. Inhibición de crecimiento de tumor en vivo Ratones nu/nu fueron inyectados subcutáneamente ya sea con 1 x 107 células NSCLC NCI-H358 ó 5 x 106 de células rabdomiosarcoma A673 en el día 0. En el día 1 y posteriormente dos veces por semana a los ratones se les administraron inyecciones intraperitoneales de 2C3 a 1, 10, ó 100 µg o controles como se indica. Los tumores se midieron después dos veces por semana durante un periodo de aproximadamente seis semanas para los ratones que tenían el NCI-H358 y cuatro semanas para los ratones que tenían el A673. El volumen del tumor se calculó de acuerdo con la vórmula: volumen = L x A x H, en donde L = longitud, A = ancho, H = altura. 2. Terapia de tumor en vivo Ratones nu/nu machos que tenían tumores NCI-H358 subcutáneos o fibrosarcoma HT1080 de 200-400 milímetros cúbicos de tamaño fueron inyectados intraperitonealmente con anticuerpos de pureba o de control. Los ratones que tenían NCI-H358 fueron tratados con 100 µg de anticuerpos por inyección tres veces por semana durante la primera semana y dos veces por semana durante la segunda y tecera semanas . Los ratones se cambiaron a 50µg por inyección cada cinco días. Los ratones que tenían HT1080 fueron tratados con 100 µg del • • iTUiüMÉffln íiir ?rti i?t?rii??r??i?Mff Éiii li t anticuerpo indicado o solución salina un día sí y un día no durante toda la duración del estudio. En ambos estudios, los ratones fueron sacrificados cuando sus tumores alcanzaron un tamaño de 2500 milímetros cúbicos o antes si los tumores comenzaron a ulcerarse. B. Resultados 1. Inhibición de crecimiento 2C3 de xenoinjertos de tumores humanos recientemente implantados 2C3 inhibe el crecimiento en vivo tanto de NCI-H358 de NSCLC como de rabdomiosarcoma A673 en ratones nu/nu de una manera dependiente de la dosis (Figura 3A y Figura 3B) . 100 µg de 2C3 dado intraperitonealmente 2 veces por semana a ratones que habían sido inyectados con células de tumor subcutáneamente un día anterior inhibieron el crecimiento de ambos tipos de tumores humanos. El volumen final del tumor en los receptores de 2C3 fue de aproximadamente 150 milímetros cúbicos en ambos sistemas de tumores, en comparación con aproximadamente 1000 milímetros cúbicos en los receptores de controles. El tratamiento ya sea con 10 ó 1 µg de 2C3 dos veces por semana fue menos efectivo para prevenir el crecimiento del tumor. Sin embargo, ambas dosis menores de 2C3 disminuyeron el crecimiento de los tumores A673 con un grado similar en comparación con los ratones no tratados. El retardo del crecimiento del tumor causado por la dosis de 10 µg de 2C3 fue menos marcado en el modelo de tumor NCI-H358. Las diferencias g^gÜj entre estos modelos de tumor y sus respuestas a la inhibición de la actividad del VEGFR2 mediante el 2C3 se correlaciona con la agresividad de los dos tipos de tumores en vivo. El NCI- H358 crece en vivo mucho más lentamente que lo que lo hace A673 y parece ser menos sensible a dosis bajas de 2C3, mientras que los tumores A673 crecen más rápidamente y agresivamente y parecen ser más sensibles a dosis más bajas de 2C3. 3E7, que se enlaza con VEGF pero no bloquea su actividad, no tuvo efecto en el crecimiento de los tumores NCI- H358. Sin embargo, 3E7 dado a una dosis de 100 µg dos veces por semana estimuló el crecimiento de tumores A673 (Figura 3B) , sugiriendo que aumente la eficiencia del VEGF en el señalamiento en el tumor. 2. Tratamiento de xenoinjertos de tumores humanos establecidos con 2C3 Ratones que tenían tumores subcutáneos NCI-H358 de NSCLC que habían crecido a un tamaño de aproximadamente 300-450 milímetros cúbicos fueron inyectados intraperitonealmente con 2C3, A4.6.1, 3E7, o una IgG de especificidad irrelevante (Figura 4). Las dosis fueron 50-100 µg cada 3-5 días. A4.6.1 se usó como un control positivo debido a que ha sido mostrado por otros investigadores que bloquea la actividad del VEGF en vivo dando como resultado una inhibición del crecimiento del tumor (Kim y colaboradores, 1993; Mesiano y colaboradores, 1998). Además de medir el volumen medio del tumor (Figura 4), las fotografías de los ratones de cada grupo de tratamiento también se tomaron para mostrar las diferencias en el tamaño del tumor y apariencia al final del estudio. El tratamiento con 2C3 o A4.6.1 condujo a una lenta regresión de los tumores sobre el transcurso del estudio. Los volúmenes medios de tumores al final del estudio fueron 30 por ciento (2C3) y 35 por ciento (4.6.1) del volumen medio del tumor inicial (Figura 4). Sin embargo, estos resultados son complicados por el hecho de que el retardo espontáneo en el crecimiento del tumor se observó en los grupos de control de ratones entre 40 días y 60 días después de la inyección de células de tumor. Los resultados hasta 40 días, antes del retardo espontáneo en crecimiento fue evidente, mostró que el tratamiento con 2C3 y A .6.1 evita el crecimiento del tumor. La Figura 5A muestra otro estudio en el cual ratones que tenían NCI H358 fueron tratados durante un periodo prolongado con 100 µg ya sea de 2C3 ó 3E7. En este estudio, las regresiones espontáneas fueron menos pronunciadas. El volumen medio del tumor de los ratones tratados con 2C3 al inicio del tratamiento fue de 480 milímetros cúbicos y después de aproximadamente 14 semanas de tratamiento el volumen medio del tumor cayó a 84 milímetros cúbicos, una disminución de aproximadamente 80 por ciento en volumen. Los ratones tratados con 3E7 comenzaron el tratamiento con un volumen medio de tumor de 428 milímetros cúbicos y elevaron a un volumen de 1326 ¿*AA&i,i ¿,.t . mi *.. ... .,MA.^,, milímetros cúbicos después de aproximadamente 14 semanas, un aumento de 300 por ciento en volumen. La Figura 5B muestra las curvas de crecimiento de tumor de los ratones que tienen un fibrosarcoma humano HT1080, 5 que todos fueron tratados cada dos días con 100 µg de 2C3, 3E7, o una IgG de control, o solución salina. El 2C3 detuvo el crecimiento de los tumores en tanto el tratamiento fue continuo. Los ratones tratados con 3E7, IgG de control o solución salina llevaron tumores que crecieron progresivamente 10 y a un tamaño que requirió que los ratones fueran sacrificados menos de 4 semanas después de la inyección de células de tumor. EJEMPLO VIII 2C3 es distinto de A4.6.1 Hay varias diferencias entre 2C3 y A4.6.1 (v.gr., 15 Tabla 5) . Los anticuerpos reconocen distintos epítopes en VEGF basados en estudios de bloqueo cruzado por Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada (Ejemplo I). Estudios de mutagénesis y cristalográficos con rayos X anteriormente han mostrado que el A4.6.1 se enlaza con un epítope en el VEGF que 20 se centra alrededor de los aminoácidos 89-94 (Muller y colaboradores, 1998) . De interés particular es el hecho de que el A4.6.1 bloquea que el VEGF se enlace tanto al VEGFR1 como al VEGFR2 (Kim y colaboradores, 1992; Wiesmann y colaboradores, 1997; 25 Muller y colaboradores, 1998; Keyt y colaboradores, 1996), mientras que el 2C3 sólo bloquea al VEGF de enlazarse con el VEGFR2 (Ejemplo IV) . Evidencia publicada importante de que A4.6.1 inhibe que el VEGF se enlace con el VEGFR2 y VEGFR1 viene de estudios cristalográficos y estructurales detallados (Kim y colaboradores, 1992; Wiesmann y colaboradores, 1997; Muller y colaboradores, 1998; Keyt y colaboradores, 1996; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Los datos publicados indican que el A4.6.1 inhibe que el VEGF se enlace al VEGFR2 compitiendo por el epítope en el VEGF que es crítico para enlazarse con el VEGFR2 , y bloquea el enlace del VEGF con el VEGFR1 más probablemente mediante impedimento estérico (Muller y colaboradores, 1998; Keyt y colaboradores, 1996) . Una versión humanizada de A4.6.1 actualmente está en ensayos clínicos (Brem, 1998; Baca y colaboradores, 1997; Presta y colaboradores, 1997; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . La quimiotaxis de macrófago/monocito y otras funciones endógenas del VEGF que son mediadas a través del VEGFR1 serán más probablemente incapacitadas por los ensayos de A4.6.1. En contraste, el 2C3 se considera ser superior debido a su capacidad de bloquear específicamente los efectos mediados por el VEGFR2. El 2C3 de este modo es potencialmente un anticuerpo más seguro, particularmente para la administración a largo plazo en humanos. Los beneficios del tratamiento con 2C3 incluyen la capacidad de la hospedera para montar una respuesta antitumor mayor, permitiendo la migración de macrófagos al tumor al mismo tiempo en su expansión de vasculatura de tumor inducida por el VEGF de bloqueo. También, los muchos beneiicios sistémicos de mantener la quimiotaxis de macrófagos y oti os efectos mediados por el VEGFR1 no deberán ser pasados por alto. TABLA 5 CARACTERÍSTICAS DE LOS ANTICUERPOS ANTI-VEGF 2C3 Y A4.6.1 Características 2C3 A4.6.1 Isotipo IgG2a, k IgGl1 Epítope sobre VEGF No definido, Continuas, centrada pero distinto de alrededor de los A4.6.12 aminoácidos 89-94 "Afinidad 1 x 10"" (M)J 8 x 10'1U (M) Bloquea al VEGF de Ño S? enlazarse con VEGFR1 Bloquea el VEGF de Si Si enlazarse con VEGFR2 Bloquea la Si Si permeabilidad inducida por el VEGF Bloquea la Si Si proliferación inducida por VEGF Directo patrón de ÑR Reactividad débil IHC en secciones de con algún BV4 tumor congeladas Patrón de Reactividad Reactividad moderada localización de moderada a con una minoría de tumores en vivo fuerte con CT BV, débil a reactividad con CT Localizaciones en Ninguna Ninguna detectable vivo de ratón detectable normal en vivo Abreviaturas usadas: IHC, inmunohistoquímica; NR, sin reactividad; BV, vasos sanguíneos; CT, tejido conectivo. 1. Referencias para datos de A4.6.1 incluyen Kim y colaboradores, 1992; Wiesmann y colaboradores, 1997; Muller y colaboradores, 1998; y Keyt y colaboradores, 1996; cada una incorporada en la presente mediante referencia. 2. El epítope que el 2C3 reconoce en el VEGF no está definido pero se ha mostrado que es distinto del epítope que reconoce el A .6.1 a través de estudios de bloqueo cruzado de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada. 3. La afinidad del 2C3 por el VEGF ha sido estimado por Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada y análisis de resonancia de plasmón de superficie. 4. A .6.1 solamente reacciona con secciones congeladas fijadas con acetona ligeramente fijadas. EJEMPLO IX Manchado de VEGF en tejido artrítico La relación entre la angiogénesis y la enfermedad se extiende más allá de lo observado en tumores vascularizados. Por ejemplo, la participación de angiogénesis aberrante está bien documentada en la artritis. Un panel de diferentes anticuerpos anti-VEGF y anticuerpos para timidina fosforilasa se han usado para manchar tejido artrítico y diferenciar éste de controles apareados. Estudios usando anticuerpos contra el VEGF han mostrado una expresión asombrosa en el pannus de la artritis reumatoide. EJEMPLO X Conjugados 2C3-Endostatina A. Clonación y expresión de endostatina El ARN fue aislado del hígado de ratón y se usó como plantilla para RT-PCR® con los siguientes cebadores: 5 ' cebador aga cea tgg gtc ata etc ate agg act ttc a (SEQ ID NO: 3) ; 3 ' cebador ctac cat ggc tat ttg gag aaa gag gtc a (SEQ ID N0:44) . El fragmento de ADNc tiene una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 12 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
Para referencia, la secuencia de aminoácidos de endostatina humana es SEQ ID NO: 14. El fragmento de ADNc se clonó en el vector de expresión H6pQE60 (Qiagen) , que codifica una etiqueta N terminal 6 x tag histidina, y luego se expresa en células M15 de E . coli . cuando la densidad de las células de E. coli alcanzó una densidad óptica de 0.6 a 560 nM, 0.1 mM de isopropiltiogalactosida (IPTG) se añadió durante 4 horas para inducir la expresión de 6-His endostatina. Las células se cosecharon por centrifugación y se usaron en regulador de lisis (B-PER Reactivo de extracción de proteína bacteriana (Pierce, Rockford, IL) ) . Los cuerpos de inclusión, que contenían la endostatina 6-His, fueron sedimentadas por centrifugación y se disolvieron en regulador A (pH 8.0, 6 M guanidina HCl (GuHCL) , 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris, 10 mM imidazol, 10 mM ß-2 ¡i ? ?* ..í..***^.*.^^.. ^^^...-,'-4,.. .,._ j,^.^^, >..-A^.. ^*,^*^**^^* ***^ JmLí mercaptoetanol) . La solución que contenía la endostatina 6-His reducida fue tratada por un excedente de ácido 5, 5 ' -ditio-bis- (2-nitrobenzoico) (reactivo de Ellman) (20 mM) y se cargó en una columna de Ni-NTA. La columna se lavó con regulador de lavado (6 M GuHCl, 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7.3) y la endostatina 6-His fue eluída de la columna con 0.2 M de imidazol en regulador de lavado. Le endostatina 6-His eluída e insoluble fue diluida con un volumen igual de regulador de redoble (3M urea, 1M Tris pH 7.3, 0.5 M L-arginina, 0.5 M NaCl, 0.1 M Na2HP04, 1 mM de glutationa reducida (GSH) ) e incubó durante la noche a temperatura ambiente. La endostatina 6-His redoblada se dializó estensamente contra solución salina regulada de fosfato, pH 7.4 a temperatura ambiente. La proteína resultante, endostatina 6-His fue soluble y muy pura basándose en SDS-PAGE bajo condiciones de no reducción cuando fue ejecutada como una sola banda de 20 kDa. B. Actividad funcional de la endostatina Además del hecho de que la proteína expresada es completamente soluble, otra evidencia de que E. coli expresó la endostatina 6-His es biológicamente activa e incluye demostrar el enlace con células endoteliales. Endostatina 6-His biotinilada fue preparada e incubada con tres diferentes tipos de células endoteliales in vi tro (células endoteliales de ratón Bend3; células endoteliales aórticas bovinas ABAE; y células ÜÉ ,^^^^,.^^,¿ ^,..,...^.^.^^...iA^Mi.iMi^^Jl endoteliales de vena umbilical humana HUVEC) . El enlace se detectó usando estreptavidina-peroxidasa junto con O-fenilenodiamina (OPD) y la absorbancia se Leyó a 490 nm. Los estudios de enlace directo mostraron que la endostatina (6-His biotinilada) se enlazó en una manera saturable a estos tres tipos diferentes de células endoteliales in vi tro . También, la endostatina expresada (sin etiqueta) se mostró convertir con la endostatina biotinilada para enlazarse con células endoteliales Bend3. C. Conjugación de endostatina con 2C3 via SMPT y 2-IT 4-Succinimidiloxicarbonil-a-metil- - (2-piridilditio) -tolueno (SMPT) en N ' N-dimetilformamida (DMF) se añadió a 2C3 IgG a una proporción molar de 5:1 (SMPT: 2C3) y se incubó a temperatura ambiente durante una hora en solución regulada de fosfato con 5 mM de EDTA (PBSE) . El SMPT libre se removió mediante cromatografía de exclusión de tamaño G25 corrida en PBSE. Concurrentemente, endostatina 6-His de ratón se incubó con 2-iminotiolano (2-IT, reactivo de Traut) a una proporción molar de 1:5 (endostatina: 2-IT) durante 1 hora a temperatura ambiente. 2-IT libre se removió mediante cromatografía de exclusión de tamaño G25 corrida en PBSE. 2C3 modificado con SMPT se mezcl con endostatina 6-His modificado con 2-IT, concentrado a 3-5 mililitros, e incubado durante 24 horas a temperatura ambiente con agitación moderada. La reacción se analizó mediante SDS-PAGE. El 2C3- fcAiá tt»»*.-*-*.-áh-i-* SMPT no conjugado se removió del conjugado mediante cromatografía por afinidad con heparina, proporcionando 2C3- endostatina . D. Conjugación de endostatina con 2C3 vía SMCC y SATA N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) se incubó con 6-His-endostatina a una proporción molar de 6:1 (SATA: endostatina) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El SATA libre se removió por cromatografía por exclusión de tamaño G25 corrida en PBSE. Endostatina 6-His modificada por SATA en PBSE se concentró a 4.0 mililitros y una solución de deacetilación de 0.4 mililitros (0.1 M de hidroxilamina) se añadió. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Concurrentemente, 2C3 IgG, en PBSE, se incubó con succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) a una proporción molar de 1:5 (2C3: SMCC). El SMCC libre se removió por cromatografía de exclusión de tamaño G25 corrida en PBSE. La endostatina modificada por SATA desacetilada se incubó entonces con 2C3 modificada por SMCC, concentrada a aproximadamente 5 mg/ml de proteína total bajo nitrógeno, y se exitosa también fue lograda usando 2-iminotiolano en vez de SATA como la sustancia tiolante. E . Proteínas de fusión de 2C3 y endostatina Como la secuencia de ADN para la endostatina de ratón y humana, y para el 2C3 están disponibles (y proporcionan en la presente) , proteínas de fusión de 2C3-endostatina se pueden preparar fácilmente. La expresión y redoble de endostatina, como se describe anteriormente, muestra que la expresión recombinante exitosa de esta molécula sin duda es posible. La preparación de proteína de fusión 2C3-endostatina puede estar en forma en la que la endostatina está presente en término C de una cadena pesada de 2C3 o se enlaza a un fragmento ScFv de 2C3. En estos casos, la tecnología recombinante hace directa variar el enlace, y el uso de secuencia de disociación selectivamente para unir las dos porciones funcionales se considera particularmente. Actualmente se prefieren las secuencias disociables por plasmina o disociables por MMP. La disponibilidad de las secuencias disociables selectivamente y la adaptabilidad de la tecnología recombinante también proporciona proteínas de fusión de 2C3-endostatina en las cuales la endostatina se sustituye en otro punto de la construcción 2C3. La endostatina permanecerá inmersa dentro del 2C3 hasta el contacto con una enzima que actúe sobre la secuencia selectivamente disociable, y en este punto la ??láAJ A*.**i-*->?.„<...*ti A>»*. ' l ? nilÉliíTlilu plliitlH fu .a t>T?É Éjftliili endostatina funcional se libera de la proteína de fusión. EJEMPLO XI Conjugados 2C3-Ans-2 A. Expresión de Ang-2 Para construir un conjugado 2C3-Ang-2, el Ang-2 preferiblemente se usa en forma recombinante, como puede ser producida en células de insecto que usan un sistema de expresión de baculovirus. El protocolo actualmente preferido para la expresión de Ang-2 y la purificación incluye la clonación del ADNc del Ang-2 de ARN de placenta de ratón mediante RT-PCR® y la clonación del ADNc del Ang-2 en el vector de expresión pFastBacl. Las células de E. coli DHIOBac competentes se transforman con el plásmido recombinante. Después de la selección de antibióticos, las colonias de E. coli que contienen el Bacmid recombinante se recogen, cultivan y recombinan con ADN de Bacmid recombinante purificado. Las células de insecto SF9 se transfectan con el ADN de Bacmid recombinante usando el reactivo del Cellfectin. El baculovirus recombinante se cosechan del sobrenadante de las células SF9 transfectadas. El baculoviius recombinante se amplifica y usa para infectar las células SF9 y las células SF9 infectadas expresarán el Ang-2. El Ang-2 se purifica del sobrenadante de estas células SF9 infectadas mediante purificación por afinidad. B. Conjugación de Ang-2 con 2C3 e-*-"5 -*-«----*fc-»--a Jt- -ffift , , ?.. ^s^,.*,..« &At*1S íía El 2C3 purificado se conjuga con Ang-2 recombinante usando el enlazador químico SMPT, generalmente como se describe anteriormente. SMPT en N ' N-dimetilformamida (DMF) se añade a 2C3 IgG a una proporción molar de 5:1 (SMPT: 2C3) y se incuba a temperatura ambiente durante una hora en solución salina regulada de fosfato con 5 mM EDTA (PBSE) . El SMPT libre se remueve mediante cromatografía de exclusión de tamaño G25 corrida en PBSE. Concurrentemente, el Ang-2 recombinante se incuba con 2-IT a temperatura ambiente. El 2-IT libre se remueve mediante cromatografía de exclusión de tamaño G25 corrida en PBSE. El 2C3 modificado con SMPT se mezcla con Ang-2 recombinante modificado con 2-IT, se concentra y se incuba durante 24 horas a temperatura ambiente con sacudimiento suave. La reacción se analiza mediante SDS-PAGE. El 2C3-SMPT no conjugado se remueve del conjugado mediante cromatografía de filtración de gel, proporcionando de este modo 2C3-endostatina . EJEMPLO XII Conjugados 2C3-Factor de teñido 2C3 se modificó con SMPT, como se describe en los ejemplos anteriores. El SMPT libre se removió mediante cromatografía G25 como se señaló anteriormente excepto que el pico (2C3-SMPT) se recolectó bajo nitrógeno. 600 µl de 2C3-SMPT se removieron a grupos tiopiridilo cuantitativos después de la adición de ditiotreitol (DTT) a 50 mM. Un promedio de fcaÉj fc... ^? «-J-*^ »^«^{ ÍffiÍtífÍlrt^^iga*^^^^^j^j grupos MPT 3 se introdujo por IgG. El factor de tejido truncado humano (tTF) que tenía un residuo cisteína introducido en el término N se redujo con 5 mM ß 2-ME. ß 2-ME fue removido por cromatografía G25. El N-Cys-tTF reducido fue recolectado con el 2C3-SMPT y se incubó a una proporci'n molar de 2.5:1 (tTF: IgG) durante 24 horas a temperatura ambiente. La reacción se concentró a 1- 2 mililitros usando /Amicon con un peso molecular de 50,000 de membrana recortada (MWCO) . El tTF no conjugado y el IgG se separaron de los conjugados usando Superdex 200 de cromatografía de exclusión de tamaño, proporcionando de este modo el 2C3-tTF. EJEMPLO XIII Conjugados 2C3-CRM107 2C3 fue modificado con SMPT. La sustancia citotóxica, CRM107 (del Dr. Jerry Fulton, Inland Laboratories, DeSoto, TX) , fue modificado con 2-IT como se describe en los ejemplos anteriores. El 2C3 modificado con SMPT se incubó con 2-IT modificado con CRM107 a una proporción molar de 1:5 (IgG: CRM107) durante 24 horas a temperatura ambiente con agitación suave. El 2C3 conjugado se separó de los reactivos libres mediante cromatografía de exclusión de tamaño Superdex 200 proporcionando de este modo el 2C3-CRM107. EJEMPLO XIV Estudios de profármacos 2C3 A. Clonación y expresión de ß-glucoronidasa (GUS) Un plásmido (pBacgus-1) que contenía el gen GUS de E. coli fue obtenido de Novagen, Inc. El plásmido fue usado como plantilla para PCR para clonar el gen GUS en el vector de expresión H6pQE60, que codifica una etiqueta de histidina 6 x N-terminal. Células M15 de E. coli que llevaban el plásmido fueron cultivadas hasta que la densidad celular alcanzó una densidad óptica de 0.6 a 560 nM. 0.1 mM de isopropiltiogalactosida (IPTG) se añadió para inducir la expresión de 6 his GUS. Después de 4 horas, las células fueron cosechadas por centrifugación. El aglomerado de E. coli como lisado en regulador de lisis celular (B-PER reactivo de extracción de proteína bacteriana (Pierce, Rockford, IL) ) . La solución se cargó en una columna Ni-NTA, la columna se lavó con regulador de lavado (6 M GuHCl, 100 mM NaH2P04, 19 mM Tris, 500 mM NaCl , pH 7.3) el 6 -His GUS enlazado se eluyó con 0.2 M de imidazol en el mismo regulador. El 6 -His GUS se basó puro en SES-PAGE, en donde se corrió como una sola banda de 75 kDa de banda. Sobre columnas de filtración de gel, el 6 -His GUS corrió como un tetrámero de aproximadamente 300 kDa. El 6-His GUS fue enzimáticamente activo juzgado por su capacidad para disociar el sustrato de p-nitrofenil-ß-D-glucoronida (PNPG) . B. Conjugación de 2C3 con ß-glucoronidasa (GUS) A &? mi &^ N-Succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) se incubó con GUS a una proporción molar de 6:1 (SATA: GUS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. SATA libre fue removida por cromatografía por exclusión de tamaño G25 corrida en PBSE. GUS modificado por SATA en PBSE se concentró a 4.0 mililitros y 0.4 mililitros de solución de desacetilación (0.1 M hidroxilamina) se añadió. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Concurrentemente 2C3 IgG, en PBSE, se incubó con succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) a una proporción molar de 1:5 (2C3: SMCC). El SMCC libre se removió mediante cromatografía por exclusión de tamaño G25 corrida en PBSE. El GUS modificado por SATA desacetilado se incubó entonces con 2C3 modificado por SMCC durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave. El GUS libre se removió mediante cromatografía de intercambio de iones sobre Q- sefarosa, con el 2C3 libre y el conjugado 2C3-GUS eluído con 0.5 M NaCl en salina regulada de fosfato. La solución resultante fue separada por cromatografía de exclusión de tamaño Superdex 200 produciendo 2C3-GUS con una pureza del 90 por ciento. C. Actividad biológica del conjugado 2C3-GUS La actividad biológica de cada componente del conjugado 2C3-GUS fue confirmada. El 2C3-GUS se enlazó específicamente con paredes recubiertas con VEGF en un Ensayo jjtiiiHi ^**'^^^^ inmunosorbente de enzima enlazada adecuadamente controlado, como se detectó por un IgG anti-ratón etiquetado con HRP secundario y OPD. El enlace medio máximo fue observado a 0.1 nM. De este modo, la porción de enlace de 2C3 funciona correctamente. La porción de GUS también retuvo actividad enzimática . El 2C3-GUS fue radioyodado con 125i a una actividad específica de 5 x 106 cpm/µg. Después de la inyección intravenosa en ratones, el 2C3-GUS radioyodado se aclaró de la sangre con una tl/2 a de aproximadamente 6 horas y tl/2 ß de aproximadamente 25 horas. D. Profármacos disociables con GUS Profármacos ß-glucoronida, tales como doxorrubicin-ß-glucoronida y calcimicin-ß-glucoronida se prepararon esencialmente como se describió en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,561,119, específicamente incorporada en la presente mediante referencia. Estos profármacos se diseñaron para liberar el componente citotóxico, tal como doxorrubicina o calcimicina, solamente cundo son degradadas por una enzima glicosida, tal como GUS. Al unir GUS con 2C3, el GUS se dirige específicamente a la vasculatura y estroma del tumor, proporcionando la disociación específica de los profármacos y liberando el componente citotóxico específicamente dentro del sitio del tumor. E. Actividad biológica del conjugado 2C3-GUS i..^i.i^Mjyf^j El 2C3-GUS específicamente localizado en la vasculatura del tumor y estroma de tumor circundante después de la inyección intravenosa en ratones SCID que llevan tumores NSCLC NCI-H358 humanos en el sitio subcutáneo. La presencia de 2C3-GUS fue detectada inmunohistoquímicamente sobre secciones congeladas de tumores con IgG anti-ratón etiquetado con HRP o con anti-GUS etiquetado con HRP. La localización máxima se observó 24-48 horas después de la inyección del 2C3-GUS. Los tejidos normales no se mancharon. La localización específica del 2C3-GUS a la vasculatura del tumor y estroma del tumor circundante permitió un profármaco administrado sistémicamente, tal como doxorrubicina glucoronida o calcimicina-glucoronida, que se activó solamente dentro del tumor. Una línea celular de hibridoma como se describe en la presente ha sido depositada bajo las provisiones del Tratado de Budapest en el American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA, EUA; y se le ha asignado el número de acceso ATCC No . PTA 1595. La invención descrita y reclamada en la presente no se limita en alcance por la línea celular PTA 1595 depositada ya que la modalidad depositada es una ilustración de un aspecto de la invención y cualquier línea celular de hibridoma equivalente que produzca anticuerpos monoclonales funcionalmente equivalente está dentro del alcance de esta invención. Sin duda, todas las composiciones y métodos descritos y reclamados en la presente se pueden hacer y ejecutar sin debida experimentación a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de las modalidades preferidas, será aparente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a la composición, métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos en la presente sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será aparente que ciertas sustancias que son tanto químicamente como fisiológicamente relacionadas se pueden sustituir por las sustancias descritas en la presente mientras que se logran los mismos o resultados similares. Todos los sustitutos y modificaciones similares aparentes para los expertos en la técnica se considera que están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se definen por las reivindicaciones anexas. . , *.* ,*.*..*^^*^. ***. *ejan> *a* REFERENCIAS Las siguientes referencias hasta el grado en que proporcionan procedimientos ejemplares u otros detalles suplementarios a los presentados en la presente, se incorporan en la presente específicamente mediante referencia . Abrams y Oldham, En: Monoclonal An tibody Therapy of Human Cáncer, Foon and Morgan (Eds.), Martinus Nijhoff Publishing, Boston, pp. 103-120, 1985. Aiello, Pierce, Foley, Takagi, Chen, Riddle, Ferrara, King, Smith, "Suppression of retinal neovascularization in vivo by inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF) using soluble VEGF-receptor chimeric proteins," Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 92:10457-10461, 1995. 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PEPTIDO SINTÉTICO <400> 9 Asp He Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu He His Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 He Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Leu 115 <210> 10 <211> 26 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: PEPTIDO SINTÉTICO <400> 10 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys 20 25 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: PEPTIDO SINTÉTICO <400> 11 Ala Pro Met Ala Glu Gly Glu Gln Lys Pro Arg Glu Val Val 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(573) <400> 12 atg cat cae cat cae cat cae cat act cat cag gac ttt cag cea gtg 48 Met His His His His His His His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val 1 5 10 15 etc cae ctg gtg gca ctg aac acc ccc ctg tet gga ggc atg cgt ggt 96 Leu His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly 20 25 30 ate cgt gga gca gat ttc cag tgc ttc cag caá gcc cga gcc gtg ggg 144 He Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly 35 40 45 ctg tcg ggc acc ttc cgg gct ttc ctg tec tet agg ctg cag gat etc 192 Leu Ser Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu 50 55 60 tat age ate gtg cgc cgt gct gac cgg ggg tet gtg ccc ate gtc aac 240 Tyr Ser He Val Arg Arg Ala Asp Arg Gly Ser Val Pro He Val Asn 65 70 75 80 ctg aag gac gag gtg cta tet ccc age tgg gac tec ctg ttt tet ggc 288 Leu Lys Asp Glu Val Leu Ser Pro Ser Trp Asp Ser Leu Phe Ser Gly 85 90 95 tec cag ggt caá ctg caá ccc ggg gcc cgc ate ttt tet ttt gac ggc 336 Ser Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gly Ala Arg He Phe Ser Phe Asp Gly 100 105 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Ala Gly Thr Phe Arg Ala 35 40 45 Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser He Val Arg Arg Ala 50 55 60 Asp Arg Ala Ala Val Pro He Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe 65 70 75 80 Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro 85 90 95 Gly Ala Arg He Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro 100 105 110 Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg 115 120 125 Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser 130 135 140 Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln 145 150 155 160 Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr He Val Leu Cys He Glu Asn 165 170 175 Ser Phe Met Thr Ala Ser 180 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial PEPTIDO SINTÉTICO <400> 15 Pro Arg Phe Lys He He Gly Gly 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: PEPTIDO SINTÉTICO <400> 16 Pro Arg Phe Arg He He Gly Gly 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: PEPTID0 SINTÉTICO <400> 17 Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp 1 5 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Description of Secuencia Artificial: PEPTIDO SINTÉTICO <400> 18 Arg Lys Ser Ser He He He Arg Met Arg Asp Val Val Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Description of Artificial Seguence : PEPTIDO SINTÉTICO <400> 19 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: PEPTID0 SINTÉTICO <400> 20 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Arg Gly Asp Asp Ala 1 5 10 15 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: PEPTIDO SINTÉTICO <400> 21 He Glu Gly Arg 1 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la 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Claims (85)

  1. 479
  2. REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF, o fragmento que enlaza antígeno del mismo, que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595 y que inhibe significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Fl -1) sin inhibir significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1) . 2. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento que enlaza antígeno del mismo.
  3. 3. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo IgG o un anticuerpo Ig .
  4. 4. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el anticuerpo es un diacuerpo scFv, Fv, Fab', Fab, anticuerpo lineal de fragmento de enlace de antígeno F(ab')2 de un anticuerpo.
  5. 5. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo es un dímero, trímero o l AA? ******** 480 multímero de dicho anticuerpo o fragmentos de enlace de antígeno del mismo.
  6. 6. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o en parte humano o fragmento de enlace de antígeno del mismo.
  7. 7. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, caracterizada porque el anticuerpo comprende una región de enlace de antígeno de dicho anticuerpo operativamente unido a la estructura del anticuerpo humano o región constante.
  8. 8. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
  9. 9. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo recombinante .
  10. 10. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo comprende cuando menos una primera región variable que incluye una región de secuencia 481 de aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO : 9.
  11. 11. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595.
  12. 12. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a cuando menos una primera sustancia biológica.
  13. 13. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 12, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a cuando menos una primera sustancia que disocia un profármaco sustancialmente inactivo para liberar un fármaco sustancialmente activo.
  14. 14. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 13, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a fosfatasa alcalina que disocia un profármaco fosfato sustancialmente inactivo para liberar un fármaco sustancialmente activo.
  15. 15. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 12, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a cuando menos una primera sustancia terapéutica o de diagnóstico. ?* L***ÍM*?1?l^? t j y-" " 482
  16. 16. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 15, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a cuando menos una primera sustancia terapéutica . 5
  17. 17. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 16, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a cuando menos una primera o una segunda sustancia terapéutica.
  18. 18. La composición de conformidad con lo reclamado 10 en la reivindicación 16 ó 17, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a cuando menos una primera sustancia quimioterapéutica, sustancia radioterapéutica, sustancia antiangiogénica, sustancia que induce la apoptosis, esteroide, antimetabolito, antraciclina, vinca alcaloide, 15 fármaco antitubulina, antibiótico, citocina, sustancia alquilante o coagulante.
  19. 19. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a una sustancia citotóxica, citostática
  20. 20 o anticelular capaz de matar o suprimir el crecimiento de la división celular de las células endoteliales. 20. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 19, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a una toxina derivada de planta, hongo 25 o bacteria. eAj*. ....,*J.Aii¡í..>Aam¡&*i^uAt ^-»-^^^^nia^Éá É i 483
  21. 21. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a una toxina de cadena A, una proteína de inactivación de ribosoma, a-sarcina, gelonina, aspergilina, restrictocina, una ribonucleasa, un epipodofilotoxina, toxina de difteria o exotoxina de Pseudomonas .
  22. 22. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 21, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a una cadena de ricina A o cadena de ricina A desglicosilada.
  23. 23. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a una sustancia antiangiogénica.
  24. 24. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 23, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a una angiopoyetina.
  25. 25. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 24, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a angiopoyetina 2 o angiopoyetina 1.
  26. 26. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 23, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a angiostatina, vasculostatina, canstatina o maspina. 484
  27. 27. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 23, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a endostatina.
  28. 28. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a un fármaco antitubulina.
  29. 29. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 28, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a un fármaco antitubulina seleccionado del grupo que consiste en colchicina, taxol, vinblastina, vincristina, vindescina y una combretastatina.
  30. 30. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a un coagulante.
  31. 31. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a un coagulante seleccionado del grupo que consiste en Factor Il/IIa, Factor Vll/VIIa, Factor IX/IXa, Factor X/Xa, un factor de coagulación dependiente de la vitamina K que carece de modificación Gla, activador de Factor X de veneno de serpiente de Russell, tromboxano A2, tromboxano A2 sintasa y o¡2 -antiplasmina .
  32. 32. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a Factor de Tejido, un Factor de Tejido MÉi^^UMilMi^ 485 humano, Factor de Tejido mutante deficiente en la capacidad para activar el Factor VII, Factor de Tejido truncado o a un Factor de Tejido dimérico, trimérico o polimérico o derivado de Factor de Tejido.
  33. 33. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 32, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente al Factor de Tejido truncado.
  34. 34. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 15, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a una sustancia de diagnóstico, de formación de imágenes o detectable.
  35. 35. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 34, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a un compuesto detectable por rayos X, o un ion radioactivo o un isótopo de resonancia magnética nuclear.
  36. 36. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 34, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a biotin, avidin o una enzima que genera un producto coloreado después del contacto con un sustrato cromogénico.
  37. 37. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 12 a la 33, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a la sustancia biológica como una proteína de fusión preparada iiillHr ?iiiip-É.i»«;¿4.tAw 486 expresando un vector recombinante que comprende en el mismo marco de lectura, un segmento de ADN que codifica el anticuerpo operativamente enlazado con un fragmento de ADN que codifica la sustancia biológica.
  38. 38. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 33, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a la sustancia biológica vía un enlace biológicamente liberable o enlazador selectivamente disociable.
  39. 39. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 38, caracterizada porque el anticuerpo se une operativamente a la sustancia biológica vía un enlazador de péptido que incluye un sitio de disociación para uroquinasa, prouroquinasa, plasmina, plasminógeno, TGFß, estafiloquinasa, Trombina, Factor IXa, Factor Xa, una metaloproteinasa, una colagenasa intersticial, una gelatinasa o una estromelisina.
  40. 40. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 36, caracterizada porque el anticuerpo se une directamente a la sustancia biológica .
  41. 41. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 36, caracterizada porque el anticuerpo se une a un segundo anticuerpo, o región "fiiiti-"*"-' iitii - - "m "ti- f r iiiirliÜMÉr"* 487 de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con la sustancia terapéutica o de diagnóstico.
  42. 42. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición es una composición farmacéuticamente aceptable.
  43. 43. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 42, caracterizada porque la composición farmacéuticamente aceptable se formula para administración parenteral .
  44. 44. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición además comprende una segunda sustancia terapéutica.
  45. 45. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 44, caracterizada porque la segunda sustancia terapéutica es una segunda sustancia anticáncer.
  46. 46. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 45, caracterizada porque la segunda sustancia anticáncer es una sustancia quimioterapéutica, una sustancia radioterapéutica, una sustancia antiangiogénica, una sustancia que induce la apoptosis, un fármaco antitubulina o una sustancia quimioterapéutica dirigida al tumor, una sustancia radioterapéutica, una sustancia i ¿~MikA..ii M i ??l £ < * ! 488 antiangiogénica, una sustancia que induce la apoptosis o un fármaco antitubulina.
  47. 47. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 46, caracterizada porque la segunda sustancia anticáncer es una angiopoyetina o una angiopoyetina dirigida al tumor.
  48. 48. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 47, caracterizada porque la segunda sustancia anticáncer es una angiopoyetina- 1 dirigida al tumor .
  49. 49. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 46, caracterizada porque la segunda sustancia anticáncer es endostatina o una endostatina dirigida al tumor.
  50. 50. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 46, caracterizada porque la segunda sustancia anticáncer es un fármaco antitubulina o un fármaco antitubulina dirigido al tumor.
  51. 51. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 46, caracterizada porque la segunda sustancia anticáncer es una construcción de sustancia terapéutica que comprende una sustancia terapéutica operativamente enlazada a un segundo anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con un componente expresado en la superficie, accesible a la l.Á.ií jiy.íá..t,§¡ jijL^ |ígaj!éi£«5 489 superficie, o localizado en la superficie de una célula de tumor, vasculatura de tumor o estroma de tumor.
  52. 52. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en terapia.
  53. 53. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11 o las reivindicaciones 34 hasta la 36, para su uso en diagnóstico.
  54. 54. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11 o las reivindicaciones 23 hasta la 29, para su uso para inhibir la angiogénesis después de la administración a un animal.
  55. 55. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 54, para su uso para inhibir la angiogénesis en un animal que tiene enfermedad neovascular ocular o degeneración macular después de la administración a dicho animal .
  56. 56. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 41, para su uso para administrar una sustancia biológica a un tumor vascularizado después de la administración al animal con un tumor vascularizado.
  57. 57. La composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso para tratar cáncer. 490
  58. 58. El uso de una composición de conformidad con lo reclamado en cualquier reivindicación anterior en terapia.
  59. 59. El uso de una composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11 o las reivindicaciones 23 a 29 en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad inhibiendo la angiogénesis .
  60. 60. El uso de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 59, caracterizado porque el medicamento se pretende para tratar enfermedad neovascular ocular o degeneración macular mediante inhibición de angiogénesis .
  61. 61. El uso de una composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 41 en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer administrando una sustancia biológica a un tumor vascularizado .
  62. 62. El uso de una composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 57 en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.
  63. 63. Una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de enlace de antígeno del mismo que se enlaza sustancialmente al mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) para su uso para inhibir la angiogénesis 491 sin la inhibición sustancial de macrófagos, osteoclastos o condroclastos .
  64. 64. El uso de una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer inhibiendo el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente el enlace del VEGF con el receptor VEGF con el VEGFR1 (Flt-1) .
  65. 65. Un juego que comprende cuando menos una primera composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 57.
  66. 66. Un juego que comprende cuando menos una primera composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 13 ó 14 y cuando menos una segunda composición que comprende un profármaco sustancialmente inactivo que se disocia mediante la sustancia biológica unida al anticuerpo en la primera composición para liberar un fármaco sustancialmente activo.
  67. 67. Un juego que comprende cuando menos una primera composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 14 y cuando menos una segunda composición que comprende combretastatin fosfato. 492
  68. 68. Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal como se define en lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 2 a la 11.
  69. 69. Anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595.
  70. 70. Un método para pieparar un anticuerpo anti-VEGF que se enlaza con sustancialmente el mismo epítope que el anticuerpo monoclonal ATC PTA 1595, que comprende inmunizar un animal no humano con una composición inmunizante que comprende cuando menos un primer componente VEGF inmunogénico y seleccionar del animal inmunizado un anticuerpo que sustancialmente reacciona coa reacción cruzada con el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595.
  71. 71. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 70, caracterizado porque el animal no humano es un ratón transgénico que comprende una biblioteca de anticuerpos humanos.
  72. 72. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 70 ó 71, caracterizado porque comprende obtener los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-VEGF y expresar esos ácidos nucleicos para obtener un anticuerpo anti-VEGF recombinante.
  73. 73. El método de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 70 hasta 72, que comprende : ..1f*«**ÍAA ..S&r »*.Ji?l!JÍlM^. A-' - =^ . í* ?t»f» 493 (a) administrar a un animal no humano una cantidad efectiva inmunizante de una composición que comprende cuando menos un primer componente VEGF inmunogénico; (b) preparar una biblioteca de fagémidos de inmunoglobulina combinatoria que expresa el ARN aislado del bazo del animal inmunizado; (c) seleccionar de la biblioteca de fagémidos una clona que expresa un anticuerpo anti-VEGF que sustancialmente hace reacción cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) ; y (d) expresar los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-VEGF de dicha clona seleccionada para proporcionar un anticuerpo anti-VEGF recombinante.
  74. 74. Un método para detectar VEGF, que comprende poner en contacto una composición sospechosa de contener VEGF con una composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 57, en condiciones efectivas para permitir la formación de complejos de VEGF/anticuerpo y detectar los complejos así formados.
  75. 75. Un método para inhibir el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR2 , sin inhibir significativamente el enlace del VEGF con el receptor del VEGF, VEGFR1 , que comprende poner en contacto una población homogénea o heterogénea de células que expresan el VEGFR2 (KDR/Flk-1) y el VEGFR1 (Flt-1) con una cantidad biológicamente efectiva de una composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 57. 494
  76. 76. Un método para inhibir específicamente la proliferación de células endoteliales inducidas por el VEGF, que comprende poner en contacto una población de células endoteliales en una cantidad biológicamente efectiva de una composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 57.
  77. 77. Un método para inhibir la proliferación de células endoteliales inducida por el VEGF, sin inhibir significativamente la función de macrófagos, osteoclastos o condroclastos inducida por el VEGF, que comprende poner en contacto un tejido que contiene células endoteliales en cuando menos uno de macrófagos, osteoclastos o condroclastos con una cantidad biológicamente efectiva de una composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 57.
  78. 78. Un método para inhibir la angiogénesis, que comprende poner en contacto una población de vaso sanguíneo potencialmente angiogénico con una composición antiangiogénica que comprende una cantidad biológicamente efectiva de una composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 57.
  79. 79. Un método para tratar una enfermedad angiogénica, que comprende administrar a un animal con una enfermedad angiogénica, cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente 495 efectiva de una composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 57.
  80. 80. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 79, caracterizado porque el animal tiene una enfermedad neovascular ocular o una degeneración macular.
  81. 81. Un método para administrar una sustancia de diagnóstico o terapéutica a un tumor vascularizado, que comprende administrar al animal con un tumor vascularizado una cantidad biológicamente efectiva de una composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 41.
  82. 82. Un método para tratar cáncer, que comprende administrar cuando menos una primera composición farmacéutica a un animal que tiene, o está en riesgo de desarrollar, un tumor sólido vascularizado, un tumor metastásico o metástasis de un tumor primario; en donde la cuando menos una primera composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 57.
  83. 83. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 81 u 82, que además comprende someter al animal a radioterapia.
  84. 84. Un método para tratar cáncer, que comprende: 496 (a) administrar una primera composición de conformidad con lo reclamado en las reivindicaciones 13 ó 14 a un animal que tiene un tumor sólido vascularizado, un tumor metastásico o metástasis de un tumor primario, localizando mediante esto el anticuerpo de dicha composición a la vasculatura o estroma del tumor; y (b) posteriormente administrar a dicho animal una segunda composición que comprende un profármaco -sustancialmente inactivo que se disocia por la sustancia biológica unida al anticuerpo en la primera composición, mediante lo cual se libera el fármaco sustancialmente activo específicamente dentro de la vasculatura o estroma del tumor.
  85. 85. El método de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 79 a 84, caracterizado porque el animal es un paciente humano.
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