CN104411332B - 与vegfr2结合的全人抗体 - Google Patents

Abstract

本申请公开了抗VEGFR2抗体的相关组合物和方法。更具体而言，公开了能与VEGFR2结合的全人抗体、能与VEGFR2结合的片段及所述抗体的衍生物，以及含有所述片段的能与VEGFR2结合的多肽。进一步地，公开了抗体片段、衍生物及多肽，以及使用所述抗体、抗体片段、衍生物及多肽的方法，包括治疗或诊断患有各种癌症的对象的方法。

Description

与VEGFR2结合的全人抗体

技术领域

本公开提供了全人抗VEGFR2抗体的组合物及方法。更具体地来说，本公开提供了与VEGFR2结合的人抗体、所述抗体的能够结合VEGFR2的片段及衍生物、包含所述片段的能够结合VEGFR2的多肽。进一步而言，本公开提供了抗体的片段、衍生物及多肽以及使用所述抗体、所述抗体片段及其衍生物和多肽的方法，包括治疗或诊断患有VEGFR2-相关疾病或症状的对象。

背景技术

血管生成是重要的细胞事件，其中血管内皮细胞增殖、修剪和重新组织，从而基于先前存在的血管网络形成新的血管。据有力证据表明，血管供应对正常和病理增殖过程都是必不可少的(Folkman and Klagsbrun(1987)Science 235:442-447)。氧输送和营养输送，以及分解代谢产物的移除，是多细胞生物体内大多数生长过程存在的限速步骤。因此，一般假定血管腔隙不仅对胚胎形成中的器官发育和分化必不可少，对成人的创面愈合和生殖功能也是必要的。

各种病症的发病机理中也涉及血管生成，包括但不限于，癌症、增殖性视网膜病症、老年龄相关性黄斑变性、风湿性关节炎(RA)和牛皮癣。血管生成对于大多数初级实体瘤的生长及其后续转移是必要的。肿瘤可以通过仅扩散最多1-2mm大小便能吸收充分的营养和氧，届时，其进一步生长则需要血管供应的建构。该过程被认为是涉及招募邻近的主成熟维管结构来萌发新的毛细血管，这些新血管朝肿瘤块生长并随后渗入其中。此外，肿瘤血管生成涉及从骨髓招募循环内皮前体细胞，以促进新血管形成(Kerbel,Carcinogenesis 21:505-515,2000；and Lynden et al.,Nat.Med.7:1194-1201,2001.)。

虽然诱导心血管被看做是肿瘤血管生成的主要模式，有些肿瘤也可能通过收编(co-opt)现有宿主血管来生长。被收编的维管结构随后退化，导致肿瘤退化，而该退化最终被肿瘤边缘的低氧诱导血管生成所逆转(Holash et al.,Science 284:1994-1998,1999)。

在许多情况下，该过程始于现存血管内皮细胞响应各种细胞因子和生长激素而被激活。在癌症中，肿瘤释放的细胞因子或血管生成因子通过与特定细胞表面受体相互作用而刺激血管内皮细胞。被激活的内皮细胞分泌使得血管基底膜降解的酶，允许内皮细胞侵入肿瘤组织。一旦定位，内皮细胞就分化而形成现存血管的新血管分支。这些心血管向肿瘤提供营养，促进其进一步生长，且还为转移提供了路线。

许多血管生成因子已经得到识别，包括特别强效因子VEGF。VEGF最初是从滤泡星状细胞(folliculostellate cells)和各种细胞系的条件培养基中纯化得来的。VEGF的各种形式作为高亲和配体与一批VEGF受体(VEGFRs)结合。VEGFRs是酪氨酸激酶受体，而许多酪氨酸激酶受体都是重要的血管生成调节因子。VEGFR家族包括3种主要的亚型：VEGFR1、VEGFR2(在人体中也称为激酶插入区域受体(Kinase Insert Domain Receptor,"KDR"))和VEGFR3。在VEGF的各形式中，已知VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D能结合并激活VEGFR2。

VEGF通过其同源受体起作用，能够在血管生成中充当内皮特异分裂素的功能。此外，有充分证据表明，VEGF和VEGFRs在以不适当血管生成(例如癌症)为特征的情况下受到正调节。由此一来，众多研究都集中在识别针对并抑制VEGFs或VEGFRs的疗法上。

针对并抑制VEGFs或VEGFRs的疗法包括抗体、多肽和小分子激酶抑制剂。其中，抗体广泛用于对配体和细胞受体的体内识别和抑制。高特异性抗体被用于抑制受体-配体相互作用，由此中和这些成分的生物活性，并特异性地将有毒试剂递送到细胞表面表达同源受体的细胞。由此一来，对能够特异地抑制VEGF/VEGFR途径以治疗以不适当血管生成(例如癌症)为特征的病症的有效疗法，仍存在需要。

抗VEGF抗体贝伐单抗("Bevacizumab(BV)")，亦称为rhuMAb VEGF或安维汀()，是根据Presta et al.(Cancer Res.57:4593-4599,1997)制得的抗VEGF重组人源化单克隆抗体。其包括突变人IgG1骨架区和来自能够抑制人VEGF与其受体结合的鼠科抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐单抗约93％的氨基酸序列，包括其大部分骨架区，源自人IgG1，且约7％的序列源自鼠抗体A.4.6.1。贝伐单抗的分子量为约149000道尔顿，且已糖基化。

发明内容

此述的抗VEGFR2结合蛋白可用于例如VEGFR2的体内或体外检测。此外，此述的某些VEGFR2结合蛋白可用于治疗VEGFR2-介导生物活性相关的疾病。例如，VEGFR2介导VEGF的促血管生成作用，且相应地，本公开的某些VEGFR2结合蛋白可用于抑制人类患者的血管生成。本公开的某些VEGFR2结合蛋白可用于治疗疾病，例如癌症、炎症性疾病、自体免疫疾病和视网膜病。与组织细胞过度增殖有关的许多病症包括血管生成部分，因此，可以预期此述的VEGFR2结合蛋白可用于治疗此类病症。

本公开提供一个与VEGFR2表位结合且结合亲和性至少为10^-6M的IgG类全人抗体，其重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ IDNO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ IDNO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ IDNO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81；其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ IDNO.56、SEQ ID NO.58,SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ IDNO.80。优选地，该全人抗体具有重链和轻链，其中该抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文称为VB-A2)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文称为VB-A3)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文称为VB-A7)、SEQ ID NO.7/SEQ IDNO.8(本文称为VBV-A7)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文称为VB-A9)、SEQ ID NO.11/SEQID NO.12(本文称为VB-A10)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文称为VB-B6)、SEQ IDNO.15/SEQ ID NO.16(本文称为VB-B10)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文称为VB-D5)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文称为VB-D6)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文称为VB-D11)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文称为VB-E1)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文称为VB-E2)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文称为VB-E7)、SEQ ID NO.29/SEQ IDNO.30(本文称为VB-F2)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文称为VB-F8)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文称为VB-G4)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文称为VB-G6)、SEQ IDNO.37/SEQ ID NO.38(本文称为VB-H4)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文称为VB-H7)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文称为VB-H9)、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文称为RV-A9)、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46(本文称为RV-F8)、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48(本文称为RV-H2)、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50(本文称为RV-H4)、SEQ ID NO.51/SEQ IDNO.52(本文称为RV-H5)、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54(本文称为C1)、SEQ ID NO.55/SEQID NO.56(本文称为VR-A2)、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58(本文称为VR-A3)、SEQ IDNO.59/SEQ ID NO.60(本文称为VR-A10),SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62(本文称为VR-B2)、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64(本文称为VR-B4)、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66(本文称为VR-B11)、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68(本文称为VR-C5)、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70(本文称为VR-C7)、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72(本文称为VR-C11)、SEQ ID NO.73/SEQ IDNO.74(本文称为VR-E3)、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76(本文称为VR-G11),SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78(本文称为VK-B8)、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80本文称为VR-H9)、SEQ IDNO.77/SEQ ID NO.81(本文称为VK-B8A)。

本公开提供一个全人抗体Fab片段，其具有重链可变域和轻链可变域，其中，重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ IDNO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59,SEQ ID NO.61,SEQ IDNO.63,SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ IDNO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81；且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ IDNO.56、SEQ ID NO.58,SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ IDNO.80。优选地，该全人抗体Fab片段具有重链可变域和轻链可变域，其中该抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ IDNO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ IDNO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60,SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ IDNO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80。

本公开提供一个单链人抗体，其具有重链可变域、轻链可变域、连接重链和轻链可变域的连接肽，其中，重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81，其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ IDNO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ IDNO.78、SEQ ID NO.80。优选地，该全人单链抗体具有重链可变域和轻链可变域，其中该抗单链全人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80。

本公开进一步提供一种广谱治疗哺乳动物癌症的方法，包括以抗VEGFR2多肽的有效剂量给药，其中所述抗VEGFR2多肽选自：一种与VEGRF2表位结合且结合亲和度为至少10^{- 6}M的IgG类全人抗体、具有重链可变域和轻链可变域的全人抗体Fab片段、具有重链可变域和轻链可变域以及连接所述轻链可变域和重链可变域的连接肽的单链人抗体，及其组合；

其中，所述全人抗体的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ IDNO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ IDNO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81，且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80；

其中，所述全人抗体Fab片段的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ IDNO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ IDNO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ IDNO.81，且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ IDNO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ IDNO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80；以及

其中，所述单链人抗体的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ IDNO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ IDNO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81，且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80。

优选地，所述全人抗体具有重链和轻链，其中所述抗体的重链/轻链可变域序列选自以下序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ IDNO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ IDNO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ IDNO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQ IDNO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ IDNO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ IDNO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.81。优选地，所述全人抗体Fab片段具有重链可变域和轻链可变域，其中所述抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文称为VB-A2)、SEQ IDNO.3/SEQ ID NO.4(本文称为VB-A3)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文称为VB-A7)、SEQ IDNO.7/SEQ ID NO.8(本文称为VBV-A7)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文称为VB-A9)、SEQID NO.11/SEQ ID NO.12(本文称为VB-A10)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文称为VB-B6)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文称为VB-B10)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文称为VB-D5)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文称为VB-D6)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文称为VB-D11)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文称为VB-E1)、SEQ ID NO.25/SEQ IDNO.26(本文称为VB-E2)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文称为VB-E7)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文称为VB-F2)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文称为VB-F8)、SEQ IDNO.33/SEQ ID NO.34(本文称为VB-G4)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文称为VB-G6)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文称为VB-H4)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文称为VB-H7)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文称为VB-H9)、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文称为RV-A9)、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46(本文称为RV-F8)、SEQ ID NO.47/SEQ IDNO.48(本文称为RV-H2)、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50(本文称为RV-H4)、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52(本文称为RV-H5)、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54(本文称为C1)、SEQ IDNO.55/SEQ ID NO.56(本文称为VR-A2)、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58(本文称为VR-A3)、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60(本文称为VR-A10)、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62(本文称为VR-B2)、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64(本文称为VR-B4)、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66(本文称为VR-B11)、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68(本文称为VR-C5)、SEQ ID NO.69/SEQ IDNO.70(本文称为VR-C7)、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72(本文称为VR-C11)、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74(本文称为VR-E3)、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76(本文称为VR-G11)、SEQ IDNO.77/SEQ ID NO.78(本文称为VK-B8)、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80(本文称为VR-H9)、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.81(本文称为VK-B8A)。优选地，所述全人单链抗体具有重链可变域和轻链可变域，其中所述单链全人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ IDNO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ IDNO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ IDNO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ IDNO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.81。

附图说明

图1展示了本申请公开的示范性抗VEGFR2抗体(VK-B8)和一种市面有售的治疗性单克隆抗体的SDS-PAGE分析。

图2展示了VK-B8如何阻断VEGF与可溶性VEGFR2-Fc结合，其IC₅₀约7.7x 10^-10M。

图3展示了与HUVE细胞结合的VK-B8细胞，且其EC₅₀为约1.299^-9M。

图4展示了100mg/ml VEGF浓度下的VEGF-介导HUVEC增殖。VK-B8与贝伐单抗()(一种市售的抗VEGF-A(配体)抗体)进行了比较。VK-B8在该体外模型中展现出的效力堪比贝伐单抗()。

图5展示了100mg/ml VEGF浓度的VEGF-刺激下HUVECs的VEFGR2受体的自体磷酸化。各种抗VEGFR2抗体在10μg/ml抗体浓度下进行比较。VK-B8为从左数第三栏。

图6展示了VK-B8和(PBS缓冲液，pH6.8)的重叠ANSEC(分析排阻色谱)色谱图：STD/标样测试(灰色虚线)、VK-B8色谱(红),色谱(绿)。

图7A和7B展示了VK-B8(PBS缓冲液，pH6.8)纯化后立刻分析以及4℃储存4个月后分析所得的重叠ANSEC(280nm紫外线痕量分析)色谱图：纯化后立即分析的VK-B8色谱(蓝)、4℃储存4个月后分析的VK-B8色谱(绿)。图7B是图7A的区域放大图，用于检查基线波动。

图8展示了两种抗体对MC38结肠肿瘤生长的作用。VK-B8与贝伐单抗()(一种市售的抗VEGF-A(配体)抗体)进行了比较。VK-B8在此体内模型中展现出优于贝伐单抗()的效力。

图9展示了两种抗体对A431表皮样癌细胞生长的作用。VK-B8与贝伐单抗()(一种市售的抗VEGF-A(配体)抗体)进行了比较。VK-B8在此体内模型中展现出优于贝伐单抗()的效力。

图10展示了一种抗VEGFR2抗体与抗EGFR抗体(爱必妥(),一种人源化抗EGFR抗体；或A6，一种全人抗EGFR抗体)共同给药的协同组合对肿瘤细胞生长的体内抑制。

图11展示了VK-B8对VEGF-诱导激活VEGFR2的抑制作用的IC₅₀值，其对所述VEGF-介导的VEGFR2激活的自体磷酸化的抑制IC₅₀为0.12nM。

图12展示了VK-B8对VEGF-诱导或VEGF-介导的p44/p42MAPK(Erk1/2)磷酸化的抑制作用的IC₅₀值。

图13展示了VK-B8对VEGF-诱导的HUVEC细胞增殖的抑制作用的IC₅₀值。该IC₅₀为14.9nM。

图14展示了VK-B8对VEGF-诱导的HUVEC细胞迁移的抑制作用的IC₅₀值。该IC₅₀为0.53nM。

图15展示了VK-B8对VEGF-C-诱导的VEGFR2激活的抑制作用的IC₅₀值，其中展示了VEGF-C-诱导的VEGFR2激活的自体磷酸化。该IC₅₀为1.9nM。

具体实施方式

本公开提供一个与VEGFR2表位结合且结合亲和性为100nM或以下的IgG类全人抗体，其重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ IDNO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ IDNO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ IDNO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81，其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ IDNO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ IDNO.79/SEQ ID NO.80。优选地，该全人抗体具有重链和轻链，其中该抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文称为VB-A2)、SEQ IDNO.3/SEQ ID NO.4(本文称为VB-A3)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文称为VB-A7)、SEQ IDNO.7/SEQ ID NO.8(本文称为VBV-A7)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文称为VB-A9)、SEQID NO.11/SEQ ID NO.12(本文称为VB-A10)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文称为VB-B6)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文称为VB-B10)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文称为VB-D5)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文称为VB-D6)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文称为VB-D11)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文称为VB-E1)、SEQ ID NO.25/SEQ IDNO.26(本文称为VB-E2)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文称为VB-E7)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文称为VB-F2)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文称为VB-F8)、SEQ IDNO.33/SEQ ID NO.34(本文称为VB-G4)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文称为VB-G6)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文称为VB-H4)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文称为VB-H7)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文称为VB-H9)、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文称为RV-A9)、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46(本文称为RV-F8)、SEQ ID NO.47/SEQ IDNO.48(本文称为RV-H2)、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50(本文称为RV-H4)、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52(本文称为RV-H5)、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54(本文称为C1)、SEQ IDNO.55/SEQ ID NO.56(本文称为VR-A2)、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58(本文称为VR-A3)、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60(本文称为VR-A10)、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62(本文称为VR-B2)、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64(本文称为VR-B4)、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66(本文称为VR-B11)、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68(本文称为VR-C5)、SEQ ID NO.69/SEQ IDNO.70(本文称为VR-C7)、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72(本文称为VR-C11)、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74(本文称为VR-E3)、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76(本文称为VR-G11)、SEQ IDNO.77/SEQ ID NO.78(本文称为VK-B8)、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80(本文称为VR-H9)、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.81(本文称为VK-B8)。

本公开提供一个全人抗体Fab片段，其具有重链可变域和轻链可变域，其中，重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ IDNO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ IDNO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ IDNO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81；且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ IDNO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ IDNO.80。优选地，该全人抗体Fab片段具有重链可变域和轻链可变域，其中该抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ IDNO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ IDNO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ IDNO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.77/SEQ IDNO.81。

本公开提供一个单链人抗体，其具有重链可变域、轻链可变域、连接重链和轻链可变域的连接肽，其中，重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81，其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ IDNO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ IDNO.78、SEQ ID NO.80。优选地，该全人单链抗体具有重链可变域和轻链可变域，其中该抗单链全人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQID NO.77/SEQ ID NO.81。

本公开进一步提供一种广谱治疗哺乳动物癌症的方法，包括以抗VEGFR2多肽的有效剂量给药，其中所述抗VEGFR2多肽选自：一种与VEGRF2表位结合且结合亲和度为至少10^{- 6}M的IgG类全人抗体、具有重链可变域和轻链可变域的全人抗体Fab片段、具有重链可变域和轻链可变域以及连接所述轻链和重链可变域的连接肽的单链人抗体，及其组合；

其中，所述全人抗体的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ IDNO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ IDNO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81，且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80；

其中，所述全人抗体Fab片段的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ IDNO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ IDNO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ IDNO.81，且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ IDNO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ IDNO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80；以及

其中，所述单链人抗体的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ IDNO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ IDNO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81，且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80。

优选地，所述全人抗体具有重链和轻链，其中所述抗体的重链/轻链可变域序列选自以下序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ IDNO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ IDNO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ IDNO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQ IDNO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ IDNO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ IDNO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.81。优选地，所述全人抗体Fab片段具有重链可变域和轻链可变域，其中所述抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.81优选地，所述全人单链抗体具有重链可变域和轻链可变域，其中所述单链全人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ IDNO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ IDNO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ IDNO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.77/SEQ IDNO.81。

优选地，以此治疗的哺乳动物癌症选自：卵巢癌、结肠癌、乳腺癌或肝癌细胞系、骨髓瘤、神经母细胞性CNS瘤、单核细胞性白血病、B细胞性白血病、T细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤、T细胞性淋巴瘤、肥大细胞性肿瘤及其组合。

“抑制”所指的是一种现象的可测量性减少，本文中所称现象通常指的是以下任一种：VEGF与VEGFR的相互作用、VEGF-或VEGFR-介导的血管生成、血管生成、血管生成症状、含VEGFR细胞的活力、VEGF依赖性Ba/F3细胞的活力、或者VEGF-或VEGFR-介导的细胞增殖(与未以该多肽处理的对照样本相比)。若出现以下情况，则认为一种多肽抑制了VEGF-或VEGFR-介导的活性：活性或相互作用减少了至少10％，优选为20％、30％、40％、or 50％，且更优选为60％、70％、80％、90％或以上。

“VEGF生物活性”指的是任何VEGF家族成员通过任何VEGF受体(但尤其是指通过VEGFR2受体发出信号)而产生作用的任何功能。VEGF配体家族包括：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PIGF)，以及各种VEGF选择性剪切形式，包括VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206(Tischer et al.,J.Biol.Chem,266:11947-11954,1991)。酪氨酸激酶受体的VEGFR家族包括：VEGFR-1(亦称为Flt-1)、VEGFR2(亦称为KDR(人类形式)或Flk-1(鼠科形式))和VEGFR-3(亦称为Flt-4)。VEGF配体与VEGF受体结合以诱导例如血管生成(angiogenesis、vasculogenesis)、内皮细胞增殖、血管舒张和细胞迁移。VEGFR2被认为是血管生成中最相关的VEGFR。VEGFR2或KDR-介导的生物活性，是VEGFR2或KDR显著参与从而使得VEGFR2或KDR的拮抗作用引起生物活性的可测量降低的任何生物功能。用于测量血管生成的方法是标准化的，且在例如Jain et al.(Nat.Rev.Cancer 2:266-276,2002)中有述。血管生成分析可以通过测量未分支血管段数(每单位面积中的段数)、功能性血管密度(每单位面积中散布的血管总长度)、血管直径、血管形成或血管体积密度(每单位面积中根据各段的长度和直径计算所得的血管体积总和)。VEGF-介导的增殖和血管生成的示范分析可参见美国专利6559126(其公开在此通过引用的方式并入本文)、Lyden et al,NatureMedicine 7:1194(2001)、Jacob et al,Exp.Pathol.15:1234(1978)和Bae et al,J.Biol.Chem.275:13588(2000)。这些分析可以使用纯化受体或配体或两者来进行，且可以在体外或体内进行。这些分析还可以使用基因导入或天然存在的配体或受体或两者在细胞中进行。抑制VEGF生物活性的多肽将导致VEGF生物活性降低至少10％，优选为20％、30％、40％、or 50％，且更优选为60％、70％、80％、90％或以上。该生物活性抑制作用还可以用IC₅₀来测量。优选地，抑制VEGF或VEGFR2的生物活性的多肽的IC₅₀低于100nM，更优选为低于10nM，最优选为低于1nM。

本发明的多肽可使用任何标准方法制得。在一个实施例中，所述多肽是以DNA重组的方法，通过将编码该多肽的核酸序列(例如，cDNA)插入重组表达载体，并在促进表达的条件下表达该DNA序列来制得的。

编码任一个本文公开的各种多肽中的核酸可以化学合成制得。可以选择密码子使用来提高细胞中的表达。所述密码子使用取决于所选择的的细胞类型。E.coli和其他细菌，以及哺乳类细胞、植物细胞、酵母菌细胞和昆虫细胞，都已经发展了专门的密码子使用模式。例如参见：Mayfield et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003100(2):438-42；Sinclairet al.Protein Expr.Purif.2002(1):96-105；Connell ND.Curr.Opin.Biotechnol.200112(5):446-9；Makrides et al.Microbiol.Rev.199660(3):512-38；和Sharp et al.Yeast.19917(7):657-78。

用于核酸操作的常见技术描述例如可参见：Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2ed.,1989；或F.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(GreenPublishing and Wiley-Interscience:New York,1987)及其定期更新，在此以引用方式并入本文。编码该多肽的DNA可操作地连接在源于哺乳类、病毒或昆虫基因的适当转录或翻译调节因子上。所述调节因子包括转录启动子、可选的用于控制转录的操纵子序列、编码适当mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。

重组DNA还可以包括可能对纯化蛋白有用的任何蛋白标记序列种类。蛋白标记的例子包括但不限于多组氨酸标记、FLAG标记、myc标记、HA标记或GST标记。适用于细菌、真菌、酵母菌和哺乳类细胞宿主的克隆和表达载体可以参见：Cloning Vectors:ALaboratory Manual,(Elsevier,N.Y.,1985)。

采取适用于宿主细胞的方法将该表达结构引入宿主细胞。已知有各种用于将核酸引入宿主细胞的方法，包括但不限于：电穿孔；以氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)或其他物质进行的转染；微弹轰击法(microprojectile bombardment)；脂质转染；以及，感染(其中载体充当感染原)。适当的宿主细胞包括原核细胞、酵母菌、哺乳类细胞或细菌细胞。

适当的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，E.coli或Bacillus spp。酵母菌，优选为Saccharomyces菌种(例如S.cerevisiae)，也可以用于多肽制备。各种哺乳类或昆虫细胞培养体系也可用于表达重组蛋白。用于在昆虫细胞中制备外源蛋白的Baculovirus体系可参见综述：Luckow and Summers(Bio/Technology,6:47,1988)。适当的哺乳类宿主细胞系的例子包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293和BHK细胞系。通过培养适当的宿主/载体体系来表达重组蛋白，以制备纯化多肽。在许多应用中，本文公开的众多多肽的小尺寸使得在E.coli中表达成为优选表达方法。然后，从培养基或细胞提取物中纯化该蛋白。

本文所公开的蛋白还可以使用细胞翻译体系来制备。为此，必须对编码该多肽的核酸进行修饰，以允许体外转录以产生mRNA并允许该mRNA在所用的特定无细胞体系(真核(例如哺乳类或酵母菌)无细胞翻译体系或原核(例如细菌)无细胞翻译体系)中进行无细胞翻译。

该多肽可以通过蛋白化学领域众所周知的蛋白分离/纯化方法进行纯化。非限制性的例子包括：提取、重结晶、盐析(例如，硫酸铵或硫酸钠)、离心、渗析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电泳、逆流分布或其任意组合。纯化后，多肽可以交换入不同缓冲液，和/或以本领域所知各种方法中的任一种(包括但不限于过滤和渗析)浓缩。

纯化多肽优选为具有至少85％纯度，更优选的纯度为至少95％，最优选纯度为至少98％。无论该纯度的确切数值是多少，该多肽的纯度足以用作医药产品。

多肽的翻译后修饰

在一些实施例中，本发明的结合性多肽还可以包括翻译后修饰。示范性翻译后蛋白修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、类泛素化、生物素酰化或添加多肽侧链或疏水基。由此一来，修饰后的可溶性多肽可能含有非氨基酸成分，例如脂类、多糖或单糖、磷酸。糖基化的一种优选形式为唾液酸化，其将一个或多个唾液酸部分链接至所属多肽。唾液酸部分提高蛋白的可溶性及血清半排出期，同时还降低其可能的免疫原性。例如参见Raju et al.Biochemistry.200131；40(30):8868-76。可以测试所述非氨基酸成分对多肽功能性的影响以了解其对VEGFR2或VEGF功能的拮抗作用(例如其对血管生成或肿瘤生长的抑制作用)。

在一个特定实施例中，所述可溶性多肽的修饰形式包括将所述可溶性多肽链接至非蛋白质高分子。在一个特定实施例中，所述高分子为聚乙二醇(PEG)、聚丙醇或聚氧化烯烃，如美国专利4640835；4496689；4301144；4670417；4791192或4179337所述。所述修饰多肽的例子包括聚乙二醇化的VK-B8。

PEG是可溶于水的聚合物，其在市面上有售，或可以根据本领域所熟知的方法(Sandler and Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,Vol.3,pages 138-161)通过乙二醇的开环聚合反应制备而成。术语“PEG”用于广泛涵盖任何聚乙二醇分子，无论其大小或PEG末端的修饰为何，且可以用以下公式代表：X--O(CH₂CH₂O)_n-1CH₂CH₂OH(1)，其中n＝20-2300且X为H或一种末端修饰(例如C_1-4烷基)。在一个实施例中，本发明的PEG的一个末端以羟基或甲氧基结尾，即X为H或CH₃(“甲氧基PEG”)。PEG还可以进一步包括：结合反应所必需的化学基团；源于该分子的化学合成的化学基团；或作为该分子的部分的最佳距离的间隔子的化学基团。此外，所述PEG可以由一个或多个连接在一起的PEG侧链组成。具有多个PEG链的PEGs称为多臂或分支PEGs。分支PEGs可以通过例如向各种多元醇(包括甘油、季戊四醇、山梨醇)添加聚氧化乙烯来制备。例如，可以从季戊四醇和环氧乙烷制备4臂分支PEG。分支PEG参见例如EP-A0473084和美国专利5932462所述。PEGs的一种形式包括两个通过赖氨酸的主要氨基链接的PEG侧链(PEG2)(Monfardini et al.,Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。

可以选择各种分子量形式的PEG(例如，约1000道尔顿(Da)-100000Da(n＝20～2300))来连接至VEGFR2结合性多肽。PEG中的重复单元数“n”是根据分子量(以道尔顿为单位)所得的近似值。优选地，一个激活的连接子上的PEG的总分子量适合于医药用途。因此，在一个实施例中，所述PEG分子的分子量不超过100000Da。例如，若3个PEG分子连接在链接子上，而每个PEG分子具有相同的分子量(12000Da，每个n约为270)，那么连接子上的PEG总分子量为约36000Da(总n为约820)。连接在连接子上的PEG分子量也可以不同，例如，在连接子上的3个PEG分子中，其中可以有2个各5000Da(每个n为约110)和1个12000Da(n为约270)的PEG分子。

本发明的一个具体实施例中，VEGFR2结合性多肽共价连接在通式--CO--(CH₂)_x--(OCH₂CH₂)_m—OR的一个聚(乙二醇)基团上，其中所述聚(乙二醇)基团的—CO(即羰基)与所述结合性多肽的一个氨基形成酰胺键；R为低级烷基；x为2或3；m为约450-约950；且n和m的选择使得所述共价复合物分子量减去结合性多肽分子量的差值为约10-40kDa。在一个实施例中，结合性多肽的赖氨酸的6-氨基基团为可用(自由)氨基。

上述结合物可以更具体地由通式(II)表示：P--NHCO--(CH₂)_x--(OCH₂CH₂)_m--OR(II)，其中P为如本文所述的结合性多肽的基团(即其不包括与通式(II)所示羰基形成酰胺的一个或多个氨基)；且其中R为低级烷基；x为2或3；m为约450至约950，且其选择在于使得共价复合物分子量减去结合性多肽分子量的差值为约10-约40Da。本文中所称的“m”的指定范围具有定向含义。在任何情况下，“m”的确切范围由PEG基团的分子量决定。

在一个特定实施例中，使用PEG的碳酸酯来形成该聚乙二醇化结合性多肽共价复合物。可以用N,N'-二琥珀酰亚胺碳酸酯(N,N'-disuccinimidylcarbonate，DSC)与PEG反应以形成活性混合PEG-琥珀酰亚胺碳酸酯，随后可用该产物与连接子的亲核基团或结合多肽的氨基进行反应(参见美国专利5281698和5932462)。在一种相似反应类型中，可以用1,1'-(二苯并三唑)碳酸酯(1,1'-(dibenzotriazolyl)carbonate)和二-(2-吡啶)碳酸酯(di-(2-pyridyl)carbonate)分别与PEG反应，以形成PEG-苯并三唑和PEG-吡啶混合碳酸酯(美国专利5382657)。

在一些实施例中，该聚乙二醇化结合性多肽包括共价连接在N端氨基酸的α-氨基上的PEG分子。位点特异性的N端还原胺化反应如Pepinsky et al.,(2001)JPET,297,1059和美国专利5824784所述。PEG-醛在采用其他可用亲核氨基的蛋白的还原胺化反应中的用途，如美国专利4002531、Wieder et al.,(1979)J.Biol.Chem.254,12579和Chamow etal.,(1994)Bioconjugate Chem.5,133所述。

在又一个实施例中，聚乙二醇化结合性多肽包括一个或多个共价连接在连接子上的PEG分子，而连接子则连接在该结合性多肽的N端氨基酸残基的α-氨基上。所述方法如美国专利公开2002/0044921和WO094/01451所述。

在一个实施例中，结合性多肽的C端被聚乙二醇化。在一个特定实施例中，通过引入C端叠氮基蛋氨酸以及通过施陶丁格反应(Staudinger reaction)缀合甲基-PEG-三芳基磷化合物，来达成C端聚二乙醇化。该C端缀合反应方法如Cazalis et al.,Bioconjug.Chem.2004；15(5):1005-1009所述。

缀合反应中，结合性多肽与激活PEG的比值可以约为1：0.5至1：50，约1:1至1:30，或约1:5至1:15。本发明中，可使用各种水性缓冲液来催化PEG至结合性多肽的共价加成。在一个实施例中，所用缓冲液的pH为约7.0至9.0。在又一个实施例中，pH在略微碱性的范围内，例如从约7.5至8.5。可以使用pKa接近中性pH的缓冲液，例如磷酸缓冲液。

可以使用本领域常规的分离和纯化技术来纯化聚乙二醇化结合性多肽，例如尺寸排阻(例如凝胶过滤)和离子交换层析法。也可以使用SDS-PAGE来分离产物。可以被分离出来的产物包括单、二聚、三聚、多聚和未聚乙二醇化的结合性多肽，以及自由PEG。单PEG共价复合物的百分比控制，可以通过在洗脱峰附近汇聚更广馏分来增加该组合物中的单PEG百分比。单PEG共价复合物百分比在约90％，则代表着产量和活性的良好平衡。可能期望的组合物中例如至少93％或至少96％的共价复合物为单PEG种类。在本发明的另一个实施例中，该单PEG共价复合物百分比为90％-96％。

在一个实施例中，本发明的该聚乙二醇化结合性多肽包括1个、2个或更多的PEG部分。在一个实施例中，该PEG部分连接在该蛋白表面的氨基酸残基上和/或远离该蛋白接触目标配体的表面。在一个实施例中，该聚乙二醇化结合性多肽中的PEG合并或总分子量为约3000-60000Da，可选为约10000-36000Da。在一个实施例中，该聚乙二醇化结合性多肽的PEG实质为线形直链PEG。

本发明的一个实施例中，该聚乙二醇化结合性多肽并非使用羟胺法(例如450mM羟胺(pH 6.5)在室温下反应8-16小时)从聚乙二醇化氨基酸残基水解而来，因此是稳定的。在一个实施例中，该组合物中超过80％为稳定的单PEG结合性多肽，更优选为至少90％，且最优选为至少95％。

在又一个实施例中，本发明中的该聚乙二醇化结合性多肽优选为，相对于未修饰蛋白保持至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的生物活性。在一个实施例中，生物活性指的是其与VEGFR2结合的能力，以KD、k_on或k_off来评估。在一个特定实施例中，该聚乙二醇化结合性多肽蛋白相对于未聚乙二醇化的结合性多肽，表现出增强的VEGFR结合能力。

相对于未修饰结合性多肽的清除率，PEG修饰的多肽的血清清除率可以降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。该PEG修饰的多肽的半排出期(t.sub.1/2)也可能相对于未修饰蛋白得到改善。相对于未修饰结合性多肽的半排出期，该PEG修饰的多肽的半排出期可以被改善至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％，或甚至1000％。在一些实施例中，该蛋白半排出期是体外测定的，例如在盐水缓冲溶液或血清中。在其他实施例中，该蛋白半排出期是体内半排出期，例如该蛋白在血清或其他动物体液中的半排出期

治疗剂型和给药模式

本公开中的特点之一在于，提供了用于治疗对抑制VEGF生物活性有应答的病症或预防其前置症状。优选的实施例中，所述病症的特征在于不适当血管生成。给药的技术和剂量取决于特定多肽类型及治疗中的特定症状，但能够被本领域技术人员容易地确定。一般来说，监管机构要求用作药物的蛋白试剂的制型能够使得致热源达到可接受的低水平。由此一来，药物制型通常会与其他制型非常不同，因为其几乎没有致热源，或至少仅含有由适当监管机构(例如，FDA)所确定的可接受致热源水平。

本公开的治疗组合物可以单位剂型与药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂一同给药。给药的非限定性示例可以是非肠道的(例如静脉注射，皮下注射)、口服或外用的。此外，可以使用任何基因治疗技术(使用编码本发明多肽的核酸)，例如裸DNA递送、重组基因和载体、基于细胞的递送，包括间接体内操作患者细胞等。

该组合物可以丸剂、片剂、胶囊、液体或持续释放片剂的形式用于口服给药；或以液体形式用于静脉注射、皮下注射或非肠道给药；或以凝胶剂、洗剂、软膏剂、乳膏剂或聚合物形式进行外用给药。

本领域中熟知的制型方法可以参见例如"Remington:The Science and Practiceof Pharmacy"(20th ed.,ed.A.R.Gennaro A R.,2000,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)。外用给药的制型可以包括例如赋形剂、无菌水、盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物原料油或氢化萘。可以使用可生物相容、可生物降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制化合物的释放。可以使用纳米颗粒剂型(如可生物降解的纳米粒子、固体脂质纳米粒、脂质体)来控制化合物的体内分布。其他潜在的有用非肠道递送体系包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。该化合物的制型浓度根据若干因素而改变，包括药物给药剂量和给药途径。

治疗有效剂量指的是对给药对象产生疗效的剂量。确切剂量取决于需治疗的病症，且可以由本领域技术人员使用已知技术来查明。一般来说，该多肽的给药为每天约0.01μg/kg至约50mg/kg，优选为每日0.01mg/kg至约30mg/kg，最优选为每日0.1mg/kg至约20mg/kg。该多肽可以每天给药(例如每日一次、两次、三次或四次)或优选为较低频率给药(例如，每周、每两周、每三周、每月或每季度)。此外，本领域已知，可能需要根据年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用、疾病严重程度来调整。

示范用途

本文所述的VEGFR2结合蛋白及其相关变体，可用于多种治疗和诊断性应用中，包括通过竞争或阻断与VEGFR2的结合，来抑制VEGF的生物活性。

本发明的多肽由于具有抑制VEGF生物活性的效果，能够有效对抗多种与不适当血管生成相关的病症，包括但不限于自免疫紊乱(例如风湿性关节炎、炎症性肠病或牛皮癣)；心脏异常(如动脉粥样硬化或血管再狭窄)；视网膜病(例如一般的增生性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性或新生血管性青光眼)、肾病(例如糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病综合征；移植排斥；炎性肾疾病；肾小球肾炎；膜增殖性肾小球肾炎；溶血性尿毒症以及高血压性肾硬化)；成血管母细胞瘤；血管瘤；甲状腺增生；组织移植；慢性炎症；梅格斯综合征(Meigs's syndrome)；心包积液；胸腔积液；自免疫疾病；糖尿病；子宫内膜异位症；慢性哮喘；不良纤维化(尤其是肝纤维化)和癌症，以及由癌症引起的并发症(如胸腔积液和腹水)。优选地，本发明的VEGFR2结合多肽可用于治疗或预防增殖性疾病或癌症以及癌症的转移扩散。癌症的非限制性实例包括膀胱、血液、骨、脑、乳房、软骨、结肠肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫或阴道的癌症。其他可治疗病症可参见美国专利6524583，在此以引用的方式引入。记载VEGFR2结合多肽的用途的其他文献包括：McLeodet al.,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2002；43(2):474-82；Watanabe et al.,Exp.Dermatol.2004；13(11):671-81；Yoshiji et al.,Gut.2003 52(9):1347-54；Verheulet al.,Oncologist.2000；5Suppl 1:45-50；以及Boldicke et al.,Stem Cells.2001 19(1):24-36。

如本文所述，血管生成相关病症包括但不限于：血管生成依赖性癌症，包括例如实体瘤、血液性肿瘤(如白血病)和转移瘤；良性肿瘤，例如血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼和化脓性肉芽肿；炎性病症，例如免疫和非免疫性炎症；慢性风湿性关节炎和牛皮癣；眼部血管发生疾病，例如糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、黄斑变性、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维增生、虹膜红变；奥斯勒-韦伯综合征(Osler-WebberSyndrome)；心肌血管生成；斑块新血管化；毛细管扩张；血友病性关节；血管纤维瘤；以及，创面肉芽和创面愈合；毛细管扩张银屑硬皮病、化脓性肉芽肿、cororany collaterals、缺血性肢体血管生成、角膜病变、虹膜红变、关节炎、糖尿病新生血管、骨折、血管、血细胞生成。

VEGFR2结合多肽可单独给药或与一种或多种附加疗法共同施予，例如化疗、放疗、免疫疗法、手术治疗或其任意组合。如上所述，在其他治疗策略中，也可以使用长期疗法或辅助疗法。

所述方法的某些实施例中，可以共同(同时)或不同时期(前后相继)地用一种或多种多肽治疗剂给药。此外，多肽治疗剂可以与另一种类的癌症治疗或血管生成抑制化合物共同给药。

在某些实施例中，本发明所述抗VEGFR2抗体剂可单独使用。可选地，所述药剂可以与针对增殖性紊乱(如肿瘤)的治疗或预防的其他常规抗癌治疗途径组合使用。例如，所述方法可用于癌症预防药，预防癌症术后复发和转移，以及作为其他常规癌症疗法的佐药。本公开认为，常规癌症疗法(例如化疗、放疗、光疗、免疫疗法和手术)的效力可以通过使用所述多肽治疗剂来增强。

据发现，多种常规化合物都具有抗肿瘤活性。这些化合物被用作化疗中的治疗剂，以收缩实体瘤，预防转移瘤和进一步生长，或降低白血病或骨髓恶性瘤中的恶性细胞数量。虽然化疗对治疗多种恶性瘤有效，但许多抗肿瘤化合物会导致有害副作用。据发现，当结合两种或以上不同治疗时，这些治疗可能产生协同作用，允许降低每种治疗的剂量，由此降低每种化合物在较高剂量下产生的有害副作用。在其他实施例中，难于以一种疗法治疗的恶性瘤可能会响应两种或以上不同疗法的组合疗法。

当本发明的多肽治疗剂附随或前后相继地与其他常规抗肿瘤剂组合给药时，所述治疗剂可能提高抗肿瘤剂的疗效，或克服所述抗肿瘤剂的细胞抗性。这能够减少抗肿瘤剂的剂量，由此降低有害副作用，或恢复抗肿瘤药在抵抗细胞中的效力。

可用于组合抗肿瘤疗法的要学化合物包括但不限于：氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、卡介苗、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、己二烯雌酚、己烯雌酚、多西他赛、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、染料木黄酮、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、依立替康、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、苏拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、硫鸟嘌呤、塞替派、二氯二茂钛、拓扑替康、曲妥珠单抗、维甲酸、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

某些化疗抗肿瘤化合物可以通过其进入例如下列基团的作用机理进行分类：代谢拮抗剂/抗癌剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)、微管干扰物如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)、新长春碱、长春碱、诺考达唑、埃博霉素和诺维本、epidipodophyllotoxins(依托泊苷、替尼泊苷)、DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶、蒽环类药物、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲密胺奥利沙伯、异环磷酰胺、美法仑、merchlorehtamine、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、泰素、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其系统性地代谢L-天冬酰胺并剥夺无法自身合成天冬酰胺的细胞)；抗血小板药物；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂如氮芥类(氮芥、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲密胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)及类似物、链佐星)、trazenes-达卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂代谢拮抗剂，例如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香化酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(例如组织纤维溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢霉素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(TNP-470、染料木黄酮)和生长因子抑制剂(例如、VEGF抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、eniposide、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松、和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导物和半胱天冬酶活化剂；和染色质干扰物。

在一些实施例中，可用于组合抗血管生成疗法的药学组合物包括：(1)“血管生成分子”释放抑制剂，例如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)；(2)血管生成分子的中和剂，例如抗βFGF抗体；以及(3)内皮细胞对血管生成刺激进行应答的抑制剂，包括胶原酶抑制剂、基底膜周转抑制剂、抑制血管生成的类固醇、源于真菌的血管生成抑制剂、血小板因子4、血小板反应蛋白、关节炎药物(如D-青霉胺和硫代苹果酸金盐)、维他命D₃类似物、α-干扰素，等等。其他的可用血管生成抑制剂可以参见：Blood et al.，Bioch.Biophys.Acta.1032:89-118(1990)；Moses et al.，Science，248:1408-1410(1990)；Ingber et al.，Lab.Invest.，59:44-51(1988)；以及美国专利5092885、5112946、5192744、5202352和6573256。此外，还有多种化合物也可用于抑制血管生成，例如，内皮抑素蛋白或衍生物、血管抑素的赖氨酸结合片段、黑色素或黑色素促进化合物、血纤维蛋白溶酶原片段(例如，血纤维蛋白溶酶原的Kringles1-3)、肌钙蛋白亚基、玻连蛋白α_vβ拮抗剂、源自鞘脂激活蛋白B(Saposin B)的多肽、抗生素或类似物(例如，四环素或新霉素)、含地诺孕素的组合物、含连接多肽的MetAP-2抑制核的化合物、化合物EM-138、查尔酮及其类似物，以及二肽酶抑制剂。参见例如美国专利6395718、6462075、6465431、6475784、6482802、6482810、6500431、6500924、6518298、6521439、6525019、6538103、6544758、6544947、6548477、6559126、6569845。

根据组合疗法的性质，可以在施加其他疗法的同时和/或之后以该多肽治疗剂给药。该多肽治疗剂的给药可以是单剂或多剂。在一些实施例中，该多肽治疗剂的给药开始于常规疗法之前的至少数天；而在其他实施例中，给药开始于紧接该传统疗法之前的时间或在施予传统疗法的同时。

此述的VEGFR2结合蛋白还可以加上可检测标记，并与表达VEGFR2的细胞接触，以用于成像应用或诊断应用。对于诊断目的，本发明的多肽优选为固定在固体支架中。优选的固体支架包括柱(例如亲和柱，如琼脂糖基的亲和柱)、微芯片或珠。

在诊断应用的一个实施例中，从以不适当血管生成为特征的病症的疑患病人取得生物样本，例如血清或组织活体切片，与本发明的可检测标记多肽接触，以检测VEGFR2水平。然后，将该VEGFR2水平与正常样本与该标记多肽接触而测得的VEGFR2水平比较。VEGFR2水平的增量达到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，可看作是以不适当血管生成为特征的病症的诊断指标。

在一些实施例中，本发明的VEGFR2结合多肽进一步附着了能够被检测的标记(例如，该标记可以是放射同位素、荧光化合物、酶或辅酶因子)。活性部分可以是放射性试剂，例如放射性重金属如铁螯合物，钆或锰的放射性螯合物，氧、氮、铁、碳或钆的正电子发射体，⁴³K、⁵²Fe、⁵⁷Co、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹³²I或⁹⁹Tc。可以使用连接有该部分的结合剂来作为成像剂，并以哺乳类(例如人类)诊断目的的有效剂量来给药，然后检测该成像剂的定位和累积。可以用放射性闪烁摄影术、核磁共振成像、计算机断层扫描或正电子成像术来检测该成像剂的定位和累积。可以使用指向VEGFR2的VEGFR2结合多肽的免疫闪烁成像，来检测和/或诊断癌症和脉管系统。例如，任何针对VEGFR2的结合性多肽，以⁹⁹锝、¹¹¹铟或¹²⁵碘标记后均可以有效地用于所述成像。对于本领域技术人员来说，显而易见，给药的放射性同位素量取决于该放射性同位素。本领域技术人员可以容易地根据用作活性部分的指定放射性核素的比活性和能量来计算成像剂的给药量。典型地，本领域技术人员在给药中使用每剂0.1-100毫居成像剂，优选为1-10毫居，更常用的是2-5毫居。因此，本发明中可用作成像剂的组合物包含缀合的放射性部分和靶向部分，其含0.1-100毫居，在一些实施例中优选为1-10毫居，在一些实施例中优选为2-5毫居，在一些实施例中更优选为1-5毫居。

该VEGFR2结合多肽还可用于向表达VEGFR2的细胞或组织递送额外的治疗试剂(包括但不限于药物化合物、化疗化合物和放疗化合物)。在一个实施例中，该VEGFR2结合性多肽与化疗试剂熔合，以将该化疗试剂靶向递送至表达VEGFR2的肿瘤细胞或组织。

该VEGFR2结合多肽可用于各种应用中，包括研究、诊断和治疗应用。例如，其可用于分离和/或纯化受体或其部分，以及用于研究受体结构(例如构象)和功能。

在一些方面中，可以使用所述多种结合性多肽来检测或测量VEGFR2表达，例如在内皮细胞(例如静脉内皮细胞)或被VEGFR2基因转染的细胞上的表达。因此，其还可以用于例如细胞分选和成像(例如流式细胞仪和荧光激活细胞分选)，以用于诊断或研究目的。

在一些实施例中，所述结合性多肽或其片段用于诊断目的时可以标记或不标记。典型地，诊断性分析需要检测结合性多肽与VEGFR2之间结合而形成的复合物。所述结合性多肽或其片段可以被直接标记，类似于抗体。可以使用各种标记，包括但不限于，放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、辅酶因子、酶抑制剂和配体(例如生物素、半抗原)。本领域技术人员熟知多种适当的免疫分析法(例如参见美国专利3817827、3850752、3901654、4098876)。未标记的结合性多肽可用于化验分析，例如凝集试验。未标记的结合性多肽还可以与另一种(一种或多种)可用于检测该结合性多肽的适当试剂(例如能与该结合性多肽反应的已标记抗体或其他适当试剂(如标记的蛋白A))组合使用。

在一个实施例中，本发明的结合性多肽可用于酶免疫分析，其中所述多肽与酶缀合。当含有VEGFR2蛋白的生物样本与所述结合性多肽VEGFR2接触时，结合性多肽和VEGFR2蛋白之间发生结合。在一个实施例中，含有表达VEGFR2蛋白的细胞(例如内皮细胞)的样本与所述抗体接触，而在结合性多肽和载有能被该结合性多肽识别的VEGFR2蛋白的细胞之间发生结合。已结合细胞可以从未结合试剂中分离，且可以测定特异结合至细胞上的结合性多肽-酶嵌合体的存在，例如通过令该样本与能够在该酶作用下产生颜色或其他可检测变化的酶底物相接触。在又一个实施例中，所述结合性多肽可以不标记，而添加第二种已标记多肽(例如一种抗体)来识别所述结合性多肽。

在一些方面中，还可以制备用于检测生物样本中的VEGFR2蛋白的存在的试剂盒。所述试剂盒可包括与VEGFR2蛋白或所述受体的部分相结合的VEGFR2结合性多肽，以及一种或多种适用于检测结合性多肽与受体蛋白或其部分之间的复合物的存在的辅助试剂。本发明的多肽组合物可提供为单独或与其他表位特异性的额外抗体组合的冻干形式，所述标记或未标记的结合性多肽和/或抗体可以与辅料(例如，缓冲液，例如Tris、磷酸和碳酸盐缓冲液；稳定剂；赋形剂；杀菌剂和/或惰性蛋白例如牛血清白蛋白)一起包含在试剂盒中。例如，该结合性多肽和/或抗体可以与辅料共同提供为冻干形式，或辅料可以单独提供，由使用者来组合。一般来说，所述辅料的含量低于多肽或抗体浓度的约5％重量，且通常总量至少为多肽或抗体浓度的约0.001％重量。当使用了第二种能够与该结合性蛋白结合的抗体时，所述抗体在该试剂盒中可以例如提供在单独的试管或容器中。该第二抗体，若存在，一般具有标记，且制型形式可以与上述抗体制型类似。

相似地，本公开还提供了一种用于检测和/或定量VEGFR2表达的方法，其中，一种含有细胞或其碎片(例如，膜碎片)的组合物在适合结合的条件下与VEGFR2结合性多肽或其部分相接触，并观察其结合。若检测到结合性多肽，则表明该结合性多肽和VEGFR2或其部分之间形成了复合物，因此表明了受体的存在。多肽与细胞的结合可以用标准方法来测定，例如实施例中所述的方法。所述方法可用于检测个体中的VEGFR2在细胞上的表达。可选地，可以评估内皮细胞表面上的VEGFR2的数量表达，例如通过流体细胞仪，且染色强度可以与疾病易感性、进程或风险相关。

本公开还提供了一种检测哺乳类对某些病症的易感性的方法。举例而言，该方法可用于检测哺乳类对依赖于细胞上的VEGFR2量和/或哺乳类体内VEGFR2-阳性细胞数量的病症进程的易感性。在一个实施例中，本发明涉及一种检测哺乳类对肿瘤的易感性的方法。在此实施例中，将需测试的样本与能结合VEGFR2的结合性多肽或其部分相接触，其中该样本包括在正常个体中表达VEGFR2的细胞。对该结合和/或结合量进行检测，以表明该个体对肿瘤的易感性，其中较高的受体水平与较高的个体对肿瘤易感性相关。

除非文中他处另有指明，否则下列术语应当理解为具有如下含义：

术语“VEGFR2抑制剂”和“VEGFR2拮抗剂”可交换使用，两者均指能可检测地抑制VEGFR2的至少一种功能的分子。相反地，“VEGFR2激动剂”是指能可检测地增强VEGFR2的至少一种功能的分子。由VEGFR2抑制剂引起的抑制不一定非要是完全抑制，只要其能被化验检测到即可。可以使用对VEGFR2功能的任何化验，本文提供了一些示例。能够被VEGFR2抑制剂所抑制或被VEGFR2激动剂所增加的VEGFR2功能的例子包括：癌细胞生长或凋亡(程序性细胞死亡)等等。VEGFR2抑制剂和VEGFR2激动剂类型的例子包括但不限于：VEGFR2结合多肽(例如抗原结合蛋白(如：VEGFR2抑制抗原结合蛋白))、抗体、抗体片段和抗体衍生物。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白”均指包括2个或以上相互以肽键连接的氨基酸残基的分子。这些术语涵盖例如天然和人工蛋白、蛋白片段、蛋白序列的多肽类似物(例如突变蛋白、变体蛋白或融合蛋白)，以及翻译后修饰蛋白，或共价或非共价修饰蛋白。肽、多肽或蛋白可以是单体或聚合体。

多肽(例如，抗体)的“变体”包括：相对于其他多肽序列而插入、删除和/或取代了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。已公开的变体包括，例如，融合蛋白。

多肽的“衍生物”是经过化学修饰的多肽(例如，抗体)，如通过连接另一个化学部分(例如，聚乙二醇，或白蛋白，如人血清白蛋白)、磷酸化和糖基化。除非另有说明，否则术语“抗体”除了指含有两条全长的重链和两条全长的轻链的抗体之外，还包括其衍生物、变体、片段及突变蛋白，其示例如下所述。

“抗原结合蛋白”是包括以下部分的蛋白：与抗原结合的部分；以及可选地，允许抗原结合部分采取促进抗原结合蛋白与蛋白的结合的构型的支架或骨架部分。抗原结合蛋白的例子包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。该抗原结合蛋白可以包括，例如，具有接枝的CDRs或CDRs衍生物的替代蛋白支架或人工支架。所述支架包括但不限于，包含引入了突变(例如用于稳定该抗原结合蛋白的三维结构的突变)的抗体衍生支架，以及包括例如生物可相容聚合物的全合成支架。例如参见：Korndorferet al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,Volume 53,Issue 1:121-129；Roque et al.,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可以使用多肽抗体模拟物("PAMs")，以及基于以纤维蛋白连接素成分为支架的抗体模拟物的支架。

抗原结合蛋白可以具有，例如，天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚物分子。在天然存在的球蛋白中，每个四聚物由2对相同的多肽链组成，每对中有一条“轻”(约25kDa)链和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100-110或以上氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羰基末端部分具有恒定区，主要负责效应子功能。人轻链归类为κ(kappa)或λ(lambda)轻链；重链归类为μ(mu)、Δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon)，分别令抗体的种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。优选地，本申请公开的该抗VEGFR2抗体的特征在于其重链和轻链氨基酸序列中的可变域序列(V_H和V_L)。优选抗体为VK-B8(κIgG抗体)。在轻链和重链中，可变域和恒定域由约12个或以上氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括一个再含约10个或以上氨基酸的“D”区。一般请参见Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))。每对轻/重链的可变域组成了抗体结合位点，因此一个完整的免疫球蛋白具有2个结合位点。

天然存在的免疫球蛋白链具有的相同通用结构为相对保守骨架区(FR)连接3个高变区(也称为互补决定区或CDRs)。从N-端到C-端，轻链和重链均包含以下域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个域中的氨基酸分配与Kabat et al.在Sequences ofProteins of Immunological Interest,5.sup.th Ed.,US Dept.of Health and HumanServices,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242,1991中所述一致。其他的免疫球蛋白链氨基酸编号系统包括IMGT.RTM.(国际免疫遗传学信息系统(InternationalImMunoGeneTics information system)；Lefranc et al.,Dev.Comp.Immunol.29:185-203；2005)和AHo(Honegger and Pluckthun,J.Mol.Biol.309(3):657-670；2001)。

“抗体”指的是完整免疫球蛋白或其能与完整抗体竞争特异结合的抗原结合部分(Fab)，除非另有说明。抗原结合部分可以由重组DNA技术或完整抗体的酶切或化学裂解法制备。抗原结合部分包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、域抗体(dAbs)，以及互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、二聚体、三聚体、四聚体和至少包含足以令特定抗原与多肽结合的免疫球蛋白部分的多肽。

Fab片段是具有V_L、V_H、C_L和C_H1域的单价片段；F(ab')₂片段是具有2个Fab片段的二价片段，其Fab片段在铰链区处由二硫键连接；Fd片段具有V_H和C_H1域；Fv片段具有抗体单臂的V_L和V_H域；dAb片段具有V_H域、V_L域或具有V_H域或V_L域的抗原结合片段(美国专利6846634和6696245，其公开在此以引用方式并入本文)。

单链抗体(scFv)是一种抗体，其中V_L和V_H域由连接子(例如，氨基酸残基合成序列)连接以形成连续蛋白链，且该连接子的长度足以允许该蛋白链自身折叠并形成单价抗原结合位点(Bird et al.,1988,Science 242:423-26and Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)。

二聚体是含有两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包括由连接子连接的V_L和V_H域，且该连接子长度短，不允许同一条链上的两个域之间配对，由此每个域能够与另一条多肽链上的互补域配对(Holliger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48,and Poljak et al.,1994,Structure 2:1121-23)。若二聚体的2条多肽链相同，则其配对所得的二聚体将具有2个相同的抗原决定位点。具有不同序列的多肽链可用于形成具有2个不同抗原结合位点的二聚体。类似地，三聚体和四聚体分别是含有3个或4个多肽链并分别形成3个或4个抗原结合位点(可以相同或不同)的抗体。

可以识别特定抗体的互补决定区(CDRs)和骨架区(FR)(Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5.sup.th Ed.,US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242,1991))。其他的免疫球蛋白链氨基酸编号系统包括IMGT.RTM(国际免疫遗传学信息系统(International ImMunoGeneTics informationsystem)；Lefranc et al.,Dev.Comp.Immunol.29:185-203；2005)和AHo(Honegger andPluckthun,J.Mol.Biol.309(3):657-670；2001)。一个分子中可以共价或非共价地并入一个或多个CDRs，来使其成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以并入作为较大多肽链的一部分的CDR(s)，可以将该CDR(s)共价连接另一个多肽链，或可以非共价地连接该CDR(s)。所述CDRs允许该抗原结合蛋白与所需特定抗原进行特异结合。

抗原结合蛋白可以具有一个或多个结合位点。若有超过一个结合位点，这些结合位点可以相同或不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白典型地具有2个相同结合位点，而“双特异”或“双官能团”抗体则具有2个不同结合位点。

术语“人抗体”包括具有源于人免疫球蛋白序列的每个可变域和恒定域的所有抗体。在一个实施例(全人抗体)中，所有的可变域和恒定域均源自人免疫球蛋白序列(全人抗体)。

人源化抗体的序列不同于源自非人物种的抗体序列，其差别在于一个或多个氨基酸的取代、删除和/或添加，由此令该人源化抗体与非人物种抗体相比，在对人类对象给药时引起免疫反应的可能性降低和/或引起的免疫反应严重性降低。在一个实施例中，非人物种抗体的重链和/或轻链的骨架和恒定区中的某些氨基酸突变，以产生人源化抗体。在又一个实施例中，人抗体的恒定区融合至非人物种的可变域。在又一个实施例中，非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基改变，以降低该非人抗体向人类对象给药时可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基要么对于该抗体与其抗原的免疫特异结合来说并不重要，或该氨基酸序列的改变是保守变化，由此该人源化抗体与抗原的结合并不显著差于该非人抗体与抗原的结合。如何制备人源化抗体的示例可以参见美国专利6054297；5886152和5877293。

术语“嵌合抗体”指的是含有来自一个抗体的一个或多个区和来自其他一个或多个抗体的一个或多个区的抗体。

此外，骨架区可以来自相同的抗VEGFR2抗体之一，一个或多个不同抗体(例如人抗体)，或来自人源化抗体。在一个嵌合抗体的实施例中，其重链和/或轻链的一部分等同于、同源于或来源于：特定物种的抗体，或类属于特定抗体类型或亚类的抗体；且所述链的剩余部分等同于、同源于或来源于：另一个特定物种的抗体，或类属于另一个特定抗体类型或亚类的抗体。还包括所述抗体具有所需生物活性的片段(美国专利4816567)。

“中和抗体”或“抑制抗体”是当过量抗VEGFR2抗体令激活或抑制量降低至少约20％(使用如本文实施例中所述的化验)时，抑制VEGFR2激活的抗体。在多个实施例中，抗原结合蛋白将VEGFR2激活量降低至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％和99.9％。

本领域技术人员根据本说明书的教导并使用本领域熟知的技术，能够容易地制备抗体片段或类似物。片段或类似物的氨基末端和羰基末端优选为靠近功能域的边界。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私人序列数据库比较，来识别结构域和功能域。可以使用计算机化的比较方法来识别存在于已知结构和/或功能的其他蛋白中的序列基序或预期蛋白构造域。

“CDR接枝抗体”是含有来自特定物种或种型抗体的一个或多个CDRs和来自相同或不同物种或种型的另一抗体的骨架的抗体。

“多特异抗体(multi-specific antibody)”是识别一种或多种抗原上的多个表位的抗体。此类型抗体的一个子类为“双特异抗体(bi-specific antibody)”，其识别相同或不同抗体上的两个不同表位。

若抗原结合蛋白在结合一种抗原(例如人VEGFR2)时的解离常数为1nM或以下，则称其与该抗原“特异结合”。

“抗原结合域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”是指抗原结合蛋白上含有与抗原相互作用的氨基酸残基(或其他化学部分)并有利于该抗原结合蛋白与该抗原间的特异性和亲和性的部分。对于与其抗原特异结合的抗体而言，这包括其至少一个CDR域的至少一部分。

“表位”是分子上连接抗原结合蛋白(例如，抗体)的部分。表位可以包括该分子的非邻近部分(例如，在多肽中，在多肽一级序列中并不相邻但在该多肽的三级和四级结构中相互足够靠近从而被抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。

两个多核苷酸或两个多肽序列的“同源百分比”是用GAP电脑程序(GCG WisconsinPackage,version 10.3(Accelrys,San Diego,Calif.)中的一部分)以其默认参数来比较序列而确定的。

“宿主细胞”是可用于表达核酸的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如E.coli；或真核细胞，例如真核单细胞(如酵母菌或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、小鼠细胞、大鼠细胞或昆虫细胞)或杂种细胞。宿主细胞的例子包括猴肾细胞COS-7系(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.,1981,Cell 23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物|(例如Veggie CHO)和在无血清培养基上生长的相关细胞系(Rasmussen et al.,1998,Cytotechnology 28:31)，或CHO的DX-B11品系(缺少DHFR)(Urlaub et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-20)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系、源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)(McMahan et al.,1991,EMBO J.10:2821)、人胚肾细胞(例如293、293EBNA或MSR293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化灵长类细胞系、正常二倍体细胞、源于初生组织和初生外植体的体外培养所得的细胞系、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。典型地，宿主细胞是能够以编码多肽且能够在该宿主细胞中表达的核酸转化或转染得到的培养细胞。术语“重组宿主细胞”可用于表示已经用需表达的核酸来转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是指包含该核酸，但在调控序列被引入该宿主细胞并与该核酸可操作连接以前，并不以所需表达水平来表达该核酸的细胞。应当理解，术语“宿主细胞”并不单指特定的对象细胞，而是也指所述细胞的后代或潜在后代。因为由于例如突变或环境影响的存在，后代中可能发生某些修饰，使得这些后代事实上与其亲代细胞并不等同，但其仍应属于本文中的“宿主细胞”术语所涵盖的范围。

抗原结合蛋白

抗原结合蛋白(例如抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白和抗体变体)是与VEGFR2(优选为人VEGFR2)结合的多肽。抗原结合蛋白包括抑制VEGFR2生物活性的抗原结合蛋白。

含有一个或多个抗原结合蛋白的寡聚物可以用作VEGFR2的拮抗剂。寡聚物可以是共价连接或非共价连接的二聚体、三聚体或更高寡聚物的形式。也可以使用包括2个或更多抗原结合蛋白的寡聚物，其例子之一为同源二聚体。其他寡聚物包括。

一个实施例指向一种含有2个融合蛋白的二聚体，所述融合蛋白是通过将一种抗VEGFR2抗体的VEGFR2结合片段与一个抗体的Fc区域相融合来获得的。该二聚体可以例如如下所述地制备：将编码该融合蛋白的基因融合插入适当的表达载体中，在以该重组表达载体转化的宿主细胞中表达该基因融合，并允许所表达的融合蛋白大致如抗体分子般组装，由此在Fc部分之间形成链间二硫键，以获得该二聚体。

术语“Fc多肽”包括源于抗体Fc区域的多肽的原生和突变形式。还包括含有促进二聚化的铰链区的所述多肽的截短形式。含有Fc部分的融合蛋白(及由此形成的寡聚物)提供的有益效果在于，易于通过蛋白质A或蛋白质G柱来以亲和层析法进行纯化。

另一种用于制备寡聚抗原结合蛋白的方法包括使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链域是促进其所在的蛋白质的寡聚化的多肽。亮氨酸拉链最初是在若干DNA结合蛋白中识别出来的(Landschulz et al.,1988,Science 240:1759)，此后在各种不同蛋白中也发现过。在已知的亮氨酸拉链中，有天然存在的多肽及其衍生物，能够二聚化或三聚化。适用于制备可溶寡聚蛋白的亮氨酸拉链域的例子如WO 94/10308所述，以及如Hoppe et al.,1994,FEBSLetters 344:191中所述的源自肺表面活化蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链。Fanslow et al.,1994,Semin.Immunol.6:267-78描述了一种修饰亮氨酸拉链，其允许与其融合的外源蛋白稳定地三聚化。在一种途径中，在适当的宿主细胞中表达含有与亮氨酸拉链融合的抗VEGFR2抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，并从培养基上清液中回收可溶寡聚抗VEGFR2抗体片段或衍生物。

本公开提供一种VEGFR2抗原结合蛋白(例如，抗VEGFR2抗体)，其具有一种或多种下列特征：可与人VEGFR2和鼠VEGFR2结合，抑制人VEGFR2激活，抑制鼠VEGFR2激活，与VEGFR2配体结合域或其附近结合。

本发明的抗原结合蛋白的抗体结合片段可以用常规技术制备。所述片段的例子包括但不限于Fab和F(ab')₂片段。

本公开提供与VEGFR2结合的单克隆抗体。单克隆抗体可以使用本领域已知的任何方法来制备，例如从完成免疫接种程序的转基因动物中收获脾细胞并使其无限增殖化。所述脾细胞可以使用本领域任何技术来达成无限增殖化，例如将其与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。用于制备融合蛋白的杂交瘤技术的骨髓瘤细胞优选为不产生抗体、融合效率高，且缺乏某些酶从而无法在某些仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的选择性培养基中生长的细胞。适用于小鼠融合的细胞系的例子包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul；用于大鼠融合的细胞系的例子包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和48210。可用于细胞融合的其他细胞系有U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。

针对VEGFR2的抗原结合蛋白可用于例如检测VEGFR2多肽的存在的体外或体内化验。所述抗原结合蛋白还可用于以亲和层析法对VEGFR2蛋白进行纯化。能够额外阻止配体结合介导的VEGFR2激活的抗原结合蛋白可以用于抑制来源于所述结合的生物活性。阻断性抗原结合蛋白可用于本申请所公开的方法中。具有VEGFR2拮抗剂功能的所述抗原结合蛋白可用于治疗任何VEGFR2引起的病症，包括但不限于各种癌症。

抗原结合蛋白可用于体外过程或体内给药以抑制VEGFR2诱导的生物活性。由此可以治疗由VEGFR2激活所引起或加重(直接或间接)的病症，所述病症的例子如本文所述。在一个实施例中，本发明提供了一种治疗方法，包括以降低VEGFR2诱导的生物活性的有效剂量，用VEGFR2阻断性抗原结合蛋白对哺乳动物进行体内给药。

抗原结合蛋白包括抑制VEGFR2生物活性(例如血管生成)的全人单克隆抗体。

抗原结合蛋白可以由多种常规技术中的任一种来制备。例如，可以使用任何本领域已知技术，从天然表达所述蛋白的细胞中纯化而得(例如，从产生一种抗体的杂交瘤中纯化该抗体)，或在重组表达体系中制备。例如，参见：Monoclonal Antibodies,Hybridomas:ANew Dimension in Biological Analyses,Kennet et al.(eds.),Plenum Press,NewYork(1980)；and Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Land(eds.),ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)。

本领域已知的任何表达体系均可用于制备本发明的重组多肽。一般来说，以含有编码一种所需多肽的DNA的重组表达载体来转化宿主细胞。可以使用的宿主细胞包括原核细胞、酵母菌或更高等的真核细胞。原核细胞包括革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，例如E.coli或bacilli。更高等的真核生物包括昆虫细胞扩已建立的源于哺乳类的细胞系。使用的哺乳类宿主细胞系的例子包括猴肾细胞(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.,1981,Cell23:175),L cells,293cells、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系、源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL70)(如McMahan et al.,1991,EMBO J.10:2821所述)。适用于细菌、真菌、酵母菌和哺乳类细胞宿主的克隆和表达载体如Pouwels et al.(Cloning Vectors:A LaboratoryManual,Elsevier,N.Y.,1985)所述。

转化后的细胞可以在促进多肽表达的条件下培养，且以常规蛋白纯化程序来回收多肽。一种所述纯化过程包括使用亲和层析法，例如，通过能与VEGFR2的全部或部分(例如胞外域)结合的基质。本申请的思路中使用的多肽包括基本不含内源性污染杂质的基本同质的重组哺乳类抗VEGFR2抗体多肽。

可以使用多种已知技术中的任一种来制备抗原结合蛋白并筛选所需性质。某些技术涉及对编码所需抗原结合蛋白(例如，抗VEGFR2抗体)的多肽链(或其部分)的核酸的分离，并通过重组DNA技术操作该核酸。例如，该核酸可以融合至另一感兴趣的核酸上，或添加、删除或取代一个或多个氨基酸残基来改变(例如，通过诱变或其他常规技术)。

单链抗体可通过氨基酸桥接(短连接肽)来连接重链和轻链可变域(Fv区)片段，以形成单一多肽链。所述单链Fvs(scFvs)通过在编码两个可变域多肽(V_L和V_H)的DNAs之间融合编码连接肽的DNA来制备。所得多肽可以自身折叠来形成抗原结合单体，或能够形成多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)，取决于两个可变域之间的柔性连接子的长度(Kortt etal.,1997,Prot.Eng.10:423；Kortt et al.,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。通过连接不同的含V_L和V_H的多肽，可以形成能与不同表位结合的多价scFvs(Kriangkum et al.,2001,Biomol.Eng.18:31-40)。为制备单链抗体而开发的技术包括如美国专利4946778；Bird,1988,Science242:423；Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；Ward etal.,1989,Nature 334:544,de Graaf et al.,2002,Methods Mol.Biol.178:379-87所述的技术。

用于从感兴趣的抗体获得不同子类或种型的抗体的方法是已知的，即子类转换(subclass switching)。因此，例如可以从IgM抗体得到IgG抗体，反之亦然。此类技术允许制备既具有特定抗体(亲代抗体)的抗原结合性质，也具有不同于亲代抗体种型或子类的抗体的相关生物性质的新抗体。可以使用重组DNA技术。所述过程中可以使用编码特定抗体多肽的克隆DNA，例如编码所需种型抗体的恒定域的DNA(Lantto et al.,2002,MethodsMol.Biol.178:303-16)。此外，若需要的是IgG4，还可能希望在铰链区中引入点突变(CPSCP->CPPCP)(Bloom et al.,1997,Protein Science 6:407)，以减缓重链间形成二硫键从而可能导致IgG4抗体异质性的趋势。

在一些特定实施例中，本发明的抗原结合蛋白对VEGFR2的结合亲和性(K_a)为至少10⁶nM。在另外一些实施例中，该抗原结合蛋白的K_a为至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹、或至少10¹⁰M。在另一个实施例中，该抗原结合蛋白的K_a与本申请实施例中所述的抗体实质相同。

在又一个实施例中，本公开提供了一种与VEGFR2之间具有低解离常数的抗原结合蛋白。在一个实施例中，该抗原结合蛋白的K_off为1X 10^-4至1X 10^-1M或更低。在又一个实施例中，该K_off为5X 10^-5至5X10^-1M或更低。在又一个实施例中，K_off与本申请实施例中所述的抗体实质相同。在又一个实施例中，抗原结合蛋白与VEGFR2结合的K_a与本申请实施例中所述的抗体实质相同。

本公开的另一个方面中，提供一种VEGFR2膜结合蛋白。在一个实施例中，该抗原结合蛋白的IC₅₀为1000nM或以下。在又一个实施例中，该IC₅₀为100nM或以下；在又一个实施例中，该IC₅₀为10nM或以下。在又一个实施例中，该IC₅₀与本申请实施例中所述的抗体实质相同。在又一个实施例中，该抗原结合蛋白抑制VEGFR2活性的IC₅₀与本申请实施例中所述的抗体实质相同。

本公开的另一个方面中，提供一种抗原结合蛋白，其与细胞表面表达的人VEGFR2结合，且当发生该结合时抑制VEGFR2在该细胞中的信号活动。可以使用任何用于测定或估计细胞表面和/或细胞内部的VEGFR2量的方法。在其他实施例中，该抗原结合蛋白绑定至VEGFR2表达细胞，使得低于约75％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、1％或0.1％的细胞表面VEGFR2得到内部化。

本公开的另一个方面中，提供一种抗原结合蛋白，其体外或体内(例如，对人类对象给药时)的半排出期为至少1天。在一个实施例中，该抗原结合蛋白的半排出期为至少3天。在又一个实施例中，该抗原结合蛋白的半排出期为4天或以上。在又一个实施例中，该抗原结合蛋白的半排出期为8天或以上。在又一个实施例中，该抗原结合蛋白衍生化或改性，从而使其半排出期与未衍生化或未改性的抗原结合蛋白相比更为长久。在又一个实施例中，该抗原结合蛋白包括一个或多个点突变，以增加血清半排出期，例如WO00/09560所述，在此以引用方式并入。

本公开还提供了多特异性抗原结合蛋白，例如双特异抗原结合蛋白(例如通过两个不同的抗原结合位点或区域，与VEGFR2的两个不同表位结合或与VEGFR2的表位和另一分子的表位结合的抗原结合蛋白)。此外，本申请公开的双特异抗原结合蛋白可以包括：来自此述的一种抗体的VEGFR2结合位点，以及来自此述的另一种抗体的另一VEGFR2结合区，其中涵盖本文引用其他出版物所描述的抗体。可选地，一种双特异性抗原结合蛋白可以包括一个来自此述的一种抗体的抗原结合位点，以及来自本领域所知的另一种VEGFR2抗体或以已知方法或此述方法制备的抗体的又一抗原结合位点。

本领域中已知多种制备双特异性抗体的方法。所述方法包括使用杂交-杂交瘤(hybrid-hybridomas)，如Milstein et al.,1983,Nature 305:537所述，以及抗体片段的化学连接(Brennan et al.,1985,Science 229:81；Glennie et al.,1987,J.Immunol.139:2367；美国专利6,010,902)。此外，双特异性抗体可以通过重组途径来制备，例如使用亮氨酸拉链部分(即，来自优选地形成异源二聚体的Fos和Jun蛋白；Kostelnyet al.,1992,J.Immunol.148:1547)或其他锁匙互动域结构，如美国专利5582996所述。额外的可用技术包括如美国专利5959083和5807706中所述的技术。

在又一个方面中，抗原结合蛋白包括抗体的衍生物。该衍生化抗体可以包括能够赋予该抗体所需性质的任何分子或物质，例如在一种特定用途中增加其半排出期。所述衍生化抗体可以包括例如可检测(或标记)的部分(例如：放射性、比色的、抗原性或酶活性分子)、可检测珠(例如磁性或电子致密性的(如金珠))、结合另一分子(例如生物素或链霉亲和素)的分子、治疗性或诊断性部分(例如，放射性、细胞毒性或药学活性部分)或能够增加该抗体对一种特定用途(例如向对象如人类对象给药，或其他体内或体外用途)的适用度的分子。可用于衍生抗体的分子的例子包括白蛋白(例如人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。连接白蛋白且聚乙二醇化的抗体衍生物可以使用本领域所熟知的技术来制备。在一个实施例中，该抗体与甲状腺素运载蛋白(TTR)或TTR变体缀合或以其他方式结合。该TTR或TTR变体可以用选自以下种类的化学物质进行化学改性：葡聚糖、聚(N-乙烯基吡咯烷)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇及聚乙烯醇。

实施例1

本实施例展示了制备流程及如何制备抗VEGFR2抗体VK-B8。其重链和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达框编码受到CMV主要立即早期启动子的驱动。其轻链和新霉素磷酸转移酶的表达框编码受到CMV主要立即早期启动子的驱动。被转染的细胞在萤光激活细胞分选(Fluorescence-Activated Cell Sorting(FACS))之前，培养于不含核苷酸的CD OptiCHO培养基(美国生命技术公司(Life Technologies))中。以FACS对细胞进行一次“分选”，以富集高产率细胞。FACS富集后，对细胞池进行培养和传代，直至细胞存活率大于90％。为了生产VK-B8，在37℃下将细胞扩展到所需密度和体积，然后在整个生产制备期间将其置于28℃下。

在稳定转染了含人VK-B8mAb IgG1重链和κ轻链结构基因的表达载体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中制备VK-B8。用于构建该细胞系的宿主细胞系为中国仓鼠卵巢二氢叶酸还原酶(dhf)缺乏宿主细胞系CHO-DG44(美国生命技术公司(Life Technologies))。该细胞系保持在摇瓶中，且每3-4日使用补充了PLURONIC F-68(生物技术公司(LifeTechnologies))和GlutaMAX I-CTS(美国生命技术公司(Life Technologies))的DG44(生物技术公司(Life Technologies))培养基来进行例行传代。使用两种质粒来产生稳定细胞池；重链和轻链表达载体分别为pIRES.VEGFR2.VKB8.HC和pIRES.VEGFR2.VKB8.LC。编码重链的质粒还具有编码dhfr以充当可放大的选择性标记的又一顺反子。编码轻链的质粒还包括还具有编码新霉素磷酸转移酶以充当选择性标记的又一顺反子。所述载体使用阳离子脂质体Freestyle Max共转染入宿主细胞系，并以DHFR和新霉素磷酸转移类表达进行筛选。

实施例2

本实施例展示了一项差示扫描量热法研究，其中使用MicroCal^TM DSC(GE医疗集团(GE Healthcare))测量了抗VEGFR2单克隆抗体VK-B8与贝伐单抗()相比的热力学稳定性。在pH7.4的PBS缓冲液中，以每分钟1℃的扫描速率(除非另有说明)记录每种抗体(0.48-0.55mg/mL)从25℃至85℃的温度自记曲线。在pH为7.4和6的PBS缓冲液中监控了VK-B8的解链温度曲线。

IgG	解链温度(单位：℃)
		Avastin	71.23
VK-B8	74.78

使用TSKgel Supper SW3000柱(日本东曹生物科学公司(TOSOH Biosciences))，以0.5mL/min的流速对pH 6.8的PBS缓冲液中的单克隆抗体VK-B8与贝伐单抗()进行了分析排阻色谱(ANSEC)(Water’s Breeze-HPLC)分析。使用相同体系，对VK-B8在4℃PBS缓冲液中的聚集体形成进行了4个月的观察。将IgG样本与美国伯乐公司(BIO-RAD)凝胶过滤蛋白标准(Cat#，151-1901：Thyroglobi＝670KDa；Gamma-globulin＝158KDa；Ovalbumin＝44KDa；Myoglobin＝17KDa；Vitamin B12＝1.35KDa)相比较。结果如图7所示，其中提供了pH 6.8的PBS缓冲液中的VK-B8和贝伐单抗()的重叠ANSEC色谱图(280nm处的紫外线痕量)；STD/标样测试(灰色虚线)、VK-B8色谱(红)、贝伐单抗()色谱(绿)。

VK-B8IgG样本在4℃下0天和4个月后的ANSEC分析如图7A和7B所示，其中展示了重叠ANSEC分析(4℃下0天(蓝)和4个月(绿)后的280nm紫外线痕量)：A：代表性全谱；B：表明VK-B8在4个月后仍保持完整的A图放大部分。

此外，还对4种抗体的结合性进行了Biacore分析。

包括VK-B8在内的数种VEGFR-2抗体的Biacore分析：

mAb	ka(1/Ms)	kd(1/s)	Kd(M)
				RV-H5	2.76E+06	2.25E-03	8.15E-10
VB-A3	3.88E+06	1.20E-02	3.09E-09
				VB-A9	1.64E+05	4.96E-04	3.02E-09
VK-B8	7.24E+05	8.73E-05	1.21.E-10

实施例3

本实施例展示了市售抗VEGF(配体)人源化单克隆抗体贝伐单抗()与VK-B8(即本申请公开的全人抗VEGFR2(受体)抗体)对MC38结肠肿瘤生长(以实体瘤体积为量度)的作用的体内对比数据。向C57BL6/6小鼠皮下注射2X10⁶MC38结肠肿瘤细胞。4天后，启动治疗方案。测试抗体以0.1ml体积进行每小鼠0.2mg的腹腔注射，每周3次。肿瘤体积测量为WxLxL/2，其中W为肿瘤宽度，L为肿瘤长度。图8表明，所公开的抗体VK-B8的效力大于市售抗体贝伐单抗(；抗VEGF配体人源化抗体)。

实施例4

本实施例展示了市售抗VEGF(配体)人源化单克隆抗体贝伐单抗()与VK-B8(即本申请公开的全人抗VEGFR2(受体)抗体)对A431表皮样瘤细胞生长(以实体瘤体积为量度)的作用的体内对比数据。向裸鼠鼠皮下注射2X 10⁶A431表皮样瘤细胞。4天后，启动治疗方案。测试抗体以0.1ml体积进行每小鼠0.2mg的腹腔注射,每周3次。肿瘤体积测量为W x Lx L/2，其中W为肿瘤宽度，L为肿瘤长度。图9表明，所公开的抗体VK-B8的效力相似于市售抗体贝伐单抗(；抗VEGF配体人源化抗体)。

实施例5

本实施例展示了市售抗VEGF(配体)人源化单克隆抗体贝伐单抗()与(1)爱必妥(Erbitux，西妥昔单抗，一种人源化抗EGFR抗体)、(2)A6(一种全人抗EGFR抗体)、(3)A6+贝伐单抗()的组合、(4)A6+爱必妥的组合，以及(5)A6+VK-B8(VK-B8即本申请公开的全人抗VEGFR2(受体)抗体)对A431表皮样瘤细胞生长(以实体瘤体积为量度)的作用的体内对比数据。向裸鼠鼠皮下注射2X10⁶A431表皮样瘤细胞。4天后，启动治疗方案。测试抗体以0.1ml体积进行每小鼠0.2mg的腹腔注射,每周3次。肿瘤体积测量为W x L x L/2，其中W为肿瘤宽度，L为肿瘤长度。图10表明，各处理组的效力相似，其中组合和A6+VK-B8组合表现出的对肿瘤生长抑制性的效力最高。

实施例6

本实施例展示了VK-B8的细胞EC₅₀测量的体外数据。实验方案：将50000HUVECs溶于100μl FACS缓冲液(PBS+2％FBS)，等份移入96孔尖底板的孔中。在FACS缓冲液中制得以50μg/ml(3.33X 10^-7M)为起点的VK-B812点3倍稀释曲线。对细胞进行离心沉淀，然后以FACS缓冲液洗涤一次，随后以25μl抗体溶液重悬浮为3份重复试样。培养0.5小时后，以FACS缓冲液洗涤细胞1次并以50μl PE缀合羊抗人IgG(γ-链特异性)二抗(Southern Biotech生物公司，Cat#2040-09)重新悬浮。再次培养细胞0.5小时，然后以FACS缓冲液洗涤一次，并以25μl的FACS缓冲液重悬浮，使用Intellicyt HTFC流式细胞仪测定FL2-H通道中的中位荧光强度值。

实验结果：VK-B8对HUVECs的细胞结合EC₅₀测得为1.3nM。在Graph Pad Prizm软件中以非线性回归拟合对数据进行了分析和标绘。数据点(图4)表示为阳性标记细胞的中位荧光强度值(MFI)+/-标准差。

实施例7

本实施例展示了细胞结合的体外数据，作为包括VK-B8在内的数种本申请公开的抗体的初步筛选的一部分。实验方案：将100000HUVECs溶于100μl FACS缓冲液(PBS+2％FBS)，等份移入试管中。对细胞进行离心沉淀，然后以FACS缓冲液洗涤一次，随后以25μl抗体溶液加上10μg/ml所述抗体重悬浮为3份。培养0.5小时后，以FACS缓冲液洗涤细胞1次并以100μl PE缀合羊抗人IgG(γ-链特异性)二抗(Southern Biotech生物公司，Cat#2040-09)重新悬浮。再次培养细胞0.5小时，然后以FACS缓冲液洗涤一次，并以300μl的FACS缓冲液重悬浮，使用FACSAria流式细胞仪(BD)测定FL2-H通道中的中位荧光强度值。

实验结果：与背景染色(对照)相比，本申请公开的抗VEGFR2抗体对HUVECs的细胞结合性强。柱状图中显示了特定荧光强度的样本总数。蓝色柱状图为VEGFR2特异性抗体，红色柱状图为背景对照。所示数据是多次试验的结果。

实施例8

本实施例展示了VK-B8(抗VEGFR2)和FDA批准的抗VEGF贝伐单抗()对VEGF介导的HUVEC增殖的抑制作用的体外数据的对比。实验方案：将补充有生长因子等的100μlEBM-2培养基(Lonza)中的50000HUVECs移入白色不透明96孔细胞培养板中。24小时后，移除培养基，PBS缓冲液洗涤细胞一次，随后在50μl无添加(基础)EBM-2培养基中饥饿培养(starve)18小时。以50μl无添加(基础)EBM-2培养基将抗体稀释为2倍指定浓度，然后在移除饥饿培养基后添加至细胞中。培养1小时后，添加50μl浓度为200ng/ml的VEGF(VEGF的终浓度为100ng/ml)。然后培养细胞48小时，随后使用Promega Cell Titer Glo试剂盒来评估增殖。荧光输出与细胞数目直接成正比。

实验结果：VK-B8抑制住了VEGF刺激下的HUVEC增殖(图7)。增殖抑制等同于等剂量贝伐单抗()。所示数据为三联样本的平均相对发光强度单位+/-标准误差。

实施例9

本实施例展示了VEGF刺激下的HUVECs VEGFR2受体的自磷酸化的体外数据。实验方案：将补充有生长因子等的2.5ml EBM-2培养基(Lonza)中的100000HUVECs移入12孔细胞培养板中。24小时后，移除培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞一次，随后在1ml无添加(基础)EBM-2培养基中饥饿培养(starve)18小时。以1ml无添加(基础)EBM-2培养基将抗体稀释为2倍指定浓度，然后在移除饥饿培养基后添加至细胞中。培养0.5小时后，添加溶于1ml基础培养基的浓度为200ng/ml的VEGF(VEGF的终浓度为100ng/ml)。然后培养细胞30分钟，以PBS洗涤细胞并以1倍细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Buffer，Cell Signaling公司)进行裂解。使用细胞信号传导途径扫描ELISA抗体对(Cell Signaling Path Scan ELISA AntibodyPair，#7824)，根据厂商说明来检测VEGFR2的磷酸化，其中修改了体积来配合半区板(所有体积减半)。

实验结果：以100ng/ml VEGF处理HUVECs，以激活VEGFR2自磷酸化。以VK-B8和其他克隆对细胞进行预处理阻断了该VEGFR2激活。贝伐单抗()处理展示出对VEGFR2自磷酸化的预期抑制作用。所示数据(图6)为三联样本的450nm平均吸光度+/-标准误差。

实施例10

本实施例展示了VK-B8对VEGF刺激下的HUVECs VEGFR2受体的自磷酸化的抑制作用的体外数据。VEGFR2一结合VEGF，即在酪氨酸1175(Tyrosine1175)处开始激活自磷酸化，引发下游信号传导并激活细胞事件，例如增殖和细胞迁移。为了评估VK-B8对VEGFR2被VEGF激活的抑制作用，将补充有生长因子等的100μl EBM-2培养基(Lonza)中的50000HUVECs移入96孔细胞培养板中。24小时后，移除培养基，PBS缓冲液洗涤细胞一次，随后在100μl无添加(基础)EBM-2培养基中饥饿培养(starve)18小时。然后，细胞与连续稀释曲线的VK-B8的预培养15分钟，然后与终浓度为50nM的VEGF共培养5分钟。以PBS洗涤细胞并以1倍细胞裂解缓冲液(Cell Signaling公司)进行裂解。使用细胞信号传导途径扫描ELISA抗体对(CellSignaling Path Scan ELISA Antibody Pair，#7824)，根据厂商说明来检测VEGFR2在Tyr1175的磷酸化，其中修改了体积来配合半区板(所有体积减半)。使用450nm吸光度相对于抗体浓度的绘图和非线性回归来测定IC₅₀值(图11)。VK-B8对VEGF诱导的VEGFR2受体的自磷酸化的抑制作用的IC₅₀为0.12nM。

实施例11

本实施例展示了VK-B8对VEGF刺激下HUVECs的p44/p42MAPK(Erk1/2)磷酸化的抑制作用的体外数据。VEGFR2一结合VEGF，即开始激活自磷酸化，引发信号级联反应，激活p44/p42MAPK(Erk1/2)的磷酸化。为了评估VK-B8对该激活的抑制作用，将补充有生长因子等的100μl EBM-2培养基(Lonza)中的50000HUVECs移入96孔细胞培养板中。24小时后，移除培养基，PBS缓冲液洗涤细胞一次，随后在100μl无添加(基础)EBM-2培养基中饥饿培养(starve)18小时。然后，细胞与连续稀释曲线的VK-B8预培养15分钟，然后与终浓度为50nM的VEGF共培养5分钟。以PBS洗涤细胞并以1倍细胞裂解缓冲液(Cell Signaling公司)进行裂解。使用细胞信号传导途径扫描ELISA抗体对(Cell Signaling Path Scan ELISA AntibodyPair，#7824)，根据厂商说明来检测VEGFR2在Tyr1175的磷酸化，其中修改了体积来配合半区板(所有体积减半)。使用450nm吸光度相对于抗体浓度的绘图和非线性回归来测定IC₅₀值(图11)。VK-B8对VEGF诱导的p44/p42MAPK(Erk1/2)磷酸化的抑制作用的IC₅₀为0.08nM。

实施例12

本实施例展示了VK-B8对VEGF介导的HUVECs增殖的抑制作用的体外数据。VEGF激活内皮细胞的VEGFR2的作用之一在于触发增殖。在肿瘤学中，肿瘤会分泌VEGF来操纵血管微环境，引起血管增殖和扩展并最终导致血管入侵肿瘤。对该过程的抑制被发现会功能性地令肿瘤饿死。为了评估VK-B8对该VEGF介导的内皮细胞增殖的抑制作用，将补充有生长因子等的100μl EBM-2培养基(Lonza)中的50000HUVECs移入96孔细胞培养板中。24小时后，移除培养基，PBS缓冲液洗涤细胞一次，随后在100μl无添加(基础)EBM-2培养基中饥饿培养(starve)18小时。然后，细胞与连续稀释曲线的VK-B8预培养15分钟，然后与终浓度为50nM的VEGF共培养48小时。为了测量增殖，使用了Promega Cell Titer 96非放射性细胞增殖试剂盒。570nm的吸光度与细胞数目直接成正比。使用570nm吸光度相对于抗体浓度的绘图和非线性回归来测定该作用的IC₅₀值(图13)。VK-B8对增殖的抑制作用的IC₅₀为14nM。

实施例13

本实施例展示了VK-B8对VEGF介导的HUVECs迁移的抑制作用的体外数据。VEGF激活内皮细胞的VEGFR2的作用之一在于触发迁移。在肿瘤学中，肿瘤会分泌VEGF来操纵血管微环境，引起血管迁移并入侵肿瘤。对该过程的抑制被发现会功能性地令肿瘤饿死。为了评估VK-B8对该VEGF介导的内皮细胞迁移的抑制作用，将每样本80000HUVECs与连续稀释曲线的VK-B8预培养20分钟，然后移入96孔改进博伊登室(modified Boyden Chamber，NeuroProbe公司，8μm孔径)的上板位点中。下板中则含有终浓度为5ng/ml的VEGF。接种细胞20小时后，计数通过膜迁移至下板的细胞数量，并相对于抗体浓度作图(图14)。根据非线性回归计算出的VK-B8对VEGF介导的HUVECs迁移的抑制作用的IC₅₀为0.5nM。

实施例14

本实施例展示了VK-B8对VEGF-C刺激下HUVECs VEGFR2受体自磷酸化的抑制作用的体外数据。除VEGF(VEGF-A)以外，该生长因子家族中的其他成员也可以结合并激活VEGFR2，导致功能性后果。生长性因子VEGF-C能够结合并激活VEGFR2和VEGFR3。在此，我们展示了VK-B8阻断VEGF-C对VEGFR2的激活的能力。为了评估VK-B8对VEGF-C激活VEGFR2的抑制作用，将补充有生长因子等的100μl EBM-2培养基(Lonza)中的50000HUVECs移入96孔细胞培养板中。24小时后，移除培养基，PBS缓冲液洗涤细胞一次，随后在100μl无添加(基础)EBM-2培养基中饥饿培养(starve)18小时。然后，细胞与连续稀释曲线的STI-A0168(VK-B8)预培养15分钟，然后与终浓度为1μg/ml的VEGF-C共培养5分钟。以PBS洗涤细胞并以1倍细胞裂解缓冲液(Cell Signaling公司)进行裂解。使用细胞信号传导途径扫描ELISA抗体对(Cell Signaling Path Scan ELISA Antibody Pair，#7824)，根据厂商说明来检测VEGFR2在Tyr1175的磷酸化，其中修改了体积来配合半区板(所有体积减半)。使用450nm吸光度相对于抗体浓度的绘图和非线性回归来测定IC₅₀值(图15)。VK-B8对VEGF-C诱导的VEGFR2自磷酸化的抑制作用的IC₅₀为1.9nM。

实施例15

本实施例提供了已识别抗体的亲和度测量、EC₅₀测量和IC₅₀测量的简表。

*为以下文献中已发表的数据：Lu,D.,etal.,278:43496-43507,JBC(2003)。

序列表：

Claims (7)

1.一种与VEGFR2表位结合且结合亲和度至少为10^-6M的IgG类全人抗体，其中所述全人抗体具有如SEQ ID NO.77所示的重链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO.78所示的轻链可变域氨基酸序列。

2.一种与VEGFR2表位结合的全人抗体Fab片段，其具有重链可变域和轻链可变域，其中，所述抗体Fab片段具有如SEQ ID NO.77所示的重链可变域氨基酸序列和如SEQ IDNO.78所示的轻链可变域氨基酸序列。

3.一种与VEGFR2表位结合的单链人抗体，其具有重链可变域、轻链可变域、连接重链和轻链可变域的连接肽，其中，所述单链人抗体包括如SEQ ID NO.77所示的重链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO.78所示的轻链可变域氨基酸序列。

4.用于治疗癌症的抗VEGFR2多肽，其中所述抗VEGFR2多肽选自：

a.与VEGRF2表位结合且结合亲和度为至少10^-6M的IgG类全人抗体；

b.与VEGFR2表位结合且具有重链可变域和轻链可变域的全人抗体Fab片段；和

c.与VEGFR2表位结合且具有重链可变域、轻链可变域以及连接所述轻链可变域和重链可变域的连接肽的单链人抗体；

其中，所述抗VEGFR2多肽具有如SEQ ID NO.77所示的重链可变域氨基酸序列和如SEQID NO.78所示的轻链可变域氨基酸序列；

其中，所述抗VEGFR2多肽以治疗癌症的有效剂量给药。

5.根据权利要求4所述的用于治疗癌症的抗VEGFR2多肽，其特征在于，所述癌症选自：膀胱癌、骨癌、脑癌、乳房癌、软骨癌、结肠癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴结癌、骨髓癌、神经组织癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、骨骼肌癌、皮肤癌、脊髓癌、脾癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、气管癌、泌尿生殖道癌、输尿管癌、尿道癌、子宫癌和阴道癌。

6.根据权利要求4所述的用于治疗癌症的抗VEGFR2多肽，其特征在于，所述抗VEGFR2多肽与有效剂量的抗肿瘤剂联用以治疗癌症，

其中所述抗肿瘤剂选自：5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷长春碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛、新长春碱、长春碱、诺考达唑、埃博霉素、诺维本、依托泊苷、替尼泊苷、放线菌素、安吖啶、蒽环类药物、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲密胺奥利沙伯、异环磷酰胺、美法仑、merchlorehtamine、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、泰素、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺、依托泊苷、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、米托蒽醌、博来霉素光神霉素、丝裂霉素、L-天冬酰胺酶氮芥、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、六甲密胺、噻替派、卡莫司汀、链佐星、达卡巴嗪甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特、雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特、来曲唑、阿那曲唑、肝素、组织纤维溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；breveldin、环孢霉素、他克莫司、西罗莫司、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、TNP-470、染料木黄酮曲妥珠单抗、维甲酸、多柔比星、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、eniposide、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松、泼尼松龙；且

其中所述抗VEGFR2多肽和抗肿瘤剂同时使用或先后使用。

7.一种药物组合物，其包含如权利要求1-3任一项所述的抗体、抗体Fab片段或单链人抗体，以及药学上可接受的载体。