CN104758250A - 一种紫杉醇脂质体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种紫杉醇脂质体及其制备方法和用途。本发明制备的紫杉醇脂质体粒径小而且分布窄，能显著提高脂质体药物的渗透速度，使药物更快速地渗透到病灶部位给药，从而增强疗效；并且由于快速给药缩短了脂质体药物在体内的输运时间，可进一步降低药物被机体酶系统和免疫系统的降解损耗引起的毒副作用。另外，本发明制备的微小粒径的脂质体可以到达常规脂质体无法到达的肿瘤组织内部。

Description

一种紫杉醇脂质体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种紫杉醇脂质体及其制备方法和用途，特别涉及极微小脂质体。

背景技术

脂质体(liposome)是一种由脂类分子自组装形成的具有类似生物膜双分子层的超分子结构(球形微囊)，其结构特征在于具有外层亲水和内层疏水的双分子层结构和内囊空腔，直径通常在几十纳米到几十微米。自从上世纪六十年代确认其结构后，以脂质体作为载体的药物传输体系已获得广泛应用(例如专利CN 1237957C、CN 101371828B、CN 101579312B)。与非载药脂质体药物制剂相比，载药脂质体可以提高药物的治疗效果并且降低药物在体内传输过程中的毒性。它把药物分子嵌入、吸附或包裹在脂质体内，通过强化的渗透和保持效应(Enhanced Permeation and Retention，EPR效应)将药物输送到病灶组织，使病灶区药物浓度增高，在提高治疗效果的同时明显降低毒副作用。脂质体载药体系的突出优点在于：其一，它是以磷脂分子为基础载体材料。生理相容性好，可以在体内生物降解且没有免疫反应。其二，通过脂质体制剂成分的优化增强其在体内的稳定性，实现对负载药物的缓控释放。由于药物包封在脂质体中，受到类脂双分子层膜的保护，可以显著提高其稳定性。在进入体内之后，由于脂质体膜的保护，药物可以免受机体酶系统和免疫系统的降解。其三，在脂质体表面修饰配体识别分子则可实现主动地、特异性靶向给药，从而改善药物的治疗指数。常见的配体有：糖、植物凝血素、肽类激素、半抗原、抗体等。

决定脂质体药物的主要物化特征有：脂质体的稳定性、对药物分子的包封率和药物释放率、以及脂质体粒径大小及尺寸分布。脂质体的粒径大小及尺寸分布控制着脂质体在体内毛细血管、细胞外基质的渗透率和在组织内的保持效应，从而影响脂质体药物在体内的传输和药物释放性能。在肿瘤病变组织内普遍存在着细胞增生、毛细血管增生、毛细血管和淋巴微管异化等情况，小的粒径和窄的粒径分布有利于提高脂质体药物在体内和肿瘤组织中的渗透性，有助于药物快速渗透到达病灶部位给药而增强疗效。快速给药不但能使药物迅速到达治疗靶标，而且能够缩短脂质体药物在体内的输运时间，可进一步降低药物被机体酶系统和免疫系统的降解损耗，并且降低毒副作用。

紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是最初由植物短叶紫杉树皮分离提取的二萜类化合物，是目前发现的最具抗癌效果的天然抗癌药物之一。大量药理药效实验证明，紫杉醇对晚期卵巢癌、转移性乳腺癌、黑色素瘤都有显著疗效，对难治性卵巢癌和转移性乳腺癌的治愈率高，对治疗前列腺癌、胃肠癌、小细胞性和非小细胞性肺癌前景良好。紫杉醇为白色结晶粉末，在pH 4到8的条件下化学性质相对稳定。紫杉醇脂溶性高，几乎不溶于水，也难溶于多种常用药用溶媒。针对紫杉醇在水溶液中的低溶解性，现有技术通过与高分子形成包合物、或通过表面活性剂增溶等方法提高紫杉醇在水溶液中的溶解程度。用脂质体装载紫杉醇制成紫杉醇脂质体增溶和增效已有报道，但是通过现有技术制备的紫杉醇脂质体粒径较大(100-200nm)，限制了对病灶部位的深层给药，而且有必要提高制剂的稳定性。

目前广泛使用的载药用脂质体的制备方法为脂膜水化法和超声分散法。脂膜水化法是将磷脂和胆固醇等类脂溶于有机溶剂，然后将溶液置于圆底烧瓶中，旋转减压蒸干有机溶剂，从而在烧瓶内壁上挂上一层类脂分子膜。随后加入缓冲溶液，充分振荡烧瓶使脂质膜水化脱落得到脂质体。如此制得的脂质体粒径在0.2-5μm之间，需要在后续步骤中将其在压力下通过具有100-200nm孔径的滤膜，从而制备成为平均粒径为100-200nm的均匀的脂质体。脂膜水化法通过滤膜压制得到的脂质体尺寸较均匀，是目前常用的方法。但是该方法会导致所需粒度分布的脂质体的产量降低，特别是对于粒径小于100nm的脂质体。如果在旋转减压蒸干有机溶剂获得类脂分子膜后，加入缓冲液，将该溶液经超声波处理也能制备脂质体。超声分散法是制备小脂质体的常用方法，但是所制备的脂质体粒径分布不均匀，相当部分的脂质体粒径超过100nm。而且，强烈的超声波易引起药物的降解，超声处理前需要对溶液进行除氧处理，超声处理时需要进行降温处理，制得的溶液中还会混有超声探头产生的金属微屑必须去除。

发明内容

为克服上述缺陷，本发明提供一种微小紫杉醇脂质体及其制备方法。所述紫杉醇脂质体粒径小而且分布窄。

本发明另一目的在于提供上述紫杉醇脂质体用于制备药物的用途。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种紫杉醇脂质体，其特征在于，所述脂质体为单室脂质体，所述单室脂质体的粒径分布在15-100nm范围之内，特别地，在20-80nm范围之内，更进一步地，在20-50nm范围之内。

根据本发明，所述紫杉醇脂质体的粒径小而且分布窄，其D97(粒径小于它的脂质体占总量的97％)为小于等于90nm，优选的，D97小于等于80nm，更优选的小于等于60nm，进一步优选小于等于50nm。

根据本发明，所述单室脂质体又称为单层泡囊，其是由一层类脂双分子层膜包裹。

根据本发明，其中所述紫杉醇药物被嵌入脂质体双层膜中或者结合在双层膜上或者包裹在脂质体内囊。所述紫杉醇药物被嵌入脂质体双层膜中是指药物的脂溶性部分嵌入到双层膜的疏水层中；所述紫杉醇药物结合在脂质体双层膜上是指药物通过电荷作用、疏水作用、物理或化学吸附作用与双层膜相互作用而负载在双层膜上；所述紫杉醇药物被包裹在脂质体内囊中是指药物被脂质体双层膜包裹在脂质体的内囊中。

根据本发明，所述脂质体由类脂分子(lipid)构成，例如可以由一种或多种类脂分子构成，即可以为单一物质也可以为混合物。所述类脂分子包括中性类脂分子，负电性类脂分子、正电性类脂分子或其混合。所述脂质体可以由中性类脂分子单独组成，也可以由两种或两种以上类脂分子混合物组成。所述混合物可为中性类脂和负电性类脂的混合物、中性类脂和正电性类脂的混合物，或者中性类脂、负电性类脂和正电性类脂的混合物。优选的，所述中性类脂和负电性类脂的混合物中，所述中性类脂分子所占比例为50-99.99％，优选70-99.9％，更优选90-99％；所述负电性类脂分子所占比例为0.01-50％，优选0.1％-30％，更优选1％-10％。所述中性类脂和正电性类脂的混合物中，所述中性类脂所占比例为50-99.99％，优选70-99.9％，更优选90-99％；所述正电性类脂所占比例为0.01-50％，优选0.1％-30％，更优选1％-10％。所述中性类脂、负电性类脂和正电性类脂的混合物中，所述中性类脂所占比例为40-99.98％，优选60-99.8％，更优选80-98％，所述负电性类脂所占比例为0.01-30％，优选0.1％-20％，更优选1％-10％，所述正电性类脂的比例为0.01-30％，优选0.1％-20％，更优选1％-10％。所述比例为摩尔比。

根据本发明，所述中性类脂包括中性磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、中性合成磷脂等。具体分子包括：大豆卵磷脂(SPC)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二癸酰基卵磷脂(DDPC)、二月桂酰基卵磷脂(DLPC)、二肉豆蔻酰基卵磷脂(DMPC)、二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰基卵磷脂(DSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二芥酰基卵磷脂(DEPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基卵磷脂(MPPC)、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基卵磷脂(MSPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基卵磷脂(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂(PSPC)、1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基卵磷脂(SMPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基卵磷脂(SPPC)、1-肉豆蔻酰基-2-油酰基卵磷脂(MOPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二芥酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺(POPE)等。

根据本发明，所述负电性类脂包括磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、负电性合成磷脂等。具体分子包括：二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二芥酰磷脂酰甘油(DEPG)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二月桂酰磷脂酸(DLPA)、二油酰磷脂酸(DOPA)等。所述负电性类脂可提高脂质体的稳定性，增加脂质体在体内血液循环系统的寿命。

根据本发明，所述正电性类脂包括合成的胺基类脂等。上述正电性类脂分子使得脂质体能通过静电作用与带负电荷的药物分子或生物大分子如蛋白质、脱氧核糖核酸、核糖核酸等结合。含正电性类脂分子的脂质体还可提高对体内病灶组织细胞膜的结合。

根据本发明，所述紫杉醇脂质体中的脂质体由类脂分子构成，所述类脂分子还任选包括附加剂，所述附加剂可为单一物质或多种物质的组合，其为可以改善脂质体的各项性能等的类脂或类脂衍生物。

所述附加剂可以为能够提高脂质体对紫杉醇药物的包封率并提高脂质体稳定性的组分，例如胆固醇或神经酰胺(Ceramide)及其衍生物，如鞘磷脂(sphingomyelin)等，其在所形成的脂质体的各个组分中的摩尔比为0-70％，优选0.01％-50％，更优选0.1％-30％。

所述附加剂还可以为聚乙二醇修饰的类脂类分子(类脂衍生物)，其在所形成的脂质体的各个组分中的摩尔比为0-50％，优选0.01％-30％，更优选0.1％-20％。其中修饰类脂类分子的聚乙二醇分子量为50-10000，优选100-3000。上述聚乙二醇修饰的类脂类分子能够提高脂质体在血清及体内环境的稳定性。

所述附加剂还可以为单糖或多糖分子修饰的类脂类分子(类脂衍生物)，如脑苷脂(cerebroside)、神经节苷脂(ganglioside)等，其在所形成的脂质体的各个组分中的摩尔比为0-50％，优选0.01％-30％，更优选0.1％-20％。所述单糖或多糖分子修饰的类脂类分子能够提高脂质体的稳定性和提高对病灶组织的选择性。

本发明还提供一种紫杉醇脂质体在制备药物中的用途，优选的，在制备治疗癌症药物中的用途。

本发明还提供了一种原位制备所述紫杉醇脂质体的方法(方法一)，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)制备类脂分子、客体分子、紫杉醇相混合的溶液；

(2)将所得混合溶液与主体分子溶液混合制备得到紫杉醇脂质体。

本发明还提供一种原位制备紫杉醇脂质体的方法(方法二)，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)制备类脂分子与客体分子的混合溶液；

(2)制备紫杉醇与客体分子的混合溶液；

(3)将上述两种混合溶液与主体分子溶液混合制备紫杉醇脂质体。

根据本发明，所述的类脂分子(lipid)为形成所述脂质体(Liposome)的所有类脂或类脂衍生物。其可为单一物质也可以为混合物。所述类脂分子包括：能够形成双分子层膜材的类脂(例如磷脂等)，以及任选的附加剂。

根据本发明，所述的客体分子为上述类脂分子的助溶剂，优选的，其为上述类脂分子在亲水环境中的助溶剂。该助溶剂优选为表面活性剂，包括离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂或高分子表面活性剂。

根据本发明，所述离子表面活性剂为阴离子型表面活性剂或阳离子型表面活性剂。所述阴离子型表面活性剂例如为羧酸盐、磺酸盐或磷酸酯盐表面活性剂，优选具有极性亲水基团为羧酸根、磺酸根、磷酸根等的脂肪烃，例如十二烷基磺酸钠、胆酸钠等。所述阳离子型表面活性剂例如可为具有极性亲水基团为伯氨基、叔氨基、仲氨基、季铵基等的脂肪烃，其中，所述脂肪基的碳原子数为8-24。

根据本发明，所述两性表面活性剂为分子上同时具有正负电荷的表面活性剂，包括卵磷脂型、氨基酸型，如十二烷基氨基丙酸、和甜菜碱型。所述甜菜碱型包括羧酸基甜菜碱、磺基甜菜碱、磷酸脂甜菜碱；例如烃(烷)基二甲基甜菜碱[RN⁺(CH₃)₂CH₂COO^-]、烃(烷)基二甲基磺乙基甜菜碱[RN⁺(CH₃)₂CH₂CH₂SO₃ ^-]、烃(烷)基二甲基磺丙基甜菜碱[RN⁺(CH₃)₂CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-]、烃(烷)基二甲基羟丙基磷酸脂甜菜碱[RN⁺(CH₃)₂CH₂CH(OH)CH₂HPO4^-]，上述例举的表面活性剂中的基团R为碳原子数为9-18的烃基。所述两性表面活性剂还包括氧化铵型表面活性剂，通常适用的氧化胺包括：C_12-18烷基二(C_1-6烷基)氧化胺，例如：月桂基二甲基氧化胺、肉豆蔻二甲基氧化胺；C_12-18烷基二(羟基C_1-6烷基)氧化胺，例如二(2-羟乙基)椰油基氧化胺、二(2-羟乙基)十六烷基氧化胺、二(2-二羟乙基)硬脂基氧化胺；C_12-18烷基酰氨基丙基氧化胺，例如：椰油酰氨基丙基二甲基氧化胺、肉桂酰氨基丙基二甲基氧化胺、椰油酰氨基丙基二(2-羟乙基)氧化胺。

根据本发明，所述非离子表面活性剂为聚氧乙烯型(聚乙二醇型)、多元醇型表面活性剂或天然糖类非离子表面活性剂。所述聚氧乙烯型表面活性剂是由环氧乙烷与含有活泼氢的化合物进行加成反应的产物，所述含有活泼氢化合物例如有：脂肪醇、烷基酚、脂肪酸、脂肪胺及脂肪酰胺、油脂、山梨醇和蔗糖等。所述聚氧乙烯型表面活性剂包括：烷基(烃基)酚聚氧乙烯醚，其中所述分子中加成的环氧乙烷数为6-20，优选9-12，例如分子中加成的环氧乙烷数为9-12的辛基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、异辛基苯基聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧丙烯醚或聚氧乙烯醚等；所述聚氧乙烯型表面活性剂还包括高碳脂肪醇聚氧乙烯醚，该脂肪醇含碳原子数为12-18，加成的环氧乙烷数为6-25，优选15-20；所述聚氧乙烯型表面活性剂还包括高碳脂肪酸甲酯乙氧基化物(由脂肪酸甲酯与环氧乙烷加成)，该脂肪酸含碳原子数为12-18，加成的环氧乙烷数为6-25，优选15-20；所述聚氧乙烯型表面活性剂还包括聚丙二醇的环氧乙烷加成物，所述聚丙二醇中丙二醇重复单元数为6-20，优选6-10，加成的环氧乙烷数为6-25，优选15-20。所述多元醇型表面活性剂是由含有多个羟基的多元醇、烷基醇胺等与高级脂肪酸生成的酯类或酰胺类化合物。包括山梨醇脂肪酸酯类、乙二醇单硬脂酸酯或双硬脂酸酯、聚乙二醇双硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、丙二醇藻酸酯、甘油单硬脂酸酯和双硬脂酸酯、蔗糖酯或烷基醇酰胺型表面活性剂等；所述山梨醇脂肪酸酯类主要包括失水山梨醇酯及其环氧乙烷加成物，例如斯潘系列，吐温系列等。斯潘系列具体包括：失水山梨醇单月桂酸酯(Span-20)、失水山梨醇单棕榈酸酯(Span-40)、失水山梨醇单硬脂酸酯(Span-60)、失水山梨醇单油酸酯(Span-80)。所述天然糖类非离子表面活性剂是由天然糖与脂肪酸或醇形成的酯或醚。其中成酯的脂肪酸或成醚的脂肪链含碳原子数为6-14，优选7-12。所述天然糖类非离子表面活性剂包括单糖酯或醚，如吡喃糖酯、葡萄糖酯或其醚，以及多糖酯或醚，如蔗糖酯、果糖酯、麦芽糖酯或其醚，具体的可为：辛基-β-D-葡萄糖甙、壬基-β-D-葡萄糖甙、癸基-β-D-葡萄糖甙、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、正十四烷基-β-D-麦芽糖苷等。

根据本发明，所述高分子表面活性剂为天然高分子表面活性剂或合成高分子表面活性剂。如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、接枝共聚物等，还可以是氟碳表面活性剂和硅基表面活性剂。

根据本发明，所述的主体分子是指所有能与作为助溶剂的客体分子结合的化合物。包括：环糊精及其衍生物、杯芳烃及其衍生物、柱芳烃及其衍生物、葫芦脲及其衍生物等。

根据本发明，所述环糊精包括6-12个D-吡喃葡萄糖单元，优选含有6、7、8个葡萄糖单元，亦即α-、β-和γ-环糊精。所述环糊精衍生物包括环糊精外表面的醇羟基全部或部分进行醚化、酯化反应生成的醚衍生物(R’-O-)、酯衍生物(R’-COO-)、或者发生氧化反应得到的醛和酮衍生物(R’-CO-)。其中，R’为C_1-6烷基、环烷基、芳基、-C_1-6烷基芳基、取代的C_1-6烷基，取代的芳基、取代的-C_1-6烷基芳基，其中所述取代基为羟基、氨基、醚基、酯基、磺酸基、亚磺酸基、硝基、亚硝基、叠氮基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯基、C_2-6炔基等。

根据本发明，所述环糊精衍生物还可以是对环糊精及其衍生物交联反应得到的桥联环糊精、环糊精交联聚合物，其中环糊精或环糊精衍生物重复单元数为2-100，优选2-20，更优选2-10。所述环糊精衍生物还可以是与高分子相连的环糊精或其衍生物，其中所述高分子为天然高分子和合成高分子，如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、接枝共聚物等，还可以是氟基高分子、硅基高分子。

根据本发明，所述杯芳烃(Calixarene)是由对位取代的苯酚、间苯二酚(resorcinol)和邻苯三酚(pyrogallol)与醛发生缩合反应得到的杯[n]芳烃，如分子式1所示：

分子式1

其中n为4-12的整数，优选为4-7；Ra独立地选自氢、C_1-6烷基(例如叔丁基、异丙基)、芳基、-C_1-6烷基芳基(例如苄基)、杂芳基、-C_1-6烷基杂芳基、醚基、酯基、磺酸基、亚磺酸基、硝基、亚硝基、叠氮基，上述基团还可以进一步被取代基取代，所述取代基为C_1-6烷基、环烷基。Rb独立地选自氢、C_1-6烷基、环烷基、芳基、-C_1-6烷基芳基等；Rc为氢。

所述杯芳烃衍生物可为杂杯芳烃及其衍生物，所述杂杯芳烃为上述分子式1中的苯环中的碳原子被1-4个杂原子取代，所述杂原子可为N、O、S等。

所述杯芳烃衍生物或杂杯芳烃衍生物为其酚羟基全部或部分进行醚化、酯化反应生成的醚、酯衍生物；所述结构如上述分子式1，其中，Rc可相同也可不同，独立地选自氢、环氧乙烷数为9-12的聚氧乙烯醚基、C_1-6烷基、环烷基、-CO-C_1-6烷基、芳基、-C_1-6烷基芳基、取代的C_1-6烷基、取代的芳基、取代的-C_1-6烷基芳基，其中所述取代基为羟基、氨基、醚基、酯基、磺酸基、亚磺酸基、硝基、亚硝基、叠氮基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯基、C_2-6炔基等。

所述杯芳烃衍生物还可以是对杯芳烃、含杂原子杯芳烃及其衍生物交联反应得到的桥联杯芳烃、杯芳烃交联聚合物，其中杯芳烃、含杂原子杯芳烃及其衍生物的重复单元数为2-100，优选2-20，更优选2-10。所述杯芳烃衍生物还可以是与高分子相连的杯芳烃、含杂原子杯芳烃或其衍生物，其中所述高分子为天然高分子和合成高分子，如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、接枝共聚物等，还可以是氟基高分子、硅基高分子。

所述柱芳烃(Pillararene)是由对苯二酚或对苯二酚醚及其衍生物通过亚甲基桥连接得到的柱[n]芳烃，如分子式2所示：

分子式2

其中n为4-12的整数，优选为4-7；R1和R2独立地选自氢、环氧乙烷数为9-12的聚氧乙烯醚基、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、环烷基、-CO-C_1-6烷基、芳基、-C_1-6烷基芳基，上述基团均可以进一步被取代基取代，其中所述取代基为羟基、氨基、醚基、酯基、磺酸基、亚磺酸基、硝基、亚硝基、叠氮基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯基、C_2-6炔基等。

所述柱芳烃衍生物可为杂柱芳烃及其衍生物，所述杂柱芳烃为上述分子式2中的苯环中的碳原子被1-4个杂原子取代，所述杂原子可为N、O、S等。

所述柱芳烃衍生物可以是对柱芳烃、含杂原子柱芳烃及其衍生物交联反应得到的桥联柱芳烃、柱芳烃交联聚合物，其中柱芳烃、含杂原子柱芳烃及其衍生物的重复单元数为2-100，优选2-20，更优选2-10。所述柱芳烃衍生物还可以是与高分子相连的柱芳烃、含杂原子柱芳烃或其衍生物，其中所述高分子为天然高分子和合成高分子，如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、接枝共聚物等，还可以是氟基高分子、硅基高分子。

所述葫芦脲(Cucurbituril)及其衍生物为甘脲及取代甘脲与甲醛缩合而成的葫芦[n]脲及其衍生物，其中n为4-12的整数，优选为5-8；取代甘脲上的取代基独立的选自：C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、环烷基、C_1-6烷氧基、芳基、C_1-6烷基芳基、C_1-6烷氧基芳基。

所述葫芦脲衍生物还可以是对葫芦脲交联反应得到的桥联葫芦脲、葫芦脲交联聚合物，其中葫芦脲重复单元数为2-100，优选2-20，更优选2-10。所述葫芦脲衍生物还可以是与高分子相连的葫芦脲，其中所述高分子为天然高分子和合成高分子，如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、接枝共聚物等，还可以是氟基高分子、硅基高分子。

本发明所述的烷基代表碳原子数为1-6的直链或支链烷基，例如，甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。

本发明所述的烯基代表碳原子数为2-6的直链或支链烯基，例如，乙烯、丙烯、异丙烯、丁烯等。

本发明所述的炔基代表碳原子数为2-6的直链或支链炔基，例如，乙炔、丙炔、丁炔等。

本发明所述的环烷基代表具有3-8个，优选4-7个环原子的碳环，例如环戊烷基、环己烷基或环庚烷基。

本发明所述的芳基指具有6-24个碳原子的单环、多环芳族基团，代表性的芳基包括：苯基、萘基等。

本发明所述的杂芳基指具有1-20个碳原子、至少1个，优选1-4个选自N、S、O杂原子的单环或多环杂芳族基团，代表性的杂芳基包括：吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基等。

本发明所述氨基代表基团-NR¹ ₂，其中，R¹独立的选自H、烷基、芳基、杂芳基、杂环基。

本发明所述的醚基代表基团-OR²，其中，R²独立的选自C_1-6烷基、-(CH₂-CH₂O)n-CH₂-CH₃(n大于2)；所述醚基例如为甲基醚、乙基醚、丙基醚、异丙基醚、丁基醚、异丁基醚、叔丁基醚、环氧乙烷数为9-12的聚氧乙烯醚基等。

本发明所述的酯基指代表基团-O-COR³，其中，R³独立的选自C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基，所述取代基可为C_1-6烷基、-OC_1-6烷基、-(CH₂-CH₂O)n-CH₂-CH₃(n大于2)等；所述酯基例如甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、含取代基为环氧乙烷数为9-12的聚氧乙烯醚的C_1-4有机酸酯等。

在所述紫杉醇脂质体的制备中，所述主体分子和客体分子可以依据主客体化学的已有知识，通过调节客体分子和主体分子的溶解性、分子大小和亲油亲水平衡使主体分子能够包裹住客体分子，从而释放出类脂分子，使其形成脂质体。

在一个优选实施方式中，所述主体分子为环糊精及其衍生物、杯芳烃及其衍生物、柱芳烃及其衍生物、葫芦脲及其衍生物，所述客体分子为离子表面活性剂。进一步的，所述离子表面活性剂优选为阴离子型表面活性剂，更优选的，所述阴离子型表面活性剂具有极性亲水基团为羧酸根、磺酸根、磷酸根等的脂肪烃，例如十二烷基磺酸钠、胆酸钠等。

在一个优选实施方式中，所述主体分子为环糊精及其衍生物、杯芳烃及其衍生物、柱芳烃及其衍生物、葫芦脲及其衍生物，所述客体分子为两性表面活性剂。进一步优选的两性表面活性剂为氨基酸型表面活性剂、氧化铵型表面活性剂。更优选为氧化胺型表面活性剂，包括：C_12-18烷基二(C_1-6烷基)氧化胺，例如：月桂基二甲基氧化胺、肉豆蔻二甲基氧化胺；C_12-18烷基二(羟基C_1-6烷基)氧化胺，例如二(2-羟乙基)椰油基氧化胺、二(2-羟乙基)十六烷基氧化胺、二(2-二羟乙基)硬脂基氧化胺；C_12-18烷基酰氨基丙基氧化胺，例如：椰油酰氨基丙基二甲基氧化胺、肉桂酰氨基丙基二甲基氧化胺、椰油酰氨基丙基二(2-羟乙基)氧化胺。

在一个优选实施方式中，所述主体分子为环糊精及其衍生物、杯芳烃及其衍生物、柱芳烃及其衍生物、葫芦脲及其衍生物，所述客体分子为非离子表面活性剂。进一步的，所述非离子表面活性剂优选为聚氧乙烯型(聚乙二醇型)、多元醇型表面活性剂、或天然糖类非离子表面活性剂。优选适用的聚氧乙烯型表面活性剂包括烷基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚、高碳脂肪酸甲酯乙氧基化物、聚丙二醇的环氧乙烷加成物，例如分子中加成的环氧乙烷数为9-12的辛基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、异辛基苯基聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧丙烯醚或聚氧乙烯醚等。所述多元醇型表面活性剂优选为山梨醇脂肪酸酯类，例如斯潘系列，吐温系列等。斯潘系列具体包括：失水山梨醇单月桂酸酯(Span-20)、失水山梨醇单棕榈酸酯(Span-40)、失水山梨醇单硬脂酸酯(Span-60)、失水山梨醇单油酸酯(Span-80)。所述天然糖类非离子表面活性剂优选为单糖酯或醚，如吡喃糖酯、葡萄糖酯或其醚，以及多糖酯或醚，如蔗糖酯、果糖酯、麦芽糖酯或其醚，具体的可为：辛基-β-D-葡萄糖甙、壬基-β-D-葡萄糖甙、癸基-β-D-葡萄糖甙、正十一烷基-β-D-麦芽糖苷等、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷等、正十四烷基-β-D-麦芽糖苷等。

进一步优选的，所述环糊精衍生物、杯芳烃衍生物、柱芳烃衍生物、葫芦脲衍生物为醚衍生物(R’-O-)、酯衍生物(R’-COO-)、或者发生氧化反应得到的醛和酮衍生物(R’-CO-)。其中，R’为C_1-6烷基、环烷基、芳基、-C_1-6烷基芳基、取代的C_1-6烷基、取代的芳基、取代的-C_1-6烷基芳基，其中所述取代基为羟基、氨基、醚基、酯基、磺酸基、亚磺酸基、硝基、亚硝基、叠氮基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯基、C_2-6炔基等。所述衍生物还可以是对主体分子进行交联反应得到的桥联、交联聚合物，其中桥联或交联的重复单元数为2-100，优选2-20，更优选2-10。所述衍生物还可以是与高分子交联的衍生物，其中所述高分子为天然高分子和合成高分子，如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、接枝共聚物等，还可以是硅基高分子。

在所述紫杉醇脂质体的制备中，所述类脂分子与客体分子的摩尔比为0.001:1至50:1，优选0.01:1至10:1，更优选0.05:1至5:1。

在所述紫杉醇脂质体的制备中，所述主体分子与客体分子的摩尔比为0.001:1至100:1，优选0.05:1至10:1，更优选0.1:1至5:1。

在一个优选实施方式中，在所述紫杉醇脂质体的制备中出现的如下溶液：所述的类脂分子与客体分子混合溶液；所述的类脂分子、客体分子、紫杉醇药物分子混合溶液；所述的紫杉醇药物分子与客体分子混合溶液；所述的主体分子溶液；在上述溶液中，优选使用的溶剂为水或缓冲盐溶液，所述缓冲盐溶液例如磷酸缓冲盐溶液，柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。缓冲盐溶液的pH值为2-12。优选的pH值为7.4。

在一个优选实施方式中，在所述紫杉醇脂质体的制备中，将所获得的紫杉醇脂质体进行分离纯化，得到纯化的紫杉醇脂质体。所述分离方法例如：高速离心、凝胶渗透色谱、尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography)、半透膜透析等。

在一个优选实施方式中，在所述紫杉醇脂质体的制备中，所获得的紫杉醇脂质体可制成固态脂质体粉末，例如通过冻干法或喷雾法。

本发明将主客体化学(host-guest chemistry)引入紫杉醇脂质体的制备中。在形成脂质体的类脂成分中加入作为客体分子的助溶剂，使得类脂分子或/和紫杉醇均匀分散溶入水溶液中。然后在所得溶液中加入主体分子在温和条件下选择性除去作为客体分子的助溶剂，由此自发地形成微小的脂质体。

本发明的紫杉醇脂质体粒径小而且分布窄。由于粒径大小及尺寸分布决定着脂质体在体内微血管、细胞外基质的渗透率，从而直接影响脂质体药物在体内的渗透性和药物释放。本发明高效、可控制备的微小脂质体能显著提高脂质体药物的渗透速度，使紫杉醇药物更快速地渗透到病灶部位给药，从而增强疗效；并且由于快速给药缩短了脂质体药物在体内的输运时间，可进一步降低紫杉醇药物被机体酶系统和免疫系统的降解损耗，并且降低毒副作用。另外，本发明制备的微小粒径的紫杉醇脂质体可以到达常规脂质体无法到达的肿瘤组织内部。

本发明的紫杉醇脂质体及其制备方法的优点如下：

1)本发明的紫杉醇脂质体粒径小而且分布窄，粒径分布为15-100nm范围之内，特别地，20-80nm，更进一步地，20-50nm。所得脂质体为单室脂质体。

2)本发明的主客体化学的制备方法，反应速率快、耗时短，提供了一条快速实时实地制备微小紫杉醇脂质体的途径。具体地，本发明的制备方法避免常用的脂膜水化法中的滤膜加压尺寸控制步骤中加压对脂质体的破坏和超声分散法中超声对紫杉醇分子的破坏。

3)通过本发明提供的将脂质体前体溶液实时混合的制备方法，克服了目前紫杉醇脂质体长时间存放后不稳定的问题，从而保证紫杉醇脂质体的质量。本发明中作为前体的类脂分子与客体分子混合溶液和主体分子溶液的稳定性高，室温下可以存放一年以上，4℃下两年，而冷冻条件下保存三年解冻亦不出现混浊。

4)本发明制备得到的脂质体粒径小，减少了脂质体成品的碰撞沉淀几率。改善了脂质体药物长时间存放不稳定的问题。经检测，本发明的紫杉醇脂质体在4℃下存放6个月，没有出现包封率和粒径的明显变化。

附图说明

图1为本发明的三种代表性主体分子结构(上)及其示意图(下)；(a)β-环糊精；(b)4-叔丁基杯[6]芳烃；(c)葫芦[7]脲。

图2为实施例1中制备的极微小脂质体扫描电镜照片。

图3为通过动态激光散射测定的实施例1中制备的极微小脂质体的粒径分布图。

图4为通过动态激光散射测定的实施例9中制备的装载紫杉醇的极微小脂质体的粒径分布图。

图5为实施例11制备的装载紫杉醇的极微小脂质体对小鼠乳腺癌动物模型的治疗效果图。

具体实施方式

实施例1制备单磷脂组分极微小脂质体(客体分子与主体分子摩尔比为1:5)

将0.01克1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(化学命名1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，SOPC，分子量788)用25毫升氯仿溶解，放入100毫升圆底烧瓶中，减压下蒸干溶剂。向圆底烧瓶中加入50毫升含有1毫摩尔/升正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(非离子表面活性剂)的磷酸缓冲盐溶液，pH值7.4。通过振荡圆底烧瓶使得SOPC完全溶解于该非离子表面活性剂磷酸缓冲盐溶液。将0.33克γ-环糊精(分子量1297)溶于50毫升室温下(25℃)水中，得到5毫摩尔/升的γ-环糊精水溶液。将SOPC溶液加入该γ-环糊精水溶液，在强力搅拌下混合15分钟。由此制得SOPC单组份极微小脂质体溶液。

图2是本实施例制备的极微小脂质体的扫描电镜照片。

采用动态激光散射来测定本实施例制备的极微小脂质体的粒径分布，如图3所示。由图中可以看出，本实施例制备的极微小脂质体的粒径分布在10-50nm范围之内。将所得溶液装入截留分子量为10000的透析袋中，悬挂于pH值7.4磷酸缓冲盐溶液中透析纯化24小时，得到纯化的脂质体药物溶液。经由液相色谱-质谱仪检测，采用电喷雾法离子化，在分子量为250-3000的范围内仅检测到SOPC的质量峰(m/z:789,[M+H]⁺)。可见，本发明制备的极微小脂质体中不含环糊精或环糊精-客体分子复合物。

实施例2使用非离子表面活性剂制备装载紫杉醇的极微小脂质体(客体分子与主体分子摩尔比为1:2)

将0.16克1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂用50毫升氯仿溶解，放入250毫升圆底烧瓶中，另加入10毫升含1毫克紫杉醇(分子量854)的甲醇-氯仿(体积比为1:1)的溶液，减压下蒸干溶剂。向圆底烧瓶中加入100毫升pH值7.4的磷酸缓冲盐溶液，该缓冲液中含有8毫摩尔/升的正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(非离子表面活性剂)。通过振荡圆底烧瓶或施加磁力搅拌使得SOPC和紫杉醇完全溶解于该非离子表面活性剂磷酸缓冲盐溶液。将2.10克γ-环糊精溶于100毫升室温下(25℃)水中。将得到的SOPC和紫杉醇混合溶液在室温下与该100毫升γ-环糊精水饱和溶液在强力搅拌下混合15分钟。由此制得SOPC单组份装载紫杉醇的极微小脂质体溶液。本实施例制备的紫杉醇极微小脂质体的粒径分布在20-50nm范围之内。

实施例3使用两性表面活性剂制备装载紫杉醇的极微小脂质体

将0.01克1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC，分子量788)用25毫升氯仿溶解，放入100毫升圆底烧瓶中，另加入5毫升含0.5毫克紫杉醇的甲醇-氯仿(体积比为1:1)的溶液，减压蒸干溶剂。向该圆底烧瓶中加入50毫升含有1毫摩尔/升LO(月桂基二甲基氧化胺)(两性表面活性剂)的磷酸缓冲盐溶液，pH值7.4。通过振荡圆底烧瓶使得SOPC和紫杉醇完全溶解。将0.10克α-环糊精溶于50毫升室温下水中。将所得SOPC和紫杉醇混合溶液加入该α-环糊精水溶液，在强力搅拌下混合15分钟。由此制得装载紫杉醇的脂质体溶液。本实施例制备的极微小脂质体的粒径分布在20-50nm范围之内。

实施例4使用离子型表面活性剂制备装载紫杉醇的极微小脂质体

将0.01克1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC，分子量788)用25毫升氯仿溶解，放入100毫升圆底烧瓶中，另加入5毫升含0.5毫克紫杉醇的甲醇-氯仿(体积比为1:1)的溶液，减压蒸干溶剂。向该圆底烧瓶中加入50毫升含有1毫摩尔/升胆酸钠(离子型表面活性剂)的磷酸缓冲盐溶液，pH值7.4。通过振荡圆底烧瓶使得SOPC和紫杉醇完全溶解于该离子型表面活性剂溶液。将0.10克α-环糊精溶于50毫升室温下水中。将所得SOPC和紫杉醇混合溶液加入该α-环糊精水溶液，在强力搅拌下混合30分钟。由此制得装载紫杉醇的微小脂质体溶液。本实施例制备的极微小脂质体的粒径分布在20-50nm范围之内。

实施例6制备带负电荷的装载紫杉醇的极微小脂质体

将0.01克1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC，分子量788)，0.2毫克二硬脂酰磷脂酰甘油钠盐(DSPG，分子量801)用25毫升氯仿溶解，放入100毫升圆底烧瓶中，另加入5毫升含0.5毫克紫杉醇的甲醇-氯仿(体积比为1:1)的溶液，减压蒸干溶剂。向圆底烧瓶中加入50毫升含有1毫摩尔/升异辛基苯基聚氧乙烯醚(曲拉通X-100，非离子表面活性剂)的磷酸缓冲盐溶液，pH值7.4。通过振荡圆底烧瓶使得类脂分子和紫杉醇完全溶解于该非离子表面活性剂溶液。将0.12克β-环糊精溶于50毫升室温下(25℃)水中，得到β-环糊精水溶液。将所得类脂分子和紫杉醇混合溶液加入该β-环糊精水溶液，在强力搅拌下混合30分钟。由此制得SOPC与DSPG摩尔比为50:1的表面带负电荷的装载紫杉醇的极微小脂质体溶液。本实施例制备的紫杉醇脂质体的粒径分布在20-50nm范围之内。

实施例7使用杯芳烃作为主体分子制备装载紫杉醇的极微小脂质体

将0.01克1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC，分子量788)用25毫升氯仿溶解，放入100毫升圆底烧瓶中，另加入5毫升含0.5毫克紫杉醇的甲醇-氯仿(体积比为1:1)的溶液，减压蒸干溶剂。向圆底烧瓶中加入50毫升含有1毫摩尔/升壬基-β-D-葡萄糖甙的磷酸缓冲盐溶液，pH值7.4。通过振荡圆底烧瓶使得SOPC和紫杉醇完全溶解于该非离子表面活性剂溶液。将0.37克市购的4-磺酸杯[8]芳烃(分子量1489)溶于50毫升室温下(25℃)水中，得到5毫摩尔/升的4-磺酸杯[8]芳烃水溶液。将SOPC和紫杉醇混合溶液加入该4-磺酸杯[8]芳烃水溶液，在强力搅拌下混合30分钟。由此制得装载紫杉醇的极微小脂质体溶液。本实施例制备的紫杉醇脂质体的粒径分布在15-60nm范围之内。

实施例8葫芦脲作为主体分子制备装载紫杉醇的极微小脂质体

将0.01克1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC，分子量788)用25毫升氯仿溶解，放入100毫升圆底烧瓶中，另加入5毫升含0.5毫克紫杉醇的甲醇-氯仿(体积比为1:1)的溶液，减压蒸干溶剂。向圆底烧瓶中加入50毫升含有1毫摩尔/升壬基-β-D-葡萄糖甙的磷酸缓冲盐溶液，pH值7.4。通过振荡圆底烧瓶使得SOPC和紫杉醇完全溶解于该非离子表面活性剂溶液。将0.29克市购的葫芦[7]脲(分子量1163)溶于50毫升室温下水中，得到葫芦[7]脲水溶液。将SOPC和紫杉醇混合溶液加入该葫芦[7]脲水溶液，在强力搅拌下混合30分钟。由此制得装载紫杉醇的极微小脂质体溶液。本实施例制备的紫杉醇脂质体的粒径分布在20-80nm范围之内。

实施例9制备含胆固醇复合组分的紫杉醇脂质体

将0.16克1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC，分子量788)、8毫克胆固醇(分子量387)用50毫升氯仿溶解，放入250毫升圆底烧瓶中，减压下蒸干溶剂。加入10毫升含1.8毫克紫杉醇(分子量854)的甲醇-氯仿(体积比为1:1)的混合溶液，减压下蒸干溶剂。向圆底烧瓶中加入100毫升含有8毫摩尔/升的异辛基苯基聚氧乙烯醚的磷酸缓冲盐溶液，pH值7.4。通过振荡圆底烧瓶或施加磁力搅拌使得所有有机成分完全溶解于该非离子表面活性剂溶液。将2.1克γ-环糊精溶于100毫升室温下(25℃)水中，得到γ-环糊精水溶液。将得到的类脂分子和紫杉醇溶液在室温下与100毫升γ-环糊精溶液在强力搅拌下混合15分钟。由此制得SOPC：胆固醇：紫杉醇混合摩尔比为100：10：1的装载紫杉醇的极微小脂质体溶液。所得溶液装入截留分子量为10000的透析袋中，悬挂于pH值7.4磷酸缓冲盐溶液中透析纯化24小时，得到纯化的装载紫杉醇的脂质体药物溶液制剂。将等体积的作为冷冻干燥辅剂的葡萄糖水溶液(0.2克/升)加入到所得溶液中，液氮急冻，迅速置于高真空(10～40Pa)的容器中，室温下冷冻干燥48小时，所得白色粉末即为含有紫杉醇的固态极微小脂质体。将该固态紫杉醇脂质体在室温下或冰箱冷冻保存。由图4可见，本实施例制备的紫杉醇脂质体的粒径分布在15-60nm范围之内。

实施例10制备含胆固醇复合组分的紫杉醇脂质体

将0.16克1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC，分子量788)、8毫克胆固醇(分子量387)用50毫升氯仿溶解，放入250毫升圆底烧瓶中，减压下蒸干溶剂。向圆底烧瓶中加入90毫升含有8毫摩尔/升的异辛基苯基聚氧乙烯醚的磷酸缓冲盐溶液，pH值7.4。通过振荡圆底烧瓶或施加磁力搅拌使得所有有机成分完全溶解于该非离子表面活性剂溶液，制成溶液一。另取10毫升含1.8毫克紫杉醇(分子量854)的甲醇-氯仿(体积比为1:1)的溶液，减压下蒸干溶剂。向圆底烧瓶中加入10毫升含有8毫摩尔/升的异辛基苯基聚氧乙烯醚的磷酸缓冲盐溶液，pH值7.4，制成溶液二。将2.1克γ-环糊精溶于100毫升室温下(25℃)水中，得到γ-环糊精水溶液。将该100毫升γ-环糊精溶液与溶液一和溶液二在室温下强力搅拌混合30分钟。由此制得SOPC：胆固醇：紫杉醇混合摩尔比为100：10：1的装载紫杉醇的极微小脂质体溶液。所得溶液装入截留分子量为10000的透析袋中，悬挂于pH值7.4磷酸缓冲盐溶液中透析纯化24小时，得到纯化的装载紫杉醇的脂质体药物溶液制剂。将等体积的作为冷冻干燥辅剂的葡萄糖水溶液(0.2克/升)加入到所得溶液中，液氮急冻，迅速置于高真空的容器中，室温下冷冻干燥48小时，所得白色粉末即为含有紫杉醇的固态极微小脂质体。将该固态紫杉醇脂质体在室温下或冰箱冷冻保存。本实施例制备的极微小脂质体的粒径在15-60nm范围之内。

实施例11制备含胆固醇和聚乙二醇类脂分子复合组分的紫杉醇脂质体

将0.16克1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC，分子量788)、8毫克胆固醇(分子量387)、4毫克聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPE-PEG，分子量2000)用50毫升氯仿溶解，放入250毫升圆底烧瓶中，减压下蒸干溶剂。加入10毫升含9毫克紫杉醇(分子量854)的甲醇-氯仿(体积比为1:1)混合溶液，减压下蒸干溶剂。向圆底烧瓶中加入100毫升含有8毫摩尔/升的异辛基苯基聚氧乙烯醚的磷酸缓冲盐溶液，pH值7.4。通过振荡圆底烧瓶或施加磁力搅拌使得所有有机成分完全溶解于该非离子表面活性剂溶液。将2.1克γ-环糊精溶于100毫升室温下(25℃)水中，得到γ-环糊精水溶液。将得到的类脂分子和紫杉醇溶液在室温下与100毫升γ-环糊精溶液在强力搅拌下混合30分钟。由此制得SOPC：胆固醇：DSPE-PEG：紫杉醇混合摩尔比为100：10：1：5的装载紫杉醇的复合组分极微小脂质体溶液。所得溶液装入截留分子量为10000的透析袋中，悬挂于pH值7.4磷酸缓冲盐溶液中透析纯化24小时，得到纯化的装载紫杉醇的脂质体药物溶液制剂。将等体积的作为冷冻干燥辅剂的葡萄糖水溶液(0.1克/升)加入到所得溶液中，液氮急冻，迅速置于高真空的容器中，室温下冻干48小时，所得白色粉末即为含有紫杉醇的固态极微小脂质体。将该固态紫杉醇脂质体在室温下或冰箱冷冻保存。

本实施例制备的极微小脂质体的粒径经动态激光散射监测为50nm±30nm。

实施例12装载紫杉醇的复合组分极微小脂质体包封率和稳定性考察

取实施例11中制备的紫杉醇脂质体冻干样品30毫克，加入氯仿5毫升，震荡混合10分钟后移至离心管，5000g离心10分钟。将有机相移至另一洁净容器，取20微升进样，进行反相高效液相色谱测定。按照中国药典的方法(《中国药典》2010版，二部，1007-1008页)，对紫杉醇的含量测定。流动相等度洗脱，色谱条件为：C18柱(4.6mm×150mm)，甲醇-水-乙腈(23:41:36)为流动相，流速1.0毫升·分钟^-1，进样量20微升，检测波长227nm。经与紫杉醇样品峰对照，所制备的紫杉醇脂质体的包封率为88±5％(三次测量均值±标准偏差)。

取实施例11中制备的紫杉醇脂质体冻干样品，按照《中国药典》2005年版附录XIXC原料药与药物制剂稳定性实验指导原则进行加速试验，结果6个月后粒径经动态激光散射监测在15nm-85nm范围之内。包封率按照上述中国药典的方法测定为85±7％(三次测量均值±标准偏差)。说明脂质体未发生融合及药物渗漏。

实施例13药效学研究

选用4T1乳腺癌细胞接种BALB.C小鼠建立小鼠乳腺癌动物模型。在BALB.C小鼠胸壁5-6肋间皮下接种肿瘤细胞0.1ml，相当于107细胞/只小鼠，每天观察肿瘤的生长情况。接种后1周，肉眼可见皮下肿块，成瘤率为100％。以接种后1周和4周为荷瘤早、晚期模型。取15只小鼠分为三组，每组5只。分别为对照组、荷瘤早期组和荷瘤晚期组。对荷瘤早期组和荷瘤晚期组从小鼠尾静脉注入实施例11制备的紫杉醇脂质体，有效注射剂量为紫杉醇0.5毫克/次，1次/日，首次注射持续3天。其后每7天注射一次。对照组荷瘤小鼠只注射生理盐水。观测对荷瘤早期组和荷瘤晚期组小鼠乳腺癌的抑制作用。以小鼠存活率对时间作图，显示治疗效果如图5所示。在无紫杉醇脂质体治疗的情况下对照组荷瘤小鼠最长可存活11周。相对于对照组，紫杉醇脂质体荷瘤早期组和荷瘤晚期组都有治疗效果。给予紫杉醇脂质体治疗后，荷瘤晚期组的最长存活16周，半存活率时间为95天。紫杉醇脂质体对荷瘤早期组小鼠的治疗效果明显，小鼠的半存活率大于120天。

Claims (10)

1.一种紫杉醇脂质体，其特征在于，所述脂质体为单室脂质体，所述单室脂质体的粒径分布在15-100nm范围之内；

特别地，所述单室脂质体的粒径分布在20-80nm范围之内，更进一步地，在20-50nm范围之内。

2.如权利要求1所述的紫杉醇脂质体，其中，所述紫杉醇药物被嵌入脂质体双层膜中或者结合在双层膜上、或者包裹在脂质体内囊。

3.如权利要求1或2所述的紫杉醇脂质体，其中，所述紫杉醇脂质体的粒径D97小于等于90nm，优选的，D97小于等于80nm，更优选的小于等于60nm，进一步优选小于等于50nm。

4.如权利要求1-3任一项所述的紫杉醇脂质体，其中，所述脂质体由类脂分子(lipid)构成，所述的类脂分子可为：中性类脂、负电性类脂、正电性类脂或其混合物；所述混合物可为中性类脂和负电性类脂的混合物、中性类脂和正电性类脂的混合物、或者中性类脂、负电性类脂和正电性类脂的混合物。进一步优选的，所述中性类脂和负电性类脂的混合物中，所述中性类脂所占比例为50-99.99％，优选70-99.9％，更优选90-99％；所述负电性类脂所占比例为0.01-50％，优选0.1％-30％，更优选1％-10％。所述中性类脂和正电性类脂的混合物中，所述中性类脂所占比例为50-99.99％，优选70-99.9％，更优选90-99％；所述正电性类脂所占比例为0.01-50％，优选0.1％-30％，更优选1％-10％。所述中性类脂、负电性类脂和正电性类脂的混合物中，所述中性类脂所占比例为40-99.98％，优选60-99.8％，更优选80-98％，所述负电性类脂所占比例为0.01-30％，优选0.1％-20％，更优选1％-10％，所述正电性类脂的比例为0.01-30％，优选0.1％-20％，更优选1％-10％，所述比例为摩尔比；

优选的，所述中性类脂包括中性磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、中性合成磷脂等。具体分子包括：大豆卵磷脂(SPC)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二癸酰基卵磷脂(DDPC)、二月桂酰基卵磷脂(DLPC)、二肉豆蔻酰基卵磷脂(DMPC)、二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰基卵磷脂(DSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二芥酰基卵磷脂(DEPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基卵磷脂(MPPC)、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基卵磷脂(MSPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基卵磷脂(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂(PSPC)、1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基卵磷脂(SMPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基卵磷脂(SPPC)、1-肉豆蔻酰基-2-油酰基卵磷脂(MOPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二芥酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺(POPE)等。

优选的，所述负电性类脂包括磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、负电性合成磷脂等。具体分子包括：二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二芥酰磷脂酰甘油(DEPG)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二月桂酰磷脂酸(DLPA)、二油酰磷脂酸(DOPA)等；

优选的，所述正电性类脂包括合成的胺基类脂分子等；

任选的，所述类脂分子还可以包括能够改善脂质体性能的附加剂，所述附加剂可为单一物质或多种物质的组合；

优选的，所述附加剂可以为能够提高脂质体对药物的包封率并提高脂质体稳定性的组分，例如胆固醇和神经酰胺(Ceramide)及其衍生物，如鞘磷脂(sphingomyelin)等，其在所形成的脂质体的各个组分中的摩尔比为0-70％，优选0.01％-50％，更优选0.1％-30％；

优选的，所述附加剂还可以为聚乙二醇修饰的类脂类分子(类脂衍生物)，其在所形成的脂质体的各个组分中的摩尔比为0-50％，优选0.01％-30％，更优选0.1％-20％。其中修饰类脂类分子的聚乙二醇分子量为50-10000，优选100-3000；

优选的，所述附加剂还可以为单糖或多糖分子修饰的类脂类分子(类脂衍生物)，如脑苷脂(cerebroside)、神经节苷脂(ganglioside)等，其在所形成的脂质体的各个组分中的摩尔比为0-50％，优选0.01％-30％，更优选0.1％-20％。

5.一种制备权利要求1-4任一项所述的紫杉醇脂质体的方法，包括如下步骤：

(1)制备类脂分子、客体分子、紫杉醇相混合的溶液；

(2)将所得混合溶液与主体分子溶液混合制备得到紫杉醇脂质体；

所述类脂分子为能够形成所述脂质体的类脂或类脂衍生物，所述的客体分子为所述类脂分子的助溶剂，所述的主体分子是指能与作为助溶剂的客体分子结合的化合物。

6.一种制备权利要求1-4任一项所述的紫杉醇脂质体的方法，包括如下步骤：

(1)分别制备类脂分子与客体分子混合溶液、紫杉醇分子与客体分子混合溶液；

(2)将上述两种混合溶液与主体分子溶液混合制备紫杉醇脂质体；

所述类脂分子为能够形成所述脂质体的类脂或类脂衍生物，所述的客体分子为所述类脂分子的助溶剂，所述的主体分子是指能与作为助溶剂的客体分子结合的化合物。

7.如权利要求5或6所述的制备方法，其中，所述的客体分子为表面活性剂，包括离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂或高分子表面活性剂；

优选的，所述离子表面活性剂为阴离子型表面活性剂或阳离子型表面活性剂。所述阴离子型表面活性剂例如为羧酸盐、磺酸盐或磷酸酯盐表面活性剂，优选具有极性亲水基团为羧酸根、磺酸根、磷酸根等的脂肪烃，例如十二烷基磺酸钠、胆酸钠等。所述阳离子型表面活性剂例如可为具有极性亲水基团为伯氨基、叔氨基、仲氨基、季铵基等的脂肪烃，其中，所述脂肪基的碳原子数为8-24；

优选的，所述两性表面活性剂为分子上同时具有正负电荷的表面活性剂，包括卵磷脂型、氨基酸型，如十二烷基氨基丙酸、和甜菜碱型。所述甜菜碱型包括羧酸基甜菜碱、磺基甜菜碱、磷酸脂甜菜碱；例如烃(烷)基二甲基甜菜碱[RN⁺(CH₃)₂CH₂COO^-]、烃(烷)基二甲基磺乙基甜菜碱[RN⁺(CH₃)₂CH₂CH₂SO₃ ^-]、烃(烷)基二甲基磺丙基甜菜碱[RN⁺(CH₃)₂CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-]、烃(烷)基二甲基羟丙基磷酸脂甜菜碱[RN⁺(CH₃)₂CH₂CH(OH)CH₂HPO4^-]，上述例举的表面活性剂中的基团R为碳原子数为9-18的烃基。所述两性表面活性剂还包括氧化铵型表面活性剂，通常适用的氧化胺包括：C_12-18烷基二(C_1-6烷基)氧化胺，例如：月桂基二甲基氧化胺、肉豆蔻二甲基氧化胺；C_12-18烷基二(羟基C_1-6烷基)氧化胺，例如二(2-羟乙基)椰油基氧化胺、二(2-羟乙基)十六烷基氧化胺、二(2-二羟乙基)硬脂基氧化胺；C_12-18烷基酰氨基丙基氧化胺，例如：椰油酰氨基丙基二甲基氧化胺、肉桂酰氨基丙基二甲基氧化胺、椰油酰氨基丙基二(2-羟乙基)氧化胺；

优选的，所述非离子表面活性剂为聚氧乙烯型(聚乙二醇型)、多元醇型表面活性剂或天然糖类非离子表面活性剂。所述聚氧乙烯型表面活性剂是由环氧乙烷与含有活泼氢的化合物进行加成反应的产物，所述含有活泼氢化合物例如有：脂肪醇、烷基酚、脂肪酸、脂肪胺及脂肪酰胺、油脂、山梨醇和蔗糖等。所述聚氧乙烯型表面活性剂包括：烷基(烃基)酚聚氧乙烯醚，其中所述分子中加成的环氧乙烷数为6-20，优选9-12，例如分子中加成的环氧乙烷数为9-12的辛基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、异辛基苯基聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧丙烯醚或聚氧乙烯醚等；所述聚氧乙烯型表面活性剂还包括高碳脂肪醇聚氧乙烯醚，该脂肪醇含碳原子数为12-18，加成的环氧乙烷数为6-25，优选15-20；所述聚氧乙烯型表面活性剂还包括高碳脂肪酸甲酯乙氧基化物(由脂肪酸甲酯与环氧乙烷加成)，该脂肪酸含碳原子数为12-18，加成的环氧乙烷数为6-25，优选15-20；所述聚氧乙烯型表面活性剂还包括聚丙二醇的环氧乙烷加成物，所述聚丙二醇中丙二醇重复单元数为6-20，优选6-10，加成的环氧乙烷数为6-25，优选15-20。所述多元醇型表面活性剂是由含有多个羟基的多元醇、烷基醇胺等与高级脂肪酸生成的酯类或酰胺类化合物。包括山梨醇脂肪酸酯类、乙二醇单硬脂酸酯或双硬脂酸酯、聚乙二醇双硬脂硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、丙二醇藻酸酯、甘油单硬脂酸酯和双硬脂酸酯、蔗糖酯或烷基醇酰胺型表面活性剂等；所述山梨醇脂肪酸酯类主要包括失水山梨醇酯及其环氧乙烷加成物，例如斯潘系列，吐温系列等。斯潘系列具体包括：失水山梨醇单月桂酸酯(Span-20)、失水山梨醇单棕榈酸酯(Span-40)、失水山梨醇单硬脂酸酯(Span-60)、失水山梨醇单油酸酯(Span-80)。所述天然糖类非离子表面活性剂是由天然糖与脂肪酸或醇形成的酯或醚。其中成酯的脂肪酸或成醚的脂肪链含碳原子数为6-14，优选7-12。所述天然糖类非离子表面活性剂包括单糖酯或醚，如吡喃糖酯、葡萄糖酯或其醚，以及多糖酯或醚，如蔗糖酯、果糖酯、麦芽糖酯或其醚，具体的可为：辛基-β-D-葡萄糖甙、壬基-β-D-葡萄糖甙、癸基-β-D-葡萄糖甙、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、正十四烷基-β-D-麦芽糖苷等；

优选的，所述高分子表面活性剂为天然高分子表面活性剂或合成高分子表面活性剂；如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、接枝共聚物等，还可以是氟碳表面活性剂和硅基表面活性剂。

8.如权利要求5-7任一项所述的制备方法，其中，所述的主体分子为：环糊精及其衍生物、杯芳烃及其衍生物、柱芳烃及其衍生物、葫芦脲及其衍生物等。

优选的，所述环糊精包括6-12个D-吡喃葡萄糖单元，优选含有6、7、8个葡萄糖单元，亦即α-、β-和γ-环糊精。所述环糊精衍生物包括环糊精外表面的醇羟基全部或部分进行醚化、酯化反应生成的醚衍生物(R’-O-)、酯衍生物(R’-COO-)、或者发生氧化反应得到的醛和酮衍生物(R’-CO-)。其中，R’为C_1-6烷基、环烷基、芳基、-C_1-6烷基芳基、取代的C_1-6烷基，取代的芳基、取代的-C_1-6烷基芳基，其中所述取代基为羟基、氨基、醚基、酯基、磺酸基、亚磺酸基、硝基、亚硝基、叠氮基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯基、C_2-6炔基等；

优选的，所述环糊精衍生物还可以是对环糊精及其衍生物交联反应得到的桥联环糊精、环糊精交联聚合物，其中环糊精或环糊精衍生物重复单元数为2-100，优选2-20，更优选2-10。所述环糊精衍生物还可以是与高分子相连的环糊精或其衍生物，其中所述高分子为天然高分子和合成高分子，如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、接枝共聚物等，还可以是氟基高分子、硅基高分子；

优选的，所述杯芳烃(Calixarene)是由对位取代的苯酚、间苯二酚(resorcinol)和邻苯三酚(pyrogallol)与醛发生缩合反应得到的杯[n]芳烃，如分子式1所示：

其中n为4-12的整数，优选为4-7；Ra独立地选自氢、C_1-6烷基(例如叔丁基、异丙基)、芳基、-C_1-6烷基芳基(例如苄基)、杂芳基、-C_1-6烷基杂芳基、醚基、酯基、磺酸基、亚磺酸基、硝基、亚硝基、叠氮基，上述基团还可以进一步被取代基取代，所述取代基为C_1-6烷基、环烷基。Rb独立地选自氢、C_1-6烷基、环烷基、芳基、C_1-6烷基芳基等；Rc为氢；

优选的，所述杯芳烃衍生物可为杂杯芳烃及其衍生物，所述杂杯芳烃为上述分子式1中的苯环中的碳原子被1-4个杂原子取代，所述杂原子可为N、O、S等；

优选的，所述杯芳烃衍生物或杂杯芳烃衍生物为其酚羟基全部或部分进行醚化、酯化反应生成的醚、酯衍生物；所述结构如上述分子式I，其中，Rc可相同也可不同，独立地选自氢、环氧乙烷数为9-12的聚氧乙烯醚基、C_1-6烷基、环烷基、-CO-C_1-6烷基、芳基、-C_1-6烷基芳基、取代的C_1-6烷基、取代的芳基、取代的-C_1-6烷基芳基，其中所述取代基为羟基、氨基、醚基、酯基、磺酸基、亚磺酸基、硝基、亚硝基、叠氮基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯基、C_2-6炔基等；

优选的，所述杯芳烃衍生物还可以是对杯芳烃、含杂原子杯芳烃及其衍生物交联反应得到的桥联杯芳烃、杯芳烃交联聚合物，其中杯芳烃、含杂原子杯芳烃及其衍生物的重复单元数为2-100，优选2-20，更优选2-10。所述杯芳烃衍生物还可以是与高分子相连的杯芳烃、含杂原子杯芳烃或其衍生物，其中所述高分子为天然高分子和合成高分子，如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、接枝共聚物等，还可以是氟基高分子、硅基高分子；

优选的，所述柱芳烃(Pillararene)是由对苯二酚或对苯二酚醚及其衍生物通过亚甲基桥连接得到的柱[n]芳烃，如分子式2所示：

其中n为4-12的整数，优选为4-7；R1和R2独立地选自氢、环氧乙烷数为9-12的聚氧乙烯醚基、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、环烷基、-CO-C_1-6烷基、芳基、-C_1-6烷基芳基，上述基团均可以进一步被取代基取代，其中所述取代基为羟基、氨基、醚基、酯基、磺酸基、亚磺酸基、硝基、亚硝基、叠氮基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯基、C_2-6炔基等；

优选的，所述柱芳烃衍生物可为杂柱芳烃及其衍生物，所述杂柱芳烃为上述分子式2中的苯环中的碳原子被1-4个杂原子取代，所述杂原子可为N、O、S等；

优选的，所述柱芳烃衍生物可以是对柱芳烃、含杂原子柱芳烃及其衍生物交联反应得到的桥联柱芳烃、柱芳烃交联聚合物，其中柱芳烃、含杂原子柱芳烃及其衍生物的重复单元数为2-100，优选2-20，更优选2-10。所述柱芳烃衍生物还可以是与高分子相连的柱芳烃、含杂原子柱芳烃或其衍生物，其中所述高分子为天然高分子和合成高分子，如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、接枝共聚物等，还可以是氟基高分子、硅基高分子；

优选的，所述葫芦脲(Cucurbituril)及其衍生物为甘脲及取代甘脲与甲醛缩合而成的葫芦[n]脲及其衍生物，其中n为4-12的整数，优选为5-8；取代甘脲上的取代基独立的选自：C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、环烷基、C_1-6烷氧基、芳基、C_1-6烷基芳基、C_1-6烷氧基芳基；

优选的，所述葫芦脲衍生物还可以是对葫芦脲交联反应得到的桥联葫芦脲、葫芦脲交联聚合物，其中葫芦脲重复单元数为2-100，优选2-20，更优选2-10。所述葫芦脲衍生物还可以是与高分子相连的葫芦脲，其中所述高分子为天然高分子和合成高分子，如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、接枝共聚物等，还可以是氟基高分子、硅基高分子。

9.如权利要求5-8任一项所述的制备方法，其中，所述类脂分子与客体分子的摩尔比为0.001:1至50:1，优选0.01:1至10:1，更优选0.05:1至5:1。

优选地，所述主体分子与客体分子的摩尔比为0.001:1至100:1，优选0.05:1至10:1，更优选0.1:1至5:1。

更优选地，所述的类脂分子、客体分子、紫杉醇混合溶液；所述的类脂分子与客体分子混合溶液；所述的紫杉醇与客体分子混合溶液；所述的主体分子溶液；在上述溶液中，所使用的溶剂为水或缓冲盐溶液，所述缓冲盐溶液例如磷酸缓冲盐溶液(优选的pH值为7.4)，柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。

10.权利要求1-4任一项所述的紫杉醇脂质体用于制备药物的用途，所述药物优选抗癌药物。