CN107530283A - 组合脂质体药物制剂 - Google Patents

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Abstract

多西紫杉醇和多柔比星可以被配制成脂质体药物组合物。在多种实施方案中，药物组合物包括(i)第一类型脂质体，其包含第一脂质层和在第一脂质层中的第一活性药物成分(API)，所述第一脂质层包含不饱和磷脂、胆固醇或胆固醇衍生物、DC‑胆固醇、阳离子脂质和优选地聚乙二醇化磷脂，以及所述第一活性药物成分包含多西紫杉醇；和(ii)第二类型脂质体，其包含第二脂质层、内部水性部分和在内部水性部分中结晶的第二API，所述第二API包含多柔比星；(iii)其中第一类型脂质体不包含多柔比星且第二类型脂质体不包含多西紫杉醇。所述药物组合物可用于治疗受试者，例如患有癌症的人类受试者。癌症可以是例如肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)；结肠癌；乳腺癌；或肝癌，优选肝细胞癌(HCC)。

Description

组合脂质体药物制剂
技术领域
本发明主要涉及脂质体药物组合物，并且在各种实施方案中更具体地涉及在两种不同类型脂质体中包含两种不同的活性药物成分(API)的脂质体药物组合物(例如，包含第一API如多西紫杉醇的第一脂质体，和包含第二API如多柔比星的第二类型脂质体)。
背景技术
脂质体技术已在临床治疗和科学研究中被用于药物递送。迄今为止，一些脂质体药物制剂已被美国食品和药物管理局(FDA)批准，许多新的脂质体制剂正在进行临床试验。然而，脂质体制剂领域仍在发展，每种活性药物成分(“API”)都面临着独特的挑战。
可应用脂质体制剂的一个领域是癌症API。例如，多柔比星的脂质体制剂目前可以商品名和获得。是先前由美国Ben Venue Laboratories为强生公司的子公司Janssen Products,LP生产的聚乙二醇化(聚乙二醇包被的)脂质体封装形式的多柔比星。是Enzon制药公司为欧洲的Cephalon以及美国和加拿大的Sopherion Therapeutics制造的非聚乙二醇化脂质体多柔比星。在欧洲和加拿大被批准与环磷酰胺组合用于治疗转移性乳腺癌，但FDA尚未批准其在美国使用。
尽管存在一些被批准的脂质体药物制剂，该领域仍然存在当前可用的制备脂质体制剂的方法的限制，其面临着与可扩展性和生产成本相关的难题。存在用于药物递送的改进的脂质体制剂的需要。
发明内容
在各个方面和实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含含有第一API(例如多西紫杉醇)的第一类型脂质体和含有第二API(例如多柔比星)的第二类型脂质体。在各种实施方案中，(i)第一类型脂质体包含第一脂质层和第一脂质层中的第一活性药物成分(API)(例如多西紫杉醇)，其中第一脂质层包含不饱和磷脂、胆固醇以及优选聚乙二醇化磷脂；和(ii)第二类型脂质体，其包含第二脂质层、内部水性部分以及内部水性部分中的第二API(例如结晶的多柔比星)。第一类型脂质体不包含第二API(例如，多柔比星)，第二类型脂质体不包含第一API(例如多西紫杉醇)。脂质体可用于治疗受试者，例如患有癌症的人类受试者。癌症可以是例如肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)；结肠癌；乳腺癌；或肝癌，优选肝细胞癌(HCC)。
本发明可以提供增加的功效和/或降低的毒性，例如与(i)其他药物组合物(其中第一药物(例如，多西紫杉醇)和/或第二药物(例如，多柔比星)不在脂质体制剂中)相比。本发明还可以为已知的脂质体和非脂质体制剂(例如，和或)提供优异的结果。
本发明可以提供第一和第二API的靶向递送，例如提供给肝脏。本发明可以减轻不期望的副作用，例如通过提供增加的药物负荷，从而减少递送一定量第一药物(例如，多西紫杉醇)和第二药物(例如多柔比星)所需的脂质体的量。另外，由于第二药物(例如多柔比星)在第二类型脂质体中结晶，所以第二药物可以具有更多的靶向递送和较少的脱靶副作用。
此外，由于第一和第二API在单独的脂质体中，因此每个脂质体可以专门为其所携带的API而设计。可以临床确定两种脂质体制剂的不同组合，包括不同的API比例、不同的给药顺序和间隔时间，以用于治疗不同类型的癌症。它还使医师能够灵活地临床调整患者的两种脂质体API的比例，以优化结果，同时最小化个体患者的不良反应。
本发明提供一种药物组合物，其包含：(i)包含第一脂质层以及第一脂质层中的第一活性药物成分(API)的第一类型脂质体，所述第一脂质层包含不饱和磷脂、胆固醇和优选聚乙二醇化磷脂，所述第一活性药物成分包含多西紫杉醇；和(ii)第二类型脂质体，其包含第二脂质层、内部水性部分和在内部水性部分中结晶的第二API，所述第二API包含多柔比星。第一类型脂质体不包含多柔比星，第二类型脂质体不包括多西紫杉醇。
在各种实施方案中，第一脂质层和/或第二脂质层由不饱和磷脂和胆固醇组成。
在各种实施方案中，第一脂质层和/或第二脂质层由不饱和磷脂、胆固醇、阳离子脂质和聚乙二醇化磷脂组成。
在各种实施方案中，第一脂质层和第二脂质层包含不同的脂质组合物(例如，不同的脂质组分和/或不同量的一些脂质组分)。在各种实施方案中，第一脂质体和第二脂质体是不同的(例如除了包含不同的API，还衍生自不同脂质溶液和/或水溶液，如下文所述)。或者，在一些实施方案中，第一和第二脂质层基本上相同(例如，除了包含不同的API外，包含基本上相同的脂质组分及其量)。
在多种实施方案中，多西紫杉醇是第一类型脂质体中唯一的API，和/或多柔比星是第二类型脂质体中唯一的API。
在各种实施方案中，第一脂质层和/或第二脂质层包含：约20-75％、优选约30-60％(摩尔)的不饱和磷脂；约10-60％、优选20-50％(摩尔)的胆固醇；约5-75％、优选约10-60％(摩尔)的阳离子脂质；和约0-20％、优选1-10％(摩尔)的聚乙二醇化磷脂。
在各种实施方案中，第一脂质层组分:多柔比星的摩尔比为约100:1至约2:1，优选约20:1至约5:1；并且第二脂质层组分:多西紫杉醇的摩尔比为约100:1至约2:1，优选约20:1至约5:1。
在各种实施方案中，多柔比星:多西紫杉醇的摩尔比为约10:1至1:10，优选约5:1至1:5，更优选约3:1至1:3。
在各种实施方案中，不饱和磷脂包括多不饱和磷脂或单不饱和磷脂，优选磷脂酰胆碱，更优选大豆卵磷脂或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)。
在各种实施方案中，胆固醇包括胆固醇衍生物，优选阳离子胆固醇衍生物，更优选氨基胆固醇衍生物，更优选二甲基氨基乙烷氨基甲酰基-胆固醇(DC-胆固醇)。
在各种实施方案中，聚乙二醇化磷脂包括磷脂酰乙醇胺，优选1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)，其中所述聚乙二醇化为PEG 500至PEG 3000，优选PEG2000。
在各种实施方案中，药物组合物被配制为用于静脉内给药。
在各种实施方案中，脂质体的Z-平均粒径为约10-200nm，优选为约15-150nm，更优选为约20-120nm。
在各种实施方案中，向受试者静脉给药后，至少约10％的组合物被递送至肝脏。
在各种实施方案中，药物组合物被用作药物。
在各种实施方案中，药物组合物被用作癌症治疗剂。
本发明还提供了一种药物组合物，其由以下组成：(i)多个本文所述或要求保护的第一类型脂质体；(ii)多个如本文所述或要求保护的第二类型脂质体；和(iii)一种或多种药物赋形剂。
本发明还提供制备本文所述或要求保护的药物组合物的方法。例如，本发明提供制备本文所述或要求保护的药物组合物的方法，其包括：(i)通过多口歧管的第一或更多端口向混合室引入不饱和磷脂、胆固醇、阳离子脂质、多西紫杉醇以及优选聚乙二醇化磷脂在乙醇中的第一脂质溶液、并通过多口歧管的第二或更多端口向混合室引入水溶液来制备第一类型脂质体，在混合室中形成的所述脂质体通过第三或更多出口离开混合室，其中所得到的第一类型脂质体不包含多柔比星；(ii)通过多口歧管的第一或更多入口将第二脂质的乙醇溶液引入到混合室中、并通过多口歧管的第二或更多个入口将水溶液引入到混合室中，来制备第二类型脂质体，在混合室中形成的脂质体通过一个或更多出口离开混合室。然后将脂质体与多柔比星一起温育以包裹多柔比星，其中所得的第二类型脂质体不包含多西紫杉醇；和(iii)组合预定量的第一类型脂质体和第二类型脂质体，从而制备本文所述或要求保护的药物组合物。
本发明提供治疗受试者的方法，包括施用有效量的本文所述或要求保护的本发明的任何药物组合物。在各种实施方案中，受试者患有癌症。在各种实施方案中，癌症是肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)；结肠癌；乳腺癌；或肝癌，优选肝细胞癌(HCC)。
当参考附图和以下描述时，本发明的这些和其它优点将是显而易见的。
附图简述
图1说明了通过动态光散射确定的脂质体制剂CPT307A的体积加权粒度分布。
图2说明了通过动态光散射确定的脂质体制剂CPT307B的体积加权粒度分布。
图3说明了通过动态光散射确定的脂质体制剂CPT319A的体积加权粒度分布。
图4说明了通过动态光散射确定的脂质体制剂CPT319B的体积加权粒度分布。
图5显示了脂质体制剂CPT319B的低温透射电子显微镜(TEM)图像。
图6呈现脂质体制剂CPT319B的负染色TEM图像。
图7表明相对于对照组，使用多西紫杉醇/多柔比星的脂质体制剂(CPT319A、CPT319B或CPT319AB)或非脂质体制剂给药后的非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤生长曲线和肿瘤重量抑制百分比(TW Inh％)。
图8说明与对照组相比，使用多西紫杉醇/多柔比星的脂质体制剂(CPT307A、CPT307B或CPT307AB)或非脂质体制剂给药后NSCLC肿瘤生长曲线和肿瘤重量抑制百分比(TW Inh％)。
图9说明了，与对照组相比，用三种不同剂量的脂质体制剂(CPT319AB)给药后的结肠癌肿瘤生长曲线。
图10说明了，与对照组相比，用三种不同剂量的脂质体制剂(CPT307AB)给药后的结肠癌肿瘤生长曲线。
图11说明了，与对照组相比，用脂质体制剂(CPT319AB)给药后的肝细胞癌肿瘤生长曲线。
图12说明与对照组相比，用脂质体制剂(CPT307A、B或AB和CPT319A、B或AB)给药后的NSCLC肿瘤生长曲线。
图13说明了与多西紫杉醇/多柔比星的非脂质体制剂相比，使用脂质体制剂(CPT307A或CPT319A)给药后多柔比星的血浆浓度曲线。*BLOQ：低于量化下限。
图14说明了用脂质体制剂(CPT319A或CPT221)给药后多柔比星的肝脏浓度曲线，以及每种脂质体制剂的DC-胆固醇百分比(DC-chol％)。
虽然本发明包括许多不同形式的实施例，但是在附图中示出并且将在此详细描述几个具体实施方案，其被理解为将本公开视为技术原理的示例，并且不是旨在将本发明限制于所示的实施方案。
发明详述
在各个方面和实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含含有第一API(例如多西紫杉醇)的第一类型脂质体，和含有第二API(例如多柔比星)的第二类型脂质体。在各种实施方案中，(i)所述第一类型脂质体包含含有不饱和磷脂、胆固醇以及优选聚乙二醇化磷脂的第一脂质层，以及在所述第一脂质层中的第一活性药物成分(API)(例如多西紫杉醇)；和(ii)第二类型脂质体，其包含第二脂质层、内部水性部分和在该内部水性部分中的第二API(例如结晶的多柔比星)。第一类型脂质体不包含第二API(例如多柔比星)，第二类型脂质体不包含第一API(例如，多西紫杉醇)。
如本文所用，短语“第一类型脂质体不包含第二API且第二类型脂质体不包含第一API”或“第一脂质体型不包含多柔比星且第二脂质体型不包含多西紫杉醇”是指，第一类型脂质体基本上不包含或包含可忽略量的第二API(例如多柔比星)，且第二类型脂质体基本上不包含或包含可忽略量的第一API(例如，多西紫杉醇)。本领域普通技术人员将理解，任何化合物在处于平衡状态的水相和非水相之间具有分配系数。例如，对于在与水相(例如，脂质体的内部水性部分)平衡的非水相(例如，脂质体的脂质层)中的疏水性化合物(例如多西紫杉醇)而言，分配系数表明一些可忽略量(例如，基本上没有)的疏水性化合物可被分配到水相中。换句话说，以下实验实施例中的第一类型脂质体中任何量的多柔比星都可被认为是基本上没有的，或可忽略量-即第一类型脂质体不包含多柔比星。同样，以下实验实施例中的第二类型脂质体中任何量的多西紫杉醇都可以被认为是基本上没有的，或可忽略量-即第二类型脂质体不包含多西紫杉醇。
脂质体可以有利地用于治疗受试者，例如患有癌症的人类受试者。癌症可以是例如肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)；结肠癌；乳腺癌；或肝癌，优选肝细胞癌(HCC)。本发明可以提供增加的功效和/或降低的毒性，例如相对于(i)其他药物组合物，其中第一药物(例如，多西紫杉醇)和/或第二药物(例如，多柔比星)不在脂质体制剂中。本发明还可以为已知的脂质体和非脂质体制剂(例如，和或)提供优异的结果。
本发明可以提供第一和第二API的靶向递送，例如提供给肝脏。本发明可以减轻不期望的副作用，例如将水不溶性药物加载到脂质体中以消除用于非脂质体药物(例如，多西紫杉醇)制剂的毒性溶剂，从而消除毒性溶剂引起的不良反应。此外，由于第一和第二API在独立的脂质体中，每个脂质体可以专门为其所携带的API而设计。可以临床确定两种脂质体制剂的不同组合，包括不同的API比例、不同的给药顺序和间隔时间，以用于治疗不同类型的癌症。它还使医师能够临床灵活调整患者的两种脂质体API的比例，以优化结果，同时最小化个体患者的不良反应。
这些脂质体的各种特征，以及包含脂质体的药物组合物以及使用和制备脂质体的方法又在下面进行了讨论。
活性药物成分(API)
在各个方面和实施方案中，所述组合物包含第一API(例如，在所述第一类型脂质体中的多西紫杉醇)和第二API(例如，独立的第二脂质体型中的多柔比星)。当将多西紫杉醇和多柔比星作为示例性实例时，其它实施方案也是可能的，其中不同的第一API位于第一类型脂质体的脂质层中，并且不同的第二API处于(例如，结晶于)第二种类型脂质体的内部水性部分中。
在各种实施方案中，两种类型脂质体可以分别包含两种(或更多种)抗癌剂、抗炎剂、抗糖尿病剂、抗真菌剂和/或抗生素。当存在另外的API(即多于两种)时，第一和/或第二类型脂质体可以包含所述另外的API。或者，另外的API可以包含在与第一和第二类型脂质体分开的脂质体中(例如，在第三类型脂质体中)。
多西紫杉醇(通用的，或商品名称或)是一种临床上良好的抗有丝分裂化疗药物，其通过干扰细胞分裂起作用。多西紫杉醇被FDA批准用于治疗局部晚期或转移性的乳腺癌、头颈癌、胃癌、激素难治性前列腺癌和非小细胞肺癌。多西紫杉醇可以用作单一药剂或与所述其他化学治疗药物组合使用，其取决于具体的癌症类型和阶段。
多西紫杉醇是紫杉烷类药物的成员，也包括化疗药物紫杉醇。因此，在一些实施方案中，多西紫杉醇可被能够置于脂质体的脂质层内的另一紫杉烷所代替。
仍未确定紫杉烷的最佳给药方案，但大多数研究发现三周或一周的给药方案之后仍具有显着的死亡率。虽然一些研究表明每周给药一次是最佳方案，但多西紫杉醇正式包装插页建议每三周给药一次。需要注意的重要毒性包括嗜中性粒细胞减少症、发热性嗜中性白细胞减少症和神经感觉障碍。这些毒性已经在II期和III期临床试验中得到充分记录，可以预期并随后进行管理。
在各种实施方案中，本发明可以增加多西紫杉醇的效力和/或减少不希望的副作用。
多柔比星(商品名称聚乙二醇化脂质体形式，商品名为非聚乙二醇化脂质体形式，商品名)，也称为羟基柔红霉素(hydroxydaunorubicin)和羟基多柔比星霉素(hydroxydaunomycin)，是一种用于癌症化疗并通过细菌物种半化学合成所衍生的药物。它是一种与天然产物柔红霉素密切相关的蒽环类抗生素(注意：在这种情况下，这并不意味着其用于治疗细菌感染)，并且像所有蒽环类药物一样，据信其通过插入DNA起作用，其中最严重的不良反应是危及生命的心脏损伤。它常用于治疗广泛的癌症，包括血液恶性肿瘤(血液癌，如白血病和淋巴瘤)、许多类型的癌(实体瘤)和软组织肉瘤。它通常作为各种化疗方案的组成部分用于联合化疗。在一些实施方案中，多柔比星可以被可置于脂质体内部水性部分的其它蒽环类抗生素或其它抗癌剂替代。
多柔比星的常见不良反应包括脱发(在大多数用该药物治疗的患者中可见)、骨髓抑制(身体骨髓产生新血细胞的能力受损)、恶心和呕吐(大约在30-90％用该药物治疗的患者中发现)、口腔粘膜炎、食管炎、腹泻、皮肤反应(包括手足综合征)以及沿药物递送的静脉的局部肿胀和发红。不常见但严重的反应包括超敏反应(包括过敏反应)、再辐射(radiation recall)、心脏损伤和肝功能障碍。
该药物作为盐酸盐经静脉内给药。它以多种不同的商品名销售，包括PFS、RDF或多柔比星是光敏的，容器通常被铝袋和/或棕蜡纸覆盖，以防止其被光影响。多柔比星也可以作为脂质体包封的形式，如(聚乙二醇化形式)、(非聚乙二醇化形式)和尽管这些形式也必须通过静脉注射给药。
在各种实施方案中，本发明可以增加多柔比星的功效和/或减少不期望的副作用。
在一些实施方案中，所述API可以是蛋白质或小分子的多核苷酸(包括寡核苷酸)。
在一个实施方案中，所述API是多核苷酸。多核苷酸可以是基因组DNA片段、cDNA、mRNA、ssRNA、dsRNA、微RNA、siRNA、shRNA、sdRNA、DsiRNA、LNA和反义DNA或RNA。
或者，API可以是小分子药物。优选地，所述分子的分子量为约1500g/mol至约50g/mol。
API可以包括例如以下两种或更多种：抗癌剂、抗生素剂、抗病毒剂、抗真菌剂或止痛剂。
示例性的抗癌药物可包括但不限于阿西维辛、阿柔比星、阿考达唑、阿美蒽醌、氨鲁米特、安曲霉素、门冬酰胺酶、阿扎胞苷、阿扎替派、比生群、博来霉素、白消安、放线菌素C、卡普睾酮、卡醋胺、卡铂、卡非佐米(carfilzomib)、卡莫司汀、卡柔比星、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、地扎胍宁、地吖醌、多西紫杉醇、多柔比星、依匹哌啶、厄洛替尼、依托泊苷、氯苯乙嘧胺、氟脲嘧啶脱氧核苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、fluorocitabine、羟基脲、异丙铂、醋酸亮丙瑞林、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、巯嘌呤、甲氨蝶呤、氯苯氨啶、丝裂红素、米托洁林、丝裂霉素、米托司培、米托蒽醌、麦考酚酸、诺考达唑、诺拉霉素、奥昔舒仑、紫杉醇、培利霉素、戊氮芥、泊非霉素、泼尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、嘌罗霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、司莫司汀、司帕霉素、锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、链佐星、他利霉素、替加氟、替尼泊苷、替罗昔隆、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、噻唑呋林、磷酸曲西立滨、曲他胺、三甲曲沙、乌拉莫司汀、乌瑞替派、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春匹定、长春罗定、长春利定、净司他丁和佐柔比星。
在具体实施方案中，抗癌剂选自卡非佐米、柔红霉素、多柔比星、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、阿糖胞苷、氟脲嘧啶脱氧核苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、异丙铂、醋酸亮丙瑞林和甲氨蝶呤。
示例性的抗生素可包括但不限于氨基糖苷类；阿米卡星；庆大霉素；卡那霉素；新霉素；奈替米星；链霉素；妥布霉素；安沙霉素类；格尔德霉素；除莠霉素；碳头孢烯；氯碳头孢；碳青霉烯；厄他培南；多利培南；亚胺培南/西司他丁；美罗培南；头孢菌素；头孢羟氨苄；头孢唑林；头孢噻吩或头孢噻吩；头孢氨苄；头孢克洛；头孢孟多；头孢西丁；头孢丙烯；头孢呋辛；头孢克肟；头孢地尼；头孢托仑；头孢哌酮；头孢噻肟；头孢泊肟；头孢他啶；头孢布烯；头孢唑肟；头孢曲松；头孢吡肟；ceftobiprole；糖肽；替考拉宁；万古霉素；大环内酯类；阿奇霉素；克拉霉素；地红霉素；红霉素；罗红霉素；醋竹桃霉素；泰利霉素；大观霉素；单酰胺菌素；氨曲南；青霉素类；阿莫西林；氨苄西林；阿洛西林；羧苄西林；氯唑西林；双氯西林；氟氯西林；美洛西林；甲氧西林；萘夫西林；苯唑西林；青霉素,哌拉西林,替卡西林；杆菌肽；多粘菌素E；多粘菌素B；喹诺酮；环丙沙星；依诺沙星；加替沙星；左氧氟沙星；洛美沙星；莫西沙星；诺氟沙星；氧氟沙星；曲伐沙星；磺酰胺；磺胺米隆；偶氮磺胺(旧称)；磺胺醋酰；磺胺甲二唑；sufanilimide(旧称)；柳氮磺吡啶；磺胺异噁唑；甲氧苄啶；甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(复方新诺明(co-trimoxazole))(TMP-SMX)；四环素；地美环素；多西环素；米诺环素；土霉素；四环素；胂凡纳明；氯霉素；克林霉素；林可霉素；乙胺丁醇；磷霉素；夫西地酸；呋喃唑酮；异烟肼；利奈唑胺；甲硝唑；莫匹罗星；呋喃妥因(nitrofuantoin)；平板霉素(platensimycin)；多粘菌素；吡嗪酰胺(purazinamide)；奎奴普丁/达福普汀；利福平或利福平(rifampin或rifampicin)；和timidazole。
示例性的抗病毒药物可包括但不限于，氨硫脲；美替沙腙；核苷和/或核苷酸；阿昔洛韦；碘苷；阿糖腺苷；利巴韦林；更昔洛韦；泛昔洛韦；伐昔洛韦；西多福韦；喷昔洛韦；缬更昔洛韦；溴夫定；利巴韦林,环胺；金刚乙胺；曲金刚胺；磷酸衍生物；膦甲酸；膦乙醇；蛋白酶抑制剂；沙奎那韦；茚地那韦；利托那韦；那非那韦；安泼那韦；洛匹那韦；福沙那韦；阿扎那韦；替拉那韦；核苷和核苷酸反转录酶抑制剂；齐多夫定；去羟肌苷；扎西他滨；司他夫定；拉米夫定；阿巴卡韦；替诺福韦；阿德福韦酯；恩曲他滨；恩替卡韦；非-核苷反转录酶抑制剂；奈韦拉平；地拉韦啶；依法韦仑；神经氨酸酶抑制剂；扎那米韦；奥塞米韦；吗啉胍；异丙肌苷；普来可那立；和恩夫韦地。
示例性的抗真菌剂可包括但不限于，烯丙胺；特比萘芬；抗代谢物；氟胞嘧啶；氮杂茂(azole)；氟康唑；伊曲康唑；酮康唑；雷夫康唑；泊沙康唑；伏立康唑；葡聚糖合成抑制剂；卡泊芬净；米卡芬净；阿尼芬净；多烯；两性霉素B；两性霉素B胶体分散(ABCD)；和灰黄霉素。
示例性的止痛剂可包括但不限于，阿片衍生物、可待因、哌替啶、美沙酮和吗啡。
在各种实施方案中，多西紫杉醇是第一类型脂质体中唯一的API，和/或多柔比星是第二类型脂质体中唯一的API。
在各种实施方案中，第一脂质层组分:多柔比星的摩尔比为约100:1至约5:1，优选约20:1至约10:1；并且第二脂质组分:多西紫杉醇的摩尔比为约100:1至约5:1，优选约20:1至约10:1。
在各种实施方案中，第二API(例如，多柔比星):第一API(例如，多西紫杉醇)的摩尔比为约10:1至1:10，优选约5:1至1:5，且更优选约3:1至1:3。
脂质层和水溶液
本发明利用脂质和水溶液，从而例如制备根据本发明的脂质体。因此，所述组合脂质和/或水溶液可影响脂质体的最终组成。
在各种实施方案中，脂质溶液可以包含有机溶剂。有机溶剂可以是水混溶性溶剂。优选地，所述水混溶性溶剂选自乙醇、甲醇、DMSO和异丙醇。最优选的有机溶剂是乙醇。
如本文所用，术语“阳离子脂质”是指在约pH 3-pH 9下携带净正电荷的脂质或胆固醇衍生物。
如本文所用，术语“阴离子脂质”是指在约pH 3-pH 9下带有净负电荷的脂质或胆固醇衍生物。
如本文所用，术语“聚乙二醇化脂质”是指与聚乙二醇聚合物缀合的脂质。
如本文所用，术语“中性脂质”是指在约pH 3-pH 9下不携带净电荷的脂质。
脂质溶液可以包含脂质的混合物。脂质的混合物优选包含胆固醇。
脂质混合物可还包括阳离子脂质。阳离子脂质可为但不限于，N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)；N-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N,N-二甲基氯化铵(“DODMA”)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTAP”)；N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N-二甲基氯化铵(“DODAP”)；3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)氨甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)；N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)；1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)；1,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)；1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)；2-{4-[(3b)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丁氧基}-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)]-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(CLinDMA)。
在一些实施方式中，脂质的混合物可包括阴离子脂质。阴离子脂质可为但不限于，二酰基甘油磷脂酸((1,2)-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DSPA)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DPPA)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DMPA)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DLPA)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA))、二酰基甘油磷酸甘油(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(DSPG)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸(1’-rac-甘油)(DPPG)；1,2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DMPG)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(DLPG)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(DOPG))、磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、以及其它与中性脂质相连的阴离子修饰基团。脂质的混合物还可包括中性脂质。中性脂质可为但不限于，二酰基甘油磷酸胆碱(氢化的L-α-卵磷脂(大豆)(HSPC)；二酰基甘油磷酸胆碱(L-α-卵磷脂(大豆)(大豆PC))；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DLPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC))、二酰基甘油磷酸乙醇胺(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE))和磷脂酰丝氨酸。
脂质的混合物还可包含聚乙二醇化脂质。聚乙二醇化脂质可为但不限于，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](mPEG-2000-DSPE)；1,2-二-十八烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](mPEG-2000-DOPE)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](mPEG-2000-DPPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](mPEG-2000-DMPE)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](mPEG-2000-DLPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](mPEG-5000-DSPE)；1,2-二-十八烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](mPEG-5000-DOPE)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](mPEG-5000-DPPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](mPEG-5000-DMPE)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](mPEG-5000-DLPE)。
脂质的混合物还可包含类脂质分子或lipidoid。脂质的混合物还可包括与脂质或胆固醇结合的分子，所述分子包括蛋白质或肽或寡核苷酸。
在各种实施方案中，所述脂质层包含本文公开的一种或多种脂质组分。
在各种实施方案中，第一脂质层和/或第二脂质层由不饱和磷脂和胆固醇组成。
在各种实施方案中，第一脂质层和/或第二脂质层由不饱和磷脂、胆固醇和聚乙二醇化磷脂组成。
在各种实施方案中，第一脂质层和第二脂质层包含不同的脂质组成(例如，不同的脂质组分和/或不同量的一些脂质组分)。在各种实施方案中，第一脂质体和第二脂质体是不同的(例如，除了包含不同的API外，还衍生自下述不同的脂质溶液和/或水溶液)。或者，在一些实施方案中，第一和第二脂质层基本上相同(例如，除了包含不同的API，包含基本上相同的脂质组分及其量)。
在各种实施方案中，第一脂质层、第二脂质层或第一和第二脂质层都包含：约20-75％、优选约30-60％(摩尔)的不饱和磷脂；约10-60％、优选20-50％(摩尔)的胆固醇；和约0-20％、优选1-10％(摩尔)的聚乙二醇化磷脂。
在各种实施方案中，脂质层组分:多柔比星的摩尔比为约100:1至约5:1，优选约20:1至约10:1；并且脂质层组分:多西紫杉醇的摩尔比为约100:1至约5:1，优选约20:1至约10:1。
在各种实施方案中，多柔比星:多西紫杉醇的摩尔比为约10:1至1:10，优选约5:1至1:5，更优选约3:1至1:3。
在各种实施方案中，不饱和磷脂包括多不饱和磷脂或单不饱和磷脂，优选磷脂酰胆碱，更优选大豆卵磷脂或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)。
在各种实施方案中，胆固醇包括胆固醇衍生物，优选阳离子胆固醇衍生物，更优选氨基胆固醇衍生物，更优选二甲基氨基乙烷氨基甲酰胆固醇(DC-胆固醇)。
在各种实施方案中，聚乙二醇化磷脂包括磷脂酰乙醇胺，优选1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)，其中聚乙二醇化为PEG 500至PEG3000，优选PEG 2000。
在各种实施方案中，调整脂质层的组成以实现第一药物的所需负载。尽管至少一部分的第一药物位于脂质层中，但是普通技术人员将理解第一药物在脂质层和内部水性部分之间具有分配系数。在一些实施方案中，基本上所有的第一药物都在脂质层中。
该方法的水溶液优选包含水和缓冲剂。缓冲剂可以是但不限于磷酸盐、组氨酸、HEPES、Tris、乙酸盐、碳酸盐和柠檬酸盐。在各种实施方案中，调节水溶液的组成以实现第二药物的所需负载(和/或结晶)。尽管至少一部分的第二药物在脂质体的内部水性部分，但是普通技术人员将理解第二药物在脂质层和内部水性部分之间具有分配系数。在一些实施方案中，基本上所有的第二药物都在内部水性部分。
尽管在一些实施方案中，第一脂质层和第二脂质层具有基本相同的脂质组成，但本领域技术人员将理解，在其它实施方案中，第一脂质层和第二脂质层可以具有不同的脂质组成(例如，不同的脂质组分和/或不同量的某些脂质组分)。
制备脂质体的方法
可以适用于制备本发明的脂质体的装置和方法的实例可以在例如美国专利申请序列号14/209,187(和US20140348900公开)中找到，其全部内容通过引用并入本文。根据本发明制备脂质体的许多不同方法的描述在下面的实施例中给出。
本发明还提供了制备本文所述或要求保护的药物组合物的方法。例如，本发明提供了制备如本文所述或要求保护的药物组合物的方法，其包括：(i)通过第一端口向混合室引入不饱和磷脂、固醇、多西紫杉醇以及优选聚乙二醇化磷脂在乙醇中的第一脂质溶液、并将第一水溶液通过第二端口引入混合室，来制备第一类型脂质体，其中所得的第一类型脂质体不包含多柔比星；(ii)通过第一端口向混合室引入乙醇中的第二脂质溶液，并通过第二端口将第二水溶液引入混合室，并将所得脂质体与多柔比星一起温育，从而制备第二类型脂质体，其中所得第二类型脂质体不包含多西紫杉醇；和(iii)组合预定量的第一类型脂质体和第二类型脂质体，从而制备本文所述或要求保护的药物组合物。
在各种实施方案中，至少一种脂质和一种水溶液入口之间的角度不是180°或大致相似的角度。在一些方面，至少一种脂质溶液流和一种水溶液流以小于约180°的角度发生碰撞。因此，在一些方面，该方法不包括T型连接器。
在一些实施方案中，至少一种脂质和一种水溶液入口之间的角度为约120°或更小，例如，115°以下，100°以下，90°以下，80°以下，72°以下，60°以下，45°以下，30°以下，18°以下。
在一些实施方案中，步骤ii)中的水溶液经由至少两个入口引入，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个。在一些实施方案中，步骤ii)中的水溶液经由至少三个但不超过11个入口引入，例如至少3个但不超过7个，至少3个但不超过5个，至少4个但不超过11个，至少5个但不超过11个，至少6个但不超过11个。
在一些实施方案中，至少两个(例如，3、4、5、6、7个等)水溶液入口和至少一个(例如，2、3、4、5个等)脂质溶液入口位于同一平面。
在一些实施方案中，至少一个(例如，2个)出口基本垂直于入口的平面。在其它实施方案中，至少一个(例如，2、3、4、5个等)出口基本不垂直于入口的平面。
在一些实施方案中，至少两个(例如，3、4、5、6、7等)水溶液入口和至少一个(例如，2、3、4、5等)脂质溶液入口不在同一平面。
制备脂质溶液
脂质溶液可以由混合在一起的各脂质的储备溶液制成。优选将脂质溶于有机溶剂中以制备脂质溶液。用于制备脂质溶液的有机溶剂可与水混溶。优选地，溶剂可以是乙醇、甲醇、DMSO、丙醇、DMF、THF、丙酮、二噁烷、乙二醇、聚乙二醇和异丙醇。更优选地，溶剂是聚乙二醇、异丙醇和乙醇。优选地，溶剂包含少于10％的水。在一些情况下，脂质溶液可以由脂质的混合物制成，然后将该混合物溶解在有机溶剂中。在该溶液中总脂质的浓度可以在约1mg/mL至约200mg/mL的范围内，例如，约1mg/mL至约100mg/mL。更优选地，在该溶液中总脂质的浓度可以在约5mg/mL至约100mg/mL的范围内或形成约10mg/mL至100mg/mL。在一些实施方案中，有机溶剂为乙醇，其浓度为约70％以上(例如，75％以上，80％以上，85％以上，90％以上，95％以上，100％)。
脂质的混合物将根据API的最佳递送的要求进行优化，并且本领域普通技术人员容易通过常规实验进行优化。
在一些实施方案中，水不溶性API可以溶解在脂质溶液中。脂质溶液中API的浓度将取决于药剂的功效，并且可以容易地由本领域普通技术人员来确定。脂质/API的比例将由脂质体对API的包封能力决定。
制备水溶液
水溶性API成分可以溶解在第一水溶液(S1)中。可以优化溶液的pH和盐度以适应使API组分和脂质之间相互作用以形成脂质体的要求。这些条件可以由本领域普通技术人员容易地确定。在下面的实施例中提供了样品。对于本领域技术人员显而易见的是，缺少API的水溶液(称为(S2))可以与具有该试剂的溶液相似。或者，S1和S2可以不同。
脂质体制备，混合溶液
脂质溶液和水溶液优选从不同端口进入歧管，每个端口的流速为约1mL/min至约6000mL/min。优选地，流速可以为约5mL/min至约1000mL/min。更优选地，流速可以为约20mL/min至约600mL/min。在一些实施方案中，基于入口的尺寸调节流速以获得所需的脂质体大小、形态、PDI和制造规模。
如上所述，第一脂质体和第二脂质体可以不同(例如，不同的脂质组分和/或不同量的一些脂质组分、不同的内部水性部分等)。在这种情况下，第一和第二脂质体可以由不同的脂质溶液和/或水溶液制成。然而，本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，第一和第二脂质层可以基本相同。
在一些实施方案中，脂质溶液和/或水溶液通过0.1-5mm的端口尺寸以约1mL/min至约2500mL/min的流速引入。
在一些实施方案中，脂质溶液和/或水溶液的流速为约0.02m/s至约40m/s，例如，0.1m/s至30m/s，0.2m/s至20m/s。根据入口尺寸调节流速，以获得所需的脂质体大小、形态、PDI和制造规模。
将API加载到脂质体中
在混合室中，脂质被认为瞬时组装成脂质体颗粒。当药物API由脂质溶液或水溶液携带时，其可以通过API和脂质之间的亲脂性或静电相互作用或两者而被包封在脂质体中。
本发明还提供了制备不含API的脂质体(即所谓的“空”脂质体)的方法。在这样的实施方案中，在歧管中混合的脂质溶液和水溶液中都不存在API。API可以通过扩散过程或另一过程加载到脂质体中。例如，多柔比星可以通过pH梯度加载到脂质体中。参见美国专利申请号10/019,200，PCT公开号WO 2001/005373，美国专利号5,785,987、5,380,531、5,316,771和5,192,549，所有这些专利通过引用并入本文。
优选地，将API与脂质体溶液混合，以通过扩散将API加载到脂质体中。在一个方面，将API溶解在水溶液中，并将溶液与空脂质体混合。另一方面，API可以容易地溶于空脂质体的溶液中，因此API可以与空脂质体的溶液直接混合。
API的溶液与API的空脂质体溶液的体积比优选在约1:50至约1:5的范围内。较低体积的溶液是优选的，因为它避免了对最终脂质体溶液的显著稀释。
药物包封效率优选大于70％。更优选地，效率大于80％。最优选地，效率大于90％。
脂质体浓度调整
可使用切向流过滤以浓缩脂质体溶液。
更换缓冲液
脂质体溶液中的残留有机溶剂可以通过更换缓冲液来除去。优选地，通过切向流过滤来更换缓冲液。在另一个实施方案中，可以通过透析来更换缓冲液。
灭菌过滤
可以将脂质体溶液灭菌，例如通过使该溶液通过0.22微米的无菌过滤器。
脂质体
在各种实施方案中，脂质体的Z-平均粒径为约10nm～约2,000nm，优选为小于300nm，更优选为约10～300nm或约20～约300nm。最优选地，平均粒径为约20至120nm。在一些实施方案中，脂质体具有约0.005至约0.8的多分散指数，例如0.005至约0.5、0.01至约0.5、0.01至约0.4、0.01至约0.2。
优选地，超过70％的API被包封在脂质体中。更优选地，超过80％的API被包封在脂质体中，最优选地，超过90％的API被包封在脂质体中。
任选地，脂质体可以是单层的。或者，脂质体可以是多层的，或者是倒立六边形或立方体的形态，或者是脂质盘或中空脂质体。
药物组合物
在各种实施方案中，药物组合物用作药物。在各种实施方案中，药物组合物用作癌症治疗剂。在各种实施方案中，药物组合物包含抗生素、抗病毒药、抗糖尿病药、抗高血压药、抗真菌药或止痛药。
本发明还提供了一种药物组合物，其由以下组成：(i)本文所述或要求保护的多个第一类型脂质体；(ii)本文所述或要求保护的多个第二类型脂质体；和(iii)一种或多种药物赋形剂。
在各种实施方案中，将多个脂质体包含在可注射制剂中，例如用于皮下，静脉内，肌内，鞘内或腹膜内注射。可注射的制剂可以是水溶液，优选在生理上相容的缓冲液例如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。可注射制剂可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，脂质体可以是干燥或粉末形式，在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)重构。
治疗和给药
本发明提供治疗受试者的方法，包括施用有效量的本文所述或要求保护的本发明的任何药物组合物。在各种实施方案中，受试者患有癌症。在各种实施方案中，所述癌症是肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)；结肠癌；乳腺癌；或肝癌，优选肝细胞癌(HCC)。
因此，本发明提供了治疗癌细胞和/或组织、包括人类受试者的癌细胞和/或组织的方法。癌症可以由细胞和组织的异常生长形成的恶性肿瘤引起，导致器官衰竭。
实体肿瘤可以是血液、骨髓或淋巴细胞以外的身体组织细胞的异常生长形成的肿瘤(细胞的新生长)或病变(解剖结构的损伤或生理功能的损害)。实体肿瘤由来自不同组织类型(如肝、结肠、乳腺或肺)的异常细胞团块组成，最初在其细胞来源的器官中生长。然而，这种癌症可通过在疾病晚期的转移性肿瘤生长扩散到其他器官。
被治疗的受试者可能已被诊断患有癌症。受试者可具有局部晚期、不可切除或转移性癌症和/或可在先前的一线治疗中失败。在各种实施方案中，癌症是肝癌(例如，肝细胞癌，HCC)。在各种实施方案中，肝癌(例如，HCC)可以是中度、晚期或终末期。肝癌(例如，HCC)可以是转移性或非转移性的。肝癌可以包括由非肝癌向肝脏的转移引起的肝肿瘤。肝癌(例如HCC)可以是可切除或不可切除的。肝癌(例如，HCC)可以包括单个肿瘤、多个肿瘤或具有浸润性生长模式(进入门静脉或肝静脉)的定义不明确的肿瘤。肝癌(例如，HCC)可以包括纤维板层、假腺管型(腺样)、多形性(巨细胞)或透明细胞模式。肝癌(例如，HCC)可以包括良好分化的形式，且肿瘤细胞与肝细胞类似，形成小梁、索和巢，和/或在细胞质中含有胆汁色素。肝癌(例如，HCC)可以包括分化不良的形式，并且恶性上皮细胞是松散的、多形性的、间变性的和/或巨型的。在一些实施方案中，肝癌(例如，HCC)与乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化或II型糖尿病有关。
在各种实施方案中，癌症是肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)；结肠癌；乳腺癌；或肝癌，优选肝细胞癌(HCC)。
在各种实施方案中，多西紫杉醇的浓度可为10、20、30、40、50、75、80、100、125、150或160mg/mL。剂量可为约10mg/m2至150mg/m2(例如，10、20、25、30、40、50、60、70、75、80、90、100、110、120、125、130、140或150mg/m2)。例如，剂量可为75mg/m2。可以每3周给药一次，持续1、2、3、4、5或6个循环。本领域技术人员将理解，多西紫杉醇的给药方针是本领域已知的，并且可以基于以下因素进行调整，所述因素包括但不限于癌症类型、癌症阶段、给药方案、多柔比星的剂量和/或本发明的药物组合物的功效。
在各种实施方案中，多柔比星的浓度可为0.1、0.5、1、1.5、2、3、4或5mg/mL。剂量可为约1mg/m2至100mg/m2(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、40、50、60、70、75、80、90或100mg/m2)。例如，剂量可为30mg/m2。可以每3周给药一次，持续1、2、3、4、5或6个循环。本领域技术人员将理解，多西紫杉醇的给药方针是本领域已知的，并且可以基于以下因素进行调整，所述因素包括但不限于癌症类型、癌症阶段、给药方案、多柔比星的剂量和/或本发明的药物组合物的功效。
在各种实施方案中，将第一API(例如多西紫杉醇)的脂质体和第二API(例如多柔比星)的脂质体混合并共同施用于受试者。
在各种实施方案中，将第一API(例如多西紫杉醇)的脂质体和第二API(例如多柔比星)的脂质体依次独立给药。
以下实施例是示例性的而不是限制性的。本领域技术人员在阅读本发明后，本技术的许多变化对其将变得显而易见。因此，该技术的范围不应参照实施例来确定，而是应参考所附权利要求及其等同物的全部范围来确定。
实施例
实施例1：制备脂质体制剂CPT307A
CPT307A包含不饱和脂质1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、胆固醇和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基9聚乙二醇)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy9polyet hyleneglycol)-2000])。通过将1200mg 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、160mg胆固醇和400mg 1,2-二硬脂酸酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基9聚乙二醇]-2000](mPEG2000-DSPE)溶于40mL无水乙醇中来制备脂质的乙醇溶液。此外，使用三种250mM硫酸铵的水溶液，pH6.5。将上述四种溶液中的每一种取二十毫升加载到20mL注射器中。每个注射器通过管道连接到五口歧管的入口。经管道，通过注射泵将注射器中的溶液泵入歧管的混合室。脂质体溶液通过出口排出并在玻璃瓶中收集，然后通过切向流过滤浓缩。通过切向流过滤将缓冲液变为组氨酸/蔗糖缓冲液(10mM组氨酸，9.2％蔗糖，pH6.5)。
通过将多柔比星(DXR)加载到空脂质体中制备脂质体制剂CPT307A。将二十八毫升的空脂质体与6.85mL DXR溶液在组氨酸/蔗糖缓冲液中以8.93mg/mL的浓度混合，并在42℃温育3小时，从而包封了99.8％的DXR。然后将包封的脂质体通过0.22μm过滤器过滤进行灭菌。CPT307A脂质溶液的组成(摩尔％)示于表1中。负载脂质体的最终Z-平均粒径为37.9nm，DXR浓度为1.74mg/mL。通过动态光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS)测定的CPT307A的体积加权粒径分布如图1所示。
表1.实施例1的脂质组成
组分 CPT307A％(摩尔)*
DOPC 73.6
胆固醇 20
mPEG2000-DSPE 6.4
DXR 13.1
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例2：制备脂质体制剂CPT307B
CPT307B的脂质组成与CPT307A相同，其包含DOPC、胆固醇和mPEG2000-DSPE。发现与饱和脂质如DSPC、DPPC、HSPC相比，不饱和脂质DOPC使脂质体具有更强的封装多西紫杉醇的能力。为了制备CPT307B，通过将2100mg DOPC、280mg胆固醇、700mg mPEG2000-DSPE和175mg多西紫杉醇(DOCE)溶解在70mL无水乙醇中来制备脂质/DOCE溶液。CPT307B脂质溶液的组成(％摩尔)示于表2中。此外，使用三种250mM硫酸铵(pH6.5)的水溶液。将上述四种溶液中的每一种取二十毫升加载到20mL注射器中。每个注射器通过管道连接到五口歧管的入口。经管道，通过注射泵将注射器中的溶液泵入歧管的混合室。脂质体溶液通过出口排出并收集在玻璃瓶中，然后通过切向流过滤浓缩。通过切向流过滤将缓冲液更换为组氨酸/蔗糖缓冲液(10mM组氨酸，9.2％蔗糖，pH6.5)。然后将制剂通过0.22μm过滤器过滤灭菌。CPT307B的Z-平均粒径为32.9nm。通过动态光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS)测定的CPT307B的体积加权粒径分布如图2所示。
表2.实施例2的脂质组成。
组分 CPT307B％(摩尔)*
DOPC 73.6
胆固醇 20
mPEG2000-DSPE 6.4
DOCE 6.0
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例3：制备组合脂质体制剂CPT307AB
通过以1:1摩尔比(或1:1.5的w/w比))混合CPT307A(参见实施例1)和CPT307B(参见实施例2)来制备脂质体制剂CPT307AB，其中DXR包封在CPT307A中且DOCE包封在CPT307B中。例如，通过混合含有1.74mg/mLDXR的12.07mL CPT307A和含有2.57mg/mL DOCE的12.26mL CPT307B来制备CPT307AB。将混合物轻轻旋转以允许完全混合。CPT307AB脂质溶液的组成(摩尔％)如表3所示。CPT307AB中DXR和DOCE的最终浓度分别为0.86mg/mL和1.29mg/mL。
表3.实施例3的脂质组成
组分 CPT307AB％(摩尔)*
DOPC 73.6
胆固醇 20
mPEG2000-DSPE 6.4
DXR 4.1
DOCE 4.1
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例4：制备脂质制剂CPT319A
CPT319A包含DOPC、胆固醇、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇)和mPEG2000-DSPE。DC-胆固醇是胆固醇的阳离子衍生物，其使脂质体带正电表面电荷，从而显着地影响脂质体的体内分布。为了制备脂质体，首先通过将1800mgDOPC、300mg胆固醇、420mgDC-胆固醇和600mg mPEG2000-DSPE溶于60mL无水乙醇中来制备脂质溶液。此外，使用三种250mM硫酸铵的水溶液，pH6.5。将上述四种溶液中的每一种取二十毫升加载到20mL注射器中。每个注射器通过管道连接到五口歧管的入口。经管道，通过注射泵将注射器中的溶液泵入歧管的混合室。将通过出口排出的脂质体溶液收集在玻璃瓶中，然后通过切向流过滤浓缩。通过切向流过滤将缓冲液更换为组氨酸/蔗糖缓冲液(10mM组氨酸，9.2％蔗糖，pH6.5)。
通过将DXR载入空脂质体来制备脂质体制剂CPT319A。将三十毫升的含有33.5mg/mL脂质的空脂质体与已经预先溶解在组氨酸/蔗糖缓冲液中的83.6mg DXR混合，并在42℃温育3小时，从而包封了94.6％的DXR。然后将包封的脂质体通过0.22μm过滤器过滤灭菌。CPT319A的组成(摩尔％)如表4所示。负载脂质体的最终Z-平均粒径为43.6nm。通过动态光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS)测定的CPT319A的体积加权粒径分布如图3所示。
表4.实施例4的脂质组成。
组分 CPT319A％(摩尔)*
DOPC 61.7
胆固醇 17.7
DC-胆固醇 15.2
mPEG2000-DSPE 5.4
DXR 10.3
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例5：制备脂质体制剂CPT319B
CPT319B包含DOPC、胆固醇、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇)和mPEG2000-DSPE。DC-胆固醇是胆固醇的阳离子衍生物，其使脂质体带正电表面电荷，从而显着地影响脂质体的体内分布。脂质组成与CPT319A相同。为了制备CPT319B，通过将1848mg DOPC、303mg胆固醇、423mg DC-胆固醇、605mg mPEG2000-DSPE和154mg DOCE溶于61.5mL无水乙醇中来制备脂质/DOCE溶液。CPT319B脂质溶液的组成(摩尔％)示于表5中。此外，使用三种250mM硫酸铵水溶液，pH6.5。将上述四种溶液中的每一种取二十毫升加载到20mL注射器中。每个注射器通过管道连接到五口歧管的入口。经管道，通过注射泵将注射器中的溶液泵入歧管的混合室。将通过出口排出的脂质体溶液收集在玻璃瓶中，然后通过切向流过滤浓缩。通过切向流过滤将缓冲液更换为组氨酸/蔗糖缓冲液(10mM组氨酸，9.2％蔗糖，pH6.5)。然后将该制剂通过0.22μm过滤器过滤灭菌。通过MalvernZetasizer Nano ZS的动态光散射测试确定的CPT319B的体积加权粒径分布如图4所示。CPT319B的Cryo-TEM图像如图5所示。颗粒绝大部分表现出具有均匀粒径的球形单层形态。CPT319B的负染色TEM图像显示在图6中，其进一步呈现具有小球形且均匀的颗粒。
表5.实施例5的脂质组成。
组成 CPT319B％(摩尔)*
DOPC 61.7
胆固醇 17.7
DC-胆固醇 15.2
mPEG2000-DSPE 5.4
DOCE 3.5
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例6：制备组合脂质体制剂CPT319AB
通过以1:1摩尔比(或1:1.5的w/w比)混合CPT319A(参见实施例4)和CPT319B(参见实施例5)来制备脂质体制剂CPT319AB，其中DXR包封在CPT319A中且DOCE包封在CPT319B中。例如，通过将含有1.24mg/mL DXR的13.7mL CPT319A和含有2.18mg/mL DOCE的11.7mLCPT319B混合来制备CPT319AB。将该混合物轻轻旋转以允许完全混合。CPT319AB脂质溶液的组成(摩尔％)如表6所示。CPT319AB中DXR和DOCE的最终浓度分别为0.67mg/mL和1.0mg/mL。
表6.实施例6的脂质组成
组分 CPT319AB％(摩尔)*
DOPC 61.7
胆固醇 17.7
DC-胆固醇 15.2
mPEG2000-DSPE 5.4
DXR 2.6
DOCE 2.6
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例7：制备脂质体制剂CPT317A
CPT317A包含与CPT319A相同类型的脂质，而脂质比不同(胆固醇增加，DOPC和DC-胆固醇降低)。为了制备CPT317A，通过将600mg DOPC、140mg胆固醇、84mg DC-胆固醇和200mg mPEG2000-DSPE溶于20mL无水乙醇中制备脂质溶液。此外，使用三种250mM硫酸铵的水溶液，pH6.5。将上述四种溶液中的每一种取二十毫升加载到20mL注射器中。每个注射器通过管道连接到五口歧管的入口。经管道，通过注射泵将注射器中的溶液泵入歧管的混合室。将通过出口排出的脂质体溶液收集在玻璃瓶中，然后通过切向流过滤浓缩。通过透析将缓冲液变成组氨酸/蔗糖缓冲液(10mM组氨酸，9.2％蔗糖，pH6.5)。
通过将DXR载入空脂质体制备脂质体制剂CPT317A。将含有40.6mg/mL脂质的15ml空脂质体与50.7mg的DXR混合，在42℃温育3小时，包封了99.2％的DXR。然后将包封的脂质体通过0.22μm过滤器过滤灭菌。通过动态光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS)测定的负载脂质体的Z-平均粒径为37.6nm。CPT317A的组成(摩尔％)示于表7中，
表7.实施例7的脂质体组成。
组分 CPT317A％(摩尔)*
DOPC 56.6
胆固醇 26.9
DC-胆固醇 11.6
mPEG2000-DSPE 5.0
DXR 11.6
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例8：制备脂质体制剂CPT317B
CPT317B的脂质体组成与CPT317A相同。为了制备CPT317B，通过将600mg DOPC、140mg胆固醇、84mg DC-胆固醇、200mg mPEG2000-DSPE和50mg DOCE溶于20mL无水乙醇中来制备脂质/DOCE溶液。CPT317B的组成(摩尔％)示于表8中。此外，使用三种250mM硫酸铵水溶液，pH6.5。将上述四种溶液中的每一种取二十毫升加载到20mL注射器中。每个注射器通过管道连接到五口歧管的入口。经管道，通过注射泵将注射器中的溶液泵入歧管的混合室。将通过出口排出的脂质体溶液收集在玻璃瓶中，然后通过切向流过滤浓缩。通过切向流过滤将缓冲液更换为组氨酸/蔗糖缓冲液(10mM组氨酸，9.2％蔗糖，pH6.5)。然后将制剂通过0.22μm过滤器过滤灭菌。通过动态光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS)测定的Z-平均粒径为47.9nm。
表8.实施例8的脂质体组成。
组分 CPT317B％(摩尔)*
DOPC 56.6
胆固醇 26.9
DC-胆固醇 11.6
mPEG2000-DSPE 5.0
DOCE 4.6
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例9：制备组合脂质体制剂CPT317AB
通过以1:1摩尔比(或1:1.5的w/w比)混合CPT317A(参见实施例7)和CPT317B(参见实施例8)来制备脂质体制剂CPT317AB，其中DXR包封在CPT317A中且DOCE包封在CPT317B中。例如，通过混合含有1.43mg/mL DXR的2.48mL CPT317A和含有1.86mg/mL DOCE的2.86mLCPT317B来制备CPT317AB。将该混合物轻轻旋转以允许完全混合。CPT317AB脂质溶液的组成(摩尔％)示于表9中。CPT317AB中DXR和DOCE的最终浓度分别为0.66mg/mL和1.0mg/mL。
表9.实施例9的脂质组成。
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例10：制备脂质体制剂CPT308B
与上述含有单不饱和脂质DOPC的其它示例性制剂不同，CPT308B含有多不饱和脂质大豆PC。发现与DOPC相比，大豆PC进一步提高了脂质体的DOCE包封能力。为了制备CPT308B，通过首先将30mg的L-α-磷脂酰胆碱(大豆PC)、10mg胆固醇、10mg的mPEG2000-DSPE和6mg的DOCE溶于2mL的无水乙醇中来制备两毫升的脂质/DOCE溶液。CPT308B的脂质制剂的组成(摩尔％)示于表10中。此外，使用三种250mM硫酸铵水溶液，pH6.5。将上述四种溶液中的每一种取两毫升加载至20mL注射器中。每个注射器通过管道连接到五口歧管的入口。经管道，通过注射泵将注射器中的溶液泵入歧管的混合室。将通过出口排出的脂质体溶液收集在玻璃小瓶中。通过透析将缓冲液变成组氨酸/蔗糖缓冲液(10mM组氨酸，9.2％蔗糖，pH6.5)。然后将制剂通过0.22μm过滤器过滤灭菌。通过动态光散射(Malvern ZetasizerNano ZS)测定的CPT308B的Z-平均粒径为34.7nm。
表10.实施例10的脂质组成。
组成 CPT308B％(摩尔)*
大豆PC 57.0
胆固醇 38.1
mPEG2000-DSPE 4.9
DOCE 10.9
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例11：制备脂质体制剂CPT309B
为了进一步提高含有大豆PC的脂质体的DOCE包封能力，增加CPT309B中大豆PC的摩尔比，同时降低胆固醇的摩尔比。为了制备CPT309B，通过将30mg的Soy PC、4mg胆固醇、10mg的mPEG2000-DSPE和6mg的DOCE溶解在2mL无水乙醇中来制备两毫升的脂质/DOCE溶液。脂质制剂CPT309B脂质溶液的组成(摩尔％)示于表11中。此外，使用三种250mM硫酸铵(pH6.5)的水溶液。将上述四种溶液中的每一种取两毫升加载至20mL注射器中。每个注射器通过管道连接到五口歧管的入口。经管道，通过注射泵将注射器中的溶液泵入歧管的混合室。将通过出口排出的脂质体溶液收集在玻璃小瓶中。通过透析将缓冲液更换为组氨酸/蔗糖缓冲液(10mM组氨酸，9.2％蔗糖，pH6.5)。然后将该制剂通过0.22μm过滤器过滤灭菌。通过动态光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS)测定的CPT309B的Z平均粒径为35.0nm。
表11.实施例11的脂质组成。
组分 CPT309B％(摩尔)
大豆PC 73.9
胆固醇 19.7
mPEG2000-DSPE 6.4
DOCE 14.2
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例12：制备脂质体制剂CPT313B
在CPT313B中，胆固醇完全被DC-胆固醇代替。为了制备CPT313B，通过将33mg的大豆PC、20.5mg的DC-胆固醇、11mg的mPEG2000-DSPE和4.4mg的DOCE溶解在2.2mL的无水乙醇中来制备脂质/DOCE溶液。CPT313B的组成(摩尔％)示于表12中。此外，使用三种250mM硫酸铵的水溶液，pH6.5。将上述四种溶液中的每一种取两毫升装入20mL注射器中。每个注射器通过管道连接到五口歧管的入口。经管道，通过注射泵将注射器中的溶液泵入歧管的混合室。将通过出口排出的脂质体溶液收集在玻璃小瓶中。通过透析将缓冲液更换为组氨酸/蔗糖缓冲液(10mM组氨酸，9.2％蔗糖，pH6.5)。然后将制剂通过0.22μm过滤器过滤灭菌。通过动态光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS)测定的CPT313B的Z-平均粒径为37.4nm。
表12.实施例12的脂质组成。
组分 CPT313B％(摩尔)*
大豆PC 50.4
mPEG2000-DSPE 4.4
DC-胆固醇 45.2
DOCE 6.5
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例13：制备脂质体制剂CPT323B
CPT323C包含DOPC、胆固醇、DC-胆固醇，但不存在聚乙二醇化脂质，表明聚乙二醇化脂质对制剂来说是可选的。为了制备CPT323B，通过将300mg DOPC、50mg胆固醇、70mg DC-胆固醇和25mg DOCE溶于10mL无水乙醇中制备脂质/DOCE溶液。CPT323B的组成(摩尔％)示于表13中。此外，使用三种250mM硫酸铵水溶液，pH6.5。将上述四种溶液各取10毫升装入20mL注射器中。每个注射器通过管道连接到五口歧管的入口。经管道，通过注射泵将注射器中的溶液泵入歧管的混合室。将通过出口排出的脂质体溶液收集在玻璃瓶中，然后通过切向流过滤浓缩。通过透析将缓冲液更换为组氨酸/蔗糖缓冲液(10mM组氨酸，9.2％蔗糖，pH6.5)。然后将制剂通过0.22μm过滤器过滤灭菌。通过CPT323B的动态光散射(MalvernZetasizer Nano ZS)测定的Z-平均粒径为47.5nm。
表13.实施例13的脂质体组成
组分 CPT323B％(摩尔)*
DOPC 59.5
胆固醇 20.1
DC-胆固醇 20.3
DOCE 4.8
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例14：制备脂质体制剂CPT324B
与其他示例性制剂不同，CPT324B含有多不饱和脂质大豆PC，从而具有较高的DOCE容量，还含有除DC-胆固醇外的阳离子脂质DOTAP。为了制备CPT324B，通过将60mg大豆PC、40mg胆固醇、60mg 1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(氯化物盐)(DOTAP)、40mg的mPEG2000-DSPE和25mgDOCE溶于10mL无水乙醇中而制备脂质/DOCE溶液。CPT324B的组成(摩尔％)示于表14中。此外，使用三种250mM硫酸铵水溶液，pH6.5。将上述四种溶液各取10毫升装入20mL注射器中。每个注射器通过管道连接到五口歧管的入口。经管道，通过注射泵将注射器中的溶液泵入歧管的混合室。将通过出口排出的脂质体溶液收集在玻璃瓶中，然后通过切向流过滤浓缩。通过透析将缓冲液更换为组氨酸/蔗糖缓冲液(10mM组氨酸，9.2％蔗糖，pH6.5)。然后将制剂通过0.22μm过滤器过滤灭菌。通过动态光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS)测定的CPT324B的Z-平均粒径为39.0nm。
表14.实施例14的脂质组成。
组分 CPT324B％(摩尔)*
大豆PC 27.6
胆固醇 36.9
mPEG2000-DSPE 4.8
DOTAP 30.7
DOCE 11.0
*该值表示每种组分相对于总脂质的摩尔％。
实施例15：组合脂质体CPT319AB增强了对非小细胞肺癌(NSCLC)的疗效
对6-8周龄的雌性Balb/c裸鼠的右肋皮下接种0.1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的NSCLC细胞系A549肿瘤细胞(1×107个细胞/小鼠)以用于肿瘤发育。在肿瘤细胞接种后第16天(肿瘤大小约117mm3)，用以下制剂通过经由尾静脉的静脉内(IV)注射开始治疗：具有5mg/kg多柔比星的CPT319A、具有7.5mg/kg多西紫杉醇的CPT319B、具有5mg/kg多柔比星/7.5mg/kg多西紫杉醇的CPT319AB、或具有5mg/kg多柔比星/7.5mg/kg多西紫杉醇的非脂质体组合制剂。在第20天、第27天和第34天进行三次额外的治疗。该研究在第45天终止。与PBS对照组相比，制剂在第45天的肿瘤生长曲线和肿瘤重量抑制百分比(TW Inh％)示于图7中。所有脂质体制剂都比DOCE/DXR的非脂质体组合更有效。此外，在本实施例中，组合脂质体CPT319AB是最有效的。与PBS对照组相比，组合脂质体制剂CPT319AB使肿瘤重量降低了81％，显著高于DOCE脂质体CPT319B的51％、DXR脂质体CPT319A的27％以及DOCE/DXR的非脂质体组合物的17％。
实施例16：组合脂质体CPT307AB增强了对NSCLC的疗效
对6-8周龄的雌性Balb/c裸鼠的右肋皮下接种0.1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的NSCLC细胞系A549肿瘤细胞(1×107个细胞/小鼠)以用于肿瘤发育。在肿瘤细胞接种后第16天(肿瘤大小约117mm3)，用以下制剂通过经由尾静脉的静脉内(IV)注射开始治疗：具有5mg/kg多柔比星的CPT307A、具有7.5mg/kg多西紫杉醇的CPT307B、具有5mg/kg多柔比星/7.5mg/kg多西紫杉醇的CPT307AB、或具有5mg/kg多柔比星/7.5mg/kg多西紫杉醇的非脂质体组合制剂。在第20天、第27天和第34天进行三次额外的治疗。该研究在第45天终止。与PBS对照组相比，制剂在第45天的肿瘤生长曲线和肿瘤重量抑制百分比(TW Inh％)示于图8中。所有脂质体制剂都比DOCE/DXR的非脂质体组合更有效。此外，在本实施例中，组合脂质体CPT307AB是最有效的。与PBS对照组相比，组合脂质体制剂CPT307AB使肿瘤重量降低了72％，显著高于DOCE脂质体CPT307B的44％、DXR脂质体CPT307A的11％以及DOCE/DXR的非脂质体组合物的17％。
实施例17：异种移植小鼠模型中组合脂质体CPT319AB对人结肠癌的抗肿瘤活性
对6-8周龄的雌性Balb/c裸鼠的右肋皮下接种0.1mL PBS缓冲液中的人结肠癌细胞系HCT-116肿瘤细胞(5×106个细胞/小鼠)以用于肿瘤发育。在肿瘤细胞接种后第9天(肿瘤大小约141mm3)，用具有3种不同剂量的CPT319AB制剂通过经由尾静脉的静脉内(IV)注射开始治疗：5mg/kg多柔比星/7.5mg/kg多西紫杉醇、2.5mg/kg多柔比星/3.75mg/kg多西紫杉醇或1.25mg/kg多柔比星/1.875mg/kg多西紫杉醇。在第16天和第23天进行两次额外的治疗。该研究在第37天终止。图9中所示的肿瘤生长曲线示出了HCT-116肿瘤细胞对脂质体制剂的剂量反应(与载体对照相比)。与载体对照相比，治疗组中的肿瘤重量分别被抑制了59％、52％和29％(剂量从高到低)。
实施例18：异种移植小鼠模型中组合脂质体CPT307AB对人结肠癌的抗肿瘤活性
对6-8周龄的雌性Balb/c裸鼠的右肋皮下接种0.1mL PBS缓冲液中的人结肠癌细胞系HCT-116肿瘤细胞(5×106个细胞/小鼠)以用于肿瘤发育。在肿瘤细胞接种后第9天(肿瘤大小约141mm3)，用具有3种不同剂量的CPT307AB制剂通过经由尾静脉的静脉内(IV)注射开始治疗：5mg/kg多柔比星/7.5mg/kg多西紫杉醇、2.5mg/kg多柔比星/3.75mg/kg多西紫杉醇或1.25mg/kg多柔比星/1.875mg/kg多西紫杉醇。在第16天和第23天进行两次额外的治疗。该研究在第37天终止。图10中所示的肿瘤生长曲线示出了HCT-116肿瘤细胞对脂质体制剂的剂量反应(与载体对照相比)。与载体对照相比，治疗组中的肿瘤重量分别被抑制了64％、52％和45％(剂量从高到低)。
实施例19：异种移植小鼠模型中组合脂质体CPT319AB对人原发性肝细胞癌的抗肿瘤活性
对6-8周龄的雌性SCID Beige小鼠的右肋皮下接种人原发性肝细胞癌肿瘤(P3 WPHCC)的碎片以用于肿瘤发育。在肿瘤细胞接种后第32天(肿瘤大小约143mm3)，用5mg/kg多柔比星/7.5mg/kg多西紫杉醇的CPT319AB制剂通过经由尾静脉的静脉内(IV)注射开始治疗。在第39天和第46天进行两次额外的治疗。该研究在第63天终止。图11中示出了肿瘤生长曲线。与载体对照相比，CPT319AB使肿瘤重量降低了68％。
实施例20：阳离子脂质DC-胆固醇增强了脂质体对NSCLC的抗肿瘤活性
对6-8周龄的雌性Balb/c裸鼠的右肋皮下接种0.1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的NSCLC细胞系A549肿瘤细胞(1×107个细胞/小鼠)以用于肿瘤发育。在肿瘤细胞接种后第16天(肿瘤大小约117mm3)，用以下制剂通过经由尾静脉的静脉内(IV)注射开始治疗：具有5mg/kg多柔比星的CPT307A或CPT319A、具有7.5mg/kg多西紫杉醇的CPT307B或CPT319B、具有5mg/kg多柔比星/7.5mg/kg多西紫杉醇的CPT307AB或CPT319AB、或具有5mg/kg多柔比星/7.5mg/kg多西紫杉醇的非脂质体组合制剂。在第20天、第27天和第34天进行三次额外的治疗。该研究在第45天终止。表15中示出了CPT307(无DC-胆固醇)和CPT319(有DC-胆固醇)制剂的脂质组成。图12中示出了肿瘤生长曲线。在表16中示出了在第45天的肿瘤生长抑制％。
肿瘤抑制的排序(由高到低)为：CPT319AB>CPT307AB>CPT319B>CPT307B>CPT319A>CPT307A>PBS。对于每种情况，CPT319(有DC-胆固醇)都比CPT307(无DC-胆固醇)更有效。这表明CPT319中的阳离子脂质DC-胆固醇增强了脂质体制剂的抗肿瘤活性。
表15.实施例20的脂质组成。
表16.实施例20在第45天的肿瘤重量抑制％
制剂 A B AB
CPT319 27％ 51％ 81％
CPT307 11％ 44％ 72％
实施例21：阳离子脂质DC-胆固醇增加了DXR的半衰期(t1/2)
将20-25g体重的雄性CD-1小鼠分成三组。通过静脉注射(IV)经由尾静脉，对每只小鼠给予单次剂量的5mg/kg DXR的CPT319A或CPT307A。使用DXR的非脂质体组合作为对照。在注射后0.167、1、3、8、24和48小时收集血样。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)测定DXR血浆浓度。DXR的血浆浓度曲线如图13所示，t1/2和血浆浓度时间曲线下面积(AUC)见表17。*BLOQ：低于量化下限。非脂质体DXR被从血液中快速清除，导致非常低的AUC(688 h x ng/mL)，而CPT319A和CPT307A分别将AUC提高了84和354倍。此外，与CPT307A的1h的t1/2相比，CPT319A显示出5.5h的t1/2，表明CPT319A中的阳离子脂质DC-胆固醇通过增加血液中的循环时间来改善制剂的PK。与注射后前3小时的CPT307A血药浓度相比，CPT319A的血药浓度快速下降，表明CPT319A的阳离子电荷使得其可以被更快地分配给其他器官，如肝脏。
表17.实施例21的t1/2和AUC值。
制剂 t1/2(h) AUC(h x ng/mL)
CPT319A 5.5 57453
CPT307A 1.0 243243
纯DXR 688
实施例22：通过改变脂质体中的阳离子脂质DC-胆固醇组成而设计的脂质体肝脏递送
为了研究阳离子脂质DC-胆固醇对脂质体DXR的体内分布的影响，使用以下三种脂质体制剂进行PK研究：1)不含DC-胆固醇的(FDA批准的脂质体DXR)；2)含有15.3％DC-胆固醇的CPT319A；和3)含有38.3％DC-胆固醇的CPT221。三种制剂的脂质组成如表18所示。
将20-25g体重的雄性CD-1小鼠分成三组。通过静脉注射(IV)经由尾静脉，对每只小鼠给予单次剂量的5mg/kg DXR的或CPT319A或CPT221。在预定时间处死小鼠并收集其肝脏。对于使用和CPT221治疗的组，在注射后0.167、0.5、1、2、4和8小时收集肝脏。对于用CPT319A治疗的组，在注射后0.167、1、3和8小时收集肝脏。使用LC-MS-MS测定肝脏中DXR的量，并计算肝脏中的DXR在所施用的DXR的总量中的百分比。DXR的肝脏浓度曲线如图14所示。
中的胆固醇在CPT221中完全被DC-胆固醇替代，导致DXR在肝脏中急剧且迅速地积累。例如，注射后10分钟，CPT221中约54％的DXR在肝脏中积累。CPT319A中DC-胆固醇对胆固醇的部分取代对应于DXR在肝脏中21％的积累，而在肝脏中积累了仅9.4％的DXR。因此，可以通过控制脂质体中的阳离子脂质的摩尔比来实现可设计的肝靶向递送。
表18.实施例22的脂质体组成。
*该值表示DXR相对于总脂质的摩尔％。

Claims (20)

1.药物组合物，包含两种类型的脂质体：
(i)第一类型脂质体，其包含：
第一脂质层，其包含不饱和磷脂、胆固醇和任选地聚乙二醇化磷脂，和
第一脂质层中的第一活性药物成分(API)，其包含多西紫杉醇；和
(ii)第二类型脂质体，其包含：
第二脂质层，内部水性部分，和
在内部水性部分中结晶的第二API，其包含多柔比星，
其中所述第一类型脂质体不包含多柔比星且所述第二类型脂质体不包含多西紫杉醇。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述第一脂质层、所述第二脂质层或第一和第二脂质层两者基本上由不饱和磷脂和胆固醇组成。
3.权利要求1的药物组合物，其中所述第一脂质层、所述第二脂质层或第一和第二脂质层两者基本上由不饱和磷脂、胆固醇和聚乙二醇化磷脂组成。
4.权利要求1-3中任一项的药物组合物，其中多西紫杉醇为所述第一类型脂质体中唯一的API，和/或多柔比星为所述第二类型脂质体中唯一的API。
5.权利要求1-4中任一项的药物组合物，其中所述第一脂质层、所述第二脂质层或第一和第二脂质层两者包含：
约20-75％、优选约30-60％(摩尔)的不饱和磷脂；
约10-60％、优选20-50％(摩尔)的胆固醇；和
约0-20％、优选1-10％(摩尔)的聚乙二醇化磷脂。
6.权利要求1-5中任一项的药物组合物，其中：
第一脂质层组分:多西紫杉醇的摩尔比为约100:1至约5:1，优选约20:1至约5:1；和
第二脂质层组分:多柔比星的摩尔比为约100:1至约5:1,优选约20:1至约5:1。
7.权利要求1-6中任一项的药物组合物，其中多柔比星:多西紫杉醇的摩尔比为约10:1至1:10，优选约5:1至1:5，且更优选约2:1至1:2。
8.权利要求1-7中任一项的药物组合物，其中所述不饱和磷脂包括多不饱和磷脂或单不饱和磷脂，优选磷脂酰胆碱，且更优选大豆卵磷脂或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)。
9.权利要求1-8中任一项的药物组合物，其中所述胆固醇包含胆固醇衍生物，优选阳离子胆固醇衍生物，更优选氨基胆固醇衍生物，且还更优选二甲基氨基乙烷氨基甲酰基-胆固醇(DC-胆固醇)、阳离子脂质或阳离子聚合物。
10.权利要求9的药物组合物，其中调整所述组合物以靶向受试者中一个或多个器官。
11.权利要求1-10中任一项的药物组合物，其中所述聚乙二醇化磷脂包含磷脂酰乙醇胺，优选1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)，且其中聚乙二醇化为PEG 500至PEG 3000，优选PEG 2000。
12.药物组合物，其由以下组成：
多个权利要求1-11中任一项中所述的第一类型脂质体；
多个权利要求1-11中任一项中所述的第二类型脂质体；和
一种或多种药物赋形剂。
13.权利要求1-12中任一项的药物组合物，其被配制为用于静脉内给药。
14.权利要求1-13中任一项的药物组合物，其中所述脂质体的Z-平均粒径为约10-200nm，优选约15-150nm，且更优选约20-120nm。
15.权利要求1-14中任一项的药物组合物，其中，在向受试者静脉内给药后，至少约10％的组合物被递送至肝脏。
16.权利要求1-15中任一项的药物组合物，其被用作药物。
17.权利要求1-16中任一项的药物组合物，其被用作癌症治疗剂。
18.一种治疗受试者的方法，包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-17中任一项的药物组合物，其中所述受试者患有癌症。
19.权利要求18的方法，其中所述癌症是肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)；结肠癌；乳腺癌；胃癌；食管癌；前列腺癌；白血病；头颈癌；胰腺癌；多发性骨髓瘤；或肝癌，优选肝细胞癌(HCC)。
20.一种制备权利要求1-17中任一项的药物组合物的方法，包括：
(i)通过第一入口或更多入口向多口歧管的混合室引入乙醇中的不饱和磷脂、固醇、多西紫杉醇以及优选聚乙二醇化磷脂的第一脂质溶液和同时通过第二入口或更多入口向多口歧管的混合室引入第一水溶液来制备第一类型脂质体，且所述脂质体通过多口歧管的一个或多个出口离开混合室，
其中所得到的第一类型脂质体不包含多柔比星；
(ii)通过第一入口或更多入口将第二脂质溶液引入到多口歧管的混合室中和同时通过第二入口或更多入口将第一水溶液引入到多口歧管的混合室中来制备第二类型脂质体，并且所述脂质体通过一个或更多出口离开多口歧管的混合室；并且将所得脂质体与多柔比星一起温育，
其中所得的第二类型脂质体不包含多西紫杉醇；且
(iii)组合预定量的第一类型脂质体和第二类型脂质体，从而制备权利要求1-17中任一项的药物组合物。
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