ES2223705T3 - Composiciones y metodos para el tratamiento de cancer mediante inhibi cion selectiva del vegf. - Google Patents
Composiciones y metodos para el tratamiento de cancer mediante inhibi cion selectiva del vegf.Info
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Abstract
Composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF purificado, o fragmento de unión al antígeno de éste, que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595 y que inhibe significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1).
Description
Composiciones y métodos para el tratamiento de
cáncer mediante inhibición selectiva del VEGF.
La presente solicitud reivindica la prioridad a
la solicitud de Patente provisional U.S.A. pendiente de No. de Serie
60/131.432, archivada el 28 de abril de 1999, el texto completo y
las ilustraciones de cuya solicitud se incorpora específicamente por
referencia en la presente sin renuncia. El Gobierno de U.S.A. posee
los derechos de la presente invención de acuerdo con la concesión de
los números 1RO1 CA74951, 5RO CA54168 y T32 GM07062 de los
Institutos Nacionales de Salud.
La presente invención se refiere, generalmente, a
los sectores de los anticuerpos, la angiogénesis y el tratamiento de
tumores. Más particularmente, proporciona anticuerpos
anti-VEGF que específicamente inhiben la unión del
VEGF a sólo uno (VEGFR2) de los dos receptores de VEGF. Tales
anticuerpos inhiben la angiogénesis e inducen la regresión del
tumor, e incluso han mejorado su seguridad debido a sus propiedades
de bloqueo específico. Las composiciones basadas en anticuerpos y
los métodos de la presente invención también se extienden al uso de
inmunoconjugados y otras combinaciones terapéuticas, juegos de
elementos (kits) y métodos, incluyendo aquellos con profármacos.
La resistencia de las células tumorales a los
agentes quimioterapéuticos representa un problema significativo en
oncología clínica. De hecho, ésta es una de las principales razones
por las que muchas de las formas más extendidas de cáncer humano aún
resisten con efectividad la intervención quimioterapéutica, a pesar
de ciertos avances en este sector.
Otra estrategia en el tratamiento del tumor es el
uso de una "inmunotoxina", en la que un anticuerpo de una
célula antitumoral se utiliza para liberar una toxina a las células
tumorales. Sin embargo, al igual que en las aproximaciones
quimioterapéuticas, la terapia de la inmunotoxina también tiene
desventajas significativas cuando se aplica a tumores sólidos. Por
ejemplo, células antígeno-negativas o
antígeno-deficientes pueden sobrevivir y repoblar el
tumor o conducir a una metástasis avanzada.
Una razón adicional para la resistencia del tumor
sólido a las terapias basadas en anticuerpos es que la masa del
tumor es generalmente impermeable a agentes macromoleculares, tales
como anticuerpos e inmunotoxinas (Burrows y otros, 1992; Dvorak y
otros, 1991a; Baxter y Jain, 1991). Tanto las distancias de difusión
físicas como la presión intersticial dentro del tumor son
limitaciones significativas para este tipo de terapia. Por lo tanto,
los tumores sólidos, que constituyen más del 90% de todos los
cánceres humanos, tienen, de este modo, una más que probada
resistencia al tratamiento con anticuerpos e inmunotoxinas.
Una estrategia más reciente se ha desarrollado
para elegir como diana la vasculatura de los tumores sólidos. Marcar
como diana los vasos sanguíneos de los tumores, en lugar de las
propias células tumorales, tiene ciertas ventajas, en cuanto a que
no es probable que conduzca al desarrollo de células tumorales
resistentes, y que las células marcadas como diana son fácilmente
accesibles. Además, la destrucción de los vasos sanguíneos lleva a
una amplificación del efecto antitumoral, ya que muchas células
tumorales cuentan con un único vaso para su oxígeno y nutrientes
(Burrows y Thorpe, 1994a; 1994b). Se describen estrategias de
ejemplo de dianas vasculares en la Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866 y
5.965.132, que particularmente describen la liberación dirigida de
agentes anticelulares y toxinas a marcadores de la vasculatura
tumoral.
Otra versión efectiva de la aproximación de diana
vascular es dirigir un factor de coagulación a un marcador expresado
o adsorbido dentro de la vasculatura del tumor (Huang y otros, 1997;
Patentes U.S.A. Nos. 5.877.289 y 6.004.555 (Solicitud U.S.A. con No.
de Serie 08/482.369, Derechos de Expedición pagados el 20 de octubre
de 1998)). La liberación de coagulantes, en lugar de toxinas, a la
vasculatura del tumor tiene las ventajas adicionales de
inmunogenicidad reducida e incluso un riesgo menor de efectos
laterales tóxicos. Tal como se da a conocer en la Patente U.S.A. No.
5.877.289, un factor de coagulación preferido para el uso en tales
"coaguligandos" específicos del tumor es una versión truncada
de la proteína inductora de la coagulación humana, el Factor Tisular
(TF), la principal iniciadora de la coagulación de la sangre.
A pesar de que la liberación específica de
toxinas y factores de coagulación a los vasos sanguíneos del tumor
representa un avance significativo en el tratamiento tumoral,
ciertas células tumorales periféricas pueden sobrevivir a la
destrucción intratumoral causada por tales terapias. Las estrategias
antiangiogénicas serían, por tanto, de uso en combinación con los
métodos de destrucción de tumores de las Patentes U.S.A. Nos.
5.855.866 y 5.877.289.
Las estrategias antiangiogénicas del tratamiento
de tumores se basan en la inhibición de la proliferación de vasos
progenitores, generalmente en la periferia de un tumor sólido. Estas
terapias se aplican mayoritariamente para reducir el riesgo de
micrometástasis o para inhibir el crecimiento posterior de un tumor
sólido después de una intervención convencional (tal como cirugía o
quimioterapia).
La angiogénesis es el desarrollo de nueva
vasculatura a partir de vasos sanguíneos preexistentes y/o
hemocitoblastos endoteliales circulantes (Asahara y otros, 1997;
Springer y otros, 1998; Folkman y Shing, 1992). La angiogénesis
juega un papel vital en muchos procesos fisiológicos, tales como la
embriogénesis, la curación de heridas y la menstruación. La
angiogénesis también es importante en ciertos cuadros patológicos.
Además de tener un papel importante en el crecimiento de tumores
sólidos y la metástasis, otras condiciones destacables con un
componente angiogénico son la artritis, la psoriasis y la
retinopatía diabética (Hanahan y Folkman, 1996; Fidler y Ellis,
1994)
La angiogénesis está regulada en tejidos normales
y malignos por el equilibrio de estímulos angiogénicos e inhibidores
angiogénicos que se producen en el tejido diana y en lugares
distantes (Fidler y otros, 1998; McNamara y otros, 1998). El
factor-A de crecimiento endotelial vascular (VEGF,
también conocido como factor de permeabilidad vascular, VPF) es un
estimulante primario de la angiogénesis. El VEGF es una citocina
multifuncional que se induce por hipoxia y mutaciones oncogénicas y
puede producirse por una amplia variedad de tejidos (Kerbel y otros,
1998; Mazure y otros, 1996).
El reconocimiento del VEGF como un estímulo
primario de la angiogénesis en condiciones patológicas ha llevado a
varios intentos de bloquear la actividad del VEGF. Se han propuesto
anticuerpos inhibidores del receptor anti-VEGF,
construcciones de receptor solubles, estrategias antisentido,
aptámeros de ARN contra VEGF e inhibidores de bajo peso molecular de
tirosina quinasa (RTK) del receptor del VEGF, para interferir con la
señalización del VEGF (Siemeister y otros, 1998). De hecho, se ha
demostrado que anticuerpos monoclonales contra el VEGF inhiben el
crecimiento de xenoinjertos de tumores humanos y la formación de
ascitis en ratones (Kim y otros, 1993; Asano y otros, 1998; Mesiano
y otros, 1998; Luo y otros, 1998a; 1998b; Borgstrom y otros, 1996;
1998).
PNAS, Volumen 94, 7192-7197
(1997) da a conocer la estructura cristalina del VEGF y epítopos
relevantes.
Frontiers in Bioscience, Volumen 4,
141-161 (1999) analiza el turno de señales en el
sistema del VEGF.
Cancer and Metastasis Reviews, Volumen 17,
155-161, (1998) da a conocer anticuerpos
monoclonales específicos para el VEGFR2 como una estrategia
terapéutica antiangiogénica.
Cancer-Immunology Immunotherapy,
Volumen 34, 343-348 (1992) da a conocer el uso de
inmunoconjugados y profármacos como una estrategia terapéutica
anticáncer.
British Journal of Cancer, Volumen 70,
786-794 (1994) analiza la terapia de profármacos de
enzimas dirigidas al anticuerpo en la terapia tumoral.
A pesar de que los estudios anteriores recalcan
la importancia del VEGF en el crecimiento de tumores sólidos, y su
potencial como diana para la terapia de tumores, sería beneficiosa
la identificación de agentes adicionales que inhibiesen la
angiogénesis inducida por el VEGF para expandir el número de
opciones terapéuticas. El desarrollo de agentes terapéuticos que
inhibieran más específicamente la unión al receptor del VEGF
representaría un avance importante, siempre y cuando sus efectos
antitumorales no estuvieran sustancialmente comprometidos por su
especificidad mejorada.
La presente invención resuelve ciertas
desventajas en las técnicas anteriores proporcionando nuevas
composiciones terapéuticas y métodos para el uso en tratamientos
antiangiogénicos y antitumorales. La presente invención se basa en
anticuerpos que inhiben específicamente la unión del VEGF a sólo uno
(VEGFR2) de los dos receptores primarios VEGF. Tales anticuerpos
inhiben la angiogénesis e inducen la regresión del tumor tan
eficazmente como otros anticuerpos anti-VEGF,
incluyendo aquellos que ya están en pruebas clínicas, e incluso han
mejorado su seguridad debido a sus propiedades de bloqueo
específico. Las composiciones y los métodos de la presente invención
también se extienden al uso de inmunoconjugados y combinaciones,
incluyendo profármacos, utilizando la categoría específica de los
anticuerpos proporcionados.
Una ventaja particular de la presente invención
es que los anticuerpos proporcionados inhiben la unión del VEGF
únicamente a VEGFR2, y no a VEGFR1. Esto contrasta con los
principales anticuerpos utilizados en la técnica anterior,
incluyendo A4.6.1, los cuales inhiben la unión del VEGF tanto a
VEGFR2 como a VEGFR1. Como el VEGFR1 tiene importantes papeles
biológicos no conectados a la angiogénesis, particularmente en la
migración de macrófagos y la quimiotaxis, y la función del
osteoclasto y el condroclasto, la presente capacidad de inhibir sólo
la angiogénesis mediante el VEGFR-2 es una ventaja
evidente. Esto, traducido a unos beneficios clínicos destacables, en
que los macrófagos aún son capaces de mediar en las respuestas
antitumorales del huésped y en que el metabolismo del hueso, por
ejemplo, en el tratamiento de cánceres pediátricos, no queda
afectado adversamente.
Una ventaja adicional es que, como la unión del
VEGF al VEGFR1 se mantiene en presencia de los anticuerpos de la
presente invención, éstos se pueden utilizar para liberar
específicamente agentes terapéuticos unidos a la vasculatura del
tumor mediante la unión al VEGF que está unido al VEGFR1, el cual se
regula a la alta en el endotelio del tumor. En el contexto de los
inmunoconjugados, por tanto, la presente invención proporciona
agentes que tienen tanto propiedades antiangiogénicas como
destructoras de tumores dentro de la misma molécula.
Aún existe una ventaja adicional en la capacidad
de las composiciones proporcionadas para neutralizar la señal de
superviviencia del VEGF, la cual se media a través del VEGFR2. Los
anticuerpos desnudos y conjugados de la presente invención, de este
modo, forman combinaciones sinergéticas con otras terapias y/o
agentes unidos, particularmente, aquellos métodos y agentes que
fracasan al intentar alcanzar la máxima efectividad in vivo
debido a la capacidad del VEGF de contrarrestar sus propiedades
destructivas.
La presente invención, de este modo, proporciona
anticuerpos que bloquean específicamente la unión del VEGF al
receptor VEGFR2, o que bloquean la unión del VEGF a, esencialmente,
sólo el receptor VEGFR2. Tales anticuerpos inhiben
significativamente la unión del VEGF al receptor VEGFR2
(KDR/Flk-1) sin inhibir significativamente la unión
del VEGF al receptor VEGFR1 (Flt-1). Los
anticuerpos, de este modo, inhiben la unión del VEGF al receptor
VEGFR2 (KDR/Flk-1), no inhiben sustancialmente la
unión del VEGF al receptor VEGFR1 (Flt-1), muestran
efectos antiangiogénicos y antitumorales in vivo y no inhiben
significativamente la quimiotaxis de macrófagos, y las funciones de
osteoclastos y condroclastos.
Los anticuerpos de la presente invención, de este
modo, se denominan sucintamente "anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, no bloqueadores
de VEGFR1". Incluso más sucintamente, se denominan "anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2", lo cual se
utiliza para simplificar en referencia a todas las composiciones,
utilizaciones y métodos de la presente invención. Un "anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2" es un anticuerpo
contra el VEGF que bloquea la unión del VEGF al receptor VEGFR2.
Quedará claro que tales anticuerpos no son anticuerpos contra el
receptor VEGFR2 en sí mismo.
Anteriormente a la presente invención, no había
ninguna motivación para generar anticuerpos
anti-VEGF que específicamente bloquearan la unión
del VEGF al receptor VEGFR2, pero no al VEGFR1, ni se preveía
ninguna ventaja de tales anticuerpos. De una manera importante, como
los anticuerpos bloqueadores necesitan impedir físicamente la
interacción de un factor de crecimiento y su(s)
receptor(es), y como los sitios de unión del receptor en los
factores de crecimiento están limitados en tamaño, no había nada que
sugiriera que tales anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores específicos de VEGFR2 se pudieran desarrollar.
Sin embargo, a la luz de los sorprendentes
descubrimientos de los inventores dados a conocer en la presente, la
técnica ha incorporado el conocimiento de que tales anticuerpos
anti-VEGF de inhibición específica pueden prepararse
y tener ventajas evidentes. La presente solicitud, además, describe
la metodología para generar candidatos de anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 y los aspectos
técnicos de rutina de los ensayos requeridos para identificar
anticuerpos específicos bloqueadores de VEGFR2 reales de un grupo de
candidatos. A la luz de esta invención, por tanto, se pueden obtener
y utilizar un grupo de anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2 en una variedad de realizaciones, incluyendo
la inhibición de la angiogénesis y el tratamiento de enfermedades
angiogénicas y tumores, sin inhibir la señalización del VEGF a
través del receptor VEGFR1 y sin las notables desventajas y efectos
laterales asociados con ello.
Como se utiliza en toda la solicitud, los
términos "un" y "una" se utilizan en el sentido de que
representan "como mínimo uno/a", "como mínimo el/la
primero/a", "uno/a o más" o "una pluralidad" de los
componentes o etapas citados, excepto en ejemplos en el que se
afirma específicamente a partir de ese momento un límite superior.
Por tanto, un "anticuerpo", como se utiliza en la presente,
representa "como mínimo un primer anticuerpo". Los límites
operables y parámetros de combinaciones, como las cantidades de cada
agente en particular, se darán a conocer a aquellos que tengan una
capacidad normal en la técnica a la luz de la presente
descripción.
Los anticuerpos que "inhiben específicamente la
unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2
(KDR/Flk-1)" pueden identificarse actualmente por
ensayos de competición y/o funcionales. Los ensayos preferidos, por
simplicidad, son los ensayos de competición basados en un ELISA. En
los ensayos de competición, se premezcla o se mezcla juntamente el
VEGF con cantidades variadas de anticuerpos de prueba (por ejemplo
un exceso molar de 100 a 1000 veces) y se determina la capacidad de
los anticuerpos de prueba para reducir la unión del VEGF al VEGFR2.
El VEGF se puede premarcar y detectar directamente, o se puede
detectar utilizando un anticuerpo anti-VEGF
(secundario) o un sistema de detección de anticuerpo secundario o
terciario. Un formato ELISA de tal ensayo de competición es un
formato preferido, pero se puede llevar a cabo cualquier tipo de
ensayo de inmunocompetición.
En tal ensayo de competición, la unión del VEGF
al VEGFR2 en presencia de un anticuerpo completamente irrelevante
(incluyendo anticuerpos monoclonales anti-VEGF no
bloqueadores) es el valor de control elevado (100%). En un ensayo de
prueba, una reducción significativa en la unión del VEGF al VEGFR2
en presencia de un anticuerpo de prueba es indicativo de un
anticuerpo de prueba que inhibe significativamente la unión del VEGF
al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1).
Una reducción significativa es una reducción en
la unión "reproducible", es decir, que se observa
constantemente. Una "reducción significativa", en términos de
la presente solicitud, se define como una reducción reproducible (en
la unión del VEGF al VEGFR2) en, como mínimo, un 45%
aproximadamente, un 50% aproximadamente, un 55% aproximadamente, un
60% aproximadamente o un 65% aproximadamente de cualquier cantidad
entre unas 100 y 1000 veces de exceso molar de anticuerpo sobre el
VEGF.
Como una característica preferida de la presente
invención es que los anticuerpos proporcionados no inhiben
sustancialmente la unión del VEGF al VEGFR1, y los anticuerpos que
muestran una reducción moderadamente significativa de la unión del
VEGF al VEGFR2 aún serán útiles, siempre y cuando no inhiban
sustancialmente la unión del VEGF al VEGFR1. No obstante, los
anticuerpos más preferidos serán aquellos que tienen una capacidad
más significativa para inhibir la unión del VEGF al VEGFR2. Estos
anticuerpos son aquellos que muestran una capacidad reproducible
para reducir la unión del VEGF al VEGFR2 en, como mínimo, un 70%
aproximadamente, un 75% aproximadamente o un 80% aproximadamente de
cualquier cantidad entre unas 100 y 1000 veces de exceso molar de
anticuerpo sobre el VEGF. A pesar de que no se requieren para llevar
a la práctica la presente invención, los anticuerpos que reducen la
unión del VEGF al VEGFR2 en, como mínimo, un 85% aproximadamente, un
90% aproximadamente, un 95% aproximadamente o incluso más, no se
excluyen de ninguna manera.
Los anticuerpos anti-VEGF, o
fragmentos de unión al antígeno de éstos, que inhiben la unión del
VEGF al receptor VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir
significativamente la unión del VEGF al receptor VEGFR1
(Flt-1) se confirman fácilmente mediante simples
ensayos de competición, tales como los descritos anteriormente, pero
utilizando VEGFR1.
La ausencia de una reducción significativa es un
"mantenimiento sustancial de la unión" "reproducible", es
decir, constantemente observado. Un "mantenimiento sustancial de
la unión", en los términos de la presente solicitud, se define
como un mantenimiento reproducible (en la unión del VEGF al VEGFR1)
de, como mínimo, un 60% aproximadamente, un 70% aproximadamente, un
80% aproximadamente o un 85% aproximadamente de cualquier cantidad
entre unas 100 y 1000 veces de exceso molar de anticuerpo sobre el
VEGF.
La intención de utilizar anticuerpos que no
inhiben sustancialmente la unión del VEGF al VEGFR1 es mantener las
funciones biológicas mediadas por el VEGFR1. Por lo tanto, un
anticuerpo sólo necesita mantener una unión suficiente del VEGF al
VEGFR1 de manera que se induzca una respuesta biológica por el VEGF.
No obstante, los anticuerpos más preferidos serán aquellos que
tienen una capacidad más significativa para mantener la unión del
VEGF al VEGFR1. Estos anticuerpos son aquellos que muestran una
capacidad reproducible para mantener la unión del VEGF al VEGFR1 en
niveles de, como mínimo, un 88% aproximadamente, un 90%
aproximadamente, un 92% aproximadamente, un 95% aproximadamente o un
98-99% aproximadamente de cualquier cantidad entre
unas 100 y 1000 veces de exceso molar de anticuerpo sobre el
VEGF.
Se entenderá que los anticuerpos que inhiben más
sustancialmente la unión del VEGF al VEGFR2 pueden probablemente
tolerar más la reducción en la unión al VEGFR1. Igualmente, allí
donde el anticuerpo tenga una reducción moderada en la unión del
VEGF al VEGFR2, el mantenimiento de la unión al VEGFR1 debería ser
rigurosamente controlado.
Otro ensayo preferido de unión para identificar
y/o confirmar que un anticuerpo inhibe la unión del VEGF al receptor
del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) es un ensayo de
coprecipitación. Un ensayo de coprecipitación prueba la capacidad
de un anticuerpo para bloquear la unión del VEGF a uno o más
receptores en solución. En un ensayo de este tipo, el VEGF o un VEGF
marcado para detectarse se incuba con una forma adecuada del
receptor.
Hay muchos formatos para llevar a cabo los
ensayos de inmunoprecipitación o coprecipitación. En el presente
caso, una "forma adecuada del receptor" puede ser el receptor
VEGFR2 en cuestión o el dominio extracelular del receptor. La
inmunoprecipitación requiere, además de reactivos estándares, la
presencia de un anticuerpo contra el receptor VEGFR2 o un epítopo en
el dominio extracelular del receptor diferente del lugar al que el
VEGF se une. La presente invención proporciona otras formas
"adecuadas" de los receptores del VEGF, es decir, los dominios
extracelulares de los receptores unidos a una parte Fc del
anticuerpo. Tales construcciones receptor/Fc se pueden precipitar
mediante la incubación con un compuesto inmunoprecipitante efectivo,
tal como un compuesto basado en la Proteína A.
Sin tener en cuenta el receptor adecuado, los
ensayos de inmunoprecipitación o coprecipitación se llevan a cabo
preferiblemente con controles. La capacidad del VEGF por sí solo de
unirse al receptor elegido debería confirmarse mediante la
precipitación en ausencia de un anticuerpo
anti-VEGF. Preferiblemente, se llevan cabo
incubaciones paralelas en presencia o ausencia de un anticuerpo con
propiedades conocidas de unión para actuar como control. Más
preferiblemente, se realizan ensayos en paralelo utilizando tanto un
anticuerpo de control bloqueador como un anticuerpo de control no
bloqueador.
Cualquier especie inmunológica enlazada se
precipita a continuación, por ejemplo, mediante la incubación con un
compuesto inmunoprecipitante efectivo, tal como un compuesto basado
en la Proteína A o unas bolas de sefarosa Proteína A. A
continuación, se examina el precipitado para la presencia del VEGF.
Allí donde el VEGF, en la incubación inicial, era un VEGF marcado
para ser detectado, tal como el VEGF radiomarcado, cualquier VEGF en
el inmunoprecipitado se puede detectar directamente. Cualquier VEGF
no marcado en el inmunoprecipitado se puede detectar mediante otros
medios adecuados, por ejemplo, por separación en gel e
inmunodetección con un anticuerpo anti-VEGF.
La capacidad de un anticuerpo para bloquear la
unión del VEGF al receptor del VEGF, tal como el VEGFR2, en tal
ensayo de coprecipitación se puede cuantificar fácilmente, a pesar
de que los resultados cualitativos también son valiosos. La
cuantificación se puede conseguir mediante la medida directa de VEGF
marcado o, por ejemplo, mediante análisis densitométricos del VEGF
inmunodetectado. Los anticuerpos que muestran una capacidad
reproducible, es decir, constantemente observada, para inhibir la
unión del VEGF al VEGFR2 pueden, de este modo, detectarse, y se
pueden elegir anticuerpos útiles según el criterio cuantitativo
expresado anteriormente.
Los anticuerpos anti-VEGF que no
inhiben significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF,
VEGFR1 (Flt-1), también se pueden identificar
fácilmente mediante la realización de ensayos de coprecipitación
como se describen anteriormente, pero utilizando VEGFR1 en lugar de
VEGFR2. Por lo tanto, los anticuerpos anti-VEGF que
inhiben la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2
(KDR/Flk-1), sin inhibir significativamente la unión
del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1),
también se pueden identificar fácilmente utilizando tales
métodos.
La presente solicitud también proporciona varios
ensayos funcionales para identificar y/o confirmar que un anticuerpo
inhibe significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF,
VEGFR2 (KDR/Flk-1). Éstos están generalmente
relacionados con la identificación del VEGFR2 como el receptor
responsable de ciertas respuestas biológicas definidas. A pesar de
que los siguientes ensayos son menos preferidos que los ensayos del
tipo competición anteriores, los cuales se llevan a cabo en sistemas
libres de células y son más reproducibles, fiables, menos laboriosos
y efectivos en coste, son, no obstante, útiles en el contexto de la
presente invención.
Por ejemplo, un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 se puede identificar
probando la capacidad para inhibir el crecimiento de células
endoteliales mediado por el VEGF (inhibiendo la actividad mitogénica
del VEGF). Se puede emplear cualquier ensayo adecuado utilizando
cualquiera de una variedad de células endoteliales en presencia del
VEGF con o sin anticuerpos de prueba. Preferiblemente, se realizan
ensayos duplicados en paralelo, tales como aquellos sin el VEGF y
aquellos con anticuerpos de control de propiedades definidas (tanto
bloqueadores como no bloqueadores). El crecimiento de células
endoteliales se puede determinar y, preferiblemente, cuantificar
exactamente, mediante cualquier medio aceptable de determinación del
número de células, incluyendo ensayos colorimétricos.
Un anticuerpo con una capacidad para inhibir el
crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF,
generalmente, mostrará una inhibición observada constantemente del
crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF de
aproximadamente un 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ó 50% o similar. La
inhibición con tales porcentajes indicará un anticuerpo con
propiedades suficientes para inhibir la angiogénesis in vivo.
Los anticuerpos con una actividad inhibitoria más significativa no
se excluyen de la presente invención.
Los ensayos funcionales adicionales para
identificar anticuerpos de acuerdo con la presente invención son
ensayos para probar el bloqueo de la fosforilación inducida por el
VEGF. Se puede emplear cualquier ensayo adecuado utilizando
cualquiera de una variedad de células endoteliales que expresan
cualquier forma de VEGFR2 nativo o fosforilable recombinante. Las
células se incuban con el VEGF en presencia o ausencia del
anticuerpo a probar durante un período de tiempo adecuado.
Preferiblemente, se realizan ensayos duplicados en paralelo, tales
como aquellos sin el VEGF y aquellos con anticuerpos de control de
propiedades definidas (tanto bloqueadores como no bloqueadores).
La fosforilación inducida por el VEGF, del VEGFR2
se puede determinar y, preferiblemente, cuantificar exactamente
mediante cualquier medio aceptable. Generalmente, el VEGFR2 se
inmunoprecipita para análisis posteriores. El grado de fosforilación
del VEGFR2 se puede determinar directamente, por ejemplo, las
células se pueden haber incubado con ATP marcado con ^{32}P,
permitiendo la cuantificación directa del ^{32}P dentro del VEGFR2
inmunoprecipitado. Preferiblemente, los VEGFR2 inmunoprecipitados se
analizan por otros medios, por ejemplo, por separación en gel e
inmunodetección con un anticuerpo que se une a los restos de
fosfotirosina. Un anticuerpo con una capacidad de inhibir la
fosforilación inducida por el VEGF, del VEGFR2, generalmente,
mostrará una reducción observada constantemente en los niveles de
VEGFR2 fosforilados.
Incluso los ensayos funcionales adicionales para
identificar los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores
de VEGFR2, de acuerdo con la presente invención, son ensayos para
probar la inhibición de la permeabilidad vascular inducida por el
VEGF. A pesar de que se puede utilizar cualquier ensayo, un ensayo
particularmente adecuado es el ensayo de permeabilidad de Miles, en
el que a animales, tales como las cobayas, se les inyecta un
colorante, tal como el colorante azul de Evans, y el aspecto del
colorante en la piel del animal se determina tras el suministro de
VEGF en presencia o ausencia de los anticuerpos de prueba.
Preferiblemente, se llevan a cabo estudios duplicados en paralelo,
tales como aquellos sin VEGF y aquellos con anticuerpos de control
de propiedades definidas (tanto bloqueadores como no bloqueadores).
El aspecto del colorante en la piel del animal es habitualmente, en
forma de manchas, tales como manchas azules, en la espalda del
animal, las cuales se pueden fotografiar y medir.
Los anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2 inhibirán la permeabilidad vascular inducida
por el VEGF como una inhibición observada constantemente, a bajas
concentraciones, tal como cuando se proporciona en un exceso molar
de 100 ó 1000 veces sobre el VEGF. Los anticuerpos que no bloquean
la unión del VEGF al VEGFR2 no mostrarán ninguna inhibición
significativa de la permeabilidad vascular inducida por el VEGF.
Generalmente, los anticuerpos que bloquean la permeabilidad inducida
por el VEGF sólo a altas concentraciones, tales como en un exceso
molar de 10 veces sobre el VEGF, no serán anticuerpos con
propiedades de acuerdo con la presente invención.
Los ensayos funcionales ampliamente aceptados de
angiogénesis y, por tanto, agentes antiangiogénicos, son el ensayo
de "micropocket" corneal de neovascularización y el ensayo
prueba de la membrana corioalantoica (CAM) de pollo. La Patente
U.S.A. No. 5.712.291 muestra que los ensayos de "micropocket"
corneal y CAM son suficientemente predictivos para identificar
agentes para el uso en el tratamiento de un número de enfermedades
angiogénicas extremadamente amplio.
La Patente U.S.A. No. 5.001.116 describe el
ensayo CAM. Esencialmente, a los embriones de pollo fertilizados se
les elimina su caparazón en el día 3 ó 4, y se implanta un disco de
metilcelulosa, que contiene el compuesto de prueba, en la membrana
corioalantoica. Se examinan los embriones 48 horas después
aproximadamente y, si aparece una zona avascular clara alrededor del
disco de metilcelulosa, se mide el diámetro de la zona. Tal como se
dio a conocer en la Patente U.S.A. No. 5.712.291, en el contexto de
la presente invención, la aparición de cualquier zona avascular es
suficiente para mostrar la presencia de un anticuerpo
antiangiogénico. Cuanto mayor es la zona, más efectivo es el
anticuerpo.
El ensayo de "micropocket" corneal de
neovascularización se puede realizar utilizando córneas de rata o
conejo. Este modelo in vivo es ampliamente aceptado como
pronóstico de la utilidad clínica, como se evidencia en las Patentes
U.S.A. Nos. 5.712.291 y 5.871.723, para objetivos evidentes. A pesar
de que no se cree que sean particularmente relevantes en la presente
invención, los ensayos corneales son preferibles sobre el ensayo CAM
porque, generalmente, reconocerán compuestos que son inactivos
per se pero que se metabolizan para dar compuestos
activos.
En la presente invención, el ensayo de
"micropocket" corneal se utiliza para identificar un agente
antiangiogénico. Esto se evidencia por una reducción significativa
en la angiogénesis, tal como se representó por una reducción
constantemente observada y preferiblemente marcada, en el número de
vasos sanguíneos en el interior de la córnea. Tales respuestas son
preferiblemente definidas como aquellas córneas que muestran sólo un
brote ocasional y/o un bucle de horquilla que no mostraba ninguna
evidencia del crecimiento sostenido cuando contactaba con la
sustancia de prueba.
Entre los anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2 (y fragmentos de unión al antígeno) de la
presente invención se incluyen, a título de ejemplo, aquellos
que:
(a) inhiben significativamente la unión del VEGF
al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1);
(b) no inhiben significativamente la unión del
VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1);
(c) inhiben, y preferiblemente, inhiben
significativamente la fosforilación, inducida por el VEGF, del
VEGFR2;
(d) inhiben, y preferiblemente, inhiben
significativamente la permeabilidad vascular inducida por el
VEGF;
(e) inhiben, y preferiblemente, inhiben
significativamente la proliferación de células endoteliales inducida
por el VEGF;
(f) inhiben, y preferiblemente, inhiben
significativamente la angiogénesis;
(g) no inhiben significativamente la estimulación
o activación mediada por el VEGFR1 de macrófagos, osteoclastos o
condroclastos; y
(h) se localizan en la vasculatura del tumor y el
estroma tumoral tras la administración a un animal con un tumor
vascularizado.
Un aspecto particular de la presente invención
está basado en el descubrimiento sorprendente y original de los
inventores, de anticuerpos que inhibían específicamente la unión del
VEGF al receptor VEGFR2, que tenían efectos antitumorales
significativos in vivo y que no inhibían la unión del VEGF al
receptor VEGFR1. En ciertas realizaciones, la presente invención, de
este modo, proporciona anticuerpos de especificidad de epítopo
definida, en las que tales anticuerpos, o fragmentos de unión al
antígeno de éstos, se unen, esencialmente, al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
La presente invención, tal como se reivindica, da
las condiciones, de acuerdo con la presente especificación y
referencias tecnológicas fácilmente disponibles, del saber hacer y
los materiales de partida. No obstante, una muestra de la línea
celular del hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 2C3 se
presentó el 27 de marzo, por recibo el 28 de marzo del 2000, para
depósito con la "American Type Culture Collection (ATCC)",
10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209,
U.S.A. y se le dio un número de entrada al ATCC, ATCC PTA 1595 el 11
de abril del 2000. Este depósito se hizo bajo las disposiciones del
Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito
de Microorganismos para los Objetivos en Procedimientos de Patentes
y las regulaciones del mismo (Tratado de Budapest). El hibridoma
estará disponible por el ATCC bajo los términos del Tratado de
Budapest sobre cuestiones de una patente U.S.A. con las
reivindicaciones pertinentes. La disponibilidad del hibridoma
depositado no debe interpretarse como una licencia para realizar la
invención en contravención de los derechos cedidos bajo la autoridad
de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.
Ciertas composiciones preferidas son, por tanto,
composiciones que comprenden, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, o un fragmento de unión al antígeno de
éste, o, como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF
purificado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une
sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595); composiciones que comprenden, como mínimo, un
primer anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión al antígeno de
éste, que se une al VEGF en, esencialmente, el mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y composiciones que
comprenden, como mínimo, un primer anticuerpo monoclonal
anti-VEGF, o un fragmento de unión al antígeno de
éste, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595).
No obstante, otras composiciones, anticuerpos,
métodos, y particularmente, la utilización médica primaria y
secundaria de la presente invención, tienen que ver con anticuerpos
anti-VEGF, o fragmentos de unión al antígeno de
éstos, que se unen al mismo, o sustancialmente al mismo epítopo que
el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), aparte del anticuerpo
monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) en sí mismo.
Los términos "que se une aproximadamente,
sustancialmente o esencialmente al mismo, o al mismo, epítopo
que" el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) representan que
un anticuerpo "reacciona de forma cruzada" con el anticuerpo
monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). "Los anticuerpos de reactividad
cruzada" son aquellos que reconocen, se unen a, o tienen
inmunoespecificidad por sustancialmente o esencialmente el mismo, o
el mismo, epítopo o "sitio epitópico" que el anticuerpo
monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), tal que son capaces de competir con
efectividad con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) por la
unión al VEGF. "Los anticuerpos de reactividad cruzada con 2C3"
son sucintamente denominados "anticuerpos similares a 2C3" y
"anticuerpos basados en 2C3", y tales términos se utilizan
indistintamente en la presente y se aplican a composiciones,
utilizaciones y métodos.
La identificación de uno o más anticuerpos que se
une(n) a aproximadamente, sustancialmente, esencialmente o al
mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) es un
asunto técnico sencillo ahora que se ha proporcionado el 2C3 con sus
propiedades ventajosas. Como la identificación de los anticuerpos de
reactividad cruzada se determina en comparación con un anticuerpo de
referencia, se entenderá que, realmente, la determinación del
epítopo al que el anticuerpo de referencia (2C3) y el anticuerpo de
prueba se unen no es, en ningún caso, necesario para identificar un
anticuerpo que se une al mismo, o sustancialmente al mismo, epítopo
que el anticuerpo monoclonal 2C3. Sin embargo, en la presente se
incluye una información considerable sobre el epítopo enlazado al
2C3 y, adicionalmente, se puede realizar un mapeo del epítopo, como
se describió por Champe y otros (1995).
La identificación de anticuerpos de reactividad
cruzada se puede determinar fácilmente utilizando cualquiera de la
variedad de ensayos de screening inmunológico en los que se puede
evaluar la competición de anticuerpos. Todos estos ensayos son
rutina en la técnica y se describen con detalle en la presente. La
Patente U.S.A. No. 5.660.827, publicada el 26 de agosto de 1997,
incluso complementa, adicionalmente, la presente enseñanza relativa
a como hacer que los anticuerpos se unan al mismo, o sustancialmente
al mismo, epítopo que un anticuerpo dado, tal como el 2C3.
Por ejemplo, allí donde se obtienen los
anticuerpos de prueba que se examinan de diferentes animales de
origen, o son incluso de diferente isotipo, se puede emplear un
simple ensayo de competición en el que el control (2C3) y los
anticuerpos de prueba se mezclan (o preadsorben) y se aplican a un
compuesto de antígeno del VEGF. Por "compuesto de antígeno del
VEGF" se entiende cualquier compuesto que contiene un antígeno
del VEGF con unión al 2C3 como se describe en la presente, tal como
un VEGF libre. De este modo, los protocolos basados en ELISAs y
transferencia tipo Western son adecuados para la utilización en
tales estudios de competición simples.
En ciertas realizaciones, se premezclarían los
anticuerpos de control (2C3) con cantidades variadas de anticuerpos
de prueba (por ejemplo, 1:10 ó 1:100) durante un período de tiempo
anterior a la aplicación a un compuesto de antígeno. En otras
realizaciones, el control y las cantidades variadas de anticuerpos
de prueba se pueden simplemente mezclar durante la exposición al
compuesto de antígeno. En cualquier caso, mediante la utilización de
especies o anticuerpos secundarios de isotipo se podrán detectar
sólo los anticuerpos de control enlazados, las uniones de los cuales
se reducirán por la presencia de un anticuerpo de prueba que
reconoce sustancialmente el mismo epítopo.
Al realizar un estudio de competición de
anticuerpos entre un anticuerpo de control y cualquier anticuerpo de
prueba (sin tener en cuenta la especie o el isotipo), se puede
marcar primero el control (2C3) con un marcador detectable, tal
como, por ejemplo, biotina o un marcador enzimático (o incluso
radioactivo) para permitir la posterior identificación. En estos
casos, se premezclarían o incubarían los anticuerpos de control
marcados con los anticuerpos de prueba a examinar en varias
proporciones (por ejemplo, 1:10 ó 1:100) y (opcionalmente, después
de un período adecuado de tiempo), a continuación, se analizaría la
reactividad de los anticuerpos de control marcados y se compararía
con el valor de control en el que no se incluía en la incubación
ningún anticuerpo de prueba potencialmente competitivo.
El ensayo puede ser, otra vez, cualquiera dentro
de un rango de ensayos inmunológicos basados en la hibridación de
anticuerpo, y los anticuerpos de control se detectarían mediante la
detección de su marcador, por ejemplo, utilizando estreptavidina en
el caso de anticuerpos biotinilados o utilizando un sustrato
cromogénico en conexión con un marcador enzimático (tal como un
sustrato de 3,3'5,5'-tetrametilbencidina (TMB) con
la enzima peroxidasa) o, simplemente, mediante la detección de un
marcador radiactivo. Un anticuerpo que se une al mismo epítopo que
los anticuerpos de control será capaz de competir con efectividad
por la unión y, de este modo, reducirá significativamente la unión
del anticuerpo de control, como se observó por la reducción en el
marcador enlazado.
La reactividad de los anticuerpos de control
(marcados) en ausencia de un anticuerpo completamente irrelevante
sería el valor elevado de control. El valor bajo de control se
obtendría mediante la incubación de los anticuerpos (2C3) marcados
con anticuerpos no marcados del mismo tipo exactamente (2C3), en el
momento de que tuviera lugar la competición y se redujera la unión
de los anticuerpos marcados. En un ensayo de prueba, una reducción
significativa en la reactividad del anticuerpo marcado en presencia
de un anticuerpo de prueba es indicativo de un anticuerpo de prueba
que reconoce el mismo epítopo, es decir, que "reacciona de forma
cruzada" con el anticuerpo (2C3) marcado.
Una reducción significativa es una reducción en
la unión "reproducible", es decir, constantemente observada.
Una "reducción significativa", en términos de la presente
solicitud, se define como una reducción reproducible (en la unión de
un 2C3 al VEGF en un ELISA) de, como mínimo, un 70% aproximadamente,
un 75% aproximadamente o un 80% aproximadamente en cualquier
proporción entre, aproximadamente 1:10 y 1:100. Los anticuerpos con
actividades de bloqueo cruzado incluso más rigurosas mostrarán una
reducción reproducible (en la unión de un 2C3 al VEGF en un ELISA o
cualquier otro ensayo adecuado) de, como mínimo, un 82%
aproximadamente, un 85% aproximadamente, un 88% aproximadamente, un
90% aproximadamente, un 92% aproximadamente o un 95% aproximadamente
o similar, en cualquier proporción entre 1:10 y 1:100
aproximadamente. A pesar de que de ningún modo se requiere para
realizar la invención, no se excluye el bloqueo cruzado completo o
casi completo, tal como el que muestra una reducción reproducible en
la unión de un 2C3 al VEGF de un 99% aproximadamente, un 98%
aproximadamente, un 97% aproximadamente o un 96% aproximadamente o
similar.
La presente invención se ejemplifica por un
anticuerpo monoclonal 2C3, producido por el hibridoma ATCC PTA 1595,
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo monoclonal.
Otro aspecto de la presente invención es un hibridoma que produce un
anticuerpo anti-VEGF monoclonal que se une
sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595).
La presente invención, además, proporciona
anticuerpos anti-VEGF que se unen sustancialmente al
mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595),
preparado mediante un proceso que comprende inmunizar un animal con,
como mínimo, un primer componente de VEGF inmunogénico y seleccionar
del animal inmunizado un anticuerpo que reacciona sustancialmente de
forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y
los anticuerpos anti-VEGF que se unen
sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595), preparado mediante un proceso que comprende
inmunizar un animal con, como mínimo, un primer compuesto VEGF
inmunogénico y seleccionar del animal inmunizado un anticuerpo
anti-VEGF de reactividad cruzada mediante la
identificación de un anticuerpo que reduce sustancialmente la unión
del anticuerpo 2C3 al VEGF.
Otros aspectos de la presente invención los
forman los anticuerpos anti-VEGF, o fragmentos de
unión al antígeno de éstos, que se unen sustancialmente al mismo
epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) y que,
específicamente, inhibe la unión del VEGF al receptor del VEGF,
VEGFR2 (KDR/Flk-1); y los anticuerpos
anti-VEGF, o fragmentos de unión al antígeno de
éstos, que se unen sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) y que inhibe la unión del
VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin
inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF,
VEGFR1 (Flt-1).
Los anticuerpos con tales combinaciones de
propiedades se pueden identificar fácilmente mediante uno o más o
una combinación de los ensayos de competición de receptor, ELISA,
coprecipitación, y/o ensayos funcionales y los ensayos de
reactividad cruzada del 2C3 descritos anteriormente. La guía
respecto a la evaluación cuantitativa de los anticuerpos similares
al 2C3 que reducen significativamente y constantemente la unión del
VEGF al VEGFR2 y que, constantemente, no inhiben significativamente
la unión del VEGF al VEGFR1 es como se describió anteriormente.
El 2C3 mostrado en la presente, reduce la
cantidad de VEGF que se enlazó a los pocillos del ELISA revestidos
de VEGFR2 a un 26% aproximadamente y un 19%, respectivamente, en
unos excesos molares sobre el VEGF de 100 y 1000 veces. Estas cifras
se equiparan a las reducciones en la unión del VEGF al VEGFR2 en un
74% aproximadamente y un 81% aproximadamente, respectivamente. El
2C3, mostrado en la presente mantiene la cantidad de VEGF que se
enlazó a los pocillos del ELISA revestidos de VEGFR2 a
aproximadamente un 92% y un 105%, respectivamente, en unos excesos
molares sobre el VEGF de 100 y 1000 veces.
Se entenderá, otra vez, que los anticuerpos de
reactividad cruzada o similares al 2C3 que inhiben más
sustancialmente la unión del VEGF al VEGFR2 pueden probablemente
tolerar más la reducción en la unión al VEGFR1. De igual modo, allí
donde un anticuerpo tenga una reducción moderada en la unión del
VEGF al VEGFR2, el mantenimiento de la unión al VEGFR1 debería ser
seguido más rigurosamente.
Por tanto, anticuerpos anti-VEGF
de ejemplo adicionales (y fragmentos de unión al antígeno) de la
presente invención, son aquellos que:
(a) se unen a un epítopo del VEGF no dependiente
de conformación, tal como se evaluó por la unión al VEGF mediante
transferencia tipo Western;
(b) se unen a un VEGF libre;
(c) inhiben significativamente la unión del VEGF
al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1);
(d) no inhiben significativamente la unión del
VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1);
(e) inhiben, y preferiblemente, inhiben
significativamente la fosforilación inducida por el VEGF, del
VEGFR2;
(f) inhiben, y preferiblemente, inhiben
significativamente la permeabilidad vascular inducida por el
VEGF;
(g)) inhiben, y preferiblemente, inhiben
significativamente la proliferación de células endoteliales inducida
por el VEGF;
(h) inhiben, y preferiblemente, inhiben
significativamente la angiogénesis;
(i) no inhiben significativamente la estimulación
o activación mediada por el VEGFR1 de macrófagos, osteoclastos o
condroclastos;
(j) se localizan en la vasculatura del tumor y el
estroma tumoral tras la administración a un animal con un tumor
vascularizado; y
(k) se unen al mismo o sustancialmente al mismo
epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
En las siguientes descripciones de composiciones,
inmunoconjugados, fármacos, combinaciones, cócteles, kits, usos
médicos primarios y secundarios y todos los métodos de acuerdo con
la presente invención, los términos "anticuerpo" e
"inmunoconjugado", o una región de unión al antígeno de éstos,
a menos que se afirme específicamente lo contrario o se aclare a
partir de la terminología científica, se refieren a un grupo de
anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 así
como a anticuerpos de reactividad cruzada con 2C3, específicos.
Los términos "anticuerpo" e
"inmunoglobulina", como se utilizan en la presente, se refieren
ampliamente a cualquier agente de unión inmunológico, incluyendo
anticuerpos monoclonales y policlonales. Dependiendo del tipo de
dominio constante en las cadenas pesadas, los anticuerpos se asignan
a una de las cinco clases principales: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
Varias de éstas se dividen en subclases o isotipos, tales como IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, y similares. Los dominios constantes de cadena
pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas
se denominan \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu,
respectivamente. Las estructuras subunitarias y las configuraciones
tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son
bien conocidas.
Generalmente, allí donde se utilizan los
anticuerpos, en lugar de las regiones de unión al antígeno, en la
presente invención, se prefieren IgG y/o IgM porque son los
anticuerpos más comunes en la situación fisiológica y porque son los
más fáciles de producir en el marco de un laboratorio.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de
mamíferos se asignan a uno de dos tipos claramente distintos: kappa
(\kappa) y lambda (\lambda), basándose en las secuencias de
aminoácidos de sus dominios constantes. Esencialmente, no hay
ninguna preferencia para la utilización de las cadenas ligeras
\kappa o \lambda en los anticuerpos de la presente
invención.
Se prefiere mucho más el uso de anticuerpos
monoclonales (MAbs) o derivados de éstos. Los MAbs son reconocidos
por tener ciertas ventajas, por ejemplo, reproducibilidad y
producción a gran escala, que los hace adecuados para el tratamiento
clínico. La presente invención, de este modo, proporciona
anticuerpos monoclonales de origen murino, humano, de mono, de rata,
de hámster, de conejo e incluso de rana o pollo. Se preferirán,
generalmente, anticuerpos monoclonales murinos, humanos o
humanizados.
Como entenderán los entendidos en la técnica, los
reactivos de unión inmunológica abarcados por el término
"anticuerpo" se extienden a todos los anticuerpos de todas las
especies, y fragmentos de unión al antígeno de éstos, incluyendo
anticuerpos diméricos, triméricos y multiméricos; anticuerpos
biespecíficos; anticuerpos quiméricos; anticuerpos humanos y
humanizados; anticuerpos recombinantes y fabricados, y fragmentos de
éstos.
El término "anticuerpo", de este modo, se
utiliza para referirse a cualquier molécula similar a un anticuerpo
que tenga una región de unión al antígeno, y este término incluye
fragmentos de anticuerpo tales como Fab', Fab, F(ab')_{2},
anticuerpos de dominios único (DABs), Fv, scFv (cadena única Fv),
anticuerpos lineales, "fragmentos bivalentes"
("diabodies") y similares. Las técnicas para la preparación y
la utilización de varias construcciones y fragmentos basados en
anticuerpos son bien conocidas en la técnica (ver Kabat y otros,
1991). Los "diabodies", en particular, están más descritos en
las Patentes EP 404.097 y WO 93/11161; mientras que los anticuerpos
lineales están más descritos en Zapata y otros (1995).
En ciertas realizaciones, las composiciones de la
invención comprenden, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF que comprende, como mínimo, una primera
región variable que comprende una región con una secuencia de
aminoácidos de, como mínimo, un 75% aproximadamente, más
preferiblemente, como mínimo, un 80% aproximadamente, más
preferiblemente, como mínimo, un 85% aproximadamente, más
preferiblemente, como mínimo, un 90% aproximadamente y todavía más
preferiblemente, como mínimo, un 95% aproximadamente o similar de
identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9; en las que dicho
anticuerpo anti-VEGF, como mínimo, mantiene
sustancialmente las propiedades biológicas de los anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 de la presente
invención, como quedo ejemplificado por el anticuerpo 2C3.
La identidad u homología con respecto a éstas y
otras secuencias de anticuerpo anti-VEGF de la
presente invención se define en la presente como el porcentaje de
residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos
a las secuencias de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9, o a la secuencia de
otro anticuerpo anti-VEGF de la presente invención,
después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es
necesario, para conseguir el máximo porcentaje en la identidad de la
secuencia. Es particularmente importante el mantenimiento de
sustancialmente las mismas o incluso de propiedades biológicas más
efectivas del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 utilizado para la comparación de la secuencia. Tales
comparaciones son fácilmente realizables, por ejemplo, utilizando
uno o más de los varios ensayos descritos en la presente en
detalle.
En ciertas realizaciones preferidas, los
anticuerpos anti-VEGF de la presente invención
comprenden, como mínimo, una primera región variable que incluye una
región con secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9, como se ejemplificó por
regiones variables que incluyen una región con secuencia de
aminoácidos codificados por las secuencias del ácido nucleico de SEQ
ID NO:6 o SEQ ID NO:8. Tales secuencias son las secuencias de Vh y
V\chi del ScFV de 2C3 que abarca las CDR1-3
(regiones determinantes de complementariedad) de las regiones
variables de las cadenas pesadas y ligeras.
En otras realizaciones preferidas, se
proporcionan anticuerpos de segunda generación que tienen
propiedades mejoradas o superiores en comparación con un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, tal como el 2C3.
Por ejemplo, los anticuerpos de segunda generación pueden tener una
afinidad de unión más fuerte, un bloqueo más efectivo de la unión
del VEGF al VEGFR2, un bloqueo más específico de la unión del VEGF
al VEGFR2, incluso un menor bloqueo de la unión del VEGF al VEGFR1,
una capacidad mejorada de inhibir la proliferación y/o migración de
células endoteliales inducida por el VEGF, una capacidad superior de
inhibir, la permeabilidad vascular inducida por el VEGF, y
preferiblemente, una aumentada capacidad de inhibir la angiogénesis
inducida por el VEGF in vivo, y tratar las enfermedades
angiogénicas, incluyendo los tumores vascularizados.
Las comparaciones para identificar anticuerpos de
segunda generación se realizan y cuantifican fácilmente, por
ejemplo, utilizando uno o más de los varios ensayos descritos en la
presente con detalle. Se abarcan en la presente invención los
anticuerpos de segunda generación que tienen una propiedad o
actividad biológica aumentada en, como mínimo, unas 10 veces,
preferiblemente, como mínimo, unas 20 veces, y más preferiblemente,
como mínimo, unas 50 veces, en comparación con los anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 de la presente
invención, ejemplificados por el anticuerpo 2C3.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos
empleados serán "humanizados", anticuerpos humanos o
parcialmente humanos. Los anticuerpos "humanizados" son,
generalmente, anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón, rata, u
otras especies no humanas, con los dominios de región variable y/o
constante de humano ("anticuerpos quiméricos parcialmente
humanos"). Varios anticuerpos monoclonales humanizados a utilizar
en la presente invención serán anticuerpos quiméricos en los que,
como mínimo, una primera región de unión al antígeno, o una región
determinante de complementariedad (CDR), de un ratón, una rata u
otro anticuerpo monoclonal no humano está acoplado operativamente, o
se "inserta", a una región constante de anticuerpo humano o
"armazón".
Los anticuerpos monoclonales "humanizados" a
utilizar en la presente también pueden ser anticuerpos monoclonales
de especies no humanas en los que uno o más de los aminoácidos
seleccionados se han intercambiado por aminoácidos observados más
normalmente en anticuerpos humanos. Esto se puede conseguir
fácilmente a través de la utilización de tecnología recombinante
rutinaria, particularmente mutagénesis específica de sitio.
Los anticuerpos completamente humanos, en lugar
de los "humanizados", también se pueden preparar y utilizar en
la presente invención. Dichos anticuerpos humanos se pueden obtener
de sujetos sanos mediante la simple obtención de una población de
linfocitos sanguíneos periféricos mezclados de un sujeto humano,
incluyendo células que presentan antígeno y que producen
anticuerpos, y estimulando la población celular in vitro
mediante la mezcla con una cantidad inmunogénicamente efectiva de
una muestra de VEGF. Las células productoras de anticuerpo
anti-VEGF humano, una vez obtenidas, se utilizan en
el hibridoma y/o la producción de anticuerpos recombinantes.
Algunas técnicas adicionales para la producción
de anticuerpos monoclonales incluyen la inmunización de un animal
transgénico, preferiblemente, un ratón transgénico, que comprende
una biblioteca de anticuerpos humanos con una cantidad
inmunogénicamente efectiva de una muestra de VEGF. Esto también
genera células productoras de anticuerpo anti-VEGF
humano para la posterior manipulación en el hibridoma y/o la
producción de anticuerpos recombinantes, con la ventaja de que las
células del bazo, en lugar de las células sanguíneas periféricas, se
pueden obtener fácilmente a partir del animal transgénico o el
ratón.
Los anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2 de acuerdo con la presente invención se
pueden preparar fácilmente mediante procesos y métodos que
comprenden:
(a) preparar células candidatas productoras de
anticuerpos; y
(b) seleccionar, de las células candidatas
productoras de anticuerpos, un anticuerpo que inhiba
significativamente la unión del VEGF a VEGFR2
(KDR/Flk-1) y no inhiba significativamente la unión
del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1 (Flt-1).
Otros anticuerpos, de acuerdo con la presente
invención, se pueden preparar fácilmente mediante la selección de un
anticuerpo que reacciona sustancialmente de forma cruzada con el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). Algunos métodos y
procesos preparativos adecuados comprenden:
(a) preparar células candidatas productoras de
anticuerpos; y
(b) seleccionar, de las células candidatas
productoras de anticuerpos, un anticuerpo que reacciona
sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595).
Otros procesos para preparar células productoras
de anticuerpos adecuadas y obtener anticuerpos de éstas se pueden
realizar in situ en un paciente dado. Es decir, simplemente
proporcionando una cantidad inmunogénicamente eficaz de una muestra
de VEGF inmunogénica a un paciente dará lugar a una generación de
anticuerpos apropiados. De este modo, el anticuerpo aún "se
obtiene" de la célula productora de anticuerpos, pero no tiene
que ser aislada de un huésped y posteriormente proporcionada a un
paciente; siendo capaz de localizarse espontáneamente en la
vasculatura del tumor y ejercer sus efectos antitumorales
biológicos. Sin embargo, no se prefieren tales realizaciones debido
a la marcada falta de especificidad.
Las células productoras de anticuerpos adecuadas
también se pueden obtener, y consecuentemente aislar anticuerpos y/o
purificarlos, mediante la estimulación de linfocitos sanguíneos
periféricos con el VEGF in vitro.
Otros métodos comprenden la administración a un
animal de un compuesto inmunizante que comprende, como mínimo, un
primer componente de VEGF inmunogénico, y la selección de un
anticuerpo, del animal inmunizado, que inhiba significativamente la
unión del VEGF a VEGFR2 (KDR/Flk-1) y no inhiba
significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1
(Flt-1), y, opcionalmente, que reaccione
sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595). Estos métodos generalmente comprenden:
(a) inmunizar un animal mediante la
administración al animal de, como mínimo, una dosis, y,
opcionalmente, más de una dosis, de una cantidad inmunogénicamente
eficaz de una muestra de VEGF inmunogénica (tal como un primer
componente de VEGF humano, un componente de VEGF sustancialmente de
longitud completa, o VEGF humano recombinado); y
(b) obtener una célula productora de anticuerpos
adecuada del animal inmunizado, tal como una célula productora de
anticuerpos que produzca un anticuerpo que inhiba significativamente
la unión del VEGF a VEGFR2 (KDR/Flk-1) y no inhiba
significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1
(Flt-1), y, opcionalmente, que reaccione
sustancialmente de forma cruzada, con el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595).
La cantidad inmunogénicamente eficaz de la
muestra o muestras de VEGF se puede administrar como conjugados del
VEGF, o en combinación con cualquier adyuvante adecuado, tal como el
adyuvante completo de Freund. Se puede emplear cualquier técnica
empírica o variación para incrementar la inmunogenicidad. Como
inmunógeno se prefiere un VEGF humano sustancialmente de longitud
completa intacto.
Sin tener en cuenta la naturaleza del proceso de
inmunización, o el tipo de animal inmunizado, se obtienen células
productoras de anticuerpos adecuadas del animal inmunizado y,
preferiblemente, posteriormente manipuladas por la mano del hombre.
"Un animal inmunizado", como se utiliza en la presente, es un
animal no humano, a menos que se afirme expresamente lo contrario. A
pesar de que se puede utilizar cualquier célula productora de
anticuerpos, más preferiblemente, se obtienen células del bazo como
fuente de células productoras de anticuerpos. Las células
productoras de anticuerpos se pueden utilizar en un proceso
preparativo que comprende:
(a) fusionar una célula productora de anticuerpos
anti-VEGF adecuada con una célula inmortal para
preparar el hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de
acuerdo con la presente invención; y
(b) obtener un anticuerpo
anti-VEGF adecuado, de acuerdo con la invención, del
hibridoma.
Las células productoras de anticuerpos
anti-VEGF "adecuadas", los hibridomas y los
anticuerpos son aquellos que producen, o existen como, anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, es decir,
anticuerpos que inhiben significativamente la unión del VEGF a
VEGFR2 (KDR/Flk-1) y no inhiben significativamente
la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1
(Flt-1), y que, opcionalmente, reaccionan
sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595).
Los métodos de preparación de anticuerpos
monoclonales basados en el hibridoma, de este modo, incluyen
aquellos que comprenden:
(a) inmunizar un animal mediante la
administración al animal de, como mínimo, una dosis, y,
opcionalmente, más de una dosis, de una cantidad inmunogénicamente
eficaz de una muestra de VEGF inmunogénica, preferiblemente una
muestra de VEGF humano intacta;
(b) preparar una colección de hibridomas
productores de anticuerpos monoclonales del animal inmunizado;
(c) seleccionar de la colección, como mínimo, un
primer hibridoma que produzca, como mínimo, un primer anticuerpo
monoclonal anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, de
acuerdo con la presente invención, opcionalmente, un anticuerpo
anti-VEGF que reaccione sustancialmente de forma
cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y
(d) cultivar, como mínimo, un primer hibridoma
productor de anticuerpos para proporcionar, como mínimo, un primer
anticuerpo monoclonal anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2; y preferiblemente
\newpage
(e) obtener, como mínimo, un primer anticuerpo
monoclonal anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 del
cultivo de, como mínimo, un primer hibridoma.
En la identificación de un anticuerpo
anti-VEGF que reacciona sustancialmente de forma
cruzada con el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), la etapa
de selección puede comprender:
(a) poner en contacto una muestra de VEGF con
unas cantidades efectivas del anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA
1595) y un anticuerpo candidato; y
(b) determinar la capacidad del anticuerpo
candidato para reducir sustancialmente la unión del anticuerpo 2C3 a
la muestra de VEGF, en la que la capacidad de un anticuerpo
candidato para reducir sustancialmente la unión del anticuerpo 2C3 a
la muestra de VEGF es indicativa de un anticuerpo
anti-VEGF que se une sustancialmente al mismo
epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
La etapa de selección puede comprender
además:
(a) poner en contacto una primera muestra de VEGF
con una cantidad de unión efectiva del anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595) y determinar la cantidad de 2C3 que se une al
VEGF;
(b) poner en contacto una segunda muestra de VEGF
con una cantidad de unión efectiva del anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595) en combinación con una cantidad competitiva efectiva
de un anticuerpo candidato y determinar la cantidad de 2C3 que se
une al VEGF en presencia del anticuerpo candidato; e
(c) identificar un anticuerpo
anti-VEGF que se une sustancialmente al mismo
epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) mediante la
selección de un anticuerpo candidato que reduce la cantidad de 2C3
que se une al VEGF en, preferiblemente, como mínimo, un 80%
aproximadamente.
Como se utilizan animales no humanos para la
inmunización, los anticuerpos monoclonales que se obtienen de tal
hibridoma frecuentemente tendrán una naturaleza no humana. Tales
anticuerpos se pueden, opcionalmente, someter a un proceso de
humanización, xenoinjerto o mutación, como se conoce por aquellos
entendidos en la técnica y posteriormente dados a conocer en la
presente. Alternativamente, se pueden utilizar animales
transgénicos, tales como ratones, que comprenden una biblioteca de
genes de anticuerpos humanos. La inmunización de tales animales, por
tanto, dará lugar directamente a la generación de anticuerpos
humanos adecuados.
Después de la producción de una célula productora
de anticuerpos adecuada, más preferiblemente un hibridoma, tanto si
produce anticuerpos humanos como no humanos, los ácidos nucleicos
que codifican anticuerpos monoclonales se pueden clonar para
preparar un anticuerpo monoclonal "recombinante". Se puede
utilizar cualquier técnica de clonación recombinante, incluyendo la
utilización de PCR^{TM} para preparar la síntesis de las
secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos. Por lo
tanto, incluso métodos adicionales preparativos de anticuerpos
monoclonales adecuados incluyen aquellos que comprenden la
utilización de células productoras de anticuerpos como se indica a
continuación:
(a) obtener, como mínimo, una primera molécula o
segmento adecuados de ácido nucleico que codifican el anticuerpo
anti-VEGF de una célula productora de anticuerpos
anti-VEGF adecuada, preferiblemente de un hibridoma;
y
(b) expresar la molécula o el segmento de ácido
nucleico en una célula huésped recombinante para obtener un
anticuerpo monoclonal recombinante anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 de acuerdo con la presente invención.
Sin embargo, se dispone de otras técnicas
recombinantes potentes que son idealmente adecuadas para la
preparación de anticuerpos monoclonales recombinantes. Tales
técnicas recombinantes incluyen los métodos preparativos de
anticuerpos monoclonales basados en una biblioteca de fagémidos que
comprenden:
(a) inmunizar un animal mediante la
administración a un animal de, como mínimo, una dosis, y,
opcionalmente, más de una dosis, de una cantidad inmunogénicamente
eficaz de una muestra de VEGF inmunogénica (tal como una muestra de
VEGF humano intacta);
(b) preparar una biblioteca combinatoria de
fagémidos de inmunoglobulina que expresan ARN aislado de las células
productoras de anticuerpo, preferiblemente del bazo, del animal
inmunizado;
(c) seleccionar de la biblioteca de fagémidos,
como mínimo, un primer clon que expresa, como mínimo, un primer
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2,
opcionalmente uno que reacciona sustancialmente de forma cruzada con
el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595);
(d) obtener ácidos nucleicos que codifican el
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de, como
mínimo, un primer clon seleccionado y expresar los ácidos nucleicos
en una célula huésped recombinante para proporcionar, como mínimo,
un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2; y preferiblemente,
(e) obtener, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 expresado por los
ácidos nucleicos obtenidos de, como mínimo, un primer clon
seleccionado.
Una vez más, en tales técnicas basadas en
bibliotecas de fagémidos, se pueden utilizar animales transgénicos
que contienen bibliotecas de genes de anticuerpos humanos, y de este
modo, que producen anticuerpos monoclonales humanos
recombinantes.
Sin tener en cuenta la manera de preparación de
un primer segmento de ácido nucleico de anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, se pueden preparar
fácilmente más segmentos adecuados de ácido nucleico de anticuerpo
mediante técnicas de biología molecular estándares. Para confirmar
que cualquier segmento de ácido nucleico de anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de segunda
generación, variante o mutante es adecuado para utilizar en la
presente invención, se hará una prueba al segmento de ácido nucleico
para confirmar la expresión de un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de acuerdo con la
presente invención. Preferiblemente, también se hará una prueba al
segmento de ácido nucleico de segunda generación, variante o mutante
para confirmar la hibridación bajo condiciones de hibridación
estándares, más preferiblemente, condiciones de hibridación
rigurosas estándares. Unas condiciones de hibridación adecuadas, a
título de ejemplo, incluyen la hibridación en un 7% aproximadamente
de dodecil sulfato sódico (SDS), Na_{3}PO_{4}0,5 M, EDTA 1 mM
aproximadamente a unos 50ºC, y lavar con un 1% aproximadamente de
SDS a unos 42ºC.
Como una variedad de anticuerpos monoclonales
recombinantes, tanto de origen humano como no humano, se pueden
preparar fácilmente, los métodos de tratamiento de la presente
invención se pueden llevar a cabo proporcionando al animal o al
paciente, como mínimo, un primer segmento de ácido nucleico que
expresa una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un
primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2
en el paciente. El "segmento de ácido nucleico que expresa un
anticuerpo basado en 2C3 o similar al 2C3,
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2", generalmente,
estará en forma de, como mínimo, una construcción de expresión, y
puede estar en forma de una construcción de expresión comprendida
dentro de un virus o dentro de una célula huésped recombinante. Los
vectores de terapia génica preferidos de la presente invención,
generalmente, serán vectores virales, tales como los comprendidos
dentro de un retrovirus recombinante, virus de herpes simplex (HSV),
adenovirus, virus adenoasociados (AAV), citomegalovirus (CMV), y
similares.
La presente invención, además, proporciona
composiciones que comprenden, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 purificado, o un
fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente, uno que se
une a, esencialmente, el mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal
2C3 (ATCC PTA 1595). Tales composiciones pueden ser composiciones
farmacéuticamente aceptables o composiciones para la utilización en
estudios de laboratorio. En términos de composiciones farmacéuticos,
éstos se pueden formular preferiblemente para administración
parental, tal como para administración intravenosa.
La presente invención proporciona una cantidad de
métodos y usos de los anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2, incluyendo los anticuerpos 2C3 de
reactividad cruzada, los anticuerpos similares al 2C3 o los
anticuerpos basados en 2C3. En todos los métodos, los términos
"un" y "una" se utilizan en el sentido que representan
"como mínimo uno/a", "como mínimo un/a primer/a", "uno/a
o más" o "una pluralidad" de etapas de los métodos
enumerados, excepto donde se indique específicamente. Esto es
particularmente relevante para las etapas de administración en los
métodos de tratamiento. De este modo, no sólo se pueden utilizar
diferentes dosis con la presente invención, sino que cantidades
diferentes de dosis, por ejemplo, se pueden utilizar inyecciones
hasta incluso inyecciones múltiples. Se pueden utilizar agentes
terapéuticos combinados, administrados antes, después o durante la
administración del anticuerpo terapéutico
anti-VEGF.
Se proporcionan varios métodos y usos útiles
in vitro que tienen importantes implicaciones biológicas. Los
primeros proporcionados son métodos sobre, y utilizaciones en, la
unión del VEGF, que, generalmente, comprende poner en contacto de
manera efectiva un compuesto que comprende el VEGF, preferiblemente
un VEGF libre (no enlazado a receptor) con, como mínimo, un primer
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un
fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente un anticuerpo
que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo
monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
Se proporcionan métodos sobre, y usos en, la
detección de VEGF, que, generalmente, comprenden poner en contacto
un compuesto sospechoso de contener VEGF con, como mínimo, un primer
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un
fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une
sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595), bajo condiciones efectivas para permitir la
formación de los complejos VEGF/anticuerpo y detectar los complejos
así formados. También se proporcionan métodos de detección y
utilizaciones que se pueden utilizar en conexión con muestras
biológicas, por ejemplo, en el diagnóstico de la angiogénesis y
tumores, y en los kits de diagnóstico basados en éste.
La presente invención proporciona métodos sobre,
y usos en, preferencial o específicamente, la inhibición de la unión
del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2, que, generalmente, comprende
poner en contacto, en presencia del VEGF, una población de células o
tejidos que incluye células endoteliales que expresan el VEGFR2
(KDR/Flk-1) con un compuesto que comprende una
cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión
al antígeno de éste, bajo condiciones efectivas para inhibir la
unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2.
Se proporcionan métodos sobre, y usos en, la
inhibición significativa de la unión del VEGF al receptor del VEGF,
VEGFR2, sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor
del VEGF, VEGFR1. Estos métodos comprenden poner en contacto, en
presencia del VEGF, una población de células o tejidos que incluye
células endoteliales que expresan el VEGFR2
(KDR/Flk-1) y el VEGFR1 (Flt-1) con
un compuesto que comprende una cantidad biológicamente efectiva de,
como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2, opcionalmente un anticuerpo
anti-VEGF que se une sustancialmente al mismo
epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un
fragmento de unión al antígeno de éste, bajo condiciones efectivas
para inhibir la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2, sin
inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF,
VEGFR1.
Existen métodos y usos adicionales de la presente
invención para analizar las funciones biológicas de los receptores
del VEGF denominados VEGFR2 y VEGFR1, que comprenden las etapas
de:
(a) poner en contacto un compuesto biológico o
tejido que comprende el VEGF y una población de células que expresan
los receptores VEGFR2 (KDR/Flk-1) y VEGFR1
(Flt-1) con un compuesto que comprende una cantidad
biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente un
anticuerpo anti-VEGF que se une sustancialmente al
mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un
fragmento de unión al antígeno de éste; y
(b) determinar el efecto del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 en, como mínimo, una
primera respuesta biológica al VEGF, en la que:
- (i)
- una alteración en una respuesta biológica en presencia del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 es indicativa de una respuesta mediada por el receptor VEGFR2, y
- (ii)
- el mantenimiento de una respuesta biológica en presencia del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 es indicativo de una respuesta mediada por el receptor VEGFR1.
Se proporcionan métodos y usos para inhibir la
proliferación, incluyendo aquellos que específicamente inhiben la
proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por el
VEGF, que, generalmente, comprende poner en contacto una población
de células o tejidos que incluye una población de células
endoteliales y VEGF con un compuesto que comprende una cantidad
biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno
que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo
monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno
del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, bajo
condiciones efectivas para inhibir la proliferación y/o migración de
células endoteliales inducidas por el VEGF.
Se proporcionan métodos sobre, y usos en, la
inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales
inducidas por el VEGF, sin inhibir significativamente la quimiotaxis
de macrófagos inducida por el VEGF, que, generalmente, comprende
poner en contacto una población de células o tejidos que contiene
células endoteliales, macrófagos y VEGF con un compuesto que
comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un
primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión
al antígeno del anticuerpo anti-VEGF, bajo
condiciones efectivas para inhibir la proliferación y/o migración de
células endoteliales inducidas por el VEGF, sin inhibir
significativamente la quimiotaxis de macrófagos inducida por el
VEGF.
Además se proporcionan métodos sobre, y usos en,
la inhibición de la proliferación y/o migración de células
endoteliales inducidas por el VEGF y, opcionalmente, la
angiogénesis, sin inhibir significativamente la estimulación por el
VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos. Los métodos,
generalmente, comprenden poner en contacto una población de células
o tejidos que contiene células endoteliales, y, como mínimo, una de
macrófagos, osteoclastos o condroclastos, con un compuesto que
comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un
primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión
al antígeno del anticuerpo, bajo condiciones efectivas para inhibir
la proliferación y/o migración de células endoteliales inducidas por
el VEGF o la angiogénesis, sin inhibir significativamente la
estimulación por el VEGF de macrófagos, osteoclastos o
condroclastos.
Los métodos y usos anteriores se pueden llevar a
cabo in vitro e in vivo, en este último caso, en el
que los tejidos y las células se localizan en el interior de un
animal y el anticuerpo anti-VEGF se administra al
animal. En ambos casos, los métodos y usos se convierten en métodos
y usos para inhibir la angiogénesis, que comprenden poner en
contacto un tejido que comprende, o una población de vasos
sanguíneos potencialmente angiogénicos, es decir, aquellos expuestos
potencialmente al VEGF, con un compuesto antiangiogénico que
comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un
primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión
al antígeno de éste, bajo condiciones efectivas para inhibir la
angiogénesis.
Allí donde las poblaciones de vasos sanguíneos
potencialmente angiogénicos se mantienen ex vivo, la presente
invención tiene utilidad en los programas de descubrimiento de
fármacos. Los ensayos de screening in vitro, con controles
fiables positivos y negativos, son útiles como una primera etapa en
el desarrollo de fármacos para inhibir o promover la angiogénesis,
así como en la descripción de información adicional del proceso
angiogénico. Allí donde la población de vasos sanguíneos
potencialmente angiogénicos se localiza en el interior de un animal
o un paciente, el compuesto antiangiogénico se administra al animal
como una forma de terapia.
"Las cantidades biológicamente efectivas",
en términos de cada uno de los métodos anteriores de inhibición son,
por tanto, cantidades de anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2, opcionalmente, anticuerpos basados en 2C3,
efectivas para inhibir la proliferación y/o migración de células
endoteliales inducidas por el VEGF; para inhibir la proliferación
y/o migración de células endoteliales inducidas por el VEGF, sin
inhibir significativamente la quimiotaxis de macrófagos inducida por
el VEGF; para inhibir la proliferación y/o migración de células
endoteliales inducidas por el VEGF o la angiogénesis, sin inhibir
significativamente la estimulación por el VEGF de macrófagos,
osteoclastos o condroclastos; y, sobretodo, para reducir la
proliferación y/o migración de células endoteliales vasculares de
una manera efectiva para así inhibir el crecimiento de los vasos
sanguíneos o la angiogénesis.
La presente invención, de este modo, proporciona
métodos sobre, y usos en, la inhibición de la angiogénesis inducida
por el VEGF y, preferiblemente, el tratamiento de una enfermedad
angiogénica, sin inhibir significativamente la estimulación por el
VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos. Los métodos,
generalmente, comprenden poner en contacto una población de células
o tejidos que contienen células endoteliales, y, como mínimo, una de
macrófagos, osteoclastos o condroclastos, con un compuesto que
comprende una cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un
primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión
al antígeno del anticuerpo, bajo condiciones efectivas para inhibir
la angiogénesis inducida por el VEGF y para el tratamiento de
enfermedades angiogénicas, sin inhibir significativamente la
estimulación por el VEGF de macrófagos, osteoclastos o
condroclastos.
Además se proporcionan métodos sobre, y usos en,
la inhibición de la angiogénesis inducida por el VEGF y,
preferiblemente, el tratamiento de una enfermedad antiangiogénica,
sin causar efectos colaterales significativos en el metabolismo del
hueso. Los métodos, generalmente, comprenden poner en contacto un
tejido o una población vasos angiogénicos que contienen células
endoteliales vasculares, y, como mínimo, una de macrófagos,
osteoclastos o condroclastos, con un compuesto que comprende una
cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión
al antígeno del anticuerpo, bajo condiciones efectivas para inhibir
la angiogénesis inducida por el VEGF y para tratar una enfermedad
antiangiogénica sin causar efectos colaterales significativos en el
metabolismo del hueso al no afectar significativamente las
actividades de macrófagos, osteoclastos o condroclastos.
Se proporcionan screenings (in vitro) y
terapias (in vivo) de fármacos antiangiogénicos en términos
de animales y pacientes que sufren de, o tienen el riesgo de
desarrollar, cualquier enfermedad o desorden caracterizado por una
vascularización indeseada, inapropiada, aberrante, excesiva y/o
patológica. Es bien conocido por aquellos con una habilidad normal
en la técnica que, como una angiogénesis aberrante tiene lugar en un
amplio conjunto de enfermedades y desórdenes, una terapia
antiangiogénica dada, una vez se ha mostrado efectiva en cualquier
sistema modelo aceptable, se puede utilizar para tratar todo el
conjunto de enfermedades y desórdenes relacionados con la
angiogénesis.
Los métodos y usos de la presente invención están
particularmente dirigidos para el uso en animales y pacientes que
sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar, cualquier forma de
tumor vascularizado; degeneración macular, incluyendo la
degeneración macular relacionada con la edad; artritis, incluyendo
la artritis reumatoide; aterosclerosis y placas ateroscleróticas;
retinopatía diabética y otras retinopatías; hiperplasias tiroideas,
incluyendo la enfermedad de Grave; hemangioma; glaucoma neovascular;
y psoriasis.
Los métodos y usos de la presente invención
también están dirigidos para el tratamiento de animales y pacientes
que sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar, malformaciones
arteriovenosas (AVM), meningioma, y restenosis vascular, incluyendo
restenosis tras angioplastia. Otros objetivos pretendidos de los
métodos y usos terapéuticos son animales y pacientes que sufren, o
tienen el riesgo de desarrollar, angiofibroma, dermatitis,
endometriosis, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas,
enfermedades y desórdenes inflamatorios, granuloma piogénico,
escleroderma, sinovitis, tracoma y adhesiones vasculares.
Como se da a conocer en la Patente U.S.A. No.
5.712.291, cada uno de los grupos de tratamientos anteriores, en
cierta manera preferidos, no son de ningún modo exhaustivos de los
tipos de condiciones que se tratan en la presente invención. La
Patente U.S.A. No. 5.712.291 identifica una cantidad de otras
condiciones que pueden ser tratadas de forma efectiva por un agente
terapéutico antiangiogénico; la intención de mostrar que el
tratamiento de todas las enfermedades angiogénicas representa un
concepto unificado, una vez se ha dado a conocer y reivindicado una
categoría definida de compuestos que inhiben la angiogénesis (en el
presente caso, anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores
de VEGFR2, opcionalmente aquellos que se unen sustancialmente al
mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595)); y
la intención de mostrar que es posible el tratamiento de todas las
enfermedades angiogénicas mediante datos de sólo un sistema modelo
único.
Incluso en aspectos adicionales, y tal como se da
a conocer en la Patente U.S.A. No. 5.712.291, los métodos y usos
dados a conocer están dirigidos para el tratamiento de animales y
pacientes que sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar,
proliferación anormal de tejido fibrovascular, acné rosáceo,
síndrome de inmunodeficiencia adquirida, oclusión arterial,
queratitis atópica, úlceras bacterianas, la enfermedad de Bechet,
tumores de sangre, enfermedad obstructiva de carótida, quemaduras
químicas, neovascularización coroidal, inflamación crónica,
desprendimiento de retina crónico, uveítis crónica, vitritis
crónica, sobreuso de lentes de contacto, rechazo de xenoinjerto
corneal, neovascularización corneal, neovascularización de
xenoinjerto corneal, la enfermedad de Crohn, la enfermedad de Eale,
queratoconjuntivitis epidémica, úlceras fúngicas, infecciones de
Herpes simplex, infecciones de Herpes zoster, síndromes de
hiperviscosidad, el sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneración de
lípidos, la enfermedad de Lyme, queratolisis marginal, la úlcera de
Mooren, infecciones por Micobacterias a parte de la lepra, miopía,
enfermedad neovascular ocular, agujeros ópticos, el síndrome de
Osler-Weber
(Osler-Weber-Rendu), osteoartritis,
la enfermedad de Paget, pars planitis, penfigoide, filectenulosis,
poliarteritis, complicaciones post-laser,
infecciones por protozoos, pseudoxantoma elástico, queratitis sicca
pterigium, queratotomía radial, neovascularización retinal,
retinopatía de premadurez, fibroplasias retrolentales, sarcoide,
escleritis, anemia de la célula falciforme, el síndrome de Sogrens,
tumores sólidos, la enfermedad de Stargart, la enfermedad de
Steven-Johnson, queratitis límbica superior,
sífilis, lupus sistémico, la degeneración marginal de Terrien,
toxoplasmosis, traumatismos, tumores del sarcoma de Ewing, tumores
de neuroblastoma, tumores de osteosarcoma, tumores de
retinoblastoma, tumores de rabdomiosarcoma, colitis ulcerosas,
oclusión de vena, deficiencia de Vitamina A y la sarcoidosis de
Wegener.
La presente invención también proporciona métodos
y usos para el tratamiento de animales y pacientes que sufren de, o
tienen el riesgo de desarrollar, artritis, al igual que el
tratamiento de la artritis utilizando agentes inmunológicos
descritos en la Patente U.S.A. No. 5.753.230. La Patente No.
5.972.922 incluso ejemplifica la aplicación de estrategias
antiangiogénicas para el tratamiento de angiogénesis indeseada
asociada con diabetes, enfermedades parasitarias, curación de
heridas deformes, hipertrofia tras cirugía, quemaduras, heridas o
traumatismos, inhibición del crecimiento capilar, inhibición de la
ovulación y la formación del corpus luteum, inhibición de la
implantación e inhibición del desarrollo del embrión en el útero.
Por lo tanto, todas las condiciones anteriores se contemplan para el
tratamiento mediante los métodos y usos de la presente
invención.
La Patente U.S.A. No. 5.639.757 se incorpora
específicamente en la presente por referencia y ejemplifica el uso
de estrategias antiangiogénicas para el tratamiento general de
rechazos de xenoinjertos. En la Patente WO 98/45331 se describen el
tratamiento de inflamación de pulmón, síndrome nefrótico,
preeclamsia, efusión pericardial, tal como la asociada con
pericarditis, y efusión pleural utilizando estrategias
antiangiogénicas basadas en la inhibición del VEGF. Los animales o
pacientes que sufren de, o tienen el riesgo de desarrollar,
cualquiera de las condiciones anteriores se contemplan, por lo
tanto, para el tratamiento mediante métodos y usos de la presente
invención.
Como se da a conocer en la Patente WO 98/16551,
las moléculas biológicas que antagonizan la función del VEGF también
son adecuadas para el uso en el tratamiento de enfermedades y
desórdenes caracterizados por una permeabilidad vascular no deseada.
Por consiguiente, los anticuerpos antagonizantes del VEGF, los
métodos y usos de la presente invención son aplicables al
tratamiento de animales y pacientes que sufren de, o tienen el
riesgo de desarrollar, enfermedades y desórdenes caracterizados por
una permeabilidad vascular no deseada, por ejemplo, edema asociado
con tumores cerebrales, ascitis asociada con malignidades, el
síndrome de Meigs, inflamación del pulmón, síndrome nefrótico,
efusión pericardial y efusión pleural y similares.
A pesar de que el tratamiento de todas las
enfermedades anteriores es posible dentro de la presente invención
unificada, un aspecto particularmente preferido de los métodos y
usos de la presente invención es la aplicación de terapias
antiangiogénicas a animales y pacientes que sufren de, o tienen el
riesgo de desarrollar, un tumor sólido vascular, un tumor
metastásico o metástasis de un tumor primario.
Además se proporcionan métodos sobre, y usos en,
la inhibición de la angiogénesis inducida por el VEGF y,
preferiblemente, el empleo de un antitumoral o el efecto mejorado de
un antitumoral sin inhibir significativamente la estimulación por el
VEGF de macrófagos, osteoclastos o condroclastos. Los métodos,
generalmente, comprenden poner en contacto un tejido, un medio
tumoral o una población vasos angiogénicos que contienen células
endoteliales vasculares, y, como mínimo, una de macrófagos,
osteoclastos o condroclastos, con un compuesto que comprende una
cantidad biológicamente efectiva de, como mínimo, un primer
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión
al antígeno del anticuerpo, bajo condiciones efectivas para inhibir
la angiogénesis inducida por el VEGF y para emplear un antitumoral o
el efecto mejorado de un antitumoral sin inhibir significativamente
la estimulación por el VEGF de macrófagos, osteoclastos o
condroclastos.
Existen métodos dados a conocer sobre, y usos en,
el tratamiento de una enfermedad asociada con la angiogénesis,
incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con la angiogénesis,
que comprenden la administración, a un animal o un paciente con
dicha enfermedad o cáncer, de una cantidad efectiva terapéuticamente
de, como mínimo, un primer compuesto farmacéutico que comprende un
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión
al antígeno o un inmunoconjugado de dicho anticuerpo
anti-VEGF.
Esta descripción une los métodos antiangiogénicos
que utilizan anticuerpos desnudos o no conjugados y fragmentos de
éstos, y métodos de marcaje vascular que utilizan inmunoconjugados
en los que el anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de
éste, está acoplado operativamente a un agente terapéutico. A menos
que se afirme específicamente lo contrario o se aclare en términos
científicos, los términos "anticuerpo y fragmentos de éste",
como se utiliza en la presente, por tanto, representan un anticuerpo
o fragmento "no conjugado o desnudo", el cual no se une a otro
agente, particularmente, un agente de diagnóstico o terapéutico.
Estas definiciones no excluyen modificaciones del anticuerpo, tales
como, sólo como ejemplo, modificaciones para mejorar la vida
biológica media, la afinidad, la avidez u otras propiedades del
anticuerpo, o combinaciones del anticuerpo con otros efectores.
Los métodos y usos de tratamiento antiangiogénico
dados a conocer también abarcan el uso tanto de anticuerpos no
conjugados o desnudos como de inmunoconjugados. En los métodos de
tratamiento antiangiogénico basados en inmunoconjugados, el
anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de éste,
preferiblemente, está acoplado operativamente a un segundo agente
antiangiogénico (siendo el primer agente antiangiogénico el propio
anticuerpo anti-VEGF). Los agentes antiangiogénicos
unidos pueden ser aquellos que tienen un efecto antiangiogénico
directo o indirecto.
Los métodos y usos de tratamiento antiangiogénico
comprenden la administración, a un animal o un paciente con una
enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las formas
de cáncer asociadas con la angiogénesis, de una cantidad efectiva
terapéuticamente de, como mínimo, un primer compuesto farmacéutico
que comprende, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no
conjugado, o un fragmento de unión al antígeno de éste,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). Igualmente, el anticuerpo
administrado se puede asociar operativamente con un segundo agente
antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, el tratamiento de
cáncer metastásico comprenden la administración, a un animal o un
paciente con cáncer metastásico, de una cantidad efectiva
terapéuticamente de, como mínimo, un primer compuesto farmacéutico
que comprende, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no
conjugado, o un fragmento de unión al antígeno de éste,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). Métodos adicionales son
aquellos en los que el anticuerpo administrado se puede asociar
operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, la reducción de la
metástasis de un cáncer primario comprenden la administración, de
una cantidad efectiva terapéuticamente de, como mínimo, un primer
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo
o no conjugado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, a un
animal o un paciente que sufre, o se trató para, un cáncer primario;
en el que el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2, desnudo o no conjugado, o un fragmento de unión al antígeno
de éste, opcionalmente, se une sustancialmente al mismo epítopo que
el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595). De forma similar, el
anticuerpo administrado se puede asociar operativamente con un
segundo agente antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, el tratamiento de
una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las
formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, comprenden además la
administración, a un animal o un paciente con tal enfermedad, por
ejemplo, un tumor vascularizado, de, como mínimo, un primer
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo
o no conjugado, opcionalmente uno que se une sustancialmente al
mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un
fragmento de unión al antígeno de éste, en una cantidad efectiva
para inhibir la angiogénesis en el sitio de la enfermedad o el tumor
vascularizado. Igualmente, el anticuerpo administrado se puede
asociar operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, el tratamiento de
una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las
formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, comprenden además la
administración, a un animal o un paciente con tal enfermedad o
cáncer, de, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no
conjugado, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo
epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un
fragmento de unión al antígeno de éste, en una cantidad efectiva
para inhibir la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2
(KDR/Flk-1), inhibiendo así la angiogénesis en el
sitio canceroso o de la enfermedad. El anticuerpo administrado se
puede, alternativamente, asociar operativamente con un segundo
agente antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, el tratamiento de
una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las
formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, también comprenden
la administración, a un animal o un paciente con un tumor
vascularizado, de una cantidad efectiva terapéuticamente de, como
mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2, desnudo o no conjugado, opcionalmente uno que se une
sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno de éste, en el
que el anticuerpo anti-VEGF inhibe sustancialmente
la unión del VEGF al receptor de VEGF, VEGFR2
(KDR/Flk-1), sin inhibir significativamente la unión
del VEGF al receptor de VEGF, VEGFR1 (Flt-1).
Igualmente, el anticuerpo administrado se puede asociar
operativamente con un segundo agente antiangiogénico.
Incluso métodos adicionales sobre, y usos en, el
tratamiento de una enfermedad asociada con la angiogénesis,
incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con la angiogénesis,
comprenden la administración, a un animal o un paciente con tal
enfermedad, cáncer o tumor vascularizado, de una cantidad efectiva
terapéuticamente de, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no
conjugado, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo
epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un
fragmento de unión al antígeno de éste, en el que el anticuerpo
anti-VEGF inhibe sustancialmente la unión del VEGF
al receptor de VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1), sin inhibir
significativamente la unión del VEGF al receptor de VEGF, VEGFR1
(Flt-1), inhibiendo así la angiogénesis en el sitio
de la enfermedad, el cáncer o el tumor vascularizado sin disminuir
significativamente la quimiotaxis de macrófagos en el animal. El
anticuerpo administrado se puede también asociar operativamente con
un segundo agente antiangiogénico.
Aún métodos adicionales sobre, y usos en, el
tratamiento de una enfermedad asociada con la angiogénesis,
incluyendo todas las formas de cáncer asociadas con la angiogénesis,
comprenden la administración, a un animal o un paciente con tal
enfermedad, cáncer o tumor vascularizado, de una cantidad efectiva
terapéuticamente de, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo o no
conjugado, opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo
epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un
fragmento de unión al antígeno de éste, en el que el anticuerpo
anti-VEGF inhibe sustancialmente la unión del VEGF
al receptor de VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1), sin inhibir
significativamente la unión del VEGF al receptor de VEGF, VEGFR1
(Flt-1), inhibiendo así la angiogénesis en el sitio
de la enfermedad, el cáncer o el tumor vascularizado sin reducir
significativamente la actividad de los macrófagos, osteoclastos y/o
condroclastos en el animal. Igualmente, el anticuerpo administrado
se puede asociar operativamente con un segundo agente
antiangiogénico.
Los métodos sobre, y usos en, el tratamiento de
una enfermedad asociada con la angiogénesis, incluyendo todas las
formas de cáncer asociadas con la angiogénesis, además comprenden la
administración, a un animal o un paciente con tal enfermedad, por
ejemplo, un tumor vascularizado, de, como mínimo, un primer
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, desnudo
o no conjugado, opcionalmente uno que se une sustancialmente al
mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un
fragmento de unión al antígeno de éste, en una cantidad efectiva
para inhibir la angiogénesis en el sitio de la enfermedad o el tumor
vascularizado sin ejercer un efecto adverso significativo en el
metabolismo óseo.
Los métodos y usos de los tratamientos
antiangiogénicos anteriores, generalmente, implicarán la
administración del compuesto efectivo farmacéuticamente, a un animal
o un paciente, sistémicamente, tal como por vía transdérmica,
intramuscular, inyección intravenosa y similares. Sin embargo, se
aceptará cualquier forma de administración que permita al agente
terapéutico localizar el sitio o sitios angiogénicos, incluyendo un
tumor o células endoteliales vasculares intratumorales. Por lo
tanto, otras formas adecuadas de liberación incluyen la vía oral,
rectal, nasal, tópica, y vaginal. La Patente U.S.A. No. 5.712.291
además describe las diversas formas de administración que se pueden
incluir en conexión con el tratamiento de una enfermedad o desorden
angiogénico.
Para usos y métodos en el tratamiento de
artritis, por ejemplo, se puede utilizar una administración
intrasinovial, como se describe para otros agentes inmunológicos en
la Patente U.S.A. No. 5.753.230. Para condiciones asociadas con el
ojo, se contemplan la administración y formulaciones oftálmicas.
La "administración", tal como se usa en la
presente, representa el suministro o liberación de agentes
terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o basado en 2C3 en una(s) cantidad(es) y
durante un período de tiempo(s) efectivo(s) para
ejercer los efectos antiangiogénicos y/o antitumorales. Se prefiere,
generalmente, la administración pasiva de agentes terapéuticos
proteináceos, en parte, por su simplicidad y reproducibilidad.
Sin embargo, el término "administración" se
usa en la presente para referirse a cualquiera y todos los medios
por los que los agentes terapéuticos del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 se
liberan o, de otra manera, se proporcionan a la vasculatura tumoral.
La "administración", por tanto, incluye el suministro de
células que producen agentes terapéuticos del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 de
una manera efectiva, para dar lugar a la liberación en el tumor. En
tales realizaciones, puede ser deseable formular o empaquetar
células en una membrana permeable, estructura o artilugio
implantable selectivamente, generalmente, uno que se pueda eliminar
para cesar la terapia. Se preferirá, generalmente, la administración
exógena del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o similares al 2C3, ya que representa un método no invasivo
que permite a la dosis estar monitorizada y controlada muy de
cerca.
Los métodos y usos terapéuticos también se
extienden al suministro de ácidos nucleicos que codifican agentes
terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o basado en 2C3 de una manera efectiva para dar lugar a su
expresión en las proximidades del tumor o su localización en el
tumor. Se puede emplear cualquier técnica de terapia génica, tal
como la liberación de ADN desnudo, genes y vectores recombinantes,
liberación basada en las células, incluyendo la manipulación ex
vivo de células de pacientes, y similares.
En realizaciones adicionales, se dan a conocer
métodos sobre, y usos en, la liberación de agentes de diagnóstico o
terapéuticos seleccionados a vasos sanguíneos angiogénicos asociados
con la enfermedad. Preferiblemente, se utilizan dichas realizaciones
para la liberación de agentes de diagnóstico o terapéuticos
seleccionados al tumor o a la vasculatura intratumoral o al estroma,
y comprende la administración, a un animal o un paciente, que tiene
un tumor vascularizado, de una cantidad efectiva biológicamente de
un compuesto que comprende, como mínimo, un primer inmunoconjugado
en el que un agente de diagnóstico o terapéutico está acoplado
operativamente a un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595).
A pesar de que no es necesario entender el
mecanismo de acción subyacente en los aspectos sobre de marcaje de
la presente invención para la práctica de dichas realizaciones, se
cree que los anticuerpos de la presente invención liberan agentes
unidos a la vasculatura tumoral y angiogénica mediante la unión a
VEGF unido al VEGFR1 expresado en ella. Estos métodos y usos de la
presente invención, de este modo, tienen que ver con la liberación
de agentes de diagnóstico o terapéuticos seleccionados a vasos
sanguíneos angiogénicos, al tumor o a la vasculatura intratumoral, y
comprenden la administración, a un animal o un paciente, que
necesita tratamiento, de una cantidad efectiva biológicamente de un
compuesto que comprende un inmunoconjugado en el que un agente de
diagnóstico o terapéutico está acoplado operativamente a, como
mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste,
opcionalmente uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), de una manera efectiva
para permitir la unión del anticuerpo al VEGF unido al VEGFR1
expresado, sobreexpresado o regulado a la alta en los vasos
sanguíneos angiogénicos, el tumor o la vasculatura intratumoral,
liberando, de este modo, el agente diagnóstico o terapéutico al
VEGF-VEGFR1 en los vasos sanguíneos angiogénicos, el
tumor o la vasculatura intratumoral.
La liberación de agentes terapéuticos
seleccionados al tumor o la vasculatura intratumoral o el estroma
actúa para detener el flujo sanguíneo, o específicamente detener el
flujo sanguíneo, en la vasculatura tumoral; para destruir, o
específicamente destruir, la vasculatura tumoral; y para inducir la
necrosis, o la necrosis específica en un tumor. Estos métodos y usos
se pueden, de este modo, resumir como métodos para el tratamiento de
un animal o un paciente, que tiene un tumor vascularizado, que
comprende la administración, a un animal o un paciente, de una
cantidad efectiva terapéuticamente de, como mínimo, un primer
compuesto farmacéutico que comprende, como mínimo, un primer
inmunoconjugado que comprende un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno
que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo
monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno
de éste, acoplado operativamente al agente terapéutico.
Las "cantidades efectivas terapéuticamente"
son cantidades de inmunoconjugados del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3
efectivas para eliminar, específicamente como mínimo, una parte del
tumor o de las células endoteliales vasculares intratumorales; para
inducir específicamente la apoptosis en, como mínimo, una parte del
tumor o de las células endoteliales vasculares intratumorales; para
provocar específicamente la coagulación en, como mínimo, una parte
del tumor o de los vasos sanguíneos intratumorales; para ocluir o
destruir específicamente, como mínimo, una parte de los vasos de
transporte sanguíneo del tumor; para inducir específicamente la
necrosis en, como mínimo, una parte de un tumor; y/o para inducir la
regresión o remisión del tumor tras la administración a animales o
pacientes seleccionados. Dichos efectos se consiguen mientras se
muestra algo de unión o ninguna a, o algo de eliminación o ninguna
de, las células endoteliales vasculares en tejidos normales y sanos;
algo de coagulación o nada en la oclusión o destrucción de vasos
sanguíneos en tejidos normales y sanos; y la ejecución de efectos
colaterales adversos controlables o negligibles en tejidos normales
y sanos del animal o paciente.
Los términos "preferencialmente" y
"específicamente", tal como se usan en la presente, en el
contexto de provocar la coagulación en, o destruir, la vasculatura
tumoral, y/o en el contexto de unirse al estroma tumoral y/o causar
la necrosis del tumor, de este modo, representan que los
inmunoconjugados del anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 actúan para conseguir la unión
estromal, la coagulación, la destrucción y/o la necrosis del tumor
que está sustancialmente confinada al estroma tumoral, la
vasculatura y el sitio del tumor, y no se extiende sustancialmente
para causar la coagulación, la destrucción y/o la necrosis del
tejido en tejidos normales y sanos del animal o sujeto. La
estructura y la función de las células y tejidos sanos, por tanto,
se mantienen sustancialmente íntegras durante la práctica de la
presente invención.
A pesar de que los anticuerpos de la presente
invención liberan de forma efectiva agentes a la vasculatura tumoral
y angiogénica mediante la unión al VEGF en asociación con el VEGFR1,
existen otros métodos y usos que operan en base a la liberación de
un agente terapéutico al estroma tumoral, en el que ejerce un efecto
terapéutico en los vasos próximos. Estos métodos y usos comprenden
la administración, a un animal o un paciente con un tumor
vascularizado, de un inmunoconjugado que comprende un agente
terapéutico operativamente acoplado a, como mínimo, un primer
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un
fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une
sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595), en una cantidad efectiva para unir el
inmunoconjugado al VEGF no unido al receptor en el interior del
estroma tumoral.
Estos métodos y usos comprenden la
administración, a un animal o un paciente con un tumor
vascularizado, de un inmunoconjugado que comprende un agente
terapéutico acoplado operativamente a, como mínimo, un primer
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un
fragmento de unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une
sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595), en una cantidad efectiva para localizar el
inmunoconjugado en el interior del estroma tumoral, de manera que el
agente terapéutico unido ejerza un efecto antitumoral en los
alrededores de la vasculatura tumoral y/o de las células
tumorales.
Los composiciones de la presente invención, así
como los métodos y usos dados a conocer, de este modo, se extienden
a composiciones que comprenden inmunoconjugados del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, que
comprenden, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un fragmento de
unión al antígeno de éste, opcionalmente uno que se une
sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595), acoplado operativamente a, como mínimo, un primer
agente de diagnóstico o terapéutico. Los conjugados terapéuticos del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado
en 2C3 se unen preferiblemente a agentes radioterapéuticos, agentes
antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis, fármacos
antitubulina, agentes citotóxicos o anticelulares, o coagulantes
(factores de coagulación).
La presente invención, de este modo, proporciona
un conjunto de anticuerpos conjugados y fragmentos de éstos en los
que el anticuerpo está acoplado operativamente a, como mínimo, un
primer agente de diagnóstico o terapéutico. El término
"inmunoconjugado" se usa ampliamente para definir la asociación
operativa del anticuerpo con otro agente efectivo y no tiene la
intención de referirse exclusivamente a cualquier tipo de asociación
operativa, y no está particularmente limitada a la
"conjugación" química. Se contemplan particularmente las
proteínas de fusión recombinantes. El modo de unión será adecuado,
siempre y cuando la liberación o el agente marcador sea capaz de
unirse a la diana y el agente de diagnóstico o terapéutico sea
suficientemente funcional tras la liberación.
También se contempla el acoplamiento de agentes
por medio de fracciones de carbohidratos en los anticuerpos. La
glicosilación, tanto de unión con O como con N, tiene lugar
espontáneamente en los anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes,
si se desea, se pueden modificar para recrear o crear puntos de
glicosilación adicional, que simplemente se consigue mediante el
diseño de las secuencias de aminoácidos apropiadas (tales como
Asn-X-Ser,
Asn-X-Thr, Ser, o Thr) en la
secuencia primaria del anticuerpo.
Actualmente, los agentes preferidos para el uso
en conjugados terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 y los usos y métodos
relacionados, son aquellos que complementan o mejoran los efectos
del anticuerpo y/o aquellos seleccionados para un tipo de tumor o
paciente particular. Los "agentes terapéuticos que complementan o
mejoran los efectos del anticuerpo" incluyen agentes
radioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de
apoptosis y fármacos antitubulina, alguno o más de uno de los cuales
se prefieren para su uso en la presente.
El acoplamiento o asociación de los agentes
preferidos con anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores
de VEGFR2 o basados en 2C3, permite obtener "inmunoconjugados",
donde tales inmunoconjugados frecuentemente tienen propiedades
antitumorales mejoradas o incluso sinergísticas. Actualmente, los
agentes antiangiogénicos preferidos para el uso de esta manera son
angiostatina, endostatina, cualquiera de las angiopoyetinas,
vasculostatina, canstatina y maspina. Actualmente, los fármacos
antitubulina preferidos incluyen colquicina, taxol, vinblastina,
vincristina, vindescina y una o más de las combretastatinas.
El uso de agentes citotóxicos y anticelulares da
lugar a "inmunotoxinas" del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3,
mientras que el uso de factores de coagulación da lugar a
"coaguligandos" del anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3. También se contempla el uso
de, como mínimo, dos agentes terapéuticos, tales como combinaciones
de uno o más agentes radioterapéuticos, agentes antiangiogénicos,
agentes inductores de apoptosis, fármacos antitubulina, agentes
citotóxicos o anticelulares, y factores de coagulación.
En ciertas aplicaciones, los agentes terapéuticos
del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o
basado en 2C3 estarán acoplados operativamente a agentes
citotóxicos, citostáticos o, de otra manera, anticelulares que
tienen la capacidad de eliminar o reprimir el crecimiento o la
división de células endoteliales. Entre los agentes anticelulares
adecuados se incluyen agentes quimioterapéuticos, así como
citotoxinas y agentes citostáticos. Los agentes citostáticos son
aquellos que, generalmente, alteran el ciclo celular natural de una
célula diana, preferiblemente de manera que se saca la célula del
ciclo celular.
Algunos ejemplos de agentes quimioterapéuticos
incluyen: esteroides, citocinas, antimetabolitos, tales como
citosina arabinosida, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina;
antraciclinas; mitomicina A; alcaloides de vinca; antibióticos;
demecolcina; etoposida; mitramicina; y agentes alquilantes
antitumorales, tales como clorambucil o melfalán. De hecho, se
podría utilizar cualquiera de los agentes dados a conocer en la
presente en la Tabla C. Algunos agentes anticelulares preferidos son
los inhibidores de la síntesis de ADN, tales como daunorubicina,
doxorubicina, adriamicina, y similares.
En ciertas aplicaciones terapéuticas, se
preferirán fracciones de toxinas, en comparación con otros agentes
potenciales, debido a la muy elevada capacidad de la mayoría de
toxinas de liberar un efecto exterminador de células. Por lo tanto,
algunos agentes anticelulares preferidos para las construcciones del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o del
anticuerpo basado en 2C3 son toxinas derivadas de bacterias, hongos
o plantas. Algunas toxinas de ejemplo incluyen epipodofilotoxinas;
endotoxina bacteriana o una fracción de lípido A de endotoxina
bacteriana; proteínas inactivadoras de ribosoma, tales como saporina
o gelonina; a-sarcina; aspergilina, restrictocina;
ribonucleasas, tal como la ribonucleasa placentaria; toxina de la
difteria y exotoxina de pseudomonas.
Las toxinas preferidas son las toxinas de cadena
A, tal como la cadena A de la ricina. La fracción de toxina que más
se prefiere es, frecuentemente, la cadena A de la ricina que ha sido
tratada para modificar o eliminar los residuos de carbohidratos,
llamada "cadena A desglicosilada" (dgA). Se prefiere la cadena
A desglicosilada de la ricina a causa de su extrema potencia, vida
media más larga, y porque es económicamente viable para fabricar en
un grado y escala clínica. También se puede utilizar cadena A de
ricina truncada y/o recombinante.
Para el marcaje tumoral y el tratamiento con
inmunotoxinas, las siguientes patentes y solicitudes de patentes
complementan adicionalmente las presentes enseñanzas respecto a los
agentes citotóxicos y anticelulares: Solicitudes U.S.A. con Serie
No. 07/846.349; 08/295.868 (Patente U.S.A. No. 6.004.554);
08/205.330 (Patente U.S.A. No. 5.855.866); 08/350.212 (Patente
U.S.A. No. 5.965.132); 08/456.495 (Patente U.S.A. No. 5.776.427);
08/457.487 (Patente U.S.A. No. 5.863.538); 08/457.229 y 08/457.031
(Patente U.S.A. No. 5.660.827) y 08/457.869 (Patente U.S.A. No.
6.051.230).
El anticuerpo basado en 2C3 u otro anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de la presente
invención se pueden unir a un fármaco antitubulina. Un(os)
"fármaco(s) antitubulina", como se usa en la presente,
representa cualquier agente, fármaco, profármaco o combinación de
éstos que inhibe la mitosis celular, preferiblemente mediante la
inhibición directa o indirecta de las actividades de la tubulina
necesarias para la mitosis celular, preferiblemente la
polimerización o despolimerización de la tubulina.
Actualmente, los fármacos antitubulina preferidos
para su uso en la presente son la colquicina; taxanos, tal como el
taxol; alcaloides de vinca, tales como la vinblastina, vincristina y
vindescina; y combretastatinas. Algunos ejemplos de combretastatinas
son la combretastatina A, B y/o D, incluyendo A-1,
A-2, A-3, A-4,
A-5, A-6, B-1,
B-2, B-3, B-4,
D-1 y D-2 y formas de profármacos de
éstas.
Los agentes terapéuticos del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3
pueden comprender un componente que es capaz de provocar la
coagulación, es decir, un coagulante. Aquí, el anticuerpo diana se
puede unir directamente o indirectamente, por ejemplo, a través de
otro anticuerpo, a un factor que directamente o indirectamente
estimula la coagulación.
Los factores de coagulación preferidos para tales
usos son el Factor Tisular (TF) y los derivados del TF, tales como
el TF truncado (tTF), el TF dimérico, trimérico,
polimérico/multimérico, y el TF mutante deficiente en la capacidad
para activar el Factor VII. Otros factores de coagulación adecuados
incluyen los coagulantes dependientes de vitamina K, tales como el
Factor II/IIa, el Factor VII/VIIa, el Factor IX/IXa y el Factor
X/Xa; los factores de coagulación dependientes de vitamina K que
carecen de la modificación Gla; el activador del Factor X del veneno
de víbora de Russell; compuestos activadores de plaquetas, tales
como el tromboxano A_{2} y la tromboxano A_{2} sintasa; e
inhibidores de la fibrinolisis, tal como la
\alpha2-antiplasmina.
El marcaje del tumor como diana y el tratamiento
con coaguligandos se describe en las siguientes patentes y
solicitudes de patente, cada una de las cuales incluso complementa
adicionalmente las presentes enseñanzas respecto a coaguligandos y
factores de coagulación: Solicitudes U.S.A. con Serie No.
07/846.349; 08/205.330 (Patente U.S.A. No. 5.855.866); 08/350.212
(Patente U.S.A. No. 5.965.132); 08/273.567; 08/482.369 (Patente
U.S.A. No. 6 093 399); 08/485.482; 08/487.427 (Patente U.S.A. No.
6.004.555); 08/479.733 (Patente U.S.A. No. 5.877.289); 08/472.631; y
08/479.727 y 08/481.904 (Patente U.S.A. No. 6.036.955).
La preparación de inmunoconjugados e
inmunotoxinas es, generalmente, bien conocida en la técnica (ver,
por ejemplo, la Patente U.S.A. No. 4.340.535). Cada una de las
siguientes patentes o solicitudes de patente incluso complementan
adicionalmente las presentes enseñanzas respecto a la generación,
purificación y uso de inmunotoxinas: Solicitudes U.S.A. con Serie
No. 07/846.349; 08/295.868 (Patente U.S.A. No. 6.004.554);
08/205.330 (Patente U.S.A. No. 5.855.866); 08/350.212 (Patente
U.S.A. No. 5.965.132); 08/456.495 (Patente U.S.A. No. 5.776.427);
08/457.487 (Patente U.S.A. No. 5.863.538); 08/457.229 y 08/457.031
(Patente U.S.A. No. 5.660.827) y 08/457.869 (Patente U.S.A. No.
6.051.230).
En la preparación de inmunoconjugados e
inmunotoxinas, se pueden conseguir ventajas mediante el uso de
ciertos enlazadores o "linkers". Por ejemplo, se prefieren,
frecuentemente, los enlazadores que contienen un enlace disulfuro
que está "impedido" estéricamente, debido a su gran estabilidad
in vivo, de este modo, previene la liberación de la fracción
de toxina anteriormente a la unión en el sitio de acción.
Generalmente, se desea tener un conjugado que permanezca intacto
bajo las condiciones encontradas en cualquier sitio del cuerpo
excepto en el sitio deseado de acción, en el cual es deseable que el
conjugado tenga unas buenas características de
"liberación".
Dependiendo del componente de toxina específico
utilizado, puede ser necesario proporcionar un péptido espaciador
que operativamente acople el anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 y el componente
de toxina, en el que el péptido espaciador es capaz de plegarse en
una estructura de bucle de enlace disulfuro. La división
proteolítica en el bucle produciría, a continuación, un polipéptido
heterodimérico en el que el anticuerpo y el componente de toxina se
unen mediante un enlace disulfuro único.
Cuando se utilizan otros componentes de toxinas,
se puede proporcionar un péptido espaciador no divisible para
acoplar operativamente el anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 y el componente
de toxina. Las toxinas que se pueden utilizar junto con péptidos
espaciadores no divisibles son aquellas que pueden, ellas mismas,
convertirse por división proteolítica, en una forma de enlace
disulfuro citotóxica. Un ejemplo de dicho componente de toxina es un
componente de la exotoxina de Pseudomonas.
Se pueden conjugar con éxito una variedad de
agentes quimioterapéuticos y otros farmacológicos con agentes
terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o basado en 2C3. Algunos ejemplos de agentes antineoplásticos
que se han conjugado con anticuerpos incluyen la doxorubicina, la
daunomicina, el metotrexato y la vinblastina. Además, se ha descrito
el acoplamiento de otros agentes, tales como la neocarzinostatina,
la macromicina, la trenimona y la \alpha-amanitina
(ver Patentes U.S.A. Nos. 5.660.827; 5.855.866; y 5.965.132).
A la luz del trabajo previo de uno de los
inventores presentes, actualmente, la preparación de coaguligandos
se lleva a cabo también fácilmente. La asociación operativa de uno o
más factores de coagulación con un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo
basado en 2C3, puede ser una unión directa, tal como las descritas
anteriormente para las inmunotoxinas. Alternativamente, la
asociación operativa puede ser un acoplamiento indirecto, tal como
donde el anticuerpo está acoplado operativamente a una segunda
región de unión, preferiblemente un anticuerpo o una región de unión
al antígeno de un anticuerpo, que se une al factor de coagulación.
El factor de coagulación debería acoplarse al anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o al anticuerpo
basado en 2C3 en un lugar diferente de su sitio de coagulación
funcional, particularmente donde se utilice una unión covalente para
unir las
moléculas.
moléculas.
Los coaguligandos unidos indirectamente se basan,
frecuentemente, en anticuerpos biespecíficos. La preparación de
anticuerpos biespecíficos también es bien conocida en la técnica. Un
método preparativo implica la preparación por separado de
anticuerpos que tienen especificidad por el componente del tumor
diana, por un lado, y el agente coagulante por el otro. A
continuación, se generan los fragmentos peptídicos
F(ab'\gamma)_{2} de los dos anticuerpos elegidos,
seguido por una reducción de cada uno para proporcionar fragmentos
separados Fab'\gamma_{SH}. A continuación los grupos SH, en una
de las dos partes a unir, se alquilan con un agente de
entrecruzamiento, tal como la o-fenilendimaleimida,
para proporcionar grupos maleimida a una parte. Esta parte se puede
entonces conjugar con la otra por medio de una unión tioéter, para
obtener el heteroconjugado deseado
F(ab'\gamma)_{2}. (Glennie y otros, 1987).
También se pueden llevar a cabo otras aproximaciones, tal como el
entrecruzamiento con SPDP o la proteína A.
Otro método para producir anticuerpos
biespecíficos es por fusión de dos hibridomas para formar un
cuadroma. Como se usa en la presente, el término "cuadroma" se
utiliza para describir la fusión productiva de dos hibridomas de
células B. Utilizando ahora técnicas estándares, dos anticuerpos que
producen hibridomas se fusionan para obtener células hijas, y se
seleccionan aquellas células que hayan mantenido la expresión de
ambos grupos de genes de clonotipo de inmunoglobulinas.
Un método preferido para generar un cuadroma
implica la selección de un mutante deficiente de enzima de, como
mínimo, uno de los hibridomas parentales. A continuación, esta
primera línea celular de hibridoma mutante se fusiona a células de
un segundo hibridoma que había sido expuesto letalmente, por
ejemplo, a yodoacetamida, impidiendo su supervivencia continuada. La
fusión celular prevé el rescate del primer hibridoma mediante la
adquisición del gen para su deficiencia enzimática del hibridoma
tratado letalmente, y el rescate del segundo hibridoma a través de
la fusión al primer hibridoma. Se prefiere, pero no es necesario, la
fusión de inmunoglobulinas del mismo isotipo, pero de diferente
subclase. Un anticuerpo de subclase mezclada permite el uso en caso
de un ensayo alternativo para el aislamiento de un cuadroma
preferido.
Para identificar los cuadromas preferidos se
pueden utilizar las realizaciones de identificación por
microtitulación, FACS, tinción con inmunofluorescencia, anticuerpos
específicos de idiotipo, ensayos de competición de unión al
antígeno, y otros métodos comunes en la técnica de la
caracterización de anticuerpos. Después del aislamiento del
cuadroma, los anticuerpos biespecíficos se purifican aparte de otros
productos celulares. Esto se puede realizar mediante una variedad de
procedimientos de aislamiento de anticuerpos, conocidos por aquellos
entendidos en la técnica de la purificación de inmunoglobulinas
(ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988). Se
prefieren las columnas de proteína A o proteína
G-sefarosa.
En la preparación de inmunoconjugados,
inmunotoxinas y coaguligandos, se pueden emplear expresiones
recombinantes. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el
anticuerpo basado en 2C3 elegido, y el agente terapéutico, toxina o
coagulante, están acoplados "in-frame" en un
vector de expresión. La expresión recombinante, de este modo, da
lugar a la traducción del ácido nucleico para obtener el
inmunoconjugado deseado. Los entrecruzadores químicos y los puentes
de avidina:biotina también pueden unir los agentes terapéuticos al
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o a los
anticuerpos basados en 2C3.
Las siguientes patentes y solicitudes de patente
incluso complementan adicionalmente las presentes enseñanzas
respecto a la preparación, purificación y uso de coaguligandos,
incluyendo coaguligandos de anticuerpos biespecíficos: Solicitudes
U.S.A. con Serie No. 07/846.349; 08/205.330 (Patente U.S.A. No.
5.855.866); 08/350.212 (Patente U.S.A. No. 5.965.132); 08/273.567;
08/482.369 (Patente U.S.A. No. 6 093 399); 08/485.482; 08/487.427
(Patente U.S.A. No. 6.004.555); 08/479.733 (Patente U.S.A. No.
5.877.289); 08/472.631; y 08/479.727 y 08/481.904 (Patente U.S.A.
No. 6.036.955).
Los inmunoconjugados con agentes
radioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de
apoptosis, fármacos antitubulina, toxinas y coagulantes, que están
preparados mediante conjugación química o expresión recombinante,
pueden emplear un enlace liberable biológicamente y/o un enlazador o
espaciador divisible selectivamente. Tales composiciones son,
preferiblemente, razonablemente estables durante la circulación y se
liberan, preferencialmente o específicamente, tras la liberación a
la enfermedad o al lugar del tumor.
Algunos ejemplos preferidos son espaciadores
sensibles a ácido, en los que se contemplan particularmente los
anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 unidos
a colquicina o doxorubicina. Otros ejemplos preferidos son
enlazadores peptídicos que incluyen un sitio de división para
peptidasas y/o proteinasas que están, específica o
preferencialmente, presentes o activas en el lugar de la enfermedad,
tal como un medio tumoral. La liberación del inmunoconjugado a la
enfermedad o el sitio del tumor da lugar a una división y a la
liberación relativamente específica del factor de coagulación.
Tal como se describe y está permitido por la
Patente U.S.A. No. 5.877.289 y se ejemplifica adicionalmente en la
presente en la Tabla B2, se prefieren particularmente, los
enlazadores peptídicos que incluyen un sitio de división para la
uroquinasa, la pro-uroquinasa, la plasmina, el
plasminógeno, el TGF\beta, la estafiloquinasa, la Trombina, el
Factor IXa, el Factor Xa o la metaloproteinasa (MMP), tal como una
colagenasa intersticial, una gelatinasa o una estromalisina.
El anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 también se puede derivatizar para introducir
grupos funcionales que permitan el acoplamiento del agente(s)
terapéutico(s) a través de un enlace liberable
biológicamente. El anticuerpo diana, de este modo, se puede
derivatizar para introducir cadenas laterales terminadas en
hidrazida, hidracina, grupos de amina primaria o secundaria. Los
agentes terapéuticos se pueden conjugar a través de un enlace con
base de Schiff, un enlace hidrazona o acil hidrazona o un enlazador
hidracida (Patente U.S.A. No. 5.474.765 y 5.762.918)
Las composiciones y métodos de la presente
invención, tanto si son principalmente antiangiogénicos o basados en
el marcaje vascular, se pueden utilizar en combinación con otros
agentes terapéuticos y de diagnóstico. En términos de agentes
biológicos, preferiblemente agentes de diagnóstico o terapéuticos,
para el uso "en combinación" con un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 de acuerdo con la
presente invención, tal como un anticuerpo basado en 2C3, el término
"combinación" se usa sucintamente para cubrir un conjunto de
realizaciones. La terminología "en combinación", a menos que se
indique específicamente lo contrario o se aclare a partir de la
terminología científica, de este modo, se aplica a varios formatos
de composiciones combinados, productos farmacéuticos, cócteles,
kits, métodos, y usos médicos primarios y secundarios.
Las realizaciones "combinadas" de la
presente invención, de este modo, incluyen, por ejemplo, aquellas en
las que el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o basado en 2C3 es un anticuerpo desnudo y se utiliza en
combinación con un agente o un agente terapéutico que no está
operativamente acoplado a éste. En tales casos, el agente o agente
terapéutico se puede utilizar en una forma dirigida o no dirigida.
En una "forma no dirigida", el agente, particularmente, agentes
terapéuticos, generalmente, se utilizará de acuerdo con su uso
estándar en la técnica. En la "forma dirigida", el agente,
generalmente, estará acoplado operativamente a un anticuerpo
diferente o a una región diana que libera el agente o el agente
terapéutico al sitio de la enfermedad angiogénica o el tumor. El uso
de dichas formas dirigidas de los agentes biológicos, tanto
terapéuticos como de diagnóstico, es también bastante estándar en la
técnica.
En otras realizaciones "combinadas" de la
presente invención, el anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 es un inmunoconjugado, en las
que el anticuerpo se asocia o combina operativamente, por sí mismo,
con el agente o agente terapéutico. En ciertos ejemplos preferidos,
el agente, incluyendo agentes terapéuticos y de diagnóstico, será
un "agente dirigido a 2C3". El acoplamiento operativo incluye
todas las formas de acoplamiento directo e indirecto como se
describe en la presente y es conocido en la técnica.
Los usos "combinados", particularmente en
términos de anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de
VEGFR2 o basados en 2C3 en combinación con agentes terapéuticos,
también incluyen composiciones combinadas, productos farmacéuticos,
cócteles, kits, métodos, y usos médicos primarios y secundarios, en
los que el agente terapéutico está en la forma de profármaco. En
tales realizaciones, el componente activador capaz de convertir el
profármaco en la forma funcional del fármaco se puede, otra vez,
asociar operativamente con los anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o basados en 2C3
de la presente invención.
En ciertas realizaciones preferidas, las
composiciones terapéuticas, combinaciones, productos farmacéuticos,
cócteles, kits, métodos, y usos médicos primarios y secundarios
serán "combinaciones de profármacos del 2C3". Como se entenderá
por aquellos con una habilidad normal en la técnica, el término
"combinación de profármacos del 2C3", a menos que se indique lo
contrario, significa que el anticuerpo basado en 2C3 está
operativamente acoplado a un componente capaz de convertir el
profármaco en el fármaco activo, no que el anticuerpo basado en 2C3
está acoplado al propio profármaco. Sin embargo, no es necesario que
las realizaciones del profármaco de la presente invención se
necesiten utilizar como combinaciones de profármacos del 2C3. Por
consiguiente, los profármacos se pueden utilizar de cualquier manera
de las que se usan en la técnica, incluyendo ADEPT y otras
formas.
De este modo, allí donde se describen
composiciones combinadas, productos farmacéuticos, cócteles, kits,
métodos, y usos médicos primarios y secundarios, preferiblemente en
términos de agentes de diagnóstico, y más preferiblemente, agentes
terapéuticos, las combinaciones incluyen anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como
anticuerpos basados en 2C3, que son anticuerpos desnudos o
inmunoconjugados, y donde la práctica de las realizaciones in
vivo de la presente invención implica la administración
anterior, simultánea y posterior de los anticuerpos desnudos o
inmunoconjugados y el agente biológico, de diagnóstico o
terapéutico; siempre que, en algunas formas conjugadas o no
conjugadas, se consiga el suministro global de algunas formas del
anticuerpo y de algunas formas del agente biológico, de diagnóstico
o terapéutico.
Las composiciones combinadas, métodos y usos
preferidos, particularmente, de la invención son aquellos que
incluyen anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de
VEGFR2 y endostatina (Patente U.S.A. No. 5.854.205). Éstos incluyen
donde la construcción del anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o del 2C3 es un anticuerpo desnudo o un
inmunoconjugado; y cuando un inmunoconjugado, en el que el
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o 2C3
está unido a endostatina, opcionalmente, con angiostatina; en el que
el método o uso terapéutico combinado implica la administración
anterior, simultánea o posterior de endostatina, opcionalmente, con
angiostatina; siempre que, en algunas formas conjugadas o no
conjugadas, se consiga el suministro global de 2C3, endostatina y,
opcionalmente, angiostatina. Se proporcionan también anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o basados en 2C3
asociados operativamente con colagenasa, como la colagenasa, cuando
se libera específicamente al tumor, que producirá endostatina in
situ, consiguiendo beneficios similares.
Las explicaciones anteriores y otras de los
efectos de la presente invención sobre tumores se realizan por
simplicidad para explicar el modo combinado de operación, el tipo de
agente(s) acoplado(s) y similares. Esta aproximación
descriptiva no debería interpretarse como una atenuación o
sobresimplificación de las propiedades beneficiosas de los
anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o de
los anticuerpos basados en 2C3 de la presente invención. Se
entenderá, por tanto, que dichos anticuerpos, por sí mismos, tienen
propiedades antiangiogénicas y propiedades de neutralización del
VEGF (tales como la neutralización de la función de supervivencia
del VEGF), que inmunoconjugados de dichos anticuerpos mantendrán
estas propiedades y las combinarán con las propiedades del agente
acoplado; y además, que el efecto combinado del anticuerpo y
cualquier agente acoplado normalmente mejorará y/o aumentará.
La invención, por tanto, proporciona
composiciones, composiciones farmacéuticas, kits terapéuticos y
cócteles medicinales que comprenden, opcionalmente en, como mínimo,
una primera composición o recipiente, una cantidad efectiva
biológicamente de, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno
que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo
monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno
de éste o un inmunoconjugado de dicho anticuerpo
anti-VEGF; y una cantidad efectiva biológicamente
de, como mínimo, un segundo agente, componente o sistema
biológico.
El "como mínimo, un segundo agente, componente
o sistema biológico" será, frecuentemente, un agente, componente
o sistema terapéutico o de diagnóstico, pero no siempre. Por
ejemplo, el como mínimo, un segundo agente, componente o sistema
biológico puede comprender componentes para la modificación del
anticuerpo y/o para acoplar otros agentes al anticuerpo. Algunos
segundos agentes, componentes o sistemas biológicos preferidos son
profármacos o componentes para producir y utilizar profármacos,
incluyendo componentes para producir el propio profármaco y
componentes para adaptar los anticuerpos de la invención a la
función en dicho profármaco o realizaciones ADEPT.
Allí donde los agentes de diagnóstico o
terapéuticos están incluidos como el, como mínimo, un segundo
agente, componente o sistema biológico, tales agentes de diagnóstico
y/o terapéuticos normalmente serán aquellos para utilizar en
conexión con enfermedades angiogénicas. Tales agentes son aquellos
adecuados para utilizar en el tratamiento o diagnóstico de una
enfermedad o desorden como se da a conocer en cualquiera de las
Patentes U.S.A. Nos. 5.712.291, 5.753.230, 5.972.922, 5.639.757, WO
98/45331 y WO 98/16551.
Allí donde la enfermedad a tratar es cáncer, se
incluirá "como mínimo un segundo agente anticancerígeno" en el
kit o cóctel terapéutico. El término "como mínimo, un segundo
agente anticancerígeno" se elige en referencia a la construcción
del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o del
2C3, siendo el primer agente anticancerígeno. Los anticuerpos de la
presente invención, de este modo, pueden combinarse con agentes
quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos, citocinas, agentes
antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis o inmunotoxinas
anticancerígenas o coaguligandos.
Los "agentes quimioterapéuticos", como se
usa en la presente, se refieren a agentes quimioterapéuticos
clásicos o fármacos utilizados en el tratamiento de malignidades.
Este término se utiliza por simplicidad a pesar del hecho de que
otros compuestos se pueden describir técnicamente como agentes
quimioterapéuticos en cuanto a que ejercen un efecto
anticancerígeno. Sin embargo, la palabra "quimioterapéutico" ha
llegado a tener un significado diferente en la técnica y se está
utilizando de acuerdo con el significado estándar. En la presente
invención se describen algunos agentes quimioterapéuticos de
ejemplo. Aquellos que tienen una habilidad normal en la técnica
entenderán fácilmente los usos y dosis apropiadas de los agentes
quimioterapéuticos, a pesar de que las dosis se pueden posiblemente
reducir cuando se utilizan en combinación con la presente
invención.
Una nueva clase de fármacos que también se pueden
denominar "agentes quimioterapéuticos" son agentes que inducen
la apoptosis. Alguno o más de uno de tales fármacos, incluyendo
genes, vectores, construcciones antisentido y ribozimas, como
apropiados, también se pueden utilizar junto con la presente
invención. Actualmente, los segundos agentes preferidos son agentes
antiangiogénicos, tales como angiostatina, endostatina,
vasculostatina, canstatina y maspina.
Otros ejemplos de agente anticancerígeno
incluyen, por ejemplo, neomicina, podofilotoxina(s),
TNF-\alpha, antagonistas
\alpha_{V}\beta_{3}, ionóforos de calcio, agentes
inductores del flujo de calcio, y cualquier derivado o profármaco de
los mismos. Actualmente, los fármacos antitubulina preferidos
incluyen colquicina, taxol, vinblastina, vincristina, vindescina,
una combretastatina o un derivado o profármaco de éstos.
Las inmunotoxinas anticancerígenas o
coaguligandos son agentes anticancerígenos más apropiados. Las
"inmunotoxinas anticancerígenas o coaguligandos", o
construcciones de agentes terapéuticos/agentes marcadores, se basan
en agentes marcadores, incluyendo anticuerpos o fragmentos de unión
al antígeno de éstos, que se unen a un componente accesible o diana
de una célula tumoral, vasculatura tumoral o estroma tumoral, y que
están acoplados operativamente a un agente terapéutico, incluyendo
agentes citotóxicos (inmunotoxinas) y factores de coagulación
(coaguligandos). Un "componente accesible o diana" de una
célula tumoral, vasculatura tumoral o estroma tumoral, es
preferiblemente un componente con una superficie expresada,
accesible o localizada, a pesar de que componentes liberados de
células tumorales necróticas, o dañadas de otra manera, o células
endoteliales vasculares también se pueden marcar, incluyendo
antígenos de células tumorales nucleares y/o citosólicas.
Se pueden utilizar tanto agentes marcadores de
anticuerpo como de no anticuerpo, incluyendo factores de
crecimiento, tales como el VEGF y el FGF; péptidos que contienen el
tripéptido R-G-D, que se unen
específicamente a la vasculatura tumoral; y otros componentes
marcadores tales como anexinas y ligandos relacionados.
Las inmunotoxinas o coaguligandos de células
antitumorales pueden comprender anticuerpos ejemplificados por el
grupo que consiste en anticuerpos denominados B3 (ATCC HB 10573),
260F9 (ATCC HB 8488), D612 (ATCC HB 9796) y KS1/4, en el que dicho
anticuerpo KS1/4 se obtiene de una célula que comprende el vector
pGKC2310 (NRRL B-18356) o el vector pG2A52 (NRRL
B-18357).
También se contemplan los agentes marcadores de
células antitumorales que comprenden un anticuerpo, o una región de
unión al antígeno de éste, que se unen a un componente intracelular
que se libera de una célula tumoral necrótica. Preferiblemente,
dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales, o fragmentos de
unión al antígeno de éstos, que se unen a un(os)
antígeno(s) intracelular(es) insolubles, presentes en
las células que pueden inducirse a ser permeables, o en células
fantasmas de sustancialmente todas las células normales y
neoplásticas, pero que no están presentes o accesibles en el
exterior de las células vivas normales de un mamífero.
Las Patentes Nos. 5.019.368, 4.861.581 y
5.882.626, cada una emitida por Alan Epstein y colegas, incluso
describen adicionalmente y enseñan como producir y utilizar
anticuerpos específicos para antígenos intracelulares que se
convierten en accesibles de células malignas in vivo. Los
anticuerpos descritos son suficientemente específicos para los
componentes celulares internos de las células malignas de mamíferos,
pero no para componentes celulares externos. Algunas dianas de
ejemplo incluyen histonas, pero se abarcan todos los componentes
intracelulares específicamente liberados de células tumorales
necróticas.
Tras la administración a un animal o un paciente
con un tumor vascularizado, tales anticuerpos se localizan en las
células malignas por el hecho de que los tumores vascularizados
contienen, de forma natural, células tumorales necróticas, debido al
(los) proceso(s) de remodelación del tumor que tiene lugar
in vivo y causa que, como mínimo, una proporción de células
malignas se conviertan en necróticas. Además, el uso de dichos
anticuerpos en combinación con otras terapias que mejoran la
necrosis tumoral sirve para aumentar la efectividad del marcaje y la
posterior terapia.
Estos tipos de anticuerpos pueden, de este modo,
utilizarse directa o indirectamente asociados con angiopoyetinas y
administrar las angiopoyetinas a las células malignas necróticas en
el interior de los tumores vascularizados, como, generalmente, se da
a conocer en la presente.
Tal como también se da a conocer en las Patentes
U.S.A. Nos. 5.019.368, 4.861.581 y 5.882.626, estos anticuerpos se
pueden utilizar en métodos de diagnóstico combinados (ver más
adelante) y en métodos para medir la efectividad de las terapias
antitumorales. Tales métodos, generalmente, implican la preparación
y administración de una versión marcada de los anticuerpos y la
medida de la unión del anticuerpo marcado con el componente celular
interno diana, preferencialmente, enlazado en el interior del tejido
necrótico. Los métodos, de este modo, reflejan el tejido necrótico,
en el que una concentración localizada del anticuerpo es indicativa
de la presencia de un tumor e indica fantasmas de células que se han
eliminado por la terapia antitumoral.
Las inmunotoxinas o coaguligandos del estroma
antitumoral, generalmente, comprenderán anticuerpos que se unen a un
componente de tejido conectivo, un componente de la membrana basal o
un componente de plaqueta activada; como se ejemplifica mediante la
unión a fibrina, RIBS o LIBS.
Las inmunotoxinas o coaguligandos de la
vasculatura antitumoral pueden comprender ligandos, anticuerpos, o
fragmentos de éstos, que se unen a un componente de los vasos
transportadores de sangre, preferiblemente, los vasos sanguíneos
intratumorales, con una superficie expresada, accesible o
localizada, en un tumor vascularizado. Tales anticuerpos incluyen
aquellos que se unen a componentes con superficie expresada de vasos
sanguíneos intratumorales de un tumor vascularizado, incluyendo
receptores de superficie de células de la vasculatura tumoral, tales
como endoglina (anticuerpos TEC-4 y
TEC-11), un receptor TGF\beta,
E-selectina, P-selectina,
VCAM-1, ICAM-2, PSMA, un receptor
VEGF/VPF, un receptor FGF, un TIE, integrina
\alpha_{V}\beta_{3}, pleiotropina, endosialina y proteínas
MHC de la Clase II. Los anticuerpos también se pueden unir a
componentes inducibles por citocina o por coagulante de los vasos
sanguíneos intratumorales. Ciertos agentes preferidos se unirán a
aminofosfolípidos, tales como la fosfatidilserina o la
fosfatidiletanolamina.
Otras inmunotoxinas o coaguligandos de la
vasculatura antitumoral pueden comprender anticuerpos, o fragmentos
de éstos, que se unen a un ligando o factor de crecimiento que se
une a un receptor de superficie de una célula de la vasculatura
intratumoral. Tales anticuerpos incluyen aquellos que se unen a
VEGF/VPF (anticuerpos GV39 y GV97), FGF, TGF\beta, un ligando que
se une a un TIE, una isoforma de fibronectina asociada al tumor,
factor de dispersión/factor de crecimiento de hepatocitos (HGF),
factor plaquetario 4 (PF4), PDGF y TIMP. Los anticuerpos, o
fragmentos de éstos, también se pueden unir a un complejo
ligando:receptor o un complejo factor de crecimiento:receptor, pero
no al ligando o al factor de crecimiento o al receptor, cuando el
ligando o el factor de crecimiento o el receptor no están en los
complejos ligando:receptor o factor de crecimiento:receptor.
Las construcciones de agente
terapéutico-anticuerpo de la vasculatura
antitumoral, de las células antitumorales o del estroma antitumoral
pueden comprender agentes antiangiogénicos, agentes inductores de
apoptosis, fármacos antitubulina, agentes citotóxicos, tales como
toxinas derivadas de plantas, hongos o bacterias. Se preferirán,
frecuentemente, la cadena A de la ricina y la cadena A de la ricina
desglicosilada. Las construcciones de agente
terapéutico-anticuerpo de la vasculatura
antitumoral, de las células antitumorales o del estroma antitumoral
pueden comprender coagulantes (factores de coagulación que actúan de
forma directa o indirecta) o regiones de unión de un segundo
anticuerpo que se une a factores de coagulación. Se preferirá,
frecuentemente, la asociación operativa con el Factor Tisular o
derivados del Factor Tisular, tal como el Factor Tisular
truncado.
En términos de composiciones, kits y/o
medicamentos de la presente invención, las cantidades efectivas
combinadas de los agentes terapéuticos se pueden comprender dentro
de un único recipiente o formas de envase, o en diferentes
recipientes o formas de envase. Los cócteles, generalmente, se
mezclarán juntos para un uso combinado. Frecuentemente se preferirán
los agentes formulados para la administración intravenosa. También
se pueden incluir componentes de imagen. Los kits también pueden
comprender instrucciones para el uso del, como mínimo un primer
anticuerpo y el uno o más de los agentes biológicos incluidos.
Generalmente hablando, el, como mínimo, un
segundo agente anticancerígeno se puede administrar al animal o
paciente, sustancialmente, simultáneamente con el agente terapéutico
del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o
basado en 2C3; tal como de un único compuesto farmacéutico o de dos
composiciones farmacéuticas administradas de manera conjunta.
Alternativamente, el, como mínimo, un segundo
agente anticancerígeno se puede administrar al animal o paciente en
un tiempo secuencial a la administración del agente terapéutico del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado
en 2C3. "En un tiempo secuencial", como se usa en la presente,
significa "escalonado", de manera que el, como mínimo, un
segundo agente anticancerígeno se administra al animal o paciente en
un tiempo diferente de la administración del agente terapéutico del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado
en 2C3. Generalmente, los dos agentes se administran en tiempos
espaciados de forma efectiva para permitir a los dos agentes ejercer
sus respectivos efectos terapéuticos, es decir, se administran en
"intervalos de tiempo biológicamente efectivos". El, como
mínimo, un segundo agente anticancerígeno se puede administrar al
animal o paciente en un tiempo biológicamente efectivo anterior al
agente terapéutico del anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, o en un tiempo biológicamente
efectivo posterior al agente terapéutico.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona métodos para el tratamiento de un animal o paciente con
un tumor vascularizado, que comprenden:
(a) someter al animal o paciente a un primer
tratamiento que reduce sustancialmente la carga principal del tumor;
y
(b) administrar posteriormente, como mínimo, un
primer agente antiangiogénico al animal o paciente en una cantidad
efectiva para inhibir la metástasis de cualquier célula tumoral
superviviente; en el que el primer agente antiangiogénico es, como
mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2, o un fragmento de unión al antígeno de éste,
opcionalmente, uno que se une sustancialmente al mismo epítopo que
el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); opcionalmente, en el
que el anticuerpo o el fragmento se asocia operativamente con un
segundo agente antiangiogénico.
Los tratamientos primeros preferidos incluyen la
resección quirúrgica y la intervención quimioterapéutica. También se
pueden utilizar agentes antiangiogénicos, tales como construcciones
de angiopoyetina 2 o angiopoyetina 2 dirigida al tumor.
Otros métodos de tratamiento para animales o
pacientes con tumores vascularizados, comprenden:
(a) administrar una primera construcción
anticuerpo-agente terapéutico al animal o paciente
en una cantidad efectiva para inducir una necrosis tumoral
sustancial; en el que la primera construcción
anticuerpo-agente terapéutico comprende un agente
terapéutico operativamente unido a un primer anticuerpo, o un
fragmento de unión al antígeno de éste, que se une a un componente
con una superficie expresada, accesible o localizada de la célula
tumoral, la vasculatura tumoral o el estroma tumoral; y
(b) administrar posteriormente un segundo
anticuerpo al animal o paciente en una cantidad efectiva para
inhibir la metástasis de cualquier célula tumoral superviviente; en
el que el segundo anticuerpo es, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o un fragmento de
unión al antígeno de éste, opcionalmente, uno que se une
sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595); y además, opcionalmente, en el que el anticuerpo o
el fragmento se asocia operativamente con un segundo agente
antiangiogénico.
En realizaciones particularmente preferidas, la
presente invención proporciona anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 y anticuerpos
basados en 2C3 para el uso en combinación con profármacos y ADEPT.
En tales composiciones, combinaciones, productos farmacéuticos,
kits, métodos y usos, el anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3, o fragmento de
éstos, se modificarán para proporcionar una capacidad de conversión
o enzimática, o se asociarán operativamente, preferiblemente, se
unirán o conjugarán covalentemente con, como mínimo, un primer
agente o enzima conversor capaz de convertir, como mínimo, un
profármaco en la forma activa del fármaco.
El anticuerpo o fragmento enzimático o conjugado
con la enzima se combinará con una formulación inicialmente separada
del "profármaco". El profármaco será una forma inactiva o
débilmente activa de un fármaco que se convierte en una forma activa
del fármaco en contacto con la capacidad enzimática, convirtiendo la
función o la enzima asociada con el anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el 2C3.
Por consiguiente, se proporcionan kits que
comprenden, preferiblemente, en composiciones y/o recipientes
separados:
(a) una cantidad biológicamente efectiva de, como
mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3, o un fragmento de éstos,
que tienen una función enzimática, preferiblemente allí donde el
anticuerpo o el fragmento se asocia operativamente con, unido o
conjugado covalentemente a, como mínimo, un primer enzima; y
(b) una cantidad biológicamente efectiva de, como
mínimo, un primer profármaco sustancialmente inactivo que se
convierte en un fármaco sustancialmente activo por la función
enzimática de, o la enzima asociada con, conjugado o unido al,
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o al
anticuerpo 2C3, o un fragmento.
Existen métodos y usos más ventajosos dados a
conocer que comprenden:
(a) administrar a un animal o un paciente con un
tumor vascularizado una cantidad biológicamente efectiva de, como
mínimo, un primer compuesto farmacéutico que comprende, como mínimo,
un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2
o un anticuerpo basado en 2C3, o un fragmento de unión al antígeno
de éstos, en el que el anticuerpo o fragmento tiene una función
enzimática, preferiblemente, en el que el anticuerpo o fragmento se
asocia operativamente con, covalentemente unido a, o conjugado con,
como mínimo, un primer enzima; en el que dicho anticuerpo o
fragmento se localiza, tras la administración, en la vasculatura, la
vasculatura intratumoral o el estroma tumoral vascularizado; y
(b) administrar posteriormente al animal o
paciente, después de un período de tiempo efectivo, una cantidad
biológicamente efectiva de, como mínimo, un segundo compuesto
farmacéutico que comprende una cantidad biológicamente efectiva de,
como mínimo, un profármaco sustancialmente inactivo; en el que el
profármaco se convierte en un fármaco sustancialmente activo por la
acción enzimática de, o la enzima asociada con, unida a, o conjugada
con el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o
el 2C3, o un fragmento, localizado en el interior de la vasculatura,
la vasculatura tumoral o el estroma de dicho tumor
vascularizado.
En otras realizaciones, los anticuerpos e
inmunoconjugados de la invención se pueden combinar con uno o más
agentes de diagnóstico, normalmente agentes de diagnóstico para el
uso en conexión con enfermedades angiogénicas. Se incluyen, de este
modo, en la presente invención, un conjunto de composiciones de
diagnóstico, kits y métodos.
En términos de tratamiento y diagnóstico de
cáncer, las composiciones, kits y métodos de diagnóstico e imagen,
de la presente invención incluyen productos de diagnóstico in
vivo e in vitro. Por ejemplo, un tumor vascularizado se
puede reproducir utilizando una cantidad diagnósticamente efectiva
de un componente de diagnóstico tumoral que comprende, como mínimo,
una primera región de unión que se une a un componente accesible de
una célula tumoral, la vasculatura tumoral o el estroma tumoral,
operativamente acoplada a un agente de imagen diagnóstica in
vivo.
La imagen del tumor se lleva a cabo,
preferiblemente, para proporcionar una imagen del estroma y/o la
vasculatura de un tumor vascularizado utilizando un componente de
diagnóstico que comprende, como mínimo, una primera región de unión
que se une a un componente accesible de la vasculatura tumoral o el
estroma tumoral. Se puede emplear cualquier región de unión adecuada
o anticuerpo, tales como aquellos descritos anteriormente en los
términos de construcciones terapéuticas. Mediante la utilización de
una construcción de un anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 marcado para la
detección, se proporcionarán ciertas ventajas, en la que la imagen
formada será predictiva de los sitios de unión del agente
terapéutico a utilizar.
Los productos de diagnóstico del tumor marcados
para la detección in vivo, tanto si son para el anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o en el 2C3 como si
no, pueden comprender un compuesto detectable por
rayos-X, tal como bismuto (III), oro(III),
lantano (III) o plomo (II); un ión radiactivo, tal como
cobre^{67}, galio^{67}, galio^{68}, indio^{111},
indio^{113}, yodo^{123}, yodo^{125}, yodo^{131},
mercurio^{197}, mercurio^{203}, renio^{186}, renio^{188},
rubidio^{97}, rubidio^{103}, tecnecio^{99m} o itrio^{90}; un
isótopo con resonancia magnética nuclear de spin, tal como cobalto
(II), cobre (II), cromo (III), disprosio (III), erbio (III),
gadolinio (III), holmio (III), hierro(II), hierro (III),
manganeso (II), neodimio (III), níquel (II), samario (III), terbio
(III), vanadio (II) o yterbio (III); o rodamina o fluoresceína.
La preimagen antes del tratamiento se puede
llevar a cabo mediante:
(a) la administración al animal o paciente de una
cantidad diagnósticamente efectiva de un compuesto farmacéutico que
comprende un agente de diagnóstico acoplado operativamente a, como
mínimo, una primera región de unión que se une a un componente
accesible de una célula tumoral, vasculatura tumoral
(preferiblemente) o estroma tumoral (preferiblemente), incluyendo
agentes de diagnóstico operativamente acoplados a construcciones de
un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un
anticuerpo basado en 2C3; y
(b) la detección, posteriormente, de la primera
región de unión marcada para la detección (o un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo
basado en 2C3) enlazado a las células tumorales, los vasos
sanguíneos del tumor (preferiblemente) o el estroma tumoral
(preferiblemente); obteniendo así una imagen del tumor, la
vasculatura del tumor y/o el estroma tumoral.
El tratamiento del cáncer también se puede llevar
a cabo mediante:
(a) la formación de una imagen de un tumor
vascularizado mediante la administración a un animal o paciente, que
tiene un tumor vascularizado, de una cantidad diagnósticamente
mínima de, como mínimo, un primer agente de unión al tumor marcado
para la detección, preferiblemente una construcción de un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo
basado en 2C3, que comprende un agente de diagnóstico operativamente
acoplado al agente de unión al tumor o al anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o al anticuerpo
basado en 2C3, formando así una imagen detectable del tumor, la
vasculatura del tumor (preferiblemente), o el estroma tumoral
(preferiblemente); y
(b) la administración, posterior, al mismo animal
o paciente de una cantidad terapéuticamente optimizada de, como
mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2 desnudo o un primer anticuerpo basado en 2C3 o una
construcción anticuerpo-agente terapéutico
utilizando dicho anticuerpo, causando así un efecto antitumoral.
Se proporcionan, de este modo, medicamentos o
formulaciones para la imagen y el tratamiento que generalmente
comprenden:
(a) un primer compuesto farmacéutico que
comprende una cantidad diagnósticamente efectiva de un agente de
unión al tumor marcado para la detección, preferiblemente una
construcción de un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3, que comprende un agente
detectable operativamente acoplado al agente de unión al tumor o al
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o al
anticuerpo basado en 2C3; y
(b) un segundo compuesto farmacéutico que
comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de, como mínimo, un
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 desnudo o
un anticuerpo 2C3 o una construcción agente
terapéutico-anticuerpo utilizando dicho
anticuerpo.
La invención también proporciona kits de
diagnóstico in vitro que comprenden, como mínimo, un primer
compuesto o un compuesto farmacéutico que comprende una cantidad
biológicamente efectiva de, como mínimo, un agente de diagnóstico
que se asocia operativamente con, como mínimo, un primer anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, opcionalmente, uno
que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo
monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o un fragmento de unión al antígeno
de éste.
La presente invención además proporciona kits
combinados en los que el agente de diagnóstico se destina al uso
fuera del cuerpo, preferiblemente en conexión con una prueba
realizada en una muestra biológica obtenida de un animal o paciente.
Como tal, la presente invención proporciona kits que comprenden,
generalmente, en, como mínimo, dos recipientes diferentes, como
mínimo, un primer compuesto, compuesto farmacéutico o cóctel
medicinal que comprende una cantidad biológicamente efectiva de,
como mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2, opcionalmente uno que se une sustancialmente
al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595), o
un fragmento de unión al antígeno o un inmunoconjugado de dicho
anticuerpo anti-VEGF; y una cantidad biológicamente
efectiva de, como mínimo, un agente, componente o sistema de
diagnóstico para el uso in vitro.
El "agente, componente o sistema de diagnóstico
para el uso in vitro" será cualquier agente de diagnóstico
o combinación de agentes que permiten el diagnóstico de una o más
enfermedades que tienen un componente angiogénico. Los productos de
diagnóstico in vitro, de este modo, incluyen aquellos
adecuados para el uso en la generación de información de diagnóstico
o pronóstico en relación con una enfermedad o desorden tal como se
da a conocer en cualquiera de las Patentes U.S.A. Nos. 5.712.291,
5.753.230, 5.972.922, 5.639.757, WO 98/45331 y WO 98/16551.
En términos de tratamiento y diagnóstico de
cáncer, los productos de diagnóstico in vitro incluirán
preferiblemente un componente de diagnóstico que comprende, como
mínimo, una primera región de unión que se une a un componente
accesible de una célula tumoral, vasculatura tumoral
(preferiblemente) o estroma tumoral (preferiblemente) acoplado
operativamente a un "agente informador o detectable" directa o
indirectamente detectable por una prueba de diagnóstico in
vitro. Los "agentes informadores o detectables"
directamente detectables in vitro incluyen aquellos, tales
como radiomarcadores y agentes informadores detectables por
inmunofluorescencia.
Los "agentes informadores o detectables"
indirectamente detectables in vitro incluyen aquellos que
funcionan junto con un(os) agente(s)
adicional(es) exógenos, tales como enzimas detectables que
producen un producto coloreado en contacto con un sustrato
cromogénico. La detección indirecta in vitro también se
extiende a componentes o sistemas informadores o detectables que
comprenden una primera región de unión que se une a un componente
accesible de una célula tumoral, vasculatura tumoral
(preferiblemente) o estroma tumoral (preferiblemente) en combinación
con, como mínimo, un anticuerpo detector que tiene
inmunoespecificidad por la primera región de unión. El "anticuerpo
detector" es preferiblemente un "anticuerpo secundario" que
está acoplado a un agente detectable de forma directa o indirecta,
tal como un radiomarcador o una enzima. Alternativamente, se puede
utilizar "un sistema de detección de anticuerpo secundario y
terciario", incluyendo un primer anticuerpo detector que tiene
inmunoespecificidad por la primera región de unión en combinación
con un segundo anticuerpo detector que tiene inmunoespecificidad por
el primer anticuerpo detector, estando el segundo anticuerpo
detector acoplado a un agente detectable de forma directa o
indirecta.
Los siguientes dibujos forman parte de la
presente especificación y se incluyen para demostrar ampliamente
aspectos de la presente invención. La presente invención se puede
entender mejor por referencia a uno o más de estos dibujos, en
combinación con la descripción detallada de las realizaciones
específicas presentadas en la presente.
Figura 1. El 2C3 inhibe el crecimiento de las
células ABAE mediado por el VEGF. Las células ABAE se hicieron
crecer en presencia de varios anticuerpos indicados y VEGF 0,5 nM.
El crecimiento después de 4 días se determinó colorimétricamente por
la conversión enzimática del MTS (reactivo de Owen) a un formazano
amarillo. Los resultados se expresan como porcentaje de la
producción de formazano en pocillos de control que se hicieron
crecer con VEGF solo. El fondo se determinó mediante el crecimiento
celular sin VEGF o anticuerpo y se sustrajo de los pocillos de
control y de muestra. Los resultados muestran la media aritmética de
determinaciones triplicadas, las desviaciones estándar de las cuales
fueron siempre menores de un 20% de la media. Se muestran las curvas
de crecimiento para los anticuerpos IgG anti-VEGF
incluyendo mAb 4.6.1 como control positivo y un IgG de especificidad
irrelevante (Control IgG) como control negativo.
Figura 2. El 2C3 bloquea la unión del VEGF al
VEGFR2 pero no al VEGFR1 en un ELISA. Los pocillos se recubrieron
con el dominio extracelular del VEGFR1 (FLt-1/Fc) o
VEGFR2 (sFlk-1) y, a continuación, se incubaron con
VEGF solo 1nM o VEGF en presencia de IgG indicada de concentración
100 nM o 1000 nM. La placa, a continuación, se incubó con
anti-VEGF de conejo (A-20, Santa
Cruz Biotechnology, Inc.) de concentración 1\mug/ml y se
desarrolló utilizando un anticuerpo de anti-conejo
de cabra conjugado con peroxidasa. Los ensayos se llevaron a cabo
por triplicado. Se muestra la media del porcentaje de unión en
ausencia de anticuerpo junto con la desviación estándar. Los
asteriscos indican los valores que estadísticamente son
significativamente diferentes (p < 0,002) de aquellos en ausencia
de anticuerpo según un test T de Student de valores por parejas.
Figura 3A y Figura 3B. El 2C3 inhibe el
crecimiento in vivo de xenoinjertos de tumores humanos.
Figura 3A: Se inyectaron 1x10^{7} células de NSCLC
NCI-H358 subcutáneamente en un ratón nu/nu en
el día 0. Figura 3B: Se inyectaron 5x10^{6} células de
rabdomiosarcoma A673 subcutáneamente en un ratón nu/nu en el
día 0. Se inyectaron intraperitonealmente (i.p.) los ratones con la
IgG indicada en el día 1 y 2 veces/semana a partir de entonces. Se
administró el 2C3 en una dosis de 100, 10 ó 1 \mug/inyección
mientras que la IgG, de especificidad irrelevante, (Figura 3A) y el
3E7 (Figura 3B) se administraron también en una dosis de 100
\mug/inyección. Se midieron los tumores 2-3 veces
por semana. En la Figura 3A se muestran la media y el error estándar
durante la duración del estudio, mientras que los datos para el
último día de estudio (día 26) se muestran en la Figura 3B.
Figura 4. El tratamiento con 2C3 reduce el tamaño
de los xenoinjertos tumorales NSCLC NCI-H358 humanos
establecidos. Se trataron intraperitonealmente ratones con tumores
NCI-H358 subcutáneos, aproximadamente de
300-450 mm^{3} de tamaño, con 50 \mug o 100
\mug de 2C3 (n = 14), mAb 4.6.1 (n = 5), 3E7 (n = 12) o un IgG de
control (n = 9) en los puntos de tiempo indicados. Se muestra la
media del volumen del tumor junto con el SEM durante 116
días.
días.
Figura 5A y Figura 5B. Comparación de los
tratamientos con 2C3 y 3E7 de xenoinjertos tumorales humanos
establecidos. Figura 5A: Se trataron ratones con tumores
NCI-H358 subcutáneos, aproximadamente de 450
mm^{3} de tamaño, con 2C3 (n = 6) ó 3E7 (n = 4). Los tratamientos
(T) se administraron intraperitonealmente en una cantidad de 100
\mug de IgG, excepto para el tratamiento inicial que consistió en
500 \mug de IgG administrados intravenosamente. Se muestra la
media del volumen del tumor junto con el SEM. Al final del estudio
(día 116), se sacrificaron los ratones y se diseccionaron los
tumores y se pesaron. El peso medio del tumor del grupo tratado con
el 2C3 fue de 0,054 g, mientras que el grupo tratado con el 3E7 tuvo
un peso medio del tumor de 0,545 g. Figura 5B: Se trataron
intraperitonealmente ratones con tumores HT1080 subcutáneos,
aproximadamente de 200-250 mm^{3} de tamaño, con
100 \mug 2C3 (n = 9), 3E7 (n = 11), IgG de control (n = 11), o
salino (n = 11). Se trataron los ratones día sí y día no como se
indica (T). Los ratones no tratados con 2C3 se sacrificaron el día
26 debido a que más del 50% de cada grupo tenían tumores ulcerados
grandes. Se muestra la media del volumen del tumor junto con el
SE.
Los tumores sólidos y carcinomas justifican más
del 90% de los cánceres en el hombre. A pesar de que se ha
investigado el uso de anticuerpos monoclonales e inmunotoxinas en la
terapia de linfomas y leucemias, estos agentes han sido
decepcionantemente inefectivos en las pruebas clínicas contra
carcinomas y otros tumores sólidos (Abrams y Oldham, 1985). Una
razón principal para la inefectividad de tratamientos basados en
anticuerpos es que las macromoléculas no se transportan fácilmente
al interior de los tumores sólidos. Incluso una vez dentro de la
masa tumoral, estas moléculas fallan en su distribución, igualmente
debido a la presencia de estrechas uniones entre las células
tumorales, el estroma fibroso, gradientes de presión intersticial y
las barreras en los sitios de unión (Dvorak y otros, 1991a).
En el desarrollo de nuevas estrategias para el
tratamiento de tumores sólidos, los métodos que implican el marcaje
como diana de la vasculatura del tumor, en lugar de las células
tumorales, ofrecen claras ventajas. Una destrucción efectiva o
bloqueo de los vasos tumorales obstaculiza el flujo sanguíneo a
través del tumor y da lugar a una avalancha de muertes de células
tumorales. Se han utilizado, de forma efectiva, construcciones de
anticuerpo-toxina y
anticuerpo-coagulante en el marcaje específico y la
destrucción de vasos tumorales, dando lugar a la necrosis tumoral
(Burrows y otros, 1992; Burrows y Thorpe, 1993; WO 93/17715; WO
96/01653; Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866; 5.877.289; 5.965.132;
6.051.230; 6.004.555; Patente U.S.A. No. 6093399, Derechos de
Expedición pagados el 20 de octubre de 1998).
Allí donde los anticuerpos, los factores de
crecimiento u otros ligandos de unión se utilizan para liberar
específicamente un coagulante a la vasculatura tumoral, tales
agentes se llaman "coaguligandos". Actualmente, un coagulante
preferido para el uso en coaguligandos es el Factor Tisular truncado
(tTF) (Huang y otros, 1997; WO 96/01653; Patente U.S.A. No.
5.877.289). El TF es el principal iniciador de la coagulación
sanguínea. En los sitios de lesión, el Factor VII/VIIa en la sangre
contacta con el, y se une al, TF en células en los tejidos
perivasculares. El complejo TF:VIIa, en presencia de la superficie
de fosfolípido, activa los factores IX y X. Esto, sucesivamente,
conlleva la formación de trombina y fibrina y, en último término, un
coágulo de sangre.
Se han descrito un conjunto de moléculas diana
adecuadas que están disponibles en el endotelio tumoral, pero
ampliamente ausentes en el endotelio normal. Por ejemplo, se pueden
utilizar dianas expresadas, tales como endoglina,
E-selectina, P-selectina,
VCAM-1, ICAM-1, PSMA, un TIE, un
ligando reactivo con LAM-1, un receptor VEGF/VPF, un
receptor FGF, integrina \alpha_{V}\beta_{3}, pleiotropina o
endosialina (Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866; 5.877.289 y 6.004.555,
Burrows y otros, 1992; Burrows y Thorpe, 1993; Huang y otros,
1997).
Otras dianas inducibles por el medio del tumor
natural o por la siguiente intervención del hombre son también
entidades marcables como diana, tal como se describe en la Patente
U.S.A. No. 5.776.427 y 6.036.955. Cuando se usan junto con la
supresión previa en los tejidos normales y en la inducción vascular
del tumor, los antígenos MHC de la Clase II también se pueden
emplear como dianas (Patentes U.S.A. Nos. 5.776.427; 6.004.554 y
6.036.955).
Las dianas adsorbidas son otro grupo adecuado,
tales como VEGF, FGF, TGF\beta, HGF, PF4, PDGF, TIMP, un ligando
que se une a un TIE o una isoforma de la fibronectina asociada al
tumor (Patente U.S.A. No. 5.877.289 y 5.965.132). Las isoformas de
la fibronectina son ligandos que se unen a la familia de integrinas
de receptores. Las isoformas de la fibronectina asociadas al tumor
son componentes marcables como diana tanto de la vasculatura tumoral
como del estroma tumoral.
Actualmente, un marcador preferido para tales
aplicaciones de marcaje de dianas clínicas es el receptor asociado
al VEGF. De hecho, los conjuntos de complejos VEGF:receptor son uno
de los marcadores más específicos de la vasculatura tumoral
observada hasta la fecha (Patente U.S.A. No. 5.877.289; 5.965.132 y
6.051.230; Lin-Ke y otros, 1996; Dvorak y otros,
1991b).
El complejo VEGF:receptor presenta una diana
atractiva para la liberación específica de fármacos u otros
efectores al endotelio tumoral, ya que los tumores son ricos en
citocinas y factores de crecimiento y ya que los receptores del VEGF
se regulan a la alta bajo las condiciones hipóxicas que se
encuentran en la mayoría de tumores sólidos (Mazure y otros, 1996;
Forsythe y otros, 1996; Waltenberger y otros, 1996; Gerber y otros,
1997; Kremer y otros, 1997). La regulación a la alta del ligando y
su receptor específicamente en el microentorno del tumor conlleva
una elevada concentración de receptor ocupado en el endotelio
vascular del tumor, en comparación con el endotelio en el tejido
normal (Patente U.S.A. No. 5.877.289 y 5.965.132). Dvorak y colegas
también mostraron que los anticuerpos policlonales de conejo
dirigidos contra el extremo N-terminal del VEGF,
tiñen selectivamente los vasos sanguíneos del tumor después de la
inyección a ratones con tumores singeneicos (Lin Ke y otros,
1996).
El papel del VEGF como diana para las
intervenciones clínicas no está limitado a terapias con
inmunotoxinas o coaguligandos. De hecho, el VEGF es uno de los
factores claves implicados en la angiogénesis de los tumores sólidos
(Ferrara, 1995; Potgens y otros, 1995), siendo tanto un agente de
permeabilidad potente (Senger y otros, 1983; Senger y otros, 1990;
Senger y otros, 1986) como un mitógeno de células endoteliales (Keck
y otros, 1989; Connolly y otros, 1989; Thomas, 1996). La conexión
entre el VEGF y la angiogénesis ha conllevado a propuestas de varias
estrategias terapéuticas enfocadas a la intervención del VEGF
(Siemeister y otros, 1998).
El factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF) es una citocina multifuncional que se induce por hipoxia y
mutaciones oncogénicas. El VEGF es un estimulante primario del
desarrollo y mantenimiento de una red vascular en la embriogénesis.
Funciona como un potente agente inductor de la permeabilidad, un
agente quimiotáctico de células endoteliales, un factor de
supervivencia endotelial, y factor de proliferación de células
endoteliales (Thomas, 1996; Neufeld y otros, 1999). Se requiere su
actividad para el desarrollo embriónico normal (Fong y otros, 1995;
Shalaby y otros, 1995), ya que la alteración dirigida a uno de ambos
alelos del VEGF da lugar a letalidad embriónica (Carmeliet y otros,
1996; Ferrara y otros, 1996).
El VEGF es un factor importante que conduce a la
angiogénesis o vasculogénesis en numerosos procesos patológicos y
fisiológicos, incluyendo la curación de heridas (Frank y otros,
1995; Burke y otros, 1995), la retinopatía diabética (Alon y otros,
1995; Malecaze y otros, 1994), la psoriasis (Detmar y otros, 1994),
la aterosclerosis (Inoue y otros, 1998), la artritis reumatoide
(Harada y otros, 1998; Nagashima y otros, 1999), el crecimiento de
tumores sólidos (Plate y otros, 1994; Claffey y otros, 1996).
Una amplia variedad de células y tejidos producen
VEGF, que existe, como mínimo, en cinco isoformas (121, 145, 165,
189 y 206 aminoácidos) que son variantes de unión codificadas por el
mismo gen (Houck y otros, 1991; Ferrara y otros, 1991; Tischer y
otros, 1991). Las dos isoformas más pequeñas, 121 y 165, se secretan
de células (Houck y otros, 1991; Anthony y otros, 1994). El VEGF
secretado es un dímero obligado de entre 38 y 46 kDa en el que los
monómeros están unidos por dos enlaces disulfuro.
Los dímeros de VEGF se unen con una elevada
afinidad a dos receptores bien caracterizados, VEGFR1
(FLT-1) y VEGFR2 (KDR/Flk-1), los
cuales son expresados selectivamente en células endoteliales
(Flt-1 y Flk-1 son los homólogos del
ratón). La K_{d} de unión del VEGF al VEGFR1 y VEGFR2 es
15-100 pM y 400-800 pM,
respectivamente (Terman y otros, 1994). Una tercera proteína de
superficie celular identificada recientemente, la
neuropilina-1, también se une al VEGF con elevada
afinidad (Olander y otros, 1991; De Vries y otros, 1992; Terman y
otros, 1992; Soker y otros, 1998).
Los VEGFR1 y VEGFR2 son miembros de la familia de
receptores de tirosina quinasa (RTK III) del Tipo III que se
caracteriza por siete repeticiones extracelulares similares a IgG,
un dominio transmembrana de expansión única, y una hendidura
intracelular del dominio de tirosina quinasa (Mustonen y Alitalo,
1995). Hasta hace muy poco, se pensaba que el VEGFR1 y VEGFR2
estaban expresados casi exclusivamente en células endoteliales
(Mustonen y Alitalo, 1995). A pesar de que se ha conocido que el
VEGFR1 y VEGFR2 tienen diferentes funciones con respecto a la
estimulación de la proliferación, migración y diferenciación de
células endoteliales (Waltenberger y otros, 1994; Guo y otros,
1995), el papel preciso que cada receptor desarrolla en la biología
del VEGF y la homeostasis de células endoteliales no estaba
claramente definido anteriormente a la presente invención.
Estudios recientes que utilizan ratones
"knockout" han mostrado que cada VEGFR1 y VEGFR2 de VEGF es
esencial para la vasculogénesis, la angiogénesis y el desarrollo del
embrión (Fong y otros, 1995; Shalaby y otros, 1995; Hiratsuka y
otros, 1998). En estudios de "knockouts" letales, los fenotipos
asociados con la falta de cada receptor fueron diferentes. La
alteración dirigida del VEGFR2 dio lugar a un embrión al que le
faltaba la diferenciación de células endoteliales y fallaba en la
formación de islas de sangre del saco vitelino o en la
vasculogénesis (Shalaby y otros, 1995). Los mutantes nulos de VEGFR1
mostraron una vasculogénesis dañada, ensamblaje de células
endoteliales desorganizado, y vasos sanguíneos dilatados (Fong y
otros, 1995; Hiratsuka y otros, 1998). El VEGFR1, evidentemente,
tiene un papel biológico vital.
El VEGFR1 tiene una mayor afinidad por el VEGF
que el VEGFR2, a pesar de que tiene una actividad de tirosina
quinasa inferior. Esto sugiere que el dominio extracelular del
VEGFR1 es particularmente importante. Esta hipótesis fue apoyada
fuertemente por los resultados de estudios en ratones
"knockout" en los que el dominio de la tirosina quinasa del
VEGFR1 se eliminó a la vez que se dejaba el dominio de unión del
VEGF intacto (Hiratsuka y otros, 1998).
Además de los anteriores "knockouts" (Fong y
otros, 1995; Shalaby y otros, 1995), los estudios de Hiratsuka y
otros (1998) indican que el VEGFR1 tiene un papel biológico vital.
Sin embargo, la señalización de la tirosina quinasa no parece ser el
factor crítico. Es interesante apuntar que los macrófagos
procedentes del VEGFR1 de los ratones "knockout" no mostraron
quimiotaxis inducida por el VEGF (Hiratsuka y otros, 1998),
implicando así al VEGFR1 como el receptor responsable para la
mediación de esta importante respuesta biológica al VEGF.
Ciertos grupos han expuesto que el VEGFR2 es el
receptor de señalización dominante en la mitogénesis inducida por el
VEGF, y la permeabilidad (Waltenberger y otros, 1994; Zachary, 1998;
Korpelainen y Alitalo, 1998). El papel del VEGFR1 en la función de
la célula endotelial está mucho menos claro, a pesar de que las
funciones en la migración de macrófagos y la quimiotaxis se
documentaron en los estudios de Hiratsuka y otros (1998),
discutidos
anteriormente.
anteriormente.
Clauss y otros (1996) también expusieron que el
VEGFR1 tiene importantes papeles en la activación de monocitos y la
quimiotaxis. De hecho, las células del linaje de
macrófagos/monocitos expresan sólo VEGFR1, que es el receptor
responsable para mediar en el reclutamiento de monocitos y la
actividad procoagulante (Clauss y otros, 1996). La unión del VEGF
al VEGFR1 en monocitos y macrófagos también actúa mediante el
incremento del calcio intracelular y la inducción de la
fosforilación de tirosina (Clauss y otros, 1996).
Se cree que la unión del dímero del VEGF al
receptor del VEGF induce la dimerización del receptor. A
continuación, la dimerización del receptor causa la
autotransfosforilación de residuos de tirosina específicos, Y801 e
Y1175, e Y1213 e Y1333 en la parte intracelular del VEGFR2 y VEGFR1,
respectivamente. Esto conlleva a una cascada de transducción de la
señal, que incluye la activación de la fosfolipasa C\gamma
(PLC\gamma) y la fosfatidilinositol 3-quinasa
(PI3K) y un incremento de iones calcio intracelulares (Hood y
Meininger, 1998; Hood y otros, 1998; Kroll y Waltenberger,
1998).
Los fenómenos intracelulares corriente abajo en
la señalización inducida por el VEGF están menos claros, a pesar de
que algunos grupos han observado que el óxido nítrico (NO) se
produce tras la activación por el VEGF del VEGFR2 (Hood y Meininger,
1998; Hood y otros, 1998; Kroll y Waltenberger, 1998). La activación
del VEGFR2, pero no del VEGFR1, por el VEGF también se ha observado
que activa Src y la cascada de la Ras-MAP quinasa,
incluyendo las quinasas MAP, ERK 1 y 2 (Waltenberger y otros, 1994,
1996; Kroll y Waltenberger, 1997).
El papel del VEGFR1 en la función de la célula
endotelial está mucho menos claro, particularmente porque los
ratones deficientes de tirosina quinasa de Flt-1 son
viables y desarrollan vasos normales (Hiratsuka y otros, 1998). Se
ha sugerido que el papel biológico principal del VEGFR1 en el
endotelio es como una molécula de unión a ligando de no
señalización, o un receptor "reclamo" que puede ser necesario
para presentar el VEGF al VEGFR2.
La conexión entre el VEGF y las condiciones
angiogénicas patológicas ha impulsado varios intentos para bloquear
la actividad del VEGF. Éstos incluyen el desarrollo de ciertos
anticuerpos neutralizadores contra el VEGF (Kim y otros, 1992;
Presta y otros, 1997; Sioussat y otros, 1993; Kondo y otros, 1993;
Asano y otros, 1995). Los anticuerpos contra los receptores del VEGF
también se han descrito, tales como los descritos en las Patentes
U.S.A. No. 5.840.301 y 5.874.542 y, posterior a la presente
invención, en WO 99/40118. De hecho, las Patentes U.S.A. No.
5.840.301 y 5.874.542 sugieren que el bloqueo de los receptores
VEGFR, en lugar del propio VEGF, es ventajoso por varias
razones.
También se han dado a conocer construcciones del
receptor soluble (Kendall y Thomas, 1993; Aiello y otros, 1995; Lin
y otros, 1998; Millauer y otros, 1996), inhibidores de tirosina
quinasa (Siemeister y otros, 1998), estrategias antisentido,
aptámeros de ARN y ribozimas contra el VEGF o receptores del VEGF
(Saleh y otros, 1996; Cheng y otros, 1996; Ke y otros, 1998; Parry y
otros, 1999).
Se ha mostrado que la aplicación de varios
métodos inhibitorios es, como mínimo, algo efectiva en el bloqueo de
la angiogénesis y/o la supresión del crecimiento del tumor mediante
la interferencia con la señalización del VEGF. De hecho, se ha
mostrado que los anticuerpos monoclonales contra el VEGF inhiben el
crecimiento de xenoinjertos tumorales humanos y la formación de
ascitis en ratones (Kim y otros, 1993; Asano y otros, 1995; 1998;
Mesiano y otros, 1998; Luo y otros, 1998a; 1998b; Borgstrom y otros,
1996; 1998).
El anticuerpo A4.6.1 es un anticuerpo
anti-VEGF de alta afinidad capaz de bloquear la
unión del VEGF tanto a VEGFR1 como a VEGFR2 (Kim y otros, 1992;
Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1998). La mutagénesis de
barrido de alanina y la cristalografía de rayos X del VEGF enlazado
por el fragmento Fab del A4.6.1 mostró que el epítopo en el VEGF al
que el A4.6.1 se une está centrado alrededor de los aminoácidos
89-94. Este dato estructural demuestra que el A4.6.1
inhibe competitivamente el VEGF de la unión al VEGFR2, pero inhibe
el VEGF de la unión al VEGFR1 más probablemente por impedimento
estérico (Muller y otros, 1998; Keyt y otros, 1996).
El A4.6.1 es el anticuerpo
anti-VEGF neutralizante utilizado más extensivamente
en la literatura hasta la fecha. Se ha mostrado que inhibe el
crecimiento y la permeabilidad vascular inducida por el VEGF de una
variedad de tumores humanos en ratones (Brem, 1998; Baca y otros,
1997; Presta y otros, 1997; Mordenti y otros, 1999; Borgstrom y
otros, 1999; Ryan y otros, 1999; Lin y otros, 1999). El A4.6.1
también inhibe la formación de ascitis en un modelo de ratón de un
carcinoma ovárico humano bien caracterizado y la diseminación
tumoral en un modelo de ratón de metástasis reciente. El A4.6.1 se
ha humanizado recientemente mediante técnicas de exposición de fagos
monovalentes y se encuentra actualmente en la Fase I de las pruebas
clínicas como agente anticancerígeno (Brem, 1998; Baca y otros,
1997; Presta y otros, 1997).
A pesar de algunos éxitos en la técnica con
anticuerpos neutralizantes contra VEGF, los presentes inventores se
dieron cuenta de que nuevos anticuerpos, particularmente aquellos
con un modo de interacción definido de forma más precisa con VEGFR1
(FLT-1) y/o VEGFR2 (KDR/Flk-1),
serían beneficiosos por una serie de razones. Por ejemplo, el
desarrollo de anticuerpos anti-VEGF que bloquearan,
selectivamente, la interacción de VEGF con sólo uno de los dos
receptores VEGF, permitiría una disección más precisa de los
mecanismos activados por el VEGF en células que expresan tanto el
VEGFR1 como el VEGFR2.
Los presentes inventores creyeron que los
anticuerpos de una especificidad de epítopo definida que bloqueaban
la unión del VEGF a sólo un receptor (VEGFR2s), bien podían tener
beneficios clínicos dependiendo, por supuesto, del mantenimiento de
sus efectos inhibitorios en un entorno in vivo. Los estudios
de ratones "knockout" de Hiratsuka y otros (1998) muestran que
tanto el VEGFR1 como el VEGFR2 tienen papeles biológicos
importantes. Anteriormente a la presente invención, la falta de
agentes inhibitorios confeccionados y efectivos obstaculizó las
oportunidades auténticas para la intervención terapéutica enfocada a
la inhibición de los efectos mediados por el VEGF a través de sólo
uno de los dos receptores.
Los presentes inventores, primeramente,
desarrollaron un conjunto de nuevos anticuerpos
anti-VEGF que tienen varias propiedades y
especificidades de epítopo. Se proporcionan seis grupos de
hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales contra el complejo
VEGF:receptor (Flk-1) o contra el propio VEGF. Cinco
de los grupos de anticuerpos no interfieren con la unión del VEGF a
su receptor, mientras que uno bloqueaba esta interacción (grupo 2C3)
e inhibía el crecimiento de células endoteliales mediado por el
VEGF.
Actualmente, se prefieren anticuerpos de los
grupos 3E7, GV39M, y 2C3, todos ellos localizados selectivamente en
el tumor tras una inyección intravenosa en ratones con xenoinjertos
tumorales humanos, para el uso en marcaje, imagen y tratamiento de
la vasculatura o tejido conectivo de los tumores sólidos.
Los anticuerpos monoclonales de la presente
invención que reconocen el complejo VEGF:receptor se localizan
selectivamente en las células endoteliales del tumor tras la
inyección en ratones con xenoinjertos tumorales humanos. Los
anticuerpos monoclonales del grupo 2C3 se localizan claramente en el
tejido conectivo perivascular del tumor, y también en los vasos
tumorales circundantes.
Los anticuerpos que reconocen el extremo
N-terminal reaccionan con el VEGF enlazado al
receptor por ELISA. El GV39M y el 11B5 muestran una alta
especificidad para el VEGF enlazado al receptor, en contraposición
con el VEGF no enlazado al receptor. Presumiblemente, el epítopo
reconocido por el GV39M y el 11B5 en el extremo
N-terminal es conformacional y se crea cuando el
VEGF se une a su receptor. El hecho de que ambos anticuerpos sean
IgMs, y por tanto, grandes en tamaño, puede ser importante para su
selectividad hacia el complejo VEGF:
receptor.
receptor.
Los anticuerpos de extremo
anti-N-terminal no inhibían el
crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF. Esto
sugiere que el extremo N-terminal del VEGF no está
implicado en la interacción del receptor y que los anticuerpos
contra el extremo N-terminal del VEGF no interfieren
con la señalización mediada por el VEGF.
En contraste, el 2C3 inhibe el crecimiento de
células endoteliales mediado por el VEGF con un IC_{50} de 3nM.
Los estudios de unión de VEGF-^{125}I que utilizan
células endoteliales que expresan KDR (células ABAE) demostraron que
el 2C3 bloquea el VEGF de la unión con KDR de una manera dependiente
de concentración. De este modo, el 2C3 es capaz de neutralizar la
misma actividad in vitro del VEGF mediada por KDR (VEGFR2)
mediante la interferencia en la unión del VEGF con su receptor.
Los ensayos inmunohistoquímicos revelaron que el
GV39M, 11B5, 3E7 y 7G3 reaccionan, de forma moderada a fuerte, con
el endotelio vascular cuando se aplican directamente a las
secciones. El GV39M muestra la mayor especificidad para las células
endoteliales tumorales con, comparativamente, poca tinción de
células tumorales o tejido conectivo. El 11B5, 3E7 y 7G3
preferencialmente tiñen células endoteliales cuando se aplican a
bajas concentraciones, pero tiñen claramente las células tumorales y
tejido conectivo a altas concentraciones.
El patrón de tinción observado con el 11B5, 3E7 y
7G3 es típico del tipo de tinción visto cuando se utilizan
anticuerpos policlonales contra el VEGF que no tienen preferencia
por una conformación particular del VEGF (Lin-Ke y
otros, 1996; Plate y otros, 1994; Claffey y otros, 1996). La tinción
selectiva del endotelio por el GV39M sugiere que se une al complejo
VEGF:receptor en estas células y es coherente con la localización en
las células endoteliales de los receptores y el hecho de que el
GV39M se une selectivamente a VEGF:sFlk-1 en un
ELISA.
De forma similar, los patrones de tinción más
amplios del 3E7 y 7G3 son coherentes con su capacidad para reconocer
tanto el VEGF libre como el enlazado al receptor. Sin embargo, se
esperaba que el 11B5 tuviera un patrón de tinción que fuera más
limitado al endotelio porque prefiere fuertemente el
VEGF:Flk-1 en la captura ELISA (ver Tabla 2). Es
posible que el 11B5 sea capaz de reconocer el VEGF que está enlazado
a los componentes del estroma, dándole un patrón de reactividad más
amplio en las secciones del tumor.
El 3E7 y GV39M se localizan selectivamente in
vivo en las células endoteliales vasculares del tejido tumoral,
mientras que el 2C3 se localiza en el tejido conectivo perivascular
de los tumores, además del endotelio. Veinticuatro horas después de
la inyección intravenosa al ratón con el tumor, el 3E7 no era
detectable en el endotelio de cualquier tejido excepto del tumor. El
GV39M, por otro lado, también se enlazó a células endoteliales o
células mesangiales en el glomérulo del riñón. La razón de la
reactividad del GV39M con los glomérulos del riñón del ratón no está
clara. Podría ser que el anticuerpo se une al complejo VEGF:receptor
en las células endoteliales normales en el riñón (Takahashi y otros,
1995). Sin embargo, los estudios de localización en cobayas con
tumores de la Línea 10 singeneicos han mostrado que el GV39M se
localiza en los vasos sanguíneos del tumor pero no en el glomérulo o
en vasos de otros tejidos normales.
La capacidad del 3E7 y el GV39M para localizarse
específicamente en el endotelio tumoral es probablemente el
resultado de, como mínimo, dos factores. Primero, el complejo
VEGF:receptor es relativamente abundante en los vasos sanguíneos del
tumor porque el microentorno hipóxico del tumor estimula la
expresión del VEGF por células tumorales y la expresión del receptor
del VEGF por células endoteliales. Segundo, los vasos sanguíneos del
tumor son más permeables que los vasos sanguíneos normales (Yuan y
otros, 1996), lo cual puede permitir al anticuerpo un mayor acceso
al complejo VEGF:receptor, que parece estar concentrado en la cara
abluminal de los vasos (Lin-Ke y otros,1996; Hong y
otros, 1995).
En un estudio previo por Lin-Ke y
colegas (1996), se encontró que anticuerpos policlonales de conejo
dirigidos contra el extremo N-terminal de VEGF de
rata se localizaban en células endoteliales del tumor tras la
inyección en ratones con carcinoma mamario de ratón TA3/St o
carcinoma ovárico MOT. En contraste, un anticuerpo policlonal de
conejo (Ab-618) dirigido contra la proteína del VEGF
completa no se localizó específicamente en células endoteliales en
estos tumores o en cualquier parte de los propios tumores.
Basándose en estos resultados,
Lin-Ke y otros (1996) concluyeron que el extremo
N-terminal del VEGF tiene la capacidad de unir
anticuerpos después de que el VEGF se haya asociado con el endotelio
microvascular y que el conjunto de VEGF libres o asociados con
células no endoteliales no es suficiente para concentrar anticuerpos
anti-VEGF dirigidos contra epítopos que no están en
el extremo N-terminal (Lin-Ke y
otros, 1996). Los presentes resultados con 3E7 y GV39M, dirigidos
contra el extremo N-terminal del VEGF, apoyan estas
conclusiones.
Sin embargo, los descubrimientos de la presente
invención que anticuerpos del grupo 2C3, dirigidos contra epítopos
que no se encuentran en el extremo N-terminal del
VEGF, se localizan tanto en la vasculatura como en el tejido
conectivo perivascular de tumores sólidos en ratones, son
remarcablemente sorprendentes sobre el trabajo de
Lin-Ke y otros (1996). La presente invención sugiere
que "una reserva" de VEGF está presente en el estroma tumoral
y, efectivamente, permite la concentración de 2C3 en la masa
tumoral. Tal marcaje del estroma tumoral como célula diana no se
podría haber predicho a partir de un estudio de publicaciones
anteriores. Los inventores contemplan que el VEGF pueda unirse a
proteoglicanos de sulfato de heparán (HSPGs) en el interior del
tumor, a pesar de que no es ciertamente necesario entender el
mecanismo de acción para realizar la presente invención.
Una rápida conclusión de la presente invención es
que los anticuerpos de los grupos GV39M y 3E7 se localizan
selectivamente en las células endoteliales del tumor en ratones,
mientras que los anticuerpos del grupo 2C3 se localizan en las
células endoteliales del tumor y en el tejido conectivo perivascular
del tumor. Puesto que la distribución del VEGF y sus receptores son
similares en el ratón y el hombre, se contempla que estos
anticuerpos muestren patrones similares de localización en pacientes
con cáncer. De este modo, el GV39M y el 3E7 se prevén para el uso en
la liberación de agentes de diagnóstico o terapéuticos en la
vasculatura tumoral en el hombre, mientras que los anticuerpos del
grupo 2C3 se contemplan como vehículos para dirigir los agentes de
diagnóstico o terapéuticos a la vasculatura tumoral y el tejido
conectivo tumoral.
Estudios avanzados sobre los anticuerpos del
grupo 2C3 revelaron incluso propiedades más sorprendentes, dando
lugar a las composiciones y usos efectivos de la presente
invención.
Un descubrimiento importante de la presente
invención, hecho utilizando ELISA, ensayos de unión al receptor y
ensayos de activación del receptor, es que los anticuerpos
monoclonales del grupo 2C3 bloquean selectivamente la interacción
del VEGF con VEGFR2 (KDR/Flk-1), pero no con VEGFR1
(FLT-1). Los anticuerpos 2C3 inhiben la
fosforilación, inducida por el VEGF, del VEGFR2 y bloquean la
permeabilidad inducida por el VEGF, implicando al VEGFR2 como el
receptor responsable de la permeabilidad inducida por el VEGF. Los
anticuerpos 2C3 también tienen una actividad antitumoral potente,
obstaculizando el crecimiento de varios tumores sólidos humanos
establecidos en modelos de animales de cáncer humano aceptados en la
técnica.
Estos descubrimientos demuestran la utilidad del
2C3 en diseccionar los mecanismos que son activados por el VEGF en
células que expresan tanto el VEGFR1 como el VEGFR2, al igual que
destacan la importancia de la actividad del VEGFR2 en el proceso de
crecimiento y supervivencia del tumor. De forma más importante,
proporcionan un modo único de intervención terapéutica, permitiendo
la inhibición específica de la angiogénesis inducida por el
VEGFR-2, sin la inhibición concomitante de la
quimiotaxis de macrófagos, la función de osteoclastos y
condroclastos (mediada por el VEGFR1).
De este modo, los descubrimientos respecto al 2C3
proporcionan, por primera vez, la motivación y los medios para
fabricar y utilizar anticuerpos anti-VEGF que
inhiban la unión del VEGF sólo al VEGFR2, y no al VEGFR1. Tales
anticuerpos, sucintamente denominados "anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2", representan
un avance en el sector y proporcionan numerosas ventajas, tanto en
términos de usos en formas "desnudas" o no conjugadas, como
cuando se conjugan o se asocian con otros agentes terapéuticos.
Los estudios de unión in vitro de la
presente invención, empleando ELISA y ensayos de coprecipitación con
proteínas de receptor purificadas, demostraron que el 2C3 bloquea la
unión del VEGF al VEGFR2. Sorprendentemente, el 2C3 no inhibió, sin
embargo, la unión del VEGF al VEGFR1 en ningún sistema de ensayo.
Para confirmar los resultados iniciales, se repitieron ELISAs de
unión en diferentes configuraciones. En cada configuración, los
resultados indicaron que el 2C3 no interfiere con la interacción
VEGF:VEGFR1. Como control para estos estudios se utilizó el
anticuerpo monoclonal 3E7, un anticuerpo dirigido contra el extremo
NH_{2}-terminal del VEGF, que no bloqueaba el VEGF
para la unión al VEGFR1 o al VEGFR2.
El grupo 2C3 de los anticuerpos de la presente
invención están, de este modo, significativamente mejorados respecto
a otros anticuerpos de bloqueo al VEGF, incluyendo el A4.6.1. El
anticuerpo anti-VEGF A4.6.1 bloqueaba la unión del
VEGF a ambos receptores del VEGF. Estudios cristalográficos y de
mutagénesis han mostrado que los epítopos de unión para el VEGFR2 y
el VEGFR1 se concentran hacia los dos polos simétricos del dímero
del VEGF (Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1997). Los
determinantes de la unión en el VEGF, que interaccionan con los dos
receptores, se superponen parcialmente y se distribuyen sobre cuatro
segmentos diferentes que se extienden por la superficie del dímero
(Muller y otros, 1998). El anticuerpo 4.6.1 se une a una región del
VEGF dentro de la región de unión al receptor de ambos receptores
(Muller y otros, 1998). Se propone que el 2C3 se une a una región
que se encuentra próxima al sitio de unión del VEGFR2, pero no al
sitio de unión del VEGFR1.
Los estudios sobre los efectos del 2C3 en la
fosforilación de los receptores inducida por el VEGF mostraron que
el 2C3 no bloquea la fosforilación del VEGFR2 inducida por el VEGF.
Esto también corresponde a los datos discutidos anteriormente y
solidifica aún más el papel del VEGFR2 en la proliferación inducida
por el VEGF.
De forma similar a los resultados de otros
estudios, no se pudo demostrar una fosforilación consistente del
VEGFR1 inducida por el VEGF (De Vries y otros, 1992; Waltenberger y
otros, 1994; Davis-Smyth y otros, 1996; Landgren y
otros, 1998). Por lo tanto, no se pudo juzgar de forma fiable si el
2C3 inhibe la fosforilación del VEGFR1 inducida por el VEGF. La baja
actividad del VEGF en la fosforilación del VEGFR1 ha llevado a otros
a sugerir que el VEGFR1 podría no ser un receptor de señalización en
células endoteliales, pero que podría actuar como un receptor de
reclamo para capturar el VEGF y amplificar su señalización a través
del VEGFR2 (Hiratsuka y otros, 1998). Sin embargo, se ha expuesto,
por Kupprion y otros (1998), la fosforilación de tirosina del VEGFR1
mediante la unión del VEGF utilizando células endoteliales
microvasculares humanas (HMEC) y, por Sawano y otros (1996),
utilizando células NIH 3T3 que sobreexpresan el VEGFR1.
Adicionalmente, Waltenberger y otros (1994) han demostrado que la
activación del VEGFR1 inducida por el VEGF se puede seguir
utilizando un ensayo de quinasa in vitro. El efecto del 2C3
en la fosforilación del VEGFR1 inducida por el VEGF, o la falta de
ésta, se podría determinar utilizando uno de los tipos de células
anteriores o un ensayo de quinasa in vitro.
Los datos de la presente ELISA de la Figura 2 y
los datos de la unión celular demuestran que los anticuerpos 2C3 no
bloquean completamente el VEGF en la unión con células que expresan
tanto el VEGFR1 como el VEGFR2. El hecho de que el 2C3 no bloquee la
unión del VEGF al VEGFR1 significa que los anticuerpos 2C3 serán
unas herramientas efectivas en la descripción del papel del VEGFR1
en la biología de las células endoteliales y de otro tipo de
células.
Utilizando el ensayo de permeabilidad de Miles en
cobayas, se examinaron las consecuencias funcionales de la
selectividad que el 2C3 muestra en el bloqueo del VEGF de la
activación de sus receptores. Tanto el 2C3 como el A4.6.1 inhibían
la permeabilidad inducida por el VEGF cuando la IgG estaba en, como
mínimo, un exceso molar de 10 veces sobre el VEGF. El 3E7 y los
anticuerpos de control no inhibían la permeabilidad inducida por el
VEGF incluso en un exceso molar de 1000 veces. Estos resultados
muestran que el VEGFR2 está implicado en la permeabilidad inducida
por el VEGF.
Este descubrimiento concuerda con informes
recientes de que una forma nueva de VEGF-C y dos
variantes VEGF-E derivadas de virus se unen al
VEGFR2 pero no al VEGFR1 y mantienen todavía la capacidad de mejorar
la permeabilidad vascular (Joukov y otros, 1998; Ogawa y otros,
1998; Meyer y otros, 1999). Probablemente las formas varias del VEGF
transmiten señales a través del VEGFR2 que causan la producción de
NO, que, sucesivamente, causa el incremento en la permeabilidad
vascular (Hood y Granger, 1998; Hood y otros, 1998; Kroll y
Waltenberger, 1998; Murohara y otros, 1998; Kupprion y otros, 1998;
Sawano y otros, 1996; Fujii y otros, 1997; Parenti y otros, 1998).
Esto apunta indirectamente a la implicación del VEGFR2, ya que se ha
mostrado la producción de NO como una consecuencia de la activación
del VEGFR2. Sin embargo, hay también algunas evidencias de lo
contrario, como Couper y otros (1997), que encontraron una fuerte
correlación entre el incremento de la permeabilidad vascular
inducida por el VEGF y la expresión del VEGFR1 in vivo.
El 2C3 inhibió el crecimiento de múltiples tipos
diferentes de tumores humanos in vivo. El efecto de 100
\mug de 2C3 administrado 2 veces/semana fue idéntico en ratones
con tumores de NSCLC NCI-H358 y rabdomiosarcoma
A673, en los que eficazmente limitó el crecimiento de los tumores a
un pequeño nódulo de aproximadamente 150 mm^{3} de tamaño. Se
observaron respuestas similares en otros modelos de tumores, tales
como HT29 y LS174T, ambos adenocarcinomas humanos de colon.
La magnitud de la supresión del crecimiento del
tumor por el 2C3 es similar a la expuesta por otros investigadores
utilizando diferentes anticuerpos anti-VEGF
neutralizantes (Asano y otros, 1998; Mesiano y otros, 1998). Un
anticuerpo monoclonal VEGFR2 anti-ratón de rata
también bloqueaba fuertemente el crecimiento de queratinocitos
humanos malignos en ratones a través de un mecanismo antiangiogénico
(Skobe y otros, 1997). La efectividad del 2C3, siendo similar a la
que otros investigadores han encontrado utilizando diferentes
anticuerpos anti-VEGF, además demuestra el papel del
VEGF en la angiogénesis tumoral y el crecimiento tumoral. Sin
embargo, el 2C3 debería proporcionar un efecto terapéutico más
seguro, basándose en sus propiedades inhibitorias específicas
discutidas en la presente.
Para analizar el efecto de la inhibición de la
actividad del VEGF en una situación cercana a las condiciones en
humanos, ratones en los que se habían establecido tumores se
trataron con 2C3. En esta situación, el tratamiento con 2C3
ralentizó significativamente el crecimiento de dos tumores humanos
agresivos, los tumores de rabdomiosarcoma A673 y adenocarcinoma de
colon LS174T. Los anticuerpos 2C3 causaron regresiones
significativas del tumor en ratones con tumores NSCLC
NCI-H358.
Los tumores tratados con 2C3 o A4.6.1 tuvieron
una regresión al 30% y 35%, respectivamente, de su tamaño original
después de aproximadamente 10 semanas de tratamiento. En un estudio
donde se permitió extender el tratamiento pasados 100 días, se
observaron incluso unas regresiones más significativas. Los
resultados sugieren que el VEGF proporciona algo más que una simple
señal mitótica para el endotelio tumoral.
El hecho de observar regresiones, en lugar de
estasis tumorales, sugiere que el VEGF proporciona algo más que una
simple señal angiogénica para el endotelio tumoral. Benjamin y otros
(1999) recientemente expusieron que los tumores contienen una amplia
fracción de vasos sanguíneos inmaduros, que aún tienen que
establecer contacto con células periendoteliales, y que estos vasos
sanguíneos dependen del VEGF para sobrevivir. Es posible que la
neutralización de VEGF provoque que estos vasos sanguíneos inmaduros
experimenten apoptosis, reduciendo así la existencia de una red
vascular en el tumor. También es posible que tenga lugar un proceso
dinámico de remodelación vascular en los tumores, implicando tanto
la formación como la regresión de vasos, y que la neutralización de
VEGF prevenga la formación de vasos llevando a un desplazamiento de
la red hacia la regresión de vasos.
El descubrimiento de que el 2C3 suprimía el
crecimiento tumoral de forma tan completa como el A4.6.1 (si no más)
indica un papel dominante para el VEGFR2 en la angiogénesis tumoral.
El proceso con multietapas de la angiogénesis requiere la
quimiotaxis de células endoteliales, la producción, invasión,
proliferación y diferenciación de metaloproteinasas. El VEGFR1 puede
que no tenga un papel en estos procesos, o puede ayudar en estos
procesos mediante la unión del VEGF y presentándolo al receptor de
señalización, VEGFR2.
Las cifras comparables para el 2C3 y el A4.6.1 en
el tratamiento tumoral son altamente relevantes: el 2C3 es
ligeramente más efectivo que el A4.6.1, a pesar de que sólo se une
al VEGFR2 y no al VEGFR1. Los presentes estudios, por tanto, indican
que el VEGFR1 no juega un papel importante en la angiogénesis
tumoral mediada por el VEGF, y además sugieren que los inhibidores
específicos del VEGFR1 pueden no tener influencia en la angiogénesis
tumoral. Estos resultados también indican que el 2C3 puede ser igual
o más efectivo que el A4.6.1, a la vez que causa menos efectos
colaterales.
La capacidad de bloquear específicamente la unión
del VEGF a VEGFR2 y la activación del mismo tiene una importancia en
dos áreas de relevancia clínica. Primero, se cree que el VEGFR1
(Flt-1) juega un papel importante en el
reclutamiento de macrófagos y monocitos en el interior del tumor, ya
que estas células expresan el VEGFR1 y responden quimiotácticamente
al VEGF a través de la señalización del VEGFR1 (Clauss y otros,
1996; Hiratsuka y otros, 1998; Akuzawa y otros, 2000). Tras la
activación de macrófagos, se estimula la transcripción del gen del
flt-1 a través de una inducción de
Egr-1, que se une a los sitios de unión del factor
de transcripción Egr-1/Sp1 superpuestos en el
promotor flt-1 humano, proporcionando la evidencia
de que el gen del flt-1 es una diana directa de
Egr-1, el factor de transcripción inducido
principalmente en la diferenciación de macrófagos (Akuzawa y otros,
2000).
Para mantener la activación de macrófagos, tal
como se requiere para producir una respuesta antitumoral rigurosa,
se debería evitar la inhibición de la señalización de VEGFR1. El
bloqueo específico de VEGFR1, permitido por la presente invención,
de este modo, proporciona ventajas importantes sobre el A4.6.1 en la
terapia tumoral, ya que la infiltración de macrófagos no se
disminuirá, permitiendo a estas células eliminar los restos de
células tumorales de tumores necróticos y provocar la reducción del
tumor. La utilización de anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2, tal como el 2C3, también permitirá la
infiltración de macrófagos para contribuir al efecto antitumoral
completo por tener un efecto citocidal directo en las células
tumorales.
De hecho, la presente invención proporciona
únicamente agentes ventajosos para el uso en todas las formas de
terapia antiangiogénica, debido a su capacidad de bloquear la
actividad angiogénica del VEGF, pero no de inhibir otras acciones
beneficiosas del VEGF, mediadas a través del VEGFR1, tales como
aquellas en células óseas o inmunes. Una segunda área de importancia
clínica afecta la capacidad de los anticuerpos, preparados de
acuerdo con la presente invención, para funcionar in vivo sin
inhibir los efectos beneficiosos de los osteoclastos y
condroclastos. Esto significa que el uso de los presentes agentes
terapéuticos de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2, incluyendo el 2C3, no se asociará con efectos colaterales en
huesos y/o cartílagos.
Los estudios in vivo han mostrado que el
VEGF acopla la remodelación de cartílago hipertrófico, la
osificación y la angiogénesis durante la formación de hueso
endocondral y que el VEGF es esencial para la remodelación del
cartílago (Gerber y otros, 1999). Se observó que la inactivación de
la señalización del VEGF a través del VEGFR1, mediante la
administración de la proteína quimérica soluble del receptor VEGFR1
(Flt-(1-3)-IgG), perjudicaba la
formación de hueso trabecular y la expansión de la zona de
condrocitos hipertróficos mediante la disminución del reclutamiento
y/o diferenciación de condroclastos (Gerber y otros, 1999).
También se ha mostrado que el VEGF puede
sustituir al factor de estimulación de colonias de macrófagos
(M-CSF) en el apoyo de la función de los
osteoclastos in vivo (Niida y otros, 1999). En estudios que
utilizan ratones osteopetróticos (op/op), con una deficiencia en
osteoclastos resultante de una mutación en el gen del
M-CSF, una inyección de M-CSF humano
recombinante (rhM-CSF) permite el reclutamiento y la
supervivencia de osteoclastos. En estudios recientes, se mostró que
una única inyección de VEGF humano recombinante puede inducir de
forma similar el reclutamiento de osteoclastos en ratones op/op
(Niida y otros, 1999).
Niida y otros (1999) expusieron que, como los
osteoclastos predominantemente expresan el VEGFR1, y que la
actividad del factor de crecimiento 1 de placenta humana
recombinante en el reclutamiento de osteoclastos era comparable a la
del rhVEGF, los efectos beneficiosos de la señalización del VEGF en
ratones osteopetróticos (op/op) son mediados a través del receptor 1
del VEGF (VEGFR-1). Estos autores, además, mostraron
que los osteoclastos inducidos por el rhM-CSF
murieron después de que el VEGF fuera inhibido (utilizando una
proteína quimérica del receptor VEGFR1, VEGFR1/Fc), pero que tales
efectos se anularon mediante inyecciones concomitantes de
rhM-CSF. Los osteoclastos mantenidos por el
rhM-CSF o el VEGF endógeno no mostraron diferencias
significativas en la actividad in vivo (Niida y otros,
1999).
Ratones op/op mutantes experimentan una
resolución de osteopetrosis relacionada con la edad acompañada por
un incremento en el número de osteoclastos. En los estudios de Niida
y otros (1999), la mayoría de osteoclastos desaparecieron después de
las inyecciones del anticuerpo anti-VEGF,
demostrando que el VEGF producido endógenamente es el responsable de
la aparición de osteoclastos en los ratones mutantes. Además, el
rhVEGF reemplazó al rhM-CSF en el apoyo de la
diferenciación de osteoclastos in vitro. Estos resultados
demuestran que el M-CSF y el VEGF tienen funciones
superpuestas en el apoyo de la función del osteoclasto y que el VEGF
actúa a través del receptor VEGFR-1 (Niida y otros,
1999).
Se puede concluir de este modo, que el 2C3, el
primero de los anticuerpos anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 de la presente invención, no bloquea el VEGF de la unión y
activación del VEGFR1, pero sí bloquea el VEGF de la unión y
activación del VEGFR2. Los efectos antitumorales de tal inhibición
del VEGFR2 están claramente demostrados. Estos resultados muestran
que el VEGFR2 es el receptor del VEGF que media en la permeabilidad
y destaca su papel en la angiogénesis tumoral. La presente
invención, por tanto, valida además la inhibición del VEGF como
terapia para el tratamiento de tumores sólidos. De forma más
importante, la presente invención proporciona un conjunto de nuevos
anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales
como aquellos basados en 2C3, para la intervención terapéutica y, en
particular, para el uso como fármacos seguros y efectivos para la
inhibición de la angiogénesis en tumores y otras enfermedades.
Los beneficios de la presente invención no se
limitan a la ausencia de efectos colaterales. A pesar de que éstas
son características importantes que tendrán notables beneficios,
particularmente en el tratamiento infantil y en pacientes con
desórdenes óseos, los anticuerpos de la presente invención tienen
otras numerosas ventajas.
Por ejemplo, los conjugados de anticuerpos
basados en los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores
de VEGFR2 o en los anticuerpos 2C3, se pueden utilizar para liberar
agentes terapéuticos al medio tumoral. De hecho, en la presente se
muestran los anticuerpos 2C3 para unirse tanto a la vasculatura
tumoral como al estroma tumoral tras la administración in
vivo, pero no para unirse a la vasculatura o al tejido conectivo
en órganos o tejidos normales. Las construcciones terapéuticas
basadas en los presentes anticuerpos, por tanto, tienen la ventaja
de combinar dos funciones dentro de una molécula: las propiedades
antiangiogénicas del anticuerpo o un fragmento de éste y las
propiedades del agente terapéutico seleccionado para el
acoplamiento.
Como el VEGFR2 es el receptor clave en el
endotelio, el bloqueo de la unión del VEGF al VEGFR2 es crítico para
un efecto antiangiogénico. A pesar de que el VEGFR1 se expresa en el
endotelio, no es transductor de señal, o es pasivo, en este
contexto. Por lo tanto, la incapacidad de los anticuerpos de la
presente invención de bloquear la unión del VEGF al VEGFR1 no tiene
consecuencias en su efectividad como agentes antiangiogénicos y
antitumorales. De hecho, en lugar de inhibir la unión del VEGF al
VEGFR1, que tiene lugar con los anticuerpos bloqueadores de los
trabajos anteriores, la capacidad de los presentes anticuerpos de
unirse al VEGF y además no perturbar sustancialmente las
interacciones VEGF-VEGFR1 mejora las propiedades de
liberación de fármacos de estos nuevos anticuerpos.
Los presentes inventores se dieron cuenta de que
incluso se esperaría que los anticuerpos bloqueadores funcionaran
para liberar agentes terapéuticos al medio tumoral mediante la unión
al VEGF localizado en el tumor que no está unido a un receptor.
Específicamente, entendieron que tales anticuerpos se unirán al VEGF
en el estroma tumoral y liberarán agentes terapéuticos al mismo.
Esto proporciona una reserva de fármaco alrededor del endotelio,
causando efectos citotóxicos u otros destructivos en las células
endoteliales vasculares y ejerciendo un efecto antitumoral.
El VEGF asociado con el estroma o el tejido
conectivo no está enlazado al receptor del VEGF en el sentido
clásico, es decir, un receptor de superficie celular. Más bien, el
VEGF está enlazado a uno o más componentes del tejido conectivo,
incluyendo proteoglicanos, tal como el proteoglicano de sulfato de
heparán, a través de una región básica del VEGF. Estas secuencias (y
los exones que las codifican) faltan en la proteína VEGF121 (y el
subyacente ADN), así que esta isoforma no debería estar presente en
el estroma en cantidades significativas. El VEGF en el estroma
tumoral se denomina frecuentemente "libre", a pesar de que está
localizado en el interior del tumor, así que "libre"
esencialmente significa no unido a un receptor.
Los inventores además dedujeron que un anticuerpo
que bloquea la unión del VEGF a uno, pero no ambos receptores, sería
incluso capaz de liberar agentes terapéuticos al medio tumoral
mediante la unión al VEGF unido al receptor en la vasculatura. Esta
es una de las características más ventajosas de la presente
invención. Concretamente, el suministro de anticuerpos que bloquean
la unión del VEGF al VEGFR2, y, por tanto, que inhiben la señal
angiogénica del VEGF, pero que no bloquean la unión del VEGF al
VEGFR1. Además de reducir los efectos colaterales sistémicos
mediante el mantenimiento de la señalización del VEGF a través del
VEGFR1 en otros tipos de células y tejidos, estos anticuerpos son
capaces de localizarse en el complejo VEGF-VEGFR1 en
la vasculatura tumoral y liberar los agentes terapéuticos
directamente a ésta.
Tanto el VEGFR1 como el VEGFR2 se regulan a la
alta en las células endoteliales del tumor, en contraposición a las
células endoteliales en tejidos normales. El VEGFR1 se expresa de
forma elevada en el endotelio vascular tumoral, lo cual hace que los
aspectos de marcaje de dianas de la presente invención sean
particularmente efectivos. De hecho, el VEGFR1, a pesar de "no
señalizar" en el endotelio, se expresa, como mínimo, en los
mismos niveles que el VEGFR2, si no a niveles más elevados. Un
factor subyacente de este fenómeno es que el VEGFR1 se regula a la
alta en respuesta tanto a la hipoxia como al VEGF, mientras que el
VEGFR2 sólo se regula a la alta en respuesta al VEGF y no está
influido por la hipoxia.
A pesar de que el papel del VEGFR1 en el
endotelio permanece incierto, el VEGFR1 puede actuar como un
receptor reclamo para "capturar" el VEGF y pasar el ligando al
receptor de señalización, VEGFR2. Para que esto sea cierto, se puede
esperar que el receptor reclamo tenga una mayor afinidad por el VEGF
que por el receptor de señalización, que es, de hecho, el caso. A la
luz de esto, y quizás también debido a los niveles de expresión
mejorados, los anticuerpos bloqueadores de VEGFR2, no bloqueadores
de VEGFR1 de la presente invención son agentes liberadores ideales
para el tratamiento tumoral. Los conjugados terapéuticos de estos
anticuerpos son capaces de inhibir, simultáneamente, la angiogénesis
a través del VEGFR2 y de destruir la vasculatura existente mediante
la liberación de un agente terapéutico al complejo
VEGF-receptor VEGFR1.
Los inventores no se limitan de ninguna manera al
razonamiento científico anterior como explicación para las
propiedades de localización del tumor y antiangiogénicas
beneficiosas de los presentes anticuerpos. A pesar de que la
utilidad de la presente invención es de por sí evidente y no
necesita una subyacente teoría para ponerla en práctica, los
inventores han considerado mecanismos alternativos mediante los
cuales los anticuerpos bloqueadores de VEGFR2, no bloqueadores de
VEGFR1 pueden localizarse de manera efectiva y específica en la
vasculatura tumoral.
Tales anticuerpos se podrían unir al VEGF que
está asociado con Npn-1 u otra proteína de unión del
VEGF, no caracterizada hasta ahora en la superficie celular o se
podría unir al VEGF que está enlazado a proteoglicanos de sulfato de
heparán en la superficie de células endoteliales. La localización
del anticuerpo también se podría mejorar mediante la unión a otro
miembro de la familia de proteínas del VEGF, es decir,
VEGF-B, VEGF-C,
VEGF-D, que se asocian con los vasos sanguíneos, a
pesar de que esto es menos probable.
Otra propiedad ventajosa de los anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, ó 2C3 de la
presente invención es que estos anticuerpos neutralizan la señal de
supervivencia o "efecto protector" del VEGF, que es mediada a
través del VEGFR2. Además de hacer a los propios anticuerpos más
efectivos, esta propiedad los hace particularmente útiles en
combinación con otros agentes que se obstaculizan por la función de
supervivencia del VEGF.
Por ejemplo, el VEGF protege el endotelio de la
radioterapia. Por lo tanto, tanto los anticuerpos desnudos como los
inmunoconjugados de la presente invención son ideales para el uso en
combinación con radioterapia. Mediante el uso de tales anticuerpos
acoplados al agente radioterapéutico se proporcionan incluso más
beneficios. Este tipo de construcción tendría la triple ventaja de:
(1) ejercer un efecto antiangiogénico a través de la parte de
anticuerpo; (2) ejercer un efecto destructivo de la vasculatura
tumoral a través de la liberación del agente radioterapéutico, y (3)
impedir a la señal de supervivencia habitual del VEGF contrarrestar
los efectos del agente radioterapéu-
tico.
tico.
Otras construcciones con efectos sinergísticos
similares son los anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2 en asociación con fármacos o profármacos
antitubulina, agentes antiapoptópicos y otros agentes
antiangiogénicos. Las acciones de agentes o fármacos que causan
apoptosis están antagonizadas por el VEGF. La presente invención,
por tanto, mejora la efectividad de tales agentes mediante la
neutralización del VEGF. Las señales de superviviencia del VEGF
también se oponen a la endostatina, limitando esta terapia. Por lo
tanto, en un uso combinado con endostatina, los anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 ó 2C3 de la
presente invención neutralizarán el VEGF y amplificarán los efectos
antitumorales de la endostatina. El 2C3 u otros anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 también se pueden
utilizar para liberar específicamente colagenasa al tumor, donde la
colagenasa producirá endostatina in situ, consiguiendo
beneficios similares.
En todas estas combinaciones mejoradas o
sinergísticas, los anticuerpos y otros agentes se pueden administrar
separadamente, o los segundos agentes se pueden unir a los
anticuerpos para una liberación específica (es decir, liberación
dirigida al VEGFR1). En combinaciones con endostatina, se preferirán
conjugados químicos o proteínas de fusión recombinantes, ya que
contrarrestarán la corta vida media de la endostatina, que es,
actualmente, una limitación de la terapia con endostatina potencial.
También se pueden emplear combinaciones con activadores del
plasminógeno del tejido (tPA), o formas diana del mismo.
Algunas ventajas adicionales de los agentes
terapéuticos de la presente invención incluyen la capacidad de
disminuir la presión intersticial. Como la permeabilidad
incrementada mediada por el VEGF contribuye a la presión
intersticial, la señalización reducida a través del VEGFR2 reducirá
tanto la permeabilidad como la presión intersticial. Esto,
sucesivamente, reducirá la barrera para que los fármacos atraviesen
completamente el tejido tumoral, de manera que se puedan eliminar
las células tumorales alejadas de la vasculatura. Se puede conseguir
una terapia prolongada ya que las presentes composiciones no tienen
inmunogenicidad o es negligible o es baja.
El término "variable", como se usa en la
presente en referencia a los anticuerpos, significa que ciertas
partes de los dominios variables difieren ampliamente en la
secuencia entre anticuerpos, y se utilizan en la unión y
especificidad de cada anticuerpo particular a su antígeno
particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye
uniformemente a lo largo de los dominios variables de los
anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados "regiones
hipervariables", ambos en los dominios variables de cadena ligera
y de cadena pesada.
Las partes de los dominios variables más
altamente conservadas se denominan la región de armazón (FR). Los
dominios variables de cadenas ligeras o pesadas nativas comprenden
cada uno cuatro FRs (FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente),
adoptando mayoritariamente una configuración de lámina \beta,
conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que
conectan, y en algunos casos, forman parte de la estructura de
lámina \beta.
Las regiones hipervariables en cada cadena se
mantienen juntas en una proximidad cercana por los FRs y, con las
regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la
formación de los sitios de unión al antígeno de los anticuerpos
(Kabat y otros, 1991, referencia). Los dominios constantes no están
directamente implicados en la unión de un anticuerpo a un antígeno,
pero exhiben varias funciones efectoras, tal como la participación
del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de
anticuerpo.
El término "región hipervariable", como se
usa en la presente, se refiere a los residuos de aminoácidos de un
anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región
hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región
determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir,
residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y
89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena
ligera y 31-35 (H1), 50-56 (H2) y
95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena
pesada; (Kabat y otros, 1991) y/o aquellos residuos de un "bucle
hipervariable" (es decir, residuos 26-32 (L1),
50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el
dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1),
53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el
dominio variable de la cadena pesada). Los residuos del
"armazón" o "FR" son aquellos residuos del dominio
variable diferentes a los residuos de la región hipervariable como
en la presente se define.
El ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas
de las cadenas Vh y V_{\kappa} del fragmento ScFv del 2C3 se
proporcionan en la presente como SEQ ID NO: 6, 7, 8 y 9. Estas
secuencias abarcan la CDR1-3 de las regiones
variables de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo.
Como se describe en la presente (Sección C3), con
el suministro de información estructural y funcional para una
molécula biológica, se puede generar un conjunto de moléculas
equivalentes o incluso mejoradas. Esto se aplica a los anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 de la presente
invención, como se ejemplifica por los anticuerpos 2C3. Aunque deben
conservarse las propiedades de un anticuerpo de unión al antígeno y
otras propiedades funcionales, existe un grado extremadamente
elevado de habilidad en la técnica de fabricar anticuerpos
equivalentes e incluso mejorados una vez se ha proporcionado un
anticuerpo de referencia. Tales habilidades técnicas se pueden, a la
luz de las secuencias y la información proporcionada en la presente,
aplicar a la producción de más anticuerpos que tengan
características parecidas, mejoradas o cualquiera que se desee.
Para los anticuerpos equivalentes, ciertos
aminoácidos pueden sustituir a otros aminoácidos en las regiones de
armazón del dominio variable o constante del anticuerpo, sin una
pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva. Es
preferible que tales cambios se hagan en las secuencias del ADN que
codifican las partes del anticuerpo y que los cambios se conserven
en la naturaleza (ver Sección C3, la información del codón en la
Tabla A, y los detalles técnicos de soporte en la mutagénesis
específica de sitio). Naturalmente, no existe un límite del número
de cambios que deberían hacerse, pero esto ya se sabrá por aquellos
con una habilidad normal en la técnica.
Otros tipos de variantes son los anticuerpos con
propiedades biológicas mejoradas respecto al anticuerpo parental del
cual se generan. Tales variantes, o compuestos de segunda
generación, son normalmente variantes sustitutivas que implican uno
o más residuos sustituidos de la región hipervariable del anticuerpo
parental. Una forma conveniente de generar tales variantes
sustitutivas es la maduración de afinidad utilizando la exposición
de fagos.
En la maduración de afinidad utilizando la
exposición de fagos, se mutan varios sitios de la región
hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar
todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las
variantes del anticuerpo generadas de este modo se exponen de un
modo monovalente de partículas de fago filamentosas como fusiones al
gen III producto del M13 empaquetado en el interior de cada
partícula. A continuación, se someten a screening las variantes
expuestas de los fagos para su actividad biológica (por ejemplo, la
afinidad de unión) como se da a conocer en la presente. Para
identificar sitios de la región hipervariable candidatos para la
modificación, se puede llevar a cabo una mutagénesis de barrido de
alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que
contribuyen significativamente a la unión al antígeno.
Alternativamente, o adicionalmente, se contempla
que la estructura cristalina del complejo
anticuerpo-antígeno se describa y analice para
identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el VEGF.
Tales residuos de contacto y residuos próximos son candidatos para
la sustitución. Una vez se generan dichas variantes, se somete el
panel de variantes a screening, tal como se describe en la presente,
y se seleccionan los anticuerpos con propiedades análogas, pero
diferentes o incluso superiores, en uno o dos ensayos relevantes
para el posterior desarrollo.
Aspectos adicionales de la presente invención,
por tanto, tienen que ver con segmentos de ADN aislados y vectores
recombinantes que codifican las regiones CDR de las cadenas ligeras
y pesadas del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2, tales como las cadenas ligeras y pesadas del 2C3, y la
creación y el uso de células huésped recombinantes a través de la
aplicación de la tecnología del ADN, que expresan dichas regiones
CDR.
La presente invención, de este modo, tiene que
ver con segmentos de ADN, aislables de cualquier mamífero,
preferiblemente, humano o murino, que son libres del ADN genómico
total y son capaces de expresar regiones CDR de las cadenas ligeras
y pesadas del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2, tales como las cadenas ligeras y pesadas del 2C3. Tal como
se usa en la presente, el término "segmento de ADN" se refiere
a una molécula de ADN que se ha aislado libre del ADN genómico total
de una especie particular. Incluidos dentro del término "segmento
de ADN", están segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de
dichos segmentos, y también vectores recombinantes, incluyendo, por
ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, y similares.
De forma similar, un segmento de ADN que
comprende un segmento de codificación o una parte del gen aislado
que codifica las regiones CDR purificadas de las cadenas ligeras y
pesadas del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2, tales como las cadenas ligeras y pesadas del 2C3, se refiere
a un segmento de ADN que incluye tales secuencias de codificación y,
en ciertos aspectos, secuencias reguladoras, aisladas
sustancialmente de otras secuencias que codifican proteínas o de
genes naturales. En este aspecto, el término "gen" se utiliza
por simplicidad para referirse a una unidad que codifica una
proteína funcional, un polipéptido o un péptido. Como se entenderá
por especialistas de la técnica, este término funcional incluye las
secuencias de codificación de anticuerpos nativas y los segmentos
creados más pequeños que expresan, o se pueden adaptar para
expresar, proteínas, polipéptidos o péptidos de unión al antígeno
adecuados.
"Aislada sustancialmente de otras secuencias de
codificación" significa que el segmento de codificación o parte
del gen aislada de interés, forma la parte significativa de la
región de codificación del segmento de ADN, y que el segmento de ADN
no contiene grandes partes del ADN de codificación natural, tal como
grandes fragmentos cromosómicos u otros genes funcionales o regiones
de codificación del ADNc. Por supuesto, esto se refiere al segmento
de ADN aislado originalmente, y no excluye genes o regiones de
codificación posteriormente añadidas al segmento por la mano del
hombre.
En realizaciones particulares, la invención tiene
que ver con segmentos de codificación aislados o partes de genes
aisladas y vectores que incorporan secuencias de ADN que codifican
regiones CDR de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, tales como las
cadenas ligeras y pesadas del 2C3, que comprenden, como mínimo, una
primera región de secuencias que incluye una región de secuencias de
aminoácidos de, como mínimo, un 75% aproximadamente, más
preferiblemente, como mínimo, un 80% aproximadamente, más
preferiblemente, como mínimo, un 85% aproximadamente, más
preferiblemente, como mínimo, un 90% aproximadamente, y todavía más
preferiblemente, como mínimo, un 95% aproximadamente o similar, de
identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9; en el que dichas regiones
CDR, como mínimo, mantienen sustancialmente las propiedades
biológicas de las regiones CDR de las secuencias de aminoácidos SEQ
ID NO:7 o SEQ ID NO:9.
Como se da a conocer en la presente, las
secuencias pueden comprender ciertos aminoácidos equivalentes
biológicamente funcionales o "sustituciones conservativas".
Otras secuencias pueden comprender aminoácidos no equivalentes
funcionalmente o "sustituciones no conservativas"
deliberadamente diseñadas para mejorar las propiedades de las CDR o
de los anticuerpos que contienen las CDR, como es conocido por
aquellos de habilidad normal en la técnica y descrito en profundidad
en la presente.
También se entenderá que las secuencias de
aminoácidos y de ácidos nucleicos pueden incluir residuos
adicionales, tales como aminoácidos adicionales N- o
C-terminales o secuencias 5' ó 3', y que incluso
correspondan a una secuencia de la presente invención, siempre y
cuando, la secuencia cumpla los criterios establecidos
anteriormente, preferiblemente que incluya el mantenimiento o mejora
de la actividad biológica de la proteína donde la expresión de la
proteína está involucrada. La adición de secuencias terminales
incluye secuencias de no codificación flanqueando las partes 3' ó 5'
de la región de codificación, y también de las regiones de
control.
Los segmentos de ácido nucleico de la presente
invención pueden, de este modo, combinarse con otras secuencias de
ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de
enzima de restricción adicional, sitios de clonación múltiple, otros
segmentos de codificación, y similares, tal que su longitud total
puede variar considerablemente. Se contempla, por tanto, que se
puede emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier
longitud, estando la longitud total preferida limitada por la
facilidad de la preparación y el uso en el protocolo del ADN
recombinante deseado.
Los vectores recombinantes, por tanto, forman
aspectos adicionales de la presente invención. Se contemplan como
vectores particularmente útiles aquellos vectores en los que la
parte de codificación del segmento de ADN se posiciona bajo el
control de un promotor. Generalmente, aunque no exclusivamente, se
empleará un promotor heterólogo o recombinante, es decir, un
promotor que no se asocia normalmente con secuencias de codificación
en su medio natural. Dichos promotores pueden incluir promotores
bacterianos, virales, eucarióticos y de mamífero, siempre y cuando,
el promotor dirija de forma efectiva la expresión del segmento de
ADN en el tipo de célula, organismo, o incluso animal, elegido para
la expresión.
El uso de combinaciones de promotor y de tipos de
células para la expresión de las proteínas es conocido por aquellos
con habilidad en la técnica de la biología molecular. Los promotores
empleados pueden ser constitutivos, o inducibles, y se pueden
utilizar bajo las condiciones apropiadas para dirigir una expresión
de alto nivel del segmento de ADN introducido, lo cual es ventajoso
en la producción a gran escala de proteínas o péptidos
recombinan-
tes.
tes.
La expresión de las secuencias de ácidos
nucleicos de la presente invención se puede conseguir
convenientemente mediante una o más técnicas estándares conocidas
por aquellos de habilidad normal en la técnica y descritas en
profundidad en la presente. Por ejemplo, la última descripción de la
expresión recombinante de las proteínas de fusión se aplica
igualmente bien a anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que no
están operativamente asociados con otras secuencias de codificación
al nivel del ácido nucleico.
Los medios para preparar y caracterizar
anticuerpos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
1988). Para preparar un antisuero policlonal, se inmuniza un animal
con un compuesto de VEGF inmunogénico, y se recoge el antisuero del
animal inmunizado. Se pueden utilizar un amplio número de especies
animales para la producción de antisuero. Normalmente el animal
utilizado para la producción de anti-antisuero es
un conejo, una rata, un hámster, una cobaya o una cabra. Debido al
volumen de sangre relativamente grande de los conejos, un conejo es
una elección preferida para la producción de anticuerpos
policlonales.
La cantidad de compuesto inmunógeno de VEGF
utilizado en la producción de anticuerpos policlonales varía según
la naturaleza del inmunógeno, así como del animal utilizado para la
inmunización. Se pueden utilizar una serie de vías para administrar
el presente inmunógeno de VEGF: subcutánea, intramuscular,
intradermal, intravenosa, intraperitoneal o intraesplénica. La
producción de anticuerpos policlonales se puede monitorizar mediante
la toma de muestras de sangre del animal inmunizado en varios puntos
tras la inmunización. Se puede administrar una segunda inyección
auxiliar. El proceso de refuerzo y valoración se repite hasta que se
consigue una cantidad de anticuerpo adecuada. Cuando se obtiene un
nivel de anticuerpos deseado, el animal inmunizado se puede
desangrar y el suero se aísla y se almacena. El animal también se
puede utilizar para general anticuerpos monoclonales.
Tal como se conoce en la técnica, la
inmunogenicidad de un compuesto particular se puede mejorar mediante
el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmune,
conocidos como adyuvantes. Algunos adyuvantes de ejemplo incluyen el
adyuvante de Freund completo, un estimulador no específico de la
respuesta inmune que contiene Mycobacterium tuberculosis
muerto; el adyuvante de Freund incompleto; y el adyuvante de
hidróxido de aluminio.
También puede ser deseable estimular el sistema
inmune del huésped, que se puede conseguir mediante la asociación
del VEGF con un transportador, o uniendo VEGF al mismo. Algunos
ejemplos de transportadores son la hemocianina extraída de lapa
(KLH) y la albúmina de suero bovino (BSA). También se pueden
utilizar como transportadores otras albúminas, tales como la
ovoalbúmina, la albúmina de suero de ratón o la albúmina de suero de
conejo. Tal como se conoce también en la técnica, un compuesto
administrado puede variar en su inmunogenicidad. Sin embargo, la
generación de anticuerpos contra el VEGF no es particularmente
difícil.
Varios métodos para la generación de anticuerpos
monoclonales (MAbs) también se conocen actualmente muy bien en la
técnica. Las técnicas de generación de anticuerpos monoclonales más
estándares, generalmente, empiezan con las mismas líneas que las
utilizadas para preparar anticuerpos policlonales (Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Una
respuesta de un anticuerpo policlonal se inicia mediante la
inmunización de un animal con un compuesto de VEGF inmunogénico y,
cuando se obtiene un nivel de anticuerpos deseado, el animal
inmunizado se puede utilizar para generar MAbs.
Los MAbs se pueden preparar fácilmente a partir
del uso de técnicas bien conocidas, tal como la ejemplificada en la
Patente U.S.A. No. 4.196.265. Normalmente, esta técnica implica
inmunizar un animal adecuado con el compuesto de VEGF inmunogénico
seleccionado. El compuesto inmunizante se administra de una manera
efectiva para estimular las células productoras de anticuerpos. Los
animales preferidos son roedores, tales como ratones y ratas, aunque
sin embargo, también es posible utilizar células de conejo, oveja y
rana. El uso de ratas puede proporcionar ciertas ventajas (Goding,
1986, pp. 60-61), pero se prefieren los ratones,
siendo el ratón BALB/c el más preferido ya que es el más utilizado
rutinariamente y generalmente da un mayor porcentaje de fusiones
estables.
Tras la inmunización, se seleccionan células
somáticas con el potencial para producir anticuerpos del VEGF,
específicamente linfocitos B (células B), para el uso en el
protocolo de generación de mAb. Estas células se pueden obtener de
biopsias de bazos, amígdalas o nódulos linfáticos, o de muestras de
sangre periférica. Se prefieren células de bazo y células de sangre
periférica, las primeras porque son una fuente rica de células
productoras de anticuerpos que están en la fase de división de
plasmablastos, y las últimas porque la sangre periférica es
fácilmente accesible. Frecuentemente, se habrán inmunizado un
conjunto de animales y se retirará el bazo de animal con la mayor
cantidad de anticuerpos y se obtendrán los linfocitos del bazo
mediante la homogenización del bazo con una jeringa. Normalmente, un
bazo procedente de un ratón inmunizado contiene aproximadamente de
5x10^{7} a 2x10^{8} linfocitos.
A continuación, se fusionan los linfocitos B
productores de anticuerpos anti-VEGF del animal
inmunizado con células de una célula de mieloma inmortal,
generalmente una de la misma especie que el animal que se inmunizó.
Las líneas de células de mieloma adecuadas para el uso en
procedimientos de fusión productores de hibridoma preferiblemente
son no productoras de anticuerpos, tienen una eficiencia de fusión
elevada, y las deficiencias enzimáticas que la deja entonces incapaz
de crecer en ciertos medios selectivos que apoyan el crecimiento de
sólo las células fusionadas deseadas (hibridomas).
Se puede utilizar cualquiera de una variedad de
células de mieloma, tal como se conoce por aquellos de habilidad en
la técnica (Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp.
75-83, 1984). Por ejemplo, allí donde el animal
inmunizado es un ratón, se puede utilizar
P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4
1, Sp210-AgI4, FO, NSO/U, MPC-11,
MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul;
para ratas, se puede utilizar R210.RCY3, Y3-Ag
1.2.3, IR983F, 4B210 o una de las líneas de células de ratón
anteriormente listadas; y U-266,
GM1500-GRG2,
LICR-LON-HMy2 y
UC729-6, son todas útiles en relación a fusiones de
células humanas.
Los métodos para generar híbridos de bazo
productor de anticuerpos o células de nódulo linfático y células de
mieloma normalmente comprenden mezclar células somáticas con células
de mieloma en una proporción 4:1, aunque la proporción puede variar
de 20:1 aproximadamente a 1:1 aproximadamente, respectivamente, en
presencia de un agente o agentes (químicos o eléctricos) que
provocan la fusión de las membranas celulares. Los métodos de fusión
que utilizan virus Sendai se han descrito por Kohler y Milstein
(1975; 1976; cada uno) y los que utilizan polietilenglicol (PEG),
tal como PEG al 37% (v/v), por Gefter y otros (1977). También es
apropiado el uso de métodos de fusión inducidos eléctricamente
(Goding pp. 71-74, 1986).
Los procedimientos de fusión normalmente producen
híbridos viables a bajas frecuencias, de 1x10^{-6} a 1x10^{-8}
aproximadamente. Sin embargo, esto no plantea un problema ya que los
híbridos fusionados y viables se diferencian de las células no
fusionadas parentales (particularmente las células de mieloma no
fusionadas que normalmente continuarían dividiéndose
indefinidamente) mediante el cultivo en un medio selectivo. El medio
selectivo es, generalmente, uno que contiene un agente que bloquea
la síntesis de novo de nucleótidos en el medio de cultivo del
tejido. Los agentes de ejemplo preferidos son la aminopterina, el
metotrexato, y la azaserina. La aminopterina y el metotrexato
bloquean la síntesis de novo tanto de purinas como de
pirimidinas, mientras que la azaserina sólo bloquea la síntesis de
purinas. Allí donde se utiliza aminopterina o metotrexato, el medio
se complementa con hipoxantina y timidina como fuente de nucleótidos
(medio HAT). Allí donde se utiliza azaserina, el medio se
complementa con hipoxantina.
El medio de selección preferido es HAT. Sólo las
células capaces de operar mecanismos de recuperación de nucleótidos
son capaces de sobrevivir en el medio HAT. Las células de mieloma
son defectuosas en enzimas clave del mecanismo de recuperación, por
ejemplo, la hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT), y no pueden
sobrevivir. Las células B pueden impulsar este mecanismo, pero
tienen un tiempo de vida limitado en el cultivo y, generalmente,
mueren en dos semanas. Por lo tanto, las únicas células que pueden
sobrevivir en el medio selectivo son aquellos híbridos formados a
partir de células B y de mieloma.
Este cultivo proporciona una población de
hibridomas de la que se seleccionan hibridomas específicos.
Normalmente, la selección de hibridomas se realiza mediante el
cultivo de células por dilución de clones únicos en placas de
microtitulación, seguido del análisis de sobrenadantes clonales
individuales (después de dos o tres semanas) para la reactividad
deseada del anti-VEGF. El ensayo debería ser
sensible, simple y rápido, tal como radioinmunoensayos,
inmunoensayos enzimáticos, ensayos de citotoxicidad, ensayos de
placa, ensayos de inmunoenlace de puntos, y similares.
A continuación, los hibridomas seleccionados se
diluirían en serie y se clonarían en líneas de células productoras
de anticuerpos anti-VEGF individuales, en las que
los clones se pueden, a continuación, propagar indefinidamente para
proporcionar MAbs. Las líneas de células se pueden explotar para la
producción de mAb de dos maneras básicas. Se puede inyectar una
muestra de hibridoma (frecuentemente en la cavidad peritoneal) a un
animal histocompatible del tipo que se utilizó para obtener las
células de mieloma y somáticas para la fusión original. El animal
inyectado desarrolla tumores secretando el anticuerpo monoclonal
específico producido por el híbrido de las células fusionadas. Los
fluidos corporales del animal, tales como suero o fluido de ascitis,
se pueden aprovechar para proporcionar MAbs en una concentración
elevada. Las líneas de células individuales se podrían también
cultivar in vitro, donde los MAbs se secretan de forma
natural en el medio de cultivo del que se pueden obtener fácilmente
en concentraciones
elevadas.
elevadas.
Los MAbs producidos por cualquiera de los medios,
generalmente, se purificarán posteriormente, por ejemplo, mediante
filtración, centrifugación, y varios métodos cromatográficos, tales
como HPLC o cromatografía de afinidad, siendo todas estas técnicas
de purificación bien conocidas por los entendidos en la técnica.
Cada una de estas técnicas de purificación implica un
fraccionamiento para separar el anticuerpo deseado de otros
componentes de una mezcla. Entre los métodos analíticos
particularmente adecuados para la preparación de anticuerpos se
incluyen, por ejemplo, la cromatografía de proteína
A-Sefarosa y/o la cromatografía de proteína
G-Sefarosa.
Actualmente, la tecnología recombinante permite
la preparación de anticuerpos que tienen la especificidad deseada a
partir de genes recombinantes que codifican un conjunto de
anticuerpos (Van Dijk y otros, 1989). Ciertas técnicas recombinantes
implican el aislamiento de los genes del anticuerpo mediante un
screening inmunológico de las bibliotecas combinatoriales de
expresión de fagos de inmunoglobulinas preparadas a partir de ARN
aislado del bazo de un animal inmunizado (Morrison y otros, 1986;
Winter y Milstein, 1991).
Para tales métodos, las bibliotecas combinatorias
de fagémidos de inmunoglobulinas se preparan a partir de ARN aislado
del bazo del animal inmunizado, y se seleccionan fagémidos que
expresan anticuerpos apropiados mediante células que usan
"panning" que expresan el antígeno y células de control. Las
ventajas de esta aproximación respecto a las técnicas de hibridomas
convencionales son que se pueden producir y examinar aproximadamente
10^{4} veces más de anticuerpos en una única ronda, y que se
generan nuevas especificidades por combinación de las cadenas
ligeras y pesadas, que además incrementa el porcentaje de
anticuerpos apropiados generados.
Un método para la generación de un amplio
repertorio de moléculas de anticuerpo diversas en bacterias utiliza
el bacteriófago lambda como vector (Huse y otros, 1989). La
producción de anticuerpos que utilizan el vector lambda implica la
clonación de poblaciones de cadena ligera y pesada de secuencias de
ADN en vectores de inicio diferentes. Posteriormente, los vectores
se combinan al azar para formar un único vector que dirige la
coexpresión de cadena ligera y pesada para formar fragmentos de
anticuerpos. Las secuencias de ADN de cadena ligera y pesada se
obtienen por amplificación, preferiblemente por PCR^{TM} o una
técnica de amplificación relacionada, de ARNm aislado de células del
bazo (o hibridomas de éstas) de un animal que se ha inmunizado con
un antígeno seleccionado. Las secuencias de cadena ligera y pesada
normalmente se amplifican utilizando iniciadores que incorporan
sitios de restricción en las terminaciones del segmento de ADN
amplificado para facilitar la clonación de los segmentos de cadena
ligera y pesada en los vectores de inicio.
Otro método para la generación y screening de
amplias bibliotecas de sitios de combinación de anticuerpos parcial
o totalmente sintéticos, o paratopos, utiliza vectores de exposición
derivados de fagos filamentosos, tales como M13, fl o fd. Estos
vectores de exposición de fagos filamentosos, referidos como
"fagémidos", producen amplias bibliotecas de anticuerpos
monoclonales que tienen inmunoespecificidades nuevas y diversas. La
tecnología utiliza un dominio de anclaje de membrana de la proteína
de revestimiento del fago filamentoso como medio para unir el
producto del gen y el gen durante la fase de ensamblaje de la
replicación del fago filamentoso, y se ha utilizado para la
clonación y la expresión de anticuerpos de bibliotecas combinatorias
(Kang y otros, 1991; Barbas y otros, 1991).
Esta técnica general para la exposición de fagos
filamentosos se describe en la Patente U.S.A. No. 5.658.727. En un
sentido más general, el método proporciona un sistema para la
simultánea clonación y screening de las especificidades de unión de
un ligando preseleccionado de los repertorios de genes de
anticuerpos que utilizan un sistema de vector único. El screening de
miembros aislados de la biblioteca para la capacidad de unión de un
ligando preseleccionado permite la correlación de la capacidad de
unión de una molécula de anticuerpo expresada con un medio
conveniente para aislar el gen que codifica el miembro de la
biblioteca.
El enlace de la expresión y el screening se lleva
a cabo mediante la combinación del marcaje de un polipéptido de
fusión en el periplasma de una célula bacteriana para permitir el
ensamblaje de un anticuerpo funcional, y el marcaje de un
polipéptido de fusión en el revestimiento de una partícula de fago
filamentoso durante el ensamblaje del fago para tener presente el
screening conveniente del miembro de la biblioteca de interés. Se
proporciona un marcaje periplásmico mediante la presencia de un
dominio de señal de secreción en un polipéptido de fusión. Se
proporciona el marcaje a una partícula de fago mediante la presencia
de un dominio de anclaje de membrana de la proteína del
revestimiento del fago filamentoso (es decir, un dominio de anclaje
de membrana derivado de cpIII o cpVIII) en un polipéptido de
fusión.
La diversidad de una biblioteca de anticuerpos
combinatoria basada en fagos filamentosos se puede incrementar
tirando de los genes de cadena ligera y pesada, mediante la
alteración de una o más de las regiones determinantes de
complementariedad de los genes de cadena pesada clonados de la
biblioteca, o mediante la introducción de mutaciones al azar en la
biblioteca por reacciones en cadena de la polimerasa propensa al
error. Algunos métodos adicionales para el screening de bibliotecas
de fagémidos se describen en las Patentes U.S.A. Nos. 5.580.717;
5.427.908; 5.403.484; y 5.223.409.
Se ha desarrollado otro método para el screening
de amplias bibliotecas de anticuerpos combinatorias, utilizando la
expresión de poblaciones de diversas secuencias de cadena ligera y
pesada en la superficie de un bacteriófago filamentoso, tales como
M13, fl o fd (Patente U.S.A. No. 5.698.426). Se sintetizan dos
poblaciones de diversas secuencias de cadena ligera (Lc) y pesada
(Hc) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR^{TM}).
Estas poblaciones se clonan en vectores basados en M13 separados,
que contienen elementos necesarios para la expresión. El vector de
cadena pesada contiene una secuencia de la proteína de revestimiento
del gen VIII (gVIII) de manera que la traducción de las secuencias
de cadena pesada produce proteínas de fusión
gVII-Hc. Se combinan las poblaciones de dos vectores
al azar, de tal manera, que sólo las partes del vector que contienen
las secuencias de Lc y Hc se juntan en un vector circular único.
El vector combinado dirige la coexpresión tanto
de las secuencias de Hc como de Lc para el ensamblaje de los dos
polipéptidos y la expresión en superficie en el M13 (Patente U.S.A.
No. 5.698.426). La etapa de combinación al azar junta diferentes
secuencias que codifican Lc y Hc dentro de dos poblaciones diversas
en un único vector. Las secuencias del vector, donadas de cada
vector independiente, son necesarias para la producción de fagos
viables. Además, como las secuencias pseudo gVIII están contenidas
en sólo uno de los dos vectores iniciales, la coexpresión de
fragmentos de anticuerpo funcionales, tal como Lc asociado a
proteínas de fusión gVIII-Hc, no se puede llevar a
cabo en la superficie del fago hasta que las secuencias del vector
se unen en el vector único.
La expresión en superficie de la biblioteca de
anticuerpos se realiza en una cepa supresora de ámbar. Un codón de
parada de ámbar entre la secuencia de Hc y la secuencia de gVIII
desune los dos componentes en una cepa no supresora. El aislamiento
del fago producido de la cepa no supresora y la infección de una
cepa supresora unirá las secuencias de Hc a la secuencia de gVIII
durante la expresión. El cultivo de la cepa supresora tras la
infección permite la coexpresión en la superficie del M13 de todas
las especies de anticuerpos dentro de la biblioteca, tal como las
proteínas de fusión gVIII (proteínas de fusión
gVIII-Fab). Alternativamente, el ADN se puede aislar
de una cepa no supresora y, a continuación, introducir en una cepa
supresora para conseguir el mismo efecto.
La biblioteca de la expresión en superficie se
verifica para fragmentos Fab específicos que unen moléculas
preseleccionadas mediante procedimientos de aislamiento por afinidad
estándar. Tales métodos incluyen, por ejemplo, "panning"
(Parmley y Smith, 1988), cromatografía de afinidad y procedimientos
de transferencia en fase sólida. Se prefiere el "panning",
porque la elevada cantidad de anticuerpos del fago se puede
comprobar fácilmente, rápidamente y en pequeños volúmenes. Además,
este procedimiento puede seleccionar especies de fragmentos Fab
menores dentro de la población, que de otra manera serían
indetectables, y amplificarlas a poblaciones sustancialmente
homogéneas. Los fragmentos Fab seleccionados se pueden caracterizar
mediante la secuenciación de los ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos tras la amplificación de la población de fagos.
Otro método para producir diversas bibliotecas de
anticuerpos y el screening para las especificidades de unión
deseables se describe en la Patente U.S.A. No. 5.667.988 y la
Patente U.S.A. No. 5.759.817. El método implica la preparación de
bibliotecas de moléculas de inmunoglobulina heterodiméricas en forma
de bibliotecas de fagémidos utilizando oligonucleótidos degenerados
y reacciones de extensión de cebador para incorporar las
degeneraciones en las regiones CDR de los dominios variables de
cadena ligera y pesada variables de inmunoglobulina, y la exposición
de los polipéptidos mutagenizados en la superficie del fagémido. A
partir de entonces, la proteína de exposición se comprueba para su
capacidad de unirse a un antígeno preseleccionado.
El método para producir una molécula de
inmunoglobulina heterodimérica, generalmente, implica (1) introducir
un gen que codifica la región V de la cadena ligera o pesada de
interés en el vector de exposición de fagémidos, (2) introducir un
sitio de unión aleatorio en un vector de proteína de exposición de
fagémidos mediante una extensión de cebador con un oligonucleótido
que contiene regiones de homología a una CDR del gen de la región V
del anticuerpo y que contiene regiones de degeneración para producir
secuencias de codificación aleatorias para formar una amplia
población de vectores de exposición, cada uno, capaz de expresar
diferentes supuestos sitios de unión expuestos a una proteína de
exposición de superficie de fagémido; (3) expresar la proteína de
exposición y el sitio de unión en la superficie de una partícula de
fago filamentosa; y (4) aislar (screening) la partícula de fago
expresada en la superficie utilizando técnicas de afinidad, tales
como "panning" de partículas de fago contra un antígeno
preseleccionado, aislando así una o más especies de fagémidos que
contienen una proteína de exposición que contiene un sitio de unión
que une un antígeno preseleccionado.
Una variación adicional de este método para la
producción de diversas bibliotecas de anticuerpos y el screening
para las especificidades de unión deseables se describe en la
Patente U.S.A. No. 5.702.892. En este método, donde sólo se emplean
secuencias de cadena pesada, éstas tienen todas las posiciones de
nucleótidos que codifican la región hipervariable CDRI o CDRIII
aleatorias, y la variabilidad genética en las CDRs se genera
independientemente de cualquier proceso biológico.
En el método, se crean dos bibliotecas para
arrastrar genéticamente motivos de oligonucleótidos dentro del
armazón de la estructura del gen de cadena pesada. A través de la
mutación aleatoria de CDRI o CDRIII, las regiones hipervariables del
gen de cadena pesada se reconstruyeron para dar lugar a una
colección de secuencias muy diversas. Las proteínas de cadena pesada
codificadas por la colección de secuencias de gen mutado poseían el
potencial para tener todas las características de unión de una
inmunoglobulina aunque sólo necesitaban una de las dos cadenas de
inmunoglobulina.
Específicamente, el método se lleva a la práctica
en ausencia de la proteína de cadena ligera de la inmunoglobulina.
Se incuba una biblioteca de proteínas de cadena pesada modificadas
por exposición de fagos con un ligando inmovilizado para seleccionar
clones que codifican proteínas recombinantes, que específicamente
unen el ligando inmovilizado. A continuación, los fagos enlazados se
disocian del ligando inmovilizado y se amplifican por crecimiento en
células huésped bacterianas. Se extienden placas virales
individuales, cada una expresando una proteína recombinante
diferente, y los clones individuales se pueden entonces prestar a
ensayos para ver la actividad de unión.
También se puede utilizar la inmunización in
vitro, o estimulación de antígeno, para generar un anticuerpo
anti-VEGF humano. Tales técnicas se pueden utilizar
para estimular linfocitos de sangre periférica de sujetos normales y
sanos, simplemente mediante la estimulación de células productoras
de anticuerpos con VEGF in vitro.
Dicha "inmunización in vitro" implica
la activación específica del antígeno de linfocitos B no
inmunizados, generalmente, dentro de una población mixta de
linfocitos (cultivos mixtos de linfocitos, MLC). Las inmunizaciones
in vitro también se pueden sostener por el crecimiento de
células B y factores de diferenciación y las linfoquinas. Los
anticuerpos producidos por estos métodos son, frecuentemente,
anticuerpos IgM (Borrebaeck y otros, 1986).
Se ha descrito otro método (Patente U.S.A. No.
5.681.729, referencia), en el que se pueden obtener linfocitos
humanos que producen principalmente anticuerpos IgG (o IgA). El
método implica, en un sentido general, transplantar linfocitos
humanos a un animal inmunodeficiente de manera que los linfocitos
humanos "toman" el cuerpo del animal; inmunizar el animal con
un antígeno deseado, para generar linfocitos humanos que produzcan
un anticuerpo específico del antígeno; y recuperar los linfocitos
humanos que producen el anticuerpo del animal. Los linfocitos
humanos, producidos de este modo, se pueden utilizar para producir
un anticuerpo monoclonal mediante la inmortalización de los
linfocitos humanos que producen el anticuerpo, la clonación de los
linfocitos originados en humanos inmortalizados obtenidos que
producen el anticuerpo, y la recuperación de un anticuerpo
monoclonal específico del antígeno deseado de los linfocitos
originados en humanos inmortalizados clonados.
Los animales inmunodeficientes que se pueden
emplear en esta técnica son aquellos que no muestran rechazo cuando
se transplantan linfocitos humanos a los animales. Dichos animales
pueden estar preparados artificialmente por tratamientos físicos,
químicos o biológicos. Se puede emplear cualquier animal
inmunodeficiente. Los linfocitos humanos se pueden obtener de sangre
periférica, bazo, nódulos linfáticos, amígdalas humanas o
similares.
La "toma" de los linfocitos humanos
transplantados en los animales se puede lograr mediante la mera
administración de linfocitos humanos a los animales. La vía de
administración no está limitada y puede ser, por ejemplo,
subcutánea, intravenosa o intraperitoneal. La dosis de los
linfocitos humanos no está limitada, y puede ser normalmente de
10^{6} a 10^{8} linfocitos por animal. A continuación, el animal
inmunodeficiente se inmuniza con el antígeno de VEGF deseado.
Tras la inmunización, se recuperan, por cualquier
método convencional, los linfocitos humanos de la sangre, el bazo,
los nódulos linfáticos u otros tejidos linfáticos. Por ejemplo, las
células mononucleares se pueden separar por el método de
centrifugación de Ficoll-Hypaque (densidad
específica: 1,077), y los monocitos se pueden eliminar mediante el
método de adsorción en plato de plástico. Se pueden eliminar las
células contaminantes que se originan en el animal inmunodeficiente
mediante el uso de un antisuero específico para células animales. El
antisuero se puede obtener mediante, por ejemplo, la inmunización de
un segundo animal, diferente, con las células del bazo del animal
inmunodeficiente, y la recuperación del suero del animal inmunizado
diferente. El tratamiento con el antisuero se puede llevar a cabo en
cualquier fase. Los linfocitos humanos también se pueden recuperar
mediante un método inmunológico que emplea una inmunoglobulina
humana expresada en la superficie celular como un marcador.
Mediante estos métodos, se pueden obtener los
linfocitos humanos que principalmente producen anticuerpos IgG e IgA
específicos a uno o más epítopos de VEGF seleccionados. A
continuación, se obtienen los anticuerpos monoclonales a partir de
los linfocitos humanos mediante la inmortalización, selección,
crecimiento celular y producción de anticuerpos.
Actualmente, la tecnología recombinante está
disponible para la preparación de anticuerpos. Además de las
bibliotecas combinatorias de expresión de fagos de inmunoglobulinas,
dadas a conocer anteriormente, otra aproximación de clonación
molecular es la preparación de anticuerpos a partir de ratones
transgénicos que contienen bibliotecas de anticuerpos humanos. Tales
técnicas se describen en la Patente U.S.A. No. 5.545.807.
En un sentido más general, estos métodos implican
la producción de un animal transgénico que ha insertado en su línea
germinal, material genético que codifica, como mínimo, parte de una
inmunoglobulina de origen humano o que se puede reorganizar para
codificar un repertorio de inmunoglobulinas. El material genético
insertado se puede producir a partir de una fuente humana, o se
puede producir sintéticamente. El material puede codificar, como
mínimo, parte de una inmunoglobulina conocida o se puede modificar
para codificar, como mínimo, parte de una inmunoglobulina
alterada.
El material genético insertado se expresa en el
animal transgénico, dando lugar a la producción de una
inmunoglobulina derivada, como mínimo en parte, del material
genético de la inmunoglobulina humana insertada. Se encuentra que el
material genético se reajusta en el animal transgénico, de manera
que se pueden producir un repertorio de inmunoglobulinas con parte o
partes derivadas de material genético insertado, incluso si el
material genético insertado se incorpora en la línea germinal en una
posición equivocada o con la geometría equivocada.
El material genético insertado puede estar en
forma de ADN clonado en vectores procarióticos, tales como plásmidos
y/o cósmidos. Se insertan fragmentos de ADN más grandes utilizando
vectores de cromosoma artificial de levadura (Burke y otros, 1987),
o mediante la introducción de fragmentos de cromosoma (Richer y Lo,
1989). El material genético insertado se puede introducir al huésped
de una manera convencional, por ejemplo, mediante una inyección, u
otros procedimientos en huevos fertilizados o células madre
embrionarias.
En aspectos preferidos, se utiliza un animal
huésped que inicialmente no transporta material genético que
codifica regiones constantes de inmunoglobulina, de manera que el
animal transgénico resultante utilizará sólo el material genético
humano insertado cuando produzca inmunoglobulinas. Esto se puede
conseguir mediante el uso de un huésped mutante natural al que le
falta el material genético relevante, o mediante la fabricación
artificial de mutantes, por ejemplo, en líneas de células que, en
última instancia, crean un huésped del que se ha eliminado el
material genético relevante.
Allí donde el animal huésped transporta material
genético que codifica las regiones constantes de inmunoglobulina, el
animal transgénico transportará el material genético natural y el
material genético insertado y producirá globulinas derivadas del
material genético natural, el material genético insertado, y mezclas
de ambos tipos de material genético. En este caso, la
inmunoglobulina deseada se puede obtener mediante el screening de
hibridomas derivados del animal transgénico, por ejemplo,
aprovechando del fenómeno de la exclusión alélica de la expresión
del gen del anticuerpo o la pérdida del cromosoma diferencial.
Una vez se ha preparado un animal transgénico
adecuado, simplemente se inmuniza el animal con el inmunógeno
deseado. Dependiendo de la naturaleza del material insertado, el
animal puede producir una inmunoglobulina quimérica, por ejemplo, de
origen mixto ratón/humano, donde el material genético de origen
extraño codifica sólo parte de la inmunoglobulina; o el animal puede
producir una inmunoglobulina completamente extraña, por ejemplo, de
origen completamente humano, donde el material genético de origen
extraño codifica una inmunoglobulina completa.
El antisuero policlonal se puede producir a
partir del animal transgénico tras la inmunización. Las células
productoras de inmunoglobulinas se pueden extraer del animal para
producir la inmunoglobulina de interés. Preferiblemente, los
anticuerpos monoclonales se producen a partir del animal
transgénico, por ejemplo, mediante la fusión de células de bazo del
animal con células de mieloma y el screening de los hibridomas
resultantes para seleccionar aquellos que producen el anticuerpo
deseado. En la presente invención se describen técnicas adecuadas
para tales procesos.
En una aproximación alternativa, el material
genético se puede incorporar al animal de tal manera que el
anticuerpo deseado se produce en los fluidos corporales, tales como
suero o secreciones externas del animal, tales como leche, calostro
o saliva. Por ejemplo, mediante la inserción in vitro de
material genético que codifica, como mínimo, parte de una
inmunoglobulina humana en un gen de un mamífero que codifica una
proteína de la leche y, a continuación, la introducción del gen en
un huevo fertilizado del mamífero, por ejemplo, por inyección, el
huevo puede desarrollarse en un mamífero hembra adulto que produce
leche que contiene inmunoglobulina derivada, como mínimo, en parte,
del material genético insertado de inmunoglobulina humana. A
continuación, se puede recolectar el anticuerpo deseado de la leche.
Las técnicas adecuadas para llevar a cabo dichos procesos son bien
conocidas por aquellos entendidos en la técnica.
Los animales transgénicos anteriores se emplean
normalmente para producir anticuerpos humanos de un único isotipo,
más específicamente, un isotipo que es esencial para la maduración
de las células B, tales como IgM y, posiblemente, IgD. Otro método
preferido para producir anticuerpos anti-VEGF
humanos es utilizar la tecnología descrita en las Patentes U.S.A.
Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; y
5.770.429; en las que los animales transgénicos descritos son
capaces de pasar de un isotipo necesario para el desarrollo de las
células B a otros isotipos.
En el desarrollo de un linfocito B, la célula
inicialmente produce IgM con una especificidad de unión determinada
por las regiones V_{H} y V_{L} reajustadas productivamente.
Posteriormente, cada célula B y sus células de la progenie
sintetizan anticuerpos con las mismas regiones V de cadena H y L,
pero pueden cambiar el isotipo de la cadena H. El uso de regiones
constantes mu o delta se determina ampliamente mediante empalmes
alternados, permitiendo que la IgM y la IgD se coexpresen en una
única célula. Los otros isotipos de cadena pesada (gamma, alfa, y
épsilon) sólo se expresan de forma nativa después de un reajuste del
gen que borra los exones del delta C y mu C. Este proceso de
reajuste del gen, denominado cambio de isotipo, normalmente tiene
lugar por recombinación entre los llamados segmentos de cambio
localizados inmediatamente en la dirección 5' de cada gen de cadena
pesada (excepto delta). Los segmentos de cambio individuales tienen
entre 2 y 10 kb de longitud, y consisten principalmente en cortas
secuencias repetidas.
Por estas razones, es preferible que los
transgenes incorporen secuencias regulatorias transcripcionales en
aproximadamente 1-2 kb de la dirección 5' de cada
región de cambio que se va a utilizar para el cambio de isotipo. Las
secuencias reguladoras transcripcionales preferiblemente incluyen un
promotor y un elemento potenciador, y más preferiblemente incluyen
la región flanqueante 5' (es decir, la dirección 5') que se asocia
de forma natural (es decir, tiene lugar en la configuración de la
línea germinal) con una región de cambio. A pesar de que la
secuencia flanqueante 5' de una región de cambio se puede unir
operativamente a una región de cambio diferente para la construcción
del transgén, en algunas realizaciones, se prefiere que cada región
de cambio incorporada en la construcción del transgén tenga una
región flanqueante 5' que tenga lugar inmediatamente en la dirección
5' en la configuración de línea germinal natural. La información de
la secuencia relativa a las secuencias de la región de cambio de la
inmunoglobulina es conocida (Mills y otros, 1990; Sideras y otros,
1989).
En el método descrito en las Patentes U.S.A. Nos.
5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y 5.770.429,
los transgenes de inmunoglobulina humana contenidos dentro del
animal transgénico, funcionan correctamente a través del mecanismo
de desarrollo de la célula B, llevando al cambio de isotipo. Por
consiguiente, en este método, se construyen estos transgenes para
producir el cambio de isotipo y uno o más de los siguientes: (1)
expresión específica de tipo celular de alto nivel, (2) reajuste del
gen funcional, (3) activación de, y respuesta a, la exclusión
alélica, (4) expresión de un repertorio principal suficiente, (5)
transducción de señal, (6) hipermutación somática, y (7) dominación
del locus del anticuerpo del transgén durante la respuesta
inmune.
Un requerimiento importante para la función del
transgén es la generación de un repertorio de anticuerpos primario
que es suficientemente diverso para generar una respuesta inmune
secundaria para un amplio conjunto de antígenos. El gen de cadena
pesada reajustada consiste en un exón de péptido de señal, un exón
de región variable y un conjunto de regiones multidominio de región
constante, cada una de las cuales se codifica por varios exones.
Cada uno de los genes de la región constante codifica la parte
constante de una clase diferente de inmunoglobulinas. Durante el
desarrollo de células B, las regiones constantes proximales de la
región V se borran llevando a la expresión de nuevas clases de
cadena pesada. Para cada clase de cadena pesada, los patrones
alternativos de empalmes de ARN dan lugar tanto a inmunoglobulinas
de transmembrana como secretadas.
El locus de la cadena pesada humana consiste en
segmentos de gen de aproximadamente 200 V que abarcan 2 Mb,
segmentos de gen de aproximadamente 30 D que abarcan 40 kb, seis
segmentos J comprimidos en un tramo de 3 kb, y nueve segmentos de
gen de región constante distribuidos por aproximadamente 300 kb. El
locus completo abarca aproximadamente 2,5 Mb de la parte distal del
largo brazo del cromosoma 14. Se conocen los fragmentos del transgén
de cadena pesada que contienen miembros de las seis familias V_{H}
conocidas, los segmentos del gen D y J, así como las regiones
constantes mu, delta, gamma 3, gamma 1 y alfa 1 (Berman y otros,
1988). Los fragmentos genómicos que contienen todos los segmentos de
gen necesarios y las secuencias reguladoras de un locus de cadena
ligera humana se construyen de forma similar.
La expresión de los transgenes ligeros y pesados
de la inmunoglobulina reajustada satisfactoriamente normalmente
tiene un efecto dominante mediante la supresión del reajuste de los
genes de inmunoglobulina endógena en el animal no humano
transgénico. Sin embargo, en ciertas realizaciones, es deseable
efectuar una inactivación completa del loci de Ig endógena, de
manera que las cadenas de inmunoglobulina híbridas, que comprenden
una región variable humana y una región constante no humana (por
ejemplo, murina) no se pueden formar, por ejemplo, mediante el
trans-cambio entre el transgén y las secuencias de
Ig endógena. Utilizando la tecnología de células madre embrionarias
y la recombinación homóloga, el repertorio de inmunoglobulina
endógena se puede eliminar fácilmente. Además, la supresión de los
genes de Ig endógena se puede realizar utilizando una variedad de
técnicas, tal como la tecnología antisentido.
En otros aspectos de la presente invención, puede
ser deseable producir una inmunoglobulina
trans-cambiada. Los anticuerpos que comprenden tales
inmunoglobulinas trans-cambiadas quiméricas se
pueden utilizar para una variedad de aplicaciones donde es deseable
tener una región constante no humana (por ejemplo, murina), para,
por ejemplo, la retención de las funciones del efector en el
huésped. La presencia de una región constante de origen murino puede
proporcionar ventajas sobre la región constante humana, por ejemplo,
para proporcionar las funciones del efector murino (por ejemplo,
fijación del complemento murino, ADCC), de manera que dicho
anticuerpo quimérico se puede analizar en un modelo de enfermedad en
ratón. Posteriormente al análisis del animal, se puede aislar la
secuencia que codifica la región variable humana, por ejemplo, por
amplificación por PCR^{TM} o clonación de ADNc de la fuente (clon
del hibridoma), y empalmar a una secuencia que codifica una región
constante humana deseada para codificar un anticuerpo de secuencia
humana más adecuado para el uso terapéutico humano.
Los anticuerpos humanizados tienen, generalmente,
como mínimo, tres ventajas potenciales para el uso en terapia
humana. Primero, porque como la parte efectora es humana, puede
interaccionar mejor con las otras partes del sistema inmunitario
humano, por ejemplo, para destruir más eficientemente células diana
mediante citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) o
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Segundo, el
sistema inmunitario humano no debería reconocer el anticuerpo como
extraño. Tercero, la vida media en la circulación humana será
similar a los anticuerpos humanos naturales, permitiendo administrar
dosis más pequeñas y menos frecuentes.
En la presente se proporcionan varios métodos
para preparar anticuerpos anti-VEGF humanos. Además
de los anticuerpos humanos, los anticuerpos "humanizados"
tienen muchas ventajas. Los anticuerpos "humanizados" son,
generalmente, anticuerpos monoclonales mutantes o quiméricos de
ratón, rata, hámster, conejo u otras especies, con dominios de
región variable y/o constante humana o cambios específicos. Las
técnicas para generar un anticuerpo anti-VEGF
llamado "humanizado" son bien conocidas por aquellos entendidos
en la técnica.
Los anticuerpos humanizados también comparten las
ventajas anteriores. Primero, la parte efectora es aún humana.
Segundo, el sistema inmunitario humano no debería reconocer el
armazón o la región constante como extraños, y por tanto, la
respuesta del anticuerpo contra dicho anticuerpo inyectado debería
ser menor que contra un anticuerpo de ratón totalmente extraño.
Tercero, los anticuerpos humanizados inyectados, en oposición a los
anticuerpos de ratón inyectados, presumiblemente tendrán una vida
media más parecida a los anticuerpos humanos naturales, permitiendo
también unas dosis más pequeñas y menos frecuentes.
Se han descrito varios métodos para producir
anticuerpos humanizados. Se puede utilizar el reajuste controlado de
dominios de anticuerpo, unidos a través de enlaces disulfuro de
proteínas, para formar nuevas moléculas de proteína artificiales o
anticuerpos "quiméricos" (Konieczny y otros, 1981). También se
puede utilizar la tecnología del ADN recombinante para construir
fusiones de genes entre secuencias de ADN, que codifican dominios de
cadena ligera y pesada variables de anticuerpo de ratón, con
dominios constantes de cadena ligera y pesada de anticuerpo humano
(Morrison y otros, 1984).
Las secuencias de ADN que codifican las partes de
unión al antígeno o regiones determinantes de complementariedad
(CDRs) de anticuerpos monoclonales murinos se pueden injertar, por
medios moleculares, en las secuencias de ADN que codifican los
armazones de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos humanos
(Riechmann y otros, 1988). Los productos recombinantes expresados se
llaman "reformados" o anticuerpos humanizados, y comprenden el
armazón de una cadena ligera o pesada de anticuerpo humano y las
partes de reconocimiento del antígeno, CDRs, de un anticuerpo
monoclonal murino.
Otro método para producir anticuerpos humanizados
se describe en la Patente U.S.A. No. 5.639.641. El método
proporciona, a través de "resurfacing", anticuerpos de roedores
humanizados que han mejorado su eficacia terapéutica debido a la
presencia de una superficie humana en la región variable. En el
método: (1) se generan alineaciones de posición de un conjunto de
regiones variables de cadena ligera y pesada de anticuerpo para
obtener un grupo de posiciones expuestas en la superficie del
armazón de la región variable de cadena ligera y pesada, en el que
las posiciones de alineación para todas las regiones variables son
idénticas en, como mínimo, un 98% aproximadamente; (2) se define un
grupo de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del
armazón de la región variable de cadena ligera y pesada para un
anticuerpo de roedor (o fragmento de éste); (3) se identifica un
grupo de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del
armazón de la región variable de cadena ligera y pesada que es el
más idéntico al grupo de residuos de aminoácidos expuestos en la
superficie del roedor; (4) el grupo de residuos de aminoácidos
expuestos en la superficie del armazón de la región variable de
cadena ligera y pesada definido en la etapa (2) se sustituye por el
grupo de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del
armazón de la región variable de cadena ligera y pesada identificado
en la etapa (3), excepto para aquellos residuos de aminoácidos que
están a menos de 5 Ángstroms de cualquier átomo de cualquier residuo
de las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo
del roedor; y (5) se produce el anticuerpo del roedor humanizado que
tiene especificidad de unión.
Un método similar para la producción de
anticuerpos humanizados se describe en las Patentes U.S.A.
Nos.
5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101. Estos métodos implican la producción de inmunoglobulinas humanizadas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y posibles aminoácidos adicionales de una inmunoglobulina donadora y una región de armazón de una inmunoglobulina humana aceptadora. Cada cadena de inmunoglobulina humanizada comprende, normalmente, además de las CDRs, aminoácidos del armazón de inmunoglobulina donadora que son capaces de interaccionar con las CDRs para efectuar una afinidad de unión, tal como uno o más aminoácidos que están inmediatamente adyacentes a una CDR en la inmunoglobulina donadora o aquellos que están a menos de 3 Angstroms aproximadamente, tal como predice la modelación molecular. Se puede designar cada una de las cadenas ligera y pesada mediante la utilización de cualquiera de ellas, cualquier combinación, o todos los criterios de posiciones varias descritos en las Patentes U.S.A. Nos. 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101. Cuando se combinan en un anticuerpo intacto, las inmunoglobulinas humanizadas son sustancialmente no inmunogénicas en humanos y mantienen sustancialmente la misma afinidad al antígeno original que la
5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101. Estos métodos implican la producción de inmunoglobulinas humanizadas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y posibles aminoácidos adicionales de una inmunoglobulina donadora y una región de armazón de una inmunoglobulina humana aceptadora. Cada cadena de inmunoglobulina humanizada comprende, normalmente, además de las CDRs, aminoácidos del armazón de inmunoglobulina donadora que son capaces de interaccionar con las CDRs para efectuar una afinidad de unión, tal como uno o más aminoácidos que están inmediatamente adyacentes a una CDR en la inmunoglobulina donadora o aquellos que están a menos de 3 Angstroms aproximadamente, tal como predice la modelación molecular. Se puede designar cada una de las cadenas ligera y pesada mediante la utilización de cualquiera de ellas, cualquier combinación, o todos los criterios de posiciones varias descritos en las Patentes U.S.A. Nos. 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101. Cuando se combinan en un anticuerpo intacto, las inmunoglobulinas humanizadas son sustancialmente no inmunogénicas en humanos y mantienen sustancialmente la misma afinidad al antígeno original que la
\hbox{inmunoglobulina donadora.}
Se describe un método adicional para producir
anticuerpos humanizados en las Patentes U.S.A. Nos. 5.565.332 y
5.733.743. Este método combina el concepto de anticuerpos
humanizados con las bibliotecas de fagémidos también descritas en
detalle en la presente. En un sentido general, el método utiliza
secuencias del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo o
población de anticuerpos dirigida contra un antígeno de interés. De
este modo, para un anticuerpo de roedor único, se pueden combinar
las secuencias que comprenden parte del sitio de unión al antígeno
del anticuerpo con repertorios diversos de secuencias de anticuerpos
humanos que pueden, en combinación, crear un sitio de unión al
antígeno completo.
Los sitios de unión al antígeno creados mediante
este proceso difieren de aquellos creados por xenoinjertos de CDR,
en los que sólo la parte de secuencia del anticuerpo de roedor
original es probable que haga contactos con antígenos de una forma
similar. Las secuencias humanas seleccionadas probablemente difieren
en la secuencia y hacen contactos alternativos con el antígeno de
aquellas del sitio de unión original. Sin embargo, las restricciones
impuestas por la unión de la parte de la secuencia original al
antígeno y las formas del antígeno y de sus sitios de unión al
antígeno, probablemente conducen a nuevos contactos de las
secuencias humanas a la misma región o epítopo del antígeno. Este
proceso ha sido denominado, por tanto, "selección grabada de
epítopo" (EIS).
Empezando con un anticuerpo animal, existe un
proceso que da lugar a la selección de anticuerpos que son
anticuerpos parcialmente humanos. Dichos anticuerpos pueden ser
suficientemente similares en secuencia a los anticuerpos humanos
para usarse directamente en terapia o tras la alteración de varios
residuos clave. Las diferencias de secuencia entre el componente del
roedor del anticuerpo seleccionado con secuencias humanas se podrían
minimizar mediante la sustitución de aquellos residuos que difieren
de los residuos de secuencias humanas, por ejemplo, mediante la
mutagénesis dirigida a sitio de residuos individuales, o por
inserción en CDR de bucles completos. Sin embargo, también se pueden
crear anticuerpos con secuencias completamente humanas. La EIS, por
tanto, ofrece un método para fabricar anticuerpos, parcialmente
humanos o completamente humanos, que se unen al mismo epítopo que el
animal o a los anticuerpos parcialmente humanos, respectivamente. En
la EIS, se pueden mostrar repertorios de fragmentos de anticuerpo en
la superficie de fase filamentosa y seleccionar los genes que
codifican fragmentos con actividades de unión al antígeno mediante
la unión del fago al antígeno.
Algunos métodos adicionales para la humanización
de anticuerpos contemplados para el uso en la presente invención se
describen en las Patentes U.S.A. Nos. 5.750.078; 5.502.167;
5.705.154; 5.770.403; 5.698.417; 5.693.493; 5.558.864; 4.935.496; y
4.816.567. Se cree que las Patentes WO 98/45331 y WO 98/45332 son
particularmente instructivas para la ejemplificación adicional de
los principios de humanización que se aplican a anticuerpos
anti-VEGF.
La mutagénesis específica de sitio es una técnica
útil en la preparación de anticuerpos individuales a través de la
mutagénesis específica del ADN subyacente. Además, la técnica
proporciona una fácil capacidad para preparar y analizar variantes
de secuencias, incorporando una o más de las consideraciones
anteriores, tanto si se humaniza como si no, mediante la
introducción de uno o más cambios de las secuencias de nucleótidos
en el ADN.
A pesar de que muchos métodos son adecuados para
su uso en la mutagénesis, actualmente se prefiere, de forma general,
el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR^{TM}). Esta
tecnología ofrece un método rápido y eficiente para introducir
mutaciones deseadas en una secuencia de ADN dada. El siguiente texto
particularmente describe el uso de la PCR^{TM} para introducir
mutaciones puntuales en una secuencia, como se puede utilizar para
cambiar el aminoácido codificado por la secuencia dada. Las
adaptaciones de este método también son adecuadas para la
introducción de sitios de enzimas de restricción en una molécula de
ADN.
En este método, se diseñan oligonucleótidos
sintéticos para incorporar una mutación puntual en un extremo de un
segmento amplificado. Tras la PCR^{TM}, los fragmentos
amplificados se tratan con fragmentos Klenow para obtener extremos
romos, y a continuación, los fragmentos con extremos romos se ligan
y se subclonan en un vector para facilitar el análisis de la
secuencia.
Para preparar el ADN molde que se desea
mutagenizar, el ADN se subclona en un vector de número de copias
alto, tal como pUC19, utilizando los sitios de restricción que
flanquean el área para mutar. A continuación, se prepara el ADN
molde utilizando una minipreparación de plásmido. Se sintetizan,
mediante un sintetizador automatizado, cebadores de oligonucleótidos
apropiados que se basan en la secuencia parental, pero que contienen
la mutación puntual deseada y que están flanqueadas en el extremo 5'
por un sitio de enzima de restricción. Se requiere, generalmente,
que el cebador sea homólogo al ADN molde en 15 bases
aproximadamente o similar. Los cebadores se pueden purificar
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante, a
pesar de que esto no es absolutamente necesario para el uso en la
PCR^{TM}. A continuación, se debería fosforilar el extremo 5' de
los oligonucleótidos.
El ADN molde debería amplificarse por PCR^{TM},
utilizando los cebadores de oligonucleótidos que contienen las
mutaciones puntuales deseadas. La concentración de MgCl_{2} en el
tampón de amplificación será, generalmente, de unos 15 mM.
Generalmente, se deberían llevar a cabo de 20 a 25 ciclos de
PCR^{TM} aproximadamente, tal como se explica a continuación:
desnaturalización, 35 segundos a 95ºC; hibridación, 2 minutos a
50ºC; y extensión, 2 minutos a 72ºC. La PCR^{TM}, generalmente,
incluirá una última extensión del ciclo de unos 10 minutos a 72ºC.
Después de la etapa de extensión final, se deberían añadir unas 5
unidades de fragmentos Klenow a la mezcla de reacción e incubar
durante 15 minutos adicionales a 30ºC. Se requiere la actividad
exonucleasa de los fragmentos Klenow para hacer los extremos parejos
y adecuados para la clonación con extremos romos.
La mezcla de reacción resultante, generalmente,
se debería analizar mediante una electroforesis en gel de acrilamida
o agarosa no desnaturalizante para verificar que la amplificación ha
producido el producto predicho. A continuación, se trataría la
mezcla de reacción mediante la eliminación de la mayoría de aceites
minerales, la extracción con cloroformo para eliminar el aceite
restante, la extracción con fenol tamponado y, a continuación, la
concentración por precipitación con etanol al 100%. Posteriormente,
se deberían digerir la mitad de los fragmentos amplificados con una
enzima de restricción que corta en las secuencias flanqueantes
utilizadas en los oligonucleótidos. Los fragmentos digeridos se
purifican en un gel de agarosa de gelatización/fusión baja.
Para subclonar los fragmentos y comprobar la
mutación puntual, se clonarían los dos fragmentos amplificados en un
vector digerido apropiadamente mediante una unión de extremos romos.
Esto se utilizaría para transformar E.coli, del que se podría
preparar, a continuación, ADN plasmídico utilizando una
minipreparación. A continuación, se analizaría la parte amplificada
del ADN plasmídico por la secuenciación de ADN para confirmar que se
generó la mutación puntual correcta. Esto es importante ya que la
ADN polimerasa Taq puede introducir mutaciones adicionales en los
fragmentos de ADN.
La introducción de una mutación puntual también
se puede efectuar utilizando etapas de la PCR^{TM} secuenciales.
En este procedimiento, los dos fragmentos que abarcan la mutación se
fijan el uno con el otro y se extienden mediante una síntesis cebada
mutuamente. A continuación, este fragmento se amplifica mediante una
segunda etapa de PCR^{TM}, evitando así la unión de extremos romos
requerida en el protocolo anterior. En este método, la preparación
del ADN molde, la generación de los cebadores de oligonucleótidos y
la primera amplificación de la PCR^{TM} se realizan como se
describe anteriormente. En este proceso, sin embargo, los
oligonucleótidos elegidos deberían ser homólogos al ADN molde en un
tramo de entre 15 y 20 bases aproximadamente y se deben también
superponer el uno con el otro en unas 10 bases o más.
En la segunda amplificación de la PCR^{TM}, se
utilizaría cada fragmento amplificado y cada cebador de secuencia
flanqueante y se llevaría a cabo la PCR^{TM} durante 20 y 25
ciclos aproximadamente, utilizando las condiciones descritas
anteriormente. Se subclonarían otra vez los fragmentos y se
comprobaría que las mutaciones puntuales eran correctas mediante la
utilización de las etapas mencionadas anteriormente.
En el uso de cualquiera de los métodos
anteriores, se prefiere, generalmente, introducir la mutación
mediante la amplificación de un fragmento tan pequeño como sea
posible. Por supuesto, deberían también considerarse cuidadosamente
parámetros, tales como la temperatura de fusión del oligonucleótido,
ya que, generalmente, estará influenciada por el contenido de GC y
la longitud del oligo. La ejecución de estos métodos, y su
optimización si es necesaria, será conocida por aquellos entendidos
en la técnica, y está descrita en profundidad en varias
publicaciones, tal como Current Protocols in Molecular
Biology, 1995.
Cuando se realiza la mutagénesis específica de
sitio, se puede emplear la Tabla A como referencia.
Independientemente del origen del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 original, el
anticuerpo intacto, los multímeros de anticuerpo, o cualquiera de
una variedad de regiones de unión al antígeno funcionales del
anticuerpo se pueden utilizar en la presente invención. Entre las
regiones funcionales de ejemplo se incluyen "diabodies",
anticuerpos lineales y fragmentos scFv, Fv, Fab', Fab,
F(ab')_{2} de los anticuerpos anti-VEGF.
Las técnicas para la preparación de dichas construcciones son bien
conocidas por los entendidos en la técnica y se ejemplifican en la
presente adicionalmente.
La elección de la construcción de anticuerpos
puede estar influenciada por varios factores. Por ejemplo, una vida
media prolongada puede ser resultado de la readsorción activa de
anticuerpos intactos en el riñón, una propiedad del fragmento Fc de
la inmunoglobulina. Los anticuerpos basados en IgG, por tanto, se
espera que muestren una depuración sanguínea más lenta que sus
homólogas Fab'. Sin embargo, las composiciones basadas en el
fragmento Fab', generalmente, mostrarán una mejor capacidad de
penetración en el tejido.
Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener
mediante proteolisis de la inmunoglobulina completa por la tiol
proteasa no específica, papaína. La digestión de papaína produce dos
fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados "fragmentos
Fab", cada uno con un sitio de unión al antígeno único, y un
"fragmento Fc" residual.
La papaína se debe activar primero mediante la
reducción del grupo sulfhidrilo en el sitio activo con cisteína,
2-mercaptoetanol o ditiotreitol. Los metales pesados
en la enzima de suministro deberían ser eliminados mediante
quelación con EDTA (2 mM) para asegurar la máxima actividad
enzimática. La enzima y el sustrato se mezclan normalmente juntos en
una proporción de 1:100 en peso. Tras la incubación, la reacción se
puede parar mediante la alquilación irreversible del grupo tiol con
yodoacetamida o simplemente por diálisis. La integridad de la
digestión se debería monitorizar por SDS-PAGE y
separar las fracciones diversas mediante cromatografía de proteína
A-sefarosa o de intercambio iónico.
El procedimiento habitual para la preparación de
fragmentos F(ab')_{2} a partir de IgG de origen humano y de
conejo es una proteolisis limitada por la enzima pepsina. Las
condiciones, 100 veces de exceso de anticuerpo en peso en tampón de
acetato a pH 4,5, a 37ºC, sugieren que el anticuerpo se divide en la
parte C-terminal del enlace disulfuro entre las
cadenas pesadas. Las velocidades de digestión de la IgG del ratón
puede variar con la subclase y las condiciones deberían elegirse
para evitar cantidades significativas de IgG completamente
degradada. En particular, la IgG_{2b} es susceptible de una
degradación completa. Las otras subclases requieren condiciones de
incubación diferentes para producir resultados óptimos, todo ellos
conocidos en la técnica.
El tratamiento de pepsina de anticuerpos intactos
produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de
combinación al antígeno y es incluso capaz de entrecruzar un
antígeno. La digestión de IgG de rata por la pepsina requiere
condiciones que incluyen la diálisis en un tampón de acetato 0,1 M,
pH 4,5, y a continuación, la incubación durante cuatro horas con un
1% en peso de pepsina; la digestión de IgG_{1} e IgG_{2a} se
mejora si primero se dializa en un tampón de formiato 0,1 M, pH 2,8,
a 4ºC, durante 16 horas seguido por un tampón acetato. La IgG_{2b}
da resultados más consistentes con incubación con proteasa V8 de
estafilococo (3% en peso) en tampón de fosfato sódico 0,1 M, pH 7,8,
durante 4 horas a 37ºC.
Un fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de
la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab
por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo terminal
del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más
cisteína(s) de la región bisagra del anticuerpo. Los
fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} se produjeron
originalmente como pares de fragmentos de Fab' que tienen cisteínas
bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos
de fragmentos de anticuerpo.
Un fragmento "Fv" es el fragmento de
anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de unión y
reconocimiento de antígeno. Esta región consiste en un dímero de un
dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada en una
asociación fuerte, covalente. Es en esta configuración que las tres
regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para
definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero
V_{H}-V_{L}. Colectivamente, las seis regiones
hipervariables confieren una especificidad de unión al antígeno al
anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o medio
de un Fv que comprende sólo tres regiones hipervariables específicas
para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir el
antígeno, aunque con una afinidad inferior que con el sitio de unión
completo.
Los fragmentos de anticuerpos de "cadena única
Fv" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del
anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una cadena
única de polipéptido. Generalmente, el polipéptido Fv además
comprende un enlazador de polipéptidos entre los dominios V_{H} y
V_{L} que permite al sFv formar la estructura deseada para la
unión al antígeno.
Las siguientes patentes y solicitudes de patentes
que se incorporan en la presente para complementar adicionalmente
las presentes enseñanzas respecto a la preparación y uso de regiones
de unión al antígeno funcionales de los anticuerpos, incluyendo los
fragmentos scFv, Fv, Fab', Fab y F(ab')_{2} de los
anticuerpos anti-VEGF: Patentes U.S.A. Nos.
5.855.866; 5.965.132; 6.051.230; 6.004.555; 5.877.289; y la Patente
U.S.A. No. 6 093 399. La Patente WO 98/45331 además describe y
enseña la preparación de regiones determinantes de complementariedad
(CDR), variables e hipervariables de anticuerpos.
Los "diabodies" son fragmentos de anticuerpo
pequeños con dos sitios de unión al antígeno, los cuales comprenden
un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un
dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena de
polipéptido (V_{H}-V_{L}). Mediante el uso de un
enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento
entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios son forzados
a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y
crear dos sitios de unión al antígeno. Los "diabodies" se
describen en las patentes EP 404.097 y WO 93/11161. Los
"anticuerpos lineales", que pueden ser monoespecíficos o
biespecíficos, comprenden un par de segmentos Fd tándem
(V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1)
que forman una pareja de regiones de unión al antígeno, como se
describe en Zapata y otros (1995).
Con la utilización de un Fab' o un fragmento de
unión al antígeno de un anticuerpo, con los beneficios
correspondientes en la penetración en el tejido, se pueden derivar
ventajas adicionales de la modificación del fragmento para
incrementar su vida media. Se pueden emplear una serie de técnicas,
tales como la manipulación o modificación de la propia molécula de
anticuerpo, y también la conjugación a transportadores inertes.
Cualquier conjugación con el único propósito de incrementar la vida
media, en lugar de liberar un agente a una diana, se debería abordar
cuidadosamente ya que Fab' y otros fragmentos se eligen para
penetrar en los tejidos. No obstante, se contempla la conjugación a
polímeros no proteínicos, tal como PEG y similares.
Las modificaciones, diferentes a la conjugación,
por tanto, se basan en la modificación de la estructura del
fragmento de anticuerpo para hacerlo más estable, y/o reducir la
velocidad del catabolismo en el cuerpo. Un mecanismo para tales
modificaciones es el uso de D-aminoácidos en lugar
de L-aminoácidos. Aquellos de habilidad normal en la
técnica entenderán que la introducción de tales modificaciones
necesita estar seguida de un riguroso análisis de la molécula
resultante para asegurar que aún mantiene las propiedades biológicas
deseadas. Las modificaciones estabilizadoras adicionales incluyen el
uso de la adición de fracciones estabilizadoras al extremo
N-terminal o C-terminal, o a ambos,
que se utilizan, en general, para prolongar la vida media de las
moléculas biológicas. A modo de ejemplo sólo, se puede desear
modificar las terminaciones por acilación o aminación.
Las modificaciones del tipo de conjugación
moderada para su uso en la presente invención incluyen la
incorporación de un epítopo de unión al receptor de rescate en el
fragmento de anticuerpo. Las técnicas para conseguir esto incluyen
la mutación de una región apropiada del fragmento de anticuerpo o la
incorporación del epítopo como un péptido etiqueta que está acoplado
al fragmento del anticuerpo. La Patente WO 96/32478 además
ejemplifica dicha tecnología. Los epítopos de unión del receptor de
rescate son normalmente regiones de tres o más aminoácidos de uno o
dos bucles del dominio Fc que se transfiere a la posición análoga en
el fragmento del anticuerpo. Los epítopos de unión del receptor de
rescate de la Patente WO 98/45331 se utilizan en la presente
invención.
A pesar de que la presente invención tiene una
utilidad significativa en los regímenes de tratamiento humano y
animal, también tiene otras muchas aplicaciones prácticas,
incluyendo muchas aplicaciones in vitro. Algunos de estos
usos se refieren a las propiedades de unión específica de los
anticuerpos o inmunoconjugados. Puesto que todos los compuestos de
la presente invención incluyen, como mínimo, un componente del
anticuerpo, se pueden utilizar en prácticamente todas las
realizaciones de unión en que se puede utilizar el anticuerpo
original.
La presencia de un agente acoplado, donde sea
relevante, aunque proporciona propiedades ventajosas, no anula la
utilidad de las regiones del primer anticuerpo en cualquier ensayo
de unión. Los ensayos de unión adecuadamente útiles incluyen, de
este modo, aquellos empleados normalmente en la técnica, tales como
en inmunotransferencias, transferencias tipo Western, transferencias
de puntos, RIAs, ELISAs, inmunohistoquímica, clasificación por
activación celular fluorescente (FACS), inmunoprecipitación,
cromatografía de afinidad, y similares, como se describe en la
presente en profundidad.
Algunos ensayos de unión estándar son aquellos en
que se inmoviliza un antígeno en una matriz de soporte sólido, por
ejemplo, nitrocelulosa, nylon o una combinación de éstos, tal como
en inmunotransferencias, transferencias tipo Western y ensayos
relacionados. Otros ensayos importantes son los ELISAs. Todos estos
ensayos se pueden adaptar fácilmente para su uso en la detección del
VEGF, ya que se puede aplicar en el diagnóstico de una enfermedad
angiogénica. Los agentes de la presente invención también se pueden
utilizar junto con bloques de tejido envueltos de parafina tanto
fijados a formalina como frescos congelados en inmunohistoquímica;
en clasificación por activación celular fluorescente, citometría de
flujo o microfluorometría de flujo; en inmunoprecipitación; en
realizaciones de purificación de antígeno, tal como la cromatografía
de afinidad, que incluso incluye, en casos de anticuerpos
biespecíficos, la purificación rápida de una etapa de uno o más
antígenos al mismo tiempo; y en otros muchos ensayos de unión que
serán conocidos por los entendidos en la técnica dada la información
presentada en la presente.
Algunos usos prácticos adicionales de los
presentes anticuerpos son como controles en ensayos funcionales.
Éstos incluyen muchos ensayos y sistemas in vivo y ex
vivo, así como estudios de modelos animales. Como las
propiedades de unión y funcionales de los anticuerpos de la presente
invención son particularmente específicas, es decir, inhiben la
unión del VEGF a, y la señalización a través de, VEGFR2, pero no
VEGFR1, tales usos de "control" son actualmente extremadamente
valiosos. Los ensayos que se benefician de tal aplicación práctica
de la presente invención incluyen, por ejemplo, ensayos relacionados
con el crecimiento de células endoteliales mediado por el VEGF, la
fosforilación inducida por el VEGF y la permeabilidad vascular
inducida por el VEGF, así como el ensayo de "micropocket"
corneal de neovascularización y el ensayo prueba de la membrana
corioalantoica (CAM) de pollo. Estos sistemas de ensayo también se
pueden desarrollar en ensayos de screening de fármacos in
vitro o ex vivo, en los que el presente suministro de
materiales biológicos con propiedades bien definidas es
particularmente importante.
A pesar de que la presente invención proporciona
anticuerpos no conjugados o desnudos sorprendentemente efectivos
para su uso en métodos antiangiogénicos, por este medio también se
proporcionan inmunoconjugados, inmunotoxinas y coaguligandos de
anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o
basados en 2C3. Los agentes preferidos actualmente para su uso en
conjugados terapéuticos de los anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o basados en 2C3
son agentes radioterapéuticos (ejemplificados por los
radiodiagnósticos dados a conocer en la presente), agentes
antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis, fármacos
antitubulina, agentes citotóxicos o anticelulares y coagulantes
(factores de coagulación).
Para generar inmunoconjugados, inmunotoxinas y
coaguligandos, se puede emplear una expresión recombinante para
crear una proteína de fusión, como se conoce por los entendidos en
la técnica y además dado a conocer en la presente. Igualmente, se
pueden generar inmunoconjugados, inmunotoxinas y coaguligandos
utilizando puentes de avidina:biotina o cualquiera de las
tecnologías de conjugación química o entrecruzamiento desarrolladas
en referencia a los conjugados de anticuerpos.
Para ciertas aplicaciones, los agentes
terapéuticos serán citotóxicos o agentes farmacológicos,
particularmente citotóxicos, citostáticos o, en cualquier caso,
agentes anticelulares que tienen la capacidad de eliminar o suprimir
el crecimiento o la división celular de células endoteliales. En
general, estos aspectos de la presente invención contemplan el uso
de cualquier agente farmacológico que se pueda conjugar a un
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un
anticuerpo similar al 2C3, y se pueda liberar en una forma activa al
endotelio marcado.
Algunos ejemplos de agentes anticelulares
incluyen agentes quimioterapéuticos, así como citotoxinas. Los
agentes quimioterapéuticos que se pueden utilizar incluyen:
hormonas, tales como esteroides; antimetabolitos, tales como
citosina arabinosida, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina;
antraciclinas; mitomicina C; alcaloides de vinca; demecolcina;
etoposida; mitramicina; agentes alquilantes antitumorales, tales
como clorambucil o melfalán. Otras realizaciones pueden incluir
agentes, tales como citocinas. Básicamente, se puede utilizar
cualquier agente anticelular, siempre y cuando, se pueda conjugar
satisfactoriamente a, o asociar con, un anticuerpo en una manera que
permita su marcaje, internalización, liberación y/o presentación a
los componentes sanguíneos en el sitio de las células endoteliales
marcadas.
Pueden haber circunstancias, tales como cuando el
antígeno diana no se internaliza mediante una vía lógica con una
intoxicación eficiente por parte del compuesto tóxico, donde se
deseará marcar agentes terapéuticos, tales como fármacos
antitumorales, citocinas, antimetabolitos, agentes alquilantes,
hormonas, y similares. Actualmente, una variedad de agentes
farmacológicos y quimioterapéuticos, que incluyen doxorubicina,
daunomicina, metotrexato, vinblastina, neocarzinostatina,
macromicina, trenimona y \alpha-amanitina, se han
conjugado satisfactoriamente a anticuerpos y se ha mostrado que
funcionan farmacológicamente.
En otras circunstancias, cualquier efecto
potencial colateral de la terapia basada en citotoxinas se puede
eliminar mediante el uso de inhibidores de la síntesis del ADN,
tales como daunorubicina, doxorubicina, adriamicina, y similares.
Estos agentes son, por tanto, ejemplos preferidos de agentes
anticelulares para su uso en la presente invención.
En términos de agentes citostáticos, tales
compuestos, generalmente, alteran el ciclo natural de la célula de
una célula diana, preferiblemente, de manera que la célula se saca
del ciclo celular.
Se conocen una gran variedad de agentes
citotóxicos que se pueden conjugar al anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o a anticuerpos
basados en 2C3. Algunos ejemplos incluyen numerosas toxinas útiles
derivadas de bacterias, hongos o plantas, que, a modo de ejemplo,
incluyen varias toxinas de cadena A, particularmente la cadena A de
ricina; proteínas inactivadoras de ribosomas, tales como saponina o
gelonina; \alpha-sarcina; aspergilina;
restrictocina; ribonucleasas, tales como ribonucleasa placental;
toxina de la difteria; y exotoxina de pseudomonas, por
nombrar unas cuantas.
De las toxinas, se prefieren las cadenas A de
ricina. La fracción de la toxina más preferida para su uso en la
presente es la cadena A de la toxina que se ha tratado para
modificar o eliminar los residuos de carbohidratos, llamada cadena A
desglicosilada (dgA). Se prefiere la cadena A de ricina
desglicosilada a causa de su extrema potencia, vida media más larga,
y porque es económicamente factible para fabricarse en un grado y
escala clínica.
Es deseable, desde un punto de vista
farmacológico, emplear la molécula más pequeña posible que, no
obstante, proporcione una respuesta biológica apropiada. De este
modo, puede ser deseable el empleo de péptidos de cadena A más
pequeños que proporcionarán una respuesta anticelular adecuada. Para
este fin, se ha descubierto, por Nagarase (Sigma), que la cadena A
de ricina se puede "truncar" mediante la eliminación de 30
aminoácidos del extremo N-terminal, y aún mantiene
una actividad de la toxina adecuada. Se propone que donde se desee,
se pueda emplear esta cadena A truncada en conjugados de acuerdo con
la presente invención.
Alternativamente, se puede encontrar que la
aplicación de la tecnología del ADN recombinante a la fracción de
cadena A de la toxina proporcionará beneficios adicionales de
acuerdo con la presente invención. Puesto que ya se ha conseguido la
clonación y la expresión de la cadena A de la ricina biológicamente
activa, actualmente es posible identificar y preparar péptidos más
pequeños, o en cualquier caso, variantes, que, no obstante, muestran
una actividad de la toxina apropiada. Además, el hecho de que la
cadena A de la ricina se haya clonado actualmente permite la
aplicación de mutagénesis dirigida a sitio, a través de la cual se
pueden preparar fácilmente y verificar los péptidos derivados de
cadena A y obtener fracciones útiles adicionales para su uso con
respecto a la presente invención.
El anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 de la presente
invención se pueden unir a un componente que es capaz de estimular
la coagulación directamente o indirectamente, para formar un
coaguligando. Aquí, los anticuerpos se pueden unir directamente al
coagulante o al factor de coagulación, o se pueden unir a una
segunda región de unión que une y, a continuación libera, el
coagulante o el factor de coagulación. Tal como se usa en la
presente, los términos "coagulante" y "factor de
coagulación" se usan cada uno para referirse a un componente que
es capaz de estimular la coagulación directamente o indirectamente
bajo condiciones apropiadas, preferiblemente cuando se proporciona a
un medio in vivo específico, tal como la vasculatura
tumoral.
Los factores de coagulación preferidos son
composiciones del Factor Tisular, tales como TF truncado (tTF),
dimérico, multimérico y moléculas de TF mutantes. El "TF
truncado" (tTF) se refiere a construcciones de TF que son
deficientes de unión a membrana debido a la eliminación de
secuencias de aminoácidos suficientes para efectuar este cambio en
propiedad. Una "cantidad suficiente", en este contexto, es una
cantidad de secuencia de aminoácidos de transmembrana originalmente
suficiente para entrar la molécula del TF en la membrana, o de otra
manera, mediar la unión funcional de membrana de la proteína TF. La
eliminación de tal "cantidad suficiente de secuencia extensiva de
transmembrana", por tanto, crea una proteína del Factor Tisular
truncada o un polipéptido deficiente en la capacidad de unión a la
membrana fosfolipídica, de tal manera que la proteína es
sustancialmente una proteína soluble, que no se une
significativamente a las membranas fosfolipídicas. De este modo, el
TF truncado, sustancialmente, falla en la conversión del Factor VII
al Factor VIIa en un ensayo de TF estándar, y sin embargo, mantiene
la llamada actividad catalítica que incluye la activación del Factor
X en presencia del Factor VIIa.
La Patente U.S.A. No. 5.504.067 además describe
tales proteínas del Factor Tisular truncado. Preferiblemente, los
Factores Tisulares para su uso en estos aspectos de la presente
invención, generalmente, carecerán de las regiones citosólicas y de
transmembrana (aminoácidos 220-263) de la proteína.
Sin embargo, no hay necesidad para las moléculas de TF truncadas de
limitarse a moléculas con una longitud exacta de 219
aminoácidos.
Las composiciones del Factor Tisular pueden ser
también útiles como dímeros. Cualquiera de las construcciones de
Factor Tisular truncado, mutado u otro, se puede preparar en forma
dimérica para su uso en la presente invención. Tal como se sabrá por
aquellos con habilidad normal en la técnica, tales dímeros de TF se
pueden preparar mediante el empleo de técnicas estándares de
biología molecular y expresión recombinante, en que se preparan dos
regiones de codificación "in-frame" y se
expresan a partir de un vector de expresión. Igualmente, se pueden
emplear varias tecnologías de conjugación química con respecto a la
preparación de dímeros de TF. Los monómeros individuales de TF se
pueden derivatizar previamente a la conjugación. Todas estas
técnicas serían fácilmente conocidas por los entendidos en la
técnica.
Si se desea, los dímeros o multímeros del Factor
Tisular se pueden unir a través de un enlace liberable
biológicamente, tal como un enlazador divisible selectivamente o una
secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, se contemplan enlazadores
peptídicos que incluyen un sitio de división para una enzima
preferencialmente localizado o activo en un medio tumoral. Algunos
ejemplos de formas de tales enlazadores peptídicos son aquellos que
se dividen por uroquinasa, plasmina, trombina, Factor IXa, Factor
Xa, o una metaloproteinasa, tal como colagenasa, gelatinasa o
estromelisina.
En ciertas realizaciones, los dímeros del Factor
Tisular pueden además comprender una fracción de inserción
obstaculizada de membrana hidrofóbica, para posteriormente impulsar
la asociación funcional del Factor Tisular con la membrana
fosfolipídica, pero sólo bajo ciertas condiciones definidas. Tal
como se describe en el contexto de los Factores Tisulares truncados,
las secuencias de asociación de la membrana hidrofóbica son,
generalmente, fragmentos de aminoácidos que provocan la asociación
con el medio fosfolipídico debido a su naturaleza hidrofóbica.
Igualmente, los ácidos grasos se pueden utilizar para proporcionar
las fracciones potenciales de inserción de membrana.
Tales secuencias de inserción de membrana se
pueden localizar en el extremo N-terminal o
C-terminal de la molécula de TF, o generalmente,
anexionadas a cualquier otro punto de la molécula, siempre y cuando,
su acoplamiento a ésta no obstaculice las propiedades funcionales de
la construcción del TF. La intención de la fracción de inserción
obstaculizada es que permanezca no funcional hasta que se localice
la construcción del TF en el medio tumoral, y permita que el anexo
hidrofóbico se vuelva accesible e incluso provoque la asociación
física con la membrana. Otra vez, se contempla que los enlaces
liberables biológicamente y las secuencias divisibles selectivamente
serán particularmente útiles en esta consideración, dividiéndose
sólo el enlace o la secuencia o, de otra manera, modificándose tras
la localización dentro del medio tumoral y la exposición a enzimas
particulares u otras moléculas bioactivas.
En otras realizaciones, las construcciones de tTF
pueden ser multiméricas o poliméricas. En este contexto, una
"construcción polimérica" contiene 3 o más construcciones de
Factor Tisular. Una "construcción de TF polimérica o
multimérica" es una construcción que comprende una primera
molécula o derivado de TF operativamente acoplada a, como mínimo,
una segunda o una tercera molécula o derivado de TF. Los multímeros
pueden comprender entre aproximadamente 3 y aproximadamente 20 de
estas moléculas de TF. Las unidades individuales de TF en los
multímeros o polímeros se pueden también unir por enlazadores
peptídicos divisibles selectivamente u otros enlaces liberables
biológicamente, según se desee. Otra vez, como se discutió
anteriormente con los dímeros TF, las construcciones se pueden
fácilmente fabricar utilizando tanto expresión como manipulación
recombinante o utilizando química sintética estándar.
Además, las construcciones de TF útiles en el
contexto de la presente invención son aquellas mutantes deficientes
en la capacidad de activar el Factor VII. Tales "mutantes de
activación del Factor VII" se definen en la presente,
generalmente, como mutantes del TF que unen el Factor VII/VIIa
funcional, activan proteolíticamente el Factor X, pero están
sustancialmente libres de la capacidad de activar proteolíticamente
el Factor VII. Por consiguiente, tales construcciones son mutantes
de TF que carecen de la actividad de activación del Factor VII.
La capacidad de tales mutantes de activación del
Factor VII para funcionar en la provocación de la coagulación
específica del tumor se basa en su liberación específica a la
vasculatura tumoral, y la presencia del Factor VIIa en niveles bajos
en el plasma. Tras la administración de tal conjugado de mutante de
activación del Factor VII, el mutante se localizará en la
vasculatura de un tumor vascularizado. Previo a la localización, el
mutante de TF, generalmente, sería incapaz de provocar la
coagulación en ningún otro sitio del cuerpo, en base a su
incapacidad para convertir el Factor VII en el Factor VIIa. Sin
embargo, tras la localización y acumulación dentro de la región
tumoral, el mutante encontrará suficiente Factor VIIa del plasma
para iniciar el mecanismo de coagulación extrínseca, llevando a una
trombosis específica del tumor. El Factor VIIa exógeno también se
puede administrar al paciente.
Se pueden preparar y utilizar alguno o más de uno
de una variedad de mutantes de activación del Factor VII en relación
con la presente invención. Hay una cantidad significativa de
conocimiento científico con respecto a los sitios de reconocimiento
en la molécula de TF para el Factor VII/VIIa. De este modo, se
entenderá que la región de activación del Factor VII, generalmente,
se encuentra entre aproximadamente el aminoácido 157 y
aproximadamente el aminoácido 167 de la molécula de TF. Sin embargo,
se contempla que los residuos externos a esta región también pueden
demostrar que son relevantes en la actividad de la activación del
Factor VII, y por tanto, se puede considerar la introducción de
mutaciones en alguno o más de uno de los residuos localizados,
generalmente, entre aproximadamente el aminoácido 106 y
aproximadamente el aminoácido 209 de la secuencia de TF (WO
94/07515; WO 94/28017).
Se puede utilizar una variedad de otros factores
de coagulación en relación con la presente invención, tal como
ejemplifican los agentes siguientes. En la presente invención se
puede utilizar trombina, Factor V/Va y derivados, Factor VIII/VIIIa
y derivados, Factor IX/IXa y derivados, Factor X/Xa y derivados,
Factor XI/XIa y derivados, Factor XII/XIIa y derivados, Factor
XIII/XIIIa y derivados, activador del Factor X y activador del
Factor V.
El activador del Factor X del veneno de víbora de
Russell se contempla para su uso en la presente invención. También
se han producido anticuerpos monoclonales específicos para el
activador del Factor X presente en el veneno de víbora de Russell, y
se podrían utilizar para liberar específicamente el agente como
parte de un ligando de unión biespecífico.
El tromboxano A_{2} se forma a partir de
endoperóxidos mediante las acciones secuenciales de los enzimas
ciclooxigenasa y tromboxano sintetasa en microsomas de plaquetas. El
tromboxano A_{2} se genera fácilmente por plaquetas y es un
potente vasoconstrictor, en virtud de su capacidad para producir la
agregación plaquetaria. Tanto el tromboxano A_{2} como los
análogos activos de éste se contemplan para su uso en la presente
invención.
La tromboxano sintasa, y otros enzimas que
sintetizan las prostaglandinas de activación de plaquetas, se pueden
también utilizar como "coagulantes" en el presente contexto. Se
conocen anticuerpos monoclonales a la tromboxano sintasa, y
purificación de inmunoafinidad de la misma; así como el ADNc para la
tromboxano sintasa humana.
La \alpha2-antiplasmina, o el
inhibidor de la \alpha2-plasmina, es una
proteinasa inhibidora natural presente en el plasma humano que actúa
para inhibir eficientemente la lisis de los coágulos de fibrina
inducidos por el activador de plasminógeno. La
\alpha2-antiplasmina es un inhibidor
particularmente potente, y se contempla para su uso en la presente
invención.
Como se dispone de la secuencia de ADNc para la
\alpha2-antiplasmina, se prefieren la expresión
recombinante y/o las proteínas de fusión. Los anticuerpos
monoclonales contra la \alpha2-antiplasmina
también están disponibles y se pueden utilizar en las realizaciones
con ligando de unión biespecífica de la presente invención. Estos
anticuerpos se podrían utilizar para liberar la
\alpha2-antiplasmina exógena al sitio diana o para
acumular \alpha2-antiplasmina endógena y
concentrarla dentro de la región marcada.
Un conjunto de fármacos ejercen sus efectos a
través de la interferencia con la actividad de la tubulina. Como las
funciones de la tubulina son esenciales para la mitosis y la
viabilidad de las células, ciertos "fármacos antitubulina" son
poderosos agentes quimioterapéuticos. Algunos de los fármacos
antitubulina mejor conocidos y preferidos actualmente para su uso
con la presente invención son la colquicina; los taxanos, tal como
el taxol; los alcaloides de vinca, tal como la vinblastina, la
vincristina y la vindescina; y las combretastatinas. Otros fármacos
antitubulina son las citocalasinas (incluyendo B, J, E), la
dolastatina, la auristatina PE, el paclitaxel, la ustiloxina D, la
rizoxina, 1069C85, la colcemida, el albendazol, la anatoxina y el
nocodazol.
Como se describe en las Patentes U.S.A. Nos.
5.892.069, 5.504.074 y 5.661.143, las combretastatinas son derivados
del estradiol que, generalmente, inhiben la mitosis celular. Algunas
combretastatinas de ejemplo que se pueden utilizar en relación con
la invención incluyen aquellas basadas en combretastatina A, B y/o D
y las descritas en las Patentes U.S.A. No. 5.892.069, 5.504.074 y
5.661.143. Las combretastatinas A-1,
A-2, A-3, A-4,
A-5, A-6, B-1,
B-2, B-3 y B-4 son
ejemplos de los tipos anteriores.
Las Patentes U.S.A. Nos. 5.569.786 y 5.409.953
describen el aislamiento, la caracterización estructural y la
síntesis de cada una de las combretastatinas A-1,
A-2, A-3, B-1,
B-2, B-3 y B-4 y las
formulaciones y métodos de utilización de tales combretastatinas
para tratar el crecimiento neoplástico. Se pueden utilizar alguna o
más de una de tales combretastatinas en relación con la presente
invención.
La combretastatina A-4, tal como
se describe en las Patentes U.S.A. Nos. 5.892.069, 5.504.074,
5.661.143 y 4.996.237, también se puede utilizar en la presente. La
Patente U.S.A. No. 5.561.122 describe profármacos de combretastatina
A-4 adecuados, los cuales se contemplan para su uso
combinado con la presente invención.
La Patente U.S.A. No. 4.940.726 particularmente
describe lactonas macrocíclicas denominadas combretastatina
D-1 y "Combretastatina D-2",
cada una de las cuales se puede utilizar en combinación con las
composiciones y métodos de la presente invención. La Patente U.S.A.
No. 5.430.062 tiene que ver con derivados de estilbeno y análogos de
combretastatina con actividad anticancerígena que se pueden utilizar
en combinación con la presente invención.
La presente invención particularmente proporciona
antiangiogénicos combinados. Las angiopoyetinas, al igual que los
miembros de la familia del VEGF, son factores de crecimiento
específicos para el endotelio vascular (Davis y Yancopoulos, 1999;
Holash y otros, 1999). Las primeras angiopoyetinas descritas eran un
activador o agonista natural del receptor,
angiopoyetina-1 (Ang-1), y un
antagonista natural del receptor, angiopoyetina-2
(Ang-2), las cuales actúan por medio del receptor de
tirosina quinasa de la célula endotelial, Tie2.
También se han identificado dos nuevas
angiopoyetinas, la angiopoyetina-3 (ratón) y la
angiopoyetina-4 (humana) (Valenzuela y otros, 1999).
La angiopoyetina-3 parece actuar como antagonista
(como Ang-2), mientras que la
angiopoyetina-4 parece funcionar como agonista (como
Ang-1) (Valenzuela y otros, 1999). Una proteína
denominada angiopoyetina-3 también fue clonada de
corazón humano y no mostró tener efectos mitogénicos en las células
endoteliales (Kim y otros, 1999).
Mientras que el VEGF es necesario para las
primeras etapas del desarrollo vascular, la
angiopoyetina-1 se requiere, generalmente, para las
últimas etapas de la vascularización. El VEGF, de este modo, actúa
para provocar la diferenciación y proliferación de células
endoteliales y la formación de los vasos primitivos. La
angiopoyetina-1 actúa, a través del receptor Tie2,
para provocar el mantenimiento y la estabilización de los vasos
maduros. La angiopoyetina-1 es, de este modo, un
factor de estabilización o maduración, pensado para convertir los
vasos inmaduros en vasos maduros mediante la estimulación de
interacciones entre las células endoteliales y las células de
soporte circundantes (Holash y otros, 1999).
Se ha mostrado que la
angiopoyetina-1 aumenta la revascularización en el
tejido isquémico (Shyu y otros, 1998) e incrementa la supervivencia
de la red vascular expuesta al VEGF o a una forma del aFGF
(Papapetropoulos y otros, 1999). Estos autores también mostraron que
la angiopoyetina-1 previene la muerte apoptótica en
las HUVEC (células endoteliales de cordón umbilical humano)
impulsada por la extracción de la misma forma de aFGF
(Papapetropoulos y otros, 1999). Tales datos concuerdan con el papel
directo de la angiopoyetina-1 en las células humanas
endoteliales y su interacción con otras moléculas angiogénicas para
estabilizar las estructuras vasculares provocando la supervivencia
de las células endoteliales diferenciadas.
Como la angiopoyetina-1 emite una
señal de estabilidad y madurez, los inventores han pensado en
aquellos aspectos de la presente invención que se relacionan con la
liberación de angiopoyetina-1 dirigida. Los
inventores razonaron que, como la angiopoyetina-1 es
un factor de madurez, dejaría que el factor de crecimiento de los
vasos sanguíneos de la sangre fuera independiente. Un aspecto de la
presente invención, por tanto, tiene que ver con el uso de la
angiopoyetina-1 dirigida al tumor para cimentar las
propiedades de no respuesta al VEGF de los vasos diana.
Es razonable pensar que el uso de un ligando de
unión al tumor para liberar angiopoyetina-1 a los
vasos sanguíneos del tumor liberaría fácilmente del orden de 500.000
moléculas de angiopoyetina-1 al lumen del vaso. Esto
abrumaría el sistema del receptor Tie2, saturando totalmente los
receptores Tie2 con el ligando de angiopoyetina-1.
De este modo, la angiopoyetina-2 sería incapaz de
unirse, y por tanto, se inhibirían los efectos combinados de la
angiopoyetina-2 y el VEGF (ver discusión a
continuación).
La liberación de angiopoyetina-1
al tumor, preferiblemente a la vasculatura del tumor, se puede
utilizar junto con una variedad de otras estrategias
anticancerígenas, como se da a conocer en la presente en detalle,
para conseguir un efecto terapéutico combinado. La respuesta típica
de un tumor a terapias que inducen, como mínimo, algo de necrosis,
es iniciar la regeneración vascular. Como la señal de la
angiopoyetina-1 fuerza a madurar a los vasos
sanguíneos, serían incapaces de remodelar y no podrían compensar la
pérdida de masa tumoral inducida por el agente terapéutico primario.
Estas observaciones, por tanto, proporcionan otro aspecto preferido
de la invención en la liberación de angiopoyetina, concretamente el
uso combinado del marcaje de angiopoyetina-1 en
combinación con alguno o más de uno de agentes anticancerígenos,
incluyendo fármacos quimioterapéuticos convencionales.
La acción de la angiopoyetina-1
tras la liberación es fundamentalmente para impedir la remodelación
vascular. Tanto si se utiliza sola, como en terapias de combinación,
el valor del marcaje de angiopoyetina-1 se aumenta
particularmente por la seguridad inherente en esta aproximación
terapéutica. No hay desventajas significativas en la terapia con
angiopoyetina-1. Incluso, en el caso desafortunado
de que una cantidad de Ang-1 marcada se mal
dirigiera a tejidos no tumorales, todo lo que resultaría sería que
la vasculatura en el área marcada se haría más estable y/o inactiva.
En esta consideración, la Ang-1 también se podría
utilizar como un agente antiinflamatorio.
La angiopoyetina-2 es actualmente
un agente preferido para su uso en terapias dirigidas al tumor,
particularmente en combinación con la inhibición del VEGF de la
presente invención. Sin embargo, debido a los efectos diferenciales
de la angiopoyetina-2 bajo diferentes condiciones,
particularmente con niveles de VEGF variantes, los inventores han
pensado otra vez cuidadosamente en aquellos aspectos de la presente
invención que se refieren a la liberación de
angiopoyetina-2 dirigida.
La angiopoyetina-2 también es un
ligando para el receptor Tie2, pero, generalmente, contrarresta la
maduración/estabilidad de los vasos sanguíneos mediados por la
angiopoyetina-1. Es, de este modo, un antagonista de
la angiopoyetina-1 y actúa para alterar la
estructura capilar. Bajo condiciones apropiadas, la
angiopoyetina-2 transmite una señal negativa a las
células diana y, la desestabilización inducida por la
angiopoyetina-2, conlleva una regresión de los
vasos. Esta es la primera característica de la
angiopoyetina-2, buscada para ser explotada en la
liberación dirigida de angiopoyetina-2 a tumores,
preferiblemente a la vasculatura tumoral.
Se contempla que simplemente liberando suficiente
angiopoyetina-2, que es fácilmente conseguible
utilizando anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de
VEGFR2, tales como 2C3, se saturaría cualquier otra señal que
pudiera estar presente en el medio tumoral y provocaría la regresión
de los vasos. Como hay una interacción controlada cuidadosamente
entre las angiopoyetinas en el medio natural, una inclinación
extrema del sistema a favor de la regresión, mediante la
señalización de angiopoyetina-2 constante, puede
bien destruir los efectos tanto de la
angiopoyetina-1 como del VEGF.
El uso de angiopoyetina-2 sola
dirigida al tumor se puede, por tanto, utilizar como ventaja para la
inducción de la regresión de los vasos del tumor, particularmente
como un mecanismo inicial de intervención terapéutica. Generalmente,
sin embargo, la desestabilización inducida por la
angiopoyetina-2 puede llevar a la regresión o a la
regeneración de los vasos. La desestabilización en ausencia de otros
estímulos angiogénicos, particularmente VEGF, es la que conduce a la
regresión de los vasos; mientras que la desestabilización en
presencia de altos niveles de VEGF facilita la respuesta angiogénica
(Holash y otros, 1999).
Los vasos sanguíneos que experimentan una
desestabilización en respuesta a la angiopoyetina-2
se pueden "rescatar" de la regresión mediante la exposición a
otros estímulos. La angiopoyetina-2 puede, por
tanto, dejar las células endoteliales sensibles a otros estímulos
angiogénicos y facilitar una respuesta angiogénica bajo condiciones
definidas. El VEGF, en particular, puede impulsar a las células
desestabilizadas por Ang-2 a proliferar y formar
nuevos vasos primitivos (Asahara y otros, 1998; Holash y otros,
1999). De hecho, se ha informado de la expresión de la
angiopoyetina-2 en tejidos tumorales (Tanaka y
otros, 1999), en los que se presumía que actuaba en combinación con
VEGF para provocar la angiogénesis (Stratmann y otros, 1998). La
neovascularización iniciada por la angiopoyetina-2 y
el VEGF hace que estas moléculas sean
"co-angiogénicas".
Actualmente, se ha informado de un modelo
coordinado para explicar los efectos positivos y negativos de la
angiopoyetina-2 en vasos sanguíneos en ciertos tipos
de tumores (Holash y otros, 1999). En este modelo, la
desestabilización inducida por la angiopoyetina-2,
inicialmente, causa una regresión de los vasos significativa en
tumores que se originan mediante la adición de vasos sanguíneos de
la vasculatura del huésped circundante. Los altos niveles de
angiopoyetina-2 producidos por las células
endoteliales asociadas al tumor responden a la señal de
supervivencia aparentemente proporcionada por una expresión
constitutiva de bajo nivel de angiopoyetina-1. La
angiopoyetina-2, de este modo, marca los vasos
añadidos para la regresión apoptópica (Holash y otros, 1999). Sin
embargo, a pesar de la necrosis tumoral resultante, las células
tumorales supervivientes regulan a la alta el VEGF para asegurar su
supervivencia. La expresión coincidente de VEGF y
angiopoyetina-2 da lugar entonces a una angiogénesis
robusta en la periferia del tumor, ya que el VEGF anula la señal de
regresión de la angiopoyetina-2 y, de hecho, provoca
el desarrollo vascular (Holash y otros, 1999).
A pesar de que a primera vista puede parecer
contradictorio, las acciones de la angiopoyetina-2
se pueden explicar y predecir ampliamente en base a otras señales
presentes, particularmente VEGF. En ausencia de otra señal
angiogénica, la angiopoyetina-2 provoca que los
vasos se desestabilicen y se vuelvan inmaduros, llevando a la
regresión. En presencia de un estímulo, particularmente VEGF, la
desestabilización causada por la angiopoyetina-2
realmente lleva a la angiogénesis ya que los vasos se han
"cebado" para recibir un estímulo angiogénico secundario. Los
efectos angiogénicos de algunos reguladores, de este modo, se cree
que se consiguen, como mínimo en parte, a través de la regulación de
un bucle autocrino de la actividad de
angiopoyetina-2 en células endoteliales
microvasculares (Mandriota y Pepper, 1998).
Los papeles biológicos duales de la
angiopoyetina-2 impulsaron a los inventores a
desarrollar estrategias terapéuticas adicionales que tienen en
cuenta otras señales en el medio tumoral, particularmente VEGF. Como
la angiopoyetina-2 y el VEGF actúan conjuntamente
para estimular la angiogénesis, un aspecto preferido de la presente
invención es utilizar la liberación de
angiopoyetina-2 dirigida al tumor en combinación con
los presentes anticuerpos inhibidores del VEGF. Esto asegurará que
la angiopoyetina-2 actúe en la regresión y no en la
angiogénesis.
A la luz de las explicaciones anteriores, se
entenderá que la presente invención proporciona anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como 2C3,
que están operativamente acoplados a, o de otra manera asociados
funcionalmente, con alguno o más de uno del grupo de
angiopoyetina-1, angiopoyetina-2,
angiopoyetina-3 y/o angiopoyetina-4.
Algunos ejemplos de composiciones de angiopoyetina-1
son los de SEQ ID NO:1 (ADN) y SEQ ID NO:2 (proteína), mientras que
los composiciones de angiopoyetina-2 se ejemplifican
por SEQ ID NO:3 (ADN) y SEQ ID NO:4 (proteína). La
angiopoyetina-3, que es un antagonista,
generalmente, se utilizará como la angiopoyetina-2;
y el agonista angiopoyetina-4 se puede utilizar como
la angiopoyetina-1. El artículo de Valenzuela y
otros (1999) además complementa la presente enseñanza respecto a la
angiopoyetina-3 y la
angiopoyetina-4.
Además, las proteínas de fusión de las
angiopoyetinas también se prevén para su uso en la presente
invención. Un ejemplo es la proteína de fusión estable
Ang-1-Ang-2 incluida
en la presente como SEQ ID NO:5. Esta proteína contiene los primeros
73 residuos de la angiopoyetina-2, hasta la
secuencia DAPLEY, fusionada al inicio de la secuencia de la
angiopoyetina-1 en el aminoácido 77. También tiene
una mutación en la posición 265 en la secuencia de la
angiopoyetina-1, donde la Cys se reemplaza por
Ser.
Otros antiangiogénicos para usar en la presente
incluyen la angiostatina y la endostatina. La angiostatina se da a
conocer en las Patentes U.S.A. 5.776.704; 5.639.725 y 5.733.876. La
angiostatina es una proteína que tiene un peso molecular de entre
unos 38 kD y unos 45 kD, tal como se determina mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida reductora, que contiene
aproximadamente regiones Kringle 1 a 4 de una molécula de
plasminógeno. La angiostatina, generalmente, tiene una secuencia de
aminoácidos sustancialmente similar a la de un fragmento de
plasminógeno murino que empieza por el aminoácido 98 de una molécula
de plasminógeno murino intacta.
La secuencia de aminoácidos de la angiostatina
varía ligeramente entre especies. Por ejemplo, en la angiostatina
humana, la secuencia de aminoácidos es sustancialmente similar a la
secuencia del fragmento de plasminógeno murino descrito
anteriormente, a pesar de que una secuencia de angiostatina humana
activa puede comenzar en el aminoácido 97 ó 99 de una secuencia de
aminoácido de plasminógeno humano intacto. Además, se puede utilizar
plasminógeno humano, ya que tiene una actividad antiangiogénica
similar, como se muestra en un modelo de tumor en ratón.
La angiostatina y la endostatina se han
convertido en foco de un intenso estudio, ya que son los primeros
inhibidores de angiogénesis que se ha demostrado que tienen
capacidad, no sólo de inhibir el crecimiento del tumor, sino también
de causar la regresión del tumor en ratones. Se ha mostrado que
existen múltiples proteasas que producen angiostatina a partir de
plasminógeno como, por ejemplo, elastasa, macrófago metaloelastasa
(MME), matrilisina (MMP-7), y colagenasa tipo
IV/gelatinasa B de 92 kDa (MMP-9).
La MME puede producir angiostatina a partir de
plasminógeno en tumores y el factor estimulador de colonias de
granulocitos-macrófagos (GMCSF) regula a la alta la
expresión del MME mediante macrófagos que inducen la producción de
angiostatina. El papel del MME en la generación de angiostatina se
apoya en el descubrimiento de que el MME, de hecho, se expresa en
muestras clínicas de carcinomas hepatocelulares de pacientes. Otra
proteasa pensada para ser capaz de producir angiostatina es la
estromelisina-1 (MMP-3). Se ha
mostrado que la MMP-3 produce fragmentos similares a
la angiostatina a partir de plasminógeno in vitro. El
mecanismo de acción de la angiostatina no está aún claro; se cree
que se une a un receptor superficial de célula no identificado en
las células endoteliales induciendo a la célula endotelial a
experimentar la muerte de la célula programada o la detención
mitótica.
La endostatina parece ser un agente
antiangiogénico y antitumoral incluso más poderoso y se prefiere
particularmente para la unión a anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como el
2C3. La endostatina es efectiva en la provocación de regresiones en
varios modelos de tumor en ratones. Los tumores no desarrollan
resistencia a la endostatina y, después de ciclos múltiples de
tratamiento, los tumores entran en un estado inactivo durante el
cual no incrementan su volumen. En este estado inactivo, se
incrementó el porcentaje de células tumorales que experimentan
apoptosis, produciendo una población que esencialmente mantiene el
mismo tamaño.
La Patente U.S.A. No. 5.854.205, a Folkman y
O'Reilly, tiene que ver con la endostatina y su uso como inhibidor
de la proliferación de células endoteliales y la angiogénesis. La
proteína endostatina corresponde a un fragmento
C-terminal de colágeno tipo XVIII, y la proteína se
puede aislar a partir de una serie de fuentes. La Patente U.S.A. No.
5.854.205 también explica que la endostatina puede tener una
secuencia de aminoácidos de un fragmento de colágeno tipo XVIII,
colágeno tipo XV, o esterasa pregástrica BOVMPE 1. Las combinaciones
de endostatina con otras proteínas antiangiogénicas, particularmente
angiostatina, también están descritas por la Patente U.S.A. No.
5.854.205, de manera que las composiciones combinadas son capaces de
hacer una regresión efectiva de la masa de un tumor dependiente de
angiogénesis.
La endostatina y la angiostatina son agentes
preferidos para la liberación al tumor según la presente invención.
La vasculostatina, la canstatina y la maspina son también agentes
preferidos. La endostatina, en particular, es uno de los agentes más
preferidos. Las proteínas de fusión endostatina-2C3
se pueden preparar, como se describe en la presente. Varias
construcciones de endostatina-2C3 unidas
químicamente también se describen en la presente solicitud.
La presente invención también se puede utilizar
para liberar agentes que inducen la apoptosis en cualquier célula en
el interior del tumor, incluyendo células tumorales y células
endoteliales vasculares del tumor. A pesar de que muchos agentes
anticancerígenos pueden tener, como parte de su mecanismo de acción,
un efecto inductor de apoptosis, se han descubierto, diseñado y
seleccionado ciertos agentes con éste como mecanismo principal, tal
como se describe a continuación.
Muchas formas de cáncer tienen informes de
mutaciones en los genes supresores de tumores, tal como p53. La
inactivación del p53 da lugar a un fallo en la provocación de
apoptosis. Con este fallo, las células cancerígenas progresan en la
tumorigénesis, en lugar de destinarse a la muerte celular. De este
modo, la liberación de supresores de tumores también se contempla
para su uso en la presente invención, para estimular la muerte
celular. Algunos ejemplos de supresores tumorales incluyen, pero no
están limitados a, p53, gen del Retinoblastoma (Rb), el tumor de
Wilm (WT1), alfa bax, la enzima convertidora de interleucina
1\beta y familia, gen MEN-1, neurofibromatosis
tipo 1 (NF1), p16 inhibidor de cdk, gen del cáncer colorectal (DCC),
gen de la polipopsis adenomatosis familiar (FAP), gen supresor de
tumores múltiples (MTS-1), BRCA1 y BRCA2.
Los preferidos para su uso son el p53 (Patentes
U.S.A. Nos. 5.747.469; 5.677.178; y 5.756.455), Retinoblastoma,
BRCA1 (Patentes U.S.A. Nos. 5.750.400; 5.654.155; 5.710.001;
5.756.294; 5.709.999; 5.693.473; 5.753.441; 5.622.829; y 5.747.282),
MEN-1 (Banco de Genes, número de acceso U93236) y
adenovirus E1A (Patente U.S.A. No. 5.776.743).
Otras composiciones que se pueden liberar por los
anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tal
como el 2C3, incluyen genes que codifican el factor de la necrosis
tumoral relacionado con el ligando inductor de apoptosis denominado
TRAIL, y el polipéptido TRAIL (Patente U.S.A. No. 5.763.223); la
proteasa asociada a la apoptosis de 24 kD de la Patente U.S.A. No.
5.605.826; el factor 1 asociado a Fas, FAF1 (Patente U.S.A. No.
5.750.653). También se contempla para su uso, en estos aspectos de
la presente invención, el suministro de la enzima convertidora de
interleucina 1\beta y los miembros de la familia, que también se
ha indicado que estimulan la apoptosis.
También se pueden utilizar compuestos, tales como
derivados de carbostiril (Patentes U.S.A. Nos. 5.672.603; y
5.464.833); péptidos apogénicos ramificados (Patente U.S.A. No.
5.591.717); inhibidores de fosfotirosina y análogos de fosfotirosina
no hidrolizables (Patentes U.S.A. Nos. 5.565.491; y 5.693.627);
agonistas de los receptores de retinoide de RXR (Patente U.S.A. No.
5.399.586); e incluso antioxidantes (Patente U.S.A. No. 5.571.523).
Los inhibidores de tirosina quinasa, tal como genisteína, también se
pueden unir a los agentes de la presente invención que están
dirigidos al receptor de la superficie de la célula, VEGFR1 (como se
indica en la Patente U.S.A. No. 5.587.459).
Los equivalentes, o incluso mejoras, de los
anticuerpos basados en 2C3 o de cualquier otro anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, se pueden fabricar
en la actualidad, generalmente, utilizando los materiales
proporcionados anteriormente como punto de partida. Se pueden hacer
modificaciones y cambios en la estructura de tal anticuerpo y aún
obtener una molécula que tenga características parecidas, o de
cualquier manera, deseables. Por ejemplo, ciertos aminoácidos se
pueden sustituir por otros aminoácidos en la estructura de una
proteína sin perder apreciablemente la capacidad de unión
interactiva. Estas consideraciones también se aplican a toxinas,
agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis,
coagulantes y similares.
Puesto que la capacidad interactiva y la
naturaleza de una proteína es lo que define la actividad biológica
funcional de la proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de
la secuencia de aminoácidos en una secuencia de proteína (o, por
supuesto, en la secuencia del ADN subyacente) y, sin embargo,
obtener una proteína con propiedades similares (agonística). De este
modo, se contempla que se pueden hacer varios cambios en la
secuencia de los anticuerpos o en los agentes terapéuticos (o en las
secuencias del ADN subyacente) sin que haya una pérdida apreciable
de su utilidad o actividad biológica. Los equivalentes biológicos
funcionales fabricados a partir de mutaciones en una secuencia de
ADN subyacente se pueden fabricar utilizando la información del
codón, proporcionada en la presente en la Tabla A, y los detalles
técnicos de soporte en la mutagénesis específica de sitio.
Se entenderá bien por los entendidos en la
técnica que, inherente a la definición de una proteína o polipéptido
"equivalente biológicamente funcional", está el concepto de que
hay un límite en el número de cambios que se pueden hacer dentro de
una parte definida de la molécula y aún, dar lugar a una molécula
con un nivel aceptable de actividad biológica equivalente. Las
proteínas o péptidos equivalentes biológicamente funcionales, de
este modo, se definen en la presente como aquellas proteínas y
péptidos en que ciertos aminoácidos se pueden sustituir, no la
mayoría ni todos. Por supuesto, se pueden fabricar y utilizar
fácilmente, de acuerdo con la presente invención, una pluralidad de
diferentes péptidos/proteínas con diferentes sustituciones.
Las sustituciones de aminoácidos se basan,
generalmente, en la similaridad relativa de los sustituyentes de la
cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad,
hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Un análisis del tamaño,
la forma y el tipo de sustituyentes de la cadena lateral del
aminoácido revela que la arginina, la lisina y la histidina tienen
todas residuos cargados positivamente; que la alanina, la glicina y
la serina tienen todas un tamaño similar; y que la fenilalanina, el
triptófano y la tirosina tiene todas una forma, generalmente,
similar. Por tanto, basándose en estas consideraciones, la arginina,
la lisina y la histidina; la alanina, la glicina y la serina; y la
fenilalanina, el triptófano y la tirosina; se definen en la presente
como equivalentes biológicamente funcionales.
Al hacer cambios más cuantitativos, se puede
considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada
aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a su
hidrofobicidad y sus características de carga y éstos son:
isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina
(+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8);
glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9);
tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5);
glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina
(-3,9); y arginina (-4,5).
La importancia del índice hidropático de los
aminoácidos al conferir una función biológica interactiva en una
proteína se entiende, generalmente, en la técnica (Kyte y Doolittle,
1982). Se sabe que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros
aminoácidos que tienen un marcador o índice hidropático similar y
aún conservar una actividad biológica similar. Al hacer cambios
basados en el índice hidropático, se prefiere la sustitución de
aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de \pm2, se
prefieren particularmente aquellos que están dentro de \pm1, e
incluso se prefieren más particularmente aquellos dentro de
\pm0,5.
Se entiende, de este modo, que un aminoácido se
puede sustituir por otro que tiene un valor de hidrofilicidad
similar y aún obtener una proteína biológicamente equivalente. Como
se detalla en la Patente U.S.A. No. 4.554.101, se han asignado los
siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácido:
arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato
(+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2);
glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1), alanina
(-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina
(-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3);
fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).
Al hacer cambios basados en los valores de
hidrofilicidad, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos
valores de hidrofilicidad están dentro de \pm2, se prefieren
particularmente aquellos que están dentro de \pm1, e incluso de
prefieren más particularmente aquellos que están dentro de \pm
0,5.
Los inmunoconjugados del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 de
la presente invención se pueden preparar fácilmente como proteínas
de fusión utilizando técnicas de biología molecular. Cualquier
proteína de fusión se puede designar y fabricar utilizando
cualquiera de los agentes terapéuticos dados a conocer en la
presente y aquellos conocidos en la técnica. La tecnología de las
proteínas de fusión se adapta fácilmente para preparar proteínas de
fusión en las dos partes de unen mediante la secuencia de un péptido
divisible selectivamente. Actualmente, las proteínas de fusión
preferidas son aquellas que contienen endostatina. La endostatina,
como con cualquier otro agente terapéutico, se puede acoplar al
extremo terminal del anticuerpo o a cualquier punto diferente de las
CDRs. Los agentes terapéuticos, tales como la endostatina, también
se pueden preparar "de forma íntegra", en la que se asocia
preferiblemente con un péptido divisible selectivamente para
permitir la liberación del agente tras el marcaje.
El uso de técnicas de ADN recombinante para
conseguir tales terminaciones es, actualmente, una práctica estándar
para aquellos entendidos en la técnica. Estos métodos incluyen, por
ejemplo, técnicas del ADN recombinante in vitro, técnicas
sintéticas y recombinación genética/recombinación in vivo. La
síntesis de ARN y ADN se puede, adicionalmente, realizar utilizando
sintetizadores automatizados (ver, por ejemplo, las técnicas
descritas en Sambrook y otros, 1989).
La preparación de tal proteína de fusión implica,
generalmente, la preparación de una primera y una segunda región de
codificación de ADN y la ligación o unión funcional de tales
regiones, "in frame", para preparar una única región de
codificación que codifica la proteína de fusión deseada. En el
presente contexto, el anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o la secuencia de ADN del anticuerpo similar al
2C3 se unirá, "in frame", con una secuencia de ADN que codifica
un agente terapéutico. Generalmente, no se cree que sea
particularmente relevante qué parte de la construcción se prepara
como región N-terminal o como región
C-terminal.
Una vez se ha producido la región de codificación
deseada, se crea un vector de expresión. Los vectores de expresión
contienen uno o más promotores en la dirección 5' de las regiones de
ADN insertadas que actúan para provocar la transcripción del ADN y,
de este modo, provocar la expresión de la proteína recombinante
codificada. Este es el significado de "expresión
recombinante".
Para obtener la llamada versión
"recombinante" del inmunoconjugado del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, se
expresa en una célula recombinante. El diseño de la expresión del
segmento(s) de ADN para la expresión en un sistema
eucariótico o procariótico se puede realizar mediante técnicas,
generalmente, conocidas por aquellos con habilidad en la expresión
recombinante. Se cree que, en principio, se puede emplear cualquier
sistema de expresión en la expresión de construcciones del
inmunoconjugado del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2 o basado en 2C3.
Tales proteínas se pueden expresar
satisfactoriamente en sistemas de expresión eucarióticos, por
ejemplo, células CHO, aunque sin embargo, se prevé que los sistemas
de expresión bacteriana, tales como E.coli
pQE-60, serán particularmente útiles para la
preparación a gran escala y la posterior purificación de los
inmunoconjugados del anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3. Los ADNcs también se pueden
expresar en sistemas bacterianos, con las proteínas codificadas
expresándose como fusiones con
\beta-galactosidasa, ubiquitina, glutationa
S-transferasa de Schistosoma japonicum, y
similares. Se cree que la expresión bacteriana tendrá ventajas sobre
la expresión eucariótica en términos de facilidad de uso y cantidad
de materiales obtenidos de esa manera.
En términos de expresión microbiana, las Patentes
U.S.A. Nos. 5.583.013; 5.221.619; 4.785.420; 4.704.362, y 4.366.246
incluso complementan adicionalmente la presente descripción en
relación a la expresión de genes en las células huésped
recombinantes.
Los inmunoconjugados del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3
producidos recombinantemente, se pueden purificar y formular para la
administración en humanos. Alternativamente, los ácidos nucleicos
que codifican los inmunoconjugados se pueden liberar a través de la
terapia génica. A pesar de que se puede emplear ADN recombinante
desnudo o plásmidos, se prefiere el uso de liposomas o vectores. La
capacidad de ciertos virus de entrar en las células a través de
endocitosis mediada por un receptor y de integrarse en el genoma de
la célula huésped y expresar los genes virales de forma estable y
eficiente, los ha hecho atractivos candidatos para la transferencia
de genes extraños en células de mamíferos. Los vectores de terapia
génica preferidos para su uso en la presente invención serán,
generalmente, vectores virales.
Los retrovirus son prometedores como vectores de
liberación de genes debido a su capacidad de integrar sus genes en
el genoma del huésped, transfiriendo una gran cantidad de material
genético extraño, infectando el amplio espectro de especies y de
tipos de células y de empaquetarse en líneas celulares especiales.
Otros virus también se pueden diseñar para servir como vectores para
transferencia génica, tales como adenovirus, virus de herpes simplex
(HSV), citomegalovirus (CMV), virus adenoasociados (AAV), tales como
aquellos descritos en la Patente No. 5.139.941.
A pesar de que algunos virus que pueden aceptar
material genético extraño están limitados en el número de
nucleótidos que pueden acomodar, y en el conjunto de células que
infectan, se ha demostrado que estos virus efectúan la expresión
génica satisfactoriamente. Sin embargo, los adenovirus no integran
su material genético en el genoma del huésped y, por tanto, no
requiere la replicación del huésped para la expresión génica,
haciéndolos idealmente adecuados para una expresión génica
heteróloga, eficiente y rápida. Son bien conocidas en el sector las
técnicas de preparación de virus infectivos defectivos para la
replicación.
En ciertas realizaciones avanzadas, el vector de
terapia génica será el HSV. Un factor que hace al HSV un vector
atractivo es el tamaño y la organización del genoma. A causa de que
el HSV es grande, la incorporación de genes múltiples o de casetes
de expresión es menos problemática que en otros sistemas virales más
pequeños. Además, la disponibilidad de secuencias de control viral
diferentes con actuación cambiante (por ejemplo, fuerza, temporal)
lo hace posible para controlar la expresión en una mayor extensión
que en otros sistemas. También es una ventaja que el virus tiene
relativamente pocos mensajes empalmados, facilitando además las
manipulaciones genéticas. El HSV también es relativamente fácil de
manipular y se puede hacer crecer a elevadas cantidades.
Por supuesto, al usar sistemas de liberación
viral, se deseará purificar suficientemente el virión para dejarlo
esencialmente libre de contaminantes indeseables, tal como
partículas virales o endotoxinas defectivas interferentes y otros
pirógenos, de manera que no causarán reacciones adversas en la
célula, animal o individuo que reciba la construcción del vector. Un
medio preferido de purificación del vector implica el uso de
gradientes de densidad flotante, tal como la centrifugación por
gradiente de cloruro de cesio.
El anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 se pueden
conjugar a agentes anticelulares o citotóxicos, para preparar
"inmunotoxinas"; o asociarse operativamente con componentes que
son capaces de estimular directa o indirectamente la coagulación,
formando, de este modo, un "coaguligando". En los
coaguligandos, el anticuerpo puede estar directamente unido a un
factor de coagulación directo o indirecto, o puede estar unido a una
segunda región de unión que une y, a continuación, libera un factor
de coagulación directo o indirecto. La aproximación de la "segunda
región de unión", generalmente, utiliza un anticuerpo de unión a
coagulante como segunda región de unión, y de este modo, da lugar a
una construcción de anticuerpo biespecífico. La preparación y uso de
anticuerpos biespecíficos en general son bien conocidos en la
técnica, y se describe en la presente en profundidad.
En la preparación de inmunotoxinas, coaguligandos
y anticuerpos biespecíficos, se puede emplear una expresión
recombinante. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el
anticuerpo elegido están acopladas, "in-frame",
a las secuencias de ácido nucleico que codifican la toxina elegida,
coagulante, o segunda región de unión para crear una unidad o vector
de expresión. La expresión recombinante da lugar a la traducción del
nuevo ácido nucleico, para producir el producto de la proteína
deseada. A pesar de que se emplean ácidos nucleicos que codifican
anticuerpos, en lugar de ligandos de unión a proteínas, la
aproximación recombinante es esencialmente la misma que aquellas
descritas en la presente anteriormente.
Volviendo a la tecnología de conjugados, la
preparación de inmunotoxinas es, generalmente, bien conocida en la
técnica. Sin embargo, se pueden conseguir ciertas ventajas a través
de la aplicación de una cierta tecnología preferida, tanto en la
preparación de las inmunotoxinas como en su purificación para la
posterior administración clínica. Por ejemplo, mientras que las
inmunotoxinas basadas en IgG normalmente mostrarán una mejor
capacidad de unión y una depuración sanguínea más lenta que sus
homólogos Fab', las inmunotoxinas basadas en fragmentos Fab',
generalmente, mostrarán una mejor capacidad de penetración en el
tejido en comparación con las inmunotoxinas basadas en la IgG.
Adicionalmente, mientras numerosos tipos de
enlazadores que contienen enlaces disulfuro se sabe que se pueden
emplear, satisfactoriamente, para conjugar la fracción de toxina al
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o al
anticuerpo basado en 2C3, se preferirán, generalmente, ciertos
enlazadores sobre otros enlazadores, basándose en las capacidades y
características farmacológicas en que se diferencian. Por ejemplo,
se prefieren los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que
está "impedido" estéricamente, debido a su mayor estabilidad
in vivo, previniendo, de este modo, la liberación de la
fracción de toxina previamente a la unión en el sitio de acción.
Se conoce una gran variedad de agentes
citotóxicos que se pueden conjugar al anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o a los anticuerpos
basados en 2C3, incluyendo toxinas derivadas de bacterias, hongos o
plantas, tales como la cadena A o la cadena A desglicosilada de la
ricina. El entrecruzamiento de una cadena A de toxina con un
anticuerpo, en ciertos casos, requiere un entrecruzador que presente
las funciones disulfuro. La razón para este hecho aún no está clara,
pero es probablemente debido a la necesidad, para ciertas fracciones
de toxinas, de ser fácilmente liberables del anticuerpo una vez el
agente ha "liberado" la toxina a las células diana.
Cada tipo de entrecruzador, así como la manera
como se realiza el entrecruzamiento, tenderá a variar la
farmacodinámica del conjugado resultante. En última instancia, en
casos en que se contempla una toxina liberable, se desea tener un
conjugado que permanezca intacto bajo las condiciones encontradas en
cualquier punto del cuerpo excepto del sitio deseado de acción, en
cuyo punto es deseable que el conjugado tenga unas buenas
características de "liberación". Por tanto, tendrá cierta
trascendencia, el esquema particular de entrecruzamiento, que
incluye, particularmente, el reactivo particular de entrecruzamiento
utilizado y las estructuras que se entrecruzan.
Dependiendo del compuesto de toxina específico
utilizado como parte de la proteína de fusión, puede ser necesario
proporcionar un péptido espaciador que operativamente acople el
anticuerpo y el compuesto de toxina que es capaz de plegarse en una
estructura de bucle con enlace disulfuro. La división proteolítica
dentro del bucle produciría entonces un polipéptido heterodimérico
en el que el anticuerpo y el compuesto de toxina están unidos por
sólo un enlace disulfuro único. Un ejemplo de dicha toxina es la
toxina de cadena A de Ricina.
Cuando se utilizan otros compuestos de toxina, se
puede proporcionar un espaciador peptídico no divisible para acoplar
operativamente el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 y el compuesto de toxina de
la proteína de fusión. Las toxinas que se pueden utilizar junto con
los espaciadores peptídicos no divisibles son aquellas que pueden,
por sí mismas, convertirse mediante división proteolítica, en una
forma citotóxica con enlace disulfuro. Un ejemplo de dicho compuesto
de toxina es un compuesto de la exotoxina de Pseudomonas.
Pueden haber circunstancias, tales como cuando el
antígeno diana no se internaliza mediante una ruta consistente con
una intoxicación eficiente por inmunotoxinas, en la que se deseará
dirigir agentes terapéuticos, tales como fármacos antitumorales,
otras citocinas, antimetabolitos, agentes alquilantes, hormonas y
similares. Actualmente se han conjugado satisfactoriamente una
variedad de agentes quimioterapéuticos y otros farmacológicos a
anticuerpos y se ha mostrado que funcionan farmacológicamente.
Algunos agentes antineoplásticos que se han investigado incluyen
doxorubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, y otros varios.
Además, se ha descrito el acoplamiento de otros agentes, tales como
neocarzinostatina, macromicina, trenimona y
\alpha-amanitina.
Allí donde los factores de coagulación se
utilizan en relación a la presente invención, cualquier unión
covalente al anticuerpo debería hacerse en un sitio diferente de su
sitio de coagulación funcional. Las composiciones, de este modo, se
"unen" de alguna manera operativa que permite que cada región
realice su función deseada sin un impedimento significativo. De este
modo, el anticuerpo se une al VEGF, y el factor de coagulación
provoca la coagulación
sanguínea.
sanguínea.
Además de la información general proporcionada en
la presente, el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 se pueden conjugar a uno o
más agentes terapéuticos que utilizan ciertos entrecruzadores
bioquímicos preferidos. Los reactivos de entrecruzamiento se
utilizan para formar puentes moleculares que juntan grupos
funcionales de dos moléculas diferentes. Para unir dos proteínas
diferentes de una manera progresiva, se pueden utilizar
entrecruzadores heterobifuncionales que eliminan la formación de
homopolímeros no deseados. Algunos ejemplos de entrecruzadores
heterobifuncionales se encuentran en la Tabla B1.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los entrecruzadores hererobifuncionales contienen
dos grupos reactivos: uno que, generalmente, reacciona con un grupo
amina primaria (por ejemplo, N-hidroxi succinimida)
y el otro que, generalmente, reacciona con un grupo tiol (por
ejemplo, piridil disulfuro, maleimidas, halógenos, etc.). A
través del grupo reactivo amina primaria, el entrecruzador puede
reaccionar con el(los) residuo(s) de lisina de una
proteína (por ejemplo, el anticuerpo seleccionado o el fragmento) y
a través del grupo reactivo tiol, el entrecruzador, ya enlazado a la
primera proteína, reacciona con el residuo de cisteína (grupo
sulfhidrilo libre) de la otra proteína (por ejemplo, el
coagulante).
Las composiciones, por tanto, generalmente
tienen, o se han derivado para obtener, un grupo funcional
disponible para las finalidades de entrecruzamiento. Este
requerimiento no se considera limitante en el sentido que una amplia
variedad de grupos se pueden utilizar de esta manera. Por ejemplo,
se pueden utilizar para unir o entrecruzar, grupos amina primaria o
secundaria, grupos hidrazida o hidracina, alcohol carboxilo,
fosfato, o grupos alquilantes.
El brazo espaciador entre los dos grupos
reactivos de un entrecruzador puede tener varias longitudes y
composiciones químicas. Un brazo espaciador más largo permite una
mayor flexibilidad de los componentes del conjugado mientras algunos
componentes particulares en el puente (por ejemplo, un grupo
benceno) puede añadir una estabilidad extra al grupo reactivo o una
resistencia incrementada de la unión química a la acción de varios
aspectos (por ejemplo, enlaces disulfuro resistentes a agentes
reductores). También se contempla, el uso de espaciadores
peptídicos, tales como
L-Leu-L-Ala-L-Leu-Ala.
Se prefiere emplear un entrecruzador que tenga
una estabilidad razonable en la sangre. Se sabe que numerosos tipos
de enlazadores que contienen enlaces disulfuro se pueden emplear
satisfactoriamente para conjugar agentes marcadores y coagulantes o
tóxicos. Los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que está
impedido estéricamente puede demostrar el hecho de ofrecer una mayor
estabilidad in vivo, impidiendo la liberación del agente
antes de la unión en el sitio de acción. Estos enlazadores son, por
tanto, un grupo preferente de agentes de enlace.
Uno de los reactivos entrecruzadores más
preferidos para su uso en inmunotoxinas es el SMPT, el cual es un
entrecruzador bifuncional que contiene un enlace disulfuro que está
"impedido estéricamente" por un anillo de benceno adyacente y
grupos metilo. Se cree que el impedimento estérico del enlace
disulfuro sirve para proteger el enlace del ataque de aniones
tiolato, tales como glutationa, que puede estar presente en tejidos
y sangre, y ayudando así a impedir el desacoplamiento del conjugado
antes de la liberación del agente acoplado al sitio del tumor. Se
contempla que el agente SMPT también se puede utilizar en relación a
los ligandos biespecíficos de la presente invención.
El reactivo de entrecruzamiento SMPT, al igual
que otros muchos reactivos de entrecruzamiento conocidos, presta la
capacidad de entrecruzar grupos funcionales, tales como el grupo SH
de la cisteína o aminas primarias (por ejemplo, el grupo amino
épsilon de la lisina). Otro posible tipo de entrecruzador incluye
las fenilazidas fotoreactivas heterobifuncionales, que contienen un
enlace disulfuro divisible, tales como el
sulfosuccinimidil-2-(p-azido
salicilamido)
etil-1,3'-ditiopropionato. El grupo
N-hidroxisuccinimidilo reacciona con los grupos
amino primarios y la fenilazida (tras fotolisis) reacciona no
selectivamente con cualquier residuo de aminoácido.
Además de entrecruzadores impedidos, los
enlazadores no impedidos también se pueden emplear de acuerdo con lo
expuesto en la presente. Otros entrecruzadores útiles, sin
considerar que contengan o generen un disulfuro protegido, incluyen
SATA, SPDP y 2-iminotiolano. La utilización de tales
entrecruzadores es bien conocida en la técnica.
Una vez conjugado, el conjugado se separa de los
agentes terapéuticos y marcadores no conjugados y de otros
contaminantes. Se dispone de un amplio número de técnicas de
purificación para su uso en el suministro de conjugados de un grado
de suficiente pureza para que sean clínicamente útiles. Se
utilizarán más, generalmente, los métodos de purificación basados en
la separación por tamaño, tales como la filtración en gel, la
permeación en gel o la cromatografía líquida de alta resolución.
También se pueden utilizar otras técnicas cromatográficas, tales
como la separación con Sefarosa-Azul.
A pesar de que se prefiere que cualquier segmento
de enlace tenga una estabilidad razonable en la sangre, para evitar
la liberación sustancial del agente acoplado antes del marcaje a la
enfermedad o el sitio del tumor, en ciertos aspectos, se contempla
la utilización de enlaces biológicamente liberables y/o espaciadores
o enlazadores selectivamente divisibles. Los "enlazadores
biológicamente liberables" son "espaciadores o enlazadores
selectivamente divisibles" que aún tienen una estabilidad
razonable en la circulación.
Los anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2 de la presente invención, tales como
anticuerpos similares al 2C3, se pueden, de este modo, unir a uno o
más agentes terapéuticos a través de un enlace biológicamente
liberable. Se puede emplear cualquier forma de anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, o "agente o
anticuerpo marcador", incluyendo anticuerpos intactos, aunque se
preferirán los fragmentos ScFv en ciertas realizacio-
nes.
nes.
Los "enlaces biológicamente liberables" o
"enlaces selectivamente hidrolizables" incluyen todas las
uniones que son liberables, divisibles o hidrolizables sólo o,
preferencialmente, bajo ciertas condiciones. Esto incluye enlaces
disulfuro o trisulfuro y enlaces lábiles al ácido, como se describe
en las Patentes U.S.A. Nos. 5.474.765 y 5.762.918, incorporada cada
una específicamente en la presente por referencia.
Se contempla particularmente, la utilización de
un espaciador sensible a ácido para el acoplamiento de un agente
terapéutico o fármaco a un anticuerpo de la presente invención. En
tales realizaciones, los agentes terapéuticos o fármacos se liberan
dentro de los compartimentos ácidos en el interior de la célula. Se
contempla que la liberación sensible a ácido puede tener lugar
extracelularmente, pero incluso después de un marcaje específico,
preferiblemente al sitio del tumor. Algunos ejemplos, actualmente
preferidos, incluyen anticuerpos similares al 2C3 unidos a
colquicina o doxorubicina a través de un espaciador sensible a
ácido. También se contempla el acoplamiento a través de las
fracciones de carbohidratos de los anticuerpos. En tales
realizaciones, los agentes terapéuticos o fármacos se liberan dentro
de los compartimentos ácidos en el interior de la célula.
El anticuerpo anti-VEGF marcador
se puede también derivatizar para introducir grupos funcionales,
permitiendo el acoplamiento del agente(s)
terapéutico(s) a través de un enlace biológicamente
liberable. El anticuerpo marcador se puede, de este modo,
derivatizar para introducir cadenas laterales que terminan en
hidrazida, hidrazina, grupos de amina primaria o secundaria. Los
agentes terapéuticos se pueden conjugar a través de una unión de
base de Schiff, un enlace de hidrazona o acil hidrazona o un
enlazador hidrazida (Patentes U.S.A. Nos. 5.474.765 y
5.762.918).
También, tal como se describe en las Patentes
U.S.A. Nos. 5.474.765 y 5.762.918, el anticuerpo
anti-VEGF marcado se puede acoplar operativamente al
agente(s) terapéutico(s) a través de uno o más enlaces
biológicamente liberables, que son enlaces sensibles a enzimas, que
incluyen enlaces peptídicos, ésteres, amidas, fosfodiésteres y
glicósidos.
Los aspectos preferidos de la presente invención
tienen que ver con el uso de enlazadores peptídicos que incluyen,
como mínimo, un primer sitio de división para una peptidasa y/o
proteinasa, que preferencialmente se localiza dentro del sitio de la
enfermedad, particularmente, dentro del medio tumoral. La liberación
mediada por el anticuerpo del agente terapéutico acoplado, de este
modo, da lugar a una división específica, dentro del sitio de la
enfermedad o del medio tumoral, dando lugar a la liberación
específica del agente activo. Ciertos enlazadores peptídicos
incluirán un sitio de división que es reconocido por uno o más
enzimas implicados en la remodelación.
Se prefieren, particularmente, los enlazadores
peptídicos que incluyen un sitio de división para uroquinasa,
pro-uroquinasa, plasmina, plasminógeno, TGF\beta,
estafiloquinasa, Trombina, Factor IXa, Factor Xa o una
metaloproteinasa, tal como una colagenasa intersticial, una
gelatinasa o una estromelisina. Las Patentes U.S.A. Nos. 6.004.555,
5.877.289 y 6 093 399, además, describen y permiten saber cómo
fabricar y utilizar construcciones agente
terapéutico-agente marcador que comprenden enlaces
biológicamente liberables y enlazadores selectivamente divisibles y
péptidos. La Patente U.S.A. No. 5.877.289, expedida el 2 de marzo de
1999, en particular, además, describe y permite saber cómo fabricar
y utilizar construcciones agente terapéutico-agente
marcador que comprenden un péptido selectivamente divisible que se
divide por uroquinasa, plasmina, Trombina, Factor IXa, Factor Xa o
una metaloproteinasa, tal como una colagenasa intersticial, una
gelatinasa o una estromelisina, dentro del medio tumoral.
Actualmente, los enlazadores peptídicos
selectivamente divisibles preferidos son aquellos que incluyen un
sitio de división para plasmina o metaloproteinasa (también conocida
como "metaloproteasas de matriz" o "MMPs"), tales como una
colagenasa intersticial, una gelatinasa o una estromelisina. Algunos
enlazadores peptídicos adicionales que se pueden utilizar
ventajosamente en relación a la presente invención incluyen, por
ejemplo, los listados en la Tabla B2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los anticuerpos biespecíficos son particularmente
útiles en el coaguligando y los aspectos angiogénicos combinados de
la presente invención. Sin embargo, los anticuerpos biespecíficos,
en general, se pueden emplear, siempre y cuando, un brazo se una al
VEGF, opcionalmente a sustancialmente el mismo epítopo que el 2C3,
y el anticuerpo biespecífico se acople al agente terapéutico,
generalmente, en un sitio diferente del sitio de unión al
antígeno.
En general, la preparación de anticuerpos
biespecíficos también es bien conocida en la técnica. Un método
implica la preparación separada de anticuerpos que tienen una
especificidad para el antígeno marcado, por un lado, y (como en la
presente) un agente coagulante por el otro. Los fragmentos
peptídicos F(ab'\gamma)_{2} se preparan a partir
de los dos anticuerpos elegidos, seguido por una reducción de cada
uno para proporcionar fragmentos Fab'\gamma_{SH} separados. Los
grupos SH de una de las dos partes a acoplar se alquilan, a
continuación, con un reactivo de entrecruzamiento, tal como
o-fenilendimaleimida, para proporcionar grupos
maleimida libres en una parte. Esta parte, entonces, se puede
conjugar a la otra por medio de una unión de tioéter, para obtener
el heteroconjugado F(ab'\gamma)_{2} deseado. Se
conocen otras técnicas, en las que se lleva a cabo el
entrecruzamiento con SPDP o proteína A, o se prepara una
construcción triespecífica.
Otro método para producir anticuerpos
biespecíficos es por fusión de dos hibridomas para formar un
cuadroma. Tal como se usa en la presente, el término "cuadroma"
se utiliza para describir la fusión productiva de dos hibridomas de
células B. Utilizando actualmente técnicas estándares, dos
anticuerpos que producen hibridomas se fusionan para obtener células
hijas, y se eligen aquellas células que han mantenido la expresión
de ambos grupos de genes de clonotipo de inmunoglobulina.
Un método preferido para la generación de un
cuadroma implica la selección de un mutante deficiente de enzima de,
como mínimo, uno de los hibridomas parentales. A continuación, esta
primera línea de células mutantes del hibridoma se fusiona a células
del segundo hibridoma que se han expuesto letalmente, por ejemplo, a
yodoacetamida, impidiendo su supervivencia continuada. La fusión
celular permite el rescate del primer hibridoma mediante la
adquisición del gen para su deficiencia enzimática del hibridoma
letalmente tratado, y el rescate del segundo hibridoma a través de
la fusión al primer hibridoma. Se prefiere, pero no es necesario, la
fusión de inmunoglobulinas del mismo isotipo, pero de diferente
subclase. Un anticuerpo de subclase mezclada permite su uso en caso
de un ensayo alternativo para el aislamiento de un cuadroma
preferido.
Más detalladamente, un método para el screening y
desarrollo del cuadroma implica obtener una línea de hibridoma que
produce el primer mAb elegido y hacerla deficiente para la enzima
metabólica esencial, hipoxantina-guanina
fosforibosiltransferasa (HGPRT). Para obtener los mutantes
deficientes del hibridoma, se hacen crecer las células en presencia
de concentraciones crecientes de 8-azaguanina (1 x
10^{-7} M a 1 x 10^{-5} M). Los mutantes se subclonan mediante
una dilución limitante y se analizan para saber su sensibilidad a
hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT). El medio de cultivo puede
consistir en, por ejemplo, DMEM complementado con un 10% de FCS,
L-Glutamina 2 mM y
penicilina-estreptomicina 1 mM.
Una línea de células complementaria del hibridoma
que produce el segundo mAb deseado, se utiliza para generar los
cuadromas mediante técnicas de fusión de células estándares.
Brevemente, 4,5 x 10^{7} células primarias sensibles al HAT se
mezclan con 2,8 x 10^{7} células secundarias resistentes al HAT
que han sido pretratadas con una dosis letal del inhibidor
bioquímico irreversible, yodoacetamida, (5 mM en tampón salino
fosfato) durante 30 minutos en hielo antes de la fusión. La fusión
celular se induce utilizando polietilenglicol (PEG) y las células se
colocan en 96 pocillos de placas de microcultivo. Los cuadromas se
seleccionan utilizando un medio que contiene HAT. Se identifican los
cultivos que contienen anticuerpos biespecíficos utilizando, por
ejemplo, un ELISA específico de isotipo en fase sólida y una tinción
por inmunofluorescencia específica de isotipo.
En una realización de identificación para
identificar el anticuerpo biespecífico, se recubren los pocillos de
las placas de microtitulación (Falcon, Becton Dickinson Labware) con
un reactivo que específicamente interacciona con uno de los
anticuerpos del hibridoma parental y que carece de reactividad
cruzada con ambos anticuerpos. Se lavan y se tapan las placas, y los
sobrenadantes (SNs) a analizar se añaden a cada pocillo. Se incuban
las placas a temperatura ambiente durante 2 horas, se descartan los
sobrenadantes, se lavan las placas y se añade un conjugado de
fosfatasa alcalina-anti-anticuerpo
diluido durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavan las placas
y se añade un sustrato de fosfatasa, por ejemplo,
p-nitrofenil fosfato (Sigma, St. Louis) a cada
pocillo. Se incuban los placas, se añade NaOH 3N a cada pocillo para
parar la reacción, y se determinan los valores de OD_{410}
utilizando un lector de
ELISA.
ELISA.
En otra realización de identificación, se
utilizan las placas de microtitulación pretratadas con
poli-L-lisina para unir una de las
células diana a cada pocillo, a continuación, las células se fijan,
por ejemplo, utilizando un 1% de glutaraldehído y en los anticuerpos
biespecíficos se analiza su capacidad para unirse a células
intactas. Además, en relación con la presente invención, para
identificar cuadromas preferidos, se pueden utilizar FACS, tinción
por inmunofluorescencia, anticuerpos específicos de idiotipo,
ensayos de competición de unión al antígeno, y otros métodos comunes
en la técnica de la caracterización de anticuerpos.
Tras el aislamiento del cuadroma, se purifican
los anticuerpos biespecíficos aparte de otros productos de las
células. Esto se puede llevar a cabo por una variedad de
procedimientos de aislamiento de proteínas, conocidos por los
entendidos en la técnica de purificación de inmunoglobulinas. Son
bien conocidos en la técnica los medios para preparar y caracterizar
anticuerpos (ver, por ejemplo, Antibodies: Laboratory Manual,
1988).
Por ejemplo, los sobrenadantes de los cuadromas
seleccionados se pasan sobre columnas de sefarosa de proteína A o
proteína G para unir IgG (dependiendo del isotipo). Los anticuerpos
enlazados se eluyen a continuación con, por ejemplo, un tampón
citrato de pH 5,0. Las fracciones eluidas que contienen BsAbs se
dializan frente a un tampón isotónico. Alternativamente, la elución
también se pasa sobre una columna de
antiinmunoglobulina-sefarosa. A continuación, se
eluye BsAb con cloruro magnésico 3,5 M. A los BsAbs purificados de
esta manera se les analiza su actividad de unión por, por ejemplo,
un ELISA específico de isotipo y un ensayo de tinción por
inmunofluorescencia de las células diana, tal como se describió
anteriormente.
Los BsABs purificados y los anticuerpos
parentales también se pueden caracterizar y aislar por
electroforesis SDS-PAGE, seguido de tinción con
plata o Coomassie. Esto es posible cuando uno de los anticuerpos
parentales tiene un peso molecular mayor que el otro, en el que la
banda de los BsAbs migra a medio camino entre la de los dos
anticuerpos parentales. La reducción de las muestras verifica la
presencia de cadenas pesadas con dos pesos moleculares aparentes
diferentes.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención, generalmente, comprenderán una cantidad efectiva de, como
mínimo, un primer anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 o un inmunoconjugado,
disuelto o disperso en un transportador farmacéuticamente aceptable
o un medio acuoso. También se contemplan agentes terapéuticos
combinados y se pueden emplear el mismo tipo de composiciones
farmacéuticas subyacentes para medicamentos simples y
combinados.
Las frases "farmacéuticamente o
farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares
y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u
otra desfavorable cuando se administran a un animal, o a un humano,
como apropiados. Los usos veterinarios se incluyen igualmente dentro
de la presente invención y las formulaciones "farmacéuticamente
aceptables" incluyen formulaciones para uso clínico y/o
veterinario.
Como se utiliza en la presente, un
"transportador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera
y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos,
agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y
retrasadores de la absorción, y similares. El uso de tales medios y
agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la
técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente
convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se
contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Para la
administración humana, las preparaciones deben reunir las
características de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y
estándares de pureza como se requiere por la FDA Office of
Biological Standards. También se pueden incorporar ingredientes
activos complementarios a las composiciones.
Las formulaciones de "dosis unidad" son
aquellas que contienen una dosis o subdosis del ingrediente
administrado adaptado para una liberación particular calculada. Por
ejemplo, las formulaciones de "dosis unidad" son aquellas que
contienen una dosis diaria o una unidad o subdosis diaria o una
dosis semanal o unidad o subdosis semanal y similares.
Los anticuerpos basados en el anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y en 2C3 o
inmunoconjugados, de la presente invención se formularán,
frecuentemente, para la administración parenteral, por ejemplo,
formulados para la inyección por vía intravenosa, intramuscular,
subcutánea, transdermal u otras vías, que incluyen la administración
peristáltica y la instilación directa a un sitio del tumor o de la
enfermedad (administración intracavidad). La preparación de una
composición acuosa que contiene tal anticuerpo o inmunoconjugado
como ingrediente activo, será conocida por los entendidos en la
técnica a la luz de la presente descripción. Normalmente, tales
composiciones se pueden preparar como inyectables, en forma de
soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar
formas sólidas adecuadas para utilizar en la preparación de
soluciones o suspensiones tras la adición de un líquido previamente
a la inyección; y también se pueden emulsificar las
preparaciones.
Las formas farmacéuticas aceptables para el uso
como inyectables incluyen soluciones acuosas estériles o
dispersiones; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de
cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la
preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o
dispersiones. En todos los casos, la forma debería ser estéril y
fluida en la extensión que exista jeringabilidad. Debería ser
estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y se
debería preservar contra la acción contaminante de microorganismos,
tales como bacterias y hongos.
Las composiciones del inmunoconjugado o del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o del
anticuerpo basado en 2C3 se pueden formular en una composición
acuosa estéril en forma de sal o neutra. Se pueden preparar
soluciones como bases libres o como sales farmacológicamente
aceptables en agua mezclada adecuadamente con un tensoactivo, tal
como hidroxipropilcelulosa. Las sales farmacéuticamente aceptables
incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos
amino libres de la proteína), y aquellas que están formadas con
ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o
fosfórico, o ácidos orgánicos como acético, trifluoroacético,
oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con
los grupos carboxilos libres también se pueden derivar de bases
inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido sódico, potásico,
amónico, cálcico, o férrico, y bases orgánicas como isopropilamina,
trimetilamina, histidina, procaína y similares.
Los transportadores adecuados incluyen
disolventes y medios de dispersión que contienen, por ejemplo, agua,
etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y
polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los
mismos, y aceites vegetales. En muchos casos, será preferible
incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico.
Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso
de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento
del tamaño de partícula requerido en caso de dispersión y/o mediante
el uso de tensoactivos.
Bajo condiciones normales de almacenamiento y
uso, todas las preparaciones deberían contener un conservante que
prevenga el crecimiento de microorganismos. La prevención de la
acción de microorganismos se puede llevar a cabo a través de varios
agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos,
clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. La
absorción prolongada de las composiciones inyectables se pueden
llevar a cabo, mediante el uso en las composiciones, de agentes
retrasantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio
y gelatina.
Previa o posteriormente a la formulación, el
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el
anticuerpo basado en 2C3 o el inmunoconjugado se deberían dializar
extensamente para eliminar las moléculas de peso molecular pequeño
no deseadas, y/o liofilizar para una formulación más fácil en el
vehículo deseado, allí donde sea apropiado. Se preparan soluciones
inyectables estériles mediante la incorporación de agentes activos,
en la cantidad necesaria, en el disolvente apropiado, con varios de
los otros ingredientes enumerados anteriormente, como se desee,
seguido por una esterilización filtrada. Generalmente, las
dispersiones se preparan mediante la incorporación de varios
ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que
contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes
requeridos de los enumerados anteriormente.
En el caso de polvos estériles para la
preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos
preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío y
secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo,
además de cualquier ingrediente adicional a partir de una solución
previamente esterilizada y filtrada de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas según
la presente invención, generalmente, incluirán una cantidad del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o del
anticuerpo basado en 2C3 o del inmunoconjugado mezclada con un
diluyente o excipiente farmacéutico aceptable, tal como una solución
acuosa estéril, para dar un intervalo de concentraciones finales,
dependiendo del uso deseado. Las técnicas de preparación son,
generalmente, bien conocidas en la técnica, tal como se ejemplifica
en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Ed. Mack Publishing
Company, 1980. Sería conveniente que la contaminación por
endotoxinas se mantuviera mínimamente en un nivel seguro, por
ejemplo, menor de 0,5 ng/mg de proteína. Además, para la
administración humana, las preparaciones deben reunir las
propiedades de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y los
estándares de pureza requeridos por la FDA Office of Biological
Standards. Tras la formulación, las soluciones de anticuerpo o
inmunoconjugado se administrarán de una manera compatible con la
formulación de dosificación y en una cantidad tal, que sea
terapéuticamente
efectiva.
efectiva.
Las formulaciones de soluciones de anticuerpos
basados en el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o basados en 2C3 o inmunoconjugados se administran fácilmente
en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de
soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se
contemplan otras formas farmacéuticamente aceptables, por ejemplo,
tabletas, pastillas, cápsulas u otros sólidos para la administración
oral, supositorios, pesarios, soluciones nasales o pulverizadores,
aerosoles, inhaladores, formulaciones tópicas, formas liposomales, y
similares. El tipo de forma de administración concordará con la
enfermedad o el desorden a tratar.
Se pueden usar y, generalmente aplicar, cápsulas
farmacéuticas de "liberación lenta" o composiciones o
preparaciones de "liberación lenta". Las formulaciones de
liberación lenta se diseñan, generalmente, para dar un nivel de
fármaco adecuado sobre un período extendido y se pueden utilizar
para liberar un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 o un inmunoconjugado de acuerdo
con la presente invención. Las formulaciones de liberación lenta se
implantan, normalmente, en la proximidad del sitio de la enfermedad,
por ejemplo, en el sitio del tumor.
Algunos ejemplos adecuados de preparaciones de
liberación lenta incluyen matrices semipermeables de polímeros
hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo o el
inmunoconjugado, cuyas matrices están en forma de artículos con
forma, por ejemplo, de películas o de microcápsulas. Algunos
ejemplos de matrices de liberación lenta incluyen poliésteres;
hidrogeles, por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
o polivinil alcohol; poliláctidos, por ejemplo, Patente U.S.A. No.
3.773.919; copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma etil-L-glutamato; acetato
de etilenvinilo no degradable; copolímeros de ácido glicólico y
ácido láctico degradables, tales como el Lupron Depot^{TM}
(microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido
glicólico y ácido láctico y acetato de leuprolida); y ácido poli-
D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que polímeros, tales como el acetato de
etilenvinilo y el ácido glicólico-ácido láctico, permiten la
liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles
liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los
anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante mucho
tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la
exposición a la humedad a 37ºC, reduciendo, de este modo, la
actividad biológica y/o cambiando la inmunogenicidad. Existen
estrategias razonables disponibles para la estabilización
dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de
agregación implica la formación de un enlace intermolecular
S-S a través de un intercambio
tio-disulfuro, se consigue la estabilización
mediante la modificación de residuos sulfhidrilos, la liofilización
a partir de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad,
el uso de aditivos apropiados, el desarrollo de composiciones de
matrices de polímero específicas, y similares.
En ciertas realizaciones, también se pueden
emplear liposomas y/o nanopartículas con el anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o anticuerpos
basados en 2C3 o inmunoconjugados. Como se resume a continuación, la
formación y utilización de liposomas son, generalmente, conocidas
por los entendidos en la técnica.
Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos
que se dispersan en un medio acuoso y espontáneamente forman unas
vesículas de bicapas concéntricas multilamelares (también
denominadas vesículas multilamelares (MLVs)). Las MLVs,
generalmente, tienen diámetros desde 25 nm a 4 \mum. La sonicación
de MLVs da lugar a la formación de vesículas unilamelares pequeñas
(SUVs) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 Ángstroms, que
contienen una solución acuosa en el núcleo.
Los fosfolípidos pueden formar una variedad de
estructuras, además de los liposomas, cuando se dispersan en agua,
dependiendo de la proporción molar de lípido en el agua. A
proporciones bajas, la estructura preferida es el liposoma. Las
características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza
iónica y la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden
mostrar una permeabilidad baja a sustancias polares e iónicas, pero
a temperaturas elevadas experimentan una transición de fase que
altera marcadamente su permeabilidad. La transición de fase implica
un cambio de una estructura ordenada, empaquetada de forma compacta,
conocida como el estado de gel, a una estructura menos ordenada y
empaquetada de forma menos compacta, conocida como el estado fluido.
Esto tiene lugar a una temperatura de transición de fase
característica y da lugar a un incremento en la permeabilidad a
iones, azúcares y fármacos.
Los liposomas interaccionan con las células a
través de cuatro mecanismos diferentes: endocitosis por células
fagocíticas del sistema reticuloendotelial, tales como macrófagos y
neutrófilos; adsorción a la superficie celular mediante fuerzas
débiles hidrofóbicas o electrostáticas, no específicas, o mediante
interacciones específicas con componentes de la superficie celular;
fusión con las membranas celulares plasmáticas mediante la inserción
de la bicapa lipídica del liposoma en la membrana plasmática, con la
liberación simultánea de los contenidos liposomales en el
citoplasma; y mediante la transferencia de lípidos liposomales a las
membranas celulares o subcelulares, o viceversa, sin
asociación alguna de los contenidos del liposoma. Mediante la
variación de la formulación del liposoma se puede alterar el
mecanismo operativo, a pesar de que más de uno puede tener lugar al
mismo tiempo.
Las nanocápsulas pueden, generalmente, atrapar
compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar los
efectos colaterales debido a la sobrecarga polimérica intracelular,
dichas partículas ultrafinas (de tamaño de unos 0,1 \mum), se
deberían diseñar mediante la utilización de polímeros capaces de ser
degradados in vivo. Se contemplan para su uso en la presente
invención nanopartículas biodegradables de
polialquil-cianoacrilato que reúnen todos los
requisitos y tales partículas pueden ser fáciles de fabricar.
Muchas enfermedades con un componente angiogénico
se asocian con el ojo. Por ejemplo, enfermedades asociadas con la
neovascularización corneal que se puede tratar según la presente
invención incluyen, pero no se limitan a, retinopatía diabética,
retinopatía de premadurez, rechazo de xenoinjerto corneal, glaucoma
neovascular y fibroplasia retrolental, queratoconjuntivitis
epidémica, deficiencia de Vitamina A, sobreuso de lentes de
contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior,
queratitis sicca pterigium, sjogrens, acné rosáceo, filectenulosis,
sífilis, infecciones de Micobacterias, degeneración de lípidos,
quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas,
infecciones de Herpes simplex, infecciones de Herpes zoster,
infecciones por protozoos, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren,
degeneración marginal de Terrien, queratolisis marginal,
traumatismos, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis,
sarcoidosis de Wegener, Escleritis, enfermedad de
Steven-Johnson, queratotomía radial perifigoide y
rechazo de gráfico corneal.
Las enfermedades asociadas con la
neovascularización retinal/coroidal que se pueden tratar según la
presente invención incluyen, pero no se limitan a, retinopatía
diabética, degeneración macular, anemia de la célula falciforme,
sarcoide, sífilis, pseudoxantoma elástico, enfermedad de Paget,
oclusión de las venas, oclusión arterial, enfermedad obstructiva de
la carótida, uveitis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas,
enfermedad de Lyme, lupus eritomatosis sistémico, retinopatía de
premadurez, enfermedad de Eales, enfermedad de Bechet, infecciones
causantes de retinitis o coroiditis, histoplasmosis ocular presunta,
enfermedad de Best, miopía, agujeros ópticos, enfermedad de
Stargart, pars planitis, desprendimiento retinal crónico, síndromes
de hiperviscosidad, toxoplasmosis, traumatismos y complicaciones
post-láser.
Otras enfermedades que se pueden tratar según la
presente invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedades
asociadas con rubeosis (neovascularización del ángulo) y
enfermedades causadas por la proliferación anormal de tejido fibroso
o fibrovascular que incluye todas las formas de vitreoretinopatía
proliferativa, asociada o no con la diabetes.
Los anticuerpos basados en el anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y en 2C3 e
inmunoconjugados de la presente invención se pueden emplear, de este
modo, ventajosamente en la preparación de composiciones
farmacéuticas adecuadas para su uso como soluciones oftálmicas,
incluyendo aquellas para una administración intravitreal y/o
intracameral. Para el tratamiento de cualquiera de las anteriores
enfermedades u otros desórdenes, la composición de un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o de un anticuerpo
basado en 2C3 de la presente invención, se administraría al ojo u
ojos del sujeto, que necesita el tratamiento, en forma de un
preparado oftálmico elaborado según la práctica farmacéutica
convencional, ver por ejemplo "Remington's Pharmaceutical
Sciences" 15ª Edición, páginas 1488 a 1501 (Mack Publishing Co.,
Easton, PA).
La preparación oftálmica contendrá un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo
basado en 2C3 en una concentración de aproximadamente un 0,01 a
aproximadamente un 1% en peso, preferiblemente de aproximadamente un
0,05 a aproximadamente un 0,5%, en una solución, suspensión o pomada
farmacéuticamente aceptable. Necesariamente, tendrá lugar alguna
variación de la concentración dependiendo del compuesto en
particular empleado, la condición del sujeto a tratar y similares, y
la persona responsable del tratamiento determinará la concentración
más adecuada para el sujeto individual. La preparación oftálmica
estará preferiblemente en forma de solución acuosa estéril que
contiene, si se desea, ingredientes adicionales, por ejemplo,
conservantes, disoluciones tampón, agentes de tonicidad,
antioxidantes y estabilizadores, agentes clarificantes o humectantes
no iónicos, agentes aumentadores de la viscosidad y similares.
Los conservantes adecuados para su uso en tal
preparación incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio,
clorobutanol, timerosal y similares. Las disoluciones tampones
adecuadas incluyen ácido bórico, bicarbonato sódico y potásico,
borato sódico y potásico, carbonato sódico y potásico, acetato
sódico, bifosfato sódico, y similares, en cantidades suficientes
para mantener el pH entre pH 6 y pH 8 aproximadamente, y
preferiblemente, entre pH 7 y pH 7,5 aproximadamente. Los agentes de
tonicidad adecuados son dextrano 40, dextrano 70, dextrosa,
glicerina, cloruro potásico, propilenglicol, cloruro sódico, y
similares, de manera que el equivalente de cloruro sódico de la
solución oftálmica está en el intervalo de 0,9 más o menos 0,2%.
Los antioxidantes y estabilizadores adecuados
incluyen bisulfito sódico, metabisulfito sódico, tiosulfito sódico,
tiourea y similares. Los agentes clarificantes y humectantes
incluyen polisorbato 80, polisorbato 20, poloxamer 282 y tiloxapol.
Los agentes aumentadores de la viscosidad incluyen dextrano 40,
dextrano 70, gelatina, glicerina, hidroxietilcelulosa,
hidroximetilpropilcelulosa, lanolina, metilcelulosa, petrolato,
polietilenglicol, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona,
carboximetilcelulosa y similares. La preparación oftálmica se
administrará tópicamente al ojo del sujeto, que necesita el
tratamiento, mediante métodos convencionales, por ejemplo, en forma
de gotas o mediante el baño del ojo en la solución oftálmica.
En el sentido más amplio, las formulaciones para
la administración tópica incluyen aquellas para su liberación a
través de la boca (bucal) y a través de la piel. Los "sistemas de
liberación tópica" también incluyen parches transdermales que
contienen el ingrediente a administrar. La liberación a través de la
piel también se puede conseguir, si se desea, mediante iontoforesis
o electrotransporte.
Las formulaciones adecuadas para la
administración tópica por la boca incluyen pastillas que comprenden
los ingredientes en una base con sabor, normalmente sucrosa y acacia
o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una
base inerte, tal como gelatina o glicerina, o sucrosa y acacia; y
elixires bucales que comprenden el ingrediente a administrar en un
líquido transportador adecuado.
Las formulaciones adecuadas para la
administración tópica por la piel incluyen pomadas, cremas, geles y
pastas que comprenden el ingrediente a administrar en un
transportador farmacéutico aceptable. La formulación de anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o basados en 2C3
para uso tópico, tales como cremas, pomadas y geles, incluye la
preparación de bases de pomadas solubles en agua u oleaginosas, como
es bien conocido por los entendidos de la técnica. Por ejemplo,
estas composiciones pueden incluir aceites vegetales, grasas
animales, y más preferiblemente, hidrocarburos semisólidos obtenidos
a partir del petróleo. Los componentes particulares utilizados
pueden incluir pomada blanca, pomada amarilla, cera de cetil
ésteres, ácido oleico, aceite de oliva, parafina, petrolato,
petrolato blanco, espermaceti, glicerito de almidón, cera blanca,
cera amarilla, lanolina, lanolina anhidra y gliceril monoestearato.
También se pueden utilizar bases de pomadas solubles en agua que
incluyen glicol éteres y derivados, polietilenglicoles, estearato de
polioxil 40 y polisorbatos.
Las formulaciones para la administración rectal
se pueden presentar como supositorio con una base adecuada que
comprende, por ejemplo, manteca de coco o un salicilato. Las
formulaciones adecuadas para la administración vaginal se pueden
presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o
formulaciones de pulverización que contienen, además del ingrediente
activo, transportadores que se sabe en la técnica que son
apropiados.
Se contempla la liberación local a través de las
vías respiratorias y nasales para el tratamiento de varias
condiciones. Estas vías de liberación también son adecuadas para la
liberación de agentes en la circulación sistémica. También se
incluyen en la presente invención, las formulaciones de ingredientes
activos en transportadores adecuados para la administración nasal,
por ejemplo, soluciones nasales, pulverizadores, aerosoles e
inhaladores. Allí donde el transportador es sólido, las
formulaciones incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de
partícula, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 500 micras, el cual
se administra, por ejemplo, mediante la inhalación rápida a través
del conducto nasal desde el recipiente del polvo mantenido cerca de
la nariz.
Las formulaciones adecuadas en las que el
transportador es un líquido son útiles en la administración nasal.
Las soluciones nasales son, normalmente, soluciones acuosas
diseñadas para ser administradas a los conductos nasales en gotas o
pulverizadores y se preparan de manera que son muy similares en
muchos aspectos a las secreciones nasales, de manera que se mantiene
una acción ciliaria normal. De este modo, las soluciones nasales
acuosas normalmente son isotónicas y ligeramente tamponadas para
mantener el pH de 5,5 a 6,5. Además, se pueden incluir en la
formulación, si se requiere, conservantes antimicrobianos, similares
a los utilizados en preparaciones oftálmicas, y estabilizadores de
fármacos apropiados. Se conocen varias preparaciones nasales
comerciales e incluyen, por ejemplo, antibióticos y antihistamínicos
y se utilizan para la profilaxis del asma.
Las inhalaciones e inhaladores son preparaciones
farmacéuticas diseñadas para la liberación de un compuesto o fármaco
en el sistema respiratorio de un paciente. Se administra un vapor o
nebulización y se alcanza el área afectada. Esta vía también se
puede utilizar para liberar agentes en la circulación sistémica. Las
inhalaciones se pueden administrar por las vías respiratorias nasal
u oral. La administración de soluciones de inhalación sólo es
efectiva si las gotitas son suficientemente finas e uniformes en
tamaño, de manera que la nebulización alcance los bronquiolos.
Otro grupo de productos, también conocidos como
inhalaciones, y a veces llamadas insuflaciones, comprende fármacos
líquidos o finamente pulverizados que se transportan a las vías
respiratorias mediante la utilización de sistemas de liberación
especiales, tales como aerosoles farmacéuticos, que mantienen una
solución o suspensión del fármaco en un propelente de gas licuado.
Cuando se libera a través de una válvula adecuada y un adaptador
oral, una dosis medida de la inhalación se propela en el interior
del tracto respiratorio del paciente. El tamaño de partícula es de
importancia principal en la administración de este tipo de
preparación. Se ha mostrado que el tamaño de partícula óptimo para
la penetración en una cavidad pulmonar es del orden de 0,5 a 7
\mum. Las nebulizaciones finas se producen mediante aerosoles
presurizados y por tanto su uso se considera ventajoso.
La presente invención también proporciona kits
terapéuticos que comprenden un anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 o un
inmunoconjugado para su uso en los presentes métodos de tratamiento.
Tales kits, generalmente, contendrán, en una forma de envase
adecuada, una formulación farmacéuticamente aceptable de, como
mínimo, un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 o un inmunoconjugado. Los kits
también pueden contener otras formulaciones farmacéuticamente
aceptables para diagnóstico/imagen o terapia combinada. Por ejemplo,
tales kits pueden contener alguno o más de uno de un grupo de
fármacos quimioterapéuticos o radioterapéuticos; agentes
antiangiogénicos; anticuerpos de células antitumorales; y/o
inmunotoxinas o coaguligandos del estroma o de la vasculatura
antitumorales.
Los kits pueden tener un único recipiente (forma
de envase) que contiene el anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 o el
inmunoconjugado, con o sin algún componente adicional, o pueden
tener diferentes recipientes para cada agente deseado. Allí donde se
proporcionan agentes terapéuticos combinados, se puede premezclar
una solución simple, en una combinación equivalente molar, o con un
componente en exceso del otro. Alternativamente, cada uno de los
anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o los
anticuerpos basados en 2C3 o los inmunoconjugados y otros
componentes de agentes anticancerígenos del kit se pueden mantener
separadamente dentro de diferentes recipientes previamente a la
administración a un paciente.
Cuando los componentes del kit se proporcionan en
una o más soluciones líquidas, se prefiere que la solución líquida
sea una solución acuosa, siendo particularmente preferida una
solución acuosa estéril. Sin embargo, los componentes del kit se
pueden proporcionar como polvo(s) seco(s). Cuando los
reactivos o componentes se proporcionan como un polvo seco, el polvo
se puede reconstituir mediante la adición de un disolvente adecuado.
Se prevé que el disolvente también se puede proporcionar en otro
recipiente.
Los recipientes del kit, generalmente, incluirán,
como mínimo, un vial, un tubo de ensayo, un matraz, una botella, una
jeringuilla u otras formas de envase, en los que el anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo
basado en 2C3 o el inmunoconjugado, y cualquier otro agente deseado,
se pueden colocar y, preferiblemente, alicuotar adecuadamente. Allí
donde se incluyan los componentes separados, el kit también,
generalmente, contendrá un segundo vial u otro recipiente en los que
se colocan los mismos, permitiendo la administración de dosis
elaboradas por separado. Los kits también pueden comprender un
segundo/tercer medio de contener una disolución tampón estéril,
farmacéuticamente aceptable u otro diluyente.
Los kits también pueden contener unos medios, por
los que se administra el anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o el anticuerpo basado en 2C3 o el
inmunoconjugado a un animal o paciente, por ejemplo, una o más
agujas o jeringas, o incluso un goteador de ojo, pipeta, u otros
aparatos similares, mediante los cuales la formulación se puede
inyectar a un animal o aplicar a un área enferma del cuerpo. Los
kits de la presente invención también incluirán, normalmente, medios
para contener viales, o similares, y otros componentes, en clara
dirección para la venta comercial, tal como, por ejemplo,
inyecciones o recipientes de plástico moldeados por soplado dentro
de los cuales los viales deseados y otros aparatos se colocan y se
mantienen.
La presente invención se puede utilizar para
tratar animales y pacientes con angiogénesis aberrante, tal como la
que contribuye a una variedad de enfermedades y desórdenes. Las más
prevalentes y/o clínicamente importantes de éstas, fuera del sector
del tratamiento del cáncer, incluyen la artritis, artritis
reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética,
degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Grave,
restenosis vascular, que incluye la restenosis que sigue a la
angioplastia, malformaciones arteriovenosas (AVM), meningioma,
hemangioma y glaucoma neovascular. Otras dianas potenciales para la
intervención incluyen angiofibroma, placas ateroscleróticas,
neovascularización de xenoinjerto corneal, articulaciones
hemofílicas, cicatrices hipertróficas, síndrome de
Osler-Weber, fibroplasia retrolental de granuloma
piogénico, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis,
dermatitis, varias enfermedades y desórdenes inflamatorios, e
incluso endiometrosis. Más enfermedades y desórdenes que son
tratables por la presente invención, y la base unificadora de tales
desórdenes angiogénicos, se exponen a continuación.
Una enfermedad en la que la angiogénesis está
implicada es la artritis reumatoide, en la que los vasos sanguíneos
en el revestimiento sinovial de las articulaciones experimentan la
angiogénesis. Además de la formación de nuevas redes vasculares, las
células endoteliales liberan factores y especies de oxígeno
reactivas que conllevan el crecimiento de pannus y la destrucción de
cartílago. Los factores implicados en la angiogénesis pueden
contribuir activamente al estado crónicamente inflamado de la
artritis reumatoide, y ayudar a mantenerlo. Los factores asociados
con la angiogénesis también tienen un papel en la osteoartritis,
contribuyendo a la destrucción de la articulación.
Harada y otros (1998) mostraron que el VEGF está
implicado en la patogénesis de la artritis reumatoide y, además, que
la medida de la concentración en suero de VEGF es un método útil, no
invasivo para la monitorización de la actividad de la enfermedad de
la artritits reumatoide. Esto apoya los usos terapéuticos y de
diagnóstico de la presente invención en relación con la artritis
reumatoide.
Nagashima y otros (1999) describieron los efectos
inhibitorios de los fármacos antirreumáticos sobre VEGF en células
cultivadas sinoviales de reumatoide. El VEGF se expresa
constitutivamente en el sinovium de la artritis reumatoide. El
fármaco antirreumático conocido, bucilamina (BUC), se observó que
incluía dentro de su mecanismo de acción la inhibición de la
producción de VEGF por células sinoviales. De este modo, los efectos
antirreumáticos de BUC están mediados por la supresión de
angiogénesis y la proliferación sinovial en el sinovium artrítico a
través de la inhibición de la producción de VEGF por células
sinoviales. El uso de la presente invención como una terapia
antiartrítica está apoyado por las acciones inhibitorias del VEGF de
este agente terapéutico existente.
Otro ejemplo de enfermedad mediada por la
angiogénesis es la enfermedad neovascular ocular. Esta enfermedad se
caracteriza por la invasión de nuevos vasos sanguíneos en las
estructuras del ojo, tal como la retina o la córnea. Es la causa más
común de ceguera y está implicada en aproximadamente veinte
enfermedades del ojo. En la regeneración macular relacionada con la
edad, los problemas visuales asociados son causados por un
crecimiento interno de capilares coroidales a través de defectos en
la membrana de Bruch con proliferación de tejido fibrovascular por
debajo del epitelio del pigmento retinal. El daño angiogénico
también se asocia con retinopatía diabética, retinopatía de
premadurez, rechazo del xenoinjerto corneal, glaucoma neovascular y
fibroplasia retrolental.
Otras enfermedades asociadas con la
neovascularización corneal incluyen, pero no se limitan a,
queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de Vitamina A, sobreuso
de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica
superior, queratitis sicca pterigium, sjogrens, acné rosáceo,
filectenulosis, sífilis, infecciones de Micobacterias, degeneración
de lípidos, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras
fúngicas, infecciones de Herpes simplex, infecciones de Herpes
zoster, infecciones por protozoos, sarcoma de Kaposi, úlcera de
Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratolisis marginal,
artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis, traumatismos,
sarcoidosis de Wegener, Escleritis, enfermedad de
Steven-Johnson, queratotomía radial perifigoide, y
rechazo de gráfico corneal.
Las enfermedades asociadas con la
neovascularización retinal/coroidal incluyen, pero no se limitan a,
retinopatía diabética, degeneración macular, anemia de la célula
falciforme, sarcoide, sífilis, pseudoxantoma elástico, enfermedad de
Paget, oclusión de las venas, oclusión arterial, enfermedad
obstructiva de la carótida, uveitis/vitritis crónica, infecciones
micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritomatosis sistémico,
retinopatía de premadurez, enfermedad de Eales, enfermedad de
Bechet, infecciones causantes de retinitis o coroiditis,
histoplasmosis ocular presunta, enfermedad de Best, miopía, agujeros
ópticos, enfermedad de Stargart, pars planitis, desprendimiento
retinal crónico, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis,
traumatismos y complicaciones post-láser.
Otras enfermedades incluyen, pero no se limitan
a, enfermedades asociadas con rubeosis (neovascularización del
ángulo) y las enfermedades causadas por la proliferación anormal de
tejido fibrovascular o fibroso que incluye todas las formas de
vitreoretinopatía proliferativa.
La inflamación crónica también implica la
angiogénesis patológica. Tal enfermedad se manifiesta como una
colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn muestra cambios
histológicos con el crecimiento interno de nuevos vasos sanguíneos
en los tejidos inflamados. La Bartonelosis, una infección bacteriana
encontrada en Sudamérica, puede dar lugar a una etapa crónica que se
caracteriza por la proliferación de células endoteliales
vasculares.
En la arterosclerosis se encuentra otro papel
patológico asociado con la angiogénesis. Las placas formadas en el
interior del lumen de los vasos sanguíneos se ha mostrado que tienen
actividad estimulatoria angiogénica. La expresión del VEGF en las
lesiones ateroscleróticas coronarias humanas fue demostrada por
Inoue y otros (1998). Esto evidencia el significado patofisiológico
del VEGF en la progresión de la aterosclerosis coronaria humana, así
como en procesos de recanalización en enfermedades coronarias
obstructivas. La presente invención proporciona un tratamiento
efectivo para tales condiciones.
Una de las enfermedades angiogénicas más
frecuentes de la infancia es el hemangioma. En la mayoría de casos,
los tumores son benignos y experimentan regresión sin intervenir. En
casos más severos, los tumores progresan a formas cavernosas amplias
e infiltrativas y crean complicaciones clínicas. Las formas
sistémicas de los hemangiomas, las hemangiomatosas, tienen un índice
de mortalidad alto. Existen hemangiomas resistentes a las terapias
que no se pueden tratar con agentes terapéuticos actualmente en
uso.
La angiogénesis también es responsable del daño
encontrado en enfermedades hereditarias, tales como la enfermedad de
Osler-Weber-Rendu, o telangiectasia
hemorrágica hereditaria. Ésta es una enfermedad hereditaria
caracterizada por múltiples angiomas pequeños, tumores de sangre o
vasos linfáticos. Los angiomas se encuentran en la piel y en las
membranas de las mucosas, acompañados frecuentemente por epistaxis
(sangrado nasal) o sangrado gastrointestinal y algunas veces con
fístulas arteriovenosas pulmonares o hepáticas.
La angiogénesis también está implicada en
procesos fisiológicos normales, tales como la reproducción y la
curación de heridas. La angiogénesis es una etapa importante en la
ovulación y también en la implantación de la blástula tras la
fertilización. La prevención de la angiogénesis se podría utilizar
para inducir amenorrea, para bloquear la ovulación o para prevenir
la implantación por la blástula.
En la curación de heridas, la reparación excesiva
o fibroplasia puede ser un efecto colateral perjudicial de los
procesos quirúrgicos y pueden ser causado o exacerbado mediante la
angiogénesis. Las adhesiones son una complicación frecuente de la
cirugía y llevan a problemas, tales como la obstrucción del
intestino delgado.
Las enfermedades y desórdenes caracterizados por
una permeabilidad vascular no deseable también se pueden tratar por
la presente invención. Éstas incluyen el edema asociado con tumores
cerebrales, ascitis asociada con malignidades, síndrome de Meigs,
inflamación del pulmón, síndrome nefrótico, efusión pericardial y
efusión pleural, tal como se da a conocer en la Patente WO
98/165551.
Cada una de las enfermedades y desórdenes
anteriores, junto con todos los tipos de tumores, tal como se
describe en las secciones siguientes, se pueden tratar eficazmente
por la presente invención de acuerdo con el conocimiento en la
técnica, tal como se da a conocer en, por ejemplo, la Patente U.S.A.
No. 5.712.291 que unificaba beneficios como resultado de la
aplicación de estrategias antiangiogénicas al tratamiento de
enfermedades angiogénicas.
Los anticuerpos y/o inmunoconjugados de la
presente invención se utilizan más preferiblemente en el tratamiento
de tumores. Los tumores en que la angiogénesis es importante
incluyen tumores malignos, y tumores benignos, tales como el neuroma
acústico, neurofibroma, tracoma y granulomas piogénicos. La
angiogénesis es particularmente prominente en la formación de
tumores sólidos y metástasis. Sin embargo, la angiogénesis también
está asociada con tumores nacidos en la sangre, tales como
leucemias, y varias enfermedades neoplásticas crónicas o agudas de
la médula ósea en las que tiene lugar la proliferación no
restringida de glóbulos blancos, normalmente acompañada por anemia,
mal funcionamiento de la coagulación sanguínea, y el aumento de los
nódulos linfáticos, hígado, y bazo. La angiogénesis también juega un
papel en las anormalidades en la médula ósea que da pie a tumores
similares a la leucemia.
La angiogénesis es importante en dos fases de la
metástasis tumoral. En la vascularización del tumor primario, la
angiogénesis permite a las células entrar en la corriente sanguínea
y circular por todo el cuerpo. Después de que las células tumorales
hayan dejado el sitio primario, y se hayan instalado en un segundo
sitio, sitio de metástasis, la angiogénesis debe tener lugar antes
de que el nuevo tumor pueda crecer y expandirse. Por lo tanto, la
prevención de la angiogénesis puede prevenir la metástasis de
tumores y contener el crecimiento neoplástico en el sitio primario,
permitiendo el tratamiento por otros agentes terapéuticos,
particularmente, construcciones agente
marcador-agente terapéutico (ver más adelante).
Los métodos del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y del anticuerpo
basado en 2C3 o del inmunoconjugado proporcionados por la presente
invención son, de este modo, ampliamente aplicables al tratamiento
de cualquier tumor maligno que tiene un componente vascular. Al usar
los anticuerpos y/o inmunoconjugados de la presente invención en el
tratamiento de tumores, particularmente vascularizados, tumores
malignos, los agentes se pueden utilizar solos o en combinación con,
por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, radioterapéuticos,
apoptópicos, antiangiogénicos y/o inmunotoxinas o coaguligandos.
Los típicos tumores vascularizados para el
tratamiento son los tumores sólidos, particularmente carcinomas, que
requieren un componente vascular para la provisión de oxígeno y
nutrientes. Algunos ejemplos de tumores sólidos que se pueden tratar
utilizando la presente invención incluyen, pero no se limitan a,
carcinomas del pulmón, pecho, ovario, estómago, páncreas, laringe,
esófago, testículo, hígado, parótida, tracto biliar, colon, recto,
cérvix, útero, endometrio, riñón, vejiga, próstata, tiroides,
carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de
células pequeñas, melanomas, gliomas, glioblastomas, neuroblastomas,
y similares. La Patente WO 98/45331 además ejemplifica la variedad
de los tipos de tumores que pueden ser tratados eficazmente
utilizando un anticuerpo anti-VEGF.
El conocimiento del papel de la angiogénesis en
el mantenimiento y metástasis de tumores ha llevado a un indicador
pronóstico para cánceres, tales como el cáncer de pecho. La cantidad
de neovascularización encontrada en el tumor primario se determinó
mediante el recuento de la densidad de microvasos en el área de
neovascularización más intensa en el carcinoma invasivo del pecho.
Se encontró que un alto nivel de densidad de microvasos se
correlacionaba con la reaparición del tumor. El control de la
angiogénesis mediante las terapias de la presente invención
reducirá o anulará la reaparición de tales tumores.
La presente invención se contempla para su uso en
el tratamiento de cualquier paciente que presente un tumor sólido. A
la luz de las propiedades específicas de las composiciones basadas
en el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2,
los agentes terapéuticos de la presente invención habrán reducido
los efectos colaterales. Las ventajas particulares darán lugar al
mantenimiento o mejora de las respuestas inmunes del huésped contra
el tumor, tal como mediada por macrófagos, y a la falta de efectos
adversos en el tejido óseo. La presente invención, de este modo,
será la terapia antiangiogénica de elección para el tratamiento de
cánceres pediátricos y de pacientes que tienen, o con riesgo de
desarrollar, osteoporosis y otras deficiencias óseas.
A pesar de que las malignidades y tumores sólidos
se pueden tratar mediante la presente invención, los anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 y 2C3, no
conjugados, de la presente invención se contemplan particularmente
para su uso en el tratamiento de pacientes con más tumores
angiogénicos, o pacientes con riesgo de desarrollar metástasis.
La presente invención también se destina como
tratamiento preventivo o profiláctico. Estos aspectos de la presente
invención incluyen la capacidad de la presente invención para tratar
pacientes que presentan un tumor primario, que pueden tener tumores
metastáticos, o células tumorales en las primeras fases de
germinación del tumor metastático. Como estrategia antiangiogénica,
la presente invención también se puede utilizar para prevenir el
desarrollo de tumores en sujetos con un riesgo alto o moderado de
desarrollar un tumor, en base de las pruebas de pronóstico y/o los
parientes cercanos que sufren un cáncer hereditario.
Las formas conjugadas o inmunotoxinas de los
anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 y 2C3
de la presente invención se contemplan particularmente para su uso
en la destrucción o desmembramiento de los tumores sólidos. Estos
aspectos de la presente invención se pueden utilizar en relación a
los anticuerpos antiangiogénicos no conjugados de la presente
invención, o con otras aproximaciones antiangiogénicas.
Se apreciará fácilmente por los entendidos en la
técnica que las formas del profármaco y del inmunoconjugado de los
presentes métodos de tratamiento tienen la ventaja clara de
proporcionar un único agente terapéutico con dos propiedades: la
propiedad antiangiogénica inherente del anticuerpo y la propiedad
terapéutica del agente acoplado (por ejemplo, citotóxica,
coagulativa, apoptópica, etc). Las formas de tratamiento con
conjugados y con profármacos de los presentes anticuerpos, de este
modo, tienen una utilidad increíblemente amplia en todo el sector
del tratamiento del cáncer.
La guía proporcionada en la presente respecto a
los pacientes más adecuados para su uso, junto con los diferentes
aspectos de la presente invención, se destina como una enseñanza de
que ciertos perfiles de pacientes pueden ayudar con la selección de
pacientes para el tratamiento mediante la presente invención. La
preselección de ciertos pacientes, o categorías de pacientes, no
anula, en cualquier caso, la utilidad de la presente invención en
relación al tratamiento de todos los pacientes que tienen un tumor
vascularizado, u otras enfermedades angiogénicas, tal como se ha
descrito anteriormente. Una consideración adicional es el hecho de
que el ataque al tumor, proporcionado por la presente invención,
puede predisponer el tumor a un tratamiento terapéutico adicional,
de manera que el tratamiento posterior da lugar a un efecto
sinergístico global o incluso lleva a la total remisión o cura.
No se cree que cualquier tipo de tumor particular
se deba excluir del tratamiento que se usa en la presente invención.
Sin embargo, el tipo de células tumorales puede ser relevante para
el uso de la presente invención junto con otros agentes
terapéuticos, particularmente quimioterapéuticos e inmunotoxinas de
células antitumorales. Tanto los aspectos conjugados como los no
conjugados de las presentes terapias incluirán un efecto
antiangiogénico que inhibirá la proliferación de la vasculatura del
tumor. Los aspectos del tratamiento con profármacos o conjugados
además destruirán u obstruirán la vasculatura del tumor. Como la
vasculatura es sustancialmente o enteramente la misma en todos los
tumores sólidos, la metodología presente se entenderá para ser
ampliamente o enteramente aplicable al tratamiento de todos los
tumores sólidos, sin tener en cuenta el fenotipo o genotipo
particular de las propias células tumorales.
Las dosis terapéuticamente efectivas de las
construcciones de anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2 o anticuerpos basados en 2C3 o
inmunoconjugados son fácilmente determinables utilizando datos de un
modelo animal, por ejemplo, tal como se muestra en los estudios
detallados en la presente. Los animales experimentales con tumores
sólidos se utilizan frecuentemente para optimizar dosis terapéuticas
apropiadas previamente al traslado a un ambiente clínico. Se conoce
que tales modelos son muy fiables en la predicción de estrategias
anticancerígenas efectivas. Por ejemplo, los ratones con tumores
sólidos, como los utilizados en los Ejemplos, se utilizan
ampliamente en pruebas preclínicas. Los inventores han usado tales
modelos de ratón, aceptados en la técnica, para determinar los
intervalos de trabajo de los agentes terapéuticos que proporcionan
efectos antitumorales beneficiosos con una toxicidad mínima.
Al utilizar anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 o anticuerpos
basados en 2C3, no conjugados, en las terapias antiangiogénicas,
también se pueden extraer otros datos publicados para ayudar en la
formulación de dosis para el tratamiento clínico. Por ejemplo, a
pesar de que los anticuerpos de la presente invención tienen claras
ventajas sobre aquellos de la técnica, la información en la
literatura sobre el tratamiento con otros anticuerpos
anti-VEGF aún se puede usar en combinación con los
datos y enseñanzas de la presente solicitud para diseñar y/u
optimizar los protocolos de tratamiento y dosis.
Por ejemplo, Borgstrom y otros (1999)
describieron la importancia del VEGF en la angiogénesis in
vivo del cáncer de pecho utilizando MAb A4.6.1. Como los
anticuerpos similares al 2C3 de la presente invención mostraban
respuestas antitumorales equivalentes o incluso mejoradas en
estudios comparativos con A4.6.1, estos anticuerpos también tendrán
una utilidad significativa en el tratamiento del cáncer de pecho.
Los inventores, además, se dieron cuenta, como se apreciará por
aquellos de habilidad normal en la técnica, que los pacientes con
cáncer de pecho son normalmente mujeres en los grupos de edad media
o avanzada, en las que la preocupación por la osteoporosis es
también clara. El anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2 y los anticuerpos basados en 2C3 de la presente invención
tendrán, de este modo, la ventaja añadida de no causar un efecto
adverso en el metabolismo óseo, y por tanto, no se preferirá su uso
en pacientes con cáncer de pecho o con el riesgo de desarrollar
osteoporosis.
El mismo tipo de ventajas hace que los agentes
terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 y del basado en 2C3 sean los fármacos preferidos para el
tratamiento de cánceres pediátricos. En niños con cáncer, es
evidente la necesidad de continuar el crecimiento óseo de una forma
sustancial y sana. Como los anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2, tales como el 2C3, no alterarán las
actividades de los osteoclastos y condroclastos, las cuales son
importantes en el desarrollo óseo, el 2C3 tendrá ventajas
importantes sobre otros anticuerpos, tal como el A4.6.1.
Borgstrom y otros (1999) también informaron que
el MAb A4.6.1 daba lugar a la regresión significativa de tumores
cuando se utilizaba en combinación con doxorubicina. Esto apoya
además el uso combinado de anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2 y agentes quimioterapéuticos o citotóxicos
convencionales para conseguir resultados clínicos significativos en
el tratamiento de una variedad de cánceres. Se contemplan
combinaciones de fármacos de doxorubicina y doxorubicina no
conjugada.
Ferrara y colegas también informaron sobre la
eficacia y la respuesta a la concentración de un anticuerpo
monoclonal anti-VEGF murino en ratones con tumores y
la extrapolación al tratamiento con humanos (Mordenti y otros,
1999). Los estudios se diseñaron para evaluar la relación
respuesta-concentración del anticuerpo monoclonal
anti-VEGF murino, de manera que se podía estimar
una concentración de plasma eficaz de la forma humanizada
recombinante del anticuerpo en pacientes de cáncer. Mordenti y otros
(1999) concluyeron que la supresión tumoral satisfactoria en ratones
desnudos se consiguió utilizando dosis del anticuerpo murino que
podrían ser fácilmente aplicadas al sistema humano para definir los
regímenes de dosificación clínica efectivos para mantener un
anticuerpo terapéutico para uso humano en el intervalo de eficacia
requerido. Por consiguiente, los datos de los modelos de ratón,
aceptados en la técnica, también se pueden trasladar a dosis humanas
apropiadas utilizando el tipo de análisis expuesto en Mordenti y
otros (1999), además de las técnicas conocidas por los entendidos en
la técnica como se ha descrito en la presente.
Los resultados de evaluaciones de seguridad
preclínicas de una forma humanizada recombinante del anticuerpo
anti-VEGF de Genentech en monos (Ryan y otros, 1999)
sirven para ejemplificar los inconvenientes del agente terapéutico
candidato particular. A pesar de que el anticuerpo tiene actividad
farmacológica en este animal, los monos en estos estudios mostraron
displasia fiseal caracterizada por un incremento relacionado con la
dosis en condrocitos hipertrofiados, la formación de placas óseas
subcondriales, y la inhibición de la invasión vascular de la placa
de crecimiento. Ninguno de dichos inconvenientes será evidente en el
uso de agentes terapéuticos del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y del basado en 2C3,
que no inhiben la unión del VEGF y la señalización en condroclastos
y condrocitos, que es mediada por el VEGFR1.
Se observaron los datos de un estudio adicional
de Lin y otros (1999) sobre la farmacocinética preclínica, la
relación entre especies y la distribución en el tejido del
anticuerpo anti-VEGF monoclonal humanizado de
Genentech. Estos estudios se llevaron a cabo en ratones, ratas,
monos y conejos, éste último utilizando el anticuerpo marcado con
^{125}I. Los datos farmacocinéticos de los ratones, ratas y monos
se utilizaron para predecir la farmacocinética del anticuerpo
homólogo humanizado utilizando una relación alométrica en humanos.
Por consiguiente, se puede desarrollar información sobre la dosis
apropiada para el tratamiento de las condiciones patológicas
humanas, tales como artritis reumatoide, neovascularización ocular y
cáncer.
Se ha empleado una versión humanizada del
anticuerpo anti-VEGF A4.6.1 en pruebas clínicas como
agente anticancerígeno (Brem, 1998; Baca y otros, 1997; Presta y
otros, 1997). Por lo tanto, tales datos clínicos también se pueden
considerar como una fuente de referencia cuando se diseñan dosis
terapéuticas para el presente tratamiento con anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y 2C3. La presente
invención muestra que el 2C3 es tan efectivo como el A4.6.1 en
estudios con ratones con tumor, a pesar de que la especificidad para
inhibir sólo acciones del VEGF mediadas por el VEGFR2 es una
ventaja. La Patente WO 98/45331 además ejemplifica las dosis de
anticuerpos humanizados anti-VEGF que se pueden
utilizar en el tratamiento.
En términos de utilizar inmunoconjugados de
anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2
conjugados o basados en 2C3 en la terapia tumoral, uno se puede
referir a la literatura científica y de patentes sobre el éxito de
la liberación de un amplio número de agentes terapéuticos a la
vasculatura tumoral para conseguir un efecto beneficioso. A modo de
ejemplo, cada una de las Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866; 5.877.289;
5.965.132; 6.051.230; 6.004.555; 5.776.427; 6.004.554; 6.036.955; y
Patente U.S.A. No. 6 093 399, además describen el uso de tales
construcciones agente terapéutico-agente marcador.
En el presente caso, las construcciones agente
terapéutico-agente marcador incluyen partes de
agente marcador que ejercen un efecto antiangiogénico, que aumentará
o, de otra manera, mejorará la actividad antitumoral del agente
terapéutico acoplado.
Como se conoce en la técnica, existen objetivos
reales que se pueden utilizar como guía en relación a las pruebas
preclínicas, antes de proceder al tratamiento clínico. Sin embargo,
a la luz del progreso de otros anticuerpos anti-VEGF
hacia el tratamiento clínico, los efectos antitumorales demostrados
en modelos aceptados mostrados en la presente, y la mejor seguridad
de las presentes estrategias, la invención actual proporciona un
agente terapéutico con una trayectoria rápida hacia el tratamiento
clínico. De este modo, se pueden emplear pruebas preclínicas para
seleccionar los anticuerpos, dosis o combinaciones más
ventajosas.
Definirá una invención útil, cualquier dosis de
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o
anticuerpo basado en 2C3 o inmunoconjugado, o medicamento combinado,
que da lugar a cualquier efecto antiangiogénico detectable de forma
constante, inhibición de metástasis, destrucción de la vasculatura
tumoral, trombosis tumoral, necrosis y/o efecto antitumoral general.
La presente invención también puede ser efectiva contra vasos
corriente abajo del tumor, es decir, marcar, como mínimo, un
subgrupo de vasos de drenaje, particularmente como citocinas
liberadas del tumor que actuarán en estos vasos, cambiando su perfil
antigénico.
También se entenderá que incluso en las
circunstancias en que los efectos tumorales y/o antiangiogénicos de
la dosis de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o anticuerpo basado en 2C3 o inmunoconjugado, o terapia
combinada, se dirigen hacia el límite inferior del intervalo
terapéutico deseado, puede ser que esta terapia sea aún igual o
incluso más efectiva que todas las otras terapias conocidas en el
contexto del marcaje de un tumor o de un paciente particular. Para
un médico es desafortunadamente evidente que ciertos tumores y
condiciones no se pueden tratar con eficacia a medio o largo plazo,
pero eso no anula la utilidad de la presente terapia,
particularmente allí donde, como mínimo, sea tan efectiva como otras
estrategias generalmente propuestas.
Al diseñar dosis apropiadas de construcciones de
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o
anticuerpo basado en 2C3 o inmunoconjugado, o agentes terapéuticos
combinados, para el tratamiento de tumores vascularizados, se puede
fácilmente extrapolar desde los estudios en animales en la presente
descritos y el conocimiento en la literatura para llegar a las dosis
apropiadas para una administración clínica. Para conseguir la
conversión de dosis animales a humanas, se tendrían en cuenta la
masa de los agentes administrados por unidad de masa del animal
experimental y, preferiblemente, se tendría en cuenta las
diferencias en el área superficial del cuerpo (m^{2}) entre el
animal experimental y el paciente humano. Todos estos cálculos y
rutinas son bien conocidos por aquellos de habilidad normal en la
técnica.
Por ejemplo, tomando las dosis satisfactorias del
2C3 en estudios de ratón, y mediante la aplicación de cálculos
estándares basados en la masa y el área superficial, las dosis
eficaces para su uso en pacientes humanos sería de entre 1
mg/m^{2} aproximadamente y 1000 mg/m^{2} aproximadamente,
preferiblemente, entre 50 mg/m^{2} y 500 mg/m^{2}
aproximadamente, y más preferiblemente, entre 10 mg/m^{2}
aproximadamente y 100 mg/m^{2} aproximadamente. Estas dosis son
apropiadas para el anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2 o para anticuerpos desnudos basados en 2C3 y el anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o para
inmunoconjugados basados en 2C3, a pesar de que se prefiere utilizar
las dosis en relación a anticuerpos desnudos o no conjugados para su
uso como antiangiogénicos.
Por consiguiente, utilizando esta información,
los inventores contemplan que las dosis bajas útiles de anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o anticuerpos
basados en 2C3 o inmunoconjugados para la administración humana
serán de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20,
25, 30, 35, 40, 45 o aproximadamente 50 mg/m^{2}; y que las dosis
elevadas útiles de tales anticuerpos o inmunoconjugados para la
administración humana serán de aproximadamente 600, 650, 700, 750,
800, 850, 900, 925, 950, 975 o aproximadamente 1000 mg/m^{2}. Las
dosis intermedias útiles de anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o anticuerpos basados en 2C3 o inmunoconjugados
para la administración humana se contemplan como cualquier dosis
entre los intervalos superiores e inferiores, tales como
aproximadamente 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250,
300, 350, 400, 450, 500, 525, 550 o aproximadamente 575 mg/m^{2} o
similar.
Se contempla cualquier intervalo en particular
que se encuentre entre las dosis de ejemplo expuestas anteriormente
o cualquier valor intermedio entre los intervalos expuestos en
particular. Allí donde se utilice los inmunoconjugados del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado
en 2C3, se entenderá que los inmunoconjugados de coagulantes se
pueden, generalmente, utilizar en dosis más elevadas que los
inmunoconjugados de toxinas.
En general, se preferirán los intervalos de
dosificación entre aproximadamente 10-100
mg/m^{2}, aproximadamente 10-90 mg/m^{2},
aproximadamente 10-80 mg/m^{2}, aproximadamente
20-100 mg/m^{2}, aproximadamente
20-90 mg/m^{2}, aproximadamente
20-80 mg/m^{2}, aproximadamente
30-100 mg/m^{2}, aproximadamente
30-90 mg/m^{2}, aproximadamente
30-80 mg/m^{2}, aproximadamente
15-100 mg/m^{2}, aproximadamente
25-100 mg/m^{2}, aproximadamente
35-100 mg/m^{2}, aproximadamente
15-90 mg/m^{2}, aproximadamente
25-90 mg/m^{2}, aproximadamente
35-90 mg/m^{2} o similar de anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o anticuerpos
basados en 2C3 o inmunoconjugados. No obstante, estos intervalos
expresados, se entenderá que, dados los parámetros y la guía
detallada presentada en la presente, se abarcarán, dentro de la
presente invención, variaciones adicionales en los intervalos
activos u óptimos.
Por lo tanto, se entenderá que las dosis
inferiores pueden ser más apropiadas en combinación con otros
agentes, y que las dosis elevadas todavía se pueden tolerar,
particularmente dada la seguridad mejorada del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y anticuerpos
basados en 2C3 que se unen sólo al VEGFR2 y, además, la seguridad
mejorada de los inmunoconjugados antiangiogénicos y coagulantes del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 y de los
basados en 2C3. El uso de anticuerpos humanos o humanizados (y
opcionalmente, proteínas humanas antiangiogénicas o coagulantes)
hace que la presente invención sea más segura para su uso clínico,
además de reducir las posibilidades de toxicidad significativa o
efectos colaterales en tejidos sanos.
La intención de los regímenes terapéuticos de la
presente invención es, generalmente, producir efectos antitumorales
significativos mientras se mantiene la dosis por debajo de los
niveles asociados con una toxicidad inaceptable. Además de variar la
propia dosis, el régimen de administración también se puede adaptar
para optimizar la estrategia del tratamiento. Un protocolo de
tratamiento es administrar entre aproximadamente 1 mg/m^{2} y
aproximadamente 1000 mg/m^{2}, preferiblemente, entre
aproximadamente 50 mg/m^{2} y aproximadamente 500 mg/m^{2}, y
más preferiblemente, entre aproximadamente 10 mg/m^{2} y
aproximadamente 100 mg/m^{2} del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o del anticuerpo
basado en 2C3 o del inmunoconjugado, o del cóctel terapéutico que
contiene los mismos, de 1 a 3 veces por semana aproximadamente,
preferiblemente mediante administración intravenosa o intramuscular,
y más preferiblemente, intravenosa.
Al administrar las dosis particulares,
preferiblemente, se proporcionaría sistemáticamente al paciente una
composición farmacéuticamente aceptable (según los estándares de
esterilidad, pirogenicidad, pureza y seguridad general de la FDA).
Se prefiere, generalmente, la inyección intravenosa. También se
contempla la infusión continua sobre un período de tiempo de 1 ó 2
horas aproximadamente o similar.
Naturalmente, antes de un uso extendido, se deben
efectuar pruebas clínicas. Los diversos elementos para dirigir una
prueba clínica, incluyendo el tratamiento en pacientes y la
monitorización, serán conocidos por los entendidos de la técnica a
la luz de la presente descripción. La siguiente información se
presenta como una guía general para su uso en el establecimiento de
dichas pruebas.
Los pacientes elegidos para los primeros estudios
de tratamiento con anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2 o basado en 2C3 habrán fallado en la respuesta a, como
mínimo, un curso de terapia convencional, y tendrán una enfermedad
objetivamente medible, tal como se determina por examen físico,
técnicas de laboratorio, y/o procesos radiográficos. Cualquier
quimioterapia debería pararse, como mínimo, dos semanas antes del
inicio del estudio. Donde se emplean anticuerpos o partes de
anticuerpos monoclonales murinos, los pacientes no deberían tener un
historial con alergia a inmunoglobulina de ratón.
Se encontrarán varias ventajas en el uso de un
catéter permanente de la vena central con un triple puerto en el
lumen. Los agentes del anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, se deberían filtrar, por
ejemplo, utilizando un filtro de 0,22 \mum, y diluir
apropiadamente, tal como con solución salina, hasta un volumen final
de 100 ml. Antes de su uso, la muestra de prueba también se debería
filtrar de una forma similar, y calcular su concentración antes y
después de la filtración mediante la determinación de A_{280}. La
recuperación esperada debería estar en el intervalo del 87% al 99%,
y, a continuación, pueden tenerse en cuenta los ajustes por la
pérdida de proteína.
El anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 o los
conjugados se pueden administrar durante un período de tiempo de
aproximadamente 4-24 horas, con cada paciente
recibiendo 2-4 infusiones en intervalos de
2-7 días. La administración también se puede llevar
a cabo mediante una velocidad constante de infusión durante un
período de 7 días. La infusión proporcionada en cualquier nivel de
dosificación dependería de cualquier toxicidad observada. Por tanto,
si se alcanza la toxicidad de Grado II después de una única
infusión, o en un período de tiempo particular para la infusión de
velocidad constante, se deberían retener las dosis adicionales o
parar la infusión por velocidad constante a menos que mejorase la
toxicidad. Se deberían administrar dosis crecientes de agentes
terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o basado en 2C3 a grupos de pacientes hasta que
aproximadamente el 60% de los pacientes mostraran una toxicidad de
Grado III o IV inaceptable en cualquier categoría. Las dosis que
representan los 2/3 de este valor se definen como dosis seguras.
El examen físico, las medidas del tumor, y las
pruebas de laboratorio se deberían realizar, por supuesto, antes del
tratamiento y en intervalos hasta un mes más tarde. Las pruebas de
laboratorio deberían incluir recuentos sanguíneos completos,
creatinina del suero, creatina quinasa, electrolitos, urea,
nitrógeno, SGOT, bilirrubina, albúmina, y proteínas en suero
totales. Las muestras de suero tomadas hasta 60 días después del
tratamiento, se deberían evaluar mediante radioinmunoensayo por la
presencia del agente terapéutico administrado, y de anticuerpos
contra cualquier parte de los mismos. Los análisis inmunológicos de
suero, utilizando cualquier ensayo estándar, tal como, por ejemplo,
ELISA o RIA, permitirán evaluar la farmacocinética y el despeje del
agente terapéutico del anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3.
Para evaluar las respuestas antitumorales, los
pacientes se deberían examinar a las 48 horas hasta 1 semana y otra
vez a los 30 días después de la última infusión. Cuando la
enfermedad palpable esté presente, se deberían medir diariamente,
durante el tratamiento, los dos diámetros perpendiculares de todas
las masas, durante 1 semana tras la finalización de la terapia, y a
los 30 días. Para medir enfermedades no palpables, se podrían
realizar escáneres CT en serie en intervalos de 1 cm por todo el
pecho, abdomen, y pelvis a las 48 horas hasta 1 semana y otra vez a
los 30 días. Las muestras de tejido también se deberían evaluar
histológicamente, y/o mediante citometría de flujo, utilizando
biopsias de los sitios de la enfermedad o incluso sangre o muestras
de fluidos si fuera apropiado.
Las respuestas clínicas se pueden definir
mediante medidas aceptables. Por ejemplo, una respuesta completa se
puede definir por la desaparición de todo tumor medible 1 mes
después del tratamiento. En cambio, una respuesta parcial se puede
definir por una reducción del 50% o superior de la suma de los
productos de los diámetros perpendiculares de los nódulos tumorales
evaluables 1 mes después del tratamiento, sin sitios tumorales que
muestren un aumento. De forma similar, una respuesta mixta se puede
definir por una reducción del 50% o superior del producto de los
diámetros perpendiculares de todas las lesiones medibles 1 mes
después del tratamiento, con progresión en uno o más sitios.
A la luz de los resultados de las pruebas
clínicas, tales como los descritos anteriormente, se puede formular
un régimen de tratamiento incluso más preciso. Aún así, algunas
variaciones en la dosis pueden ser más tarde necesarias dependiendo
de la condición del sujeto a tratar. El doctor responsable de la
administración, a la luz de la presente descripción, será capaz de
determinar la dosis apropiada para el sujeto individual. Tal
optimización y ajuste se lleva a cabo rutinariamente en la técnica y
de ninguna manera refleja una falta de experimentación.
La presente invención se puede combinar con otras
terapias, tanto si se usa para tratar enfermedades angiogénicas,
tales como artritis, psoriasis, aterosclerosis, retinopatía
diabética, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad
de Grave, restenosis vascular, hemangioma y glaucoma vascular (u
otras enfermedades descritas anteriormente), como para tumores
sólidos.
Los métodos de tratamiento del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 de
la presente invención se pueden combinar con otros métodos,
generalmente, empleados en el tratamiento del tumor, enfermedad o
desorden particular que muestra el paciente. Siempre y cuando una
aproximación terapéutica particular se sepa que no es perjudicial
para las condiciones en sí del paciente, y no contrarreste
significativamente el tratamiento del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, se
contempla su combinación con la presente invención.
En relación con el tratamiento de tumores
sólidos, la presente invención se puede utilizar en combinación con
aproximaciones clásicas, tales como cirugía, radioterapia,
quimioterapia, y similares. La invención, por tanto, proporciona
terapias combinadas, en que las construcciones del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 se
utilizan simultáneamente con, antes, o después del tratamiento
quirúrgico o de radiación; o se administran a pacientes con, antes,
o después de agentes quimioterapéuticos, radioterapéuticos o
antiangiogénicos convencionales, o inmunotoxinas o coaguligandos
marcados.
Se prefiere particularmente el uso combinado de
la presente invención con radioterapia, agentes antiangiogénicos,
radioterapéuticos, agentes inductores de apoptosis y fármacos
antitubulina. Muchos ejemplos de tales agentes se han descrito
anteriormente junto con los inmunoconjugados de la presente
invención. Cualquiera de los agentes inicialmente descritos para su
uso como una parte del conjugado terapéutico también se pueden usar
separadamente, pero aún en combinación operable con la presente
invención.
Cuando uno o más agentes se utilizan en
combinación con la terapia del anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, no hay necesidad de que los
resultados combinados sean aditivos de los efectos observados cuando
cada tratamiento se lleva a cabo por separado. A pesar de que, como
mínimo, los efectos aditivos son, generalmente, deseables, cualquier
efecto antitumoral incrementado en una de las terapias simples
sería de provecho. Además, no hay una necesidad particular para que
el tratamiento combinado muestre efectos sinergísticos, a pesar de
que es ciertamente posible y ventajoso.
Para llevar a la práctica la terapia antitumoral
combinada, simplemente se administraría a un animal una construcción
del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o
basado en 2C3, en combinación con otro agente anticancerígeno de una
manera efectiva para dar lugar a sus acciones antitumorales
combinadas en el interior del animal. Por lo tanto, se
proporcionarían agentes en cantidades efectivas y durante períodos
de tiempo efectivos para dar lugar a su presencia combinada dentro
de la vasculatura tumoral y sus acciones combinadas en el medio
tumoral. Para conseguir este objetivo, los agentes anticancerígenos
y terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2 o basado en 2C3 se pueden administrar simultáneamente al
animal, en una composición simple, o como dos composiciones
diferentes que utilizan vías de administración diferentes.
Alternativamente, el tratamiento del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3
puede preceder, o seguir, al tratamiento con agente anticancerígeno
en, por ejemplo, intervalos que varían de minutos a semanas y meses.
Se aseguraría así, que el agente anticancerígeno y el agente del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado
en 2C3 ejercen un efecto ventajosamente combinado en el tumor.
La mayoría de agentes anticancerígenos se
administrarían previamente a la terapia antiangiogénica del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado
en 2C3. Sin embargo, allí donde se utilizan los inmunoconjugados del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado
en 2C3, se pueden administrar, posteriormente o simultáneamente,
varios agentes anticancerígenos.
El uso general de combinaciones de sustancias en
el tratamiento del cáncer es bien conocido. Por ejemplo, la Patente
U.S.A. No. 5.710.134 da a conocer componentes que inducen a la
necrosis en tumores en combinación con sustancias o
"profármacos" no tóxicos. Los enzimas liberados por los
procesos necróticos dividen el "profármaco" no tóxico en el
"fármaco" tóxico, que lleva a la muerte de la célula tumoral.
También, la Patente U.S.A. No. 5.747.469 da a conocer el uso
combinado de vectores virales que codifican p53 y agentes dañantes
de ADN. Cualquier aproximación similar se puede utilizar con la
presente invención.
En algunas situaciones, puede ser incluso
deseable extender el período de tiempo para el tratamiento de forma
significativa, con lapsos de varios días (2, 3, 4, 5, 6 ó 7), varias
semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o incluso varios meses (1, 2, 3,
4, 5, 6, 7 u 8) entre las respectivas administraciones. Esto sería
ventajoso en circunstancias en las que un tratamiento estuviera
dirigido sustancialmente a destruir el tumor, tales como cirugía o
quimioterapia, y otro tratamiento estuviera dirigido a prevenir la
micrometástasis o el recrecimiento del tumor, tal como la terapia
basada en antiangiogénicos. Los antiangiogénicos se deberían
administrar en un tiempo prudente tras la cirugía para permitir la
curación de heridas.
También se prevé que se utilizará más de una
administración del agente del anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3 o del agente anticancerígeno.
Los agentes se pueden administrar de forma intercambiable, en días o
semanas alternadas; o se puede administrar una secuencia del
tratamiento del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o basado en 2C3, seguido por una secuencia de terapia con
agente anticancerígeno. En cualquier caso, para conseguir la
regresión del tumor utilizando una terapia combinada, todo lo que se
necesita es liberar ambos agentes en una cantidad combinada efectiva
para que ejerzan un efecto antitumoral, sin tener en cuenta los
tiempos de administración.
En términos de cirugía, cualquier intervención
quirúrgica se puede practicar junto con la presente invención. En
relación a la radioterapia, se contempla cualquier mecanismo que
induce al daño local de ADN en el interior de las células tumorales,
tales como radiación-\gamma,
rayos-X, radiación-UV, microondas e
incluso emisiones electrónicas y similares. También se contempla la
liberación dirigida de radioisótopos a las células tumorales, y esto
se puede utilizar en relación a los anticuerpos marcadores u otros
medios de marcaje, y preferiblemente, anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales como el
2C3.
También se ha probado que la terapia con
citocinas es una compañera efectiva para los regímenes terapéuticos
combinados. Se pueden emplear varias citocinas en tales
aproximaciones combinadas. Los ejemplos de citocinas incluyen:
IL-1\alpha, IL-1\beta,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11, IL-12, IL-13,
TGF-\beta, GM-CSF,
M-CSF, G-CSF, TNF\alpha,
TNF\beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF,
IFN-\alpha, IFN-\beta,
IFN-\gamma. Las citocinas se administran según los
regímenes estándares, consecuentes con indicaciones clínicas, tales
como la condición del paciente y la toxicidad relativa de la
citocina. Las uteroglobinas también se pueden utilizar para prevenir
o inhibir la metástasis (Patente U.S.A. No. 5.696.092).
En ciertas realizaciones, los agentes
terapéuticos del anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o basado en 2C3 de la presente invención se pueden
administrar en combinación con un agente quimioterapéutico. En los
métodos de tratamiento combinado, dados a conocer en la presente, se
pueden utilizar una variedad de agentes quimioterapéuticos. Los
agentes quimioterapéuticos contemplados como ejemplos incluyen, por
ejemplo, adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina,
daunomicina, doxorubicina, tamoxifeno, taxol, taxotero, vincristina,
vinblastina, vinorelbina, etopósido (VP-16),
5-fluorouracilo (5FU), citosina arabinosida,
ciclofofamida, tiotepa, metotrexato, camptotecina,
actinomicina-D, mitomicina C, cisplatina (CDDP),
aminopterina, combretastatina(s), y derivados y profármacos
de éstos.
Tal como se entenderá por aquellos de habilidad
normal en la técnica, las dosis apropiadas de agentes
quimioterapéuticos estarán, generalmente, alrededor de aquellas
empleadas en las terapias clínicas, en las que los agentes
quimioterapéuticos se administran solos o en combinación con otros
agentes quimioterapéuticos. Sólo a modo de ejemplo, se pueden
utilizar agentes, tales como cisplatina, y otros alquilantes de ADN.
La cisplatina se ha utilizado ampliamente para tratar el cáncer, con
dosis eficaces utilizadas en aplicaciones clínicas, de 20 mg/m^{2}
durante 5 días cada 3 semanas para un total de tres cursos. La
cisplatina no se absorbe oralmente y se debe, por tanto, liberar a
través de una inyección intravenosa, subcutánea, intratumoral o
intraperitoneal.
Algunos agentes útiles adicionales incluyen
compuestos que interfieren en la replicación del ADN, la mitosis y
la segregación cromosómica. Tales compuestos quimioterapeúticos
incluyen adriamicina, también conocida como doxorubicina, etopósido,
verapamil, podofilotoxina, y similares. Ampliamente usados en
ajustes clínicos para el tratamiento de neoplasmas, estos compuestos
se administran a través de inyecciones intravenosas en bolo en dosis
que varían de 25 a 75 mg/m^{2} en intervalos de 21 días para
adriamicina, de 35 a 50 mg/m^{2} para etopósido intravenosamente u
oralmente con el doble de la dosis intravenosa.
También se pueden utilizar los agentes que
interrumpen la síntesis y fidelidad de los precursores de
polinucleótidos. Particularmente útiles son los agentes que se han
sometido a extensas pruebas y están fácilmente disponibles. De esta
manera, agentes como el 5-fluorouracilo
(5-FU) son preferencialmente útiles por el tejido
neoplástico, haciendo este agente particularmente útil para el
marcaje de células neoplásticas. A pesar de que el
5-FU es bastante tóxico, es aplicable en un amplio
conjunto de transportadores, incluyendo los tópicos, aunque la
administración intravenosa con dosis que varían de 3 a 15 mg/kg/día
es la normalmente utilizada.
Los agentes quimioterapéuticos de ejemplo para la
terapia combinada están listados en la Tabla C. Cada uno de los
agentes listados, es ejemplificante pero no limitante. El técnico
con capacidad se puede dirigir a "Remington's Pharmaceutical
Sciences" 15ª Edición, capítulo 33, en particular, las páginas
624-652. La variación de la dosis probablemente
tendrá lugar dependiendo de la condición a tratar. El doctor que
administra el tratamiento será capaz de determinar la dosis
apropiada para el sujeto individual.
Bajo condiciones fisiológicas normales, los
humanos o los animales experimentan angiogénesis sólo en situaciones
específicas limitadas. Por ejemplo, la angiogénesis se observa
normalmente en la curación de heridas, el desarrollo embrionario y
fetal y la formación del corpus luteum, el endometrio y la
placenta. La angiogénesis no controlada (persistente y/o no
regulada) está relacionada con varios estados de enfermedad, y tiene
lugar durante la metástasis tumoral.
Se piensa que tanto la angiogénesis controlada
como la no controlada proceden de una manera similar. Las células
endoteliales y los pericitos, rodeados por una membrana base, forman
los vasos sanguíneos capilares. La angiogénesis empieza con la
erosión de la membrana base por enzimas liberadas por células
endoteliales y leucocitos. Las células endoteliales, que recubren el
lumen de los vasos sanguíneos, a continuación, sobresalen a través
de la membrana base. Los estimulantes angiogénicos inducen a las
células endoteliales a migrar a través de la membrana base
erosionada. Las células migratorias forman un "brote" lejos del
vaso sanguíneo parental, en el que las células endoteliales
proliferan y experimentan mitosis. Los brotes endoteliales se unen
el uno con el otro para formar bucles capilares creando un nuevo
vaso sanguíneo.
La presente invención del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3, se
puede utilizar en combinación con cualquiera o más de las terapias
antiangiogénicas. Se incluyen combinaciones con otros agentes que
inhiben el VEGF, tales como otros anticuerpos neutralizantes (Kim y
otros, 1992; Presta y otros, 1997; Sioussat y otros, 1993; Kondo y
otros, 1993; Asano y otros, 1995), construcciones de receptores
solubles (Kendall y Thomas, 1993; Aiello y otros, 1995; Lin y otros,
1998; Millauer y otros, 1996), inhibidores de tirosina quinasa
(Siemeister y otros, 1998), estrategias antisentido, aptámeros de
ARN y ribozimas contra VEGF o receptores de VEGF (Saleh y otros,
1996; Cheng y otros, 1996; Ke y otros, 1998; Parry y otros, 1999).
También se pueden emplear variantes de VEGF con propiedades
antagonísticas, tal como se describe en la Patente WO 98/16551.
Las terapias antiangiogénicas se pueden basar en
la administración de un agente antiangiogénico o la inhibición de un
agente angiogénico. La inhibición de agentes angiogénicos se puede
conseguir mediante uno o más de los métodos descritos para inhibir
el VEGF, incluyendo anticuerpos neutralizantes, construcciones de
receptores solubles, inhibidores de pequeñas moléculas, antisentido,
aptámeros de ARN y ribozimas. Por ejemplo, se pueden emplear
anticuerpos para angiogenina, tal como se describe en la Patente
U.S.A. No. 5.520.914, incorporada específicamente en la presente por
referencia. En cuanto a que el FGF está relacionado con la
angiogénesis, también se pueden utilizar inhibidores de FGF. Algunos
ejemplos son los compuestos que tienen
N-acetilglucosamina alternando en la secuencia con
ácido urónico 2-O-sulfatado, como
sus unidades de repetición principales, incluyendo
glicosaminoglicanos, tal como sulfato de arcarán. Tales compuestos
están descritos en la Patente U.S.A. No. 6.028.061 y se pueden
utilizar en combinación con la presente.
Actualmente, se conocen numerosos inhibidores de
tirosina quinasa útiles para el tratamiento de la angiogénesis, como
se pone de manifiesto en varios estados de enfermedades. Éstos
incluyen, por ejemplo, las
4-aminopirrolo[2,3-d]pirimidinas
de la Patente U.S.A. No. 5.639.757, que también se pueden utilizar
en combinación con la presente invención. Algunos ejemplos
adicionales de moléculas orgánicas capaces de modular la señal de
transducción de tirosina quinasa a través del receptor VEGFR2, son
los compuestos de quinazolina y las composiciones de la Patente
U.S.A. No. 5.792.771, que describe combinaciones adicionales para su
uso con la presente invención en el tratamiento de enfermedades
angiogénicas.
También se ha mostrado que compuestos
químicamente diferentes inhiben la angiogénesis y se pueden utilizar
en combinación con la presente invención. Por ejemplo, se pueden
emplear en terapia combinada esteroides, tales como esteroides
4,9(11) angiostáticos y esteroides oxigenados en
C-21, tal como se describen en la Patente U.S.A. No.
5.972.922, incorporada específicamente en la presente por
referencia. Las Patentes U.S.A. Nos. 5.712.291 y 5.593.990 describen
la talidomida y compuestos relacionados, precursores, análogos,
metabolitos y productos de hidrólisis, que también se pueden
utilizar en combinación con la presente invención para inhibir la
angiogénesis. Los compuestos de las Patentes U.S.A. Nos. 5.712.291 y
5.593.990 se pueden administrar oralmente. Algunos ejemplos
adicionales de agentes antiangiogénicos que son útiles en relación a
la terapia combinada, están listados en la Tabla D. Cada uno de los
agentes listados en la misma es ejemplificante y, de ningún modo,
limitante.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Algunos componentes preferidos para su uso en la
inhibición de la angiogénesis son la angiostatina, endostatina,
vasculostatina, canstatina y maspina. Tales agentes están descritos
anteriormente junto con los inmunoconjugados de la presente
invención, pero se pueden utilizar en forma combinada, pero no
conjugada. Otros agentes preferidos, también descritos anteriormente
en forma de inmunoconjugado, son las angiopoyetinas,
particularmente, la angiopoyetina-2, que se
contempla para su uso combinado con la presente invención.
Ya se ha visto que ciertas terapias
antiangiogénicas causan regresiones tumorales, incluyendo el
polisacárido bacteriano CM101 y el anticuerpo LM609. El CM101 es un
polisacárido bacteriano que ha sido bien caracterizado en su
capacidad de inducir la inflamación vascular en tumores. El CM101 se
une y se entrecruza con receptores expresados en el endotelio
desdiferenciado que estimula la activación del sistema de
complemento. También inicia una respuesta inflamatoria, conducida
por citocinas, que selectivamente marca el tumor. Es un agente
únicamente antipatoangiogénico que regula a la baja la expresión del
VEGF y sus receptores. El CM101 está, actualmente, en pruebas
clínicas como fármaco anticancerígeno, y se puede utilizar en
combinación con la presente.
La trombospondina (TSP-1) y el
factor plaquetario 4 (PF4) también se pueden utilizar en combinación
con la presente invención. Ambos son inhibidores de la angiogénesis
que se asocian con heparina y se encuentran en los
\alpha-gránulos plaquetarios. La
TSP-1 es una glicoproteína grande de multidominio de
450 kDa y es un constituyente de la matriz extracelular. La
TSP-1 se une a muchas de las moléculas de
proteoglicanos encontradas en la matriz extracelular incluyendo,
HSPGs, fibronectina, laminina, y diferentes tipos de colágeno. La
TSP-1 inhibe la migración y la proliferación de las
células endoteliales in vitro y la angiogénesis in
vivo. La TSP-1 también puede suprimir el
fenotipo maligno y la tumorigénesis de las células endoteliales
transformadas. Se ha visto que el gen supresor de tumor p53 regula
directamente la expresión de la TSP-1, de manera que
la pérdida de actividad del p53 causa una reducción drástica en la
producción de la TSP-1 y un concomitante incremento
en la angiogénesis iniciada del tumor.
El PF4 es una proteína de 70 aminoácidos, miembro
de la familia CXC ELR de las quimiocinas, que es capaz de inhibir
potencialmente la proliferación de células endoteliales in
vitro y la angiogénesis in vivo. El PF4 administrado
intratumoralmente o liberado mediante un vector adenoviral es capaz
de causar la inhibición del crecimiento tumoral.
Los interferones y los inhibidores de
metaloproteinasa son dos clases de inhibidores angiogénicos
naturales que se pueden combinar con la presente invención. La
actividad antiendotelial de los interferones es conocida desde
principios de los años 80, aunque el mecanismo de inhibición aún no
está claro. Se sabe que pueden inhibir la migración de células
endoteliales y que tienen algo de actividad antiangiogénica in
vivo que posiblemente está mediada por una capacidad de inhibir
la producción de promotores angiogénicos mediante células tumorales.
Los tumores vasculares, en particular, son sensibles al interferón,
por ejemplo, proliferando hemangiomas que se pueden tratar
satisfactoriamente con IFN\alpha.
Los inhibidores tisulares de metaloproteinasas
(TIMPs) son una familia de inhibidores naturales de metaloproteasas
de matriz (MMPs) que también pueden inhibir la angiogénesis y se
pueden utilizar en protocolos de tratamiento combinado. Las MMPs
juegan un papel clave en el proceso angiogénico ya que degradan la
matriz a través de la que migran las células endoteliales y los
fibroblastos cuando se extiende o se remodela la red vascular. De
hecho, un miembro de las MMPs, MMP-2, se ha visto
que se asocia con endotelio activado a través de la integrina
\alpha_{v}\beta_{3}, presumiblemente, para este objetivo. Si
la interacción se interrumpe por un fragmento de
MMP-2, entonces la angiogénesis se regula a la baja
y se inhibe el crecimiento de tumores.
Existe un número de agentes farmacológicos que
inhiben la angiogénesis, alguno o más de uno de los cuales se pueden
utilizar en combinación con la presente invención. Éstos incluyen
AGM-1470/TNP-470, talidomida, y
carboxiamidotriazol (CAI). En 1990, se encontró que la fumagilina es
un potente inhibidor de la angiogénesis, y, desde entonces, se han
desarrollado los análogos sintéticos de la fumagilina,
AGM-1470 y TNP-470. Ambos fármacos
inhiben la proliferación de células endoteliales in vitro y
la angiogénesis in vivo. Se ha estudiado ampliamente el
TNP-470 en pruebas humanas clínicas con datos que
sugieren que una administración a largo plazo es óptima.
Originalmente, la talidomida se utilizaba como un
sedante pero se encontró que era un potente teratógeno y se
abandonó. En 1994, se encontró que la talidomida es un inhibidor de
la angiogénesis. Actualmente, la talidomida se usa en pruebas
clínicas como agente anticancerígeno así como para el tratamiento de
enfermedades vasculares del ojo.
El CAI es un inhibidor sintético de la
angiogénesis de peso molecular pequeño que actúa de bloqueador del
canal de calcio que previene la reorganización de la actina, la
migración de las células endoteliales y la propagación sobre
colágeno IV. El CAI inhibe la neovascularización en concentraciones
fisiológicas accesibles y, oralmente, es bien tolerado por los
pacientes de cáncer. Las pruebas clínicas con CAI han producido una
estabilización de la enfermedad en el 49% de los pacientes de cáncer
que tenían una enfermedad progresiva antes del tratamiento.
Se observó que la cortisona, en presencia de
heparina o fragmentos de heparina, inhibe el crecimiento tumoral en
ratones mediante el bloqueo de la proliferación de células
endoteliales. El mecanismo implicado en el efecto inhibidor aditivo
del esteroide y la heparina no está claro, a pesar de que se piensa
que la heparina puede incrementar la absorción del esteroide por las
células endoteliales. Se ha mostrado que la mezcla incrementa la
disolución de la membrana base por debajo de los capilares
nuevamente formados, y ésta es una posible explicación para el
efecto angiostático aditivo. Los conjugados
heparina-cortisol también tienen potentes efectos
angiostáticos y antitumorales in vivo.
Algunos inhibidores de angiogénesis específicos,
adicionales, incluyen, pero no se limitan a, Factor Antiinvasivo,
ácidos retinoicos y paclitaxel (Patente U.S.A. No. 5.716.981);
AGM-1470 (Ingber y otros, 1990); extracto de
cartílago de tiburón (Patente U.S.A. No. 5.618.925); poliamida
aniónica u oligómeros de poliurea (Patente U.S.A. No. 5.593.664);
derivados de oxindol (Patente U.S.A. No. 5.576.330); derivados de
estradiol (Patente U.S.A. No. 5.504.074); y los derivados de
tiazolopirimidina (Patente U.S.A. No. 5.599.813) también se
contemplan para su uso como composiciones antiangiogénicas para los
usos combinados de la presente invención.
Las composiciones que comprenden un antagonista
de una integrina \alpha_{V}\beta_{3} también se pueden
utilizar para inhibir la angiogénesis en combinación con la presente
invención. Como se da a conocer en la Patente U.S.A. No. 5.766.591,
los polipéptidos que contienen RGD y sales de la misma, incluyendo
polipéptidos cíclicos, son ejemplos adecuados de antagonistas de
integrina \alpha_{V}\beta_{3}.
El anticuerpo LM609 contra la integrina
\alpha_{V}\beta_{3} también induce a la regresión de
tumores. Los antagonistas de la integrina
\alpha_{V}\beta_{3}, tal como el LM609, inducen a la
apoptosis de las células endoteliales angiogénicas, dejando sin
afectar los vasos sanguíneos inactivos. El LM609 u otros
antagonistas de \alpha_{V}\beta_{3} también pueden trabajar
mediante la inhibición de la interacción de
\alpha_{V}\beta_{3} y MMP-2, una enzima
proteolítica que se piensa que juega un papel importante en la
migración de células endoteliales y fibroblastos. La Patente U.S.A.
No. 5.753.230 describe anticuerpos contra
\alpha_{V}\beta_{3} (vitronectina
\alpha_{V}\beta_{3}) para combinar con la presente invención
en la inhibición de angiogénesis.
En este caso, la apoptosis del endotelio
angiogénico puede tener un efecto cascada en el resto de la red
vascular. La inhibición de cualquier respuesta de la red vascular
del tumor a la señal del tumor para expanderse puede, de hecho,
iniciar el colapso, parcial o total, de la red dando lugar a la
muerte de la célula tumoral y la pérdida de volumen del tumor. Es
posible que la endostatina y la angiostatina actúen de una manera
similar. El hecho de que el LM609 no afecte a los vasos inactivos
pero sea capaz de causar regresiones tumorales, sugiere firmemente
que no todos los vasos sanguíneos en el tumor necesitan ser marcados
en el tratamiento para obtener un efecto antitumoral.
También se pueden utilizar otros métodos de
intervención terapéutica, basados en la alteración de la
señalización a través del receptor Tie2, en combinación con la
presente invención, tal como la utilización de un receptor soluble
Tie2 capaz de bloquear la activación de Tie2 (Lin y otros, 1998). Se
ha mostrado que la liberación de tal construcción utilizando terapia
génica adenoviral recombinante es efectiva en el tratamiento del
cáncer y en la reducción de la metástasis (Lin y otros, 1998).
Los agentes terapéuticos del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3,
también se pueden combinar ventajosamente con métodos para inducir
la apoptosis. Anteriormente, se han descrito varios agentes
inductores de apoptosis en relación con los inmunoconjugados de la
presente invención. Cualquier agente inductor de apoptosis de este
tipo se puede utilizar en combinación con la presente invención sin
estar unido a un anticuerpo de la presente invención.
A parte de los agentes inductores de apoptosis
descritos anteriormente como inmunoconjugados, se han identificado
algunos oncógenos que inhiben la apoptosis, o la muerte celular
programada. Algunos ejemplos de oncógenos en esta categoría
incluyen, pero no se limitan a, bcr-abl,
bcl-2 (diferente de bcl-1, ciclina
D1; Banco de Genes, números de acceso, M14745, X06487; Patente
U.S.A. No. 5.650.491; y 5.539.094) y miembros de la familia que
incluyen Bcl-xl, Mcl-1, Bak, A1,
A20. La sobreexpresión de bcl-2 se descubrió
primeramente en los linfomas de las células T. El
bcl-2 actúa como un oncógeno mediante la unión y la
inactivación de Bax, una proteína del mecanismo apoptópico. La
inhibición de la función del bcl-2 evita la
inactivación de Bax, y permite que el mecanismo apoptópico
continúe.
La inhibición de esta clase de oncógenos, por
ejemplo, utilizando una secuencia de nucleótidos antisentido, se
contempla para su uso en la presente invención para incrementar la
apoptosis (Patentes U.S.A. Nos. 5.650.491; 5.539.094, y
5.583.034).
Los métodos de tratamiento de la presente
invención se pueden utilizar en combinación con (otras)
inmunotoxinas y/o coaguligandos, en que la parte marcadora de los
mismos, por ejemplo, anticuerpo o ligando, está dirigida a un
marcador relativamente específico de la células tumorales, la
vasculatura tumoral o el estroma tumoral. Al igual que los agentes
quimioterapéuticos y antiangiogénicos, discutidos anteriormente, el
uso combinado de toxinas o coagulantes marcados, generalmente, dará
lugar a resultados antitumorales aditivos, marcadamente mayores que
aditivos o incluso sinergísticos.
Generalmente hablando, los anticuerpos o ligandos
para su uso en estos aspectos adicionales de la presente invención,
preferiblemente reconocerán los antígenos de tumores accesibles que
se expresan, preferencialmente, o específicamente, en el sitio del
tumor. Los anticuerpos o ligandos también mostrarán,
preferiblemente, propiedades de alta afinidad; y los anticuerpos,
ligandos o conjugados de éstos, no ejercerán efectos colaterales
significativos in vivo contra los tejidos normales
sostenedores de la vida, tales como uno o más tejidos seleccionados
del corazón, riñón, cerebro, hígado, médula ósea, colon, pecho,
próstata, tiroides, vesícula biliar, pulmón, glándulas adrenales,
músculo, fibras nerviosas, páncreas, piel, u otros órganos o tejidos
sostenedores de la vida en el cuerpo humano. El término "efectos
colaterales significativos", tal como se usa en la presente, se
refiere a un anticuerpo, ligando o conjugado de anticuerpo, que,
cuando se administre in vivo, producirá sólo efectos
colaterales negligibles o clínicamente manejables, tales como
aquellos encontrados normalmente durante la quimioterapia.
Como mínimo, una región de unión de estos
segundos agentes anticancerígenos, empleados en combinación con la
presente invención, será un componente capaz de liberar una toxina o
un factor de coagulación a la región tumoral, es decir, capaz de
localizarse dentro del sitio del tumor. Tales agentes marcadores se
pueden dirigir contra un componente de una célula tumoral,
vasculatura tumoral o estroma tumoral. Los agentes marcadores,
generalmente, se unirán a un componente localizado en la superficie,
accesible en la superficie o expresado en la superficie de una
célula tumoral, vasculatura tumoral o estroma tumoral. Sin embargo,
una vez se inicia la destrucción de la vasculatura tumoral o la
célula tumoral, se liberan los componentes internos, permitiendo el
marcaje adicional de, en principio, cualquier componente del
tumor.
Se han descrito muchos antígenos de células
tumorales, cualquiera de los cuales puede ser utilizado como diana
en relación con los aspectos combinados de la presente invención.
Los antígenos de células tumorales apropiados para el marcaje
adicional de coaguligandos e inmunotoxinas incluyen aquellos
reconocidos por los anticuerpos B3 (Patente U.S.A. No. 5.242.813);
ATCC HB 10573); KSI/4 (Patente U.S.A. No. 4.975.369); obtenido a
partir de una célula que comprende los vectores NRRL
B-18356 y/o NRRL B-18357); 260F9
(ATCC HB 8488); y D612 (Patente U.S.A. No. 5.183.756); (ATCC HB
9796). También se puede consultar el Catálogo ATCC de cualquier año
posterior para identificar otras líneas de células apropiadas que
producen los anticuerpos de las células antitumorales.
Para el marcaje de la vasculatura tumoral, el
anticuerpo o ligando marcador, frecuentemente, se unirá a un
marcador expresado por, adsorbido a, inducido en o, de cualquier
manera, localizado en los vasos sanguíneos intratumorales de un
tumor vascularizado. Las moléculas diana apropiadas expresadas
incluyen, por ejemplo, endoglina, E-selectina,
P-selectina, VCAM-1,
ICAM-1, PSMA (Liu y otros, 1997), un TIE, un ligando
reactivo con LAM-1, un receptor de VEGF/VPF, un
receptor de FGF, integrina \alpha_{V}\beta_{3}, pleiotropina
y endosialina. Las dianas adsorbidas adecuadas son aquellas, tales
como VEGF, FGF, TGF\beta, HGF, PF4, PDGF, TIMP, un ligando que se
une a un TIE e isoformas de fibronectina asociadas al tumor. Los
antígenos inducibles natural y artificialmente por citocinas y
coagulantes también se pueden marcar, tales como
ELAM-1, VCAM-1,
ICAM-1, un ligando reactivo con
LAM-1, endoglina, e incluso la Clase II de MHC
(inducible por citocina, por ejemplo, por IL-1,
TNF-\alpha, IFN-\gamma,
IL-4 y/o TNF-\beta); y
E-selectina, P-selectina, PDGF e
ICAM-1 (inducible por coagulante, por ejemplo, por
trombina, Factor IX/IXa, Factor X/Xa y/o plasmina).
Las siguientes patentes y solicitudes de patente
incluso complementan las presentes enseñanzas respecto a la
preparación y uso de inmunotoxinas dirigidas contra marcadores de la
vasculatura tumoral localizados, inducidos, adsorbidos o expresados:
Patente U.S.A. No. 6 093 399; Patentes U.S.A. Nos. 5.855.866;
5.965.132; 6.051.230; 6.004.555; 5.877.289; 6.004.554; 5.776.427;
5.863.538; 5.660.827 y 6.036.955.
Además, los métodos y composiciones marcadoras de
la vasculatura tumoral incluyen los aminofosfolípidos marcadores,
tales como fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, descubiertas
recientemente para ser marcadores específicos y accesibles de los
vasos sanguíneos tumorales. La sola administración de anticuerpos
anti-aminofosfolípidos es suficiente para inducir la
trombosis y la regresión del tumor. La presente invención, de este
modo, se puede combinar de forma efectiva con anticuerpos
anti-fosfatidilserina y/o
anti-fosfatidiletanolamina no conjugados; o se
pueden utilizar inmunoconjugados de tales anticuerpos.
Las Patentes PCT WO 00/02587 y U.S.A. No. 6 312
694 incluso complementan la presente enseñanza respecto a la
preparación y uso de anticuerpos de
anti-aminofosfolípidos e inmunotoxinas, y, además,
complementan las presentes enseñanzas respecto al uso de conjugados
de proteínas de unión del aminofosfolípido, tales como conjugados de
annexina, para su uso en la liberación de toxinas y coagulantes a
los vasos sanguíneos del tumor y para la inducción de trombosis y
regresión tumoral.
Las dianas adecuadas del estroma tumoral incluyen
componentes de la matriz extracelular del tumor o del estroma, o
componentes a los que éstos están unidos; incluyendo marcadores de
membrana base, colágeno tipo IV, laminina, sulfato de heparán,
proteoglicano, fibronectinas, plaquetas activadas, LIBS y tenascina.
Un marcador preferido para tales usos es RIBS.
Las siguientes patentes y solicitudes de patente
incluso complementan las presentes enseñanzas respecto a la
preparación y uso de los agentes de marcaje del estroma tumoral:
Solicitudes U.S.A. con Serie No. 08/482.369 (Patente U.S.A. No. 6
093 399); 08/485.482; 08/487.427 (Patente U.S.A. No. 6.004.555);
08/479.733 (Patente U.S.A. No. 5.877.289); 08/472.631; y 08/479.727
y 08/481.904 (Patente U.S.A. No. 6.036.955).
Los segundos agentes terapéuticos
anticancerígenos se pueden acoplar operativamente a cualquiera de
los agentes citotóxicos o, en cualquier caso, agentes anticelulares
descritos en la presente para su uso en las inmunotoxinas del
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado
en 2C3. Sin embargo, los agentes anticelulares adecuados también
incluyen radioisótopos. Se preferirán fracciones de toxinas, tales
como la cadena A de ricina y la cadena A desglicosilada (dgA).
El segundo agente marcado para su uso opcional
con la presente invención puede comprender un componente marcado que
es capaz de provocar la coagulación, es decir, un coaguligando.
Aquí, el anticuerpo o ligando marcador se puede unir, directa o
indirectamente, por ejemplo, a través de otro anticuerpo, a
cualquier factor que, directa o indirectamente, estimula la
coagulación, incluyendo cualquiera de aquellos descritos en la
presente para su uso en los coaguligandos del anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3. Los
factores de coagulación preferidos para tales usos son el Factor
Tisular (TF) y derivados de TF, tales como TF truncado (tTF), TF
dimérico y multimérico, y TF mutante deficiente en la capacidad de
activar el Factor VII.
Las dosis efectivas de inmunotoxinas y
coaguligandos para su uso combinado en el tratamiento del cáncer
estarán entre 0,1 mg/kg aproximadamente y 2 mg/kg aproximadamente, y
preferiblemente, entre 0,8 mg/kg aproximadamente y 1,2 mg/kg
aproximadamente, cuando se administra a través de la vía IV con una
frecuencia de 1 vez por semana. Necesariamente tendrán lugar algunas
variaciones en la dosificación dependiendo de la condición del
sujeto a tratar. El doctor responsable de la administración
determinará la dosis apropiada para el sujeto individual.
El anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 de la presente
invención, se pueden utilizar junto con profármacos, en los que el
anticuerpo basado en 2C3 o el anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2, se asocia operativamente con un componente
activador del profármaco, tal como una enzima activadora del
profármaco, que convierte el profármaco en la forma más activa
simplemente tras el contacto con el anticuerpo. Esta tecnología se
denomina, generalmente, "ADEPT", y se describe en, por ejemplo,
las Patentes WO 95/13095; WO 97/26918, WO 97/24143, y las Patentes
U.S.A. Nos. 4.975.278 y 5.658.568.
El término "profármaco", tal como se usa en
la presente, se refiere a un precursor o forma derivada de una
sustancia biológicamente o farmacéuticamente activa que ejerce
efectos citotóxicos, o en cualquier caso, anticelulares reducidos en
células diana, incluyendo las células endoteliales vasculares del
tumor, en comparación con el fármaco padre en el que se basa.
Preferiblemente, el profármaco o la forma precursora ejerce efectos
citotóxicos o anticelulares significativamente reducidos, o más
preferiblemente, negligibles en comparación con la forma padre o
"nativa". Los "profármacos" son capaces de ser activados o
convertidos para producir la forma padre más activa del fármaco.
La capacidad técnica para fabricar y usar
profármacos existe dentro de la habilidad de los técnicos
habituales. Willman y otros (1986) y Stella y otros (1985), cada uno
complementa, además, la descripción y la enseñanza respecto a cómo
fabricar y utilizar varios profármacos. Las construcciones de
profármacos de ejemplo que se pueden utilizar en el contexto de la
presente invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que
contienen fosfato (Patente U.S.A. No. 4.975.278), profármacos que
contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos
basados en péptidos (Patentes U.S.A. Nos. 5.660.829, 5.587.161;
5.405.990; WO 97/07118), profármacos modificados con
D-aminoácidos, profármacos glicosilados (Patentes
U.S.A. Nos. 5.561.119, 5.646.298; 4.904.768, 5.041.424), profármacos
que contienen \beta-lactama, profármacos que
contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida (Patente U.S.A.
No. 4.975.278), profármacos que contienen fenilacetamida
opcionalmente sustituida, e incluso 5-fluorocitosina
(Patente U.S.A. No. 4.975.278) y profármacos con
5-fluorouridina y similares.
El tipo de agente terapéutico o fármaco
citotóxico que se puede utilizar en forma de profármaco es, en
principio, ilimitado. Para tal forma de liberación, se preferirán
los agentes más citotóxicos, sobre, por ejemplo, la liberación de
coagulantes, los cuales son menos preferidos para su uso como
profármacos. Lo único que se necesita para formar el profármaco es
diseñar la construcción, de manera que el profármaco sea
sustancialmente inactivo y el fármaco "liberado" o activado
tenga actividad sustancial, o, como mínimo, suficiente para el
objetivo deseado.
También se conocen y se contemplan, para su uso
en la presente, varias mejoras de los profármacos originales, como
se da a conocer en las Patentes WO 95/03830; EP 751.144
(antraciclinas); WO 97/07097 (ciclopropilindoles); y WO 96/20169.
Por ejemplo, los profármacos con Km reducido se describen en la
Patente U.S.A. No. 5.621.002, los cuales se pueden utilizar en el
contexto de la presente invención. También se conoce la terapia con
profármacos que se pueden dirigir intracelularmente, como se
ejemplifica en la patente WO 96/03151, y se puede llevar a la
práctica en la presente.
Para utilizar en ADEPT, el agente que activa o
convierte el profármaco en el fármaco más activo está acoplado
operativamente al anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2 o al anticuerpo similar al 2C3. De este modo, el
anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o el
anticuerpo similar al 2C3 localiza el profármaco convirtiendo la
capacidad dentro del sitio angiogénico, preferiblemente, dentro del
estroma y la vasculatura tumoral, de manera que el fármaco activo
sólo se produce en tales regiones y no en la circulación o en
tejidos sanos.
Las enzimas que se pueden acoplar al anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o a los anticuerpos
basados en 2C3 para actuar en la activación del profármaco,
incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina para su uso en
combinación con profármacos que contienen fosfato (Patente U.S.A.
No. 4.975.278); arilsulfatasa para su uso en combinación con
profármacos que contienen sulfato (Patente U.S.A. No. 5.270.196),
peptidasas y proteasas, tales como proteasa serratia, termolisina,
subtilisina, carboxipeptidasa (Patentes U.S.A. Nos. 5.660.829;
5.587.161; 5.405.990) y catepsinas (incluyendo la catepsina B y L),
para su uso en combinación con los profármacos basados en péptidos;
D-alanilcarboxipeptidasas para su uso en combinación
con profármacos modificados con D-aminoácidos;
enzimas divisoras de carbohidratos, tales como
\beta-galactosidasa y neuraminidasa para su uso en
combinación con profármacos glicosilados (Patentes U.S.A. Nos.
5.561.119; 5.646.298); \beta-lactamasa para su uso
en combinación con profármacos que contienen
\beta-lactama; penicilina amidasas, tales como la
penicilina V amidasa (Patente U.S.A. No. 4.975.278) o la penicilina
G amidasa, para su uso en combinación con fármacos derivatizados en
sus nitrógenos amino con grupos fenoxiacetamida o fenilacetamida; y
citosina desaminasa (Patentes U.S.A. Nos. 5.338.678; 5.545.548) para
su uso en combinación con profármacos basados en la
5-fluorocitosina (Patente U.S.A. No. 4.975.278).
Los anticuerpos con actividad enzimática,
conocidos como anticuerpos catalíticos o "abzimas", también se
pueden emplear para convertir los profármacos en fármacos activos.
De este modo, los abzimas basados en el anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o en los anticuerpos
similares al 2C3 forman otro aspecto de la presente invención. La
capacidad técnica para fabricar abzimas también existe dentro de una
de las habilidades habituales en la técnica, como se ejemplifica por
Massey y otros (1987), incorporada específicamente en la presente
por referencia con el objetivo de complementar las enseñanzas sobre
abzimas. Además se contemplan, los anticuerpos catalíticos capaces
de catalizar la ruptura de un profármaco en la posición carbamato,
tal como un aril carbamato de mostaza de nitrógeno, como se describe
en la Patente EP 745.673, incorporada específicamente en la presente
por referencia.
La presente invención, además, proporciona
métodos de diagnóstico e imagen in vitro e in vivo.
Tales métodos son aplicables para su uso en la generación de
información de diagnóstico, pronóstico o de imagen para cualquier
enfermedad angiogénica, como se ejemplifica por la artritis,
psoriasis y tumores sólidos, pero incluyendo todas las enfermedades
angiogénicas dadas a conocer en la presente. Fuera del sector de la
imagen y del diagnóstico del tumor, estos aspectos de la invención
son más preferidos para su uso en pruebas de diagnóstico in
vitro, preferiblemente allí donde las muestras se pueden obtener
de forma no invasiva y se pueden probar en ensayos con muchas
muestras y/o allí donde el diagnóstico clínico es ambiguo y se desea
una confirmación.
En algunas realizaciones adicionales, la presente
invención se refiere a métodos de inmunodetección para unir,
purificar, eliminar, cuantificar o, en cualquier caso, generalmente,
detectar el VEGF y para diagnosticar enfermedades angiogénicas. Los
anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2 de la
presente invención, tal como el 2C3, se pueden emplear para detectar
el VEGF in vivo (ver más adelante), en muestras aisladas de
tejidos, biopsias o hisopos y/o en muestras de tejido homogeneizado.
Tales métodos de inmunodetección tienen una evidente utilidad
diagnóstica, pero también tienen aplicaciones para muestras no
clínicas, tales como en la titulación de muestras de antígenos, y
similares.
Se han descrito en la literatura científica, tal
como, por ejemplo, en Nakamura y otros (1987), las etapas de varios
métodos útiles de inmunodetección. En general, los métodos de
inmunoenlace incluyen obtener una muestra sospechosa de contener
VEGF y hacer contactar la muestra con anticuerpos
anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tal como el 2C3,
bajo condiciones efectivas para permitir la formación de
inmunocomplejos. En tales métodos, el anticuerpo se puede unir a un
soporte sólido, tal como en forma de matriz columnar, y aplicar la
muestra sospechosa de contener VEGF al anticuerpo inmovilizado.
Más preferiblemente, los métodos de inmunoenlace
incluyen métodos para detectar o cuantificar la cantidad de VEGF en
una muestra, y estos métodos requieren la detección o cuantificación
de cualquier complejo inmune formado durante el proceso de enlace.
Aquí, se obtendría una muestra sospechosa de contener VEGF y se
haría contactar la muestra con un anticuerpo según lo expuesto en la
presente y, a continuación, se detectaría o cuantificaría la
cantidad de complejos inmunes formados bajo condiciones
específicas.
Las muestras biológicas analizadas pueden ser
cualquier muestra sospechosa de contener VEGF, generalmente, de un
animal o paciente sospechoso de tener una enfermedad angiogénica.
Las muestras pueden ser una sección o ejemplar de tejido, una
biopsia, un hisopo o una muestra de prueba de frotis, un extracto de
tejido homogeneizado o formas separadas o purificadas de los
mismos.
Poner en contacto la muestra biológica elegida
con el anticuerpo bajo condiciones efectivas y durante un período de
tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunes
(complejos inmunes primarios) es, generalmente, una cuestión de
añadir simplemente una composición de anticuerpo a la muestra e
incubar la mezcla durante un período de tiempo suficientemente largo
para que los anticuerpos formen los complejos inmunes con, es decir,
se unan a, cualquier VEGF presente. Después de este tiempo, la
composición muestra-anticuerpo, tal como una sección
de tejido, una placa de ELISA, transferencias de puntos o tipo
Western, generalmente, se lavará para eliminar cualquier especie de
anticuerpo enlazado no específicamente, permitiendo sólo ser
detectados aquellos anticuerpos específicamente enlazados dentro de
los complejos inmunes primarios.
La detección de la formación de inmunocomplejos
es bien conocida en la técnica y se puede conseguir a través de la
aplicación de numerosas aproximaciones. Estos métodos, generalmente,
se basan en la detección de una etiqueta o un marcador, tal como
cualquier etiqueta o marca radioactiva, fluorescente, biológica o
enzimática conocida en la técnica. Las Patentes U.S.A. relacionadas
con el uso de tales marcas incluyen 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350;
3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. Se prefiere,
generalmente, el uso de enzimas que generan un producto coloreado
tras el contacto con un sustrato cromogénico. También se puede
utilizar, como se conoce en la técnica, un ligando de unión
secundario, tal como sistema de unión de un segundo anticuerpo o un
ligando biotina/avidina.
Los anticuerpos anti-VEGF,
bloqueadores de VEGFR2, tal como el 2C3, empleados en la detección,
se pueden unir ellos mismos a una marca detectable, en la que, a
continuación, simplemente se detectaría esta marca, permitiendo así
la determinación de la cantidad de complejos inmunes primarios en la
composición.
Preferiblemente, los complejos inmunes primarios
se detectan por medio de un segundo ligando de unión que tiene una
afinidad de unión por los anticuerpos de la presente invención. En
tales casos, el segundo ligando de unión se puede unir a una segunda
marca detectable. El segundo ligando de unión es, en sí,
frecuentemente, un anticuerpo, y, de este modo, se puede denominar
un anticuerpo "secundario". Los complejos inmunes primarios se
ponen en contacto con el ligando de unión secundario marcado, o
anticuerpo, bajo condiciones efectivas y durante un período de
tiempo suficiente que permita la formación de complejos inmunes
secundarios. Los complejos inmunes secundarios, generalmente, se
lavan para eliminar cualquier anticuerpo o ligando secundario
marcado enlazado no específicamente, y, a continuación, se detecta
la marca restante en los complejos inmunes secundarios.
Algunos métodos adicionales incluyen la detección
de complejos inmunes primarios mediante una aproximación de dos
etapas. Un segundo ligando de unión, tal como un anticuerpo, que
tiene una afinidad de unión por el primer anticuerpo, se utiliza
para formar complejos inmunes secundarios, tal como se ha descrito
anteriormente. Después de lavar, los complejos inmunes secundarios
se ponen en contacto con un tercer ligando de unión o anticuerpo que
tiene una afinidad de unión por el segundo anticuerpo, otra vez bajo
condiciones efectivas y durante un período de tiempo suficiente que
permita la formación de complejos inmunes (complejos inmunes
terciarios). El tercer ligando o anticuerpo se une a una marca
detectable, permitiendo la detección de los complejos inmunes
terciarios así formados. Si se desea, este sistema puede
proporcionar una amplificación de señal.
En el diagnóstico o monitorización clínica de
pacientes con enfermedad angiogénica, la detección del VEGF, o un
incremento en los niveles de VEGF, en comparación con los niveles en
una muestra biológica correspondiente, de un sujeto normal, es
indicativo de un paciente con una enfermedad angiogénica.
Sin embargo, tal como se conoce por los
entendidos en la técnica, tales diagnósticos clínicos no se harían
probablemente en base a este método de aislamiento. Los entendidos
en la técnica están muy familiarizados con la diferenciación entre
la expresión significativa de un biomarcador, el cual representa una
identificación positiva, y un nivel bajo o expresión de fondo de un
biomarcador. De hecho, los niveles de expresión de fondo se
utilizan, frecuentemente, para formar un "corte" por encima del
cual un incremento en la coloración y se valorará como significativo
o positivo.
Se prefieren estos aspectos de la invención para
su uso en los métodos de formación de imágenes del tumor y los
métodos de formación de imágenes y tratamiento de tumores
combinados. Los anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores
de VEGFR2 o los anticuerpos basados en 2C3 que se unen a uno o más
agentes detectables, se prevén para su uso en la formación de
imágenes per se, o para la formación de
pre-imágenes del tumor para formar una imagen fiable
previa al tratamiento. Tales métodos y composiciones también se
pueden aplicar al diagnóstico y formación de imágenes de cualquier
otra enfermedad o condición angiogénica, particularmente tumores no
malignos, aterosclerosis y condiciones en las que se desea una
imagen interna para objetivos de diagnóstico o pronóstico o para
diseñar un tratamiento.
Los anticuerpos para la formación de imágenes
basados en 2C3 o en el anticuerpo anti-VEGF,
bloqueador de VEGFR2, generalmente, comprenderán un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2 o basado en 2C3
operativamente acoplado, o conjugado a, una marca detectable. Las
"marcas detectables" son compuestos o elementos que se pueden
detectar debido a sus propiedades funcionales específicas, o
características químicas, el uso de los cuales permite detectar, y
si se desea, cuantificar, el componente al que están acoplados. En
conjugados de anticuerpo para protocolos de diagnóstico in
vivo o "métodos de formación de imágenes", se requieren
marcas que se pueden detectar utilizando métodos no invasivos.
En la técnica se conocen muchos agentes de
formación de imágenes apropiados, así como también los métodos para
su acoplamiento a anticuerpos o ligandos de unión (ver, por ejemplo,
Patentes U.S.A. Nos. 5.021.236 y 4.472.509). Ciertos métodos de
acoplamiento implican el uso de un complejo quelato metálico que
emplea, por ejemplo, un agente quelante orgánico, tal como DTPA
acoplado al anticuerpo (Patente U.S.A. No. 4.472.509). Los
anticuerpos monoclonales también se pueden hacer reaccionar con una
enzima en presencia de un agente de acoplamiento, tal como
glutaraldehído o peryodato. Los conjugados con marcadores de
fluoresceína se preparan en presencia de estos agentes de
acoplamiento o mediante la reacción con un isotiocianato.
Un ejemplo de marcas detectables son los iones
paramagnéticos. En este caso, los iones adecuados incluyen cromo
(III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II),
níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio
(III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III),
holmio (III) y erbio (III), siendo el gadolinio particularmente
preferido.
Los iones útiles en otros contextos, tales como
la formación de imágenes por rayos-X, incluyen,
pero no se limitan a, lantano (III), oro (III), plomo (II), y
especialmente, bismuto (III). Las marcas fluorescentes incluyen
rodamina, fluoresceína y renografina. La rodamina y la fluoresceína
frecuentemente se unen a través de un intermedio de
isotiocianato.
En el caso de isótopos radioactivos para
aplicaciones de diagnóstico, los ejemplos adecuados incluyen
^{14}carbono, ^{51}cromo, ^{36}cloro, ^{57}cobalto,
^{58}cobalto, cobre^{67}, ^{152}Eu, galio^{67},
^{3}hidrógeno, yodo^{123}, yodo^{125}, yodo^{131},
indio^{111}, ^{59}hierro, ^{32}fósforo, renio^{186},
renio^{188}, ^{75}selenio, ^{35}azufre, tecnecio^{99m} e
itrio^{90}. El ^{125}I se prefiere frecuentemente para su uso en
ciertas realizaciones, y el tecnecio^{99m} y el indio^{111} se
prefieren frecuentemente debido a su baja energía e idoneidad para
la detección en un amplio intervalo.
Los anticuerpos basados en 2C3 o el anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, marcados
radiactivamente para su uso en la presente invención, se pueden
producir según métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo,
los grupos funcionales intermediarios que se usan frecuentemente
para unir iones metálicos radioisotópicos a anticuerpos son el ácido
dietilentriaminopentaacético (DTPA) y el ácido
etilendiaminotetracético (EDTA).
Los anticuerpos monoclonales también se pueden
yodar mediante el contacto con yoduro sódico o potásico y un agente
oxidante químico, tal como hipoclorito sódico, o un agente oxidante
enzimático, tal como lactoperoxidasa. Los anticuerpos, de acuerdo
con la presente invención, se pueden marcar con tecnecio^{99m}
mediante un proceso de intercambio de ligando, por ejemplo, mediante
la reducción de pertecnato con una solución de estaño, quelando el
tecnecio reducido sobre una columna Sephadex y aplicando el
anticuerpo a esta columna; o mediante técnicas de marcaje directo,
por ejemplo, mediante la incubación de pertecnato, un agente
reductor, tal como SnCl_{2}, una solución tampón, tal como una
solución de ftalato de sodio-potasio, y el
anticuerpo.
Cualquiera de los tipos anteriores de anticuerpos
basados en 2C3 o de anticuerpo anti-VEGF, bloqueador
de VEGFR2, marcados para su detección, se pueden utilizar en la
formación de imágenes o en aspectos de formación de imágenes y
tratamiento combinados de la presente invención. Son igualmente
adecuados para su uso en diagnósticos in vitro. Las dosis
para las realizaciones con formación de imágenes in vivo son,
generalmente, menores que para terapia, pero también dependen de la
edad y el peso del paciente. Una sola dosis debería ser
suficiente.
Los métodos de formación de imágenes o
diagnóstico in vivo, generalmente, comprenden la
administración a un paciente de una cantidad diagnósticamente
efectiva de un anticuerpo anti-VEGF, bloqueador de
VEGFR2 o un anticuerpo basado en 2C3 que se conjuga con un marcador
que es detectable por métodos no invasivos. El conjugado
anticuerpo-marcador se deja suficiente tiempo para
localizar y unirse al VEGF en el interior del tumor. A continuación,
el tumor se expone a un instrumento de detección para identificar el
marcador detectable, formando, de este modo, la imagen del
tumor.
En aún realizaciones adicionales, la presente
invención proporciona kits de diagnóstico, que incluyen tanto kits
de formación de imágenes como de inmunodetección, para su uso con
métodos de formación de imágenes e inmunodetección descritos
anteriormente. Por consiguiente, se proporcionan en el kit,
generalmente, comprendidos dentro de un recipiente adecuado, los
anticuerpos anti-VEGF, bloqueadores de VEGFR2, tales
como el 2C3.
Para la inmunodetección, los anticuerpos se
pueden enlazar a un soporte sólido, tal como un pocillo de una placa
de microtitulación, aunque se prefieren las soluciones o polvos para
la reconstitución de anticuerpos. Los kits de inmunodetección,
preferiblemente, comprenden, como mínimo, un primer reactivo de
inmunodetección. Los reactivos de inmunodetección del kit pueden
adoptar cualquiera de una variedad de formas, incluyendo aquellas
marcas detectables que se asocian con, o se unen al, anticuerpo
dado. También se contemplan las marcas detectables que se asocian
con, o se acoplan a, un ligando de unión secundario. Algunos
ejemplos de ligandos secundarios son aquellos anticuerpos
secundarios que tienen afinidad de unión por el primer
anticuerpo.
Algunos reactivos de inmunodetección adicionales,
adecuados para su uso en los presentes kits incluyen el reactivo de
dos componentes que comprende un anticuerpo secundario, que tiene
afinidad de unión por el primer anticuerpo, junto con un tercer
anticuerpo, que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo,
estando el tercer anticuerpo unido a una marca detectable. Como se
ha informado anteriormente, en la técnica se conocen algunas marcas
de ejemplo y todas estas marcas se pueden emplear en relación con la
presente invención. Estos kits pueden contener conjugados
marca-anticuerpo, en una forma conjugada completa,
en forma de intermedios, o como fracciones separadas para ser
conjugadas por el usuario del kit.
Los kits de formación de imágenes,
preferiblemente, comprenderán un anticuerpo
anti-VEGF, bloqueador de VEGFR2, tal como el 2C3, el
cual ya está acoplado a una marca detectable in vivo. Sin
embargo, la marca y los medios de acoplamiento se podrían
suministrar de forma separada.
Cada kit puede, además, comprender agentes de
control, tales como composiciones adecuadamente alicuotadas de VEGF,
marcadas o no marcadas, que se pueden utilizar para preparar una
curva estándar para un ensayo de detección. Los componentes de los
kits se pueden compactar en un medio acuoso o en forma
liofilizada.
Las formas de envase de los kits, generalmente,
incluirán, como mínimo, un vial, un tubo de ensayo, un matraz, una
botella, una jeringuilla u otras formas de envase, en los que se
puede colocar el anticuerpo o el antígeno, y, preferiblemente,
alícuotas de forma adecuada. Allí donde se proporciona un segundo o
tercer ligando de unión o un componente adicional, el kit,
generalmente, también contendrá un segundo, tercer u otro recipiente
adicional dentro del cual se puede colocar este ligando o
componente. Los kits también pueden incluir otros reactivos de
diagnóstico de alguna o algunas enfermedades angiogénicas.
Preferiblemente, se usará un segundo reactivo de diagnóstico que no
se base en la unión de VEGF.
Los kits de la presente invención normalmente
también incluirán medios para contener el anticuerpo, y cualquier
otro recipiente para los reactivos, en clara dirección para la venta
comercial. Tales recipientes pueden incluir inyecciones o
recipientes de plástico moldeados por soplado, dentro de los cuales
se guardan los viales deseados.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar las realizaciones preferidas de la presente invención.
Sería de comprender, por parte de los entendidos en la técnica, que
las técnicas dadas a conocer en los siguientes ejemplos, representan
técnicas descubiertas por el inventor para que funcionen
correctamente en la práctica de la presente invención, y, de este
modo, se puede considerar que constituyen los modos preferidos para
su práctica. Sin embargo, aquellos entendidos en la técnica, a la
luz de la presente descripción, deberían comprender que se pueden
realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se dan
a conocer y todavía obtener resultados parecidos o similares sin
huir del espíritu y el ámbito de la invención.
Se sintetizaron los péptidos correspondientes a
los 26 aminoácidos del extremo N-terminal del VEGF
humano (huVEGF; SEQ ID NO:10) y a los 25 aminoácidos del extremo
N-terminal del VEGF de cobaya (spVEGF; SEQ ID No:11)
por el Biopolimers Facility del Howard Hughes Medical Institute en
el UT Southwestern Medical Center de Dallas. Los péptidos tenían las
siguientes secuencias (N a C):
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYC; SEQ ID
NO:10;
y
APMAEGEQKPREVVKFMDVYKRSYC; SEQ ID
NO:11
Los péptidos se conjugaron a través de la
cisteína del extremo C-terminal a tiroglobulina
utilizando el enlazador succinimidil
4-(N-maleimidometil)
ciclohexano-1-carboxilato (SMCC)
(Pierce, Rockford, IL). Los conjugados de control también se
prepararon y consistían en L-cisteína unida a
tiroglobulina. Los conjugados se separaron del péptido libre o el
enlazador mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
El VEGF humano recombinante también se utilizó
separadamente como un inmunógeno (obtenido por Dr. S. Ramakrishnan,
University of Minnesota, Minneapolis, MN).
Para la producción de anticuerpos
anti-gpVEGF que producen hibridomas, se inmunizaron
ratones C57/B1-6 con el conjugado
gpVEGF-péptido-tiroglobulina en
adyuvante TiterMax (CytRX Co., Norcross, Ga). Para la producción de
anticuerpos VEGF anti-humanos, se inmunizaron
ratones BALB/c tanto con el conjugado
huVEGF-péptido-tiroglobulina o VEGF
humano recombinante en TiterMax. Tres días después del último
estímulo, se fusionaron esplenocitos con células de mieloma
P3X63AG8.653 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) y se
cultivaron, tal como se describe por Morrow y otros (1990).
Se purificaron los anticuerpos IgG (2C3, 12D7,
3E7) del sobrenadante del cultivo de tejido mediante la
precipitación de sulfato amónico y cromatografía de Proteína A
utilizando el sistema de tamponación Elución/Unión Inmunopura Pierce
(Pierce).
Se purificaron los anticuerpos IgM (GV39M, 11B5,
7G3) del sobrenadante del tejido de cultivo mediante la
precipitación de una solución saturada al 50% de sulfato amónico, la
resuspensión de los pelets en PBS (pH 7,4) y la diálisis frente a
dH_{2}O para precipitar la euglobulina. El precipitado de
dH_{2}O se resuspendió en PBS y se fraccionó por cromatografía de
exclusión por tamaño en una columna de Sepharosa S300 (Pharmacia).
La fracción IgM fue del 85-90% de pureza, tal como
se evalúa por SDS-PAGE.
Se han utilizado varios anticuerpos de control en
todos estos estudios que incluyen mAb 4.6.1 (VEGF
anti-humano de ratón del Genentech, Inc.),
Ab-3 (VEGF anti-humano de ratón del
Oncogene Science, Inc.), A-20 (VEGF
anti-humano de conejo del Santa Cruz Biotechnology,
Inc., Santa Cruz, CA), OX7 (Thy 1.1 anti-rata de
ratón del Dr. A. F. Williams, MRC Cellular Immunology Unit, Oxford,
UK), MTSA (una IgM de mieloma de ratón de especificidad irrelevante
del Dr. E. S. Vitetta, UT-Southwestern, Dallas, TX),
1A8 (8Flk-1 anti-ratón de ratón;
Philip E. Thorpe y colegas), MECA 32 (endotelio
anti-ratón de rata del Dr. E. Butcher, Stanford
University, Stanford, CA), y TEC 11 (endoglina
anti-humana de ratón; Patente U.S.A. No.
5.660.827).
Para el screening inicial, se recubrieron placas
ELISA de 96 pocillos (Falcon, Franklin Lakes, NJ) con 250 ng del
péptido VEGF o el conjugado
VEGF-Cys-tiroglobulina y se
bloquearon con hidrolisato ácido de caseína al 5% (Sigma, St. Louis,
MO). Los sobrenadantes de los hibridomas anti-gpVEGF
y los hibridomas VEGF anti-humanos iniciales se
verificaron en las placas recubiertas de antígeno a través de una
técnica ELISA indirecta dual (Crowther, 1995).
Los hibridomas que mostraron reactividad
preferencial con el péptido VEGF-tiroglobulina pero
ninguna, o una reactividad muy débil, con
Cys-tiroglobulina se verificaron adicionalmente con
inmunohistoquímica (descrito a continuación) en secciona congeladas
de tejido tumoral.
Las células tumorales de carcinoma hepatocelular
de la línea 10 de cobaya (obtenidas del Dr. Ronald Neuman, NIH,
Bethesda, MD) se hicieron crecer en cobayas de la cepa dos (NCI,
Bethesda, MD). Los tumores humanos carcinoma de pulmón de células no
pequeñas (NSCLC) NCI-H358, NSCLC
NCI-H460 (ambos obtenidos del Dr. Adi Gazdar, UT
Southwestern, Dallas, TX), adenocarcinoma de colon HT29 (American
Type Culture Collection), y el linfoma de Hodgkin L540CY (obtenido
del Profesor V. Diehl, Colonia, Alemania) se hicieron crecer como
xenoinjertos en ratones CB17 SCID (Charles river, Wilmington,
MA).
Los tumores fueron congelados instantáneamente en
nitrógeno líquido y almacenados a -70ºC. Se obtuvieron muestras
congeladas de ejemplares tumorales de pacientes de la National
Cancer Institute Cooperative Human Tissue Network (Southern
Division, Birmingham, AL). Se realizó la inmunohistoquímica, tal
como está descrita por Burrows y otros (1995).
Los sobrenadantes de hibridoma de animales
inmunizados con VEGF se verificaron a través de una técnica ELISA
indirecta diferencial empleando tres antígenos diferentes: VEGF
humano solo, complejo VEGF:Flk-1/SEAP, y
Flk-1/SEAP solo. Para el VEGF humano solo, se
recubrieron ciertas placas ELISA con 100 ng de VEGF.
Para el Flk-1/SEAP solo, se
recubrieron otras placas ELISA con 500 ng de
Flk-1/SEAP, una forma soluble del receptor de VEGF
de ratón (se obtuvieron células que segregan
Flk-1/SEAP del Dr. Ihor Lemischka, Princeton
University, Princeton, NJ). La proteína Flk-1/SEAP
se produjo y se purificó tal como se describe por Tessler y otros
(1994). Básicamente, el dominio extracelular de
Flk-1 (sFlk-1) se produjo en células
de Spodoptera frugiperda (Sf9) y se purificó mediante
técnicas de inmunoafinidad utilizando un anticuerpo monoclonal
anti-Flk-1 (1A8). A continuación, el
sFlk-1 se biotiniló y se enlazó en placas
recubiertas de avidina.
Para preparar placas recubiertas con el complejo
VEGF:Flk-1/SEAP, se biotiniló la
Flk-1 purificada y se hizo reaccionar con VEGF
durante toda la noche a 4ºC en un tampón de unión (HEPES 10 mM, NaCl
150 mM, albúmina de suero bovino 20 \mug/ml y heparina 0,1
\mug/ml) en una proporción molar de sFlk-1 a VEGF
de 2,5:1 para ayudar en la formación del dímero. A continuación, el
complejo VEGF:sFlk-1 se incubó en pocillos
recubiertos de avidina de una placa de microtitulación de 96
pocillos para producir placas recubiertas con VEGF asociado con su
receptor.
A continuación, se determinó la reactividad de
los anticuerpos con VEGF solo, sFlk-1 biotinilado y
el complejo VEGF:sFlk-1 en estudios controlados
utilizando los tres antígenos en placas recubiertas de avidina. La
reactividad se determinó tal como se describió anteriormente para el
screening inicial.
También se desarrolló un ELISA de captura. En el
ELISA de captura, se recubrieron placas de microtitulación con 100
ng del anticuerpo indicado durante toda la noche a 4ºC. Se lavaron y
se bloquearon los pocillos como se indicó anteriormente, y a
continuación, se incubaron con varias concentraciones de VEGF
biotinilado o VEGF:sFlk-1-biotina.
La estreptavidina conjugada a peroxidasa (Kirkegaard & Perry
Laboratories, Inc.) diluida 1:2000, se utilizó como una segunda capa
y se desarrolló.
Los estudios ELISA de competición se realizaron
mediante un primer marcaje de los anticuerpos con peroxidasa, según
las instrucciones del fabricante (EZ-Link Activated
Peroxidase, Pierce). El antígeno utilizado para los estudios de
competición con 12D7, 3E7, 2C3 y 7G3 fue
VEGF-biotina capturado por avidina en una placa
ELISA. Se incubaron, aproximadamente, 0,5-2,0
\mug/ml de anticuerpo de prueba marcado con peroxidasa en la placa
en presencia de una disolución tampón sola, una IgG irrelevante, o
los otros anticuerpos de competición anti-VEGF en un
exceso de 10-100 veces.
Se calculó la unión del anticuerpo marcado
mediante la adición del sustrato
3,3'5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (Kirkegaard and
Perry Laboratories, Inc). Después de 15 minutos, se pararon las
reacciones con H_{3}PO_{4} 1M y se leyeron
espectrofotométricamente a 450 nm. El ensayo se realizó por
triplicado, como mínimo, dos veces para cada combinación de
anticuerpo competidor y marcado. Dos anticuerpos se consideró que
estaban en el mismo grupo epítopo si se bloqueaban el uno al otro,
de forma cruzada, la unión en más de un 80%.
El GV39M y el 11B5 no mantenían la actividad de
unión después del marcaje con peroxidasa pero toleraban la
biotinilación. Se biotinilaron el GV39M y el 11B5 y se analizaron
frente a VEGF:sFlk-1 que había sido capturado por el
anticuerpo anti-Flk-1 (1A8) o
recubierto directamente en una placa ELISA.
Se separó el VEGF recombinante purificado en
presencia de suero de ternera fetal al 5% mediante
SDS-PAGE al 12%, bajo condiciones reductoras y no
reductoras, y se transfirió a nitrocelulosa. La membrana de
nitrocelulosa se bloqueó utilizando Sea-Block
PP82-41 (East Coast Biologics, Berwick, ME) y se
sondeó con anticuerpos primarios utilizando un aparato de
mini-transferencia (Inmunetics, Cambridge, MA). Las
membranas se desarrollaron tras la incubación con el anticuerpo
secundario conjugado de peroxidasa apropiado, por
quimioluminiscencia mejorada de ECL.
La Tabla 1 resume la información sobre la
clase/subclase de diferentes anticuerpos anti-VEGF,
los grupos epítopos que éstos reconocen en el VEGF, y su unión
preferencial al VEGF o al complejo VEGF:receptor
(VEGF:Flk-1). En todos los ejemplos, los anticuerpos
se unieron igualmente bien a VEGF121 y VEGF165 y produjeron
esencialmente los mismos resultados. Los resultados siguientes
corresponden a VEGF165 a menos que se estipule lo contrario.
\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \begin{minipage}{140mm} 1. Los grupos de epítopos se determinaron a través de un ELISA competitivo.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 2. Los ratones se inmunizaron con un péptido sintético, correspondiente a los 26 aminoácidos del extremo N-terminal del VEGF humano (11B5, 3E7, 7G3, y 12D7) o bien a los 25 aminoácidos del extremo N-terminal del VEGF de cobaya (GV39M), o con VEGF humano recombinante de longitud completa (2C3).\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 3. Para verificar la reactividad de los anticuerpos con VEGF solo o con VEGF asociado con sFlk-1 (VEGF:Flk-1) se realizó un ELISA indirecto y uno de captura.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 4. El A4.6.1 tiene un epítopo definido exactamente, el cual es diferente del epítopo del Grupo 4 reconocido por 2C3. Los estudios sobre el A4.6.1 se explican en Kim y otros, 1992; Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1998; y Keyt y otros, 1996, incorporada específicamente en la presente por referencia.\end{minipage} \cr}
Los estudios de unión competitiva utilizando
anticuerpos de prueba biotinilados o marcados con peroxidasa y un
exceso de 10-100 veces de anticuerpos competitivos
no marcados mostraron que el 2C3 se une a un único epítopo. Estos
estudios primeramente revelaron que el GV39M y el 11B5 se bloquearon
el uno al otro, de forma cruzada, la unión a
VEGF:Flk-1, y que el 3E7 y 7G3 se bloquearon el uno
al otro, de forma cruzada, la unión a VEGF-biotina
capturada sobre avidina. El GV39M y 11B5 se asignaron
arbitrariamente al grupo de epítopo 1, mientras que el 3E7 y 7G3 se
asignaron al grupo de epítopo 2.
El 2C3 y el anticuerpo restante, 12D7, no
interfirieron significativamente en la unión del otro o en la unión
del resto de anticuerpos al VEGF o al complejo VEGF:receptor. El
12D7 se asignó al grupo de epítopo 3, y el 2C3 se asignó al grupo de
epítopo 4 (Tabla 1).
Tal como se expresó en la tabla anterior, el 2C3
ve un epítopo diferente al anticuerpo A4.6.1. Los estudios de
competición de los inventores mostraron que el 2C3 y el A4.6.1 no
reaccionan de forma cruzada. El epítopo reconocido por el A4.6.1
también se había definido exactamente y es un epítopo continuo
centrado alrededor de los aminoácidos 89-94 (Kim y
otros, 1992; Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1998; Keyt y
otros, 1996). Existen también un número conocido de diferencias
entre el 2C3 y el A4.6.1 (ver más adelante).
Existían marcadas diferencias en la capacidad de
los anticuerpos para unirse a VEGF soluble en forma libre y compleja
(Tabla 2). Estos estudios proporcionaron evidencias adicionales de
la naturaleza única del 2C3. La Tabla 2 muestra que el GV39M y el
11B5 exhiben una fuerte preferencia por el complejo VEGF:receptor,
alcanzando una unión media-máxima con
VEGF:Flk-1 con 5,5 y 2 nM, respectivamente, en
comparación con 400 y 800 nM, respectivamente, para el VEGF libre en
solución.
En cambio, el 2C3 y el 12D7 exhibieron una
preferencia por el VEGF libre, alcanzando una unión
media-máxima con 1 y 20 nM, respectivamente, en
comparación con 150 y 250 nM, respectivamente, para el complejo
VEGF:Flk-1. Sin embargo, tras una inyección in
vivo (ver más adelante), el 2C3 se localiza en la vasculatura
tumoral, así como en el estroma tumoral.
El 3E7 se enlazó igual de bien al VEGF libre y al
complejo VEGF:Flk-1, alcanzando una unión
media-máxima con 1 nM para ambos.
\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ * Valor extrapolado\cr \begin{minipage}{140mm} 1. Los valores de la unión media-máxima se determinaron mediante la valoración de VEGF biotinilado y sFlk-1 biotinilado complejados con VEGF en pocillos triplicados recubiertos del anticuerpo indicado y, a continuación, el desarrollo con avidina marcada con peroxidasa.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 2. Las proporciones mayores de 1,0 indican una preferencia del anticuerpo por el complejo (VEGF/VEGF:Flk-1), mientras que proporciones menores de 1,0 indican una preferencia por el VEGF.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 3. Los anticuerpos de control utilizados incluían: 1A8 (anti-Flk-1 de ratón), Mab 4.6.1 (VEGF anti-humano de ratón de Genentech), y una IgM irrelevante como control negativo.\end{minipage} \cr 4. NR: No se detectó reacción.\cr}
Los análisis por transferencia tipo Western
muestran que el 12D7, 2C3 y 7G3 reaccionan con VEGF121 y VEGF165
desnaturalizado bajo condiciones reductoras y no reductoras. Estos
anticuerpos, por tanto, parecen reconocer epítopos no dependen de la
conformación.
En cambio, el GV39M, 11B5, y 3E7 no reaccionaron
con VEGF en transferencias tipo Western, posiblemente porque
reconocen un epítopo en el extremo N-terminal del
VEGF que depende de la conformación y se deforma bajo condiciones
desnaturalizantes.
Los análisis por transferencia tipo Western de
los anticuerpos anti-VEGF se llevaron a cabo
mediante la separación de VEGF165 en presencia de un 5% de FCS
utilizando SDS-PAGE en un gel al 12% y el análisis
mediante un protocolo de Transferencia tipo Western estándar
utilizando detección ECL. Los anticuerpos primarios se incubaron con
la membrana de nitrocelulosa utilizando un aparato de
mini-transferencia multi-línea. Los
anticuerpos de control incluían: Ab-3, una IgG
monoclonal específica para VEGF del Oncogene Science en una
concentración de 1 \mug/ml, A-20, un anticuerpo
anti-VEGF de ratón de Santa Cruz Biotechnology, Inc.
en una concentración de 5 \mug/ml, y una IgG de especificidad
irrelevante en una concentración de 10 \mug/ml.
Una Transferencia tipo Western típico para los
diferentes anticuerpos, incluyendo el 2C3 en una concentración de 5
\mug/ml, mostró VEGF dimérico como una banda amplia de
aproximadamente 42 kd. También fue evidente un multímero de VEGF de
aproximadamente 130 kd con el 12D7, 7G3, y un anticuerpo de control
positivo.
Los tumores examinados a través de
inmunohistoquímica fueron tumores humanos de varios tipos de
pacientes de cáncer, xenoinjertos de tumor humano transplantables de
varios tipos desarrollados en ratones, tumor de la Línea 10 de
cobaya desarrollado en cobaya, y tumor 3LL de ratón desarrollado en
ratones (ver leyenda de la Tabla 3 para más detalles).
Se determinó la reactividad inmunohistoquímica
del 3E7, GV39M, y 11B5 en xenoinjertos NSCLC
NCI-H358 humanos y se comparó con anticuerpos de
control (una IgG de especificidad irrelevante; A-20,
un anticuerpo anti-VEGF de conejo; y MECA 32; un
anticuerpo de célula endotelial anti-ratón de rata).
Se tiñeron secciones congeladas de 8 \mum de NSCLC
NCI-H358 humanos desarrollados en ratones SCID
utilizando una técnica de inmunoperoxidasa indirecta y se
contracoloreó con hematoxilina.
Se determinó que el GV39M y el 11B5, que
reconocen el grupo de epítopo 1 en VEGF, teñían fuertemente las
células del endotelio vascular y, moderadamente, el tejido conectivo
perivascular, en todos los tumores examinados. Los anticuerpos del
grupo de epítopo 1 diferían en su reactividad con las células
tumorales, en cuanto a que el GV39M sólo reaccionaba débilmente con
células tumorales mientras que el 11B5 reaccionaba más severamente.
Aproximadamente un 80% de las células endoteliales que se tiñeron
por MECA 32 (ratón) o TEC 11 (humano) también se tiñeron por GV39M y
11B5.
El 3E7 y el 7G3, que reconocen el grupo de
epítopo 2 del VEGF, mostraron reactividad con células endoteliales
vasculares, tejido conectivo, y células tumorales en todos los
tumores examinados (Tabla 3). La intensidad de tinción de la célula
endotelial era normalmente más intensa que la tinción de la célula
tumoral o del tejido conectivo, especialmente cuando los anticuerpos
se aplicaron en concentraciones bajas (1-2
\mug/ml) donde no existía una selectividad apreciablemente
incrementada para el endotelio vascular.
Reactividad inmunohistoquímica
de anticuerpos anti-VEGF en secciones de
tumores
Tinción de células Endoteliales
Tinción de células Endoteliales
\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \begin{minipage}{140mm} Los ensayos inmunohistoquímicos se realizaron en secciones congeladas fijadas en acetona de tejidos tumorales a través de técnicas inmunohistoquímicas estándares. Las secciones se examinaron microscópicamente y se clasificó su reactividad como se indica: -, negativa; +/-, muy débil; 1+, débil; 2+, moderada; 3+, fuerte; 4+, muy fuerte.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 1. El 2C3 y el 12D7 se aplicaron en una concentración de 20 \mu g/ml; todos los otros anticuerpos estaban en una concentración de 5-10 \mu g/ml.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 2. Definiciones de reactividad: EC = endotelio; CT = tejido conectivo; TC = célula tumoral; NR = no hay reacción.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 3. Los xenoinjertos de tumores humanos analizados: NSCLC NCI-H358, NSCLC NCI-H460, adenocarcinoma de colon HT29, linfoma de Hodgkin L540.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 4. Los tumores humanos analizados: Sarcoma de tejido suave, linfoma de Hodgkin, Renal, Pecho, Parótida, Colon, Pulmón, y Carcinomas endometriales.\end{minipage} \cr 5. Reactividad con VEGF de cobaya en secciones de tumores de cobaya de la línea 10.\cr \begin{minipage}{140mm} 6. Reactividad con VEGF de ratón en secciones de tumores de carcinoma de pulmón de Lewis 3LL de un ratón.\end{minipage} \cr}
El 12D7 y el 2C3 no tiñeron las secciones
congeladas de ninguno de los tejidos tumorales, probablemente porque
la fijación de acetona al tejido destruyó la unión del anticuerpo.
Sin embargo, tras la inyección in vivo (ver posteriormente),
el 2C3 se localizó en el tejido tumoral.
El GV39M, 11B5, 3E7 y 7G3 reaccionaron con la
vasculatura de roedor en secciones congeladas de tumores de la linea
10 de cobaya desarrollados en cobayas y de tumor 3LL de ratón
desarrollado en ratones. El GV39M, 11B5, y 7G3 reaccionaron tan
fuertemente con la vasculatura tumoral de cobaya y ratón como lo
hicieron con la vasculatura humana en muestras de tumores humanos.
El 3E7 tiñó el tumor 3LL de ratón menos intensamente de lo que lo
hizo con las secciones tumorales de cobaya o humano, sugiriendo que
el 3E7 tiene una afinidad inferior para el VEGF de ratón. Estos
resultados concuerdan con los ensayos realizados mediante un ELISA
indirecto, en los que se mostraba que todos los anticuerpos, excepto
el 2C3, reaccionan con VEGF de ratón.
Se colocaron células endoteliales aórticas
bovinas adultas (ABAE) en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos
en una proporción de 1500 células/pocillo y se hicieron crecer en
presencia de VEGF humano 0,5 nM, con la adición de varios
anticuerpos de muestra y control. Los pocillos de control recibieron
medios con o sin VEGF.
Después de 4 días de incubación, se cuantificaron
las células mediante un ensayo de conversión de MTS (sal interna de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboxilmetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio),
en el que la conversión de MTS a formazán es proporcional al número
de células y se puede seguir mediante absorbancia a 490 nm (Cell
Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega,
Madison, WI). El ensayo se realizó según las instrucciones del
fabricante.
El crecimiento de células se estimó mediante la
sustracción de la conversión de MTS en cultivos a los que no se
añadió VEGF. Los resultados se expresaron como un porcentaje de la
conversión de MTS en cultivos de control a los que sólo se añadió
VEGF (Buttke y otros, 1993).
Los anticuerpos IgG, 3E7 y 12D7, que reconocen
los grupos de epítopo 1-3 en VEGF, no inhibían el
crecimiento mediado por el VEGF de las células ABAE (figura 1),
sugiriendo que son anticuerpos anti-VEGF no
bloqueadores, cuyos epítopos no están implicados en la interacción
VEGF:KDR. El anticuerpo IgM, GV39M, también reconoce los grupos de
epítopo 1-3 en VEGF, e igualmente no inhibía el
crecimiento mediado por el VEGF de las células ABAE y es un
anticuerpo anti-VEGF no bloqueador.
En cambio, el 2C3 contra el epítopo 4 en VEGF y
un anticuerpo anti-VEGF neutralizante de referencia,
Mab 4.6.1, inhibían el crecimiento de ABAE mediado por el VEGF en un
50% a las concentraciones de 3 nM y 1 nM, respectivamente (figura
1). Esto indica que el 2C3 puede neutralizar la actividad mitogénica
del VEGF.
La definición del 2C3 como bloqueador de Mab
distingue el 2C3 de un grupo de anticuerpos además del GV39M, 3E7 y
12D7. Varios anticuerpos anti-VEGF, tal como el
Ab-3, se sabe que son monoclonales no bloqueadores,
los cuales son claramente diferentes del 2C3.
Uno de los anticuerpos IgM, 11B5, era tóxico a
las células ABAE en una concentración de 8 nM o superior. Las
células se separaron en 30 minutos y en 24 horas se tiñeron con azul
tripán. Este efecto parecer ser específico del tipo de célula ya que
las HUVEC, células endoteliales aórticas porcinas, y las células
bEND.3 no quedaban afectadas por el 11B5, incluso, a una
concentración de 40 nM. El efecto tóxico del 11B5 parece ser
independiente del factor de crecimiento como ocurría en ausencia del
VEGF añadido y en presencia del factor básico del crecimiento de
fibroblastos (bFGF).
Los tumores se hicieron crecer subcutáneamente en
ratones inmunocomprometidos (NSCLC NCI-H358 en
ratones nu/nu y adenocarcinoma de colon HT29 en ratones SCID)
hasta que el volumen del tumor era de aproximadamente 1 cm^{3}. Se
inyectaron intravenosamente a través de una vena de la cola, 100
\mug de anticuerpo no marcado para estudios que utilizaron ratones
SCID, o 100 \mug de anticuerpo biotinilado para estudios que
utilizaron ratones desnudos. Veinticuatro horas más tarde, se
anestesiaron los ratones, se rociaron con PBS, y se recogieron el
tumor y los órganos que incluían al corazón, pulmones, hígado,
riñones, intestinos y bazo y se congelaron instantáneamente en
nitrógeno líquido.
El tumor y los órganos de cada ratón se
seccionaron en un criostato y se tiñeron inmunohistoquímicamente
para un anticuerpo, como se describió anteriormente, con la
excepción de que las secciones de los ratones desnudos se
desarrollaron utilizando el complejo de
estreptavidina-biotina marcado con peroxidasa (Dako,
Carpinteria, CA) y las secciones de los ratones SCID se
desarrollaron utilizando anticuerpos secundarios conjugados con dos
peroxidasas, una IgG + IgM anti-ratón de cabra
seguida por una IgG anti-cabra de conejo.
Se determinó la localización in vivo del
2C3, 3E7, y GV39M en xenoinjertos de tumores humanos. Se inyectaron
intravenosamente 100 \mug de 2C3 biotinilado o IgG de control del
mismo isotipo en ratones nu/nu con NSCLC
NCI-H358 humano. Se inyectaron 100 \mug de GV39M y
3E7 o IgG de control del mismo isotipo en ratones SCID con
adenocarcinomas colónicos humanos, HT29. Veinticuatro horas después,
se sacrificaron los ratones, se desangraron y se extrajeron los
tumores y tejidos. Se analizaron inmunohistoquímicamente secciones
congeladas de los tumores y los tejidos para determinar la unión y
distribución de los anticuerpos (Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \begin{minipage}{140mm} Los ensayos inmunohistoquímicos se realizaron en secciones congeladas de tejidos fijados en acetona, incluyendo el tumor, del ratón con tumor que había recibido 100 mg del anticuerpo indicado de forma intravenosa, 24 horas antes al sacrificio. Las secciones se examinaron microscópicamente y se clasificó su reactividad específica como se indica: -, negativa; +/-, muy débil; 1+, débil; 2+, moderada; 3+, fuerte; 4+, muy fuerte.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 1. El GV39M se unió específicamente a células endoteliales o mesangiales en los glomérulos renales.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 2. El 3E7 y GV39M se unieron específicamente al endotelio vascular del tumor mientras que el 2C3 se unió específicamente al estroma tumoral.\end{minipage} \cr 3. Control = IgM de especificidad irrelevante.\cr}
El 3E7 se localizó específicamente en el
endotelio vascular dentro de los tumores. Aproximadamente un 70% de
los vasos sanguíneos de MECA 32 positivos se tiñeron por 3E7
inyectado in vivo. Los vasos sanguíneos más amplios que
alimentaban la microvasculatura, eran positivos para el 3E7. Los
microvasos pequeños en ambas partes del estroma y los nidos del
tumor también fueron positivos para el 3E7. La intensidad de la
tinción por el 3E7 se incrementó en y alrededor de las áreas de
necrosis focal. En las áreas necróticas del tumor, el anticuerpo
extravascular era evidente, pero en regiones sanas del tumor había
una pequeña evidencia de tinción extravascular. El endotelio
vascular en todos los tejidos normales examinados, incluyendo el
riñón, no estaba teñido por el 3E7.
El GV39M también se localizó específicamente en
el endotelio vascular de los tumores. Aproximadamente un 80% de los
vasos sanguíneos de MECA 32 positivos en el tumor se tiñeron por
GV39M. Los vasos positivos para el GV39M se distribuían
uniformemente por todo el tumor, incluyendo vasos sanguíneos
amplios, pero también capilares pequeños. Igual que con el 3E7, la
intensidad de tinción de los vasos sanguíneos positivos para el
GV39M se incrementó en áreas de necrosis focal en el tumor. Sin
embargo, a diferencia del 3E7, las células endoteliales o
mesangiales de los glomérulos renales también estaban teñidas.
Parece ser que la tinción de los glomérulos renales por el GV39M es
específica de antígeno, ya que una IgM de control de especificidad
irrelevante no producía la tinción de los glomérulos renales. El
endotelio vascular de otros tejidos, aparte del riñón, no se tiñó
por el GV39M.
Tras una inyección intravenosa, el 2C3
biotinilado produjo una tinción intensa del tejido conectivo
alrededor de la vasculatura del tumor humano NSCLC H358. Las amplias
partes del tejido estromal que conectan los nidos de la célula
tumoral se tiñeron por el 2C3, observándose la mayor intensidad de
localización en las partes más amplias del estroma. En estas
regiones, no era posible distinguir el endotelio vascular del tejido
conectivo circundante. Sin embargo, se tiñeron las células
endoteliales de vasos que no estaban rodeados por el estroma, tales
como vasos que circulaban a través de los propios nidos de células
tumorales. En ninguno de los tejidos normales examinados se detectó
tinción por el 2C3.
En el modelo de tumor humano HT29, el 2C3 también
se localizó fuertemente en el tejido conectivo, pero la tinción más
intensa se observó en las regiones necróticas del tumor.
Se obtuvieron células endoteliales aórticas
porcinas (PAE) transfectadas con VEGFR1 (PAE/FLT) o VEGFR2 (PAE/KDR)
del Dr. Johannes Waltenberger (Ulm, Alemania), preparadas tal como
se describe en Waltenberger y otros (1994, incorporada
específicamente en la presente por referencia), y se hicieron crecer
en un medio F-12 que contenía un 5% de FCS,
L-glutamina, penicilina, y estreptomicina (GPS). Las
células bEND.3 se obtuvieron del Dr. Werner Risau (Bad Nauheim,
Alemania) y se hicieron crecer en un medio DMEM que contenía un 5%
de FCS y GPS. En un medio DMEM que contenía un 10% de FCS y GPS se
hicieron crecer NSCLC NCI-H358 (obtenidos del Dr.
Adi Gazdar, UT-Southwestern, Dallas, TX),
rabdomiosarcoma humano A673, y fibrosarcoma humano HT1080 (ambas del
American Type Culture Collection).
El 2C3 y el 3E7, anticuerpos monoclonales
anti-VEGF, y el 1A8, anticuerpo monoclonal
anti-Flk-1, y el T014, un anticuerpo
policlonal anti-Flk-1 son como se
describieron anteriormente en el Ejemplo I y en Brekken y otros
(1998) y Huang y otros (1998), cada una incorporada específicamente
en la presente por referencia. El A4.6.1, anticuerpo monoclonal VEGF
anti-humano de ratón, se obtuvo del Dr. Jin Kim
(Genentech Inc., CA) y se ha descrito ya anteriormente (Kim y otros,
1992; incorporada específicamente en la presente por referencia).
Los anticuerpos de control negativo utilizados fueron OX7, un
anticuerpo Thy1.1 anti-rata de ratón (Bukovsky y
otros, 1983), obtenido del Dr. A.F. Williams (MRC Cellular
Inmmunology Unit, Oxford, UK) y el C44, un anticuerpo
anti-colquicina de ratón (Rouan y otros, 1990,
obtenido de la ATCC).
Con el dominio extracelular del VEGFR1
(Flt-1/Fc, R&D Systems, Minneapolis) o del
VEGFR2 (sFlk-1-biotina) se
recubrieron directamente pocillos de una placa de microtitulación o
dichos dominios se capturaron por pocillos recubiertos de
NeutrAvidina (Pierce, Rockford, IL), respectivamente. Se incubó el
VEGF en una concentración de 1 nM (40 ng/ml) en los pocillos en
presencia o ausencia de anticuerpos de prueba o control de
concentración 100-1000 nM (15-150
\mug/ml). A continuación, se incubaron los pocillos con anticuerpo
anti-VEGF de conejo 1 \mug/ml
(A-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,
CA).
Las reacciones se desarrollaron mediante la
adición de anticuerpo anti-conejo de cabra marcado
con peroxidasa (Dako, Carpinteria, CA) y se visualizaron mediante la
adición del sustrato 3,3'5,5'-tetrametilbencidina
(TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.). Las reacciones se
detuvieron después de 15 minutos con H_{3}PO_{4} 1M y se leyeron
espectrofotométricamente a 450 nm.
El ensayo también se realizó mediante el
recubrimiento de pocillos de placas de microtitulación con IgG de
prueba o de control. A continuación, se incubaron los pocillos con
VEGF:Flt-1/Fc o
VEGF:sFlk-1-biotina y se
desarrollaron con Fc anti-humano de cabra marcado
con peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) o con
estreptavidina marcada con peroxidasa, respectivamente, y se
visualizaron como se indicó anteriormente.
Se preincubaron 40 ng de VEGF con el
F(ab')_{2} del 2C3 (20 \mug) o del A4.6.1 (10 y 1 \mug)
durante 30 minutos en un tampón de unión (DMEM con CaCl_{2} 1 mM,
CuSO_{4} 0,1 mM, y 0,5% de triptona). Se añadieron 200 ng de las
formas solubles de VEGFR1 (Flt-1/Fc) o VEGFR2
(KDR/Fc, R&D Systems, Minneapolis, MN) para un volumen total de
50 \mul y se incubaron durante 2 horas. Las construcciones
receptor/Fc se precipitaron utilizando bolas de Proteína
A-sefarosa y el precipitado resultante se lavó 4
veces con tampón de unión.
Se añadió un tampón reductor de muestra al pelet
y sobrenadante de cada reacción y ambos se analizaron mediante
SDS-PAGE 12% y se transfirieron a membranas de PVDF.
A continuación, las membranas se probaron con 12D7 (1,0 \mug/ml),
un anticuerpo anti-VEGF de ratón y se desarrollaron,
después de incubación, con IgG anti-ratón de cabra
marcada con peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.)
mediante un sustrato de quimioluminiscencia de Súper Señal (Pierce,
Rockford, IL). Las construcciones solubles receptor/Fc también se
detectaron mediante el uso de Fc anti-humano de
cabra conjugado con peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc.).
En el ensayo ELISA, el anticuerpo 2C3
anti-VEGF bloqueaba el VEGF en la unión a VEGFR2
(KDR/Flk-1) pero no a VEGFR1
(FLT-1). En presencia de un exceso molar de 100
veces y 1000 veces de 2C3, la cantidad de VEGF que se unía a los
pocillos recubiertos con VEGFR2 se reducía al 26 y 19%,
respectivamente, de la cantidad de VEGF que se unía en ausencia de
2C3 (figura 2). En cambio, en presencia de un exceso molar de 100
veces y 1000 veces de 2C3, la cantidad de VEGF que se unía a los
pocillos recubiertos con VEGFR1 era del 92 y 105% respectivamente,
de la cantidad que se unía en ausencia de 2C3 (figura 2).
Las cantidades de VEGF que se unían a VEGFR1 y a
VEGFR2 no se vieron afectadas por la presencia de un exceso de
100-1000 veces de anticuerpo monoclonal
anti-VEGF no bloqueador 3E7 o de una IgG de control
de especificidad irrelevante (figura 2). El A4.6.1 bloqueaba la
unión del VEGF a VEGFR2 (KDR/Flk-1) y a VEGFR1
(FLT-1).
La capacidad del 2C3 de bloquear la unión del
VEGF a VEGFR1/Fc o a VEGFR2/Fc en solución se evaluó con ensayos de
coprecipitación. Se incubaron 40 ng de VEGF con 200 ng de dominio
extracelular de VEGFR1 unido a una parte de Fc
(Flt-1/Fc) o VEGFR2 (KDR/Fc) unido a una parte de Fc
(Flt-1/Fc) en presencia o ausencia de 2C3 o
F(ab')_{2} de 4.6.1. Las construcciones receptor/Fc se
precipitaron mediante la incubación con bolas de Proteína A
sefarosa. El precipitado se lavó y se resuspendió en un tampón
reductor de muestra y se separó con SDS-PAGE 12% y
se transfirió a PVDF. La membrana se bloqueó con PP82 y se probó con
anticuerpo anti-VEGF de ratón 12D7 (1 \mug/ml) y
se desarrolló bajo condiciones de quimioluminiscencia estándares. Se
detectaron el monómero y el dímero de VEGF junto con
F(ab')_{2}.
El VEGF mezclado con VEGFR1/Fc o VEGFR2/Fc se
coprecipitó con la ayuda de Proteína A-sefarosa,
mostrando que el VEGF se une a ambos receptores. La adición del
F(ab')_{2} de 2C3 bloqueaba la unión del VEGF al VEGFR2/Fc,
pero no a VEGFR1/Fc. En cambio, el F(ab')_{2} de 4.6.1
bloqueaba la unión del VEGF tanto a VEGFR2/Fc como a VEGFR1/Fc. Los
resultados confirman que el 2C3 inhibe la unión del VEGF a VEGFR2
pero no a VEGFR1, mientras que el anticuerpo 4.6.1 inhibe la unión
del VEGF tanto a VEGFR2 como a VEGFR1.
Las células PAE/KDR, PAE/FLT, y bEND.3 se
hicieron crecer hasta una confluencia del 80-90% en
platos de tejido de 100 mm en un medio que contenía un 5% se suero.
A continuación, las células se privaron de suero durante 24 horas en
un medio que contenía un 0,1% de suero. Después de un pretratamiento
con ortovanadato sódico 100 nM en PBS durante 30 minutos, las
células se incubaron con VEGF165 5 nM (200 ng/ml), bFGF 5nM (100
ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN), o un medio acondicionado
con un tumor A673, en presencia o ausencia, de anticuerpos de prueba
o de control durante 15 minutos adicionales.
A continuación, se lavaron las células con PBS,
enfriado con hielo, que contenía EDTA 10 mM, fluoruro sódico 2 mM,
ortovanadato sódico 2 mM y se lisaron con tampón de lisis (Tris 50
mM, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, 0,25% de
desoxicolato sódico, 0,1% de CHAPS, EDTA 5 mM, MgCl_{2} 1,5 mM,
fluoruro sódico 2 mM, ortovanadato sódico 2 mM, 10% de glicerol e
inhibidores de proteasa (tabletas de un Cóctel Inhibidor de Proteasa
Completo, Boehringer Mannheim). Los lisados se aclararon por
centrifugación y el sobrenadante resultante se utilizó para
inmunoprecipitación.
El VEGFR1 y el VEGFR2 se inmunoprecipitaron
mediante la incubación de lisados de células durante toda la noche a
4ºC con 5 \mug de extremo N-terminal de
anti-FLT-1 de pollo (Upstate
Biotechnology, Lake Placid, NY) o 10 \mug de T014
(anti-Flk-1 purificado por
afinidad), respectivamente. Las reacciones que utilizaban el
anticuerpo anti-FLT-1 de pollo se
incubaron posteriormente con un anticuerpo puente
anti-pollo de cabra (Kirkegaard and Perry
Laboratories, Inc.) durante 1 hora a 4ºC. A continuación, el
complejo inmune se precipitó con Proteína A/G sefarosa, se lavó
múltiples veces con un tampón de lisis al 10% (con inhibidores de
proteasa añadidos) en PBS-tween (0,2%) y se hizo
hervir en un tampón de SDS de muestra que contenía
\beta-mercaptoetanol 100 mM y urea 8 M.
A continuación, se separaron las muestras
mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de
PVDF. Las membranas se bloquearon durante 30-60
minutos con PP81 (East Coast Biologics, Berwick, ME) y se probaron
para residuos de fosfotirosina con 0,5 \mug/ml de 4G10 (Upstate
Biotechnology, Lake Placid, NY) durante toda la noche a 4ºC. Las
membranas de PVDF se desarrollaron, tras incubación, con IgG
anti-ratón de conejo marcada con peroxidasa (Dako,
Carpinteria, CA) mediante un sustrato de quimioluminiscencia de
Súper Señal (Pierce, Rockford, IL). A continuación, las membranas de
PVDF se deshicieron con un tampón de Elución Inmunopuro (Pierce,
Rockford, IL) durante 30 minutos a 55ºC y se reprobaron para niveles
de receptor con anti-FLT-1 de pollo
0,5 \mug/ml o T014 1,0 \mug/ml y se desarrollaron, como se
indicó anteriormente, tras la incubación, con un anticuerpo
secundario conjugado con peroxidasa.
En estos estudios, las células PAE/KDR se
estimularon durante 15 minutos con PBS, bFGF (5 nM, 100 ng/ml),
VEGF165 (5 nM, 210 ng/ml), medio acondicionado con A673 (CM), CM en
combinación con anticuerpos particulares (separadamente, CNTL, 2C3,
3E7, A4.6.1 con una concentración de 100 nM, 15 \mug/ml), o T014
solo (100 nM, 15 \mug/ml). Las células PAE/FLT también se
estimularon durante 15 minutos con PBS, VEGF165 (5 nM, 210 ng/ml),
medio acondicionado con A673 (CM), CM en combinación con anticuerpos
particulares (separadamente, 2C3, 3E7, A4.6.1 con una concentración
de 100 nM, 15 \mug/ml), o T014 solo (100 nM, 15 \mug/ml). A
continuación, se incubaron las células en un tampón de lisis y se
inmunoprecipitó el receptor, se separó por SDS-PAGE
bajo condiciones reductoras, se transfirió a membranas de PVDF y se
probó con 4G10 (0,5 \mug/ml), anticuerpo
anti-fosfotirosina de ratón, y se desarrolló bajo
condiciones de quimioluminiscencia estándares. A continuación, se
deshicieron las membranas y se reprobó con la IgG inmunoprecipitante
para determinar el nivel de proteína de receptor en cada línea.
Los resultados mostraron que el 2C3, junto con el
A4.6.1, un anticuerpo anti-VEGF neutralizante de
control, bloquean la fosforilación inducida por el VEGF, de VEGFR2
en células PAE/KDR. Esto está de acuerdo con los resultados previos
que demostraban que el 2C3 y el A4.6.1 bloquean el crecimiento de
células endoteliales mediado por el VEGF (Ejemplo II; Brekken y
otros, 1998). Las transferencias tipo Western de VEGFR2 en los
inmunoprecipitados se realizaron para probar las cantidades de
proteína de VEFGR2 en cada línea. El 3E7, que reconoce un epítopo
del extremo NH_{2}-terminal del VEGF, no bloqueaba
la fosforilación inducida por el VEGF, de VEGFR2, ni tampoco lo hizo
la IgG de control de especificidad irrelevante.
El efecto del 2C3 en la fosforilación inducida
por el VEGF, de VEGFR1, no está claro. Tal como ya han mostrado
otros investigadores, la fosforilación inducida por el VEGF, de
VEGFR1 en células PAE/FLT es difícil de demostrar, posiblemente
debido a la baja actividad de quinasa intrínseca de VEGFR1 (De Vries
y otros, 1992; Waltenberger y otros, 1994;
Davis-Smyth y otros, 1996; Landgren y otros,
1998).
El protocolo se siguió tal como se describe por
Murohara y otros (1998). Brevemente, se anestesiaron
400-450 g de cobaya sin pelo, IAF, macho (Charles
River, Wilmington, MA) y, a continuación, se inyectaron
intravenosamente con 0,5 ml de tinte azul de Evan (0,5%) en PBS
estéril a través de una vena de la oreja. Veinte minutos más tarde,
se inyectaron intradérmicamente (i.d.) 20 ng de VEGF en presencia o
ausencia de los anticuerpos de prueba o de control. Se fotografiaron
las manchas azules resultantes de la espalda de la cobaya y se
midieron con un calibrador, 30 minutos después de las inyecciones
i.d.
Para investigar los efectos del 2C3 en la
permeabilidad inducida por el VEGF, se anestesiaron
400-450 g, en tamaño, de cobaya (cepa Hartley) sin
pelo IAF y se inyectaron intravenosamente con 0,5 ml de tinte azul
de Evan (0,5%) en PBS estéril a través de una vena de la oreja.
Veinte minutos más tarde, se inyectaron intradérmicamente (i.d.) 25
ng de VEGF en presencia o ausencia de los anticuerpos de prueba o de
control. Se fotografiaron las manchas azules resultantes de la
espalda de la cobaya y se midieron con un calibrador, 30 minutos
después de las inyecciones i.d.
Utilizando el ensayo de permeabilidad de Miles,
se encontró que el 2C3, que bloquea al VEGF de la activación de
VEGFR2, inhibía la permeabilidad inducida por el VEGF en cobayas.
Este efecto era evidente con 2C3 con un exceso molar de 10, 100, ó
1000 veces sobre el VEGF. El A4.6.1, que bloquea el VEGF de la
activación de VEGFR2 y VEGFR1, bloqueaba la permeabilidad inducida
por el VEGF con un exceso molar de 10 veces (estudios presentes y
Kim y otros, 1992). El 3E7, y un IgG de control que no bloquea la
interacción VEGF: VEGFR2, tampoco bloquean la permeabilidad inducida
por el VEGF en los ensayos de permeabilidad de Miles en cobayas.
Estos resultados sugieren que la permeabilidad
endotelial, mediada por el VEGF, está mediada, como mínimo en parte,
a través de la activación de VEGFR2. Estos resultados concuerdan con
aquellos de otros investigadores que mostraron que la actividad de
la tirosina quinasa del VEGFR2 es necesaria para la permeabilidad
inducida por el VEGF (Murohara y otros, 1998; Joukov y otros, 1998;
Ogawa y otros, 1998).
Se inyectaron subcutáneamente 1 x 10^{7}
células NSCLC NCI-H358 ó 5 x 10^{6} células de
rabdomiosarcoma A673 a ratones nu/nu en el día 0. En el día 1
y, posteriormente, dos veces por semana, a los ratones se les
suministraron intraperitonealmente inyecciones de 2C3 en cantidades
de 1, 10 ó 100 \mug o controles, tal como se indicó. A
continuación, se midieron los tumores dos veces por semana durante
un período de aproximadamente seis semanas, para los ratones con
NCI-H358 y de cuatro semanas, para los ratones con
A673. El volumen del tumor se calculó según la fórmula: volumen = L
x W x H, en la que L = longitud, W = anchura, H = altura.
Se inyectaron intraperitonealmente anticuerpos de
control o de prueba a ratones nu/nu machos que tenían tumores
NCI-H358 o fibrosarcoma HT1080 subcutáneo de
200-400 mm^{3} de tamaño. Los ratones con
NCI-H358 se trataron con 100 \mug de anticuerpos
por inyección tres veces por semana durante la primera semana y dos
veces por semana durante la segunda y tercera semana. A
continuación, se cambió a 50 \mug por inyección cada cinco días.
Los ratones con HT1080 se trataron con 100 \mug del anticuerpo
indicado o solución salina un día sí y otro no durante toda la
duración del estudio. En ambos estudios, los ratones se sacrificaron
cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 2500 mm^{3} o antes, si
los tumores empezaban a ulcerar.
El 2C3 inhibe el crecimiento in vivo de
NSCLC NCI-H358 y del rabdomiosarcoma A673 en ratones
nu/nu de una forma dependiente de la dosis (figura 3A y
figura 3B). Se administraron intraperitonealmente 100 \mug de 2C3,
dos veces por semana, a ratones que habían sido inyectados
subcutáneamente con células tumorales un día antes, y se inhibió el
crecimiento de ambos tipos de tumores humanos. El volumen del tumor
final en los receptores de 2C3 era aproximadamente de 150 mm^{3}
en ambos sistemas tumorales, en comparación con los aproximadamente
1000 mm^{3} en los receptores de los controles.
El tratamiento con 10 ó 1 \mug de 2C3 dos veces
por semana era menos efectivo en la prevención del crecimiento del
tumor. Sin embargo, ambas dosis inferiores de 2C3 ralentizaban el
crecimiento de tumores A673 hasta un grado similar comparado al de
ratones no tratados. El retraso en el crecimiento del tumor, causado
por una dosis de 10 \mug de 2C3, era menos marcado en el modelo de
tumor NCI-H358. Las diferencias entre estos dos
modelos de tumor y sus respuestas a la inhibición de la actividad de
VEGFR2 por el 2C3 se correlacionan con la agresividad de los dos
tipos de tumores in vivo. El NCI-H358 crece
in vivo mucho más lentamente que lo hace el A673 y parece ser
menos sensible a las dosis bajas de 2C3, mientras que los tumores
A673 crecen más rápidamente y agresivamente y parecen ser más
sensibles a las dosis bajas de 2C3.
El 3E7, que se une al VEGF, pero no bloquea su
actividad, no tenía ningún efecto en el crecimiento de tumores
NCI-H358. Sin embargo, el 3E7 administrado en una
dosis de 100 \mug, dos veces por semana, estimulaba el crecimiento
de tumores A673 (figura 3B), sugiriendo que incrementa la eficiencia
de la señalización del VEGF en el tumor.
Se inyectaron intraperitonealmente 2C3, A4.6.1,
3E7, o una IgG de especificidad irrelevante (figura 4) a ratones con
tumores subcutáneos NSCLC NCI-H358, que habían
crecido hasta un tamaño aproximado de 300-450
mm^{3}. Las dosis fueron de 50-100 \mug cada
3-5 días. El A4.6.1 se utilizó como un control
positivo ya que se había observado por otros investigadores que
bloqueaba la actividad del VEGF in vivo, dando lugar a una
inhibición del crecimiento del tumor (Kim y otros, 1993; Mesiano y
otros, 1998). Además de medirse el volumen medio del tumor (figura
4), también se tomaron fotografías de los ratones de cada grupo de
tratamiento para mostrar las diferencias en el tamaño del tumor y la
apariencia al final del estudio.
El tratamiento con 2C3 o A4.6.1 llevó a una
regresión lenta de los tumores durante el curso del estudio. Los
volúmenes medios de los tumores al final del estudio fueron del 30%
(2C3) y del 35% (4.6.1) del volumen inicial medio del tumor (figura
4). Sin embargo, estos resultados son complicados debido al hecho de
que se observó un retraso espontáneo en el crecimiento del tumor, en
los grupos de control de los ratones, entre 40 y 60 días después de
la inyección de células tumorales. Los resultados hasta los 40 días,
antes de que el retraso espontáneo en el crecimiento fuera evidente,
mostraron que el tratamiento con 2C3 y A4.6.1 previene el
crecimiento del tumor.
La figura 5A muestra un estudio adicional en el
que los ratones con NCI H358 se trataron durante un período
prolongado de tiempo con 100 \mug de 2C3 o 3E7. En este estudio,
las regresiones espontáneas fueron menos pronunciadas. El volumen
medio del tumor de los ratones tratados con 2C3 al inicio del
tratamiento era de 480 mm^{3} y después de aproximadamente 14
semanas de tratamiento, el volumen medio del tumor cayó hasta los 84
mm^{3}, un descenso de aproximadamente el 80% en volumen. Los
ratones tratados con 3E7 iniciaron el tratamiento con un volumen
medio del tumor de 428 mm^{3} y se aumentó hasta un volumen de
1326 mm^{3} después de aproximadamente 14 semanas, un incremento
del 300% en volumen.
La figura 5B muestra las curvas del crecimiento
del tumor de ratones con fibrosarcoma humano HT1080, cada uno de los
cuales fueron tratados, cada dos días, con 100 \mug de 2C3, 3E7,
una IgG de control, o solución salina. El 2C3 detuvo el crecimiento
de los tumores durante el tiempo que se continuó el tratamiento. Los
ratones tratados con 3E7, IgG de control o solución salina crearon
tumores que crecieron progresivamente y hasta un tamaño que requirió
sacrificar los ratones antes de 4 semanas después de la inyección en
células tumorales.
Existen algunas diferencias entre el 2C3 y el
A4.6.1 (por ejemplo, Tabla 5). Los anticuerpos reconocen diferentes
epítopos en el VEGF basados en los estudios de bloqueo cruzado con
ELISA (Ejemplo I). La mutagénesis y los estudios cristalográficos
con Rayos-X han mostrado anteriormente que el A4.6.1
se une a un epítopo en el VEGF que está centrado alrededor de los
aminoácidos 89-94 (Muller y otros, 1998).
De particular interés es el hecho de que el
A4.6.1 bloquea el VEGF de la unión tanto a VEGFR1 como a VEGFR2 (Kim
y otros, 1992; Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1998; Keyt y
otros, 1996), mientras que el 2C3 sólo bloquea el VEGF de la unión a
VEGFR2 (Ejemplo IV). La evidencia convincente publicada de que el
A4.6.1 inhibe la unión del VEGF a VEGFR2 y VEGFR1 proviene de
estudios estructurales y cristalográficos detallados (Kim y otros,
1992; Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros, 1998; Keyt y otros,
1996). Los datos publicados indican que el A4.6.1 inhibe la unión
del VEGF a VEGFR2 mediante la competición por el epítopo en el VEGF
que es crítico para la unión a VEGFR2, y bloquea la unión del VEGF a
VEGFR1 probablemente debido a impedimentos estéricos (Muller y
otros, 1998; Keyt y otros, 1996).
Una versión humanizada del A4.6.1 se encuentra
actualmente en pruebas clínicas (Brem, 1998; Baca y otros, 1997;
Presta y otros, 1997). La quimiotaxis de macrófagos/monocitos y
otras funciones endógenas del VEGF que son mediadas a través del
VEGFR1 probablemente disminuirán en las pruebas con A4.6.1. En
cambio, el 2C3 se prevé que sea superior debido a su capacidad de
bloquear específicamente los efectos mediados por el VEGFR2. El 2C3
es, de este modo, un anticuerpo potencialmente más seguro,
particularmente para la administración en humanos. Los beneficios
del tratamiento con 2C3 incluyen la capacidad del huésped de crear
una respuesta anti-tumoral mayor, permitiendo la
migración de macrófagos al tumor al mismo tiempo que bloquea la
expansión de la vasculatura del tumor inducida por el VEGF. Además,
no se deberían pasar por alto los muchos beneficios sistémicos de
mantener la quimiotaxis de macrófagos y otros efectos mediados por
VEGFR1.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \begin{minipage}{140mm} Abreviaciones utilizadas: IHC, inmunohistoquímica; NR, sin reactividad; BV, vasos sanguíneos; CT, tejido conectivo.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 1. Las referencias para los datos del A4.6.1 incluyen Kim y otros, 1992; Wiesmann y otros, 1997; Muller y otros; 1998 y Keyt y otros, 1996.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 2. El epítopo que el 2C3 reconoce en el VEGF no está definido pero se ha mostrado que es diferente del epítopo que el A4.6.1 reconoce a partir de estudios de bloqueo cruzado con ELISA.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 3. La afinidad del 2C3 por el VEGF se ha estimado mediante un ELISA y un análisis de resonancia de plasmones superficiales.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{140mm} 4. El A4.6.1 sólo reacciona con secciones congeladas fijadas en acetona, ligeramente fijadas.\end{minipage} \cr}
La relación entre angiogénesis y enfermedad se
extiende más allá de lo observado en tumores vacularizados. Por
ejemplo, la implicación de angiogénesis aberrante está bien
documentada en la artritis. Se han utilizado un conjunto de
diferentes anticuerpos anti-VEGF y anticuerpos para
timidina fosforilasa para teñir tejido artrítico y diferenciar a
éste de controles complementados. En estudios que utilizan
anticuerpos contra VEGF se ha mostrado una expresión sorprendente en
el pannus de la artritis reumatoide.
Se aisló el ARN del hígado de un ratón y se
utilizó como molde para RT-PCR^{TM} con los
siguientes cebadores:
cebador 5' aga cca tgg gtc ata ctc
atc agg act ttc a (SEQ ID
NO:43);
cebador 3' ctac cat ggc tat ttg
gag aaa gag gtc a (SEQ ID
No:44).
El fragmento ADNc resultante tiene la secuencia
de ADN de SEQ ID NO:12 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO:13. Para referencia, la secuencia de aminoácidos de la
endostatina humana es SEQ ID NO:14. El fragmento de ADNc de ratón se
clonó en el vector de expresión H6pQE60 (Qiagen), el cual codifica
el tag de 6 x histidina del extremo N-terminal, y a
continuación, se expresó en células de E.coli M15. Cuando la
densidad de la célula de E. coli alcanzó una densidad óptica
de 0,6 a 560 nM, se añadió isopropiltiogalactósido (IPTG) 0,1 mM
durante 4 horas para inducir la expresión de endostatina
6-His. Las células se recogieron por centrifugación
y se lisaron en un tampón de lisis (Reactivo de Extracción de
Proteína Bacteriana B-PER (Pierce, Rockford,
IL)).
Los cuerpos de inclusión, que contenían la
endostatina 6-His, se sedimentaron por
centrifugación y se disolvieron en un tampón A (pH 8,0, HCl
guanidina (GuHCl) 6 M, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris 10 mM,
imidazol 10 mM,
\beta-2-mercaptoetanol 10 mM). Se
trató la solución que contenía la endostatina 6-His
reducida con un exceso de ácido
5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoico)
(reactivo de Ellman) (20 mM) y se cargó en una columna
Ni-NTA. La columna se lavó con tampón de lavado
(GuHCl 6 M, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris 10 mM, NaCl 500 mM, pH
7,3) y la endostatina 6-His se eluyó de la columna
con imidazol 0,2 M en tampón de lavado.
El eluido y la endostatina 6-His
insoluble se diluyeron con un volumen igual de tampón de
replegamiento (urea 3M, Tris 1 M pH 7,3, L-arginina
0,5 M, NaCl 0,5 M, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, glutationa reducida 1
mM (GSH)) y se incubaron durante toda la noche a temperatura
ambiente. La endostatina 6-His replegada se dializó
extensamente frente a PBS, pH 7,4 a temperatura ambiente. La
proteína resultante, la endostatina 6-His, era
soluble y muy pura según un análisis SDS-PAGE bajo
condiciones no reductoras en el que apareció como una única banda de
20 kDa.
Además del hecho de que la proteína expresada es
totalmente soluble, otra evidencia de que la endostatina
6-His expresada en E.coli es biológicamente
activa, incluye la unión probada a células endoteliales. Se preparó
endostatina 6-His biotinilada y se incubó con tres
tipos de células endoteliales diferentes in vitro (células
endoteliales de ratón Bend3; células endoteliales aórticas bovinas,
ABAE; y células endoteliales de cordón umbilical humano, HUVEC). La
unión se detectó utilizando
estreptavidina-peroxidasa junto con
O-fenilendiamina (OPD) y se leyó la absorbancia a
490 nm.
Los estudios de unión directa mostraron que la
endostatina (6-His Biotinilada) se enlazó de una
forma saturable a estos tres tipos diferentes de células
endoteliales in vitro. También se observó que la endostatina
(sin marcar) competía con la endostatina biotinilada por la unión a
células endoteliales Bend3.
Se añadió
4-succinimidiloxicarbonil-\alpha-metil-\alpha-(2-piridilditio)-tolueno
(SMPT) en N'N-dimetilformamida (DMF) a una IgG 2C3
en una proporción molar de 5:1 (SMPT:2C3) y se incubó a temperatura
ambiente (RT) durante 1 hora en PBS con EDTA 5 mM (PBSE). Se extrajo
el SMPT libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25
llevada a cabo en PBSE. Simultáneamente, se incubó la endostatina
6-His de ratón con 2-iminotiolano
(2-IT, reactivo de Traut) en una proporción molar de
1:5 (endostatina:2-IT) durante 1 hora a RT. Se
extrajo el 2-IT libre mediante una cromatografía de
exclusión por tamaño G25 llevada a cabo en PBSE.
El 2C3 modificado con SMPT se mezcló con
endostatina 6-His modificada con
2-IT, se concentró a 3-5 ml, y se
incubó durante 24 horas a RT con agitación moderada. Se analizó la
reacción por SDS-PAGE. El 2C3-SMPT
no conjugado se extrajo del conjugado mediante cromatografía de
afinidad de heparina, proporcionando así
2C3-endostatina.
Se incubó N-succinimidil
S-acetiltioacetato (SATA) con endostatina
6-His en una proporción molar de 6:1
(SATA:endostatina) durante 30 minutos a RT. Se extrajo el SATA libre
mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25 llevada a
cabo en PBSE. La endostatina 6-His modificada con
SATA en PBSE se concentró a 4,0 ml y se añadió 0,4 ml de solución de
desacetilación (hidroxilamina 0,1 M). La mezcla se incubó a RT
durante 2 horas. Simultáneamente, IgG 2C3, en PBSE, se incubó con
succinimidil
4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
(SMCC) en una proporción molar de 1:5 (2C3:SMCC). Se extrajo el SMCC
libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25 llevada
a cabo en PBSE.
A continuación, la endostatina modificada con
SATA desacetilada se incubó con 2C3 modificado con SMCC, se
concentró a aproximadamente 5 mg/ml de proteína total bajo
nitrógeno, y se incubó durante toda la noche a RT con agitación
moderada. La reacción se analizó mediante SDS-PAGE.
Se extrajo el 2C3-MCC no conjugado del conjugado
2C3-endostatina mediante cromatografía de afinidad
de heparina en PBSE, proporcionando así
2C3-endostatina. También se consiguió una
conjugación satisfactoria utilizando 2-iminotiolano
en lugar de SATA como agente tiolante.
Como las secuencias de ADN para endostatina
humana y de ratón, y para el 2C3 están disponibles (y proporcionadas
en la presente), las proteínas de fusión
2C3-endostatina se pueden preparar fácilmente. La
expresión y el replegamiento de la endostatina, tal como se
describió anteriormente, muestran que la expresión recombinante
satisfactoria de esta molécula es, efectivamente, posible.
La preparación de una proteína de fusión
2C3-endostatina puede hacerse de forma que la
endostatina esté presente en el extremo C-terminal
de la cadena pesada de 2C3 o unida a un fragmento ScFv del 2C3. En
estos casos, la tecnología recombinante hace que la variación de las
uniones sea muy sencilla, y se prevé, particularmente, el uso de
secuencias divisibles selectivamente para unir las dos partes
funcionales. Actualmente se prefieren las secuencias divisibles de
plasmina o MMP.
La disponibilidad de secuencias divisibles
selectivamente y la adaptabilidad de la tecnología recombinante,
también prevén proteínas de fusión en las que la endostatina se
sustituye en otro punto de la construcción del 2C3. La endostatina
permanecerá incrustada en el interior del 2C3 hasta que contacte con
una enzima que actúe en la secuencia selectivamente divisible, en
cuyo punto la endostatina funcional se libera de la proteína de
fusión.
Para construir un conjugado
2C3-Ang-2, la Ang-2
se usa preferiblemente en forma recombinante, ya que se puede
producir en células de insectos que utilizan un sistema de expresión
de baculovirus. El protocolo actual preferido para la expresión y
purificación de Ang-2 implica la clonación de ADNc
de Ang-2 a partir de ARN de placenta de ratón
mediante RT-PCR^{TM} y la clonación del ADNc de
Ang-2 en el vector de expresión pFastBac1. Las
células competentes de E. coli DH10Bac se transforman con el
plásmido recombinante.
Tras la selección antibiótica, se eligen las
colonias de E. coli que contienen Bácmido recombinante, se
hacen crecer y se purifica el ADN de Bácmido recombinante. Las
células de insecto SF9 se transfectan con el ADN de Bácmido
recombinante utilizando el reactivo Cellfectin. Se recogen los
baculovirus recombinantes del sobrenadante de las células SF9
transfectadas. Los baculovirus recombinantes se amplifican y se
utilizan para infectar células SF9 y, entonces, las células SF9
infectadas expresarán Ang-2. La
Ang-2 se purifica a partir del sobrenadante de tales
células SF9 infectadas mediante purificación de afinidad.
El 2C3 purificado se conjuga al
Ang-2 recombinante utilizando el enlazador químico
SMPT, generalmente, tal como se describió anteriormente. Se añadió
SMPT en N'N-dimetilformamida (DMF) a una IgG 2C3 en
una proporción molar de 5:1 (SMPT:2C3) y se incubó a temperatura
ambiente (RT) durante 1 hora en PBS con EDTA 5 mM (PBSE). Se extrajo
el SMPT libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25
llevada a cabo en PBSE. Simultáneamente, se incubó
Ang-2 recombinante con 2-IT a RT. Se
extrajo el 2-IT libre mediante una cromatografía de
exclusión por tamaño G25 llevada a cabo en PBSE.
El 2C3 modificado con SMPT se mezcla con
Ang-2 recombinante modificado con
2-IT, se concentra, y se incuba durante 24 horas a
RT con agitación moderada. Se analiza la reacción por
SDS-PAGE. El 2C3-SMPT no conjugado
se extrae del conjugado mediante cromatografía de filtración en
gel, proporcionando así 2C3-endostatina.
El 2C3 se modificó con SMPT, tal como se
describió en los ejemplos anteriores. Se extrajo el SMPT libre
mediante una cromatografía G25, tal como se describió anteriormente,
a excepción del pico (2C3-SMPT) que se recogió bajo
nitrógeno. Se extrajeron 600 \mul de 2C3-SMPT para
cuantificar los grupos tiopiridilo tras la adición de ditiotreitol
(DTT) a 50 mM. Se introdujeron una media de 3 grupos MPT por IgG. El
factor tisular truncado humano (tTF) que tiene un residuo de
cisteína introducido en el extremo N-terminal se
redujo con \beta2-ME 5 mM. Se extrajo el
\beta2-ME por cromatografía G25.
Se juntó el
N-Cys-tTF reducido con el
2C3-SMPT y se incubaron en una proporción molar
2,5:1 (tTF:IgG) durante 24 horas a RT. La reacción se concentró
hasta 1-2 ml utilizando un Amicon con una membrana
cortada de peso molecular de 50.000 (MWCO). El tTF y IgG no
conjugados se separaron de los conjugados utilizando una
cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200, proporcionando,
de este modo, 2C3-tTF.
El 2C3 se modificó con SMPT. El agente
citotóxico, CRM107 (del Dr. Jerry Fulton; Inland Laboratories,
DeSoto, TX) se modificó con 2-IT, tal como se ha
descrito en los ejemplos anteriores. El 2C3 modificado con SMPT se
incubó con CRM107 modificado con 2-IT en una
proporción molar de 1:5 (IgG: CRM107) durante 24 horas a RT con
agitación moderada. El 2C3 conjugado se separó de los reactivos
libres mediante una cromatografía de exclusión por tamaño Superdex
200, proporcionando, de este modo, 2C3-CRM107.
Se obtuvo, de Novagen, Inc, un plásmido
(pBacgus-1) que contenía el gen de GUS de
E.coli. Se utilizó el plásmido como molde para PCR para
clonar el gen de GUS en el vector de expresión H6pQE60, el cual
codifica un tag de 6 x histidina de extremo
N-terminal. Se hicieron crecer células de E.
coli M15 que transportaban el plásmido hasta que la densidad de
la células alcanzó una densidad óptica de 0,6 a 560 nM. Se añadió
isopropiltiogalactósido (IPTG) para inducir la expresión del GUS 6
his. Después de 4 horas, las células se recogieron por
centrifugación.
El pelet de E.coli se lisó en un tampón de
lisis de células (Reactivo de Extracción de Proteína Bacteriana
B-PER (Pierce, Rockford, IL)). La solución se cargó
en una columna Ni-NTA, ésta se lavó con tampón de
lavado (GuHCl 6 M, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris 10 mM, NaCl 500
mM, pH 7,3) y la GUS 6-His enlazada se eluyó con
imidazol 0,2 M en el mismo tampón.
Según un análisis SDS-PAGE, en el
que apareció como una única banda de 75 kDa, la GUS
6-his era pura. En las columnas de filtración en
gel, la GUs 6-His aparece como un tetrámero de unos
300 kDa. La GUS 6-His era enzimáticamente activa,
tal como se deduce de su capacidad de dividir el sustrato
p-nitrofenil-\beta-D-glucurónido
(PNPG).
Se incubó N-succinimidil
S-acetiltioacetato (SATA) con GUS en una proporción
molar 6:1 (SATA:GUS) durante 30 minutos a RT. Se extrajo el SATA
libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25 llevada
a cabo en PBSE. La GUS modificada con SATA se concentró hasta 4,0 ml
y se añadieron 0,4 ml de solución de desacetilación (hidroxilamina
0,1 M). La mezcla se incubó durante 2 horas a RT. Simultáneamente,
IgG 2C3, en PBSE, se incubó con succinimidil
4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
(SMCC) en una proporción molar de 1:5 (2C3:SMCC). Se extrajo el
SMCC libre mediante una cromatografía de exclusión por tamaño G25
llevada a cabo en PBSE.
A continuación, el GUS modificada con SATA se
incubó con 2C3 modificado con SMCC durante toda la noche a RT con
agitación moderada. Se extrajo la GUS libre mediante una
cromatografía de intercambio iónico en Q-Sefarosa,
eluyendo el 2C3 libre y el conjugado 2C3-GUS con
NaCl 0,5 M en PBS. La solución resultante se separó mediante una
cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200, obteniendo
2C3-GUS con una pureza del 90%.
Se confirmó la actividad biológica de cada
componente del conjugado 2C3-GUS. El
2C3-GUS se enlazó específicamente a pocillos
recubiertos de VEGF en un ELISA controlado apropiadamente, ya que se
detectaba mediante una IgG anti-ratón marcada con
HRP secundaria y OPD. La unión media-máxima se
observó con una concentración de 0,1 nM. De este modo, la parte de
unión del 2C3 funciona correctamente. La parte de GUS también
mantuvo la actividad enzimática.
El 2C3-GUS se radioyodinizó con
^{125}I con una actividad específica de 5 x 10^{6} cpm/\mug.
Tras inyectar intravenosamente a los ratones, el
2C3-GUS radioyodinizado se aclaró de la sangre con
un t_{1/2} \alpha de unas 6 horas y un t_{1/2} \beta de unas
25 horas.
Los profármacos de
\beta-glucurónido, tales como
doxorubicina-\beta-glucurónido y
calcimicina-\beta-glucurónido se
prepararon, esencialmente, tal como se describe en la Patente U.S.A.
5.561.119, incorporada específicamente en la presente por
referencia. Tales profármacos se diseñan para liberar el componente
citotóxico, tal como la doxorubicina o la calcimicina, sólo cuando
se degradan por una enzima glicosida, tal como GUS. Mediante el
acoplamiento de GUS a 2C3, la GUS se dirige específicamente al
estroma y la vasculatura tumoral, proporcionando así la división
específica de los profármacos y liberando el componente citotóxico
específicamente en el interior del tumor.
El 2C3-GUS se localizó
específicamente en la vasculatura tumoral y en los alrededores del
estroma tumoral tras una inyección intravenosa en ratones SCID con
tumores NSCLC NCI-H358 humanos en el sitio
subcutáneo. Se detectó la presencia de 2C3-GUS
inmunohistoquímicamente en secciones congeladas de tumores con IgG
anti-ratón marcada con HRP o
anti-GUS marcada con HRP. La localización máxima se
observó a las 24-48 horas después de la inyección de
2C3-GUS. Los tejidos normales no se tiñeron. La
localización específica del 2C3-GUS en la
vasculatura tumoral y en los alrededores del estroma tumoral permite
que un profármaco administrado sistémicamente, tal como
doxorubicina-glucurónido y
calcimicina-glucurónido, sea activado sólo en el
interior del tumor.
Una línea de células de hibridoma, tal como se
describe en la presente, se ha depositado bajo las disposiciones del
Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC),
Manassas, VA, USA; y se ha asignado un número de acceso ATCC No. PTA
1595. La invención descrita y reivindicada en la presente no está
limitada en su alcance por la línea de células PTA 1595 depositada,
ya que la realización depositada es una ilustración de un aspecto de
la invención y las líneas de células de hibridoma equivalentes que
producen anticuerpos monoclonales funcionalmente equivalentes están
dentro del alcance de esta invención. De hecho, todas las
composiciones y métodos dados a conocer y reivindicados en la
presente se pueden fabricar y ejecutar sin una experimentación
excesiva a la luz de la presente descripción.
Las siguientes referencias proporcionan
procedimientos de ejemplo u otros detalles complementarios a
aquellos señalados posteriormente en la presente.
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<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 496
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
cada una incorporada en la presente
por
referencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO
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<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His
His Glu Val Val Lys}
\sac{Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr
Cys}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Pro Met Ala Glu Gly Glu Gln Lys Pro Arg
Glu Val Val Lys Phe}
\sac{Met Asp Val Tyr Lys Arg Ser Tyr Cys}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 573
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(573)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Arg Phe Arg Ile Ile Gly Gly}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Lys ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp
Val Val Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys
Gly Asp Asp Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Arg
Gly Asp Asp Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Glu Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Gly Arg}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Ser Ile Asp Gly Arg}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Gly Leu Trp Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ile Ala Gly Gln}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Glu Gly Leu Arg Val Gly}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Val Val}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Arg}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Leu Gly Ile Ser Ser Thr}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Gln Ala Leu Ala Met Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Ala Leu Ala Met Ser Ala Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Tyr His Leu Val Ser Gln}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Ala Phe Leu Glu Ser Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
Claims (79)
1. Composición que comprende una cantidad
biológicamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF
purificado, o fragmento de unión al antígeno de éste, que se une
sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal ATCC
PTA 1595 y que inhibe significativamente la unión del VEGF al
receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1) sin inhibir
significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1
(Flt-1).
2. Composición, según la reivindicación 1, en la
que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de
unión al antígeno de éste.
3. Composición, según la reivindicación 1 ó 2, en
la que dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG o un anticuerpo
IgM.
4. Composición, según la reivindicación 1 ó 2, en
la que dicho anticuerpo es un scFv, Fv, Fab', Fab, un
"diabody", un anticuerpo lineal o un fragmento de unión al
antígeno F(ab')_{2} de un anticuerpo.
5. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo es un
dímero, un trímero o un multímero de dicho anticuerpo o fragmentos
de unión al antígeno de éstos.
6. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo es un
anticuerpo humano, humanizado o parcialmente humano o un fragmento
de unión al antígeno de éste.
7. Composición, según la reivindicación 6, en la
que dicho anticuerpo comprende una región de unión al antígeno de
dicho anticuerpo acoplada operativamente a un armazón o región
constante de anticuerpo humano.
8. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo es un
anticuerpo quimérico.
9. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo es un
anticuerpo recombinante.
10. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo comprende,
como mínimo, una primera región variable que incluye una región de
secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO:7 o SEQ ID NO:9.
11. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo es el
anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595.
12. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo está
acoplado operativamente a, como mínimo, un primer agente
biológico.
13. Composición, según la reivindicación 12, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a, como mínimo,
un primer agente que divide un profármaco sustancialmente inactivo
para liberar un fármaco sustancialmente activo.
14. Composición, según la reivindicación 13, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a fosfatasa
alcalina que divide un profármaco de fosfato sustancialmente
inactivo para liberar un fármaco sustancialmente activo.
15. Composición, según la reivindicación 12, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a, como
mínimo, un primer agente terapéutico o agente de diagnóstico.
16. Composición, según la reivindicación 15, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a, como mínimo,
un primer agente terapéutico.
17. Composición, según la reivindicación 16, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a, como mínimo,
un primer y un segundo agente terapéutico.
18. Composición, según la reivindicación 16 ó 17,
en la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a, como
mínimo, un primer agente quimioterapéutico, agente radioterapéutico,
agente antiangiogénico, agente inductor de apoptosis, esteroide,
antimetabolito, antraciclina, alcaloide de vinca, fármaco
antitubulina, antibiótico, citocina, agente alquilante o
coagulante.
19. Composición, según la reivindicación 18, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un agente
citotóxico, citostático o anticelular capaz de destruir o suprimir
el crecimiento o la división celular de células endoteliales.
\newpage
20. Composición, según la reivindicación 19, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a toxinas
derivadas de plantas, hongos o bacterias.
21. Composición, según la reivindicación 20, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a una toxina de
cadena A, una proteína inactivadora de ribosomas,
\alpha-sarcina, gelonina, aspergilina,
restrictocina, una ribonucleasa, una epipodofilotoxina, toxina de la
difteria o exotoxina de Pseudomonas.
22. Composición, según la reivindicación 21, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a la cadena A
de la ricina o a la cadena A de la ricina desglicosilada.
23. Composición, según la reivindicación 18, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un agente
antiangiogénico.
24. Composición, según la reivindicación 23, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a una
angiopoyetina.
25. Composición, según la reivindicación 24, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a la
angiopoyetina-2 o la
angiopoyetina-1.
26. Composición, según la reivindicación 23, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a angiostatina,
vasculostatina, canstatina o maspina.
27. Composición, según la reivindicación 23, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a la
endostatina.
28. Composición, según la reivindicación 18, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un fármaco
antitubulina.
29. Composición, según la reivindicación 28, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un fármaco
antitubulina seleccionado del grupo que consiste en colquicina,
taxol, vinblastina, vincristina, vindescina y una
combretastatina.
30. Composición, según la reivindicación 18, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un
coagulante.
31. Composición, según la reivindicación 30, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un coagulante
seleccionado del grupo que consiste en Factor II/IIa, Factor
VII/VIIa, Factor IX/IXA, Factor X/Xa, un factor de coagulación
dependiente de vitamina K que carece de la modificación Gla,
activador del Factor X del veneno de víbora de Russell, tromboxano
A2, tromboxano A2 sintasa y
\alpha2-antiplasmina.
32. Composición, según la reivindicación 30, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a Factor
Tisular, un Factor Tisular humano, un Factor Tisular mutante
deficiente en la capacidad de activar el Factor VII, Factor Tisular
truncado o a un Factor Tisular dimérico, trimérico o polimérico o un
derivado del Factor Tisular.
33. Composición, según la reivindicación 32, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a Factor
Tisular truncado.
34. Composición, según la reivindicación 15, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un agente de
diagnóstico, un agente imagen o un agente detectable.
35. Composición, según la reivindicación 34, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a un compuesto
detectable por Rayos-X, un ión radiactivo o un
isótopo de resonancia magnética nuclear de spin.
36. Composición, según la reivindicación 34, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a biotina,
avidina o a una enzima que genera un producto coloreado tras entrar
en contacto con un sustrato cromogénico.
37. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 33, en la que dicho anticuerpo está acoplado
operativamente a dicho agente biológico como una proteína de fusión
preparada mediante la expresión de un vector recombinante que
comprende, en el mismo marco de lectura, un segmento de ADN que
codifica dicho anticuerpo unido operativamente a un segmento de ADN
que codifica dicho agente biológico.
38. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 33, en la que dicho anticuerpo está acoplado
operativamente a dicho agente biológico a través de un enlace
biológicamente liberable o un enlazador selectivamente
divisible.
39. Composición, según la reivindicación 38, en
la que dicho anticuerpo está acoplado operativamente a dicho agente
biológico a través de un enlazador peptídico que incluye un sitio de
división para uroquinasa, pro-uroquinasa, plasmina,
plasminógeno, TGF\beta, estafiloquinasa, Trombina, Factor IXa,
Factor Xa, una metaloproteinasa, una colagenasa intersticial, una
gelatinasa o una estromelisina.
40. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 36, en la que dicho anticuerpo está acoplado
directamente a dicho agente biológico.
41. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 36, en la que dicho anticuerpo está acoplado a
un segundo anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de éste,
que se une a dicho agente terapéutico o de diagnóstico.
42. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición es una
composición farmacéuticamente aceptable.
43. Composición, según la reivindicación 42, en
la que dicha composición farmacéuticamente aceptable se formula para
administración parental.
44. Composición, según la reivindicación 42, en
la que dicha composición farmacéuticamente aceptable es una
formulación liposomal.
45. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición además
comprende un segundo agente terapéutico.
46. Composición, según la reivindicación 45, en
la que dicho segundo agente terapéutico es un segundo agente
anticancerígeno.
47. Composición, según la reivindicación 46, en
la que dicho segundo agente anticancerígeno es un agente
quimioterapéutico, agente radioterapéutico, agente antiangiogénico,
agente inductor de apoptosis, fármaco antitubulina o un agente
quimioterapéutico, agente radioterapéutico, agente antiangiogénico,
agente inductor de apoptosis o fármaco antitubulina dirigido al
tumor.
48. Composición, según la reivindicación 47, en
la que dicho segundo agente anticancerígeno es una angiopoyetina o
una angiopoyetina dirigida al tumor.
49. Composición, según la reivindicación 48, en
la que dicho segundo agente anticancerígeno es
angiopoyetina-1 dirigida al tumor.
50. Composición, según la reivindicación 47, en
la que dicho segundo agente anticancerígeno es endostatina o una
endostatina dirigida al tumor.
51. Composición, según la reivindicación 47, en
la que dicho segundo agente anticancerígeno es un fármaco
antitubulina o un fármaco antitubulina dirigido al tumor.
52. Composición, según la reivindicación 47, en
la que dicho segundo agente anticancerígeno es una construcción
anticuerpo-agente terapéutico que comprende un
agente terapéutico que se une operativamente a un segundo
anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une
a un componente expresado en la superficie, accesible en la
superficie o localizado en la superficie, de una célula tumoral,
vasculatura tumoral o estroma tumoral.
53. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, para su utilización en terapia.
54. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 o reivindicaciones 34 a 36, para su
utilización en diagnóstico.
55. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 o reivindicaciones 23 a 29, para su
utilización en la inhibición de la angiogénesis tras la
administración a un animal.
56. Composición, según la reivindicación 55, para
su utilización en la inhibición de la angiogénesis en un animal que
tiene una enfermedad neovascular ocular o una degeneración macular
tras la administración a dicho animal.
57. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 41, para su utilización en la liberación de un
agente biológico a un tumor vascularizado tras la administración a
un animal con un tumor vascularizado.
58. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, para su utilización en el tratamiento
del cáncer.
59. Utilización de una composición, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o reivindicaciones 23 a
29, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una
enfermedad mediante la inhibición de laangiogé-
nesis.
nesis.
60. Utilización, según la reivindicación 59, en
la que dicho medicamento está dirigido al tratamiento de
enfermedades neovasculares oculares o degeneración macular mediante
la inhibición de angiogénesis.
61. Utilización de una composición, según
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 41, en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento del cáncer mediante la liberación de
un agente biológico a un tumor vascularizado.
62. Utilización de una composición, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58, en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento del cáncer.
63. Composición que comprende una cantidad
biológicamente efectiva de un anticuerpo anti-VEGF,
o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une
sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 2C3
(ATCC PTA 1595) para su utilización en terapia, sin una inhibición
sustancial de macrófagos, osteoclastos o condroclastos.
64. Utilización de una composición que comprende
una cantidad biológicamente efectiva de un anticuerpo
anti-VEGF, o un fragmento de unión al antígeno de
éste, que se une sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo
monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595) en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento del cáncer mediante la inhibición de la unión
del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR2 (KDR/Flk-1),
sin inhibir significativamente la unión del VEGF al receptor del
VEGF, VEGFR1 (Flt-1).
65. Kit que comprende, como mínimo, una primera
composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58.
66. Kit que comprende, como mínimo, una primera
composición, según la reivindicación 13 ó 14, y, como mínimo, una
segunda composición que comprende un profármaco sustancialmente
inactivo, que se divide por el agente biológico acoplado al
anticuerpo en dicha primera composición, para liberar un fármaco
sustancialmente activo.
67. Kit que comprende, como mínimo, una primera
composición, según la reivindicación 14, y, como mínimo, una segunda
composición que comprende fosfato de combretastatina.
68. Hibridoma que produce un anticuerpo
monoclonal anti-VEGF que se une sustancialmente al
mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595 y que
inhibe significativamente la unión del VEGF al receptor del VEGF,
VEGFR2 (KDR/Flk-1), sin inhibir significativamente
la unión del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1
(Flt-1).
69. Anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595.
70. Inmunoconjugado que comprende un anticuerpo
monoclonal ATCC PTA 1595 acoplado operativamente a, como mínimo, un
primer agente biológico.
71. Método para la preparación de un anticuerpo
anti-VEGF que se une sustancialmente al mismo
epítopo que el anticuerpo monoclonal ATCC PTA 1595, que comprende
inmunizar un animal no humano con una composición inmunizante que
comprende, como mínimo, un primer componente de VEGF inmunogénico y
seleccionar, del animal inmunizado, un anticuerpo que reacciona
sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal ATCC
PTA 1595.
72. Método, según la reivindicación 71, en el que
dicho animal no humano es un ratón transgénico que comprende una
biblioteca de anticuerpos humanos.
73. Método, según la reivindicación 71 ó 72, que
comprende obtener los ácidos nucleicos que codifican dicho
anticuerpo anti-VEGF y expresar dichos ácidos
nucleicos para obtener un anticuerpo anti-VEGF
recombinante.
74. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 71 a 73, que comprende:
(a) administrar a un animal no humano una
cantidad inmunizante efectiva de una composición que comprende, como
mínimo, un primer componente VEGF inmunogénico;
(b) preparar una biblioteca combinatoria de
fagémidos de inmunoglobulina que expresan ARN aislado del bazo de un
animal inmunizado;
(c) seleccionar de la biblioteca de fagémidos, un
clon que expresa un anticuerpo anti-VEGF que,
reacciona sustancialmente de forma cruzada con el anticuerpo
monoclonal 2C3 (ATCC PTA 1595); y
(d) expresar los ácidos nucleicos que codifican
el anticuerpo anti-VEGF de dicho clon seleccionado
para proporcionar un anticuerpo anti-VEGF
recombinante.
75. Método de detección de VEGF, que comprende
poner en contacto una composición in vitro sospechosa de
contener VEGF con una composición, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 58, bajo condiciones efectivas para permitir la
formación de complejos VEGF/anticuerpo y detectar los complejos así
formados.
76. Método de inhibición de la unión del VEGF al
receptor del VEGF, VEGFR2, sin inhibición significativa de la unión
del VEGF al receptor del VEGF, VEGFR1, que comprende poner en
contacto una población de células in vitro, homogéneas o
heterogéneas, que expresan VEGFR2 (KDR/Flk-1) y
VEGFR1 (Flt-1), con una cantidad biológicamente
efectiva de una composición, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 58.
77. Método de inhibición específica de la
proliferación de células endoteliales inducida por el VEGF, que
comprende poner en contacto una población de células endoteliales
in vitro con una cantidad biológicamente efectiva de una
composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58.
78. Método de inhibición de la proliferación de
células endoteliales inducida por el VEGF, sin inhibición
significativa de la función de los macrófagos, osteoclastos o
condroclastos inducida por el VEGF, que comprende poner en contacto
una muestra de tejido in vitro que contiene células
endoteliales y, como mínimo, una de macrófagos, osteoclastos y
condroclastos, con una cantidad biológicamente efectiva de una
composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58.
79. Método de inhibición de la angiogénesis, que
comprende poner en contacto una población de vasos sanguíneos in
vitro con una composición antiangiogénica, que comprende una
cantidad biológicamente efectiva de una composición, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58.
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