CN101766570A - 一种靶向肿瘤细胞的pH敏前体阳离子纳米脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向肿瘤细胞的pH敏前体阳离子纳米脂质体及其制备方法，其产品由阳离子脂质体及其表面通过静电力结合的带有负电荷且易于在酸性环境下溶解的亲水层所构成。在静脉注射后既不和血液中表面带负电荷的细胞相融合，又能够在脂质体到达肿瘤部位后与肿瘤细胞迅速融合，有效释放药物杀伤肿瘤细胞。不仅可以有效将抗癌药物转运到肿瘤细胞内。而且克服了现有脂质体存在的不足，增加了抗癌药物杀死肿瘤细胞的效率，减小了药物的毒性。
Description
技术领域
本发明属于抗癌药物剂型领域，具体涉及一种靶向肿瘤细胞的纳米脂质体及其制备方法。
背景技术
脂质体载体是癌症治疗中目前最具潜力的药物传递系统之一，药物经脂质体包封后，药物在肿瘤组织蓄积增多，对正常组织毒性降低。此外，脂质体还能改善药物的溶解性并提高药物结构的稳定性等。然而普通脂质体经静脉注射后，很快被网状内皮系统(Reticuloendothelial System，RES)视作外源物质，被巨噬细胞摄取运送至肝、脾、骨髓等部位，易对这些部位的非病变细胞产生毒性。于是人们通过对脂质体进行表面修饰，使其避开RES的捕获，更多的进入毛细血管通透性较高且淋巴回流缺失的实质性肿瘤，降低抗肿瘤药物对正常细胞的毒性，提高药物利用率。
然而传统的使用PEG修饰的长循环脂质体如聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)脂质体、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)脂质体、聚乙二醇-胆固醇(PEG-CHOL)都具有体内不易降解的特性，可能会在到达肿瘤部位时由于PEG仍附着于脂质体表面而阻碍脂质体与肿瘤细胞的融合。阳离子脂质体(如含有氨基化合物的脂质体及壳聚糖修饰的脂质体)虽然在体外能极大提高与细胞的融合速度，但静脉注射后会首先和血液中表面带负电荷的细胞融合，造成毒性。
现代研究表明，肿瘤组织局部缺氧，酸性代谢物蓄积导致局部pH降低到pH6.8以下，使肿瘤组织局部呈酸性环境。
发明内容
本发明的目的就是根据上述现有技术的不足而提出一种靶向肿瘤细胞的pH敏前体阳离子纳米脂质体及其制备方法。该脂质体在静脉注射后既不和血液中表面带负电荷的细胞相融合，又能在到达肿瘤组织后与肿瘤细胞有效融合。
本发明有效利用了肿瘤组织局部的酸性环境，在阳离子纳米脂质体的表面通过静电力结合一层在酸性环境下易于溶解的带负电荷的亲水层。其表面的亲水层不仅能使脂质体在静脉注射后不和血液中表面带负电荷的细胞相融合而避免产生毒性，还能使脂质体在到达肿瘤部位的酸性环境后自行脱落，暴露出阳离子脂质体，而阳离子脂质体能与肿瘤细胞有效融合，可大大提高抗肿瘤药物的利用率。
本发明阳离子纳米脂质体的膜材由磷脂、胆固醇和含碱基脂质所组成，其组成的重量比为：磷脂0.5～1、胆固醇0～0.5、含碱基脂质0.01～0.1；亲水层为羧甲基壳聚糖，其分子量为50KDa～1000KDa，取代度为50％～70％，浓度为0.2％～2.0％；羧甲基壳聚糖和阳离子脂质体以静电力相结合，羧甲基壳聚糖长链上丰富的极性基团在复合物表面形成带负电的亲水层，亲水层和阳离子纳米脂质体以静电力相结合构成了本发明的产品。
本发明的产品在pH7.4的血液循环中的电位为-20～-50mV，不可能和血液中表面带负电荷的细胞相融合，因而不会造成红细胞溶血产生毒性。到达肿瘤组织后，由于该环境pH降低到7.0以下，羧甲基壳聚糖电离受抑制，亲水层脱离阳离子纳米脂质体，转变为带正电的阳离子脂质体，在静电力作用下，阳离子脂质体与肿瘤细胞迅速融合释放药物。
本发明的制备方法是：
一、制备阳离子纳米脂质体溶液：取0.5～1重量份磷脂、0～0.5重量份胆固醇、0.01～0.1重量份碱基脂质，用常规方法制取阳离子纳米脂质体溶液；
二、制备羧甲基壳聚糖溶液：用常规方法配制分子量50KDa～1000KDa，取代度为
50％～70％，浓度为0.2％～2.0％的羧甲基壳聚糖溶液；
三，孵育pH敏前体阳离子纳米脂质体：按体积比1∶5将阳离子纳米脂质体溶液缓慢滴加到羧甲基壳聚糖溶液中，并在室温下进行充分搅拌，每一体积阳离子纳米脂质体溶液滴加到羧甲基壳聚糖溶液中并在室温下进行充分搅拌的时间为：滴加时间为1～10分钟，搅拌时间为10～30分钟。
本发明的产品具有pH敏感性，其表面的亲水层可以在pH值较低的肿瘤组织自行脱落，未到达肿瘤组织前不释放药物，到达肿瘤组织后与肿瘤细胞迅速融合，杀伤肿瘤细胞。本发明方法设计合理，制备工艺简单，成本低廉，体内外稳定性好，可广泛作为抗肿瘤药物的载体，具有很好的应用前景。
附图说明
图1本发明的结构示意图。图中1-药物，2-阳离子纳米脂质体，3-为亲水层；
图2本发明的产品到达肿瘤组织后遇酸性环境其亲水层溶解脱落后的结构示意图，图中4-肿瘤组织；
图3为本发明产品与肿瘤组织融合后的结构示意图。
图4为本发明产品的透射电镜图。
具体实施方式
下面结合具体药物进一步介绍本发明的几个具体实施例：
实例1.称取蛋黄卵磷脂100mg，十八胺1mg和药物羟基喜树碱4mg，溶解于20ml无水乙醇(冰醋酸调pH至5.5)，转移至500ml的茄形瓶中40℃恒温水浴用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明类脂薄膜，用40℃去离子水10ml水化类脂薄膜，形成微黄色粗悬液，经过高压均质机在140MPa压力下经50nm膜挤压乳匀6次，得到阳离子脂质体溶液。配制分子量50KDa，取代度为50％，浓度为2.0％的羧甲基壳聚糖溶液，将10ml脂质体溶液缓慢滴加到10ml羧甲基壳聚糖溶液中，滴加时间为10分钟，室温搅拌时间为15分钟，获得羧甲基壳聚糖修饰的阳离子纳米脂质体。
用Zetasizer3000HS激光粒度分析仪测定Zeta电位、粒径大小，比较羧甲基壳聚糖包衣前，以及包衣后pH7.4和pH6.8条件下的变化，结果见表1。
表1不同状态脂质体的Zeta电位、平均粒径
Tab.1 Zeta potential，average size of liposomes in different state.n＝3
实例2.称取蛋黄卵磷脂50mg，DC-Chol 1mg，胆固醇50mg和药物阿霉素4mg，溶解于20ml无水乙醇，转移至500ml的茄形瓶中40℃恒温水浴用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明类脂薄膜，成膜后真空干燥8小时以上除尽有机溶剂，取10ml200mmol/l硫酸铵溶液水化类脂薄膜2h以上，形成空白脂质体粗悬液，经高压均质机在140MPa压力下经50nm膜挤压乳匀6次后，用pH7.4磷酸盐缓冲溶液透析9h除去外水相硫酸铵，制得空白脂质体。取空白脂质体加入等量阿霉素的PBS溶液，40℃恒温磁力搅拌20min，即得阿霉素阳离子脂质体。配制分子量1000KDa，取代度为70％，浓度为0.2％的羧甲基壳聚糖溶液，将10ml脂质体溶液缓慢滴加到10ml羧甲基壳聚糖溶液中，滴加时间为5分钟，室温搅拌时间为15分钟，获得羧甲基壳聚糖修饰的阳离子纳米脂质体。
用Zetasizer3000HS激光粒度分析仪测定Zeta电位、粒径大小，比较羧甲基壳聚糖包衣前，以及包衣后pH7.4和pH6.8条件下的变化，结果见表2。
表2不同状态脂质体的Zeta电位、平均粒径
Tab.2 Zeta potential，average size of liposomes in different state.n＝3
实例3.称取大豆卵磷脂80mg，DC-Chol 2mg，胆固醇20mg和药物紫杉醇4mg，溶解于20ml无水乙醇(冰醋酸调pH至5.5)，转移至500ml的茄形瓶中40℃恒温水浴用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明类脂薄膜，用40℃去离子水10ml水化类脂薄膜，形成粗悬液，经过300W超声探头处理60min，挤压过膜，孔径为0.22μm，得到阳离子脂质体溶液。配制分子量210KDa，取代度为60％，浓度为1.0％的羧甲基壳聚糖溶液，将10ml脂质体溶液缓慢滴加到50ml羧甲基壳聚糖溶液中，滴加时间为5分钟，室温搅拌时间为10分钟，获得羧甲基壳聚糖修饰的阳离子纳米脂质体。
用Zetasizer3000HS激光粒度分析仪测定Zeta电位、粒径大小，比较羧甲基壳聚糖包衣前，以及包衣后pH7.4和pH6.8条件下的变化，结果见表2。
表3不同状态脂质体的Zeta电位、平均粒径
Tab.3 Zeta potential，average size of liposomes in different state.n＝3
实例4.称取DOPE50mg，DOTMA50mg，胆固醇20mg和药物马钱子碱4mg，溶解于20ml无水乙醇，转移至500ml的茄形瓶中40℃恒温水浴用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明类脂薄膜，成膜后真空干燥8小时以上除尽有机溶剂，取10ml200mmol/l硫酸铵溶液水化类脂薄膜2h以上，形成空白脂质体粗悬液，经高压均质机在140MPa压力下经50nm膜挤压乳匀6次后，用pH7.4磷酸盐缓冲溶液透析9h除去外水相硫酸铵，制得空白脂质体。取空白脂质体加入等量马钱子碱的PBS溶液，40℃恒温磁力搅拌20min，即得马钱子碱阳离子脂质体。配制分子量210KDa，取代度为58％，浓度为1.0％的羧甲基壳聚糖溶液，将10ml脂质体溶液缓慢滴加到100ml羧甲基壳聚糖溶液中，滴加时间为1分钟，室温搅拌时间为30分钟，获得羧甲基壳聚糖修饰的阳离子纳米脂质体。用Zetasizer3000HS激光粒度分析仪测定Zeta电位、粒径大小，比较羧甲基壳聚糖包衣前，以及包衣后pH7.4和pH6.8条件下的变化，结果见表2。
表4不同状态脂质体的Zeta电位、平均粒径
Tab.4 Zeta potential，average size of liposomes in different state.n＝3
Claims (5)
1.一种靶向肿瘤细胞的pH敏前体阳离子纳米脂质体，其特征在于：
在阳离子纳米脂质体的表面通过静电力结合有一在酸性环境下易于溶解的带负电荷的亲水层。
2.根据权利要求1所述的一种靶向肿瘤细胞的pH敏前体阳离子纳米脂质体，其特征在于：
所述的阳离子纳米脂质体的膜材由磷脂、胆固醇和含碱基脂质组成，其组成的重量比为磷脂0.5～1、胆固醇0～0.5、含碱基脂质0.01～0.1。
3.根据权利要求1或2所述的一种靶向肿瘤细胞的pH敏前体阳离子纳米脂质体，其特征在于：
所述的在酸性环境下易于溶解的带负电荷的亲水层的成分为羧甲基壳聚糖，其分子量为50KDa～1000KDa，取代度为50％～70％，浓度为0.2％～2.0％。
4.一种制备靶向肿瘤细胞的pH敏前体阳离子纳米脂质体的方法，其特征在于：
①制备阳离子纳米脂质体溶液：取0.5～1重量份磷脂、0～0.5重量份胆固醇、0～0.1重量份碱基脂质，用常规方法制取阳离子纳米脂质体溶液；
②制备羧甲基壳聚糖溶液：用常规方法配制分子量为50KDa～1000KDa，取代度为50％～70％，浓度为0.2％～2.0％的羧甲基壳聚糖溶液；
③孵育pH敏前体阳离子纳米脂质体：按体积比1∶1～1∶10将阳离子纳米脂质体溶液缓慢滴加到羧甲基壳聚糖溶液中，并在室温下进行充分搅拌。
5.根据权利要求4所述的一种制备靶向肿瘤细胞的pH敏前体阳离子纳米脂质体的方法，其特征在于：
将每一体积阳离子纳米脂质体溶液缓慢滴加到羧甲基壳聚糖溶液中，并在室温下进行充分搅拌的时间为：滴加时间为1～10分钟，搅拌时间为10～30分钟。
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| CN109498818A (zh) * | 2018-05-25 | 2019-03-22 | 福州大学 | 一种产生NO的pH敏感脂质体及其制备方法 |
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