ES2223705T3 - Composiciones y metodos para el tratamiento de cancer mediante inhibi cion selectiva del vegf. - Google Patents

Composiciones y metodos para el tratamiento de cancer mediante inhibi cion selectiva del vegf.

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ES2223705T3
ES2223705T3 ES01125821T ES01125821T ES2223705T3 ES 2223705 T3 ES2223705 T3 ES 2223705T3 ES 01125821 T ES01125821 T ES 01125821T ES 01125821 T ES01125821 T ES 01125821T ES 2223705 T3 ES2223705 T3 ES 2223705T3
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ES
Spain
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antibody
vegf
composition
antibodies
agent
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ES01125821T
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English (en)
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Rolf A.Dr. Brekken
Philip Edward Dr. Thorpe
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University of Texas System
Original Assignee
University of Texas System
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Abstract

Composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF purificado, o fragmento de unión al antígeno de éste, que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595 y que inhibe significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1).

Description

Composiciones y métodos para el tratamiento de cáncer mediante inhibición selectiva del VEGF.
Antecedentes de la invención
La presente solicitud reivindica la prioridad a la solicitud de Patente provisional U.S.A. pendiente de No. de Serie 60/131.432, archivada el 28 de abril de 1999, el texto completo y las ilustraciones de cuya solicitud se incorpora específicamente por referencia en la presente sin renuncia. El Gobierno de U.S.A. posee los derechos de la presente invención de acuerdo con la concesión de los números 1RO1 CA74951, 5RO CA54168 y T32 GM07062 de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Sector de la invención
La presente invención se refiere, generalmente, a los sectores de los anticuerpos, la angiogénesis y el tratamiento de tumores. Más particularmente, proporciona anticuerpos anti-VEGF que específicamente inhiben la unión del VEGF a sólo uno (VEGFR2) de los dos receptores de VEGF. Tales anticuerpos inhiben la angiogénesis e inducen la regresión del tumor, e incluso han mejorado su seguridad debido a sus propiedades de bloqueo específico. Las composiciones basadas en anticuerpos y los métodos de la presente invención también se extienden al uso de inmunoconjugados y otras combinaciones terapéuticas, juegos de elementos (kits) y métodos, incluyendo aquellos con profármacos.
2. Descripción de la técnica relacionada
La resistencia de las células tumorales a los agentes quimioterapéuticos representa un problema significativo en oncología clínica. De hecho, ésta es una de las principales razones por las que muchas de las formas más extendidas de cáncer humano aún resisten con efectividad la intervención quimioterapéutica, a pesar de ciertos avances en este sector.
Otra estrategia en el tratamiento del tumor es el uso de una "inmunotoxina", en la que un anticuerpo de una célula antitumoral se utiliza para liberar una toxina a las células tumorales. Sin embargo, al igual que en las aproximaciones quimioterapéuticas, la terapia de la inmunotoxina también tiene desventajas significativas cuando se aplica a tumores sólidos. Por ejemplo, células antígeno-negativas o antígeno-deficientes pueden sobrevivir y repoblar el tumor o conducir a una metástasis avanzada.
Una razón adicional para la resistencia del tumor sólido a las terapias basadas en anticuerpos es que la masa del tumor es generalmente impermeable a agentes macromoleculares, tales como anticuerpos e inmunotoxinas (Burrows y otros, 1992; Dvorak y otros, 1991a; Baxter y Jain, 1991). Tanto las distancias de difusión físicas como la presión intersticial dentro del tumor son limitaciones significativas para este tipo de terapia. Por lo tanto, los tumores sólidos, que constituyen más del 90% de todos los cánceres humanos, tienen, de este modo, una más que probada resistencia al tratamiento con anticuerpos e inmunotoxinas.
Una estrategia más reciente se ha desarrollado para elegir como diana la vasculatura de los tumores sólidos. Marcar como diana los vasos sanguíneos de los tumores, en lugar de las propias células tumorales, tiene ciertas ventajas, en cuanto a que no es probable que conduzca al desarrollo de células tumorales resistentes, y que las células marcadas como diana son fácilmente accesibles. Además, la destrucción de los vasos sanguíneos lleva a una amplificación del efecto antitumoral, ya que muchas células tumorales cuentan con un único vaso para su oxígeno y nutrientes (Burrows y Thorpe, 1994a; 1994b). Se describen estrategias de ejemplo de dianas vasculares en la Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866 y 5.965.132, que particularmente describen la liberación dirigida de agentes anticelulares y toxinas a marcadores de la vasculatura tumoral.
Otra versión efectiva de la aproximación de diana vascular es dirigir un factor de coagulación a un marcador expresado o adsorbido dentro de la vasculatura del tumor (Huang y otros, 1997; Patentes U.S.A. Nos. 5.877.289 y 6.004.555 (Solicitud U.S.A. con No. de Serie 08/482.369, Derechos de Expedición pagados el 20 de octubre de 1998)). La liberación de coagulantes, en lugar de toxinas, a la vasculatura del tumor tiene las ventajas adicionales de inmunogenicidad reducida e incluso un riesgo menor de efectos laterales tóxicos. Tal como se da a conocer en la Patente U.S.A. No. 5.877.289, un factor de coagulación preferido para el uso en tales "coaguligandos" específicos del tumor es una versión truncada de la proteína inductora de la coagulación humana, el Factor Tisular (TF), la principal iniciadora de la coagulación de la sangre.
A pesar de que la liberación específica de toxinas y factores de coagulación a los vasos sanguíneos del tumor representa un avance significativo en el tratamiento tumoral, ciertas células tumorales periféricas pueden sobrevivir a la destrucción intratumoral causada por tales terapias. Las estrategias antiangiogénicas serían, por tanto, de uso en combinación con los métodos de destrucción de tumores de las Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866 y 5.877.289.
Las estrategias antiangiogénicas del tratamiento de tumores se basan en la inhibición de la proliferación de vasos progenitores, generalmente en la periferia de un tumor sólido. Estas terapias se aplican mayoritariamente para reducir el riesgo de micrometástasis o para inhibir el crecimiento posterior de un tumor sólido después de una intervención convencional (tal como cirugía o quimioterapia).
La angiogénesis es el desarrollo de nueva vasculatura a partir de vasos sanguíneos preexistentes y/o hemocitoblastos endoteliales circulantes (Asahara y otros, 1997; Springer y otros, 1998; Folkman y Shing, 1992). La angiogénesis juega un papel vital en muchos procesos fisiológicos, tales como la embriogénesis, la curación de heridas y la menstruación. La angiogénesis también es importante en ciertos cuadros patológicos. Además de tener un papel importante en el crecimiento de tumores sólidos y la metástasis, otras condiciones destacables con un componente angiogénico son la artritis, la psoriasis y la retinopatía diabética (Hanahan y Folkman, 1996; Fidler y Ellis, 1994)
La angiogénesis está regulada en tejidos normales y malignos por el equilibrio de estímulos angiogénicos e inhibidores angiogénicos que se producen en el tejido diana y en lugares distantes (Fidler y otros, 1998; McNamara y otros, 1998). El factor-A de crecimiento endotelial vascular (VEGF, también conocido como factor de permeabilidad vascular, VPF) es un estimulante primario de la angiogénesis. El VEGF es una citocina multifuncional que se induce por hipoxia y mutaciones oncogénicas y puede producirse por una amplia variedad de tejidos (Kerbel y otros, 1998; Mazure y otros, 1996).
El reconocimiento del VEGF como un estímulo primario de la angiogénesis en condiciones patológicas ha llevado a varios intentos de bloquear la actividad del VEGF. Se han propuesto anticuerpos inhibidores del receptor anti-VEGF, construcciones de receptor solubles, estrategias antisentido, aptámeros de ARN contra VEGF e inhibidores de bajo peso molecular de tirosina quinasa (RTK) del receptor del VEGF, para interferir con la señalización del VEGF (Siemeister y otros, 1998). De hecho, se ha demostrado que anticuerpos monoclonales contra el VEGF inhiben el crecimiento de xenoinjertos de tumores humanos y la formación de ascitis en ratones (Kim y otros, 1993; Asano y otros, 1998; Mesiano y otros, 1998; Luo y otros, 1998a; 1998b; Borgstrom y otros, 1996; 1998).
PNAS, Volumen 94, 7192-7197 (1997) da a conocer la estructura cristalina del VEGF y epítopos relevantes.
Frontiers in Bioscience, Volumen 4, 141-161 (1999) analiza el turno de señales en el sistema del VEGF.
Cancer and Metastasis Reviews, Volumen 17, 155-161, (1998) da a conocer anticuerpos monoclonales específicos para el VEGFR2 como una estrategia terapéutica antiangiogénica.
Cancer-Immunology Immunotherapy, Volumen 34, 343-348 (1992) da a conocer el uso de inmunoconjugados y profármacos como una estrategia terapéutica anticáncer.
British Journal of Cancer, Volumen 70, 786-794 (1994) analiza la terapia de profármacos de enzimas dirigidas al anticuerpo en la terapia tumoral.
A pesar de que los estudios anteriores recalcan la importancia del VEGF en el crecimiento de tumores sólidos, y su potencial como diana para la terapia de tumores, sería beneficiosa la identificación de agentes adicionales que inhibiesen la angiogénesis inducida por el VEGF para expandir el número de opciones terapéuticas. El desarrollo de agentes terapéuticos que inhibieran más específicamente la unión al receptor del VEGF representaría un avance importante, siempre y cuando sus efectos antitumorales no estuvieran sustancialmente comprometidos por su especificidad mejorada.
Resumen de la invención
La presente invención resuelve ciertas desventajas en las técnicas anteriores proporcionando nuevas composiciones terapéuticas y métodos para el uso en tratamientos antiangiogénicos y antitumorales. La presente invención se basa en anticuerpos que inhiben específicamente la unión del VEGF a sólo uno (VEGFR2) de los dos receptores primarios VEGF. Tales anticuerpos inhiben la angiogénesis e inducen la regresión del tumor tan eficazmente como otros anticuerpos anti-VEGF, incluyendo aquellos que ya están en pruebas clínicas, e incluso han mejorado su seguridad debido a sus propiedades de bloqueo específico. Las composiciones y los métodos de la presente invención también se extienden al uso de inmunoconjugados y combinaciones, incluyendo profármacos, utilizando la categoría específica de los anticuerpos proporcionados.
Una ventaja particular de la presente invención es que los anticuerpos proporcionados inhiben la unión del VEGF únicamente a VEGFR2, y no a VEGFR1. Esto contrasta con los principales anticuerpos utilizados en la técnica anterior, incluyendo A4.6.1, los cuales inhiben la unión del VEGF tanto a VEGFR2 como a VEGFR1. Como el VEGFR1 tiene importantes papeles biológicos no conectados a la angiogénesis, particularmente en la migración de macrófagos y la quimiotaxis, y la función del osteoclasto y el condroclasto, la presente capacidad de inhibir sólo la angiogénesis mediante el VEGFR-2 es una ventaja evidente. Esto, traducido a unos beneficios clínicos destacables, en que los macrófagos aún son capaces de mediar en las respuestas antitumorales del huésped y en que el metabolismo del hueso, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres pediátricos, no queda afectado adversamente.
Una ventaja adicional es que, como la unión del VEGF al VEGFR1 se mantiene en presencia de los anticuerpos de la presente invención, éstos se pueden utilizar para liberar específicamente agentes terapéuticos unidos a la vasculatura del tumor mediante la unión al VEGF que está unido al VEGFR1, el cual se regula a la alta en el endotelio del tumor. En el contexto de los inmunoconjugados, por tanto, la presente invención proporciona agentes que tienen tanto propiedades antiangiogénicas como destructoras de tumores dentro de la misma molécula.
Aún existe una ventaja adicional en la capacidad de las composiciones proporcionadas para neutralizar la señal de superviviencia del VEGF, la cual se media a través del VEGFR2. Los anticuerpos desnudos y conjugados de la presente invención, de este modo, forman combinaciones sinergéticas con otras terapias y/o agentes unidos, particularmente, aquellos métodos y agentes que fracasan al intentar alcanzar la máxima efectividad in vivo debido a la capacidad del VEGF de contrarrestar sus propiedades destructivas.
La presente invención, de este modo, proporciona anticuerpos que bloquean específicamente la unión del VEGF al receptor VEGFR2, o que bloquean la unión del VEGF a, esencialmente, sólo el receptor VEGFR2. Tales anticuerpos inhiben significativamente la unión del VEGF al receptor VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor VEGFR1 (Flt-1). Los anticuerpos, de este modo, inhiben la unión del VEGF al receptor VEGFR2 (KDR/Flk-1), no inhiben sustancialmente la unión del VEGF al receptor VEGFR1 (Flt-1), muestran efectos antiangiogénicos y antitumorales in vivo y no inhiben significativamente la quimiotaxis de macrófagos, y las funciones de osteoclastos y condroclastos.
Los anticuerpos de la presente invención, de este modo, se denominan sucintamente "anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, no bloqueadores de VEGFR1". Incluso más sucintamente, se denominan "anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2", lo cual se utiliza para simplificar en referencia a todas las composiciones, utilizaciones y métodos de la presente invención. Un "anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2" es un anticuerpo contra el VEGF que bloquea la unión del VEGF al receptor VEGFR2. Quedará claro que tales anticuerpos no son anticuerpos contra el receptor VEGFR2 en sí mismo.
Anteriormente a la presente invención, no había ninguna motivación para generar anticuerpos anti-VEGF que específicamente bloquearan la unión del VEGF al receptor VEGFR2, pero no al VEGFR1, ni se preveía ninguna ventaja de tales anticuerpos. De una manera importante, como los anticuerpos bloqueadores necesitan impedir físicamente la interacción de un factor de crecimiento y su(s) receptor(es), y como los sitios de unión del receptor en los factores de crecimiento están limitados en tamaño, no había nada que sugiriera que tales anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores específicos de VEGFR2 se pudieran desarrollar.
Sin embargo, a la luz de los sorprendentes descubrimientos de los inventores dados a conocer en la presente, la técnica ha incorporado el conocimiento de que tales anticuerpos anti-VEGF de inhibición específica pueden prepararse y tener ventajas evidentes. La presente solicitud, además, describe la metodología para generar candidatos de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 y los aspectos técnicos de rutina de los ensayos requeridos para identificar anticuerpos específicos bloqueadores de VEGFR2 reales de un grupo de candidatos. A la luz de esta invención, por tanto, se pueden obtener y utilizar un grupo de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 en una variedad de realizaciones, incluyendo la inhibición de la angiogénesis y el tratamiento de enfermedades angiogénicas y tumores, sin inhibir la señalización del VEGF a través del receptor VEGFR1 y sin las notables desventajas y efectos laterales asociados con ello.
Como se utiliza en toda la solicitud, los términos "un" y "una" se utilizan en el sentido de que representan "como mínimo uno/a", "como mínimo el/la primero/a", "uno/a o más" o "una pluralidad" de los componentes o etapas citados, excepto en ejemplos en el que se afirma específicamente a partir de ese momento un límite superior. Por tanto, un "anticuerpo", como se utiliza en la presente, representa "como mínimo un primer anticuerpo". Los límites operables y parámetros de combinaciones, como las cantidades de cada agente en particular, se darán a conocer a aquellos que tengan una capacidad normal en la técnica a la luz de la presente descripción.
Los anticuerpos que "inhiben específicamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1)" pueden identificarse actualmente por ensayos de competición y/o funcionales. Los ensayos preferidos, por simplicidad, son los ensayos de competición basados en un ELISA. En los ensayos de competición, se premezcla o se mezcla juntamente el VEGF con cantidades variadas de anticuerpos de prueba (por ejemplo un exceso molar de 100 a 1000 veces) y se determina la capacidad de los anticuerpos de prueba para reducir la unión del VEGF al VEGFR2. El VEGF se puede premarcar y detectar directamente, o se puede detectar utilizando un anticuerpo anti-VEGF (secundario) o un sistema de detección de anticuerpo secundario o terciario. Un formato ELISA de tal ensayo de competición es un formato preferido, pero se puede llevar a cabo cualquier tipo de ensayo de inmunocompetición.
En tal ensayo de competición, la unión del VEGF al VEGFR2 en presencia de un anticuerpo completamente irrelevante (incluyendo anticuerpos monoclonales anti-VEGF no bloqueadores) es el valor de control elevado (100%). En un ensayo de prueba, una reducción significativa en la unión del VEGF al VEGFR2 en presencia de un anticuerpo de prueba es indicativo de un anticuerpo de prueba que inhibe significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1).
Una reducción significativa es una reducción en la unión "reproducible", es decir, que se observa constantemente. Una "reducción significativa", en términos de la presente solicitud, se define como una reducción reproducible (en la unión del VEGF al VEGFR2) en, como mínimo, un 45% aproximadamente, un 50% aproximadamente, un 55% aproximadamente, un 60% aproximadamente o un 65% aproximadamente de cualquier cantidad entre unas 100 y 1000 veces de exceso molar de anticuerpo sobre el VEGF.
Como una característica preferida de la presente invención es que los anticuerpos proporcionados no inhiben sustancialmente la unión del VEGF al VEGFR1, y los anticuerpos que muestran una reducción moderadamente significativa de la unión del VEGF al VEGFR2 aún serán útiles, siempre y cuando no inhiban sustancialmente la unión del VEGF al VEGFR1. No obstante, los anticuerpos más preferidos serán aquellos que tienen una capacidad más significativa para inhibir la unión del VEGF al VEGFR2. Estos anticuerpos son aquellos que muestran una capacidad reproducible para reducir la unión del VEGF al VEGFR2 en, como mínimo, un 70% aproximadamente, un 75% aproximadamente o un 80% aproximadamente de cualquier cantidad entre unas 100 y 1000 veces de exceso molar de anticuerpo sobre el VEGF. A pesar de que no se requieren para llevar a la práctica la presente invención, los anticuerpos que reducen la unión del VEGF al VEGFR2 en, como mínimo, un 85% aproximadamente, un 90% aproximadamente, un 95% aproximadamente o incluso más, no se excluyen de ninguna manera.
Los anticuerpos anti-VEGF, o fragmentos de unión al antígeno de éstos, que inhiben la unión del VEGF al receptor VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor VEGFR1 (Flt-1) se confirman fácilmente mediante simples ensayos de competición, tales como los descritos anteriormente, pero utilizando VEGFR1.
La ausencia de una reducción significativa es un "mantenimiento sustancial de la unión" "reproducible", es decir, constantemente observado. Un "mantenimiento sustancial de la unión", en los términos de la presente solicitud, se define como un mantenimiento reproducible (en la unión del VEGF al VEGFR1) de, como mínimo, un 60% aproximadamente, un 70% aproximadamente, un 80% aproximadamente o un 85% aproximadamente de cualquier cantidad entre unas 100 y 1000 veces de exceso molar de anticuerpo sobre el VEGF.
La intención de utilizar anticuerpos que no inhiben sustancialmente la unión del VEGF al VEGFR1 es mantener las funciones biológicas mediadas por el VEGFR1. Por lo tanto, un anticuerpo sólo necesita mantener una unión suficiente del VEGF al VEGFR1 de manera que se induzca una respuesta biológica por el VEGF. No obstante, los anticuerpos más preferidos serán aquellos que tienen una capacidad más significativa para mantener la unión del VEGF al VEGFR1. Estos anticuerpos son aquellos que muestran una capacidad reproducible para mantener la unión del VEGF al VEGFR1 en niveles de, como mínimo, un 88% aproximadamente, un 90% aproximadamente, un 92% aproximadamente, un 95% aproximadamente o un 98-99% aproximadamente de cualquier cantidad entre unas 100 y 1000 veces de exceso molar de anticuerpo sobre el VEGF.
Se entenderá que los anticuerpos que inhiben más sustancialmente la unión del VEGF al VEGFR2 pueden probablemente tolerar más la reducción en la unión al VEGFR1. Igualmente, allí donde el anticuerpo tenga una reducción moderada en la unión del VEGF al VEGFR2, el mantenimiento de la unión al VEGFR1 debería ser rigurosamente controlado.
Otro ensayo preferido de unión para identificar y/o confirmar que un anticuerpo inhibe la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) es un ensayo de coprecipitación. Un ensayo de coprecipitación prueba la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión del VEGF a uno o más receptores en solución. En un ensayo de este tipo, el VEGF o un VEGF marcado para detectarse se incuba con una forma adecuada del receptor.
Hay muchos formatos para llevar a cabo los ensayos de inmunoprecipitación o coprecipitación. En el presente caso, una "forma adecuada del receptor" puede ser el receptor VEGFR2 en cuestión o el dominio extracelular del receptor. La inmunoprecipitación requiere, además de reactivos estándares, la presencia de un anticuerpo contra el receptor VEGFR2 o un epítopo en el dominio extracelular del receptor diferente del lugar al que el VEGF se une. La presente invención proporciona otras formas "adecuadas" de los receptores del VEGF, es decir, los dominios extracelulares de los receptores unidos a una parte Fc del anticuerpo. Tales construcciones receptor/Fc se pueden precipitar mediante la incubación con un compuesto inmunoprecipitante efectivo, tal como un compuesto basado en la Proteína A.
Sin tener en cuenta el receptor adecuado, los ensayos de inmunoprecipitación o coprecipitación se llevan a cabo preferiblemente con controles. La capacidad del VEGF por sí solo de unirse al receptor elegido debería confirmarse mediante la precipitación en ausencia de un anticuerpo anti-VEGF. Preferiblemente, se llevan cabo incubaciones paralelas en presencia o ausencia de un anticuerpo con propiedades conocidas de unión para actuar como control. Más preferiblemente, se realizan ensayos en paralelo utilizando tanto un anticuerpo de control bloqueador como un anticuerpo de control no bloqueador.
Cualquier especie inmunológica enlazada se precipita a continuación, por ejemplo, mediante la incubación con un compuesto inmunoprecipitante efectivo, tal como un compuesto basado en la Proteína A o unas bolas de sefarosa Proteína A. A continuación, se examina el precipitado para la presencia del VEGF. Allí donde el VEGF, en la incubación inicial, era un VEGF marcado para ser detectado, tal como el VEGF radiomarcado, cualquier VEGF en el inmunoprecipitado se puede detectar directamente. Cualquier VEGF no marcado en el inmunoprecipitado se puede detectar mediante otros medios adecuados, por ejemplo, por separación en gel e inmunodetección con un anticuerpo anti-VEGF.
La capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión del VEGF al receptor del VEGF, tal como el VEGFR2, en tal ensayo de coprecipitación se puede cuantificar fácilmente, a pesar de que los resultados cualitativos también son valiosos. La cuantificación se puede conseguir mediante la medida directa de VEGF marcado o, por ejemplo, mediante análisis densitométricos del VEGF inmunodetectado. Los anticuerpos que muestran una capacidad reproducible, es decir, constantemente observada, para inhibir la unión del VEGF al VEGFR2 pueden, de este modo, detectarse, y se pueden elegir anticuerpos útiles según el criterio cuantitativo expresado anteriormente.
Los anticuerpos anti-VEGF que no inhiben significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1), también se pueden identificar fácilmente mediante la realización de ensayos de coprecipitación como se describen anteriormente, pero utilizando VEGFR1 en lugar de VEGFR2. Por lo tanto, los anticuerpos anti-VEGF que inhiben la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1), sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1), también se pueden identificar fácilmente utilizando tales métodos.
La presente solicitud también proporciona varios ensayos funcionales para identificar y/o confirmar que un anticuerpo inhibe significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1). Éstos están generalmente relacionados con la identificación del VEGFR2 como el receptor responsable de ciertas respuestas biológicas definidas. A pesar de que los siguientes ensayos son menos preferidos que los ensayos del tipo competición anteriores, los cuales se llevan a cabo en sistemas libres de células y son más reproducibles, fiables, menos laboriosos y efectivos en coste, son, no obstante, útiles en el contexto de la presente invención.
Por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 se puede identificar probando la capacidad para inhibir el crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF (inhibiendo la actividad mitogénica del VEGF). Se puede emplear cualquier ensayo adecuado utilizando cualquiera de una variedad de células endoteliales en presencia del VEGF con o sin anticuerpos de prueba. Preferiblemente, se realizan ensayos duplicados en paralelo, tales como aquellos sin el VEGF y aquellos con anticuerpos de control de propiedades definidas (tanto bloqueadores como no bloqueadores). El crecimiento de células endoteliales se puede determinar y, preferiblemente, cuantificar exactamente, mediante cualquier medio aceptable de determinación del número de células, incluyendo ensayos colorimétricos.
Un anticuerpo con una capacidad para inhibir el crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF, generalmente, mostrará una inhibición observada constantemente del crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF de aproximadamente un 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ó 50% o similar. La inhibición con tales porcentajes indicará un anticuerpo con propiedades suficientes para inhibir la angiogénesis in vivo. Los anticuerpos con una actividad inhibitoria más significativa no se excluyen de la presente invención.
Los ensayos funcionales adicionales para identificar anticuerpos de acuerdo con la presente invención son ensayos para probar el bloqueo de la fosforilación inducida por el VEGF. Se puede emplear cualquier ensayo adecuado utilizando cualquiera de una variedad de células endoteliales que expresan cualquier forma de VEGFR2 nativo o fosforilable recombinante. Las células se incuban con el VEGF en presencia o ausencia del anticuerpo a probar durante un período de tiempo adecuado. Preferiblemente, se realizan ensayos duplicados en paralelo, tales como aquellos sin el VEGF y aquellos con anticuerpos de control de propiedades definidas (tanto bloqueadores como no bloqueadores).
La fosforilación inducida por el VEGF, del VEGFR2 se puede determinar y, preferiblemente, cuantificar exactamente mediante cualquier medio aceptable. Generalmente, el VEGFR2 se inmunoprecipita para análisis posteriores. El grado de fosforilación del VEGFR2 se puede determinar directamente, por ejemplo, las células se pueden haber incubado con ATP marcado con ^{32}P, permitiendo la cuantificación directa del ^{32}P dentro del VEGFR2 inmunoprecipitado. Preferiblemente, los VEGFR2 inmunoprecipitados se analizan por otros medios, por ejemplo, por separación en gel e inmunodetección con un anticuerpo que se une a los restos de fosfotirosina. Un anticuerpo con una capacidad de inhibir la fosforilación inducida por el VEGF, del VEGFR2, generalmente, mostrará una reducción observada constantemente en los niveles de VEGFR2 fosforilados.
Incluso los ensayos funcionales adicionales para identificar los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, de acuerdo con la presente invención, son ensayos para probar la inhibición de la permeabilidad vascular inducida por el VEGF. A pesar de que se puede utilizar cualquier ensayo, un ensayo particularmente adecuado es el ensayo de permeabilidad de Miles, en el que a animales, tales como las cobayas, se les inyecta un colorante, tal como el colorante azul de Evans, y el aspecto del colorante en la piel del animal se determina tras el suministro de VEGF en presencia o ausencia de los anticuerpos de prueba. Preferiblemente, se llevan a cabo estudios duplicados en paralelo, tales como aquellos sin VEGF y aquellos con anticuerpos de control de propiedades definidas (tanto bloqueadores como no bloqueadores). El aspecto del colorante en la piel del animal es habitualmente, en forma de manchas, tales como manchas azules, en la espalda del animal, las cuales se pueden fotografiar y medir.
Los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 inhibirán la permeabilidad vascular inducida por el VEGF como una inhibición observada constantemente, a bajas concentraciones, tal como cuando se proporciona en un exceso molar de 100 ó 1000 veces sobre el VEGF. Los anticuerpos que no bloquean la unión del VEGF al VEGFR2 no mostrarán ninguna inhibición significativa de la permeabilidad vascular inducida por el VEGF. Generalmente, los anticuerpos que bloquean la permeabilidad inducida por el VEGF sólo a altas concentraciones, tales como en un exceso molar de 10 veces sobre el VEGF, no serán anticuerpos con propiedades de acuerdo con la presente invención.
Los ensayos funcionales ampliamente aceptados de angiogénesis y, por tanto, agentes antiangiogénicos, son el ensayo de "micropocket" corneal de neovascularización y el ensayo prueba de la membrana corioalantoica (CAM) de pollo. La Patente U.S.A. No. 5.712.291 muestra que los ensayos de "micropocket" corneal y CAM son suficientemente predictivos para identificar agentes para el uso en el tratamiento de un número de enfermedades angiogénicas extremadamente amplio.
La Patente U.S.A. No. 5.001.116 describe el ensayo CAM. Esencialmente, a los embriones de pollo fertilizados se les elimina su caparazón en el día 3 ó 4, y se implanta un disco de metilcelulosa, que contiene el compuesto de prueba, en la membrana corioalantoica. Se examinan los embriones 48 horas después aproximadamente y, si aparece una zona avascular clara alrededor del disco de metilcelulosa, se mide el diámetro de la zona. Tal como se dio a conocer en la Patente U.S.A. No. 5.712.291, en el contexto de la presente invención, la aparición de cualquier zona avascular es suficiente para mostrar la presencia de un anticuerpo antiangiogénico. Cuanto mayor es la zona, más efectivo es el anticuerpo.
El ensayo de "micropocket" corneal de neovascularización se puede realizar utilizando córneas de rata o conejo. Este modelo in vivo es ampliamente aceptado como pronóstico de la utilidad clínica, como se evidencia en las Patentes U.S.A. Nos. 5.712.291 y 5.871.723, para objetivos evidentes. A pesar de que no se cree que sean particularmente relevantes en la presente invención, los ensayos corneales son preferibles sobre el ensayo CAM porque, generalmente, reconocerán compuestos que son inactivos per se pero que se metabolizan para dar compuestos activos.
En la presente invención, el ensayo de "micropocket" corneal se utiliza para identificar un agente antiangiogénico. Esto se evidencia por una reducción significativa en la angiogénesis, tal como se representó por una reducción constantemente observada y preferiblemente marcada, en el número de vasos sanguíneos en el interior de la córnea. Tales respuestas son preferiblemente definidas como aquellas córneas que muestran sólo un brote ocasional y/o un bucle de horquilla que no mostraba ninguna evidencia del crecimiento sostenido cuando contactaba con la sustancia de prueba.
Entre los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 (y fragmentos de unión al antígeno) de la presente invención se incluyen, a título de ejemplo, aquellos que:
(a) inhiben significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1);
(b) no inhiben significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1);
(c) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente la fosforilación, inducida por el VEGF, del VEGFR2;
(d) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente la permeabilidad vascular inducida por el VEGF;
(e) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente la proliferación de células endoteliales inducida por el VEGF;
(f) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente la angiogénesis;
(g) no inhiben significativamente la estimulación o activación mediada por el VEGFR1 de macrófagos, osteoclastos o condroclastos; y
(h) se localizan en la vasculatura del tumor y el estroma tumoral tras la administración a un animal con un tumor vascularizado.
Un aspecto particular de la presente invención está basado en el descubrimiento sorprendente y original de los inventores, de anticuerpos que inhibían específicamente la unión del VEGF al receptor VEGFR2, que tenían efectos antitumorales significativos in vivo y que no inhibían la unión del VEGF al receptor VEGFR1. En ciertas realizaciones, la presente invención, de este modo, proporciona anticuerpos de especificidad de epítopo definida, en las que tales anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno de éstos, se unen, esencialmente, al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
La presente invención, tal como se reivindica, da las condiciones, de acuerdo con la presente especificación y referencias tecnológicas fácilmente disponibles, del saber hacer y los materiales de partida. No obstante, una muestra de la línea celular del hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 2C3 se presentó el 27 de marzo, por recibo el 28 de marzo del 2000, para depósito con la "American Type Culture Collection (ATCC)", 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, U.S.A. y se le dio un número de entrada al ATCC, ATCC PTA 1595 el 11 de abril del 2000. Este depósito se hizo bajo las disposiciones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Objetivos en Procedimientos de Patentes y las regulaciones del mismo (Tratado de Budapest). El hibridoma estará disponible por el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest sobre cuestiones de una patente U.S.A. con las reivindicaciones pertinentes. La disponibilidad del hibridoma depositado no debe interpretarse como una licencia para realizar la invención en contravención de los derechos cedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.
Ciertas composiciones preferidas son, por tanto, composiciones que comprenden, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento de unión al antígeno de éste, o, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF purificado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); composiciones que comprenden, como mínimo, un primer anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une al VEGF en, esencialmente, el mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y composiciones que comprenden, como mínimo, un primer anticuerpo monoclonal anti-VEGF, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
No obstante, otras composiciones, anticuerpos, métodos, y particularmente, la utilización médica primaria y secundaria de la presente invención, tienen que ver con anticuerpos anti-VEGF, o fragmentos de unión al antígeno de éstos, que se unen al mismo, o sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), aparte del anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) en sí mismo.
Los términos "que se une aproximadamente, sustancialmente o esencialmente al mismo, o al mismo, epítopo que" el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) representan que un anticuerpo "reacciona de forma cruzada" con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). "Los anticuerpos de reactividad cruzada" son aquellos que reconocen, se unen a, o tienen inmunoespecificidad por sustancialmente o esencialmente el mismo, o el mismo, epítopo o "sitio epitópico" que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), tal que son capaces de competir con efectividad con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) por la unión al VEGF. "Los anticuerpos de reactividad cruzada con 2C3" son sucintamente denominados "anticuerpos similares a 2C3" y "anticuerpos basados en 2C3", y tales términos se utilizan indistintamente en la presente y se aplican a composiciones, utilizaciones y métodos.
La identificación de uno o más anticuerpos que se une(n) a aproximadamente, sustancialmente, esencialmente o al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) es un asunto técnico sencillo ahora que se ha proporcionado el 2C3 con sus propiedades ventajosas. Como la identificación de los anticuerpos de reactividad cruzada se determina en comparación con un anticuerpo de referencia, se entenderá que, realmente, la determinación del epítopo al que el anticuerpo de referencia (2C3) y el anticuerpo de prueba se unen no es, en ningún caso, necesario para identificar un anticuerpo que se une al mismo, o sustancialmente al mismo, epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3. Sin embargo, en la presente se incluye una información considerable sobre el epítopo enlazado al 2C3 y, adicionalmente, se puede realizar un mapeo del epítopo, como se describió por Champe y otros (1995).
La identificación de anticuerpos de reactividad cruzada se puede determinar fácilmente utilizando cualquiera de la variedad de ensayos de screening inmunológico en los que se puede evaluar la competición de anticuerpos. Todos estos ensayos son rutina en la técnica y se describen con detalle en la presente. La Patente U.S.A. No. 5.660.827, publicada el 26 de agosto de 1997, incluso complementa, adicionalmente, la presente enseñanza relativa a como hacer que los anticuerpos se unan al mismo, o sustancialmente al mismo, epítopo que un anticuerpo dado, tal como el 2C3.
Por ejemplo, allí donde se obtienen los anticuerpos de prueba que se examinan de diferentes animales de origen, o son incluso de diferente isotipo, se puede emplear un simple ensayo de competición en el que el control (2C3) y los anticuerpos de prueba se mezclan (o preadsorben) y se aplican a un compuesto de antígeno del VEGF. Por "compuesto de antígeno del VEGF" se entiende cualquier compuesto que contiene un antígeno del VEGF con unión al 2C3 como se describe en la presente, tal como un VEGF libre. De este modo, los protocolos basados en ELISAs y transferencia tipo Western son adecuados para la utilización en tales estudios de competición simples.
En ciertas realizaciones, se premezclarían los anticuerpos de control (2C3) con cantidades variadas de anticuerpos de prueba (por ejemplo, 1:10 ó 1:100) durante un período de tiempo anterior a la aplicación a un compuesto de antígeno. En otras realizaciones, el control y las cantidades variadas de anticuerpos de prueba se pueden simplemente mezclar durante la exposición al compuesto de antígeno. En cualquier caso, mediante la utilización de especies o anticuerpos secundarios de isotipo se podrán detectar sólo los anticuerpos de control enlazados, las uniones de los cuales se reducirán por la presencia de un anticuerpo de prueba que reconoce sustancialmente el mismo epítopo.
Al realizar un estudio de competición de anticuerpos entre un anticuerpo de control y cualquier anticuerpo de prueba (sin tener en cuenta la especie o el isotipo), se puede marcar primero el control (2C3) con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, biotina o un marcador enzimático (o incluso radioactivo) para permitir la posterior identificación. En estos casos, se premezclarían o incubarían los anticuerpos de control marcados con los anticuerpos de prueba a examinar en varias proporciones (por ejemplo, 1:10 ó 1:100) y (opcionalmente, después de un período adecuado de tiempo), a continuación, se analizaría la reactividad de los anticuerpos de control marcados y se compararía con el valor de control en el que no se incluía en la incubación ningún anticuerpo de prueba potencialmente competitivo.
El ensayo puede ser, otra vez, cualquiera dentro de un rango de ensayos inmunológicos basados en la hibridación de anticuerpo, y los anticuerpos de control se detectarían mediante la detección de su marcador, por ejemplo, utilizando estreptavidina en el caso de anticuerpos biotinilados o utilizando un sustrato cromogénico en conexión con un marcador enzimático (tal como un sustrato de 3,3'5,5'-tetrametilbencidina (TMB) con la enzima peroxidasa) o, simplemente, mediante la detección de un marcador radiactivo. Un anticuerpo que se une al mismo epítopo que los anticuerpos de control será capaz de competir con efectividad por la unión y, de este modo, reducirá significativamente la unión del anticuerpo de control, como se observó por la reducción en el marcador enlazado.
La reactividad de los anticuerpos de control (marcados) en ausencia de un anticuerpo completamente irrelevante sería el valor elevado de control. El valor bajo de control se obtendría mediante la incubación de los anticuerpos (2C3) marcados con anticuerpos no marcados del mismo tipo exactamente (2C3), en el momento de que tuviera lugar la competición y se redujera la unión de los anticuerpos marcados. En un ensayo de prueba, una reducción significativa en la reactividad del anticuerpo marcado en presencia de un anticuerpo de prueba es indicativo de un anticuerpo de prueba que reconoce el mismo epítopo, es decir, que "reacciona de forma cruzada" con el anticuerpo (2C3) marcado.
Una reducción significativa es una reducción en la unión "reproducible", es decir, constantemente observada. Una "reducción significativa", en términos de la presente solicitud, se define como una reducción reproducible (en la unión de un 2C3 al VEGF en un ELISA) de, como mínimo, un 70% aproximadamente, un 75% aproximadamente o un 80% aproximadamente en cualquier proporción entre, aproximadamente 1:10 y 1:100. Los anticuerpos con actividades de bloqueo cruzado incluso más rigurosas mostrarán una reducción reproducible (en la unión de un 2C3 al VEGF en un ELISA o cualquier otro ensayo adecuado) de, como mínimo, un 82% aproximadamente, un 85% aproximadamente, un 88% aproximadamente, un 90% aproximadamente, un 92% aproximadamente o un 95% aproximadamente o similar, en cualquier proporción entre 1:10 y 1:100 aproximadamente. A pesar de que de ningún modo se requiere para realizar la invención, no se excluye el bloqueo cruzado completo o casi completo, tal como el que muestra una reducción reproducible en la unión de un 2C3 al VEGF de un 99% aproximadamente, un 98% aproximadamente, un 97% aproximadamente o un 96% aproximadamente o similar.
La presente invención se ejemplifica por un anticuerpo monoclonal 2C3, producido por el hibridoma ATCC PTA 1595, o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo monoclonal. Otro aspecto de la presente invención es un hibridoma que produce un anticuerpo anti-VEGF monoclonal que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
La presente invención, además, proporciona anticuerpos anti-VEGF que se unen sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), preparado mediante un proceso que comprende inmunizar un animal con, como mínimo, un primer componente de VEGF inmunogénico y seleccionar del animal inmunizado un anticuerpo que reacciona sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y los anticuerpos anti-VEGF que se unen sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), preparado mediante un proceso que comprende inmunizar un animal con, como mínimo, un primer compuesto VEGF inmunogénico y seleccionar del animal inmunizado un anticuerpo anti-VEGF de reactividad cruzada mediante la identificación de un anticuerpo que reduce sustancialmente la unión del anticuerpo 2C3 al VEGF.
Otros aspectos de la presente invención los forman los anticuerpos anti-VEGF, o fragmentos de unión al antígeno de éstos, que se unen sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) y que, específicamente, inhibe la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1); y los anticuerpos anti-VEGF, o fragmentos de unión al antígeno de éstos, que se unen sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) y que inhibe la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1).
Los anticuerpos con tales combinaciones de propiedades se pueden identificar fácilmente mediante uno o más o una combinación de los ensayos de competición de receptor, ELISA, coprecipitación, y/o ensayos funcionales y los ensayos de reactividad cruzada del 2C3 descritos anteriormente. La guía respecto a la evaluación cuantitativa de los anticuerpos similares al 2C3 que reducen significativamente y constantemente la unión del VEGF al VEGFR2 y que, constantemente, no inhiben significativamente la unión del VEGF al VEGFR1 es como se describió anteriormente.
El 2C3 mostrado en la presente, reduce la cantidad de VEGF que se enlazó a los pocillos del ELISA revestidos de VEGFR2 a un 26% aproximadamente y un 19%, respectivamente, en unos excesos molares sobre el VEGF de 100 y 1000 veces. Estas cifras se equiparan a las reducciones en la unión del VEGF al VEGFR2 en un 74% aproximadamente y un 81% aproximadamente, respectivamente. El 2C3, mostrado en la presente mantiene la cantidad de VEGF que se enlazó a los pocillos del ELISA revestidos de VEGFR2 a aproximadamente un 92% y un 105%, respectivamente, en unos excesos molares sobre el VEGF de 100 y 1000 veces.
Se entenderá, otra vez, que los anticuerpos de reactividad cruzada o similares al 2C3 que inhiben más sustancialmente la unión del VEGF al VEGFR2 pueden probablemente tolerar más la reducción en la unión al VEGFR1. De igual modo, allí donde un anticuerpo tenga una reducción moderada en la unión del VEGF al VEGFR2, el mantenimiento de la unión al VEGFR1 debería ser seguido más rigurosamente.
Por tanto, anticuerpos anti-VEGF de ejemplo adicionales (y fragmentos de unión al antígeno) de la presente invención, son aquellos que:
(a) se unen a un epítopo del VEGF no dependiente de conformación, tal como se evaluó por la unión al VEGF mediante transferencia tipo Western;
(b) se unen a un VEGF libre;
(c) inhiben significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1);
(d) no inhiben significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1);
(e) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente la fosforilación inducida por el VEGF, del VEGFR2;
(f) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente la permeabilidad vascular inducida por el VEGF;
(g)) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente la proliferación de células endoteliales inducida por el VEGF;
(h) inhiben, y preferiblemente, inhiben significativamente la angiogénesis;
(i) no inhiben significativamente la estimulación o activación mediada por el VEGFR1 de macrófagos, osteoclastos o condroclastos;
(j) se localizan en la vasculatura del tumor y el estroma tumoral tras la administración a un animal con un tumor vascularizado; y
(k) se unen al mismo o sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
En las siguientes descripciones de composiciones, inmunoconjugados, fármacos, combinaciones, cócteles, kits, usos médicos primarios y secundarios y todos los métodos de acuerdo con la presente invención, los términos "anticuerpo" e "inmunoconjugado", o una región de unión al antígeno de éstos, a menos que se afirme específicamente lo contrario o se aclare a partir de la terminología científica, se refieren a un grupo de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 así como a anticuerpos de reactividad cruzada con 2C3, específicos.
Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina", como se utilizan en la presente, se refieren ampliamente a cualquier agente de unión inmunológico, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales. Dependiendo del tipo de dominio constante en las cadenas pesadas, los anticuerpos se asignan a una de las cinco clases principales: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Varias de éstas se dividen en subclases o isotipos, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, y similares. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu, respectivamente. Las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Generalmente, allí donde se utilizan los anticuerpos, en lugar de las regiones de unión al antígeno, en la presente invención, se prefieren IgG y/o IgM porque son los anticuerpos más comunes en la situación fisiológica y porque son los más fáciles de producir en el marco de un laboratorio.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de mamíferos se asignan a uno de dos tipos claramente distintos: kappa (\kappa) y lambda (\lambda), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Esencialmente, no hay ninguna preferencia para la utilización de las cadenas ligeras \kappa o \lambda en los anticuerpos de la presente invención.
Se prefiere mucho más el uso de anticuerpos monoclonales (MAbs) o derivados de éstos. Los MAbs son reconocidos por tener ciertas ventajas, por ejemplo, reproducibilidad y producción a gran escala, que los hace adecuados para el tratamiento clínico. La presente invención, de este modo, proporciona anticuerpos monoclonales de origen murino, humano, de mono, de rata, de hámster, de conejo e incluso de rana o pollo. Se preferirán, generalmente, anticuerpos monoclonales murinos, humanos o humanizados.
Como entenderán los entendidos en la técnica, los reactivos de unión inmunológica abarcados por el término "anticuerpo" se extienden a todos los anticuerpos de todas las especies, y fragmentos de unión al antígeno de éstos, incluyendo anticuerpos diméricos, triméricos y multiméricos; anticuerpos biespecíficos; anticuerpos quiméricos; anticuerpos humanos y humanizados; anticuerpos recombinantes y fabricados, y fragmentos de éstos.
El término "anticuerpo", de este modo, se utiliza para referirse a cualquier molécula similar a un anticuerpo que tenga una región de unión al antígeno, y este término incluye fragmentos de anticuerpo tales como Fab', Fab, F(ab')_{2}, anticuerpos de dominios único (DABs), Fv, scFv (cadena única Fv), anticuerpos lineales, "fragmentos bivalentes" ("diabodies") y similares. Las técnicas para la preparación y la utilización de varias construcciones y fragmentos basados en anticuerpos son bien conocidas en la técnica (ver Kabat y otros, 1991). Los "diabodies", en particular, están más descritos en las Patentes EP 404.097 y WO 93/11161; mientras que los anticuerpos lineales están más descritos en Zapata y otros (1995).
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF que comprende, como mínimo, una primera región variable que comprende una región con una secuencia de aminoácidos de, como mínimo, un 75% aproximadamente, más preferiblemente, como mínimo, un 80% aproximadamente, más preferiblemente, como mínimo, un 85% aproximadamente, más preferiblemente, como mínimo, un 90% aproximadamente y todavía más preferiblemente, como mínimo, un 95% aproximadamente o similar de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9; en las que dicho anticuerpo anti-VEGF, como mínimo, mantiene sustancialmente las propiedades biológicas de los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 de la presente invención, como quedo ejemplificado por el anticuerpo 2C3.
La identidad u homología con respecto a éstas y otras secuencias de anticuerpo anti-VEGF de la presente invención se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a las secuencias de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9, o a la secuencia de otro anticuerpo anti-VEGF de la presente invención, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje en la identidad de la secuencia. Es particularmente importante el mantenimiento de sustancialmente las mismas o incluso de propiedades biológicas más efectivas del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 utilizado para la comparación de la secuencia. Tales comparaciones son fácilmente realizables, por ejemplo, utilizando uno o más de los varios ensayos descritos en la presente en detalle.
En ciertas realizaciones preferidas, los anticuerpos anti-VEGF de la presente invención comprenden, como mínimo, una primera región variable que incluye una región con secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9, como se ejemplificó por regiones variables que incluyen una región con secuencia de aminoácidos codificados por las secuencias del ácido nucleico de SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:8. Tales secuencias son las secuencias de Vh y V\chi del ScFV de 2C3 que abarca las CDR1-3 (regiones determinantes de complementariedad) de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras.
En otras realizaciones preferidas, se proporcionan anticuerpos de segunda generación que tienen propiedades mejoradas o superiores en comparación con un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, tal como el 2C3. Por ejemplo, los anticuerpos de segunda generación pueden tener una afinidad de unión más fuerte, un bloqueo más efectivo de la unión del VEGF al VEGFR2, un bloqueo más específico de la unión del VEGF al VEGFR2, incluso un menor bloqueo de la unión del VEGF al VEGFR1, una capacidad mejorada de inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales inducida por el VEGF, una capacidad superior de inhibir, la permeabilidad vascular inducida por el VEGF, y preferiblemente, una aumentada capacidad de inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF in vivo, y tratar las enfermedades angiogénicas, incluyendo los tumores vascularizados.
Las comparaciones para identificar anticuerpos de segunda generación se realizan y cuantifican fácilmente, por ejemplo, utilizando uno o más de los varios ensayos descritos en la presente con detalle. Se abarcan en la presente invención los anticuerpos de segunda generación que tienen una propiedad o actividad biológica aumentada en, como mínimo, unas 10 veces, preferiblemente, como mínimo, unas 20 veces, y más preferiblemente, como mínimo, unas 50 veces, en comparación con los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 de la presente invención, ejemplificados por el anticuerpo 2C3.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos empleados serán "humanizados", anticuerpos humanos o parcialmente humanos. Los anticuerpos "humanizados" son, generalmente, anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón, rata, u otras especies no humanas, con los dominios de región variable y/o constante de humano ("anticuerpos quiméricos parcialmente humanos"). Varios anticuerpos monoclonales humanizados a utilizar en la presente invención serán anticuerpos quiméricos en los que, como mínimo, una primera región de unión al antígeno, o una región determinante de complementariedad (CDR), de un ratón, una rata u otro anticuerpo monoclonal no humano está acoplado operativamente, o se "inserta", a una región constante de anticuerpo humano o "armazón".
Los anticuerpos monoclonales "humanizados" a utilizar en la presente también pueden ser anticuerpos monoclonales de especies no humanas en los que uno o más de los aminoácidos seleccionados se han intercambiado por aminoácidos observados más normalmente en anticuerpos humanos. Esto se puede conseguir fácilmente a través de la utilización de tecnología recombinante rutinaria, particularmente mutagénesis específica de sitio.
Los anticuerpos completamente humanos, en lugar de los "humanizados", también se pueden preparar y utilizar en la presente invención. Dichos anticuerpos humanos se pueden obtener de sujetos sanos mediante la simple obtención de una población de linfocitos sanguíneos periféricos mezclados de un sujeto humano, incluyendo células que presentan antígeno y que producen anticuerpos, y estimulando la población celular in vitro mediante la mezcla con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de VEGF. Las células productoras de anticuerpo anti-VEGF humano, una vez obtenidas, se utilizan en el hibridoma y/o la producción de anticuerpos recombinantes.
Algunas técnicas adicionales para la producción de anticuerpos monoclonales incluyen la inmunización de un animal transgénico, preferiblemente, un ratón transgénico, que comprende una biblioteca de anticuerpos humanos con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de VEGF. Esto también genera células productoras de anticuerpo anti-VEGF humano para la posterior manipulación en el hibridoma y/o la producción de anticuerpos recombinantes, con la ventaja de que las células del bazo, en lugar de las células sanguíneas periféricas, se pueden obtener fácilmente a partir del animal transgénico o el ratón.
Los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 de acuerdo con la presente invención se pueden preparar fácilmente mediante procesos y métodos que comprenden:
(a) preparar células candidatas productoras de anticuerpos; y
(b) seleccionar, de las células candidatas productoras de anticuerpos, un anticuerpo que inhiba significativamente la unión del VEGF a VEGFR2 (KDR/Flk-1) y no inhiba significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1).
Otros anticuerpos, de acuerdo con la presente invención, se pueden preparar fácilmente mediante la selección de un anticuerpo que reacciona sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). Algunos métodos y procesos preparativos adecuados comprenden:
(a) preparar células candidatas productoras de anticuerpos; y
(b) seleccionar, de las células candidatas productoras de anticuerpos, un anticuerpo que reacciona sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
Otros procesos para preparar células productoras de anticuerpos adecuadas y obtener anticuerpos de éstas se pueden realizar in situ en un paciente dado. Es decir, simplemente proporcionando una cantidad inmunogénicamente eficaz de una muestra de VEGF inmunogénica a un paciente dará lugar a una generación de anticuerpos apropiados. De este modo, el anticuerpo aún "se obtiene" de la célula productora de anticuerpos, pero no tiene que ser aislada de un huésped y posteriormente proporcionada a un paciente; siendo capaz de localizarse espontáneamente en la vasculatura del tumor y ejercer sus efectos antitumorales biológicos. Sin embargo, no se prefieren tales realizaciones debido a la marcada falta de especificidad.
Las células productoras de anticuerpos adecuadas también se pueden obtener, y consecuentemente aislar anticuerpos y/o purificarlos, mediante la estimulación de linfocitos sanguíneos periféricos con el VEGF in vitro.
Otros métodos comprenden la administración a un animal de un compuesto inmunizante que comprende, como mínimo, un primer componente de VEGF inmunogénico, y la selección de un anticuerpo, del animal inmunizado, que inhiba significativamente la unión del VEGF a VEGFR2 (KDR/Flk-1) y no inhiba significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1), y, opcionalmente, que reaccione sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). Estos métodos generalmente comprenden:
(a) inmunizar un animal mediante la administración al animal de, como mínimo, una dosis, y, opcionalmente, más de una dosis, de una cantidad inmunogénicamente eficaz de una muestra de VEGF inmunogénica (tal como un primer componente de VEGF humano, un componente de VEGF sustancialmente de longitud completa, o VEGF humano recombinado); y
(b) obtener una célula productora de anticuerpos adecuada del animal inmunizado, tal como una célula productora de anticuerpos que produzca un anticuerpo que inhiba significativamente la unión del VEGF a VEGFR2 (KDR/Flk-1) y no inhiba significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1), y, opcionalmente, que reaccione sustancialmente de forma cruzada, con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
La cantidad inmunogénicamente eficaz de la muestra o muestras de VEGF se puede administrar como conjugados del VEGF, o en combinación con cualquier adyuvante adecuado, tal como el adyuvante completo de Freund. Se puede emplear cualquier técnica empírica o variación para incrementar la inmunogenicidad. Como inmunógeno se prefiere un VEGF humano sustancialmente de longitud completa intacto.
Sin tener en cuenta la naturaleza del proceso de inmunización, o el tipo de animal inmunizado, se obtienen células productoras de anticuerpos adecuadas del animal inmunizado y, preferiblemente, posteriormente manipuladas por la mano del hombre. "Un animal inmunizado", como se utiliza en la presente, es un animal no humano, a menos que se afirme expresamente lo contrario. A pesar de que se puede utilizar cualquier célula productora de anticuerpos, más preferiblemente, se obtienen células del bazo como fuente de células productoras de anticuerpos. Las células productoras de anticuerpos se pueden utilizar en un proceso preparativo que comprende:
(a) fusionar una célula productora de anticuerpos anti-VEGF adecuada con una célula inmortal para preparar el hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención; y
(b) obtener un anticuerpo anti-VEGF adecuado, de acuerdo con la invención, del hibridoma.
Las células productoras de anticuerpos anti-VEGF "adecuadas", los hibridomas y los anticuerpos son aquellos que producen, o existen como, anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, es decir, anticuerpos que inhiben significativamente la unión del VEGF a VEGFR2 (KDR/Flk-1) y no inhiben significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1), y que, opcionalmente, reaccionan sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
Los métodos de preparación de anticuerpos monoclonales basados en el hibridoma, de este modo, incluyen aquellos que comprenden:
(a) inmunizar un animal mediante la administración al animal de, como mínimo, una dosis, y, opcionalmente, más de una dosis, de una cantidad inmunogénicamente eficaz de una muestra de VEGF inmunogénica, preferiblemente una muestra de VEGF humano intacta;
(b) preparar una colección de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales del animal inmunizado;
(c) seleccionar de la colección, como mínimo, un primer hibridoma que produzca, como mínimo, un primer anticuerpo monoclonal anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, de acuerdo con la presente invención, opcionalmente, un anticuerpo anti-VEGF que reaccione sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y
(d) cultivar, como mínimo, un primer hibridoma productor de anticuerpos para proporcionar, como mínimo, un primer anticuerpo monoclonal anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2; y preferiblemente
\newpage
(e) obtener, como mínimo, un primer anticuerpo monoclonal anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 del cultivo de, como mínimo, un primer hibridoma.
En la identificación de un anticuerpo anti-VEGF que reacciona sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), la etapa de selección puede comprender:
(a) poner en contacto una muestra de VEGF con unas cantidades efectivas del anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) y un anticuerpo candidato; y
(b) determinar la capacidad del anticuerpo candidato para reducir sustancialmente la unión del anticuerpo 2C3 a la muestra de VEGF, en la que la capacidad de un anticuerpo candidato para reducir sustancialmente la unión del anticuerpo 2C3 a la muestra de VEGF es indicativa de un anticuerpo anti-VEGF que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
La etapa de selección puede comprender además:
(a) poner en contacto una primera muestra de VEGF con una cantidad de unión efectiva del anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) y determinar la cantidad de 2C3 que se une al VEGF;
(b) poner en contacto una segunda muestra de VEGF con una cantidad de unión efectiva del anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) en combinación con una cantidad competitiva efectiva de un anticuerpo candidato y determinar la cantidad de 2C3 que se une al VEGF en presencia del anticuerpo candidato; e
(c) identificar un anticuerpo anti-VEGF que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) mediante la selección de un anticuerpo candidato que reduce la cantidad de 2C3 que se une al VEGF en, preferiblemente, como mínimo, un 80% aproximadamente.
Como se utilizan animales no humanos para la inmunización, los anticuerpos monoclonales que se obtienen de tal hibridoma frecuentemente tendrán una naturaleza no humana. Tales anticuerpos se pueden, opcionalmente, someter a un proceso de humanización, xenoinjerto o mutación, como se conoce por aquellos entendidos en la técnica y posteriormente dados a conocer en la presente. Alternativamente, se pueden utilizar animales transgénicos, tales como ratones, que comprenden una biblioteca de genes de anticuerpos humanos. La inmunización de tales animales, por tanto, dará lugar directamente a la generación de anticuerpos humanos adecuados.
Después de la producción de una célula productora de anticuerpos adecuada, más preferiblemente un hibridoma, tanto si produce anticuerpos humanos como no humanos, los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos monoclonales se pueden clonar para preparar un anticuerpo monoclonal "recombinante". Se puede utilizar cualquier técnica de clonación recombinante, incluyendo la utilización de PCR^{TM} para preparar la síntesis de las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos. Por lo tanto, incluso métodos adicionales preparativos de anticuerpos monoclonales adecuados incluyen aquellos que comprenden la utilización de células productoras de anticuerpos como se indica a continuación:
(a) obtener, como mínimo, una primera molécula o segmento adecuados de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-VEGF de una célula productora de anticuerpos anti-VEGF adecuada, preferiblemente de un hibridoma; y
(b) expresar la molécula o el segmento de ácido nucleico en una célula huésped recombinante para obtener un anticuerpo monoclonal recombinante anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de acuerdo con la presente invención.
Sin embargo, se dispone de otras técnicas recombinantes potentes que son idealmente adecuadas para la preparación de anticuerpos monoclonales recombinantes. Tales técnicas recombinantes incluyen los métodos preparativos de anticuerpos monoclonales basados en una biblioteca de fagémidos que comprenden:
(a) inmunizar un animal mediante la administración a un animal de, como mínimo, una dosis, y, opcionalmente, más de una dosis, de una cantidad inmunogénicamente eficaz de una muestra de VEGF inmunogénica (tal como una muestra de VEGF humano intacta);
(b) preparar una biblioteca combinatoria de fagémidos de inmunoglobulina que expresan ARN aislado de las células productoras de anticuerpo, preferiblemente del bazo, del animal inmunizado;
(c) seleccionar de la biblioteca de fagémidos, como mínimo, un primer clon que expresa, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que reacciona sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595);
(d) obtener ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de, como mínimo, un primer clon seleccionado y expresar los ácidos nucleicos en una célula huésped recombinante para proporcionar, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2; y preferiblemente,
(e) obtener, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 expresado por los ácidos nucleicos obtenidos de, como mínimo, un primer clon seleccionado.
Una vez más, en tales técnicas basadas en bibliotecas de fagémidos, se pueden utilizar animales transgénicos que contienen bibliotecas de genes de anticuerpos humanos, y de este modo, que producen anticuerpos monoclonales humanos recombinantes.
Sin tener en cuenta la manera de preparación de un primer segmento de ácido nucleico de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, se pueden preparar fácilmente más segmentos adecuados de ácido nucleico de anticuerpo mediante técnicas de biología molecular estándares. Para confirmar que cualquier segmento de ácido nucleico de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de segunda generación, variante o mutante es adecuado para utilizar en la presente invención, se hará una prueba al segmento de ácido nucleico para confirmar la expresión de un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, también se hará una prueba al segmento de ácido nucleico de segunda generación, variante o mutante para confirmar la hibridación bajo condiciones de hibridación estándares, más preferiblemente, condiciones de hibridación rigurosas estándares. Unas condiciones de hibridación adecuadas, a título de ejemplo, incluyen la hibridación en un 7% aproximadamente de dodecil sulfato sódico (SDS), Na_{3}PO_{4}0,5 M, EDTA 1 mM aproximadamente a unos 50ºC, y lavar con un 1% aproximadamente de SDS a unos 42ºC.
Como una variedad de anticuerpos monoclonales recombinantes, tanto de origen humano como no humano, se pueden preparar fácilmente, los métodos de tratamiento de la presente invención se pueden llevar a cabo proporcionando al animal o al paciente, como mínimo, un primer segmento de ácido nucleico que expresa una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 en el paciente. El "segmento de ácido nucleico que expresa un anticuerpo basado en 2C3 o similar al 2C3, anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2", generalmente, estará en forma de, como mínimo, una construcción de expresión, y puede estar en forma de una construcción de expresión comprendida dentro de un virus o dentro de una célula huésped recombinante. Los vectores de terapia génica preferidos de la presente invención, generalmente, serán vectores virales, tales como los comprendidos dentro de un retrovirus recombinante, virus de herpes simplex (HSV), adenovirus, virus adenoasociados (AAV), citomegalovirus (CMV), y similares.
La presente invención, además, proporciona composiciones que comprenden, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 purificado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente, uno que se une a, esencialmente, el mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). Tales composiciones pueden ser composiciones farmacéuticamente aceptables o composiciones para la utilización en estudios de laboratorio. En términos de composiciones farmacéuticos, éstos se pueden formular preferiblemente para administración parental, tal como para administración intravenosa.
La presente invención proporciona una cantidad de métodos y usos de los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, incluyendo los anticuerpos 2C3 de reactividad cruzada, los anticuerpos similares al 2C3 o los anticuerpos basados en 2C3. En todos los métodos, los términos "un" y "una" se utilizan en el sentido que representan "como mínimo uno/a", "como mínimo un/a primer/a", "uno/a o más" o "una pluralidad" de etapas de los métodos enumerados, excepto donde se indique específicamente. Esto es particularmente relevante para las etapas de administración en los métodos de tratamiento. De este modo, no sólo se pueden utilizar diferentes dosis con la presente invención, sino que cantidades diferentes de dosis, por ejemplo, se pueden utilizar inyecciones hasta incluso inyecciones múltiples. Se pueden utilizar agentes terapéuticos combinados, administrados antes, después o durante la administración del anticuerpo terapéutico anti-VEGF.
Se proporcionan varios métodos y usos útiles in vitro que tienen importantes implicaciones biológicas. Los primeros proporcionados son métodos sobre, y utilizaciones en, la unión del VEGF, que, generalmente, comprende poner en contacto de manera efectiva un compuesto que comprende el VEGF, preferiblemente un VEGF libre (no enlazado a receptor) con, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
Se proporcionan métodos sobre, y usos en, la detección de VEGF, que, generalmente, comprenden poner en contacto un compuesto sospechoso de contener VEGF con, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), bajo condiciones efectivas para permitir la formación de los complejos VEGF/anticuerpo y detectar los complejos así formados. También se proporcionan métodos de detección y utilizaciones que se pueden utilizar en conexión con muestras biológicas, por ejemplo, en el diagnóstico de la angiogénesis y tumores, y en los kits de diagnóstico basados en éste.
La presente invención proporciona métodos sobre, y usos en, preferencial o específicamente, la inhibición de la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2, que, generalmente, comprende poner en contacto, en presencia del VEGF, una población de células o tejidos que incluye células endoteliales que expresan el VEGFR2 (KDR/Flk-1) con un compuesto que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste, bajo condiciones efectivas para inhibir la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2.
Se proporcionan métodos sobre, y usos en, la inhibición significativa de la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2, sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1. Estos métodos comprenden poner en contacto, en presencia del VEGF, una población de células o tejidos que incluye células endoteliales que expresan el VEGFR2 (KDR/Flk-1) y el VEGFR1 (Flt-1) con un compuesto que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente un anticuerpo anti-VEGF que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste, bajo condiciones efectivas para inhibir la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2, sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1.
Existen métodos y usos adicionales de la presente invención para analizar las funciones biológicas de los receptores del VEGF denominados VEGFR2 y VEGFR1, que comprenden las etapas de:
(a) poner en contacto un compuesto biológico o tejido que comprende el VEGF y una población de células que expresan los receptores VEGFR2 (KDR/Flk-1) y VEGFR1 (Flt-1) con un compuesto que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente un anticuerpo anti-VEGF que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste; y
(b) determinar el efecto del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 en, como mínimo, una primera respuesta biológica al VEGF, en la que:
(i)
una alteración en una respuesta biológica en presencia del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 es indicativa de una respuesta mediada por el receptor VEGFR2, y
(ii)
el mantenimiento de una respuesta biológica en presencia del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 es indicativo de una respuesta mediada por el receptor VEGFR1.
Se proporcionan métodos y usos para inhibir la proliferación, incluyendo aquellos que específicamente inhiben la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por el VEGF, que, generalmente, comprende poner en contacto una población de células o tejidos que incluye una población de células endoteliales y VEGF con un compuesto que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, bajo condiciones efectivas para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por el VEGF.
Se proporcionan métodos sobre, y usos en, la inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por el VEGF, sin inhibir significativamente la quimiotaxis de macrófagos inducida por el VEGF, que, generalmente, comprende poner en contacto una población de células o tejidos que contiene células endoteliales, macrófagos y VEGF con un compuesto que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo anti-VEGF, bajo condiciones efectivas para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por el VEGF, sin inhibir significativamente la quimiotaxis de macrófagos inducida por el VEGF.
Además se proporcionan métodos sobre, y usos en, la inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por el VEGF y, opcionalmente, la angiogénesis, sin inhibir significativamente la estimulación por el VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos. Los métodos, generalmente, comprenden poner en contacto una población de células o tejidos que contiene células endoteliales, y, como mínimo, una de macrófagos, osteoclastos o condroclastos, con un compuesto que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo, bajo condiciones efectivas para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por el VEGF o la angiogénesis, sin inhibir significativamente la estimulación por el VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos.
Los métodos y usos anteriores se pueden llevar a cabo in vitro e in vivo, en este último caso, en el que los tejidos y las células se localizan en el interior de un animal y el anticuerpo anti-VEGF se administra al animal. En ambos casos, los métodos y usos se convierten en métodos y usos para inhibir la angiogénesis, que comprenden poner en contacto un tejido que comprende, o una población de vasos sanguíneos potencialmente angiogénicos, es decir, aquellos expuestos potencialmente al VEGF, con un compuesto antiangiogénico que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste, bajo condiciones efectivas para inhibir la angiogénesis.
Allí donde las poblaciones de vasos sanguíneos potencialmente angiogénicos se mantienen ex vivo, la presente invención tiene utilidad en los programas de descubrimiento de fármacos. Los ensayos de screening in vitro, con controles fiables positivos y negativos, son útiles como una primera etapa en el desarrollo de fármacos para inhibir o promover la angiogénesis, así como en la descripción de información adicional del proceso angiogénico. Allí donde la población de vasos sanguíneos potencialmente angiogénicos se localiza en el interior de un animal o un paciente, el compuesto antiangiogénico se administra al animal como una forma de terapia.
"Las cantidades biológicamente efectivas", en términos de cada uno de los métodos anteriores de inhibición son, por tanto, cantidades de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, opcionalmente, anticuerpos basados en 2C3, efectivas para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por el VEGF; para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por el VEGF, sin inhibir significativamente la quimiotaxis de macrófagos inducida por el VEGF; para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por el VEGF o la angiogénesis, sin inhibir significativamente la estimulación por el VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos; y, sobretodo, para reducir la proliferación y/o migración de células endoteliales vasculares de una manera efectiva para así inhibir el crecimiento de los vasos sanguíneos o la angiogénesis.
La presente invención, de este modo, proporciona métodos sobre, y usos en, la inhibición de la angiogénesis inducida por el VEGF y, preferiblemente, el tratamiento de una enfermedad angiogénica, sin inhibir significativamente la estimulación por el VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos. Los métodos, generalmente, comprenden poner en contacto una población de células o tejidos que contienen células endoteliales, y, como mínimo, una de macrófagos, osteoclastos o condroclastos, con un compuesto que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo, bajo condiciones efectivas para inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF y para el tratamiento de enfermedades angiogénicas, sin inhibir significativamente la estimulación por el VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos.
Además se proporcionan métodos sobre, y usos en, la inhibición de la angiogénesis inducida por el VEGF y, preferiblemente, el tratamiento de una enfermedad antiangiogénica, sin causar efectos colaterales significativos en el metabolismo del hueso. Los métodos, generalmente, comprenden poner en contacto un tejido o una población vasos angiogénicos que contienen células endoteliales vasculares, y, como mínimo, una de macrófagos, osteoclastos o condroclastos, con un compuesto que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo, bajo condiciones efectivas para inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF y para tratar una enfermedad antiangiogénica sin causar efectos colaterales significativos en el metabolismo del hueso al no afectar significativamente las actividades de macrófagos, osteoclastos o condroclastos.
Se proporcionan screenings (in vitro) y terapias (in vivo) de fármacos antiangiogénicos en términos de animales y pacientes que sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar, cualquier enfermedad o desorden caracterizado por una vascularización indeseada, inapropiada, aberrante, excesiva y/o patológica. Es bien conocido por aquellos con una habilidad normal en la técnica que, como una angiogénesis aberrante tiene lugar en un amplio conjunto de enfermedades y desórdenes, una terapia antiangiogénica dada, una vez se ha mostrado efectiva en cualquier sistema modelo aceptable, se puede utilizar para tratar todo el conjunto de enfermedades y desórdenes relacionados con la angiogénesis.
Los métodos y usos de la presente invención están particularmente dirigidos para el uso en animales y pacientes que sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar, cualquier forma de tumor vascularizado; degeneración macular, incluyendo la degeneración macular relacionada con la edad; artritis, incluyendo la artritis reumatoide; aterosclerosis y placas ateroscleróticas; retinopatía diabética y otras retinopatías; hiperplasias tiroideas, incluyendo la enfermedad de Grave; hemangioma; glaucoma neovascular; y psoriasis.
Los métodos y usos de la presente invención también están dirigidos para el tratamiento de animales y pacientes que sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar, malformaciones arteriovenosas (AVM), meningioma, y restenosis vascular, incluyendo restenosis tras angioplastia. Otros objetivos pretendidos de los métodos y usos terapéuticos son animales y pacientes que sufren, o tienen el riesgo de desarrollar, angiofibroma, dermatitis, endometriosis, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, enfermedades y desórdenes inflamatorios, granuloma piogénico, escleroderma, sinovitis, tracoma y adhesiones vasculares.
Como se da a conocer en la Patente U.S.A. No. 5.712.291, cada uno de los grupos de tratamientos anteriores, en cierta manera preferidos, no son de ningún modo exhaustivos de los tipos de condiciones que se tratan en la presente invención. La Patente U.S.A. No. 5.712.291 identifica una cantidad de otras condiciones que pueden ser tratadas de forma efectiva por un agente terapéutico antiangiogénico; la intención de mostrar que el tratamiento de todas las enfermedades angiogénicas representa un concepto unificado, una vez se ha dado a conocer y reivindicado una categoría definida de compuestos que inhiben la angiogénesis (en el presente caso, anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, opcionalmente aquellos que se unen sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595)); y la intención de mostrar que es posible el tratamiento de todas las enfermedades angiogénicas mediante datos de sólo un sistema modelo único.
Incluso en aspectos adicionales, y tal como se da a conocer en la Patente U.S.A. No. 5.712.291, los métodos y usos dados a conocer están dirigidos para el tratamiento de animales y pacientes que sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar, proliferación anormal de tejido fibrovascular, acné rosáceo, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, oclusión arterial, queratitis atópica, úlceras bacterianas, la enfermedad de Bechet, tumores de sangre, enfermedad obstructiva de carótida, quemaduras químicas, neovascularización coroidal, inflamación crónica, desprendimiento de retina crónico, uveítis crónica, vitritis crónica, sobreuso de lentes de contacto, rechazo de xenoinjerto corneal, neovascularización corneal, neovascularización de xenoinjerto corneal, la enfermedad de Crohn, la enfermedad de Eale, queratoconjuntivitis epidémica, úlceras fúngicas, infecciones de Herpes simplex, infecciones de Herpes zoster, síndromes de hiperviscosidad, el sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneración de lípidos, la enfermedad de Lyme, queratolisis marginal, la úlcera de Mooren, infecciones por Micobacterias a parte de la lepra, miopía, enfermedad neovascular ocular, agujeros ópticos, el síndrome de Osler-Weber (Osler-Weber-Rendu), osteoartritis, la enfermedad de Paget, pars planitis, penfigoide, filectenulosis, poliarteritis, complicaciones post-laser, infecciones por protozoos, pseudoxantoma elástico, queratitis sicca pterigium, queratotomía radial, neovascularización retinal, retinopatía de premadurez, fibroplasias retrolentales, sarcoide, escleritis, anemia de la célula falciforme, el síndrome de Sogrens, tumores sólidos, la enfermedad de Stargart, la enfermedad de Steven-Johnson, queratitis límbica superior, sífilis, lupus sistémico, la degeneración marginal de Terrien, toxoplasmosis, traumatismos, tumores del sarcoma de Ewing, tumores de neuroblastoma, tumores de osteosarcoma, tumores de retinoblastoma, tumores de rabdomiosarcoma, colitis ulcerosas, oclusión de vena, deficiencia de Vitamina A y la sarcoidosis de Wegener.
La presente invención también proporciona métodos y usos para el tratamiento de animales y pacientes que sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar, artritis, al igual que el tratamiento de la artritis utilizando agentes inmunológicos descritos en la Patente U.S.A. No. 5.753.230. La Patente No. 5.972.922 incluso ejemplifica la aplicación de estrategias antiangiogénicas para el tratamiento de angiogénesis indeseada asociada con diabetes, enfermedades parasitarias, curación de heridas deformes, hipertrofia tras cirugía, quemaduras, heridas o traumatismos, inhibición del crecimiento capilar, inhibición de la ovulación y la formación del corpus luteum, inhibición de la implantación e inhibición del desarrollo del embrión en el útero. Por lo tanto, todas las condiciones anteriores se contemplan para el tratamiento mediante los métodos y usos de la presente invención.
La Patente U.S.A. No. 5.639.757 se incorpora específicamente en la presente por referencia y ejemplifica el uso de estrategias antiangiogénicas para el tratamiento general de rechazos de xenoinjertos. En la Patente WO 98/45331 se describen el tratamiento de inflamación de pulmón, síndrome nefrótico, preeclamsia, efusión pericardial, tal como la asociada con pericarditis, y efusión pleural utilizando estrategias antiangiogénicas basadas en la inhibición del VEGF. Los animales o pacientes que sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar, cualquiera de las condiciones anteriores se contemplan, por lo tanto, para el tratamiento mediante métodos y usos de la presente invención.
Como se da a conocer en la Patente WO 98/16551, las moléculas biológicas que antagonizan la función del VEGF también son adecuadas para el uso en el tratamiento de enfermedades y desórdenes caracterizados por una permeabilidad vascular no deseada. Por consiguiente, los anticuerpos antagonizantes del VEGF, los métodos y usos de la presente invención son aplicables al tratamiento de animales y pacientes que sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar, enfermedades y desórdenes caracterizados por una permeabilidad vascular no deseada, por ejemplo, edema asociado con tumores cerebrales, ascitis asociada con malignidades, el síndrome de Meigs, inflamación del pulmón, síndrome nefrótico, efusión pericardial y efusión pleural y similares.
A pesar de que el tratamiento de todas las enfermedades anteriores es posible dentro de la presente invención unificada, un aspecto particularmente preferido de los métodos y usos de la presente invención es la aplicación de terapias antiangiogénicas a animales y pacientes que sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar, un tumor sólido vascular, un tumor metastásico o metástasis de un tumor primario.
Además se proporcionan métodos sobre, y usos en, la inhibición de la angiogénesis inducida por el VEGF y, preferiblemente, el empleo de un antitumoral o el efecto mejorado de un antitumoral sin inhibir significativamente la estimulación por el VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos. Los métodos, generalmente, comprenden poner en contacto un tejido, un medio tumoral o una población vasos angiogénicos que contienen células endoteliales vasculares, y, como mínimo, una de macrófagos, osteoclastos o condroclastos, con un compuesto que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo, bajo condiciones efectivas para inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF y para emplear un antitumoral o el efecto mejorado de un antitumoral sin inhibir significativamente la estimulación por el VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos.
Existen métodos dados a conocer sobre, y usos en, el tratamiento de una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, que comprenden la administración, a un animal o un paciente con dicha enfermedad o cáncer, de una cantidad efectiva terapéuticamente de, como mínimo, un primer compuesto farmacéutico que comprende un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno o un inmunoconjugado de dicho anticuerpo anti-VEGF.
Esta descripción une los métodos antiangiogénicos que utilizan anticuerpos desnudos o no conjugados y fragmentos de éstos, y métodos de marcaje vascular que utilizan inmunoconjugados en los que el anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de éste, está acoplado operativamente a un agente terapéutico. A menos que se afirme específicamente lo contrario o se aclare en términos científicos, los términos "anticuerpo y fragmentos de éste", como se utiliza en la presente, por tanto, representan un anticuerpo o fragmento "no conjugado o desnudo", el cual no se une a otro agente, particularmente, un agente de diagnóstico o terapéutico. Estas definiciones no excluyen modificaciones del anticuerpo, tales como, sólo como ejemplo, modificaciones para mejorar la vida biológica media, la afinidad, la avidez u otras propiedades del anticuerpo, o combinaciones del anticuerpo con otros efectores.
Los métodos y usos de tratamiento antiangiogénico dados a conocer también abarcan el uso tanto de anticuerpos no conjugados o desnudos como de inmunoconjugados. En los métodos de tratamiento antiangiogénico basados en inmunoconjugados, el anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de éste, preferiblemente, está acoplado operativamente a un segundo agente antiangiogénico (siendo el primer agente antiangiogénico el propio anticuerpo anti-VEGF). Los agentes antiangiogénicos unidos pueden ser aquellos que tienen un efecto antiangiogénico directo o indirecto.
Los métodos y usos de tratamiento antiangiogénico comprenden la administración, a un animal o un paciente con una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, de una cantidad efectiva terapéuticamente de, como mínimo, un primer compuesto farmacéutico que comprende, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no conjugado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). Igualmente, el anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, el tratamiento de cáncer metastásico comprenden la administración, a un animal o un paciente con cáncer metastásico, de una cantidad efectiva terapéuticamente de, como mínimo, un primer compuesto farmacéutico que comprende, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no conjugado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). Métodos adicionales son aquellos en los que el anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, la reducción de la metástasis de un cáncer primario comprenden la administración, de una cantidad efectiva terapéuticamente de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no conjugado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, a un animal o un paciente que sufre, o se trató para, un cáncer primario; en el que el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no conjugado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente, se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). De forma similar, el anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, el tratamiento de una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, comprenden además la administración, a un animal o un paciente con tal enfermedad, por ejemplo, un tumor vascularizado, de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no conjugado, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste, en una cantidad efectiva para inhibir la angiogénesis en el sitio de la enfermedad o el tumor vascularizado. Igualmente, el anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, el tratamiento de una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, comprenden además la administración, a un animal o un paciente con tal enfermedad o cáncer, de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no conjugado, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste, en una cantidad efectiva para inhibir la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1), inhibiendo así la angiogénesis en el sitio canceroso o de la enfermedad. El anticuerpo administrado se puede, alternativamente, asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, el tratamiento de una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, también comprenden la administración, a un animal o un paciente con un tumor vascularizado, de una cantidad efectiva terapéuticamente de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no conjugado, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste, en el que el anticuerpo anti-VEGF inhibe sustancialmente la unión del VEGF al receptor de VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1), sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor de VEGF, VEGFR1 (Flt-1). Igualmente, el anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Incluso métodos adicionales sobre, y usos en, el tratamiento de una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, comprenden la administración, a un animal o un paciente con tal enfermedad, cáncer o tumor vascularizado, de una cantidad efectiva terapéuticamente de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no conjugado, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste, en el que el anticuerpo anti-VEGF inhibe sustancialmente la unión del VEGF al receptor de VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1), sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor de VEGF, VEGFR1 (Flt-1), inhibiendo así la angiogénesis en el sitio de la enfermedad, el cáncer o el tumor vascularizado sin disminuir significativamente la quimiotaxis de macrófagos en el animal. El anticuerpo administrado se puede también asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Aún métodos adicionales sobre, y usos en, el tratamiento de una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, comprenden la administración, a un animal o un paciente con tal enfermedad, cáncer o tumor vascularizado, de una cantidad efectiva terapéuticamente de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no conjugado, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste, en el que el anticuerpo anti-VEGF inhibe sustancialmente la unión del VEGF al receptor de VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1), sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor de VEGF, VEGFR1 (Flt-1), inhibiendo así la angiogénesis en el sitio de la enfermedad, el cáncer o el tumor vascularizado sin reducir significativamente la actividad de los macrófagos, osteoclastos y/o condroclastos en el animal. Igualmente, el anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, el tratamiento de una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, además comprenden la administración, a un animal o un paciente con tal enfermedad, por ejemplo, un tumor vascularizado, de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no conjugado, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste, en una cantidad efectiva para inhibir la angiogénesis en el sitio de la enfermedad o el tumor vascularizado sin ejercer un efecto adverso significativo en el metabolismo óseo.
Los métodos y usos de los tratamientos antiangiogénicos anteriores, generalmente, implicarán la administración del compuesto efectivo farmacéuticamente, a un animal o un paciente, sistémicamente, tal como por vía transdérmica, intramuscular, inyección intravenosa y similares. Sin embargo, se aceptará cualquier forma de administración que permita al agente terapéutico localizar el sitio o sitios angiogénicos, incluyendo un tumor o células endoteliales vasculares intratumorales. Por lo tanto, otras formas adecuadas de liberación incluyen la vía oral, rectal, nasal, tópica, y vaginal. La Patente U.S.A. No. 5.712.291 además describe las diversas formas de administración que se pueden incluir en conexión con el tratamiento de una enfermedad o desorden angiogénico.
Para usos y métodos en el tratamiento de artritis, por ejemplo, se puede utilizar una administración intrasinovial, como se describe para otros agentes inmunológicos en la Patente U.S.A. No. 5.753.230. Para condiciones asociadas con el ojo, se contemplan la administración y formulaciones oftálmicas.
La "administración", tal como se usa en la presente, representa el suministro o liberación de agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 en una(s) cantidad(es) y durante un período de tiempo(s) efectivo(s) para ejercer los efectos antiangiogénicos y/o antitumorales. Se prefiere, generalmente, la administración pasiva de agentes terapéuticos proteináceos, en parte, por su simplicidad y reproducibilidad.
Sin embargo, el término "administración" se usa en la presente para referirse a cualquiera y todos los medios por los que los agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 se liberan o, de otra manera, se proporcionan a la vasculatura tumoral. La "administración", por tanto, incluye el suministro de células que producen agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 de una manera efectiva, para dar lugar a la liberación en el tumor. En tales realizaciones, puede ser deseable formular o empaquetar células en una membrana permeable, estructura o artilugio implantable selectivamente, generalmente, uno que se pueda eliminar para cesar la terapia. Se preferirá, generalmente, la administración exógena del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o similares al 2C3, ya que representa un método no invasivo que permite a la dosis estar monitorizada y controlada muy de cerca.
Los métodos y usos terapéuticos también se extienden al suministro de ácidos nucleicos que codifican agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 de una manera efectiva para dar lugar a su expresión en las proximidades del tumor o su localización en el tumor. Se puede emplear cualquier técnica de terapia génica, tal como la liberación de ADN desnudo, genes y vectores recombinantes, liberación basada en las células, incluyendo la manipulación ex vivo de células de pacientes, y similares.
En realizaciones adicionales, se dan a conocer métodos sobre, y usos en, la liberación de agentes de diagnóstico o terapéuticos seleccionados a vasos sanguíneos angiogénicos asociados con la enfermedad. Preferiblemente, se utilizan dichas realizaciones para la liberación de agentes de diagnóstico o terapéuticos seleccionados al tumor o a la vasculatura intratumoral o al estroma, y comprende la administración, a un animal o un paciente, que tiene un tumor vascularizado, de una cantidad efectiva biológicamente de un compuesto que comprende, como mínimo, un primer inmunoconjugado en el que un agente de diagnóstico o terapéutico está acoplado operativamente a un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
A pesar de que no es necesario entender el mecanismo de acción subyacente en los aspectos sobre de marcaje de la presente invención para la práctica de dichas realizaciones, se cree que los anticuerpos de la presente invención liberan agentes unidos a la vasculatura tumoral y angiogénica mediante la unión a VEGF unido al VEGFR1 expresado en ella. Estos métodos y usos de la presente invención, de este modo, tienen que ver con la liberación de agentes de diagnóstico o terapéuticos seleccionados a vasos sanguíneos angiogénicos, al tumor o a la vasculatura intratumoral, y comprenden la administración, a un animal o un paciente, que necesita tratamiento, de una cantidad efectiva biológicamente de un compuesto que comprende un inmunoconjugado en el que un agente de diagnóstico o terapéutico está acoplado operativamente a, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), de una manera efectiva para permitir la unión del anticuerpo al VEGF unido al VEGFR1 expresado, sobreexpresado o regulado a la alta en los vasos sanguíneos angiogénicos, el tumor o la vasculatura intratumoral, liberando, de este modo, el agente diagnóstico o terapéutico al VEGF-VEGFR1 en los vasos sanguíneos angiogénicos, el tumor o la vasculatura intratumoral.
La liberación de agentes terapéuticos seleccionados al tumor o la vasculatura intratumoral o el estroma actúa para detener el flujo sanguíneo, o específicamente detener el flujo sanguíneo, en la vasculatura tumoral; para destruir, o específicamente destruir, la vasculatura tumoral; y para inducir la necrosis, o la necrosis específica en un tumor. Estos métodos y usos se pueden, de este modo, resumir como métodos para el tratamiento de un animal o un paciente, que tiene un tumor vascularizado, que comprende la administración, a un animal o un paciente, de una cantidad efectiva terapéuticamente de, como mínimo, un primer compuesto farmacéutico que comprende, como mínimo, un primer inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste, acoplado operativamente al agente terapéutico.
Las "cantidades efectivas terapéuticamente" son cantidades de inmunoconjugados del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 efectivas para eliminar, específicamente como mínimo, una parte del tumor o de las células endoteliales vasculares intratumorales; para inducir específicamente la apoptosis en, como mínimo, una parte del tumor o de las células endoteliales vasculares intratumorales; para provocar específicamente la coagulación en, como mínimo, una parte del tumor o de los vasos sanguíneos intratumorales; para ocluir o destruir específicamente, como mínimo, una parte de los vasos de transporte sanguíneo del tumor; para inducir específicamente la necrosis en, como mínimo, una parte de un tumor; y/o para inducir la regresión o remisión del tumor tras la administración a animales o pacientes seleccionados. Dichos efectos se consiguen mientras se muestra algo de unión o ninguna a, o algo de eliminación o ninguna de, las células endoteliales vasculares en tejidos normales y sanos; algo de coagulación o nada en la oclusión o destrucción de vasos sanguíneos en tejidos normales y sanos; y la ejecución de efectos colaterales adversos controlables o negligibles en tejidos normales y sanos del animal o paciente.
Los términos "preferencialmente" y "específicamente", tal como se usan en la presente, en el contexto de provocar la coagulación en, o destruir, la vasculatura tumoral, y/o en el contexto de unirse al estroma tumoral y/o causar la necrosis del tumor, de este modo, representan que los inmunoconjugados del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 actúan para conseguir la unión estromal, la coagulación, la destrucción y/o la necrosis del tumor que está sustancialmente confinada al estroma tumoral, la vasculatura y el sitio del tumor, y no se extiende sustancialmente para causar la coagulación, la destrucción y/o la necrosis del tejido en tejidos normales y sanos del animal o sujeto. La estructura y la función de las células y tejidos sanos, por tanto, se mantienen sustancialmente íntegras durante la práctica de la presente invención.
A pesar de que los anticuerpos de la presente invención liberan de forma efectiva agentes a la vasculatura tumoral y angiogénica mediante la unión al VEGF en asociación con el VEGFR1, existen otros métodos y usos que operan en base a la liberación de un agente terapéutico al estroma tumoral, en el que ejerce un efecto terapéutico en los vasos próximos. Estos métodos y usos comprenden la administración, a un animal o un paciente con un tumor vascularizado, de un inmunoconjugado que comprende un agente terapéutico operativamente acoplado a, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), en una cantidad efectiva para unir el inmunoconjugado al VEGF no unido al receptor en el interior del estroma tumoral.
Estos métodos y usos comprenden la administración, a un animal o un paciente con un tumor vascularizado, de un inmunoconjugado que comprende un agente terapéutico acoplado operativamente a, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), en una cantidad efectiva para localizar el inmunoconjugado en el interior del estroma tumoral, de manera que el agente terapéutico unido ejerza un efecto antitumoral en los alrededores de la vasculatura tumoral y/o de las células tumorales.
Los composiciones de la presente invención, así como los métodos y usos dados a conocer, de este modo, se extienden a composiciones que comprenden inmunoconjugados del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, que comprenden, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), acoplado operativamente a, como mínimo, un primer agente de diagnóstico o terapéutico. Los conjugados terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 se unen preferiblemente a agentes radioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis, fármacos antitubulina, agentes citotóxicos o anticelulares, o coagulantes (factores de coagulación).
La presente invención, de este modo, proporciona un conjunto de anticuerpos conjugados y fragmentos de éstos en los que el anticuerpo está acoplado operativamente a, como mínimo, un primer agente de diagnóstico o terapéutico. El término "inmunoconjugado" se usa ampliamente para definir la asociación operativa del anticuerpo con otro agente efectivo y no tiene la intención de referirse exclusivamente a cualquier tipo de asociación operativa, y no está particularmente limitada a la "conjugación" química. Se contemplan particularmente las proteínas de fusión recombinantes. El modo de unión será adecuado, siempre y cuando la liberación o el agente marcador sea capaz de unirse a la diana y el agente de diagnóstico o terapéutico sea suficientemente funcional tras la liberación.
También se contempla el acoplamiento de agentes por medio de fracciones de carbohidratos en los anticuerpos. La glicosilación, tanto de unión con O como con N, tiene lugar espontáneamente en los anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes, si se desea, se pueden modificar para recrear o crear puntos de glicosilación adicional, que simplemente se consigue mediante el diseño de las secuencias de aminoácidos apropiadas (tales como Asn-X-Ser, Asn-X-Thr, Ser, o Thr) en la secuencia primaria del anticuerpo.
Actualmente, los agentes preferidos para el uso en conjugados terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 y los usos y métodos relacionados, son aquellos que complementan o mejoran los efectos del anticuerpo y/o aquellos seleccionados para un tipo de tumor o paciente particular. Los "agentes terapéuticos que complementan o mejoran los efectos del anticuerpo" incluyen agentes radioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis y fármacos antitubulina, alguno o más de uno de los cuales se prefieren para su uso en la presente.
El acoplamiento o asociación de los agentes preferidos con anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o basados en 2C3, permite obtener "inmunoconjugados", donde tales inmunoconjugados frecuentemente tienen propiedades antitumorales mejoradas o incluso sinergísticas. Actualmente, los agentes antiangiogénicos preferidos para el uso de esta manera son angiostatina, endostatina, cualquiera de las angiopoyetinas, vasculostatina, canstatina y maspina. Actualmente, los fármacos antitubulina preferidos incluyen colquicina, taxol, vinblastina, vincristina, vindescina y una o más de las combretastatinas.
El uso de agentes citotóxicos y anticelulares da lugar a "inmunotoxinas" del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, mientras que el uso de factores de coagulación da lugar a "coaguligandos" del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3. También se contempla el uso de, como mínimo, dos agentes terapéuticos, tales como combinaciones de uno o más agentes radioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis, fármacos antitubulina, agentes citotóxicos o anticelulares, y factores de coagulación.
En ciertas aplicaciones, los agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 estarán acoplados operativamente a agentes citotóxicos, citostáticos o, de otra manera, anticelulares que tienen la capacidad de eliminar o reprimir el crecimiento o la división de células endoteliales. Entre los agentes anticelulares adecuados se incluyen agentes quimioterapéuticos, así como citotoxinas y agentes citostáticos. Los agentes citostáticos son aquellos que, generalmente, alteran el ciclo celular natural de una célula diana, preferiblemente de manera que se saca la célula del ciclo celular.
Algunos ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen: esteroides, citocinas, antimetabolitos, tales como citosina arabinosida, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina; antraciclinas; mitomicina A; alcaloides de vinca; antibióticos; demecolcina; etoposida; mitramicina; y agentes alquilantes antitumorales, tales como clorambucil o melfalán. De hecho, se podría utilizar cualquiera de los agentes dados a conocer en la presente en la Tabla C. Algunos agentes anticelulares preferidos son los inhibidores de la síntesis de ADN, tales como daunorubicina, doxorubicina, adriamicina, y similares.
En ciertas aplicaciones terapéuticas, se preferirán fracciones de toxinas, en comparación con otros agentes potenciales, debido a la muy elevada capacidad de la mayoría de toxinas de liberar un efecto exterminador de células. Por lo tanto, algunos agentes anticelulares preferidos para las construcciones del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o del anticuerpo basado en 2C3 son toxinas derivadas de bacterias, hongos o plantas. Algunas toxinas de ejemplo incluyen epipodofilotoxinas; endotoxina bacteriana o una fracción de lípido A de endotoxina bacteriana; proteínas inactivadoras de ribosoma, tales como saporina o gelonina; a-sarcina; aspergilina, restrictocina; ribonucleasas, tal como la ribonucleasa placentaria; toxina de la difteria y exotoxina de pseudomonas.
Las toxinas preferidas son las toxinas de cadena A, tal como la cadena A de la ricina. La fracción de toxina que más se prefiere es, frecuentemente, la cadena A de la ricina que ha sido tratada para modificar o eliminar los residuos de carbohidratos, llamada "cadena A desglicosilada" (dgA). Se prefiere la cadena A desglicosilada de la ricina a causa de su extrema potencia, vida media más larga, y porque es económicamente viable para fabricar en un grado y escala clínica. También se puede utilizar cadena A de ricina truncada y/o recombinante.
Para el marcaje tumoral y el tratamiento con inmunotoxinas, las siguientes patentes y solicitudes de patentes complementan adicionalmente las presentes enseñanzas respecto a los agentes citotóxicos y anticelulares: Solicitudes U.S.A. con Serie No. 07/846.349; 08/295.868 (Patente U.S.A. No. 6.004.554); 08/205.330 (Patente U.S.A. No. 5.855.866); 08/350.212 (Patente U.S.A. No. 5.965.132); 08/456.495 (Patente U.S.A. No. 5.776.427); 08/457.487 (Patente U.S.A. No. 5.863.538); 08/457.229 y 08/457.031 (Patente U.S.A. No. 5.660.827) y 08/457.869 (Patente U.S.A. No. 6.051.230).
El anticuerpo basado en 2C3 u otro anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de la presente invención se pueden unir a un fármaco antitubulina. Un(os) "fármaco(s) antitubulina", como se usa en la presente, representa cualquier agente, fármaco, profármaco o combinación de éstos que inhibe la mitosis celular, preferiblemente mediante la inhibición directa o indirecta de las actividades de la tubulina necesarias para la mitosis celular, preferiblemente la polimerización o despolimerización de la tubulina.
Actualmente, los fármacos antitubulina preferidos para su uso en la presente son la colquicina; taxanos, tal como el taxol; alcaloides de vinca, tales como la vinblastina, vincristina y vindescina; y combretastatinas. Algunos ejemplos de combretastatinas son la combretastatina A, B y/o D, incluyendo A-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, B-1, B-2, B-3, B-4, D-1 y D-2 y formas de profármacos de éstas.
Los agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 pueden comprender un componente que es capaz de provocar la coagulación, es decir, un coagulante. Aquí, el anticuerpo diana se puede unir directamente o indirectamente, por ejemplo, a través de otro anticuerpo, a un factor que directamente o indirectamente estimula la coagulación.
Los factores de coagulación preferidos para tales usos son el Factor Tisular (TF) y los derivados del TF, tales como el TF truncado (tTF), el TF dimérico, trimérico, polimérico/multimérico, y el TF mutante deficiente en la capacidad para activar el Factor VII. Otros factores de coagulación adecuados incluyen los coagulantes dependientes de vitamina K, tales como el Factor II/IIa, el Factor VII/VIIa, el Factor IX/IXa y el Factor X/Xa; los factores de coagulación dependientes de vitamina K que carecen de la modificación Gla; el activador del Factor X del veneno de víbora de Russell; compuestos activadores de plaquetas, tales como el tromboxano A_{2} y la tromboxano A_{2} sintasa; e inhibidores de la fibrinolisis, tal como la \alpha2-antiplasmina.
El marcaje del tumor como diana y el tratamiento con coaguligandos se describe en las siguientes patentes y solicitudes de patente, cada una de las cuales incluso complementa adicionalmente las presentes enseñanzas respecto a coaguligandos y factores de coagulación: Solicitudes U.S.A. con Serie No. 07/846.349; 08/205.330 (Patente U.S.A. No. 5.855.866); 08/350.212 (Patente U.S.A. No. 5.965.132); 08/273.567; 08/482.369 (Patente U.S.A. No. 6 093 399); 08/485.482; 08/487.427 (Patente U.S.A. No. 6.004.555); 08/479.733 (Patente U.S.A. No. 5.877.289); 08/472.631; y 08/479.727 y 08/481.904 (Patente U.S.A. No. 6.036.955).
La preparación de inmunoconjugados e inmunotoxinas es, generalmente, bien conocida en la técnica (ver, por ejemplo, la Patente U.S.A. No. 4.340.535). Cada una de las siguientes patentes o solicitudes de patente incluso complementan adicionalmente las presentes enseñanzas respecto a la generación, purificación y uso de inmunotoxinas: Solicitudes U.S.A. con Serie No. 07/846.349; 08/295.868 (Patente U.S.A. No. 6.004.554); 08/205.330 (Patente U.S.A. No. 5.855.866); 08/350.212 (Patente U.S.A. No. 5.965.132); 08/456.495 (Patente U.S.A. No. 5.776.427); 08/457.487 (Patente U.S.A. No. 5.863.538); 08/457.229 y 08/457.031 (Patente U.S.A. No. 5.660.827) y 08/457.869 (Patente U.S.A. No. 6.051.230).
En la preparación de inmunoconjugados e inmunotoxinas, se pueden conseguir ventajas mediante el uso de ciertos enlazadores o "linkers". Por ejemplo, se prefieren, frecuentemente, los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que está "impedido" estéricamente, debido a su gran estabilidad in vivo, de este modo, previene la liberación de la fracción de toxina anteriormente a la unión en el sitio de acción. Generalmente, se desea tener un conjugado que permanezca intacto bajo las condiciones encontradas en cualquier sitio del cuerpo excepto en el sitio deseado de acción, en el cual es deseable que el conjugado tenga unas buenas características de "liberación".
Dependiendo del componente de toxina específico utilizado, puede ser necesario proporcionar un péptido espaciador que operativamente acople el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 y el componente de toxina, en el que el péptido espaciador es capaz de plegarse en una estructura de bucle de enlace disulfuro. La división proteolítica en el bucle produciría, a continuación, un polipéptido heterodimérico en el que el anticuerpo y el componente de toxina se unen mediante un enlace disulfuro único.
Cuando se utilizan otros componentes de toxinas, se puede proporcionar un péptido espaciador no divisible para acoplar operativamente el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 y el componente de toxina. Las toxinas que se pueden utilizar junto con péptidos espaciadores no divisibles son aquellas que pueden, ellas mismas, convertirse por división proteolítica, en una forma de enlace disulfuro citotóxica. Un ejemplo de dicho componente de toxina es un componente de la exotoxina de Pseudomonas.
Se pueden conjugar con éxito una variedad de agentes quimioterapéuticos y otros farmacológicos con agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3. Algunos ejemplos de agentes antineoplásticos que se han conjugado con anticuerpos incluyen la doxorubicina, la daunomicina, el metotrexato y la vinblastina. Además, se ha descrito el acoplamiento de otros agentes, tales como la neocarzinostatina, la macromicina, la trenimona y la \alpha-amanitina (ver Patentes U.S.A. Nos. 5.660.827; 5.855.866; y 5.965.132).
A la luz del trabajo previo de uno de los inventores presentes, actualmente, la preparación de coaguligandos se lleva a cabo también fácilmente. La asociación operativa de uno o más factores de coagulación con un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3, puede ser una unión directa, tal como las descritas anteriormente para las inmunotoxinas. Alternativamente, la asociación operativa puede ser un acoplamiento indirecto, tal como donde el anticuerpo está acoplado operativamente a una segunda región de unión, preferiblemente un anticuerpo o una región de unión al antígeno de un anticuerpo, que se une al factor de coagulación. El factor de coagulación debería acoplarse al anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o al anticuerpo basado en 2C3 en un lugar diferente de su sitio de coagulación funcional, particularmente donde se utilice una unión covalente para unir las
moléculas.
Los coaguligandos unidos indirectamente se basan, frecuentemente, en anticuerpos biespecíficos. La preparación de anticuerpos biespecíficos también es bien conocida en la técnica. Un método preparativo implica la preparación por separado de anticuerpos que tienen especificidad por el componente del tumor diana, por un lado, y el agente coagulante por el otro. A continuación, se generan los fragmentos peptídicos F(ab'\gamma)_{2} de los dos anticuerpos elegidos, seguido por una reducción de cada uno para proporcionar fragmentos separados Fab'\gamma_{SH}. A continuación los grupos SH, en una de las dos partes a unir, se alquilan con un agente de entrecruzamiento, tal como la o-fenilendimaleimida, para proporcionar grupos maleimida a una parte. Esta parte se puede entonces conjugar con la otra por medio de una unión tioéter, para obtener el heteroconjugado deseado F(ab'\gamma)_{2}. (Glennie y otros, 1987). También se pueden llevar a cabo otras aproximaciones, tal como el entrecruzamiento con SPDP o la proteína A.
Otro método para producir anticuerpos biespecíficos es por fusión de dos hibridomas para formar un cuadroma. Como se usa en la presente, el término "cuadroma" se utiliza para describir la fusión productiva de dos hibridomas de células B. Utilizando ahora técnicas estándares, dos anticuerpos que producen hibridomas se fusionan para obtener células hijas, y se seleccionan aquellas células que hayan mantenido la expresión de ambos grupos de genes de clonotipo de inmunoglobulinas.
Un método preferido para generar un cuadroma implica la selección de un mutante deficiente de enzima de, como mínimo, uno de los hibridomas parentales. A continuación, esta primera línea celular de hibridoma mutante se fusiona a células de un segundo hibridoma que había sido expuesto letalmente, por ejemplo, a yodoacetamida, impidiendo su supervivencia continuada. La fusión celular prevé el rescate del primer hibridoma mediante la adquisición del gen para su deficiencia enzimática del hibridoma tratado letalmente, y el rescate del segundo hibridoma a través de la fusión al primer hibridoma. Se prefiere, pero no es necesario, la fusión de inmunoglobulinas del mismo isotipo, pero de diferente subclase. Un anticuerpo de subclase mezclada permite el uso en caso de un ensayo alternativo para el aislamiento de un cuadroma preferido.
Para identificar los cuadromas preferidos se pueden utilizar las realizaciones de identificación por microtitulación, FACS, tinción con inmunofluorescencia, anticuerpos específicos de idiotipo, ensayos de competición de unión al antígeno, y otros métodos comunes en la técnica de la caracterización de anticuerpos. Después del aislamiento del cuadroma, los anticuerpos biespecíficos se purifican aparte de otros productos celulares. Esto se puede realizar mediante una variedad de procedimientos de aislamiento de anticuerpos, conocidos por aquellos entendidos en la técnica de la purificación de inmunoglobulinas (ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988). Se prefieren las columnas de proteína A o proteína G-sefarosa.
En la preparación de inmunoconjugados, inmunotoxinas y coaguligandos, se pueden emplear expresiones recombinantes. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 elegido, y el agente terapéutico, toxina o coagulante, están acoplados "in-frame" en un vector de expresión. La expresión recombinante, de este modo, da lugar a la traducción del ácido nucleico para obtener el inmunoconjugado deseado. Los entrecruzadores químicos y los puentes de avidina:biotina también pueden unir los agentes terapéuticos al anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o a los anticuerpos basados en 2C3.
Las siguientes patentes y solicitudes de patente incluso complementan adicionalmente las presentes enseñanzas respecto a la preparación, purificación y uso de coaguligandos, incluyendo coaguligandos de anticuerpos biespecíficos: Solicitudes U.S.A. con Serie No. 07/846.349; 08/205.330 (Patente U.S.A. No. 5.855.866); 08/350.212 (Patente U.S.A. No. 5.965.132); 08/273.567; 08/482.369 (Patente U.S.A. No. 6 093 399); 08/485.482; 08/487.427 (Patente U.S.A. No. 6.004.555); 08/479.733 (Patente U.S.A. No. 5.877.289); 08/472.631; y 08/479.727 y 08/481.904 (Patente U.S.A. No. 6.036.955).
Los inmunoconjugados con agentes radioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis, fármacos antitubulina, toxinas y coagulantes, que están preparados mediante conjugación química o expresión recombinante, pueden emplear un enlace liberable biológicamente y/o un enlazador o espaciador divisible selectivamente. Tales composiciones son, preferiblemente, razonablemente estables durante la circulación y se liberan, preferencialmente o específicamente, tras la liberación a la enfermedad o al lugar del tumor.
Algunos ejemplos preferidos son espaciadores sensibles a ácido, en los que se contemplan particularmente los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 unidos a colquicina o doxorubicina. Otros ejemplos preferidos son enlazadores peptídicos que incluyen un sitio de división para peptidasas y/o proteinasas que están, específica o preferencialmente, presentes o activas en el lugar de la enfermedad, tal como un medio tumoral. La liberación del inmunoconjugado a la enfermedad o el sitio del tumor da lugar a una división y a la liberación relativamente específica del factor de coagulación.
Tal como se describe y está permitido por la Patente U.S.A. No. 5.877.289 y se ejemplifica adicionalmente en la presente en la Tabla B2, se prefieren particularmente, los enlazadores peptídicos que incluyen un sitio de división para la uroquinasa, la pro-uroquinasa, la plasmina, el plasminógeno, el TGF\beta, la estafiloquinasa, la Trombina, el Factor IXa, el Factor Xa o la metaloproteinasa (MMP), tal como una colagenasa intersticial, una gelatinasa o una estromalisina.
El anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 también se puede derivatizar para introducir grupos funcionales que permitan el acoplamiento del agente(s) terapéutico(s) a través de un enlace liberable biológicamente. El anticuerpo diana, de este modo, se puede derivatizar para introducir cadenas laterales terminadas en hidrazida, hidracina, grupos de amina primaria o secundaria. Los agentes terapéuticos se pueden conjugar a través de un enlace con base de Schiff, un enlace hidrazona o acil hidrazona o un enlazador hidracida (Patente U.S.A. No. 5.474.765 y 5.762.918)
Las composiciones y métodos de la presente invención, tanto si son principalmente antiangiogénicos o basados en el marcaje vascular, se pueden utilizar en combinación con otros agentes terapéuticos y de diagnóstico. En términos de agentes biológicos, preferiblemente agentes de diagnóstico o terapéuticos, para el uso "en combinación" con un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de acuerdo con la presente invención, tal como un anticuerpo basado en 2C3, el término "combinación" se usa sucintamente para cubrir un conjunto de realizaciones. La terminología "en combinación", a menos que se indique específicamente lo contrario o se aclare a partir de la terminología científica, de este modo, se aplica a varios formatos de composiciones combinados, productos farmacéuticos, cócteles, kits, métodos, y usos médicos primarios y secundarios.
Las realizaciones "combinadas" de la presente invención, de este modo, incluyen, por ejemplo, aquellas en las que el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 es un anticuerpo desnudo y se utiliza en combinación con un agente o un agente terapéutico que no está operativamente acoplado a éste. En tales casos, el agente o agente terapéutico se puede utilizar en una forma dirigida o no dirigida. En una "forma no dirigida", el agente, particularmente, agentes terapéuticos, generalmente, se utilizará de acuerdo con su uso estándar en la técnica. En la "forma dirigida", el agente, generalmente, estará acoplado operativamente a un anticuerpo diferente o a una región diana que libera el agente o el agente terapéutico al sitio de la enfermedad angiogénica o el tumor. El uso de dichas formas dirigidas de los agentes biológicos, tanto terapéuticos como de diagnóstico, es también bastante estándar en la técnica.
En otras realizaciones "combinadas" de la presente invención, el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 es un inmunoconjugado, en las que el anticuerpo se asocia o combina operativamente, por sí mismo, con el agente o agente terapéutico. En ciertos ejemplos preferidos, el agente, incluyendo agentes terapéuticos y de diagnóstico, será un "agente dirigido a 2C3". El acoplamiento operativo incluye todas las formas de acoplamiento directo e indirecto como se describe en la presente y es conocido en la técnica.
Los usos "combinados", particularmente en términos de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o basados en 2C3 en combinación con agentes terapéuticos, también incluyen composiciones combinadas, productos farmacéuticos, cócteles, kits, métodos, y usos médicos primarios y secundarios, en los que el agente terapéutico está en la forma de profármaco. En tales realizaciones, el componente activador capaz de convertir el profármaco en la forma funcional del fármaco se puede, otra vez, asociar operativamente con los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o basados en 2C3 de la presente invención.
En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones terapéuticas, combinaciones, productos farmacéuticos, cócteles, kits, métodos, y usos médicos primarios y secundarios serán "combinaciones de profármacos del 2C3". Como se entenderá por aquellos con una habilidad normal en la técnica, el término "combinación de profármacos del 2C3", a menos que se indique lo contrario, significa que el anticuerpo basado en 2C3 está operativamente acoplado a un componente capaz de convertir el profármaco en el fármaco activo, no que el anticuerpo basado en 2C3 está acoplado al propio profármaco. Sin embargo, no es necesario que las realizaciones del profármaco de la presente invención se necesiten utilizar como combinaciones de profármacos del 2C3. Por consiguiente, los profármacos se pueden utilizar de cualquier manera de las que se usan en la técnica, incluyendo ADEPT y otras formas.
De este modo, allí donde se describen composiciones combinadas, productos farmacéuticos, cócteles, kits, métodos, y usos médicos primarios y secundarios, preferiblemente en términos de agentes de diagnóstico, y más preferiblemente, agentes terapéuticos, las combinaciones incluyen anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como anticuerpos basados en 2C3, que son anticuerpos desnudos o inmunoconjugados, y donde la práctica de las realizaciones in vivo de la presente invención implica la administración anterior, simultánea y posterior de los anticuerpos desnudos o inmunoconjugados y el agente biológico, de diagnóstico o terapéutico; siempre que, en algunas formas conjugadas o no conjugadas, se consiga el suministro global de algunas formas del anticuerpo y de algunas formas del agente biológico, de diagnóstico o terapéutico.
Las composiciones combinadas, métodos y usos preferidos, particularmente, de la invención son aquellos que incluyen anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 y endostatina (Patente U.S.A. No. 5.854.205). Éstos incluyen donde la construcción del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o del 2C3 es un anticuerpo desnudo o un inmunoconjugado; y cuando un inmunoconjugado, en el que el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o 2C3 está unido a endostatina, opcionalmente, con angiostatina; en el que el método o uso terapéutico combinado implica la administración anterior, simultánea o posterior de endostatina, opcionalmente, con angiostatina; siempre que, en algunas formas conjugadas o no conjugadas, se consiga el suministro global de 2C3, endostatina y, opcionalmente, angiostatina. Se proporcionan también anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o basados en 2C3 asociados operativamente con colagenasa, como la colagenasa, cuando se libera específicamente al tumor, que producirá endostatina in situ, consiguiendo beneficios similares.
Las explicaciones anteriores y otras de los efectos de la presente invención sobre tumores se realizan por simplicidad para explicar el modo combinado de operación, el tipo de agente(s) acoplado(s) y similares. Esta aproximación descriptiva no debería interpretarse como una atenuación o sobresimplificación de las propiedades beneficiosas de los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o de los anticuerpos basados en 2C3 de la presente invención. Se entenderá, por tanto, que dichos anticuerpos, por sí mismos, tienen propiedades antiangiogénicas y propiedades de neutralización del VEGF (tales como la neutralización de la función de supervivencia del VEGF), que inmunoconjugados de dichos anticuerpos mantendrán estas propiedades y las combinarán con las propiedades del agente acoplado; y además, que el efecto combinado del anticuerpo y cualquier agente acoplado normalmente mejorará y/o aumentará.
La invención, por tanto, proporciona composiciones, composiciones farmacéuticas, kits terapéuticos y cócteles medicinales que comprenden, opcionalmente en, como mínimo, una primera composición o recipiente, una cantidad efectiva biológicamente de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste o un inmunoconjugado de dicho anticuerpo anti-VEGF; y una cantidad efectiva biológicamente de, como mínimo, un segundo agente, componente o sistema biológico.
El "como mínimo, un segundo agente, componente o sistema biológico" será, frecuentemente, un agente, componente o sistema terapéutico o de diagnóstico, pero no siempre. Por ejemplo, el como mínimo, un segundo agente, componente o sistema biológico puede comprender componentes para la modificación del anticuerpo y/o para acoplar otros agentes al anticuerpo. Algunos segundos agentes, componentes o sistemas biológicos preferidos son profármacos o componentes para producir y utilizar profármacos, incluyendo componentes para producir el propio profármaco y componentes para adaptar los anticuerpos de la invención a la función en dicho profármaco o realizaciones ADEPT.
Allí donde los agentes de diagnóstico o terapéuticos están incluidos como el, como mínimo, un segundo agente, componente o sistema biológico, tales agentes de diagnóstico y/o terapéuticos normalmente serán aquellos para utilizar en conexión con enfermedades angiogénicas. Tales agentes son aquellos adecuados para utilizar en el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad o desorden como se da a conocer en cualquiera de las Patentes U.S.A. Nos. 5.712.291, 5.753.230, 5.972.922, 5.639.757, WO 98/45331 y WO 98/16551.
Allí donde la enfermedad a tratar es cáncer, se incluirá "como mínimo un segundo agente anticancerígeno" en el kit o cóctel terapéutico. El término "como mínimo, un segundo agente anticancerígeno" se elige en referencia a la construcción del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o del 2C3, siendo el primer agente anticancerígeno. Los anticuerpos de la presente invención, de este modo, pueden combinarse con agentes quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos, citocinas, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis o inmunotoxinas anticancerígenas o coaguligandos.
Los "agentes quimioterapéuticos", como se usa en la presente, se refieren a agentes quimioterapéuticos clásicos o fármacos utilizados en el tratamiento de malignidades. Este término se utiliza por simplicidad a pesar del hecho de que otros compuestos se pueden describir técnicamente como agentes quimioterapéuticos en cuanto a que ejercen un efecto anticancerígeno. Sin embargo, la palabra "quimioterapéutico" ha llegado a tener un significado diferente en la técnica y se está utilizando de acuerdo con el significado estándar. En la presente invención se describen algunos agentes quimioterapéuticos de ejemplo. Aquellos que tienen una habilidad normal en la técnica entenderán fácilmente los usos y dosis apropiadas de los agentes quimioterapéuticos, a pesar de que las dosis se pueden posiblemente reducir cuando se utilizan en combinación con la presente invención.
Una nueva clase de fármacos que también se pueden denominar "agentes quimioterapéuticos" son agentes que inducen la apoptosis. Alguno o más de uno de tales fármacos, incluyendo genes, vectores, construcciones antisentido y ribozimas, como apropiados, también se pueden utilizar junto con la presente invención. Actualmente, los segundos agentes preferidos son agentes antiangiogénicos, tales como angiostatina, endostatina, vasculostatina, canstatina y maspina.
Otros ejemplos de agente anticancerígeno incluyen, por ejemplo, neomicina, podofilotoxina(s), TNF-\alpha, antagonistas \alpha_{V}\beta_{3}, ionóforos de calcio, agentes inductores del flujo de calcio, y cualquier derivado o profármaco de los mismos. Actualmente, los fármacos antitubulina preferidos incluyen colquicina, taxol, vinblastina, vincristina, vindescina, una combretastatina o un derivado o profármaco de éstos.
Las inmunotoxinas anticancerígenas o coaguligandos son agentes anticancerígenos más apropiados. Las "inmunotoxinas anticancerígenas o coaguligandos", o construcciones de agentes terapéuticos/agentes marcadores, se basan en agentes marcadores, incluyendo anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de éstos, que se unen a un componente accesible o diana de una célula tumoral, vasculatura tumoral o estroma tumoral, y que están acoplados operativamente a un agente terapéutico, incluyendo agentes citotóxicos (inmunotoxinas) y factores de coagulación (coaguligandos). Un "componente accesible o diana" de una célula tumoral, vasculatura tumoral o estroma tumoral, es preferiblemente un componente con una superficie expresada, accesible o localizada, a pesar de que componentes liberados de células tumorales necróticas, o dañadas de otra manera, o células endoteliales vasculares también se pueden marcar, incluyendo antígenos de células tumorales nucleares y/o citosólicas.
Se pueden utilizar tanto agentes marcadores de anticuerpo como de no anticuerpo, incluyendo factores de crecimiento, tales como el VEGF y el FGF; péptidos que contienen el tripéptido R-G-D, que se unen específicamente a la vasculatura tumoral; y otros componentes marcadores tales como anexinas y ligandos relacionados.
Las inmunotoxinas o coaguligandos de células antitumorales pueden comprender anticuerpos ejemplificados por el grupo que consiste en anticuerpos denominados B3 (ATCC HB 10573), 260F9 (ATCC HB 8488), D612 (ATCC HB 9796) y KS1/4, en el que dicho anticuerpo KS1/4 se obtiene de una célula que comprende el vector pGKC2310 (NRRL B-18356) o el vector pG2A52 (NRRL B-18357).
También se contemplan los agentes marcadores de células antitumorales que comprenden un anticuerpo, o una región de unión al antígeno de éste, que se unen a un componente intracelular que se libera de una célula tumoral necrótica. Preferiblemente, dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión al antígeno de éstos, que se unen a un(os) antígeno(s) intracelular(es) insolubles, presentes en las células que pueden inducirse a ser permeables, o en células fantasmas de sustancialmente todas las células normales y neoplásticas, pero que no están presentes o accesibles en el exterior de las células vivas normales de un mamífero.
Las Patentes Nos. 5.019.368, 4.861.581 y 5.882.626, cada una emitida por Alan Epstein y colegas, incluso describen adicionalmente y enseñan como producir y utilizar anticuerpos específicos para antígenos intracelulares que se convierten en accesibles de células malignas in vivo. Los anticuerpos descritos son suficientemente específicos para los componentes celulares internos de las células malignas de mamíferos, pero no para componentes celulares externos. Algunas dianas de ejemplo incluyen histonas, pero se abarcan todos los componentes intracelulares específicamente liberados de células tumorales necróticas.
Tras la administración a un animal o un paciente con un tumor vascularizado, tales anticuerpos se localizan en las células malignas por el hecho de que los tumores vascularizados contienen, de forma natural, células tumorales necróticas, debido al (los) proceso(s) de remodelación del tumor que tiene lugar in vivo y causa que, como mínimo, una proporción de células malignas se conviertan en necróticas. Además, el uso de dichos anticuerpos en combinación con otras terapias que mejoran la necrosis tumoral sirve para aumentar la efectividad del marcaje y la posterior terapia.
Estos tipos de anticuerpos pueden, de este modo, utilizarse directa o indirectamente asociados con angiopoyetinas y administrar las angiopoyetinas a las células malignas necróticas en el interior de los tumores vascularizados, como, generalmente, se da a conocer en la presente.
Tal como también se da a conocer en las Patentes U.S.A. Nos. 5.019.368, 4.861.581 y 5.882.626, estos anticuerpos se pueden utilizar en métodos de diagnóstico combinados (ver más adelante) y en métodos para medir la efectividad de las terapias antitumorales. Tales métodos, generalmente, implican la preparación y administración de una versión marcada de los anticuerpos y la medida de la unión del anticuerpo marcado con el componente celular interno diana, preferencialmente, enlazado en el interior del tejido necrótico. Los métodos, de este modo, reflejan el tejido necrótico, en el que una concentración localizada del anticuerpo es indicativa de la presencia de un tumor e indica fantasmas de células que se han eliminado por la terapia antitumoral.
Las inmunotoxinas o coaguligandos del estroma antitumoral, generalmente, comprenderán anticuerpos que se unen a un componente de tejido conectivo, un componente de la membrana basal o un componente de plaqueta activada; como se ejemplifica mediante la unión a fibrina, RIBS o LIBS.
Las inmunotoxinas o coaguligandos de la vasculatura antitumoral pueden comprender ligandos, anticuerpos, o fragmentos de éstos, que se unen a un componente de los vasos transportadores de sangre, preferiblemente, los vasos sanguíneos intratumorales, con una superficie expresada, accesible o localizada, en un tumor vascularizado. Tales anticuerpos incluyen aquellos que se unen a componentes con superficie expresada de vasos sanguíneos intratumorales de un tumor vascularizado, incluyendo receptores de superficie de células de la vasculatura tumoral, tales como endoglina (anticuerpos TEC-4 y TEC-11), un receptor TGF\beta, E-selectina, P-selectina, VCAM-1, ICAM-2, PSMA, un receptor VEGF/VPF, un receptor FGF, un TIE, integrina \alpha_{V}\beta_{3}, pleiotropina, endosialina y proteínas MHC de la Clase II. Los anticuerpos también se pueden unir a componentes inducibles por citocina o por coagulante de los vasos sanguíneos intratumorales. Ciertos agentes preferidos se unirán a aminofosfolípidos, tales como la fosfatidilserina o la fosfatidiletanolamina.
Otras inmunotoxinas o coaguligandos de la vasculatura antitumoral pueden comprender anticuerpos, o fragmentos de éstos, que se unen a un ligando o factor de crecimiento que se une a un receptor de superficie de una célula de la vasculatura intratumoral. Tales anticuerpos incluyen aquellos que se unen a VEGF/VPF (anticuerpos GV39 y GV97), FGF, TGF\beta, un ligando que se une a un TIE, una isoforma de fibronectina asociada al tumor, factor de dispersión/factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor plaquetario 4 (PF4), PDGF y TIMP. Los anticuerpos, o fragmentos de éstos, también se pueden unir a un complejo ligando:receptor o un complejo factor de crecimiento:receptor, pero no al ligando o al factor de crecimiento o al receptor, cuando el ligando o el factor de crecimiento o el receptor no están en los complejos ligando:receptor o factor de crecimiento:receptor.
Las construcciones de agente terapéutico-anticuerpo de la vasculatura antitumoral, de las células antitumorales o del estroma antitumoral pueden comprender agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis, fármacos antitubulina, agentes citotóxicos, tales como toxinas derivadas de plantas, hongos o bacterias. Se preferirán, frecuentemente, la cadena A de la ricina y la cadena A de la ricina desglicosilada. Las construcciones de agente terapéutico-anticuerpo de la vasculatura antitumoral, de las células antitumorales o del estroma antitumoral pueden comprender coagulantes (factores de coagulación que actúan de forma directa o indirecta) o regiones de unión de un segundo anticuerpo que se une a factores de coagulación. Se preferirá, frecuentemente, la asociación operativa con el Factor Tisular o derivados del Factor Tisular, tal como el Factor Tisular truncado.
En términos de composiciones, kits y/o medicamentos de la presente invención, las cantidades efectivas combinadas de los agentes terapéuticos se pueden comprender dentro de un único recipiente o formas de envase, o en diferentes recipientes o formas de envase. Los cócteles, generalmente, se mezclarán juntos para un uso combinado. Frecuentemente se preferirán los agentes formulados para la administración intravenosa. También se pueden incluir componentes de imagen. Los kits también pueden comprender instrucciones para el uso del, como mínimo un primer anticuerpo y el uno o más de los agentes biológicos incluidos.
Generalmente hablando, el, como mínimo, un segundo agente anticancerígeno se puede administrar al animal o paciente, sustancialmente, simultáneamente con el agente terapéutico del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3; tal como de un único compuesto farmacéutico o de dos composiciones farmacéuticas administradas de manera conjunta.
Alternativamente, el, como mínimo, un segundo agente anticancerígeno se puede administrar al animal o paciente en un tiempo secuencial a la administración del agente terapéutico del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3. "En un tiempo secuencial", como se usa en la presente, significa "escalonado", de manera que el, como mínimo, un segundo agente anticancerígeno se administra al animal o paciente en un tiempo diferente de la administración del agente terapéutico del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3. Generalmente, los dos agentes se administran en tiempos espaciados de forma efectiva para permitir a los dos agentes ejercer sus respectivos efectos terapéuticos, es decir, se administran en "intervalos de tiempo biológicamente efectivos". El, como mínimo, un segundo agente anticancerígeno se puede administrar al animal o paciente en un tiempo biológicamente efectivo anterior al agente terapéutico del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, o en un tiempo biológicamente efectivo posterior al agente terapéutico.
Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de un animal o paciente con un tumor vascularizado, que comprenden:
(a) someter al animal o paciente a un primer tratamiento que reduce sustancialmente la carga principal del tumor; y
(b) administrar posteriormente, como mínimo, un primer agente antiangiogénico al animal o paciente en una cantidad efectiva para inhibir la metástasis de cualquier célula tumoral superviviente; en el que el primer agente antiangiogénico es, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente, uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); opcionalmente, en el que el anticuerpo o el fragmento se asocia operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Los tratamientos primeros preferidos incluyen la resección quirúrgica y la intervención quimioterapéutica. También se pueden utilizar agentes antiangiogénicos, tales como construcciones de angiopoyetina 2 o angiopoyetina 2 dirigida al tumor.
Otros métodos de tratamiento para animales o pacientes con tumores vascularizados, comprenden:
(a) administrar una primera construcción anticuerpo-agente terapéutico al animal o paciente en una cantidad efectiva para inducir una necrosis tumoral sustancial; en el que la primera construcción anticuerpo-agente terapéutico comprende un agente terapéutico operativamente unido a un primer anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une a un componente con una superficie expresada, accesible o localizada de la célula tumoral, la vasculatura tumoral o el estroma tumoral; y
(b) administrar posteriormente un segundo anticuerpo al animal o paciente en una cantidad efectiva para inhibir la metástasis de cualquier célula tumoral superviviente; en el que el segundo anticuerpo es, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente, uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y además, opcionalmente, en el que el anticuerpo o el fragmento se asocia operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
En realizaciones particularmente preferidas, la presente invención proporciona anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 y anticuerpos basados en 2C3 para el uso en combinación con profármacos y ADEPT. En tales composiciones, combinaciones, productos farmacéuticos, kits, métodos y usos, el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3, o fragmento de éstos, se modificarán para proporcionar una capacidad de conversión o enzimática, o se asociarán operativamente, preferiblemente, se unirán o conjugarán covalentemente con, como mínimo, un primer agente o enzima conversor capaz de convertir, como mínimo, un profármaco en la forma activa del fármaco.
El anticuerpo o fragmento enzimático o conjugado con la enzima se combinará con una formulación inicialmente separada del "profármaco". El profármaco será una forma inactiva o débilmente activa de un fármaco que se convierte en una forma activa del fármaco en contacto con la capacidad enzimática, convirtiendo la función o la enzima asociada con el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el 2C3.
Por consiguiente, se proporcionan kits que comprenden, preferiblemente, en composiciones y/o recipientes separados:
(a) una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3, o un fragmento de éstos, que tienen una función enzimática, preferiblemente allí donde el anticuerpo o el fragmento se asocia operativamente con, unido o conjugado covalentemente a, como mínimo, un primer enzima; y
(b) una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer profármaco sustancialmente inactivo que se convierte en un fármaco sustancialmente activo por la función enzimática de, o la enzima asociada con, conjugado o unido al, anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o al anticuerpo 2C3, o un fragmento.
Existen métodos y usos más ventajosos dados a conocer que comprenden:
(a) administrar a un animal o un paciente con un tumor vascularizado una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer compuesto farmacéutico que comprende, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3, o un fragmento de unión al antígeno de éstos, en el que el anticuerpo o fragmento tiene una función enzimática, preferiblemente, en el que el anticuerpo o fragmento se asocia operativamente con, covalentemente unido a, o conjugado con, como mínimo, un primer enzima; en el que dicho anticuerpo o fragmento se localiza, tras la administración, en la vasculatura, la vasculatura intratumoral o el estroma tumoral vascularizado; y
(b) administrar posteriormente al animal o paciente, después de un período de tiempo efectivo, una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un segundo compuesto farmacéutico que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un profármaco sustancialmente inactivo; en el que el profármaco se convierte en un fármaco sustancialmente activo por la acción enzimática de, o la enzima asociada con, unida a, o conjugada con el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el 2C3, o un fragmento, localizado en el interior de la vasculatura, la vasculatura tumoral o el estroma de dicho tumor vascularizado.
En otras realizaciones, los anticuerpos e inmunoconjugados de la invención se pueden combinar con uno o más agentes de diagnóstico, normalmente agentes de diagnóstico para el uso en conexión con enfermedades angiogénicas. Se incluyen, de este modo, en la presente invención, un conjunto de composiciones de diagnóstico, kits y métodos.
En términos de tratamiento y diagnóstico de cáncer, las composiciones, kits y métodos de diagnóstico e imagen, de la presente invención incluyen productos de diagnóstico in vivo e in vitro. Por ejemplo, un tumor vascularizado se puede reproducir utilizando una cantidad diagnósticamente efectiva de un componente de diagnóstico tumoral que comprende, como mínimo, una primera región de unión que se une a un componente accesible de una célula tumoral, la vasculatura tumoral o el estroma tumoral, operativamente acoplada a un agente de imagen diagnóstica in vivo.
La imagen del tumor se lleva a cabo, preferiblemente, para proporcionar una imagen del estroma y/o la vasculatura de un tumor vascularizado utilizando un componente de diagnóstico que comprende, como mínimo, una primera región de unión que se une a un componente accesible de la vasculatura tumoral o el estroma tumoral. Se puede emplear cualquier región de unión adecuada o anticuerpo, tales como aquellos descritos anteriormente en los términos de construcciones terapéuticas. Mediante la utilización de una construcción de un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 marcado para la detección, se proporcionarán ciertas ventajas, en la que la imagen formada será predictiva de los sitios de unión del agente terapéutico a utilizar.
Los productos de diagnóstico del tumor marcados para la detección in vivo, tanto si son para el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o en el 2C3 como si no, pueden comprender un compuesto detectable por rayos-X, tal como bismuto (III), oro(III), lantano (III) o plomo (II); un ión radiactivo, tal como cobre^{67}, galio^{67}, galio^{68}, indio^{111}, indio^{113}, yodo^{123}, yodo^{125}, yodo^{131}, mercurio^{197}, mercurio^{203}, renio^{186}, renio^{188}, rubidio^{97}, rubidio^{103}, tecnecio^{99m} o itrio^{90}; un isótopo con resonancia magnética nuclear de spin, tal como cobalto (II), cobre (II), cromo (III), disprosio (III), erbio (III), gadolinio (III), holmio (III), hierro(II), hierro (III), manganeso (II), neodimio (III), níquel (II), samario (III), terbio (III), vanadio (II) o yterbio (III); o rodamina o fluoresceína.
La preimagen antes del tratamiento se puede llevar a cabo mediante:
(a) la administración al animal o paciente de una cantidad diagnósticamente efectiva de un compuesto farmacéutico que comprende un agente de diagnóstico acoplado operativamente a, como mínimo, una primera región de unión que se une a un componente accesible de una célula tumoral, vasculatura tumoral (preferiblemente) o estroma tumoral (preferiblemente), incluyendo agentes de diagnóstico operativamente acoplados a construcciones de un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3; y
(b) la detección, posteriormente, de la primera región de unión marcada para la detección (o un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3) enlazado a las células tumorales, los vasos sanguíneos del tumor (preferiblemente) o el estroma tumoral (preferiblemente); obteniendo así una imagen del tumor, la vasculatura del tumor y/o el estroma tumoral.
El tratamiento del cáncer también se puede llevar a cabo mediante:
(a) la formación de una imagen de un tumor vascularizado mediante la administración a un animal o paciente, que tiene un tumor vascularizado, de una cantidad diagnósticamente mínima de, como mínimo, un primer agente de unión al tumor marcado para la detección, preferiblemente una construcción de un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3, que comprende un agente de diagnóstico operativamente acoplado al agente de unión al tumor o al anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o al anticuerpo basado en 2C3, formando así una imagen detectable del tumor, la vasculatura del tumor (preferiblemente), o el estroma tumoral (preferiblemente); y
(b) la administración, posterior, al mismo animal o paciente de una cantidad terapéuticamente optimizada de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 desnudo o un primer anticuerpo basado en 2C3 o una construcción anticuerpo-agente terapéutico utilizando dicho anticuerpo, causando así un efecto antitumoral.
Se proporcionan, de este modo, medicamentos o formulaciones para la imagen y el tratamiento que generalmente comprenden:
(a) un primer compuesto farmacéutico que comprende una cantidad diagnósticamente efectiva de un agente de unión al tumor marcado para la detección, preferiblemente una construcción de un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3, que comprende un agente detectable operativamente acoplado al agente de unión al tumor o al anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o al anticuerpo basado en 2C3; y
(b) un segundo compuesto farmacéutico que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de, como mínimo, un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 desnudo o un anticuerpo 2C3 o una construcción agente terapéutico-anticuerpo utilizando dicho anticuerpo.
La invención también proporciona kits de diagnóstico in vitro que comprenden, como mínimo, un primer compuesto o un compuesto farmacéutico que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un agente de diagnóstico que se asocia operativamente con, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente, uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste.
La presente invención además proporciona kits combinados en los que el agente de diagnóstico se destina al uso fuera del cuerpo, preferiblemente en conexión con una prueba realizada en una muestra biológica obtenida de un animal o paciente. Como tal, la presente invención proporciona kits que comprenden, generalmente, en, como mínimo, dos recipientes diferentes, como mínimo, un primer compuesto, compuesto farmacéutico o cóctel medicinal que comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno o un inmunoconjugado de dicho anticuerpo anti-VEGF; y una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un agente, componente o sistema de diagnóstico para el uso in vitro.
El "agente, componente o sistema de diagnóstico para el uso in vitro" será cualquier agente de diagnóstico o combinación de agentes que permiten el diagnóstico de una o más enfermedades que tienen un componente angiogénico. Los productos de diagnóstico in vitro, de este modo, incluyen aquellos adecuados para el uso en la generación de información de diagnóstico o pronóstico en relación con una enfermedad o desorden tal como se da a conocer en cualquiera de las Patentes U.S.A. Nos. 5.712.291, 5.753.230, 5.972.922, 5.639.757, WO 98/45331 y WO 98/16551.
En términos de tratamiento y diagnóstico de cáncer, los productos de diagnóstico in vitro incluirán preferiblemente un componente de diagnóstico que comprende, como mínimo, una primera región de unión que se une a un componente accesible de una célula tumoral, vasculatura tumoral (preferiblemente) o estroma tumoral (preferiblemente) acoplado operativamente a un "agente informador o detectable" directa o indirectamente detectable por una prueba de diagnóstico in vitro. Los "agentes informadores o detectables" directamente detectables in vitro incluyen aquellos, tales como radiomarcadores y agentes informadores detectables por inmunofluorescencia.
Los "agentes informadores o detectables" indirectamente detectables in vitro incluyen aquellos que funcionan junto con un(os) agente(s) adicional(es) exógenos, tales como enzimas detectables que producen un producto coloreado en contacto con un sustrato cromogénico. La detección indirecta in vitro también se extiende a componentes o sistemas informadores o detectables que comprenden una primera región de unión que se une a un componente accesible de una célula tumoral, vasculatura tumoral (preferiblemente) o estroma tumoral (preferiblemente) en combinación con, como mínimo, un anticuerpo detector que tiene inmunoespecificidad por la primera región de unión. El "anticuerpo detector" es preferiblemente un "anticuerpo secundario" que está acoplado a un agente detectable de forma directa o indirecta, tal como un radiomarcador o una enzima. Alternativamente, se puede utilizar "un sistema de detección de anticuerpo secundario y terciario", incluyendo un primer anticuerpo detector que tiene inmunoespecificidad por la primera región de unión en combinación con un segundo anticuerpo detector que tiene inmunoespecificidad por el primer anticuerpo detector, estando el segundo anticuerpo detector acoplado a un agente detectable de forma directa o indirecta.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar ampliamente aspectos de la presente invención. La presente invención se puede entender mejor por referencia a uno o más de estos dibujos, en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en la presente.
Figura 1. El 2C3 inhibe el crecimiento de las células ABAE mediado por el VEGF. Las células ABAE se hicieron crecer en presencia de varios anticuerpos indicados y VEGF 0,5 nM. El crecimiento después de 4 días se determinó colorimétricamente por la conversión enzimática del MTS (reactivo de Owen) a un formazano amarillo. Los resultados se expresan como porcentaje de la producción de formazano en pocillos de control que se hicieron crecer con VEGF solo. El fondo se determinó mediante el crecimiento celular sin VEGF o anticuerpo y se sustrajo de los pocillos de control y de muestra. Los resultados muestran la media aritmética de determinaciones triplicadas, las desviaciones estándar de las cuales fueron siempre menores de un 20% de la media. Se muestran las curvas de crecimiento para los anticuerpos IgG anti-VEGF incluyendo mAb 4.6.1 como control positivo y un IgG de especificidad irrelevante (Control IgG) como control negativo.
Figura 2. El 2C3 bloquea la unión del VEGF al VEGFR2 pero no al VEGFR1 en un ELISA. Los pocillos se recubrieron con el dominio extracelular del VEGFR1 (FLt-1/Fc) o VEGFR2 (sFlk-1) y, a continuación, se incubaron con VEGF solo 1nM o VEGF en presencia de IgG indicada de concentración 100 nM o 1000 nM. La placa, a continuación, se incubó con anti-VEGF de conejo (A-20, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) de concentración 1\mug/ml y se desarrolló utilizando un anticuerpo de anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa. Los ensayos se llevaron a cabo por triplicado. Se muestra la media del porcentaje de unión en ausencia de anticuerpo junto con la desviación estándar. Los asteriscos indican los valores que estadísticamente son significativamente diferentes (p < 0,002) de aquellos en ausencia de anticuerpo según un test T de Student de valores por parejas.
Figura 3A y Figura 3B. El 2C3 inhibe el crecimiento in vivo de xenoinjertos de tumores humanos. Figura 3A: Se inyectaron 1x10^{7} células de NSCLC NCI-H358 subcutáneamente en un ratón nu/nu en el día 0. Figura 3B: Se inyectaron 5x10^{6} células de rabdomiosarcoma A673 subcutáneamente en un ratón nu/nu en el día 0. Se inyectaron intraperitonealmente (i.p.) los ratones con la IgG indicada en el día 1 y 2 veces/semana a partir de entonces. Se administró el 2C3 en una dosis de 100, 10 ó 1 \mug/inyección mientras que la IgG, de especificidad irrelevante, (Figura 3A) y el 3E7 (Figura 3B) se administraron también en una dosis de 100 \mug/inyección. Se midieron los tumores 2-3 veces por semana. En la Figura 3A se muestran la media y el error estándar durante la duración del estudio, mientras que los datos para el último día de estudio (día 26) se muestran en la Figura 3B.
Figura 4. El tratamiento con 2C3 reduce el tamaño de los xenoinjertos tumorales NSCLC NCI-H358 humanos establecidos. Se trataron intraperitonealmente ratones con tumores NCI-H358 subcutáneos, aproximadamente de 300-450 mm^{3} de tamaño, con 50 \mug o 100 \mug de 2C3 (n = 14), mAb 4.6.1 (n = 5), 3E7 (n = 12) o un IgG de control (n = 9) en los puntos de tiempo indicados. Se muestra la media del volumen del tumor junto con el SEM durante 116
días.
Figura 5A y Figura 5B. Comparación de los tratamientos con 2C3 y 3E7 de xenoinjertos tumorales humanos establecidos. Figura 5A: Se trataron ratones con tumores NCI-H358 subcutáneos, aproximadamente de 450 mm^{3} de tamaño, con 2C3 (n = 6) ó 3E7 (n = 4). Los tratamientos (T) se administraron intraperitonealmente en una cantidad de 100 \mug de IgG, excepto para el tratamiento inicial que consistió en 500 \mug de IgG administrados intravenosamente. Se muestra la media del volumen del tumor junto con el SEM. Al final del estudio (día 116), se sacrificaron los ratones y se diseccionaron los tumores y se pesaron. El peso medio del tumor del grupo tratado con el 2C3 fue de 0,054 g, mientras que el grupo tratado con el 3E7 tuvo un peso medio del tumor de 0,545 g. Figura 5B: Se trataron intraperitonealmente ratones con tumores HT1080 subcutáneos, aproximadamente de 200-250 mm^{3} de tamaño, con 100 \mug 2C3 (n = 9), 3E7 (n = 11), IgG de control (n = 11), o salino (n = 11). Se trataron los ratones día sí y día no como se indica (T). Los ratones no tratados con 2C3 se sacrificaron el día 26 debido a que más del 50% de cada grupo tenían tumores ulcerados grandes. Se muestra la media del volumen del tumor junto con el SE.
Descripción de las realizaciones ilustrativas
Los tumores sólidos y carcinomas justifican más del 90% de los cánceres en el hombre. A pesar de que se ha investigado el uso de anticuerpos monoclonales e inmunotoxinas en la terapia de linfomas y leucemias, estos agentes han sido decepcionantemente inefectivos en las pruebas clínicas contra carcinomas y otros tumores sólidos (Abrams y Oldham, 1985). Una razón principal para la inefectividad de tratamientos basados en anticuerpos es que las macromoléculas no se transportan fácilmente al interior de los tumores sólidos. Incluso una vez dentro de la masa tumoral, estas moléculas fallan en su distribución, igualmente debido a la presencia de estrechas uniones entre las células tumorales, el estroma fibroso, gradientes de presión intersticial y las barreras en los sitios de unión (Dvorak y otros, 1991a).
En el desarrollo de nuevas estrategias para el tratamiento de tumores sólidos, los métodos que implican el marcaje como diana de la vasculatura del tumor, en lugar de las células tumorales, ofrecen claras ventajas. Una destrucción efectiva o bloqueo de los vasos tumorales obstaculiza el flujo sanguíneo a través del tumor y da lugar a una avalancha de muertes de células tumorales. Se han utilizado, de forma efectiva, construcciones de anticuerpo-toxina y anticuerpo-coagulante en el marcaje específico y la destrucción de vasos tumorales, dando lugar a la necrosis tumoral (Burrows y otros, 1992; Burrows y Thorpe, 1993; WO 93/17715; WO 96/01653; Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866; 5.877.289; 5.965.132; 6.051.230; 6.004.555; Patente U.S.A. No. 6093399, Derechos de Expedición pagados el 20 de octubre de 1998).
Allí donde los anticuerpos, los factores de crecimiento u otros ligandos de unión se utilizan para liberar específicamente un coagulante a la vasculatura tumoral, tales agentes se llaman "coaguligandos". Actualmente, un coagulante preferido para el uso en coaguligandos es el Factor Tisular truncado (tTF) (Huang y otros, 1997; WO 96/01653; Patente U.S.A. No. 5.877.289). El TF es el principal iniciador de la coagulación sanguínea. En los sitios de lesión, el Factor VII/VIIa en la sangre contacta con el, y se une al, TF en células en los tejidos perivasculares. El complejo TF:VIIa, en presencia de la superficie de fosfolípido, activa los factores IX y X. Esto, sucesivamente, conlleva la formación de trombina y fibrina y, en último término, un coágulo de sangre.
Se han descrito un conjunto de moléculas diana adecuadas que están disponibles en el endotelio tumoral, pero ampliamente ausentes en el endotelio normal. Por ejemplo, se pueden utilizar dianas expresadas, tales como endoglina, E-selectina, P-selectina, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, un TIE, un ligando reactivo con LAM-1, un receptor VEGF/VPF, un receptor FGF, integrina \alpha_{V}\beta_{3}, pleiotropina o endosialina (Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866; 5.877.289 y 6.004.555, Burrows y otros, 1992; Burrows y Thorpe, 1993; Huang y otros, 1997).
Otras dianas inducibles por el medio del tumor natural o por la siguiente intervención del hombre son también entidades marcables como diana, tal como se describe en la Patente U.S.A. No. 5.776.427 y 6.036.955. Cuando se usan junto con la supresión previa en los tejidos normales y en la inducción vascular del tumor, los antígenos MHC de la Clase II también se pueden emplear como dianas (Patentes U.S.A. Nos. 5.776.427; 6.004.554 y 6.036.955).
Las dianas adsorbidas son otro grupo adecuado, tales como VEGF, FGF, TGF\beta, HGF, PF4, PDGF, TIMP, un ligando que se une a un TIE o una isoforma de la fibronectina asociada al tumor (Patente U.S.A. No. 5.877.289 y 5.965.132). Las isoformas de la fibronectina son ligandos que se unen a la familia de integrinas de receptores. Las isoformas de la fibronectina asociadas al tumor son componentes marcables como diana tanto de la vasculatura tumoral como del estroma tumoral.
Actualmente, un marcador preferido para tales aplicaciones de marcaje de dianas clínicas es el receptor asociado al VEGF. De hecho, los conjuntos de complejos VEGF:receptor son uno de los marcadores más específicos de la vasculatura tumoral observada hasta la fecha (Patente U.S.A. No. 5.877.289; 5.965.132 y 6.051.230; Lin-Ke y otros, 1996; Dvorak y otros, 1991b).
El complejo VEGF:receptor presenta una diana atractiva para la liberación específica de fármacos u otros efectores al endotelio tumoral, ya que los tumores son ricos en citocinas y factores de crecimiento y ya que los receptores del VEGF se regulan a la alta bajo las condiciones hipóxicas que se encuentran en la mayoría de tumores sólidos (Mazure y otros, 1996; Forsythe y otros, 1996; Waltenberger y otros, 1996; Gerber y otros, 1997; Kremer y otros, 1997). La regulación a la alta del ligando y su receptor específicamente en el microentorno del tumor conlleva una elevada concentración de receptor ocupado en el endotelio vascular del tumor, en comparación con el endotelio en el tejido normal (Patente U.S.A. No. 5.877.289 y 5.965.132). Dvorak y colegas también mostraron que los anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra el extremo N-terminal del VEGF, tiñen selectivamente los vasos sanguíneos del tumor después de la inyección a ratones con tumores singeneicos (Lin Ke y otros, 1996).
El papel del VEGF como diana para las intervenciones clínicas no está limitado a terapias con inmunotoxinas o coaguligandos. De hecho, el VEGF es uno de los factores claves implicados en la angiogénesis de los tumores sólidos (Ferrara, 1995; Potgens y otros, 1995), siendo tanto un agente de permeabilidad potente (Senger y otros, 1983; Senger y otros, 1990; Senger y otros, 1986) como un mitógeno de células endoteliales (Keck y otros, 1989; Connolly y otros, 1989; Thomas, 1996). La conexión entre el VEGF y la angiogénesis ha conllevado a propuestas de varias estrategias terapéuticas enfocadas a la intervención del VEGF (Siemeister y otros, 1998).
A. VEGF y receptores de VEGF
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una citocina multifuncional que se induce por hipoxia y mutaciones oncogénicas. El VEGF es un estimulante primario del desarrollo y mantenimiento de una red vascular en la embriogénesis. Funciona como un potente agente inductor de la permeabilidad, un agente quimiotáctico de células endoteliales, un factor de supervivencia endotelial, y factor de proliferación de células endoteliales (Thomas, 1996; Neufeld y otros, 1999). Se requiere su actividad para el desarrollo embriónico normal (Fong y otros, 1995; Shalaby y otros, 1995), ya que la alteración dirigida a uno de ambos alelos del VEGF da lugar a letalidad embriónica (Carmeliet y otros, 1996; Ferrara y otros, 1996).
El VEGF es un factor importante que conduce a la angiogénesis o vasculogénesis en numerosos procesos patológicos y fisiológicos, incluyendo la curación de heridas (Frank y otros, 1995; Burke y otros, 1995), la retinopatía diabética (Alon y otros, 1995; Malecaze y otros, 1994), la psoriasis (Detmar y otros, 1994), la aterosclerosis (Inoue y otros, 1998), la artritis reumatoide (Harada y otros, 1998; Nagashima y otros, 1999), el crecimiento de tumores sólidos (Plate y otros, 1994; Claffey y otros, 1996).
Una amplia variedad de células y tejidos producen VEGF, que existe, como mínimo, en cinco isoformas (121, 145, 165, 189 y 206 aminoácidos) que son variantes de unión codificadas por el mismo gen (Houck y otros, 1991; Ferrara y otros, 1991; Tischer y otros, 1991). Las dos isoformas más pequeñas, 121 y 165, se secretan de células (Houck y otros, 1991; Anthony y otros, 1994). El VEGF secretado es un dímero obligado de entre 38 y 46 kDa en el que los monómeros están unidos por dos enlaces disulfuro.
Los dímeros de VEGF se unen con una elevada afinidad a dos receptores bien caracterizados, VEGFR1 (FLT-1) y VEGFR2 (KDR/Flk-1), los cuales son expresados selectivamente en células endoteliales (Flt-1 y Flk-1 son los homólogos del ratón). La K_{d} de unión del VEGF al VEGFR1 y VEGFR2 es 15-100 pM y 400-800 pM, respectivamente (Terman y otros, 1994). Una tercera proteína de superficie celular identificada recientemente, la neuropilina-1, también se une al VEGF con elevada afinidad (Olander y otros, 1991; De Vries y otros, 1992; Terman y otros, 1992; Soker y otros, 1998).
Los VEGFR1 y VEGFR2 son miembros de la familia de receptores de tirosina quinasa (RTK III) del Tipo III que se caracteriza por siete repeticiones extracelulares similares a IgG, un dominio transmembrana de expansión única, y una hendidura intracelular del dominio de tirosina quinasa (Mustonen y Alitalo, 1995). Hasta hace muy poco, se pensaba que el VEGFR1 y VEGFR2 estaban expresados casi exclusivamente en células endoteliales (Mustonen y Alitalo, 1995). A pesar de que se ha conocido que el VEGFR1 y VEGFR2 tienen diferentes funciones con respecto a la estimulación de la proliferación, migración y diferenciación de células endoteliales (Waltenberger y otros, 1994; Guo y otros, 1995), el papel preciso que cada receptor desarrolla en la biología del VEGF y la homeostasis de células endoteliales no estaba claramente definido anteriormente a la presente invención.
Estudios recientes que utilizan ratones "knockout" han mostrado que cada VEGFR1 y VEGFR2 de VEGF es esencial para la vasculogénesis, la angiogénesis y el desarrollo del embrión (Fong y otros, 1995; Shalaby y otros, 1995; Hiratsuka y otros, 1998). En estudios de "knockouts" letales, los fenotipos asociados con la falta de cada receptor fueron diferentes. La alteración dirigida del VEGFR2 dio lugar a un embrión al que le faltaba la diferenciación de células endoteliales y fallaba en la formación de islas de sangre del saco vitelino o en la vasculogénesis (Shalaby y otros, 1995). Los mutantes nulos de VEGFR1 mostraron una vasculogénesis dañada, ensamblaje de células endoteliales desorganizado, y vasos sanguíneos dilatados (Fong y otros, 1995; Hiratsuka y otros, 1998). El VEGFR1, evidentemente, tiene un papel biológico vital.
El VEGFR1 tiene una mayor afinidad por el VEGF que el VEGFR2, a pesar de que tiene una actividad de tirosina quinasa inferior. Esto sugiere que el dominio extracelular del VEGFR1 es particularmente importante. Esta hipótesis fue apoyada fuertemente por los resultados de estudios en ratones "knockout" en los que el dominio de la tirosina quinasa del VEGFR1 se eliminó a la vez que se dejaba el dominio de unión del VEGF intacto (Hiratsuka y otros, 1998).
Además de los anteriores "knockouts" (Fong y otros, 1995; Shalaby y otros, 1995), los estudios de Hiratsuka y otros (1998) indican que el VEGFR1 tiene un papel biológico vital. Sin embargo, la señalización de la tirosina quinasa no parece ser el factor crítico. Es interesante apuntar que los macrófagos procedentes del VEGFR1 de los ratones "knockout" no mostraron quimiotaxis inducida por el VEGF (Hiratsuka y otros, 1998), implicando así al VEGFR1 como el receptor responsable para la mediación de esta importante respuesta biológica al VEGF.
Ciertos grupos han expuesto que el VEGFR2 es el receptor de señalización dominante en la mitogénesis inducida por el VEGF, y la permeabilidad (Waltenberger y otros, 1994; Zachary, 1998; Korpelainen y Alitalo, 1998). El papel del VEGFR1 en la función de la célula endotelial está mucho menos claro, a pesar de que las funciones en la migración de macrófagos y la quimiotaxis se documentaron en los estudios de Hiratsuka y otros (1998), discutidos
anteriormente.
Clauss y otros (1996) también expusieron que el VEGFR1 tiene importantes papeles en la activación de monocitos y la quimiotaxis. De hecho, las células del linaje de macrófagos/monocitos expresan sólo VEGFR1, que es el receptor responsable para mediar en el reclutamiento de monocitos y la actividad procoagulante (Clauss y otros, 1996). La unión del VEGF al VEGFR1 en monocitos y macrófagos también actúa mediante el incremento del calcio intracelular y la inducción de la fosforilación de tirosina (Clauss y otros, 1996).
Se cree que la unión del dímero del VEGF al receptor del VEGF induce la dimerización del receptor. A continuación, la dimerización del receptor causa la autotransfosforilación de residuos de tirosina específicos, Y801 e Y1175, e Y1213 e Y1333 en la parte intracelular del VEGFR2 y VEGFR1, respectivamente. Esto conlleva a una cascada de transducción de la señal, que incluye la activación de la fosfolipasa C\gamma (PLC\gamma) y la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y un incremento de iones calcio intracelulares (Hood y Meininger, 1998; Hood y otros, 1998; Kroll y Waltenberger, 1998).
Los fenómenos intracelulares corriente abajo en la señalización inducida por el VEGF están menos claros, a pesar de que algunos grupos han observado que el óxido nítrico (NO) se produce tras la activación por el VEGF del VEGFR2 (Hood y Meininger, 1998; Hood y otros, 1998; Kroll y Waltenberger, 1998). La activación del VEGFR2, pero no del VEGFR1, por el VEGF también se ha observado que activa Src y la cascada de la Ras-MAP quinasa, incluyendo las quinasas MAP, ERK 1 y 2 (Waltenberger y otros, 1994, 1996; Kroll y Waltenberger, 1997).
El papel del VEGFR1 en la función de la célula endotelial está mucho menos claro, particularmente porque los ratones deficientes de tirosina quinasa de Flt-1 son viables y desarrollan vasos normales (Hiratsuka y otros, 1998). Se ha sugerido que el papel biológico principal del VEGFR1 en el endotelio es como una molécula de unión a ligando de no señalización, o un receptor "reclamo" que puede ser necesario para presentar el VEGF al VEGFR2.
La conexión entre el VEGF y las condiciones angiogénicas patológicas ha impulsado varios intentos para bloquear la actividad del VEGF. Éstos incluyen el desarrollo de ciertos anticuerpos neutralizadores contra el VEGF (Kim y otros, 1992; Presta y otros, 1997; Sioussat y otros, 1993; Kondo y otros, 1993; Asano y otros, 1995). Los anticuerpos contra los receptores del VEGF también se han descrito, tales como los descritos en las Patentes U.S.A. No. 5.840.301 y 5.874.542 y, posterior a la presente invención, en WO 99/40118. De hecho, las Patentes U.S.A. No. 5.840.301 y 5.874.542 sugieren que el bloqueo de los receptores VEGFR, en lugar del propio VEGF, es ventajoso por varias razones.
También se han dado a conocer construcciones del receptor soluble (Kendall y Thomas, 1993; Aiello y otros, 1995; Lin y otros, 1998; Millauer y otros, 1996), inhibidores de tirosina quinasa (Siemeister y otros, 1998), estrategias antisentido, aptámeros de ARN y ribozimas contra el VEGF o receptores del VEGF (Saleh y otros, 1996; Cheng y otros, 1996; Ke y otros, 1998; Parry y otros, 1999).
B. Anticuerpos anti-VEGF B1. Conjunto de propiedades del anticuerpo
Se ha mostrado que la aplicación de varios métodos inhibitorios es, como mínimo, algo efectiva en el bloqueo de la angiogénesis y/o la supresión del crecimiento del tumor mediante la interferencia con la señalización del VEGF. De hecho, se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales contra el VEGF inhiben el crecimiento de xenoinjertos tumorales humanos y la formación de ascitis en ratones (Kim y otros, 1993; Asano y otros, 1995; 1998; Mesiano y otros, 1998; Luo y otros, 1998a; 1998b; Borgstrom y otros, 1996; 1998).
El anticuerpo A4.6.1 es un anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad capaz de bloquear la unión del VEGF tanto a VEGFR1 como a VEGFR2 (Kim y otros, 1992; Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1998). La mutagénesis de barrido de alanina y la cristalografía de rayos X del VEGF enlazado por el fragmento Fab del A4.6.1 mostró que el epítopo en el VEGF al que el A4.6.1 se une está centrado alrededor de los aminoácidos 89-94. Este dato estructural demuestra que el A4.6.1 inhibe competitivamente el VEGF de la unión al VEGFR2, pero inhibe el VEGF de la unión al VEGFR1 más probablemente por impedimento estérico (Muller y otros, 1998; Keyt y otros, 1996).
El A4.6.1 es el anticuerpo anti-VEGF neutralizante utilizado más extensivamente en la literatura hasta la fecha. Se ha mostrado que inhibe el crecimiento y la permeabilidad vascular inducida por el VEGF de una variedad de tumores humanos en ratones (Brem, 1998; Baca y otros, 1997; Presta y otros, 1997; Mordenti y otros, 1999; Borgstrom y otros, 1999; Ryan y otros, 1999; Lin y otros, 1999). El A4.6.1 también inhibe la formación de ascitis en un modelo de ratón de un carcinoma ovárico humano bien caracterizado y la diseminación tumoral en un modelo de ratón de metástasis reciente. El A4.6.1 se ha humanizado recientemente mediante técnicas de exposición de fagos monovalentes y se encuentra actualmente en la Fase I de las pruebas clínicas como agente anticancerígeno (Brem, 1998; Baca y otros, 1997; Presta y otros, 1997).
A pesar de algunos éxitos en la técnica con anticuerpos neutralizantes contra VEGF, los presentes inventores se dieron cuenta de que nuevos anticuerpos, particularmente aquellos con un modo de interacción definido de forma más precisa con VEGFR1 (FLT-1) y/o VEGFR2 (KDR/Flk-1), serían beneficiosos por una serie de razones. Por ejemplo, el desarrollo de anticuerpos anti-VEGF que bloquearan, selectivamente, la interacción de VEGF con sólo uno de los dos receptores VEGF, permitiría una disección más precisa de los mecanismos activados por el VEGF en células que expresan tanto el VEGFR1 como el VEGFR2.
Los presentes inventores creyeron que los anticuerpos de una especificidad de epítopo definida que bloqueaban la unión del VEGF a sólo un receptor (VEGFR2s), bien podían tener beneficios clínicos dependiendo, por supuesto, del mantenimiento de sus efectos inhibitorios en un entorno in vivo. Los estudios de ratones "knockout" de Hiratsuka y otros (1998) muestran que tanto el VEGFR1 como el VEGFR2 tienen papeles biológicos importantes. Anteriormente a la presente invención, la falta de agentes inhibitorios confeccionados y efectivos obstaculizó las oportunidades auténticas para la intervención terapéutica enfocada a la inhibición de los efectos mediados por el VEGF a través de sólo uno de los dos receptores.
Los presentes inventores, primeramente, desarrollaron un conjunto de nuevos anticuerpos anti-VEGF que tienen varias propiedades y especificidades de epítopo. Se proporcionan seis grupos de hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales contra el complejo VEGF:receptor (Flk-1) o contra el propio VEGF. Cinco de los grupos de anticuerpos no interfieren con la unión del VEGF a su receptor, mientras que uno bloqueaba esta interacción (grupo 2C3) e inhibía el crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF.
Actualmente, se prefieren anticuerpos de los grupos 3E7, GV39M, y 2C3, todos ellos localizados selectivamente en el tumor tras una inyección intravenosa en ratones con xenoinjertos tumorales humanos, para el uso en marcaje, imagen y tratamiento de la vasculatura o tejido conectivo de los tumores sólidos.
Los anticuerpos monoclonales de la presente invención que reconocen el complejo VEGF:receptor se localizan selectivamente en las células endoteliales del tumor tras la inyección en ratones con xenoinjertos tumorales humanos. Los anticuerpos monoclonales del grupo 2C3 se localizan claramente en el tejido conectivo perivascular del tumor, y también en los vasos tumorales circundantes.
Los anticuerpos que reconocen el extremo N-terminal reaccionan con el VEGF enlazado al receptor por ELISA. El GV39M y el 11B5 muestran una alta especificidad para el VEGF enlazado al receptor, en contraposición con el VEGF no enlazado al receptor. Presumiblemente, el epítopo reconocido por el GV39M y el 11B5 en el extremo N-terminal es conformacional y se crea cuando el VEGF se une a su receptor. El hecho de que ambos anticuerpos sean IgMs, y por tanto, grandes en tamaño, puede ser importante para su selectividad hacia el complejo VEGF:
receptor.
Los anticuerpos de extremo anti-N-terminal no inhibían el crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF. Esto sugiere que el extremo N-terminal del VEGF no está implicado en la interacción del receptor y que los anticuerpos contra el extremo N-terminal del VEGF no interfieren con la señalización mediada por el VEGF.
En contraste, el 2C3 inhibe el crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF con un IC_{50} de 3nM. Los estudios de unión de VEGF-^{125}I que utilizan células endoteliales que expresan KDR (células ABAE) demostraron que el 2C3 bloquea el VEGF de la unión con KDR de una manera dependiente de concentración. De este modo, el 2C3 es capaz de neutralizar la misma actividad in vitro del VEGF mediada por KDR (VEGFR2) mediante la interferencia en la unión del VEGF con su receptor.
Los ensayos inmunohistoquímicos revelaron que el GV39M, 11B5, 3E7 y 7G3 reaccionan, de forma moderada a fuerte, con el endotelio vascular cuando se aplican directamente a las secciones. El GV39M muestra la mayor especificidad para las células endoteliales tumorales con, comparativamente, poca tinción de células tumorales o tejido conectivo. El 11B5, 3E7 y 7G3 preferencialmente tiñen células endoteliales cuando se aplican a bajas concentraciones, pero tiñen claramente las células tumorales y tejido conectivo a altas concentraciones.
El patrón de tinción observado con el 11B5, 3E7 y 7G3 es típico del tipo de tinción visto cuando se utilizan anticuerpos policlonales contra el VEGF que no tienen preferencia por una conformación particular del VEGF (Lin-Ke y otros, 1996; Plate y otros, 1994; Claffey y otros, 1996). La tinción selectiva del endotelio por el GV39M sugiere que se une al complejo VEGF:receptor en estas células y es coherente con la localización en las células endoteliales de los receptores y el hecho de que el GV39M se une selectivamente a VEGF:sFlk-1 en un ELISA.
De forma similar, los patrones de tinción más amplios del 3E7 y 7G3 son coherentes con su capacidad para reconocer tanto el VEGF libre como el enlazado al receptor. Sin embargo, se esperaba que el 11B5 tuviera un patrón de tinción que fuera más limitado al endotelio porque prefiere fuertemente el VEGF:Flk-1 en la captura ELISA (ver Tabla 2). Es posible que el 11B5 sea capaz de reconocer el VEGF que está enlazado a los componentes del estroma, dándole un patrón de reactividad más amplio en las secciones del tumor.
El 3E7 y GV39M se localizan selectivamente in vivo en las células endoteliales vasculares del tejido tumoral, mientras que el 2C3 se localiza en el tejido conectivo perivascular de los tumores, además del endotelio. Veinticuatro horas después de la inyección intravenosa al ratón con el tumor, el 3E7 no era detectable en el endotelio de cualquier tejido excepto del tumor. El GV39M, por otro lado, también se enlazó a células endoteliales o células mesangiales en el glomérulo del riñón. La razón de la reactividad del GV39M con los glomérulos del riñón del ratón no está clara. Podría ser que el anticuerpo se une al complejo VEGF:receptor en las células endoteliales normales en el riñón (Takahashi y otros, 1995). Sin embargo, los estudios de localización en cobayas con tumores de la Línea 10 singeneicos han mostrado que el GV39M se localiza en los vasos sanguíneos del tumor pero no en el glomérulo o en vasos de otros tejidos normales.
La capacidad del 3E7 y el GV39M para localizarse específicamente en el endotelio tumoral es probablemente el resultado de, como mínimo, dos factores. Primero, el complejo VEGF:receptor es relativamente abundante en los vasos sanguíneos del tumor porque el microentorno hipóxico del tumor estimula la expresión del VEGF por células tumorales y la expresión del receptor del VEGF por células endoteliales. Segundo, los vasos sanguíneos del tumor son más permeables que los vasos sanguíneos normales (Yuan y otros, 1996), lo cual puede permitir al anticuerpo un mayor acceso al complejo VEGF:receptor, que parece estar concentrado en la cara abluminal de los vasos (Lin-Ke y otros,1996; Hong y otros, 1995).
En un estudio previo por Lin-Ke y colegas (1996), se encontró que anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra el extremo N-terminal de VEGF de rata se localizaban en células endoteliales del tumor tras la inyección en ratones con carcinoma mamario de ratón TA3/St o carcinoma ovárico MOT. En contraste, un anticuerpo policlonal de conejo (Ab-618) dirigido contra la proteína del VEGF completa no se localizó específicamente en células endoteliales en estos tumores o en cualquier parte de los propios tumores.
Basándose en estos resultados, Lin-Ke y otros (1996) concluyeron que el extremo N-terminal del VEGF tiene la capacidad de unir anticuerpos después de que el VEGF se haya asociado con el endotelio microvascular y que el conjunto de VEGF libres o asociados con células no endoteliales no es suficiente para concentrar anticuerpos anti-VEGF dirigidos contra epítopos que no están en el extremo N-terminal (Lin-Ke y otros, 1996). Los presentes resultados con 3E7 y GV39M, dirigidos contra el extremo N-terminal del VEGF, apoyan estas conclusiones.
Sin embargo, los descubrimientos de la presente invención que anticuerpos del grupo 2C3, dirigidos contra epítopos que no se encuentran en el extremo N-terminal del VEGF, se localizan tanto en la vasculatura como en el tejido conectivo perivascular de tumores sólidos en ratones, son remarcablemente sorprendentes sobre el trabajo de Lin-Ke y otros (1996). La presente invención sugiere que "una reserva" de VEGF está presente en el estroma tumoral y, efectivamente, permite la concentración de 2C3 en la masa tumoral. Tal marcaje del estroma tumoral como célula diana no se podría haber predicho a partir de un estudio de publicaciones anteriores. Los inventores contemplan que el VEGF pueda unirse a proteoglicanos de sulfato de heparán (HSPGs) en el interior del tumor, a pesar de que no es ciertamente necesario entender el mecanismo de acción para realizar la presente invención.
Una rápida conclusión de la presente invención es que los anticuerpos de los grupos GV39M y 3E7 se localizan selectivamente en las células endoteliales del tumor en ratones, mientras que los anticuerpos del grupo 2C3 se localizan en las células endoteliales del tumor y en el tejido conectivo perivascular del tumor. Puesto que la distribución del VEGF y sus receptores son similares en el ratón y el hombre, se contempla que estos anticuerpos muestren patrones similares de localización en pacientes con cáncer. De este modo, el GV39M y el 3E7 se prevén para el uso en la liberación de agentes de diagnóstico o terapéuticos en la vasculatura tumoral en el hombre, mientras que los anticuerpos del grupo 2C3 se contemplan como vehículos para dirigir los agentes de diagnóstico o terapéuticos a la vasculatura tumoral y el tejido conectivo tumoral.
B2. Anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 y 2C3
Estudios avanzados sobre los anticuerpos del grupo 2C3 revelaron incluso propiedades más sorprendentes, dando lugar a las composiciones y usos efectivos de la presente invención.
Un descubrimiento importante de la presente invención, hecho utilizando ELISA, ensayos de unión al receptor y ensayos de activación del receptor, es que los anticuerpos monoclonales del grupo 2C3 bloquean selectivamente la interacción del VEGF con VEGFR2 (KDR/Flk-1), pero no con VEGFR1 (FLT-1). Los anticuerpos 2C3 inhiben la fosforilación, inducida por el VEGF, del VEGFR2 y bloquean la permeabilidad inducida por el VEGF, implicando al VEGFR2 como el receptor responsable de la permeabilidad inducida por el VEGF. Los anticuerpos 2C3 también tienen una actividad antitumoral potente, obstaculizando el crecimiento de varios tumores sólidos humanos establecidos en modelos de animales de cáncer humano aceptados en la técnica.
Estos descubrimientos demuestran la utilidad del 2C3 en diseccionar los mecanismos que son activados por el VEGF en células que expresan tanto el VEGFR1 como el VEGFR2, al igual que destacan la importancia de la actividad del VEGFR2 en el proceso de crecimiento y supervivencia del tumor. De forma más importante, proporcionan un modo único de intervención terapéutica, permitiendo la inhibición específica de la angiogénesis inducida por el VEGFR-2, sin la inhibición concomitante de la quimiotaxis de macrófagos, la función de osteoclastos y condroclastos (mediada por el VEGFR1).
De este modo, los descubrimientos respecto al 2C3 proporcionan, por primera vez, la motivación y los medios para fabricar y utilizar anticuerpos anti-VEGF que inhiban la unión del VEGF sólo al VEGFR2, y no al VEGFR1. Tales anticuerpos, sucintamente denominados "anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2", representan un avance en el sector y proporcionan numerosas ventajas, tanto en términos de usos en formas "desnudas" o no conjugadas, como cuando se conjugan o se asocian con otros agentes terapéuticos.
Los estudios de unión in vitro de la presente invención, empleando ELISA y ensayos de coprecipitación con proteínas de receptor purificadas, demostraron que el 2C3 bloquea la unión del VEGF al VEGFR2. Sorprendentemente, el 2C3 no inhibió, sin embargo, la unión del VEGF al VEGFR1 en ningún sistema de ensayo. Para confirmar los resultados iniciales, se repitieron ELISAs de unión en diferentes configuraciones. En cada configuración, los resultados indicaron que el 2C3 no interfiere con la interacción VEGF:VEGFR1. Como control para estos estudios se utilizó el anticuerpo monoclonal 3E7, un anticuerpo dirigido contra el extremo NH_{2}-terminal del VEGF, que no bloqueaba el VEGF para la unión al VEGFR1 o al VEGFR2.
El grupo 2C3 de los anticuerpos de la presente invención están, de este modo, significativamente mejorados respecto a otros anticuerpos de bloqueo al VEGF, incluyendo el A4.6.1. El anticuerpo anti-VEGF A4.6.1 bloqueaba la unión del VEGF a ambos receptores del VEGF. Estudios cristalográficos y de mutagénesis han mostrado que los epítopos de unión para el VEGFR2 y el VEGFR1 se concentran hacia los dos polos simétricos del dímero del VEGF (Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1997). Los determinantes de la unión en el VEGF, que interaccionan con los dos receptores, se superponen parcialmente y se distribuyen sobre cuatro segmentos diferentes que se extienden por la superficie del dímero (Muller y otros, 1998). El anticuerpo 4.6.1 se une a una región del VEGF dentro de la región de unión al receptor de ambos receptores (Muller y otros, 1998). Se propone que el 2C3 se une a una región que se encuentra próxima al sitio de unión del VEGFR2, pero no al sitio de unión del VEGFR1.
Los estudios sobre los efectos del 2C3 en la fosforilación de los receptores inducida por el VEGF mostraron que el 2C3 no bloquea la fosforilación del VEGFR2 inducida por el VEGF. Esto también corresponde a los datos discutidos anteriormente y solidifica aún más el papel del VEGFR2 en la proliferación inducida por el VEGF.
De forma similar a los resultados de otros estudios, no se pudo demostrar una fosforilación consistente del VEGFR1 inducida por el VEGF (De Vries y otros, 1992; Waltenberger y otros, 1994; Davis-Smyth y otros, 1996; Landgren y otros, 1998). Por lo tanto, no se pudo juzgar de forma fiable si el 2C3 inhibe la fosforilación del VEGFR1 inducida por el VEGF. La baja actividad del VEGF en la fosforilación del VEGFR1 ha llevado a otros a sugerir que el VEGFR1 podría no ser un receptor de señalización en células endoteliales, pero que podría actuar como un receptor de reclamo para capturar el VEGF y amplificar su señalización a través del VEGFR2 (Hiratsuka y otros, 1998). Sin embargo, se ha expuesto, por Kupprion y otros (1998), la fosforilación de tirosina del VEGFR1 mediante la unión del VEGF utilizando células endoteliales microvasculares humanas (HMEC) y, por Sawano y otros (1996), utilizando células NIH 3T3 que sobreexpresan el VEGFR1. Adicionalmente, Waltenberger y otros (1994) han demostrado que la activación del VEGFR1 inducida por el VEGF se puede seguir utilizando un ensayo de quinasa in vitro. El efecto del 2C3 en la fosforilación del VEGFR1 inducida por el VEGF, o la falta de ésta, se podría determinar utilizando uno de los tipos de células anteriores o un ensayo de quinasa in vitro.
Los datos de la presente ELISA de la Figura 2 y los datos de la unión celular demuestran que los anticuerpos 2C3 no bloquean completamente el VEGF en la unión con células que expresan tanto el VEGFR1 como el VEGFR2. El hecho de que el 2C3 no bloquee la unión del VEGF al VEGFR1 significa que los anticuerpos 2C3 serán unas herramientas efectivas en la descripción del papel del VEGFR1 en la biología de las células endoteliales y de otro tipo de células.
Utilizando el ensayo de permeabilidad de Miles en cobayas, se examinaron las consecuencias funcionales de la selectividad que el 2C3 muestra en el bloqueo del VEGF de la activación de sus receptores. Tanto el 2C3 como el A4.6.1 inhibían la permeabilidad inducida por el VEGF cuando la IgG estaba en, como mínimo, un exceso molar de 10 veces sobre el VEGF. El 3E7 y los anticuerpos de control no inhibían la permeabilidad inducida por el VEGF incluso en un exceso molar de 1000 veces. Estos resultados muestran que el VEGFR2 está implicado en la permeabilidad inducida por el VEGF.
Este descubrimiento concuerda con informes recientes de que una forma nueva de VEGF-C y dos variantes VEGF-E derivadas de virus se unen al VEGFR2 pero no al VEGFR1 y mantienen todavía la capacidad de mejorar la permeabilidad vascular (Joukov y otros, 1998; Ogawa y otros, 1998; Meyer y otros, 1999). Probablemente las formas varias del VEGF transmiten señales a través del VEGFR2 que causan la producción de NO, que, sucesivamente, causa el incremento en la permeabilidad vascular (Hood y Granger, 1998; Hood y otros, 1998; Kroll y Waltenberger, 1998; Murohara y otros, 1998; Kupprion y otros, 1998; Sawano y otros, 1996; Fujii y otros, 1997; Parenti y otros, 1998). Esto apunta indirectamente a la implicación del VEGFR2, ya que se ha mostrado la producción de NO como una consecuencia de la activación del VEGFR2. Sin embargo, hay también algunas evidencias de lo contrario, como Couper y otros (1997), que encontraron una fuerte correlación entre el incremento de la permeabilidad vascular inducida por el VEGF y la expresión del VEGFR1 in vivo.
El 2C3 inhibió el crecimiento de múltiples tipos diferentes de tumores humanos in vivo. El efecto de 100 \mug de 2C3 administrado 2 veces/semana fue idéntico en ratones con tumores de NSCLC NCI-H358 y rabdomiosarcoma A673, en los que eficazmente limitó el crecimiento de los tumores a un pequeño nódulo de aproximadamente 150 mm^{3} de tamaño. Se observaron respuestas similares en otros modelos de tumores, tales como HT29 y LS174T, ambos adenocarcinomas humanos de colon.
La magnitud de la supresión del crecimiento del tumor por el 2C3 es similar a la expuesta por otros investigadores utilizando diferentes anticuerpos anti-VEGF neutralizantes (Asano y otros, 1998; Mesiano y otros, 1998). Un anticuerpo monoclonal VEGFR2 anti-ratón de rata también bloqueaba fuertemente el crecimiento de queratinocitos humanos malignos en ratones a través de un mecanismo antiangiogénico (Skobe y otros, 1997). La efectividad del 2C3, siendo similar a la que otros investigadores han encontrado utilizando diferentes anticuerpos anti-VEGF, además demuestra el papel del VEGF en la angiogénesis tumoral y el crecimiento tumoral. Sin embargo, el 2C3 debería proporcionar un efecto terapéutico más seguro, basándose en sus propiedades inhibitorias específicas discutidas en la presente.
Para analizar el efecto de la inhibición de la actividad del VEGF en una situación cercana a las condiciones en humanos, ratones en los que se habían establecido tumores se trataron con 2C3. En esta situación, el tratamiento con 2C3 ralentizó significativamente el crecimiento de dos tumores humanos agresivos, los tumores de rabdomiosarcoma A673 y adenocarcinoma de colon LS174T. Los anticuerpos 2C3 causaron regresiones significativas del tumor en ratones con tumores NSCLC NCI-H358.
Los tumores tratados con 2C3 o A4.6.1 tuvieron una regresión al 30% y 35%, respectivamente, de su tamaño original después de aproximadamente 10 semanas de tratamiento. En un estudio donde se permitió extender el tratamiento pasados 100 días, se observaron incluso unas regresiones más significativas. Los resultados sugieren que el VEGF proporciona algo más que una simple señal mitótica para el endotelio tumoral.
El hecho de observar regresiones, en lugar de estasis tumorales, sugiere que el VEGF proporciona algo más que una simple señal angiogénica para el endotelio tumoral. Benjamin y otros (1999) recientemente expusieron que los tumores contienen una amplia fracción de vasos sanguíneos inmaduros, que aún tienen que establecer contacto con células periendoteliales, y que estos vasos sanguíneos dependen del VEGF para sobrevivir. Es posible que la neutralización de VEGF provoque que estos vasos sanguíneos inmaduros experimenten apoptosis, reduciendo así la existencia de una red vascular en el tumor. También es posible que tenga lugar un proceso dinámico de remodelación vascular en los tumores, implicando tanto la formación como la regresión de vasos, y que la neutralización de VEGF prevenga la formación de vasos llevando a un desplazamiento de la red hacia la regresión de vasos.
El descubrimiento de que el 2C3 suprimía el crecimiento tumoral de forma tan completa como el A4.6.1 (si no más) indica un papel dominante para el VEGFR2 en la angiogénesis tumoral. El proceso con multietapas de la angiogénesis requiere la quimiotaxis de células endoteliales, la producción, invasión, proliferación y diferenciación de metaloproteinasas. El VEGFR1 puede que no tenga un papel en estos procesos, o puede ayudar en estos procesos mediante la unión del VEGF y presentándolo al receptor de señalización, VEGFR2.
Las cifras comparables para el 2C3 y el A4.6.1 en el tratamiento tumoral son altamente relevantes: el 2C3 es ligeramente más efectivo que el A4.6.1, a pesar de que sólo se une al VEGFR2 y no al VEGFR1. Los presentes estudios, por tanto, indican que el VEGFR1 no juega un papel importante en la angiogénesis tumoral mediada por el VEGF, y además sugieren que los inhibidores específicos del VEGFR1 pueden no tener influencia en la angiogénesis tumoral. Estos resultados también indican que el 2C3 puede ser igual o más efectivo que el A4.6.1, a la vez que causa menos efectos colaterales.
La capacidad de bloquear específicamente la unión del VEGF a VEGFR2 y la activación del mismo tiene una importancia en dos áreas de relevancia clínica. Primero, se cree que el VEGFR1 (Flt-1) juega un papel importante en el reclutamiento de macrófagos y monocitos en el interior del tumor, ya que estas células expresan el VEGFR1 y responden quimiotácticamente al VEGF a través de la señalización del VEGFR1 (Clauss y otros, 1996; Hiratsuka y otros, 1998; Akuzawa y otros, 2000). Tras la activación de macrófagos, se estimula la transcripción del gen del flt-1 a través de una inducción de Egr-1, que se une a los sitios de unión del factor de transcripción Egr-1/Sp1 superpuestos en el promotor flt-1 humano, proporcionando la evidencia de que el gen del flt-1 es una diana directa de Egr-1, el factor de transcripción inducido principalmente en la diferenciación de macrófagos (Akuzawa y otros, 2000).
Para mantener la activación de macrófagos, tal como se requiere para producir una respuesta antitumoral rigurosa, se debería evitar la inhibición de la señalización de VEGFR1. El bloqueo específico de VEGFR1, permitido por la presente invención, de este modo, proporciona ventajas importantes sobre el A4.6.1 en la terapia tumoral, ya que la infiltración de macrófagos no se disminuirá, permitiendo a estas células eliminar los restos de células tumorales de tumores necróticos y provocar la reducción del tumor. La utilización de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tal como el 2C3, también permitirá la infiltración de macrófagos para contribuir al efecto antitumoral completo por tener un efecto citocidal directo en las células tumorales.
De hecho, la presente invención proporciona únicamente agentes ventajosos para el uso en todas las formas de terapia antiangiogénica, debido a su capacidad de bloquear la actividad angiogénica del VEGF, pero no de inhibir otras acciones beneficiosas del VEGF, mediadas a través del VEGFR1, tales como aquellas en células óseas o inmunes. Una segunda área de importancia clínica afecta la capacidad de los anticuerpos, preparados de acuerdo con la presente invención, para funcionar in vivo sin inhibir los efectos beneficiosos de los osteoclastos y condroclastos. Esto significa que el uso de los presentes agentes terapéuticos de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, incluyendo el 2C3, no se asociará con efectos colaterales en huesos y/o cartílagos.
Los estudios in vivo han mostrado que el VEGF acopla la remodelación de cartílago hipertrófico, la osificación y la angiogénesis durante la formación de hueso endocondral y que el VEGF es esencial para la remodelación del cartílago (Gerber y otros, 1999). Se observó que la inactivación de la señalización del VEGF a través del VEGFR1, mediante la administración de la proteína quimérica soluble del receptor VEGFR1 (Flt-(1-3)-IgG), perjudicaba la formación de hueso trabecular y la expansión de la zona de condrocitos hipertróficos mediante la disminución del reclutamiento y/o diferenciación de condroclastos (Gerber y otros, 1999).
También se ha mostrado que el VEGF puede sustituir al factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-CSF) en el apoyo de la función de los osteoclastos in vivo (Niida y otros, 1999). En estudios que utilizan ratones osteopetróticos (op/op), con una deficiencia en osteoclastos resultante de una mutación en el gen del M-CSF, una inyección de M-CSF humano recombinante (rhM-CSF) permite el reclutamiento y la supervivencia de osteoclastos. En estudios recientes, se mostró que una única inyección de VEGF humano recombinante puede inducir de forma similar el reclutamiento de osteoclastos en ratones op/op (Niida y otros, 1999).
Niida y otros (1999) expusieron que, como los osteoclastos predominantemente expresan el VEGFR1, y que la actividad del factor de crecimiento 1 de placenta humana recombinante en el reclutamiento de osteoclastos era comparable a la del rhVEGF, los efectos beneficiosos de la señalización del VEGF en ratones osteopetróticos (op/op) son mediados a través del receptor 1 del VEGF (VEGFR-1). Estos autores, además, mostraron que los osteoclastos inducidos por el rhM-CSF murieron después de que el VEGF fuera inhibido (utilizando una proteína quimérica del receptor VEGFR1, VEGFR1/Fc), pero que tales efectos se anularon mediante inyecciones concomitantes de rhM-CSF. Los osteoclastos mantenidos por el rhM-CSF o el VEGF endógeno no mostraron diferencias significativas en la actividad in vivo (Niida y otros, 1999).
Ratones op/op mutantes experimentan una resolución de osteopetrosis relacionada con la edad acompañada por un incremento en el número de osteoclastos. En los estudios de Niida y otros (1999), la mayoría de osteoclastos desaparecieron después de las inyecciones del anticuerpo anti-VEGF, demostrando que el VEGF producido endógenamente es el responsable de la aparición de osteoclastos en los ratones mutantes. Además, el rhVEGF reemplazó al rhM-CSF en el apoyo de la diferenciación de osteoclastos in vitro. Estos resultados demuestran que el M-CSF y el VEGF tienen funciones superpuestas en el apoyo de la función del osteoclasto y que el VEGF actúa a través del receptor VEGFR-1 (Niida y otros, 1999).
Se puede concluir de este modo, que el 2C3, el primero de los anticuerpos anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de la presente invención, no bloquea el VEGF de la unión y activación del VEGFR1, pero sí bloquea el VEGF de la unión y activación del VEGFR2. Los efectos antitumorales de tal inhibición del VEGFR2 están claramente demostrados. Estos resultados muestran que el VEGFR2 es el receptor del VEGF que media en la permeabilidad y destaca su papel en la angiogénesis tumoral. La presente invención, por tanto, valida además la inhibición del VEGF como terapia para el tratamiento de tumores sólidos. De forma más importante, la presente invención proporciona un conjunto de nuevos anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como aquellos basados en 2C3, para la intervención terapéutica y, en particular, para el uso como fármacos seguros y efectivos para la inhibición de la angiogénesis en tumores y otras enfermedades.
Los beneficios de la presente invención no se limitan a la ausencia de efectos colaterales. A pesar de que éstas son características importantes que tendrán notables beneficios, particularmente en el tratamiento infantil y en pacientes con desórdenes óseos, los anticuerpos de la presente invención tienen otras numerosas ventajas.
Por ejemplo, los conjugados de anticuerpos basados en los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o en los anticuerpos 2C3, se pueden utilizar para liberar agentes terapéuticos al medio tumoral. De hecho, en la presente se muestran los anticuerpos 2C3 para unirse tanto a la vasculatura tumoral como al estroma tumoral tras la administración in vivo, pero no para unirse a la vasculatura o al tejido conectivo en órganos o tejidos normales. Las construcciones terapéuticas basadas en los presentes anticuerpos, por tanto, tienen la ventaja de combinar dos funciones dentro de una molécula: las propiedades antiangiogénicas del anticuerpo o un fragmento de éste y las propiedades del agente terapéutico seleccionado para el acoplamiento.
Como el VEGFR2 es el receptor clave en el endotelio, el bloqueo de la unión del VEGF al VEGFR2 es crítico para un efecto antiangiogénico. A pesar de que el VEGFR1 se expresa en el endotelio, no es transductor de señal, o es pasivo, en este contexto. Por lo tanto, la incapacidad de los anticuerpos de la presente invención de bloquear la unión del VEGF al VEGFR1 no tiene consecuencias en su efectividad como agentes antiangiogénicos y antitumorales. De hecho, en lugar de inhibir la unión del VEGF al VEGFR1, que tiene lugar con los anticuerpos bloqueadores de los trabajos anteriores, la capacidad de los presentes anticuerpos de unirse al VEGF y además no perturbar sustancialmente las interacciones VEGF-VEGFR1 mejora las propiedades de liberación de fármacos de estos nuevos anticuerpos.
Los presentes inventores se dieron cuenta de que incluso se esperaría que los anticuerpos bloqueadores funcionaran para liberar agentes terapéuticos al medio tumoral mediante la unión al VEGF localizado en el tumor que no está unido a un receptor. Específicamente, entendieron que tales anticuerpos se unirán al VEGF en el estroma tumoral y liberarán agentes terapéuticos al mismo. Esto proporciona una reserva de fármaco alrededor del endotelio, causando efectos citotóxicos u otros destructivos en las células endoteliales vasculares y ejerciendo un efecto antitumoral.
El VEGF asociado con el estroma o el tejido conectivo no está enlazado al receptor del VEGF en el sentido clásico, es decir, un receptor de superficie celular. Más bien, el VEGF está enlazado a uno o más componentes del tejido conectivo, incluyendo proteoglicanos, tal como el proteoglicano de sulfato de heparán, a través de una región básica del VEGF. Estas secuencias (y los exones que las codifican) faltan en la proteína VEGF121 (y el subyacente ADN), así que esta isoforma no debería estar presente en el estroma en cantidades significativas. El VEGF en el estroma tumoral se denomina frecuentemente "libre", a pesar de que está localizado en el interior del tumor, así que "libre" esencialmente significa no unido a un receptor.
Los inventores además dedujeron que un anticuerpo que bloquea la unión del VEGF a uno, pero no ambos receptores, sería incluso capaz de liberar agentes terapéuticos al medio tumoral mediante la unión al VEGF unido al receptor en la vasculatura. Esta es una de las características más ventajosas de la presente invención. Concretamente, el suministro de anticuerpos que bloquean la unión del VEGF al VEGFR2, y, por tanto, que inhiben la señal angiogénica del VEGF, pero que no bloquean la unión del VEGF al VEGFR1. Además de reducir los efectos colaterales sistémicos mediante el mantenimiento de la señalización del VEGF a través del VEGFR1 en otros tipos de células y tejidos, estos anticuerpos son capaces de localizarse en el complejo VEGF-VEGFR1 en la vasculatura tumoral y liberar los agentes terapéuticos directamente a ésta.
Tanto el VEGFR1 como el VEGFR2 se regulan a la alta en las células endoteliales del tumor, en contraposición a las células endoteliales en tejidos normales. El VEGFR1 se expresa de forma elevada en el endotelio vascular tumoral, lo cual hace que los aspectos de marcaje de dianas de la presente invención sean particularmente efectivos. De hecho, el VEGFR1, a pesar de "no señalizar" en el endotelio, se expresa, como mínimo, en los mismos niveles que el VEGFR2, si no a niveles más elevados. Un factor subyacente de este fenómeno es que el VEGFR1 se regula a la alta en respuesta tanto a la hipoxia como al VEGF, mientras que el VEGFR2 sólo se regula a la alta en respuesta al VEGF y no está influido por la hipoxia.
A pesar de que el papel del VEGFR1 en el endotelio permanece incierto, el VEGFR1 puede actuar como un receptor reclamo para "capturar" el VEGF y pasar el ligando al receptor de señalización, VEGFR2. Para que esto sea cierto, se puede esperar que el receptor reclamo tenga una mayor afinidad por el VEGF que por el receptor de señalización, que es, de hecho, el caso. A la luz de esto, y quizás también debido a los niveles de expresión mejorados, los anticuerpos bloqueadores de VEGFR2, no bloqueadores de VEGFR1 de la presente invención son agentes liberadores ideales para el tratamiento tumoral. Los conjugados terapéuticos de estos anticuerpos son capaces de inhibir, simultáneamente, la angiogénesis a través del VEGFR2 y de destruir la vasculatura existente mediante la liberación de un agente terapéutico al complejo VEGF-receptor VEGFR1.
Los inventores no se limitan de ninguna manera al razonamiento científico anterior como explicación para las propiedades de localización del tumor y antiangiogénicas beneficiosas de los presentes anticuerpos. A pesar de que la utilidad de la presente invención es de por sí evidente y no necesita una subyacente teoría para ponerla en práctica, los inventores han considerado mecanismos alternativos mediante los cuales los anticuerpos bloqueadores de VEGFR2, no bloqueadores de VEGFR1 pueden localizarse de manera efectiva y específica en la vasculatura tumoral.
Tales anticuerpos se podrían unir al VEGF que está asociado con Npn-1 u otra proteína de unión del VEGF, no caracterizada hasta ahora en la superficie celular o se podría unir al VEGF que está enlazado a proteoglicanos de sulfato de heparán en la superficie de células endoteliales. La localización del anticuerpo también se podría mejorar mediante la unión a otro miembro de la familia de proteínas del VEGF, es decir, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, que se asocian con los vasos sanguíneos, a pesar de que esto es menos probable.
Otra propiedad ventajosa de los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, ó 2C3 de la presente invención es que estos anticuerpos neutralizan la señal de supervivencia o "efecto protector" del VEGF, que es mediada a través del VEGFR2. Además de hacer a los propios anticuerpos más efectivos, esta propiedad los hace particularmente útiles en combinación con otros agentes que se obstaculizan por la función de supervivencia del VEGF.
Por ejemplo, el VEGF protege el endotelio de la radioterapia. Por lo tanto, tanto los anticuerpos desnudos como los inmunoconjugados de la presente invención son ideales para el uso en combinación con radioterapia. Mediante el uso de tales anticuerpos acoplados al agente radioterapéutico se proporcionan incluso más beneficios. Este tipo de construcción tendría la triple ventaja de: (1) ejercer un efecto antiangiogénico a través de la parte de anticuerpo; (2) ejercer un efecto destructivo de la vasculatura tumoral a través de la liberación del agente radioterapéutico, y (3) impedir a la señal de supervivencia habitual del VEGF contrarrestar los efectos del agente radioterapéu-
tico.
Otras construcciones con efectos sinergísticos similares son los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 en asociación con fármacos o profármacos antitubulina, agentes antiapoptópicos y otros agentes antiangiogénicos. Las acciones de agentes o fármacos que causan apoptosis están antagonizadas por el VEGF. La presente invención, por tanto, mejora la efectividad de tales agentes mediante la neutralización del VEGF. Las señales de superviviencia del VEGF también se oponen a la endostatina, limitando esta terapia. Por lo tanto, en un uso combinado con endostatina, los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 ó 2C3 de la presente invención neutralizarán el VEGF y amplificarán los efectos antitumorales de la endostatina. El 2C3 u otros anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 también se pueden utilizar para liberar específicamente colagenasa al tumor, donde la colagenasa producirá endostatina in situ, consiguiendo beneficios similares.
En todas estas combinaciones mejoradas o sinergísticas, los anticuerpos y otros agentes se pueden administrar separadamente, o los segundos agentes se pueden unir a los anticuerpos para una liberación específica (es decir, liberación dirigida al VEGFR1). En combinaciones con endostatina, se preferirán conjugados químicos o proteínas de fusión recombinantes, ya que contrarrestarán la corta vida media de la endostatina, que es, actualmente, una limitación de la terapia con endostatina potencial. También se pueden emplear combinaciones con activadores del plasminógeno del tejido (tPA), o formas diana del mismo.
Algunas ventajas adicionales de los agentes terapéuticos de la presente invención incluyen la capacidad de disminuir la presión intersticial. Como la permeabilidad incrementada mediada por el VEGF contribuye a la presión intersticial, la señalización reducida a través del VEGFR2 reducirá tanto la permeabilidad como la presión intersticial. Esto, sucesivamente, reducirá la barrera para que los fármacos atraviesen completamente el tejido tumoral, de manera que se puedan eliminar las células tumorales alejadas de la vasculatura. Se puede conseguir una terapia prolongada ya que las presentes composiciones no tienen inmunogenicidad o es negligible o es baja.
B3. Secuencias CDR del anticuerpo 2C3
El término "variable", como se usa en la presente en referencia a los anticuerpos, significa que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos, y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular a su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados "regiones hipervariables", ambos en los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada.
Las partes de los dominios variables más altamente conservadas se denominan la región de armazón (FR). Los dominios variables de cadenas ligeras o pesadas nativas comprenden cada uno cuatro FRs (FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente), adoptando mayoritariamente una configuración de lámina \beta, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina \beta.
Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en una proximidad cercana por los FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación de los sitios de unión al antígeno de los anticuerpos (Kabat y otros, 1991, referencia). Los dominios constantes no están directamente implicados en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tal como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
El término "región hipervariable", como se usa en la presente, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-56 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; (Kabat y otros, 1991) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada). Los residuos del "armazón" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable diferentes a los residuos de la región hipervariable como en la presente se define.
El ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de las cadenas Vh y V_{\kappa} del fragmento ScFv del 2C3 se proporcionan en la presente como SEQ ID NO: 6, 7, 8 y 9. Estas secuencias abarcan la CDR1-3 de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo.
Como se describe en la presente (Sección C3), con el suministro de información estructural y funcional para una molécula biológica, se puede generar un conjunto de moléculas equivalentes o incluso mejoradas. Esto se aplica a los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 de la presente invención, como se ejemplifica por los anticuerpos 2C3. Aunque deben conservarse las propiedades de un anticuerpo de unión al antígeno y otras propiedades funcionales, existe un grado extremadamente elevado de habilidad en la técnica de fabricar anticuerpos equivalentes e incluso mejorados una vez se ha proporcionado un anticuerpo de referencia. Tales habilidades técnicas se pueden, a la luz de las secuencias y la información proporcionada en la presente, aplicar a la producción de más anticuerpos que tengan características parecidas, mejoradas o cualquiera que se desee.
Para los anticuerpos equivalentes, ciertos aminoácidos pueden sustituir a otros aminoácidos en las regiones de armazón del dominio variable o constante del anticuerpo, sin una pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva. Es preferible que tales cambios se hagan en las secuencias del ADN que codifican las partes del anticuerpo y que los cambios se conserven en la naturaleza (ver Sección C3, la información del codón en la Tabla A, y los detalles técnicos de soporte en la mutagénesis específica de sitio). Naturalmente, no existe un límite del número de cambios que deberían hacerse, pero esto ya se sabrá por aquellos con una habilidad normal en la técnica.
Otros tipos de variantes son los anticuerpos con propiedades biológicas mejoradas respecto al anticuerpo parental del cual se generan. Tales variantes, o compuestos de segunda generación, son normalmente variantes sustitutivas que implican uno o más residuos sustituidos de la región hipervariable del anticuerpo parental. Una forma conveniente de generar tales variantes sustitutivas es la maduración de afinidad utilizando la exposición de fagos.
En la maduración de afinidad utilizando la exposición de fagos, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las variantes del anticuerpo generadas de este modo se exponen de un modo monovalente de partículas de fago filamentosas como fusiones al gen III producto del M13 empaquetado en el interior de cada partícula. A continuación, se someten a screening las variantes expuestas de los fagos para su actividad biológica (por ejemplo, la afinidad de unión) como se da a conocer en la presente. Para identificar sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, se puede llevar a cabo una mutagénesis de barrido de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno.
Alternativamente, o adicionalmente, se contempla que la estructura cristalina del complejo anticuerpo-antígeno se describa y analice para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el VEGF. Tales residuos de contacto y residuos próximos son candidatos para la sustitución. Una vez se generan dichas variantes, se somete el panel de variantes a screening, tal como se describe en la presente, y se seleccionan los anticuerpos con propiedades análogas, pero diferentes o incluso superiores, en uno o dos ensayos relevantes para el posterior desarrollo.
Aspectos adicionales de la presente invención, por tanto, tienen que ver con segmentos de ADN aislados y vectores recombinantes que codifican las regiones CDR de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, tales como las cadenas ligeras y pesadas del 2C3, y la creación y el uso de células huésped recombinantes a través de la aplicación de la tecnología del ADN, que expresan dichas regiones CDR.
La presente invención, de este modo, tiene que ver con segmentos de ADN, aislables de cualquier mamífero, preferiblemente, humano o murino, que son libres del ADN genómico total y son capaces de expresar regiones CDR de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, tales como las cadenas ligeras y pesadas del 2C3. Tal como se usa en la presente, el término "segmento de ADN" se refiere a una molécula de ADN que se ha aislado libre del ADN genómico total de una especie particular. Incluidos dentro del término "segmento de ADN", están segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos, y también vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, y similares.
De forma similar, un segmento de ADN que comprende un segmento de codificación o una parte del gen aislado que codifica las regiones CDR purificadas de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, tales como las cadenas ligeras y pesadas del 2C3, se refiere a un segmento de ADN que incluye tales secuencias de codificación y, en ciertos aspectos, secuencias reguladoras, aisladas sustancialmente de otras secuencias que codifican proteínas o de genes naturales. En este aspecto, el término "gen" se utiliza por simplicidad para referirse a una unidad que codifica una proteína funcional, un polipéptido o un péptido. Como se entenderá por especialistas de la técnica, este término funcional incluye las secuencias de codificación de anticuerpos nativas y los segmentos creados más pequeños que expresan, o se pueden adaptar para expresar, proteínas, polipéptidos o péptidos de unión al antígeno adecuados.
"Aislada sustancialmente de otras secuencias de codificación" significa que el segmento de codificación o parte del gen aislada de interés, forma la parte significativa de la región de codificación del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene grandes partes del ADN de codificación natural, tal como grandes fragmentos cromosómicos u otros genes funcionales o regiones de codificación del ADNc. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN aislado originalmente, y no excluye genes o regiones de codificación posteriormente añadidas al segmento por la mano del hombre.
En realizaciones particulares, la invención tiene que ver con segmentos de codificación aislados o partes de genes aisladas y vectores que incorporan secuencias de ADN que codifican regiones CDR de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, tales como las cadenas ligeras y pesadas del 2C3, que comprenden, como mínimo, una primera región de secuencias que incluye una región de secuencias de aminoácidos de, como mínimo, un 75% aproximadamente, más preferiblemente, como mínimo, un 80% aproximadamente, más preferiblemente, como mínimo, un 85% aproximadamente, más preferiblemente, como mínimo, un 90% aproximadamente, y todavía más preferiblemente, como mínimo, un 95% aproximadamente o similar, de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9; en el que dichas regiones CDR, como mínimo, mantienen sustancialmente las propiedades biológicas de las regiones CDR de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9.
Como se da a conocer en la presente, las secuencias pueden comprender ciertos aminoácidos equivalentes biológicamente funcionales o "sustituciones conservativas". Otras secuencias pueden comprender aminoácidos no equivalentes funcionalmente o "sustituciones no conservativas" deliberadamente diseñadas para mejorar las propiedades de las CDR o de los anticuerpos que contienen las CDR, como es conocido por aquellos de habilidad normal en la técnica y descrito en profundidad en la presente.
También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos adicionales N- o C-terminales o secuencias 5' ó 3', y que incluso correspondan a una secuencia de la presente invención, siempre y cuando, la secuencia cumpla los criterios establecidos anteriormente, preferiblemente que incluya el mantenimiento o mejora de la actividad biológica de la proteína donde la expresión de la proteína está involucrada. La adición de secuencias terminales incluye secuencias de no codificación flanqueando las partes 3' ó 5' de la región de codificación, y también de las regiones de control.
Los segmentos de ácido nucleico de la presente invención pueden, de este modo, combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzima de restricción adicional, sitios de clonación múltiple, otros segmentos de codificación, y similares, tal que su longitud total puede variar considerablemente. Se contempla, por tanto, que se puede emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando la longitud total preferida limitada por la facilidad de la preparación y el uso en el protocolo del ADN recombinante deseado.
Los vectores recombinantes, por tanto, forman aspectos adicionales de la presente invención. Se contemplan como vectores particularmente útiles aquellos vectores en los que la parte de codificación del segmento de ADN se posiciona bajo el control de un promotor. Generalmente, aunque no exclusivamente, se empleará un promotor heterólogo o recombinante, es decir, un promotor que no se asocia normalmente con secuencias de codificación en su medio natural. Dichos promotores pueden incluir promotores bacterianos, virales, eucarióticos y de mamífero, siempre y cuando, el promotor dirija de forma efectiva la expresión del segmento de ADN en el tipo de célula, organismo, o incluso animal, elegido para la expresión.
El uso de combinaciones de promotor y de tipos de células para la expresión de las proteínas es conocido por aquellos con habilidad en la técnica de la biología molecular. Los promotores empleados pueden ser constitutivos, o inducibles, y se pueden utilizar bajo las condiciones apropiadas para dirigir una expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido, lo cual es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas o péptidos recombinan-
tes.
La expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención se puede conseguir convenientemente mediante una o más técnicas estándares conocidas por aquellos de habilidad normal en la técnica y descritas en profundidad en la presente. Por ejemplo, la última descripción de la expresión recombinante de las proteínas de fusión se aplica igualmente bien a anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que no están operativamente asociados con otras secuencias de codificación al nivel del ácido nucleico.
B4. Anticuerpos policlonales
Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Para preparar un antisuero policlonal, se inmuniza un animal con un compuesto de VEGF inmunogénico, y se recoge el antisuero del animal inmunizado. Se pueden utilizar un amplio número de especies animales para la producción de antisuero. Normalmente el animal utilizado para la producción de anti-antisuero es un conejo, una rata, un hámster, una cobaya o una cabra. Debido al volumen de sangre relativamente grande de los conejos, un conejo es una elección preferida para la producción de anticuerpos policlonales.
La cantidad de compuesto inmunógeno de VEGF utilizado en la producción de anticuerpos policlonales varía según la naturaleza del inmunógeno, así como del animal utilizado para la inmunización. Se pueden utilizar una serie de vías para administrar el presente inmunógeno de VEGF: subcutánea, intramuscular, intradermal, intravenosa, intraperitoneal o intraesplénica. La producción de anticuerpos policlonales se puede monitorizar mediante la toma de muestras de sangre del animal inmunizado en varios puntos tras la inmunización. Se puede administrar una segunda inyección auxiliar. El proceso de refuerzo y valoración se repite hasta que se consigue una cantidad de anticuerpo adecuada. Cuando se obtiene un nivel de anticuerpos deseado, el animal inmunizado se puede desangrar y el suero se aísla y se almacena. El animal también se puede utilizar para general anticuerpos monoclonales.
Tal como se conoce en la técnica, la inmunogenicidad de un compuesto particular se puede mejorar mediante el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Algunos adyuvantes de ejemplo incluyen el adyuvante de Freund completo, un estimulador no específico de la respuesta inmune que contiene Mycobacterium tuberculosis muerto; el adyuvante de Freund incompleto; y el adyuvante de hidróxido de aluminio.
También puede ser deseable estimular el sistema inmune del huésped, que se puede conseguir mediante la asociación del VEGF con un transportador, o uniendo VEGF al mismo. Algunos ejemplos de transportadores son la hemocianina extraída de lapa (KLH) y la albúmina de suero bovino (BSA). También se pueden utilizar como transportadores otras albúminas, tales como la ovoalbúmina, la albúmina de suero de ratón o la albúmina de suero de conejo. Tal como se conoce también en la técnica, un compuesto administrado puede variar en su inmunogenicidad. Sin embargo, la generación de anticuerpos contra el VEGF no es particularmente difícil.
B5. Anticuerpos monoclonales
Varios métodos para la generación de anticuerpos monoclonales (MAbs) también se conocen actualmente muy bien en la técnica. Las técnicas de generación de anticuerpos monoclonales más estándares, generalmente, empiezan con las mismas líneas que las utilizadas para preparar anticuerpos policlonales (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Una respuesta de un anticuerpo policlonal se inicia mediante la inmunización de un animal con un compuesto de VEGF inmunogénico y, cuando se obtiene un nivel de anticuerpos deseado, el animal inmunizado se puede utilizar para generar MAbs.
Los MAbs se pueden preparar fácilmente a partir del uso de técnicas bien conocidas, tal como la ejemplificada en la Patente U.S.A. No. 4.196.265. Normalmente, esta técnica implica inmunizar un animal adecuado con el compuesto de VEGF inmunogénico seleccionado. El compuesto inmunizante se administra de una manera efectiva para estimular las células productoras de anticuerpos. Los animales preferidos son roedores, tales como ratones y ratas, aunque sin embargo, también es posible utilizar células de conejo, oveja y rana. El uso de ratas puede proporcionar ciertas ventajas (Goding, 1986, pp. 60-61), pero se prefieren los ratones, siendo el ratón BALB/c el más preferido ya que es el más utilizado rutinariamente y generalmente da un mayor porcentaje de fusiones estables.
Tras la inmunización, se seleccionan células somáticas con el potencial para producir anticuerpos del VEGF, específicamente linfocitos B (células B), para el uso en el protocolo de generación de mAb. Estas células se pueden obtener de biopsias de bazos, amígdalas o nódulos linfáticos, o de muestras de sangre periférica. Se prefieren células de bazo y células de sangre periférica, las primeras porque son una fuente rica de células productoras de anticuerpos que están en la fase de división de plasmablastos, y las últimas porque la sangre periférica es fácilmente accesible. Frecuentemente, se habrán inmunizado un conjunto de animales y se retirará el bazo de animal con la mayor cantidad de anticuerpos y se obtendrán los linfocitos del bazo mediante la homogenización del bazo con una jeringa. Normalmente, un bazo procedente de un ratón inmunizado contiene aproximadamente de 5x10^{7} a 2x10^{8} linfocitos.
A continuación, se fusionan los linfocitos B productores de anticuerpos anti-VEGF del animal inmunizado con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal que se inmunizó. Las líneas de células de mieloma adecuadas para el uso en procedimientos de fusión productores de hibridoma preferiblemente son no productoras de anticuerpos, tienen una eficiencia de fusión elevada, y las deficiencias enzimáticas que la deja entonces incapaz de crecer en ciertos medios selectivos que apoyan el crecimiento de sólo las células fusionadas deseadas (hibridomas).
Se puede utilizar cualquiera de una variedad de células de mieloma, tal como se conoce por aquellos de habilidad en la técnica (Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984). Por ejemplo, allí donde el animal inmunizado es un ratón, se puede utilizar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-AgI4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para ratas, se puede utilizar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, 4B210 o una de las líneas de células de ratón anteriormente listadas; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6, son todas útiles en relación a fusiones de células humanas.
Los métodos para generar híbridos de bazo productor de anticuerpos o células de nódulo linfático y células de mieloma normalmente comprenden mezclar células somáticas con células de mieloma en una proporción 4:1, aunque la proporción puede variar de 20:1 aproximadamente a 1:1 aproximadamente, respectivamente, en presencia de un agente o agentes (químicos o eléctricos) que provocan la fusión de las membranas celulares. Los métodos de fusión que utilizan virus Sendai se han descrito por Kohler y Milstein (1975; 1976; cada uno) y los que utilizan polietilenglicol (PEG), tal como PEG al 37% (v/v), por Gefter y otros (1977). También es apropiado el uso de métodos de fusión inducidos eléctricamente (Goding pp. 71-74, 1986).
Los procedimientos de fusión normalmente producen híbridos viables a bajas frecuencias, de 1x10^{-6} a 1x10^{-8} aproximadamente. Sin embargo, esto no plantea un problema ya que los híbridos fusionados y viables se diferencian de las células no fusionadas parentales (particularmente las células de mieloma no fusionadas que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente) mediante el cultivo en un medio selectivo. El medio selectivo es, generalmente, uno que contiene un agente que bloquea la síntesis de novo de nucleótidos en el medio de cultivo del tejido. Los agentes de ejemplo preferidos son la aminopterina, el metotrexato, y la azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la síntesis de novo tanto de purinas como de pirimidinas, mientras que la azaserina sólo bloquea la síntesis de purinas. Allí donde se utiliza aminopterina o metotrexato, el medio se complementa con hipoxantina y timidina como fuente de nucleótidos (medio HAT). Allí donde se utiliza azaserina, el medio se complementa con hipoxantina.
El medio de selección preferido es HAT. Sólo las células capaces de operar mecanismos de recuperación de nucleótidos son capaces de sobrevivir en el medio HAT. Las células de mieloma son defectuosas en enzimas clave del mecanismo de recuperación, por ejemplo, la hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT), y no pueden sobrevivir. Las células B pueden impulsar este mecanismo, pero tienen un tiempo de vida limitado en el cultivo y, generalmente, mueren en dos semanas. Por lo tanto, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son aquellos híbridos formados a partir de células B y de mieloma.
Este cultivo proporciona una población de hibridomas de la que se seleccionan hibridomas específicos. Normalmente, la selección de hibridomas se realiza mediante el cultivo de células por dilución de clones únicos en placas de microtitulación, seguido del análisis de sobrenadantes clonales individuales (después de dos o tres semanas) para la reactividad deseada del anti-VEGF. El ensayo debería ser sensible, simple y rápido, tal como radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, ensayos de citotoxicidad, ensayos de placa, ensayos de inmunoenlace de puntos, y similares.
A continuación, los hibridomas seleccionados se diluirían en serie y se clonarían en líneas de células productoras de anticuerpos anti-VEGF individuales, en las que los clones se pueden, a continuación, propagar indefinidamente para proporcionar MAbs. Las líneas de células se pueden explotar para la producción de mAb de dos maneras básicas. Se puede inyectar una muestra de hibridoma (frecuentemente en la cavidad peritoneal) a un animal histocompatible del tipo que se utilizó para obtener las células de mieloma y somáticas para la fusión original. El animal inyectado desarrolla tumores secretando el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido de las células fusionadas. Los fluidos corporales del animal, tales como suero o fluido de ascitis, se pueden aprovechar para proporcionar MAbs en una concentración elevada. Las líneas de células individuales se podrían también cultivar in vitro, donde los MAbs se secretan de forma natural en el medio de cultivo del que se pueden obtener fácilmente en concentraciones
elevadas.
Los MAbs producidos por cualquiera de los medios, generalmente, se purificarán posteriormente, por ejemplo, mediante filtración, centrifugación, y varios métodos cromatográficos, tales como HPLC o cromatografía de afinidad, siendo todas estas técnicas de purificación bien conocidas por los entendidos en la técnica. Cada una de estas técnicas de purificación implica un fraccionamiento para separar el anticuerpo deseado de otros componentes de una mezcla. Entre los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de anticuerpos se incluyen, por ejemplo, la cromatografía de proteína A-Sefarosa y/o la cromatografía de proteína G-Sefarosa.
B6. Anticuerpos de bibliotecas de fagémidos
Actualmente, la tecnología recombinante permite la preparación de anticuerpos que tienen la especificidad deseada a partir de genes recombinantes que codifican un conjunto de anticuerpos (Van Dijk y otros, 1989). Ciertas técnicas recombinantes implican el aislamiento de los genes del anticuerpo mediante un screening inmunológico de las bibliotecas combinatoriales de expresión de fagos de inmunoglobulinas preparadas a partir de ARN aislado del bazo de un animal inmunizado (Morrison y otros, 1986; Winter y Milstein, 1991).
Para tales métodos, las bibliotecas combinatorias de fagémidos de inmunoglobulinas se preparan a partir de ARN aislado del bazo del animal inmunizado, y se seleccionan fagémidos que expresan anticuerpos apropiados mediante células que usan "panning" que expresan el antígeno y células de control. Las ventajas de esta aproximación respecto a las técnicas de hibridomas convencionales son que se pueden producir y examinar aproximadamente 10^{4} veces más de anticuerpos en una única ronda, y que se generan nuevas especificidades por combinación de las cadenas ligeras y pesadas, que además incrementa el porcentaje de anticuerpos apropiados generados.
Un método para la generación de un amplio repertorio de moléculas de anticuerpo diversas en bacterias utiliza el bacteriófago lambda como vector (Huse y otros, 1989). La producción de anticuerpos que utilizan el vector lambda implica la clonación de poblaciones de cadena ligera y pesada de secuencias de ADN en vectores de inicio diferentes. Posteriormente, los vectores se combinan al azar para formar un único vector que dirige la coexpresión de cadena ligera y pesada para formar fragmentos de anticuerpos. Las secuencias de ADN de cadena ligera y pesada se obtienen por amplificación, preferiblemente por PCR^{TM} o una técnica de amplificación relacionada, de ARNm aislado de células del bazo (o hibridomas de éstas) de un animal que se ha inmunizado con un antígeno seleccionado. Las secuencias de cadena ligera y pesada normalmente se amplifican utilizando iniciadores que incorporan sitios de restricción en las terminaciones del segmento de ADN amplificado para facilitar la clonación de los segmentos de cadena ligera y pesada en los vectores de inicio.
Otro método para la generación y screening de amplias bibliotecas de sitios de combinación de anticuerpos parcial o totalmente sintéticos, o paratopos, utiliza vectores de exposición derivados de fagos filamentosos, tales como M13, fl o fd. Estos vectores de exposición de fagos filamentosos, referidos como "fagémidos", producen amplias bibliotecas de anticuerpos monoclonales que tienen inmunoespecificidades nuevas y diversas. La tecnología utiliza un dominio de anclaje de membrana de la proteína de revestimiento del fago filamentoso como medio para unir el producto del gen y el gen durante la fase de ensamblaje de la replicación del fago filamentoso, y se ha utilizado para la clonación y la expresión de anticuerpos de bibliotecas combinatorias (Kang y otros, 1991; Barbas y otros, 1991).
Esta técnica general para la exposición de fagos filamentosos se describe en la Patente U.S.A. No. 5.658.727. En un sentido más general, el método proporciona un sistema para la simultánea clonación y screening de las especificidades de unión de un ligando preseleccionado de los repertorios de genes de anticuerpos que utilizan un sistema de vector único. El screening de miembros aislados de la biblioteca para la capacidad de unión de un ligando preseleccionado permite la correlación de la capacidad de unión de una molécula de anticuerpo expresada con un medio conveniente para aislar el gen que codifica el miembro de la biblioteca.
El enlace de la expresión y el screening se lleva a cabo mediante la combinación del marcaje de un polipéptido de fusión en el periplasma de una célula bacteriana para permitir el ensamblaje de un anticuerpo funcional, y el marcaje de un polipéptido de fusión en el revestimiento de una partícula de fago filamentoso durante el ensamblaje del fago para tener presente el screening conveniente del miembro de la biblioteca de interés. Se proporciona un marcaje periplásmico mediante la presencia de un dominio de señal de secreción en un polipéptido de fusión. Se proporciona el marcaje a una partícula de fago mediante la presencia de un dominio de anclaje de membrana de la proteína del revestimiento del fago filamentoso (es decir, un dominio de anclaje de membrana derivado de cpIII o cpVIII) en un polipéptido de fusión.
La diversidad de una biblioteca de anticuerpos combinatoria basada en fagos filamentosos se puede incrementar tirando de los genes de cadena ligera y pesada, mediante la alteración de una o más de las regiones determinantes de complementariedad de los genes de cadena pesada clonados de la biblioteca, o mediante la introducción de mutaciones al azar en la biblioteca por reacciones en cadena de la polimerasa propensa al error. Algunos métodos adicionales para el screening de bibliotecas de fagémidos se describen en las Patentes U.S.A. Nos. 5.580.717; 5.427.908; 5.403.484; y 5.223.409.
Se ha desarrollado otro método para el screening de amplias bibliotecas de anticuerpos combinatorias, utilizando la expresión de poblaciones de diversas secuencias de cadena ligera y pesada en la superficie de un bacteriófago filamentoso, tales como M13, fl o fd (Patente U.S.A. No. 5.698.426). Se sintetizan dos poblaciones de diversas secuencias de cadena ligera (Lc) y pesada (Hc) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR^{TM}). Estas poblaciones se clonan en vectores basados en M13 separados, que contienen elementos necesarios para la expresión. El vector de cadena pesada contiene una secuencia de la proteína de revestimiento del gen VIII (gVIII) de manera que la traducción de las secuencias de cadena pesada produce proteínas de fusión gVII-Hc. Se combinan las poblaciones de dos vectores al azar, de tal manera, que sólo las partes del vector que contienen las secuencias de Lc y Hc se juntan en un vector circular único.
El vector combinado dirige la coexpresión tanto de las secuencias de Hc como de Lc para el ensamblaje de los dos polipéptidos y la expresión en superficie en el M13 (Patente U.S.A. No. 5.698.426). La etapa de combinación al azar junta diferentes secuencias que codifican Lc y Hc dentro de dos poblaciones diversas en un único vector. Las secuencias del vector, donadas de cada vector independiente, son necesarias para la producción de fagos viables. Además, como las secuencias pseudo gVIII están contenidas en sólo uno de los dos vectores iniciales, la coexpresión de fragmentos de anticuerpo funcionales, tal como Lc asociado a proteínas de fusión gVIII-Hc, no se puede llevar a cabo en la superficie del fago hasta que las secuencias del vector se unen en el vector único.
La expresión en superficie de la biblioteca de anticuerpos se realiza en una cepa supresora de ámbar. Un codón de parada de ámbar entre la secuencia de Hc y la secuencia de gVIII desune los dos componentes en una cepa no supresora. El aislamiento del fago producido de la cepa no supresora y la infección de una cepa supresora unirá las secuencias de Hc a la secuencia de gVIII durante la expresión. El cultivo de la cepa supresora tras la infección permite la coexpresión en la superficie del M13 de todas las especies de anticuerpos dentro de la biblioteca, tal como las proteínas de fusión gVIII (proteínas de fusión gVIII-Fab). Alternativamente, el ADN se puede aislar de una cepa no supresora y, a continuación, introducir en una cepa supresora para conseguir el mismo efecto.
La biblioteca de la expresión en superficie se verifica para fragmentos Fab específicos que unen moléculas preseleccionadas mediante procedimientos de aislamiento por afinidad estándar. Tales métodos incluyen, por ejemplo, "panning" (Parmley y Smith, 1988), cromatografía de afinidad y procedimientos de transferencia en fase sólida. Se prefiere el "panning", porque la elevada cantidad de anticuerpos del fago se puede comprobar fácilmente, rápidamente y en pequeños volúmenes. Además, este procedimiento puede seleccionar especies de fragmentos Fab menores dentro de la población, que de otra manera serían indetectables, y amplificarlas a poblaciones sustancialmente homogéneas. Los fragmentos Fab seleccionados se pueden caracterizar mediante la secuenciación de los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos tras la amplificación de la población de fagos.
Otro método para producir diversas bibliotecas de anticuerpos y el screening para las especificidades de unión deseables se describe en la Patente U.S.A. No. 5.667.988 y la Patente U.S.A. No. 5.759.817. El método implica la preparación de bibliotecas de moléculas de inmunoglobulina heterodiméricas en forma de bibliotecas de fagémidos utilizando oligonucleótidos degenerados y reacciones de extensión de cebador para incorporar las degeneraciones en las regiones CDR de los dominios variables de cadena ligera y pesada variables de inmunoglobulina, y la exposición de los polipéptidos mutagenizados en la superficie del fagémido. A partir de entonces, la proteína de exposición se comprueba para su capacidad de unirse a un antígeno preseleccionado.
El método para producir una molécula de inmunoglobulina heterodimérica, generalmente, implica (1) introducir un gen que codifica la región V de la cadena ligera o pesada de interés en el vector de exposición de fagémidos, (2) introducir un sitio de unión aleatorio en un vector de proteína de exposición de fagémidos mediante una extensión de cebador con un oligonucleótido que contiene regiones de homología a una CDR del gen de la región V del anticuerpo y que contiene regiones de degeneración para producir secuencias de codificación aleatorias para formar una amplia población de vectores de exposición, cada uno, capaz de expresar diferentes supuestos sitios de unión expuestos a una proteína de exposición de superficie de fagémido; (3) expresar la proteína de exposición y el sitio de unión en la superficie de una partícula de fago filamentosa; y (4) aislar (screening) la partícula de fago expresada en la superficie utilizando técnicas de afinidad, tales como "panning" de partículas de fago contra un antígeno preseleccionado, aislando así una o más especies de fagémidos que contienen una proteína de exposición que contiene un sitio de unión que une un antígeno preseleccionado.
Una variación adicional de este método para la producción de diversas bibliotecas de anticuerpos y el screening para las especificidades de unión deseables se describe en la Patente U.S.A. No. 5.702.892. En este método, donde sólo se emplean secuencias de cadena pesada, éstas tienen todas las posiciones de nucleótidos que codifican la región hipervariable CDRI o CDRIII aleatorias, y la variabilidad genética en las CDRs se genera independientemente de cualquier proceso biológico.
En el método, se crean dos bibliotecas para arrastrar genéticamente motivos de oligonucleótidos dentro del armazón de la estructura del gen de cadena pesada. A través de la mutación aleatoria de CDRI o CDRIII, las regiones hipervariables del gen de cadena pesada se reconstruyeron para dar lugar a una colección de secuencias muy diversas. Las proteínas de cadena pesada codificadas por la colección de secuencias de gen mutado poseían el potencial para tener todas las características de unión de una inmunoglobulina aunque sólo necesitaban una de las dos cadenas de inmunoglobulina.
Específicamente, el método se lleva a la práctica en ausencia de la proteína de cadena ligera de la inmunoglobulina. Se incuba una biblioteca de proteínas de cadena pesada modificadas por exposición de fagos con un ligando inmovilizado para seleccionar clones que codifican proteínas recombinantes, que específicamente unen el ligando inmovilizado. A continuación, los fagos enlazados se disocian del ligando inmovilizado y se amplifican por crecimiento en células huésped bacterianas. Se extienden placas virales individuales, cada una expresando una proteína recombinante diferente, y los clones individuales se pueden entonces prestar a ensayos para ver la actividad de unión.
B7. Anticuerpos de linfocitos humanos
También se puede utilizar la inmunización in vitro, o estimulación de antígeno, para generar un anticuerpo anti-VEGF humano. Tales técnicas se pueden utilizar para estimular linfocitos de sangre periférica de sujetos normales y sanos, simplemente mediante la estimulación de células productoras de anticuerpos con VEGF in vitro.
Dicha "inmunización in vitro" implica la activación específica del antígeno de linfocitos B no inmunizados, generalmente, dentro de una población mixta de linfocitos (cultivos mixtos de linfocitos, MLC). Las inmunizaciones in vitro también se pueden sostener por el crecimiento de células B y factores de diferenciación y las linfoquinas. Los anticuerpos producidos por estos métodos son, frecuentemente, anticuerpos IgM (Borrebaeck y otros, 1986).
Se ha descrito otro método (Patente U.S.A. No. 5.681.729, referencia), en el que se pueden obtener linfocitos humanos que producen principalmente anticuerpos IgG (o IgA). El método implica, en un sentido general, transplantar linfocitos humanos a un animal inmunodeficiente de manera que los linfocitos humanos "toman" el cuerpo del animal; inmunizar el animal con un antígeno deseado, para generar linfocitos humanos que produzcan un anticuerpo específico del antígeno; y recuperar los linfocitos humanos que producen el anticuerpo del animal. Los linfocitos humanos, producidos de este modo, se pueden utilizar para producir un anticuerpo monoclonal mediante la inmortalización de los linfocitos humanos que producen el anticuerpo, la clonación de los linfocitos originados en humanos inmortalizados obtenidos que producen el anticuerpo, y la recuperación de un anticuerpo monoclonal específico del antígeno deseado de los linfocitos originados en humanos inmortalizados clonados.
Los animales inmunodeficientes que se pueden emplear en esta técnica son aquellos que no muestran rechazo cuando se transplantan linfocitos humanos a los animales. Dichos animales pueden estar preparados artificialmente por tratamientos físicos, químicos o biológicos. Se puede emplear cualquier animal inmunodeficiente. Los linfocitos humanos se pueden obtener de sangre periférica, bazo, nódulos linfáticos, amígdalas humanas o similares.
La "toma" de los linfocitos humanos transplantados en los animales se puede lograr mediante la mera administración de linfocitos humanos a los animales. La vía de administración no está limitada y puede ser, por ejemplo, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal. La dosis de los linfocitos humanos no está limitada, y puede ser normalmente de 10^{6} a 10^{8} linfocitos por animal. A continuación, el animal inmunodeficiente se inmuniza con el antígeno de VEGF deseado.
Tras la inmunización, se recuperan, por cualquier método convencional, los linfocitos humanos de la sangre, el bazo, los nódulos linfáticos u otros tejidos linfáticos. Por ejemplo, las células mononucleares se pueden separar por el método de centrifugación de Ficoll-Hypaque (densidad específica: 1,077), y los monocitos se pueden eliminar mediante el método de adsorción en plato de plástico. Se pueden eliminar las células contaminantes que se originan en el animal inmunodeficiente mediante el uso de un antisuero específico para células animales. El antisuero se puede obtener mediante, por ejemplo, la inmunización de un segundo animal, diferente, con las células del bazo del animal inmunodeficiente, y la recuperación del suero del animal inmunizado diferente. El tratamiento con el antisuero se puede llevar a cabo en cualquier fase. Los linfocitos humanos también se pueden recuperar mediante un método inmunológico que emplea una inmunoglobulina humana expresada en la superficie celular como un marcador.
Mediante estos métodos, se pueden obtener los linfocitos humanos que principalmente producen anticuerpos IgG e IgA específicos a uno o más epítopos de VEGF seleccionados. A continuación, se obtienen los anticuerpos monoclonales a partir de los linfocitos humanos mediante la inmortalización, selección, crecimiento celular y producción de anticuerpos.
B8. Ratones transgénicos que contienen bibliotecas de anticuerpos humanos
Actualmente, la tecnología recombinante está disponible para la preparación de anticuerpos. Además de las bibliotecas combinatorias de expresión de fagos de inmunoglobulinas, dadas a conocer anteriormente, otra aproximación de clonación molecular es la preparación de anticuerpos a partir de ratones transgénicos que contienen bibliotecas de anticuerpos humanos. Tales técnicas se describen en la Patente U.S.A. No. 5.545.807.
En un sentido más general, estos métodos implican la producción de un animal transgénico que ha insertado en su línea germinal, material genético que codifica, como mínimo, parte de una inmunoglobulina de origen humano o que se puede reorganizar para codificar un repertorio de inmunoglobulinas. El material genético insertado se puede producir a partir de una fuente humana, o se puede producir sintéticamente. El material puede codificar, como mínimo, parte de una inmunoglobulina conocida o se puede modificar para codificar, como mínimo, parte de una inmunoglobulina alterada.
El material genético insertado se expresa en el animal transgénico, dando lugar a la producción de una inmunoglobulina derivada, como mínimo en parte, del material genético de la inmunoglobulina humana insertada. Se encuentra que el material genético se reajusta en el animal transgénico, de manera que se pueden producir un repertorio de inmunoglobulinas con parte o partes derivadas de material genético insertado, incluso si el material genético insertado se incorpora en la línea germinal en una posición equivocada o con la geometría equivocada.
El material genético insertado puede estar en forma de ADN clonado en vectores procarióticos, tales como plásmidos y/o cósmidos. Se insertan fragmentos de ADN más grandes utilizando vectores de cromosoma artificial de levadura (Burke y otros, 1987), o mediante la introducción de fragmentos de cromosoma (Richer y Lo, 1989). El material genético insertado se puede introducir al huésped de una manera convencional, por ejemplo, mediante una inyección, u otros procedimientos en huevos fertilizados o células madre embrionarias.
En aspectos preferidos, se utiliza un animal huésped que inicialmente no transporta material genético que codifica regiones constantes de inmunoglobulina, de manera que el animal transgénico resultante utilizará sólo el material genético humano insertado cuando produzca inmunoglobulinas. Esto se puede conseguir mediante el uso de un huésped mutante natural al que le falta el material genético relevante, o mediante la fabricación artificial de mutantes, por ejemplo, en líneas de células que, en última instancia, crean un huésped del que se ha eliminado el material genético relevante.
Allí donde el animal huésped transporta material genético que codifica las regiones constantes de inmunoglobulina, el animal transgénico transportará el material genético natural y el material genético insertado y producirá globulinas derivadas del material genético natural, el material genético insertado, y mezclas de ambos tipos de material genético. En este caso, la inmunoglobulina deseada se puede obtener mediante el screening de hibridomas derivados del animal transgénico, por ejemplo, aprovechando del fenómeno de la exclusión alélica de la expresión del gen del anticuerpo o la pérdida del cromosoma diferencial.
Una vez se ha preparado un animal transgénico adecuado, simplemente se inmuniza el animal con el inmunógeno deseado. Dependiendo de la naturaleza del material insertado, el animal puede producir una inmunoglobulina quimérica, por ejemplo, de origen mixto ratón/humano, donde el material genético de origen extraño codifica sólo parte de la inmunoglobulina; o el animal puede producir una inmunoglobulina completamente extraña, por ejemplo, de origen completamente humano, donde el material genético de origen extraño codifica una inmunoglobulina completa.
El antisuero policlonal se puede producir a partir del animal transgénico tras la inmunización. Las células productoras de inmunoglobulinas se pueden extraer del animal para producir la inmunoglobulina de interés. Preferiblemente, los anticuerpos monoclonales se producen a partir del animal transgénico, por ejemplo, mediante la fusión de células de bazo del animal con células de mieloma y el screening de los hibridomas resultantes para seleccionar aquellos que producen el anticuerpo deseado. En la presente invención se describen técnicas adecuadas para tales procesos.
En una aproximación alternativa, el material genético se puede incorporar al animal de tal manera que el anticuerpo deseado se produce en los fluidos corporales, tales como suero o secreciones externas del animal, tales como leche, calostro o saliva. Por ejemplo, mediante la inserción in vitro de material genético que codifica, como mínimo, parte de una inmunoglobulina humana en un gen de un mamífero que codifica una proteína de la leche y, a continuación, la introducción del gen en un huevo fertilizado del mamífero, por ejemplo, por inyección, el huevo puede desarrollarse en un mamífero hembra adulto que produce leche que contiene inmunoglobulina derivada, como mínimo, en parte, del material genético insertado de inmunoglobulina humana. A continuación, se puede recolectar el anticuerpo deseado de la leche. Las técnicas adecuadas para llevar a cabo dichos procesos son bien conocidas por aquellos entendidos en la técnica.
Los animales transgénicos anteriores se emplean normalmente para producir anticuerpos humanos de un único isotipo, más específicamente, un isotipo que es esencial para la maduración de las células B, tales como IgM y, posiblemente, IgD. Otro método preferido para producir anticuerpos anti-VEGF humanos es utilizar la tecnología descrita en las Patentes U.S.A. Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; y 5.770.429; en las que los animales transgénicos descritos son capaces de pasar de un isotipo necesario para el desarrollo de las células B a otros isotipos.
En el desarrollo de un linfocito B, la célula inicialmente produce IgM con una especificidad de unión determinada por las regiones V_{H} y V_{L} reajustadas productivamente. Posteriormente, cada célula B y sus células de la progenie sintetizan anticuerpos con las mismas regiones V de cadena H y L, pero pueden cambiar el isotipo de la cadena H. El uso de regiones constantes mu o delta se determina ampliamente mediante empalmes alternados, permitiendo que la IgM y la IgD se coexpresen en una única célula. Los otros isotipos de cadena pesada (gamma, alfa, y épsilon) sólo se expresan de forma nativa después de un reajuste del gen que borra los exones del delta C y mu C. Este proceso de reajuste del gen, denominado cambio de isotipo, normalmente tiene lugar por recombinación entre los llamados segmentos de cambio localizados inmediatamente en la dirección 5' de cada gen de cadena pesada (excepto delta). Los segmentos de cambio individuales tienen entre 2 y 10 kb de longitud, y consisten principalmente en cortas secuencias repetidas.
Por estas razones, es preferible que los transgenes incorporen secuencias regulatorias transcripcionales en aproximadamente 1-2 kb de la dirección 5' de cada región de cambio que se va a utilizar para el cambio de isotipo. Las secuencias reguladoras transcripcionales preferiblemente incluyen un promotor y un elemento potenciador, y más preferiblemente incluyen la región flanqueante 5' (es decir, la dirección 5') que se asocia de forma natural (es decir, tiene lugar en la configuración de la línea germinal) con una región de cambio. A pesar de que la secuencia flanqueante 5' de una región de cambio se puede unir operativamente a una región de cambio diferente para la construcción del transgén, en algunas realizaciones, se prefiere que cada región de cambio incorporada en la construcción del transgén tenga una región flanqueante 5' que tenga lugar inmediatamente en la dirección 5' en la configuración de línea germinal natural. La información de la secuencia relativa a las secuencias de la región de cambio de la inmunoglobulina es conocida (Mills y otros, 1990; Sideras y otros, 1989).
En el método descrito en las Patentes U.S.A. Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y 5.770.429, los transgenes de inmunoglobulina humana contenidos dentro del animal transgénico, funcionan correctamente a través del mecanismo de desarrollo de la célula B, llevando al cambio de isotipo. Por consiguiente, en este método, se construyen estos transgenes para producir el cambio de isotipo y uno o más de los siguientes: (1) expresión específica de tipo celular de alto nivel, (2) reajuste del gen funcional, (3) activación de, y respuesta a, la exclusión alélica, (4) expresión de un repertorio principal suficiente, (5) transducción de señal, (6) hipermutación somática, y (7) dominación del locus del anticuerpo del transgén durante la respuesta inmune.
Un requerimiento importante para la función del transgén es la generación de un repertorio de anticuerpos primario que es suficientemente diverso para generar una respuesta inmune secundaria para un amplio conjunto de antígenos. El gen de cadena pesada reajustada consiste en un exón de péptido de señal, un exón de región variable y un conjunto de regiones multidominio de región constante, cada una de las cuales se codifica por varios exones. Cada uno de los genes de la región constante codifica la parte constante de una clase diferente de inmunoglobulinas. Durante el desarrollo de células B, las regiones constantes proximales de la región V se borran llevando a la expresión de nuevas clases de cadena pesada. Para cada clase de cadena pesada, los patrones alternativos de empalmes de ARN dan lugar tanto a inmunoglobulinas de transmembrana como secretadas.
El locus de la cadena pesada humana consiste en segmentos de gen de aproximadamente 200 V que abarcan 2 Mb, segmentos de gen de aproximadamente 30 D que abarcan 40 kb, seis segmentos J comprimidos en un tramo de 3 kb, y nueve segmentos de gen de región constante distribuidos por aproximadamente 300 kb. El locus completo abarca aproximadamente 2,5 Mb de la parte distal del largo brazo del cromosoma 14. Se conocen los fragmentos del transgén de cadena pesada que contienen miembros de las seis familias V_{H} conocidas, los segmentos del gen D y J, así como las regiones constantes mu, delta, gamma 3, gamma 1 y alfa 1 (Berman y otros, 1988). Los fragmentos genómicos que contienen todos los segmentos de gen necesarios y las secuencias reguladoras de un locus de cadena ligera humana se construyen de forma similar.
La expresión de los transgenes ligeros y pesados de la inmunoglobulina reajustada satisfactoriamente normalmente tiene un efecto dominante mediante la supresión del reajuste de los genes de inmunoglobulina endógena en el animal no humano transgénico. Sin embargo, en ciertas realizaciones, es deseable efectuar una inactivación completa del loci de Ig endógena, de manera que las cadenas de inmunoglobulina híbridas, que comprenden una región variable humana y una región constante no humana (por ejemplo, murina) no se pueden formar, por ejemplo, mediante el trans-cambio entre el transgén y las secuencias de Ig endógena. Utilizando la tecnología de células madre embrionarias y la recombinación homóloga, el repertorio de inmunoglobulina endógena se puede eliminar fácilmente. Además, la supresión de los genes de Ig endógena se puede realizar utilizando una variedad de técnicas, tal como la tecnología antisentido.
En otros aspectos de la presente invención, puede ser deseable producir una inmunoglobulina trans-cambiada. Los anticuerpos que comprenden tales inmunoglobulinas trans-cambiadas quiméricas se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones donde es deseable tener una región constante no humana (por ejemplo, murina), para, por ejemplo, la retención de las funciones del efector en el huésped. La presencia de una región constante de origen murino puede proporcionar ventajas sobre la región constante humana, por ejemplo, para proporcionar las funciones del efector murino (por ejemplo, fijación del complemento murino, ADCC), de manera que dicho anticuerpo quimérico se puede analizar en un modelo de enfermedad en ratón. Posteriormente al análisis del animal, se puede aislar la secuencia que codifica la región variable humana, por ejemplo, por amplificación por PCR^{TM} o clonación de ADNc de la fuente (clon del hibridoma), y empalmar a una secuencia que codifica una región constante humana deseada para codificar un anticuerpo de secuencia humana más adecuado para el uso terapéutico humano.
B9. Anticuerpos humanizados
Los anticuerpos humanizados tienen, generalmente, como mínimo, tres ventajas potenciales para el uso en terapia humana. Primero, porque como la parte efectora es humana, puede interaccionar mejor con las otras partes del sistema inmunitario humano, por ejemplo, para destruir más eficientemente células diana mediante citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Segundo, el sistema inmunitario humano no debería reconocer el anticuerpo como extraño. Tercero, la vida media en la circulación humana será similar a los anticuerpos humanos naturales, permitiendo administrar dosis más pequeñas y menos frecuentes.
En la presente se proporcionan varios métodos para preparar anticuerpos anti-VEGF humanos. Además de los anticuerpos humanos, los anticuerpos "humanizados" tienen muchas ventajas. Los anticuerpos "humanizados" son, generalmente, anticuerpos monoclonales mutantes o quiméricos de ratón, rata, hámster, conejo u otras especies, con dominios de región variable y/o constante humana o cambios específicos. Las técnicas para generar un anticuerpo anti-VEGF llamado "humanizado" son bien conocidas por aquellos entendidos en la técnica.
Los anticuerpos humanizados también comparten las ventajas anteriores. Primero, la parte efectora es aún humana. Segundo, el sistema inmunitario humano no debería reconocer el armazón o la región constante como extraños, y por tanto, la respuesta del anticuerpo contra dicho anticuerpo inyectado debería ser menor que contra un anticuerpo de ratón totalmente extraño. Tercero, los anticuerpos humanizados inyectados, en oposición a los anticuerpos de ratón inyectados, presumiblemente tendrán una vida media más parecida a los anticuerpos humanos naturales, permitiendo también unas dosis más pequeñas y menos frecuentes.
Se han descrito varios métodos para producir anticuerpos humanizados. Se puede utilizar el reajuste controlado de dominios de anticuerpo, unidos a través de enlaces disulfuro de proteínas, para formar nuevas moléculas de proteína artificiales o anticuerpos "quiméricos" (Konieczny y otros, 1981). También se puede utilizar la tecnología del ADN recombinante para construir fusiones de genes entre secuencias de ADN, que codifican dominios de cadena ligera y pesada variables de anticuerpo de ratón, con dominios constantes de cadena ligera y pesada de anticuerpo humano (Morrison y otros, 1984).
Las secuencias de ADN que codifican las partes de unión al antígeno o regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de anticuerpos monoclonales murinos se pueden injertar, por medios moleculares, en las secuencias de ADN que codifican los armazones de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos humanos (Riechmann y otros, 1988). Los productos recombinantes expresados se llaman "reformados" o anticuerpos humanizados, y comprenden el armazón de una cadena ligera o pesada de anticuerpo humano y las partes de reconocimiento del antígeno, CDRs, de un anticuerpo monoclonal murino.
Otro método para producir anticuerpos humanizados se describe en la Patente U.S.A. No. 5.639.641. El método proporciona, a través de "resurfacing", anticuerpos de roedores humanizados que han mejorado su eficacia terapéutica debido a la presencia de una superficie humana en la región variable. En el método: (1) se generan alineaciones de posición de un conjunto de regiones variables de cadena ligera y pesada de anticuerpo para obtener un grupo de posiciones expuestas en la superficie del armazón de la región variable de cadena ligera y pesada, en el que las posiciones de alineación para todas las regiones variables son idénticas en, como mínimo, un 98% aproximadamente; (2) se define un grupo de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del armazón de la región variable de cadena ligera y pesada para un anticuerpo de roedor (o fragmento de éste); (3) se identifica un grupo de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del armazón de la región variable de cadena ligera y pesada que es el más idéntico al grupo de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del roedor; (4) el grupo de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del armazón de la región variable de cadena ligera y pesada definido en la etapa (2) se sustituye por el grupo de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del armazón de la región variable de cadena ligera y pesada identificado en la etapa (3), excepto para aquellos residuos de aminoácidos que están a menos de 5 Ángstroms de cualquier átomo de cualquier residuo de las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo del roedor; y (5) se produce el anticuerpo del roedor humanizado que tiene especificidad de unión.
Un método similar para la producción de anticuerpos humanizados se describe en las Patentes U.S.A. Nos.
5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101. Estos métodos implican la producción de inmunoglobulinas humanizadas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y posibles aminoácidos adicionales de una inmunoglobulina donadora y una región de armazón de una inmunoglobulina humana aceptadora. Cada cadena de inmunoglobulina humanizada comprende, normalmente, además de las CDRs, aminoácidos del armazón de inmunoglobulina donadora que son capaces de interaccionar con las CDRs para efectuar una afinidad de unión, tal como uno o más aminoácidos que están inmediatamente adyacentes a una CDR en la inmunoglobulina donadora o aquellos que están a menos de 3 Angstroms aproximadamente, tal como predice la modelación molecular. Se puede designar cada una de las cadenas ligera y pesada mediante la utilización de cualquiera de ellas, cualquier combinación, o todos los criterios de posiciones varias descritos en las Patentes U.S.A. Nos. 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101. Cuando se combinan en un anticuerpo intacto, las inmunoglobulinas humanizadas son sustancialmente no inmunogénicas en humanos y mantienen sustancialmente la misma afinidad al antígeno original que la 
\hbox{inmunoglobulina
donadora.}
Se describe un método adicional para producir anticuerpos humanizados en las Patentes U.S.A. Nos. 5.565.332 y 5.733.743. Este método combina el concepto de anticuerpos humanizados con las bibliotecas de fagémidos también descritas en detalle en la presente. En un sentido general, el método utiliza secuencias del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo o población de anticuerpos dirigida contra un antígeno de interés. De este modo, para un anticuerpo de roedor único, se pueden combinar las secuencias que comprenden parte del sitio de unión al antígeno del anticuerpo con repertorios diversos de secuencias de anticuerpos humanos que pueden, en combinación, crear un sitio de unión al antígeno completo.
Los sitios de unión al antígeno creados mediante este proceso difieren de aquellos creados por xenoinjertos de CDR, en los que sólo la parte de secuencia del anticuerpo de roedor original es probable que haga contactos con antígenos de una forma similar. Las secuencias humanas seleccionadas probablemente difieren en la secuencia y hacen contactos alternativos con el antígeno de aquellas del sitio de unión original. Sin embargo, las restricciones impuestas por la unión de la parte de la secuencia original al antígeno y las formas del antígeno y de sus sitios de unión al antígeno, probablemente conducen a nuevos contactos de las secuencias humanas a la misma región o epítopo del antígeno. Este proceso ha sido denominado, por tanto, "selección grabada de epítopo" (EIS).
Empezando con un anticuerpo animal, existe un proceso que da lugar a la selección de anticuerpos que son anticuerpos parcialmente humanos. Dichos anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia a los anticuerpos humanos para usarse directamente en terapia o tras la alteración de varios residuos clave. Las diferencias de secuencia entre el componente del roedor del anticuerpo seleccionado con secuencias humanas se podrían minimizar mediante la sustitución de aquellos residuos que difieren de los residuos de secuencias humanas, por ejemplo, mediante la mutagénesis dirigida a sitio de residuos individuales, o por inserción en CDR de bucles completos. Sin embargo, también se pueden crear anticuerpos con secuencias completamente humanas. La EIS, por tanto, ofrece un método para fabricar anticuerpos, parcialmente humanos o completamente humanos, que se unen al mismo epítopo que el animal o a los anticuerpos parcialmente humanos, respectivamente. En la EIS, se pueden mostrar repertorios de fragmentos de anticuerpo en la superficie de fase filamentosa y seleccionar los genes que codifican fragmentos con actividades de unión al antígeno mediante la unión del fago al antígeno.
Algunos métodos adicionales para la humanización de anticuerpos contemplados para el uso en la presente invención se describen en las Patentes U.S.A. Nos. 5.750.078; 5.502.167; 5.705.154; 5.770.403; 5.698.417; 5.693.493; 5.558.864; 4.935.496; y 4.816.567. Se cree que las Patentes WO 98/45331 y WO 98/45332 son particularmente instructivas para la ejemplificación adicional de los principios de humanización que se aplican a anticuerpos anti-VEGF.
B10. Mutagénesis por PCR^{TM}
La mutagénesis específica de sitio es una técnica útil en la preparación de anticuerpos individuales a través de la mutagénesis específica del ADN subyacente. Además, la técnica proporciona una fácil capacidad para preparar y analizar variantes de secuencias, incorporando una o más de las consideraciones anteriores, tanto si se humaniza como si no, mediante la introducción de uno o más cambios de las secuencias de nucleótidos en el ADN.
A pesar de que muchos métodos son adecuados para su uso en la mutagénesis, actualmente se prefiere, de forma general, el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR^{TM}). Esta tecnología ofrece un método rápido y eficiente para introducir mutaciones deseadas en una secuencia de ADN dada. El siguiente texto particularmente describe el uso de la PCR^{TM} para introducir mutaciones puntuales en una secuencia, como se puede utilizar para cambiar el aminoácido codificado por la secuencia dada. Las adaptaciones de este método también son adecuadas para la introducción de sitios de enzimas de restricción en una molécula de ADN.
En este método, se diseñan oligonucleótidos sintéticos para incorporar una mutación puntual en un extremo de un segmento amplificado. Tras la PCR^{TM}, los fragmentos amplificados se tratan con fragmentos Klenow para obtener extremos romos, y a continuación, los fragmentos con extremos romos se ligan y se subclonan en un vector para facilitar el análisis de la secuencia.
Para preparar el ADN molde que se desea mutagenizar, el ADN se subclona en un vector de número de copias alto, tal como pUC19, utilizando los sitios de restricción que flanquean el área para mutar. A continuación, se prepara el ADN molde utilizando una minipreparación de plásmido. Se sintetizan, mediante un sintetizador automatizado, cebadores de oligonucleótidos apropiados que se basan en la secuencia parental, pero que contienen la mutación puntual deseada y que están flanqueadas en el extremo 5' por un sitio de enzima de restricción. Se requiere, generalmente, que el cebador sea homólogo al ADN molde en 15 bases aproximadamente o similar. Los cebadores se pueden purificar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante, a pesar de que esto no es absolutamente necesario para el uso en la PCR^{TM}. A continuación, se debería fosforilar el extremo 5' de los oligonucleótidos.
El ADN molde debería amplificarse por PCR^{TM}, utilizando los cebadores de oligonucleótidos que contienen las mutaciones puntuales deseadas. La concentración de MgCl_{2} en el tampón de amplificación será, generalmente, de unos 15 mM. Generalmente, se deberían llevar a cabo de 20 a 25 ciclos de PCR^{TM} aproximadamente, tal como se explica a continuación: desnaturalización, 35 segundos a 95ºC; hibridación, 2 minutos a 50ºC; y extensión, 2 minutos a 72ºC. La PCR^{TM}, generalmente, incluirá una última extensión del ciclo de unos 10 minutos a 72ºC. Después de la etapa de extensión final, se deberían añadir unas 5 unidades de fragmentos Klenow a la mezcla de reacción e incubar durante 15 minutos adicionales a 30ºC. Se requiere la actividad exonucleasa de los fragmentos Klenow para hacer los extremos parejos y adecuados para la clonación con extremos romos.
La mezcla de reacción resultante, generalmente, se debería analizar mediante una electroforesis en gel de acrilamida o agarosa no desnaturalizante para verificar que la amplificación ha producido el producto predicho. A continuación, se trataría la mezcla de reacción mediante la eliminación de la mayoría de aceites minerales, la extracción con cloroformo para eliminar el aceite restante, la extracción con fenol tamponado y, a continuación, la concentración por precipitación con etanol al 100%. Posteriormente, se deberían digerir la mitad de los fragmentos amplificados con una enzima de restricción que corta en las secuencias flanqueantes utilizadas en los oligonucleótidos. Los fragmentos digeridos se purifican en un gel de agarosa de gelatización/fusión baja.
Para subclonar los fragmentos y comprobar la mutación puntual, se clonarían los dos fragmentos amplificados en un vector digerido apropiadamente mediante una unión de extremos romos. Esto se utilizaría para transformar E.coli, del que se podría preparar, a continuación, ADN plasmídico utilizando una minipreparación. A continuación, se analizaría la parte amplificada del ADN plasmídico por la secuenciación de ADN para confirmar que se generó la mutación puntual correcta. Esto es importante ya que la ADN polimerasa Taq puede introducir mutaciones adicionales en los fragmentos de ADN.
La introducción de una mutación puntual también se puede efectuar utilizando etapas de la PCR^{TM} secuenciales. En este procedimiento, los dos fragmentos que abarcan la mutación se fijan el uno con el otro y se extienden mediante una síntesis cebada mutuamente. A continuación, este fragmento se amplifica mediante una segunda etapa de PCR^{TM}, evitando así la unión de extremos romos requerida en el protocolo anterior. En este método, la preparación del ADN molde, la generación de los cebadores de oligonucleótidos y la primera amplificación de la PCR^{TM} se realizan como se describe anteriormente. En este proceso, sin embargo, los oligonucleótidos elegidos deberían ser homólogos al ADN molde en un tramo de entre 15 y 20 bases aproximadamente y se deben también superponer el uno con el otro en unas 10 bases o más.
En la segunda amplificación de la PCR^{TM}, se utilizaría cada fragmento amplificado y cada cebador de secuencia flanqueante y se llevaría a cabo la PCR^{TM} durante 20 y 25 ciclos aproximadamente, utilizando las condiciones descritas anteriormente. Se subclonarían otra vez los fragmentos y se comprobaría que las mutaciones puntuales eran correctas mediante la utilización de las etapas mencionadas anteriormente.
En el uso de cualquiera de los métodos anteriores, se prefiere, generalmente, introducir la mutación mediante la amplificación de un fragmento tan pequeño como sea posible. Por supuesto, deberían también considerarse cuidadosamente parámetros, tales como la temperatura de fusión del oligonucleótido, ya que, generalmente, estará influenciada por el contenido de GC y la longitud del oligo. La ejecución de estos métodos, y su optimización si es necesaria, será conocida por aquellos entendidos en la técnica, y está descrita en profundidad en varias publicaciones, tal como Current Protocols in Molecular Biology, 1995.
Cuando se realiza la mutagénesis específica de sitio, se puede emplear la Tabla A como referencia.
TABLA A
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B11. Fragmentos de anticuerpos y derivados
Independientemente del origen del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 original, el anticuerpo intacto, los multímeros de anticuerpo, o cualquiera de una variedad de regiones de unión al antígeno funcionales del anticuerpo se pueden utilizar en la presente invención. Entre las regiones funcionales de ejemplo se incluyen "diabodies", anticuerpos lineales y fragmentos scFv, Fv, Fab', Fab, F(ab')_{2} de los anticuerpos anti-VEGF. Las técnicas para la preparación de dichas construcciones son bien conocidas por los entendidos en la técnica y se ejemplifican en la presente adicionalmente.
La elección de la construcción de anticuerpos puede estar influenciada por varios factores. Por ejemplo, una vida media prolongada puede ser resultado de la readsorción activa de anticuerpos intactos en el riñón, una propiedad del fragmento Fc de la inmunoglobulina. Los anticuerpos basados en IgG, por tanto, se espera que muestren una depuración sanguínea más lenta que sus homólogas Fab'. Sin embargo, las composiciones basadas en el fragmento Fab', generalmente, mostrarán una mejor capacidad de penetración en el tejido.
Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener mediante proteolisis de la inmunoglobulina completa por la tiol proteasa no específica, papaína. La digestión de papaína produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados "fragmentos Fab", cada uno con un sitio de unión al antígeno único, y un "fragmento Fc" residual.
La papaína se debe activar primero mediante la reducción del grupo sulfhidrilo en el sitio activo con cisteína, 2-mercaptoetanol o ditiotreitol. Los metales pesados en la enzima de suministro deberían ser eliminados mediante quelación con EDTA (2 mM) para asegurar la máxima actividad enzimática. La enzima y el sustrato se mezclan normalmente juntos en una proporción de 1:100 en peso. Tras la incubación, la reacción se puede parar mediante la alquilación irreversible del grupo tiol con yodoacetamida o simplemente por diálisis. La integridad de la digestión se debería monitorizar por SDS-PAGE y separar las fracciones diversas mediante cromatografía de proteína A-sefarosa o de intercambio iónico.
El procedimiento habitual para la preparación de fragmentos F(ab')_{2} a partir de IgG de origen humano y de conejo es una proteolisis limitada por la enzima pepsina. Las condiciones, 100 veces de exceso de anticuerpo en peso en tampón de acetato a pH 4,5, a 37ºC, sugieren que el anticuerpo se divide en la parte C-terminal del enlace disulfuro entre las cadenas pesadas. Las velocidades de digestión de la IgG del ratón puede variar con la subclase y las condiciones deberían elegirse para evitar cantidades significativas de IgG completamente degradada. En particular, la IgG_{2b} es susceptible de una degradación completa. Las otras subclases requieren condiciones de incubación diferentes para producir resultados óptimos, todo ellos conocidos en la técnica.
El tratamiento de pepsina de anticuerpos intactos produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación al antígeno y es incluso capaz de entrecruzar un antígeno. La digestión de IgG de rata por la pepsina requiere condiciones que incluyen la diálisis en un tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5, y a continuación, la incubación durante cuatro horas con un 1% en peso de pepsina; la digestión de IgG_{1} e IgG_{2a} se mejora si primero se dializa en un tampón de formiato 0,1 M, pH 2,8, a 4ºC, durante 16 horas seguido por un tampón acetato. La IgG_{2b} da resultados más consistentes con incubación con proteasa V8 de estafilococo (3% en peso) en tampón de fosfato sódico 0,1 M, pH 7,8, durante 4 horas a 37ºC.
Un fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteína(s) de la región bisagra del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} se produjeron originalmente como pares de fragmentos de Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
Un fragmento "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento de antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada en una asociación fuerte, covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren una especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o medio de un Fv que comprende sólo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir el antígeno, aunque con una afinidad inferior que con el sitio de unión completo.
Los fragmentos de anticuerpos de "cadena única Fv" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una cadena única de polipéptido. Generalmente, el polipéptido Fv además comprende un enlazador de polipéptidos entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno.
Las siguientes patentes y solicitudes de patentes que se incorporan en la presente para complementar adicionalmente las presentes enseñanzas respecto a la preparación y uso de regiones de unión al antígeno funcionales de los anticuerpos, incluyendo los fragmentos scFv, Fv, Fab', Fab y F(ab')_{2} de los anticuerpos anti-VEGF: Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866; 5.965.132; 6.051.230; 6.004.555; 5.877.289; y la Patente U.S.A. No. 6 093 399. La Patente WO 98/45331 además describe y enseña la preparación de regiones determinantes de complementariedad (CDR), variables e hipervariables de anticuerpos.
Los "diabodies" son fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión al antígeno, los cuales comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena de polipéptido (V_{H}-V_{L}). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los "diabodies" se describen en las patentes EP 404.097 y WO 93/11161. Los "anticuerpos lineales", que pueden ser monoespecíficos o biespecíficos, comprenden un par de segmentos Fd tándem (V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1) que forman una pareja de regiones de unión al antígeno, como se describe en Zapata y otros (1995).
Con la utilización de un Fab' o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo, con los beneficios correspondientes en la penetración en el tejido, se pueden derivar ventajas adicionales de la modificación del fragmento para incrementar su vida media. Se pueden emplear una serie de técnicas, tales como la manipulación o modificación de la propia molécula de anticuerpo, y también la conjugación a transportadores inertes. Cualquier conjugación con el único propósito de incrementar la vida media, en lugar de liberar un agente a una diana, se debería abordar cuidadosamente ya que Fab' y otros fragmentos se eligen para penetrar en los tejidos. No obstante, se contempla la conjugación a polímeros no proteínicos, tal como PEG y similares.
Las modificaciones, diferentes a la conjugación, por tanto, se basan en la modificación de la estructura del fragmento de anticuerpo para hacerlo más estable, y/o reducir la velocidad del catabolismo en el cuerpo. Un mecanismo para tales modificaciones es el uso de D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos. Aquellos de habilidad normal en la técnica entenderán que la introducción de tales modificaciones necesita estar seguida de un riguroso análisis de la molécula resultante para asegurar que aún mantiene las propiedades biológicas deseadas. Las modificaciones estabilizadoras adicionales incluyen el uso de la adición de fracciones estabilizadoras al extremo N-terminal o C-terminal, o a ambos, que se utilizan, en general, para prolongar la vida media de las moléculas biológicas. A modo de ejemplo sólo, se puede desear modificar las terminaciones por acilación o aminación.
Las modificaciones del tipo de conjugación moderada para su uso en la presente invención incluyen la incorporación de un epítopo de unión al receptor de rescate en el fragmento de anticuerpo. Las técnicas para conseguir esto incluyen la mutación de una región apropiada del fragmento de anticuerpo o la incorporación del epítopo como un péptido etiqueta que está acoplado al fragmento del anticuerpo. La Patente WO 96/32478 además ejemplifica dicha tecnología. Los epítopos de unión del receptor de rescate son normalmente regiones de tres o más aminoácidos de uno o dos bucles del dominio Fc que se transfiere a la posición análoga en el fragmento del anticuerpo. Los epítopos de unión del receptor de rescate de la Patente WO 98/45331 se utilizan en la presente invención.
B12. Ensayos funcionales y de unión
A pesar de que la presente invención tiene una utilidad significativa en los regímenes de tratamiento humano y animal, también tiene otras muchas aplicaciones prácticas, incluyendo muchas aplicaciones in vitro. Algunos de estos usos se refieren a las propiedades de unión específica de los anticuerpos o inmunoconjugados. Puesto que todos los compuestos de la presente invención incluyen, como mínimo, un componente del anticuerpo, se pueden utilizar en prácticamente todas las realizaciones de unión en que se puede utilizar el anticuerpo original.
La presencia de un agente acoplado, donde sea relevante, aunque proporciona propiedades ventajosas, no anula la utilidad de las regiones del primer anticuerpo en cualquier ensayo de unión. Los ensayos de unión adecuadamente útiles incluyen, de este modo, aquellos empleados normalmente en la técnica, tales como en inmunotransferencias, transferencias tipo Western, transferencias de puntos, RIAs, ELISAs, inmunohistoquímica, clasificación por activación celular fluorescente (FACS), inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad, y similares, como se describe en la presente en profundidad.
Algunos ensayos de unión estándar son aquellos en que se inmoviliza un antígeno en una matriz de soporte sólido, por ejemplo, nitrocelulosa, nylon o una combinación de éstos, tal como en inmunotransferencias, transferencias tipo Western y ensayos relacionados. Otros ensayos importantes son los ELISAs. Todos estos ensayos se pueden adaptar fácilmente para su uso en la detección del VEGF, ya que se puede aplicar en el diagnóstico de una enfermedad angiogénica. Los agentes de la presente invención también se pueden utilizar junto con bloques de tejido envueltos de parafina tanto fijados a formalina como frescos congelados en inmunohistoquímica; en clasificación por activación celular fluorescente, citometría de flujo o microfluorometría de flujo; en inmunoprecipitación; en realizaciones de purificación de antígeno, tal como la cromatografía de afinidad, que incluso incluye, en casos de anticuerpos biespecíficos, la purificación rápida de una etapa de uno o más antígenos al mismo tiempo; y en otros muchos ensayos de unión que serán conocidos por los entendidos en la técnica dada la información presentada en la presente.
Algunos usos prácticos adicionales de los presentes anticuerpos son como controles en ensayos funcionales. Éstos incluyen muchos ensayos y sistemas in vivo y ex vivo, así como estudios de modelos animales. Como las propiedades de unión y funcionales de los anticuerpos de la presente invención son particularmente específicas, es decir, inhiben la unión del VEGF a, y la señalización a través de, VEGFR2, pero no VEGFR1, tales usos de "control" son actualmente extremadamente valiosos. Los ensayos que se benefician de tal aplicación práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, ensayos relacionados con el crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF, la fosforilación inducida por el VEGF y la permeabilidad vascular inducida por el VEGF, así como el ensayo de "micropocket" corneal de neovascularización y el ensayo prueba de la membrana corioalantoica (CAM) de pollo. Estos sistemas de ensayo también se pueden desarrollar en ensayos de screening de fármacos in vitro o ex vivo, en los que el presente suministro de materiales biológicos con propiedades bien definidas es particularmente importante.
C. Inmunoconjugados
A pesar de que la presente invención proporciona anticuerpos no conjugados o desnudos sorprendentemente efectivos para su uso en métodos antiangiogénicos, por este medio también se proporcionan inmunoconjugados, inmunotoxinas y coaguligandos de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o basados en 2C3. Los agentes preferidos actualmente para su uso en conjugados terapéuticos de los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o basados en 2C3 son agentes radioterapéuticos (ejemplificados por los radiodiagnósticos dados a conocer en la presente), agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis, fármacos antitubulina, agentes citotóxicos o anticelulares y coagulantes (factores de coagulación).
Para generar inmunoconjugados, inmunotoxinas y coaguligandos, se puede emplear una expresión recombinante para crear una proteína de fusión, como se conoce por los entendidos en la técnica y además dado a conocer en la presente. Igualmente, se pueden generar inmunoconjugados, inmunotoxinas y coaguligandos utilizando puentes de avidina:biotina o cualquiera de las tecnologías de conjugación química o entrecruzamiento desarrolladas en referencia a los conjugados de anticuerpos.
C1. Agentes tóxicos y anticelulares
Para ciertas aplicaciones, los agentes terapéuticos serán citotóxicos o agentes farmacológicos, particularmente citotóxicos, citostáticos o, en cualquier caso, agentes anticelulares que tienen la capacidad de eliminar o suprimir el crecimiento o la división celular de células endoteliales. En general, estos aspectos de la presente invención contemplan el uso de cualquier agente farmacológico que se pueda conjugar a un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo similar al 2C3, y se pueda liberar en una forma activa al endotelio marcado.
Algunos ejemplos de agentes anticelulares incluyen agentes quimioterapéuticos, así como citotoxinas. Los agentes quimioterapéuticos que se pueden utilizar incluyen: hormonas, tales como esteroides; antimetabolitos, tales como citosina arabinosida, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina; antraciclinas; mitomicina C; alcaloides de vinca; demecolcina; etoposida; mitramicina; agentes alquilantes antitumorales, tales como clorambucil o melfalán. Otras realizaciones pueden incluir agentes, tales como citocinas. Básicamente, se puede utilizar cualquier agente anticelular, siempre y cuando, se pueda conjugar satisfactoriamente a, o asociar con, un anticuerpo en una manera que permita su marcaje, internalización, liberación y/o presentación a los componentes sanguíneos en el sitio de las células endoteliales marcadas.
Pueden haber circunstancias, tales como cuando el antígeno diana no se internaliza mediante una vía lógica con una intoxicación eficiente por parte del compuesto tóxico, donde se deseará marcar agentes terapéuticos, tales como fármacos antitumorales, citocinas, antimetabolitos, agentes alquilantes, hormonas, y similares. Actualmente, una variedad de agentes farmacológicos y quimioterapéuticos, que incluyen doxorubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, neocarzinostatina, macromicina, trenimona y \alpha-amanitina, se han conjugado satisfactoriamente a anticuerpos y se ha mostrado que funcionan farmacológicamente.
En otras circunstancias, cualquier efecto potencial colateral de la terapia basada en citotoxinas se puede eliminar mediante el uso de inhibidores de la síntesis del ADN, tales como daunorubicina, doxorubicina, adriamicina, y similares. Estos agentes son, por tanto, ejemplos preferidos de agentes anticelulares para su uso en la presente invención.
En términos de agentes citostáticos, tales compuestos, generalmente, alteran el ciclo natural de la célula de una célula diana, preferiblemente, de manera que la célula se saca del ciclo celular.
Se conocen una gran variedad de agentes citotóxicos que se pueden conjugar al anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o a anticuerpos basados en 2C3. Algunos ejemplos incluyen numerosas toxinas útiles derivadas de bacterias, hongos o plantas, que, a modo de ejemplo, incluyen varias toxinas de cadena A, particularmente la cadena A de ricina; proteínas inactivadoras de ribosomas, tales como saponina o gelonina; \alpha-sarcina; aspergilina; restrictocina; ribonucleasas, tales como ribonucleasa placental; toxina de la difteria; y exotoxina de pseudomonas, por nombrar unas cuantas.
De las toxinas, se prefieren las cadenas A de ricina. La fracción de la toxina más preferida para su uso en la presente es la cadena A de la toxina que se ha tratado para modificar o eliminar los residuos de carbohidratos, llamada cadena A desglicosilada (dgA). Se prefiere la cadena A de ricina desglicosilada a causa de su extrema potencia, vida media más larga, y porque es económicamente factible para fabricarse en un grado y escala clínica.
Es deseable, desde un punto de vista farmacológico, emplear la molécula más pequeña posible que, no obstante, proporcione una respuesta biológica apropiada. De este modo, puede ser deseable el empleo de péptidos de cadena A más pequeños que proporcionarán una respuesta anticelular adecuada. Para este fin, se ha descubierto, por Nagarase (Sigma), que la cadena A de ricina se puede "truncar" mediante la eliminación de 30 aminoácidos del extremo N-terminal, y aún mantiene una actividad de la toxina adecuada. Se propone que donde se desee, se pueda emplear esta cadena A truncada en conjugados de acuerdo con la presente invención.
Alternativamente, se puede encontrar que la aplicación de la tecnología del ADN recombinante a la fracción de cadena A de la toxina proporcionará beneficios adicionales de acuerdo con la presente invención. Puesto que ya se ha conseguido la clonación y la expresión de la cadena A de la ricina biológicamente activa, actualmente es posible identificar y preparar péptidos más pequeños, o en cualquier caso, variantes, que, no obstante, muestran una actividad de la toxina apropiada. Además, el hecho de que la cadena A de la ricina se haya clonado actualmente permite la aplicación de mutagénesis dirigida a sitio, a través de la cual se pueden preparar fácilmente y verificar los péptidos derivados de cadena A y obtener fracciones útiles adicionales para su uso con respecto a la presente invención.
C2. Factores de coagulación
El anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 de la presente invención se pueden unir a un componente que es capaz de estimular la coagulación directamente o indirectamente, para formar un coaguligando. Aquí, los anticuerpos se pueden unir directamente al coagulante o al factor de coagulación, o se pueden unir a una segunda región de unión que une y, a continuación libera, el coagulante o el factor de coagulación. Tal como se usa en la presente, los términos "coagulante" y "factor de coagulación" se usan cada uno para referirse a un componente que es capaz de estimular la coagulación directamente o indirectamente bajo condiciones apropiadas, preferiblemente cuando se proporciona a un medio in vivo específico, tal como la vasculatura tumoral.
Los factores de coagulación preferidos son composiciones del Factor Tisular, tales como TF truncado (tTF), dimérico, multimérico y moléculas de TF mutantes. El "TF truncado" (tTF) se refiere a construcciones de TF que son deficientes de unión a membrana debido a la eliminación de secuencias de aminoácidos suficientes para efectuar este cambio en propiedad. Una "cantidad suficiente", en este contexto, es una cantidad de secuencia de aminoácidos de transmembrana originalmente suficiente para entrar la molécula del TF en la membrana, o de otra manera, mediar la unión funcional de membrana de la proteína TF. La eliminación de tal "cantidad suficiente de secuencia extensiva de transmembrana", por tanto, crea una proteína del Factor Tisular truncada o un polipéptido deficiente en la capacidad de unión a la membrana fosfolipídica, de tal manera que la proteína es sustancialmente una proteína soluble, que no se une significativamente a las membranas fosfolipídicas. De este modo, el TF truncado, sustancialmente, falla en la conversión del Factor VII al Factor VIIa en un ensayo de TF estándar, y sin embargo, mantiene la llamada actividad catalítica que incluye la activación del Factor X en presencia del Factor VIIa.
La Patente U.S.A. No. 5.504.067 además describe tales proteínas del Factor Tisular truncado. Preferiblemente, los Factores Tisulares para su uso en estos aspectos de la presente invención, generalmente, carecerán de las regiones citosólicas y de transmembrana (aminoácidos 220-263) de la proteína. Sin embargo, no hay necesidad para las moléculas de TF truncadas de limitarse a moléculas con una longitud exacta de 219 aminoácidos.
Las composiciones del Factor Tisular pueden ser también útiles como dímeros. Cualquiera de las construcciones de Factor Tisular truncado, mutado u otro, se puede preparar en forma dimérica para su uso en la presente invención. Tal como se sabrá por aquellos con habilidad normal en la técnica, tales dímeros de TF se pueden preparar mediante el empleo de técnicas estándares de biología molecular y expresión recombinante, en que se preparan dos regiones de codificación "in-frame" y se expresan a partir de un vector de expresión. Igualmente, se pueden emplear varias tecnologías de conjugación química con respecto a la preparación de dímeros de TF. Los monómeros individuales de TF se pueden derivatizar previamente a la conjugación. Todas estas técnicas serían fácilmente conocidas por los entendidos en la técnica.
Si se desea, los dímeros o multímeros del Factor Tisular se pueden unir a través de un enlace liberable biológicamente, tal como un enlazador divisible selectivamente o una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, se contemplan enlazadores peptídicos que incluyen un sitio de división para una enzima preferencialmente localizado o activo en un medio tumoral. Algunos ejemplos de formas de tales enlazadores peptídicos son aquellos que se dividen por uroquinasa, plasmina, trombina, Factor IXa, Factor Xa, o una metaloproteinasa, tal como colagenasa, gelatinasa o estromelisina.
En ciertas realizaciones, los dímeros del Factor Tisular pueden además comprender una fracción de inserción obstaculizada de membrana hidrofóbica, para posteriormente impulsar la asociación funcional del Factor Tisular con la membrana fosfolipídica, pero sólo bajo ciertas condiciones definidas. Tal como se describe en el contexto de los Factores Tisulares truncados, las secuencias de asociación de la membrana hidrofóbica son, generalmente, fragmentos de aminoácidos que provocan la asociación con el medio fosfolipídico debido a su naturaleza hidrofóbica. Igualmente, los ácidos grasos se pueden utilizar para proporcionar las fracciones potenciales de inserción de membrana.
Tales secuencias de inserción de membrana se pueden localizar en el extremo N-terminal o C-terminal de la molécula de TF, o generalmente, anexionadas a cualquier otro punto de la molécula, siempre y cuando, su acoplamiento a ésta no obstaculice las propiedades funcionales de la construcción del TF. La intención de la fracción de inserción obstaculizada es que permanezca no funcional hasta que se localice la construcción del TF en el medio tumoral, y permita que el anexo hidrofóbico se vuelva accesible e incluso provoque la asociación física con la membrana. Otra vez, se contempla que los enlaces liberables biológicamente y las secuencias divisibles selectivamente serán particularmente útiles en esta consideración, dividiéndose sólo el enlace o la secuencia o, de otra manera, modificándose tras la localización dentro del medio tumoral y la exposición a enzimas particulares u otras moléculas bioactivas.
En otras realizaciones, las construcciones de tTF pueden ser multiméricas o poliméricas. En este contexto, una "construcción polimérica" contiene 3 o más construcciones de Factor Tisular. Una "construcción de TF polimérica o multimérica" es una construcción que comprende una primera molécula o derivado de TF operativamente acoplada a, como mínimo, una segunda o una tercera molécula o derivado de TF. Los multímeros pueden comprender entre aproximadamente 3 y aproximadamente 20 de estas moléculas de TF. Las unidades individuales de TF en los multímeros o polímeros se pueden también unir por enlazadores peptídicos divisibles selectivamente u otros enlaces liberables biológicamente, según se desee. Otra vez, como se discutió anteriormente con los dímeros TF, las construcciones se pueden fácilmente fabricar utilizando tanto expresión como manipulación recombinante o utilizando química sintética estándar.
Además, las construcciones de TF útiles en el contexto de la presente invención son aquellas mutantes deficientes en la capacidad de activar el Factor VII. Tales "mutantes de activación del Factor VII" se definen en la presente, generalmente, como mutantes del TF que unen el Factor VII/VIIa funcional, activan proteolíticamente el Factor X, pero están sustancialmente libres de la capacidad de activar proteolíticamente el Factor VII. Por consiguiente, tales construcciones son mutantes de TF que carecen de la actividad de activación del Factor VII.
La capacidad de tales mutantes de activación del Factor VII para funcionar en la provocación de la coagulación específica del tumor se basa en su liberación específica a la vasculatura tumoral, y la presencia del Factor VIIa en niveles bajos en el plasma. Tras la administración de tal conjugado de mutante de activación del Factor VII, el mutante se localizará en la vasculatura de un tumor vascularizado. Previo a la localización, el mutante de TF, generalmente, sería incapaz de provocar la coagulación en ningún otro sitio del cuerpo, en base a su incapacidad para convertir el Factor VII en el Factor VIIa. Sin embargo, tras la localización y acumulación dentro de la región tumoral, el mutante encontrará suficiente Factor VIIa del plasma para iniciar el mecanismo de coagulación extrínseca, llevando a una trombosis específica del tumor. El Factor VIIa exógeno también se puede administrar al paciente.
Se pueden preparar y utilizar alguno o más de uno de una variedad de mutantes de activación del Factor VII en relación con la presente invención. Hay una cantidad significativa de conocimiento científico con respecto a los sitios de reconocimiento en la molécula de TF para el Factor VII/VIIa. De este modo, se entenderá que la región de activación del Factor VII, generalmente, se encuentra entre aproximadamente el aminoácido 157 y aproximadamente el aminoácido 167 de la molécula de TF. Sin embargo, se contempla que los residuos externos a esta región también pueden demostrar que son relevantes en la actividad de la activación del Factor VII, y por tanto, se puede considerar la introducción de mutaciones en alguno o más de uno de los residuos localizados, generalmente, entre aproximadamente el aminoácido 106 y aproximadamente el aminoácido 209 de la secuencia de TF (WO 94/07515; WO 94/28017).
Se puede utilizar una variedad de otros factores de coagulación en relación con la presente invención, tal como ejemplifican los agentes siguientes. En la presente invención se puede utilizar trombina, Factor V/Va y derivados, Factor VIII/VIIIa y derivados, Factor IX/IXa y derivados, Factor X/Xa y derivados, Factor XI/XIa y derivados, Factor XII/XIIa y derivados, Factor XIII/XIIIa y derivados, activador del Factor X y activador del Factor V.
El activador del Factor X del veneno de víbora de Russell se contempla para su uso en la presente invención. También se han producido anticuerpos monoclonales específicos para el activador del Factor X presente en el veneno de víbora de Russell, y se podrían utilizar para liberar específicamente el agente como parte de un ligando de unión biespecífico.
El tromboxano A_{2} se forma a partir de endoperóxidos mediante las acciones secuenciales de los enzimas ciclooxigenasa y tromboxano sintetasa en microsomas de plaquetas. El tromboxano A_{2} se genera fácilmente por plaquetas y es un potente vasoconstrictor, en virtud de su capacidad para producir la agregación plaquetaria. Tanto el tromboxano A_{2} como los análogos activos de éste se contemplan para su uso en la presente invención.
La tromboxano sintasa, y otros enzimas que sintetizan las prostaglandinas de activación de plaquetas, se pueden también utilizar como "coagulantes" en el presente contexto. Se conocen anticuerpos monoclonales a la tromboxano sintasa, y purificación de inmunoafinidad de la misma; así como el ADNc para la tromboxano sintasa humana.
La \alpha2-antiplasmina, o el inhibidor de la \alpha2-plasmina, es una proteinasa inhibidora natural presente en el plasma humano que actúa para inhibir eficientemente la lisis de los coágulos de fibrina inducidos por el activador de plasminógeno. La \alpha2-antiplasmina es un inhibidor particularmente potente, y se contempla para su uso en la presente invención.
Como se dispone de la secuencia de ADNc para la \alpha2-antiplasmina, se prefieren la expresión recombinante y/o las proteínas de fusión. Los anticuerpos monoclonales contra la \alpha2-antiplasmina también están disponibles y se pueden utilizar en las realizaciones con ligando de unión biespecífica de la presente invención. Estos anticuerpos se podrían utilizar para liberar la \alpha2-antiplasmina exógena al sitio diana o para acumular \alpha2-antiplasmina endógena y concentrarla dentro de la región marcada.
C3. Fármacos antitubulina
Un conjunto de fármacos ejercen sus efectos a través de la interferencia con la actividad de la tubulina. Como las funciones de la tubulina son esenciales para la mitosis y la viabilidad de las células, ciertos "fármacos antitubulina" son poderosos agentes quimioterapéuticos. Algunos de los fármacos antitubulina mejor conocidos y preferidos actualmente para su uso con la presente invención son la colquicina; los taxanos, tal como el taxol; los alcaloides de vinca, tal como la vinblastina, la vincristina y la vindescina; y las combretastatinas. Otros fármacos antitubulina son las citocalasinas (incluyendo B, J, E), la dolastatina, la auristatina PE, el paclitaxel, la ustiloxina D, la rizoxina, 1069C85, la colcemida, el albendazol, la anatoxina y el nocodazol.
Como se describe en las Patentes U.S.A. Nos. 5.892.069, 5.504.074 y 5.661.143, las combretastatinas son derivados del estradiol que, generalmente, inhiben la mitosis celular. Algunas combretastatinas de ejemplo que se pueden utilizar en relación con la invención incluyen aquellas basadas en combretastatina A, B y/o D y las descritas en las Patentes U.S.A. No. 5.892.069, 5.504.074 y 5.661.143. Las combretastatinas A-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, B-1, B-2, B-3 y B-4 son ejemplos de los tipos anteriores.
Las Patentes U.S.A. Nos. 5.569.786 y 5.409.953 describen el aislamiento, la caracterización estructural y la síntesis de cada una de las combretastatinas A-1, A-2, A-3, B-1, B-2, B-3 y B-4 y las formulaciones y métodos de utilización de tales combretastatinas para tratar el crecimiento neoplástico. Se pueden utilizar alguna o más de una de tales combretastatinas en relación con la presente invención.
La combretastatina A-4, tal como se describe en las Patentes U.S.A. Nos. 5.892.069, 5.504.074, 5.661.143 y 4.996.237, también se puede utilizar en la presente. La Patente U.S.A. No. 5.561.122 describe profármacos de combretastatina A-4 adecuados, los cuales se contemplan para su uso combinado con la presente invención.
La Patente U.S.A. No. 4.940.726 particularmente describe lactonas macrocíclicas denominadas combretastatina D-1 y "Combretastatina D-2", cada una de las cuales se puede utilizar en combinación con las composiciones y métodos de la presente invención. La Patente U.S.A. No. 5.430.062 tiene que ver con derivados de estilbeno y análogos de combretastatina con actividad anticancerígena que se pueden utilizar en combinación con la presente invención.
C4. Agentes antiangiogénicos
La presente invención particularmente proporciona antiangiogénicos combinados. Las angiopoyetinas, al igual que los miembros de la familia del VEGF, son factores de crecimiento específicos para el endotelio vascular (Davis y Yancopoulos, 1999; Holash y otros, 1999). Las primeras angiopoyetinas descritas eran un activador o agonista natural del receptor, angiopoyetina-1 (Ang-1), y un antagonista natural del receptor, angiopoyetina-2 (Ang-2), las cuales actúan por medio del receptor de tirosina quinasa de la célula endotelial, Tie2.
También se han identificado dos nuevas angiopoyetinas, la angiopoyetina-3 (ratón) y la angiopoyetina-4 (humana) (Valenzuela y otros, 1999). La angiopoyetina-3 parece actuar como antagonista (como Ang-2), mientras que la angiopoyetina-4 parece funcionar como agonista (como Ang-1) (Valenzuela y otros, 1999). Una proteína denominada angiopoyetina-3 también fue clonada de corazón humano y no mostró tener efectos mitogénicos en las células endoteliales (Kim y otros, 1999).
Mientras que el VEGF es necesario para las primeras etapas del desarrollo vascular, la angiopoyetina-1 se requiere, generalmente, para las últimas etapas de la vascularización. El VEGF, de este modo, actúa para provocar la diferenciación y proliferación de células endoteliales y la formación de los vasos primitivos. La angiopoyetina-1 actúa, a través del receptor Tie2, para provocar el mantenimiento y la estabilización de los vasos maduros. La angiopoyetina-1 es, de este modo, un factor de estabilización o maduración, pensado para convertir los vasos inmaduros en vasos maduros mediante la estimulación de interacciones entre las células endoteliales y las células de soporte circundantes (Holash y otros, 1999).
Se ha mostrado que la angiopoyetina-1 aumenta la revascularización en el tejido isquémico (Shyu y otros, 1998) e incrementa la supervivencia de la red vascular expuesta al VEGF o a una forma del aFGF (Papapetropoulos y otros, 1999). Estos autores también mostraron que la angiopoyetina-1 previene la muerte apoptótica en las HUVEC (células endoteliales de cordón umbilical humano) impulsada por la extracción de la misma forma de aFGF (Papapetropoulos y otros, 1999). Tales datos concuerdan con el papel directo de la angiopoyetina-1 en las células humanas endoteliales y su interacción con otras moléculas angiogénicas para estabilizar las estructuras vasculares provocando la supervivencia de las células endoteliales diferenciadas.
Como la angiopoyetina-1 emite una señal de estabilidad y madurez, los inventores han pensado en aquellos aspectos de la presente invención que se relacionan con la liberación de angiopoyetina-1 dirigida. Los inventores razonaron que, como la angiopoyetina-1 es un factor de madurez, dejaría que el factor de crecimiento de los vasos sanguíneos de la sangre fuera independiente. Un aspecto de la presente invención, por tanto, tiene que ver con el uso de la angiopoyetina-1 dirigida al tumor para cimentar las propiedades de no respuesta al VEGF de los vasos diana.
Es razonable pensar que el uso de un ligando de unión al tumor para liberar angiopoyetina-1 a los vasos sanguíneos del tumor liberaría fácilmente del orden de 500.000 moléculas de angiopoyetina-1 al lumen del vaso. Esto abrumaría el sistema del receptor Tie2, saturando totalmente los receptores Tie2 con el ligando de angiopoyetina-1. De este modo, la angiopoyetina-2 sería incapaz de unirse, y por tanto, se inhibirían los efectos combinados de la angiopoyetina-2 y el VEGF (ver discusión a continuación).
La liberación de angiopoyetina-1 al tumor, preferiblemente a la vasculatura del tumor, se puede utilizar junto con una variedad de otras estrategias anticancerígenas, como se da a conocer en la presente en detalle, para conseguir un efecto terapéutico combinado. La respuesta típica de un tumor a terapias que inducen, como mínimo, algo de necrosis, es iniciar la regeneración vascular. Como la señal de la angiopoyetina-1 fuerza a madurar a los vasos sanguíneos, serían incapaces de remodelar y no podrían compensar la pérdida de masa tumoral inducida por el agente terapéutico primario. Estas observaciones, por tanto, proporcionan otro aspecto preferido de la invención en la liberación de angiopoyetina, concretamente el uso combinado del marcaje de angiopoyetina-1 en combinación con alguno o más de uno de agentes anticancerígenos, incluyendo fármacos quimioterapéuticos convencionales.
La acción de la angiopoyetina-1 tras la liberación es fundamentalmente para impedir la remodelación vascular. Tanto si se utiliza sola, como en terapias de combinación, el valor del marcaje de angiopoyetina-1 se aumenta particularmente por la seguridad inherente en esta aproximación terapéutica. No hay desventajas significativas en la terapia con angiopoyetina-1. Incluso, en el caso desafortunado de que una cantidad de Ang-1 marcada se mal dirigiera a tejidos no tumorales, todo lo que resultaría sería que la vasculatura en el área marcada se haría más estable y/o inactiva. En esta consideración, la Ang-1 también se podría utilizar como un agente antiinflamatorio.
La angiopoyetina-2 es actualmente un agente preferido para su uso en terapias dirigidas al tumor, particularmente en combinación con la inhibición del VEGF de la presente invención. Sin embargo, debido a los efectos diferenciales de la angiopoyetina-2 bajo diferentes condiciones, particularmente con niveles de VEGF variantes, los inventores han pensado otra vez cuidadosamente en aquellos aspectos de la presente invención que se refieren a la liberación de angiopoyetina-2 dirigida.
La angiopoyetina-2 también es un ligando para el receptor Tie2, pero, generalmente, contrarresta la maduración/estabilidad de los vasos sanguíneos mediados por la angiopoyetina-1. Es, de este modo, un antagonista de la angiopoyetina-1 y actúa para alterar la estructura capilar. Bajo condiciones apropiadas, la angiopoyetina-2 transmite una señal negativa a las células diana y, la desestabilización inducida por la angiopoyetina-2, conlleva una regresión de los vasos. Esta es la primera característica de la angiopoyetina-2, buscada para ser explotada en la liberación dirigida de angiopoyetina-2 a tumores, preferiblemente a la vasculatura tumoral.
Se contempla que simplemente liberando suficiente angiopoyetina-2, que es fácilmente conseguible utilizando anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como 2C3, se saturaría cualquier otra señal que pudiera estar presente en el medio tumoral y provocaría la regresión de los vasos. Como hay una interacción controlada cuidadosamente entre las angiopoyetinas en el medio natural, una inclinación extrema del sistema a favor de la regresión, mediante la señalización de angiopoyetina-2 constante, puede bien destruir los efectos tanto de la angiopoyetina-1 como del VEGF.
El uso de angiopoyetina-2 sola dirigida al tumor se puede, por tanto, utilizar como ventaja para la inducción de la regresión de los vasos del tumor, particularmente como un mecanismo inicial de intervención terapéutica. Generalmente, sin embargo, la desestabilización inducida por la angiopoyetina-2 puede llevar a la regresión o a la regeneración de los vasos. La desestabilización en ausencia de otros estímulos angiogénicos, particularmente VEGF, es la que conduce a la regresión de los vasos; mientras que la desestabilización en presencia de altos niveles de VEGF facilita la respuesta angiogénica (Holash y otros, 1999).
Los vasos sanguíneos que experimentan una desestabilización en respuesta a la angiopoyetina-2 se pueden "rescatar" de la regresión mediante la exposición a otros estímulos. La angiopoyetina-2 puede, por tanto, dejar las células endoteliales sensibles a otros estímulos angiogénicos y facilitar una respuesta angiogénica bajo condiciones definidas. El VEGF, en particular, puede impulsar a las células desestabilizadas por Ang-2 a proliferar y formar nuevos vasos primitivos (Asahara y otros, 1998; Holash y otros, 1999). De hecho, se ha informado de la expresión de la angiopoyetina-2 en tejidos tumorales (Tanaka y otros, 1999), en los que se presumía que actuaba en combinación con VEGF para provocar la angiogénesis (Stratmann y otros, 1998). La neovascularización iniciada por la angiopoyetina-2 y el VEGF hace que estas moléculas sean "co-angiogénicas".
Actualmente, se ha informado de un modelo coordinado para explicar los efectos positivos y negativos de la angiopoyetina-2 en vasos sanguíneos en ciertos tipos de tumores (Holash y otros, 1999). En este modelo, la desestabilización inducida por la angiopoyetina-2, inicialmente, causa una regresión de los vasos significativa en tumores que se originan mediante la adición de vasos sanguíneos de la vasculatura del huésped circundante. Los altos niveles de angiopoyetina-2 producidos por las células endoteliales asociadas al tumor responden a la señal de supervivencia aparentemente proporcionada por una expresión constitutiva de bajo nivel de angiopoyetina-1. La angiopoyetina-2, de este modo, marca los vasos añadidos para la regresión apoptópica (Holash y otros, 1999). Sin embargo, a pesar de la necrosis tumoral resultante, las células tumorales supervivientes regulan a la alta el VEGF para asegurar su supervivencia. La expresión coincidente de VEGF y angiopoyetina-2 da lugar entonces a una angiogénesis robusta en la periferia del tumor, ya que el VEGF anula la señal de regresión de la angiopoyetina-2 y, de hecho, provoca el desarrollo vascular (Holash y otros, 1999).
A pesar de que a primera vista puede parecer contradictorio, las acciones de la angiopoyetina-2 se pueden explicar y predecir ampliamente en base a otras señales presentes, particularmente VEGF. En ausencia de otra señal angiogénica, la angiopoyetina-2 provoca que los vasos se desestabilicen y se vuelvan inmaduros, llevando a la regresión. En presencia de un estímulo, particularmente VEGF, la desestabilización causada por la angiopoyetina-2 realmente lleva a la angiogénesis ya que los vasos se han "cebado" para recibir un estímulo angiogénico secundario. Los efectos angiogénicos de algunos reguladores, de este modo, se cree que se consiguen, como mínimo en parte, a través de la regulación de un bucle autocrino de la actividad de angiopoyetina-2 en células endoteliales microvasculares (Mandriota y Pepper, 1998).
Los papeles biológicos duales de la angiopoyetina-2 impulsaron a los inventores a desarrollar estrategias terapéuticas adicionales que tienen en cuenta otras señales en el medio tumoral, particularmente VEGF. Como la angiopoyetina-2 y el VEGF actúan conjuntamente para estimular la angiogénesis, un aspecto preferido de la presente invención es utilizar la liberación de angiopoyetina-2 dirigida al tumor en combinación con los presentes anticuerpos inhibidores del VEGF. Esto asegurará que la angiopoyetina-2 actúe en la regresión y no en la angiogénesis.
A la luz de las explicaciones anteriores, se entenderá que la presente invención proporciona anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como 2C3, que están operativamente acoplados a, o de otra manera asociados funcionalmente, con alguno o más de uno del grupo de angiopoyetina-1, angiopoyetina-2, angiopoyetina-3 y/o angiopoyetina-4. Algunos ejemplos de composiciones de angiopoyetina-1 son los de SEQ ID NO:1 (ADN) y SEQ ID NO:2 (proteína), mientras que los composiciones de angiopoyetina-2 se ejemplifican por SEQ ID NO:3 (ADN) y SEQ ID NO:4 (proteína). La angiopoyetina-3, que es un antagonista, generalmente, se utilizará como la angiopoyetina-2; y el agonista angiopoyetina-4 se puede utilizar como la angiopoyetina-1. El artículo de Valenzuela y otros (1999) además complementa la presente enseñanza respecto a la angiopoyetina-3 y la angiopoyetina-4.
Además, las proteínas de fusión de las angiopoyetinas también se prevén para su uso en la presente invención. Un ejemplo es la proteína de fusión estable Ang-1-Ang-2 incluida en la presente como SEQ ID NO:5. Esta proteína contiene los primeros 73 residuos de la angiopoyetina-2, hasta la secuencia DAPLEY, fusionada al inicio de la secuencia de la angiopoyetina-1 en el aminoácido 77. También tiene una mutación en la posición 265 en la secuencia de la angiopoyetina-1, donde la Cys se reemplaza por Ser.
Otros antiangiogénicos para usar en la presente incluyen la angiostatina y la endostatina. La angiostatina se da a conocer en las Patentes U.S.A. 5.776.704; 5.639.725 y 5.733.876. La angiostatina es una proteína que tiene un peso molecular de entre unos 38 kD y unos 45 kD, tal como se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida reductora, que contiene aproximadamente regiones Kringle 1 a 4 de una molécula de plasminógeno. La angiostatina, generalmente, tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la de un fragmento de plasminógeno murino que empieza por el aminoácido 98 de una molécula de plasminógeno murino intacta.
La secuencia de aminoácidos de la angiostatina varía ligeramente entre especies. Por ejemplo, en la angiostatina humana, la secuencia de aminoácidos es sustancialmente similar a la secuencia del fragmento de plasminógeno murino descrito anteriormente, a pesar de que una secuencia de angiostatina humana activa puede comenzar en el aminoácido 97 ó 99 de una secuencia de aminoácido de plasminógeno humano intacto. Además, se puede utilizar plasminógeno humano, ya que tiene una actividad antiangiogénica similar, como se muestra en un modelo de tumor en ratón.
La angiostatina y la endostatina se han convertido en foco de un intenso estudio, ya que son los primeros inhibidores de angiogénesis que se ha demostrado que tienen capacidad, no sólo de inhibir el crecimiento del tumor, sino también de causar la regresión del tumor en ratones. Se ha mostrado que existen múltiples proteasas que producen angiostatina a partir de plasminógeno como, por ejemplo, elastasa, macrófago metaloelastasa (MME), matrilisina (MMP-7), y colagenasa tipo IV/gelatinasa B de 92 kDa (MMP-9).
La MME puede producir angiostatina a partir de plasminógeno en tumores y el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF) regula a la alta la expresión del MME mediante macrófagos que inducen la producción de angiostatina. El papel del MME en la generación de angiostatina se apoya en el descubrimiento de que el MME, de hecho, se expresa en muestras clínicas de carcinomas hepatocelulares de pacientes. Otra proteasa pensada para ser capaz de producir angiostatina es la estromelisina-1 (MMP-3). Se ha mostrado que la MMP-3 produce fragmentos similares a la angiostatina a partir de plasminógeno in vitro. El mecanismo de acción de la angiostatina no está aún claro; se cree que se une a un receptor superficial de célula no identificado en las células endoteliales induciendo a la célula endotelial a experimentar la muerte de la célula programada o la detención mitótica.
La endostatina parece ser un agente antiangiogénico y antitumoral incluso más poderoso y se prefiere particularmente para la unión a anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como el 2C3. La endostatina es efectiva en la provocación de regresiones en varios modelos de tumor en ratones. Los tumores no desarrollan resistencia a la endostatina y, después de ciclos múltiples de tratamiento, los tumores entran en un estado inactivo durante el cual no incrementan su volumen. En este estado inactivo, se incrementó el porcentaje de células tumorales que experimentan apoptosis, produciendo una población que esencialmente mantiene el mismo tamaño.
La Patente U.S.A. No. 5.854.205, a Folkman y O'Reilly, tiene que ver con la endostatina y su uso como inhibidor de la proliferación de células endoteliales y la angiogénesis. La proteína endostatina corresponde a un fragmento C-terminal de colágeno tipo XVIII, y la proteína se puede aislar a partir de una serie de fuentes. La Patente U.S.A. No. 5.854.205 también explica que la endostatina puede tener una secuencia de aminoácidos de un fragmento de colágeno tipo XVIII, colágeno tipo XV, o esterasa pregástrica BOVMPE 1. Las combinaciones de endostatina con otras proteínas antiangiogénicas, particularmente angiostatina, también están descritas por la Patente U.S.A. No. 5.854.205, de manera que las composiciones combinadas son capaces de hacer una regresión efectiva de la masa de un tumor dependiente de angiogénesis.
La endostatina y la angiostatina son agentes preferidos para la liberación al tumor según la presente invención. La vasculostatina, la canstatina y la maspina son también agentes preferidos. La endostatina, en particular, es uno de los agentes más preferidos. Las proteínas de fusión endostatina-2C3 se pueden preparar, como se describe en la presente. Varias construcciones de endostatina-2C3 unidas químicamente también se describen en la presente solicitud.
C5. Agentes inductores de apoptosis
La presente invención también se puede utilizar para liberar agentes que inducen la apoptosis en cualquier célula en el interior del tumor, incluyendo células tumorales y células endoteliales vasculares del tumor. A pesar de que muchos agentes anticancerígenos pueden tener, como parte de su mecanismo de acción, un efecto inductor de apoptosis, se han descubierto, diseñado y seleccionado ciertos agentes con éste como mecanismo principal, tal como se describe a continuación.
Muchas formas de cáncer tienen informes de mutaciones en los genes supresores de tumores, tal como p53. La inactivación del p53 da lugar a un fallo en la provocación de apoptosis. Con este fallo, las células cancerígenas progresan en la tumorigénesis, en lugar de destinarse a la muerte celular. De este modo, la liberación de supresores de tumores también se contempla para su uso en la presente invención, para estimular la muerte celular. Algunos ejemplos de supresores tumorales incluyen, pero no están limitados a, p53, gen del Retinoblastoma (Rb), el tumor de Wilm (WT1), alfa bax, la enzima convertidora de interleucina 1\beta y familia, gen MEN-1, neurofibromatosis tipo 1 (NF1), p16 inhibidor de cdk, gen del cáncer colorectal (DCC), gen de la polipopsis adenomatosis familiar (FAP), gen supresor de tumores múltiples (MTS-1), BRCA1 y BRCA2.
Los preferidos para su uso son el p53 (Patentes U.S.A. Nos. 5.747.469; 5.677.178; y 5.756.455), Retinoblastoma, BRCA1 (Patentes U.S.A. Nos. 5.750.400; 5.654.155; 5.710.001; 5.756.294; 5.709.999; 5.693.473; 5.753.441; 5.622.829; y 5.747.282), MEN-1 (Banco de Genes, número de acceso U93236) y adenovirus E1A (Patente U.S.A. No. 5.776.743).
Otras composiciones que se pueden liberar por los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tal como el 2C3, incluyen genes que codifican el factor de la necrosis tumoral relacionado con el ligando inductor de apoptosis denominado TRAIL, y el polipéptido TRAIL (Patente U.S.A. No. 5.763.223); la proteasa asociada a la apoptosis de 24 kD de la Patente U.S.A. No. 5.605.826; el factor 1 asociado a Fas, FAF1 (Patente U.S.A. No. 5.750.653). También se contempla para su uso, en estos aspectos de la presente invención, el suministro de la enzima convertidora de interleucina 1\beta y los miembros de la familia, que también se ha indicado que estimulan la apoptosis.
También se pueden utilizar compuestos, tales como derivados de carbostiril (Patentes U.S.A. Nos. 5.672.603; y 5.464.833); péptidos apogénicos ramificados (Patente U.S.A. No. 5.591.717); inhibidores de fosfotirosina y análogos de fosfotirosina no hidrolizables (Patentes U.S.A. Nos. 5.565.491; y 5.693.627); agonistas de los receptores de retinoide de RXR (Patente U.S.A. No. 5.399.586); e incluso antioxidantes (Patente U.S.A. No. 5.571.523). Los inhibidores de tirosina quinasa, tal como genisteína, también se pueden unir a los agentes de la presente invención que están dirigidos al receptor de la superficie de la célula, VEGFR1 (como se indica en la Patente U.S.A. No. 5.587.459).
C6. Equivalentes biológicamente funcionales
Los equivalentes, o incluso mejoras, de los anticuerpos basados en 2C3 o de cualquier otro anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, se pueden fabricar en la actualidad, generalmente, utilizando los materiales proporcionados anteriormente como punto de partida. Se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de tal anticuerpo y aún obtener una molécula que tenga características parecidas, o de cualquier manera, deseables. Por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en la estructura de una proteína sin perder apreciablemente la capacidad de unión interactiva. Estas consideraciones también se aplican a toxinas, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis, coagulantes y similares.
Puesto que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína es lo que define la actividad biológica funcional de la proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de la secuencia de aminoácidos en una secuencia de proteína (o, por supuesto, en la secuencia del ADN subyacente) y, sin embargo, obtener una proteína con propiedades similares (agonística). De este modo, se contempla que se pueden hacer varios cambios en la secuencia de los anticuerpos o en los agentes terapéuticos (o en las secuencias del ADN subyacente) sin que haya una pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Los equivalentes biológicos funcionales fabricados a partir de mutaciones en una secuencia de ADN subyacente se pueden fabricar utilizando la información del codón, proporcionada en la presente en la Tabla A, y los detalles técnicos de soporte en la mutagénesis específica de sitio.
Se entenderá bien por los entendidos en la técnica que, inherente a la definición de una proteína o polipéptido "equivalente biológicamente funcional", está el concepto de que hay un límite en el número de cambios que se pueden hacer dentro de una parte definida de la molécula y aún, dar lugar a una molécula con un nivel aceptable de actividad biológica equivalente. Las proteínas o péptidos equivalentes biológicamente funcionales, de este modo, se definen en la presente como aquellas proteínas y péptidos en que ciertos aminoácidos se pueden sustituir, no la mayoría ni todos. Por supuesto, se pueden fabricar y utilizar fácilmente, de acuerdo con la presente invención, una pluralidad de diferentes péptidos/proteínas con diferentes sustituciones.
Las sustituciones de aminoácidos se basan, generalmente, en la similaridad relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Un análisis del tamaño, la forma y el tipo de sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido revela que la arginina, la lisina y la histidina tienen todas residuos cargados positivamente; que la alanina, la glicina y la serina tienen todas un tamaño similar; y que la fenilalanina, el triptófano y la tirosina tiene todas una forma, generalmente, similar. Por tanto, basándose en estas consideraciones, la arginina, la lisina y la histidina; la alanina, la glicina y la serina; y la fenilalanina, el triptófano y la tirosina; se definen en la presente como equivalentes biológicamente funcionales.
Al hacer cambios más cuantitativos, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a su hidrofobicidad y sus características de carga y éstos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
La importancia del índice hidropático de los aminoácidos al conferir una función biológica interactiva en una proteína se entiende, generalmente, en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se sabe que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen un marcador o índice hidropático similar y aún conservar una actividad biológica similar. Al hacer cambios basados en el índice hidropático, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de \pm2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro de \pm1, e incluso se prefieren más particularmente aquellos dentro de \pm0,5.
Se entiende, de este modo, que un aminoácido se puede sustituir por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar y aún obtener una proteína biológicamente equivalente. Como se detalla en la Patente U.S.A. No. 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1), alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).
Al hacer cambios basados en los valores de hidrofilicidad, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de \pm2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro de \pm1, e incluso de prefieren más particularmente aquellos que están dentro de \pm 0,5.
C7. Proteínas de fusión y expresión recombinante
Los inmunoconjugados del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 de la presente invención se pueden preparar fácilmente como proteínas de fusión utilizando técnicas de biología molecular. Cualquier proteína de fusión se puede designar y fabricar utilizando cualquiera de los agentes terapéuticos dados a conocer en la presente y aquellos conocidos en la técnica. La tecnología de las proteínas de fusión se adapta fácilmente para preparar proteínas de fusión en las dos partes de unen mediante la secuencia de un péptido divisible selectivamente. Actualmente, las proteínas de fusión preferidas son aquellas que contienen endostatina. La endostatina, como con cualquier otro agente terapéutico, se puede acoplar al extremo terminal del anticuerpo o a cualquier punto diferente de las CDRs. Los agentes terapéuticos, tales como la endostatina, también se pueden preparar "de forma íntegra", en la que se asocia preferiblemente con un péptido divisible selectivamente para permitir la liberación del agente tras el marcaje.
El uso de técnicas de ADN recombinante para conseguir tales terminaciones es, actualmente, una práctica estándar para aquellos entendidos en la técnica. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas del ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética/recombinación in vivo. La síntesis de ARN y ADN se puede, adicionalmente, realizar utilizando sintetizadores automatizados (ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y otros, 1989).
La preparación de tal proteína de fusión implica, generalmente, la preparación de una primera y una segunda región de codificación de ADN y la ligación o unión funcional de tales regiones, "in frame", para preparar una única región de codificación que codifica la proteína de fusión deseada. En el presente contexto, el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o la secuencia de ADN del anticuerpo similar al 2C3 se unirá, "in frame", con una secuencia de ADN que codifica un agente terapéutico. Generalmente, no se cree que sea particularmente relevante qué parte de la construcción se prepara como región N-terminal o como región C-terminal.
Una vez se ha producido la región de codificación deseada, se crea un vector de expresión. Los vectores de expresión contienen uno o más promotores en la dirección 5' de las regiones de ADN insertadas que actúan para provocar la transcripción del ADN y, de este modo, provocar la expresión de la proteína recombinante codificada. Este es el significado de "expresión recombinante".
Para obtener la llamada versión "recombinante" del inmunoconjugado del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, se expresa en una célula recombinante. El diseño de la expresión del segmento(s) de ADN para la expresión en un sistema eucariótico o procariótico se puede realizar mediante técnicas, generalmente, conocidas por aquellos con habilidad en la expresión recombinante. Se cree que, en principio, se puede emplear cualquier sistema de expresión en la expresión de construcciones del inmunoconjugado del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3.
Tales proteínas se pueden expresar satisfactoriamente en sistemas de expresión eucarióticos, por ejemplo, células CHO, aunque sin embargo, se prevé que los sistemas de expresión bacteriana, tales como E.coli pQE-60, serán particularmente útiles para la preparación a gran escala y la posterior purificación de los inmunoconjugados del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3. Los ADNcs también se pueden expresar en sistemas bacterianos, con las proteínas codificadas expresándose como fusiones con \beta-galactosidasa, ubiquitina, glutationa S-transferasa de Schistosoma japonicum, y similares. Se cree que la expresión bacteriana tendrá ventajas sobre la expresión eucariótica en términos de facilidad de uso y cantidad de materiales obtenidos de esa manera.
En términos de expresión microbiana, las Patentes U.S.A. Nos. 5.583.013; 5.221.619; 4.785.420; 4.704.362, y 4.366.246 incluso complementan adicionalmente la presente descripción en relación a la expresión de genes en las células huésped recombinantes.
Los inmunoconjugados del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 producidos recombinantemente, se pueden purificar y formular para la administración en humanos. Alternativamente, los ácidos nucleicos que codifican los inmunoconjugados se pueden liberar a través de la terapia génica. A pesar de que se puede emplear ADN recombinante desnudo o plásmidos, se prefiere el uso de liposomas o vectores. La capacidad de ciertos virus de entrar en las células a través de endocitosis mediada por un receptor y de integrarse en el genoma de la célula huésped y expresar los genes virales de forma estable y eficiente, los ha hecho atractivos candidatos para la transferencia de genes extraños en células de mamíferos. Los vectores de terapia génica preferidos para su uso en la presente invención serán, generalmente, vectores virales.
Los retrovirus son prometedores como vectores de liberación de genes debido a su capacidad de integrar sus genes en el genoma del huésped, transfiriendo una gran cantidad de material genético extraño, infectando el amplio espectro de especies y de tipos de células y de empaquetarse en líneas celulares especiales. Otros virus también se pueden diseñar para servir como vectores para transferencia génica, tales como adenovirus, virus de herpes simplex (HSV), citomegalovirus (CMV), virus adenoasociados (AAV), tales como aquellos descritos en la Patente No. 5.139.941.
A pesar de que algunos virus que pueden aceptar material genético extraño están limitados en el número de nucleótidos que pueden acomodar, y en el conjunto de células que infectan, se ha demostrado que estos virus efectúan la expresión génica satisfactoriamente. Sin embargo, los adenovirus no integran su material genético en el genoma del huésped y, por tanto, no requiere la replicación del huésped para la expresión génica, haciéndolos idealmente adecuados para una expresión génica heteróloga, eficiente y rápida. Son bien conocidas en el sector las técnicas de preparación de virus infectivos defectivos para la replicación.
En ciertas realizaciones avanzadas, el vector de terapia génica será el HSV. Un factor que hace al HSV un vector atractivo es el tamaño y la organización del genoma. A causa de que el HSV es grande, la incorporación de genes múltiples o de casetes de expresión es menos problemática que en otros sistemas virales más pequeños. Además, la disponibilidad de secuencias de control viral diferentes con actuación cambiante (por ejemplo, fuerza, temporal) lo hace posible para controlar la expresión en una mayor extensión que en otros sistemas. También es una ventaja que el virus tiene relativamente pocos mensajes empalmados, facilitando además las manipulaciones genéticas. El HSV también es relativamente fácil de manipular y se puede hacer crecer a elevadas cantidades.
Por supuesto, al usar sistemas de liberación viral, se deseará purificar suficientemente el virión para dejarlo esencialmente libre de contaminantes indeseables, tal como partículas virales o endotoxinas defectivas interferentes y otros pirógenos, de manera que no causarán reacciones adversas en la célula, animal o individuo que reciba la construcción del vector. Un medio preferido de purificación del vector implica el uso de gradientes de densidad flotante, tal como la centrifugación por gradiente de cloruro de cesio.
C8. Conjugados de anticuerpos
El anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 se pueden conjugar a agentes anticelulares o citotóxicos, para preparar "inmunotoxinas"; o asociarse operativamente con componentes que son capaces de estimular directa o indirectamente la coagulación, formando, de este modo, un "coaguligando". En los coaguligandos, el anticuerpo puede estar directamente unido a un factor de coagulación directo o indirecto, o puede estar unido a una segunda región de unión que une y, a continuación, libera un factor de coagulación directo o indirecto. La aproximación de la "segunda región de unión", generalmente, utiliza un anticuerpo de unión a coagulante como segunda región de unión, y de este modo, da lugar a una construcción de anticuerpo biespecífico. La preparación y uso de anticuerpos biespecíficos en general son bien conocidos en la técnica, y se describe en la presente en profundidad.
En la preparación de inmunotoxinas, coaguligandos y anticuerpos biespecíficos, se puede emplear una expresión recombinante. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo elegido están acopladas, "in-frame", a las secuencias de ácido nucleico que codifican la toxina elegida, coagulante, o segunda región de unión para crear una unidad o vector de expresión. La expresión recombinante da lugar a la traducción del nuevo ácido nucleico, para producir el producto de la proteína deseada. A pesar de que se emplean ácidos nucleicos que codifican anticuerpos, en lugar de ligandos de unión a proteínas, la aproximación recombinante es esencialmente la misma que aquellas descritas en la presente anteriormente.
Volviendo a la tecnología de conjugados, la preparación de inmunotoxinas es, generalmente, bien conocida en la técnica. Sin embargo, se pueden conseguir ciertas ventajas a través de la aplicación de una cierta tecnología preferida, tanto en la preparación de las inmunotoxinas como en su purificación para la posterior administración clínica. Por ejemplo, mientras que las inmunotoxinas basadas en IgG normalmente mostrarán una mejor capacidad de unión y una depuración sanguínea más lenta que sus homólogos Fab', las inmunotoxinas basadas en fragmentos Fab', generalmente, mostrarán una mejor capacidad de penetración en el tejido en comparación con las inmunotoxinas basadas en la IgG.
Adicionalmente, mientras numerosos tipos de enlazadores que contienen enlaces disulfuro se sabe que se pueden emplear, satisfactoriamente, para conjugar la fracción de toxina al anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o al anticuerpo basado en 2C3, se preferirán, generalmente, ciertos enlazadores sobre otros enlazadores, basándose en las capacidades y características farmacológicas en que se diferencian. Por ejemplo, se prefieren los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que está "impedido" estéricamente, debido a su mayor estabilidad in vivo, previniendo, de este modo, la liberación de la fracción de toxina previamente a la unión en el sitio de acción.
Se conoce una gran variedad de agentes citotóxicos que se pueden conjugar al anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o a los anticuerpos basados en 2C3, incluyendo toxinas derivadas de bacterias, hongos o plantas, tales como la cadena A o la cadena A desglicosilada de la ricina. El entrecruzamiento de una cadena A de toxina con un anticuerpo, en ciertos casos, requiere un entrecruzador que presente las funciones disulfuro. La razón para este hecho aún no está clara, pero es probablemente debido a la necesidad, para ciertas fracciones de toxinas, de ser fácilmente liberables del anticuerpo una vez el agente ha "liberado" la toxina a las células diana.
Cada tipo de entrecruzador, así como la manera como se realiza el entrecruzamiento, tenderá a variar la farmacodinámica del conjugado resultante. En última instancia, en casos en que se contempla una toxina liberable, se desea tener un conjugado que permanezca intacto bajo las condiciones encontradas en cualquier punto del cuerpo excepto del sitio deseado de acción, en cuyo punto es deseable que el conjugado tenga unas buenas características de "liberación". Por tanto, tendrá cierta trascendencia, el esquema particular de entrecruzamiento, que incluye, particularmente, el reactivo particular de entrecruzamiento utilizado y las estructuras que se entrecruzan.
Dependiendo del compuesto de toxina específico utilizado como parte de la proteína de fusión, puede ser necesario proporcionar un péptido espaciador que operativamente acople el anticuerpo y el compuesto de toxina que es capaz de plegarse en una estructura de bucle con enlace disulfuro. La división proteolítica dentro del bucle produciría entonces un polipéptido heterodimérico en el que el anticuerpo y el compuesto de toxina están unidos por sólo un enlace disulfuro único. Un ejemplo de dicha toxina es la toxina de cadena A de Ricina.
Cuando se utilizan otros compuestos de toxina, se puede proporcionar un espaciador peptídico no divisible para acoplar operativamente el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 y el compuesto de toxina de la proteína de fusión. Las toxinas que se pueden utilizar junto con los espaciadores peptídicos no divisibles son aquellas que pueden, por sí mismas, convertirse mediante división proteolítica, en una forma citotóxica con enlace disulfuro. Un ejemplo de dicho compuesto de toxina es un compuesto de la exotoxina de Pseudomonas.
Pueden haber circunstancias, tales como cuando el antígeno diana no se internaliza mediante una ruta consistente con una intoxicación eficiente por inmunotoxinas, en la que se deseará dirigir agentes terapéuticos, tales como fármacos antitumorales, otras citocinas, antimetabolitos, agentes alquilantes, hormonas y similares. Actualmente se han conjugado satisfactoriamente una variedad de agentes quimioterapéuticos y otros farmacológicos a anticuerpos y se ha mostrado que funcionan farmacológicamente. Algunos agentes antineoplásticos que se han investigado incluyen doxorubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, y otros varios. Además, se ha descrito el acoplamiento de otros agentes, tales como neocarzinostatina, macromicina, trenimona y \alpha-amanitina.
Allí donde los factores de coagulación se utilizan en relación a la presente invención, cualquier unión covalente al anticuerpo debería hacerse en un sitio diferente de su sitio de coagulación funcional. Las composiciones, de este modo, se "unen" de alguna manera operativa que permite que cada región realice su función deseada sin un impedimento significativo. De este modo, el anticuerpo se une al VEGF, y el factor de coagulación provoca la coagulación
sanguínea.
C9. Entrecruzadores bioquímicos
Además de la información general proporcionada en la presente, el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 se pueden conjugar a uno o más agentes terapéuticos que utilizan ciertos entrecruzadores bioquímicos preferidos. Los reactivos de entrecruzamiento se utilizan para formar puentes moleculares que juntan grupos funcionales de dos moléculas diferentes. Para unir dos proteínas diferentes de una manera progresiva, se pueden utilizar entrecruzadores heterobifuncionales que eliminan la formación de homopolímeros no deseados. Algunos ejemplos de entrecruzadores heterobifuncionales se encuentran en la Tabla B1.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA B1 Entrecruzadores heterobifuncionales
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Los entrecruzadores hererobifuncionales contienen dos grupos reactivos: uno que, generalmente, reacciona con un grupo amina primaria (por ejemplo, N-hidroxi succinimida) y el otro que, generalmente, reacciona con un grupo tiol (por ejemplo, piridil disulfuro, maleimidas, halógenos, etc.). A través del grupo reactivo amina primaria, el entrecruzador puede reaccionar con el(los) residuo(s) de lisina de una proteína (por ejemplo, el anticuerpo seleccionado o el fragmento) y a través del grupo reactivo tiol, el entrecruzador, ya enlazado a la primera proteína, reacciona con el residuo de cisteína (grupo sulfhidrilo libre) de la otra proteína (por ejemplo, el coagulante).
Las composiciones, por tanto, generalmente tienen, o se han derivado para obtener, un grupo funcional disponible para las finalidades de entrecruzamiento. Este requerimiento no se considera limitante en el sentido que una amplia variedad de grupos se pueden utilizar de esta manera. Por ejemplo, se pueden utilizar para unir o entrecruzar, grupos amina primaria o secundaria, grupos hidrazida o hidracina, alcohol carboxilo, fosfato, o grupos alquilantes.
El brazo espaciador entre los dos grupos reactivos de un entrecruzador puede tener varias longitudes y composiciones químicas. Un brazo espaciador más largo permite una mayor flexibilidad de los componentes del conjugado mientras algunos componentes particulares en el puente (por ejemplo, un grupo benceno) puede añadir una estabilidad extra al grupo reactivo o una resistencia incrementada de la unión química a la acción de varios aspectos (por ejemplo, enlaces disulfuro resistentes a agentes reductores). También se contempla, el uso de espaciadores peptídicos, tales como L-Leu-L-Ala-L-Leu-Ala.
Se prefiere emplear un entrecruzador que tenga una estabilidad razonable en la sangre. Se sabe que numerosos tipos de enlazadores que contienen enlaces disulfuro se pueden emplear satisfactoriamente para conjugar agentes marcadores y coagulantes o tóxicos. Los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que está impedido estéricamente puede demostrar el hecho de ofrecer una mayor estabilidad in vivo, impidiendo la liberación del agente antes de la unión en el sitio de acción. Estos enlazadores son, por tanto, un grupo preferente de agentes de enlace.
Uno de los reactivos entrecruzadores más preferidos para su uso en inmunotoxinas es el SMPT, el cual es un entrecruzador bifuncional que contiene un enlace disulfuro que está "impedido estéricamente" por un anillo de benceno adyacente y grupos metilo. Se cree que el impedimento estérico del enlace disulfuro sirve para proteger el enlace del ataque de aniones tiolato, tales como glutationa, que puede estar presente en tejidos y sangre, y ayudando así a impedir el desacoplamiento del conjugado antes de la liberación del agente acoplado al sitio del tumor. Se contempla que el agente SMPT también se puede utilizar en relación a los ligandos biespecíficos de la presente invención.
El reactivo de entrecruzamiento SMPT, al igual que otros muchos reactivos de entrecruzamiento conocidos, presta la capacidad de entrecruzar grupos funcionales, tales como el grupo SH de la cisteína o aminas primarias (por ejemplo, el grupo amino épsilon de la lisina). Otro posible tipo de entrecruzador incluye las fenilazidas fotoreactivas heterobifuncionales, que contienen un enlace disulfuro divisible, tales como el sulfosuccinimidil-2-(p-azido salicilamido) etil-1,3'-ditiopropionato. El grupo N-hidroxisuccinimidilo reacciona con los grupos amino primarios y la fenilazida (tras fotolisis) reacciona no selectivamente con cualquier residuo de aminoácido.
Además de entrecruzadores impedidos, los enlazadores no impedidos también se pueden emplear de acuerdo con lo expuesto en la presente. Otros entrecruzadores útiles, sin considerar que contengan o generen un disulfuro protegido, incluyen SATA, SPDP y 2-iminotiolano. La utilización de tales entrecruzadores es bien conocida en la técnica.
Una vez conjugado, el conjugado se separa de los agentes terapéuticos y marcadores no conjugados y de otros contaminantes. Se dispone de un amplio número de técnicas de purificación para su uso en el suministro de conjugados de un grado de suficiente pureza para que sean clínicamente útiles. Se utilizarán más, generalmente, los métodos de purificación basados en la separación por tamaño, tales como la filtración en gel, la permeación en gel o la cromatografía líquida de alta resolución. También se pueden utilizar otras técnicas cromatográficas, tales como la separación con Sefarosa-Azul.
C10. Enlazadores biológicamente liberables
A pesar de que se prefiere que cualquier segmento de enlace tenga una estabilidad razonable en la sangre, para evitar la liberación sustancial del agente acoplado antes del marcaje a la enfermedad o el sitio del tumor, en ciertos aspectos, se contempla la utilización de enlaces biológicamente liberables y/o espaciadores o enlazadores selectivamente divisibles. Los "enlazadores biológicamente liberables" son "espaciadores o enlazadores selectivamente divisibles" que aún tienen una estabilidad razonable en la circulación.
Los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 de la presente invención, tales como anticuerpos similares al 2C3, se pueden, de este modo, unir a uno o más agentes terapéuticos a través de un enlace biológicamente liberable. Se puede emplear cualquier forma de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o "agente o anticuerpo marcador", incluyendo anticuerpos intactos, aunque se preferirán los fragmentos ScFv en ciertas realizacio-
nes.
Los "enlaces biológicamente liberables" o "enlaces selectivamente hidrolizables" incluyen todas las uniones que son liberables, divisibles o hidrolizables sólo o, preferencialmente, bajo ciertas condiciones. Esto incluye enlaces disulfuro o trisulfuro y enlaces lábiles al ácido, como se describe en las Patentes U.S.A. Nos. 5.474.765 y 5.762.918, incorporada cada una específicamente en la presente por referencia.
Se contempla particularmente, la utilización de un espaciador sensible a ácido para el acoplamiento de un agente terapéutico o fármaco a un anticuerpo de la presente invención. En tales realizaciones, los agentes terapéuticos o fármacos se liberan dentro de los compartimentos ácidos en el interior de la célula. Se contempla que la liberación sensible a ácido puede tener lugar extracelularmente, pero incluso después de un marcaje específico, preferiblemente al sitio del tumor. Algunos ejemplos, actualmente preferidos, incluyen anticuerpos similares al 2C3 unidos a colquicina o doxorubicina a través de un espaciador sensible a ácido. También se contempla el acoplamiento a través de las fracciones de carbohidratos de los anticuerpos. En tales realizaciones, los agentes terapéuticos o fármacos se liberan dentro de los compartimentos ácidos en el interior de la célula.
El anticuerpo anti-VEGF marcador se puede también derivatizar para introducir grupos funcionales, permitiendo el acoplamiento del agente(s) terapéutico(s) a través de un enlace biológicamente liberable. El anticuerpo marcador se puede, de este modo, derivatizar para introducir cadenas laterales que terminan en hidrazida, hidrazina, grupos de amina primaria o secundaria. Los agentes terapéuticos se pueden conjugar a través de una unión de base de Schiff, un enlace de hidrazona o acil hidrazona o un enlazador hidrazida (Patentes U.S.A. Nos. 5.474.765 y 5.762.918).
También, tal como se describe en las Patentes U.S.A. Nos. 5.474.765 y 5.762.918, el anticuerpo anti-VEGF marcado se puede acoplar operativamente al agente(s) terapéutico(s) a través de uno o más enlaces biológicamente liberables, que son enlaces sensibles a enzimas, que incluyen enlaces peptídicos, ésteres, amidas, fosfodiésteres y glicósidos.
Los aspectos preferidos de la presente invención tienen que ver con el uso de enlazadores peptídicos que incluyen, como mínimo, un primer sitio de división para una peptidasa y/o proteinasa, que preferencialmente se localiza dentro del sitio de la enfermedad, particularmente, dentro del medio tumoral. La liberación mediada por el anticuerpo del agente terapéutico acoplado, de este modo, da lugar a una división específica, dentro del sitio de la enfermedad o del medio tumoral, dando lugar a la liberación específica del agente activo. Ciertos enlazadores peptídicos incluirán un sitio de división que es reconocido por uno o más enzimas implicados en la remodelación.
Se prefieren, particularmente, los enlazadores peptídicos que incluyen un sitio de división para uroquinasa, pro-uroquinasa, plasmina, plasminógeno, TGF\beta, estafiloquinasa, Trombina, Factor IXa, Factor Xa o una metaloproteinasa, tal como una colagenasa intersticial, una gelatinasa o una estromelisina. Las Patentes U.S.A. Nos. 6.004.555, 5.877.289 y 6 093 399, además, describen y permiten saber cómo fabricar y utilizar construcciones agente terapéutico-agente marcador que comprenden enlaces biológicamente liberables y enlazadores selectivamente divisibles y péptidos. La Patente U.S.A. No. 5.877.289, expedida el 2 de marzo de 1999, en particular, además, describe y permite saber cómo fabricar y utilizar construcciones agente terapéutico-agente marcador que comprenden un péptido selectivamente divisible que se divide por uroquinasa, plasmina, Trombina, Factor IXa, Factor Xa o una metaloproteinasa, tal como una colagenasa intersticial, una gelatinasa o una estromelisina, dentro del medio tumoral.
Actualmente, los enlazadores peptídicos selectivamente divisibles preferidos son aquellos que incluyen un sitio de división para plasmina o metaloproteinasa (también conocida como "metaloproteasas de matriz" o "MMPs"), tales como una colagenasa intersticial, una gelatinasa o una estromelisina. Algunos enlazadores peptídicos adicionales que se pueden utilizar ventajosamente en relación a la presente invención incluyen, por ejemplo, los listados en la Tabla B2.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA B2 Secuencias de enlazadores divisibles
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C11. Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son particularmente útiles en el coaguligando y los aspectos angiogénicos combinados de la presente invención. Sin embargo, los anticuerpos biespecíficos, en general, se pueden emplear, siempre y cuando, un brazo se una al VEGF, opcionalmente a sustancialmente el mismo epítopo que el 2C3, y el anticuerpo biespecífico se acople al agente terapéutico, generalmente, en un sitio diferente del sitio de unión al antígeno.
En general, la preparación de anticuerpos biespecíficos también es bien conocida en la técnica. Un método implica la preparación separada de anticuerpos que tienen una especificidad para el antígeno marcado, por un lado, y (como en la presente) un agente coagulante por el otro. Los fragmentos peptídicos F(ab'\gamma)_{2} se preparan a partir de los dos anticuerpos elegidos, seguido por una reducción de cada uno para proporcionar fragmentos Fab'\gamma_{SH} separados. Los grupos SH de una de las dos partes a acoplar se alquilan, a continuación, con un reactivo de entrecruzamiento, tal como o-fenilendimaleimida, para proporcionar grupos maleimida libres en una parte. Esta parte, entonces, se puede conjugar a la otra por medio de una unión de tioéter, para obtener el heteroconjugado F(ab'\gamma)_{2} deseado. Se conocen otras técnicas, en las que se lleva a cabo el entrecruzamiento con SPDP o proteína A, o se prepara una construcción triespecífica.
Otro método para producir anticuerpos biespecíficos es por fusión de dos hibridomas para formar un cuadroma. Tal como se usa en la presente, el término "cuadroma" se utiliza para describir la fusión productiva de dos hibridomas de células B. Utilizando actualmente técnicas estándares, dos anticuerpos que producen hibridomas se fusionan para obtener células hijas, y se eligen aquellas células que han mantenido la expresión de ambos grupos de genes de clonotipo de inmunoglobulina.
Un método preferido para la generación de un cuadroma implica la selección de un mutante deficiente de enzima de, como mínimo, uno de los hibridomas parentales. A continuación, esta primera línea de células mutantes del hibridoma se fusiona a células del segundo hibridoma que se han expuesto letalmente, por ejemplo, a yodoacetamida, impidiendo su supervivencia continuada. La fusión celular permite el rescate del primer hibridoma mediante la adquisición del gen para su deficiencia enzimática del hibridoma letalmente tratado, y el rescate del segundo hibridoma a través de la fusión al primer hibridoma. Se prefiere, pero no es necesario, la fusión de inmunoglobulinas del mismo isotipo, pero de diferente subclase. Un anticuerpo de subclase mezclada permite su uso en caso de un ensayo alternativo para el aislamiento de un cuadroma preferido.
Más detalladamente, un método para el screening y desarrollo del cuadroma implica obtener una línea de hibridoma que produce el primer mAb elegido y hacerla deficiente para la enzima metabólica esencial, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT). Para obtener los mutantes deficientes del hibridoma, se hacen crecer las células en presencia de concentraciones crecientes de 8-azaguanina (1 x 10^{-7} M a 1 x 10^{-5} M). Los mutantes se subclonan mediante una dilución limitante y se analizan para saber su sensibilidad a hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT). El medio de cultivo puede consistir en, por ejemplo, DMEM complementado con un 10% de FCS, L-Glutamina 2 mM y penicilina-estreptomicina 1 mM.
Una línea de células complementaria del hibridoma que produce el segundo mAb deseado, se utiliza para generar los cuadromas mediante técnicas de fusión de células estándares. Brevemente, 4,5 x 10^{7} células primarias sensibles al HAT se mezclan con 2,8 x 10^{7} células secundarias resistentes al HAT que han sido pretratadas con una dosis letal del inhibidor bioquímico irreversible, yodoacetamida, (5 mM en tampón salino fosfato) durante 30 minutos en hielo antes de la fusión. La fusión celular se induce utilizando polietilenglicol (PEG) y las células se colocan en 96 pocillos de placas de microcultivo. Los cuadromas se seleccionan utilizando un medio que contiene HAT. Se identifican los cultivos que contienen anticuerpos biespecíficos utilizando, por ejemplo, un ELISA específico de isotipo en fase sólida y una tinción por inmunofluorescencia específica de isotipo.
En una realización de identificación para identificar el anticuerpo biespecífico, se recubren los pocillos de las placas de microtitulación (Falcon, Becton Dickinson Labware) con un reactivo que específicamente interacciona con uno de los anticuerpos del hibridoma parental y que carece de reactividad cruzada con ambos anticuerpos. Se lavan y se tapan las placas, y los sobrenadantes (SNs) a analizar se añaden a cada pocillo. Se incuban las placas a temperatura ambiente durante 2 horas, se descartan los sobrenadantes, se lavan las placas y se añade un conjugado de fosfatasa alcalina-anti-anticuerpo diluido durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavan las placas y se añade un sustrato de fosfatasa, por ejemplo, p-nitrofenil fosfato (Sigma, St. Louis) a cada pocillo. Se incuban los placas, se añade NaOH 3N a cada pocillo para parar la reacción, y se determinan los valores de OD_{410} utilizando un lector de
ELISA.
En otra realización de identificación, se utilizan las placas de microtitulación pretratadas con poli-L-lisina para unir una de las células diana a cada pocillo, a continuación, las células se fijan, por ejemplo, utilizando un 1% de glutaraldehído y en los anticuerpos biespecíficos se analiza su capacidad para unirse a células intactas. Además, en relación con la presente invención, para identificar cuadromas preferidos, se pueden utilizar FACS, tinción por inmunofluorescencia, anticuerpos específicos de idiotipo, ensayos de competición de unión al antígeno, y otros métodos comunes en la técnica de la caracterización de anticuerpos.
Tras el aislamiento del cuadroma, se purifican los anticuerpos biespecíficos aparte de otros productos de las células. Esto se puede llevar a cabo por una variedad de procedimientos de aislamiento de proteínas, conocidos por los entendidos en la técnica de purificación de inmunoglobulinas. Son bien conocidos en la técnica los medios para preparar y caracterizar anticuerpos (ver, por ejemplo, Antibodies: Laboratory Manual, 1988).
Por ejemplo, los sobrenadantes de los cuadromas seleccionados se pasan sobre columnas de sefarosa de proteína A o proteína G para unir IgG (dependiendo del isotipo). Los anticuerpos enlazados se eluyen a continuación con, por ejemplo, un tampón citrato de pH 5,0. Las fracciones eluidas que contienen BsAbs se dializan frente a un tampón isotónico. Alternativamente, la elución también se pasa sobre una columna de antiinmunoglobulina-sefarosa. A continuación, se eluye BsAb con cloruro magnésico 3,5 M. A los BsAbs purificados de esta manera se les analiza su actividad de unión por, por ejemplo, un ELISA específico de isotipo y un ensayo de tinción por inmunofluorescencia de las células diana, tal como se describió anteriormente.
Los BsABs purificados y los anticuerpos parentales también se pueden caracterizar y aislar por electroforesis SDS-PAGE, seguido de tinción con plata o Coomassie. Esto es posible cuando uno de los anticuerpos parentales tiene un peso molecular mayor que el otro, en el que la banda de los BsAbs migra a medio camino entre la de los dos anticuerpos parentales. La reducción de las muestras verifica la presencia de cadenas pesadas con dos pesos moleculares aparentes diferentes.
D. Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, generalmente, comprenderán una cantidad efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 o un inmunoconjugado, disuelto o disperso en un transportador farmacéuticamente aceptable o un medio acuoso. También se contemplan agentes terapéuticos combinados y se pueden emplear el mismo tipo de composiciones farmacéuticas subyacentes para medicamentos simples y combinados.
Las frases "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra desfavorable cuando se administran a un animal, o a un humano, como apropiados. Los usos veterinarios se incluyen igualmente dentro de la presente invención y las formulaciones "farmacéuticamente aceptables" incluyen formulaciones para uso clínico y/o veterinario.
Como se utiliza en la presente, un "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retrasadores de la absorción, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Para la administración humana, las preparaciones deben reunir las características de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y estándares de pureza como se requiere por la FDA Office of Biological Standards. También se pueden incorporar ingredientes activos complementarios a las composiciones.
Las formulaciones de "dosis unidad" son aquellas que contienen una dosis o subdosis del ingrediente administrado adaptado para una liberación particular calculada. Por ejemplo, las formulaciones de "dosis unidad" son aquellas que contienen una dosis diaria o una unidad o subdosis diaria o una dosis semanal o unidad o subdosis semanal y similares.
D1. Formulaciones inyectables
Los anticuerpos basados en el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y en 2C3 o inmunoconjugados, de la presente invención se formularán, frecuentemente, para la administración parenteral, por ejemplo, formulados para la inyección por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdermal u otras vías, que incluyen la administración peristáltica y la instilación directa a un sitio del tumor o de la enfermedad (administración intracavidad). La preparación de una composición acuosa que contiene tal anticuerpo o inmunoconjugado como ingrediente activo, será conocida por los entendidos en la técnica a la luz de la presente descripción. Normalmente, tales composiciones se pueden preparar como inyectables, en forma de soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para utilizar en la preparación de soluciones o suspensiones tras la adición de un líquido previamente a la inyección; y también se pueden emulsificar las preparaciones.
Las formas farmacéuticas aceptables para el uso como inyectables incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones. En todos los casos, la forma debería ser estéril y fluida en la extensión que exista jeringabilidad. Debería ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debería preservar contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Las composiciones del inmunoconjugado o del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o del anticuerpo basado en 2C3 se pueden formular en una composición acuosa estéril en forma de sal o neutra. Se pueden preparar soluciones como bases libres o como sales farmacológicamente aceptables en agua mezclada adecuadamente con un tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína), y aquellas que están formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como acético, trifluoroacético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilos libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido sódico, potásico, amónico, cálcico, o férrico, y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
Los transportadores adecuados incluyen disolventes y medios de dispersión que contienen, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en caso de dispersión y/o mediante el uso de tensoactivos.
Bajo condiciones normales de almacenamiento y uso, todas las preparaciones deberían contener un conservante que prevenga el crecimiento de microorganismos. La prevención de la acción de microorganismos se puede llevar a cabo a través de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se pueden llevar a cabo, mediante el uso en las composiciones, de agentes retrasantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Previa o posteriormente a la formulación, el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 o el inmunoconjugado se deberían dializar extensamente para eliminar las moléculas de peso molecular pequeño no deseadas, y/o liofilizar para una formulación más fácil en el vehículo deseado, allí donde sea apropiado. Se preparan soluciones inyectables estériles mediante la incorporación de agentes activos, en la cantidad necesaria, en el disolvente apropiado, con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, como se desee, seguido por una esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de varios ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente.
En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo, además de cualquier ingrediente adicional a partir de una solución previamente esterilizada y filtrada de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas según la presente invención, generalmente, incluirán una cantidad del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o del anticuerpo basado en 2C3 o del inmunoconjugado mezclada con un diluyente o excipiente farmacéutico aceptable, tal como una solución acuosa estéril, para dar un intervalo de concentraciones finales, dependiendo del uso deseado. Las técnicas de preparación son, generalmente, bien conocidas en la técnica, tal como se ejemplifica en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Ed. Mack Publishing Company, 1980. Sería conveniente que la contaminación por endotoxinas se mantuviera mínimamente en un nivel seguro, por ejemplo, menor de 0,5 ng/mg de proteína. Además, para la administración humana, las preparaciones deben reunir las propiedades de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y los estándares de pureza requeridos por la FDA Office of Biological Standards. Tras la formulación, las soluciones de anticuerpo o inmunoconjugado se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal, que sea terapéuticamente
efectiva.
D2. Formulaciones de liberación lenta
Las formulaciones de soluciones de anticuerpos basados en el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basados en 2C3 o inmunoconjugados se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se contemplan otras formas farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, tabletas, pastillas, cápsulas u otros sólidos para la administración oral, supositorios, pesarios, soluciones nasales o pulverizadores, aerosoles, inhaladores, formulaciones tópicas, formas liposomales, y similares. El tipo de forma de administración concordará con la enfermedad o el desorden a tratar.
Se pueden usar y, generalmente aplicar, cápsulas farmacéuticas de "liberación lenta" o composiciones o preparaciones de "liberación lenta". Las formulaciones de liberación lenta se diseñan, generalmente, para dar un nivel de fármaco adecuado sobre un período extendido y se pueden utilizar para liberar un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 o un inmunoconjugado de acuerdo con la presente invención. Las formulaciones de liberación lenta se implantan, normalmente, en la proximidad del sitio de la enfermedad, por ejemplo, en el sitio del tumor.
Algunos ejemplos adecuados de preparaciones de liberación lenta incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo o el inmunoconjugado, cuyas matrices están en forma de artículos con forma, por ejemplo, de películas o de microcápsulas. Algunos ejemplos de matrices de liberación lenta incluyen poliésteres; hidrogeles, por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o polivinil alcohol; poliláctidos, por ejemplo, Patente U.S.A. No. 3.773.919; copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma etil-L-glutamato; acetato de etilenvinilo no degradable; copolímeros de ácido glicólico y ácido láctico degradables, tales como el Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido glicólico y ácido láctico y acetato de leuprolida); y ácido poli- D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que polímeros, tales como el acetato de etilenvinilo y el ácido glicólico-ácido láctico, permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, reduciendo, de este modo, la actividad biológica y/o cambiando la inmunogenicidad. Existen estrategias razonables disponibles para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación implica la formación de un enlace intermolecular S-S a través de un intercambio tio-disulfuro, se consigue la estabilización mediante la modificación de residuos sulfhidrilos, la liofilización a partir de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, el uso de aditivos apropiados, el desarrollo de composiciones de matrices de polímero específicas, y similares.
D3. Liposomas y nanopartículas
En ciertas realizaciones, también se pueden emplear liposomas y/o nanopartículas con el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o anticuerpos basados en 2C3 o inmunoconjugados. Como se resume a continuación, la formación y utilización de liposomas son, generalmente, conocidas por los entendidos en la técnica.
Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y espontáneamente forman unas vesículas de bicapas concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLVs)). Las MLVs, generalmente, tienen diámetros desde 25 nm a 4 \mum. La sonicación de MLVs da lugar a la formación de vesículas unilamelares pequeñas (SUVs) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 Ángstroms, que contienen una solución acuosa en el núcleo.
Los fosfolípidos pueden formar una variedad de estructuras, además de los liposomas, cuando se dispersan en agua, dependiendo de la proporción molar de lípido en el agua. A proporciones bajas, la estructura preferida es el liposoma. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar una permeabilidad baja a sustancias polares e iónicas, pero a temperaturas elevadas experimentan una transición de fase que altera marcadamente su permeabilidad. La transición de fase implica un cambio de una estructura ordenada, empaquetada de forma compacta, conocida como el estado de gel, a una estructura menos ordenada y empaquetada de forma menos compacta, conocida como el estado fluido. Esto tiene lugar a una temperatura de transición de fase característica y da lugar a un incremento en la permeabilidad a iones, azúcares y fármacos.
Los liposomas interaccionan con las células a través de cuatro mecanismos diferentes: endocitosis por células fagocíticas del sistema reticuloendotelial, tales como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular mediante fuerzas débiles hidrofóbicas o electrostáticas, no específicas, o mediante interacciones específicas con componentes de la superficie celular; fusión con las membranas celulares plasmáticas mediante la inserción de la bicapa lipídica del liposoma en la membrana plasmática, con la liberación simultánea de los contenidos liposomales en el citoplasma; y mediante la transferencia de lípidos liposomales a las membranas celulares o subcelulares, o viceversa, sin asociación alguna de los contenidos del liposoma. Mediante la variación de la formulación del liposoma se puede alterar el mecanismo operativo, a pesar de que más de uno puede tener lugar al mismo tiempo.
Las nanocápsulas pueden, generalmente, atrapar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar los efectos colaterales debido a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de tamaño de unos 0,1 \mum), se deberían diseñar mediante la utilización de polímeros capaces de ser degradados in vivo. Se contemplan para su uso en la presente invención nanopartículas biodegradables de polialquil-cianoacrilato que reúnen todos los requisitos y tales partículas pueden ser fáciles de fabricar.
D4. Formulaciones oftálmicas
Muchas enfermedades con un componente angiogénico se asocian con el ojo. Por ejemplo, enfermedades asociadas con la neovascularización corneal que se puede tratar según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, rechazo de xenoinjerto corneal, glaucoma neovascular y fibroplasia retrolental, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de Vitamina A, sobreuso de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, queratitis sicca pterigium, sjogrens, acné rosáceo, filectenulosis, sífilis, infecciones de Micobacterias, degeneración de lípidos, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, infecciones de Herpes simplex, infecciones de Herpes zoster, infecciones por protozoos, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratolisis marginal, traumatismos, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis, sarcoidosis de Wegener, Escleritis, enfermedad de Steven-Johnson, queratotomía radial perifigoide y rechazo de gráfico corneal.
Las enfermedades asociadas con la neovascularización retinal/coroidal que se pueden tratar según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, retinopatía diabética, degeneración macular, anemia de la célula falciforme, sarcoide, sífilis, pseudoxantoma elástico, enfermedad de Paget, oclusión de las venas, oclusión arterial, enfermedad obstructiva de la carótida, uveitis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritomatosis sistémico, retinopatía de premadurez, enfermedad de Eales, enfermedad de Bechet, infecciones causantes de retinitis o coroiditis, histoplasmosis ocular presunta, enfermedad de Best, miopía, agujeros ópticos, enfermedad de Stargart, pars planitis, desprendimiento retinal crónico, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, traumatismos y complicaciones post-láser.
Otras enfermedades que se pueden tratar según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas con rubeosis (neovascularización del ángulo) y enfermedades causadas por la proliferación anormal de tejido fibroso o fibrovascular que incluye todas las formas de vitreoretinopatía proliferativa, asociada o no con la diabetes.
Los anticuerpos basados en el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y en 2C3 e inmunoconjugados de la presente invención se pueden emplear, de este modo, ventajosamente en la preparación de composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso como soluciones oftálmicas, incluyendo aquellas para una administración intravitreal y/o intracameral. Para el tratamiento de cualquiera de las anteriores enfermedades u otros desórdenes, la composición de un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o de un anticuerpo basado en 2C3 de la presente invención, se administraría al ojo u ojos del sujeto, que necesita el tratamiento, en forma de un preparado oftálmico elaborado según la práctica farmacéutica convencional, ver por ejemplo "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, páginas 1488 a 1501 (Mack Publishing Co., Easton, PA).
La preparación oftálmica contendrá un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 en una concentración de aproximadamente un 0,01 a aproximadamente un 1% en peso, preferiblemente de aproximadamente un 0,05 a aproximadamente un 0,5%, en una solución, suspensión o pomada farmacéuticamente aceptable. Necesariamente, tendrá lugar alguna variación de la concentración dependiendo del compuesto en particular empleado, la condición del sujeto a tratar y similares, y la persona responsable del tratamiento determinará la concentración más adecuada para el sujeto individual. La preparación oftálmica estará preferiblemente en forma de solución acuosa estéril que contiene, si se desea, ingredientes adicionales, por ejemplo, conservantes, disoluciones tampón, agentes de tonicidad, antioxidantes y estabilizadores, agentes clarificantes o humectantes no iónicos, agentes aumentadores de la viscosidad y similares.
Los conservantes adecuados para su uso en tal preparación incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorobutanol, timerosal y similares. Las disoluciones tampones adecuadas incluyen ácido bórico, bicarbonato sódico y potásico, borato sódico y potásico, carbonato sódico y potásico, acetato sódico, bifosfato sódico, y similares, en cantidades suficientes para mantener el pH entre pH 6 y pH 8 aproximadamente, y preferiblemente, entre pH 7 y pH 7,5 aproximadamente. Los agentes de tonicidad adecuados son dextrano 40, dextrano 70, dextrosa, glicerina, cloruro potásico, propilenglicol, cloruro sódico, y similares, de manera que el equivalente de cloruro sódico de la solución oftálmica está en el intervalo de 0,9 más o menos 0,2%.
Los antioxidantes y estabilizadores adecuados incluyen bisulfito sódico, metabisulfito sódico, tiosulfito sódico, tiourea y similares. Los agentes clarificantes y humectantes incluyen polisorbato 80, polisorbato 20, poloxamer 282 y tiloxapol. Los agentes aumentadores de la viscosidad incluyen dextrano 40, dextrano 70, gelatina, glicerina, hidroxietilcelulosa, hidroximetilpropilcelulosa, lanolina, metilcelulosa, petrolato, polietilenglicol, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona, carboximetilcelulosa y similares. La preparación oftálmica se administrará tópicamente al ojo del sujeto, que necesita el tratamiento, mediante métodos convencionales, por ejemplo, en forma de gotas o mediante el baño del ojo en la solución oftálmica.
D5. Formulaciones tópicas
En el sentido más amplio, las formulaciones para la administración tópica incluyen aquellas para su liberación a través de la boca (bucal) y a través de la piel. Los "sistemas de liberación tópica" también incluyen parches transdermales que contienen el ingrediente a administrar. La liberación a través de la piel también se puede conseguir, si se desea, mediante iontoforesis o electrotransporte.
Las formulaciones adecuadas para la administración tópica por la boca incluyen pastillas que comprenden los ingredientes en una base con sabor, normalmente sucrosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina o glicerina, o sucrosa y acacia; y elixires bucales que comprenden el ingrediente a administrar en un líquido transportador adecuado.
Las formulaciones adecuadas para la administración tópica por la piel incluyen pomadas, cremas, geles y pastas que comprenden el ingrediente a administrar en un transportador farmacéutico aceptable. La formulación de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o basados en 2C3 para uso tópico, tales como cremas, pomadas y geles, incluye la preparación de bases de pomadas solubles en agua u oleaginosas, como es bien conocido por los entendidos de la técnica. Por ejemplo, estas composiciones pueden incluir aceites vegetales, grasas animales, y más preferiblemente, hidrocarburos semisólidos obtenidos a partir del petróleo. Los componentes particulares utilizados pueden incluir pomada blanca, pomada amarilla, cera de cetil ésteres, ácido oleico, aceite de oliva, parafina, petrolato, petrolato blanco, espermaceti, glicerito de almidón, cera blanca, cera amarilla, lanolina, lanolina anhidra y gliceril monoestearato. También se pueden utilizar bases de pomadas solubles en agua que incluyen glicol éteres y derivados, polietilenglicoles, estearato de polioxil 40 y polisorbatos.
Las formulaciones para la administración rectal se pueden presentar como supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de coco o un salicilato. Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización que contienen, además del ingrediente activo, transportadores que se sabe en la técnica que son apropiados.
D6. Formulaciones nasales
Se contempla la liberación local a través de las vías respiratorias y nasales para el tratamiento de varias condiciones. Estas vías de liberación también son adecuadas para la liberación de agentes en la circulación sistémica. También se incluyen en la presente invención, las formulaciones de ingredientes activos en transportadores adecuados para la administración nasal, por ejemplo, soluciones nasales, pulverizadores, aerosoles e inhaladores. Allí donde el transportador es sólido, las formulaciones incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 500 micras, el cual se administra, por ejemplo, mediante la inhalación rápida a través del conducto nasal desde el recipiente del polvo mantenido cerca de la nariz.
Las formulaciones adecuadas en las que el transportador es un líquido son útiles en la administración nasal. Las soluciones nasales son, normalmente, soluciones acuosas diseñadas para ser administradas a los conductos nasales en gotas o pulverizadores y se preparan de manera que son muy similares en muchos aspectos a las secreciones nasales, de manera que se mantiene una acción ciliaria normal. De este modo, las soluciones nasales acuosas normalmente son isotónicas y ligeramente tamponadas para mantener el pH de 5,5 a 6,5. Además, se pueden incluir en la formulación, si se requiere, conservantes antimicrobianos, similares a los utilizados en preparaciones oftálmicas, y estabilizadores de fármacos apropiados. Se conocen varias preparaciones nasales comerciales e incluyen, por ejemplo, antibióticos y antihistamínicos y se utilizan para la profilaxis del asma.
Las inhalaciones e inhaladores son preparaciones farmacéuticas diseñadas para la liberación de un compuesto o fármaco en el sistema respiratorio de un paciente. Se administra un vapor o nebulización y se alcanza el área afectada. Esta vía también se puede utilizar para liberar agentes en la circulación sistémica. Las inhalaciones se pueden administrar por las vías respiratorias nasal u oral. La administración de soluciones de inhalación sólo es efectiva si las gotitas son suficientemente finas e uniformes en tamaño, de manera que la nebulización alcance los bronquiolos.
Otro grupo de productos, también conocidos como inhalaciones, y a veces llamadas insuflaciones, comprende fármacos líquidos o finamente pulverizados que se transportan a las vías respiratorias mediante la utilización de sistemas de liberación especiales, tales como aerosoles farmacéuticos, que mantienen una solución o suspensión del fármaco en un propelente de gas licuado. Cuando se libera a través de una válvula adecuada y un adaptador oral, una dosis medida de la inhalación se propela en el interior del tracto respiratorio del paciente. El tamaño de partícula es de importancia principal en la administración de este tipo de preparación. Se ha mostrado que el tamaño de partícula óptimo para la penetración en una cavidad pulmonar es del orden de 0,5 a 7 \mum. Las nebulizaciones finas se producen mediante aerosoles presurizados y por tanto su uso se considera ventajoso.
E. Kits terapéuticos
La presente invención también proporciona kits terapéuticos que comprenden un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 o un inmunoconjugado para su uso en los presentes métodos de tratamiento. Tales kits, generalmente, contendrán, en una forma de envase adecuada, una formulación farmacéuticamente aceptable de, como mínimo, un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 o un inmunoconjugado. Los kits también pueden contener otras formulaciones farmacéuticamente aceptables para diagnóstico/imagen o terapia combinada. Por ejemplo, tales kits pueden contener alguno o más de uno de un grupo de fármacos quimioterapéuticos o radioterapéuticos; agentes antiangiogénicos; anticuerpos de células antitumorales; y/o inmunotoxinas o coaguligandos del estroma o de la vasculatura antitumorales.
Los kits pueden tener un único recipiente (forma de envase) que contiene el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 o el inmunoconjugado, con o sin algún componente adicional, o pueden tener diferentes recipientes para cada agente deseado. Allí donde se proporcionan agentes terapéuticos combinados, se puede premezclar una solución simple, en una combinación equivalente molar, o con un componente en exceso del otro. Alternativamente, cada uno de los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 o los inmunoconjugados y otros componentes de agentes anticancerígenos del kit se pueden mantener separadamente dentro de diferentes recipientes previamente a la administración a un paciente.
Cuando los componentes del kit se proporcionan en una o más soluciones líquidas, se prefiere que la solución líquida sea una solución acuosa, siendo particularmente preferida una solución acuosa estéril. Sin embargo, los componentes del kit se pueden proporcionar como polvo(s) seco(s). Cuando los reactivos o componentes se proporcionan como un polvo seco, el polvo se puede reconstituir mediante la adición de un disolvente adecuado. Se prevé que el disolvente también se puede proporcionar en otro recipiente.
Los recipientes del kit, generalmente, incluirán, como mínimo, un vial, un tubo de ensayo, un matraz, una botella, una jeringuilla u otras formas de envase, en los que el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 o el inmunoconjugado, y cualquier otro agente deseado, se pueden colocar y, preferiblemente, alicuotar adecuadamente. Allí donde se incluyan los componentes separados, el kit también, generalmente, contendrá un segundo vial u otro recipiente en los que se colocan los mismos, permitiendo la administración de dosis elaboradas por separado. Los kits también pueden comprender un segundo/tercer medio de contener una disolución tampón estéril, farmacéuticamente aceptable u otro diluyente.
Los kits también pueden contener unos medios, por los que se administra el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 o el inmunoconjugado a un animal o paciente, por ejemplo, una o más agujas o jeringas, o incluso un goteador de ojo, pipeta, u otros aparatos similares, mediante los cuales la formulación se puede inyectar a un animal o aplicar a un área enferma del cuerpo. Los kits de la presente invención también incluirán, normalmente, medios para contener viales, o similares, y otros componentes, en clara dirección para la venta comercial, tal como, por ejemplo, inyecciones o recipientes de plástico moldeados por soplado dentro de los cuales los viales deseados y otros aparatos se colocan y se mantienen.
F. Terapia antiangiogénica
La presente invención se puede utilizar para tratar animales y pacientes con angiogénesis aberrante, tal como la que contribuye a una variedad de enfermedades y desórdenes. Las más prevalentes y/o clínicamente importantes de éstas, fuera del sector del tratamiento del cáncer, incluyen la artritis, artritis reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Grave, restenosis vascular, que incluye la restenosis que sigue a la angioplastia, malformaciones arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma y glaucoma neovascular. Otras dianas potenciales para la intervención incluyen angiofibroma, placas ateroscleróticas, neovascularización de xenoinjerto corneal, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, síndrome de Osler-Weber, fibroplasia retrolental de granuloma piogénico, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, varias enfermedades y desórdenes inflamatorios, e incluso endiometrosis. Más enfermedades y desórdenes que son tratables por la presente invención, y la base unificadora de tales desórdenes angiogénicos, se exponen a continuación.
Una enfermedad en la que la angiogénesis está implicada es la artritis reumatoide, en la que los vasos sanguíneos en el revestimiento sinovial de las articulaciones experimentan la angiogénesis. Además de la formación de nuevas redes vasculares, las células endoteliales liberan factores y especies de oxígeno reactivas que conllevan el crecimiento de pannus y la destrucción de cartílago. Los factores implicados en la angiogénesis pueden contribuir activamente al estado crónicamente inflamado de la artritis reumatoide, y ayudar a mantenerlo. Los factores asociados con la angiogénesis también tienen un papel en la osteoartritis, contribuyendo a la destrucción de la articulación.
Harada y otros (1998) mostraron que el VEGF está implicado en la patogénesis de la artritis reumatoide y, además, que la medida de la concentración en suero de VEGF es un método útil, no invasivo para la monitorización de la actividad de la enfermedad de la artritits reumatoide. Esto apoya los usos terapéuticos y de diagnóstico de la presente invención en relación con la artritis reumatoide.
Nagashima y otros (1999) describieron los efectos inhibitorios de los fármacos antirreumáticos sobre VEGF en células cultivadas sinoviales de reumatoide. El VEGF se expresa constitutivamente en el sinovium de la artritis reumatoide. El fármaco antirreumático conocido, bucilamina (BUC), se observó que incluía dentro de su mecanismo de acción la inhibición de la producción de VEGF por células sinoviales. De este modo, los efectos antirreumáticos de BUC están mediados por la supresión de angiogénesis y la proliferación sinovial en el sinovium artrítico a través de la inhibición de la producción de VEGF por células sinoviales. El uso de la presente invención como una terapia antiartrítica está apoyado por las acciones inhibitorias del VEGF de este agente terapéutico existente.
Otro ejemplo de enfermedad mediada por la angiogénesis es la enfermedad neovascular ocular. Esta enfermedad se caracteriza por la invasión de nuevos vasos sanguíneos en las estructuras del ojo, tal como la retina o la córnea. Es la causa más común de ceguera y está implicada en aproximadamente veinte enfermedades del ojo. En la regeneración macular relacionada con la edad, los problemas visuales asociados son causados por un crecimiento interno de capilares coroidales a través de defectos en la membrana de Bruch con proliferación de tejido fibrovascular por debajo del epitelio del pigmento retinal. El daño angiogénico también se asocia con retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, rechazo del xenoinjerto corneal, glaucoma neovascular y fibroplasia retrolental.
Otras enfermedades asociadas con la neovascularización corneal incluyen, pero no se limitan a, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de Vitamina A, sobreuso de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, queratitis sicca pterigium, sjogrens, acné rosáceo, filectenulosis, sífilis, infecciones de Micobacterias, degeneración de lípidos, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, infecciones de Herpes simplex, infecciones de Herpes zoster, infecciones por protozoos, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratolisis marginal, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis, traumatismos, sarcoidosis de Wegener, Escleritis, enfermedad de Steven-Johnson, queratotomía radial perifigoide, y rechazo de gráfico corneal.
Las enfermedades asociadas con la neovascularización retinal/coroidal incluyen, pero no se limitan a, retinopatía diabética, degeneración macular, anemia de la célula falciforme, sarcoide, sífilis, pseudoxantoma elástico, enfermedad de Paget, oclusión de las venas, oclusión arterial, enfermedad obstructiva de la carótida, uveitis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritomatosis sistémico, retinopatía de premadurez, enfermedad de Eales, enfermedad de Bechet, infecciones causantes de retinitis o coroiditis, histoplasmosis ocular presunta, enfermedad de Best, miopía, agujeros ópticos, enfermedad de Stargart, pars planitis, desprendimiento retinal crónico, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, traumatismos y complicaciones post-láser.
Otras enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas con rubeosis (neovascularización del ángulo) y las enfermedades causadas por la proliferación anormal de tejido fibrovascular o fibroso que incluye todas las formas de vitreoretinopatía proliferativa.
La inflamación crónica también implica la angiogénesis patológica. Tal enfermedad se manifiesta como una colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn muestra cambios histológicos con el crecimiento interno de nuevos vasos sanguíneos en los tejidos inflamados. La Bartonelosis, una infección bacteriana encontrada en Sudamérica, puede dar lugar a una etapa crónica que se caracteriza por la proliferación de células endoteliales vasculares.
En la arterosclerosis se encuentra otro papel patológico asociado con la angiogénesis. Las placas formadas en el interior del lumen de los vasos sanguíneos se ha mostrado que tienen actividad estimulatoria angiogénica. La expresión del VEGF en las lesiones ateroscleróticas coronarias humanas fue demostrada por Inoue y otros (1998). Esto evidencia el significado patofisiológico del VEGF en la progresión de la aterosclerosis coronaria humana, así como en procesos de recanalización en enfermedades coronarias obstructivas. La presente invención proporciona un tratamiento efectivo para tales condiciones.
Una de las enfermedades angiogénicas más frecuentes de la infancia es el hemangioma. En la mayoría de casos, los tumores son benignos y experimentan regresión sin intervenir. En casos más severos, los tumores progresan a formas cavernosas amplias e infiltrativas y crean complicaciones clínicas. Las formas sistémicas de los hemangiomas, las hemangiomatosas, tienen un índice de mortalidad alto. Existen hemangiomas resistentes a las terapias que no se pueden tratar con agentes terapéuticos actualmente en uso.
La angiogénesis también es responsable del daño encontrado en enfermedades hereditarias, tales como la enfermedad de Osler-Weber-Rendu, o telangiectasia hemorrágica hereditaria. Ésta es una enfermedad hereditaria caracterizada por múltiples angiomas pequeños, tumores de sangre o vasos linfáticos. Los angiomas se encuentran en la piel y en las membranas de las mucosas, acompañados frecuentemente por epistaxis (sangrado nasal) o sangrado gastrointestinal y algunas veces con fístulas arteriovenosas pulmonares o hepáticas.
La angiogénesis también está implicada en procesos fisiológicos normales, tales como la reproducción y la curación de heridas. La angiogénesis es una etapa importante en la ovulación y también en la implantación de la blástula tras la fertilización. La prevención de la angiogénesis se podría utilizar para inducir amenorrea, para bloquear la ovulación o para prevenir la implantación por la blástula.
En la curación de heridas, la reparación excesiva o fibroplasia puede ser un efecto colateral perjudicial de los procesos quirúrgicos y pueden ser causado o exacerbado mediante la angiogénesis. Las adhesiones son una complicación frecuente de la cirugía y llevan a problemas, tales como la obstrucción del intestino delgado.
Las enfermedades y desórdenes caracterizados por una permeabilidad vascular no deseable también se pueden tratar por la presente invención. Éstas incluyen el edema asociado con tumores cerebrales, ascitis asociada con malignidades, síndrome de Meigs, inflamación del pulmón, síndrome nefrótico, efusión pericardial y efusión pleural, tal como se da a conocer en la Patente WO 98/165551.
Cada una de las enfermedades y desórdenes anteriores, junto con todos los tipos de tumores, tal como se describe en las secciones siguientes, se pueden tratar eficazmente por la presente invención de acuerdo con el conocimiento en la técnica, tal como se da a conocer en, por ejemplo, la Patente U.S.A. No. 5.712.291 que unificaba beneficios como resultado de la aplicación de estrategias antiangiogénicas al tratamiento de enfermedades angiogénicas.
Los anticuerpos y/o inmunoconjugados de la presente invención se utilizan más preferiblemente en el tratamiento de tumores. Los tumores en que la angiogénesis es importante incluyen tumores malignos, y tumores benignos, tales como el neuroma acústico, neurofibroma, tracoma y granulomas piogénicos. La angiogénesis es particularmente prominente en la formación de tumores sólidos y metástasis. Sin embargo, la angiogénesis también está asociada con tumores nacidos en la sangre, tales como leucemias, y varias enfermedades neoplásticas crónicas o agudas de la médula ósea en las que tiene lugar la proliferación no restringida de glóbulos blancos, normalmente acompañada por anemia, mal funcionamiento de la coagulación sanguínea, y el aumento de los nódulos linfáticos, hígado, y bazo. La angiogénesis también juega un papel en las anormalidades en la médula ósea que da pie a tumores similares a la leucemia.
La angiogénesis es importante en dos fases de la metástasis tumoral. En la vascularización del tumor primario, la angiogénesis permite a las células entrar en la corriente sanguínea y circular por todo el cuerpo. Después de que las células tumorales hayan dejado el sitio primario, y se hayan instalado en un segundo sitio, sitio de metástasis, la angiogénesis debe tener lugar antes de que el nuevo tumor pueda crecer y expandirse. Por lo tanto, la prevención de la angiogénesis puede prevenir la metástasis de tumores y contener el crecimiento neoplástico en el sitio primario, permitiendo el tratamiento por otros agentes terapéuticos, particularmente, construcciones agente marcador-agente terapéutico (ver más adelante).
Los métodos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y del anticuerpo basado en 2C3 o del inmunoconjugado proporcionados por la presente invención son, de este modo, ampliamente aplicables al tratamiento de cualquier tumor maligno que tiene un componente vascular. Al usar los anticuerpos y/o inmunoconjugados de la presente invención en el tratamiento de tumores, particularmente vascularizados, tumores malignos, los agentes se pueden utilizar solos o en combinación con, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, radioterapéuticos, apoptópicos, antiangiogénicos y/o inmunotoxinas o coaguligandos.
Los típicos tumores vascularizados para el tratamiento son los tumores sólidos, particularmente carcinomas, que requieren un componente vascular para la provisión de oxígeno y nutrientes. Algunos ejemplos de tumores sólidos que se pueden tratar utilizando la presente invención incluyen, pero no se limitan a, carcinomas del pulmón, pecho, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículo, hígado, parótida, tracto biliar, colon, recto, cérvix, útero, endometrio, riñón, vejiga, próstata, tiroides, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de células pequeñas, melanomas, gliomas, glioblastomas, neuroblastomas, y similares. La Patente WO 98/45331 además ejemplifica la variedad de los tipos de tumores que pueden ser tratados eficazmente utilizando un anticuerpo anti-VEGF.
El conocimiento del papel de la angiogénesis en el mantenimiento y metástasis de tumores ha llevado a un indicador pronóstico para cánceres, tales como el cáncer de pecho. La cantidad de neovascularización encontrada en el tumor primario se determinó mediante el recuento de la densidad de microvasos en el área de neovascularización más intensa en el carcinoma invasivo del pecho. Se encontró que un alto nivel de densidad de microvasos se correlacionaba con la reaparición del tumor. El control de la angiogénesis mediante las terapias de la presente invención reducirá o anulará la reaparición de tales tumores.
La presente invención se contempla para su uso en el tratamiento de cualquier paciente que presente un tumor sólido. A la luz de las propiedades específicas de las composiciones basadas en el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, los agentes terapéuticos de la presente invención habrán reducido los efectos colaterales. Las ventajas particulares darán lugar al mantenimiento o mejora de las respuestas inmunes del huésped contra el tumor, tal como mediada por macrófagos, y a la falta de efectos adversos en el tejido óseo. La presente invención, de este modo, será la terapia antiangiogénica de elección para el tratamiento de cánceres pediátricos y de pacientes que tienen, o con riesgo de desarrollar, osteoporosis y otras deficiencias óseas.
A pesar de que las malignidades y tumores sólidos se pueden tratar mediante la presente invención, los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 y 2C3, no conjugados, de la presente invención se contemplan particularmente para su uso en el tratamiento de pacientes con más tumores angiogénicos, o pacientes con riesgo de desarrollar metástasis.
La presente invención también se destina como tratamiento preventivo o profiláctico. Estos aspectos de la presente invención incluyen la capacidad de la presente invención para tratar pacientes que presentan un tumor primario, que pueden tener tumores metastáticos, o células tumorales en las primeras fases de germinación del tumor metastático. Como estrategia antiangiogénica, la presente invención también se puede utilizar para prevenir el desarrollo de tumores en sujetos con un riesgo alto o moderado de desarrollar un tumor, en base de las pruebas de pronóstico y/o los parientes cercanos que sufren un cáncer hereditario.
Las formas conjugadas o inmunotoxinas de los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 y 2C3 de la presente invención se contemplan particularmente para su uso en la destrucción o desmembramiento de los tumores sólidos. Estos aspectos de la presente invención se pueden utilizar en relación a los anticuerpos antiangiogénicos no conjugados de la presente invención, o con otras aproximaciones antiangiogénicas.
Se apreciará fácilmente por los entendidos en la técnica que las formas del profármaco y del inmunoconjugado de los presentes métodos de tratamiento tienen la ventaja clara de proporcionar un único agente terapéutico con dos propiedades: la propiedad antiangiogénica inherente del anticuerpo y la propiedad terapéutica del agente acoplado (por ejemplo, citotóxica, coagulativa, apoptópica, etc). Las formas de tratamiento con conjugados y con profármacos de los presentes anticuerpos, de este modo, tienen una utilidad increíblemente amplia en todo el sector del tratamiento del cáncer.
La guía proporcionada en la presente respecto a los pacientes más adecuados para su uso, junto con los diferentes aspectos de la presente invención, se destina como una enseñanza de que ciertos perfiles de pacientes pueden ayudar con la selección de pacientes para el tratamiento mediante la presente invención. La preselección de ciertos pacientes, o categorías de pacientes, no anula, en cualquier caso, la utilidad de la presente invención en relación al tratamiento de todos los pacientes que tienen un tumor vascularizado, u otras enfermedades angiogénicas, tal como se ha descrito anteriormente. Una consideración adicional es el hecho de que el ataque al tumor, proporcionado por la presente invención, puede predisponer el tumor a un tratamiento terapéutico adicional, de manera que el tratamiento posterior da lugar a un efecto sinergístico global o incluso lleva a la total remisión o cura.
No se cree que cualquier tipo de tumor particular se deba excluir del tratamiento que se usa en la presente invención. Sin embargo, el tipo de células tumorales puede ser relevante para el uso de la presente invención junto con otros agentes terapéuticos, particularmente quimioterapéuticos e inmunotoxinas de células antitumorales. Tanto los aspectos conjugados como los no conjugados de las presentes terapias incluirán un efecto antiangiogénico que inhibirá la proliferación de la vasculatura del tumor. Los aspectos del tratamiento con profármacos o conjugados además destruirán u obstruirán la vasculatura del tumor. Como la vasculatura es sustancialmente o enteramente la misma en todos los tumores sólidos, la metodología presente se entenderá para ser ampliamente o enteramente aplicable al tratamiento de todos los tumores sólidos, sin tener en cuenta el fenotipo o genotipo particular de las propias células tumorales.
Las dosis terapéuticamente efectivas de las construcciones de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o anticuerpos basados en 2C3 o inmunoconjugados son fácilmente determinables utilizando datos de un modelo animal, por ejemplo, tal como se muestra en los estudios detallados en la presente. Los animales experimentales con tumores sólidos se utilizan frecuentemente para optimizar dosis terapéuticas apropiadas previamente al traslado a un ambiente clínico. Se conoce que tales modelos son muy fiables en la predicción de estrategias anticancerígenas efectivas. Por ejemplo, los ratones con tumores sólidos, como los utilizados en los Ejemplos, se utilizan ampliamente en pruebas preclínicas. Los inventores han usado tales modelos de ratón, aceptados en la técnica, para determinar los intervalos de trabajo de los agentes terapéuticos que proporcionan efectos antitumorales beneficiosos con una toxicidad mínima.
Al utilizar anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o anticuerpos basados en 2C3, no conjugados, en las terapias antiangiogénicas, también se pueden extraer otros datos publicados para ayudar en la formulación de dosis para el tratamiento clínico. Por ejemplo, a pesar de que los anticuerpos de la presente invención tienen claras ventajas sobre aquellos de la técnica, la información en la literatura sobre el tratamiento con otros anticuerpos anti-VEGF aún se puede usar en combinación con los datos y enseñanzas de la presente solicitud para diseñar y/u optimizar los protocolos de tratamiento y dosis.
Por ejemplo, Borgstrom y otros (1999) describieron la importancia del VEGF en la angiogénesis in vivo del cáncer de pecho utilizando MAb A4.6.1. Como los anticuerpos similares al 2C3 de la presente invención mostraban respuestas antitumorales equivalentes o incluso mejoradas en estudios comparativos con A4.6.1, estos anticuerpos también tendrán una utilidad significativa en el tratamiento del cáncer de pecho. Los inventores, además, se dieron cuenta, como se apreciará por aquellos de habilidad normal en la técnica, que los pacientes con cáncer de pecho son normalmente mujeres en los grupos de edad media o avanzada, en las que la preocupación por la osteoporosis es también clara. El anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y los anticuerpos basados en 2C3 de la presente invención tendrán, de este modo, la ventaja añadida de no causar un efecto adverso en el metabolismo óseo, y por tanto, no se preferirá su uso en pacientes con cáncer de pecho o con el riesgo de desarrollar osteoporosis.
El mismo tipo de ventajas hace que los agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y del basado en 2C3 sean los fármacos preferidos para el tratamiento de cánceres pediátricos. En niños con cáncer, es evidente la necesidad de continuar el crecimiento óseo de una forma sustancial y sana. Como los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como el 2C3, no alterarán las actividades de los osteoclastos y condroclastos, las cuales son importantes en el desarrollo óseo, el 2C3 tendrá ventajas importantes sobre otros anticuerpos, tal como el A4.6.1.
Borgstrom y otros (1999) también informaron que el MAb A4.6.1 daba lugar a la regresión significativa de tumores cuando se utilizaba en combinación con doxorubicina. Esto apoya además el uso combinado de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 y agentes quimioterapéuticos o citotóxicos convencionales para conseguir resultados clínicos significativos en el tratamiento de una variedad de cánceres. Se contemplan combinaciones de fármacos de doxorubicina y doxorubicina no conjugada.
Ferrara y colegas también informaron sobre la eficacia y la respuesta a la concentración de un anticuerpo monoclonal anti-VEGF murino en ratones con tumores y la extrapolación al tratamiento con humanos (Mordenti y otros, 1999). Los estudios se diseñaron para evaluar la relación respuesta-concentración del anticuerpo monoclonal anti-VEGF murino, de manera que se podía estimar una concentración de plasma eficaz de la forma humanizada recombinante del anticuerpo en pacientes de cáncer. Mordenti y otros (1999) concluyeron que la supresión tumoral satisfactoria en ratones desnudos se consiguió utilizando dosis del anticuerpo murino que podrían ser fácilmente aplicadas al sistema humano para definir los regímenes de dosificación clínica efectivos para mantener un anticuerpo terapéutico para uso humano en el intervalo de eficacia requerido. Por consiguiente, los datos de los modelos de ratón, aceptados en la técnica, también se pueden trasladar a dosis humanas apropiadas utilizando el tipo de análisis expuesto en Mordenti y otros (1999), además de las técnicas conocidas por los entendidos en la técnica como se ha descrito en la presente.
Los resultados de evaluaciones de seguridad preclínicas de una forma humanizada recombinante del anticuerpo anti-VEGF de Genentech en monos (Ryan y otros, 1999) sirven para ejemplificar los inconvenientes del agente terapéutico candidato particular. A pesar de que el anticuerpo tiene actividad farmacológica en este animal, los monos en estos estudios mostraron displasia fiseal caracterizada por un incremento relacionado con la dosis en condrocitos hipertrofiados, la formación de placas óseas subcondriales, y la inhibición de la invasión vascular de la placa de crecimiento. Ninguno de dichos inconvenientes será evidente en el uso de agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y del basado en 2C3, que no inhiben la unión del VEGF y la señalización en condroclastos y condrocitos, que es mediada por el VEGFR1.
Se observaron los datos de un estudio adicional de Lin y otros (1999) sobre la farmacocinética preclínica, la relación entre especies y la distribución en el tejido del anticuerpo anti-VEGF monoclonal humanizado de Genentech. Estos estudios se llevaron a cabo en ratones, ratas, monos y conejos, éste último utilizando el anticuerpo marcado con ^{125}I. Los datos farmacocinéticos de los ratones, ratas y monos se utilizaron para predecir la farmacocinética del anticuerpo homólogo humanizado utilizando una relación alométrica en humanos. Por consiguiente, se puede desarrollar información sobre la dosis apropiada para el tratamiento de las condiciones patológicas humanas, tales como artritis reumatoide, neovascularización ocular y cáncer.
Se ha empleado una versión humanizada del anticuerpo anti-VEGF A4.6.1 en pruebas clínicas como agente anticancerígeno (Brem, 1998; Baca y otros, 1997; Presta y otros, 1997). Por lo tanto, tales datos clínicos también se pueden considerar como una fuente de referencia cuando se diseñan dosis terapéuticas para el presente tratamiento con anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y 2C3. La presente invención muestra que el 2C3 es tan efectivo como el A4.6.1 en estudios con ratones con tumor, a pesar de que la especificidad para inhibir sólo acciones del VEGF mediadas por el VEGFR2 es una ventaja. La Patente WO 98/45331 además ejemplifica las dosis de anticuerpos humanizados anti-VEGF que se pueden utilizar en el tratamiento.
En términos de utilizar inmunoconjugados de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 conjugados o basados en 2C3 en la terapia tumoral, uno se puede referir a la literatura científica y de patentes sobre el éxito de la liberación de un amplio número de agentes terapéuticos a la vasculatura tumoral para conseguir un efecto beneficioso. A modo de ejemplo, cada una de las Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866; 5.877.289; 5.965.132; 6.051.230; 6.004.555; 5.776.427; 6.004.554; 6.036.955; y Patente U.S.A. No. 6 093 399, además describen el uso de tales construcciones agente terapéutico-agente marcador. En el presente caso, las construcciones agente terapéutico-agente marcador incluyen partes de agente marcador que ejercen un efecto antiangiogénico, que aumentará o, de otra manera, mejorará la actividad antitumoral del agente terapéutico acoplado.
Como se conoce en la técnica, existen objetivos reales que se pueden utilizar como guía en relación a las pruebas preclínicas, antes de proceder al tratamiento clínico. Sin embargo, a la luz del progreso de otros anticuerpos anti-VEGF hacia el tratamiento clínico, los efectos antitumorales demostrados en modelos aceptados mostrados en la presente, y la mejor seguridad de las presentes estrategias, la invención actual proporciona un agente terapéutico con una trayectoria rápida hacia el tratamiento clínico. De este modo, se pueden emplear pruebas preclínicas para seleccionar los anticuerpos, dosis o combinaciones más ventajosas.
Definirá una invención útil, cualquier dosis de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o anticuerpo basado en 2C3 o inmunoconjugado, o medicamento combinado, que da lugar a cualquier efecto antiangiogénico detectable de forma constante, inhibición de metástasis, destrucción de la vasculatura tumoral, trombosis tumoral, necrosis y/o efecto antitumoral general. La presente invención también puede ser efectiva contra vasos corriente abajo del tumor, es decir, marcar, como mínimo, un subgrupo de vasos de drenaje, particularmente como citocinas liberadas del tumor que actuarán en estos vasos, cambiando su perfil antigénico.
También se entenderá que incluso en las circunstancias en que los efectos tumorales y/o antiangiogénicos de la dosis de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o anticuerpo basado en 2C3 o inmunoconjugado, o terapia combinada, se dirigen hacia el límite inferior del intervalo terapéutico deseado, puede ser que esta terapia sea aún igual o incluso más efectiva que todas las otras terapias conocidas en el contexto del marcaje de un tumor o de un paciente particular. Para un médico es desafortunadamente evidente que ciertos tumores y condiciones no se pueden tratar con eficacia a medio o largo plazo, pero eso no anula la utilidad de la presente terapia, particularmente allí donde, como mínimo, sea tan efectiva como otras estrategias generalmente propuestas.
Al diseñar dosis apropiadas de construcciones de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o anticuerpo basado en 2C3 o inmunoconjugado, o agentes terapéuticos combinados, para el tratamiento de tumores vascularizados, se puede fácilmente extrapolar desde los estudios en animales en la presente descritos y el conocimiento en la literatura para llegar a las dosis apropiadas para una administración clínica. Para conseguir la conversión de dosis animales a humanas, se tendrían en cuenta la masa de los agentes administrados por unidad de masa del animal experimental y, preferiblemente, se tendría en cuenta las diferencias en el área superficial del cuerpo (m^{2}) entre el animal experimental y el paciente humano. Todos estos cálculos y rutinas son bien conocidos por aquellos de habilidad normal en la técnica.
Por ejemplo, tomando las dosis satisfactorias del 2C3 en estudios de ratón, y mediante la aplicación de cálculos estándares basados en la masa y el área superficial, las dosis eficaces para su uso en pacientes humanos sería de entre 1 mg/m^{2} aproximadamente y 1000 mg/m^{2} aproximadamente, preferiblemente, entre 50 mg/m^{2} y 500 mg/m^{2} aproximadamente, y más preferiblemente, entre 10 mg/m^{2} aproximadamente y 100 mg/m^{2} aproximadamente. Estas dosis son apropiadas para el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o para anticuerpos desnudos basados en 2C3 y el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o para inmunoconjugados basados en 2C3, a pesar de que se prefiere utilizar las dosis en relación a anticuerpos desnudos o no conjugados para su uso como antiangiogénicos.
Por consiguiente, utilizando esta información, los inventores contemplan que las dosis bajas útiles de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o anticuerpos basados en 2C3 o inmunoconjugados para la administración humana serán de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o aproximadamente 50 mg/m^{2}; y que las dosis elevadas útiles de tales anticuerpos o inmunoconjugados para la administración humana serán de aproximadamente 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 925, 950, 975 o aproximadamente 1000 mg/m^{2}. Las dosis intermedias útiles de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o anticuerpos basados en 2C3 o inmunoconjugados para la administración humana se contemplan como cualquier dosis entre los intervalos superiores e inferiores, tales como aproximadamente 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 525, 550 o aproximadamente 575 mg/m^{2} o similar.
Se contempla cualquier intervalo en particular que se encuentre entre las dosis de ejemplo expuestas anteriormente o cualquier valor intermedio entre los intervalos expuestos en particular. Allí donde se utilice los inmunoconjugados del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, se entenderá que los inmunoconjugados de coagulantes se pueden, generalmente, utilizar en dosis más elevadas que los inmunoconjugados de toxinas.
En general, se preferirán los intervalos de dosificación entre aproximadamente 10-100 mg/m^{2}, aproximadamente 10-90 mg/m^{2}, aproximadamente 10-80 mg/m^{2}, aproximadamente 20-100 mg/m^{2}, aproximadamente 20-90 mg/m^{2}, aproximadamente 20-80 mg/m^{2}, aproximadamente 30-100 mg/m^{2}, aproximadamente 30-90 mg/m^{2}, aproximadamente 30-80 mg/m^{2}, aproximadamente 15-100 mg/m^{2}, aproximadamente 25-100 mg/m^{2}, aproximadamente 35-100 mg/m^{2}, aproximadamente 15-90 mg/m^{2}, aproximadamente 25-90 mg/m^{2}, aproximadamente 35-90 mg/m^{2} o similar de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o anticuerpos basados en 2C3 o inmunoconjugados. No obstante, estos intervalos expresados, se entenderá que, dados los parámetros y la guía detallada presentada en la presente, se abarcarán, dentro de la presente invención, variaciones adicionales en los intervalos activos u óptimos.
Por lo tanto, se entenderá que las dosis inferiores pueden ser más apropiadas en combinación con otros agentes, y que las dosis elevadas todavía se pueden tolerar, particularmente dada la seguridad mejorada del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y anticuerpos basados en 2C3 que se unen sólo al VEGFR2 y, además, la seguridad mejorada de los inmunoconjugados antiangiogénicos y coagulantes del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y de los basados en 2C3. El uso de anticuerpos humanos o humanizados (y opcionalmente, proteínas humanas antiangiogénicas o coagulantes) hace que la presente invención sea más segura para su uso clínico, además de reducir las posibilidades de toxicidad significativa o efectos colaterales en tejidos sanos.
La intención de los regímenes terapéuticos de la presente invención es, generalmente, producir efectos antitumorales significativos mientras se mantiene la dosis por debajo de los niveles asociados con una toxicidad inaceptable. Además de variar la propia dosis, el régimen de administración también se puede adaptar para optimizar la estrategia del tratamiento. Un protocolo de tratamiento es administrar entre aproximadamente 1 mg/m^{2} y aproximadamente 1000 mg/m^{2}, preferiblemente, entre aproximadamente 50 mg/m^{2} y aproximadamente 500 mg/m^{2}, y más preferiblemente, entre aproximadamente 10 mg/m^{2} y aproximadamente 100 mg/m^{2} del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o del anticuerpo basado en 2C3 o del inmunoconjugado, o del cóctel terapéutico que contiene los mismos, de 1 a 3 veces por semana aproximadamente, preferiblemente mediante administración intravenosa o intramuscular, y más preferiblemente, intravenosa.
Al administrar las dosis particulares, preferiblemente, se proporcionaría sistemáticamente al paciente una composición farmacéuticamente aceptable (según los estándares de esterilidad, pirogenicidad, pureza y seguridad general de la FDA). Se prefiere, generalmente, la inyección intravenosa. También se contempla la infusión continua sobre un período de tiempo de 1 ó 2 horas aproximadamente o similar.
Naturalmente, antes de un uso extendido, se deben efectuar pruebas clínicas. Los diversos elementos para dirigir una prueba clínica, incluyendo el tratamiento en pacientes y la monitorización, serán conocidos por los entendidos de la técnica a la luz de la presente descripción. La siguiente información se presenta como una guía general para su uso en el establecimiento de dichas pruebas.
Los pacientes elegidos para los primeros estudios de tratamiento con anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 habrán fallado en la respuesta a, como mínimo, un curso de terapia convencional, y tendrán una enfermedad objetivamente medible, tal como se determina por examen físico, técnicas de laboratorio, y/o procesos radiográficos. Cualquier quimioterapia debería pararse, como mínimo, dos semanas antes del inicio del estudio. Donde se emplean anticuerpos o partes de anticuerpos monoclonales murinos, los pacientes no deberían tener un historial con alergia a inmunoglobulina de ratón.
Se encontrarán varias ventajas en el uso de un catéter permanente de la vena central con un triple puerto en el lumen. Los agentes del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, se deberían filtrar, por ejemplo, utilizando un filtro de 0,22 \mum, y diluir apropiadamente, tal como con solución salina, hasta un volumen final de 100 ml. Antes de su uso, la muestra de prueba también se debería filtrar de una forma similar, y calcular su concentración antes y después de la filtración mediante la determinación de A_{280}. La recuperación esperada debería estar en el intervalo del 87% al 99%, y, a continuación, pueden tenerse en cuenta los ajustes por la pérdida de proteína.
El anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 o los conjugados se pueden administrar durante un período de tiempo de aproximadamente 4-24 horas, con cada paciente recibiendo 2-4 infusiones en intervalos de 2-7 días. La administración también se puede llevar a cabo mediante una velocidad constante de infusión durante un período de 7 días. La infusión proporcionada en cualquier nivel de dosificación dependería de cualquier toxicidad observada. Por tanto, si se alcanza la toxicidad de Grado II después de una única infusión, o en un período de tiempo particular para la infusión de velocidad constante, se deberían retener las dosis adicionales o parar la infusión por velocidad constante a menos que mejorase la toxicidad. Se deberían administrar dosis crecientes de agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 a grupos de pacientes hasta que aproximadamente el 60% de los pacientes mostraran una toxicidad de Grado III o IV inaceptable en cualquier categoría. Las dosis que representan los 2/3 de este valor se definen como dosis seguras.
El examen físico, las medidas del tumor, y las pruebas de laboratorio se deberían realizar, por supuesto, antes del tratamiento y en intervalos hasta un mes más tarde. Las pruebas de laboratorio deberían incluir recuentos sanguíneos completos, creatinina del suero, creatina quinasa, electrolitos, urea, nitrógeno, SGOT, bilirrubina, albúmina, y proteínas en suero totales. Las muestras de suero tomadas hasta 60 días después del tratamiento, se deberían evaluar mediante radioinmunoensayo por la presencia del agente terapéutico administrado, y de anticuerpos contra cualquier parte de los mismos. Los análisis inmunológicos de suero, utilizando cualquier ensayo estándar, tal como, por ejemplo, ELISA o RIA, permitirán evaluar la farmacocinética y el despeje del agente terapéutico del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3.
Para evaluar las respuestas antitumorales, los pacientes se deberían examinar a las 48 horas hasta 1 semana y otra vez a los 30 días después de la última infusión. Cuando la enfermedad palpable esté presente, se deberían medir diariamente, durante el tratamiento, los dos diámetros perpendiculares de todas las masas, durante 1 semana tras la finalización de la terapia, y a los 30 días. Para medir enfermedades no palpables, se podrían realizar escáneres CT en serie en intervalos de 1 cm por todo el pecho, abdomen, y pelvis a las 48 horas hasta 1 semana y otra vez a los 30 días. Las muestras de tejido también se deberían evaluar histológicamente, y/o mediante citometría de flujo, utilizando biopsias de los sitios de la enfermedad o incluso sangre o muestras de fluidos si fuera apropiado.
Las respuestas clínicas se pueden definir mediante medidas aceptables. Por ejemplo, una respuesta completa se puede definir por la desaparición de todo tumor medible 1 mes después del tratamiento. En cambio, una respuesta parcial se puede definir por una reducción del 50% o superior de la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de los nódulos tumorales evaluables 1 mes después del tratamiento, sin sitios tumorales que muestren un aumento. De forma similar, una respuesta mixta se puede definir por una reducción del 50% o superior del producto de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones medibles 1 mes después del tratamiento, con progresión en uno o más sitios.
A la luz de los resultados de las pruebas clínicas, tales como los descritos anteriormente, se puede formular un régimen de tratamiento incluso más preciso. Aún así, algunas variaciones en la dosis pueden ser más tarde necesarias dependiendo de la condición del sujeto a tratar. El doctor responsable de la administración, a la luz de la presente descripción, será capaz de determinar la dosis apropiada para el sujeto individual. Tal optimización y ajuste se lleva a cabo rutinariamente en la técnica y de ninguna manera refleja una falta de experimentación.
G. Terapias de combinación
La presente invención se puede combinar con otras terapias, tanto si se usa para tratar enfermedades angiogénicas, tales como artritis, psoriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Grave, restenosis vascular, hemangioma y glaucoma vascular (u otras enfermedades descritas anteriormente), como para tumores sólidos.
Los métodos de tratamiento del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 de la presente invención se pueden combinar con otros métodos, generalmente, empleados en el tratamiento del tumor, enfermedad o desorden particular que muestra el paciente. Siempre y cuando una aproximación terapéutica particular se sepa que no es perjudicial para las condiciones en sí del paciente, y no contrarreste significativamente el tratamiento del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, se contempla su combinación con la presente invención.
En relación con el tratamiento de tumores sólidos, la presente invención se puede utilizar en combinación con aproximaciones clásicas, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia, y similares. La invención, por tanto, proporciona terapias combinadas, en que las construcciones del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 se utilizan simultáneamente con, antes, o después del tratamiento quirúrgico o de radiación; o se administran a pacientes con, antes, o después de agentes quimioterapéuticos, radioterapéuticos o antiangiogénicos convencionales, o inmunotoxinas o coaguligandos marcados.
Se prefiere particularmente el uso combinado de la presente invención con radioterapia, agentes antiangiogénicos, radioterapéuticos, agentes inductores de apoptosis y fármacos antitubulina. Muchos ejemplos de tales agentes se han descrito anteriormente junto con los inmunoconjugados de la presente invención. Cualquiera de los agentes inicialmente descritos para su uso como una parte del conjugado terapéutico también se pueden usar separadamente, pero aún en combinación operable con la presente invención.
Cuando uno o más agentes se utilizan en combinación con la terapia del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, no hay necesidad de que los resultados combinados sean aditivos de los efectos observados cuando cada tratamiento se lleva a cabo por separado. A pesar de que, como mínimo, los efectos aditivos son, generalmente, deseables, cualquier efecto antitumoral incrementado en una de las terapias simples sería de provecho. Además, no hay una necesidad particular para que el tratamiento combinado muestre efectos sinergísticos, a pesar de que es ciertamente posible y ventajoso.
Para llevar a la práctica la terapia antitumoral combinada, simplemente se administraría a un animal una construcción del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, en combinación con otro agente anticancerígeno de una manera efectiva para dar lugar a sus acciones antitumorales combinadas en el interior del animal. Por lo tanto, se proporcionarían agentes en cantidades efectivas y durante períodos de tiempo efectivos para dar lugar a su presencia combinada dentro de la vasculatura tumoral y sus acciones combinadas en el medio tumoral. Para conseguir este objetivo, los agentes anticancerígenos y terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 se pueden administrar simultáneamente al animal, en una composición simple, o como dos composiciones diferentes que utilizan vías de administración diferentes.
Alternativamente, el tratamiento del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 puede preceder, o seguir, al tratamiento con agente anticancerígeno en, por ejemplo, intervalos que varían de minutos a semanas y meses. Se aseguraría así, que el agente anticancerígeno y el agente del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 ejercen un efecto ventajosamente combinado en el tumor.
La mayoría de agentes anticancerígenos se administrarían previamente a la terapia antiangiogénica del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3. Sin embargo, allí donde se utilizan los inmunoconjugados del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, se pueden administrar, posteriormente o simultáneamente, varios agentes anticancerígenos.
El uso general de combinaciones de sustancias en el tratamiento del cáncer es bien conocido. Por ejemplo, la Patente U.S.A. No. 5.710.134 da a conocer componentes que inducen a la necrosis en tumores en combinación con sustancias o "profármacos" no tóxicos. Los enzimas liberados por los procesos necróticos dividen el "profármaco" no tóxico en el "fármaco" tóxico, que lleva a la muerte de la célula tumoral. También, la Patente U.S.A. No. 5.747.469 da a conocer el uso combinado de vectores virales que codifican p53 y agentes dañantes de ADN. Cualquier aproximación similar se puede utilizar con la presente invención.
En algunas situaciones, puede ser incluso deseable extender el período de tiempo para el tratamiento de forma significativa, con lapsos de varios días (2, 3, 4, 5, 6 ó 7), varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o incluso varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las respectivas administraciones. Esto sería ventajoso en circunstancias en las que un tratamiento estuviera dirigido sustancialmente a destruir el tumor, tales como cirugía o quimioterapia, y otro tratamiento estuviera dirigido a prevenir la micrometástasis o el recrecimiento del tumor, tal como la terapia basada en antiangiogénicos. Los antiangiogénicos se deberían administrar en un tiempo prudente tras la cirugía para permitir la curación de heridas.
También se prevé que se utilizará más de una administración del agente del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 o del agente anticancerígeno. Los agentes se pueden administrar de forma intercambiable, en días o semanas alternadas; o se puede administrar una secuencia del tratamiento del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, seguido por una secuencia de terapia con agente anticancerígeno. En cualquier caso, para conseguir la regresión del tumor utilizando una terapia combinada, todo lo que se necesita es liberar ambos agentes en una cantidad combinada efectiva para que ejerzan un efecto antitumoral, sin tener en cuenta los tiempos de administración.
En términos de cirugía, cualquier intervención quirúrgica se puede practicar junto con la presente invención. En relación a la radioterapia, se contempla cualquier mecanismo que induce al daño local de ADN en el interior de las células tumorales, tales como radiación-\gamma, rayos-X, radiación-UV, microondas e incluso emisiones electrónicas y similares. También se contempla la liberación dirigida de radioisótopos a las células tumorales, y esto se puede utilizar en relación a los anticuerpos marcadores u otros medios de marcaje, y preferiblemente, anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como el 2C3.
También se ha probado que la terapia con citocinas es una compañera efectiva para los regímenes terapéuticos combinados. Se pueden emplear varias citocinas en tales aproximaciones combinadas. Los ejemplos de citocinas incluyen: IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-\beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF\alpha, TNF\beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\gamma. Las citocinas se administran según los regímenes estándares, consecuentes con indicaciones clínicas, tales como la condición del paciente y la toxicidad relativa de la citocina. Las uteroglobinas también se pueden utilizar para prevenir o inhibir la metástasis (Patente U.S.A. No. 5.696.092).
G1. Agentes quimioterapéuticos
En ciertas realizaciones, los agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 de la presente invención se pueden administrar en combinación con un agente quimioterapéutico. En los métodos de tratamiento combinado, dados a conocer en la presente, se pueden utilizar una variedad de agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos contemplados como ejemplos incluyen, por ejemplo, adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina, daunomicina, doxorubicina, tamoxifeno, taxol, taxotero, vincristina, vinblastina, vinorelbina, etopósido (VP-16), 5-fluorouracilo (5FU), citosina arabinosida, ciclofofamida, tiotepa, metotrexato, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatina (CDDP), aminopterina, combretastatina(s), y derivados y profármacos de éstos.
Tal como se entenderá por aquellos de habilidad normal en la técnica, las dosis apropiadas de agentes quimioterapéuticos estarán, generalmente, alrededor de aquellas empleadas en las terapias clínicas, en las que los agentes quimioterapéuticos se administran solos o en combinación con otros agentes quimioterapéuticos. Sólo a modo de ejemplo, se pueden utilizar agentes, tales como cisplatina, y otros alquilantes de ADN. La cisplatina se ha utilizado ampliamente para tratar el cáncer, con dosis eficaces utilizadas en aplicaciones clínicas, de 20 mg/m^{2} durante 5 días cada 3 semanas para un total de tres cursos. La cisplatina no se absorbe oralmente y se debe, por tanto, liberar a través de una inyección intravenosa, subcutánea, intratumoral o intraperitoneal.
Algunos agentes útiles adicionales incluyen compuestos que interfieren en la replicación del ADN, la mitosis y la segregación cromosómica. Tales compuestos quimioterapeúticos incluyen adriamicina, también conocida como doxorubicina, etopósido, verapamil, podofilotoxina, y similares. Ampliamente usados en ajustes clínicos para el tratamiento de neoplasmas, estos compuestos se administran a través de inyecciones intravenosas en bolo en dosis que varían de 25 a 75 mg/m^{2} en intervalos de 21 días para adriamicina, de 35 a 50 mg/m^{2} para etopósido intravenosamente u oralmente con el doble de la dosis intravenosa.
También se pueden utilizar los agentes que interrumpen la síntesis y fidelidad de los precursores de polinucleótidos. Particularmente útiles son los agentes que se han sometido a extensas pruebas y están fácilmente disponibles. De esta manera, agentes como el 5-fluorouracilo (5-FU) son preferencialmente útiles por el tejido neoplástico, haciendo este agente particularmente útil para el marcaje de células neoplásticas. A pesar de que el 5-FU es bastante tóxico, es aplicable en un amplio conjunto de transportadores, incluyendo los tópicos, aunque la administración intravenosa con dosis que varían de 3 a 15 mg/kg/día es la normalmente utilizada.
Los agentes quimioterapéuticos de ejemplo para la terapia combinada están listados en la Tabla C. Cada uno de los agentes listados, es ejemplificante pero no limitante. El técnico con capacidad se puede dirigir a "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, capítulo 33, en particular, las páginas 624-652. La variación de la dosis probablemente tendrá lugar dependiendo de la condición a tratar. El doctor que administra el tratamiento será capaz de determinar la dosis apropiada para el sujeto individual.
TABLA C Agentes quimioterapéuticos útiles en la enfermedad neoplástica
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G2. Antiangiogénicos
Bajo condiciones fisiológicas normales, los humanos o los animales experimentan angiogénesis sólo en situaciones específicas limitadas. Por ejemplo, la angiogénesis se observa normalmente en la curación de heridas, el desarrollo embrionario y fetal y la formación del corpus luteum, el endometrio y la placenta. La angiogénesis no controlada (persistente y/o no regulada) está relacionada con varios estados de enfermedad, y tiene lugar durante la metástasis tumoral.
Se piensa que tanto la angiogénesis controlada como la no controlada proceden de una manera similar. Las células endoteliales y los pericitos, rodeados por una membrana base, forman los vasos sanguíneos capilares. La angiogénesis empieza con la erosión de la membrana base por enzimas liberadas por células endoteliales y leucocitos. Las células endoteliales, que recubren el lumen de los vasos sanguíneos, a continuación, sobresalen a través de la membrana base. Los estimulantes angiogénicos inducen a las células endoteliales a migrar a través de la membrana base erosionada. Las células migratorias forman un "brote" lejos del vaso sanguíneo parental, en el que las células endoteliales proliferan y experimentan mitosis. Los brotes endoteliales se unen el uno con el otro para formar bucles capilares creando un nuevo vaso sanguíneo.
La presente invención del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, se puede utilizar en combinación con cualquiera o más de las terapias antiangiogénicas. Se incluyen combinaciones con otros agentes que inhiben el VEGF, tales como otros anticuerpos neutralizantes (Kim y otros, 1992; Presta y otros, 1997; Sioussat y otros, 1993; Kondo y otros, 1993; Asano y otros, 1995), construcciones de receptores solubles (Kendall y Thomas, 1993; Aiello y otros, 1995; Lin y otros, 1998; Millauer y otros, 1996), inhibidores de tirosina quinasa (Siemeister y otros, 1998), estrategias antisentido, aptámeros de ARN y ribozimas contra VEGF o receptores de VEGF (Saleh y otros, 1996; Cheng y otros, 1996; Ke y otros, 1998; Parry y otros, 1999). También se pueden emplear variantes de VEGF con propiedades antagonísticas, tal como se describe en la Patente WO 98/16551.
Las terapias antiangiogénicas se pueden basar en la administración de un agente antiangiogénico o la inhibición de un agente angiogénico. La inhibición de agentes angiogénicos se puede conseguir mediante uno o más de los métodos descritos para inhibir el VEGF, incluyendo anticuerpos neutralizantes, construcciones de receptores solubles, inhibidores de pequeñas moléculas, antisentido, aptámeros de ARN y ribozimas. Por ejemplo, se pueden emplear anticuerpos para angiogenina, tal como se describe en la Patente U.S.A. No. 5.520.914, incorporada específicamente en la presente por referencia. En cuanto a que el FGF está relacionado con la angiogénesis, también se pueden utilizar inhibidores de FGF. Algunos ejemplos son los compuestos que tienen N-acetilglucosamina alternando en la secuencia con ácido urónico 2-O-sulfatado, como sus unidades de repetición principales, incluyendo glicosaminoglicanos, tal como sulfato de arcarán. Tales compuestos están descritos en la Patente U.S.A. No. 6.028.061 y se pueden utilizar en combinación con la presente.
Actualmente, se conocen numerosos inhibidores de tirosina quinasa útiles para el tratamiento de la angiogénesis, como se pone de manifiesto en varios estados de enfermedades. Éstos incluyen, por ejemplo, las 4-aminopirrolo[2,3-d]pirimidinas de la Patente U.S.A. No. 5.639.757, que también se pueden utilizar en combinación con la presente invención. Algunos ejemplos adicionales de moléculas orgánicas capaces de modular la señal de transducción de tirosina quinasa a través del receptor VEGFR2, son los compuestos de quinazolina y las composiciones de la Patente U.S.A. No. 5.792.771, que describe combinaciones adicionales para su uso con la presente invención en el tratamiento de enfermedades angiogénicas.
También se ha mostrado que compuestos químicamente diferentes inhiben la angiogénesis y se pueden utilizar en combinación con la presente invención. Por ejemplo, se pueden emplear en terapia combinada esteroides, tales como esteroides 4,9(11) angiostáticos y esteroides oxigenados en C-21, tal como se describen en la Patente U.S.A. No. 5.972.922, incorporada específicamente en la presente por referencia. Las Patentes U.S.A. Nos. 5.712.291 y 5.593.990 describen la talidomida y compuestos relacionados, precursores, análogos, metabolitos y productos de hidrólisis, que también se pueden utilizar en combinación con la presente invención para inhibir la angiogénesis. Los compuestos de las Patentes U.S.A. Nos. 5.712.291 y 5.593.990 se pueden administrar oralmente. Algunos ejemplos adicionales de agentes antiangiogénicos que son útiles en relación a la terapia combinada, están listados en la Tabla D. Cada uno de los agentes listados en la misma es ejemplificante y, de ningún modo, limitante.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA D Inhibidores y reguladores negativos de angiogénesis
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Algunos componentes preferidos para su uso en la inhibición de la angiogénesis son la angiostatina, endostatina, vasculostatina, canstatina y maspina. Tales agentes están descritos anteriormente junto con los inmunoconjugados de la presente invención, pero se pueden utilizar en forma combinada, pero no conjugada. Otros agentes preferidos, también descritos anteriormente en forma de inmunoconjugado, son las angiopoyetinas, particularmente, la angiopoyetina-2, que se contempla para su uso combinado con la presente invención.
Ya se ha visto que ciertas terapias antiangiogénicas causan regresiones tumorales, incluyendo el polisacárido bacteriano CM101 y el anticuerpo LM609. El CM101 es un polisacárido bacteriano que ha sido bien caracterizado en su capacidad de inducir la inflamación vascular en tumores. El CM101 se une y se entrecruza con receptores expresados en el endotelio desdiferenciado que estimula la activación del sistema de complemento. También inicia una respuesta inflamatoria, conducida por citocinas, que selectivamente marca el tumor. Es un agente únicamente antipatoangiogénico que regula a la baja la expresión del VEGF y sus receptores. El CM101 está, actualmente, en pruebas clínicas como fármaco anticancerígeno, y se puede utilizar en combinación con la presente.
La trombospondina (TSP-1) y el factor plaquetario 4 (PF4) también se pueden utilizar en combinación con la presente invención. Ambos son inhibidores de la angiogénesis que se asocian con heparina y se encuentran en los \alpha-gránulos plaquetarios. La TSP-1 es una glicoproteína grande de multidominio de 450 kDa y es un constituyente de la matriz extracelular. La TSP-1 se une a muchas de las moléculas de proteoglicanos encontradas en la matriz extracelular incluyendo, HSPGs, fibronectina, laminina, y diferentes tipos de colágeno. La TSP-1 inhibe la migración y la proliferación de las células endoteliales in vitro y la angiogénesis in vivo. La TSP-1 también puede suprimir el fenotipo maligno y la tumorigénesis de las células endoteliales transformadas. Se ha visto que el gen supresor de tumor p53 regula directamente la expresión de la TSP-1, de manera que la pérdida de actividad del p53 causa una reducción drástica en la producción de la TSP-1 y un concomitante incremento en la angiogénesis iniciada del tumor.
El PF4 es una proteína de 70 aminoácidos, miembro de la familia CXC ELR de las quimiocinas, que es capaz de inhibir potencialmente la proliferación de células endoteliales in vitro y la angiogénesis in vivo. El PF4 administrado intratumoralmente o liberado mediante un vector adenoviral es capaz de causar la inhibición del crecimiento tumoral.
Los interferones y los inhibidores de metaloproteinasa son dos clases de inhibidores angiogénicos naturales que se pueden combinar con la presente invención. La actividad antiendotelial de los interferones es conocida desde principios de los años 80, aunque el mecanismo de inhibición aún no está claro. Se sabe que pueden inhibir la migración de células endoteliales y que tienen algo de actividad antiangiogénica in vivo que posiblemente está mediada por una capacidad de inhibir la producción de promotores angiogénicos mediante células tumorales. Los tumores vasculares, en particular, son sensibles al interferón, por ejemplo, proliferando hemangiomas que se pueden tratar satisfactoriamente con IFN\alpha.
Los inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMPs) son una familia de inhibidores naturales de metaloproteasas de matriz (MMPs) que también pueden inhibir la angiogénesis y se pueden utilizar en protocolos de tratamiento combinado. Las MMPs juegan un papel clave en el proceso angiogénico ya que degradan la matriz a través de la que migran las células endoteliales y los fibroblastos cuando se extiende o se remodela la red vascular. De hecho, un miembro de las MMPs, MMP-2, se ha visto que se asocia con endotelio activado a través de la integrina \alpha_{v}\beta_{3}, presumiblemente, para este objetivo. Si la interacción se interrumpe por un fragmento de MMP-2, entonces la angiogénesis se regula a la baja y se inhibe el crecimiento de tumores.
Existe un número de agentes farmacológicos que inhiben la angiogénesis, alguno o más de uno de los cuales se pueden utilizar en combinación con la presente invención. Éstos incluyen AGM-1470/TNP-470, talidomida, y carboxiamidotriazol (CAI). En 1990, se encontró que la fumagilina es un potente inhibidor de la angiogénesis, y, desde entonces, se han desarrollado los análogos sintéticos de la fumagilina, AGM-1470 y TNP-470. Ambos fármacos inhiben la proliferación de células endoteliales in vitro y la angiogénesis in vivo. Se ha estudiado ampliamente el TNP-470 en pruebas humanas clínicas con datos que sugieren que una administración a largo plazo es óptima.
Originalmente, la talidomida se utilizaba como un sedante pero se encontró que era un potente teratógeno y se abandonó. En 1994, se encontró que la talidomida es un inhibidor de la angiogénesis. Actualmente, la talidomida se usa en pruebas clínicas como agente anticancerígeno así como para el tratamiento de enfermedades vasculares del ojo.
El CAI es un inhibidor sintético de la angiogénesis de peso molecular pequeño que actúa de bloqueador del canal de calcio que previene la reorganización de la actina, la migración de las células endoteliales y la propagación sobre colágeno IV. El CAI inhibe la neovascularización en concentraciones fisiológicas accesibles y, oralmente, es bien tolerado por los pacientes de cáncer. Las pruebas clínicas con CAI han producido una estabilización de la enfermedad en el 49% de los pacientes de cáncer que tenían una enfermedad progresiva antes del tratamiento.
Se observó que la cortisona, en presencia de heparina o fragmentos de heparina, inhibe el crecimiento tumoral en ratones mediante el bloqueo de la proliferación de células endoteliales. El mecanismo implicado en el efecto inhibidor aditivo del esteroide y la heparina no está claro, a pesar de que se piensa que la heparina puede incrementar la absorción del esteroide por las células endoteliales. Se ha mostrado que la mezcla incrementa la disolución de la membrana base por debajo de los capilares nuevamente formados, y ésta es una posible explicación para el efecto angiostático aditivo. Los conjugados heparina-cortisol también tienen potentes efectos angiostáticos y antitumorales in vivo.
Algunos inhibidores de angiogénesis específicos, adicionales, incluyen, pero no se limitan a, Factor Antiinvasivo, ácidos retinoicos y paclitaxel (Patente U.S.A. No. 5.716.981); AGM-1470 (Ingber y otros, 1990); extracto de cartílago de tiburón (Patente U.S.A. No. 5.618.925); poliamida aniónica u oligómeros de poliurea (Patente U.S.A. No. 5.593.664); derivados de oxindol (Patente U.S.A. No. 5.576.330); derivados de estradiol (Patente U.S.A. No. 5.504.074); y los derivados de tiazolopirimidina (Patente U.S.A. No. 5.599.813) también se contemplan para su uso como composiciones antiangiogénicas para los usos combinados de la presente invención.
Las composiciones que comprenden un antagonista de una integrina \alpha_{V}\beta_{3} también se pueden utilizar para inhibir la angiogénesis en combinación con la presente invención. Como se da a conocer en la Patente U.S.A. No. 5.766.591, los polipéptidos que contienen RGD y sales de la misma, incluyendo polipéptidos cíclicos, son ejemplos adecuados de antagonistas de integrina \alpha_{V}\beta_{3}.
El anticuerpo LM609 contra la integrina \alpha_{V}\beta_{3} también induce a la regresión de tumores. Los antagonistas de la integrina \alpha_{V}\beta_{3}, tal como el LM609, inducen a la apoptosis de las células endoteliales angiogénicas, dejando sin afectar los vasos sanguíneos inactivos. El LM609 u otros antagonistas de \alpha_{V}\beta_{3} también pueden trabajar mediante la inhibición de la interacción de \alpha_{V}\beta_{3} y MMP-2, una enzima proteolítica que se piensa que juega un papel importante en la migración de células endoteliales y fibroblastos. La Patente U.S.A. No. 5.753.230 describe anticuerpos contra \alpha_{V}\beta_{3} (vitronectina \alpha_{V}\beta_{3}) para combinar con la presente invención en la inhibición de angiogénesis.
En este caso, la apoptosis del endotelio angiogénico puede tener un efecto cascada en el resto de la red vascular. La inhibición de cualquier respuesta de la red vascular del tumor a la señal del tumor para expanderse puede, de hecho, iniciar el colapso, parcial o total, de la red dando lugar a la muerte de la célula tumoral y la pérdida de volumen del tumor. Es posible que la endostatina y la angiostatina actúen de una manera similar. El hecho de que el LM609 no afecte a los vasos inactivos pero sea capaz de causar regresiones tumorales, sugiere firmemente que no todos los vasos sanguíneos en el tumor necesitan ser marcados en el tratamiento para obtener un efecto antitumoral.
También se pueden utilizar otros métodos de intervención terapéutica, basados en la alteración de la señalización a través del receptor Tie2, en combinación con la presente invención, tal como la utilización de un receptor soluble Tie2 capaz de bloquear la activación de Tie2 (Lin y otros, 1998). Se ha mostrado que la liberación de tal construcción utilizando terapia génica adenoviral recombinante es efectiva en el tratamiento del cáncer y en la reducción de la metástasis (Lin y otros, 1998).
G3. Agentes inductores de apoptosis
Los agentes terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, también se pueden combinar ventajosamente con métodos para inducir la apoptosis. Anteriormente, se han descrito varios agentes inductores de apoptosis en relación con los inmunoconjugados de la presente invención. Cualquier agente inductor de apoptosis de este tipo se puede utilizar en combinación con la presente invención sin estar unido a un anticuerpo de la presente invención.
A parte de los agentes inductores de apoptosis descritos anteriormente como inmunoconjugados, se han identificado algunos oncógenos que inhiben la apoptosis, o la muerte celular programada. Algunos ejemplos de oncógenos en esta categoría incluyen, pero no se limitan a, bcr-abl, bcl-2 (diferente de bcl-1, ciclina D1; Banco de Genes, números de acceso, M14745, X06487; Patente U.S.A. No. 5.650.491; y 5.539.094) y miembros de la familia que incluyen Bcl-xl, Mcl-1, Bak, A1, A20. La sobreexpresión de bcl-2 se descubrió primeramente en los linfomas de las células T. El bcl-2 actúa como un oncógeno mediante la unión y la inactivación de Bax, una proteína del mecanismo apoptópico. La inhibición de la función del bcl-2 evita la inactivación de Bax, y permite que el mecanismo apoptópico continúe.
La inhibición de esta clase de oncógenos, por ejemplo, utilizando una secuencia de nucleótidos antisentido, se contempla para su uso en la presente invención para incrementar la apoptosis (Patentes U.S.A. Nos. 5.650.491; 5.539.094, y 5.583.034).
G4. Inmunotoxinas y coaguligandos
Los métodos de tratamiento de la presente invención se pueden utilizar en combinación con (otras) inmunotoxinas y/o coaguligandos, en que la parte marcadora de los mismos, por ejemplo, anticuerpo o ligando, está dirigida a un marcador relativamente específico de la células tumorales, la vasculatura tumoral o el estroma tumoral. Al igual que los agentes quimioterapéuticos y antiangiogénicos, discutidos anteriormente, el uso combinado de toxinas o coagulantes marcados, generalmente, dará lugar a resultados antitumorales aditivos, marcadamente mayores que aditivos o incluso sinergísticos.
Generalmente hablando, los anticuerpos o ligandos para su uso en estos aspectos adicionales de la presente invención, preferiblemente reconocerán los antígenos de tumores accesibles que se expresan, preferencialmente, o específicamente, en el sitio del tumor. Los anticuerpos o ligandos también mostrarán, preferiblemente, propiedades de alta afinidad; y los anticuerpos, ligandos o conjugados de éstos, no ejercerán efectos colaterales significativos in vivo contra los tejidos normales sostenedores de la vida, tales como uno o más tejidos seleccionados del corazón, riñón, cerebro, hígado, médula ósea, colon, pecho, próstata, tiroides, vesícula biliar, pulmón, glándulas adrenales, músculo, fibras nerviosas, páncreas, piel, u otros órganos o tejidos sostenedores de la vida en el cuerpo humano. El término "efectos colaterales significativos", tal como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo, ligando o conjugado de anticuerpo, que, cuando se administre in vivo, producirá sólo efectos colaterales negligibles o clínicamente manejables, tales como aquellos encontrados normalmente durante la quimioterapia.
Como mínimo, una región de unión de estos segundos agentes anticancerígenos, empleados en combinación con la presente invención, será un componente capaz de liberar una toxina o un factor de coagulación a la región tumoral, es decir, capaz de localizarse dentro del sitio del tumor. Tales agentes marcadores se pueden dirigir contra un componente de una célula tumoral, vasculatura tumoral o estroma tumoral. Los agentes marcadores, generalmente, se unirán a un componente localizado en la superficie, accesible en la superficie o expresado en la superficie de una célula tumoral, vasculatura tumoral o estroma tumoral. Sin embargo, una vez se inicia la destrucción de la vasculatura tumoral o la célula tumoral, se liberan los componentes internos, permitiendo el marcaje adicional de, en principio, cualquier componente del tumor.
Se han descrito muchos antígenos de células tumorales, cualquiera de los cuales puede ser utilizado como diana en relación con los aspectos combinados de la presente invención. Los antígenos de células tumorales apropiados para el marcaje adicional de coaguligandos e inmunotoxinas incluyen aquellos reconocidos por los anticuerpos B3 (Patente U.S.A. No. 5.242.813); ATCC HB 10573); KSI/4 (Patente U.S.A. No. 4.975.369); obtenido a partir de una célula que comprende los vectores NRRL B-18356 y/o NRRL B-18357); 260F9 (ATCC HB 8488); y D612 (Patente U.S.A. No. 5.183.756); (ATCC HB 9796). También se puede consultar el Catálogo ATCC de cualquier año posterior para identificar otras líneas de células apropiadas que producen los anticuerpos de las células antitumorales.
Para el marcaje de la vasculatura tumoral, el anticuerpo o ligando marcador, frecuentemente, se unirá a un marcador expresado por, adsorbido a, inducido en o, de cualquier manera, localizado en los vasos sanguíneos intratumorales de un tumor vascularizado. Las moléculas diana apropiadas expresadas incluyen, por ejemplo, endoglina, E-selectina, P-selectina, VCAM-1, ICAM-1, PSMA (Liu y otros, 1997), un TIE, un ligando reactivo con LAM-1, un receptor de VEGF/VPF, un receptor de FGF, integrina \alpha_{V}\beta_{3}, pleiotropina y endosialina. Las dianas adsorbidas adecuadas son aquellas, tales como VEGF, FGF, TGF\beta, HGF, PF4, PDGF, TIMP, un ligando que se une a un TIE e isoformas de fibronectina asociadas al tumor. Los antígenos inducibles natural y artificialmente por citocinas y coagulantes también se pueden marcar, tales como ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, un ligando reactivo con LAM-1, endoglina, e incluso la Clase II de MHC (inducible por citocina, por ejemplo, por IL-1, TNF-\alpha, IFN-\gamma, IL-4 y/o TNF-\beta); y E-selectina, P-selectina, PDGF e ICAM-1 (inducible por coagulante, por ejemplo, por trombina, Factor IX/IXa, Factor X/Xa y/o plasmina).
Las siguientes patentes y solicitudes de patente incluso complementan las presentes enseñanzas respecto a la preparación y uso de inmunotoxinas dirigidas contra marcadores de la vasculatura tumoral localizados, inducidos, adsorbidos o expresados: Patente U.S.A. No. 6 093 399; Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866; 5.965.132; 6.051.230; 6.004.555; 5.877.289; 6.004.554; 5.776.427; 5.863.538; 5.660.827 y 6.036.955.
Además, los métodos y composiciones marcadoras de la vasculatura tumoral incluyen los aminofosfolípidos marcadores, tales como fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, descubiertas recientemente para ser marcadores específicos y accesibles de los vasos sanguíneos tumorales. La sola administración de anticuerpos anti-aminofosfolípidos es suficiente para inducir la trombosis y la regresión del tumor. La presente invención, de este modo, se puede combinar de forma efectiva con anticuerpos anti-fosfatidilserina y/o anti-fosfatidiletanolamina no conjugados; o se pueden utilizar inmunoconjugados de tales anticuerpos.
Las Patentes PCT WO 00/02587 y U.S.A. No. 6 312 694 incluso complementan la presente enseñanza respecto a la preparación y uso de anticuerpos de anti-aminofosfolípidos e inmunotoxinas, y, además, complementan las presentes enseñanzas respecto al uso de conjugados de proteínas de unión del aminofosfolípido, tales como conjugados de annexina, para su uso en la liberación de toxinas y coagulantes a los vasos sanguíneos del tumor y para la inducción de trombosis y regresión tumoral.
Las dianas adecuadas del estroma tumoral incluyen componentes de la matriz extracelular del tumor o del estroma, o componentes a los que éstos están unidos; incluyendo marcadores de membrana base, colágeno tipo IV, laminina, sulfato de heparán, proteoglicano, fibronectinas, plaquetas activadas, LIBS y tenascina. Un marcador preferido para tales usos es RIBS.
Las siguientes patentes y solicitudes de patente incluso complementan las presentes enseñanzas respecto a la preparación y uso de los agentes de marcaje del estroma tumoral: Solicitudes U.S.A. con Serie No. 08/482.369 (Patente U.S.A. No. 6 093 399); 08/485.482; 08/487.427 (Patente U.S.A. No. 6.004.555); 08/479.733 (Patente U.S.A. No. 5.877.289); 08/472.631; y 08/479.727 y 08/481.904 (Patente U.S.A. No. 6.036.955).
Los segundos agentes terapéuticos anticancerígenos se pueden acoplar operativamente a cualquiera de los agentes citotóxicos o, en cualquier caso, agentes anticelulares descritos en la presente para su uso en las inmunotoxinas del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3. Sin embargo, los agentes anticelulares adecuados también incluyen radioisótopos. Se preferirán fracciones de toxinas, tales como la cadena A de ricina y la cadena A desglicosilada (dgA).
El segundo agente marcado para su uso opcional con la presente invención puede comprender un componente marcado que es capaz de provocar la coagulación, es decir, un coaguligando. Aquí, el anticuerpo o ligando marcador se puede unir, directa o indirectamente, por ejemplo, a través de otro anticuerpo, a cualquier factor que, directa o indirectamente, estimula la coagulación, incluyendo cualquiera de aquellos descritos en la presente para su uso en los coaguligandos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3. Los factores de coagulación preferidos para tales usos son el Factor Tisular (TF) y derivados de TF, tales como TF truncado (tTF), TF dimérico y multimérico, y TF mutante deficiente en la capacidad de activar el Factor VII.
Las dosis efectivas de inmunotoxinas y coaguligandos para su uso combinado en el tratamiento del cáncer estarán entre 0,1 mg/kg aproximadamente y 2 mg/kg aproximadamente, y preferiblemente, entre 0,8 mg/kg aproximadamente y 1,2 mg/kg aproximadamente, cuando se administra a través de la vía IV con una frecuencia de 1 vez por semana. Necesariamente tendrán lugar algunas variaciones en la dosificación dependiendo de la condición del sujeto a tratar. El doctor responsable de la administración determinará la dosis apropiada para el sujeto individual.
G5. ADEPT y terapia con profármacos
El anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 de la presente invención, se pueden utilizar junto con profármacos, en los que el anticuerpo basado en 2C3 o el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, se asocia operativamente con un componente activador del profármaco, tal como una enzima activadora del profármaco, que convierte el profármaco en la forma más activa simplemente tras el contacto con el anticuerpo. Esta tecnología se denomina, generalmente, "ADEPT", y se describe en, por ejemplo, las Patentes WO 95/13095; WO 97/26918, WO 97/24143, y las Patentes U.S.A. Nos. 4.975.278 y 5.658.568.
El término "profármaco", tal como se usa en la presente, se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia biológicamente o farmacéuticamente activa que ejerce efectos citotóxicos, o en cualquier caso, anticelulares reducidos en células diana, incluyendo las células endoteliales vasculares del tumor, en comparación con el fármaco padre en el que se basa. Preferiblemente, el profármaco o la forma precursora ejerce efectos citotóxicos o anticelulares significativamente reducidos, o más preferiblemente, negligibles en comparación con la forma padre o "nativa". Los "profármacos" son capaces de ser activados o convertidos para producir la forma padre más activa del fármaco.
La capacidad técnica para fabricar y usar profármacos existe dentro de la habilidad de los técnicos habituales. Willman y otros (1986) y Stella y otros (1985), cada uno complementa, además, la descripción y la enseñanza respecto a cómo fabricar y utilizar varios profármacos. Las construcciones de profármacos de ejemplo que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato (Patente U.S.A. No. 4.975.278), profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos basados en péptidos (Patentes U.S.A. Nos. 5.660.829, 5.587.161; 5.405.990; WO 97/07118), profármacos modificados con D-aminoácidos, profármacos glicosilados (Patentes U.S.A. Nos. 5.561.119, 5.646.298; 4.904.768, 5.041.424), profármacos que contienen \beta-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida (Patente U.S.A. No. 4.975.278), profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, e incluso 5-fluorocitosina (Patente U.S.A. No. 4.975.278) y profármacos con 5-fluorouridina y similares.
El tipo de agente terapéutico o fármaco citotóxico que se puede utilizar en forma de profármaco es, en principio, ilimitado. Para tal forma de liberación, se preferirán los agentes más citotóxicos, sobre, por ejemplo, la liberación de coagulantes, los cuales son menos preferidos para su uso como profármacos. Lo único que se necesita para formar el profármaco es diseñar la construcción, de manera que el profármaco sea sustancialmente inactivo y el fármaco "liberado" o activado tenga actividad sustancial, o, como mínimo, suficiente para el objetivo deseado.
También se conocen y se contemplan, para su uso en la presente, varias mejoras de los profármacos originales, como se da a conocer en las Patentes WO 95/03830; EP 751.144 (antraciclinas); WO 97/07097 (ciclopropilindoles); y WO 96/20169. Por ejemplo, los profármacos con Km reducido se describen en la Patente U.S.A. No. 5.621.002, los cuales se pueden utilizar en el contexto de la presente invención. También se conoce la terapia con profármacos que se pueden dirigir intracelularmente, como se ejemplifica en la patente WO 96/03151, y se puede llevar a la práctica en la presente.
Para utilizar en ADEPT, el agente que activa o convierte el profármaco en el fármaco más activo está acoplado operativamente al anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o al anticuerpo similar al 2C3. De este modo, el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo similar al 2C3 localiza el profármaco convirtiendo la capacidad dentro del sitio angiogénico, preferiblemente, dentro del estroma y la vasculatura tumoral, de manera que el fármaco activo sólo se produce en tales regiones y no en la circulación o en tejidos sanos.
Las enzimas que se pueden acoplar al anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o a los anticuerpos basados en 2C3 para actuar en la activación del profármaco, incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina para su uso en combinación con profármacos que contienen fosfato (Patente U.S.A. No. 4.975.278); arilsulfatasa para su uso en combinación con profármacos que contienen sulfato (Patente U.S.A. No. 5.270.196), peptidasas y proteasas, tales como proteasa serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasa (Patentes U.S.A. Nos. 5.660.829; 5.587.161; 5.405.990) y catepsinas (incluyendo la catepsina B y L), para su uso en combinación con los profármacos basados en péptidos; D-alanilcarboxipeptidasas para su uso en combinación con profármacos modificados con D-aminoácidos; enzimas divisoras de carbohidratos, tales como \beta-galactosidasa y neuraminidasa para su uso en combinación con profármacos glicosilados (Patentes U.S.A. Nos. 5.561.119; 5.646.298); \beta-lactamasa para su uso en combinación con profármacos que contienen \beta-lactama; penicilina amidasas, tales como la penicilina V amidasa (Patente U.S.A. No. 4.975.278) o la penicilina G amidasa, para su uso en combinación con fármacos derivatizados en sus nitrógenos amino con grupos fenoxiacetamida o fenilacetamida; y citosina desaminasa (Patentes U.S.A. Nos. 5.338.678; 5.545.548) para su uso en combinación con profármacos basados en la 5-fluorocitosina (Patente U.S.A. No. 4.975.278).
Los anticuerpos con actividad enzimática, conocidos como anticuerpos catalíticos o "abzimas", también se pueden emplear para convertir los profármacos en fármacos activos. De este modo, los abzimas basados en el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o en los anticuerpos similares al 2C3 forman otro aspecto de la presente invención. La capacidad técnica para fabricar abzimas también existe dentro de una de las habilidades habituales en la técnica, como se ejemplifica por Massey y otros (1987), incorporada específicamente en la presente por referencia con el objetivo de complementar las enseñanzas sobre abzimas. Además se contemplan, los anticuerpos catalíticos capaces de catalizar la ruptura de un profármaco en la posición carbamato, tal como un aril carbamato de mostaza de nitrógeno, como se describe en la Patente EP 745.673, incorporada específicamente en la presente por referencia.
H. Diagnóstico e imagen
La presente invención, además, proporciona métodos de diagnóstico e imagen in vitro e in vivo. Tales métodos son aplicables para su uso en la generación de información de diagnóstico, pronóstico o de imagen para cualquier enfermedad angiogénica, como se ejemplifica por la artritis, psoriasis y tumores sólidos, pero incluyendo todas las enfermedades angiogénicas dadas a conocer en la presente. Fuera del sector de la imagen y del diagnóstico del tumor, estos aspectos de la invención son más preferidos para su uso en pruebas de diagnóstico in vitro, preferiblemente allí donde las muestras se pueden obtener de forma no invasiva y se pueden probar en ensayos con muchas muestras y/o allí donde el diagnóstico clínico es ambiguo y se desea una confirmación.
H1. Métodos y kits de inmunodetección
En algunas realizaciones adicionales, la presente invención se refiere a métodos de inmunodetección para unir, purificar, eliminar, cuantificar o, en cualquier caso, generalmente, detectar el VEGF y para diagnosticar enfermedades angiogénicas. Los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 de la presente invención, tal como el 2C3, se pueden emplear para detectar el VEGF in vivo (ver más adelante), en muestras aisladas de tejidos, biopsias o hisopos y/o en muestras de tejido homogeneizado. Tales métodos de inmunodetección tienen una evidente utilidad diagnóstica, pero también tienen aplicaciones para muestras no clínicas, tales como en la titulación de muestras de antígenos, y similares.
Se han descrito en la literatura científica, tal como, por ejemplo, en Nakamura y otros (1987), las etapas de varios métodos útiles de inmunodetección. En general, los métodos de inmunoenlace incluyen obtener una muestra sospechosa de contener VEGF y hacer contactar la muestra con anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tal como el 2C3, bajo condiciones efectivas para permitir la formación de inmunocomplejos. En tales métodos, el anticuerpo se puede unir a un soporte sólido, tal como en forma de matriz columnar, y aplicar la muestra sospechosa de contener VEGF al anticuerpo inmovilizado.
Más preferiblemente, los métodos de inmunoenlace incluyen métodos para detectar o cuantificar la cantidad de VEGF en una muestra, y estos métodos requieren la detección o cuantificación de cualquier complejo inmune formado durante el proceso de enlace. Aquí, se obtendría una muestra sospechosa de contener VEGF y se haría contactar la muestra con un anticuerpo según lo expuesto en la presente y, a continuación, se detectaría o cuantificaría la cantidad de complejos inmunes formados bajo condiciones específicas.
Las muestras biológicas analizadas pueden ser cualquier muestra sospechosa de contener VEGF, generalmente, de un animal o paciente sospechoso de tener una enfermedad angiogénica. Las muestras pueden ser una sección o ejemplar de tejido, una biopsia, un hisopo o una muestra de prueba de frotis, un extracto de tejido homogeneizado o formas separadas o purificadas de los mismos.
Poner en contacto la muestra biológica elegida con el anticuerpo bajo condiciones efectivas y durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunes (complejos inmunes primarios) es, generalmente, una cuestión de añadir simplemente una composición de anticuerpo a la muestra e incubar la mezcla durante un período de tiempo suficientemente largo para que los anticuerpos formen los complejos inmunes con, es decir, se unan a, cualquier VEGF presente. Después de este tiempo, la composición muestra-anticuerpo, tal como una sección de tejido, una placa de ELISA, transferencias de puntos o tipo Western, generalmente, se lavará para eliminar cualquier especie de anticuerpo enlazado no específicamente, permitiendo sólo ser detectados aquellos anticuerpos específicamente enlazados dentro de los complejos inmunes primarios.
La detección de la formación de inmunocomplejos es bien conocida en la técnica y se puede conseguir a través de la aplicación de numerosas aproximaciones. Estos métodos, generalmente, se basan en la detección de una etiqueta o un marcador, tal como cualquier etiqueta o marca radioactiva, fluorescente, biológica o enzimática conocida en la técnica. Las Patentes U.S.A. relacionadas con el uso de tales marcas incluyen 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. Se prefiere, generalmente, el uso de enzimas que generan un producto coloreado tras el contacto con un sustrato cromogénico. También se puede utilizar, como se conoce en la técnica, un ligando de unión secundario, tal como sistema de unión de un segundo anticuerpo o un ligando biotina/avidina.
Los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tal como el 2C3, empleados en la detección, se pueden unir ellos mismos a una marca detectable, en la que, a continuación, simplemente se detectaría esta marca, permitiendo así la determinación de la cantidad de complejos inmunes primarios en la composición.
Preferiblemente, los complejos inmunes primarios se detectan por medio de un segundo ligando de unión que tiene una afinidad de unión por los anticuerpos de la presente invención. En tales casos, el segundo ligando de unión se puede unir a una segunda marca detectable. El segundo ligando de unión es, en sí, frecuentemente, un anticuerpo, y, de este modo, se puede denominar un anticuerpo "secundario". Los complejos inmunes primarios se ponen en contacto con el ligando de unión secundario marcado, o anticuerpo, bajo condiciones efectivas y durante un período de tiempo suficiente que permita la formación de complejos inmunes secundarios. Los complejos inmunes secundarios, generalmente, se lavan para eliminar cualquier anticuerpo o ligando secundario marcado enlazado no específicamente, y, a continuación, se detecta la marca restante en los complejos inmunes secundarios.
Algunos métodos adicionales incluyen la detección de complejos inmunes primarios mediante una aproximación de dos etapas. Un segundo ligando de unión, tal como un anticuerpo, que tiene una afinidad de unión por el primer anticuerpo, se utiliza para formar complejos inmunes secundarios, tal como se ha descrito anteriormente. Después de lavar, los complejos inmunes secundarios se ponen en contacto con un tercer ligando de unión o anticuerpo que tiene una afinidad de unión por el segundo anticuerpo, otra vez bajo condiciones efectivas y durante un período de tiempo suficiente que permita la formación de complejos inmunes (complejos inmunes terciarios). El tercer ligando o anticuerpo se une a una marca detectable, permitiendo la detección de los complejos inmunes terciarios así formados. Si se desea, este sistema puede proporcionar una amplificación de señal.
En el diagnóstico o monitorización clínica de pacientes con enfermedad angiogénica, la detección del VEGF, o un incremento en los niveles de VEGF, en comparación con los niveles en una muestra biológica correspondiente, de un sujeto normal, es indicativo de un paciente con una enfermedad angiogénica.
Sin embargo, tal como se conoce por los entendidos en la técnica, tales diagnósticos clínicos no se harían probablemente en base a este método de aislamiento. Los entendidos en la técnica están muy familiarizados con la diferenciación entre la expresión significativa de un biomarcador, el cual representa una identificación positiva, y un nivel bajo o expresión de fondo de un biomarcador. De hecho, los niveles de expresión de fondo se utilizan, frecuentemente, para formar un "corte" por encima del cual un incremento en la coloración y se valorará como significativo o positivo.
H2. Formación de imágenes
Se prefieren estos aspectos de la invención para su uso en los métodos de formación de imágenes del tumor y los métodos de formación de imágenes y tratamiento de tumores combinados. Los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 que se unen a uno o más agentes detectables, se prevén para su uso en la formación de imágenes per se, o para la formación de pre-imágenes del tumor para formar una imagen fiable previa al tratamiento. Tales métodos y composiciones también se pueden aplicar al diagnóstico y formación de imágenes de cualquier otra enfermedad o condición angiogénica, particularmente tumores no malignos, aterosclerosis y condiciones en las que se desea una imagen interna para objetivos de diagnóstico o pronóstico o para diseñar un tratamiento.
Los anticuerpos para la formación de imágenes basados en 2C3 o en el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, generalmente, comprenderán un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 operativamente acoplado, o conjugado a, una marca detectable. Las "marcas detectables" son compuestos o elementos que se pueden detectar debido a sus propiedades funcionales específicas, o características químicas, el uso de los cuales permite detectar, y si se desea, cuantificar, el componente al que están acoplados. En conjugados de anticuerpo para protocolos de diagnóstico in vivo o "métodos de formación de imágenes", se requieren marcas que se pueden detectar utilizando métodos no invasivos.
En la técnica se conocen muchos agentes de formación de imágenes apropiados, así como también los métodos para su acoplamiento a anticuerpos o ligandos de unión (ver, por ejemplo, Patentes U.S.A. Nos. 5.021.236 y 4.472.509). Ciertos métodos de acoplamiento implican el uso de un complejo quelato metálico que emplea, por ejemplo, un agente quelante orgánico, tal como DTPA acoplado al anticuerpo (Patente U.S.A. No. 4.472.509). Los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer reaccionar con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento, tal como glutaraldehído o peryodato. Los conjugados con marcadores de fluoresceína se preparan en presencia de estos agentes de acoplamiento o mediante la reacción con un isotiocianato.
Un ejemplo de marcas detectables son los iones paramagnéticos. En este caso, los iones adecuados incluyen cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y erbio (III), siendo el gadolinio particularmente preferido.
Los iones útiles en otros contextos, tales como la formación de imágenes por rayos-X, incluyen, pero no se limitan a, lantano (III), oro (III), plomo (II), y especialmente, bismuto (III). Las marcas fluorescentes incluyen rodamina, fluoresceína y renografina. La rodamina y la fluoresceína frecuentemente se unen a través de un intermedio de isotiocianato.
En el caso de isótopos radioactivos para aplicaciones de diagnóstico, los ejemplos adecuados incluyen ^{14}carbono, ^{51}cromo, ^{36}cloro, ^{57}cobalto, ^{58}cobalto, cobre^{67}, ^{152}Eu, galio^{67}, ^{3}hidrógeno, yodo^{123}, yodo^{125}, yodo^{131}, indio^{111}, ^{59}hierro, ^{32}fósforo, renio^{186}, renio^{188}, ^{75}selenio, ^{35}azufre, tecnecio^{99m} e itrio^{90}. El ^{125}I se prefiere frecuentemente para su uso en ciertas realizaciones, y el tecnecio^{99m} y el indio^{111} se prefieren frecuentemente debido a su baja energía e idoneidad para la detección en un amplio intervalo.
Los anticuerpos basados en 2C3 o el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, marcados radiactivamente para su uso en la presente invención, se pueden producir según métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los grupos funcionales intermediarios que se usan frecuentemente para unir iones metálicos radioisotópicos a anticuerpos son el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y el ácido etilendiaminotetracético (EDTA).
Los anticuerpos monoclonales también se pueden yodar mediante el contacto con yoduro sódico o potásico y un agente oxidante químico, tal como hipoclorito sódico, o un agente oxidante enzimático, tal como lactoperoxidasa. Los anticuerpos, de acuerdo con la presente invención, se pueden marcar con tecnecio^{99m} mediante un proceso de intercambio de ligando, por ejemplo, mediante la reducción de pertecnato con una solución de estaño, quelando el tecnecio reducido sobre una columna Sephadex y aplicando el anticuerpo a esta columna; o mediante técnicas de marcaje directo, por ejemplo, mediante la incubación de pertecnato, un agente reductor, tal como SnCl_{2}, una solución tampón, tal como una solución de ftalato de sodio-potasio, y el anticuerpo.
Cualquiera de los tipos anteriores de anticuerpos basados en 2C3 o de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, marcados para su detección, se pueden utilizar en la formación de imágenes o en aspectos de formación de imágenes y tratamiento combinados de la presente invención. Son igualmente adecuados para su uso en diagnósticos in vitro. Las dosis para las realizaciones con formación de imágenes in vivo son, generalmente, menores que para terapia, pero también dependen de la edad y el peso del paciente. Una sola dosis debería ser suficiente.
Los métodos de formación de imágenes o diagnóstico in vivo, generalmente, comprenden la administración a un paciente de una cantidad diagnósticamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 que se conjuga con un marcador que es detectable por métodos no invasivos. El conjugado anticuerpo-marcador se deja suficiente tiempo para localizar y unirse al VEGF en el interior del tumor. A continuación, el tumor se expone a un instrumento de detección para identificar el marcador detectable, formando, de este modo, la imagen del tumor.
H3. Kits de diagnóstico
En aún realizaciones adicionales, la presente invención proporciona kits de diagnóstico, que incluyen tanto kits de formación de imágenes como de inmunodetección, para su uso con métodos de formación de imágenes e inmunodetección descritos anteriormente. Por consiguiente, se proporcionan en el kit, generalmente, comprendidos dentro de un recipiente adecuado, los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como el 2C3.
Para la inmunodetección, los anticuerpos se pueden enlazar a un soporte sólido, tal como un pocillo de una placa de microtitulación, aunque se prefieren las soluciones o polvos para la reconstitución de anticuerpos. Los kits de inmunodetección, preferiblemente, comprenden, como mínimo, un primer reactivo de inmunodetección. Los reactivos de inmunodetección del kit pueden adoptar cualquiera de una variedad de formas, incluyendo aquellas marcas detectables que se asocian con, o se unen al, anticuerpo dado. También se contemplan las marcas detectables que se asocian con, o se acoplan a, un ligando de unión secundario. Algunos ejemplos de ligandos secundarios son aquellos anticuerpos secundarios que tienen afinidad de unión por el primer anticuerpo.
Algunos reactivos de inmunodetección adicionales, adecuados para su uso en los presentes kits incluyen el reactivo de dos componentes que comprende un anticuerpo secundario, que tiene afinidad de unión por el primer anticuerpo, junto con un tercer anticuerpo, que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, estando el tercer anticuerpo unido a una marca detectable. Como se ha informado anteriormente, en la técnica se conocen algunas marcas de ejemplo y todas estas marcas se pueden emplear en relación con la presente invención. Estos kits pueden contener conjugados marca-anticuerpo, en una forma conjugada completa, en forma de intermedios, o como fracciones separadas para ser conjugadas por el usuario del kit.
Los kits de formación de imágenes, preferiblemente, comprenderán un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, tal como el 2C3, el cual ya está acoplado a una marca detectable in vivo. Sin embargo, la marca y los medios de acoplamiento se podrían suministrar de forma separada.
Cada kit puede, además, comprender agentes de control, tales como composiciones adecuadamente alicuotadas de VEGF, marcadas o no marcadas, que se pueden utilizar para preparar una curva estándar para un ensayo de detección. Los componentes de los kits se pueden compactar en un medio acuoso o en forma liofilizada.
Las formas de envase de los kits, generalmente, incluirán, como mínimo, un vial, un tubo de ensayo, un matraz, una botella, una jeringuilla u otras formas de envase, en los que se puede colocar el anticuerpo o el antígeno, y, preferiblemente, alícuotas de forma adecuada. Allí donde se proporciona un segundo o tercer ligando de unión o un componente adicional, el kit, generalmente, también contendrá un segundo, tercer u otro recipiente adicional dentro del cual se puede colocar este ligando o componente. Los kits también pueden incluir otros reactivos de diagnóstico de alguna o algunas enfermedades angiogénicas. Preferiblemente, se usará un segundo reactivo de diagnóstico que no se base en la unión de VEGF.
Los kits de la presente invención normalmente también incluirán medios para contener el anticuerpo, y cualquier otro recipiente para los reactivos, en clara dirección para la venta comercial. Tales recipientes pueden incluir inyecciones o recipientes de plástico moldeados por soplado, dentro de los cuales se guardan los viales deseados.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la presente invención. Sería de comprender, por parte de los entendidos en la técnica, que las técnicas dadas a conocer en los siguientes ejemplos, representan técnicas descubiertas por el inventor para que funcionen correctamente en la práctica de la presente invención, y, de este modo, se puede considerar que constituyen los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos entendidos en la técnica, a la luz de la presente descripción, deberían comprender que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se dan a conocer y todavía obtener resultados parecidos o similares sin huir del espíritu y el ámbito de la invención.
Ejemplo I Generación y Características Únicas del Anticuerpo Anti-VEGF 2C3 A. Materiales y métodos 1. Inmunógenos
Se sintetizaron los péptidos correspondientes a los 26 aminoácidos del extremo N-terminal del VEGF humano (huVEGF; SEQ ID NO:10) y a los 25 aminoácidos del extremo N-terminal del VEGF de cobaya (spVEGF; SEQ ID No:11) por el Biopolimers Facility del Howard Hughes Medical Institute en el UT Southwestern Medical Center de Dallas. Los péptidos tenían las siguientes secuencias (N a C):
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYC; SEQ ID NO:10; y
APMAEGEQKPREVVKFMDVYKRSYC; SEQ ID NO:11
Los péptidos se conjugaron a través de la cisteína del extremo C-terminal a tiroglobulina utilizando el enlazador succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) (Pierce, Rockford, IL). Los conjugados de control también se prepararon y consistían en L-cisteína unida a tiroglobulina. Los conjugados se separaron del péptido libre o el enlazador mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
El VEGF humano recombinante también se utilizó separadamente como un inmunógeno (obtenido por Dr. S. Ramakrishnan, University of Minnesota, Minneapolis, MN).
2. Hibridomas
Para la producción de anticuerpos anti-gpVEGF que producen hibridomas, se inmunizaron ratones C57/B1-6 con el conjugado gpVEGF-péptido-tiroglobulina en adyuvante TiterMax (CytRX Co., Norcross, Ga). Para la producción de anticuerpos VEGF anti-humanos, se inmunizaron ratones BALB/c tanto con el conjugado huVEGF-péptido-tiroglobulina o VEGF humano recombinante en TiterMax. Tres días después del último estímulo, se fusionaron esplenocitos con células de mieloma P3X63AG8.653 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) y se cultivaron, tal como se describe por Morrow y otros (1990).
3. Purificación de anticuerpos
Se purificaron los anticuerpos IgG (2C3, 12D7, 3E7) del sobrenadante del cultivo de tejido mediante la precipitación de sulfato amónico y cromatografía de Proteína A utilizando el sistema de tamponación Elución/Unión Inmunopura Pierce (Pierce).
Se purificaron los anticuerpos IgM (GV39M, 11B5, 7G3) del sobrenadante del tejido de cultivo mediante la precipitación de una solución saturada al 50% de sulfato amónico, la resuspensión de los pelets en PBS (pH 7,4) y la diálisis frente a dH_{2}O para precipitar la euglobulina. El precipitado de dH_{2}O se resuspendió en PBS y se fraccionó por cromatografía de exclusión por tamaño en una columna de Sepharosa S300 (Pharmacia). La fracción IgM fue del 85-90% de pureza, tal como se evalúa por SDS-PAGE.
4. Anticuerpos de control
Se han utilizado varios anticuerpos de control en todos estos estudios que incluyen mAb 4.6.1 (VEGF anti-humano de ratón del Genentech, Inc.), Ab-3 (VEGF anti-humano de ratón del Oncogene Science, Inc.), A-20 (VEGF anti-humano de conejo del Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), OX7 (Thy 1.1 anti-rata de ratón del Dr. A. F. Williams, MRC Cellular Immunology Unit, Oxford, UK), MTSA (una IgM de mieloma de ratón de especificidad irrelevante del Dr. E. S. Vitetta, UT-Southwestern, Dallas, TX), 1A8 (8Flk-1 anti-ratón de ratón; Philip E. Thorpe y colegas), MECA 32 (endotelio anti-ratón de rata del Dr. E. Butcher, Stanford University, Stanford, CA), y TEC 11 (endoglina anti-humana de ratón; Patente U.S.A. No. 5.660.827).
5. Screening inicial
Para el screening inicial, se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos (Falcon, Franklin Lakes, NJ) con 250 ng del péptido VEGF o el conjugado VEGF-Cys-tiroglobulina y se bloquearon con hidrolisato ácido de caseína al 5% (Sigma, St. Louis, MO). Los sobrenadantes de los hibridomas anti-gpVEGF y los hibridomas VEGF anti-humanos iniciales se verificaron en las placas recubiertas de antígeno a través de una técnica ELISA indirecta dual (Crowther, 1995).
Los hibridomas que mostraron reactividad preferencial con el péptido VEGF-tiroglobulina pero ninguna, o una reactividad muy débil, con Cys-tiroglobulina se verificaron adicionalmente con inmunohistoquímica (descrito a continuación) en secciona congeladas de tejido tumoral.
6. Inmunohistoquímica
Las células tumorales de carcinoma hepatocelular de la línea 10 de cobaya (obtenidas del Dr. Ronald Neuman, NIH, Bethesda, MD) se hicieron crecer en cobayas de la cepa dos (NCI, Bethesda, MD). Los tumores humanos carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) NCI-H358, NSCLC NCI-H460 (ambos obtenidos del Dr. Adi Gazdar, UT Southwestern, Dallas, TX), adenocarcinoma de colon HT29 (American Type Culture Collection), y el linfoma de Hodgkin L540CY (obtenido del Profesor V. Diehl, Colonia, Alemania) se hicieron crecer como xenoinjertos en ratones CB17 SCID (Charles river, Wilmington, MA).
Los tumores fueron congelados instantáneamente en nitrógeno líquido y almacenados a -70ºC. Se obtuvieron muestras congeladas de ejemplares tumorales de pacientes de la National Cancer Institute Cooperative Human Tissue Network (Southern Division, Birmingham, AL). Se realizó la inmunohistoquímica, tal como está descrita por Burrows y otros (1995).
7. Ensayo ELISA
Los sobrenadantes de hibridoma de animales inmunizados con VEGF se verificaron a través de una técnica ELISA indirecta diferencial empleando tres antígenos diferentes: VEGF humano solo, complejo VEGF:Flk-1/SEAP, y Flk-1/SEAP solo. Para el VEGF humano solo, se recubrieron ciertas placas ELISA con 100 ng de VEGF.
Para el Flk-1/SEAP solo, se recubrieron otras placas ELISA con 500 ng de Flk-1/SEAP, una forma soluble del receptor de VEGF de ratón (se obtuvieron células que segregan Flk-1/SEAP del Dr. Ihor Lemischka, Princeton University, Princeton, NJ). La proteína Flk-1/SEAP se produjo y se purificó tal como se describe por Tessler y otros (1994). Básicamente, el dominio extracelular de Flk-1 (sFlk-1) se produjo en células de Spodoptera frugiperda (Sf9) y se purificó mediante técnicas de inmunoafinidad utilizando un anticuerpo monoclonal anti-Flk-1 (1A8). A continuación, el sFlk-1 se biotiniló y se enlazó en placas recubiertas de avidina.
Para preparar placas recubiertas con el complejo VEGF:Flk-1/SEAP, se biotiniló la Flk-1 purificada y se hizo reaccionar con VEGF durante toda la noche a 4ºC en un tampón de unión (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, albúmina de suero bovino 20 \mug/ml y heparina 0,1 \mug/ml) en una proporción molar de sFlk-1 a VEGF de 2,5:1 para ayudar en la formación del dímero. A continuación, el complejo VEGF:sFlk-1 se incubó en pocillos recubiertos de avidina de una placa de microtitulación de 96 pocillos para producir placas recubiertas con VEGF asociado con su receptor.
A continuación, se determinó la reactividad de los anticuerpos con VEGF solo, sFlk-1 biotinilado y el complejo VEGF:sFlk-1 en estudios controlados utilizando los tres antígenos en placas recubiertas de avidina. La reactividad se determinó tal como se describió anteriormente para el screening inicial.
También se desarrolló un ELISA de captura. En el ELISA de captura, se recubrieron placas de microtitulación con 100 ng del anticuerpo indicado durante toda la noche a 4ºC. Se lavaron y se bloquearon los pocillos como se indicó anteriormente, y a continuación, se incubaron con varias concentraciones de VEGF biotinilado o VEGF:sFlk-1-biotina. La estreptavidina conjugada a peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) diluida 1:2000, se utilizó como una segunda capa y se desarrolló.
Los estudios ELISA de competición se realizaron mediante un primer marcaje de los anticuerpos con peroxidasa, según las instrucciones del fabricante (EZ-Link Activated Peroxidase, Pierce). El antígeno utilizado para los estudios de competición con 12D7, 3E7, 2C3 y 7G3 fue VEGF-biotina capturado por avidina en una placa ELISA. Se incubaron, aproximadamente, 0,5-2,0 \mug/ml de anticuerpo de prueba marcado con peroxidasa en la placa en presencia de una disolución tampón sola, una IgG irrelevante, o los otros anticuerpos de competición anti-VEGF en un exceso de 10-100 veces.
Se calculó la unión del anticuerpo marcado mediante la adición del sustrato 3,3'5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc). Después de 15 minutos, se pararon las reacciones con H_{3}PO_{4} 1M y se leyeron espectrofotométricamente a 450 nm. El ensayo se realizó por triplicado, como mínimo, dos veces para cada combinación de anticuerpo competidor y marcado. Dos anticuerpos se consideró que estaban en el mismo grupo epítopo si se bloqueaban el uno al otro, de forma cruzada, la unión en más de un 80%.
El GV39M y el 11B5 no mantenían la actividad de unión después del marcaje con peroxidasa pero toleraban la biotinilación. Se biotinilaron el GV39M y el 11B5 y se analizaron frente a VEGF:sFlk-1 que había sido capturado por el anticuerpo anti-Flk-1 (1A8) o recubierto directamente en una placa ELISA.
8. Análisis por transferencia tipo Western
Se separó el VEGF recombinante purificado en presencia de suero de ternera fetal al 5% mediante SDS-PAGE al 12%, bajo condiciones reductoras y no reductoras, y se transfirió a nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa se bloqueó utilizando Sea-Block PP82-41 (East Coast Biologics, Berwick, ME) y se sondeó con anticuerpos primarios utilizando un aparato de mini-transferencia (Inmunetics, Cambridge, MA). Las membranas se desarrollaron tras la incubación con el anticuerpo secundario conjugado de peroxidasa apropiado, por quimioluminiscencia mejorada de ECL.
B. Resultados 1. El 2C3 tiene una especificidad de epítopo única
La Tabla 1 resume la información sobre la clase/subclase de diferentes anticuerpos anti-VEGF, los grupos epítopos que éstos reconocen en el VEGF, y su unión preferencial al VEGF o al complejo VEGF:receptor (VEGF:Flk-1). En todos los ejemplos, los anticuerpos se unieron igualmente bien a VEGF121 y VEGF165 y produjeron esencialmente los mismos resultados. Los resultados siguientes corresponden a VEGF165 a menos que se estipule lo contrario.
TABLA 1 Resumen de las propiedades del anticuerpo anti-VEGF
9 
\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{140mm} 1. Los grupos de epítopos se
determinaron a través de un ELISA
competitivo.\end{minipage} \cr  \begin{minipage}{140mm} 2.
Los ratones se inmunizaron con un péptido sintético, correspondiente
a los 26 aminoácidos del extremo N-terminal del VEGF
humano (11B5, 3E7, 7G3, y 12D7) o bien a los 25 aminoácidos del 
extremo N-terminal del VEGF de cobaya (GV39M), o con
VEGF humano recombinante de longitud completa
(2C3).\end{minipage} \cr  \begin{minipage}{140mm} 3. Para
verificar la reactividad de los anticuerpos con VEGF solo o con VEGF
asociado con sFlk-1 (VEGF:Flk-1) se
realizó un ELISA indirecto y uno de captura.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{140mm} 4. El A4.6.1 tiene un epítopo definido
exactamente, el cual es diferente del epítopo del Grupo 4 reconocido
por 2C3. Los estudios sobre el A4.6.1 se explican en Kim y otros,
1992; Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1998; y Keyt y otros,
1996, incorporada específicamente en la presente por
referencia.\end{minipage} \cr}
Los estudios de unión competitiva utilizando anticuerpos de prueba biotinilados o marcados con peroxidasa y un exceso de 10-100 veces de anticuerpos competitivos no marcados mostraron que el 2C3 se une a un único epítopo. Estos estudios primeramente revelaron que el GV39M y el 11B5 se bloquearon el uno al otro, de forma cruzada, la unión a VEGF:Flk-1, y que el 3E7 y 7G3 se bloquearon el uno al otro, de forma cruzada, la unión a VEGF-biotina capturada sobre avidina. El GV39M y 11B5 se asignaron arbitrariamente al grupo de epítopo 1, mientras que el 3E7 y 7G3 se asignaron al grupo de epítopo 2.
El 2C3 y el anticuerpo restante, 12D7, no interfirieron significativamente en la unión del otro o en la unión del resto de anticuerpos al VEGF o al complejo VEGF:receptor. El 12D7 se asignó al grupo de epítopo 3, y el 2C3 se asignó al grupo de epítopo 4 (Tabla 1).
Tal como se expresó en la tabla anterior, el 2C3 ve un epítopo diferente al anticuerpo A4.6.1. Los estudios de competición de los inventores mostraron que el 2C3 y el A4.6.1 no reaccionan de forma cruzada. El epítopo reconocido por el A4.6.1 también se había definido exactamente y es un epítopo continuo centrado alrededor de los aminoácidos 89-94 (Kim y otros, 1992; Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1998; Keyt y otros, 1996). Existen también un número conocido de diferencias entre el 2C3 y el A4.6.1 (ver más adelante).
2. El 2C3 se puede unir al VEGF libre
Existían marcadas diferencias en la capacidad de los anticuerpos para unirse a VEGF soluble en forma libre y compleja (Tabla 2). Estos estudios proporcionaron evidencias adicionales de la naturaleza única del 2C3. La Tabla 2 muestra que el GV39M y el 11B5 exhiben una fuerte preferencia por el complejo VEGF:receptor, alcanzando una unión media-máxima con VEGF:Flk-1 con 5,5 y 2 nM, respectivamente, en comparación con 400 y 800 nM, respectivamente, para el VEGF libre en solución.
En cambio, el 2C3 y el 12D7 exhibieron una preferencia por el VEGF libre, alcanzando una unión media-máxima con 1 y 20 nM, respectivamente, en comparación con 150 y 250 nM, respectivamente, para el complejo VEGF:Flk-1. Sin embargo, tras una inyección in vivo (ver más adelante), el 2C3 se localiza en la vasculatura tumoral, así como en el estroma tumoral.
El 3E7 se enlazó igual de bien al VEGF libre y al complejo VEGF:Flk-1, alcanzando una unión media-máxima con 1 nM para ambos.
TABLA 2 ELISA de captura de VEGF vs. VEGF:FLK-1
10 
\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 * Valor extrapolado\cr  \begin{minipage}{140mm} 1. Los valores
de la unión media-máxima se determinaron mediante la
valoración de VEGF biotinilado y sFlk-1 biotinilado
complejados con VEGF en pocillos triplicados recubiertos del
anticuerpo indicado y, a continuación, el desarrollo con avidina
marcada con peroxidasa.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{140mm} 2. Las proporciones mayores de 1,0
indican una preferencia del anticuerpo por el complejo
(VEGF/VEGF:Flk-1), mientras que proporciones menores
de 1,0 indican una preferencia por el VEGF.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{140mm} 3. Los anticuerpos de control
utilizados incluían: 1A8 (anti-Flk-1
de ratón), Mab 4.6.1 (VEGF anti-humano de ratón de
Genentech), y una IgM irrelevante como control
negativo.\end{minipage} \cr  4. NR: No se detectó
reacción.\cr}
3. El 2C3 reconoce un epítopo no dependiente de conformación
Los análisis por transferencia tipo Western muestran que el 12D7, 2C3 y 7G3 reaccionan con VEGF121 y VEGF165 desnaturalizado bajo condiciones reductoras y no reductoras. Estos anticuerpos, por tanto, parecen reconocer epítopos no dependen de la conformación.
En cambio, el GV39M, 11B5, y 3E7 no reaccionaron con VEGF en transferencias tipo Western, posiblemente porque reconocen un epítopo en el extremo N-terminal del VEGF que depende de la conformación y se deforma bajo condiciones desnaturalizantes.
Los análisis por transferencia tipo Western de los anticuerpos anti-VEGF se llevaron a cabo mediante la separación de VEGF165 en presencia de un 5% de FCS utilizando SDS-PAGE en un gel al 12% y el análisis mediante un protocolo de Transferencia tipo Western estándar utilizando detección ECL. Los anticuerpos primarios se incubaron con la membrana de nitrocelulosa utilizando un aparato de mini-transferencia multi-línea. Los anticuerpos de control incluían: Ab-3, una IgG monoclonal específica para VEGF del Oncogene Science en una concentración de 1 \mug/ml, A-20, un anticuerpo anti-VEGF de ratón de Santa Cruz Biotechnology, Inc. en una concentración de 5 \mug/ml, y una IgG de especificidad irrelevante en una concentración de 10 \mug/ml.
Una Transferencia tipo Western típico para los diferentes anticuerpos, incluyendo el 2C3 en una concentración de 5 \mug/ml, mostró VEGF dimérico como una banda amplia de aproximadamente 42 kd. También fue evidente un multímero de VEGF de aproximadamente 130 kd con el 12D7, 7G3, y un anticuerpo de control positivo.
4. Inmunohistoquímica de tumor
Los tumores examinados a través de inmunohistoquímica fueron tumores humanos de varios tipos de pacientes de cáncer, xenoinjertos de tumor humano transplantables de varios tipos desarrollados en ratones, tumor de la Línea 10 de cobaya desarrollado en cobaya, y tumor 3LL de ratón desarrollado en ratones (ver leyenda de la Tabla 3 para más detalles).
Se determinó la reactividad inmunohistoquímica del 3E7, GV39M, y 11B5 en xenoinjertos NSCLC NCI-H358 humanos y se comparó con anticuerpos de control (una IgG de especificidad irrelevante; A-20, un anticuerpo anti-VEGF de conejo; y MECA 32; un anticuerpo de célula endotelial anti-ratón de rata). Se tiñeron secciones congeladas de 8 \mum de NSCLC NCI-H358 humanos desarrollados en ratones SCID utilizando una técnica de inmunoperoxidasa indirecta y se contracoloreó con hematoxilina.
Se determinó que el GV39M y el 11B5, que reconocen el grupo de epítopo 1 en VEGF, teñían fuertemente las células del endotelio vascular y, moderadamente, el tejido conectivo perivascular, en todos los tumores examinados. Los anticuerpos del grupo de epítopo 1 diferían en su reactividad con las células tumorales, en cuanto a que el GV39M sólo reaccionaba débilmente con células tumorales mientras que el 11B5 reaccionaba más severamente. Aproximadamente un 80% de las células endoteliales que se tiñeron por MECA 32 (ratón) o TEC 11 (humano) también se tiñeron por GV39M y 11B5.
El 3E7 y el 7G3, que reconocen el grupo de epítopo 2 del VEGF, mostraron reactividad con células endoteliales vasculares, tejido conectivo, y células tumorales en todos los tumores examinados (Tabla 3). La intensidad de tinción de la célula endotelial era normalmente más intensa que la tinción de la célula tumoral o del tejido conectivo, especialmente cuando los anticuerpos se aplicaron en concentraciones bajas (1-2 \mug/ml) donde no existía una selectividad apreciablemente incrementada para el endotelio vascular.
TABLA 3
Reactividad inmunohistoquímica de anticuerpos anti-VEGF en secciones de tumores
Tinción de células Endoteliales
11 
\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{140mm} Los ensayos inmunohistoquímicos se
realizaron en secciones congeladas fijadas en acetona de tejidos
tumorales a través de técnicas inmunohistoquímicas estándares. Las
secciones se examinaron microscópicamente y se clasificó su
reactividad como se indica: -, negativa; +/-, muy débil; 1+, débil;
2+, moderada; 3+, fuerte; 4+, muy fuerte.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{140mm} 1. El 2C3 y el 12D7 se aplicaron en una
concentración de 20  \mu g/ml; todos los otros anticuerpos estaban
en una concentración de 5-10
 \mu g/ml.\end{minipage} \cr  \begin{minipage}{140mm} 2.
Definiciones de reactividad: EC = endotelio; CT = tejido conectivo;
TC = célula tumoral; NR = no hay reacción.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{140mm} 3. Los xenoinjertos de tumores humanos
analizados: NSCLC NCI-H358, NSCLC
NCI-H460, adenocarcinoma de colon HT29, linfoma de
Hodgkin L540.\end{minipage} \cr  \begin{minipage}{140mm} 4.
Los tumores humanos analizados: Sarcoma de tejido suave, linfoma de
Hodgkin, Renal, Pecho, Parótida, Colon, Pulmón, y Carcinomas
endometriales.\end{minipage} \cr  5. Reactividad con VEGF de
cobaya en secciones de tumores de cobaya de la línea 10.\cr
 \begin{minipage}{140mm} 6. Reactividad con VEGF de ratón en
secciones de tumores de carcinoma de pulmón de Lewis 3LL de un
ratón.\end{minipage} \cr}
El 12D7 y el 2C3 no tiñeron las secciones congeladas de ninguno de los tejidos tumorales, probablemente porque la fijación de acetona al tejido destruyó la unión del anticuerpo. Sin embargo, tras la inyección in vivo (ver posteriormente), el 2C3 se localizó en el tejido tumoral.
El GV39M, 11B5, 3E7 y 7G3 reaccionaron con la vasculatura de roedor en secciones congeladas de tumores de la linea 10 de cobaya desarrollados en cobayas y de tumor 3LL de ratón desarrollado en ratones. El GV39M, 11B5, y 7G3 reaccionaron tan fuertemente con la vasculatura tumoral de cobaya y ratón como lo hicieron con la vasculatura humana en muestras de tumores humanos. El 3E7 tiñó el tumor 3LL de ratón menos intensamente de lo que lo hizo con las secciones tumorales de cobaya o humano, sugiriendo que el 3E7 tiene una afinidad inferior para el VEGF de ratón. Estos resultados concuerdan con los ensayos realizados mediante un ELISA indirecto, en los que se mostraba que todos los anticuerpos, excepto el 2C3, reaccionan con VEGF de ratón.
Ejemplo II El 2C3 inhibe la migración de células endoteliales A. Materiales y métodos Ensayo de crecimiento de células endoteliales
Se colocaron células endoteliales aórticas bovinas adultas (ABAE) en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos en una proporción de 1500 células/pocillo y se hicieron crecer en presencia de VEGF humano 0,5 nM, con la adición de varios anticuerpos de muestra y control. Los pocillos de control recibieron medios con o sin VEGF.
Después de 4 días de incubación, se cuantificaron las células mediante un ensayo de conversión de MTS (sal interna de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboxilmetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio), en el que la conversión de MTS a formazán es proporcional al número de células y se puede seguir mediante absorbancia a 490 nm (Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI). El ensayo se realizó según las instrucciones del fabricante.
El crecimiento de células se estimó mediante la sustracción de la conversión de MTS en cultivos a los que no se añadió VEGF. Los resultados se expresaron como un porcentaje de la conversión de MTS en cultivos de control a los que sólo se añadió VEGF (Buttke y otros, 1993).
B. Resultados Inhibición del crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF
Los anticuerpos IgG, 3E7 y 12D7, que reconocen los grupos de epítopo 1-3 en VEGF, no inhibían el crecimiento mediado por el VEGF de las células ABAE (figura 1), sugiriendo que son anticuerpos anti-VEGF no bloqueadores, cuyos epítopos no están implicados en la interacción VEGF:KDR. El anticuerpo IgM, GV39M, también reconoce los grupos de epítopo 1-3 en VEGF, e igualmente no inhibía el crecimiento mediado por el VEGF de las células ABAE y es un anticuerpo anti-VEGF no bloqueador.
En cambio, el 2C3 contra el epítopo 4 en VEGF y un anticuerpo anti-VEGF neutralizante de referencia, Mab 4.6.1, inhibían el crecimiento de ABAE mediado por el VEGF en un 50% a las concentraciones de 3 nM y 1 nM, respectivamente (figura 1). Esto indica que el 2C3 puede neutralizar la actividad mitogénica del VEGF.
La definición del 2C3 como bloqueador de Mab distingue el 2C3 de un grupo de anticuerpos además del GV39M, 3E7 y 12D7. Varios anticuerpos anti-VEGF, tal como el Ab-3, se sabe que son monoclonales no bloqueadores, los cuales son claramente diferentes del 2C3.
Uno de los anticuerpos IgM, 11B5, era tóxico a las células ABAE en una concentración de 8 nM o superior. Las células se separaron en 30 minutos y en 24 horas se tiñeron con azul tripán. Este efecto parecer ser específico del tipo de célula ya que las HUVEC, células endoteliales aórticas porcinas, y las células bEND.3 no quedaban afectadas por el 11B5, incluso, a una concentración de 40 nM. El efecto tóxico del 11B5 parece ser independiente del factor de crecimiento como ocurría en ausencia del VEGF añadido y en presencia del factor básico del crecimiento de fibroblastos (bFGF).
Ejemplo III El 2C3 se localiza específicamente en tumores in vivo A. Materiales y métodos Localización in vivo de xenoinjertos de tumores humanos
Los tumores se hicieron crecer subcutáneamente en ratones inmunocomprometidos (NSCLC NCI-H358 en ratones nu/nu y adenocarcinoma de colon HT29 en ratones SCID) hasta que el volumen del tumor era de aproximadamente 1 cm^{3}. Se inyectaron intravenosamente a través de una vena de la cola, 100 \mug de anticuerpo no marcado para estudios que utilizaron ratones SCID, o 100 \mug de anticuerpo biotinilado para estudios que utilizaron ratones desnudos. Veinticuatro horas más tarde, se anestesiaron los ratones, se rociaron con PBS, y se recogieron el tumor y los órganos que incluían al corazón, pulmones, hígado, riñones, intestinos y bazo y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido.
El tumor y los órganos de cada ratón se seccionaron en un criostato y se tiñeron inmunohistoquímicamente para un anticuerpo, como se describió anteriormente, con la excepción de que las secciones de los ratones desnudos se desarrollaron utilizando el complejo de estreptavidina-biotina marcado con peroxidasa (Dako, Carpinteria, CA) y las secciones de los ratones SCID se desarrollaron utilizando anticuerpos secundarios conjugados con dos peroxidasas, una IgG + IgM anti-ratón de cabra seguida por una IgG anti-cabra de conejo.
B. Resultados Localización in vivo de ratones con tumor
Se determinó la localización in vivo del 2C3, 3E7, y GV39M en xenoinjertos de tumores humanos. Se inyectaron intravenosamente 100 \mug de 2C3 biotinilado o IgG de control del mismo isotipo en ratones nu/nu con NSCLC NCI-H358 humano. Se inyectaron 100 \mug de GV39M y 3E7 o IgG de control del mismo isotipo en ratones SCID con adenocarcinomas colónicos humanos, HT29. Veinticuatro horas después, se sacrificaron los ratones, se desangraron y se extrajeron los tumores y tejidos. Se analizaron inmunohistoquímicamente secciones congeladas de los tumores y los tejidos para determinar la unión y distribución de los anticuerpos (Tabla 4).
TABLA 4 Distribución en los tejidos de anticuerpos anti-VEGF en ratones con tumor 
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{140mm} Los ensayos inmunohistoquímicos se
realizaron en secciones congeladas de tejidos fijados en acetona,
incluyendo el tumor, del ratón con tumor que había recibido 100 mg
del anticuerpo indicado de forma intravenosa, 24 horas antes al
sacrificio. Las secciones se examinaron microscópicamente y se
clasificó su reactividad específica como se indica: -, negativa;
+/-, muy débil; 1+, débil; 2+, moderada; 3+, fuerte; 4+, muy
fuerte.\end{minipage} \cr  \begin{minipage}{140mm} 1. El
GV39M se unió específicamente a células endoteliales o mesangiales
en los glomérulos renales.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{140mm} 2. El 3E7 y GV39M se unieron
específicamente al endotelio vascular del tumor mientras que el 2C3
se unió específicamente al estroma tumoral.\end{minipage} \cr 
3. Control = IgM de especificidad
irrelevante.\cr}
El 3E7 se localizó específicamente en el endotelio vascular dentro de los tumores. Aproximadamente un 70% de los vasos sanguíneos de MECA 32 positivos se tiñeron por 3E7 inyectado in vivo. Los vasos sanguíneos más amplios que alimentaban la microvasculatura, eran positivos para el 3E7. Los microvasos pequeños en ambas partes del estroma y los nidos del tumor también fueron positivos para el 3E7. La intensidad de la tinción por el 3E7 se incrementó en y alrededor de las áreas de necrosis focal. En las áreas necróticas del tumor, el anticuerpo extravascular era evidente, pero en regiones sanas del tumor había una pequeña evidencia de tinción extravascular. El endotelio vascular en todos los tejidos normales examinados, incluyendo el riñón, no estaba teñido por el 3E7.
El GV39M también se localizó específicamente en el endotelio vascular de los tumores. Aproximadamente un 80% de los vasos sanguíneos de MECA 32 positivos en el tumor se tiñeron por GV39M. Los vasos positivos para el GV39M se distribuían uniformemente por todo el tumor, incluyendo vasos sanguíneos amplios, pero también capilares pequeños. Igual que con el 3E7, la intensidad de tinción de los vasos sanguíneos positivos para el GV39M se incrementó en áreas de necrosis focal en el tumor. Sin embargo, a diferencia del 3E7, las células endoteliales o mesangiales de los glomérulos renales también estaban teñidas. Parece ser que la tinción de los glomérulos renales por el GV39M es específica de antígeno, ya que una IgM de control de especificidad irrelevante no producía la tinción de los glomérulos renales. El endotelio vascular de otros tejidos, aparte del riñón, no se tiñó por el GV39M.
Tras una inyección intravenosa, el 2C3 biotinilado produjo una tinción intensa del tejido conectivo alrededor de la vasculatura del tumor humano NSCLC H358. Las amplias partes del tejido estromal que conectan los nidos de la célula tumoral se tiñeron por el 2C3, observándose la mayor intensidad de localización en las partes más amplias del estroma. En estas regiones, no era posible distinguir el endotelio vascular del tejido conectivo circundante. Sin embargo, se tiñeron las células endoteliales de vasos que no estaban rodeados por el estroma, tales como vasos que circulaban a través de los propios nidos de células tumorales. En ninguno de los tejidos normales examinados se detectó tinción por el 2C3.
En el modelo de tumor humano HT29, el 2C3 también se localizó fuertemente en el tejido conectivo, pero la tinción más intensa se observó en las regiones necróticas del tumor.
Ejemplo IV El 2C3 inhibe la unión del VEGF al VEGFR2, pero no al VEGFR1 A. Materiales y métodos 1. Líneas de células y anticuerpos
Se obtuvieron células endoteliales aórticas porcinas (PAE) transfectadas con VEGFR1 (PAE/FLT) o VEGFR2 (PAE/KDR) del Dr. Johannes Waltenberger (Ulm, Alemania), preparadas tal como se describe en Waltenberger y otros (1994, incorporada específicamente en la presente por referencia), y se hicieron crecer en un medio F-12 que contenía un 5% de FCS, L-glutamina, penicilina, y estreptomicina (GPS). Las células bEND.3 se obtuvieron del Dr. Werner Risau (Bad Nauheim, Alemania) y se hicieron crecer en un medio DMEM que contenía un 5% de FCS y GPS. En un medio DMEM que contenía un 10% de FCS y GPS se hicieron crecer NSCLC NCI-H358 (obtenidos del Dr. Adi Gazdar, UT-Southwestern, Dallas, TX), rabdomiosarcoma humano A673, y fibrosarcoma humano HT1080 (ambas del American Type Culture Collection).
El 2C3 y el 3E7, anticuerpos monoclonales anti-VEGF, y el 1A8, anticuerpo monoclonal anti-Flk-1, y el T014, un anticuerpo policlonal anti-Flk-1 son como se describieron anteriormente en el Ejemplo I y en Brekken y otros (1998) y Huang y otros (1998), cada una incorporada específicamente en la presente por referencia. El A4.6.1, anticuerpo monoclonal VEGF anti-humano de ratón, se obtuvo del Dr. Jin Kim (Genentech Inc., CA) y se ha descrito ya anteriormente (Kim y otros, 1992; incorporada específicamente en la presente por referencia). Los anticuerpos de control negativo utilizados fueron OX7, un anticuerpo Thy1.1 anti-rata de ratón (Bukovsky y otros, 1983), obtenido del Dr. A.F. Williams (MRC Cellular Inmmunology Unit, Oxford, UK) y el C44, un anticuerpo anti-colquicina de ratón (Rouan y otros, 1990, obtenido de la ATCC).
2. Ensayo ELISA
Con el dominio extracelular del VEGFR1 (Flt-1/Fc, R&D Systems, Minneapolis) o del VEGFR2 (sFlk-1-biotina) se recubrieron directamente pocillos de una placa de microtitulación o dichos dominios se capturaron por pocillos recubiertos de NeutrAvidina (Pierce, Rockford, IL), respectivamente. Se incubó el VEGF en una concentración de 1 nM (40 ng/ml) en los pocillos en presencia o ausencia de anticuerpos de prueba o control de concentración 100-1000 nM (15-150 \mug/ml). A continuación, se incubaron los pocillos con anticuerpo anti-VEGF de conejo 1 \mug/ml (A-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Las reacciones se desarrollaron mediante la adición de anticuerpo anti-conejo de cabra marcado con peroxidasa (Dako, Carpinteria, CA) y se visualizaron mediante la adición del sustrato 3,3'5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.). Las reacciones se detuvieron después de 15 minutos con H_{3}PO_{4} 1M y se leyeron espectrofotométricamente a 450 nm.
El ensayo también se realizó mediante el recubrimiento de pocillos de placas de microtitulación con IgG de prueba o de control. A continuación, se incubaron los pocillos con VEGF:Flt-1/Fc o VEGF:sFlk-1-biotina y se desarrollaron con Fc anti-humano de cabra marcado con peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) o con estreptavidina marcada con peroxidasa, respectivamente, y se visualizaron como se indicó anteriormente.
3. Ensayo de coprecipitación
Se preincubaron 40 ng de VEGF con el F(ab')_{2} del 2C3 (20 \mug) o del A4.6.1 (10 y 1 \mug) durante 30 minutos en un tampón de unión (DMEM con CaCl_{2} 1 mM, CuSO_{4} 0,1 mM, y 0,5% de triptona). Se añadieron 200 ng de las formas solubles de VEGFR1 (Flt-1/Fc) o VEGFR2 (KDR/Fc, R&D Systems, Minneapolis, MN) para un volumen total de 50 \mul y se incubaron durante 2 horas. Las construcciones receptor/Fc se precipitaron utilizando bolas de Proteína A-sefarosa y el precipitado resultante se lavó 4 veces con tampón de unión.
Se añadió un tampón reductor de muestra al pelet y sobrenadante de cada reacción y ambos se analizaron mediante SDS-PAGE 12% y se transfirieron a membranas de PVDF. A continuación, las membranas se probaron con 12D7 (1,0 \mug/ml), un anticuerpo anti-VEGF de ratón y se desarrollaron, después de incubación, con IgG anti-ratón de cabra marcada con peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) mediante un sustrato de quimioluminiscencia de Súper Señal (Pierce, Rockford, IL). Las construcciones solubles receptor/Fc también se detectaron mediante el uso de Fc anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.).
B. Resultados 1. El 2C3 bloquea la Unión del VEGF al VEGFR2, pero no al VEGFR1 en ELISAs
En el ensayo ELISA, el anticuerpo 2C3 anti-VEGF bloqueaba el VEGF en la unión a VEGFR2 (KDR/Flk-1) pero no a VEGFR1 (FLT-1). En presencia de un exceso molar de 100 veces y 1000 veces de 2C3, la cantidad de VEGF que se unía a los pocillos recubiertos con VEGFR2 se reducía al 26 y 19%, respectivamente, de la cantidad de VEGF que se unía en ausencia de 2C3 (figura 2). En cambio, en presencia de un exceso molar de 100 veces y 1000 veces de 2C3, la cantidad de VEGF que se unía a los pocillos recubiertos con VEGFR1 era del 92 y 105% respectivamente, de la cantidad que se unía en ausencia de 2C3 (figura 2).
Las cantidades de VEGF que se unían a VEGFR1 y a VEGFR2 no se vieron afectadas por la presencia de un exceso de 100-1000 veces de anticuerpo monoclonal anti-VEGF no bloqueador 3E7 o de una IgG de control de especificidad irrelevante (figura 2). El A4.6.1 bloqueaba la unión del VEGF a VEGFR2 (KDR/Flk-1) y a VEGFR1 (FLT-1).
2. El 2C3 bloquea la Unión del VEGF al VEGFR2, pero no al VEGFR1 en solución
La capacidad del 2C3 de bloquear la unión del VEGF a VEGFR1/Fc o a VEGFR2/Fc en solución se evaluó con ensayos de coprecipitación. Se incubaron 40 ng de VEGF con 200 ng de dominio extracelular de VEGFR1 unido a una parte de Fc (Flt-1/Fc) o VEGFR2 (KDR/Fc) unido a una parte de Fc (Flt-1/Fc) en presencia o ausencia de 2C3 o F(ab')_{2} de 4.6.1. Las construcciones receptor/Fc se precipitaron mediante la incubación con bolas de Proteína A sefarosa. El precipitado se lavó y se resuspendió en un tampón reductor de muestra y se separó con SDS-PAGE 12% y se transfirió a PVDF. La membrana se bloqueó con PP82 y se probó con anticuerpo anti-VEGF de ratón 12D7 (1 \mug/ml) y se desarrolló bajo condiciones de quimioluminiscencia estándares. Se detectaron el monómero y el dímero de VEGF junto con F(ab')_{2}.
El VEGF mezclado con VEGFR1/Fc o VEGFR2/Fc se coprecipitó con la ayuda de Proteína A-sefarosa, mostrando que el VEGF se une a ambos receptores. La adición del F(ab')_{2} de 2C3 bloqueaba la unión del VEGF al VEGFR2/Fc, pero no a VEGFR1/Fc. En cambio, el F(ab')_{2} de 4.6.1 bloqueaba la unión del VEGF tanto a VEGFR2/Fc como a VEGFR1/Fc. Los resultados confirman que el 2C3 inhibe la unión del VEGF a VEGFR2 pero no a VEGFR1, mientras que el anticuerpo 4.6.1 inhibe la unión del VEGF tanto a VEGFR2 como a VEGFR1.
Ejemplo V El 2C3 bloquea la fosforilación, inducida por el VEGF, del VEGFR2 A. Materiales y métodos Inmunoprecipitación y análisis por transferencia tipo Western
Las células PAE/KDR, PAE/FLT, y bEND.3 se hicieron crecer hasta una confluencia del 80-90% en platos de tejido de 100 mm en un medio que contenía un 5% se suero. A continuación, las células se privaron de suero durante 24 horas en un medio que contenía un 0,1% de suero. Después de un pretratamiento con ortovanadato sódico 100 nM en PBS durante 30 minutos, las células se incubaron con VEGF165 5 nM (200 ng/ml), bFGF 5nM (100 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN), o un medio acondicionado con un tumor A673, en presencia o ausencia, de anticuerpos de prueba o de control durante 15 minutos adicionales.
A continuación, se lavaron las células con PBS, enfriado con hielo, que contenía EDTA 10 mM, fluoruro sódico 2 mM, ortovanadato sódico 2 mM y se lisaron con tampón de lisis (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, 0,25% de desoxicolato sódico, 0,1% de CHAPS, EDTA 5 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, fluoruro sódico 2 mM, ortovanadato sódico 2 mM, 10% de glicerol e inhibidores de proteasa (tabletas de un Cóctel Inhibidor de Proteasa Completo, Boehringer Mannheim). Los lisados se aclararon por centrifugación y el sobrenadante resultante se utilizó para inmunoprecipitación.
El VEGFR1 y el VEGFR2 se inmunoprecipitaron mediante la incubación de lisados de células durante toda la noche a 4ºC con 5 \mug de extremo N-terminal de anti-FLT-1 de pollo (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) o 10 \mug de T014 (anti-Flk-1 purificado por afinidad), respectivamente. Las reacciones que utilizaban el anticuerpo anti-FLT-1 de pollo se incubaron posteriormente con un anticuerpo puente anti-pollo de cabra (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) durante 1 hora a 4ºC. A continuación, el complejo inmune se precipitó con Proteína A/G sefarosa, se lavó múltiples veces con un tampón de lisis al 10% (con inhibidores de proteasa añadidos) en PBS-tween (0,2%) y se hizo hervir en un tampón de SDS de muestra que contenía \beta-mercaptoetanol 100 mM y urea 8 M.
A continuación, se separaron las muestras mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon durante 30-60 minutos con PP81 (East Coast Biologics, Berwick, ME) y se probaron para residuos de fosfotirosina con 0,5 \mug/ml de 4G10 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) durante toda la noche a 4ºC. Las membranas de PVDF se desarrollaron, tras incubación, con IgG anti-ratón de conejo marcada con peroxidasa (Dako, Carpinteria, CA) mediante un sustrato de quimioluminiscencia de Súper Señal (Pierce, Rockford, IL). A continuación, las membranas de PVDF se deshicieron con un tampón de Elución Inmunopuro (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos a 55ºC y se reprobaron para niveles de receptor con anti-FLT-1 de pollo 0,5 \mug/ml o T014 1,0 \mug/ml y se desarrollaron, como se indicó anteriormente, tras la incubación, con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa.
B. Resultados Bloqueo de la fosforilación inducida por el VEGF
En estos estudios, las células PAE/KDR se estimularon durante 15 minutos con PBS, bFGF (5 nM, 100 ng/ml), VEGF165 (5 nM, 210 ng/ml), medio acondicionado con A673 (CM), CM en combinación con anticuerpos particulares (separadamente, CNTL, 2C3, 3E7, A4.6.1 con una concentración de 100 nM, 15 \mug/ml), o T014 solo (100 nM, 15 \mug/ml). Las células PAE/FLT también se estimularon durante 15 minutos con PBS, VEGF165 (5 nM, 210 ng/ml), medio acondicionado con A673 (CM), CM en combinación con anticuerpos particulares (separadamente, 2C3, 3E7, A4.6.1 con una concentración de 100 nM, 15 \mug/ml), o T014 solo (100 nM, 15 \mug/ml). A continuación, se incubaron las células en un tampón de lisis y se inmunoprecipitó el receptor, se separó por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras, se transfirió a membranas de PVDF y se probó con 4G10 (0,5 \mug/ml), anticuerpo anti-fosfotirosina de ratón, y se desarrolló bajo condiciones de quimioluminiscencia estándares. A continuación, se deshicieron las membranas y se reprobó con la IgG inmunoprecipitante para determinar el nivel de proteína de receptor en cada línea.
Los resultados mostraron que el 2C3, junto con el A4.6.1, un anticuerpo anti-VEGF neutralizante de control, bloquean la fosforilación inducida por el VEGF, de VEGFR2 en células PAE/KDR. Esto está de acuerdo con los resultados previos que demostraban que el 2C3 y el A4.6.1 bloquean el crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF (Ejemplo II; Brekken y otros, 1998). Las transferencias tipo Western de VEGFR2 en los inmunoprecipitados se realizaron para probar las cantidades de proteína de VEFGR2 en cada línea. El 3E7, que reconoce un epítopo del extremo NH_{2}-terminal del VEGF, no bloqueaba la fosforilación inducida por el VEGF, de VEGFR2, ni tampoco lo hizo la IgG de control de especificidad irrelevante.
El efecto del 2C3 en la fosforilación inducida por el VEGF, de VEGFR1, no está claro. Tal como ya han mostrado otros investigadores, la fosforilación inducida por el VEGF, de VEGFR1 en células PAE/FLT es difícil de demostrar, posiblemente debido a la baja actividad de quinasa intrínseca de VEGFR1 (De Vries y otros, 1992; Waltenberger y otros, 1994; Davis-Smyth y otros, 1996; Landgren y otros, 1998).
Ejemplo VI El 2C3 inhibe la permeabilidad inducida por el VEGF A. Materiales y métodos Ensayo de permeabilidad de miles
El protocolo se siguió tal como se describe por Murohara y otros (1998). Brevemente, se anestesiaron 400-450 g de cobaya sin pelo, IAF, macho (Charles River, Wilmington, MA) y, a continuación, se inyectaron intravenosamente con 0,5 ml de tinte azul de Evan (0,5%) en PBS estéril a través de una vena de la oreja. Veinte minutos más tarde, se inyectaron intradérmicamente (i.d.) 20 ng de VEGF en presencia o ausencia de los anticuerpos de prueba o de control. Se fotografiaron las manchas azules resultantes de la espalda de la cobaya y se midieron con un calibrador, 30 minutos después de las inyecciones i.d.
B. Resultados El 2C3 bloquea la permeabilidad inducida por el VEGF
Para investigar los efectos del 2C3 en la permeabilidad inducida por el VEGF, se anestesiaron 400-450 g, en tamaño, de cobaya (cepa Hartley) sin pelo IAF y se inyectaron intravenosamente con 0,5 ml de tinte azul de Evan (0,5%) en PBS estéril a través de una vena de la oreja. Veinte minutos más tarde, se inyectaron intradérmicamente (i.d.) 25 ng de VEGF en presencia o ausencia de los anticuerpos de prueba o de control. Se fotografiaron las manchas azules resultantes de la espalda de la cobaya y se midieron con un calibrador, 30 minutos después de las inyecciones i.d.
Utilizando el ensayo de permeabilidad de Miles, se encontró que el 2C3, que bloquea al VEGF de la activación de VEGFR2, inhibía la permeabilidad inducida por el VEGF en cobayas. Este efecto era evidente con 2C3 con un exceso molar de 10, 100, ó 1000 veces sobre el VEGF. El A4.6.1, que bloquea el VEGF de la activación de VEGFR2 y VEGFR1, bloqueaba la permeabilidad inducida por el VEGF con un exceso molar de 10 veces (estudios presentes y Kim y otros, 1992). El 3E7, y un IgG de control que no bloquea la interacción VEGF: VEGFR2, tampoco bloquean la permeabilidad inducida por el VEGF en los ensayos de permeabilidad de Miles en cobayas.
Estos resultados sugieren que la permeabilidad endotelial, mediada por el VEGF, está mediada, como mínimo en parte, a través de la activación de VEGFR2. Estos resultados concuerdan con aquellos de otros investigadores que mostraron que la actividad de la tirosina quinasa del VEGFR2 es necesaria para la permeabilidad inducida por el VEGF (Murohara y otros, 1998; Joukov y otros, 1998; Ogawa y otros, 1998).
Ejemplo VII Efectos anti-tumorales del 2C3 A. Materiales y métodos 1. Inhibición del crecimiento del tumor in vivo
Se inyectaron subcutáneamente 1 x 10^{7} células NSCLC NCI-H358 ó 5 x 10^{6} células de rabdomiosarcoma A673 a ratones nu/nu en el día 0. En el día 1 y, posteriormente, dos veces por semana, a los ratones se les suministraron intraperitonealmente inyecciones de 2C3 en cantidades de 1, 10 ó 100 \mug o controles, tal como se indicó. A continuación, se midieron los tumores dos veces por semana durante un período de aproximadamente seis semanas, para los ratones con NCI-H358 y de cuatro semanas, para los ratones con A673. El volumen del tumor se calculó según la fórmula: volumen = L x W x H, en la que L = longitud, W = anchura, H = altura.
2. Terapia tumoral in vivo
Se inyectaron intraperitonealmente anticuerpos de control o de prueba a ratones nu/nu machos que tenían tumores NCI-H358 o fibrosarcoma HT1080 subcutáneo de 200-400 mm^{3} de tamaño. Los ratones con NCI-H358 se trataron con 100 \mug de anticuerpos por inyección tres veces por semana durante la primera semana y dos veces por semana durante la segunda y tercera semana. A continuación, se cambió a 50 \mug por inyección cada cinco días. Los ratones con HT1080 se trataron con 100 \mug del anticuerpo indicado o solución salina un día sí y otro no durante toda la duración del estudio. En ambos estudios, los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 2500 mm^{3} o antes, si los tumores empezaban a ulcerar.
B. Resultados 1. Inhibición del 2C3 del crecimiento de xenoinjertos de tumores humanos recién implantados
El 2C3 inhibe el crecimiento in vivo de NSCLC NCI-H358 y del rabdomiosarcoma A673 en ratones nu/nu de una forma dependiente de la dosis (figura 3A y figura 3B). Se administraron intraperitonealmente 100 \mug de 2C3, dos veces por semana, a ratones que habían sido inyectados subcutáneamente con células tumorales un día antes, y se inhibió el crecimiento de ambos tipos de tumores humanos. El volumen del tumor final en los receptores de 2C3 era aproximadamente de 150 mm^{3} en ambos sistemas tumorales, en comparación con los aproximadamente 1000 mm^{3} en los receptores de los controles.
El tratamiento con 10 ó 1 \mug de 2C3 dos veces por semana era menos efectivo en la prevención del crecimiento del tumor. Sin embargo, ambas dosis inferiores de 2C3 ralentizaban el crecimiento de tumores A673 hasta un grado similar comparado al de ratones no tratados. El retraso en el crecimiento del tumor, causado por una dosis de 10 \mug de 2C3, era menos marcado en el modelo de tumor NCI-H358. Las diferencias entre estos dos modelos de tumor y sus respuestas a la inhibición de la actividad de VEGFR2 por el 2C3 se correlacionan con la agresividad de los dos tipos de tumores in vivo. El NCI-H358 crece in vivo mucho más lentamente que lo hace el A673 y parece ser menos sensible a las dosis bajas de 2C3, mientras que los tumores A673 crecen más rápidamente y agresivamente y parecen ser más sensibles a las dosis bajas de 2C3.
El 3E7, que se une al VEGF, pero no bloquea su actividad, no tenía ningún efecto en el crecimiento de tumores NCI-H358. Sin embargo, el 3E7 administrado en una dosis de 100 \mug, dos veces por semana, estimulaba el crecimiento de tumores A673 (figura 3B), sugiriendo que incrementa la eficiencia de la señalización del VEGF en el tumor.
2. Tratamiento de xenoinjertos de tumores humanos establecidos con 2c3
Se inyectaron intraperitonealmente 2C3, A4.6.1, 3E7, o una IgG de especificidad irrelevante (figura 4) a ratones con tumores subcutáneos NSCLC NCI-H358, que habían crecido hasta un tamaño aproximado de 300-450 mm^{3}. Las dosis fueron de 50-100 \mug cada 3-5 días. El A4.6.1 se utilizó como un control positivo ya que se había observado por otros investigadores que bloqueaba la actividad del VEGF in vivo, dando lugar a una inhibición del crecimiento del tumor (Kim y otros, 1993; Mesiano y otros, 1998). Además de medirse el volumen medio del tumor (figura 4), también se tomaron fotografías de los ratones de cada grupo de tratamiento para mostrar las diferencias en el tamaño del tumor y la apariencia al final del estudio.
El tratamiento con 2C3 o A4.6.1 llevó a una regresión lenta de los tumores durante el curso del estudio. Los volúmenes medios de los tumores al final del estudio fueron del 30% (2C3) y del 35% (4.6.1) del volumen inicial medio del tumor (figura 4). Sin embargo, estos resultados son complicados debido al hecho de que se observó un retraso espontáneo en el crecimiento del tumor, en los grupos de control de los ratones, entre 40 y 60 días después de la inyección de células tumorales. Los resultados hasta los 40 días, antes de que el retraso espontáneo en el crecimiento fuera evidente, mostraron que el tratamiento con 2C3 y A4.6.1 previene el crecimiento del tumor.
La figura 5A muestra un estudio adicional en el que los ratones con NCI H358 se trataron durante un período prolongado de tiempo con 100 \mug de 2C3 o 3E7. En este estudio, las regresiones espontáneas fueron menos pronunciadas. El volumen medio del tumor de los ratones tratados con 2C3 al inicio del tratamiento era de 480 mm^{3} y después de aproximadamente 14 semanas de tratamiento, el volumen medio del tumor cayó hasta los 84 mm^{3}, un descenso de aproximadamente el 80% en volumen. Los ratones tratados con 3E7 iniciaron el tratamiento con un volumen medio del tumor de 428 mm^{3} y se aumentó hasta un volumen de 1326 mm^{3} después de aproximadamente 14 semanas, un incremento del 300% en volumen.
La figura 5B muestra las curvas del crecimiento del tumor de ratones con fibrosarcoma humano HT1080, cada uno de los cuales fueron tratados, cada dos días, con 100 \mug de 2C3, 3E7, una IgG de control, o solución salina. El 2C3 detuvo el crecimiento de los tumores durante el tiempo que se continuó el tratamiento. Los ratones tratados con 3E7, IgG de control o solución salina crearon tumores que crecieron progresivamente y hasta un tamaño que requirió sacrificar los ratones antes de 4 semanas después de la inyección en células tumorales.
Ejemplo VIII El 2C3 es diferente del A4.6.1
Existen algunas diferencias entre el 2C3 y el A4.6.1 (por ejemplo, Tabla 5). Los anticuerpos reconocen diferentes epítopos en el VEGF basados en los estudios de bloqueo cruzado con ELISA (Ejemplo I). La mutagénesis y los estudios cristalográficos con Rayos-X han mostrado anteriormente que el A4.6.1 se une a un epítopo en el VEGF que está centrado alrededor de los aminoácidos 89-94 (Muller y otros, 1998).
De particular interés es el hecho de que el A4.6.1 bloquea el VEGF de la unión tanto a VEGFR1 como a VEGFR2 (Kim y otros, 1992; Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1998; Keyt y otros, 1996), mientras que el 2C3 sólo bloquea el VEGF de la unión a VEGFR2 (Ejemplo IV). La evidencia convincente publicada de que el A4.6.1 inhibe la unión del VEGF a VEGFR2 y VEGFR1 proviene de estudios estructurales y cristalográficos detallados (Kim y otros, 1992; Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1998; Keyt y otros, 1996). Los datos publicados indican que el A4.6.1 inhibe la unión del VEGF a VEGFR2 mediante la competición por el epítopo en el VEGF que es crítico para la unión a VEGFR2, y bloquea la unión del VEGF a VEGFR1 probablemente debido a impedimentos estéricos (Muller y otros, 1998; Keyt y otros, 1996).
Una versión humanizada del A4.6.1 se encuentra actualmente en pruebas clínicas (Brem, 1998; Baca y otros, 1997; Presta y otros, 1997). La quimiotaxis de macrófagos/monocitos y otras funciones endógenas del VEGF que son mediadas a través del VEGFR1 probablemente disminuirán en las pruebas con A4.6.1. En cambio, el 2C3 se prevé que sea superior debido a su capacidad de bloquear específicamente los efectos mediados por el VEGFR2. El 2C3 es, de este modo, un anticuerpo potencialmente más seguro, particularmente para la administración en humanos. Los beneficios del tratamiento con 2C3 incluyen la capacidad del huésped de crear una respuesta anti-tumoral mayor, permitiendo la migración de macrófagos al tumor al mismo tiempo que bloquea la expansión de la vasculatura del tumor inducida por el VEGF. Además, no se deberían pasar por alto los muchos beneficios sistémicos de mantener la quimiotaxis de macrófagos y otros efectos mediados por VEGFR1.
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TABLA 5 Características de los anticuerpos anti-VEGF 2C3 y A4.6.1
13 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{140mm} Abreviaciones utilizadas: IHC,
inmunohistoquímica; NR, sin reactividad; BV, vasos sanguíneos; CT,
tejido conectivo.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{140mm} 1. Las referencias para los datos del
A4.6.1 incluyen Kim y otros, 1992; Wiesmann y otros, 1997; Muller y
otros; 1998 y Keyt y otros, 1996.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{140mm} 2. El epítopo que el 2C3 reconoce en el
VEGF no está definido pero se ha mostrado que es diferente del
epítopo que el A4.6.1 reconoce a partir de estudios de bloqueo
cruzado con ELISA.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{140mm} 3. La afinidad del 2C3 por el VEGF se
ha estimado mediante un ELISA y un análisis de resonancia de
plasmones superficiales.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{140mm} 4. El A4.6.1 sólo reacciona con
secciones congeladas fijadas en acetona, ligeramente
fijadas.\end{minipage} \cr}
Ejemplo IX Tinción con VEGF en tejido artrítico
La relación entre angiogénesis y enfermedad se extiende más allá de lo observado en tumores vacularizados. Por ejemplo, la implicación de angiogénesis aberrante está bien documentada en la artritis. Se han utilizado un conjunto de diferentes anticuerpos anti-VEGF y anticuerpos para timidina fosforilasa para teñir tejido artrítico y diferenciar a éste de controles complementados. En estudios que utilizan anticuerpos contra VEGF se ha mostrado una expresión sorprendente en el pannus de la artritis reumatoide.
Ejemplo X Conjugados 2C3-endostatina A. Clonación y expresión de la endostatina
Se aisló el ARN del hígado de un ratón y se utilizó como molde para RT-PCR^{TM} con los siguientes cebadores:
cebador 5' aga cca tgg gtc ata ctc atc agg act ttc a (SEQ ID NO:43);
cebador 3' ctac cat ggc tat ttg gag aaa gag gtc a (SEQ ID No:44).
El fragmento ADNc resultante tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO:12 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13. Para referencia, la secuencia de aminoácidos de la endostatina humana es SEQ ID NO:14. El fragmento de ADNc de ratón se clonó en el vector de expresión H6pQE60 (Qiagen), el cual codifica el tag de 6 x histidina del extremo N-terminal, y a continuación, se expresó en células de E.coli M15. Cuando la densidad de la célula de E. coli alcanzó una densidad óptica de 0,6 a 560 nM, se añadió isopropiltiogalactósido (IPTG) 0,1 mM durante 4 horas para inducir la expresión de endostatina 6-His. Las células se recogieron por centrifugación y se lisaron en un tampón de lisis (Reactivo de Extracción de Proteína Bacteriana B-PER (Pierce, Rockford, IL)).
Los cuerpos de inclusión, que contenían la endostatina 6-His, se sedimentaron por centrifugación y se disolvieron en un tampón A (pH 8,0, HCl guanidina (GuHCl) 6 M, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris 10 mM, imidazol 10 mM, \beta-2-mercaptoetanol 10 mM). Se trató la solución que contenía la endostatina 6-His reducida con un exceso de ácido 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) (reactivo de Ellman) (20 mM) y se cargó en una columna Ni-NTA. La columna se lavó con tampón de lavado (GuHCl 6 M, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris 10 mM, NaCl 500 mM, pH 7,3) y la endostatina 6-His se eluyó de la columna con imidazol 0,2 M en tampón de lavado.
El eluido y la endostatina 6-His insoluble se diluyeron con un volumen igual de tampón de replegamiento (urea 3M, Tris 1 M pH 7,3, L-arginina 0,5 M, NaCl 0,5 M, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, glutationa reducida 1 mM (GSH)) y se incubaron durante toda la noche a temperatura ambiente. La endostatina 6-His replegada se dializó extensamente frente a PBS, pH 7,4 a temperatura ambiente. La proteína resultante, la endostatina 6-His, era soluble y muy pura según un análisis SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras en el que apareció como una única banda de 20 kDa.
B. Actividad funcional de la endostatina
Además del hecho de que la proteína expresada es totalmente soluble, otra evidencia de que la endostatina 6-His expresada en E.coli es biológicamente activa, incluye la unión probada a células endoteliales. Se preparó endostatina 6-His biotinilada y se incubó con tres tipos de células endoteliales diferentes in vitro (células endoteliales de ratón Bend3; células endoteliales aórticas bovinas, ABAE; y células endoteliales de cordón umbilical humano, HUVEC). La unión se detectó utilizando estreptavidina-peroxidasa junto con O-fenilendiamina (OPD) y se leyó la absorbancia a 490 nm.
Los estudios de unión directa mostraron que la endostatina (6-His Biotinilada) se enlazó de una forma saturable a estos tres tipos diferentes de células endoteliales in vitro. También se observó que la endostatina (sin marcar) competía con la endostatina biotinilada por la unión a células endoteliales Bend3.
C. Conjugación de la endostatina a 2C3 a través de SMPT y 2-IT
Se añadió 4-succinimidiloxicarbonil-\alpha-metil-\alpha-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT) en N'N-dimetilformamida (DMF) a una IgG 2C3 en una proporción molar de 5:1 (SMPT:2C3) y se incubó a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora en PBS con EDTA 5 mM (PBSE). Se extrajo el SMPT libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25 llevada a cabo en PBSE. Simultáneamente, se incubó la endostatina 6-His de ratón con 2-iminotiolano (2-IT, reactivo de Traut) en una proporción molar de 1:5 (endostatina:2-IT) durante 1 hora a RT. Se extrajo el 2-IT libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25 llevada a cabo en PBSE.
El 2C3 modificado con SMPT se mezcló con endostatina 6-His modificada con 2-IT, se concentró a 3-5 ml, y se incubó durante 24 horas a RT con agitación moderada. Se analizó la reacción por SDS-PAGE. El 2C3-SMPT no conjugado se extrajo del conjugado mediante cromatografía de afinidad de heparina, proporcionando así 2C3-endostatina.
D. Conjugación de la endostatina a 2C3 a través de SMCC y SATA
Se incubó N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) con endostatina 6-His en una proporción molar de 6:1 (SATA:endostatina) durante 30 minutos a RT. Se extrajo el SATA libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25 llevada a cabo en PBSE. La endostatina 6-His modificada con SATA en PBSE se concentró a 4,0 ml y se añadió 0,4 ml de solución de desacetilación (hidroxilamina 0,1 M). La mezcla se incubó a RT durante 2 horas. Simultáneamente, IgG 2C3, en PBSE, se incubó con succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) en una proporción molar de 1:5 (2C3:SMCC). Se extrajo el SMCC libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25 llevada a cabo en PBSE.
A continuación, la endostatina modificada con SATA desacetilada se incubó con 2C3 modificado con SMCC, se concentró a aproximadamente 5 mg/ml de proteína total bajo nitrógeno, y se incubó durante toda la noche a RT con agitación moderada. La reacción se analizó mediante SDS-PAGE. Se extrajo el 2C3-MCC no conjugado del conjugado 2C3-endostatina mediante cromatografía de afinidad de heparina en PBSE, proporcionando así 2C3-endostatina. También se consiguió una conjugación satisfactoria utilizando 2-iminotiolano en lugar de SATA como agente tiolante.
E. Proteínas de fusión de 2C3 y endostatina
Como las secuencias de ADN para endostatina humana y de ratón, y para el 2C3 están disponibles (y proporcionadas en la presente), las proteínas de fusión 2C3-endostatina se pueden preparar fácilmente. La expresión y el replegamiento de la endostatina, tal como se describió anteriormente, muestran que la expresión recombinante satisfactoria de esta molécula es, efectivamente, posible.
La preparación de una proteína de fusión 2C3-endostatina puede hacerse de forma que la endostatina esté presente en el extremo C-terminal de la cadena pesada de 2C3 o unida a un fragmento ScFv del 2C3. En estos casos, la tecnología recombinante hace que la variación de las uniones sea muy sencilla, y se prevé, particularmente, el uso de secuencias divisibles selectivamente para unir las dos partes funcionales. Actualmente se prefieren las secuencias divisibles de plasmina o MMP.
La disponibilidad de secuencias divisibles selectivamente y la adaptabilidad de la tecnología recombinante, también prevén proteínas de fusión en las que la endostatina se sustituye en otro punto de la construcción del 2C3. La endostatina permanecerá incrustada en el interior del 2C3 hasta que contacte con una enzima que actúe en la secuencia selectivamente divisible, en cuyo punto la endostatina funcional se libera de la proteína de fusión.
Ejemplo XI Conjugados 2C3-Ang-2 A. Expresión de Ang-2
Para construir un conjugado 2C3-Ang-2, la Ang-2 se usa preferiblemente en forma recombinante, ya que se puede producir en células de insectos que utilizan un sistema de expresión de baculovirus. El protocolo actual preferido para la expresión y purificación de Ang-2 implica la clonación de ADNc de Ang-2 a partir de ARN de placenta de ratón mediante RT-PCR^{TM} y la clonación del ADNc de Ang-2 en el vector de expresión pFastBac1. Las células competentes de E. coli DH10Bac se transforman con el plásmido recombinante.
Tras la selección antibiótica, se eligen las colonias de E. coli que contienen Bácmido recombinante, se hacen crecer y se purifica el ADN de Bácmido recombinante. Las células de insecto SF9 se transfectan con el ADN de Bácmido recombinante utilizando el reactivo Cellfectin. Se recogen los baculovirus recombinantes del sobrenadante de las células SF9 transfectadas. Los baculovirus recombinantes se amplifican y se utilizan para infectar células SF9 y, entonces, las células SF9 infectadas expresarán Ang-2. La Ang-2 se purifica a partir del sobrenadante de tales células SF9 infectadas mediante purificación de afinidad.
B. Conjugación de Ang-2 a 2C3
El 2C3 purificado se conjuga al Ang-2 recombinante utilizando el enlazador químico SMPT, generalmente, tal como se describió anteriormente. Se añadió SMPT en N'N-dimetilformamida (DMF) a una IgG 2C3 en una proporción molar de 5:1 (SMPT:2C3) y se incubó a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora en PBS con EDTA 5 mM (PBSE). Se extrajo el SMPT libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25 llevada a cabo en PBSE. Simultáneamente, se incubó Ang-2 recombinante con 2-IT a RT. Se extrajo el 2-IT libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25 llevada a cabo en PBSE.
El 2C3 modificado con SMPT se mezcla con Ang-2 recombinante modificado con 2-IT, se concentra, y se incuba durante 24 horas a RT con agitación moderada. Se analiza la reacción por SDS-PAGE. El 2C3-SMPT no conjugado se extrae del conjugado mediante cromatografía de filtración en gel, proporcionando así 2C3-endostatina.
Ejemplo XII Conjugados 2C3-factor tisular
El 2C3 se modificó con SMPT, tal como se describió en los ejemplos anteriores. Se extrajo el SMPT libre mediante una cromatografía G25, tal como se describió anteriormente, a excepción del pico (2C3-SMPT) que se recogió bajo nitrógeno. Se extrajeron 600 \mul de 2C3-SMPT para cuantificar los grupos tiopiridilo tras la adición de ditiotreitol (DTT) a 50 mM. Se introdujeron una media de 3 grupos MPT por IgG. El factor tisular truncado humano (tTF) que tiene un residuo de cisteína introducido en el extremo N-terminal se redujo con \beta2-ME 5 mM. Se extrajo el \beta2-ME por cromatografía G25.
Se juntó el N-Cys-tTF reducido con el 2C3-SMPT y se incubaron en una proporción molar 2,5:1 (tTF:IgG) durante 24 horas a RT. La reacción se concentró hasta 1-2 ml utilizando un Amicon con una membrana cortada de peso molecular de 50.000 (MWCO). El tTF y IgG no conjugados se separaron de los conjugados utilizando una cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200, proporcionando, de este modo, 2C3-tTF.
Ejemplo XIII Conjugados 2C3-CRM107
El 2C3 se modificó con SMPT. El agente citotóxico, CRM107 (del Dr. Jerry Fulton; Inland Laboratories, DeSoto, TX) se modificó con 2-IT, tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores. El 2C3 modificado con SMPT se incubó con CRM107 modificado con 2-IT en una proporción molar de 1:5 (IgG: CRM107) durante 24 horas a RT con agitación moderada. El 2C3 conjugado se separó de los reactivos libres mediante una cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200, proporcionando, de este modo, 2C3-CRM107.
Ejemplo XIV Estudios de profármacos de 2C3 A. Clonación y expresión de \beta-glucuronidasa (GUS)
Se obtuvo, de Novagen, Inc, un plásmido (pBacgus-1) que contenía el gen de GUS de E.coli. Se utilizó el plásmido como molde para PCR para clonar el gen de GUS en el vector de expresión H6pQE60, el cual codifica un tag de 6 x histidina de extremo N-terminal. Se hicieron crecer células de E. coli M15 que transportaban el plásmido hasta que la densidad de la células alcanzó una densidad óptica de 0,6 a 560 nM. Se añadió isopropiltiogalactósido (IPTG) para inducir la expresión del GUS 6 his. Después de 4 horas, las células se recogieron por centrifugación.
El pelet de E.coli se lisó en un tampón de lisis de células (Reactivo de Extracción de Proteína Bacteriana B-PER (Pierce, Rockford, IL)). La solución se cargó en una columna Ni-NTA, ésta se lavó con tampón de lavado (GuHCl 6 M, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris 10 mM, NaCl 500 mM, pH 7,3) y la GUS 6-His enlazada se eluyó con imidazol 0,2 M en el mismo tampón.
Según un análisis SDS-PAGE, en el que apareció como una única banda de 75 kDa, la GUS 6-his era pura. En las columnas de filtración en gel, la GUs 6-His aparece como un tetrámero de unos 300 kDa. La GUS 6-His era enzimáticamente activa, tal como se deduce de su capacidad de dividir el sustrato p-nitrofenil-\beta-D-glucurónido (PNPG).
B. Conjugación de 2C3 a \beta-glucuronidasa (GUS)
Se incubó N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) con GUS en una proporción molar 6:1 (SATA:GUS) durante 30 minutos a RT. Se extrajo el SATA libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25 llevada a cabo en PBSE. La GUS modificada con SATA se concentró hasta 4,0 ml y se añadieron 0,4 ml de solución de desacetilación (hidroxilamina 0,1 M). La mezcla se incubó durante 2 horas a RT. Simultáneamente, IgG 2C3, en PBSE, se incubó con succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) en una proporción molar de 1:5 (2C3:SMCC). Se extrajo el SMCC libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25 llevada a cabo en PBSE.
A continuación, el GUS modificada con SATA se incubó con 2C3 modificado con SMCC durante toda la noche a RT con agitación moderada. Se extrajo la GUS libre mediante una cromatografía de intercambio iónico en Q-Sefarosa, eluyendo el 2C3 libre y el conjugado 2C3-GUS con NaCl 0,5 M en PBS. La solución resultante se separó mediante una cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200, obteniendo 2C3-GUS con una pureza del 90%.
C. Actividad biológica del conjugado 2C3-GUS
Se confirmó la actividad biológica de cada componente del conjugado 2C3-GUS. El 2C3-GUS se enlazó específicamente a pocillos recubiertos de VEGF en un ELISA controlado apropiadamente, ya que se detectaba mediante una IgG anti-ratón marcada con HRP secundaria y OPD. La unión media-máxima se observó con una concentración de 0,1 nM. De este modo, la parte de unión del 2C3 funciona correctamente. La parte de GUS también mantuvo la actividad enzimática.
El 2C3-GUS se radioyodinizó con ^{125}I con una actividad específica de 5 x 10^{6} cpm/\mug. Tras inyectar intravenosamente a los ratones, el 2C3-GUS radioyodinizado se aclaró de la sangre con un t_{1/2} \alpha de unas 6 horas y un t_{1/2} \beta de unas 25 horas.
D. Profármacos divisibles de GUS
Los profármacos de \beta-glucurónido, tales como doxorubicina-\beta-glucurónido y calcimicina-\beta-glucurónido se prepararon, esencialmente, tal como se describe en la Patente U.S.A. 5.561.119, incorporada específicamente en la presente por referencia. Tales profármacos se diseñan para liberar el componente citotóxico, tal como la doxorubicina o la calcimicina, sólo cuando se degradan por una enzima glicosida, tal como GUS. Mediante el acoplamiento de GUS a 2C3, la GUS se dirige específicamente al estroma y la vasculatura tumoral, proporcionando así la división específica de los profármacos y liberando el componente citotóxico específicamente en el interior del tumor.
E. Actividad biológica del conjugado 2C3-GUS
El 2C3-GUS se localizó específicamente en la vasculatura tumoral y en los alrededores del estroma tumoral tras una inyección intravenosa en ratones SCID con tumores NSCLC NCI-H358 humanos en el sitio subcutáneo. Se detectó la presencia de 2C3-GUS inmunohistoquímicamente en secciones congeladas de tumores con IgG anti-ratón marcada con HRP o anti-GUS marcada con HRP. La localización máxima se observó a las 24-48 horas después de la inyección de 2C3-GUS. Los tejidos normales no se tiñeron. La localización específica del 2C3-GUS en la vasculatura tumoral y en los alrededores del estroma tumoral permite que un profármaco administrado sistémicamente, tal como doxorubicina-glucurónido y calcimicina-glucurónido, sea activado sólo en el interior del tumor.
Una línea de células de hibridoma, tal como se describe en la presente, se ha depositado bajo las disposiciones del Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA; y se ha asignado un número de acceso ATCC No. PTA 1595. La invención descrita y reivindicada en la presente no está limitada en su alcance por la línea de células PTA 1595 depositada, ya que la realización depositada es una ilustración de un aspecto de la invención y las líneas de células de hibridoma equivalentes que producen anticuerpos monoclonales funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta invención. De hecho, todas las composiciones y métodos dados a conocer y reivindicados en la presente se pueden fabricar y ejecutar sin una experimentación excesiva a la luz de la presente descripción.
Referencias
Las siguientes referencias proporcionan procedimientos de ejemplo u otros detalles complementarios a aquellos señalados posteriormente en la presente.
Abrams y Oldham, en: Monoclonal Antibody Therapy of Human Cancer, Foon and Morgan (Eds.), Martinus Nijhoff Publishing, Boston, pp 103-120, 1985.
Aiello, Pierce, Foley, Takagi, Chen, Riddle, Ferrara, King, Smith, "Suppression of retinal neovascularization in vivo by inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF) using soluble VEGF-receptor chimeric proteins"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:10457-10461, 1995.
Akuzawa, Kurabayashi, Ohyama, Arai, Nagai, "Zinc finger transcription factor Egr-1 activates Flt-1 gene expression in THP-1 cells on induction for macrophage differentiation", Arteriosclerosis, Trombosis, and Vascular Biology, 20(2):377-84, 2000.
Alon, Hemo, Itin, Peter, Stone, Keshet, "Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels ans has implications for retinopathy of prematurity,"Nature Med., 1:1024-1028, 1995.
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Anthony, Wheeler, Elcock, Pickett, Thomas, "Short report: identification of a specific pattern of vascular endothelial growth factor mRNA expresion in human placenta and cultured placental fibroblasts", Placenta, 15:557-61, 1994.
Asahara y otros, "Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis" Science, 275(5302):964-967, 1997
Asahara, Chen, Takahashi, Fujikawa, Kearney, Magner, Yancopoulos, Isner, "Tie2 receptor ligands, angiopoietin-1 and angiopoietin-2, modulate VEGF-induced postnatal neovascularization"Circ. Res., 83(3):233-40, 1998.
Asano, Yukita, Matsumoto, Kondo, Suzuki, "Inhibition of tumor growth and metastasis by an immunoneutralizing monoclonal antibody to human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor,"Cancer Res. 55:5296-5301, 1995.
Asano, Yukita, Matsumoto, Hanatani, Suzuki, "An anti-human VEGF monoclonal antibody, MV833, that exhibits potent anti-tumor activity in vivo,"Hybridoma, 17:185-90, 1998.
Baca y otros, "Antibody humanization using monovalent phage display" J. Biol. Chem., 272(16):10678-84, 1997.
Barbas, Kang, Lerner y Benkovic, "Assembly of combinatorial libraries on phage surfaces: the gene III site," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(18):7978-7982, 1991.
Baxter y Jain, "Transport of fluid and macromolecules in tumors," Micro. Res., 41:5-23, 1991.
Benjamin, Golijanin, Itin, Pode y Keshet, "Selective ablation of immature blood vessels in established human tumors follows vascular endothelial growth factor withdrawal," J. Clin. Invest., 103(2):159-165, 1999.
Berman, Mellis, Pollock, Smith, Suh, Heinke, Kowal, Surti, Chess, Cantor, y otros, "Content and organization of the human IG VH locus: definition of three new VH families and linkage to the Ig CH locus,"EMBO J., 7(3):727-738, 1988
Borgstrom, Hillan, Sriamarao, Ferrara, "Complete inhibition of angiogenesis and growth of microtumors by anti-vascular endothelial growth factor neutralizing antibody: novel concepts of angiostatic therapy from intravital videomicroscopy,"Cancer Res., 56(17):4032-1439, 1996.
Borgstrom, Bourdon, Hillan, Sriamarao, Ferrara, "Neutralizing anti-vascular endothelial growth factor antibody completely inhibits angiogenesis and growth of human prostate carcinoma micro tumors in vivo,"Prostate, 35(1):1-10, 1998.
Borgstrom, Gold, Hillan, Ferrara, "Importance of VEGF for breast cancer angiogenesis in vivo: implications from intravital microscopy of combination treatments with an anti-VEGF neutralizing monoclonal antibody and doxorubicin, "Anticancer Research, 19(5B):4203-11, 1999.
Bornstein, "Thrombospondins: structure and regulation of expression,"FASEB J, 6(14):3290-3299, 1992.
Borrebaeck y Moller, "In vitro immunization. Effect of growth and differentiation factors on antigen-specific B cell activation and production of monoclonal antibodies to autologous antigens and weak inmunogens," J. Inmunol., 136(10):3710-3715, 1986.
Brekken, Huang, King, Thorpe,"Vascular endothelial growth factor as a marker of tumor endothelium,"Cancer Res., 58(9):1952-1959, 1998.
Brem, "Angiogenesis antagonists: current clinical trials,"Angiogenesis, 2:9-20, 1998.
Bukovsky, Presl, Zidovsky, Mancal,"The localization of Thy-1.1, MRC OX 2 and Ia antigens in the rat ovary and fallopian tube,"Immunology, 48(3):587-596, 1983.
Burke y otros, "Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors", Science, 236, 806-812, 1987.
Burke, Lehman-Bruinsma, Powell, "Vascular endothelial growth factor causes endothelial proliferation after vascular injury,"Biochem. Biophys. Res. Comm., 207:348-354, 1995.
Burrows y Thorpe, "Vascular targeting-a new approach to the therapy of solid tumors", Pharmacol. Ther., 64:155-174, 1994a.
Burrows y Thorpe, "Eradication of large solid tumors in mice with an immunotoxin directed against tumor vasculature", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8996-9000, 1994b.
Burrows, Watanabe, Thorpe, "A murine model for antibody-directed targeting of vascular endothelial cells in solids tumors",Cancer Res., 52:5954-5962, 1992.
Burrows, Derbyshire, Tazzari, Amlot, Gazdar, King, Letarte, Vitetta, Thorpe, "Endoglin is an endothelial cell proliferation marker that is upregulated in tumor vasculature", Clin. Cancer Res., 1:1623-1634, 1995.
Buttke, McCabrey, Owen, J. Immunol. Methods, 157:233-240,1993.
Campbell, en: Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burden and Von Knippenberg (Eds.), Elseview, Amsterdam, pp. 75-83, 1984.
Carmeliet, Ferreira, Breier, Pollefeyt, Kieckens, Gertsenstein, Fahrig, Vandenhoeck, Harpal, Eberhardt, Declercq, Pawling, Moons, Collen, Risau, Nagy, "Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele", Nature, 380(6573):435-439, 1996.
Champe y otros, J.Biol Chem, 270:1388-1394, 1995.
Cheng, Huang, Nagane, Ji, Wang, Shih, Arap, Huang, Cavenee, "Suppression of glioblastoma angiogenicity and tumorigenicity by inhibition of endogenous expresión of vascular endothelial growth factor", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8502-8507, 1996.
Claffey, Brown, del Aguila, Tognazzi, Yeo, Manseau, Dvorak, "Expression of vascular permeability factor/vas-cular endothelial growth factor by melanoma cells increases tumor growth, angiogenesis, and experimental metastasis", Cancer Res., 56:172-181, 1996.
Clapp y otros, "The 16-kilodalton N-terminal fragment of human prolactin is a potent inhibitor of angiogenesis", Endocrinology, 133(3):1292-1299, 1993.
Clauss y otros, "The vascular endothelial cell growth factor reception Flt-1 mediates biological activities", J. Biol. Chem., 271(30):17629-17634, 1996.
Connolly, Heuvelman, Nelson, Olander, Eppley, Delfino, Siegel, Leimgruber, Feder, "Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angiogenesis", J. Clin. Invest., 84:1470-1478, 1989.
Coughlin y otros, "Interleukin-12 and interleukin-18 synergistically induce murine tumor regression which involves inhibition of angiogenesis", J. Clin. Invest., 101(6):1441-1452, 1998.
Couper, Bryant, Eldrup-Jorgenses, Bredenberg, Lindner, "Vascular endothelial growth factor increases the mitogenic response to fibroblast growth factor-2 in vascular smooth muscle cells in vivo via expression of fms-like tyrosine kinase-1", Circ. Res., 81(6):932-939, 1997.
Crowther, en: ELISA Theory and Practice, Totowa: Humana Press, 1995.
D'Amato y otros: "Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (9):4082-4085, 1994.
D'Angelo y otros: "Activation of mitogen-activated protein kinases by vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in capillary endothelial cells is inhibited by the antiangiogenic factor 16-kDa N-terminal fragment of prolactin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(14):6374-6378, 1995.
Davis and Yancopoulos, "The angiopoietins: Yin and Yang in angiogenesis", Curr. Top. Microbiol. Immunol., 237:173-85, 1999.
Davis-Smyth, Chen, Park, Presta, Ferrara, "The second immunoglobulin-like domain of the VEGF tyrosine kinase receptor Flt-1 determines ligand binding and may initiate a signal transduction cascade", EMBO. J., 15(18):4919-4927, 1996.
Detmar, Brown, Claffey, Yeo, Kocher, Jackman, Berse, Dvorak, "Overexpression of vascular premeabilty factor/vascular endothelial growth factor and its receptors in psoriasis", J. Exp. Med., 180:1141-1146, 1994.
DeVore y otros, "Phase I Study of the Antineovascularization Drug CM101", Clin. Cancer Res., 3(3):365-372, 1997.
deVries, Escobedo, Ueno, Houck, Ferrara, Williams, "The fms-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor", Science, 255(5047):989-991, 1992.
Dvorak, Nagy, Dvorak, "Structure of solid tumors and their vasculature: implications for therapy with monoclonal antibodies", Cancer Cells, 3:77-85, 1991a.
Dvorak, Sioussat, Brown, Berse, Nagy, Sotrel, Manseau, Vandewater, Senger, "Distribution of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) in tumors-concentration in tumor blood vessels", J. Exp. Med., 174:1275-1278, 1991b.
Ferrara, "The role of vascular endothelial growth factor in pathological angiogenesis", Breast Cancer Res. Treat., 36:127-137, 1995.
Ferrara, Clapp, Weiner, "The 16K fragment of prolactin specifically inhibits basal of fibroblast growth factor stimulated growth of capillary endothelial cells", Endocrinology, 129(2):896-900, 1991.
Ferrara, Houck, Jakeman, Winer, Leung, "The vascular endothelial growth factor family of polypeptides", J. Cell. Biochem., 47:211-218, 1991.
Ferrara, Carver-Moore, Chen, Dowd, Lu, O'Shea, Powell-Braxton, Hillan, Moore, "Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene", Nature, 380(6573):439-442, 1996.
Fidler y Ellis, "The implications of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis [comment]", Cell, 79(2):185-188, 1994.
Fidler, Kumar, Bielenberg, Ellis, "Molecular determinants of angiogenesis in cancer metastasis", Cancer J. Sci. Am., 4 Suppl 1:S58-66, 1998.
Folkman and Shing, "Angiogenesis", J. Biol. Chem., 267:10931-10934, 1992.
Folkman y otros, "Angiogenesis inhibition and tumor regression caused by heparin or a heparin fragment in the presence of cortisone", Science, 221:719-725, 1983.
Fong, Rossant, Gertsenstein, Breitman, "Role of the Flt-1 receptor tyrosine kinase in regulating the assemby of vascular endothelium", Nature, 376:66-70, 1995.
Forsythe, Jiang, Iyer, Agani, Leung, Koos, Semenza, "Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1", Mol. Cell. Biol., 16:4604-4613, 1996.
Fotsis y otros, "The endogenous estrogen metabolite 2-methoxyoestradiol inhibits angiogenesis and suppresses tumor growth", Nature, 368(6468):237-239, 1994.
Frank, Hubner, Breier, Longaker, Greenhalgh, Werner, "Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured growth factor expression in cultured keratinocytes. Implications for normal and impaired wound healing", J. Biol. Chem., 270:12607-12613, 1995.
Frater-Schroder y otros, "Tumor necrosis factor type alpha, a potent inhibitor of endothelial cell growth in vitro, is angiogenic in vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84(15):5277-5281, 1987.
Frazier, "Thrombospondins", Curr. Opin. Cell Biol., 3(5):792-799, 1991.
Fujii y otros, "Role of nitric oxide, prostaglandins and tyrosine kinase in vascular endothelial growth factor-induced increase in vascular permeability in mouse skin", Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 356(4):475-480, 1997.
Gagliardi y Collins, "Inhibition of angiogenesis by antiestrogens", Cancer Res., 53(3):533-535, 1993.
Gagliardi, Hadd, Collins, "Inhibition of angiogenesis by suramin", Cancer Res., 52(18):5073-5075, 1992.
Gagliardi y otros, "Antiangiogenic and antiproliferative activity of suramin analogues", Cancer Chemother. Pharmacol., 41(2):117-124, 1998.
Gefter y otros, "A simple method for polyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myeloma cells", Somatic Cell Genet.,3:231-236, 1977.
Gerber, Condorelli, Park, Ferrara, "Different transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptors genes", J. Biol. Chem., 272:23659-23667, 1997.
Gerber, Vu, Ryan, Kowalski, Werb, Ferrara, "VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation", Nature Medicine, 5(6):623-8, 1999.
Glennie y otros, "Preparation and performance of bispecific F(ab' gamma)2 antibody containing thioether-linked Fab'gamma fragments", J. Immunol., 139:2367-2375, 1987.
Goding, en: Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2^{nd} Edition, Academic Press, Orlando, Fl., pp. 60-61, 65-66, 71-74, 1986.
Good y otros, "A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(17):6624-6628, 1990.
Grant y otros, "Fibronectin fragments modulate human retinal capillary cell proliferation and migration", Diabetes, 47(8):1335-1340, 1998.
Guo, Jia, Song, Warren, Donner, "Vascular endothelial cell growth factor promotes tyrosine phosphorylation of mediators of signal transduction that contain SH2 domains", J. Biol. Chem., 270:6729-6733, 1995.
Hanahan y Folkman, "Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis", Cell, 86(3):353:364, 1996.
Harada, Mitsuyama, Yoshida, Sakisaka, Taniguchi, Kawaguchi, Ariyoshi, Saiki, Sakamoto, Nagata, Sata, Matsuo, Tanikawa, "Vascular endothelial growth factor in patients with rheumatoid arthritis", Scandinavian J. Rheumatol., 27(5):377-80, 1998.
Haran y otros, "Tamoxifen enhances cell death in implanted MCF7 breast cancer by inhibiting endothelium growth", Cancer Res., 54(21):5511-5514, 1994.
Hasselaar y Sage, "SPARC antagonizes the effect of basic fibroblast growth factor on the migration of bovine aortic endothelial cells", J. Cell Biochem., 49(3):272-283, 1992.
Hellerqvist y otros, "Antitumor effects of GBS toxin: a polysaccharide exotoxin from group B beta-hemolytic streptococcus", J. Cancer Res. Clin. Oncol., 120(1-2):63-70, 1993.
Hiratsuka, Minowa, Kuno, Noda, Shibuya, "Flt.1 lacking the tyrosine kinase domain is sufficient for normal development and angiogenesis in mice", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(16):9349-9354, 1998.
Hiscox y Jiang, "Interleukin-12, an emerging anti-tumor cytokine", In Vivo, 11(2):125-132, 1997.
Holash y otros, "Vessel Cooption, Regression, and Growth in Tumors Mediated by Angiopoietins and VEGF", Science, 284:1994-1998, 1999.
Hong, Nagy, Senger, Dvorak, Dvorak, "Ultrastructural localization of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) to the abluminal plasma membrane and vesiculovacuolar organelles of tumor microvascular endothelium", J. Histochem. Cytochem., 43:381-389, 1995.
Hood y Granger, "Protein kinase G mediates vascular endothelial growth factor-induced Raf-1 activation and proliferation in human endothelial cells", J. Biol. Chem., 273(36):23504-23508, 1998.
Hood, Meininger, Ziche, Granger, "VEGF upregulates ecNOS message, protein, and NO production in human endothelial cells", Am. J. Physiol., 274(3 Pt 2):H1054-1058, 1998.
Hori y otros, "Differential effects of angiostatic steroids and dexamethasone on angiogenesis and cytokine levels in rat sponge implants", Br. J. Pharmacol., 118(7):1584:1591, 1996.
Houck, Ferrara, Winer, Cachianes, Li, Leung, "The vascular endothelial growth factor family: Identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA", Molec. Endo., 5(12):1806-1814, 1991.
Huang, Molema, King, Watkins, Edgington, Thorpe, "Tumor infarction in mice by antibody-directed targeting of tissue factor to tumor vasculature", Science, 275:547-550, 1997.
Huang, Gottstein, Brekken, Thorpe, "Expression of soluble VEGF receptor 2 and characterization of its binding by surface plasmon resonance", Biochem. Biophys. Res. Commun., 252(3):643-648, 1998.
Huse, Sastry, Iverson, Kang, Alting-Mees, Burton, Benkovic and Lerner, Science, 246(4935):1275-1281, 1981.
Ingber y otros, "Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth", Nature, 48:555-557, 1990.
Inoue, Itoh, Ueda, Naruko, Kojima, Komatsu, Doi, Ogawa, Tamura, Takaya, Igaki, Yamashita, Chun, Masatsugu, Becker, Nakao, "Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in human coronary atherosclerotic lesions: possible pathophysiological significance of VEGF in progression of atherosclerosis", Circulation, 98(20):2108-16, 1998.
Iwamoto y otros, "Inhibition of angiogenesis, tumor growth and experimental metastasis of human fibrosarcoma cells IIT1080 by a multimeric form of the laminin sequence Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(YIGSR)", Br. J. Cancer, 73(5):589-595, 1996.
Jackson y otros, "Stimulation and inhibition of angiogenesis by placental proliferin and proliferin-related protein", Science, 266(5190):1581-1584, 1994.
Jendraschak y Sage, "Regulation of angiogenesis by SPARC and angiostatin: implications for tumor cell biology", Semin. Cancer Biol., 7(3):139-146, 1996.
Joukov, Kumar, Sorsa, Arighi, Weich, Saksela, Alitalo, "A recombinant mutant vascular endothelial growth factor-C that has lost vascular endothelial growth factor receptor-2 binding, activation, and vascular permeability activities", J. Biol. Chem., 273(12):6599-6602, 1998.
Kabat y otros, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 5^{th} Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, pp 647-669 en particular.
Kang, Barbas, Janda, Benkovic and Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88(10):4363-4366, 1991
Keck, Hauser, Krivi, Sanzo, Warren, Feder, Connolly, "Vascular permeabilty factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF", Science, 246:1309-1312, 1989.
Kendall y Thomas, "Inhibition of vascular endothelial cell growth factor activity by an endogenously encoded soluble receptor", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10705-10709, 1993.
Kenyon, Browne, D'Amato, "Effects of thalidomide and related metabolites in a mouse corneal model of neovascularization", Exp. Eye Res., 64(6):971-978, 1997.
Kerbel, Viloria-Petit, Okada, Rak, "Establishing a link between oncogenes and tumor angiogenesis", Mol. Med., 4(5):286-295, 1998.
Keyt y otros, "Identification of vascular endothelial growth factor determinants for binding KDR and FLT-1 receptors. Generation of recepto-selective VEGF variants by site-directed mutagenesis", J. Biol. Chem., 271(10):5638-46, 1996.
Kim, Li, Houck, Winer, Ferrara, "The vascular endothelial growth factor proteins: identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies", Growth Factors, 7:53-64, 1992.
Kim, Li, Winer, Armanini, Gillett, Phillips, "Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo", Nature, 362:841-844, 1993.
Kim, Kwak, Ahn, So, Liu, Koh, Koh, "Molecular cloning and characterization of a novel angiopoietin family protein, angiopoietin-3", FEBS Lett., 443(3):353-6, 1999.
Kleinman y otros, "The laminins: a family of basement membrana glycoproteins important in cell differentiation and tumor metastases", Vitam. Horm., 47:161-186, 1993.
Kohler y Milstein, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature, 256:495-497, 1975.
Kohler y Milstein, "Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion", Eur. J. Immunol., 6:511-519, 1976.
Konieczny, Bobrezcka, Laidler and Rybarska, "The combination of IgM subunits and proteolytic IgG fragment by controlled formation of interchain disulphides", Haematologia, 14(1):95-99, 1981.
Kondo, Asano, Suzuki, "Signifiance of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor for solid tumor growth, and its inhibition by the antibody", Biochem. Biophys. Res. Commun., 194:1234-1241, 1993.
Korpelainen y Alitalo, "Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis", Curr. Opin. Cell Biol., 10(2):159-164, 1998.
Kremer, Breier, Risau, Plate, "Up-regulation of flk-1/vascular endothelial growth factor receptor 2 by its ligand in a cerebral slice cultural system", Cancer Res., 57:3852-3859, 1997.
Kroll y Waltenberger, "The vascular endothelial growth factor receptor KDR activates multiple signal transduction pathways in porcine aortic endothelial cells", J. Biol. Chem., 272:32521-7, 1997.
Kroll y Waltenberger, "VEGF-A induces expression of eNOS and iNOS in endothelial cells via VEGF receptor-2 (KDR)", Biochem. Biophys. Res. Commun., 252(3):743-746, 1998.
Kupprion, Motamed, Sage, "SPARC (BM-40, osteonectin) inhibits the mitogenic effect of vascular endothelial growth factor on microvascular endothelial cells", J. Biol. Chem., 273(45):29635-29640, 1998.
Kyte y Doolittle, "A simple method for displaying the hydropathic character of a protein", J. Mol. Biol., 157(1):105-132, 1982.
Landgren, Schiller, Cao, Claesson-Welsh, "Placenta growth factor stimulates MAP kinase and mitogenicity but not phospholipase C-gamma and migration of endothelial cells expressing Fit 1", Oncogene, 16(3):359-367, 1998.
Lane, Iruela-Arispe, Sage, "Regulation of gene expression by SPARC during angiogenesis in vitro. Changes in fibronectin, thrombospondin-1, and plasminogen activator inhibitor-1", J. Biol. Chem., 267(23):16736-16745, 1992.
Lee y otros, "Inhibition of urokinase activity by the antiangiogenic factor 16K prolactin: activation of plasminogen activator inhibitor 1 expression", Endocrinolgy, 139(9):3696-3703, 1998.
Lin, Sankar, Shan, Dewhirst, Polverini, Quinn, Peters, "Inhibition of tumor growth by targeting tumor endothelium using a soluble vascular endothelial growth factor receptor", Cell Growth Differ., 9:49-58, 1998.
Lin, Buxton, Acheson, Radziejewski, Maisonpierre, Yancopulos, Channon, Hale, Dewhirst, George, Peters, "Anti-angiogenic gene therapy targeting the endothelium-specific receptor tyrosine kinase Tie2", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(15):8229-34, 1998.
Lin, Nguyen, Mendoza, Escandon, Fei, Meng, Modi, "Preclinical pharmacokinetics, interspecies scaling, and tissue distribution of a humanized monoclonal antibody against vascular endothelial growth factor", J. Pharmacol. Exp. Therap., 288(1):371-8, 1999.
Lindner y Borden, "Effects of tamoxifen and interferon-beta or the combination on tumor-induced angiogenesis", Int. J. Cancer, 71(3):456-461, 1997.
Lingen, Polverini, Bouck, "Retinoic acid and interferon alpha act synergistically as antiangiogenic and antitumor agents against human head and neck squamous cell carcinoma", Cancer Res., 58(23):5551-5558, 1998.
Lingen, Polverini, Bouck, "Inhibition of squamous cell carcinoma angiogenesis by direct interaction of retinoic acid with endothelial cells", Lab. Invest., 74(2):476-483, 1996.
Lin-Ke, Hong-Qu, Nagy, Eckelhoefer, Masse, Dvorak, Dvorak, "Vascular targeting of solid and ascites tumours with antibodies to vascular endothelial growth factor", Eur. J. Cancer, 32A(14):2467-2473, 1996.
Luo, Toyoda, Shibuya, "Differential inhibition of fluid accumulation and tumor growth in two mouse ascites tumors by an antivascular endothelial growth factor/permeability factor neutralizing antibody", Cancer Res., 58(12):2594-2600, 1998a.
Luo, Yamaguchi, Shinkai, Shitara, Shibuya, "Significant expression of vascular endothelial growth factor/vascu-lar permeability factor in mouse ascites tumors", Cancer Res., 58(12):2652-2660, 1998b.
Majewski y otros, "Vitamin D3 is a potent inhibitor of tumor cell-induced angiogenesis", J. Investig. Dermatol. Symp Proc., 1(1):97-101, 1996.
Malecaze, Clamens, Simorre-Pinatel, Mathis, Chollet, Favard, Bayard, Plouet, "Detection of vascular endothelial growth factor messenger RNA and vascular endothelial growth factor-like activity in proliferative diabetic retinopathy", Arch. Opthalmol., 112:1476-1482, 1994.
Mandriota y Pepper, "Regulation of angiopoietin-2 m-RNA levels in bovine microvascular endothelial cells by cytokines and hypoxia", Circ. Res., 83(8):852-9, 1998.
Manetti y otros, "Synthesis and binding mode of heterocyclic analogues of suramin inhibiting the human basic fibroblast growth factor", Bioorg. Med. Chem., 6(7):947-958, 1998.
Massey y otros, Nature, 328:457-458, 1987.
Mazure, Chen, Yeh, Laderoute, Giaccia, "Oncogenic transformation and hypoxia synergistically act to modulate vascular endothelial growth factor expression", Cancer Res., 56:3436-3440, 1996.
McNamara, Harmey, Walsh, Redmond, Bouchier-Hayes, "Significance of angiogenesis in cancer therapy [published erratum appears in Br J Surg., Oct;85(10):1449, 1998]", Br. J. Surg., 85(8):1044-1055, 1998.
Mesiano, Ferrara, Jaffe, "Role of vascular endothelial growth factor in ovarian cancer: inhibition of ascites formation by immunoneutralization", Am. J. Pathol., 153(4):1249-1256, 1998.
Meyer, Clauss, Lepple-Wienhues, Waltenberger, Augustin, Ziche, Lanz, Buttner, Rziha, Dehio, "A novel vascular endothelial growth factor encoded by Orf virus, VEGF-E, mediates angiogenesis via signaling through VEGFR-2 (KDR) but not VEGFR-1 (Flt-1) receptor tyrosine kinases", EMBO J., 18:363-74, 1999.
Millauer, Longhi, Plate, Shawver, Risau, Ullrich, Strawn, "Dominant-negative inhibition of Flk-1 suppresses the growth of many tumor types in vivo", Cancer Res., 56:1615-1620, 1996.
Mills, Brooker y Camerini-Otero, "Sequences of human immunoglobulin switch regions: implications for recombination and transcription", Nucl. Acids Res., 18:7305-7316, 1990.
Moore y otros, "Tumor angiogenesis is regulated by CXC chemokines", J. Lab, Clin, Med., 132(2):97-103, 1998.
Mordenti, Thomsen, Licko, Chen, Meng, Ferrara, "Efficacy and concentration-resposnse of murine anti-VEGF monoclonal antibody in tumor-bearing mice and extrapolation to humans", Toxicologic Pathology, 27(1):14-21, 1999.
Morrison, Johnson, Herzenberg y Oi, "Chimeric human antibody molecules: mouse antigenbinding domains with human constant region domains", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81(21):6851-6855, 1984.
Morrison, Wims, Kobrin y Oi, "Production of novel immunoglobulin molecules by gene transfection", Mt. Sinai J. Med., 53(3):175, 1986.
Morrow, Unuvar, King, Mleczko, "Techniques for the production of monoclonal and polyclonal antibodies", en: Colloidal Gold: Principles, Methods and Applications, M.A. Hayat (ed.), Orlando: Academic Press, pp.31-57, 1990.
Muller, Li, Christinger, Wells, Cunningham, De Vos, "Vascular Endothelial growth factor: Crystal structure and functional mapping of the kinase domain receptor binding site", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:7192-7197, 1997.
Muller, Chen, Christinger, Li, Cunningham, Lowman, De Vos, "VEGF and the Fab fragment of a humanized neutralizing antibody: crystal structure of the complex at 2.4 A resolution and mutational analysis of the interface", Structure, 6(9):1153-67, 1998.
Murohara, Horowitz, Silver, Tsurumi, Chen, Sullivan, Isner, "Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor enhances vascular permeability via nitric oxide and prostacyclin", Circulation, 97(1):99-107, 1998.
Mustonen y Alitalo, "Endothelial receptor tyrosine kinases involved in angiogenesis", J. Cell Biol., 129:895-898, 1995.
Nagashima, Yoshino, Aono, Takai, Sasano, "Inhibitory effects of anti-rheumatic drugs on vascular endothelial growth factor in cultured rheumatoid synovial cells", Clin. Exp. Immunol., 116(2):360-5, 1999.
Nagler, Feferman, Shoshan, "Reduction in basic fibroblast growth factor mediated angiogenesis in vivo by linomide", Connect Tissue Res., 37(1-2):61-68, 1998.
Nakamura y otros, Enzyme Immunoassays: Heterogeneus and Homogeneus Systems, Capítulo 27.
Neufeld, Cohen, Gengrinovitch, Poltorak, "Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors", FASEB J., 13(1):9-22, 1999.
Niida, Kaku, Amano, Yoshida, Kataoka, Nishikawa, Tanne, Maeda, Nishikawa, Kodama, "Vascular endothelial growth factor can substitute for macrophage colony-stimulating factor in the support of osteoclastic bone resorption", J. Exp. Med., 190(2):293-8, 1999.
Ogawa, Oku, Sawano, Yamaguchi, Yazaki, Shibuya, "A novel type of vascular endothelial growth factor, VEGF-E (NZ-7 VEGF), preferentially utilizes KDR/Flk-1 receptor and carries a potent mitotic activity without heparin-binding domain", J. Biol. Chem., 273(47):31273-31282, 1998.
Oikawa y otros, "A highly potent antiangiogenic activity of retinoids", Cancer Lett., 48(2):157-162, 1989.
Olander, Connolly, DeLarco, "Specific binding of vascular permeability factor to endothelial cells", Biochem. Biophys. Res. Comm., 175:68-76, 1991.
O'Reilly y otros, "Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.", Cell, 79:315-328, 1994.
O'Reilly y otros, "Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth", Cell, 88(2):277-285, 1997.
Papapetropoulos, Garcia-Cardena, Dengler, Maisonpierre, Yancopoulos, Sessa, "Direct actions of angiopoietin-1 on human endothelium: evidence for network stabilization, cell survival, and interaction with other angiogenic growth factors", Lab. Invest., 79(2):213-23, 1999.
Parenti y otros, "Nitric oxide is an upstream signal of vascular endothelial growth factor-induced extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation in postcapillary endothelium", J. Biol. Chem., 273(7):4220-4226, 1998.
Parmley y Smith, "Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes", Gene, 73(2):305-318, 1988.
Pepper y otros, "Leukemia inhibitory factor (LIF) inhibits angiogenesis in vitro", J. Cell Sci., 108(Pt 1):73-83, 1995.
Plate, Breier, Weich, Mennel, Risau, "Vascular endothelial growth factor and glioma angiogenesis: coordinate induction of VEGF receptors, distribution of VEGF protein and possible in vivo regulatory mechanisms", Int. J. Cancer, 59:520-529, 1994.
Potgens, Westphal, DeWaal, Ruiter, "The role of vascular permeability factor and basic fibroblast growth factor in tumor angiogenesis", en: Growth Factors in Tumor Angiogenesis, Berlin: Walter de Gruyer & Co. pp.57-70, 1995.
Presta, Chen, O'Connor, Chisholm, Meng, Krummen, Winkler, Ferrara, "Humanization of an anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders", Cancer Res., 57:4593-4599, 1997.
Quinn y otros, "CM101, a polysaccharide antitumor agent, does not inhibit wound healing in murine models", J. Cancer Res. Clin. Oncol., 121(4):253-256, 1995.
RayChaudhury y D'Amore, "Endothelial cell regulation by transforming growth factor-beta", J. Cell Biochem., 47(3):224-229, 1991.
Richer y Lo, "Introduction of human DNA into mouse eggs by injection of dissected human chromosome fragments", Science 245, 175-177, 1989.
Riechmann, Clark, Waldmann and Winter, "Reshaping human antibodies for therapy", Nature, 332(6162):323-327, 1988.
Rouan, Otterness, Cunningham, Holden, Rhodes, "Reversal of colchicine-induced mitotic arrest in Chinese hamster cells with a colchicine-specific monoclonal antibody", Am. J. Pathol., 137(4):779-787, 1990.
Ryan, Eppler, Hagler, Bruner, Thomford, Hall, Shopp, O'Neill, "Preclinical safety evaluation of rhuMAbVEGF, an antiangiogenic humanized monoclonal antibody", Toxicologic Phatology, 27(1):78-86, 1999.
Sakamoto y otros, "Heparin plus cortisone acetate inhibit tumor growth by blocking endothelial cell proliferation", Canc. J., 1:55-58, 1986.
Saleh, Stacker, Wilks, "Inhibition of growth of C6 glioma cells in vivo by expression of antisense vascular endothelial growth factor sequence", Cancer Res., 56:393-401, 1996.
Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Sang, "Complex role of matrix metalloproteinases in angiogenesis", Cell Res., 8(3):171-177, 1998.
Sawano, Takahashi, Yamaguchi, Aonuma, Shibuya, "Flt-1 but not KDR/Flk-1 tyrosine kinase is a receptor for placenta growth factor, which is related to vascular endothelial growth factor", Cell Growth Differ, 7(2):213-221, 1996.
Senger, Galli, Dvorak, Perruzzi, Harvey, Dvorak, "Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid", Science, 219:983-985, 1983.
Senger, Perruzzi, Feder, Dvorak, "A highly conserved vascular permeability factor secreted by a variety of human and rodent tumor cell lines", Cancer Res., 46:5629-5632, 1986.
Senger, Connolly, Vandewater, Feder, Dvorak, "Purification and NH2-terminal amino acid sequence of guinea pig tumor secreted vascular permeability factor", Cancer Res., 50:1774-1778, 1990.
Shalaby, Rossant, Yamaguchi, Gertsenstein, Wu, Breitman, Schuh, "Failure of blood island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice", Nature, 376:62-66, 1995.
Sheibani y Frazier, "Thrombospondin 1 expression in transformed endothelial cells restores a normal phenotype and suppresses their tumorigenesis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(15):6788-6792, 1995.
Sheu y otros, "Inhibition of angiogenesis in vitro and in vivo: comparison of the relative activities of triflavin, an Arg-Gly-Asp-containing peptide and anti-alpha(v)beta3 integrin monoclonal antibody", Biochim. Biophys. Acta,1336(3):445-454, 1997.
Shyu, Manor, Magner, Yancopoulos, Isner, "Direct intramuscular injection of plasmid DNA encoding angiopoietin-1 but not angiopoietin-2 augments revascularization in the rabbit ischemic hindlimb", Circulation, 98(19):2081-7, 1998.
Sideras, Mizuta, Kanamori, Suzuki, Okamoto, Kuze, Ohno, Doi, Fukuhara, Hassan y otros, "Production of sterile transcripts of C gamma genes in an IgM-producing human neoplastic B cell line that switches to IgG-producing cells", Intl. Immunol., 1(6):631-642, 1989.
Siemeister, Martiny-Baron, Marme, "The pivotal role of VEGF in tumor angiogenesis: molecular facts and therapeutic opportunities", Cancer Metastasis Rev., 17(2):241-248, 1998.
Sioussat, Dvorak, Brock, Senger, "Inhibition of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) with antipeptide antibodies", Arch. Biochem. Biophys., 301:15-20, 1993.
Sipos y otros, "Inhibition of tumor angiogenesis", Ann. NY Acad. Sci., 732:263-272, 1994.
Skobe, Rockwell, Goldstein, Vosseler, Fusenig, "Halting angiogenesis suppresses carcinoma cell invasion", Nat. Med., 3:1222-7, 1997.
Soff y otros, "Expression of plasminogen activator inhibitor type 1 by human prostate carcinoma cells inhibits primary tumor growth, tumor-associated angiogenesis, and metastasis to lung and liver in an athymic mouse model", J. Clin. Invest., 96(6):2593-2600, 1995.
Soker, Takashima, Miao, Neufeld, Klagsbrun, "Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor", Cell, 92(6):735-745, 1998.
Springer, Chen, Kraft, Bednarski, Blau,"VEGF gene delivery to muscle: potential role for vasculogenesis in adults", Mol. Cell., 2(5):549-558, 1998.
Stella y otros, "Prodrugs: A chemical approach to targeted drug delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt y otros, Eds. Human Press, 1985, pp 247-267.
Stratmann, Risau, Plate, "Cell type-specific expresion of angiopoietin-1 and angiopoietin-2 suggests a role in glioblastoma angiogenesis", Am. J. Pathol., 153(5):1333-9, 1998.
Tada y otros, "Inhibition of tubular morphogenesis in human microvascular endothelial cells by co-culture with chondrocytes and involvement of transforming growth factor beta: a model for avascularity in human cartilage", Biochim. Biophys. Acta., 1201(2):135-142, 1994.
Takahashi, Shirasawa, Miyakc, Yahagi, Maruyama, Kasahara, Kawamura, Matsumura, Mitarai, Sakai, "Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells", Biochem. Biophys. Res. Comm., 209:218-226, 1995.
Takano y otros, "Suramin, an anticancer and angiosuppressive agent, inhibits endothelial cell binding of basic fibroblast growth factor, migration, proliferation, and induction of urokinase-type plasminogen activator", Cancer Res., 54(10):2654-2660, 1994.
Tanaka, Mori, Sakamoto, Makuuchi, Sugimachi, Wands,"Biologic significance of angiopoietin-2 expression in human hepatocellular carcinoma", J. Clin. Invest., 103(3):341-5, 1999.
Tanaka y otros, "Viral vector-mediated transduction of a modified platelet factor 4 cDNA inhibits angiogenesis and tumor growth", Nat. Med., 3(4):437-442, 1997.
Terman, Dougher-Vermazen, Carrion, Dimitrov, Armellino, Gospodarowicz, Bohlen, "Identification of the KDR tyrosine kinase as a receptor for vascular endothelial cell growth factor", Biochem. Biophys. Res. Comm., 187:1579-1586, 1992.
Terman, Khandke, Dougher-Vermazen, Maglione, Lassam, Gospodarowicz, Persico, Bohlen, Eisinger,
"VEGF receptor subtypes KDR and FLT1 show different sensitivities to heparin and placenta growth factor",Growth Factors, 11(3):187-195, 1994.
Tessler, Rockwell, Hicklin, Cohen, Levi, Witte, Lemischka, Neufeld, "Heparin modulates the interaction of VEGF 165 with soluble and cell associated flk-1 receptors", J. Biol. Chem., 269:12456-12461, 1994.
Thomas, "Vascular endothelial growth factor, a potent and selective angiogenic agent", J. Biol. Chem., 271:603-606, 1996.
Thorpe y otros, "Heparin-Steroid Conjugates: New Angiogenesis Inhibitors with Antitumor Activity in Mice", Cancer Res., 53:3000-3007, 1993.
Tischer, Mitchell, Hartman, Silva, Gospodarowicz, Fiddes, Abraham,"The human gene for vascular endothelial growth factor", J. Biol. Chem., 266:11947-11954, 1991.
Tolsma y otros, "Peptides derived from two separate domains of the matrix protein thrombospondin-1 have anti-angiogenic activity", J. Cell. Biol., 122(2):497-511, 1993.
Tryggvason, "The laminin family", Curr. Opin. Cell Biol., 5(5):877-882, 1993.
Valenzuela, Griffiths, Rojas, Aldrich, Jones, Zhou, McClain, Copeland, Gilbert, Jenkins, Huang, Papadopoulos, Maisonpierre, Davis, Yancopoulos, "Angiopoietins 3 and 4: diverging gene counterparts in mice and humans", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(5):1904-9, 1999.
Van Dijk, Warnaar, Van Eendenburg, Thienpont, Braakman, Boot, Fleuren and Bolhuis, "Induction of tumor-cell lysis by bi-specific monoclonal antibodies recognizing renal-cell carcinoma and CD3 antigen", Int. J. Cancer, 43:344-349, 1989.
Volpert, Lawler, Bouck, "A human fibrosarcoma inhibits systemic angiogenesis and the growth of experimental metastases via thrombospondin-1", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(11):6343-6348, 1998.
Vukanovic y otros, "Antiangiogenic effects of the quinoline-3-carboxamide linomide", Cancer Res., 53(8):1833-1837, 1993.
Waltenberger, Claessons-Welsh, Siegbahn, Shibuya, Heldin, "Different signal transduction properties of KDR and Flt1, two receptors for vascular endothelial growth factor", J. Biol. Chem., 269(43):26988-26995, 1994.
Waltenberger, Mayr, Pentz, Hombach, "Functional upregulation of the vascular endothelial growth factor receptor KDR by hypoxia", Circulation, 94:1647-1657, 1996.
Waltenberger y otros, "Suramin is a potent inhibitor of vascular endothelial growth factor. A contribution to the molecular basis of its antiangiogenic action", J. Mol. Cell Cardiol., 28(7)1523-1529, 1996.
Wamil y otros, "Soluble E-selectin in cancer patients as a marker of the therapeutic efficacy of CM101, a tumor-inhibiting anti-neovascularization agent, evaluated in phase I clinical trail", J. Cancer. Res. Clin. Oncol., 123(3)173-179, 1997.
Wells, "Starving cancer into submission", Chem. Biol., 5(4):R87-88, 1998.
Wiesmann, Fuh, Christinger, Eigenbrot, Wells, De Vos, "Crystal structure at 1.7. A resolution of VEGF in complex with domain 2 of the Flt-1 receptor,"Cell, 91(5)695-704, 1997.
Willman y otros, "Prodrugs in cancer therapy", Biochem. Soc. Trans., 14:375-382, 1988.
Winter y Milstein, "Man-made antibodies", Nature, 349:293-299, 1991.
Wolff y otros, "Dexamethasone inhibits glioma-induced formation of capillary like structures in vitro and angiogenesis in vivo", Klin. Padiatr., 209(4):275-277, 1997.
Yoon y otros, "Inhibitory effect of Korean mistletoe (Viscum album coloratum) extract on tumour angiogenesis and metastasis of haematogenous and non haematogenous tumour cells in mice", Cancer Lett, 97(1):83-91, 1995.
Yoshida y otros, "Suppression of hepatoma growth and angiogenesis by a fumagillin derivative TNP470: possible involvement of nitric oxide synthase", Cancer Res., 58(16):3751-3756, 1998.
Yuan, Chen, Dellian, Safabakhsh, Ferrara, Jain, "Time-dependent vascular regression and permeability changes in established human tumor xenografts induced by an anti-vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor antibody", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:14765-14770, 1996.
Yamamura y otros, "Effect of Matrigel and laminin peptide YIGSR on tumor growth and metastasis", Semin. Cancer Biol., 4(4):259-265, 1993.
Zachary, "Vascular endothelial growth factor: how it transmits its signal", Exp. Nephrol., 6(6):480-487, 1998.
Zapata y otros, Protein Eng., 8(10):1057-1062, 1995.
Zichc y otros, "Linomide blocks angiogenesis by breast carcinoma vascular endothelial growth factor transfectans", Br. J. Cancer, 77(7):1123-1129, 1998.
<110> Conjunto de reactivos, Sistema de la Universidad de Texas
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Composiciones y métodos para el tratamiento de cáncer mediante la inhibición 
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<120> selectiva de VEGF
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<130> 40001.002510
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<140> Desconocido
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<141> 2000-04-28
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<150> 60/131,432
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<151> 1999-04-28
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<160> 44
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<170> PatentIn Ver.2.0
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<210> 1
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<211> 2149
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14 
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15
16 
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19
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21
22
cada una incorporada en la presente por referencia
23 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<211> 573
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(573)
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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34 
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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\sa{Arg Lys ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu}
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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\sa{Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala}
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Arg Gly Asp Asp Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Glu Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Gly Arg}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Ser Ile Asp Gly Arg}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Gly Leu Trp Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
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\sa{Gly Ile Ala Gly Gln}
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<210> 28
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
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\sa{Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile}
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<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 29
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\sa{Gly Pro Glu Gly Leu Arg Val Gly}
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<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\newpage
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<400> 30
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\sa{Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Val Val}
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<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 31
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\sa{Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Arg}
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 32
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\sa{Ala Gly Leu Gly Ile Ser Ser Thr}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
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\sa{Glu Pro Gln Ala Leu Ala Met Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 34
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\sa{Gln Ala Leu Ala Met Ser Ala Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
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\sa{Ala Ala Tyr His Leu Val Ser Gln}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
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\sa{Met Asp Ala Phe Leu Glu Ser Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO

Claims (79)

1. Composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF purificado, o fragmento de unión al antígeno de éste, que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595 y que inhibe significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1).
2. Composición, según la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno de éste.
3. Composición, según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG o un anticuerpo IgM.
4. Composición, según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho anticuerpo es un scFv, Fv, Fab', Fab, un "diabody", un anticuerpo lineal o un fragmento de unión al antígeno F(ab')_{2} de un anticuerpo.
5. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo es un dímero, un trímero o un multímero de dicho anticuerpo o fragmentos de unión al antígeno de éstos.
6. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o parcialmente humano o un fragmento de unión al antígeno de éste.
7. Composición, según la reivindicación 6, en la que dicho anticuerpo comprende una región de unión al antígeno de dicho anticuerpo acoplada operativamente a un armazón o región constante de anticuerpo humano.
8. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
9. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo recombinante.
10. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo comprende, como mínimo, una primera región variable que incluye una región de secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9.
11. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595.
12. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a, como mínimo, un primer agente biológico.
13. Composición, según la reivindicación 12, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a, como mínimo, un primer agente que divide un profármaco sustancialmente inactivo para liberar un fármaco sustancialmente activo.
14. Composición, según la reivindicación 13, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a fosfatasa alcalina que divide un profármaco de fosfato sustancialmente inactivo para liberar un fármaco sustancialmente activo.
15. Composición, según la reivindicación 12, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a, como mínimo, un primer agente terapéutico o agente de diagnóstico.
16. Composición, según la reivindicación 15, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a, como mínimo, un primer agente terapéutico.
17. Composición, según la reivindicación 16, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a, como mínimo, un primer y un segundo agente terapéutico.
18. Composición, según la reivindicación 16 ó 17, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a, como mínimo, un primer agente quimioterapéutico, agente radioterapéutico, agente antiangiogénico, agente inductor de apoptosis, esteroide, antimetabolito, antraciclina, alcaloide de vinca, fármaco antitubulina, antibiótico, citocina, agente alquilante o coagulante.
19. Composición, según la reivindicación 18, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un agente citotóxico, citostático o anticelular capaz de destruir o suprimir el crecimiento o la división celular de células endoteliales.
\newpage
20. Composición, según la reivindicación 19, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a toxinas derivadas de plantas, hongos o bacterias.
21. Composición, según la reivindicación 20, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a una toxina de cadena A, una proteína inactivadora de ribosomas, \alpha-sarcina, gelonina, aspergilina, restrictocina, una ribonucleasa, una epipodofilotoxina, toxina de la difteria o exotoxina de Pseudomonas.
22. Composición, según la reivindicación 21, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a la cadena A de la ricina o a la cadena A de la ricina desglicosilada.
23. Composición, según la reivindicación 18, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un agente antiangiogénico.
24. Composición, según la reivindicación 23, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a una angiopoyetina.
25. Composición, según la reivindicación 24, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a la angiopoyetina-2 o la angiopoyetina-1.
26. Composición, según la reivindicación 23, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a angiostatina, vasculostatina, canstatina o maspina.
27. Composición, según la reivindicación 23, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a la endostatina.
28. Composición, según la reivindicación 18, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un fármaco antitubulina.
29. Composición, según la reivindicación 28, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un fármaco antitubulina seleccionado del grupo que consiste en colquicina, taxol, vinblastina, vincristina, vindescina y una combretastatina.
30. Composición, según la reivindicación 18, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un coagulante.
31. Composición, según la reivindicación 30, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un coagulante seleccionado del grupo que consiste en Factor II/IIa, Factor VII/VIIa, Factor IX/IXA, Factor X/Xa, un factor de coagulación dependiente de vitamina K que carece de la modificación Gla, activador del Factor X del veneno de víbora de Russell, tromboxano A2, tromboxano A2 sintasa y \alpha2-antiplasmina.
32. Composición, según la reivindicación 30, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a Factor Tisular, un Factor Tisular humano, un Factor Tisular mutante deficiente en la capacidad de activar el Factor VII, Factor Tisular truncado o a un Factor Tisular dimérico, trimérico o polimérico o un derivado del Factor Tisular.
33. Composición, según la reivindicación 32, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a Factor Tisular truncado.
34. Composición, según la reivindicación 15, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un agente de diagnóstico, un agente imagen o un agente detectable.
35. Composición, según la reivindicación 34, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un compuesto detectable por Rayos-X, un ión radiactivo o un isótopo de resonancia magnética nuclear de spin.
36. Composición, según la reivindicación 34, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a biotina, avidina o a una enzima que genera un producto coloreado tras entrar en contacto con un sustrato cromogénico.
37. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 33, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a dicho agente biológico como una proteína de fusión preparada mediante la expresión de un vector recombinante que comprende, en el mismo marco de lectura, un segmento de ADN que codifica dicho anticuerpo unido operativamente a un segmento de ADN que codifica dicho agente biológico.
38. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 33, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a dicho agente biológico a través de un enlace biológicamente liberable o un enlazador selectivamente divisible.
39. Composición, según la reivindicación 38, en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a dicho agente biológico a través de un enlazador peptídico que incluye un sitio de división para uroquinasa, pro-uroquinasa, plasmina, plasminógeno, TGF\beta, estafiloquinasa, Trombina, Factor IXa, Factor Xa, una metaloproteinasa, una colagenasa intersticial, una gelatinasa o una estromelisina.
40. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 36, en la que dicho anticuerpo está acoplado directamente a dicho agente biológico.
41. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 36, en la que dicho anticuerpo está acoplado a un segundo anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une a dicho agente terapéutico o de diagnóstico.
42. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición es una composición farmacéuticamente aceptable.
43. Composición, según la reivindicación 42, en la que dicha composición farmacéuticamente aceptable se formula para administración parental.
44. Composición, según la reivindicación 42, en la que dicha composición farmacéuticamente aceptable es una formulación liposomal.
45. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición además comprende un segundo agente terapéutico.
46. Composición, según la reivindicación 45, en la que dicho segundo agente terapéutico es un segundo agente anticancerígeno.
47. Composición, según la reivindicación 46, en la que dicho segundo agente anticancerígeno es un agente quimioterapéutico, agente radioterapéutico, agente antiangiogénico, agente inductor de apoptosis, fármaco antitubulina o un agente quimioterapéutico, agente radioterapéutico, agente antiangiogénico, agente inductor de apoptosis o fármaco antitubulina dirigido al tumor.
48. Composición, según la reivindicación 47, en la que dicho segundo agente anticancerígeno es una angiopoyetina o una angiopoyetina dirigida al tumor.
49. Composición, según la reivindicación 48, en la que dicho segundo agente anticancerígeno es angiopoyetina-1 dirigida al tumor.
50. Composición, según la reivindicación 47, en la que dicho segundo agente anticancerígeno es endostatina o una endostatina dirigida al tumor.
51. Composición, según la reivindicación 47, en la que dicho segundo agente anticancerígeno es un fármaco antitubulina o un fármaco antitubulina dirigido al tumor.
52. Composición, según la reivindicación 47, en la que dicho segundo agente anticancerígeno es una construcción anticuerpo-agente terapéutico que comprende un agente terapéutico que se une operativamente a un segundo anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une a un componente expresado en la superficie, accesible en la superficie o localizado en la superficie, de una célula tumoral, vasculatura tumoral o estroma tumoral.
53. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su utilización en terapia.
54. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o reivindicaciones 34 a 36, para su utilización en diagnóstico.
55. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o reivindicaciones 23 a 29, para su utilización en la inhibición de la angiogénesis tras la administración a un animal.
56. Composición, según la reivindicación 55, para su utilización en la inhibición de la angiogénesis en un animal que tiene una enfermedad neovascular ocular o una degeneración macular tras la administración a dicho animal.
57. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 41, para su utilización en la liberación de un agente biológico a un tumor vascularizado tras la administración a un animal con un tumor vascularizado.
58. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su utilización en el tratamiento del cáncer.
59. Utilización de una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o reivindicaciones 23 a 29, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediante la inhibición de laangiogé-
nesis.
60. Utilización, según la reivindicación 59, en la que dicho medicamento está dirigido al tratamiento de enfermedades neovasculares oculares o degeneración macular mediante la inhibición de angiogénesis.
61. Utilización de una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 41, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer mediante la liberación de un agente biológico a un tumor vascularizado.
62. Utilización de una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
63. Composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) para su utilización en terapia, sin una inhibición sustancial de macrófagos, osteoclastos o condroclastos.
64. Utilización de una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer mediante la inhibición de la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1), sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1).
65. Kit que comprende, como mínimo, una primera composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58.
66. Kit que comprende, como mínimo, una primera composición, según la reivindicación 13 ó 14, y, como mínimo, una segunda composición que comprende un profármaco sustancialmente inactivo, que se divide por el agente biológico acoplado al anticuerpo en dicha primera composición, para liberar un fármaco sustancialmente activo.
67. Kit que comprende, como mínimo, una primera composición, según la reivindicación 14, y, como mínimo, una segunda composición que comprende fosfato de combretastatina.
68. Hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal anti-VEGF que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595 y que inhibe significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1), sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1).
69. Anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595.
70. Inmunoconjugado que comprende un anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595 acoplado operativamente a, como mínimo, un primer agente biológico.
71. Método para la preparación de un anticuerpo anti-VEGF que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595, que comprende inmunizar un animal no humano con una composición inmunizante que comprende, como mínimo, un primer componente de VEGF inmunogénico y seleccionar, del animal inmunizado, un anticuerpo que reacciona sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595.
72. Método, según la reivindicación 71, en el que dicho animal no humano es un ratón transgénico que comprende una biblioteca de anticuerpos humanos.
73. Método, según la reivindicación 71 ó 72, que comprende obtener los ácidos nucleicos que codifican dicho anticuerpo anti-VEGF y expresar dichos ácidos nucleicos para obtener un anticuerpo anti-VEGF recombinante.
74. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 71 a 73, que comprende:
(a) administrar a un animal no humano una cantidad inmunizante efectiva de una composición que comprende, como mínimo, un primer componente VEGF inmunogénico;
(b) preparar una biblioteca combinatoria de fagémidos de inmunoglobulina que expresan ARN aislado del bazo de un animal inmunizado;
(c) seleccionar de la biblioteca de fagémidos, un clon que expresa un anticuerpo anti-VEGF que, reacciona sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y
(d) expresar los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-VEGF de dicho clon seleccionado para proporcionar un anticuerpo anti-VEGF recombinante.
75. Método de detección de VEGF, que comprende poner en contacto una composición in vitro sospechosa de contener VEGF con una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58, bajo condiciones efectivas para permitir la formación de complejos VEGF/anticuerpo y detectar los complejos así formados.
76. Método de inhibición de la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2, sin inhibición significativa de la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1, que comprende poner en contacto una población de células in vitro, homogéneas o heterogéneas, que expresan VEGFR2 (KDR/Flk-1) y VEGFR1 (Flt-1), con una cantidad biológicamente efectiva de una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58.
77. Método de inhibición específica de la proliferación de células endoteliales inducida por el VEGF, que comprende poner en contacto una población de células endoteliales in vitro con una cantidad biológicamente efectiva de una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58.
78. Método de inhibición de la proliferación de células endoteliales inducida por el VEGF, sin inhibición significativa de la función de los macrófagos, osteoclastos o condroclastos inducida por el VEGF, que comprende poner en contacto una muestra de tejido in vitro que contiene células endoteliales y, como mínimo, una de macrófagos, osteoclastos y condroclastos, con una cantidad biológicamente efectiva de una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58.
79. Método de inhibición de la angiogénesis, que comprende poner en contacto una población de vasos sanguíneos in vitro con una composición antiangiogénica, que comprende una cantidad biológicamente efectiva de una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58.
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Families Citing this family (521)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5367057A (en) * 1991-04-02 1994-11-22 The Trustees Of Princeton University Tyrosine kinase receptor flk-2 and fragments thereof
US20030108545A1 (en) * 1994-02-10 2003-06-12 Patricia Rockwell Combination methods of inhibiting tumor growth with a vascular endothelial growth factor receptor antagonist
US6448077B1 (en) * 1994-02-10 2002-09-10 Imclone Systems, Inc. Chimeric and humanized monoclonal antibodies specific to VEGF receptors
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
JP2002500879A (ja) * 1998-01-23 2002-01-15 イムクローン システムズ インコーポレーテッド 幹細胞の精製ポピュレーション
AU770896C (en) * 1998-09-29 2006-09-07 Gamida Cell Ltd. Methods of controlling proliferation and differentiation of stem and progenitor cells
US6537520B1 (en) * 1998-03-31 2003-03-25 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders
US20030176663A1 (en) * 1998-05-11 2003-09-18 Eidgenossische Technische Hochscule Specific binding molecules for scintigraphy
AU757698C (en) * 1998-06-01 2004-04-08 Agensys, Inc. Novel serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
US6962702B2 (en) 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
WO2000037025A2 (en) * 1998-12-21 2000-06-29 Ludwig Institute For Cancer Research Antibodies to truncated vegf-d and uses thereof
IT1312077B1 (it) * 1999-04-15 2002-04-04 Univ Degli Studi Milano Polipeptidi ad attivita' antiangiogenica.
US6342221B1 (en) 1999-04-28 2002-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate compositions for selectively inhibiting VEGF
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US6924359B1 (en) 1999-07-01 2005-08-02 Yale University Neovascular-targeted immunoconjugates
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
CA2385528C (en) 1999-10-01 2013-12-10 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
WO2001024828A2 (en) * 1999-10-06 2001-04-12 Basf Aktiengesellschaft MODULATORS OF CYTOKINE MEDIATED SIGNALLING PATHWAYS AND INTEGRIN αVβ3 RECEPTOR ANTAGONISTS FOR COMBINATION THERAPY
US7740841B1 (en) * 2000-01-28 2010-06-22 Sunnybrook Health Science Center Therapeutic method for reducing angiogenesis
CA2714081C (en) * 2000-02-10 2013-08-06 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for treating conditions of the eye
EP1259548A1 (en) * 2000-02-24 2002-11-27 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US20040191260A1 (en) * 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
EP1268544A2 (en) 2000-03-31 2003-01-02 Institut Pasteur Peptides blocking vascular endothelial growth factor (vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said peptides and methods of use thereof
US7355019B2 (en) * 2000-06-06 2008-04-08 Sibtech, Inc. Cysteine-containing peptide tag for site-specific conjugation of proteins
US7288390B2 (en) * 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
FR2813606B1 (fr) * 2000-09-01 2004-04-30 Inst Nat Sante Rech Med Proteine bard1 tronquee, et ses applications diagnostiques et therapeutiques
AU2001288025A1 (en) * 2000-09-05 2002-03-22 Biosight Ltd. Peptide conjugated anti-cancer prodrugs
US8314060B2 (en) * 2000-09-05 2012-11-20 Biosight Ltd. Peptide conjugated anti-cancer prodrugs
AU1218202A (en) * 2000-09-07 2002-03-22 Schering Ag Receptor in the ED<sub>b</sub> fibronectin domain
US20020091082A1 (en) * 2000-09-13 2002-07-11 Aiello Lloyd P. Methods of modulating symptoms of hypertension
ATE355275T1 (de) * 2000-10-20 2006-03-15 Eisai R&D Man Co Ltd Stickstoff-enthaltende aromatische ringverbindungen zur behandlung von tumorerkrankungen
US7273722B2 (en) 2000-11-29 2007-09-25 Allergan, Inc. Neurotoxins with enhanced target specificity
US20050209310A1 (en) * 2000-12-22 2005-09-22 Chaplin David J Methods for modulating tumor growth and metastasis
US7037906B1 (en) * 2000-12-22 2006-05-02 Oxigene, Inc. Methods for modulating tumor growth and metastasis
WO2002096948A2 (en) * 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
CA2436092A1 (en) * 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Modified antibodies and methods of use
US20030077826A1 (en) * 2001-02-02 2003-04-24 Lena Edelman Chimeric molecules containing a module able to target specific cells and a module regulating the apoptogenic function of the permeability transition pore complex (PTPC)
US7601825B2 (en) * 2001-03-05 2009-10-13 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 121P1F1 useful in treatment and detection of cancer
US6924358B2 (en) 2001-03-05 2005-08-02 Agensys, Inc. 121P1F1: a tissue specific protein highly expressed in various cancers
WO2002069907A2 (en) * 2001-03-07 2002-09-12 Mannkind Corporation Anti-neovasculature preparations for cancer
CA2441953A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-03 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods for inhibition of angiogenesis, tumor growth and metastasis by fully human anti-il8 and anti-muc18 in diverse types of tumors
US20040198960A1 (en) * 2001-03-29 2004-10-07 Janoff Edward N Human monoclonal antibodies against capsular polysaccharides of streptococcus pneumoniae
AU2002257132A1 (en) * 2001-04-06 2002-10-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Erbb interface peptidomimetics and methods of use thereof
US20030191073A1 (en) * 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
ATE470676T1 (de) * 2001-04-13 2010-06-15 Human Genome Sciences Inc Anti-vegf-2 antikörper
US20030170786A1 (en) * 2001-04-13 2003-09-11 Rosen Craig A. Vascular endothelial growth factor 2
US6884869B2 (en) * 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US7256257B2 (en) 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20040234497A1 (en) * 2001-05-04 2004-11-25 Yi Luo Hyaluronic acid containing bioconjugates:targeted delivery of anti-cancer drugs to cancer cells
US7456146B2 (en) * 2001-05-09 2008-11-25 Ghc Research Development Corporation Lytic peptide prodrugs
US20090226429A1 (en) * 2001-05-25 2009-09-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies That Immunospecifically Bind to TRAIL Receptors
US7361341B2 (en) * 2001-05-25 2008-04-22 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US20030007974A1 (en) * 2001-05-30 2003-01-09 Nanus David M. Endopeptidase/anti-PSMA antibody fusion proteins for treatment of cancer
US7514078B2 (en) * 2001-06-01 2009-04-07 Cornell Research Foundation, Inc. Methods of treating prostate cancer with anti-prostate specific membrane antigen antibodies
US7045605B2 (en) * 2001-06-01 2006-05-16 Cornell Research Foundation, Inc. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
US7666414B2 (en) * 2001-06-01 2010-02-23 Cornell Research Foundation, Inc. Methods for treating prostate cancer using modified antibodies to prostate-specific membrane antigen
JP2005501011A (ja) * 2001-06-08 2005-01-13 ユタ ベンチャー ザ セカンド リミテッド パートナーシップ 組織特異的内皮膜タンパク質
WO2002102973A2 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
AU2002316305A1 (en) * 2001-06-20 2003-01-08 Vlaams Interuniversitair Institut Voor Biotechnologie Method of treating atherosclerosis and other inflammatory diseases
US20050271663A1 (en) * 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
AU2002319402B2 (en) * 2001-06-28 2008-09-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
CA2453474A1 (en) * 2001-07-13 2003-01-23 Imclone Systems Incorporated Vegfr-1 antibodies to treat breast cancer
WO2003012072A2 (en) * 2001-08-03 2003-02-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies to activated erbb family members and methods of use thereof
EP1423012B1 (en) * 2001-08-10 2007-11-14 Imclone Systems, Inc. Medical use of stem cells expressing vegfr-1
US7494646B2 (en) * 2001-09-06 2009-02-24 Agensys, Inc. Antibodies and molecules derived therefrom that bind to STEAP-1 proteins
ES2537074T3 (es) * 2001-09-06 2015-06-02 Agensys, Inc. Ácido nucleico y proteína correspondiente denominados STEAP-1 útiles en el tratamiento y la detección de cáncer
AU2002305767B2 (en) * 2001-09-20 2008-04-10 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and compositions for treating and preventing skin disorders using binding agents specific for PSMA
US20030124132A1 (en) * 2001-09-27 2003-07-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined compositions for tumor vasculature coaguligand treatment
PL374495A1 (en) * 2001-10-15 2005-10-31 Immunomedics, Inc. Direct targeting binding proteins
US7226594B2 (en) * 2001-11-07 2007-06-05 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
GB0126879D0 (en) * 2001-11-08 2002-01-02 Astrazeneca Ab Combination therapy
EP1453546A2 (en) * 2001-12-04 2004-09-08 Nanospectra Biosciences, Inc. Treatment of angiogenesis disorders using targeted nanoparticles
EP1467756A4 (en) * 2001-12-28 2007-03-21 Abgenix Inc METHODS OF USING ANTI-MUC18 ANTIBODIES
US20030194421A1 (en) * 2001-12-28 2003-10-16 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Treatment of uveitis
CA2472154A1 (en) * 2001-12-28 2003-07-17 Abgenix, Inc. Use of antibodies against the muc18 antigen
MXPA04006554A (es) * 2002-01-02 2005-03-31 Genentech Inc Composiciones y metodos para diagnostico y tratamiento de tumor.
EP1461360B1 (en) * 2002-01-03 2010-08-18 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Conjugates comprising an antibody specific for the ed-b domain of fibronectin and their use for the detection and treatment of tumours
JP4242590B2 (ja) * 2002-01-11 2009-03-25 俊一 塩澤 慢性関節リウマチの疾患感受性遺伝子、及びその利用
EP2075256A2 (en) 2002-01-14 2009-07-01 William Herman Multispecific binding molecules
US7241444B2 (en) * 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
US20080193445A1 (en) * 2002-01-18 2008-08-14 Liliane Goetsch Novel anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
CA2472578A1 (en) * 2002-01-24 2003-07-31 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Anti-cancer combination and use thereof
IL152904A0 (en) * 2002-01-24 2003-06-24 Gamida Cell Ltd Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
WO2003062404A1 (en) * 2002-01-25 2003-07-31 Gamida-Cell Ltd. Methods of expanding stem and progenitor cells and expanded cell populations obtained thereby
US6992176B2 (en) * 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
US7071311B2 (en) * 2002-02-13 2006-07-04 Sirna Therapeutics, Inc. Antibodies having specificity for 2′-C-allyl nucleic acids
US20050042632A1 (en) * 2002-02-13 2005-02-24 Sirna Therapeutics, Inc. Antibodies having specificity for nucleic acids
EP1485075A4 (en) * 2002-02-20 2006-04-26 Dyax Corp MHC-PEPTIDE COMPLEX BINDING LIGANDS
US8435529B2 (en) 2002-06-14 2013-05-07 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
US8491896B2 (en) * 2002-06-14 2013-07-23 Immunomedics, Inc. Anti-pancreatic cancer antibodies
CA2478169C (en) * 2002-03-04 2013-04-16 Imclone Systems Incorporated Human antibodies specific to kdr and uses thereof
SG108837A1 (en) * 2002-03-11 2005-02-28 Pi Eta Consulting Co Pte Ltd An enterprise knowledge and information acquisition, management and communications system with intelligent user interfaces
US20050124794A1 (en) * 2002-03-15 2005-06-09 Mccrae Keith Cell surface tropomyosin as a target of angiogenesis inhibition
US20060002940A1 (en) * 2002-03-15 2006-01-05 Jennifer Stevenson Method of immunotherapy
US20070178065A1 (en) * 2002-05-03 2007-08-02 Lattime Edmund C Neutralizing factors as vaccine adjuvants
US20050169883A1 (en) * 2002-05-06 2005-08-04 Prestwich Glenn D. Preblocking with non-ha gags increases effectiveness of ha conjugated anticancer agents
CN100396670C (zh) * 2002-05-15 2008-06-25 詹森药业有限公司 作为pdfg受体抑制剂的n-取代的3-氨基苯并环戊二烯并吡唑及药用组合物和用途
AU2003233662B2 (en) 2002-05-23 2010-04-01 Trustees Of The University Of Pennsylvania Fas peptide mimetics and uses thereof
WO2003101495A1 (en) * 2002-05-29 2003-12-11 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for radioimmunotherapy of brain and cns tumors
JP4511108B2 (ja) * 2002-05-31 2010-07-28 オンコリクス インコーポレイテッド ヒトプロラクチン拮抗剤−血管新生阻害剤融合蛋白質
US20040022726A1 (en) * 2002-06-03 2004-02-05 Goldenberg David M. Methods and compositions for intravesical therapy of bladder cancer
US9599619B2 (en) 2002-06-14 2017-03-21 Immunomedics, Inc. Anti-pancreatic cancer antibodies
US8821868B2 (en) 2002-06-14 2014-09-02 Immunomedics, Inc. Anti-pancreatic cancer antibodies
RU2005100777A (ru) * 2002-06-14 2005-08-27 Иммуномедикс, Инк. (Us) Моноклональное антитело рам4 и его применение для диагностики и лечения рака поджелудочной железы
EP2301968A3 (en) * 2002-06-14 2011-06-29 Immunomedics, Inc. Humanized monoclonal antibody HPAM4
US9238081B2 (en) * 2002-06-14 2016-01-19 Immunomedics, Inc. Detection of early-stage pancreatic adenocarcinoma
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US9321832B2 (en) * 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
JP2006512895A (ja) * 2002-06-28 2006-04-20 ドマンティス リミテッド リガンド
ATE491725T1 (de) 2002-07-15 2011-01-15 Univ Texas Antikörper mit bindung an anionische phospholipide und aminophospholipide und ihre verwendung bei der behandlung von virusinfektionen
US7205298B2 (en) 2002-07-18 2007-04-17 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted triazine kinase inhibitors
NZ520321A (en) * 2002-07-19 2005-03-24 Auckland Uniservices Ltd Use of an agent adapted to inhibit HIF in use together with an antiangiogenic agent for treating tumours in a non- human animal
ES2544527T3 (es) * 2002-07-31 2015-09-01 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de fármacos y su uso para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa
US20040224986A1 (en) 2002-08-16 2004-11-11 Bart De Corte Piperidinyl targeting compounds that selectively bind integrins
BR0313534A (pt) * 2002-08-16 2005-07-12 Janssen Pharmaceutica Nv Antagonistas de integrinade ácido carboxìlico de piperidinoìla
US7226755B1 (en) * 2002-09-25 2007-06-05 The Procter & Gamble Company HPTPbeta as a target in treatment of angiogenesis mediated disorders
US7507568B2 (en) * 2002-09-25 2009-03-24 The Proctor & Gamble Company Three dimensional coordinates of HPTPbeta
EP1549344B1 (en) * 2002-10-10 2015-01-07 Merck Patent GmbH Pharmaceutical compositions directed to erb-b1 receptors
US9701754B1 (en) 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
JP4494977B2 (ja) * 2002-12-17 2010-06-30 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｇｄ２に結合するマウス１４．１８抗体のヒト化抗体（ｈ１４．１８）およびそのｉｌ−２融合タンパク質
AU2003290330A1 (en) * 2002-12-27 2004-07-22 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US20050026826A1 (en) * 2003-01-17 2005-02-03 Margarethe Hoenig Feline proinsulin, insulin and constituent peptides
US7402385B2 (en) * 2003-02-11 2008-07-22 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Radiolabeled antibodies for treatment of tumors
US20060039858A1 (en) * 2003-02-11 2006-02-23 Ekaterina Dadachova Radiolabeled antibodies and peptides for treatment of tumors
ES2347959T3 (es) * 2003-02-20 2010-11-26 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de anticuerpos anti-cd70-farmaco y su uso para el tratamiento del cancer.
US20080025989A1 (en) * 2003-02-20 2008-01-31 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7759468B1 (en) * 2003-03-05 2010-07-20 University Of Kentucky Research Foundation Bioactive peptide-based probes
ATE442861T1 (de) * 2003-03-07 2009-10-15 Univ Texas Gegen antikörper gerichtete photodynamische therapie
EP1604665B1 (en) * 2003-03-10 2011-05-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. C-kit kinase inhibitor
DK1608685T3 (da) * 2003-03-28 2007-06-11 Regeneron Pharma VEGF antagonister til behandlingen af diabetes
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
MXPA05012613A (es) * 2003-05-23 2006-05-25 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores de origen glial.
RS20181002A1 (sr) * 2003-05-30 2018-12-31 Genentech Inc Tretman sa anti-vegf antitelima
US9708410B2 (en) 2003-05-30 2017-07-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
US7605235B2 (en) * 2003-05-30 2009-10-20 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
WO2005021710A2 (en) * 2003-06-02 2005-03-10 University Of Miami Chimeric molecules and methods of use
WO2005000223A2 (en) * 2003-06-04 2005-01-06 Children's Medical Center Corporation Method of treating retinopathies and disorders associated with blood vessel loss
US7178491B2 (en) * 2003-06-05 2007-02-20 Caterpillar Inc Control system and method for engine valve actuator
US9005613B2 (en) 2003-06-16 2015-04-14 Immunomedics, Inc. Anti-mucin antibodies for early detection and treatment of pancreatic cancer
CA2529056C (en) * 2003-06-17 2013-09-10 Mannkind Corporation Combinations of tumor-associated antigens in compositions for various types of cancers
CA2527054C (en) 2003-06-25 2013-01-08 Peregrine Pharmaceuticals, Inc. Methods and apparatus for continuous large-scale radiolabeling of proteins
CN1930187B (zh) * 2003-06-27 2015-08-19 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
EP2457586A1 (en) * 2003-06-27 2012-05-30 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
US7825085B2 (en) * 2003-06-30 2010-11-02 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Fragments of NKp44 and NKp46 for targeting viral-infected and tumor cells
DE602004030464D1 (de) * 2003-07-02 2011-01-20 Innate Pharma Methode zur produktion und evaluierung der zytotoxizität von kir2dl nk-rezeptor antikörpern
US20090191213A9 (en) * 2003-07-02 2009-07-30 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for regulating NK cell activity
AR046510A1 (es) 2003-07-25 2005-12-14 Regeneron Pharma Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo
CA2533878A1 (en) * 2003-07-29 2005-09-22 Immunomedics, Inc. Fluorinated carbohydrate conjugates
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
WO2005044853A2 (en) * 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
AP2012006644A0 (en) * 2003-08-01 2012-12-31 Genentech Inc Anti-VEGF antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2012201667B2 (en) * 2003-08-01 2014-11-27 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US7758859B2 (en) * 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
CA2534197A1 (en) * 2003-08-06 2005-02-24 Thomas Jefferson University Use of a vegf antagonist in combination with radiation therapy
CA2534898A1 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
US7547518B2 (en) 2003-08-19 2009-06-16 Becton, Dickinson And Company Method of screening endothelial cells for angiogenic capability
AU2004268614C1 (en) * 2003-08-27 2010-10-28 Ophthotech Corporation Combination therapy for the treatment of ocular neovascular disorders
WO2005074417A2 (en) * 2003-09-03 2005-08-18 Salk Institute For Biological Studies Multiple antigen detection assays and reagents
SG149815A1 (en) 2003-11-06 2009-02-27 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005044788A1 (ja) * 2003-11-11 2005-05-19 Eisai Co., Ltd. ウレア誘導体およびその製造方法
WO2005047319A2 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Dna sequence and expressed recombinant glycoproteins related to feline thyrotropin
JP2007511514A (ja) * 2003-11-13 2007-05-10 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 生体分子標的同定用の固定化ｎ置換三環状３−アミノピラゾール
WO2005048938A2 (en) * 2003-11-13 2005-06-02 California Pacific Medical Center Anti-pecam therapy for metastasis suppression
US20080220049A1 (en) * 2003-12-05 2008-09-11 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company Compositions and methods for intraocular delivery of fibronectin scaffold domain proteins
CN1946417A (zh) 2003-12-05 2007-04-11 阿德内克休斯治疗公司 2型血管内皮生长因子受体的抑制剂
US7799327B2 (en) * 2003-12-24 2010-09-21 Henry John Smith Autoantibodies utilized as carrier agents for pharmaceutical compounds used in cancer treatment
US20090155266A1 (en) * 2004-01-16 2009-06-18 Yale University Methods and Compositions Relating to Vascular Endothelial Growth Factor and TH2 Mediated Inflammatory Diseases
WO2005072340A2 (en) * 2004-01-27 2005-08-11 Compugen Ltd. Novel polynucleotides encoding polypeptides and methods using same
US20110020273A1 (en) * 2005-04-06 2011-01-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific Immunocytokine Dock-and-Lock (DNL) Complexes and Therapeutic Use Thereof
WO2005084710A2 (en) * 2004-03-02 2005-09-15 Massachusetts Institute Of Technology Nanocell drug delivery system
US20050214280A1 (en) * 2004-03-02 2005-09-29 Ludwig Institute For Cancer Research Method for inhibiting tumor formation and growth
WO2005094882A1 (en) * 2004-03-03 2005-10-13 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
ATE507240T1 (de) * 2004-03-05 2011-05-15 Vegenics Pty Ltd Materialien und verfahren für wachstumsfaktorbindende konstrukte
JP2007527539A (ja) * 2004-03-05 2007-09-27 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート ハイスループットグリカンマイクロアレイ
WO2005087811A2 (en) * 2004-03-10 2005-09-22 Creighton University Estrogen receptors and methods of use
AU2012265582B2 (en) * 2004-03-26 2015-04-16 Ophthotech Corporation Combination therapy for the treatment of ocular neovascular disorders
US8470315B2 (en) 2004-04-13 2013-06-25 Quintessence Biosciences, Inc. Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents
CA2563735C (en) 2004-04-22 2020-07-14 Agensys, Inc. Antibodies and molecules derived therefrom that bind to steap-1 proteins
US20060182783A1 (en) * 2004-04-30 2006-08-17 Allergan, Inc. Sustained release intraocular drug delivery systems
CN1304427C (zh) * 2004-06-08 2007-03-14 成都康弘生物科技有限公司 抑制血管新生的融合蛋白质及其用途
US20060008468A1 (en) * 2004-06-17 2006-01-12 Chih-Sheng Chiang Combinations of tumor-associated antigens in diagnostics for various types of cancers
US20060159689A1 (en) * 2004-06-17 2006-07-20 Chih-Sheng Chiang Combinations of tumor-associated antigens in diagnostics for various types of cancers
US8029766B2 (en) * 2004-06-18 2011-10-04 Elmaleh David R Intravascular imaging device and uses thereof
US20060008415A1 (en) * 2004-06-25 2006-01-12 Protein Design Labs, Inc. Stable liquid and lyophilized formulation of proteins
WO2006003179A2 (en) 2004-07-01 2006-01-12 Novo Nordisk A/S Antibodies binding to receptors kir2dl1, -2, 3 but not kir2ds4 and their therapeutic use
WO2006002474A1 (en) * 2004-07-02 2006-01-12 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Alpha-helical mimetics
JP2008514900A (ja) 2004-07-30 2008-05-08 アデザ・バイオメデイカル・コーポレイシヨン 疾病および他の状態のマーカーとしての癌胎児性フィブロネクチンならびに癌胎児性フィブロネクチンの検出のための方法
JP4807802B2 (ja) * 2004-07-30 2011-11-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ媒介性活性をブロックすることによるｉ型糖尿病を処置する方法
WO2006016276A2 (en) 2004-08-03 2006-02-16 Innate Pharma S.A. Therapeutic and diagnostic methods and compositions targeting 4ig-b7-h3 and its counterpart nk cell receptor
US20070003943A1 (en) * 2004-08-09 2007-01-04 Northwestern University Tumor angiogenesis inhibitor alpha 1-antitrypsin
CN1316249C (zh) * 2004-08-25 2007-05-16 北京健平九星生物医药科技有限公司 一种酶联检测试剂盒及制备方法
WO2006024092A1 (en) * 2004-08-31 2006-03-09 Newsouth Innovations Pty Limited Vegf inhibition
AR050642A1 (es) * 2004-09-10 2006-11-08 Wyeth Corp Anticuerpos anti-5t4 humanizados y conjugados anticuerpo anti-5t4/ calicheamicina
US8772269B2 (en) * 2004-09-13 2014-07-08 Eisai R&D Management Co., Ltd. Use of sulfonamide-including compounds in combination with angiogenesis inhibitors
EP2364699A1 (en) 2004-09-13 2011-09-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Joint use of sulfonamide based compound with angiogenesis inhibitor
EP1799812A4 (en) * 2004-09-16 2009-09-09 Gamida Cell Ltd EX VIVO CULTIVATION METHODS OF STEM CELLS AND PRECURSOR BY CO-CULTURE WITH MESENCHYMAL CELLS
AU2005283422C1 (en) * 2004-09-17 2017-02-02 Eisai R & D Management Co., Ltd. Medicinal composition
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
JP2008515800A (ja) * 2004-10-04 2008-05-15 セルゲイト， インコーポレイテッド 眼科疾患の処置剤としてのポリアミン類似化合物
US20090010887A1 (en) * 2004-10-06 2009-01-08 Ben-Sasson Shmuel A Method and composition for enhancing anti-angiogenic therapy
US8337838B2 (en) * 2004-10-15 2012-12-25 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
US7641903B2 (en) * 2004-10-15 2010-01-05 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
EP1799262A4 (en) * 2004-10-15 2009-10-21 Seattle Genetics Inc ANTI-CD70 ANTIBODIES AND ITS USE FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER DISORDERS AND IMMUNE DISORDERS
ES2390676T3 (es) * 2004-10-21 2012-11-15 Genentech, Inc. Método para el tratamiento de enfermedades neovasculares intraoculares
ES2325344B1 (es) * 2004-11-02 2010-06-09 Univ Madrid Autonoma Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes.
US7595149B1 (en) 2004-11-08 2009-09-29 University Of Kentucky Research Foundation Methods for cancer detection
EP2377555A3 (en) 2004-11-18 2011-11-23 Imclone LLC Antibodies against vascular endothelial growth factor receptor-1
WO2006068758A2 (en) * 2004-11-19 2006-06-29 The Scripps Research Institute Detection, prevention and treatment of breast cancer
NZ555286A (en) * 2004-12-17 2010-04-30 Genentech Inc Antiangiogenesis therapy of autoimmune disease in patients who have failed prior therapy
NZ556029A (en) 2004-12-21 2010-04-30 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
US20120269886A1 (en) 2004-12-22 2012-10-25 Nitto Denko Corporation Therapeutic agent for pulmonary fibrosis
HUE048419T2 (hu) 2004-12-22 2020-08-28 Nitto Denko Corp Gyógyszerhordozó és kit gyógyszerhordozó kit fibrózis gátlására
EP3026063A1 (en) 2004-12-28 2016-06-01 Innate Pharma S.A. Monoclonal antibodies against nkg2a
EP1835932A2 (en) * 2004-12-29 2007-09-26 Mannkind Corporation Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against mhc class i-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes
PL1833506T3 (pl) * 2004-12-29 2016-01-29 Mannkind Corp Zastosowanie kompozycji zawierających różne antygeny związane z nowotworem jako szczepionek przeciwnowotworowych
ATE531733T1 (de) * 2005-01-06 2011-11-15 Novo Nordisk As Kir-bindende wirkstoffe und verfahren zu ihrer verwendung
EP2446897A1 (en) 2005-01-06 2012-05-02 Novo Nordisk A/S Anti-KIR combination treatments and methods
DK1835937T3 (da) 2005-01-06 2012-07-23 Novo Nordisk As Sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af virusinfektion
WO2006084054A2 (en) * 2005-02-02 2006-08-10 Children's Medical Center Corporation Method of treating angiogenic diseases
US20080213399A1 (en) * 2005-02-03 2008-09-04 Topotarget Uk Limited Combination Therapies Using Hdac Inhibitors
US7722867B2 (en) * 2005-02-07 2010-05-25 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
US8691780B2 (en) * 2005-02-17 2014-04-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Txr1 and enhanced taxane sensitivity based on the modulation of a pathway mediated thereby
AU2006218653A1 (en) * 2005-03-02 2006-09-08 Barnett, Gene Ph.D. Pharmaceutically acceptable carrier for ophthalmic compositions
CA2598452A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treating anemia by inhibition of vegf
PL1861116T3 (pl) 2005-03-25 2016-02-29 Regeneron Pharma Formulacje antagonistów VEGF
US20060222595A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Priyabrata Mukherjee Nanoparticles for therapeutic and diagnostic applications
EP2444099A1 (en) 2005-03-31 2012-04-25 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
US8350009B2 (en) * 2005-03-31 2013-01-08 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
EP1712241A1 (en) * 2005-04-15 2006-10-18 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Composition for treating cancer adapted for intra-tumoral administration and uses thereof
DK1871418T3 (da) 2005-04-19 2014-06-10 Seattle Genetics Inc Humaniserede anti-cd70-bindende midler og anvendelser deraf
KR101329437B1 (ko) 2005-05-13 2013-11-14 토포타겟 유케이 리미티드 Ｈｄａｃ 억제제의 약학 제형
US7767710B2 (en) * 2005-05-25 2010-08-03 Calosyn Pharma, Inc. Method for treating osteoarthritis
US20060269579A1 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Musculoskeletal Research Llc Compositions for treating osteoarthritis
WO2006130673A1 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Janssen Pharmaceutica, N.V. 3-benzoimidazolyl-pyrazolopyridines useful in treating kinase disorders
US8071768B2 (en) * 2005-06-10 2011-12-06 Janssen Pharmaceutica, N.V. Alkylquinoline and alkylquinazoline kinase modulators
US7825244B2 (en) * 2005-06-10 2010-11-02 Janssen Pharmaceutica Nv Intermediates useful in the synthesis of alkylquinoline and alkylquinazoline kinase modulators, and related methods of synthesis
US20060281768A1 (en) * 2005-06-10 2006-12-14 Gaul Michael D Thienopyrimidine and thienopyridine kinase modulators
US20060281788A1 (en) * 2005-06-10 2006-12-14 Baumann Christian A Synergistic modulation of flt3 kinase using a flt3 inhibitor and a farnesyl transferase inhibitor
WO2006138567A2 (en) 2005-06-17 2006-12-28 Mannkind Corporation Methods and compositions to elicit multivalent immune responses against dominant and subdominant epitopes, expressed on cancer cells and tumor stroma
EP1748050A1 (en) * 2005-07-28 2007-01-31 Rijksuniversiteit Groningen Targeting-enhanced activation of galectins
EP1925941B1 (en) * 2005-08-01 2012-11-28 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for prediction of the efficacy of vascularization inhibitor
EP1925676A4 (en) 2005-08-02 2010-11-10 Eisai R&D Man Co Ltd TEST METHOD FOR THE EFFECT OF A VASCULARIZATION INHIBITOR
ES2363758T3 (es) 2005-08-15 2011-08-16 Vegenics Pty Ltd Vegf y pdgf modificados con propiedades angiogénicas mejoradas.
WO2007026864A1 (ja) * 2005-09-01 2007-03-08 Eisai R & D Management Co., Ltd. 崩壊性の改善された医薬組成物の製造方法
US8044179B2 (en) * 2005-09-13 2011-10-25 National Research Council Of Canada Methods and compositions for modulating tumor cell activity
GB0519398D0 (en) * 2005-09-23 2005-11-02 Antisoma Plc Biological materials and uses thereof
CA2623236A1 (en) * 2005-09-26 2007-04-05 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to cd70
US20070071756A1 (en) * 2005-09-26 2007-03-29 Peyman Gholam A Delivery of an agent to ameliorate inflammation
CN101300272B (zh) 2005-10-14 2013-09-18 依奈特制药公司 用于治疗增生性病症的组合物和方法
AU2006304897B2 (en) 2005-10-18 2012-07-12 Janssen Pharmaceutica N.V. Method of inhibiting FLT3 kinase
CN101534865A (zh) * 2005-10-19 2009-09-16 Ibc药品公司 生物活性装配体的制备方法及其用途
JP2009516757A (ja) * 2005-10-21 2009-04-23 メディバス エルエルシー ポリ（エステルウレア）ポリマーおよび使用法
US20090291437A1 (en) * 2005-11-02 2009-11-26 O'brien Sean Methods for targeting quadruplex sequences
CA2627598C (en) 2005-11-07 2013-06-25 Eisai R & D Management Co., Ltd. Use of combination of anti-angiogenic substance and c-kit kinase inhibitor
US8812112B2 (en) * 2005-11-10 2014-08-19 ElectroCore, LLC Electrical treatment of bronchial constriction
US9037247B2 (en) 2005-11-10 2015-05-19 ElectroCore, LLC Non-invasive treatment of bronchial constriction
US20110125203A1 (en) * 2009-03-20 2011-05-26 ElectroCore, LLC. Magnetic Stimulation Devices and Methods of Therapy
US8041428B2 (en) 2006-02-10 2011-10-18 Electrocore Llc Electrical stimulation treatment of hypotension
CN101674862A (zh) * 2005-11-10 2010-03-17 电子核心公司 支气管收缩的电刺激治疗
EP2361619A1 (en) 2005-11-10 2011-08-31 TopoTarget UK Limited Histone deacetylase (hdac) inhibitors (pxd-101) alone for the treatment of hematological cancer
EP1964837A4 (en) * 2005-11-22 2010-12-22 Eisai R&D Man Co Ltd Antitumor agent against multiple myeloma
US8846393B2 (en) 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
AU2006321364B2 (en) * 2005-12-01 2011-11-10 Domantis Limited Noncompetitive domain antibody formats that bind Interleukin 1 Receptor type 1
PT1962895E (pt) † 2005-12-16 2013-03-28 Regeneron Pharma Utilização terapêutica de um antagonista dll4 e de um inibidor fcev para inibição de crescimento de tumores
AP3433A (en) * 2005-12-21 2015-10-31 Janssen Pharmaceutica Nv Triazolopyridazines as tyrosine kinase modultors
US9572886B2 (en) 2005-12-22 2017-02-21 Nitto Denko Corporation Agent for treating myelofibrosis
AU2006350220A1 (en) * 2005-12-23 2008-05-08 Board Of Regents Of The University Of Texas System Anti-hyperproliferative therapies targeting HDGF
US20090317475A1 (en) * 2006-01-03 2009-12-24 Beardsley Robert A Combination antitumor therapies
WO2007129223A2 (en) * 2006-01-23 2007-11-15 Ad Group Systems and methods for distributing emergency messages
US20070175313A1 (en) * 2006-01-31 2007-08-02 Kevin Vandervliet MP3 player holder assembly
AU2006338184B2 (en) * 2006-02-10 2011-11-24 ElectroCore, LLC. Electrical stimulation treatment of hypotension
EP1984064A4 (en) * 2006-02-10 2009-11-11 Electrocore Inc METHODS AND APPARATUS USED TO TREAT ANAPHYLAXIS USING ELECTRICAL MODULATION
WO2007101202A1 (en) * 2006-02-27 2007-09-07 Research Development Foundation Cell-targeted ikb and methods for the use thereof
ES2363891T3 (es) 2006-03-20 2011-08-18 The Regents Of The University Of California Anticuerpos contra el antígeno de células troncales de la próstata (psca) modificados genéticamente para el direccionamiento al cáncer.
TW200812615A (en) * 2006-03-22 2008-03-16 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an antibody for vascular endothelial growth factor and an antibody for human epithelial growth factor receptor type 2
TWI390034B (zh) 2006-04-06 2013-03-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Novel anti-CD98 antibody
EP2004697A2 (en) 2006-04-07 2008-12-24 The Procter & Gamble Company Antibodies that bind human protein tyrosine phosphatase beta (hptpbeta) and uses thereof
US20100241188A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Electrocore, Inc. Percutaneous Electrical Treatment Of Tissue
NZ572200A (en) 2006-04-20 2011-09-30 Janssen Pharmaceutica Nv Method of inhibiting c-kit kinase
SI2021335T1 (sl) 2006-04-20 2011-09-30 Janssen Pharmaceutica Nv Heterocikliäśne spojine kot zaviralci c-fms kinaze
EP2016070B1 (en) 2006-04-20 2016-01-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Inhibitors of c-fms kinase
US8697716B2 (en) 2006-04-20 2014-04-15 Janssen Pharmaceutica Nv Method of inhibiting C-KIT kinase
US20070253960A1 (en) * 2006-04-28 2007-11-01 Josee Roy Pharmaceutical removal of vascular extensions from a degenerating disc
US20070258976A1 (en) * 2006-05-04 2007-11-08 Ward Keith W Combination Therapy for Diseases Involving Angiogenesis
CN101437543A (zh) * 2006-05-04 2009-05-20 佛维雅制药股份有限公司 用于治疗新生血管病的包含vegf抑制剂和丝氨酸蛋白酶的组合
US20070265170A1 (en) * 2006-05-15 2007-11-15 Ola Blixt Detection, prevention and treatment of ovarian cancer
CN101443009A (zh) * 2006-05-18 2009-05-27 卫材R&D管理有限公司 针对甲状腺癌的抗肿瘤剂
MX2008014722A (es) * 2006-05-19 2011-04-15 Teva Pharma Proteinas de fusion, usos de las mismas y procesos para producir las mismas.
US20100196336A1 (en) 2006-05-23 2010-08-05 Dongsu Park Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods
US8101721B2 (en) * 2006-06-15 2012-01-24 Fibron Ltd. Antibodies blocking fibroblast growth factor receptor activation and methods of use thereof
CA2655411A1 (en) * 2006-06-15 2007-12-21 Biogen Idec Ma Inc. Combination therapy employing lymphotoxin beta receptor binding molecules in combination with second agents
EP2944306B1 (en) 2006-06-16 2021-01-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations suitable for intravitreal administration
JP2009541333A (ja) * 2006-06-23 2009-11-26 クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド 修飾リボヌクレアーゼ
US7795444B2 (en) * 2006-06-27 2010-09-14 Warner Chilcott Company Human protein tyrosine phosphatase inhibitors and methods of use
US7589212B2 (en) 2006-06-27 2009-09-15 Procter & Gamble Company Human protein tyrosine phosphatase inhibitors and methods of use
US7622593B2 (en) * 2006-06-27 2009-11-24 The Procter & Gamble Company Human protein tyrosine phosphatase inhibitors and methods of use
US8846685B2 (en) 2006-06-27 2014-09-30 Aerpio Therapeutics Inc. Human protein tyrosine phosphatase inhibitors and methods of use
JPWO2008001956A1 (ja) * 2006-06-29 2009-12-03 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 肝線維症治療剤
US20100021379A1 (en) * 2006-06-29 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Chemical Antibodies for Immunotherapy and Imaging
JP2009543868A (ja) 2006-07-17 2009-12-10 クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド 癌治療に関する方法および組成物
EP2049666A2 (en) * 2006-07-28 2009-04-22 Sanofi-Aventis Composition and method for treatment of tumors
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
EP2065372B1 (en) * 2006-08-28 2012-11-28 Eisai R&D Management Co., Ltd. Antitumor agent for undifferentiated gastric cancer
US20080070855A1 (en) * 2006-09-20 2008-03-20 James Pitzer Gills Treatment with anti-VEGF agents to prevent postoperative inflammation and angiogenesis in normal and diseased eyes
PL2066694T3 (pl) 2006-09-29 2016-04-29 Oncomed Pharm Inc Kompozycje i sposoby diagnozowania i leczenia nowotworu
KR20090067214A (ko) * 2006-10-17 2009-06-24 다이액스 코포레이션 순차적 병용 요법
CA2666809A1 (en) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-cancer agent comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
US8975374B2 (en) * 2006-10-20 2015-03-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition comprising anti-HB-EGF antibody as active ingredient
EP2078731A4 (en) * 2006-10-20 2012-08-01 Forerunner Pharma Res Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ANTI-HB-EGF ANTIBODY AS ACTIVE INGREDIENT
JP5795833B2 (ja) * 2006-10-27 2015-10-14 エルパス・インコーポレイテッドＬｐａｔｈ， Ｉｎｃ． スフィンゴシン−１−リン酸と結合させるための組成物および方法
PT2845866T (pt) 2006-10-27 2017-08-09 Genentech Inc Anticorpos e imunoconjugados e utilizações dos mesmos
CN101687031B (zh) * 2006-10-27 2014-05-14 勒帕斯公司 用于治疗眼疾和眼病的组合物及方法
WO2008059052A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Innate Pharma Improved methods of using phosphoantigen for the treatment of cancer
EP3156415A1 (en) 2006-11-22 2017-04-19 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including igf-ir
WO2008064336A2 (en) 2006-11-22 2008-05-29 Inivitrogen Corporation Autoimmune disease biomarkers
NZ578354A (en) * 2006-12-14 2012-01-12 Medarex Inc Antibody-partner molecule conjugates that bind cd70 and uses thereof
MX2009006779A (es) * 2006-12-19 2009-08-27 Genentech Inc Antagonistas especificos para terapia con adyuvantes y neo-adyuvantes y el tratamiento de tumores en etapa temprana.
WO2008074853A1 (en) * 2006-12-21 2008-06-26 Novartis Ag Ophthalmic rebamipide solution
WO2008081942A1 (ja) * 2007-01-05 2008-07-10 The University Of Tokyo 抗prg-3抗体を用いる癌の診断および治療
US20080213253A1 (en) * 2007-01-12 2008-09-04 Dyax Corp. Combination therapy for the treatment of cancer
WO2008093855A1 (ja) * 2007-01-29 2008-08-07 Eisai R & D Management Co., Ltd. 未分化型胃癌治療用組成物
US7816390B2 (en) * 2007-01-31 2010-10-19 Janssen Pharmaceutica Nv N-substituted tricyclic 3-aminopyrazoles as anti-mitotic tubulin polymerization inhibitors
ATE516814T1 (de) * 2007-02-02 2011-08-15 Bristol Myers Squibb Co 10fn3 domain zur behandlung von krankheiten begleitet von unerwünschter angiogenese
WO2008093246A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Vegenics Limited Vegf receptor antagonist for treating organ transplant alloimmunity and arteriosclerosis
TWI407971B (zh) 2007-03-30 2013-09-11 Nitto Denko Corp Cancer cells and tumor-related fibroblasts
US20080286337A1 (en) * 2007-05-15 2008-11-20 Boston Foundation For Sight Method of treating a disease in an eye using a scleral lens
WO2008149147A2 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists
KR100883430B1 (ko) * 2007-06-13 2009-02-12 한국생명공학연구원 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 인간 단클론항체 및그 용도
PE20090368A1 (es) * 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
US20090047689A1 (en) * 2007-06-20 2009-02-19 John Kolman Autoantigen biomarkers for early diagnosis of lung adenocarcinoma
US8629144B2 (en) * 2007-06-21 2014-01-14 Janssen Pharmaceutica Nv Polymorphic and hydrate forms, salts and process for preparing 6-{difluoro[6-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-3-yl]methyl}quinoline
US8334239B2 (en) 2007-07-10 2012-12-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System High affinity VEGF-receptor antagonists
EP2641618A3 (en) 2007-07-16 2013-10-23 Genentech, Inc. Humanized anti-CD79B antibodies and immunoconjugates and methods of use
SG183023A1 (en) 2007-07-16 2012-08-30 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
WO2009025806A2 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R & D Company Use of vegfr-2 inhibitors for treating metastatic cancer
JP6035009B2 (ja) 2007-08-22 2016-11-30 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 活性化可能な結合ポリペプチドおよびその同定方法ならびに使用
US8940298B2 (en) 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
EP2207570A2 (en) * 2007-09-14 2010-07-21 Nitto Denko Corporation Drug carriers
CN101868446A (zh) * 2007-09-25 2010-10-20 托波塔吉特英国有限公司 某些异羟肟酸化合物的合成方法
WO2009042854A1 (en) * 2007-09-26 2009-04-02 Musculoskeletal Research Llc Ion-channel regulator compositions and methods of using same
EP3714906A1 (en) * 2007-10-03 2020-09-30 Cornell University Treatment of proliferative disorders using radiolabelled antibodies to psma
EP2205271B1 (en) * 2007-10-08 2014-05-21 Quintessence Biosciences, Inc. Compositions and methods for ribonuclease-based therapies
JO3240B1 (ar) * 2007-10-17 2018-03-08 Janssen Pharmaceutica Nv c-fms مثبطات كيناز
US8361465B2 (en) * 2007-10-26 2013-01-29 Lpath, Inc. Use of anti-sphingosine-1-phosphate antibodies in combination with chemotherapeutic agents
US20090170770A1 (en) * 2007-11-06 2009-07-02 Ali Hafezi-Moghadam Methods and compositions for treating conditions associated with angiogenesis using a vascular adhesion protein-1 (vap 1) inhibitor
WO2009062174A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-14 University Of Utah Research Foundation Use of angiogenesis antagonists in conditions of abnormal venous proliferation
NZ586053A (en) 2007-11-09 2012-09-28 Peregrine Pharmaceuticals Inc Anti-vegf antibody compositions and methods
CA2704000C (en) 2007-11-09 2016-12-13 Eisai R&D Management Co., Ltd. Combination of anti-angiogenic substance and anti-tumor platinum complex
AU2013205269B2 (en) * 2007-11-09 2016-05-19 Affitech Research As Anti-VEGF antibody compositions and methods
ES2369717T3 (es) * 2007-11-30 2011-12-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Estabilización de conjugados que comprenden una molécula conectora de tiourea.
TWI468417B (zh) * 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
WO2009083225A2 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Biolnvent International Ab Formulation
US8253725B2 (en) * 2007-12-28 2012-08-28 St. Jude Medical, Atrial Fibrillation Division, Inc. Method and system for generating surface models of geometric structures
CA2713137C (en) * 2008-01-25 2017-10-24 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Targeting of innate immune response to tumor site
CA2713930A1 (en) * 2008-01-29 2009-08-06 Eisai R & D Management Co., Ltd. Combined use of angiogenesis inhibitor and taxane
IL295449A (en) 2008-01-31 2022-10-01 Genentech Inc and fusion antibody-drug-cd79b engineered antibodies cysteine-
CN102007145A (zh) 2008-02-14 2011-04-06 百时美施贵宝公司 基于结合egfr的工程化蛋白质的靶向治疗剂
SI2262493T1 (sl) * 2008-03-07 2015-07-31 Onxeo Dk Branch Of Onxeo S.A. France Postopki zdravljenja z uporabo podaljšane kontinuirane infuzije belinostata
EP2644204B1 (en) 2008-03-18 2017-04-19 Genentech, Inc. Combinations of an Anti-HER2 antibody-drug conjugate and pertuzumab
CN103992405B (zh) * 2008-03-26 2016-08-17 宜康公司 抗-vegf抗体
AU2014202474B2 (en) * 2008-03-26 2016-07-28 Epitomics, Inc. Anti-VEGF antibody
KR100998569B1 (ko) * 2008-03-31 2010-12-07 한국원자력연구원 암 또는 전이암 진단 및 치료용 방사면역접합체，및 이를이용한 암 또는 전이암 억제제 개발
WO2009125394A1 (en) * 2008-04-09 2009-10-15 Technion Research & Development Foundation Ltd. Anti human immunodeficiency antibodies and uses thereof
EP2636513B1 (en) * 2008-04-10 2014-08-27 Stratasys Ltd. System and method for three dimensional model printing
ES2620285T3 (es) 2008-05-02 2017-06-28 Novartis Ag Moléculas de unión con base en fibronectina mejorada y usos de las mismas
CA2723197C (en) 2008-05-02 2017-09-19 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
ES2338400B1 (es) * 2008-05-06 2011-09-14 David Benet Ferrus Conjunto de moleculas antiangiogenicas y su uso.
US8082730B2 (en) * 2008-05-20 2011-12-27 Caterpillar Inc. Engine system having particulate reduction device and method
JP2011520961A (ja) * 2008-05-22 2011-07-21 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 多価フィブロネクチンをベースとする足場ドメインタンパク質
US20090298088A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Belyaev Alexander S Cleavable catalytic binding and detection system
HUE032894T2 (hu) 2008-06-25 2017-11-28 Esbatech Alcon Biomed Res Unit VEGF-gátló, stabilis és oldható antitestek
US20100069616A1 (en) * 2008-08-06 2010-03-18 The Regents Of The University Of California Engineered antibody-nanoparticle conjugates
EP2334695B1 (en) 2008-10-01 2015-12-23 Quintessence Biosciences, Inc. Therapeutic ribonucleases
US9434610B2 (en) * 2008-10-07 2016-09-06 Rexahn Pharmaceuticals, Inc. HPMA—docetaxel conjugates and uses therefore
US8871202B2 (en) 2008-10-24 2014-10-28 Lpath, Inc. Prevention and treatment of pain using antibodies to sphingosine-1-phosphate
PT2365828E (pt) 2008-11-07 2014-12-12 Galaxy Biotech Llc Anticorpos monoclonais para o receptor 2 do factor de crescimento de fibroblastos
PA8849001A1 (es) 2008-11-21 2010-06-28 Lilly Co Eli Anticuerpos de c-met
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
KR101093717B1 (ko) 2008-11-26 2011-12-19 한국생명공학연구원 Ｖｅｇｆ―특이적인 인간항체
UA105198C2 (ru) 2008-12-12 2014-04-25 Берингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Антитело против инсулиноподобных факторов роста
JP5851842B2 (ja) * 2009-01-12 2016-02-03 サイトムエックス セラピューティクス, インク.CytomX Therapeutics, Inc. 改変した抗体組成物、それを作製および使用する方法
GB0900555D0 (en) * 2009-01-14 2009-02-11 Topotarget As New methods
US8940501B2 (en) 2009-01-30 2015-01-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
WO2010091234A2 (en) 2009-02-06 2010-08-12 The General Hospital Corporation Methods of treating vascular lesions
DK3912643T3 (da) 2009-02-13 2022-10-17 Immunomedics Inc Immunokonjugater med en intracellulært-spaltelig binding
US20160095939A1 (en) 2014-10-07 2016-04-07 Immunomedics, Inc. Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates
CA2752510C (en) * 2009-02-17 2024-01-23 Neil Bander Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
WO2010096838A2 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Cytomx Therapeutics, Llc Proproteins and methods of use thereof
KR101224468B1 (ko) 2009-05-20 2013-01-23 주식회사 파멥신 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도
US20120135064A1 (en) * 2009-05-27 2012-05-31 Northeastern University Conjugated nanodelivery vehicles
GB0909906D0 (en) 2009-06-09 2009-07-22 Affitech As Antibodies
US8883832B2 (en) 2009-07-06 2014-11-11 Aerpio Therapeutics Inc. Compounds, compositions, and methods for preventing metastasis of cancer cells
DK2451279T3 (da) 2009-07-06 2019-05-20 Aerpio Therapeutics Inc Benzosulfonamid derivater forbindelser deraf og deres brug til at forhindre metastaser af cancerceller
US8956600B2 (en) * 2009-08-10 2015-02-17 Taiwan Liposome Co. Ltd. Ophthalmic drug delivery system containing phospholipid and cholesterol
CN102002104A (zh) 2009-08-28 2011-04-06 江苏先声药物研究有限公司 一种抗vegf的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物
US8178307B2 (en) * 2009-09-02 2012-05-15 National Tsing Hua University Methods and compositions for detection of lethal cell and uses thereof
US8642515B2 (en) 2009-09-04 2014-02-04 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Genetic determinants of prostate cancer risk
EP2293071A1 (en) * 2009-09-07 2011-03-09 Universität Zu Köln Biomarker for colorectal cancer
EP2478110B1 (en) 2009-09-16 2016-01-06 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
MX2012004416A (es) 2009-10-13 2012-05-08 Rexahn Pharmaceuticals Inc Sistemas polimericos para el suministro de agentes anticancer.
ES2895226T3 (es) 2009-10-16 2022-02-18 Mereo Biopharma 5 Inc Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos
AU2010324506B2 (en) 2009-11-24 2015-02-26 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-clusterin antibodies and antigen binding fragments and their use to reduce tumor volume
WO2011068845A1 (en) 2009-12-02 2011-06-09 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
EP3511023A1 (en) 2009-12-02 2019-07-17 Imaginab, Inc. J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use
JP6046494B2 (ja) * 2010-02-08 2016-12-14 アジェンシス，インコーポレイテッド １６１ｐ２ｆ１０ｂタンパク質に結合する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
GB201002238D0 (en) 2010-02-10 2010-03-31 Affitech As Antibodies
WO2011119871A1 (en) 2010-03-24 2011-09-29 Rxi Phrmaceuticals Corporation Rna interference in ocular indications
US9080171B2 (en) 2010-03-24 2015-07-14 RXi Parmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering RNAi compounds
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
WO2011140182A2 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Medimmune, Llc Optimized degenerative muscle disease diagnostics and treatments
CN103180339B (zh) 2010-05-26 2016-04-27 百时美施贵宝公司 具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质
ES2573515T3 (es) 2010-06-25 2016-06-08 Eisai R&D Management Co., Ltd. Agente antitumoral que emplea compuestos con efecto inhibitorio de cinasas combinados
EP2591002A2 (en) * 2010-07-07 2013-05-15 Tubitak Recombinant antibody structures binding to and blocking the activity of vascular endothelial growth factor 2 (vegfr- 2 /kdr)
CN101942022B (zh) * 2010-07-29 2013-07-24 华东理工大学 抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白、构建方法及其用途
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
EP2675485A4 (en) 2011-02-15 2014-10-15 Immunomedics Inc ANTI-MUCIN ANTIBODY FOR THE EARLY RECOGNITION AND TREATMENT OF PANCREATIC CANCER
US8722044B2 (en) 2011-03-15 2014-05-13 Janssen Biotech, Inc. Human tissue factor antibody and uses thereof
WO2012142174A1 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Electronic Biosciences Inc. Site specific chemically modified nanopore devices
RU2580609C2 (ru) 2011-04-18 2016-04-10 Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. Противоопухолевое терапевтическое средство
JO3283B1 (ar) 2011-04-26 2018-09-16 Sanofi Sa تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI)
EP2704751B1 (en) 2011-05-02 2019-04-17 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
ES2841809T3 (es) 2011-06-03 2021-07-09 Eisai R&D Man Co Ltd Biomarcadores para pronosticar y evaluar el grado de respuesta de sujetos con cáncer de tiroides y de riñón a compuestos de lenvatinib
CN103764830A (zh) * 2011-06-30 2014-04-30 基因信号国际公司 含有irs-1抑制剂和vegf抑制剂的组合物
US9682144B2 (en) 2011-06-30 2017-06-20 Gene Signal International, Sa Composition comprising inhibitors of IRS-1 and of VEGF
EP2540828A1 (en) * 2011-06-30 2013-01-02 Gene Signal International SA Composition comprising inhibitors of IRS-1 and of VEGF
US8921533B2 (en) 2011-07-25 2014-12-30 Chromatin Technologies Glycosylated valproic acid analogs and uses thereof
PE20141537A1 (es) 2011-09-23 2014-11-17 Oncomed Pharm Inc Agentes de ligacion al factor de crecimiento endotelial vascular/ligando 4 similar a delta (vegf/dll4) y usos de los mismos
CN102492038B (zh) * 2011-12-09 2014-05-28 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 抗人Tim-3的中和性单克隆抗体L3D及其用途
WO2013088250A1 (en) 2011-12-13 2013-06-20 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Bacterially derived, intact minicells for delivery of therapeutic agents to brain tumors
SG11201404608WA (en) 2012-02-13 2014-09-26 Gamida Cell Ltd Mesenchymal stem cells conditioned medium and methods of generating and using the same
AU2013224591A1 (en) 2012-02-22 2014-07-24 Alethia Biotherapeutics Inc. Co-use of a clusterin inhibitor with an EGFR inhibitor to treat cancer
WO2013134431A1 (en) 2012-03-06 2013-09-12 Life Technologies Corporation Biomarkers for systemic lupus erythematosus
WO2013149219A2 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Sorrento Therapeutics Inc. Fully human antibodies that bind to vegfr2
US20150204873A1 (en) 2012-06-18 2015-07-23 Electonic Biosciences, Inc. Cell-free assay device and methods of use
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
JOP20180012A1 (ar) 2012-08-07 2019-01-30 Janssen Pharmaceutica Nv عملية السلفنة باستخدام نونافلوروبوتانيسولفونيل فلوريد
WO2014025675A1 (en) 2012-08-07 2014-02-13 Janssen Pharmaceutica Nv Process for the preparation of heterocyclic ester derivatives
US9315567B2 (en) 2012-08-14 2016-04-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
US9382329B2 (en) 2012-08-14 2016-07-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells
EP2914961A4 (en) 2012-10-31 2016-04-20 Oncomed Pharm Inc METHODS AND MONITORING A TREATMENT BY AN ANTAGONIST OF DLL4
CA2891280C (en) 2012-11-24 2018-03-20 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
PT2900277T (pt) 2012-12-13 2022-05-25 Immunomedics Inc Doses de imunoconjugados de anticorpos e sn-38 para melhorar a eficácia e diminuir a toxicidade
AU2013364953A1 (en) 2012-12-21 2015-04-30 Eisai R&D Management Co., Ltd. Amorphous form of quinoline derivative, and method for producing same
US9770426B2 (en) 2013-01-11 2017-09-26 Massachusetts Eye And Ear Infirmary CYP450 lipid metabolites reduce inflammation and angiogenesis
US9745558B2 (en) 2013-02-18 2017-08-29 Vegenics Pty Limited VEGFR-3 ligand binding molecules and uses thereof
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
KR102049990B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-03 삼성전자주식회사 c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질
US9452228B2 (en) 2013-04-01 2016-09-27 Immunomedics, Inc. Antibodies reactive with an epitope located in the N-terminal region of MUC5AC comprising cysteine-rich subdomain 2 (Cys2)
WO2014182635A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Baldwin Megan E Biomarkers for age-related macular degeneration (amd)
US10517861B2 (en) 2013-05-14 2019-12-31 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of endometrial cancer subjects to lenvatinib compounds
KR101541478B1 (ko) 2013-05-31 2015-08-05 동아쏘시오홀딩스 주식회사 항-vegf 항체 및 이를 포함하는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물
WO2015006734A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Ophthotech Corporation Methods for treating or preventing ophthalmological conditions
RS58719B1 (sr) 2013-08-01 2019-06-28 Five Prime Therapeutics Inc Nefukozilisana anti-fgfr2iiib antitela
US10934550B2 (en) 2013-12-02 2021-03-02 Phio Pharmaceuticals Corp. Immunotherapy of cancer
US9914769B2 (en) * 2014-07-15 2018-03-13 Kymab Limited Precision medicine for cholesterol treatment
AU2015219495B2 (en) 2014-02-21 2019-11-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells
US9139649B2 (en) 2014-02-25 2015-09-22 Immunomedics, Inc. Humanized anti-CD22 antibody
EP3122757B1 (en) 2014-02-28 2023-09-06 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Charged linkers and their uses for conjugation
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
KR20220162886A (ko) 2014-03-20 2022-12-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 혈청 알부민-결합 피브로넥틴 유형 iii 도메인
WO2015164541A1 (en) * 2014-04-22 2015-10-29 Presage Biosciences, Inc. Methods and devices for evaluating drug candidates
EP3160504B1 (en) 2014-06-24 2020-09-16 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
RS58957B1 (sr) 2014-07-18 2019-08-30 Sanofi Sa Postupak za predviđanje ishoda tretmana sa afliberceptom kod pacijenta za kog se sumnja da boluje od raka
HRP20221047T1 (hr) 2014-08-28 2022-11-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. Derivat kinolina visoke čistoće i postupak za njegovu proizvodnju
ES2796903T3 (es) 2014-09-23 2020-11-30 Hoffmann La Roche Procedimiento de uso de inmunoconjugados anti-CD79b
ES2808153T3 (es) 2014-10-31 2021-02-25 Mereo Biopharma 5 Inc Terapia de combinación para tratamiento de enfermedad
TWI695837B (zh) 2014-12-04 2020-06-11 比利時商健生藥品公司 作為激酶調節劑之三唑並嗒
WO2016109943A1 (zh) * 2015-01-06 2016-07-14 珠海亿胜生物制药有限公司 抗vegf抗体
AR103477A1 (es) 2015-01-28 2017-05-10 Lilly Co Eli Compuestos de vegfa / ang2
FI3263106T3 (fi) 2015-02-25 2024-01-03 Eisai R&D Man Co Ltd Menetelmä kinoliinijohdannaisen kitkeryyden tukahduttamiseksi
EP3265059A4 (en) 2015-03-03 2018-08-29 Cureport Inc. Combination liposomal pharmaceutical formulations
EP3265063A4 (en) 2015-03-03 2018-11-07 Cureport, Inc. Dual loaded liposomal pharmaceutical formulations
CA2978226A1 (en) 2015-03-04 2016-09-09 Merck Sharpe & Dohme Corp. Combination of a pd-1 antagonist and a vegfr/fgfr/ret tyrosine kinase inhibitor for treating cancer
CA2981543A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
CA2988707C (en) 2015-06-16 2023-10-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Combination of cbp/catenin inhibitor and immune checkpoint inhibitor for treating cancer
PT3313443T (pt) 2015-06-25 2023-08-30 Immunomedics Inc Combinação de anticorpos anti-hla-dr ou anti-trop-2 com inibidores de microtúbulos, inibidores de parp, inibidores de bruton quinase ou inibidores de fosfoinositídeo 3-quinase melhora significativamente o resultado terapêutico no cancro
EP3316885B1 (en) 2015-07-01 2021-06-23 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
CN113350518A (zh) 2015-07-12 2021-09-07 杭州多禧生物科技有限公司 与细胞结合分子的共轭偶联的桥连接体
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
RU2763916C2 (ru) 2015-09-23 2022-01-11 Дженентек, Инк. Оптимизированные варианты анти-vegf антител
JP6893504B2 (ja) 2015-09-23 2021-06-23 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 速い解離速度を有する血清アルブミン結合フィブロネクチンタイプｉｉｉドメイン
EP3353204B1 (en) 2015-09-23 2023-10-18 Mereo BioPharma 5, Inc. Bi-specific anti-vegf/dll4 antibody for use in treating platinum-resistant ovarian cancer
CA3003157A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 The Jackson Laboratory Compositions and methods relating to tumor analysis
SG11201804134YA (en) 2015-11-23 2018-06-28 Five Prime Therapeutics Inc Fgfr2 inhibitors alone or in combination with immune stimulating agents in cancer treatment
HUE063335T2 (hu) 2015-12-03 2024-01-28 Regeneron Pharma Módszerek genetikai variánsok és klinikai eredmény közötti összefüggés megállapítására idõskori makuladegenerációban szenvedõ, anti-VEGF-fel kezelt betegeknél
BR112018013407A2 (pt) 2015-12-30 2018-12-18 Kodiak Sciences Inc anticorpos e conjugados dos mesmos
US11008387B2 (en) 2016-01-06 2021-05-18 Order-Made Medical Research Inc. Antibody inhibiting binding of VEGF to NRP1
EP3401331B1 (en) 2016-01-06 2022-04-06 Order-Made Medical Research Inc. High-affinity anti-vegf antibody
JP7181091B2 (ja) * 2016-05-10 2022-11-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ポリペプチドの組み換え産生中にトリスルフィド結合を減少させる方法
AU2017275081B2 (en) 2016-05-30 2023-12-07 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Anti-human hemoglobin monoclonal antibody or antibody kit, insoluble carrier particle to which anti-human hemoglobin monoclonal antibody is immobilized, and measurement reagent and measurement method using same
GB2551979A (en) 2016-06-30 2018-01-10 Rs Arastirma Egitim Danismanlik Llac Sanayi Ticaret Ltd Cleavable polymer drug conjugates
AU2017334224A1 (en) * 2016-09-27 2019-03-21 The University Of The Highlands And Islands Antigen biomarkers
US10537563B2 (en) * 2016-10-14 2020-01-21 Novartis Ag Methods for treating ocular disease using inhibitors of CSF-1R
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
JP7138350B2 (ja) 2016-11-14 2022-09-16 ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー．，エルティディ． 共役連結体、該連結体を含有する細胞結合分子－薬物共役体、並びに該共役体及び連結体の使用及び製造方法
GB2556055B (en) 2016-11-16 2022-03-23 Rs Arastirma Egitim Danismanlik Ilac Sanayi Ticaret Ltd Sti Self-assembled diblock copolymers composed of pegmema and drug bearing polymeric segments
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
SG11201909218RA (en) 2017-04-03 2019-11-28 Hoffmann La Roche Antibodies binding to steap-1
US11311626B2 (en) 2017-05-02 2022-04-26 National Cancer Center Japan Plasmin-cleavable anti-insoluble fibrin antibody-drug conjugate
KR20200006538A (ko) 2017-05-16 2020-01-20 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. 암 치료에서 화학요법제와 병용되는 항-fgfr2 항체
US10543231B2 (en) 2017-05-19 2020-01-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
US10894019B2 (en) 2017-08-15 2021-01-19 University Of South Carolina Drug delivery system and method for targeting cancer stem cells
JP7436365B2 (ja) * 2017-12-29 2024-02-21 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 抗ｖｅｇｆ抗体及び使用の方法
KR102644938B1 (ko) * 2018-03-19 2024-03-07 주식회사 파멥신 항-vegfr-2 항체
JP2021522308A (ja) 2018-05-04 2021-08-30 トゥリーズ 上皮細胞及び骨髄細胞の両方を活性化するｔｌｒ３リガンド
US11672767B2 (en) 2019-05-13 2023-06-13 University Of South Carolina Enzymatically cleavable self-assembled nanoparticles for morphogen delivery
JP2022545181A (ja) 2019-08-30 2022-10-26 ユニバーシティ オブ ロチェスター がん治療のためのセプチン阻害剤
EP4041312A4 (en) 2019-10-10 2023-12-20 Kodiak Sciences Inc. METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER
TW202138388A (zh) 2019-12-30 2021-10-16 美商西根公司 以非海藻糖苷化抗－ｃｄ７０抗體治療癌症之方法
US11883432B2 (en) 2020-12-18 2024-01-30 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor system with adaptable receptor specificity
JPWO2022239720A1 (es) 2021-05-10 2022-11-17

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4456550A (en) 1982-11-22 1984-06-26 President And Fellows Of Harvard College Vascular permeability factor
US4925922A (en) * 1983-02-22 1990-05-15 Xoma Corporation Potentiation of cytotoxic conjugates
FR2566271B1 (fr) 1984-06-20 1986-11-07 Sanofi Sa Nouveaux conjugues cytotoxiques utilisables en therapeutique et procede d'obtention
CA1289880C (en) 1985-12-06 1991-10-01 Jeffrey L. Winkelhake Anti-human ovarian cancer immunotoxins and methods of use thereof
FR2601679B1 (fr) 1986-07-15 1990-05-25 Sanofi Sa Immunotoxines, procede de preparation et compositions pharmaceutiques en contenant
CA1338645C (en) 1987-01-06 1996-10-15 George R. Pettit Isolation, structural elucidation and synthesis of novel antineoplastic substances denominated "combretastatins"
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5008196A (en) 1987-08-21 1991-04-16 Monsanto Company Stimulation of endothelial cell growth
US5036003A (en) 1987-08-21 1991-07-30 Monsanto Company Antibodies to VPF
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
US5024834A (en) 1988-07-12 1991-06-18 Cetus Corporation Thioether linked immunotoxin conjugates
US6007817A (en) 1988-10-11 1999-12-28 University Of Southern California Vasopermeability enhancing immunoconjugates
US5240848A (en) 1988-11-21 1993-08-31 Monsanto Company Dna sequences encoding human vascular permeability factor having 189 amino acids
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4940726A (en) 1989-04-26 1990-07-10 Arizona Board Of Regents Cell growth inhibitory macrocyclic lactones denominated Combretastatin D-1 and Combretastatin D-2
US5332671A (en) 1989-05-12 1994-07-26 Genetech, Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US5194596A (en) 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5165923A (en) 1989-11-20 1992-11-24 Imperial Cancer Research Technology Methods and compositions for the treatment of hodgkin's disease
DK0536350T3 (da) 1991-02-22 2002-09-02 American Cyanamid Co Identifikation af et nyt humant receptor-tyrosinkinase-gen
US6582959B2 (en) * 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
US20030206899A1 (en) * 1991-03-29 2003-11-06 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US20020032313A1 (en) * 1991-03-29 2002-03-14 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US6022541A (en) 1991-10-18 2000-02-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Immunological preparation for concurrent specific binding to spatially exposed regions of vascular permeability factor bound in-vivo to a tumor associated blood vessel
AU2861692A (en) 1991-10-18 1993-05-21 Beth Israel Hospital Association, The Vascular permeability factor targeted compounds
US5234955A (en) 1991-12-20 1993-08-10 Eli Lilly And Company Antitumor compositions and methods of treatment
US6093399A (en) 1992-03-05 2000-07-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
US5877289A (en) 1992-03-05 1999-03-02 The Scripps Research Institute Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US6036955A (en) 1992-03-05 2000-03-14 The Scripps Research Institute Kits and methods for the specific coagulation of vasculature
DK0627940T3 (da) 1992-03-05 2003-09-01 Univ Texas Anvendelse af immunokonjugater til diagnose og/eller terapi af vaskulariserede tumorer
US6004555A (en) 1992-03-05 1999-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for the specific coagulation of vasculature
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5281700A (en) 1992-08-11 1994-01-25 The Regents Of The University Of California Method of recovering endothelial membrane from tissue and applications thereof
BR9207175A (pt) 1992-10-28 1995-12-12 Genentech Inc Composição contendo antagonista de fator de crescimento de célula endotelial vascular sequência aminoácida de anticorpo monoclonal polipeptídeo e método de tratamento de tumor em mamífero
EP0669988B2 (en) 1992-10-29 2009-07-08 The Australian National University Angiogenesis inhibitory antibodies
CN1173991C (zh) 1992-11-13 2004-11-03 马克斯普朗克科学促进协会 作为血管内皮生长因子受体的f1k-1
US5879672A (en) 1994-10-07 1999-03-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 ligand 1
US5643755A (en) 1994-10-07 1997-07-01 Regeneron Pharmaceuticals Inc. Nucleic acid encoding tie-2 ligand
US5840301A (en) 1994-02-10 1998-11-24 Imclone Systems Incorporated Methods of use of chimerized, humanized, and single chain antibodies specific to VEGF receptors
GB9410533D0 (en) 1994-05-26 1994-07-13 Lynxvale Ltd In situ hybridisation and immuno-Chemical localisation of a growth factor
US5786344A (en) * 1994-07-05 1998-07-28 Arch Development Corporation Camptothecin drug combinations and methods with reduced side effects
CA2194369C (en) 1994-07-11 2004-08-31 Philip E. Thorpe Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
US5650490A (en) 1994-10-07 1997-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 ligand 2
US5814464A (en) 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5561122A (en) 1994-12-22 1996-10-01 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Combretastatin A-4 prodrug
US5730977A (en) 1995-08-21 1998-03-24 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Anti-VEGF human monoclonal antibody
US6020473A (en) 1995-08-25 2000-02-01 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding variants of vascular endothelial cell growth factor
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
JPH09124697A (ja) 1995-11-01 1997-05-13 Toagosei Co Ltd ペプチド及びモノクローナル抗体
US5942385A (en) 1996-03-21 1999-08-24 Sugen, Inc. Method for molecular diagnosis of tumor angiogenesis and metastasis
US5851797A (en) 1996-06-19 1998-12-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie ligand-3, methods of making and uses thereof
US6008319A (en) 1996-12-23 1999-12-28 University Of Southern California Vasopermeability enhancing peptide of human interleukin-2 and immunoconjugates thereof
US6291667B1 (en) 1997-01-31 2001-09-18 Parkash S. Gill Method and composition for treatment of kaposi's sarcoma
ES2361267T3 (es) 1997-04-07 2011-06-15 Genentech Inc. Procedimiento para la produccion de anticuerpos humanizados mediante mutagénesis aleatoria.
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
JP3957765B2 (ja) 1997-04-07 2007-08-15 ジェネンテク・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
ATE312935T1 (de) * 1997-06-03 2005-12-15 Regulatorische sequenzen für die in-vivo- expression einer heterologen dns-sequenz in endothelzellen und ihre verwendungen.
US5972338A (en) 1997-09-19 1999-10-26 Genentech, Inc. Tie ligands homologues
US6057435A (en) 1997-09-19 2000-05-02 Genentech, Inc. Tie ligand homologues
US6030831A (en) 1997-09-19 2000-02-29 Genetech, Inc. Tie ligand homologues
AU2299099A (en) 1998-02-04 1999-08-23 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Antibodies against human vegf receptor kdr
WO2000034337A1 (en) 1998-12-10 2000-06-15 Tsukuba Research Laboratory, Toagosei Co., Ltd. Humanized monoclonal antibodies against vascular endothelial cell growth factor
EP2016953A3 (en) 1998-12-22 2009-04-15 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists and uses thereof
US6342221B1 (en) 1999-04-28 2002-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate compositions for selectively inhibiting VEGF
US6703020B1 (en) * 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US7740841B1 (en) 2000-01-28 2010-06-22 Sunnybrook Health Science Center Therapeutic method for reducing angiogenesis
AU2002327310B2 (en) * 2001-07-17 2006-09-28 Research Development Foundation Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins

Also Published As

Publication number Publication date
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