CN114831940B - 一种负载抗癌药物的载药体系及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米药剂技术领域，公开了一种负载抗癌药物的载药体系及其制备方法与应用。制备方法包括：将1,2‑二油酰甘油‑3‑磷酸乙醇胺、胆固醇、1,2‑二肉豆蔻酰‑sn‑甘油‑3‑甲氧基聚乙二醇、1，2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸酯或1，2‑二油酰基‑3‑(二甲氨基)丙烷和抗癌药物一起溶于二氯甲烷中，旋转蒸发得到的一层磷脂薄膜用三蒸水水化，超声后透析，得负载抗癌药物的脂质体溶液。本发明载药体系具有由磷脂双分子层构成的亲脂性外壳，内部为水核，可包裹疏水性或亲水性药物；电位随着第四种磷脂摩尔百分比的改变而改变；可延长药物在体内的血液循环时间，提高药物的生物利用度；在体内主要分布在肝脏和脾脏。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药剂技术领域，具体涉及一种负载抗癌药物的载药体系及其制备方法与应用。
背景技术
据统计，近几年神经退行性疾病、癌症、心血管疾病等相关疾病发病率正在大幅度增加，且癌症已成为全球第二大死亡原因，这对人类生命构成了巨大的威胁。到目前为止，癌症的治疗方法很多，常规临床治疗包括手术切除、药物治疗、放射治疗等，利用化学药物去干预或者治疗肿瘤疾病是比较常用的手段之一。单一药物治疗指数很窄，需要多次给药，常导致器官对药物不耐受，因此人们专注于开发纳米载体制剂。纳米载体是一种纳米级输送系统，它的应用极为广泛，在人类疾病的多模式成像、药物传递和靶向治疗等纳米医学领域发挥着关键作用。与游离药物分子相对比，纳米载体可以改善各种类型药物的溶解性、降低药物的毒副作用、提高治疗效果的同时降低给药次数等。根据纳米载体材料的不同，可分为聚合物纳米载体、脂质纳米载体、金属和无机纳米载体。这些不同类型的纳米载体目前都已经被广泛用于研究药物的传递。
在药物输送系统中，脂质体的结构是一个极性头部基团面向内、外水相的球形囊泡，直径通常小于1000nm。此外，双层可以在温度升高时从有序状态切换到无序状态。发生这种变化的相变温度(Tm)取决于脂类的分子结构，从而改变脂质体的通透性，影响药物的释放。另外脂质体因其优良的生物相容性和生物降解性、制备方法简单以及能够同时包裹亲水性和亲脂性分子被认为是应用最广泛的纳米粒子之一，这也使其具有了独特的特性。目前脂质体制剂仍是药物新剂型研究的主要方向，通常可以将脂质体分为两类：靶向脂质体和非靶向脂质体。靶向脂质体多数是通过多种配体(如抗体、适配体、蛋白质和肽等)进行表面修饰来实现组织器官的主动蓄积，而非靶向脂质体则主要通过增强渗透和滞留效应(EPR)使得其在大多数肿瘤组织中被动蓄积。很多文献中都表明脂质体制剂已可以被广泛用于提高药效、降低包埋药物的毒性和提高肿瘤部位特异性。
发明内容
本发明目的在于提供一种负载抗癌药物的载药体系及其制备方法与应用。制备的载药体系具有由磷脂双分子层构成的亲脂性外壳，内部为水核，可包裹疏水性或亲水性药物；电位随着第四种磷脂摩尔百分比的改变而改变；可延长药物在体内的血液循环时间，提高药物的生物利用度；在体内主要分布在肝脏和脾脏。可应用于相关疾病中的治疗。
为解决以上问题，本发明提供了一种负载抗癌药物的载药体系的制备方法，包括以下步骤：
1)将1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺、胆固醇、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇、抗癌药物溶于二氯甲烷中，并加入第四种磷脂，混合均匀，旋转蒸发除去有机溶剂，得到一层磷脂薄膜；所述第四种磷脂为1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯或1，2-二油酰基-3-(二甲氨基)丙烷；
2)将所述磷脂薄膜用三蒸水水化，超声5min，接着将溶液转移至透析袋中，搅拌条件下纯水透析12h以除去未包裹的抗癌药物，得负载抗癌药物的脂质体溶液。
进一步的，步骤1)中所述1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺与胆固醇、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇、第四种磷脂的摩尔比为69：40：4：X，X为0、12.6或48.4。
进一步的，步骤1)中所述抗癌药物与四种磷脂总量的质量比为1：4，所述四种磷脂为1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺、胆固醇、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇和第四种磷脂；
进一步的，所述抗癌药物为阿霉素或多西他赛。
进一步的，步骤2)中所述磷脂薄膜与所述三蒸水的质量体积比为3.84mg：4mL。
进一步的，步骤2)中所述透析袋的截留分子量为14000。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的负载抗癌药物的载药体系。
进一步的，所述负载抗癌药物的载药体系的水合粒径为90-160nm。
本发明还提供了一种上述的负载抗癌药物的载药体系在制备靶向肝脾抗癌药物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、本发明的载药体系通过固定组分中三种脂质的摩尔比，改变加入第四种磷脂的种类以及摩尔比，可以改变粒子表面电荷的带电情况和电荷大小，从而提高载药体系在体内的被动靶向能力。
2、本发明的载药体系可以防止粒子间聚集，减少粒子在体内与血浆蛋白结合，延长药物的血液循环时间，提高药物的生物利用度。
3、本发明的载药体系可以增加药物在体内的生物分布，靶向肝脏和脾脏。
4、本发明的载药体系生物相容性高于其他纳米载体，具有生物降解性、低毒性。此外其制备简单方便，表面易于修饰，可以快速大规模生产。
附图说明
图1为实施例1-1提供的空载中性脂质体(0％Liposomess)、实施例1-2提供的空载的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体(10％DOPA/DODAP Liposomes)、实施例1-3提供的空载的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体(30％DOPA/DODAP Liposomes)、实施例2-1和实施例3-1提供的负载抗癌药物的中性脂质体(0％Liposomes-DOX、0％Liposomes-DTX)、实施例2-2和实施例3-2提供的负载抗癌药物的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体(10％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、10％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)、实施例2-3和实施例3-3提供的负载抗癌药物的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体(30％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、30％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)、对比例1-1提供的空载的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体(50％DOPA/DODAP Liposomes)、对比例1-2和对比例1-3提供的负载抗癌药物的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体(50％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、50％DOPA/DODAPLiposomes-DTX)的水合粒径统计图；图1中，A图为改变1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)摩尔百分比后测得的空载Liposomes和负载抗癌药物的Liposomes的水合粒径，B图为改变1，2-二油酰基-3-(二甲氨基)丙烷(DODAP)摩尔百分比后测得的空载Liposomes和负载抗癌药物的Liposomes的水合粒径。
图2为实施例1-1提供的空载中性脂质体(0％Liposomes)、实施例1-2提供的空载的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体(10％DOPA/DODAP Liposomes)、实施例1-3提供的空载的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体(30％DOPA/DODAP Liposomes)、实施例2-1和实施例3-1提供的负载抗癌药物的中性脂质体(0％Liposomes-DOX、0％Liposomes-DTX)、实施例2-2和实施例3-2提供的负载抗癌药物的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体(10％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、10％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)、实施例2-3和实施例3-3提供的负载抗癌药物的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体(30％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、30％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)、对比例1-1提供的空载的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体(50％DOPA/DODAP Liposomes)、对比例1-2和对比例1-3提供的负载抗癌药物的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体(50％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、50％DOPA/DODAPLiposomes-DTX)的电位变化统计图；图1中，A图为改变1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)摩尔百分比后测得的空载Liposomes和负载抗癌药物的Liposomes的电位值，B图为改变1，2-二油酰基-3-(二甲氨基)丙烷(DODAP)摩尔百分比后测得的空载Liposomes和负载抗癌药物的Liposomes的电位值。
图3为实施例2-1和实施例3-1提供的负载抗癌药物的中性脂质体(0％Liposomes-DOX、0％Liposomes-DTX)、实施例2-2和实施例3-2提供的负载抗癌药物的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体(10％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、10％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)、实施例2-3和实施例3-3提供的负载抗癌药物的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体(30％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、30％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)、对比例1-2和对比例1-3提供的负载抗癌药物的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体(50％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、50％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)的包封率统计图；图3中，A图为负载阿霉素(DOX)的不同摩尔百分比的Liposomes的包封率，B图负载多西他赛(DTX)的不同摩尔百分比的Liposomes的包封率。
图4为实施例1-1提供的空载的中性脂质体(0％Liposomes)的透射电镜图。
图5为多西他赛、实施例3-1提供的负载多西他赛的中性脂质体(0％Liposomes-DTX)、对比例1-3提供的负载多西他赛的50％阴离子和阳离子脂质体(50％DOPA/DODAPLiposomes-DTX)在常氧条件下的多西他赛释放曲线；
图6为多西他赛、实施例3-1提供的负载多西他赛的中性脂质体(0％Liposomes-DTX)、实施例3-2提供的负载多西他赛的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体(10％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)、实施例3-3提供的负载多西他赛的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体(30％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)、对比例1-3提供的负载多西他赛的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体(50％DOPA/DODAPLiposomes-DTX)在体内主要器官的分布结果；图6中，A图为负载多西他赛的不同摩尔百分比DOPALiposomes在给药6h后在取出心肝脾肺肾后所测的每克组织的药物量占注射总药物的百分比；B图为负载多西他赛的不同摩尔百分比DODAP Liposomes在给药6h后在取出心肝脾肺肾后所测的每克组织的药物量占注射总药物的百分比。
图7为多西他赛、实施例3-1提供的负载多西他赛的中性脂质体(0％Liposomes-DTX)、对比例1-3提供的负载多西他赛的50％阴离子和阳离子脂质体(50％DOPA/DODAPLiposomes-DTX)在不同时间点测量的小鼠血液中的药物浓度。
图8为本发明制备的一种负载抗癌药物的载药体系的结构示意图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行具体描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
实施例1-1
空载的中性脂质体的制备：
将2.57mg(69当量)1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、0.77mg(40当量)胆固醇(CHOL)、0.5mg(4当量)1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)溶于二氯甲烷；加入用二氯甲烷溶解的0mg(0当量)1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA，两者混合均匀，旋转蒸发5min除去有机试剂，得到一层磷脂薄膜；将得到的磷脂薄膜与4ml三蒸水水化，超声5min，将溶液转移至透析袋(MW＝14000),搅拌条件下纯水透析12h，得空载的中性脂质体溶液(0％Liposomes)。
测试得到空载的脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该脂质体电位近中性，说明空载脂质体构建成功。
将空载的中性脂质体在铜网上，滤纸吸去多余的液体，用1％磷钨酸溶液染色，染色1～2min后继续用清水滴洗3次，用滤纸吸去多余液体，晾干后用透射电镜(TEM,JEM-1230,Japan)观察形态，空载的中性脂质体溶液(0％Liposomes)透射电镜图如图4所示。
实施例1-2
空载的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体的制备：
(1)将2.22mg(69当量)1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、0.67mg(40当量)胆固醇(CHOL)、0.43mg(4当量)1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)溶于二氯甲烷；加入用二氯甲烷溶解的0.52mg(12.6当量)1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)，其余步骤同实施例1-1(透射观察除外)，得空载的阴离子脂质体溶液(10％DOPALiposomes)。
(2)将2.32mg(69当量)1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、0.7mg(40当量)胆固醇(CHOL)、0.451mg(4当量)1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)溶于二氯甲烷；加入用二氯甲烷溶解的0.369mg(12.6当量)1，2-二油酰基-3-(二甲氨基)丙烷(DODAP)，其余步骤同实施例1-1(透射观察除外)，得空载的阳离子脂质体溶液(10％DODAPLiposomes)。
测试得到空载的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该10％阴离子脂质体和阳离子脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该10％阴离子脂质体电位带负电荷，10％阳离子脂质体电位带正电荷，说明空载的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体构建成功。
实施例1-3
空载的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体的制备：
(1)将2.22mg(69当量)1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、0.67mg(40当量)胆固醇(CHOL)、0.43mg(4当量)1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)溶于二氯甲烷；加入用二氯甲烷溶解的0.52mg(12.6当量)1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)，其余步骤同实施例1-1(透射观察除外)，得空载的阴离子脂质体溶液(10％DOPALiposomes)。
(2)将2.32mg(69当量)1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、0.7mg(40当量)胆固醇(CHOL)、0.451mg(4当量)1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)溶于二氯甲烷；加入用二氯甲烷溶解的0.369mg(12.6当量)1，2-二油酰基-3-(二甲氨基)丙烷(DODAP)，其余步骤同实施例1-1(透射观察除外)，得空载的阳离子脂质体溶液(10％DODAPLiposomes)。
测试得到空载的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该30％阴离子脂质体和阳离子脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该30％阴离子脂质体电位带负电荷，30％阳离子脂质体电位带正电荷，说明空载的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体构建成功。
实施例2-1
负载阿霉素的中性脂质体的制备：
在实施例1-1中加入0.96mg阿霉素(DOX)，其余步骤同实施例1-1。透析后得到负载阿霉素的中性脂质体(0％Liposomes-DOX)。
测试得到负载阿霉素的中性脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该负载阿霉素的中性脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该负载阿霉素的中性脂质体电位为中性，说明负载阿霉素的中性脂质体构建成功。
实施例2-2
负载阿霉素的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体的制备：
在实施例1-2中步骤(1)、(2)分别加入0.96mg阿霉素(DOX)，其余步骤同实施例1-2。透析后得到负载阿霉素的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体(10％DOPA Liposomes-DOX、10％DODAP Liposomes-DOX)。
测试得到负载阿霉素的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该负载阿霉素的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该负载阿霉素的10％阴离子脂质体电位带负电荷，负载阿霉素的10％阳离子脂质体电位带正电荷，说明负载阿霉素的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体构建成功。
实施例2-3
负载阿霉素的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体的制备：
在实施例1-3中步骤(1)、(2)分别加入0.96mg阿霉素(DOX)，其余步骤同实施例1-3。透析后得到负载阿霉素的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体(30％DOPA Liposomes-DOX、30％DODAP Liposomes-DOX)。
测试得到负载阿霉素的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该负载阿霉素的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该负载阿霉素的30％阴离子脂质体电位带负电荷，负载阿霉素的30％阳离子脂质体电位带正电荷，说明负载阿霉素的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体构建成功。
实施例3-1
负载多西他赛的中性脂质体的制备：
在实施例1-1中加入0.96mg多西他赛(DTX)，其余步骤同实施例1-1。透析后得到负载多西他赛的中性脂质体(0％Liposomes-DTX)。
本实施例中负载多西他赛的中性脂质体的结构示意图如图8所示，由图8可知，该中性脂质体具有磷脂双分子层构成的亲脂性外壳，内部为水核，多西他赛被包裹在磷脂双分子层之间。
测试得到负载多西他赛的中性脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该负载多西他赛的中性脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该负载多西他赛的中性脂质体电位为中性，说明负载多西他赛的中性脂质体构建成功。
实施例3-2
负载多西他赛的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体的制备：
在实施例1-2中步骤(1)、(2)分别加入0.96mg多西他赛(DTX)，其余步骤同实施例1-2。透析后得到负载多西他赛的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体(10％DOPALiposomes-DTX、10％DODAP Liposomes-DTX)。
测试得到负载多西他赛的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该负载多西他赛的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该负载多西他赛的10％阴离子脂质体电位带负电荷，负载多西他赛的10％阳离子脂质体电位带正电荷，说明负载多西他赛的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体构建成功。
实施例3-3
负载多西他赛的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体的制备：
在实施例1-3中步骤(1)、(2)分别加入0.96mg多西他赛(DTX)，其余步骤同实施例1-3。透析后得到负载多西他赛的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体(30％DOPALiposomes-DTX、30％DODAP Liposomes-DTX)。
测试得到负载多西他赛的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该负载多西他赛的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该负载多西他赛的30％阴离子脂质体电位带负电荷，负载多西他赛的30％阳离子脂质体电位带正电荷，说明负载多西他赛的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体构建成功。
对比例1-1
空载50％阴离子脂质体和阳离子脂质体的制备：
(1)将1.07mg(69当量)1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、0.32mg(40当量)胆固醇(CHOL)、0.21mg(4当量)1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)溶于二氯甲烷；加入用二氯甲烷溶解的2.24mg(113当量)1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)，其余步骤同实施例1-1(透射观察除外)，得空载的阴离子脂质体溶液(50％DOPALiposomes)。
(2)将1.31mg(69当量)1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、0.39mg(40当量)胆固醇(CHOL)、0.26mg(4当量)1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)溶于二氯甲烷；加入用二氯甲烷溶解的1.88mg(48.4当量)1，2-二油酰基-3-(二甲氨基)丙烷(DODAP)，其余步骤同实施例1-1(透射观察除外)，得空载的阳离子脂质体溶液(50％DODAPLiposomes)。
测试得到空载的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该50％阴离子脂质体和阳离子脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该50％阴离子脂质体电位带负电荷，50％阳离子脂质体电位带正电荷，说明空载的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体构建成功。
对比例1-2
负载阿霉素的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体的制备：
在对比例1-1中步骤(1)、(2)分别加入0.96mg阿霉素(DOX)，其余步骤同对比例1-1。透析后得到负载阿霉素的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体(50％DOPA Liposomes-DOX、50％DODAP Liposomes-DOX)。
测试得到负载阿霉素的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该负载阿霉素的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该负载阿霉素的50％阴离子脂质体电位带负电荷，负载阿霉素的50％阳离子脂质体电位带正电荷，说明负载阿霉素的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体构建成功。
对比例1-3
负载多西他赛的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体的制备：
在对比例1-1中步骤(1)、(2)分别加入0.96mg多西他赛(DTX)，其余步骤同对比例1-1。透析后得到负载多西他赛的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体(50％DOPALiposomes-DTX、50％DODAP Liposomes-DTX)。
测试得到负载多西他赛的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体溶液的粒径，结果如图1所示，该负载多西他赛的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体的粒径在90-160nm之间；如图2所示，该负载多西他赛的50％阴离子脂质体电位带负电荷，负载多西他赛的50％阳离子脂质体电位带正电荷，说明负载多西他赛的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体构建成功。
实施例4
DTX、0％Liposomes-DTX、50％DOPA Liposomes-DTX在常氧条件下的体外药物释放曲线测定:
利用多西他赛、实施例3-1得到的负载多西他赛的脂质体(0％Liposomes-DTX)、对比例1-3得到的负载多西他赛的50％阴离子脂质体(50％DOPA Liposomes-DTX)，充分混匀后静置，在时间为0h，0.05h，0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，12h和24h时，各取0.2ml的上清液，并且每次取0.2ml的上清液的同时需补充相同体积的新鲜PBS溶液，使得整个体系的体积保持不变。然后将其加入到3ml甲醇溶液，用高效液相色谱仪(HPLC)检测溶液中DTX的含量，从而计算出DTX累积释放的量。
DTX释放曲线图如图5所示，根据图5可以发现，与其余两组相比，0％Liposomes-DTX在同一时间释放出更少的药物，说明了0％Liposomes-DTX可以延长药物的释放时间，降低血药浓度的波动。
实施例5
DTX、负载多西他赛的不同摩尔百分比脂质体在不同器官中的分布：
将ICR小鼠随机分为8组，每组3只，各组分别以5mg/kg体重的剂量尾静脉注射游离多西他赛、实施例3-1得到的负载多西他赛的脂质体(0％Liposomes-DTX)、实施例3-2得到的负载多西他赛的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体(10％DOPA Liposomes-DTX、10％DODAP Liposomes-DTX)、实施例3-3得到的负载多西他赛的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体(30％DOPA Liposomes-DTX、30％DODAP Liposomes-DTX)、对比例1-3得到的负载多西他赛的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体(50％DOPA Liposomes-DTX、50％DODAPLiposomes-DTX)。在给药6h后腹腔注射水合氯醛进行小鼠麻醉，接着生理盐水灌注，分别取出心、肝、脾、肺、肾等组织。对组织称重后利用匀浆机进行匀浆。将匀浆后的组织加入5ml混合液(三氯甲烷：甲醇＝4:1)，粉碎超声10min，8000r/min离心10min，取出下层三氯甲烷溶液旋干后，加入3ml甲醇溶液复溶，8000r/min离心10min，利用HPLC测量上清液中不同组织中的药物含量，每克组织中体组织中药物占注射总药物百分比的统计如图6所示。
根据图6可知，Liposomes主要分布在肝脏和脾脏，并且DOPA或DODAP摩尔比在30％的时候，肝脏和脾脏中显示出最高的药物含量。
实施例6
DTX、0％Liposomes-DTX、50％DOPA Liposomes-DTX药代动力学:
健康的BALB/c小鼠随机分为3组，每组3只，各组分别以5mg/kg体重的剂量尾静脉注射多西他赛(对照组1)、实施例3-1得到的负载多西他赛的中性脂质体(0％Liposomes-DTX)、对比例1-3得到的负载多西他赛的50％阴离子脂质体(50％DOPA Liposomes-DTX，对照组2)。尾静脉给药后第0.05h、0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、24h通过眼眶取血获得1ml血液，4℃静置，3000r/min离心5min，取0.2ml上层血清。将其加入到0.2ml的PBS溶液和3ml三氯甲烷溶液中，涡旋5min，5500r/min离心10min，取出三氯甲烷层液体，旋干三氯甲烷后加入2ml甲醇复溶，8000r/min离心10min，利用HPLC测量上清液中不同组织中的药物含量。
根据图7，测量了ICR小鼠在给药24h内不同时间点血浆中DTX浓度-时间曲线图。与对照组1-2相比，0％Liposomes-DTX在体内的半衰期长，清除速率慢，可以延长药物在体内的血液循环时间，同时提高药物在体内的生物利用度。
荧光分光光度计和HPLC测实施例2-1和实施例3-1提供的负载抗癌药物的中性脂质体(0％Liposomes-DOX、0％Liposomes-DTX)、实施例2-2和实施例3-2提供的负载抗癌药物的10％阴离子脂质体和阳离子脂质体(10％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、10％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)、实施例2-3和实施例3-3提供的负载抗癌药物的30％阴离子脂质体和阳离子脂质体(30％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、30％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)、对比例1-2和对比例1-3提供的负载抗癌药物的50％阴离子脂质体和阳离子脂质体(50％DOPA/DODAP Liposomes-DOX、50％DOPA/DODAP Liposomes-DTX)的包封率，包封率统计图如图3所示。
根据图3可知，负载DTX的脂质体的包封率均高于载DOX的脂质体的包封率，说明包裹DTX的脂质体z在治疗过程中可以减少给药次数，从而减轻组织或细胞对药物的耐药性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种负载抗癌药物的载药体系的制备方法，其特征在于，所述负载抗癌药物的载药体系为负载抗癌药物的脂质体溶液，所述制备方法包括以下步骤：
1）将1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺、胆固醇、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇、抗癌药物溶于二氯甲烷中，并加入第四种磷脂，混合均匀，旋转蒸发除去有机溶剂，得到一层磷脂薄膜；所述第四种磷脂为1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯或1，2-二油酰基-3-（二甲氨基）丙烷；所述1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺与胆固醇、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇、第四种磷脂的摩尔比为69：40：4：X，X为48.4；所述抗癌药物与四种磷脂总量的质量比为1：4，所述四种磷脂为1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺、胆固醇、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇和第四种磷脂；
2）将所述磷脂薄膜用三蒸水水化，超声5min，接着将溶液转移至透析袋中，搅拌条件下纯水透析12h以除去未包裹的抗癌药物，得负载抗癌药物的脂质体溶液；所述抗癌药物为多西他赛；所述磷脂薄膜与所述三蒸水的质量体积比为3.84mg：4mL。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述透析袋的截留分子量为14000。
3.根据权利要求1或2所述制备方法制备得到的负载抗癌药物的载药体系。
4.根据权利要求3所述的负载抗癌药物的载药体系，其特征在于，所述负载抗癌药物的载药体系的水合粒径为90-160nm。
5.根据权利要求4所述负载抗癌药物的载药体系在制备靶向肝脾抗癌药物中的应用。
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