KR20020019905A - Ｖｅｇｆ를 선택적으로 억제하여 암을 치료하는 조성물 및방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명에서는, VEGF가 2가지의 VEGF 수용체 중에서 하나의 수용체 (VEGFR2)에 결합하는 것을 특이적으로 억제하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는, 안지오제네시스를 효과적으로 억제하며, 종양 퇴행을 유도하고, 특이성으로 인해 안전성이 우수하다. 따라서, 본 발명에서는, 암 및 기타의 안지오제네시스성 질환을 치료하기 위한 새로운 항체-기초 조성물, 방법 및 복합 프로토콜을 제공한다. 또한, 본 발명에서는 새로운 VEGF-특이성 항체를 이용한 유익한 면역 컨쥬게이트 및 전구약물 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

ＶＥＧＦ를 선택적으로 억제하여 암을 치료하는 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR CANCER TREATMENT BY SELECTIVELY INHIBITING VEGF}
화학 치료제에 대해 암 세포가 내성을 가지게 되는 것은 임상 종양학 분야에있어서 큰 문제가 되고 있다. 사실상, 이러한 점이, 이 분야에 있어서 발전이 있었음에도 불구하고 대부분의 많은 형태의 인간의 암이 화학 치료법에 대해 효과적으로 내성을 나타내는 주요 이유 중의 하나이다.
다른 암 치료 방법은, 항-종양 세포 항체를 사용하여 독소를 종양 세포에 전달하는 면역 독소 (immunotoxin)의 사용이다. 하지만, 화학 치료법과 마찬가지로, 고형 종양에 사용할 경우에는 면역 독소법도 큰 문제점을 가진다. 예를 들면, 항원-네가티브 세포 (즉, 항원-결핍 세포)는 살아남을 수 있으며, 종양이 다시 군집을 이루게 되거나 전이성 단계로 발전할 수 있다.
고형 종양이 항체에 기초한 치료법에 대해 내성을 나타내는 또 다른 이유는, 일반적으로 항체 및 면역 독소와 같은 거대분자 제제는 종양체에 흡수될 수 없기 때문이다 {참조: Burrows 등, 1992; Dvorak 등, 1991a; Baxter 및 Jain, 1991}. 종양 내에서의 간질 압력 (interstitial pressure) 및 물리적 확산 거리가 이러한 치료법을 크게 제한하는 요소이다. 따라서, 인간의 모든 암의 90% 이상을 차지하는 고형 종양은 항체 및 면역 독소 치료법에 대해 저항성을 가지게 된다.
보다 최근의 치료 방법은, 고형 종양의 혈관 (vasculature)을 표적으로 하는 것이다. 종양 세포 자체가 아닌 종양 세포의 혈관을 표적으로 하게 되면, 내성을 가지는 종양 세포가 발생되는 것을 막을 수 있고, 표적 세포에 쉽게 접근할 수 있다는 잇점이 있다. 또한, 많은 종양 세포들이 산소 및 영양분 공급을 받기 위해 하나의 혈관에 의존하기 때문에, 혈관을 파괴시키게 되면 항종양 효과가 증폭된다 {참조: Burrows 및 Thorpe, 1994a; 1994b}. 혈관 표적 방법의 예는, 항-세포 제제및 독소를 종양 혈관 마커 (marker)에 표적 전달시키는 것을 구체적으로 기술하고 있는 미합중국 특허 제5,855,866호 및 제5,965,132호에 기재되어 있다.
혈관을 표적으로 하는 방법 중에서 또 다른 효과적인 방법은, 종양 혈관내에 발현 또는 흡수된 마커에 응고 인자(coagulant)를 표적시키는 방법이다 {참조: Huang 등, 1997; 미합중국 특허 제5,877,289호, 제6,004,555호 및 제5, , 호 (특허출원 제08/482,369호, 특허등록료 납부일: 1998년 10월 20일)}. 독소 대신에 응고 인자를 종양 혈관에 전달시키는 방법은, 면역 반응을 줄이고 독소의 부작용 위험을 줄일 수 있다는 장점이 있다. 미합중국 특허 제5,877,289호에 기재된 바와 같이, 상기한 종양-특이성 "응고 리간드 (coaguligand)"에 사용할 바람직한 응고 인자는, 혈액 응고의 주요 시발 인자, 조직 인자 (TF) 및 인간의 응고 유도 단백질의 절단 형태(truncated version)이다.
독소 및 응고 인자를 종양 혈관에 특이적으로 전달하는 방법은 종양 치료에 있어서의 큰 발전을 나타내지만, 소정의 말초 종양 세포는 이러한 치료법에 의한 종양내 파괴를 견뎌낼 수 있다. 따라서, 항-안지오제네시스 방법은 미합중국 특허 제5,855,866호 및 제5,877,289호에 기재된 종양 파괴 방법과 함께 사용된다.
항-안지오제네시스 종양 치료법은, 주로 고형 종양의 말단부에서 자라 나오는 혈관의 증식을 억제하는 것에 기초한다. 이러한 치료법은, 미세 전이 (micrometastasis)의 위험을 줄이거나, 보다 전형적인 치료 (예를 들면, 외과 수술 또는 화학 치료) 후에 고형 종양이 추가적으로 성장하는 것을 억제하는 데에 대개 사용된다.
안지오제네시스 (angiogenesis)는 존재하는 혈관 및/또는 순환하는 내피 간세포 (endothelial stem cell)로부터 새로운 혈관체 (vasculature)가 발생하는 것이다 {참조: Asahara 등, 1997; Springer 등, 1998; Folkman 및 Shing, 1992}. 안지오제네시스는, 여러 생리학적 과정 (예를 들면, 배 생성, 상처 치유 및 월경)에 있어서 핵심적인 역할을 수행한다. 또한, 안지오제네시스는 소정의 병리학적 문제에서도 중요하다. 고형 종양의 성장 및 전이에서의 역할에 덧붙여, 안지오제네시스 성분에 의한 기타의 다른 뚜렷한 상황들로는 관절염, 건선 및 당뇨성 망막증이 있다 {참조: Hanahan 및 Folkman, 1996; Fidler 및 Ellis, 1994}.
안지오제네시스는, 표적 조직 및 멀리 떨어진 부위에서 생성된 안지오제네시스 자극제 및 억제제의 균형을 통해 정상 조직 및 악성 조직에서 조절된다 {참조: Fidler 등, 1998; McNamara 등, 1998}. 혈관 내피 성장 인자-A [VEGF, 혈관 투과성 인자(VPF)로도 불림]는 안지오제네시스의 주요 자극제이다. VEGF는, 저산소증 및 발암성 돌연변이에 의해 유도되고 다양한 조직에서 생성될 수 있는, 다기능성 사이토카인이다 {참조: Kerbel 등, 1998; Mazure 등, 1996}.
병리적인 상황에서 VEGF가 안지오제네시스의 주요 자극제임을 알게 됨으로써, VEGF의 활성을 차단하려는 시도가 많이 있어왔다. VEGF 신호전달을 방해하기 위해, 억제성 항-VEGF 수용체 항체, 가용성 수용체 작제물, 안티센스 방법, VEGF에 대한 RNA 앱타머 (aptamer) 및 저분자량 VEGF 수용체 타이로신 카이네이즈 (RTK) 억제제가 제안되었다 {참조: Siemeister 등, 1998}. 사실상, VEGF에 대한 모노클론 항체는, 마우스에서의 복수 (ascite) 형성 및 인간의 종양이종이식편(xenograft) 성장을 억제하는 것으로 관찰되었다 {참조: Kim 등, 1993; Asano 등, 1998; Mesiano 등, 1998; Luo 등, 1998a, 1998b; Borgstrom 등, 1996, 1998}.
상기 연구들이 고형 종양 성장에 있어서의 VEGF의 중요성 및 종양 치료에 있어서 표적으로 할 수 있음을 강조하고 있으나, VEGF-유도 안지오제네시스을 억제하는 추가의 제제를 밝혀냄으로써 치료 방법 선택의 수를 증가시킬 수 있다는 잇점이 있다. VEGF 수용체 결합을 보다 특이적으로 억제하는 치료제의 개발은, 항-종양 효과가 향상된 특이성과 실질적으로 상쇄되지 않는 한, 당해 분야에서 중요한 발전을 의미할 것이다.
본 발명은, 권리의 포기 (disclaimer) 없이 전체 내용 및 도면이 구체적으로 참조 문헌으로서 포함되어 있는 현재 계류중인 미합중국 일부(provisional) 특허 출원 제60/131,432호 (출원일: 1999년 4월 28일)를 우선권으로 주장하고 있다. 국립보건국으로부터 승인받은 IROI CA74951, 5RO CA54168 및 T32 GM07062과 관련한 본 발명에 대한 소유권은 미합중국 정부에 속한다.
전체적으로, 본 발명은 항체, 안지오제네시스 (angiogenesis) 및 암 치료 분야에 관련된 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명에서는, 2가지의 VEGF 수용체 중 하나의 수용체 (VEGFR2)에 VEGF가 결합하는 것을 특이적으로 억제하는 항-VEGF 항체를 제공한다. 상기 항체는 안지오제네시스를 억제하고 암 퇴행을 유도하며, 특이적인 방해 특성으로 인해 안정성이 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 항체에 기초한 조성물 및 방법은, 전구 약물을 포함하여 면역 컨쥬게이트 (immunoconjugate) 및 기타의 치료 배합, 킷트 및 방법의 용도로 확장 사용될 수 있다.
하기 도면은 본원 명세서의 일부분을 구성하며, 본 발명의 소정의 양태를 보여주기 위해 포함된 것이다. 본 발명은 본원의 상세한 설명 및 하나 이상의 하기 도면을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1: 2C3는 ABAE 세포의 VEGF에 의해 매개되는 성장을 억제한다. ABAE 세포를 다양한 항체 및 0.5nM VEGF의 존재하에 성장시켰다. 4일 후, MTS (Owen 시약)를 yellow formazan(노란색 포르마잔) 으로 효소 변환시켜 성장을 측색하였다. 이러한 측정 결과는, VEGF 만을 사용하여 성장시킨 대조 웰(control well)에서의 포르마잔 생성률로 나타난다. VEGF 또는 항체없이 세포를 성장시켜 배경 (background)를 측정한 후, 상기한 대조 웰 및 샘플 웰로부터 차감하였다. 이 결과는 3중 측정값의 산술 평균을 나타내며, 표준 편차는 항상 산술 평균의20% 미만이었다. 포지티브 대조군으로서 mAb를 포함하는 항-VEGF IgG 항체에 대한 성장 곡선, 및 네가티브 대조군으로서 비-관련성 특이성의 IgG (대조 IgG)에 대한 성장 곡선을 보여준다.
도 2: ELISA에서, 2C3는 VEGF가 VEGFR2에 결합하는 것을 차단하지만, VEGFR1에 결합하는 것은 차단하지 않는다. VEGFR1의 세포외 도메인 (Flt-1/Fc) 또는 VEGFR2의 세포외 도메인 (sFlk-1)으로 웰을 코팅한 후, 1nM의 VEGF만을 사용하여 웰을 인큐베이션시키거나, 100nM 또는 1000nM의 기재된 IgG의 존재하에 VEGF을 사용하여 웰을 인큐베이션시킨다. 그리고나서, 상기 플레이트를 1㎍/ml의 토끼의 항-VEGF (A-20, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)와 함께 인큐베이션시키고, 퍼옥시데이즈-융합된 염소 항-토끼 항체를 사용하여 전개시켰다. 3중으로 분석하였다. 본 도면에서 항체 부재하에 평균 결합률 및 표준 편차를 보여주고 있다. *는, Student-쌍 T 테스트에 의해 항체 부재하에서의 수치와 통계적으로 유의성있는 차이(p〈0.002)가 있는 수치를 보여준다.
도 3A 및 3B: 2C3는 인간의 종양 이종이식편의 생체내 성장을 억제한다. 도3A: 제0일째, 1×107NCI-H358 NSCLC 세포를 nu/nu 마우스에 피하 주사하였다. 도3B: 제0일째, 5×106A673 횡문근육종 (rhabdomyosarcoma) 세포를 nu/nu 마우스에 피하 주사하였다. 그리고 나서, 제1일째 및 2회/주씩, 기재된 IgG를 마우스에 i.p. 주사하였다. 2C3를 투여량 100, 10 또는 1(㎍/주사)로 투여하고, 비관련성 특이성의 대조 IgG (도 3A) 및 3E7 (도 3B)를 투여량 100(㎍/주사)로 투여하였다. 1주에 2 내지 3회에 걸쳐 종양을 측정하였다. 도 3A에서는 연구 기간동안에는 평균 및 표준 오차를 보여주고 있으며, 도 3B에서는 연구 마지막 날 (제26일) 동안의 데이터를 보여주고 있다.
도 4: 2C3 치료는 형성된 인간의 NCI-H358 NSCLC 종양 이종이식편의 크기를 감소시킨다. 크기가 대략 300 내지 450mm3인 피하 NCI-H358 종양을 가지고 있는 마우스에 대해, 기재된 시기에 50㎍ 또는 100㎍의 2C3 (n=14), mAb 4.6.1 (n=5), 3E7 (n=12) 또는 대조 IgG (n=9)로 i.p. 치료하였다. 116일 동안에 걸쳐 SEM 및 평균 종양 체적을 보여준다.
도 5A 및 도 5B: 형성된 인간의 종양 이종이식편의 2C3 및 3E7 치료를 비교한 도면이다. 도 5A: 크기가 대략 450mm3인 피하 NCI-H358 종양을 가지고 있는 마우스에 대해, 2C3 (n=6) 또는 3E7 (n=4)로 치료하였다. 치료 (T)는, 500㎍의 IgG를 i.v. 투여한 초기 치료를 제외하고는, 100㎍의 IgG를 i.p. 투여한 것이다. SEM 및 평균 종양 체적을 보여준다. 본 연구의 최종일 (제116일)에, 상기 마우스를죽인 후에 종양을 절단하여 중량을 측정하였다. 2C3 치료 그룹에 대한 평균 종양 중량은 0.054g인 반면, 3E7 치료 그룹은 0.545g이었다. 도 5B: 크기가 대략 250mm3인 피하 HT1080 종양을 가지고 있는 마우스에 대해, 100㎍의 2C3 (n=9), 3E7 (n=11), 대조 IgG (n=11) 또는 염수 (n=11)을 i.p. 투여하였다. T로 표시된 바와 같이 2일에 한번씩 마우스를 치료하였다. 각 그룹의 50% 이상의 마우스가 큰 궤양을 가진 종양을 가지게 됨으로써, 2C3로 치료받지 않은 마우스를 제26일째에 죽였다. SE 및 평균 종양 체적을 보여준다.
발명의 요약
본 발명은, 새로운 치료 조성물 및 항-안지오제네시스 및 항-종양 치료에 사용하는 방법을 제공함으로써 선행 기술의 단점들을 극복하였다. 본 발명은 VEGF가 2가지의 주요 VEGF 수용체 중 하나의 수용체 (VEGFR2)에 대해서만 결합하는 것을 선택적으로 억제하는 항체에 기초한 것이다. 상기 항체는, 이미 임상 시험 중인 것을 포함한 기타의 항-VEGF 항체들과 동일한 정도로 유효하게 안지오제네시스를 억제하고 종양 퇴행을 유도하며, 선별적인 차단 특성에 기닝하여 안정성이 향상되었다. 또한, 본 발명의 조성물 및 방법은, 제공되는 특정 카테고리의 항체를 사용하여 전구 약물을 포함한 복합체 및 면역 컨쥬게이트의 사용에도 확장된다.
본 발명이 갖는 특정 잇점은, 본 발명의 항체는 VEGF가 VEGFR1이 아닌VEGFR2에 대해서만 결합하는 것을 억제한다. 이는, VEGF가 VEGFR1 및 VEGFR2 모두에 결합하는 것을 억제하는 A4.6.1을 포함한 선행 기술의 주요 항체들과 상이하다. VEGFR1은 안지오제네시스와 무관한 생물학적 역할, 특히 마크로파지 이동, 화학주성 (chemotaxis), 및 오스테오클라스트 (osteoclast) 및 콘드로클라스트 기능에 중요한 역할을 하기 때문에, 본 발명에서와 같이 VEGFR2-매개 안지오제네시스 만을 억제할 수 있는 능력은 뛰어난 잇점이다. 이는, 마크로파지가 숙주의 항-종양 반응을 매개할 수 있으며 골 대사 (예를 들면, 소아암 치료시)는 부작용 효과가 없다는 점에 있어서, 임상적으로 큰 잇점으로 생각된다.
추가의 잇점은, VEGF의 VEGFR1 수용체에 대한 결합은 본 발명의 항체의 존재하에서도 유지되기 때문에, 종양 내피에서 상향 조절 (up-regulation)되는 VEGFR1 수용체에 결합하는 VEGF에 결합함으로서 부착된 치료제를 종양 혈관체로 특이적으로 전달하는 데에 사용될 수 있다는 점이다. 따라서, 면역 컨쥬게이트의 경우, 본 발명에서는 동일한 분자내에 항-안지오제네시스 및 종양 파괴 특성 모두를 가지는 제제를 제공한다.
또한, 본 발명의 조성물이 VEGFR2 수용체를 통해 매개되는 VEGF의 생존 신호를 중화시킬 수 있다는 추가의 잇점이 있다. 따라서, 본 발명의 노출된(naked) 항체 및 융합된 항체는 기타의 다른 치료법 및/또는 부착된 제제 (특히, VEGF가 파괴 특성을 상쇄시킬 수 있기 때문에 생체내에서는 최대 효능을 발휘할 수 없는 방법 및 제제)와 시너지 효과를 가지는 복합체를 형성한다.
따라서, 본 발명에서는, VEGF가 VEGFR2 수용체에 결합하는 것을 특이적으로차단하거나 기본적으로 VEGFR2 수용체에 대해서만 결합하는 것을 차단하는 항체를 제공한다. 상기 항체는, VEGF가 VEGFR2 수용체 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 유의성 있게 (significantly) 억제하는 반면, VEGFR1 수용체 (Flt-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하지 않는다. 따라서, 상기 항체는 VEGF가 VEGFR2 수용체 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것은 억제하지만, VEGFR1 수용체 (Flt-1)에 결합하는 것은 실질적으로 억제하지 않으며; 생체내에서 항-안지오제네시스 및 항-종양 효과를 나타내고; 마크로파지 화학주성, 오스테오클라스트 및 콘드로클라스트 기능을 유의성 있게 억제하지 않는다.
따라서, 본 발명의 항체는 간단하게 "VEGFR2-차단, VEGFR1-비차단, 항-VEGF 항체"로 불린다. 더 간단하게는, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법에 대해 언급시 간단하게 사용도록, 본 발명의 항체는 "VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체"로 부른다. "VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체"는, VEGF가 VEGFR2 수용체에 결합하는 것을 차단하는 VEGF에 대한 항체이다. 분명한 것은, 상기 항체는 VEGFR2 수용체 자체에 대한 항체는 아니다.
본 발명 이전에는, VEGF가 VEGFR2 수용체(VEGFR1 수용체는 제외)에 결합하는 것을 특이적으로 억제하는 항-VEGF 항체를 생산하려는 시도는 없었으며, 이러한 항체의 잇점에 대해서도 생각하지 못했다. 중요한 점은,
차단 항체는 성장 인자 및 이의 수용체의 상호 작용을 물리적으로 방해할 필요가 있으며, 성장 인자 상의 수용체 결합 부위의 크기는 제한이 있기 때문에, 상기한 특이적인 "VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체"가 개발될 수 있을 거라는 제안은 없었다.
하지만, 본 발명자들이 본원에 개시한 바와 같이, 상기한 특이적인 억제성 항-VEGF 항체는 제조될 수 있으며 큰 잇점을 가지는 것을 알 수 있다. 또한, 본원에서는 후보 "VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체"를 생산하는 방법, 및 후보 집단 중에서 실질적인 "VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체"를 선별하는 데에 필요한 통상의 분석 기술을 기술하고 있다. 따라서, 본 발명에 의해, 일련의 "VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체"가 제조될 수 있으며, VEGFR1 수용체를 통해 VEGF 신호 전달을 억제하지 않고 큰 결함 및 부작용 없이 안지오제네시스의 억제와 안지오제네시스 질환 및 종양의 치료를 포함한 다양한 양태로 사용가능하다.
본원 전체에 걸쳐 사용되고 있는 바와 같이, 용어 "a" 및 "an"는, 특별하게 상한치를 정한 경우를 제외하고는, 언급된 성분 또는 단계가 "적어도 하나", "적어도 제1", "하나 이상" 또는 "복수"인 것을 의미한다. 따라서, 본원의 용어 "항체(an antibody)"는 "적어도 제1 항체"를 의미한다. 단일 제제의 용량에서와 마찬가지로, 사용가능한 한계 및 복합 파라미터는 본원의 기재내용에 비추어 당업자들에게는 공지된 것이다.
"VEGF가 VEGFR2 수용체 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 특이적으로 억제하는" 항체는, 경쟁 분석법 및/또는 기능 분석법을 통해 동정될 수 있다. 간단하게는, 바람직한 분석법은 ELISA에 기초한 경쟁 분석법이다. 경쟁 분석법에 있어서, 다양한 용량의 테스트 항체 (예를 들면, 100배 내지 1000배 몰 과량)와 VEGF를 예비 혼합(pre-mix) 또는 혼합(admix)한 후, VEGF가 VEGFR2에 결합하는 것을 테스트 항체가 감소시킬 수 있는 능력을 측정한다. VEGF를 예비-표지시키고 직접 검출하거나, (제2) 항-VEGF 항체 또는 제2 및 제3 항체 검출 시스템을 사용하여 검출할 수 있다. 이러한 경쟁 분석법에서 바람직한 포맷은 ELISA 포맷이나, 어떠한 형태의 면역 경쟁 분석법도 사용될 수 있다.
상기한 경쟁 분석법에 있어서, 전혀 상관성이 없는 항체 (비-차단 항-VEGF 모노클론 항체)의 존재하에 VEGF가 VEGFR2에 결합하는 것은 대조 상한치 (control high value, 100%)이다. 테스트 분석에 있어서, 테스트 항체의 존재하에 VEGF의 VEGFR2에 대한 결합도가 유의성 있게 감소한다는 것은, VEGF가 VEGFR2 수용체 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 테스트 항체가 유의성 있게 억제한다는 것을 보여준다.
유의성있는 감소 (significant reduction)는 결합에 있어서의 재현가능한 (reproducible), 즉 일관되게 관찰되는, 감소이다. 본원에서의 "유의성있는 감소"는, VEGF에 대한 약 100배 내지 약 1000배 몰 과량의 항체의 양에서 적어도 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60% 또는 약 65%의 재현가능한 감소 (VEGF의 VEGFR2에의 결합에 있어서)를 의미한다.
본 발명의 바람직한 양태는 제공된 항체가 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 실질적으로 억제하지 않는 것이기 때문에, 이러한 항체가 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 실질적으로 억제하지 않는 한, VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 온건한 정도로(moderately) 유의성있게 감소시키는 항체가 유용할 것이다. 이러한 항체는, VEGF에 대한 약 100배 내지 약 1000배 몰 과량의 항체의 양에서 적어도 약70%, 약 75% 또는 약 80%의 재현가능한 감소 (VEGF의 VEGFR2에의 결합에 있어서)시킬 수 있는 항체이다. 본 발명을 실시하는 데에 반드시 필요한 것은 아니지만, VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상 감소시키는 항체들도 제외되는 것은 아니다.
VEGF가 VEGFR2 수용체 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 억제하는 반면에 VEGFR1 수용체 (Flt-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하지 않는 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 상기한 바와 같은 단순한 경쟁 분석법 및 VEGFR1을 사용하여 손쉽게 확인할 수 있다.
유의성 있게 감소하지 않는 것은, 재현가능한(reproducible), 즉 일관되게 관찰되는(consistently observed), "실질적인 결합의 유지(substantial maintenance of binding)"이다. 본원에서의 "실질적인 결합의 유지"는, VEGF에 대한 약 100배 내지 약 1000배 몰 과량의 항체의 양에서 적어도 약 60%, 약 75%, 약 80% 또는 약 85%의 재현가능한 유지 (VEGF의 VEGFR1에의 결합에 있어서)를 의미한다.
VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 실질적으로 억제하지 않는 항체를 사용하는 이유는, VEGFR1에 의해 매개되는 생물학적 기능들을 유지하기 위해서이다. 따라서, 항체는 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 충분히 유지시킴으로써 VEGF에 의해 생물학적 반응이 유도된다. 그럼에도 불구하고, 보다 바람직한 항체는 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 유지시킬 수 있는 보다 유의성 있는 능력을 가지는 항체이다. 이러한 항체는, VEGF에 대한 약 100배 내지 약 1000배 몰 과량의 항체의 양에서 적어도 약88%, 약 90%, 약 92%, 약 95% 또는 약 98 내지 99% 수준으로 VEGF의 VEGFR1에의 결합을 유지시킬 수 있는 재현가능한 능력을 가지는 항체이다.
VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 보다 실질적으로 억제시키는 항체는 VEGFR1에 대한 결합에 있어서 보다 큰 감소를 용인할 수 있다. 이와 마찬가지로, VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 온건한 정도로 억제시키는 항체의 경우, VEGFR1에 대한 결합의 유지가 보다 엄격하게 요구되어진다.
VEGF가 VEGFR2 수용체 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 억제하는 항체의 동정 및/또는 확인하기 위한 또 다른 바람직한 결합 분석법은 공-침전 분석 (co-precipitation assay)이다. 공-침전 분석법에서는, 용액 중의 하나 이상의 수용체에 VEGF가 결합하는 것을 차단할 수 있는 소정의 항체의 능력을 테스트한다. 이러한 분석에서, VEGF 또는 검출가능하게 표지된 VEGF를 적합한 형태의 수용체와 함께 인큐베이션시킨다.
면역 침전 분석 또는 공-침전 분석을 수행하는 데에는 여러 가지의 포맷이 있다. 본 발명의 경우, "적합한 형태의 수용체"는 문제가 되는 VEGFR2 수용체이거나 이 수용체의 세포외 도메인일 수 있다. 면역 침전 분석의 경우, 표준 시약 이외에도, VEGFR2 수용체에 대한 항체 또는 VEGF가 결합하는 부위와는 상이한 VEGFR2 수용체의 세포외 도메인 상의 에피토프가 필요하다. 본 발명에서는, 다른 "적합한" 형태의 VEGF 수용체, 즉 Fc 항체 부위에 연결된 VEGF 수용체의 세포외 부도메인을 제공한다. 상기 수용체/Fc 작제물은 효과적인 면역침전 조성물 (예를 들면, 단백질 A를 기본으로 한 조성물)과 함께 인큐베이션시킴으로써 침전될 수 있다.
상기한 적합한 수용체와는 무관하게, 상기 면역 침전 분석 또는 공-침전 분석을 대조군 (control)과 함께 수행하는 것이 바람직하다. 선택된 수용체에 대한 VEGF의 결합능력은 항-VEGF 항체가 존재하지 않는 상태에서 침전시켜 확인할 수 있어야 한다. 바람직하게는, 대조군으로서 작용하는 공지된 결합 특성을 가진 항체가 존재 또는 비-존재하는 상태에서 병행 인큐베이션을 수행한다. 가장 바람직하게는, 차단 대조 항체 및 비-차단 대조 항체 모두를 사용하여 병행 분석한다.
그리고 나서, 예를 들면, 효과적인 면역침전 조성물 (예를 들면, 단백질 A 조성물 또는 단백질 A 세팔로즈 비드)과 함께 인큐베이션시켜, 부착된 면역 종 (immunological species)을 면역 침전시킨다. 그리고 나서, 침전물에 대해 VEGF 존재 여부를 테스트한다. 초기 인큐베이션시의 VEGF가 검출가능하게 표지된 VEGF (예를 들면, 방사선으로 표지된 VEGF)인 경우, 면역 침전물에서의 VEGF는 직접 검출가능하다. 면역 침전물 중에서 표지되지 않은 VEGF는 기타의 적합한 수단 (예를 들면, 항-VEGF 항체를 이용한 면역 검출법 및 겔 분리법)을 이용하여 검출될 수 있다.
상기한 공-침전 분석의 경우, 정성적인 결과 또한 중요하지만, VEGF의 VEGF 수용체 (예를 들면, VEGFR2)에 대한 결합을 억제할 수 있는 항체의 능력은 손쉽게 정량화시킬 수 있다. 표지된 VEGF를 직접 측정하거나, 예를 들면, 면역 검출된 VEGF를 밀도 측정 분석함으로써, 정량화할 수 있다. 따라서, VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 억제할 수 있는 재현가능한 (즉, 일관되게 측정되는) 능력을 보이는 항체를 검출할 수 있으며, 상기 요약된 정량화 기준에 따라 유용한 항체를 선택할 수 있다.
또한, 상기한 공-침전 분석법을 사용하고, VEGFR2 대신에 VEGFR1을 사용하여, VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR1 (Flt-1)에 대한 결합을 유의성 있게 억제하지 않는 항-VEGF 항체를 손쉽게 동정할 수 있다. 따라서, VEGF가 VEGFR2 수용체 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 억제하는 반면에 VEGFR1 수용체 (Flt-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하지 않는 항-VEGF 항체를 상기 방법에 따라 용이하게 동정할 수 있다.
또한, 본원에서는 소정의 VEGF가 VEGFR2 수용체 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 유의성 있게 억제하는 지를 동정 및/또는 확인하는 다양한 기능 분석법을 제공한다. 이는, 일반적으로, 소정의 생물학적 반응에 관여하는 수용체로서의 VEGFR2의 동정과 관련되어 있다. 무-세포(cell-free) 시스템에서 수행되고 가장 재현가능성이 높고 신뢰성이 크며 노동을 줄일 수 있으며 비용 효과적인 상기한 경쟁형 분석법보다는 덜 바람직하지만, 하기의 분석법도 본 발명의 범위에서는 유용하다.
예를 들면, VEGF-매개 내피세포 성장의 억제 (VEGF의 유사분열 능력을 억제) 능력이 있는 지를 테스트함으로서 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체를 동정할 수 있다. 테스트 항체를 사용하거나 사용하지 않고, VEGF의 존재하에서 다양한 내피 세포를 사용하여 적합하게 분석할 수 있다. 바람직하게는, 예를 들면, 소정의 특성을 가진 대조 항체 (차단 및 비-차단 항체)를 이용한 분석 및 VEGF를 사용하지 않은 분석과 같이, 듀플리케이트 분석을 병행하여 수행한다. 세포수를 측정하는 데에 사용될 수 있는 수단 (색 계측 분석을 포함)을 이용하여, 내피 세포 성장을 측정할 수 있으며, 바람직하게는 정확하게 정량화할 수 있다.
VEGF-매개 내피 세포 성장을 억제할 수 있는 항체는, 일반적으로 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 등의 VEGF-매개 내피세포 성장 억제율을 일관되게 보인다. 이러한 범위의 억제율은, 생체내에서 안지오제네시스를 억제하기에 충분한 특성을 가진 항체임을 나타낸다. 이보다 더 큰 유의성의 억제 활성을 가지는 항체가 본 발명에서 제외되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항체를 동정하는 또 다른 기능 분석은, VEGF-유도 인산화의 차단을 테스트하는 분석이다. 어떠한 형태의 본래의 (naive)- 또는 재조합-인산화가능한 VEGFR2를 발현하는 다양한 내피 세포를 사용하여 적합하게 분석할 수 있다. 적합한 시간 동안, 테스트할 항체의 존재 또는 비-존재하에서 VEGF와 함께 세포를 인큐베이션시킨다. 바람직하게는, 소정의 특성을 가진 대조 항체 (차단 및 비-차단 항체 모두)를 이용한 분석 및 VEGF를 사용하지 않는 분석과 같이, 듀플리케이트 분석을 병행 수행한다.
적합한 수단을 이용하여 VEGFR2의 VEGF-유도 인산화를 측정하고, 바람직하게는 정확하게 정량화할 수 있다. 일반적으로, VEGFR2를 면역 침전시켜 추가로 분석한다. VEGFR2의 인산화 정도를 직접 측정할 수 있으며, 예를 들면,32P-표지된 ATP와 함께 상기 세포를 인큐베이션시켜 면역 침전된 VEGFR2 내의32P를 직접 정량화할 수 있다. 바람직하게는, 면역침전된 VEGFR2를 기타의 다른 수단 (예를 들면, 포스포티로신 잔기에 결합하는 항체를 이용한 면역 검출법 및 겔 분리법)을 사용하여 분석한다. 일반적으로, VEGFR2의 VEGF-유도 인산화 억제 능력을 가진 항체의 경우, 인산화된 VEGFR2의 수준이 일관되게 감소됨을 관찰할 수 있다.
본 발명에 따른 "VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체"를 동정하는 또 다른 기능 분석은, VEGF-유도 혈관 투과의 억제를 테스트하는 분석이다. 상기한 분석이 사용될 수는 있으나, 특히 적합한 분석은 마일즈 투과 분석 (Miles permeability assay)이다. 이 분석에서는, 기니아 피그와 같은 동물에 염료 (예를 들면, Evan's blue dye)를 주입한 후, 테스트 항체의 존재 또는 비-존재하에서 VEGF를 제공한 후에 상기 동물 피부에서 상기 염료가 나타나는 지를 측정한다. 바람직하게는, 소정의 특성을 가진 대조 항체 (차단 및 비-차단 항체 모두)를 이용한 분석 및 VEGF를 사용하지 않는 분석과 같이, 듀플리케이트 분석을 병행 수행한다. 상기 동물의 피부에서 염료가 나타나는 경우에는 통상적으로 파란색의 점과 같은 점 (spot) 형태로 동물의 등쪽에 나타나므로, 사진을 찍거나 측정할 수 있다.
"VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체"는, VEGF에 대한 100배 또는 1000배 몰 과량에서와 같이 낮은 농도하에서 일관되게 억제하는 바와 같이 VEGF-유도 혈관 투과를 억제할 것이다. VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 차단하지 않는 항체는, VEGF-유도 혈관 투과를 유의성있게 억제하지 않을 것이다. 일반적으로, VEGF에 대해 10배 몰 과량과 같이 높은 농도하에서만 VEGF-유도 투과성을 차단하는 항체는 본 발명에 따른 특성을 가진 항체는 아니다.
안지오제네시스 및 항-안지오제네시스 제제에 대해 널리 받아들여지고 있는기능 분석은, 신생 혈관에 대한 각막 미세포켓 분석 및 병아리 융모요막 분석 (CAM) 분석이다. 특히 본원에서 참조문헌으로 포함되어 있는 미합중국 특허 제5,712,291에서는, 매우 광범위한 범위의 안지오제네시스 질환의 치료에 사용될 수 있는 제제를 동정하는 데에 있어서, 각막 미세포켓 및 CAM 분석으로 충분히 예측할 수 있다.
또한, 본원에서 참조문헌으로 포함되어 있는 미합중국 특허 제5,001,116호에서는 CAM 분석에 대해서 기술하고 있다. 기본적으로, 수정된 병아리 배를 제3일 또는 제4일째에 껍질로부터 제거한 후, 테스트 화합물을 함유하는 메틸셀룰로즈 디스크를 융모요막에 이식한다. 약 48시간 이후에 상기 배(embryo)를 검사한 후, 메틸셀룰로즈 디스크 주위에 투명한 무혈관 부위(avascular zone)가 나타나면 무혈관 부위의 직경을 측정한다. 본원에서 참조문헌으로 포함하고 인용하고 있는 미합중국 특허 제5,712,291호에서 기재하고 있는 바와 같이, 본 발명과 관련하여, 무혈관 부위가 보이게 되면 항-안지오제네시스 항체임을 증명하기에 충분하다. 무혈관 부위가 클수록, 항체의 효능은 더 큰 것이다.
신생 혈관의 각막 미세포켓 분석은, 랫트 또는 토끼의 각막을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 생체내 모델은, 본원에 참조문헌으로 포함되어 있는 미합중국 특허 제5,712,291호 및 제5,871,723호에서 증명하고 있는 바와 같이, 임상에서의 유용할 수 있다는 것을 예측할 수 있는 방법으로서 널리 받아들여지고 있다. 본 발명과는 특별히 관련성이 없는 것일 수 있으나, 상기한 각막 분석이 CAM 분석에 비해 바람직한 데, 각막 분석은 그 자체로는 비활성이나 대사 경로를 거쳐 활성 화합물을 만들어 내는 화합물을 일반적으로 찾아낼 수 있기 때문이다.
본 발명에 있어서, 항-안지오제네시스 제제를 동정하기 위해 각막 미세포켓 (corneal micropocket) 분석을 이용한다. 이는, 안지오제네시스의 유의성 있는 감소를 일관되게 관찰할 수 있는 경우, 바람직하게는 각막 내의 혈관 수가 크게 감소하는 경우에 확인된다. 바람직하게는, 상기 반응은, 테스트 물질과 접촉한 경우에 지속된 성장을 보이지 않는 듬성듬성한 돌기 (occasional sprout) 및/또는 헤어핀 루프 (hairpin loop) 만을 보이는 각막으로 정의된다.
본 발명의 "VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 (및 항원-결합 단편)"의 예로는 하기의 항체들이 있다:
(a) VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 대한 결합을 유의성있게 억제하는 항체;
(b) VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR1 (Flt-1)에 대한 결합을 유의성있게 억제하지 않는 항체;
(c) VEGFR2의 VEGF-유도 인산화를 억제, 바람직하게는 유의성있게 억제하는 항체;
(d) VEGF-유도 혈관 투과을 억제, 바람직하게는 유의성 있게 억제하는 항체;
(e) VEGF-매개 내피세포 증식을 억제, 바람직하게는 유의성 있게 억제하는 항체;
(f) 안지오제네시스를 억제, 바람직하게는 유의성 있게 억제하는 항체;
(g) 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트의 VEGFR1-매개 자극또는 활성화를 유의성있게 억제하지 않는 항체; 및
(h) 혈관생성된 종양을 가진 동물에게 투여한 경우, 종양 혈관체 및 종양 기질로 찾아가는 항체.
본 발명의 특정 양태는, 생체내에서 뛰어난 항종양 효과를 가지지만 VEGF가 VEGFR1 수용체에 결합하는 것을 억제하지 않는, VEGR의 VEGFR2 수용체에 대한 결합을 특이적으로 억제하는 항체에 대한 본원의 발명자의 발견에 기초한 것이다. 따라서, 본 발명의 소정의 양태에서는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)과 기본적으로 동일한 에피토프에 결합하는, 소정의 에피토프-특이성을 가진 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본원의 명세서 및 용이하게 입수가능한 기술 문헌, 노하우 및 출발 물질에 근거하여 본원에서 청구한 발명이 이루어질 수 있다. 이에 불구하고, 상기한 2C3 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 라인 샘플을 American Type Culture Collection (ATCC, 미합중국 VA 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불러버드 10801 소재)에 2000년 3월 27일에 제출 (수취일: 3월 28일)하여 기탁하였으며, 2000년 4월 11일에 기탁번호 ATCC PTA 1595를 부여받았다. 상기 기탁은, 특허 획득을 위한 미생물 기탁에 관한 국제 조약인 부다페스트 조약 및 이의 시행 규칙에 따라 이루어졌다. 상기 하이브리도마는, 관련된 특허청구항에 대한 미합중국 특허 부여후 부다페스트 조약의 규정에 따라 ATCC로부터 입수가능하다. 상기 기탁된 하이브리도마가 입수 가능하다고 하는 것이, 특허법에 따라 정부의 권한하에 부여된 권리에 반하여 본 발명을 실시할 수 있는 라이센스를 의미하는 것으로 간주되지는 않는다.
따라서, 바람직한 조성물은,
모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)과 실질적으로(substantially) 동일한 에피토프에 결합하는, 적어도 제1 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 적어도 정제된 제1 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물;
모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)과 기본적으로(essentially) 동일한 에피토프에 결합하는, 적어도 제1 모노클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물; 및
모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)과 동일한 에피토프에 결합하는, 적어도 제1 항-VEGF 모노클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물이다.
하지만, 본 발명에 있어서 소정의 다른 조성물, 항체, 방법 및 특히 제1 및제2 의학적 용도에서는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)가 아닌 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)과 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
용어 "모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)과 동일하거나 거의 실질적으로 또는 기본적으로 동일한 에피토프"는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)과 교차반응 (cross-react)하는 항체를 의미한다. "교차 반응성 항체"는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)과 동일하거나 실질적으로 또는 기본적으로 동일한 에피토프를 인식하거나 결합하거나 이에 대해 면역특이성을 가지는 항체이므로, VEGF와의 결합에 대해 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)과 효과적으로 경쟁할 수 ㅣ있다. 간단하게는, "2C3-교차반응성 항체"는 "2C3-유사 항체" 및 "2C3-기초한 항체"라고 부를 수 있으며, 이 용어는 본원에서 상호 사용가능하며, 조성물, 용도 및 방법에 적용된다.
모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)과 동일하거나 거의 실질적으로 또는 기본적으로 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체를 동정하는 것은, 유용한 특성을 가진 2C3가 제공되어 있기 때문에 기술적으로 용이하다. 기준 항체(reference antibody)와 비교하여 교차반응성 항체를 동정하기 때문에, 모노클론 항체 2C3과 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 동정하기 위해, 기준 항체 (2C3) 및 테스트 항체가 결합하는 에피토프를 실제로 측정할 필요는 없다. 하지만, 2C3에 의해 결합되는 에피토프에 대한 많은 정보들이 본원에 기술되어 있으며, 본원에서 참조문헌으로 포함되어 있는 Champe 등 (1995) 기재한 바와 같이, 에피토프 맵핑을 추가로 수행할 수 있다.
항체 경쟁을 분석할 수 있는 다양한 면역 스크리닝 분석법을 사용하여 교차 반응성 항체를 용이하게 동정할 수 있다. 이러한 분석법은 당해 기술분야에서는 통상적인 방법으로서, 이에 대해서는 본원에서 상세하게 기재하고 있다. 미합중국 특허 제5,660,827호 (특허 부여일: 1997년 8월 26일)는, 2C3와 같은 소정의 항체의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제조하는 방법에 대해 본원의 기재 내용을 보충하기 위해 참조문헌으로서 본원에 포함되어 있다.
예를 들면, 상이한 동물 또는 상이한 이소타입 (isotype)으로부터 검사할 테스트 항체를 수집한 경우, 대조 항체 (2C3) 및 테스트 항체를 혼합 (또는 예비-흡수)시킨 후에 VEGF 항원 조성물에 도입시키는 간단한 경쟁 분석법을 이용할 수 있다. 용어 "VEGF 항원 조성물"은, 본원에 기재된 2C3-결합 VEGF 항원 (예를 들면, 자유 VEGF)을 함유하는 모든 조성물을 의미한다. 따라서, 상기한 단순 경쟁 분석 연구에 있어서, ELISA 및 웨스턴 블랏팅에 기초한 프로토콜을 사용하는 것이 적합하다.
본 발명의 소정의 양태에서는, 항원 조성물에 도입시키기 이전에 소정의 시간 동안 다양한 양 (예를 들면, 1:10 또는 1:100)의 항체와 대조 항체 (2C3)를 예비 혼합시킨다. 다른 양태에서는, 항원 조성물에 노출시키는 동안, 대조 항체 및 다양한 양의 테스트 항체를 간단하게 혼합시킬 수 있다. 어떠한 경우에 있어서도, 제2 종 또는 이소타입 항체를 이용하여 결합된 대조 항체만을 검출할 수 있으며, 실질적으로 동일한 에피토프를 인식하는 테스트 항체의 존재에 의해 이러한 결합은 감소하게 된다.
대조 항체와 테스트 항체 (종 또는 이소타입에 상관없이) 사이의 항체 경쟁 연구를 수행함에 있어서, 비오틴 또는 효소 표지 (또는 방사성 표지)와 같은 검출가능한 표지를 사용하여 대조 항체 (2C3)를 표지시킨 후에 동정할 수 있게 할 수 있다. 이 경우, 다양한 비율 (예를 들면, 1:10 또는 1:100) (및 임의적으로는 적합한 시간 경과후) 로 시험할 테스트 항체와 표지된 대조 항체를 함께 예비-혼합 또는 인큐베이션시키고 나서, 표지된 대조 항체의 반응성을 분석하여 대조치와 비교한다 (이때, 경쟁 가능성이 없는 테스트 항체는 함께 인큐베이션시키지 않는다).
이러한 분석은 항체 혼성화에 기초한 일련의 면역 분석 중 하나이며, 표지를검출하는 수단 (예를 들면, 비오틴화된 항체의 경우, 스트렙타비딘)을 이용하거나, 효소 표지를 가진 염색체 기질 (예를 들면, 퍼옥시데이즈를 가진 3,3'5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB))을 이용하거나, 간단하게 방사성 표지를 검출함으로써, 대조 항체를 검출한다. 대조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 효과적으로 경쟁하여 결합할 수 있을 것이므로, 결합된 표지의 감소를 통해 알 수 있는 바와 같이, 대조 항체의 결합을 유의성있게 감소시킬 것이다.
전혀 관련성이 없는 항체가 없는 경우에 (표지된) 대조 항체의 반응성은 상한 대조치 (high control value)가 된다. 하한 대조치 (control low value)는, 경쟁이 일어나서 표지된 항체의 결합이 감소될 때, 완전히 동일한 형태(2C3)의 비-표지된 항체와 표지된 항체 (2C3)를 함께 인큐베이션시킴으로써 수득할 수 있다. 테스트 분석에 있어서, 테스트 항체의 존재하에 표지된 항체의 반응성이 유의성있게 감소하는 것은 동일한 에피토프를 인식하는 테스트 항체 (즉, 표지된 2C3 항체와 교차반응하는 항체)가 있다는 것을 나타낸다.
유의성 있게 감소하는 것은, 재현가능한(reproducible), 즉 일관되게 관찰되는, 결합의 감소이다. 본원에서의 "유의성있는 감소"는, 약 1:10 내지 약 1:100의 비율 사이에서 적어도 약 70%, 약 75% 또는 약 80%의 재현가능한 감소 (ELISA에서 VEGF에 대한 2C3의 결합에 있어서)를 의미한다. 보다 엄격한(stringent) 교차-차단 활성을 가지는 항체의 재현가능한 감소 (ELISA 또는 기타의 적합한 분석에서 VEGF에 대한 2C3의 결합에 있어서)는, 약 1:10 내지 약 1:100의 비율 사이에서 적어도 약 82%, 약 85%, 약 88%, 약 90%, 약 92% 또는 약 95% 등이다. 본 발명의 실시에 필요하지는 않으나, 재현가능한 감소(VEGF에 대한 2C3의 결합에 있어서)가 약 99%, 약 98%, 약 97% 또는 약 96%와 같이 완전한 또는 거의 완전한 교차-차단되는 경우도 제외되지 않는다.
본 발명의 한 양태는, 하이브리도마 ATCC PTA 1595에 의해 생산되는 모노클론 항체 2C3 또는 이의 항원-결합 단편이다. 본 발명의 다른 양태는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항-VEGF 항체를 생산하는 하이브리도마이다.
또한, 본 발명에서는, 적어도 제1 면역원성 VEGF 성분을 이용하여 동물에게 면역 반응시키는 단계, 및 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 교차 반응하는 항체를 상기 면역된 동물로부터 선별하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항-VEGF 항체; 및 적어도 제1 면역원성 VEGF 성분을 이용하여 동물에게 면역 반응시키는 단계, 및 VEGF에 대한 2C3 항체의 결합을 실질적으로 감소시키는 항체를 동정함으로써 교차 반응성 항-VEGF 항체를 상기 면역된 동물로부터 선별하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항-VEGF 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하고, VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 대한 결합을 특이적으로 억제하는, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 VEGF가 VEGFR2 수용체 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 억제하는 반면에 VEGFR1 수용체 (Flt-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하지 않는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
수용체 경쟁 분석, ELISA 분석, 공-침전 분석 및/또는 기능 분석 및 2C3-교차반응성 분석 중 하나 이상 또는 결합하여, 상기 특성을 가지는 항체를 용이하게 동정할 수 있다. VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 일관되게 유의성있게 감소시키는 반면에 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합은 일관되게 유의성있게 감소시키지 않는 2C3-유사 항체의 정량 분석에 대한 지침은 상기에 기재되어 있다.
본원에서 2C3는, VEGFR2-코팅된 ELISA 웰 (well)에 결합하는 VEGF의 양을 약 26% 및 19% (각각, VEGR에 대해 100배 및 1000배 몰 과량에서)로 감소시키는 것으로 관찰되었다. 이러한 수치는, VEGR의 VEGFR2에 대한 결합을 각각 약 74% 및 약 81%를 감소시키는 것과 동일하다. 본원에서 2C3는, VEGFR2-코팅된 ELISA 웰에 결합하는 VEGF의 양을 약 92% 및 105% (각각, VEGR에 대해 100배 및 1000배 몰 과량에서)로 유지시키는 것으로 관찰되었다.
VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 보다 더 실질적으로 억제하는 2C3-유사 또는 교차반응성 항체의 경우, VEGFR1에 대한 결합이 보다 더 감소되더라도 이를 용인(tolerate)할 수 있을 것임을 이해할 수 있다. 이와 동일하게, VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 보다 온건한 정도로 (moderately) 억제하는 항체의 경우, VEGFR1에 대한 결합의 유지는 보다 엄격(stringent)해야 한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 있어서의 항-VEGF 항체 (및 이의 항원-결합 단편)는 다음과 같다:
(a) 웨스턴 블랏에서 VEGF에 대한 결합에 의해 분석할 수 있는 바와 같이, 비-형태상 의존성(non-conformationally dependent) VEGF 에피토프에 결합하는 항체;
(b) 자유 VEGF에 결합하는 항체;
(c) VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 대한 결합을 유의성 있게 억제하는 항체;
(d) VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR1 (Flt-1)에 대한 결합을 유의성 있게 억제하지 않는 항체;
(e) VEGF-유도되는 VEGFR2의 인산화를 억제, 및 바람직하게는 유의성 있게 억제하는 항체;
(f) VEGF-유도 혈관 투과를 억제, 및 바람직하게는 유의성 있게 억제하는 항체;
(g) VEGF-유도 내피세포 증식을 억제, 및 바람직하게는 유의성 있게 억제하는 항체;
(h) 안지오제네시스를 억제, 및 바람직하게는 유의성 있게 억제하는 항체;
(i) 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트의 VEGFR1-매개 자극 또는 활성화를 유의성있게 억제하지 않는 항체;
(j) 혈관생성된 종양을 가진 동물에게 투여하면, 종양 혈관체 및 종양 기질을 찾아가는 항체;
(k) 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
본 발명에 따른 조성물, 면역 컨쥬게이트, 약제, 배합물, 칵테일, 킷트, 제1 및 제2 의학적 용도 및 모든 방법에 대한 하기의 기재에 있어서, 용어 "항체" 및 "면역 컨쥬게이트" 또는 이의 항원-결합 단편은, 특별히 다르게 기재되어 있거나 과학 용어와 분명히 다르게 기술되어 있는 경우 이외에는, 특정 2C3-교차 반응성 항체 및 일련의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체를 의미한다.
본원에서 용어 "항체" 및 "면역 글로불린"은, 폴리클론 항체 및 모노클론 항체를 포함하여, 모든 면역성 결합 제제를 광범위하게 의미한다. 중쇄의 불변 도메인의 형태에 따라, 항체는 5가지의 주요 클래스 (IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 중 하나에 속한다. 이들 중 몇몇은, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등과 같이 서브클래스 또는 이소타입 (isotype)로 더 분류된다. 상이한 클래스의 면역 글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ이다. 상이한 클래스의 면역 글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형태는 이미 잘 알려져 있다.
일반적으로, 항원-결합 부위가 아닌 항체가 본 발명에서 사용되는 경우, IgG 및/또는 IgM이 바람직한데, 이는 생리적인 환경에서 상기 항체들이 가장 많은 항체이며, 실험실 세팅에서 가장 용이하게 제조할 수 있기 때문이다.
포유동물 항체의 "경쇄 (light chain)"은, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 2가지의 뚜렷이 구분되는 형태 중의 하나에 속한다 - 카파 (κ) 및 람다 (λ). 본 발명의 항체에 있어서, 카파 (κ) 경쇄를 사용하거나 람다 (λ) 경쇄를사용하거나 더 바람직한 것은 기본적으로 없다.
모노클론 항체 (MAb) 또는 이의 유도체를 사용하는 것이 더 바람직하다. MAb는 몇 가지의 잇점 (예를 들면, 재생산 가능성 및 대규모 생산 가능성으로 인해 임상 치료에 적합하다)이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서는, 쥐, 인간, 원숭이, 랫트, 햄스터, 래빗 및 개구리 또는 닭에서 유래하는 모노클론 항체를 제공한다. 쥐, 인간 또는 인간화된 모노클론 항체가 일반적으로 바람직하다.
따라서, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는, 항원 결합 부위를 가지는 모든 항원-유사 분자를 의미하며, Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체 (DAB), Fv, scFv (단일쇄 Fv), 선형 항체, 디아바디 (diobody) 등과 같은 항체 단편을 포함한다. 다양한 항체-기초 작제물 및 단편을 제조 및 사용하는 기술은 이미 잘 알려져 있다 {참조: Kabat 등, 1991, 본원에서 인용문헌으로서 포함되어 있음}. 특히, 디아바디에 대해서는 EP 제404,097호 및 WO 제93/11161호 (각각 본원에서 참조문헌으로 포함되어 있음)에서 추가로 기재되어 있으며, 선형 항체에 대해서는 Zapata 등 (1995, 본원에서 참조문헌으로 포함되어 있음)에서 추가로 기재되어 있다.
본 발명의 조성물에 관한 소정의 양태에서는, 서열 번호 제7 또는 제9의 아미노산 서열과의 동일성이 적어도 약 75%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 등의 아미노산 서열 부위를 포함하는, 제1 변이 부위를 적어도 포함하는 제1 항-VEGF 항체를 적어도 포함한다. 이 때, 상기한 항-VEGF 항체는2C3 항체에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체의 생물학적 특성을 적어도 실질적으로 유지한다.
본원에서 본 발명의 여러 가지의 항-VEGF 항체의 서열과 관련하여 "동일성 또는 유사성"은, 서열을 배열하고 최대 서열 동일성 퍼센트를 얻기 위해 필요한 경우에는 갭 (gap)을 삽입한 후, 후보 서열 (candidate sequence)에 있어서, 서열번호 제7 또는 제9의 서열과 동일한 아미노산 서열 잔기의 퍼센트 (%), 또는 본 발명의 다른 항-VEGF 항체의 서열과 동일한 아미노산 서열 잔기의 퍼센트 (%)로서 정의된다.
소정의 바람직한 양태에서는, 본 발명의 항-VEGF 항체는, 서열번호 제6 또는 제8의 핵산 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열 부위를 포함하는 변위 부위에 의해 예시되는 바와 같이, 서열 번호 제7 또는 제9의 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열 부위를 포함하는 제1 변이 부위를 적어도 포함한다. 상기 서열은, 중쇄 및 경쇄의 변이 부위의 CDR1-3 (complementarity determining regions)을 포함하는 2C3 ScFv의 Vh 및 Vk 서열이다.
다른 바람직한 양태에서는, 2C3와 같은 본래의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체와 비교하여 향상된 (즉, 보다 우수한) 특성을 가지는 제2세대 항체(the second generation antibody)가 제공된다. 예를 들면, 제2 세대 항체는 결합 친화성이 더 크며, VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 보다 더 효과적으로 차단하며, VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 보다 더 특이적으로 차단하며, VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 보다 덜 차단하며, VEGF-유도 증식 및/또는 내피세포의 이동을 억제하는 능력이 더 향상되었으며, VEGF-유도 혈관 투과성을 억제하는 능력이 더 우수하며, 바람직하게는 생체내에서 VEGF-유도 안지오제네시스를 억제하는 능력이 더 강화되었으며, 혈관생성된 종양을 포함하여 안지오제네시스 질환을 치료하는 능력이 더 강화되었다.
예를 들면, 본원에 기재된 여러 가지의 분석법을 하나 이상 이용하여 비교 분석 및 정량화하여, 효과적인 제2세대 항체를 용이하게 동정한다. 2C3 항체에 예시된 본 발명의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체와 비교하여, 적어도 약 10배, 바람직하게는 적어도 약 20배, 보다 바람직하게는 적어도 약 50배의 강화된 생물학적 특성 또는 활성을 가지는 제2 세대 항체가 본 발명에 포함된다.
소정의 양태에서는, 사용되는 항체가 "인간화된 (humanized)", 부분-인간 또는 인간의 항체이다. 일반적으로, "인간화된" 항체는, 인간의 불변 영역 및/또는 변이 영역 도메인을 포함하는, 마우스, 랫트 또는 비-인간 종으로부터 유래하는 키메라 모노클론 항체 ("부분-인간 키메라 항체")이다. 본 발명에서 사용되는 다양한 인간화된 모노클론 항체는, 마우스, 랫트 또는 기타의 비-인간 모노클론 항체의 적어도 제1 항원-결합 부위 (즉, 상보성 결정 부위 (CDR))가 인간 항체 불변 부위 (즉, 골격(framework))에 작동가능하게 부착 또는 이식(graft)되어 있다.
또한, 본원에서 사용되는 "인간화된 모노클론 항체"는, 하나 이상의 아미노산이 인간 항체에서 보다 공통적으로 관찰되는 아미노산과 교환된 비-인간 종으로부터 유래하는 모노클론 항체일 수 있다. 이는, 통상의 재조합 기술 (특히, 부위-특정 돌연변이)를 통해 용이하게 수행될 수 있다.
또한, 인간화된 항체가 아닌 완전한 인간의 항체를 제조하여 사용할 수 있다. 항원-표출 세포 및 항체-생산 세포를 포함한 혼합된 말초 혈액 림프구 집단을 인간 개체로부터 간단히 수득하고, 면역학적으로 효과적인 양의 VEGF 샘플로 혼합하여 실험실에서 상기 세포군을 자극함으로써, 상기한 인간의 항체를 건강한 개체로부터 얻을 수 있다. 인간의 항-VEGF 항체-생산 세포를 수득한 후, 이러한 세포를 하이브리도마 및/또는 재조합 항체를 생산하는 데에 사용한다.
인간의 모노클론 항체를 생산하는 다른 기법에서는, 면역학적으로 효과적인 양의 VEGF 샘플을 가진 인간 항체 라이브러리를 포함하는 형질전환 동물 (바람직하게는, 형질전환 마우스)을 면역시키는 것을 포함한다. 또한, 이는 하이브리도마 및/또는 재조합 항체 생산에 있어서 추가로 조작하기 위한 인간의 항-VEGF 항체-생산 세포를 생산하는 데, 말초 혈액 세포에 비해 비장 세포를 형질 전환 동물 또는 마우스로부터 용이하게 얻을 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체는 하기의 단계를 포함하는 공정 및 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다:
(a) 후보 항체-생산 세포를 제조하는 단계; 및
(b) VEGF가 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 유의성있게 억제하는 반면에 VEGFR1 수용체 (Flt-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하지 않는 항체를, 상기한 후보 항체-생산 세포로부터 선별하는 단계.
본 발명에 따른 다른 항체는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 교차반응하는 항체를 선별함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 적합한 제조 공정 및 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 후보 항체-생산 세포를 제조하는 단계; 및
(b) 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 교차반응하는 항체를 상기한 후보 항체-생산 세포로부터 선별하는 단계.
적합한 항체-생산 세포를 제조하고 이 세포로부터 항체를 수득하는 공정은, 소정의 환자에게 원위치(in situ)로 수행될 수 있다. 즉, 면역학적으로 효과적인 양의 면역원성 VEGF 샘플을 환자에게 단순히 제공함으로써, 적합한 항체를 생산할 수 있다. 따라서, 상기 항체는 항체-생산 세포로부터 수득되지만, 숙주로부터 단리되어 환자에게 제공될 필요가 없이 종양 혈관체를 즉시 찾아가서 생물학적인 항-종양 효과를 발휘할 수 있다.
또한, 적합한 항체-생산 세포를 수득한 후, 실험실내에서 VEGF로 말초 혈액 림프구를 자극시킴으로써 항체를 분리 및/또는 정제할 수 있다.
기타의 방법에서는, 적어도 제1 면역원성 VEGF 성분을 포함하는 면역 조성물을 동물에게 투여하는 단계; 및 VEGF가 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 유의성있게 억제하는 반면에 VEGFR1 수용체 (Flt-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하지 않고, 임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 교차 반응하는, 항체를 상기 면역된 동물로부터 선별하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서는 일반적으로 하기의 단계를 포함한다:
(a) 면역학적으로 효과적인 양의 면역원성 VEGF 샘플 (예를 들면, 제1 인간 VEGF 성분, 실질적으로 전장 VEGF 성분 또는 인간의 재조합 VEGF)을 적어도 1회, 및 임의적으로는 1회 이상 동물에게 투여하여 동물을 면역시키는 단계; 및
(b) VEGF가 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 유의성있게 억제하는 반면에 VEGFR1 수용체 (Flt-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하지 않고, 임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 교차 반응하는 항체를 생산하는 항체-생산 세포와 같은 적합한 항체-생산 세포를 상기 면역된 동물로부터 수득하는 단계.
VEGF 컨쥬게이트 또는 적합한 보조제 (예를 들면, Freund 완전 보조제)와의 배합 형태의 면역학적으로 효과적인 양의 VEGF 샘플을 투여한다. 면역원성을 증가시키기 위해서, 어떠한 실험 기법 또는 이의 변영 기법들도 사용할 수 있다. 본래의(intact), 실질적으로 전장인 인간의 VEGF가 면역원으로서 일반적으로 바람직하다.
면역 과정의 특성 또는 면역된 동물의 유형과는 상관없이, 면역된 동물로부터 적합한 항체-생산 세포를 수득하고, 인간의 손으로 추가 조작하는 것이 바람직하다. 본원에서의 "면역된 동물 (immunized animal)"은, 달리 표현되어 있지 않는 경우, 인간이 아닌 동물을 의미한다. 모든 항체-생산 세포가 사용될 수 있지만, 항체-생산 세포의 입수원으로서 비장 세포를 수득하는 것이 가장 바람직하다. 항체-생산 세포는 하기의 단계를 포함하는 제조 공정에서 사용될 수 있다:
(a) 본 발명에 따른 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하기 위해 불멸 세포 (immortal cell)와 적합한 항-VEGF 항체-생산 세포를 융합시키는 단계; 및
(b) 상기 하이브리도마로부터 본 발명에 따른 적합한 항-VEGF 항체를 수득하는 단계.
"적합한" 항-VEGF 항체-생산 세포, 하이브리도마 및 항체는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 {즉, VEGF가 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것을 유의성있게 억제하는 반면에 VEGFR1 수용체 (Flt-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하지 않고, 임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 교차 반응하는 항체}로서 존재하거나 이러한 항체를 생산한다.
따라서, 하이브리도마-기초 모노클론 항체 제조 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 면역학적으로 효과적인 양의 면역원성 VEGF 샘플 (바람직하게는, 본래의 인간 VEGF 샘플)을 적어도 1회, 및 임의적으로는 1회 이상 동물에게 투여하여 동물을 면역시키는 단계;
(b) 상기 면역된 동물로부터 모노클론 항체-생산 하이브리도마 컬렉션을 제조하는 단계;
(c) 본 발명에 따른 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 모노클론 항체, 임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 교차 반응하는 항-VEGF 항체를 생산하는 제1 하이브리도마를 상기 컬렉션으로부터 선별하는 단계;
(d) 상기한 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 모노클론 항체를 제공하기 위해, 상기한 적어도 제1 항체-생산 하이브리도마를 배양시키는 단계; 및
바람직하게는, (e) 상기 배양된 적어도 제1 하이브리도마로부터 상기한 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 모노클론 항체를 수득하는 단계.
모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 교차 반응하는 항-VEGF 항체를 동정하는 경우, 상기한 선별 단계는 하기의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 효과적인 양의 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595) 및 후보 항체를 VEGF 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(b) 2C3 항체의 VEGF 샘플에 대한 결합을 실질적으로 감소시킬 수 있는 후보 항체의 능력을 측정하는 단계
{이때, 2C3 항체의 VEGF 샘플에 대한 결합을 실질적으로 감소시킬 수 있는 후보 항체는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항-VEGF 항체임을 나타낸다}.
또한, 상기 선별 단계는 하기의 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(a) 결합하기에 효과적인 양의 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)를 제1 VEGF 샘플과 접촉시키고, VEGF에 결합하는 2C3의 양을 측정하는 단계;
(b) 경쟁하기에 효과적인 양의 후보 항체 및 결합하기에 효과적인 양의 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595) 배합물을 제2 VEGF 샘플과 접촉시키고, 후보 항체의 존재하에 VEG7F에 결합하는 2C3의 양을 측정하는 단계; 및
(c) VEGF에 결합하는 2C3의 양을 감소(바람직하게는, 적어도 80% 이상)시키는 후보 항체를 선별함으로써, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항-VEGF 항체를 동정하는 단계.
인간이 아닌 동물이 면역반응에 사용되기 때문에, 상기 하이브리도마로부터 수득되는 모노클론 항체는 종종 비-인간 조성 (non-humnan make up)을 가지는 경우가 종종 있다. 이러한 항체는, 임의적으로, 인간화 공정 (humanization process), 이식 또는 돌연변이를 시킬 수 있으며, 이러한 공정에 대해서는 당업자에게 공지되어 있으며, 본원에 추가로 참조문헌으로서 포함되어 있다. 이와 달리, 인간의 항체 유전자 라이브러리를 포함하는 마우스와 같은 형질전환 동물을 사용할 수 있다. 따라서, 이러한 동물을 면역시키면, 적합한 인간의 항체를 직접 생산할 수 있게 된다.
인간 항체 또는 비-인간 항체를 생산하는 적합한 항체-생산 세포 (가장 바람직하게는, 하이브리도마)를 생산한 후, "재조합" 모노클론 항체를 제조하기 위해 모노클론 항체를 코드하는 핵산을 클로닝할 수 있다. 상기 항체를 코드하는 핵산 서열을 합성하기 위해 PCRTM을 프라이머로 사용하는 방법을 포함하여, 모든 재조합 클로닝 기법을 사용할 수 있다. 따라서, 또 다른 적합한 모노클론 항체 제조 방법에는, 항체-생산 세포를 사용하여 하기의 단계를 포함하는 방법이 포함된다:
(a) 적합한 항-VEGF 항체-생산 세포 (바람직하게는, 하이브리도마)로부터 적합한 제1 항-VEGF 항체-코딩 핵산 분자 또는 분절을 적어도 수득하는 단계; 및
(b) 본 발명에 따른 재조합 VEGFR2-차단, 항-VEGF 모노클론 항체를 수득하기 위해, 상기한 핵산 분자 또는 분절을 재조합 숙주 세포에서 발현시키는 단계.
그러나, 재조합 모노클론 항체를 제조할 수 있도록 이상적으로 적합화시킨 기타의 다른 우수한 재조합 기법들도 사용할 수 있다. 이러한 재조합 기법들로는, 하기의 단계를 포함하는 파지미드 라이브러리(phagemid library)-기초 모노클론 항체 제조 방법이 포함된다:
(a) 면역학적으로 효과적인 양의 면역원성 VEGF 샘플 (예를 들면, 본래의 인간 VEGF 샘플)을 적어도 1회, 및 임의적으로는 1회 이상 동물에게 투여하여 동물을 면역시키는 단계;
(b) 상기 면역된 동물의 항체-생산 세포 (바람직하게는, 비장 세포)로부터 분리된 RNA를 발현하는 면역 글로불린 파지미드 복합 라이브러리를 제조하는 단계;
(c) 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체, 임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 교차 반응하는 항-VEGF 항체를 발현하는 적어도 제1 클론을 상기 파지미드 라이브러리로부터 선별하는 단계;
(d) 상기한 적어도 제1 선별된 클론으로부터 VEGFR2-차단, 항-VEGF를 코딩하는 핵산을 수득하고, 상기한 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 모노클론 항체를 제공하기 위해 상기한 핵산을 재조합 숙주 세포내에서 발현시키는 단계; 및
바람직하게는, (e) 상기한 핵산에 의해 발현된 상기한 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체를 상기 선별된 적어도 제1 클론으로부터 수득하는 단계.
또한, 상기 파지미드 라이브러리-기초 기법에서는, 인간의 항체 유전자 라이브러리를 함유하는 형질전환 동물을 사용할 수 있어서, 재조합 인간 모노클론 항체를 생산할 수 있다.
제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 핵산 절편의 제조 방식과는 무관하게, 표준 분자 생물 기법을 사용하여 다른 적합한 항체 핵산 절편이 용이하게 제조될 수 있다. 모든 변이체, 돌연변이체 또는 제2 세대 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 핵산 절편이 본 발명에서 사용하기에 적합한 지 여부를 확인하기 위해, 본 발명에 따른 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체의 발현을 확인하기 위해 상기 핵산 절편을 테스트한다. 변이체, 돌연변이체 또는 제2 세대 핵산 절편을, 바람직하게는 표준 혼성화 조건, 보다 바람직하게는 표준 스트린전트 혼성화 조건하에서 혼성화 여부를 확인하기 위해 테스트한다. 적합한 혼성화 조건의 예로는, 약 50℃에서 약 7%의 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 약 0.5M NaPO4, 약 1mM EDTA 에서 혼성화시키고; 약 42℃에서 약 1%의 SDS로 세척하는 것이 포함된다.
인간 또는 비-인간에서 유래하는 다양한 재조합 모노클론 항체는 용이하게 제조할 수 있기 때문에, 환자내에서 생물학적으로 효과적인 양의 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체를 발현하는 적어도 제1 핵산 절편을 동물 또는 환자에게 제공함으로써 본 발명의 치료 방법을 수행할 수 있다. 일반적으로, "VEGFR2-차단, 항-VEGF, 2CE-유사 또는 2C3-기초 항체를 발현하는 핵산 절편"은, 적어도 발현 작제물 형태일 수 있으며, 바이러스 또는 재조합 숙주 세포내에 포함되어 있는 발현 작제물 형태일 수 있다. 본 발명의 바람직한 유전자 치료 벡터는 바이러스 벡터이며, 예를 들면, 재조합 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 등이다.
또한, 본 발명에서는, 정제된 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 기본적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 조성물 또는 실험실 연구용 조성물일 수 있다.
본 발명에서는, 2C3-교차 반응성 항체, 2C3-유사 항체 또는 2C3-기초 항체를 포함한, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체의 다수의 방법 및 용도를 제공한다. 모든 방법에 있어서, 용어 "a" 및 "an"은, 특별히 기술되어 있는 경우를 제외하고는, 언급된 방법에 있어서 "적어도 하나", "적어도 제1", "하나 이상" 또는 "복수의" 단계를 의미한다. 특히, 이는 치료 방법에서의 투여 단계와 관련이 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상이한 투여량을 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 복합 주사를 포함하여 상이한 횟수로 투여 (예를 들면, 주사)할 수도 있다. 항-VEGF 치료 항체를 투여하기 이전, 투여한 이후 또는 투여하는 동안 배합 치료법을 사용하여 투여할 수 있다.
중요한 생물학적 의미를 가지는 여러 가지의 유용한 실험실 내 방법 및 용도가 제공된다. 일반적으로, VEGF (바람직하게는, 자유(수용체가 결합되지 않은) VEGF)를 포함하는 조성물을 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체와 효과적으로 접촉시키는 것을 포함하는, VEGF를 결합시키는 방법 및 이의 용도를 제공한다.
효과적으로 VEGF/항체 복합체를 형성할 수 있는 조건하에서, VEGF를 함유하는 것으로 예상되는 조성물과 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편 [임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체]을 접촉시키는 단계; 및 이렇게 형성된 복합체를검출하는 단계를 일반적으로 포함하는, VEGF를 검출하는 방법 및 VEGF를 검출하는 용도가 제공된다.
본 발명에서는, VEGF의 존재하에서 VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 효과적으로 억제하는 조건하에, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물과 VEGFR2 (KDR/Flk-1)을 발현하는 내피세포를 포함하는 세포군 또는 조직군을 접촉시키는 단계를 포함하는, VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 선택적으로 또는 특이적으로 억제하는 방법 및 용도를 제공한다.
본 발명에서는, VEGF의 VEGFR2에 대한 결합은 유의성있게 억제하는 반면에 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 유의성있게 억제하지 않는 방법 및 용도가 제공된다.
이러한 방법은, VEGF 존재하에서 VEGF의 VEGFR2에 대한 결합은 억제하는 반면에 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 유의성있게 억제하지 않는 데에 효과적인 조건하에, VEGFR2 (KDR/Flk-1) 및 VEGFR1 (Flt-1)을 발현하는 내피 세포군을 포함하는 세포군 또는 조직군을, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항-VEGF 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
또한, VEGFR2 및 VEGFR1으로 표현되는 VEGF 수용체의 생물학적 역할을 분석하는 본 발명의 방법 및 용도에서는 하기의 단계를 포함한다:
(a) VEGFR2 (KDR/Flk-1) 및 VEGFR1 (Flt-1) 수용체를 발현하는 세포군 및 VEGF를 포함하는 생물학적 조성물 또는 조직을, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항-VEGF 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계;
(b) VEGF에 대한 적어도 제1 생물학적 반응시, 상기한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체의 효과를 측정하는 단계
{이때, (i) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체의 존재하에 생물학적 반응의 변화는, VEGFR2 수용체에 의해 매개되는 반응을 보여주는 것이며;
(ii) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체의 존재하에 생물학적 반응의 유지는, VEGFR1 수용체에 의해 매개되는 반응을 보여주는 것이다}.
본 발명에서는, VEGF-유도 내피 세포 증식 및/또는 이동을 효과적으로 억제하는 조건하에, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물과, 내피 세포 및 VEGF를 포함하는 세포군 또는 조직군을 접촉시키는 단계를 일반적으로 포함하는, VEGF-유도 내피세포 증식 및/또는 이동을 특이적으로 억제하는 증식 억제 방법 및 용도가 제공된다.
본 발명에서는, VEGF-유도 마크로파지 화학주성을 유의성있게 억제하지 않으면서 VEGF-유도 내피 세포 증식 및/또는 이동을 효과적으로 억제하는 조건하에, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물과, 내피 세포, 마크로파지 및 VEGF를 함유하는 세포군 또는 조직군을 접촉시키는 단계를 일반적으로 포함하는, VEGF-유도 내피세포 증식 및/또는 이동을 억제하는 증식 억제 방법 및 용도가 제공된다.
또한, 본 발명에서는, VEGF의 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트에 대한 자극을 유의성있게 억제하지 않으면서 VEGF-유도 내피세포 증식 및/또는 이동 (및 임의적으로는 안지오제네시스)을 억제하는 방법 및 용도가 제공된다. 일반적으로, 상기 방법은, VEGF의 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트에 대한 자극을 유의성있게 억제하지 않으면서 VEGF-유도 내피 세포 증식 및/또는 이동 또는 안지오제네시스를 효과적으로 억제하는 조건하에, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물과, 적어도 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트 중 하나 이상 및 내피세포를 함유하는 세포군 또는 조직군을 접촉시키는 단계를 일반적으로 포함한다.
상기한 방법 및 용도는 실험실내 및 생체내에서 수행될 수 있다. 생체내에서 수행되는 경우, 상기 조직군 또는 세포군은 동물내에 위치하는 것이며, 상기 항-VEGF 항체를 상기 동물에게 투여한다. 상기한 2가지의 경우 모두의 방법 및 용도는, 안지오제네시스를 효과적으로 억제하는 조건하에서, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항-안지오제네시스 조성물과, 혈관생성-가능한(potentially angiogenic) 혈관 (즉, VEGF에 노출될 가능성이 있는 혈관) 또는 혈관군을 포함하는 조직을 접촉시키는 단계를 포함하는, 안지오제네시스 억제 방법 및 용도가 된다.
혈관생성-가능한 혈관군을 생체외 (ex vivo)에서 유지시키는 경우, 본 발명은 약물 발견 프로그램에서 유용하게 사용될 수 있다. 실험실 내-스크리닝 분석은, 안지오제네시스를 억제하거나 촉진하는 약물을 개발하고 안지오제네시스 반응에 대한 추가의 정보를 밝혀내는 데에 있어서 제1 단계로서 유용하다. 혈관생성-가능한 혈관군이 동물 또는 환자의 체내에 위치하는 경우, 상기 항-안지오제네시스 조성물을 상기 동물에게 치료 형태로 투여한다.
상기한 각각의 억제 방법에 있어서, "생물학적 유효량"은, VEGF-유도 내피세포 증식 및/또는 이동을 억제하기에 유효하고; VEGF-유도 마크로파지 화학주성을 유의성있게 억제하지 않으면서, VEGF-유도 내피세포 증식 및/또는 이동을 억제하기에 유효하며; VEGF의 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트에 대한 자극을 유의성있게 억제하지 않으면서 VEGF-유도 내피 세포 증식 및/또는 이동 또는 안지오제네시스를 억제하기에 유효하고; 결국, 혈관 성장 또는 안지오제네시스를 유효하게 억제하는 방식으로, 혈관 내피 세포의 증식 및/또는 이동을 감소시키기에 유효한; VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 (임의적으로, 2C3-기초 항체)의 양이다.
따라서, 본 발명에서는, VEGF의 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트에 대한 자극을 유의성있게 억제하지 않으면서 VEGF-유도 안지오제네시스를 억제하고, 바람직하게는 안지오제네시스 질환을 치료하는 방법 및 용도를 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은, VEGF의 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트에 대한 자극을 유의성있게 억제하지 않으면서 VEGF-유도 안지오제네시스를 억제하고 안지오제네시스 질환을 치료하기에 효과적인 조건하에, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물과, 적어도 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트 중 하나 이상을 함유하는 세포군 또는 조직군을 접촉시키는 단계를 일반적으로 포함한다.
본 발명에서는, 골 대사에 유의성있는 부작용을 유발하지 않으면서 VEGF-유도 안지오제네시스를 억제하고, 바람직하게는 안지오제네시스 질환을 치료하는 방법 및 용도를 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은, 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트의 활성을 유의성있게 손상시키지 않음으로써 골 대사에 유의성있는 부작용을 유발하지 않으면서 VEGF-유도 안지오제네시스를 억제하고 안지오제네시스 질환을 치료하기에 효과적인 조건하에, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물과, 적어도 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트 중 하나이상 및 혈관 내피 세포를 함유하는 혈관생성 혈관군 또는 조직군을 접촉시키는 단계를 일반적으로 포함한다.
본 발명에서는, 바람직하지 않으며, 적합하지 않고, 비정상적이고 과다하고/과다하거나 병리적인 혈관생성이 특징인 모든 종류의 질환을 가지고 있거나 발생시킬 위험이 있는 동물 및 환자에 있어서, 항-안지오제네시스 약물 스크리닝 (실험실내) 및 치료법 (생체내)이 제공된다. 비정상적인 안지오제네시스는 광범위한 질환에서 발생하기 때문에, 소정의 모델 시스템에서 효과적인 것으로 관찰된 항-안지오제네시스 치료법은 모든 범위의 안지오제네시스-관련 질환을 치료하는 데에 사용될 수 있다는 것은 당업자에게는 명백히 알려져 있는 사실이다.
특히, 본 발명의 방법 및 용도는, 모든 형태의 혈관생성된 종양; 연령-관련 퇴행성 반점과 같은 퇴행성 반점 (macular degeneration); 류마티스 관절염을 포함한 관절염; 아테로마성 동맥 경화증 및 아테로마성 동맥 경화증 플래이크; 당뇨성 망막증 및 기타의 망막증; Grave 질환을 포함한 갑상선 과증식; 혈관종 (hemangioma); 신생혈관 녹내장; 및 건선을 가지고 있거나 발생시킬 위험이 있는 동물 및 환자용으로 사용하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 방법 및 용도는 동정맥 이형성 (arteriovenous malformation, AVM), 수막종 (meningioma) 및 혈관성형 후 재발협착증 (restenosis)을 포함한 혈관 협착증을 가지고 있거나 발생시킬 위험이 있는 동물 및 환자를 치료하는 데에 사용하기 위한 것이다. 상기한 치료 방법 및 용도의 기타의 다른 대상은, 섬유성 혈관종 (angiofibroma), 피부염 (dermatitis), 자궁내막증(endometriosis), 호혈성 관절 (hemophilic joint), 과영양 상처, 염증성 질환, 화농생성 과립종 (pyogenic granuloma), 경피증 (scleroderma), 활막증 (synovitis), 기관지염 및 혈관 부착증을 가지고 있거나 발생시킬 위험이 있는 동물 및 환자이다.
본원에서 참조문헌으로 포함되어 있는 미합중국 특허 제5,712,291호에 기재되어 있는 바와 같이, 상기한 바람직한 치료 그룹 각각은 본 발명에 의해 치료되는 유형의 모든 조건은 아니다.
항-안지오제네시스 치료에 의해 효과적으로 치료될 수 있는 수많은 다른 조건을 동정할 목적; 소정의 카테고리의 안지오제네시스-억제 화합물이 개시되고 청구되면 (본 경우, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체, 임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체), 모든 안지오제네시스성 질환이 통합된 개념을 나타내는 것이라는 것을 보여줄 목적; 단일 모델 시스템에서만 수득한 데이터에 의해 모든 안지오제네시스성 질환을 치료할 수 있다는 것을 보여줄 목적을 포함한, 소정의 특정 목적을 위해 본원에서 미합중국 특허 제5,712,291호를 포함하고 있다.
본 발명의 다른 양태에서는, 미합중국 특허 제5,712,291호에 기재되어 있는 바와 같이, 본 발명의 방법 및 용도는, 혈관 섬유성 조직의 비정상적인 증식, 딸기코 (acne rosacea), 후천성 면역 결핍증, 동맥 폐쇄증, 아토피성 각막염 (keratitis), 박테리아성 궤양, Bechets 질환, 혈액 종양, 카로티드 폐쇄 질환, 화학적 화상, 맥락막 신생혈관증, 만성 염증, 만성 망막 탈착증, 만성포도막염(uveitis), 만성 유리체염 (vitritis), 콘택트 렌즈 과용, 각막 이식편 거부, 각막 신생혈관증, 각막 이식편 신생혈관증, Crohn 질환, Eales 질환, 상피 각결막염 (keratoconjunctivitis), 곰팡이성 궤양, 헤르페스 심플렉스 감염증, 헤르페스 조스터 감염증, 과점도증, 카포시 육종, 백혈병, 지질 퇴행증, Lyme 질환, 변연 표피박리 (marginal keratolysis), Mooren 궤양, 나병 (leprosy)를 제외한 미코박테리아 감염증, 근시 (myopia), 수정체 신생혈관 질환, 이와 (optic pit), Osler-Weber 신드롬 (Osler-Weber-Rendu, 골관절염, Pagets 질환, 국부 planitis, phemphigoid, phylectenulosis, polyarteritis, 레이저-치료후 합병증, 원생동물 감염증, 슈도크산토마 elasticum, pterygium keratitis sicca, 방사상 각막절개, 망막 신생혈관증, 성인전 망막질환, 수정체후방 섬유증식증, 유육종 (sarcoid), 공막염 (scleritis), 겸상 세포 빈혈증, Sogrens 신드롬, 고형 종양, Stargarts 질환, Steven's Johnson 질환, 상지 각막염 (superior limbic keratitis), 매독, 전신성 루퍼스, Terrien 변연 퇴행성 질환, 톡소플라스마증, 외상, Ewing 육종, 신경아세포종, 골육종, 망막아세포종, 횡문근육종 (rhabdomyosarcoma), 궤양성 회장염, 정맥 폐쇄증, 비타민 A 결핍증 및 Wegeners sarcoidosis을 가지고 있거나 발생시킬 위험이 있는 동물 및 환자를 치료하기 위한 것이다.
또한, 본 발명에서는, 미합중국 특허 제5,753,230호 (본원에서 참조문헌으로 포함)에 기재된 면역제제를 사용하여 관절염을 치료하는 것과 공통되는, 관절염을 가지고 있거나 발생시킬 위험이 있는 동물 및 환자를 치료하는 방법 및 용도를 제공한다. 당뇨병, 기생 질환, 비정상적인 상처 치유, 수술후 과영양증, 화상, 상처 또는 외상, 털 성장의 억제, 배란 및 황체 생성 억제, 자궁내의 착상 억제 및 배 발생 억제와 관련된 바람직하지 않은 안지오제네시스를 치료하는 데에 항-안지오제네시스 전략을 사용한다는 것을 예시해주는 미합중국 특허 제5,972,922호가 본원에서 참조문헌으로 포함되어 있다. 따라서, 상기한 모든 상태들은 본 발명의 방법 및 용도에 의한 치료에 사용되는 것으로 간주된다.
또한, 본원에 참조문헌으로 포함되어 있는 미합중국 특허 제5,639,757호에서는, 이식 거부 현상에 대한 일반적인 치료방법으로서 항-안지오제네시스의 사용을 예시하고 있다. 폐 염증, 신증 신드롬 (nephrotic syndrome), 자가전증 (preeclampsia), 심막 삼출 (pericardial effusion), 심막염 및 흉막 삼출을 VEGF 억제에 기초한 항-안지오제네시스 전략을 이용하여 치료하는 것에 대해 WO 제98/45331호 (본원에 참조문헌으로서 포함)에 기재되어 있다. 따라서, 상기한 상태를 가지거나 발생시킬 위험이 있는 동물 및 환자는, 본 발명의 방법 및 용도를 이용하여 치료할 수 있는 것으로 생각된다.
WO 제98/16551호(본원에 참조문헌으로서 포함)에 기재되어 있는 바와 같이, VEGF 기능을 억제하는 생물학적 분자들은 바람직하지 않은 혈관 투과 (vascular permeability)를 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용하기가 적합하다. 따라서, 본 발명의 VEGF-길항 항체, 방법 및 용도는, 바람직하지 않은 혈관 투과 (예를 들면, 뇌종양-관련 부종, 악성 종양-관련 복수, Meigs 신드롬, 폐 염증, 신증 신드롬, 심막 삼출 및 흉막 삼출 등)를 특징으로 하는 질환을 가지거나 발생시킬 위험이 있는 동물 및 환자를 치료하는 데 사용할 수 있다.
총체적인 본 발명에 의해 상기한 질환이 치료될 수 있으나, 본 발명 보다 바람직한 양태의 방법 및 용도는, 혈관생성된 고형 종양, 전이성 종양 또는 1차 종양으로부터 전이된 종양을 가지고 있거나 발생시킬 위험이 있는 동물 및 환자에게 항-안지오제네시스 치료법으로 사용하는 것이다.
또한, 본 발명에서는, VEGF의 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트의 자극을 유의성있게 억제하지 않으면서, VEGF-유도 안지오제네시스를 억제하고, 바람직하게는 항-종양 또는 향상된 항-종양 활성을 나타내는 데에 사용되는 방법 및 용도가 제공된다. 일반적으로 상기 방법은, VEGF의 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트에 대한 자극을 유의성있게 억제하지 않으면서, VEGF-유도 안지오제네시스를 억제하고 항-종양 또는 향상된 항-종양 활성을 나타내기에 효과적인 조건하에, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물과, 적어도 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트 중 하나 이상 및 혈관 내피세포를 함유하는 혈관생성-혈관군, 종양 환경 또는 조직을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명에서는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항-VEGF 항체의 면역 컨쥬게이트를 포함하는 치료학적 유효량의 적어도 제1 약제학적 조성물을, 안지오제네시스-관련 모든 형태의 암을포함한 안지오제네시스-관련 질환을 가진 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 안지오제네시스-관련 질환의 치료 방법 및 용도를 제공한다.
본 발명은, 컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 치료제에 작동가능하게 부착된 면역 컨쥬게이트를 사용하는 혈관-표적 방법과, 상기 항체 및 이의 단편을 사용하는 항-안지오제네시스 방법을 결합한 것이다.
달리 표현되거나 과학 용어로 명확하게 기술되어 있는 경우를 제외하고는, 용어 "항체 및 이의 단편"은, 기타의 제제 (특히, 치료제 또는 진단제)가 부착되지 않은 "컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked)" 항체 또는 단편을 의미한다. 이러한 정의는, 상기 항체 또는 상기 항체와 효능인자간의 복합체의 생물학적 반감기, 결합성 (avidity) 또는 기타의 특성을 향상시키기 위한 변형 등과 같은 상기 항체의 변형을 배제하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 항-안지오제네시스 치료 방법 및 용도는, 컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked) 항체 및 면역 컨쥬게이트 모두의 사용을 포함한다. 면역 컨쥬게이트에 기초한 항-안지오제네시스 치료 방법에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 항-안지오제네시스 제제 (상기한 제1 항-안지오제네시스 제제인 항-VEGF 항체)에 작동가능하게 부착되어 있는 것이 바람직하다. 상기 부착된 항-안지오제네시스 제제는, 직접적 또는 간접적인 항-안지오제네시스 효과를 가지는 제제일 수 있다.
상기한 항-안지오제네시스 치료 방법 및 용도는, 적어도 제1 컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3(ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 치료학적 유효량의 적어도 제1 약제학적 조성물을, 모든 형태의 안지오제네시스-관련 암을 포함한 안지오제네시스-관련 질환을 가진 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이와 동일하게, 상기 투여되는 항체는 제2 항-안지오제네시스 제제와 작동가능하게 연결될 수 있다.
전이성 암을 치료하는 방법 및 용도는, 적어도 제1 컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 치료학적 유효량의 적어도 제1 약제학적 조성물을, 전이성 암을 가진 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법에서, 상기 투여되는 항체는 제2 항-안지오제네시스 제제와 작동가능하게 연결될 수 있다.
1차 암 (primary cancer)으로부터의 전이를 감소시키는 방법 및 용도는, 치료학적 유효량의 적어도 제1 컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을, 1차 암을 가지고 있거나 1차 암에 대한 치료를 받은 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이와 유사하게, 상기 투여되는 항체는 제2 항-안지오제네시스 제제와 작동가능하게 연결될 수 있다.
또한, 모든 형태의 안지오제네시스-관련 암을 포함한 안지오제네시스-관련 질환을 치료하는 방법 및 용도는, 적어도 제1 컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked)VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 질환 부위 또는 혈관생성된 종양 내의 안지오제네시스를 억제하기에 효과적인 양으로, 상기 질환 (예를 들면, 혈관생성된 종양)을 가지고 있는 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이와 동일하게, 상기 투여되는 항체는 제2 항-안지오제네시스 제제와 작동가능하게 연결될 수 있다.
또한, 모든 형태의 안지오제네시스-관련 암을 포함한 안지오제네시스-관련 질환을 치료하는 방법 및 용도는, VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 결합을 억제함으로써 질환 부위 또는 암 부위 내의 안지오제네시스를 억제하기에 효과적인 양의, 적어도 제1 컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을, 상기 질환 또는 암을 가지고 있는 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 또는, 상기 투여되는 항체는 제2 항-안지오제네시스 제제와 작동가능하게 연결될 수 있다.
또한, 모든 형태의 안지오제네시스-관련 암을 포함한 안지오제네시스-관련 질환을 치료하는 방법 및 용도는, 치료학적 유효량의 적어도 제1 컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을, 혈관생성된 종양을 가지고 있는 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이때, 상기한 VEGF 항체는 VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에대한 결합을 실질적으로 억제하는 반면에 VEGF 항체는 VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR1 (Flt-1)에 대한 결합을 유의성있게 억제하지 않는다. 이와 동일하게, 상기 투여되는 항체는 제2 항-안지오제네시스 제제와 작동가능하게 연결될 수 있다.
또한, 모든 형태의 안지오제네시스-관련 암을 포함한 안지오제네시스-관련 질환을 치료하는 방법 및 용도는, 치료학적 유효량의 적어도 제1 컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을, 상기 질환, 암 또는 혈관생성된 종양을 가지고 있는 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이때, 상기한 VEGF 항체는 VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 대한 결합을 실질적으로 억제하는 반면에 VEGF 항체는 VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR1 (Flt-1)에 대한 결합을 유의성있게 억제하지 않음으로써, 상기 동물의 마크로파지 화학주성을 유의성있게 손상시키지 않고 상기 질환 부위, 암 또는 혈관생성된 종양 내의 안지오제네시스를 억제한다. 또한, 상기 투여되는 항체는 제2 항-안지오제네시스 제제와 작동가능하게 연결될 수 있다.
또한, 모든 형태의 안지오제네시스-관련 암을 포함한 안지오제네시스-관련 질환을 치료하는 방법 및 용도는, 치료학적 유효량의 적어도 제1 컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을, 상기 질환, 암 또는 혈관생성된 종양을 가지고 있는 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이때, 상기한 VEGF 항체는 VEGF의 VEGF 수용체VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 대한 결합을 실질적으로 억제하는 반면에 VEGF 항체는 VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR1 (Flt-1)에 대한 결합을 유의성있게 억제하지 않음으로써, 상기 동물의 마크로파지, 오스테오클라스트 및/또는 콘드로클라스트 활성을 유의성있게 손상시키지 않고 상기 질환 부위, 암 또는 혈관생성된 종양 내의 안지오제네시스를 억제한다. 이와 동일하게, 상기 투여되는 항체는 제2 항-안지오제네시스 제제와 작동가능하게 연결될 수 있다.
또한, 모든 형태의 안지오제네시스-관련 암을 포함한 안지오제네시스-관련 질환을 치료하는 방법 및 용도는, 골 대사에 유의성있는 부작용을 나타내지 않으면서 상기 질환 부위 또는 혈관생성된 종양 내의 안지오제네시스를 억제하기에 효과적인 양의, 적어도 제1 컨쥬게이트되지 않은 (즉, naked) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을, 상기 질환 (예를 들면, 혈관생성된 종양)을 가지고 있는 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
일반적으로, 상기 항-안지오제네시스 치료 방법 및 용도는, 상기 약제학적으로 효과적인 조성물을 상기 동물 또는 인간에게 전신 투여 (예를 들면, 경피 주사, 근육내 주사, 정맥내 주사 등)하는 것을 포함한다. 하지만, 상기 치료제가 종양 또는 종양내 혈관 내피 세포를 포함한, 혈관생성 부위를 찾아갈 수 있도록 해주는 투여 경로는 어떠한 경로라도 사용할 수 있다. 따라서, 기타의 다른 적합한 전달 경로에는, 경구 투여, 회장 투여, 비강 투여, 국부 투여 및 질내 투여가 포함된다. 미합중국 특허 제5,712,291호(본원에서 참조문헌으로 포함)에서는, 안지오제네시스성 질환을 치료하는 것과 관련되어 사용될 수 있는 다양한 투여 경로에 대해 기술하고 있다.
기타의 면역 제제에 대해 기재하고 있는 미합중국 특허 제5,753,230호(본원에서 참조문헌으로 포함)에서와 같이, 관절염 치료 방법 및 용도 (예를 들면, 활액내 투여)가 사용될 수 있다. 눈과 관련된 상태를 치료하기 위해, 시 제형 (ophthalmic formation) 및 투여가 포함될 수 있다.
본원에서의 "투여(administration)"는, 항-안지오제네시스 및/또는 항-종양 효과를 나타내기에 효과적인 기간 및 투여량으로 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료제를 제공 또는 전달하는 것을 의미한다. 일반적으로, 간단하고 재현가능하다는 부분적인 이유로 인해, 단백양 치료제 (proteinaceous therapeutics)를 수동 투여 (passive administration)하는 것이 바람직하다.
하지만, 본원에서의 용어 "투여"는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료제를 종양 혈관체에 제공 또는 전달하는 모든 수단을 의미한다. 따라서, "투여"는 상기 종양에 효과적으로 전달할 수 있는 방식으로 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료제를 생산하는 세포를 제공하는 것을 포함한다. 상기 양태의 경우, 선택 투과성 막, 구조 도는 이식가능한 장치 (일반적으로, 치료를 중지하기 위해서 제거할 수 있는 장치) 내에 상기 세포를 제형 또는 패키지하는 것이 바람직할 수 있다. 외인성 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-유사체의 투여가 일반적으로 바람직한 데, 이는 투여량을 상세하게 모니터 및 통제할 수 있는 비-침입성 방법 (non-invasive method)을 대표하기 때문이다.
또한, 본 발명의 방법 및 용도는, 상기 종양 주위에서 발현되거나 상기 종양의 위치를 찾아가기에 효과적인 방식으로, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료제를 코드하는 핵산을 제공하는 데에 연장하여 사용된다. 환자 세포의 세포외 조작 등을 포함하여, naked DNA 전달, 재조합 유전자 및 벡터, 세포-기초 전달과 같은 모든 유전자 치료 기법이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태에서는, 질환-관련 혈관생성 혈관에 선택된 진단제 또는 치료제를 전달하는 방법 및 용도를 제공한다. 상기 양태는, 종양 또는 종양내 혈관체 또는 기질에 선택된 치료제 또는 진단제를 전달시키는 데에 사용되는 것이 바람직하며; 진단제 또는 치료제가 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편에 작동가능하게 부착된, 적어도 제1 면역 컨쥬게이트를 포함하는 생물학적 유효량의 조성물을 혈관생성된 종양을 가진 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
상기 양태들을 실시하기 위해서 본 발명에서 목표하는 양태에 기초하는 활성 메카니즘을 이해할 필요는 없으나, 본 발명의 항체는 안지오제네시스 및 종양 혈관체 상에 발현되어 있는 VEGFR1에 VEGF가 결합함으로써 부착된 제제를 상기 혈관체에 전달하는 것으로 생각된다. 따라서, 이러한 방법 및 용도는, 안지오제네시스 혈관, 종양 또는 종양내 혈관체에 선택된 치료제 또는 진단제를 전달하는 것과 관련된 것이다. 이러한 방법 및 용도는, 진단제 또는 치료제가 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편에 작동가능하게 부착된, 면역 컨쥬게이트를 포함하는 생물학적 유효량의 조성물을 치료가 필요한 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이때, 이러한 방법 및 용도는, 안지오제네시스 혈관, 종양 또는 종양내 혈관체에서 발현, 과발현 또는 상향 조절된 VEGFR1에 VEGF가 결합할 수 있도록 하는 방식으로 투여된다.
종양 또는 종양내 혈관체 또는 기질에 선택된 치료제를 전달하게 되면, 종양 혈관체내의 혈류를 중지 또는 특이적으로 중지시키는 활성을 나타내거나, 종양 혈관체를 파괴 또는 특이적으로 파괴시키는 활성을 나타내거나, 종양내의 괴사 또는 특이적인 괴사를 유도하는 활성을 나타낸다. 따라서, 상기 방법 및 용도는, 치료제에 작동가능하게 부착된, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 적어도 제1 면역 컨쥬게이트를 포함하는 치료학적 유효량의 적어도 제1 약제학적 조성물을 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관생성된 종양을 가진 동물 또는 환자를 치료하는 방법으로 요약될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "치료학적 유효량"은, 적어도 일부분의 종양 또는 종양내 혈관 내피세포를 특이적으로 살해; 적어도 일부분의 종양 또는 종양내 혈관 내피세포에서 특이적으로 세포사멸을 유도; 적어도 일부분의 종양 또는 종양내 혈관 내피세포에서 특이적으로 응고반응을 촉진; 종양 혈관에 적어도 일부분의 혈류 운송을 특이적으로 폐쇄하거나 파괴; 적어도 일부분의 종양내에서 특이적으로 괴사를 유도하거나; 및/또는 선별된 동물 또는 환자에게 투여하면 종양 퇴행 또는 감소를 유도하기에 효과적인 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트의 용량이다. 이러한 효과는, 정상의 건강한 조직내의 혈관 내피세포에는 거의 또는 전혀 결합하지 않거나 이를 거의 또는 전혀 살해하지 않음으로써 발휘되고; 정상의 건강한 조직내의 혈관을 거의 또는 전혀 응고시키지 않거나, 폐쇄 또는 파괴하지 않음으로써 발휘되며; 정상의 건강한 동물 또는 환자의 조직에는 무시할 정도의 또는 통제가능한 정도의 부작용을 나타냄으로써 발휘된다.
종양 혈관체의 응고 또는 파괴를 촉진하고/촉진하거나 종양 기질에 부착하고/부착하거나 종양 괴사를 유발함에 있어서 용어 "선별적으로" 또는 "특이적으로"는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트가, 상기 동물 또는 환자의 종양 기질, 혈관체 및 종양 부위에만 실질적으로 한정되고, 정상의 건강한 조직으로 실질적으로 확장되어 응고, 파괴 및/또는 조직 괴사를 유발하지는 않으면서, 기질 결합, 응고, 파괴 및/또는 종양 괴사를 나타내도록 기능하는 것을 의미한다. 따라서, 건강한 세포 및 조직의 구조 및 기능은 본 발명의 실시에 의해서 실질적으로 손상되지 않고 유지된다.
본 발명의 항체는 VEGF가 VEGFR1에 결합함으로써 혈관생성 및 종양 혈관체에 제제를 효과적으로 전달할 수 있으나, 주위의 혈관에 치료 효과를 나타내는 치료제를 종양 기질에 전달하는 것을 기본으로 하여 작용하는 기타의 다른 방법 및 용도가 사용될 수 있다. 이러한 방법 및 용도는, 종양 기질내 수용체가 결합되지 않은 VEGF에 면역 컨쥬게이트를 결합시키기에 효과적인 양의, 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편에 작동가능하게 부착된 치료제를 포함한 면역 컨쥬게이트를 혈관생성 종양을 가진 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
이러한 방법 및 용도는, 부착된 치료제가 주위의 종양 혈관체 및/또는 종양 세포에 항-종양 효과를 발휘할 수 있도록 종양 기질내로 면역 컨쥬게이트를 위치시키기에 효과적인 양의, 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편에 작동가능하게 부착된 치료제를 포함한 면역 컨쥬게이트를 혈관생성 종양을 가진 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명의 방법 및 용도는 물론이고 조성물은, 적어도 제1 치료제 또는 진단제에 작동가능하게 부착된 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트를 포함하는 조성물로 확장된다. 바람직하게는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초한 치료학적 면역 컨쥬게이트는, 방사선 치료제, 항-안지오제네시스 제제, 세포사멸 유도제, 항-튜불린 약제, 항-세포 또는 세포 독성제 또는 응고제 (응고 인자)에 결합된다.
따라서, 본 발명에서는, 상기 항체가 적어도 제1 치료제 또는 진단제에 작동가능하게 부착된 일련의 컨쥬게이트 항체 및 이의 단편을 제공한다. 용어 "면역 컨쥬게이트 (immunoconjugate)"는, 다른 효능성 제제와 상기 항체의 작동 결합체를의미하는 것으로서, 단일한 형태의 작동 결합체만에 한정되는 것은 아니며, 특히 화학 컨쥬게이트에 한정되지 않는, 광범위한 의미로 사용된다. 특히, 재조합 융합 단백질이 포함된다. 상기한 전달 또는 표적 제제가 상기 표적에 결합할 수 있고 상기 치료제 또는 진단제가 전달 후에 충분히 기능을 발휘할 수 있는 한, 부착 방식은 적합하다.
또한, 항체 상의 탄수화물 잔기를 통한 제제의 부착도 포함된다. O-결합 및 N-결합 글리코실레이션은 항체에서 자연적으로 발생한다. 재조합 항체는, 필요한 경우, 추가의 글리코실레이션 부위를 만들기 위해 변형시킬 수 있다. 이는, 적합한 아미노산 서열 (예를 들면, Asn-X-Ser, Asn-X-Thr, Ser 또는 Thr)을 상기 항체의 1차 서열 (primary sequence)에 삽입함으로써 간단히 수행될 수 있다.
VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초한 치료학적 컨쥬게이트, 이와 관련된 방법 및 용도에 사용되는 현재 바람직한 제제는, 상기 항체의 효과를 보충하거나 강화시키는 제제 및/또는 특정 유형의 종양 또는 환자를 위해 선택된 제제이다. "상기 항체의 효과를 보충하거나 강화시키는 치료제"에는, 방사선 치료제, 항-안지오제네시스 제제, 세포사멸 유도제 및 항-튜불린 약제가 포함되며, 이러한 치료제 하나 이상이 모두 사용하기에 바람직하다.
VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초한 항체와 상기 적합한 제제를 부착 또는 결합시키면, 종종 강화되고 시너지 효과를 나타내는 항-종양 특성을 나타내는 면역 컨쥬게이트를 제조할 수 있다. 현재, 이러한 방식으로 사용하기에 바람직한 항-안지오제네시스 제제는, 안지오스탄틴, 엔도스탄틴, 안지오포이에틴, 바스쿨로스탄틴, 칸스탄틴 및 마스핀이다. 현재, 바람직한 항-튜불린 약제는, 콜키친, 탁솔, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 하나 이상의 콤브레타스타틴이다.
항-세포 및 세포 독성 제제를 사용하게 되면 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초한 "면역 독소 (immunotoxin)"이 만들어지는 반면, 응고 인자를 사용하게 되면 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초한 "응고 리간드(coaguligand)"가 만들어 진다. 또한, 하나 이상의 방사선 치료제, 항-안지오제네시스 제제, 세포사멸 유도제, 항-튜불린 약제, 항-세포 및 세포독성 제제 및 응고 인자를 복합하여 사용하는 것과 같이, 적어도 2가지의 치료제를 사용할 수도 있다.
소정의 경우에는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초한 치료제는, 내피 세포의 성장 또는 세포 분열을 차단 또는 억제하는 능력을 가진 세포 독성, 세포분열 억제 또는 항-세포제에 작동가능하게 부착된다. 적합한 항-세포 제제에는, 세포 독소 및 세포분열억제제 뿐만 아니라 화학 치료제가 포함된다. 일반적으로, 세포분열억제제 (cytostatic agent)는, 표적 세포의 자연적인 세포 사이클을 방해하여, 바람직하게는 표적 세포를 세포 사이클에서 벗어나도록 하는 제제이다.
화학 치료제의 예로는, 스테로이드; 사이토카인; 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트 또는 아미놉테린과 같은 항-대사제; 안트라사이클린; 마이토신 C; 빈카 알카로이드; 항생제; 데모콜킨; 에토포시드; 미트라마이신; 및 클로르암부실 또는 멜팔란과 같은 항-종양 알킬화제가 포함된다. 사실상, 하기 표 C에 개시된 모든 제제가 사용될 수 있다. 소정의 바람직한 항-세포 제제는, DNA 합성 억제제 (예를 들면, 다우노루비신, 독소루비신, 아드리아마이신 등)이다.
소정의 치료 용도에서는, 기타의 제제와 비교하여 대부분의 독소는 세포 살해 효과가 매우 크기 때문에, 독소 잔기를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초한 항체 작제물에 사용하기에 적합한 소정의 항-세포 제제는, 식물-유래 독소, 곰팡이-유래 독소 또는 세균-유래 독소이다. 독소의 예로는, 에피포도필로 독소; 세균성 내독소 또는 세균성 내독소의 지질 A 잔기; 리보좀-불활성화 단백질 (예를 들면, 사포린 또는 겔로닌); a-sarcin; 아스페르길린; 리스트릭토신; 리보뉴클레이즈 (예를 들면, 태반 리보뉴클레이즈); 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소가 포함된다.
바람직한 독소는, A 사슬 독소 (예를 들면, 리신 A 사슬)이다. 가장 바람직한 독소 잔기는, 종종 "탈당화된 A 사슬 (dgA)"로 불리는 탄수화물 잔기를 변형 또는 제거된 리신 A 사슬이다. 탈당화된 A 사슬은, 효능이 매우 크고, 반감기가 길며, 임상 수준으로 제조하기에도 비용 효과적이기 때문에 바람직하다. 재조합 및/또는 절단된(truncated) 리신 A 사슬을 사용할 수도 있다.
면역 독소를 이용한 종양 표적화 및 치료를 위해, 하기의 특허 및 특허 출원이 항-세포 및 세포 독성 제제와 관련한 본원의 설명을 보충하기 위해 참조 문헌으로서 포함되어 있다: 미합중국 특허출원 제07/846,349호; 제08/295,868호 (특허 제6,004,554호); 제08/205,330호 (특허 제5,855,866호); 제08/350,212호 (특허 제5,965,132호); 제08/456,495호 (특허 제5,776,427호); 제08/457,487호 (특허 제5,863,538호); 제08/457,229호 및 제08/457,031호 (특허 제5,660,827호) 및 제08/457,869호 (특허 제6,051,230호).
본 발명의 2C3-기초한 또는 기타의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체는 항-튜불린 약제에 결합될 수 있다. 본원에서의 용어 "항-튜불린 약제 (anti-tubulin drug)"는, 바람직하게는 세포의 유사분열에 필수적인 튜불린 활성 (바람직하게는, 튜불린 중합화 또는 탈중합화)을 직접적 또는 간접적으로 억제함으로써, 세포의 유사분열을 억제하는 모든 제제, 약제, 전구 약제 또는 이의 배합물을 의미한다.
현재, 사용되기에 바람직한 항-튜불린 약제는, 콜키친; 탁솔과 같은 탁산; 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 빈데신과 같은 빈카 알카로이드; 및 콤브레타스타틴이다. 콤브레타스타틴의 예로는, 콤브레타스타틴 A, B 및/또는 D (A-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, B-1, B-2, B-3, B-4, D-1 및 D-2 및 이의 전구 약물 형태를 포함)이다.
상기한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초한 치료제는, 응고를 촉진할 수 있는 성분 (즉, 응고인자)를 포함할 수 있다. 이때, 상기한 표적 항체는, 직접적 또는 간접적으로 (예를 들면 다른 항체를 통해), 응고를 직접적으로 또는 간접적으로 촉진시키는 인자에 결합될 수 있다.
사용하기에 바람직한 응고 인자는, 조직 인자 (TF) 및 TF 유도체 {예를 들면, 절단된 TF (tTF), 이량체 TF, 삼량체 TF, 중합체/다량체 TF, 및 인자 VII을 활성시키는 능력이 결핍된 돌연변이 TF}이다. 기타의 적합한 응고 인자에는, 비타민 K-의존형 응고 인자 (예를 들면, 인자 II/IIa, 인자 VII/VIIa, 인자 IX/IXa 및 인자 X/Xa); Gla 변형되지 않은 비타민 K-의존형 응고 인자; Russell viper venom 인자 X 활성 인자; 혈소판-활성 화합물 (예를 들면, 트롬복산 A2및 트롬복산 A2신테이즈; 및 피브린-용해 억제제 (예를 들면, α2-안티플라스민)이 포함된다.
응고 리간드 (coaguligand)를 이용한 종양 표적화 및 치료에 대해서는, 응고 리간드 및 응고 인자에 관해 본원의 기재 내용을 보다 더 보충하기 위해 본원에 참조문헌으로 포함된 하기의 특허 및 특허 출원에 기재되어 있다: 미합중국 특허출원 제07/846,349호; 제08/205,330호 (특허 제5,855,866호); 제08/350,212호 (특허 제5,965,132호); 제08/273,567호; 제08/482,369호 (특허 제5,xxx, xxx호, 특허료 수납일 - 1998년 10월 20일); 제08/485,482호; 제08/487,427호 (특허 제6,004,555호); 제08/479,733호 (특허 제5,877,289호); 제08/472,631호; 제08/479,727호 및 제08/481,904호 (특허 제6,036,955호).
면역 컨쥬게이트 및 면역 독소의 제조 방법은 당해 기술분야에서 일반적으로 잘 알려져 있다 {참조: 예를 들면, 미합중국 특허 제4,340,5354호(본원에서 참조문헌으로서 포함)}. 하기의 특허 및 특허 출원은, 면역 독소의 제조, 정제 및 용법에 대해 본원의 설명을 보충하기 위해 본원에 참조문헌으로서 포함되어 있다:
미합중국 특허출원 제07/846,349호; 제08/295,868호 (특허 제6,004,554호); 제08/205,330호 (특허 제5,855,866호); 제08/350,212호 (특허 제5,965,132호); 제08/456,495호 (특허 제5,776,427호); 제08/457,487호 (특허 제5,863,538호); 제08/457,229호 및 제08/457,031호 (특허 제5,660,827호) 및 제08/457,869호 (특허 제6,051,230호).
면역 컨쥬게이트 및 면역 독소의 제조시, 소정의 링커 (linker)를 사용하면 잇점이 있을 수 있다. 예를 들면, 입체적으로 "방해된(hindered)" 디설파이드 결합을 함유하는 링커가 종종 바람직한 데, 그 이유는 생체내에서 매우 안정성이 커서 활성 부위에서 결합되기 이전에 독신 잔기가 방출되는 것을 방지하기 때문이다. 일반적으로, 목적하는 활성 부위를 제외하고 모든 조건하에서 본래의 상태대로 유지되는 컨쥬게이트를 가지는 것이 바람직하다 (이때, 목적하는 활성 부위에서는 컨쥬게이트가 우수한 방출 특성을 가지는 것이 바람직하다).
사용되는 소정의 독소 화합물에 따라,
상기한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 및 독소 화합물을 작동가능하게 부착시키는 펩타이드 스페이서 (peptide spacer)를 제공하는 것이 필요할 수도 있다. 상기 펩타이드 스페이서는 접혀서 디설파이드-결합된 루프 구조가 될 수 있다. 상기 루프내의 단백질 분해 절단으로 인해, 상기 항체 및 독소 화합물이 단일 디설파이드 결합만으로 결합되는 헤테로다이머 폴리펩티드가 생성된다.
소정의 다른 독소 화합물이 사용되는 경우, 절단 불가능한 펩티드 스페이서가 제공되어, 상기한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 및 독소 화합물을 작동가능하게 부착시킨다. 절단 불가능한 펩티드 스페이서와 함께 사용할 수 있는 독소는, 단백질 분해 절단에 의해 세포 독성 디설파이드-결합 형태로 변환될 수 있다. 이러한 독소 화합물의 예는 슈도모나스 외독소 화합물이다.
또한, 다양한 화학 치료제 및 기타의 약제학적 제제를 VEGFR2-차단, 항-VEGF항체 또는 2C3-기초 치료제에 성공적으로 융합시킬 수 있다. 항체에 융합되는 항-신생혈관 제제의 예로는, 독소루비신, 다우노마이신, 메토트렉세이트 및 빈블라스틴이 있다. 또한, 네오카르지노스탄틴, 마크로마이신, 트레니몬 및 알파-아마니틴과 같은 기타의 제제의 부착에 대해서 이미 기재되어 있다 {참조: 미합중국 특허 제5,660,827호, 제5,855,866호 및 제5,965,132호 (본원에 참조문헌으로 포함)}.
본원의 발명자 중 한 발명자의 이전의 연구에 비추어 보면, 응고 리간드의 제조 방법은 현재에도 용이하게 실시할 수 있다. VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체와 하나 이상의 응고 인자의 작동 가능한 연결은 직접 결합 (예를 들면, 상기 면역 독소에 기재한 바와 동일) 일 수 있다. 이와 달리, 작동가능한 연결이, 상기 항체가 제2 결합 부위 (바람직하게는, 상기 응고 인자에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부위)에 작동가능하게 부착되는 경우와 같이, 간접 부착일 수 있다. 상기 응고 인자는, 특히 공유 결합을 사용하여 결합되는 경우, 응고 기능 부위와는 상이한 부위에서 상기한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체에 부착되어야 한다.
간접적으로 결합된 응고 리간드는, 종종 이중 특이성 항체 (bispecific antibody)에 기초한다. 이중 특이성 항체의 제조방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 소정의 제조 방법에서는, 한편으로는 표적 종양 성분에 대한 특이성을 가지는 항체를 제조하고, 다른 한편으로는 응고 제제를 가지는 항체를 별개로 제조하는 방법을 포함한다. 그리고 나서, 상기 2가지의 선택된 항체에서 펩틱 F(ab'γ)2단편을 생성한 후, 각각 환원시켜 별개의 Fab'γSH단편을 만든다. 커플링될 상기 2가지의 성분 중 하나에 있는 SH 그룹을 교차 결합 시약 (예를 들면, o-페닐렌디말레이미드)으로 알킬화시켜 자유 말레이미드 그룹을 만든다. 그리고 나서, 티오에테르 결합을 사용하여, 이 성분을 다른 성분과 융합시켜 목적하는 F(ab'γ)2헤테로컨쥬게이트를 제조한다 {참조: Glennie 등, 1987; 본원에서 참조문헌으로 포함}. SPDP 또는 단백질 A를 이용한 교차 결합과 같은 다른 방법도 사용될 수 있다.
이중 특이성 항체를 제조하는 다른 방법은, 2가지의 하이브리도마를 융합시켜 콰드로마 (quadroma)를 형성시키는 방법이다. 본원에서 용어 "콰드로마"는, 2가지의 B 세포 하이브리도마의 생산성있는 융합체를 의미한다. 현재의 표준 기술을 사용하여, 2가지의 항체-생산 하이브리도마를 융합시켜 딸세포를 만든 후, 2가지의 클론 형태의 면역 글로불린 유전자 세트의 발현이 유지되는 세포를 선별한다.
콰드로마를 생산하는 바람직한 방법은, 하나 이상의 모(parental) 하이브리도마 중 효소-결핍 돌연변이를 선별하는 방법을 포함한다. 제1 돌연변이 하이브리도마 세포 라인을, 예를 들면 요오도아세트아미드에 치명적으로 노출시켜 계속 생존하지 못하도록 한 제2 하이브리도마 세포에 융합시킨다. 세포 융합으로 인해, 상기 치명적으로 처리된 하이브리도마로부터 효소 결핍 유전을 위한 유전자를 획득하여 제1 하이브리도마를 구하고, 제1 하이브리도마에 융합시킴으로써 제2 하이브리도마를 구한다. 동일한 이소타입이지만 상이한 서브클래스의 면역 글로불린을융합시키는 것이 바람직하지만, 반드시 필요한 것은 아니다. 바람직한 콰드로마의 분리를 위한 다른 분석법의 경우, 혼합된 서브클래스 항체를 사용할 수 있다.
바람직한 콰드로마를 밝혀내기 위해, 마이크로타이터 동정예, FACS, 면역 형광 염색법, 이디오타입-특이성 항체, 항원-결합 경쟁 분석 및 기타의 공지된 방법들이 사용될 수 있다. 콰드로마를 분리한 후, 기타의 세포 생성물로부터 이중 특이성 항체를 정제한다. 이는, 면역 글로불린 정제와 관련한 분야의 당업자에게 공지되어 있는 다양한 항체 분리 공정에 의해 수행될 수 있다 {참조: 예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988 (본원에서 참조문헌으로 포함)}. 단백질 A 또는 단백질 G 세파로즈 칼럼이 바람직하다.
면역 컨쥬게이트를 제조하는 경우, 면역 독소 및 응고 리간드, 재조합 발현이 사용될 수 있다. 선택된 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체를 코드하는 핵산 서열; 및 치료제, 독소 또는 응고제를 발현 벡터내에 내부 프레임(in-frame) 부착시킨다. 재조합 발현을 시키면, 상기 핵산이 번역되어 목적하는 면역 컨쥬게이트가 생산된다. 또한, 화학 교차 링커 및 아비딘:비오틴 가교는, 상기한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체에 상기 치료제를 결합시킬 수 있다.
하기 특허 및 특허 출원은, 응고 리간드(이중 특이성 항체 응고 리간드를 포함) 제조, 정제 및 용법에 관한 본원의 설명을 보충하기 위해 본원에서 참조문헌으로 포함되어 있다: 미합중국 특허출원 제07/846,349호; 제08/205,330호 (특허 제5,855,866호); 제08/350,212호 (특허 제5,965,132호); 제08/273,567호;제08/482,369호 (특허 제5,xxx, xxx호, 특허료 수납일 - 1998년 10월 20일); 제08/485,482호; 제08/487,427호 (특허 제6,004,555호); 제08/479,733호 (특허 제5,877,289호); 제08/472,631호; 제08/479,727호 및 제08/481,904호 (특허 제6,036,955호).
방사선 치료제, 항-안지오제네시스 제제, 세포사멸 유도제, 항-튜불린 약제, 독소 및 응고 리간드와의 면역 컨쥬게이트 (화학 융합 또는 재조합 발현에 의해 제조)는, 생물학적으로 방출가능한 결합 및/또는 선별적으로 절단가능한 스페이서 또는 링커를 사용할 수 있다. 바람직하게, 이러한 조성물은 혈류 순환 동안 매우 안정적이며, 상기한 질환 또는 종양 부위에 전달된 후에 선별적으로 또는 특이적으로 방출된다.
소정의 바람직한 예는, 산-민감성 스페이서인 데, 이때 콜키친 또는 독소루비신에 결합된 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체가 특히 고려된다. 기타의 다른 바람직한 예는, 질환 부위 (예를 들면, 종양 환경) 내에서 특이적 또는 선별적으로 존재하거나 활성을 나타내는 펩티드 분해효소 및/또는 단백질 분해효소의 절단 부위를 포함하는 펩티드 링커이다. 상기한 면역 컨쥬게이트를 상기 질환 또는 종양 부위에 전달하게 되면, 상기 응고 인자가 절단되고 상대적으로 특이적인 방출이 일어난다.
미합중국 특허 제5,877,289호 (본원에서 참조문헌으로 포함)에 기재 및 실시되고 하기 표 B2에 예시된 바와 같이, 유로키나제, 프로-유로키나제, 플라스민, 플라스미노겐, TGFβ, 스타필로키나제, 트롬빈, 인자 IXa, 인자 Xa 또는 간질 콜라게나제와 같은 메탈로프로티나제 (MMP), 젤라티나제 또는 스트로멜리신에 대한 절단 부위를 포함하는 펩티드 링커가 특히 바람직하다.
또한, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체는, 생물학적으로 방출가능한 결합을 통해 치료제가 부착될 수 있도록하는 기능성 그룹을 도입시켜 유도체를 만들 수 있다. 따라서, 상기 표적 항체는, 히드라지드, 히드라진, 1차 아민 또는 2차 아민 그룹의 측쇄를 절단시켜 유도체를 만들 수 있다. Schiff 염기 결합, 히드라존 또는 아실 히드라존 결합 또는 히드라지드 링크를 통해, 치료제를 컨쥬게이션시킬 수 있다 {참조: 미합중국 특허 제5,474,765호 및 제5,762,918호 (본원에서 참조문헌으로 포함)}.
주로 항-안지오제네시스 또는 혈관-표적화를 기초로 하는 본 발명의 조성물 및 방법은 기타의 치료제 및 진단제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3-기초 항체)와 배합하여 사용하는 생물 제제 (바람직하게는, 진단제 또는 치료제)에 있어서, 용어 "배합(in combination)"은 일련의 양태를 포함하는 의미로 사용된다. 달리 표현되거나 과학 용어로 구체적으로 규정되어 있는 경우를 제외하고는, 용어 "배합"은 다양한 형태의 배합 조성물, 약제, 칵테일, 킷트, 방법 및 제1 및 제2 의학 용도에 적용된다.
따라서, 본 발명의 "배합" 양태는, 예를 들면, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체가 naked 항체이고, 이에 작동가능하게 부착되지 않은 제제 또는 치료제와 배합되어 사용되는 경우도 포함한다. 이 경우, 상기 제제 또는 치료제는 비-표적화되거나 표적화된 형태로 사용될 수 있다. 일반적으로, "비-표적화된 형태"의 경우, 상기 제제 (특히, 치료제)는 당해 기술분야에서 표준적으로 사용되는 용도에 따라 사용된다. 일반적으로, "표적화된 형태"의 경우, 상기 제제는, 상기 제제 또는 치료제를 혈관생성 질환 부위 또는 종양으로 전달하는 상이한 항체 또는 표적 부위에 작동가능하게 부착된다. 상기한 표적화된 형태의 생물학적 제제 (진단제 및 치료제)의 사용은 당해 기술분야에서 이미 표준화된 것이다.
본 발명의 다른 "배합" 양태에서는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 자체가 상기 제제 또는 치료제에 작동가능하게 결합 또는 배합된 면역 컨쥬게이트이다. 소정의 바람직한 실시예에서는, 진단제 및 치료제를 포함한 상기 제제는 "2C3-표적화된 제제"이다. 상기한 작동가능한 부착은, 본원에 기재되어 있고 당해 기술분야에서 공지되어 있는 모든 직접적 및 간접적 부착 형태를 포함한다.
특히, 전구 약물 형태의 치료제와 배합한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체의 경우, "배합 용도"에는 배합 조성물, 약제, 칵테일, 킷트, 방법, 제1 및 제2 의학적 용도가 포함된다. 이 경우, 전구 약물을 기능성 형태의 약물로 전환시킬 수 있는 활성화 성분을 본 발명의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체에 작동가능하게 결합시킬 수 있다.
소정의 양태의 경우, 상기한 배합 조성물, 약제, 칵테일, 킷트, 방법, 제1 및 제2 의학적 용도는 "2C3-전구 약물 배합"이다. 당업자들은 이해할 수 있는 바와 같이, 달리 표현되어 있는 경우를 제외하고는, "2C3-전구 약물 배합"은 2C3-기초 항체가 전구 약물에 부착된 것이 아니라, 전구 약물을 활성 약물로 전환시킬 수있는 성분에 작동가능하게 부착된 것이다. 그러나, 본 발명의 전구 약물 양태가 2C3-전구 약물 배합으로서 사용되어야 할 필요는 없다. 따라서, ADEPT 및 기타의 형태를 포함하여 당해 분야에서 사용되는 모든 형태의 전구 약물이 사용될 수 있다.
따라서, 배합 조성물, 약제, 칵테일, 킷트, 방법, 제1 및 제2 의학적 용도가 바람직하게는 진단제로서, 더욱 바람직하게는 치료제로서 기재된 경우, 상기 배합은 naked 항체 및 면역 컨쥬게이트 형태의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3-기초 항체)를 포함한다. 이때, 본 발명의 생체내 양태를 실시하는 경우, 몇몇 융합된 또는 비-융합된 형태에서 몇몇 상기 항체 및 생물학적 진단제 또는 치료제 형태가 전체적으로 제공될 수 있는 한, 상기한 naked 항체 또는 면역 컨쥬게이트 및 생물학적 진단제 또는 치료제의 사전 (prior), 동시 또는 후속 투여를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 배합 조성물, 방법 및 용도는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 및 엔도스타틴을 포함하는 것이다 {참조: 미합중국 특허 제5,8854,205호 (본원에서 참조문헌으로 포함)}. 몇몇 융합된 또는 비-융합된 형태에서 2C3, 엔도스타틴 및 임의적으로 안지오스타틴이 전체적으로 제공될 수 있는 한, 상기한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 작제물은 naked 항체 또는 면역 컨쥬게이트이고; 면역 컨쥬게이트인 경우에는, 상기한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 작제물은 엔도스타틴 (임의적으로는, 안지오스타틴과 함께)에 결합되며; 상기 배합 치료 방법 또는 용도에는 엔도스타틴 (임의적으로는,안지오스타틴과 함께)의 사전,동시 또는 후속 투여를 포함한다. 또한, 본 발명에서는, 콜라게나제가 종양에 특이적으로 전달되면 원위치 (in situ)에서 엔도스타틴을 생산하기 때문에 엔도스타틴과 유사한 잇점을 콜라게나제가 제공할 수 있기 때문에, 콜라게나제와 작동가능하게 결합된 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체가 제공된다.
종양에 대한 본 발명의 효과를 나타내는 상기 설명 및 기타의 설명들은, 결합된 작용 방식, 부착되는 제제의 유형 등을 간단하게 설명하기 위한 것이다. 이러한 기재 방식으로 인해, 본 발명의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 -기초 항체의 잇점을 과소평가하거나 너무 간단한 것으로 이해해서는 안된다. 따라서, 상기 항체 자체가 항-안지오제네시스 특성 및 VEGF 중화 특성 (예를 들면, VEGF의 생존 기능을 중화)을 가지고 있으며; 상기 항체의 면역 컨쥬게이트는 상기 특성을 유지하고, 이러한 특성을 부착된 제제의 특성과 결합시키며; 상기 항체 및 부착된 제제의 결합 효과는 통상적으로 강화 및/또는 증폭된다는 것을 이해하게 될 것이다.
따라서, 본 발명에서는, 임의적으로 적어도 제1 조성물 또는 용기내에, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체, 임의적으로는 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항-VEGF 항체의 면역 컨쥬게이트; 및 생물학적 유효량의 적어도 제2 생물 제제, 성분 또는 시스템을 포함하는, 조성물, 약제학적 조성물, 치료 킷트 및 의료용 칵테일을 제공한다.
상기한 "적어도 제2 생물 제제, 성분 또는 시스템"은, 치료제 또는 진단제,성분 또는 시스템인 경우가 종종 있고, 그렇지 않은 경우도 있다. 예를 들면, 상기한 "적어도 제2 생물 제제, 성분 또는 시스템"은, 상기한 항체의 변형 및/또는 상기 항체에 기타의 제제를 부착하기 위한 성분을 포함할 수 있다. 소정의 바람직한 제2 생물 제제, 성분 또는 시스템은, 전구 약물 또는 전구 약물의 제조 및 사용을 위한 성분 (전구 약물 자체를 제조하기 위한 성분, 및 상기한 전구 약물 양태 또는 ADEPT 양태에서 기능을 나타내도록 본 발명의 항체를 적합화시키기 위한 성분을 포함)이다.
상기한 적어도 제2 생물 제제, 성분 또는 시스템으로서 치료제 또는 진단제가 포함되는 경우, 상기 치료제 및/또는 진단제는 통상적으로 혈관생성-관련 질환에 사용되는 것이다. 이러한 제제는, 미합중국 특허 제5,712,291호, 제5,753,230호, 제5,972,922호, 제5,639,757호, WO 제98/45331호 및 WO 제98/16551호 (본원에 참조문헌으로 각각 포함)에 기재된 질환의 치료 또는 진단용으로 사용하기에 적합하다.
치료할 질환이 암인 경우, "적어도 제2 항암제"가 상기 치료 킷트 또는 칵테일에 포함된다. 용어 "적어도 제2 항암제"는, 제1 항암제인 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 작제물을 고려하여 선택한 용어이다. 따라서, 본 발명의 항체는 화학 치료제, 방사선 치료제, 사이토카인, 항-안지오제네시스 제제, 세포 사멸 유도제 또는 항암 면역 독소 또는 응고 리간드와 배합하여 사용될 수 있다.
본원에서 "화학 치료제"는, 악성 종양 치료에 사용되는 전통적인 화학 치료제 또는 약물을 의미한다. 상기 용어는, 기타의 화합물들도 항암 효과를 나타내는경우에는 기술적으로는 화학 치료제로 기재될 수 있지만, 간소화시키기 위해 사용된다. 그러나, "화학 치료제"는 당해 분야에서 특이한 의미를 가지고 있으며, 이러한 표준적인 의미에 따라 사용된다. 수많은 화학 치료제가 본원에 예시되어 있다. 화학 치료제를 본 발명과 배합하여 사용하는 경우에는 그 투여량이 감소하겠지만, 당업자들은 화학 치료제의 용법 및 적합한 투여량에 대해서 용이하게 이해할 것이다.
새로운 유형의 "화학 치료제"는 세포 사멸(apoptosis)를 유도하는 제제이다. 적합한 유전자, 벡터, 안티센스 작제물 및 리보자임을 포함한 하나 이상의 상기 약물을 본 발명과 함께 사용할 수도 있다. 현재 바람직한 제2 제제는 항-안지오제네시스 제제 (예를 들면, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 바스큘로스타틴, 칸스타틴 및 마스핀)이다.
다른 항암제의 예로는, 네오마이신, 포도필로톡신, TNF-알파, αVVβ3V길항제, 칼슘 이오노포어, 칼슐-플럭스 유도제 및 이의 유도체 또는 전구 약물이 포함된다. 현재 바람직한 항-튜불린 약물에는, 콜키친, 탁솔, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 콤브레타스타틴 또는 이의 유도체 또는 전구 약물이 포함된다.
또한, 항암 면역 컨쥬게이트 또는 응고 리간드가 적합한 항암제이다. "항암 면역 컨쥬게이트 또는 응고 리간드" 또는 표적화 제제/치료제 작제물은, 세포 독성 제제 (면역 독소) 및 응고 인자 (응고 리간드)를 포함한 치료제에 작동가능하게 부착되고 종양 세포, 종양 혈관체 또는 종양 기질의 표적가능한 또는 접근가능한 성분에 결합한, 표적화 제제 (항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함)에 기초한 것이다. 종양 세포, 종양 혈관체 또는 종양 기질의 "표적가능한 또는 접근가능한 성분"은, 괴사 또는 손상받은 종양 세포 또는 혈관 내피세포로부터 방출된 성분 (종양 세포의 세포질 및/또는 핵 항원을 포함)이 표적화될 수도 있지만, 바람직하게는 표면-발현된, 표면-접근가능한 또는 표면-위치한 성분이다.
성장 인자 (예를 들면, VEGF 및 FGF), 종양 혈관체에 특이적으로 결합하는 트리펩티드 R-G-D를 함유하는 펩티드 및 기타의 표적화 성분 (예를 들면, 에넥신 및 관련 리간드)을 포함한, 항체 및 비-항체 표적화 제제 모두를 사용할 수 있다.
항-종양 세포 면역 독소 또는 응고 리간드는, 하기 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항체를 포함할 수 있다: B3 (ATCC HB 10573), 260F9 (ATCC HB 8488), D612 (ATCC HB 9796) 및 KS1/4 {벡터 pGKC2310 (NRRL B-18356) 또는 벡터 pG2A52 (NRRL B-18357)을 포함하는 세포로부터 수득된 항체}.
또한, 본 발명에서는, 괴사 종양 세포에서 방출되는 세포내 성분에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 포함하는 항-종양 세포 표적화제를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 항체는, 유도되어 투과가능한 세포내에 존재하거나, 실질적으로 모든 암 세포 및 정상 세포의 세포 고스트 (cell ghost)내에 존재하지만 포유동물의 정상적으로 살아있는 세포의 외부 상에 존재하지 않거나 접근 불가능한, 불용성 세포내 항원에 결합하는 모노클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
미합중국 특허 제5,019,368호, 제4,861,581호 및 제5,882,626호 (특허권자: 각각 Alan Epstein 및 그의 동료; 본원에서 참조문헌으로 포함)에서는, 세포내에서악성 종양세포(malignant)로부터 접근가능한 세포내 항원에 특이적인 항체의 제조 및 사용 방법을 기술하고 있다. 상기 항체는, 포유 동물의 악성 종양 세포의 세포내 성분에 충분한 정도의 특이성을 가지지만, 세포외 성분에 대해서는 그러하지 않다. 표적으로서 히스톤이 예시되어 있으나, 괴사 종양 세포(necrotic tumor cell)로부터 특이적으로 방출되는 모든 세포내 성분이 포함된다.
혈관생성된 종양을 가진 동물 또는 환자에게 상기 항체를 투여하면, 생체내에서 발생하여 적어도 일부분의 악성 종양 세포가 괴사 종양 세포가 되도록 유도하는 종양-리모델링 과정으로 인해서 혈관생성된 종양은 괴사 종양 세포를 자연적으로 함유하기 때문에, 상기 항체는 상기한 악성 종양 세포의 위치를 찾아낸다. 또한, 종양의 괴사를 강화시키는 기타의 치료제와 함께 상기 항체를 사용하게 되면, 표적 및 후속 치료의 효능을 강화시키는 데 도움이 된다.
따라서, 본원에서 일반적으로 개시하고 있는 바와 같이, 이러한 유형의 항체는 안지오포이에틴과 직접적 또는 간접적으로 결합하는 데에 사용할 수 있으며, 또는 혈관생성된 종양내의 괴사 악성 종양세포에 안지오포이에틴을 투여하는 데에 사용될 수 있다.
미합중국 특허 제5,019,368호, 제4,861,581호 및 제5,882,626호 (특허권자: 각각 Alan Epstein 및 그의 동료; 본원에서 참조문헌으로 포함)에서 기재하고 있는 바와 같이, 상기 항체는 결합된 진단 방법 (하기에서 설명) 및 항-종양 치료법의 효능을 측정하는 방법에 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은, 표지된 상태의 상기 항체를 제조 및 투여하고, 괴사 조직내에 선별적으로 부착되어 있는 세포내 성분 표적에 대한 상기 표지된 항체의 결합을 측정하는 것을 포함한다. 따라서, 상기 항체의 국부 농도(localized concentration)가 종양의 존재를 나타내는 상기 방법은 괴사 조직을 표시하고, 상기 항-종양 치료법에 의해 살해된 세포의 고스트를 보여준다.
일반적으로, 항-종양 기질 면역 독소 또는 응고 리간드는, 결합 조직 성분, 기저막 성분 또는 활성화된 혈소판 성분에 결합하는 항체를 포함한다 (예를 들면, 피브린, RIBS 또는 LIBS에 결합).
항-종양 혈관체 면역 독소 또는 응고 리간드는, 혈관생성된 종양의 표면-발현되거나, 표면-접근 가능한 또는 표면-국부화된 혈액운반-혈관 성분 (바람직하게는, 종양내 혈관)에 결합하는 리간드, 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체는, 종양내 혈관체 세포 표면 수용체 {예를 들면, 엔도글린 (TEC-4 및 TEC-11 항체), TGF 베타 수용체, E-셀렉틴, P-셀렉틴, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, VEGF/VPF 수용체, FGF 수용체, TIE, αVβ3인테그린, 플레이오트로핀, 엔도시알린 및 MHC 클래스 II 단백질}를 포함한, 혈관생성된 종양의 종양내 혈관의 표면-발현된 성분에 결합하는 항체를 포함한다. 또한, 상기 항체는 종양내 혈관의 사이토카인-유도가능한 또는 응고 리간드-유도가능한 성분에 결합할 수 있다. 소정의 바람직한 제제가 아미노포스포리피드 (예를 들면, 포스파티딜세린 또는 포스파티딜에탄올아민)에 결합한다.
기타의 다른 항-종양 혈관체 면역 독소 또는 응고 리간드는, 종양내 혈관 세포 표면 수용체에 결합하는 리간드 또는 성장 인자에 결합하는, 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 항체는, TIE, 종양-관련 피브로넥틴 아이소폼, 스캐터 인자(scatter factor)/간세포 성장 인자 (HGF), 혈소판 인자 4 (PF4), PDGF 및 TIMP에 결합하는 리간드, TGF 베타, FGF, VEGF/VPF (GV39 및 GV97 항체)에 결합하는 항체를 포함한다. 또한, 상기 항체 또는 이의 단편은, 리간드/수용체 복합체 또는 성장 인자/수용체 복합체에 결합할 수 있으나; 리간드, 성장 인자 또는 수용체가 리간드/수용체 복합체 또는 성장인자/수용체 복합체 내에 있지 않은 경우에는 상기 리간드, 성장 인자 또는 수용체에 결합하지 않을 수 있다.
항-종양 세포, 항-종양 기질 또는 항-종양 혈관체 항체-치료제 작제물은, 항-안지오제네시스 제제, 세포사멸 유도제, 항-튜불린 약제, 세포독성제 (예를 들면, 식물-유래 독소, 곰팡이-유래 독소 또는 세균-유래 독소)를 포함할 수 있다. 리신 A 사슬 및 탈당화된 리신 A 사슬이 바람직한 경우도 종종 있다. 항-종양 세포, 항-종양 기질 또는 항-종양 혈관체 항체-치료제 작제물은, 응고제 (직접 또는 간접적으로 작용하는 응고 인자)- 또는 응고 인자에 결합하는 제2 항체-결합 부위를 포함할 수 있다. 종종, 조직 인자 (Tissue factor) 또는 조직 인자 유도체 (예를 들면, 절단된 조직 인자)에 작동가능하게 결합되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물, 킷트 및/또는 약제의 경우, 효과적인 배합량의 치료제가 단일 용기 또는 용기 수단내에 포함되거나, 상이한 용기 또는 용기 수단내에 포함될 수 있다. 일반적으로, 칵테일은 복합 사용되도록 혼합된다. 종종, 정맥내 투여용으로 제형된 제제가 바람직하다. 표현 성분 (imaging component)가 포함될 수도 있다. 또한, 킷트는 적어도 제1 항체 및 하나 이상의 다른 생물 제제를 사용하는 지시 사항을 포함할 수 있다.
일반적으로, 상기 적어도 제2 항암제는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 -기초 치료제와 실질적으로 동시에, 예를 들면 단일 약제학적 조성물 또는 시간상 가까이 투여되는 2가지의 약제학적 조성물로 동물 또는 환자에게 투여될 수 있다.
이와 달리, 상기 적어도 제2 항암제는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 -기초 치료제를 시차를 두고 동물 또는 환자에게 투여될 수 있다. 용어 "시차를 두고 (at a time sequential)"는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 -기초 치료제 투여시와 다른 시기에 시차를 두고 상기 적어도 제2 항암제를 투여하는 것을 의미한다. 일반적으로, 상기 2가지의 제제가 각각의 치료 특성을 발휘할 수 있도록 상기 2가지의 제제를 효과적으로 시간 간격을 두고 투여 (즉, "생물학적으로 효과적인 시간 간격"을 두고 투여)한다. 상기 적어도 제2 항암제는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 -기초 치료제 투여하기 이전에 생물학적으로 효과적인 시기에 투여하거나; VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 -기초 치료제 투여후 생물학적으로 효과적인 시기에 투여할 수 있다.
따라서, 본 발명에서는, 하기 단계를 포함하여 혈관생성된 종양을 가진 동물 또는 환자를 치료하는 방법을 제공한다:
(a) 종양 부담 (tumor burden)을 실질적으로 감소시키는 제1 치료를 상기 동물 또는 환자에게 실시하는 단계; 및
(b) 상기 제1 치료에 후속하여, 생존하는 종양 세포가 전이되는 것을 억제하기에 효과적인 양의 적어도 제1 항-안지오제네시스 제제를 상기 동물 또는 환자에게 투여하는 단계 {여기서, 상기 제1 항-안지오제네시스 제제는 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편이고; 임의적으로는, 상기 항체 또는 이의 단편은 제2 항-안지오제네시스 제제와 작동가능하게 결합되어 있다}.
바람직한 제1 치료에는, 외과적 절제 및 화학치료법이 포함된다. 또한, 안지오포이에틴 2 또는 종양-표적된 안지오포이에틴 2 작제물과 같은 결합된 항-안지오제네시스 제제가 사용될 수도 있다.
혈관생성된 종양을 가진 동물 또는 인간을 치료하는 다른 방법에서는 하기의 단계를 포함한다:
(a) 실질적인 종양 괴사를 유도하기에 효과적인 양의 제1 항체 치료제 작제물을 상기 동물 또는 환자에게 투여하는 단계 {여기서, 상기 제1 항체 치료제 작제물은, 종양 세포, 종양 혈관체 또는 종양 기질의 표면-발현된, 표면-접근가능한 또는 표면-국부화된 성분에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 작동가능하게 결합된 치료제를 포함한다}; 및
(b) 상기 단계에 후속하여, 생존하는 종양 세포가 전이되는 것을 억제하기에 효과적인 양의 적어도 제2 항체를 상기 동물 또는 환자에게 투여하는 단계 {여기서, 상기 제2 항체는 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편이고; 임의적으로는, 상기 항체 또는 이의 단편은 제2 항-안지오제네시스 제제와 작동가능하게 결합되어 있다}.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서는, 전구 약물 및 ADEPT와 함께 사용하는 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체를 제공한다. 조성물, 배합물, 약제, 킷트, 방법 및 용도로 사용하는 경우, 이러한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체이거나 이의 단편을 변형시켜 변환 또는 효소 능력을 제공하거나, 적어도 하나의 전구 약물을 활성 형태의 약물로 변환시킬 수 있는 적어도 제1 변환 제제 또는 효소와 작동가능하게 연결 (바람직하게는, 공유 결합 또는 컨쥬게이션)시킨다.
상기한 효소 또는 효소-컨쥬게이션된 항체 또는 이의 단편은, 처음부터 분리된 별개의 제형의 전구 약물과 배합된다. 이러한 전구 약물은 불활성 또는 매우 약한 활성을 가지는 약물로서, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체와 결합된 효소 활성, 변환 능력 또는 효소에 접촉하게 되면 활성 형태의 약물로 변환된다.
따라서, 본 발명에서는 하기 성분을 (바람직하게는, 별개의 조성물 및/또는 용기내에) 포함하는 킷트를 제공한다:
(a) 효소 기능을 가지는, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 {바람직하게는, 상기 항체 또는 단편은 적어도 제1 효소와 작동가능하게 연결, 공유 결합 또는 컨쥬게이션된다}; 및
(b) 상기한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 또는 이의 단편에 연결, 결합 또는 컨쥬게이션된 효소 또는 이러한 효소의 기능에 의해 실질적으로 활성 약물로 변환되는, 생물학적 유효량의 실질적으로 불활성인 적어도 제1 전구 약물.
또한, 본 발명에서는 하기 단계를 포함하는 유익한 방법 및 용도를 제공한다:
(a) 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 생물학적 유효량의 적어도 제1 약제학적 조성물을 혈관생성된 종양을 가진 동물 또는 환자에게 투여하는 단계 {여기서, 상기 항체 또는 이의 단편은 효소 활성을 가지며 (바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 단편은 적어도 제1 효소에 작동가능하게 연결, 공유 결합 또는 컨쥬게이션되어 있다); 상기 하체 또는 이의 단편은 투여후에 혈관생성된 종양의 혈관체, 종양내 혈관체 또는 기질을 찾아간다}; 및
(b) 상기 단계에 후속하여 효과적인 시간이 경과한 후, 생물학적 유효량의 하나 이상의 실질적으로 불활성인 전구 약물을 포함하는 생물학적 유효량의 적어도 제2 약제학적 조성물을 상기 동물 또는 환자에게 투여하는 단계 {여기서, 상기 전구 약물은, 상기 혈관생성된 종양의 혈관체, 종양내 혈관체 또는 기질내에 위치한 상기한 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 또는 이의 단편에 연결, 결합 또는 컨쥬게이션된 효소 또는 이러한 효소의 기능에 의해, 실질적으로 활성을 가지는 약물로 변환된다}.
소정의 다른 양태에서의 본 발명의 항체 및 면역 컨쥬게이트는, 하나 이상의 진단제, 특히 안지오제네시스-관련 질환에 사용하는 진단제와 함께 사용할 수 있다. 따라서, 일련의 진단 조성물, 킷트 및 방법이 본 발명의 범위내에 포함된다.
암 진단 및 치료에 있어서, 본 발명의 진단 및 이미징 조성물, 킷트 및 방법은 생체내 및 실험실내 진단을 포함한다. 예를 들면, 생체내 진단 이미징 제제에 작동가능하게 부착된 종양 세포, 종양 혈관체 또는 종양 기질의 접근가능한 성분에 결합하는 적어도 제1 결합 부위를 포함하는, 진단에 효과적인 양의 종양 진단 성분을 사용하여, 혈관생성된 종양을 이미지화(imaging)시킬 수 있다.
바람직하게는, 종양 혈관체 또는 종양 기질의 접근가능한 성분에 결합하는 적어도 제1 결합 부위를 포함하는 진단 성분을 사용하여, 혈관생성된 종양의 기질 및/또는 혈관체의 이미지를 제공할 수 있도록 종양을 이미지화시킨다. 치료 작제물에 대해서 상기 기술한 바와 같은, 적합한 결합 부위 또는 항체를 사용할 수 있다. 검출가능하게 표지된 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 작제물을 이용하게 되면 소정의 잇점이 제공된다. 이때, 형성된 이미지로 인해, 사용할 치료제의 결합 부위를 예측할 수 있다.
VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체이든지 아니든지, 검출가능하게 표지된 생체내 종양 진단제는, X선-검출가능한 화합물 {예를 들면, 비스머스(III), 금 (III), 란타늄 (III) 또는 납 (III)}; 방사성 이온 {예를 들면, 구리67, 갈륨67, 갈륨68, 인듐111, 인듐113, 아이오다인123, 아이오다인125,아이오다인131, 수은197, 수은203, 레늄186, 레늄188, 루비듐97, 루비듐103, 테크네튬99m또는 이트륨90}; 핵 자기 회전-공명 동위원소 {예를 들면, 코발트(II), 구리(II), 크로뮴(III), 디스프로슘(III), 에르븀(III), 가돌리늄(III), 홀뮴(III), 철(II), 철(III), 망간(II), 네오디뮴(III), 니켈(II), 사마륨(III), 테르븀(III), 바나듐(II) 또는 이테븀(III)}; 또는 로다민 또는 플루오레신을 포함할 수 있다.
종양 치료이전에 예비-이미징 (pre-imaging)을 하기 단계에 의해 수행할 수 있다:
(a) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 작제물에 작동가능하게 부착된 진단제를 포함하는, 종양 세포, (바람직하게는) 종양 혈관체 또는 (바람직하게는) 종양 기질의 접근가능한 성분에 결합하는 적어도 제1 결합 부위에 작동가능하게 부착된 진단제를 포함한 진단 유효량의 약제학적 조성물을 상기 동물 또는 인간에게 투여하는 단계; 및
(b) 상기 단계에 후속하여, 상기 종양 세포, (바람직하게는) 종양 혈관체 또는 (바람직하게는) 종양 기질에 결합된 검출가능하게 표지된-제1 결합 부위 (또는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체)를 검출하여, 상기 종양, 종양 혈관체 및/또는 종양 기질의 이미지(image)를 수득하는 단계.
또한, 하기 단계를 포함하여 암 치료를 수행할 수 있다:
(a) VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체에 작동가능하게 부착된 진단제를 포함하는, 검출가능하게 표지된 적어도 제1 종양 결합제 (바람직하게는,VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 작제물)를 진단하기에 최소량만큼 혈관생성된 종양을 가진 동물 또는 환자에게 투여함으로써, 혈관생성된 종양의 이미지를 형성시켜, 상기 종양, (바람직하게는) 종양 혈관체 또는 (바람직하게는) 종양 기질의 검출가능한 이미지를 형성시키는 단계; 및
(b) 상기 단계에 후속하여, 적어도 제1 naked VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체이거나 이러한 항체를 이용한 치료제-항체 작제물을 치료하기에 최적의 양만큼 상기 동물 또는 환자에게 투여하여, 항-종양 효과를 발생시키는 단계.
따라서, 본 발명에서는,
(a) 검출가능하게 표지된 종양-결합 제제이거나 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체에 작동가능하게 부착된 검출가능한 제제를 포함하는, 진단하기에 효과적인 양의 상기한 종양-결합 제제 (바람직하게는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 작제물)을 포함하는 제1 약제학적 조성물; 및
(b) 치료학적 유효량의 하나 이상의 naked VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체이거나 이러한 항체를 이용한 치료제-항체 작제물을 포함하는 제2 약제학적 조성물을 포함하는, 이미징 및 치료 제형 또는 약제가 제공된다.
또한, 본 발명에서는, 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된, 생물학적 유효량의 하나 이상의 진단제를 포함하는 적어도 제1 조성물 또는 약제학적 조성물을 포함하는 실험실 내 진단용 킷트를 제공한다.
또한, 본 발명에서는, 바람직하게는 동물 또는 환자에서 수집한 생물학적 표본 상에서 수행하는 테스트와 관련하여, 신체 외부에서 사용할 목적의 진단제를 포함하는 결합 킷트를 제공한다. 이와 같이, 본 발명에서는, 생물학적 유효량의 적어도 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 [임의적으로는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체] 또는 이의 항원-결합 단편 또는 상기한 항-VEGF 항체의 면역 컨쥬게이트, 및 생물학적 유효량의 하나 이상의 실험실내 사용용 진단제, 성분 또는 시스템을 포함하는, 적어도 제1 조성물, 약제학적 조성물 또는 약제 칵테일을 일반적으로 2 이상의 상이한 용기내에 포함하는 킷트를 제공한다.
상기한 "실험실내 사용용 진단제, 성분 또는 시스템"은, 안지오제네시스 성분을 가지는 하나 이상의 질환을 진단할 수 있는 모든 진단 제제 또는 진단 복합 제제이다. 따라서, 상기한 실험실내-진단제에는, 하기 특허에 개시된 질환과 관련한 진단 정보 또는 예후 정보를 얻는 데에 적합한 진단제를 포함한다: 미합중국 특허 제5,712,291호, 제5,753,230호, 제5,972,922호, 제5,639,757호, WO 98/45331 및 WO 98/16551 (본원에서 참조문헌으로서 포함).
암 진단 및 치료에 있어서, 상기한 실험실내 진단제는, 실험실내 진단 테스트에 의해 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 "검출가능한 또는 리포터(reporter) 제제"에 작동가능하게 부착된 종양 세포, (바람직하게는) 종양 혈관체 또는 (바람직하게는) 종양 기질의 접근가능한 성분에 결합하는 적어도 제1 결합 부위를 포함하는 진단 성분을 포함하는 것이 바람직하다. 실험실내에서 직접적으로 검출가능한 "검출가능한 또는 리포터(reporter) 제제"에는, 방사성 표지와 같은 제제 및 면역 형광에 의해 검출가능한 리포터 제제가 포함된다.
실험실내에서 간접적으로 검출가능한 "검출가능한 또는 리포터(reporter) 제제"에는, 추가의 외인성(exogeneous) 제제 {예를 들면, 색원체 기질과 접촉하면 채색된 생성물을 만들어내는 검출가능한 효소}와 함께 작용하는 제제가 포함된다. 또한, 실험실내 간접 검출방법은, 상기한 제1 결합 부위에 대해 면역 특이성을 가지는 하나 이상의 검출 항체와 함께 종양 세포, (바람직하게는) 종양 혈관체 또는 (바람직하게는) 종양 기질의 접근가능한 성분에 결합하는 상기한 제1 결합 부위를 포함하는 검출가능한 또는 리포터 성분 또는 시스템에도 적용될 수 있다. 상기한 "검출 항체"는 직접적 또는 간접적 검출 제제 (예를 들면, 방사성 표지 또는 효소)에 부착된 "2차 항체"가 바람직하다. 이와 달리, 상기한 제1 결합 부위에 대해 면역 특이성을 가지는 제1 검출 항체 및 제1 검출 항체에 대해 면역 특이성을 가지는 제2 검출 항체를 함께 포함하는 {여기서, 제2 검출 항체는 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 제제에 부착되어 있다}, "2차 및 3차 항체 검출 시스템"이 사용될 수 있다.
고형 종양 및 암이 인간의 모든 암의 90% 이상을 차지한다. 림프종 및 백혈병의 치료에 모노클론 항체 및 면역 독소의 사용하는 것에 대해서 연구되어 왔으나, 암 및 기타의 고형 종양에 대한 임상 시험에서는 비효과적이었다 {참조: Abrams 및 Oldham, 1985}. 항체-기초 치료가 비효과적인 주요 이유는, 거대 분자가 고형 종양으로 이송되기가 용이하지 않다는 점이다. 일단 종양체 내에 들어갔다 하더라도, 종양 세포, 섬유성 기질, 간질 압력 구배 및 결합 부위 장벽 사이에 존재하는 tight junction에 의해 상기 거대 분자가 균일하게 분배될 수가 없다 {참조: Dvorak 등, 1991a}.
고형 종양을 치료하는 새로운 전략을 개발하는 중에, 종양 세포가 아닌 종양의 혈관체를 표적으로하는 방법이 큰 잇점이 있다는 것을 알게 되었다. 종양 혈관을 효과적으로 파괴하거나 차단함으로써 혈액이 종양으로 흘러가는 것을 막음으로써, 계속적으로 종양 세포가 죽게된다. 소정의 종양 혈관을 표적화 및 파괴시켜 종양을 괴사시키는 데에 항체-독소 및 항체-응고제 작제물이 이미 효과적으로 사용되어 왔다 {참조: Burrows 등, 1992; Burrows 및 Thorpe, 1993; WO93/17715; WO96/01653; 미합중국 특허 제5,855,866호; 제5,877,289호; 제5,965,132호; 제6,051,230호; 제6,004,555호; 미합중국 특허출원 제08/482,369호 (특허료 납부일: 1998년 10월 20일) - 각각 본원에 참조문헌으로 포함}.
항체, 성장 인자 또는 기타의 결합 리간드를 사용하여 종양 혈관체로 응고제(coagulant)를 특이적으로 전달하는 경우, 이러한 제제는 "응고 리간드 (coaguligand)"로 지칭한다. 응고 리간드로서 사용하기에 현재 바람직한 응고제는, 절단된 조직 인자 (tTF) 이다 {참조: Huang 등, 1997; WO96/01653; 미합중국 특허 제5,877,289호}. TF는 혈액 응고의 주요 시발 인자이다. 상처 부위에서, 혈액내의 인자 VII/VIIa가 말초혈관 조직내의 세포상의 TF와 접촉하여 결합한다. 상기한 인지질 표면의 존재하에 TF:VIIa 복합체가 인자 IX 및 X를 활성화시킨다. 그리고 나서, 트롬빈 및 피브린을 형성하게 되고, 최종적으로 혈액 덩어리 (blood clot)이 형성된다.
종양 내피상에서는 이용가능하지만 정상적인 내피에서는 대부분 존재하지 않는, 일련의 적합한 표적 분자들이 이미 개시되어 있다. 예를 들면, 엔도글린, E-셀렉틴, P-셀렉틴, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, TIE, LAM과 반응성을 나타내는 리간드, VEGF/VPF 수용체, FGF 수용체, αVβ3인테그린, 플레이오트로핀 또는 엔도시알린과 같은 발현된 표적이 사용될 수 있다 {참조: Burrows 등, 1992; Burrows 및 Thorpe, 1993; Huang 등, 1997; 미합중국 특허 제5,855,866호; 제5,877,289호; 제6,004,555호 - 각각 본원에 참조문헌으로 포함}.
또한, 미합중국 특허 제5,776,427호 및 제6,036,955호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재된 바와 같이, 자연적인 종양 환경 또는 인간의 간섭에 의해 유도가능한 기타의 표적이 표적화가능한 것이다. 정상적인 조직 및 조양 혈관 유도에서 사전에 억제하여 사용하는 경우, MHC 클래스 II 항원을 표적으로 사용할 수 있다 {참조: 미합중국 특허 제5,776,427호, 제6,004,554호 및 제6,036,955호 - 각각 본원에 참조문헌으로 포함}.
흡수되는 표적은, TIE 또는 종양-관련 피브로넥틴 아이소폼에 결합하는 리간드, TIMP, PDGF, PF4, HGF, TGF 베타, FGF, VEGF와 같은 기타의 적합한 그룹이다 {참조: 미합중국 특허 제5,877,289호 및 제5,965,132호 - 각각 본원에 참조문헌으로 포함}. 피브로넥틴 아이소폼은, 인테그린 패밀리에 속하는 수용체에 결합하는 리간드이다. 종양-관련 피브로넥틴 아이소폼은, 종양 혈관체 및 종양 기질 모두의 표적 가능한 성분이다.
상기한 임상 표적 적용시에 현재 바람직한 마커 중 하나는, 수용체-연결 VEGF이다. 사실상, VEGF/수용체 복합체는 현재까지 관찰된 것중에서 가장 특이성을 가지는 종양 혈관체 마커 중에 하나이다 {참조: 미합중국 특허 제5,877,289호 ; 제5,965,132호; 제6,051,230호; Lin-Ke 등, 1996; Dvorak 등, 1991b - 각각 본원에 참조문헌으로 포함}.
이러한 VEGF/수용체 복합체는, 종양은 사이토카인 및 성장 인자가 풍부하고 VEGF 수용체는 대부분의 고형 종양에서 발견되는 저산소 상태에서 상향 조절 (up-regulation) 되기 때문에, 약물 또는 기타의 효능제를 종양 내피에 특이적으로 전달하는 표적을 제공한다 {참조: Mazure 등, 1996; Forsythe 등, 1996; Waltenberger 등, 1996; Gerber 등, 1997; Kremer 등, 1997}. 종양 미세환경에서 특이적으로 상기한 리간드 및 이의 수용체가 모두가 상향 조절됨으로써, 정상 조직내의 혈관 내피와 비교하여 종양 혈관 내피상에 있는 수용체의 농도가 높다 {참조: 미합중국 특허 제5,877,289호 및 제5,965,132호}. Dvorak 및 동료들은, VEGF의 N 말단에 대한 토끼의 폴리클론 항체를 동계 종양 (syngeneic tumor)를 가지고 있는 마우스에 주사하여 종양 혈관을 특이적으로 염색시킨 것을 보여주었다 {참조: Lin-ke 등, 1996}.
임상적으로 개입하기 위한 표적으로서의 VEGF의 역할은, 면역 독소 또는 응고 리간드 치료에만 한정되는 것은 아니다. 사실상, VEGF는 고형 종야의 안지오제네시스에 관여하는 주요한 인자 중 하나로서 {참조: Ferrara, 1995; Potgens 등, 1995}, 강력한 투과성 제제 {참조: Senger 등, 1983; Senger 등, 1990; Senger 등, 1986} 및 내피세포-유사분열 유도제)(mitogen) {참조: Keck 등, 1983; Connolly 등, 1989; Thomas, 1996} 이다. VEGF와 안지오제네시스 사이의 관련성으로 인해, VEGF 간섭을 목표로 한 다양한 치료 전략이 제안되어 왔다 {참조: Siemeister 등, 1998}.
A. VEGF 및 VEGF 수용체
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는, 저산소 및 발암성 돌연변이에 의해 유도되는 다기능성 사이토카인이다. VEGF는, 배 발생에서 혈관 네트워크의 발생 및 유지를 자극하는 주요 인자이다. VEGF는, 강력한 침투 유도제, 내피세포 화학주성제, 내피 생존제 및 내피세포 증식 인자로서 작용한다 {참조: Thomas, 1996; Neufeld 등, 1999}. VEGF 대립형질 중 하나 또는 둘 다가 표적화되어 간섭을 받게 되면 배(embryo)에게는 치명적인 결과를 가져오기 때문에 {참조: Carmeliet 등, 1996; Ferrara 등, 1996}, 정상적인 배 발생을 위해서는 VEGF의 활성이 필요하다 {참조: Fong 등, 1995; Shalaby 등, 1995}.
VEGF는, 상처 치유 {참조: Frank 등, 1995; Burke 등, 1995}, 당뇨성 망막증 {참조: Alon 등, 1995; Malecaze 등, 1994}, 건선 {참조: Detmar 등, 1994}, 아테로마성 동맥 경화증 {참조: Inoue 등, 1998}, 류마티스성 관절염 {참조: Harada 등, 1998; Nagashima 등, 1999}, 고형 종양 성장 {참조: Plate 등, 1994; Claffey 등, 1996}를 포함하여 수많은 생리 및 병리 과정에서 안지오제네시스 또는 혈관생성을 유도하는 주요한 인자이다
여러 다양한 세포 및 조직에서는, 동일한 유전자에 의해 코드되는 스플라이스 변이체 (splice variant)인 적어도 5가지의 아이소폼 (121, 145, 165, 189 및 206 아미노산)으로 존재하는 VEGF를 생산한다 {참조: Houck 등, 1991; Ferrara 등, 1991; Tischer 등, 1991}. 작은 2가지의 아이소폼 (121 및 165)은 세포로부터 방출된다 {참조: Houck 등, 1991; Anthony 등, 1994}. 방출된 VEGF는, 모노머가 2개의 디설파이드 결합에 의해 결합된 38 내지 46KDa의 오블리게이트 다이머 (obligate dimer)이다.
VEGF 다이머는, 내피 세포상에서 선별적으로 발현되는 2가지의 수용체인 VEGFR1 (FLT-1) 및 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 높은 친화성으로 결합한다 - Flt-1 및 Flk-1은 마우스 동형이다. VEGF의 VEGFR1 및 VEGFR2에 대한 결합 Kd는 각각 15-100pM 및 400-800pM이다 {참조: Terman 등, 1994}. 최근에 밝혀진 제3의 세포 표면 단백질인 뉴로필린-1 또한 VEGF에 높은 친화성으로 결합한다 {참조: Olander 등, 1991; De Vries 등, 1992; Terman 등, 1992; Soker 등, 1998}.
VEGFR1 및 VEGFR2는, 7개의 세포외 IgG-유사 반복체 (repeat), 1개의 세포막 통과-도메인 및 세포내 분절 티로신 카이네이즈 도메인을 가지는 것이 특징인 타입 III 수용체 티로신 카이네이즈 (RTK III) 패밀리에 속한다 {참조: Mustonen 및 Alitalo, 1995}. 매우 최근까지, VEGFR1 및 VEGFR2는 내피세포 상에서만 거의 발현되는 것으로 생각되었다 {참조: Mustonen 및 Alitalo, 1995}. VEGFR1 및 VEGFR2가 내피세포의 증식, 이동 및 발생에 있어서 상이한 기능을 수행한다는 것이 보고되었으나 {참조: Waltenberger 등, 1994; Guo 등, 1995}, 각각의 수용체가 VEGF 생물학 및 내피세포 항상성에 있어서 수행하는 정확한 역할에 대해서는 본 발명 이전에는 분명하게 밝혀지지는 않았다.
녹-아웃 (knockout) 마우스를 이용한 최근의 연구에서는, VEGF, VEGFR1 및 VEGFR2 각각이 혈관생성, 안지오제네시스 및 배 발생에 필수적이라는 것을 보여준다 {참조: Fong 등, 1995; Shalaby 등, 1995; Hiratsuka 등, 1998}. 치명적으로 녹-아웃시킨 경우, 각 수용체가 없는 표현형은 각각 상이했다. VEGFR2를 표적화하여 파괴하는 경우, 배에 있어서 내피 세포 분화가 일어나지 않았으며, 난황란 혈관도를 형성하지 못하거나 혈관생성이 이루어지지 않았다 {참조: Shalaby 등, 1995}. VEGFR1이 없는 돌연변이체는, 혈관생성이 손상을 받았으며, 내피 세포가 무작위로 배치되었으며, 혈관이 팽창되었다 {참조: Fong 등, 1995; Hiratsuka 등, 1998}. VEGFR1은 필수적인 생물학적 역할을 수행하는 것이 분명하다.
VEGFR1은, 티로신 카이네이즈 활성은 VEGFR2에 비해 작지만, VEGFR2에 비해 VEGF에 대한 친화성은 더 크다. 이는, VEGFR1의 세포외 도메인이 특히 중요하다는 것을 암시한다. 이러한 가정은, VEGFR1의 티로신 카이네이즈 도메인을 제거하고 VEGF 결합 도메인은 그대로 유지한 녹-아웃 마우스에서의 연구 결과에 의해 강력히 뒷받침된다 {참조: Hiratsuka 등, 1998}. VEGFR1-티로신 카이네이즈 결손 배는 정상적인 혈관을 발생시켰으며, 끝까지 살아남았다 {참조: Hiratsuka 등, 1998}.
그 이전의 녹-아웃 연구에 추가하여 {참조: Fong 등, 1995; Shalaby 등,1995}, Hiratsuka 등(1998)의 연구에서도 VEGFR1이 필수적인 생물학적 역할을 가지고 있음을 보여준다. 하지만, 티로신 카이네이즈 신호전달은 핵심 요소로 보이지 않는다. VEGFR1 녹-아웃 마우스에서의 마크로파지는 VEGF-유도 화학 주성을 보이지 않음으로써 {참조: Hiratsuka 등, 1998 (본원에서 참조문헌으로 포함)}, VEGFR1이 VEGF에 이러한 중요한 생물학적 반응을 매개하는 것을 책임지는 수용체일 것이라는 것을 암시한다.
소정의 연구 그룹에서는, VEGFR2가 VEGF-유도 유사분열 및 투과에 있어서 주요한 신호전달 수용체라고 보고하였다 {참조: Waltenberger 등, 1994; Zachary, 1998; Korpelainen 및 Alitalo, 1998}. VEGFR1이 마크로파지의 이동 및 화학주성에 기능을 한다는 것을 Hiratsuka 등(1998)의 연구에서 보여주고 있으나, 내피 세포의 기능에 있어서의 VEGFR1의 역할은 아직 분명한 것은 아니다.
Clauss 등(1996; 본원에서 참조문헌으로 포함)은, VEGFR1이 모노사이트의 활성화 및 화학 주성에 주요한 역할을 수행함을 보고하였다. 사실상, 마크로파지/모노사이트 계열의 세포들은, 모노사이트의 점증 (recruitment) 및 응고제 이전(procoagulant) 활성을 매개하는 수용체인 VEGFR1만을 발현한다 {참조: Clauss 등, 1996}. 모노사이트 및 마크로파지 상의 VEGFR1에 대한 VEGF의 결합은, 세포내 칼슘의 농도를 증가시키고 티로신 인산화를 유도함으로써 활성을 나타낸다 {참조: Clauss 등, 1996}.
VEGF 다이머의 VEGF 수용체에 대한 결합으로 인해, 수용체의 다이머화가 유도되는 것으로 생각된다. 그리고나서, 이러한 수용체의 다이머화로 인해, VEGFR1및 VEGFR2의 세포내 측면상의 특이한 티로신 잔기인 각각 Y801과 Y1175 및 Y1213과 Y1333의 자가 상호 인산화 과정 (autotransphosphorylation)이 유도된다. 이로 인해, 신호 전달 캐스캐이드가 발생하게 되어, 포스포리파제 Cγ (PLCγ) 및 포스파티딜리노시톨 3-카이네이즈 (PI3K)가 활성화되고, 세포내의 칼슘 이온의 농도가 증가하게 된다 {참조: Hood 및 Meininger, 1998; Hood 등, 1998; Kroll 및 Waltenberger, 1998}.
또한, VEGF가 VEGFR2를 활성화시킨 후에 질산 (NO)이 생산된다는 것을 많은 연구 그룹에서 개시하였으나, VEGF-유도 신호전달에 있어서 세포내에서 발생하는 후속 하부 사건에 대해서는 분명하지 않다 {참조: Hood 및 Meininger, 1998; Hood 등, 1998; Kroll 및 Waltenberger, 1998}. VEGF에 의한 VEGFR2 (VEGFR1이 아닌)의 활성화는, MAP 카이네이즈, ERK 1 및 2를 포함한 Src 및 Ras-MAP 카이네이즈 캐스캐이드를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다 {참조: Waltenberger 등, 1994, 1996; Kroll 및 Waltenberger, 1997}.
특히, Flt-1 티로신 카이네이즈-결손 마우스는 생존가능하고 정상적인 혈관을 발생시키기 때문에, 내피 세포의 기능에 있어서의 VEGFR1의 역할에 대해서는 보다 덜 분명하다 {참조: Hiratsuka 등, 1998}. 내피세포에 대한 VEGFR1의 생물학적 주요 역할은 비-신호전달 리간드-결합 분자 또는 VEGFR2에 VEGF를 전달하는 데에 필요한 "데코이 (decoy)" 수용체라고 제안되었다.
VEGF와 병리적인 안지오제네시스 상태 사이의 연관성으로 인해, VEGF의 활성을 차단하려는 여러 번의 시도가 있어왔다. 이러한 것으로는, VEGF에 대한 소정의중화 항체의 개발이 포함된다 {참조: Kim 등, 1992; Presta 등, 1997; Sioussat 등, 1993; Kondo 등, 1993; Asano 등, 1995}. 또한, VEGF 수용체에 대한 항체에 대한 하기 문헌에서 기재되었다: 미합중국 특허 제5,840,301호; 제5,874,542호; 및 WO99/40118. 미합중국 특허 제5,840,301호 및 제5,874,542호에서는, VEGF 자체보다 VEGF 수용체를 차단하는 것이 여러 이유로 인해 잇점이 있다는 것을 제안하고 있다.
가용성 수용체 작제물 {참조: Kendall 및 Thomas, 1993; Aiello 등, 1995; Lin 등, 1998; Millauer 등, 1996}, 티로신 카이네이즈 억제제 {참조: Siemeister 등, 1998}, 안티센스 전략, RNA 앱타머 (aptamer) 및 VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 리보좀이 기재되어 있다 {참조: Saleh 등, 1996; Cheng 등, 1996; Ke 등, 1998; Parry 등, 1999 (각각 본원에 참조문헌을 포함)}.
B. 항-VEGF 항체
B1. 일련의 항체의 특성
다양한 억제 방법들이, VEGF 신호전달을 방해함으로써 안지오제네시스를 차단하고/하거나 종양 성장을 억제하는 데에 적어도 어느 정도는 효과적인 것으로 나타났다. 사실상, VEGF에 대한 모노클론 항체는, 마우스에서 인간의 종양 이종이식편 성장 및 복수 (ascite) 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다 {참조: Kim 등, 1993; Asano 등, 1995; Mesiano 등, 1998; Luo 등, 1998a; 1998b; Borgstrom 등, 1996;1998}.
항체 A 4.6.1은, VEGFR1 및 VEGFR2 모두에 대해 VEGF가 결합하는 것을 차단할 수 있는 고친화성의 항-VEGF 항체이다 {참조: Kim 등, 1992; Wiesmann 등, 1997; Muller 등, 1998}. A 4.6.1의 Fab 단편에 의해 결합된 VEGF의 알라닌 스캐닝 돌연변이 형성 및 X-ray 결정도에서는, A 4.6.1이 결합하는 VEGF 상의 에피토프가 아미노산 89 내지 94 주위에 모여있다는 것을 보여준다. 이러한 구조에 대한 데이터에에서는, A 4.6.1이 VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하지만, VEGF의 VEGFR1에 대한 결합은 주로 입체적인 방해 (steric hindrance)에 의해 억제하는 것을 나타낸다 {참조: Muller 등, 1998; Keyt 등, 1996 - 각각 본원의 참조문헌에 포함}.
A 4.6.1은, 현재까지 문헌에서 가장 광범위하게 사용되고 있는 중화 항-VEGF 항체이다. A 4.6.1은, 마우스 내에서 인간의 다양한 종양의 성장 및 VEGF-유도 혈관 투과를 억제하는 것으로 알려져 있다 {참조: Brem, 1999; Baca 등, 1997; Presta 등, 1997; Mordenti 등, 1999; Borgstrom 등, 1999; Ryan 등, 1999; Lin 등, 1999 - 각각 본원의 참조문헌에 포함}. 또한, A 4.6.1은, 잘 알려진 인간의 난소암-마우스 모델에서 복수(ascite) 형성을 억제하고, 새로운 전이 마우스 모델에서 종양이 퍼지는 것을 억제한다. A 4.6.1은, 1가 파아지 디스플레이 기술에 의해 최근에 인간화되었으며, 1상 임상 시험에서 항암제로서 현재 사용되고 있다 {참조: Brem, 1999; Baca 등, 1997; Presta 등, 1997 - 각각 본원의 참조문헌에 포함}.
당해 분야에서 VEGF-중화 항체를 사용하여 어느 정도의 성공이 있었음에도 불구하고, 본 발명자들은 새로운 항체, 특히 VEGFR1 (FLT-1) 및/또는 VEGFR2(KDR/Flk-1)과 보다 정확하게 상호작용하는 항체가 여러 가지 이유로 인해 더 잇점이 있다는 것을 알게 되었다. 예를 들면, 2가지의 VEGF 수용체 중에서 하나의 수용체에 대한 VEGF의 상호작용을 선택적으로 차단하는 항-VEGF 항체를 개발하게 되면, VEGFR1 및 VEGFR2를 모두 발현하는 세포에서 VEGF에 의해 활성화되는 경로를 보다 정확하게 분석할 수 있게 된다.
하나의 수용체 (VEGFR2)에 대해서만 VEGF가 결합하는 것을 차단하는 에피토프-특이성을 가지는 항체는, 생체내 환경에서 이의 억제 효과를 유지하는 것과 관련된 임상 효과를 가지는 것이 당연할 것이라는 것을 본 발명자들은 믿게 되었다. Hiratsuka 등 (1998)의 녹-아웃 마우스 연구에서는, VEGFR1 및 VEGFR2가 모두 중요한 생물학적 역할을 가진다는 것을 보여준다. 본 발명 전에는, 상기 2가지의 수용체 중에서 하나의 수용체를 통해서만 VEGF-매개 효과를 억제하는 것을 목적으로 하는 치료 방법은 효과적이고 잘 정의된 억제제가 없었기 때문에 실제적으로 사용할 수 없었다.
본 발명에서, 다양한 에피토프-특이성 및 특성을 가지는 새로운 항-VEGF 항체를 최초로 개발하였다. 본 발명에서는, VEGF:수용체 (Flk-1) 복합체 또는 VEGF에 대한 모노클론 항체를 방출하는 6개 그룹의 하이브리도마가 제공된다. 이중에서 5가지의 항체 그룹은 VEGF가 이의 수용체에 결합하는 것을 억제하지 않는 반면, 하나의 항체 그룹 (2C3 그룹)이 이러한 상호작용을 억제하며 VEGF-매개 내피세포의 성장을 억제하였다.
인간의 종양 이종이식편을 가지는 마우스에 정맥내 주사한 후에 선택적으로상기 종양을 찾아가는 3E7, GV39M 및 2C3 그룹의 항체는, 고형 종양의 혈관체 또는 결합 조직의 표적화, 이미지화 및 치료에 현재 바람직하게 사용되고 있다.
VEGF:수용체 복합체를 인식하는 본 발명의 모노클론 항체는, 인간의 종양 이종이식편을 가지는 마우스에 정맥내 주사한 후에 선택적으로 종양 내피세포를 찾아간다. 2C3 그룹의 모노클론 항체는, 상기 종양의 혈관 주위의 결합 조직 및 주위의 종양 혈관을 뚜렷하게 찾아낸다.
N 말단을 인식하는 상기 항체는 ELISA에 의해 VEGF에 결합된 수용체와 반응한다. GV39M 및 11B5는, 수용체가 결합되지 않은 VEGF에 대해서와는 달리, 수용체-결합된 VEGF에 대한 높은 특이성을 가진다. N 말단 상에서 GV39M 및 11B5에 의해 인식되는 에피토프는, 형태적인 특성을 가지는 것으로 생각되며(conformational), VEGF가 이의 수용체에 결합할 때에 생성된다. 상기 항체 둘다가 IgM이므로 크기가 크다는 사실은, VEGF:수용체 복합체에 대한 이의 특이성에 있어서 중요할 수 있다.
상기한 항-N 말단 항체는, VEGF-매개 내피세포 성장을 억제하지 않았다. 이는, VEGF의 N 말단은 수용체와의 상호 작용에 관여하지 않으며, VEGF의 N 말단에 대한 항체는 VEGF-매개 신호전달을 방해하지 않음을 의미한다.
이와 달리, 2C3는 내피세포의 VEGF-매개 성장을 억제한다 (IC50= 3nM). 내피세포를 발현하는 KDR (ABAE 세포)을 사용한125I-VEGF 결합 연구에서는, 2C3가 VEGF의 KDR에 대한 결합을 농도에 따라 차단함을 보였다. 따라서, 2C3는 실험실내에서 VEGF가 이의 수용체에 결합하는 것을 방해함으로써 KDR (VEGFR2)-매개 VEGF 활성을 중화시킬 수 있다.
면역조직화학 분석에 따르면, 혈관 내피세포 절개편에 직접 도입한 경우, GV39M, 11B5, 3E7 및 7G3는 혈관 내피세포와 온건한 정도 내지 강한 정도로 반응한다. GV39M은, 종양 세포 또는 결합 조직을 비교적 거의 염색시키지 않으면서 종양 내피세포에 대한 높은 특이성을 보인다. 11B5, 3E7 및 7G3는, 낮은 농도에서는 내피세포를 선택적으로 염색시키지만, 높은 농도에서는 종양 세포 및 결합 조직을 염색시킨다.
11B5, 3E7 및 7G3를 사용하여 관찰되는 염색 형태는, VEGF의 특정 형태에 특이성을 가지지 않는 VEGF에 대한 폴리클론 항체를 사용한 때에 관찰되는 염색 형태가 통상적이다 {참조: Lin-Ke 등, 1996; Plate 등, 1994; Claffey 등, 1996}. GV39M에 의한 내피세포의 선택적인 염색은, GV39M이 내피세포상의 VEGF:수용체 복합체에 결합함을 암시해주며, 상기 수용체의 내피세포의 위치와 일치하고, ELISA에서 GV39M이 VEGF:sFlk-1에 선택적으로 결합함을 암시해준다.
이와 유사하게, 3E7 및 7G3의 보다 넓은 염색 형태는 자유 VEGF 및 수용체-결합된 VEGF를 모두 인식할 수 있는 11B5, 3E7 및 7G3의 능력과 일치한다. 하지만, 11B5는 포획 ELISA 에서 VEGF:Flk-1와 강하게 결합하기 때문에 (참조: 표 2), 내피세포에 보다 한정된 염색 형태를 가질 것으로 예상되었다. 기질 성분에 결합하는 VEGF를 11B5는 인식할 수 있음으로써, 11B5는 종양 절단편에 대해 보다 광범위한 반응 형태를 가질 수 있다.
3E7 및 GV39M은 종양 조직의 혈관 내피세포에 대해 생체내에서 선택적으로 찾지만, 2C3는 종양의 혈관 내피세포 뿐만 아니라 혈관 주위의 결합 조직 또한 찾아간다. 종양을 가지고 있는 마우스에 대해 정맥내 주사한 후 24시간 경과후, 3E7은 종양을 제외한 다른 조직의 내피세포에서는 검출되지 않았다. 반면, GV39M은 신장의 신사구체(glomeruli) 내의 내피세포 또는 사구체 간질 세포 (mesangial cell)에 결합하였다. GV39M이 마우스의 신사구체와 반응을 보이는 이유는 확실하지 않다. 신장의 정상적인 내피세포 상의 VEGF:수용체 복합체에 상기 항체가 결합할 수도 있다 {참조: Takahashi 등, 1995}. 하지만, 동일 계열의 10개의 종양을 가진 기니아 피그에 대한 위치 연구에서는, GV39M이 종양의 혈관을 찾아가지만, 기타의 정상 조직내의 신사구체 간질 또는 혈관을 찾아가지는 않는다는 것을 보여주었다.
3E7 및 GV39M이 종양 내피세포를 특이적으로 찾아갈 수 있는 능력은, 적어도 2가지의 요인에 기인한 것 같다. 첫째, 저산소의 종양 미세환경이 종양 세포에 의한 VEGF의 발현 및 내피세포에 의한 VEGF 수용체의 발현을 자극하기 때문에, VEGF:수용체 복합체는 종양 혈관상에 상대적으로 풍부하다. 둘째, 종양 혈관은 정상 혈관에 비해 보다 투과성이 좋아서 {참조: Yuan 등, 1996}, 상기 혈관의 관강에서 떨어진 표면 (abluminal face)에 집중되어 있는 것으로 보이는 VEGF:수용체 복합체에 상기 항체가 접근하기가 좋을 수 있다.
Lin-Ke 및 그의 동료들의 연구 (1996) 이전에는, 랫트의 VEGF의 N 말단에 대한 토끼의 폴리클론 항체를 TA3/St 마우스 유방암 또는 MOT 난소암을 가진 마우스에 주사하면, 상기 항체가 종양의 내피세포를 찾아가는 것으로 확인되었다. 이와 달리, 전체 VEGF에 대한 토끼의 폴리클론 항체 (Ab-618)은 종양내의 내피세포 또는 종양 내의 다른 부위를 특이적으로 찾아가지 않았다.
이러한 결과에 기초하여, Lin-Ke 등 (1996)은 VEGF가 모세혈관 내피와 결합한 후에 VEGF의 N 말단이 항체에 결합하는 능력을 가지고 있으며, 자유 또는 내피세포-결합되지 않은 VEGF 풀 (pool)이 비-N 말단 에피토프에 대한 항-VEGF 항체를 농축시키기에는 충분하지 않다고 결론지었다. VEGF의 N 말단에 대한 3E7 및 GV39M의 결과가 이러한 결론을 지지한다.
하지만, VEGF 상의 비-N 말단 에피토프에 대한 2C33 항체 그룹이 마우스내의 고형 종양의 혈관 및 혈관 주위의 결합 조직을 모두 찾아간다는 본 발명에서 찾아낸 사실은, Lin-Ke 등 (1996)의 연구 결과와 비교하면 매우 놀라운 사실이다. 본 발명에서는, VEGF 풀이 종양 기질내에 존재하고, 종양 질량체내에 2C3가 농축되게 할 수 있게 된다고 제안하고 있다. 이러한 종양 기질 표적화는, 이전의 문헌을 통해서는 예측될 수 없는 사실이다. 본 발명자들은, 활성 메카니즘은 본 발명을 실시하는 데에 반드시 필요하지는 않으나, VEGF가 종양 내의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (HSPG)에 결합할 수 있다고 생각한다.
본 발명의 초기의 결론은, GV39M 및 3E7 항체 그룹은 마우스내의 종양 내피 세포를 선택적으로 찾아가는 반면, 2C3 항체 그룹은 종양 내피 세포 및 종양의 주위 혈관 결합 조직을 찾아간다는 것이다. VEGF 및 이의 수용체의 분포는 마우스 및 인간에서 서로 유사하기 때문에, 상기 항체들은 암 환자의 종양의 위치 파악에서도 유사한 형태를 보일 것으로 생각된다. 따라서, GV39M 및 3E7은 인간의 종양 혈관체에 치료제 또는 진단제를 전달하는 데에 사용될 수 있는 것으로 생각되는 반면, 2C3 항체 그룹은 종양 혈관체 및 종양 결합 조직에 치료제 또는 진단제를 표적화시키는 비히클로서 사용될 수 있다고 생각된다.
B2. VEGFR2-차단, 항-VEGF 및 2C3 항체
2C3 항체 그룹에 대한 추가의 연구에서는 또 다른 놀라운 특성을 밝혀냄으로써, 본 발명의 효과적인 조성물 및 용도를 제공하였다.
ELISA를 사용하여 수용체 결합 분석 및 수용체 활성화 분석을 통해 본 발명에서 발견한 중요한 사실은, 2C3 그룹의 모노클론 항체는 VEGF의 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 대한 상호작용을 선택적으로 차단하는 반면에 VEGFR1 (FLT-1)에 대해서는 그렇지 않다는 점이다. 2C3 항체는 VEGFR2의 VEGF-유도 인산화를 억제하고, VEGF-유도 투과를 차단함으로써, VEGFR2가 VEGF-유도 투과를 담당하는 수용체라는 것을 암시해준다. 또한, 2C3 항체는 강력한 항-종양 활성을 가짐으로써, 당해 분야에서 인정되고 있는 인간의 암에 대한 동물 모델에서 다양한 종류의 확립된 인간의 고형 종양의 성장을 중지시킨다.
VEGFR1 및 VEGFR2를 모두 발현하는 세포에서 VEGF에 의해 활성화되는 경로를 분석하고, 종양의 성장 및 생존 과정에서의 VEGFR2 활성의 중요성을 부각시킴에 있어서, 상기한 발견 사실들이 2C3의 중요성을 보여준다. 보다 중요한 점은, 부수적으로 발생하는 마크로파지의 화학 주성, 오스테오클라스트 및 콘드로클라스트 기능의 억제 (VEGFR1에 의해 매개) 없이, VEGFR2-유도 안지오제네시스를 특이적으로 억제하는 새로운 형태의 치료 방법을 제공한다는 것이다.
따라서, 2C3에 대한 발견으로 인해, 본 발명에서는 VEGFR1이 아닌 VEGFR2에 대한 VEGF의 결합을 억제하는 항-VEGF 항체를 제조 및 사용할 의도 및 수단을 최초로 제공한다. 간단하게 용어 "VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체"로 불리는 상기 항체는, 당해 분야에서 큰 발전을 이루었음을 보여주며, 컨쥬게이션 되지 않은 자유 형태로서 및 기타의 다른 치료제와 컨쥬게이션되거나 연결된 경우 모두에서 다양한 잇점을 제공한다.
정제된 수용체 단백질을 이용한 공-침전 분석 및 ELISA를 사용한 본 발명의 실험실내 결합 연구에서는, 2C3가 VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 차단한다는 점을 보여주었다. 놀랍게도, 2C3가 모든 분석 시스템에서 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 억제하지는 않았다. 이러한 초기 결과를 확인하기 위해, 상이한 구성 (configuration)으로 결합 ELISA를 반복하였다. 각 구성에서의 결과는, 2C3가 VEGF:VEGFR1 상호 작용을 간섭하지 않는다는 것을 보여주었다. 이러한 연구에 대한 대조군으로서 모노클론 3E7 (VEGF의 NH2말단에 대한 항체)를 사용하였는 데, 이는 VEGF의 VEGFR1 또는 VEGFR2에 대한 결합을 차단하지 않았다.
따라서, 본 발명의 2C3 항체 그룹은 A 4.6.1을 포함한 VEGF의 기타의 다른 차단 항체 보다 매우 향상된 항체이다. A4.6.1 항-VEGF 항체는, VEGF의 2가지의 VEGF 항체 모두에 대한 결합을 차단하였다. 결정 분석 및 돌연변이 연구 결과, VEGFR1 및 VEGFR2에 대한 결합 에피토프는 VEGF 다이머의 2개의 대칭적인 폴(pole) 쪽으로 집중되어 있음을 알 수 있었다 {참조: Wiesmann 등, 1997; Muller 등, 1997}. 상기 2가지의 수용체와 상호작용하는 VEGF 상의 결합 결정기 (binding determinant)는, 부분적으로 중첩되어 있고, 다이머 표면을 가로지르는 4가지의 사이한 절편 상에 분포되어 있다 {참조: Muller 등, 1997}. 항체 A 4.6.1은 상기한 2가지의 수용체의 수용체 결합 부위내의 VEGF 부위에 결합한다 {참조: Muller 등, 1998}. 2C3는 VEGFR2 결합 부위에 인접한 부위에 결합하는 반면, VEGFR1 결합 부위에 인접한 부위에는 결합하지 않는 것으로 제안되고 있다.
상기한 수용체의 VEGF-유도 인산화에 대한 2C3의 영향에 대한 연구는, 2C3는 VEGFR2의 VEGF-유도 인산화를 차단하지 않는다는 것을 보여주었다. 또한, 이러한 결과는 상기한 데이터와도 상응하는 결과이며, VEGF-유도 증식에서의 VEGFR2가 역할을 한다는 사싱ㄹ을 지지해준다.
다른 연구 결과와 유사하게, VEGFR1이 일관되게 VEGF-유도 인산화시킨다는 것은 보고되지 않았다 {참조: De Vries 등, 1992; Waltenberger 등, 1994; Davis-Smyth 등, 1996; Landgren 등, 1998}. 따라서, 2C3가 VEGFR1의 VEGF-유도 인산화를 억제하는 지에 대해서는 신뢰성있는 결과는 없다. VEGF이 VEGFR1 인산화에 대해 낮은 활성을 갖는다는 결과는, VEGFR1이 내피세포 상의 신호전달 수용체가 아닐 수 있다는 점과 VEGFR1이 데코이(decoy) 수용체로서 작용하여 VEGF를 포획하여 VEGFR2를 통한 신호전달을 증폭시킬 수 있을 것이라고 다른 연구자들이 생각하게 만들었다 {참조: Hiratsuka 등, 1998}. 하지만, VEGF 결합에 의한 VEGFR1의 티로신 인산화는, 인간의 모세혈관 내피세포 (HMEC)를 이용한 Kupprion 등 (1998) 및VEGFR1을 과발현하는 NIH 3T3 세포를 이용한 Sawano 등 (1996)에 의해 보고되었다. 또한, Waltenberger 등 (1994)은, 실험실내 카이네이즈 분석을 이용하여 VEGF-유도 VEGFR1 활성화가 이루어질 수 있음을 보여주었다. 2C3이 VEGFR1의 VEGF-유도 인산화에 대해 영향을 끼치는 지 또는 그렇지 않은 지에 대해서는, 상기한 세포 유형 중 하나 또는 실험실내 카이네이즈 분석을 이용하여 측정할 수 있다.
도 2의 ELISA 데이터 및 세포 결합 데이터에서는, VEGFR1 및 VEGFR2를 모두 발현하는 세포에 VEGF가 결합하는 것을 2C3가 완전히 차단하지 않는다는 것을 보여준다. 2C3가 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 차단하지 않는다는 사실은, 내피세포 및 기타 유형의 세포의 생물학에 있어서 VEGFR1의 역할을 규명하는 데에 있어서 2C3 항체가 유용한 수단이 될 것이라는 것을 의미한다.
2C3가 VEGF가 이의 수용체를 활성화시키는 것을 차단한다는 것을 보여주는 선별성 기능 결과에 대해, 기니아 피그에서 Miles 투과성 분석을 이용하여 시험하였다. 2C3 및 A 4.6.1 둘 다, IgG를 VEGF보다 10배 이상 과량 (몰)으로 투여한 경우, VEGF-유도 투과를 억제하였다. 3E7 및 대조군 항체는 1000배의 과량 (몰)에서도 VEGF-유도 투과를 억제하지 않았다. 이러한 결과를 통해, VEGFR2가 VEGF-유도 투과에 관여함을 알 수 있다.
이러한 결과는, 새로운 형태의 VEGF-C 및 2가지의 바이러스성 VEGF-E 변이체가 VEGFR2에는 결합하지만 VEGFR1에는 결합하지 않으면서 혈관 투과를 강화시킬 수 있는 능력을 보유한다는 최근의 연구 결과와도 일치한다 {참조: Joukov 등, 1998; Ogawa 등, 1998; Meyer 등, 1999}. 아마도, 다양한 형태의 VEGF가 VEGFR2를 통해신호를 전달하여 NO 생산을 유도함으로써 혈관 투과 증가를 유발하는 것으로 생각된다 {참조: Hood 및 Granger, 1998; Hood 등, 1998; Kroll 및 Waltenberger, 1998; Murohara 등, 1998; Kupprion 등, 1998; Sawano 등, 1996; Fujii 등, 1997; Parenti 등, 1998}. 이는, NO 생성이 VEGFR2 활성화의 결과인 것으로 관찰되었기 때문에, 간접적으로 VEGFR2가 관여함을 보여준다. 하지만, Couper 등 (1997)은 VEGF에 의해 유도되는 증가된 혈관 투과와 생체내에서의 VEGFR1 발현 사이의 큰 관련성을 발견한 것과 같이, 이와 상반되는 몇몇 증거들도 있다.
2C3는 생체내에서 여러 상이한 종류의 인간의 종양의 성장을 억제하였다. 1주에 2회씩 2C3 100㎍를 투여한 경우의 효과는, 종양이 크기가 약 150mm3인 작은 덩어리 (nodule)로 성장하는 것을 효과적으로 억제한 피하 NCI-H358 NSCLC 및 A673 횡문근육종을 가지는 마우스에서도 동일하였다. 인간의 결장 선암인 HT29 및 LS174T와 같은 기타의 다른 종양 모델에서도 이와 유사한 반응을 관찰하였다.
2C3에 의한 종양 성장 억제 정도는, 상이한 중화 항-VEGF 항체를 이용한 다른 연구자들에 의한 보고와 유사하였다 {참조: Asano 등, 1998; Mesiano 등, 1998}. 또한, 모노클론 랫트 항-마우스 VEGFR2 항체는, 항-안지오제네시스 메카니즘을 이용하여 마우스에서 인간의 각질 세포 악성 종양의 성장을 강력하게 억제하였다 {참조: Skobe 등, 1997}. 다른 연구자들이 상이한 항-VEGF 항체를 사용하여 발견한 사실과 유사한 2C3의 효능은, VEGF가 종양의 안지오제네시스 및 종양 성장에 역할을 한다는 것을 추가로 보여준다. 하지만, 2C3는 여기서 기재한 특정의 억제 특성에 기초한 안전한 치료제를 제공하여야 한다.
인간에서의 상태와 유사한 세팅에서 VEGF 활성을 억제하는 효과를 분석하기 위해, 종양을 가진 마우스를 2C3로 치료하였다. 이 세팅에서, 2C3 치료는 2가지의 활성이 큰 인간 종양 A673 횡문근육종 및 LS174T 결장 선암 종양의 성장을 크게 억제시켰다. 2C3 항체는 NCI-358 NSCLC 항체를 가지는 마우스에서 큰 정도로 종양 퇴행을 유도하였다.
약 10주간의 치료 후, 2C3 또는 A4.6.1로 치료한 종양은 최초 크기의 각각 30% 및 35%로 퇴행되었다. 100일 이상을 치료한 경우에는, 그보다 더 크게 퇴행되었다. 이러한 결과는, VEGF는 종양 내피세포에 대해 유사분열 신호 이상을 제공한다는 것을 암시해준다.
종양 정체 (stasis)가 아닌 퇴행 (regression)이 관찰되었다는 사실은, VEGF가 종양 내피세포에 대한 안지오제네시스 신호 이상을 제공한다는 것을 암시해준다. Benjamin 등 (1999)의 최근 보고에 의하면, 종양은 내피세포 주위의 세포와 접촉선을 확립하지 않은 많은 분획의 미성숙 혈관을 함유하고 있으며, 이러한 혈관은 생존을 위해 VEGF에 의존해야한다는 것이다. VEGF를 중화시킴으로써 이러한 미성숙 혈관이 세포사멸되도록 유도하여 종양내에 존재하는 혈관 네트워크를 감소시키는 것이 가능하다. 또한, 혈관 형성 및 혈관 퇴행를 수반하는 역동적인 혈관 리모델링 과정이 종양내에서 발생하고, VEGF의 중화로 혈관 형성이 혈관 퇴행으로 이동되는 것을 방지할 수도 있다.
2C3가 A4.6.1과 같이 (그 이상은 아닐지라도) 종양 성장을 완전히 억제하였다는 사실은, 종양의 안지오제네시스에서 VEGFR2에 대한 주요 역할을 보여준다. 다단계의 안지오제네시스 반응을 위해서는, 내피세포 화학주성, 메탈로프로티네이즈 생산, 침입, 증식 및 발생이 필요하다. VEGFR1은 이러한 반응에서 역할을 수행하지 않거나, VEGF에 결합하여 VEGF를 신호전달 수용체 VEGFR2에 전달함으로써 보조적인 역할을 수행할 수도 있다.
종양 치료에 있어서 2C3 및 A4.6.1에 대한 비교가능한 수치는 매우 상관성이 높다: 2C3는 VEGFR2에만 결합하고 VEGFR1에는 결합하지 않으나, A4.6.1 보다 조금 더 효과적이다. 따라서, 본 발명의 연구에서는, VEGFR1은 VEGF-매개 종양 안지오제네시스에는 중요한 역할을 수행하지 않는다는 것을 보여주며, VEGFR1-특이성 억제제는 종양 안지오제네시스에 영향을 끼치지 않을 것이라는 것을 보여준다. 또한, 이러한 결과는, 2C3는 A4.6.1과 동일하거나 더 효과적인 반면에 부작용은 더 적을 수 있다는 것을 보여준다.
VEGF의 VEGFR2에 대한 결합 및 VEGFR2의 활성화를 특이적으로 차단할 수 있는 능력은 2가지의 임상 관련 분야에서 중요성을 가진다. 첫째, VEGFR1 (Flt-1)은, 마크로파지 및 모노사이트는 VEGFR1을 발현하고 VEGFR1 신호전달을 통해 VEGF에 화학주성 반응을 하기 때문에, 마크로파지 및 모노사이트가 종양내로 도입되는 데에 중요한 역할을 수행한다 {참조: Clauss 등, 1996; Hiratsuka 등, 1998; Akuzawa 등, 2000}. 마크로파지를 활성화하면, 인간의 flt-1 프로모터에서 중첩되는 Egr-1/Sp1 전사 인자-결합 부위에 결합하는 Egr-1의 유도를 통해 flt-1 유전자의 전사가 촉발된다. 이는, 마크로파지 발생시 주로 유도되는 전사 인자인 flt-1유전자가 Egr-1의 직접 표적이라는 것을 증명한다 {참조: Akuzawa 등, 2000}.
강력한 항종양 활성을 위해서 필요한 마크로파지의 활성화를 유지시키기 위해, VEGFR1 신호전달의 억제를 피해야 한다. 따라서, 마크로파지의 침입(infiltration)이 손상되지 않음으로써 마크로파지가 괴사 종양으로부터의 종양 세포 잔해물을 제거하고 종양 축소 (shrinkage)를 활성화시키기 때문에, 본 발명에 의해 성취되는 VEGFR1의 특이적인 차단은 종양 치료에 있어서 A4.6.1에 비해 더 중요한 잇점을 제공한다. 또한, 2C3와 같은 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체를 사용하면, 침입하는 마크로파지가 종양 세포에 대해 직접적으로 세포 살해 효과를 가짐으로써 전체적인 항-종양 효과에 기여한다.
사실상, 본 발명에서는, 예를 들면 면역 세포 및 골 세포에 대해, VEGF 안지오제네시스 활성을 차단하고 VEGFR1에 의해 매개되는 기타의 다른 유용한 활성을 억제하지 않는 능력에 기인하여, 모든 형태의 항-안지오제네시스 치료법에 유용하게 사용할 수 있는 새로운 제제를 제공한다. 임상적으로 중요한 두번째 분야에서는, 본 발명에 따라 제조되는 항체가 오스테오클라스트 및 콘드로클라스트의 유익한 효과를 억제함이 없이 생체내에서 기능할 수 있다는 점에 주목한다. 이는, 본 발명의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 (2C3를 포함) 치료제를 사용하더라도 골 및/또는 연골에 대해 부작용을 나타내지 않음을 의미한다.
생체내 연구에 따르면, VEGF가 연골내 골 형성 과정중의 비대 연골 리모델링, 골화 과정 및 안지오제네시스와 관련되고, VEGF가 연골 리모델링에 필수적임이 관찰되었다 {참조: Gerber 등, 1999 (본원에 참조문헌으로 포함)}. 가용성VEGFR1 수용체 키메라 단백질 (Flt-(1-3)-IgG)를 투여함으로써, VEGFR1을 통한 VEGF의 신호 전달을 불활성화시키면, 콘드로클라스트의 도입 (recruitment) 및/또는 발생을 감소시킴으로써 비대 콘드로사이트 구역의 팽창 및 골주(trabecular bone) 형성이 손상된다 {참조: Gerber 등, 1999}.
또한, VEGF는 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF)를 대체하여 생체내에서 오스테오클라스트 기능을 도와줄 수 있다는 것이 관찰되었다 {참조: Niida 등, 1999 (본원에서 참조문헌으로 포함)}. M-CSF 유전자에서의 돌연변이로 인한 오스테오클라스트가 부족한 골화석증(osteopetrotic, op/op) 마우스를 이용한 연구에서, 재조합 인간 M-CSF (rhM-CSF)를 주사하면 오스테오클라스트가 도입되어 생존함을 보여주었다. 최근의 연구 결과에 따르면, 재조합 인간 VEGF를 1회 주사하면 이와 유사하게 op/op 마우스에서 오스테오클라스트가 도입되는 것을 유도할 수 있다 {참조: Niida 등, 1999}.
Niida 등 (1999)에 의하면, 오스테오클라스트가 현저하게 VEGFR1을 발현시키고, 오스테오클라스트가 도입된 후에 재조합 인간 태반 성장인자 1의 활성은 rhVEGF의 활성에 비교될 정도이므로, 골화석증 (op/op) 마우스에서의 VEGF 신호전달이 갖는 유용한 효과는 VEGFR1에 의해 매개된다. 또한, 상기 Niida 등 (1999)에의하면, VEGF가 억제 (VEGFR1 수용체 키메라 단백질 VEGFR1/Fc)된 후에는 rhM-CSF-유도된 오스테오클라스트가 죽게 되고, 이러한 효과는 rhM-CSF를 투여함으로써 방지되었다. rhM-CSF 또는 내인성 VEGF에 의해 지지되는 오스테오클라스트는 생체내 활성에는 큰 차이를 보이지 않았다 {참조: Niida 등, 1999}.
돌연변이 op/op 마우스는, 오스테오클라스트 수가 증가함에 따라 수반되는 골화석증 (osteopetrosis)의 연령-관련 소산 (age-related resolution)된다. Niida 등 (1999)의 연구에서는, 항-VEGF 항체를 주사한 후에 대부분의 오스테오클라스트가 사라졌다. 이를 통해, 내인성 VEGF가 돌연변이 마우스에서의 오스테오클라스트의 출현 여부를 관할한다는 것을 알 수 있다. 또한, rhVEGF는 실험실내에서의 오스테오클라스트의 분화를 지지하는 데에 있어서 rhM-CSF를 대신하였다. 이러한 결과는, M-CSF 및 VEGF가 오스테오클라스트의 기능을 지지하는 데에 있어서 중첩된 기능을 가짐을 보여주며, VEGF가 VEGFR1 수용체를 통해 작용함을 보여준다 {참조: Niida 등, 1999}.
따라서, 본 발명의 제1 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체인 2C3는 VEGF가 VEGFR1에 결합하여 활성화시키는 것을 차단하지 않으나, VEGF가 VEGFR2에 결합하여 활성화시키는 것은 차단한다. 이러한 VEGFR2를 억제하는 항종양 효과는 분명히 알 수 있다. 이러한 결과는, VEGFR2가 투과를 매개하고 종양 안지오제네시스에서 역할이 큰 VEGF 수용체임을 보여준다. 따라서, 본 발명에서는 VEGF 억제가 고형 종양 치료법으로 유효함을 보여준다. 보다 중요한 점은, 본 발명에서는, 치료용으로 사용하고, 특히 종양 및 기타의 질환에서 안지오제네시스를 억제하는 안전하고 효과적인 약제용으로 사용할, 새로운 일련의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3에 기초한 항체)를 제공한다.
본 발명의 잇점은 부작용이 없다는 것에 한정되지 않는다. 이는 중요한 특성이기는 하지만 (특히, 소아 환자 또는 골 질환 환자의 치료시), 본 발명의 항체는 여러 가지 다른 잇점들이 많다.
예를 들면, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 항체에 기초한 항체 컨쥬게이트는 종양 환경에 치료제를 전달하는 데에 사용될 수 있다. 사실상, 2C3 항체는 생체내 투여시 종양 혈관체 및 종양 기질 모두에 결합할 수 있으나, 정상적인 기관 또는 조직의 혈관체 또는 결합 조직에는 결합하지 않는 것으로 관찰된다. 따라서, 본 발명의 항체에 기초한 치료 작제물은 하나의 분자내에 2가지의 복합 기능을 가지는 잇점이 있다 - 즉, 상기 항체 또는 이의 단편의 항-안지오제네시스 특성 및 선택적으로 부착되는 치료제의 특성.
VEGFR2는 내피세포상의 주요 수용체이므로, VEGF의 VEGFR2에 대한 결합의 차단은 항-안지오제네시스 효과를 위해서는 매우 중요하다. VEGFR1이 내피세포상에 발현된다 하더라도, 이는 비-신호전달 또는 수동성이다. 따라서, 본 발명의 항체가 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 차단하지 못하는 것으로 인해 항-안지오제네시스 제제 및 항-종양 제제로서의 효능에는 아무런 영향을 끼치지 않는다. 사실상, 선행기술의 차단 항체를 사용하는 경우에 발생하는 바와 같이 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합을 억제하는 대신, 본 발명의 항체는 VEGF에 결합하지만 VEGF-VEGFR1 상호작용을 실질적으로 방해하지 않을 수 있는 능력을 가짐으로써 본 발명의 새로운 항체의 약물 전달 능력을 강화시킨다.
본 발명자들은, 차단 항체의 기능은 수용체에 결합되어 있지 않은 종양-위치한 VEGF에 결합함으로써 치료제가 종양 환경에 전달하도록 차단 항체가 기능할 것으로 예측된다는 것을 인식하였다. 특히, 본 발명자들은 차단 항체가 종양 기질내의 VEGF에 결합하여 치료제를 전달할 것으로 이해하였다. 이로 인해, 내피 세포 주위에 약물을 제공함으로써, 혈관 내피세포에 대한 세포독성 효과 또는 기타의 치명적 효과를 유발하고 항-종양 효과를 발휘한다.
종양 기질- 또는 결합 조직-관련 VEGF는 전통적인 의미로 VEGF 수용체 (즉, 세포 표면 수용체)에 결합되는 것이 아니다. 그보다, VEGF는 VEGF의 기본 부위(basic region)를 통해 하나 이상의 결합 조직 성분 (헤파린 설페이트 프로테오글리칸과 같은 프로테오글리칸을 포함)에 결합한다. 이러한 서열 (및 이를 코드하는 엑손)은 VEGF121 단백질 (및 이를 코드하는 DNA)에서는 결실되어 있어서, 이러한 아이소폼은 기질내에 많은 양으로 존재하지 않는다. 종양 기질내의 VEGF는, 종양내에 위치한 경우에도 종종 "자유 (free)"라고 지칭되므로, "자유"라는 용어는 기본적으로 수용체-비결합된 것을 의미한다.
또한, 본 발명에서는, VEGF가 하나의 수용체에만 결합하고 2가지의 수용체에는 결합하지 않는 항체는 상기 혈관체상에 수용체-결합된 VEGF에 결합함으로써 종양 환경에 치료제를 전달할 수 있다고 추정하였다. 이는, 본 발명이 갖는 가장 유용한 잇점 중 하나이다. 말하자면, VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 억제하지만 VEGF의 VEGFR1에 대한 결합은 차단하지 않는 항체의 제공은 VEGF로부터의 안지오제네시스 신호를 억제한다. 다른 유형의 세포 및 조직에서 VEGFR1을 통한 VEGF 신호전달을 유지함으로써 전체적으로 부작용을 감소시키는 것 이외에도, 종양 혈관체 상의 VEGF-VEGFR1 복합체를 위치를 파악하여 여기에 치료제를 직접 전달할 수 있다.
정상적인 조직에서의 내피세포에서와는 달리, VEGFR1 및 VEGFR2 모두가 종양내피세포상에서 상향 조절된다. VEGFR1은 종양 혈관 내피세포상에서 상향 조절되어, 본 발명의 표적화와 관련된 양태에서 특히 효과적이다. 사실상, VEGFR1은 내피세포에서는 "비-신호전달성"이지만, VEGFR2에 비해 높은 수준은 아니더라도 적어도 동일한 수준으로 발현된다. 이러한 현상을 설명하는 요인은, VEGFR1은 저산소상태 및 VEGF 모두에 대해 반응하여 상향 조절되는 반면, VEGFR2는 VEGF에 의해서만 반응하여 상향 조절되고 저산소 상태에 의해서는 영향을 받지 않는다.
VEGFR1의 내피세포에 대한 역할은 아직 분명하지는 않으나, VEGFR1은 데코이 수용체로서 작용하여 VEGF를 포획하여 이 리간드를 신호전달 수용체인 VEGFR2에 전달함으로써 작용할 수 있다. 이것이 사실이기 위해서는, 데코이 수용체가 상기 신호전달 수용체에 비해 VEGF에 대한 친화성이 더 커야 하는 데, 사실상 이와 같다. 이와 관련하여, 발현 수준이 증가함에 따라, 본 발명의 VEGFR2-차단, VEGFR1-비차단 항체가 종양 치료에 이상적인 전달 제제이다. 이러한 항체의 치료 컨쥬게이트는 VEGFR2를 통해 안지오제네시스를 동시에 억제할 수 있고, 치료제를 VEGF-VEGFR1 수용체 복합체에 전달함으로써 존재하는 혈관체를 파괴할 수 있다.
본 발명의 유익한 항-안지오제네시스 특성 및 종양-위치화 특성을 설명하기 위한 전술한 과학적 추론에 한정되지 않는다. 본 발명의 유용성은 그 자체로서 명백하며 실행하기 기본 이론은 필요없으나, 본 발명자들은 VEGFR2-차단, VEGFR1-비차단 항체가 종양 혈관체를 효과적 및 특이적으로 찾아갈 수 있는 다른 메카니즘을 고려하였다.
이러한 항체는, Npn-1 또는 상기 세포 표면상의 특징이 알려지지 않은 VEGF-결합 단백질과 관련된 VEGF에 결합하거나, 내피세포 표면상의 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 결합된 VEGF에 결합할 수 있다. 또한, 항체의 위치화 (localization)는, 혈관과 관련된 VEGF 패밀리에 속하는 다른 단백질 (즉, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D)에 결합함으로써 강화될 수도 있으나, 그럴 가능성은 적다.
본 발명의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 항체의 다른 잇점이 되는 특성은, 본 발명의 항체는 VEGFR2에 의해 매개되는 VEGF의 생존 신호 또는 "보호 효과"를 중화시킨다. 이러한 항체를 보다 효과적으로 만드는 것 이외에, 이러한 특성은 VEGF의 생존 기능에 의해 손상을 받는 기타의 다른 제제와 함께 사용함으로써특히 유용하다.
예를 들면, VEGF는 내피세포가 방사성 치료를 받을 때에 이를 보호한다. 따라서, 본 발명의 naked 항체 및 면역 컨쥬게이트는 방사성 치료와 함께 사용하기에 이상적이다. 방사선 치료제에 부착된 상기 항체를 사용하는 경우에는 보다 더 잇점이 많다. 이러한 유형의 작제물은 3가지의 잇점이 있다 - (1) 상기 항체의 일부분을 통해 항-안지오제네시스 효과를 발휘한다; (2) 방사성 제제를 전달함으로써 종양 혈관체 파괴 효과를 발휘한다; (3) VEGF의 전형적인 생존 신호가 방사성 치료제의 효과를 상쇄시키는 것을 방지한다.
유사한 시너지 효과를 가지는 기타의 작제물은, 항-튜불린 약물 또는 전구약물, 항-세포사멸 유도제 및 기타의 항-안지오제네시스 제제와 결합된 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체이다. 세포사멸을 유발하는 제제 또는 약물의 활성은 VEGF에 의해 억제된다. 또한, VEGF 생존 신호는 엔도스타틴에 방해함으로써, 이러한 치료법을 제한한다. 따라서, 엔도스타틴과 함께 사용하는 경우, 본 발명의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 또는 2C3 항체는 VEGF를 중화시키고, 엔도스타틴의 항-종양 효과를 증가시킨다. 2C3 항체 또는 기타의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체는, 콜라게나제가 원위치에서 엔도스타틴을 생산하는 종양으로 콜라게나제를 특이적으로 전달시키는 데에 사용하여 유사한 효과를 거둘 수 있다.
상기한 바와 같이 배합하여 강화 또는 시너지 효과를 거두는 경우, 상기한 항체 및 기타의 제제를 각각 별개로 투여될 수 있으며, 특이적으로 전달 (즉, VEGFR1에 대해 표적화하여 전달)하기 위해 제2 제제를 상기 항체에 결합시킬 수도 있다. 엔도스타틴과 함께 사용하는 경우, 화학적 컨쥬게이트 또는 재조합 융합 단백질이 바람직한 데, 그 이유는 짧은 반감기를 가지는 엔도스타틴의 치료 한계를 극복해주기 때문이다. 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA)와 배합하거나 이의 표적화된 형태가 사용될 수 있다.
본 발명의 치료제가 갖는 또 다른 잇점에는, 간질압 (interstitial pressure)를 낮출 수 있다는 점이 포함된다. VEGF-매개 투과성이 증가하면 간질압을 증가시키므로, VEGFR2를 통한 신호전달이 감소되면 투과성 및 간질압 모두를 낮추게 된다. 이로 인해, 종양 조직 전체를 가로지르는 약물에 대한 방벽을 감소시켜, 혈관체에서 멀리 떨어진 종양 세포를 살해할 수 있다. 본 발명의 조성물은 면역원성 (immunogenicity)가 없거나, 무시할 정도이거나 적기 때문에, 이를 이용하여 오랜 기간 동안 치료할 수 있다.
B3. 2C3 항체 CDR 서열
항체에 대해 본원에서 사용하고 있는 용어 "변이(variable)"은, 소정의 변이도메인 부위는 항체 서열에 있어서 많이 상이하고, 각 항체의 이의 항원에 대한 결합 및 특이성과 관련하여 사용된다. 하지만, 가변성(variability)은 항체의 변이도메인 전체에 균일하게 분포되어 있지는 않다. 경쇄 및 중쇄의 변이도메인에 있는 "초변이부위 (hypervariable region)"라고 불리는 3개의 절편내에 집중되어 있다.
변이도메인 중에서 보다 보존성이 높은 부위는 프레임워크 부위 (framework region, FR)이라고 불린다. 본래의 중쇄 및 경쇄의 변이도메인 각각은, 4개의 FR (FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함하고 있는 데, 대개 베타-시이트 형상을 가지고 있으면서 초변이부위에 의해 연결되어 있어서, 루프 형상으로 결합되며 때때로 베타-시이트 구조의 일부를 형성한다.
각 쇄에 있어서 초변이부위는, 서로 FR에 의해 묶여져 있으며, 항체의 항원-결합 부위를 형성케 한다 {참조: Kabat 등, 1991 (본원에서 참조문헌으로 포함)}. 불변성 도메인 (constant domain)은 항체가 항원에 결합하는 하는 데에 있어서는 직접 관여하지 않으나, 다양한 효능인자 (effector)로서의 기능 (예를 들면, 항체-의존 세포 독성에 있어서 항체의 참여)을 가진다.
본원에서의 용어 "초변이부위 (hypervariable region)"는, 항원-결합과 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초변이부위는, "상보성 결정 부위 (CDR)"의 아미노산 잔기 {즉, 경쇄의 변이부위에 있어서, 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3); 중쇄의 변이부위에 있어서, 잔기 31-35 (H1), 50-56 (H2) 및 95-102 (H3) - Kabat 등 (1991): 본원에서 참조문헌으로 포함} 및/또는 "초변이루프"의 아미노산 잔기 {즉, 경쇄의 변이부위에 있어서, 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3); 중쇄의 변이부위에 있어서, 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)}를 포함한다. "프레임워크 (즉, FR)" 잔기는, 본원에서 정의한 초변이부위가 아닌 변이도메인 잔기이다.
2C3 ScFv 단편의 Vh쇄 및 Vk쇄의 DNA 서열 및 이의 아미노산 서열은 서열번호 제6, 제7, 제8 및 제9로 개시되어 있다. 이 서열들은, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 변이부위의 CDR1-3를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 (C3 참조), 생물학적 분자의 구조 및 기능에 관한 정보가 제공되면, 일련의 균등물 또는 개량된 분자를 제조할 수 있다. 이는 본 발명의 VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체 (2C3 항체로 예시되어 있음)에도 적용된다. 항체의 항원-결합 특성 및 기타의 기능 특성은 보존되어야 하지만, 기준 항체가 제공되어 있으면 이의 균등물 또는 개량된 항체를 제조할 수 있을 정도의 고도의 당업자의 기술이 존재하고 있다. 본원에서 제공하고 있는 서열 및 정보에 의해, 이러한 기술적인 능력은 유사한 특성, 개량된 특성 또는 바람직한 특성을 가지는 항체를 추가로 제조하는 데에 사용될 수 있다.
균등 항체의 경우, 상호 결합 능력을 크게 손상시키지 않고, 상기 항체의 불변 또는 변이도메인 프레임워크 부위에 있는 소정의 아미노산을 대체할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 변화는 상기 항체를 코드하는 DNA 서열상의 변화를 통해 이루어질 수 있고, 이러한 변화는 본질적으로 보존된다 {참조: 섹션 C3, 표 A의 코돈정보, 및 위치 특이적 돌연변이에 대한 상세한 보충 설명 부분}.
다른 종류의 변이체는, 모 항체(parent antibody)로부터 생성되는, 모 항체에 비해 개량된 생물학적 특성을 가지는 항체이다. 전형적으로, 이러한 변이체 또는 제2 세대 화합물은 모 항체의 초변이부위 잔기 중 하나 이상이 치환된 변이체이다 이러한 치환된 변이체를 제조하는 편리한 방법은, 파지 디스플레이를 이용한 친화성 성숙화 방법(affinity maturation)이다.
파지 디스플레이를 이용한 친화성 성숙화 방법(affinity maturation)에서는, 여러 개의 초변이부위 (예를 들면, 6 내지 7개 부위)를 돌연변이시켜 각 부위에서 가능한 모든 아미노산 치환체를 제조한다. 이렇게 제조된 항체 변이체는, 각 입자내에 패키지된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 필라멘트성 파지 입자로부터 1가(monovalent) 형식으로 디스플레이된다. 이렇게 파지-디스플레이된 변이체를 스크리닝하여 본원에 기재된 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화성)을 분석한다. 변형할 초변이후보 부위를 찾기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이를 수행하여 항원 결합에 크게 기여하는 초변이부위 잔기를 동정할 수 있다.
이와 달리 또는 이에 첨가하여, 항원-항체 결합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 VEGF 사이의 접촉점을 찾아내는 것을 고려할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 또는 이의 인접한 잔기는 치환할 수 있는 후보 부위이다. 이러한 변이체를 제조한 후, 변이체 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 유사하지만 상이하거나 보다 우수한 특성을 가지는 항체를 선택하여 추가 개발한다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는, VEGFR2-차단, 항-VEGF 항체의 중쇄 및경쇄(예를 들면, 2C3 중쇄 및 경쇄)의 CDR 부위 를 코드하는 분리된 DNA 절편 및 재조합 벡터; 및 DNA 기술을 이용하여 상기 CDR 부위를 발현하는 재조합 숙주 세포를 제조 및 사용하는 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 전체 게놈 DNA가 없고, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체의 중쇄 및 경쇄 (예를 들면, 2C3 중쇄 및 경쇄)의 CDR 부위를 발현할 수 있는, 모든 포유 동물 (바람직하게는, 인간 또는 쥐)에서 분리가능한 DNA 절편(segment)에 관한 것이다. 본원에서의 용어 "DNA 절편"은, 특정 종의 총 게놈 DNA가 없는 분리된 DNA 분자를 의미한다. "DNA 절편"에는, DNA 절편, 이의 보다 작은 단편, 및 재조합 벡터 (예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 등)이 포함된다.
이와 유사하게, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체의 중쇄 및 경쇄 (예를 들면, 2C3 중쇄 및 경쇄)의 정제된 CDR 부위를 코드하는 코드 절편 또는 분리된 유전자 부위를 포함하는 DNA 절편은, 상기 코드 서열을 포함하는 DNA 절편 및 소정의 경우에는 기타의 천연 유전자 또는 단백질-발현 서열로부터 실질적으로 분리된 조절 서열을 의미한다. 이 경우, 용어 "유전자"는 기능성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코드하는 유닛을 의미하는 것으로 간단히 사용된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 이러한 기능성 표현의 용어에는 본래의 항체를 코드하는 서열; 및 적합한 항원-결합 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 발현하거나 발현하도록 변형된 것일 수 있는 보다 크기가 작은 조작된 절편을 포함한다.
"기타의 코드 서열로부터 실질적으로 분리된 (isolated substantially away from other coding sequences)"는, 소정의 코드 절편 또는 분리된 유전자 일부분이DNA 절편의 코드 부위의 중요한 일부를 형성하고, DNA 절편이 천연적으로 발생하는 코드 DNA (예를 들면, 크기가 큰 염색체 단편, 기타의 기능성 유전자 또는 cDNA 코드 부위)를 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 물론, 이는 본래 분리된 DNA 절편을 포함하며, 인간의 조작으로 나중에 상기 절편에 추가된 유전자 또는 코드 부위를 제외하지 않는다.
본 발명의 특정 양태는, 서열번호 제7 또는 제9의 아미노산 서열과의 상동성이 적어도 약 75%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 등인 아미노산 부위를 포함하는 제1 서열 부위를 적어도 포함하는, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체의 중쇄 및 경쇄 (예를 들면, 2C3 중쇄 및 경쇄)의 CDR 부위를 코드하는 DNA 서열을 함유한 분리된 코드 절편 또는 분리된 유전자 일부 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 이때, 상기한 CDR 부위는 서열번호 제7 또는 제9의 CDR 부위의 생물학적 특성을 적어도 실질적으로 유지한다.
본원에서 기재되어 있는 바와 같이, 상기 서열은 소정의 생물 기능상 균등한 아미노산 또는 "보존된 치환(conservative substitution)"를 포함할 수 있다. 기타의 서열은, 당업자에게 잘 알려져 있고 본원에 추가로 기재되어 있는 바와 같이 CDR 또는 CDR을 함유하는 항체의 특성을 향상시키기 위해 세밀하게 조작된, 기능상 비-균등한 아미노산 또는 "비-보존된 치환"을 포함할 수 있다.
또한, 상기한 기준을 충족하고 바람직하게는 단백질 발현이 관여하는 생물학적 단백질 활성을 유지 또는 향상을 포함하는 경우, 아미노산 및 핵산 서열은 추가의 잔기 (예를 들면, 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열)를 포함할 수 있으며, 본 발명의 서열에 상응한다. 말단 서열의 추가에는, 코드 부위의 5' 또는 3' 부위에 접하는 다양한 비-코드 서열 및 조절 부위를 포함한다.
따라서, 본 발명의 핵산 절편은 기타의 DNA 서열 (예를 들면, 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 추가의 제한효소 부위, 다중 클로닝 부위, 기타의 코드 부위 등)과 배합되어, 전체 길이가 크게 달라질 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 총 길이는 제조의 용이성 및 목적하는 재조합 DNA 프로토콜의 사용으로 인해 제한된다.
따라서, 본 발명의 추가의 양태는 재조합 벡터에 관한 것이다. 특히 유용한 벡터는, 상기한 DNA 절편의 코드 부위가 프로모터의 통제하에 있는 벡터인 것으로 생각된다. 일반적으로, 재조합 또는 이질성 프로모터 (즉, 자연 환경하에서는 코드 서열과 통상적으로 결합되지 않는 프로모터)가 사용되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 프로모터에는, 발현을 위해 선택된 세포 유형, 기관 또는 동물에서 상기 DNA 절편을 효과적으로 발현시킬 수 있는 한, 세균성 프로모터, 바이러스 프로모터, 진핵세포 프로모터 및 포유동물 프로모터가 포함될 수 있다.
단백질 발현을 위해 사용할 프로모터 및 세포 유형에 대해서는 분자 생물학 분야의 당업자에게는 잘 알려져 있다. 사용되는 프로모터는 구조성 (constitutive) 또는 유도성(inducible) 프로모터일 수 있으며, 적합한 조건하에서 높은 수준으로 도입된 DNA 절편을 발현시키도록 사용될 수 있어서, 재조합 단백질 또는 펩티드를 대규모 생산하는 데에 유익하다.
본 발명의 핵산 서열의 발현은, 하나 이상의 당업계의 통상의 기술 및 본원의 기재 내용을 통해 용이하게 이루어질 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질의 재조합 발현에 관한 추후의 기재 내용들도, 핵산 수준에서 기타의 코드 서열에 작동가능하게 연결되지 않은 항체 및 항체 단편에도 동일하게 적용된다.
B4. 폴리클론 항체
항체를 제조하고 특성을 밝히는 수단은 당업계에 잘 알려져 있다 참조: 예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (본원에 참조문헌으로 포함). 폴리클론 항혈청을 제조하기 위해, 면역원성 VEGF 조성물로 동물을 면역시키고나서, 이렇게 면역된 동물로부터 항혈청을 수득한다. 넓은 범위의 동물 종을 사용하여 항혈청을 제조할 수 있다. 통상적으로, 항-항혈청의 제조에 사용되는 동물은 토끼, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그 또는 염소이다. 토끼는 혈액량이 많기 때문에, 폴리클론 항체 제조에 사용하기에 바람직하다.
폴리클론 항체의 제조에 사용되는 VEGF 조성물의 양은, 상기 면역원의 성질 및 면역시키는 동물에 따라 달라진다. 다양한 경로를 통해 본 발명의 VEGF 면역원을 피하, 근육내, 경피, 정맥내, 복강내 및 비장내 투여할 수 있다. 폴리클론 항체의 제조는, 면역된 동물의 혈액 표본을 면역후 다양한 시점에서 추출하여 모니터링할 수 있다. 제2 (추가자극, booster) 주사를 투여할 수도 있다. 강화 및 적정 과정은, 적합한 역가 (suitable titer)가 얻어질 때까지 반복된다. 적정한 수준의 역가가 얻어지면, 면역된 동물의 피를 흘리게 해서 혈청을 분리하여 보관한다. 또한, 이 동물을 사용하여 모노클론 항체를 제조할 수도 있다.
당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 소정의 조성물의 면역원성은 면역 반응의 비-특이적 자극제 (보조제로 알려져 있음)를 사용하여 강화시킬 수 있다. 보조제의 예로는, 죽은 미코박테리움 튜버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는 비-특이적 면역반응 자극제인 완전한 Freund 보조제; 불완전한 Freund 보조제; 및 알루미늄 하이드록사이드 보조제가 포함된다.
또한, 숙주의 면역 시스템을 추가자극(booster)하는 것이 바람직할 수 있는 데, 이는 VEGF를 캐리어 (carrier)에 연결시키거나 커플링시켜서 추가자극할 수 있다. 캐리어의 예로는, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 소의 혈청 알부민 (BSA)이 있다. 난소 알부민, 마우스의 혈청 알부민 또는 토끼의 혈청 알부민과 같은 기타의 알부민도 캐리어로 사용될 수 있다. 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 소정의 조성물은 면역원성에 있어서 상이하다. 하지만, VEGF에 대한 항체의 제조는 특별히 어려운 것은 아니다.
B5. 모노클론 항체
모노클론 항체 (MAb)의 제조 방법은 여러 가지가 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 가장 표준적인 모노클론 항체 제조 기법은 폴리클론 항체를 제조하는 데에 사용한 것과 동일한 라인을 사용하는 것으로 시작한다 참조: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (본원에 참조문헌으로 포함). 폴리클론 항체 반응은, 동물을 면역원성 VEGF 조성물로 면역시킴으로써 시발되며, 소정의 역가 (titer)가 얻어지면 면역된 동물을 사용하여 MAb를 제조한다.
MAb는 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다 참조: 예를들면, 미합중국 특허 제4,196,265호 (본원에 참조문헌으로 포함). 통상적으로, 이러한 기법은, 적합한 동물을 선택된 VEGF 면역원 조성물로 면역 반응시키는 것을 포함한다. 상기 면역 조성물을 효과적인 방법으로 투여하여 항체-생성 세포를 자극한다. 마우스 및 랫트와 같은 설치류가 바람직한 동물이지만, 토끼, 양 및 개구리 세포도 사용할 수 있다. 랫트를 사용하면 소정의 잇점이 있으나 참조: Goding, 1986, pp.60-61 (본원에 참조문헌으로 포함), 마우스가 바람직하며, BALB/c 마우스는 가장 통상적으로 사용되고 있고 안정되게 융합되는 확률이 일반적으로 높아서 가장 바람직하다.
면역반응시킨 후, VEGF 항체를 생산하는 능력을 가진 체세포, 특히 B 림프구 (B 세포)를 선택하여 mAb 제조 프로토콜에 사용한다. 상기 세포는 절개된 비장, 편도선 또는 림프절에서 수득하거나, 말초 혈액 샘플에서 수득할 수 있다. 비장 세포 및 말초혈액 세포가 바람직한 데, 비장 세포에는 분열하는 플라스마블라스트(plasmablast) 단계에 있는 항체-생산 세포가 풍부하기 때문이고, 말초혈액 세포는 용이하게 입수할 수 있기 때문이다. 종종, 일련의 동물을 면역반응시키고, 가장 높은 항체 역가를 가지는 동물의 비장을 제거하여, 비장을 시린지로 균질화시켜 비장 림프구를 수득한다. 통상적으로, 면역된 마우스에서 수득한 비장은 대략 5×107내지 2×108개의 림프구를 함유한다.
면역된 동물로부터 수득한 항-VEGF 항체-생산 B 림프구를, 일반적으로 면역된 동물과 동일한 종의 불멸의 골수종 세포 (immortal myeloma cell)와 융합시킨다. 하이브리도마-생성 융합 공정에 사용하기에 적합한 골수종 세포 라인은 항체를 생산하지 않고, 융합 효율이 크며, 목적하는 융합 세포 (하이브리도마)만의 성장을 돕는 소정의 선택 배지에서 성장할 수 없는 효소 결핍된 것이 바람직하다.
당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 수많은 골수종 세포 중에서 하나를 사용할 수 있다 {참조: Goding, pp.65-66; Campbell, pp.75-83, 1984 (본원에 참조문헌으로 포함)}. 예를 들면, 면역된 동물이 마우스인 경우에는 P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GFG1.7 및 S194/5XX0 Bul을 사용할 수 있고; 랫트를 사용하는 경우에는 R210.RCY3, Y3-Ag1.2.3, IR983F, 4B210 또는 상기한 마우스 세포라인 중 하나를 사용할 수 있으며; 인간 세포 융합과 관련하여, U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-MHy2 및 UC729-6이 유용하다.
일반적으로, 항체-생산 비장 또는 림프절 세포 및 골수종 세포의 제조 방법은, 세포막 융합을 촉진시키는 제제 (화학적 제제 또는 전기적 제제)의 존재하에 체세포를 골수종 세포와 4:1 비율 (약 20:1 내지 약 1:1로 변할 수 있음)로 혼합시키는 단계를 포함한다. Sendai 바이러스를 이용한 융합 방법은 Kohler 및 Milstein (1975; 1976 - 본원에 참조문헌으로 포함)이 기재하고 있으며, 37%(v/v) PEG와 같은 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 융합 방법은 Gefter 등 (1977 - 본원에 참조문헌으로 포함)이 기재하고 있다. 전기 유도-융합 방법을 사용하는 것도 적합하다 {참조: Goding, pp.71-71 - 본원에 참조문헌으로 포함}.
대개, 융합 공정을 사용하는 경우, 생존가능한 하이브리드의 생산율은 약 1×10-6내지 1×10-8이다. 하지만, 이러한 생존가능한 융합 하이브리드가 선택된 배지에서 배양됨으로써 융합되지 않은 모세포 (특히, 통상적으로 무한정 분열을 계속하는 융합되지 않은 골수종 세포)로부터 분화되기 때문에 문제가 없다. 상기한 선택적인 배지는, 조직 배양 배지에서 뉴클레오티드의 신생 합성 (de novo synthesis)을 차단하는 제제를 포함하는 배지이다. 바람직한 제제의 예로는, 아미놉테린, 메토트렉세이트 및 아자세린이 있다. 아미놉테린 및 메토트렉세이트는 퓨린 및 피리미딘 모두의 신생 합성을 차단하는 반면, 아자세린은 퓨린 합성만을 차단한다. 아미놉테린 또는 메토트렉세이트가 사용되는 경우, 상기 배지에 하이포크산틴 및 티미딘을 뉴클레오티드 공급원으로 보충시킨다 (HAT 배지). 아자세린이 사용되는 경우, 상기 배지는 하이포크산틴을 보충시킨다.
바람직한 선택 배지는 HAT 배지이다. 뉴클레오티드 회수 경로 (salvage pathway)를 작동시킬 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 상기한 회수 경로의 핵심 효소 (예를 들면, 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT))가 없기 때문에 생존할 수 없다. B 세포는, 상기 경로를 작동시킬 수 있으나, 배지에서의 생존 기간이 한정되어 있으며 일반적으로 약 2주내에 죽는다. 따라서, 상기한 선택배지에서 생존할 수 있는 세포는 골수종 세포 및 B 세포로부터 형성된 하이브리도마 뿐이다.
이러한 배양방법은 소정의 하이브리도마가 선별되는 하이브리도마 군을 제공한다. 통상적으로, 하이브리도마의 선별은, 미세적정 플레이트에서 단일 클론 희석물로 상기 세포를 배양한 후에 (약 2 내지 3주후) 개개의 단일 클론 상등액을 테스트하여 목적하는 항-VEGF 반응성을 가지는 지를 알아보는 단계를 통해 수행된다. 상기 분석법은, 민감하고 간단하며 신속하여야 하는 데, 예를 들면 방사선면역 분석, 효소 면역 분석, 세포독성 분석, 플래이크 분석, 점 면역결합 분석 등이다.
그리고 나서, 선별된 하이브리도마를 순차 희석시키고, 개개의 항-VEGF 항체-생산 세포 라인에 클로닝한 후, 이러한 클론을 무한 증식시켜 MAb를 제조할 수 있다. 2가지의 기본적인 방법을 사용하여 상기 세포 라인을 mAb 제조에 사용할 수 있다. 상기한 하이브리도마 샘플을 조직적합성 유형의 동물에 주사 (종종, 복강내 투여)하여, 융합에 사용할 체세포 및 골수종 세포를 제공할 수 있다. 주사 투여된 동물은, 상기 융합된 세포 하이브리드에 의해 제조되는 특정의 모노클론 항체를 방출하는 종양을 발생시킨다. 혈청 또는 복수와 같은 상기 동물의 체액을 뽑아서 고농도의 MAb를 제공할 수 있다. 또한, 개개의 세포 라인을 실험실내에서 배양할 수 있는 데, 이 경우에는 MAb가 자연적으로 상기 배양 배지로 방출되어 고농도로 용이하게 수득할 수 있다.
상기한 2가지 중 어느 방법을 사용하여 제조된 MAb는, 예를 들면 여과, 원심분리 및 다양한 크로마토그래피 방법 (예를 들면, HPLC 또는 친화성 크로마토그래피)을 사용하여 추가 정제할 수 있는 데, 이러한 모든 정제 기법은 당업자들에게는 명백히 잘 알려져 있다. 이러한 정제 기법 각각은, 목적하는 항체를 기타의 혼합물 성분으로부터 분리하는 분획법을 포함한다. 항체의 제조에 특히 바람직한 분석 방법은, 예를 들면 단백질 A-세파로즈 및/또는 단백질 G-세파로즈 크로마토그래피방법이 포함된다.
B6. 파지미드 라이브러리(phagemid library)로부터의 항체
현재 재조합 기법을 이용하여, 일련의 항체를 코드하는 재조합 유전자로부터 목적하는 특이성을 가지는 항체를 제조할 수 있다 {참조: Van Dijk 등, 1989 (본원에서 참조문헌으로 포함)}. 소정의 재조합 기법에서는, 면역시킨 동물의 비장에서 분리한 RNA로부터 제조한 복합 면역글로불린 파지 발현 라이브러리를 면역 스크리닝하여 항체 유전자를 분리하는 것을 포함한다 {참조: Morrison 등, 1986; Winter 및 Milstein, 1991 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)}.
상기 방법의 경우, 복합 면역 글로불린 파지미드 라이브러리를 면역시킨 동물의 비장에서 분리한 RNA로부터 제조하고, 상기 항원 및 대조 세포를 발현하는 세포를 사용하여 패닝(panning)하여 적합한 항체를 발현하는 파지미드를 선택한다. 이러한 방법이 기존의 하이브리도마 기법에 비해 가지는 잇점은, 1 라운드로 약 104배의 항체를 생산하여 스크리닝할 수 있으며, H 및 L쇄 복합에 의해 새로운 특이성을 만들어내서 적합한 항체가 생산되는 확률을 증가시킨다.
다양한 항체 분자를 세균내에서 생산하는 하나의 방법에서는, 벡터로서 박테리오파지 γ를 사용한다 {참조: Huse 등, 1989 (본원에서 참조문헌으로 포함)}. γ벡터를 사용하여 항체를 제조하는 경우, DNA 서열의 중쇄 및 경쇄군을 별개의 출발 벡터에 삽입하는 것을 포함한다. 그리고나서, 이 벡터를 임의적으로 배합하여, 항체 단편을 형성하는 중쇄 및 경쇄를 함께 발현시키는 단일 벡터를 형성시킨다.선택된 항원으로 면역시킨 동물로부터 비장 세포 (또는 이의 하이브리도마)에서 분리한 mRNA를 증폭, 바람직하게는 PCR 기법 또는 관련된 증폭 방법을 사용하여, 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을 수득한다. 통상적으로, 중쇄 및 경쇄 절편을 출발 벡터에 삽입하는 것을 용이하게 하기 위해서 제한 부위를 증폭된 DNA 절편의 말단에 삽입하는 프라이머를 사용하여, 중쇄 및 경쇄 서열을 증폭시킨다.
전체 또는 일부의 합성 항체 결합 부위 (즉, 파라토프) 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 다른 방법에서는, 필라멘트성 파지 (예를 들면, M13, fl 또는 fd)에서 유래한 디스플레이 벡터를 사용한다. 이러한 필라멘트성 파지 디스플레이 벡터 ("파지미드"로 지칭)는, 다양하고 신규한 면역 특이성을 가지는 모노클론 항체 라이브러리를 생산한다. 이러한 기법에서는, 필라멘트성 파지 복제의 조합 단계 (assembly stage) 동안에 유전자 생성물 및 유전자를 연결하는 수단으로서 필라멘트성 파지 코트 단백질 막 앵커 도메인을 사용하며, 복합 라이브러리로부터 항체를 클로닝하고 발현시키는 데에 사용될 수 있다 {참조: Kang 등, 1991; Barbas 등, 1991 (본원에서 참조문헌으로 포함)}.
이러한 필라멘트성 파지 디스플레이를 위한 일반적인 기법은 미합중국 특허 제5,658,727호(본원에서 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법에서는, 단일 벡터 시스템을 이용하여 항체 유전자 레파토리에서 예비-선택된 리간드-결합 특이성을 가진 것을 자극하여 클로닝하고 스크리닝하는 시스템을 제공한다. 분리된 라이브러리 구성원 중에서 예비-선택된 리간드-결합 능력을 가지는 것을 스크리닝하여, 상기 라이브러리 구성원을 코드하는 유전자를 분리하는 기존의수단과 발현된 항체 분자의 결합능력을 결합시킬 수 있다.
기능성 항체를 조합할 수 있도록 융합 폴리펩티드를 세균 세포의 세포외질로 표적화하고, 목적하는 라이브러리 구성원을 스크리닝할 수 있도록 파지를 조합하는 동안에 필라멘트성 파지 입자의 코트에 융합 폴리펩티드를 표적화함으로써, 발현 및 스크리닝을 결합할 수 있다. 융합 폴리펩티드에 방출 신호 도메인의 존재하에 세포외질을 표적화한다. 필라멘트성 파지 코트 단백질 막 앵커 도메인 (즉, cpIII- 또는 cpVIII-유래 막 앵커 도메인)의 존재하에, 파지 입자를 표적화한다.
필라멘트성 파지-기초 복합 항체 라이브러리의 다양성의 증가는, 중쇄 및 경쇄 유전자를 셔플링 (shuffling)하거나, 상기 라이브러리의 클로닝된 중쇄 유전자의 상보성 결정 부위 하나 이상을 변경시키거나, 결함-경향이 있는 (error-prone) 폴리머라제 쇄 반응을 이용하여 상기 라이브러리에 무작위의 돌연변이를 도입하여 이루어질 수 있다. 파지미드 라이브러리를 스크리닝하는 추가의 방법은, 미합중국 특허 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,403,484호, 제5,223,409호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다.
필라멘트성 박테리오파지 (예를 들면, M13, fl 또는 fd - 미합중국 특허 제5,698,426호)의 표면상에 다양한 중쇄 및 경쇄군의 서열을 발현하는 것을 이용한, 큰 복합 항체 라이브러리를 스크리닝하는 다른 방법이 개발되었다. 2가지의 다양한 중쇄 (Hc) 및 경쇄 (Lc) 군을, 발현에 필요한 요소들을 함유하는 별개의 M13-기초 벡터에 삽입한다. 상기한 중쇄 벡터는 유전자 VIII (gVIII) 코트 단백질 서열을 함유하여, 이러한 중쇄 서열을 번역하여 gVIII-Hc 융합 단백질을 생산한다.2가지 벡터군을 무작위로 결합시켜, Hc 및 Lc 서열을 함유하는 벡터 부위만을 단일 환 벡터에 결합시킨다.
상기한 결합 벡터는, 상기 2가지의 폴리펩티드의 조합 및 M13 상에서의 발현을 위한 Hc 및 Lc 서열의 공-발현을 유도한다 {참조: 미합중국 특허 제5,698,426호 (본원에서 참조문헌으로 포함)}. 이러한 결합 단계에서는, 2가지의 다양한 군내의 상이한 Hc 및 Lc를 코드하는 서열을 단일 벡터에 무작위로 넣는다. 각각의 독립된 벡터에서 유래한 벡터 서열은, 생존가능한 파지의 생산에 필수적이다. 또한, 슈도 gVIII 서열은 상기 2가지의 출발 벡터 중 하나의 벡터에만 함유되어 있기 때문에, 상기 벡터 서열이 단일 벡터내에 결합될 때까지는 파지 표면상에서 Lc-결합된 gVIII-Hc 융합 단백질로서 기능성 항체 단편을 공-발현시킬 수 없다.
상기 항체 라이브러리의 표면 발현은, 앰버 서프레서 계통 (amber suppressor strain)에서 발현된다. Hc 서열과 gVIII 서열 사이의 앰버 종료 코돈은 비-서프레서 계통에서는 상기 2가지 성분의 결합을 끊는다. 상기한 비-서프레서 계통에서 제조된 파지를 분리하고 서프레서 계통을 감염시키면, 발현하는 동안에 Hc 서열을 gVIII 서열에 결합시킨다. 감염후에 서프레서 계통을 배양함으로써, gVIII 융합 단백질 (gVIII-Fab 융합 단백질)로서 상기 라이브러리내의 모든 항체 종의 M13 표면상에서 공-발현시킬 수 있다. 이와 달리, 상기 DNA를 비-서프레서 계통에서 분리한 후, 서프레서 계통을 도입시켜 동일한 효과를 거둘 수도 있다.
상기한 표면 발현 라이브러리를 스크리닝하여, 표준 친화성 분리 공정을 이용하여 예비선택된 분자에 결합하는 특정 Fab 단편을 찾아낸다. 이러한 방법에는,예를 들면, 패닝 (panning) {참조: Parmley 및 Smith, 1988 (본원에서 참조문헌으로 포함)}, 친화성 크로마토그래피 및 고상 블로팅 공정이 포함된다. 패닝은, 높은 역가를 가지는 파지를 용이하고 신속하게 소량을 스크리닝할 수 있기 때문에 바람직하다. 또한, 이 공정을 통해, 이 공정을 사용하지 않은 경우에는 검출불가능하고 실질적으로 균일한 군으로 증폭시켜야 했던 군 내의 소량의 Fab 단편 종을 선별할 수 있다. 선택된 Fab 단편은, 파지 군을 증폭시킨 후에 상기 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열을 밝히는 것을 특징으로 한다.
다양한 항체 라이브러리를 제조하고 바람직한 결합 특이성을 가지는 것을 스크리닝하는 다른 방법은 미합중국 특허 제5,667,988호 및 제5,759,817호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다. 상기 방법에서는, 변성된 (degenerate) 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 연장 반응을 이용하여 면역 글로불린 변이중쇄 및 경쇄 변이도메인의 CDR 부위에 변이(degeneracy)를 혼입하고 파지미드 표면상에 돌연변이된 폴리펩티드를 디스플레이하여, 파지미드 라이브러리 형태로 헤테로다이머-면역 글로불린 분자 라이브러리를 제조하는 것을 포함한다. 그리고 나서, 상기 디스플레이 단백질을 스크리닝하여, 예비-선택된 항원에 결합하는 능력을 가진 단백질을 선별한다.
일반적으로, 헤테로다이머-면역 글로불린 분자를 제조하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(1) 목적하는 중쇄 또는 경쇄 V 부위-코드 유전자를 파지미드 디스플레이 벡터에 도입하는 단계;
(2) 항체 V 부위 유전자의 CDR과 상동성을 가지는 부위를 함유하고, 파지미드 표면 디스플레이 단백질 상에 표현된 상이한 임시의 결합 부위를 발현할 수 있는 큰 집단의 디스플레이 벡터를 형성하도록 무작위-코드 서열을 생산하는 변성 부위를 함유하는, 올리고뉴클레오티드를 사용하여 프라이머 연장법으로 상기한 파지미드 디스플레이 단백질 벡터에 무작위-결합 부위를 도입하는 단계;
(3) 필라멘트성 파지 입자 표면상에서 상기한 디스플레이 단백질 및 결합 부위를 발현시키는 단계; 및
(4) 친화성 기법 (예를 들면, 예비-선택된 항원에 대한 파지 입자의 패닝)을 사용하여 표면-발현된 파지 입자를 분리 (스크리닝)함으로써, 예비-선택된 항원에 결합하는 결합 부위를 함유하는 디스플레이 단백질을 포함하는 하나 이상의 파지미드 종을 분리하는 단계.
다양한 항체 라이브러리를 제조하고 목적하는 결합 특이성을 가지는 항체를 스크리닝하는 이 방법의 다른 변형 방법은, 미합중국 특허 제5,702,892호 (본원에서 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다. 이 방법에서는, 중쇄 서열만을 이용하며, CDRI 또는 CDRIII 초변이부위를 코드하는 모든 뉴클레오티드 부위에서 이러한 중쇄 서열이 무작위적이며, CDR에서의 유전자 변이성은 모든 생물학적 과정과 무관하게 발생한다.
상기 방법에서는, 2가지의 라이브러리를 조작하여, 중쇄 유전자 구조의 프레임워크내의 올리고뉴클레오티드 모티프를 유전적으로 셔플링 (shuffling)시킨다. CDRI 또는 CDRIII를 무작위로 돌연변이시켜, 중쇄의 초변이 부위를 재작제시켜 변이성이 큰 서열을 가지는 콜렉션을 수득한다. 돌연변이된 유전자 서열 콜렉션에 의해 코드되는 중쇄 단백질은, 면역 글로불린의 결합 특성을 모두 가지면서 2가지의 면역 글로불린 쇄 중에서 하나만을 필요로한다.
특히, 상기 방법은 면역 글로불린 경쇄 단백질이 없는 조건하에서 수행된다. 파지 발현-변형된 중쇄 단백질 라이브러리를 부동화시킨 리간드와 함께 인큐베이션시켜, 부동화된 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 단백질을 코드하는 클론을 선별한다. 그리고 나서, 결합된 파지를 부동화된 리간드와 분리시키고, 세균 숙주 세포내에서 성장시켜 증폭시킨다. 상이한 재조합 단백질을 각각 발현하는 개개의 바이러스성 플래이크가 늘어나고, 각 클론에 대해 결합 활성을 분석할 수 있다.
B7. 인간 림프구로부터의 항체
또한, 실험실내 면역반응 (또는 항원 자극반응)을 사용하여 인간의 항-VEGF 항체를 제조할 수 있다. 이러한 기법을 사용하여, 실험실내에서 VEGF를 가진 항체-생산 세포를 자극함으로써 정상의 건강한 신체에서 말초혈액 림프구를 자극할 수 있다.
상기 "실험실내 면역반응 (in vitro immunization)"은, 일반적으로 림프구 혼합군 (혼합 림프구 배양물, MLC)내의 비-면역 B 림프구를 항원-특이 활성화시키는 것을 포함한다. 또한, 실험실내 면역반응은, B 세포 성장 및 분화 인자 및 림포카인에 의해 지지된다. 이 방법으로 제조되는 항체는 종종 IgM 항체이다 {참조: Borrebaeck 등, 1986 (본원에 참조문헌으로 포함)}.
주로 IgG (또는 IgA) 항체를 생산하는 인간 림프구를 수득할 수 있는 다른방법이 이미 알려져 있다 {참조: 미합중국 특허 제5,681,729호 (본원에 참조문헌으로 포함)}. 일반적으로, 이 방법은, 인간 림프구를 면역결핍 동물에 이식하여, 이 동물내에 "자리잡게하는 (take)" 단계; 상기 동물을 목적하는 항원으로 면역시켜, 상기 항원에 특이적인 항체를 생산하는 인간 림프구를 생산하는 단계; 및 상기 항체를 생산하는 인간 림프구를 상기 동물로부터 회수하는 단계를 포함한다. 상기 항체를 생산하는 인간 림프구를 불멸화시키는 단계; 상기 항체를 생산하는 수득된 불멸화-인간 유래 림프구를 클로닝하는 단계; 및 목적하는 항원에 특이적인 모노클론 항체를 클로닝한 불멸화-인간 유래 림프구에서 회수하는 단계에 의해, 이렇게 생산된 인간 림프구를 사용하여 모노클론 항체를 생산할 수 있다.
상기 방법에서 사용될 수 있는 면역결핍 동물은, 인간 림프구를 상기 동물에게 이식하였을 때에 거부 반응을 보이지 않는 동물이다. 이러한 동물은, 물리적, 화학적 또는 생물학적 처리를 통해 조작하여 만들 수 있다. 모든 면역결핍 동물을 사용할 수 있다. 인간의 말초혈액, 비장, 림프절, 편도선 등에서 인간 림프구를 수집할 수 있다.
이식된 인간 림프구를 상기 동물내에 "자리잡게 하는것(taking)"은, 인간 림프구를 상기 동물에 단순히 투여함으로써 가능할 수 있다. 투여 경로는 제한되지는 않으나, 예를 들면 피하 투여, 정맥내 투여 또는 복강내 투여일 수 있다. 인간 림프구의 투여량은 제한되지 않으나, 통상적으로 동물 1 마리당 106내지 108림프구일 수 있다. 그리고 나서, 상기한 면역결핍 동물을 목적하는 VEGF 항원으로 면역시킨다.
면역시킨 후, 기존의 모든 방법을 사용하여 혈액, 비장, 림프절 또는 기타의 림프 조직에서 인간 림프구를 회수한다. 예를 들면, Ficoll-Hypaque 원심분리 방법 (특정 중력: 1.077)을 사용하여 단핵 세포를 분리할 수 있으며, 플라스틱 디쉬 흡수법을 사용하여 상기 모노사이트를 제거할 수 있다. 면역결핍 동물에서 유래하는 오염원 세포는, 상기 동물 세포에 대해 특이적인 항혈청을 사용하여 제거할 수 있다. 이러한 항혈청은, 예를 들면, 면역결핍 동물의 비장 세포를 이용하여 제2의 상이한 동물을 면역시킨 후, 이렇게 면역된 상이한 동물로부터 혈청을 회수하여 수득할 수 있다. 항혈청을 이용한 상기한 처리방법은 모든 단계에서 사용될 수 있다. 또한, 마커로서 인간 림프구 세포 표면 상에 발현되는 인간 면역 글로불린을 이용한 면역적인 방법을 이용하여, 인간 림프구를 회수할 수 있다.
이러한 방법에 의해, 하나 이상의 선별된 VEGF 에피토프에 특이적인 IgA 및 IgG 항체를 주로 생산하는 인간 림프구를 수득할 수 있다. 그리고 나서, 불멸화 (immortalization), 선별화, 세포 성장 및 항체 생산을 통해, 상기 인간 림프구에서 모노클론 항체를 수득한다.
B8. 인간 항체 라이브러리를 함유하는 형질전환 마우스
현재, 항체 생산을 위해 재조합 기법을 사용할 수 있다. 상기한 복합 면역 글로불린 파지 발현 라이브러리에 추가하여, 다른 분자 클로닝 방법에서는 인간 항체 라이브러리를 함유하는 형질전환 마우스로부터 항체를 제조한다. 이러한 기법에 대해서는 미합중국 특허 제5,545,807호 (본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어있다.
대개, 이러한 방법에서는, 인간 유래-면역 글로불린의 적어도 일부를 코드하거나 재배열되어 면역 글로불린 레파토리를 코드할 수 있는 유전 물질을 배선 (germline)에 삽입한 형질전환 동물의 생산을 포함한다. 삽입된 유전 물질은, 인간 공급원에서부터 생산될 수도 있고, 합성되어 생산될 수도 있다. 상기한 유전 물질은 공지된 면역 글로불린의 적어도 일부를 코드할 수 있으며, 변형된 면역 글로불린의 적어도 일부를 코드하는 변형된 것일 수도 있다.
상기 삽입된 유전 물질을 형질전환 동물내에서 발현시켜, 삽입된 인간 면역 글로불린 유전 물질에서 최소한 일부가 유래한 면역 글로불린을 생산한다. 삽입된 유전 물질이 배선내의 잘못된 위치 또는 잘못된 기하학적 배열로 혼입되었다 하더라도, 상기한 유전 물질은 형질전환 동물내에서 재배열되어, 삽입된 유전 물질 레파토리에서 일부 유래하는 면역 글로불린 레파토리 (repertoire)를 생산할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
상기 삽입된 유전 물질은, 플라스미드 및/또는 코스미드와 같은 원핵생물 벡터내에 삽입된 DNA 형태일 수 있다. 보다 큰 DNA 단편은 인공적인 효모 염색체 벡터를 사용하거나 {참조: Burke 등, 1987 (본원에 참조문헌으로 포함)}, 염색체 단편을 도입하여 삽입할 수 있다 {참조: Richer 및 Lo, 1989 (본원에 참조문헌으로 포함)}. 상기 삽입된 유전 물질은, 기존의 방식 (예를 들면, 수정란 또는 배 줄기 세포내에 주사 또는 기타의 공정을 사용)으로 숙주내에 도입시킬 수 있다.
바람직한 양태에서는, 면역 글로불린의 불변 영역을 코드하는 유전 물질을초기에는 함유하지 않는 숙주 동물을 사용하여, 면역 글로불린을 생산하는 경우에 수득한 형질전환 동물이 삽입된 인간의 유전 물질만을 이용하도록 한다. 이는, 관련된 유전 물질이 없는 천연 발생-돌연변이 숙주를 사용하거나, 관련된 유전 물질이 제거된 숙주를 최종적으로 제조하기 위한 세포 라인에서와 같이 인공적으로 돌연변이체를 제조함으로써 가능하다.
상기 숙주 동물이 면역 글로불린의 불변 영역을 코드하는 유전 물질을 함유하는 경우, 형질전환 동물은 천연 유전 물질 및 삽입된 유전 물질을 가지게 되며, 천연 유전 물질, 삽입된 유전 물질 및 이의 혼합 유전 물질에서 유래하는 면역 글로불린을 생산한다. 이 경우, 상기한 형질전환 동물로부터 유래하는 하이브리도마를 스크리닝함으로써, 예를 들면 항체 유전자 발현의 대립형질 제외 또는 염색체 차등 손실 현상을 이용하여, 목적하는 면역 글로불린을 수득할 수 있다.
적합한 형질전환 동물을 제조한 후, 이 동물을 목적하는 면역원으로 간단하게 면역시킨다. 삽입되는 물질의 성질에 따라, 이 동물은, 외부에서 유래하는 유전 물질이 면역 글로불린의 일부분만을 코드하는 키메라 면역 글로불린(예를 들면, 마우스/인간 유래)을 생산할 수 있고; 외부에서 유래하는 유전 물질이 면역 글로불린의 전체를 코드하는 전적으로 외부성 면역 글로불린 (예를 들면, 전체가 인간에서 유래)을 생산할 수도 있다.
면역반응시킨 후에 형질전환 동물로부터 폴리클론 항혈청을 생산할 수 있다. 목적하는 면역 글로불린을 생산하는 면역 글로불린-생산 세포를 상기 동물로부터 회수한다. 바람직하게는, 예를 들면, 상기 동물의 비장 세포를 골수종 세포와 융합한 후, 수득되는 하이브리도마를 스크리닝하여 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별함으로써, 형질전환 동물로부터 모노클론 항체를 생산한다. 이러한 공정에 사용하기에 적합한 기법은 하기에 기재되어 있다.
이와 달리, 목적하는 항체가 체액 (예를 들면, 혈청이나, 젖, 초유 또는 침과 같은 상기 동물의 외부 방출물)에서 생산되는 방식으로, 상기 유전 물질을 상기 동물에 혼입할 수 있다. 예를 들면, 적어도 일부의 인간의 면역 글로불린을 코드하는 유전 물질을 젖 단백질을 코드하는 포유동물의 유전자에 실험실 내에서 삽입하고 나서, 이 유전자를 상기 포유 동물의 수정란에 도입 (예를 들면, 주사)함으로써, 삽입된 인간의 면역 글로불린 유전 물질로부터 적어도 일부분 유도되는 면역 글로불린을 함유하는 젖을 생산하는 포유동물 암컷 성체로 발생할 수 있다. 그리고 나서, 상기 젖으로부터 목적하는 항체를 수집할 수 있다. 이러한 공정을 수행하기에 적합한 기법은 당업자들에게는 명백할 것이다.
대개, 전술한 형질전환 동물은 동일한 이소타입 (특히, IgM 및 가능하게는 IgD와 같은 B 세포 성숙에 필수적인 이소타입)의 인간 항체를 생산하는 데에 사용된다. 인간의 항-VEGF 항체를 생산하는 다른 바람직한 방법은, 미합중국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호 및 제5,770,429호 (각각 본원에서 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다. 상기 문헌에서는, B 세포 발생에 필요한 이소타입에서 기타의 다른 이소타입으로 변환될 수 있는 형질전환 동물이 기재되어 있다.
B 림프구의 발생에 있어서, 이 세포는, 생산적으로 재배열된 VH및 VL영역에 의해 결정되는 결합 특이성을 가지는 IgM을 초기에 생산한다. 그리고 나서, 각 B 세포 및 이의 딸세포는 동일한 H쇄 및 L쇄 영역을 가지는 항체를 합성하지만, H쇄의 이소타입을 변환시킬 수 있다. μ또는 δ불변 영역의 사용은 교대 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 주로 결정되어, IgM 및 IgD가 단일 세포내에서 함께 발현될 수 있도록 한다. 다른 중쇄 이소타입 (γ, α및 ε)은, 유전자 재배열로 인해 C μ또는 C δ엑손을 절단한 후에 자연적으로만 발현된다. 대개, 이러한 유전자 재배열 과정 ("이소타입 스위칭")은, 각 중쇄 유전자 (델타 제외)의 바로 상향에 위치하는 소위 스위치 절편 사이에서의 재조합에 의해 이루어진다. 이러한 개개의 스위치 절편은 길이가 2 내지 10kb이고, 주로 짧은 반복 서열로 이루어져 있다.
이러한 이유로 인해, 이소타입 스위칭에 사용될 각 스위치 영역에서 상향으로 약 1 내지 2kb 내에 트랜스 유전자(transgene)가 전사 조절 서열을 혼입하는 것이 바람직하다. 이러한 전사 조절 서열은, 프로모터 및 인헨서 요소를 포함하는 것이 바람직하며, 스위치 영역과 자연적으로 연결된(즉, 배선 형상에서 발생하는) 5'-플랭킹 (즉, 상향) 영역을 포함하는 것이 보다 바람직하다. 하나의 스위치 영역으로부터 5' 플랭킹 서열은, 트랜스 유전자 작제를 위한 상이한 스위치 영역에 작동가능하게 연결되어 있다. 소정의 양태에서는, 트랜스 유전자 작제물내에 혼입된 각 스위치 영역이 천연 배선 형상에서 바로 상향에 있는 5' 플랭킹 영역을 가지는 것이 바람직하다. 면역 글로불린 스위치 영역 서열과 관련된 서열 정보는 이미 알려져 있다 {참조: Mills 등, 1990; Sidera 등, 1989 (본원에서 참조문헌으로 포함)}.
미합중국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호 및 제5,770,429호에 기재된 방법에서는, 형질전환된 동물내에 함유된 인간의 면역 글로불린 트랜스 유전자가 B 세포 발생 경로에서 정확하게 기능을 발휘하여, 이소타입 스위칭을 가져왔다. 따라서, 이 방법에서는, 이소타입 스위칭이 발생하고 다음 중 하나 이상이 발생되도록 트랜스 유전자를 작제한다: (1) 높은 수준의 발현 및 세포 유형-특이성 발현; (2) 기능을 나타내는 유전자 재배열; (3) 대립형질 제외 (allelic exclusion)의 활성화 및 이에 대한 반응; (4) 주요 레파토리의 충분한 발현; (5) 신호 전달; (6) 체세포 초돌연변이 (hypermutation); 및 (7) 면역 반응 동안의 트랜스 유전자 항체 로커스의 우성화 (domination).
트랜스 유전자의 기능에 가장 필요한 것은, 다양한 항원에 대한 제2 면역 반응을 유발하기에 충분할 정도로 다양한 주요 항체 레파토리(primary antibody repertoire)의 생성이다. 재배열된 중쇄 유전자는, 각각 다수의 엑손으로 코드되는 다중 도메인-불변 영역의 탄뎀 배열 (tandem array), 변이영역 엑손 및 신호 펩티드 엑손으로 이루어져 있다. 각각의 불변 영역 유전자는, 상이한 클래스의 면역 글로불린의 불변 영역을 코드한다. B 세포 발생 동안, V 영역-인접 불변 영역이 제거되어, 새로운 클래스의 중쇄가 발현된다. 각각의 중쇄 클래스의 경우, 다른RNA 스플라이싱 방식으로 인해 세포막 통과- 및 방출-면역 글로불린 모두가 생성된다.
인간의 중쇄의 유전자 좌위는, 2Mb인 대략 200V 유전자 절편, 약 40kb인 대략 30D 유전자 절편, 3kb내의 6개의 J 절편, 및 대략 300kb에 걸쳐 퍼져 있는 9개의 불변 영역 유전자 절편으로 이루어져 있다. 전체 유전자 좌위는, 제14 염색체의 긴 팔 (long arm)의 말단 부위의 약 2.5Mb에 걸쳐 있다. μ, δ, γ3, γ1 및 α1 불변 영역 뿐만 아니라, 6가지의 공지된 VH패밀리 구성원, D 및 J 유전자 절편을 함유하는 중쇄 트랜스유전자 단편은 이미 공지되어 있다 {참조: Berman 등, 1988 (본원에서 참조문헌으로 포함)}. 이와 유사하게, 인간의 경쇄 유전자 좌위에서 유래하는 모든 필요한 유전자 절편 및 조절 서열을 함유하는 게놈 단편이 작제된다.
대개, 성공적으로 재배열된 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자의 발현은, 트랜스유전자성 비-인간 동물에서 내인성 면역 글로불린 유전자의 재배열을 억제함으로써 우성 효과를 가진다. 하지만, 소정의 양태에서는, 예를 들면 트랜스유전자와 내인성 Ig 서열 사이에 트랜스-스위칭시킴으로써, 인간의 변이영역 및 비-인간 (예를 들면, 쥐) 불변 영역을 포함하는 하이브리드 면역 글로불린 쇄가 형성될 수 없도록 내인성 Ig 유전자 좌위를 완전히 불활성화하는 것이 바람직하다. 배 줄기 세포 기술 및 동질 재조합 기법을 이용하여, 내인성 면역 글로불린 레파토리를 용이하게 제거할 수 있다. 또한, 안티센스 기술과 같은 다양한 기술을 이용하여, 내인성 Ig 유전자를 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서는, 트랜스-스위칭된 면역 글로불린이 바람직할 수 있다. 트랜스-스위칭된 키메라 면역 글로불린을 포함하는 항체는, 비-인간 (예를 들면, 쥐) 불변 영역을 가지는 것이 바람직한 다양한 경우, 예를 들면 숙주내에서 효능인자(effector) 기능을 보유하기 위해 사용될 수 있다. 쥐의 불변 영역의 존재로 인해, 쥐의 효능인자 기능 (예를 들면, ADCC, 쥐의 보체 고정)을 제공함으로써 마우스의 질환 모델에서 상기 키메라 항체를 테스트할 수 있어서 인간의 불변 영역에 비해 잇점이 있다. 상기한 동물 테스트이후에, 상기 공급원 (하이브리도마 클론)으로부터 PCRTM증폭 또는 cDNA 클로닝 등을 통해 인간의 변이 영역-코드 서열을 분리할 수 있으며, 인간 치료에 보다 적합한 인간 서열 항체를 코드하는 목적하는 인간의 불변 영역을 코드하는 서열에 연결할 수 있다.
B9. 인간화된 항체 (Humanized Antibodies)
일반적으로, 인간 항체는 인간 치료에 있어서 3가지 이상의 잇점을 가지고 있다. 첫째, 효능인자 부위가 인간 부위이기 때문에, 인간의 면역 시스템의 다른 부분과 보다 잘 작용하여, 예를 들면 보체-의존 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존 세포성 세포독성 (ADCC)에 의해 표적 세포를 보다 효과적으로 파괴한다. 둘째, 인간의 면역 시스템은 인간 항체를 외부 물질로 인식하지 않는다. 셋째, 인간의 순환계내에서의 반감기가 천연 인간 항체와 유사하므로, 보다 적은 양 및 보다 적은 횟수를 투여할 수 있다.
본원에서는, 인간의 항-VEGF 항체를 제조하는 여러 방법을 제공한다. 인간 항체에 더불어, "인간화된 항체"는 많은 장점이 있다. 일반적으로, "인간화된 (humanized)" 항체는, 인간의 불변 및/또는 변이 영역 도메인 또는 특정 변이를 갖는, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 또는 기타의 종에서 유래한 키메라 또는 모노클론 항체이다. 소위 "인간화된" 항-VEGF 항체의 제조 기법은 당업자들에게는 명백하다.
또한, 인간화된 항체는 전술한 잇점들도 가진다. 첫째, 효능인자 부위는 여전히 인간 부위이다. 둘째, 인간의 면역 시스템은 이의 프레임워크 또는 불변 영역을 외부 물질로 인식하지 않기 때문에, 주사된 항체에 대한 항체 반응이 외부 마우스 항체에 비해 훨씬 작다. 셋째, 주사된 마우스 항체와는 달리, 주사된 인간화된 항체의 반감기는 천연 인간 항체와 더욱 유사하여, 보다 적은 양 및 보다 적은 횟수를 투여할 수 있다.
인간화된 항체를 제조하는 수많은 방법들이 이미 알려져 있다. 단백질 디설파이드 결합을 통해 결합된 항체 도메인을 통제하에 재배열하여 형성한 새로운 인공 단백질 분자, 즉 "키메라 항체"가 사용될 수 있다 {참조: Konieczny 등, 1981 (본원에서 참조문헌으로 포함)}. 또한, 재조합 DNA 기법을 사용하여, 마우스 항체의 변이 영역과 중쇄 도메인과 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 불변 영역 사이에 유전자 융합시킬 수 있다 [참조: Morrison 등, 1984 (본원에서 참조문헌으로 포함)}.
분자적인 수단을 사용하여, 쥐의 모노클론 항체의 항원-결합 부위 또는 상보성 결정 부위 (CDR)를 코드하는 DNA를, 인간 항체의 중쇄 및 경쇄의 프레임워크를코드하는 DNA 서열에 이식시킬 수 있다 {참조: Riechmann 등, 1988}. 이렇게 발현된 재조합 산물을 "재형성된 (reshaped)" 즉 인간화된 항체라고 부르며, 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 프레임워크과 쥐의 모노클론 항체의 항원 인식 부위 (CDR)을 포함한다.
인간화된 항체를 제조하는 다른 방법은 미합중국 특허 제5,639,641호(본원에서 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다. 이 방법에서는, 재표면화 (resurfacing)를 통해, 변이 영역의 인간 표면의 표현으로 인해 치료 효과가 더 향상된 인간화된 설치류의 항체를 제공한다. 이 방법에서는, (1) 항체 중쇄 및 경쇄 변이 영역 풀(pool)을 위치 배열시켜, 1 세트의 중쇄 및 경쇄 변이 영역 프레임워크 표면-노출된 부위를 생성하는 단계; (2) 1 세트의 중쇄 및 경쇄 변이 영역 프레임워크 표면-노출된 아미노산 잔기가 설치류 항체 (또는 이의 단편)에 대해 정의되는 단계; (3) 상기한 설치류 표면-노출된 아미노산 잔기 세트와 가장 비슷하게 일치하는 1세트의 중쇄 및 경쇄 및 중쇄 변이 영역 프레임워크 표면-노출된 아미노산 잔기를 동정하는 단계; (4) 상기한 설치류 항체의 상보성 결정 영역의 잔기가 원자 5Å 이내에 있는 아미노산 잔기를 제외하고, 단계 (2)에서 정의된 중쇄 및 경쇄 및 중쇄 변이 영역 프레임워크 표면-노출된 아미노산 잔기 세트가, 단계 (3)에서 동정된 중쇄 및 경쇄 및 중쇄 변이 영역 프레임워크 표면-노출된 아미노산 잔기 세트와 치환되는 단계; 및 (5) 결합 특이성을 가지는 인간화된 설치류 항체가 생산하는 단계를 포함한다.
인간화된 항체를 제조하는 이와 유사한 방법이 미합중국 특허 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,585,089호 및 제5,530,101호 (본원에서 각각 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다. 이들 방법에서는, 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 공여자의 면역 글로불린으로부터의 추가의 아미노산 및 수용하는 인간 면역 글로불린으로부터의 프레임워크 영역을 가지는, 인간화된 면역 글로불린을 생산하는 것을 포함한다. 대개, 각각의 인간화된 면역 글로불린은, CDR 이외에도, CDR과 반응하여 결합 친화성을 발휘할 수 있는 공여자 면역 글로불린 프레임워크로부터의 아미노산 (예를 들면, 분자 모델링에 의해 예측되는, 공여자의 면역 글로불린내의 CDR에 바로 인접한 하나 이상의 아미노산 또는 약 3Å 이내의 아미노산)을 포함한다. 미합중국 특허 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,585,089호 및 제5,530,101호 (본원에서 각각 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있는 다양한 위치 기준 중에 하나 또는 여러 가지 기준을 함께 사용하거나 모두 사용하여 상기한 중쇄 및 경쇄를 설계할 수 있다. 본래의 항체에 인간화된 면역 글로불린을 결합하는 경우, 인간화된 면역 글로불린은 인간에서는 실질적으로 비-면역원성이며, 본래의 항원에 대한 공여자 면역 글로불린과 실질적으로 동일한 친화성을 유지한다.
인간화된 항체를 제조하는 다른 방법이 미합중국 특허 제5,565,332호 및 제5,733,743호 (본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다. 이 방법은, 인간화된 항체의 개념과 본원에 기재되어 있는 파지미드 라이브러리를 결합한 것이다. 일반적으로 설명하면, 상기 방법에서는, 목적하는 항원에 대한 항체 또는 항체군의 항원-결합 부위의 서열을 이용한다. 따라서, 설치류의 단일 항체의 경우, 이 항체의 항원-결합 부위의 일부를 포함하는 서열이 인간 항체의 다양한 레파토리의 서열과 배합되어 전체 항원-결합 부위를 생성할 수 있다.
최초의 설치류 항체의 서열 일부만이 항원과 유사한 방식으로 접촉한다는 점에 있어서, 본 공정에 따라 제조되는 항원-결합 부위는 CDR 이식에 의해 제조되는 것과는 상이하다. 상기 선택된 인간 서열은 서열면에 있어서는 상이할 가능성이 크며, 최초의 결합 부위의 서열에서 비롯한 항원과 접촉할 수도 있다. 하지만, 항원의 최초 서열 일부분의 결합, 항원 및 항원-결합 부위의 형상에 의한 제한으로 인해, 상기한 인간 서열이 상기 항원의 동일한 부위 또는 에피토프에 새로이 접촉하게 할 가능성도 있다. 따라서, 이러한 과정을 "에피토프-각인된 선별 (epitope imprinted selection (EIS)"라고 부른다.
동물 항체를 이용하는 것으로 시작하는 한 공정에서는, 부분적인 인간 항체를 선별할 수 있다. 이러한 항체는, 인간 항체와 서열면에서 충분히 유사하여, 치료에 직접 사용하거나, 몇몇 핵심 잔기의 변형후에 직접 사용할 수 있다. 인간 서열과 상기 선별된 항체의 설치류 성분 사이의 서열상의 차이는, 예를 들면 개개의 잔기의 부위-돌연변이 (site directed mutagenesis) 또는 전체 루프의 CDR 이식에 의해, 인간 서열 잔기와 상이한 잔기를 대체함으로써 최소화할 수 있다. 하지만, 전체가 인간 서열인 항체를 제조할 수도 있다. 따라서, EIS를 통해, 동물 항체 또는 부분적인 인간 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 부분적인 인간 항체 또는 전체 인간 항체를 제조하는 방법을 제공할 수 있다. EIS에서는, 항체 단편 레파토리가, 상기 파지를 항원에 결합시켜 선별한 항원-결합 활성을 가진 단편을 코드하는 유전자 및 필라멘트상(filamentous phase)의 표면상에서 디스플레이될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 것으로 생각되는 항체를 인간화시키는 다른 방법들은 미합중국 특허 제5,750,078호, 제5,502,167호, 제5,705,154호, 제5,770,403호, 제5,698,417호, 제5,693,493호, 제5,558,864호, 제4,935,496호 및 제4,816,567호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다. WO98/45331 및 WO98/45332는, 특히 항-VEGF 항체에 적용할 수 있는 항체의 인간화 공정에 대한 원칙을 보여주는 것으로서 본원에서 참조문헌으로 포함하고 있다.
B10. PCR TM 에 의한 돌연변이 생성
부위-특이 돌연변이 생성 (site-specific mutagenesis)는, 주요한 DNA의 특이적인 돌연변이 생성을 통해 개개의 항체를 제조하는 데에 유용한 기술이다. 또한, 이 방법을 통해, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 DNA에 도입함으로써, 인간화시키거나 아니거나 상기한 사항들을 고려하여, 서열 변이체를 제조 및 테스트할 수 있다.
많은 방법들이 돌연변이 생성에 적합하게 사용될 수 있으나, 현재로서는 폴리머라제 쇄 반응 (PCRTM)을 사용하는 것이 바람직하다. 이 방법은, 소정의 DNA 서열에 목적하는 돌연변이를 도입하는 효율적이고 신속한 방법을 제공한다. 특히 아래의 내용에서는, 소정의 서열에 의해 코드되는 아미노산을 변경하는 데에 사용될 수 있는 바와 같이, 소정의 서열에 점 돌연변이 (point mutation)을 도입하기 위한 PCRTM의 사용을 기재하고 있다. 또한, 이 방법을 변형하여, 제한 효소 부위를 DNA 분자에 도입하는 데에도 적합하게 사용할 수 있다.
본 방법에서는, 증폭된 절편의 한쪽 말단에 점 돌연변이를 도입하도록 합성 올리고뉴클레오티드를 설계한다. PCRTM을 거친 후, Klenow 단편을 처리하여 상기 증폭된 단편의 말단을 블런트(blunt)하게 하고, 블런트-말단 단편을 결찰(ligation)하고, 서열 분석을 용이하게 하기 위해 이를 벡터내에 삽입한다.
돌연변이시키고자 하는 주형 DNA를 제조하기 위해, 돌연변이시킬 부위에 인접하는(flanking) 제한효소 부위를 사용하여, 높은 카피 수(copy number)의 벡터 (예를 들면, pUC19)에 상기 DNA를 서브-클로닝(subcloning)한다. 그리고 나서, 플라스미드 미니프렙(miniprep)을 사용하여 주형 DNA를 제조한다. 모서열 (parent sequence)에 기초하지만, 목적하는 점 돌연변이를 가지고 있으며, 제한효소 부위에 의해 5' 말단에서 인접해 있는, 적합한 올리고뉴클레오티드를 자동 합성기를 사용하여 합성한다. 일반적으로, 대략 15 염기 정도의 주형 DNA에 상응하는 프라이머 (primer)가 필요하다. 변성-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 프라이머를 정제할 수 있으나, 이는 PCRTM을 사용하는 데에 있어서 반드시 필요한 것은 아니다. 그리고 나서, 상기한 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 인산화시킨다.
목적하는 점 돌연변이를 가지고 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, PCRTM에 의해 상기한 주형 DNA를 증폭시킨다. 상기한 증폭 버퍼에서의 MgCl2의 농도는, 일반적으로 약 15mM이다. 일반적으로, 다음에 기재된 바와 같이, 약 20 내지 25 사이클의 PCR을 수행하여야 한다: 95℃에서의 35초간 변성(denaturation) 단계, 50℃에서 2분간 혼성화 단계, 및 72℃에서 2분간 연장(extension) 단계. 일반적으로, PCR에서는 72℃에서 약 10분간의 마지막 사이클 연장 단계를 포함한다. 최종 연장 단계후, 약 5 유닛의 Klenow 단편을 상기 제한 혼합물에 첨가하고 나서, 약 30℃에서 추가로 15분 동안 인큐베이션시켜야 한다. Klenow 단편의 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 활성은, 말단을 매끈하게 하여 블런트-말단 클로닝에 적합하도록 하는 데에 필수적이다.
일반적으로, 이렇게 수득한 반응 혼합물은 비-변성 아가로즈 또는 아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하여, 상기 증폭 과정을 통해 예상된 생성물을 생산하였는 지를 확인하여야 한다. 그리고 나서, 상기 반응 혼합물에 대해, 대부분의 미네랄 오일을 제거하고나서, 클로로포름으로 잔류 오일을 추출한 후, 버퍼링된 페놀을 사용하여 추출하고 나서, 100% 에탄올로 침전시켜 농축시킨다. 그리고 나서, 상기 올리고뉴클레오티드에서 사용되는 인접한 서열에서 절단하는 제한 효소를 이용하여 상기 증폭된 단편의 약 절반을 단축(digest)시켜야 한다. 이렇게 단축된 단편을 낮은 겔화/용융 아가로즈 겔(low gelling/melting agarose gel) 상에서 정제한다.
상기 단편을 서브-클로닝하고 점 돌연변이를 확인하기 위해, 블런트-말단 결찰을 통해 적합하게 단축된 벡터에 상기한 2개의 증폭 단편을 서브-클로닝하여야 한다. 이를 통해 이.콜라이 (E.coli)를 형질전환시킬 수 있는 데, 이로부터 미니프렙(miniprep)을 이용하여 플라스미드 DNA를 제조할 수 있다. 플라스미드 DNA의 증폭 부위를 DNA 시퀀싱으로 분석하여, 정확한 점 돌연변이가 생성되었는 지를 확인할 수 있다. 이는 매우 중요한 데, Taq DNA 폴리머라제가 DNA 단편에 추가의 돌연변이가 생기도록 할 수 있기 때문이다.
또한, 점 돌연변이의 도입은 시계열적인(sequential) PCRTM단계를 사용하여 이루어질 수도 있다. 이 공정에서, 돌연변이를 가지는 상기 2개의 단편을 서로 어닐링 (annealing)시키고, 상호 프라임-합성 (mutually primed synthesis)에 의해 연장시킨다. 그리고 나서, 제2 PCRTM단계를 이용하여 이 단편을 증폭함으로써, 상기 프로토콜에서 필요로하는 블런트-말단 결찰을 피할 수 있다. 이 방법에서는, 주형 DNA의 제조, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 생성 및 제1 PCRTM증폭 단계는 상기한 바와 같이 수행된다. 하지만, 이 공정에서는, 상기 선택된 올리고뉴클레오티드가 약 15 내지 약 20 염기의 주형 DNA와 상동성을 가져야 하며, 약 10 염기 이상이 중복되어야 한다.
제2 PCRTM증폭에서는, 각각의 증폭 단편 및 인접 서열 프라이머를 이용하고, 상기한 조건하에서 약 20 내지 약 25 사이클의 PCRTM을 수행한다. 상기 단편을 다시 서브-클로닝하고, 상기한 단계를 이용하여 점 돌연변이가 정확한 지를 검사한다.
상기한 2가지의 방법 중 어느 방법을 사용하는 경우에도, 가능한한 작은 단편을 증폭하여 돌연변이를 도입하는 것이 일반적으로 바람직하다. 물론, GC 함량 및 올리고뉴클레오티드의 길이에 의해 일반적으로 영향을 받는 올리고뉴클레오티드의 용융점과 같은 파라미터들을 주위깊게 고려하여야 한다. 이러한 방법, 및 필요한 경우에는 최적화 방법의 실행은 당업자들에게는 명백할 것이며, 다양한 문헌에 추가로 기재되어 있다 {참조:Current Protocols in Molecular Biology, 1995 (본원에 참조문헌으로 포함)}.
부위-특이적 돌연변이를 생성시키는 경우, 하기 표 A를 참조하여 수행할 수 있다.
[표 A]
아미노산 코돈
알라닌 Ala A GCA GCC GCG GCU
시스테인 Cys C UGC UGU
아스파르트산 Asp D GAC GAU
글루타민산 Glu E GAA GAG
페닐알라닌 Phe F UUC UUU
글리신 Gly G GGA GGC GGG GGU
히스티딘 His H CAC CAU
이소류신 Ile I AUA AUC AUU
라이신 Lys K AAA AAG
류신 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
메티오닌 Met M AUG
아스파라긴 Asn N AAC AAU
프롤린 Pro P CCA CCC CCG CCU
글루타민 Gln Q CAA CAG
아르기닌 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
세린 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
트레오닌 Thr T ACA ACC ACG ACU
발린 Val V GUA GUC GUG GUU
트립토판 Trp W UGG
티로신 Tyr Y UAC UAU
B11. 항체 단편 및 유도체
본래의(original) VEGFR2-차단,항-VEGF 항체의 공급원과는 무관하게, 본래의(intact) 항체, 항체 멀티머(multimer) 이거나 이의 다양한 기능성 항원-결합 부위가 본 발명에서 사용될 수 있다. 기능성 부위의 예로는, 항-VEGF 항체의 scFv, Fv, Fab', Fab, F(ab')2단편, 선형 항체 및 디아바디 (diabody)가 포함된다. 이러한 작제물을 제조하는 기법들은 당업자들에게는 잘 알려져 있으며, 본원에 추가로 예시되어 있다.
항체 작제물의 선택은, 여러 가지 요소에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, 면역 글로불린의 Fc 부분의 특성인, 신장내의 본래의 항체를 능동적으로 재흡수함으로써 반감기를 연장시킬 수 있다. 따라서, IgG-기초 항체는 Fab'에 비해 혈액에서 제거되는 것이 더 적을 것으로 예상된다. 하지만, Fab' 단편-기초 조성물은 일반적으로 조직 투과성이 보다 우수하다.
항체 단편은, 비-특이적 티올 프로티에이즈 (파파인, papain)을 사용하여 전체 면역 글로불린을 가수분해함으로써 수득할 수 있다. 파파인-절단으로 인해, 각각 단일 항원-결합 부위를 가지는 2개의 동일한 항원-결합 단편 (Fab 단편) 및 잔여(residual) "Fc 단편"이 생성된다.
우선, 시스테인, 2-머캅토에탄올 또는 디티오트레이톨을 가진 활성 부위에 있는 설피드릴 그룹을 환원시켜, 파파인을 활성화시켜야 한다. 상기 스톡 효소 (stock enzyme) 내의 중금속은, 효소 활성을 최대화하기 위해서 EDTA (2mM)을 사용하여 킬레이션 (chelation)시켜 제거하여야 한다. 통상적으로, 효소와 기질은 1:100의 중량비로 혼합한다. 인큐베이션시킨 후, 요오드아세트아미드를 이용하여 상기 티올 그룹을 비가역적으로 알킬화시키거나 단순히 투석시켜, 상기 반응을 종료시킬 수 있다. 단백질 A-세파로즈 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리된 다양한 분획 및 SDS-PAGE에 의해, 상기 절단의 종료 여부를 모니터링하여야 한다.
토끼 및 인간 유래의 IgG에서 F(ab')2단편을 제조하는 통상의 공정은, 효소 "펩신"을 이용한 한정된 단백질 분해이다. 37℃, pH4.5, 아세테이트 버퍼내에서의 100× 항체 과량 (w/w)의 조건은, 중쇄 사이의 디설파이드 결합의 C 말단부에서 항체가 절단됨을 암시해준다. 마우스 IgG의 절단률은 서브클래스에 따라 달라질 수 있으며, 상당량의 IgG가 완전히 분해되는 것을 피할 수 있는 반응 조건을 선택하여야 한다. 특히, IgG2b은 완전히 분해 (degradation)되기 쉽다. 다른 서브 클래스는 최적의 결과를 얻기 위한 인큐베이션 조건이 상이한 데, 이는 당업자들에게는 잘 알려져 있다.
본래의 항체를 펩신으로 처리함으로써, 2개의 항원-결합 부위를 가지며 항원과 교차 결합할 수 있는 능력을 여전히 보유한 F(ab')2단편이 생성된다. 펩신으로 랫트의 IgG를 절단하는 경우, 0.1M 아세테이트 버퍼 및 pH 4.5에서의 투석 및 1%(w/w)의 펩신과 함께 4시간 동안의 인큐베이션을 포함한 조건이 필요하다. 16시간동안 4℃ 및 pH2.8에서 0.1M 포르메이트에 대한 첫번째 투석후에 아세테이트 버퍼로 투석하게 되면, IgG2a절단이 향상된다. IgG2b는, 37℃에서 4시간 동안 pH7.8의 0.1M 인산나트륨 버퍼에서 스타필로코커스 V8 프로티에이즈 (3% w/w)에서 인큐베이션시킴으로써 보다 일관된 결과를 가져온다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은, 항체 힌지 부위로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 몇몇 잔기가 추가됨으로써, Fab 단편과 상이하다.F(ab')2항체 단편은, 사이에 힌지 시스테인을 가지고 있는 1쌍의 Fab' 단편으로서 원래 생성된 것이다. 또한, 항체 단편의 기타의 화학적 커플링에 대해서는 이미 알려져 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 변이 도메인이 공유결합으로 단단하게 연결된 다이머로 이루어져 있다. 이러한 형상에서, 각 변이 도메인의 3개의 초변이 영역이 상호작용하여, VH-VL다이머의 표면상에서 항원-결합 부위를 정의한다. 모두 총괄하여, 6개의 초변이 영역이 항체에 대한 항원-결합 특이성을 가지게 한다. 하지만, 전체 결합 부위보다 낮은 친화성에서도, 하나의 변이 도메인 (또는 항원에 대해 특이성을 가지는 3개의 초변이 영역만을 포함하는 Fv의 절반)만으로도 항원을 인식하여 결합할 수 있다.
"단일쇄 Fv" (즉,"sFv") 항체 단편은, 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하는 VH및 VL항체 도메인을 포함한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는, sFv가 항원 결합에 필요한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 VH및 VL도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.
하기 특허 및 특허출원들은, 항-VEGF 항체의 scFv, Fv, Fab', Fab, F(ab')2단편을 포함한 항체의 기능성, 항원-결합 부위의 제조 및 용도에 관한 본원의 기재내용을 보충하기 위해 본원에 참조문헌으로 포함되어 있다: 미합중국 특허제5,855,866호, 제5,965,132호, 제6,051,230호, 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 특허출원 제08/482,369호 (특허료 납부일: 1998년 10월 20일). WO98/45331호에서는, 항체의 변이 영역, 초변이 영역 및 상보성 결정 (CDR) 영역의 제조에 대해서 추가 기술하고 있으며, 본원의 참조문헌에 포함되어 있다.
"디아보디 (diabody)"는 2개의 항원-결합 부위를 가지는 작은 항체 단편으로서, 동일한 폴리펩티드 쇄의 경쇄 변이 도메인 (VL)에 결합된 중쇄 변이 영역 (VH)을 포함한다. 너무 짧아서 상기한 동일 쇄의 2개의 도메인이 쌍을 이루게 할 수 없는 링커를 사용하여, 상기 도메인이 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 이루게 하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 한다. 디아보디는 EP 제404,097호 및 WO93/11161 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다. 이중-특이성 또는 단일-특이성을 가지는 "선형 항체"는, 1쌍의 항원 결합 부위를 형성하는 1쌍의 탄뎀 (tandem) Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다 {참조: Zapata 등, (1995) - 본원에 참조문헌으로 포함}.
Fab' 단편 (즉, 항체의 항원-결합 단편)을 사용하는 경우, 이 단편을 변형시켜 반감기를 증가시키면 추가의 잇점이 있다. 상기 항체 분자 자체의 조작 또는 변형 및 불활성 캐리어에 컨쥬게이션시키는 것과 같은 다양한 기법들이 사용될 수 있다. 제제를 표적에 전달시키는 목적 보다는 반감기를 증가시키는 목적만을 위해서는 컨쥬게이션 방법이 조심스럽게 수행되어져야 한다. 왜냐하면, Fab' 및 기타의 단편들이 조직을 통과하도록 선택되기 때문이다. 그럼에도 불구하고, PEG 등과같은 비-단백질 폴리머에 컨쥬게이션시키는 것도 고려할 수 있다.
따라서, 컨쥬게이션이 아닌 변형 공정은, 체내에서의 대사활동률을 보다 안정되고/되거나 감소시키기 위해 항체 단편의 구조를 변형시키는 것을 기초로 한다. 이러한 변형을 위한 한가지의 메카니즘은, L-아미노산 대신에 D-아미노산을 사용하는 것이다. 상기한 변형 공정이후에 수득한 분자를 과감하게 테스트하여 목적하는 생물학적 특성을 여전히 보유하고 있는 지를 확인하는 과정이 후속되어야 한다는 것을 당업자들은 잘 알고 있을 것이다. 또한, 안정화 변형 공정에서는, 생물 분자의 반감기를 연장시키기 위해 일반적으로 사용되는 N 말단 및/또는 C 말단에 안정화 잔기를 추가하는 것이 포함된다. 예를 들면, 아실화 또는 아민화에 의해 말단부를 변형시킬 수도 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 온건한 유형의 컨쥬게이션 변형 공정은, 회수 수용체(salvage receptor)-결합 에피토프를 상기 항체 단편에 혼입시키는 것을 포함한다. 이러한 기법에서는, 상기 항체 단편에 부착된 펩티드 태그로서 상기 에피토프를 혼입하거나, 상기 항체 단편의 적합한 영역을 돌연변이시키는 것을 포함한다. WO96/32478(본원의 참조문헌에 포함)에서는 이러한 기법의 예를 기술하고 있다. 통상적으로, 회수 수용체(salvage receptor)-결합 에피토프는, 상기 항체 단편상의 유사 위치에 이동된 Fc 도메인의 하나 또는 2개의 롭 (lop)으로부터의 3 이상의 아미노산으로된 영역이다. WO98/45331의 회수 수용체(salvage receptor)-결합 에피토프는 본 발명에 사용할 수 있는 것으로서 본원에서 참조하고 있다.
B12. 결합 및 기능 분석
본 발명은 동물 및 인간의 치료에 특히 유용하지만, 많은 실험실내 사용을 포함한 다른 실용적인 용도를 가지고 있다. 이러한 용도는, 항체 또는 면역 컨쥬게이트의 특이적인 결합 특성과 관련된 것이다. 본 발명의 모든 화합물이 하나 이상의 항체 성분을 포함하고 있다는 점에서, 본래의 항체가 사용될 수 있는 실제적으로 모든 결합 양태에서 사용될 수 있다.
부착된 제제로 인한 장점이 있으나, 이로 인해 결합 분석에 있어서 제1 항체 영역의 유용성이 상실되는 것은 아니다. 따라서, 적합한 유용한 결합 분석으로는, 본원에서 추가로 기재되어 있는 바와 같은, 면역 블롯, 웨스턴 블롯, 점 블롯, RIA, ELISA, 면역 조직 화학, 형광-활성 세포 분류 (FACS), 면역 침전법, 친화성 크로마토그래피 등의 당업계에서 공통적으로 사용되고 있는 기법들이 포함된다.
소정의 표준 결합 분석은, 면역 블롯, 웨스턴 블롯 및 관련된 분석법에서 사용되고 있는 것과 같이, 항원을 고형 지지 매트릭스 (예를 들면, 니트로셀룰로즈, 나일론 또는 이의 결합)에 고착시키는 분석법이다. 다른 중요한 분석법은 ELISA이다. 이러한 모든 분석법들은, 안지오제네시스 질환의 진단에 사용될 수 있는 바와 같이, VEGF의 검출에 사용할 수 있도록 용이하게 조정할 수 있다. 또한, 본 발명의 제제들은, 면역 조직 화학법에서 금방 얼린 (fresh-frozen) 포리말린-고정된, 파라핀-박혀있는 조직 블락 (block)과 함께; 형광-활성 세포 분류, 플로우 사이토메트리 (flow cytometry) 또는 플로우 마이크로플루오로메트리 (flow microfluorometry); 면역 침전; 이중-특이성 항체의 경우에는 동시에 하나 이상의 항원을 신속하게 단일 단계에서 정제하는 것을 포함하는 친화성 크로마토그래피와같은, 항원 정제 양태; 및 본원에 기재된 당업계에 잘 알려진 다른 결합 분석에서, 사용될 수 있다.
본 발명 항체의 또 다른 실용적인 용도는, 기능성 분석에서의 대조군 (control)로서의 사용이다. 이러한 것으로는, 동물 모델 연구 뿐만 아니라 많은 실험실내 및 생체외 분석 및 시스템이 포함된다. 본 발명 항체의 결합 및 기능 특성은 특히 특이성을 가지기 때문에, 즉 본 발명 항체는 VEGF의 VEGFR1 이 아닌 VEGFR2에 대한 신호전달 및 결합을 억제하기 때문에, 이러한 대조군으로서의 용도는 실질적으로 매우 중요하다. 본 발명의 이러한 실용적인 사용으로서 얻을 수 있는 잇점을 가지는 분석으로는, 예를 들면, 닭의 융모요막 분석 (CAM) 및 각막 신생혈관 마이크로포켓 분석 뿐만 아니라, VEGF-매개 내피세포 성장, VEGF-유도 인산화 및 VEGF-유도 혈관 투과 분석이 포함된다. 또한, 이러한 분석 시스템들은, 특성이 잘 정의된 생물 물질의 제공이 특히 중요한, 실험실내 또는 생체외 약물 스크리닝 분석 시스템으로 개발될 수 있다.
C. 면역 컨쥬게이트 (Immunoconjugate)
본 발명에서 항-안지오제네시스 방법에 사용할 매우 효과적인 naked 또는 비-컨쥬게이션된 항체를 제공하지만, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트, 면역 독소 및 응고 리간드 또한 제공한다. 현재, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료 컨쥬게이트에서 사용하기에 바람직한 제제는, 방사선 치료제 (본원에 기재된 방사선 진단제로서 예시된 것과 동일), 항-안지오제네시스 제제, 세포사멸 유도제, 항-튜불린 약제, 항-세포성 또는 세포독성 제제 및 응고제 (응고 인자)이다.
면역 컨쥬게이트, 면역 독소 및 응고 리간드를 생산하기 위해, 융합 단백질을 생산하기 위해 재조합 발현(당업자들에게 잘 알려져 있으며, 본원에도 기재되어 있음)을 이용할 수 있다. 이와 동일하게, 항체 컨쥬게이트를 기초로 하여 개발된 교차 링커 기술 및 화학적 컨쥬게이션 또는 아비딘:비오틴 가교를 이용하여, 면역 컨쥬게이트, 면역 독소 및 응고 리간드를 생산할 수 있다.
C1. 독소 및 항-세포제
소정의 용도의 경우, 치료제는 세포 독성 또는 약물학적 제제이며, 특히 내피 세포의 성장 또는 분열을 차단 또는 억제하는 능력을 가진 세포 독성, 세포분열 정지 또는 항-세포 제제이다. 일반적으로, 본 발명의 이러한 양태에서는, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-유사 항체에 컨쥬게이션될 수 있고 활성 형태로 표적 내피세포에 전달될 수 있는, 모든 약제를 사용할 수 있다.
항-세포제의 예로는, 세포 독소 뿐만 아니라 화학 치료제가 포함된다. 사용될 수 있는 화학 치료제에는, 호르몬 (예를 들면, 스테로이드); 항-대사제 (예를 들면, 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트 또는 아미놉테린); 안트라사이클린; 미토마이신 C; 빈카 알카로이드; 데메콜키친; 에토포시드; 미트라마이신; 항-종양 알킬화제 (예를 들면, 클로르암부실 또는 멜팔란)가 포함된다. 다른 양태에서는, 사이토카인과 같은 제제가 포함될 수 있다. 기본적으로, 표적 내피 세포 부위의 혈액 성분을 표적화, 내부화, 방출 및/또는 표시할 수 있는 방식으로 항체와 성공적으로 컨쥬게이션 또는 연결될 수 있는 한, 모든 항-세포제가 사용될 수 있다.
항종양 약제, 사이토카인, 항-대사제, 알킬화제, 호르몬 등과 같은 화학치료제를 표적화하고자 하는, 일관되게 독성 화합물이 효율적으로 작용하는 경로를 통해 표적 항원이 내부화 (internalization)되지 않는 때가 있다. 독소루비신, 다우노마이신, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 네오카르지노스타틴, 매크로마이신, 트레니몬 및 알파-아마니틴과 같은 다양한 종류의 화학치료제 및 약제가 항체에 성공적으로 컨쥬게이션되어 약리 효과를 보이는 것으로 밝혀졌다.
다른 경우에서는, DNA 합성 억제제 (예를 들면, 다우노루비신, 독소루비신, 아드리아마이신 등)의 사용으로 인한, 세포독소-기초 치료법이 나타낼 수 있는 부작용을 제거할 수 있다. 따라서, 상기 제제들은 본 발명에서 사용하기에 바람직한 항-세포 제제의 예이다.
세포분열 억제제 (cytostatic agent)는, 표적 세포의 천연 세포 주기를 일반적으로 방해하여, 바람직하게는 세포 주기에서 벗어나도록 한다.
많은 세포독성 제제들이, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 예로는, 다양한 A 사슬 독신 (특히, 리신 A 사슬); 리보좀-불활성화 단백질 (예를 들면, 사포린 똔느 겔로닌); 알파-사르신; 아스페르길린; 리스트릭토신; 리보뉴클리에이즈 (예를 들면, 태반 리보뉴클리에이즈); 디프테리아 독소; 및 슈도모나스 외부 독소 등의 수많은 유용한 식물-유래, 곰팡이-유래 또는 세균-유래 독소 등이 있다.
이러한 독소 중에서, 리신 A가 바람직하다. 사용하기에 가장 바람직한 독소잔기는, 탄수화물 잔기가 변형 처리되거나 제거된 독소 A 사슬인 소위 "탈당화된 A 사슬 (dgA)"이다. 탈당화된 리신 A 사슬이 바람직한데, 그 이유는 강력하고 반감기가 길며 임상 규모 및 임상 수준으로 제조하기에 경제성이 있기 때문이다.
약리학적 관점에서 볼때, 적합한 생물학적 반응을 제공하면서 가장 작은 분자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 적합한 항-세포 반응을 제공하는 크기가 보다 작은 A 사슬 펩티드가 바람직할 수 있다. 이 경우, Nagarase (Sigma)를 사용하여 30개의 N 말단 아미노산을 제거하여, 적합한 독성 활성을 그대로 유지하는 "절단된 (truncated)" 리신 A 사슬을 만들 수 있다는 것이 알려져 있다. 필요한 경우, 이러한 절단된 A 사슬을 이용하여 본 발명에 따른 컨쥬게이트에 사용할 수 있다는 것이 제안되어 있다.
이와 달리, 독소 A 사슬 잔기에 재조합 DNA 기술을 사용하여 본 발명에 따른 추가의 잇점을 제공할 수 있다. 현재, 생물학적 활성의 리신 A 사슬을 클로닝 및 발현시킬 수 있기 때문에, 적합한 독소 활성을 발휘하는 보다 작은 펩티드 또는 변이체를 동정 및 제조할 수 있다. 또한, 현재 리신 A 사슬이 클로닝되어 있으므로, 부위-특정 돌연변이 생성 방법을 사용하여, A 사슬-유도 펩티드를 용이하게 제조 및 스크리닝할 수 있으며, 본 발명과 관련한 용도로 사용하기에 유용한 추가의 잔기를 수득할 수 있다.
C2. 응고 인자(coagulation factor)
본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체는 응고를 직접적 또는 간접적으로 자극할 수 있는 성분에 연결되어 응고 리간드 (coaguligand)를 형성할 수 있다. 여기서, 상기한 항체는 응고제 또는 응고 인자에 직접 연결될 수 있고, 응고제 또는 응고 인자에 결합하여 이를 방출하는ㄴ 제2 결합 부위에 결합할 수도 있다. 본원에서의 용어 "응고제 (coagulant)" 및 "응고 인자 (coagulation factor)"는 각각, 바람직하게는 종양 혈관체와 같은 특정의 생체내 환경에 제공된 경우, 적합한 조건하에서 직접적 또는 간접적으로 응고를 자극할 수 있는 성분을 의미한다.
바람직한 응고 인자로는, 절단된 TF (tTF), 다이머 TM 분자, 멀티머 TF 분자 및 돌연변이 TF 분자와 같은 조직 인자(Tissue Factor) 조성물이다. "절단된 TF (tTF)"는, 특성 변화를 일으키기에 충분한 아미노산 서열을 제거함으로써 세포막-결합을 할 수 없는 TF 작제물이다. 이 경우에 "충분한 양"은, 세포막에 TF 분자가 들어오거나 TF 단백질의 기능성 막 결합을 매개할 수 있을 정도의 충분한 세포막 통과-아미노산 서열의 양을 의미한다. 따라서, "충분한 양의 세포막 통과-서열 (tranmembrane spanning sequence)"의 제거로 인해, 인지질 막-결합 능력이 없어서 인지질 막에 유의성있게 결합하지 않는 실질적인 가용성 단백질인, 절단된 조직 인자 단백질 또는 펩티드가 생성된다. 따라서, 절단된 TF는, 표준 TF 분석에서 실질적으로 인자 VII가 인자 VIIa로 변환시킬 수 없으나, 인자 VIIa의 존재하에 인자 X를 활성화시키는 것을 포함한 소위 촉매 활성은 그대로 유지한다.
미합중국 특허 제5,504,067호 (본원에 참조문헌으로 포함)에서는, 이러한 절단된 조직 인자 단백질이 기재되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 이러한 양태에서의 조직 인자에는, 일반적으로 세포막 통과 영역 및 세포질 영역 (아미노산 220내지 263)이 없다. 하지만, 상기한 절단된 TF 분자가, 정확하게 219개의 아미노산으로 된 분자에 한정될 필요는 없다.
또한, 다이머로서의 조직 인자 조성물이 유용할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위해, 절단된, 돌연변이된 또는 기타의 조직 인자 작제물을 다이머 형태로 제조할 수 있다. 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 이러한 TF 다이머는, 2개의 코드 부위를 프레임-내 (in-frame)에서 제조하여 발현 벡터에서 발현하는, 분자 생물 및 재조합 발현에 관한 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이와 동일하게, TF 다이머 제조와 관련하여, 다양한 화학적인 컨쥬게이션 기법들이 사용될 수 있다. 컨쥬게이션시키기 이전에, 개개의 TF 모노머를 유도화할 수 있다. 이러한 모든 기법들은 당업자들에게는 잘 알려져 있을 것이다.
필요한 경우, 생물학적으로 방출가능한 결합 (예를 들면, 선택적으로 절단가능한 링커 또는 아미노산 서열)을 통해, 조직 인자 다이머 또는 멀티머를 결합할 수 있다. 예를 들면, 종양 환경내에서 선별적으로 존재하거나 활성화되는 효소에 대한 절단 부위를 포함하는 펩티드 링커를 사용할 수 있다. 이러한 펩티드 링커의 예로는, 유로키나제, 플라스민, 트롬빈, 인자 IXa, 인자 Xa 또는 메탈로프로티네이즈 (예를 들면, 콜라게나제, 젤라티나제 또는 스트로멜리신)에 의해 절단된 펩티드 링커가 있다.
소정의 경우, 조직 인자 다이머는, 추후에 소정의 조건하에서만 인지질 막을 조직 인자와 기능적으로 연결시키도록, 방해된 (hindered) 소수성 막 삽입 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 절단된 조직 인자와 관련하여 기술한 바와 같이, 일반적으로 소수성 막-연결 서열은, 소수성에 의해 인지질 환경과의 결합을 촉진하는 일련의 아미노산이다. 이와 동일하게, 막 삽입 잔기를 제공하기 위해 지방산을 사용할 수 있다.
이러한 막 삽입 서열은, TF 분자의 N 또는 C 말단부에 위치하거나, TF 작제물의 기능을 방해하지 않는 한 다른 위치에 부착될 수 있다. 상기한 방해된 삽입 잔기를 사용하는 목적은, TF 작제물이 종양 환경내에 위치하여 소수성 부착물이 접근가능하고 막과의 물리적 결합을 촉진할 때까지는 상기 삽입 잔기가 기능을 나타내지 않기 때문이다. 또한, 이 경우에, 생물학적으로 방출가능한 결합 및 선택적으로 절단가능한 서열이 특히 유용하다. 이때, 상기 결합 또는 서열은, 종양 환경내에 위치하거나 특정 효소 또는 기타의 생물활성 분자에 노출되었을 때에만, 절단되거나 변형된다.
다른 양태의 경우, tTF 작제물이 멀티머 또는 폴리머일 수 있다. 이 경우, "폴리머 작제물"은 3 이상의 조직 인자 작제물을 함유한다. "멀티머 또는 폴리머 TF 작제물"은, 제1 TF 분자 또는 유도체가 적어도 제2 및 제3 TF 분자 또는 유도체에 작동가능하게 부착되어 있는 작제물이다. 멀티머 TF 작제물은, 약 3 내지 약 20개의 TF 분자를 포함할 수 있다. 또한, 멀티머 또는 폴리머내의 개개의 TF 유닛은, 바람직한 선택적으로 절단가능한 펩티드 링커 또는 기타의 생물학적으로 방출가능한 결합에 의해 연결될 수도 있다. 또한, 상기한 TF 다이머에서와 같이, 상기 작제물은 재조합 조작 및 발현이나 표준적인 합성 화학을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명에서 유용한 또 다른 TF 작제물은, 인자 VII을 활성화할 수 없는 돌연변이체이다. "인자 VII 활성-돌연변이"는, 기능성 인자 VII/VIIa에 결합하고 단백질 가수분해하여 인자 X를 활성화시키지만 인자 VII를 단백질 가수분해하여 활성화시키는 능력이 실질적으로 없는, TF 돌연변이체이다. 따라서, 이러한 작제물은 인자 VII 활성화 능력이 없는 TF 돌연변이체이다.
종양-특이적 응고의 촉진 작용에 있어서의 인자 VII 활성화-돌연변이의 능력은, 이를 종양 혈관체에 특이 전달하는 것과 혈장에서의 낮은 농도의 인자 VIIa에 기초한 것이다. 상기한 인자 VII 활성화-돌연변이 컨쥬게이트를 투여하면, 이 돌연변이체는 혈관생성된 종양의 혈관체내에 위치하게 된다. 종양 혈관체내에 위치 (localization)되기 전에는, 인자 VII를 인자 VIIa로 변환시킬 수 없기 때문에, 일반적으로 TF 돌연변이체는 다른 체내 부위에서는 응고를 촉진할 수 없다. 하지만, 종양 부위내에 위치 및 축적되면, TF 돌연변이체는 혈장으로부터 충분한 양의 인자 VIIa와 접하게 되어, 외인성 응고 경로 (extrinsic coagulation pathway)가 시작되게 함으로써 종양-특이적 혈전 생성 (trombosis)이 이루어진다. 외인성 인자 VIIa를 환자에게 투여할 수도 있다.
본 발명과 관련하여, 다양한 인자 VII 활성화-돌연변이체 중 하나 이상을 제조 및 사용할 수 있다. 인자 VII/VIIa에 대한 TF 분자 상의 인식 부위와 관련한 상당한 양의 과학적 지식들이 알려져 있다. 따라서, TF 분자의 아미노산 약 157 내지 약 167 사이에 인자 VII 활성화 영역이 일반적으로 위치한다고 이해되고 있다. 하지만, 이 부위 밖의 잔기들도 인자 VII 활성화와 관련성이 있는 것으로 밝혀질 수 있으므로, TF 서열의 아미노산 약 106 내지 약 209 사이에 일반적으로 위치한 하나 이상의 잔기에 돌연변이를 도입하는 것을 고려할 수도 있다 {참조: WO94/07515 및 WO94/28017}.
본 발명과 관련하여, 하기에 예시된 기타의 다양한 응고 인자들이 사용될 수 있다. 트롬빈, 인자 V/Va 및 이의 유도체, 인자 VIII/VIIIa 및 이의 유도체, 인자 IX/IXa 및 이의 유도체, 인자 X/Xa 및 이의 유도체, 인자 XI/XIa 및 이의 유도체, 인자 XII/XIIa 및 이의 유도체, 인자 XIII/XIIIa 및 이의 유도체, 인자 X 활성화 인자 및 인자 V 활성화 인자가 본 발명에 사용될 수 있다.
Russell의 살모사 독액 (viper venom)에 존재하는 인자 X 활성화인자를 본 발명에서 사용할 수 있다. Russell의 살모사 독액 (viper venom)에 존재하는 인자 X 활성화인자에 특이성을 가지는 모노클론 항체을 제조하여 이중 특이성의 결합 리간드의 일부분으로서 상기 제제를 특이적으로 전달하는 데에 사용될 수 있다.
트롬복산 A2는, 혈소판 마이크로좀 (microsome)내에서 사이클로옥시게나제 및 트롬복산 합성효소를 순차적으로 반응시켜 엔도퍼옥시드 (endoperoxide)에서 형성된다. 트롬복산 A2는 혈소판에 의해 용이하게 생성되며, 혈소판을 축적할 수 있는 능력을 가지는 강력한 혈관 수축제이다. 트롬복산 A2및 이의 활성 유사체를 본 발명에서 사용할 수 있다.
트롬복산 합성효소, 및 혈소판-활성화 프로스타글란딘을 합성하는 기타의 효소들도 본 발명에서 "응집제"로서 사용할 수 있다. 인간의 트롬복산 합성효소에대한 cDNA가 알려져 있는 바와 마찬가지로, 트롬복산 합성효소에 대한 모노클론 항체 및 트롬복산 합성효소의 면역친화성 정제에 대해서도 알려져 있다.
α2-항플라스민 또는 α2-플라스민 억제 인자는, 플라스미노겐 활성인자에 의해 유도되는 피브린 혈병 (clot) 분해를 효과적으로 억제하는 인간 혈장내에 천연적으로 존재하는 프로티네이즈 억제인자이다. α2-항플라스민은 특히 강력한 억제인자이며, 본 발명에서 사용할 수 있다.
α2-항플라스민의 cDNA 서열이 알려져 있기 때문에, 재조합 발현 및/또는 융합 단백질이 바람직하다. α2-항플라스민에 대한 모노클론 항체가 알려져 있기 때문에, 본 발명의 이중 특이성 결합 리간드 양태에서 사용될 수 있다. 이러한 항체는, 표적 부위에 외인성 α2-항플라스민을 전달하거나 외인성 α2-항플라스민을 축적하는 데에 사용할 수 있고, 표적 영역 내에 α2-항플라스민을 집중시키는 데에 사용될 수 있다.
C3. 항-튜불린 약제
소정의 약물들은 튜불린의 활성을 방해함으로써 효과를 나타낸다. 유사분열 및 세포 생존에 있어서 튜불린의 기능이 필수적이기 때문에, 소정의 "항-튜불린 약물"은 강력한 화학치료제이다. 본 발명에서 사용하기에 잘 알려져 있고 현재 바람직한 항-튜불린 약제로는, 콜키친, 탁산 (예를 들면, 탁솔), 빈카 알카로이드 (예를 들면, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 빈데신) 및 콤브레타스타틴이 있다. 기타의 적합한 항-튜불린 약제로는, 사이토칼라신 (B, J, E를 포함), 돌라스타틴, 아우리스타틴 PE, 패클리탁셀, 우스틸록신 D, 리조신, 1069C85, 콜세미드, 알벤다졸, 아자톡신 및 노코다졸이 있다.
미합중국 특허 제5,892,069호, 제5,504,074호 및 제5,661,143호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있는 바와 같이, 콤브레타스타틴은 일반적으로 세포의 유사분열을 억제하는 에스트라디올 유도체이다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 콤브레타스타틴의 예로는, 콤브레타스타틴 A, B 및/또는 D에 기초한 것과 미합중국 특허 제5,892,069호, 제5,504,074호 및 제5,661,143호에 기재된 것이 있다. 이의 예로는, 콤브레타스타틴 A-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, B-1, B-2, B-3 및 B-4가 있다.
미합중국 특허 제5,569,786호 및 제5,409,953호에서는, 콤브레타스타틴 A-1, A-2, A-3, B-1, B-2, B-3 및 B-4의 분리, 구조 특성화 및 합성; 제형; 및 상기 콤브레타스타틴을 이용하여 암 성장을 치료하는 방법을 기재하고 있다. 상기한 콤브레타스타틴 중 하나 이상을 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다.
미합중국 특허 제5,892,069호, 제5,504,074호, 제5,661,143호 및 제4,996,237호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있는 콤브레타스타틴 A-4를 사용할 수 있다. 또한, 미합중국 특허 제5,561,122호에서는 적합한 콤브레타스타틴 A-4 전구약물을 기재하고 있는 데, 이는 본 발명과 함께 사용할 수 있을 것이다.
미합중국 특허 제4,940,726호 (본원에 참조문헌으로 포함)에서는, 거대환 락톤-명명된 (macrocyclic lactones denominated) 콤브레타스타틴 D-1 및 D-2가 기재되어 있는 데, 이는 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용할 수 있을 것이다. 미합중국 특허 제5,430,062호는, 항암 활성을 가진 스틸벤 유도체 및 콤브레타스타틴 유사체에 관한 것인 데, 이는 본 발명과 함께 사용할 수 있을 것이다.
C4. 항-안지오제네시스 제제
특히, 본 발명에서는 배합된 항-안지오제네시스 제제를 제공한다. VEGF 패밀리 구성원과 동일하게, 안지오포이에틴은 혈관 내피에 특이적인 성장 인자이다{참조: Davis 및 Yancopoulos; Holash 등, 1999 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)}. 최초로 기재된 안지오포이에틴은, 천연 수용체 활성인자 (즉, 애고니스트)인 안지오포이에틴-1 (Ang-1) 및 천연 수용체 길항인자인 안지오포이에틴-2 (Ang-2)로서, 이 2가지는 내피세포의 티로신 카이네이즈 수용체인 Tie2를 통해 활성을 나타낸다.
2가지의 새로운 안지오포이에틴인 안지오포이에틴3 (마우스) 및 안지오포이에틴-4 (인간)이 밝혀졌다 {참조: Valenzuela 등, 1999}. 안지오포이에틴-3은 길항인자 (Ang-2와 유사)로서 작용하는 것 같고, 안지오포이에틴-4는 활성인자 (Ang-1과 유사)로서 작용하는 것 같다 {참조: Valenzuela 등, 1999}. 또한, 안지오포이에틴-3은 인간의 심장에서 클로닝되었으며, 내피세포에 대해서는 유사분열 유도 효과는 나타내지 않는 것으로 보고되었다{참조: Kim 등, 1999}.
VEGF가 혈관 발생의 초기 단계에 필수적인 데에 반해, 안지오포이에틴-1은 일반적으로 혈관생성의 후기 단계에 필요하다. 따라서, VEGF는 내피세포 발생, 증식 및 원시적인 혈관 생성을 촉진한다. 안지오포이에틴-1은 Tie2 수용체를 통해 성숙한 혈관의 유지 및 안정화를 촉진한다. 따라서, 안지오포이에틴-1은 성숙화 인자 또는 안정화 인자로서, 내피세포 및 주위의 지지 세포 사이의 상호작용을 촉진하여 미성숙 혈관을 성숙 혈관으로 전환하는 것으로 생각된다 {참조: Holash 등, 1999}.
안지오포이에틴-1은 허혈성 조직에서의 혈관 재생성을 강화하고 {참조: Shyu 등, 1998}, VEGF 또는 FGF 형태에 노출된 혈관 네트워크의 생존을 증가시키는 것으로 관찰되었다 {참조: Papapetropoulos 등, 1999}. 또한, 상기 저자들은, 안지오포이에틴-1이 동일한 형태의 FGF의 제거에 의해 유발되는 HUVEC에서 세포사멸을 방지한다는 것을 보였다 {참조: Papapetropoulos 등, 1999}. 이러한 데이터는, 안지오포이에틴-1이 인간 내피세포에 대한 직접적인 역할, 및 기타의 안지오제네시스 분자와 상호작용하여 분화된 내피세포의 생존을 촉진시킴으로써 혈관 구조체를 안정화시키는 것과 일치된다.
안지오포이에틴-1은 성숙 신호 및 안정화 신호를 전달하기 때문에, 본 발명의 이러한 양태가 표적화된 안지오포이에틴-1 전달과 관련성에 대해 주위깊게 고려하였다. 안지오포이에틴-1은 성숙화 인자이므로 종양 혈관을 성장 인자와 독립적이 되도록 할 것이라고 본 발명자들은 추정하였다. 따라서, 본 발명의 한 양태는, 표적 혈관의 VEGF-비반응성을 강화하기 위해 종양-표적화된 안지오포이에틴-1을 사용하는 것에 관한 것이다.
안지오포이에틴-1을 종양 혈관에 전달하기 위해 종양-결합 리간드를 사용하게 되면, 혈관강(vessel lumen)에 500,000개의 안지오포이에틴-1 분자를 용이하게 전달하게 되는 것으로 추정된다. 이는, Tie2 수용체 시스템을 압도하는 것으로서, 안지오포이에틴-1 리간드로서 Tie2 수용체를 완전히 포화시킨다. 따라서, 안지오포이에틴-2는 결합할 수 없어서, 안지오포이에틴-2 및 VEGF의 복합 효과 (하기에 기재되어 있음)는 억제된다.
종양 (바람직하게는, 종양 혈관체)로의 안지오포이에틴-1의 전달은, 복합 치료 효과를 거두기 위해 기타의 다양한 항암 전략(아래에서 상세히 기술함)과 함께 사용할 수 있다. 적어도 어느 정도의 괴사를 유도하는 치료에 대한 종양의 통상적인 반응은 혈관의 퇴행이 시작되게 하는 것이다. 안지오포이에틴-1 신호가 혈관이 성숙되는 것을 유도하기 때문에, 리모델링하거나 주요 치료제에 의해 유도되는 종양체의 손실을 보상할 수 없다. 따라서, 이를 통해 본 발명의 안지오포이에틴 전달과 관련한 바람직한 양태, 즉 기존의 화학치료 약물을 포함한 하나 이상의 항암제와 배합한 안지오포이에틴-1 표적화의 복합 사용이 제공된다.
안지오포이에틴-1이 전달된 후 수행하는 활성은 근본적으로는 혈관 리모델링을 방지하는 것이다. 이를 단독으로 사용하거나 복합 치료 형태에서, 안지오포이에틴-1 표적화의 가치는 이 치료 방법이 가지고 있는 안전성에 의해 더 커진다. 안지오포이에틴-1 치료법에 대한 큰 하락세는 없다. 발생하지는 않을 것 같지만 만약에라도 소정의 양의 표적화된 Ang-1이 비-종양 조직에 잘못 유도되는 경우라 하더라도, 표적된 부위의 혈관체는 보다 안정화되고/되거나 정지될 것이다. 이와 관련하여, Ang-1을 소염제로서 사용할 수도 있다.
최근에, 안지오포이에틴-2가 종양-표적 치료법 (특히, 본 발명의 VEGF 억제와 함께)에 사용하기에 바람직한 제제이다. 하지만, 상이한 조건하에서 안지오포이에틴-2의 효과가 상이하기 때문에(특히, VEGF 수준이 달라짐), 본 발명자들은 표적화된 안지오포이에틴-2 전달과 관련한 본 발명의 양태에 대해 주위깊게 고려하였다.
또한, 안지오포이에틴-2 또한 Tie2 수용체에 대한 리간드이지만, 일반적으로 안지오포이에틴-1에 의해 매개되는 혈관 성숙/안정화를 상쇄시킨다. 따라서, 안지오포이에틴-2는 안지오포이에틴-1의 길항제이며, 모세혈관 구조를 방해하는 작용을 한다. 적합한 조건하에서, 안지오포이에틴 2는 표적 세포에 네가티브 신호를 전달하며, 안지오포이에틴-2에 의해 유도되는 불안정화는 혈관 퇴행을 유도한다. 이는, 종양 (바람직하게는, 종양 혈관체)에 안지오포이에틴-2를 표적 전달함에 있어서 요구되는 안지오포이에틴-2의 제1 특성이다.
VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3)를 사용하여 용이하게 수행할 수 있는 충분한 양의 안지오포이에틴-2의 단순한 전달은, 종양 환경에 존재할 수 있는 기타의 다른 신호를 압도할 것이며, 혈관 퇴행을 촉진할 것이다. 자연적인 환경에서 안지오포이에틴 사이 조심스럽게 조절되는 상호 작용이 있기 때문에, 끊임없는 안지오포이에틴-2 신호전달에 의해 퇴행을 압도적으로 유도하는 상기 시스템은 안지오포이에틴-1 및 VEGF의 효과를 제거하는 것은 당연하다.
따라서, 종양-표적된 안지오포이에틴-2 만을 사용함으로써, 특히 치료의 초기 메카니즘으로서 종양 혈관 퇴행을 유도하는 잇점을 얻을 수 있다. 하지만, 일반적으로, 안지오포이에틴-2에 의해 유도되는 불안정화는 혈관 퇴행 또는 재생을 유도할 수 있다. 다른 안지오제네시스 자극(특히, VEGF)이 없는 경우의 불안정화는 혈관 퇴행을 유도하지만, 높은 수준의 VEGF의 존재하에서의 불안정화는 안지오제네시스 반응을 촉진한다 {참조: Holash 등, 1999}.
안지오포이에틴-2에 반응하여 불안정화 과정을 겪는 혈관은 다른 자극에 노출됨으로써 퇴행되는 것으로부터 "구제(rescue)"될 수 있다. 따라서, 안지오포이에틴-2는 내피 세포를 기타의 다른 안지오제네시스 자극에 대해 반응하도록 하고, 소정의 조건하에서 안지오제네시스 반응을 촉진한다. 특히, VEGF는 Ang-2-불안정화된 세포가 증식하여 신생 원시 혈관을 형성하도록 유도할 수 있다 {참조: Asahara 등, 1998; Holash 등, 1999}. 사실상, 종양 조직내에서의 안지오포이에틴-2의 발현이 보고되었는 데 {참조: Tanaka 등, 1999}, 이 경우 VEGF와 함께 작용하여 안지오제네시스를 촉진하는 것으로 생각되었다 {참조: Stratmann 등, 1998}. 안지오포이에틴-2 및 VEGF에 의해 시발된 신생혈관 생성으로 인해, 상기 분자들은 "공-안지오제네시스성(co-angiogenic)"으로 만든다.
안지오포이에틴-2가 소정의 유형의 종양내의 혈관에 대해 미치는 포지티브 효과 및 네가티브 효과를 설명하기 위한 통합 모델이 현재 보고되어 있다 {참조: Holash 등, 1999}. 이 모델에 있어서, 안지오포이에틴-2에 의해 유도된 불안정화는 주위의 숙주 혈관체로부터 혈관을 흡수(coopting)함으로써 유래하는 종양의 혈관 퇴행이 크게 유발된다. 종양-관련 내피세포에 의해 생산되는 고수준의 안지오포이에틴-2는, 안지오포이에틴-1이 낮은 수준으로 계속 (constitutive) 발현됨으로서 제공되는 생존 신호를 상쇄한다 {참조: Holash 등, 1999}. 하지만, 이로 인한 종양의 괴사에도 불구하고, 생존하는 종양 세포는 VEGF를 상향조절 (upregulation)하여 확실히 생존할 수 있도록 한다. VEGF 및 안지오포이에틴-2가 함께 발현함에따라, VEGF가 안지오포이에틴-2에서 나오는 퇴행 신호를 상쇄시키고 혈관 발생을 촉진시키기 때문에, 종양 말단에서 안지오제네시스가 강화된다 {참조: Holash 등, 1999}.
처음에는 모순되는 것처럼 보이지만, 안지오포이에틴-2의 작용은 존재하는 기타의 신호 (특히, VEGF)에 기초하여 설명될 수 있고 대개 예측가능하다. 다른 안지오제네시스 신호가 없는 경우, 안지오포이에틴-2는 혈관의 불안정화를 유도하고 미성숙되게 하여 퇴행시킨다. 자극 (특히, VEGF)이 존재하는 경우, 상기 혈관이 "프라임되어(primed)" 제2의 안지오제네시스 자극을 받음으로써, 안지오포이에틴-2에 의해 유발된 불안정화가 실질적으로는 안지오제네시스를 유도하게 된다. 적어도 일부분은, 미소혈관 내피세포에서 안지오포이에틴-2 활성의 자가분비 루프(autocrine loop)의 조절을 통해, 수많은 조절인자의 안지오제네시스 효과를 얻을 수 있는 것으로 생각된다 {참조: Mandriota 및 Pepper, 1998}.
안지오포이에틴-2의 이중적인 생물학적 기능으로 인해, 본 발명자들은 종양 환경에서 기타의 신호 (특히, VEGF)에 상응하는 추가의 치료 전략을 개발하게 되었다. 안지오포이에틴-2 및 VEGF가 함께 작용하여 안지오제네시스를 자극하기 때문에, 본 발명의 바람직한 한 양태는 본 발명의 VEGF 억제 항체와 함께 안지오포이에틴-2를 종양-표적 전달하는 데에 사용하는 것이다. 이로 인해, 안지오포이에틴-2는 퇴행에 작용하고 안지오제네시스에는 작용하지 않을 것이다.
앞에서 설명한 내용에 비추어, 본 발명에서는, 하나 이상의 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 안지오포이에틴-3 및/또는 안지오포이에틴-4에 작동가능하게부착되거나 기능적으로 연결된 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3)를 제공함을 이해할 수 있을 것이다. 안지오포이에틴-1 조성물의 예는 서열번호 제1 (DNA) 및 제2 (단백질)이고, 안지오포이에틴-2 조성물의 예는 서열번호 제3 (DNA) 및 제4 (단백질)이다. 길항제인 안지오포이에틴-3은 일반적으로 안지오포이에틴-2로서 사용되고, 길항제인 안지오포이에틴-4는 안지오포이에틴-1의 방식으로 사용될 수 있다. 안지오포이에틴-3 및 안지오포이에틴-4에 대한 본원의 설명을 보충하기 위해 Valenzuela 등 (1999)의 문헌을 본원에 참조문헌으로 포함하였다.
또한, 안지오포이에틴의 융합 단백질도 본 발명에서 사용할 수 있다. 하나의 예로는, 안정한 Ang-1-Ang-2 융합 단백질 (서열번호 제5)이 있다. 이러한 융합 단백질은 아미노산 77에서 시작하는 안지오포이에틴-1 서열에 융합된, 안지오포이에틴-2의 DAPLEY 서열까지 처음 73개의 잔기를 함유한다. 또한, 상기 융합 단백질은, 안지오포이에틴-1 서열에서 265번째 위치에서 돌연변이 (Cys 가 Ser로 변경)를 가지고 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 기타의 항-안지오제네시스 제제에는, 안지오스타틴 및 엔도스타틴이 포함된다. 안지오스타틴은 미합중국 특허 제5,776,704호, 제5,639,725호 및 제5,733,876호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다. 안지오스타틴은 분자량이 약 38kD에서 약 45kD 사이 (폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정) 이며, 대략 플라스미노겐 분자의 Kringle 1 내지 4 부위를 함유하고 있다. 일반적으로, 안지오스타틴은, 본래의 쥐의 플라스미노겐 분자의 아미노산 번호 제98에서 시작하는 쥐의 플라스미노겐 단편의 아미노산과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가지고 있다.
안지오스타틴의 아미노산 서열은 종에 따라 약간씩 상이하다. 예를 들면, 인간의 활성 안지오스타틴의 서열은 인간의 본래의(intact) 아미노산 서열의 아미노산 번호 제97 또는 제99에서 시작할 수 있지만, 인간의 안지오스타틴의 아미노산 서열은 상기한 쥐의 플라스미노겐 단편의 아미노산 서열과 실질적으로 유사하다. 또한, 쥐의 종양 모델에서 관찰된 바와 같이, 인간의 플라스미노겐은 항-안지오제네시스 활성을 가지기 때문에 사용될 수 있다.
안지오스타틴 및 엔도스타틴은 쥐에 있어서 종양 성장을 억제할 뿐만 아니라 종양 퇴행을 유도하기 때문에 집중 연구 대상이 되어 왔다. 엘라스테이즈, 마크로파지 메탈로엘라스테이즈 (MME), 매트리라이신 (MMP-7) 및 92kDa 젤라티네이즈 B/제IV형 콜라게네이즈 (MMP-9)를 포함한, 플라스미노겐에서 안지오스타틴을 생산하는 것으로 관찰된 많은 단백질 분해효소들이 있다.
MME는 종양에서 플라스미노겐으로부터 안지오스타틴을 생산할 수 있으며, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GMCSF)는 안지오스타틴의 생성을 유도하는 마크로파지에 의해 MME의 발현을 상향조절한다. 안지오스타틴의 생성에 있어서 MME가 수행하는 역할에 대해서는, 환자에게서 수집한 간세포 암종 임상 샘플에서 실제로 MME가 발현되는 것을 밝힌 사실에 의해 지지된다. 안지오스타틴을 생산할 수 있다고 생각되는 기타의 다른 단백질 분해효소는 스트로멜리신-1 (MMP-3)이다. MMP-3는 플라스미노겐으로부터 안지오스타틴-유사 단편을 실험실내에서 생산하는 것으로 관찰되었다. 안지오스타틴에 대한 활성 메카니즘에 대해서는 아직 분명하지는 않지만, 안지오스타틴이 내피세포상의 미확인 세포 표면 수용체에 결합하여 내피세포가 프로그램된 세포사멸 또는 유사분열 억제가 되도록 유도하는 것으로 가정하고 있다.
엔도스타틴은 항-안지오제네시스 및 항-종양 제제로서 보다 더 강력한 것으로 보이며, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3)에 결합하는 것과 관련하여 특히 바람직하다. 엔도스타틴은 마우스에 있어서 수많은 종양 모델에서 종양 퇴행을 유발하는 데에 효과적이다. 종양은 엔도스타틴에 대한 내성을 가지지 않으며, 수차례에 걸친 치료후에 종양은 잠복기에 들어가서 종양 체적이 증가하지 않는다. 이러한 잠복기 상태에서는, 세포사멸을 겪는 종양 세포의 비율이 증가하여 종양 크기가 기본적으로 동일한 종양군이 되었다.
미합중국 특허 제5,854,205호 (특허권자: Folkman 및 O'Reilly - 본원에 참조문헌으로 포함)는, 엔도스타틴 및 내피세포 증식과 안지오제네시스의 억제제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 엔도스타틴 단백질은 제XVIII형 콜라겐의 C 말단 단편에 상응하며, 다양한 공급원으로부터 분리될 수 있다. 또한, 미합중국 특허 제5,854,205호에서는, 엔도스타틴이 제XVIII형 콜라겐, 제XV형 콜라젠 또는 BOVMPE 1 예비-위액 에스테라제 (pregastric esterase)의 단편의 아미노산 서열을 가질 수 있음을 교시하고 있다. 미합중국 특허 제5,854,205호에서는, 엔도스타틴 및 기타의 다른 항-안지오제네시스 단백질 (특히, 안지오스타틴)을 배합한 조성물이 안지오제네시스-의존 종양체를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 개시하고 있다.
엔도스타틴 및 안지오스타틴은 본 발명에 따른 종양 전달용 제제로서 바람직하다. 또한, 바스큘로스타틴, 칸스타틴 및 마스핀도 바람직한 제제이다. 엔도스타틴이 특히 바람직한 제제이다. 엔도스타틴-2C3 융합 단백질은 본원에서 기술한 바와 같이 제조될 수 있다. 또한, 다양한 형태의 화학적으로 결합된 엔도스타틴-2C3 작제물이 본원에 기재되어 있다.
C5. 세포사멸 유도제(Apoptosis-Inducing Agents)
또한, 본 발명은, 종양 세포 및 종양 혈관 내피세포를 포함한 종양내의 모든 세포에서 세포사멸을 유도하는 제제를 전달하는 데에 사용될 수 있다. 많은 항암제들이 활성 메카니즘의 일부로서 세포사멸 유도 효과를 가지고는 있지만, 아래에서 기재하고 있는 바와 같이 주요 메카니즘으로서 이러한 활성을 가지는 소정의 제제를 발견, 설계 또는 선별하였다.
많은 형태의 암에서는 종양 억제 유전자 (예를 들면, p53)에 돌연변이가 있는 것으로 보고되어 왔다. p53의 불활성화로 인해, 세포사멸을 촉진할 수 없게 된다. 이로 인해, 암 세포가 사멸되는 대신에 종양 생성이 진행된다. 따라서, 세포 사멸을 촉진하기 위해 종양 억제인자 (tumor suppressor)를 본 발명에서 사용할 수 있을 것이다. 이러한 종양 억제인자의 예로는, p53, 망막아세포종 유전자 (Rb), Wilm 종양 (WT1), 백스 알파, 인터류킨-1b-전환 효소 및 패밀리, MEN-1 유전자, 제1형 신경섬유종증 (NF1), cdk 억제인자 p16, 결회장암 유전자 (DCC), 가족성 선암 폴립종 유전자 (FAP), 다중 종양 억제 유전자 (MTS-1), BRCA1 및 BRCA2가 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
사용하기에 바람직한 것은, p53 (미합중국 특허 제5,747,469호, 제5,677,178호 및 제5,756,455호 - 본원에 참조문헌으로 포함), 망막아세포종 유전자, BRCA1 (미합중국 특허 제5,750,400호, 제5,654,155호, 제5,710,001호, 제5,756,294호, 제5,709,999호, 제5,693,473호, 제5,753,441호, 제5,622,829호 및 제5,747,282호 - 본원에 참조문헌으로 포함), MEN-1 유전자 (GenBank 접근 번호 제U93236호) 및 아데노바이러스 E1A 유전자 (미합중국 특허 제5,776,743호 - 본원에 참조문헌으로 포함)이다.
VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3)에 의해 전달될 수 있는 기타의 조성물은, Fas-관련 인자 FAF-1 (미합중국 특허 제5,750,653호 - 본원에 참조문헌으로 포함); 미합중국 특허 제5,605,826호(본원에 참조문헌으로 포함)의 24KD 세포사멸-관련 단백질 분해효소; TRAIL 및 TRAIL 폴리펩티드 (미합중국 특허 제5,763,223호 - 본원에 참조문헌으로 포함)로 명명된 종양 괴사 인자-관련 세포사멸 유도제를 코드하는 유전자를 포함한다. 또한, 본 발명의 한 양태에서는, 세포사멸을 유도하는 것으로 보고되어 있는 인터류킨-1β-전환 효소 및 패밀리 구성원을 이용한다.
카르보스티릴 유도체 (미합중국 특허 제5,672,603호 및 제5,464,833호 - 본원에 참조문헌으로 포함), 측쇄 아포젠 펩티드 (미합중국 특허 제5,591,717호 - 본원에 참조문헌으로 포함), 포스포티로신 유도제 및 비-가수분해성 포스포티로신 유사체 (미합중국 특허 제5,565,491호 및 제5,693,627호 - 본원에 참조문헌으로 포함), RXR 레티노이드 수용체의 효능제 (미합중국 특허 제5,399,586호 - 본원에 참조문헌으로 포함) 및 항산화제 (미합중국 특허 제5,571,523호 - 본원에 참조문헌으로 포함)와 같은 화합물들이 사용될 수도 있다. 또한, 제니스테인과 같은 티로신 카이네이즈 억제제를, 세포 표면 수용체인 VEGFR1을 표적화하는 본 발명의 제제에 결합시킬 수도 있다 (미합중국 특허 제5,587,459호 - 본원에 참조문헌으로 포함).
C6. 생물학적 기능성 균등물
일반적으로 상기한 재료를 출발점으로 시작하여, 2C3 항체 또는 기타의 모든 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체의 균등물 또는 개량물을 제조할 수 있다. 상기한 항체의 구조에 대한 변형 및 변화를 줌으로써, 이와 유사하거나 바람직한 특성을 가지는 분자를 수득할 수 있다. 예를 들면, 상호 결합력이 크게 손실되지 않으면서 단백질 구조에 있어서 소정의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체할 수 있다. 또한, 이러한 생각은 독소, 항-안지오제네시스 제제, 세포사멸 유도제, 응고제 등에도 적용된다.
단백질의 생물학적 기능 활성을 정의하는 것은 단백질의 상호작용 능력 및 성질이기 때문에, 단백질 서열 (또는 이를 코드하는 DNA 서열)에 있어서 소정의 아미노산 서열이 치환되어도 유사한 특성 (효능제로서의 특성)을 가진 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 생물학적 유용성 또는 활성은 크게 손실되지 않으면서 상기한 항체 또는 치료제의 서열 (또는 이를 코드하는 DNA 서열)이 다양하게 변화될 수 있다. DNA 서열을 돌연변이시켜 제조되는 생물학적 기능성 균등물은, 상기한 표 A에 기재된 코돈 정보 및 부위-특이적 돌연변이 생성에 대한 보충적인 기술적인 상세한 내용을 사용하여 제조할 수 있다.
또한, "생물학적 기능성 균등 (biologically functional equivalent)" 단백질 또는 펩티드의 정의에 있어서, 이러한 개념은 상기 분자의 소정의 부위에서 이루어질 수 있는 변화의 수에 제한이 있어서, 수용할 수 있을 정도의 균등한 생물학적 활성을 가지는 분자라는 개념이라는 것이 당업자에게 명백하게 이해될 것이다. 따라서, 본원에서의 "생물학적 기능성 균등 단백질 및 펩티드"는, 소정의 아미노산 (대부분 또는 모든 아미노산은 아님)이 치환될 수 있는 단백질 및 펩티드를 의미한다. 물론, 상이하게 치환된 다수의 상이한 단백질/펩티드는 본 발명에 따라 용이하게 제조 및 사용될 수 있다.
일반적으로, 아미노산 치환은, 소수성, 친수성, 부하, 크기 등의 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성에 기초한다. 아미노산 측쇄 치환기의 크기, 형상 및 유형을 분석하면, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘은 모두 (+)-부하 잔기이고; 알라닌, 글리신 및 세린은 모두 크기가 비슷하고; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 모두 유사한 형상을 가지고 있다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 사항들을 고려하여, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글리신 및 세린; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 본원에서 생물학적 기능성 균등물로서 정의된다.
보다 양적으로 변경을 주는 경우, 아미노산의 수 인덱스 (hydropathic index)를 고려할 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성 및 부하 특성에 기초하여 각각의 수 인덱스를 가지고 있다 - 이소류신 (+4.5), 발린 (+4.2), 류신 (+3.8), 페닐알라닌 (+2.8), 시스테인/시스틴 (+2.5), 메티오닌 (+1.9), 알라닌 (+1.8), 글리신 (-0.4), 트레오닌 (-0.7), 세린 (-0.8), 트립토판 (-0.9), 티로신 (-1.3), 프롤린 (-1.6), 히스티딘 (-3.2), 글루타메이트 (-3.5), 글루타민 (-3.5), 아스파르테이트 (-3.5), 라이신 (-3.9) 및 아르기닌 (-4.5).
단백질에 상호 생물적 기능을 전달함에 있어서 아미노산의 수 인덱스의 중요성은 당업계에 잘 알려져 있다 {참조: Kyte 및 Doolittle, 1982 - 본원에 참조문헌으로 포함}. 소정의 아미노산이 유사한 수 인덱스 또는 수치를 가지는 다른 아미노산과 치환되어도 유사한 생물학적 기능을 여전히 유지할 수 있는 것으로 알려져 있다. 상기한 수 인덱스에 기초하여 변화를 준 경우, 수 인덱스 ±2 이내에서 아미노산 치환이 이루어진 경우가 바람직하며, ±1 이내인 경우가 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 경우가 더욱 바람직하다.
따라서, 유사한 친수성 수치를 가지는 다른 아미노산으로 치환을 하여 생물학적으로 균등한 단백질을 수득할 수 있는 것으로 이해된다. 미합중국 특허 제4,554,101호 (본원에 참조문헌으로 포함)에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 하기의 아미노산에 대한 친수성 수치는 다음과 같다: 아르기닌 (+3.0), 라이신 (+3.0), 아스파르테이트 (+3.0±1), 글루타메이트 (+3.0±1), 세린 (+0.3), 아스파라긴 (+0.2), 글루타민 (+0.2), 글리신 (0), 트레오닌 (-0.4), 프롤린 (-0.5±1), 알라닌 (-0.5), 히스티딘 (-0.5), 시스테인 (-1.0), 메티오닌 (-1.3), 발린 (-1.5), 류신 (-1.8), 이소류신 (-1.8), 티로신 (-2.3), 페닐알라닌 (-2.5) 및 트립토판 (-3.4).
친수성 수치에 기초하여 변화를 주는 경우, 친수성 수치 ±2 이내에서 아미노산 치환이 이루어진 경우가 바람직하며, ±1 이내인 경우가 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 경우가 더욱 바람직하다.
C7. 융합 단백질 및 재조합 발현
본 발명에 따른 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트는, 분자 생물학적 기법을 사용하여 융합 단백질로서 용이하게 제조될 수 있다. 모든 융합 단백질은 본원의 기재내용 및 당업계에 알려져 있는 치료제를 사용하여 설계 및 제조될 수 있다. 융합 단백질 기술을 용이하게 변형하여, 선택적으로 절단가능한 펩티드 서열로 2개의 부위를 결합한 융합 단백질을 제조할 수 있다. 현재 바람직한 융합 단백질은 엔도스타틴을 함유한 융합 단백질이다. 기타의 다른 치료제와 마찬가지로 엔도스타틴은, 상기한 항체의 말단부 또는 CDR이 아닌 모든 부위에 부착될 수 있다. 또한, 바람직하게는, 엔도스타틴과 같은 치료제는 통합적으로 (integrally) 제조될 수 있는 데, 이 경우 선택적으로 절단가능한 펩티드와 결합하여 상기 제제를 표적화한 후에 방출할 수 있도록 한다.
이를 위해 재조합 DNA 기술을 이용하는 것이 현재 당업자들의 표준 관행이다. 이러한 방법으로는, 예를 들면, 실험실내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재좋바/유전자 재조합 방법이 포함된다. 또한, 합성기를 사용하여 DNA 및 RNA를 합성할 수 있다 {참조: 예를 들면, Sambrook 등, 1989 (본원에 참조문헌으로 포함)에 기재된 방법}.
일반적으로, 이러한 융합 단백질의 제조에는, 목적하는 융합 단백질을 코드하는 단일 코딩 부위를 제조하기 위해, 프레임내에 제1 및 제2 DNA 코딩 부위 및 이 부위의 기능성 결찰 또는 결합 부위를 제조하는 것을 포함한다. 본 발명의 이러한 양태에 있어서, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-유사 항체의 DNA 서열을치료제를 코드하는 DNA 서열과 프레임내에 결합시킨다. 일반적으로, 상기 작제물의 어느 부위가 N 말단부 또는 C 말단부로서 제조되는 지는 특별히 관련이 없는 것으로 이해된다.
일단 목적하는 코딩 부위가 생성되면, 발현 벡터가 만들어진다. 발현 벡터는 삽입된 DNA의 상향에 하나 이상의 프로모터를 가지고 있어서, 삽입된 DNA의 전사를 촉진하여 코드된 재조합 단백질의 발현을 촉진한다. 이것이 "재조합 발현"의 의미이다.
소위 "재조합" 형태의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트를 수득하기 위해, 이를 재조합 세포내에서 발현시킨다. 원핵 또는 진핵 시스템에서 발현시키기 위해, 재조합 발현 분야에 있어서의 당업자들이 잘 알고 있는 기법을 이용하여 DNA 절편을 조작할 수 있다. VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트 작제물을 발현시키는 데에 있어서, 실질적으로 모든 발현 시스템이 사용될 수 있는 것으로 생각된다.
상기 단백질은 진핵 발현 시스템 (예를 들면, CHO 세포)에서 성공적으로 발현될 수 있으나, 세균 발현 시스템 (예를 들면, E.coli pQE-60)이 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트의 대규모 제조 및 정제에 특히 유용할 것으로 생각된다. 또한, cDNA는 세균 시스템에서 발현될 수 있는 데, 이때 코딩된 단백질은 β-갈락토시데이즈, 유비퀴틴, 쉬스토소마 자포니큠 (Schistosoma japonicum) 글루타티온 S-트랜스퍼라제 등과의 융합체로서 발현된다. 재료 사용의 용이성 및 수득량에 있어서, 세균 발현 시스템이 진핵 발현 시스템에 비해 유리한것으로 생각된다.
미생물 발현과 관련하여, 재조합 숙주 세포내에서의 유전자 발현과 관련한 본원의 기재 내용을 보충하기 우해 미합중국 특허 제5,583,013호, 제5,221,619호, 제4,785,420호, 제4,704,362호 및 제4,366,246호를 참조문헌으로 포함하였다.
재조합 방법으로 생산된 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트는, 인간에게 투여하기 위해 정제 및 제형화할 수 있다. 이와 달리, 상기 면역 컨쥬게이트를 코드하는 핵산을 유전자 치료법을 통해 전달할 수 있다. naked 재조합 DNA 또는 플라스미드를 사용할 수 있으나, 리포좀 또는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 수용체-매개 세포내합임 (endocytosis)을 통해 세포내로 들어가서 숙주 세포의 유전체에 통합되어 바이러스 유전자를 안정되게 및 효과적으로 발현할 수 있는 바이러스는, 외부 유전자를 포유동물의 세포내로 전달하는 데에 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되기에 바람직한 유전자 치료 벡터는 바이러스 벡터이다.
레트로바이러스는 유전자 전달 벡터로서 가능성이 있는 데, 이는 자신의 유전자를 숙주의 유전체에 통합시킬 수 있으며, 다량의 외부 유전 물질을 전달할 수 있고, 다양한 종 및 세포에 감염될 수 있고, 특정 세포라인에서 패키지될 수 있기 때문이다. 또한, 기타의 다른 바이러스들 {예를 들면, 미합중국 특허 제5,139,941호 (본원에 참조문헌으로 포함)에 기재된 바와 같이, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 및 아데노-관련 바이러스 (AAV)}도 유전자 전달을 위한 벡터로서 사용할 수 있도록 조작할 수 있다.
외부의 유전 물질을 수용할 수 있는 몇몇 바이러스들은 전달할 수 있는 뉴클레오티의 수 및 감염가능한 세포 유형에 제한이 있지만, 상기한 바이러스들은 성공적으로 유전자를 발현시키는 것으로 관찰되었다. 하지만, 아데노바이러스는 자신의 유전자 물질을 숙주 게놈에 혼입시키지 않기 때문에 자신의 유전자 발현을 위해서 숙주의 복제가 필요없어서, 신속하고 효율적인 이질성 유전자 발현을 위해서 가장 이상적이다. 복제-결함 감염성 바이러스 (replication-defective infective virus)를 제조하는 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 소정의 양태에서는, 상기한 유전자 치료 벡터가 HSV이다. HSV가 적합한 벡터로 생각되게 하는 요인은, HSV의 게놈 크기 및 조직이다. HSV는 크기가 크기 때문에, 다중 유전자 또는 발현 카세트의 혼입이 크기가 작은 기타의 다른 바이러스 시스템에 비해 문제가 작다. 또한, 다양한 성능 (예를 들면, 강도, 시간성)을 가진 상이한 바이러스 조절 서열을 사용할 수 있기 때문에, 다른 시스템에 비해 더 큰 정도로 발현을 조절할 수 있다. 또한, HSV는 절단된 메시지 (spliced message)가 상대적으로 거의 적기 때문에 유전자 조작이 용이하다는 잇점이 있다. 또한, HSV는 상대적으로 조작이 용이하고 높은 역가로 성장시킬 수 있다.
물론, 바이러스 전달 시스템을 이용하는 경우, 바람직하지 않은 오염 물질 (예를 들면, 결함성 방해 바이러스 입자 또는 엔도톡신) 및 기타의 피로젠(pyrogen)이 기본적으로 없을 정도로 충분하게 비리온 (virion)을 정제하여, 상기한 벡터 작제물을 수용하는 세포, 동물 또는 개체내에서 바람직하지 않은 반응을 유발하지 않도록 한다. 상기한 벡터를 정제하는 바람직한 방법에서는, 부양성 밀도 구배 (예를 들면, 세슘 클로라이드 구배 원심분리)를 사용한다.
C8. 항체 컨쥬게이트
VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체를, 항-세포 제제 또는 세포독성 제제에 컨쥬게이션시켜 "면역 독소(immunotoxin)"를 제조하거나, 응고를 직접적 또는 간접적으로 자극할 수 있는 성분과 작동가능하게 연결시켜 "응고 리간드(coaguligand)"를 형성할 수 있다. 응고 리간드의 경우, 상기 항체는 직접적 또는 간접적 응고 인자와 직접적으로 결합하거나, 직접적 또는 간접적 응고 인자에 결합하여 방출되는 제2 결합 부위에 결합할 수 있다. 일반적으로, "제2 결합 부위" 방식은, 제2 결합 부위로서 응고제-결합 항체를 사용하여 이중 특이성 항체 작제물을 생성한다. 이중 특이성 (bispecific) 항체의 제조 및 사용은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 추가로 기재되어 있다.
면역 독소, 응고 리간드 및 이중 특이성 항체의 제조시에 재조합 발현을 사용할 수 있다. 선택된 항체를 코드하는 핵산 서열을, 선택된 독소, 응고제 또는 제2 결합 부위를 코드하는 핵산 서열에 프레임-내(in-frame) 부착하여, 발현 유닛 또는 벡터를 제조한다. 재조합 발현 결과, 새로운 핵산이 번역되어 목적하는 단백질 생성물을 수득하게 된다. 단백질-결합 리간드가 아닌 항체를 코드하는 핵산을 사용하는 경우에도, 재조합 방식은 본원에 기재한 바와 기본적으로 동일하다.
컨쥬게이트 기법과 관련하여, 면역 독소의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 하지만, 면역 독소의 제조 및 이의 임상 투여를 위한 정제에 있어서 소정의 바람직한 기법을 사용하는 경우에는 소정의 잇점이 있다. 예를 들면, IgG-기초 면역 독소는 통상적으로 결합 능력이 보다 우수하고 Fab'-기초 면역 독소와 비교하여 혈액내 제거가 더 느린 반면, Fab'-기초 면역 독소는 IgG-기초 면역 독소에 비해 조직 투과 능력이 일반적으로 더 우수하다.
또한, 독소 잔기를 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체에 컨쥬게이션시키는 데에 성공적으로 사용될 수 있는 수많은 유형의 디설파이드 결합을 함유하는 링커 (linker)가 알려져 있지만, 약리학적 특성 및 능력이 상이하기 때문에 소정의 링커가 다른 링커에 비해 일반적으로 바람직하다. 예를 들면, 입체적으로 "방해된 (hindered)" 디설파이드 결합을 가지는 링커는, 생체내에서 안정성이 더 커서 작용 부위에 결합하기 이전에 독소 잔기가 방출되는 것을 방지할 수 있기 때문에 바람직하다.
식물-유래 독소, 곰팡이-유래 독소 및 세균-유래 독소 (예를 들면, 리신 A 사슬 또는 탈당화된 A 사슬)를 포함한, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 다양한 세포독성 제제가 알려져 있다. 소정의 경우, 독소 A 사슬을 항체에 교차 결합시키기 위해서는, 디설파이드 기능을 가지는 교차-링커가 필요하다. 그 이유는 불확실하지만, 상기 제제가 표적 세포에 독소를 "전달"하면 소정의 독소 잔기가 용이하게 방출될 수 있도록 하기 위해서인 것 같다.
상기한 교차 결합이 어떻게 수행되는 것과 교차 링커의 유형은, 수득되는 컨쥬게이트의 약동학을 상이하게 하는 경향이 있다. 궁극적으로, 방출가능한 독소가 고려되는 경우, 목적하는 활성 부위 (이곳에서 양호한 방출 특성을 보유하는 것이바람직하다)를 제외한 체내의 모든 부위에서 발견되는 상태에서 본래의 형태로 유지되는 컨쥬게이트를 제조하는 것이 바람직하다. 따라서, 사용되는 특정 교차 결합 제제 및 교차 결합되는 구조를 포함하여, 특정 교차 결합 체계가 어느 정도 중요하다.
융합 단백질의 일부로서 사용되는 특정 독소 화합물에 따라, 상기한 항체 및 독소 화합물을 작동가능하게 부착하여 디설파이드-결합된 루프 구조로 접을 수 있는 펩티드 스페이서(peptide spacer)를 제공하는 것이 필요하다. 상기 루프내에서의 단백질 가수분해를 통해 헤테로다이머 폴리펩티드가 생성되는 데, 이 때 항체 및 독소 화합물은 단일 디설파이드 결합에 의해서만 연결된다. 상기한 독소의 예로는 리신 A 사슬 독소이 있다.
소정의 다른 독소 화합물을 사용하는 경우, 절단 불가능한 펩티드 스페이서를 제공하여, 융합 단백질의 독소 화합물 및 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체를 작동가능하게 부착시킨다. 절단 불가능한 펩티드 스페이서와 관련하여 사용될 수 있는 독소는, 단백질 가수분해에 의해 세포 독성 디설파이드-결합된 형태로 변환될 수 있는 것이다. 이러한 독소 화합물의 예로는 슈도모나스 엑소톡신(Pseudomonasexotoxin) 화합물이 있다.
표적 항원이 면역 독소에 의한 효율적으로 일관되게 흡수 (intoxication)되는 경로에 의해 내부화되지 않는 경우와 같이, 화학치료제 (예를 들면, 항종양 약제, 기타의 사이토카인, 항대사제, 알킬화제, 호르몬 등)를 표적하고자 하는 경우가 있다. 다양한 치료제 및 약리 제제를 항체에 성공적으로 컨쥬게이션시켜 약리학적 효과를 거두는 것을 관찰하였다. 연구되어진 항종양제의 예로는, 독소루비신, 다우노마이신, 메토트렉세이트, 빈블라스틴 등이 있다. 또한, 네오카르지노스타틴, 마크로마이신, 트레니몬 및 알파-아마니틴과 같은 기타의 제제를 부착하는 것에 대해서도 이미 기재되어 있다.
응고 인자를 본 발명과 관련하여 사용하는 경우, 본 발명의 항체에 대한 공유 결합은 기능성 응고 부위와는 상이한 부위에서 이루어져야 한다. 따라서, 각 부위가 자신의 목적하는 기능을 크게 손상하지 않고 발휘할 수 있는 작동가능한 방식으로 결합된다. 따라서, 상기한 항체는 VEGF에 결합하고, 응고 인자는 혈액 응고를 촉진한다.
C9. 생화학적 교차-링커
상기한 일반적인 정보 이외에도, 소정의 바람직한 생화학적 교차-링커를 사용하여 하나 이상의 치료제에 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체를 컨쥬게이션시킬 수 있다. 교차결합 제제는, 2가지의 상이한 분자의 기능성 그룹을 서로 결합하는 분자 가교를 형성하기 위해 사용된다. 단계별로 2가지의 상이한 단백질을 결합하기 위해, 원하지 않는 호모폴리머 형성을 제거하는 헤테로-이중 기능성 교차-링커를 사용할 수 있다. 헤테로-이중 기능성 교차-링커의 예는 하기 표 B1에 기재되어 있다.
[표 B1]
링커(linker) 반응 대상 잇점 및 용도 교차 결합후 스페이서 암 길이 (spacer arm lengh)
SMPT 1차 아민설프하이드릴 큰 안정성 11.2A
SPDP 1차 아민설프하이드릴 - 티오닐화-절단가능한 교차결합 6.8A
LC-SPDP 1차 아민설프하이드릴 길이가 연장된 스페이서 암 15.6A
설포-LC-SPDP 1차 아민설프하이드릴 - 길이가 연장된 스페이서 암- 수용성 15.6A
SMCC 1차 아민설프하이드릴 - 안정된 말레이미드 반응성 그룹- 효소-항체 컨쥬게이션--햅텐-담체 단백질 컨쥬게이션 11.6A
설포-SMCC 1차 아민설프하이드릴 -안정된 말레이미드 반응성 그룹-수용성-효소-항체 단백질 컨쥬게이션 11.6A
MBS 1차 아민설프하이드릴 -효소-항체 컨쥬게이션-햅텐-담체 단백질 컨쥬게이션 9.9A
설포-MBS 1차 아민설프하이드릴 수용성 9.9A
SIAB 1차 아민설프하이드릴 효소-항체 컨쥬게이션 10.6A
설포-SIAB 1차 아민설프하이드릴 수용성 10.6A
SMPB 1차 아민설프하이드릴 -길이가 연장된 스페이서 암-효소-항체 컨쥬게이션 14.5A
설포-SMPB 1차 아민설프하이드릴 -길이가 연장된 스페이서 암-수용성 14.5A
EDC/설포-NHS 1차 아민카복실 그룹 햅텐-담체 컨쥬게이션 0
ABH 탄수화물비-선택적 당 그룹과의 반응 11.9A
헤테로-이중기능성 교차 링커는 2가지의 반응성 그룹을 함유하고 있다 - 1차 아민 그룹 (예를 들면, N-하이드록시 숙신이미드)과 일반적으로 반응하는 그룹; 및 티올 그룹 (예를 들면, 피리딜 디설파이드, 말레이미드, 할로겐 등)과 일반적으로반응하는 그룹. 1차 아민 그룹을 통해 교차 링커는 하나의 단백질 (예를 들면, 선택된 항체 또는 단편)의 라이신 잔기와 반응할 수 있으며, 티올 반응성 그룹을 통해 이미 제1 단백질에 결합된 교차 링커는 다른 단백질 (예를 들면, 응고인자)의 시스테인 잔기 (자유 설프하이드릴 그룹)와 반응할 수 있다.
따라서, 일반적으로 조성물은 교차 결합을 목적으로 하여 사용가능한 기능성 그룹을 가지거나 유도화되어 가진. 이는, 다양한 그룹이 이러한 방식으로 사용될 수 있다는 점에 있어서 제한을 주지는 않는다. 예를 들면, 결합 또는 교차 결합을 위해, 1차 또는 2차 아민 그룹, 히드라지드 또는 히드라진 그룹, 카복실 알코올, 포스페이트 또는 알킬화 그룹이 사용될 수 있다.
교차 링커의 2개의 반응성 그룹사이의 스페이서 암 (spacer arm)은 다양한 길이 및 화학적 조성물을 가질 수 있다. 스페이서 암의 길이가 길면 상기한 컨쥬게이트 성분의 유연성이 보다 우수한 반면, 가교에 있는 소정의 특정 성분 (예를 들면, 벤젠 그룹)은 상기 반응성 그룹에 초과되는 안정성을 부여하거나 다양한 활성 양태에 대한 화학적 결합의 저항성 (예를 들면, 환원제에 대해 내성을 가지는 디설파이드 결합)을 크게 할 수 있다. 펩티드 스페이서 (예를 들면, L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala)를 사용할 수도 있다.
혈액내에서 상당한 정도의 안정성을 가지는 교차 링커를 사용하는 것이 바람직하다. 표적 제제 및 독소 또는 응고 제제를 컨쥬게이션시키는 데에 성공적으로 사용될 수 있는 다양한 유형의 디설파이드 결합-함유 링커가 알려져 있다. 입체적으로 방해를 받고 있는 디설파이드 결합을 가지고 있는 링커는, 생체내에서 보다큰 안정성을 가지게 되어 활성 부위에 결합하기 전에 상기 제제가 방출되는 것을 방지할 것이다. 따라서, 이러한 링커는 바람직한 결합 제제이다.
면역 독소에 사용하기에 가장 바람직한 교차 결합 제제 중 하나는, 인접한 벤젠 고리 및 메틸 그룹에 의해 입체적으로 방해를 받고 있는 디설파이드 결합을 함유하고 있는 이중 기능성 교차 링커인 SMPT이다. 디설파이드 결합이 입체적으로 방해 (steric hindrance)를 받게 되면, 티올레이트 그룹 (예를 들면, 조직 및 혈액내에 존재할 수 있는 글루타티온)에 의해 디설파이드 결합이 공격받는 것을 방지하여 부착된 상기 제제를 종양 부위에 전달하기 이전에 상기 컨쥬게이트가 디커플링 (decoupling)되는 것을 방지하는 데에 도움이 된다. 또한, SMPT 제제는 본 발명의 이중 특이성 리간드와 함께 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
이미 알려져 있는 기타의 많은 교차 결합 제제와 마찬가지로, SMPT 교차결합 제제는, 1차 아민 또는 시스테인의 SH와 같은 기능성 그룹 (예를 들면, 라이신의 엡실론 아미노 그룹)에 교차결합력을 부여한다. 다른 유형의 교차 링커로는, 절단가능한 디설파이드 결합을 함유하는 헤테로-이중기능성 광반응 페닐아지드 (예를 들면, 설포숙신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트)가 포함된다. N-하이드록시숙신이미딜 그룹은 1차 아민 그룹과 반응하고, 페닐아지드 (광분해 후)는 모든 아미노산 잔기와 비선택적으로 반응한다.
방해를 받는 교차 링커 이외에도, 방해를 받지않는 링커를 사용할 수도 있다. 보호받는 디설파이드를 함유하거나 생성하지 않는 것으로 생각되는 기타의 유용한 교차 링커로는, SATA, SPDP 및 2-이미노티올란이 있다. 이러한 교차 링커의사용은 당업계에 잘 알려져 있다.
컨쥬게이션된 후, 컨쥬게이션되지 않은 표적 및 치료 제제와 기타의 오염물질로부터 컨쥬게이트를 분리한다. 임상적으로 유용하게 사용할 수 있도록 충분한 정도의 순도를 가지는 컨쥬게이트를 제공하기 위해서, 수많은 정제 기법들을 사용할 수 있다. 크기에 따른 분리에 기초한 정제법 (예를 들면, 겔 여과, 겔 투과 또는 고성능 액체 크로마토그래피)이 일반적으로 가장 많이 사용된다. 블루-세파로즈 분리법과 같은 기타의 크로마토그래피 기법도 사용할 수 있다.
C10. 생물학적으로 방출가능한 링커
혈액내에서 상당한 정도의 안정성을 가지는 링커 잔기는 모두가 바람직하지만, 질환 또는 종양 부위에 표적되기 전에 부착된 제제가 실질적으로 방출되는 것을 방지하기 위해서 소정의 양태에서는, 생물학적으로 방출가능한 결합 및/또는 선택적으로 절단가능한 스페이서 또는 링커를 사용할 수 있다. "생물학적으로 방출가능한 결합" 및 "선택적으로 절단가능한 스페이서 또는 링커"는 순환계내에서 상당한 정도의 안정성을 가진다.
따라서, 본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3-유사 항체)는 생물학적으로 방출가능한 결합을 통해 하나 이상의 치료제에 결합될 수 있다. ScFv 단편이 소정의 양태에서는 바람직하지만, 본래의 항체 (intact antibody)를 포함한 모든 형태의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 "표적 항체 또는 제제"를 사용할 수 있다.
"생물학적으로 방출가능한 결합" 또는 "선택적으로 가수분해가능한 결합"에는, 소정의 조건하에서만 또는 소정의 조건하에서 우호적으로 방출가능하거나 절단가능하거나 가수분해가능한 모든 결합이 포함된다. 이러한 결합으로는, 미합중국 특허 제5,474,765호 및 제5,762,918호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있는 바와 같이, 디설파이드 결합, 트리설파이드 결합 및 산-변화가능한(acid-labile) 결합이 포함된다.
특히, 본 발명의 항체에 치료제 또는 약물을 부착하기 위해 산-민감성 스페이서를 사용할 수 있다. 이 경우, 치료제 또는 약물은 세포내의 산성 구획 (acidic compartment) 내에서 방출된다. 산-민감성 방출이 세포외에서도 일어날 수 있으나, 종양 부위에 표적된 후에 방출되는 것이 바람직하다. 현재 바람직한 예로는, 산-민감성 스페이서를 통해 콜키친 또는 독소루비신에 결합된 2C3-유사 항체가 포함된다. 상기 항체의 탄수화물 잔기를 통해 부착될 수도 있다. 이 경우, 치료제 또는 약물은 세포내의 산성 구획내에서 방출된다.
또한, 항-VEGF 항체의 표적화를 유도하여, 생물학적으로 방출가능한 결합을 통해 치료제를 부착할 수 있는 기능성 그룹을 도입할 수도 있다. 따라서, 표적 항체를 유도화하여, 히드라지드, 히드라진, 1차 아민 또는 2차 아민 그룹에서 종료하는 측쇄를 도입할 수 있다. 치료제는, Schiff 염기 결합, 히드라존 또는 아실 히드라존 결합이거나 히드라지드 링커를 통해 컨쥬게이션시킬 수 있다 {참조: 미합중국 특허 제5,474,765호 및 제5,762,918호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)}.
미합중국 특허 제5,474,765호 및 제5,762,918호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있는 바와 같이, 효소-민감성 결합 (펩티드 결합, 에스테르, 아미드, 포스포디에스테르 및 글리코시드를 포함)인 하나 이상의 생물학적으로 방출가능한 결합을 통해 표적 항-VEGF 항체를 치료제에 작동가능하게 부착시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서는, 질환 부위 (특히 종양 환경) 내에 우선적으로 위치하는 펩티다제 및/또는 프로티네이즈에 대한 제1 절단 부위를 적어도 포함하는 펩티드 링커를 사용한다. 따라서, 부착된 치료제의 항체-매개 전달의 결과, 질환 부위 또는 종양 환경내에서 특히 절단되어 활성 제제가 특이적으로 방출된다. 소정의 펩티드 링커는, 리모델링에 관여하는 하나 이상의 효소에의해 인식되는 절단 부위를 포함한다.
간질 콜라게나제, 젤라티나제 또는 스트로멜리신과 같은, 유로키나제, 프로-유로키나제, 플라스민, 플라스미노겐, TGF 베타, 스타필로키나제, 트롬빈, 인자 IXa, 인자 Xa 또는 메탈로프로티네이즈에 대한 절단 부위를 포함하는 펩티드 링커가 특히 바람직하다. 생물학적으로 방출가능한 결합 및 선택적으로 절단가능한 링커 및 펩티드를 포함하는 표적화 제제-치료제 작제물의 제조 방법 및 사용 방법에 대한 추가 기재를 위해, 미합중국 특허 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 특허출원 제08/482,369호 (특허료 납부일: 1998년 10월 20일)를 본원에 참조문헌으로 포함하였다. 특히, 미합중국 특허 제5,877,289호 (특허부여일: 1999년 3월 2일)는, 간질 콜라게나제, 젤라티나제 또는 스트로멜리신과 같이 종양 환경내에서 유로키나제, 플라스민, 트롬빈, 인자 IXa, 인자 Xa 또는 메탈로프로티네이즈에 의해 절단되는 선택적으로 절단가능한 펩티드를 포함하는 표적화 제제-치료제 작제물의 제조 방법및 사용 방법에 대한 추가 기재를 위해 본원에 참조문헌으로 포함하였다.
현재 바람직한 선별적으로 절단가능한 펩티드 링커는, 간질 콜라게나제, 젤라티나제 또는 스트로멜리신과 같은, 플라스민 또는 메탈로프로티네이즈 ("매트릭스 메탈로프로티에이즈" 또는 "MMP"로도 알려져 있음)에 대한 절단 부위를 포함하는 펩티드 링커이다. 본 발명과 관련하여 유익하게 사용될 수 있는 기타의 펩티드 링커는 하기 표 B2에 예시되어 있다.
[표 B2]
절단가능한 서열의 유형 아미노산 서열 서열번호
플라스민-절단가능한 서열
프로-유로키나제 PRFKIIGG 제15
PRFRIIGG 제16
TGFβ SSRHRRALD 제17
플라스미노겐 RKSSIIIRMRDVVL 제18
스타필로키나제 SSSFDKGKYKKGDDA 제19
SSSFDKGKYKRGDDA WP20
인자 Xa-절단가능한 서열
IEGR 제21
IDGR 제22
GGSIDGR 제23
MMP-절단가능한 서열
젤라티나제 A PLGLWA 제24
콜라게나제-절단가능한 서열
송아지 피부 콜라겐(α1(I)사슬) GPQGIAGQ 제25
송아지 피부 콜라겐(α2(I)사슬) GPQGLLGA 제26
소의 연골 콜라겐(α1(II)사슬) GIAGQ 제27
인간의 간 콜라겐(α1(III)사슬) GPLGIAGI 제28
인간 α2M GPEGLRVG 제29
인간 PZP YGAGLGVV 제30
AGLGVVER 제31
AGLGISST 제32
랫트 α1M EPQALAMS 제33
QALAMSAI 제34
랫트 α2M AAYHLVSQ 제35
MDAFLESS 제36
랫트 α1I3(2J) ESLPVVAV 제37
랫트 α1I3(27J) SAPAVESE 제38
인간 섬유모세포 콜라게나제 (자가분해성 절단)
DVAQFVLT 제39
VAQFVLTE 제40
AQFVLTEG 제41
PVQPIGPQ 제42
C11. 이중 특이성 항체 (Bispecific Antibodies)
특히, 본 발명의 응고 리간드 및 결합된 항-안지오제네시스 양태에 있어서, 이중 특이성 항체가 유용하다. 하지만, 하나의 암 (arm)이 (임의적으로는, 2C3와 실질적으로 동일한 에피토프에서) VEGF에 결합하고 이중 특이성 항체가 (일반적으로, 항원-결합 부위와는 상이한 영역에서) 치료제에 부착되는 한, 일반적으로 이중 특이성 항체를 사용할 수 있다.
일반적으로, 이중 특이성 항체의 제조방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 한 방법에서는, 표적 항원에 대해 특이성을 가지는 항체를 제조하고, 이와 별개로 응고 제제를 제조한다. 2가지의 선택된 항체로부터 절단가능한 (peptic) F(ab'γ)2단편을 제조한 후, 각각 환원시켜 별개의 Fab'γSH단편을 제조한다. 커플링될 2개의 파트너 중 하나의 파트너 상에 있는 SH 그룹을 교차 결합 제제 (예를 들면, o-페닐렌디말레이미드)를 사용하여 알킬화시켜 하나의 파트너 상에 자유 말레이미드 그룹을 제공한다. 이 때, 이 파트너를 티오에테르 결합을 통해 다른 파트너와 컨쥬게이션시켜 목적하는 F(ab'γ)2헤테로컨쥬게이트를 수득할 수 있다. SPDP 또는 단백질 A와 교차 결합시키는 방법 또는 삼중 특이성 작제물의 제조 방법도 알려져 있다.
이중 특이성 항체를 제조하는 다른 방법은, 2개의 하이브리도마를 융합시켜 콰드로마 (quadroma)를 형성하는 것이다. 본원에서 "콰드로마"는 2개의 B 세포 하이브리도마를 융합하여 생성시킨 것을 의미한다. 현재 표준적인 기법을 사용하여, 하이브리도마를 생산하는 2개의 항체를 융합시켜 딸세포를 수득한 후, 2가지의 면역 글로불린 유전자 클론 세트를 발현할 수 있는 딸세포를 선별한다.
콰드로마를 생산하는 바람직한 방법에서는, 하나 이상의 모(parental) 하이브리도마 중 효소-결핍 돌연변이체를 선별하는 것을 포함한다. 이러한 제1 돌연변이 하이브리도마 세포라인을, 치명적인 효과를 가지는 요오도아세트아미드 등에 노출시켜 계속 성장하는 것이 억제된 제2 하이브리도마 세포에 융합시킨다. 세포 융합을 통해, 상기 치명적으로 처리된 하이브리도마부터 효소 결핍된 유전자를 얻음으로써 제1 하이브리도마를 살릴 수 있고, 제1 하이브리도마에 융합시킴으로써 제2 하이브리도마를 살릴 수 있다. 상이한 서브-클래스의 동일한 아이소타입을 갖는면역 글로불린을 융합시키는 것이 바람직하지만, 반드시 그렇게 할 필요는 없다. 혼합된 서브-클래스의 항체는, 바람직한 콰드로마를 분리하기 위한 대체 분석의 경우에 사용할 수 있다.
보다 상세하게는, 콰드로마 발생 및 스크리닝 방법 중 하나는, 제1 선택된 mAb를 방출하는 하이브리도마를 수득하는 단계 및 필수적인 대사 효소인 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HGPRT)이 결함되도록 하는 단계를 포함한다. 상기 하이브리도마의 결함성 돌연변이체를 수득하기 위해, 8-아자구아닌의 농도를 증가시키면서 (1×10-7M 내지 1×10-5M) 세포를 성장시킨다. 이러한 돌연변이체를 제한된 희석으로 서브클로닝시킨 후, 하이포크산틴/아미놉테린/티미딘 (HAT) 민감성 테스트를 수행한다. 배양 배지는, 예를 들면, 10% FCS, 2mM L-글루타민 및 1mM 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM으로 이루어져 있을 수 있다.
표준 세포 융합 기술을 이용하여, 제2의 목적하는 mAb를 생산하는 상보성 하이브리도마 세포라인을 사용하여 콰드로마를 생산한다. 간략하게는, 4.5×107HAT-민감성 제1 세포를, 융합 이전에 얼음 위에서 30분간 치사량의 비가역성 생화학적 억제제인 요오도아세트아미드 (포스페이트로 버퍼링된 염수 중 5mM)로 미리 처리된 2.8×107HAT-내성 제2 세포와 혼합한다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하여 세포 융합을 유도하고, 상기 세포를 96-웰 마이크로배양 플레이트에 위치시킨다. HAT-함유 배지를 사용하여 콰드로마를 선별한다. 예를 들면, 고상 아이소타입-특이성 ELISA 및 아이소타입-특이성 면역 형광 염색법을 사용하여, 이중 특이성 항체를 함유하는 배양물을 동정한다.
이중 특이성 항체를 동정하는 한 양태에서는, 모 하이브리도마 항체 중 하나와 특이적으로 반응하고 2가지의 항체 모두에 대해 교차-반응성이 없는, 시약으로 마이크로타이터 플레이트 (Falcon, Becton Dickinson Labware)의 웰을 코팅한다. 상기 플레이트를 세척하고 차단한 후, 테스트할 상층물 (SNs)을 각 웰에 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 플레이트를 인큐베이션시킨 후, 상층물을 방출시키고, 플레이트를 세척하고 나서, 희석된 염기성 포스파타제-항-항체 컨쥬게이트를 실온에서 2시간동안 첨가하였다. 플레이트를 세척하고나서, 포스파타제 기질 (예를 들면, P-니트로페닐 포스페이트 (Sigma, St.Louis))을 각 웰에 첨가시킨다. 플레이트를 인큐베이션시키고, 3N NaOH를 각 웰에 첨가하여 반응을 중단시킨 후, ELISA 판독기를 사용하여 OD410수치를 측정한다.
다른 동정 양태에서는, 폴리-L-라이신으로 미리 처리된 미세적정 플레이트를 사용하여 표적 세포 중 하나를 각 웰에 결합시킨 후, 예를 들면 1% 글루타르알데히드를 사용하여 이 세포를 고정시키고 나서, 이중 특이성 항체의 순수한 세포 (intact cell)에 결합할 수 있는 능력의 유무를 테스트한다. 또한, 항체의 특성 분석에 공통적으로 사용되는 FACS, 면역 형광 염색법, 이디오타입-특이성 항체, 항원-결합 경쟁 분석 및 기타의 방법들을 사용하여 바람직한 콰드로마를 동정한다.
콰드로마를 분리한 후, 이중 특이성 항체를 다른 세포 생성물과 분리하여 정제한다. 이는, 면역 글로불린 정제 분야에서 당업자에게 잘 알려져 있는 다양한단백질 분리 공정에 의해 수행될 수 있다. 항체의 제조 및 특성 분석 수단은 당업계에 잘 알려져 있다 {참조: 예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988}.
예를 들면, 선택된 콰드로마로부터의 상층물을 단백질 A 또는 단백질 G 세파로즈 칼럼에 전달하여 IgG (아이소타입에 의존)에 결합시킨다. 그리고 나서, 결합된 항체를, 예를 들면 pH5.0 시트레이트 버퍼를 사용하여 용출시킨다. BsAb를 함유하는 용출 분획을 등장 버퍼에 대해 투석시킨다. 이와 달리, 용출물을 항-면역 글로불린-세파로즈 칼럼에 전달한다. 그리고 나서, BsAb를 3.5M 마그네슘 클로라이드로 용출시킨다. 예를 들면, 표적 세포에 대한 상기한 이소타입-특이성 ELISA 및 면역 형광 염색 분석을 통해, 상기 정제된 BsAb에 대해 결합 활성을 테스트한다.
또한, 정제된 BsAb 및 모 항체(parental antibody)를 SDS-PAGE 전기영동을 통해 특성 분석 및 분리한 후, 은 또는 쿠마시 (Coomassie)로 염색시킨다. 이는, 모 항체 중 하나가 다른 하나에 비해 분자량이 커서, BsAb 밴드가 2개의 모 항체 밴드 사이에서 이동하는 경우에 가능하다. 샘플을 환원시켜, 2가지의 상이한 분자량을 가지는 중쇄의 존재를 확인한다.
D. 약제학적 조성물
본 발명의 약제학적 조성물은, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 수성 배지 중에 용해 또는 분산된, 효과적인 양의 적어도 제1 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체를 일반적으로 포함한다. 또한, 배합된 치료제도 포함되며, 단일 및 배합 약물용으로서 동일한 유형의 기본적인 약제학적 조성물을 사용할 수 있다.
용어 "약제학적 또는 약리학적으로 허용가능한"은, 동물 또는 인간에게 적합하게 투여된 경우에 부작용, 알레르기 반응 또는 기타의 다른 바람직하지 않은 반응이 발생되지 않는 분자체 및 조성물을 의미한다. 수의용으로서의 용도도 본 발명에 포함되며, "약제학적으로 허용가능한" 제형에는 임상 용도용 및/또는 수의 용도용 제형이 모두 포함된다.
본원에서의 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"에는, 모든 용매, 분산 매개물, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수-지연제 등이 포함된다. 약제학적 활성 물질을 위한 상기한 매개물 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 기존의 매개물 및 제제가 활성 성분과 병행할 수 없는 경우를 제외하고는, 치료 조성물에 사용할 수 있다. 인간에게 투여하는 경우, FDA 사무국의 생물 표준에서 요구하고 있는 무균성, 발열성, 일반적인 안전성 및 순도 기준을 충족하도록 제제를 제조하여야 한다. 또한, 상기 조성물에 보충적인 활성 성분을 첨가할 수도 있다.
"유닛 투여(Unit-dosage)" 제형은, 특정 시간 전달에 맞게 투여되는 성분의 투여량(dose) 또는 서브-투여량(sub-dose)을 함유하는 제형이다. 예를 들면, 1일 투여량 또는 유닛이거나 1일 서브-투여량, 또는 1주 투여량 또는 유닛이거나 1주 서브-투여량 등을 포함하는 제형이다.
D1. 주사 제형 (Injectable Formulations)
본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트는, 비경구 투여용 {예를 들면, 정맥 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 경피 주사또는 기타 투여 경로 (종양 또는 질환 부위에 연동 투여 및 직접 점적 (강내 투여)을 포함)}으로 대부분 제형된다. 활성 성분으로서 상기 항체 또는 면역 컨쥬게이트를 함유하는 수성 조성물의 제조는 본원의 기재에 근거하여 당업자들에게 잘 알려져 있을 것이다. 통상적으로, 상기한 조성물은 주사가능한 수용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있으며; 주사 이전에 액체를 첨가하여 용액 또는 현탁액을 제조하기에 적합한 고형 형태로서 제조될 수 있으며; 에멀젼 형태로 제조될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 제형에는, 멸균 수용액 또는 분산액; 깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함한 제형; 및 멸균 주사 용액 또는 분산액을 즉석으로 제조하기 위한 멸균 분말이 포함된다. 이러한 모든 경우에 있어서, 주입가능성 (syringability)가 존재하는 정도에서 상기 제형들은 멸균되어 있고 및 유체성이어야 한다. 제조 및 보관 조건하에서 안정하여야 하며, 미생물 (예를 들면, 세균 및 곰팡이)의 오염 활성에 대해 보존되어야 한다.
상기한 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체이거나 면역 컨쥬게이트 조성물은, 중성 또는 염 형태의 멸균 수성 조성물로 제형될 수 있다. 자유 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서의 용액은, 계면 활성제 (예를 들면, 하이드록시프로필셀룰로즈)와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염으로는, 산 부가염 (상기 단백질의 자유 아미노 그룹으로 형성) 및 무기산 (예를 들면, 염산 또는 인산) 또는 유기산 (예를 들면, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등)으로 형성된 염이 포함된다. 자유 카복실 그룹으로 형성된 염은, 무기 염기 (예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄,칼슘 또는 수산화제2철) 및 유기 염기 (예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등)로부터 유도될 수 있다.
적합한 담체로는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 수성 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 및 분산 매개물이 포함된다. 많은 경우, 당 또는 염화 나트륨과 같은 등장제 (isotonic agent)를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 코팅제 (예를 들면, 레시틴)의 사용, 분산의 경우 필요로 하는 입자 크기의 유지 및/또는 계면 활성제의 사용을 통해, 적합한 유체성(fluidity)을 유지할 수 있다.
통상적인 보과 및 사용 조건하에서, 상기한 모든 제제들은 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제를 함유하여야 한다. 다양한 항균제 및 항진균제 (예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등)를 사용하여 미생물의 활성을 방지할 수 있다. 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 사용하여 주사용 조성물의 지속적인 흡수를 가능하게 할 수 있다.
제형 이전 또는 제형후, 상기한 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체이거나 면역 컨쥬게이트를 광범위하게 투석시켜, 목적하지 않는 저분자량의 분자를 제거하고/하거나, 적합한 경우에는 목적하는 비히클로 보다 용이하게 제형하기위해 동결건조시켜야 한다. 상기한 기타의 성분을 가지고 있는 적합한 용매 중에 필요한 용량의 활성 성분을 혼입한 후에 여과 멸균시켜, 주사용 멸균 조성물을 제조한다. 일반적으로, 기본 분산 배지 및 상기한 필수적인 기타의 성분들을 포함하는 멸균 비히클에 멸균 활성 성분을 혼입함으로써, 분산제를 제조한다.
주사용 멸균 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 바람직한 제조 방법은, 활성 성분 분말 및 미리 멸균 여과된 용액으로부터의 바람직한 추가의 성분을 생산하는, 진공 건조 기법 및 동결 건조 기법이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 적합한 약제학적 조성물은, 목적하는 용도에 따라 최종 농도 범위를 조정하기 위한 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제 (예를 들면, 멸균 수용액)와 혼합된, 상기한 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체이거나 면역 컨쥬게이트를 포함한다. 일반적인 제조 방법은 하기 문헌에 예시된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다 {참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. Mack Publishing Company, 1980 (본원에 참조문헌으로 포함)}. 엔도톡신 오염은 안전한 수준으로 최소한으로 (예를 들면, 0.5ng/단백질 1mg 미만) 유지되어야 한다. 또한, 인간에게 투여하는 경우, FDA 사무국의 생물 표준에서 요구하고 있는 무균성, 발열성, 일반적인 안전성 및 순도 기준을 충족하도록 제제를 제조하여야 한다. 제형화한 후, 상기 항체 또는 면역 컨쥬게이트 용액을 투여 제형과 병행가능한 방식으로 투여하고, 치료학적으로 효과적인 양을 사용하여 투여한다.
D2. 지속방출형 제형
VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체이거나 면역 컨쥬게이트 용액 제형은 다양한 투여 형태 (예를 들면, 상기한 주사용 용액 형태)로 용이하게 투여되며, 기타의 약제학적으로 허용가능한 형태 (예를 들면, 정제, 알약, 캡슐 또는 경구 투여용 고체, 좌제, 페사리, 비강 용액 또는 분무제, 에어로졸, 흡입제, 국부제형, 리포좀 형태 등)도 사용가능하다. 투여 제형의 유형은 치료할 질환에 따라 달라진다.
약제학적 "서방형" 캡슐 또는 "지속방출형" 조성물 또는 제제를 사용할 수 있으며, 일반적으로 적용가능하다. 일반적으로, 서방형 제형은 오랜 기간에 걸쳐 일정한 수준의 약물을 전달하도록 설계되며, 본 발명에 따른 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체이거나 면역 컨쥬게이트의 전달에 사용할 수 있다. 통상적으로, 서방형 제형은 질환 부위 (예를 들면, 종양 부위) 근처에 전달된다.
지속 방출형 제제 중 적합한 예로는, 상기 항체 또는 면역 컨쥬게이트를 함유하는 고형 소숫성 폴리머로 된 반투과성 매트릭스를 포함한다. 이 때, 상기한 매트릭스는 성형 제품 형태 (예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐)이다. 지속방출 매트릭스의 예로는, 폴리에스테르; 하이드로겔 (예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)); 폴리락티드 (예를 들면, 미합중국 특허 제3,773,919호); L-글루탐산 및 γ에틸-L-글루타메이트와의 공중합체; 분해불가능한 에틸렌-비닐 아세테이트; 분해가능한 락트산-글리콜산 공중합체 [예를 들면, Lupron DepotTM(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트를 포함하는 주사용 마이크로스피어)]; 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다.
에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상동안 분자가 방출될 수 있도록 하는 반면, 하이드로겔 (hydrogel)은 이보다 짧은 기간동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 체내에서 장기간 동안 머무르는 경우, 37℃에서 습기에 노출되기 때문에 변성되거나 응집되어 생물학적 활성의 감소 및/또는 면역원성의 변화를 가져올 수 있다. 관련된 메카니즘에 따라 안정화시키는 바람직한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 응집 메카니즘이 티오-디설파이드 상호교환을 통해 분자간 S-S 결합 형성시키는 경우, 설프하이드릴 잔기를 변경시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 적합한 첨가제를 사용하여 습기 함유량을 조절하고, 특이적인 중합체 매트릭스 조성물을 발생시키는 등을 통해 안정화시킬 수 있다.
D3. 리포좀(Liposomes) 및 나노 입자 (Nanoparticles)
소정의 양태에서는, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체이거나 면역 컨쥬게이트와 함께 리포좀 및/또는 나노 입자를 사용할 수 있다. 리포좀의 제형 및 사용에 대해서는 아래에서 요약되어 있는 바와 같이 당업자들에게 일반적으로 잘 알려져 있다.
리포좀은, 수성 배지에서 분산된 포스포리피드에서 형성되며, 멀티라멜라 집중 이중층 소포 [multilamellar concentric bilayer vesicle, 다중 라멜라 소포 (MLV)로도 부름]로부터 바로 형성된다. 일반적으로, MLV의 직경은 25nm 내지 4㎛이다. MLV를 음파처리하면, 중심부에 수용액을 함유한 직경 200 내지 500Å의 단일 라멜라 소낭 (SUV)이 형성된다.
인지질은, 지질:물의 몰비에 따라, 물에 분산된 때에 리포좀이 아닌 다양한 구조를 형성할 수 있다. 낮은 비율에서는, 리포좀이 바람직한 구조이다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온에 따라 달라진다. 리포좀은 이온 물질 및 극성 물질에 대해서는 투과성이 낮으나, 높은 온도에서 투과성을 크게 변화시키는 상 변이를 거친다. 상 변이(phase transition)는, 겔 상태로 알려져 있는 밀집되어 패키지된 질서정연한 구조에서 유체 상태로 알려져 있는 느슨하게 패키지된 질서정연한 정도가 낮은 구조로 변화되는 것을 포함한다. 상 변이는 특정의 상 변이 온도에서 발생하며, 이로 인해 이온, 당 및 약물에 대한 투과성이 증가된다.
리포좀은 4가지의 상이한 메카니즘을 통해 세포와 상호작용한다: 망막내피 시스템의 식세포 (예를 들면, 마크로파지 및 중성구)에 의한 엔도사이토시스 (endocytosis); 비특이적 약한 소수성 힘 또는 정전기력에 의하거나, 세포 표면 성분과의 특이적인 상호작용에 의한, 세포 표면으로의 병합 (adsorption); 리포좀의 지질 이중막을 플라즈마 막으로 삽입하고 이와 동시에 리포좀의 내용물을 세포질로 방출시킴으로써, 플라즈마 세포막과의 융합; 및 리포좀 내용물과는 상관없이, 리포좀 지질을 세포막 또는 세포내막으로의 이동. 하나 이상의 메카니즘이 동시에 작동할 수 있으나, 리포좀 제형을 다양하게 함으로써 작동하는 메카니즘을 변경시킬 수 있다.
일반적으로, 나노 캡슐은 안정되고 재생가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과다 부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자 (크기 약 0.1㎛)는 생체내에서 분해될 수 있도록 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이러한 조건을 충족하는 생분해가능한 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자는 본 발명에서 사용할 수 있으며, 이러한 입자는 용이하게 제조할 수 있을 것이다.
D4. 시 제형(Ophthalmic Formulations)
안지오제네시스 성분을 가진 질환 중 많은 질환들이 눈과 관련된 질환이다. 예를 들면, 본 발명에 따라 치료가능한 각막 신생혈관-관련 질환에는, 당뇨성 망막증, 미성숙 망막증, 각막 이식 거부증, 신생혈관 녹내장 및 수정체후방 섬유증식증, 전염성 상피 각결막염 (keratoconjunctivitis), 비타민 A 결핍증, 콘택트 렌즈 과다 착용, 아토피성 각막염, 상지(superior limbic) 각막염, pterygium keratitis sicca, sjogrens, acne rosacea, phylectenulosis, 매독, 미코박테리아 감염증, 지질 분해, 화학적 화상, 세균성 궤양, 진균성 궤양, 헤르페스 심플렉스 감염증, 헤르페스 조스터 감염증, 원생동물 감염증, 카포시 육종, Mooren 궤양, Terrien 변연 퇴행성 질환, 변연 각질 분해증, 외상, 류마티스성 관절염, 전신성 루퍼스, polyarteritis, Wegeners sarcoidosis, 공막염 (scleritis), Steven's Johnson 질환, periphigoid radial keratotomy 및 각막 이식편 거부증이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 치료가능한 망막/맥락막 신생혈관-관련 질환에는, 당뇨성 망막증, 황반 퇴행, 겸상 적혈구 빈혈증, sarcoid, 매독, pseudoxanthoma elasticum, Pagets 질환, 정맥 폐색증, 동맥 폐색증, 카로티드 폐쇄 질환, 만성 포도막염/유리체염, 미코박테리아 감염증, Lyme 질환, 전신성 루퍼스 홍반증, 미성숙 망막증, Eales 질환, Bechets 질환, 망막염 또는 맥락막염을 유발하는 감염증, 안구 히스토마플라스모시스증, Bests 질환, myopia, 이와, Stargarts 질환, pars planitis, 만성 망막 분리증, 과점도 신드롬, 톡소플라스모시스, 외상 및 레이저 치료후 합병증이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 치료가능한 기타의 질환에는, 당뇨병과 관련되었거나 관련되지 않았거나, 모든 형태의 증식성 초자체망막증 (vitroretinopathy)을 포함한, 섬유성혈관 또는 섬유성 조직의 비정상적인 증식에 의해 유발되는 질환 및 rubeosis(앵글의 신생혈관생성)-관련 질환이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체 및 면역 컨쥬게이트는, 초자체내 및/또는 수정체내 투여를 포함한 안구용 용액으로서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물의 제조에 사용하기에 유익할 수 있다. 상기한 질환 및 기타의 질환을 치료하는 경우, 본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 조성물은, 기존의 약제 관행에 따라 안구용 제제 형태로 치료를 받아야할 필요가 있는 환자의 눈에 투여된다 {참조: 예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pp.1488-1501 (Mack Publishing Co., Easton, PA)}.
안구용 제제는, 약제학적으로 허용가능한 용액, 현탁액 또는 연고 중 약 0.01 내지 약 1중량% (바람직하게는, 약 0.05 내지 약 0.5 중량%)의 농도의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체를 함유한다. 사용되는 화합물, 치료할 환자의 상태 등에 따라 농도는 어느 정도 변하게 되며, 치료를 담당하는 자가 각 개체에 가장 적합한 농도를 결정할 것이다. 바람직하게는, 안구용 제제는, 예를 들면 방부제, 버퍼, 긴장도(tonicity) 제제, 항산화제 및 안정화제, 비-이온성 습윤제 또는 투명화제, 점도 강화제 등과 같은 추가의 성분들을 필요로하는 경우에 함유하는 멸균 수용액 형태이다.
이러한 용액에 사용하기에 적합한 방부제에는, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로로부탄올, 티메로살 등이 포함된다. 적합한 버퍼로는, 붕산, 중탄산나트륨 및 중탄산칼륨, 붕산나트륨 및 붕산칼륨, 탄산나트륨 및 탄산칼륨, 아세트산나트륨, 이인산 나트륨 등이 포함되며, 버퍼의 양은 pH를 약 6 내지 8 (바람직하게는, pH 약 7 내지 7.5)을 유지하기에 충분한 양으로 한다. 적합한 긴장도 제제는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 덱스트로즈, 글리세린, 염화칼륨, 프로필렌 글리콜, 염화나트륨 등이며, 안구용 용액의 염화나트륨 당량은 0.9±0.2%이 되도록 한다.
적합한 항산화제 및 안정화제에는, 나트륨 바이설파이트, 나트륨 메타바이설파이트, 나트륨 티오설파이트, 티오우레아 등이 포함된다. 적합한 습윤제 및 투명화제에는, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 282 및 틸록사폴이 포함된다. 적합한 점도 강화제에는, 덱스트란 40, 덱스트란 70, 젤라틴, 글리세린, 하이드록시에틸셀룰로즈, 하이드록스메틸프로필셀룰로즈, 라놀린, 메틸셀룰로즈, 페트로라툼, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 카복시메틸셀룰로즈 등이 포함된다. 안구용 제제는 통상의 방법 (예를 들면, 방울 형태 또는 안구용 용액으로 눈을 씻는 방법)에 따라 치료를 필요로 하는 환자의 눈에 국부 투여한다.
D5. 국부용 제형(Topical Formulation)
넓은 의미로는, 국부 투여용 제형은 구강 및 피부를 통한 전달을 포함한다. 또한, "국부 전달 시스템"은 전달할 성분을 함유하는 경피용 패치를 포함한다. 또한, 피부를 통한 전달은, 원하는 경우, 이온삼투요법 (iontophoresis) 또는 전자 전달법을 통해 이루어질 수 있다.
구강내 국부 투여용으로 적합한 제형으로는, 향기가 있는 대개 수크로즈 및 아카시아 또는 트라가칸트 기재 (basis)하에 상기 성분을 포함하는 로젠지 (lozenge); 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로즈 및 아카시아와 같은 불활성 기재하에 활성 성분을 포함하는 패스틸 (pastille); 및 적합한 액체 담체내에 투여될 성분을 포함하는 구강세척제가 포함된다.
피부-국부 투여용으로 적합한 제형으로는, 약제학적으로 허용가능한 담체내에 투여될 성분을 포함하는 연고, 크림, 젤 및 패이스트가 포함된다. 연고, 크림 및 젤과 같은 국부 투여용 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체의 제형으로는, 당업계에 잘 알려져 있는, 유성 또는 수용성 연고-기재(basis) 제제가 포함된다. 예를 들면, 이러한 조성물은 식물성 오일, 동물성 지방, 보다 바람직하게는 석유에서 수득한 반고체 탄수화물을 포함할 수 있다. 사용되는 특정 성분은, 백색 연고, 노란색 연고, 세틸 에스테르 왁스, 올레산, 올리브 오일, 파라핀, 페트로라툼, 백색 페트로라툼, 스퍼마세티, 전분 글리세라이트, 백색 왁스, 노란색 왁스, 라놀린, 무수 라놀린 및 글리세릴 모노스테아레이트를 포함할 수 있다. 또한, 글리세롤 에테르 및 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥실 40 스테아레이트 및 폴리소르베이트를 포함한, 다양한 수용성 연고 기재가 사용될 수 있다.
직장 투여용 제형은, 예를 들면 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적합한 기재를 갖춘 좌제 형태일 수 있다. 질 투여용 제형은, 당업계에서 적합한 것으로 알려져 있는 담체 및 활성 성분을 함유하는, 페사리, 탐폰, 크림, 젤, 패이스트, 거품 또는 분무식 제형 형태일 수 있다.
D6. 비강 제형
비강 및 호흡기 통로를 통한 국부 전달은, 다양한 상태를 치료하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 이러한 전달 경로는 전신성 순환계로 제제를 전달하는 데에도 적합하다. 따라서, 비강 용액, 스프레이, 에어로졸 및 흡입물과 같은 비강 투여에 적합한 담체내에 활성 성분을 함유하는 제형은 본 발명의 범위내에 속한다. 담체가 고체인 경우, 상기 제형은 입자 크기가 예를 들면 20 내지 500 미크론인 굵은 분말을 포함하는 데, 이러한 분말의 투여는 예를 들면 분말 용기를 코 가까이 대고 분말 용기로부터 빨리 흡입하여 비강 통로를 통해 흡입함으로써 이루어진다.
담체가 액체인 적합한 제형은 비강 투여에 유용하다. 통상적으로, 비강용 용액은 방울 또는 스프레이 형태로 비강 통로로 투여되도록 설계된 수용액이며, 대부분 비강 방출과 유사하여 정상적인 섬모 활동이 유지되도록 제조된다. 따라서, 비강용 수용액은 일반적으로 등장액이거나 약간 버퍼링되어 pH 5.5 내지 6.5를 유지토록 한다. 또한, 안구용 제제에서 사용된 것과 유사한 항-미생물 방부제 및 필요한 경우에 적합한 약물 안정화제를 포함할 수 있다. 다양한 비강용 제제가 시판되고 있으며, 예를 들면 항생제 및 항-히스타민제가 포함되며, 천식 예방에 사용되고 있다.
흡입물 및 흡입제는, 약물 또는 화합물을 환자의 기관지로 전달하도록 설계된 약제학적 제제이다. 증기 또는 연무 (mist)를 투여하면 손상 부위에 도달한다. 또한, 이러한 경로를 사용하여 제제를 전신성 순환계에 전달할 수 있다. 비강 또는 구강 호흡 통로를 사용하여 흡입물을 투여할 수 있다. 흡입 용액의 투여는, 방울이 충분히 미세하고 크기가 일정하여 연무가 기관지에 도달하는 경우에만 효과적이다.
흡입물로도 알려져 있으며 호흡물 (insufflation)로도 종종 불리는 다른 생성물 그룹은, 액화된 가스 추진체내에 약물 용액 또는 현탁액을 가지는 특별 전달 시스템 (예를 들면, 약제학적 에어로졸)을 사용하여 호흡기 통로로 이동되는 미세한 분말 또는 액체 약물을 포함한다. 적합한 밸브 및 구강 적응기를 통해 방출된 때, 환자의 호흡기 통로로 측정된 양의 흡입물을 추진한다. 입자 크기가 이러한 유형의 투여에 가장 중요하다. 폐강내로 투과하기 위한 최적의 입자 크기는 0.5 내지 7㎛인 것으로 보고되어 있다. 미세한 연무는 압력을 가한 에어로졸에 의해 생산되어, 이의 사용은 잇점이 있는 것으로 생각된다.
E. 치료용 킷트
또한, 본 발명에서는 본 발명의 치료 방법에 사용하기 위한 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트를 포함하는 치료용 킷트를 제공한다. 일반적으로, 이러한 킷트는, 적합한 용기 수단내에, 하나 이상의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트의 약제학적으로 허용가능한 제형을 함유한다. 또한, 이러한 킷트는 진단/이미징 또는 복합 치료용의 기타의 다른 약제학적으로 허용가능한 제형을 함유할 수도 있다. 예를 들면, 상기한 킷트는, 하나 이상의 화학치료제 또는 방사선 치료제; 항-안지오제네시스 제제; 항-종양 세포 항체; 및/또는 항종양 혈관체 또는 항-종양 기질 면역 독소 또는 응고 리간드를 함유할 수 있다.
상기한 킷트는, 추가 성분을 포함하거나 포함하지 않는, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트를 함유하는 단일 용기 (용기 수단)를 가지거나; 목적하는 각각의 제제를 함유하는 상이한 용기를 가질 수도 있다. 복합 치료제가 제공되는 경우, 단일 용액은 몰 당량 배합 또는 하나의 성분이 다른 성분보다 과량으로 예비-혼합될 수 있다. 또는, 환자에게 투여하기 이전에, 상기한 킷트의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트 및 기타의 항암제 성분을 상이한 용기내에 별개로 보유할 수 있다.
상기한 킷트의 성분들이 하나 이상의 액체 용액내에 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액인 것이 바람직하며, 멸균 수용액이 특히 바람직하다. 하지만, 상기한 킷트의 성분들이 건조 분말 형태로서 제공될 수도 있다. 제제 또는 성분들이 건조 분말로서 제공되는 경우, 적합한 용매를 첨가하여 이 분말을 재구성시킬 수 있다. 이러한 용매는 다른 용기내에 제공될 수도 있다.
일반적으로, 상기한 킷트의 용기로는, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트 및 다른 바람직한 제제가 위치될 수 있는 (바람직하게는, 적합하게, 일정 분량이 포함되는), 하나 이상의 바이알, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 시린지 또는 기타의 용기 수단이 포함된다. 별개의 성분을 포함하는 경우, 상기한 킷트는 별개의 성분이 위치하는 제2 바이알 또는 기타의 용기를 일반적으로 포함하여, 각각 별개로 투여할 수 있다. 또한, 상기 킷트는 약제학적으로 허용가능한 멸균 버퍼 또는 기타의 희석제를 함유하기 위한 제2/제3 용기 수단을 포함할 수 있다.
또한, 상기한 킷트는, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트를 동물 또는 환자에게 투여하기 위한 수단 (예를 들면, 하나 이상의 바늘 또는 시린지, 눈 점적기, 피펫 또는 기타의 유사 장치)을 함유할 수 있다. 이러한 수단으로부터 상기 제형이 동물에게 주사되거나 체내의 질환 부위에 도입될 수 있다. 또한, 본 발명의 킷트는, 목적하는 바이알 및 기타의 장치가 위치하고 유지되는, 통상적으로 밀집된 구획내에 바이알 (또는 이와 유사한 것) 및 기타의 성분을 함유하는 수단 (예를 들면, 주사 또는 송풍 성형된 플라스틱 용기)을 포함한다.
F. 항-안지오제네시스 치료
본 발명은, 다양한 질환을 일으키는 비정상적인 안지오제네시스를 가진 동물 및 환자를 치료하는 데에 사용될 수 있다. 암 치료 이외에 상기한 질환 중에서 가장 빈도가 높고/높거나 임상적으로 중요한 질환으로는, 관절염, 류마티스성 관절염, 건선, 아테롬성 동맥경화증, 당뇨성 망막증, 연령-관련 백반 퇴행, Grave 질환, 혈관 재발 협착증 (angioplasty 이후의 재발 협착증을 포함), 동정맥 이형성 (AVM), 수막종, 혈관종 (hemangioma) 및 신생혈관 녹내장이 포함된다. 또 다른치료가능한 표적으로는, 섬유성 혈관종 (angiofibroma), atherosclerotic plaques, 각막 이식편 신생혈관 생성, 호혈성 관절, 과영양 상처, osler-weber 신드롬, 화농생성 과립종 수정체 후방 섬유증식증, 경피증, 기관지염, 혈관 부착증, 활막증, 피부염, 기타의 다양한 염증성 질환 및 endometriosis가 포함된다. 본 발명에 의해 치료가능한 다른 질환 및 상기한 안지오제네시스성 질환의 통일된 기준은 하기에 기재되어 있다.
안지오제네시스가 관여하는 하나의 질환은 류마티스성 관절염으로서, 관절의 활액 라이닝 (synovial lining)에 있는 혈관이 안지오제네시스를 수행한다. 새로운 혈관 네트워크를 형성하는 것 이외에도, 내피세포는 판너스 (pannus) 성장 및 카틸리지 파괴를 유발하는 인자 및 반응성 산소를 방출한다. 안지오제네시스에 관여하는 인자들은, 류마티스성 관절염의 만성 염증 상태를 적극적으로 유발하거나 유지하는 데에 도움이 될 수 있다. 또한, 안지오제네시스와 관련된 인자들은 관절이 파괴되는 골관절염에서 일정 역할을 수행한다.
Harada 등 (1998, 본원에 참조문헌으로 포함)은, VEGF가 류마티스성 관절염의 병리 기전에 관여하고 있으며, VEGF의 혈청 농도를 측정하는 것은 류마티스성 관절염의 질환 활성을 모니터링하는 유용한 방법임을 보였다. 이는, 본 발명을 류마티스성 관절염의 치료 및 진단에 사용할 수 있음을 지원한다.
Nagashima 등 (1999, 본원에 참조문헌으로 포함)은, 항-류마티스 약물이 배양된 류마티스성 활액 세포내의 VEGF에 대해 억제 효과를 보임을 기재하였다. VEGF는 류마티스성 관절염 활액에서 계속적으로 (constitutively) 발현된다. 공지되어 있는 항-류마티스 약물인 부실아민 (BUC)의 활성 메카니즘에는, 활액 세포에 의한 VEGF 생산 억제가 포함된다. 따라서, BUC의 항-류마티스 효과는, 활액 세포에 의한 VEGF의 생산을 억제하여 관절염 활막내에서의 안지오제네시스 억제 및 활액 증식에 의해 매개된다. 항-관절염 치료법으로서의 본 발명의 용도는, 상기한 현재 존재하는 치료제의 VEGF의 억제 활성에 의해 지지된다.
안지오제네시스에 의해 매개되는 다른 질환의 예는 눈 신생혈관 질환이다. 이 질환의 특성은, 신생 혈관이 눈 구조 (예를 들면, 망막 또는 각막)로 침입하는 것이다. 이는 실명이 되는 가장 공통되는 원인이며, 대략 20가지의 눈 질환과 관련되어 있다. 연령-관련 백반 퇴행 (age-related macular degeneration)의 경우, 망막 색소 내피 아래의 섬유성 혈관 조직의 증식과 함께 Bruch 막의 결함을 통해 맥락막 모세혈관이 안쪽으로 성장하여 시각 장애가 발생한다. 또한, 안지오제네시스성 손상은 당뇨성 망막증, 미성숙 망막증, 각막 이식편 거부증, 신생혈관 녹내장 및 수정체후방 섬유증식증과 관련되어 있다.
각막 신생혈관생성증과 관련된 기타의 질환으로는, 전염성 상피 각결막염 (keratoconjunctivitis), 비타민 A 결핍증, 콘택트 렌즈 과다 착용, 아토피성 각막염, 상지(superior limbic) 각막염, pterygium keratitis sicca, sjogrens, acne rosacea, phylectenulosis, 매독, 미코박테리아 감염증, 지질 분해, 화학적 화상, 세균성 궤양, 진균성 궤양, 헤르페스 심플렉스 감염증, 헤르페스 조스터 감염증, 원생동물 감염증, 카포시 육종, Mooren 궤양, Terrien 변연 퇴행성 질환, 변연 각질 분해증, 외상, 류마티스성 관절염, 전신성 루퍼스, polyarteritis, Wegenerssarcoidosis, 공막염 (scleritis), Steven's Johnson 질환, periphigoid radial keratotomy 및 각막 이식편 거부증이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
망막/맥락막 신생혈관생성증과 관련된 질환으로는, 당뇨성 망막증, 황반 퇴행, 겸상 적혈구 빈혈증, sarcoid, 매독, pseudoxanthoma elasticum, Pagets 질환, 정맥 폐색증, 동맥 폐색증, 카로티드 폐쇄 질환, 만성 포도막염/유리체염, 미코박테리아 감염증, Lyme 질환, 전신성 루퍼스 홍반증, 미성숙 망막증, Eales 질환, Bechets 질환, 망막염 또는 맥락막염을 유발하는 감염증, 안구 히스토마플라스모시스증, Bests 질환, myopia, 이와, Stargarts 질환, pars planitis, 만성 망막 분리증, 과점도 신드롬, 톡소플라스모시스, 외상 및 레이저 치료후 합병증이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
기타의 질환으로는, 모든 형태의 증식성 초자체망막증 (vitroretinopathy)을 포함한, 섬유성혈관 또는 섬유성 조직의 비정상적인 증식에 의해 유발되는 질환 및 rubeosis(앵글의 신생혈관생성)-관련 질환이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 만성 염증은 병리학적 안지오제네시스와 관련되어 있다. 궤양성 결장염 및 Crohn 질환과 같은 질환 상태에서는, 신생 혈관이 염증 조직내로 자람으로 인해 조직 변화를 보인다. 남아메리카에서 발견된 세균성 감염증인 Bartonellosis는 혈관 내피세포의 증식이 특징인 만성 단계가 진행될 수 있다.
안지오제네시스와 관련된 다른 병리학적 역할은 아테롬성 동맥경화증이다. 혈관 내강내에 형성되는 플래이크는 안지오제네시스 자극 활성을 가지는 것으로 관찰되었다. 인간의 관상 아테롬성 동맥경화 병변에서의 VEGF의 발현은 Inoue 등 (1998, 본원에 참조문헌으로 포함)에 의해 보고되었다. 이는, 인간의 관상 아테롬성 동맥경화증의 진행 및 폐쇄성 관상동맥 질환에서의 재-관형성(recanalization) 과정에 있어서 VEGF가 중요한 병생리학적 역할을 수행함을 뒷받침해준다. 본 발명에서는 이러한 상태에 대한 효과적인 치료법을 제공한다.
소아에 있어서 가장 빈번히 발생하는 안지오제네시스성 질환 중 하나는 혈관종 (hemangioma)이다. 대부분의 경우, 상기 종양은 양성이며 치료 없이도 퇴행된다. 보다 심각한 경우에는, 상기 종양이 공동이 많고 (cavernous) 침윤성 형태로 발전하고 임상적으로 합병증을 생기게 한다. 전신성 형태의 혈관종 (hemangiomatoses)은 치사율이 높다. 현재 사용되고 있는 치료제로는 치료할 수 없는, 치료에 내성을 나타내는 혈관종이 존재한다.
또한, 안지오제네시스는 유전성 질환 (예를 들면, Osler-Weber-Rendu 질환 또는 유전성 출혈 모세혈관확장증)에서 발견되는 손상의 원인이다. 이는, 다수의 작은 혈관종인 혈관 또는 림프관의 종양을 가지는 것을 특징으로 하는 유전성 질환이다. 상기한 혈관종은 피부 및 점막에서 발견되며, epistaxis (코피) 또는 위장관 출혈을 종종 수반하며, 때로는 폐 또는 간 관상정맥 누출이 발생한다.
또한, 안지오제네시스는 재생 및 상처 치료와 같은 정상적인 생리 과정에도 관여한다. 안지오제네시스는 배란 및 수정후 포배 착상에 있어서 중요한 단계이다. 안지오제네시스의 방해는, 무월경을 유도하거나, 배란을 차단하거나, 포배의 착상을 방해하는 데에 사용될 수 있다.
상처 치료의 경우, 과다한 복구 또는 섬유증식증은 외과 과정의 치명적인 부작용일 수 있으며, 안지오제네시스에 의해 악화될 수 있다. 유착 (adhesion)은 외과치료에 흔히 나타나는 합병증이며, 소장 폐쇄와 같은 문제를 유발한다.
본 발명을 이용하여 바람직하지 않은 혈관 투과가 특징인 질환을 치료할 수 있다. 이러한 질환으로는, 뇌종양-관련 부종, 악성종양-관련 복수 (ascite), Meigs 신드롬, 폐렴, 신장 신드롬, 심막 삼출 및 늑막 삼출이 포함된다 {참조: WO98/16551 (본원에 참조문헌으로 포함)}.
하기에 기재된 바와 같이, 모든 종류의 종양 및 상기한 질환은, 당업계의 지식 (참조: 미합중국 특허 제5,712,291호) 및 본 발명을 사용하여 안지오제네시스 질환의 치료를 위해 항-안지오제네시스 전략을 이용함으로써 효과적으로 치료될 수 있다.
본 발명의 항체 및/또는 면역 컨쥬게이트는 종양 치료에 사용하는 것이 가장 바람직하다. 안지오제네시스가 중요한 종양으로는, 악성 종양 및 양성 종양 (예를 들면, 청각 신경종, 신경섬유종, trachoma 및 화농성 과립종)이 포함된다. 특히, 안지오제네시스는 고형 종양 형성 및 전이에 뚜렷하게 나타난다. 하지만, 안지오제네시스는 혈액-유래 종양 (예를 들면, 백혈병); 및 백혈구의 무제한 증식이 일어난 후에 대개 빈혈, 손상된 혈액 응고 및 림프절, 간 및 비장의 비대가 후속하는, 다양한 급성 또는 만성 골수암질환과도 관련되어 있다. 또한, 안지오제네시스는 백혈병-유사 종양을 발생시키는 비정상 골수에서도 역할을 한다.
안지오제네시스는 종양 전이의 2 단계에서 중요하다. 1차 종양의 혈관생성시, 안지오제네시스를 통해 세포가 혈류로 들어가서 체내 전체를 순환할 수 있게 된다. 종양 세포가 1차 부위를 떠나 제2의 전이 부위에 안착하게 되면, 새로운 종양이 자라고 증식할 수 있기 전에 안지오제네시스가 일어나야 한다. 따라서, 안지오제네시스를 억제하면 종양의 전이를 방지할 수 있으며, 암 성장을 1차 부위에 한정시킬 수 있게 되어, 기타의 다른 치료제 (특히, 하기의 치료제-표적 제제 작제물)를 사용하여 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트 방법은, 혈관 성분을 가지는 악성 종양을 치료하는 데에 광범위하게 사용될 수 있다. 종양 치료 (특히, 혈관생성된 악성 종양 치료)에 본 발명의 항체 및/또는 면역 컨쥬게이트를 사용하는 경우, 상기 제제는 단독으로 사용되거나 화학치료제, 방사선치료제, 세포사멸제, 항-안지오제네시스 제제 및/또는 면역 독소 또는 응고 리간드와 함께 사용될 수 있다.
통상적으로 치료할 혈관생성된 종양은 고형 종양, 특히 산소 및 영양분 공급을 위해 혈관성분을 필요로 하는 암이다. 본 발명을 사용하여 치료할 수 있는 고형 종양의 예로는, 폐암, 유방암, 난소암, 위암, 췌장암, 인후암, 식도암, 전립선암, 간암, 이하선암, 담즙관암, 결장암, 직장암, 질암, 자궁암, 자궁내막암, 신장암, 방과암, 고환암, 편도선암, 비늘 세포암, 선암, 소세포암, 흑색종, 신경교종, 교아세포종, 신경아세포종 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 항-VEGF 항체를 사용하여 다양한 유형의 종양을 효과적으로 치료할 수 있음을 추가로 예시해주기 위해, 본원에서 WO98/45331을 참조문헌에 포함시켰다.
안지오제네시스가 종양의 유지 및 전이에 있어서 수행하는 역할에 대한 지식을 통해, 유방암과 같은 암을 예상할 수 있다. 1차 종양에서 발견되는 신생혈관의 양은, 침투성 유방암에서 가장 신생혈관이 강하게 나타나는 지역의 미세혈관 농도를 계측하여 측정하였다. 미세혈관의 높은 농도는, 종양 재발과 관련성이 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 치료에 의한 안지오제네시스의 통제는 상기 종양의 재발을 감소 또는 봉쇄시킨다.
본 발명은 고형 종양을 가진 환자의 치료에 사용될 수 있다. VEGFR2-차단,항-VEGF 항체-기초 조성물의 특성에 비추어, 본 발명의 치료제는 부작용이 작을 것이다. 이러한 특정 잇점으로 인해, 마크로파지에 의해 매개되는 바와 같은 종양에 대한 숙주 면역 반응을 유지 또는 강화시키고, 골 조직에 대한 부작용이 없게 된다. 따라서, 본 발명은 소아암 및 골다공증 및 기타의 골 결핍증을 가지고 있거나 발생시킬 위험이 있는 환자의 치료에 있어서 항-안지오제네시스 치료법이 될 것이다.
모든 악성 종양 및 고형 종양이 본 발명에 의해 치료될 수 있을 지라도, 본 발명의 컨쥬게이트되지 않은 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3 항체는 안지오제네시스가 보다 크게 일어나고 있는 종양을 가지고 있거나 전이될 위험을 가지고 있는 환자의 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 방지 또는 예방 치료로서 사용될 수 있다. 이러한 본 발명의 양태에서는, 전이성 종양을 가지는 1차 종양 또는 전이성 종양이 퍼지는 초기 단계의 종양 세포를 나타내는 환자를 치료하는 데에 본 발명을 사용될 수 있다.항-안지오제네시스 전략으로서, 본 발명은 징후 테스트 및/또는 유전성 암으로 고통받고 있는 가까운 친척에 근거하여, 종양을 발생시킬 위험이 중간 또는 큰 개체에서 종양 발생을 방지하기 위해 사용될 수 있을 것이다.
또한, 본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3 항체의 컨쥬게이트 또는 면역 독소 형태는 고형 종양의 파괴 또는 축소 (de-bulking)시키는 데에 사용될 수 있다. 이러한 본 발명의 양태는, 본 발명의 컨쥬게이션되지 않은 항-안지오제네시스 항체와 함께 사용될 수 있으며, 기타의 다른 항-안지오제네시스 방법과 함께 사용될 수도 있다.
본 발명의 치료법의 면역 컨쥬게이트 및 전구 약물 형태는 2가지 특성을 가진 단일 치료제를 제공한다는 잇점을 가지고 있다는 것은 당업자들이 용이하게 이해할 것이다 - 본 발명의 항체가 본래 가지는 항-안지오제네시스 특성; 및 부착된 제제의 치료 특성 (예를 들면, 세포 독성, 응고성, 세포사멸성 등). 따라서, 본 발명의 항체의 컨쥬게이트 및 전구약물 치료 형태는 암 치료 분야 전체에 걸쳐 매우 넓은 유용성을 가진다.
본 발명의 상이한 양태와 관련하여 사용하기에 보다 적합한 환자에 관한 본원에 기재된 지침은, 본 발명에 의한 치료를 받기 위한 환자의 선별하는 데에 도움을 주기 위한 것이다. 소정의 환자 또는 환자의 카테고리의 예비 선발을 한다고 해서, 혈관생성된 종양 또는 상기한 기타의 안지오제네시스-관련 질환을 가진 모든 환자를 치료하는 것과 관련된 본 발명의 유용성을 상쇄시키지는 않는다. 본 발명에서 제공되는 상기한 종양에 대한 공격으로 종양을 미리 처리한 후에 추가 치료를 받게 하여, 전체적으로 시너지 효과를 가져오거나 전체적으로 회복 또는 치유되게 한다.
특정 유형의 종양이 본 발명을 사용한 치료에서 제외되어야 한다고 생각되지는 않는다. 하지만, 종양 세포의 유형은 기타의 다른 치료제 (특히, 화학치료제 및 항-종양세포 면역 독소) 및 본 발명을 함께 사용하는 것과 관련성이 있을 수 있다. 본 발명의 비-컨쥬게이트 및 컨쥬게이트 양태 모두는, 종양 혈관 증식을 억제하는 항-안지오제네시스 효과를 포함한다. 컨쥬게이트 및 전구약물 치료 양태는 종양 혈관을 더 파괴 또는 폐색시킬 것이다. 혈관체는 모든 고형 종양에서 실질적 또는 전체적으로 동일하기 때문에, 본 발명의 치료방법은, 종양 세포 자체의 특정 표현형 또는 유전자형과 무관하게, 모든 고형 종양의 치료에 널리 또는 완전히 사용할 수 있을 것으로 이해된다.
VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트 작제물의 치료학적 유효량은, 아래에 기재된 연구 결과에서 보여주는 것과 같은 동물 모델에서 얻은 데이터를 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 고형 종양을 가지는 실험 동물은, 임상 환경으로 전환시키기 이전에 적합한 치료양을 최적화하기 위해 종종 이용된다. 이러한 동물 모델은, 효과적인 항암 전략을 예측하는 데에 매우 신뢰성이 높은 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 하기 실시예에서 사용되고 있는 것과 같은 고형 종양을 가진 마우스가 예비 임상 시험에서 널리 사용되고 있다. 본 발명자들은 최소의 독성을 가지면서 항-종양 효과를 가지는 치료제의 실시 범위를 결정하기 위해 당업계에서 허용되고 있는 마우스 모델을 사용하였다.
컨쥬게이션되지 않은 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체를 항-안지오제네시스 치료에 사용하는 경우, 임상 치료에 사용할 치료 제형과 관련하여 도움이 되도록 기타의 다른 공지된 데이터를 고려할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체가 선행기술에 비해 새로운 잇점을 가지고 있으나, 기타의 항-VEGF 항체를 이용한 치료와 관련한 문헌에 기재된 정보 및 본원에 기재된 데어터 및 교시 내용을 함께 사용하여 치료 프로토콜 및 투여량을 설계 및/또는 최적화할 수 있다.
예를 들면, Borgstrom 등 (1999)은, MAb A4..6.1을 이용하여 생체내 유방암 안지오제네시스에 있어서 VEGF의 중요성에 대해 기재하고 있다. 본 발명의 2C3-유사 항체가 A4.6.1과의 비교 연구에서 이와 균등한 또는 보다 우수한 항종양 반응을 보였기 때문에, 본 발명의 항체는 유방암 치료에 매우 유용할 것이다. 또한, 당업자들이 이해하고 있는 바와 같이, 본 발명자들은 유방암 환자는 통상적으로 골다공증에 대한 걱정이 큰 중년 이후의 여성이라는 것을 인식하였다. 따라서, 본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체는 골 대사에 부작용을 유발하지 않는 추가의 잇점을 가지며, 골다공증을 가지고 있거나 발생시킬 위험이 있는 유방암 환자에게 사용되는 것은 바람직하지 않다.
이러한 잇점으로 인해, 본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 치료제는 소아암 치료에 사용하기에 적합한 약제가 된다. 암을 가진 소아의 경우, 건강을 유지하고 골 성장이 크게 일어날 필요성이 있다. VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3 항체)는 골 생성에 중요한 오스테오클라스트 및 콘드로클라스트의 활성을 크게 손상시키지 않기 때문에, 2C3는 기타의 다른 항체 (예를 들면,A4.6.1)에 비해 중요한 잇점을 가진다.
본원에 참조문헌으로 포함되어 있는 Borgstrom 등 (1999)에서는, MAb A4.6.1을 독소루비신과 함께 사용한 결과 종양 퇴행이 크게 일어났음을 보고하였다. 이는, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 기존의 세포독성 또는 화학치료제를 함께 사용하여 다양한 종류의 암을 치료할 수 있다는 임상적으로 매우 중요한 사실을 추가로 보여주는 결과이다. 컨쥬게이션되지 않은 독소루비신 및 독소루비신 전구 약물 배합체를 사용할 수도 있다.
Ferrara 및 동료들은, 종양을 가진 마우스에서의 쥐의 항-VEGF 모노클론 항체의 효능 및 농도-반응과 인간 치료에 대한 추론에 대해 보고하고 있다 {참조: Mordenti 등, 1999 (본원에 참조문헌으로 포함)}. 상기 연구는, 쥐의 항-VEGF 모노클론 항체의 농도-반응 관련성을 측정하여 암 환자에 있어서 재조합-인간화된 형태의 상기 항체의 효과적인 혈장 농도를 예측하기 위한 것이었다. Mordenti 등 (1999)은, 누드 마우스에서의 성공적인 종양 억제는, 필요한 효율적인 범위로 인간에 사용할 치료 항체를 유지하기에 효과적인 임상 투여 방법을 결정하기 위해, 인간 시스템에 용이하게 적용할 수 있는 쥐의 항체 투여를 사용하여 얻을 수 있다고 결론지었다. 따라서, 현재 당업계에서 받아들여지고 있는 마우스 모델에서 얻은 데이터를 기초로 하여, Mordenti 등 (1999)이 보고한 분석 유형 및 본원에 개시된 당업자들에게 알려져 있는 기법들을 이용하여 적합한 인간 투여에 사용할 수 있을 것이다.
원숭이에 있어서 Genentech사의 인간화된 재조합 형태의 항-VEGF 항체에 대한 예비 임상 안전성 평가 결과 {참조: Ryan 등, 1999 (본원에 참조문헌으로 포함)}는, 특정 후보 치료제가 가지는 단점들을 예시해준다. 상기 항체는 상기 동물에서 약리 효과를 가지지만, 상기 연구에서의 원숭이는 비대 콘드로사이트의 투여량-관련 증가, 연골하 골 플레이트 형성 및 성장 플레이트의 혈관 침입 억제가 특징인 성장 형성 장애 (physeal dysplasia)를 보였다. 상기한 단점들은, VEGFR1에 의해 매개되는 콘드로클라스트 및 콘드로사이트에서의 VEGF의 결합 및 신호전달을 억제하지 않는 본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체를 사용하는 경우에는 나타나지 않는다.
Genentech사의 인간화된 모노클론 항-VEGF 항체의 예비 임상 약동학, 종간 스케일링 및 조직 분배 연구 데이터가 Lin 등 (1999, 본원에 참조문헌으로 포함)에 의해 보고되었다. 이 연구는, 마우스, 랫트, 원숭이 및 토끼에 대해 수행한 것으로서, 후자는125I-표지된 항체를 사용하였다. 마우스, 랫트 및 원숭이에서 얻은 약동학 데이터는, 인간에서의 상대변화측정 스케일링을 사용하여 상기 인간화된 항체의 약동학을 예측하기 위해 사용하였다. 따라서, 인간의 병리 상태 (예를 들면, 류마티스성 관절염, 안구 신생혈관생성 및 암)를 치료하기 위한 적합한 투여 정보를 개발할 수 있다.
인간화된 형태의 항-VEGF 항체 A4.6.1은 항암제로서 임상 시험에 사용되었다 {참조: Brem, 1998; Baca 등, 1997; Presta 등, 1997 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)}. 따라서, 상기한 임상 데이터는 본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및2C3 치료를 위한 치료 투여량을 결정하는 데에 기준으로서 생각될 수 있다. VEGF이 VEGFR2-매개 활성만을 억제하는 것이 유익할 지라도, 종양을 가진 마우스에서의 연구에서 본 발명의 2C3가 A4.6.1과 마찬가지로 효과적임을 보인다. 또한, 치료에 사용될 수 있는 인간화된 항-VEGF 항체의 투여량을 추가로 예시하기 위해 WO98/45331을 본원에 참조문헌으로서 포함하였다.
종양 치료에 있어서 컨쥬게이션된 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트의 사용과 관련하여, 유리한 결과를 얻기 위해 종양 혈관체에 광범위한 치료제를 성공적으로 전달하는 것에 대한 과학 문헌 및 특허 문헌을 참조할 수 있다. 예를 들면, 상기한 치료제-표적화제 작제물의 사용을 추가로 기재하기 위해, 미합중국 특허 제5,855,866호, 제5,877.289호, 제5,965,132호, 제6,051,230호, 제6,004,555호, 제5,776,427호, 제6,004,554호 및 제6,036,955호, 특허출원 제08/482,369호 (특허료 납부일: 1998년 10월 20일)을 본원에 참조문헌으로 포함하였다. 본 발명의 경우, 상기한 치료제-표적화제 작제물은, 부착된 치료제의 항종양 활성을 증대시키거나 강화시키는 항-안지오제네시스 효과를 가지는 표적화 제제 부위를 포함한다.
당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 임상 치료에 들어가기 이전에 예비 임상 시험과 관련한 지침으로서 사용될 수 있는 실제 객관적인 사실이 있다. 하지만, 기타의 항-VEGF 항체의 임상에의 사용, 본원에서 보여주는 채택된 모델에서의 항종양 효과 및 본 발명의 방법의 강화된 안전성면에서, 본 발명은 임상 치료에 신속하게 적용할 수 있는 치료제를 제공한다. 따라서, 예비 임상 시험을 수행하여, 가장이로운 항체, 투여량 또는 복합 치료를 선별할 수 있다.
지속적으로 항-안지오제네시스 효과, 전이 억제, 종양 혈관체 파괴, 종양 혈전형성, 괴사 및/또는 일반적인 항종양 효과를 가지는 것으로 검출되는 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트는 유용한 발명이 될 것이다. 따라서, 본 발명은, 특히 종양에서 방출되는 사이토카인이 혈관에 작용하여 항원성 프로파일을 변경시키기 때문에, 종양 하류의 혈관에 대해 효과적이므로 적어도 서브-세트의 배출 혈관(draining vessel)을 표적화할 수 있다.
또한, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트 투여 또는 복합 치료가 가지는 항-안지오제네시스 및/또는 항종양 효과가 목적하는 치료 범위의 최저를 향한 경우, 이러한 치료법은 특정 종양 표적 또는 환자에 있어서 다른 모든 공지된 치료법과 동등하거나 보다 효과적일 수 있다. 소정의 종양 및 상태들은 중장기간 동안 효과적으로 치료할 수 없다는 것이 불행하게도 임상의들은 명백히 알고 있으나, 그렇다 할지라도 일반적으로 제안되고 있는 기타의 다른 방법에 따른 효과와 적어도 동일한 정도의 효과를 가지는 본 치료법의 유용성이 부인되는 것은 아니다.
혈관생성된 종양을 치료하기 위한 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트 작제물의 적합한 투여량을 결정함에 있어서, 본원에 기재된 동물 연구 결과 및 기존의 문헌에 따른 내용으로부터 적합한 임상 투여량을 용이하게 추론할 수 있을 것이다. 동물 투여량에서 인간 투여량으로 전환하기 위해, 실험 동물의 단위 질량당 투여되는 제제의 질량을 계산하고, 실험 동물과 인간환자 사이의 체표면적 (m2) 차이를 계산하는 것이 바람직하다. 이러한 모든 계산은 당업자들에게는 잘 알려져 있으며 통상 이루어지고 있는 과정이다.
예를 들면, 마우스 연구에서의 성공적인 2C3 투여량을 사용하고, 질량 및 체표면적에 기초한 표준 계산법을 사용한 결과, 인간 환자에 있어서의 효과적인 투여량은 약 1mg/m2내지 약 1000mg/m2, 바람직하게는 약 50mg/m2내지 500mg/m2, 가장 바람직하게는 약 10mg/m2내지 약 100mg/m2이다. 상기한 투여량은 항-안지오제네시스 제제로서 사용하기 위한 naked 또는 비-컨쥬게이션된 항체와 관련하여 사용하기에 적합할 지라도, 상기한 투여량은 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 naked 항체 ; 및 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트에 대한 적합한 투여량이다.
따라서, 인간에 투여하기 위한 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트의 유용한 적은 투여량은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 약 50mg/m2이고; 유용한 큰 투여량은 약 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 925, 950, 975 또는 약 1000mg/m2이다. 인간에 투여하기 위한 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트의 유용한 중간 정도의 투여량은 상기한 적은 투여량과 큰 투여량 사이의 투여량일 수 있는 데, 예를 들면 약 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200,250, 300, 350, 400, 450, 500, 525, 550 또는 약 575mg/m2등이다.
상기 예시된 투여량을 이용한 특정 투여량 범위 및 상기 특정 범위 사이의 중간 수치를 사용할 수 있다. VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트를 사용하는 경우, 응고 면역 컨쥬게이트는 독소 면역 컨쥬게이트에 비해 높은 투여량으로 일반적으로 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
일반적으로, 약 10 내지 100mg/m2, 약 10 내지 90mg/m2, 약 10 내지 80mg/m2, 약 20 내지 100mg/m2, 약 20 내지 90mg/m2, 약 20 내지 80mg/m2, 약 30 내지 100mg/m2, 약 30 내지 90mg/m2, 약 30 내지 80mg/m2, 약 15 내지 100mg/m2, 약 25 내지 100mg/m2, 약 35 내지 100mg/m2, 약 15 내지 90mg/m2, 약 25 내지 90mg/m2, 약 35 내지 90mg/m2등의 투여량 범위의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트를 사용하는 것이 바람직하다. 상기한 투여량 범위와 상관없이, 본원에 기재된 파라미터 및 상세한 지침에 기초하여, 활성 또는 최적 범위가 변화되더라도 본 발명의 범위내에 포함된다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 다른 제제와 복합하여 사용하는 경우에는 적은 투여량이 보다 바람직할 수 있으며, VEGFR2에만 결합하는 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 항체의 강화된 안전성과 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 및 2C3-기초 응고인자 및 항-안지오제네시스 면역 컨쥬게이트의 강화된 안전성을 특히 고려하면, 큰 투여량도 용인될수 있을 것이다. 인간 항체 또는 인간화된 항체 (및, 임의적으로는, 인간 응고인자 또는 항-안지오제네시스 단백질)를 사용함으로써 본 발명을 임상용으로 사용하기에 보다 안전하고, 건강한 조직에 대해 큰 독성 또는 부작용을 끼칠 가능성이 줄어든다.
본 발명의 치료 요법의 의도는, 허용하지 못할 정도의 독성과 관련된 수준 이하로 투여량을 유지하면서 상당한 정도의 항종양 효과를 가지게 하는 것이다. 투여량 자체를 변화시키는 것과 더불어, 치료 방법을 최적화하기 위해 투여 방법을 조정할 수 있다. 하나의 치료 프로토콜은, 약 1mg/m2내지 약 1000mg/m2, 바람직하게는 약 50mg/m2내지 500mg/m2, 가장 바람직하게는 약 10mg/m2내지 약 100mg/m2의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 또는 면역 컨쥬게이트; 또는 이를 포함하는 치료 칵테일을 1주당 약 1 내지 3회, 바람직하게는 정맥내 투여 또는 근육내 투여 (가장 바람직하게는, 정맥내 투여)하는 것이다.
상기 특정 투여량을 투여하는 경우, 약제학적으로 허용가능한 조성물 (멸균성, 발열성, 순도 및 일반적인 안전성에 관한 FDA 기준에 따름)을 환자에게 전신 투여하는 것이 바람직하다.
당연히, 널리 사용되기 이전에 임상 시험을 거치게 된다. 환자 치료 및 모니터링을 포함한 임상 시험을 수행하는 다양한 요소들은 본원 기재내용에 비추어 당업자들에게 공지되어 있을 것이다. 하기 정보는 이러한 시험들을 확립하기 위해 사용되는 일반적인 지침으로서 제공된 것이다.
상기한 제1 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료 연구를 위해 선택된 환자들은, 기존의 치료법 중 하나 이상에 대해서는 반응을 보이지 않으며, 물리적인 시험, 실험실 기법 및/또는 방사선 공정을 통해 측정되는 객관적으로 측정가능한 질환을 가지는 환자이다. 본 연구에 착수하기 이전에 최소한 2주 전에는 모든 화학치료는 중단하여야 한다. 쥐의 모노클론 항체 또는 항체의 일부분을 사용하는 경우, 상기 환자들은 쥐의 면역 글로불린에 대해 알레르기 반응을 보인 적이 없어야 한다.
삼중 내강 포트 (triple lumen port)를 가진 내재하는 중심 정맥 카테테르 (indwelling central venous catheter)를 사용하게 되면 소정의 잇점이 있다. 예를 들면, 0.22μ필터를 이용하여 상기한 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 제제를 여과한 후, 염수 등을 이용하여 적합하게 희석시켜 최종 체적이 100ml가 되게 한다. 사용하기 이전에, 테스트 샘플을 상기와 동일한 방식으로 여과시킨 후, A280를 측정하여 여과 이전 및 이후의 농도를 분석하여야 한다. 예상되는 회수율은 87% 내지 99% 이어야 하며, 단백질 손실을 조정할 수 있다.
약 4 내지 24시간에 걸쳐, 각 환자가 2 내지 7일간의 간격으로 2 내지 4회를 주입(infusion)받도록, 상기한 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체 또는 컨쥬게이트를 투여할 수 있다. 또한, 7일간에 걸쳐 일정한 속도로 주입하여 투여할 수도 있다. 모든 투여량 수준에서의 상기한 주입은, 관찰되는 독성에 따라 정해져야 한다. 따라서, 1회 주입후 또는 일정한 속도로 주입하는 동안 특정 시간에독성 II 등급이 되는 경우, 독성이 개선되지 않는 한 추가 투여를 보류시키거나 일정한 속도의 주입을 중단시켜야 한다. 환자 중 약 60%가 모든 카테고리에 있어서 허용가능하지 않는 등급 III 또는 IV의 독성을 나타낼 때까지, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료제의 투여량을 증가시켜 환자에게 투여한다. 이러한 수치의 2/3에 해당하는 투여량이 안전한 투여량으로 정의된다.
물론, 물리적인 검사, 종양 측정 및 실험실 테스트는 치료이전 및 이후 최대 1개월까지의 시간 간격을 두고 수행되어야 한다. 실험실 테스트에는, 완전한 혈구수 계측, 혈청 크레아티닌, 크레아틴 카이네이즈, 전해질, 유레아, 질소, SGOT, 빌리루빈, 알부민 및 총 혈청 단백질을 포함하여야 한다. 치료후 최대 60일간 입수한 혈청 샘플에 대해, 투여된 치료제 및 항체의 존재에 대한 방사성 면역 분석으로 평가하여야 한다. ELISA 또는 RIA와 같은 표준 분석법을 사용하여 혈청을 면역 분석하면, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료제의 약동학 및 제거를 평가할 수 있다.
항종양 반응을 평가하기 위해, 환자에 대해 마지막 주입후 48시간 내지 1주에서 시험하고, 30일에 다시 시험한다. 뚜렷이 나타나는 질환이 존재하는 경우, 치료하는 동안, 치료 종류후 1주일 이내 및 제30일에 모든 질량체의 수직 직경을 측정하여야 한다. 뚜렷하지 않은 질환을 치료하기 위해서는, 가슴, 복부 및 골반 전체에 대해 48시간에서 1주 및 30일째에 1cm 간격으로 일련의 CT 스캐닝을 수행할 수 있다. 또한, 질환 부위에서 수득한 생검 또는 적합한 경우에는 혈액이나 체액 샘플을 이용하여, 조직 계측기 및/또는 플로우 계측기를 사용하여 조직 샘플을 분석하여야 한다.
임상 반응은 허용가능한 측정치로 정의될 수 있다. 예를 들면, 완전 반응 (complete response)은 치료이후 1개월 후에 모든 측정가능한 종양이 사라진 것으로 정의될 수 있다. 부분 반응(partial response)은 치료이후 1개월 후에 모든 측정가능한 종양 결절의 수직 직경의 50% 이상 감소하고 종양 부위의 증가는 없는 것으로 정의될 수 있다. 이와 유사하게, 혼합 반응 (mixed response)은 치료이후 1개월 후에 모든 측정가능한 병변의 수직 직경이 50% 이상 감소하고 하나 이상의 부위에서 진행이 된 경우로 정의될 수 있다.
상기한 바와 같은 임상 시험결과에 비추여, 보다 정확한 치료 방법을 정할 수 있을 것이다. 치료 대상의 상태에 따라, 추후에 투여량을 어느 정도 변경해야 할 필요성이 있을 수도 있다. 본원에 기재된 내용에 비추어, 투여를 담당하는 내과의는 각각의 개인별로 적합한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 이러한 최적화 및 조정 과정은 당업계에서는 통상적으로 이루어지는 것이며, 과도한 시험을 필요로 하지 않는다.
G. 복합 치료
관절염, 건선, 아테롬성 동맥경화증, 당뇨성 망막증, 연령-관련 맥락막 퇴행, Grave 질환, 혈관 재발 협착증, 혈관종 및 신생혈관생성 녹내장 (또는 상기한 기타의 질환)과 같은 안지오제네시스성 질환 또는 고형 종양을 치료하는 경우, 본 발명은 기타의 치료법과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료 방법은, 환자가 보이는 특정 종양 또는 질환의 치료에 일반적으로 사용되는 기타의 다른 방법과 함께 사용될 수 있다. 특정 치료 방법이 환자 상태에 치명적이지 않고, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료를 크게 상쇄시키지 않는 경우, 본 발명은 복합 치료 방법으로 사용할 수 있다.
고형 종양의 치료와 관련하여, 본 발명은 고전적인 방법 (예를 들면, 외과 수술, 방사선 치료, 화학치료 등)과 함께 사용될 수 있다. 따라서, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 작제물을, 외과 수술 또는 방사선 치료와 동시 또는 이전 또는 이후에 사용하거나; 기존의 화학치료, 방사선 치료 또는 항-안지오제네시스 제제 또는 표적화된 면역독소 또는 응고 리간드와 함께 또는 이전에 또는 이후에 환자에게 투여하는, 복합 치료법을 본 발명에서 제공한다.
방사선치료, 방사선치료제, 항-안지오제네시스 제제, 세포사멸 유도제 및 항-튜불린제와 본 발명의 복합 사용이 특히 바람직하다. 상기 제제의 많은 예들이 본 발명의 면역 컨쥬게이트와 관련하여 상기에 기재되었다. 치료 컨쥬게이트의 일부분으로서 사용하기 위해 앞에서 기재된 제제들은 별개로 사용될 수도 있으나, 본 발명과 함께 작동가능하게 복합 사용할 수 있다.
하나 이상의 제제를 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료법과 복합 사용하는 경우, 복합 치료 효과가 각 치료법을 별개로 수행하였을 때 관찰되는 효과의 합이 될 필요는 없다. 적어도 가산 효과를 가지는 것이 일반적으로 바람직하겠지만, 상기한 단일 치료법 중 하나를 사용할 때의 효과보다 큰 항종양 효과를 가지는 경우는 유리한 것이다. 또한, 시너지 효과를 가지는 것이 분명히 가능하고잇점이 있겠지만, 필수 사항은 아니다.
복합 항-종양 치료법을 수행하기 위해, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 작제물과 기타의 항암제를 복합하여, 항종양 복합 활성을 나타내기에 효과적인 방식으로 동물에게 투여한다. 따라서, 종양 혈관체내에 복합 형태로 존재하고 복합 활성을 나타내기에 효과적인 양 및 기간 동안 상기 제제를 제공한다. 이를 위해, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료제 및 항암제를 단일 조성물 형태 또는 상이한 투여 경로를 통한 2가지의 상이한 조성물 형태로 동물에게 동시에 투여할 수 있다.
이와 달리, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료는 항암제 치료에 앞서서 또는 이후에 (예를 들면, 수분 내지 수주 및 수개월의 간격을 두고) 수행할 수 있다. VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 제제 및 항암제는 종양에 대해 유리한 복합 효과를 발휘한다는 것을 확신하게 될 것이다.
대부분의 항암제는, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항-안지오제네시스 치료에 앞서서 투여된다. 하지만, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 컨쥬게이트가 사용되는 경우, 다양한 항암제를 동시에 또는 후속하여 투여할 수 있다.
암 치료에 있어서 물질의 복합 사용에 관해서는 일반적으로 잘 알려져 있다. 예를 들면, 미합중국 특허 제5,710,134호 (본원에서 참조문헌으로 포함)에서는, 비독성 물질 또는 "전구 약물"과 복합하여 괴사를 유도하는 성분을 개시하고 있다. 괴사 과정에서 방출되는 효소가 비독성 "전구 약물"을 절단하여 독성 "약물"로 전환시켜 종양 세포를 죽이게 된다. 또한, 미합중국 특허 제5,747,469호 (본원에서 참조문헌으로 포함)에서는, p53를 코드하는 바이러스 벡터 및 DNA-손상 제제를 복합 사용하는 것에 대해 기술하고 있다. 이와 유사한 방법들은 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
소정의 경우, 특히 각 투여 사이의 기간이 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일), 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주) 또는 수개월 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개월)인 경우, 치료 기간을 연장시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 외과 수술 또는 화학 치료와 같이 하나의 치료법은 종양을 실질적으로 파괴하는 것이 목적이고 항-안지오제네시스-기초 치료법과 같은 다른 치료법은 미세전이 또는 종양의 재성장을 방지하는 것이 목적인 경우에 유리할 수 있다. 항-안지오제네시스 제제는, 상처 치유를 효과적으로 하기 위해 외과 수술후에 투여 시점을 조심스럽게 결정하여 투여하여야 한다.
또한, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 제제 또는 항암제 중 하나를 1회 이상 투여할 수도 있다. 상기 제제는 일 또는 주를 교대로 하여 상호교환하여 투여할 수 있고; 일련의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료를 한 후에 일련의 항암제 치료를 수행할 수도 있다. 어떠한 경우에도, 복합 치료법을 사용하여 종양을 퇴행시키기 위해서는, 투여 횟수와 무관하에 항종양 효과를 발휘하기에 효과적인 양으로 상기한 2가지의 제제를 전달하는 것이 필요하다.
외과 수술의 경우, 외과 수술 (surgical intervention)은 본 발명과 복합적으로 시행될 수 있다. 방사선 치료와 관련하여, 종양 세포내에 국부적으로 DNA 손상을 유도하는 모든 메카니즘 (예를 들면, γ-방사, X선, UV 방사, 극초단파 및 전자파 등)을 사용할 수 있다. 방사성 동위원소를 종양 세포에 직접 전달할 수도 있으며, 이러한 방법은 표적 항체 또는 기타의 표적화 수단 (바람직하게는, 2C3와 같은 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체)과 함께 사용될 수 있다.
또한, 사이토카인이 복합 치료에 효과적인 파트너로 알려져 있다. 이러한 복합 치료방법에 다양한 사이토카인이 사용될 수 있다. 사이토카인의 예로는, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-β, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNFα, TNFβ, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ이 포함된다. 사이토카인은, 환자의 상태 및 상대적인 독성과 같은 임상 증상에 따라 표준 치료법에 따라 투여한다. 또한, 유테로글로빈은 전이를 방지 또는 억제하기 위해 사용될 수 있다 {참조: 미합중국 특허 제5,696,092호 (본원에 참조문헌으로 포함)}.
G1. 화학 치료제
소정의 양태에서는, 본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료제를 화학치료제와 함께 복합 투여할 수 있다. 본원에 기재된 복합치료법에서는 다양한 종류의 화학 치료제를 사용할 수 있다. 이러한 화학 치료제의 예로는, 아드리아마이신, 닥티노마이신, 미토마이신, 카르미노마이신, 다우노마이신, 독소루비신, 타목시펜, 탁솔, 탁소테레, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 에토포시드 (VP-16), 5-플루오로우라실 (5FU), 시토신 아라비노시드, 사이클로포파미드, 티오테파, 메토트렉세이트, 캄포테신, 악티노마이신-D, 미토마이신 C, 시스플라틴(CDDP), 아미놉테린, 콤브레타스타틴 및 이의 유도체 및 전구 약물이 포함된다.
당업자들이 이해하는 바와 같이, 화학치료제의 적합한 투여량은 상기 화학치료제를 단독으로 또는 다른 화학치료제와 함께 복합 투여하는 임상 치료에서 이미 사용되고 있는 투여량 부근의 양이다. 예를 들면, 시스플라틴과 같은 제제 및 기타의 DNA-알킬화제가 사용될 수 있다. 시스플라틴은 암 치료에 널리 사용되고 있는 데, 총 3회(course) 동안 3주 마다 5일간 20mg/m2을 임상 투여하여 효과를 나타낸다. 시스플라틴은 경구 흡수되지 않기 때문에, 주사, 정맥 투여, 경피 투여, 종양내 투여 또는 복강내 투여를 통해 전달되어야 한다.
또 다른 유용한 제제로는, DNA 복제, 유사분열 및 염색체 분리를 방해하는 화합물이 포함된다. 이러한 화학 치료제로는, 아드리아마이신 (독소루비신으로도 알려져 있음), 에토포시드, 베라파밀, 포도필로톡신 등이 포함된다. 임상적으로 암 치료에 널리 사용되고 있는 상기 화합물의 경우, 아드리아마이신의 경우에는 21일간의 간격을 두고 25 내지 75mg/m2을 정맥내 덩어리 주사 (bolus injection) 투여하고, 에토포시드의 경우에는 35 내지 50mg/m2을 정맥내 투여하거나 정맥내 투여량의 2배의 투여량을 구강 투여한다.
폴리뉴클레오티드 전구체의 합성 및 신뢰성 (fidelity)을 방해하는 제제를 사용할 수도 있다. 광범위한 테스트를 거치고 용이하게 입수가능한 제제가 특히 유용하다. 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 제제는 암 조직에서 우선적으로 사용되기 때문에, 암 세포를 표적하는 데에 매우 유용하다. 5-FU는 꽤 독성이 있지만,비경구를 포함한 다양한 담체내에 적용할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우에는 투여량 3 내지 15 mg/kg/일을 통상적으로 사용한다.
복합 치료에 사용하는 화학치료제의 예들이 하기 표 C에 나열되어 있다. 나열된 각 제제는 예시적인 것일 뿐 이에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 "Remington's Pharmaceutical Science" 15th Edition, chapter 33, pp.624-652"를 참조할 것이다. 치료할 상태에 따라 투여량은 변할 수 있다. 치료를 담당하는 의사는 개인에게 적합한 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
[표 C]
신생물 질환에 유용한 화학치료제
G2. 항-안지오제네시스 제제
정상적인 생리 조건하에서는, 인간 또는 동물은 매우 특이한 상태에서만 안지오제네시스를 겪게 된다. 예를 들면, 상처 치유, 태아 및 배 발생, 황체 형성, 자궁내막 형성 및 태반 형성시 안지오제네시스가 통상적으로 관찰된다. 통제되지 않는 (지속적인 및/또는 조절되지 않는) 안지오제네시스는 다양한 질환과 관련되며, 종양 전이시에 발생한다.
통제되거나 통제되지 않는 안지오제네시스는 유사한 방식으로 진행되는 것으로 생각된다. 기저막에 의해 둘러싸여 있는 혈관 주위 세포 및 내피세포는 모세혈관을 형성한다. 내피세포 및 백혈구에서 방출되는 효소에 의해 기저막이 파괴되면서 안지오제네시스가 시작된다. 이때, 혈관 내강을 따라 위치하는 내피세포가 기저막을 뚫고 들어간다. 안지오제네시스 자극 인자가 내피 세포를 유도하여 파괴된 기저막을 뚫고 이동하도록 한다. 이러한 이동성 세포는 모 혈관으로부터 "돌출부(sprout)"를 형성하는 데, 여기서 내피 세포가 유사분열하여 증식이 일어난다. 내피 돌출부가 상호 통합되어 모세 루프를 형성하여 새로운 혈관을 생성한다.
본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체는, 하나 이상의 기타의 항-안지오제네시스 치료법과 함께 복합 사용할 수 있다. VEGF를 억제하는 기타의 제제 {예를 들면, 기타의 중성화 항체 (Kim 등, 1992; Presta 등, 1997; Sioussat 등, 1993; Kondo 등, 1993; Asano 등, 1995); 가용성 수용체 작제물 (Kendall 및 Thomas, 1993; Aiello 등, 1995; Lin 등, 1998; Millauer 등, 1996); 티로신 카이네이즈 억제제 (Siemeister 등, 1998); VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 리보자임, RNA 앱타머 및 안티센스 전략 (Saleh 등, 1996; Cheng 등, 1996; Ke 등,1998; Parry 등, 1999)}와의 복합 치료가 포함된다. 길항 특성을 가지는 VEGF 변이체들도 사용될 수 있다 {참조: WO98/16551}.
항-안지오제네시스 치료법은 항-안지오제네시스 제제의 제공 또는 안지오제네시스 제제의 억제에 기초할 수 있다. 안지오제네시스 제제의 억제는 VEGF를 억제하기 위한 상기한 하나 이상의 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 중화 항체, 가용성 수용체 작제물, 소분자 억제제, 안티센스, RNA 앱타머 및 리보자임이 사용될 수 있다. 예를 들면, 안지오제닌에 대한 항체가 사용될 수 있다 {참조: 미합중국 특허 제5,520,914호 (본원에 참조문헌으로 포함)}. FGF는 안지오제네시스와 관련되어 있다는 점에 있어서, FGF 억제제가 사용될 수 있다. 소정의 예로는, 아르카란 설페이트와 같은 글리코사미노클리칸을 포함한, 주요 반복 유닛으로서 2-O-설페이트 우론산과 N-아세틸글루코사민이 순서상 교대하는 화합물이 있다. 이러한 화합물은 미합중국 특허 제6,028,061호에 기재되어 있으며, 본 발명과 복합 사용할 수 있다.
다양한 질환 상태에서 나타나는 안지오제네시스를 치료하기에 유용한 수많은 티롯니 카이네이즈 억제제가 알려져 있다. 이러한 예로는, 4-아미노피롤로[2,3-d]피리미딘 (미합중국 특허 제5,639,757호 - 본원에 참조문헌으로 포함)이 있으며, 본 발명과 복합하여 사용할 수 있다. VEGFR2 수용체를 통해 티로신 카이네이즈 신호 전달을 조절할 수 있는 유기 분자의 추가의 예는, 안지오제네시스 질환 치료시 본 발명과 함께 복합 사용하는 것을 추가로 기재하기 위해 본원에 참조문헌으로 포함한 미합중국 특허 제5,792,771호의 퀴나졸린 화합물 및 조성물이 있다.
또한, 기타의 화학적 클래스의 화합물들이 안지오제네시스를 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 본 발명과 함께 복합 사용할 수 있을 것이다. 예를 들면, 지혈성 (angiostatic) 4,9(11)-스테로이드 및 C21-산소화 스테로이드와 같은 스테로이드 {참조: 미합중국 특허 제5,972,922호 (본원에 참조문헌으로 포함)}가 복합 치료에 사용될 수 있을 것이다. 미합중국 특허 제5,712,291호 및 제5,593,990호 (본원에 참조문헌으로 포함)에서는, 탈리도미드 및 관련 화합물, 전구체, 유사체, 대사물 및 가수분해 생성물을 기재하고 있는 데, 이들은 본 발명과 함께 복합 사용되어 안지오제네시스를 억제할 수 있다. 미합중국 특허 제5,712,291호 및 제5,593,990호에 기재된 화합물은 경구 투여할 수 있다. 복합치료와 관련하여 유용하게 사용될 수 있는 또 다른 항-안지오제네시스 제제의 예는 하기의 표 D에 나열되어 있다. 하기 나열되어 있는 제제들은 예시에 불과하며 이에 한정되는 것은 아니다.
[표 D]
안지오제네시스의 억제제 및 네가티브 조절제
물질 참조문헌
안지오스타틴 O'Reily 등, 1994
엔도스타틴 O'Reily 등, 1997
16KDa 프로락틴 단편 Ferrara 등, 1991; Clapp 등, 1993; D'Angelo 등, 1995; Lee 등, 1998
라미닌 펩티드 kleinman 등, 1993; Yamamura 등, 1993; Iwamoto 등, 1996; Tryggvason, 1993
피브로넥틴 펩티드 Grant 등, 1998; Sheu 등, 1997
조직 메탈로프로티네이즈 억제제 (TIMP 1, 2, 3, 4) Sang, 1998
플라스미노겐 활성화제 억제제 (PAI-2) Soff 등, 1995
종양 괴사 인자 α(높은 투여량, 실험실내) Frater-Schroder 등, 1987
TGF-β1 RayChadhury 및 D'Amore, 1991; Tada 등, 1994
인터페론 (IFN-α, -β, -γ) Moore 등, 1998; Lingen 등, 1998
ELR-CXC 케모카인: IL-12, SDF-1, MIG, 혈소판 인자 4 (PF-4), IP-10 Moore 등, 1998; Hiscox 및 Jiang, 1997; Coughlin 등, 1998; Tanaka 등, 1997
트롬보스폰딘 (TSP) Good 등, 1990; Frazier, 1991; Bornstein, 1992; Tolsma 등, 1993; Sheibani 및 Frazier, 1995; Volpert 등, 1998
SPARC Hasselaar 및 Sage, 1992; Lane 등, 1992; Jendraschak 및 Sage, 1996
2-메톡시오에스트라디올 Fotsis 등, 1994
프롤리페린-관련 단백질 Jackson 등, 1994
수마린 Gagliardi 등, 1992; Tanaka 등, 1994; Waltenberger 등, 1996; Gagliardi 등, 1998; Manetti 등, 1998
탈리도미드 D'Amato 등, 1994; Kenyon 등, 1997; Wells, 1998
코르티손 Thorpe 등, 1993; Folkman 등, 1983; Sakamoto 등, 1986
리노미드 Vukanovic 등, 1993; Ziche 등, 1998; Nagler 등, 1998
푸마길린 (AGM-1470, TNP-470) Sipos 등, 1994; Yoshida 등, 1998
타목시펜 Gagliardi 및 Collins, 1993; Lindner 및 Borden, 1997; Haran 등, 1994
한국형 미스트레토 추출물(Viscum album coloratum) Yoon 등, 1995
레티노이드 Oikawa 등, 1989; Lingen 등, 1996; Majewski 등, 1996
CM101 Hellerqvist 등, 1993; Quinn 등, 1995; Wamil 등, 1997; Devore 등, 1997
덱사메타손 Hori 등, 1996; Wolff 등, 1997
백혈병 억제 인자 (LIF) Pepper 등, 1995
안지오제네시스를 억제하는 데에 사용될 수 있는 소정의 바람직한 성분들로는, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 바스쿨로스타틴, 칸스타틴 및 마스핀이 있다. 이러한 제제들은 본 발명의 면역 컨쥬게이트와 관련하여 이미 기재되었으며, 복합 형태 및 컨쥬게이트되지 않은 형태로 사용될 수 있다. 또한, 면역 컨쥬게이트 형태에서 상기한 기타의 바람직한 제제로는 안지오포이에틴 (특히, 안지오포이에틴-2)이 있으며, 이는 본 발명과 함께 복합 사용될 수 있다.
세균성 다당류 CM101 및 항체 LM609를 포함한 소정의 항-안지오제네시스 치료법이 종양 퇴행을 유발한다는 것이 이미 밝혀졌다. CM101은, 종양에서 신생혈관생성 염증을 유도하는 능력이 있는 것으로 잘 알려져 있는 세균성 다당류이다. CM101은, 보체 시스템의 활성화를 자극하는 퇴행된 (dedifferentiated) 내피 상에 발현된 수용체와 결합하여 교차 결합한다. 또한, CM101은 종양을 특이적으로 표적화하는 사이토카인-유발 염증 반응을 시작케 한다. CM101은 VEGF 및 이의 수용체의 발현을 하향 조절하는 특유한 항-병리성 안지오제네시스 제제이다. CM101은 항암제로서 현재 임상 시험에 있으며, 본 발명과 함께 복합 사용될 수 있다.
또한, 트롬보스폰딘 (TSP-1) 및 혈소판 인자 4 (PF4)가 본 발명과 함께 복합 사용될 수 있다. 이들은, 헤파린과 관련된 안지오제네시스 억제제이며, 혈소판 α-과립에서 발견된다. TSP-1은 세포외 매트릭스의 구성성분인 450kDa의 다중 도메인의 큰 당단백질이다. TSP-1은, HSPG, 피브로넥틴, 라미닌 및 상이한 유형의 콜라겐을 포함한, 세포외 매트릭스에서 발견되는 많은 프로테오글리칸 분자에 결합한다. TSP-1은, 실험실내에서 내피세포의 이동 및 증식을 억제하고, 생체내에서 안지오제네시스를 억제한다. 또한, TSP-1은 형질변형된 내피세포의 악성 표현형 및 종양 형성을 억제한다. 종양 억제 유전자 p53은, TSP-1의 발현을 직접 조절하는 것으로 밝혀졌는 데, p53 활성을 잃게 되면 TSP-1 생산이 급격히 감소하게 되고 이에 부수하여 종양-시발 안지오제네시스가 증가한다.
PF4는, 실험실내에서 내피세포 증식을 강력하게 억제할 수 있고 생체내에서 안지오제네시스를 강력하게 억제할 수 있는 CXC ELR 케모카인 패밀리에 속하는 70aa 단백질이다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달되거나 종양내 투여된 PF4는,종양 성장을 억제할 수 있다.
인터페론 및 메탈로프로티네이즈 억제제는, 본 발명과 복합 사용될 수 있는 자연발생적인 2가지의 안지오제네시스 억제제 클래스이다. 인터페론의 항-내피 활성에 대해서는 1980년대부터 알려져 있었지만, 억제 메카니즘에 대해서는 아직 불확실하다. 인터페론은 내피세포의 이동을 억제할 수 있으며, 종양 세포에 의한 안지오제네시스 프로모터 생산을 억제할 수 있는 능력에 의해 매개될 수 있는 소정의 생체내 항-안지오제네시스 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 특히, 혈관생성 종양은 인터페론에 민감한 데, 예를 들면 증식하는 혈관종은 IFNα에 의해 성공적으로 치료될 수 있다.
메탈로프로티네이즈의 조직 억제제 (TIMP)는, 안지오제네시스를 억제할 수 있고 복합 치료 프로토콜에서 사용될 수 있는, 자연발생적인 매트릭스 메탈로프로티네이즈 (MMP)의 억제제 패밀리이다. MMP는, 혈관 네트워크를 연장 또는 리모델링할 때에 내피세포 및 섬유아세포가 이동하는 매트릭스를 분해하기 때문에 안지오제네시스에서 핵심 역할을 수행한다. 사실상, MMP 중의 하나인 MMP-2는 인테그린 αvβ3를 통해 활성화된 내피와 관련되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 상호 작용이 MMP-2 단편에 의해 방해되면, 안지오제네시스가 줄어들게 되어 종양 성장이 억제된다.
안지오제네시스를 억제하는 수많은 약리학적 제제가 있는 데, 이들 중 하나 이상은 본 발명과 함께 복합 사용될 수 있다. 이러한 제제로는, AGM-1470/TNP-470, 탈리도미드 및 카복시아미도트리아졸 (CAI)이 포함된다. 푸마길린은, 1990년도에 안지오제네시스의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌으며, 그 이후로 푸마길린의 합성 유사체인 AGM-1470 및 TNP-470이 개발되었다. 이들 2가지 약물 모두는, 실험실내에서 내피세포 증식을 억제하고, 생체내에서 안지오제네시스를 억제한다. TNP-470은 인간 임상 실험에서 광범위하게 연구되어 왔는 데, 실험 데이터를 보면 장기간 투여가 최적인 것으로 나타났다.
탈리도미드는 원래 진정제로서 사용되었는 데, 강력한 최기 물질 (teratogen)인 것으로 밝혀졌으며, 사용되지 않았다. 1994년에, 탈리도미드는 안지오제네시스 억제제인 것으로 밝혀졌다. 현재, 탈리도미드는 항암제 및 혈관생성 눈 질환 치료제로 임상 시험 중에 있다.
CAI는, 액틴의 재구성, 내피세포 이동 및 콜라겐 IV상에서의 분산을 억제하는 칼슘 채널 차단제로서 작동하는, 저분자량의 안지오제네시스-합성 억제제이다. CAI는, 생리적으로 가능한 농도에서 신생혈관생성을 억제하며, 암 환자들이 경구 투여시 참을 수 있다. CAI를 이용한 임상 시험 결과, 치료전에 진행성 질환을 가진 암 환자의 49%에서 질환이 안정되었음을 보였다.
헤파린 또는 헤파린 단편 존재하의 코르티손은, 내피세포 증식을 차단함으로써 마우스에서 종양 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 상기 스테로이드 및 헤파린의 결합된 억제 효과와 관련된 메카니즘은 불확실하지만, 헤파린이 내피세포가 상기 스테로이드를 흡수하는 것을 증가시킬 수 있는 것으로 생각된다. 상기 혼합물은 새로이 형성된 모세혈관 아래의 기저막의 분해를 증가시키는 것으로 관찰되었으며, 이를 통해 상기한 결합 지혈 효과를 설명할 수 있을 것이다. 헤파린-코르티손 컨쥬게이트는 생체내에서 강력한 지혈 효과 및 항종양 효과 활성을 가진다.
또 다른 안지오제네시스 억제제로는, 항-침윤 인자, 레티놀산 및 패클리탁셀 (미합중국 특허 제5,716,981호-본원에 참조문헌으로 포함); AGM-1470 (Ingber 등, 1990-본원에 참조문헌으로 포함); 상어의 연골 추출물 (미합중국 특허 제5,618,925호-본원에 참조문헌으로 포함); 음이온 폴리아미드 또는 폴리우레아 올리고머 (미합중국 특허 제5,593,664호-본원에 참조문헌으로 포함); 옥신돌 유도체 (미합중국 특허 제5,576,330호-본원에 참조문헌으로 포함); 에스트라디올 유도체 (미합중국 특허 제5,504,074호-본원에 참조문헌으로 포함); 및 티아졸로피리미딘 유도체 (미합중국 특허 제5,599,813호-본원에 참조문헌으로 포함)가 포함되며 이에 한정되는 것은 아니다. 이들은, 본 발명과 복합 사용을 위한 항-안지오제네시스 조성물로서 사용될 수 있다.
αvβ3인테그린의 길항제를 포함하는 조성물은 본 발명과 함께 안지오제네시스를 억제하는 데에 사용될 수 있다. 미합중국 특허 제5,766,591호(본원에 참조문헌으로 포함)에 기재된 바와 같이, 사이클릭 폴리펩티드를 포함한 RGD-함유 폴리펩티드 및 이의 염은 αvβ3인테그린 길항제의 적합한 예이다.
또한, αvβ3인테그린에 대한 항체 LM609는 종양 퇴행을 유도한다. LM609와 같은 인테그린 αvβ3길항제는 안지오제네시스성 내피세포의 사멸을 유도하고, 정지상태의 혈관은 영향을 받지 않는다. LM609 또는 기타의 αvβ3길항제는, 내피세포및 섬유아세포의 이동에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되는 단백질 가수분해 효소인 MMP-2 및 αvβ3의 상호작용을 억제함으로써 작용할 수도 있다. 미합중국 특허 제5,753,230호에서는, 안지오제네시스를 억제하기 위해 본 발명과 함께 복합 사용하기 위한 αvβ3(비트로넥틴 αvβ3)에 대한 항체를 기재하고 있다.
이 경우에 안지오제네시스성 내피의 사멸(apoptosis)은, 나머지의 혈관 네트워크에 대해 캐스캐이드 효과를 나타낼 수 있다. 증식하라는 종양 신호에 대해 완전히 반응하는 것으로부터 종양 혈관 네트워크를 억제하는 것은, 사실상, 혈관 네트워크의 부분적 또는 완전한 붕괴를 촉발하여, 종양 세포가 죽거나 종양 체적이 감소한다. 엔도스타틴 및 안지오스타틴이 유사한 방식으로 작용할 수 있다. LM609가 정지된 혈관에는 영향을 미치지 않으나 종양 퇴행을 유발할 수 있다는 사실은, 항종양 효과를 얻기 위해 종양내의 모든 혈관이 치료를 위해 표적화될 필요는 없다는 것을 강하게 시사해준다.
Tie2 수용체를 통한 신호전달을 변경하는 것에 기초하는 다른 치료 방법 {예를 들면, Tie2 활성화를 차단할 수 있는 가용성 Tie2 수용체를 사용하는 방법 (Lin 등, 1998)}은, 본 발명과 함께 복합 사용될 수 있다. 재조합 아데노바이러스 유전자 치료법을 사용하는 상기 작제물의 전달은, 암 치료 및 전이 감소에 효과적인 것으로 밝혀졌다 {참조: Lin 등, 1998}.
G3. 세포사멸-유도제 (Apoptosis-Inducing Agents)
VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 치료제는 다른 방법과 복합사용되어 세포사멸을 유도하는 데에 유리할 수 있다. 본 발명의 면역 컨쥬게이트와 관련하여 다양한 세포사멸 유도제에 대해 이미 기재하였다. 이러한 모든 세포사멸 유도제가, 본 발명의 항체와 결합되지 않고 본 발명과 함께 복합 사용될 수 있다.
면역 컨쥬게이트로서 상기한 세포사멸 유도제와는 달리, 세포사멸 (즉, 프로그램된 세포 사멸)을 억제하는 수많은 발암 유전자가 밝혀졌다. 이러한 발암 유전자의 예로는, bcr-abl, bcl-2 (bcl-1, cyclin D1과는 상이함; GenBank 접근 번호 M14745, X06487; 미합중국 특허 제5,650,491호 및 제5,539,094호 - 각각 본원에 참조문헌으로 포함) 및 Bcl-xl, Mcl-1, Bak, A1, A20을 포함한 패밀리 구성원이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. bcl-2의 과발현이 T 세포 림프종에서 처음 발견되었다. bcl-2는, 세포사멸 경로에 있는 단백질인 Bax에 결합하여 불활성화시킴으로써 발암 유전자로서 작용한다. bcl-2 기능의 억제는 Bax의 불활성화를 방지하고, 세포사멸 경로가 계속 진행될 수 있도록 한다.
예를 들면, 안티센스 뉴클레오티드 서열을 이용하여 이러한 클래스의 발암 유전자의 억제는, 세포사멸을 강화시키기 위해 본 발명에서 사용될 수 있을 것이다 {참조: 미합중국 특허 제5,650,491호 및 제5,583,034호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)}.
G4. 면역 독소 (Immunotoxins) 및 응고 리간드 (Coaguligands)
본 발명의 치료방법은, 표적화 부위 (예를 들면, 항체 또는 리간드)가 종양 세포, 종양 혈관체 또는 종양 기질의 상대적으로 특이적인 마커에 대한, (기타의) 면역 독소 및/또는 응고 리간드와 함께 복합 사용될 수 있다. 상기한 화학치료제및 항-안지오제네시스 제제와 마찬가지로, 표적화된 독소 또는 응고제와 복합 사용함으로써 항-종양 가산(additive) 효과, 가산 효과보다 큰 효과 또는 시너지 효과를 일반적으로 가져올 것이다.
일반적으로, 본 발명의 이러한 추가적인 양태에서 사용되는 항체 또는 리간드는, 종양 부위에서 우선적으로 또는 특이적으로 발현되는 접근가능한 종양 항원을 인식하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 항체 또는 리간드는 높은 친화성을 보이는 것이 바람직하며; 상기 항체 또는 리간드 또는 이의 컨쥬게이트는 생명을 유지시키는 정상 조직 (예를 들면, 인간의 심장, 신장, 뇌, 간, 골수, 결장, 유방, 전립선, 편도선, 방광, 폐, 부신, 근육, 신경섬유, 췌장, 피부 또는 기타 장기 또는 조직에서 선택된 하나 이상의 조직)에 대해서는 유의성 있는 생체내 부작용은 없을 것이다. 용어 "유의성있는 부작용 (significant side effects)"은, 생체내에 투입되었을 때, 화학치료시에 통상적으로 발생하는 부작용과 같이 무시할 수 있을 정도 또는 임상적으로 다룰 수 있을 정도의 부작용만을 발생시키는 항체, 리간드 또는 항체 컨쥬게이트를 의미한다.
본 발명에 사용되는 상기한 제2 항암제의 하나 이상의 결합 부위는, 독소 또는 응고 인자를 종양 부위에 전달하는 (즉, 종양 부위내에 위치할 수 있는) 성분이 될 것이다. 이러한 표적화 제제는, 종양 세포, 종양 혈관체 또는 종양 기질의 성분에 대한 것일 수 있다. 일반적으로, 상기한 표적화 제제는 종양 세포, 종양 혈관체 또는 종양 기질의 표면-발현된, 표면-접근가능한 또는 표면-위치한 성분에 결합할 것이다. 하지만, 종양 혈관체 및 종양 세포의 파괴가 시작되면, 내부 성분이방출되어 실질적으로 모든 종양 성분이 추가의 표적이 될 수 있다.
많은 종양 세포 항원이 기재되어 있는 데, 이들 모두가 본 발명의 복합 양태에서 표적으로서 사용될 수 있을 것이다. 추가의 면역 독소 및 응고 리간드 표적화를 위한 적합한 종양 세포 항원으로는, 항체 B3에 의해 인식되는 항원 (미합중국 특허 제5,242,813호; ATCC HB10573); KSI/4에 의해 인식되는 항원 (미합중국 특허 제4,975,369호; 벡터 NRRL B-18356 및/또는 NRRL B-18357를 포함하는 세포에서 입수); 및 D612에 의해 인식되는 항원 (미합중국 특허 제5,183,756호; ATCC HB9796)이 있다. 그 이후 년도의 ATCC 카탈로그를 참조하여, 항종양 세포 항체를 제조하는 기타의 다른 적합한 세포 라인을 알아낼 수도 있다.
종양 혈관체 표적화를 위해, 상기한 표적화 항체 또는 리간드는, 혈관생성된 종양의 종양내 혈관에서 발현된 마커, 이러한 종양내 혈관에 흡수된 마커, 이러한 종양내 혈관상에 유도된 마커 또는 이러한 종양내 혈관에 위치된 마커에 종종 결합할 것이다. 적합하게 발현된 표적 분자로는, 예를 들면, 엔도글린, E-셀렉틴, P-셀렉틴, VCAM-1, ICAM-1, PSMA (Liu 등, 1997), TIE, LAM-1과 반응하는 리간드, VEGF/VPF 수용체, FGF 수용체, αVβ3인테그린, 플레이트로핀 및 엔도시알린이 있다. 적합한 흡수된 표적으로는, VEGF, FGF, TGFβ, HGF, PF4, PDGF, TIMP, TIE에 결합하는 리간드 및 종양-관련 피브로넥틴 이소폼 등이 있다. ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, LAM-1에 반응하는 리간드, 엔도글린, MHC 클래스 II (예를 들면 IL-1, TNF-α, IFN-γ, IL-4 및/또는 TNF-β에 의해 사이토카인-유도가능); 및 E-셀렉틴,P-셀렉틴, PDGF 및 ICAM-1 (예를 들면, 트롬빈, 인자 IX/IXa, 인자 X/Xa 및/또는 플라스민에 의해 응고인자-유도가능)과 같이 사이토카인 및 응고제에 의해 자연적으로 및 인공적으로 유도가능한 항원이 표적화될 수도 있다.
종양 혈관체의 발현된, 흡수된, 유도된 또는 위치된 마커에 대한 면역 독소의 제조 및 사용에 대한 본 발명의 기재를 보충하기 위해 하기 특허 및 특허출원을 본원에 참조문헌으로 포함하였다: 미합중국 특허출원 제08/482/369호 (특허료납부일: 1998년 10월 20일), 특허 제5,855,866호, 제5,965,132호, 제6,051,230호, 제6,004,555호, 제5,877,289호, 제6,004,554호, 제5,776,427호, 제5,863,538호, 제5,660,827호 및 제6,036,955호.
또 다른 종양 혈관체-표적화 조성물 및 방법으로는, 종양 혈관의 접근가능하고 특이적인 마커로 최근에 밝혀진 아미노포스포리피드 (예를 들면, 포스파티딜세린 및 포스파티딜에탄올아민)를 표적화하는 조성물 및 방법이다. 항-아미노포스포리피드 만을 단독으로 투여하는 경우에도, 혈전 형성 및 종양 퇴행을 유도하기에 충분하다. 따라서, 본 발명은 컨쥬게이트되지 않은 항-포스타티딜세린 및/또느 포스파티딜에탄올아민 항체와 함께 효과적으로 복합사용하거나; 상기 항체의 면역 컨쥬게이트를 사용할 수 있다.
항-아미노포스포리피드 항체 및 면역 독소의 제조 및 사용에 대한 본 발명의 기재 내용을 추가로 보충하기 위해 미합중국 예비특허출원 제60/092/672호 (출원일: 1998년 7월 13일) 및 제60/092,589호 (출원일: 1998년 7월 13일)을 본원에 참조문헌으로 포함하였다. 또한, 제60/092,589호에서는, 종양 혈관으로의 독소 및응고제의 전달 및 혈전 형성과 종양 퇴행을 유도하는 데 있어서의 유도아미노포스포리피드-결합 단백질 컨쥬게이트 (예를 들면, 아넥신 컨쥬게이트)의 사용에 관한 본 발명의 기재를 보충해주고 있다.
적합한 종양 기질 표적으로는, 기저막 마커, 제IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 설페이트, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 활성화된 혈소판, LIBS 및 테나신을 포함한, 종양 세포외 매트릭스 또는 기질 성분이거나 이에 부착된 성분이 포함된다.
종양 기질 표적화 제제의 제조 및 사용에 관한 본원의 기재를 추가로 보충하기 위해 하기 특허 및 특허 출원을 참조문헌으로 포함하였다: 미합중국 특허출원 제08/482/369호 (특허료납부일: 1998년 10월 20일), 특허출원 제08/485,482호, 제08/487,427호 (특허 제6,004,555호), 제08/479,733호 (제5,877,289호), 제08/472,631호, 제08/479,727호 및 제08/481,904호 (제6,036,955호).
상기한 제2 항암 치료제는, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 면역 독소에 사용하기 위해 본원에 기재된 세포독성 제제 또는 기타의 항세포제에 작동가능하게 부착될 수 있다. 하지만, 적합한 항세포제로는 방사선 동위원소가 있다. 리신 A 및 탈당화된 A 쇄 (dgA)와 같은 독소 잔기가 바람직하다.
본 발명과 함께 최적으로 사용하기 위한 제2의 표적화된 제제는, 응고를 촉진할 수 있는 표적화된 성분 (즉, 응고 리간드)를 포함할 수 있다. 여기서, 상기한 표적화 항체 또는 리간드는, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 응고 리간드에 사용하기 위해 본원에 기재된 것을 포함한 응고를 직접적 또는 간접적으로 촉진하는 인자에 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들면, 다른 항체를 통해) 결합할 수 있다. 이러한 용도로 바람직한 응고 인자는 조직 인자 (TF) 및 TF 유도체 {예를 들면, 절단된 TF (tTF), 멀티머 TF 및 인자 VII을 활성화시키는 능력이 결핍된 돌연변이체 TF}이다.
IV 경로를 통해 1주에 약1회씩의 빈도로 투여하는 경우, 암 치료시 복합 사용을 위한 면역 독소 및 응고 리간드의 효과적인 투여량은, 약 0.1 내지 약 2mg/kg, 바람직하게는 약 0.8 내지 약 1.2mg/kg이다. 치료 대상의 상태에 따라, 어느 정도 투여량은 변하게 된다. 투여를 책임지는 의사는 각 개인별로 적합한 투여량을 결정할 것이다.
G5. ADEPT 및 전구약물 치료
본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체는 전구약물과 함께 복합 사용될 수 있는 데, 이때 상기 항체와 접촉한 경우에만 전구약물을 보다 활성 형태로 전환시키는 전구약물-활성화 성분 (예를 들면, 전구약물-활성화 효소)과 상기한 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체는 작동가능하게 연결되어 있다. 이러한 기술을 일반적으로 "ADEPT"라고 하며, 예를 들면 WO95/13095, WO97/26918, WO97/24143, 및 미합중국 특허 제4,975,278호 및 제5,658,568호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있다.
본원에서의 용어 "전구 약물"은, 기초가 되는 모 약물 (parent drug)과 비교하여, 종양 혈관 내피세포를 포함한 표적 세포에 감소된 세포독성 또는 항세포 효과를 발휘하는 생물학적 또는 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다. 바람직하게는, 상기한 전구약물 또는 전구체 형태는, 본래의 또는 모 형태와 비교하여, 유의성있게 감소된, 또는 보다 바람직하게는 무시할 정도의 세포독성 또는 항세포 효과를 발휘한다. "전구 약물"은 활성화되거나 변환되어 보다 활성의 모 약물 형태를 가질 수 있다.
당업자들은 전구 약물을 제조 및 사용하는 기술적인 능력을 가지고 있다. Willman 등 (1986) 및 Stella 등 (1985)은, 다양한 전구 약물의 제조 및 사용 방법에 관한 본원의 기재 내용을 보충하기 위해 본원에 참조문헌으로 포함하였다. 본 발명에서 사용될 수 있는 전구약물 작제물의 예로는, 포스페이트-함유 전구 약물 (미합중국 특허 제4,975,278호), 티오포스페이트-함유 전구 약물, 설페이트-함유 전구 약물, 펩티드-기초 전구 약물 (미합중국 특허 제5,660,829호, 제5,587,161호, 제5,405,990호, WO97/07118), D-아미노산 변형된 전구약물, 글리코실화된 전구약물 (미합중국 특허 제5,561,119호, 제5,646,298호, 제4,904,768호, 제5,041,424호), β-락탐-함유 전구약물, 임의적으로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 (미합중국 특허 제4,975,278호), 임의적으로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 (미합중국 특허 제4,975,278호) 및 제5-플루오로우리딘 전구약물 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
전구약물 형태로 사용될 수 있는 치료제 또는 세포독성제 유형에는 실제적으로 제한이 없다. 예를 들면 전구약물로서 사용하기에는 덜 바람직한 응고제의 전달과 비교하여, 보다 강한 세포독성제는 상기한 형태의 전달에 바람직하다. 전구약물의 형성시에 필요한 것은, 전구약물은 실질적으로 불활성이고 "방출된" 또는 활성화된 약물은 목적하는 활성을 실질적으로 또는 적어도 충분할 정도로 가지도록상기 작제물을 설계해야 한다는 것이다.
또한, 최초의 전구약물에 대한 다양한 개량물이 알려져 있으며, 본 발명과 함께 사용될 수 있을 것이다 {참조: WO95/03830, EP751,144 (안트라사이클린), WO97/07097 (사이클로프로필린돌), WO96/20169}. 예를 들면, 감소된 Km을 가진 전구약물이 미합중국 특허 제5,621,002호 (본원에 참조문헌으로 포함)에 기재되어 있으며, 이는 본 발명에서 사용될 수 있다. 또한, 세포내에서 수행되는 전구약물 치료법이 알려져 있으며 {참조: WO96/03151 (본원에 참조문헌으로 포함)}, 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
ADEPT에서 사용하기 위해, 전구약물을 보다 활성을 가지는 약물로 활성화시키거나 전환시키는 제제를, 본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체에 작동가능하게 부착시킨다. 따라서, 상기한 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체가, 안지오제네시스 부위 (바람직하게는, 종양 혈관체 및 기질) 내에 전구약물-전환 능력을 전달하여, 이 부위에서만 활성 약물이 생산되고 순환계 또는 건강한 조직내에서는 생산되지 않는다.
VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체에 부착되어 전구약물 활성화에서 작용하는 효소로는, 포스페이트-함유 전구약물과 함께 사용할 알칼라인 포스파타제 (미합중국 특허 제4,975,278호); 설페이트-함유 전구약물과 함께 사용할 아릴설파타제 (미합중국 특허 제5,270,196호); 펩티드-기초 전구약물과 함께 사용할, 세라티아 프로티에이즈, 테르모라이신, 섭틸리신, 카르복시펩티다제 (미합중국 특허 제5,660,829호, 제5,587,161호 및 제5,405,990호) 및 카텝신 (카텝신 B 및 L을포함)와 같은 펩티다제 및 프로티에이즈; D-아미노산-변형 전구과 함께 사용할 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물과 함께 사용할, β-갈락토시데이즈 및 뉴라미니다제와 같은 카보하이드레이트-절단 효소; β락탐-함유 전구약물과 함께 사용할 β-락타메이즈; 페녹시아세트아미드 또는 페닐아세트아미드 그룹으로 아미노 질소에서 유도체화된 약물과 함께 사용할, 페니실린 V 아미다제 (미합중국 특허 제4,975,278호) 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제; 및 5-플루오로시토신-기초 전구약물 (미합중국 특허 제4,975,278호)과 함께 사용할 시토신 데아미나제 (미합중국 특허 제5,338,678호 및 제5,545,548호)가 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 촉매성 항체 (즉 "abzyme")으로 알려져 있는 효소 활성을 가진 항체는, 전구약물을 활성 약물로 전환시키는 데에 사용될 수 있다. 따라서, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-유사 항체에 기초한 abzyme은 본 발명의 다른 양태를 형성한다. abzyme에 관한 내용을 보충하기 위해 본원에 참조문헌으로 포함한 Massey 등 (1987)에 기재된 바와 같이, 당업자들은 abzyme을 제조하는 기술적인 능력을 보유하고 있다. EP745,673 (본원에 참조 문헌으로 포함)에 기재된 바와 같이, 카바메이트 (예를 들면, 질소 머스타드 아릴 카바메이트) 위치에서 전구 약물의 분해를 촉매할 수 있는 촉매성 항체를 또한 사용할 수 있다.
H. 진단제(Diagnostics) 및 이미징(Imaging)
또한, 본 발명에서는 실험실내 및 생체내 진단제 및 이미징 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 모든 안지오제네시스 질환 (예를 들면, 관절염, 건선, 고형종양 및 본원에 기재된 모든 안지오제네시스성 질환)에 대한 진단 정보, 예상 징후 정보 또는 이미징 정보를 수득하는 데에 사용될 수 있다. 종양 진단 및 이미징 분야 이외의 분야에서, 본 발명의 이러한 양태는, 바람직하게는 샘플을 비침윤적으로 입수하여 대량 분석 테스트할 수 있는 경우 및/또는 임상 진단이 모호하여 확인이 필요한 경우, 실험실내에서 진단 테스트용으로 사용하기에 가장 바람직하다.
H1. 면역 검출 방법 및 킷트
본 발명의 다른 양태는, VEGF에 결합, 정제, 제거, 정량화 또는 일반적으로 검출하여 안지오제네시스성 질환을 진단하는, 면역 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3)는, 분리된 문제의 조직, 생검 또는 스와브 (swab) 및/또는 균질화된 조직 샘플에서 VEGF를 생체내에서 검출하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 면역검출방법은 진단용으로 매우 유용하다는 것은 확실하지만, 비-임상용 샘플 등에 사용 (예를 들면, 항원 샘플의 적정시 사용)할 수 있다.
여러 가지 유용한 면역검출방법의 단계들이 과학 문헌에 기재되어 있다 {참조: 예를 들면, Nakamura 등 (1987) - 본원에 참조문헌으로 포함}. 일반적으로, 면역검출방법은 VEGF를 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 수집하는 단계; 및 면역 복합체를 형성하기에 효과적인 조건하에서 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3)와 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, 상기 항체는 예를 들면 칼럼 매트릭스 형태의 고형 지지물에 결합될 수 있으며, VEGF를 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 상기 부동화된 항체에 접촉시킨다.
보다 바람직하게는, 면역 결합 방법은 샘플내의 VEGF의 양을 검출 또는 정량화하는 방법을 포함하는 데, 이러한 방법은 결합 과정에서 형성되는 면역 복합체의 검출 또는 정량화를 필요로 한다. 여기서, VEGF를 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 수득한 후, 상기한 바에 따라 상기 샘플을 상기 항체와 접촉시키고 나서, 특정 조건하에서 형성된 면역 복합체의 양을 검출 또는 정량화한다.
분석되는 생물학적 샘플은 VEGF를 함유하고 있는 것으로 생각되는 모든 샘플일 수 있으며, 일반적으로 안지오제네시스성 질환을 가지는 것으로 생각되는 동물 또는 인간으로부터 수집한 것이다. 상기한 샘플은, 조직 절편 또는 표본, 생검, 스와브 또는 스미어(smear) 테스트 샘플, 균질화된 조직 추출물, 또는 상기한 것의 분리되거나 정제된 형태일 수 있다.
면역 복합체 (1차 면역 복합체)를 형성하기에 효과적인 조건하에서 충분한 시간 동안 상기 항체와 선택된 생물학적 샘플을 접촉시키는 것은, 항체 조성물을 상기 샘플에 단순히 첨가하고, 상기 항체가 존재하는 VEGF와 면역 복합체를 형성 (즉, VEGF에 결합)하기에 충분한 시간동안 상기 혼합물을 인큐베이션시키는 것이다. 이후, 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블랏 또는 웨스턴 블랏과 같은 샘플-항체 조성물을 세척하여 비-특이적으로 결합된 항체종을 제거하여, 상기 1차 면역 복합체와 특이적으로 결합된 항체만을 검출할 수 있다.
면역 복합체 형성여부의 검출은 당업계에 널리 알려져 있으며, 다양한 방법을 통해 수행할 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법들은 표지 또는 마커 (예를 들면, 당업계에 알려져 있는 방사성, 형광성, 생물학적 또는 효소성 태그 또는 표지)의 검출에 기초한다. 이러한 표지의 사용과 관련된 미합중국 특허로는, 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,227,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호 (각각 본원에서 참조문헌으로 포함)가 포함된다. 색원체 기질과 접촉하자마자 채색된 생성물을 생산하는 효소의 사용이 일반적으로 바람직하다. 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 2차 결합 리간드 (예를 들면, 2차 항체 또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배치)를 사용할 수도 있다.
검출방법에 사용되는 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3) 자체가 검출가능한 표지에 결합될 수 있으며, 이 표지를 간단히 검출하여, 조성물내의 1차 면역 복합체의 양을 측정할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 2차 결합 리간드를 이용하여 상기한 1차 면역 복합체를 검출한다. 이 경우, 2차 결합 리간드는 검출가능한 표지에 결합할 수 있다. 2차 결합 리간드가 항체인 경우도 종종 있으므로, "2차 항체"로도 불릴 수 있다. 2차 면역 복합체가 형성되기에 효과적인 조건하에서 충분한 시간 동안, 상기한 1차 면역 복합체를 상기 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 그리고 나서, 2차 면역 복합체를 일반적으로 세척하여 비특이적으로 결합된 2차 항체 또는 리간드를 제거하고, 2차 면역 복합체내에 잔류하는 표지를 검출한다.
다른 방법에서는, 2개의 단계를 이용하여 1차 면역 복합체를 검출한다. 제1 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 제2 결합 리간드 (예를 들면, 항체)를 사용하여, 상기한 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성한다. 세척 후, 3차 면역 복합체가형성되기에 효과적인 조건하에서 충분한 시간 동안, 2차 면역 복합체를 2차 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 제3 결합 리간드와 접촉시킨다. 3차 리간드 또는 항체가 검출가능한 표지에 결합함으로써, 형성된 3차 면역 복합체를 검출할 수 있다. 이러한 시스템은, 원하는 경우, 신호 증폭을 제공할 수 있다.
안지오제네시스성 질환을 가진 환자의 임상 진단 또는 모니터링에 있어서, 정상적인 개체에서 수집한 생물학적 샘플에서의 수준과 비교하여, VEGF가 검출되거나 VEGF의 수준이 증가한 것은 환자가 안지오제네시스성 질환을 가지고 있음을 나타낸다.
하지만, 당업자들에게 알려져 있는 바와 같이, 상기한 임상 진단은 분리시의 방법에 기초한 것은 아니다. 포지티브 동정을 나타내는 바이오마커의 유의성있는 발현과 바이오마커의 낮은 수준 또는 배경 발현사이의 차이를 당업자들은 잘 알고 있다. 사실상, 배경 발현 수준 (background expression level)은 "컷-오프(cut-off)"를 형성하여, 이러한 수준 이상으로 염색되는 것이 유의성있는 또는 포지티브로서 계측된다.
H2. 이미징 (Imaging)
본 발명의 이러한 양태는, 종양의 이미징 방법 및 종양 치료와 이미징의 복합 방법에 사용하기에 바람직하다. 하나 이상의 검출가능한 제제에 결합된 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체는, 이미징 자체에 사용될 수 있으며, 치료하기 전에 신뢰성있는 이미지를 형성하기 위해 종양을 예비-이미징하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 상기한 조성물 및 방법은, 다른 안지오제네시스성 질환또는 상태, 특히 비-악성 종양, 아테롬성 동맥경화증, 및 내부 이미지가 진단 또는 증상예측 또는 치료 설계에 바람직한 상태의 이미징 및 진단에 사용할 수 있다.
일반적으로, VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 이미징 항체는, 검출가능한 표지에 작동가능하게 부착되거나 컨쥬게이트된 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체를 포함한다. "검출가능한 표지"는, 특정 기능 또는 화학적 특성에 의해 검출할 수 있는 화합물 또는 원소이며, 이를 사용함으로써 이들이 부착된 성분을 검출할 수 있으며, 원하는 경우에는 정량화할 수 있다. 생체내 진단 프로토콜 또는 "이미징 방법"에 사용되는 항체 컨쥬게이트에서, 비-침윤성 방법을 사용하는 검출할 수 있는 표지가 필요하다.
항체 및 결합 리간드에 부착하는 방법과 마찬가지로 {참조: 예를 들면, 미합중국 특허 제5,021,236 및 제4,472509호 (각각 본원에 참조문헌으로 포함)}, 많은 적합한 이미징 제제가 당업계에 알려져 있다. 소정의 부착 방법에서는, 상기 항체에 부착된 DTPA와 같은 유기 킬레이트화제 등을 이용하여 금속 킬레이트 복합체를 사용한다 {참조: 미합중국 특허 제4,472,509호}. 또한, 커플링 제제 (예를 들면, 글루타르알데히드 또는 페리오데이트)의 존재하에 모노클론 항체와 효소를 반응시킬 수 있다. 상기한 커플링 제제 존재하에 또는 이소티오시아네이트와 반응시켜, 플루오레세인 마커를 가진 컨쥬게이트를 제조한다.
검출가능한 표지의 예로는 파라마그네틱 이온이 있다. 이 경우, 적합한 이온으로는, 크로뮴 (III), 마그네슘 (II), 철 (III), 철 (II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴 (III), 사마륨 (III), 이테르븀 (III), 가돌리늄(III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III) 및 에르븀 (III)이 포함되며, 가돌리늄이 특히 바람직하다.
X선 이미징과 같이 다른 양태에서 유용한 이온으로는, 란탄 (III), 금 (II), 납 (II) 및 특히 비스머스 (III)가 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다. 형광 표지로는 로다민, 플루오레세인 및 레노그라핀이 포함된다. 로다민 및 플루오레세인은 이소티오시아네이트 중간체를 통해 종종 결합된다.
방사성 동위원소를 진단용으로 사용하는 경우, 적합한 예로는14탄소,51크로뮴,36염소,58코발트,76구리,152Eu,67갈륨,3수소,123요오드,125요오드,131요오드,111인듐,59철,32인,186레늄,188레늄,75셀레늄,35황,99m테크네튬 및90이테륨이 있다.125I가 소정의 양태에서는 종종 바람직하며,99m테크네튬 및111인듐은 낮은 에너지 및 적합성으로 인해 장기간 동안 검출하기에 종종 적합하다.
본 발명에서 사용할 방사성 표지된 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체는 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 항체에 방사성 동위원소를 결합시키는 데에 사용될 수 있는 중간 기능성 그룹은, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 및 에틸렌 디아민테트라아세트산 (EDTA)이다.
또한, 모노클론 항체는 나트륨 요도드 또는 칼륨 요오드 및 화학적 산화제 (예를 들면, 나트륨 하이드로클로라이트) 또는 효소성 산화제 (예를 들면, 락토퍼옥시다제)와 접촉시켜 요오드화시킬 수 있다. 본 발명에 따른 항체는, 리간드 교환공정 {예를 들면, 주석 용액으로 페르테크네이트를 환원시킨 후, 환원된 테크네튬을 세파로즈 칼럼상에서 킬레이트화시키고, 상기 항체를 상기 칼럼에 접촉시키는 공정} 또는 직접적인 표지 기법 {예를 들면, 페르테크네이트, SNCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼륨 패탈레이트 용액과 같은 버퍼 용액 및 상기 항체를 인큐베이션시키는 방법}을 이용하여99m테크네튬으로 표지시킬 수 있다.
상기한 유형의 검출가능하게 표지된 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체는 본 발명의 이미징 양태 또는 이미징과 치료의 복합 양태에서 사용될 수 있다. 이는, 실험실내에서 진단용으로 사용하기에도 적합하다. 생체내 이미징으로 사용하는 경우의 투여량은 치료시 보다는 일반적으로 적지만, 환자의 연령 및 체중에 따라 다르다. 1회 투여량만으로 충분해야 한다.
일반적으로, 생체내 진단 또는 이미징 방법은, 비-침윤성(non-invasive) 방법으로 검출가능한 마커에 컨쥬게이트된, 진단을 위해 효과적인 양의 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 또는 2C3-기초 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 항체-마커 컨쥬게이트는, 충분한 시간 동안 종양내의 VEGF를 찾아내어 결합하도록 한다. 그리고 나서, 환자를 검출 장치에 노출시켜 검출가능한 마커를 동정하여, 종양 이미징을 형성시킨다.
H3. 진단용 킷트
본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기한 면역 검출 및 이미징 방법과 함께 사용하기 위한, 면역 검출 및 이미징 킷트를 포함하는 진단용 킷트를 제공한다. 따라서, 2C3과 같은 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체는, 일반적으로 적합한 용기내에 포함되어 있는 상기한 킷트내에 제공되어 있다.
면역 검출 (immunodetection)의 경우, 재구성시킬 항체 용액 또는 분말이 바직하지만, 상기 항체를 고형 지지물 (예를 들면, 미세적정 플래이트 웰)에 결합시킬 수 있다. 바람직하게는, 면역 검출 킷트는 적어도 제1 면역검출 시약을 포함한다. 상기한 킷트의 면역 검출 시약은, 상기 항체와 연결되거나 결합된 검출가능한 표지를 포함한, 여러 가지 다양한 형태를 가질 수 있다. 2차 결합 리간드에 연결 또는 부착되는 검출가능한 표지를 사용할 수도 있다. 2차 리간드의 예로는, 상기한 제1 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 2차 항체가 있다.
본 발명의 킷트에 사용하기 위한 또 다른 적합한 면역 검출 시약으로는, 제1 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 2차 항체; 및 검출가능한 표지에 결합된, 2차 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 3차 항체를 포함하는, 2 성분 시약이 있다. 상기한 바와 같이, 수많은 표지들이 당업계에 예시되어 있으며, 이들 표지들은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 상기 킷트는, 완전히 컨쥬게이트된 형태, 중간체 형태 또는 킷트 사용에 의해 컨쥬게이트될 별개의 잔기로서의, 항체-표지 컨쥬게이트를 함유할 수 있다.
바람직하게는, 상기한 이미징 킷트는, 생체내 검출가능한 표지에 이미 부착된 VEGFR2-차단,항-VEGF 항체 (예를 들면, 2C3)를 포함한다. 하지만, 상기한 표지 및 부착 수단은 별개로 공급될 수 있다.
킷트는, 검출 분석용 표준 곡선을 만드는 데에 사용될 수 있는, 표지되거나표지되지 않은 대조군 제제 (예를 들면, 적합한 양의 VEGF 용액)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 킷트의 성분들은 수성 배지내 또는 동결건조된 형태로 패키지될 수 있다.
일반적으로, 상기 킷트의 용기 수단은 하나 이상의 바이알, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 시린지 또는 기타의 용기 수단을 포함하며, 이 용기 수단에 상기 항체 또는 항원을 (바람직하게는, 일정 분량) 위치시킨다. 2차 또는 3차 결합 리간드 또는 추가 성분이 제공되는 경우, 상기한 킷트는 제2, 제3 또는 기타의 추가 용기를 일반적으로 함유하며, 이 용기안에 상기 리간드 또는 성분을 위치시킬 수 있다. 또한, 상기 킷트는 하나 이상의 안지오제네시스성 질환의 진단에 사용할 기타의 진단 시약을 포함한다. 바람직하게는, VEGF 결합에 기초하지 않는 제2 진단제를 사용한다.
또한, 본 발명의 킷트는, 상업용으로 판매하기 위해, 상기 항체를 함유하는 수단 및 기타의 시약 용기를 밀집되어 포함하는 것이 통상적이다. 이러한 용기는, 목적하는 바이알을 함유하는 사출 성형 또는 송풍 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 설명하기 위해 포함된 것이다. 하기 실시예에서 사용한 기법들은 본 발명의 실시에 잘 작용할 것으로 본 발명자가 발견한 기법을 나타내며, 따라서 이러한 기법들은 본 발명의 실시에 바람직한 방식이 될 것으로 당업자들은 이해할 것이다. 하지만, 본원의 기재에 비추어, 본원에 기재된 특정 양태에서 많은 변화가 있을 수 있으며, 이는 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 유사한 결과를 얻을 것이라는 것을 당업자들은 이해할 것이다.
실시예 1
항-VEGF 항체 2C3의 제조 및 특성
A. 재료 및 방법
1. 면역원
Biopolymers Facility of the Howard Hughes Medical Institute (달라스, UT사우스웨스턴 의료 센터 소재)에 의해, 인간 VEGF의 N말단 26개의 아미노산에 상응하는 펩티드 (huVEGF; 서열번호 제10) 및 기니아 피그 VEGF의 N말단 25개의 아미노산에 상응하는 펩티드 (gpVEGF; 서열번호 제11)을 합성하였다. 상기 펩티드는 하기의 서열을 가진다 (N에서 C로의 방향)
서열번호 제10: APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYC
서열번호 제11: APMAEGEQKPREVVKFMDVYKRSYC
석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC) 링커 {Pierce, Rockford, IL}를 이용하여, C 말단 시스테인을 통해 상기 펩티드를 티로글로불린에 컨쥬게이션시켰다. 또한, 티로글로불린에 결합된 L-시스테인으로 이루어진 대조군 컨쥬게이트를 제조하였다. 크기 선별 크로마토그래피를 이용하여, 자유 펩티드 또는 링커와 컨쥬게이트를 분리하였다.
또한, 재조합 인간 VEGF를 면역원으로서 별개로 사용하였다 (미네소타주 미네소타 대학의 S.Ramakrishnan 박사로부터 입수).
2. 하이브리도마
항-gpVEGF 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하는 경우, C57/B1-6 마우스를 TiterMax 보조제 (CytRX Co., Norcross, GA) 중의 gpVEGF-펩티드-티로글로불린 컨쥬게이트로 면역시켰다. 항-인간 VEGF 항체를 생산하는 경우, TiterMax 중의 재조합 인간 VEGF 또는 huVEGF-펩티드-티로글로불린 컨쥬게이트로 BALB/c 마우스를 면역시켰다. Morrow 등 (1990, 본원에 참조문헌으로 포함)이 기재한 바와 같이, 마지막 보조 주사(booster)를 투여한 후 3일 후에, 비장 세포를 흑색종P3X63AG8.653 세포 (ATCC, Rockville, MD)와 융합시킨 후에 배양시켰다.
3. 항체 정제
Pierce ImmunoPure Binding/Elution buffering system (Pierce)를 이용하는 단백질 A 크로마토그래피 및 암모늄 설페이트 침전에 의해, 조직 배양물 상층액으로부터 IgG 항체 (2C3, 12D7, 3E7)를 정제하였다.
50% 포화 암모늄 설페이트 침전, PBS (pH 7.4)에서 펠렛의 재현탁 및 dH2O에대한 투석시켜 유글로불린 (euglobulin)을 침전시킴으로써, IgM 항체 (GV39M, 11B5, 7G3)를 조직 배양물 상층액으로부터 정제하였다. dH2O 침전물을 PBS 내에서 재현탁시키고, 세파로즈 S300 칼럼 (Pharmacia) 상에서 크기-배제 크로마토그래피로 분획시켰다. SDS-PAGE에 의해 측정한 결과, 상기 IgM 분획은 순도 85 내지 90% 이었다.
4. 대조 항체 (Control Antibodies)
mAb4.6.1 (마우스 항-인간 VEGF, Genentech, Inc.에서 입수), Ab-3 (마우스 항-인간 VEGF, OncogeneScience, Inc.에서 입수), A-20 (토끼 항-인간 VEGF, Santa Cruz Biotechnology, Inc.에서 입수 - 캘리포니아 산타크루즈 소재), OX7 (마우스 항-랫트 Thy1.1, 영국 Oxford MRC Cellular Immunology Unit의 A.F.Williams 박사로부터 입수), MTSA (관련성 없는 특이성을 갖는 마우스 흑색종 IgM, 텍사스 달라스 UT-Southwestern의 E.S.Vitetta 박사로부터 입수), 1A8 (마우스 항-마우스 Flk-1, Philip E.Thorpe 및 동료로부터 입수), MECA 32 (랫트 항-마우스 내피, 캘리포니아 스탠포드 소재의 스탠포드 대학의 E.Butcher 박사로부터 입수) 및 TEC 11 (마우스 항-인간 엔도글린, 미합중국 특허 제5,660,827호)를 포함한 다양한 대조 항체를 본 연구 내내 사용하였다.
5. 초기 스크리닝
초기 스크리닝을 위해, 96-웰 ELISA 플래이트 (Falcon, 뉴저지 프랭크린 레이크 소재)를 VEGF 펩티드 또는 VEGF-Cys-티로글로불린 컨쥬게이트 250ng으로 코팅한 후, 5% 카세인산 하이드로라이세이트 (Sigma, St.Louis, MO)로 블라킹하였다. 항-gpVEGF 하이브리도마 및 최초의 항-인간 VEGF 하이브리도마로부터의 상층물을, 이중 간접 ELISA 기법 (Crowther, 1995)을 통해 항원-코팅된 플래이트상에서 스크리닝하였다.
VEGF 펩티드-티로글로불린에 대해서는 우선적인 반응성을 보이지만 Cys-티로글로불린에 대해서는 반응성이 없거나 약한 하이브리도마를, 동결된 종양 조직 절편 상에서 면역조직화학법 (하기 기재)을 통해 추가로 스크리닝하였다.
6. 면역조직화학법 (Immunohistochemistry)
기니아 피그 라인 10 간세포암 종양 세포 (NIH의 Ronald Neuman 박사로부터 입수, Betheda, MD)를 변종 2 기니아 피그 (NCI, Bethesda, MD)에서 성장시켰다. 인간 종양 NCI-H358 비-소세포 폐암 (NSCLC), NCI-H460 NSCLC (텍사스 달라스 소재의 UT Southwestern의 Adi Gazdar 박사로부터 입수), HT29 결장 선암 (ATCC) 및 L540CY 호지킨스 림프종 (독일 Cologne의 V.Diehl 박사로부터 입수)을 CB17 SCID 마우스 (Charles River, Wilmington, MA)에서 이종이식편으로서 성장시켰다.
종양을 액체 질소내에서 급속 냉동시킨 후, -70℃에서 보관하였다. 환자에서 수집한 냉동된 종양 샘플을 National Cancer Institute Cooperative Human Tissue Network (Southern Division, Birmingham, AL)에서 입수하였다. Burrow 등 (1995)이 기재한 바와 같이 면역조직화학법을 수행하였다.
7. ELISA 분석
VEGF로 면역시킨 동물로부터의 하이브리도마 상층물을, 3가지의 상이한 항원 (인간의 VEGF 단독, VEGF:Flk-1/SEAP 복합체, 및 Flk-1/SEAP 단독)을 이용한 간접 차별 ELISA 기법을 통해 스크리닝하였다. 인간 VEGF만을 사용한 경우, 소정의 ELISA 플레이트를 VEGF 100ng으로 코팅시켰다.
Flk-1/SEAP 단독의 경우, 마우스 VEGF 수용체의 가용성 형태 (Flk-1/SEAP을 방출하는 세포는 뉴저지 프린스턴 소재의 프린스턴 대학의 Ihor Lemischka 박사로부터 입수), Flk-1/SEAP 500ng으로 코팅시켰다. Tessler 등 (1994)이 기재한 대로, Flk-1/SEAP 단백질을 생산 및 정제시켰다. 기본적으로, Flk-1의 세포외 도메인 (sFlk-1)은Spodoptera frugiperda(Sf9) 세포에서 생산하여, 모노클론 항-Flk-1 항체 (1A8)를 이용한 면역친화성 기법으로 정제하였다. 그리고 나서, sFlk-1을 비오티닐화하고 아비딘-코팅된 플레이트에 결합시켰다.
VEGF:Flk-1/SEAP 복합체로 코팅된 플레이트를 제조하기 위해, 정제된 sFlk-1을 비오틴화시키고, 결합 버퍼 (10mM HEPES, 150mM NaCl, 20㎍/ml 소혈청 알부민 및 0.1㎍/ml 헤파린)내에서 몰비 2.5:1의 sFlk-1:VEGF에서 밤새동안 4℃에서 VEGF와 반응시켰다. 그리고 나서, VEGF:sFlk-1 복합체를 96-웰 미세적정 플레이트 중아비딘-코팅된 웰에서 인큐베이션시켜, VEGF 및 이의 수용체 결합체로 코팅된 플레이트를 제조하였다.
VEGF 단독, 비오틴화된 sFlk-1 및 VEGF:sFlk-1 복합체의 반응성은, 아비딘-코팅된 플레이트상에서 상기한 3가지의 항원을 이용한 조절된 연구에서 결정하였다. 상기한 최초 스크리닝에서 기재한 바와 같이 반응성을 결정하였다.
또한, 포획 ELISA를 현상 (development)하였다. 포횔 ELISA의 경우, 미세적정 플레이트를 상기한 항체 100ng으로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 상기 웰을 세척하고 상기한 바와 같이 블라킹한 후, 다양한 농도의 비오틴화-VEGF 또는 VEGF:sFlk-1-비오틴과 함께 인큐베이션시켰다. 퍼옥시데이즈에 컨쥬게이트된 스트렙트아비딘 (Kirkegaar & Perry Laboratories, Inc.)을 1:2000으로 희석시킨 후, 제2 층으로 사용하여 현상하였다.
제조원 (EZ-Link Activated Peroxidase, Pierce)의 지시에 따라, 퍼옥시데이즈를 사용하여 상기 항체를 먼저 표지함으로써 경쟁 ELISA 연구를 수행하였다. 12D7, 3E7, 2C3 및 7G3를 이용한 경쟁 연구에 사용할 항원은, ELISA 플레이트상에 아비딘에 의해 포획된 VEGF-비오틴이었다. 대략 0.5 내지 2.0㎍/ml의 퍼옥시데이즈-표지된 테스트 항체를, 버퍼만 존재하에 또는 관련성 없는 IgG 존재하에 또는 10 내지 100배 과량의 기타의 항-VEGF 경쟁 항체의 존재하에 상기한 플레이트 상에서 인큐베이션시켰다.
3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 (Kirkegaard and PerryLaboratories, Inc.)을 첨가하여, 표지된 항체의 결합을 분석하였다. 1M H3PO4와 반응시킨 후에 15분 후에 반응을 중단하고나서, 450nM에서 계측하였다. 이러한 분석은 3중으로 수행하였으며, 적어도 2회는 표지된 항체 및 경쟁 항체의 각 배합에 대해 수행하였다. 2개의 항체가 80% 이상 결합을 교차 차단하는 경우, 이러한 2개의 항체는 서로 동일한 에피토프 그룹에 속하는 것으로 간주하였다.
GV39M 및 11B5는, 퍼옥시데이즈-표지 이후에 결합 활성을 보유하지 않았지만, 비오틴화는 용인하였다. GV39M 및 11B5는 비오틴화되었으며, 항-Flk-1 항체 (1A8)에 의해 포획되었거나 ELISA 플레이트 상에서 직접 코팅된 VEGF:sFlk-1 에 대해 테스트하였다.
8. 웨스턴 블랏 분석
5% 태아 송아지 혈청의 존재하에, 환원 및 비-환원 조건하에서 12% SDS-PAGE에 의해 정제된 재조합 VEGF를 분리한 후, 니트로셀룰로즈로 이동시켰다. Sea-Block PP82-41 (East Coast Biologics, Berwick, ME)을 사용하여 니트로셀룰로즈 막을 블로킹한 후, 미니-블라터 (mini-blotter) 장치 (Immunetics, Cambridge, MA)를 이용하여 1차 항체로 프로브 (probe) 하였다. 적합한 퍼옥시데이즈-컨쥬게이트된 2차 항체로 인큐베이션시킨 후, ECL-강화 화학 발광으로 상기 막을 현상하였다.
B. 결과
1. 2C3는 특유의 에피토프 특이성을 보유한다
하기 표 1은, 상이한 항-VEGF 항체의 클래스/서브클래스, 이것이 VEGF 상에서 인식하는 에피토프 그룹, 및 이의 VEGF 또는 VEGF:수용체 복합체 (VEGF:Flk-1)에 대한 우선적인 결합에 대한 정보를 요약한 것이다. 모든 경우에 있어서, VEGF121 및 VEGF165에 결합된 항체는, 기본적으로 동일한 결과를 가져왔다. 달리 조작되지 않았다면, 하기의 결과는 VEGF165에 대한 것이다.
[표 1]
항-VEGF 항체 특성 요약
에피토프 그룹1 클론 이소타입 VEGF 면역원2 현저한 반응3
1 GV39M IgM, k Gp N말단 VEGF:Flk-1
1 11B5 IgM, k Hu N말단 VEGF:Flk-1
2 3E7 IgG1, l Hu N말단 VEGF 및 VEGF:Flk-1
2 7G3 IgM, k Hu N말단 VEGF 및 VEGF:Flk-1
3 12D7 IgG1, k Hu N말단 VEGF
3 2C3 IgG2a, k rHuVEGF VEGF
aa89-94 주위 중심4 A4.6.1 IgG1 VEGF
{상기에서, 1: 에피토프 그룹은 경쟁 ELISA를 통해 결정하였다.
2: 인간 VEGF의 N 말단의 26개의 아미노산에 상응하는 합성 펩티드 (11B5, 3E7, 7G3 및 12D7), 기니아 피그 VEGF의 N 말단의 25개의 아미노산에 상응하는 합성 펩티드 (GV39M) 또는 전장의 재조합 인간 VEGF 에 상응하는 합성 펩티드(2C3)를 이용하여 마우스를 면역시켰다.
3: VEGF 단독과의 반응성 또는 sFlk-1과 결합된 VEGF (VEGF:Flk-1)과의 반응성을 알아보기 위해, 상기 항체를 간접 또는 포획 ELISA에서 스크리닝하였다.
4: A4.6.1은, 2C3에 의해 인식되는 에피토프 그룹 4와는 상이한, 정확하게 정의된 에피토프를 가진다. A4.6.1에 대한 연구는 Kim 등 (1992), Wiesmann 등(1997), Muller 등 (1996)에 기재되어 있다}
비오틴화- 또는 퍼옥시데이즈-표지된 테스트 항체 및 10 내지 100배 과량의 비-표지된 경쟁 항체를 이용한 경쟁 결합 연구 결과, 2C3는 특유의 에피토프에 결합함을 보였다. 이 연구 결과, GV39M 및 11B5는 VEGF:Flk-1에 대한 결합을 교차 차단하였으며, 3E7 및 7G3는 아비딘 상에 포획된 VEGF-비오틴에 대한 결합을 교차 차단하였다. GV39M 및 11B5는 임의적으로 제1 에피토프 그룹으로 지정하였고, 3E7 및 7G3는 제2 에피토프 그룹으로 지정하였다.
2C3 및 나머지 항체인 12D7은, VEGF 또는 VEGF:수용체에 대한 서로의 결합 또는 VEGF 또는 VEGF:수용체에 대한 다른 항체의 결합을 유의성있게 방해하지 않았다. 12D7은 제3 에피토프 그룹으로 지정하였으며, 2C3는 제4 에피토프 그룹으로 지정하였다 (참조: 표 1).
상기한 표에서 기재된 바와 같이, 2C3는 항체 A4.6.1과는 상이한 에피토프를 보인다. 본 발명자의 경쟁 연구 결과, 2C3 및 A4.6.1은 교차 반응하지 않았다. A4.6.1에 의해 인식되는 에피토프는 정확하게 정의되었으며, 아미노산 89 내지 94를 중심으로 연속된 에피토프이다 {참조: Kim 등, 1992; Wiesmann 등, 1997; Muller 등, 1998; Keyt 등, 1996}. 또한, 2C3 및 A4.6.1 사이에 많은 차이점이 있다 (하기 참조).
2. 2C3는 자유 VEGF에 결합 가능하다
상기한 항체들이 자유 형태 및 복합체 형태의 가용성 VEGF에 결합할 수 있는 능력에 있어서는 큰 차이가 있었다 (표 2 참조). 이 연구에서는, 2C3의 특이한 성질을 보여주었다. 표 2에서는, GV39M 및 11B5가 VEGF:수용체 복합체에 대해 강한 선호도를 보여 5.5 및 2nM에서 각각 VEGF:Flk-1과 50% 최대 결합을 달성한 반면에, 용액내의 자유 VEGF에 대해서는 400 및 800nM에서 50% 최대 결합을 달성하였다.
반면에, 2C3 및 12D7은 자유 VEGF에 대해 선호도를 보여 1 및 20nM에서 각각 50% 최대 결합을 달성한 반면에, VEGF:Flk-1 복합체에 대해서는 150 및 250nM에서 50% 최대 결합을 달성하였다. 하지만, 생체내 주사후, 2C3는 종양 혈관 및 종양 기질의 위치를 찾아갔다 (하기 참조).
3E7은 자유 VEGF 및 VEGF:Flk-1 복합체에 대해 동일한 정도로 결합하였으며, 각각에 대해 1nM에서 50% 최대 결합을 달성하였다.
[표 2]
VEGF vs. VEGF:Flk-1의 ELISA 포획
클론 50% 최대 결합을 가져오는 농도 (nM)1 VEGF/VEGF:Flk-1의 비율2
VEGF VEGF:Flk-1
GV39M 400* 5.5 72.7
11B5 800* 2 400.0
3E7 0.9 1 0.9
12D7 20 250* 0.1
2C3 1 150 0.007
MAb 4.6.13 0.3 500* 0.0006
1A8 NR4 1.5
대조군 NR 600*
{상기에서, * : 외삽 수치.
1: 비오티닐화된 VEGF와 비오티닐화된 VEGF/sFlk-1 복합체를 표시된 항체로 코팅된 웰 상에 3중으로 적정한 후, 퍼옥시데이즈-표지된 아비딘으로 현상한다.
2: 1.0 보다 큰 비율은 복합체 (VEGF:Flk-1)에 대한 항체에 대해 우호적임을나타내는 반면, 1.0보다 작은 비율은 VEGF에 대해 우호적임을 나타낸다.
3: 사용된 대조 항체는 1A8 (마우스 항-Flk-1), Mab 4.6.1 (마우스 항-인간 VEGF, Genentech에서 입수) 및 네가티브 대조군으로서 관련성 없는 IgM이 포함된다.
4: NR은 반응이 관찰되지 않았음을 나타낸다}
3. 2C3는 비-형태 의존적인 에피토프를 인식한다
웨스턴 블랏 분석 결과, 12D7, 2C3 및 7G3는 변성된 VEGF121 및 VEGF165와 환원 및 비-환원 조건하에서 반응함을 알 수 있었다. 따라서, 상기 항체들은 형태의존적이지 않는 에피토프를 인식하는 것으로 생각된다.
이와 달리, GV39M, 11B5 및 3E7은 웨스턴 블랏에서 VEGF와 반응하지 않았는 데, 그 이유는 형태-의존적이고 변형 조건하에서 왜곡되는 VEGF의 N 말단 상의 에피토프를 상기 항체들이 인식하기 때문일 수 있다.
항-VEGF 항체의 웨스턴 블랏 분석은, 12% 겔상에서 SDS-PAGE를 사용하여 5% FCS의 존재하에 VEGF165를 분리한 후, ECL 검출을 이용한 표준 웨스턴 블랏팅 프로토콜로 분석하여 수행하였다. 상기한 1차 항체는, 다중 라인의 미니블라터 장치를 사용하여 니트로셀룰로즈 막과 함께 인큐베이션시켰다. 대조 항체로는,
1㎍/ml의 Ab-3 (VEGF에 대해 특이적인 모노클론 IgG, Oncogene Science에서 입수); 5㎍/ml의 토끼의 항-VEGF 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.에서 입수); 및 10㎍/ml의 관련성 없는 특이성을 가진 IgG이 포함되었다.
5㎍/ml의 2C3를 포함하여 상기 상이한 항체에 대해 통상적인 웨스턴 블랏을수행한 결과, 다이머 VEGF가 약 42kd에서 큰 밴드로 나타났다. 또한, 약 130kd의 VEGF 멀티머는 12D7, 7G3 및 포지티브 대조 항체와 함께 명백하였다.
4. 종양 면역조직화학법
면역조직화학법을 통해 검사한 종양은, 암환자에게서 입수한 다양한 유형의 인간 종양; 마우스에서 성장시킨 다양한 유형의 이식가능한 인간의 종양 이종이식편; 기니아 피그에서 성장시킨 기니아 피그 라인 10 종양; 및 마우스에서 성장시킨 마우스 3LL 종양이었다 {하기 표3 참조}.
NCI-H358 인간 NSCLC 이종이식편상에서 3E7, GV39M 및 11B5의 면역조직화학 반응성을 측정하여 대조 항체 (관련성 없는 특이성을 가진 IgG; 토끼의 항-VEGF 항체인 A-20; 및 랫트의 항-마우스 내피세포 항체인 MECA32)와 비교하였다. SCID 마우스에서 성장시킨 NCI-H358 인간 NSCLC의 동결된 절편 8㎛를 간접 면역퍼옥시데이즈 기법을 이용하여 염새한 후에 헤마토실린으로 역염색 (counterstain)시켰다.
VEGF 상의 제1 에피토프 그룹을 인식하는 GV39M 및 11B5는 검사한 모든 종양에서 혈관내피세포를 진하게 염색시키고 혈관주위의 결합조직은 약간 염색시켰다. 상기한 제1 에피토프 그룹의 항체는 종양 세포와의 반응성에 있어서 상이하였는 데, GV39M은 종양 세포와 약하게 반응한 반면에 11B5는 매우 강하게 반응하였다. MECA32 (마우스) 또는 TEC11 (인간)으로 염색된 내피세포의 약 80%는 GV39M 및 11B5에 의해서도 염색되었다.
제2 VEGF 에피토프 그룹을 인식하는 3E7 및 7G3는, 검사한 모든 종양에서 종양 세포, 결합 조직 및 혈관내피세포와 반응성을 보였다 (표 3 참조). 특히 혈관내피에 대한 크게 증가한 선별성을 보인 낮은 농도 (1 내지 2㎍/ml)에서 상기 항체들을 사용하였을 때, 내피세포 염색의 강도는 종양 세포 또는 결합조직의 염색의 강도에 비해 일반적으로 강했다.
[표 3]
종양 절편에 대한 항-VEGF 항체의 면역 조직 반응성
내피세포 염색
그룹 클론1 반응성2 이종이식편3(다양) Hu 종양4(다양) 기니아 피그 종양5(라인 10) 마우스 종양6(3LL)
1 GV39M EC〉CT〉TC 3-4+ 2-3+ 4+ 3+
1 11B5 EC〉CT=TC 3+ 3+ 3+ 3+
2 3E7 EC〉CT=TC 2+ 2+ 2+ 1-2+
2 7G3 EC〉CT=TC 3+ 2-3+ 3+ 2+
3 12D7 NR - - - -
4 2C3 NR - - - -
{상기는, 표준 면역조직화학 기법을 사용하여, 아세톤으로 고정시킨 종양 조직 동결 절편에 대해 면역조직화학 분석을 수행한 결과이다. 상기 단편을 현미경으로 관찰한 후, 다음과 같이 반응성에 대해 수치화하였다: - 네가티브, ±매우 약함, 1+ 약함, 2+ 중간, 3+ 강함, 4+ 매우 강함.
1: 2C3 및 12D7은 20㎍/ml를 투여하였고, 기타의 다른 항체는 5 내지 10㎍/ml를 투여하였다.
2: 반응성 정의 - EC는 내피; CT는 결합 조직; TC는 종양 세포; NR은 반응 없음.
3: 테스트된 인간 종양 이종이식편 - NCI-H358 NSCLC, NCI-H460 NSCLC, HT29 결장 선암, L540 호지킨스 림프종.
4: 테스트된 인간 종양 - 연조직암, 호지킨스 림프종, 신장암, 유방암, 이하선암, 결장암, 폐암 및 자궁내막암.
5: 라인 10 기니아 피그 종양 절편에서의 기니아 피그 VEGF와의 반응성.
6: 마우스 3LL 루이스 폐암 종양 절편에서의 마우스 VEGF와의 반응성}
12D7 및 2C3는 종양 조직의 동결 절편을 염색시키지 않았는 데, 이는 종양 조직을 아세톤으로 고정시킴으로써 항체 결합을 파괴했기 때문일 수 있다. 하지만, 2C3는 생체내에 주사한 후에는 종양 조직에 찾아갔다 (하기 참조).
GV39M, 11B5, 3E7 및 7G3는, 기니아 피그에서 성장시킨 기니아 피그 라인 10 종양의 동결 절편 및 마우스에서 성장시킨 마우스 3LL 종양의 동결 절편상에서 설치류의 혈관과 반응하였다. GV39M, 11B5 및 7G3는, 인간 종양 표본에서 인간 혈관체와 반응한 정도와 마찬가지로, 기니아 피그 및 마우스 종양 혈관체와 강하게 반응하였다. 3E7은, 기니아 피그 또는 인간의 종양 절편과 반응할 때보다는 약하게 마우스 3LL 종양을 염색시켰는 데, 이를 통해 3E7이 마우스 VEGF에 대한 친화성이 이보다 작음을 알 수 있다. 이러한 결과는, 2C3를 제외한 모든 항체가 마우스 VEGF와 반응하였음을 보인 간접 ELISA 분석 결과와 일치한다.
실시예 2
2C3의 내피세포이동의 억제
A. 재료 및 방법 - 내피세포 성장 분석
성체의 소 대동맥 내피 (ABAE) 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 1500세포/웰의 비율로 주입한 후, 0.5nM의 인간 VEGF 존재하에 다양한 샘플과 대조 항체와 함께 성장시켰다. 대조 웰에는, VEGF 존재 또는 비존재하에 배지를 공급하였다.
4일간의 인큐베이션 후, MTS {(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복실메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내부염} 변환 분석에 의해 상기 세포를 정량화하였는 데, 이 때 세포수에 비례하여 MTS가 포르마잔으로 변환시킨 후, 490nM (Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI)에서 흡수시킬 수 있다. 상기 분석은 제조원의 지시 사항에 따라 수행하였다.
VEGF가 첨가되지 않은 배양물에서의 MTS 변환을 차감하여 세포 성장을 측정하였다. VEGF 만이 첨가된 대조 배양물에서의 MTS 변환의 퍼센트로서 결과를 표현하였다 (참조: Buttke 등, 1993).
B. 결과 - VEGF-매개 내피세포 성장의 억제
VEGF 상의 제1 내지 제3 에피토프 그룹을 인식하는 IgG 항체 3E7 및 12D7은, ABAE 세포의 VEGF-매개 성장을 억제하지 않았다 (도 1 참조). 이는, 상기 항체들이 비차단 항-VEGF 항체로서, 이들의 에피토프는 VEGF:KDR 상호작용에 관여하지 않음을 시사한다. 또한, VEGF 상의 제1 내지 제3 에피토프 그룹을 인식하는 IgM 항체 GV39M도, ABAE 세포의 VEGF-매개 성장을 억제하지 않았으며, 비차단 항-VEGF 항체이다.
이와 달리, VEGF 상의 제4 에피토프 그룹에 대한 2C3 및 기준 중화 항-VEGF 항체인 Mab4.6.1은, ABAE 세포의 VEGF-매개 성장을 각각 3nM 및 1nM에서 50%씩 억제시켰다 (도 1 참조). 이는, 2C3가 VEGF의 유사분열 활성을 중화시킬 수 있음을보여준 것이다.
2C3가 차단 Mab로 정의됨으로써, 2C3는 GV39M, 3E7, 12D7 및 기타의 다른 항체와 다른 항체임을 알 수 있다. Ab-3와 같은 다양항 항-VEGF 항체는, 2C3와는 다른 비차단 모노클론 항체로 알려져 있다.
IgM 항체 중 하나인 11B5는, 8nM 이상의 농도에서 ABAE 세포에 대해 독성을 나타내었다. 30분 및 24시간 이내에 분리된 상기 세포들은 트리판 블루 염색액을 흡수하였다. HUVEC, 돼지 대동맥 내피세포 및 bEND.3 세포는 40nM의 11B5에 의해서도 영향을 받지 않았기 때문에, 상기 결과는 세포 유형 특이적인 것 같다. 첨가된 VEGF의 부존재하에서 및 기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)의 존재하에서 상기한 독성 효과가 발생했기 때문에, 11B5의 독성효과는 성장인자와는 무관한 것 같다.
실시예 3
2C3의 생체내에서 종양의 특이적인 위치 확인
A. 재료 및 방법 - 인간 종양 이종이식편에 대한 생체내 위치확인
종양 체적이 약 1cm3가 될 때까지, 면역관용된 (immunocompromised) 마우스 (nu/nu 마우스에서의 NCI-H358 NSCLC; 및 SCID 마우스에서 HT29 결장 선암)에서 종양이 피하에서 성장하였다. SCID 마우스를 이용한 비-표지된 항체 100㎍ 또는 누드 마우스를 이용한 비오틴화된 항체 100㎍을, 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 24시간 경과후, 상기 마우스를 마취시킨 후, PBS를 뿌린 후, 종양 및 기관 (심장, 폐, 간, 신장, 소장 및 비장)을 수집하여 액체 질소내에서 급속 냉동시켰다.
각 마우스에서 수집한 종양 및 기관을 냉각기상에서 절편으로 나눈 후, 상기한 바와 같이 면역조직화학적으로 항체를 찾기 위해 염색하였다. 이때, 누드 마우스에서 수집한 절편은 퍼옥시데이즈-표지된 스트렙타비딘-비오틴 복합체 (Dako, Carpinteria, CA)를 이용하여 현상하고; SCID 마우스에서 수집한 절편은 2가지의 퍼옥시데이즈-컨쥬게이트된 2차 항체, 염소의 항-마우스 IgG+IgM 및 그리고 나서 토끼의 항-염소 IgG를 이용하여 현상시켰다.
B. 결과 - 종양을 가진 마우스에서 생체내 위치확인
인간 종양 이종이식편에서 2C3, 3E7 및 GV39M의 생체내 위치를 측정하였다. 비오틴화된 2C3 또는 이소타입-일치된 (isotype-matched) 대조 IgG 100㎍을 NCI-H358 인간 NSCLC를 가진 nu/nu 마우스에 i.v. 주사하였다. GV39M 및 3E7 또는 이소타입-일치된 대조 IgG 100㎍을 HT29 인간 결장선암을 가진 SCID 마우스에 주사하였다. 24시간 경과후, 마우스를 죽인 후에 피를 뽑고 종양 및 조직을 제거하였다. 상기 종양 및 조직의 동결 절편을 면역조직화학 분석하여, 상기 항체의 결합 및 분포를 측정하였다 (하기 표 4 참조).
[표 4]
종양을 가진 마우스에서 항-VEGF 항체의 조직 분포
항체 면역조직화학 반응성
심장 폐 간 신장1 소장 비장 종양2
2C3 - - - - - - 3+
3E7 - - - - - - 1 내지 2+
GV39M - - - 2+ - - 2+
대조3 - - - - - - -
{죽이기 24시간 전에 정맥을 통해 상기한 항체 1000mg을 투여받은 종양-함유마우스에서 수득한, 아세톤으로 고정한 조직 절편 (종양 포함)에 대해 면역조직화학 분석을 수행하였다. 상기 절편에 대해 현미경으로 검사한 후, 특이적인 반응성에 대해 다음과 같이 수치화하였다: - 네가티브, ±매우 약함, 1+ 약함, 2+ 중간, 3+ 강함, 4+ 매우 강함.
1: GV39M은 신장의 신사구체의 내피세포 또는 사구체 간질 세포에 특이적으로 결합하였다.
2: 3E7 및 GV39M은 종양 혈관 내피에 특이적으로 결합한 반면, 2C3는 종양 기질에 특이적으로 결합하였다.
3: 대조는 관련성없는 특이성을 가진 IgM이다}
3E7은, 종양내의 혈관내피의 위치를 특이적으로 찾아내었다. MECA 32 포지티브 혈관 중 약 70%는 생체내 주사된 3E7에 의해 염색되었다. 미세혈관에 영양분을 공급하는 보다 큰 혈관들은 3E7-포지티브를 나타내었다. 기질 트랙 및 종양 네스트내에서의 작은 미세혈관들도 3E7에 대해 포지티브 반응을 보였다. 3E7의 염색 강도는 괴사 중심부 내 또는 주위에서 증가하였다. 종양 괴사 지역에서는 혈관외 항체가 뚜렷하였지만, 종양의 정상 부위에서는 혈관외 염색이 거의 없었다. 신장을 포함하여 검사한 모든 정상적인 조직에서의 혈관내피는 3E7에 의해 염색되지 않았다.
또한, GV39M은 종양 혈관내피의 위치를 특이적으로 찾아내었다. 종양내의 MECA 32 포지티브 혈관 중 약 80%는 GV39M에 의해 염색되었다. GV39M-포지티브 혈관은, 큰 혈관 및 작은 모세혈관을 포함하여 종양 전체에 균일하게 분포하였다.3E7과 마찬가지로, GV39M-포지티브 혈관의 염색 강도는 종양 괴사 중심부에서 증가하였다. 하지만, 3E7과는 달리, 신장 사구체내의 내피세포 또는 사구체간질 세포 또한 염색되었다. 관련성 없는 특이성을 갖는 대조 IgM은 사구체간질 세포를 염색시키지 않았기 때문에, GV39M에 의한 사구체간질 세포의 염색은 항원-특이적인 것으로 보인다. 신장 이외의 조직에서의 혈관내피는 GV39M에 의해 염색되지 않았다.
비오틴화된 2C3는, i.v 주사후 H358 인간 NSCLC 종양 혈관 주위의 결합 조직을 진하게 염색시켰다. 종양 세포 네스트 (nest)를 연결하는 큰 트랙(track)의 기질 조직은 2c3에 의해 염색되었는 데, 가장 큰 트랙의 기질에서 가장 진하게 염색되었다. 상기 부위에서 혈관내피와 주위의 결합 조직을 구분하는 것은 불가능하였다. 하지만, 기질에 의해 둘러싸여 있지 않은 내피세포 (예를 들면, 종양 세포 네스트를 관통하는 혈관내의 내피세포)는 염색되었다. 검사된 어떠한 정상조직에서도 2C3에 의해 검출가능한 염색은 없었다.
HT29 인간 종양 모델에 있어서, 2C3는 결합 조직의 위치를 강하게 찾지만, 가장 강하게 염색되는 부위는 종양의 괴사 부위였다.
실시예 4
2C3의 VEGF-VEGFR2 결합 억제 및 VEGF-VEGFR1 결합 비-억제
A. 재료 및 방법
1. 세포 라인 및 항체
VEGFR1으로 형질감염시킨 돼지의 대동맥 내피 (PAE) 세포 (PAE/FLT) 또는 VEGFR2로 형질감염시킨 돼지의 대동맥 내피 세포 (PAE/KDR)를 JohannesWaltenberger 박사 (독일 울름)로부터 입수하고; Waltenberger 등 (1994, 본원에 참조문헌으로 포함)이 기재한 바대로 제조하고 나서; 5% FCS, L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신 (GPS)을 함유한 F-12 배지에서 성장시켰다. bEND.3 세포는 Werner Risau 박사 (Bad Nauheim, 독일)로부터 입수하고, 5% FCS 및 GPS를 함유한 DMEM 배지에서 성장시켰다. NCI-H358 NSCLC (텍사스 달라스 소재의 UT-Southwestern의 Adi Gazdar 박사로부터 입수), A673 인간 횡문근육종 및 HT1080 인간 섬유육종 (각각 ATCC에서 입수)을 10% FCS 및 GPS를 함유한 DMEM 배지에서 성장시켰다.
2C3 및 3E7 항-VEGF 모노클론 항체, 및 1A8 모노클론 항-Flk-1 항체, 및 T014 폴리클론 항-Flk-1 항체는 상기 실시예 1 및 Brekken 등 (1998) 및 Huang 등 (1998)에 기재되어 있다. A4.6.1 마우스 항-인간 VEGF 모노클론항체는 Jin Kim 박사 (Genentech Inc., CA)로부터 입수하였으며, 이전에 이미 기재되어 있었다 (참조: Kim 등, 1992 - 본원에 참조문헌으로 포함). 마우스 항-랫트 Thy1.1 항체인 OX7 (Bukovsky 등, 1983; 영국 옥스퍼드 소재의 MRC Cellular Immunology Unit의 A.F.Williams 박사로부터 입수) 및 마우스 항-콜키친 항체 (Rouan 등, 1990; ATCC로부터 입수)를 네가티브 대조 항체로 사용하였다.
2. ELISA 분석
VEGFR1 (Flt-1/Fc, R&D Systems, 미네아폴리스 소재) 또는 VEGFR2 (sFlk-1-비오틴)의 세포외 도메인을, 각각 미세적정 플레이트의 웰 상에 직접 코팅시키거나 NeutrAvidin (Pierce, 일리노이 록포드 소재)-코팅된 웰에 의해 포획시켰다. 농도1nM (40ng/ml)의 VEGF를, 100 내지 1000nM (15 내지 150㎍/ml)의 대조 또는 테스트 항체의 존재 또는 비-존재하에 인큐베이션시켰다. 그리고 나서, 토끼 항-VEGF 항체 (A-20, Santa Cruz Biotechnology, 캘리포니아 산타 크루즈 소재) 1㎍/ml 과 함께 상기 웰을 인큐베이션시켰다.
포옥시데이즈-표지된 염소 항-토끼 항체 (Dako, Carpinteria, CA)를 첨가하여 상기 반응물을 현상시키고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.)을 첨가하여 시각화하였다. 상기 반응물을 1M H2PO4와 15분간 반응시킨 후에 중단한 후, 450nM에서 계측하였다.
또한, 대조 또는 테스트 IgG로 미세적정 플레이트 웰을 코팅시켜 상기 분석을 수행하였다. 그리고 나서, 상기 웰을 VEGF:Flt-1/Fc 또는 VEGF:sFlk-1-비오틴과 함께 인큐베이션시킨 후, 각각 퍼옥시데이즈-표지된 염소 항-인간 Fc (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) 또는 퍼옥시데이즈-표지된 스트렙트아비딘으로 현상시킨 후에 시각화하였다.
3. 공침전 분석
결합 버퍼내에서 30분간 2C3 (20㎍) 또는 A4.6.1 (10 및 1㎍)의 F(ab')2와 함께 VEGF 40ng을 예비 인큐베이션시켰다. 가용성 형태의 VEGFR1 (Flt-1/Fc) 또는 VEGFR2 (KDR/Fc, R&D Systems, 미네아폴리스 소재) 200ng을 첨가하여 총 체적 50㎕이 되도록 한 후, 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 단백질 A-세파로즈 비드를 이용하여 상기한 수용체/Fc 작제물을 침전시킨 후, 잔류 침전물을 결합 버퍼로 4회 세척하였다.
각 반응물의 펠렛 및 상층물에 환원 샘플 버퍼를 첨가한 후, 12% SDS-PAGE로 분석하고 PVDF 막으로 이동시켰다. 상기 막을 1.0㎍/ml의 12D7 마우스 항-VEGF 항체로 프로브하고, Super Signal 화학발광 기질 (Pierce, 일리노이 록포드 소재)에의해 퍼옥시데이즈-표지된 염소 항-마우스 IgG (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.)와 함께 인큐베이션시킨 후에 현상하였다. 또한, 퍼옥시데이즈-컨쥬게이트된 염소 항-인간 Fc (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.)를 이용하여, 상기한 가용성 수용체/Fc 작제물을 검출하였다.
B. 결과
1. ELISA에서 2C3은 VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 차단하지만, VEGFRR1에 대한 결합은 차단하지 않는다
ELISA 분석에서, 항-VEGF 항체 2C3는 VEGF가 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것은 차단하지만, VEGFR1 (FLT-1)에 결합하는 것은 차단하지 않았다. 100배 및 1000배 몰 과량의 2C3의 존재하에 VEGFR2-코팅된 웰에 부착된 VEGF의 양은, 2C3 부존재하에 부착된 양의 각각 26% 및 19%로 감소하였다 (도 2 참조). 이와 달리, 100배 및 1000배 몰 과량의 2C3의 존재하에 VEGFR1-코팅된 웰에 부착된 VEGF의 양은, 2C3 부존재하에 부착된 양의 각각 92% 및 105%였다 (도 2 참조).
VEGFR1 또는 VEGFR2에 부착된 VEGF의 양은, 비-차단 모노클론 항-VEGF 항체 3E7 또는 관련성없는 특이성을 가진 대조 IgG의 100 내지 1000배 몰 과량의 존재에도 영향을 받지 않았다 (도 2 참조). A4.6.1은 VEGF가 VEGFR2 (KDR/Flk-1) 및VEGFR1 (FLT-1) 모두에 결합하는 것을 차단하였다.
2. 용액내에서 2C3은 VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 차단하지만, VEGFRR1에 대한 결합은 차단하지 않는다
VEGF의 용액중의 VEGFR1/Fc 또는 VEGFR2/Fc에 대한 결합을 차단하는 2C3의 능력을 공침전 분석에서 분석하였다. 2C3 또는 4.6.1 F(ab')2의 존재 또는 부존재하에서 결합된 VEGFR2 (KDR/Fc) 또는 Fc 부위에 결합된 VEGFR1 (Flt-1/Fc)의 세포외 도메인 200ng과 함께 VEGF 40ng을 인큐베이션시켰다. 단백질 A 세파로즈 비드와 함께 인큐베이션시켜, 상기한 수용체/Fc 작제물을 침전시켰다. 상기 침전물을 세척한 후에 환원 샘플 버퍼내에서 재현탁시킨 후, 12% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF로 이동시켰다. 상기 막을 PP82로 차단하고, 12D7 마우스 항-VEGF 항체 (1㎍/ml)로 프로브한 후, 표준 화학발광 조건하에서 현상하였다. F(ab')2및 VEGF 모노머 및 다이머를 검출하였다.
VEGFR1/Fc 또는 VEGFR2/Fc와 함께 혼합한 VEGF를 단백질 A 세파로즈로 공침전시킨 결과, VEGF가 상기 2가지의 수용체에 모두 결합함을 보였다. F(ab')2을 추가한 결과, VEGF의 VEGFR2/Fc에 대한 결합이 차단되었으나, VEGFR1/Fc에 대한 결합은 차단되지 않았다. 이와 달리, 4.6.1F(ab')2는, VEGF의 VEGFR2/Fc 및 VEGFR1/Fc에 대한 결합 모두를 차단하였다. 이 결과를 통해, 2C3는 VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 차단하지만 VEGFR1에 대한 결합은 차단하지 않는 반면, 4.6.1 항체는 VEGF의 VEGFR2 및 VEGFR1에 대한 결합을 모두 차단함을 확인하였다.
실시예 5
2C3의 VEGFR2의 VEGF-유도 인산화 차단
A. 재료 및 방법 - 면역 침전 및 웨스턴 블랏 분석
PAE/KDR, PAE/FLT 및 bEND.3 세포를 성장시켜 5% 혈청을 함유한 배지에서 100mm 조직 접시에서 80 내지 90% 합류하였다. 그리고 나서, 0.1% 혈청을 함유한 배지에서 24시간 동안 상기 세포에 혈청을 주입하지 않았다 (serum starved). PBS 중의 100nM 나트륨 오르토바나데이트와 함께 30분간 예비처리한 후, 추가 15분 동안 대조 또는 테스트 항체의 존재 또는 부존재하에 5nM (200ng/ml) VEGF165, 5nM (100ng/ml) bFGF (R&D Systems, 미네아폴리스, MN) 또는 A673 종양-조건화 배지와 함께 상기 세포를 인큐베이션시켰다.
그리고 나서, 10mM EDTA, 2mM 플루오로나트륨 및 2mM 나트륨 오르토바나데이트를 함유하는 빙냉 PBS로 상기 세포를 세척한 후, 용해 버퍼 {50mM Tris, 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.25% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% CHAPS, 5mM EDTA, 1.5mM MgCl2, 2mM 플루오로나트륨, 2mM 나트륨 오르토바나데이트, 10% 글리세롤 및 프로티에이즈 억제제 (Complete Protease Inhibitor Cocktail tablets, Boehringer Mannheim)}에서 용해시켰다. 원심분리시켜 상기 용해물을 투명화시킨 후, 잔류 상층물을 면역 침전시키는 데에 사용하였다.
VEGFR1 및 VEGFR2는, 닭 항-FLT-1 N말단 (Upstate Biotechnology, 뉴욕 레이크 플래시드 소재) 5㎍ 또는 T014 (친화 정제된 항-Flk-1) 10㎍과 함께 각각 밤새4℃에서 상기 세포 용해물을 인큐베이션시켜 면역침전시켰다. 그리고 나서, 상기한 닭 항-FLT-1 항체를 이용한 반응물을 4℃에서 1시간 동안 가교-염소 항-닭 항체 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) 와 함께 인큐베이션시켰다. 그리고 나서, 상기 면역 복합체를 단백질 A/G 세파로즈로 침전시킨 후, PBS-트윈 (0.2%) 중의 10% 용해 버퍼 (첨가된 프로티에이즈 억제제와 함께)로 수차례 세척하고 나서, 100mM β-머캅토에탄올 및 8M 우레아를 함유하는 SDS 샘플 버퍼에서 끓였다.
그리고 나서, 상기 샘플을 SDS-PAGE로 분리한 후에 PVDF 막으로 이동시켰다. 상기 막을 PP81 (East Coast Biologics, Berwick, ME)로 30분 내지 60분 동안 블라킹한 후, 4℃에서 밤새 4G10 (Upstate Biotechnology, 뉴욕 레이크 플래시드) 0.5㎍/ml으로 포스포티로신 잔기를 위해 프로브하였다. Super Signal 화학 발광 기질 (Pierce, 일리노이 록포드 소재)에 의해 퍼옥시데이즈-표지된 토끼 항-마우스 IgG (Dako, 캘리포니아 카르핀테리아 소재)와 함께 인큐베이션한 후, 상기 PVDF 막을 현상하였다. 그리고 나서, 상기 PVDF 막을 ImmunoPure Elution 버퍼 (Pierce, 일리노이 록포드 소재)로 30분간 55℃에서 스트립핑한 후, 닭 항-FLT-1 0.5㎍ 또는 T014 1.0㎍과 함께 수용체 수준에 대해 재프로브하고나서, 적합한 퍼옥시데이즈-컨쥬게이트된 2차 항체와 함께 인큐베이션시킨 후에 상기한 바와 같이 현상하였다.
B. 결과 - VEGF-유도 인산화의 차단
본 연구에서는, PBS, bFGF (5nM, 100ng/ml), VEGF165 (5nM, 210ng/ml), A673-조건된 배지 (CM), 특정 항체 (별개로 100nM, 15㎍/ml의 CNTL, 2C3, 3E7, A4.6.1)와 CM의 복합체 또는 T014 단독 (100nM, 15㎍/ml)와 함께 PAE/KDR 세포를15분간 자극하였다. 또한, PBS, VEGF165 (5nM, 210ng/ml), A673-조건된 배지 (CM), 특정 항체 (별개로 100nM, 15㎍/ml의 2C3, 3E7, A4.6.1)와 CM의 복합체 또는 T014 단독 (100nM, 15㎍/ml)와 함께 PAE/FLT 세포를 15분간 자극하였다. 그리고 나서, 상기 세포를 용해 버퍼내에서 인큐베이션시킨 후, 상기 수용체를 면역 침전시키고 나서, 환원 조건하에서 SDS-PAGE로 분리한 후, PVDF 막으로 이동시킨 후, 4G10 마우스 항-포스포-티로신 항체 (0.5㎍/ml)로 프로브하고 나서, 표준 화학발광 조건하에서 현상하였다. 그리고 나서, 상기 막을 면역침전 IgG로 스트리핑 및 재프로브화하여, 각 레인의 수용체 단백질 수준을 측정하였다.
상기 결과에서는, 대조 중화 항-VEGF 항체인 A4.6.1 및 2C3는 PAE/KDR 세포에서 VEGFR2의 VEGF-유도 인산화를 차단함으로 보였다. 이는, 2C3 및 A4.6.1 모두가 VEGF-매개 내피세포 성장을 차단하였음을 보인 전술한 결과 (참조: 실시예 2; Brekken 등, 1998)와 일치하였다. 면역 침전물에서의 VEGFR2에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 각 레인에서의 VEGFR2의 양을 알 수 있었다. VEGF의 NH2말단을 인식하는 3E7은, VEGFR2의 VEGF-유도 인산화 및 관련성없는 특이성을 갖는 대조 IgG 도 차단하지 않았다.
VEGFR1의 VEGF-유도 인산화에 대한 2C3의 효과는 확실하지 않다. 다른 과학자들이 보고한 바와 같이, VEGFR1의 내재한 카이네이즈 활성이 작기 때문에 PAE/FLT 세포에서의 VEGFR1의 VEGF-유도 인산화를 보이기는 어렵다 {참조: De Vries 등, 1992; Waltenberger 등, 1994; Davis-Smyth 등, 1996; Landgren 등,1998}.
실시예 6
2C3의 VEGF-유도 투과 억제
A. 재료 및 방법 - Miles 투과 분석
하기 프로토콜은 Murohara 등 (1998, 본원에 참조문헌으로 포함)에 기재된 것이다. 간략하게 설명하면, 400 내지 450g의 수컷 IAF-털을 다 벗긴 기니아 피그 (Charles River, 마이애미 윌밍톤)를 마취시킨 후, 멸균 PBS 중의 0.5% Evan 블루 염색액 0.5ml를 귀의 정맥을 통해 i.v 주사하였다. 20분 경과후, 대조 또는 테스트 항체의 존재 또는 부존재하에 VEGF 20ng을 경피 주사하였다. 이렇게 하여 관찰된 기니아 피그의 등쪽의 파란색 반점을 사진 찍은 후, 경피 주사후 30분 후에 캘리퍼로 측정하였다.
B. 결과 - 2C3는 VEGF-유도 투과를 차단한다
2C3의 VEGF-유도 투과에 대한 효과를 측정하기 위해, 400 내지 450g의 IAF- 털을 다 벗긴 기니아 피그 (Hartley 품종)를 마취시킨 후, 멸균 PBS 중의 0.5% Evan 블루 염색액 0.5ml를 귀의 정맥을 통해 i.v 주사하였다. 20분 경과후, 대조 또는 테스트 항체의 존재 또는 부존재하에 VEGF 25ng을 경피 주사하였다. 이렇게 하여 관찰된 기니아 피그의 등쪽의 파란색 반점을 사진 찍은 후, 경피 주사후 30분 후에 캘리퍼로 측정하였다.
상기한 Miles 투과성 분석을 이용하여, VEGF가 VEGFR2를 활성화시키는 것을 차단하는 2C3가 기니아 피그에서 VEGF-유도 투과를 억제시키는 것을 확인하였다.VEGF가 VEGFR1 및 VEGFR2를 모두 활성화시키는 것을 차단하는 A4.6.1은 10배 몰 과량에서 VEGF-유도 투과를 억제시켰다 {참조: 본 연구 및 Kim 등, 1992}. 3E7, 및 VEGF:VEGFR2 상호작용을 차단하지 않는 대조 IgG는 기니아 피그에서의 Miles 투과성 분석에서 VEGF-유도 투과를 차단하지 않는다.
이러한 결과는, VEGF에 의해 매개되는 내피 투과는 적어도 부분적으로 VEGFR2 활성화를 통해 매개됨을 시사해준다. 이 결과는, VEGFR2의 티로신 카이네이즈 활성이 VEGF-유도 투과에 필수적임을 보인 다른 과학자들의 결과와도 일치한다 {참조: Murohara 등, 1998; Joukov 등, 1998; Ogawa 등, 1998}.
실시예 7
2C3의 항종양 효과
A. 재료 및 방법
1. 생체내 종양 성장 억제
제0일째, 1×107NCI-H358 NSCLC 세포 또는 5×106A673 횡문근육종 세포를 nu/nu 마우스에 피하 주사하였다. 제1일째 및 그 후에 1주에 2회씩, 상기한 바와 같이 1, 10 또는 100㎍의 2C3 또는 대조 항체를 상기 마우스에 i.p 주사하였다. 그리고 나서, NCI-H358을 가진 마우스의 경우에는 약 6주 동안, A673을 가진 마우스의 경우에는 4주 동안, 1주에 2회씩 상기 종양을 측정하였다. 종양 체적을 다음의 공식에 따라 계산하였다: 체적 = L×W×H (여기서, L은 길이, W는 폭, H는 높이).
2. 생체내 종양 치료
크기 200 내지 400mm3의 피하 NCI-H358 종양 또는 HT1080 섬유육종을 가지는 수컷 nu/nu 마우스에 테스트 또는 대조 항체를 i.p 주사하였다. 상기한 NCI-H358을 가진 마우스에 대해, 첫째주 동안에는 1주에 3회씩, 둘째주 및 셋째주 동안에는 1주에 2회씩, 1회 주사시 항체 100㎍으로 치료하였다. 그리고 나서, 5일마다 1회 주사시 50㎍씩을 투여하였다. 상기한 HT1080을 가진 마우스에 대해, 본 연구기간동안 계속 2일에 한번씩 상기 항체 또는 염수 100㎍으로 치료하였다. 상기한 2가지 연구 모두에서, 종양 크기가 2500mm3에 도달하거나 종양에 궤양이 생기기 시작하면 이보다 일찍 마우스를 죽였다.
B. 결과
1. 2C3는 새로 이식된 인간 종양 이종이식편의 성장을 억제한다
2C3는, nu/nu 마우스에서 투여량-의존 방식으로 NCI-H358 NSCLC 및 A673 횡문근육종의 생체내 성장을 억제한다 (도 3A 및 3B 참조). 1일 전에 종양 세포를 피하 주사한 마우스에 100㎍의 2C3를 1주에 2회씩 i.p 투여한 결과, 상기 2가지 종류의 인간 종양 모두가 성장이 억제되었다. 2C3를 투여받은 마우스에서의 최종 종양 체적은 상기 2가지 종양 시스템 모두에서 대략 150mm3인 반면, 대조 항체를 투여받은 마우스의 경우에는 1000mm3이었다.
1주에 2회씩 10 또는 1㎍의 2C3로 치료하는 것은 종양 성장을 억제하는 데에는 이보다 덜 효과적이었다. 하지만, 상기한 2가지의 적은 투여량의 2C3로 치료한 경우에도, 치료받지 않은 마우스와 비교하여 유사할 정도로 A673 종양의 성장을 늦췄다. 10㎍의 2C3에 의한 종양 성장 지연은 NCI-H358 종양 모델에서는 덜 뚜렷하였다. 이러한 2가지 종양 모델과 2C3에 의한 VEGFR2 활성 억제에 대한 반응 사이의 차이는, 생체내에서 상기한 2가지 종류의 종양의 공격성과 관련성이 있다. NCI-H358은 A673 보다 생체내에서 보다 천천히 성장하며 낮은 투여량의 2C3에 대해서는 민감성이 떨어지는 반면, A673은 보다 빨리 공격적으로 성장하며 낮은 투여량의 2C3에 보다 민감성이 크다.
VEGF에 결합하지만 이의 활성을 차단하지 않는 3E7은, NCI-H358 종양의 성장에 대해 영향을 끼치지 않았다. 하지만, 1주에 2회씩 100㎍의 투여량으로 3E7을 치료한 경우에는 A673 종양의 성장을 자극하였는 데 (도 3B 참조), 이는 3E7이 종양내의 VEGF 신호전달 효율을 증가시키는 것을 시사한다.
2. 2C3을 이용한 인간 종양 이종이식편의 치료
크기 300 내지 450mm3로 성장시킨 피하 NCI-H358 NSCLC 종양을 가진 마우스에, 2C3, A4.6.1, 3E7 또는 관련성없는 특이성을 가진 IgG로 i.p 주사했다 (도 4 참조). 3 내지 5일에 한번씩 50 내지 100㎍을 투여하였다. A4.6.1은 포지티브 대조 항체로 사용하였는 데, 이는 생체내에서 VEGF 활성을 차단하여 종양 성장을 억제한다고 다른 과학자들에 의해 밝혀져 있었기 때문이다 (참조: Kim 등, 1993; Mesiano 등, 1998). 평균 종양 체적을 측정함과 더불어 (도 4 참조), 각 치료 그룹의 마우스에 대해 사진을 찍어서 본 연구 종료시 종양 크기 및 외형의 차이를 확인하였다.
2C3 또는 A4.6.1을 이용해 치료한 경우, 본 연구가 진행되는 동안에 걸쳐 종양 퇴행이 일어났다. 본 연구 종료시 평균 종양 체적은, 최초의 평균 종양 체적의 30% (2C3) 및 35% (A4.6.1)이었다. 하지만, 종양 세포 주사후 40일 내지 60일 사이에서 대조군에서 종양 성장이 자발적으로 지연 (spontaneous retardation)되었다는 사실로 인해, 상기 결과는 난해하였다. 상기한 자발적인 성장 지연이 분명히 일어나기 이전 40일까지의 결과에서는, 2C3 및 A4.6.1을 이용한 치료로 인해 종양 성장이 방해되었다는 것을 보여주었다.
도 5A에서는, 2C3 또는 3E7 100㎍을 이용하여 장기간 동안에 NCI H358을 가진 마우스를 처리한 다른 연구 결과를 보여준다. 치료 시작시에 2C3-치료 마우스의 평균 종양 체적은 480mm3이었으며, 대략 14주 동안의 치료 기간 경과후의 평균 종양체적은 84mm3로 약 80% 감소하였다. 3E7-치료 마우스의 치료 시작시의 평균 종양 체적은 428mm3이었으며, 대략 14주 동안의 치료 기간 경과후의 평균 종양체적은 1326mm3로 300% 증가하였다.
도 5B에서는, 2C3, 3E7 또는 대조 IgG 또는 염수 100㎍을 이용하여 2일에 한번씩 치료받은, 인간의 섬유육종 HT1080을 가진 마우스의 종양 성장 곡선을 보여준다. 2C3는, 치료가 계속되는 동안에는 종양 성장을 차단하였다. 3E7, 대조 IgG또는 염수로 치료한 마우스는, 점진적으로 종양 크기가 커져 종양 세포 주사후 4주 미만에 마우스를 죽여야 했다.
실시예 8
A4.6.1과 상이한 2C3
2C3와 A4.7.1 사이에는 많은 차이점이 있다 (참조: 예를 들면, 표 5). 상기 항체들은, ELISA 교차-차단 연구에 기초한 VEGF 상의 상이한 에피토프를 인식한다 (참조: 실시예 1). 돌연변이생성 및 X선 결정분석 연구에서는, A4.6.1이 아미노산 89 내지 94 주위에 중심을 가진 VEGF 상의 에피토프에 결합한다는 것을 이미 밝혔다 (참조: Muller 등, 1998).
특히, A4.6.1은 VEGF가 VEGFR1 및 VEGFR2 모두에 결합하는 것을 차단하지만 (Kim 등, 1992; Wiesmann 등, 1997; Muller 등, 1998; Keyt 등, 1996), 2C3는 VEGF가 VEGFR2에 결합하는 것만을 차단한다 (실시예 4 참조)는 점이 주목을 끈다. A4.6.1이 VEGF가 VEGFR1 및 VEGFR2 모두에 결합하는 것을 차단한다는 증거는, 상세한 결정분석 및 구조 연구를 통해 알 수 있다(Kim 등, 1992; Wiesmann 등, 1997; Muller 등, 1998; Keyt 등, 1996 - 각각 본원에 참조문헌으로 포함). 상기 공표된 데이터를 보면, A4.6.1이 VEGFR2에 결합하는 데에 핵심적인 VEGF 상의 에피토프에 대해 VEGF와 경쟁함으로써 VEGF가 VEGFR2에 결합하는 것을 억제하며, VEGF가 VEGFR1에 결합하는 것을 억제하는 것은 입체적인 방해를 통해서일 가능성이 가장 높다 (참조: Muller 등, 1998; Keyt 등, 1996).
인간화된 형태의 A4.6.1이 현재 임상 시험 중에 있다 (참조: Brem, 1998;Baca 등, 1997; Presta 등, 1997 - 각각 본원에 참조문헌으로 포함). VEGFR1에 의해 매개되는 VEGF의 마크로파지/모노사이트 화학 주성 및 기타의 내인성 기능은, 상기한 A4.6.1 임상 시험에서 손상입을 가능성이 매우 크다. 이와 달리, 2C3는, VEGFR2-매개 효과만을 특이적으로 차단할 수 있기 때문에 보다 우수한 것으로 생각된다. 따라서, 2C3는 매우 안전한 항체이며, 특히 인간에게 장기간 투여하는 경우에 그렇다. 2C3를 이용하여 치료하는 경우의 잇점으로는, VEGF-유도 종양 혈관 팽창을 차단하는 동시에 마크로파지가 종양 부위로 이동하게 함으로써 치료받는 환자가 항종양 반응을 크게 할 수 있다는 점이 포함된다. 또한, VEGFR1에 의해 매개되는 마크로파지 화학 주성 및 기타의 효과들을 유지함으로써 얻는 많은 시스템상의 잇점들을 간과하여서는 안된다.
[표 5]
항-VEGF 항체 2C3 및 A4.6.1의 특성
특성 2C3 A4.6.1
이소타입 IgG2a,k IgG11
VEGF 상의 에피토프 정의되지 않음, A4.6.1과는 상이2 아미노산 989-94 주위에 중심, 연속적
VEGF의 VEGFR1에 대한 결합의 차단 여부 No Yes
VEGF의 VEGFR2에 대한 결합의 차단 여부 Yes Yes
VEGF-유도 투과의 차단 여부 Yes Yes
VEGF-유도 증식의 차단 여부 Yes Yes
동결 종양 절편상의 직접 IHC 패턴 NR 약간의 BV와 약한 반응성4
생체내 종양 위치화 패턴 CT와 중간 정도 내지 강한 반응성 소수의 BV와 중간 정도의 반응성, CT와 약하거나 반응성 없음
생체내 정상 마우스 조직 위치화 검출안됨 검출안됨
친화성 1×10-9(M)3 8×10-10(M)
{상기에서 사용된 약자: IHC - 면역조직화학법, NR - 반응성 없음, BV - 혈관, CT - 결합 조직.
1: A4.6.1에 대한 참조문헌은 Kim 등 (1992), Wiesmann 등 (1997), Muller 등 (1996) 및 Keyt 등 (1996)이 포함된다 - 각각 본원에 참조문헌으로 포함.
2: 2c3가 VEGF상에서 인식하는 에피토프는 정의되지 않았지만, ELISA 교차차단 연구를 통해 A4.6.1이 인식하는 에피토프와는 상이함을 알 수 있었다.
3: 2C3의 VEGF에 대한 친화성은 ELISA 및 표면 플라스몬 공명 분석을 통해 측정하였다.
4: A4.6.1은 아세톤으로 약하게 고정된 동결 절편과만 반응한다}
실시예 9
관절염 조직에서의 VEGF 염색
안지오제네시스와 질환 사이의 관계는, 혈관생성된 종양에서 관찰된 것 이상이다. 예를 들면, 비정상적인 안지오제네시스가 관절염과 관련되어 있다는 것은 잘 알려져 있다. 일련의 상이한 항-VEGF 항체 및 티미딘 포스포릴레이즈에 대한 항체를 사용하여 관절염 조직을 염색시켰는 데, 이는 상응하는 대조 항체와는 상이하였다. VEGF에 대한 항체를 이용한 연구에서는, 류마티스성 관절염이 있는 활막액에서 크게 발현되었다.
실시예 10
2C3-엔도스타틴 컨쥬게이트
A. 엔도스타틴의 클로닝 및 발현
마우스의 간으로부터 RNA를 분리한 후, 하기의 프라이머와 함께 RT-PCRTM을 위한 주형으로 사용하였다:
5' 프라이머 - aga cca tgg gtc ata ctc atc agg act ttc a (서열번호 제43)
3' 프라이머 - ctac cat ggc tat ttg gag aaa gag gtc a (서열번호 제44)
이로 인해 수득한 cDNA 단편은 서열번호 제12의 DNA 서열을 가지며, 서열번호 제13의 아미노산 서열을 가진다. 참고로, 인간의 엔도스타틴의 아미노산 서열은 서열번호 제14이다. 마우스 cDNA 단편을, N 말단 6×히스티딘 태그를 코드하는 발현 벡터 H6pQE60 (Qiagen)에 삽입한 후,E.coliM15 세포에서 발현시켰다.E.coli세포 밀도가 최적 밀도인 560nM에서 0.6에 도달하면, 4시간 동안 0.1mM 이소프로필티오갈락토시드 (IPTG)를 첨가하여 6-His 엔도스타틴의 발현을 유도하였다. 상기 세포를 원심분리하여 수집한 후, 용해 버퍼 (B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent (Pierce, Rockford, IL))내에서 용해시켰다.
상기한 6-His 엔도스타틴을 함유한 혼입체 (inclusion body)를 원심분리시켜 침전시킨 후, 버퍼 A {pH8.0, 6M 구아니딘 HCl (GuHCL), 100mM NaH2PO4, 10mM Tris, 10mM 이미다졸, 10mM β-2 머캅토에탄올} 에서 용해시켰다. 상기 환원된 6-His 엔도스타틴을 함유한 용액을 과량의 5,5'-디티오-비스-(2-니트로벤조산) (Ellman 시약) (20mM)으로 처리한 후, Ni-NTA 칼럼에 부하하였다. 상기 칼럼을 세척 버퍼 {6M GuHCl, 100mM NaH2PO4, 10mM Tris, 500mM NaCl, pH7.3}로 세척한 후, 세척 버퍼 중의 0.2M 이미다졸로 상기 칼럼으로부터 6-His 엔도스타틴을 용출시켰다.
상기 용출된 불용성 6-His 엔도스타틴을, 동일 부피의 재접힘(refolding) 버퍼 {3M 우레아, 1M Tris pH7.3, 0.5M L-아르기닌, 0.5M NaCl, 0.1M Na2HPO4, 1mM 환원된 글루타티온 (GSH)}으로 희석시키고, 밤새 실온에서 인큐베이션시켰다. 실온및 pH7.4에서 재접힌 6-His 엔도스타틴을 PBS에 대해 광범위하게 투석시켰다. 이렇게 수득한 단백질인 6-His 엔도스타틴은, 단일 20kDa 밴드를 가지는 비-환원 조건하에서 SDS-PAGE 분석에 기초하여 매우 순도가 높으며 가용성이었다.
B. 엔도스타틴의 기능 활성
발현된 단백질이 완전히 가용성이라는 사실이외에도E.coli-발현된 6-His 엔도스타틴이 생물학적으로 활성을 가진다는 증거로는, 내피세포에 결합한다는 점이다. 비오틴화된 6-His 엔도스타틴은, 실험실내에서 3가지의 상이한 유형의 내피세포 (Bend3 - 마우스 내피세포; ABAE - 소의 대동맥 내피세포; 및 HUVEC - 인간의 태반 정맥 내피세포)를 사용하여 제조 및 인큐베이션시켰다. 스트렙트아비딘-퍼옥시데이즈와O-페닐렌디아민 (OPD)을 함께 사용하여 결합을 측정하였으며, 흡수도는 490nm에서 계측하였다.
상기한 직접 결합 연구 결과, (비오틴화된 6-His) 엔도스타틴은 실험실내에서 상기한 3가지의 상이한 유형의 내피세포에 포화 결합하였다. 또한, 발현된 엔도스타틴 (표지 없음)은, Bend3 내피세포에 결합하기 위해 비오틴화된 엔도스타틴과 경쟁하는 것으로 관찰되었다.
C. SMPT 및 2-IT를 통한 엔도스타틴의 2C3에의 컨쥬게이션
N'N-디메틸포름아미드 (DMF) 중의 4-석신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)-톨루엔 (SMPT)을 2C3 IgG에 몰 비율 5:1 (SMPT:2C3)로 첨가한 후, 5mM EDTA (PBSE)와 함께 PBS에서 1시간 동안 실온(RT)에서 인큐베이션시켰다. PBSE에서 수행되는 G25 크기 배제 크로마토그래피를 통해 자유 SMPT를 제거하였다. 이와 동시에, 마우스의 6-His 엔도스타틴을 2-이미노티올란 (2-IT, Traut 시약)과 함께 몰 비율 1:5 (엔도스타틴:2C3)로 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. PBSE에서 수행되는 G25 크기 배제 크로마토그래피를 통해 자유 2-IT를 제거하였다.
SMPT-변형된 2C3를 2-IT-변형된 6-His 엔도스타틴과 함께 혼합한 후, 3 내지 5ml로 농축시키고 나서, RT에서 24시간 동안 가볍게 흔들면서 인큐베이션시켰다. SDS-PAGE를 통해 상기 반응물을 분석하였다. 헤파린 친화성 크로마토그래피를 이용하여 상기 컨쥬게이트로부터 컨쥬게이트되지 않은 2C3-SMPT를 제거하여, 2C3-엔도스타틴을 수득하였다.
D. SMCC 및 SATA를 통한 엔도스타틴의 2C3에의 컨쥬게이션
N-석신이미딜 S-아세틸티오아세테이트 (SATA)를 6-His 엔도스타틴과 함께 몰비율 6:1 (SATA:엔도스타틴)로 RT에서 30분간 인큐베이션시켰다. PBSE에서 수행되는 G25 크기 배제 크로마토그래피를 통해 자유 SATA를 제거하였다. PBSE 중의 SATA-변형된 6-His 엔도스타틴을 4.0ml로 농축시키고, 0.4ml의 탈아세틸화 용액 (0.1M 하이드록실아민)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 RT에서 2시간 동안 배양시켰다. 이와 동시에, 4-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC)와 함께 몰 비율 1:5 (2C3:SMCC)로 PBSE 중에서 2C3 IgG를 인큐베이션시켰다. PBSE에서 수행되는 G25 크기 배제 크로마토그래피를 통해 자유 SMCC를 제거하였다.
그리고 나서, 탈아세틸화된 SATA-변형된 엔도스타틴을 SMCC-변형된 2C3와 함께 인큐베이션시킨 후, 질소하에서 총 단백질 약 5mg/ml로 농축시키고 나서, 가볍게 교반시키면서 밤새 RT에서 인큐베이션시켰다. SDS-PAGE를 통해 상기 반응물을 분석하였다. PBSE 중에서 헤파린 친화성 크로마토그래피를 이용하여 상기 2C3-엔도스타틴 컨쥬게이트로부터 컨쥬게이트되지 않은 2C3-MCC를 제거하여, 2C3-엔도스타틴을 수득하였다. 또한, 황화제로서 SATA 대신에 2-이미노티올란을 사용하여, 성공적으로 컨쥬게이션시켰다.
E. 2C3 및 엔도스타틴의 융합 단백질
마우스 및 인간 엔도스타틴의 DNA 서열 및 2C3의 DNA 서열이 이미 입수가능하므로 (또한, 본원에 제공되어 있음), 2C3-엔도스타틴 융합 단백질을 용이하게 제조할 수 있다. 상기한 바와 같이, 엔도스타틴의 발현 및 재접힘은, 이 분자의 성공적인 재조합 발현이 사실상 가능함을 보여준다.
제조된 2C3-엔도스타틴 융합 단백질은, 엔도스타틴이 2C3 중쇄의 C 말단에 존재하는 형태 또는 2C3 ScFv 단편에 결합된 형태일 수 있다. 이 경우, 재조합 기술을 통해 상기 결합을 변화시키기 용이하고, 상기 2가지의 기능성 부위를 결합시키기 위해 선택적으로 절단가능한 서열을 사용할 수도 있다. 플라스민-절단가능한 또는 MMP-절단가능한 서열이 현재 바람직하다.
또한, 선택적으로 절단가능한 서열의 사용가능성 및 재조합 기술의 조정가능성으로 인해, 2C3 작제물의 다른 쪽에 엔도스타틴이 치환된 2C3-엔도스타틴 융합 단백질을 제공할 수 있다. 선택적으로 절단가능한 서열에서 작용하는 효소와 접촉하여 상기 융합 단백질로부터 기능성 엔도스타틴이 방출될 때까지는, 엔도스타틴은 2C3 내에 함입되어 있을 것이다.
실시예 11
2C3-Ang-2 컨쥬게이트
A. Ang-2의 발현
2C3-Ang-2 컨쥬게이트를 작제하기 위해, 재조합 형태의 Ang-2를 사용하는 것이 바람직한 데, 이는 바큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 곤충세포내에서 생산될 수 있다. Ang-2 발현 및 정제를 위해 현재 바람직한 프로토콜에서는, RT-PCRTM을 이용해 마우스 태반 RNA로부터 Ang-2 cDNA를 클로닝하고, Ang-2 cDNA를 pFastBac1 발현 벡터에 혼입시키는 것을 포함한다. 상기한 재조합 플라스미로 경쟁가능한 DH10BacE.coli세포를 형질전환시켰다.
항생제 선별후, 재조합 Bacmid를 함유하는E.coli콜로니를 선택하여 성장시킨 후, 재조합 Bacmid DNA를 정제하였다. Cellfectin 시약을 사용하여, 곤충 세포 SF9을 재조합 Bacmid DNA로 형질전환시켰다. 형질전환된 SF9 세포의 상층물로부터 재조합 바큘로바이러스를 수집하였다. 재조합 바큘로바이러스를 증폭하여 SF9 세포를 감염시키는 데 사용하면, 감염된 SF9 세포는 Ang-2를 발현한다. 친화성 정제를 통해 상기 감염된 SF9 세포의 상층물로부터 Ang-2를 정제한다.
B. Ang-2의 2C3에의 컨쥬게이션
일반적으로 상기한 바와 같이, 화학적 링커 SMPT를 이용하여 정제된 2C3를 재조합 Ang-2에 컨쥬게이션시킨다. N'N-디메틸포름아미드 (DMF) 중의 SMPT를 2C3 IgG에 몰비율 5:1 (SMPT:2C3)로 첨가한 후, 5mM EDTA (PBSE)을 가진 PBS 중에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. PBSE에서 수행되는 G25 크기 배제 크로마토그래피를 통해 자유 SMPT를 제거한다. 이와 동시에, 재조합 Ang-2를 2-IT와 함께 RT에서 인큐베이션시킨다. PBSE에서 수행되는 G25 크기 배제 크로마토그래피를 통해 자유 2-IT를 제거한다.
SMPT-변형된 2C3를 2IT-변형된 재조합 Ang-2와 함께 혼합하고, 농축시킨 후, 가볍게 흔들면서 RT에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. SDS-PAGE를 사용하여 상기 반응물을 분석한다. 겔 여과 크로마토그래피를 통해 상기 컨쥬게이트로부터 컨쥬게이트되지 않은 2C3-SMPT를 제거하여, 2C3-엔도스타틴을 수득한다.
실시예 12
2C3-조직 인자 컨쥬게이트
상기 실시예에 기재된 바와 같이, 2C3를 SMPT로 변형시켰다. 피크 (2C3-SMPT)를 질소하에서 수집하는 것을 제외하고는, 상기에서 설명한 바와 같이 G25 크로마토그래피를 통해 자유 SMPT를 제거하였다. 디티오트레이톨 (DTT)를 첨가하여 50mM로 만든 후, 2C3-SMPT 600㎕을 제거하여 티오피리딜 그룹을 정량화하였다. 3 MPT 그룹 평균을 IgG 당 도입하였다. N 말단부에 시스테인이 도입된, 절단된 인간 조직 인자 (tTF)를 β2-ME 5mM로 환원시켰다. G25 크로마토그래피를 사용하여β2-ME를 제거하였다.
2C3-SMPT와 환원된 N-Cys-tTF를 모은 후, RT에서 24시간 동안 몰 비율 2.5:1 (tTF:IgG)로 인큐베이션시켰다. 50,000 분자량이 제거된 (MWCO) 막을 가진 Amicon을 이용하여, 상기 반응물을 농축시켜 1 내지 2ml가 되게 하였다. Superdex 200 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 컨쥬게이트와 컨쥬게이트되지 않은 tTF 및 IgG를 분리하여, 2C3-tTF를 수득하였다.
실시예 13
2C3-CRM107 컨쥬게이트
2C3를 SMPT로 변형시켰다. 상기 실시예에 기재된 바와 같이, 세포독성제 CRM107 (텍사스 데소토 소재, Inland Laboratories의 Jerry Fulton 박사로부터 입수)을 2-IT로 변형시켰다. SMPT-변형된 2C3를 2IT-변형된 CRM107과 몰비율 1:5 (IgG:CRM107)로 RT에서 24시간 동안 가볍게 흔들면서 인큐베이션시켰다. Superdex 200 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 자유 반응물과 컨쥬게이트 2C3를 분리하여, 2C3-CRM107을 수득하였다.
실시예 14
2C3 전구약물 연구
A. 베타-글루쿠로니다제 (GUS)의 클로닝 및 발현
E.coli GUS 유전자를 함유하는 플라스미드 (pBacgus-1)는 Novagen, Inc.에서 입수하였다. 상기 플라스미드는 PCR용 주형으로 사용하여, N말단 6×히스티딘 태그를 코드하는 H6pQE60 발현 벡터에 GUS 유전자를 삽입하였다. 상기 세포 밀도가최적 밀도인 560nM에서 0.6이 될 때까지, 상기 플라스미드를 함유하는 E.coli M15 세포를 성장시켰다. 0.1mM 이소프로필티오갈락토시드 (IPTG)를 첨가하여, 6 His GUS의 발현을 유도하였다. 4시간 경과 후, 원심분리시켜 상기 세포를 수집하였다.
상기 E.coli 펠렛을 세포 용해 버퍼 {B-PER Bacterial Protein Extraction 시약 (Pierce, Rockford, IL)}내에서 용해시켰다. 상기 용액을 Ni-NTA 칼럼상에 부하한 후, 이 칼럼을 세척 버퍼 {6M GuHCl, 100mM NaH2PO4, 10mM Tris, 500mM NaCl, pH7.3}로 세척하고 나서, 동일한 버퍼 중의 0.2M 이미다졸을 이용하여 결합된 6-His GUS를 용출시켰다.
75kDa의 단일 밴드에서 수행된 SDS-PAGE에 근거하여, 상기 6-His GUS는 순수하였다. 겔 여과 칼럼상에서, 상기 6-His GUS는 약 300kDa의 테트라머로 진행한다. 기질 p-니트로페닐-베타-D-글루쿠로니드 (PNPG)를 절단할 수 있는 능력으로 판단할 수 있는 바와 같이, 상기 6-His GUS는 효소 활성을 가지고 있었다.
B. 2C3의 베타-글루쿠로니다제(GUS)에의 컨쥬게이션
N-석신이미딜 S-아세틸티오아세테이트 (SATA)를 GUS와 함께 몰비율 6:1 (SATA:GUS)로 RT에서 30분간 인큐베이션시켰다. PBSE 중에서 진행되는 G25 크로마토그래피를 통해 자유 SATA를 제거하였다. PBSE 중의 SATA-변형된 GUS를 4.0ml로 농축시킨 후, 0.4ml의 탈아세트화 용액 (0.1M 하이드록시아민)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 RT에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 이와 동시에, PBSE 중에서 2C3 IgG를 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC)와 함께 몰비율 1:5 (2C3:SMCC)로 인큐베이션시켰다. PBSE 중에서 진행되는 G25 크로마토그래피를 통해 자유 SMCC를 제거하였다.
그리고 나서, 탈아세트화된 SATA-변형된 GUS를 SMCC-변형된 2C3와 함께 밤새 RT에서 가볍게 교반하면서 인큐베이션시켰다. Q-세파로즈상에서 이온교환 크로마토그래피를 통해 자유 GUS를 제거하고, 자유 2C3 및 2C3-GUS 컨쥬게이트를 PBS 중의 0.5M NaCl로 용출시켰다. Superdex 200 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 상기 반응물을 분리하여, 순도 90%의 2C3-GUS를 수득하였다.
C. 2C3-GUS 컨쥬게이트의 생물학적 활성
2C3-GUS 컨쥬게이트의 각 성분의 생물학적 활성을 확인하였다. 2차 HRP-표지된 항-마우스 IgG 및 OPD에 의해 검출된 바와 같이, 적합하게 조절된 ELISA에서 2C3-GUS가 VEGF-코팅된 웰에 특이적으로 부착하였다. 0.1nM에서 50% 최대 결합이 관찰되었다. 따라서, 2C3 결합부위는 정확하게 기능하고 있다. 또한, GUS 부위는 효소 활성을 보유하고 있었다.
125I를 이용하여 5×106cpm/㎍의 특이 활성으로 2C3-GUS를 방사성 요오드처리하였다. 마우스에 정맥 주사한 후, 약 6시간의 t1/2α및 약 25시간의 t1/2β로 방사성 요오드-처리된 2C3-GUS가 혈액으로부터 제거되었다.
D. GUS-절단가능한 전구약물
미합중국 특허 제5,561,119호 (본원에 참조문헌으로 포함)에서 기재된 바와 기본적으로 동일한 방법으로, 독소루비신-베타-글루쿠로니드 및 칼시마이신-베타-글루투로니드와 같은 베타-글루쿠로니드를 제조하였다. 상기 전구약물은, GUS와 같은 글루코시드 효소에 의해 분해되었을 때만 독성 성분 (예를 들면, 독소루비신 또는 칼시마이신)을 방출하도록 설계되었다. GUS를 2C3에 부착시킴으로써, GUS는 종양 혈관체 및 기질에 대해 특이적으로 표적화되어, 상기 전구약물의 특이적인 절단 및 종양 부위내에서 특이적으로 세포독성 성분의 방출하게 된다.
E. 2C3-GUS 컨쥬게이트의 생물학적 활성
2C3-GUS는, 피하 부위에 인간 NCI-H358 NSCLC 종양을 가진 SCID 마우스에 i.v 주사한 후에, 종양 혈관체 및 주위의 종양 기질의 위치를 특이적으로 찾아내었다. 2C3-GUS의 존재여부는, HRP-표지된 항-마우스 IgG 또는 HRP-표지된 항-GUS를 이용하여 동결된 종양 절편상에서 면역조직화학적으로 검출되었다. 2C3-GUS를 주사한 후 24 내지 48시간 경과 후에 최대 위치확인(maximal localization)이 관찰되었다. 정상적인 조직은 염색되지 않았다. 2C3-GUS가 종양 혈관체 및 주위 종양 기질의 위치를 특이적으로 찾음으로써, 전신 투여되는 전구약물 (예를 들면, 독소루비신 글루쿠로니드 또는 칼시마이신 글루쿠로니드)이 종양내에서만 활성화되도록 한다.
본원에 기재된 하이브리도마 세포라인은 부다페스트 조약의 조항에 따라 미합중국 버지니아 마나사스 소재의 American Type Culture Collection (ATTC)에 기탁하였으며, 기탁번호는 ATCC No.PTA 1595이다. 기탁된 양태는 본 발명의 한 양태를 보여주는 것이며 기능상 균등한 모노클론 항체를 생산하는 모든 균등한 하이브리도마 세포라인도 본 발명의 범위에 속하기 때문에, 본원에서 기재되고 청구되는발명은 기탁된 PTA 1595 세포라인에만 한정되는 것은 아니다. 사실상, 본원에서 기재되고 청구되고 있는 모든 조성물 및 방법은 본원의 기재내용에 따라 과도한 시험없이 제조 및 실시될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 양태에 따라 기재되어 있으나, 본 발명의 범위 및 개념을 벗어남이 없이 본원에 기재된 조성물, 방법, 단계 또는 순서에 대해 변형이 있을 수 있다는 것은 당업자들에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적 및 물리적으로 고나련된 소정의 제제가 본원에 기재된 제제와 교체되어도 이와 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 점은 명백하다. 당업자에게 명백한 모든 유사한 치환 및 변형은 하기 청구범위에서 청구하고 있는 본 발명의 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주한다.
참조문헌
하기의 참조문헌들은 본원에 기재된 내용을 보충하는 예시적인 공정 또는 다른 세부 사항들을 제공해준다:

Claims (82)

  1. 모노클론 항체 ATCC PTA 1595와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하고, VEGF가 VEGF 수용체 VEGFR1 (Flt-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하지 않고 VEGF 수용체 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하는, 생물학적 유효량의 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 모노클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 IgG 항체 또는 IgM 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 항체의 scFv, Fv, Fab', Fab, 디아바디 (diabody), 선형 항체 또는 F(ab')2항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 상기 항체의 이량체, 삼량체 또는 다량체이거나 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 항체, 인간화된 항체 또는 부분적으로 인간 항체이거나 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항체가 인간의 항체 골격 또는 불변 부위에 작동가능하게 부착된 상기 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 재조합 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 제7 또는 제9의 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열 부위를 포함하는 제1 변이 부위를 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 모노클론 항체 ATCC PTA 1595인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 적어도 제1 생물학적 제제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체가, 실질적으로 불활성인 전구 약물을 절단하여 실질적으로 활성인 약물을 방출하는 적어도 제1 제제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항체가, 실질적으로 불활성인 인산-전구 약물을 절단하여 실질적으로 활성인 약물을 방출하는 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 항체가 적어도 제1 치료제 또는 진단제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항체가 적어도 제1 치료제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항체가 적어도 제1 및 제2 치료제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 항체가, 적어도 제1 화학 치료제, 방사선 치료제, 항-안지오제네시스 제제, 세포사멸-유도제, 스테로이드, 항-대사제, 안트라사이클린, 빈카 알카로이드, 항-튜불린 약제, 항생제, 사이토카인, 알킬화제 또는 응고제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 항체가, 내피 세포의 성장 또는 세포 분열을 파괴하거나 억제할 수 있는 세포 독성제, 세포 성장 억제제 또는 항-세포제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항체가 식물성 독소, 진균성 독소 또는 세균성 독소에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항체가, A 사슬 독소, 리보좀-불활성화 단백질, α-사르신, 겔로닌, 아스페르길린, 리스트릭토신, 리보뉴클리에이즈, 에피포도필로톡신, 디프테리아 독소 또는 슈도모나스 엑소톡신에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항체가 리신 A 사슬 또는 탈당-리신 A 사슬에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제18항에 있어서, 상기 항체가 항-안지오제네시스 제제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항체가 안지오포이에틴에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 항체가 안지오포이에틴-2에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제23항에 있어서, 상기 항체가 안지오스타틴, 바스큘로스타틴, 칸스타틴 또는 마스핀에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제23항에 있어서, 상기 항체가 엔도스타틴에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제18항에 있어서, 상기 항체가 항-튜불린 약제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 항체가, 콜키친, 탁솔, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 콤브레타스타틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항-튜불린 약제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제18항에 있어서, 상기 항체가 응고제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 항체가, 인자 II/IIa, 인자 VII/VIIa, 인자 IX/IXa, 인자 X/Xa, Gla 변형이 되지 않은 비타민 K-의존성 응고 인자, 러셀 바이퍼 베놈 인자 X 활성인자, 트롬복산 A2, 트롬복산 A2신테이즈 및 α2-안티플라스민으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 응고제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 항체가, 조직 인자, 인간의 조직 인자, 인자 VII를 활성화시킬 능력이 결핍된 돌연변이-조직 인자, 절단된 조직 인자, 이량체, 삼량체 또는 다량체 조직 인자 또는 조직 인자 유도체에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 항체가 절단된 조직 인자(truncated Tissue Factor)에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제15항에 있어서, 상기 항체가 진단 제제, 이미지화 제제 또는 검출가능용 제제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 항체가 X선-검출가능한 화합물, 방사선 이온 또는 핵 자기 스핀 공명 동위원소에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 상기 항체가, 색소생산 기질 (chromogenic substrate)과 접촉하면 채색된 생성물을 생산하는 효소, 아비딘 또는 비오틴에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제12항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가, 상기한 생물학적 제제를 코드하는 DNA 절편에 작동가능하게 연결된 상기 항체를 코드하는 DNA 절편을 동일한 판독 프레임 내에 포함하는 재조합 벡터를 발현시켜 제조된 융합 단백질로서의 상기 생물학적 제제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제12항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가, 방출가능한 결합 또는 선택적으로 절단가능한 링커를 통해 상기 생물학적 제제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항체가, 유로키나제, 프로-유로키나제, 플라스민, 플라스미노겐, TGFβ, 스타필로키나제, 트롬빈, 인자 IXa, 인자 Xa, 메탈로프로티나제, 간질 콜라게나제, 젤라티나제 또는 스트로멜리신의 절단 부위를 포함하는 펩티드 링커를 통해 상기 생물학적 제제에 작동가능하게 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제12항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 상기 생물학적 제제에 직접 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제15항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가, 상기 치료제 또는 진단제에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 부위에 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 조성물이 비경구 또는 정맥내 투여용으로 제형된 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 제2 치료제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 제2 치료제가 제2 항암제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 제2 항암제가, 화학 치료제, 방사선 치료제, 항-안지오제네시스 제제, 세포사멸-유도제, 항-튜불린 약제이거나; 화학 치료제, 방사선 치료제, 항-안지오제네시스 제제, 세포사멸-유도제 또는 항-튜불린 약제의 전구 약물 또는 종양-표적 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 제2 항암제가 안지오포이에틴 또는 종양-표적 안지오포이에틴인 것을 특징으로 하는 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 제2 항암제가 안지오포이에틴-2 또는 종양-표적 안지오포이에틴-2인 것을 특징으로 하는 조성물.
  49. 제46항에 있어서, 제2 항암제가 엔도스타틴 또는 종양-표적 엔도스타틴인 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 제46항에 있어서, 제2 항암제가 항-튜불린 약제 또는 종양-표적 항-튜불린 약제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. 제46항에 있어서, 제2 항암제가, 종양 세포, 종양 혈관체 또는 종양 기질의 세포 표면-발현된 성분, 세포 표면-접근 가능한 성분 또는 세포 표면-국부 성분에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된 치료제를 포함하는 항체-치료제 구성체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  53. 제1항 내지 제11항 또는 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 진단용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  54. 제1항 내지 11항 또는 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 동물에게 투여하여 안지오제네시스를 억제하는 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  55. 제12항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관생성된 종양을 가진 동물에게 투여하여 생물학적 제제를 혈관생성된 종양에 전달하는 용도로 사용되는 것을특징으로 하는 조성물.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 치료용으로 사용하는 용도.
  58. 안지오제네시스를 억제함으로써 질환을 치료하는 약제를 제조하는 데에 제1항 내지 제11항 또는 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 사용하는 용도.
  59. 생물학적 제제를 혈관생성된 종양에 전달함으로써 암을 치료하는 약제를 제조하는 데에 제12항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 사용하는 용도.
  60. 암 치료용 약제를 제조하는 데에 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 사용하는 용도.
  61. 마크로파지, 오스테오클라스트 또는 콘드로클라스트를 실질적으로 억제하지 않고 안지오제네시스를 억제하는 데에 사용되는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 생물학적 유효량의 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물.
  62. VEGF가 VEGF 수용체 VEGFR1 (Flt-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하지 않고 VEGF 수용체 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에 결합하는 것은 유의성 있게 억제함으로써 암을 치료하는 약제를 제조하는 데에 사용되는, 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 생물학적 유효량의 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 용도.
  63. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 제1 조성물을 적어도 포함하는 킷트.
  64. 적어도 제13항 또는 제14항에 따른 제1 조성물, 및 제1 조성물에서의 항체에 부착되어 있는 생물학적 제제에 의해 절단되어 실질적으로 활성을 나타내는 약제를 방출하는 실질적으로 불활성인 전구 약물을 포함하는 적어도 제2 조성물을 포함하는 킷트.
  65. 적어도 제14항에 따른 제1 조성물 및 콤브레타스타틴 포스페이트를 포함하는 적어도 제2 조성물을 포함하는 킷트.
  66. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마.
  67. 모노클론 항체 ATCC PTA 1595.
  68. 적어도 제1 면역원성 VEGF 성분을 포함하는 면역 조성물을 이용하여 인간이 아닌 동물에게 면역 반응시키는 단계; 및 모노클론 항체 ATCC PTA 1595와 실질적으로 교차 반응하는 항체를 상기 면역된 동물로부터 선별하는 단계를 포함하여, 모노클론 항체 ATCC PTA 1595와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항-VEGF 항체를 제조하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기한 인간이 아닌 동물이 인간의 항체 라이브러리를 포함하는 형질전환 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기한 항-VEGF 항체를 코드하는 핵산을 수득하는 단계 및 재조합 항-VEGF 항체를 수득하기 위해 상기 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 적어도 제1 면역원성 VEGF 성분을 포함하는 면역 효과량의 조성물을 인간이 아닌 동물에게 투여하는 단계;
    (b) 상기 면역된 동물의 비장으로부터 분리된 RNA를 발현하는 복합 면역글로불린 파지미드 라이브러리 (combinatorial immunoglobulin phagemid library)를 제조하는 단계;
    (c) 모노클론 항체 2C3 (ATCC PTA 1595)와 실질적으로 교차 반응하는 항-VEGF 항체를 발현하는 클론을 상기 파지미드 라이브러리로부터 선별하는 단계; 및
    (d) 재조합 항-VEGF 항체를 제공하기 위해, 상기 선별된 클론으로부터 상기 항-VEGF 항체를 코드하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. VEGF/항체 복합체가 형성되기에 효과적인 조건하에서 VEGF를 가지는 것으로 생각되는 조성물을 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계 및 상기 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하여, VEGF를 검출하는 방법.
  73. VEGFR2 (KDR/Flk-1) 및 VEGFR1 (Flt-1)을 발현하는 동질 또는 이질 세포군을 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 생물학적 유효량의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하여, VEGF가 VEGF 수용체 VEGFR1에 결합하는 것은 유의성 있게 억제하지 않고 VEGF 수용체 VEGFR2에 결합하는 것을 억제하는 방법.
  74. 내피 세포군을 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 생물학적 유효량의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하여, VEGF-유도성 내피 세포 증식을 특이적으로 억제시키는 방법.
  75. 내피 세포; 및 마크로파지, 오스테오클라스트 및 콘드라클라스트 중 하나 이상을 함유하는 조직을 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 생물학적 유효량의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하여, VEGF-유도성 마크로파지, 오스테오클라스트 및 콘드라클라스트의 기능을 유의성있게 억제하지 않고 VEGF-유도성 내피 세포 증식을 억제하는 방법.
  76. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 생물학적 유효량의 조성물을 포함하는 항-안지오제네시스 조성물을 안지오제네시스-가능성있는 혈관군과 접촉시키는 것을 포함하여, 안지오제네시스를 억제시키는 방법.
  77. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 생물학적 유효량의 조성물을 포함하는 적어도 제1 약제학적 조성물을 안지오제네시스 질환을 가진 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 안지오제네시스 질환을 치료하는 방법.
  78. 제12항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 생물학적 유효량의 조성물을 혈관생성된 종양을 가진 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 혈관생성된 혈관에 진단제또는 치료제를 전달시키는 방법.
  79. 혈관생성된 고형 종양, 전이성 종양 또는 1차 종양으로부터 전이된 종양이 있거나 발생될 위험이 있는 동물에게, 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 치료학적 유효량의 조성물을 포함하는 제1 약제학적 조성물을 적어도 투여하는 것을 포함하여, 암을 치료하는 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 동물에 대해 방사선 치료를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. (a) 혈관생성된 고형 종양, 전이성 종양 또는 1차 종양으로부터 전이된 종양을 가진 동물에게 제13항 또는 제14항에 따른 제1 조성물을 투여하여, 상기 조성물의 항체를 종양 혈관체 또는 기질로 이동시키는 단계; 및
    (b) 상기 제1 조성물 중의 항체에 부착된 생물학적 제제에 의해 절단되어 특이적으로 상기 종양 혈관체 또는 기질내에 실질적으로 활성을 나타내는 약제를 방출시키는 실질적으로 불활성인 전구 약물을 포함하는 제2 조성물을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 인간 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
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